UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS Departamento de Biología Celular WIU19filE11311333 5309885181* UNIVERSIDAD COMPLUTENSEg-ss-3S?4úr- 3 EL RECEPTOR AUDITIVO DE LA RATA ADULTA Y EN DESARROLLO. ESTUDIO ELECTROFISIOLÓGICO DE LESIONES NEUROTÓXICAS Y OTOTÓXICAS TESIS DOCTORAL FRANCISCO JAVIER CARRICONDO OREJANA Madrid, 2000 U SU OVr CA TI UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS Departamento de Biologia Celular EL RECEPTOR AUDITIVO DE LA RATA ADULTA Y EN DESARROLLO. ESTUDIO ELECTROFISIOLÓGICO DE LESIONES N EU ROTÓXICAS Y OTOTÓXICAS Memoria realizada para la obtención del Grado de Doctor en Ciencias Biológicas por D. Francisco Javier Carricondo Orejana Francisco Javier Madrid, 2000 FACULTAD DE MEDICINA Pabellón 5 Planta baja Teléfa.: (91)3941375 - 3941383 Telefax: (91)3941383 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID CENTRO DE CULTIVOS CELULARES (CAl.) D. PABLO GIL-LOYZAGA, Catedrático del Departamento de Cirugía II (O.R.L.) de la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense de Madrid y Director del Centro de Cultivos Celulares (C.A.l.- U.C.M.), CERTIFICA: que la memoria de investigación titulada “El receptor auditivo de la rata adulta y en desarrollo. Estudio electrofisiológico de lesiones neurotóxicas y ototóxicas” ha sido realizada, bajo mi dirección, por D. FRANCISCO JAVIER CARRICONDO OREJANA, y que dicha memoria SI reúne las características necesarias para su presentación como Tesis Doctoral. Fdo.: G¡l-Loyzaga Iv “Yo, hevisto cosasqíte vosotrosno creenau. Atacarnavesen llamasmásallá de Orzon. He visto rayosCbrillar en la oscuridad cercade la Puedade Tanhausser... Todosestosmomentosseperderánen el tiempo, comolaSrimasen la ¡liMa. Es hora de morir” BíadeRanner(P~idley Scot4 1982) A mi familia. A Elena. y AGRADECIMIENTOS Ya que el apadado de agradecimientos de cualquier memada de Tesis Doctoral es, seguramente, el más frecuentado por todos los lectores, ajenos o no a la investigación, intentaré hacer un esfuerzo mental para no olvidarme de ninguna de aquellas personas o instituciones a quienes tanto debo y sin las cuales este trabajo no hubiera sido posible. Como es de bien nacido ser agradecido y no pretendo ser menos, valga a todos ellos mi más sincero agradecimiento (Llave Correas, 1999). Durante todo este tiempo, muchas han sido las personas a las que debo gratitud por haberme ayudado y animado, de distintas maneras, para la realización de esta Memoria de Tesis Doctoral. A todos ellos está dedicado este trabajo. De todos modos, quisiera hacer un recuerdo especial para aquellas personas con las que he convivido en el laboratorio durante todos estosaños y que han compartido conmigo este periodo. Al Profesor D. Pablo Gil-Loyzaga, Catedrático de Neurobiología de la Audición de la Universidad Complutense de Madrid y Director del Centro de Cultivos Celulares (CAl-UCM). mi agradecimiento más profunda Hace seis años que entré a formar parte de su grupo de investigación y gracias a él, principalmente, esta Tesis Doctoral es, hoy, una realidad. Con él he aprendido lo que realmente es la investigación científica, a llevada a cabo con rigor y a entender los sacrificios que se deben hacer en su nombre. Tras este tiempo, espero no haber defraudado la confianza que depositó en mly que éste sea el primerpaso de un largo camino de trabajo juntos. Gracias Pablo. Al Profesor D. Joaquín Poch-Broto, Catedrático de Otorrinolaringología de la Universidad Complutense de Madrid y Jefe de Servicio de Cirugía II (ORL) del Hospital Clínico Universitario San Cadas de Madrid, todo el interés y la paciencia que ha demostrado para conmigo en las múltiples visitas que le he hecho. Sin su apoyo y confianza, buena parte de este trabajo no hubiera podido realizarse. A todos aquellos que en algún momento pasaron por el laboratorio, porque de todos ellos recibí, de una u otra manera, ayuda y amistad. De todos modos, me gustada agradecer especialmente su dedicación a aquellas personas que me han acompañado durante este último periodo. A Mariví Bartolomé la debo muchas cosas pero sobre todo su apoyo constante y su infinita paciencia para conmigo y el resto de los electrofisiólogos del laboratorio. A Angeles Ibáñez, mi géminis favorita, a la que nunca pocht agradecer, en su justa medida, sus desvelos casi matemales a los que la he sometido con mis cosas. A It Angeles Vicente, la mega de la molécula, con la que he compartido muy buenos momentos y por su paciencia porperseguirme constantemente para que no haga mido mientras trabaja. A los otorrinos Jesús San Román y Eduardo del Castillo, mis compañeros de electrofisiología y mis amigos, excepcionales desde VI el punto de vista personal y profesional y de los que he recibido constantes muestras de amistad y respeto y que me han aguantado la mayor parte del tiempo. A las “peques” Sofía Martin-Serrano, Lorena Maestre y Victoda Moneo, que consiguieron introducir en el laboratorio, desde el primer día, la frescura de una sonrisa espontánea y a las que debo su amistad y confianza, sobre todo espero haber sido acertado en la mayoría de las preguntas de los interrogatorios a los que me han sometido. A las maestras del laboratorio, las técnicos del equipo Teresa Rodríguez, Encama Muñoz, Mabel Alonso y Ana González a las que agradezco todo el esfuerzo que ha supuesto el procesamiento de mis muestras morfológicas. En concreto nunca podré agradecer suficiente los agradables momentos de la comida que he compartido con Mabel Alonso y por su paciencia por hacer las funciones de mensajería con su “marlo” Jaime. Y, por supuesto, a MS Cruz González, por ser tan buena y tan paciente conmigo. Al Dr Manuel Moro y D Pilar Melero, del Servicio de Neonatologla del Hospital Clínico Universitario San Canos de Madrid, sin cuya colaboración y su apoyo no hubiera podido llevar a cabo los trabajos que realicé con ellos. Capitulo apane me merece el Dr Julio Sanjuán Juarist¿ ex-jefe del Servicio de Fono- Audiologia del Hospital Ramón y Caja) de Madrid, por la gentil cesión de sus equipos de registro de potenciales microfónicos cocleares y por la inestimable ayuda que siempre me ha ofrecido. Su ingenio y su capacidad para la creación y el diseño de nuevos equipos son admirables y dignos de mención. Fuera del laboratorio mis amigos fueron los que me soportaron, me animaron y me ayudaron. A todos ellos mi más efusivo agradecimiento y sobre todo a César, Ana, César, Marga, Gema, Juan Caflos, Juan Cadas “pelitost RaqueL Rafa, Ros¿ Pedro, Belén, Patricia, Marian, Imanol y un largo etc. que espero que me perdonen por no poder personalizar desde aquí a cada uno de ellos mi gratitud. También quiero agradecer a Jesús y a Enrique, mis astrónomos preferidos, el haberme enseñado que a millones de años luz de aquí también existen cosas maravillosas que merece la pena observar A mi familia, mis padres y mi hermana, sin cuyo apoyo no hubiera podido llegar hasta aquí, ya que siempre han respetado mis decisiones y las han aceptado con grandes dosis de cariño y comprensión. A Elena Rodrigo, mi compañera, mi amiga. mi faro, mi norte y mi guía, para la que mi agradecimiento no tiene límite. Sólo ella sabe todo lo que esto significa para mi y a ella va dedicado este trabajo con todo mi cariño. Y como no, un recuerdo especial para todos los animales de laboratorio. Su sacrificio permite los avances científicos. Vaya desde aquí un llamamiento a la ática en su uso en investigación y al respeto hacia estas criaturas, que no siempre se consideran como lo que son, seres vivos. VII Financiación del trabajo Los experimentos incluidos en esta Memoria de Tesis Doctoral han sido financiados por el proyecto F.l.S. 9810732. VIII Abreviaturas Descarboxilasa de aminoácidos aromáticos. Acetil colina. Acído kafnico. a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propionato. Análisis de la varianza. Adenosin trifosfofato. Bel. Factor neurotrófico derivado del cerebro. Conducto auditivo externo. Célula ciliada externa. Célula ciliada interna. Péptido relacionado con el Colin-acetil transferasa. Contingente de variación negativa. Dopamina. Acido D-2-amino-5-fosfonopentanoico. decibelio. Dopamina-~hidroxilasa. Diltiazem. 6-7-dinitroquinoxalin-2-3-diona. Acido 3,4-dihidroxifenilacético. Acido y amino butírico. Descarboxilasa de ácido glutámico. Glutamato. Glutamato monosódico. Nivel humano. Cromatografía líquida de Serotonina. Acido homovanílico. Hertzio. Acido iboténico. inositol 1 4,5-trifosfato. Kanamicina. Núcleo coclear anteroventral Núcleo coclear dorsal. Núcleo coclear posteroventral. N-metil-D-aspartato. Potencial de acción compuesto. Potencial microfónico coclear. Día postnatal. Feniletanolamina N-metiltransferasa. Nivel de presión sonora. Tírosína hídroxilasa. gen de la calcitonina. alta resolución. AAD: ACM: AK: AMPA: ANOVA: ATP: BDNF: CAE: CCE: CCI: CGRP: ChAT: CVN: DA: D-AP-5: dB: DBH: DIL: DNQX: DOPAC: GABA: GAD: GLU: GMS: ML: HP LC: 5-MT: MVA: Hz: IBO: IP3: KANA: NCAV: NOD: NCPV: NMDA: PAC: PMC: PND: PNMT: SPL: TM: DC INDICE x INTRODUCCIÓN 1 Generalidades 3 Filogenia del receptor auditivo 6 Anatomía y fisiología del receptor auditivo de los mamíferos euterios 20 Oído externo 20 Oído medio 22 Oído interno 26 - Morfología de la cóclea 26 - El órgano de Corti 29 - Células neurosensoriales del órgano de Corti 30 a) Céluias ciliadas internas (CCIs) 31 b) Células ciliadas externas Inervación coclear simpática 38 - Neurotransmisores del receptor auditivo 41 a) Neurotransmisores del sistema aferente coclear 41 a.1) Sistema CCI - fibra aferente de tipo 1 41 a.2) Sistema CCE - fibra aferente de tipo II 44 b) Neurotransmisores del sistema eferente coclear. 