‘> ‘~L ~ ~ ti — — UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGíA III ¿ 5 30111IIi1ii 095396 ls *UNIVERSIDAD COMPLUTENSE ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD LEUCOCITARIA EN PRESENCIAY EN FASE POSTANTIBIÓTICA DE ANTIMICROBIANOS BETALACTÁMIC OS. TESIS DOCTORAL IreneHerreraInsila Madrid, Septiembre1995 D. JoséPrieto Prieto, Catedráticodel Departamentode Microbiología 1 de la Facultadde Medicina de la UniversidadComplutensede Madrid y D~ María LuisaGómez-LusCentelles,Profesoratitular del DepartamentodeMicrobiología 1 de la Facultadde Medicina de la UniversidadComplutensedeMadrid CERTIFICAN: Queel presentetrabajode investigación,titulado: ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD LEUCOCITARIA EN PRESENCIAY EN FASE POSTANTmIÓTJCADE ANTIMICROBIANOS BETALACTÁMICOS, constituyela Memoriapresentadapor Irene HerreraJnsúaparaaspiraral grado deDoctoraen CienciasBiológicas, y ha sido realizadobajo nuestradirecciónen el Departamentode Microbiología1 dela Facultadde Medicinade la Universidad Complutensede Madrid. Y para que conste, expedimosy firmamos el presentecertificado en Madrid, Septiembrede 1995. Fdo. Fdo.JoséPrietoPrieto (j~ t~-&~ Fdo. IreneHerreraInsúa Luisa Gómez-LusCentelles AGRADECIMIENTOS: Al Prof.Dr.JoséPrietoPrieto,por la confianzaquedepositéen mí, por el interés quemostróen mi trabajoy por su inestimableayuda. A la Prof.Dra.Ma LuisaGómez-Lus,por su orientaciónen el desarrollode este trabajo, su constanteayuda y acertadosconsejos. A mis compañerosdel Departamentode Microbiología,por sucolaboración. A la Dra. PaolaPérezFernández. A mi familia. A mis padres. r INDICE 21. INTRODUCCIóN . 1. Antecedentesdel tema 2. Objetivos 3. Acción de los antimicrobianossobre los leucocitos polimorfonucleares 3.1. Acción directade los antimicrobianossobrelas funciones de los leucocitosPMNs 3.1. 1. Penetracióny actividadde los antimicrobianosen el interior de los fagocitos 3.1.2.Quimiotaxis 2 6 7 8 8 8 3.1.3.Fagocitosisy muerteintracelularde los microorganismos 3.2. Acción indirectade los antimicrobianossobrelas funciones de los leucocitosPMNs 3.2.1. Efectode las concentracionessub-CMI 3.2.2. EfectoPALE 4. Antimicrobianos 4.1. Propiedadesde los antibióticosbetalactámicos 9 10 10 12 16 16 4.2. Carbapenemes 17 4.2.1. Imipenem 4.2.1.1.Estructuraquímica 4.2.1.2.Mecanismode acción 4.2.1.3.Actividad bactericida 4.2.1.4. Resistenciaa il-lactamasas 4.2.1.5. Espectroantimicrobiano 4.2.1.6.Farmacocinética 4.2.1.7. Indicacionesterapéuticas 4.2.1.8. Reaccionesadversas 4.2.2.Meropenem 4.2.2.1.Estructuraquímica 4.2.2.2.Mecanismode acción 4.2.2.3.Actividad bactericida 4.2.2.4.Resistenciaa il-lactamasas 4.2.2.5.Espectroantimicrobiano 18 18 18 18 19 19 19 20 20 20 20 21 21 21 22 4.2.2.6. Farmacocinética 4.2.2.7. Indicacionesterapéuticas 4.2.2.8.Reaccionesadversas 4.3. Cefalosporinas 4.3.1. Cefepime 4.3.1.1.Estructuraquímica 4.3.1.2.Mecanismode acción 4.3.1.3.Actividad bactericida 4.3.1.4.Resistenciaa I3-lactamasas 4.3.1.5.Farmacocinética 4.3.1.6.Espectroantimicrobiano 4.3.1.7.Indicacionesterapéuticas 4.3.1.8.Reaccionesadversas 4.3.2. Cefpodoxima 4.3.2.1.Estructuraquímica 4.3.2.2.Mecanismode acción 4.3.2.3.Actividad bactericida 4.3.2.4.Resistenciaa B-lactamasas 4.3.2.5.Espectroantimicrobiano 4.3.2.6.Farmacocinética 4.3.2.7.Indicacionesterapéuticas 4.3.2.8.Reaccionesadversas II. MATERIAL Y METODOS 1. Material 1. 1. Microorganismos 1.2. Antimicrobianos 1.3. Sueroy leucocitospolimorfonucleares 1.3.1. Obtencióndel suerohumano 1.3.2. Obtención,cómputoy viabilidad de los polimorfonucleares 1.3.2.1. Obtenciónde leucocitosPMNs 1.3.2.2.Cómputocelular 1.3.2.3.Viabilidad celular leucocitos 22 23 23 23 23 23 24 24 24 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 28 28 30 30 30 30 30 30 30 30 31 32 2. Métodos 32 2. 1. Determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias(CMIs) 32 2.2. Estudiodel Efecto PostantibióticoLeucocitario (PALE) 32 2.2.1.Preparacióndel inóculo 32 2.2.2.Tratamientoantimicrobiano 33 2.2.3. Estudiodel efectoantimicrobianoen el crecimiento 33 2.2.4.Estudiode la sensibilidadal suero 33 2.2.5.Actividad bactericidade los leucocitosPMNs en la fasepostantibiótica.PALE 34 2.3. Estudio de la actividad bactericida de leucocitos PMNs en presenciacontinuade antimicrobianos 35 2.3.1. Preparacióndel inóculo 35 2.3.2. Estudiode las curvasde letalidaddeE.coli y $..In¡~us 35 2.3.3. Actividad bactericidade los leucocitosPMNs en presencia continuade antimicrobianos 35 2.4. Métodosde cálculoestadístico 36 111. RESULTADOS 38 1. Concentracionesmínimasinhibitorias (CMIs) 38 2. Estudiodelefectopostantibióticoleucocitario 38 2.1. Estudiodel pretratamientoantimicrobianosobre 38 2. 1. 1. Efecto sobreel crecimientode E. coli 2.1.1.1.Efectode imipenem 2.1.1.2.Efectode meropenem 2.1.1.3.Efectode cefepime 2.1.1.4. Efecto de cefpodoxima 2.1.2. Efecto sobre el crecimiento de 5. aureus 2.1.2.1. Efecto de imipenem 2.1.2.2. Efecto de meropenem 2.1.2.3. Efecto de cefepime 2.1.2.4. Efecto de cefpodoxima 38 38 39 39 40 40 40 41 41 41 el crecimientobacteriano 2.2. Efecto del suero en el crecimientobacteriano 42 2.2.1. Efectodel sueroen el crecimientode li,soli 2.2.1. 1. Efectodel sueroen el crecimientode E. coli no pretratado con antimicrobiano 2.2.1.2.Efectodel sueroen el crecimientode~sgii pretratado con imipenem 2.2.1.3.Efectodel sueroen el crecimientode B~s~ii pretratado con meropenem 2.2.1.4. Efectodel sueroen el crecimientode E. coli pretratado con cefepime 2.2.1.5. Efectodel sueroen el crecimientode E. coli pretratado con cefpodoxima 2.2.2. Efectodel suero en el crecimientode S.aureus 2.2.2.1.Efectodel sueroen el crecimientode S. aureusno pretratado con antimicrobiano 2.2.2.2.Efectodel sueroen el crecimientode S. aureuspretratado conimipenem 2.2.2.3.Efectodel sueroen el crecimientode 5. aureuspretratado con meropenem 2.2.2.4.Efectodel sueroen el crecimientode S. aureuspretratado con cefepime 2.2.2.5.Efectodel sueroen el crecimientode 5. aureuspretratado con cefpodoxima 2.3. Actividad de los leucocitosPMNs. P.A.L.E 2.3.1. Actividad de los leucocitosPMNs frente a E. coli 2.3.1.1. Actividad de los leucocitosPMNs frente a E. ccli no pretratado con antimicrobiano 2.3.1.2. Actividad de los leucocitosPMNs frentea E. coli pretratado con imipenem 2.3.1.3. Actividad de los leucocitosPMNs frente a E. ccli pretratado con meropenem 2.3. 1.4. Actividad de los leucocitos PMNs frente a E. ccli pretratado con cefepime 42 42 43 43 44 44 45 45 45 46 47 47 48 48 48 49 51 53 2.3.1.5.Actividad de los leucocitosPMNs frente a E. coli pretratado con cefpodoxima 2.3.2.Actividad de los leucocitosPMNs frente a S. aureus 2.3.2.1.Actividad de los leucocitosPMNs frente a 5. aureusno pretratado conantimicrobiano 2.3.2.2.Actividad de los leucocitosPMNs frente a 5. aureuspretratado con imipenem 2.3.2.3.Actividad de los leucocitosPMNs frentea5. aureuspretratado con meropenem 2.3.2.4.Actividad de los leucocitosPMNs frente a 5. aureuspretratado con cefepime 2.3.2.5.Actividad de los leucocitosPMNs frentea 5. aureuspretratado con cefpodoxima 3. Estudiode la actividadbactericidade los leucocitosPMNsen presenciacontinuade antiniicrobianos 3.1. Actividad bactericidade leucocitosPMNs frente a E. coli en presenciacontinuade antimicrobianos 3.1.1. Actividad bactericidade leucocitosPMNs frentea E. coli en presenciacontinuade imipenem 3.1.1.1.Efectode 1/2 CMI de imipenem 3.1.1.2.Efectode 4 CMI de imipenem 3. 1.2. Actividad bactericida de leucocitos PMNs frentea E. coli en presencia continua meropenem 3.1.2.1. Efecto de 1/2 CMI de meropenem 3.1.2.2. Efecto de 4 CMI de meropenem 3.1.3. Actividad bactericida de leucocitos PMNs frente a E. coli en presenciacontinuacefepime 3.1.3.1.Efectode 1/2 CMI de cefepime 3.1.3.2.Efectode 4 CMI de cefepime 3.1.4. Actividad bactericida de leucocitos PMNs frente a E. coli en presencia continua cefpodoxima 3.1.4.1. Efecto de 1/2 CMI de cefpodoxima 3.1.4.2. Efecto de 4 CMI de cefpodoxima 65 70 ... ‘70 70 70 70 72 72 73 74 74 75 76 76 77 55 57 57 58 61 63 3.2. Actividad bactericida de leucocitos PMNs frente a 5. aureus en presenciacontinuade antimicrobianos 3.2.1. Actividad bactericidade leucocitosPMNs frente a 5. aureusen presenciacontinuade imipenem 3.2.1.1.Efectode 1/2 CMI de imipenem 3.2.1.2.Efectode4 CMI de imipenem 3.2.2.Actividad bactericidade leucocitosPMNs frentea 5. aureusen presenciacontinuameropenem 3.2.2.1.Efectode 1/2 CMI de meropenem 3.2.2.2.Efectode 4 CMI de meropenem 3.2.3. Actividad bactericidade leucocitosPMNs frente a 5. aureusen presenciacontinuacefepime 3.2.3.1.Efectode 1/2 CMI de cefepime 3.2.3.2.Efecto de 4 CMI de cefepime 3.2.4. Actividad bactericidade leucocitosPMNs frentea 5. aureusen presenciacontinuacefpodoxima 3.2.4.1.Efecto de 1/2 CMI de cefpodoxima 3.2.4.2.Efectode 4 CMI de cefpodoxima IV. GRÁFICOS V. DISCUSIÓN 1. Análisis delmétodoexperimental 1. 1. Preparacióndel inóculo 1 .2. Pretratamientoantimicrobianoy exposicióncontinua de los microorganismos al antimicrobiano 1.2. 1. Pretratamiento antimicrobiano 1.2.2. Exposición continua de los microorganismos al antimicrobiano 1.3. Extracción de leucocitos PMNs 1.4. Lisis de los leucocitos y efecto del pH en las bacterias 2. Análisis de los resultados 2.1. Efecto postantibiótico leucocitario (PALE) 2. 1.1. Efecto del pretratamientoantimicrobianosobre la cinéticade crecimientode E. coli y 5. aureus 2.1. 1. 1. Efecto del pretratamiento antimicrobiano de E. coli • . . . 78 78 78 80 81 81 82 84 84 85 86 • . . . 86 87 .91 124 124 124 125 125 126 126 127 128 128 128 128 2.1.1.2.Efectodel pretratamientoantimicrobianode S. aureus 2.1.2. Efectodel suerosobrela cinéticade crecimientode E. coli y S. aureus 2.1.2.1. Efecto del suero sobre E. coIl y 5. aureus control 2.1.2.2. Efecto del suero sobreE. coli y 5. aureuspretratados 2.1.3. Actividad bactericida de los leucocitos PMNs 2.1.3. 1. Actividad bactericida de los leucocitos PMNs frente a E. coli y 5. aureus control 2. 1.3.2. Actividad bactericidade los leucocitosPMNs frente a E. coli y S. aureus pretratados 2.2. Efecto de la presencia continua de antimicrobianos sobre la actividad bactericidade los leucocitosPMNs 2.2.1. Cinéticasde letalidaden E. ccli y 5. aureus 2.2.1.1. Cinéticas de letalidad en E. coli 2.2.1.2. Cinéticas de letalidad en 5. aureus 2.2.2. Actividad bactericida de los leucocitosPMNs frente a E. coli y 5. aureus en presencia de antimicrobianos 3. Aplicación clínica de los estudios sobre la modificación de la actividad leucocitaria en fase postantibiótica y en presencia de antimicrobiano VI. CONCLUSIONES VII. BIBLIOGRAFIA VIII. APENDICE 130 131 131 133 135 135 136 144 144 144 145 • . . . 145 151 155 158 181 7 ABREVIATURAS CMB ConcentraciónMáxima Bactericida CMI Concentración Mínima Inhibitoria DE DesviaciónEstándar DHP-I Dehidropeptidasa1 HBSS SoluciónSalinaEqulibradade Hank Ig Inmunoglobulina IN Intravenosa PAE Efectopostantibiótico PALE EfectoPostantibióticoLeucocitario PBPS Proteínas Fijadoras de Penicilina PMNs Polimorfonucleares SAMR Stauhylococcus aureus meticilina resistente 5H14 Suero Humano Normal UFC Unidades Formadoras de Colonias — 1 INTRODUCCIÓN Introducción 1. ANTECEDENTES DEL TEMA La investigaciónde los efectosinmunomoduladoresde los antimicrobianos comenzó casi al mismo tiempo que su desarrollo. Numerosos investigadores apoyaron las observaciones de los estudios de Metchnikoff, publicados a principios de este siglo, que demostraban la importancia de las células fagociticasen la defensadel organismo contra agentesmicrobianos. Desdeentoncesdiferentesestudiosseñalaronque los antibióticosson normalmenteineficacesparael tratamiento de infecciones en ausencia de células fagocíticas competentes. Sin embargo, la mayoría de las investigaciones estaban centradas en el estudio de las relacionesentre los microorganismosy los antibióticos. En los últimos veinte años, el número creciente de pacientes inmunocomprometidosque presentaninfeccionesdifíciles de tratar y el intento de reducir los problemasde infeccionesnosocomialesy superinfecciones,ha estimulado la investigaciónparaunamejorcomprensiónde las interaccionesentrelos antibióticos y el procesofagocítico, y selecciónde agentescon propiedadesinmunoestimulatorias que puedan ayudar en la recuperación de la infección. El interés de la interacción entre antimicrobianos y fagocitos: leucocitos polimorfonucleares y macrófagos,seha centradoen: - la influencia de los antibióticos en la quimiotaxis - la accióndirectade los antibióticosen las funcionesde las célulasfagocíticas, comofagocitosis,muerteintracelulary respuestametabólica - fagocitosis y muerte de las bacteriasalteradaspor el contactoprevio con el antimicrobiano - penetración intracelular de los antibióticos y actividad intracelular contra las bacterias fagocitadas (1). Los resultados presentan grandes dificultades para su comparación e interpretación debido a las variaciones en la metodología empleada para el ensayo de las funciones fagocitarías y las diferencias en el diseño experimental, incluyendo las concentraciones empleadas y el tipo de células fagociticas y microorganismos utilizados. Por otra parte, el intento de delimitar variables para correlacionar los resultados 2 Introducción obtenidos in vitro, con la situación iii vivo, es complejo. Los resultados in vivo dependendel modelo animal escogidoy la posibilidadde que la respuestaseadebida a factoresindividualesdel hospedador,debeser siempreconsiderada.Los resultados de los experimentos in vitro pueden aclarar los mecanismosespecíficosde la potenciación o inhibición de determinados parámetros del sistema inmune y los resultados de los experimentosin vivo pueden proporcionar información útil para el tratamientoempírico (2). La terapia continua, cuyo objetivo es mantenerlos niveles del fármacopor encimade la concentraciónmínima inhibitoria duranteel intervalo entredosis, sigue siendola basede la mayoríadelos regímenesdeantibióticosempleadoscorrientemente (3). Sin embargo,en la décadade los cuarenta,la experienciaclínica demostróqueuna terapiasatisfactoriaparala neumoníaneumocócicaconpenicilina,sepodíaalcanzarcon un régimen de dosis discontinuo, proporcionando niveles inhibitorios durante solo la mitad del intervalo entredosis. La supresión persistente delcrecimientobacterianodespuésde la exposiciónal antibiótico, descritacomo efectopostantibiótico(PAE) (4), ha sido confirmadopara variasclasesdeantibióticos.El interésen conocerel fenómenoPAE radicaen el ánimo de establecer terapias antimicrobianas discontinuas eficaces. El PAE in vivo permitida un descensode los niveles de antibiótico en los tejidos, de manera que la actividad antibacteriana pudiese estar ausente durante una fracción del intervalo de dosis, sin pérdida de la eficacia del antimicrobianocomo resultadode un recrecimientobacteriano(5). Aunque el efecto postantibióticoconfiere ventajaal hospedador,es bastante improbableque sea la explicación suficiente del éxito de la terapia antibacteriana discontinua(3). La participacióndc los factores de defensadel organismo en la eliminación de las bacterias, después de una exposición a niveles suprainhibitorios de antibiótico,ha sidodemostradoin vitro porvariosgrupos(Alexandery Good, 1968(6); Solberg,1978 (7); Horney Tomasz,1981 (8); McDonald,Wetherally Pruul, 1981 (9). McDonaldet al. demostraronque microorganismosen fasepostantibióticason más sensiblesa la fagocitosisy muertepor leucocitos humanosy llamaron a este 3 Introducción fenómeno,efectoP.A.L.E. (PostantibioticLeukocyteEnhancement). Algunos autores estudian las variaciones en el efecto fagocítico y bactericida de los leucocitoscuandoseexponena un pretratamientoantimicrobianoy posteriormente se incorporanlos microorganismos(10) o exponiendoconjuntamentelos leucocitosy bacterias a la acción antimicrobiana (11). En la situaciónin vivo, el tiempo real de contacto de la bacteria con niveles suprainhibitoriosde antibiótico, puedeser realmentecono, especialmentecon una dosificación intermitente. Sin embargo, una breve exposición de la bacteria al antibiótico puede ser importante en el resultado terapéutico. La exposición a concentracionesterapéuticasde antibióticoscon distintos mecanismosde acciónha demostradoalterar la superficiecelular bacteriana(12). Estos cambiospuedentraer consigo alteraciones en una gran variedadde propiedadesde la superficie celular importantesen la interacción con los componentesde defensa del hospedador, incluyendocambiosen los antígenosde superficiecelular(13,14),hidrofobicidad(15), excreción de toxinas y enzimas(16), pérdidade lipopolisacáridosy cambios en el grosor de la pared celular (12,17). Mientras las perturbacionesinducidaspor el antibióticoen la superficiebacterianaalteran su interacción con las opsoninasy las célulasfagocfticas,los mecanismospor los cualessemodulala sensibilidadala muerte fagocíticasonbastantedesconocidos.Seha demostradoqueel incrementode la muerte del estreptococo fi-hemolítico del grupo A por leucocitos, despuésde una breve exposición a eritromicina, se debe a un aumento de la ingesta fagocitica (18), mientras el incremento de la muerte de Escherichia coli después de la exposición a cloranfenicol depende de un aumento de la muerte intracelular (19); y el aumento de opsonización es el mecanismo por el cual la exposición de cocos Gram-positivos a niveles subinhibitorios de clindamicina, incrementala sensibilidada la muerte por células fagociticas (14,20). Están implicados mecanismosde muerte intracelular tanto dependientes(19,21)comoindependientesde oxígeno(22). Nuestro interésen este trabajo se ha centradoen el estudiode la actividad bactericida de leucocitos polimorfonucleares, en dossentidos.Primero,el efectode una breve exposición de las bacterias a antimicrobianos betalactámicos, que simula niveles 4 — r Introducción de antibióticoalcanzadosin vivo durante el tiempo en que el fármaco estápresente,en un régimendedosificacióndiscontinuo,y evitacualquierinteracciónentreel antibiótico y los polimorfos. El resultado de una infección puede ser considerado como consecuencia de la interacción entre una combinación de factores, en los cuales el antibiótico puede interaccionar de forma sinérgica o antagónica, con los fagocitos en la eliminación de la bacteria. En segundo lugar, estudiamos la fagocitosis y muerte intracelular de las bacterias en presencia del antimicrobiano,polimorfonuclearesy factoresséricos, máspróximo a la situación real in vivo donde el antimicrobiano puede penetrar en los compartimientos intracelulares de lospolimorfosy sesuperponenlas interaccionesentre antibiótico-leucocitos PMNs, antibiótico-microorganismos y leucocitos PMNs- microorganismos. 