UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA TESIS DOCTORAL Desarrollo galénico y evaluación de formulaciones multicomponente para autoinyectores contra agentes químicos de guerra (neurotóxicos) MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR María José Rodríguez Fernández Directores Juan José Torrado Durán Dolores Remedios Serrano López Madrid © María José Rodríguez Fernández, 2023 Madrid, 2023 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID Facultad de Farmacia DESARROLLO GALÉNICO Y EVALUACIÓN DE FORMULACIONES MULTICOMPONENTE PARA AUTOINYECTORES CONTRA AGENTES QUÍMICOS DE GUERRA (NEUROTÓXICOS) DOCTORADO EN FARMACIA MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR María José Rodríguez Fernández DIRECTORES: Dr. Juan José Torrado Durán Dra. Dolores Remedios Serrano López Madrid, 2023 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID Facultad de Farmacia DESARROLLO GALÉNICO Y EVALUACIÓN DE FORMULACIONES MULTICOMPONENTE PARA AUTOINYECTORES CONTRA AGENTES QUÍMICOS DE GUERRA (NEUROTÓXICOS) DOCTORADO EN FARMACIA MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR María José Rodríguez Fernández DIRECTORES: Dr. Juan José Torrado Durán Dra. Dolores Remedios Serrano López Agradecimientos No puedo comenzar esta sección sin agradecer a mi director, D. Juan José Torrado Durán, el haber hecho posible esta tesis. Su atrevimiento al aceptar una tesis de un ámbito tan específico, como son los antídotos de guerra, es algo que permite que la ciencia avance en un entorno tan poco común como es la farmacia militar. Le agradezco especialmente haber involucrado a Dña. Dolores Serrano López (mi codirectora), que junto con él, han hecho posible que hoy, gracias a su guía y apoyo, podáis leer estas líneas. Y no puedo olvidarme de Daniel Hernández Franco, cuya colaboración en este último año ha sido clave para completar la fase experimental. Muchísimas veces me he preguntado por qué inicié esta tesis doctoral y mi primera respuesta es “mi ignorancia”. El trabajo, esfuerzo, tiempo e incluso en ciertos momentos incomprensión y soledad que puede generar un proyecto de esta envergadura es patente por todos los que nos embarcamos en algo así. Pero si voy más allá de las apariencias y de la dificultad, algo que siempre ha ido dentro de mí es mi curiosidad por todo, mi gusto por saber, mi necesidad de saber el origen de las cosas… Hace unos años, leí un libro llamado “Réquiem por Nagasaki”, es la historia de Takashi Nagai, un médico radiólogo japonés que sobrevivió a la bomba atómica de Nagasaki, me dejó fascinada su historia, su conversión y su entrega a la ciencia después del desastre vivido. Hace unas semanas leí su propia autobiografía “Lo que no muere nunca” y en él pude encontrar palabras que responden a mi pregunta inicial de los inicios de esta tesis: “Su amor por la verdad y la razón lo llevan ante todo a apasionarse por la ciencia médica, tras las huellas de sus padres y, antes aún, de su abuelo. En una época en que la tecnología y la ciencia avanzaban rápidamente en Europa y América, y pasaba de puntillas por Japón, Takashi descubre en ese mundo no solo la belleza de la Verdad, sino también la Bondad, seguro de que sirviendo a la medicina y a la ciencia podrá contribuir al bien de sus pacientes y al progreso de toda la humanidad, para la eternidad. Con estos grandes ideales se lanza por ese camino con todo su ser” (Lo que no muere nunca, Takashi Pablo Nagai, 2023). Volviendo a los orígenes, quisiera mostrar mi más sincero agradecimiento, ya que sin ellos no hubiese sido posible, a los miembros y antiguos miembros del Centro Militar de Farmacia de la Defensa, pero en especial al CEMILFARDEF-Córdoba donde encontré mi pasión profesional “los antídotos”, pocas cosas me han llenado tanto como esto en mi trayectoria en farmacia militar. En especial al General Juan José Sánchez Ramos que fue mi maestro en el mundo de los antídotos, me enseñó su querencia por los autoinyectables NRBQ. Y a mis compañeros de Colmenar, en especial a la Teniente Coronel Puente y al Capitán Blasco, por su gran apoyo y ayuda para realizar el desarrollo de este proyecto. Gracias de corazón, los principios de esta tesis no hubieran sido nada sin vosotros. A mi familia, de forma especial a mis padres, porque no sería quien soy hoy sin el sacrificio diario que han hecho por mí durante toda mi vida, tanto la profesional como la personal. A mi hermano, porque siempre es un símbolo de paciencia y tranquilidad que tengo que aprender. A mi hermana por ser tan valiente con la adversidad, y por traer al mundo a mis dos queridas sobrinas que adoro con locura. A mi querida Unidad Militar de Emergencias, que tanto tiempo me ha robado durante la pandemia para poder dar continuidad al desarrollo de este proyecto, aunque sinceramente, no cambiaría la experiencia vivida por nada del mundo. No hay antídoto de guerra que valga, si no hay unidades operativas como la UME, con tantas personas valientes y entregadas a los demás, os admiro desde lo más profundo de mi corazón, y en especial a todos mis compañeros del GIETMA, los actuales y los que ya no están. Hoy me puedo sentir orgullosa y gritar más fuerte que nunca, el artículo tercero de nuestro IDEARIO “la perseverancia: no reconociendo como insuperable ningún obstáculo”, tesis finalizada. Y quisiera mostrar mi agradecimiento al Cabo Moreno por colaborar con los dibujos de la portada, no paro de sorprenderme de las personas tan valiosas que me encuentro en el día a día en mi Regimiento (RAIEM). A mis queridos Reservistas Voluntarios, estas maravillosas personas que me voy encontrando por cada uno de los destinos que paso, con su pasión, ilusión, alegría, profesionalidad y entusiasmo hacia las Fuerzas Armadas. A cada uno de ellos de corazón les doy las gracias, siempre han tenido palabras de aliento para mí, animándome a superar el reto de una tesis doctoral y no dejándome vencer por los momentos de oscuridad. Vosotros también sois partícipes de esta victoria. A mis amigos, tanto los que están cerca como los que están lejos, por aguantar mis constantes lamentos del peso que me ha generado en ciertos momentos el doctorado. En especial a Noe y Rodri, porque han sido un ejemplo de “humanidad y entrega” en la universidad. A Elena por su eterna fidelidad. A mi Currita, que desde el cielo me acompaña. A la Palo por ponerme los pies en la tierra. Pi, Ángel, Patri, Onin, mis Teresas, Fran, mi Ana Córdoba, María, Sol, Maritri, Mari Tere, que son apoyos incondicionales en cualquier momento de la vida, simplemente vuestra presencia me llena el corazón. Finalmente, mi más profundo agradecimiento y cariño a Dani, por todo el tiempo que le ha robado esta tesis, a veces incomprensible, pero no hay victoria sin sacrificio, y tu virtud de “espera” siempre te define, no dejes nunca de esperarme. Gracias por tu apoyo, que infinitas veces ha sido silencioso y discreto, pero no menos importante, TQ. 1 ÍNDICE 1. RESUMEN / SUMMARY ................................................................................................. 3 1.1. RESUMEN ....................................................................................................................... 3 1.2. SUMMARY ..................................................................................................................... 5 2. CÓDIGO DE ABREVIATURAS ..................................................................................... 7 3. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 9 3.1. ARMAS QUÍMICAS ....................................................................................................... 11 3.2. AGENTES NEUROTÓXICOS ........................................................................................... 19 3.3. AMENAZAS ACTUALES ................................................................................................. 53 3.4. CONTRAMEDIDA ACTUAL EN ESPAÑA FRENTE AGENTES NEUROTÓXICOS: AUTOINYECTOR ....................................................................................................................... 55 4. OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO ................................................ 63 4.1. OBJETIVO PRINCIPAL ................................................................................................... 65 4.2. OBJETIVOS SECUNDARIOS .......................................................................................... 65 4.3. PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO ................................................................................... 65 5. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................. 81 5.1. MATERIAL .................................................................................................................... 83 5.2. MÉTODOS .................................................................................................................... 84 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 95 6.1 FABRICACIÓN DE MUESTRAS DE F1, F2, DIAZEPAM Y MIDAZOLAM .......................... 97 6.2 CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO BAJO ESTUDIO DE ESTABILIDAD .................... 98 6.3 MUESTREO DE LAS DIFERENTES CONDICIONES .......................................................... 99 6.4 RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN DEL MÉTODO POR HPLC ...................................... 104 6.5 RESULTADOS DEL ANÁLISIS POR HPLC ...................................................................... 108 6.6 EVALUACIÓN Y DISCUSIÓN DE LAS DOS FORMULACIONES MULTICOMPONENTE ... 119 7. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 124 8. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................. 128 9. ANEXOS .......................................................................................................................... 149 2 3 1. RESUMEN / SUMMARY 1.1. RESUMEN DESARROLLO GALÉNICO Y EVALUACIÓN DE FORMULACIONES MULTICOMPONENTE PARA AUTOINYECTORES CONTRA AGENTES QUÍMICOS DE GUERRA (NEUROTÓXICOS) Introducción En estos últimos años la posibilidad de exposición a agentes químicos de guerra, en particular a agentes neurotóxicos, no es algo tan improbable. La exposición a estos agentes puede producirse en operaciones militares como los conocidos ataques de Siria en 2013, o en el ámbito civil como el caso Navalni en 2020. También puede darse una exposición accidental como el bote de colonia, en un parque en Amesbury (Reino Unido) en 2018. Cualquier incidente con agentes NRBQ (nucleares, radiológicos, biológicos o químicos) causa un gran pánico y caos en la población, llegando a provocar en ciertas ocasiones un gran colapso en los sistemas de salud. Por ello, se acentúa la necesidad de desarrollar contramedidas sanitarias efectivas, terapias farmacológicas que contrarresten los efectos indeseables que causan los agentes neurotóxicos. El tratamiento frente a intoxicaciones por organofosforados ha sido tema de estudio durante décadas. El enfoque principal en el desarrollo de tratamientos efectivos se ha centrado en los agentes altamente tóxicos como sarín, tabún, somán, VX y Novichok, presentando entre ellos una alta variabilidad en sus propiedades fisicoquímicas, toxicodinámicas y toxicocinéticas. La terapia más efectiva durante años se ha basado en un componente antimuscarínico como la atropina para disminuir los efectos colinérgicos, usada conjuntamente con la administración de una oxima que sea lo suficiente nucleofílica para reactivar la acetilcolinesterasa, como pralidoxima, obidoxima o HI-6, y un tercer compuesto del grupo de las benzodiacepinas para contrarrestar las convulsiones sobre el sistema nervioso central como el diazepam o el midazolam. En España, desde la década de los 90, se dispone de un sistema autoinyector que contiene atropina y oxima, y en 2015 se amplió con uno nuevo de benzodiacepinas, debiéndose administrar ambos autoinyectores en caso de intoxicaciones agudas por agentes neurotóxicos. En otros países, también se ha intentado desarrollar autoinyectores multicomponentes con tres principios activos en una misma forma farmacéutica1–4; lo que discierne, es el uso de diferentes principios activos dentro de la misma familia, basándose en la doctrina sanitaria militar de cada país, y en las características de estabilidad de los principios activos dentro de la forma farmacéutica. Objetivos y resultados Esta tesis tiene dos objetivos principales. El primer objetivo consisitió en evaluar la estabilidad de las benzodiacepinas, el diazepam y el cloruro de midazolam en el envase primario del autoinyector, con juntas de estanqueidad de diferente composición (unas clásicas de clorobutilo -PH 701/50 BLACK- y otras más nuevas de bromobutilo -4023/50 GRAY-), comprobando la adsorción de estos principios activos en el envase primario. 4 El segundo objetivo de esta tesis era optimizar la estabilidad química de dos disoluciones multicomponente contra agentes neurotóxicos. La disolución F1 contenía sulfato de atropina, cloruro de pralidoxima y cloruro de midazolam; mientras que la disolución F2 tenía sulfato de atropina, cloruro de obidoxima y cloruro de midazolam. Las variables estudiadas en el experimento fueron las siguientes: las juntas de estanqueidad del envase primario (PH 701/50 BLACK y 4023/50 GRAY), el pH de la disolución (3 ó 4) y la temperatura de almacenamiento (4 °C durante 12 meses, 25 °C durante 36 meses y 40 °C durante 9 meses). Además, para poder llevar a cabo la cuantificación de los diferentes principios activos, se desarrollaron y validaron dos métodos mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El primero de ellos se usó para separar y cuantificar el fármaco en las muestras de diazepam y midazolam y el segundo método para determinar la estabilidad de los diferentes principios activos de autoinyector multicomponente en un único análisis. Conclusiones La formulación de diazepam fue más estable que la formulación de midazolam, siendo el pH un factor clave en la estabilidad de ambos principios activos. Por otro lado, las juntas de estanqueidad de bromobutilo han demostrado tener una menor adsorción del principio activo, lo que es favorable ya que existe más fármaco disponible en solución. En el estudio de preparación de disoluciones multicomponente, se evidenció la inestabilidad del cloruro de midazolam en las condiciones y variables estudiadas, no cumpliendo las condiciones exigidas en cuanto a riqueza de formulaciones inyectables. Sin embargo, el cloruro de pralidoxima si que cumplió con los criterios de estabilidad. El comportamiento demostrado por el sulfato de atropina y el cloruro de obidoxima en algunos puntos experimentales tanto “a tiempo real” como en “condiciones aceleradas” indica que es necesario mejorar la formulación original en futuras investigaciones con el fin de lograr mejorar su estabilidad fisicoquímica. El efecto de las diferentes juntas de estanqueidad y el pH de la disolución no tuvieron un impacto significativo en la estabilidad fisicoquímica del autoinyector multicomponente. 5 1.2. SUMMARY GALENIC DEVELOPMENT AND EVALUATION OF MULTICOMPONENT FORMULATIONS FOR AUTO-INJECTORS AGAINST CHEMICAL WAR AGENTS (NEUROTOXICS) Introduction Lately, the possibility of exposure to chemical warfare agents, specifically neurotoxic agents is not so unlikely. This exposure can take place during military operations such as the well-known attacks in Syria in 2013, or in a civil sphere such as the Navalni case in 2020. It can also occur as accidental exposure such as the bottle of cologne in a park in Amesbury (United Kingdom) in 2018. Any incident caused by NRBQ (Nuclear, Radioactive, Biological or Chemical, NRBQ) can lead to great panic and chaos in the population, causing a collapse in the health systems. For this reason, the need to develop effective health countermeasures, pharmacological therapies that counteract the undesirable effects caused by neurotoxic agents, is accentuated. Treatment against organophosphate poisoning has been the subject of study for decades. The main focus in developing effective treatments has been on highly toxic agents such as sarin, tabun, soman, VX, and Novichok which have a high variability among their physicochemical, toxicodynamic, and toxicokinetic properties. The most effective therapy for years is based on an antimuscarinic component such as atropine to decrease cholinergic effects, used in conjunction with the administration of an oxime that is nucleophilic enough to reactivate the acetylcholinesterase, such as pralidoxime, obidoxime, or HI-6 along with a third compound from the group of benzodiazepines to counteract seizures on the central nervous system such as diazepam or midazolam. In Spain, since the 1990s, an auto-injector system containing atropine and oxime has been developed, and in 2015, a new auto-injector for benzodiazepines was developed; both autoinjectors should be administered in case of acute poisoning by neurotoxic agents. In other countries, the development of multicomponent autoinjectors with three active ingredients in the same dosage form is not a novel idea1–4; what discerns is the use of different active principles within the same family, based on the military health protocol of each country, and the stability characteristics of the drugs within the pharmaceutical dosage form. Objectives and results This thesis has two main objectives. The first objective was to assess the stability of benzodiazepines, diazepam and midazolam chloride, in the primary packaging of the autoinjector with sealing gaskets of different compositions (conventional ones consisting of chlorobutyl -PH 701/50 BLACK- and a newer one made of bromobutyl -4023/50 GRAY-) and to check the adsorption of these drugs in the primary packaging. The second aim was focused on developing a multicomponent autoinjector formulation against neurotoxic agents and evaluating its pyhsicochemical stability. One formulation contained (F1) atropine sulfate, pralidoxime chloride, and midazolam chloride; while F2 was consisting of atropine sulfate, obidoxime chloride, and midazolam chloride. The following variables were taken into consideration the sealing joints of the primary packaging (PH 701/50 BLACK and 6 4023/50 GRAY), the pH of the solution (3 or 4), and the storage temperature (4 °C for 12 months, 25 °C for 36 months and 40 °C for 9 months). Additionally, two HPLC methods were developed to quantify diazepam and midazolam and also to separate and quantify all the drugs of the multicomponent autoinjector in a single analysi. Conclusions The diazepam formulation was more stable than the midazolam formulation. This can be attributed to pH differences between solutions. On the other hand, bromobutyl gaskets showed less adsorption of benzodiazepines. During the second study, the degradation of midazolam chloride under the studied conditions and variables was significantly high leading to instability of the multicomponent auto-injectable formulation, not meeting the required conditions in terms of drug content; pralidoxime chloride met the stability criteria; however, the behavior demonstrated by atropine sulfate and obidoxime chloride in some samples in "real-time" and "accelerated" conditions showed that the formulation must be improved in terms of physicochemical stability for future research. No significant differences were found between the sealing joints and the pH between formulations. 7 2. CÓDIGO DE ABREVIATURAS ACh: Acetilcolina. AChE: Acetilcolinesterasa. ANPAQ: Autoridad Nacional para la Prohibición de Armas Químicas. ATNAA: Antidote treatment nerve agent autoinjector (Autoinyector frente agentes nerviosos). BBB: Barrera hematoencefálica. BuChE: butirilcolinesterasa. CAQ: Convención para la prohibición de Armas Químicas. CEMILFARDEF: Centro Militar de Farmacia de la Defensa. CBRN: Defensa nuclear, radiológica, biológica y química. CWAs (chemical warfare agents): Armas Químicas de Guerra. EPI NRBQ: Equipo de protección individual NRBQ. FAS: Fuerzas Armadas Españolas. GA: Tabún. GB: Sarín. GD: Somán. GF: Ciclosarín. ICH: Comité Internacional de Armonización. IM/im: Intramuscular. IV/iv: Intravenoso. NRBQ: Nuclear, radiológico, biológico y químico. RFE: Real Farmacopea Española. SNC: Sistema nervioso central. OP: Organofosforados. OPAQ: Organización para la Prohibición de Armas Químicas. OTAN: Organización del Tratado del Atlántico Norte. PVDF: membrana de fluoruro de polivinilideno. TIC: Químicos Industriales Tóxicos. WWI: Primera Guerra Mundial. WWII: Segunda Guerra Mundial. 8 Introducción 9 Exposición de Auschwitz en el Centro de Exposiciones Arte Canal de Madrid, 2018. 3. INTRODUCCIÓN Introducción 10 Introducción 11 3.1. ARMAS QUÍMICAS 3.1.1. HISTORIA DEL USO DE ARMAS QUÍMICAS El empleo de sustancias tóxicas como armas se remonta su uso a varios miles de años. Está relacionado con los métodos tradicionales de caza, incluido el uso de armas envenenadas (flechas, lanzas), la contaminación del agua (estanques, pesca) o la intoxicación de animales con productos tóxicos procedentes de la combustión5,6. La primera práctica intencionada documentada de productos químicos (como armas) ocurrió en el 423 a.C., cuando los espartanos sitiaban ciudades atenienses quemando maderas impregnadas de azufre para producir nubes sulfurosas7. La guerra química a gran escala empezó con la Primera Guerra Mundial (WWI, 28 julio 1914 – 11 noviembre 1918) con el desarrollo de la industria química alemana; diferentes compuestos químicos fueron usados como agentes irritantes, mostazas y neumotóxicos8,9, alrededor de 45 tipos (18 letales y 27 más o menos irritantes)8. Se conoce que, durante los últimos meses de 1914, los agentes irritantes usados por Alemania y Francia causaron efectos mínimos. Pero el 22 de abril de 1915, las tropas alemanas lanzaron los primeros ataques de gas tóxico (agentes neumotóxicos) a gran escala en Ypres (Bélgica), usando 6.000 botellas que liberaron 168 toneladas de cloro a lo largo de 4 millas de primera línea, afectando a 15.000 soldados y matando a 5.000 soldados británicos, franceses y canadienses. El cloro (Cl2) siendo el primer agente químico usado, fue el único compuesto usado en su estado elemental como gas de guerra10. Es un gas amarillo-verdoso, dos veces más denso que el aire, con olor irritante y desagradable, causando espasmos de laringe, quemadura en ojos, nariz y garganta, bronquitis y asfixia11. Figura 1. Ataque alemán con bombonas de cloro en 1915 (Fuente: Exposición de Auschwitz en el Centro de Exposiciones Arte Canal de Madrid, 2018). Con este primer ataque por cloro, los aliados empezaron a usar poco después máscaras de protección7,8. Al final de 1915, otro nuevo compuesto fue incluido en la guerra por Fritz Haber, el fosgeno, usado por las tropas alemanas. El fosgeno (COCl2) o cloruro de carbonilo, es un gas incoloro con olor a heno rancio; ataca a los pulmones, causando edema y muerte10. En mayo de 1916, los alemanes empezaron a usar difosgeno (C2Cl4O2), mientras que los franceses dos meses más tarde intentaron con cianuro de hidrógeno (HCN, también conocido como ácido cianhídrico) y cianuro de cloro (CNCl), pero al ser menos denso que el aire no consiguieron su utilidad en el campo de batalla11. Introducción 12 En julio de 1917, cerca de Ypres, se usó por primera vez el gas mostaza (C₄H₈Cl₂S) por las tropas alemanas, desde entonces se empezó a llamar Iperita8,12. Este ataque marcó el comienzo de una nueva era en la guerra química, ocasionando sobre 15.000 bajas británicas en tres semanas10. Este compuesto era persistente y permanecía sobre los objetos largo periodo de tiempo, provocando que fuera indispensable la protección sobre todo el cuerpo, ya que, tras varias horas del inicio a la exposición producía ampollas11. Tanto los vesicantes como los Químicos Industriales Tóxicos (TIC) usados durante la WWI, se encontraban disponibles en la industria química de la época. Al demostrarse que estos agentes eran efectivos a nivel táctico, se investigó y desarrolló el inicio de “Programas de Armas Químicas de Guerra”7. Estos programas intentaron obtener sustancias químicas que fueran efectivas en batalla por sus propiedades físico-químicas y toxicológicas, aunque ellas no se usaran en el campo de la industria9. Durante la Primera Guerra Mundial, se liberaron aproximadamente 124.200 toneladas de armas químicas de guerra (cloro, fosgeno, mostazas, etc) causando al menos 1,3 millones de heridos, de los cuales más de 90.000 fallecieron (un 80% de fosgeno)8,11. Se llegó a la conclusión, que la efectividad de las armas químicas en comparación con las armas clásicas era evidente: 1 tonelada de explosivos clásicos causó 4,9 heridos, 1 tonelada de munición química causó 11,5 heridos y 1 tonelada de iperita causó 36,4 heridos5,8. La gran cantidad de heridos causados por el uso de armas químicas durante la WWI y las peligrosas consecuencias para humanos y el medio ambiente, provocó que en Junio de 1925, dieciséis países firmaran el “Protocolo de Ginebra” para la “Prohibición del uso en guerra de asfixiantes, tóxicos y otros gases y métodos bacteriológicos”8,11,13. Durante la Guerra del Rif (1921-1926) en la zona ocupada por los españoles en Marruecos, las fuerzas españolas lanzaron proyectiles de gas y bombas mostaza sobre los rifeños14. En 1935, Italia usó armas químicas durante la invasión a Etiopía, en un primer momento lanzaron bombas con agentes mostazas y después rociaron desde aviones de forma experimental polvo sobre la superficie14. Japón uso armas químicas contra las fuerzas chinas durante el comienzo de la segunda guerra sino-japonesa en 1937. Los informes indican que los japoneses usaron agentes mostaza, lewisita, fosgeno, cianuro de hidrógeno y gases lacrimógenos dentro de bombas, proyectiles y botes de humo14,15. La aparición de agentes nerviosos fue justo antes de la Segunda Guerra Mundial por científicos alemanes. Se potenció el estudio y producción de plaguicidas para proteger los cultivos alemanes de vid de la propagación del escarabajo polixena, realizándose en la industria alemana nazi (IG Farbenindustrie)7,12,16,17. El “tabún” (compuesto organofosforado fluorado: N,N- dimetilfosforamidocianidato de O-etilo) fue desarrollado en 1936 por Gerhard Schrader, al realizar una investigación de insecticidas para IG Farbenindustrie, pero fue abandonado su uso como insecticida por su gran toxicidad en humanos, por una contaminación del propio Schrader y su personal de laboratorio7,14,18–20. Por otro lado, el “sarín” (metilfosfonofluoridato de O- isopropilo) fue sintetizado en 1938, y su nombre es un acrónimo que provenía de sus descubridores: Schrader, Ambrose, Rudringer y Van der Linde12,18. Entre 10.000 y 30.000 tonelada de tabún y 5-10 toneladas de sarín fueron producidas durante la Segunda Guerra Mundial. El tercer agente neurotóxico alemán fue el “somán” (metilfosfonofluoridato de O- Introducción 13 pinacolilo), sintetizado en 1944 por el Dr. Richard Kuhn, pero no se desarrollaron instalaciones de producción a gran escala7,16,19. Etil sarín (isopropiletilfosfonofluoridato) y ciclosarin (ciclohexil metilfosfonofluoridato) fueron sintetizados al mismo tiempo, el ciclosarin es más potente y persistente que el sarín21. Al comienzo de la Segunda Guerra Mundial (WWII, 1 septiembre 1939 – 2 septiembre 1945), el ejército alemán llenó bombas, proyectiles y cohetes con tabún y lo almacenaron, pero finalmente no lo usaron en la guerra y parece que fue arrojado al mar Báltico11,16. En toda Europa prevaleció la moderación mutua y se minimizó el uso de agentes de guerra química, salvo en la campaña de Japón donde se utilizaron cantidades significativas contra China5,8,21. Los únicos incidentes a tener en cuenta con armas químicas durante la WWII fueron: el bombardeo de 17 buques estadounidenses por aviones alemanes en el puerto de Bari (Italia), de los cuales, uno de ellos se encontraba transportando municiones químicas (100 toneladas de gas mostaza), causando más de 1.000 bajas de militares y un número similar de bajas civiles22,23; por otro lado el uso de monóxido de carbono y cianuro de hidrógeno (Zyklon B) para el exterminio del pueblo judío en los campos de concentración de Auschwitz, Mauthausen y Sachsenhausen creados por Hitler5,11,12. Figura 2. Lata de Zyklon B (Fuente: Exposición de Auschwitz en el Centro de Exposiciones Arte Canal de Madrid, 2018). Cuando los aliados descubrieron estos agentes nerviosos al final de la guerra, finales de 1945, la División Técnica del Servicio de Guerra Química de EE. UU. propuso unificar la nomenclatura de los agentes neurotóxicos de guerra mediante un código de dos letras24. A propuesta de la División de Instrucción se utilizaría la letra “G” (German, “alemán”) seguida de otra letra, empezando por la “A” y saltándose el código GC para no confundirlo con el CG del fosgeno. Así, el tabún se denominaría “GA”, el sarín “GB”, y el somán “GD”7. En 1952, científicos británicos de Imperial Chemical Industries (ICI) sintetizaron un agente nervioso más potente, mientras buscaban sustituir el diclorodifeniltricloetano (DDT), el Dr. Ranajit Ghosh y J.F. Newman sintetizaron el VX (O-etil-S(2-diisopropilamino-etil)-metil- fosfonotiolato), un compuesto que acabaría siendo el más eficaz y potente de los agentes de guerra químicos conocido. Esta sustancia fue entregada a EE. UU. para uso militar, y se le denominó “venomous agent X”(VX)12,19. Una fuga de este producto mató a 6.000 ovejas cerca de una base militar en Skull Valley, Utah en 19688,18. Los rusos desarrollaron un agente nervioso similar, una variable referida como VR o “VX ruso”, y también apareció el “VX chino” (CVX)25,26. Las armas químicas también tuvieron protagonismo más tarde en la Guerra Civil en Yemen (1963-1967)14,27, y en la Guerra entre Irán e Irak (1980-1988) donde se usaron mostazas azufradas, tabún y sarín28–30. Los soviéticos fueron acusados de usar este tipo de armas entre 1979-1989 en Afganistán, y en 1995 por las fuerzas serbias en Bosnia. También en la Guerra de Vietnam (1955-1975) fueron heridos más de un millón de vietnamitas y americanos con el agente “Naranja” (una mezcla de dos herbicidas)8. Entre 1970s y 1990s la Unión Soviética desarrolló en secreto una nueva generación de agentes nerviosos, la cuarta generación de armas químicas, conocidos como Novichok (A-230, A-232, A- Introducción 14 234, A-242 y A-262)31,32. El primer agente, denominado A-230, fue desarrollado en 1973 y consistía en un compuesto organofosforado derivado del ácido fosfónico (enlace fósforo- carbono), al igual que los agentes neurotóxicos de la serie G y V con nitrógeno. En 1975, se estudiaron más de cien variantes del A-230, de las cuales sólo cinco resultaron tener una estabilidad adecuada. Uno de ellos, el A-232, era de especial interés, porque no era un derivado del ácido fosfónico, sino del ácido fosfórico32. En 1976, pruebas realizadas con animales en Shikhany, tanto para el A-230 como el A-232, mostraron entre cinco y ocho veces mayor toxicidad que el VX. En 1993 se descubrió el Novichok-7, diez veces más potente que el somán32. A finales del siglo XX, diferentes grupos terroristas hicieron uso de armas químicas como lo sucedido en Japón por la secta Aum Shinrikyo, que hasta en dos ocasiones usaron gas sarín para atentar. El primero fue en Matsumoto en 1994, en una zona residencial donde diseminaron sarín con la ayuda de un calefactor y un ventilador de coche para vaporizar el agente y dispersarlo, matando a 7 personas e hiriendo a más de 60033,34. El otro ataque sucedió en el metro de Tokio en 1995, diseminando sarín líquido contenido en bolsas de plástico con agujeros, los agentes goteaban desde la bolsa y se evaporaban, miles de usuarios del metro fueron expuestos al agente tóxico. En este ataque murieron 12 personas y resultaron heridas más de 5.00035–38. 3.1.2. DEFINICIÓN Un “agente químico de guerra” según la AMedP-7.1, es un compuesto químico destinado a ser utilizada en operaciones militares para matar, herir gravemente o incapacitar al personal a través de sus efectos fisiológicos. El término excluye agentes antidisturbios, herbicidas y sustancias que generan humo y fuego39. Según la Convención para la Prohibición de Armas Químicas (CAQ), se define como sustancia química tóxica a toda sustancia química que, por su acción química sobre los procesos vitales, pueda causar la muerte, la incapacidad temporal o lesiones permanentes a seres humanos o animales por sus propiedades tóxicas40. Según la CAQ, se define como “arma química de guerra” (de ahora en adelante también CWAs)40: a. Las sustancias químicas tóxicas o sus precursores, salvo cuando se destinen a fines no prohibidos por la convención, siempre que los tipos y cantidades de que se trate sean compatibles con esos fines; b. Las municiones o dispositivos destinados de modo expreso a causar la muerte o lesiones mediante las propiedades tóxicas de las sustancias especificadas en el apartado a) que libere el empleo de esas municiones o dispositivos, o c. Cualquier equipo destinado de modo expreso a ser utilizado directamente en relación con el empleo de las municiones o dispositivos especificados en el apartado b). Las armas químicas de guerra es una de las mayores amenazas en la civilización moderna, debido a la expansión del terrorismo poniendo en peligro a cualquier país del mundo41. Estos agentes se pueden obtener fácilmente, aumentando enormemente la complejidad y extensión de la amenaza total. Como por ejemplo, el uso de fábricas de insecticidas organofosforados con fines ilícitos en la producción de agentes neurotóxicos42. La liberación de agentes químicos de guerra puede realizarse por medios convencionales o no convencionales, causando grandes lesiones y contaminación42. Un sistema de liberación fiable, Introducción 15 que produzca una diseminación efectiva, puede ser incluso más difícil de obtener que el propio agente, el cual no sea inactivado por el efecto térmico de la explosión5,9. El uso de estos compuestos en ciertos lugares públicos (como aeropuertos, ciudades, puertos…) lo convierten en puntos especialmente vulnerables para ser atacados42. Desafortunadamente, en la definición de “Armas de Destrucción masiva” las Armas Químicas de Guerra también forman parte, definiéndose como “armas explosivas atómicas, armas con material radiactivo, armas químicas y biológicas letales, y cualquier arma que se desarrolle en el futuro que tenga unas características comparables en efecto destructivo a las de la bomba atómica u otras armas anteriormente mencionadas” (Definición realizada por la ONU en septiembre de 1947)7,13. 3.1.3. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DE LOS AGENTES QUÍMICOS Las propiedades físicas de los agentes químicos afectan al estado en el que se pueden encontrar en el medio ambiente: gaseoso, líquido o sólido. Su presión de vapor varía de alto a insignificante, su densidad de vapor varía desde más ligero que el aire hasta más pesado. El rango de olor puede variar de inexistente a muy picante o característico. Los agentes pueden ser solubles o insolubles en agua y esto tiene un impacto directo de su efecto sobre la mucosa húmeda y los signos y síntomas tempranos39. El uso del término “gas de guerra” es un término poco apropiado. Las mostazas azufradas y los agentes neurotóxicos son líquidos a temperatura ambiente, y también los agentes antidisturbios. Estos compuestos son dispersados en forma de aerosol para aumentar su eficiencia, lo que probablemente lleva a confusión con los gases. Algunas armas químicas (como cloro, fosgeno, cianuro de hidrógeno) son gases en estado natural, y aunque se consideran obsoletos en su uso en la guerra, pueden ser usados como agentes improvisados especialmente por ataques terroristas43. La volatilidad de las CWAs líquidas genera aparición de gases tóxicos al evaporarse. La volatilidad es inversamente proporcional a la persistencia (Figura 3), y la tendencia de permanecer en el medio ambiente43. Figura 3. Gráfico de comparación de persistencia con ejemplos ilustrativos39. Introducción 16 Se define como persistencia a la duración en tiempo en el que un agente químico sigue siendo un peligro. Los agentes con un alto punto de ebullición y baja presión de vapor tienden a ser “persistentes”, mientras que los agentes con un bajo punto de ebullición y alta presión de vapor tienden a ser “no persistentes o volátiles”. Los agentes persistentes continúan presentando un peligro durante períodos considerables después de la liberación, al permanecer como un peligro de contacto o al evaporarse durante un período más largo o en una temperatura más cálida (como el día o la primavera) produciendo un peligro por inhalación39,44. 3.1.4. RUTAS DE ENTRADA Hay que tener presente que los agentes químicos de guerra tienen muy buenas propiedades de absorción y capacidad de penetrar en diferentes materiales (madera, caucho, tela, piel y similares). Por lo tanto, todo material contaminado con agentes químicos de guerra, son una fuente importante de intoxicación45–47. Los CWAs entran al cuerpo por distintas vías42,48:  Vía respiratoria: la inhalación de gases, vapores y aerosoles pueden ser absorbidos a través de la mucosa de las vías respiratorias superiores e inferiores incluyendo nariz, boca, garganta y/o alvéolos de los pulmones.  Vía cutánea: vapor, líquido, gotas y partículas sólidas puede ser absorbido por la superficie de la piel, ojos y las membranas mucosas. Las heridas y abrasiones son más susceptibles de la absorción que la piel intacta. Hay factores adicionales que afectan a la absorción como la oclusión de la piel contaminada y los ambientes cálidos y húmedos.  Vía oral: por contaminación de comida y agua puede ser absorbido a través del tracto gastrointestinal. 3.1.5. CLASIFICACIÓN DE LAS ARMAS QUÍMICAS DE GUERRA Los agentes químicos se pueden clasificar en base a diferentes criterios como la toxicología y antídotos, lugar de acción, acción fisiológica o uso militar. Aunque también se pueden clasificar de manera tradicional, no tradicional, agentes precursores de CWAs, componentes militares y TIC o estatus legal39. A continuación, se indica de las principales clasificaciones químicas tradicionales NRBQ (en cursiva las basadas en la Primera Guerra Mundial)39: a. Agentes nerviosos o neurotóxicos (organofosforados). b. Vesicantes (“agentes generadores de ampollas”). c. Agentes pulmonares (“agentes asfixiantes”). d. Cianuros (“agentes sanguíneos”). e. Agentes incapacitantes. f. Agentes antidisturbios (RCA). g. Agentes basados en medicamentos (PBA). h. Agentes fumígenos y agentes incendiarios militares. En algunos casos, la denominación describe mecanismos incorrectos como por ejemplo cianuros (“agentes sanguíneos”) no afectan directamente a la sangre. Introducción 17 Agentes Principales representantes Dispersión Mecanismo de acción Efectos en el organismo Neumotóxicos Cloro (Cl) Cloropicrina (PS) Fosgeno (CG) Difosgeno (DP) Gas Absorción a través de los pulmones, acilación de proteínas que regulan la permeabilidad de la membrana alveolar Lesiones en el sistema respiratorio que van desde irritación de la nariz hasta edema pulmonar y muerte Cianurados (hemotóxicos) Ácido cianhídrico (AC) Cloruro de cianógeno (CK) Arsina (SA) Gas Absorción a través de los pulmones y la piel, inhibición de la citocromo oxidasa mitocondrial, impidiendo que las células utilicen oxígeno La capacidad de las células afectadas por la ausencia de oxígeno provoca daños en órganos vitales, incluidos SNC, sistema cardiovascular y respiratorio Vesicantes Mostazas azufradas (H, HD) Mostazas nitrogenadas (HN) Lewisita (L) Oxima fosgeno (CX) Líquido Aerosol Vapor Polvo Absorción a través de los pulmones y la piel, alquilación de distintas moléculas que regulan el buen funcionamiento de las células Lesiones de los tejidos con los que entran en contacto, (piel, mucosas y ojos). En la piel aparecen ampollas. Si hay absorción, aparecen efectos radiomiméticos en la médula ósea Neurotóxicos Tabún (GA) Sarín (GB) Soman (GD) Ciclosarin (GF) VX Novichok Líquido Aerosol Vapor Polvo Absorción a través de los pulmones (serie G) y contacto con la piel (VX). Inhibición de la acetilcolinesterasa Se altera el normal funcionamiento del SNC y periférico por la acumulación de acetilcolina Incapacitantes BZ LSD Gas Depresores o estimulantes del SNC Producen efectos físicos o mentales temporales durante horas o días. Principalmente alucinaciones Antidisturbios Gas lacrimógeno (CS) Spray de pimienta (OC) Líquido Aerosol Absorción a través de pulmones, piel y ojos. Irritantes rápidos Según el tipo, predomina la acción lacrimógena, emética o estornutatoria Tabla I. Principales agentes químicos de guerra "clásicos"7,40. Los Productos Químicos Industriales Tóxicos (TIC) normalmente están considerados fuera de la clasificación tradicional de agentes químicos, pero en el pasado muchos TIC han sido usados en distintas guerras, como cloro, fosgeno, cianuro de hidrógeno, etc. No están prohibidos por la Convención para la Prohibición de Armas Químicas debido a su uso en industrias civiles. Algunos de ellos son, en términos operativos, muy importantes porque pueden ser usados como precursores en la fabricación de agentes químicos o productos de descomposición, o efectos semejantes5,39. 3.1.6. PROPIEDADES TOXICOLÓGICAS No todos los individuos y especies reaccionan del mismo modo frente a una cantidad de agentes. Además, los estudios toxicológicos estiman que los efectos biológicos son potenciales a las distintas vías de exposición39. En la siguiente tabla (Tabla II) se puede observar la LD50 y LCt50 de algunas armas químicas, mostrando su potencial toxicológico. Introducción 18 AGENTE LD50 (mg) LCt50 (mg.min.m-3) Cloro (Cl) - 13.500 Cloruro de cianógeno (CK) - 4.700 Cianuro de hidrógeno (AC) 7.000 (piel) 2.600 Lewisita (L) 2.800 (piel) 1.200 (inhalación) Fosgeno (CG) - 1.500 Ricina 0,34 (mg/Kg) - Sarín (GB) 1.7000 (piel) 33 Somán (GD) 350 (piel) 33 Mostaza azufrada (HD) 1.400 (piel) 1.000 (inhalación) 5-10.000 (piel)* Tabún (GA) 1.500 (piel) 70 VX 3 (piel) 12 *LCt50 disminuye con temperatura ambiente creciente (ejemplo, mayor de 29 °C). - Dosis letal 50 (LD50): es una estimación estadística de la dosis que causa la muerte del 50% de la población expuesta. - Producto concentración-tiempo de exposición letal medio (LCt50): es el producto de la concentración de una sustancia química en el aire y el tiempo de exposición que es mortal para el 50% de la población expuesta. Tabla II. Comparación de LD50 y LCt50 incluyendo algunas toxinas39. 3.1.7. LA CONVENCIÓN PARA LA PROHIBICIÓN DE ARMAS QUÍMICAS La principal herramienta de control frente a la proliferación de armamento químico fue la conocida “Convención sobre la Prohibición del Desarrollo, la Producción, el Almacenamiento y el Empleo de Armas Químicas y sobre su Destrucción” (CAQ), que entró en vigor el 29 de abril de 1997, pero que empezó su negociación en 1972 en Genova40,49. La Convención es un tratado internacional por el que se prohíbe el desarrollo, la producción, el almacenamiento, la transferencia y el empleo de armas químicas, y se dispone además la destrucción de estas armas en un plazo de tiempo específico40. Esta Convención tiene carácter único, pues constituye el primer tratado multilateral destinado a prohibir toda una categoría de armas de destrucción masiva y a velar por la verificación internacional de su destrucción. Asimismo, se trata del primer tratado de desarme negociado en un marco completamente multilateral, en pro de una mayor transparencia y de su aplicación por igual en todos los Estados Partes. Actualmente, la Convención cuenta con 193 Estados Partes, estando España incluido dentro de esta Convención; hay un país que ha firmado, pero no ratificado (Israel), y 5 países que no han firmado (Angola, Egipto, Corea del Norte, Siria y Sudán). Los Estados que no han firmado la Convención y los firmantes que no han presentado su instrumento de ratificación están sometidos a restricciones de comercio exterior40. De su aplicación internacional se encarga la “Organización para la Prohibición de Armas Químicas” (OPAQ), como organismo encargado de velar por el cumplimiento de la Convención, con sede en La Haya (Países Bajos). Todos los firmantes son miembros de la OPAQ40. Figura 4. Organización para la Prohibición de Armas Químicas. Introducción 19 Se han declarado más de 72.300 toneladas de armas químicas (incluidos precursores) y se han destruido alrededor de las 72.100 toneladas40, más de 6.000 inspecciones se han llevado a cabo y se les ha entregado el Premio Nobel de la Paz en 201349. A nivel nacional, la Autoridad Nacional para la Prohibición de Armas Químicas (ANPAQ) de cada Estado Parte es la encargada de velar por el cumplimiento de las disposiciones de la Convención en su territorio y es el enlace nacional con la OPAQ y con los demás Estados Partes de la Convención. El ANPAQ en España es un órgano colegiado de la Administración General del Estado adscrito al Ministerio de Asuntos Exteriores y de Cooperación. Cuyas actividades se encuentran recogidas en la Ley 49/1999 y Real Decreto 78/2019, sobre medidas de control de sustancias químicas susceptibles de desvío para la fabricación de armas químicas50. 3.2. AGENTES NEUROTÓXICOS 3.2.1. DEFINICIÓN Los agentes neurotóxicos, también conocidos como agentes nerviosos, son compuestos organofosforados altamente tóxicos en dosis pequeñas. Son similares en acción a los insecticidas organofosforados, pero más potentes, de mayor acción y con una tendencia a ser irreversible después de un tiempo6,16,42. Los agentes nerviosos actúan sobre las colinesterasas (por ello su nombre), y afecta sobre receptores nicotínicos y muscarínicos51. Contienen un átomo de fósforo central unido a tres heteroátomos19. La diversidad estructural se debe a los diferentes sustituyentes en el átomo tetraedral de fósforo. Los sustituyentes en 1R y 2R son alquilo, alcoxi, alquiltio o grupos amino, y el sustituyente en 3R es un residuo acilo lábil (grupo haluro, ciano, fenol o tio), conocido como el grupo saliente26,29,52. Todos tienen al menos dos enantiómeros, salvo el somán que tiene cuatro. Los estereoisómeros juegan un papel crucial en el rango de toxicidad de cada compuesto52,53. Tabla III. Compuestos inhibidores de la AChE (NA: Agentes nerviosos, pesticidas)54. Introducción 20 3.2.2. CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES NEUROTÓXICOS Los agentes nerviosos pueden ser clasificados en dos grandes grupos: - “Agentes G”: son todos los derivados del éster del ácido fosfónico conteniendo unos un radical cianuro y otros un radical fluoruro55. Se conoce como serie “G” en la nomenclatura militar utilizada por los países de la OTAN porque se ha considerado como una abreviatura de “German”(alemán), y la segunda letra es el código (“A”, “B” y siguientes) identificando el orden en el cual estos compuestos fueron descubiertos e identificados analíticamente por las Fuerzas Aliadas55. Se engloba el tabún, sarín, somán y ciclosarín, los cuales, se caracterizan por ser volátiles, presentando amenaza en su estado vapor y líquido, sin embargo, tienen baja persistencia en campo abierto. - “Agentes V”: el VX es un éster del ácido fosfónico con un radical sulfuro, se sintetizó por primera vez en Reino Unido. Se conoce como serie “V” por la palabra “Venom” (veneno)55. Se encuentra VX, VE, VM, CVX (isómero chino) y R-VX (VR, isómero ruso), se caracterizan por su insignificante volatilidad con alta persistencia en el medio ambiente, incrementando su toxicidad. Hay un tercer grupo que ha nacido recientemente, Novichok-5 y Novichok-7, son agentes nerviosos binarios que llegan a ser letales después de mezclarse, por separado ambos componentes son benignos. Su toxicidad supera de 10 a 100 veces más que un agente nervioso convencional26. Los agentes neurotóxicos pueden ser considerados como las CWAs más importantes por su alta toxicidad y su alta versatilidad para uso táctico. Esta alta versatilidad es atribuida al hecho de que, aunque todos los agentes nerviosos son líquidos a temperatura ambiente, algunos pueden ser considerados agentes persistentes (como VX) por su baja volatilidad, sin embargo, otros pueden ser considerados no persistentes (como sarín) por su alta volatilidad. Los agentes persistentes suelen ser usados contra objetivos sin interés ocupacional que debe estar contaminado durante un periodo de tiempo. Al contrario, los agentes no persistentes deberían evaporarse rápidamente y serían de elección contra objetivos que necesitan ser ocupados9,16. Hay estudios que marcan la relativa letalidad de los agentes nerviosos (basado en estudios con animales) obteniéndose el siguiente orden de mayor a menor letalidad VX>somán>sarín>tabún56. El somán es considerado como uno de los más tóxicos debido a su alta lipofilia y alta afinidad por la AChE cerebral, causando rápido envejecimiento de la AChE cuando se compara con sarín, el cual es menos lipófilo, aunque su afinidad por la AChE cerebral es alta también57. La intoxicación por somán es difícil de contrarrestar debido a que induce en corto periodo de tiempo convulsiones epilépticas y daño cerebral58. 3.2.3. PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS El aspecto de los agentes nerviosos puede variar desde líquidos incoloros a líquidos con un tono marrón claro. Algunos son volátiles, mientras que otros no se volatilizan a temperatura ambiente. La mayoría son inodoros, aunque algunos presentan un ligero olor a fruta. Las soluciones acuosas no tienen sabor39,42,55. En concreto, los agentes G son líquidos viscosos de volatilidad variada (densidad de vapor relativa entre 4,86 y 6,33) con olores leves (“ligeramente afrutado” o “picante”, “olor a alcanfor”). El agente VX es un líquido coloreado de tono ámbar con una densidad de vapor de 0,2; y es inodoro39,55 (Tabla IV). Introducción 21 La electrofilicidad del átomo de fósforo es crucial para las acciones biológicas de los OP. Los organofosforados que tienen dobles enlaces entre los átomos de fósforo y oxígeno son altamente electrofílicos en el átomo de fósforo y, en consecuencia, son altamente reactivos. Los grupos que mejoran la reactividad del átomo de fósforo son nitro, ciano, halógeno, cetona y éster carboxílico. Los grupos desactivadores incluyen hidroxilo y ácido carboxílico26. Parámetro GA GB GD GF VX Nº CAS 77-81-6 107-44-8 96-64-0 329-99-7 50782-69-9 Nombre químico O-Etil-N,N- dimetilamido cianofosfato Isopropil metilfosfono- fluoridato Pinacolil metilfosfono- fluoridato O-ciclohexil metilfosfono- fluoridato S-(2-diisopropil- aminoetil) O-etil metil fosfonotiolato Nombre común Tabún Sarín Somán Ciclosarín VX Fórmula química C5H11N2O2P C4H10FO2P C7H16FO2P C7H14FO2P C11H26NO2PS Masa molecular (g/mol) 162,1 140,1 182,17 180,2 267,4 Estado físico Líquido, vapor Líquido, vapor Líquido, vapor Líquido, vapor Líquido oleoso, vapor Presión de vapor (mm Hg) 0,04 (20 °C) 2,10 (20 °C) 0,27 (20 °C) 0,056 (20 °C) 0,0007 (20 °C) Volatilidad (mg/m3 a 25 °C) 610 22.000 3.900 548 a 20°C; 817 a 25°C 10,5 Densidad líquido (g/ml) 1,08 (25° C) 1,10 (20 °C) 1,01 (20 °C) 1,1327 (20 °C) 1,006 (20 °C) Densidad vapor (aire=1) 5,63 4,86 6,33 6,20 9,20 Punto de fusión (°C) - 50 - 56 - 80 - 30 - 20 Punto de ebullición (°C) 245 ̴147 167 239 298 Solubilidad en agua 98 g/L (25 °C); 72 g/L (20 °C) Miscible ̴20 g/L (25 °C) 0,37% (20 °C) 30 g/L (25 °C) Vida media hidrólisis (20 °C) ̴8,5 h (pH 7) ̴7 h (pH 4-5) 39-41 h (pH 7) 80 h 80-83 h (pH 7) 45 h (pH 6,65) 42 h ̴30 días (pH 7) Olor Ligeramente a fruta, sin olor cuando está puro Inodoro en estado puro Afrutado, olor a alcanfor cuando está impuro Perceptible, afrutado, sin olor en estado puro Sin olor en estado puro Tabla IV. Propiedades físicas y químicas de los Agentes Nerviosos Organofosforados16,19,55,59. Los agentes nerviosos presentan una presión de vapor y una toxicidad aguda suficientemente elevada en estado vapor, siendo rápidamente letales. Dentro de la serie G, se considera que GB es el más peligroso en estado vapor (el orden de peligro en estado vapor aproximadamente es GB>GD>GF>GA). El agente VX fue diseñado deliberadamente para que tuviera baja volatilidad, es aproximadamente 2.000 veces menos volátil que el GB. Aunque no es muy volátil, los vapores de VX (si es posible acumularlos) tienen sin embargo mayor potencia que los agentes G55. Hay pocos datos que caracterizan a los agentes VE (O-etil-S-[2-(dietilamino)etil]etilfosfonotiato, Nº CAS 21738-25-O) o VM (O-etil-s-[2-(dietilamino)etil]metilfosfonotiato, Nº CAS 21770-86-5)55. En general, los agentes nerviosos son moderadamente solubles en agua con hidrólisis lenta entre pH 4 y pH 7, mientras que en soluciones fuertemente alcalinas las agentes G son degradados rápidamente, altamente solubles en lípidos y se inactivan rápidamente por álcalis fuertes y cloración6,39. Debido a esa lipofilicidad, se prevé que tengan un gran volumen de distribución, distribuyéndose rápidamente en tejido graso (donde están protegidos del Introducción 22 metabolismo), representando toxicidad adicional al ser capaces de penetrar la barrera hematoencefálica (BBB)60,61. Existe amenaza frente a la persistencia de los agentes neurotóxicos en el medioambiente. La degradación de todos ellos está correlacionado con el pH y con la temperatura del medio en el que se encuentren, que es directamente proporcional a la presión de vapor como a la densidad de vapor59. En la siguiente tabla se observa la persistencia de los diferentes AN en el medioambiente62. Agente Persistencia Tabún Líquido esparcido de 1 a 2 días. En agua 1 día (20 °C) y 6 días (5 °C). Sarín Se evapora tan rápido como el agua. Somán En forma de líquido esparcido de 1 a 2 días. Los espesantes pueden aumentar tiempos. Ciclosarín En forma de líquido esparcido de 1 a 2 días. VX En forma de líquido esparcido puede persistir durante semanas o meses (se evapora 2.000 veces más lento que el sarín). Tabla V. Persistencia de agentes neurotóxicos62. Los factores meteorológicos son importantes, en el caso de la existencia de aire, el viento puede dispersar agentes volátiles. Por otro lado, una temperatura ambiente más alta, aumenta la volatilidad y disminuye la persistencia. Además, algunos agentes pueden congelarse en la ropa y luego vaporizarse si se llevan dentro. La lluvia tiende a diluir el agente, reduciendo su toxicidad y promoviendo su hidrólisis, lo que lleva a su inactivación63. 3.2.4. RUTAS DE EXPOSICIÓN Los agentes nerviosos pueden ser absorbidos a través de cualquier superficie del cuerpo39,42,48. Los G fueron inicialmente diseñados para actuar vía inhalación, mientras que los V actúan inicialmente por penetración a través de la piel. Sin embargo, pueden ser absorbidos a través de cualquier capa de células epiteliales, como tracto respiratorio o gastrointestinal, así como las conjuntivas6. Dependiendo de su estado físico, las rutas de exposición que se ven afectadas varían:  Estado vapor: las vías de exposición más probables son la percutánea y la inhalación48, cuanto más volátil sea el agente, como es el caso del sarín, mayor probabilidad de intoxicación por vía inhalatoria que por vía percutánea48,55. Cuando se dispersa como vapor, inicialmente es absorbido a través del tracto respiratorio, con un efecto local en el árbol respiratorio, además tiene un efecto local en el ojo. Es la ruta de absorción más rápida y efectiva39.  Estado spray o aerosol: las gotas pueden ser absorbidas a través de la piel, ojos, tracto gastrointestinal y tracto respiratorio39,42,48. Cualquier aerosol que se haya depositado sobre la piel permanecerá hasta que se elimine o se absorba, y la posibilidad de una intoxicación por vía percutánea aumentará dependiendo de la volatilidad del agente en cuestión. E igualmente, cuanto mayor presión de vapor de un AN, mayor sería el peligro de intoxicación por vía inhalatoria48. Aun así, el mayor efecto de cualquier AN en estado aerosol es la miosis.  Estado líquido: pueden ser absorbidos a través de la piel, ojos, boca, y mucosas de la nariz. Normalmente después de una exposición a través de la piel, existe un periodo de Introducción 23 latencia con efectos locales al principio y después aparecerán los efectos sistémicos. La piel expuesta produce sudoración y/o contracciones musculares (fasciculaciones). El efecto en el ojo por la exposición a un líquido provoca un efecto similar a la miosis, y normalmente una hiperemia conjuntival. Los efectos sobre las mucosas incluyen contracciones del músculo subyacente y secreciones glandulares39,42. Los agentes V se consideran mayor amenaza por vía percutánea55. Los agentes nerviosos pueden además ser absorbidos a través del tracto gastrointestinal cuando se ingiere comida o agua42. La rapidez con la cual aparecen los efectos es directamente proporcional a la cantidad de agente absorbida en un periodo de tiempo determinado y la vía de absorción. Si se absorbe suficiente agente, los efectos locales son seguidos por efectos sistémicos generalizados18,39,42. A continuación, se detalla un cuadro con los riesgos de exposición de los diferentes NA: Tabla VI. Riesgos de exposición de los principales neurotóxicos47. No hay que perder de vista que en el desarrollo de contramedidas médicas (tratamiento), se observa que es probable que las diferentes rutas de exposición tengan diferentes requisitos para un tratamiento efectivo. Hay una “ventana de oportunidad” limitada para la administración de terapia inmediata después del agente inhalado. Las señales de intoxicación se desarrollan en minutos y si la terapia se administra con signos de intoxicación y a intervalos de 15 minutos, si no persisten los signos, es probable que los niveles terapéuticos de los medicamentos permanezcan en el torrente sanguíneo después de que el agente haya sido metabolizado. En contraste, si es intoxicación por vía percutánea, la aparición de signos será más lenta y puede no aparecer durante algunas horas. Si la terapia se toma con signos y a intervalos de 15 minutos a partir de entonces, es probable que el agente continúe siendo absorbido después de que los niveles del medicamento hayan caído por debajo de los niveles terapéuticos y se requiera más asistencia médica y gestión sanitaria64. El período de latencia entre la exposición y el inicio y progresión de los signos y síntomas depende de dos cosas: dosis absorbida y ruta de exposición. La exposición en forma líquida de Parámetro GA GB GD GF VX Vx TWA 0,00002 ppm 0,00002 ppm 0,000004 ppm 0,00001 ppm 0,0000009 ppm 0,0000009 ppm IDHL 0,03 ppm 0,03 ppm 0,008 ppm 0,03 ppm 0,002 ppm 0,002 ppm LC50 2 ppm 1,2 ppm 0,9 ppm 0,05 ppm 0,3 ppm 0,3 ppm LD50 1 g/persona 1,7 g/persona 0,35 g/persona 0,35 g/persona 0,01 g/persona 0,01 g/persona Rutas Inhalación Dérmica Ingestión Inhalación Dérmica Ingestión Inhalación Dérmica Ingestión Inhalación Dérmica Ingestión Inhalación Dérmica Ingestión Inhalación Dérmica Ingestión Distancia de evacuación (m: millas) Inicial: 700 pies DW día: 1,2 m DW noche: 5,5 m Inicial: 700 pies DW día: 1,2 m DW noche: 5,5 m Inicial: 700 pies DW día: 1,2 m DW noche: 5,5 m Inicial: 700 pies DW día: 1,2 m DW noche: 5,5 m Inicial: 700 pies DW día: 1,2 m DW noche: 5,5 m Inicial: 700 pies DW día: 1,2 m DW noche: 5,5 m TWA (Time-Weighted Average): es el promedio de la concentración de un químico que un trabajador normal puede estar expuesto continuamente durante un día laboral normal de 8 horas y una semana de 40 horas sin mostrar cualquier efecto adverso. IDLH (Immediately Dangerous to Life or Health): representa la concentración máxima expresada en ppm o mg/m3 a la cual, en caso de fallo o inexistencia de equipo respiratorio, se podría escapar en un plazo de 30 minutos sin experimentar síntomas graves ni efectos irreversibles para la salud. DW: distancia de evacuación a favor del viento. Introducción 24 agentes nerviosos tendrá un periodo de latencia de unos 30 minutos más o menos, aunque unos efectos moderados de unas gotas de VX sobre la piel puede tardar unas 18 horas en aparecer42. Las primeras 4-6 horas son las más crítica en la intoxicación aguda con OP. Si hay una mejoría en síntomas después del tratamiento inicial, es muy probable que el paciente sobreviva si se continua con el tratamiento adecuado65. 3.2.5. TOXICOCINÉTICA Los estudios toxicocinéticos junto con los estudios toxicodinámicos de los agentes nerviosos, proporciona una base cuantitativa para el diseño de nuevas estrategias contra la intoxicación frente agentes neurotóxicos66,67. Estos estudios han permitido estrategias en las cuales la colinesterasa fosforilada es reactivada con oximas, normalmente en combinación con la administración de depresores del sistema nervioso central para suprimir convulsiones y otros efectos centrales, además de la administración de antagonistas colinérgicos muscarínicos como la atropina66. La toxicocinética de los AN depende de múltiples condiciones, como las propiedades fisicoquímicas del tóxico (por ejemplo, hidrofobicidad, carga, isómero y peso molecular), su dosis y concentración, y su reactividad química y estabilidad. Además, la ruta de exposición es un parámetro crucial que afecta a la efectividad de la incorporación y al tiempo de distribución dentro de un organismo67(Figura 5). Figura 5. Etapas elementales de la toxicocinética de AN en mamíferos67. Las diferentes etapas de la toxicocinética de los AN en el organismo son29,67: Introducción 25 a. Invasión: Puede ser por cualquiera de las siguientes barreras (piel, ojos, pulmones o tracto gastrointestinal) por su estructura lipofílica. b. Distribución: una vez que los AN han penetrado a la sangre, se distribuye por todo el cuerpo, incluso atravesando la barrera hematoencefálica, causando toxicidad dentro del SNC y SNP. También se acumula particularmente en tejidos grasos. c. Biotransformación y eliminación: las enzimas del plasma y los tejidos son principalmente responsables de la hidrólisis de los AN produciendo derivados de los ácidos fosfóricos y fosfónicos caracterizados por su alta solubilidad en agua y su poca toxicidad. Los agentes G son rápidamente hidrolizados, mientras que los tipo V son más estables frente a la hidrólisis enzimática, aunque puede sufrir transformación por oxidación del nitrógeno, azufre o ambos. (véase Tabla IV “vida media hidrólisis”). c.1. Hidrólisis enzimática: las enzimas que hidrolizan los AN separan el grupo reactivo (F o CN) del átomo de fósforo central, cambiando el grupo nuceofílico por un hidroxilo. Estas enzimas se encuentran presentes en plasma, y más extendido en riñón e hígado, facilitando la eliminación del tóxico de la circulación. c.2. Formación de aductos proteicos: en el organismo hay numerosas proteínas que permiten formar enlaces covalentes con los AN, contribuyendo a la destoxificación. Las serin-esterasas son los objetivos principales de los AN provocando la formación de un aducto irreversible. c.3. Excreción: los riñones juegan un papel principal en la eliminación de estos tóxicos, más que el hígado. Sin entrar mucho en detalle en esta tesis, los agentes nerviosos tienen niveles toxicológicos relevantes. Después de estudios basados en mediciones toxicocinéticas de estos agentes con una variedad de rutas de exposición a diferentes dosis, se determinó con ello el periodo de tiempo por el cual los niveles tóxicos agudos aparecen. Se ha demostrado la relevancia de tales estudios, ya que la resistencia del agente nervioso in vivo es más larga de lo previsto, siendo la exposición percutánea a VX la más notable. Es evidente que estos estudios pueden usarse para el desarrollo de estrategias para la administración oportuna de antídotos66. 3.2.6. MECANISMO DE ACCIÓN 3.2.6.1. COLINESTERASAS Décadas de investigación han permitido aceptar una amplia visión de las colinesterasas como una familia de enzimas que hidrolizan los ésteres de colina , como la acetilcolina (llamada a partir de ahora como ACh) (Figura 6), que es el neurotransmisor responsable de la conducción del impulso nervioso a los lugares de la transmisión colinérgica, terminando así la neurotransmisión en el sistema nervioso central, uniones neuromusculares y el sistema nervioso autónomo68–70. Una única enzima es capaz de hidrolizar 6 x 105 de moléculas de ACh por minuto26,71. Introducción 26 Los componentes de la familia de las colinesterasas comparten más del 50% de su secuencia homóloga y tienen patrones de plegado básicamente similares. Sin embargo, su especificidad tanto en sustrato como en inhibidor diferencia dos grupos distintos: “acetilcolinesterasa” (AChE; EC 3.1.1.7) la cual hidroliza principalmente la ACh (también conocida como “colinesterasa específica”) y “butirilcolinesterasa” (ChE o BuChE; EC 3.1.1.8) la cual es veinte veces menos eficaz que la AChE en la hidrólisis de ACh, pero puede hidrolizar un amplio rango considerable de sustratos (conocida como “pseudocolinesterasa” o “colinesterasa no específica”)68,72. La AChE es la colinesterasa principal en el sistema nervioso, sin embargo, la BChE se encuentra en altas concentraciones en el sistema periférico (plasma, hígado, fluido cerebroespinal y células gliales)68,73. Los efectos inhibidores de la AChE pueden ser fatales dependiendo de la dosis del tóxico, sin embargo, la inhibición de la BuChE no tiene consecuencias conocidas sobre la función normal del cuerpo65. Asimismo, los AN interactúan con otro tipo de enzimas de desintoxicación como carboxylesterasas (CarbE, E.C.3.1.1.1), tripsina (E.C.3.4.21.4), chimotripsina (E.C.3.4.21.1) y A- esterasas (arilesterasa y paraoxonasa). El grado de dichas interacciones (que puede variar de dos a cinco veces menos el perfil de selectividad frente a la inhibición producida a la AChE) puede alterar la magnitud y el alcance de la cascada tóxica después de la inhibición de la AChE55,72. Figura 7. Sinapsis colinérgica52. Figura 6. Mecanismo de hidrólisis de ACh por la AChE24. Introducción 27 Se encontró que las colinesterasas eran serina hidrolasas, pertenecientes a la superfamilia de pliegues α/β. Sus estructuras cristalinas tridimensionales revelaron un núcleo globular, penetrado por un surco estrecho (el "desfiladero") revestido de residuos aromáticos, en el fondo del cual se encuentra el lugar activo. Se han identificado varios puntos funcionales en el desfiladero del lugar activo: (i) la tríada catalítica, compuesta de ácido glutámico, histidina y residuos de serina, que catalizan la hidrólisis del sustrato mediante un mecanismo de transmisión de carga; (ii) la bolsa de acilo, que interactúa con el grupo acilo de los sustratos; y (iii) el sitio de unión de colina aniónica, que interactúa con los grupos catiónicos de los sustratos (Figura 8). Otro componente importante es el orificio de oxianión, que estabiliza el estado de transición al acomodar el oxígeno carbonílico cargado negativamente54,68. Figura 8. Esquema de AChE representándose el lugar catalítico activo y periférico aniónico41. El efecto tóxico está basado en la inhibición de la enzima AChE, es decir, inhibición de la hidrolisis del neurotransmisor ACh cargado positivamente, sustituyéndose por una unión del AN similar en el centro activo de la enzima53,74 (Figura 9), llevándose a cabo sobre todo en el sistema nervioso y en la membrana exterior de los glóbulos rojos. La inhibición se debe a la formación de un enlace covalente P-O en el lugar activo de la catálisis de la AChE, permitiendo la acumulación de la ACh en la sinapsis y consecuentemente estimulando los receptores colinérgicos, generando una crisis colinérgica en diferentes lugares de acción39,42. Introducción 28 Figura 9. Comparativa del mecanismo de acción de la AChE: dispone de un centro catalítico con un sitio de unión a éster (sitio éster) y un sitio aniónico. A1: La acetilcolina forma un enlace covalente con el aminoácido serina (Ser). Histidina (His) y Glutamina (Glu) estabilizan la transición química. La colina se separa. A2: el grupo acetilo se va, la enzima es regenerada. B1: Enlace de somán a AChE. Se forma un enlace covalente entre el fósforo y la Ser, mientras se separa el fluoruro. B2: Entonces hay dos caminos alternativos: administración temprana de oximas pueden dividir el enlace covalente y regenerar la enzima, pero después del envejecimiento (escisión del alquilo grupo del oxígeno que está unido al fósforo) las oximas son ineficaces74. Como se ha indicado en la anterior figura, tras la fosforilación la enzima es inactivada y puede desembocar en alguno de los siguientes tres procesos75–79 (Figura 10):  Hidrólisis endógena de la enzima fosforilada, retornando su actividad esterasa (Fig 10 paso 1).  Reactivación por un potente nucleófilo (como una oxima) (Fig 10, paso 3).  “Envejecimiento” produciéndose cambios bioquímicos que estabilizan la molécula fosforilada inactiva (Fig 10 paso 4). Figura 10. Inhibición de la AChE por los agentes nerviosos: después de la formación reversible del complejo entre AChE y OP (paso 1), la serina activa (lugar esteárico, E-OH) es fosforilado; la reacción permite la salida del grupo X (paso 2). La enzima fosforilada puede ser reactivada por un agente nucleofílico como una oxima (paso 3); el agua es un nucleófilo bastante débil para una reactivación espontánea rápida. La enzima fosforilada puede sufrir una dealquilación a través de la ruptura del puente alquil-oxígeno, provocando una inactivación irreversible de la enzima “envejecimiento” (paso 4). El desplazamiento directo del aducto envejecido (paso 5) se piensa todavía que es imposible80. Introducción 29 Según se observa en la Figura 10, la recuperación de la función enzimática depende de la resíntesis (hidrólisis endógena, paso 3) de la AChE, el cual es un proceso relativamente lento (aproximadamente 1-3% por día en humanos) 61,65,75, pero la adición de un fuerte nucleófilo (tal como una oxima) puede acelerar varios niveles de magnitud79. Una vez que el complejo AN-AChE desemboca al estado “envejecimiento” (Fig 10, paso 4), la reactivación de la AChE inhibida no es posible (ni por reactivación espontánea ni por oximas), debido a la pérdida de un grupo alquil o alcoxi en la escisión del enlace alquilo-oxígeno55,65,79,81. Los tiempos de envejecimiento varían según el AN (Tabla VII), el GD envejece rápidamente a 1,3 minutos cuando se une a las colinesterasas de los glóbulos rojos. El GA es de 46 horas aproximadamente, GB es 5-12 horas y el VX no envejece significativamente (aproximadamente 48 horas)55,79. ENVEJECIMIENTO GA 46 horas GB 5 horas GD 2 minutos VX > 48 horas Tabla VII: Tiempos de envejecimiento según agente39. La variación en la toxicidad aguda del OP es el resultado de sus diferentes estructuras químicas, ratios de reactivación espontánea y envejecimiento29,65. En algunos estudios, se detallan razones optimistas que mejorarán el enigma de la reactivación del aducto AChE-OP envejecido, basado en un esfuerzo en conjunto entre el diseño, la bioquímica y la química computacional76. 3.2.6.2. RECEPTORES COLINÉRGICOS Los receptores colinérgicos están divididos en muscarínicos y nicotínicos, en base de su sensibilidad a la estimulación farmacológica por muscarina y nicotina respectivamente. Ambos receptores son diferentes en fundamento, los receptores muscarínicos utilizan un segundo sistema de mensajería, mientras que los nicotínicos, son canales iónicos activados por ligando16. Según el receptor colinérgico al que llega el AN y su vía de absorción, se describe en la siguiente tabla (Tabla VIII) un resumen de signos y síntomas. Aunque en el apartado 3.2.7. “Efectos clínicos” se podrá observar otras clasificaciones según los signos y síntomas. Introducción 30 Mecanismo Lugar de acción Signos y síntomas* Muscarínico tras la absorción local (dependiendo de la dosis) Pupilas Miosis marcada Cuerpo ciliar Dolor de cabeza frontal, dolor ocular al enfocar, visión borrosa Mucosas nasales Rinorrea, hiperemia Árbol bronquial Opresión en el pecho, broncoconstricción, aumento de secreción, tos Gastrointestinal Náusea y vómito ocasional Muscarínico seguido de absorción sistémica (dependiendo de la dosis) Árbol bronquial Opresión en el pecho, con espiraciones prolongadas de sibilancias por broncoconstricción o aumento de la secreción, disnea, dolor en el pecho, aumento de la secreción bronquial, tos, cianosis, edema pulmonar Gastrointestinal Anorexia, náusea, vómito, calambres abdominales, opresión epigástrica y subesternal (cardioespamo) con “ardor de estómago” y eructos, diarrea, tenesmos, defecación involuntaria Glándulas sudoríparas Aumento de sudor Glándulas salivares Aumento de salivación Glándulas lagrimales Aumento de lagrimación Corazón Bradicardia** Pupilas Miosis, ocasionalmente desigual, más tarde miosis máxima (precisa) Cuerpo ciliar Visión borrosa, dolor de cabeza Vejiga Frecuente e involuntaria micción Nicotínico seguido de absorción local o sistémica Músculo estriado Fatiga, debilidad leve, espasmos musculares, fasciculaciones, calambres, debilidad generalizada / parálisis flácida con disnea y cianosis Ganglios simpáticos Palidez, elevación transitoria de la presión arterial seguida de hipotensión Sistema nervioso central (efectos muscarínicos y nicotínicos) Efectos agudos: debilidad generalizada, depresión del centro respiratorio y circulatorio con disnea, cianosis, hipotensión, convulsiones, pérdida de conciencia y coma Efectos a largo plazo: vértigo, tensión, ansiedad, temblores, inquietud, labilidad emocional, excesivo sueño, insomnio, pesadillas, dolores de cabeza, temblor, abstinencia y depresión, ráfagas de ondas lentas de tensión elevada en electroencefalografía, especialmente en hiperventilación, somnolencia, dificultad de concentración, lentitud en el recuerdo, confusión, dificultad para hablar y ataxia * Estos son los más comunes signos y síntomas – puede variar dependiendo del lugar de acción. ** Cardiovascular- La frecuencia cardiaca puede disminuir debido a la estimulación del nervio vago, pero a menudo aumenta debido a otros factores como el estrés, la hipoxia y la estimulación adrenérgica debido a la estimulación ganglionar. Por lo tanto, la frecuencia cardíaca puede ser alta, baja o en el rango normal. Se pueden producir bradiarritmias como bloqueo cardíaco de primer, segundo o tercer grado. La tensión arterial puede estar elevada debido al aumento del tono vascular simpático. Tabla VIII. Signos y síntomas por agentes nerviosos39,42,82 3.2.7. EFECTOS CLÍNICOS Introducción 31 El orden en el cual los signos y síntomas aparecen depende de la dosis y la vía de exposición, existe relación entre dosis-respuesta55,82. La duración de los efectos está determinada principalmente por las propiedades del compuesto: su liposolubilidad, la estabilidad del complejo OP-AChE y si es reactivable tras el uso de oximas65,82. La ruta de exposición a menudo está determinada por si el agente es un líquido o vapor. Con todo ello, los efectos clínicos tras la exposición son descritos en la siguiente tabla, junto con la duración de los efectos 39: Agente nervioso Tipos de efecto Vía de absorción Descripción de los efectos Tiempo de aparición de los efectos tras exposición Duración de los efectos Exposición media Exposición severa Vapor Local Pulmones Rinorrea, hiperemia nasal, opresión de pecho, sibilancias De uno a varios minutos Unas horas 1 – 2 días Vapor Local Ojos Miosis, hiperemia conjuntival, dolor de ojos, dolor de cabeza frontal De uno a varios minutos Miosis 24 horas 2 – 3 días Vapor Sistémico Pulmones Efectos muscarínicos, nicotínicos y en el sistema nerviosos central Menos de un minuto a unos pocos minutos después de una exposición moderada o severa De varias horas a un día Efectos agudos 2 – 3 días. Efectos en el SNC de días a semanas. Líquido Local Ojos Similar a los efectos del vapor Instantáneamente Similar a los efectos del vapor - Líquido Local Ingestión Gastrointestinal Sobre 30 minutos después de la ingestión De varias horas a un día 2 – 5 días Líquido Local Piel Fasciculaciones en el lugar de contacto 3 minutos – 2 horas 3 días 5 días Líquido Sistémico Pulmones Similar al vapor Varios minutos - 1 – 5 días Líquido Sistémico Ojos Similar al vapor Varios minutos - 2 – 4 días Líquido Sistémico Piel Fasciculaciones generalizadas y sudoración 15 minutos – 2 horas - 2 – 5 días Líquido Sistémico Ingestión Síntomas tempranos gastrointestinales 15 minutos – 2 horas - 3 – 5 días Tabla IX. Efectos locales y sistémicos de agentes nerviosos en forma de vapor y líquido39. Introducción 32 Según la gravedad de la intoxicación frente AN, los efectos pueden encuadrarse de forma específica83: Signos tóxicos Intoxicación por agentes nerviosos Miosis/lacrimación Leve Moderada Severa Fasciculaciones locales Hipersalivación/transpiración Náuseas Vómitos/defecación/micción Broncoconstricción/broncorrea Bradicardia /depresión circulatoria Depresión respiratoria Convulsiones Coma Tabla X. Signos de intoxicación por agentes nerviosos en relación con la gravedad de la intoxicación83. Los signos clínicos de intoxicación empiezan a ser severos sin haber una inhibición neuronal de AChE completa, tal vez entre el 75-90 % de la enzima inhibida53. El efecto más característico es la miosis, la miosis está asociado al primer efecto notable frente a la exposición de vapor de agentes G, debido a que su aparición sucede a concentraciones mucho más bajas que las necesarias para producir signos de toxicidad severos48. También se suma el dolor delante y detrás de los ojos por espasmo ciliar, cierta dificultad de acomodación para ver y cefalea frontal82. Figura 11. Signos y síntomas característicos en la intoxicación por OP (1: hipersecreción, 2: miosis, 3: mareo)84. Efectos agudos: Si se llega a una aparición total de todos los signos y síntomas se produce lo que se conoce como “crisis colinérgica”42. El control de la actividad convulsiva es crítico para la supervivencia y neuroprotección después de la exposición. Sin una intervención temprana, esta actividad convulsiva puede conducir a daños severos cerebrales y a la muerte84,85. Efectos altas dosis: La exposición a altas dosis ha demostrado un daño severo neuropatológico a nivel cerebral, afectando a la degeneración neuronal y necrosis de distintas partes del cerebro. Además, provoca alteraciones severas en el comportamiento y funciones cognitivas, especialmente en el deterioro del aprendizaje y la memoria, que puede persistir un largo tiempo después de dejar de estar expuesto al agente nervioso. Los efectos neurológicos y neurofisiológicos son detectables meses o incluso años después de recuperarse de una intoxicación aguda86. Efectos acumulativos: Exposiciones puntuales de manera repetida frente AN (a concentraciones insuficientes para producir síntomas) puede provocar síntomas fuera de tiempo (acumulativos). La exposición continuada, posiblemente durante varios días, puede estar seguido por el Introducción 33 incremento de efectos graves. Después de la exposición sintomática, incrementa la susceptibilidad por los efectos colinérgicos pudiendo persistir hasta 3 meses39,82. Efectos a largo plazo: Los efectos a largo plazo se encuentran escasamente documentados. Se han observado cambios mínimos en el electrocardiograma después de haber transcurrido un año tras la exposición a AN39. A largo plazo, también se han detectado déficits neuropsiquiátricos expuestos a bajos niveles de agentes neurotóxicos87. Efectos letales: En ausencia de tratamiento, la muerte es causada por asfixia resultante de la obstrucción del tracto respiratorio, parálisis de los músculos respiratorios y depresión central de la respiración. La respiración es superficial, laboriosa y rápida, y la víctima puede quedarse sin aliento. La cianosis aumenta39. 3.2.8. PROTOCOLO A SEGUIR EN UN INCIDENTE CON AGENTE NEUROTÓXICO Las primeras 4-6 horas son las más críticas tras una intoxicación aguda con AN. Si hay mejoría en síntomas después de un tratamiento inicial, es muy probable que el paciente sobreviva siempre que se continúe con el tratamiento adecuado53,88. Los elementos esenciales para prevenir y tratar una intoxicación por agentes neurotóxicos son42,77: 1. Colocarse la máscara protectora y la capucha ante los primeros indicios de un ataque por agente nervioso. 2. Administrar antídotos intramusculares tan pronto como se observen los primeros signos y síntomas. 3. Administrar un anticonvulsivante en intoxicados severos o en heridos que se observe convulsiones. 4. Sacar al intoxicado de la zona contaminada a zonas aireadas. 5. Eliminar o neutralizar líquidos contaminados inmediatamente. 6. Eliminar las secreciones de la vía respiratoria si están obstruyendo. Puede ser necesaria la succión de la vía respiratoria. 7. Eliminar la máscara al intoxicada y establecer una vía respiratoria (administrar ventilación asistida si se requiere). 8. Administrar oxígeno de manera suplementaria. Nunca se debe administrar antídotos antes de la exposición frente AN, ni por prevención. Hacerlo puede aumentar la absorción del AN por inhibición de la broncoconstricción y la secreción bronquial42. 3.2.9. TRATAMIENTO Dentro del ámbito NRBQ, los antídotos son productos farmacéuticos que contrarrestan los efectos que puede generar un agente químico, biológico, nuclear o radiológico a los intoxicados. Diferentes mecanismos de acción les caracterizan, en el caso de antídotos frente agentes químicos, pueden actuar revirtiendo el efecto del agente en el sitio de acción (toxicodinámica) como las oximas, o pueden actuar contrarrestando los efectos de la toxicidad del agente químico Introducción 34 (atropina y diazepam). Algunos otros antídotos, actúan para alterar la distribución o aumentar el metabolismo y la eliminación del producto químico (como los agentes quelantes)39. Los antídotos desarrollados para el tratamiento contra los AN se dividen en dos tipos39,42,89:  Pretratamiento (administración pre-exposición): se basa en proteger de la fosforilación a la serina activa de la AChE, la familia de los carbamatos (piridostigmina) son los más conocidos.  Tratamiento post-exposición: se combina tres fármacos (anticolinérgico, reactivador de la AChE y anticonvulsivante). Los principales principios activos usados como agentes anticolinérgicos (antídotos funcionales) que antagonizan los efectos de la acumulación de la ACh en la sinapsis colinérgica es la atropina, los reactivadores de la AChE (conocidos como oximas por su grupo funcional oxima) restauran la AChE inhibida por el OP inhibidor (antídotos causales). Los efectos de ambos son sinérgicos. Y por último sustancias activas como benzodiacepinas (diazepam, midazolam y avizafona) que son usados como anticonvulsivantes54. El tratamiento post-exposición debe ir acompañado de oxigenoterapia y ventilación asistida, siempre que sea necesario. Es importante retirar al individuo de la zona contaminada y llevar a cabo la descontaminación superficial lo antes posible82,90,91. La descontaminación es fundamental para el personal de rescate y personal sanitario, existe riesgo de que se produzca una contaminación secundaria, como ocurrió en los atentados de Japón33,92,93. Los intoxicados deben ser desprendidos de sus ropas y se pueden utilizar lavados corporales a base de soluciones alcalinas, como hipoclorito sódico al 0,5 %, los agentes neurotóxicos se hidrolizan rápidamente en medios alcalinos y sufren procesos de oxidación59. Como se ha indicado anteriormente, la unión entre un agente nervioso y la AChE es prácticamente irreversible en ausencia de un reactivador de la enzima. En el estado “envejecido” los reactivadores llegan a ser ineficaces. Este inconveniente ha sido mitigado, en parte, por el uso de carbamatos (unión reversible de AChE) como tratamiento previo (potenciadores del tratamiento)39. Todavía no hay antídotos declarados contra los agentes Novichok, pero se cree que las oximas comerciales como 2-PAM y HI-6 deberían funcionar31. 3.2.9.1. PRETRATAMIENTO 3.2.9.1.1. CARBAMATOS El pretratamiento permite que una fracción de la AChE permanezca oculta al agente fosforilante durante la fase aguda de la intoxicación94. Los carbamatos son unos compuestos que se unen mediante enlace covalente al lugar activo de la serina de la AChE, este enlace es relativamente lábil bajo condiciones acuosas. Posteriormente, la enzima es capaz de sufrir una descarbamilación espontánea, permitiendo la restauración de la actividad de la AChE95,96. Los patrones tradicionales de despliegue militar permiten una opción de pretratamiento y, aunque esto podría tener menor utilidad para las poblaciones civiles, los pretratamientos podrían ser considerado como un medio de proporcionar primeros auxilios con protección adicional97. Introducción 35 A) BROMURO DE PIRIDOSTIGMINA (bromuro de 3-dimetilaminocarboniloxi-N- metilpiridinio) El bromuro de piridostigmina es un derivado del ácido carbámico. Sintetizado por Urban y Schnider en 194598. Desde 1951 es la droga de elección frente a la Miastenia Gravis, en los ochenta se empieza a ver sus beneficios como pretratamiento frente agentes nerviosos99,100; y en 2003, la FDA aprobó su uso para el pretratamiento contra el somán101,102. Es el pretratamiento principal establecido en la mayoría de los países de la OTAN103,104. Se denomina pretratamiento y no profilaxis, debido a que la administración previa de bromuro de piridostigmina aumenta la eficacia del tratamiento posterior a la intoxicación por el agente neurotóxico103. Mecanismo de acción: La piridostigmina inhibe la AChE al formar un enlace covalente en el sublugar esteárico de la enzima, el cual, es responsable de la escisión del acetato y la colina. La inhibición consiste en un paso de carbamilación, en el cual, la piridostigmina transfiere su radical carbamato para activar el lugar del grupo hidroxilo de la serina de la AChE, y un paso de descarbamilación, en el cual, el grupo carbamilo es hidrolizado, permitiendo la recuperación de la actividad enzimática96. El complejo AChE-Piridostigmina ocasiona que, una vez en contacto con el agente neurotóxico, se disponga de una cantidad de AChE (15-40% de la AChE eritrocitaria) que no puede ser bloqueada (fosforilada) al estarlo ya por el carbamato. La descarbamilación gradual y espontánea del complejo AChE-piridostigmina, en paralelo con la eliminación del agente neurotóxico, liberará suficiente AChE consiguiendo que la estimulación colinérgica se normalice103,105. El complejo formado entre carbamato-AChE (con una vida media de 31-81 min106,107) rompe más rápidamente que el complejo OP-AChE39 (con una media mayor a 7 días108). Consecuentemente, el agente nervioso no unido se hidroliza rápidamente al encontrarse ocupado el lugar activo de la AChE100. Los carbamatos se suelen usar en combinación con terapia inmediata post-exposición. Especialmente, es efectivo en la unión contra el somán por su rápido “envejecimiento”105. Régimen de dosis: El tratamiento con piridostigmina está planteado para un corto período de tiempo, un comprimido de 30 mg de bromuro de piridostigmina cada 8 horas por vía oral, generalmente entre 14 y 28 días, aunque esto varía entre las distintas naciones y del estado de amenaza del AN. El pretratamiento debe interrumpirse al aparecer síntomas de intoxicación por agentes nerviosos después de un ataque químico, iniciándose la terapia post-exposición. No se debe usar después de la exposición, porque bloqueará toda la AChE, y como resultado puede agravar los efectos de la intoxicación por agente nervioso39,42. Figura 12. Estructura química del bromuro de piridostigmina (Nº CAS: 101-26-8). Introducción 36 Farmacocinética y farmacodinámica: la vida media en plasma tras administración oral es entre 6-8 horas109. Por otro lado, al ser una molécula con carga positiva (nitrógeno cuaternario), es incapaz de atravesar la BBB en circunstancias normales, solo protegiendo el sistema periférico89,105, por ello, se ha asociado a fármacos anticolinérgicos que penetran en la BBB para disminuir este problema y asegurar la neuroprotección110. No hay signos ni síntomas colinérgicos agudos significativos asociados a estos niveles de inhibición, ya que la inhibición de la enzima es más lenta que la debida al agente nervioso y existe una inhibición insignificante de la AChE central. Junto con la terapia inmediata, se obtiene una buena protección contra la letalidad dentro de las 2 horas de la primera dosis39,55. Efectos adversos: aparición de síntomas gastrointestinales como aumento de flatos, heces blandas, calambres abdominales y náuseas. Otros efectos que se pueda dar son la urgencia urinaria, cefalea, rinorrea, aumento de secreciones bronquiales, diaforesis y hormigueo de las extremidades. Todos estos efectos son tolerables por la mayoría y no conduciendo a una degradación significante del combatiente, y en uno o dos días se mejora39,103. Además, la experiencia clínica de más de cincuenta años no ha evidenciado la existencia de efectos adversos a largo plazo103. El bromuro de piridostigmina fue muy empleado durante la primera Guerra del Golfo, se han planteado interrogantes respecto a su relación con alteraciones en la salud sufridas por tropas americanas desplazadas en este conflicto. Se conoce como “Síndrome de la guerra del Golfo” (Gulf war illness-GWI) y se relaciona con la exposición concomitante a otros productos como pesticidas y repelentes de insectos (N,N-Dietil-meta-toluamida, conocido como DEET), productos organofosforados y sustancias tóxicas producidas por la combustión del petróleo en los incendios provocados en los pozos petrolíferos8,111,112. 3.2.9.2. POST-TRATAMIENTO La elección del tratamiento apropiado para una intoxicación con agentes neurotóxicos depende del agente, como de la concentración y la vía de exposición. Exposiciones bajas a vapores de agente neurotóxico puede necesitar solo descontaminación y observación del intoxicado, mientras que altas exposiciones a vapor o líquido requiere descontaminación inmediata, administración de antídotos, respiración artificial, monitorización y terapia de soporte desde las primeras horas a varios días55. La terapia inmediata frente a una intoxicación por agentes neurotóxicos está basada en un tratamiento farmacológico que implica el uso de1,26,39,55,77,113–115: a. Anticolinérgicos (antimuscarínicos) que antagonice los efectos muscarínicos. b. Oximas para reactivar la enzima inhibida y así corregir tanto efectos muscarínicos como nicotínicos. c. Benzodiacepinas para prevenir la actividad anticonvulsivante y proteger frente al posible daño en el SNC. Estudios experimentales han demostrado que un retraso de 12 minutos en la administración de atropina y oxima reduce el ratio de protección sustancialmente (LD50 con tratamiento/LD50 sin tratamiento), incluso en el caso de agentes nerviosos distintos al somán (véase Tabla XI )116. Introducción 37 Tiempo de inicio de terapia tras exposición Ratio de protección (95% límites de confianza) Sarín Somán VX 10 segundos 93,0 (56-157) 15,0 (9,5-23) 35,0 (21-57) 1 minuto 34,0 (30-46)a 13,0 (7,5-21) 28,0 (16-49) 4 minutos 12,0 (7,1-19)a 7,8 (5,5-11)a 12,0 (6,5-22)a 8 minutos 5,4 (3,8-7,7)a 4,7 (3,8-5,8)a 5,6 (3,8-8,3) 12 minutos --- 4,3 (3,0-6,2)a --- Nota: a Significativamente diferente (p < 0,005) del valor de 10 segundos. Tabla XI. Efectos del retraso de la terapia (iv atropina, pralidoxima, diazepam) sobre ratios de protección en cobayas que recibieron piridostigmina 30 min antes del agente nervioso116. En EE. UU., la “Agencia para Sustancias Tóxicas y el Registro de Enfermedades” (ATSDR) tiene estandarizado un protocolo de tratamiento con antídotos para la gestión de emergencias de protección civil (Tabla XII), muy similar al establecido en ámbito OTAN en incidentes terroristas. Edad paciente Antídotos Otro tratamiento Signos y síntomas leve/moderado a Signos y síntomas severos b Bebés (0-2 años) Atropina: 0,05 mg/Kg im ó 0,02 mg/kg iv Atropina: 0,1 mg/Kg im ó 0,02 mg/kg iv Es necesario ventilación asistida. Repetir atropina (2 mg im o 1 mg im para bebes) cada 5-10 minutos hasta que las secreciones han disminuido, la respiración es normal y la resistencia en vías respiratorias ha vuelto a la normalidad. La fentolamina para 2-PAM induce hipertensión (5 mg iv para adultos; 1 mg iv para niños). Diazepam para convulsiones (0,2 a 0,5 mg iv desde bebés a 5 años; 1 mg iv para niños mayores de 5 años; 5 mg iv para adultos). 2-PAM-Cl: 15 mg/Kg iv lentamente 2-PAM-Cl: 15 mg/Kg iv lentamente Niño (2-10 años) Atropina: 1,0 mg im Atropina: 2,0 mg im 2-PAM-Cl: 15 mg/Kg iv lentamente 2-PAM-Cl: 15 mg/Kg iv lentamente Adolescente (> 10 años) Atropina: 2,0 mg im Atropina: 4,0 mg im 2-PAM-Cl: 15 mg/Kg iv lentamente 2-PAM-Cl: 15 mg/Kg iv lentamente Adulto Atropina: 2,0-4,0 mg im Atropina: 6,0 mg im 2-PAM-Cl: 15 mg/Kg (1 g) iv lentamente 2-PAM-Cl: 15 mg/Kg iv lentamente Anciano, débil Atropina: 1,0 mg im Atropina: 2,0 mg im 2-PAM-Cl: 5-10 mg/Kg iv lentamente 2-PAM-Cl: 5-10mg/Kg iv lentamente a Signos y síntomas leve/moderados incluyen sudoración localizada, fasciculaciones musculares, nausea, vómito, debilidad y disnea. b Signos y síntomas severos incluyen inconsciencia, convulsiones, apnea, parálisis flácida. Tabla XII. Recomendaciones según el Protocolo de antídotos frente a emergencias en exposiciones a agentes nerviosos117. 3.2.9.2.1. ANTICOLINÉRGICOS El sulfato de atropina es el fármaco de elección para el tratamiento frente a las intoxicaciones por agentes nerviosos, aunque la escopolamina (hyoscina) puede ser usada también, además de la benactizina, biperideno o trihexifenidilo39. A) SULFATO DE ATROPINA (sulfato de bis [(2RS)-2-fenil-3-hidroxipropanoato de (1R,3r,5S)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-ilo] monohidrato) La atropina es un alcaloide de la Atropa belladona que fue aislado por Main en 1835. Fue utilizado por primera vez con éxito contra un agente inhibidor de colinesterasa por Fraser en Introducción 38 1863, y desde entonces ha seguido siendo la piedra angular de la terapia de intoxicación por OP26. La atropina es un alcaloide tropano con una estructura amina terciaria que permite que atraviese al sistema nervioso central. Los alcaloides de tropano contienen nitrógeno bicíclico, compuestos que se encuentran en la naturaleza en plantas de la familia de las Solanaceae y Erythroxylaceae, teniendo una larga historia en su uso como venenos y agentes terapéuticos51. Es un antagonista competitivo de receptores muscarínicos (M1-M5) tanto a nivel central como periférico51,118. Se presenta como polvo cristalino, blanco o casi blanco, o cristales incoloros, con un peso molecular de 695 g/mol, muy soluble en agua y fácilmente soluble en etanol al 96 %119. Normalmente, disponible como sal sulfato. Figura 13. Estructura química del sulfato de atropina (Nº CAS 55-48-1). La atropina fue elegida en los años 40 como antídoto estándar frente agentes nerviosos. La dosis de atropina necesaria para antagonizar estos agentes nerviosos es mucho menor que la necesaria para antagonizar insecticidas OP, en gran parte por sus diferencias farmacocinéticas. Los beneficios de añadir pralidoxima a la atropina fue descubierto en los años 50, y en los 60 la pralidoxima ya estaba establecida como antídoto estándar en adicción con atropina para estos agentes26,51. Mecanismo de acción: Bloquea el efecto del exceso de acetilcolina en los receptores muscarínicos como consecuencia de la inhibición de la AChE, produciendo alivio de los síntomas parasimpáticos que incluyen secreciones excesivas, espasmos, lacrimación, náuseas, broncoespasmo y bradicardia. Si se administra en grandes dosis, algunos efectos terapéuticos también se producen dentro del SNC, aunque por su baja lipofilia no penetra en la barrera hematoencefálica fácilmente, se cree que los receptores muscarínicos centrales no son idénticos a los de la periferia42. Sin embargo, se ha comprobado que la atropina no se une a los receptores nicotínicos, por ello, no hay un efecto directo en los receptores nicotínicos de ACh en la unión neuromuscular39,65,114,118. Se piensa que la atropina contrarresta la depresión respiratoria en la médula oblonga42. Es probable que tenga un papel en la prevención de la activación de neurotransmisores importantes en las etapas posteriores, más refractarias, como las convulsiones inducidas por agentes nerviosos39,42,77. Régimen de dosis: La dosificación estándar de atropina depende de la severidad de la intoxicación. La dosis inicial es de 2 mg en adulto (0,02 mg/Kg en un niño), vía iv o im, se estableció dicha cantidad porque puede revertir los efectos a bajas o moderadas Introducción 39 exposiciones73,120,121. Se repite cada 5-10 minutos hasta hiperatropinización (rubor, sequedad de boca, nariz, pulmones y piel, ritmo cardiaco entre 80-100/minuto, tensión sanguínea normal y midriasis)65. Se mantendrá esa dosis al menos hasta 24-48 horas después de la exposición, dependiendo de la necesidad del paciente39,122. Los pacientes con síntomas severos requieren un incremento de los niveles de atropina, para contrarrestar la resistencia de la vía respiratoria y disminución de las secreciones. La mayoría de los intoxicados no deben necesitar una dosis mayor a 20 mg aproximadamente en las primeras horas o máximo de 50 mg en un periodo de 24 horas42,90. Según la Organización Mundial de la Salud, de acuerdo al International Programme on Chemical Safety Evaluation (2002), en intoxicaciones severas por OP la dosis total de atropina administrada durante 5 semanas de tratamiento puede ascender hasta 30.000 mg. Farmacocinética y farmacodinámica: la atropina es absorbida rápidamente por la mayoría de vías de administración incluida la inhalación, oral e im123. Una inyección im de 2 mg alcanzará la eficacia máxima de 3 a 10 minutos42. En ausencia de agente neurotóxico la inyección im causará los efectos provocados por la atropina durante varias horas, sin embargo, en presencia del agente tóxico la duración de la acción del antídoto puede acortarse significativamente, requiriéndose dosis repetidas de atropina para lograr y mantener el efecto clínico deseado42. Signos de eficacia del tratamiento: Los signos de una atropinización exitosa incluyen disminución del broncoespasmo, reducción de la resistencia de las vías respiratorias, secado de las secreciones bronquiales y salivales, reducción de la sudoración y una estabilización en la frecuencia cardíaca de aproximadamente 90 latidos por minuto39,124. Si el corazón late muy rápido y la boca empieza a estar muy seca, el intoxicado ha recibido suficiente dosis de antídoto, el cual ha neutralizado los efectos peligrosos del agente nervioso. Si un intoxicado es capaz de andar y no tiene confusión ni desorientación, no necesita un segundo autoinyector. Y si se hace, puede causar incapacitación42. La desaparición de la miosis no debe usarse como objetivo final porque los agentes nerviosos pueden provocar un efecto local en el ojo39,114,125. Efectos adversos: A la dosis de 2 mg, aumenta la frecuencia cardiaca aproximadamente a 35 latidos/minuto, sequedad de boca, piel seca, midriasis y alteraciones oculares de alojamiento. Estos efectos pueden durar de 4 a 6 horas con la excepción de la visión borrosa, que puede persistir durante unas 24 horas121. La atropina, especialmente en presencia de hipoxia, puede hacer que el miocardio sea más susceptible a las arritmias. La sobredosis de atropina puede producir euforia, alucinaciones, ansiedad y delirio6,39. En ausencia de AN: Los efectos que causa la atropina en ausencia de AN incluye sequedad de piel, boca, garganta y leve dificultad para tragar. Además, puede tener una sensación de calor, leve enrojecimiento, pulso rápido, cierta indecisión al orinar y un deseo ocasional de eructar. Las pupilas pueden estar ligeramente dilatadas, pero reaccionan a la luz. En algunos individuos, puede haber somnolencia, lentitud de la memoria y disminución del recuerdo39,42,51. Estos síntomas no deberían interferir con la actividad ordinaria. Si se repite una segunda dosis de 2 mg de atropina dentro de la misma hora sin agente nervioso, los síntomas incrementan. Una tercera dosis de 2 mg de atropina (e igualmente sin agente nervioso) dentro de la misma hora incapacitará a la mayoría de la gente. Los efectos de la atropina sin agente neurotóxico pueden Introducción 40 durar de 3 a 5 horas después de la primera o segunda inyección y de 12 a 24 horas después de una severa sobredosis. Normalmente, los heridos se recuperarán totalmente en menos de 24 horas de una sobredosis de atropina. La sobredosis puede ser incapacitante, pero presenta poco peligro para la vida en un ambiente templado para el individuo estresado sin calor39,42. Si se traslada a ámbito militar, la dosis de atropina que se tolera bien en climas templados, puede ser muy incapacitante al interferir con el mecanismo de sudoración en ambientes cálidos, desérticos o tropicales o en individuos con estrés por calor. Esto puede reducir drásticamente la efectividad de combate de las tropas que han sufrido poco o ninguna exposición a un AN. Una dosis de atropina puede reducir eficiencia, dos dosis reducirá drásticamente la eficiencia del combate, y tres dosis incapacitará a las tropas durante varias horas42. Estabilidad química de la atropina en disolución: su degradación más habitual es a través de una reacción de hidrólisis espontánea no enzimática en soluciones acuosas, generando tropina y ácido trópico, los cuales no son tóxicos, pero no producen la actividad antimuscarínica deseada de la atropina126. Otro tipo de degradación puede ser por deshidratación de la molécula produciéndose apoatropina, y ésta a su vez puede sufrir hidrólisis produciendo ácido atrópico y tropanol, la dimerización de estos compuestos puede producir belladonina y ácido isatrópico, respectivamente. Esta dimerización solo ocurre en condiciones extremas, como altas temperaturas o después de largos períodos de tiempo sin estar en condiciones de almacenamiento normales127. Hubo un estudio realizado por Lund en 1968, en el cual calculó la vida media de una disolución acuosa de atropina llegando a los 1.700 años a un pH de 3,0 a 20 °C128. Otro estudio, predijo que la vida media podría ser 1.800 años a un pH de 4.0 y una temperatura constante de 20 °C129. Un aumento de temperatura de 10 °C redujo la vida media prevista a 473 años129,130. Por el contrario, semividas experimentales y calculadas de atropina a valores de pH >11,5 varió entre 18 y 137 minutos a temperaturas de 25 °C, 32,5 °C y 40 °C130. Y entre pH 8-10,5 a 40 °C varió de 3,4 a 116 horas130. Otro estudio demostró que a pH 4,5 la reacción catalítica predominante es de iones hidroxilo, por debajo de pH 3, la reacción catalítica es de iones hidrógeno, entre estos dos rangos, ambos iones contribuyen a hidrólisis129. El pH de máxima estabilidad para atropina en soluciones acuosas estériles varía entre 4,11 a 0 °C y 3,24 a 100 °C129. Hubo otros estudios de estabilidad en el caso de formulaciones multicomponente (sulfato de atropina, tremedoxime bromuro y benactyzine) en envases de plástico y vidrio, con condiciones de almacenamiento diferentes. Las muestras preparadas a pH 2,8 y almacenados bajo las siguientes condiciones: 80 °C durante 3 semanas, 65 °C durante 7 semanas, 52 °C durante 3 meses, a 40 °C (en una camisa de agua incubadora) durante 4 meses y en nevera a 5 °C durante 4 meses. No hubo pérdidas significativas de sulfato de atropina en cualquiera de las condiciones, aunque las impurezas no se analizaron específicamente131. En otro estudio para otra formulación multicomponente realizado por Clair et al., el sulfato de atropina se mantuvo estable durante un período de seis meses sin productos de degradación detectados, donde las muestras acuosas de atropina se mantuvieron a un pH 4 y temperaturas de 5 °C, 25 °C y 40 °C. Las pequeñas cantidades de tropina encontradas en las muestras sugirieron cierta degradación, aunque también era posible que hubiera algo de tropina incluida durante la fabricación2. Introducción 41 3.2.9.2.2. OXIMA En torno a 1955, investigadores de EE. UU.132 y Reino Unido133 publicaron que el compuesto piridinio pralidoxima (es decir, yoduro de 2-PAM) reactivaba eficazmente a las colinesterasas fosforiladas. Solo tres años después, Namba e Hiraki llegaron a la conclusión de que hasta aquel momento la intoxicación por alquilfosfatos había sido tratado principalmente con atropina, pero ahora la atropina debía ser reemplazada por la pralidoxima134. Los programas de investigación sobre oximas se iniciaron en la década de los 50 y todavía están en marcha. Inicialmente, la atención se centró en la identificación de una oxima que fuera eficaz contra el somán. Pero durante las siguientes dos décadas, el enfoque principal fue el desarrollo de oximas de amplio espectro que cubrieran la gama de estructuras diferentes de AN. Desafortunadamente, no se ha identificado tal compuesto41,78,135–138. Por lo que, en la actualidad, solo pralidoxima, obidoxima, TMB-4 y HI-6 se encuentran en uso139. El éxito de estos compuestos se logra por el ataque nucleofílico, siendo un compuesto estructuralmente similar a la estructura química de la ACh26,46. El ataque nucleofílico sucede sobre el átomo de fósforo de la enzima inhibida, debido a su alta afinidad de la enzima-oxima y su poderosa nucleofilicidad, eliminando el enlace del OP y recobrando la actividad catalítica de la enzima39,42,65. Las oximas se unen a la AChE como inhibidores reversibles y forman complejos con AChE en el lugar de acilación (catalítico), o en el lugar alostérico, o en ambos sitios de la enzima y protegen a AChE de la fosforilación. Cuando se une el inhibidor reversible al lugar de acción catalítico, la protección es debida a una competición directa entre OP y el inhibidor reversible65. La estructura química de la molécula del organofosforado afecta directamente a la unión de la oxima, porque el radical que se une en el átomo de fósforo aumenta que se obstaculice el acercamiento del grupo oxima, disminuyendo la capacidad de reactivación140. Mecanismo de acción: la reactivación se produce a través de una reacción de dos pasos, primero formando un complejo reversible fosfonil-AChE tipo Michaelis (estado de transición pentacoordinado) seguido por el desplazamiento del residuo de fósforo del estado de transición. La eficacia del reactivador es atribuido a la nucleofilia de la oxima y al ratio de decadencia del Figura 14. Moléculas genéricas de oximas. Figura 15. Ejemplos de oximas. Introducción 42 compuesto intermedio de la oxima fosforilada, esto depende de la estructura de la oxima, del OP como de la estructura de la enzima78. Cinco factores estructurales importantes influyen en la afinidad de los reactivadores de la AChE sobre la AChE inhibida (Figura 9 del punto 3.2.6.1 Colinesterasas): (a) presencia de un grupo oxima, (b) posición del grupo oxima en el anillo aromático, (c) número de grupos oxima en la estructura reactivadora, (d) distancia y forma en la unión entre los anillos aromáticos y (e) presencia de nitrógeno cuaternario en la molécula reactivadora54. La oxima solo puede ser beneficiosa mientras la AChE inhibida no esté completamente en forma “envejecida”65,125. Algunos autores han visto que las oximas fosforiladas, formadas durante la reacción de reactivación, pueden ser potentes inhibidores de la AChE, causando posible re- inhibición de la enzima78,141. Por otro lado, las oximas fosforiladas con un radical 2- en el anillo piridínico (como 2-PAM, HI-6) son inestables, mientras que los 4-piridinas aldoximas son bastante más estables141. Figura 16. Mecanismo de reactivación de la AChE por la pralidoxima: el nitrógeno aromático cargado positivamente es “atraído” al lugar aniónico de la AChE, permitiendo que la porción oxima reactiva de la molécula se posicione sobre el lugar activo fosforilado de la enzima. La pralidoxima se fosforila y reactiva la AChE125. En particular, la velocidad del ataque nucleofílico, aunque depende de las propiedades de la oxima (reactividad), es completamente independiente de la concentración de oxima. Se da la relevancia clínica de esta consideración, por el hecho, de que las concentraciones de oxima resultan suficientes al 50-70 % de saturación aproximadamente. Las concentraciones más altas no mejoran la reactivación, y además puede aumentar los efectos adversos142. Para la evaluación de la eficacia clínica de las diferentes oximas, se considera el tiempo medio de reactivación y la concentración necesaria para lograr este tiempo medio (Figura 17). Se puede suponer que cuanto más corto sea el tiempo medio de reactivación a una concentración de oxima tolerable, más eficaz es la oxima139. Introducción 43 La lipofilia de los OP es un inconveniente, dicha cualidad ocasiona que puedan atravesar con facilidad la BBB y otras membranas biológicas causando un impacto nocivo sobre las AChE del SNC. Los reactivadores comunes de la AChE son compuestos con carga electrostática y apenas cruzan la BBB, siendo solo activas en AChE del sistema nervioso periférico143,144. Reactivadores mono-cargados o sin carga pueden facilitar atravesar la BBB41. Excepcionalmente, el HI-6 es capaz de atravesar debido a su perfil farmacocinético y los dos átomos cuaternarios de nitrógeno de su estructura. Si una oxima puede atravesar la BBB es un punto a tener en cuenta145. Las tres oximas más en uso son39: a. Pralidoxima. b. Obidoxima. c. HI-6. La potencia relativa y efectividad de las diferentes oximas en la reactivación de la AChE inhibida varía según el agente nervioso. En la Tabla XIII se presenta una protocolo aproximado de la capacidad de reactivación relativa (basada en datos in vitro)39: Pralidoxima Obidoxima HI-6 Tabún (GA) - +/- - Sarín (GB) + + + Somán (GD) - - - Ciclosarin (GF) +/- +/- + VX + + + Leyenda: + efectivo - inefectivo +/- parcialmente efectivo Tabla XIII. Comparación in vitro de la efectividad de las oximas39. Figura 17. Relación entre el tiempo medio de reactivación y la concentración de oxima139. Introducción 44 Régimen de dosis : Las dosis recomendadas actualmente de oximas para uso intravenoso (basado en los datos procedentes de intoxicaciones por insecticidas organofosforados) se muestran en la siguiente tabla, estos datos pueden ser extrapolados para una inyección im39,139. Oxima Vía de administración Dosis inicial Dosis posteriores Cloruro de pralidoxima (2-PAM) Dosis individual autoinyector 600 mg Repetir dosis cada 10-12 horas si es necesario Máxima dosis adulto 2 g (30mg/Kg) Pralidoxima mesilato (P2S) Dosis individual autoinyector 500 mg Repetir dosis cada 10-12 horas si es necesario Máxima dosis adulto 2 g (30 mg/Kg) Cloruro de obidoxima Dosis individual autoinyector 220 mg 750 mg/día como infusión continua Máxima dosis adulto 250 mg HI-6 Dosis individual autoinyector 500 mg - Tabla XIV. Dosis recomendadas de oximas39. Farmacocinética y farmacodinámica: La absorción y distribución de todas las oximas está limitada por su alta polaridad y su baja lipofilia (debido a su nitrógeno cuaternario y su hidrofílico grupo oxima), sin embargo, es esencial la conservación de su estructura para conseguir su capacidad reactivadora88,146. Estimar el proceso de distribución es complicado, por estar ligado el estado de ionización al pH fisiológico, además, el estado de ionización explica sus propiedades nucleofílicas, vitales para la reactivación a través de su lugar de acción en el sitio activo de la AChE147. En ausencia de mejora clínica, la administración de oxima por períodos superiores a 24- 48 h es poco probable que logre una mayor reactivación de la enzima86. Estabilidad química de las oximas en disolución: La estabilidad de las oximas en solución acuosa varía ampliamente. En general, la degradación se realiza por dos mecanismos dependientes de pH148:  A valores de pH por debajo de 3, las oximas se hidrolizan a sus aldehídos e hidroxilaminas correspondientes. Variedad de estados de equilibrio se establecen entre la oxima y los productos de hidrólisis dependiendo de pH, temperatura y concentración de oxima. Generalmente, las soluciones concentradas, como las que se utilizan para autoinyectores, son menos estables y los productos de degradación aceleran la descomposición. Los buffer y el material del envase (metal, gomas, juntas) pueden también acelerar la descomposición149.  A pH 4, el ataque en el grupo oxima es catalizado por agua o iones hidróxido, dando como resultado un nitrilo de piridinio intermedio. Este último es muy inestable y se descompone en un derivado de piridona y cianuro libre o formas carboxamida, que se degrada aún más en el derivado carboxi y amoniaco148. Fracaso de la terapia oxima: el fracaso de la terapia puede ser debido a la baja eficacia de la oxima por el AN (ejemplo, la pralidoxima frente al GA, o el rápido “envejecimiento” del GD). Por ello, se hace vital la identificación del AN para permitir el uso de la oxima correcta siempre que fuera posible. Hay signos evidentes que indican fracaso de la terapia con oxima, uno de ellos es la necesidad de administración de altas dosis de atropina, o la estimulación nicotínica que incluye fasciculación, parálisis muscular voluntaria continua e insuficiencia respiratoria39. Hoy en día no se dispone de una oxima de amplio espectro que sea capaz de reactivar la AChE inhibida por cualquier tipo de agente neurotóxico, seguramente es debido a que no se ha llevado a cabo un estudio exhaustivo de la relación estructura-actividad90,137. Hay estudios que marcan que la combinación de varias oximas como la obidoxima y el HI-6 puede ser una alternativa para Introducción 45 obtener efectos beneficiosos, no solo por ampliar el umbral de acción frente a diferentes agentes neurotóxicos, si no a nivel galénico con respecto a la disolución de la oximas y la tolerancia en el lugar de inyección150. La oxima de elección en Japón, Reino Unido, EE.UU., España y Francia es la pralidoxima; en Holanda, Finlandia, Noruega y Alemania es la obidoxima; HI-6 en Suiza y Canadá151–153. TMB-4 es solo usado en Israel154. Y el resto de oximas desarrolladas durante las últimas décadas están muy lejos del uso clínico y, por lo tanto, no se consideran en esta tesis. A) PRALIDOXIMA (2-[(hidroxiimino)metil]-1-metilpiridin-1-ium) La pralidoxima fue estudiada y publicada de manera independiente en 1955 por Wilson y Ginsburg en EE. UU. y en paralelo Childs et al. en Reino Unido, fue el primer reactivador efectivo usado en intoxicación por OP en humanos132,133. Figura 18. Estructura química del cloruro de pralidoxima (Nº Cas 51-15-0). Este compuesto dispone de cuatro sales: cloruro (2-PAM Cl) usada mundialmente, mesilato (P2S) usada en Reino Unido, iodado y metilsulfato usado en Japón, India y Australia26. El cloruro de pralidoxima es una oxima cuaternaria piridínica con un peso molecular (PM) de 173 g/mol, cuya solubilidad en agua es excelente y compatible a nivel fisiológico. Mientras que la sal yodada, con un PM de 264 g/mol, es menos acuosa y puede inducir iodismo potencialmente, la mesilato con un PM de 232,3 g/mol y la metilsulfato 248,3 g/mol26,155. El 2-PAM es muy efectivo en la reactivación de la AChE inhibida por sarín o VX33,156,157, pero no es eficaz en la reactivación de la enzima inhibida por tabún o somán157,158. Régimen de dosis: bolus único de 600 mg de pralidoxima, con una concentración máxima de 5̴0 μM159, usando tres autoinyectores simultáneamente se debería conseguir una concentración máxima de 145 μM159. Bajo estas condiciones en una intoxicación por agentes G (con vida media corta) un único autoinyector de pralidoxima debería ser suficiente en la mayoría de los casos. En casos graves, puede ser apropiado dosis repetidas, la necesidad de una terapia de infusión debería ser la excepción. En la intoxicación por tabún no se puede esperar una reactivación efectiva y en la intoxicación por somán el rápido envejecimiento evitará la reactivación en condiciones realistas139. La reactivación de los agentes V necesita un régimen de dosis diferente, los estudios realizados enfatizan la necesidad de comenzar la terapia con oxima lo antes posible y continuar posteriormente, tanto tiempo como AN libre circule por el cuerpo139. Dependiendo del grado de intoxicación, una inyección de 600 mg será efectiva de 6 a 8 minutos y mantendrá su efectividad durante más de una hora. En ausencia del AN, la pralidoxima permanecerá en el sistema circulatorio durante varias horas sin aparente efecto adverso. En Introducción 46 presencia de AN, es posible que se necesiten más dosis im adicionales entre 60 a 90 minutos de la dosis inicial, especialmente cuando hay una evidencia continua de absorción de OP42. Farmacocinética y farmacodinámica: se distribuye a través del torrente sanguíneo y es eliminado mayormente por los riñones (el 90 % de la pralidoxima eliminada se encuentra intacta)160,161. El tiempo medio de eliminación de la pralidoxima es 1,3 horas73,159. Es la única oxima que penetra en el interior de la membrana celular y se puede localizar en el interior de los glóbulos rojos148. Como sal cuaternaria, la 2-PAM no penetra la BBB, solo aproximadamente un 10% del nivel plasmático es capaz de atravesar, ciertos autores plantean que tal cantidad podría ser suficiente para tratar los síntomas centrales de la intoxicación41,75,144. Efectos adversos: Los efectos adversos que puede producir una sobredosis de pralidoxima son visión borrosa, somnolencia, dolor de cabeza, náuseas, vómitos, vértigo y aumento de la frecuencia cardíaca y la tensión arterial39,42,65. De 40 a 60 minutos después de la inyección im puede aparecer un dolor medio-moderado en el lugar de la inyección65. En pacientes con deficiencia renal debe usarse con precaución, y quizá se haga necesario reducir la dosis. También se debe tener precaución en pacientes con miastenia gravis porque puede precipitar a una crisis miasténica162. Estabilidad química de pralidoxima en solución: Hay estudios que demuestran que tras almacenar a temperatura ambiente una solución acuosa de 2-PAM Cl (300 mg ml-1), con pH inicial de 4,2 se obtuvo un 91 % de 2-PAM durante 10 años163. B) OBIDOXIMA (1,3-Bis(4-hidroxiiminometil-1-pyridinio)-2-oxapropano dicloro) La obidoxima (LüH-6, Toxogonina) fue sintetizada por Lüttringhaus y Hagedorn en Alemania en la década de los 6078,164. Este compuesto tiene un peso molecular de 359,2 g/mol165 y buena solubilidad en agua166. Figura 19. Estructura química del cloruro de obidoxima (Nº CAS 114-90-9). Fue introducida en la práctica médica en 1964 por haber demostrado una gran eficacia como antídoto frente a las intoxicaciones por OP167. Se ha demostrado que en animales experimentales, la administración de la obidoxima con atropina protege eficientemente frente a la intoxicación por tabún, sarín y VX78,158. Es ineficaz frente al somán158,168. Pero más eficaz que el HI-6 frente al tabún158. Régimen de dosis: La obidoxima puede ser administrada en bolus únicos de 220 mg139,169, con una concentración máxima de 4̴0 μM159, usando tres autoinyectores simultáneamente se Introducción 47 debería conseguir una concentración máxima de 120 μM159. Bajo estas condiciones, en una intoxicación por agentes G (con vida media corta) un autoinyector de obidoxima debería ser suficiente en la mayoría de los casos. En casos graves, pueden ser apropiadas dosis repetidas, la necesidad de una terapia de infusión debería ser la excepción. En la intoxicación por tabún no se puede esperar una reactivación efectiva y en la intoxicación por somán el envejecimiento rápido evitará la reactivación en condiciones realistas139. La reactivación de los agentes V necesita un régimen de dosis diferente, los estudios realizados enfatizan la necesidad de comenzar terapia con oxima lo antes posible y continuar con la administración de oxima, durante el tiempo que el AN esté libre circulando por el cuerpo.139 En el libro Martindale “The Complete Drug Reference”, refleja que puede ser administrada con atropina en una dosis inicial de 250 mg (4 mg/Kg) en inyección intravenosa lenta. Esto puede seguirse con una infusión iv de 750 mg durante 24 horas, de manera continua hasta que disminuya la concentración de OP. Alternativamente, dosis repetidas de 4-8 mg /kg puede ser administrada en intervalos de 2-4 horas. Además se puede administrar por vía im165. Farmacocinética y farmacodinámica: La obidoxima es químicamente más estable que pralidoxima y no se han encontrado metabolitos hasta ahora148. Tras su administración, se encuentra altas concentraciones en plasma, ya que su volumen de distribución es pequeño170. Se elimina por la orina170. Su vida media de eliminación es de 1,4 horas159. Efectos adversos: hipotensión, sensación de calor en la cara y disfunción hepática. En la inyección intramuscular puede producir un dolor agudo en el lugar de la inyección después de una dosificación múltiple39. Varios estudios indican que sus efectos hepáticos son transitorios en el 10 % de pacientes intoxicados gravemente o incluso no se observa hepatotoxicidad aparente46,53,171. Estabilidad química de la obidoxima en disolución: su degradación es a través de una reacción de hidrólisis obteniéndose el correspondiente aldehído (bis(4-formil-1-pyridinometil) éter dicloro y la hidroxilamina. La solución de obidoxima almacenada a altas temperaturas desarrolla un color marrón oscuro, y su degradación es completa a cualquier temperatura172. Es conocido que la obidoxima es mucho más estable que la pralidoxima mesilato en solución a temperaturas ambientales altas63. Hay estudios que demuestran que las ampollas de obidoxima se pueden almacenar a temperatura ambiente durante más de 30 años antes de que su concentración disminuya un 10%172. C) HI-6 (1-(2-hidroxiiminometil-1-piridinio)-3-(4-carbamoyl-1-piridinio)-2-oxapropano dicloruro) El HI-6 fue sintetizada por el grupo de estudio de Hagedorn en Freiburg (Alemania) en 1966, por ello también conocido como “serie Hagedorn” u oximas-H104,173. Es un oxima bispiridínica asimétrica, se encuentra en forma de sal dicloruro o dimetanosulfonato (DMS). También conocida como asoxima cloruro, con un peso molecular de 359,2 g/mol165. Introducción 48 Figura 20. Estructura química del HI-6 (Nº CAS 34433-31-3). Es la primera oxima que puede reactivar la AChE inhibida por somán3,157,173,174. Ofrece mejor protección que la obidoxima en intoxicaciones por somán, sarín, ciclosarín y VX, pero no frente a una intoxicación por tabún78,113,173,175. Frente a la pralidoxima, ha demostrado ser superior como terapia aguda en cobayas frente a la intoxicación por ciclorsarín, somán y VX115,157,158. Por su alta eficacia, el ejército checo, eslovaco, suizo y canadiense lo tienen como oxima de elección frente a intoxicación por agentes nerviosos176. Régimen de dosis: la dosis recomendada está entre 0,8-1,0 gr4. Estudios clínicos han demostrado que dosis entre 250-500 mg vía im alcanzan concentraciones plasmáticas mayores de 4 mg/L en 4-6 minutos168. El ejército de la República Checa también usa la vía transdérmica (TRANSAT, parches impregnados con HI-6)177. Farmacocinética y farmacodinámica: Por su inestabilidad acuosa, gran parte de su eliminación por orina es de metabolitos y no del compuesto original178. Su vida media de eliminación es una hora159. Efectos adversos: No se han notificado hasta ahora efectos adversos relacionados con la función cardiovascular, respiratoria, del SNC, muscular o visual después del uso179,180. Estabilidad química del HI-6 en disolución: existen estudios contradictorios sobre la estabilidad del HI-6 en soluciones acuosas. El estudio realizado por Eyer demuestra mayor estabilidad del principio activo en soluciones ácidas entre pH 2 y 3, en dicho estudio recomienda su almacenamiento en concentraciones no superiores a 0,1 M en soluciones acuosas a pH 2,5 y bajas temperaturas, calculando una vida útil aproximadamente de 20 años (almacenando a una temperatura de 8 °C). Demostrando que soluciones muy concentradas de HI-6 sufren mayor degradación, dando lugar a la formación de productos de degradación como hidroxilamina y el aldehído correspondiente178. Por otro lado, Brown et al. ha demostrado que tanto el pH como la temperatura contribuyen directamente en la inestabilidad del HI-6 en solución acuosa, los datos obtenidos muestran que valores de pH mayores de 4 o menores de 3, con una temperatura mayor de 37 °C provoca rápida degradación del principio activo174. La gran desventaja del HI-6 comparado con otras oximas es su mayor inestabilidad en disoluciones acuosas, y su fabricación debe ser en sistemas de doble cámara para separar en un lado la fase acuosa y en otro el HI-6 liofilizado105,114,152. La estabilidad del HI-6 liofilizado es excelente (estimando una vida media de 73 años a 25 °C)63. Introducción 49 Se ha demostrado que sufre un mecanismo de degradación inducido por la luz, causando fotoisomerismo, aumentando el isómero-Z ante la exposición a luz181, teniendo influencia sobre la eficacia de la reactivación. 3.2.9.2.3. BENZODIACEPINAS Las benzodiacepinas son depresores del SNC, ansiolíticos y relajantes musculares. Su principal lugar de acción es sobre los receptores del ácido gamma-aminobutírico (GABA), especialmente sobre el GABAA. El receptor GABAA está ligado a un canal de cloro y es parte de la superfamilia de receptores que incluyen los receptores nicotínicos de ACh y los receptores de glicina. GABA es el mayor neurotransmisor inhibitorio en el SNC de mamíferos. Las benzodiacepinas alteran la unión del GABA al receptor GABAA de manera alostérica65,105. Todas las benzodiacepinas comparten una estructura química en común según se muestra en la Figura 21. Esta estructura une un anillo de benceno con un anillo de diazepina, haciendo referencia a su nombre. El anillo de fenilo adicional está presente en todas las benzodiacepinas clínicamente importantes y sirve como un punto de sustitución para modular algunas características farmacológicas182. La principal consecuencia de la acción de las benzodiacepinas en el SNC es la hiperpolarización de neuronas, debido al incremento de la frecuencia de apertura del canal de cloro provocando un aumento del flujo negativo por los iones cloro hacia el interior de la célula182. Esto hace que las neuronas sean significativamente menos susceptibles a la despolarización inducida colinérgicamente65. En pacientes intoxicados con OP, las benzodiacepinas pueden tener un efecto beneficioso reduciendo la ansiedad e inquietud, reduciendo las fasciculaciones musculares, deteniendo las convulsiones, controlando la aprensión y agitación, y posiblemente reduciendo la morbilidad y mortalidad65. En escenarios bélicos, la necesidad de asistencia médica inmediata y de primeros auxilios hizo que se generaran grandes avances en las benzodiacepinas, por ejemplo, la eficacia protectora del diazepam frente a las intoxicaciones por AN en formato de comprimidos de 5 mg. El ejército inglés creó un sistema de tapa desmontable que contenía un comprimido de 5 mg de diazepam, mientras que el ejército sueco estableció los comprimidos de diazepam de 5 mg como uso profiláctico hasta tres días. El diazepam se administró en un sistema autoinyector por primera vez en noviembre de 1990, el cual, contenía 10 mg, y se estableció su uso como co- administración con atropina y oxima para el inicio de intoxicación severa con agentes neurotóxicos183. Figura 21. Estructura genérica de las benzodiacepinas. Introducción 50 El joven doctor iraquí Foroutan indicó en sus lecciones aprendidas durante la guerra Irán-Irak, el uso de diazepam como único anticonvulsivante disponible en unidades de emergencia química184. Hay evidencias experimentales que demuestran que la administración temprana (5-10 minutos) de una benzodiacepina antagoniza la actividad convulsiva de un AN, mejorando la morbilidad y mortalidad. Actualmente el diazepam (o su prefármaco avizafona) es el que más ampliamente se usa y debe ser administrado en una dosis inicial de 5-10 mg y dosis repetidas hasta controlar las convulsiones39. Benzodiacepinas como midazolam o lorazepam pueden ser usadas y ser efectivas en intoxicaciones por agentes neurotóxicos39,42. La FDA y el ejército francés ya consideran al midazolam como tratamiento de referencia frente a las convulsiones por agentes nerviosos65, tanto que la FDA en el 2018 aprobó el Seizalam® (midazolam im) y en el 2022 aprobó el primer autoinyector de midazolam185. Tanto con diazepam como midazolam, se garantiza absorción inmediata y completa por vía iv. La vía im, en el caso del midazolam es una buena opción por disponer de buenos perfiles de absorción, sin embargo, para el diazepam se ha visto que es lenta, incompleta, errática y depende del lugar de administración186. Por ello, hay estudios que desaconsejan el uso de diazepam por vía im, al menos, que no exista otra alternativa182. A continuación, se muestra las diferencias farmacodinámicas relativas en humanos entre el diazepam y el midazolam182 (Tabla XV): Diazepam Midazolam Anticonvulsivante Inicio de acción IV Rápido (minutos) Rápido (minutos) IM No recomendable 2-10 minutos Duración de la acción IV 1-2 horas 30-80 min IM Impredecible 1-2 horas Sedante Inicio de acción IV Rápido (minutos) Rápido (minutos) IM Impredecible 5-10 minutos Duración relativa de acción Dosis única Corta Corta Dosis repetida Larga Intermedio Tabla XV. Propiedades farmacodinámicas relativas del diazepam y el midazolam182. Si no se administra terapia anticonvulsiva, se puede producir un daño cerebral irreversible, y se ve agravado por períodos de hipoxia. La atropina protege parcialmente frente a las convulsiones y el daño cerebral en una intoxicación severa (otros colinérgicos difieren de esta capacidad que tiene la atropina). Pero la temprana administración de anticonvulsivantes es vital para salvar la vida y disminuir el daño cerebral39. Introducción 51 A) DIAZEPAM (7-cloro-5-fenil-1-metil-1,3-dihidro-2H-1,4-benzodiazepin-2-ona) El diazepam es un polvo cristalino, blanco o casi blanco, muy poco soluble en agua, soluble en etanol al 96 por ciento119. Con un peso molecular de 284,7 g/mol119. Figura 22. Estructura química del diazepam (Nº CAS 439-14-5). El diazepam debe ser administrado en pacientes intoxicados con presencia de convulsiones o fasciculaciones musculares pronunciadas65. Régimen de dosis: Las dosis recomendadas es de 10-20 mg187. Una inyección im de 10 mg en el muslo normalmente produce su efecto en 10 minutos, con una concentración máxima a la hora42. Farmacocinética y farmacodinámica: hay diferentes factores que influyen en la absorción im de diazepam como el lugar de inyección, profundidad de la inyección, sexo, actividad muscular y la cantidad de tejido adiposo en el lugar de inyección186,188. Publicaciones antiguas, indican que la absorción del diazepam im es pobre, errática e irregular, con niveles en plasma bajos comparados con los niveles tras una administración oral189–191. Una administración im en nalgas, tendrá una absorción más baja que una administración en el muslo, donde la absorción sistémica es más rápida192. Estudios más recientes, avalan que la inyección en el muslo produce niveles constantes en plasma con un rápido inicio de absorción, incidiendo que se comporta de manera bioequivalente a una jeringa prellenada iv, y prácticamente sin generar dolor intenso en el lugar de inyección193. Por otro lado, la principal vía metabólica es la desmetilación e hidroxilación, generando desmetildiazepam y oxazepam respectivamente, ambos metabolitos con actividad depresora en el SNC183. La principal vía de eliminación es la urinaria en forma de sulfatos y glucorónidos188. Efectos adversos: La somnolencia, la sedación, la debilidad muscular y la ataxia son los efectos adversos más frecuentes165. Dolor y tromboflebitis pueden ocurrir con algunas formulaciones intravenosas de diazepam165. En ausencia de agente neurotóxico: una dosis de 10 mg produce una disminución del rendimiento de 2 a 5 horas aproximadamente. El individuo no puede tomar decisiones de manera eficiente, reduce el estado de alerta y disminuye la capacidad de respirar correctamente. Por ello, los heridos deberían estar tumbados de lado hasta conseguir el estado de alerta. En el lugar de inyección puede haber irritación transitoria y dolor42. Estabilidad química del diazepam en disolución: el diazepam puede ser adsorbido en algunos envases de plástico, es recomendable no usar en este tipo de envases165,194,195. Puede producirse Introducción 52 precipitaciones del principio activo en forma de cristales si durante la fabricación de la disolución no se disuelve bien en el diluyente alcohólico. El diazepam se degrada por hidrólisis del enlace 4,5-azometina para formar un compuesto intermedio que a su vez se hidroliza para producir un derivado de glicina y 2-metilamino-5- clorobenzofenona. En soluciones de pH por debajo de 3,3 la reacción de degradación no es reversible. A valores de pH superiores a 3,3 la primera etapa de hidrólisis es reversible196. B) CLORURO DE MIDAZOLAM (8-clor-6-[2-fluorofenil]-1-metil-4H-imidazol [1,5-a] [1,4] benzodiacepina) El midazolam fue sintetizado por primera vez en 1975 por Armin Walser y Rodney Fryer en Hoffmann-LaRoche en EE. UU.197. Desde entonces, se ha usado frecuentemente y se ha incluido en la lista esencial de medicamentos de la Organización Mundial de la Salud (OMS)197. El cloruro de midazolam tiene aspecto de polvo cristalino. Soluble en agua198. Con un peso molecular de su sal cloruro de 362,2 g/mol165. Figura 23. Estructura química del cloruro de midazolam (Nº CAS 59467-96-8). Está disponible como fármaco de elección frente a la epilepsia y estados convulsivos agudos, incluyendo convulsiones inducidas por agentes nerviosos197,199. Mecanismo de acción: su actividad anticonvulsivante es resultado de su potenciación alostérica del receptor del ácido aminobutírico (GABAA). No activa los receptores GABA directamente, si no que modula alostéricamente los efectos GABA197. Farmacocinética y farmacodinámica: la sal cloruro de midazolam es muy soluble en agua y por lo tanto fácilmente absorbido por inyección intramuscular. Inicio de acción relativamente rápido (5-10 min), la concentración plasmática máxima se alcanza en aproximadamente 30 minutos después de la inyección im con una biodisponibilidad mayor al 90 %. La semivida de eliminación es 1,5-2,5 horas 186,197. Efectos adversos: somnolencia, sedación, ataxia, disartria, diplopía, vértigo, mareo, pérdida de la memoria reciente, reacciones de hostilidad y depresión200. Estabilidad química del midazolam en disolución: La base libre es una sustancia lipofílica con baja solubilidad en agua. El nitrógeno básico en posición 2 del anillo de la imidazobenzodiazepina capacita al midazolam para formar sales solubles en agua con ácidos. A pH<5, midazolam es desprotonado y abre el anillo diazepina debido a la hidrólisis catalítica del enlace doble 4,5 del anillo. Estas características fisicoquímicas son interesantes en la formulación de productos inyectables acuosos con larga vida media197. Introducción 53 En un estudio realizado por la Universidad de Cincinnati en 2013, sobre la estabilidad química de autoinyectores de midazolam con respecto a su almacenamiento en diferentes servicios de urgencias en distintos hospitales del país, se observó que no había una correlación entre la temperatura y la degradación del principio activo tras realizar un almacenamiento durante 60 días201. 3.3. AMENAZAS ACTUALES 3.3.1. A NIVEL INTERNACIONAL Antes del 11 de septiembre, en 1994 y 1995, fue la primera vez que el uso de armas químicas saltó del ámbito militar al ámbito civil. Una organización religiosa en Japón (Aum Shinriyo), usó sarín tanto en el ataque en Matsumoto en 1994, como en el metro de Tokio en 1995, causando un gran número de heridos y muertos9,33,36,37. Aunque en esa ocasión los agentes nerviosos utilizados eran bastante impuros, tuvieron la capacidad de matar y causar gran pánico en la población37,113. Además, en diciembre de 1994 y en enero de 1995, atacaron a dos personas con VX, ambos sobrevivieron, pero necesitaron hospitalización de forma prolongada202. Esta misma secta, asesinó en diciembre de 1994, en la ciudad de Osaka (Japón) a un hombre de 28 años, al ser identificado erróneamente como un policía infiltrado en la secta, fue atacado por dos hombres que le rociaron VX sobre el cuello202,203. Después del ataque del 11S del 2001 en EE.UU., se ha percibido aumento del riesgo frente a posibles ataques con armas químicas, especialmente por grupos unidos al terrorismo yihadista9,105. Además, el envío de cartas que contenían esporas de Bacillus anthracis acompañado por imágenes del ataque de las “Torres Gemelas” de Nueva York, incrementó la conciencia sobre la posibilidad de ataques con “armas de destrucción masiva”, incluyendo los ataques con armas químicas9. El uso de sarín el 21 de agosto de 2013, durante el conflicto de Siria fue confirmado por la ONU, y corroboró que los agentes nerviosos son todavía una amenaza real204,205. Cinco años después, en el 2018, se volvió a constatar el empleo de armas químicas en dicho conflicto206. De hecho, el 11 de diciembre de 2020, se impugna la Declaración de Armas Químicas de Siria por el Director General de la OPAQ, el español Fernando Arias, el cual, declara en una reunión del Consejo de Seguridad que debido a las lagunas, inconsistencias y discrepancias que siguen sin resolverse, la declaración presentada por Siria de destrucción de todas las existencias de armas químicas, aún no puede considerarse precisa y completa207. En 2017, Según la consultora estadounidense Booz Allen Hamilton, regresó la violencia extremista a Europa, planteando grandes amenazas en la seguridad europea208. La capacidad de los individuos para ser radicalizados por internet, o después de viajar a zonas de conflicto supone una gran amenaza206,208. Entre 2011 y 2016, se estimó que entre 5.000-7.000 europeos se unieron a grupos extremistas en Iraq y Siria208: Introducción 54 IRAQ En 2014, ISIS consiguió acceder a los búnkeres que anteriormente fueron utilizados para producir y desarrollar el programa iraquí de armas químicas, que incluía agentes nerviosos y gas mostaza en cohetes que aún podrían estar en Iraq. LIBIA Se especula que desde que el ISIS empezara a operar en Libia, han podido obtener acceso al programa de armas químicas que está bajo el control del gobierno de Libia. SIRIA ISIS informa que en Siria tiene acceso a armas similares a sarín y ricino. Tabla XVI. Casos notables de ISIS que usó o planeó el uso de materiales químicos208,209. El 13 de febrero de 2017, Kim Jong-Nam, hermanastro del presidente de la República Popular de Corea, es intoxicado por dos mujeres en el aeropuerto internacional de Kuala Lumpur (Malasia), al pasarle un pañuelo por la cara impregnado con VX210,211. El 4 de marzo de 2018 en Salisbury (Reino Unido), hubo un intento de asesinato con un agente neurotóxico, conocido como Novichok (A-234). Se encontraron en el asiento de un parque a Sergey Skripal (excoronel ruso anterior director de inteligencia de Rusia) con su hija Yulia en estado de coma. Supone el primer empleo de armas químicas en suelo europeo después de 1945, y una violación flagrante de la Convención de Armas Químicas de 199744,212,213. La fuente de exposición pudo ser el contacto directo con superficies contaminadas en el domicilio (entre ellos, un picaporte)23. El 30 de junio de 2018 en Amesbury (Reino Unido), una pareja, Dawn Sturgess y Charlie Rowley, encuentran un pulverizador en un parque, al usarlo la mujer fallece y el hombre sobrevive. Han sido envenenados por Novichok (A-234), el mismo tóxico usado en Salisbury23,213. El 20 de agosto de 2020, el opositor ruso Alexéi Navalni fue intoxicado con Novichok en la ciudad siberiana de Tomsk214. Se evidenció que su ropa interior estaba impregnada con el agente Novichok A-234. 3.3.2. A NIVEL NACIONAL La seguridad nacional en España se puede ver comprometida por elementos de muy diversa índole según su naturaleza geopolítica, tecnológica, económica o social, llegando a convertirse en amenazas que pueden alterar dicha seguridad. Los conflictos armados, se mantiene como una de las amenazas más significativas, puesto que a los tradicionales conflictos armados se unen formas adicionales de agresión e influencia, amenazas asociadas a la proliferación de armas de destrucción masiva y otras variantes de actos hostiles215. En el ámbito de la OTAN, España es un aliado fiable, seguro y comprometido con la Alianza Atlántica desde hace más de 35 años, que mantiene una participación activa en el diálogo político y en el desarrollo de las capacidades de defensa de la OTAN para una protección de 360˚, capaz de responder mejor a los retos y amenazas, con independencia de su origen o ubicación206. La Estrategia de Seguridad Nacional de 2017, ya marcaba que la proliferación de las armas de destrucción masiva (nucleares, químicas, radiológicas y biológicas) suponían una grave amenaza para la paz y seguridad internacional, afectando directamente a la Seguridad Nacional215. Pero la vigente Estrategia de Seguridad Nacional de 2021, sigue reiterando que las armas de destrucción masiva (nucleares, biológicas, químicas y radiológicas) están dentro de los riesgos y Introducción 55 amenazas considerados. Debido a que el régimen de prohibición de armas químicas se enfrenta a importantes retos, como los ataques registrados en los últimos años en Siria. Asimismo, los riesgos derivados del desvío y contrabando de materiales de doble uso aumentan considerablemente debido a la transferencia de conocimiento tecnológico y el movimiento global de mercancías216. Es de especial preocupación la posibilidad de que sustancias químicas tóxicas puedan ser empleadas por actores no estatales o gobiernos de Estados. Además de la violación del Derecho Internacional Humanitario, por el uso de armas químicas contra civiles en conflicto, existe el riesgo que grupos terroristas puedan utilizar las armas químicas fuera de la zona de conflicto para realizar actos terroristas215. La Constitución Española encomienda a las Fuerzas Armadas (FAS) la misión de “garantizar la soberanía e independencia de España, defender su integridad territorial y el ordenamiento constitucional”217. La Ley Orgánica 05/2005, de la Defensa Nacional, desarrolla dicha misión, contemplando los tipos de operaciones a llevar a cabo por las FAS tanto en territorio nacional como en el exterior, que pueden conducir a acciones de prevención de conflictos o disuasión, de mantenimiento de la paz, actuaciones en situaciones de crisis y, en su caso, de respuesta a la agresión218. El documento “Concepto de Empleo de las Fuerzas Armadas” de 2017, se une a lo ya dicho anteriormente. La naturaleza compleja de los retos a los que nos enfrentamos supone una dificultad añadida a la hora de garantizar el grado de seguridad que la sociedad demanda en el siglo XXI. La proliferación de armas de destrucción masiva, un desafío creciente para la seguridad internacional a pesar de las acciones diplomáticas y medidas de control existentes, y máxime cuando se combina con otros riesgos como su uso por movimientos terroristas o grupos extremistas218. 3.4. CONTRAMEDIDA ACTUAL EN ESPAÑA FRENTE AGENTES NEUROTÓXICOS: AUTOINYECTOR Un medicamento es todo producto que, convenientemente administrado al organismo, es capaz de curar, paliar, prevenir o diagnosticar un estado patológico. “Convenientemente administrado” hace referencia a dotar al fármaco de unas características que lo hagan adecuado para su administración al organismo a través de una determinada vía. Ello implica la incorporación del fármaco a un sistema fisicoquímico, de complejidad muy variable, como es una forma farmacéutica219. Según la Real Farmacopea Española, las preparaciones parenterales son preparaciones estériles destinadas a ser inyectadas, administradas por perfusión, o implantadas en el cuerpo humano119. La inyección intramuscular permite formar un depósito de principio activo en el lugar de inyección, desde donde el fármaco debe difundirse a través del tejido muscular y atravesar la membrana de los capilares220,221. El autoinyector es un dispositivo que permite a un individuo administrarse una dosis unitaria de solución medicamentosa por vía intramuscular, de forma fácil, segura y eficaz a sí mismo o a otra persona156,222. Libera de forma automática una dosis exacta, estéril, apirógena y libre de Introducción 56 partículas de un medicamento inyectable con solo activar su mecanismo de disparo223. Con su forma de pluma/lápiz hace que su manejo sea intuitivo, su uso llega a ser bastante sencillo y con la capacidad de que uno mismo sea capaz de administrárselo156. Más de veinte compañías farmacéuticas han desarrollado aproximadamente 80 tipos de autoinyectores hasta la actualidad. Cerca de 50 principios activos se han desarrollado como productos combinados para la administración mediante autoinyectores224. En situaciones de emergencia o en incidentes con bajas masivas, como es un incidente con agentes químicos de guerra, el autoinyector es el dispositivo de elección para administración inmediata de medicamentos113,224,225. A nivel militar, se lleva usando este sistema de inyección más de 60 años4,104. Durante la WWII se hizo evidente la necesidad de un dispositivo para la administración rápida por vía parenteral por el propio combatiente223. El Syrette, introducido por el ejército norteamericano en 1950 4,226, fue uno de los primeros autoinyectores, formado por un tubo de metal flexible similar a un tubo de pomada oftálmica, con una aguja y su protector acoplado. Desarrollado para inyección de morfina como analgésico potente, presentó problemas de esterilidad, estabilidad y fugas223. El personal militar era reacio a pincharse al ver la aguja, lo que llevó a desarrollar en Edgewood (Maryland, EE.UU.) y en Porton Down (Reino Unido), a finales de los años cincuenta, los primeros autoinyectores en los que no se veían las agujas, y una simple presión sobre el muslo hacía que el dispositivo se disparase inyectando la solución de atropina de forma automática. En EE.UU., el primer autoinyector se normalizó en 19597,227. Los autoinyectores han llegado alcanzar bastante popularidad, con una amplia ventaja de uso sobre las jeringas prellenadas manuales, por un lado por requerir menos experiencia por parte del usuario113,224, y por otro lado se ha comprobado que los autoinyectores alcanzan la circulación general en la mitad de tiempo que con la administración tradicional mediante jeringa/aguja113,156. El autoinyector en las FAS se ha concebido especialmente para su utilización en Defensa NRBQ, frente a un ataque con agentes neurotóxicos, en el que el combatiente pueda administrarse rápidamente a través de la ropa (EPI NRBQ) e incluso en la oscuridad, en tanto es evacuado de la zona de conflicto 222,225,228. Figura 24. Ejemplos de jeringas de morfina usadas durante la WWII. Fuente: Museo Nacional de Historia Militar en Diekirch (Luxemburgo). Figura 25. Ejemplos de jeringas de atropina de la WWII. Fuente: Museo Nacional de Historia Militar en Diekirch (Luxemburgo). Introducción 57 Los autoinyectores frente a la Defensa NRBQ carecen de interés para la industria farmacéutica civil, por ello tras la Guerra del Golfo Pérsico y la Operación Tormenta del Desierto en 1991, y posteriormente el conflicto bélico con Irak en 1998, pusieron en evidencia la incapacidad de respuesta a la demanda de este dispositivo que sufrieron los países de nuestro entorno. Haciendo patente la necesidad de una fabricación propia por parte de los servicios farmacéuticos de las FAS españolas en las instalaciones especializadas que disponían en Córdoba, como recurso estratégico de interés militar, iniciando el diseño y desarrollo del primer modelo en 1990 (el cual años más tarde fue registrado en la Oficina Española de Patentes y Marcas con la patente número 9102545 / 2055648)223. La primera producción de autoinyectores fue en 1992, estaban equipados con una jeringa de vidrio con aguja insertada, cargada con 2 mg de sulfato de atropina y 220 mg de clorhidrato de obidoxima en 2 ml. El reducido volumen y la escasa longitud de aguja efectiva (< 17 mm), llevaron al desarrollo de una segunda generación de autoinyectores, cuya producción comenzó en 1998, equipados con una jeringa específicamente personalizada, cargada con 2 mg de sulfato de atropina y 600 mg de cloruro de pralidoxima en 3 ml. En 2006, comienza la producción de la tercera generación, actualmente en vigor en la que se reduce peso y dimensiones y se mejora su calidad y seguridad, formado por cuatro piezas fabricadas en material plástico ABBR (alta resistencia al impacto), una varilla de duraluminio, un muelle helicoidal a compresión rectificado y fabricado en acero inoxidable AIS 302 templado, y cuatro bolas de precisión de acero al carbono C-500 cromado, y una jeringa prellenada en su interior de fabricación propia con la capacidad de contener 3 ml223 (Figura 26 y 27). Figura 26. Modelo autoinyector AJP, Jeringa Prellenada y Autoinyectable AJP (3ª generación)223. Figura 27. Autoinyectable de Atropina-Oxima DEF. Carcasa e interior. Introducción 58 Numerosas ventajas consolidan esta forma de presentación, como: - Envase estanco y estéril que contiene la dosis exacta de solución medicamentosa, capaz de mantener esas condiciones durante un periodo de tiempo sin sufrir alteraciones durante el almacenamiento, estando preparado para su uso de forma inmediata en cualquier situación de emergencia220,223,224. - No se observa la aguja hipodérmica intramuscular, cuya longitud puede provocar objeción a la hora de administrarse uno mismo223. - El peso y las dimensiones son factores de importancia en su portabilidad. Además de su robustez, necesaria para un correcto funcionamiento y protección de su contenido, incluso en situaciones límite de estrés físico (golpes, caídas y estrés de campaña)223. - El control del disparo, el cual no debe activarse inadvertidamente mientras que son transportados o almacenados, por un seguro en el mecanismo. - Con poco entrenamiento y habilidad se sabe administrar correctamente, sin necesidad de personal médico o sanitario para su uso113,156,224. - La administración de autoinyectores vía im permite una absorción más rápida113,156,229. - Además, se evita la inactivación de los principios activos en el tracto gastrointestinal, o el efecto de primer paso acusado por vía digestiva. Minimizando a su vez los posibles efectos secundarios que el fármaco pueda ocasionar sobre el sistema digestivo, o si la vía está imposibilitada por vómitos u obstrucción intestinal o por falta de cooperación del paciente224,230. Los elementos críticos a tener en cuenta en el diseño de un dispositivo autoinyectable se trata de variables cuantificables que definen la calidad del producto, tales como fuerzas del muelle, defectos físicos del vidrio, siliconado, inyectabilidad, esterilidad, pirógenos, inercia química, contenido de la solución, contenido de partículas, estabilidad, peso de la jeringa prellenada, fuerza de activación, resistencia, longitud efectiva de la aguja, resistencia, dosis descargada tras la activación y tiempo de autoinyección223. Dependiendo de la doctrina sanitaria de cada país, los ejércitos están abastecidos con autoinyectores que contienen únicamente atropina (por ejemplo AtroPen®), o una combinación de dos autoinyectores (Mark 1 Kit®, autoinyector de atropina más autoinyector de pralidoxima), o combinado en el mismo autoinyector (por ejemplo el autoinyector estadounidense frente agentes nerviosos –ATNAA®- que contiene 600 mg de pralidoxima y 2,1 mg de atropina)42,101,231, u obidoxima (como ATOX II®, que contiene 220 mg de obidoxima y 2 mg de sulfato de atropina). Por otro lado, el CANA® (Convulsant antidote for nerve agent autoinjector, Autoinyector antídoto anticonvulsivante frente agentes nerviosos) con una solución que contiene 10 mg de diazepam42,101,231. O el reciente autoinyector de midazolam que contiene 10 mg, y ha sido aprobado por la FDA en agosto del 2022185. Figura 28. Antídotos CANA® (izquierda) y ATNAA® (derecha) 42. Introducción 59 La doctrina sanitaria de cada país marca cuántos autoinyectores se planean distribuir por combatiente. En un gran número de países, se planean tres autoinyectores por persona, conteniendo un total de 6 mg de sulfato de atropina, y normalmente uno de ellos contiene oxima. En general, se recomienda utilizar el primer autoinyector cuando aparecen los primeros signos. Después de 5 a 10 minutos, el segundo autoinyector debe ser administrado si no se produce mejoría, seguido del tercero después de unos 5-10 min en caso de que no mejore. En casos graves, los tres autoinyectores debe administrarse al mismo tiempo139. El afán de usar el HI-6 como reactivador por parte de ciertos países, generó el diseño de un autoinyector de doble cámara, en una cámara la solución de atropina y en otra el HI-6 liofilizado4. La empresa Chemprotect SK de República Checa comercializó este autoinyector. Más tarde apareció la posibilidad de crear un autoinyector de tres cámaras, con la idea de disminuir la manipulación y la reducción de pinchazos. Partió del Departamento de Toxicología y Farmacia Militar de la Facultad de Ciencias Médicas Militares de la Universidad de la Defensa de República Checa, donde cada componente se encuentra en una de las cámaras, por un lado atropina en solución, luego HI-6 liofilizado y en una última cámara la solución de diazepam (Figura 29)4,177. También la empresa Chemprotect SK lo comercializó, tanto con HI-6 como con obidoxima, ofreciéndolos en su catálogo de 2016, pero en su nuevo catálogo de 2018, ya no se encontraba disponible dichos tricomponentes (Figura 29)232,233. No se ha encontrado referencias de la eliminación de dichos tricomponentes. Además de los anteriormente mencionados, varios autoinyectores con interés militar están disponibles en el mercado farmacéutico internacional con diferentes combinaciones de antídotos contra agentes nerviosos (atropina, obidoxima, pralidoxima, avizafona y HI-6)228,233,234. Figura 29. Autoinyectores de la empresa Chemprotect SK, autoinyector de tres cámaras (izquierda), catálogo de la empresa Chemprotect SK 2016 (derecha arriba) y catálogo 2018 (derecha abajo). Introducción 60 Denominación Composición Disponibles en el mercado 2023 AtroPen® Atropina sulfato 2 mg ✓ Atropine Actrevo® Atropina sulfato 2 mg ✓ Atropine Autoinyector® Atropina sulfato 2 mg ✓ Mark 1 Kit® 1 Atropina sulfato 2 mg 1 Pralidoxima cloruro 600 mg  ATNAA® Atropina sulfato 2 mg + Pralidoxima cloruro 600 mg ✓ ATOX II® Atropina sulfato 2 mg + Obidoxima cloruro 600 mg  CANA® Diazepam 10 mg  COMPOBEN® Atropina sulfato 2 mg + Pralidoxima mesilato 500 mg + Avizafona clorhidrato 10 mg ✓ DOUBLEPEN® PA Atropina sulfato 2 mg + Pralidoxima cloruro 600 mg ✓ DOUBLEPEN® OA Atropina sulfato 2 mg + Obidoxima cloruro 220 mg ✓ DUODOTE ® Atropina sulfato 2 mg + Pralidoxima cloruro 600 mg ✓ Ineurope® Atropina sulfato 2 mg + Pralidoxima mesilato 350 mg + Avizafona clorhidrato 20 mg ✓ Kit IZAS-05® 1 Atropina sulfato 2 mg 1 Atropina sulfato 2 mg + Pralidoxima cloruro 600 mg 1 Diazepam 10 mg ✓ MULTIPAN HAD® Atropina sulfato 2 mg + HI-6 750 mg + Diazepam 10 mg  RAFA MIDAZOLAM® Midazolam cloruro 10 mg ✓ TRIPLEPEN OAD® Atropina sulfato 2 mg + Obidoxima cloruro 220 mg + Diazepam 10 mg  TROBIGARD® Atropina sulfato 2 mg + Obidoxima cloruro 220 mg ✓ Tabla XVII. Listado de autoinyectores que han estado o están disponibles en el mercado frente agentes neurotóxicos. Introducción 61 3.4.1. ADMINISTRACIÓN AUTOINYECTORES Según tratados de tecnología farmacéutica, en la administración intramuscular, se inyecta volúmenes de hasta 5-7 mL, prefiriéndose músculos del muslo o del glúteo220. El lugar de inyección para la administración correcta de un autoinyector es la parte externa del muslo o la parte superior de la nalga, dependiendo de la constitución del individuo. La inyección debe realizarse en un área muscular grande, si el individuo es de constitución delgada la inyección debe administrarse en el cuarto exterior superior de la nalga, evitando lesiones en el fémur en este tipo de personas42,231. Figura 30. Lugar de inyección en el muslo42,235. Introducción 62 Objetivos y planteamiento 63 “Rif 1909” Cuadro de Ferrer-Dalmau en homenaje a la Sanidad Militar en el Museo de Farmacia Militar (Base Militar de San Pedro, Colmenar Viejo, Madrid). 4. OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO Objetivos y planteamiento 64 Objetivos y planteamiento 65 4.1. OBJETIVO PRINCIPAL El objetivo principal de este trabajo es determinar la estabilidad química de varias soluciones multicomponentes, las cuales, contienen diferentes principios activos utilizados frente a intoxicaciones por agentes neurotóxicos, buscando optimizar la fabricación, administración y el transporte de los autoinyectores de los que se dispone en la actualidad en el Petitorio de Farmacia Militar236. 4.2. OBJETIVOS SECUNDARIOS Valorar la estabilidad de las benzodiacepinas, diazepam y midazolam, en el envase primario del autoinyector y la adsorción en las juntas de estanqueidad de diferente composición. 4.3. PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO Desde el primer momento, se plantea la obtención de una disolución multicomponente buscando su estabilidad físico-química con las tres familias principales de principios activos necesarios frente a intoxicaciones por agentes neurotóxicos y cuya adquisición en el mercado farmacéutico español fuese factible sin derivar para su obtención en una compra extranjera (adquisición compleja y dilatada en el tiempo dentro de la Administración Pública). Dicha disolución debe contener un principio activo anticolinérgico, un principio activo reactivador de la enzima colinesterasa y un principio activo anticonvulsivante dentro de la familia de las benzodiacepinas. Basándonos en el estudio teórico de los diferentes fármacos mencionados anteriormente en el apartado 3.2.9. de esta tesis, se plantean hasta 6 posibles disoluciones de multicomponente: Nº SOLUCIÓN VOLUMEN SULFATO DE ATROPINA CLORURO DE PRALIDOXIMA CLORURO DE OBIDOXIMA HI-6 DIAZEPAM CLORURO DE MIDAZOLAM 1 3 ml 2 mg 600 mg / / 10 mg / 2 3 ml 2 mg 600 mg / / / 10 mg 3 3 ml 2 mg / 220 mg / 10 mg / 4 3 ml 2 mg / 220 mg / / 10 mg 5 3 ml 2 mg / / 750 mg 10 mg / 6 3 ml 2 mg / / 750 mg / 10 mg Tabla XVIII. Propuesta de diferentes formulaciones para la solución multicomponente. Objetivos y planteamiento 66 4.3.1. PLANTEAMIENTO DE ELECCIÓN ENTRE COLINÉRGICOS La atropina es el principio activo menos cuestionado de la terapia convencional, la amplia experiencia en la utilización de atropina ha hecho que se mantenga como fármaco de elección4,51,237. 4.3.2. PLANTEAMIENTO DE ELECCIÓN ENTRE OXIMAS Las oximas de primera generación, como la pralidoxima (PAM) y la obidoxima, tienen el inconveniente de ser poco útiles en la reactivación de la AChE inhibida por somán, que sufre rápidamente el proceso de envejecimiento90,238. La segunda generación de oximas tiene mejor espectro de acción, presentando cierta eficacia en la inhibición por somán, el HI-6 es la única oxima actualmente comercializada de esta segunda generación, pero es poco eficaz en la reactivación de la AChE inhibida por tabún. Un inconveniente ya descrito del HI-6 es su baja estabilidad en solución acuosa, que dificulta su formulación en autoinyectores. Esto obliga a su utilización en autoinyectores de doble o triple cámara, en los cuales la oxima liofilizada se encuentra separada de la solución de atropina y diazepam26,90,178. Los autoinyectores de doble/triple cámara dificulta mucho el proceso de fabricación, generando la necesidad de adquisición de equipos específicos de fabricación que no se dispone en estos momentos en el Centro Militar de Farmacia de la Defensa. Además, otra desventaja a tener en cuenta, es el tiempo inicial de espera hasta la disolución del HI-6 en el interior del dispositivo, paso necesario antes de ser inyectado63. Diferentes grupos de investigación mantienen la búsqueda de nuevas oximas con mayor lipofilia aumentando su capacidad de atravesar la BBB, lo cual, es inversamente proporcional a la solubilidad de estos compuestos en soluciones acuosas, dificultando la administración intravenosa o intramuscular de dichos compuestos60. El coste económico de los principios activos también es un factor a tener en cuenta, en este caso el coste excesivo del HI-6, donde 100 g tiene un coste aproximado de 700.000 euros (presupuesto solicitado a una empresa de API en Junio de 2018), provoca serias dificultades para su adquisición. Por ello, se descarta el HI-6 y se incluye en el estudio el cloruro de pralidoxima y el cloruro de obidoxima. 4.3.3. PLANTEAMIENTO DE ELECCIÓN ENTRE DIAZEPAM-MIDAZOLAM En noviembre de 1990, el ejército americano presentaba el diazepam como antídoto anticonvulsivante frente AN, reconocía que el diazepam y otras benzodiacepinas proporcionaban mejoras significativas en la prevención de los efectos letales a la exposición de AN cuando se usaba como tratamiento adjunto, junto con la terapia anticolinérgica y oxima estándar239. Sin embargo, los resultados experimentales mostraron que el diazepam puede que no sea el anticonvulsivante óptimo, primero porque aunque redujo la incidencia y gravedad de la neuropatología en animales intoxicados con AN, la protección nunca fue completa; en segundo lugar, se encontró en modelos de primates que la dosis de diazepam necesaria para controlar las convulsiones inducidas por somán podrían ser mayores de lo que se estimó inicialmente; por último, hubo continuas preocupaciones por parte de los médicos clínicos que Objetivos y planteamiento 67 la vía de administración im no alcanzaría niveles terapéuticos suficientes para detener las convulsiones239,240. La diferencia de solubilidad del diazepam con respecto a la atropina y las oximas de primera generación, que son hidrosolubles, impide inicialmente la formulación conjunta de los tres principios activos en un mismo autoinyector con una única cámara. Algunos ejércitos, como el francés, utilizan un profármaco derivado del diazepam, el avizafone, soluble en soluciones acuosas y en vivo es metabolizado por una aminopeptidasa que da lugar a la lisina y diazepam2,241. Otros países, como EE.UU., en vez de incorporar el anticonvulsivante a la mezcla atropina-oxima, apuestan por un segundo autoinyector de diazepam90. La elección de una benzodiacepina como lorazepam o midazolam para su administración por vía intramuscular sería más correcto debido a su mejor biodisponibilidad. Cabría pensar que el lorazepam sería la benzodiacepina de elección, ya que presenta una semivida de eliminación mayor que el midazolam, pero el midazolam es mucho más rápido y potente por vía intramuscular240,242,243. En el estudio realizado por McDonough con cinco benzodiacepinas (avizafona, clonazepam, loprazolam, lorazepam, midazolam) en cobayas, los resultados mostraron que todas las benzodiacepinas analizadas presentaron la misma eficacia, sin embargo, hubo diferencias en la potencia y en la rapidez con que se controlaron las convulsiones después de la inyección im. El midazolam tenía el "mejor" perfil terapéutico, era aproximadamente el doble de potente que el diazepam y fue el compuesto de acción más rápido de los probados239. En otro estudio realizado por el mismo autor, demostró que frente a un test de convulsiones realizados con seis agentes nerviosos, el midazolam controló las convulsiones dos veces más rápido que el diazepam cuando son administrados por vía im244. Por este motivo, el midazolam empezó a ser considerado por el ejército americano como posible sustituto del diazepam para las convulsiones generadas por los agentes nerviosos244. Midazolam ofrece varias ventajas sobre otras benzodiacepinas, incluyendo su rápido inicio de acción, su corta duración, solubilidad en agua, y mayor caducidad186,197. Tiene la mayor caducidad de las benzodiacepinas, 2-3 años a temperatura ambiente197. Se suma que en los servicios de emergencia estadounidenses, se ha empezado a usar el midazolam vía im en lugar de por vía iv, en gran parte porque la administración im es más rápida y capaz de alcanzar el lugar diana199,245. Desde agosto de 2022, está aprobado por la FDA el autoinyector de midazolam, para convulsiones provocadas por agentes neurotóxicos185. Actualmente, el autoinyector de diazepam es el que se dispone en el petitorio de Farmacia Militar, pero la bibliografía describe la tendencia de sustituirse por midazolam, por ello en esta tesis se plantea la disolución multicomponente con midazolam. Aun así, paralelamente, se plantea un estudio de la estabilidad química de ambas benzodiacepinas en los envases primarios del autoinyector, y valorar las interferencias de las benzodiacepinas con los componentes de las juntas de estanqueidad. 4.3.4. ESTUDIO DE LAS DIFERENTES POSIBILIDADES DE PRINCIPIOS ACTIVOS A continuación, se realiza una búsqueda más orientada a características físicoquímicas propias de cada principio activo, como solubilidad, pH, interacciones/incompatibilidades y por último su estabilidad química y física de los seis posibles fármacos a seleccionar: Objetivos y planteamiento 68 Principio activo Solubilidad Estabilidad Interacciones pH Sulfato de atropina Agua119 Química: se degrada en tropina más ácido trópico, y en apoatropina119,246 Diazepam198 Conservantes (hidroxibenzoato)165 Álcalis196 4,5-6,2119 3,0 – 6,5247* Cloruro de pralidoxima Fácilmente soluble en agua198 En alcohol: en 100 partes196 Física: no testado198 pH > 4149 Soluciones muy concentradas149 2 - 3248 3,5 - 4,5247* Cloruro de obidoxima Agua172 Química: se degrada en aldehído más hidroxilamina172. Física: altas temperaturas desarrolla color marrón oscuro172 --- 2,5172 Cloruro de asoxima (HI-6) Inestable en soluciones acuosas105,178 Química: se degrada en aldehído más hidroxilamina178. Soluciones con altas concentraciones mayor degradación178 A la luz se produce isómero Z181 2181. 2,5178. Diazepam Poco en agua. Soluble en etanol 96 %119,198 Química: se degrada en 4,5- azometina. Se degrada en glicina más 2- metilamino-5-clorobenzofenona196. Física: si se diluye puede precipitar198 Interacciona con otros principios activos en solución198 No envasar en PVC196,249 6,2-6,9247 6,5-7* Cloruro de midazolam Soluble en agua198 Física: precipitado blanco con dimenhidrinato, fentobarbital sódico, ranitidina198 Apertura anillo con pH ≤ 4198,250 2,5-3,7247 * Especificaciones del Centro Militar de Farmacia de la Defensa-Córdoba. Tabla XIX. Características físico-químicas del SA, CP, CO, HI-6, D y CM. Con lo planteado hasta ahora, se descartan dos APIs, uno perteneciente al grupo de las oximas y otro al grupo de las benzodiacepinas. Dentro de las oximas, el HI-6 se desestima principalmente desde el punto de vista económico y su inestabilidad en agua, ya que la formulación parte de una disolución acuosa. Dentro de las benzodiacepinas, se descarta el diazepam por su insolubilidad en agua y su inestabilidad a pH ácidos, interfiriendo en la estabilidad del resto de componentes. Consecuentemente, el cuadro inicial de las 6 soluciones de partida se reduce, descartando las soluciones 1, 3, 5 y 6 en el estudio teórico: Nº SOLUCIÓN VOLUMEN SULFATO DE ATROPINA CLORURO DE PRALIDOXIMA CLORURO DE OBIDOXIMA HI-6 DIAZEPAM CLORURO DE MIDAZOLAM 2 3 ml 2 mg 600 mg / / / 10 mg 4 3 ml 2 mg / 220 mg / / 10 mg Tabla XX. Soluciones multicomponente que se desarrollarán en la parte experimental. Se reducen a dos el número de posibles soluciones multicomponentes, a partir de ahora la solución nº 2 se conocerá como “Formulación 1” y la solución nº 4 como “Formulación 2”, denominadas F1 y F2 respectivamente de aquí en adelante. Objetivos y planteamiento 69 4.3.5. ESTABILIDAD DE FORMAS FARMACÉUTICAS INYECTABLES Las formulaciones inyectables, al estar destinadas a traspasar las barreras protectoras que constituyen la piel y las mucosas, deben responder a un cierto número de exigencias y estar adaptadas a las condiciones fisiológicas de la sangre y de los tejidos implicados. Cuanto mayor sea este grado de adaptación, mejor tolerada será la preparación. En términos generales, las preparaciones parenterales, deben cumplir los siguientes requisitos básicos: limpidez, pH, isotonía, esterilidad y ausencia de pirógenos220. Por ello, a partir de este punto, se plantearon las disyuntivas propias a tener en cuenta frente a una formulación de una solución inyectable, como la elección del pH, limpidez, isotonía, elección de excipientes, elección de envase, etc. La estabilidad es una de las principales propiedades que definen la calidad de un medicamento y debe ser evaluada desde la fase de descubrimiento de un nuevo fármaco hasta la fase de desarrollo y comercialización. La estabilidad puede definirse como la capacidad de una formulación, en un envase determinado, para mantener sus especificaciones físicas, químicas, microbiológicas, terapéuticas y toxicológicas251. Por otro lado, en el ámbito de la tecnología farmacéutica, el conocido profesor Ramón Salazar plantea que el grado de variación permitido en cuanto a estabilidad depende del producto, de su uso, de la dosis y de su vía de administración. El primer término a considerar es la cantidad de inestabilidad que puede ser aceptada teniendo en cuenta la no toxicidad del producto y la eficacia252. 4.3.5.1. ESTABILIDAD QUÍMICA La inestabilidad de un medicamento puede conducir a una pérdida de eficacia debido a la degradación química por hidrólisis, oxidación, racemización, polimerización o degradación fotoquímica del principio activo y/o de los excipientes de formulación251,252. Por lo tanto, es crucial diseñar y realizar estudios de estabilidad para disponer de evidencias de la variación en la calidad del medicamento a lo largo del tiempo, cuando se encuentra bajo la acción de distintos factores ambientales251. Dentro de la estabilidad de los fármacos, uno de los aspectos más estudiados, es el correspondiente a la pérdida de fármaco debida a un proceso de degradación química del mismo, con la consecuente reducción de su potencia o contenido. Y a su vez, de la posible toxicidad de sus productos de degradación251,252. Las posibles vías de degradación química que nos podemos encontrar en la propuesta de autoinyector son251:  Hidrólisis: La presencia de agua provoca la degradación de fármacos susceptibles a hidrólisis. Fármacos con grupos funcionales éster, amidas, lactonas o imidas.  Oxidación: depende de la presencia o no de grupos reactivos al oxígeno u otros agentes oxidantes. Grupos susceptibles a la oxidación son aldehídos, fenoles, catecoles y alcoholes.  Fotodegradación: sensibilidad a la luz.  Interacciones fármaco-excipiente. Objetivos y planteamiento 70 Los factores que afectan a la estabilidad química incluyen factores intrínsecos como la estructura molecular del fármaco, y factores ambientales, como251:  Temperatura: es un factor determinante ya que al incrementar la temperatura, frecuentemente, se produce un aumento del valor de la constante de velocidad de degradación (aproximadamente la velocidad se duplica por cada 10° de elevación de la misma252). En la mayoría de los casos, afortunadamente, la degradación del fármaco a temperatura ambiente es muy lenta y la estimación de su velocidad de degradación requeriría mucho tiempo. Sin embargo, al incrementar la temperatura también aumenta la velocidad de degradación.  pH: es uno de los factores más condicionantes de la estabilidad. El efecto del pH puede deberse a la acción catalítica que presentan los iones H+ y OH- en muchas reacciones de degradación. Es necesario determinar el pH de máxima estabilidad del fármaco.  Composición del tampón y fuerza iónica: debe seleccionarse la concentración de la solución reguladora más baja posible que permita mantener el valor del pH adecuado durante todo el periodo de validez.  Constante dieléctrica de los solventes: uno de los disolventes más utilizados en la formulación de medicamentos es el agua, sin embargo, para los fármacos susceptibles a procesos de hidrólisis sustituir este solvente por otro no acuoso puede ser una solución para evitar su degradación.  Oxígeno: la transformación de una entidad química en otra más pobre en electrones o más rica en oxígeno. Cuando un producto se oxida lo hace a costa de otro que se reduce. Son oxidables prácticamente todas las funciones orgánicas252.  Luz: numerosas referencias en la literatura farmacéutica dan cuenta de la inestabilidad de principios activos por reacciones fotolíticas.  Estado cristalino y polimorfismo: el estado cristalino puede condicionar su estabilidad química, muchos además presentan polimorfismo que puede mostrar diferente reactividad. 4.3.5.2. ESTABILIDAD FÍSICA Hay que tener en cuenta que un cambio en una propiedad física afecta frecuentemente a otras propiedades físicas252. Las formas de dosificación pueden sufrir cambios físicos durante su almacenamiento. Las principales propiedades físicas en disoluciones son la apariencia y características organolépticas. En general, aunque es considerado como signo de inestabilidad física, un cambio de coloración puede servir para alertar sobre la posibilidad de que exista un problema de estabilidad química. Lo mismo ocurre con el olor, la aparición de turbidez, o la formación de precipitados251. En las disoluciones parenterales debe evaluarse la compatibilidad del principio activo y los excipientes de la formulación con el envase primario. Tiene como finalidad demostrar la ausencia de interacciones como la adsorción de los componentes de la formulación en la superficie del envase o la migración de componentes del material de acondicionamiento a la formulación (leachables)251. Objetivos y planteamiento 71 4.3.5.3. ESTABILIDAD MICROBIOLÓGICA La estabilidad microbiológica hace referencia a que la esterilidad o los niveles de contaminación microbiana se mantengan a niveles acordes con los requisitos especificados. Las formas farmacéuticas líquidas, por su alto contenido en agua, son más propensas a la contaminación microbiana. Para evitar la contaminación de la formulación durante el almacenamiento y uso deben tomarse algunas medidas como son un diseño apropiado de los envases, la utilización de envases monodosis, el mantenimiento de condiciones de almacenamiento adecuadas y la adición de sustancias antimicrobianas como conservante251. Forma de dosificación Conservante Concentración (%p/v) Inyectables Fenol Clorobutanol Clorocresol Nitrato de fenilmercurio Alcohol bencílico Metabisulfito sódico Bisulfito sódico Metilparabeno 0,5 0,25-0,5 0,1 0,001 0,1-3 0,0025-0,66 0,13-0,2 0,4 Tabla XXI. Conservantes251. Además, para ciertas formulaciones parenterales no se puede realizar una esterilización terminal por inestabilidad de la materia prima o del material de acondicionamiento, provocando un aumento del control de las condiciones en la fabricación para minimizar la contaminación microbiana, se conoce como “vía aséptica”230. 4.3.6. PLANTEAMIENTO DE ELECCIÓN DE EXCIPIENTES Normalmente, la transformación de un fármaco en el correspondiente medicamento implica la adición de una serie de sustancias auxiliares, conocidas genéricamente como excipientes o coadyuvantes, que carecen de actividad farmacológica propia219. Para la vía intramuscular, las formas de dosificación más adecuadas son las disoluciones y suspensiones inyectables. El proceso de absorción del fármaco a partir de una forma de dosificación implica la liberación previa del fármaco que, normalmente, concluye con su disolución en el entorno biológico. Por lo tanto, la cantidad absorbida y la velocidad con la que tiene lugar el proceso de absorción depende de la facilidad con la que se produce su disolución in vivo y de la facilidad con la que atraviesa las membranas biológicas que lo separan de la circulación sanguínea219. Los principales tipos de excipientes para formulación de disoluciones parenterales son vehículos o disolventes, agentes solubilizantes, tensoactivos, reguladores de pH, isotonizantes, conservantes, antimicrobianos y antioxidantes220,230: a) Vehículos o disolventes: el principal para la fabricación de preparaciones parenterales líquidas es el agua, debido principalmente a su condición de componente fisiológico. b) Agentes solubilizantes: vehículos no acuosos miscibles con agua como etanol, propilenglicol, polietilenglicol, etc. Todos ellos usados para la formulación de diazepam, ya que este principio activo es insoluble en agua. Objetivos y planteamiento 72 c) Tensoactivos: agentes solubilizantes. En nuestro caso no los usamos. d) Reguladores de pH y agentes isotonizantes: se utilizan para aproximar el pH del preparado parenteral a valores fisiológicos o para fijar unas condiciones de pH en las cuales el principio activo sea estable. En nuestro caso usamos, ácido clorhídrico al 37% para acidificar e hidróxido sódico 0,01 N para basificar. e) Conservantes antimicrobianos: se utilizan para prevenir el crecimiento de microorganismos. La concentración, la temperatura, el coeficiente de reparto y en especial el pH del medio afecta a los conservantes microbianos. En nuestro caso no los usamos para disminuir las posibles interacciones de este excipiente. f) Conservantes antioxidantes y quelantes: son muy eficaces para estabilizar productos farmacéuticos que experimentan reacciones en cadena medidas por radicales libres252. Se incorporan en formulaciones que el principio activo es fácilmente oxidable. En algunos casos, se puede proteger el preparado trabajando en atmósfera inerte o desplazando el oxígeno disuelto, mediante saturación de la disolución de fármaco con nitrógeno (usado en nuestro caso). Hemos utilizado un sulfito inorgánico como conservante antioxidante, el metabisulfito sódico. Las cantidades de antioxidante que se vayan a utilizar han de ser siempre las mínimas que permitan su acción y es importante controlar que no interaccionen con componentes de la formulación. La bibliografía recomienda entre 1,0 – 0,01 % p/v253, en nuestro caso seguimos los porcentajes que se utiliza en los inyectables del CEMILFARDEF de un 0,1% p/v, correspondiente a 3 mg por envase. 4.3.7. ESTUDIO DE ISOTONICIDAD Desde un punto de vista teórico, solo deben administrarse por vía parenteral preparados isotónicos. En la práctica, se buscan soluciones isoosmóticas añadiendo al preparado los excipientes adecuados (por ejemplo, cloruro sódico). La administración de preparados no isotónicos suele ser dolorosa, además puede afectar a la concentración del fármaco y, por tanto, condicionar su eficacia y seguridad. Así, en el caso de soluciones hipertónicas, se puede producir la salida de líquidos celulares, que dan lugar a una dilución de la disolución del fármaco. Por el contrario, si se administra una solución hipotónica, se produce un fenómeno de aumento de la concentración del fármaco en la preparación administrada, pudiendo inducir precipitación y aparición de fenómenos de irritación, así como pérdida de eficacia220. En general, para determinar la tonicidad de las disoluciones inyectables se acude a la aplicación de métodos indirectos. Entre ellos, se encuentra el descenso crioscópico, determinación de la concentración molar, el equivalente isotónico en cloruro sódico (el usado en nuestro caso) y el de dilución220. Los excipientes isotonizantes se utilizan en preparados para perfusión (en gran volumen), porque en las de pequeño volumen no se produce apenas dolor, ya que se diluye con la sangre rápidamente230. El método basado en el equivalente isotónico en cloruro sódico (NaCl) se basa en una disolución de cloruro sódico al 0,9 % p/v en agua como solución patrón. Para ello, se define el equivalente en cloruro sódico como el peso de esta sal que equivale a un gramo de la sustancia considerada en cuanto a su comportamiento crioscópico (que tiene el mismo efecto osmótico). Lógicamente, Objetivos y planteamiento 73 si un preparado tiene un equivalente en cloruro sódico inferior a 0,9 % se deberá añadir un agente isotonizante para que el preparado sea isoosmótico220. Las cantidades de dos sustancias que son isotónico-equivalentes son proporcionales al peso molecular de cada una multiplicado por el valor i de la otra. Por lo tanto, el equivalente en cloruro sódico (EI) de una determinada sustancia se puede calcular de acuerdo con la siguiente expresión: EI= (M NaCl / i NaCl) x (i compuesto / M compuesto) Tras los cálculos con nuestras formulaciones, se obtiene un valor de EI para la F1 de -0,1671 gramos de NaCl, y para la F2 de 0,024 gramos de NaCl. Finalmente, se decide no añadir NaCl a ninguna de las dos formulaciones, por no ser una cantidad que pueda influir en la estabilidad de las soluciones a estudio y tratarse nuestro desarrollo de un preparado de pequeño volumen. 4.3.8. ELECCIÓN DEL pH El pH es un factor importante para tener en cuenta en la formulación de formas farmacéuticas acuosas de administración parenteral, puesto que puede condicionar no solo la tolerancia de la preparación por el organismo, sino también su estabilidad y la actividad del principio activo220. El pH de la sangre se encuentra entre 7,35-7,40, pero por su poder regulador puede tolerar preparados con pH entre 4 y 10, fuera de estos rangos la administración puede producir dolor, así como inflamación y lesiones en tejidos, pudiendo afectar también a la estabilidad y a la actividad del principio activo, condicionando su conservación y periodo de validez220. El ajuste de pH de una solución para uso parenteral puede llevarse a cabo mediante la adición de un ácido o una base, en este estudio en caso de ser necesario el uso de ácidos y bases, se emplearán los que habitualmente se usan en el ajuste de soluciones parenterales en la fabricación del Módulo de Estériles del CEMILFARDEF (previamente teniendo en cuenta las sales de los principios activos usados en la solución multicomponente, ácido clorhídrico al 37% para acidificar y NaOH 0,01 N para basificar). Además, en la bibliografía se encontró condicionantes (en cuanto a pH) a tener en cuenta de los principios activos usados: - Sulfato de atropina: se conoce que la estabilidad de la atropina mejora en solución ácida. Es aconsejable que el pH de una solución acuosa de sulfato de atropina se encuentre aproximadamente entre 3 y 4129,246. A un pH neutro (pH 7-8) o en condiciones básicas (pH 8-10; > 11,5) se produce una degradación notable129. - Cloruro de pralidoxima: en soluciones parenterales tiene mayor estabilidad con valores de pH cercano al 3163. - Cloruro de midazolam: a pH mayores de 4 predomina el midazolam con anillo cerrado, a pH ácido suele producirse hidrólisis en el anillo imidazol de la estructura que conlleva a que exista a pH entre 1-4 un equilibrio entre el midazolam con anillo abierto y cerrado (benzofenona)254. Objetivos y planteamiento 74 Teniendo en cuenta el pH óptimo (tabla XIX) de los diferentes compuestos, se planteó desarrollar dos experimentos, una solución multicomponente con un pH 3 y otra con pH 4, queriendo discernir el mejor comportamiento de la solución a dichos pH. 4.3.9. ELECCIÓN DE TEMPERATURA (ZONAS CLIMÁTICAS) Las zonas climáticas es un concepto que se usa para los estudios de estabilidad, el mundo puede dividirse en cuatro zonas climáticas definidas por la temperatura y la humedad relativa [I: Temperatura (21 °C y 45 % HR), II: Mediterránea y subtropical (25 °C y 60 % HR), III: Calor y sequedad (31 °C y 40 % HR), y por último IV: Calor y humedad (31 °C y 70 % HR)]. Aunque esos valores varían a lo largo del año, es posible utilizar un equivalente cinético promedio de temperatura y humedad relativa. Por tanto, al exponer en un estudio de estabilidad los productos farmacéuticos a estas temperaturas y humedades relativas, se provocará los mismos cambios o estrés del producto como si fuera expuesto a las condiciones climáticas normales de esta zona252. Inicialmente, el uso de este futuro antídoto no estará únicamente ligado a territorio nacional, por lo que conviene estudiar su estabilidad en distintas condiciones climáticas, ya que las tropas de las Fuerzas Armadas Españolas pueden estar desplegados en cualquier parte del mundo, simulando países como Afganistán para las condiciones aceleradas de 40 °C, o la Antártida para las condiciones en frío o el Líbano para unas condiciones a 25 °C. Por ello, se plantea el estudio de estabilidad en diferentes condiciones siguiendo normativa del Comité Internacional de Armonización (ICH), establecidos en su directriz principal (ICH) Q1A(R2) “Estudios de estabilidad de nuevos principios activos y medicamentos derivados”255. Para abarcar el comportamiento de diferentes países y medicamentos, la guía contiene cierta flexibilidad en los requisitos, reconociendo que se pueden usar enfoques alternativos de estabilidad si están científicamente justificados256. Por ello, se plantean las siguientes tres temperaturas: - “En frío”: 4 ± 2 °C durante 12 meses. - “A tiempo real” (largo plazo): 25 ± 2 °C / 60 ± 5 % H.R. durante 36 meses. - “Aceleradas” (corto plazo): 40 ± 2 °C / 75 ± 5 % H.R. durante 9 meses. 4.3.10. ELECCIÓN DE ENVASES En todo preparado parenteral, además del principio activo y los excipientes, deben considerarse como componentes imprescindibles para garantizar la esterilidad, el recipiente y el cierre. Estos componentes no pueden considerarse aisladamente ya que unos influyen en los otros230. El material ideal para el envase de un medicamento es aquel que siendo químicamente inerte no cede ninguno de sus componentes al contenido, no absorbe ningún componente al medicamento y es impermeable a todos ellos así como a los gases y vapores atmosféricos252. Los recipientes destinados a preparados parenterales, incluyendo cierres elastoméricos, deben ser estériles y no incorporar pirógenos220. Objetivos y planteamiento 75 La jeringa del autoinyector no es un recipiente de vidrio en su totalidad, es un tubo de vidrio donde se genera una cámara estanca que albergará la disolución medicamentosa a través de dos juntas de estanqueidad en cada uno de sus extremos. El vidrio es el material de envase por excelencia utilizado desde los comienzos de la comercialización de medicamentos. Es prácticamente impermeable tanto a los agentes atmosféricos como a todos los componentes medicamentosos, pero se debe tener en cuenta su relativa baja resistencia al ataque hidrolítico252. La calidad del vidrio es de gran importancia, ya que no debe ceder iones alcalinos a la solución que contiene. Debe ser de tipo I, es decir vidrio neutro, de boro-silicato y elevada resistencia hidrolítica119,230. Los envases de cristal son más recomendables que los de plástico, debido a la disminución de pérdidas por vapor, formación de color y reacciones anómalas131. Los valores de pH en envases de cristal son más homogéneos a cualquier temperatura, sin embargo, se han observado discrepancias de pH en envases de plástico, disminuyendo los valores en algunos casos considerablemente, seguramente causado por una reacción con algún componente del material plástico a esa temperatura131. En cuanto a los cierres elastoméricos (también denominados como juntas de estanqueidad en este estudio), se deben caracterizar por ser herméticos, esterilizables, flexibles y elásticos, químicamente inertes, impermeables a líquidos y gases, no ceder ninguna sustancia al medicamento ni tomar o modificar nada del mismo. Pueden estar constituidos de caucho natural, caucho butilo, clorobutilo, bromobutilo, etilenpropileno, silicona, uretano, fluoroelastómeros, estirenobutadieno, poliisopreno, nitrilo, neopreno o polibutadieno. Además, pueden llevar incorporados agentes de vulcanización tipo azufre, peróxidos, óxidos de zinc, cadmio, magnesio, resinas y aminas. Plastificantes tipo ácidos grasos, resina de pino, aceites vegetales y minerales, polietileno, vaselina, ftalatos y fosfatos orgánicos230. En 2018, en el Centro Militar de Farmacia de la Defensa-Colmenar Viejo, se planteó la posibilidad de poder aumentar la caducidad de todos aquellos antídotos críticos dentro del ámbito NRBQ, según se había visto en publicaciones realizadas por la FDA257. Dentro de este grupo, se encontraban los tres lotes de autoinyectables de diazepam fabricados por primera vez en 2015 en el Centro Militar de Farmacia de la Defensa de Córdoba. Tras haber superado su fecha de caducidad en 2017, en 2018 y fechas posteriores, se les realizó análisis a dichos lotes de producto terminado para ver su comportamiento, obteniéndose los resultados indicados a continuación: Objetivos y planteamiento 76 LOTE J01 062017 Pruebas generales Pruebas Especificaciones 10/06/2015 11/06/2018 14/01/2019 01/08/2019 Aspecto Líquido untuoso, incoloro o débilmente amarillo Cumple Cumple Cumple Cumple pH 6,20 - 6,90 6,55 6,63 6,63 6,60 Identificación A HPLC 98 - 102 % 95,47 % 76,20 % 75,50 % 73,60 % LOTE J02 062017 Pruebas generales Pruebas Especificaciones 10/06/2015 11/06/2018 14/01/2019 01/08/2019 Aspecto Líquido untuoso, incoloro o débilmente amarillo Cumple Cumple Cumple Cumple pH 6,20 - 6,90 6,5 6,62 6,67 6,61 Identificación A HPLC 98 - 102% 94,66 % 74,30 % 76,20 % 72,30 % LOTE J03 062017 Pruebas generales Pruebas Especificaciones 10/06/2015 11/06/2018 14/01/2019 01/08/2019 Aspecto Líquido untuoso, incoloro o débilmente amarillo Cumple Cumple Cumple Cumple pH 6,20 - 6,90 6,59 6,64 6,65 6,63 Identificación A HPLC 98 - 102% 94,40 % 76,50 % 76,80 % 70,00 % Tabla XXII. Análisis de producto terminado de Autoinyectores de Diazepam tras su caducidad. Se observa una disminución notable de la riqueza de la solución inyectable de diazepam. Tras una amplia búsqueda bibliográfica, se encuentra que el diazpeam es uno de los principios activos que tiende a ser adsorbido por cierto tipo de materiales plásticos que contienen matrices poliméricas que presentan mezclas de halo-butyl-isopreno195,249,258–262. Además, en estos estudios se indica que esa adsorción del principio activo se acumula en la matriz polimérica. El diazepam es prácticamente insoluble en agua, pero muy soluble en alcoholes119. Dado que el diazepam es mucho más soluble en disolventes orgánicos que en solución acuosa, se puede especular que los envases plásticos pueden actuar de manera similar a un solvente orgánico para absorber algo de la solución del diazepam194. El modelo de junta de estanqueidad utilizado en los autoinyectores hasta el momento de la fabricación de las muestras de esta tesis en el CEMILFARDEF es “PH 701/50 C BLACK”. Se consulta a la empresa fabricante de las juntas y el Servicio Técnico afirma que la formulación del modelo usado es una formulación antigua y no recomiendan su uso para diazepam. La solución que plantean es el uso de juntas de estanqueidad con una nueva formulación, cuyo modelo es “4023/50 GRAY”. Figura 31. Junta de estanqueidad PH701/50 C BLACK (izquierda) y 4023/50 GRAY (derecha). Objetivos y planteamiento 77 Composición genérica PH 701/50 C BLACK 4023/50 GRAY Tipo de elastómero Clorobutilo Bromobutilo Sistema de refuerzo Mineral inerte Mineral inerte Sistema de curado Resina fenólica Inusual Contenido de caucho natural seco 0,0 % 0,0 % Tabla XXIII. Descripción general de la composición de la formulación de las juntas de estanqueidad PH 701/50 C BLACK y 4023/50 GRAY. Por ello, se decide estudiar como variable la composición de las juntas de estanqueidad tras la criticidad observada por la posible interferencia con la solución medicamentosa. Se planifica dos estudios en paralelo con ambas juntas, con el fin de realizar un estudio comparativo. Buscando observar el comportamiento de las juntas de estanqueidad con las diferentes benzodiacepinas que tratamos en esta tesis, se establece un cuadro de experimentos para analizar la estabilidad de las soluciones únicas de diazepam y su futuro sustituto midazolam. Asimismo, se valorará el principio activo adsorbido en la matriz de la junta de estanqueidad comparándolo con las formulaciones propias de las benzodiacepinas anteriormente indicadas (Figuras 34 y 35). Y por otro lado, se amplía el estudio del efecto de las juntas de estanqueidad no solo a las dos disoluciones de benzodiacepinas, si no, que se abordará también el comportamiento de las dos disoluciones del multicomponente (Figuras 32 y 33). 4.3.11. PLANTEAMIENTO FINAL DEL ESTUDIO (CUADROS DE EXPERIMENTOS) Como conclusión, y realizando un compendio de todos los parámetros tratados en este apartado 4.3, se plantean los siguientes cuatro cuadros de experimentos: Objetivos y planteamiento 78 Figura 32. Cuadro de experimentos de la Formulación 1 (sulfato de atropina, cloruro de pralidoxima y cloruro de midazolam). Figura 33. Cuadro de experimentos Formulación 2 (sulfato de atropina, cloruro de obidoxima y cloruro de midazolam). Objetivos y planteamiento 79 Figura 34. Cuadro de experimentos de la solución de diazepam. Figura 35. Cuadro de experimentos de solución de cloruro de midazolam. Objetivos y planteamiento 80 Material y métodos 81 Botiquín de antídotos de la Segunda Guerra Mundial en el Museo Nacional de Historia Militar en Diekirch (Luxemburgo). 5. MATERIAL Y MÉTODOS Material y métodos 82 Material y métodos 83 5.1. MATERIAL 5.1.1. MATERIA PRIMA - Sulfato de atropina de Shaoxing Minsheng Pharmaceutical Co. - Cloruro de pralidoxima de Raschig GmbH. - Cloruro de obidoxima de Merck KGaA. - Cloruro de midazolam de Fagrón ibérica. - Diazepam de Disproquimia S.A. - Metabisulfito sódico de Panreac Química S.L.U. - Propilenglicol de Quality Quemicals S.L. - Alcohol bencílico de Manuel Riesgo S.A. - Benzoato de sodio de Siemsgluss Ibérica S.A.U. - Etanol 96% de Alcoholes del Sur S.A. - Ácido benzoico de Panreac Química S.L.U. - EDTA disódico de Panreac Química S.L.U. 5.1.2. REACTIVOS - Hidrogenofosfato de sodio 1M de Fisher Scientific SL. - Acetonitrilo de Fisher Scientific SL. - Ácido 1-heptanosulfónico 20mM de Fisher Scientific SL. - Ácido fosfórico de Fisher Scientific SL. - Cloruro de tetraetilamonio de Fisher Scientific SL. - Metanol R de Fisher Scientific SL. - 1-heptanosulfonato de Fisher Scientific SL. - Acetato de amonio de Fisher Scientific SL. - Hidróxido tetrabutilamina de Fisher Scientific SL. - HCl 37% de Panreac Química S.L.U. - NaOH 0,01 N de Panreac Química S.L.U. 5.1.3. MATERIAL DESECHABLE - Microtubos de 2,0 ml SuperClear de VWR, 211-0034. - Tubos de vidrio de 3 ml de AGRADO S.L. - Juntas de estanqueidad “PH 701/50 C BLACK” de West Pharmaceutical Services Inc. - Juntas de estanqueidad “4023/50 GRAY” de West Pharmaceutical Services Inc. - Microfiltro de 0,45 μm de PALL Technologies S.A. - Columnas HPLC, YMC Basic S-C8 (REF. BA99S05-2546WT). - Etiquetas adhesivas. 5.1.4. EQUIPOS - Balanza de pesada (Mettler Toledo SR16001, n/s: 1117441340). - pHmetro (CRISON pH 25, n/s: 635064). - Taponadora (BD, n/s: 540). - Nevera BOSCH. - Estufa BINDER (KBF 240, n/s: 05-91439T/HR). - Cámara climática CONSISTROL. Material y métodos 84 - HPLC Jasco PU-1580, Jasco UV-1575, Jasco AS-2050- Plus autosampler. - Congelador LIEBHERR. 5.1.5. INSTRUMENTAL DE LABORATORIO - Paleta de pesadas. - Botes de vidrio SCHOTT de 1 litro. - Pipetas Pasteur. - Pipetas LABMATE Soft 1-5 ml. - Pipetas Kartell 20 μl. - Agitador magnético. 5.2. MÉTODOS A continuación, se detallan los distintos métodos utilizados en orden cronológico de empleo: 5.2.1. Fabricación de muestras de la Formulación 1, Formulación 2, Diazepam y Midazolam. 5.2.2. Estudio de estabilidad bajo las condiciones de almacenamiento siguiendo la normativa ICH. 5.2.3. Validación del método de análisis. 5.2.4. Evaluación de los resultados. 5.2.1 FABRICACIÓN DE MUESTRAS DE LA FORMULACIÓN 1, FORMULACIÓN 2, DIAZEPAM Y MIDAZOLAM. 5.2.1.1. FABRICACIÓN “FORMULACIÓN 1” En el cuadro de experimentos establecido para el estudio de estabilidad de la Formulación 1 (Figura 32), se calculó un total de 114 jeringas de autoinyectores de F1 con pH 3, e igualmente, 114 unidades de F1 con pH 4, correspondiente a un volumen de 700 ml cada formulación. Además, se tiene en cuenta que durante la etapa de llenado se puede hacer necesario purgar pequeños volúmenes (200 ml aproximadamente), por ello se prepara un total de 900 ml por fórmula. Como se observa en el siguiente diagrama de flujo (Figura 36 y 37), la fabricación se desarrolla en varias etapas, desde la pesada y preparación del material de acondicionamiento del envase primario, como la disolución de los principios activos y excipiente, ajuste de pH, filtración 0,45 μm, dosificación, taponado, identificación y almacenamiento en los envases secundarios que se mantendrán en las condiciones establecidas en el estudio. Material y métodos 85 Figura 36. Diagrama de flujo de la fabricación de 900 ml de Formulación 1 - pH 3. Material y métodos 86 Figura 37. Diagrama de flujo de la fabricación de 900 ml de Formulación 1 - pH 4. Material y métodos 87 5.2.1.2. FABRICACIÓN “FORMULACIÓN 2” En el cuadro de experimentos establecido para el estudio de estabilidad de la Formulación 2 (Figura 33), se calculó un total de 114 jeringas de autoinyectores de F2 con pH 3, e igualmente, 114 unidades de F2 con pH 4, correspondiente a un volumen de 700 ml cada formulación. Igualmente, se suma 200 ml de volumen de purga, preparándose 900 ml en total por fórmula. A continuación, se sigue el mismo diagrama de flujo de fabricación (Figura 38 y 39). Material y métodos 88 Figura 38. Diagrama de flujo de la fabricación de 900 ml de la Formulación 2 - pH 3. Material y métodos 89 Figura 39. Diagrama de flujo de la fabricación de 900 ml de la Formulación 2 - pH 4. Material y métodos 90 5.2.1.3. FABRICACIÓN “DIAZEPAM” En el cuadro de experimentos establecido para el estudio de estabilidad del Diazepam (Figura 34), se calculó un total de 108 jeringas de autoinyectores, correspondiente a un volumen de 500 ml. En el diagrama de flujo de fabricación (Figura 40) se observa las diferentes etapas, desde la pesada y preparación del material de acondicionamiento del envase primario, como la disolución del principio activo con sus excipientes, ajuste de pH, dosificación, taponado, identificación y almacenamiento en los envases secundarios que se mantendrán en las condiciones establecidas en el estudio. Figura 40. Diagrama de flujo de la fabricación de 500 ml de Diazepam. Material y métodos 91 5.2.1.4. FABRICACIÓN “MIDAZOLAM” En el cuadro de experimentos establecido para el estudio de estabilidad del Midazolam (Figura 35), se calculó un total de 108 jeringas de autoinyectores, correspondiente a un volumen de 500 ml. Como se observa en el diagrama de flujo (Figura 41), la fabricación se sustenta en varias etapas, desde la pesada y preparación del material de acondicionamiento del envase primario, como la disolución del principio activo y el excipiente, ajuste de pH, dosificación, taponado, identificación y almacenamiento en los envases secundarios que se mantendrán en las condiciones establecidas en el estudio. Figura 41. Diagrama de flujo de fabricación de 500 ml de Midazolam. Material y métodos 92 5.2.2 ESTUDIO DE ESTABILIDAD BAJO LAS CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO SIGUIENDO LA NORMATIVA ICH Los estudios de estabilidad se definen como aquel conjunto de ensayos relacionados con las características físicas, químicas, biológicas y microbiológicas de un principio activo o un producto farmacéutico, encaminado a la obtención de información acerca de su estabilidad, a fin de definir su período de eficacia en determinadas condiciones de envase y almacenamiento. La guía de estabilidad de ICH no solo está destinada a fines de registro, sino que también informa del estudio de estabilidad durante un nuevo desarrollo, por ejemplo, las condiciones de almacenamiento descritas en la guía pueden proporcionar un marco para los protocolos de estabilidad de desarrollo utilizados para garantizar la calidad, seguridad y eficacia del medicamento256. La normativa en vigor en España relativa a los estudios de estabilidad de medicamentos sigue los principios desarrollados por el Comité Internacional de Armonización (ICH), establecidos en su directriz principal, ICH Q1A(R2) “Relativa a los procedimientos de los estudios de estabilidad de nuevos principios activos y medicamentos derivados”. El objetivo de los estudios de estabilidad es suministrar evidencias de la variación de la calidad del fármaco o del medicamento a lo largo del tiempo, cuando se encuentra bajo la acción de distintos factores251: a) Factores ambientales tales como temperatura, humedad relativa (H.R.), luz, oxígeno y otros como vibración o congelamiento. b) Factores relativos al producto, que pueden incluir:  Propiedades físicas y químicas del principio activo y de los excipientes, como la presencia de ciertas impurezas, la forma cristalina o polimórfica particular, el tamaño de partículas y la posible presencia de agua u otros disolventes.  La forma farmacéutica y su composición.  El proceso de manufactura, incluyendo las condiciones ambientales, los procedimientos tecnológicos y otros como personal, equipos, entre otros más.  La naturaleza del envase con el producto farmacéutico tiene un contacto directo. El estudio de estabilidad acelerado está diseñado para aumentar la velocidad de degradación química o los cambios físicos de un principio activo o un producto farmacéutico usando condiciones de almacenamiento forzadas. Cuando se observa algún cambio significativo, se recomienda realizar un estudio en condiciones intermedias de un plazo de seis meses251. Se entiende por cambio significativo en los parámetros de estabilidad, lo siguiente251: - Disminución del 5 % en la valoración de los principios activos fundamentales comparado con tiempo cero. - pH fuera de especificaciones. - Presencia de cualquier producto de degradación por encima de especificaciones. - Incumplimiento del criterio de aceptación para apariencia y atributos físicos. En esta tesis, basado el estudio de estabilidad en diferentes condiciones de almacenamiento, se proponen las siguientes condiciones: Material y métodos 93 Tipo de estudio Condiciones de almacenamiento251 Tiempo mínimo de estudio para presentar a registro251 Tiempo propuesto para esta formulación multicomponente A largo plazo (“A tiempo real”) 25 ± 2 °C / 60 ± 5 % H.R. 12 meses 36 meses Acelerado (“Corto plazo”) 40 ± 2 °C / 75 ± 5% H.R. 6 meses 9 meses En frío 4 ± 2 °C 6 meses 12 meses Tabla XXVI. Condiciones de almacenamiento para registro vs propuesta condiciones de almacenamiento para esta tesis. La frecuencia de muestreo para estudios de estabilidad a largo plazo se realiza cada tres meses durante el primer año, cada seis meses para el segundo año y, posteriormente, de forma anual hasta agotar el periodo de validez propuesto. Para los estudios de estabilidad a corto plazo, en condiciones de almacenamiento denominadas aceleradas, se recomienda utilizar al menos tres puntos incluyendo los puntos de inicio y fin del estudio. En nuestro estudio lo establecemos mensualmente, alargándolo hasta los 9 meses [ver punto 4.3.11 Planteamiento final del estudio (cuadros de experimentos)]. 5.2.3 VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE ANÁLISIS Los métodos analíticos empleados en el estudio de estabilidad para la detección del principio activo se encuentran recopilados en la Real Farmacopea Española119, así como en la Farmacopea Europea263. Existen diferentes métodos analíticos, no siendo todas de igual utilidad. En la RFE, la cromatografía de líquidos es la técnica analítica marcada para la cuantificación de principios activos en industria, tanto en producto terminado como en estudios de estabilidad. Para la valoración de la estabilidad química, debe utilizarse metodología analítica indicadora de estabilidad, es decir metódica analítica cuantitativa, basada en características estructurales y propiedades químicas de cada principio activo de una forma farmacéutica, que permita distinguir cada principio activo de sus productos de degradación, de tal manera que pueda ser analizado de forma selectiva y precisa. 5.2.3.1. MÉTODO DE ANÁLISIS DEL SULFATO DE ATROPINA, OXIMAS (PRALIDOXIMA Y OBIDOXIMA) Y MIDAZOLAM EN UN ÚNICO ANÁLISIS Se utiliza un equipo modular Jasco con una bomba Jasco PU-1580, un inyector automático Jasco AS-2050-Plus con un capilar de inyección de hasta 100 μL, y un detector UV-visible Jasco UV- 1575. La longitud de onda de análisis es de 220 nm. La fase móvil se basa en la descrita en el método analítico de HPLC para atropina en USP 38 (2015) aunque aumentando la proporción de acetonitrilo para facilitar el análisis de midazolam. La mezcla de acetonitrilo (calidad gradiente HPLC): fase acuosa seleccionada tiene unas proporciones 30:70 (v:v). La fase acuosa es un tampón de 1,8 g/l KH2PO4 con 2,5 g/l de heptanosulfonato sódico y ácido fosfórico para ajustar el pH final a 2,5. Esta fase móvil se filtra por filtro 0,45 µm (Supor®-450, Pall Corporation Ref: 60173) y se desgasifica por ultrasonidos. Se trabaja en condiciones isocráticas con una velocidad de flujo constante de 1 ml/min. La fase estacionaria es una columna Zorbax Eclipse XDB-C18 de Material y métodos 94 dimensiones 150 x 4,6 mm con un tamaño de partícula interna de 3,5 µm. La presión habitual de trabajo es de aproximadamente 12,3 MPa. El volumen de inyección es de 20 µL. 5.2.3.2. MÉTODO DE ANÁLISIS DEL DIAZEPAM Se utilizó un equipo modular Jasco HPLC con una bomba Jasco PU-1580, un automuestreador Jasco AS-2050-Plus ajustado a un bucle de muestreo de 100 μl y un detector UV-visible Jasco UV-1575. La longitud de onda de detección se fijó en 254 nm. La fase móvil se basó en el método HPLC descrito en Eur. Ph. (10ª edición, 2019) para el ensayo de diazepam que consiste en una mezcla de acetonitrilo (grado de gradiente de HPLC): metanol (grado de gradiente de HPLC): fase acuosa en proporciones de 22:34:44 (v:v:v). La fase acuosa fue una solución tampón de 3,4 g/l KH2PO4 con pH 5 ajustado con NaOH 2 M. La fase móvil se filtró a través de un filtro de 0,45 µm (Supor®-450, Pall Corporation Ref: 60173) y se desgasificó. El caudal se fijó en 1 ml/min. La fase estacionaria fue una columna YMC basic S-C8 (ref. BA99S05-2546WT) de 250 x 4,6 mm con un tamaño de partícula de 5 µm. La presión de trabajo típica rondaba los 14,4 MPa. 5.2.3.3. MÉTODO DE ANÁLISIS DEL CLORURO DE MIDAZOLAM Se utilizó un equipo modular Jasco HPLC con una bomba Jasco PU-1580, un automuestreador Jasco AS-2050-Plus ajustado a un bucle de muestreo de 100 μl y un detector UV-visible Jasco UV-1575. La longitud de onda de detección se fijó en 254 nm. La fase móvil se basó en el método HPLC descrito en Eur. Ph. (10ª edición, 2019) para el ensayo de diazepam que consiste en una mezcla de acetonitrilo (grado de gradiente de HPLC): metanol (grado de gradiente de HPLC): fase acuosa en proporciones de 22:34:44 (v:v:v). La fase acuosa fue una solución tampón de 3,4 g/l KH2PO4 con pH 5 ajustado con NaOH 2 M. La fase móvil se filtró a través de un filtro de 0,45 µm (Supor®-450, Pall Corporation Ref: 60173) y se desgasificó. El caudal se fijó en 1 ml/min. La fase estacionaria fue una columna YMC basic S-C8 (ref. BA99S05-2546WT) de 250 x 4,6 mm con un tamaño de partícula de 5 µm. La presión de trabajo típica rondaba los 14,4 MPa. 5.2.4 EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS. Una vez realizado el estudio de estabilidad, se lleva a cabo el correspondiente tratamiento matemático de los resultados obtenidos, y así valorar el objetivo por el cual se realizó el estudio. En la guía ICH Q1E, que se centra en la evaluación de los datos de estabilidad, se recomienda el tipo de análisis para predecir la estabilidad de un medicamento a largo plazo a partir de los datos obtenidos en los estudios de estabilidad acelerados251. Nosotros lo realizamos en las tres condiciones de estabilidad que se han almacenado las muestras. Si los datos del estudio de estabilidad muestran unos reducidos niveles de degradación y una pequeña variabilidad, el periodo de validez que se busca estará garantizado, demostrando un grado de estabilidad apto y no será necesario realizar ningún análisis estadístico posterior251. Resultados y discusión 95 Cementerio de la I Guerra Mundial en Ypres (Bélgica) 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Resultados y discusión 96 Resultados y discusión 97 6.1 FABRICACIÓN DE MUESTRAS DE F1, F2, DIAZEPAM Y MIDAZOLAM La fabricación de las muestras se realizaron en las salas blancas del módulo de Estériles del Centro Militar de Farmacia de la Defensa (Colmenar Viejo, Madrid). Las jeringas prellenadas del autoinyector se fabricaron bajo las condiciones exigentes que requiere una formulación parenteral, aunque teniendo presente que el objeto de estudio de esta tesis es la estabilidad química y no microbiológica. No obstante, se intentó mantener unas condiciones asépticas en la fabricación, ejemplo de ello, fue realizarlo en salas de grado A, B y C (según marca normativa GMP264), el uso de utillaje estéril, la fabricación se realizó con agua para inyectables119 y excipientes de uso farmacéutico, hubo una prefiltración de 0,45 micras, el envasado se realizó con nitrógeno y el material de acondicionamiento primario era estéril. a) b) c) d) e) f) Resultados y discusión 98 6.2 CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO BAJO ESTUDIO DE ESTABILIDAD El estudio de estabilidad donde se almacenaron las muestras fabricadas fue en las instalaciones del Centro Militar de Farmacia de la Defensa (Colmenar Viejo, Madrid). Las muestras se almacenan en cámaras climáticas y nevera a diferentes temperaturas según se ha indicado anteriormente en el apartado 5.2.2. Figura 43. a) Nevera producción, b) estufa climática de 40 °C y c) cámara climática de 25 °C. CEMILFARDEF – Colmenar Viejo. Figura 42. a) Pesada de materia prima, b) llenado de jeringas prellenadas con pipeta LABMATE, c) bandeja con jeringas prellenadas con JEN tras finalizar la etapa de taponado, d) bandeja con jeringas prellenadas con JEA tras finalizar la etapa de taponado, e) jeringa prellenada con JEA (izquierda) y Jeringa prellenada con JEN (derecha), f) jeringas identificadas con sus condiciones de almacenamiento, g) embalaje secundario de las formulaciones F1 y F2 a su pH 3 y 4 respectivamente y h) embalaje secundario de las formulaciones de Diazepam y Midazolam. g) h) c) b) ) c) a) Resultados y discusión 99 En las condiciones a 4 °C hay una incidencia durante el estudio de estabilidad, es debido a la rotura de la nevera, dejando de funcionar el 14 de agosto de 2019 y permaneciendo las muestras a 20 °C hasta el 13 de septiembre de 2019, coincidiendo con periodo vacacional. Se extraen de la nevera averiada y se introducen en una nueva nevera en las mismas dependencias. Todo queda registrado en un registrador de temperatura “datalogger”, también las muestras en condiciones “a tiempo real” y “aceleradas” estaban acompañadas de un datalogger para la comprobación de la temperatura y humedad durante todo el estudio. Decidimos iniciar de nuevo el estudio de estabilidad para las condiciones de 4 °C, tomando el 23 de septiembre de 2019 como tiempo cero, y a partir de ahí se recalcula su fecha teórica de muestreo. 6.3 MUESTREO DE LAS DIFERENTES CONDICIONES En la tabla XXV, se señala la fecha de muestreos teóricos programadas siguiendo lo establecido en el capítulo 4 “Objetivos y planteamiento”, junto con la fecha real de muestreo. A continuación, en la figura 44, 45 y 46 se expone un cuadro por condición climática con el aspecto de cada una de las muestras de las jeringas al salir de su estudio estabilidad indicado en su fecha de muestreo. Resultados y discusión 100 Tabla XXV. Programación de muestreo. Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al F1 -p H 3- JE A 23 /1 2/ 20 19 21 /1 2/ 20 19 23 /0 3/ 20 20 23 /0 3/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 F1 -p H 3- JE N 23 /1 2/ 20 19 21 /1 2/ 20 19 23 /0 3/ 20 20 23 /0 3/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 F1 -p H 4- JE A 23 /1 2/ 20 19 21 /1 2/ 20 19 23 /0 3/ 20 20 23 /0 3/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 F1 -p H 4- JE N 23 /1 2/ 20 19 21 /1 2/ 20 19 23 /0 3/ 20 20 23 /0 3/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 F2 -p H 3- JE A 23 /1 2/ 20 19 21 /1 2/ 20 19 23 /0 3/ 20 20 23 /0 3/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 F2 -p H 3- JE N 23 /1 2/ 20 19 21 /1 2/ 20 19 23 /0 3/ 20 20 23 /0 3/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 F2 -p H 4- JE A 23 /1 2/ 20 19 21 /1 2/ 20 19 23 /0 3/ 20 20 23 /0 3/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 F2 -p H 3- JE N 23 /1 2/ 20 19 21 /1 2/ 20 19 23 /0 3/ 20 20 23 /0 3/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 D IA ZE PA M -J EA 23 /1 2/ 20 19 21 /1 2/ 20 19 23 /0 3/ 20 20 23 /0 3/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 D IA ZE PA M -J EN 23 /1 2/ 20 19 21 /1 2/ 20 19 23 /0 3/ 20 20 23 /0 3/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 M ID A ZO LA M -J EA 23 /1 2/ 20 19 21 /1 2/ 20 19 23 /0 3/ 20 20 23 /0 3/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 M ID A ZO LA M -J EN 23 /1 2/ 20 19 21 /1 2/ 20 19 23 /0 3/ 20 20 23 /0 3/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 6/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 23 /0 9/ 20 20 Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al F1 -p H 3- JE A 03 /0 7/ 20 19 03 /0 7/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 28 /0 6/ 20 20 29 /0 6/ 20 20 28 /1 2/ 20 20 29 /1 2/ 20 20 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 22 28 /0 6/ 20 22 F1 -p H 3- JE N 03 /0 7/ 20 19 03 /0 7/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 28 /0 6/ 20 20 29 /0 6/ 20 20 28 /1 2/ 20 20 29 /1 2/ 20 20 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 22 28 /0 6/ 20 22 F1 -p H 4- JE A 03 /0 7/ 20 19 03 /0 7/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 28 /0 6/ 20 20 29 /0 6/ 20 20 28 /1 2/ 20 20 29 /1 2/ 20 20 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 22 28 /0 6/ 20 22 F1 -p H 4- JE N 03 /0 7/ 20 19 03 /0 7/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 28 /0 6/ 20 20 29 /0 6/ 20 20 28 /1 2/ 20 20 29 /1 2/ 20 20 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 22 28 /0 6/ 20 22 F2 -p H 3- JE A 03 /0 7/ 20 19 03 /0 7/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 28 /0 6/ 20 20 29 /0 6/ 20 20 28 /1 2/ 20 20 29 /1 2/ 20 20 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 22 28 /0 6/ 20 22 F2 -p H 3- JE N 03 /0 7/ 20 19 03 /0 7/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 28 /0 6/ 20 20 29 /0 6/ 20 20 28 /1 2/ 20 20 29 /1 2/ 20 20 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 22 28 /0 6/ 20 22 F2 -p H 4- JE A 03 /0 7/ 20 19 03 /0 7/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 28 /0 6/ 20 20 29 /0 6/ 20 20 28 /1 2/ 20 20 29 /1 2/ 20 20 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 22 28 /0 6/ 20 22 F2 -p H 3- JE N 03 /0 7/ 20 19 03 /0 7/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 28 /0 6/ 20 20 29 /0 6/ 20 20 28 /1 2/ 20 20 29 /1 2/ 20 20 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 22 28 /0 6/ 20 22 D IA ZE PA M -J EA 03 /0 7/ 20 19 03 /0 7/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 28 /0 6/ 20 20 29 /0 6/ 20 20 28 /1 2/ 20 20 29 /1 2/ 20 20 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 22 28 /0 6/ 20 22 D IA ZE PA M -J EN 03 /0 7/ 20 19 03 /0 7/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 28 /0 6/ 20 20 29 /0 6/ 20 20 28 /1 2/ 20 20 29 /1 2/ 20 20 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 22 28 /0 6/ 20 22 M ID A ZO LA M -J EA 03 /0 7/ 20 19 03 /0 7/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 28 /0 6/ 20 20 29 /0 6/ 20 20 28 /1 2/ 20 20 29 /1 2/ 20 20 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 22 28 /0 6/ 20 22 M ID A ZO LA M -J EN 03 /0 7/ 20 19 03 /0 7/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 28 /0 6/ 20 20 29 /0 6/ 20 20 28 /1 2/ 20 20 29 /1 2/ 20 20 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 21 28 /0 6/ 20 22 28 /0 6/ 20 22 Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al Fe ch a te ór ic a Fe ch a re al F1 -p H 3- JE A 28 /0 7/ 20 19 30 /0 7/ 20 19 28 /0 8/ 20 19 05 /0 9/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 0/ 20 19 31 /1 0/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 F1 -p H 3- JE N 28 /0 7/ 20 19 30 /0 7/ 20 19 28 /0 8/ 20 19 05 /0 9/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 0/ 20 19 31 /1 0/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 F1 -p H 4- JE A 28 /0 7/ 20 19 30 /0 7/ 20 19 28 /0 8/ 20 19 05 /0 9/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 0/ 20 19 31 /1 0/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 F1 -p H 4- JE N 28 /0 7/ 20 19 30 /0 7/ 20 19 28 /0 8/ 20 19 05 /0 9/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 0/ 20 19 31 /1 0/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 F2 -p H 3- JE A 28 /0 7/ 20 19 30 /0 7/ 20 19 28 /0 8/ 20 19 05 /0 9/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 0/ 20 19 31 /1 0/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 F2 -p H 3- JE N 28 /0 7/ 20 19 30 /0 7/ 20 19 28 /0 8/ 20 19 05 /0 9/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 0/ 20 19 31 /1 0/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 F2 -p H 4- JE A 28 /0 7/ 20 19 30 /0 7/ 20 19 28 /0 8/ 20 19 05 /0 9/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 0/ 20 19 31 /1 0/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 F2 -p H 3- JE N 28 /0 7/ 20 19 30 /0 7/ 20 19 28 /0 8/ 20 19 05 /0 9/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 0/ 20 19 31 /1 0/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 D IA ZE PA M -J EA 28 /0 7/ 20 19 30 /0 7/ 20 19 28 /0 8/ 20 19 05 /0 9/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 0/ 20 19 31 /1 0/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 D IA ZE PA M -J EN 28 /0 7/ 20 19 30 /0 7/ 20 19 28 /0 8/ 20 19 05 /0 9/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 0/ 20 19 31 /1 0/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 M ID A ZO LA M -J EA 28 /0 7/ 20 19 30 /0 7/ 20 19 28 /0 8/ 20 19 05 /0 9/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 0/ 20 19 31 /1 0/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 M ID A ZO LA M -J EN 28 /0 7/ 20 19 30 /0 7/ 20 19 28 /0 8/ 20 19 05 /0 9/ 20 19 28 /0 9/ 20 19 27 /0 9/ 20 19 28 /1 0/ 20 19 31 /1 0/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 1/ 20 19 28 /1 2/ 20 19 26 /1 2/ 20 19 28 /0 3/ 20 20 30 /0 3/ 20 20 24 m es es 36 m es es 3 m es es 6 m es es 9 m es es 12 m es es 18 m es es 9 m es es M U ES TR EO 1 m es es 2 m es es 3 m es es 4 m es es 5 m es es 6 m es es 3 m es es 6 m es es 9 m es es 12 m es es “E n fr ío ” 4° ±2 °C “A ti em po re al ” (l ar go p la zo ): 2 5° ±2 °C / 6 0± 5% H .R . “A ce le ra da s” (c or to p la zo ): 4 0° ±2 °C / 7 5± 5% H .R . 0 m es es Resultados y discusión 101 Figura 44. Aspecto de las muestras almacenadas a 4 ± 2 °C tras finalizar su tiempo de estudio. Hay dos rasgos evidentes que observamos durante el muestreo a 4 °C, el primero es el cambio de coloración de la disolución de F2 a un tono más amarillento debido seguramente a la obidoxima, ya indicado por Rubnov en su bibliografía172, siendo más pronunciado en las de pH4. Y el segundo cambio es la pérdida de color de la JEN en las muestras de la disolución del midazolam, evolucionando a mayor decoloración en las últimas muestras del estudio. Resultados y discusión 102 Figura 45. Aspecto de las muestras almacenadas a 25 ± 2 °C / 60 ± 5 % H.R. tras finalizar sus condiciones de almacenamiento. A 25 °C observamos cambio de color en la disolución en F1 como en F2, aunque en F2 es más pronunciada. También hay degradación de la JEN en las muestras de midazolam, y en los últimos muestreos de F2 pH3 y pH4. Por otro lado, las JEA con el diazepam sufren un deterioro de la superficie de la junta perdiendo el brillo inicial. Resultados y discusión 103 Figura 46. Aspecto de las muestras almacenadas a 40 ± 2 °C / 75 ± 5 % H.R. tras finalizar sus condiciones de almacenamiento. Resultados y discusión 104 A 40 °C se observa el cambio de color en la disolución de F1, F2 y diazepam, en F2 es más pronunciada. También hay degradación del color de JEN en las muestras de midazolam, diazepam y F2 pH3, y en JEA se observa agrietamiento de la junta con el diazepam, perdiendo el brillo inicial. Figura 47. Degradación de la JEN (izquierda) y de la JEA (derecha), comparándose con una junta n ueva en cada imagen. 6.4 RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN DEL MÉTODO POR HPLC La validación de los métodos por HPLC, como el análisis de todas las muestras, se realizaron en el Departamento de Farmacia Galénica de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid. Para la validación se prepararon muestras patrón de referencia de F1 y F2: Formulación 1 (F1) Formulación 2 (F2) Sulfato de atropina 0,667 mg/ml 0,667 mg/ml Cloruro de pralidoxima 200 mg/ml - Cloruro de obidoxima - 73,333 mg/ml Cloruro de midazolam 3,333 mg/ml 3,333 mg/ml Tabla XXVI. Composición cuantitativa de las formulaciones inyectables F1 y F2. Las muestras patrón de referencia se preparan por disolución de sulfato de atropina, cloruro de pralidoxima y cloruro de obidoxima en agua purificada hasta concentración final de 10 µg/ml. El cloruro de midazolam se disuelve inicialmente en metanol puro y posteriormente se diluye en mezcla de metanol:agua (50:50) hasta concentración final de 10 µg/ml. Todas las muestras para analizar se filtran por filtro PVDF 0,45 μm. Las figuras 47 y 48 muestran cromatogramas de patrones de referencia. Resultados y discusión 105 Figura 48. Cromatograma de patrón de cloruro de pralidoxima (tiempo de retención 2,1 minutos), sulfato de atropina (tiempo de retención de 3,3 minutos) y cloruro de midazolam (tiempo de retención de 12,7 minutos). Figura 49. Cromatograma de patrón de cloruro de obidoxima (tiempo de retención 2,2 minutos), sulfato de atropina (tiempo de retención de 3,3 minutos) y cloruro de midazolam (tiempo de retención de 12,7 minutos). Pralidoxima y obidoxima tienen un segundo pico minoritario con un tiempo de retención de aproximadamente 4 minutos que está cercano al tiempo de retención del sulfato de atropina (3,3 minutos). En estudios previos consultados sobre autoinyectores con 2-PAM, se identifica por cromatografía líquida dos picos en el cromatograma, ambos picos presentan espectrometría de masas idéntico, lo que sugiere presencia de isómeros265, pudiendo aclarar el segundo pico que sale en nuestro cromatograma de la Figura 48 y 49. Las muestras problemas a analizar se preparan por dilución de 0,1 ml de formulación problema en 100 ml de una mezcla de metanol:agua purificada en proporciones 50:50 (v:v). Las figuras 50 y 51 muestran cromatogramas característicos de las formulaciones F1 y F2 después de 24 meses de almacenamiento a temperatura 25 °C. Resultados y discusión 106 Figura 50. Cromatograma de una muestra de la formulación F1 con 24 meses a 25 °C, con cloruro de pralidoxima (tiempo de retención 2,0 minutos), sulfato de atropina (tiempo de retención de 3,3 minutos) y cloruro de midazolam (tiempo de retención de 12,7 minutos). Figura 51. Cromatograma de una muestra de la formulación F2 con 24 meses a 25 °C, con cloruro de obidoxima (tiempo de retención 2,2 minutos), con sulfato de atropina (tiempo de retención de 3,3 minutos) y cloruro de midazolam (tiempo de retención de 12,7 minutos). Normalmente todos los autoinyectores que contienen oxima:atropina tienen un ratio milimolar de 1:100, e incluso 1:1100, y el gran pico de oxima en el frente del cromatograma tras el solvente hace que el análisis de la atropina y sus productos de descomposición en estas mezclas sea difícil266. Se prueban dos variantes durante el proceso de validación, para optimizar los análisis: 1. En la preparación de muestras problemas, se aumenta la dilución de 0,1 ml a 0,2 ml en 100 ml, pero se descarta porque tiene más error de repetibilidad a pesar de aumentar la cantidad. 2. Se varía la inyección del volumen problema en el HPLC de 10 µl a los 20 µl, pero se obtiene mayor variabilidad. Por lo que se mantiene el volumen de inyección de 10 µl. Para la validación del método se preparan tres patrones diferentes de cada principio activo y se preparan diluciones del 25 %, 50 %, 75 %, 100 % y 125 %. Las rectas de calibrado presentan Resultados y discusión 107 buena linealidad generalmente mayor de 0,99 y valores de repetibilidad y reproducibilidad menores a 5 %. A continuación, se muestran ejemplos de las rectas de regresión obtenidas (donde y es el área del pico y x la concentración en % del teórico 100 %) (Figura 52): • Pralidoxima: y = 4990,9x - 40,16 (R² = 0,95) • Obidoxima: y = 2006,5x - 160,36 (R² = 0,99) • Atropina: y = 5,2356x - 0,22 (R² = 0,99) • Midazolam: y = 172,72x - 14,91 (R² = 0,98) Figura 52. Rectas de calibrado. Se determina la riqueza de los principios activos según las rectas de calibración obtenidas con los patrones. La degradación de los principios activos se ajusta a cinéticas de orden uno de acuerdo a la ecuación (1): L Ct = L C0 – Kd t (1) Donde, Ct es la concentración a tiempo de muestreo t expresada en %, C0 es la concentración inicial que es 100, t es el tiempo de muestreo y Kd es la constante de degradación según ajuste a orden uno y que tiene como unidades t-1 (en nuestro caso mes-1). Para facilitar los cálculos con esta constante de degradación se calcula el tiempo de degradación del 10 % del principio activo (t10) que expresaremos en meses y que se obtiene con la ecuación (2): t10 = (L 100-L 90) /Kd = 0,105/Kd (2) Resultados y discusión 108 6.5 RESULTADOS DEL ANÁLISIS POR HPLC Generalmente, en aquellos resultados que se observan cambios químicos incluye cambios en la riqueza del producto, que puede deberse al aumento de productos de degradación, o a la disminución del ingrediente activo y/o posibles cambios de características organolépticas por el incremento de la degradación. Figura 53. HPLC Jasco PU-1580, Jasco UV-1575, Jasco AS-2050-Plus autosampler (del departamento de Farmacia Galénica, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid). 6.5.1. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE LA FORMULACIÓN 1 Todas las muestras de F1, según lo descrito en el cuadro de experimentos del capítulo 4.3.11, fueron analizadas con el método validado por HPLC explicado anteriormente en el apartado 6.4. A continuación, se expone los resultados obtenidos en cada una de las condiciones de estabilidad, analizando a su vez por separado cada uno de los principios activos de la formulación multicomponente, examinando su comportamiento en la combinación con las diferentes variables de pH 3 y 4, y las distintas juntas de estanqueidad PH 701/50 C BLACK y 4023/50 GRAY. El objetivo de esta tesis no es obtener un período de caducidad para cada una de las formulaciones, si no estudiar el comportamiento de las distintas formulaciones con diferentes variables y determinar cuál presenta una mejor estabilidad química. Sin embargo, si consideramos positivo tener en cuenta los criterios de aceptación que marca la USP para mejorar el criterio de evaluación, según la USP 44 NF 39 (2021) los parámetros de valoración para el cloruro de pralidoxima inyectable debe estar comprendido entre un 90 – 110 % e igualmente para el cloruro de obidoxima inyectable, para el sulfato de atropina inyectable indica que debe estar dentro del 93 – 107 % y para el cloruro de midazolam inyectable establece entre 90 – 110 %. Resultados y discusión 109  “En frío” 4 ± 2 °C: Figura 54. Resultados de la concentración de F1 de cloruro de pralidoxima (arriba izquierda), sulfato de atropina (arriba derecha) y cloruro de midazolam (abajo) en los análisis del muestreo de las condiciones climáticas “en frío” (4 ± 2°C). 0 2 4 6 8 10 12 75 80 85 90 95 100 105 110 115 C o n c e n tr a c ió n P ra lid o x im a ( % ) F 1 _ 4 º C Tiempo (Meses) 0 2 4 6 8 10 12 75 80 85 90 95 100 105 110 115 C o n c e n tr a c ió n A tr o p in a ( % ) F 1 _ 4 º C Tiempo (Meses) 0 2 4 6 8 10 12 75 80 85 90 95 100 105 110 115 C o n c e n tr a c ió n M id a z o la m ( % ) F 1 _ 4 º C Tiempo (Meses) pH 3 JEA pH 3 JEN pH 4 JEA pH 4 JEN Resultados y discusión 110 La estabilidad de la Formulación 1 en condiciones climáticas a 4 ± 2°C, se puede observar en líneas generales una tendencia bastante buena para el cloruro de pralidoxima y sulfato de atropina, el cloruro de midazolam presenta diferencias más significativas con las variables a estudio. En el caso del cloruro de pralidoxima no vemos una diferencia tangible entre las cuatro formulaciones, mínimamente se obtiene una mejor concentración para pH 4 JEN y JEA. En cuanto a las especificaciones marcadas por USP 44 NF 39 para el cloruro de pralidoxima, las cuatro se encuentran alrededor del 97-100 % de riqueza, por lo que cumplen criterios de aceptación. El cloruro de pralidoxima en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “en frío” se puede considerar ESTABLE. En cuanto al sulfato de atropina, no evidenciamos diferencias significativas entre las variables de pH y juntas de estanqueidad, todas se encuentran dentro del 95 – 100 %, cumpliendo los criterios de aceptación marcados por USP. Las formulaciones de pH 4 tienen mínimamente un mejor perfil que las de pH 3, y JEN en relación con JEA es preferible la de nueva composición con bromobutilo. El sulfato de atropina en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “en frío” se puede considerar ESTABLE. El cloruro de midazolam en estas condiciones climáticas tiene una estabilidad superior en comparación con las condiciones “a tiempo real” y “aceleradas”, pero es manifiesto que en unas condiciones tan ideales como son “en frío” el principio activo no es estable. Se observa una diferencia entre las formulaciones de pH 3 y pH 4, siendo estas últimas las que mantienen mayor riqueza (92 – 101 %). E igualmente, existe diferencia clara entre JEN y JEA, teniendo las 4923/50 GRAY mejor perfil, pero no con ello consiguiendo que las muestras superaran criterios de aceptación por USP para pH 3 JEA y JEN, sin embargo, pH 4 JEA y JEN sí cumplirían. El cloruro de midazolam en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “en frío” solo se podría plantear la elección de la formulación pH 4 tanto JEN como JEA, cuyos perfiles de estabilidad son mejores comparándolo con el resto.  “A tiempo real” 25 ± 2 °C / 60 ± 5 % H.R.: Los resultados que se obtienen en estas condiciones son los que se extrapolan mejor al proceso de degradación real que sufrirían los cuatro principios activos de las formulaciones a estudio. Resultados y discusión 111 Figura 55. Resultados de la concentración de F1 de cloruro de pralidoxima (arriba izquierda), sulfato de atropina (arriba derecha) y cloruro de midazolam (abajo) en los análisis del muestreo de las condiciones climáticas “a tiempo real” (25 ± 2 °C / 60 ± 5 % H.R.). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 20 40 60 80 100 C o n c e n tr a c ió n M id a z o la m ( % ) F 1 _ 2 5 º C Tiempo (Meses) pH 3 JEA pH 3 JEN pH 4 JEA pH 4 JEN 0 5 10 15 20 25 30 35 40 75 80 85 90 95 100 105 110 115 C o n c e n tr a c ió n P ra lid o x im a ( % ) F 1 _ 2 5 º C Tiempo (Meses) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 75 80 85 90 95 100 105 110 115 C o n c e n tr a c ió n A tr o p in a ( % ) F 1 _ 2 5 º C Tiempo (Meses) Resultados y discusión 112 La estabilidad de la Formulación 1 en condiciones climáticas a 25 ± 2 °C / 60 ± 5 % H.R., se observa en líneas generales una tendencia bastante buena para el cloruro de pralidoxima y sulfato de atropina, el cloruro de midazolam presenta una inestabilidad clara. En el cloruro de pralidoxima observamos una tendencia muy estable, dentro de los rangos de riqueza permitidos por USP comprendidos entre 97 – 100 %. La fórmula de mejor perfil es la de pH 4 JEA. El cloruro de pralidoxima en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “a tiempo real” se puede considerar ESTABLE. En cuanto al sulfato de atropina, observamos una variabilidad mayor entre los resultados de los distintos muestreos, que puede deberse a la baja concentración de la atropina comparado con las oximas dentro de la misma muestra. En líneas generales, la tendencia está dentro de los rangos permitidos por USP, con una riqueza que no baja del 96 % para la de peor perfil que es pH 3 JEA. En cuanto a las juntas de estanqueidad, no se observa relación diferencial entre JEN y JEA en ningún pH. El sulfato de atropina en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “a tiempo real” se puede considerar ESTABLE. El cloruro de midazolam a esta temperatura, evidenciamos claramente la inestabilidad del principio activo, sufriendo una degradación muy alta desde el inicio del estudio, llegando a una riqueza menor del 20 % antes de los 10 meses. No se diferencia evidencia en cuanto al factor junta de estanqueidad, debido a la caída tan grande de riqueza. En la bibliografía marca que a pH menores de 5, el midazolam es desprotonado y abre el anillo de diazepina debido a la hidrolisis catalítica del doble enlace 4,5 del anillo197. Se hace notorio que queda fuera de las especificaciones marcadas por USP, se considera INESTABLE.  “Acelerado” 40 ± 2 °C / 75 ± 5 % H.R.: Los resultados en unas condiciones aceleradas permiten visualizar por adelantado el posible comportamiento del principio activo, aumentando la velocidad de degradación química o los cambios físicos del principio activo, por lo que las conclusiones que se saca de ellas son muy valiosas. En la bibliografía se aconseja que, si se observa algún cambio significativo en el estudio acelerado, se recomienda realizar un estudio en condiciones intermedias por un plazo mínimo de seis meses, que en nuestro caso ya está incluido en el estudio de esta tesis. Resultados y discusión 113 Figura 56. Resultados de la concentración de F1 de cloruro de pralidoxima (arriba izquierda), sulfato de atropina (arriba derecha) y cloruro de midazolam (abajo) en los análisis del muestreo de las condiciones climáticas “aceleradas” (40 ± 2 °C / 75 ± 5 % H.R). 0 2 4 6 8 10 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 C o n c e n tr a c ió n P ra lid o x im a ( % ) F 1 _ 4 0 º C Tiempo (Meses) 0 2 4 6 8 10 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 C o n c e n tr a c ió n A tr o p in a ( % ) F 1 _ 4 0 º C Tiempo (Meses) 0 5 10 0 20 40 60 80 100 C o n c e n tr a c ió n M id a z o la m ( % ) F 1 _ 4 0 º C Tiempo (Meses) pH 3 JEA pH 3 JEN pH 4 JEA pH 4 JEN Resultados y discusión 114 El cloruro de pralidoxima, en estos nueve meses de estabilidad a 40 °C, observamos que no disminuye de un 95 % la riqueza, por lo que no sufre una degradación notable en unas condiciones forzadas, cumpliendo criterios de aceptación de la USP. El cloruro de pralidoxima en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “aceleradas” se puede considerar ESTABLE. El sulfato de atropina tiene una degradación más marcada en las formulaciones con pH 3 que las de pH 4, con respecto a las juntas de estanqueidad en el caso de las de pH 3 se observa leve mejoría con la JEN, sin embargo, con las de pH 4 con la JEA. Este principio activo en estas condiciones quedaría fuera de las especificaciones marcadas por USP de 93 – 107 %. El sulfato de atropina en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “aceleradas” se considera INESTABLE. El cloruro de midazolam en estas condiciones aceleradas deja ver, lo que ya se observó en las condiciones “a tiempo real”, hay una degradación acelerada del principio activo. No se puede valorar el factor junta de estanqueidad por la velocidad tan elevada de degradación. E igualmente, queda fuera de las especificaciones marcadas en el criterio de aceptación por la USP. Se considera INESTABLE. 6.5.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE LA FORMULACIÓN 2 Todas las muestras de F2, según lo descrito en el cuadro de experimentos del capítulo 4.3.11, fueron analizadas con el método validado por HPLC explicado anteriormente en el apartado 6.4. A continuación, se expone los resultados obtenidos en cada una de las condiciones de estabilidad, analizando a su vez por separado cada uno de los principios activos de la formulación multicomponente, analizando su comportamiento en la combinación con las diferentes variables de pH 3 y 4, y las distintas juntas de estanqueidad PH 701/50 C BLACK y 4023/50 GRAY.  “En frío” 4 ± 2 °C: 0 2 4 6 8 10 12 75 80 85 90 95 100 105 110 115 C o n c e n tr a c ió n O b id o x im a ( % ) F 2 _ 4 º C Tiempo (Meses) Resultados y discusión 115 Figura 57. Resultados de la concentración de F2 de cloruro de obidoxima (arriba izquierda), sulfato de atropina (arriba derecha) y cloruro de midazolam (abajo) en los análisis del muestreo de las condiciones climáticas “en frío” (4 ± 2°C). El cloruro de obidoxima en condiciones climáticas “en frío” presenta una tendencia estable, no se observa diferencia significativa entre la variable pH de las cuatro fórmulas, teniendo un rango de riqueza del 92 – 96 %, cumpliendo criterios de aceptación de USP. En cuanto a la variable juntas de estanqueidad, no se observan diferencias relevantes entre las cuatro formulaciones. El cloruro de obidoxima en esta formulación F2, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “en frío” se considera ESTABLE. En el sulfato de atropina, se observa una mayor estabilidad en las formulaciones que tienen pH 4. Y entre la variable juntas de estanqueidad, se observa un mejor perfil para las que tienen JEN. En cuanto a criterios de aceptación de USP para el sulfato de atropina las cuatro fórmulas están dentro de rangos 93 - 107 %. El sulfato de atropina en esta formulación F2, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad y en estas condiciones climáticas “en frío” se considera ESTABLE. 0 2 4 6 8 10 12 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 C o n c e n tr a c ió n M id a z o la m ( % ) F 2 _ 4 º C Tiempo (Meses) pH 3 JEA pH 3 JEN pH 4 JEA pH 4 JEN 0 2 4 6 8 10 12 75 80 85 90 95 100 105 110 115 C o n c e n tr a c ió n A tr o p in a ( % ) F 2 _ 4 º C Tiempo (Meses) Resultados y discusión 116 El cloruro de midazolam en la F2 tiene una mayor velocidad de degradación comparado con la F1 a la misma temperatura, teniendo en cuenta que las constantes de degradación en estudios a temperaturas de 4 °C se enlentecen. Disminuyendo su riqueza más del 30 % en pH 3 JEN. Las fórmulas de pH 4 tienen mejor perfil, pero tampoco superan los criterios de aceptación de riqueza por USP, quedándose en valores alrededor del 50 % de riqueza. La variable juntas de estanqueidad no marca diferencia en estas condiciones. El cloruro de midazolam en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “en frío” se puede considerar INESTABLE. Si hubiera que elegir alguna de las dos formulaciones dentro de las condiciones de frío, teniendo en cuenta el factor estabilidad, claramente la de mayor concentración sería la F1 manteniendo sus niveles de riqueza por encima de F2. Aunque ninguna de las dos formulaciones cumple criterios de aceptación en los parámetros exigidos de riqueza en una formulación inyectable.  “A tiempo real” 25 ± 2 °C / 60 ± 5 % H.R.: 0 5 10 15 20 25 30 35 40 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 C o n c e n tr a c ió n O b id o x im a ( % ) F 2 _ 2 5 º C Tiempo (Meses) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 C o n c e n tr a c ió n A tr o p in a ( % ) F 2 _ 2 5 º C Tiempo (Meses) Resultados y discusión 117 Figura 58. Resultados de la concentración de F2 de cloruro de obidoxima (arriba izquierda), sulfato de atropina (arriba derecha) y cloruro de midazolam (abajo) en los análisis del muestreo de las condiciones climáticas “a tiempo real” (25 ± 2 °C / 60 ± 5 % H.R.). En el cloruro de obidoxima se observa un ratio de degradación en el tiempo, obteniendo una riqueza entre el 70 - 80 % en las muestras finales del estudio, no cumpliendo criterios de aceptación de USP. Si se relaciona estos datos con el color observado en el muestreo de las jeringas de F2, seguramente esté relacionado el color marrón oscuro con la degradación del cloruro de obidoxima como ya se ha indicado anteriormente. Se observa que las muestras con JEA, tanto para pH 3 como pH 4, tienen una mínima mejoría en estabilidad. El cloruro de obidoxima en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “a tiempo real” se puede considerar INESTABLE. En cuanto al sulfato de atropina, se observa una variabilidad mayor entre los resultados de los distintos muestreos, que puede deberse a su baja concentración comparado con la oxima. En líneas generales la tendencia está dentro de los rangos permitidos por USP, con una riqueza que no baja del 94 % para la de peor perfil que es pH 4 JEN. Las muestras con pH 3 tienen mejor resultados que las de pH 4. En cuanto a las juntas de estanqueidad, se observa una mínima relación diferencial entre JEN y JEA, siendo JEA algo mejor. El sulfato de atropina en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad y en estas condiciones climáticas “a tiempo real” se puede considerar ESTABLE. El cloruro de midazolam, al igual que en la F1 en estas mismas condiciones de estabilidad, se evidencia claramente la degradación del principio activo, evidenciando una pérdida muy alta de riqueza menor del 5 % antes de los 6 meses. El cloruro de midazolam en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “a tiempo real” es claramente INESTABLE. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 20 40 60 80 100 C o n c e n tr a c ió n M id a z o la m ( % ) F 2 _ 2 5 º C Tiempo (Meses) pH 3 JEA pH 3 JEN pH 4 JEA pH 4 JEN Resultados y discusión 118  “Acelerado” 40 ± 2 °C / 75 ± 5 % H.R.: Figura 59. Resultados de la concentración de F2 de cloruro de obidoxima (arriba izquierda), sulfato de atropina (arriba derecha) y cloruro de midazolam (abajo) en los análisis del muestreo de las condiciones climáticas “aceleradas” (40 ± 2 °C / 75 ± 5 % H.R.). 0 2 4 6 8 10 50 60 70 80 90 100 110 C o n c e n tr a c ió n O b id o x im a ( % ) F 2 _ 4 0 º C Tiempo (Meses) 0 2 4 6 8 10 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 C o n c e n tr a c ió n A tr o p in a ( % ) F 2 _ 4 0 º C Tiempo (Meses) 0 2 4 6 8 10 0 20 40 60 80 100 C o n ce n tr a ci ó n M id a zo la m ( % ) F 2 _ 4 0 º C Tiempo (Meses) pH 3 JEA pH 3 JEN pH 4 JEA pH 4 JEN Resultados y discusión 119 El cloruro de obidoxima, en estos nueve meses de condiciones aceleradas, muestra una degradación constante, llegando a una riqueza de alrededor del 60 % en las cuatro fórmulas, las dos fórmulas con JEA tienen unos resultados mínimamente mejores, pero no destacables con el resto, quedándose las cuatro fuera de los criterios de aceptación de la USP. El cloruro de obidoxima en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “aceleradas” se puede considerar INESTABLE. El sulfato de atropina no demuestra una velocidad degradación muy marcada para ser unas condiciones de almacenamiento forzadas, se observa cierta mejoría para las muestras con pH 4, todas se salen fuera de criterios de aceptación para USP, salvo pH 4 JEA que al final del estudio da una riqueza del 95 %. No se observa diferencia notoria en cuanto a la variable de juntas de estanqueidad. El sulfato de atropina en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “aceleradas” se puede considerar INESTABLE. El cloruro de midazolam, al igual que en F1 en estas mismas condiciones, demuestra una velocidad de degradación muy significativa, no permitiendo valorar el factor juntas de estanqueidad. Sin duda no cumplen criterios de aceptación para USP. El cloruro de midazolam en esta formulación, con estas variables de pH y juntas de estanqueidad, y en estas condiciones climáticas “a tiempo real” se puede considerar INESTABLE. 6.5.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DIAZEPAM Y MIDAZOLAM Estos resultados están desarrollados en el artículo publicado, adjunto en el Anexo 1 “Effect of Primary Packaging Material on the Stability Characteristics of Diazepam and Midazolam Parenteral Formulations”. 6.6 EVALUACIÓN Y DISCUSIÓN DE LAS DOS FORMULACIONES MULTICOMPONENTE El proceso de estabilidad implica averiguar qué vías de degradación están disponibles para un nuevo desarrollo galénico, qué pasos se pueden tomar para evaluar el grado de degradación que es más probable encontrar bajo almacenamiento normal y qué estrategias están disponibles para prevenir o limitar cualquier degradación observada. La degradación química constituye un factor importante en el fallo de un medicamento o formulación durante el almacenamiento, pero los cambios físicos también pueden ser una fuente de inestabilidad256. En este estudio de estabilidad, los cambios físicos más notables ya se indicaron en el punto 6.3 “Muestreo de las diferentes condiciones”, donde el color anaranjado/marrón que iban adquiriendo según avanzaba el tiempo de muestreo sobre las muestras F2 era evidente, las cuales, contienen obidoxima, indicándolo Rubnov en su artículo “Autocatalytic degradation and stability of obidoxime”172. Aunque no fue exclusivo de esas condiciones, también se observó en F1 e incluso en el diazepam en las condiciones a 40 °C. En el caso del diazepam, la leve coloración amarillenta seguramente sea debido a la presencia de uno de sus productos de degradación más importantes MACB (metilaminoclorobenzofenona)2. Desde luego, la decoloración de las juntas de estanqueidad ha sido la incompatibilidad física inesperada en este estudio de estabilidad, en especial con las de nueva composición 4023/50 Resultados y discusión 120 GRAY, resultando una degradación del color inicial, aunque en muestreos finales también se observó pérdida de brillo de las JEA y un agrietamiento de ambas dos. Figura 60. Incompatibilidad física de las juntas de estanqueidad, pérdida de color de JEN (izquierda) y degradación de capa superior de JEA observado por microscopio electrónico (derecha). El trabajo experimental a realizar para concretar una incompatibilidad es de complejidad variable, en ocasiones puede consistir simplemente en la comprobación analítica de que la mezcla de dos sustancias conduce a su alteración252. Desde el inicio de este desarrollo galénico, se era consciente que realizar un estudio de estabilidad con dos formulaciones de distinta composición, con distintos pH y distintas juntas de estanqueidad, aumentaba la complejidad de obtener conclusiones claras y unánimes con tantas variables. Desde luego, se han obtenido resultados evidentes que han quedado reflejado en los análisis de riqueza por HPLC. Se acostumbra a clasificar las incompatibilidades en físicas y químicas, aun reconociendo que las fronteras entre ambas no pueden estar bien definidas, serán incompatibilidades físicas las que se evidencia un cambio del estado físico del medicamento (precipitaciones, alteraciones del color, separación de dos fases líquidas, etc), las incompatibilidades químicas son más sutiles y consistirían en la alteración de las moléculas por hidrólisis, oxidación y otros mecanismos, sin alteración aparente de las características físicas del medicamento252. Cuando la coexistencia de dos principios activos en una formulación ocasiona por interacción de ambas o por las condiciones del medio, la alteración más o menos rápida de las características farmacotécnicas del medicamento, de la cantidad de principio activo o, en definitiva, de la actividad terapéutica, se dice que dichas sustancias son incompatibles252. En este estudio se hace evidente que el cloruro de midazolam tiene una incompatibilidad química con una velocidad de degradación muy alta hasta su ausencia casi completa en las condiciones “a tiempo real” y las “aceleradas”, por lo que no se considera un principio activo estable en una formulación multicomponente con pH 3 o pH 4, y además se podría añadir con un grado de degradación dependiente de la temperatura. En la siguiente figura, se ha realizado un compendio de los resultados obtenidos en el último muestreo al finalizar el periodo de estabilidad de cada estación del cuadro de experimentos. En él se puede visualizar puntualmente la tendencia en conjunto de cada componente con las distintas variables a estudio. Resultados y discusión 121 Figura 61. Resultados en % de la riqueza obtenida en el último muestreo de cada una de las condiciones de almacenamiento. Resultados y discusión 122 Si se compara el cloruro de pralidoxima con el cloruro de obidoxima, vemos clara evidencia que la pralidoxima es bastante más estable en las condiciones marcadas en este estudio, hasta incluso a altas temperaturas en condiciones aceleradas, no evidenciándose en la obidoxima el mismo comportamiento. Se han encontrado estudios sobre la obidoxima que confirman su inestabilidad a altas temperaturas, indican que almacenada a temperatura elevada desarrolla un color marrón oscuro y se logra la degradación completa de la obidoxima172. Por otro lado, hay estudios de estabilidad de la obidoxima que marcan valores por encima del 90 % de riqueza en ampollas a temperatura ambiente durante 30 años172, pero en nuestro caso a temperatura de 25 °C , tanto pH 3 como 4, la riqueza ha llegado a valores finales de estudio alrededor del 72 – 82 %, es cierto que se encuentra en una solución con varios principios activos, encontrándose sola la toxogonina en la disolución planteada en el estudio de Rubnov. Generalmente, las disoluciones concentradas de oximas, como las que se utilizan para autoinyectores, son menos estables y los productos de degradación aceleran la descomposición. Los buffer y el material del envase (metal, gomas, juntas) pueden también acelerar la descomposición149. El sulfato de atropina también es bastante estable, salvo en condiciones aceleradas que sin duda el principio activo sufre una degradación mayor por el incremento de temperatura. Hay estudios, que han registrado que la atropina a altas temperaturas disminuye su vida media significativamente129,130. La estabilidad del sulfato de atropina en medio acuoso mejora si se mantiene a valores bajos de pH y temperatura246. Es conocida su estabilidad a temperatura ambiente, un estudio calculó que la vida media de la solución acuosa de atropina puede ser superior a 1.700 años a un pH de 3,0 y a 20 °C128. Otro estudio predijo una vida media de 1.800 años a un pH de 4,0 y una temperatura constante de 20 °C129. Un aumento de temperatura de 10 °C redujo la vida media prevista a 473 años129. Por el contrario, valores de semivida experimentales y calculados para soluciones acuosas de atropina con pH entre 8 a 10,5 en 40 °C varió de 3,4 a 116 horas130. Por otro lado, el sulfato de atropina en este estudio no muestra diferencias de estabilidad química si se encuentra en una disolución multicomponente F1 o en una como F2. Hay estudios con autoinyectores multicomponentes, que con características similiares a este estudio, no se observa pérdida significativa del sulfato de atropina2,131,267,268. En cuanto al pH, el sulfato de atropina en F1 obtiene mejores resultados a pH 4 en cualquiera de las condiciones, sin embargo, en F2 no hay diferencia entre pH. Con la composición de las juntas de estanqueidad no se observa diferencia, en estas condiciones de estudio para este principio activo actúan de manera similar. En cuanto al cloruro de midazolam, los resultados obtenidos en su estudio de estabilidad han sido bastante desfavorables, en las condiciones “a tiempo real” y “aceleradas” a pH 3 y pH 4 se degrada prácticamente en su totalidad en ambas formulaciones, experimentando una degradación dependiente de la temperatura. En condiciones de frío, en F1 la benzodiacepina se degrada alrededor de un 15% con pH 3, mientras que solo un 10 % a pH 4. Sin embargo, en F2, la constante de degradación del cloruro de midazolam es mayor, más de tres cuartas partes de su riqueza a pH 3 y alrededor de un 50 % de degradación para pH 4. Hay estudios de solubilidad del midazolam a diferentes pH, y demuestran que a pH > 4 se encuentra midazolam en la muestra, sin embargo, a pH entre 1-4 hay un equilibrio entre midazolam y su benzofenona de anillo abierto254. Esto podría explicar, Resultados y discusión 123 únicamente en condiciones “en frío” (que es donde se percibe concentración de midazolam) esa diferencia entre pH 3 y pH 4, teniendo la de mayor pH mayor riqueza de midazolam, de más de un 10 % en F1, y de un 25 % en F2. Estos valores obtenidos del cloruro de midazolam no son permisibles ni desde el punto de vista farmacotécnico ni farmacológico, ya que no realizaría la función deseada frente a las convulsiones ocasionadas por agentes neurotóxicos. Y a pesar de que F1 tiene mejores valores, y se podría estimar una caducidad de 6 meses en nevera para estos autoinyectores, no es viable por su alta reposición en períodos tan cortos de tiempo, tampoco logísticamente es aceptable, porque el interviniente transporta los autoinyectores en su propio botiquín individual atado a su pierna, sin poder almacenarlo en condiciones de frío. Desafortunadamente, en virtud de la inestabilidad del midazolam, no se podría diseñar ninguna de las formulaciones planteadas en estas tesis como formulación multicomponente, debido a la inestabilidad química en las condiciones que se ha diseñado en este desarrollo. El estudio de mercado, a nivel internacional, realizado durante esta tesis sobre autoinyectores multicomponente ha permitido evidenciar la ausencia de formulaciones como las que hemos planteado en este desarrollo. Se encuentran disponibles conteniendo sulfato de atropina, pralidoxima y diazepam/avizafona. El autoinyector multicomponente fabricado por una empresa checa que contenía la oxima HI-6 ya no se encuentra en el mercado por posibles problemas de estabilidad. Denominación Composición Laboratorio / País COMPOBEN® Atropina sulfato 2 mg + Pralidoxima mesilato 500 mg + Avizafona clorhidrato 10 mg Meridian Medical Technologies (EE.UU.) Ineurope® Atropina sulfato 2 mg + Pralidoxima mesilato 350 mg + Avizafona clorhidrato 20 mg Ministerio de Defensa (Francia) Tabla XXVII. Autoinyectores multicomponente en el mercado internacional. Conclusiones 124 Museo de Farmacia Militar, sala dedicada a los antídotos NRBQ (Base Militar de San Pedro, Colmenar Viejo, Madrid). 7. CONCLUSIONES Conclusiones 125 Conclusiones 126 1. La existencia de agentes neurotóxicos supone un gran riesgo y justifican la existencia de formulaciones de antídotos y métodos de protección. 2. Se han desarrollado dos formulaciones de antídotos en los que se combinan diferentes agentes neuroprotectores estudiando su estabilidad a tres temperaturas diferentes, diferentes pH y distintos tipos de juntas de estanqueidad. 3. Se ha validado un método de HPLC para analizar las formulaciones multicomponentes que permite cuantificar en un único análisis los tres principios activos presentes dentro de una misma muestra. 4. El cloruro de pralidoxima es más estable que el cloruro de obidoxima, sin existir diferencias en cuanto al pH de la disolución. Respecto a las juntas de estanqueidad, se observa un mejor comportamiento con las JEA que con las JEN en la obidoxima. 5. El sulfato de atropina es estable en condiciones a largo plazo (temperatura y tiempo) mientras que sufre inestabilidad química cuando se expone a condiciones aceleradas. 6. El cloruro de midazolam es el principio activo más inestable de las formulaciones multicomponente. Sin embargo, al preparar el midazolam independiente en única una formulación sin el resto de componentes, la estabilidad es suficiente para su uso. Esta buena estabilidad de midazolam cuando está sin combinar con pralidoxima y atropina indica que en una formulación multicámara si sería posible obtener una formulación potencialmente estable. 7. La JEA y la JEN se comportan de manera similar en ambas formulaciones multicomponente, destacando la degradación asociada al uso de JEN mayoritariamente en el estudio entre diazepam y cloruro de midazolam. 8. Se debería plantear para futuros estudios con estos principios activos otras condiciones de pH, uso de excipientes que ayuden a mejorar la estabilidad, o incluso su fabricación en distintas cámaras dentro de la jeringa del autoinyector que permitan resolver el problema de inestabilidad del midazolam en presencia con los otros dos compuestos activos (pralidoxima y atropina) de la formulación de mezcla de antídotos de mayor estabilidad. Conclusiones 127 Bibliografía 128 8. BIBLIOGRAFÍA Carta que anuncia la entrega del Premio Nobel de la Paz en 2013 a la Organización para la Prohibición de las Armas Químicas. Bibliografía 129 Bibliografía 130 1. Lallement G, Clarencon D, Brochier G, et al. Efficacy of atropine/pralidoxime/diazepam or atropine/HI-6/prodiazepam in primates intoxicated by soman. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 1997;56(2):325-332. doi:10.1016/S0091-3057(96)00292-4 2. Clair P, Wiberg K, Granelli I, Carlsson Bratt I, Blanchet G. Stability study of a new antidote drug combination (Atropine-HI-6-Prodiazepam) for treatment of organophosphate poisoning. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2000;9(3):259-263. doi:10.1016/S0928-0987(99)00062-7 3. RamaRao G, Afley P, Acharya J, Bhattacharya BK. Efficacy of antidotes (midazolam, atropine and HI-6) on nerve agent induced molecular and neuropathological changes. BMC Neuroscience. 2014;15:1-11. doi:10.1186/1471-2202-15-47 4. Bajgar J. 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