44 b.1) Acetílcolina (ACh) 45 b.2) Acido y-amino butírico (GABA) 45 b.3) Dopamina (DA) 46 b.4) Serotonina (5HT) 47 b.5) Péptidos opioides 48 b.6) Péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) 49 XI - Fisiología coclear 49 a) Potencial endococlear 50 b) Mecánica coclear 51 c) La transducción del sonido a mensaje neural 55 d) Electrofisiología auditiva 59 e) Ontogenia funcional auditiva 64 Patolog las cocleares 67 a) Neurotoxicidad en el receptor auditivo. Fisiopatología de las sinapsis glutamatérgicas 68 b) Ototoxicidad inducida por antibióticos aminoglicósidos 75 JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO 77 MATERIAL Y METODOS 80 Protocolo de neurotoxicidad 82 a) Diseño experimental 82 b) Tratamientos 83 c) Estudio electrofisiológico 83 d) Estudio morfológico 85 Protocolo de ototoxicidad 86 a) Neurotoxicidad en la rata adulta 87 b) Ototoxícidad en la rata adulta 88 c) Ototoxicidad en la rata en desarrollo 88 d) Registro del potencial microfónico coclear 89 RESULTADOS 95 Neurotoxicidad en el receptor auditivo 96 a) Período del 20 al 50 día postnatal 96 b> Período del 60 al 90 día postnatal 103 c) Período del 90 al 120 día postnatal 108 d) Período del 150 al 180 día postnatal 113 e) Período del 300 al 330 día postnatal 118 XII Ototoxicidad en el desarrollo del receptor auditivo 123 a) Neurotoxicidad en la rata adulta 123 b) Ototoxicidad en la rata adulta 127 c) Ototoxicidad en la rata en desarrollo 130 DISCUSION 135 1. Neuratoxicidad en el receptor auditivo 136 a) Análisis de las alteraciones cocleares de etiología neu rotóxica 136 b) Análisis comparado de los efectos de la neurotoxicidad inducida por la administración de GMS a lo largo del desarrollo coclear 143 c) Análisis de los efectos protectores del tratamiento con diltiazem frente a la neurotoxicidad inducida por GMS en el desarrollo coclear 150 II. Ototoxicidad en el receptor auditivo 156 a) Análisis de los efectos de la neurotoxicidad sobre el PMC y el PAC del nervio auditivo en ratas adultas 156 b> Análisis de los efectos sobre el PMC del tratamiento con kanamicina enel receptor auditivo de la rata adulta 158 c) Análisis de los efectos de la administración de KANA en el desarrollo del receptor auditivo 159 III: Neurotoxicidad y ototoxicidad 162 CONCLUSIONES 164 BIBLIOGRAFíA 167 iNTRODUCCIÓN 2 La supervivencia de cualquier forma de vida depende del análisis de información procedente del exterior. Esta capacidad posibilita al organismo para la detección de cambios ambientales en su hábitat y, a su vez, para establecer las relaciones intraespecíficas einterespecíficas necesarias para la supervivencia del individuo. Es por ello que los elementos encargados de recibir, analizar e interpretar esta gran cantidad de información, los órganos de los sentidos, son determinantes para la selección natural. Este proceso, a lo largo de la historia natural, ha hecho que se seleccionen aquellos organismos que más y mejor reciban e interpreten esas señales externas, induciendo el desarrollo y la evolución de órganos receptores más o menos especializados en la captación y análisis de determinadas señales, según los requerimientos específicos de cada especie. La necesidad de recopilar la información derivada de una de estas señales, las vibraciones de las moléculas del medio externo, hace que, evolutivamente, aparezcan diferentes órganos que facilitan la captación de estos pequeños cambios de presión. Entre ellos está el receptor auditivo y otros órganos filogénicamente no homólogos pero si análogos en su funcionalidad receptora, como son el órgano de Johnston y los órganos timpánicos de los artrópodos y los órganos de la línea lateral de la mayoría de los vertebrados acuáticos. El receptor auditivo como tal, filogénicamente, aparece en los vertebrados acuáticos a partir del órgano vestibular y alcanza su mayor expresión morfológica y funcional en los vertebrados terrestres, particularmente en los mamíferos euterios. En éstos, la audición juega un papel fundamental para la vida del individuo en la localización, defensa, orientación espacial y en la comunicación intra e interespecífica. En el hombre, esta capacidad de comunicación ha dado lugar al lenguaje y con él al desarrollo y evolución de las diversas culturas históricas. 3 EL RECEPTOR AUDITIVO Generalidades La audición es la propiedad de captar e interpretar las vibraciones moleculares del media externo (Gil-Layzaga y Pujol, 1999). Estas vibraciones de las moléculas del medio constituyen las ondas de presión u ondas sonoras que se caracterizan mediante el uso de dos variables, la frecuencia (ciclos/sg o hertzios, Hz) y la intensidad . Adaptado de Tellería (1991). En la línea evolutiva del filo Chordata, al que pertenecen los vertebrados, las primeras evidencias de la existencia de un órgano laberíntico se encuentran en fósiles de los ostracodermos (Cl. Pterasp¡domorph9, los primitivos agnatos o peces sin mandíbula, en los que ya se puede observar un laberinto con dos canales semicirculares bien definidos (Stensio, 1927). En los cordados evolutivamente más antiguos, tunicados y cefalocordados, no se han encontrado signos de presencia del órgano vestibular (Baird, 1976). Esta primitiva estructura vestibular de los ostracodermos se puede observar en los agnatos actuales, lampreas . Los peces óseos ya cuentan con una cápsula ática osificada con el utrículo, sáculo y lagena más diferenciados (Doménech y Vilas, 1992). La distribución del laberinto vestibular es parecida en todos los grupos de osteictios, mientras que la organización del utrículo, sáculo y lagena es más variable. El utrículo es básicamente tubular con una pequeña depresión anteroventral donde se aloja la mácula utricular recubierta por una membrana otolitica, en la que se insertan los cilios de las células sensoriales, y un otolito. Las máculas sacular y lagenar quedan totalmente independizadas al igual que sus otolitos . El último paso en la evolución del receptor auditivo se encuentra en los mamíferos. Procedentes de los reptiles de la Subclase Synapsida, uno de los grupos de reptiles más arcaicos y diferenciados, evolucionaron independientemente hasta el Jurásico. En este intervalo estuvieron representados por el O. Pelycosauria primero y, después, por el O. Therapsida, del que evolucionaron directamente los mamíferos. Los terápsidos tenían rasgos típicamente reptilianos, pero también poseían determinados caracteres 18 mamalianos. Así, tenían dentición heterodonta y un paladar secundario desarrollado. Incluso es posible que poseyeran pelo y fueran endotermos. Por otro lado, carecían de zona lumbar en la columna vertebral, por lo que eran incapaces de correr flexionando su columna vertebral en el plano sagital, como los mamíferos actuales, tenían una mandíbula inferior formada por varias piezas y, en cuanto al aparato auditivo, su oído medio constaba de una sóla pieza, la columnilla, al participar los huesos articular y cuadrado, futuros martillo y yunque mamalianos, en la articulación mandibular. El desarrollo de un eficiente aparato masticador, un paladar secundario, el viviparismo y el consiguiente desarrollo de las glándulas mamarias, son algunos de los rasgos que permitieron al grupo extenderse y diversificarse en el Terciario tan pronto como desaparecieron una buena parte de los reptiles del Secundario (Tellerla, 1991). Los mamíferos constituyen un grupo no excesivamente diversificado, pese a sus indudables logros evolutivos. Esto es tal vez debido a los importantes requerimientos energéticos de la endotermia, lo que deja sitio, en los ecosistemas más pobres, para otros vertebrados metabólicamente menos exigentes. Así, la Cl. Mammalla se subdivide en dos grandes grupos: la Subcl. Protother¡a representada por el O. Monotomate . Se trata de una estructura compuesta de colágeno, glicoproteinas y glicosaminglicanos (Gil-Loyzaga y cols., 1985 a y b; 1990; 1991; 1997 a; Khalkhali-Ellis y cols., 1987), que va variando en anchura a lo largo de la espiral coclear aumentando progresivamente desde la base hasta el ápex coclear. Presenta una estructura fibrilar con regiones delimitadas y en su cara basal se anclan los estereocilios de las células ciliadas. Su papel funcional se relaciona con la producción de desplazamientos en los cilios de las células sensoriales y, por lo tanto, con la iniciación de la transducción mecanoeléctrica de la señal sonora, además de constituir un reservorio iónico, sobre todo de K+, en equilibrio con la endolinfa Células ciliadas internas (CCIs> Aunque ambos tipos de células ciliadas tienen características neurosensoriales, son las células ciliadas internas Células ciliadas externas son también células neurosensoriales pero difieren en su cometido funcional de las CCIs, relacionándose con la modulación en la micromecánica coclear. Se disponen en tres hileras a lo largo de toda la espiral coclear variando su tamaño e incrementándolo progresivamente, desde la base, donde son células pequeñas de tamaño similar a las CCIs, hasta el ápex coclear, donde pueden llegar a medir el doble que las CCIs (Gil-Loyzaga y Pujol, 1999). Los estereocilios de estas células se disponen formando ángulos, en forma de ‘y” con el vértice orientado hacia la estría vascular . Las proyecciones entre el tálamo y la corteza 38 son recíprocas y establecen relaciones homólogas en ambas direcciones (Ramón y Cajal, 1909; Diamond y cols., 1969; Oliver y Hall, 1978 b). El tracto córtico-colicular se origina en el área cortical auditiva primaria y termina bilateralmente en la corteza de ambos colículos inferiores. La corteza auditiva también envía fibras al colículo superior, procedentes de regiones periféricas del área primaria. Ambos colículos envían fibras al núcleo pontino dorsolateral a través del tracto tectopontino (Rasmussen, 1964; van Noort, 1969; Diamond y cols., 1969; Jones y cols., 1976; Oliver y Hall, 1978 a y b; Thompson, 1978). La proyección colículo-olivar, preferentemente ipsilateral, termina en los núcleos periolivares (Saldaña, 1989), donde contactan los axones ascendentes de las neuronas octopus (Warr, 1969) estableciendo una interacción entre las vías ascendente y descendente. La proyección colicular sobre los núcleos cocleares es bilateral, de manera que las fibras terminan en la región dorsal de dichos núcleos de manera constante, simétrica y con organización tonotópica y, sobre todo, en el área de dominio de los granos (Saldaña, 1989; Gil-Loyzaga y Poch-Broto, 2000 a; Gil-Loyzaga y Pujol, 1992; 1999). Los núcleos periolivares del complejo olivar superior contienen las neuronas cuyos axones forman el haz olivococlear descendente, y alcanzan la cóclea inervando las CCEs y las dendritas de tipo 1 bajo las CCIs Inervación coclear simpática La inervación simpática coclear puede provenir del ganglio cervical superior o del ganglio estrellado u - o‘uNf 4 - oooo - ocooo -cacaNo-Ja, tocacao-acaoo - cl>oE130u,2?ou,E(oeca5-4 -, o5 -a,e(6oa,caEa,o - u>w‘uu -o>~1Z 0-5eL . o‘a - ‘ucdN4 •< w<3 e <3 UEo4 -ci> u, (3w(3(3 0 2 E e ¡ C o ’- e N 1~ (3 u 1-s U — E S 0 =0 41 - Neurotransmisores del receotor auditivo Se han identificado gran número de sustancias neuroactivas, neurotransmisores y neuromoduladores, en el receptor auditivo de los mamíferos. Todas ellas, con funcionalidad más o menos conocida, participan de manera conjunta en la fisiología coclear, tanto en la transmisión del mensaje auditivo al sistema nervioso central, como en el mantenimiento de un estado de recepción óptima del sistema y en la defensa del mismo frente a situaciones patológicas que podrían dañar irreversiblemente al receptor auditivo. La gran complejidad inherente al