5 1 Introducción 2. OBJETIVOS Teniendoen cuentalo anteriormenteexpuesto,los objetivosde estetrabajoson los siguientes: 1. Determinarsi un breve tratamientode Escherichiacoli y Staphylococcus aureuscon cuatro veces la CMI de los antimicrobianos:imipenem, meropenem, cefepimey cefpodoxima,induceuna supresiónsignificativadel crecimientobacteriano postantibiótico o efecto PAE. 2. Estudiar si dicho tratamiento influye en la sensibilidad de ambos microorganismos al suero humano normal. 3. Cuantificar el cambio en la sensibilidad a la muerte fagocítica por leucocitos polimorfonucleares humanos (PMNs), de microorganismos pretratados con los antimicrobianos mencionados en fasepostantibiótica,efectoPALE. 4. Cuantificar el cambio en la sensibilidad de los microorganismos, a la muerte fagocítica por PMNs humanos, en presencia continua de los antimicrobianosde este estudio. 5. Analizas si el cambioen la sensibilidadde los microorganismosa la muerte fagocftica por PMNs, en la fase postantibiótica y en presencia continua de antibiótico, estácondicionadopor el tipo de antimicrobiano,microorganismoo ambosfactores. 6 — ~1— Introducción 3. ACCIÓN DE LOS ANTIMICROBIÁNOS SOBRE LOS LEUCOCITOS POLIMORFONUCLEARES. Los leucocitos especialmente los granulocitos neutrófilos, constituyen el mecanismo fundamental de eliminación de los gérmenespresentesen los tejidos. La respuesta neutrófila ante una infección bacterianalocalizada se desarrollaen varías etapas. En primer lugar se produce la movilización de los leucocitosdesdela médula óseaa la circulaciónsanguínea.Luego,los leucocitosneutrófiloscirculantesseadhieren al endoteliode los capilaresvecinosal áreainfectaday lo atraviesan,pasandoasíal espaciointersticial, y migranhaciael foco inflamatorio. Estos pasos son mediadosy estimuladospor unaserie de sustanciasqueactúancomofactoresquimiotácticos.Los factores quimiotícticosmás importantesson ciertos productosde la activación del complemento,comoel C3a, CSay C567, sustanciasde origen bacterianoy sustancias producidaspor los propiosleucocitos(comoel leucotrienoB4). Tras la llegadade los neutrófilosal lugardela infección seiniciael procesode la fagocitosisde lasbacterias. La fagocitosisbacterianaa cargode los neutrófilosseve favorecidapor sustanciascon capacidad opsonizante, como las inmunoglobulinas, productos del complemento, fibronectina y otras, las cuales permiten la adherencia de las bacterias a la membrana del leucocito. Una vez las bacterias han sido fagocitadas se produce su destrucción intracelular, realizada principalmente a través de mecanismos independientes de oxígeno o dependientes de oxígeno que pueden ser mediadoso no por mieloperoxidasa. Muchos antimicrobianoshan demostradosu capacidadpara interferir con diversos aspectosdel sistema de defensadel hospedador,como la adherencia microbiana,producción de toxinas, quimiotaxis, opsonización,ingestión y muerte fagocíticapor leucocitosPMNs, y modulaciónde la respuestade las célulasT y B. Los antibióticos pueden interactuar con los PMNs de dos formas: el antimicrobiano puede alterar las funciones de los leucocitos (efecto directo) y la bacteria puedeser modificadapor el antibiótico con consecuenciasindirectasen la fagocitosis y/o muerte intracelular porel PMN (efectoindirecto). Un tercermodo de interacción, del cual existen pocos datos, seríala modificacióndel antibióticopor los PMNs (23). 7 Introducción 3.1. Acción directa de los antimicrobianos sobre las funciones de los leucocitosPMNs. 3.1.1. Penetración y actividad de los antimicrobianos en el interior de los fagocitos. La entradadelosagentesantimicrobianoses un requisitoparala actividadcontra bacteriasintrafagocíticas.En la penetraciónde los antimicrobianosal interior de las célulasfagocitariasinfluyendiversosfactoresrelacionadoscon el propiofármaco,tales como la temperatura, el pH, la viabilidad de las células y la estructura molecular del antibiótico. Otros factores son, el tipo de célula fagocítica y la concentración extracelular del antibiótico (24). Sin embargo,la capacidadde los antibióticospara entrar en los fagocitos,no predice exactamentela actividad del fármaco contra organismosintracelulares.La actividad intrafagocíticadel antibiótico dependede múltiples factores (25). a) la localizaciónintracelularespecíficay la concentracióndel antimicrobiano b) laspropiedadesintrínsecasantibacterianasdel agente(mecanismode acción) c) el efectodel medio intracelularen la actividadbiológica del antibióticoy m la susceptibilidad del microrganismo d) la influenciadel antibiótico en la función del fagocito (fagocitosis,sistemas microbicidas, etc) En términos generales, la mayoría de los estudios han señaladoque los antibióticosbetalactámicosy los aminoglicósidosno pasanni son activosen el interior de lascélulas fagocitarias.Los macrólidos,aunquese concentranen el interior de los fagocitos, solo son activos a elevadas concentraciones, debido a que se localiza en el fagosomaquetieneun pH ácido. Todaslas quinolonaspasany sonactivasen el interior del fagocito. Con las tetraciclínas existen pocos estudios de penetración y actividad intrafagocitaria, estos trabajos señalan que penetran pero carecen de actividad intracelular, aunque oxitetraciclina es activa en el interior de los fagocitos. La rifampicinapasay esmuy activaen el interior tantodePMNs comode macrófagos(1). 3.1.2. Quimiotaxis Los antibióticosbetalactámicosno afectana la quimiotaxisanivelesterapéuticos 8 —I —— Introducción convencionales (26). Las tetraciclinas y los aminoglicósidos parecen inhibir la respuesta quimiotáctica de los leucocitos, este efecto negativo ha sido observado tanto in vitro como in vivo (1). Los macrólidos (eritromicina y roxitromicina) estimulan la quimiotaxisen respuestaa CSa(27,28).Otrosgruposdeantibióticoscomoclindamicina y rifampicina, no han mostrado efecto sobre la quimiotaxis (29). 3.1.3. Fagocitosis y muerte intracelular de los microorganismos. Los experimentos en los que el antimicrobiano está presente en el medio de incubación de PMNs y bacterias, muestran problemas de interpretación puesto que el efectodel antibióticopuedeestarrelacionadocon su interaccióncon cualquierade los componentesquese hallanen el sistemaanalizadoy no necesariamentecon la célula fagocítica. Los antibióticosbetalactámicosy eritronúcinano afectanla fagocitosisdeforma directa.Los datosdisponiblessobrela influenciade aminoglicósidosen la fagocitosis son contradictorios y en el caso de clindamicina, no hay suficientes estudios para poder extraer conclusiones. Las tetraciclinas parecen ejercer efectos negativos en la actividad fagocitica de los leucocitos (1). Cefozidimay cefotaximaincrementanla muertede S. aureuspor PMNs (30). El mecanismode estesinergismoes diferenteparalas dos cefalosporinas,cefotaxima incrementóla muertey la respuestaoxidativade los PMNs a partículasopsonizadas($.~, aureusy zimosan).Estosefectosno se observaroncon partículasno opsonizadas.En el casode cefozidima,el sinergismobactericidaestabarelacionadocon la interacción con el sistemaindependientede oxígenode los PMNs. La rifampicina afecta a la respuestaoxidativa de los PMNs, deprimiendola producciónde superóxidoy la quimioluminiscenciade forma dosisdependiente(31). Las ciclinasdeprimenvarias funcionesde los PMNs por mecanismosespecíficos,el másimportanteespor quelaciónde calcio intracelular(32), ademáslasciclinaspueden influir en la actividad de los PMNs por generaciónde singletesde oxigenodebidosa la exposicióna la luz Uy (33) condañode las estructurasde los PMNs queparticipan en el estallidorespiratorio.Los aminoglicósidosdificultan la actividadcandidicidade los PMNs (34). El mecanismoresponsablede estosefectospodríaestarrelacionadocon 9 1 Introducción la inhibición del metabolismode los fosfoinositidos. También seha descritosinergismoentrela actividadbactericidade los PMNs y macrólidoscomoeritromicina, roxitromicina(35) o josamicina(36). El mecanismo de estesinergismono estáclaramentedemostradoin vitro yaqueestoscompuestosno alteran significativamente la quimiotaxis ni el metabolismo oxidativo a las concentracionesa las quesi se incrementala muertepor PMNs. El incrementode la muertebacterianapodría estarrelacionadocon las concentracionesintracelularesde estosfármacosen los fagolisosomas,dondepotenciaríanlos mecanismosbactericidas intrínsecos de las células (37). Losmecanismosmedianteloscualeslas fluorquinolonasinfluyenmoderadamente en la respuestade los PMNs, son desconocidos.Se ha hallado un aumentoen la fagocitosis y muerte bacteriana con norfioxacino y pefloxacino, así como la estimulaciónde la vía hexosamonofosfatocon ciprofloxacinoy ofloxacino (38). 3.2. Acción indirecta de los antimicrobianossobre las funcionesde los leucocitosPMNs. 3.2.1.Efectode las concentracionessub-CMI. Normalmentela actividadde los antimicrobianossedescribepor su capacidad paramataro inhibir el crecimientode los microorganismos,debidoa ello se intentan conseguirconcentracionesde antibiótico queexcedanla CMI-CMB en el lugar de la infección. Pero las concentracionesde antibiótico, generalmenteexcedenla CMI, durantelimitadosperíodosde tiempo, despuéslas concentracionesson menoresquela CMI (sub-CMIs).Esto es obvio en tejidos, dondelas infeccionesestánlocalizadasy dondelasconcentracionesde antibióticoson frecuentementemenoresquelas halladas en sangre(39). Las concentracionessub-CMI tienen distintasactividadesen la morfología y fisiologíade las bacteriasquepuedenindirectamenteafectarsu virulenciay sensibilidad a las célulasfagociticas. La síntesis de factoresde virulencia como la proteínaM de Streptococcus pyo~enespuedeserreprimidacuandola bacteriaproductoracrececonconcentraciones subinhibitoriasde clindamicina(40). La proteínaA puedeimpedir la opsonizaciónde 10 ~~1~ Introducción estafilococospor suero (41). El incrementoen la fagocitosis y muerte de S. aureus puedeocurrir trasla inhibición de la biosintesisde la proteínaA debidoa la exposición a concentracionessubinhibitoriasde antibióticos(clindamicinay ácido fusídico) (13). Otros factoresde virulenciacuyaexpresiónpuedeser moduladapor concentraciones sub-CMI de antibióticosson: el antígenoK y hemolisinasen E. coli (42,43) y la cápsulalipopolisacáridaen Bacteroidesfrarilis y Haemophilusinfluenzae(44,45,46). Lapreincubaciónconconcentracionessub-CMJspuedeprovocarmodificaciones en la adhesividad(39), en la sensibilidadde las bacteriasal suero (47), y también modificacionesen los requerimientosopsónicos(48). Concentracionessubinhibitorias de gentamicinaincrementanla fagocitosisde bacteriasaerobiaspor PMNs a travésde un mecanismodirecto quedalia a la bacteriafacilitando su opsonizacióny fagocitosis (52). En un trabajo con dos cepascapsuladasde E. coli, el pretratamientocon concentracionessub-CMIsdenetilmicinaelevótantoel consumodecomplementocomo la fagocitosis(42). El pretratamientocon concentracionessub-CMIs, puedetambiénmodificar la sensibilidadalos mecanismosde muerteindependienteso dependientesde oxígeno.Se ha observadoquedespuésde crecerdurantela nocheen presenciade concentraciones sub-CMJde ceftriaxona,los filamentosde Klebsiellapneumoniaesufrieronun aumento de sensibilidada la muerteindependientede oxígeno,comoocurriótambiénenel caso de 5. aureus tratada con ceftriaxona (53). Por el contrario, los filamentos de P . aeruginosadebidosa la exposicióna ceftriaxona,mostraronunamayorsensibilidada la muertedependientede oxígenoquelas bacteriascontrol no tratadas(54). Las bacteriaspreincubadaspueden liberar sustanciascapacesde estimular directamentelascélulasfagocíticas(49) o exponerotrosantígenos(50). La filamentaciónde bacteriasGram-negativas,despuésde la preincubacióncon concentracionessub-CMIs de betalactámicosy fluorquinolonas (16) aumenta la sensibilidadala actividaddelos leucocitos.Las concentracionessubinhibitoriaspueden debilitar la integridadde la estructurabacteriana.Esto puedefacilitar el accesode los factoresdel fagocitoa susdianasen las bacteriastratadas(51). 11 1 Introducción 3.2.1. EfectoPALE Iii vitro los antibióticos retrasanel crecimientoy el metabolismobacteriano duranteun períodosuperioral tiempode exposiciónal antimicrobiano,estefenómeno esconocidocomoefectopostantibióticoo PAE (4,55).El términoefectopostantibiótico se define comoel períodode recuperacióno la supresiónpersistentedel crecimiento bacterianotrasunabreveexposiciónal antimicrobiano(4). El PAE parecetenersu principal implicaciónen las pautasde dosificaciónde antimicrobianos, pero la eficacia terapéutica de los antibióticos dependede la funcionalidadde los mecanismosde defensadel organismo.A este respectoBagle et al. (56) sugirieronqueel efectopostantibióticopuedecontribuir a la eficacia de los regímenesdedosisde antibióticos,peroreconocenque los factoresdel hospedadorson crucialesen el intervalo de dosificacióndel tratamiento. Los estudiosde Alexandery Good (1968)(6) demostraronquela exposiciónde Staphylococcusaureusa la penicilinay estreptomicinaa concentracionesmayoresque la CMI aumentabala capacidadbactericidade los PMNs humanos. Posteriormenteseestablecióqueun períodocorto de contactoentrela bacteria y el antibióticoera suficientepara sensibilizarla bacteriaa la actividad del leucocito (57). Este incrementoobservadoen la sensibilidadde la bacteriapretratadano podía deberseal antibióticoresidual(4), sinoacambiosestructuralesen la membranaexterna de la bacteriainducidospor el antibiótico (58). Algunos autores postularon que los compuestosque modifican la superficie celular bacteriana serían más apropiadospara activar los procesosde fagocitosis y muerte intracelular por los PMNs que aquellos que tenfan un locus de actuación subcelular.Sin embargo se habían observadocambios en la permeabilidadde la membranacelular despuésde la exposiciónde E. coli a cloranfenicol, inducidos a travésde un mecanismode acciónintracelularde esteantibiótico.Por tantoesteefecto de aumentode sensibilidadno seobservabaúnicamentecon antibióticosqueteníansu sitio de acciónen la pared, sino tambiénen aquelloscon actividadintracelular. En la situación“in vivo” el tiempo real de contactode la bacteriacon niveles suprainhibitoriosdeantibiótico,puedeserrelativamentecorto, sobretodoen unaterapia 12 Introducción de dosis seriadas, en la que los niveles de antibiótico desciendenpor debajo de concentraciones inhibitorias durante una parte del intervalo de dosificación. Exposiciones previas al antimicrobiano duranteun breveperíododetiemposimulanlos niveles de antibiótico alcanzados durante su dosificación. La exposiciónde bacteriasa altasconcentracionesde antimicrobianosdurante limitados períodosde tiempopuedeafectarsu interaccióncon los leucocitosPMNs. McDonald et al. (9,59) y Pruul et al. (60,61,19,48)demostraronque los organismosen fasepostantibióticaeran mássusceptiblesa la actividad antibacteriana delos leucocitoshumanos.Ellosdenominaronaestefenómeno“PALE” (Postantibiotie leukocyteenibanceinent) Con Escherichiacoli se ha determinadoque los antibióticos que inhiben la síntesisprotéicainducen un efecto PALE superioral queproducenlos antibióticos betalactámicos(9). El pretratamientode Staohylococcusaureus y Streotococcus pyo~enescon penicilina O, amoxicilina, eritromicinay clindamicinaprovocatambién un incremento en la sensibilidad a la acción letal de los leucocitos (62). Este incrementode la susceptibilidadestárelacionadocon cambiosfenotípicos en la bacteriaqueafectana la fagocitosisy muerteintracelular. Diversaspropiedadesde la estructurasuperficialbacteriana,importantesen la interaccióncon los componentesde defensadel huésped,puedenser alteradospor exposiciónal antibiótico. La hidrofobicidadde la superficiebacterianaparecedesempeñarun importante papelen la interacciónentrebacteriasy fagocitos.Seha demostradoque la asociación bacteria-célulafagocíticadisminuyecuandoaumentanlaspropiedadeshidrofílicasde la paredcelularbacteriana(63). El incrementode la hidrofobicidadde la bacteriaexpuesta a antibióticos,apoyala hipótesisde quela exposiciónal antimicrobianodesorganizalas estructurasexternasde la paredcelular responsablesde la resistenciaa la fagocitosis por PMNs. Las alteracionesocasionadasporel antibióticoconduciríanaunaexposición de los lípidos de la membranaexterna,aumentandola hidrofobicidad de la célula bacteriana(48). Las mutaciones liso-rugosas, que modifican estructuraslipopolisacMidas, 13 — •—•—•—•I — Introducción disminuyenla resistenciaa la fagocitosisy a la actividadbactericidade extractosde gránulos de leucocitos (19). Se ha demostrado además, que perturbaciones no letales dela membranaexterna,de bacteriasgram-negativasresistentesal suero,provocanun cambiofenotípicoreversiblehaciala sensibilidadal suero(61). Los cambiosen la permeabilidadde la membranaexternade E. coli hansido observadosdespuésde la exposicióna altos niveles de cloranfenicol. La actividad bacteriostáticadel cloranfenicolestáasociadaconsu interferenciaen la síntesisprotéica mediantela supresiónde la actividad peptidil-transferasaen la subunidad50 5 del ribosomabacteriano.Sin embargo,esto no explica su actividad bactericidain vivo frente a Haemonhilusinfluenzae,quepuedeestarrelacionadacon la desestabilización de la estructuray funcionalidadde la membranaexterna bacterianaa través de la incorporaciónde proteínasincompletasde bajo peso molecular que aumentansu permeabilidady susceptibilidada PMNs humanos(61). La filamentaciónde bacilos Grain-negativosha sido puestade manifiestoen múltiples estudiosin vitro y constatadaenpacientesinfecciososqueestabantratadoscon antibióticos(15). Cuandola poblaciónde bacteriases expuestaa concentracionesde antibiótico igualeso mayoresque la CMI, tiene lugar la lisis pero no se produceen toda la población al mismo tiempo. Esto da lugar en muchoscasosa unamezclade filamentosy filamentoslisados.Lorian et al. demostraronque las bacteriasexpuestas a antibióticosbetalactámicosy a aquellosquedirectao indirectamenteproducenuna alteraciónen la síntesisprotéica,inducenelongacióny algunasvecesformasfusiformes en Gram-negativos.Ademásde su morfologíaseproducencambiosen el pesoy en la masade la bacteria.El estudiode la capacidadbactericidade los PMNs sobrebacilos gram-negativosy susrespectivosfilamentos,evaluadocomopesode microorganismos muertos/PMNs(16), reveló quelos filamentosson significativamentemássusceptibles quelos bacilosnormalesa la actividadbactericidade los leucocitosPMNs. El máximoefectoPALErequierelaparticipacióndeanticuerposy complemento. El requerimientode anticuerposindica queel PALE operaa travésde la activaciónde la víaclásicadel complemento.La faltadeactividadantimicrobianadel sueroabsorbido en presenciade leucocitospuede ser compensadapor una incubación previa de la 14 Introduccic5n bacteriaen suerohumanonormal. Si la unión a anticuerposantesdel tratamientocon el antimicrobianoes eficaz, probablementeel PALE no sedebea un incrementoen el consumode anticuerpos,sino a la exposiciónde nuevossitiosde unión al anticuerpo debidoal pretratamiento(61). La susceptibilidada la muertefagocitica,es moduladaatravésde mecanismos en gran partedesconocidos. El incrementoen la muertedeestreptococosgrupoA por leucocitos,despuésde unabreveexposicióna eritromicina,fue dependientede un aumentoen la fagocitosis (18). Por el contrarío,el descensoen la viabilidad deEscherichiacoli despuésdeuna incubación in vitro con cloranfenicolfue relacionadocon un aumentoen la muerte intracelular (19). Tanto los mecanismosdependientesde oxIgeno (19,21), comolos independientes(22), sehallan involucradosen el incrementode la muerteintracelular de bacteriasdañadaspor antibióticos. Ademásde estosestudiosin vitro tambiénsehan realizadotrabajosutilizando modelosanimalesquesugierenqueel fenómenoPALE podríadarsetambiéniii vivo. Eagleet al. (66,67)demostraronen ratonesquela DL50 deestreptococosgrupo A y B disminuíade 100 a 1000 vecessilos animaleseraninoculadosconorganismos en fasePAE, sin embargo,en esteestudiono sedeterminóqué factor del hospedador eraresponsablede esteefecto. Gerber y Craig (68) observaronquelas bacteriasen fasePAE eraneliminadas másrápidamenteque las bacteriasno tratadas,cuandoeran inyectadasen muslosde ratonesnormales.Estos organismosno eraneliminadossi eran inyectadosen ratones neutropénicos,y finalmentevolvían a crecercuandoel PAE desaparecía. Estosestudiossugierenqueel efectoPALE es tambiénun fenómenoquetiene lugar in vivo. 15 Introducción 4. ANTIMICROBIANOS 4.1. Propiedadesde los antibióticosbetalactímicos. La estructurabásicade los antibióticosbetalactámicosconsisteen un anillo fi- lactánuicode cuatromiembrosquepuedeexistir comoun anillo aislado,representados por los monobactámicos,o puedeestar unido a un segundoanillo formando una estructurabicíclica comoseencuentraen otrasclases(69). La pared celular que envuelve las células bacterianasestá formada por peptidoglicanoqueconstade péptidosdecadenacortaqueseenlazany unena un largo polímeropolisacáridoconstituidopor unidadesalternasde ácido N-acetilglucosamnina y N-acetilmurámicocon uniones de tipo glicosídico B-(1,4), el grupo carboxilo del ácido murénúcogeneralmenteestá sustituidopor unacadenapeptídicadeaminoácidos D- y L-. Las uniones cruzadastienen lugar bien directamente(organismosGram- negativos)o medianteun puenteinterpeptídico(organismosGram-positivos)entreel residuodiamino en posición 3 de la cadenapeptídicay D-ala en posición 4 de la subunidadpeptídicaadyacente.En las bacteriasGram-positivas,el peptidoglicanoestá directamenteunidopor enlacescovalentesal ácido teicoico o al ácido teicurónico.En las bacteriasGram-negativas,el peptidoglicanoestá unido de forma covalentea una membranaexternalipoprotelca(70). La unión cruzadacon eliminacióndel D-alaterminal sedenominareacciónde ~spepÚ~ción, las enzimasquecatalizanestareacciónson lasprincipalesdianasde los antibióticos 13-lactámicos.La eliminación del D-ala terminal es función de las carboxipeptidasas,enzimas también sujetas a la inhibición por il-lactímicos. La transglicosilaciónquees responsablede la polimerizaciónde la cadenade glicano en peptidoglicanono es sensiblea los B-lactámicos(69). Los antibióticosil-lactámicos,por tanto, interfierenen el pasometabólicofinal de la formación de la pared celular, quedandopor ello, laxa, incompletay muy susceptibleal estallido y ruptura frente a soluciones no isotónicas con las del protoplasma(71). Las dianas celulares para los antibióticosIl-lactímicos son los enzimasque catalizan la síntesis de las unionescruzadasdepeptidoglicanode la paredcelular.Estos 16 Introducción enzimas son proteínasfijadoras de penicilina (PBPs). Se han descrito ocho PBPs localizadasen la membranainternade la paredcelularo en la membranacitoplasmática (72). Los compuestosB-lactámicostienendiferentesafinidadesparavarias PBPs y dependiendode su unión específicaa una PBP tienen diferentesefectossobre las bacterias.La inactivaciónde algunasPBPs(PBP lA, IB, 2 y 3) provocala muertede la célulabacteriana.Por el contrario,otrasPBPs(PBP4, 5 y 6) no sonesencialespara la viabilidad de la bacteriay su inactivaciónpor moléculasde B-lactámicosno es letal parala bacteria(73,74). La actividadde los compuestosB-lactámicossedebela capacidadde atravesar la paredde la bacteriay asíalcanzarun receptor,afinidadpor los enzimasimplicados en la síntesisde la paredcelular (PBPs) (75) y estabilidadfrente a las 13-lactamasas, enzimasproducidaspor las bacteriasquehidrolizanel enlaceamidacíclico del núcleo de lapenicilina, lo queconduceala produccióndepeniciloatossin actividadbacteriana. En los organismos Gram positivos, las JI-lactamasas se segregan extracelularmente,mientrasqueen los Gram-negativossuelenlocalizarseen el espacio periplásmico de la bacteria. Las 13-lactamasas pueden estar codificadas cromosómicamenteo por plásmidosde resistencia.Las primeraspuedenseragrupadas en lasclases1 y II de Richmondquecorrespondenalascefalosporinasasy penicilinasas respectivamente;mientrasquelassegundaspuedenagruparseen B-lactamasasdeamplio es~tro,llamadastipo TEM y aquellasquehidrolizanmásrápidamenteoxacilina(OXA 1, 2 y 3), carbenicilina(PSE 1, 2, 3, 4) que correspondena las clases III y V respectivamente.Estos tipos producen mayor resistencia a penicilinas que a cefalosporinas.Por último, la claseIV deIl-lactamasasdeamplioespectro, son enzimas codificadascromosomicamente,por ejemplo, SHV-1 y HMS-1 (76). 4.2. Carbapenemes. Los carbapenemesson un grupo de antibióticosbetalactámicosque tienen un átomode carbonoen lugardel átomodeazufrey unainsaturaciónen el anillo de cinco miembrosunido al anillo 13-lactámico.El tamañopequeñoy la estructuracompactade estosagenteslespermiteatravesarfácilmentela paredcelular de lasbacteriasGram- 17 — — — —.•-—— —•-r~-~---~— Introducción negativas. 4.2.1. Imipenem 4.2.1.1.Estructuraquímica Imipenem(N-formimidoiltienamicina)poseeunacadenalateral de hidroxietilo quedebidoa suconfiguracióntrans, quecontrastaconla configuracióncis deotros 13- lactámicos,proporcionaresistenciaa la hidrólisispor 13-lactamasasbacterianas(77). OH $ NHCX NH 4.2.1.2.Mecanismo de acción Imipenem provoca en la célula bacteriana las consecuencias esperadas de un antibiótico 13-lactámico, la síntesis de pared celular se interrumpe. Sin embargo, las consecuencias morfológicas de esta inhibición son inusuales,en lugar de filamentos como suele suceder con penicilinas y cefalosporinas, aparecenpequeñasesferaso elipsoides. Estas observacionessugierenqueimipenemactúasobreunadianadistinta. La unión preferente de los Il-lactámicos a la PBP 2 da lugara célulasredondeadas,por otra parte los agentes que no se unen a PBP 2 pero tienen alta afinidad por PBP 3 inducenlargosfilamentos(78). Imipenemseunea PBP 2 y PBP 1 (79), estoexplica los diferentesefectosmorfológicosqueproduceesteagente,y las perturbacionesen la superficiede la célula queconducena la muertey lisis. 4.2.1.3.Actividad bactericida Imipenemesbactericida,tiene una CMB igual o muy similar a la CMI contra variosgénerosde organismos(79). Borobio et al. (1981) encontraronen generaluna relaciónentreCMI/CMB de unaunidadpara anaerobiosGram-positivosy cepasde Bacteroides(80). La relaciónfue independientedel incrementodel tamañode inóculo 18 COOH 1~ Introducción (1O~ a 10~ ufc) y no fue afectada por el medio empleado o su pH. Otros autores (81) hallaronquela CMB excedíala CMI soloen un pequeñonúmerodeespecies.También demostraronque la adición de suero (másdel 75% del medio)no incrementala CMI o CMB, ellos señalaronquesedebíaa la bajaunión de imipenema lasproteínasdel suero.Por otraparte, estudiossobreunagranvariedadde aisladosclínicos, mostraron que había un pequeño efecto del tamaño del inéculo sobre las concentraciones inhibitorias y quelas CMBs no eranmayoresde 2 a4 vecesla CMI (82). 4.2.1.4.Resistenciaa 8-lactamasas Imipeneminducela producciónde ¡3-lactamasas;sin embargopermaneceactivo contralas bacteriasproductorasde 13-lactamasas.Imipenemes resistentea la mayoría delasIl-lactamasasexceptoaquellasproducidaspor Xanthomonasmaltophiliay algunas cepasde B. fra2ilis (83,84). 4.2.1.5.Espectroantimicrobiano Imipenem tiene un amplio espectroantibacteriano,es bactericida contra la mayoría de las bacterias aerobias Gram-positivasy Gram-negativasy bacterias anaerobias(85). TieneunaexcelenteactividadcontracocosGram-positivosincluidos los estreptococos grupo D. Más del 90% de la mayoría de las especies de organismos Gram-negativosson susceptibles,incluyendo aquellosresistentesa otros agentes¡3- lactámicos y aminoglucósidos(86,87). Imipenemesmuy efectivocontralosorganismos anaerobiosy en generalsu actividadescomparableala demetronidazoly clindamicina. Xanthomonasmaltonhiliageneralmenteesresistenteaimipenem,asícomociertascepas de Pseudomonascepaciay Enterococcusfaecium(88,89). 4.2.1.6.Fannacocinética Imipenem tienepropiedadesfarmacocinéticasmuysimilaresaotros¡3-lactámicos, penetrabien en lugaresdistintos del compartimentovascular. Alcanza altos niveles rápidamenteen arcasbien irrigadas tales como la cavidad peritonealy penetraen lugaresmenosaccesiblescomoen el liquido cerebroespinalen gradosimilar a otros 13- lactámicos(90). La unión a proteínasplasmáticases de un 20%. La vida media de imipenemesde 1 horay no seve modificadacuandoseadministraimipenem/dilastatina (91). Los nivelesmáximosen plasmatras la administraciónintravenosade 0.5 y 1 g. 19 Introducción deimipenem/cilastatina(lasdosisy nivelesserefierenexclusivamenteal imipenem)son respectivamentede21 a58 y 41 a 83 mg/l (92). Imipenemes inactivadoen el riñónpor una enzima, la dehidropeptidasa1, que no tiene una función fisiológica conocida, medianteaperturadel anillo B-lactámico.Cilastatina(L-cisteinil-tio-hexanoato)inhibe la actuacióndel enzima,por ello la combinaciónimipenem/cilastatinaseempleaen el tratamientode las infeccionesen unarelacióndepeso1:1(93). Tanto paraimipenem como para cilastatina,la eliminaciónes renalpor filtración glomerular y secreción tubular. Cuando imipenem es administradosolo por vía intravenosa,los niveles excretadosen orina son bajosy variables(6 a 38% de la dosis)entre individuos(94), mientrasque si se administracon cilastatinaen igual cantidad(95) la recuperación urinariaescercanaal 70% dela dosis,microbiológicanienteactivoy sin sufrir cambios. 4.2.1.7.Indicacionesterapéuticas Presentauna eficacia alta en el tratamiento de una amplia variedad de infecciones causadaspor bacterias aerobias Gram-positivas o Gram-negativasy anaerobios,así como aquellasdebidasa ambas, tales como infeccionesde tejidos blandos,pulmonares,abdominales,ginecológicasy septicemia(96). 4.2.1.8.Reaccionesadversas Las reacciones adversas más comunes son: molestiasgastrointestinales(nauseas, vómitos y diarrea), neurológicas,reaccionesalérgicas y un transitorio aumentode niveles de enzimasrenales(97). 4.2.2.Meropenem 4.2.2.1.Estructuraquímica CH3 CON .cc:11 CH3 8 NH Meropenemesun nuevoantibióticodel grupo carbapenemque tieneen común OH CH3 COOH 20 Introducción conimipenemun alfa-hidroxietilen el átomode carbono4, perodifiereen queposee un grupo metilo en el carbono 1 que le proporciona resistencia a la hidrólisis por el enzimarenaldehidropeptidasa1 (98) debidoaello, los primerosdatosfarmacocinéticos indican queno parecenecesariala asociacióncon cilastatina,y una cadenalateralde dimetil-carbamoilpirrolidintioen el carbono3 (99). Esprobablequeel sustituyentedel carbono3 explique el aumentode actividad de este agentecontrabacterias Gram- negativas(100,101). 4.2.2.2.Mecanismode acción Meropenementrafácilmenteenla célulabacterianaeinteractúaconlasproteínas diana (PBPs)en la membranacitoplasmáticacausandola muerte celular debido a la interrupciónen la síntesisde la paredcelular.La afinidadde uniónde meropenema las PBPsde E. coli, P. aeru2inosay S.aureushan sido determinadas.La principal diana de meropenemen E. cpu esPBP2, en PL~njgÉo seunea PBP 3 y PBP 2 (102). En 5. aureusla afinidadde unión es muy altaparatodaslas PBPsexceptoparaPBP 3, posiblementedebidoa unavida mediamuy corta del complejomeropenem-PBP3. Los cambios morfológicos confirman cuáles son las principales dianas de meropenem, en E. coli produce formas redondeadasmientras que en P. aeru2inosainduce filamentación. 4.2.2.3.Actividad bactericida Lascinéticasde actividadantibacterianade meropenemhan sidoestudiadascon aerobiosGram-negativosy Gram-positivosy anaerobios.Las concentracionesde dos a cuatrovecesla CMI generalmentesonbactericidasdentrode lasprimerashorastras añadirel agente.Paraun amplio númerodecepasla CMB fue igual o dobledela CMI. La presenciade suero humano(10ó 25 %), y variacionesen el pH del mediode 6,7 u 8, o en el tamañode inóculo no alteran significativamentela CMI (103). 4.2.2.4.Resistenciaa B-lactamasas Meropenemno es inactivadopor 13-lactamasascromosómicaso plasmídicas, incluyendolos enzimasque inactivan cefalosporinasde 3a generación. La única B- lactamasa quedestruyea meropenem,asícomoa imipenemy otrosagentestalescomo ceftazidimay cefotaximase halla en Xanthomonasmaltophilia (101). Tiene menos 21 Introducción potencial que imipenem para inducir 8-lactamasastipo 1 pero mayor potencialque ceftazidima. 4.2.2.5.Espectro antimicrobiano Meropenemposeeun amplio espectrode actividadcontraaerobiosy anaerobios incluyendo estafilococos, estreptoccosIl-hemoliticos, Strentococcuspneumoniae , Haemophilus influenzae, Neisseria sp., enterobacterias y Pseudomonassp., Acinetobactersp.,Bacteroidessp., Clostridiumsp.,Peptostreptococcussp.Comparado con imipenem, meropenemfue más activo contra bacterias Gram-negativas,en enterobacteriases4-8vecessuperioraimipenem(104),contraPseudomonasaeru~inosa meropenemestambiénmásactivoqueimipenem(2-4veces),porel contrarioimipenem es másactivo frente a Grain-positivos. La actividad de los dos antibióticos contra anaerobioses similar y al igual queimipenemesinactivoen Xanthomonasmaltophilia , SAMR y E. faecium(98). 4.2.2.6.Farmacocinética La penetraciónde meropenemen fluidos inflamadosesmuy rápida (105) y la uniónaproteínasplasmáticasesbastantebaja(2%). La vida mediaen plasmaes, como en el casode imipenem,de aproximadamente1 hora (0.98horas).Tras unainyección intravenosadurante5 minutosde 1 mg de meropenemsódicodisueltoen 20 ml. de agua, se alcanzauna concentraciónpico en plasma de 23.6 hg/ml (105). La farmacocinéticadeimipenemdespuésdeunaadministraciónintravenosaen combinación con cilastatinaes bastantesimilar a la observadadespuésde una administración intravenosademeropenemsolo. Estoconfirmala estabilidadde meropenemala enzima renal dehidropeptidasa1. La eliminación,igual que imipenem,es renalpor filtración glomerular y secreción tubular. La recuperación urinaría de meropenem es del 75 % de la dosis administrada. Meropenem no parece necesitar la combinaciónconun inhibidor de la DHP-I, como cilastatinaparaalcanzaraltasconcentracionesurinarias,la mayor parteseelimina comomeropenem(70%) y el restocomosu metabolitoICI 213,689de anillo abierto. 4.2.2.7. Indicacionesterapéuticas Meropenem poseeun elevadonivel de actividad contraunaamplia variedadde 22 Introducción patógenosbacterianos,miembrosde la familia Enterobacteriaceae,Staohylococcussp. (exceptocepas meticilina-resistentes)y Bacteroidesfra~ilis son inhibidas por bajas concentraciones.Es más activo que imipenem, gentamicinay amikacina, contra Pseudomonasaeruginosa(106), la alta actividad de este agentecontra cepas de P.aeruginosaproductorasde ¡3-lactamasasesparticularmenteinteresante. Los estudios farmacológicos y clínicos deberán establecer la utilidad clínica de este nuevoagente,especialmenteparael tratamientode infeccionesunnanas. 4.2.2.8.Reaccionesadversas La escasainformaciónfarmacocinéticaindicaquemeropenemesbien tolerado (107) y quepuedeseradministradosin un inhibidor del enzimaDHP-I. Los estudios inicialestambiénindicanquelospotencialesnefrotóxicosy neurotóxicosde meropenem son menoresquelos de imipenem. 4.3. Cefalosporinas. Las cefalosporinasson antibióticos betalactámicos,bactericidas, de amplio espectroy escasatoxicidad lo que las hacesermuy utilizadasen la prácticamédica. Estanformadaspor un anillo betalactániicounidoa otro dedihidrotiazina.En contraste con las penicilinas la molécula de cefalosporinatiene más lugarespara su potencial manipulación,además,el núcleode las cefalosporinasesinherentementemásresistente a lasbetalactamasasqueel de las penicilinas(108). De cualquierforma, la producción de betalactamasases el principal mecanismo responsablede la inactivación de cefalosporinas. 4.3.1. Cefepime 4.3.1.1.Estructura química Cefepimeesunacefalosporinametoxiiminoaminotiazolildecuartageneración, contieneun grupo metil-pirrolidino en la posición 3 de la fraccióndihidrotiazinadel núcleocefem, lo que le permitepenetrara travesde los canalesde las porinasde las bacterias Gram-negativas, más rápidamente que otras cefalosporinas (109). 4.3.1.2. Mecanismo de acción Se ha observado que la más importante diana de cefepime en Escherichia coli y Pseudomonasaeruilinosaes la PBP 3. Cefepimetambiénseunecon muchaafinidad 23 Introducción NH2 N 0—CONH 8 8 ¡ CH3 N o N x OCH 3 00 2 a la PBP2 de E. coli. Cuandola concentraciónde antibiótico sehallacercade la CMI de E. coli, seobservala formaciónde filamentosbacterianos(110). Por otraparte, la presenciaen la estructurade cefepimede unacadenalateralen la posición3 del anillo cefalosporámicocon una carga positiva, le confiere un incrementoen el grado de permeabilidad(111),quele permiteaccedermásfacilmenteal espacioperiplásmicode la bacteriaGram-negativa,dondeejercesuacciónuniendosea las PBPs. 4.3.1.3.Actividad bactericida La actividadbactericidade cefepimeha sido confirmadapor los bajosvalores dela concentraciónmínimainhibitoria y los resultadosde lascurvasde letalidadcontra cepasproductorasde diferentesil-lactamasas(112). La variación en el pH, tipo de medio, tamaño de inóculo y adición de suero humanoen el medio, no alteró la actividad de cefepimecon aisladosclínicos de E. coli, Klebsiella pneumoniaey P± aerueinosa(113). 4.3.1.4.Resistenciaa 8-lactamasas Cefepimetiene actividadantemicroorganismosproductoresde betalactamasas frentealos quemuchascefalosporinassemostrabanpocoefectivas,comprobandosesu efectividadcontrabacteriasque tienendes-reprimidoel gen constitutivoproductorde betalactamasas.También se observaunaescasareducciónde actividad frente a cepas bacterianas con genes que codifican para la producción de elevadosniveles de betalactamasas,ello sedebea la resistenciaa la hidrólisis por las betalactamasasque le confieresu grupo iminometoxi y a la bajaafinidadpor estasenzimas(114,115). 24 Introducción 4.3.1.5.Farmacocinética De la administraciónvía intravenosade 1 gr de cefepimefuerondeterminados los siguientesparámetrosbioquímicos:laconcentraciónmáximadeantibióticoen suero correspondíaa 70 mg/l, la vida mediaen suero a 2,2 horas, y la unión a proteinas plasmáticaseradel 19% (116). Esta cefalosporinaesescasamentemetabolizadaen el organismo,siendoel 80% de la dosisadministradarecuperadasin cambiosen la orina (117). La vía másimportantede eliminaciónesa través de los riñones,por filtración glomerular(118). 4.3.1.6.Espectroantimicrobiano Cefepime es altamenteactivo ‘in vitro” contra enterobacterias.También es activo frente a Pseudomonasaeruginosaaunquealgunas cepas con resistenciaa betalactámicosno mediadapor plásmidosson a veces menossensibles.Su actividad varíafrente aotrasespeciesde Pseudomonas.Haemonhilusinfluenzaees muy sensible acefepime.Camoylobactercoli/iejuni son normalmentesensibles.Tienebuenaactividad frente a Staphylococcusaureusy estafilococoscoagulasanegativos,Staohylococcus haemolyticusestaen el límite de sensibilidad.Todoslos estreptococosson sensibles exceptolosEnterococcussppy Streptococcuspneumoniaemuy resistentesapenicilina. Se muestran resistentes tambiénBacteroidesfra2ilis, B. oralis, Clostridium difficile y algunosotros clostridium aunquees activoanteotrosanaerobios. 4.3.1.7. Indicacionesterapéuticas Estaindicadoen el tratamientodeneumonias,bronquitis,einfeccionesdel tracto urinario, también se han llevado a cabo estudiossatisfactoriosen el tratamientode meningitis en modelos animales como en ratas. 4.3.1.8. Reacciones adversas Se han descrito cefaleas,pruritos, diarreas y aumentode transaminasasen sangre. 4.3.2. Cefpodoxima 4.3.2.1.Estructura química Cefpodoximaproxetil esunacefalosporinametoxiiminoaminotiazolil de tercera generacióncuyo radicalcarboxílicodelnúcleocefemha sidoesterificadoconun grupo 25 Introduccidn N NH2 —CONH $ N o N ~ CHj—00H3 OGH co~ isopropiloxicarbonioxietilocon el fin de permitir su absorcióntras la administración oral. La cefpodoximalibre esla queposeela actividadantibiótica,siendoliberadapor su hidrólisis del ester(119). 4.3.2.2.Mecanismodeacción Cefpodoximacomolos otrosantibióticosbetalactámicospenetraa travésde los porosde la paredbacterianay sefija sobrelas PBPs,inhibiendolosprocesosde síntesis de dichaparedasociadosa la morfologíayio a la división celular, y produciendola destruccióndel microorganismo,induciendoademásen las bacteriasdram-positivasla activaciónde enzimasautolíticas(autolisinas). Cefpodoxima ejerce su acciónpor inhibición de lasPBPs,en concretosobrela PBP3 de E. coli por la quepresentala máximaafinidad, siendola únicaPBP quese saturaa la CMI. Estemecanismodeacciónexplicasuactividadantibacterianaal inhibir la PBP responsablede la formacióndel septo.El bloqueodeesta enzimaconducea la filamentación. 4.3.2.3.Actividad bactericida Cefpodoxima es bactericida a unaconcentraciónigual a la CMI paracepasde E. coli, productoraso no productorasde il-lactamasas,y K. pneumoniaey de cuatro vecesmayor que la CMI para5. marcescens,con 5. aureus la relación CMB:CMI es mucho mayor (120). La actividad de cefpodoximain vitro es poco afectada por la adición de suero, el tipo de medio de cultivo empleado, aunque un incremento del tamañode inóculo mayorde 106 ufc/ml, reducela potenciadel antibióticocontracepas 26 Introducción de enterobacteriasproductorasde 43-lactamasas(121). 4.3.2.4.Resistenciaa il-lactainasas Cefpodoximapresentaunabuenaestabilidaden presenciadelosprincipalestipos de betalactamasas(122), y es de 4 a 16 vecesmás activa que amoxicilina/ácido clavulánico,cefaclory cefuroximafrenteadiversostiposdeenterobacteriasproductoras de betalactamasas. 4.3.2.5.Espectro antimicrobiano Cefpodoxima tiene actividad bactericida frente a la gran mayoría de patógenos dram-positivosy dram-negativos,sobretodo frentea los causantesde infeccionesdel tracto respiratorioy urinaria. Muestragran actividadfrentea enterobacteriascomoEscherichiacoli, Proteus spp y £Úi~clQr spp aunquetiene CMI elevadaspara Klebsiella spp y especies productorasde cefalosporinasaclase1 tales como Enterobacterspp, Serratiaspp y Mor2anellaspp (123). Es muy activa frentea Haemophilusinfluenzae.Muestrabuenaactividad ante Streptococcus nneumoniae, Streptococcuspyo~enes y frente a estreptococos betahemolíticosde los gruposB, C y G. Presentatambiénactividada concentraciones terapeútiicasanteStaDhylococcusaureusy Stanhylococcusepidermidis.Son especies resistentesPseudomonasaeru~inosay otrasespeciesde Pseudomonas. 4.3.2.6.Farmacocinética La mitad de la dosis de cefpodoximaadministradaalcanza la circulación sistémica.El fármacoes absorbidorápidamentealcanzandounaconcentraciónmáxima de 1,4 mg/l a lasdos horasde la administraciónde unaúnica dosis de 100 mg y tiene una vida media en suero de 2,11 horas(119). Cefpodoximapenetrabien en los tejidos del tracto respiratorio alto y bajo, losparámetrosdepenetracióndel antibióticoa través de la barrerahematoencefálicaen ausenciade inflamación, no han sido determinados en humanos,aunqueen ratasel pasoes escaso.Cefpodoximase metabolizaen muy poca cantidad en el organismo. Más del 90% del volumen total de cefpadoxima recogido en arma es excretado dentro de las 12 horas siguientesala administracióndel fármaco.En la eliminacióndel antibiótico estaimplicada la secrecióntubular. 27 Introducción 4.3.2.7.Indicacionesterapéuticas Estaindicadoen el tratamientode infeccionesde las víasrespiratoriasaltasy bajas causadaspor gérmenessensiblesa la cefpodoxima,en concreto: amigdalitis y faringitis, sinusitis aguda, bronquitis purulenta aguda, neumonía bacteriana, exacerbaciónde bronquitis crónica obstructiva,particularmentedurantela crisis de repetición. 4.3.2.8.Reaccionesadversas Esencialmentepueden aparecer trastornos digestivos, cefaleas, manifestaciones alérgicas, alteraciones hepato-biliares: elevación moderada y transitoria de transaminasasGOT, GPT y de fosfatasaalcalina, manifestacionesrenales: ligero aumentode la ureasanguineay creatinemia,alteracioneshematológicas:trombocitosis, trombocitopenia,leucopeniay eosinoffliaaunqueestasson bastanteraras. 28 MATE~AL Y MÉTODOS Material y métodos 1. MATERIAL 1.1.Microorganismos. Escherichiacoli ATCC 25922y StanhylococcusaureusATCC 25923.Lascepas seconservaronen agarMillíer-Hinton (OXOID) a O 0C, llevándosea cabosubcultivos en medio fresco cada2-3 días. 1.2. Antimicrobianos Imipenem,suministradopor Merck, Sharp& Dohme,potencia964 gg/mg. Meropenem,suministradopor ICI Pharmaceuticals,potencia864 gg/mg. Cefepime,suministradopor Brystol-Myers Squibb, potencia 825 pg/mg. Cefpodoxima,suministradopor RousselUclaf, potencia 941 vg/mg. Las soluciones srockde antibiótico seprepararona partir depolvo valoradoy se almacenaron en viales a -20 0C hastasu utilización, sedesechóel antibióticosobrante de los viales unavez descongelados. 1.3. Sueroy leucocitospolimorfonucleares. 1.3.1.Obtencióndel suerohumano. El pooi de suero humanonormal fue obtenidoa partir de sangrevenosade donantessanosqueno estabantomandomedicación.La sangreserecogióen tubosde vidrio estériles y se dejó coagulara temperaturaambiente; tras retirar el coágulose centrifugó duranteveinte minutosa 1. IOOxg. Se mezclaronlos distintossuerosy se envasaronen alícuotasde 1 mí, quesecongelarona -30 0C. La cantidadquese ibaa utilizar se descongelaba y el sobrante era desechado. 1.3.2. Obtención, cómputo y viabilidad de los polimorfonucleares. 1.3.2.1.Obtenciónde leucocitosPMNs. El métodoutilizado para la extracciónde los leucocitosPMNs humanosestá basado en el descrito por Paul Eggleton et al. (124). La sangrefue extraídade voluntariossanosqueno estabantomandomedicación,y anticoaguladaen tubos de etilendianúnotetraacético(EDTA) potásico(1.5 mg/l). Un volumendeSml de sangre seañadióa un tubo cónico de poliestireno(25 mm x 90 mm) quecontenía16 ml de cloruro amónico, frío (4 0C) y a pH 7.2. La mezclase mantuvoen baño de hielo 30 leucocitos .1 Materialy métodos durante15 minutoscon el fin deproducir la lisis deeritrocitos.Transcurridoesetiempo secentrifugóa láOxg durante10 minutos. El sobrenadanteseextrajo conmicropipeta y el sedimentode células blancasse resuspendiónuevamenteen 16 ml de cloruro amónicorepitiendoel proceso. Trasla segundacentrifugaciónel sedimentoseresuspendióen 5 ml desolución salinaequilibradade Hank (HiBSS) sin calcio ni magnesio,permaneciendoen bañode hielo hastael término de la preparacióndel inóculo bacteriano. Se procedió a la tercera y última centrifugación (l6Oxg, 10 minutos); el sedimentofinalde leucocitosseresuspendióen 1 ml deHBSS enriquecidaconun 0.1% degelatina. 1.3.2.2.Cómputocelular. La determinación del número de leucocitos se realizó con la ayuda de microscopioópticoen cámarade Neubauer.Se depositóun volumenen la cámarade 0.2 ml de unadilución 1:10 de la suspensiónleucocitaria. Seconsideraronlos siguientesaspectos: 1. Númerode leucocitoscontados:es la mediadel númerode PMNs en los cuatro cuadrantesde la partesuperiorde la cámaray de los cuatrocuadrantesde la parte inferior de la cámara. 2. Correcciónde volumen:considerandoquecadacuadrantede la cámaratiene unasdimensionesde ixíxí y por tanto un volumende 0.1 mm3, comolos leucocitos hansido contadosen los cuatrocuadrantes,el volumentotal consideradoes0.4 mm3. Para obtener un volumen de 1 mm3 debemultiplicarse 0.4 por 2.5. Por tanto, 2.5 es el factor de correcciónde volumen. 3. Correcciónde dilución: debidoa quelas célulashablansidodiluidasal 1/10, el factordecorrecciónde la dilución seráigual a 10. 4. Cómputofinal: leucocitos/mm3— n0 de leucocitoscontadosx correcciónde volumenx correcciónde dilución. Parareferir el númerode PMNs en númerode células por mí, el resultadode la operaciónanterior lo multiplicamospor 1.000. 31 Material y métodos 1.3.2.3.Viabilidad celular. La viabilidad celularsedeterminé,porexclusióndel colorantevital azul tripano (R.A.L. Ugine-Kuhlmann)al inicio y final del experimento.Un volumen de la suspensióncelular, se mezcló con un volumenigual de azul tripanoal 0.4%. Pasados tres minutos, la reacción de detuvo añadiendoformaldehidoal 10%. Se tomó una alícuota de la mezcla y se llenaron las dos partes de la cámara de Neubauer, procediéndoseal recuentocelular conmicroscopioóptico(40x). Seefectuóel recuento de leucocitos viables y leucocitostotales. Las célulasno viables presentanel núcleo teñido de azul. El resultadoexpresadoen porcentajede célulasviablessecalculódela siguiente forma: PMNs viables % célulasviables = x 100 PMNs totales Todos los experimentosde estetrabajo fueron realizadoscon una viabilidad superior al 95%. 2. MÉTODOS 2.1.Determinación de las concentracionesmínimas inhibitorias (CMIs). Lasconcentracionesmínimasinhibitorias(CMI) secalcularonporel métodode macrodilución en caldo Múller-Hinton (125). La CMI se definió como la mínima concentraciónde antimicrobianocapazde impedir el crecimientovisible (turbidez)de la bacteriaen comparacióncon el tubo control. 2.2 Estudio del Efecto Postantibiético Leucocitario (PALE). 2.2.1. Preparación del inóculo. El díaanterioral del experimentosepreparó un inóculo de la bacteria en caldo Múller-Hinton. Se incubóen estufaa37 0C durantetodala noche.Las bacteriasen fase logarítmica se prepararon por dilución en caldo Múller-Hinton a partir del cultivo overnight. Se incubaronen baño de agitación a 37 0C hastaalcanzar un valor de absorbanciamedidocon espectrofotómetroa 580 nm de luz visible de 0.3 paraE. coli y 0.25 para5. aureus,lo que suponeaproximadamentelO~ UFC/ml. 32 Material y métodos 2.2.2 Tratamientoantimicrobiano. Alícuotas de 0.2 ml del cultivo bacteriano se añadieron a tubos que contenían caldo Múller-Hinton con antimicrobianoa unaconcentraciónde cuatrovecesla CMI correspondientea la cepautilizadaen cadacaso,resultandoun volumenfinal de2 ml. Se incluyó un tubo con bacteriasy medio Millier-Hinton sin antimicrobianocomo control. Las bacteriasseexpusieronal antimicrobianodurante10 minutos, incubándose en bañode agitación(52 U) a 37 0C. Al final del períodode incubación,seañadieron8 ml de caldofrescoparadiluir el antimicrobianodel medio y centrifugamosa 2.OOOxg durante 10 minutospara eliminarlo. Se extrajo el sobrenadantecuidadosamentey el sedimentobacterianose resuspendióen HBSS-gelatinahastaunaconcentraciónde 10~ UFC/ml. 2.2.3.Estudiodel efecto antimicrobiano en el crecimiento. Muestras de 0.2 ml de bacterias tratadas con los distintos antimicrobianos y de bacteriascontrolno tratadas,se añadieronatubos depoliestirenoqueconteníanHBSS- gelatinay se incubarondurantetres horas a 37 0C en baño de agitación (52 U). A intervalosde unahora, setomaronalícuotasde lasbacteriastratadasy de las bacterias control para determinarsu cinéticade crecimiento,expresadaen UFC/ml. Paraello, sehicieron dilucionesdecimalesde las distintasmezclasenaguaestéril apH 10.8 (3) y se sembraronmuestrasen placasde agarMúller-Hinton quese incubarona 37 0C, durante 18-24 horas. Se contabilizó el número de UFC/placa y se determinó el 1og 10 UFC/ml pararepresentargráficamenteel crecimientobacterianoa lo largodel tiempo. Se midió el efecto antibacterianodel antimicrobianocalculandola diferencia entreel 1og10 UFC/ml de las bacteriascontrol y el 1og10 UFC/ml de las bacterias tratadasa lo largo del tiempo. 2.2.4.Estudiode la sensibilidadal suero. Estudiamossi la presenciadel suerohumanonormal(SHN) aunaconcentración del 20% respectodel volumen total, puede influir en el crecimiento de bacterias pretratadascon antimicrobianoy en el de bacteriascontrol sin pretratar.Paraello, se tomaronalícuotasde0.2 ml deHBSS-gelatinasuplementadocon20% de suerohumano 33 Material y métodos normal. Los tubos con las mezclasseincubarona 37 0C en bañode agitación(52 U) durantetres horas. A intervalosde unahora, se tomaron alícuotasde las bacterias tratadasy de las bacteriascontrol paradeterminarsu cinéticade crecimientosegúnel númerodeUFC/ml.Paraello, sehicierondilucionesdecimalesde las distintasmezclas en aguaestérila pH 10.8 (126) y se sembraronmuestrasen placasde agarMúller- Hinton que se incubarona 37 0C, durante18-24 horas.Se contabilizóel númerode UFC/placay sedeterminóel 1og 10UFCIml pararepresentargráficamenteel crecimiento bacterianoa lo largo del tiempo. El efecto del suero se midió calculandola diferenciaentreel 1og10 UFC/ml de lasbacteriascontrol y el 1og10UFC/ml de las bacteriastratadasambasen presenciade suero,a lo largodel tiempo. 2.2.5. Actividad bactericida de los leucocitos PMNs en la fase postantibiótica. PALE. La actividadbactericidade los leucocitosPMNs seestudióincubandoalícuotas de 0.2 ml de bacteriaspretratadasy de bacteriascontrol con leucocitos PMNs, en HBSS-gelatina,enpresenciay ausenciadel20%de SHN. El volumentotal de los tubos fue de 2 ml y la relación final de bacteriasa leucocitosfue de 10:1. Pararealizarel cómputode microorganismosviables,a intervalosde unahora, setomaronalícuotasde las distintasmezclasy se añadierona tubos queconteníanaguaestérila pH 10.8con el fin de romperlos PMNs y liberar las bacteriasquepermanecíanviablesa pesarde habersido fagocitadas(126). Serealizarondilucionesdecimalesy sesembraronmuestrasen placasde agar Millíer-Hinton, incubándosea 37 0C durante18-24 horas. El númerode UFC/ml de representóen unidadeslogarítmicasa lo largodel tiempo. La muertefagociticasemidió calculandoel númerode bacteriasmuertaspor el PMN respectodel control sin PMN, tantoparael controlcomoparalas pretratadas,a lo largodel tiempo y seexpresóen términosde porcentaje. El efectoPALE se midió estableciendola relaciónentrela fagocitosisde las bacteriastratadasrespectoa la fagocitosisde las bacteriascontrol. Los ensayosse repitieron cinco vecesparacadaantimicrobiano. 34 Material y métodos 2.3. Estudio de la actividad bactericida de leucocitosPMNs en presencia continua de antimicrobianos. 2.3.1.Preparación del inóculo. El inóculo bacterianofuepreparadode idénticamaneraqueen el apanado2.2.1. del estudiodel EfectoPostantibióticoLeucocitario(PALE). 2.3.2.Estudio de las cunasde letalidad de E.coli y S1..nrcus. Alícuotasde 0.2 ml de cultivo bacterianocon un númerode 108 UFC/ml, se añadierona tubosqueconteníancaldoMijiler-Hinton en un volumenfinal de 2 mí,para seguirel mismo procesode: incubaciónen bañode agitación (52 U) a 37 0C durante 10 minutos, dilución y posterior centrifugación, con el fin de poder establecer comparacionesentrelascinéticasde crecimientoen fasepostantibióticay en presencia continuade antibiótico. Se extrajo el sobrenadantey el sedimentobacterianose resuspendióenHBSS- gelatinahastaunaconcentraciónde 10~ UFC/ml. Muestrasde 0.2 ml de la suspensión bacterianafueron añadidasa tubos de poliestireno que conteníanHBSS-gelatina suplementadocon un 20% de SHN, y antimicrobianoa unaconcentraciónde 4 y 1/2 CMI correspondientea la cepautilizadaen cadacaso,resultandoun volumenfinal de 2 ml. Se incluyó como control un tubo con HBSS-gelatinay 20% de suero y sin antimicrobiano,al que fue añadidoel mismo volumende suspensiónbacteriana.Los tubosseincubarondurantetreshorasa37 0C en bañode agitación(52 U). A intervalos deunahorasetomaronalícuotasde las bacteriastratadasy de lasbacteriascontrolpara determinar su cinética de crecimiento, expresadaen UFC/ml. Fueron realizadas dilucionesdecimalesde las distintasmezclasen aguaestéril a pH 10.8 (126) y se sembraron muestrasenplacasdeagarMúller-Hintonqueseincubarona 37 0C, durante 18-24horas.Secontabilizóel númerodecoloniasen cadaplacay sedeterminóel 1og 10 UFC/mlpararepresentargráficamenteel crecimientobacterianoa lo largo del tiempo. 2.3.3.Actividad bactericidade los leucocitosPMNs en presenciacontinua de anthnicrobianos. Fueronincubadasalícuotasde 0.2 ml del cultivo bacteriano(1O~ UFC/m1)con leucocitosPMNs en HBSS-gelatinasuplementadacon un 20% de SHNy antimicrobiano 35 Material y métodos a unaconcentraciónde 4 y 1/2 CMI, en un volumentotal de 2 ml. Comocontrol fue incluido un tubo con leucocitosPMNs en HBSS-gelatinacon un 20% de SHN y sin antimicrobiano,al que le fue añadido0.2 ml de la suspensiónbacteriana.La relación final de bacteriasa leucocitosfue de 10:1. Pararealizarel cómputode microorganismosviables,a intervalosde unahora, se tomaronalícuotasde lasdistintasmezclasy seañadierona tubos queconteníanagua estéril a pH 10.8 con el fin de romper los PMNs y liberar las bacterias que permanecíanviablesa pesarde habersido fagocitadas(126). Se realizarondilucionesdecimalesy sesembraronmuestrasen placasde agar Múller-Hinton, incubándosea 37 0C durante18-24 horas. El númerode UFC/ml de representóen unidadeslogarítmicasa lo largo del tiempo. La muertefagocíticase midió calculandoel númerode bacteriasmuertaspor el PMN respectodel control sin PMN, tantoparael controlcomoparalas incubadascon 1/2 y 4xCMI, a lo largo del tiempoy seexpresóen términosde porcentaje. Los ensayosse repitieroncinco vecesparacadaantimicrobiano. 2.4. Métodosdecálculoestadístico. Los estudiosestadísticosrealizadosfueron: 1. Estudiodescriptivodel crecimientobacterianocalculandola mediaaritmética y la desviaciónestándarde los resultadosobtenidosen cadacaso. 2. Estudio mediantela prueba no paramétricaU de Mann-Whitney para comparar la significación de los resultados. Las diferencias se consideraron significativasen los casosen los quela probabilidadde quelasdiferenciassedebieran al azar fuerapC 0.05 (127). 36 RESULTADOS Resultados 1. CONCENTRACIONES MINIMAS INHIBITORIAS (CMIs). La CMI se considerócomo la concentraciónmenorde antibiótico capaz de impedirel crecimientovisible de la bacteria.Las CMIs obtenidasparaE. coli ATCC 25922y 5. aureusATCC 25923se reflejan en la tabla 1. Antimicrobiano CMI (m~/fl E. ccli 5. aureus Imipenem 0.25 0.03 Meropenem 0.06 0.25 Cefepime 0.03 1.00 Cefpodoxima 0.25 1.00 2. ESTUDIODEL EFECTO POSTANTIBIÓTICO LEUCOCITABIO. 2.1. Estudio del pretratamiento antimicrobiano sobre el crecimiento bacteriano. 2.1.1.Efecto sobre el crecimiento de E. coil . 2.1.1.1.Efecto de imipenem. El tratamientode E. cali con 4xCMI de imipenem durante10 minutos, no produjo diferencias estadísticamentesignificativas (13<0.05) en su cinética de crecimientorespectodel control a lo largo de todo el ensayo,Figura(1 .a.).El efecto antimicrobianodel tratamientocon imipenemdurantelas treshorasdel ensayoserecoge en la tabla2. Tiemno (lx) Control Tratado 1 0.86+0.17 0.81+0.10 2 1.15+0.10 0.98+0.13 3 1.34+0.16 1.25+0.12 Tabla 2. Efecto del pretratannentocon imipenem en la cinética de crecimientode E.coli. Cambioen el Log10(±D.E.)del total de bacteriasviables despuésde t horas de incubación. 38 Resultados 2.1.1.2.Efecto de meropenem. La curva de crecimiento de E. coli después de una exposición durante diez minutos a meropenem(4xCMI) no presentódiferencias estadísticamentesignificativas pc 0.05) con la curva de crecimiento de E. coli no expuestoal antimicrobiano, (figura 2.a.). La tabla 3 muestra el efectoantibacteriano. Tiempo (lx) Control Tratado 1 0.86±0.17 0.80+0.13 2 1.15+0.10 1.07+0.10 3 1.34+0.16 1.35±0.15 Tabla 3. Efecto del pretratamiento con meropenem en la cinética de crecimiento de E.coli. Cambio en el Log10 (±D.E.)del total de bacterias viables despuésde t horas de incubación. 2.1.1.3.Efecto de cefepime El tratamiento de ~ggfl con cefepime (4xCMI) durante 10 minutos, no influyó en la cinética de crecimientobacteriano. El análisis estadísticoseñalóque las curvas de crecimiento de bacterias tratadas con el antimicrobiano y bacterias control, sin tratamientono eran significativamentediferentes (p<0.05), (figura 3.a.). El efecto antibacteriano se refleja en la tabla 4. Tiemno (lx) Control Tratado 1 0.86±0.17 0.78+0.12 2 1.15+0.10 1.17+0.12 3 1.34+0.16 1.31+0.15 Tabla4. Efectodel pretratamientocon cefepimeen la cinéticade crecimientode E.coli. Cambio en el Log10 (±D.E.)del total de bacteriasviablesdespuésde t horas de incubación. 39 Resultados 2.1.1.4.Efectode cefpodoxixna Las cinéticasde crecimientode E. coli control (sin tratamientoantimicrobiano) y de ~sQii tratado con cefpodoxima, no presentandiferencias estadisticaniente significativas (p<0.05).Por tanto, la exposiciónde ff~ii durante10 minutoscon cefpodoxima(4xCMI), no alteró su cinéticade crecimiento,(figura 4.a.). La tabla 5 muestrael efectoantibacteriano. Tiemno dfl Control Tratado 1 0.86+0.17 0.89+0.05 2 1.15±0.10 1.07+0.12 3 1.34+0.16 1.26+0.09 Tabla 5. Efectodel pretratamientocon cefpodoximaen la cinéticade crecimientode E.coli. Cambioen el Log10 (±D.E.)del total de bacteriasviables despuésde t horas de incubación. 2.1.2.Efectosobreel crecimientode S.aureus . 2.1.2.1.Efectode imipenem. El tratamientocon4xCMI deimipenemdurante10 minutosprodujodiferencias significativasacusadasen el crecimientode 8. aureuspretratadorespectodel control, (figura 5.a.). La tabla6 muestrael efectoantibacteriano: Tiempo (h~ Control Tratado 1 0.41+0.13 -0.49+0.07 2 0.65+0.11 -0.32+0.11 3 0.92+0.11 0.11+0.13 Tabla 6. Efecto del pretratamientocon imipenem en la cinética de crecimiento de S.aureus.Cambioen el Log10(±D.E.)del total de bacteriasviablesdespuésde t horas de incubación. 40 Resultados 2.1.2.2.Efectode meropenem. El tratamientode 5. aureuscon 4xCMI de meropenem,durante10 minutos, alteró significativamente la cinética de crecimiento de bacterias tratadasrespectoa las bacteriascontrol, Control+PMN Tratado+PMN 1 0.64±0.13 0.50±0.07 2 0.97+0.08 0.90 jO. 12 3 1.32+0.07 1.25±0.13 Tabla 28. Fagocitosis y muerte intracelular por PMNs, de E. coli pretratadocon cefepime. Cambio en el Log10 (titE.) del total de bacteriasviablesdespuésde t horas 53 Resultados de incubación. La muertefagocíticade bacteriaspretratadasconcefepimefue mayorquela de bacteriascontrol, 35.16 y 26.05% respectivamente,aunqueel incrementono fue tan notablecomoen el casode imipenemy meropenem.(Tabla30, figura 3.c). 2.3.1.4.b.Presenciadesuero. La presenciade suero en el medio de incubación aumentó la actividad leucocitaria.Sehallarondiferenciassignificativasentrelascinéticasdecrecimientode E. coli pretratado,en presenciade PMNs y en presenciade PM?Ns y suero,durante todo el ensayo. La capacidad bactericida de los leucocitos PMNs fue mayor frentea bacteriasquehablansidoexpuestasa cefepime,incubadascon sueroen el medio, que frente a bacteriascontroles también incubadascon suero. Las diferencias fueron significativas durante las tres horas (figura 3.b). La tabla 29 muestrala cinética de crecimientode LsoiÁ control y pretratadocon cefepime,en presenciade PMNs y suero. Tiempo Control +PMN +SHN Tratado+PMN +SI-1N 1 0.39 ±0.09 0.14+0.07 2 0.62±0.06 0.39+0.11 3 0.82±0.14 0.63±0.10 Tabla 29. Fagocitosisy muerte intracelularpor PMNs, de E. coil pretratadocon cefepime,en presenciade suero.Cambio en el Log10 (±D.E.)del total de bacterias viablesdespuésde t horasde incubación. El porcentaje medio de muerte fagocítica de las bacterias tratadasfue del 78.06% frente al 67.75% de lasbacteriascontrol. (Tabla 30, figura 3.c). La tabla 30 muestrael porcentajede muertefagociticade bacteriascontrol y tratadasconcefepime,en presenciay ausenciade suero. 54 Resultados Tiemno Control+PMN Trptado+PMN 1 0.64+0.13 0.62+0.15 2 0.97+0.08 0.87+0.10 3 1.32+0.07 1.18±0.09 Tabla 31. Fagocitosis y muerte intracelular por PMNs, de E. coli pretratado con cefpodoxima. Cambio en el Log~ (±D.E.)del total de bacterias viables después de t 55 Resultados horas de incubación. El porcentaje medio de muerte fagocitica de las bacteriaspretratadascon cefpodoximafue ligeramentesuperior(33.33%)al de las bacteriascontrol (26.05%), peroel aumentoen la actividadleucocitariadebidoal pretratamientoantimicrobiano, fue el menor de los cuatro antibióticosestudiados(Tabla33, figura 4.cj. 2.3.1.5.b.Presenciadesuero. Las cinéticas de crecimiento de las bacteriastratadascon cefpodoxima, en presenciadesueroy enpresenciade sueroy PMNs, muestrandiferenciassignificativas (p< 0.05) durantetodo el tiempo que duró el experimento.las diferenciasfueron mayoresqueentrebacteriastratadasincubadascon o sin PMNs (figura 4.1,). Entrelas bacteriascontroly pretratadascon cefpodoxima,incubadascon suero y PMNs, no fueronhalladasdiferenciasestadísticamentesignificativas,durantetodo el ensayo. La tabla32 muestralas cinéticasde crecimientode E. coli incubadoconPMNs y suero,tratadoy control. Control+PMN+SHN Tratado+PMN+SI-IN 1 0.39+0.09 0.35+0.07 2 0.62±0.06 0.57+0.09 3 0.82+0.14 0.75+0.13 Tabla 32. Fagocitosisy muerte intracelular por PMNs, de ~ pretratadocon cefpodoxima,en presenciade suero.Cambioen el Log10(±D.E.)del total de bacterias viablesdespuésde t horas de incubación. El porcentajemedio de muerte fagocítica de las bacterias tratadasfue del 68.76% similar al de las bacteriasno tratadas:67.75%. (Tabla 33, figura 3.c.). La tabla 33 muestra los porcentajes de muerte fagocítica de E. coli trataday sin tratar con cefpodoxima. 56 Resultados Tiempo Control Tratado -SHN +SHN +51-JN 39.75% 66.12% 46.29% 62.84% 2 33.93% 65.33% 36.90% 66.88% 3 4.50% 71.81% 16.82% 76.58% Tabla33. Porcentajede muertefagociticade~soli pretratadocon cefpodoxima,en ausencia(-SHN) y en presencia(+SHN) de suero. Los valores, expresadosen porcentaje,serefierenal descensoen el númerode bacteriasincubadasconPMNs, con respectoal númerode bacteriasincubadasen ausenciade PMNs. 2.3.2.Actividad de los leucocitosPMNs frentea S.aureus . 2.3.2.1.Actividad de los leucocitosPMNs frente a S.aureusno pretratado con antbnicrobiano. 2.3.2.1.a.Ausencia de suero. Para entender los resultados obtenidos en la fagocitosis, en ausenciade suero, de S. aureusesesencialteneren cuentaquetantopara las bacterias control como para lasbacteriaspretratadascon antimicrobiano,la presenciade leucocitosy ausenciade suero determinóun aumentoen el númerode UFC respectoa los correspondientes controles sin PMN. Este hecho, que se analizará en el capítulo Discusión, no permite presentar los valores de muerte fagocítica en términos de porcentaje y estudiarlosde la misma manera que se hará con los datos de fagocitosisen presenciade suero que sí siguen la misma pauta que en el caso de E. coli. Por ello, los resultados referentes al número de UFC obtenidos en las mezclas C+PMN y AM+PMN sedan en términos de incrementode Log10 UFC/ml alo largodel tiempo. Lascinéticasde crecimientode S. aureus en presenciay ausenciade leucocitos PMNs no presentandiferenciasestadfsticamentesignificativas (y <0.05). La tabla 34 refleja las cinéticas de crecimientode S. aureusen presenciay ausenciade PMNs. 57 Resultados Tiempo Control Control+PMN 1 0.41 +0.08 0.52+0. 15 2 0.65±0.13 0.75±0.12 3 0.92+0. 17 0.98+0.09 Tabla 34. Fagocitosisy muerteintracelularde S. aureus.Cambioen el Log10(±D.E.) del total de bacteriasviablesdespuésde t horas de incubación. 2.3.2.1.b. Presencia de suero. Entre las cinéticas de crecimiento de bacteriasincubadasconsuero y bacterias incubadasconPMNs y suero,fueronhalladasdiferenciasestadisticamentesignificativas, durantetodo el ensayo.El númerode bacteriasviables en presenciade leucocitosy suero, fue menor que en ausencia de PMNs, La tabla 35 muestrael crecimientode S. aureusen presenciade suero y en presenciade PMNs y suero. Tiempo (lx’) Control+SHN Control+PMN+SI-IN 0.44±0.07 0.23+0.05 2 0.67+0.06 0.55+0.06 3 0.88+0.12 0.74+0.14 Tabla 35. Fagocitosisy muerte intracelularpor PMNs, en presenciade suero, de S.aureus.Cambioen el Log10(±D.E.)del total debacteriasviablesdespuésde t horas de incubación. 2.3.2.2.Actividad de los leucocitosPMNs frente a S. aureuspretratado con imipenem. 2.3.2.2.a.Ausenciade suero. Comoanteriormentefue mencionado,la presenciade leucocitosen ausenciade suero determinóun aumentoen el número de UFC de las bacteriastratadascon imipenemrespectoa las bacteriastratadasincubadassin PMNs (figura 5.a.). 58 ~1 Resultados Entre las cinéticasde crecimientode S. aureuscontroly tratadoconimipenem, en presenciade PMNs, fueron halladasdiferenciasestadísticamentesignificativasa tiempost=1, t=2 y t=3 horas. La tabla36 muestralas cinéticasde crecimiento,en presenciadePMNs, de ~, aureuscontrol y S. aureus pretratado con imipenem. Tiempo Control+PMN Tratado+PMN 1 0.52+0.15 -0.03+0.19 2 0.75+0.12 -0.13+0.07 3 0.98+0.09 0.22±0.16 Tabla 36. Fagocitosisy muerteintracelularpor PMNs, de S. aureuspretratadocon iniipenem.Cambioen el Log10(±D.E.)del total de bacteriasviablesdespuésde t horas de incubación. Las diferenciasen las cinéticasde crecimientode bacteriascontrol y bacterias tratadas, en presenciade leucocitos, respectoa sus correspondientescontroles en ausenciadePMNs, fueronmayoresen el casode las bacteriastratadas(Tabla37). Tiempo Control Tratado -0.11 -0.46 2 -0.10 -0.19 3 -0.06 -0.11 Tabla37. Diferenciasen Log10UFC/ml de bacteriascontrol y tratadasconimipenem, en ausenciay presenciade PMNs. 2.3.2.2.b.Presenciade suero. Las curvasde crecimientode S. aureuspretratadoconimipenem,enpresencia de PMNs y en presenciade PMNs y suero,presentarongrandesdiferencias(p<0.05) durante las treshorasdel ensayo. En presencia de suero, el número debacteriasviables,incubadasconPMNs, fue 59 Resultados mayoren el casode bacteriascontrolesque bacteriastratadas.Las diferenciasfueron estadisticamentesignificativasa tiempo t=1, t=2, t=3 horas,(figura 5.b.). La tabla 38 muestrala cinéticade crecimientode S. aureusen presenciade PMNs y suero,de bacteriascontrol y bacteriastratadascon inñpenem. Tiempo (lx) Control+PMN+SHN Tratado +PMN+SHN 1 0.23+0.05 -0.43+0.12 2 0.55+0.06 -0.29+0.11 3 0.74+0.14 -0.02+0.07 Tabla38. Fagocitosisy muerte intracelularpor PMNs, de S. aureuspretratadocon imipenem,en presenciade suero. Cambio en el Log10 (±D.E.)del total debacterias viablesdespuésde t horasde incubación. El porcentajemedio de muertefagocitica,en presenciade suero, debacterias controlesfue del 30.03%,la muertefagocíticade bacteriaspretratadascon imipenem fue del 67.88% (tabla 39, figura 5.c.). La tabla39 muestrael porcentajede bacteriasmuertasdebidoa la actividadde los leucocitosPMNs en presenciade suero. fl~mu~Á.b= Control +SHN Tratado+SHN 1 38.30% 65.31% 2 24.26% 74.92% 3 27.63% 45.11% Tabla39. Porcentajede muerte fagocfticade S. aureus pretratadocon imipenem,en presenciade suero. Los valores,expresadosen porcentaje,se refierenal descensoen el número de bacteriasincubadascon PMNs, con respectoal número de bacterias incubadasen ausenciade PMNs. 60 1 —, Resultados 2.3.2.3.Actividad de los leucocitosPMNs frente a 5. aureuspretratado con meropenem. 2.3.2.3.a.Ausencia de suero. El número de bacteriasviables tratadascon meropenem,fue mayor cuando fueronincubadascon PMNs, que en ausenciade estos.(Figura6.aj. Se hallaron diferenciassignificativasentrelasbacteriascontrol y tratadas,en presenciadePMNs. La tabla40 muestrael crecimientode S.aureuscontroly tratado, enpresenciade PMNs. Tiemoo Control Tratado 1 -0.11 -0.50 2 -0.10 -0.39 3 -0.06 -0.23 Tabla41. Diferenciasen Log~UFC/mlde bacteriascontroly tratadasconmeropenem, en ausenciay presenciade PMNs. 61 Resultados 2.3.2.3.b.Presenciade suero. Como en el caso de imipenem las cinéticas de crecimiento de 5. aureus pretratadocon meropenemen presenciade PMNs, y en presenciadePMNsy suero, presentarongrandesdiferencias durantelas tres horas del ensayo. El número de bacteriasviablesfue mayoren el casodebacteriascontrolesqueen el casodebacterias tratadas(figura 6.b.). La tabla42 refleja la cinéticadecrecimientode5. aureusenpresenciadePMNs y suero,de bacteriascontrol y tratadascon meropenem. Control+PMN+SHN Tratado+PMN+SHN 1 0.23 +0.05 -0.33+0.07 2 0.55±0.06 -0.27±0.09 3 0.74+0.14 0.06+0.10 Tabla 42. Fagocitosisy muerte intracelularpor PMNs, de S. aureuspretratadocon meropenem,en presenciade suero.Cambioen el Log10 (±D.E.) del total debacterias viablesdespuésde t horasde incubación. El porcentajemedio de muertefagocítica en presenciade suero, de bacterias tratadasfue del 64.20% frente al 30.03% de bacteriascontroles. (Tabla 43, figura 6.c.). En la tabla 43 sepresentanlos porcentajesde muertefagocítica de bacterias control y tratadas,incubadascon suero. Tiempo Control+ SHN Tratado+SHN 1 38.30% 67.64% 2 24.26% 67.63% 3 27.63% 57.34% Tabla43. Porcentajede muertefagocíticade tai~~uz pretratadocon meropenem,en presenciade suero.Los valores,expresadosen porcentaje,se refierenal descensoen el númerode bacteriasincubadascon PMNs, con respectoal número de bacterias 62 Resultados incubadas en ausencia de PMNs. 2.3.2.4.Actividad de los leucocitosPMNs frente a S.aureuspretratado con cefepime. 2.3.2.4.a.Ausencia de suero. Como en el casode los carbapenemes,el número de bacterias viables tratadas con cefepime, fue mayor cuando fueron incubadas conPMNs, queen ausenciadeestos (figura 7.a.). Las diferencias entre las cinéticas de crecimiento de bacteriascontroles y tratadas, en presencia de PMNs, presentaron diferencias estadisticamente significativas, solo a tiempot=1 hora. La tabla44 muestrael crecimientode bacterias control y tratadas,en presenciade PMNs. Control+PMN Tratado+ PMN 1 0.52±0.15 0.32+0.14 2 0.75±0.12 0.65+0.17 3 0.98±0.09 0.88+0.15 Tabla44. Fagocitosisy muerte intracelularpor PMNs, de 5. aureuspretratadocon cefepime.Cambioenel Log10 (±D.E.)del total debacteriasviablesdespuésde t horas de incubación.La tabla45 muestra las diferencias (Log10 UFC/ml) de bacterias control y tratadascon cefepime, en presencia de leucocitos y ausencia de suero. Tiempo (lx’) Control Tratado 1 -0.11 -0.56 2 -0.10 -0.41 3 -0.06 -0.51 Tabla 45. Diferencias en Log10 UFC/ml de bacterias control y tratadas con cefepime, en ausenciay presenciade PMNs. 63 Resultados 2.3.2.4.b.Presenciade suero. El suero incrementó la actividad fagocítica de los leucocitos, se hallaron diferenciassignificativasa tiempot= 1 y t=2 horasentrelas cinéticasde crecimiento de bacteriastratadas,en presenciade PMN y en presenciade PMN y suero.Entre las curvas de crecimiento de bacterias control y tratadas, incubadas con suero y PMNS no sehallarondiferenciassignificativasdurantetodo el ensayo.(Figura7.b.). La tabla46 muestrael crecimientode 5. aureus,en presenciade PMNs y suero, de bacterias control y tratadasconcefepime. Tiemno con cefpodoxima, en presencia de leucocitos y ausencia de suero. Tiempo (lx’) Control Tratado 1 -0.11 -0.57 2 -0.10 -0.59 3 -0.06 -0.61 Tabla 49. Diferencias en Log10 UFC/ml de bacterias control y tratadas con cefpodoxima,en ausenciay presenciade PMNs. 65 Resultados 2.3.2.5.b.Presenciade suero. El sueroprovocóun descensoen el númerode bacteriasviablespretratadascon cefpodoxima e incubadas con PMNs. Las diferencias entre las cinéticasde crecimiento de bacteriastratadascon celjodoximaen presenciade suero,y en presenciadePMNs y suero,presentandiferenciasestadlsticainentesignificativas(p<0.05)durantelas tres horasdel ensayo. Entre lascurvasde crecimientode bacteriascontrol y tratadas,incubadascon PMNs y suero, fueron halladas diferencias estadísticamentesignificativas con cefpodoxima,en presenciade PMNs y suero. Tiempo Control+PMN+SHN Trptado+PMN4-SHN 1 0.23±0.05 -0.04+0.06 2 0.55±0.06 0.07+0.12 3 0.74+0.14 0.68+0.22 Tabla50. Fagocitosisy muerteintracelularpor PMNs, de 5. aureuspretratadocon cefpodoxima,enpresenciade suero.Cambioen el Log10(±D.E.)del total de bacterias viablesdespuésde t horas de incubación. El porcentajemediode muertefagociticaenpresenciade suero,de lasbacterias tratadascon cefpodoximafue mayarqueel de las bacteriascontroles,60.82% frente a 30.03% respectivamente(tabla51, figura 8.c.). En la tabla 51 se muestranlos porcentajesde muertefagocitica de bacterias control y tratadas,incubadascon suero. Tiempo (it) Control+SHN Trptadod-SHN 1 38.30% 67.26% 2 24.26% 73.12% 3 27.63% 45.10% Tabla51. Porcentajede muertefagocfticadeS. aureuspretratadoconcelbodoxima,en 66 Resultados presenciade suero.Los valores, expresados en porcentaje, se refierenal descensoen el número de bacteriasincubadascon PMNs, con respectoal número de bacterias incubadas en ausencia de PMiNs. 67 R esultados <4eno 1‘-u 1 +++ ensot-. Nount“o(‘4(‘4 teenenIt, ‘o VNtteenun0(‘4tte0 0 0 0 U N Co ten~41 teen‘osote-.4 oU .- teo ’ te ‘o O ’ (‘4 tec l C lte0 0 en0 0teoenso teoVN ‘teU - 0 0 ‘otec l enU - te0 0 0 0 ‘o‘Oteoe,’ ‘.0 en — ‘ c>1 0 ¡ OOO)—E— uuuuu- 111- ~ cc o u - o 4 )’ 1.-i rloom ++ teenO ’. en ‘e nteoen0 0 enter4‘4‘O teten0 0 ente ’ 0 0 -t0 0 te0 0 0 0 o’ teo‘oo’teenV N teoenU - te , soenso te‘o(‘4i0 0 c l ‘oteo’(‘4‘o oooEU , u-oou - ootlEEoo‘oOU , o4 ) .0oooence.4 - 4)4)E4) -oU , oo4 - oO , U , o4)0r4)E‘oO ) c ice 4) b --n 68 o.0neno.0nC l +++ ‘oU - ooot008‘oenci C o socisoo ’ (‘4oC l 0 0 ci00C l o -4 ’ ooo ’ oU - oo-4-4oenCMoU - oc i ‘oooU - ootci00toUNooo-4o ‘o — % o 444) •~e ~ o 00> ~ o 0 1-o o> ~~~ u u oÉ l + oosc‘oci -4ci‘oUNo 00oo 00 VN en C l ci c id en-4ci U - -4 ci ci U - C l ‘ciociC l o ‘ci R esultados ‘o4 ) eoue.0Eou‘oO,‘oo-oe4) .0oonEu o 2oeooEu aen m a4> 4)ou - — o oo — ‘A1- E M.0 enUN o 69 7-— Resultados 3.ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD BACTERICIDA DE LOS LEUCOCITOS PMNs EN PRESENCIA CONTINUA DE ANTIMICROBIANOS. 3.1. Actividad bactericida de leucocitos PMNs frente a E. coil en presenciacontinua de anthnicrobiano. 3.1.1.Actividad bactericida de leucocitosPMNs frente a Ls¡>M enpresencia continua de iinipenenx. 3.1.1.1.Efecto de 1/2 CMI de imipenem. La presenciade 1/2 CMI de imipenem en un cultivo de E coli redujo significativamenteel númerode bacteriasviables, durantelas treshorasde exposición. En presencia de PMNs, se incrementó el descenso en el número de viablesy fueron halladasdiferenciasestadfsticainentesignificativasentre las cinéticas de letalidad de bacteriasincubadascon antibiótico, en ausenciade PMNs y en presenciade PMNs (figura 9.aj. La tabla 54 muestrala cinéticade letalidaddeE. coli en presenciade 1/2 CMI de imipenemy en presencia/ausenciade PMNs. lIJÉ C+5HN C+PMN+SHN I/20M1+5HN 1/20M14-PMN+SHN 1 0.77+0.06 0.39+0.09 0.05+0.06 -0.46+0.03 2 1.08+0.13 0.62+0.06 -0.06+0.04 -0.73+0.07 3 1.37+0.08 0.82+0.14 -0.12+0.07 -0.84+0.12 Tabla 54. Efecto de 1/2xCMI de imipenem en presencia/ausencia de PMNs. Cambio en el Log10 UFC/ml (±D.E.)del total de bacterias viables después de t horas de incubación. La muerte fagocítica de fr....~ii fue sinérgicamenteincrementadacuando imipenem(1/2 CMI) estuvocontinuamentepresenteen el cultivo bacteriano,esdecir, el cultivo del microorganismoen presenciadel antimícrobianoy PMNs mostró un descensomayoren el numerode bacteriasviables,quela sumadel efectobactericida de imipenem y de la actividad de los leucocitos por separado (figura 9.b., tabla 57). 3.1.1.2. Efecto de 4 CMI de hnipenem. La presencia de 4 CMI de imipenem provocó un rápido y notable descenso en 70 ~‘1 Resultados el númerode viablesde~squi. En presenciade PMNs, el descensofue mayor y las diferenciasfueronestadisticanientesignificativasdurantetodo el ensayo(figura 9.a.). La tabla 55 muestrala cinéticade letalidad de&~ii incubadocon4 CMI de imipenem,tanto en presenciacomoen ausenciade PMNs. c+sHN C+PMN+SHN 4CMI+SHN 4CMI+PMN+SHN 1 0.77±0.06 0.39±0.09 0.08±0.07 -0.71±0.09 2 1.08+0.13 0.62+0.06 -1.60+0.12 -2.49+0.12 3 1.37+0.08 0.82+0.14 -2.11±0.10 -2.88±0.13 Tabla 55. Efecto de 4xCMI de imipenem en presencia/ausencia de PMNs. Cambio en el Log10 UFC/ml (±D.E.)del total de bacterias viables despuésde t horas de incubación. La exposicióncontinuaa imipenem(4 CMI) provocóun incrementosinérgico de la muerte fagocitica de E. coli mayor que en el caso de la exposición a 1/2 CMI (figura 9.b., tabla 57). La tabla 56 expresa el porcentaje de muerte fagocítica por leucocitos PMNs, en presencia de 1/2 CMI y 4 CMI de imipenem. Tiempo Ch) Control+SHN 1/2CMI+SHN 4CMI+SHN 1 66.12% 69.01% 83.78% 2 65.33% 78.56% 87.11% 3 71.81% 80.71% 83.02% Tabla 56. Porcentaje de muerte fagocítica de E. coli en presencia de 1I2xCMI y 4xCMI de imipenen’i. Los valores, expresados en porcentaje, se refieren al descenso en el número de bacterias incubadas con PMNs, con respecto al número de bacterias incubadasen ausenciade PMNs. La tabla 57 expresa la reducción de bacterias viables, expresada en Log10 UFC/ml, respecto al cultivo control, sin antibiótico ni PMNs. 71 Resultados C+PMN II2CMI 4CM1 1/20M1+PMN 4CM1+PMN 1 0.38±0.09 0.72±0.10 0.69+0.09 1.23±0.07 1.48+0.07 2 0.46+0.07 1.14+0.10 2.68±0.12 1.81+0.12 3.57+0.08 3 0.55±0.08 1.49±0.07 3.48+0.1 2.21±0,13 4.25+0.07 Tabla 57. Reducciónde bacteriasviables, expresadaen Log10 UFC/ml (±D.E.) respectoal cultivo control, sin antibióticoni PMNs. 3.1.2.Actividad bactericida de PMNs frente a E1ntl en presenciacontinua de meropenem. 3.1.2.1.Efecto de 1/2 CMI de meropenem. La presenciade 1/2 CMI de meropenemimpidió el aumentoen el númerode viables,si bien no provocóun descensocomo en el caso de imipenem.En presencia de PMNs seprodujo un descensoen el númerode viables y las cinéticasde letalidad de E. coli incubadacon 1/2 CMI de meropenemy 1/2 CMI en presenciade PMNs presentarondiferenciasestadísticamentesignificativasdurantelas treshorasdel ensayo (figura l0.a.). La tabla 58 muestrala cinéticade letalidadde E. coli en presenciade 1/2 CMI de meropenemy en presencia/ausenciade PMNs. C+5HN C+PMN+5HN 1/2CMI+5HN 1/20M1+PMN+5HN 1 0.77+0.06 0.39+0.09 0.16+0.09 -0.34+0.08 2 1.08+0.13 0.62+0.06 0.19±0.10 -0.54+0.08 3 1.37+0.08 0.82+0.14 0.20+0.12 -0.56+0.13 Tabla 58. Efectode 1/2xCMJde meropenemen presencia/ausenciade PMNs. Cambio en el Log10 UFC/ml (±D.E.)del total de bacteriasviables despuésde t horas de incubación. La muertefagocíticade E. coli fue sinérgicamenteincrementada,igual queen el caso de imipenem, cuandomeropenem(1/2 CMI) estuvo presenteen el cultivo bacteriano(figura 10.b., tabla 61). 72 Resultados 3.1.2.2.Efecto de 4 CMI de mneropenem. Meropenem (4 CMI) provocó un descenso rápido en el número de bacterias viables, si bien el descensofue de menorcuantíaque en el caso de imipenem. En presenciade PMNs el descensofue mayor y las diferencias entre las cinéticas de letalidadde E. coli incubadocon 4 CMI de meropenem,en presenciay ausenciade PMNs, mostrarondurantetodo el ensayo diferenciasestadisticamentesignificativas (figura l0.a.).La tabla59 reflejala cinéticadeletalidadde E. coli incubadocon4 CMI demeropenem,tantoen presenciacomoen ausenciade PMNs. c+SHN C+PMN+5HN 40M11-5HN ICMI+PMN+sHN 1 0.77±0.06 0.39+0.09 0.03±0.12 -0.76+0.10 2 1.08±0.13 0.62±0.06 -0.98+0.13 -1.93+0.11 3 1.37±0.08 0.82±0.14 -1.63+0.06 -2.89+0.10 Tabla59. Efectode 4xCMI de meropenemen presencia/ausenciade PMNs. Cambio en el Log10 UFC/ml (±D.E.)del total de bacteriasviables despuésde t horas de incubación. El efectosinérgicode meropenem(4 CMI) con los leucocitosfue también,como en el casode imipenem,mayorqueel halladocon 1/2 CMI (figura lOt., tabla 61). La tabla60 expresael porcentajedemuertefagocíticaporleucocitosPMNs, en presenciade 1/2 CMI y 4 CMI de meropenem. Tiempo(lx) Control+SHN 1/2CMI+SHN 4CMI+SHN 1 66.12% 68.38% 83.78% 2 65.33% 81.37% 88.73% 3 71.81% 82.62% 94.50% Tabla 60. Porcentaje de muerte fagocitica de E. coli en presencia de 1/2xCMI y 4xCMI de meropenem.Los valores, expresadosen porcentaje,se refieren al descensoen el número de bacterias incubadas con PMNs, con respecto al número de bacterias 73 Resultados incubadas en ausencia de PMNs. La tabla 61 expresala reducción de bacteriasviables, expresadaen Log10 IJFC/ml, respectoal cultivo control, sin antibióticoni PMNs. lIJÉ c+PMN 1/2CM! 4CM! t/20M!+PMN 40M1+PMN 1 0.38±0.09 0.61+0.12 0.74+0.06 1.11±0.10 1.53±0.10 2 0.46±0.07 0.89±0.10 2.06+0.01 1.62±0.15 3.01±0.11 3 0.55+0.08 1.17+0.09 3.00+0.10 1.93+0.12 4.26+0.15 Tabla 61. Reducción de bacterias viables, expresadaen Log10 UFC/ml (±D.E.) respecto al cultivo control, sin antibióticoni PMNs. 3.1.3. Actividad bactericidade PMNs frente a E. coli en presencia continuade cefepinie. 3.1.3.1.Efectode 1/2 CMI de cefepime. Unaconcentraciónde 1/2CMI decefepimeconsiguióun descensoenel número de bacteriasviablesdurantetodo el ensayo,aunquede menormagnitudque la misma concentraciónde imipenem.Las diferenciasen las cinéticasde letalidadde E. coli en presenciade 1/2 CMI, incubadocony sin PMNs fueronsignificativasen las treshoras del experimento(figura 11.a.). La tabla62 muestrala cinéticade letalidadde E. coli en presenciade 1/2 CMI de cefepimey en presencia/ausenciade PMNs. C+5HN C+PMN+5HN I/2CMI+5HN 1/20M1+PMN+5HN 0.77+0.06 0.39±0.09 0.04+0.08 -0.30+0.07 2 1.08+0.13 0.62+0.06 -0.19±0.12 -0.51+0.12 3 1.37±0.08 0.82+0.14 -0.30±0.13 -0.62+0.11 Tabla 62. Efecto de 1/2xCMI de cefepime en presencia/ausencia de PMNs. Cambio en el Log10 UFC/ml (±D.E.)del total de bacterias viables despuésde t horas de incubación. El antibióticoen combinacióncon los leucocitos,ejercenun efectoaditivo en 74 Resultados la muerte fagocítica de E. coli (figura 11.b., tabla 65). 3.1.3.2. Efecto de 4 CMI de cefepime. La presencia de 4 CMI de cefepime en el medio de incubación de E. coli provocóun descensomayoren el númerode bacteriasviablesqueen presenciade 1/2 CMI. Es decir, como en los casos anteriores de imipenemy meropenem,la actividad bactericidafue dependientede la concentraciónde antibiótico. En presencia de PMNs, el descenso de viables fue mayor que en ausencia de estos (figura 1l.a.). La tabla 63 refleja la cinética de letalidad de E. coli incubadocon 4 CMI de cefepime, tanto en ausencia como en presencia de PMNs. C+SHN C+PMN+5HN 40M1+5HN 4CM!+PMN+5HN 1 0.77±0.06 0.39+0.09 -0.23±0.11 -0.62±0.12 2 1.08±0.13 0.62±0.06 -0.82±0.12 -1.24±0.15 3 1.37±0.08 0.82±0.14 -1.38+0.12 -2.39+0.10 Tabla 63. Efecto de 4xCMI de cefepime en presencia/ausencia de PMNs. Cambio en el Log10 UFC/ml (±D.E.)del total de bacterias viables despuésde t horas de incubación. El antibiótico, en combinación con los leucocitos ejerció un efecto aditivo sobre la muerte fagocítica de E. coli. La suma de la actividad de los PMNs y la actividad del antibiótico de forma independientefue de igual magnitud que el efecto conjunto de PMNs y antimicrobiano(figura lI.b., tabla65). La tabla64 muestrael porcentajede muertefagocíticaporleucocitosPMNs, en presenciade 1/2 CMI y 4 CMI de cefepime. La tabla 65 expresala reducción de bacteriasviables, expresadaen Log10 UFCImI, respectoal cultivo control, sin antibióticoni PMNs. 75 Resultados Tiempo Contro¡+SHN l/2CMI+SHN 4CMI+SHN 1 66.12% 59.26% 59.25% 2 65.33% 67.63% 70.49% 3 71.81% 54.28% 78.12% Tabla68. Porcentajedemuertefagocíticade B~.g.qiien presenciade l/2xCMI y 4xCMI decefpodoxima.Los valores,expresadosen porcentaje,se refierenal descensoen el número de bacterias incubadascon PMNs, con respecto al número de bacterias incubadas en ausencia de PMNs. La tabla 69 expresa la reducción de bacterias viables, expresadaen Log10 UFC/ml, respecto al cultivo control, sin antibiótico ni PMNs. __ C+PMN JJQQfrI] 4CM! l/2CMI+PMN 4CMI+PMN 1 0.38±0.09 0.51±0.10 0.65±0.11 0.90±0.07 1.04±0.15 2 0.46±0.07 0.87±0.13 1.97±0.12 1.54±0.09 2.50±0.10 3 0.55±0.08 1.56±0.10 2.72±0.11 1.90±0.10 3.38±0.13 Tabla 69. Reducción de bacterias viables, expresadaen Log10 UFC/ml (±D.E.) respecto al cultivo control, sin antibiótico ni PMNs. 3.2. Actividad bactericida de leucocitos PMNs frente a 5. aureus en presenciacontinua de antimicrobiano. 3.2.1. Actividad bactericida de PMNs frente a 5. aureus en presencia continua de imipenem. 3.2.1.1.Efecto de 1/2 CMI de iniipenem. La presencia de 1/2 CMI de imipenem en el cultivo de 5. aureus estabilizó el crecimiento bacteriano durante las tres horas del ensayo.En presenciade PMNs se 78 Resultados produjoun descensopoco acentuado,aunquelas cinéticasde letalidaden presenciay en ausenciadePNMs,con1/2 CMI deimipenem,presentarondiferenciassignificativas (figura 13.a.). La tabla 70 muestrala cinéticade letalidadde 5. aureusen presenciade 1/2 CMI de imipenemy en presencia/ausenciade PMNs. C+SHN C+PMN+SHN II2CM!+SHN IIZCMI+PMN+SHN 1 0.44+0.07 0.23+0.05 0.14±0.07 -0.01±0.07 2 0.67±0.06 0.55±0.06 0.13±0.14 -0.13±0.09 3 0.88+0.12 0.74+0.14 0.15±0.08 -0.18+0.10 Tabla 70. Efectode 1/2xCMI de imipenemen presencia/ausenciade PMNs. Cambio en el Log10 UFC/ml (+D.E.) del total de bacteriasviables despuésde t horas de incubación. La muertefagocíticade 5. aureuspresentóun incrementosinérgicodebidoa la exposición continuaa 1/2 CMI de imipenem (figura 13.b., tabla 74). La tabla 71 expresael porcentajede muertefagocítica por leucocitosPMN, en presenciade 1/2 CMI de imipenem. Tiemno Ch’> Control+SHN 1/2xCMI+SHN 1 38.35% 29.23% 2 24. 15% 45.03% 3 27.55% 53.24% Tabla71. Porcentajede muertefagociticade 5. aureusen presenciade 1/2xCMI de imipenem.Los valores,expresadosenporcentaje,serefierenal descensoen el número de bacteriasincubadascon PMNs, con respectoal númerode bacteriasincubadasen ausenciade PMNs. 79 Resultados 3.2.1.2.Efectode 4 CMI de imipenem. La presenciade 4 CMI de imipenemprovocó un descensoen el número de bacteriasviables. En presenciade PMNs, el descensofue menorqueen ausenciade estos,lascinéticasde letalidadfueronestadísticamentesignificativas(p<0.OS)(figura 13.a.). La tabla 72 muestrala cinéticade letalidadde taiimiiz incubadocon 4 CMI de imipenem,tantoen presenciacomoen ausenciade PMNs. C+5HN C +PMN+SHN 4xcMI+5HN 4xcMI+PMN+SHN 0.44±0.07 0.23±0.05 -0.22±0.07 -0.05±0.10 2 0.67+0.06 0.55+0.06 -2.15+0.05 -1.97+0.12 3 0.88±0.12 0.74+0.14 -2.57+0.09 -2.42±0.07 Tabla72. Efectode 4xCMI deimipenemen presencia/ausenciade PMNs. Cambioen el Log10 UFC/ml (+D.E.) del total de bacteriasviables después de t horas de incubación. La combinaciónde imipenem (4 CMI) y la actividad de los leucocitostuvo como resultadoun efecto menorque la sumade ambosefectosindependientemente (figura 13.b., tabla74). En presenciade 4 CMI de los antibióticosde esteestudio,la incubaciónde~ aureuscon leucocitosPMNs, dio comoresultadoun númeromayorde UFC respecto al correspondientecontrol, es decir, la presenciade 4 CMI en ausenciadePMNs. Este hechoqueseanalizaráen el capítuloDiscusión, no permitepresentarlos resultadosde muertefagocítica en términosde porcentaje,por ello, los resultados referentesal número de UFC obtenidosen presenciade 4 CMI de antibiótico se presentanen incrementode Log10UFC/ml a lo largodel tiempo. 80 Resultados Thrnnalh} Control+SHN 4xCMI+SHN 1 -0.21 0.17 2 -0.12 0.18 3 -0.14 0.15 Tabla73. Diferenciasen Log10UFC/mldebacteriascontrol e incubadas con imipeneni, en ausenciay presenciade PMNs. La tabla 74 expresala reducciónde bacteriasviables, expresadaen Log10 UFC/ml, respecto al cultivo control, sin antibiótico ni PMNs. C+PMN 1/ICMI 4CMI 1/2CMI+PMN 4CMI+PMN 1 0.21±0.07 0.30±0.13 0.66±0.09 0.45±0.11 0.49±0.05 2 0.12±0.06 0.54±0.10 2.82±0.05 0.80±0.10 2.64±0.17 3 0.14±0.08 0.73±0.07 3.45±0.06 1.06±0.07 3.30±0.03 Tabla 74. Reducciónde bacterias viables, expresadaen Log10 UFC/ml (±D.E.) respectoal cultivo control, sin antibióticoni PMNs. 3.2.2. Actividad bactericidade PMNs frente a 5. aureusen presencia continuade meropenem. 3.2.2.1.Efectode 1/2 CMI de meropenem. La presenciade 1/2 CMI de meropenemestabilizael crecimientode 5.aureus . En presenciadePMNs, seprodujoun pequeñodescensoen el númerodeviables, las diferenciasentrelas cinéticasde letalidadde 5. aureuscon 1/2 CMI de meropenem, en presenciay ausenciadePMNs fueronsolosignificativasa tiempot= 3 horas (figura 14.a.). La tabla 75 muestrala cinéticade letalidad de 5. aureusen presenciade 1/2 CMI deimipenem y en presencia/ausencia de PMNs. 81 Resultados C+5HN C+PMN+5HN I/2CMI+5HN l/2CMI+PMN+5HN 1 0.44+0.0’7 0.23±0.05 0.01+0.12 -0.03+0.08 2 0.67±0.06 0.55+0.06 0.07±0.07 -0.04±0.09 3 0.88±0.12 0.74±0.14 0.16+0.06 -0.13+0.10 Tabla75. Efectode 1/2xCMI de meropenemen presencia/ausenciadePMNs. Cambio en el Log10 UFC/ml (+D.E.) del total de bacteriasviables despuésde t horas de incubación. La muerte fagocítica de 5. aureusen presencia de 1/2 CMI de meropenem presentóefectoaditivo, es decir, la acciónconjuntadel antibióticoy los leucocitosfue de igual magnitudquela sumade ambosefectospor separado(figura 14.b., tabla79). La tabla 76 expresael porcentajede muerte fagocítica por leucocitosPMNs, en presencia de 1/2 CMI de meropenem. Tiempo (it’> Control+SHN 1/2xCMI+SHN 1 38.35% 9.09% 2 24.15% 22.35% 3 27.55% 43.74% Tabla 76. Porcentajede muertefagocitica de S. aureusen presenciade 1/2xCMI de meropenem.Los valores, expresadosen porcentaje,se refieren al descensoen el número de bacterias incubadascon PMNs, con respectoal número de bacterias incubadasen ausenciade PMNs. 3.2.2.2.Efectode 4 CMI de ineropenem. La presencia de 4 CMI de meropenem ocasionó un descenso en el número de bacteriasviables. En presenciade PMNs, el descensofue menorque en ausenciade estos.Las cinéticasde letalidadfueronestadísticamentesignificativas a tiempo t = 2 y t=3 horas (figura 14.a.). La tabla 77 muestra la cinética de letalidad de 5. aureus incubadocon 4 CMI de meropenem,tanto en presenciacomoen ausenciadePMNs. 82 Resultados C +PMN +5HN 0.23 ±0.05 4xCMI +51-114 -0.12+0.10 4xCMI+PMN-4-5HN -0.24+ 0.09 2 0.67+0.06 3 0.88±0.12 0.55±0.06 0.74+0.14 -2.04+0.12 -2.74+0.13 -0.74+0.13 -1.34±0.13 Tabla77. Efectode 4xCMI de meropenemen presencia/ausenciade PMNs. Cambio en el Log~0 UFC/ml (±D.E.)del total de bacteriasviables despuésde t horas de incubación. Como en el caso de imipenem,la combinaciónde meropenem(4 CMI) y la actividadde los leucocitos,tuvo comoresultadoun efectomenorquela sumade ambos efectosindependientemente(figura 14.b., tabla79). Control+SHN -0.21 -0.12 -43.14 4xCMI+SHN 0.12 1.30 1.40 Tabla 78. Diferencias en Log10 UFC/ml de bacterias control e incubadas con meropenem,en ausenciay presenciade PMNs. La tabla 79 expresala reducción de bacteriasviables, expresadaen Log10 UFC/ml, respectoal cultivo control, sin antibiótico ni PMNs. C + PMN 1 0.21±0.07 2 0.12±0.06 3 0.14±0.08 1/2CM! 4CM ! 0.43±0.06 0.56±0.17 0.60±0.08 0.72±0.07 2.71±0. 11 3.62j0.09 Tabla 79. Reducciónde bacteriasviables, respectoal cultivo control, sin antibióticoni expresada PMNs. en Log10 UFC/ml (+D.E.) flúl 1 C+SHN 0.44±0.07 Tiempo (lx’ > 1 2 3 1/2CMI+PMN 0.47±0.10 0.71 ±0.15 1.01±0. 11 4CM1+PMN 0.68±0.09 1.41 ±0.14 2.22±0.13 83 Resultados 3.2.3. Actividad bactericida de PMNs frente a S~..anrtuz en presencia continua de cefepime. 3.2.3.1.Efecto de 1/2 CMII de cefepime. La presenciade 1/2 CMI de cefepimedio lugara diferenciassignificativascon la cinética de crecimientode bacteriascontrol aunqueno provocóun descensoen el númerode viables(figura 15.a.).La tabla80 reflejala cinéticade letalidadde S.aureus en presenciade 1/2 CMI de cefepimey en presencia/ausenciade PMNs. c+sHN C+PMN+SHN l/ZCMI+5HN I/2CMI+PMN+5HN 1 0.44+0.07 0.23+0.05 -0.04+0.10 -0.17+0.07 2 0.67+0.06 0.55+0.06 0.14+0.11 -0.42+0.09 3 0.88+0.12 0.74+0.14 0.26+0.12 -0.89+0.10 Tabla80. Efectode 1/2xCMIde cefepimeen presencialausenciadePMNs. Cambioen el Log10 UFC/ml (±D.E.)del total de bacterias viables despuésde t horas de incubación. Seencontróun efectosinérgicoen la muertefagociticade5. aureusenpresencia continuade 1/2 CMI de cefepime(figura 15.b., tabla 84). La tabla 81 expresael porcentajede muerte fagocítica por leucocitosPMNs, en presenciade 1/2 CMI de cefepime. Tiempo (lx) Control+SHN 1/2xCMI+SHN 1 38.35% 25.88% 2 24.15% 89.28% 3 27.55% 92.92% Tabla 81. Porcentaje de muerte fagocítica de S. aureusen presenciade l/2xCML de cefepime.Los valores,expresadosen porcentaje,se refierenal descensoen el número de bacteriasincubadascon PMNs, con respectoal númerode bacteriasincubadasen ausenciade PMNs. 84 Resultados 3.2.3.2.Efectode 4 CMI de cefepime. La presenciade 4 CMI de cefepimeprovocó un descensoen el número de bacteriasviables. En presenciade PMNs, el descensofue menorqueen ausenciade estos,las cinéticasde letalidadmostrarondiferenciasestadisticamentesignificativasa tiempo t=2 y t=3 horas(figura 15.a.). La tabla 82 muestrala cinéticade letalidadde £.air~usincubadocon 4 CMI de cefepime,en presencia/ausenciade PMNs. C+5HN C+PMN+SHN 4xCMI+5HN 4xCMl+PMN+SHN 1 0.44+0.07 0.23±0.05 -0.41±0.10 -0.38+0.12 2 0.67±0.06 0.55+0.06 -1.14+0.11 -0.80+0.03 3 0.88±0.12 0.74+0.14 -2.02+0.07 -1.47+0.13 Tabla 82. Efecto de 4xCMI de cefepimeen presencia/ausenciade PMNs. Cambioen el Log10 UiT/ml (±D.E.)del total de bacteriasviables después de t horas de incubación. La combinaciónde cefepime(4 CMI) y la actividad de los PMNs dio como resultadoun efecto menorquela sumade los efectosde forma independiente(figura l5.b., tabla 84). Tiempo Ch~ Control+S}IN 4xCMI+SHN -0.21 0.03 2 -0.12 0.34 3 -0.14 0.55 Tabla83. Diferenciasen Log10UFC/ml debacteriascontrole incubadasconcefepime, en ausenciay presenciadePMNs. La tabla 84 expresala reducción de bacteriasviables, expresadaen Log10 UFC/ml, respectoal cultivo control, sin antibiótico ni PMNs. 85 Resultados C+PMN ¡/2CM! 4CM! !/2cM1+PMN 4CMI+PMN 1 0.21±0.07 0.48±0.07 0.85±0.10 0.61±0.07 0.82±0.03 2 0.12±0.06 0.53±0.06 1.81±0.15 1.09±0.06 1.47±0.06 3 0.14±0.08 0.62±0.09 2.90±0.10 1.77±0.09 2.35±0.09 Tabla 84. Reducción de bacterias viables, expresadaen Log10 UFC/ml (±D.E.) respectoal cultivo control, sin antibiótico ni PMNs. 3.2.4. Actividad bactericidade PMNs frente a 5. aureusen presencia continuade cefpodoxima. 3.2.4.1.Efecto de 1/2 CMI de cefpodoxima. Lapresenciade 1/2 CMI decefpodoximano provocóun descensoen el número de viablesaunqueel númerode U?FC/ml a lo largo de las tres horas del ensayofue menor y presentó diferencias estadisticamentesignificativas con la cinética de crecimientode bacteriascontrol (figura 16.a.). La tabla85 refleja la cinéticadeletalidadde S. aureusen presenciade 1/2 CMI decefpodoximay en presencia/ausenciade PMNs. C+5HN c+PMN+5HN 1/2CM1+5HN 1/2CM!+PMN+5HN 0.44+0.07 0.23±0.05 0.01+0.09 -0.27±0.07 2 0.67+0.06 0.55+0.06 0.23+0 10 -0.44+0.11 3 0.88+0.12 0.74+0.14 0.32+0.12 -0.91+0.13 Tabla85. Efectode 1 /2xCMI de cefpodoximaen presencia/ausenciadePMNs.Cambio en el Log10 UFC/ml (±D.E.)del total de bacteriasviables despuésde t horas de incubación.La presenciade 1/2 CMI de cefpodoximaprovocóun efecto sinérgicoen la muertefagocíticade S.~...au¡~us(figura 16.b., tabla 89). La tabla86 expresael porcentajede muertefagocíticapor leucocitosPMNs,en presenciade 1/2 CMI de cefpodoxíma. 86 Resultados Tiemno Ch) Contro¡+SHN l/2xCMI+SHN 1 38.35% 47.51% 2 24.15% 78,62% 3 27.55% 94.11% Tabla 86. Porcentajede muerte fagocíticade &.an¡~ai en presenciade l/2xCMI de cefpodoxima.Los valores, expresadosen porcentaje,se refieren al descensoen el número de bacterias incubadascon PMNs, con respectoal número de bacterias incubadasen ausenciade PMNs. 3.2.4.2.Efectode4 CMI de cefpodoxima. La presenciade 4 CMI de cefpodoxima,provocóun descensoen el númerode bacteriasviables. En presenciade PMNs, tuvo lugar el mismo efectoque con los anterioresantibióticos,el descensofue menorqueen ausenciade estos.Las cinéticas de letalidad fueron diferentes deforma significativadurantetodo el experimento(figura 16.a.). La tabla 87 muestrala cinéticade letalidad de 5. aureusincubadocon 4 CMI de cefpodoxima, en presencia/ausencia de PMNs. C+5HN c-4-PMN+sHN 4xCMI+5HN 4xCMN-PMN+SHN 1 0.44+0.07 0.23+0.05 -0.46+0.10 -0.34+0.13 2 0.67+0.06 0.55+0.06 -1.50+0.11 -0.75+0.11 3 0.88±0.12 0.74±0.14 -2.17+0.07 -1.63+0.17 Tabla87. Efectode 4xCMI de ceftodoxima en presencia/ausenciade PMNs. Cambio en el Log10 UFC/ml (±D.E.)del total de bacteriasviables despuésde t horas de incubación. La combinaciónde cefpodoxima(4 CMI) y la actividadde los leucocitosdio como resultadoun efecto menorque la sumade los efectosde forma independiente (figura 16.b., tabla 89). 87 Resultados Control+SHN -0.21 -0.12 -0.14 4xCMI+SHN 0.80 0.40 0.54 Tabla 88. Diferencias en Log10 UFC/ml de bacterias control e incubadascon cef¶podoxima,en ausenciay presenciade PMNs. La tabla 89 expresala reducciónde bacteriasviables, expresadaen Log10 UFC/ml, respecto al cultivo control, sin antibióticoni PMNs. ma 1 C+PMN 0.21±0.07 2 0.12±0.06 3 0.14±0.08 IIICMI 0.43±0.07 0.90±0.12 0.44±0.05 0.56±0.09 1.82±0.13 3.00±0.10 Tabla 89. Reducción de bacterias viables, expresadaen Log10 UFC/ml (+D. E.) respectoal cultivo control, sin antibióticoni PMNs. 88 Tiemno Ch ) 1 2 3 I/2CM1+PMN 0.71±0.17 1.11±0.13 1.79±0.10 4cMl+PMN 0.78±0.12 1.42±0.13 2.51±0.14 7 R esultados ‘Aooo •.~ cd O4) .~ o-4 o‘o t~ 4) .— ‘— ‘A4) ‘e ~ cd o ‘e o . — ‘~O cd4) 4) C ‘A ....d cd ‘A ‘4 ~ ‘—‘A ‘e a) cd ~> “e cd — . o cd ‘eo ~0 4) 4) ~ ‘e ‘A~ cd ~ .o • 4) o — o ’cd — 4) .0 ’-~ cd 89 GRÁFICOS G rfficos o , z2:ci)+zo-+ c,J *zr .c +1— o , o - E Z e 2: ¡2 CO+zo-+ci*z E 2:CO+ o C i + o oo, z c’J +1- — 4 3— o * o . E Z a> ~ iz o - +o*ci Eo oo>o o .C inéticas de crecim iento con suero (S H N )de E . co il, p re tra ta d ocon im ipenem (1 ) y sin p re tra ta m ie n to(C ), en p re se n ciay ausenciade P M N s. 91 Gráficos % muerte fagocítica 100 80 60 40 20 E Control E Control + SHN l~IPretratado •Pretratada + SHN Figura Le. Muerte fagocítica de E. coli pretratadocon imipenem y sin pretratamiento(control), en presenciay ausenciade suero(SHN). Los valores, expresados en porcentaje, serefierenal descensoenel númerodebacteriasincubadas conPMNs, con respecto al número de bacterias incubadas en ausencia de l’MNs. 92 o Tiempo (h> T Eooa>o-J G ráficos o, 22:Co+72o-+ CV *22: -~ Co .c +1- o + o.E ~ 0~ 2:Co+22o-+o*z2:Co+o+ o z2 CV +1- — 4 3- oo-E Z o> 2 ¡2 0~+o*o E1>=oo , o o . C inéticasde crecim ientocon suero(S H N )de E . ccli, pretratadocon m eropenem (T ) y sin p re tra ta m ie n to(C ),en p re se n ciay ausenciade P M N s. 93 o>o> Gráficos % muerte fagocitica 100 80 60 40 20 o Tiempo ~ Control [EIlControi + SHN []Pretratado •Pretratado + SHN Figura 2.c. Muerte fagoelticade E. coli pretratadocon sneropenemy sinpretratamiento(control), en presenciay ausenciade suero(SHN). Los valores,expresadosen porcentaje, se refieren al descenso en el número de bacterias incubadas con PMNs, con respecto al número de bacterias incubadas en ausencia de PMNs. 1 2 3 94 Eo= o o,o-J G ráficos cd, 2rCo+72o-+3- CV *22:Co .c + — 3— o , o.E Z a> 2: ¡:0 3 +22o-+o*22:CO+o+ o 2 ¡2 o-+o*o Eo=2o>o.4 O < o F ig u ra 3 .a .C inéticasde crecim ientode ~ ~ g¡i, p re tra ta d ocon cefepim e(T ) y sin p re tra ta m ie n to(C ), en p re se n ciay ausenciade P M N s. F ig u ra 3.h. C inéticas de crecim iento con suero (S l-fN ) de E . ccli, p re tra ta d ocon cefepim e (T ) y sin p re tra ta m ie n to(C ),en presenciay ausenciade P M N s. 95 o> < o Gráficos % muerte fagocftica 100 80 60 40 20 0- Control [E]Contro¡ + SHN Pretratado •Pretratado + SHN Figura 3.c. Muerte fagocitica de E. coli pretratadocon cefepime y sin pretratamiento (control), en presenciay ausenciadesuero(SHN). Los valores, expresados en porcentaje, se refieren al descenso en el número de bacterias incubadas con PMNa, con respecto al número de bacterias incubadas en ausencia de PMNs. Tiempo (h) 96 G ráficos o , 22:Co+22o-+3- CM *22: -— CO .c +1- o + o.E 2 a> 2: ¡2 0 3 +22o-+(-3*22: E Co+<-3 + o>o o < o C~3 2 CV a .+3- — 4 -t 3— oo.E 2 a> 2 ¡2 0 ~ +o*o E<3= g o,o.4 0 <‘y F ig u ra 4 .a .C inéticasdecrecim ientode E .ccli,p re tra ta d ocon ce fp o d o xin ia(T ) y sin p re tra ta m ie n to(C ), en p re se n ciay ausenciade P M N s- F ig u ra 4.b. C inéticasde crecim ientocon suero(S H N )de~ ~ g1i,p re tra ta d ocon cefpodoxim a (1 )y sin p re tra ta m ie n to(C ), e n p re se n ciay a u se n ciade P M N s. 97 o >o, Gráficos % muerte fagocitica 100 80 60 40 20 o Tiempo (h) EControl [EControl + SHN Pretratado •Pretratado + SHN Figura 4.c. Muertefagocfticade E. coti pretratadocon ce~,odoximay sin pretratamiento(control), en presenciay ausenciade suero(SHN). Los valores, expresados en porcentaje, se refieren al descenso en el número de bacterias incubadas con PMNs, con respecto al número de bacterias incubadas en ausencia de PMNs. 1 2 3 98 Eo= o o>o-J G ráficos ‘o 22:C O+22o-+3- CV *22: -— 03 -c + — 3- o 4 - o.E Z 0~ 2: ¡2 CO+z2 — o-+o*22:Co+o+ o 2 ¡2 o-+o*O Eo o o > 2 o F ig u ra L a . C inéticasde crecim ientode 5.aureus,p re tra ta d ocon im ipenem (‘1)y sin p re tra ta m ie n to(C ), e n p re s e n c iay a u s e n c iade P M N s. F ig u ra L b . C in é tica sde crecim ientocon suero(S H N )de 5. a u re u s,p re tra ta d oc o n im ip e n e in (T ) y sin p re tra ta m ie n to(C ), en presenciay ausenciade P M N s. 99 o>o> Gráficos % muerte fagocítica 100 80 60 40 20 O Tiempo [DControl + SHN EPretratado + SHN Figura 5.c. Muerte fagocíticade 5. aureuspretratadoconimipenem y sin pretratamiento(control), en presenciay ausenciade suero(SHN)- Los valores, expresados en porcentaje, se refieren al descenso en el número de bacterias incubadas con PMNs, con respecto al número de bacterias incubadas en ausencia de PMNs. 1 2 3 loo G ráficos ‘o 72:03+22o-+3- CM *22: — 03 -c +3- o + o - E ~ a> 2: -g 0 3 +72a.+<5*z2: E 0 3+O+ o o > o o .4 e> 22 CV o-+3-- e . 4 — 3- o * o . E Z a> 2 ¡:o . +<-y(-y Eo o o >o o .4 < o F ig u ra 6 a . C inéticasde crecim ientode 5. aureus,pretratadocon nieropenem (1 ) y sin p re tra ta m ie n to (C ), en p re se n ciay ausenciade P M N s- F ig u ra 6 .b . C inéticasde crecim iento con suero (S H N )de S . a u re u s,p re tra ta d ocon m eropenem (T ) y sin p re tra ta m ie n to(C ), en presenciay ausenciade P M N s. 101 o ,o, < o Gráficos % muerte fagocítica 100 80 60 40 20 o Tiempo (h) LiControl + SHN EPretratacio + SHN Figura 6.c. Muertefagoclt¡cade S. aureuspretratadocon meropenemy sinpretratamiento(control), en presenciay ausenciade suero(SEN). Los valores, expresados en porcentaje, se refieren al descenso en el número de bacterias incubadas con PMNs, con respecto al número de bacterias incubadas en ausencia de PMNs. 1 2 3 102 G ráficos ‘o 22:C o+72o-+3— CV *22:03 .c +3- o * o - E 2 a> 2: -; CO+7 . 2o-+O*22: E Co+ o <-3 = + o > o-J o < o ‘o 22 CM o-+3- e . 4 -c 3- o * o-E Z a> 2 ¡2 o-+(-3*O Eo o o > o4 0 < o F ig u ra 7 .a .C inéticasde crecim ientode S . aureus,pretratadocon cefepim e(1 )y sin p re tra ta m ie n to(C ), en p re se n ciay ausenciade P M N s. F ig u ra 7.1>. C inéticasde crecim ientocon suero (S H N )de 5.aureus,p re tra ta d ocon cefepim e (T ) y sin p re tra ta m ie n to(C ), en presenciay ausenciade P M N s. 103 o ,o> Gráficos % muerte fagocítica 100 80 60 40 20 o Tiempo (h) EControl + SHN EJPretratado + SMN Figura 7.c. Muerte fagocfticade S. aureuspretratadocon cefepimey sin pretratasniento(control), en presenciay ausenciade suero(SHN)- Los valores, expresados en porcentaje, se refieren al descenso en el número de bacterias incubadas con PMNs, con respecto al número de bacterias incubadas en ausencia de PMNs. 1 2 3 104 G rá fic o s ‘o 7rC o+22o--4- 3- CV 22: e . C o -c +3- o + o.E 2 o-> 2 : ¡2 0 3 +72 — o-+O*2 E 2:CO+ <5 0 = + o a>o.4 0‘o 22 CV +3- -c 3- 0 * o . E Z a> 2 ¡2 a.+O*O Eo= o‘e a>o.4 0 < o F ig u ra L a . C inéticas de crecim ientode 5.aureus,pretratadocon cefpodoxim a(T ) y sin p re tra ta m ie n to (C ), en p re se n ciay ausenciade P M N s. F ig u ra 8.1>.C inéticasde crecim ientocon suero(S H N )de 5. a u re u s,p re tra ta d ocon ce fp o d o xim a(1 ) y sin p re tra ta m ie n to(C ), en presenciay ausenciade P M N s. 105 o>o> Gráficos % muerte fagocftica 100 80 60 40 20 o Tiempo (h> EControl + SHN EPretratado + SHN Figura 8.c. Muerte fagociticade 5. aureuspretratadocon cefpodoximay sin pretratamiento(control), en presenciay ausenciade suero(SHN)- Los valores, expresados en porcentaje, se refieren al descenso en el número de bacterias incubadas con PMNs, con respecto al número de bacterias incubadas en ausencia de PMNs. 1 2 3 106 Gráficos Log4o- 3 2,5 2 1 ,5 1 0,5 o EPMN+ SHN •4 CMI+ SHN •1/2 CMI+SHN+PMN [E4 CMI+ SHN+ PMN Figura 9.1>. Reducciónde E. coti viables debidoa ¡a exposiciónde la bacteriaa imipenem (1/2 y 4 CMI), PMNs o ambosfactores. Los valores, expresados en Log,, UFC/nil, se refieren al descenso medio obtenido durante las tres horas del ensayo, en el número de viables respecto a los microorganismos control (sin incubación con PMNs ni antibiótico). 1 108 Gráficos Log4o- (ufc/mI) Tiempo 3 2,5 2 1,5 1 0,5 o •1/2 CMI+ SHN+ PMN~PMN+SHN 1/2 CMI+SHN •4 CMI+ SHN [E4 CMI+ SHN+ PMN Figura 10.1>. Reducciónde E. coli viablesdebidoa la exposiciónde ¡abacteriaa meropenem(1/2 y 4 CMI), PMNso ambosfactores. Los valores, expresados en Log,« UFC/ml, se refieren al descenso medio obtenido durante las tres horas del ensayo, en el número de viables respecto a los microorganismos control ( sin incubación con PMNs ni antibiótico) - 110 Gráficos Log40 Tiempo (h> ~C+SHN +C+SHN-i-PMN *1/2 CMI±SHN --1/2 CMI+SHN±PMN*4 CMI+SHN +4 CMI+SHN+PMN Figura 12.a. Cinéticasde letalidadde E. coti con 1/2y 4 CMI de cefpodoximaen presenciay ausencia de PMNs. 9 4 o 1 2 3 113 Gráficos Reducción viables (Log1o-UFC/mI> 3 2,5 2 1,5 1 0,5 o EIPMN+ SHN •4 CMb- SHN 1/2 CMI+ SHN E 4 CMI+ SHN+ PMN •1/2 CMI+SHN+PMN Figura 12.1>. Reducciónde E. cdi viablesdebidoa la exposiciónde la bacteriaa ce~odoxinm(1/2 y 4 CMI), PMNs o ambosfactores. * Los valores, expresados en Log,< tJFChril, se refieren al descenso medio obtenido durante las tres horas del ensayo, en cl número de viables respecto a los microorganismos control [7?’?j~jj EIPMN+ SI-IN •4 CMb- SHN E~i~1I2 CMI+SHN E 4 CMb- SHN+ PMN •1/2 CMb- SHN+ PMN Figura 13.b. Reducciónde 5. aureusviablesdebidoa la exposiciónde la bacteriaa imipenem(1/2 y 4 CMI), PMNso ambosfactores. Los valores, expresados en Log,0 UPC/ml, so refieren al descenso medio obtenido durante las tres horas del ensayo, en el número de viables respecto a los microorganismos control ( sin incubación con PMNs ni antibiótico). 3 2,5 2 1,5 1 0,5 o 116 Gráficos Log0(ufc/mI> Tiempo (h> ~C+SHN ±C+SHN+PMN -~1I2 CMI+SHN+PMN *4 CMI+SHN *1/2 CMI+SHN +4 CMI-i-SHN+PMN Figura 14.a. Cinéticasde letalidaddeS. aureuscon 1/2y 4 CMI demeropenemen presenciay ausencia de PMNs. 9 4 0 1 2 3 117 Gráficos Reducción viables Tiempo -‘-C+SHN +C+SHN-i-PMN *1/2 CMI+SHN ~1/2 CMI+SHN+PMN X-4 CMI+SHN +4 CMI+SHN+PMN Figura 115.a. Cinéticasde letalidadde 5. aureuscon 1/2 y 4 CMI de cefepimeen presenciay ausencia de PMNs. 9 4 o ‘1 2 3 119 Gráficos Reducción viables ~C+SHN +C+SHN+PMN *1/2 CMI+SHN ~-1/2 CMI+SHN+PMN *4 CMI+SHN +4 CMI+SHN+PMN Figura 16.a. Cinéticasde letalidad de 5. aureus con 1/2 y 4 CMI de cefpodoximaen presenciay ausenciadePMNs. 9 0 1 2 3 121 Gráficos Reducción viables . Reducciónde 5. aureusviablesdebidoa la exposiciónde la bacteriaa cefpodoxima(1/2 y 4 CMI), PMNso ambosfactores. * Los valores, expresados en Log,0 UFC/ml, se refieren al descenso medio obtenido durante las tres horas del ensayo, en el número de viables respecto a los microorganismos control ( sin incubacióncon PMNs ni antibiótico). 122 3 2,5 2 1,5 1 0,5 o 1 DISCUSIÓN Discusión 1. ANÁLISIS DEL MÉTODO EXPERIMENTAL. El métodoexperimentalempleadoen este trabajo para el estudiodel efecto postantibióticoleucocitario, así como para el estudiode la actividadbactericidadel leucocito en presenciacontinua de antibiótico, se basa en la técnicadescritapor McDonaldy Pruul, autoresquehandefinidoel efectoPALE. No obstante,hemosrealizadoalgunasmodificacionesen la metodología,conel propósitode adecuarlos mediosde los quedisponemosconlos objetivospropuestos. Por tanto, esteanálisisde la metodologíasecentraráen aquellaspartesmásrelevantes del protocoloexperimental. 1.1. Preparacióndel ¡¡¡óculo. Iniciamosel protocoloexperimentala partirde caldo quecontienebacteriasen fasede crecimientoexponencial,preparadoa partir de una dilución de un cultivo overnight, quese incubaen medio fresco2 6 3 horas.En numerososestudiosno se sigueeste procesosino quea partir de un cultivo overnight, directamentese inicia el ensayo, tomandouna muestray diluyéndolaen el medio adecuadoparaconseguir determinadapoblaciónbacteriana.Hayestudios(128) queconfirmanquecualquierade los dosprocedimientossonválidos,porqueno sealterala sensibilidadde la bacteriaal antibiótico con el que posteriormenteserátratada. En nuestroestudio, seguimosel primer procedimientopara asegurarquela poblaciónbacterianaestuvieraen fasede crecimientoexponencialde forma uniforme, sincronizaday efectiva. El caldo bacterianosedejacrecerhastaquealcanzaunaturbidezque, medida conel espectrofotómetro,tieneun valordeabsorbancia,a580nmde luz visible, de0.3 para ~~jj y 0.25 para S. aureus,quesuponeunas108 UFC/ml. La turbidez y el númerodeUFC/ml quesuponepuedendiferir entrelos gruposde microorganismosy lospropiosaisladosdentrodeun grupo.Estasdiferenciaspuedenserdebidasal tamailo de las células bacterianas,a la presenciade dime, cápsulasy otros componentes superficiales,a la agregaciónde los organismoso a la pérdidade viabilidad celular. Todasestasinterferenciasse agravansi la turbidezsemide por métodoscomo el de McFarland(129),quesuponenunaparticipaciónactivade la subjetividaddel individuo en la medida. Paraevitarlo se utilizó el espectrofotómetroy se hicieron, durante 124 Discusión pruebasprevias,curvasde crecimientoen las quese relacionaabsorbanciaa 580 nm y númerode unidadesformadorasde coloniaspor mililitro paranuestrascepas- 1.2. Pretratamiento antimicrobiano y exposición continua de los microorganismosal antimicrobiano. 1.2.1. Pretratamientoantimicrobiano. En el estudio de las alteracionesen la interacciónentre los fagocitos y las bacterias,debidasa los efectosdel antibiótico sobreestas,es esencialquecualquier efectodel antimicrobianosobreel microorganismopuedaser distinguidode un efecto del antibióticosobrela fagocitosis.Estadistinciónpuedeser realizadapor laexposición del microorganismoal antibióticoantesde ser incubadacon los leucocitos. Se hicieron pruebasprevias para determinarqué tiempo de exposiciónal antibiótico y quéconcentracióndel mismo resultaríanadecuadaspara el ensayo.Se concluyó queun pretratamientode diez minutoserael tiempo máximorequeridopara causaralteracionesen las bacteriassin quedisminuyerael tamañodel inóculo inicial respectodel control. Valores por encimade 4 vecesla CMI reducíanigualmente,el inóculo inicial, mientrasqueestaera la máximaconcentraciónqueno resultabaletal. Por otra parte, las concentracionesde antibiótico empleadasen esteestudio, tuvieron en cuenta la recomendaciónde administrar dosis que permitan que los niveles plasmáticosdel antibióticosean4 a 10 vecesmayoresque la concentraciónmínima inhibitoria frenteal patógeno(130). Por todo ello, elegimosconcentracionesde 4xCMI de cadaantimicrobianoempleado. Tras el tratamiento, el antibiótico debe ser eliminado por dilución y centrifugación.La centrifugacióna 1.200ges un métodoempleadohabitualmentepara eliminar y separarel antimicrobiano de las bacterias aunque el descensode la temperatura,las alteracionesmecánicasy el alejamientotemporalde las bacteriasdel medio nutritivo provocan un pequeñodescensoen el número de viables (131). Sin embargo,esteesun inconvenientemenor,yaquetantolos cultivoscontroles,comolos tratados con antimicrobiano, sufren el mismo proceso. Además se verificó experimentalmente,queel númerode UFC/ml contadasen placa, correspondíana lo esperadoparael valor de la absorbancia. 125 Discusión 1.2.2. Exposicióncontinuade los microorganismosal antimicrobiano. Dos concentracionesde antibiótico, una suprainhibitoria(4xCMI, la misma concentraciónempleadaenel estudiodelefectoPALE) y otra subinhibitoria(l/2xCMD, fueron empleadasen el estudiode la actividadbactericidade leucocitosPMNs sobre bacteriasen presenciacontinuade antimicrobianos,con el propósitode compararel efectodelantimicrobianosobrela actividadleucocitariaen fasepostantibiótica,con el efecto sobre la actividad bactericida de los leucocitos en presenciacontinua de antibiótico,y por otraparte,podercompararel efectode dosconcentracionesdistintas de antimicrobianosobrela actividadde los leucocitosPMNs. Una vez preparadoel inóculo y ajustadoa 10~ UFCImI, se siguió el mismo procesode incubaciónen bañode agitacióna 37 oc durantediezminutos,dilución y posteriorcentrifugación,parapoder establecercomparacionesentre las cinéticasde crecimientoen fasepostantibióticay en presenciacontinuade antibiótico. 1.3. Extracciónde leucocitosPMNs. El método de extracción de los PMNs está basadoen la lisis de eritrocitos mediantetratamientocon cloruro amónicoy posteriorpurificaciónpor centrifugación diferencialen HBSS(124). Porestatécnicaseobtieneunaaltaconcentraciónde PMNs morfológica y funcionalmenteintactos a partir de un pequeñovolumen de sangre completa.Sepuedenobtenerhasta4x106 célulasde 1 ml de sangre,ya quela pérdida celulares menorqueen las técnicasde separaciónqueutilizan gradientesdedensidad. Además la rapidez con la cual se pueden obtenerlos polimorfos es un aspecto importante,solamenteserequieren45 minutosparala extraccióntotal de las célulasa partir de sangrecompleta. El segundo lavado de los PMNs en NH 4Cl, antesde resuspenderlosen HBSS, elimina por completo los eritrocitos presentes.Aunque la centrifugacióndiferencial no proporcionael grado de purezaque se ha atribuido a algunastécnicasde separaciónen gradientede densidad(>95%), tiene la ventajade exponera los PMNs al mínimo estímuloposible.Seha especuladosobresi el cloruro amónicopodríaalterarel balanceelectrolítico de los PMNs, sin embargosedemostró en un estudio(132), quelos efectoseranreversiblescuandolas célulasseresuspendian en medio fisiológico. 126 Discusión SerecomiendaEDTA potásicocomoanticoagulante,yaqueel citrato y la sangre heparinizadano permiten el aislamientode PMNs segúneste método con la misma eficacia.Ademásel citrato y la heparmnason estimulantesdel estallidorespiratoriode los PMNs. En los últimos años,varios autoreshan expresadosu preocupaciónacercadel posible efecto de los polinieros de gradientede densidadsobre el metabolismoo propiedadesde superficiede los PMNs. Por ejemplo,el dextranoinhibe la migración de PMNs en agarosa(133),estimulael metabolismocelular(134) y tambiénseuneen parte irreversiblementea la célula alterandola carga superficial (135). El Ficolí o Percolípuedenprovocarla pérdidade la capacidadde adherenciasobresuperficiesde plásticoo cristal (135,136). El Ficoll-Hypaquealtera la capacidadmigratoria de los granulocitosen agarosa(137) y puedeinterferir conel transportede sodiodelos PMNs (138). Otros problemasson la posible contaminaciónde algunos lotes de Ficolí- Hypaque con lipopo1isac~ridos bacterianos, que pueden alterar morfológica y funcionalmentea los PMNs aisladospor estemétodo(139), y pequeñoscambiosen el procesode manufacturaciónde los polímerosde gradientede densidad,queproducen alteracionesimportantesen laspropiedadesdeseparación(140). Aunqueesimportante considerarlos efectosde todosestosagentessobrelas funcionesde los PMNs, hayque tenerpresentequemuchosinvestigadoresempleanestos métodosde aislamientocon éxito. Por último, enfrentamosdiez bacteriaspor PMN porqueun rango de 6 a 12 microorganismospor leucocitose suelenencontraren los ensayosclínicos (141-143). 1.4. Lisis de los leucocitosy efectodel pH en las bacterias. En experimentosquerequierenla lisis de los leucocitosPMNs algunosautores utilizan el choqueosmóticoen aguadestiladaa temperaturaambiente(144) o a O o-C (145). Este método de lisis pareceser el menosnocivo para los microorganismos intracelulares,sin embargola lisis completade PMNs es difícil de alcanzar.Unabaja osmolaridadjunto con un elevadopH y temperatura,ocasionala lisis de los PMNs en orina (146). 127 Discusión Gargan et al. (126) investigaronel pH y la temperaturaóptima del agua destilada, necesariospara lisar totalmentelos PMNs. El 87% de los PMNs fueron lisadosdespuésdepermanecercinco minutosen aguadestiladaestérila 37 oc y pH 10, mientrasque a pH 11, el porcentajede lisis fue del 995%. La conclusiónde este trabajoafirma que un sistemaeficaz para lisar los PMNs sin producir dañosen las bacteriasintracelulares,esemplearaguadestiladaa un elevadopH y a 37 oc. En esteestudio, hemosllevado a cabo la lisis de PMNs, basándonosen el método de Gargan et al. El porcentajede lisis de PMNs que alcanzamoses aproximadamentedel 99%. El pH del aguadestiladafue 10.8 puestoqueestosmismos autoresadviertenquemientrasLaiairn¡z (opsonizadoy no opsonizado)mantuvosu viabilidad a valoresdepH mayoresde 11, conL~ii opsonizadosedebeprocurarun especialcuidadoparaqueel pH del aguano excedade 11, ya quees sensiblea pH superioresa 11.2. Este pH es el adecuadopara lisar los PMNs (124) sin que se perjudique la viabilidad bacteriana,como se desprendede que la cinética de las bacteriascontrol sea la esperadapara nuestrascepas. Hay estudios(128,147)que determinanquemiembrosdela familiaEnterobacteriaceae,P. aeruzinosa,estafilococos y enterococospuedenpermanecermásde seishorasen aguao soluciónsalinaantesde su inoculaciónen placasde agar sin quehayaalteración en el recuentode UFC/ml. Nosotrosprocuramossembraren menosde 15 minutos, tal y comorecomiendanlas normasdel N.C.C.L. (148). 2. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS. 2.1. Efecto PostantibiéticoLeucocitario (PALE>. 2.1.1. Efecto del pretratamiento antimicrobiano sobre la cinética de crecimiento de E.coli y 5. aureus . 2.1.1.1.Efecto del pretratamiento antimicrobiano de E. coil . La supresión del crecimiento bacterianoes el principal y más claroefecto que los antimicrobianospuedenpresentartanto in vitro como iii vivo. La supresióndel crecimientobacterianopuedeocurrir duranteun cierto tiempodespuésde la exposición de la bacteriaal antibiótico.El términoefectopostantibiótico(PAS), ha llegadoa ser el másampliamenteempleadoparadescribireste fenómeno. 128 Discusión El mecanismopreciso por el que se estableceel PAE es desconocido,pero múltiples factoresdebenestar implicados.Aunqueel término PAE fue definido para enfatizarel hechode que la previaexposiciónal fármacoes la causantedel fenómeno, otrasteoríasseinclinan a destacarel papel de lasconcentracionessubinhibitoriasdel antibiótico, al queestánexpuestaslas bacteriastras la eliminacióndel antibióticodel medio,en la presentaciónde este fenómeno.Algunos autoressugierenque el tiempo necesariopara la liberación del antibiótico de sus receptoressería el tiempo de recuperacióndel crecimientobacteriano(62),paraotrosautores,el PAEseríael tiempo de resíntesisdelasproteínasy enzimasafectadospor la accióndel fármaco(149). Otras causasposiblesque se citan son la difusión del antibiótico desdesus receptores,la modificaciónde la síntesisdel DNA, la producciónde factoresendógenosdel tipo de los quese implicanen la respuestaSOSde f..sgli, etc. (62). Losresultadosobtenidosen los últimosdiezañossobreel efectoPAE conducen a cuatro conceptosgenerales(62,150,151). 1. La actividadantimicrobiana(bactericidao bacteriostática)esun prerrequisito paraun PAE. 2. El PAE y su duración están correlacionadoscon la concentracióndel antimicrobianoy la duraciónde la exposiciónhastaunarespuestamáxima. 3. Inhibidores de la síntesis de proteínas (macrólidos, tetracicinas y aminoglicósidos)inhibidoresde RNA polimerasa(rifampina) einhibidoresde la DNA- girasa (quinolonas)presentanun PAE de largaduración frente a organismos(iram- positivosy MIC) required for efflcacy of beta-lactams in animal infection models. Abstr. 86, 178 Bibliografía p.135. ProgramAbstr. 33rd. Intersci.Conf.Antimicrob. AgentsChemother. 179 APÉNDICE Apéndice SoluciónsalinaequilibradadeHank (IIBSS): - Sin Ca2~ ni Mg2~ dNa 8 gramos ~KCl 0,4 gramos Na2HPOú2H2O 0,048 gramos KH2PO4 0,06 gramos Glucosa 1,0 gramos - Reactivos adicionales para HBSS completo Cadí2 0,14 gramos NaIHCO3 0,35 gramos MgSO4.2H20 0,16 gramos MgCl2.6H,O 0,1 gramos Gelatina al 0,1% Gelatina al 1%: 1 gramo de gelatinaen polvo (Sigma, ChemicalCompany)se disuelveen 100 ml de agua destilada estéril y se calienta al baño María para licuaría. Se guarda en nevera hasta su uso. Solución isotónica de cloruro amónico: ClNH4 4,16 gramos NaHCO3 0,42 gramos Azul tripín al 4%: El colorante azul Tripan (R.A.L. Ugine-Kuhlmann) se diluyen en 100 ml de agua destilada estéril y se mantiene a temperaturaambientehastasu uso. 181 ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD LEUCOCITARIA EN PRESENCIA Y EN FASE POSTANTIBIÓTICA DE ANTIMICROBIANOS BETALACTÁMICOS AGRADECIMIENTOS ÍNDICE ABREVIATURAS I. INTRODUCCIÓN 1. Antecedentes del tema 2. Objetivos 3. Acción de los antimicrobianos sobre los leucocitos polimorfonucleares 4. Antimicrobianos II. MATERIAL Y MÉTODOS 1. Material 2. Métodos III. RESULTADOS 1. Concentraciones mínimas inhibitorias (CMIs) 2. Estudio del efecto postantibiótico leucocitario 3. Estudio de la actividad bactericida de los leucocitos PMNs en presencia continua de antimicrobianos IV. GRÁFICOS V. DISCUSIÓN 1. Análisis del método experimental 2. Análisis de los resultados 3. Aplicación clínica de los estudios sobre la modificación de la actividad leucocitaria en fase postantibiótica y en... VI. CONCLUSIONES VII. BIBLIOGRAFÍA VIII. APÉNDICE L: `K: