UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE ÓPTICA Y OPTOMETRÍA TESIS DOCTORAL Aplicaciones de los dinucleótidos para el diagnóstico y el tratamiento del ojo seco Applications of dinucleotides for dry eye diagnosis and treatment MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Carlos Carpena Torres DIRECTORES Juan Gonzalo Carracedo Rodríguez Fernando Huete Toral © Carlos Carpena Torres, 2022 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE ÓPTICA Y OPTOMETRÍA TESIS DOCTORAL Aplicaciones de los dinucleótidos para el diagnóstico y el tratamiento del ojo seco Applications of dinucleotides for dry eye diagnosis and treatment MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Carlos Carpena Torres DIRECTORES Juan Gonzalo Carracedo Rodríguez Fernando Huete Toral Madrid, 2021 Dr. Juan Gonzalo Carracedo Rodríguez, profesor titular del Departamento de Optometría y Visión de la Universidad Complutense de Madrid. Dr. Fernando Huete Toral, profesor asociado del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad Complutense de Madrid. CERTIFICAN Que la Tesis Doctoral titulada Aplicaciones de los dinucleótidos para el diagnóstico y el tratamiento del ojo seco, cuyo autor es el doctorando D. Carlos Carpena Torres, ha sido realizada en el Departamento de Optometría y Visión de la Facultad de Óptica y Optometría de la Universidad Complutense de Madrid bajo la dirección de los que suscriben, cumpliendo las condiciones exigidas para optar al título de Doctor con Mención Internacional. Madrid, noviembre de 2021 Dr. Juan Gonzalo Carracedo Rodríguez Dr. Fernando Huete Toral Para Suso No esperen nombres, estadísticas, fechas. Lo sólido se me escapa, solo queda entre mis dedos una atmósfera imprecisa, técnicamente soy una impresionista de la vieja escuela. María Gainza, La luz negra AGRADECIMIENTOS Como bien apunta Antonio Orejudo en su relato Periodismo y literatura: cómo escribo mi artículo semanal en la prensa española, debería de comenzar dando gracias, que no las gracias, al Banco Santander S.A. y su filantrópica colaboración con la magnífica Universidad Complutense de Madrid (S.L., imagino) por la oportunidad que me dieron de formarme científica e intelectualmente, allá por el año 2016, bajo el amparo económico de 250 € al mes, una cifra nada desdeñable para un chaval de provincias que vino a Madrid tirando de ahorros y que acabó en un laboratorio regentado por tres señores que nada tenían que ver con el Banco Santander S.A. Gracias de nuevo, S.A. En este preciso y exacto instante, que es el ahora, abandono la subordinación para ajustarme al canon científico porque, si no lo sabéis, los científicos odian la subordinación; es una merma que sólo incita a la metáfora y a la retórica y, ¿a quién le gusta la retórica? Allá voy, aventurándome a dar las gracias: A los dos BOSSES, Gonzalo y Suso, gracias a quienes empecé a investigar con todas las facilidades y la confianza del mundo. Gracias, Gon, por hacer fácil el día a día y trabajar contigo, además de por haberme allanado el terreno desde que empecé. Y gracias, Suso, por enseñarme a hacer ciencia como se hace la vida y conseguir que un optometrista como yo se abriese a todos los campos del conocimiento. A Fer, por ser un centro de buenas ideas y gran parte de la logística no sólo de esta tesis, sino de los más de 5 años que llevamos trabajando juntos. Igualmente a Basilio, por toda la ayuda y la generosidad demostrada. A todas las que me habéis ayudado con los experimentos de la tesis, ya que sin vosotras esto no habría llegado a buen puerto: Pastrana, Marisa, Bea, Cris Bautista, Alba, Candela, Álex, María Pérez de Lara y Almudena. A Marta y Lorenzo, por facilitarme la estancia en el International Iberian Nanotechnology Laboratory. A Rafa, por la paciencia y todo lo que he aprendido a tu lado. Special thanks to my machi, Monisha, for all those amazing and stressful moments inside and outside the lab. Thank you for sharing with me a piece of your wonderful culture and love. A Laura, María Serramito, Jesús, Teresa, Ana, María Lafora, Julia, Wael, Azza y al resto del grupo de investigación, por hacer que ir a trabajar no sea ir a trabajar, por lo aprendido a vuestro lado y lo que queda. A mis gatiñas salvajes Ana, Desi, Marta, Candela, que se lleva la doble mención de doctorado, Anxo y Xurxo, por los momentos que habéis hecho que valiese la pena vivir antes, durante y espero que después de la pandemia. A Paula, Bad Bunny y Raquel, por alegrarme muchos días malos. A Raúl y Manolo, o Raúl y Manuel como se hacen llamar ellos, porque estoy escribiendo esto antes de ir a veros a Tenerife y me alegro de teneros a mi lado a pesar del tiempo y la distancia. A mi familia, claro. Primero a mi madre porque, según dice, merece llevarse el principal agradecimiento por haberme parido, y yo también creo que se lo merece. A mi padre, aunque dice que él no me ha ayudado a hacer la tesis, y tiene razón, pero está feo no mencionarlo siquiera siendo mi padre. A mi abuela, por haberme acompañado siempre, Laura, Javier y al resto, por el tiempo que os debo. ÍNDICE ABREVIATURAS ..................................................................................................... 19 ÍNDICES DE FIGURAS Y TABLAS ......................................................................... 23 ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................... 25 ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................ 32 RESUMEN · SUMMARY .......................................................................................... 35 RESUMEN ....................................................................................................... 37 Aplicaciones de los dinucleótidos para el diagnóstico del ojo seco ......... 38 Aplicaciones de los dinucleótidos para el tratamiento del ojo seco ......... 38 SUMMARY ....................................................................................................... 41 Applications of dinucleotides for dry eye diagnosis .................................. 42 Applications of dinucleotides for dry eye treatment .................................. 42 CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN GENERAL ............................................................. 45 LA SUPERFICIE OCULAR .............................................................................. 47 Película lagrimal ...................................................................................... 47 Córnea ..................................................................................................... 51 Conjuntiva ................................................................................................ 56 Párpados y sus glándulas lagrimales ...................................................... 58 Glándula lagrimal principal ...................................................................... 60 EL OJO SECO ................................................................................................. 62 Definición ................................................................................................. 62 Clasificación............................................................................................. 63 Epidemiología .......................................................................................... 65 Fisiopatología .......................................................................................... 68 Diagnóstico .............................................................................................. 71 Tratamiento ............................................................................................. 75 LOS DINUCLEÓSIDOS POLIFOSFATOS ....................................................... 79 Estructura y características ..................................................................... 79 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018542 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018543 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018546 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018554 Receptores purinérgicos P2 .................................................................... 81 Receptores ionotrópicos P2X .......................................................... 82 Receptores metabotrópicos P2Y ..................................................... 85 Localización de los receptores P2 en el ojo ............................................. 88 Papel en el diagnóstico del ojo seco ........................................................ 89 Efecto sobre la secreción lagrimal ........................................................... 92 Efecto sobre los componentes lagrimales ............................................... 94 Efecto sobre la cicatrización corneal ....................................................... 95 Papel en otras estructuras oculares ........................................................ 97 CAPÍTULO II. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ................................. 99 JUSTIFICACIÓN ............................................................................................ 101 HIPÓTESIS .................................................................................................... 104 OBJETIVOS ................................................................................................... 105 Objetivos generales ............................................................................... 105 Objetivos específicos ............................................................................. 105 CAPÍTULO III. OPTIMIZACIÓN DE UN MODELO DE OJO SECO EN CONEJOS INDUCIDO POR LA INSTILACIÓN TÓPICA DE CLORURO DE BENZALCONIO 107 FASE I. ESTUDIO PILOTO .................................................................................... 109 INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 111 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................... 114 Diseño del estudio ................................................................................. 114 Animales ................................................................................................ 115 Evaluación de efectos secundarios indeseados .................................... 115 Medidas sobre la superficie ocular ........................................................ 116 RESULTADOS ............................................................................................... 117 Efectos secundarios indeseados ........................................................... 117 Medidas sobre la superficie ocular ........................................................ 118 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018580 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018587 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018587 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018589 DISCUSIÓN ................................................................................................... 125 FASE II. ESTUDIO FINAL...................................................................................... 127 INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 129 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................... 130 Diseño del estudio ................................................................................. 130 Animales ................................................................................................ 131 Medidas de la lágrima ............................................................................ 131 Examen con lámpara de hendidura ....................................................... 132 Citología conjuntival ............................................................................... 133 PCR cuantitativa .................................................................................... 134 Análisis estadístico ................................................................................ 135 RESULTADOS ............................................................................................... 137 Medidas de la lágrima ............................................................................ 138 Examen con lámpara de hendidura ....................................................... 140 Citología conjuntival ............................................................................... 143 PCR cuantitativa .................................................................................... 143 DISCUSIÓN ................................................................................................... 146 APLICACIONES DE LOS DINUCLEÓTIDOS PARA EL DIAGNÓSTICO DEL OJO SECO ..................................................................................................................... 153 CAPÍTULO IV. MEDIDA COLORIMÉTRICA DE LA CONCENTRACIÓN DE FOSFATO LIBRE EN LA LÁGRIMA DE CONEJOS CON OJO SECO INDUCIDO ............................................................................................................................... 155 INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 157 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................... 158 Diseño del estudio ................................................................................. 158 Animales ................................................................................................ 159 Recogida y procesado de la lágrima ...................................................... 159 Medida de la concentración de fosfato libre en la lágrima ..................... 160 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018601 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018617 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018617 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018619 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018619 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018619 Análisis estadístico ................................................................................ 162 RESULTADOS ............................................................................................... 163 DISCUSIÓN ................................................................................................... 164 APLICACIONES DE LOS DINUCLEÓTIDOS PARA EL TRATAMIENTO DEL OJO SECO ..................................................................................................................... 167 CAPÍTULO V. DESARROLLO PRECLÍNICO DE UNA LÁGRIMA ARTIFICIAL BASADA EN UN EXTRACTO DE ARTEMIA SALINA QUE CONTIENE DINUCLEÓTIDOS .................................................................................................. 169 INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 171 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................... 173 Diseño del estudio ................................................................................. 173 Animales ................................................................................................ 173 Preparación del extracto de Artemia salina ........................................... 174 Medidas mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) ......... 176 Medidas oculares ................................................................................... 177 Análisis estadístico ................................................................................ 179 RESULTADOS ............................................................................................... 180 Medidas mediante HPLC ....................................................................... 180 Medidas oculares ................................................................................... 181 DISCUSIÓN ................................................................................................... 187 CAPÍTULO VI. EFECTO DE UNA LÁGRIMA ARTIFICIAL BASADA EN UN EXTRACTO DE ARTEMIA SALINA EN UN MODELO DE OJO SECO EN CONEJOS ............................................................................................................................... 193 INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 195 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................... 197 Diseño del estudio ................................................................................. 197 Animales ................................................................................................ 198 Composición de la lágrima artificial basada en Artemia salina .............. 198 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018629 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018629 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018631 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018631 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018631 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018645 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018645 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018645 Medidas de la lágrima ............................................................................ 199 Examen con lámpara de hendidura ....................................................... 200 Citología conjuntival ............................................................................... 200 PCR cuantitativa .................................................................................... 201 Análisis estadístico ................................................................................ 203 RESULTADOS ............................................................................................... 204 Medidas de la lágrima ............................................................................ 204 Examen con lámpara de hendidura ....................................................... 207 Citología conjuntival ............................................................................... 209 PCR cuantitativa .................................................................................... 211 DISCUSIÓN ................................................................................................... 214 CAPÍTULO VII. EFECTO DE UNA LÁGRIMA ARTIFICIAL BASADA EN UN EXTRACTO DE ARTEMIA SALINA SOBRE LA CICATRIZACIÓN CORNEAL EN CONEJOS .............................................................................................................. 223 INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 225 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................... 227 Diseño del estudio ................................................................................. 227 Animales ................................................................................................ 228 Desepitelización química de la córnea y captura de las imágenes ........ 229 Procesamiento y medida de las imágenes ............................................ 230 Análisis estadístico ................................................................................ 231 RESULTADOS ............................................................................................... 233 DISCUSIÓN ................................................................................................... 237 CONCLUSIONES · CONCLUSIONS ..................................................................... 241 CONCLUSIONES .......................................................................................... 243 CONCLUSIONS ............................................................................................. 245 ANEXO. PRODUCCIÓN CIENTÍFICA ................................................................... 247 PUBLICACIONES .......................................................................................... 249 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018663 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018663 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018663 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018673 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018677 Tesis doctoral ........................................................................................ 249 Otras ...................................................................................................... 249 CONGRESOS ................................................................................................ 252 Tesis doctoral ........................................................................................ 252 Otros ...................................................................................................... 253 REFERENCIAS ...................................................................................................... 257 file:///C:/Users/carlo/Dropbox/TESIS/20211011/20211011%20TESIS%20FINAL.docx%23_Toc85018684 19 ABREVIATURAS 20 21 AC: adenilato ciclasa. ADP: adenosina difosfato. AMP: adenosina monofosfato. Ap2A: diadenosina difosfato. Ap3A: diadenosina trifosfato. Ap4A: diadenosina tetrafosfato. Ap5A: diadenosina pentafosfato. Ap6A: diadenosina hexafosfato. ATP: adenosina trifosfato. BAC: cloruro de benzalconio, del inglés benzalkonium chloride. DAG: diacilglicerol. dCp4U: desoxicitidina-uridina tetrafosfato. DE: desviación estándar. EGF: factor de crecimiento epidérmico, del inglés epidermal growth factor. Gp2A: guanosina-adenosina tetrafosfato. Gp2G: diguanosina difosfato. Gp3G: diguanosina trifosfato. Gp4G: diguanosina tetrafosfato. HPLC: cromatografía líquida de alta eficacia. HPMC: hipromelosa. HPRT1: hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa 1. IGF: factor de crecimiento insulínico, del inglés insuline-like growth factor. IL: Interleucina. IP3: inositol trifosfato. 22 LASIK: queratomileusis in-situ asistida por láser, del inglés laser assisted in-situ keratomileusis. LIPCOF: pliegues paralelos al párpado, del inglés lid parallel conjunctival folds. MAPK: proteína quinasa activada por mitógenos, del inglés mitogen-activated protein kinases. MMP9: metaloproteinasa de matriz 9. NF-kB: factor nuclear kB, del inglés nuclear factor kB. PCR: reacción en cadena de la polimerasa, del inglés polymerase chain reaction. PIP2: fosfatidiliositol bifosfato. PKC: proteína quinasa C, del inglés protein kinase C. PLCβ: fosfolipasa Cβ, del inglés phospholipase Cβ. TNF: factor de necrosis tumoral, del inglés tumor necrosis factor. Up4U: diuridina tetrafosfato. UTP: uridina trifosfato. VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular, del inglés vascular endotelial growth factor. 23 ÍNDICES DE FIGURAS Y TABLAS 24 25 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema de la estructura bicapa de la película lagrimal en el que se muestra la capa interna formada por la porción acuosa y las mucinas tanto transmembrana (unidas al glicocálix del epitelio) como en forma de gel, además de la capa lipídica cubriendo dicha porción muco-acuosa. Imagen modificada de Willcox et al., 2017 (8). ................................................................................................................................. 48 Figura 2. Corte histológico de la córnea en el que se observan sus diferentes capas, así como un detalle esquemático del epitelio con algunas de sus uniones celulares. Imágenes modificadas de DelMonte y Kim, 2011 (30) y Meeney y Mudhar, 2013 (41). ................................................................................................................................. 53 Figura 3. Imagen de la conjuntiva bulbar obtenida mediante microscopía confocal a partir de una citología de impresión teñida con la técnica de Schiff. En ella se observan algunos estratos de células epiteliales y las células de Goblet intercaladas. ........... 57 Figura 4. Esquema de la morfología de las glándulas de Meibomio en el que se muestran las diferentes estructuras implicadas en la secreción del meibum hacia la película lagrimal. Imagen modificada de Knop y Knop, 2009 (67). ........................... 60 Figura 5. Imágenes de la glándula lagrimal principal obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido en las que se observan los acinos y la red de capilares que los rodean. Imágenes tomadas de Obata, 2006 (68). .................................................... 61 Figura 6. Clasificación del ojo seco en la que se muestra la subclasificación tanto de su forma evaporativa como acuodeficiente en base al informe del comité de expertos de la TFOS, 2017 (71, 84). ....................................................................................... 64 Figura 7. Esquema de la fisiopatología del ojo seco en el que se muestra la cadena de eventos a partir de los cuales se inicia la enfermedad, además de desarrollarse como consecuencia del círculo vicioso. .................................................................... 69 Figura 8. Esquema de la batería de pruebas diagnósticas del ojo seco en la que la anamnesis se hace en primer lugar, seguida de los cuestionarios de sintomatología y la evaluación de los marcadores de homeostasis para, una vez hecho el diagnóstico, acabar clasificando la enfermedad según su etiología y severidad. Imagen modificada de Wolffsohn et al., 2017 (89). .................................................................................. 75 26 Figura 9. Estructura de los dinucleósidos polifosfatos. Arriba se muestra el diadenosina tetrafosfato (Ap4A), un dinucleótido natural con una base nitrogenada de adenina (purina), mientras que abajo se muestra el diuridina tetrafosfato (Up4U), en este caso sintético y con una base nitrogenada de uracilo (pirimidina). ................... 80 Figura 10. Esquema de la estructura de los receptores purinérgicos P2 tanto ionotrópicos (P2X) como metabotrópicos (P2Y). Los receptores P2X muestran dos dominios transmembrana, un bucle extracelular y los extremos N- y C-terminal en el medio intracelular. Los receptores P2Y muestran siete dominios transmembrana, tres bucles y el extremo N-terminal en el medio extracelular, y otros tres bucles, el extremo C-terminal y la proteína G acoplada en el medio intracelular. .................................. 82 Figura 11. Esquema de las vías de señalización del receptor P2Y2. A partir de la activación del receptor P2Y2 mediante agonistas se produce la separación de la subunidad Gα de la proteína G (Gq/11 y Gi/o). La proteína Gq/11 activa la vía fosfolipasa C (PLCβ), mientras que la proteína Gi/o activa la vía adenilato ciclasa (AC). ............ 88 Figura 12. Imagen representativa de una úlcera corneal con cicatrización producida por la instilación tópica de cloruro de benzalconio al 0.2% y 0.3% después de 15 y 10 instilaciones respectivamente. Se observa la falta de transparencia debido a la úlcera mediante la técnica de iluminación indirecta con lámpara de hendidura. ............... 118 Figura 13. Efecto normalizado sobre la secreción lagrimal de 5, 10, 15 y 20 instilaciones (INST) de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.1% (A), 0.2% (B) y 0.3% (C), incluyendo el período de lavado o wash out (WO). Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. ................................................ 120 Figura 14. Efecto normalizado sobre el tiempo de rotura lagrimal de 5, 10, 15 y 20 instilaciones (INST) de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.1% (A), 0.2% (B) y 0.3% (C), incluyendo el período de lavado o wash out (WO). Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. ................................................ 122 Figura 15. Variación de la tinción corneal tras 5, 10, 15 y 20 instilaciones (INST) de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.1% (A), 0.2% (B) y 0.3% (C), incluyendo el período de lavado o wash out (WO). Los valores positivos y 27 negativos representan un deterioro o una mejora respecto a las medidas basales, respectivamente. .................................................................................................... 123 Figura 16. Variación de la hiperemia conjuntival tras 5, 10, 15 y 20 instilaciones (INST) de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.1% (A), 0.2% (B) y 0.3% (C), incluyendo el período de lavado o wash out (WO). Los valores positivos y negativos representan un deterioro o una mejora respecto a las medidas basales, respectivamente. .................................................................................................... 124 Figura 17. Imágenes representativas del daño en la superficie ocular en términos de tinción corneal (arriba) y densidad de células Goblet (abajo) antes (PRE) y después (POST) de la instilación de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.2%. Se observa un aumento en la tinción corneal y un descenso en la densidad de células Goblet (células más brillantes) tras la instilación de BAC al 0.2%. ............. 137 Figura 18. Efecto normalizado sobre la secreción lagrimal sin anestesia (A) y con anestesia (B) de la instilación de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.2% durante 5 días consecutivos. Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre ambos grupos. *P < 0.05, test de la t de Student para muestras independientes. ........................................... 139 Figura 19. Efecto normalizado sobre el tiempo de rotura lagrimal (A) y la osmolaridad lagrimal (B) de la instilación de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.2% durante 5 días consecutivos. Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre ambos grupos. *P < 0.05, test de la t de Student para muestras independientes. ^P < 0.05, test de la U de Mann- Whitney................................................................................................................... 141 Figura 20. Variación de la tinción corneal (A) y la hiperemia conjuntival (B) tras la instilación de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.2% durante 5 días consecutivos. Los valores positivos representan un deterioro respecto a las medidas basales. La comparación estadística se hizo entre ambos grupos. *P < 0.05, test de la U de Mann-Whitney. ............................................................................... 142 Figura 21. Efecto normalizado sobre la densidad de células Goblet (A) y la altura de la nube de mucina (B) de la instilación de solución salina (control) y cloruro de 28 benzalconio (BAC) al 0.2% durante 5 días consecutivos. Los valores inferiores al 100% representan una disminución respecto a las medidas basales. La comparación estadística se hizo entre ambos grupos. *P < 0.05, test de la t de Student para muestras independientes........................................................................................ 144 Figura 22. Variación de los niveles de ARNm de IL-6 en las células conjuntivales tras la instilación de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.2% durante 5 días consecutivos. Los valores positivos y negativos representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre ambos grupos. *P < 0.05, test de la U de Mann- Whitney................................................................................................................... 145 Figura 23. Apariencia visual del reactivo Malachite Green para diferentes concentraciones de fosfato libre en solución (arriba) y curva de calibrado obtenida a partir de la absorbancia para una longitud de onda de 660 nm (abajo). Se observa un aumento en la absorbancia directamente proporcional a la concentración de fosfato libre, acompañado de un cambio de color desde el amarillo a tonalidades verde-cian. ............................................................................................................................... 161 Figura 24. Resultados del cálculo de la concentración de fosfato libre en la lágrima de los conejos con ojo seco inducido y sanos. La comparación estadística se hizo entre los dos grupos, pero no hubo diferencias estadísticamente significativas (P = 0.452). ............................................................................................................................... 163 Figura 25. Cromatograma representativo de un extracto de Artemia salina al 4% que contiene diguanosina tetrafosfato (Gp4G) mediante cromatografía líquida de alta eficacia. .................................................................................................................. 176 Figura 26. Curva de calibrado obtenida mediante HPLC a partir de la medición del Gp4G en los extractos de Artemia salina al 2%, 4%, 6%, 8% y 10%. El área de absorbancia (eje y) representa el área del cromatograma bajo la curva del pico de Gp4G por unidad de tiempo (ver Figura 25). ........................................................... 180 Figura 27. Efecto normalizado sobre la secreción lagrimal de la instilación de solución salina (control) y diferentes concentraciones de Artemia salina (2%, 4%, 6%, 8% y 10%) tras 20 min de la última instilación (POST). Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución, respectivamente, respecto a las medidas basales (PRE). La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y 29 POST dentro de cada grupo. *P < 0.05, test de los rangos con signo de Wilcoxon. ............................................................................................................................... 182 Figura 28. Efecto normalizado sobre el tiempo de rotura lagrimal de la instilación de solución salina (control) y diferentes concentraciones de Artemia salina (2%, 4%, 6%, 8% y 10%) tras 20 min de la última instilación (POST). Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución, respectivamente, respecto a las medidas basales (PRE). La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo, pero no hubo diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05)........................................................................................... 183 Figura 29. Variación de la tinción corneal tras la instilación de solución salina (control) y diferentes concentraciones de Artemia salina (2%, 4%, 6%, 8% y 10%). Las medidas se hicieron 20 min después de la última instilación (POST). Los valores positivos y negativos representan un deterioro o una mejora, respectivamente, respecto a las medidas basales (PRE). La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo. *P < 0.05, **P < 0.01, test de los rangos con signo de Wilcoxon. ................................................................................................................ 185 Figura 30. Imágenes representativas de la tinción corneal antes (PRE) y después (POST) de la última instilación de solución salina (control) y Artemia salina al 4%. Se observa una mejora en la tinción corneal fisiológica con la Artemia salina al 4%, siendo ésta la única concentración que produjo dicha mejora. .......................................... 186 Figura 31. Efecto normalizado sobre la secreción lagrimal (A) y el tiempo de rotura lagrimal (B) de la instilación durante 5 días consecutivos de solución salina (sano), cloruro de benzalconio (BAC) + solución salina (ojo seco), BAC + hipromelosa (ojo seco + HPMC) y BAC + Artemia salina (ojo seco + Artemia). Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre todos los grupos. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, test de la t de Student para muestras independientes. ........................................................... ¡Error! Marcador no definido. Figura 32. Variación de la tinción corneal (A) y la hiperemia conjuntival (B) tras la instilación durante 5 días consecutivos de solución salina (sano), cloruro de benzalconio (BAC) + solución salina (ojo seco), BAC + hipromelosa (ojo seco + HPMC) y BAC + Artemia salina (ojo seco + Artemia). Los valores positivos y negativos 30 representan un deterioro y una mejora respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre todos los grupos. **P < 0.01, ***P < 0.001, test de la t de Student para muestras independientes. ^^^P < 0.001, test de la U de Mann-Whitney. ............................................................................... 208 Figura 33. Efecto normalizado sobre la densidad de células Goblet (A) y la altura de la nube de mucina (B) de la instilación durante 5 días consecutivos de solución salina (sano), cloruro de benzalconio (BAC) + solución salina (ojo seco), BAC + hipromelosa (ojo seco + HPMC) y BAC + Artemia salina (ojo seco + Artemia). Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre todos los grupos. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, test de la t de Student para muestras independientes........................................................................................ 210 Figura 34. Imagen representativa de la densidad de células Goblet antes (PRE) y después (POST) de la instilación de los diferentes tratamientos: solución salina (sano), cloruro de benzalconio (BAC) + solución salina (ojo seco), BAC + hipromelosa (ojo seco + HPMC) y BAC + Artemia salina (ojo seco + Artemia). Se observa una disminución de la densidad de células Goblet (células más brillantes) en los tres grupos con ojo seco, pero de menor magnitud tras el tratamiento con la lágrima artificial basada en Artemia salina. ......................................................................... 211 Figura 35. Variación de los niveles de ARNm de IL-1β (A), IL-6 (B) y MMP9 (C) en las células conjuntivales tras la instilación durante 5 días consecutivos de solución salina (sano), cloruro de benzalconio (BAC) + solución salina (ojo seco), BAC + hipromelosa (ojo seco + HPMC) y BAC + Artemia salina (ojo seco + Artemia). Los valores positivos y negativos representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre todos los grupos. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, test de la U de Mann-Whitney. ....................... 213 Figura 36. Imagen representativa de la desepitelización corneal obtenida con la lámpara de hendidura (izquierda) y después de su procesamiento con el programa informático ImageJ (derecha). La imagen procesada muestra el área teñida con fluoresceína delimitada por una línea amarilla. ...................................................... 230 Figura 37. Imágenes representativas del proceso de cicatrización corneal obtenidas mediante la lámpara de hendidura durante las 24 h de evaluación. Se observa una 31 reducción progresiva del área de desepitelización hasta cerrarse casi por completo. ............................................................................................................................... 233 Figura 38. Resultados del área de desepitelización corneal tras la instilación de solución salina (control), hipromelosa (HPMC) (A) y Artemia salina (B) durante las 24 h de evaluación. Las rectas representan el ajuste lineal de cada tratamiento. La comparación estadística se hizo entre el ojo control y el ojo tratado (HPMC o Artemia) dentro de cada grupo. *P < 0.05, test de la t de Student para muestras relacionadas. ............................................................................................................................... 234 Figura 39. Resultados del cálculo del ratio de cicatrización corneal tras la instilación de solución salina (control), hipromelosa (HPMC) y Artemia salina. La comparación estadística se hizo entre los dos grupos y, dentro de cada grupo, entre el ojo control y el ojo tratado (HPMC o Artemia), pero no hubo diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05)........................................................................................... 235 Figura 40. Resultados de la estimación del tiempo de cicatrización corneal tras la instilación de solución salina (control), hipromelosa (HPMC) y Artemia salina. La comparación estadística se hizo entre los dos grupos y, dentro de cada grupo, entre el ojo control y el ojo tratado (HPMC o Artemia). *P < 0.05, test de la t de Student para muestras relacionadas. .......................................................................................... 236 32 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Principales agonistas y antagonistas de naturaleza nucleotídica de los receptores purinérgicos P2X y afinidad agonista de los diadenosina polifosfatos a dichos receptores. Datos tomados de Guzmán-Aranguez et al., 2007 (182) y Burnstock, 2018 (183). ............................................................................................. 84 Tabla 2. Principales agonistas y antagonistas de naturaleza nucleotídica de los receptores purinérgicos P2Y y afinidad agonista de los diadenosina polifosfatos a dichos receptores. Datos tomados de Guzmán-Aranguez et al., 2007 (182) y Burnstock, 2018 (183). ............................................................................................. 87 Tabla 3. Localización de los receptores purinérgicos P2 en la superficie ocular, el polo anterior y el polo posterior, así como la función fisiológica que ejerce la activación de estos receptores mediante agonistas o antagonistas. Datos tomados y modificados de Carracedo et al., 2016 (190). .................................................................................... 89 Tabla 4. Resultados del estudio piloto relativos a la presencia de efectos secundarios indeseados en la córnea en términos de ulceración, neovascularización y cicatrización tras la instilación de solución salina (control) y las diferentes concentraciones de cloruro de benzalconio (0.1%, 0.2% y 0.3%). Los signos positivo y negativo indican la presencia o ausencia de estos signos respectivamente. ........................................ 117 Tabla 5. Valores de todas las variables bajo estudio antes (PRE) y tras 5, 10, 15 y 20 instilaciones, incluyendo el período de lavado o wash out, de solución salina (control) y cloruro de benzalconio al 0.1%, 0.2% y 0.3%. ..................................................... 119 Tabla 6. Valores de todas las variables bajo estudio antes (PRE) y después (POST) de la instilación de solución salina (control) y cloruro de benzalconio al 0.2% durante 5 días consecutivos. La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo. *P < 0.05, test de la t de Student para muestras relacionadas. ^P < 0.05, test de los rangos con signo de Wilcoxon. ............................................. 138 Tabla 7. Características de los diferentes extractos en función de la concentración de Artemia salina. ........................................................................................................ 175 Tabla 8. Escala de Draize para evaluar el grado de irritación ocular. *Resultado positivo. **No existe una puntuación límite para considerarse resultado positivo. . 178 33 Tabla 9. Valores de la secreción lagrimal antes (PRE) y después (POST) de la instilación de las diferentes concentraciones de Artemia salina: control, 2%, 4%, 6%, 8% y 10%. Las medidas se hicieron 20 min después de la última instilación. La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo. *P < 0.05, test de los rangos con signo de Wilcoxon. ............................................. 181 Tabla 10. Valores del tiempo de rotura lagrimal antes (PRE) y después (POST) de la instilación de las diferentes concentraciones de Artemia salina: control, 2%, 4%, 6%, 8% y 10%. Las medidas se hicieron 20 min después de la última instilación. La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo, pero no hubo diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05). ..................... 183 Tabla 11. Valores de la tinción corneal antes (PRE) y después (POST) de la instilación de las diferentes concentraciones de Artemia salina: control, 2%, 4%, 6%, 8% y 10%. Las medidas se hicieron 20 min después de la última instilación. La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo. *P < 0.05, test de los rangos con signo de Wilcoxon............................................................... 184 Tabla 12. Secuencias de los diferentes primers específicos analizados mediante PCR cuantitativa. ............................................................................................................ 202 Tabla 13. Valores de todos las variables bajo estudio antes (PRE) y después (POST) de la instilación de los diferentes tratamientos durante 5 días consecutivos. La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo. *P < 0.05, test de la t de Student para muestras relacionadas. ^P < 0.05, test de los rangos con signo de Wilcoxon. ............................................................................... 206 34 35 RESUMEN · SUMMARY 36 37 RESUMEN La presente tesis doctoral se ha llevado a cabo bajo un contexto de colaboración entre el grupo de investigación OCUPHARM de la Universidad Complutense de Madrid y la empresa spin-off Ocupharm Diagnostics S.L. con el objetivo de desarrollar nuevos productos sanitarios para el diagnóstico y el tratamiento del ojo seco en base a la investigación y el conocimiento en torno a los dinucleótidos que se ha generado durante las últimas dos décadas como consecuencia de dicha colaboración. El ojo seco es una enfermedad multifactorial de la superficie ocular en la que se produce una pérdida de homeostasis de la película lagrimal, acompañada de un proceso inflamatorio que conduce al daño de la superficie ocular. Por su parte, los dinucleótidos presentes de forma natural en la lágrima desempeñan un papel importante en el diagnóstico del ojo seco, ya que algunos de éstos actúan como biomarcadores diagnósticos. Además, estos compuestos pueden actuar como agonistas del receptor P2Y2 expresado en las células de la superficie ocular, lo que les confiere propiedades secretagogas sobre los componentes acuoso, mucínico y lipídico de la lágrima, así como propiedades cicatrizantes útiles para el tratamiento del ojo seco. Capítulo III: El fin de este estudio dentro de la presente tesis doctoral fue optimizar un modelo de ojo seco en conejos inducido por la instilación tópica de cloruro de benzalconio (BAC) al 0.2% para medir posteriormente la concentración de fosfato libre en la lágrima (Capítulo IV), además de evaluar el efecto de una lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina (Capítulo VI). Se demostró que la instilación tópica de BAC al 0.2% dos veces al día durante 5 días consecutivos deterioró algunos 38 marcadores de ojo seco como la secreción lagrimal, el tiempo de rotura lagrimal, la tinción corneal, la hiperemia conjuntival, la densidad de células Goblet, la altura de la nube de mucina y los niveles de ARNm de IL-6 en las células conjuntivales. Por tanto, fue posible reducir el número de días de instilación de BAC al 0.2% necesarios para inducir un modelo de ojo seco en conejos en comparación con el modelo original, en el que se necesitaron 14 días de instilación de BAC al 0.1%. Aplicaciones de los dinucleótidos para el diagnóstico del ojo seco Capítulo IV: Se cuantificó la concentración de fosfato libre en la lágrima de conejos con ojo seco inducido por la instilación tópica de BAC al 0.2% en comparación con conejos sanos. El fosfato libre de las muestras de lágrima se detectó y cuantificó con un kit comercial que contiene verde de malaquita y basa su medida en la proporcionalidad directa entre la concentración de fosfato libre y la absorbancia para una longitud de onda de 660 nm. Los conejos con ojo seco inducido mostraron un ligero aumento en la concentración de fosfato libre en comparación con los conejos sanos, aunque ambos grupos no mostraron diferencias estadísticamente significativas. Por lo tanto, estos resultados abren la posibilidad al desarrollo de un nuevo sistema diagnóstico del ojo seco, pero se hace necesario un estudio clínico en pacientes con ojo seco para confirmar los hallazgos encontrados. Aplicaciones de los dinucleótidos para el tratamiento del ojo seco Capítulo V: La Artemia salina es un crustáceo que contiene cantidades altas de dinucleótidos, principalmente de diguanosina tetrafosfato (Gp4G), en donde radica su 39 interés para incorporarse como principio activo en una lágrima artificial. Por esta razón, se llevó a cabo el desarrollo preclínico de una lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina para su posterior evaluación en modelos animales de ojo seco (Capítulo VI) y cicatrización corneal (Capítulo VII). Para ello, se evaluó la seguridad y la eficacia a corto plazo de la instilación tópica de diferentes concentraciones de un extracto de Artemia salina (2%, 4%, 6%, 8% y 10%) en conejos. En términos de seguridad, ninguna de las concentraciones mostró efectos secundarios indeseados sobre la superficie ocular. Respecto a la eficacia, sólo el extracto de Artemia salina al 4% produjo un aumento significativo en la secreción lagrimal y mejoró la tinción corneal fisiológica, mientras que no tuvo efecto sobre el tiempo de rotura lagrimal. Por tanto, esta solución oftálmica al 4% se presenta como un posible nuevo tratamiento para el ojo seco y la regeneración de la superficie ocular. Capítulo VI: Se evaluó el efecto de una lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% sobre el modelo de ojo seco en conejos inducido por la instilación tópica de BAC al 0.2%. Además de haberse encontrado un aumento de la secreción lagrimal y una mejora de la tinción corneal, previamente reportados en el Capítulo V, la lágrima artificial mostró efectos beneficiosos sobre el tiempo de rotura lagrimal, la densidad de células Goblet, la altura de la nube de mucina secretada por las células Goblet y los niveles de ARNm de IL-1β y MMP9 en las células conjuntivales. Por lo tanto, se confirmó el potencial de la lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% como agente secretagogo para el tratamiento del ojo seco, a la vez que se abrió la puerta a futuros estudios clínicos que permitan extrapolar los hallazgos encontrados a pacientes con ojo seco. Capítulo VII: El objetivo de este último estudio fue evaluar el efecto de la lagrimal artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% sobre la velocidad de 40 cicatrización corneal en conejos a los que se les provocó una desepitelización química de la córnea. La desepitelización se hizo mediante la aplicación de un disco de papel Whatman nº1 de 3 mm de diámetro impregnado en 1-heptanol sobre la superficie corneal. Al contrario de lo que cabría esperar, la instilación tópica de la lágrima artificial no tuvo efecto sobre la velocidad de cicatrización corneal durante las 24 h posteriores a la desepitelización, por lo que podría presentar limitaciones como tratamiento regenerativo frente a un daño severo de la superficie ocular. 41 SUMMARY The current doctoral thesis was carried out in collaboration with the research group OCUPHARM of the Complutense University of Madrid and the spin-off Ocupharm Diagnostics. The aim was to develop new medical devices for dry eye diagnosis and treatment based on the research and knowledge about dinucleotides compiled by the research group and company over the last two decades. Dry eye is a multifactorial disease of the ocular surface caused by a loss of homeostasis of the tear film, accompanied by an inflammatory process that leads to ocular surface damage. The naturally occurring dinucleotides in tears play an important role in dry eye diagnosis as some act as diagnostic biomarkers of the disease. Furthermore, these compounds can act as agonists of the P2Y2 receptor expressed in the ocular surface cells, which provides them with secretagogue properties over the aqueous, mucinous, and lipidic components of tears, as well as with wound healing properties, both useful for dry eye treatment. Chapter III: The purpose of the study was to optimize a rabbit dry eye model induced by the topical instillation of 0.2% benzalkonium chloride (BAC) to subsequently measure the concentration of free phosphate in tears (Chapter IV). It also aimed to evaluate the effect of artificial tears based on an extract of Artemia salina (Chapter VI). It was found that the topical instillation of 0.2% BAC, twice daily, for 5 consecutive days deteriorated some dry eye markers such as tear secretion, tear break-up time, corneal staining, conjunctival hyperemia, Goblet cell density, mucin cloud height, and ARNm levels of IL-6 in conjunctival cells. It was therefore possible to reduce the days of 42 instillation of 0.2% BAC to induce a rabbit dry eye model compared with the original model, which required the instillation of 0.1% BAC for 14 days. Applications of dinucleotides for dry eye diagnosis Chapter IV: The concentration of free phosphate in tears of rabbits with dry eye induced by the topical instillation of 0.2% BAC was quantified compared with healthy rabbits. The free phosphate in tear samples was detected and quantified using a commercial kit containing malachite green which bases its measurement on the direct proportionality between free phosphate concentration and absorbance for a 660 nm wavelength. The rabbits with induced dry eye showed a slight increase in the concentration of free phosphate compared with the healthy rabbits, despite both groups showing no statistically significant differences. Therefore, these results opened the door to developing a new dry eye diagnostic system, although a clinical study in dry eye patients was necessary to confirm the current findings. Applications of dinucleotides for dry eye treatment Chapter V: The Artemia salina is a crustacean which contains high levels of dinucleotides, especially diguanosine tetraphosphate (Gp4G), so that its use as an active ingredient in artificial tears would be interesting. For this reason, the study focused on the development of artificial tears based on an extract of Artemia salina from a preclinical viewpoint and its evaluation at a later stage in animal models of dry eye (Chapter VI) and corneal wound healing (Chapter VII). In this respect, the study evaluated the short-term safety and efficacy of the topical instillation of different 43 concentrations of an extract of Artemia salina (2%, 4%, 6%, 8%, and 10%) in rabbits. In terms of safety, none of the concentrations showed undesirable side effects over the ocular surface. Concerning efficacy, only the extract of 4% Artemia salina led to a significant increase in tear secretion and improved physiological corneal staining, although it did not affect tear break-up time. Consequently, this 4% ophthalmic solution is presented as a possible new treatment for dry eye and ocular surface regeneration. Chapter VI: The purpose of the study was to evaluate the effect of artificial tears based on an extract of 4% Artemia salina in the rabbit dry eye model induced by the topical instillation of 0.2% BAC. In addition to an increase in tear secretion and an improvement in corneal staining, as previously reported in Chapter V, the artificial tears showed beneficial effects on tear break-up time, density of Goblet cells, mucin cloud height secreted by Goblet cells, and ARNm levels of IL-1β and MMP9 in conjunctival cells. Therefore, the results confirmed the potential of the artificial tears based on an extract of 4% Artemia salina for dry eye treatment, as well as opening the door to future clinical studies allowing the current findings to be extrapolated to dry eye patients. Chapter VII: The aim of this study was to evaluate the effect of artificial tears based on an extract of 4% Artemia salina on corneal wound healing time after inducing a chemical de-epithelialization in rabbits. The de-epithelialization was performed by applying a Whatman filter paper No 1 of 3 mm diameter impregnated in 1-heptanol over the corneal surface. Contrary to what might be expected, the topical instillation of the artificial tears did not affect corneal wound healing time in the 24 h following de- epithelialization. For this reason, the artificial tears based on an extract of 4% Artemia salina could present limitations as a regenerative treatment for severe ocular surface damage. 44 45 CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN GENERAL 46 47 LA SUPERFICIE OCULAR La superficie ocular es una unidad funcional compuesta por la película lagrimal, la córnea, la conjuntiva, los párpados y sus glándulas lagrimales, además de la glándula lagrimal principal y los nervios que se encargan de la inervación de estas estructuras, siendo su homeostasis fundamental para una buena visión y salud ocular (1). En esta sección se describirán las diferentes estructuras de la superficie ocular y sus funciones para entender la importancia de cada una de ellas en el mantenimiento de la homeostasis y su papel frente a la aparición de algunas patologías oculares, entre las que se encuentra el ojo seco. Película lagrimal La película lagrimal representa la capa más externa de la superficie ocular, cubre la totalidad de la córnea y la conjuntiva, y se encarga de proteger y humectar la córnea, así como de mantener una buena visión, ya que es la primera superficie refractiva que está en contacto con el aire (2). Frente al modelo clásico que dividía la película lagrimal en tres capas (una capa interna de mucinas cubriendo la córnea y la conjuntiva, otra capa acuosa intermedia y una última capa lipídica en contacto con el aire) (3), en la actualidad se adopta el modelo bicapa que establece una capa interna formada por mucinas y componente acuoso, y una capa externa de lípidos que envuelve a dicha porción muco-acuosa (Figura 1) (2). El espesor de la película lagrimal es de aproximadamente 2-6 µm, de los cuales sólo entre 40-100 nm corresponden a la capa 48 lipídica (4, 5). Además, la velocidad de producción de la lágrima varía entre 0.5-2.0 µL/min (6), mientras que la capacidad de drenaje a través de los canalículos lagrimales se calcula que es de aproximadamente 3 µL/min (7). Figura 1. Esquema de la estructura bicapa de la película lagrimal en el que se muestra la capa interna formada por la porción acuosa y las mucinas tanto transmembrana (unidas al glicocálix del epitelio) como en forma de gel, además de la capa lipídica cubriendo dicha porción muco-acuosa. Imagen modificada de Willcox et al., 2017 (8). En relación con los componentes de la película lagrimal, las mucinas son un conjunto de glicoproteínas hidrofílicas que tienen la función de mantener la película lagrimal adherida a la superficie ocular, humectar y lubricar dicha superficie y formar una barrera biológica ante agentes externos y patógenos oculares. Éstas se pueden 49 clasificar en mucinas transmembrana, mucinas en forma de gel y mucinas solubles (9, 10). Las mucinas transmembrana son aquellas que se unen apicalmente al glicocálix de las células del epitelio tanto corneal como conjuntival, siendo a su vez las células responsables de su síntesis junto a la glándula lagrimal principal. Las principales mucinas transmembrana son la MUC1, la MUC4 y la MUC16, que se encargan de la adhesión de la película lagrimal a la superficie ocular, ya que su dominio apical pone en contacto a la córnea y la conjuntiva con el resto de la película lagrimal, además de tener una función de barrera protectora (9). Por otra parte, la MUC5AC, que es la principal mucina en forma de gel, se encuentra disuelta en la porción acuosa de la película lagrimal, confiriéndole la viscosidad necesaria para humectar y lubricar la superficie ocular, mantener tanto la estabilidad como la regularidad de la propia película lagrimal y proteger ante agentes externos que posteriormente son eliminados a través del parpadeo (11). A diferencia de las mucinas transmembrana, las mucinas en forma de gel son secretadas por las células de Goblet de la conjuntiva. Por último, las mucinas solubles, entre las que se encuentra la MUC7, parecen desempeñar un papel residual, que se desconoce, sobre la superficie ocular, a pesar de estar expresadas en la glándula lagrimal principal y en el epitelio conjuntival (12). Sin embargo, la MUC7 sí cobra importancia en otras localizaciones como la saliva o la tráquea como agente antibiótico y antifúngico (13, 14). En la porción acuosa de la película lagrimal se encuentran disueltos electrolitos, proteínas y otros compuestos responsables no sólo de las propiedades de la película lagrimal y las funciones de ésta sobre la superficie ocular, sino también de otros procesos fisiológicos oculares (2). Los electrolitos con mayor concentración en la lágrima son: Na+, K+, Ca2+ y Mg2+ (15, 16). Estos iones se encargan de mantener tanto el pH de la lágrima ligeramente básico en torno a 7.5 (17) como su osmolaridad en 50 valores próximos a 300 mOsm/L bajo condiciones de normalidad (18). A su vez, existen una gran cantidad de proteínas disueltas en la lágrima con funciones muy diversas sobre la superficie ocular entre las que cabe destacar el factor de crecimiento epidérmico (EGF, del inglés Epidermal Growth Factor) que estimula el crecimiento y la diferenciación celular (19), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, del inglés Vascular Endotelial Growth Factor) que está implicado en la angiogénesis y la migración de las células endoteliales (19-21), proteínas mediadoras en la respuesta inmune e inflamatoria como las interleucinas (ILs) (19-21), el factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés Tumor Necrosis Factor) (19-21) o la metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9) (22), la lisozima que presenta propiedades tanto bactericidas ante bacterias grampositivas como catalíticas (23), y la lactoferrina que también tiene acción bactericida, además de actuar como un antioxidante (24). A parte de estas proteínas con importantes funciones sobre la superficie ocular, en la lágrima se encuentran compuestos como los dinucleótidos, que son objeto de estudio de la presente tesis doctoral, la glucosa (25), la melatonina (26) o la dopamina (27), entre otros. La superficie externa de la película lagrimal está formada por una capa lipídica que se compone de una fase hidrofílica o polar y otra fase hidrofóbica o apolar en contacto con la porción acuosa y el aire, respectivamente. A pesar de que no se conoce con detalle el origen de cada uno de los lípidos presentes en la lágrima, se sabe que la mayor parte de ellos son secretados por las glándulas de Meibomio y otra parte por las glándulas de Zeis, estando ambos tipos de glándulas localizadas en el borde libre del párpado (2). La literatura científica también recoge que la fase polar está formada por la porción polar de ácidos grasos omega-3 y pequeñas cantidades de ácidos grasos libres y colesterol, mientras que la fase apolar se compone de ceras, 51 triglicéridos, ésteres de colesterilo y la porción apolar de ácidos grasos omega-3, entre otros (28, 29). La función principal de la capa lipídica es evitar la evaporación de la película lagrimal para que ésta se mantenga sobre la superficie ocular el mayor tiempo posible tras el parpadeo. Córnea La córnea es una estructura transparente y avascular que, junto con la esclera y el limbo esclerocorneal, forma parte de la túnica externa del globo ocular, aportando dos tercios de su poder refractivo total. Además, sus propiedades biomecánicas y de barrera permiten la protección del ojo ante agentes mecánicos y patógenos, y la interacción con el medio externo (30). Histológicamente, desde la porción externa hacia la interna, la córnea se divide en el epitelio, la membrana de Bowman, el estroma, la capa de Dua (la última en ser descrita) (31), la membrana de Descemet y el endotelio (Figura 2). El espesor central de la córnea es de aproximadamente 550 µm y se engrosa hacia la periferia (32, 33). Al ser la córnea un tejido avascular, se nutre de pequeños capilares del limbo esclerocorneal, de la película lagrimal en su región epitelial y del humor acuoso en contacto con el endotelio. En cuanto a su inervación, parte del nervio nasociliar de la rama oftálmica del nervio trigémino (V par craneal) discurre en paralelo a la superficie corneal por la región anterior del estroma, penetrando y formando el plexo sub-basal a través de la membrana de Bowman y el epitelio basal (34). A su vez, el plexo sub-basal se ramifica hacia la región superficial del epitelio, inervándolo por completo. El epitelio corneal es la capa más superficial de la córnea, estando en contacto con la película lagrimal, y está formado por entre cinco y siete capas de células 52 pluriestratificadas y no queratinizadas en la región central que aumentan hasta las diez capas en la periferia. Las células del epitelio se regeneran completamente en aproximadamente una semana mediante la descamación de las células más superficiales (35). El espesor del epitelio corneal es de 50-60 µm y, en función de la profundidad en la que se localicen las células, éstas tienen una morfología diferente (Figura 2) (36, 37). Así pues, en la región interna del epitelio se encuentran las células basales o columnares que tienen un aspecto poligonal, siendo más alargadas vertical que horizontalmente. Estas células basales son las únicas con actividad mitótica y durante su período de vida pasan a ser células intermedias o alares para, posteriormente, convertirse en células apicales o planas que son desescamadas hacia la lágrima. Las células basales se unen entre sí mediante desmosomas, uniones estrechas (tight junctions) que forman una barrera de baja permeabilidad y uniones gap. Además, estas células se unen a su membrana basal mediante hemidesmosomas. Por otro lado, las células intermedias o alares son células de transición entre las células basales y las apicales, y están conectadas entre sí mediante desmosomas, uniones adherentes y uniones gap, pero no presentan tight junctions al igual que las células apicales o planas (38). Por último, estas células apicales presentan microvellosidades que están en contacto con la película lagrimal, lo que les permite tener mayor superficie para alojar al glicocálix que, como se explicó anteriormente, tiene como función principal unirse a las mucinas transmembrana (9). Debajo del epitelio corneal se encuentra la membrana de Bowman que es una capa acelular de un espesor comprendido entre 8-12 µm (36). Se compone de proteoglicanos y microfibrillas de colágeno tipo I, III, V, VII y XIII muy compactas que se proyectan hacia el estroma corneal, uniéndose a las fibras de éste (39). A pesar de ser una capa ampliamente estudiada, sus funciones parecen no estar del todo claras 53 como muestra el hecho de que existan algunas anomalías congénitas en la que los pacientes no presentan membrana de Bowman, pero conservan la función corneal. No obstante, se piensa que podría tener un papel residual en la biomecánica y la cicatrización corneal al ser la capa de separación entre las células epiteliales y los queratocitos del estroma (39, 40). Figura 2. Corte histológico de la córnea en el que se observan sus diferentes capas, así como un detalle esquemático del epitelio con algunas de sus uniones celulares más relevantes fisiológicamente. Imágenes modificadas de DelMonte y Kim, 2011 (30) y Meeney y Mudhar, 2013 (41). Representando el 90% del espesor de la córnea, el estroma está compuesto principalmente por fibras de colágeno que se disponen paralelas entre sí de forma 54 regular, lo que permite la transparencia de la córnea, además de agua, proteoglicanos que ayudan a mantener la distancia entre las fibras de colágeno, glicosoaminoglicanos y queratocitos responsables de la síntesis de este colágeno. El colágeno más común en el estroma corneal es el de tipo I, pero también existen en menor medida otros colágenos como los de tipo V, VI, XII, XIII, XIV y XXIV (36, 42). Las fibras de colágeno, además de mantener la transparencia corneal, son las responsables de las propiedades biomecánicas de la córnea, especialmente las fibras de la región anterior al ser las más compactas (42-44). Los queratocitos son células planas que se disponen por todo el estroma y se encargan de mantener su homeostasis sintetizando el colágeno para restaurar las fibras dañadas, las metaloproteasas de matriz que degradan el colágeno y los glicosoaminoglicanos. Estas células ayudan tanto a la dispersión de nutrientes por el lecho estromal como a la eliminación de productos de deshecho (30). Entre el estroma y la membrana de Descemet se encuentra la capa de Dua, descrita en 2013. Esta capa es acelular y tiene una gran resistencia mecánica, a pesar de tener un espesor de sólo 10 µm, debido a la presencia de lamelas de colágeno tipo I que se orientan en diferentes direcciones (31, 43). Debajo de la capa de Dua se encuentra la membrana de Descemet, actuando como membrana basal del endotelio corneal al que se une mediante hemidesmosomas. Esta membrana se compone principalmente de colágeno tipo IV y VIII y glicoproteínas de cuya síntesis se encargan las propias células del endotelio. El espesor de esta capa varía en función de la edad, aumentando de los 3 µm en el recién nacido hasta los 8-10 µm en el adulto (30). En último lugar, y ya en contacto con el humor acuoso, se encuentra el endotelio corneal, formado por una monocapa de células hexagonales de aproximadamente 10 µm de espesor, cuya función principal es regular el transporte de agua y nutrientes 55 desde el humor acuoso hacia el estroma, además de retirar el exceso de agua en sentido inverso (30). La densidad de células endoteliales es de más de 3500 células/mm2 en niños (45, 46) y se va reduciendo con la edad hasta aproximadamente las 2500 células/mm2 en adultos (47-49) debido a su limitada capacidad mitótica. Cuando el número de células se reduce por debajo de las 1000 células/mm2, existe el riesgo de que se produzca una distrofia del endotelio que derive en un edema estromal por exceso de agua proveniente del humor acuoso. Si esto ocurre, las fibras de colágeno del estroma pierden su disposición con la consecuente pérdida tanto de la transparencia corneal, que puede afectar a la visión, como de la homeostasis corneal en general (50, 51). La córnea presenta dos funciones estructurales estrechamente ligadas a la integridad ocular, como son la función de barrera y la cicatrización corneal frente a agresiones externas. En cuanto al proceso de cicatrización corneal, éste empieza por la expresión de una gran cantidad de factores de crecimiento y necrosis, citoquinas y metaloproteasas de matriz que regulan los procesos celulares de apoptosis, proliferación, crecimiento, diferenciación, migración y adhesión (52). En primer lugar, se lleva a cabo la necrosis de las células corneales dañadas y, posteriormente, la fibronectina que es sintetizada junto a la membrana de Descemet migra hacia la región anterior del estroma para adherir una monocapa de células epiteliales a la zona afectada. A continuación, se produce la migración de células epiteliales desde el limbo esclerocorneal, donde se produce su mitosis y diferenciación a partir de células madre mesenquimatosas, hacia la región afectada. Por último, en caso de que la matriz estromal se vea dañada, los queratocitos se encargan de su regeneración. El proceso de cicatrización corneal puede durar entre uno y varios días en función de la extensión 56 y profundidad del área afectada, y se considera satisfactorio si la córnea mantiene su transparencia, regularidad y avascularidad (52, 53). Respecto a la función de barrera, ésta se define como la permeabilidad selectiva que presenta la córnea al agua, los electrolitos y otros solutos. El epitelio es la principal barrera de entrada a la córnea, pero presenta una baja permeabilidad debido a las tight junctions de las células basales, lo que provoca que el paso de fármacos al interior ocular sea muy limitado (54). Por el contrario, tanto el estroma como el endotelio facilitan la difusión de compuestos polares gracias al alto contenido de agua del primero y la especialización en el transporte de agua y nutrientes del segundo (30). Conjuntiva La conjuntiva es una membrana transparente y vascular que cubre parte de la región anterior de la esclera (conjuntiva bulbar) y el interior de los párpados (conjuntiva tarsal). La zona de unión entre la conjuntiva bulbar y la tarsal se conoce como fórnix. Histológicamente, la conjuntiva está compuesta por un epitelio estratificado, escamoso y no queratinizado que forma de tres a cinco capas de células, cuyo espesor medio es de aproximadamente 35 µm y en él se intercalan células de Goblet (Figura 3). Al ser un tejido vascular, también se pueden encontrar linfocitos B y T, además de otras células como los melanocitos (55, 56). La porción bulbar de la conjuntiva recibe la sangre de las arterias ciliares anteriores, mientras que la porción tarsal la recibe de las arcadas laterales y mediales de las arterias palpebrales (57). Además, la conjuntiva también recibe nutrientes de la película lagrimal. En cuanto a su inervación, al igual que la córnea, recibe proyecciones de la rama oftálmica del 57 nervio trigémino (V par craneal) como son los nervios supraorbitario, infraorbitario, supratroclear, infratroclear, lagrimal y los nervios ciliares largos (56). Al igual que el epitelio corneal, el epitelio conjuntival proviene de células madre mesenquimatosas del limbo esclerocorneal que se diferencian en células cuboidales para ocupar la región posterior del epitelio y aplanarse a medida que avanzan hacia la superficie y ser eliminadas por la película lagrimal una vez desescamadas (58). Como ya se comentó anteriormente, el epitelio conjuntival es el encargado de sintetizar las mucinas transmembrana que se unen a su glicocálix para adherir la película lagrimal a la superficie ocular, además de actuar como barrera ante el daño mecánico, sustancias externas y patógenos (9). Figura 3. Imagen de la conjuntiva bulbar obtenida mediante microscopía confocal a partir de una citología de impresión teñida con la técnica de Schiff. En ella se observan algunos estratos de células epiteliales y las células de Goblet intercaladas. 58 Por otra parte, las células de Goblet son glándulas unicelulares apocrinas cuya función principal es secretar la MUC5AC a la película lagrimal, confiriéndole la viscosidad que ésta necesita para humectar la superficie ocular, protegerla ante agentes externos y mantener la estabilidad de la película lagrimal. Además, se encargan de producir citoquinas y ácido retinoico que median en la respuesta inmune de la superficie ocular (59, 60). La densidad media de células de Goblet es de aproximadamente 250 células/mm2 (61) y, junto con la capacidad de estas células para producir mucinas, es fundamental para mantener la homeostasis de la superficie ocular (62, 63). Párpados y sus glándulas lagrimales Los párpados suponen la primera barrera física que protege a la superficie ocular y su buena función es crucial para la homeostasis lagrimal. El parpadeo permite renovar la capa lipídica de la película lagrimal, además de distribuirla uniformemente sobre la superficie ocular, razón por la cual la baja frecuencia de parpadeo y el parpadeo incompleto favorecen la evaporación de la lágrima (64). En el párpado existen cinco tipos de glándulas que, en mayor o menor medida, contribuyen a la composición de la película lagrimal, siendo éstas las glándulas de Meibomio, Zeiss, Moll, Wolfring y Krause. Las glándulas de Meibomio son las principales responsables de la secreción del componente lipídico de la lágrima. Estas glándulas se localizan en la placa tarsal de ambos párpados y se componen de acinos glandulares que se disponen a lo largo de un ducto central con el que conectan a través de ductos más pequeños (Figura 4). El ducto central es el encargado de liberar el producto de secreción o meibum hacia los 59 orificios del borde libre del párpado gracias a la presión que ejerce la contracción del músculo de Riolano durante el parpadeo (64, 65). Las células de los acinos son holocrinas y liberan a su interior diferentes tipos de lípidos como acilglicéridos, ceras, ésteres de colesterol, colesterol, ácidos grasos, fosfolípidos o esfingolípidos (66). En número, el tarso superior tiene una media de aproximadamente treinta y una glándulas de Meibomio, mientras que en el tarso inferior es de veintiséis. Adicionalmente, la longitud y el volumen de las glándulas superiores (5.5 mm y 26 µL, respectivamente) son mayores que en las glándulas inferiores (2.0 mm y 13 µL) (65). También en el borde libre de los párpados se encuentran las glándulas de Moll, que son glándulas sudoríparas de tipo apocrino que podrían ayudar a regular la temperatura de la superficie ocular, además de secretar inmunoglobulina A, MUC1 y lisozimas implicadas en la respuesta inmune. Por su parte, las glándulas de Zeiss son sebáceas y se encuentran en los folículos pilosos de las pestañas. Debido a su localización alejada de la película lagrimal, se desconoce en qué medida contribuyen a la composición de la capa lipídica de la película lagrimal. Ya por último, las glándulas de Wolfring y de Krause, también conocidas como glándulas lagrimales accesorias, son de tipo seroso y se localizan en la región del tarso palpebral y el fórnix, respectivamente, encargándose de la secreción del 5-10% del componente acuoso de la lágrima (55). 60 Figura 4. Esquema de la morfología de las glándulas de Meibomio en el que se muestran las diferentes estructuras implicadas en la secreción del meibum hacia la película lagrimal. Imagen modificada de Knop y Knop, 2009 (67). Glándula lagrimal principal La glándula lagrimal principal se localiza en la región superior-temporal de la órbita anterior y está compuesta por acinos exocrinos, además de células mioepiteliales, cuya función es la de secretar el 90-95% del componente acuoso de la película lagrimal a través de unos conductos excretores que conectan con la superficie ocular (Figura 5). En este componente acuoso excretado existen electrolitos y otros 61 componentes esenciales como la lisozima, la lactoferrina o la inmunoglobulina A, además de una parte de las mucinas transmembrana y solubles. El tamaño de la glándula lagrimal es de 20 x 25 mm y tiene dos lóbulos, uno orbital y otro palpebral, que tienen un espesor de 3 y 5 mm, respectivamente (68, 69). La glándula lagrimal recibe los nutrientes de la arteria lagrimal, mientras que de su inervación se encargan el nervio lagrimal, que es un nervio sensitivo que deriva de la rama oftálmica del nervio trigémino (V par craneal), y tanto fibras preganglionares parasimpáticas del nervio facial (VII par craneal) como fibras posganglionares simpáticas (70), siendo ambos tipos de fibras las responsables de estimular la secreción lagrimal (68, 69). Figura 5. Imágenes de la glándula lagrimal principal obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido en las que se observan los acinos y la red de capilares que los rodean. Imágenes tomadas de Obata, 2006 (68). 62 EL OJO SECO Definición En 2017, el informe del comité de expertos de la denominada TFOS (del inglés Tear Film and Ocular Surface Society) definió el ojo seco como “una enfermedad multifactorial de la superficie ocular que se caracteriza por una pérdida de homeostasis de la película lagrimal, acompañada de síntomas oculares, en la que la inestabilidad y la hiperosmolaridad de la película lagrimal, la inflamación y el daño de la superficie ocular, y las anomalías neurosensoriales tienen un papel etiológico” (71). Respecto a la antigua definición de ojo seco del mismo comité en 2007, que consideraba al ojo seco como “una enfermedad multifactorial de la lágrima y la superficie ocular que produce síntomas de incomodidad, trastornos visuales e inestabilidad de la película lagrimal con daño potencial de la superficie ocular, y acompañada de un aumento en la osmolaridad de la película lagrimal e inflamación de la superficie ocular” (72), la nueva definición es más concisa e incorpora las anomalías neurosensoriales como parte de la fisiopatología de la enfermedad debido al daño neuronal de los receptores nociceptivos de la córnea a consecuencia del daño tisular (71). El resto de los términos recogidos en la definición de 2017 también se incluían en la definición de 2007, habiéndose ampliado el concepto de “síntomas” para no restringirlos a la incomodidad ocular y los trastornos visuales. Los síntomas más frecuentes asociados al ojo seco son la incomodidad ocular y los trastornos visuales, pero además existe otra gran variedad de síntomas como la sequedad ocular, el dolor ocular, la irritación ocular, la sensación de arena, ardor, picor 63 o cuerpo extraño, la sensibilidad a la luz o algunas limitaciones en las actividades cotidianas (73-79). Por otro lado, debido a que el ojo seco es una enfermedad multifactorial, sus signos oculares dependen de su etiología. Como se detallará en la sección Diagnóstico, la mayoría de los signos son comunes en todos los tipos de ojo seco, pero hay algunos que son específicos en base a la clasificación del ojo seco. Clasificación En el pasado, el ojo seco se clasificó en dos categorías completamente diferenciadas en base a su etiología como son el ojo seco evaporativo y el ojo seco acuodeficiente (72, 80). Sin embargo, gracias al avance en el conocimiento del ojo seco, se sabe que estas dos clasificaciones no son entidades diferenciadas, sino que tienen una fisiopatología común en la que la forma evaporativa de la enfermedad coexiste con su forma acuodeficiente, y viceversa, una vez que los pacientes entran en el denominado “círculo vicioso”, tal y como se detallará en la sección Fisiopatología (81). Por lo tanto, en la actualidad, el ojo seco se sigue clasificando como ojo seco evaporativo y ojo seco acuodeficiente para diferenciar la etiología de la enfermedad y seleccionar el mejor tratamiento en base a esta etiología, pero se entiende que ambas clasificaciones forman parte de un todo que se presenta como ojo seco mixto (71). La forma predominante de ojo seco es la evaporativa, habiendo una gran parte de pacientes que comparten la forma evaporativa con la acuodeficiente, lo que se denomina forma mixta, y una pequeña parte de éstos que presentan únicamente la forma acuodeficiente (82, 83). Por un lado, el ojo seco evaporativo se debe a una 64 afectación de los párpados y/o de la superficie ocular que disminuye o altera los componentes lipídicos y/o mucínicos de la película lagrimal, afectando a la estabilidad de ésta. Por su parte, el ojo seco acuodeficiente se debe a una afectación de la glándula lagrimal principal que disminuye el componente acuoso de la película lagrimal. Figura 6. Clasificación del ojo seco en la que se muestra la subclasificación tanto de su forma evaporativa como acuodeficiente en base al informe del comité de expertos de la TFOS, 2017 (71, 84). 65 Dentro de ambas clasificaciones de ojo seco se establece una subclasificación atendiendo a la etiología que desencadena la enfermedad (Figura 6). Así pues, el ojo seco evaporativo puede estar asociado a la disfunción de las glándulas de Meibomio (siendo ésta la causa principal) (84-86), trastornos palpebrales que afectan tanto al parpadeo como a la distribución de la película lagrimal y otros factores intrínsecos y extrínsecos que afectan a la superficie ocular. En el caso del ojo seco acuodeficiente, éste puede asociarse o no al síndrome de Sjögren, además de otros factores que afectan a las vías aferentes y eferentes de la glándula lagrimal principal, y otras enfermedades (84). Epidemiología En 2007, el primer informe del comité de expertos de la TFOS estimó que la prevalencia del ojo seco se encontraba entre aproximadamente el 5 y el 30% de la población mundial mayor de 50 años (87). En el informe de 2017, este rango se amplió hasta el 5-50% tras identificar un total de cuatrocientos treinta y siete estudios de prevalencia (88). Esta variabilidad entre estudios se debe a las diferencias de criterio para diagnosticar el ojo seco, el carácter multifactorial de la enfermedad y otros factores como la localización geográfica de los pacientes, así como su raza, edad y sexo. Con el fin de estandarizar el diagnóstico del ojo seco y hacer comparables los estudios epidemiológicos, este comité de expertos estableció en 2017 una batería de pruebas diagnósticas basada en los síntomas y los signos de la enfermedad (89), como se detallará en la sección Diagnóstico. A la hora de establecer la prevalencia del ojo seco en base a sus síntomas, la principal limitación es la gran variedad de cuestionarios disponibles para el 66 diagnóstico. Al unificar los criterios diagnósticos en torno a un único cuestionario como es el WHS (del inglés Women’s Health Study questionnaire), diferentes estudios reportaron una prevalencia del ojo seco en torno al 10-25% en poblaciones generales de Asia Oriental, disminuyendo hasta el 1-13% cuando el mismo diagnóstico lo realizó un especialista en base a los signos de la enfermedad (90-94). Esta diferencia de prevalencia entre el diagnóstico mediante síntomas y signos pone de manifiesto la necesidad de estandarizar criterios diagnósticos. En relación con otros estudios en Asia Oriental, varios de éstos mostraron una prevalencia de síntomas en torno al 20-50% (95-97) y una prevalencia de signos que disminuyó hasta el 5-35% (95, 96). Dado que el ojo seco es una enfermedad en la que coexisten tanto síntomas como signos, se haría necesario reportar su prevalencia considerando ambos (88). En este sentido, un estudio de Tian et al. (98) reveló una prevalencia de aproximadamente el 30% en una población de Shanghái (China), habiendo considerado tanto los síntomas como los signos de la enfermedad. No obstante, este tipo de estudios no son frecuentes en la literatura científica, lo que limita las conclusiones obtenidas. Hasta ahora, el análisis de prevalencia se ha centrado en Asia Oriental para evaluar de forma aislada geográficamente cómo varían estos porcentajes en función de si el diagnóstico se hace en base a los síntomas, los signos o ambos. Sin embargo, la prevalencia del ojo seco también varía en función de la localización geográfica, habiéndose estimado en torno al 7% en Estados Unidos (99) y Australia (100), 9% en Irán (101), 11% en España (86, 102), 13% en Brasil (103) y 30% en México (104). Ante la falta de datos epidemiológicos en África (105) y la limitación de no haberse utilizado criterios diagnósticos estandarizados en estos estudios, en Asia Oriental se encontraría la mayor prevalencia de ojo seco, razón por la cual se ha asociado a la raza asiática con un mayor riesgo de padecer la enfermedad (88). En este mismo 67 sentido, un estudio hecho en Singapur por Tan et al. (106) no encontró diferencias en la sintomatología entre caucásicos y asiáticos. En cuanto a la asociación entre el ojo seco y la edad, sí existe suficiente evidencia científica que demuestra como los síntomas de ojo seco aumentan a partir de los 40 años, afectando especialmente a la población mayor de 80 años. Además, los signos de la enfermedad también parecen aumentar proporcionalmente a partir de los 50 años (88), asociándose con los cambios anatómicos y fisiológicos en la superficie ocular con la edad. Por el contrario, algunos estudios no encontraron relación entre el ojo seco y la edad en algunas poblaciones asiáticas (106-108) y estadounidenses (109). Adicionalmente, las mujeres tienen más riesgo de padecer ojo seco que los hombres, lo que se asocia a la función de los esteroides sexuales (andrógenos y estrógenos), las hormonas tanto pituitarias como tiroideas, los glucocorticoides, la insulina y al factor de crecimiento insulínico (IGF, del inglés Insuline-like Growth Factor) tipo 1, además de a otros factores genéticos asociados al complemento cromosómico sexual XX y la expresión de algunos genes autosómicos específicos del sexo femenino (110). Atendiendo a los aspectos socioeconómicos de la enfermedad, la sintomatología de ojo seco es uno de los principales motivos de atención médica ocular, lo que supone un gran gasto tanto para los sistemas sanitarios como para los pacientes. Este impacto económico negativo se asocia a los gastos del tratamiento de la enfermedad y a la pérdida de productividad laboral. Por ello, como ocurre en otras muchas enfermedades, los pacientes con un nivel sociocultural que les permite ser conscientes de la problemática asociada al ojo seco y que además tienen acceso a un sistema de salud gratuito o pueden permitirse los costes derivados de la enfermedad tienen un mejor pronóstico de ésta (88). Al margen del aspecto 68 económico, el ojo seco también disminuye la calidad de vida de los pacientes, tiene un impacto negativo sobre la visión y puede llegar a afectar a la salud mental, habiéndose relacionado con la depresión y la ansiedad (111). Por último, y a modo de resumen, se incide en la necesidad de estandarizar el diagnóstico del ojo seco para su uso en los estudios epidemiológicos, teniendo en cuenta tanto los síntomas como los signos de la enfermedad. No obstante, la literatura científica indica que los síntomas del ojo seco son más prevalentes que sus signos, además de que las personas mayores de 50 años y las mujeres tienen un mayor riesgo de padecer la enfermedad. Fisiopatología El ojo seco es una enfermedad en la que la hiperosmolaridad lagrimal se considera su principal factor desencadenante. Hay que tener en cuenta que, en el caso del ojo seco evaporativo, la hiperosmolaridad se produce por un exceso de evaporación de la película lagrimal, mientras que en la forma acuodeficiente de la enfermedad, la hiperosmolaridad es consecuencia de una disminución de la secreción lagrimal y una mayor evaporación de la lágrima. Por lo tanto, la evaporación de la película lagrimal es la responsable de la hiperosmolaridad lagrimal en los dos tipos de ojo seco (84). Sin embargo, también se han propuesto otros factores desencadenantes de la enfermedad como son la inflamación de la superficie ocular, el daño de la superficie ocular y la inestabilidad de la película lagrimal, que pueden aparecer a causa de factores iatrogénicos como la toxicidad de algunos medicamentos tópicos, los alérgenos o las cirugías oculares, por ejemplo, además de alteraciones anatómicas y fisiológicas (81). A partir de estos factores 69 desencadenantes del ojo seco, se produce una cadena de eventos en los que la enfermedad entra en un círculo vicioso que se explicará a continuación (Figura 7). Figura 7. Esquema de la fisiopatología del ojo seco en el que se muestra la cadena de eventos a partir de los cuales se inicia la enfermedad, además de desarrollarse como consecuencia del círculo vicioso. El modelo del círculo vicioso como mecanismo del ojo seco fue propuesto inicialmente por el comité de expertos de la TFOS en su informe de 2007 (72) y sigue vigente en la actualidad (84). Partiendo de la hiperosmolaridad lagrimal como el factor desencadenante de la enfermedad, se produce una cascada de eventos inflamatorios en los epitelios de la superficie ocular que activan las vías de señalización tanto de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK, del inglés Mitogen-Activated Protein Kinases) como del factor nuclear kB (NF-kB, del inglés Nuclear Factor kB) 70 (112, 113), a la vez que se generan IL-1, TNF-α y MMP9 que promueven la aparición de células inflamatorias en la superficie ocular (20-22). Ante esta respuesta inflamatoria, se produce la pérdida de células de Goblet y mucinas transmembrana, así como la apoptosis de las células epiteliales y la muerte de éstas a causa de la hiperosmolaridad lagrimal (114, 115). La pérdida de células de Goblet y células epiteliales disminuye la producción tanto de MUC5AC como del resto de mucinas que son fundamentales para mantener la estabilidad de la película lagrimal (11), favoreciendo su evaporación. Además de aumentar esta evaporación, el círculo vicioso también disminuye la secreción lagrimal por la pérdida de sensibilidad corneal asociada al daño neurosensorial y la inflamación de la glándula lagrimal principal (116). Por último, la evaporación de la película lagrimal produce la hiperosmolaridad lagrimal, cerrando el círculo vicioso. A la vez que el círculo vicioso empeora el ojo seco, la superficie ocular tiene algunos mecanismos de compensación para disminuir la progresión de la enfermedad. Por un lado, la hiperosmolaridad lagrimal está implicada en la estimulación de la secreción lagrimal refleja al producir un aumento en la actividad de los termorreceptores corneales similar al efecto del frío (117). Además, se conoce que la temperatura de la superficie ocular disminuye tras el parpadeo, ayudando a estimular la secreción lagrimal refleja (118, 119). Por esta razón, se piensa que la hiperosmolaridad también podría jugar un papel en el aumento de la frecuencia de parpadeo junto a la sensación de incomodidad ocular (117). Como se comentó anteriormente, la incomodidad ocular y los trastornos visuales son los síntomas más frecuentes del ojo seco. La incomodidad ocular se asocia a la hiperosmolaridad lagrimal a razón de un estudio de Liu et al. (120) en el que se demostró que la instilación tópica de soluciones hiperosmolares produce mayores 71 niveles de incomodidad ocular, además de otro estudio de Hirata y Rosenblatt (121) que asoció la hiperosmolaridad lagrimal con un aumento en la actividad de los termorreceptores corneales, cuya respuesta es responsable de esta sensación de incomodidad. Por otro lado, la sintomatología visual se produce por la inestabilidad de la película lagrimal que da lugar a una superficie refractiva irregular, afectando a la calidad visual de los pacientes (76, 77). Respecto al daño de la superficie ocular, se pueden encontrar signos en las diferentes estructuras de ésta, algunos de los cuales se utilizan para el diagnóstico del ojo seco, tal y como se detallará en la sección Diagnóstico. En la córnea, puede aparecer queratitis punteada superficial, queratitis filamentosa y/o queratoconjuntivitis límbica superior; en la conjuntiva: epiteliopatía punteada, alteración de las mucinas del glicocálix epitelial, pérdida de células de Goblet y/o pliegues paralelos al párpado (LIPCOF, del inglés Lid Parallel Conjunctival Folds); en los párpados: epiteliopatía del borde palpebral en limpiaparabrisas y/o irregularidades en este borde; en la glándula lagrimal: infiltrados de células inflamatorias (84). Diagnóstico La principal limitación en el diagnóstico del ojo seco es que no existe una correlación entre los síntomas y los signos de la enfermedad (122-124), lo que imposibilita establecer un único test como gold standard para este diagnóstico. Por ello, basar el diagnóstico exclusivamente en los síntomas o los signos de la enfermedad limita su sensibilidad y especificidad, además del seguimiento clínico de los pacientes, el desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas y el análisis 72 epidemiológico (89). Por lo tanto, para un correcto diagnóstico del ojo seco, se hace necesario evaluar tanto los síntomas como los signos. En la definición de ojo seco se establece que es una enfermedad en la que coexisten tanto síntomas como signos, por lo que sin síntomas no hay ojo seco y viceversa. En torno a esta idea, el comité de expertos de la TFOS estandarizó en 2017 una batería de pruebas diagnósticas con los requerimientos de que éstas tuvieran un papel directo sobre la fisiopatología del ojo seco, se pudieran utilizar para el seguimiento del progreso de la enfermedad y fuesen específicos de ésta (89). La elección de los test se hizo en base a la evidencia científica en torno a su sensibilidad y especificidad, así como a su carácter poco invasivo y sencillez a la hora de implantarlos en la práctica clínica. Así pues, el ojo seco se diagnostica cuando existen tanto síntomas como al menos un resultado positivo en los signos que se detallan a continuación, siendo el orden de la batería de pruebas el siguiente (Figura 8): 1. Anamnesis: el objetivo es hacer un cribado inicial en base a los antecedentes del paciente y sus hábitos de vida para identificar los factores de riesgo de padecer ojo seco. 2. Síntomas: la sintomatología se puede medir tanto con el test DEQ-5 (del inglés 5-Item Dry Eye Questionnaire) como con el test OSDI (del inglés Ocular Surface Disease Index), pudiendo tener un resultado positivo cualquier de los dos cuestionarios para considerar al paciente sintomático. ▪ DEQ-5: se evalúa la frecuencia y la intensidad de la incomodidad ocular, la sequedad ocular y los ojos llorosos. Se considera un resultado positivo una puntuación ≥ 6 (79). 73 ▪ OSDI: se evalúa la frecuencia de los síntomas oculares, visuales y ante factores medioambientales adversos, así como las limitaciones en algunas actividades cotidianas. Se considera un resultado positivo una puntuación ≥ 13 (125). 3. Signos: una vez confirmada la sintomatología, es necesario que se dé al menos un resultado positivo en el tiempo de rotura lagrimal, la osmolaridad lagrimal o la tinción de la superficie ocular. ▪ Tiempo de rotura lagrimal: se evalúa el tiempo que tarda la película lagrima en empezar a evaporarse y se puede medir tanto de forma no invasiva, la cual se aconseja, como invasiva, mediante la tinción de la lágrima con fluoresceína. Se considera un resultado positivo un valor < 10 s (126, 127). ▪ Osmolaridad lagrimal: es necesario medirla bajo condiciones estables de temperatura, recogiendo muestra del menisco lagrimal que está en contacto con el párpado inferior. Se considera un resultado positivo un valor ≥ 308 mOsm/L en cualquier ojo o una diferencia entre ambos ojos > 8 mOsm/L (127). ▪ Tinción de la superficie ocular: se evalúa el daño de la córnea, la conjuntiva y el borde palpebral mediante la tinción con fluoresceína (córnea y conjuntiva) y verde lisamina (conjuntiva y borde palpebral). Se considera un resultado positivo una tinción > 5 puntos en la córnea (128), > 9 puntos en la conjuntiva (129) o una epiteliopatía del borde palpebral > 2 mm de longitud o > 25% del ancho palpebral (130). 4. Clasificación: una vez diagnosticado el ojo seco, éste se clasifica según su etiología en evaporativo o acuodeficiente y según su severidad en leve, moderado o severo. 74 ▪ Ojo seco evaporativo: se clasifica en base al diagnóstico de la disfunción de las glándulas de Meibomio al ser su causa principal. De acuerdo con las recomendaciones del informe internacional sobre la disfunción de las glándulas de Meibomio (131), ésta se clasifica como leve: grado 4-7 de secreción, grado 1 de expresión o patrón lipídico amorfo/de color; moderada: grado 8-12 de secreción, grado 2 de expresión o patrón lipídico de onda/trama; severa: grado 13 de secreción, grado 3 de expresión o patrón lipídico globular/de color anormal. Adicionalmente, se puede utilizar la meibografía para cuantificar el grado de pérdida de glándulas de Meibomio (132, 133). ▪ Ojo seco acuodeficiente: se clasifica en base a la medida de la altura del menisco lagrimal como leve: 0.2 mm ≥ altura > 0.1 mm; moderado: 0.1 ≥ altura > 0.0 mm; severo: altura = 0.0 mm (134, 135). Esta medida se puede hacer mediante lámpara de hendidura o tomografía de coherencia óptica. Por último, ante la existencia de otras patologías que tienen síntomas y signos similares al ojo seco, se hace necesario un diagnóstico diferencial para no confundirlo con la conjuntivitis alérgica, viral o bacteriana, la blefaritis anterior, el demódex, algunas infecciones parasitarias y otras anomalías de la superficie ocular (89). De ahí que también exista la necesidad de considerar tanto los síntomas como los signos para el diagnóstico de la enfermedad. 75 Figura 8. Esquema de la batería de pruebas diagnósticas del ojo seco en la que la anamnesis se hace en primer lugar, seguida de los cuestionarios de sintomatología y la evaluación de los marcadores de homeostasis para, una vez hecho el diagnóstico, acabar clasificando la enfermedad según su etiología y severidad. Imagen modificada de Wolffsohn et al., 2017 (89). Tratamiento Existen una gran cantidad de tratamientos para el ojo seco que se seleccionan en función de su etiología y severidad, siendo la mayoría de ellos comunes a ambas formas de la enfermedad debido a que comparten fisiopatología. Además, la elección 76 de los tratamientos se hace atendiendo a la situación y las necesidades particulares de cada paciente (136). Tanto en la fase preclínica del ojo seco, en la que los pacientes sólo presentan síntomas o signos, como en su estadio inicial, las primeras medidas que se toman son preventivas y educacionales para hacer consciente al paciente de la problemática asociada a la enfermedad, su prognosis y las opciones de tratamiento. A partir de este momento, se modifican los hábitos de vida que puedan suponer un factor de riesgo a nivel ambiental o dietético y se revisa el tratamiento médico sistémico u ocular (136). A nivel dietético, se podrían incluir suplementos de ácidos grasos esenciales como el omega-3, a pesar de que su evidencia para mejorar los síntomas y los signos del ojo seco es limitada (137). Como primera línea de tratamiento, la instilación tópica de lágrimas artificiales con agentes humectantes como el ácido hialurónico (138), la hipromelosa (hidroxipropilmetilcelulosa) (139) o la carmelosa (carboximetilcelulosa) (140) se utiliza no sólo en estadios iniciales, sino también en moderados y severos (141, 142), especialmente aquellas lágrimas que tienen mayor viscosidad. Estas lágrimas artificiales son el tratamiento que más se prescribe debido a sus propiedades humectantes, antiinflamatorias y cicatrizantes sobre la superficie ocular, que ayudan a mejorar los síntomas y los signos (138-142). En el caso de la disfunción de las glándulas de Meibomio, también se pueden instilar lágrimas artificiales con lípidos como agentes humectantes (143). Por último, también se recomienda la higiene de los párpados y el uso de compresas de calor sobre éstos para favorecer la secreción del meibum hacia la película lagrimal (144). En estadios moderados, los tratamientos anteriores se pueden combinar con fármacos y otros tratamientos que se detallan a continuación (136). A partir de esta fase, se recomienda que las lágrimas artificiales no contengan agentes conservantes 77 para evitar el efecto citotóxico de éstos sobre la superficie ocular (145), además de utilizarse durante la noche en forma de gel para aumentar su tiempo de residencia. En cuanto a los fármacos oculares, habría que destacar el uso de antiinflamatorios no esteroideos como el diclofenaco, corticoides como la metilprednisolona o la dexametasona que se utilizan por períodos cortos de tiempo e inmunosupresores como la ciclosporina A (146, 147). Todos estos antiinflamatorios son eficaces para mejorar los síntomas y los signos del ojo seco, además de reducir la inflamación de la superficie ocular y el progreso de la enfermedad. Por otro lado, los antibióticos tanto tópicos como orales se administran en aquellos casos en los que existe ojo seco asociado a una blefaritis anterior (148). En relación con la presente tesis doctoral, la instilación de agentes secretagogos, entre los que se encuentran los dinucleótidos, se usa para estimular la secreción de los componentes acuoso, mucínico y lipídico de la lágrima. Sus mecanismos de acción se explicarán en la siguiente sección. Existen además otros tratamientos más específicos para conservar el volumen lagrimal como son la oclusión puntual de los conductos lagrimales para evitar su drenaje (149) y el uso de gafas protectoras para evitar la excesiva evaporación de la película lagrimal a causa de agentes medioambientales. Respecto al tratamiento con instrumental especializado de la disfunción de las glándulas de Meibomio, tanto la terapia térmica como la terapia de luz pulsada sobre los párpados se han mostrado eficaces en la mejora de la función de estas glándulas y la sintomatología ocular (150, 151). Cuando la eficacia de los tratamientos ya explicados es limitada sobre la forma severa del ojo seco, existe la alternativa de administrar secretagogos orales, instilar suero autólogo y/o adaptar lentes de contacto esclerales (136). Los secretagogos orales se utilizan para tratar el síndrome de Sjögren porque ayudan a estimular tanto la secreción lagrimal como salival. La pilocarpina y la cevimelina son los secretagogos 78 orales más utilizados y demostraron su eficacia para mejorar los síntomas y los signos en estos pacientes (152-154). Por su parte, el suero autólogo es una buena opción de tratamiento para reparar el daño de la superficie ocular al tener propiedades similares a las de la lágrima en términos de pH, osmolaridad, nutrientes, vitaminas, fibronectinas o factores de crecimiento (155). Asimismo, las lentes esclerales actúan como barrera protectora de la superficie ocular ante agentes externos y, además, ayudan a humectarla mediante la creación de un reservorio lagrimal entre la córnea y la cara posterior de la lente (156). En ocasiones, frente a casos extremos de la enfermedad, se hacen necesarios tratamientos poco conservadores como la instilación de corticoides a largo plazo, el injerto de membrana amniótica sobre la superficie corneal y conjuntival, y algunos procedimientos quirúrgicos como, por ejemplo, el trasplante de glándula salival, la oclusión de los conductos lagrimales, la tarsorrafia y otras blefaroplastias (136). 79 LOS DINUCLEÓSIDOS POLIFOSFATOS Estructura y características Los dinucleótidos son moléculas orgánicas formadas por la unión de dos nucleósidos, compuestos por una pentosa y una base nitrogenada cada uno, mediante un número variable de grupos fosfato. El interés que despiertan los dinucleótidos en la presente tesis doctoral reside en los dinucleósidos polifosfatos, una familia de dinucleótidos que tienen una ribosa como pentosa y cuyas bases nitrogenadas de ambos nucleósidos pueden ser la misma o diferentes, ya sean purinas (adenina o guanina) o pirimidinas (timina, citosina o uracilo) (Figura 9). Los dinucleósidos polifosfatos también se conocen como α, ω-dinucleósidos polifosfatos, dinucleósido 5’, 5’’’-P1, Pn polifosfato o NpnN, en donde “N” es la inicial de la base nitrogenada (A, G, T, C o U) y “n” el número de fosfatos que varía entre dos y siete (157). A pesar de que existen muchas combinaciones posibles entre las bases nitrogenadas y el número de fosfatos, sólo unos pocos dinucleósidos polifosfatos han sido descritos en los seres vivos, entre los que se encuentran los diadenosina polifosfatos (ApnA), los diguanosina polifosfatos (GpnG) y una combinación con ambas bases nitrogenadas (GpnA) (158-161). A parte de estos dinucleótidos presentes de forma natural, se han sintetizado otros como el diuridina tetrafosfato (Up4U), el uridina desoxicitidina tetrafosfato (dCp4U) o los dinosina polifosfatos (IpnI), que tienen importantes propiedades para el tratamiento del ojo seco y otras enfermedades oculares (162-165), como se detallará más adelante. 80 Figura 9. Estructura de los dinucleósidos polifosfatos. Arriba se muestra el diadenosina tetrafosfato (Ap4A), un dinucleótido natural con una base nitrogenada de adenina (purina), mientras que abajo se muestra el diuridina tetrafosfato (Up4U), en este caso sintético y con una base nitrogenada de uracilo (pirimidina). La conformación de los dinucleósidos polifosfatos depende de sus condiciones de pH, temperatura y la concentración de iones presentes en el medio. Bajo condiciones fisiológicas, estos dinucleótidos presentan una conformación en la que las bases nitrogenadas están apiladas debido al plegamiento de la cadena de fosfatos que presenta carga negativa bajo pH 7 (166). Así pues, aunque no se conoce su conformación cuando se unen a los receptores purinérgicos, se piensa que el tamaño de la cadena de fosfato, la capacidad de los fosfatos para formar enlaces con cationes divalentes y las condiciones de pH son las que determinan la selectividad de dichos receptores (167-169). 81 Por otro lado, el descubrimiento de algunos diadenosina polifosfatos tanto en las vesículas de secreción de las células cromafines como en las vesículas sinápticas permitió conocer donde se almacenaban y liberaban estos dinucleótidos al medio extracelular junto a otros nucleótidos como los adenosina monofosfato (AMP), difosfato (ADP) y trifosfato (ATP) (170, 171). Esta liberación al medio extracelular se produce de manera Ca2+ dependiente, es decir, a partir de la señalización que produce la despolarización celular cuando los canales de calcio se abren, permitiendo la entrada de Ca2+ al medio intracelular (171, 172). A parte de la exocitosis, se han propuesto otras vías de liberación de los nucleótidos al medio extracelular a través de proteínas de transporte, hemicanales como las conexinas o las panexinas e incluso algún receptor purinérgico ionotrópico (173-175). A nivel neuronal, los dinucleósidos polifosfatos, principalmente el Ap4A y el diadenosina pentafosfato (Ap5A), modulan la actividad de los neurotransmisores colinérgicos, adrenérgicos y aminoacidérgicos (176), estando presentes en las neuronas simpáticas, parasimpáticas y sensoriales, así como en algunos tipos de células gliales, inmunitarias, epiteliales, endoteliales o musculares, entre otras (177). Además, se conoce que los dinucleósidos polifosfatos regulan procesos fisiológicos en múltiples sistemas y órganos del cuerpo, incluyendo el ojo, en donde se centrará la atención en las siguientes secciones. Receptores purinérgicos P2 Los receptores purinérgicos se dividen en dos familias, una que se activa selectivamente mediante la adenosina (receptores P1) y otra mediante los nucleótidos 82 y los dinucleótidos (receptores P2). Estos receptores P2 se subdividen a su vez en ionotrópicos (P2X) y metabotrópicos (P2Y) acoplados a proteínas G (Figura 10) (178). Figura 10. Esquema de la estructura de los receptores purinérgicos P2 tanto ionotrópicos (P2X) como metabotrópicos (P2Y). Los receptores P2X muestran dos dominios transmembrana, un bucle extracelular y los extremos N- y C-terminal en el medio intracelular. Los receptores P2Y muestran siete dominios transmembrana, tres bucles y el extremo N-terminal en el medio extracelular, y otros tres bucles, el extremo C-terminal y la proteína G acoplada en el medio intracelular. Receptores ionotrópicos P2X Los receptores P2X son canales iónicos que se activan mediante la unión de nucleótidos o dinucleótidos, los cuales permiten un paso rápido y no selectivo de pequeños cationes (Ca2+, Na+ y K+) del medio extracelular al intracelular, produciendo la despolarización de la membrana celular. Esta despolarización activa los canales de calcio dependientes de voltaje, permitiendo la entrada selectiva de Ca2+ al citosol (179). Al ser receptores ionotrópicos que no dependen de segundos mensajeros, su 83 respuesta es muy rápida (del orden de los milisegundos), por lo que estos receptores P2X se localizan principalmente en las células neuronales simpáticas y sensoriales, musculares lisas y secretoras endocrinas, aunque también pueden encontrarse en menor medida en la mayoría de los sistemas del organismo (177). Existen siete subtipos de receptores P2X, desde el P2X1 hasta el P2X7. En cuanto a su estructura, estos receptores P2X están formados por dos dominios transmembrana, un bucle extracelular largo que se caracteriza por tener diez cisteínas residuales y dos extremos intracelulares cortos N- y C-terminal (Figura 10). El extremo N-terminal parece mantener su secuencia en todos los subtipos, mientras que el extremo C-terminal varía tanto su secuencia como longitud, razón por la que se considera que es este C-terminal el responsable de la especificidad de cada receptor (180, 181). Las subunidades P2X1-7 no son funcionales por sí mismas, sino que necesitan unirse en grupos de tres para formar homotrímeros o heterotrímeros funcionales, en caso de que las tres subunidades sean iguales o diferentes, respectivamente (179). Por otro lado, se ha demostrado que los diadenosina polifosfatos son capaces de activar todos los receptores P2X. Un único diadenosina polifosfato puede ser agonista de varios de estos receptores, siendo el Ap4A el único que activa a todos ellos, y un único receptor puede ser activado por varios de estos dinucleótidos . En la Tabla 1 se recogen los principales agonistas y antagonistas de naturaleza nucleotídica de los receptores purinérgicos P2X, así como la afinidad agonista de los diadenosina polifosfatos por dichos receptores. 84 Tabla 1. Principales agonistas y antagonistas de naturaleza nucleotídica de los receptores purinérgicos P2X y afinidad agonista de los diadenosina polifosfatos a dichos receptores. Datos tomados de Guzmán-Aranguez et al., 2007 (182) y Burnstock, 2018 (183). RECEPTOR AGONISTAS ANTAGONISTAS AFINIDAD DE LOS DIADENOSINA POLIFOSFATOS P2X1 BzATP > Lβ,γ-meATP ≥ ATP = 2-MeSATP = α,β-meATP; PAPET-ATP NF449 > Ip5I > TNP-ATP > RO0437626 > NF110 > NF279 = NF023 = RO1 = MRS2159 > PPNDS = suramina = PPADS Ap6A > Ap5A > Ap4A > Ap3A P2X2 ATP ≥ ATPγS ≥ 2-MeSATP > α,β-meATP > β,γ-CF2meATP = BzATP PSB-1011 > RB2 = NF279 = isoPPADS > PPADS > suramina = NF770 = NF778 = aminoglicósido = TNP-ATP Ap4A P2X3 2-MeSATP ≥ ATP ≥ α,β-meATP = PAPET-ATP = BzATP TNP-ATP = isoPPADS > A317491 > NF110 > PPADS = Ip5I = rojo fenol = RO4 = RN1838 = espinorfina = AF353 = RO85 Ap3A > Ap4A > Ap5A > Ap6A P2X4 ATP > α,β-meATP = = CTP = 2-MeSATP = BzATP 5-BDBD > TNP-ATP = PPADS > BBG = paroxetina = fenolftaleína = CORM2 = fluoxetina Ap6A > Ap4A P2X5 ATP = 2-MeSATP = ATPγS > α,β-meATP = GTP BBG > PPADS > suramina > RB-2 = TNP-ATP Ap4A > Ap5A > Ap6A > Ap3A P2X6 Sólo como heteromultímero Sólo como heteromultímero Ap4A P2X7 BzATP > ATP ≥ 2-MeSATP > α,β-meATP = β,γ-meATP A-740003 > A-438079 = BBG = A-804598 = AZ11645373 = A-847227 = AZ-10606120 = CBB = GSK314181A = GSK1482160 = suramina = PPADS = KN-62 = KN04 = MRS2427 = RN-6189 = GSK1370319 = AZ-109056 = AZD-9056 = CE-224535 = oxATP Ap2A = Ap3A = Ap4A = Ap5A = Ap6A Concentración < 1 mM 85 Receptores metabotrópicos P2Y Los receptores P2Y son de tipo metabotrópico, lo que implica que están acoplados a proteínas G heterotriméricas que, cuando se activan a partir de la estimulación del receptor, se separan en una subunidad monomérica Gα de señalización y otra subunidad dimérica Gβγ que se mantiene acoplada. Estos receptores se subdividen en dos familias como son los receptores de tipo P2Y1 (subtipos P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11) y los de tipo P2Y12 (subtipos P2Y12, P2Y13 y P2Y14) (183). Respecto a su estructura, los receptores P2Y están formados por siete dominios transmembrana hidrófobos conectados entre sí mediante tres bucles extracelulares y tres bucles intracelulares, además de tener un extremo extracelular N-terminal y otro intracelular C-terminal junto al que se acoplan las proteínas G (Figura 10) (183, 184). Los receptores P2Y pueden activar o inhibir enzimas como la fosfolipasa Cβ (PLCβ, del inglés Phospholipase Cβ) o la adenilato ciclasa (AC), además de canales iónicos, a través de las proteínas G. Por su parte, los receptores de tipo P2Y1 están acoplados a proteínas Gq/11 que activan a la PLCβ, induciendo a su vez la formación de inositol trifosfato (IP3) que aumenta la concentración de Ca2+ intracelular a partir de su movilización desde los orgánulos citoplasmáticos (184). Adicionalmente, la PLCβ activa a la proteína quinasa C (PKC, del inglés Protein Kinase C) en aquellas células en las que está presente (185). Por otro lado, los receptores de tipo P2Y12 están acoplados a proteínas Gi/o que inhiben a la AC y, como consecuencia, la concentración de AMP cíclico (AMPc) intracelular disminuye (186, 187). 86 En la Tabla 2 se recogen los principales agonistas y antagonistas de naturaleza nucleotídica de los receptores purinérgicos P2Y, así como la afinidad agonista de los diadenosina polifosfatos por dichos receptores. Por el interés que tiene en la presente tesis doctoral, se profundizará sobre el receptor P2Y2. Hay que tener en cuenta que, de todos los receptores P2Y, sólo los receptores P2Y1 y P2Y2 se estimulan mediante los diadenosina polifosfatos (188), estando éstos últimos implicados en la fisiología de algunas estructuras oculares. Como se explicó anteriormente, el receptor P2Y2 (Figura 11) activa a la PLCβ a través de una proteína Gq/11. Esta PLCβ es capaz de hidrolizar al fosfatidiliositol bifosfato (PIP2) presente en la membrana celular para convertirlo tanto en IP3 como en diacilglicerol (DAG), los cuales actúan como segundos mensajeros. Por un lado, el IP3 moviliza el Ca2+ intracelular desde el interior del retículo endoplasmático hacia el citosol. Tanto este aumento del Ca2+ intracelular producido por el IP3 como la señalización del DAG activan a la PKC (189). La peculiaridad que presenta el receptor P2Y2 es que, a pesar de ser un receptor de tipo P2Y1, también puede activar la vía AC, a través de proteínas Gi/o, cuando se expone a bajas concentraciones de agonistas, disminuyendo los niveles de AMPc intracelular (187). Por último, cabe destacar que el receptor P2Y2 se expresa en la mayoría de los tipos de células, incluyendo aquellas relevantes para el mantenimiento de la homeostasis de la superficie ocular (177). 87 Tabla 2. Principales agonistas y antagonistas de naturaleza nucleotídica de los receptores purinérgicos P2Y y afinidad agonista de los diadenosina polifosfatos a dichos receptores. Datos tomados de Guzmán-Aranguez et al., 2007 (182) y Burnstock, 2018 (183). RECEPTOR AGONISTAS ANTAGONISTAS AFINIDAD DE LOS DIADENOSINA POLIFOSFATOS P2Y1 MRS2365 > 2MeSADP = Ap5(βγ) > ADPβS > ATP > 2MeSATP = ADP MRS 2500 > MRS 2279 > MRS 2179 > suramina > PPADS = PIT Ap3A > Ap4A > Ap5A = Ap6A > Ap2A P2Y2 2-S-UTP > UTP = MRS2698 > ATP = INS365 > INS37217 = UTPγS > ATPγS = MRS2768 = Up4-fenil ester AR-C126313 > suramina > RB-2 = PSB-716 = MRS2576 Ap4A > Ap5A > Ap6A > Ap3A P2Y4 2-N3-dUTP > UTPγS = UTP ≥ ATP ≥ Ap4A = INS365 = INS31217 = CTP = ITP ATP > RB-2 > suramina = MRS2577 = PPADS - P2Y6 MRS 2693 > UDPβS = PBS0474 > INS48823 = Up3U = fenacil-UDP > UDP > UTP > ATP = α,β-meUDP = IDP MRS2578 > RB-2 = PPADS = MRS2567 = MRS2575 = suramina Ap5A > Ap3A Concentración > 1 mM P2Y11 ATPγS AR-C67085MX > BzATP ≥ ATP = NF546 = NAD+ = NAADP+ = 2MeSATP NF157 > Suramina > RB-2 = 5’-AMPs = NF340 = AMP-α-5 - P2Y12 2MeSADP = 2MeSATP > ADP > ATP = ADP-β-S AR-C69931MX > AZD6140 = INS50589 > RB-2 > 2MeSAMP = AR-C66096 = CT50547 = PSB0413 = carbanucleósidos = MRS2395 = ARC67085 = clopidogrel = tioclopidina = suramina = INS49266 - P2Y13 ADP = 2MeSADP > 2MeSATP = ATP AR-C69931MX > AR-C67085 > MRS2211 = 2MeSAMP = PPADS > suramina Ap4A (antagonista) P2Y14 MRS2690 > UDP > UDP-glucosa > UDP-galactosa > UDP-glucurónico > UDP-N-acetilglucosamina PPTN = PZB01415033 - 88 Figura 11. Esquema de las vías de señalización del receptor P2Y2. A partir de la activación del receptor P2Y2 mediante agonistas se produce la separación de la subunidad Gα de la proteína G (Gq/11 y Gi/o). La proteína Gq/11 activa la vía fosfolipasa C (PLCβ), mientras que la proteína Gi/o activa la vía adenilato ciclasa (AC). Localización de los receptores P2 en el ojo La presencia de los receptores purinérgicos P2 tanto ionotrópicos como metabotrópicos se ha reportado en muchas estructuras del ojo. En la Tabla 3 se detalla la localización de estos receptores y las funciones fisiológicas que tienen un interés terapéutico para el tratamiento de algunas patologías oculares. 89 Tabla 3. Localización de los receptores purinérgicos P2 en la superficie ocular, el polo anterior y el polo posterior, así como la función fisiológica que ejerce la activación de estos receptores mediante agonistas o antagonistas. Datos tomados y modificados de Carracedo et al., 2016 (190). LOCALIZACIÓN ACCIÓN Y RECEPTOR FUNCIÓN FISIOLÓGICA Epitelio corneal1 Agonista de P2Y2 Acelerar la reepitelización corneal Endotelio corneal1 - - Epitelio conjuntival1 Agonista de P2Y2 Estimular la producción de tanto el componente acuoso como el mucínico de la película lagrimal Glándulas de Meibomio1 Agonista de P2Y2 Estimular la producción del componen lipídico de la película lagrimal Glándula lagrimal1 - - Procesos ciliares2 Agonista de P2Y6 Disminuir la presión intraocular Antagonista de P2Y2 Malla trabecular2 Agonista de P2X2 Disminuir la presión intraocular Agonista de P2Y1 Epitelio pigmentario de la retina3 Agonista de P2Y2 Estimular la reabsorción del fluido subretiniano tras daño retiniano y reparar el epitelio tras inflamación retiniana Agonista de P2Y6 Reparar el epitelio tras inflamación retiniana Antagonista de P2X7 Prevenir la apoptosis en la degeneración macular asociada a la edad y la retinopatía diabética Fotorreceptores3 Antagonista de P2X7 Prevenir la apoptosis en patologías oculares hereditarias (retinosis pigmentaria) Células ganglionares3 Antagonista de P2X7 Prevenir la apoptosis en patologías oculares (glaucoma) Células de Müller3 Agonista de P2Y2 Prevenir el edema osmótico en retinopatías isquémicas e hipóxicas Antagonista de P2X7 Reducir la proliferación en la vitreoretinopatía proliferativa Pericitos de la retina3 Agonista de P2Y4 Prevenir la apoptosis en patologías oculares hereditarias (retinosis pigmentaria) Antagonista de P2X7 1Superficie ocular; 2polo anterior; 3polo posterior. Papel en el diagnóstico del ojo seco Los dinucleótidos actúan como biomarcadores de algunas enfermedades, entre las que se encuentra el ojo seco, a la vez que pueden utilizarse para el tratamiento de éstas debido a las funciones fisiológicas que tienen en el ojo (Tabla 3). Por ello, en este apartado se explicará el papel de los dinucleótidos en el diagnóstico del ojo seco. 90 En 2002, Pintor et al. (191) reportaron por primera vez la presencia de algunos diadenosina polifosfatos como el diadenosina trifosfato (Ap3A), el Ap4A y el Ap5A en la lágrima humana, siendo el Ap4A la molécula con mayor concentración en ésta (108.0 ± 18.3 nM), seguido del Ap5A (37.0 ± 6.2 nM) y el Ap3A (1.5 ± 1.7 nM). En un principio, la presencia de los diadenosina polifosfatos en la lágrima se asoció a la exocitosis por parte de los terminales nerviosos de la superficie ocular (192), pero experimentos posteriores en conejos a los que se les denervó dichos receptores mostraron que la concentración de estos dinucleótidos en la lágrima no se vio alterada (182). Descartada la hipótesis de que la liberación de los dinucleótidos a la lágrima se produce de forma Ca2+ dependiente, se confirmó que la liberación tanto del Ap4A como del Ap5A se produce en el epitelio corneal debido al estrés mecánico que sufren estas células, relacionándose de forma directa la concentración de estos dinucleótidos con la frecuencia de parpadeo (193, 194). Además, los niveles de Ap4A en la lágrima se ven aumentados con la edad, especialmente a partir de los 50 años, y no parece haber una relación clara entre el sexo y las concentraciones tanto de Ap4A como de Ap5A (190). En pacientes con sintomatología de ojo seco, Peral et al. (193) encontraron niveles más altos de Ap4A y Ap5A en la lágrima en comparación con sujetos sanos sin sintomatología. En aquellos pacientes sintomáticos con secreción lagrimal normal, la concentración de Ap4A fue de 0.59 ± 0.33 µM (5 veces más que el grupo sano), mientras que la de Ap5A fue de 0.06 ± 0.02 µM (1.5 veces más que el grupo sano). Por otro lado, en los pacientes sintomáticos con baja secreción lagrimal, la concentración de Ap4A fue de 10.68 ± 1.87 µM y la de Ap5A de 12.45 ± 0.20 µM (100 y 345 veces más que el grupo sano, respectivamente). 91 En la lágrima de pacientes con síndrome de Sjögren, que presentan ojo seco acuodeficiente severo, Carracedo et al. (195) también reportaron concentraciones de Ap4A y Ap5A más altas que en sujetos sanos, siendo estos valores de 4.09 ± 1.36 µM para el Ap4A y 39.51 ± 8.45 µM para el Ap5A. El síndrome de Sjögren es un trastorno autoinmune que daña tanto a la glándula lagrimal como a la glándula salival (196). En la glándula salival se demostró que la presencia del receptor P2Y2 regula tanto la expresión de los receptores de EGF como la infiltración de linfocitos asociados al proceso inflamatorio (197, 198). A pesar de que en la glándula lagrimal no se han descrito todavía las funciones del receptor P2Y2 (199), se piensa que podría tener un papel similar al que tiene en la glándula salival (190). El queratocono y la cirugía refractiva corneal son otras condiciones oculares en las que se han reportado concentraciones altas de diadenosina polifosfatos en la lágrima. Por su parte, el queratocono es una ectasia corneal progresiva que se caracteriza por un adelgazamiento del estroma que produce una protrusión de la córnea y un aumento de su curvatura (200). Es una enfermedad de carácter inflamatorio en la que los pacientes presentan signos y síntomas de ojo seco (63, 201), razones éstas, junto al frotamiento frecuente de los ojos, por las cuales se explican los niveles elevados de Ap4A encontrados en la lágrima de estos pacientes (2.56 ± 1.10 µM) (63, 201). En el caso de la cirugía refractiva corneal, en donde los sujetos tratados muestran signos y síntomas de ojo seco (202, 203), un estudio de Carracedo et al. (204) mostró que únicamente la técnica de queratomileusis in-situ asistida por láser (LASIK, del inglés Laser Assisted In-Situ Keratomileusis) aumentó los niveles de Ap4A en la lágrima desde 0.10 ± 0.03 µM antes de la cirugía hasta 0.25 ± 0.11 µM un mes después de ésta, reduciéndose esta concentración hasta alcanzar los valores basales tres meses después del tratamiento. 92 Al margen del ojo seco, un estudio de Carracedo et al. (205) confirmó que el porte de lentes de contacto rígidas permeables al gas también aumenta los niveles de Ap4A en la lágrima de estos usuarios, asociándose este aumento con el roce que producen las lentes sobre la cara anterior de la córnea. Al contrario, otro estudio del mismo grupo de investigación mostró que el porte de lentes esclerales, que no presentan movimiento sobre la superficie ocular, puede reducir los niveles de este mismo dinucleótido en la lágrima de pacientes con queratocono (201). Por otra parte, en la lágrima de pacientes con aniridia también se han encontrado niveles elevados de Ap4A (5.28 ± 0.77 µM) (206). Efecto sobre la secreción lagrimal En 2002, junto al descubrimiento de la presencia de los diadenosina polifosfatos en la lágrima, Pintor et al. (192) también describieron que la instilación de estos dinucleótidos sobre la superficie ocular aumentó la secreción lagrimal de conejos albinos de Nueva Zelanda. En comparación con las medidas basales de estos conejos, el Ap4A produjo un aumento en la secreción lagrimal del 62%, el Ap5A del 26% y el diadenosina hexafosfato (Ap6A) del 25%, mientras que ni el diadenosina difosfato (Ap2A) ni el Ap3A produjeron ningún cambio. El efecto del Ap4A sobre la secreción lagrimal de estos conejos se produce sólo entre 20 y 60 minutos después de su instilación, motivo por el que Dominguez-Godinez et al. (207) utilizaron lentes de contacto hidrofílicas cargadas con este dinucleótido para liberarlo de forma controlada sobre la superficie ocular y aumentar su efecto hasta 180 minutos después de colocarse las lentes. El efecto de los diadenosina polifosfatos sobre la secreción lagrimal se asocia a la capacidad que tienen éstos de actuar como agonistas del 93 receptor P2Y2, estimulando la liberación de Cl- por parte del epitelio conjuntival al medio extracelular, en este caso la superficie ocular, y la consecuente movilización de agua (192, 208, 209). El único dinucleótido que está actualmente disponible como fármaco para el tratamiento del ojo seco es el Up4U, también conocido como diquafosol. Su uso comercial está aprobado únicamente en Asia, concretamente en Japón, Corea del Sur y China (210). El diquafosol empezó a desarrollarse a principios de este siglo, junto al estudio del efecto de los diadenosina polifosfatos sobre la secreción lagrimal por parte de Pintor et al. (192), y los primeros experimentos animales demostraron sus propiedades secretagogas a la hora de aumentar tanto el componente acuoso como el mucínico de la película lagrimal gracias a su acción agonista sobre el receptor P2Y2 (162, 163, 209, 211, 212). En otro estudio reciente de Dominguez-Godinez et al. (213) se encontró que el efecto del Up4U sobre el aumento de la secreción lagrimal de conejos albinos de Nueva Zelanda fue de un 33%, porcentaje ligeramente inferior al obtenido por el Ap4A (192). Adicionalmente, estos autores utilizaron lentes de contacto hidrofílicas cargadas con Up4U para aumentar su efecto hasta 300 minutos después de ser colocadas (213). Ya en humanos, diversos estudios mostraron la capacidad del diquafosol al 3% para aumentar tanto la secreción lagrimal como el volumen lagrimal en pacientes con ojo seco (210, 214-216), habiendo confirmado también su seguridad y eficacia para mejorar el resto de los signos y los síntomas de esta enfermedad en pacientes con síndrome de Sjögren (217), ojo seco acuodeficiente (218), ojo seco evaporativo (219), ojo seco asociado a la cirugía de cataratas (220), e incluso portadores de lentes de contacto (215) y sujetos sanos (221). A parte de los dinucleótidos anteriormente mencionados, el diguanosina tetrafosfato (Gp4G) también es capaz de aumentar la secreción lagrimal, asociándose 94 su efecto a la estimulación del receptor P2Y2. En un estudio reciente sin publicar del grupo de investigación de la presente tesis doctoral se comprobó que la instilación de este dinucleótido sobre la superficie ocular de conejos albinos de Nueva Zelanda aumentó su secreción lagrimal en torno a un 40% (190). Efecto sobre los componentes lagrimales Como se acaba de explicar en el apartado anterior, los dinucleótidos tienen un efecto secretagogo sobre el componente mucínico de la película lagrimal. En 1998, Jumblatt y Jumblatt (222) propusieron al receptor P2Y2 presente en las células conjuntivales como responsable de la secreción de mucinas a la superficie ocular a partir del efecto secretagogo que produjo la instilación de algunos agonistas de este receptor como el ATP o el uridina trifosfato (UTP). Siendo el Up4U otro agonista del receptor P2Y2, Fujihara et al. (162) comprobaron por primera vez que la instilación de este compuesto en un modelo de ojo seco en ratas aumentó la expresión de mucinas en las células de Goblet. Experimentos posteriores en otros modelos de ojo seco en conejos (163), ratones (223) y perros (224) confirmaron el efecto secretagogo del Up4U sobre el componente mucínico. En relación con el componente lipídico, otro estudio Ikeda et al. (225) en un modelo de ojo seco en conejos demostró que la instilación de Up4U también podría aumentar la cantidad de lípidos secretados por las glándulas de Meibomio. Además, Endo et al. (226) confirmaron en un estudio reciente que la acción agonista del Up4U sobre el receptor P2Y2 es responsable de la liberación de colesterol por parte de las glándulas de Meibomio. Volviendo al efecto de los dinucleótidos sobre la secreción mucínica, Carracedo et al. (190) comprobaron que la instilación de Ap4A podría ser un buen método para aumentar dicha secreción, aunque 95 tendría un efecto mucho menor que el Up4U. En humanos no se ha comprobado de forma directa si la instilación de dinucleótidos sería capaz de aumentar la producción de mucinas, pero dos estudios de Shigeyasu et al. (227, 228) encontraron un aumento en la concentración de ácido siálico, una molécula que se puede encontrar en los terminales de las cadenas de mucinas y que sirve como marcador de éstas en muestras biológicas, en la lágrima tras la instilación de Up4U a corto y largo plazo. A parte de estimular la producción de mucinas y lípidos, compuestos responsables de la estabilidad de la película lagrimal, la instilación de dinucleótidos también aumenta los niveles de lisozima y lactoferrina en la lágrima, lo que podría potenciar su acción bactericida sobre la superficie ocular. Por un lado, Peral et al. (23) mostraron que la instilación de Up4U y Ap4A aumentó la concentración de lisozima en la lágrima de conejos albinos de Nueva Zelanda en un 119% y 93%, respectivamente, manteniéndose el efecto hasta 5 horas después de su instilación. Respecto a la lactoferrina, Loma et al. (24) encontraron un aumento de su concentración en la lágrima de estos conejos en torno a un 18% tras la instilación de Ap4A, manteniendo su efecto durante 4 horas. En estos experimentos se utilizaron antagonistas de los receptores purinérgicos P2 para confirmar que tanto los receptores metabotrópicos P2Y1 y P2Y2 como los receptores ionotrópicos P2X2 y P2X4 son los responsables de mediar la producción de ambos bactericidas por parte de las células epiteliales de la córnea y la conjuntiva (23, 24, 229). Efecto sobre la cicatrización corneal En 2002, Fujihara et al. (163) mostraron por primera vez que la instilación de Up4U ayudó a disminuir la tinción corneal en un modelo de ojo seco en conejos. En 96 2004, Pintor et al. (230) midieron la capacidad de regeneración del epitelio corneal en un modelo de cicatrización en conejos tras la instilación de Ap3A, Ap4A y Ap5A. Durante las siguientes 24 horas a esta instilación, sólo el Ap4A consiguió aumentar la velocidad de cicatrización corneal, mientras que los otros dos dinucleótidos no tuvieron ningún efecto sobre ésta. Posteriormente, experimentos in vitro de Mediero et al. (231) evaluaron el efecto de estos diadenosina polifosfatos sobre la velocidad de migración celular del epitelio corneal, confirmando que el Ap4A aumenta esta velocidad, mientras que el Ap3A y el Ap5A la disminuyen. El uso de antagonistas de los receptores purinérgicos P2 permitió explicar el efecto contrario que tienen estos diadenosina polifosfatos entre sí. El Ap4A permitiría aumentar la velocidad de cicatrización a partir de la estimulación del receptor P2Y2 y, por el contrario, tanto el Ap3A como el Ap5A inhibirían dicha cicatrización por su acción agonista sobre el receptor P2Y6 (231-233). Por otro lado, a parte de la instilación de Ap4A sobre la superficie ocular, el propio Ap4A presente en la lágrima podría tener un papel esencial en el proceso de cicatrización corneal (234). Además, se conoce que tras un daño epitelial los niveles de Ap4A disminuyen durante el período de latencia y vuelven a la normalidad cuando empieza a producirse la migración celular (231). En cuanto a las vías de señalización celular freten al daño del epitelio corneal, Mediero et al. (235, 236) demostraron que tanto la activación del receptor P2Y2 por el Ap4A como la activación del receptor P2Y6 por el Ap3A activan a su vez la vía MAPK y otras vías dependientes de la señalización de la PKC. 97 Papel en otras estructuras oculares Los dinucleótidos despiertan un interés terapéutico no sólo en el tratamiento del ojo seco, sino también en otras patologías oculares debido a la gran cantidad de funciones fisiológicas que desempeñan (Tabla 3). En el caso de la córnea, el Ap4A tiene la capacidad de aumentar la permeabilidad del epitelio, teniendo su efecto máximo 2 horas después de su aplicación, a partir de la disrupción temporal de las tight junctions de las células basales mediada por la activación del receptor P2Y2 (237). Por lo tanto, ante la baja permeabilidad corneal y el corto tiempo de residencia de los colirios sobre la superficie ocular (238, 239), la instilación de Ap4A previa a otro tratamiento tópico puede favorecer su transporte paracelular al interior ocular, aumentando la biodisponibilidad y el efecto de dicho tratamiento (240). En el polo anterior se ha reportado la presencia de diadenosina polifosfatos en el humor acuoso tanto en conejos como en humanos. En conejos, se han medido concentraciones de Ap4A y Ap5A de 0.34 mM y 0.08 mM, respectivamente (241), mientras que en humanos esta concentración es de 0.02 mM para ambos dinucleótidos (242), valores inferiores a los encontrados en conejos. Además, en pacientes con glaucoma se han detectado niveles de Ap4A 15 veces superiores a los de sujetos sanos (242). El humor acuoso se secreta en los procesos ciliares y es drenado a través de la malla trabecular al canal de Schlemm. Tanto en los procesos ciliares como en la malla trabecular se han localizado algunos receptores purinérgicos P2 que desempeñan un papel clave en la regulación de la presión intraocular (190). Por un lado, la acción agonista del receptor P2Y6 y la acción antagonista del receptor P2Y2 en los procesos ciliares disminuyen la secreción del humor acuoso (243-245), reduciendo la presión intraocular. Por otro lado, la acción agonista de los receptores 98 P2X2 y P2Y1 en el cuerpo ciliar y la malla trabecular favorece tanto la apertura del ángulo iridocorneal como el drenaje del humor acuoso (244, 246, 247), reduciendo también esta presión intraocular. Dado que los diadenosina polifosfatos tienen una acción agonista sobre los receptores P2Y1 y P2Y2, que produce un efecto contrario sobre la presión intraocular, además de interaccionar con el resto de los receptores ionotrópicos P2X, la aplicación de estos dinucleótidos para reducir dicha presión está condicionada por un complejo sistema de receptores y funciones fisiológicas. Un estudio de Pintor et al. (241) comprobó que la instilación tópica de Ap4A en conejos normotensos disminuyó la presión intraocular en torno a un 30%, mientras que por el contrario, el Ap2A, el Ap3A y el Ap5A la aumentaron. Por último, al margen de reducir la presión intraocular, la aplicación tópica de Ap4A podría tener un efecto de neuroprotección sobre los terminales simpáticos del cuerpo ciliar (248). En el polo posterior también se localizan diversos receptores purinérgicos P2 que median en procesos fisiológicos frente al daño retiniano (Tabla 3), de los cuales cabe destacar la presencia del receptor P2Y2 (182, 190). Diferentes estudios in vitro y preclínicos en modelos animales de daño retiniano demostraron que la activación del receptor P2Y2 por parte del desoxicitidina uridina tetrafosfato o Denufosol, un dinucleótido sintético, podría reabsorber el edema subretiniano y ayudar a restaurar la función retiniana de la región dañada (164, 249, 250). 99 CAPÍTULO II JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 100 101 JUSTIFICACIÓN La presente tesis doctoral se ha llevado a cabo bajo un contexto de colaboración entre el grupo de investigación OCUPHARM de la Universidad Complutense de Madrid y la empresa spin-off Ocupharm Diagnostics S.L., con el objetivo de desarrollar nuevos productos sanitarios para el diagnóstico y el tratamiento del ojo seco en base a la investigación y el conocimiento en torno a los dinucleótidos que se ha generado durante las últimas dos décadas como consecuencia de dicha colaboración. En relación con el diagnóstico del ojo seco, la experimentación realizada desde el grupo de investigación durante la primera década del s. XXI puso de manifiesto el papel de los dinucleótidos presentes en la lágrima como biomarcadores moleculares para el diagnóstico de la enfermedad, especialmente en el caso del Ap4A (190, 193, 195). En 2015, a raíz de esta investigación, la empresa Ocupharm Diagnostics S.L. recibió financiación a través de un proyecto europeo titulado “Validation of a novel diagnostic biomarker for dry eye syndrome based in nucleotides detection (H2020- SMEINST-1-2014/ID:673533)” para evaluar la capacidad diagnóstica del Ap4A presente en la lágrima de los pacientes con ojo seco, habiéndose reportado una sensibilidad del 74% y una especificidad del 96% al cuantificar el Ap4A mediante cromatografía líquida de alta eficacia. Con el fin de desarrollar un dispositivo diagnóstico del ojo seco basado en la detección colorimétrica del Ap4A, y como una alternativa de mercado a otros instrumentos disponibles como TearLab (TearLab Corporation; San Diego, California, Estados Unidos) o InflammaDry (Quidel Corporation; San Diego, California, Estados Unidos), al inicio de la presente tesis doctoral se colaboró con el International Iberian Nanotechnology Laboratory (Braga, Portugal) en el desarrollo de un sistema de detección del Ap4A con nanopartículas de 102 oro. Sin embargo, ante la imposibilidad de desarrollar técnicamente dicho sistema, razón por la cual no se incluyeron estos resultados en la presente tesis doctoral, se pensó en la detección del fosfato libre en la lágrima mediante un kit comercial basado en el verde de malaquita como una alternativa colorimétrica a la detección del Ap4A con nanopartículas de oro. Por esta razón, en el Capítulo IV de esta tesis doctoral se desarrolló un método de medida colorimétrica del fosfato libre en la lágrima y, como un primer acercamiento preclínico, se cuantificó la concentración de fosfato libre en la lágrima de conejos con ojo seco inducido por la instilación tópica de cloruro de benzalconio al 0.2% en comparación con conejos sanos. En paralelo a la investigación sobre el papel de los dinucleótidos en el diagnóstico del ojo seco, el grupo de investigación de la presente tesis doctoral también demostró la capacidad de algunos dinucleósidos polifosfatos como el Ap4A, el Ap5A, el Ap6A y el Gp4G para estimular tanto la secreción lagrimal (192, 207) como la cicatrización corneal (230, 231) a partir de la activación de los receptores purinérgicos P2Y2 expresados en las células de la superficie ocular. Estas propiedades de los dinucleótidos, junto a otras reportadas por diferentes autores como la estimulación de la producción de mucinas (163) y lípidos (226) de la lágrima, hacen de estos compuestos candidatos ideales para el tratamiento del ojo seco. A este respecto, ya existe en el mercado asiático un tratamiento tópico de Up4U, conocido como diquafosol, que demostró su seguridad y eficacia en pacientes con ojo seco (210, 220). No obstante, como una alternativa de mercado, en la presente tesis doctoral se estudiaron las propiedades de un extracto de Artemia salina, un crustáceo que contiene altas concentraciones de dinucleótidos, especialmente de Gp4G (158, 251), dentro del desarrollo de una nueva lágrima artificial basada en dicho extracto. El desarrollo de esta lágrima artificial se hizo en colaboración con la empresa Avizor S.A. 103 (Madrid, España) con el objetivo de comercializarse como producto sanitario, por lo que en el Capítulo V se llevó a cabo la investigación preclínica necesaria para tal fin. Además, una vez desarrollada la lágrima artificial, y con el objetivo de encontrar nuevas aplicaciones extrapolables a la investigación clínica, se evaluó su efecto tanto en un modelo de ojo seco en conejos inducido por la instilación tópica de cloruro de benzalconio al 0.2% (Capítulo VI) como en un modelo de cicatrización corneal severa (Capítulo VII) en conejos. 104 HIPÓTESIS En la presente tesis doctoral existen dos líneas de investigación en torno al papel de los dinucleótidos en el diagnóstico y el tratamiento del ojo seco, por lo que se plantearon las siguientes dos hipótesis: I. Considerando que algunos dinucleótidos y nucleótidos como el Ap4A, el Ap5A y el ATP están sobreexpresados en la lágrima de los pacientes con ojo seco, actuando como biomarcadores moleculares de la enfermedad, se propone la siguiente hipótesis: la concentración de fosfato libre en la lágrima de pacientes con ojo seco podría estar elevada respecto a sujetos sanos debido a la degradación natural o espontánea de dichos nucleótidos. En base a este hipótesis, se plantea la posibilidad de que el fosfato libre en la lágrima se pueda detectar y cuantificar colorimétricamente usando un kit comercial que contiene verde de malaquita, abriendo la puerta al desarrollo de un nuevo método diagnóstico colorimétrico del ojo seco. II. Dado que los dinucleótidos presentan propiedades secretagogas sobre los componentes acuoso, mucínico y lipídico de la película lagrimal, así como propiedades cicatrizantes sobre la superficie ocular, se propone la siguiente hipótesis: la instilación tópica de un extracto de Artemia salina, un crustáceo que contiene altas concentraciones de dinucleótidos, sería útil como tratamiento del ojo seco. Por ello, se plantea el estudio de la propiedades de una lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina, la cual podría presentar propiedades beneficiosas sobre los signos del ojo seco en relación con la función de la lágrima y tanto el daño como la inflamación de la superficie ocular. 105 OBJETIVOS Objetivos generales Desarrollar un nuevo método diagnóstico del ojo seco basado en la detección colorimétrica del fosfato libre en la lágrima, así como evaluar las propiedades sobre la superficie ocular de una lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina que contiene dinucleótidos. Objetivos específicos I. Optimizar un modelo de ojo seco en conejos inducido por la instilación tópica de cloruro de benzalconio al 0.2% con el fin de reducir el número de días de instilación propuesto en el modelo original. II. Medir la concentración de fosfato libre en la lágrima de conejos con ojo seco inducido en comparación con conejos sanos mediante un método colorimétrico basado en el verde de malaquita. III. Evaluar la seguridad y la eficacia de la instilación tópica de diferentes concentraciones de un extracto de Artemia salina sobre la secreción lagrimal, el tiempo de rotura lagrimal y la tinción corneal en conejos. IV. Evaluar el efecto de una lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% sobre la función de la lágrima y tanto el daño como la inflamación de la superficie ocular en un modelo de ojo seco en conejos. 106 V. Evaluar el efecto de una lagrimal artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% sobre la velocidad de cicatrización corneal en conejos a los que se les provocó una desepitelización química de la córnea. 107 CAPÍTULO III OPTIMIZACIÓN DE UN MODELO DE OJO SECO EN CONEJOS INDUCIDO POR LA INSTILACIÓN TÓPICA DE CLORURO DE BENZALCONIO 108 109 FASE I ESTUDIO PILOTO 110 111 INTRODUCCIÓN El uso de modelos animales de ojo seco permite el descubrimiento y el desarrollo de nuevos biomarcadores diagnósticos y tratamientos para esta enfermedad. En función de la etiología y la clasificación del ojo seco, se han desarrollado diferentes modelos animales en conejos, ratones, ratas y perros (252-254). En el caso de los conejos, el ojo seco se ha inducido mediante diferentes procedimientos como la dacrioadenectomía (255), la castración tanto femenina como masculina (256, 257), la desecación de la superficie ocular (258), la inducción de dacrioadenitis crónica autoinmune (259), la inyección de concanavalina A en la glándula lagrimal (260), la lesión del conducto lagrimal (261), la denervación corneal (262) y la instilación tópica tanto de atropina (263) como de cloruro de benzalconio (BAC) (264). De todos estos procedimientos, el estudio actual se centra en la instilación tópica de BAC para optimizar un modelo de ojo seco en conejos. De todos estos procedimientos, se seleccionó la instilación de BAC debido a que no requiere ningún tipo de intervención quirúrgica o ambiental para inducir el ojo seco. El BAC es un agente tensioactivo catiónico que se clasifica como un compuesto de amonio cuaternario y se utiliza como conservante de soluciones oftálmicas como colirios y soluciones de limpieza para lentes de contacto. Además, se usa frecuentemente en la medicación para el glaucoma, razón por la cual estos pacientes pueden presentar efectos secundarios indeseados sobre la superficie ocular debido a la toxicidad e irritación que produce el BAC (265, 266). La concentración de BAC que se encuentra en las formulaciones oftálmicas comerciales está entre 0.005% y 0.02%, teniendo estos porcentajes la capacidad de lisar las células del epitelio corneal (267). Además, el BAC produce daño en la estructura de algunos compuestos de la película 112 lagrimal (268), la inervación corneal (269) y las células conjuntivales (270). Es por todos estos efectos indeseados sobre la superficie ocular que la instilación tópica de BAC se ha utilizado para el desarrollo de modelos de ojo seco tanto en conejos (264) como ratones (271). Los modelos animales basados en la instilación tópica de BAC permiten la evaluación de diferentes marcadores diagnósticos del ojo seco en relación con la calidad de la película lagrimal y tanto el daño como la inflamación de la superficie ocular. En conejos, este modelo animal se ha utilizado para evaluar la eficacia de diferentes formulaciones oftálmicas con ácido hialurónico (272, 273), povidona (272), epigalocatequin galato (273, 274), suero con inactivación viral (275), carboximetil- pululano (276) o ciclosporina A (277). A parte, este modelo se ha utilizado para evaluar nuevos tratamientos de liberación controlada de fármacos como nanopartículas funcionalizadas tanto con antiinflamatorios (278) como con epigalocatequin galato y ácido hialurónico (279), además de lentes de contacto con ciclosporina A dentro de su estructura (280). Otros autores investigaron la eficacia de tratamientos para el ojo seco como la inyección de un hidrogel termosensible de quitosano en el canalículo lagrimal (281), además del efecto de la trabeculectomía para el tratamiento del glaucoma sobre el ojo seco (282). El modelo original de ojo seco en conejos inducido por la administración tópica de BAC fue desarrollado por Xiong et al. (264), quienes propusieron la instilación de BAC al 0.1% dos veces al día durante 14 días consecutivos. Además del BAC al 0.1%, estos autores evaluaron otras concentraciones mayores (0.2%, 0.3%, 0.5% y 1%), asegurando que todas ellas no fueron seguras para los conejos, pero sin reportar resultados al respecto. Otros autores también indujeron este mismo modelo en 113 conejos instilando BAC al 0.1% durante 21 (282) y 28 (273, 275, 279) días consecutivos. En ratones, Lin et al. (271) fueron quienes desarrollaron el modelo original mediante la instilación de BAC al 0.2% dos veces al día durante 7 días consecutivos, habiendo sido utilizado por otros autores satisfactoriamente (283, 284). En base a que la instilación de BAC al 0.2% en ratones permitió reducir los días a la mitad en comparación con la instilación de BAC al 0.1% en conejos, el capítulo actual se centra en la idea de reducir el número de días de instilación de BAC necesarios para inducir el modelo de ojo seco en conejos mediante el aumento de la concentración de BAC. Por ello, el objetivo del estudio actual fue establecer la concentración de BAC y el número de días de instilación de dicha concentración necesarios para optimizar el modelo de ojo seco en conejos desarrollado originalmente por Xiong et al. (264), quienes establecieron 14 días de instilación de BAC al 0.1%. Para tal fin, se instilaron diferentes concentraciones de BAC (0.1%, 0.2% y 0.3%) durante 12 días, evaluando, principalmente, la presencia de efectos secundarios indeseados y, secundariamente, midiendo la secreción lagrimal, el tiempo de rotura lagrimal, la tinción corneal y la hiperemia conjuntival. 114 MATERIAL Y MÉTODOS Diseño del estudio Se hizo un estudio experimental y prospectivo de acuerdo con la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO, del inglés Association for Research in Vision and Ophthamology) para el uso de animales en investigación y la Directiva 2010/63/EU del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. Se hicieron un total de 2 instilaciones diarias de 35 μL de solución salina (control) y BAC al 0.1%, 0.2% y 0.3% durante 5 días consecutivos, seguido de un período de wash out de 2 días y, finalmente, de nuevo 2 instilaciones diarias de los diferentes compuestos durante 5 días. Las instilaciones se hicieron de lunes a viernes durante las 2 semanas de experimentación (una instilación a las 10:00 y otra a las 18:00), mientras que el período de wash out se hizo el sábado y el domingo de la primera semana. La solución salina fue provista por Avizor (Madrid, Madrid), mientras que el BAC por Merck (Darmstadt, Alemania). Todas las medidas se hicieron antes de la primera instilación (PRE), tras 5 y 10 instilaciones (1ª semana), un período de lavado o wash out (WO), y tras 15 y 20 instilaciones (2ª semana). Las medidas de secreción lagrimal, tiempo de rotura lagrimal, tinción corneal e hiperemia conjuntival se realizaron 1 h después de la instilación de los diferentes compuestos. 115 Animales Se utilizaron un total de 8 conejos albinos de Nueva Zelanda machos, evaluando ambos ojos de cada conejos. Se establecieron 4 grupos: 2 conejos como controles con solución salina (nojos = 4), 2 conejos con BAC al 0.1% (nojos = 4), 2 conejos con BAC al 0.2% (nojos = 4) y 2 conejos con BAC al 0.3% (nojos = 4), Los conejos fueron suministrados por la granja San Bernardo (Navarra, España) y se mantuvieron en jaulas durante 7 días para adaptarlos a sus nuevas condiciones de estabulación antes del comienzo de los experimentos. Su peso el primer día de experimentación estuvo entre 2.0 y 2.5 kg y se les proporcionó libre acceso a comida y agua. Las condiciones ambientales del animalario estuvieron controladas con ciclos de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad a una temperatura de 18ºC y una humedad del 30%. Evaluación de efectos secundarios indeseados Tanto la concentración de BAC como el número de días de instilación se establecieron en base a la presencia de efectos secundarios indeseados en la córnea en términos de ulceración, neovascularización y cicatrización durante el examen con lámpara de hendidura, criterios previamente establecidos por Xiong et al. (264) en el modelo original. 116 Medidas sobre la superficie ocular La secreción lagrimal se midió sin anestesia mediante el test de Schirmer (Aiesi; Nápoles, Italia) durante 5 min. Para ello, se apoyó la tira de papel dentro del párpado inferior de los conejos y se cerró los ojos de éstos para evitar la secreción refleja asociada al parpadeo. El tiempo de rotura lagrimal se midió durante el examen con lámpara de hendidura tras la instilación de 5 μL de fluoresceína sódica comercial al 2% (Alcon Cusí; Barcelona, España) sobre la superficie ocular de los conejos. A continuación, se forzó el parpadeo manual de los conejos en dos ocasiones consecutivas y las medidas se tomaron por triplicado con un cronómetro. El examen con lámpara de hendidura se realizó con un modelo VX75 (Luneau Technology; Chartres, España) y, además de evaluar la presencia de efectos secundarios indeseados y medir el tiempo de rotura lagrimal, se gradaron los signos de tinción corneal e hiperemia conjuntival mediante la escala de Efron (285), que clasifica la severidad de los signos como: normal (0), leve (1), media (2), moderada (3) y severa (4). La tinción corneal se cuantificó después de medir el tiempo de rotura lagrimal con la fluoresceína sódica. 117 RESULTADOS Efectos secundarios indeseados En la Tabla 4 se detalla la presencia de ulceración, neovascularización y cicatrización en la córnea en función de la concentración de BAC y el número de instilaciones, mientras que en la Figura 12 se muestra una imagen representativa tanto de la úlcera como de la cicatrización corneal producida en los conejos. Todos los efectos secundarios indeseados se manifestaron en primer lugar tras 10 instilaciones de BAC al 0.3% y, posteriormente, tras 15 instilaciones de BAC al 0.2%. Tabla 4. Resultados del estudio piloto relativos a la presencia de efectos secundarios indeseados en la córnea en términos de ulceración, neovascularización y cicatrización tras la instilación de solución salina (control) y las diferentes concentraciones de cloruro de benzalconio (0.1%, 0.2% y 0.3%). Los signos positivo y negativo indican la presencia o ausencia de estos signos respectivamente. SIGNO GRUPO NÚMERO DE INSTILACIONES 5 10 15 20 Ulceración Control - - - - BAC al 0.1% - - - - BAC al 0.2% - - + + BAC al 0.3% - + + + Neovascularización Control - - - - BAC al 0.1% - - - - BAC al 0.2% - - + + BAC al 0.3% - + + + Cicatrización Control - - - - BAC al 0.1% - - - - BAC al 0.2% - - + + BAC al 0.3% - + + + BAC: cloruro de benzalconio. 118 Figura 12. Imagen representativa de una úlcera corneal con cicatrización producida por la instilación tópica de cloruro de benzalconio al 0.2% y 0.3% después de 15 y 10 instilaciones respectivamente. Se observa la falta de transparencia debido a la úlcera mediante la técnica de iluminación indirecta con lámpara de hendidura. Medidas sobre la superficie ocular La Tabla 5 muestra los valores de todos las variables bajo estudio antes y tras la instilación de cada uno de los tratamientos durante los 12 días de experimentación, incluyendo el período de lavado o wash out. La Figura 13 muestra el efecto normalizado sobre la secreción lagrimal de los diferentes tratamientos, donde se puede observar que la instilación de todas las concentraciones de BAC (0.1%, 0.2% y 0.3%) aumentó aproximadamente al doble la secreción lagrimal de los conejos en cada uno de los días de evaluación, excepto tras el período de wash out, que redujo ligeramente el volumen lagrimal alcanzado tras 10 instilaciones. 119 Tabla 5. Valores de todas las variables bajo estudio antes (PRE) y tras 5, 10, 15 y 20 instilaciones, incluyendo el período de lavado o wash out, de solución salina (control) y cloruro de benzalconio al 0.1%, 0.2% y 0.3%. VARIABLE GRUPO MEDIA ± DE PRE 5 INST 10 INST WO 15 INST 20 INST Secreción lagrimal (μL) Control 12.88 ± 3.91 12.88 ± 5.06 14.00 ± 3.25 11.63 ± 3.82 12.13 ± 3.80 14.30 ± 4.36 BAC al 0.1% 8.75 ± 3.30 14.75 ± 2.22 17.00 ± 7.53 14.00 ± 2.16 16.50 ± 4.66 16.75 ± 4.93 BAC al 0.2% 10.50 ± 5.32 20.50 ± 4.44 19.50 ± 6.56 16.25 ± 7.27 23.75 ± 6.85 18.00 ± 3.74 BAC al 0.3% 10.25 ± 1.89 18.00 ± 2.45 19.50 ± 2.08 12.25 ± 6.85 20.75 ± 4.57 19.75 ± 8.54 Tiempo de rotura lagrimal (s) Control 5.71 ± 1.88 6.04 ± 1.42 4.46 ± 0.84 4.58 ± 1.43 5.42 ± 1.96 4.96 ± 0.82 BAC al 0.1% 5.75 ± 1.14 3.50 ± 1.14 2.84 ± 0.19 3.34 ± 1.46 3.33 ± 0.86 2.67 ± 0.72 BAC al 0.2% 6.83 ± 2.08 6.17 ± 2.44 2.42 ± 0.63 3.42 ± 0.50 2.34 ± 0.39 1.00 ± 0.00 BAC al 0.3% 7.42 ± 3.98 2.58 ± 0.42 2.08 ± 1.07 1.59 ± 0.79 1.17 ± 0.23 1.00 ± 0.00 Tinción corneal (puntuación) Control 1.00 ± 0.75 1.13 ± 1.25 1.50 ± 0.93 1.25 ± 1.04 1.50 ± 0.97 1.50 ± 1.20 BAC al 0.1% 1.50 ± 0.58 2.75 ± 0.50 2.75 ± 0.50 2.00 ± 0.82 1.75 ± 0.50 2.50 ± 0.58 BAC al 0.2% 1.50 ± 0.58 3.00 ± 0.00 4.00 ± 0.00 2.75 ± 0.50 3.50 ± 0.58 4.00 ± 0.00 BAC al 0.3% 0.50 ± 0.58 3.75 ± 0.50 4.00 ± 0.00 4.00 ± 0.00 4.00 ± 0.00 4.00 ± 0.00 Hiperemia conjuntival (puntuación) Control 0.75 ± 0.89 0.00 ± 0.00 0.13 ± 0.35 0.13 ± 0.35 0.13 ± 0.35 0.25 ± 0.70 BAC al 0.1% 0.00 ± 0.00 1.75 ± 0.96 1.50 ± 0.58 0.00 ± 0.00 0.50 ± 0.58 2.00 ± 0.00 BAC al 0.2% 0.00 ± 0.00 2.75 ± 0.50 3.25 ± 0.50 1.00 ± 0.00 2.75 ± 0.50 2.50 ± 0.58 BAC al 0.3% 0.00 ± 0.00 3.00 ± 0.00 4.00 ± 0.00 1.50 ± 0.58 3.25 ± 0.50 4.00 ± 0.00 BAC: cloruro de benzalconio, INST: instilaciones, WO: wash out. 120 Figura 13. Efecto normalizado sobre la secreción lagrimal de 5, 10, 15 y 20 instilaciones (INST) de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.1% (A), 0.2% (B) y 0.3% (C), incluyendo el período de lavado o wash out (WO). Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. 0 40 80 120 160 200 240 280 320 PRE 5 INST 10 INST WO 15 INST 20 INST SE C R EC IÓ N L A G R IM A L N O R M A LI ZA D A ( % ) BAC 0.1% CONTROL 0 40 80 120 160 200 240 280 320 PRE 5 INST 10 INST WO 15 INST 20 INST SE C R EC IÓ N L A G R IM A L N O R M A LI ZA D A ( % ) BAC 0.2% CONTROL 0 40 80 120 160 200 240 280 320 PRE 5 INST 10 INST WO 15 INST 20 INST SE C R EC IÓ N L A G R IM A L N O R M A LI ZA D A ( % ) BAC 0.3% CONTROL A B C 121 Por otro lado, la Figura 14 muestra el efecto normalizado sobre el tiempo de rotura lagrimal de los diferentes tratamientos. El BAC al 0.1% disminuyó dicho tiempo hasta estabilizarse después de 10 instilaciones. Sin embargo, las concentraciones más altas de BAC (0.2% y 0.3%) disminuyeron progresivamente el tiempo de rotura lagrimal hasta que, tras 20 instilaciones, el tiempo de rotura fue mínimo (Tabla 5). El efecto sobre la tinción corneal de los diferentes tratamientos se muestra en la Figura 15, en la que se observa como la instilación de BAC al 0.2% y 0.3% alcanzó la máxima severidad tras 10 instilaciones, a diferencia del BAC al 0.1%, que indujo menor grado de tinción corneal incluso después de 20 instilaciones. Además, el período de wash out produjo cierta recuperación de la tinción corneal para las concentraciones de BAC al 0.1% y 0.2%. Por último, la Figura 16 muestra el efecto sobre la hiperemia conjuntival de los diferentes tratamientos. La severidad de la hiperemia conjuntival estuvo directamente relacionada con la concentración de BAC en cada uno de los días de evaluación. Además, de nuevo el período de wash out redujo el grado de severidad para todas las concentraciones de BAC. 122 Figura 14. Efecto normalizado sobre el tiempo de rotura lagrimal de 5, 10, 15 y 20 instilaciones (INST) de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.1% (A), 0.2% (B) y 0.3% (C), incluyendo el período de lavado o wash out (WO). Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. 0 20 40 60 80 100 120 140 PRE 5 INST 10 INST WO 15 INST 20 INST TI EM P O D E R O TU R A L A G R IM A L N O R M A LI ZA D O ( % ) BAC 0.1% CONTROL 0 20 40 60 80 100 120 140 PRE 5 INST 10 INST WO 15 INST 20 INST TI EM P O D E R O TU R A L A G R IM A L N O R M A LI ZA D O ( % ) BAC 0.2% CONTROL 0 20 40 60 80 100 120 140 PRE 5 INST 10 INST WO 15 INST 20 INST TI EM P O D E R O TU R A L A G R IM A L N O R M A LI ZA D O ( % ) BAC 0.3% CONTROL A B C 123 Figura 15. Variación de la tinción corneal tras 5, 10, 15 y 20 instilaciones (INST) de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.1% (A), 0.2% (B) y 0.3% (C), incluyendo el período de lavado o wash out (WO). Los valores positivos y negativos representan un deterioro o una mejora respecto a las medidas basales, respectivamente. -1 0 1 2 3 4 PRE 5 INST 10 INST WO 15 INST 20 INST V A R IA C IÓ N D E LA T IN C IÓ N C O R N EA L (P U N TU A C IÓ N ) BAC 0.1% CONTROL -1 0 1 2 3 4 PRE 5 INST 10 INST WO 15 INST 20 INST V A R IA C IÓ N D E LA T IN C IÓ N C O R N EA L (P U N TU A C IÓ N ) BAC 0.2% CONTROL -1 0 1 2 3 4 PRE 5 INST 10 INST WO 15 INST 20 INST V A R IA C IÓ N D E LA T IN C IÓ N C O R N EA L (P U N TU A C IÓ N ) BAC 0.3% CONTROL A B C 124 Figura 16. Variación de la hiperemia conjuntival tras 5, 10, 15 y 20 instilaciones (INST) de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.1% (A), 0.2% (B) y 0.3% (C), incluyendo el período de lavado o wash out (WO). Los valores positivos y negativos representan un deterioro o una mejora respecto a las medidas basales, respectivamente. -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 PRE 5 INST 10 INST WO 15 INST 20 INST V A R IA C IÓ N D E LA H IP ER EM IA C O N JU N TI V A L (P U N TU A C IÓ N ) BAC 0.1% CONTROL -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 PRE 5 INST 10 INST WO 15 INST 20 INST V A R IA C IÓ N D E LA H IP ER EM IA C O N JU N TI V A L (P U N TU A C IÓ N ) BAC 0.2% CONTROL -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 PRE 5 INST 10 INST WO 15 INST 20 INST V A R IA C IÓ N D E LA H IP ER EM IA C O N JU N TI V A L (P U N TU A C IÓ N ) BAC 0.3% CONTROL A B C 125 DISCUSIÓN El estudio piloto actual se centró en la elección de la concentración de BAC y los días de instilación necesarios para reducir los días de experimentación del modelo original desarrollado por Xiong et al. (264), quienes establecieron 14 días de instilación de BAC al 0.1% para inducir el ojo seco en conejos. En este sentido, se decidió evaluar concentraciones de BAC más altas (0.2% y 0.3%) para comprobar cuántos días se necesitaban para inducir algunos signos del ojo seco bajo condiciones de seguridad, es decir, sin producir efectos secundarios indeseados sobre la superficie ocular asociados a la toxicidad del BAC. En términos de seguridad, que fue el criterio principal para seleccionar la dosis y la pauta de instilación del BAC, todos los conejos que recibieron la instilación tópica de BAC al 0.2% y 0.3% mostraron ulceración, cicatrización y neovascularización en la córnea tras 15 y 10 instilaciones, respectivamente. Teniendo en cuenta que la toxicidad del BAC al 0.3% fue mucho mayor que la del BAC al 0.2% y que el deterioro del tiempo de rotura lagrimal y la tinción corneal fue similar tras 10 instilaciones de BAC al 0.2% y 5 instilaciones de BAC al 0.3% (ver Tabla 5), condiciones en las que no aparecieron efectos secundarios indeseados, se decidió elegir la instilación de BAC al 0.2% durante 5 días consecutivos. Por otro lado, cabe destacar que la secreción lagrimal no disminuyó tras la instilación de las diferentes concentraciones de BAC (ver Figura 13), al contrario de lo que cabría esperar en la forma acuodeficiente del ojo seco (71). Esta hipersecreción lagrimal se asoció a la irritación que produce el BAC sobre la superficie ocular (265, 266), que, en contacto con la tira de Schirmer, produciría dicha secreción refleja. Por esta razón, en el estudio final de la Fase II se midió la secreción lagrimal tanto sin 126 anestesia como con anestesia tópica para evitar la secreción lagrimal refleja y reproducir la forma acuodeficiente del ojo seco. La principal limitación del estudio piloto actual fue el reducido número de conejos que se utilizó en cada grupo (n = 2), lo que no permitió hacer un contraste de hipótesis comparando las variables cuantitativas entre los diferentes grupos. No obstante, ya que fue un estudio piloto y que la validación del método se hizo en la Fase II con una muestra mayor y más variables analizadas, no se consideró justificada la utilización de más conejos en esta primera fase. En conclusión, se seleccionó una concentración de BAC al 0.2% y un total de 2 instilaciones diarias durante 5 días consecutivos para optimizar el modelo de ojo seco en conejos de Xiong et al. (264), habiéndose validado posteriormente este método en la Fase II. 127 FASE II ESTUDIO FINAL 128 129 INTRODUCCIÓN Una vez seleccionada la concentración de BAC al 0.2% y establecida la pauta de instilación en 2 instilaciones diarias durante 5 días consecutivos en el estudio piloto de la Fase I, el objetivo de este estudio final fue validar la optimización del modelo original de ojo seco en conejos inducido por la instilación tópica de BAC propuesto por Xiong et al. (264), quienes establecieron una pauta de instilación de BAC al 0.1% durante 14 días. Para la validación del modelo, se evaluó la presencia de efectos secundarios indeseados y se tomaron medidas de la función de la lágrima, así como del daño y la inflamación de la superficie ocular. El fin último de este estudio dentro de la presente tesis doctoral fue la utilización de este modelo de ojo seco para medir la concentración de fosfato libre en la lágrima mediante un método colorimétrico basado en el verde de malaquita (Capítulo IV), además de evaluar el efecto de la lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% (Capítulo VI). 130 MATERIAL Y MÉTODOS Diseño del estudio Se hizo un estudio experimental, prospectivo y aleatorizado de acuerdo con la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO, del inglés Association for Research in Vision and Ophthamology) para el uso de animales en investigación y la Directiva 2010/63/EU del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. Todas las medidas se hicieron antes (PRE) y después (POST) de la instilación tópica de solución salina (Avizor; Madrid, Spain) como control negativo y BAC al 0.2% (Merck; Darmstadt, Alemania). Se hicieron un total de 2 instilaciones de 35 μL por día durante 5 días consecutivos, de lunes a viernes, siendo una de ellas por la mañana (10:00) y otra por la tarde (18:00). El último día, sólo se hizo una instilación por la mañana y las medidas se tomaron 1 h después de ésta. Por tanto, se realizaron un total de 9 instilaciones por ojo en cada conejo. La concentración de BAC y el número de días de instilación se seleccionaron en base a los resultados del estudio piloto previo que se detalla en la Fase I de este capítulo. Todas las pruebas se hicieron sin anestesia, a excepción de la secreción lagrimal que se hizo tanto sin anestesia como con anestesia tópica. Las pruebas tuvieron el siguiente orden: osmolaridad lagrimal, secreción lagrimal sin anestesia, examen mediante lámpara de hendidura, citología conjuntival y secreción lagrimal con anestesia. La anestesia para medir la secreción lagrimal se instiló después de hacer el resto de las medidas. 131 Animales Se utilizaron un total de 10 conejos albinos de Nueva Zelanda machos, considerando ambos ojos para la experimentación (nojos = 20). Los conejos se dividieron aleatoriamente en 2 grupos: 5 conejos como controles con solución salina (nojos = 10) y 5 conejos con BAC al 0.2% (nojos = 10). Los conejos procedieron de la granja San Bernardo (Navarra, España). Antes del inicio de la experimentación, los conejos estuvieron en jaulas durante un período de 7 días para adaptarlos a las nuevas condiciones de estabulación. Su peso el primer día de experimentación estuvo entre 2.0 y 2.5 kg. Los conejos se mantuvieron estabulados durante todo el período de experimentación con libre acceso a comida y agua, teniendo unas condiciones ambientales controladas con ciclos de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad a una temperatura de 18ºC y una humedad del 30%. Medidas de la lágrima La secreción lagrimal se midió mediante el test de Schirmer (Aiesi; Nápoles, Italia) durante 5 min. La tira de papel se posicionó dentro del párpado inferior y los ojos de los conejos se cerraron durante la medida para evitar la secreción refleja. Cada milímetro mojado de la tira se corresponde con 1 μL de secreción lagrimal. Las medidas se realizaron tanto sin anestesia como con anestesia tópica. Para la anestesia tópica, se instilaron dos gotas de un colirio comercial que contenía 5 mg/mL de tetracaína clorhidrato y 0.5 mg/mL de nafazolina clorhidrato (Alcon Cusí; Barcelona, España) con una diferencia de 5 min entre ambas instilaciones. Las medidas se tomaron 5 min después de la última instilación. 132 El tiempo de rotura lagrimal se midió durante el examen con lámpara de hendidura. Para ello, se instilaron 5 μL de fluoresceína sódica comercial al 2% (Alcon Cusí) sobre la superficie ocular de los conejos. Seguidamente, se hizo parpadear manualmente a los conejos en dos ocasiones consecutivas para tomar tres medidas con un cronómetro. La osmolaridad lagrimal se midió con el dispositivo TearLab (TearLab Corporation; San Diego, California, Estados Unidos), siendo éste un osmómetro que basa su medida en el análisis de la impedancia eléctrica de 50 nL de la película lagrimal. La medida se hizo poniendo en contacto el chip del dispositivo con la región temporal del menisco lagrimal de los conejos. Todas las medidas se hicieron en una habitación bajo condiciones controladas de temperatura a 18ºC. Ambos ojos se midieron de forma consecutiva, primero el ojo derecho y después el ojo izquierdo. Examen con lámpara de hendidura El daño de la superficie ocular se evaluó utilizando una lámpara de hendidura VX75 (Luneau Technology; Chartres, Francia). La severidad de los signos de tinción corneal e hiperemia conjuntival se cuantificó mediante la escala de Efron (285), clasificando estos signos como: normal (0), leve (1), medio (2), moderado (3) y severo (4). Para medir la tinción corneal se usó la misma fluoresceína sódica que para medir el tiempo de rotura lagrimal. Adicionalmente, se evaluó la presencia de efectos secundarios indeseados en la córnea como úlcera, neovascularización y cicatrización para confirmar la seguridad de la instilación de BAC al 0.2%. 133 Citología conjuntival La citología conjuntival se hizo con el dispositivo EYEPRIM (Opia Technologies; París, Francia) siguiendo las instrucciones del fabricante. El dispositivo se puso en contacto con la conjuntiva de los conejos para recolectar tanto células epiteliales como células Goblet. Se tomaron dos citologías de la conjuntiva tarsal en cada ojo, una del cuadrante superior y otra del inferior. La citología superior se utilizó para medir tanto la densidad de células Goblet como la altura de la nube de mucina es estas células, mientras que la citología inferior se utilizó para cuantificar los niveles de ARNm de interleuquina 6 (IL-6) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction). La citología superior se fijó en etanol al 96% durante 24 h a 4ºC. Las células se tiñeron mediante la técnica de Schiff. Las muestras se sumergieron en ácido peryódico al 1% durante 10 min, seguidamente en reactivo Schiff puro durante 3 min y hematoxilina de Harris durante 20 s. Una vez teñidas, las muestras se fijaron de nuevo en etanol al 70% durante 2 min, etanol al 96% durante 4 min, etanol puro durante 4 min y xileno puro durante 9 min. Finalmente, las muestras se montaron en un portaobjetos con Entellan. Todos los reactivos fueron suministrados por la compañía Merck. El procedimiento de visualización de las muestras y la medida tanto de la densidad de células Goblet como de la altura de la nube de mucina se hizo con el programa informático LSM Image Browser (Zeiss; Oberkochen, Alemania) siguiendo los procedimientos descritos por Peral y Pintor (62). Para ello, se utilizó un microscopio confocal Axiovert 200 M (Zeiss) en el cual se utilizaron objetivos de magnificación de X20 y X40 durante todo el proceso. La hematoxilina de las muestras se excitó con un 134 láser de longitud de onda de 488 nm y la luz emitida se filtró con un filtro entre 505 y 530 nm, mientras que el ácido peryódico-Schiff se excitó con un láser de longitud de onda de 543 nm y la luz emitida se filtró con un filtro de 560 nm. El Z-stacking para visualizar las células en tres dimensiones se hizo con una pupila de 180 μm y un intervalo de corte o stack de 0.25 μm. La densidad de células Goblet (Figura 17) se cuantificó en 5 regiones diferentes de cada muestra, mientras que la altura de la nube de mucina, incluyendo el espesor celular total, se cuantificó en 15 células diferentes de cada muestra. PCR cuantitativa El objetivo de los siguientes procedimientos fue cuantificar los niveles de ARNm de IL-6 en las células conjuntivales. Las muestras se procesaron a partir de la citología conjuntival inferior, la cual fue fijada previamente en RNAlater (Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachusetts, Estados Unidos) durante 24 horas a 4ºC. Posteriormente, el RNAlater se quitó de las muestras y éstas se guardaron a -80ºC hasta su procesado. El ARN total de las muestras se aisló y purificó con los kits QIAshredder y RNeasy Mini Kit (Qiagen; Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La síntesis de la primera cadena de ADNc se hizo tomando 22 μL del RNA total mediante el kit de transcripción inversa de gran capacidad de ADNc y el primer hexamérico aleatorio (Thermo Fisher Scientific). La PCR cuantitativa se hizo por triplicado para cada muestra utilizando el ADNc, el kit Quantitect SYBR Green (Qiagen) y el primer específico de IL-6 (5´-GCCTCACAAACTTCCTGGAG-3´/5´- 135 GATGGTGTGTTCTGACCGTG-3´) mediante el sistema de PCR cuantitativa QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific). La programación de los ciclos de temperatura del sistema fue la siguiente: 15 min a 95ºC, 40 ciclos de 15 s a 94ºC, 30 s a 55ºC y 34 s a 72ºC. Se incluyeron secuencias como controles negativos en todos los experimentos. El análisis de las curvas de alta resolución de fusión confirmó la especificidad del IL-6 y descartó la presencia de dímeros de cebadores. El gen de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1) (5’-CTGGCAAAACAATGCAGACCT-3’/5’- GTCCTTTTCACCAGCAGGCTT-3’) se usó como control interno para normalizar la expresión de ARNm, una vez confirmada su estabilidad por PCR cuantitativa. La validación de la estabilidad del gen HPRT1 y el análisis de la PCR cuantitativa se hizo mediante la fórmula 2-ΔCt, una vez confirmada la eficiencia de la PCR. Los resultados de los niveles de ARNm de IL-6 se expresaron en términos de fold change, que representa el cambio proporcional de dichos niveles respecto a los niveles del gen HPRT1. Análisis estadístico El análisis estadístico se hizo con el programa informático SPSS Statistics 23 (IBM; Chicago, Illinois, Estados Unidos). La normalidad de las distribuciones se comprobó mediante el test de Shapiro-Wilk. Para comparar las medidas antes (PRE) y después (POST) de la instilación en ambos tratamientos dentro de un mismo grupo se utilizó el test de la t de Student para muestras relacionadas, en caso de distribuciones normales, y el test de los rangos con signo de Wilcoxon, en caso de 136 distribuciones no normales. Además, se comparó el efecto de ambos tratamientos (diferencia entre medidas PRE y POST) entre los distintos grupos mediante el test de la t de Student para muestras independientes, en caso de distribuciones normales, y el test de la U de Mann-Whitney, en caso de distribuciones no normales. Se estableció un nivel de significancia del 95% (P < 0.05) en todos los test estadísticos. Las variables analizadas fueron: secreción lagrimal sin anestesia, secreción lagrimal con anestesia, tiempo de rotura lagrimal, osmolaridad lagrimal, tinción corneal, hiperemia conjuntival, densidad de células Goblet, altura de la nube de mucina y niveles de ARNm de IL-6. Los resultados se muestran como media ± desviación estándar (DE). 137 RESULTADOS La instilación del BAC al 0.2% durante 5 días consecutivos no produjo efectos secundarios indeseados en la córnea como úlcera, neovascularización y cicatrización, confirmando la seguridad bajo estas condiciones de experimentación. La Figura 17 muestra el daño en la superficie ocular producido por la instilación del BAC al 0.2% en términos de tinción corneal y densidad de células Goblet. Figura 17. Imágenes representativas del daño en la superficie ocular en términos de tinción corneal (arriba) y densidad de células Goblet (abajo) antes (PRE) y después (POST) de la instilación de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.2%. Se observa un aumento en la tinción corneal y un descenso en la densidad de células Goblet (células más brillantes) tras la instilación de BAC al 0.2%. La Tabla 6 muestra los valores de todos las variables bajo estudio antes y después de la instilación de ambos tratamientos durante 5 días consecutivos, además de su comparación estadística. 138 Tabla 6. Valores de todas las variables bajo estudio antes (PRE) y después (POST) de la instilación de solución salina (control) y cloruro de benzalconio al 0.2% durante 5 días consecutivos. La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo. *P < 0.05, test de la t de Student para muestras relacionadas. ^P < 0.05, test de los rangos con signo de Wilcoxon. VARIABLE GRUPO MEDIA ± DE P-VALOR PRE POST Secreción lagrimal sin anestesia (μL) Control 11.90 ± 2.89 8.40 ± 4.12 0.032* BAC al 0.2% 9.60 ± 3.13 17.80 ± 4.69 0.008* Secreción lagrimal con anestesia (μL) Control 5.80 ± 1.03 6.00 ± 1.15 0.414 BAC al 0.2% 6.60 ± 0.52 4.60 ± 0.84 0.004^ Tiempo de rotura lagrimal (s) Control 5.03 ± 1.82 3.90 ± 1.39 0.036^ BAC al 0.2% 4.30 ± 1.15 1.27 ± 0.34 0.005^ Osmolaridad lagrimal sin anestesia (mOsm/L) Control 309.70 ± 13.66 332.80 ± 13.49 0.008* BAC al 0.2% 313.00 ± 12.75 296.10 ± 11.71 0.014* Tinción corneal (puntuación) Control 1.40 ± 0.70 1.70 ± 0.95 0.405 BAC al 0.2% 1.40 ± 0.70 4.00 ± 0.00 0.004^ Hiperemia conjuntival (puntuación) Control 0.10 ± 0.32 0.10 ± 0.32 1.000 BAC al 0.2% 0.30 ± 0.68 3.40 ± 0.52 0.004^ Densidad de células Goblet (células/mm2) Control 683.57 ± 77.63 636.19 ± 140.20 0.304 BAC al 0.2% 703.12 ± 75.76 250.89 ± 77.71 < 0.001* Altura de la nube de mucina (μm) Control 27.48 ± 0.74 26.71 ± 0.79 0.469 BAC al 0.2% 27.72 ± 0.54 15.76 ± 0.63 < 0.001* Niveles de ARNm de IL-6 (fold change) Control 0.020 ± 0.031 0.017 ± 0.008 0.770 BAC al 0.2% 0.032 ± 0.063 0.322 ± 0.252 0.002^ BAC: cloruro de benzalconio. Medidas de la lágrima La Figura 18 muestra el efecto normalizado sobre la secreción lagrimal tanto sin anestesia como con anestesia de la instilación de ambos tratamientos, además de la comparación estadística entre ambos grupos. 139 Figura 18. Efecto normalizado sobre la secreción lagrimal sin anestesia (A) y con anestesia (B) de la instilación de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.2% durante 5 días consecutivos. Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre ambos grupos. *P < 0.05, test de la t de Student para muestras independientes. En relación con la secreción lagrimal, se obtuvieron resultados diferentes sin y con anestesia tópica. En la secreción lagrimal sin anestesia, hubo un aumento 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 POST SE C R EC IÓ N L A G R IM A L SI N A N ES TE SI A N O R M A LI ZA D A ( % ) CONTROL BAC 0.2% 0 20 40 60 80 100 120 140 POST SE C R EC IÓ N L A G R IM A L C O N A N ES TE SI A N O R M A LI ZA D A ( % ) CONTROL BAC 0.2% A B * P < 0.001 * P < 0.001 140 estadísticamente significativo del 85.42 ± 22.51% tras la instilación del BAC al 0.2% en comparación con el grupo control que sufrió una disminución del 29.41 ± 14.43% (P < 0.001; comparación entre ambos grupos). Por el contrario, con anestesia, hubo una disminución estadísticamente significativa del 30.30 ± 5.33% con el BAC al 0.2% comparado con el grupo control (P < 0.001; comparación entre ambos grupos), el cual no mostró cambios estadísticos respecto a sus medidas basales. Por otro lado, la Figura 19 muestra el efecto normalizado sobre el tiempo de rotura y la osmolaridad lagrimales de la instilación de ambos tratamientos, además de la comparación estadística entre ambos grupos. En el tiempo de rotura lagrimal, hubo una disminución con ambos tratamientos, pero ésta fue mayor tras la instilación de BAC al 0.2% (70.47 ± 18.86%) en comparación con el grupo control (22.47 ± 8.01%) (P = 0.007; comparación entre ambos grupos). En el caso de la osmolaridad lagrimal, hubo una disminución estadísticamente significativa del 5.40 ± 0.21% con el BAC al 0.2% en comparación con el grupo control, que mostró un aumento del 7.46 ± 0.30% (P < 0.001; comparación entre ambos grupos). Examen con lámpara de hendidura La Figura 20 muestra el efecto sobre la tinción corneal y la hiperemia conjuntival tras la instilación de ambos tratamientos, además de la comparación estadística entre ambos grupos. Estos valores no se normalizaron en porcentaje al ser variables discretas. 141 Figura 19. Efecto normalizado sobre el tiempo de rotura lagrimal (A) y la osmolaridad lagrimal (B) de la instilación de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.2% durante 5 días consecutivos. Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre ambos grupos. *P < 0.05, test de la t de Student para muestras independientes. ^P < 0.05, test de la U de Mann- Whitney. Tras la instilación del BAC al 0.2%, hubo un deterioro estadísticamente significativo en la puntuación tanto de la tinción corneal (2.60 ± 0.70) como de la 0 20 40 60 80 100 120 POST TI EM P O D E R O TU R A L A G R IM A L N O R M A LI ZA D O ( % ) CONTROL BAC 0.2% 60 80 100 120 140 POST O SM O LA R ID A D L A G R IM A L SI N A N ES TE SI A N O R M A LI ZA D A ( % ) CONTROL BAC 0.2% A B * P < 0.001 ^ P = 0.007 142 hiperemia conjuntival (3.10 ± 0.74) en comparación con el grupo control (P < 0.001; comparación entre ambos grupos), el cual no mostró diferencias estadísticamente significativas respecto a sus medidas basales. Figura 20. Variación de la tinción corneal (A) y la hiperemia conjuntival (B) tras la instilación de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.2% durante 5 días consecutivos. Los valores positivos representan un deterioro respecto a las medidas basales. La comparación estadística se hizo entre ambos grupos. *P < 0.05, test de la U de Mann-Whitney. 0 1 2 3 4 POST V A R IA C IÓ N D E LA T IN C IÓ N C O R N EA L (P U N TU A C IÓ N ) CONTROL BAC 0.2% 0 1 2 3 4 POST V A R IA C IÓ N D E LA H IP ER EM IA C O N JU N TI V A L (P U N TU A C IÓ N ) CONTROL BAC 0.2% A B * P < 0.001 * P < 0.001 143 Citología conjuntival La Figura 21 muestra el efecto normalizado sobre la densidad de células Goblet y la altura de la nube de mucina de la instilación de ambos tratamientos, además de la comparación estadística entre ambos grupos. La instilación de BAC al 0.2% produjo una disminución estadísticamente significativa tanto de la densidad de células Goblet (64.32 ± 19.92%) como de la altura de la nube de mucina (43.15 ± 1.72%) en comparación con el grupo control (P < 0.001; comparación entre ambos grupos), en donde no hubo diferencias estadísticamente significativas respecto a sus medidas basales. PCR cuantitativa La Figura 22 muestra el efecto sobre los niveles de ARNm de IL-6 en las células conjuntivales tras la instilación de ambos tratamientos, además de la comparación estadística entre ambos grupos. Previamente, los resultados se normalizaron respecto a la señal del gen HPRT1 como control interno (Tabla 6). En los niveles de ARNm de IL-6, hubo un aumento estadísticamente significativo de 0.322 ± 0.252 veces (fold change) tras la instilación del BAC al 0.2% respecto a sus niveles basales (P = 0.002), mientras que el grupo control no mostró cambios. Comparando el efecto entre ambos tratamientos, la instilación de BAC al 0.2% produjo un aumento de 0.293 ± 0.263 en el fold change en comparación al grupo control (P = 0.002; comparación entre ambos grupos). 144 Figura 21. Efecto normalizado sobre la densidad de células Goblet (A) y la altura de la nube de mucina (B) de la instilación de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.2% durante 5 días consecutivos. Los valores inferiores al 100% representan una disminución respecto a las medidas basales. La comparación estadística se hizo entre ambos grupos. *P < 0.05, test de la t de Student para muestras independientes. 0 20 40 60 80 100 120 POST D EN SI D A D D E C ÉL U LA S G O B LE T N O R M A LI ZA D A ( % ) CONTROL BAC 0.2% 20 40 60 80 100 120 POST A LT U R A D E LA N U B E D E M U C IN A N O R M A LI ZA D A ( % ) CONTROL BAC 0.2% A B * P < 0.001 * P < 0.001 145 Figura 22. Variación de los niveles de ARNm de IL-6 en las células conjuntivales tras la instilación de solución salina (control) y cloruro de benzalconio (BAC) al 0.2% durante 5 días consecutivos. Los valores positivos y negativos representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre ambos grupos. *P < 0.05, test de la U de Mann- Whitney. -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 POST V A R IA C IÓ N D E LO S N IV EL ES D E A R N m D E IL -6 ( FO LD -C H A N G E) CONTROL BAC 0.2% * P = 0.002 146 DISCUSIÓN El estudio actual mostró la posibilidad de optimizar el modelo de ojo seco en conejos inducido por la instilación tópica de BAC, reduciendo el número de días de instilación de 14 días del modelo original de Xiong et al. (264) a 5 días de este estudio. Esto se consiguió aumentando la concentración de BAC de 0.1% a 0.2%. La instilación tópica de BAC al 0.2% dos veces al día durante 5 días consecutivos deterioró algunos marcadores del ojo seco como la secreción lagrimal con anestesia, el tiempo de rotura lagrimal, la tinción corneal, la hiperemia conjuntival, la densidad de células Goblet, la altura de la nube de mucina y los niveles de ARNm de IL-6 en las células conjuntivales. Por el contrario, esta instilación produjo una aparente mejora al aumentar la secreción lagrimal sin anestesia y disminuir la osmolaridad lagrimal, lo que podría estar asociado a diferentes factores que se discuten en esta sección. En términos de seguridad, la instilación de BAC al 0.2% durante 5 días consecutivos no produjo efectos secundarios indeseados en la córnea de los conejos como úlcera, neovascularización o cicatrización. En el estudio piloto previo, se observó como la instilación de BAC al 0.2% produjo todos estos efectos secundarios durante la segunda semana de instilación, tras 15 instilaciones (ver Tabla 4). Para optimizar el modelo original, Xiong et al. (264) evaluaron concentraciones de BAC mayores de 0.1% (0.2%, 0.3%, 0.5% y 1%), diferentes frecuencias de instilación (de 1 a 4 veces al día) y diferentes días de tratamiento (de 7 a 28 días consecutivos). Estos autores sugirieron que la instilación de concentraciones de BAC mayores de 0.1% producirían ulcera corneal, acompañada de neovascularización y cicatrización, durante un período de 14 días consecutivos. Sin embargo, éstos no reportaron resultados cualitativos ni cuantitativos de los primeros 7 días de instilación, razón por 147 la cual se pensó que la instilación de BAC al 0.2% durante 5 días consecutivos podría ser una opción para reducir el número de días necesarios para inducir el modelo. Teniendo en cuenta que en el estudio actual no se encontraron efectos secundarios indeseados sobre la superficie ocular, la instilación de BAC al 0.2% durante 5 días consecutivos podría considerarse un método apropiado para inducir ojo seco a los conejos. En ratones, otros autores fueron capaces de inducir el mismo modelo de ojo seco instilando BAC al 0.2% durante 7 días consecutivos (271, 283, 284), lo que concuerda con los resultados del estudio actual. Sin embargo, debería tenerse en cuenta que la anatomía y la fisiología de los conejos no es la misma que la de los ratones, teniendo éstos últimos estructuras oculares más delgadas (286, 287). El porcentaje de éxito de este modelo de ojo seco se podría analizar teniendo en cuenta tanto su seguridad como eficacia. En cuanto a la seguridad, este porcentaje de éxito podría considerarse del 100% ya que ninguno de los conejos mostró efectos secundarios indeseados tras la instilación del BAC al 0.2%. Respecto a su eficacia, el 100% de los ojos sufrieron un deterioro de la secreción lagrimal, el tiempo de rotura lagrimal, la tinción corneal, la hiperemia conjuntival, la densidad de células Goblet y la altura de la nube de mucina, mientras que el 80% de los ojos aumento sus niveles de ARNm de IL-6 en las células conjuntivales. En cuanto a la secreción lagrimal, cabría destacar que el efecto del BAC al 0.2% fue completamente diferente sin anestesia y con anestesia. Sin anestesia, hubo un aumento en torno a un 115% en comparación con el grupo control (ver Figura 18.A), al contrario de lo que ocurre en el ojo seco acuodeficiente (71). Esta hipersecreción refleja se asoció con la propia irritación de la superficie ocular tras la instilación del BAC (265, 266). Con anestesia tópica, sí hubo una disminución de la secreción lagrimal, como cabría esperar, en torno a un 34% en comparación con el grupo control 148 (ver Figura 18.B). Los resultados con anestesia coinciden con los de diferentes estudios que encontraron una disminución similar tras la instilación de BAC al 0.1%, tanto con anestesia tópica (264) como con anestesia general (273, 275, 276, 279- 282). Por tanto, se requeriría del uso de anestesia para evaluar la secreción lagrimal en este modelo de ojo seco. Los valores de la secreción lagrimal con anestesia que reportaron los estudios referenciados variaron entre 3 y 10 μL mediante el uso del test de Schirmer durante 5 min (264, 273, 275, 276, 279, 280, 282). Como cabría esperar, el tiempo de rotura lagrimal se redujo tras la instilación de BAC al 0.2% en torno a un 48% en comparación con el grupo control (ver Figura 19.A), evaporándose la lágrima aproximadamente al segundo de parpadear (ver Tabla 6). Esta inestabilidad severa de la película lagrimal es parte de la fisiopatología del ojo seco, que deriva del daño y la inflamación de la superficie ocular (84). Tras un análisis de la literatura científica, sólo Choi et al. (280) evaluaron el tiempo de rotura lagrimal utilizando este modelo de ojo seco tras la instilación de BAC al 0.1% durante 14 días. Estos autores encontraron una reducción en torno a un 73% en comparación con su grupo control. La osmolaridad lagrimal, junto con la secreción lagrimal sin anestesia, fue la otra variable que tampoco tuvo los resultados que cabrían esperar en el ojo seco (71). En el estudio actual, la instilación de BAC al 0.2% produjo una disminución de la osmolaridad lagrimal en torno a un 13% en comparación con el grupo control (ver Figura 19.B). No se encontraron otros estudios en la literatura científica evaluando la osmolaridad lagrimal en este modelo de ojo seco en conejos. Teniendo en cuenta que la medida de la osmolaridad lagrimal se hizo sin anestesia, al igual que una de las medidas de la secreción lagrimal, podría existir una relación causal entre ambas variables al ser las únicas que no se comportaron como cabría esperar. El aumento 149 de la secreción lagrimal sin anestesia podría estar diluyendo los compuestos iónicos presentes en la lágrima, reduciendo así su concentración y, por tanto, la osmolaridad lagrimal. Esta teoría se fundamenta en la correlación negativa encontrada entre la osmolaridad y la secreción lagrimales sin anestesia (r = -0.791, P < 0.001) en la muestra total de este estudio. Apoyando esta teoría, Kim et al. (288) también encontraron una correlación negativa entre ambas variables (r = -0.625, P < 0.001) en pacientes con síndrome de Sjögren primario. Por otro lado, se observó que todos los parámetros lagrimales, excepto la secreción lagrimal sin anestesia, se deterioraron en el grupo control tras la instilación de la solución salina (ver Tabla 6). Teniendo en cuenta que la solución salina se usó como control negativo al no producir ningún efecto sobre la superficie ocular, estos cambios se asociaron a las condiciones ambientales de los conejos durante la experimentación. En relación con el daño de la superficie ocular, todos los conejos alcanzaron la máxima puntuación de tinción corneal tras la instilación de BAC al 0.2% (ver Tabla 6). Este daño corneal se acompañó de un aumento en la hiperemia conjuntival (ver Figura 20.B), y una disminución de la densidad de células Goblet en torno a un 57% en comparación con el grupo control (ver Figura 21.A). Sumado a esta disminución de la densidad, la funcionalidad de las células Goblet se vio afectada, ya que la altura de la nube de mucina disminuyó en torno a un 40% en comparación con el grupo control (ver Figura 21.B). La severidad d es estos marcadores sugiere que la instilación de BAC al 0.2% es un método rápido para inducir daño en la superficie ocular. En el modelo original de ojo seco en conejos, Xiong et al. (264) encontraron una menor tinción corneal tras la instilación de BAC al 0.1% durante 14 días consecutivos en comparación con el estudio actual, pero una mayor disminución de la densidad de 150 células Goblet. Además, como cabría esperar, otros autores también encontraron un daño en la superficie ocular similar (272-282). Algunos de estos estudios también reportaron una disminución en el espesor del epitelio corneal (273, 278, 279), sugiriéndose como otro posible marcador para evaluar en este modelo de ojo seco. Respecto a la inflamación de la superficie ocular, los niveles altos de ARNm de IL-6 en las células conjuntivales sugerirían la presencia de dicha inflamación (ver Figura 22). Una de las cosas que llama la atención es que la desviación estándar del grupo tratado con BAC al 0.2% fue similar a su valor medio. Esto se debió a que dos ojos mostraron niveles más bajos de ARNm de IL-6 después del tratamiento en comparación con sus medidas basales, aumentando la variabilidad de los resultados. Diferentes estudios también encontraron un aumento de los niveles de ARNm de IL-6 en las células conjuntivales tras la instilación de BAC al 0.1% (273, 279, 280), a la vez que un aumento en la expresión de otros biomarcadores moleculares en las células conjuntivales como IL-1β (279, 280, 282), IL-8 (273, 279) y TNF-α (273, 279, 280). Adicionalmente, otros autores reportaron una disminución de la funcionalidad de las células Goblet al encontrar niveles más bajos de ARNm de mucina MUC5AC tras la instilación de BAC (264, 278). Este modelo de ojo seco en conejos se ha utilizado para medir la eficacia de diferentes soluciones oftálmicas y sistemas de liberación controlada de fármacos para el tratamiento de dicha enfermedad (272-281). Algunos estudios administraron sus tratamientos durante el período de instilación del BAC (272, 276-278, 280), mientras que otros empezaron el tratamiento después de la instilación del BAC (273-275, 279, 281), durante el período de reversibilidad del modelo de ojo seco. Li et al. (289) estudiaron el período de reversibilidad del modelo original de Xiong et al. (264) en conejos, concluyendo que los signos de la enfermedad se mantuvieron entre 14 y 21 151 días tras la instilación del BAC al 0.1%. Considerando que ambas alternativas se han utilizado satisfactoriamente, lo lógico sería aplicar el tratamiento durante el período de instilación del BAC para ahorrar tiempo de experimentación, siendo el objetivo de esta optimización del modelo de ojo seco. Sin embargo, sería necesario comparar ambas alternativas en futuros estudios para llegar a una conclusión al respecto. El estudio actual tuvo algunas limitaciones que podrían mejorarse en futuros estudios. Teniendo en cuenta que la osmolaridad lagrimal disminuyó tras la instilación de BAC al 0.2% y su correlación negativa con la secreción lagrimal sin anestesia, también sería necesario utilizar anestesia tópica para medir la osmolaridad lagrimal en este modelo. Dado que todos los estudios encontrados en la literatura científica utilizaron anestesia, bien general o tópica (264, 273, 275, 276, 279-282), ésta podría utilizarse no sólo para medir la secreción y la osmolaridad lagrimales, sino también durante todos los procedimientos para facilitar la manipulación de los conejos. Por último, el número de días de instilación del BAC al 0.2% podría haberse reducido incluso más en caso de que se hubieran realizado mediciones diarias. En conclusión, la instilación tópica de 35 μL de BAC al 0.2% durante 5 días consecutivos, dos veces al día, fue un procedimiento adecuado para inducir un modelo de ojo seco en conejos, reduciendo el número de días de instilación en comparación con el modelo original de Xiong et al. (14 días) (264). 152 153 APLICACIONES DE LOS DINUCLEÓTIDOS PARA EL DIAGNÓSTICO DEL OJO SECO 154 155 CAPÍTULO IV MEDIDA COLORIMÉTRICA DE LA CONCENTRACIÓN DE FOSFATO LIBRE EN LA LÁGRIMA DE CONEJOS CON OJO SECO INDUCIDO 156 157 INTRODUCCIÓN El fosfato es un anión inorgánico que se encuentra libre en los sistemas biológicos (290), incluida la lágrima, en donde se ha reportado una concentración fisiológica en torno a 1.45 mM en humanos (291). Sin embargo, se desconoce el papel que desempeña en dicho fluido ocular. Además, el fosfato inorgánico forma parte de la composición de algunos colirios oftálmicos al incorporarse como excipiente en forma de tampón fosfato, cuyo exceso de concentración en estas soluciones se ha asociado con la formación de calcificaciones corneales (291-295). Por otro lado, parte del fosfato inorgánico presente en el organismo se debe a la liberación de éste en los procesos de degradación de los nucleótidos (296, 297). Teniendo en cuenta que no sólo los dinucleótidos como el Ap4A y el Ap5A tienen mayor concentración en la lágrima de pacientes con ojo seco (190, 193, 195), sino que otro nucleótido como el ATP también (115), se plantea la hipótesis de que la concentración de fosfato libre en la lágrima de pacientes con ojo seco esté elevada como consecuencia de la degradación de dichos compuestos de naturaleza nucleotídica. Como un primer acercamiento preclínico, el objetivo del estudio actual fue medir la concentración de fosfato libre en la lágrima de conejos con ojo seco inducido en comparación con conejos sanos. Para ello, el fosfato libre se cuantificó mediante un método colorimétrico desarrollado a partir de la utilización de un kit comercial basado en el verde de malaquita. 158 MATERIAL Y MÉTODOS Diseño del estudio Se hizo un estudio experimental, transversal y aleatorizado de acuerdo con la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO, del inglés Association for Research in Vision and Ophthamology) para el uso de animales en investigación y la Directiva 2010/63/EU del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. La concentración de fosfato libre en la lágrima se cuantificó en conejos con ojo seco inducido en comparación con conejos sanos. Para ello, se recogieron muestras de lágrima de conejos tanto sanos (control) como con ojo seco inducido a partir de la instilación tópica de cloruro de benzalconio (BAC) al 0.2% con el protocolo establecido en el Capítulo III (298). Tras los 5 días necesarios para inducir el modelo de ojo seco, las muestras de lágrima se recogieron 1 hora después de la última instilación de solución salina y BAC en los conejos sanos y con ojo seco, respectivamente. Para reducir el número de conejos en experimentación, en este estudio se utilizaron las muestras de lágrima de los conejos en los que se evaluó el efecto de la lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% (Capítulo VI); en concreto, de aquellos conejos sanos y con ojo seco que se utilizaron como controles, por lo que ninguno de éstos fue sometido a ningún otro tratamiento simultáneamente. 159 Animales Se utilizaron un total de 10 conejos albinos de Nueva Zelanda machos, considerando ambos ojos para el análisis estadístico (n = 20). Los conejos se dividieron aleatoriamente en 2 grupos: 5 conejos sanos como control (nojos = 10) y 5 conejos con ojo seco inducido (nojos = 10). Los conejos fueron suministrados por el animalario de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid (España). Antes del inicio de la experimentación, los conejos estuvieron en jaulas durante un período de 7 días para adaptarlos a sus nuevas condiciones de estabulación. Su peso estuvo entre 3.0 y 3.5 kg. Las condiciones de estabulación permitieron a los conejos el libre acceso a comida y agua, mientras que las condiciones ambientales estuvieron controladas bajo ciclos de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad a una temperatura de 18ºC y una humedad del 30%. Recogida y procesado de la lágrima Las muestras de lágrima se recogieron mediante el test de Schirmer (Aiesi; Nápoles, Italia) durante 5 min con anestesia tópica. La tira de papel se posicionó en el párpado inferior de los conejos y se les cerró los ojos para evitar la secreción refleja. La anestesia tópica se indujo mediante la instilación de dos gotas, espaciadas en el tiempo 5 min, de colirio comercial compuesto por 4 mg/mL de oxibuprocaína clorhidrato y 1 mg/mL de tetracaína clorhidrato (Alcon Cusí; Barcelona, España). Las muestras se recogieron 5 min después de la última instilación y se guardaron en un 160 tubo de microcentrífuga (Eppendorf; Hamburgo, Alemania) en un congelador a -80ºC hasta su procesado. El procesado de las muestras para la posterior medición del fosfato libre se hizo añadiendo 500 mL de agua ultrapura a cada una de las muestras. Después, se agitaron las muestras durante 5 min en un agitador vórtex 681/10 (Akralab; Alicante, España) para que la lágrima de la tira de Schirmer se diluyera con el agua ultrapura. Seguidamente, se retiraron las tiras de Schirmer de los tubos de microcentrífuga y las muestras se calentaron en un incubador de bloque seco AccuBlock (Labnet International; Edison, Nueva Jersey, Estados Unidos) a 98ºC durante 2 min. Tras enfriarse en un baño de hielo durante 5 min, las muestras se centrifugaron en una centrífuga Kubota 6500 (Kubota; Tokio, Japón) a 13000 rpm y 4ºC durante 5 min. Finalmente, el sobrenadante de cada muestra se traspasó a un nuevo tubo de microcentrífuga y el pellet se descartó. Medida de la concentración de fosfato libre en la lágrima La concentración de fosfato libre de las muestras procesadas se cuantificó con el kit comercial Malachite Green (Merck; Darmstadt, Alemania), que permite la medición colorimétrica del fosfato libre en una solución (Figura 23). Siguiendo las instrucciones del fabricante, se hicieron reaccionar 80 µL del sobrenadante de las muestras procesadas, las cuales se diluyeron 12 veces para trabajar dentro del rango de detección del kit, con 20 µL del reactivo de trabajo en una microplaca de 96 pocillos (Fisher Scientific; Hampton, Nuevo Hampshire, Estados Unidos). Tras 15 min de incubación en un agitador orbital Cole-Parmer SSM1 (Stuart; Stafford, Reino Unido) bajo unas condiciones de 250 rpm y temperatura ambiente, se midió la absorbancia 161 de las muestras para una longitud de onda de 660 nm con un lector de placas PowerWave XS2 (BioTek; Winooski, Vermont, Estados Unidos). Se midieron un total de tres muestras de cada ojo. En paralelo a la medida de las muestras, se hizo una curva de calibrado con concentraciones de fosfato libre de 0, 4, 8, 12, 16, 24, 32 y 40 µM (Figura 23) para calcular la concentración final de éste en la lágrima de los conejos, teniendo en cuenta el volumen lagrimal recogido en la tira de Schirmer y los factores de dilución aplicados. Figura 23. Apariencia visual del reactivo Malachite Green para diferentes concentraciones de fosfato libre en solución (arriba) y curva de calibrado obtenida a partir de la absorbancia para una longitud de onda de 660 nm (abajo). Se observa un aumento en la absorbancia directamente proporcional a la concentración de fosfato libre, acompañado de un cambio de color desde el amarillo a tonalidades verde-cian. y = 0.0093x + 0.1298 R² = 0.9642 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 A B SO R B A N C IA 6 6 0 n m CONCENTRACIÓN DE FOSFATO LIBRE (µM) 0 µM 4 µM 8 µM 12 µM 16 µM 24 µM 32 µM 40 µM 162 Análisis estadístico El análisis estadístico se hizo con el programa informático SPSS Statistics 23 (IBM; Chicago, Illinois, Estados Unidos). La normalidad de las distribuciones de la concentración de fosfato libre en la lágrima en cada grupo se confirmó mediante el test de Shapiro-Wilk, razón por la cual se seleccionó el test de la t de Student para muestras independientes para comparar las medidas entre ambos grupos. Además, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson entre la concentración de fosfato libre en la lágrima y el volumen lagrimal en la muestra total de conejos. Se estableció un nivel de significancia del 95% (P < 0.05). Los resultados se muestran como media ± desviación estándar (DE). 163 RESULTADOS La Figura 24 muestra los resultados de la concentración de fosfato libre en la lágrima, que fue mayor en los conejos con ojo seco inducido (22.50 ± 14.06 mM) en comparación con los conejos sanos (18.40 ± 9.35 mM). Sin embargo, no hubo diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos (P = 0.452). Por otro lado, tampoco existió correlación entre la concentración de fosfato libre en la lágrima y el volumen lagrimal en la muestra total (r = -0.419, P = 0.066). Los valores del volumen lagrimal, que se corresponden con la secreción lagrimal reportada en el Capítulo VI, fueron de 6.30 ± 2.26 µL en los conejos con ojo seco inducido y 6.00 ± 3.10 µL en los conejos sanos (P = 0.807; comparación entre ambos grupos). Figura 24. Resultados del cálculo de la concentración de fosfato libre en la lágrima de los conejos con ojo seco inducido y sanos. La comparación estadística se hizo entre los dos grupos, pero no hubo diferencias estadísticamente significativas (P = 0.452). 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 POST C O N C EN TR A C IÓ N D E FO SF A TO L IB R E EN L A L Á G R IM A ( m M ) SANO OJO SECO 164 DISCUSIÓN En el estudio actual se ha conseguido la detección colorimétrica del fosfato libre en la lágrima de conejos, abriéndose una posibilidad al desarrollo de un nuevo sistema diagnóstico del ojo seco. No obstante, los resultados del modelo de ojo seco, a pesar de mostrar un ligero aumento en la concentración de fosfato libre en comparación con los conejos sanos (ver Figura 24), no mostraron diferencias estadísticas que apoyen la hipótesis inicial. En esta sección se discuten algunos de los factores que podrían justificar el hecho de no haber encontrado diferencias entre ambos grupos. Al comparar los valores de la concentración de fosfato libre en la lágrima de los conejos con los reportados por Bernauer et al. (291) en humanos, se encontró que dichos valores tuvieron un orden de magnitud superior en los conejos. En comparación con el Ap4A diluido en la lágrima de conejos de la misma especie (299), el fosfato libre también presentó un orden de magnitud tres veces superior (191, 291). Sin embargo, se desconoce qué papel podría desempeñar esta cantidad de fosfato libre en la lágrima o si, por el contrario, es solamente un producto de la degradación de otros compuestos de naturaleza nucleotídica (290). En el Capítulo III, aunque no se reportaron resultados de la concentración de Ap4A en la lágrima, ésta se midió mediante cromatografía líquida de alta eficacia, habiéndose encontrado valores de 2.07 ± 1.35 µM en los conejos con ojo seco inducido y 1.73 ± 1.09 µM en los conejos sanos, diferencia entre ambos grupos que no fue estadísticamente significativa (P = 0.332), al igual que ocurrió con el fosfato libre en el presente capítulo. El hecho de que la concentración de ambas moléculas no se encontrase elevada en el modelo de ojo seco no descarta la posibilidad de que el fosfato libre sí pudiera estar elevado en la lágrima de pacientes con ojo seco, tal y 165 como ocurre con el Ap4A (190, 193, 195). De cara a un futuro estudio clínico, sería interesante comprobar si el fosfato libre en la lágrima se ve aumentado cuando se estimula la liberación de Ap4A y Ap5A a partir del estrés mecánico del epitelio corneal mediante el parpadeo (194), lo que ofrecería evidencia sobre si el fosfato libre es consecuencia directa de la degradación de dichos dinucleótidos o no. Respecto al hecho de no haber encontrado diferencias estadísticas en la concentración de fosfato libre entre los conejos sanos y con ojo seco inducido, cabe señalar que la instilación tópica de BAC al 0.2% para inducir el ojo seco no produjo cambios en la secreción lagrimal, al contrario de lo que se ha reportado previamente en el Capítulo III (298). Por tanto, el hecho de que los conejos con ojo seco inducido no presentasen menor secreción lagrimal podría ser una explicación a porqué no se encontraron diferencias entre ambos grupos, a la vez que cuestionaría la utilización de este modelo de ojo seco en su forma acuodeficiente. En relación con lo expuesto, Peral et al. (193) reportaron que la concentración de Ap4A en la lágrima de pacientes con ojo seco y baja secreción lagrimal fue mayor en comparación con la de aquellos pacientes con secreción normal. Por el contrario, en el estudio actual no se encontró una correlación inversa entre la concentración de fosfato libre y la secreción lagrimal, aunque los valores de significancia estuvieron cercanos a 0.05 (P = 0.066). La recogida de lágrima mediante el test de Schirmer durante 5 min hace que la concentración de fosfato libre dependa de la secreción lagrimal, en vista de lo cual otros métodos de recogida podrían ofrecer resultados diferentes (300). Recoger un volumen fijo de lágrima en todas las muestras con el test de Schirmer, una micropipeta u otros instrumentos haría que la concentración de fosfato dependiese del volumen lagrimal analizado, pero no de la secreción lagrimal. En el caso del fosfato libre, habría 166 que evaluar en futuros estudios los diferentes métodos de recogida lagrimal para comprobar si ofrecen resultados comparables. La principal limitación de este estudio fue que se llevó a cabo en un modelo de ojo seco en conejos, por lo que habría que extrapolarlo a la investigación clínica para estudiar las implicaciones reales del fosfato libre como biomarcador molecular. Además, el número de conejos fue reducido, limitando la comparación estadística entre ambos grupos y la interpretación de los resultados. En conclusión, fue posible la detección colorimétrica del fosfato libre en la lágrima de conejos mediante el uso de un kit comercial basado en el verde de malaquita, aunque no se encontraron diferencias en la concentración lagrimal de esta molécula entre los conejos con ojo seco inducido y los conejos sanos. No obstante, se propone al fosfato libre presente en la lágrima como un posible nuevo biomarcador molecular del ojo seco, haciéndose necesario un estudio clínico en pacientes con la enfermedad para evaluar su capacidad diagnóstica en términos de sensibilidad y especificidad. 167 APLICACIONES DE LOS DINUCLEÓTIDOS PARA EL TRATAMIENTO DEL OJO SECO 168 169 CAPÍTULO V DESARROLLO PRECLÍNICO DE UNA LÁGRIMA ARTIFICIAL BASADA EN UN EXTRACTO DE ARTEMIA SALINA QUE CONTIENE DINUCLEÓTIDOS 170 171 INTRODUCCIÓN La Artemia salina es un crustáceo braquiópodo perteneciente al orden Anostraca que habita aguas continentales saladas y destaca por la riqueza en su composición de ácidos grasos (301), proteínas (302), glucanos (303) y compuestos de naturaleza nucleotídica. Entre los nucleótidos presentes en el estadio quístico de la Artemia salina, destaca la presencia de dinucleósidos polifosfatos, principalmente de diguanosina tetrafosfato (Gp4G), además de otros compuestos de la misma naturaleza como las diguanosinas trifosfato (Gp3G) y difosfato (Gp2G), o la guanosina-adenosina tetrafosfato (Gp4A) (158, 251). El interés que despierta el Gp4G en el tratamiento del ojo seco reside en la capacidad que tienen algunos dinucleótidos para estimular la producción de lágrima, además de acelerar el proceso de cicatrización corneal (190). Sus propiedades secretagogas de los componentes acuoso (192, 207, 212, 213), mucínico (163) y lipídico (226) de la lágrima convierten a los dinucleótidos en candidatos ideales para el tratamiento del ojo seco tanto en su forma acuodeficiente como evaporativa. El mecanismo de acción de estas moléculas sobre la secreción lagrimal y la cicatrización corneal deriva de su acción agonista sobre el receptor P2Y2, que promueve la salida de cloruro y agua al medio extracelular (190, 226, 243, 304). En el grupo de investigación de la presente tesis doctoral, se ha demostrado en experimentos recientes que la instilación tópica de Gp4G estimula la secreción lagrimal (190). Por tanto, dado que se conoce que la Artemia salina tiene una concentración alta de dinucleótidos, principalmente de Gp4G (158, 251), el objetivo del estudio actual fue evaluar la eficacia de la instilación tópica de un extracto de Artemia salina sobre la secreción lagrimal, el tiempo de rotura lagrimal y la tinción corneal en conejos. 172 Además, en términos de seguridad, se evaluó la presencia de efectos secundarios indeseados asociados a dicha instilación. El fin último de este estudio fue el desarrollo preclínico de una lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina para su posterior evaluación tanto en un modelo animal de ojo seco (Capítulo VI) como en un ensayo clínico para su comercialización. 173 MATERIAL Y MÉTODOS Diseño del estudio Se hizo un estudio experimental, prospectivo a corto plazo y aleatorizado de acuerdo con la declaración de la ARVO para el uso de animales en investigación y la Directiva 2010/63/EU del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. La secreción lagrimal, el tiempo de rotura lagrimal y la tinción corneal se midieron antes (PRE) y después (POST) de la instilación tópica de las diferentes soluciones durante el mismo día. En cada conejo, se instiló aleatoriamente un extracto de Artemia salina al 2%, 4%, 6%, 8% o 10% en un ojo y solución salina como control negativo en el ojo contralateral. Se instilaron 35 μL de las soluciones cada hora sobre la superficie ocular durante 5 horas (5 instilaciones por ojo). Las medidas se hicieron sin anestesia 20 min después de la última instilación, cuando se produce el efecto máximo de los dinucleótidos sobre la secreción lagrimal (207, 213). El orden de las pruebas fue el siguiente: secreción lagrimal, tiempo de rotura lagrimal y tinción corneal. Animales Se utilizaron un total de 24 conejos albinos de Nueva Zelanda machos durante la experimentación. Los conejos se dividieron aleatoriamente en 5 grupos en función de la concentración de Artemia salina instilada: 2% (n = 4), 4% (n = 8), 6% (n = 4), 8% (n = 4) y 10% (n = 4). El grupo control se consideró como la suma de todos los ojos 174 que recibieron solución salina (n = 24). En el grupo con Artemia salina al 4% se utilizaron 8 conejos en total, ya que 4 de ellos se reservaron para duplicar la muestra de la concentración que tuvo mejores resultados. La procedencia de los conejos fue la granja San Bernardo (Navarra, España). Antes de la experimentación, los conejos estuvieron 7 días en las jaulas para adaptarlos a las nuevas condiciones de estabulación. Durante la experimentación, los conejos se mantuvieron en las mismas jaulas con libre acceso a comida y agua, bajo condiciones ambientales controladas con ciclos de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad a una temperatura de 18ºC y humedad del 30%. El primer día de experimentación, el peso de los conejos estuvo entre 2.0 y 2.5 kg. Preparación del extracto de Artemia salina El procedimiento de preparación del extracto de Artemia salina se hizo de acuerdo con el protocolo especificado en la patente WO/2018/015582 (305). El extracto original se hizo a partir de quistes de Artemia salina (Ashland; Wilmington, Delaware, Estados Unidos), los cuales se mezclaron con agua ultrapura hasta obtener una concentración final de 20 mg/mL. Este preparado se homogeneizó mecánicamente durante 30 s, dos veces consecutivas. A continuación, esta solución se sometió a un baño seco a 98ºC durante 2 min, seguido de un baño en hielo durante 5 min. Para eliminar las proteínas de la solución, ésta se centrifugó a 22000 rcf durante 4 min a 4ºC. Una vez centrifugada, se separó el sobrenadante para filtrarlo con un filtro de poro de 0.22 μm, obteniendo el extracto final. A partir de este extracto, se hicieron alícuotas para obtener las diferentes concentraciones de Artemia salina al 2%, 4%, 6%, 8% y 10%. Para preparar las alícuotas, el extracto original de Artemia 175 salina se diluyó en una solución base que contenía hidroxipropilmetilcelulosa (hipromelosa) al 0.24% como agente viscosante, electrolitos como K+, Mg2+ y Ca2+, y buffer borato. La empresa Avizor (Madrid, España) fue le encargada de preparar las alícuotas a partir del extracto de Artemia salina. La solución control fue solución salina comercial (Avizor), la cual no contenía hipromelosa. Las características fisicoquímicas de los diferentes extractos de Artemia salina se especifican en la Tabla 7. Estas soluciones tuvieron diferentes características debido a que sus parámetros dependen de la concentración de Artemia salina, que tiene una osmolalidad alta (> 1000 mOsm/Kg) y un pH de 5. Tabla 7. Características de los diferentes extractos en función de la concentración de Artemia salina. PARÁMETRO CONCENTRACIÓN DE ARTEMIA SALINA 0% 2% 4% 6% 8% 10% Osmolalidad (mOsm/Kg) 300 174 248 318 390 476 pH 7.2 7.4 7.1 7.0 6.7 6.6 Viscosidad (cP) 1 5.6 5.6 5.4 5.6 5.1 0%: solución salina (control). Los parámetros de las soluciones se midieron con los siguientes instrumentos: un osmómetro Vapro 5520 (Wescor Environmental; Logan, Utah, Estados Unidos), un viscosímetro DV2T (Brookfield Viscometers; Harlow, Reino Unido) y un pH-metro GLP 21 (Crison Instruments; Barcelona, España). 176 Medidas mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) La concentración del extracto de Artemia salina de las soluciones se midió antes de su instilación para confirmar la proporcionalidad entre éstas usando un sistema de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC, del inglés high-performance liquid chromatography) Agilent 1260 (Agilent Technologies; Santa Clara, California, Estados Unidos, considerando el Gp4G como el principio activo estándar (Figura 25). Figura 25. Cromatograma representativo de un extracto de Artemia salina al 4% que contiene diguanosina tetrafosfato (Gp4G) mediante cromatografía líquida de alta eficacia. Siguiendo el protocolo descrito por Pérez de Lara et al. (306), los niveles de Gp4G se midieron en 100 μL de los diferentes extractos de Artemia salina mediante el sistema de HPLC, que incorporó una bomba isocrática y una columna C18 de fase reversa KromaPhase (Scharlab; Barcelona, España) de 250 mm de longitud y 4.6 mm de diámetro. La fase móvil se compuso de fosfato monopotásico 10 mM, 177 tetrabutilamonio bisulfato 2 mM y acetonitrilo al 18%, habiéndose ajustado a un pH 7.5 con hidróxido de potasio 5 mM. Los compuestos de la fase móvil fueron suministrados por Nessler (Madrid, España). El flujo de la cromatografía fue de 2 mL/min y la medida del Gp4G se hizo con un detector de absorbancia para una longitud de onda de 260 nm. Medidas oculares La secreción lagrimal se midió mediante el test de Schirmer (Aiesi; Nápoles, Italia) durante 5 min. La tira de papel se colocó dentro del párpado inferior de los conejos y se cerraron los ojos de los conejos durante la medida para evitar el parpadeo reflejo. Cada milímetro mojado de la tira se corresponde con 1 μL de secreción lagrimal. Las medidas se hicieron sin anestesia. El tiempo de rotura lagrimal se midió utilizando una lámpara de hendidura VX75 (Luneau Technology; Chartres, Francia) después de instilar 5 μL de fluoresceína sódica comercial al 2% (Alcon Cusí; Barcelona, España) sobre la superficie ocular de los conejos. Se hicieron tres medidas con un cronómetro después de forzar manualmente el parpadeo de los conejos. La tinción corneal también se cuantifico durante el examen mediante lámpara de hendidura, utilizando la escala de Efron (285) que clasifica estos signos como: normal (0), leve (1), medio (2), moderado (3) y severo (4). En términos de seguridad, se utilizó la escala de Draize para evaluar el grado de irritación ocular, de acuerdo con la norma española UNE-EN ISO 10993-10:2013 (Evaluación biológica de productos sanitarios. Parte 10: Ensayos de irritación y 178 sensibilización cutánea), mediante la lámpara de hendidura VX75, considerando como efecto secundario indeseado la presencia de un resultado positivo en la opacidad corneal, la reacción del iris a luz, así como el enrojecimiento, la quemosis y la secreción conjuntivales (Tabla 8) (307). Tabla 8. Escala de Draize para evaluar el grado de irritación ocular. *Resultado positivo. **No existe una puntuación límite para considerarse resultado positivo. REACCIÓN PUNTUACIÓN C ó rn e a Grado de densidad de opacidad (área más densa) Sin opacidad 0 Área dispersa o difusa; detalles del iris claramente visibles 1* Áreas translúcidas fácilmente perceptibles; detalles del iris ligeramente oscurecidos 2* Zonas opalescentes; sin detalles de iris visibles; tamaño de la pupila apenas perceptible 3* Opaco; iris invisible 4* Área de opacidad** Sin opacidad 0 Un cuarto (o menos), pero no cero 1 Menos de una cuarta parte, menos de la mitad 2 Más de la mitad, menos de tres cuartos 3 Más de tres cuartas partes, hasta el área completa 4 Ir is Reacción a la luz Normal 0 Pliegues por encima de lo normal; congestión, hinchazón y/o inyección circuncorneal; iris con reacción a la luz 1 Sin reacción a la luz, hemorragia y/o destrozado 2* C o n ju n ti v a Enrojecimiento de la conjuntiva tarsal y bulbar Sin enrojecimiento 0 Vasos inyectados por encima de lo normal 1 Vasos más difusos y rojos; vasos no fácil de discernir individualmente 2* Enrojecimiento de vasos difuso 3* Quemosis Sin quemosis 0 Cualquier hinchazón por encima de lo normal (incluyendo la membrana nictitante) 1 Hinchazón evidente con eversión parcial de los párpados 2* Hinchazón con los párpados medio cerrados 3* Hinchazón con los párpados entre medio cerrados y completamente cerrados 4* Secreción** Normal 0 Cualquier cantidad diferente a lo normal 1 Secreción que humedece los párpados y los pelos adyacentes a los párpados 2 Secreción que humedece los párpados y un área considerable alrededor del ojo 3 179 Análisis estadístico El análisis estadístico se hizo con el programa informático SPSS Statistics 23 (IBM; Chicago, Illinois, Estados Unidos). La distribución de las variables se comprobó mediante el test de Shapiro-Wilk, dando como resultado una no normalidad de todas las distribuciones, excepto para los valores de tinción corneal del grupo control. Por esta razón se seleccionó el test de los rangos con signo de Wilcoxon para la comparación estadística entre medidas antes (PRE) y después (POST) de la instilación tópica de las diferentes soluciones. Se estableció un nivel de significancia del 95% (P < 0.05). Los variables analizadas fueron: secreción lagrimal, tiempo de rotura lagrimal y tinción corneal. Los resultados se muestran como media ± desviación estándar (DE). 180 RESULTADOS Medidas mediante HPLC La Figura 26 muestra la curva de calibrado obtenida a partir de la medición del Gp4G en los diferentes extractos de Artemia salina, la cual resultó en una tendencia lineal con un coeficiente de determinación (R2) superior a 0.99. La concentración de Gp4G en los extractos de Artemia salina al 2%, 4%, 6%, 8% y 10% fue de 5, 10, 15, 20 y 25 µM, respectivamente. Figura 26. Curva de calibrado obtenida mediante HPLC a partir de la medición del Gp4G en los extractos de Artemia salina al 2%, 4%, 6%, 8% y 10%. El área de absorbancia (eje y) representa el área del cromatograma bajo la curva del pico de Gp4G por unidad de tiempo (ver Figura 25). y = 51030x + 4923.7 R² = 0.9996 0.E+00 1.E+05 2.E+05 3.E+05 4.E+05 5.E+05 6.E+05 0 2 4 6 8 10 Á R EA D E A B SO R B A N C IA ( u V ·s ) CONCENTRACIÓN DE ARTEMIA SALINA (%) 181 Medidas oculares La Tabla 9 muestra los valores de la secreción lagrimal antes y después de la instilación de las diferentes soluciones, además de su comparación estadística, mientras que la Figura 27 muestra el efecto normalizado de estas soluciones. Hubo un aumento estadísticamente significativo del 43.88 ± 6.73% con el extracto de Artemia salina al 4% en comparación con sus medidas basales (P = 0.049). El resto de las concentraciones de Artemia salina mostraron un ligero aumento, pero sin llegar a ser estadísticamente significativo (P ≥ 0.05). Tabla 9. Valores de la secreción lagrimal antes (PRE) y después (POST) de la instilación de las diferentes concentraciones de Artemia salina: control, 2%, 4%, 6%, 8% y 10%. Las medidas se hicieron 20 min después de la última instilación. La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo. *P < 0.05, test de los rangos con signo de Wilcoxon. GRUPO SECRECIÓN LAGRIMAL (μL) P-VALOR PRE POST Control (n = 24) 15.17 ± 6.21 14.00 ± 4.61 0.903 2% (n = 4) 13.00 ± 6.32 14.00 ± 2.16 0.785 4% (n = 8) 12.25 ± 4.40 17.63 ± 3.89 0.049* 6% (n = 4) 15.00 ± 2.16 19.25 ± 5.68 0.068 8% (n = 4) 11.00 ± 2.71 14.75 ± 6.85 0.593 10% (n = 4) 17.75 ± 7.54 19.50 ± 6.66 1.000 Control: solución salina. 182 Figura 27. Efecto normalizado sobre la secreción lagrimal de la instilación de solución salina (control) y diferentes concentraciones de Artemia salina (2%, 4%, 6%, 8% y 10%) tras 20 min de la última instilación (POST). Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución, respectivamente, respecto a las medidas basales (PRE). La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo. *P < 0.05, test de los rangos con signo de Wilcoxon. Respecto al tiempo de rotura lagrimal, en la Tabla 10 se muestran sus valores antes y después de la instilación de las diferentes soluciones, además de su comparación estadística, mientras que la Figura 28 muestra el efecto normalizado de estas soluciones. Hubo disparidad en los resultados con las diferentes concentraciones de Artemia salina, sin llegar a encontrarse diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05). Por un lado, las concentraciones de Artemia salina al 4%, 6% y 8% aumentaron la estabilidad de la película lagrimal, mientras que por otro lado, las concentraciones al 2% y 10% disminuyeron esta estabilidad, al igual que ocurrió en el grupo control. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 POST SE C R EC IÓ N L A G R IM A L N O R M A LI ZA D A ( % ) CONTROL 2% 4% 6% 8% 10% * 183 Tabla 10. Valores del tiempo de rotura lagrimal antes (PRE) y después (POST) de la instilación de las diferentes concentraciones de Artemia salina: control, 2%, 4%, 6%, 8% y 10%. Las medidas se hicieron 20 min después de la última instilación. La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo, pero no hubo diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05). GRUPO TIEMPO DE ROTURA LAGRIMAL (s) P-VALOR PRE POST Control (n = 24) 4.35 ± 2.63 3.93 ± 1.23 0.795 2% (n = 4) 7.42 ± 9.07 3.25 ± 0.32 0.593 4% (n = 8) 4.33 ± 1.58 5.38 ± 1.94 0.362 6% (n = 4) 3.17 ± 0.43 4.08 ± 0.83 0.197 8% (n = 4) 4.42 ± 2.20 4.83 ± 2.14 1.000 10% (n = 4) 4.58 ± 2.33 3.83 ± 0.79 0.593 Control: solución salina. Figura 28. Efecto normalizado sobre el tiempo de rotura lagrimal de la instilación de solución salina (control) y diferentes concentraciones de Artemia salina (2%, 4%, 6%, 8% y 10%) tras 20 min de la última instilación (POST). Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución, respectivamente, respecto a las medidas basales (PRE). La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo, pero no hubo diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 POST TI EM P O D E R O TU R A L A G R IM A L N O R M A LI ZA D O ( % ) CONTROL 2% 4% 6% 8% 10% 184 En el caso de la tinción corneal, la Tabla 11 muestra los valores de ésta antes y después de la instilación de las diferentes soluciones, además de su comparación estadística, mientras que la Figura 29 muestra el efecto de estas soluciones. Hubo una mejora estadísticamente significativa en la puntuación de 0.88 ± 0.83 con el extracto de Artemia salina al 4% en comparación con sus medidas basales (P = 0.038), cuya imagen representativa se muestra en la Figura 30. Por el contrario, en el grupo control se produjo un deterioro de 0.50 ± 0.83 (P = 0.008). El resto de las concentraciones de Artemia salina no mostraron diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05). En términos de seguridad, ninguna de las concentraciones de Artemia salina presentó efectos secundarios indeseados, ya que no se obtuvo ningún resultado positivo en la escala de Draize. Tabla 11. Valores de la tinción corneal antes (PRE) y después (POST) de la instilación de las diferentes concentraciones de Artemia salina: control, 2%, 4%, 6%, 8% y 10%. Las medidas se hicieron 20 min después de la última instilación. La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo. *P < 0.05, test de los rangos con signo de Wilcoxon. GRUPO TINCIÓN CORNEAL (puntuación) P-VALOR PRE POST Control (n = 24) 1.58 ± 0.93 2.08 ± 0.88 0.008* 2% (n = 4) 1.25 ± 0.96 1.00 ± 0.82 0.705 4% (n = 8) 1.63 ± 0.52 0.75 ± 0.88 0.038* 6% (n = 4) 1.75 ± 0.96 1.25 ± 0.96 0.414 8% (n = 4) 1.25 ± 0.50 2.00 ± 0.10 0.083 10% (n = 4) 1.50 ± 0.58 2.00 ± 0.82 0.414 Control: solución salina. 185 Figura 29. Variación de la tinción corneal tras la instilación de solución salina (control) y diferentes concentraciones de Artemia salina (2%, 4%, 6%, 8% y 10%). Las medidas se hicieron 20 min después de la última instilación (POST). Los valores positivos y negativos representan un deterioro o una mejora, respectivamente, respecto a las medidas basales (PRE). La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo. *P < 0.05, **P < 0.01, test de los rangos con signo de Wilcoxon. -3 -2 -1 0 1 2 3 POST V A R IA C IÓ N D E LA T IN C IÓ N C O R N EA L (P U N TU A C IÓ N ) CONTROL 2% 4% 6% 8% 10% * ** 186 Figura 30. Imágenes representativas de la tinción corneal antes (PRE) y después (POST) de la última instilación de solución salina (control) y Artemia salina al 4%. Se observa una mejora en la tinción corneal fisiológica con la Artemia salina al 4%, siendo ésta la única concentración que produjo dicha mejora. 187 DISCUSIÓN El uso de agentes secretagogos para estimular la producción de los componentes acuoso, mucínico y lipídico de la lágrima está indicado para el tratamiento del ojo seco tanto en su forma acuodeficiente como evaporativa (136). En este sentido, la instilación tópica de dinucleósidos polifosfatos se ha demostrado como un tratamiento eficaz para mejorar los signos y síntomas del ojo seco (190). El estudio actual muestra que la instilación de un extracto de Artemia salina que contiene estos dinucleótidos es un buen método para estimular la secreción lagrimal en conejos. Este efecto se asoció a la activación de los receptores purinérgicos P2Y2 sobre la superficie ocular por parte del Gp4G (190, 308), el principal dinucleótido presente en la Artemia salina. Además, algunas concentraciones de Artemia salina también mejoraron el tiempo de rotura lagrimal y la tinción corneal, mostrando resultados prometedores para un futuro ensayo clínico. Antes de la instilación tópica de las diferentes soluciones, se cuantificó la concentración de Gp4G de éstas, confirmándose la proporcionalidad de la concentración de Artemia salina entre los diferentes extractos (ver Figura 26). En términos de secreción lagrimal, sólo la concentración de Artemia salina al 4% produjo un aumento estadísticamente significativo, alrededor de un 44% (ver Figura 27), confirmando su efecto secretagogo sobre el componente acuoso. Al contrario de lo que cabría esperar de los dinucleósidos polifosfatos, la relación dosis-respuesta de la Artemia salina, cuyo principio activo principal es el Gp4G, no alcanzó un punto de saturación (192, 230). Este hecho podría explicarse teniendo en cuenta que las propiedades fisicoquímicas de las diferentes soluciones dependen de su concentración de Artemia salina (ver Tabla 7). Por un lado, la hiperosmolalidad de los 188 extractos de Artemia salina podría haber producido un efecto citotóxico sobre las células de la superficie ocular (115, 309), afectando a la secreción lagrimal mediada por los receptores purinérgicos. Esta teoría se apoya en los resultados de la tinción corneal, que mostraron cierto grado de daño corneal con los extractos de Artemia salina al 8% y 10% (ver Figura 29). Por otro lado, la hipoosmolalidad de alguno de estos extractos podría estar produciendo un edema corneal (310), bloqueando la secreción lagrimal. Considerando ambas teorías y que la osmolalidad de la lágrima de los conejos está en torno a 300 mOsm/Kg (255), la hipoosmolalidad (174 mOsm/Kg) y la hiperosmolalidad (476 mOsm/Kg) de los extractos de Artemia salina al 2% y 10%, respectivamente, podrían justificar por qué dichos extractos no produjeron la respuesta esperada sobre la secreción lagrimal. También hay que tener en cuenta que el extracto de Artemia salina contiene, además de Gp4G, otros dinucleótidos como Gp2G, Gp3G y Gp4A (158, 251) que establecerían un equilibrio de fuerzas entre un efecto secretagogo y otro antisecretagogo en función de la concentración de cada dinucleótido, razón por la cual la hipoosmolaridad y la hiperosmolaridad de los extractos no justificaría por sí solas la falta de efecto sobre la secreción lagrimal. El efecto de la instilación de Gp4G sobre la secreción no se ha reportado en la literatura científica. Sin embargo, experimentos previos en el grupo de investigación de la presente tesis doctoral demostraron un aumento en la secreción lagrimal en torno al 40% (190), resultados que coinciden con los obtenidos con el extracto de Artemia salina al 4% en el estudio actual. A pesar de que no se utilizó un control positivo en este estudio, el efecto de otros dinucleótidos como el Ap4A y el Up4U sobre la secreción lagrimal ha sido ampliamente reportado en la literatura científica bajo condiciones de experimentación similares. En 2002, Pintor et al. (192) estudiaron el efecto de algunos diadenosina polifosfatos sobre 189 la secreción lagrimal en conejos albinos de Nueva Zelanda, mostrando un aumento alrededor de un 60% con Ap4A y de un 20% tanto con Ap5A como con Ap6A, sugiriendo que estas moléculas actúan como agonistas del receptor purinérgico P2Y2 (209). Además, Dominguez-Godinez et al. (207) encontraron un aumento en la secreción lagrimal en torno a un 100% mediante la liberación controlada de Ap4A con lentes de contacto hidrofílicas en los mismos conejos. Con la instilación de otros dinucleótidos como el Gp4G y el Up4U, también se ha sugerido que el mecanismo de acción para el aumento de la secreción lagrimal es la activación del receptor P2Y2. En cuanto al Up4U o diquafosol, que es el único dinucleótido comercializado para el tratamiento del ojo seco, éste demostró su eficacia para aumentar la producción de lágrima en términos de sus componentes acuoso (212, 213), mucínico (163) y lipídico (226) en conejos. Tras la instilación de diquafosol, Dominguez-Godinez et al. (213) mostraron un aumento en la secreción lagrimal alrededor de un 33%, mientras que Yerxa et al. (212) encontraron que este aumento fue más del triple en comparación con sus medidas basales. A pesar de que los resultados de Yerxa et al. (212) parecen mucho mejores que los del estudio actual u otros autores (192, 207, 213), debe tenerse en cuenta que ellos sólo hicieron el test de Schirmer durante 15 segundos en lugar de 2 o 5 min. Por otro lado, los resultados de algunos estudios reportaron que el efecto máximo de los dinucleósidos polifosfatos sobre la secreción lagrimal está entre 20 y 60 min después de ser instilados (207, 212, 213). Respecto al tiempo de rotura lagrimal, ninguno de los grupos mostró diferencias estadísticamente significativas (ver Figura 28), pero la tendencia fue similar al caso de la secreción lagrimal, mostrando mejores resultados las concentraciones de Artemia salina al 4% y 6%. Por el contrario, la concentración de Artemia salina al 2% mostró una severa disminución, en torno a un 55%. Este deterioro de la estabilidad de la 190 película lagrimal se asoció a un único conejo que tuvo valores basales por encima de la normalidad. Cuando se eliminó este conejo de la muestra, el extracto al 2% mostró un aumento del tiempo de rotura lagrimal del 8%, que no llegó a ser estadísticamente significativo. La limitación en el número de conejos por grupo no permitió confirmar la mejora de la estabilidad de la película lagrimal con ninguna concentración de Artemia salina. En la literatura científica, no se encontraron estudios evaluando el tiempo de rotura lagrimal tras la instilación de dinucleósidos polifosfatos en conejos. Sin embargo, Fujihara et al. (163) reportaron un aumento en la producción de mucinas, moléculas esenciales para la estabilidad de la película lagrimal (2), tras la instilación de diquafosol en un modelo de ojo seco en conejos. Además, un estudio reciente de Endo et al. (226) demostró que la activación del receptor P2Y2 también estimularía la producción de colesterol en las glándulas de Meibomio, lo que ayudaría a evitar la evaporación de la película lagrimal. Considerando estos resultados, no debería descartarse la idea de que el Gp4G presente en la Artemia salina podría mejorar la estabilidad de la película lagrimal en futuros estudios clínicos. Por último, en relación con la tinción corneal, sólo el extracto de Artemia salina al 4% mostró una mejora estadísticamente significativa (ver Figura 29). Al contrario, hubo un deterioro estadísticamente significativo en el grupo control que se asoció a factores ambientales, ya que la solución salina se considera un control negativo. A pesar de que los conejos eran sanos, mostraron cierto grado de tinción corneal que se considera fisiológica (ver Tabla 11), permitiendo así detectar la mejora con la Artemia salina al 4%. Como en el caso de la estimulación de la secreción lagrimal, esta mejora en la tinción corneal se asociaría a la activación del receptor P2Y2 en las células corneales por parte del Gp4G (190, 308). 191 En 2002, Fujihara et al. (163) encontraron que la instilación de diquafosol mejoró el daño de la superficie corneal en un modelo de ojo seco en conejos. Más tarde, en 2004, Pintor et al. (192) demostraron que la instilación de Ap4A también fue capaz de acelerar la reepitelización corneal en conejos albinos de Nueva Zelanda, mientras que experimentos posteriores del mismo grupo de investigación mostraron como la activación del receptor P2Y2 por parte del Ap4A está implicada en la aceleración de este proceso (231, 234-236). El estudio actual es el primer paso para el desarrollo preclínico de una lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina y su posterior evaluación en un modelo de ojo seco (Capítulo VI) y ensayo clínico, por lo que presenta algunas limitaciones. En primer lugar, la osmolalidad y el pH de los extractos de Artemia salina se podrían haber ajustado a los parámetros fisiológicos de la lágrima, ya que existe la posibilidad de que la hipoosmolalidad y la hiperosmolalidad de alguno de estos extractos pudiera haber producido un efecto citotóxico sobre la superficie ocular, afectando a la señalización de los receptores purinérgicos de estas células. A parte, el número reducido de conejos en cada grupo limitó el análisis estadístico, especialmente en los grupos de Artemia salina al 2%, 6%, 8% y 10% (n = 4). Esta fue la razón por la que se duplicó el número de conejos en el grupo con Artemia salina al 4% (n = 8) una vez que se comprobó que esta concentración fue la que ofreció mejores resultados. En conclusión, la instilación tópica de un extracto de Artemia salina al 4% produjo tanto la estimulación de la secreción lagrimal como una ligera mejora en la tinción corneal fisiológica. Además, ninguna de las concentraciones del extracto de Artemia salina presentó efectos secundarios indeseados sobre la superficie ocular. Por lo 192 tanto, esta solución oftálmica al 4% se presenta como un posible nuevo tratamiento para el ojo seco y la regeneración de la superficie ocular. 193 CAPÍTULO VI EFECTO DE UNA LÁGRIMA ARTIFICIAL BASADA EN UN EXTRACTO DE ARTEMIA SALINA EN UN MODELO DE OJO SECO EN CONEJOS 194 195 INTRODUCCIÓN En el capítulo anterior se reportó la seguridad y la eficacia del extracto de Artemia salina al 4% para estimular la secreción lagrimal y reducir la tinción corneal fisiológica en conejos sanos (Capítulo V) (311), habiéndose propuesto como un posible nuevo tratamiento para el ojo seco. Llegados a este punto, se ha continuado con el desarrollo de una lágrima artificial basada en dicho extracto de Artemia salina al 4% para su comercialización por parte de la empresa Avizor (Madrid, España). Bajo este contexto, el estudio actual se centra en la búsqueda de otras propiedades de dicha lágrima artificial sobre el modelo de ojo seco optimizado en el Capítulo III (298), con el fin de extrapolar los hallazgos a futuros estudios clínicos. Cabe recordar que el interés que despiertan los dinucleótidos, y por tanto también el extracto de Artemia salina, para el tratamiento del ojo seco se encuentra en la acción agonista de éstos sobre los receptores P2Y2 de la superficie ocular (190). A través de este mecanismo, la instilación tópica de Ap4A y Up4U demostró su capacidad para estimular los componentes acuoso (192, 207, 212, 213), mucínico (163) y lipídico (226) de la lágrima, así como acelerar el proceso de cicatrización corneal (163, 230, 231). Además, desde una perspectiva clínica, la literatura científica respalda la seguridad y eficacia de la forma comercial del Up4U, el diquafosol, para el tratamiento de pacientes con ojo seco (210, 220). Acerca del extracto de Artemia salina, cuyo componente nucleotídico principal es el Gp4G (158, 251), se desconoce la capacidad de dicho extracto para estimular la secreción mucínica o si presenta propiedades antiinflamatorias que pudiesen ayudar al tratamiento del ojo seco. 196 Por tanto, el objetivo del estudio actual fue evaluar el efecto de la lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% sobre la función de la lágrima y tanto el daño como la inflamación de la superficie ocular en un modelo de ojo seco en conejos. Para ello, el ojo seco se indujo mediante la instilación tópica de BAC al 0.2% dos veces al día durante 5 días consecutivos (Capítulo III) (298), mientras que el efecto de la lágrima artificial se comparó con el de la solución salina y la hipromelosa al 0.24%, que es el agente viscosante de dicha lágrima artificial, como controles. 197 MATERIAL Y MÉTODOS Diseño del estudio Se hizo un estudio experimental, prospectivo y aleatorizado de acuerdo con la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO, del inglés Association for Research in Vision and Ophthamology) para el uso de animales en investigación y la Directiva 2010/63/EU del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. Todas las pruebas se hicieron antes (PRE) y después (POST) de la instilación tópica de los diferentes tratamientos: solución salina como control negativo (grupo sano), BAC al 0.2% + solución salina (grupo ojo seco), BAC al 0.2% + hipromelosa al 0.24% (grupo ojo seco + HPMC) y BAC al 0.2% + Artemia salina (grupo ojo seco + Artemia). Para el BAC al 0.2%, se hicieron un total de 2 instilaciones de 35 µL cada día (a las 10:00 h y 18:00 h) durante 5 días consecutivos, excepto el último día en el que sólo se realizó la primera instilación. Tanto para la hipromelosa al 0.24% como para la Artemia salina, se hicieron un total de 3 instilaciones de 35 µL cada día (a las 12:00 h, 14:00 h y 16:00 h). En total, se realizaron 9 instilaciones de BAC al 0.2% o solución salina por ojo en cada conejo y 15 instilaciones de hipromelosa al 0.24%, Artemia salina o solución salina. La solución salina fue provista por Avizor (Madrid, España) y el BAC por Merck (Darmstadt, Alemania). El último día, las pruebas se hicieron 20 min después de la última instilación a las 16:00 h, momento en el que los dinucleótidos producen el mayor efecto sobre la 198 secreción lagrimal (207, 213). El orden de las pruebas fue el siguiente: secreción lagrimal, examen con lámpara de hendidura y citología conjuntival. Animales Se utilizaron un total de 20 conejos albinos de Nueva Zelanda machos. Se establecieron 4 grupos aleatorizados: 5 conejos sanos como control negativo (nojos = 10), 5 conejos con ojo seco inducido como control positivo (nojos = 10), 5 conejos con ojo seco inducido e hipromelosa (nojos = 10) y 5 conejos con ojo seco inducido y Artemia salina (nojos = 10). Los animales fueron suministrados por el animalario de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid (España). Los conejos permanecieron en sus jaulas durante los 7 días previos a la experimentación para que se acostumbrasen a las nuevas condiciones de estabulación. El peso de los conejos estuvo entre 3.0 y 3.5 kg antes de empezar la experimentación y tuvieron libre acceso a comida y agua durante los 5 días de experimentación. Las condiciones de estabulación fueron controladas bajo ciclos de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, temperatura de 18ºC y humedad del 30%. Composición de la lágrima artificial basada en Artemia salina La lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina fue fabricada y suministrada por la empresa Avizor. La composición cualitativa de dicha lágrima artificial fue la siguiente: extracto de Artemia salina al 4% como componente activo, 199 hidroxipropilmetilcelulosa (hipromelosa) al 0.24% como agente viscosante, ácido bórico y bórax como tampón, y cloruro cálcico (CaCl2), cloruro potásico (KCl) y cloruro magnésico (MgCl2) como electrolitos. La lágrima artificial de hipromelosa al 0.24% tuvo la misma composición que la lágrima artificial basada en Artemia salina, pero sin el extracto del crustáceo. Medidas de la lágrima La secreción lagrimal se midió bajo anestesia tópica con el test de Schirmer (Aiesi; Nápoles, Italia) durante 5 min. Para ello, se colocó la tira de papel en el párpado inferior y se cerró los ojos de los conejos para evitar la secreción refleja asociada al parpadeo. Cada milímetro de la tira de Schirmer se corresponde con 1 µL. La anestesia tópica se indujo tras la instilación de dos gotas, espaciadas por un tiempo de 5 min, de un colirio comercial con 4 mg/mL de oxibuprocaína clorhidrato y 1 mg/mL de tetracaína clorhidrato (Alcon Cusí; Barcelona, España). Las medidas de la secreción lagrimal se tomaron 5 min después de la última instilación de anestésico. El tiempo de rotura lagrimal se midió durante el examen con lámpara de hendidura. Tras la instilación tópica de 5 μL de fluoresceína sódica comercial al 2% (Alcon Cusí) sobre la superficie ocular, el tiempo de rotura lagrimal se midió tres veces consecutivas con un cronómetro después de forzar manualmente el parpadeo de los conejos. 200 Examen con lámpara de hendidura Los signos de daño de la superficie ocular se examinaron con una lámpara de hendidura VX75 (Luneau Technology; Chartres, Francia). La severidad de la tinción corneal y la hiperemia conjuntival se cuantificaron mediante la escala de Efron, que clasifica dicha severidad como: normal (0), leve (1), media (2), moderada (3) y severa (4). La tinción corneal se cuantificó inmediatamente después de medir el tiempo de rotura lagrimal con fluoresceína sódica. Citología conjuntival El dispositivo EYEPRIM (Opia Technologies; París, Francia) se utilizó para tomar muestras de citología conjuntival de los cuadrantes superior e inferior. La citología superior se utilizó para cuantificar tanto la densidad de células Goblet como la altura de la nube de mucina de dichas células, mientras que la citología inferior se utilizó para cuantificar los niveles de ARNm de interleucinas 1β (IL-1β) y 6 (IL-6), y metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9) en las células conjuntivales mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction). La citología superior se fijó en etanol al 96% a 4ºC durante 24 h para, posteriormente, teñir las células epiteliales y Goblet mediante la técnica de Schiff. Para ello, se sumergieron las muestras en ácido peryódico al 1% durante 10 min, seguido de reactivo Schiff puro durante 3 min y hematoxilina de Harris durante 20 s. Finalmente, las muestras se fijaron en etanol al 70% durante 2 min, etanol al 96% durante 4 min, etanol puro durante 4 min y xileno puro durante 9 min, para acabar 201 montando las muestras en un portaobjetos con Entellan. Todos los compuestos fueron suministrados por la empresa Merck. La visualización de las muestras y la toma de imágenes para su posterior análisis se hizo con el sistema de microscopía confocal FV1200 (Olympus; Tokio, Japón), mientras que las imágenes se analizaron con el programa informático ImageJ (National Institutes of Health; Bethesda, Maryland, Estados Unidos), en base a los procedimientos de Peral y Pintor (62). Las muestras se excitaron con un láser de longitud de onda de 559 nm y la emisión de luz se filtró entre 580 y 620 nm. El objetivo de magnificación de X20 se utilizó para capturar las imágenes destinadas a cuantificar la densidad de células Goblet y el objetivo de X40 para hacer el Z-stacking con el fin de cuantificar la altura de la nube de mucina. El Z-stacking para visualizar la nube de mucina en tres dimensiones se hizo con una pupila de 180 μm y un intervalo de corte o stack de 0.25 μm. La densidad de células Goblet se cuantificó en 5 regiones diferentes de cada muestra y la altura de la nube de mucina, incluyendo el espesor de las células de Goblet, se cuantificó en 15 de estas células para cada muestra. PCR cuantitativa Como se dijo anteriormente, la citología conjuntival inferior se utilizó para cuantificar los niveles de ARNm de IL-1β, IL-6 y MMP9 en las células conjuntivales, razón por la cual, una vez recogidas, se fijaron en RNAlater (Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachusetts, Estados Unidos) a 4ºC durante 24 h. Una vez pasado este tiempo, el RNAlater se eliminó de las muestras y éstas se conservaron a -80ºC hasta 202 ser procesadas. Para aislar y purificar el RNA de las muestras se utilizaron los kits comerciales QIAshredder y RNeasy Mini Kit (Qiagen; Hilden, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la síntesis de la primera cadena de ADNc se tomaron 22 μL del RNA extraído de las muestras mediante el kit de transcripción inversa de gran capacidad de ADNc y el primer hexamérico aleatorio (Thermo Fisher Scientific). La PCR cuantitativo se hizo con el sistema QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific) mediante un triplicado de las muestras utilizando el ADNc, el kit comercial Quantitect SYBR Green (Qiagen) y los primers específicos de IL-1β, IL-6 y MMP9 (Tabla 12). El gen de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1) se usó como control interno para normalizar la expresión de ARNm de IL-1β, IL-6 y MMP9. La programación de la PCR cuantitativa fue la siguiente: 15 min a 95ºC, 40 ciclos de 15 s a 94ºC, 30 s a 55ºC y 34 s a 72ºC. Además, se incluyeron controles negativos en todas las mediciones para confirmar que no hubiese contaminación en las muestras. Tabla 12. Secuencias de los diferentes primers específicos analizados mediante PCR cuantitativa. PRIMER SECUENCIA (forward / reverse) HPRT1 5’-CTGGCAAAACAATGCAGACCT-3’/5’-GTCCTTTTCACCAGCAGGCTT-3’ IL-1β 5’-TTGAAGAAGAACCCGTCCTCTG-3’/5’-CTCATACGTGCCAGACAACACC-3’ IL-6 5’-GCCTCACAAACTTCCTGGAG-3’/ 5’-GATGGTGTGTTCTGACCGTG-3’ MMP9 5’-AAGACGCAGACGGTGGATTC-3’/5’-ACTCACACGCCAGAAGAAGC-3’ HPRT1: hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa 1, IL-1β: interleucina 1β, IL-6: interleucina 6, MMP9: metaloproteinasa de matriz 9. El análisis de las curvas de alta resolución confirmó la especificidad de los primers de IL-1β, IL-6 y MMP9 y descartó la presencia de dímeros cebadores. La 203 estabilidad del gen HPRT1 y el análisis de los datos de la PCR cuantitativa se realizaron mediante la fórmula 2-ΔCt. Los resultados de los niveles de ARNm de IL-1β, IL-6 y MMP9 se expresaron en términos de fold change, que representa el cambio proporcional de dichos niveles respecto a los niveles del gen HPRT1. Análisis estadístico El análisis estadístico se hizo con el programa informático SPSS Statistics 23 (IBM; Chicago, Illinois, Estados Unidos). La normalidad de las diferentes variables se comprobó con el test de Shapiro-Wilk. La comparación de las medidas antes (PRE) y después (POST) de la instilación de los diferentes tratamientos dentro de un mismo grupo se hizo con el test de la t de Student para muestras relacionadas (distribuciones normales) o el test de los rangos con signo de Wilcoxon (distribuciones no normales). Además, la comparación del efecto de los diferentes tratamientos (diferencial entre las medidas PRE y POST) entre los diferentes grupos se hizo con el test de la t de Student para muestras independientes (distribuciones normales) o el test de la U de Mann- Whitney (distribuciones no normales). Se estableció un nivel de significancia del 95% (P < 0.05) en todos los test estadísticos. Las variables analizadas fueron: secreción lagrimal, tiempo de rotura lagrimal, tinción corneal, hiperemia conjuntival, densidad de células Goblet, altura de la nube de mucina y niveles de ARNm de IL-1β, IL-6 y MMP9. Los resultados se muestran como media ± desviación estándar (DE). 204 RESULTADOS La Tabla 13 recoge los valores de todas las variables bajo estudio antes (PRE) y después (POST) de la instilación de los diferentes tratamientos durante 5 días en cada grupo, además de la comparación estadística entre las medidas PRE y POST. Medidas de la lágrima La Figura 31 muestra el efecto normalizado de la instilación de los diferentes tratamientos sobre la secreción lagrimal y el tiempo de rotura lagrimal, además de la comparación estadística entre todos los grupos. En relación con la secreción lagrimal, el grupo de conejos con ojo seco sometido a tratamiento con Artemia salina fue el único que mostró un aumento estadísticamente significativo del 64.38 ± 18.41% en comparación con el resto de los grupos (P < 0.05). Los demás grupos, además de no mostrar diferencias estadísticas entre sí, tampoco sufrieron cambios respecto a sus medidas basales (P ≥ 0.05). En el tiempo de rotura lagrimal, hubo un deterioro estadísticamente significativo en los tres grupos de conejos con ojo seco inducido en comparación con el grupo de conejos sanos (P < 0.05), siendo éste del 69.13 ± 25.31% en el grupo con ojo seco, 67.78 ± 36.16% en el grupo con ojo seco + hipromelosa y 37.73 ± 14.85% en el grupo con ojo seco + Artemia salina. Como se observa, el tratamiento con Artemia salina en los conejos con ojo seco produjo una mejora del tiempo de rotura lagrimal en comparación con el tratamiento con hipromelosa, siendo la comparación entre ambos grupos estadísticamente significativa (P = 0.001). 205 Figura 31. Efecto normalizado sobre la secreción lagrimal (A) y el tiempo de rotura lagrimal (B) de la instilación durante 5 días consecutivos de solución salina (sano), cloruro de benzalconio (BAC) + solución salina (ojo seco), BAC + hipromelosa (ojo seco + HPMC) y BAC + Artemia salina (ojo seco + Artemia). Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre todos los grupos. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, test de la t de Student para muestras independientes. 0 20 40 60 80 100 120 POST TI EM P O D E R O TU R A L A G R IM A L N O R M A LI ZA D O ( % ) SANO OJO SECO OJO SECO + HPMC OJO SECO + ARTEMIA 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 POST SE C R EC IÓ N L A G R IM A L N O R M A LI ZA D A ( % ) SANO OJO SECO OJO SECO + HPMC OJO SECO + ARTEMIA ** ** ** *** *** ** * A B 206 Tabla 13. Valores de todos las variables bajo estudio antes (PRE) y después (POST) de la instilación de los diferentes tratamientos durante 5 días consecutivos. La comparación estadística se hizo entre los valores PRE y POST dentro de cada grupo. *P < 0.05, test de la t de Student para muestras relacionadas. ^P < 0.05, test de los rangos con signo de Wilcoxon. VARIABLE GRUPO MEDIA ± DE P-VALOR PRE POST Secreción lagrimal (μL) Sano 7.00 ± 3.43 6.00 ± 3.09 0.373 Ojo seco 7.80 ± 2.15 6.30 ± 2.26 0.081 Ojo seco + HPMC 8.10 ± 2.51 7.40 ± 2.99 0.477 Ojo seco + Artemia 7.30 ± 2.71 12.00 ± 3.43 0.008^ Tiempo de rotura lagrimal (s) Sano 4.17 ± 0.65 4.10 ± 1.34 0.896 Ojo seco 5.40 ± 2.74 1.67 ± 0.61 0.005* Ojo seco + HPMC 5.17 ± 1.48 1.67 ± 0.89 0.005^ Ojo seco + Artemia 4.07 ± 1.06 2.53 ± 1.00 < 0.001* Tinción corneal (puntuación) Sano 1.90 ± 0.88 1.70 ± 1.06 0.516 Ojo seco 1.60 ± 0.84 4.00 ± 0.00 0.004* Ojo seco + HPMC 1.70 ± 0.95 3.70 ± 0.48 0.007* Ojo seco + Artemia 2.30 ± 0.67 3.00 ± 0.94 0.140 Hiperemia conjuntival (puntuación) Sano 0.00 ± 0.00 0.10 ± 0.32 0.317 Ojo seco 0.00 ± 0.00 3.40 ± 0.70 0.004* Ojo seco + HPMC 0.00 ± 0.00 3.50 ± 0.85 0.004* Ojo seco + Artemia 0.00 ± 0.00 2.90 ± 0.57 0.004* Densidad de células Goblet (células/mm2) Sano 641.17 ± 216.67 646.52 ± 263.47 0.960 Ojo seco 911.71 ± 319.88 291.47 ± 103.24 < 0.001* Ojo seco + HPMC 850.79 ± 297.06 382.86 ± 336.16 0.022* Ojo seco + Artemia 851.83 ± 248.35 578.38 ± 254.14 0.071 Altura de la nube de mucina (μm) Sano 18.41 ± 1.00 18.14 ± 1.57 0.532 Ojo seco 16.76 ± 2.06 10.75 ± 1.74 < 0.001* Ojo seco + HPMC 16.67 ± 1.21 13.95 ± 4.02 0.053 Ojo seco + Artemia 16.59 ± 1.87 15.46 ± 1.89 0.139 Niveles de ARNm de IL-1β (fold change) Sano 6.430 ± 8.572 3.466 ± 3.067 0.878 Ojo seco 7.758 ± 11.702 42.369 ± 42.889 0.009^ Ojo seco + HPMC 4.103 ± 2.772 46.116 ± 26.483 0.001* Ojo seco + Artemia 1.295 ± 1.838 12.408 ± 10.426 0.012^ Niveles de ARNm de IL-6 (fold change) Sano 0.072 ± 0.082 0.416 ± 0.457 0.028^ Ojo seco 0.046 ± 0.036 0.338 ± 0.401 0.017^ Ojo seco + HPMC 0.051 ± 0.086 0.230 ± 0.195 0.009^ Ojo seco + Artemia 0.026 ± 0.033 0.175 ± 0.132 0.025^ Niveles de ARNm de MMP9 (fold change) Sano 0.028 ± 0.034 - - Ojo seco 0.042 ± 0.059 0.314 ± 0.266 0.009^ Ojo seco + HPMC 0.030 ± 0.017 0.525 ± 0.483 0.005^ Ojo seco + Artemia 0.012 ± 0.017 0.174 ± 0.176 0.012^ HPMC: hipromelosa. 207 Examen con lámpara de hendidura La Figura 32 muestra el efecto de la instilación de los diferentes tratamientos sobre la secreción lagrimal y el tiempo de rotura lagrimal, además de la comparación estadística entre todos los grupos. El efecto sobre estas variables no se normalizó en porcentaje respecto a las medidas basales porque son variables discretas. Respecto a la tinción corneal, los grupos de conejos tanto sanos como con ojo seco sometidos a tratamiento con Artemia salina mostraron una mejora estadísticamente significativa respecto a los conejos con ojo seco inducido utilizados como controles positivos y bajo la instilación de hipromelosa (P < 0.05), habiendo sufrido estos dos últimos grupos un deterioro de 2.40 ± 0.84 y 2.00 ± 1.05, respectivamente. Por otro lado, a pesar de que los conejos con ojo seco tratados con Artemia salina presentaron un deterioro de la tinción corneal respecto a sus medidas basales, no hubo diferencias estadísticas en comparación con los conejos sanos (P = 0.109). En cuanto a la hiperemia conjuntival, se encontró un deterioro estadísticamente significativo en los tres grupos de conejos con ojo seco inducido en comparación con los conejos sanos (P < 0.05), siendo éste de 3.40 ± 0.70 en el grupo con ojo seco, 3.50 ± 0.85 en el grupo con ojo seco + hipromelosa y 2.90 ± 0.57 en el grupo con ojo seco + Artemia salina. Además, los tratamientos con hipromelosa y Artemia salina no tuvieron efecto sobre la hiperemia conjuntival, ya que no presentaron diferencias respecto al grupo de conejos con ojo seco utilizados como controles positivos (P ≥ 0.05). 208 Figura 32. Variación de la tinción corneal (A) y la hiperemia conjuntival (B) tras la instilación durante 5 días consecutivos de solución salina (sano), cloruro de benzalconio (BAC) + solución salina (ojo seco), BAC + hipromelosa (ojo seco + HPMC) y BAC + Artemia salina (ojo seco + Artemia). Los valores positivos y negativos representan un deterioro y una mejora respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre todos los grupos. **P < 0.01, ***P < 0.001, test de la t de Student para muestras independientes. ^^^P < 0.001, test de la U de Mann-Whitney. 0 1 2 3 4 5 POST V A R IA C IÓ N D E LA H IP ER EM IA C O N JU N TI V A L (P U N TU A C IÓ N ) SANO OJO SECO OJO SECO + HPMC OJO SECO + ARTEMIA -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 POST V A R IA C IÓ N D E LA T IN C IÓ N C O R N EA L (P U N TU A C IÓ N ) SANO OJO SECO OJO SECO + HPMC OJO SECO + ARTEMIA *** ^^^ ** *** *** ^^^ ^^^ B A 209 Citología conjuntival La Figura 33 muestra el efecto normalizado de la instilación de los diferentes tratamientos sobre la densidad de células Goblet y la altura de la nube de mucina, además de la comparación estadística entre todos los grupos. Adicionalmente, en la Figura 34 se muestran imágenes representativas que se utilizaron para cuantificar la densidad de células Goblet en los diferentes grupos. En relación con la densidad de células Goblet, los grupos de conejos con ojo seco utilizados como controles positivos y los sometidos a tratamiento con hipromelosa sufrieron una disminución del 68.03 ± 24.10% y 55.00 ± 48.29, respectivamente, que fue estadísticamente significativa en comparación con los conejos sanos (P < 0.05). Por otro lado, a pesar de que también hubo un deterioro en los conejos con ojo seco inducido bajo tratamiento con Artemia salina respecto a los conejos sanos, éste no fue estadísticamente significativo (P = 0.117), mostrando valores más cercanos a los del conejo sano. En la altura de la nube de mucina, de nuevo los grupos de conejos con ojo seco utilizados como controles positivos y aquellos bajo tratamiento con hipromelosa sufrieron un deterioro estadísticamente significativo del 35.81 ± 5.78% y 16.31 ± 4.70%, respectivamente, en comparación con los conejos tanto sanos como con ojo seco tratados con Artemia salina. Además, el tratamiento con Artemia salina en los conejos con ojo seco no produjo ningún efecto respecto al grupo de conejos sanos utilizado como control negativo (P = 0.329). 210 Figura 33. Efecto normalizado sobre la densidad de células Goblet (A) y la altura de la nube de mucina (B) de la instilación durante 5 días consecutivos de solución salina (sano), cloruro de benzalconio (BAC) + solución salina (ojo seco), BAC + hipromelosa (ojo seco + HPMC) y BAC + Artemia salina (ojo seco + Artemia). Los valores superiores e inferiores al 100% representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre todos los grupos. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, test de la t de Student para muestras independientes. 20 40 60 80 100 120 POST A LT U R A D E LA N U B E D E M U C IN A N O R M A LI ZA D A ( % ) SANO OJO SECO OJO SECO + HPMC OJO SECO + ARTEMIA 0 20 40 60 80 100 120 140 160 POST D EN SI D A D D E C ÉL U LA S G O B LE T N O R M A LI ZA D A ( % ) SANO OJO SECO OJO SECO + HPMC OJO SECO + ARTEMIA A B ** * *** * * *** 211 Figura 34. Imagen representativa de la densidad de células Goblet antes (PRE) y después (POST) de la instilación de los diferentes tratamientos: solución salina (sano), cloruro de benzalconio (BAC) + solución salina (ojo seco), BAC + hipromelosa (ojo seco + HPMC) y BAC + Artemia salina (ojo seco + Artemia). Se observa una disminución de la densidad de células Goblet (células más brillantes) en los tres grupos con ojo seco, pero de menor magnitud tras el tratamiento con la lágrima artificial basada en Artemia salina. PCR cuantitativa La Figura 35 muestra el efecto de la instilación de los diferentes tratamientos sobre los niveles de ARNm de IL-1β, IL-6 y MMP9, además de la comparación estadística entre todos los grupos. Previamente, los resultados se normalizaron respecto a la señal del gen HPRT1 como control interno (Tabla 13). En los niveles de IL-1β, los tres grupos de conejos con ojo seco mostraron un aumento estadísticamente significativo en comparación con el grupo de conejos sanos (P < 0.05), siendo la variación en el fold change de 34.611 ± 35.999 en el grupo con 212 ojo seco, 42.014 ± 27.068 en el grupo con ojo seco + hipromelosa y 11.114 ± 9.537 en el grupo con ojo seco + Artemia salina. Además, el tratamiento con Artemia salina produjo una disminución en la expresión de ARNm de IL-1β respecto al tratamiento con hipromelosa (P = 0.001). En relación con los niveles de IL-6, ninguno de los grupos presentó diferencias estadísticamente significativas en comparación con el resto, a pesar de que en los conejos con ojo seco tratados con hipromelosa y Artemia salina se encontraron los valores medios más bajos. Respecto a los niveles de MMP9, éstos estuvieron por debajo de los límites de detección de la PCR cuantitativa para las medidas POST en el grupo de conejos sanos. No obstante, en los conejos con ojo seco inducido, el tratamiento con Artemia salina también disminuyó significativamente la expresión de ARNm de MMP9 en comparación con la hipromelosa (P = 0.021). La variación en el fold change fue de 0.162 ± 0.165 con la Artemia salina y 0.494 ± 0.477 con la hipromelosa. 213 Figura 35. Variación de los niveles de ARNm de IL-1β (A), IL-6 (B) y MMP9 (C) en las células conjuntivales tras la instilación durante 5 días consecutivos de solución salina (sano), cloruro de benzalconio (BAC) + solución salina (ojo seco), BAC + hipromelosa (ojo seco + HPMC) y BAC + Artemia salina (ojo seco + Artemia). Los valores positivos y negativos representan un aumento o una disminución respecto a las medidas basales, respectivamente. La comparación estadística se hizo entre todos los grupos. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, test de la U de Mann-Whitney. 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 POST V A R IA C IÓ N D E LO S N IV EL ES D E A R N m D E IL -6 ( FO LD C H A N G E) SANO OJO SECO OJO SECO + HPMC OJO SECO + ARTEMIA -20 0 20 40 60 80 100 POST V A R IA C IÓ N D E LO S N IV EL ES D E A R N m D E IL -1 β (F O LD C H A N G E) SANO OJO SECO OJO SECO + HPMC OJO SECO + ARTEMIA 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 POST V A R IA C IÓ N D E LO S N IV EL ES D E A R N m D E M M P 9 ( FO LD C H A N G E) SANO OJO SECO OJO SECO + HPMC OJO SECO + ARTEMIA ** *** ** ** * A B C 214 DISCUSIÓN En el estudio actual se ha evaluado el efecto de la lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina sobre un modelo de ojo seco en conejos, habiéndose confirmado sus propiedades tanto secretagogas del componente acuoso de la lágrima como cicatrizantes a la hora de mejorar la tinción corneal, previamente reportadas en el Capítulo V (311). Además, también se han encontrado efectos beneficiosos sobre la estabilidad de la película lagrimal, la densidad de células Goblet, la cantidad de secreción mucínica de dichas células y el proceso inflamatorio. En esta sección, se discuten las implicaciones que podrían tener estos hallazgos en el tratamiento de las diferentes formas de ojo seco con la lágrima artificial de Artemia salina. Respecto a la secreción lagrimal, la instilación tópica de la lágrima artificial con Artemia salina al 4% produjo un aumento significativo del 64% en los conejos con ojo seco inducido (ver Figura 31.A), valores ligeramente superiores a los reportados en el Capítulo V (311) tras la instilación del mismo extracto en conejos sanos, que fue del 44%. No obstante, hay que tener en cuenta que en ambos estudios se encontró un aumento del volumen lagrimal recogido en torno a 4-5 µL respecto a las medidas basales. Por otro lado, el hecho de que el tratamiento con hipromelosa no mostrase efecto confirmaría que la estimulación de la secreción lagrimal se debe al propio extracto de Artemia salina. Como ya se ha comentado anteriormente, el efecto secretagogo de la lágrima artificial sobre el componente acuoso lagrimal se asocia a la acción agonista de los dinucleótidos presentes en la Artemia salina, especialmente al Gp4G, sobre el receptor purinérgico P2Y2 expresado en el epitelio conjuntival (192, 207, 212, 213). En este sentido, un estudio previo del grupo de investigación de la presente tesis doctoral encontró que la instilación de Gp4G aumentó la secreción 215 lagrimal en torno a un 40% en conejos sanos, valores ligeramente inferiores al estudio actual (64%) (190). Como se comentó en el capítulo anterior, la estimulación de la secreción lagrimal producida por los dinucleótidos ha sido ampliamente reportada en la literatura científica. Cabe destacar de nuevo que, tras la instilación tópica de Ap4A, Pintor et al. (192) mostraron un aumento en la secreción lagrimal de aproximadamente un 40% en conejos albinos de Nueva Zelanda, mientras que Dominguez-Godinez et al. (207) encontraron que la liberación controlada de Ap4A con lentes de contacto hidrofílicas aumentó dicha secreción hasta un 100% en la misma especie de conejos. Por su parte, Yerxa et al. (212) también demostraron las propiedades secretagogas del Up4U, o diquafosol en su forma comercial, sobre el componente acuoso de la lágrima, a la vez que otro estudio de Dominguez-Godinez et al. (213) reportó un aumento de la secreción lagrimal en torno a un 33% tras la instilación de Up4U en conejos (192, 207). En cuanto al modelo de ojo seco, cabe destacar que la instilación tópica de BAC al 0.2% como control positivo no disminuyó la secreción lagrimal en comparación con el grupo de conejos sanos, al contrario de lo que ocurrió en los experimentos del Capítulo III (298). Este hecho pondría en entredicho la utilización de este modelo de ojo seco para estudiar la forma acuodeficiente de la enfermedad. Al igual que antes, el tratamiento con Artemia salina mostró una mejora significativa en el tiempo de rotura lagrimal en comparación con la instilación de hipromelosa en los conejos con ojo seco (ver Figura 31.B), poniendo de manifiesto el efecto beneficioso del extracto de crustáceo sobre la estabilidad lagrimal. A pesar de que la lágrima artificial con Artemia salina no mostró diferencias respecto al grupo control positivo de conejos con ojo seco, las diferencias estuvieron cerca de la 216 significancia estadística (P = 0.061), por lo que se podría asumir cierta evidencia de mejora. Sin embargo, la comparación de las medidas POST entre ambos grupos sólo mostró un aumento en el tiempo de rotura lagrimal de menos de 1 s por parte de la Artemia salina (ver Tabla 13), lo que no se considera relevante a la hora de mejorar la severidad del ojo seco. Hasta donde se conoce, sólo el estudio realizado en el Capítulo V (311) evaluó el tiempo de rotura lagrimal tras el tratamiento con dinucleótidos en conejos, no habiéndose encontrado cambios con el extracto de Artemia salina al 4%. Por otra parte, diferentes estudios demostraron que la activación del receptor P2Y2 por parte del Up4U es responsable de la producción de mucinas y lípidos en las células de Goblet y las glándulas de Meibomio, respectivamente (162, 163, 225, 226). Teniendo en cuenta que las mucinas y los lípidos son los compuestos responsables de la estabilidad de la película lagrimal (2), no se descarta la posibilidad de que la lágrima artificial con Artemia salina ayude a mejorar dicha estabilidad en futuros estudios clínicos en base a la hipótesis de que el Gp4G presente en el crustáceo podría actuar como agonista del receptor P2Y2. El análisis mediante microscopía confocal de las citologías conjuntivales también confirmó un efecto secretagogo sobre el componente mucínico con la lágrima artificial basada en Artemia salina (ver Figura 33). En términos de densidad de células Goblet, la instilación tópica de Artemia salina no mostró diferencias respecto al tratamiento con hipromelosa y al grupo control positivo de conejos con ojo seco, pero a su vez tampoco respecto a los conejos sanos, lo que parece indicar cierto efecto protector del extracto de Artemia salina sobre la muerte celular inducida por el BAC al 0.2%. Los resultados de la altura de mucina también demostraron que la cantidad de mucina secretada a la superficie ocular por parte de las células Goblet fue mayor tras el tratamiento con Artemia salina, ya que, además de mostrar resultados similares a los 217 conejos sanos, aumentó la altura de mucina en comparación con la hipromelosa y los conejos utilizados como controles positivos del modelo de ojo seco. Por tanto, el extracto de Artemia salina serviría para preservar el número de células Goblet, que está reducido en pacientes con ojo seco (62), así como aumentar la cantidad de mucina que estas células secretan. Como se mencionó en el párrafo anterior, las propiedades secretagogas del componente mucínico de la lágrima se deben a la acción agonista de los dinucleótidos sobre el receptor P2Y2, aunque sólo se ha confirmado en el caso del Up4U (162, 163) y no con otros dinucleótidos como el Ap4A y el Gp4G. A este respecto, diferentes estudios realizados en conejos y ratas encontraron que la instilación tópica de Up4U aumentó la producción de mucinas en las células Goblet (162, 163) y la concentración de mucina MUC5AC disuelta en la lágrima (312, 313). En humanos, Shigeyasu et al. (227, 228) no reportaron un aumento en la concentración de mucinas en la lágrima de forma directa tras la instilación a corto y largo plazo de Up4U, pero sí en la concentración de ácido siálico, una molécula que se une a los terminales de las cadenas de mucinas. Además de proteger frente al daño de las células Goblet producido por el BAC al 0.2%, el tratamiento con Artemia salina ayudó a proteger el epitelio corneal al mostrar una mejora en la tinción corneal en comparación con los conejos con ojo seco bajo tratamiento con hipromelosa y utilizados como controles positivos (ver Figura 32.A). Al no existir diferencias estadísticas entre las medidas de la tinción corneal antes y después de la instilación de Artemia salina (ver Tabla 13), se podría deducir que esta lágrima artificial previno el daño del epitelio corneal. No obstante, cuando se comparan las medidas POST entre los grupos de conejos sanos y con ojo seco tratados con Artemia salina, se comprueba como realmente la severidad en los conejos sanos fue leve-media, mientras que en el grupo con Artemia salina fue 218 moderada. Las propiedades cicatrizantes del extracto de Artemia salina también se asociaron a la acción agonista del Gp4G presente en el crustáceo sobre los receptores P2Y2 localizados en el epitelio corneal, tal y como se ha confirmado empíricamente con el Ap4A y el Up4U (163, 231, 234-236). A través de este mecanismo, investigadores del grupo de investigación de la presente tesis doctoral encontraron que la instilación de Ap4A aumentó la velocidad de cicatrización corneal al favorecer la migración celular del epitelio corneal (230, 231). Adicionalmente, Fujihara et al. (163) demostraron por primera vez que la instilación de Up4U fue útil para mejorar la tinción corneal en un modelo animal de ojo seco. Por el contrario, otros diadenosina polifosfatos como el Ap3A y el Ap5A actúan como agonista del receptor P2Y6, que también se expresa en el epitelio corneal, reduciendo la velocidad de cicatrización corneal al inhibir la migración celular (231-233). En esta línea, los experimentos del Capítulo VII de la presente tesis doctoral reportaron que la instilación de la lágrima artificial basada en Artemia salina no tuvo efecto sobre la velocidad de cicatrización corneal en conejos a los que se les provocó una desepitelización química severa. Como se discute en dicho capítulo, se pone de manifiesto la complejidad de la interacción de los diferentes dinucleótidos sobre la cicatrización corneal y la necesidad de caracterizar cómo los dinucleótidos presentes en el extracto de Artemia salina actúan sobre los receptores purinérgicos P2Y para entender a través de qué mecanismos celulares se favorece o no la cicatrización corneal. En términos de hiperemia conjuntival, cabe señalar brevemente que el tratamiento con la lágrima artificial basada en Artemia salina no mejoró la severidad inducida por la instilación tópica de BAC al 0.2% (ver Figura 32.B). Los resultados de la PCR cuantitativa también sugirieron que la lágrima artificial basada en Artemia salina podría tener un efecto beneficioso sobre el proceso 219 inflamatorio de la superficie ocular inducido por el BAC al 0.2%, ya que se encontró una disminución en los niveles de ARNm de IL-1β y MMP9 en comparación con la hipromelosa (ver Figura 35). Sin embargo, a pesar de que el tratamiento con Artemia salina también redujo la expresión de todos los marcadores inflamatorios respecto a los conejos con ojo seco utilizados como controles positivos, ambos grupos no mostraron diferencias estadísticas. Esta falta de significancia estadística se asoció a la variabilidad que presentaron los resultados del grupo de controles positivos, la cual se ve reflejada en la desviación estándar de dicho grupo. El hecho de haber aumentado el tamaño muestral podría haber confirmado estadísticamente la tendencia del extracto de Artemia salina a disminuir los niveles de ARNm de IL-1β y MMP9. Por otro lado, la expresión de ARNm de IL-6 no se vio afectada por la instilación de BAC al 0.2%, a diferencia de lo que ocurrió en los experimentos del Capítulo III (298), en los que se reportó un aumento. Estos resultados contradictorios podrían explicarse teniendo en cuenta que la expresión de ARNm, incluyendo el de las citoquinas, no es un proceso estable a lo largo del tiempo (314, 315) y que, además, los conejos sanos también sufrieron un aumento en los niveles de ARNm de IL-6 que enmascararía el posible efecto del BAC al 0.2%. Por tanto, ante el riesgo de no encontrar un aumento en la expresión de ARNm de marcadores inflamatorios en futuros estudios, se plantea la necesidad de analizar varios de estos marcadores simultáneamente, además de cuantificar de forma directa la expresión proteica como alternativa. En relación con otros estudios de la literatura científica, recientemente se ha demostrado la eficacia del Up4U o diquafosol para disminuir la inflamación de la superficie ocular en modelos de ojo seco tanto in vitro como in vivo (313, 316-318), habiéndose reportado una disminución en la expresión proteica y de ARNm de IL-1β e IL-6, entre otros marcadores, en concordancia con los resultados de la lágrima 220 artificial basada en Artemia salina del estudio actual. Kim et al. (316) y Park et al. (318) encontraron que este efecto antiinflamatorio también estaría mediado por la inhibición de la vía de señalización del factor nuclear kB, la cual regula a su vez la expresión de MMP9 (319). No obstante, se desconoce si el efecto antiinflamatorio de los dinucleótidos sobre la superficie ocular está mediado por los receptores purinérgicos P2Y, al igual que ocurre en otras patologías sistémicas (320), o bien se debe al efecto protector de estos compuestos frente al daño y la pérdida de homeostasis de la superficie ocular. Teniendo en cuenta el carácter multifactorial y la fisiopatología del ojo seco (84), la combinación de todos estos procesos supondría una teoría lógica para explicar las propiedades antiinflamatorias de los dinucleótidos. A modo de resumen, la lágrima artificial basada en Artemia salina se presenta como un agente secretagogo capaz de estimular la secreción de los componentes acuoso y mucínico de la lágrima, habiendo manifestado además propiedades cicatrizantes y antiinflamatorias. Por ello, esta lágrima artificial podría ser útil para el tratamiento del ojo seco tanto en su forma acuodeficiente como evaporativa (71). En este sentido, ya existe un agente secretagogo de naturaleza nucleotídica, el diquafosol, que está comercializado en Asia, y cuya seguridad y eficacia para mejorar los signos y síntomas del ojo seco han sido ampliamente reportadas en la literatura científica (210, 220). El diquafosol demostró su eficacia en un amplio espectro de pacientes como aquellos con síndrome de Sjögren (217), ojo seco acuodeficiente (321), ojo seco evaporativo (219), ojo seco asociado a la cirugía de cataratas (220), e incluso portadores de lentes de contacto (215) y sujetos sanos (221). La principal limitación del estudio actual fue la falta de caracterización previa de la interacción entre los dinucleótidos presentes en el extracto de Artemia salina y los receptores purinérgicos P2Y localizados en la superficie ocular, por lo que sólo fue 221 posible hipotetizar acerca de la acción agonista del Gp4G sobre el receptor P2Y2 para justificar el efecto beneficioso sobre la secreción lagrimal, la tinción corneal, la densidad de células Goblet y la altura de la nube de mucina. Por otro lado, el modelo de ojo seco inducido por la instilación tópica de BAC al 0.2% no reproduce el carácter crónico de la enfermedad, razón por la cual no fue posible evaluar el efecto del tratamiento con la lágrima artificial a largo plazo. Finalmente, a diferencia de los experimentos del Capítulo III (298), en los que se optimizó el modelo animal de ojo seco, no fue posible medir la osmolaridad lagrimal en esta ocasión, lo que supuso una limitación teniendo en cuenta que la hiperosmolaridad lagrima se considera uno de los factores desencadenante del ojo seco (84). En conclusión, la lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% mostró propiedades secretagogas sobre los componentes acuoso y mucínico de la lágrima, además de un efecto protector frente al daño y la inflamación de la superficie ocular en un modelo de ojo seco en conejos. Por tanto, se confirma el potencial de esta lágrima artificial como agente secretagogo para el tratamiento del ojo seco, a la vez que se abre la puerta a futuros estudios clínicos que permitan extrapolar los hallazgos encontrados a pacientes con ojo seco. 222 223 CAPÍTULO VII EFECTO DE UNA LÁGRIMA ARTIFICIAL BASADA EN UN EXTRACTO DE ARTEMIA SALINA SOBRE LA CICATRIZACIÓN CORNEAL EN CONEJOS 224 225 INTRODUCCIÓN Los resultados mostrados en los dos capítulos anteriores demostraron la eficacia de la lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% que contiene dinucleótidos, principalmente Gp4G, para mejorar el daño del epitelio corneal tanto en conejos sanos (Capítulo V) (311) como en conejos con ojo seco inducido (Capítulo VI). En otros estudios, la instilación tópica de dinucleótidos como el Up4U y el Ap4A también demostró su eficacia en conejos para mejorar el daño corneal en un modelo de ojo seco (163) y acelerar el proceso de cicatrización corneal (230, 234), respectivamente. La mejora del daño del epitelio corneal por parte de algunos dinucleótidos como el Up4U o el Ap4A se debe a la activación del receptor P2Y2 (231, 234-236), capaz de aumentar la velocidad de migración celular durante el proceso de cicatrización (231- 233). Por el contrario, otros dinucleótidos como el Ap3A y el Ap5A retrasan la cicatrización corneal al actuar como agonistas del receptor P2Y6 (231, 235). A pesar de que no se ha descrito que el Gp4G actúe sobre la superficie ocular a través del receptor P2Y2, en la presente tesis doctoral se ha demostrado que la lagrima artificial basada en Artemia salina ayudaría a mejorar la tinción corneal en conejos (Capítulos V y VI) (311). Sin embargo, se desconoce si esta lágrima artificial tiene la capacidad de acelerar el proceso de cicatrización corneal ante la presencia de una lesión epitelial más severa. Por lo tanto, el objetivo del estudio actual fue evaluar el efecto de la lagrimal artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% sobre la velocidad de cicatrización corneal en conejos a los que se les provocó una desepitelización química de la córnea. Para ello, se comparó su efecto con el de la solución salina como control 226 negativo y la hipromelosa al 0.24%, que es el agente viscosante de dicha lágrima artificial. 227 MATERIAL Y MÉTODOS Diseño del estudio Se hizo un estudio experimental, prospectivo a corto plazo, cruzado y aleatorizado de acuerdo con la declaración de la ARVO para el uso de animales en investigación y la Directiva 2010/63/EU del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. El área de desepitelización corneal se midió inmediatamente después de producir la lesión química (medida basal) y tras 8, 10, 12, 14 ,16, 18, 20, 22 y 24 h. La desepitelización se hizo a las 00:00, durante el período nocturno, y las medidas del día siguiente empezaron a partir de las 8:00, al inicio del período diurno. En cada conejo se instiló uno de los dos tratamientos (hipromelosa al 0.24% o Artemia salina) en un ojo y solución salina como control negativo en el ojo contralateral. Se hicieron 3 instilaciones tópicas de 35 μL de cada una de las soluciones: inmediatamente después de la desepitelización y tras 8 y 16 h. Todas las soluciones fueron las mismas que se utilizaron en los experimentos del Capítulo VI, habiendo sido fabricadas y suministradas por la empresa Avizor (Madrid, España). Tanto la elección del tratamiento como del ojo tratado en cada conejo fueron aleatorizados. Las medidas se hicieron en 2 días distintos con un período de wash out o lavado de 7 días entre ellos. El primer día, la mitad de los conejos recibieron hipromelosa como tratamiento en un ojo y la otra mitad Artemia salina. Durante el segundo día, los conejos que recibieron hipromelosa el primer día pasaron a recibir 228 Artemia salina, y viceversa. Además de cruzar el tratamiento recibido por cada conejo, también se cruzaron los ojos. Es decir, el ojo en el que instiló hipromelosa o Artemia salina durante el primer día pasó a recibir solución salina el segundo día, y viceversa. Animales Se utilizaron un total de 10 conejos albinos de Nueva Zelanda machos. Como se comentó anteriormente, el estudio fue cruzado, por lo que todos los conejos formaron parte tanto del grupo tratado con hipromelosa (n = 10) como del grupo tratado con Artemia salina (n = 10). Dentro de cada grupo, un ojo fue tratado con hipromelosa o Artemia salina (nojos = 10) y el ojo contralateral se utilizó como control negativo (nojos = 10). Los conejos fueron suministrados por el animalario de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid (España). Previamente a este estudio, los conejos se utilizaron para los experimentos reportados en los Capítulos IV y VI. A pesar de que sólo se utilizaron como conejos control, cuyo único tratamiento fue solución salina, se dejó un período de wash out de 14 días entre los experimentos del Capítulo VI y los del capítulo actual. Al reutilizarse, los conejos tuvieron un peso de entre 4.0 y 4.5 kg el primer día de experimentación. Las condiciones de estabulación se mantuvieron con libre acceso a comida y agua, además de un ambiente controlado con ciclos de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad a una temperatura de 18ºC y una humedad del 30%. 229 Desepitelización química de la córnea y captura de las imágenes Antes de desepitelizar la córnea, se anestesió tópicamente la superficie ocular mediante la instilación de una gota de colirio comercial compuesto por 4 mg/mL de oxibuprocaína clorhidrato y 1 mg/mL de tetracaína clorhidrato (Alcon Cusí; Barcelona, España). Cincos minutos después, la desepitelización se hizo mediante la aplicación de un disco de papel Whatman nº1 (Merck; Darmstadt, Alemania) de 3 mm de diámetro impregnado en 1-heptanol (Merck) sobre la superficie corneal. Primero, los discos se impregnaron en la solución de 1-heptanol y el exceso de líquido se eliminó poniendo en contacto el disco mojado con otro papel Whatman seco. Seguidamente, el papel impregnado se apoyó con unas pinzas en el centro de la superficie corneal durante 30 s e inmediatamente después se hizo un lavado de la superficie ocular con 5 mL de solución salina (Avizor). Este procedicimiento fue propuesto previamente por Cintron et al. (322) y Pintor et al. (230). Las lesiones químicas del epitelio corneal se tiñeron mediante la instilación de 5 μL de fluoresceína sódica comercial al 2% (Alcon Cusí) para ser posteriormente evaluadas con una lámpara de hendidura VX75 (Luneau Technology; Chartres, Francia). Las imágenes se capturaron utilizando el objetivo de magnificación de X5 de la lámpara de hendidura mediante el sistema EyePix 3, incorporado en la propia lámpara. La toma de imágenes enfocadas se hizo posicionando el área corneal desepitelizada perpendicularmente al objetivo de la lámpara de hendidura. 230 Procesamiento y medida de las imágenes Tanto el procesamiento de las imágenes como la medida del área de desepitelización se realizaron con el programa informático ImageJ (National Institutes of Health; Bethesda, Maryland, Estados Unidos). Una vez abierta la imagen en el programa, se cambió a un formato de 8 bits (Image → Type → 8-bit). En segundo lugar, se saturó la imagen mediante un contraste rojo para aislar el área teñida con fluoresceína (Image → Adjust → Threshold) como se muestra en la Figura 36. Por último, se seleccionó el área teñida con la herramienta Wand (tracing) tool para acabar midiendo dicho área (Analyze → Measure). Figura 36. Imagen representativa de la desepitelización corneal obtenida con la lámpara de hendidura (izquierda) y después de su procesamiento con el programa informático ImageJ (derecha). La imagen procesada muestra el área teñida con fluoresceína delimitada por una línea amarilla. 231 La dimensión del área obtenida fue píxel2, por lo que para calcular los valores en mm2 se asumió un área de las medidas basales de 7.07 mm2, teniendo en cuenta que el diámetro del papel Whatman con el que se hizo la desepitelización fue de 3 mm. En base a esto, el área de desepitelización del resto de las medidas (8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 h) se calculó normalizando los valores obtenidos por el programa respecto a las medidas basales. Análisis estadístico El análisis estadístico se hizo con el programa informático SPSS Statistics 23 (IBM; Chicago, Illinois, Estados Unidos). La capacidad de cicatrización corneal de los tratamientos se analizó a partir del cálculo del ratio de cicatrización y el tiempo estimado de cicatrización mediante el método propuesto por Crosson et al. (323). El ratio de cicatrización se obtuvo a partir de la pendiente resultante de la regresión lineal entre el área de desepitelización (variable dependiente) y el tiempo transcurrido desde que se indujo dicha desepitelización (variable independiente), por lo que se expresó en mm2/h. La ordenada en el origen de dicha regresión lineal permitió obtener el tiempo estimado de cicatrización, que representa el tiempo en el que el área de desepitelización sería de 0 mm2. En relación con el contraste de hipótesis, la normalidad de las distribuciones se calculó mediante el test de Shapiro-Wilk. Tanto el test de la t de Student para muestras relacionadas, en caso de distribuciones normales, como el test de los rangos con signo de Wilcoxon, en caso de distribuciones no normales, se utilizaron para comparar el ratio de cicatrización y el tiempo estimado de cicatrización entre los dos grupos y, dentro de cada grupo, entre el ojo tratado y el ojo control. Además, estos test también 232 se utilizaron para realizar la comparación estadística del área de desepitelización en los diferentes tiempos de evaluación (medida basal y tras 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 h) entre el ojo tratado y el ojo control dentro de cada grupo. Se estableció un nivel de significancia del 95% (P < 0.05) en todos los test estadísticos. Los resultados se muestran como media ± desviación estándar (DE). 233 RESULTADOS La Figura 37 muestra las imágenes representativas del proceso de cicatrización corneal durante las 24 h de evaluación, mientras que la Figura 38 muestra los resultados del área de desepitelización corneal y la regresión lineal a partir de la cual se calculó el ratio de cicatrización y el tiempo estimado de cicatrización. En comparación con la solución control, la instilación de la hipromelosa mejoró de forma estadísticamente significativa (P < 0.05) el área de desepitelización tras 16, 18, 20 y 22 h, aunque no se observaron diferencias tras 24 h (P = 0.123). Por otro lado, la instilación de la Artemia salina no produjo efecto sobre dicho área (P ≥ 0.05). Figura 37. Imágenes representativas del proceso de cicatrización corneal obtenidas mediante la lámpara de hendidura durante las 24 h de evaluación. Se observa una reducción progresiva del área de desepitelización hasta cerrarse casi por completo. 234 Figura 38. Resultados del área de desepitelización corneal tras la instilación de solución salina (control), hipromelosa (HPMC) (A) y Artemia salina (B) durante las 24 h de evaluación. Las rectas representan el ajuste lineal de cada tratamiento. La comparación estadística se hizo entre el ojo control y el ojo tratado (HPMC o Artemia) dentro de cada grupo. *P < 0.05, test de la t de Student para muestras relacionadas. En relación con el ratio de cicatrización (Figura 39), no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05) entre ninguno de los tratamientos. Por el contrario, el tiempo estimado de cicatrización (Figura 40) fue 1:15 ± 1:15 h:min más -1 0 1 2 3 4 5 6 7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Á R EA D E D ES EP IT EL IZ A C IÓ N ( m m 2 ) TIEMPO (h) CONTROL HPMC -1 0 1 2 3 4 5 6 7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Á R EA D E D ES EP IT EL IZ A C IÓ N ( m m 2 ) TIEMPO (h) CONTROL ARTEMIA A B * * * * 235 rápido tras la instilación de la hipromelosa en comparación con la Artemia salina (P = 0.011). Según esta estimación, la lesión química del epitelio corneal cicatrizaría en 23:42 ± 1:00 h:min con la hipromelosa y 24:57 ± 0:43 h:min con la Artemia salina. Figura 39. Resultados del cálculo del ratio de cicatrización corneal tras la instilación de solución salina (control), hipromelosa (HPMC) y Artemia salina. La comparación estadística se hizo entre los dos grupos y, dentro de cada grupo, entre el ojo control y el ojo tratado (HPMC o Artemia), pero no hubo diferencias estadísticamente significativas (P ≥ 0.05). 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 HPMC ARTEMIA R A TI O D E C IC A TR IZ A C IÓ N ( m m 2 / h ) CONTROL TRATADO 236 Figura 40. Resultados de la estimación del tiempo de cicatrización corneal tras la instilación de solución salina (control), hipromelosa (HPMC) y Artemia salina. La comparación estadística se hizo entre los dos grupos y, dentro de cada grupo, entre el ojo control y el ojo tratado (HPMC o Artemia). *P < 0.05, test de la t de Student para muestras relacionadas. 0 4 8 12 16 20 24 28 32 HPMC ARTEMIA TI EM P O E ST IM A D O D E C IC A TR IZ A C IÓ N ( h ) CONTROL TRATADO * 237 DISCUSIÓN Una vez demostrada la capacidad de la lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% para mejorar el daño corneal tanto en conejos sanos (Capítulo V) (311) como con ojo seco inducido (Capítulo VI), el estudio actual se centró en evaluar la capacidad de ésta para aumentar la velocidad de cicatrización tras inducir una desepitelización corneal de mayor severidad. Al contrario de lo que cabría esperar, sólo la solución con hipromelosa mostró resultados favorables sobre dicho proceso de cicatrización. Considerando que la hipromelosa al 0.24% es el agente viscosante de la lágrima artificial basada en Artemia salina, se esperaría que dicha lágrima artificial tuviera al menos un efecto comparable o mayor en caso de sinergia. En esta sección se exponen algunas hipótesis sobre por qué el efecto de la lágrima artificial basada en Artemia salina no fue el esperado. Como ya se ha comentado, la instilación de hipromelosa fue el único tratamiento que disminuyó el área de desepitelización en comparación con la solución salina como control negativo (ver Figura 38). Sin embargo, esta mejora sólo fue estadísticamente significativa durante 6 h de evaluación y no se vio reflejada en una mejora del ratio de cicatrización (ver Figura 39) o el tiempo estimado de cicatrización (ver Figura 40). En comparación con la lágrima artificial basada en Artemia salina, la hipromelosa obtuvo un tiempo estimado de cicatrización estadísticamente menor, en torno a 1 h, lo que no se considera clínicamente relevante. En los Capítulos V y VI se ha asociado la mejora de la tinción corneal por parte del extracto de Artemia salina a la acción agonista del Gp4G sobre el receptor P2Y2, el principal dinucleótido (158, 251). No obstante, no hay literatura científica en la que se demuestre que el Gp4G actúe selectivamente sobre este receptor. Adicionalmente, la Artemia salina se compone en menor medida de 238 otros dinucleótidos como el Gp3G, el Gp2G y el Gp4A (158, 251), de los cuales tampoco se ha caracterizado su interacción con los receptores purinérgicos. Por lo tanto, existe la posibilidad de que algunos de estos dinucleótidos tengan un efecto agonista sobre los receptores P2Y6 presentes en la superficie ocular, que retrasaría la reepitelización corneal en lugar de acelerarla (231, 235). Sin embargo, esta hipótesis no explicaría por qué la Artemia salina sí fue capaz de reducir la tinción corneal en los Capítulos V (311) y VI. Otra posible explicación para la falta de efecto de la Artemia salina es que, en caso de que los dinucleótidos presentes fuesen agonistas del receptor P2Y2, su concentración podría ser insuficiente. También cabría la posibilidad de que dichos dinucleótidos tuvieran una mayor afinidad por otros receptores purinérgicos expresados en la superficie ocular, como el P2Y1 o el P2Y4 (324), lo que reduciría su potencia de acción sobre el receptor P2Y2. Previamente, dos estudios del grupo de investigación de la presente tesis doctoral demostraron que la instilación tópica de Ap4A aumentó la velocidad de cicatrización corneal en conejos a los que se les indujo una desepitelización mediante el mismo procedimiento (230, 234). Pintor et al. (230) y Crooke et al. (234) utilizaron concentraciones de Ap4A de 1 mM y 100 µM, respectivamente, siendo éstas 100 y 10 veces superiores a la concentración de Gp4G en el extracto de Artemia salina, que es de 10 µM. Teniendo en cuenta los resultados de los Capítulos V (311) y VI, la baja concentración de dinucleótidos en la lágrima artificial podría ser suficiente para mejorar la tinción corneal, pero no para acelerar un proceso de cicatrización más severo como el inducido en el estudio actual. Por otro lado, las cadenas de hipromelosa, el agente viscosante de la lágrima artificial con Artemia salina, podrían estar generando micelas que envuelvan a los dinucleótidos, dificultando la difusión e interacción de estos compuestos con los 239 receptores purinérgicos, lo que también podría explicar la falta de efecto. Además, queda la duda de si aumentando el número de instilaciones con dicha lágrima artificial se conseguiría un efecto diferente en beneficio o detrimento de la cicatrización. En las conclusiones del Capítulo V se presentó al extracto de Artemia salina al 4% como un posible tratamiento para la regeneración de la superficie ocular, pero los resultados del estudio actual no corroboraron este hecho. No obstante, es necesario trasladar el conocimiento obtenido en esta tesis doctoral a la investigación clínica para conocer hasta qué punto las propiedades cicatrizantes de esta lágrima artificial son extrapolables desde la experimentación animal. Como se discutió en el capítulo anterior, la principal limitación del estudio actual fue la falta de caracterización previa de la interacción de los diferentes dinucleótidos presentes en el extracto de Artemia salina con los receptores purinérgicos de la superficie ocular. Ante esta falta de investigación básica, no podría explicarse por qué la lágrima artificial sí mejoró las tinciones corneales, pero no aumentó la velocidad de cicatrización. Otra limitación del estudio es intrínseca a la técnica de medida de la desepitelización. A pesar de haberse utilizado esta técnica en otros estudios previos, nunca se ha medido su repetibilidad para validarla, por lo que factores como la inclinación del ojo del conejo respecto al ocular de la lámpara de hendidura o el punto de enfoque de ésta podrían estar sesgando el efecto de los diferentes tratamientos. Por último, el hecho de haber incluido otro grupo control con instilación tópica de Gp4G en concentraciones más alta habría permitido conocer si la falta de efecto por parte de la Artemia salina se debió a la baja concentración de Gp4G del extracto u otras razones como, por ejemplo, la falta de afinidad del dinucleótido por el receptor P2Y2. 240 En conclusión, la instilación tópica de una lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% no tuvo efecto sobre la velocidad de cicatrización corneal tras inducir una desepitelización química en conejos, por lo que podría presentar limitaciones como tratamiento regenerativo frente a un daño severo de la superficie ocular. 241 CONCLUSIONES · CONCLUSIONS 242 243 CONCLUSIONES I. La instilación tópica de 35 μL de cloruro de benzalconio al 0.2% durante 5 días consecutivos, dos veces al día, fue un procedimiento adecuado para inducir un modelo de ojo seco en conejos, reduciendo el número de días de instilación en comparación con el modelo original, que fue de 14 días. II. Fue posible la detección colorimétrica del fosfato libre en la lágrima de conejos mediante el uso de un kit comercial basado en el verde de malaquita, aunque no se encontraron diferencias en la concentración lagrimal de esta molécula entre los conejos con ojo seco inducido y los conejos sanos. No obstante, se propone al fosfato libre presente en la lágrima como un posible nuevo biomarcador molecular del ojo seco, haciéndose necesario un estudio clínico en pacientes con la enfermedad para evaluar su capacidad diagnóstica en términos de sensibilidad y especificidad. III. La instilación tópica de un extracto de Artemia salina al 4% produjo tanto la estimulación de la secreción lagrimal como una ligera mejora en la tinción corneal fisiológica en conejos. Además, ninguna de las concentraciones del extracto de Artemia salina presentó efectos secundarios indeseados sobre la superficie ocular. Por lo tanto, esta solución oftálmica al 4% se presenta como un posible nuevo tratamiento para el ojo seco y la regeneración de la superficie ocular. IV. La lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% mostró propiedades secretagogas sobre los componentes acuoso y mucínico de la lágrima, además de un efecto protector frente al daño y la inflamación de la superficie ocular en un modelo de ojo seco en conejos. Por tanto, se confirma el potencial de esta lágrima artificial como agente secretagogo para el tratamiento 244 del ojo seco, a la vez que se abre la puerta a futuros estudios clínicos que permitan extrapolar los hallazgos encontrados a pacientes con ojo seco. V. La instilación tópica de una lágrima artificial basada en un extracto de Artemia salina al 4% no tuvo efecto sobre la velocidad de cicatrización corneal tras inducir una desepitelización química en conejos, por lo que podría presentar limitaciones como tratamiento regenerativo frente a un daño severo de la superficie ocular. 245 CONCLUSIONS I. The topical instillation of 35 μL of 0.2% benzalkonium chloride for 5 consecutive days, twice daily, was a proper procedure to induce a rabbit dry eye model and reduce the days of instillation compared with the original model, which was 14 days. II. It was possible the colorimetric detection of free phosphate in tears of rabbits by using a commercial kit based on malachite green, despite the concentration of this molecule in tears showed no differences between rabbits with induced dry eye and healthy rabbits. Nevertheless, free phosphate in tears is proposed as a possible new molecular biomarker for dry eye diagnosis, a clinical study on dry eye patients being necessary to evaluate its diagnostic capability in terms of sensitivity and specificity. III. The topical instillation of an extract of 4% Artemia salina both stimulated tear secretion and improved physiological corneal staining in rabbits. Besides, none of the concentrations of the extract of Artemia salina produced undesirable side effects over the ocular surface. Therefore, this ophthalmic solution based on 4% Artemia salina is proposed as a possible new treatment for dry eye and ocular surface regeneration. IV. The artificial tears based on an extract of 4% Artemia salina showed secretagogue properties on aqueous and mucinous components of tears, accompanied by a protective effect against ocular surface damage and inflammation in a rabbit dry eye model. Thus, the potential of these artificial tears as a secretagogue agent for dry eye treatment is confirmed, which opens the door for future clinical studies to extrapolate the findings to dry eye patients. 246 V. The topical instillation of artificial tears based on an extract of 4% Artemia salina did not affect corneal wound healing time after inducing a chemical de-epithelialization in rabbits. Therefore, this treatment could present limitations for the regeneration of severe ocular surface damage. 247 ANEXO PRODUCCIÓN CIENTÍFICA 248 249 PUBLICACIONES Tesis doctoral 1. Carpena-Torres C, Pintor J, Huete-Toral F, Martin-Gil A, Rodríguez-Pomar C, Martínez-Águila A, Carracedo G. Efficacy of artificial tears based on an extract of Artemia salina containing dinucleotides in a rabbit dry eye model. International Journal of Molecular Sciences 2021; 22(21): 11999. 2. Carpena-Torres C, Pintor J, Huete-Toral F, Rodriguez-Pomar C, Martínez-Águila A, Carracedo G. Preclinical development of artificial tears based on an extract of Artemia salina containing dinucleotides in rabbits. Current Eye Research 2021; 46(2): 174-178. 3. Carpena-Torres C, Pintor J, Pérez de Lara MJ, Huete-Toral F, Crooke A, Pastrana C, Carracedo G. Optimization of a rabbit dry eye model induced by topical instillation of benzalkonium chloride. Journal of Ophthalmology 2020; 2020: 7204951. Otras 4. Carballo-Alvarez J, Caballero-Magro E, Cortes-Escudero I, Carpena-Torres C. Correction of ocular aberrations with prismatic rigid-gas-permeable contact lenses in keratoconic patients. Optometry and Vision Science 2021 [Online ahead of print]. 5. 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Ponencia titulada ‘Estimulación de la secreción lagrimal con una lágrima artificial basada en Artemia salina que contiene dinucleótidos en conejos’ en: 26 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2021 (Online). 3. Ponencia titulada ‘Optimization of a rabbit dry eye model induced by topical instillation of benzalkonium chloride’ en: 4º PhDay Complutense FOO 2020 (Online). 4. Póster titulado ‘Stimulation of tear secretion with eye drops based on an extract of Artemia salina containing dinucleotides in rabbits’ en: The Association for Research in Vision and Ophthalmology 2020 (Online). 5. Ponencia titulada ‘Gold nanoparticle-based colorimetric biosensor for dry eye diagnosis’ en: 3er PhDay Complutense FOO 2019 (Madrid, España). 6. Póster titulado ‘Biosensor based DNA for dry eye detection’ en: Nanomed Europe 2019 (Braga, Portugal). 7. Ponencia titulada ‘Diagnosis of dry eye assissted by gold nanoparticles’ en: Congresso Internacional de Optometria e Ciências da Visâo 2019 (Braga, Portugal). 8. Ponencia invitada titulada ‘Delivery of dinucleotides with contact lenses for dry eye treatment’ en: New Frontiers in Ocular Therapeutics 2 2018 (Dublín, República de Irlanda). 253 Otros 9. Ponencia titulada ‘The stimulation of the optic nerve with a blue optical fiber modifies dopamine and melatonin levels in rabbits’ en: VII International Congress of Research in Retina and Vision 2021 (Murcia, España). 10. Ponencia titulada ‘Eficacia de la refracción basada en aberrometría en comparación con la refracción subjetiva en jóvenes hipermétropes’ en: 26 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2021 (Online). 11. Ponencia titulada ‘Calidad óptica con lentes de contacto rígidas permeables al gas corneales prismáticas en queratocono’ en: 26 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2021 (Online). 12. Póster titulado ‘Comparación de dos autorefractómetros de frente de onda: monocular de campo cerrado versus binocular de campo abierto’ en: 26 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2021 (Online). 13. Póster titulado ‘Eficacia y repetibilidad de la refracción basada en aberrometría en pacientes con queratocono’ en: 26 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2021 (Online). 14. Póster titulado ‘Análisis de las aberraciones ópticos residuales tras la adaptación de lentes RPG corneales en queratocono’ en: 26 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2021 (Online). 15. Póster titulado ‘Cambios en la calidad visual con lentes de contacto blandas tras la instilación de lágrimas de ácido hialurónico’ en: 26 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2021 (Online). 16. Póster titulado ‘Selective stimulation of the optic nerve head with blue light increases vitreal dopamine levels in rabbits’ en: The Association for Research in Vision and Ophthalmology 2021 (Online). 17. Póster titulado ‘A comparison between aberrometry-based automated subjective refraction and traditional subjective refraction in keratoconus patients’ en: The Association for Research in Vision and Ophthalmology 2021 (Online). 18. Ponencia invitada titulada ‘Precisión de los sistemas de refracción automatizada basados en aberrometría’ en: Alicante Refractiva Internacional 2020 (Online). 254 19. Póster titulado ‘In vivo changes in wettability of hydrophilic contact lenses after an Aloe vera – HPMC based artificial tear drop’ en: 4º PhDay Complutense FOO 2020 (Online). 20. Póster titulado ‘Comparison of two wavefront autorefractors: binocular open-field versus monocular closed-field’ en: The Association for Research in Vision and Ophthalmology 2020 (Online). 21. Ponencia titulada ‘Development of a LSPR-based sensor for the detection of Acanthamoeba’ en: 3rd PhDay – UCM 2019 (Madrid, España). 22. Póster titulado ‘Evaluation of the anti-inflammatory effect of an ophthalmic tear substitute based on a combination of aloe vera and hydroxypropylmethylcellulose’ en: 3rd PhDay – UCM 2019 (Madrid, España). 23. Ponencia invitada titulada ‘Aberraciones ópticas y lentes de contacto’ en: XXI Jornadas Científicas Andaluzas de la Visión 2019 (Almería, España). 24. Ponencia invitada titulada ‘El frente de onda: Una realidad en la práctica clínica’ en: 95 Congreso de la Sociedad Española de Oftalmología 2019 (Madrid, España). 25. Póster titulado ‘Eficacia y repetibilidad de la refracción basada en aberrometría en niños y adolescentes’ en: OPTOM Meeting 2019 (Valladolid, España). 26. Póster titulado ‘Comparación de dos autorefractómetros de frente de onda en niños y adolescentes: monocular vs binocular’ en: OPTOM Meeting 2019 (Valladolid, España). 27. Ponencia titulada ‘Visual quality changes with soft contact lenses after different hyaluronic acid eye drops instillation’ en: Congresso Internacional de Optometria e Ciências da Visâo 2019 (Braga, Portugal). 28. Póster titulado ‘Efficacy and repeatability of aberrometry-based binocular refraction compared with subjective refraction in keratoconus patients’ en: The Association for Research in Vision and Ophthalmology 2019 (Vancouver, Canadá). 29. Póster titulado ‘Efficacy and repeatability of aberrometry-based binocular refraction compared with subjective refraction’ en: The Association for Research in Vision and Ophthalmology 2018 (Hawaii, Estados Unidos). 30. Póster titulado ‘Characterization of corneal high-order aberrations in keratoconus of different phenotypes’ en: Congresso Internacional de Optometria e Ciências da Visâo 2018 (Braga, Portugal). 255 31. Póster titulado ‘Anterior corneal curvature and aberration after scleral lens wear in keratoconus patients’ en: Congresso Internacional de Optometria e Ciências da Visâo 2018 (Braga, Portugal). 32. Póster titulado ‘How long should it be waited to evaluate soft contact lenses after its insertion?’ en: Congresso Internacional de Optometria e Ciências da Visâo 2018 (Braga, Portugal). 33. Póster titulado ‘In-vivo wettability changes after tear substitutes instillation in hydrophilic contact lens users’ en: Congresso Internacional de Optometria e Ciências da Visâo 2018 (Braga, Portugal). 34. Ponencia invitada titulada ‘EyeRefract: Beneficios del uso de las nuevas tecnologías’ en: ExpoÓptica 2018 (Madrid, España). 35. Ponencia titulada ‘Efecto de dos soluciones de mantenimiento con agentes humectantes en usuarios de lentes de contacto para dispositivos electrónicos’ en: 25 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2018 (Madrid, España). 36. Ponencia titulada ‘Evaluación de la eficacia y repetibilidad de la refracción objetiva basada en aberrometría comparada con la refracción subjetiva’ en: 25 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2018 (Madrid, España). 37. Ponencia titulada ‘Evaluación de las propiedades humectantes y antiinflamatorias de una solución basada en aloe vera’ en: 25 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2018 (Madrid, España). 38. Póster titulado ‘Estabilización de la humectación in vivo, confort y calidad visual tras la inserción de lentes de contacto hidrofílicas’ en: 25 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2018 (Madrid, España). 39. Póster titulado ‘Efecto sobre la película lagrimal de un nuevo tratamiento para el síndrome de ojo seco’ en: 25 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2018 (Madrid, España). 40. Póster titulado ‘Variación de la calidad de imagen retiniana tras la adaptación de lentes de contacto hidrofílicas de diferentes asfericidades’ en: 25 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2018 (Madrid, España). 256 41. Póster titulado ‘Cambios en la humectación in vivo tras la instilación de lágrimas artificiales con lentes de contacto’ en: 25 Congreso Internacional de Optometría, Contactología y Óptica Oftálmica 2018 (Madrid, España). 42. Póster titulado ‘Variation of coma aberration with prismatic soft contact lenses’ en: 40th British Contact Lens Association Clinical Conference Exhibition 2017 (Liverpool, Reino Unido). 43. Póster titulado ‘Variation of coma aberration with prismatic soft contact lenses’ en: Congresso Internacional de Optometria e Ciências da Visâo 2017 (Braga, Portugal). 44. Póster titulado ‘In vivo wettability changes in soft contact lenses after different tear drops instillation’ en: Congresso Internacional de Optometria e Ciências da Visâo 2017 (Braga, Portugal). 45. Póster titulado ‘Evaluation of the anti-inflammatory effect of a humectant solution based on aloe vera’ en: Congresso Internacional de Optometria e Ciências da Visâo 2017 (Braga, Portugal). 46. Póster titulado ‘Variation of visual function with prismatic soft contact lenses’ en: OPTOM Meeting Academy 2017 (Barcelona, España). 47. Póster titulado ‘Corneal aberrometry changes after scleral lens wearing in patients with keratoconus’ en: OPTOM Meeting Academy 2017 (Barcelona, España). 48. Ponencia titulada ‘Evaluation of DEM test in Spanish young footballers’ en: Congresso Internacional de Optometria e Ciências da Visâo 2016 (Braga, Portugal). 49. Póster titulado ‘Presence of melatonin in human tears’ en: Congresso Internacional de Optometria e Ciências da Visâo 2016 (Braga, Portugal). 50. Póster titulado ‘Hábitos para la prevención de la DMAE: Alimentación, uso de filtros y tabaquismo’ en: I Congreso de Estudiantes de Investigación Biosanitaria 2015 (Granada, España). 257 REFERENCIAS 258 259 1. Nelson JD, Craig JP, Akpek EK, Azar DT, Belmonte C, Bron AJ, et al. TFOS DEWS II Introduction. Ocul Surf. 2017;15(3):269-75. 2. 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Portada ÍNDICE ABREVIATURAS ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE TABLAS RESUMEN SUMMARY CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN GENERAL LA SUPERFICIE OCULAR EL OJO SECO LOS DINUCLEÓSIDOS POLIFOSFATOS CAPÍTULO II JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS JUSTIFICACIÓN HIPÓTESIS OBJETIVOS CAPÍTULO III OPTIMIZACIÓN DE UN MODELO DE OJO SECO EN CONEJOS INDUCIDO POR LA INSTILACIÓN TÓPICA DE CLORURO DE BENZALCONIO FASE I ESTUDIO PILOTO FASE II ESTUDIO FINAL CAPÍTULO IV MEDIDA COLORIMÉTRICA DE LA CONCENTRACIÓN DE FOSFATO LIBRE EN LA LÁGRIMA DE CONEJOS CON OJO SECO INDUCIDO INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN CAPÍTULO VI EFECTO DE UNA LÁGRIMA ARTIFICIAL BASADA EN UN EXTRACTO DE ARTEMIA SALINA EN UN MODELO DE OJO SECO EN CONEJOS INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN CAPÍTULO VII EFECTO DE UNA LÁGRIMA ARTIFICIAL BASADA EN UN EXTRACTO DE ARTEMIA SALINA SOBRE LA CICATRIZACIÓN CORNEAL EN CONEJOS INTRODUCCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN CONCLUSIONES CONCLUSIONS PUBLICACIONES REFERENCIAS