sistema de neurotransmisión auditiva hace que para simplificar su estudio se separe la vía aferente de la eferente, sin olvidar que todo ello forma un conjunto funcional indivisible (Fig. 8). a) Neurotransmisores del sistema aferente coclear. Estos neurotransmisores son los implicados en las sinapsis entre las células ciliadas, CCIs y CCEs, y las neuronas aferentes del ganglio espiral coclear. Permiten el envío del mensaje auditivo, recogido por las células sensoriales, del sistema al sistema nervioso central. El sistema aferente de neurotransmisión se puede dividir en dos subsistemas: - CCI y fibra aferente de tipo 1. - CCE y fibra aferente de tipo II. a.1> Sistema CCI - fibra aferente de tipo 1 El glutamato Se ha demostrado por métodos bioquímicos la presencia de ACh Mido y-amino butírico (GABA> La primera evidencia de la presencia de GABA en la cóclea partió de estudios bioquímicos con HPLC (Drescher y cols., 1983), en los que se detectó la liberación del neurotransmisor a la perilinfa coclear, mediante estimulación sonora, por lo que podría resultar de una activación de mecanismos sinápticos La transducción del sonido a mensaje neumí El estímulo sonoro llega a la cóclea produciendo un desplazamiento de la membrana basilar desde la base hasta el ápex. Este desplazamiento provoca la elevación del órgano de Corti hacia la membrana tectoria, haciendo que los estereocilios de las células ciliadas se flexionen Electrofisiología auditiva Cada uno de los procesos implicados en la transducción mecano- eléctrica coclear y en la transmisión del mensaje neural producen cambios en los potenciales celulares que pueden ser registrados mediante técnicas electrofisiológicas. En la cóclea se distinguen dos tipos de potenciales, potencial estático, que es un potencial que no se ve afectado por el mensaje auditivo, es el 60 potencial endococlear, y los potenciales dinámicos, que son aquellos que se generan tras la estimulación sonora. Los potenciales dinámicos dependerán del método de registro y del estímulo utilizado. Según esto tenemos diferentes tipos: - Potencial de sumación: Descrito inicialmente por Davis en 1958, se trata de un potencial muy complejo y que se presenta temporalmente coincidiendo con el potencial microfónico coclear y el potencial de acción compuesto del nervio auditivo. Consiste en una alteración de la línea base de potencial, positiva o negativa, que parece envolver la señal registrada. No se conoce su origen aunque parece estar relacionado con las CCEs : Se trata de un potencial que reproduce, en frecuencia y amplitud, el sonido que lo genera (Sohmer y Pratt, 1976). Es el primer potencial que se produce tras la estimulación acústica y su intensidad es menor que la intensidad del potencial de acción compuesto coclear . Se registra mediante la técnica de electrococleografía y corresponde a la señal que se obtiene en los primeros 5 ms posteriores a la estimulación, que se realiza con clicks. Consta de dos ondas negativas, Nl y N2, cuya amplitud aumenta a medida que aumenta el estímulo, es decir, a medida que va aumentando el número de unidades neurales aferentes que crean un potencial unitario para formar el PAC ‘— 4 fi) 4 -’.’-. O ce U‘u - o “O -~ t -~.~ Q J -u - u ge cl) eca (3 -4 -. ce -4-’ O (1) ceu‘cuí> — — eO re - ¡-4 ,flca ¡-4 c~ ‘4-4 11 U ) O) ti) ca u ‘-4 , O (u kca4 “e u U) o O e S O .b o O u AL rd r# r ‘7 U 64 Todos ellos se han utilizado en investigación e, incluso, se han llegado a aplicar en clínica para determinaciones objetivas de umbral auditivo o en la determinación de alteraciones en la vía auditiva (Fig. 13). Actualmente, los más utilizados son los potenciales evocados auditivos de tronco cerebral. - Potenciales evocados auditivos de tronco cerebral: Representan la actividad bioeléctrica sincrónica de la vía auditiva en los 10 ms posteriores a la estimulación sonora (Fig. 12). Son los más utilizados ya que son muy constantes en el tiempo y en distintos pacientes (Alíen y Starr, 1978). Es un potencial de campo por lo que su registro se realiza con electrodos de superficie colocados en ambas mastoides y en vertex. Está compuesto, en la rata, por cinco ondas principales (Shaw, 1987) cuyo origen parece ser: - Onda 1: Actividad del nervio auditivo. - Onda II: Actividad de los núcleos cocleares. - Onda III: Actividad del complejo olivar superior. - Onda IV: Actividad del núcleo del lemnisco lateral. - Onda V: Actividad del coliculo inferior. El lugar de generación de las dos primeras ondas es aceptado por la mayoría de los autores, sin embargo, existen muchas discrepancias con respecto a las demás. A ello se une que estos potenciales dependen de muchos factores como los filtros utilizados, tipo de estímulo y su tasa de repetición, situación e impedancia de los electrodos, etc. (López Moya, 1992). e> Ontogenia funcional auditiva El sistema auditivo periférico de muchos mamíferos no termina de desarrollarse hasta varios días o semanas después del nacimiento (Walsh y McGee, 1986). 65 Tanto el oído externo como el oído medio determinan la llegada de sonidos al oído interno, por lo que hasta que no se desarrollan no hay llegada de un estimulo efectivo a la cóclea (Simón, 1995). La cóclea inmadura se caracteriza por un mayor grosor de la membrana basilar, rigidez mecánica, volumen reducido de las rampas, presencia del árgano de KOlliker e inervación inmadura , estableciéndose los contactos sinápticos en las CCIs antes que en las CCEs (Pujol y cols., 1978; Lenoiry cols., 1980 a y b). Las células del ganglio espiral maduran durante la primera semana postnatal comenzando por la base y terminando por el ápex (Schwartz y cols., 1983; Romand y Romand, 1984), al igual que la mielinización de las fibras (Romand y cols., 1980; Romand y Romand, 1984). La mielinización de las fibras no parece influir, de manera significativa, en el desarrollo de los potenciales auditivos cuando se compara la latencia y la amplitud de la onda 1 del potencial evocado de tronco cerebral con el grado de mielinización Estudio morfológico Tras el estudio electrofisiológico se llevó a cabo la fijación del tejido coclear para realizar el estudio morfológico. Para ello y bajo anestesia profunda se sacrificó el animal y se extrajeron ambas cócleas, que fueron perfundidas perilinfáticamente con una solución de fijación de glutaraldehido al 2.5% en tampón fosfato 0.1 M, pH 7.4. Tras una postfijación en el mismo fijador de 2 horas a temperatura ambiente, se comenzó el proceso de decalcificación en una solución de ácido ascórbico al 1% en NaCí al 0.9%, tras el cual las cócleas se postfijaron en 0s04 y se incluyeron en Spurr. A partir de aquí se realizó el seccionamiento de la muestra en cortes de 1 jim de espesor en un ultramicrotomo (LKB Bromma 86 8800-111 Ultratome). Las secciones fueron teñidas en azul de Richardson y estudiadas y fotografiadas en un microscopio óptico (Leica Leitz DMRB). PROTOCOLO DE OTOTOXICIDAD Este protocolo se diseñó para el estudio del comportamiento del potencial de microfónico coclear (PMC) y del potencial de acción compuesto del nervio coclear (PAC), frente a la neurotoxicidad inducida por un agonista glutamatérgico, en este caso el ácido kaínico (AK), y frente a la ototoxicidad inducida por la administración de un antibiótico aminoglucósido, la kanamicina (KANA). En este último caso, se realizaron dos experimentos independientes, uno para el estudio de la ototoxicidad en la rata adulta y otro para el estudio de los períodos más sensibles a la ototoxicidad en el desarrollo del receptor auditivo (Carricondo y cols., 2000). Para la realización de los tres experimentos incluidos en este protocolo se usaron en total 31 ratas de la cepa Long-Evans distribuidas en los siguientes grupos de tratamiento Periodo de tratamiento. Días postnatales 10-13 10-20. Adulto-Ú Y-~ AK 4 • KANA. 6 6 5 CONTROL 10 A continuación se desglosarán los materiales y métodos utilizados en cada uno de estos tres experimentos. 87 a) Neurotoxicidad coclear en la rata adulta En este experimento se evaluaron los efectos sobre el PMC y el PAC producidos por la administración de AK, para lo cual se designaron los siguientes grupos de estudio: - Grupo AK: 4 ratas que recibieron una inyección intraperitoneal (5 mg/Kg) de AK (Sigma). - Grupo control: El grupo control utilizado en este caso para la valoración de los datos del PAC fue el mismo que el utilizado en el protocolo de neurotoxicidad explicado anteriormente Los animales fueron anestesiados con una solución de hidrato de cloral al 8% en agua destilada, tras lo cual se llevó a cabo el registro electrofisiológico del PMC y del PAC en la cámara anecoica 4150 100 50 0 300 250 200 >4íso 100 50 O 20 30 40 60 80 70 80 90 100 de 20 30 40 50 60 70 80 90 lOO dB Amplitud Nl 12 KHz 350 300 250 200 isa 100 50 0 400 350 300 250 >4200 150 100 50 o 250 200 150 100 50 o 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dR Amplitud Nl 8 KHz 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dR Amplitud Nl 4 KHz400 350 300 250 >oo 150 100 50 O 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dR 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dR Figura 18 101 Figura 19: Imágenes a microscopia óptica de la cóclea de un animal tratado con GMS en los días 2 al 5 postnatal. a) Espira media coclear; b) Detalle del órgano de Corti, en el que se pueden observan algunos edemas dendríticos en la base de la CCI (flecha negra); c) Detalle del ganglio espiral coclear en el que se observan los núcleos de las fibras aferentes de tipo 1 (estrellas). CCEs: células ciliadas externas; CCL célula ciliada interna; GE: ganglio espiral; MT: membrana tectoria; OC: órgano de Cortí 102 — Figura 20: Imágenes a microscopia óptica de la cóclea de un animal tratado con DIL+GMS en los días 2 al 5 postnatal. a) Espira media coclear; b) Detalle del árgano de Corti; c) Detalle del ganglio espiral coclear en el que se observan los núcleos de las fibras aferentes de tipo 1 (estrellas) y algunos huecos de fibras muertas Periodo del 60 al 90 día postnatal. Los efectos de la administración del neurotóxico GMS en la producción del PAC fueron, en general, de mayor calibre que los observados en los estudios referentes al anterior periodo, es decir, del 20 al 50 día postnatal. Así, la latencia de la onda Nl del PAC del nervio coclear 450 100 50 o 300 250 200 >4150 100 50 O 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dB Amplitud Nl 16 KHz 20 30 40 50 60 70 80 90 lOO dE Amplitud Nl 12 KHz 350 300 250 200 150 100 50 O 400 350 300 250 >4200 150 100 50 o 250 200 150 100 so o 20 30 40 50 80 70 60 90 100 dB Amplitud Nl 8 KHz 20 30 40 50 60 70 60 90 100 dB Amplitud Nl 4 KHz400 - 350 300 250 >4200 150- 100- 50 - O 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dB Figura 22 106 Figura 23: Imágenes a microscopia óptica de la cóclea de un animal tratado con GMS en los días 6 al 9 postnatal. a> Espira media codear; b) Detalle del órgano de Cortí, en el que se pueden observan edemas dendríticos en la base de la CCI (flecha negra>; c) Detalle del ganglio espiral coclear en el que se observan las fibras aferentes de tipo 1 (estrellas) y los huecos dejados por las fibras desaparecidas (flechas). CCEs: células ciliadas externas; CCL célula ciliada interna; GE: ganglio espirat OC: órgano de Cadí 107 Figura 24: Imágenes a microscopia óptica de la cóclea de un animal tratado con DIL+GMS en los días 6 al 9 postnatal. a) Espira media coclear; b) Detalle del órgano de Corti; c) Detalle del ganglio espiral coclear en el que se observan las fibras aferentes de tipo 1 (estrellas) y algunos huecos dejados por fibras muertas (flechas). CCEs: células ciliadas externas; CCL célula ciliada interna; GE: ganglio espirat OC: órgano de Cadi. ‘os c) Período del 90 al 120 día postnatal. Electrofisiológicamente y morfológicamente, la administración de GMS en este periodo produjo alteraciones similares a las encontradas en los animales tratados en el período del 60 al 90 día postnatal. La latencia de la onda Nl del PAC del VIII par (Fig. 25) se vió afectada por el tratamiento con el neurotóxico, de manera que incrementó sus valores respecto a los valores obtenidos del grupo control en todas las frecuencias de estudio. En este caso, la preadministración de DIL a la del GMS, remedó de alguna manera algunos de los datos de latencia del grupo GMS, consiguiendo diminuir discretamente los valores de latencia acercándolos a los del grupo control. La amplitud de la onda Nl del PAC también se mostró muy alterada por el tratamiento con GMS en este periodo . 109 Período 9-12 pnd. Latencia de Nl del PAC Latencia Nl 22 KHz 20 30 40 50 80 70 80 90 100 dE CONTROL -u—GMS9-12 PND —a-- DIL+GMS 9-12 PND 1,9- 1.7 - 1.5 - ¡1.3 - 1.1 — 0,9 - 0,7 20 1,9- 1,7- 1,5- 1,1 - 0.9 - 0.7 20 2.5 2,3 2,1 1,9 1,7 u E 15i~; 1 Latenc¡a NI 18 KHz 30 40 50 60 70 80 90 100 dB Latencla Nl 16 KHz 30 40 50 60 70 80 90 100 dB Latencla Nl 12 KHz 1.9 - 1,7- 1,5- ¡1,3 - 1,1 — 0,9 - 0,7 20 1,7 1,6 1,5 1,4 T 1,3 ¡1,2 1.1 0,9 0,8 0,7 20 2,1 1,9 1,7 1,5 u E 1,3 1,1 0.9 0,7 30 40 50 80 70 80 90 100 dB Latencla Nl 8 KHz 30 40 50 70 80 90 100 Latencia Nl 4 KHz 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dR Figura 25 110 Período 9-12 pnd. Amplitud de Nl del PAC 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dR —e--CONTROL -u-GMS9-12 PHD —a— DIL+GMS 9-12 PND Amplitud Nl 18 KHz 20 30 40 50 80 70 80 90 100 dR Amplitud Nl 18 KHz 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dR Amplitud Nl 12 KHz 300 250 200 >450 100 50 O 300 250 200 >4150 100 50 O 400 350 300 250 >400 150 100 50 o 350 300 250 200 150 100 50 o 400 350 300 250 ~400 150 100 50 o 250 200 150 100 50 o 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dR Amplitud Nl 8 KHz 20 30 40 50 60 70 80 90 lOO de Amplitud Nl 4 KHz 20 so 40 50 60 70 80 90 100 dR Figura 26 III Figura 27: Imágenes a microscopia óptica de la cóclea de un animal tratado con GMS en los días 9 al 12 postnatal. a> Espira media coclear; b> Detalle del órgano de Corti; c) Detalle del ganglio espiral coclear en el que se observan los huecos dejados por las fibras aferentes desaparecidas (flechas>. CCEs: células ciliadas externas; CCL celula9 ciliada interna; GE: ganglio espiral; OC: órgano de Cadi. ~ Y ¡¡2 Figura 28: Imágenes a microscopia óptica de la cóclea de un animal tratado con DIL+GMS en los días 9 al 12 postnatal. a) Espira media coclear; b> Detalle del órgano de Corti; e) Detalle del ganglio espiral coclear en el que se observan las fibras aferentes de tipo 1 (estrellas) y huecos dejados por fibras muertas , se observa que las alteraciones del ganglio espiral, aun siendo menores que en grupos precedentes, todavía significan una pérdida significativa del número de neuronas en el ganglio (Fig. 31 c). La preadministración de DIL indujo una protección, aunque no total, de las neuronas del ganglio espiral, observándose todavía un pequeño número de neuronas perdidas (Fig. 32). 114 Período 15-18 pnd. Latencia de Nl del PAC Latencia Nl 22 KHz 1.7 1.6 1.5 1,4 1,3 ¡1,2 1,1 - 1- 0.9 - 0,8 - 0,7 1,7- 1.6 - 1.5 - 1.4 - 1,3- ¡1.2- 1.1 — 1— 0.9 - 0,8 - 0,7 2,3 2.1 1.9 - 1,7- ¡1.5. 1.3 - 1,1 - 0.9 - 0,7 20 30 40 50 80 70 80 90 100 Latencia Nl 18KHz Latencla Nl 12 KHz Latencla Nl 4 KHz CONTROL —u---GMS 15-18 PND —a--- DIL+GMS 15-18 PND 1.9- 1,7 -- 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dR 1.5 - 1,1 0,9- 0,7 1,9 1.7 1,5 ¡1.3 1,1 0,9 0.7 1,9 1,7 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dR 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dB Latencia Nl 8 KHz 20 30 40 50 60 70 80 90 lOO dR 1.5-- ¡1,3-- 1,1 0,9 -- 0.7 dR 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dR Figura 29 115 Período 15-18 pnd. Amplitud de Nl del PAC --e—CONTROL -u---GMS 15-I8PND -a— DIL+GMS 15-18 PND 300 250 200 ‘aso 100 50 o Amplitud Nl 18 KHz 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dB Amplitud Nl 16 KHz 20 30 40 50 60 70 80 90 100 O Amplitud Nl 12 KHz300 - - 250-- 200-- >4iso - - 100- 50 - 0-> 20 350 300 250 200 150 100 so o 400 350 300 250 ~00 150 100 50 o 250 200 150 100 50 o 30 40 50 60 70 80 96 100 dB Amplitud Nl 8 KHz 20 30 40 50 60 70 80 90 lOO dE Amplitud Nl 4 KHz400 350 300 250 >4200 150 100 50 o 20 30 40 50 60 70 80 90 lOO dE 20 30 40 so 60 70 80 90 100 dB Figura 30 116 Figura 31: Imágenes a microscopia óptica de la cóclea de un animal tratado con GMS en los dias 15 al 18 postnatal. a> Espira media coclear; b) Detalle del órgano de Corti; c> Detalle del ganglio espiral coclear en el que se observan los huecas dejados por las fibras aferentes desaparec¡das (flechas>. CCEs: células ciliadas externas; CCI: célula ciliada interna; GE: ganglio espiral; OC: órgano de Corti. 117 Figura 32: Imágenes a microscopia óptica de la cóclea de un animal tratado con DIL+GMS en los días 15 al 18 postnatal. a> Espira media coclear; b> Detalle del órgano de Corti; c> Detalle del ganglio espiral coclear en el que prácticamente no se observan huecos de fibras muertas y desaparecidas. CCEs: células ciliadas externas; CCL célula ciliada interna; GE: ganglio espiral; OC: órgano de Cortí 118 e) Periodo del 300 al 330 día postnatal. Los efectos morfológicos y electrofisiológicos del tratamiento con GMS en este periodo fueron menores que en los grupos precedentes. La latencia de la onda Nl del PAC del nervio coclear apenas se vió afectada por el tratamiento con el neurotóxico (Fig. 33) comparando los valores obtenidos en este grupo con los del grupo control. De la misma manera, la preadministración de DIL a la administración de GMS tampoco produjo alteraciones significativas en el comportamiento de la latencia de la onda Nl del PAC respecto a los valores obtenidos en los otros dos grupos de estudio, control y GMS. En cuanto a los resultados de la amplitud de la onda Nl del PAC del VIII par (Fig. 34), se observaron disminuciones significativas de la amplitud en los animales tratados con GMS, respecto a los valores del grupo control. Estas disminuciones de la amplitud solo fueron aparentes en estimulaciones de media y alta intensidad, en las frecuencias de estímulo 22, 18, 16, y 12 KHz mientras que en las frecuencia más graves de estimulación, 8 y 4 KHz, no se observan estas variaciones. El pretratamiento con DIL corrige estos valores llevándolos incluso, en algunos casos, por encima de los valores medios obtenidos en el grupo control. En las imágenes de microscopia se observaron pequeñas muestras de las alteraciones producidas por el GMS (Fig. 35), de manera que se detectó un pequeño número de huecos en el ganglio espiral dejados por neuronas muertas (Pig. 35 c). El tratamiento con DIL (Fig. 36) corrigió esta situación devolviendo al receptor auditivo a su estado normal. 119 Período 30-33 pnd. Latencia de Nl del PAC Latencla Nl 22 KHz Latencia Nl 16 KHz 1.7 1,5 1,5 1,4 - 1,3 1.2 1,1 1- 0,9 - 0,8 0,7 1,6 -- 1,5 - 1.4 - 1,3- 1,2- e E 1,1 1• 0,9 0.8 - 0.7 Latencia Nl 18 KHz Latencia Nl 12 KHz 20 30 40 50 *2 70 80 90 lOO 2,3-- 2,1 -- 1,9-- 1.7-- ¡1.s 1,3-- 1,1 -- 0,9-- 0,7 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Latencia Nl 4 KHz dB —e—CONTROL -u-- GMS 30-33 PND -~— DIL+GMS 30-33 PND 1,9 -r 171 15> 1,1 -— 0,9-- 0,7 20 30 40 50 70 80 90 100 20 30 40 50 5 70 80 90 100 19‘1 1,7- 1,1 -— 0,9-- 0,7 Latencia Nl 8 KHz 20 30 40 50 60 70 80 90 lOO dE 1,9-- 1,7 -- 1,5-- ¡1,3-- 1,1 -- 0,9 -- 0,7 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dB Figura 33 120 Período 30-33 pnd. Amplitud de Nl del PAC Amplitud Nl 18KHz 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dE Amplitud Nl 12KHz -.—CONTROL -u— GMS 30-33 PND —a-- DIL+GMS 30-33 PND 1 1 A 1< T 20 30 40 50 60 70 80 90 lOO dE Amplitud Nl 18KHz 350 300 250 200 150 100 50 o 350 300 250 200 150 loo 50 0 400 350 300 250 ~00 150 100 50 o 350 300 250 - 200 - 150 loo 50 - o 450 400 350 300 250 200 150 loo 50 o 300 250 200 ~ 50 100 50 0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dE Amplitud Nl 8 KHz 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dB Amplitud Nl 4 KHz 20 30 40 50 60 70 A0 90 100 dE 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dE Figura 34 121 Figura 35: Imágenes a microscopia óptica de la cóclea de un animal tratado con GMS en los días 30 al 33 postnatal. a) Espira media coclear; b) Detalle del órgano de Corti; c) Detalle del ganglio espiral coclear en el que se observan algunos huecos dejados por las fibras aferentes desaparecidas (flechas). CCEs: células ciliadas externas; CCL célula ciliada interna; GE: ganglio espiral; OC: órgano de Codi. 122 Figura 36: Imágenes a microscopia óptica de la cóclea de un animal tratado con DIL+GMS en los días 30 al 33 postnatal. a> Espira media coclear; b) Detalle del órgano de Corti; c> Detalle del ganglio espiral coclear en el que se observan las neuronas que lo constituyen (estrella). CCEs: células ciliadas externas; CCL célula ciliada interna; GE: ganglio espiral; OC: órgano de Cortí 123 OTOTOXICIDAD EN EL DESARROLLO DEL RECEPTOR AUDITIVO A continuación se comentarán los resultados obtenidos tras la realización del protocolo de ototoxicidad propuesto en el apanado de materia/y métodos. a) Neurotoxicidad coclear en la mU adulta Este experimento de neurotoxicidad fue llevado a cabo mediante la administración de un agonista glutamatérgico, el ácido kaínico (AK), en ratas adultas. La neurotoxicidad así inducida afectó desigualmente a los dos tipos de potenciales cocleares evaluados en este protocolo, el PAC y el PMO. En cuanto al PAC del VIII par (Fig. 37), la administración intraperitoneal de AK produjo grandes alteraciones en los valores evaluados del PAC. Así, la latencia de aparición de la onda Nl se incrementó significativamente en todas las frecuencias de estimulación, respecto a los valores considerados como control del experimento. Por otro lado, el parámetro más afectado por el tratamiento con el AK fue el de la amplitud de la onda, que sufrió una amplia regresión de sus valores comparándolos con los obtenidos en el grupo control. Por otro lado, en los registros del PMC (Fig. 38), se observó que la administración de AK no produjo variaciones significativas en la media de los umbrales de audición para este potencial en ninguna de las frecuencias de estimulación estudiadas (Fig. 38 a). En esta figura se muestran dos ejemplos de registros de PMO de un animal control (Fig. 38 b) y de un animal tratado con AK (Fig. 38 c), en los que se puede observar la falta de diferencias en el umbral auditivo para el PMC, considerando como umbral la mínima intensidad que es registrada inteligiblemente. El exámen microscópico de estas cócleas . No se observaron daños en las COEs ni en otras estructuras cocleares. 124 Efectos del ácido kainico sobre el PAC Latencía Nl 22 KHz 300- 250- 200 - ~50- 100- 50- o 30 40 50 ¡9 70 80 90 100 Latencia Nl 18 KHz 350- 300- 250- 200- j. 150- lOO- 50- 0 30 40 50 59 70 80 90 lOO Amplitud Nl 22 KHz — u • • 20 30 40 50 ¡9 70 80 90 100 Amplitud Nl 18KHz 20 30 40 50 59 70 80 90 100 Latencla Nl 16 KHz 300- Amplitud Nl 18 KHz 250 -- 200-- ~50- 100- 50- o ¡9 70 80 90 100 u—u--——. — u • 20 30 40 60 ¡9 70 80 90 100 400 350 300 260 >~00 150 100 50 o 20 30 40 50 22 70 80 90 100 30 40 50 60 70 80 90 100 dB —‘—CONTROL -u- ACIDO KAINICO l,9~ 1,7;~ 0,7 20 2,1 1,9 1,7 1,5 213 1,1 0,9 0,7> 20 t 1,44- 1,3+ 1.11 0,9 1 0,8 0,7-. 20 Latencia Nl 12 KHz 1 16 lis’ 14t 1,3 12 ~ 11 0,9 0,8 07 20 Amplitud Nl 12 KHz Figura 37 126 Figura 39: Imágenes microscópicas del órgano de Corti de rata. a) Detalle de la espira media coclear de una rata del grupo control. b> Detalle de la espira media coclear de una rata tratada con ácido kaínico. El tratamiento con el neurotóxico produjo edemas dendríticos en las fibras aferentes de tipo 1 del ganglio espiral, que se pueden observar en la base de la CCI (flechas). CCEs: células ciliadas externas, CCL célula ciliada interna, MT membrana tectoria, TC: túnel de Cortí 127 b) Ototoxicidad en la rata adulta Este experimento permitió evaluar la evolución de la afectación ototóxica a lo largo de un tratamiento crónico, que en este caso duró 22 días, sobre los umbrales auditivos del PMC (Fig. 40). La administración diaria de KANA produjo un incremento constante de los umbrales auditivos para el PMC desde el tercer día de tratamiento (Fig. 40 a), hasta el umbral máximo, conseguido para todas las frecuencias de estímulo en el 220 día de tratamiento. Por otro lado, no todas las curvas de frecuencias de estudio se comportaron de igual manera a lo largo del tratamiento. Así, en el día 0, registro previo al comienzo del tratamiento con KANA, no se obtuvieron los mismos umbrales auditivos “basales” para todas las frecuencias, de manera que los menores umbrales se obtuvieron con las frecuencias de estimulación más agudas, 4000, 2000 y 1000 Hz, mientras que para las frecuencias de estímulo más graves, 500 y 250 Hz, se obtuvieron umbrales más elevados. A partir de estos umbrales, todas las curvas incrementaron sus valores de umbral medio durante el tratamiento con KANA. A continuación se presentan dos ejemplos de registros de PMC en dos momentos del tratamiento con KANA, en el día 90 y en el 220 (Fig. 40 c). En las imágenes de microscopia (Fig. 41) se pudieron observar los efectos de este tratamiento crónico con el antibiótico aminoglucósido KANA. Las lesiones se centraron en el epitelio sensorial del órgano de Corti con degeneración de las células ciliadas, en especial las de la espira basal de la cóclea (Fig. 41 b), aunque en las demás espiras la afectación también fue evidente en las CCEs, además de la aparición de edemas dendríticos de las fibras aferentes de tipo 1 en la base de las COIs (Fig. 41 a>. No se observaron daños en otras estructuras cocleares como el ganglio espiral. 129 Figura 41: Imágenes microscápicas del órgano de Cortí de rata adulto tratado con kanamicina durante 22 días. a) Detalle de la espira media coclear. El tratamiento crónico con kanamicina produjo alteraciones en las CCEs así como un inicio de edemas dendriticos en las fibras aferentes de tipo 1 (flecha). b) Detalle de la espira basal coclear. La espira basal coclear es la más afectada por el tratamiento con el antibiótico, con pérdida del epitelio sensorial del órgano de Corti (rectángulo). No se observan daños apreciables en las fibras del ganglio espiral (estrella). CCEs: células ciliadas externas, CCL célula ciliada interna, MT membrana tectoria. a ¡ e’ 130 c> Ototoxicidad en la rata en desarrollo Este experimento permitió evaluar el periodo de sensibilidad extrema en la ontogenia del receptor auditivo a los daños de etiología ototóxica por tratamiento con KANA. Tras el tratamiento con KANA en los dos períodos de desarrollo postnatal del estudio, es decir, del 100 al 130 día postnatal y del jQO al 200 día postnataí, se observan grandes alteraciones en el PAC del nervio coclear. La latencia de la onda Nl del PAC del VIII par (Fig. 42), sufre una gran regresión en ambos grupos de tratamiento, retrasando su aparición y perdiendo la morfología típica de una curva input-output Por otro lado, la amplitud de la onda Nl del PAC (Fig. 43) también sufre modificaciones importantes en los animales tratados en el período de desarrollo con KANA, produciéndose disminuciones importantes de los datos de amplitud respecto a los valores obtenidos en los animales del grupo control. Este tratamiento con KANA también alteró los componentes del umbral de audición para el PAC del nervio coclear a todas las frecuencias de estudio o al envejecimiento (Maragos y cols., 1987; Pujol y cols., 1991). Esta liberación de glutamato desemboca en la acumulación de una gran cantidad de glutamato extracelular que los mecanismos de recaptación normalmente implicados en su regulación, como la recaptación por las células de la glía circundante, no 137 pueden controlar el proceso (Pujol y cols., 1991). De esta manera, el aumento de glutamato en la sinapsis produce una apertura prolongada de los canales iónicos asociados a los receptores glutamatérgicos postsinápticos, que permite el flujo de iones Na+, K+ y Ca2+ y la entrada pasiva de C1 al interior de la neurona (Eybalin, 1993). El desequilibrio osmótico resultante causa la entrada de agua en el elemento postsináptico, proceso que desemboca en un edema celular (Rothman, 1985; Olney y cols., 1987). Por un lado, hay un fenómeno de excitotoxicidad de desarrollo rápido que parece ser dependiente de la entrada de C1, mientras que la neurotoxicidad de desarrollo lento es dependiente del en la que están implicadas proteasas y lipasas Ca2+~dependientes (Choi, 1985; 1987; Garthwaite y cols., 1986; Murphy y cols., 1988). Consecuentemente, en la cóclea, los edemas dendríticos de las fibras aferentes de tipo 1 del ganglio espiral que se observan durante o tras el comienzo de las condiciones traumáticas, como los sonidos intensos, hipoxia- isquemia o la acción de aminoácidos excitatorios, implica al primer proceso, mientras que las subsecuentes pérdidas de fibras mielinizadas y las neuronas del ganglio espiral coclear probablemente implican mecanismos Ca2+~ dependientes (Eybalin, 1993>. En la cóclea, los procesos neurotóxicos (Fig. 46> han sido analizados tras la inducción de hipoxia o anoxia (Nadol y Burgess, 1985; Billet y cols., 1989; Puel y Pujol, 1992), bien por hiperestimulación por sonidos mantenidos de elevada intensidad (Robertson, 1983; Cousillas y Rebillard, 1988) o bien mediante la administración de agonistas glutamatérgicos en animales de experimentación (Pujol y cols., 1985; Jensen, 1988; Juiz y cols., 1989; Gil- Loyzaga y Pujol, 1990 a y b; Puel y cols., 1991 a; Janssen y cols., 1991; Janssen, 1992; Eybalin, 1993; Gil-Loyzaga y cols., 1993 b; 1999 b). 138 I«pox Figura 46: Esquema general de los procesos implicados en la neurotoxicidad del Ruido alta CCI e Y, r Cela!a degUite-] Fibmn qfesw¡te tipo 1 GASA DA ~frral receptor auditivo (Adaptado de GiI-Loyzaga y cols., 1999 a). 139 La administración de agonistas de los receptores glutamatérgicos, de tipo NMDA o no-NMDA, reproduce las alteraciones observadas en las patologías hipóxico-isquémicas cocleares y en el trauma acústico. Los agonistas glutamatérgicos más utilizados para la evaluación de los efectos en el receptor auditivo de los procesos neurotóxicos han sido los agonistas de receptores ionotrópicos, como el AK, el AMPA o el NMDA, aunque también han sido evaluados los efectos de la administración de glutamato en forma de su sal monosódica , aunque también los animales tratados del 150 al 180 día postnatal con GMS presentaron también una disminución significativa en el número de neuronas en el ganglio espiral (Fig. 31>. En el estudio de los efectos electrofisiológicos de la administración de GMS sobre el PAC en todos los grupos por separado, no se aprecian bien el grado de afectación neurotóxica de cada grupo de edad respecto de los demás. En un análisis comparado de estos efectos inducido por el tratamiento con GMS en los distintos períodos de desarrollo (Figs. 47 y 48), se observa que el PAC del nervio coclear se ve afectado de distinta manera en los diferentes períodos de tratamiento de GMS a lo largo del desarrollo del receptor auditivo. Esta variabilidad de las alteraciones electrofisiológicas cocleares frente a la neurotoxicidad inducida por la administración intraperitoneal de GMS en los diferentes grupos de tratamiento permitió el estudio de los períodos de máxima sensibilidad a la patología neurotóxica. 144 Análisis comparado de los efectos neurotc5xicos de GMS a lo largo del desarrollo. Latencia Nl del PAC Latencia Nl 22 KHz 20 30 40 50 ¡9 70 80 90 lOO Latencia Nl 16 KHz 20 30 40 50 6~ 70 80 90 100 1,7 - 1.6 1,5 - 1,4 - 1.3 ¡1,2 1.1 - 1- 0,9 - 0.8 - 0,7 Latencia Nl 18 KHz 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dR 1.9 -- 1.7 -- 1.5 1,1 -- 0.9 -- 0,7 Latencia Nl 12 KHz 50 60 70 80 90 100 dB Latencia Nl 8 KHz2,1 1,9 1,7 1,5 E 1,3 1,1 0,9 0,7 20 30 40 50 60 70 80 90 dR —4--CONTROL -u— GMS 2-5 PND —á-GMS6-9PND -x-GMS9-12 PND —u—GMS 15-18 PHD —.--GMS3O-33PND 2.5 2.3 2.1 1.9 1.7 .5 1.3 leí - 0,9 - 0,7 20 30 40 50 60 70 dR100 1,9 1,7 1.5 -- ¡1.3- 1,1 -- 0,9 - 0,7 1,7 1,6 1,5 1,4 1.3 ¡1.2 1.1 0,9 0.8 0,7 20 30 40 Latencia Nl 4 KHz 80 90100 Figura 47 145 Anáilsis comparado de los efectos neurotóxicos de GMS a lo largo del desarrollo. Amplitud Nl del PAC 300 250 200 >~150 100 50 o 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dB 300 250 200 ~150 100 50 O 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dB 400 350 300 250 >~200 150 100 50 o 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dE 350 300 250 200 j. 150 100 50 o 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dE 400 350 300 250 ‘~~2o0 150 100 50 o 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dB 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dB -4— CONTROL -u- OMS 2:5 PND -a— OMS 6-9 PND —n— OMS 9-12 PND -u—OMS 15-18 PND —.—GMS 30-33 PND 250 200 150 = 100 50 o Amplitud Nl 18 KHz Amplitud Nl 12 KHz Amplitud Nl 8 KHz Amplitud Nl 4 KHz Figura 48 ¡46 En general, los valores de la latencia (Fig. 47) de los distintos grupos se aproximaron mucho a los valores obtenidos en el grupo control, pero en el caso de los grupos de administración de GMS en los días 60 al 90 día postnatal y durante el 90 y el 120 día postnatal los aumentos de latencia de la onda Nl del PAC encontrados con respecto al grupo control fueron mayores que en otros grupos, sobre todo en las frecuencias 8 y 4 KHz. También el grupo de administración durante los días 150 al 180 mostró una latencia incrementada bajo estimulación de 16 KHz. En cuanto al análisis comparado de los valores de la amplitud de la onda Nl del PAC del nervio coclear (Fig. 48), los datos obtenidos muestran una mayor afectación al tratamiento con GMS en los períodos del 60 al 90 día postnatal y del 90 al 120 día postnatal, mostrando una gran disminución de dicha amplitud de la onda Nl del PAC frente a los valores obtenidos en el grupo control. También se observaron disminuciones variables en magnitud en los grupos de tratamiento del 20 al 50 día postnatal y del ¶50 al 180 día postnatal. El grupo menos afectado por la administración intraperitoneal de GMS, para estos valores de amplitud, fue el de tratamiento durante los días postnatales 300 al 330• Estos resultados parecen indicar que las alteraciones registradas en el PAC del nervio coclear se correlacionan perfectamente con la magnitud los daños neurotóxicos inducidos en el receptor auditivo y que, como ya hemos comentado anteriormente, el PAC del VIII par refleja el número de neuronas que disparan sus respectivos potenciales sincrónicamente tras la estimulación sonora. Además, también queda demostrada la existencia de un período, entre el 60 y 120 día postnatal y que podría alargarse hasta el 180 día postnatal, en el que el receptor auditivo de la rata es muy sensible a los procesos neurotóxicos, que en este caso fueron inducidos por la administración de GMS 147 pero que pueden ser perfectamente extrapolables a procesos patológicos cocleares de origen hipóxico-isquémico. La existencia de este periodo de máxima sensibilidad de las fibras aferentes del ganglio espiral coclear a la neurotoxicidad puede estar relacionada con un incremento, durante este periodo de desarrollo del receptor auditivo, de la expresión de los receptores glutamatérgicos en dichas fibras, previo a su reorganización definitiva en las fibras aferentes de la cóclea madura. La presencia de los receptores glutamatérgicos en las fibras aferentes de la cóclea en desarrollo ha sido demostrada mediante el análisis de los efectos de la administración de distintos agonistas glutamatérgicos durante la ontogenia en animales de laboratorio. Así, la administración intracoclear de AK en ratas de 6 días de vida induce la aparición de lesiones edematosas en las dendritas aferentes del ganglio espiral. Estas lesiones pudieron ser observadas en la base de las CCIs y de las OCEs (Pujol y cols., 1985; 1987; Gil-Loyzaga y Pujol, 1990 a y b; Simmons y cols., 1990). De hecho, la sensibilidad de las fibras aferentes cocleares al AK se ha demostrado en neuronas en cultivo procedentes de cócleas de embriones de rata de 18 días de gestación (GiI-Loyzaga y Pujol, 1990 b), así como en embriones de 17 días de edad gestacional y en ratas de 1 día de edad postnatal (Gil-Loyzaga y Pujol, 1990 b), lo cual indica que la expresión de receptores glutamatérgicos está presente en períodos muy tempranos del desarrollo ontogénico de la cóclea y que las CCEs están inervadas, al menos en un corto período del desarrollo, por fibras glutamatérgicas. Respecto a este último punto, se especula sobre si las fibras aferentes de tipo II, que inervan a las CCEs, pudieran expresar receptores glutamatérgicos en algún momento del desarrollo o si las fibras aferentes de tipo 1 pudieran lanzar colaterales, en este período ontogénico, a las COEs para inervarlas. Los datos disponibles al 148 respecto sitúan la segunda hipótesis como la más acertada, de manera que al avanzar la sinaptogénesis coclear estas colaterales se retraerían (Pujol y cols., 1985; Pujol y cols., 1987; Gil-Loyzaga y Pujol, 1990 a y b>. La hipótesis de posibles sobreexpresiones, durante el desarrollo, de los receptores glutamatérgicos en las fibras aferentes cocleares viene apoyada por datos en los que se describen fluctuaciones del número de receptores glutamatérgicos, en concreto los receptores NMDA, en determinadas regiones del sistema nervioso central y periférico durante el desarrollo (Garthwaite y cols., 1987; Bode-Greuel y Singer, 1989; McDonald y cols., 1988; 1989; Tremblay y cols., 1988; Represa y cols., 1989). En el presente estudio se observa una coincidencia temporal entre el periodo en que las fibras aferentes son más sensibles a la neurotoxicidad, con datos preliminares sobre una reorganización significativa de la población neuronal del ganglio espiral coclear, que incluye la muerte fisiológica de un elevado número de neuronas (Sobkowicz, 1992). En la rata, el ganglio espiral pierde en este período, 5~ y 60 día postnatal, aproximadamente de un 22% a un 25% de la población neuronal del ganglio (Rueda y cols., 1987), mientras que en el embrión de pollo de 8 a 14 días se pierden alrededor de un 25% de la población neuronal del ganglio coclear . En estas condiciones de neurotoxicidad, los mecanismos que habitualmente regulan la concentración de Ca2+ en el citoplasma, como el intercambiador Na~ICa2~, la ATP-asa Ca2~-dependiente y la captación de Ca2+ intracelular en orgánulos citoplásmicos, quedan totalmente desfasados y no pueden controlar el exceso del ión. El proceso se agrava con la disminución de ATP intracelular debido a la h¡poxia que desencadena el proceso neurotóxico, que impedirá que las proteínas ATP-dependientes saquen al exterior de la célula el Ca2~ (Matías-Guiu, 1990>. Como ya se ha mencionado, existen varios caminos que permiten la entrada, en determinadas condiciones, del Ca2+. Así, el ión podrá entrar en la célula a través de los canales voltage-dependientes de Ca2+, el canal iónico asociado a los receptores NMDA, el intercambiador intramembrana de Na~/Ca2~, además de la liberación del Ca2~ hacia el citoplasma por parte de los depósitos del ión en el retículo endoplásmico, en respuesta de la activación de receptores del inositol trifosfato por segundos mensajeros intracitoplásmicos, liberados por receptores metabotrópicos (Weiss y cols., 1990; Stys y cols., 1991). Por lo tanto, parece lógico pensar que el bloqueo especifico de uno o varios de estos caminos de entrada del Ca2+ en la fibra podría redundar en la 152 posible protección de la fibra frente al proceso neurotóxico. Esta hipótesis ha sido investigada por numerosos grupos de investigación, centrándose la mayoría de estas investigaciones en el uso de antagonistas de los receptores NMDA para bloquear la entrada de Ca2+ a través de su canal asociado (Rothman, 1984; Simon y cols., 1984; Clark y Rothman, 1987; Gilí y coís., 1987; Goldberg y cols., 1987; Faden y cols., 1989; Olney y cols., 1989; Puel y cols., 1991 b; Siegel, 1991; Janssen, 1992; Pujol y cols., 1992 a). En el receptor auditivo, se ha evaluado también la capacidad de protección de los antagonistas de los canales volto-dependientes de Ca2+ frente a los efectos neurotóxicos derivados de la administración de agonistas glutamatérgicos. De hecho, el bloqueo específico de estos canales de Ca2 ha sido el objetivo de investigación para la búsqueda de un método eficaz de neuroprotección del receptor auditivo en desarrollo frente a la neurotoxicidad de esta memoria de Tesis Doctoral. En experimentos preliminares de nuestro laboratorio, la administración de diltiazem previa a la de AK o de GMS, en ratas adultas, produjo a disminución significativa del número de dendritas con procesos edematosos que se hallaron tras el tratamiento con estos neurotóxicos (Gil-Loyzaga y cols., 1993 b), así como una recuperación de los valores normales de la latencia y la amplitud de la onda Nl del PAC del nervio coclear (Carricondo, 1995). Prácticamente los mismos efectos protectores los encontramos utilizando el nimodipino, una dihidropiridina, frente a la neurotoxicidad coclear inducida por la administración inducida por AK (Hernández, 1993). En los resultados electrofisiológicos presentados en esta memoria, se observa una tendencia general a la recuperación, en mayor o menor medida, de los valores de latenciay de amplitud de la onda Nl del PAC del nervio coclear que fueron alterados por los efectos neurotóxicos inducidos por la administración en distintos periodos del desarrollo de GMS. De todos modos 153 este grado de protección frente a la neurotoxicidad varió dependiendo del periodo de desarrollo postnatal en que se inyectó el GMS. Así, la administración previa de diltiazem previa a la GMS, produjo los mejores resultados electrofisiológicos en los grupos de tratamiento del 20 al 50 (Figs. 17 y 18), del 150 al 180 (Figs. 29 y 30> y del 300 al 330 día postnatal (Figs. 33 y 34). En estos grupos se observó que los valores de amplitud de la onda Nl del PAC del VIII par, que se vieron más afectados por el tratamiento con GMS que los de la latencia, recuperaron en gran medida las mediciones obtenidas en el grupo control. En el grupo de tratamiento del 60 al 90 día postnatal, se observó que la administración de diltiazem, si bien produjo pequeños incrementos de la amplitud de la onda Nl del PAC, respecto a los valores obtenidos en el grupo tratado con GMS, no produjo ningún efecto significativo de recuperación de los valores de la latencia de dicha onda (Figs. 21 y 22). Este mismo comportamiento lo encontramos en los registros de los animales tratados con diltiazem y GMS durante el 90 y el 120 día postnatal. En este caso, la amplitud de la onda Nl del PAC se recupera bien frente a los valores alcanzados por el grupo de tratamiento con GMS, pero los valores de latencia siguen siendo elevados. Estos resultados electrofisiológicos han sido corroborados por los estudios morfológicos de las cócleas de estos animales. Así, podemos indicar que la recuperación de unidades neuronales en el ganglio espiral debida a la administración de diltiazem es evidente sobre todo en el grupo de tratamiento deI ¶50 al 180 día postnatal (Fig. 32). En los grupos que respondieron peor electrofisiológicamente al tratamiento con diltiazem, esto es, los grupos de tratamiento del 60 al 90 (Fig. 24> y del 90 al 120 día postnatal (Fig. 28), presentaron todavía pérdidas, si bien algo menores que las del grupo de tratamiento con GMS, de neuronas en el ganglio espiral. ‘54 Estos resultados demuestran la existencia de un período especialmente sensible a la actuación de los procesos neurotóxicos en el desarrollo coclear de la rata. Este período, que ya fue descrito en el análisis de los efectos de la administración de GMS en el desarrollo, sería el que incluye el período comprendido entre el 60 y el 120 día postnatal. La diferente actuación protectora del antagonista del calcio frente a los efectos de la neurotoxicidad en el PAC, es decir actuación de mejora de la amplitud pero no de la latencia del PAC del nervio coclear, en este período de máxima sensibilidad neurotóxica podría estar relacionada con el desarrollo de las distintas subpoblaciones de fibras aferentes de tipo 1 del ganglio espiral coclear descritas según su tasa de descarga espontánea (Liberman, 1978; 1980; 1982 a y b; Liberman y Oliver, 1984; Liberman y cols., 1990). Estas diferencias son, probablemente debidas a la distribución diferencial de los receptores glutamatérgicos de tipo no-NMDA, de bajo umbral de activación, y los NMDA, de alto umbral de activación. Esta hipótesis nos induce a pensar que las fibras de alta frecuencia de descarga espontánea deberían tener una elevada cantidad de receptores glutamatérgicos de bajo umbral de activación, es decir, de tipo no-NMDA, en la membrana postsináptica, mientras que las de media y baja frecuencia de descarga espontánea podrían tener en su superficie postsináptica mayor cantidad de receptores de alto umbral de activación. La consecuencia de esta hipótesis en la generación del PAC del nervio coclear sería que la latencia del PAC estaría definida por aquellas fibras que respondiesen antes al estímulo sonoro, es decir, las de alta frecuencia de descarga espontánea y bajo umbral de activación, mientras que la amplitud seria el reflejo de todo el tren de fibras de media o baja frecuencia de descarga espontánea y de alto umbral de activación que dispararían en sincronía tras el estímulo sonoro. Este diferente comportamiento fisiológico de las fibras de tipo 1 del ganglio espiral coclear, podría tener sus consecuencias para la 155 funcionalidad protectora del antagonista del Ca2+ en situaciones neurotóxicas, pudiendo, como en nuestro caso, predominar de alguna manera la protección sobre aquellas fibras de media y baja frecuencia de descarga en comparación con las de alta frecuencia de descarga cuya fisiología de activación las haría más sensibles a la neurotoxicidad. Estos resultados sugieren que el uso de bloqueantes de los canales voltodependientes de Ca2+ puede ser un buen método para la protección de las fibras aferentes de tipo 1 del ganglio espiral frente a los procesos neurotóxicos derivados de la administración de GMS. Los resultados obtenidos en el grupo de administración de animales adultos, del 300 al 330 día postnatal, son corroborados por los experimentos preliminares obtenidos en nuestro laboratorio (Gil-Loyzaga y cols., 1993 b; Hernández, 1993; Carricondo, 1995), mientras que la capacidad protectora de estas substancias en los procesos neurotóxicos inducidos durante el desarrollo del receptor auditivo parece depender de una sensibilidad variable del sistema a la neurotoxicidad a lo largo del desarrollo ontogénico. Basándonos en la capacidad neuroprotectora de estos bloqueantes del calcio demostrada con anterioridad, podemos pensar que la disminución de la capacidad de protección del sistema exhibida en los animales de este periodo de máxima sensibilidad no es debida en sí misma al diltiazem, sino que tal vez las concentraciones utilizadas para inducir la neuroprotección deberían ser adecuadas al momento de desarrollo coclear en el que se instaure el tratamiento protector frente a la neurotoxicidad, es decir, a mayor sensibilidad del sistema, tal vez mayor debería ser la administración del antagonista del Ca2~, para proteger a la fibra. 156 II. OTOTOXICIDAD EN EL RECEPTOR AUDITIVO El protocolo de ototoxicidad fue diseñado para la evaluación de las aptitudes de registro del potencial microfónico coclear (PMO), de un nuevo equipo de registro de dichos potenciales diseñado y desarrollado por el Dr. Julio Sanjuán Juaristi, del servicio de Fonoaudiología del Hospital Ramón y Cajal de Madrid. La aplicación experimental de este nuevo equipo nos permitió, además, analizar los efectos sobre la generación del PMO de los procesos neurotóxicos y ototóxicos. Así, este protocolo se diseñó en tres fases de manera que en un primer momento se evaluaron los efectos de la administración de un neurotóxico, el AK, en animales adultos sobre el PMO y a continuación se estudiaron las alteraciones funcionales auditivas de animales adultos y en fases de desarrollo postnatal frente a la ototoxicidad inducida por la administración de un antibiótico aminoglucósido, la kanamicina. a) Análisis de los efectos de la neurotoxicidad sobre el PMC y el PAC del nervio auditivo en ratas adultas. El análisis de los resultados obtenidos en esta fase del estudio nos permitió realizar la determinación del lugar de producción del potencial que se registró con el nuevo equipo de registro. El tratamiento con AK, que fue el neurotóxico seleccionado para la inducción de la neurotoxicidad coclear, produjo los resultados esperados tras este tipo de tratamiento y que ya han sido analizados en el apartado anterior. Así, la neurotoxicidad producida por el AK se manifestó en los registros del PAC del nervio coclear, como un aumento significativo de la latencia y una elevada disminución de la amplitud de la onda Nl del PAC, en comparación con los valores obtenidos en el grupo control (Fig. 37). En este caso, las alteraciones en el PAC son un fiel reflejo del proceso neurotóxico desencadenado por el AK, que afectó específicamente a las fibras aferentes ‘57 de tipo 1 del ganglio espiral coclear, produciendo los típicos edemas dendriticos en la zona basal de las eCís del órgano de Corti y del receptor auditivo (Juiz y cols., 1989; Gil-Loyzaga y Pujol, 1990 a y b; Gil-Loyzaga y cols., 1993 b; 1998 b; 1999 b). Esta afectación neurotóxica se concreta en la producción de edemas dendríticos en las fibras aferentes de tipo 1 del ganglio espiral coclear, mientras que no se observan daños en las células ciliadas ni en las fibras 158 aferentes de tipo II. En nuestros resultados, la administración de AK no produjo cambios significativos en los umbrales de audición para el PMO. Estos resultados son corroborados por estudios previos (Jenison y cols., 1986; Puel y cols., 1991 a y b) que describen la ausencia de efectos de la administración de agonistas glutamatérgicos en la producción del PMC. Este hecho demuestra claramente que el potencial registrado con el nuevo equipo no se genera en el conjunto formado por las COIs y las fibras aferentes de tipo 1 del ganglio espiral. Un efecto que se observa en los registros del PMO es el aumento del umbral auditivo en las frecuencias de estimulación más graves, 500 y 250 Hz. Este efecto puede ser debido a que las frecuencias de estos sonidos son demasiado graves para el receptor auditivo de la rata y están en el límite de su espectro audible. b) Análisis de los efectos sobre el PMO del tratamiento con kanamicina en el receptor auditivo de la rata adulta. El análisis de la ototoxicidad inducida por el tratamiento con antibióticos aminoglucósidos en la rata adulta fue el objetivo de esta segunda fase de estudio. Las propiedades ototóxicas de estas sustancias han sido profusamente estudiadas y son bien conocidas (Eybalin, 1993). Su administración produce cambios significativos en el PMO (Nuttall y cols., 1977; Dumas y Oharachon, 1982), así como lesiones en las OCEs y en otras estructuras del órgano de Corti . El desarrollo de la afección ototóxica fue posible gracias a la capacidad del nuevo equipo de registro de PMO de registrar el potencial con electrodos de superficie, sin necesidad de ‘59 ninguna intervención quirúrgica. El incremento progresivo de los umbrales auditivos para el PMC indica la gran especificidad y agudeza de este PMC registrado. Las alteraciones producidas por este tratamiento crónico con KANA sobre el PMC fueron corroboradas por las imágenes de microscopia de las cócleas de estos animales, en las que se observan claramente las afectaciones en el órgano de Cortí de la ototoxicidad (Fig. 41). Dichas alteraciones se concretaron en la eliminación de las células ciliadas del epitelio sensorial del órgano de Corti, de manera que la porción coclear más afectada por el proceso ototóxico fue la espira basal, aunque el daño en el epitelio sensorial fue también evidente en las espiras más apicales. Esta gradación en el daño ototóxico desde la base hacia el ápex coclear, concuerda con el comportamiento típico descrito en estudios previos (Eybalin, 1993>. En este caso, en el registro previo al tratamiento crónico con KANA, se observa, al igual que en el estudio de neurotoxicidad anterior, que los valores de umbral para el PMO se incrementan en las frecuencias graves, lo que concuerda con la idea de que la rata no puede codificar correctamente estos sonidos tan graves. En resumen, esta fase de estudio nos permitió concluir que, efectivamente, el potencial registrado por el nuevo equipo se producía en las COEs y que por lo tanto se trataba realmente del PMO. c) Análisis de los efectos de la administración de KANA en el desarrollo del receptor auditivo. Como complemento al estudio de la ototoxicidad en animales adultos y al estudio de los efectos de la neurotoxicidad en el desarrollo del receptor auditivo, se propuso esta tercera fase de este protocolo, el estudio de los efectos a largo plazo de la administración del antibiótico aminoglucósido KANA en un período del desarrollo del receptor auditivo. Los dos tratamientos 160 descritos en el apartado de material y métodos comienzan la administración de KANA en el 100 día postnatal y se alarga hasta el 130 y el 200 día postnatal. Este periodo de administración fue seleccionado por ser el descrito en la literatura científica como periodo de máxima sensibilidad a la acción ototóxica de los antibióticos aminoglucósidos (Pujol, 1986>, periodo en el cual la administración de antibióticos aminoglucósidos en bajas dosis, que no afectarían a la cóclea madura de un individuo adulto, produce grandes daños en la cóclea en desarrollo . La nueva técnica de registro de PMC demostró una gran especificidad en la exploración tonal de la cóclea, gracias a calidad de sus filtros de banda y su sistema de amplificación. El tono puro utilizado como estímulo permitió una exploración tonotópica fiable, necesaria, por otro lado, para el registro de PMC fiables. Este nuevo equipo de registro de PMO, diseñado como método de exploración para humanos, con estímulos de tonos entre 4000 y 250 Hz, para la exploración de la zona conversacional humana (F¡g. 1), fue capaz de detectar una hipoacusia sensorial de la cóclea de la rata para las frecuencias de estimulación más graves, 500 y 250 Hz1 lo que demuestra la capacidad del sistema para explorar el estado fisiológico del receptor auditivo en la búsqueda de hipoacusias sensoriales que puedan ser debidas a un malfuncionamiento o a una alteración de las COEs en cualquier zona de la cóclea. Por otro lado, este método de registro ha sido probado en la exploración y el despistaje de sordera en recién nacidos (De los Santos y cols., 1998; 1999; Sanjuán, 1998) con resultados interesantes y prometedores como posible método de screening para la detección precoz de sorderas y como prueba audiológica, cuyos resultados combinados con los de otras pruebas (Fig. 13) pueden aportar datos importantes en el diagnóstico de las sorderas. 162 III. NEUROTOXICIDAD Y OTOTOXICIDAD La comparación entre ambas patologías es compleja y hay que tener en cuenta que la etiología no es común y, por lo tanto, debemos ser cautelosos a la hora de realizar esta comparación. En cuanto a la etiología, en capítulos anteriores de esta memoria se han explicado los factores desencadenantes de ambas patologías, de manera que la neurotoxicidad afecta básicamente a las fibras aferentes de tipo 1 del ganglio espiral mientras que la ototoxicidad afecta, en sus primeras fases, a las células sensoriales del órgano de Corti. Por otro lado, es interesante la comparación de los efectos a largo plazo de ambas patologías presentados en esta memoria. Así, cuando ambos procesos se desencadenaron en los periodos más sensibles del desarrollo ontogénico del receptor auditivo, se observaron pérdidas significativas de las neuronas del ganglio espiral coclear. Por el contrario, la neurotoxicidad no afectó al órgano de Cortí mientras que la ototoxicidad eliminó todo rastro del epitelio sensorial. Es interesante el dato de la determinación de los períodos de máxima sensibilidad de las dos afectaciones. Ambos coinciden en el tiempo, aunque el periodo de sensibilidad neurotóxica se presenta unos días antes que el determinado para la ototoxicidad. El hecho de que cuando sucede una pérdida de células ciliadas, causado por un tratamiento con antibióticos aminoglucósidos, acaece una degeneración de las fibras aferentes del ganglio espiral, sugiere que las células ciliadas deben producir sustancias que sean reconocidas por las fibras aferentes para que puedan alcanzarlas. Estas sustancias, entre las que podría encontrarse el glutamato, haría que las neuronas aumentasen la expresión de los receptores para detectarías y crecer hacia las células ciliadas e inervarlas. Esta sobreexpresión de receptores gluatamatérgicos justificaría la existencia del periodo de sensibilidad neurotóxica definido en esta Tesis Doctoral. 163 El hecho común de la pérdida del número de neuronas del ganglio espiral es importante, ya no por la comparación entre ambas patologías, sino por la comparación de esta alteración con la presbiacusia, o sordera por envejecimiento del receptor auditivo, afección que en el ser humano tiene una prevalencia muy importante (Schuknecht, 1993). En esta denominación se incluyen un gran número de patologías degenerativas que se originan durante el envejecimiento natural o fisiológico del organismo, en los que intervienen una gran serie de factores aparte del determinante fundamental de la edad, como son el ambiente urbano ruidoso, antecedentes familiares de hipoacusia, la utilización subtóxica de medicamentos lesivas para el oído, las enfermedades vasculares que someten a hipoxia al oído interno, alteraciones metabólicas, etc. En estudios postmortem de pacientes que habían sufrido de presbiacusia severa se demostraron pérdidas de células sensoriales y degeneración retrógrada de las fibras del ganglio espiral coclear (Johnsson y Hawkins, 1972; Nomura y Kawabata, 1979; Gleeson y Felix, 1987; Suzuka y Schuknecht, 1988; Johnsson y cols., 1990; Felix y cols., 1990>. Estos mismos hechos se han descrito en animales de experimentación, de entre los cuales destacan los estudios con ratones de la cepa C571BL16, que presentan la característica de presentar un envejecimiento neurosensorial precoz, que les ha convertido en objeto de estudio de modelos de presbiacusia (Willott y cols., 1987; 1988; Henry y McGinn, 1992; Bartolomé y cols., 1999 b; Carricondo y cols., 1999 a>. Es por todo ello que las patologías neurotóxica y ototóxica, exploradas en esta Memoria de Tesis Doctoral, pueden tener relaciones interesantes y puntos comunes, en el diagnóstico y tratamiento, con la presbiacusia. 164 CONCLUSIONES 165 1. La administración intraperitoneal de glutamato monosódico produce lesiones en el receptor auditivo superponibles a las obtenidas con otros neurotóxicos. Electrofisiológicamente se aprecia un aumento de la latencia y una reducción de la amplitud de la onda Nl del potencial de acción compuesto del nervio auditivo. Morfológicamente se observa la formación de edemas dendríticos en las fibras aferentes de tipo 1 deI ganglio espiral coclear. Por todo ello podemos concluir que la administración de agonistas glutamatérgicos, en particular el glutamato monosódico administrado intraperitonealmente, es un buen modelo para el estudio de las patologías neurotóxicas, ya que las alteraciones que produce son totalmente equiparables a las observadas en procesos patológicos de tipo hipóxico-isquémico o en otros tratamientos con neurotóxicos. 2. En el desarrollo ontogénico del receptor auditivo existe un período de máxima sensibilidad a los daños producidos por la neurotoxicidad inducida por la administración intraperitoneal de glutamato monosódico. En este periodo, que estaría comprendido entre el 60 y el 120 día de vida postnatal, el tratamiento con el agonista glutamatérgico produce grandes pérdidas de unidades neuronales en le ganglio espiral coclear, con los consiguientes efectos sobre la formación del potencial de acción compuesto del nervio auditivo. 3. La neurotoxicidad inducida por la administración de glutamato monosódico en distintas etapas del desarrollo puede ser antagonizada mediante el tratamiento con el antagonista de los canales volto-dependientes de Ca2~ diltiazem. Esto sugiere que dicho catión juega un papel fundamental en la fisiopatología de este proceso. No obstante, se han observado variaciones en la actividad de diltiazem a lo largo del desarrollo postnatal. 166 4. La neurotoxicidad inducida por ácido kaínico produjo alteraciones en el potencial de acción compuesto del nervio auditivo, mientras que no produjo efectos significativos en el potencial microfónico coclear, lo que corrobora que los potenciales microfónicos cocleares no se generan en el conjunto formado por las células ciliadas internas y las fibras aferentes de tipo 1 deI ganglio espiral, y que el neurotransmisor implicado en las sinapsis entra las fibras aferentes de tipo II y las células ciliadas externas no es el glutamato. 5. Los procesos ototóxicos inducidos por el tratamiento con antibióticos aminoglucósidos afectan a las células sensoriales del órgano de Corti en una primera fase, e inducen una degeneración retrógrada de las fibras nerviosas del ganglio espiral coclear. Estos daños afectan significativamente al potencial de acción compuesto del nervio auditivo y al potencial microfónico coclear lo que demuestra que la génesis del potencial microfónico coclear se enclava en las células ciliadas externas del órgano de Corti. 6. El nuevo equipo de registro de potenciales microfónicos cocleares constituye una buena herramienta que, combinada con el resto de pruebas audiológicas ya establecidas, puede aportar valiosos datos sobre la fisiología coclear y colaborar en las pruebas de despistaje y de detección precoz de la sordera en la clínica otorrinolaringológica. 7. Las patologías neurotóxica y ototóxica producen efectos distintos pero también comunes entre ellas y comparándolas con las alteraciones encontradas en la presbiacusia, enfermedad degenerativa del receptor auditivo que presenta signos comunes a ambas. El conocimiento de estas patologías puede aportar datos interesantes para la comprensión de la evolución de la presbiacusia en el ser humano y en la búsqueda de posibles patrones de tratamiento o prevención. 167 BIBLIOGRAFíA 168 Abou-Madi L, Pontarotti P, Tramu G, Cupo A y Eybalin M (1987). Coexistence of putative neuroactive substances in lateral olivocochlear neurons of rat and guinea pig. Hear Res 30: 135-14& Adams JC, Mroz EA, Sewell WF (1987>. A possible neurotransmitter role for CGRP in a hair-celí sensory organ. Brain Res 419: 347-351. Alíen AR y Starr A (1978). Auditory brain stem potentials in monkey (M. mulata> and man. Electroenceph Clin Neumphysiol 45: 55-63. Altschuler RA, Sheridan CE, Horn JE y Wenthold RJ <1989). lmmunocytochemical localization of glutamate immunoreactivity in the guinea pig cochlea. Hear Res 42: 167-174. 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AGRADECIMIENTOS Abreviaturas ÍNDICE INTRODUCCIÓN Generalidades Filogenia del receptor auditivo Anatomía y fisiología del receptor auditivo de los mamíferos euterios Oído externo Oído medio Oído interno JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO MATERIAL Y MÉTODOS Protocolo de neurotoxicidad Protocolo de ototoxicidad RESULTADOS Neurotoxicidad en el receptor auditivo Ototoxicidad en el desarrollo del receptor auditivo DISCUSIÓN I. Neuratoxicidad en el receptor auditivo II. Ototoxicidad en el receptor auditivo III. Neurotoxicidad y ototoxicidad CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA ,: ´LMÑ: ´MLÑ: