UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS TESIS DOCTORAL Streptococcus pneumoniae y Staphylococcus aureus : enfermedad invasiva, biofilm y terapia MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Julio Sempere García Directores José Enrique Yuste Lobo Mirian Domenech Lucas Madrid © Julio Sempere García, 2022 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS TESIS DOCTORAL Streptococcus pneumoniae y Staphylococcus aureus: enfermedad invasiva, biofilm y terapia MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Julio Sempere García DIRECTORES José Enrique Yuste Lobo Mirian Domenech Lucas Madrid, 2022 Agradecimientos Llevaba meses pensando en que por fin llegaría el momento de escribir los agradecimien- tos y sería lo más fácil, y ahora me encuentro enfrentándome a estos sin saber muy bien lo que escribir. El primer consejo que daría a alguien que va a realizar una tesis doctoral: no dejes nada para el final, ni siquiera los agradecimientos. Lo primero de todo quiero agradecer a mis dos directores de tesis José y Miri. Quiero empezar contando cómo acabé en el laboratorio de neumococos del CNM-ISCIII. Cur- sando tercero de Bioquímica en la UCM me uní al proyecto de aprendizaje-servicio SWI (actualmente MicroMundo) y me tocó en el equipo de la profesora Covadonga Vázquez (aquí una pequeña pausa para agradecer a Cova todo lo que ha hecho por mi) y a la vez cursaba microbiología clínica con la profesora Mª José Valderrama (que quiero agrade- cerle por esa asignatura que me hizo meterme de lleno en la micro clínica y por conven- cerme para cursar el Máster de Microbiología). Con estas experiencias quise buscar labo- ratorio para realizar prácticas extracurriculares antes de empezar el TFG, y el “bicho” que más me interesó fue mi querido neumococo. Me recomendaron encarecidamente que me fuese al CIB a realizar estas prácticas con Miri. ¡La sorpresa que me llevé cuando me rechazó! ¡Viniendo con recomendación y todo…! Lo que no sabía era que el destino no la iba a dejar librarse de mí. La otra opción para trabajar con este patógeno tan “chulo” era el laboratorio de referencia de neumococo en el CNM-ISCIII. Así que gracias a José, acabé realizando las prácticas extracurriculares en la unidad de neumococos y de ahí nadie me ha movido. La siguiente sorpresa, o destino, fue que Miri acabó uniéndose al labora- torio cuando yo iba a empezar mi TFM y al final tuvo no sólo que tragarme y aguantarme durante un curso escolar, sino durante toda mi tesis y mucho más allá. La conclusión de esta historia, y eso que yo, lo que es concluir, concluir, no sé, es que es muy difícil librarse de mí, y que a veces en la vida ocurren estas cosas. Después de haberme enrollado, como siempre, empiezo a agradecer de verdad. Miri y José, muchísimas gracias, pero de verdad, muchísimas gracias, por todo lo que habéis hecho por mí. No sabéis la suerte que he tenido, cruzarme con gente que no sólo te dirija, sino que te hagan sentir pasión por lo que haces es muy difícil. José, por lo que has luchado por mi continuidad en el centro, estaré siempre eternamente agradecido. Miri, por aguantarme por pelearme y por todo, por estar siempre ahí que lo necesito. A ambos, por todos los buenos momentos, por esas risas y esos motes, por todas las discusiones de ciencia y cotilleos no científicos, por los congresos, por crear un ambiente que haga que quiera continuar en la ciencia en la investigación, por los “persimonios”, por todo… Después me gustaría agradecer a mi laboratorio de neumos, a lo que ha sido mi familia del CNM-ISCIII. La primera que me acogió, mi Lolita, la vida del centro, de Maja- dahonda y de España. Nunca he echado más de menos a una persona, tu ausencia desde que te jubilaste se nota cada día. Me enseñaste “la microbiología de verdad no esas tontás que os enseñan en la facultad”, me acogiste y me protegiste como a un polluelo cuando estaba perdido y no sabía ni rotular los tubos bien. Qué peleas teníamos, qué gritos pe- gábamos, qué risas echábamos, qué buenos momentos. A Bea e Idoia, qué buenos mo- mentos hemos pasado, cuánto tiempo compartido y muchas gracias por toda la ayuda. También quiero agradecer a Mirella, que llegó y nos encerraron tres meses en casa, que ha sido un apoyo y ayuda constante. Por último, de mi lab de neumo quiero agradecer a mis “polluelos”: a Covi que, aunque me la liase con la placa de secuenciación y yo la amenazase de morirme del disgusto, siempre ha sido un placer trabajar con ella y a Darío, el peleón, que te preguntaba por qué, cómo, pero y sí, etc. con cada paso de cada proto- colo, pero hacía todo con entusiasmo y determinación. Por todos los momentos junto a mis compañeros, por buscar una excusa semanal para traer bollos del Atuel, muchas gra- cias. Del CNM no me puedo olvidar de las chicas de Taxo: Sylvia, Pilar y Silvia. Muchas gracias por tantas comidas juntos, compartiendo tantas ideas, tantas recetas, tantos momentos, muchas gracias por todo. También a Cris y Raquel, que desde el covid han estado aguán- tándome todos los días, por esas comidas incluso en los peores momentos, por las largas conversaciones de a ver cuándo me vacunan o qué mal la situación laboral en la ciencia, por todos los consejos, muchas gracias. A Fede de intrahospitalarias, que me prestó toda la colección de S. aureus que hizo posible esta tesis, que nos traía bombones cada vez que se iba de viaje, por todos los buenos momentos celebrando cumpleaños y despedidas. Muchas gracias también a Isa, Manu, Mª José, Elena y mucha gente más que cada día da vida al centro. De la Complu no puedo olvidarme de las chicas del laboratorio 7 de micro, a Cova y Belén, muchas gracias por vuestros consejos y por guiarme también. A Jessi, Marta, Carol y Clara, al ya pasado pero presente en nuestros corazones Alex. También a mis amigos del máster, “bacilux de verdad”: Alonso, Estela, Ahlam, Josu, Patri, Nerea y Alex (le menciono dos veces por si en un futuro se hace importante que el peloteo sirva de algo). Yéndome un poco más al pasado no puedo olvidarme de mis compañeras de bioquímica, pero sobre todo amigas de toda la vida, Alba, Luci y Ana. Hemos pasado tantos buenos momentos durante los años que hemos pasado juntos, tanto para ser “los que no tienen amigos”…no he podido tener más suerte con la gente que me ha tocado vivir estos años de formación. Ahora por último ya me voy a mi familia (tanto de sangre como mi “núcleo”). Lo primero de todo agradecer a mis padres, Remo y Alicia, porque gracias a ellos estoy (literalmente) donde estoy. ¡Lo que han tenido que aguantar! El esfuerzo que mis padres han hecho toda mi vida, tanto en lo personal como en lo educativo, para poder acceder a todo y llegar a este momento es algo que nunca les podré recompensar. Todas las horas que han sacrificado para llevarme a los sitios, para que hiciese las actividades extraescolares, para que estudiase, para que disfrutase, para todo. Os quiero y no he podido tener más suerte (aunque haya repetido esto ya unas 700 veces durante los agradecimientos). Muchas gra- cias y esto no podría haber ocurrido sin vosotros. No me olvido de mi hermana, Virginia, que es la persona en quien más confío y a quien más quiero en el mundo. Hemos discu- tido, nos hemos pegado, nos hemos perdonado, pero un buen hermano es lo mejor que te puede pasar y yo tengo la mejor hermana del mundo. Aunque diga que ella es la guapa y yo soy el listo (cuando sabe que yo soy el listo Y el guapo). A Eusti, mi gata, por estar (obviamente). A Roci, por ser una alegría constante y preocuparse tanto por mí, por estar ahí siempre que la necesito y acogerme siempre con un cariño enorme. También quiero agradecer a mis tíos más cercanos, tía Emi, tía Luisa, tío Luis, tía Leo y más parte de mi familia por todo su apoyo durante mi vida. De mi otra familia, mi núcleo, que me han soportado durante todos estos años, y han hecho que estos dos últimos gracias a la ***** de coronavirus hayan sido llevaderos, muchísimas gracias. A Dani, una de las personas más generosas que he conocido y cono- ceré en mi vida. No me voy a poder librar de ti en mi vida, esto es a lo que llaman familia elegida. A Momo, que me enseña lo que es ser asertivo, que me confía y a quien confío todo, que me ha hecho la vida mucho más feliz y llevadera. A Inés, que me ha enseñado lo que es ser fuerte, con la que he vivido aventuras en hostales de mala muerte, con la que he pasado de los mejores momentos de mi vida. A Víctor, la persona que más me tiene que aguantar y aun así sigue pasando todo el tiempo conmigo, la persona que ha sido mi apoyo diario estos dos últimos años y con la que podría pasar toda mi vida y muchas más. A todos, os quiero muchísimo y muchas gracias, pero de verdad de la buena. No me olvido tampoco de Anita, que me deja tener el privilegio de ser una de las pocas personas en denominarla con ese -ita; de Irene, que desde que se ha ido a Suecia me falta una persona en mi vida, mi compañera de gimnasio de carreras y de cotilleos; de Laura, feita, y las tardes de jueguitos; de Adrián, que aguantó mi jugada maestra del Avalon; de Alberto y sus bíceps; de mis compañeros de mi peor vicio, el “League of Legends”, que amenizan mis tardes y me acompañaron durante toda la pandemia; tampoco me olvido de la gente del pasado, que ya no está en mi vida y han aportado cosas buenas y cosas malas. También dije que agradecería en mi tesis a la saga Crepúsculo y a Lady Gaga, y no faltaría menos después de la cantidad de veces que he podido consumir su contenido en mi vida. Como no, me he enrollado escribiendo los agradecimientos, pero uno es como es (en mi caso pesado) y tiene que convivir con ello. Quiero acabar citando a mi directora de tesis: y ahora preparaos para un trocito de ciencia… A mis padres, Alicia y Remo A mi hermana, Virginia A mi núcleo, Vic, Inés, Momo y Dani ABREVIATURAS Además de las unidades y abreviaturas aceptadas por el Sistema Internacional de medidas (SI) (http://physics.nist.gov/cuu/Units/index.html) y la International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (https://iupac.org/what-we-do/nomenclature/), en esta Tesis Doctoral se han utilizado las siguientes abreviaturas: ADNe, ADN extracelular que forma parte de la matriz del biofilm. AMX, amoxicilina. Bap, proteína asociada a biofilm de S. aureus. BSA, seroalbúmina bovina. C+Y, medio CpH8 suplementado con extracto de levadura al 0.08%. CBP(s), proteína(s) de unión a colina. CC, complejo clonal. CDN, cefditoren. CFD, cefpodoxima. CFX, cefixima. cgMLST, core genome MLST (definición más abajo) CMI, concentración mínima inhibitoria. CLSI, Instituto de Estándares de Laboratorio Clínico. CLSM, microscopía de barrido láser confocal. CP5, serotipo capsular 5 de S. aureus. CP8, serotipo capsular 8 de S. aureus. CPS, polisacárido capsular. CRO, ceftriaxona. CRP, proteína C-reactiva. CSP, péptido estimulador de competencia. CTX, cefotaxima. CV, solución de cristal violeta al 1% en agua. Cys, cisteamina. DDAO, 7-hidroxi-9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona). DMI, dispositivo médico invasivo. DOC, desoxicolato sódico. EC, exudado cutáneo. EH, exudado de herida. http://physics.nist.gov/cuu/Units/index.html https://iupac.org/what-we-do/nomenclature/ MATERIALES Y MÉTODOS EHT, extracto de humo de tabaco. EITRI, enfermedades infecciosas del tracto respiratorio inferior. EN, exudado nasofaríngeo. ENI, enfermedad neumocócica invasiva. EP, exudado perianal. EPOC, enfermedad pulmonar obstructiva crónica. EPS, sustancias poliméricas extracelulares. ERY, eritromicina. ET(A/B), toxinas exfoliativas. EUCAST, European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. fH, factor H. FITC, isotiocianato de fluoresceína. GS, glándula suprarrenal. HBSS, Hank’s Balanced Salt Solution. HL-60, línea celular que se diferencia a neutrófilos. LB, lavado broncoalveolar. LCR, líquido cefalorraquídeo. LRN, laboratorio de referencia de neumococos. LIH, laboratorio de infecciones intrahospitalarias. L-PL, líquido pleural. LTAs, ácidos lipoteicóicos. LVX, levofloxacino. MAC, complejo de ataque a la membrana. MLST, tipificación mediante secuenciación multilocular o mutilocus sequence typing. NAC, N-acetil-L-cisteina. NP, necropsia pulmonar. Nuc, termonucleasa extracelular de S. aureus. ·OH, radicales hidroxilo. Opt, optoquina. PBP, proteínas de unión a penicilina. P-Cho, fosforilcolina PEN, penicilina. PIA, adhesina de polisacárido intercelular, también llamado PNAG. PlyA, neumolisina. PNAG, poly-β(1-6)-N-acetilglucosamina, también llamado PIA. PVL, leucocidina de Panton-Valentine. QS, quorum sensing. SARM, Staphylococcus aureus resistente a meticilina. SARM-AH, SARM asociado a hospitales. SARM-AC, SARM adquirido en comunidad. SARM-AG, SARM asociado a ganado. SASM, S. aureus susceptible a meticilina. ST(s), secuencitipo(s). Tampón SP, tampón fosfato sódico 20 mM (ajustado a pH 6.9, salvo indicación en contra). TAs, ácidos teicóicos. TSA, agar de tripticaseína. TSB, caldo de tripticaseína. TSBGY, TSB suplementado con glucosa (0.4%) y extracto de levadura (0.3%). TSST, toxina del síndrome del shock tóxico. UFC, unidades formadoras de colonias. VNC(7/13/15/20), vacuna neumocócica conjugada (7/13/15/20)-valente. VNP23, vacuna neumocócica polisacarídica 23-valente. WGA, aglutinina de germen de trigo (Triticum vulgare). ÍNDICE RESUMEN ........................................................................................................................... i SUMMARY ......................................................................................................................... v I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 1 1. STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE: CARACTERÍSTICAS Y PATOGÉNESIS ................ 3 1.1. Aspectos históricos ........................................................................................................................................................................... 3 1.2. Características generales ................................................................................................................................................................... 4 1.2.1. Polisacárido capsular, genes capsulares y tipificación ................................................................................................................ 5 1.2.2. Proteínas de unión a colina o CBPs ............................................................................................................................................ 7 1.3. Importancia clínica ............................................................................................................................................................................ 10 1.3.1. Vacunas frente a S. pneumoniae .............................................................................................................................................. 12 1.3.2. Impacto de las vacunas en la enfermedad neumocócica invasiva ............................................................................................ 15 1.3.3. Resistencia a antibióticos .......................................................................................................................................................... 15 1.4. Patogénesis de la enfermedad neumocócica ................................................................................................................................. 17 1.4.1. Adhesión y colonización ............................................................................................................................................................ 17 1.4.2. Invasión, inflamación y shock .................................................................................................................................................... 19 1.5. Sistema inmune y S. pneumoniae.................................................................................................................................................... 20 1.5.1. El sistema del complemento ...................................................................................................................................................... 20 1.5.2. Fagocitosis y receptores celulares............................................................................................................................................. 24 2. STAPHYLOCOCCUS AUREUS: CARACTERÍSTICAS Y PATOGÉNESIS ..................... 26 2.1. Aspectos históricos ......................................................................................................................................................................... 26 2.2. Características generales ................................................................................................................................................................. 27 2.2.1. Polisacárido capsular en S. aureus ........................................................................................................................................... 28 2.3. Importancia clínica de S. aureus ...................................................................................................................................................... 29 2.3.1. S. aureus resistente a meticilina ................................................................................................................................................ 31 2.4. Mecanismos de patogenicidad de S. aureus ................................................................................................................................. 32 2.4.1. Adhesión y colonización ............................................................................................................................................................ 32 2.4.2. Las toxinas de S. aureus .......................................................................................................................................................... 34 1.5. Sistema inmune y S. aureus ............................................................................................................................................................. 37 2.5.1. El sistema del complemento ...................................................................................................................................................... 37 2.5.2. Fagocitosis y receptores celulares............................................................................................................................................. 38 3. CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOFILMS BACTERIANOS ........................................... 39 3.1. Características de los biofilms ......................................................................................................................................................... 39 3.1.1. Formación de un biofilm ............................................................................................................................................................ 41 3.2. Biofilms de S. pneumoniae ............................................................................................................................................................... 43 3.2.1. Regulación del biofilm neumocócico.......................................................................................................................................... 43 3.2.2. Importancia del CPS en el biofilm neumocócico ........................................................................................................................ 44 3.2.3. Matriz extracelular del biofilm neumocócico .............................................................................................................................. 46 3.3. Biofilms de S. aureus ........................................................................................................................................................................ 47 3.3.1. Regulación del biofilm de S. aureus ......................................................................................................................................... 47 3.3.2. Matriz extracelular del biofilm estafilocócico .............................................................................................................................. 49 3.4. Biofilms mixtos .................................................................................................................................................................................. 51 3.5. Terapias antibiofilm........................................................................................................................................................................... 52 3.6. Los biofilms en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el humo de tabaco ..................................................... 53 II. OBJETIVOS ................................................................................................................. 55 III. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 59 1. ESTIRPES BACTERIANAS Y OLIGONUCLEÓTIDOS .................................................. 61 2. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVOS ................................................................... 65 2.1. Estudios de susceptibilidad antibiótica .......................................................................................................................................... 66 3. REACTIVOS Y OTROS PRODUCTOS ......................................................................... 67 3.1. Obtención de sueros humanos ........................................................................................................................................................ 69 3.2. Obtención del extracto de humo de tabaco .................................................................................................................................... 69 4. CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES ISOGÉNICOS: TRANSFORMACIÓN GENÉTICA.... 70 5. TÉCNICAS DE ADN ..................................................................................................... 70 5.1. Preparación de ADN cromosómico ................................................................................................................................................. 70 5.2. Electroforesis de ADN en geles de agarosa.................................................................................................................................... 71 5.3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación...................................................................................................... 72 5.4. Secuenciación masiva: preparación de librerías, secuenciación y ensamblaje.......................................................................... 72 6. BIOFILMS..................................................................................................................... 73 6.1. Biofilms de S. pneumoniae .............................................................................................................................................................. 73 6.1.1. Inhibición y disgregación del biofilm de S. pneumoniae ........................................................................................................... 74 6.2. Biofilms de S. aureus ........................................................................................................................................................................ 74 6.1.1. Inhibición y disgregación del biofilm de S. aureus .................................................................................................................... 75 6.3. Biofilms mixtos de S. aureus y S. pneumoniae .............................................................................................................................. 76 6.4. Microscopía de barrido láser confocal ........................................................................................................................................... 76 7. ENSAYOS DE DEPOSICIÓN DEL COMPONENTE C3 .................................................. 77 8. OPSONOFAGOCITOSIS .............................................................................................. 77 8.1. Opsonofagocitosis de cultivos planctónicos de S. pneumoniae y S. aureus ............................................................................. 78 8.2. Opsonofagocitosis de biofilms de S. pneumoniae y S. aureus .................................................................................................... 78 8.3. Fagocitosis mediada por el receptor PSGL-1 ................................................................................................................................. 79 8.4. Opsonofagocitosis de biofilms de S. pneumoniae, S. aureus y biofilms mixtos S. aureus –S. pneumoniae con sueros pre y post VCN13 .............................................................................................................................................................................................. 80 9. MODELOS ANIMALES ................................................................................................. 81 10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................... 81 IV. RESULTADOS ............................................................................................................ 83 1. RELEVANCIA CLÍNICA Y EPIDEMIOLOGÍA DE LOS SEROTIPOS 22F Y 33F INCLUI- DOS EN LAS NUEVAS VACUNAS NEUMOCÓCICAS CONJUGADAS ............................ 85 1.1. Evolución de la enfermedad neumocócica invasiva producida por los serotipos 22F y 33F en España en el periodo 2009– 2021: impacto del SARS-CoV-2 ............................................................................................................................................................... 85 1.2. Análisis genético de los clones circulantes de los serotipos 22F y 33F ...................................................................................... 95 1.3. Caracterización del biofilm de aislados circulantes de los serotipos 22F y 33F ......................................................................... 97 1.4. Mecanismos de patogenicidad de aislados clínicos pediátricos y adultos de los serotipos 22F y 33F.................................. 102 1.5. Interacción del sistema inmune frente a nuevos serotipos vacunales ...................................................................................... 110 2. EVOLUCIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A CEFDITOREN Y OTROS ANTIBIÓTICOS EN AISLADOS CLÍNICOS DE S. PNEUMONIAE EN ESPAÑA DURANTE EL PERIODO 2004– 2020 ............................................................................................................................... 115 3. EPIDEMIOLOGÍA Y PATOGÉNESIS DE S. AUREUS SUSCEPTIBLE/RESISTENTE A METICILINA ................................................................................................................... 126 3.1. S. aureus en España ....................................................................................................................................................................... 126 3.2. Caracterización del biofilm de aislados clínicos SASM y SARM ................................................................................................ 128 3.3. Caracterización de la matriz de los biofilms de aislados clínicos de S. aureus ....................................................................... 134 3.4. Evolución del biofilm de aislados clínicos de S. aureus ............................................................................................................ 143 3.5. Evasión del sistema inmune en S. aureus .................................................................................................................................... 155 4. BIOFILMS MIXTOS DE S. AUREUS Y S. PNEUMONIAE ........................................... 160 4.1. Desarrollo de un biofilm mixto de S. aureus y S. pneumoniae ................................................................................................... 160 4.2. Terapias frente a biofilms mixtos de S. aureus y S. pneumoniae .............................................................................................. 168 4.2.1. Los efectos bactericidas de NAC y Cys en los biofilms mixtos SASM-Sp y SARM-Sp............................................................ 168 4.2.1. Efecto bactericida de los enzibióticos Cpl-711 y CHAPk en los biofilms mixtos SASM-Sp y SARM-Sp .................................. 175 4.2.3. Los efectos bactericidas del enzibiótico de tercera generación ChiDENPs-711...................................................................... 179 5. EFECTO DEL EXTRACTO DE HUMO DE TABACO EN BIOFILMS DE S. AUREUS y BIOFILMS MIXTOS DE S. AUREUS–S. PNEUMONIAE .................................................. 183 5.1. Efecto del EHT en biofilms de S. aureus ....................................................................................................................................... 183 5.2. Efecto del EHT en biofilms mixtos de S. aureus–S. pneumoniae ............................................................................................... 194 6. EFECTO DE LA VACUNA CONJUGADA NEUMOCÓCICA 13-VALENTE EN LA COLO- NIZACIÓN DE S. PNEUMONIAE y S. AUREUS ............................................................. 202 6.1. Estudio de la evasión del sistema inmune por biofilms de serotipos vacunales de neumococo incluidos en la VCN13 ..... 202 6.2. Evaluación de sueros de pacientes con tratamientos de metotrexato y rituximab vacunados con VCN13 y PPV23 ............ 206 6.3. Impacto de la vacunación con la VCN13 en la colonización de S. aureus ................................................................................ 207 V. DISCUSIÓN................................................................................................................ 211 1. RELEVANCIA CLÍNICA Y EPIDEMIOLOGÍA DE LOS SEROTIPOS 22F Y 33F INCLUI- DOS EN LAS NUEVAS VACUNAS NEUMOCÓCICAS CONJUGADAS .......................... 213 2. EVOLUCIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A CEFDITOREN Y OTROS ANTIBIÓTICOS EN AISLADOS CLÍNICOS DE S. PNEUMONIAE EN ESPAÑA DURANTE EL PERIODO 2004– 2020 ............................................................................................................................... 221 3. EPIDEMIOLOGÍA Y PATOGÉNESIS DE S. AUREUS SUSCEPTIBLE/RESISTENTE A METICILINA ................................................................................................................... 225 4. BIOFILMS MIXTOS DE S. AUREUS Y S. PNEUMONIAE ........................................... 235 5. EFECTO DEL EXTRACTO DE HUMO DE TABACO EN BIOFILMS DE S. AUREUS Y BIOFILMS MIXTOS DE S. AUREUS–S. PNEUMONIAE .................................................. 245 6. EFECTO DE LA VACUNA CONJUGADA NEUMOCÓCICA 13-VALENTE EN LA COLO- NIZACIÓN DE S. PNEUMONIAE Y S. AUREUS ............................................................. 250 VI. CONCLUSIONES .......................................................................................... 255 VII. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 259 ANEXO I: ARTÍCULOS PUBLICADOS............................................................... 305 RESUMEN i Streptococcus pneumoniae y Staphylococcus aureus: enfermedad inva- siva, biofilm y terapia Streptococcus pneumoniae (neumococo) es el principal responsable de neumonía bacteriana adquirida en comunidad. Su principal factor de virulencia es el polisacárido capsular (CPS), dividiéndolo en, al menos, 101 serotipos. Entre un 5–10% de adultos y un 20–40% de niños, están colonizados por este patógeno, siendo este estado de portador en la nasofaringe, un prerrequisito para la posterior diseminación a vías es- tériles y producir enfermedad neumocócica invasiva (ENI). La ENI es prevenible por vacunación, en la actualidad se usan en España dos vacunas: la vacuna conjugada 13-valente (VCN13) y la vacuna polisacarídica 23-valente (VPN23). Desde la intro- ducción de las vacunas conjugadas se ha observado un fenómeno denominado re- emplazo de serotipos. Staphylococcus aureus, es otro patógeno relevante responsable de un rango amplio de infecciones, desde menos graves como la foliculitis hasta infecciones invasivas graves como la endocarditis. S. aureus posee un gran arsenal de factores de virulen- cia como el CPS, presente en más del 90% de los aislados clínicos. Su principal relevancia clínica reside en su resistencia a antibióticos, especialmente S. aureus resistente a meticilina (SARM). S. aureus coloniza hasta el 80% de individuos. La mayoría de las bacterias pueden formar biofilms. El biofilm neumocócico se asocia al estado portador y a enfermedades infecciosas crónicas como otitis media y sinusi- tis. El biofilm de S. aureus también se encuentra extendido en clínica, produciendo infecciones asociadas a dispositivos médicos invasivos y mostrando una regulación compleja y multifactorial. Los biofilms estafilocócicos se pueden dividir según su ma- triz extracelular: biofilms de matriz polisacarídica (ica-dependientes) o biofilms de ma- triz extracelular rica en proteínas y ADN extracelular (ica-independientes). En infec- ciones asociadas a biofilms, estos suelen estar integrados por varias especies, por lo que biofilms mixtos de patógenos como S. aureus y S. pneumoniae son habituales en clínica, por ejemplo, en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), pro- ducida a consecuencia del tabaquismo. En esta Memoria, se ha evaluado la epidemiología de los serotipos 22F y 33F cau- santes de ENI en España. La incidencia por los serotipos 22F y 33F ha aumentado RESUMEN ii desde la introducción de la VCN13, sobre todo en la población adulta ≥65 años. Desde la pandemia por el virus SARS-CoV-2 (2020) ha ocurrido una caída drástica en el número de casos y la incidencia de ambos serotipos. Los clones circulantes predominantes fueron el ST43322F y el ST71733F. La caracterización del biofilm de aislados clínicos de ambos serotipos mostró que los aislados clínicos pediátricos for- man mayor biofilm que los aislados clínicos adultos. Se observó una mayor evasión del sistema inmune en los biofilms del serotipo 22F. Además, se evaluó la suscepti- bilidad en aislados clínicos de S. pneumoniae no sensibles a penicilina a diferentes antibióticos durante el periodo 2004-2020. El cefditoren mostró ser una buena elec- ción como cefalosporina oral para el tratamiento de infecciones por S. pneumoniae. Por último, se observó que desde la introducción de la VCN13 se está produciendo un aumento de aislados clínicos de S. pneumoniae no susceptibles a antibióticos que pertenecen a serotipos no vacunales. Se caracterizó la formación de biofilm de aislados clínicos de S. aureus que poseen distintas toxinas y no se observó una relación entre factores de virulencia y formación de biofilm. Los aislados con toxina exfoliativa A mostraban un patrón de biofilm bimo- dal de buenas formadoras de biofilm y malas formadoras de biofilm. Al analizar la matriz de estos aislados se observó una diferencia notable en la biomasa según el tiempo de incubación del biofilm. Por ello, se estudió la evolución de los biofilms du- rante 28 h observándose que las cepas malas formadoras de biofilm mostraban una evolución irregular, formando buen biofilm a las 16 y 23 h y un mal biofilm a las 19 y 24 h. Por último, se confirmó que el biofilm de S. aureus evade mejor la opsonofa- gocitosis que un cultivo planctónico de manera independiente del sistema del com- plemento. El receptor de leucocitos PSGL-1 no reconoce específicamente a S. au- reus. Se desarrolló dos biofilms mixtos in vitro de S. aureus y S. pneumoniae utilizando una cepa de S. pneumoniae del serotipo 19A y una cepa SASM o SARM. S. pneumoniae necesita una ventaja en el inóculo y en el cultivo planctónico para alcanzar una po- blación similar a la de S. aureus en el biofilm mixto. Los modelos se utilizaron para probar nuevas terapias antibiofilm con la cisteamina (Cys) y la N-acetil-L-cisteína (NAC). Cys fue un candidato ideal para la prevención y NAC para el tratamiento de los biofilms mixtos. RESUMEN iii Se evaluó el efecto del extracto de humo de tabaco (EHT) en biofilms de S. aureus y en biofilms mixtos S. aureus-S. pneumoniae. Los resultados mostraron que el EHT incrementa la formación de biofilm de S. aureus, teniendo mayor efecto en aislados clínicos malos formadores de biofilm a las 24 h. En los biofilms mixtos, el EHT también aumentó la viabilidad de ambas poblaciones integrantes del biofilm. El último objetivo fue evaluar el impacto de la VCN13 en los biofilms de serotipos vacunales y no vacunales de S. pneumoniae y en S. aureus. Se observó protección en los sueros de pacientes vacunados frente a biofilms de los serotipos 3, 18C, 19F y 19A, pero no frente al biofilm del serotipo vacunal 14. En pacientes sometidos a tratamientos biológicos sólo se encontró protección frente al biofilm del serotipo 19F. Por último, se confirmó que la vacunación no tenía ningún efecto frente a biofilms de S. aureus. Como conclusiones de esta Memoria, la vigilancia epidemiológica tanto de los sero- tipos emergentes de S. pneumoniae como de la resistencia a antibióticos es necesa- ria. Los biofilms de S. aureus presentan evoluciones irregulares en su desarrollo. La Cys y la NAC son buenos candidatos como terapia frente a biofilms mixtos S. aureus- S. pneumoniae. El EHT induce aumento de la viabilidad y biomasa del biofilm. La VCN13 protege frente al estado portador de serotipos vacunales de neumococo y no tiene efecto sobre biofilms de S. aureus. SUMMARY v Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus: invasive dis- ease, biofilm and therapy Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is the main responsible of bacterial com- munity-acquired pneumonia. Its main virulence factor is the capsular polysaccharide (CPS), which classifies the pneumococcus in at least 101 different serotypes. Be- tween 5-10% of adults and up to 40% of children are colonized asymptomatically, being the carrier state a requirement for the development of invasive pneumococcal disease (IPD). IPD is vaccine-preventable, there are two vaccines used in Spain: the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV13) for children and adults and the 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine (PPV23) for adults. Since the intro- duction of conjugate vaccines, non-vaccine serotypes have emerged, a phenomenon called serotype replacement. Staphylococcus aureus, also a relevant pathogen, is responsible for a wide range of diseases: from less severe such as folliculitis to severe invasive diseases like endo- carditis. S. aureus has an arsenal of virulence factors to evade the immune system including a CPS, present in up to 90% of clinical isolates. The main clinical relevance of S. aureus remains in its great clinical impact due to the antibiotic resistance, spe- cifically caused by methicillin-resistant S. aureus (MRSA) strains. S. aureus colonizes up to 80% of the population. Most bacteria can form biofilms. Pneumococcal biofilm is associated with the carrier state and chronic infections such as otitis media and sinusitis. S. aureus biofilm is also relevant in clinical practice, as it is associated with infections on indwelling medical devices. Staphylococcal biofilms can be divided into two categories depending on the composition of the extracellular matrix: biofilms with polysaccharide matrix (ica-de- pendent) or biofilms with a protein and extracellular DNA matrix (ica-independent). We usually find mixed biofilms causing infections, and mixed biofilms by pathogens such as S. aureus and S. pneumoniae are worrisome in clinical practice. For example, mixed biofilms can be implicated in chronic obstructive pulmonary diseases (COPD), one of the consequences of tobacco consumption. SUMMARY vi In the present Thesis, we have evaluated the epidemiology of IPD caused by sero- types 22F and 33F in Spain. Since the introduction of PCV13, the incidence by sero- types 22F and 33F has increased, especially in adults ≥ 65 years old. But SARS-CoV- 2 (2020) pandemic has produced a drastic drop in cases and incidence by both sero- types. The main circulating clones were ST43322F and ST71733F. We characterized the biofilm of clinical isolates of both serotypes, observing that pediatric isolates formed greater biofilm than adult isolates. We also observed a better immune evasion by serotype 22F. Moreover, we evaluated the evolution of non-susceptible to penicillin pneumococcal clinical isolates to different antibiotics, including oral cephalosporins, during the period 2004-2020. 2020. The oral cephalosporin cefditoren showed the best potential to treat infections by S. pneumoniae. Finally, since the introduction of PCV13, we have observed an increase of non-PVC13 isolates with reduced suscep- tibility to antibiotics. We characterized the biofilm formation of several clinical isolates expressing different toxins to study a potential moonlighting effect (extracellular matrix stabilization by al- kaline virulence factor). We did not observe a clear relationship between virulence factors and biofilm formation. Exfoliative toxin A positive clinical isolates showed a bimodal pattern of good/bad biofilm. When we analyzed the composition of their ex- tracellular matrix, we observed a remarkable difference in biofilm formation between incubations. Thus, we examined biofilm formation during a 28 h period and we ob- served that bad biofilm former strains showed irregular patterns, with periods of bad biofilm formation (20 and 24 h) and periods of good biofilm formation (16 and 23 h). Finally, we confirmed that the evasion of the opsonophagocytosis by S. aureus bio- films was complement-independent. Moreover, we found that the PSGL-1 receptor did not recognize S. aureus. We developed two in vitro S. aureus and S. pneumoniae mixed biofilms using a sero- type 19A S. pneumoniae strain and a MSSA or MRSA strain. In the mixed biofilm, S. pneumoniae needs an advantage in the inoculum and the planktonic culture to reach a similar population as S. aureus. We used both models to test new antibiofilm thera- pies by cysteamine (Cys) and N-acetyl-L-cysteine (NAC). Cys is an ideal candidate for prevention and NAC for the treatment of mixed biofilms. SUMMARY vii We evaluated the effect of tobacco smoke extract (TSE) on S. aureus biofilms and S. aureus–S. pneumoniae mixed biofilms. TSE increased biofilm formation in S. aureus, having a greater effect in bad biofilm former strains at 24 h. In mixed biofilms, TSE increased the viability of both populations within the biofilm. The last objective of the present Ph.D. thesis was to evaluate the impact of PCV13 in biofilms of different S. pneumoniae vaccine and non-vaccine serotypes and in S. au- reus. We observed protection in vaccinated patients against biofilms of serotypes 3, 18C, 19F, and 19A, but we did not observe protection against the vaccine serotype 14. Vaccinated patients with biological therapies only showed protection against sero- type 19F biofilm. Finally, vaccination with PCV13 did not have any effect against S. aureus. In conclusion, epidemiological surveillance of S. pneumoniae emergent serotypes and antibiotic resistance is necessary. S. aureus biofilms showed irregular patterns during biofilm formation. Cys and NAC are good therapeutical candidates against S. aureus– S. pneumoniae mixed biofilms. TSE increases viability and biomass within the bio- films. Finally, PCV13 protects against the carrier state of certain vaccine serotypes and does not have any effect on S. aureus biofilms. I. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 3 1. STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE: CARACTERÍSTICAS Y PATOGÉNESIS 1.1. Aspectos históricos Streptococcus pneumoniae, conocido como neumococo, es una bacteria que fue des- cubierta de manera simultánea por Sternberg y Pasteur en 1880, aunque Pasteur (Pasteur, 1881) hizo públicas sus observaciones antes que Sternberg (Sternberg, 1881). En 1884, Gram desarrolló la tinción que lleva su nombre para facilitar la visua- lización de neumococo en el tejido pulmonar, categorizándolo como Gram-positivo (Gram, 1884). Ese mismo año se denominó a la bacteria como Micrococcus pneu- moniae (Klein, 1884), más tarde como Diplococcus pneumoniae debido a los pares de cocos que formaba el patógeno (Weichselbaum, 1886) y, finalmente en 1901, S. pneumoniae (Chester, 1909), aunque no fue oficialmente aceptada hasta 1980 (Skerman et al., 1980). Neumococo ha desempeñado un papel fundamental en el nacimiento de la biología molecular. Los estudios de Griffith que dieron evidencia de la transformación genética bacteriana fueron realizados con S. pneumoniae. Griffith demostró que cuando se inoculaba en un ratón una mezcla de células capsuladas muertas por calor junto a células no capsuladas vivas (que no eran virulentas) se producía una infección letal y las bacterias recuperadas presentaban un tipo capsulado (Griffith, 1928). A la sus- tancia que causaba este cambio lo denominó “principio transformante”, que fue pos- teriormente identificado como el ADN (Avery et al., 1944). A su vez, Klemper y Klem- per, demostraron que el suero de conejos inoculados con la bacteria muerta por calor o con filtrado del medio de cultivo confería inmunidad frente a una infección por el mismo aislado, pero no necesariamente frente a infecciones por otros aislados clíni- cos. Además, esto demostraba que los sueros de conejos previamente inmunizados protegían a los conejos de la infección por neumococo (Austrian, 1981). En los años 20 del siglo XX se demostró que el polisacárido capsular (CPS) era el responsable de la actividad inmunológica descrita frente a neumococo, convirtiéndose en el primer antígeno no proteico identificado (Heidelberger y Avery, 1923, Heidelberger y Avery, 1924, Heidelberger et al., 1925). INTRODUCCIÓN 4 1.2. Características generales S. pneumoniae es una bacteria Gram-positiva, de 0.5–1.25 µm de longitud con una forma oval, siendo los extremos distales lanceolados. Generalmente encontramos a este microorganismo formando parejas (diplococos) o cadenas cortas. Es inmóvil y no forma endosporas. Está considerado un miembro α-hemolítico del género Strep- tococcus, ya que al ser cultivado en placas de agar sangre en aerobiosis presenta una marcada α-hemólisis debido a la producción de peróxido de hidrógeno (Barnard y Stinson, 1996), pero al ser incubado en anaerobiosis, se observa una β-hemolisis debido a la acción de la neumolisina (Ply) (Brzin, 1969). Además, es una bacteria ácido-láctica, anaerobia facultativa, catalasa-negativa y sensible a las sales biliares como el desoxicolato sódico (DOC). La sensibilidad a sales biliares se debe princi- palmente a que disparan la acción de la principal autolisina del neumococo, LytA, que degrada la pared en un proceso dependiente de colina (Mosser y Tomasz, 1970). S. pneumoniae es auxótrofo de colina, siendo este aminoalcohol imprescindible para el crecimiento de este microorganismo (Tomasz, 1967) y, en forma de fosforilcolina (P- Cho), un componente estructural de los ácidos teicoicos (TAs) y lipoteicoicos (LTAs) de la pared celular (Brundish y Baddiley, 1968, Fischer et al., 1993). Otra caracterís- tica, a parte de la lisis en presencia de DOC, que nos sirve para identificar aislados clínicos de neumococo es su sensibilidad a optoquina (Opt) (Lund y Henrichsen, 1978). Esta sensibilidad a la optoquina, un derivado de la quinina, se debe a que es un inhibidor específico de proteínas presentes en la subunidad F0 de la ATPasa pro- tón-motriz (H+-ATPasa) de neumococo (Fenoll et al., 1994). Sin embargo, se han en- contrado aislados de neumococo que son Opt-resistentes (de la Campa et al., 1997) y estreptococos filogenéticamente próximos a neumococo (estreptococos del grupo mitis como Streptococcus pseudopneumoniae, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis y Streptococcus infantis) que son Opt-sensibles (Martín-Galiano et al., 2003, Balsalobre et al., 2006). Sobre la base de lo anterior, es recomendable utilizar la sen- sibilidad a Opt junto a la lisis en presencia de DOC para poder realizar un diagnóstico correcto. Neumococo es un patógeno humano aunque, de forma excepcional, se hayan aislado neumococos a partir de animales de compañía y otros que habían estado previa- mente en contacto con humanos (van der Linden et al., 2009). INTRODUCCIÓN 5 1.2.1. Polisacárido capsular, genes capsulares y tipificación Una de las principales características de S. pneumoniae es su cápsula (Figura 1), siendo su principal factor de virulencia ya que bloquea el reconocimiento del micro- organismo por parte del hospedador impidiendo así la fagocitosis (Llull et al., 2001b, Hyams et al., 2010a, Geno et al., 2015). El CPS es la estructura más externa y está formada por polisacáridos complejos basados en unidades repetidas de azúcares. Este se encuentra unido de manera covalente a azúcares de la pared celular (Larson y Yother, 2017), lo cual dificulta el análisis del CPS ya que se requiere de manera pura para poder analizar su estructura (Sørensen et al., 1990). Estas unidades repe- tidas de azúcares suelen tener de dos a diez residuos y a menudo sustituciones de O-acetil, fosfoglicerol y piruvyl acetal en diferentes sitios/ratios (Calix et al., 2012). En la actualidad se han descrito hasta 101 serotipos capsulares (Ganaie et al., 2020, Pimenta et al., 2021), divididos en 46 serogrupos numerados del 1 al 48 (no se utili- zaron los números 26 y 30), de los cuáles algunos incluyen un único serotipo (como el 1 y el 3) y otros hasta 7 (como el serogrupo 6). Tradicionalmente el primer serotipo de un serogrupo se ha descrito con la letra F (por first) (Lund, 1970). La mayoría de CPS son aniónicos, por lo que la mayoría de aislados clínicos tienen carga negativa, que ayuda a neumococo a que no sean eliminados por el mucus, además de repeler por cargas electroestáticas la fagocitosis (Nelson et al., 2007, Geno et al., 2015). Hay varias excepciones, entre ellas los serotipos 7A, 7F, 14, 33F, 33A y 37 que no están cargados (Kamerling, 1999, Lin et al., 2013) Figura 1. Imagen al microscopio electrónico de transmisión de una cepa capsulada del serotipo 19F de neumococo. Se observa el diplococo y la cápsula polisacarídica que rodea a las células. Reproducido de Amerighi et al., 2016. INTRODUCCIÓN 6 El locus responsable de la síntesis del CPS es el locus cap o cps, que se encuentra situado entre los genes dexB y aliA (sin ningún tipo de relación con la síntesis del CPS) a excepción del serotipo 37, cuya síntesis de CPS depende de una única pro- teína codificada por el gen tts situado lejos del locus cap (Llull et al., 2001a, Bentley et al., 2006, Moscoso y García, 2009). La mayoría de serotipos, a excepción de los serotipos 3 y 37, sintetizan su CPS mediante un mecanismo polimerasa-dependiente (Wzy), en la cual las subunidades repetidas se unen individualmente a undecaprenil fosfato en la cara interna de la membrana (Arrecubieta et al., 1996, Llull et al., 2001a). Por otro lado, en los serotipo 3 y 37 son glicosiltransferasa-(sintasa-)dependientes y las secuencias comunes que codifican proteínas con función reguladora no están presentes (serotipo 37) (Llull et al., 2001a) o están mutadas (serotipo 3) (Arrecubieta et al., 1996). La regulación de la cápsula es compleja, de manera que hay fenómenos de transformación y recombinación en los cuáles los genes que codifican para un tipo de cápsula son intercambiados; este suceso denominado capsular switching es im- portante porque puede dar lugar a fenómenos de escape a las vacunas (Brueggemann et al., 2007). La tipificación de neumococo se ha basado tradicionalmente en la serotipificación mediante la reacción capsular, llamada Quellung (Neufeld, 1902), utilizando anticuer- pos contra el CPS obtenidos en conejos mediante inoculación de células tratadas con formaldehído (Mørch, 1942). Otras técnicas de reacción capsular se han desarrollado posteriormente para simplificar el procedimiento (Fenoll et al., 1997, Marimon et al., 2010). La necesidad de identificar diferentes aislados del mismo serotipo que mos- traban diferentes patrones de resistencia a antibióticos hizo que se desarrollasen téc- nicas moleculares como la electroforesis de ADN genómico de campo pulsante (PFGE) (Gasc et al., 1991, Lefevre et al., 1993) y, posteriormente, la técnica de se- cuenciación multilocular (MLST, Multilocus Sequence Typing) (Enright y Spratt, 1999). La técnica MLST, es junto a la reacción capsular, la técnica más usada hoy en día para la tipificación de neumococo. Se basa en los mismos principios que la electroforesis enzimática multilocular (MLEE) (Selander et al., 1986, Hall et al., 1996) pero, el MLST, utiliza la comparación de secuencias parciales de siete genes muy conservados (housekeeping) que definen el denominado secuencitipo (ST), en lugar de la movilidad electroforética de sus productos respectivos. Esto permite una com- paración sencilla gracias a una base de datos que se ha creado en internet (Enright INTRODUCCIÓN 7 y Spratt, 1998, Jolley et al., 2018). Además, existen programas que permiten agrupar los diferentes STs en complejos clonales (CC), que son el conjunto de STs idénticos y los que difieren entre sí con al menos un miembro del grupo en sólo uno de los siete genes (Feil et al., 2004). Los siete genes usados en el MLST de neumococo son: aroE (siquimato deshidrogenasa), gdh (glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), gki (glu- coquinasa), recP (transcetolasa), spi (peptidasa señal I), xpt (xantina fosforribosil- transferasa) y ddl (D-alanina-D-alanina ligasa). A partir del MLST se desarrolló pos- teriormente el análisis mediante secuenciación multilocular (MLSA, Multilocus Se- quence Analysis), que utiliza genes diferentes a los de la MLST para identificar espe- cies de estreptococos α-hemolíticos, viridans, que están relacionados con S. pneu- moniae y que son difíciles de diferenciar por otros métodos (Hanage et al., 2006, Bishop et al., 2009) 1.2.2. Proteínas de unión a colina o CBPs Las proteínas de unión a colina (CBPs) se pueden encontrar en todas las cepas de neumococo, localizadas en la superficie celular (Maestro y Sanz, 2016). Estas pro- teínas se basan en la suma de dos dominios diferentes: un dominio funcional y un dominio de unión a colina (CBD) conservado. El dominio funcional es el responsable de la actividad biológica de la proteína mientras que el CBD permite a las proteínas la unión no-covalente a los residuos de P-Cho de los TAs y LTAs de la pared celular del neumococo (García et al., 1990). A excepción de las mureín hidrolasas LytB y LytC, el módulo de unión a colina se encuentra en el C-terminal que, en el caso de PspA y PspC, está precedido por una región rica en prolina (Brooks-Walter et al., 1999). El número de CBPs en neumococo es cepa-dependiente, pero suele haber entre 13 y 16 CBPs por cepa (Maestro y Sanz, 2016). Muchas de las CBPs se pueden encontrar en otras especies comensales cercanas a neumococo con residuos de P- Cho en su pared celular como S. mitis, S. pseudopneumoniae y S. oralis (Moscoso et al., 2005, Llull et al., 2006, Reichmann et al., 2011). También se pueden encontrar en otras especies bacterianas más alejadas filogenéticamente de neumococo como Clostridium beijerinckii (García et al., 1988, Podvin et al., 1988, Sánchez-Beato y García, 1996), Clostridiodes difficile (Demarest et al., 2005, Ho et al., 2005) y Erysi- pelothrix rhusiopathiae (Makino et al., 2000, To y Nagai, 2007, da Silva et al., 2008, Ogawa et al., 2011) INTRODUCCIÓN 8 Algunas CBPs, como LytA, LytB, LytC, Pce y CbpD, están implicadas en la hidrólisis de diferentes enlaces covalentes de la pared celular de S. pneumoniae. La principal hidrolasa de la pared celular, N-acetylmuramoyl-L-alanina amidasa o LytA, es la prin- cipal enzima autolítica de neumococo. LytA produce la lisis de la pared celular de neumococo, liberando la citotoxina Ply y mediadores inflamatorios como los TAs y fragmentos de peptidoglicano (Canvin et al., 1995). Se han descrito dos familias de alelos del gen lytA, pero estos polimorfismos no afectan a la estructura primaria de la proteína ya que se conservan todos los aminoácidos (Morales et al., 2010). Otra de las hidrolasas de la pared celular es LytB, una N-acetylglucosaminidasa la cual tiene un amplio espectro de funciones, como participar en la colonización de la nasofaringe (Ramos-Sevillano et al., 2011), es responsable de la separación celular después del ciclo celular (de Las Rivas et al., 2002), tiene un papel activo y estructural en la for- mación y mantenimiento de los biofilms neumocócicos (Domenech y García, 2020) y también está implicada en la evasión del sistema inmune (Ramos-Sevillano et al., 2011). A pesar de tener polimorfismos en las repeticiones del módulo de unión a colina, LytB es una proteína bien conservada (Moscoso et al., 2005). La tercera hi- drolasa de la pared celular es LytC, una enzima autolítica que rompe los residuos N- acetylmuramoyl-N-glucosaminyl del polisacárido de la pared celular (García et al., 1999). La mayoría de aislados clínicos poseen el gen lytC, además de ser el gen de neumococo con más expresión en la nasofaringe humana (Sakai et al., 2013). Entre las funciones de LytC destaca su papel en la colonización (Ramos-Sevillano et al., 2011), en la formación de biofilms (Moscoso et al., 2006), su participación en el fenó- meno conocido como fratricidio (Claverys y Håvarstein, 2007) y su habilidad para evadir el sistema inmune por diferentes mecanismos (Ramos-Sevillano et al., 2011). CbpF, una de las CBPs más abundantes en la pared celular de neumococo, no posee actividad catalítica pero funciona como regulador de LytC, interactuando con el pep- tidoglicano de la pared celular e impidiendo el acceso de LytC y otras lisozimas a este sustrato (Molina et al., 2009). Pce es una esterasa de residuos P-Cho de los TAs y LTAs (Höltje y Tomasz, 1974, Vollmer y Tomasz, 2001, de las Rivas et al., 2001). Su principal función es participar en la distribución y restructuración del contenido de colina en la pared celular; por lo tanto, Pce regula indirectamente la actividad de las otras CBPs (Hermoso et al., 2005). Esta regulación de residuos de P-Cho hace tam- bién que el reconocimiento de la bacteria por la proteína C-reactiva (CRP) esté dis- minuido, por lo que el patógeno podrá evadir el sistema inmune (Kharat y Tomasz, INTRODUCCIÓN 9 2006). Por último, está la CbpD, implicada en la división de S. pneumoniae y expre- sada durante la fase de competencia (Kausmally et al., 2005). Esta proteína en culti- vos líquidos participa en el fratricidio junto a LytA, LytC y CibAB (Guiral et al., 2005). Otra pareja de CBPs con alta importancia biológica son PspA y PspC. PspA es una de las CBPs más estudiadas, ya que prácticamente se encuentra en todos los aisla- dos clínicos (Crain et al., 1990, Hollingshead et al., 2000). PspA es muy variable y se divide en dos grandes familias basadas en las diferencias de la región helicoidal si- tuada antes de la región rica en prolina (Hollingshead et al., 2000). Es esencial en la patogénesis de neumococo ya que interfiere con la activación del complemento, im- pidiendo la deposición de C3b, C5b (Tu et al., 1999, Ren et al., 2004b, Ren et al., 2012) e inhibiendo la proteína C-reactiva (Mukerji et al., 2012), y se une a lactoferrina protegiendo a neumococo del polipéptido (Hammerschmidt et al., 1999, Jedrzejas, 2006). PspC, al igual que PspA, tiene una gran variabilidad y, a nivel de alelos, se puede clasificar en 11 grupos diferentes (Brooks-Walter et al., 1999, Du et al., 2021). PspC participa en adhesión y colonización de la nasofaringe, en la colonización del pulmón y promueve la invasión (Rosenow et al., 1997, Balachandran et al., 2002). Además, evade el sistema inmune de diferente maneras, mediante la unión al recep- tor polimérico de inmunoglobulinas (Hammerschmidt et al., 1997, Kerr et al., 2006) y a la evasión del complemento, reclutando a los reguladores negativos Factor H (fH) y C4BP (Janulczyk et al., 2000, Dave et al., 2001, Jarva et al., 2002, Hammerschmidt et al., 2007, van der Maten et al., 2018) y evitando la lisis por el complejo terminal del complemento (TCC) mediante la unión a vitronectina (Voss et al., 2013, Kohler et al., 2015). También cabe destacar las CBPs que principalmente tienen función como adhesinas. Un ejemplo de este grupo son la PcpA, que forma parte de la subfamilia de proteínas con repeticiones ricas en leucinas en el N-terminal (LRRTP) (Glover et al., 2008, Frolet et al., 2010). PcpA, al igual que PspA, se encuentra en todos los aislados clí- nicos, y es importante para el establecimiento de la neumonía neumocócica (Sánchez-Beato et al., 1998, Frolet et al., 2010). En el caso de CbpG, su función dependerá de si está secretada, que se encargará de romper la matriz extracelular del hospedador, o unida a la superficie bacteriana, participando en la adhesión a la mucosa de la nasofaringe (Gosink et al., 2000). También está CbpM, cuya función está menos estudiada, pero se demostró que podía unirse a fibronectina, participando INTRODUCCIÓN 10 en la adhesión al epitelio de neumococo (Afshar et al., 2016), además de supuesta- mente interactuar con la CRP (Frolet et al., 2010). Por último, CbpI (Frolet et al., 2010), CbpJ (Yamaguchi et al., 2019, Xu et al., 2019) y CbpL (Frolet et al., 2010, Yamaguchi et al., 2019) tienen funciones en adhesión y evasión inmune, mientras que CbpK tiene una función desconocida por ahora en la patogénesis de neumococo (Maestro y Sanz, 2016). 1.3. Importancia clínica S. pneumoniae tiene una gran importancia por su gran capacidad para causar enfer- medad en el ser humano. Esta bacteria se encuentra colonizando la nasofaringe de portadores sanos, principalmente de niños (entre el 20–40% de niños sanos) y oca- sionalmente adultos (5–10%) (Loughran et al., 2019). Esta colonización en el hospe- dador, el estado de portador, comienza poco después del nacimiento, donde neumo- coco establece una relación comensal asintomática (Kadioglu et al., 2008). En algu- nas ocasiones, este equilibrio con el hospedador se rompe, por lo que el patógeno puede invadir nichos estériles y no estériles causando diferentes patologías (Weiser et al., 2018). Las enfermedades infecciosas del tracto respiratorio inferior (EITRI) se asocian a elevadas tasas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Antes de que apareciese el SARS-CoV-2, las EITRI eran la cuarta causa de mortalidad en el mundo con cerca de 2,38 millones de fallecimientos, siendo S. pneumoniae el principal agente etiológico de estas neumonías, afectando de forma mayoritaria a la población menor de 5 años y los adultos por encima de 60 (GBD, 2018). La colonización naso- faríngea es un prerrequisito para el establecimiento de la enfermedad neumocócica invasiva (ENI) y para el establecimiento de enfermedades no invasivas como neumo- nía no invasiva, otitis y sinusitis (Bogaert et al., 2004). Manifestaciones clínicas más graves se dan cuando el neumococo alcanza zonas estériles como la sangre o el líquido cefalorraquídeo (LCR), donde produce enfermedades como neumonía inva- siva, sepsis y meningitis (Figura 2). También puede producir enfermedades como miocarditis, pericarditis y artritis aguda (Henriques-Normark y Tuomanen, 2013, Brown et al., 2014, Shenoy et al., 2017). La ENI puede causar muerte y, sobre todo en los casos de meningitis, está asociada a secuelas (Baraff et al., 1993, Koedel et al., 2002). En un meta-análisis global de meningitis bacterianas se observó que el principal agente etiológico era neumococo tanto en población pediátrica (de un 22.5 INTRODUCCIÓN 11 a un 44.1% de los casos) como en población adulta (de un 9.6 a un 75.5% de los casos) (Oordt-Speets et al., 2018). Figura 2. Esquema de las diversas afecciones producidas por S. pneumoniae. Uno de los principales factores de riesgo de sufrir ENI es la edad. La mayor preva- lencia de neumococo en la población pediátrica se debe a la inmadurez de su sistema inmune, que produce una menor capacidad de responder a antígenos polisacarídi- cos. Además, la colonización y adquisición de nuevas cepas es mayor en esta edad (Hussain et al., 2005). En el caso de la población adulta mayor de 65 años, se da el fenómeno de inmunosenescencia, defectos inmunes asociados a la edad, que con- tribuyen a la mayor carga de enfermedad en esta población (Krone et al., 2014). Hay enfermedades de base que también suponen un mayor riesgo de padecer neumonía neumocócica y ENI, destacando las patologías crónicas cardiovasculares, diabetes mellitus, inmunodeficiencias, asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). También, ciertos hábitos de vida como el tabaquismo, aumentan el riesgo (Torres et al., 2015). Por lo tanto, se puede observar la importancia del estado inmu- nológico del paciente a la hora de sufrir ENI o no; por ejemplo, los pacientes que sufren una primoinfección por el virus de la gripe pueden sufrir una sobreinfección por S. pneumoniae y una forma más grave de la enfermedad (MacIntyre et al., 2018). Es importante destacar que, en la actualidad, la pandemia producida por el SARS- INTRODUCCIÓN 12 CoV-2 causante de la COVID19, ha provocado un colapso en el sistema sanitario, económico y social mundial. Estudios recientes en pacientes ingresados en las uni- dades de cuidados intensivos por neumonías producidas por SARS-CoV-2, demues- tran que neumococo puede ser uno de los patógenos bacterianos que pueden pro- ducir coinfecciones con este virus, incrementando la severidad de la neumonía por SARS-CoV-2 (Contou et al., 2020, Nieto-Moro et al., 2020, Cucchiari et al., 2020). 1.3.1. Vacunas frente a S. pneumoniae La prevención de la ENI es esencial ya que, como se ha mencionado previamente, se trata de una de las principales causas de mortalidad dentro de las enfermedades infecciosas. En la actualidad existen dos tipos de vacunas frente a S. pneumoniae y ambas utilizan el principal factor de virulencia del neumococo, el CPS. Los primeros ensayos clínicos para encontrar una vacuna frente a la enfermedad neumocócica fueron utilizando una vacuna de célula entera en Sudáfrica en 1914 (Wright et al., 1914, Moberley et al., 2013). Posteriormente se decidió usar aproximaciones con po- lisacárido purificado, primero una vacuna neumocócica polisacarídica de cuatro se- rotipos (VNP4) (MacLeod et al., 1945), luego se realizaron diferentes ensayos clínicos de una VNP6, una VNP13 y una VNP14 (Austrian, 1977, Riley et al., 1977), esta última mostró una elevada eficacia frente a la neumonía bacteriémica. Estas vacunas contenían 50 µg del CPS de cada serotipo purificado. La VNP14 se licenció en Esta- dos Unidos en 1977 pero, en 1983, se sustituyó por una formulación con 23 CPS, la VNP23, que contenía 25 µg de cada CPS (Moberley et al., 2013). La mencionada VNP23 contiene los polisacáridos capsulares de los 23 principales serotipos que causaban ENI en el momento de su desarrollo (1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F Y 33F). Esta vacuna de contenido polisacarídico tiene una serie de limitaciones, ya que sólo está recomendada en población mayor de dos años y la respuesta inmune humoral que produce es independiente de linfocitos T. Por lo tanto, produce anticuerpos pero no una memoria inmunológica, disminuyendo su papel protector a lo largo del tiempo (Stein, 1992, Andrews et al., 2012, Hayward et al., 2016). La VNP23 tampoco evita el estado de portador asintomático y su capacidad de prevenir la neumonía neumo- cócica es limitada (Jackson et al., 2003). INTRODUCCIÓN 13 Debido a dichas limitaciones, en 2000 se comercializó la primera vacuna conjugada contra neumococo, la vacuna neumocócica conjugada 7-valente (VNC7), que solu- cionaba alguna de las limitaciones de la polisacarídica: podía ser suministrada desde los dos meses de edad y produce memoria inmunológica, siendo una vacuna eficaz y segura. En esta formulación al estar combinados los CPS con una proteína inmu- nogénica, el toxoide diftérico, podía producir una respuesta inmune dependiente de linfocitos T (Hayward et al., 2016). La principal limitación de la VCN7 fue su número reducido de polisacáridos capsulares diferentes, ya que sólo cubría 7 serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F). Posteriormente, se han ido desarrollando vacunas con- jugadas que incluyen hasta 10 y 13 serotipos, como son la VNC10 (cubre los seroti- pos de la VCN7 más los serotipos 1, 5 y 7F, utilizando, además, una proteína trans- portadora o carrier diferente a la VNC7/VNC13) y la VCN13, que es la más utilizada en la actualidad (cubre los serotipos de la VNC10 más los serotipos 3, 6A y 19A). Actualmente están muy próximas de ser autorizadas por las agencias reguladoras y comercializarse la VNC15 (cubrirá los serotipos de la VCN13 más los serotipos 22F y 33F) (Greenberg et al., 2018, Stacey et al., 2019) y la VNC20 (cubrirá los serotipos de la VCN13 más los serotipos 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F, y 33F) (Thompson et al., 2019, Hurley et al., 2020) (Figura 3). Diferentes estudios han demostrado que la VCN13 no sólo tiene efecto frente a la ENI sino que también disminuye la neumonía neumocócica y el estado del portador, teniendo un efecto rebaño o de inmunidad indirecta en la población adulta (Bonten et al., 2015, McLaughlin et al., 2018). Debido al limitado número de serotipos que puede cubrir una vacuna compuesta por polisacáridos y a fenómenos que explicaremos en el siguiente apartado, se están desarrollando otro tipo de aproximaciones a la vacunación por neumococo. Se estu- dia el uso de vacunas de célula completa, basadas en vacunas atenuadas vivas (Ramos-Sevillano et al., 2020), vacunas atenuadas, extractos crudos (Moffitt et al., 2012, Malley y Anderson, 2012, Xu et al., 2014) o en sistemas acelulares (Zhang et al., 2013). También hay ensayos clínicos de formulaciones usando proteínas candi- datas a vacunas, en los que, en vez de usar una sola, se utilizan combinaciones de diferentes proteínas recombinantes para obtener un efecto complementario en la res- puesta inmune (Briles et al., 2000, Sempere et al., 2021), además de evitar la hete- rogeneidad de las proteínas entre los diferentes aislados clínicos (Gámez et al., 2018). INTRODUCCIÓN 14 Figura 3. Cobertura de las presentes y futuras vacunas antineumocócicas en niños < 5 años y adultos ≥ 65 años basadas en datos epidemiológicos de España de 2019 de Miguel et al 2020. (A) Cobertura de las vacunas VCN13, VCN15 y VCN20 en niños < 5 años. (B) Cobertura de las vacunas VCN13, VCN15, VCN20 y la VNP23 en adultos ≥ 65 años. Los porcentajes corresponden a los casos de ENI notificados en 2019 que cubrirían potencialmente las vacu- nas. INTRODUCCIÓN 15 1.3.2. Impacto de las vacunas en la enfermedad neumocócica invasiva Desde la introducción de las vacunas conjugadas la incidencia de la ENI por serotipos vacunales se ha visto reducida. Por ejemplo, desde la introducción de la VNC7 en 2001 en España (vacunando sólo a población pediátrica y sin estar financiada) dis- minuyó la incidencia por todos los serotipos vacunales tanto en población pediátrica como adulta, mostrando un efecto rebaño en la población adulta (Fenoll et al., 2009, Fenoll et al., 2015). Este mismo fenómeno se observó en otros países como Inglaterra (Ladhani et al., 2013) y EE.UU. (Tan, 2012). El principal problema fue que, en la ma- yoría de países, se produjo el fenómeno denominado reemplazo de serotipos, que consiste en que la vacuna como sólo cubría 7 de los más de 92 serotipos descritos en esa época observaron que otros serotipos estaban ocupando el lugar que habían dejado aquellos que estaban incluidos en la vacuna, apreciando un aumento de por- tación y de incidencia de ENI por serotipos no vacunales (Fenoll et al., 2009, Weinberger et al., 2011, Fenoll et al., 2015). El incremento de serotipos no-VNC7, sobre todo del 19A, hizo necesaria una vacuna conjugada que incluyese más seroti- pos. Desde la introducción de la VNC13, la incidencia de la ENI por serotipos vacu- nales VCN13 se ha reducido aún más (Waight et al., 2015, Pilishvili et al., 2017, Ladhani et al., 2018, de Miguel et al., 2020, Oyewole et al., 2021). Esta vacunación también se ha visto acompañada por un aumento de serotipos no vacunales pudiendo peligrar el efecto de las vacunas conjugadas (Savulescu et al., 2017, Ladhani et al., 2018, Richter et al., 2019, Ouldali et al., 2020), aunque en Estados Unidos los seroti- pos no-VCN13 se han mantenido estables. Esta diferencia se puede deber a las di- ferentes pautas de vacunación pediátrica entre los países, ya que EE.UU. usa una pauta 3+1 (primaria + booster) y, en España como en la mayoría de países europeos, se utiliza una pauta 2+1 (Lewnard y Hanage, 2019). 1.3.3. Resistencia a los antibióticos Una de las medidas más efectivas para combatir el aumento de la resistencia a los antibióticos en S. pneumoniae fue la introducción de las vacunas conjugadas. La VCN7 se asoció con un significativo descenso en las tasas de resistencia antibiótica en S. pneumoniae en muchos países, incluida España (Liñares et al., 2010). Como se explicaba en el párrafo anterior, el fenómeno de reemplazo de serotipos que pro- ducen ENI, sobre todo aquellos asociados a resistencia antibiótica, es preocupante. INTRODUCCIÓN 16 Después de la introducción de la VCN7, empezaron a surgir aislados multirresistentes del serotipo 19A en todo el mundo (Fenoll et al., 2015, Cassiolato et al., 2018). Aun- que la introducción de la VCN13 que cubría este serotipo redujo su tendencia ascen- dente, sigue siendo uno de los serotipos vacunales más frecuentes en ENI (Moore et al., 2015, Glikman et al., 2018, Ladhani et al., 2018). Por otro lado, el uso de la VCN13 ha provocado el aumento de casos por serotipo 11A con alto nivel de resistencia a β- lactámicos (Aguinagalde et al., 2015). Para el tratamiento de las infecciones neumocócicas en las diferentes localizaciones se emplean como primera opción los antibióticos β-lactámicos, cuya diana son las proteínas de unión a penicilina (PBPs), inhibiendo la síntesis de la pared celular. Los primeros aislados clínicos con susceptibilidad reducida a penicilina (PEN) se descri- bieron en los años sesenta del siglo pasado (Hansman y Bullen, 1967), expandién- dose a lo largo del mundo durante las décadas siguientes. Esta resistencia en neu- mococo se debe a una modificación de las proteínas de unión a penicilina (PBPs), por lo que resulta en una reducida afinidad tanto para las penicilinas como para otros β-lactámicos (Coffey et al., 1995). Sin embargo, las cefalosporinas parenterales como la cefotaxima (CTX) o ceftriaxona (CRO), cefalosporina orales como cefditoren (CDN) y carbapenemes, son menos afectados y, por ello, son generalmente los compuestos más activos. Del grupo de los macrólidos, la eritromicina (ERY) es el más utilizado para tratar in- fecciones producidas por S. pneumoniae. Los macrólidos inhiben la síntesis proteica mediante la unión a la subunidad ribosómica 50S. Uno de los principales inconve- nientes de este grupo es la pronta y elevada aparición de resistencias (Pérez-Trallero et al., 2005, Liñares et al., 2010). Esta resistencia está mediada por dos mecanismos: modificación de la diana, debido a una metilasa ribosómica codificada por el gen ermC; o por un sistema de bomba de flujo codificado por el gen mef que también confiere resistencia a numerosos miembros de la familia de los macrólidos (Leclercq y Courvalin, 2002). INTRODUCCIÓN 17 1.4. Patogénesis de la enfermedad neumocócica 1.4.1. Adhesión y colonización S. pneumoniae ha desarrollado la capacidad de colonizar las superficies mucosas del tracto respiratorio superior. Esta colonización es un requisito previo para la disemina- ción a zonas estériles causando la ENI, como ya se ha comentado. Para enfrentarse a las dos primeras barreras del hospedador, el moco y la lisozima, este patógeno ha desarrollado varias estrategias. Neumococo puede evadir el moco por tres vías dife- rentes: una gran parte de serotipos tienen un polisacárido con carga negativa que disminuye la probabilidad de ser atrapado por los residuos de ácido siálico presentes en la mucosa (Nelson et al., 2007); neumococo tiene las exoglicosidasas NanA, NanB, BgaA y StrH que degradan los glicoconjugados del moco, disminuyendo la viscosidad y evitando el atrapamiento (Tong et al., 2001, King et al., 2006, Burnaugh et al., 2008); por último, la neumolisina Ply, uno de los principales factores de virulen- cia, es una citolisina dependiente del colesterol que produce poros en las membranas celulares y disminuye los movimientos ciliares de las células epiteliales, permitiendo que neumococo se adhieran a las mismas con más facilidad sin ser eliminado por el moco (Feldman et al., 1990, Feldman et al., 2002). Además, para evitar la actividad de la lisozima, que es una muramidasa que rompe el peptidoglicano bacteriano al hidrolizar los enlaces que unen las moléculas acetiladas N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico, neumococo posee las enzimas N-acetilglucosamina desacetilasa A (PdgA) y una O-acetiltransferasa (Adr) de los residuos de ácido N-acetilmurámico que le confieren resistencia a la actividad de la lisozima (Vollmer y Tomasz, 2000, Vollmer y Tomasz, 2002, Crisóstomo et al., 2006, Davis et al., 2008). En el proceso de adhesión, neumococo utiliza sus diferentes proteínas de superficie que se unirán a los carbohidratos del hospedador, proteínas del plasma y proteínas de la matriz eucariótica. Hay diferentes familias de proteínas implicadas en la adhe- sión, entre las que se encuentran las previamente mencionadas CBPs, las proteínas de la familia LPXTG, lipoproteínas y otros tipos. En el apartado 1.2.2. ya se descri- bieron diferentes ejemplos de CBPs implicadas en adhesión. Las proteínas LPXTG se unen covalentemente a la pared celular mediante una secuencia LPXTG; algunos ejemplos son la neuraminidasa NanA (Uchiyama et al., 2009, Sharapova et al., 2021) y las proteasas HtrA e Iga (Hendrickx et al., 2011). Las lipoproteínas como PsaA INTRODUCCIÓN 18 también tienen un papel importante en adhesión a las células del hospedador (Johnston et al., 2004). También se demostró que una tercera parte de los neumoco- cos sintetizan pili (Barocchi et al., 2006, Aguiar et al., 2008, Moschioni et al., 2008), que confieren a las cepas que lo poseen una mejor adhesión (Löfling et al., 2011). Además del impedimento del moco y la lisozima, neumococo en la mucosa nasofa- ríngea es atacado por componentes del sistema inmune innato como la IgA secretora (sIgA) (Janoff et al., 1999), la lactoferrina (Shaper et al., 2004) y componentes del sistema del complemento (Picard et al., 2003, Bogaert et al., 2010). Para defenderse de los tres, neumococo utiliza varios mecanismos. Contra la sIgA, que al unirse al neumococo facilita la opsonización de la bacteria, utiliza la cápsula que impide su unión y la proteasa Iga que degrada IgA1 (Janoff et al., 1999, Weiser et al., 2003, Fasching et al., 2007). Para contrarrestar la acción de la lactoferrina, que es un bac- teriostático al secuestrar el hierro necesario para el metabolismo bacteriano e induce fagocitosis y muerte bacteriana, S. pneumoniae sintetiza la CBP PspA que se une al sitio activo de la apolactoferrina humana inhibiendo la actividad de la misma (Shaper et al., 2004, Senkovich et al., 2007). Los mecanismos de evasión del complemento por parte de neumococo se describirán más adelante. Un aspecto importante destacable es que neumococo es capaz de cambiar su feno- tipo y realizar variación de fase en la cual regulará la expresión de cápsula y otros factores de virulencia, para adaptarse al nicho en el que se encuentra. Esta variación de fase que alterna entre fase transparente y fase opaca se puede observar al mi- croscopio (Weiser et al., 1994, Loughran et al., 2019). El fenotipo transparente en el que neumococo expresa mayores niveles de P-Cho y PspC en su superficie, facili- tando la adhesión y colonización de la nasofaringe (Rosenow et al., 1997, Kim et al., 1999, Loughran et al., 2019). En el fenotipo opaco por el contrario, neumococo ex- presa elevados niveles de capsula y proteína PspA, otorgando un fenotipo resistente a la fagocitosis y permitiéndole sobrevivir en la sangre (Kim y Weiser, 1998, Loughran et al., 2019). INTRODUCCIÓN 19 1.4.2. Invasión, inflamación y shock Para invadir el organismo neumococo utiliza la transcitosis que, adicionalmente, le permite formar reservorios bacterianos intraepiteliales y la recolonización posterior de la nasofaringe. Se han descrito dos mecanismos principales con los que neumococo es capaz de atravesar la barrera epitelial (Weiser et al., 2018). El primero es la inter- acción de los dominios de P-Cho de los TAs y LTAs de neumococo con los receptores PAF que se encuentran en la superficie de células epiteliales respiratorias o células endoteliales vasculares activadas por citoquinas. Neumococo usa la ruta de reciclaje de los receptores PAF para entrar en la célula (Cundell et al., 1996, Weiser et al., 2018). El segundo mecanismo descrito es la interacción entre la CBP PspC y la por- ción extracelular del receptor de las inmunoglobulinas poliméricas (pIgR) que se en- cuentra en las células epiteliales respiratorias (Brooks-Walter et al., 1999, Hammerschmidt et al., 2000, Zhang et al., 2000). Aquí también neumococo se apro- vecha de una maquinaria de transcitosis de la célula para translocarse e invadir. A su vez, otra región de PspC puede unirse al receptor de laminina del endotelio micro- vascular del cerebro, facilitando la penetración de la barrera hematoencefálica que es importante para el desarrollo de meningitis neumocócica (Orihuela et al., 2009). Finalmente, tanto el receptor PAF (PAFr) como el receptor de laminina son necesa- rios para la invasión de cardiomiocitos y la formación de microlesiones cardíacas, una de las complicaciones de la ENI (Brown et al., 2014). Se ha descrito un mecanismo de macropinocitosis independiente de PAFr y que no requiere P-Cho, que se basa en interacciones con la actina (Loh et al., 2017). La transcitosis no es la única vía de neumococo para invadir, la migración pericelular (o paracelular) que es otro meca- nismo que utiliza para atravesar capas de células epiteliales y endoteliales (Pancholi et al., 2003). Neumococo tiene la capacidad de adherirse y activar el plasminógeno mediante una serie de proteínas como la Eno, GapA y Pce, produciendo plasmina que es una serín proteasa que degrada las proteínas implicadas en uniones estre- chas intercelulares afectando de este modo a la cadherina del endotelio vascular (Attali et al., 2008, Dejana et al., 2008). Además, se ha observado que Ply tiene la capacidad de abrir las uniones estrechas permitiendo el paso de neumococo (Rayner et al., 1995). INTRODUCCIÓN 20 Una vez llega a la membrana basal, compuesta principalmente de una red de colá- geno tipo I, laminina y proteoglicanos, neumococo usa la hialuronato liasa para de- gradar los principales componentes de la matriz extracelular, facilitando así el desa- rrollo de la enfermedad invasiva (Jedrzejas, 2007, Maruyama et al., 2009). Tras esta invasión se liberan una serie de productos bacterianos, muchos de ellos altamente proinflamatorios, que pueden conducir a una respuesta inflamatoria descontrolada en el hospedador produciendo la llamada tormenta de citoquinas. Esta hiperactivación del sistema inmune produce la mayor parte del daño tisular y orgánico tanto en neu- monía y meningitis (Calbo y Garau, 2010, Gerber y Nau, 2010) como en el shock que tiene lugar en muchos casos tras la infección neumocócica (Calbo y Garau, 2011). Recientemente, se ha descrito que la desialización mediada por NanA altera la inter- acción Siglec-5-TLR-2 y reduce el reclutamiento de fosfatasa SHP-1 a Siglec-5. Este proceso activa vías de inflamación múltiples y muerte celular causando inflamación y citotoxicidad excesivas en el macrófago infectado (Tseng et al., 2021). 1.5. Sistema inmune y S. pneumoniae 1.5.1. El sistema del complemento Una de las primeras líneas de defensa del sistema inmune innato es el complemento, que está integrado por, aproximadamente, unas 30 proteínas plasmáticas y unidas a membrana celular, que al reconocer al microorganismo invasor inician una cascada regulada por diversas proteínas (Walport, 2001a, Walport, 2001b, Ballanti et al., 2013, Syed et al., 2020). Existen tres vías diferentes que desembocan en el componente clave C3b (Figura 4.). INTRODUCCIÓN 21 Figura 4. Activación de las tres vías del sistema del complemento. Reproducido y adaptado de Kulkarni et al., 2018. INTRODUCCIÓN 22 La vía clásica del complemento se inicia con el reconocimiento del patógeno por an- ticuerpos. Esta unión permite que el complejo C1 se una a la fracción constante (Fc) del anticuerpo, sobre todo a IgG e IgM (Schreiber y Frank, 1972, Syed et al., 2020). El componente C1q de este complejo activa a las serín proteasas C1r y C1s. Esto lleva a la producción de C4 y C2 que genera C4b2a que es la convertasa del compo- nente C3 de la vía clásica que genera C3b, capaz de unirse a la superficie bacteriana (Walport, 2001a, Heesterbeek et al., 2018). Aun así, se ha demostrado la activación de la vía clásica en ausencia de anticuerpos específicos, ya que tanto C1q como IgM pueden reconocer directamente a determinados patógenos como neumococo (Brown et al., 2002). También son capaces de unirse junto a CRP en un complejo recono- ciendo motivos P-Cho de la superficie bacteriana, o bien reconocer ligandos como pentraxina-3 y el componente P del suero amiloide (SAP) y unirse a marcadores de daño tisular como el ADN y membranas mitocondriales (Szalai et al., 1999, Yuste et al., 2007, Kang et al., 2009, Terrasse et al., 2012, Agarwal et al., 2014, Syed et al., 2020). La vía de las lectinas se inicia cuando las lectinas de unión a manosa (MBL) o ficoli- nas se unen, de una forma dependiente de calcio, a carbohidratos que contienen residuos acetilados o manosa (Fujita et al., 2004, Ip et al., 2009, Endo et al., 2011). Estas MBLs y ficolinas forman complejos con serín proteasas tipo 2 llamadas MASP (MBL-associated protease), estructuralmente homólogas a C1r y C1s, que permiten la formación de C4 y C2, originando la misma C3 convertasa que la producida por la vía clásica (Syed et al., 2020). No se tiene muy claro la importancia de esta vía en neumococo, ya que no hay un vínculo claro en deficiencias de unión de MBL y sus- ceptibilidad incrementada a las infecciones neumocócicas (Lundbo et al., 2014). La vía alternativa se basa en la hidrólisis espontánea de C3 y la deposición de C3b directamente a grupos hidroxilo de carbohidratos y proteínas de la superficie celular, de una manera no específica. Este C3b se podrá unir al factor B, exponiéndolo al factor D, formando un complejo que permite la amplificación de la activación del com- plemento degradando más C3 a C3a y C3b, uniéndose a la superficie (Walport, 2001a, Syed et al., 2020). Esta vía alternativa es muy importante en la opsonización de S. pneumoniae ya que, ratones deficientes en factor D, presentan deficiencias en los niveles de opsonofagocitosis frente a neumococo (Xu et al., 2001) y, además, INTRODUCCIÓN 23 ratones deficientes en factor B son más susceptibles a la otitis media neumocócica (Tong et al., 2010, Li et al., 2011). Las tres vías de activación convergen en el componente C3b, que tiene un papel clave en la inmunidad innata. El propio C3b es capaz de actuar como una opsonina al reconocer los microorganismos e inducir la fagocitosis a través del receptor del complemento CR1 (Sahu y Lambris, 2001). También el componente generado de su hidrólisis, el iC3b es capaz de mediar la fagocitosis por los receptores del comple- mento CR3 y CR4 (Sahu y Lambris, 2001). Además, C3b es capaz de unirse a las convertasas de C5 (C4b2a3b y C4bBb3b) degradando el componente C5, que dará lugar a dos componentes: C5a (una anafilotoxina) y C5b, que iniciará la formación del complejo del ataque a la membrana (MAC) (Medicus et al., 1976, Takata et al., 1987, Bajic et al., 2015). Cuando las convertasas rompen C5 en C5a y C5b, el frag- mento grande C5b es estabilizado rápidamente con C6. Una vez se une C7 al com- plejo C5bC6, este complejo es lipofílico y se puede insertar en la membrana plasmá- tica (Walport, 2001a, Kondos et al., 2010, Syed et al., 2020). Para la formación del MAC se unirán también C8 y entre seis y nueve moléculas C9. Es importante destacar que la formación del MAC hace que se lisen las bacterias Gram-negativas, pero en las Gram-positivas, como poseen una pared celular gruesa, se dificulta la penetración de este complejo hasta la membrana bacteriana (Joiner, 1985, Moffitt y Frank, 1994, Zipfel et al., 2007). S. pneumoniae ha desarrollado varios mecanismos para evitar el depósito del complemento, siendo el principal el CPS que limita el complemento de- positado en la superficie (Hyams et al., 2010b). También dispone de una serie de proteínas de superficie como LytC, PspC, PspA, PsaA, PhpA y Ply que contribuyen a la reducción del complemento depositado (Zhang et al., 2001, Jarva et al., 2002, Ren et al., 2004a, Quin et al., 2005, Quin et al., 2007, Ochs et al., 2008, Ramos- Sevillano et al., 2011). La regulación del complemento es esencial para prevenir daño en las células del hospedador y limitar la inflamación local (Walport, 2001a). Esta regulación está me- diada por componentes solubles del plasma y proteínas asociadas a membranas. Dependiendo de la vía hay unos reguladores negativos u otros. El C4BP es el princi- pal regulador de la vía clásica, ya que se une a C4b y actúa como cofactor del factor I, hidrolizando C4b a C4d. También se puede disociar irreversiblemente la convertasa de C3 de la vía clásica (Gigli et al., 1979, Blom et al., 2003, Syed et al., 2020). El fH INTRODUCCIÓN 24 es el principal regulador negativo de la vía alternativa, ya que inhibe la actividad del complemento a nivel de C3b bloqueando la unión del factor B a este componente. Este factor también actúa de cofactor del factor I rompiendo C3b a iC3b y disociando la convertasa de C4 de la vía alternativa (Weiler et al., 1976, Sahu y Lambris, 2001, Syed et al., 2020). Otros ejemplos son la vitronectina y la clusterina, que impiden la inserción del complejo C5b-7 a la superficie celular y la polimerización de C9, inhi- biendo la formación del MAC (Falgarone y Chiocchia, 2009). Como se comentó pre- viamente en el apartado de las CBPs, S. pneumoniae tiene proteínas como LytA y PspC que participan en la evasión de la inmunidad del complemento al reclutar regu- ladores negativos como fH y C4BP, impidiendo la activación de las vías clásicas y alternativa (Dave et al., 2001, Jarva et al., 2002, Janulczyk et al., 2000, Hammerschmidt et al., 2007, Ramos-Sevillano et al., 2015). Además, PspC se puede unir a la vitronectina afectando a la inmunidad del complemento (Voss et al., 2013, Kohler et al., 2015). 1.5.2. Fagocitosis y receptores celulares La fagocitosis es el proceso en el cual células del sistema inmune como los neutrófi- los, macrófagos o células dendríticas, ingieren partículas sólidas, células muertas y agentes patógenos, introduciéndolas en el interior celular para proceder a su elimi- nación y coordinar su respuesta adaptativa (Botelho y Grinstein, 2011). En contraste a Neisseria meningitidis, la actividad bactericida del MAC no tiene importancia en S. pneumoniae, donde la fagocitosis es el principal mecanismo para combatir la infec- ción neumocócica (Standish y Weiser, 2009). Previa a la fagocitosis microbiana, las diferentes opsoninas del suero se unen y reconocen a los patógenos para su elimi- nación (Marriott y Dockrell, 2007). Cuando el fagocito profesional contacta con el pa- tógeno invasor, internaliza al microorganismo en vacuolas derivadas de su mem- brana plasmática llamadas fagosomas. Después se escinde la membrana y en el fagosoma madurará fusionándose con diferentes endosomas y lisosomas formando el fagolisosoma, con pH ácido y rico en hidrolasas que degradarán al patógeno inter- nalizado (Botelho y Grinstein, 2011, Fairn y Grinstein, 2012). Esta degradación se da por una combinación de mecanismos oxidativos y no oxidativos (Dahlgren y Karlsson, 1999, Nauseef, 2007). INTRODUCCIÓN 25 En el caso de neumococo y muchos otros microorganismos, la fagocitosis es el prin- cipal mecanismo de eliminación empleado por el sistema inmune del hospedador. Para esto es necesario que los fagocitos profesionales expresen receptores de alta afinidad para ciertas opsoninas destacando C3b e iC3b para ser reconocidos por los llamados receptores del complemento (Sahu y Lambris, 2001). Los principales recep- tores del complemento son CR1, CR2, CR3, CR4, CR5a y CR3a; la mayoría de ellos se unen a diferentes fragmentos y productos de C3 (Carroll, 1998, Holers, 2014). CR1 se encuentra ampliamente extendido en eritrocitos, leucocitos polimorfonucleares, fa- gocitos, linfocitos B y T, etc. Este receptor se une tanto a C3b como a C4b e, incluso, se puede unir a C1q (Holers, 2014). CR2 se une a productos de degradación de C3b como iC3b, C3dg y C3d y es importante para promover la activación de linfocitos B y la memoria inmunológica (Carroll, 2000, Holers, 2014). Tanto CR3 como CR4, que se pueden encontrar en los macrófagos situados en los tejidos y fagocitos mononu- cleares, se pueden unir al producto iC3b (Holers, 2014). Otros de los receptores importantes que participan en la fagocitosis son los FcR (García-García y Rosales, 2002). Estos receptores se unen a la fracción Fc de los anticuerpos como IgG, desencadenando una cascada de señales que lleva a la reor- ganización de la actina y la membrana en los fagocitosis, formando los pseudópodos que dan lugar al fagosoma (García-García y Rosales, 2002). Las isoformas FcRI, FcRIIA y FcRIIIA son las que contribuyen a la fagocitosis en humanos (Joshi et al., 2006). Por último, es interesante mencionar la importancia que está cobrando el ligando de la glicoproteína P-selectina-1 (PSGL1) en el reconocimiento directo de patógenos. Para que ocurra la extravasación leucocitaria, paso necesario para el encuentro del leucocito con el patógeno, es esencial la interacción entre las selectinas y los ligandos de selectina (Vicente-Manzanares y Sánchez-Madrid, 2004). Existen tres tipos de se- lectinas, en las cuales la P-selectina y la E-selectina son inducidas en respuesta a estímulos inflamatorios en células endoteliales activadas (Tedder et al., 1995), una activación necesaria para protegerse de patógenos invasores como S. pneumoniae (Bullard et al., 1996, Munoz et al., 1997). Dentro de estos receptores que reconocen P- y E-selectinas se encuentra PSGL-1, con un papel esencial en los primeros pasos de la extravasación (Sako et al., 1993, Vicente-Manzanares y Sánchez-Madrid, 2004). Se ha observado que patógenos intracelulares obligados como Anaplasma INTRODUCCIÓN 26 phagocytophilum y Ehrilichia sp. utilizan PSGL-1 para entrar en la célula y replicarse intracelularmente (Herron et al., 2000, Cossart y Sansonetti, 2004, Troese y Carlyon, 2009). Pero lo más importante, se ha demostrado que PSGL-1, en neutrófilos, reco- noce directamente el CPS y la LytA de S. pneumoniae fagocitándolo (Ramos- Sevillano et al., 2016). Además, la interacción con PSGL-1 es diferente según el CPS expresado y podría explicar la mayor prevalencia de algunos serotipos respecto a otros (Ramos-Sevillano et al., 2016). 2. STAPHYLOCOCCUS AUREUS: CARACTERÍSTICAS Y PATOGÉNESIS 2.1. Aspectos históricos En 1880, el cirujano escocés Alexander Ogston descubrió que una de las principales causas del pus tenía origen infeccioso (Ogston, 1984, Orenstein, 2011). El cirujano, cansado de la alta mortalidad asociada a las operaciones, decidió mirar al microsco- pio el pus que salía de uno de sus pacientes y descubrió micrococos (Ogston, 1882). A estos micrococos, por la disposición que formaban los clústeres, los denominó “sta- phylococci”, del griego staphyle, que significaba racimo de uvas (Orenstein, 2011). Posteriormente, en 1884, Rosenbach, un cirujano alemán, aisló dos cepas diferentes de “staphylococci”: a la cepa que formaba colonias pigmentadas la denominó Sta- phylococcus aureus y, a las que formaban colonias blancas, Staphylococcus albus, que posteriormente se denominaría Staphylococcus epidermidis (Rosenbach, 1884). En el momento del descubrimiento la mayoría de pacientes infectados con S. aureus morían, con una tasa de mortalidad cercana al 82% en los pacientes con septicemia (Skinner y Keefer, 1941, Oliveira et al., 2018). Esta situación cambió y se redujo la mortalidad con la llegada de la penicilina a la práctica clínica (Ladhani y Garbash, 2005) pero, a principios de 1940, empezaron a surgir las primeras cepas resistentes a este antibiótico, llegando a representar un 25% de los aislados clínicos al final de la década (Rammelkamp y Maxon, 1942, Kirby, 1944, Chambers, 2001). La aparición de cepas resistentes a meticilina y la importancia de estas hace que se clasifique a este patógeno en dos categorías, S. aureus sensible a meticilina o SASM y S. aureus resistente a meticilina o SARM. La perspectiva histórica de la resistencia a antibióti- cos de S. aureus se comentará más adelante. INTRODUCCIÓN 27 2.2. Características generales Staphylococcus aureus es un coco Gram-positivo de 0.5–2 µm de diámetro que se encuentran agrupados característicamente en racimos. Los estafilococos producen la enzima catalasa, diferenciándolos de los estreptococos y enterococos. Además, S. aureus se diferencia de otras especies de estafilococos de interés en medicina (como S. epidermidis, Staphylococcus lugdunensis y Staphylococcus saprophyticus) por la producción de plasmacoagulasa (coagulasa), a los que denominaremos estafilococos coagulasa negativa (Harris et al., 2002). Los estafilococos son inmóviles, no forman esporas y son anaerobios facultativos. Como requerimientos nutricionales necesitan una fuente orgánica de nitrógeno, suplementada con unos 5 a 12 aminoácidos entre ellos arginina y valina, también requieren vitaminas B como la tiamina y nicotinamida (Kloos, 1986, Wilkinson, 1997, Harris et al., 2002). Además, son tolerantes a altas concentraciones de sal y muestran resistencia al calor (Kloos, 1986, Wilkinson, 1997). También los estafilococos se pueden diferenciar de los estreptococos por la compo- sición de la pared celular (Wilkinson, 1997). En el caso de S. aureus, la pared en apariencia amorfa tiene un diámetro de 20–40 nm y el peptidoglicano es el compo- nente básico representando un 50% de la masa de la pared celular. Los TAs y LTAs constituyen la otra parte importante con un 40% del total de la pared celular (Waldvogel, 1990), que además contribuyen a la carga negativa de la superficie ce- lular y juegan un papel en la adquisición y localización de iones metálicos (Wilkinson, 1997), particularmente cationes bivalentes, y en la actividad de las enzima autolíticas. El resto de la masa de la pared celular son proteínas de superficie, exoproteínas y las autolisinas (Harris et al., 2002). A diferencia de neumococo, S. aureus es muy versátil respecto a su hospedador, se puede encontrar, además de en humanos, en gatos y perros domésticos, caballos, cabras, ovejas, vacas, conejos, cerdos y pollos. Hay muchas enfermedades asocia- das a estas especies, pero las que más impacto económico tienen son la mastitis en las vacas lecheras y otros rumiantes, enfermedades sistémicas letales en conejos y bumblefoot en aves (Peton y Le Loir, 2014, Peacock y Paterson, 2015). INTRODUCCIÓN 28 2.2.1. Polisacárido capsular en S. aureus Como en neumococo, el CPS es un factor de virulencia esencial debido a sus propie- dades antifagocíticas que le permiten evadir el sistema inmune (Thakker et al., 1998, Nanra et al., 2013). Hasta un 90% de los aislados clínicos de S. aureus poseen CPS (Karakawa et al., 1985, Thakker et al., 1998, Harris et al., 2002), existiendo hasta 11 serotipos distintos descritos hasta la fecha (Visansirikul et al., 2020). Los dos más prevalentes son el serotipo 5 (CP5) y el 8 (CP8) (O'Riordan y Lee, 2004), cuya es- tructura química es muy similar ya que ambos consisten en unidades repetidas de ácido D-N-acetil manosaminuronico, L-N-acetil fucosamina y D-N-acetil fucosamina (Keinhörster et al., 2019) (Figura 5). La diferencia entre ellos reside en los enlaces entre los azúcares y el sitio de O-acetilación del ácido manosaminuronico (Fournier et al., 1984, Fournier et al., 1987). El CPS está unido covalentemente al peptidogli- cano de la pared celular (Chan et al., 2014). Figura 5. Imagen al microscopio electrónico de transmisión de una cepa capsulada del serotipo 5 de S. aureus. Reproducido de O'Riordan y Lee, 2004. La presencia del CPS no siempre es una ventaja en la infección de S. aureus (O'Riordan y Lee, 2004, Tuchscherr et al., 2010). Mientras que en modelos murinos de bacteriemia, en artritis séptica, abscesos e infecciones asociadas a heridas qui- rúrgicas sí que juega un papel esencial (Nilsson et al., 1997, Thakker et al., 1998, INTRODUCCIÓN 29 Portolés et al., 2001, Watts et al., 2005, McLoughlin et al., 2006, Keinhörster et al., 2019), en infecciones de glándulas mamarias y endocarditis inducida por catéter los mutantes en el CPS son más virulentos (Baddour et al., 1992, Nemeth y Lee, 1995, Tuchscherr et al., 2010). Esto podría deberse a que el CPS impide la unión de adhe- sinas a sus moléculas diana (Pöhlmann-Dietze et al., 2000, Risley et al., 2007). Tam- bién la pérdida de expresión de CPS, que suele darse por mutaciones en genes esen- ciales para la síntesis del polisacárido o en regiones promotoras (Cocchiaro et al., 2006, Tuchscherr et al., 2010), está asociada a infecciones crónicas por S. aureus como la osteomielitis, mastitis y fibrosis quística (Herbert et al., 1997, Lattar et al., 2009, Tuchscherr et al., 2010). Es importante destacar que la expresión de CP5 y CP8 es dependiente de las condiciones ambientales (Keinhörster et al., 2019). En experimentos in vitro se observó que en condiciones de alta salinidad, limitación de hierro o medio sólido aumenta la expresión (Lee et al., 1993, Pöhlmann-Dietze et al., 2000, George et al., 2015), mientras que el extracto de levadura, medios alcalinos, altos contenidos de glucosa y poca oxigenación disminuyen su expresión (Dassy et al., 1991, Stringfellow et al., 1991, Herbert et al., 1997, George et al., 2015). Además, durante las fases logarítmica y exponencial temprana apenas hay expresión de CPS, mientras que en la estacionaría y tardía estacionaria sí se expresa (George et al., 2015). 2.3. Importancia clínica de S. aureus A pesar de que el género Staphylococcus incluye 52 especies y 28 subespecies, S. aureus es la que tiene mayor relevancia clínica (Lee et al., 2018). Además de ser uno de los principales patógenos causantes de infecciones intrahospitalarias. S. aureus se puede encontrar colonizando asintomáticamente el tracto respiratorio superior hu- mano en hasta el 80% de la población, variando según el estudio (Wertheim et al., 2004, Wertheim et al., 2005, Kuehnert et al., 2006, van den Bergh et al., 2012, Bosch et al., 2013, Esposito et al., 2014, Becker et al., 2017). Aunque también se pueda encontrar en la microbiota comensal de la piel de más del 30% de individuos, la mu- cosa nasal es el principal nicho ecológico de esta bacteria (Wertheim et al., 2005). Cuando la barrera mucosa o cutánea se rompen, S. aureus tiene acceso a zonas estériles y causa infección. En la mayoría de casos es necesaria la colonización de S. aureus para que se produzca la infección (Kluytmans et al., 1997), aunque puede INTRODUCCIÓN 30 darse minoritariamente por contaminación de catéteres o heridas. El rango de enfer- medades que puede producir esta bacteria es amplio: desde más leves asociadas a manifestaciones en la piel y tejidos blandos como foliculitis, furúnculos, impétigo, mastitis, infecciones de heridas quirúrgicas y síndrome de la piel escaldada, a enfer- medades más graves como bacteriemia, neumonía, endocarditis, infecciones en hue- sos y articulaciones y el síndrome del shock tóxico (Figura 6) (Peacock y Paterson, 2015). Una de las enfermedades mejor descritas que produce S. aureus y con más incidencia en la población es la bacteriemia (Tong et al., 2015). La incidencia de esta patología infecciosa en países desarrollados es de 10 a 30 casos por 100 000 habi- tantes por año (Laupland et al., 2013). Aunque los datos globales de estas tasas de incidencia se han mantenido durante los últimos 20 años, la contribución de SARM al desarrollo de episodios de bacteriemia muestra una tendencia ascendente (Wyllie et al., 2005, Allard et al., 2008, Laupland et al., 2008, El Atrouni et al., 2009). En el caso de la bacteriemia, la fuente primaria de infección predice la mortalidad, siendo la bacteriemia sin foco la que más mortalidad acumula (22–48%), seguida de la en- docarditis (25–60%) y la neumonía (39–67%), mientras que tienen tasas menores la bacteriemia asociada a catéteres (7–21%), infecciones de piel o tejido blando (15– 17%) y las infecciones del tracto urinario (10%) (van Hal et al., 2012, Kaasch et al., 2014). Figura 6. Esquema de las zonas que coloniza y las diversas afecciones producidas por S. aureus. INTRODUCCIÓN 31 Las personas con dispositivos médicos invasivos (DMI) suelen ser más susceptibles a la infección por S. aureus, debido a que suelen ser infecciones relacionadas con el estado de biofilm, como se comentará más adelante. También los pacientes con el sistema inmune comprometido son un grupo de alto riesgo para estas infecciones (Lee et al., 2018). Como se espera, la incidencia de bacteriemia y la mortalidad de estos episodios aumentan con la edad (van Hal et al., 2012), también en pacientes con infección activa por VIH (Larsen et al., 2012). Al igual que S. pneumoniae, S. aureus puede producir una neumonía secundaria a una primoinfección por el virus de la gripe (Murray et al., 2010, Dawood et al., 2010, van den Bergh et al., 2012). Y la bacteriemia producida por S. aureus se ha asociado a ratios de mortalidad altos en pacientes hospitalizados con COVID-19 (Cusumano et al., 2020). 2.3.1. S. aureus resistente a meticilina Los primeros aislados resistentes a meticilina se describieron en 1961 en Inglaterra, al poco tiempo de introducir este antibiótico en la práctica clínica (Jevons, 1961). Aun así, mediante secuenciación del genoma completo, se han analizado cepas SARM previas a la introducción de la meticilina, que datan de los 40, con lo que hace pensar que su aparición fue debida al uso de la penicilina (Harkins et al., 2017). La meticilina se usó ampliamente, pero debido a su toxicidad se dejó de utilizar en humanos y se reemplazó por otras penicilinas como oxacilina, flucloxacina y dicloxacilina (Lee et al., 2018). En la primera década desde su descripción, los SARM fueron los culpables de diferentes brotes intrahospitalarios en diferentes partes del mundo (Chambers y Deleo, 2009), surgiendo el SARM asociado a hospitales (SARM-AH). Posteriormente, en los 80 y 90 se empezaron a ver aislados SARM en pacientes que no habían tenido ningún tipo de contacto hospitalario, surgiendo el SARM adquirido en la comunidad (SARM-AC) (Faoagali et al., 1992, Fridkin et al., 2005) y, por último, también se aso- cia a exposición a ganado (SARM asociado a ganado, SARM-AG) (Voss et al., 2005). A pesar de que la meticilina no se usa ya en el entorno clínico, se ha mantenido el nombre SARM, y se denominan cepas resistentes a meticilina aquellas cepas que presentan una resistencia a casi todos los β-lactámicos, excepto a algunas cefalos- porinas de última generación (Peacock y Paterson, 2015). Los aislados SARM tam- bién pueden adquirir resistencia a muchos otros antibióticos alternativos, compli- cando el tratamiento y la infección (Rodvold y McConeghy, 2014, Stryjewski y Corey, INTRODUCCIÓN 32 2014), incluyendo antibióticos de último recurso como la vancomicina y agentes nue- vos como linezolid y daptomicina (Gould et al., 2012, Kos et al., 2012, McGuinness et al., 2017). Al contrario que la resistencia de S. aureus a penicilina, la resistencia a meticilina no está mediada por una β-lactamasa codificada en un plásmido (Dyke et al., 1966). El gen responsable de la resistencia a meticilina, llamado mecr en un principio, está localizado en el cromosoma (Sjöström et al., 1975) y codifica una PBP con una afini- dad reducida a los β-lactámicos que se denominó PBP2a (Hartman y Tomasz, 1984, Peacock y Paterson, 2015). Este gen se denominó mecA (Ubukata et al., 1989). Pos- teriormente, al secuenciar la región alrededor de mecA, se descubrió un elemento genético móvil que se llamó SCCmec (por Staphylococcal Chromosome Cassete), presente en los aislados SARM y ausente en los aislados SASM (Katayama et al., 2000). Los elementos SCCmec son variables, existiendo 11 tipos diferentes hasta la fecha (Ito et al., 2012). Este elemento móvil contiene mecA y sus genes reguladores mecI y mecR, una recombinasa ccr que es la responsable del movimiento del SSC- mec y tres regiones J (Peacock y Paterson, 2015). Este elemento SSCmec se usa para la vigilancia epidemiológica de los aislados SARM basado en su combinación de los genes mec y ccr y a veces la subtipificación basado en las regiones J (Ito, 2009). Todos los tipos de SSCmec contienen mecA excepto el tipo XI, que contiene su homologo mecC, que dará lugar a la PBP2aLGA, nombrado así por la cepa SARM LGA251 de la cual se aisló por primera vez este SSCmec (García-Álvarez et al., 2011). También se ha descrito resistencia a meticilina codificada en plásmidos, donde está implicado el gen mecB (Becker et al., 2018). 2.4. Mecanismos de patogenicidad de S. aureus 2.4.1. Adhesión y colonización Como ya se comentó previamente, la colonización de S. aureus precede la infección (Kluytmans et al., 1997). Esta colonización no es estática, sino que la mayoría de estudios han encontrado tres patrones temporales (Höffler et al., 1978, Eriksen et al., 1995). En, aproximadamente, el 15% de los individuos, la colonización por S. aureus es continua; a estos se les denominará portadores persistentes. En torno al 70% de los individuos se puede encontrar una colonización intermitente, en la que podrán INTRODUCCIÓN 33 adquirir cepas de S. aureus y librarse de él numerosas veces de manera espontánea. Por último, existe un porcentaje pequeño de la población que nunca serán portado- res. El estado de portador estará determinado por factores del hospedador como po- limorfismos en genes implicados en la respuesta inflamatoria (Emonts et al., 2008). En los primeros pasos de adhesión a las células epiteliales del hospedador entran en juego los TAs de la pared celular, pudiéndose observar un incremento en la expresión de genes implicados en la síntesis de los TAs, mientras que otras adhesinas como CflB y IsdA se expresan en fases más tardías (Burian et al., 2010). Los reguladores globales de virulencia también están implicados, ya que los genes agr y sae no están activos en las fases tempranas de la adhesión, pero el sistema de dos componentes WalkR sí que tiene un papel importante, existiendo una elevada expresión de los genes sak y sceD controlados por este sistema (Burian et al., 2010). En esta colonización inicial también importa la interacción con otras especies coloni- zadoras, compitiendo en las fosas nasales por ocupar este hábitat con especies como Cutibacterium acnes, S. lugdunensis o S. epidermidis. Estudios de colonización han mostrado que la existencia de ciertas especies se correlaciona con la presencia o ausencia de S. aureus (Liu et al., 2015). Por ejemplo, la existencia de S. epidermidis se ha correlacionado positivamente con la presencia de S. aureus (Lemon et al., 2010, Liu et al., 2015). Al contrario, S. lugdunensis produce un compuesto antimicro- biano llamado lugdunina que inhibe y destruye a S. aureus (Zipperer et al., 2016). En la nasofaringe, otro nicho muy dinámico, compite con otras especies como S. pneu- moniae, Moraxella catarrhalis y Haemophilus influenzae, cuya importancia clínica hace de especial interés esta interacción (Dunne et al., 2013). Desde la era preva- cuna neumocócica conjugada y hasta la introducción de la VCN-7, varios estudios han reportado una asociación negativa entre S. pneumoniae y S. aureus, descri- biendo que la portación de algún serotipo VCN-7 impedía la colonización por S. au- reus (Regev-Yochay et al., 2004, Spijkerman et al., 2012, Chien et al., 2013, Dunne et al., 2013). El mecanismo descrito que justificaba la asociación negativa implicaba la muerte de S. aureus por radicales hidroxilo (·OH) producidos por neumococo, que inducían la degradación del ADN y la muerte del patógeno (Wu et al., 2019). Sin embargo, otros estudios de colonización mostraban que hasta el 24% de los pacien- tes estaban colonizados por ambas especies (Melles et al., 2007, Quintero et al., 2011, Ebruke et al., 2016) y que la vacunación con las vacunas conjugadas no había modificado la colonización de la nasofaringe por S. aureus (Cohen et al., 2007, Lee INTRODUCCIÓN 34 et al., 2009). Además, la co-colonización entre ambas especies en modelos animales es posible (Park et al., 2008, Margolis, 2009). 2.4.2. Las toxinas de S. aureus El hecho de que esta bacteria Gram-positiva sea un buen patógeno, puede atribuirse a su arsenal de factores de virulencia, donde las toxinas secretadas por S. aureus juegan un papel muy importante (Otto, 2010, Bartlett y Hulten, 2010, Oliveira et al., 2018). Estas toxinas están relacionadas con diferentes enfermedades como el sín- drome del shock toxico, síndrome de la piel escaldada, neumonía necrotizante e in- fecciones de piel graves (Dinges et al., 2000, Jarraud et al., 2002, Ladhani y Garbash, 2005, Oliveira et al., 2018). Las principales toxinas de estafilococo se pueden dividir en tres grupos: formadoras de poros, exfoliativas y súper antígenos (Tabla 1). Estas toxinas son capaces de dañar las membranas celulares del hospedador, degradar las conexiones intercelulares o modular la respuesta inmune (Grumann et al., 2014). En el grupo de las toxinas formadoras de poros se encuentran las dos principales hemolisinas. La α-hemolisina la secretan el 95% de los aislados clínicos de S. aureus (Grumann et al., 2014); se basa en monómeros proteicos que pueden oligomerizar, formando un barril β y alterando la membrana celular al formar poros (Seilie y Bubeck Wardenburg, 2017). S. aureus también tiene β-hemolisina, cuyo papel en la enferme- dad no se entiende del todo pero que, en humanos, es citotóxica y parece importante en infecciones crónicas de piel y en mastitis bovina (Aarestrup et al., 1999, Dinges et al., 2000, Katayama et al., 2013). También en este grupo se encuentran las leucoto- xinas, que consisten en dos componentes proteicos diferentes que se ensamblan para formar barriles β que forman poros (Aman et al., 2010, Yamashita et al., 2011). Entre estas leucotoxinas la más conocida es la leucocidina de Panton-Valentine (PVL), que tiene la subunidad proteica S que le confiere especificidad de tipo celular, con gran afinidad por leucocitos y neutrófilos (Aman et al., 2010, Yoong y Torres, 2013), y la subunidad proteica F. Cuando se une la subunidad S a su receptor se produce un cambio conformacional permitiendo la dimerización con el componente F (Spaan et al., 2015). La PVL se encuentra en el 5% de los aislados clínicos de S. aureus y se asocia con SARM-AC, particularmente aquellas que causan neumonía o infecciones de piel y tejidos blandos (Yoong y Torres, 2013). Las neumonías asocia- INTRODUCCIÓN 35 das a la PVL son más letales, sobre todo porque la citotoxina provoca una hiperacti- vación de la inflamación (Gillet et al., 2002). Las modulinas solubles en fenol (PSMs) son otro tipo de toxinas formadoras de poros, cuya unión no es específica, llevando a la desintegración de la membrana y su posterior oligomerización formando el poro (Otto, 2014). Estas modulinas están implicadas en la estructuración del biofilm y en la capacidad invasiva de S. aureus (Periasamy et al., 2012, Wang et al., 2007). El segundo grupo de relevancia son las toxinas exfoliativas, que son serín proteasas que lisan la epidermis (Bukowski et al., 2010). Estas toxinas reconocen e hidrolizan las uniones intercelulares, concretamente, las cadherinas desmosomales de las ca- pas superficiales de la piel provocando descamación y formación de ampollas (Melish y Glasgow, 1971, Nishifuji et al., 2008). Hay cuatro tipos de toxinas exfoliativas (ETs) denominadas A,B,C y D. La ETA y ETB son las implicadas en el daño de la pìel en humanos (Lee et al., 1987, Oliveira et al., 2018). Estas ETs se encuentran en un 5% de los aislados clínicos de S. aureus, siendo ETA más prevalente en Europa, África y América y ETB en Japón (Ladhani, 2001). Estas cepas productoras de toxinas ex- foliativas están asociadas al impétigo con ampollas localizado y al síndrome de la piel escaldada (Oliveira et al., 2018). El gen eta, que codifica la ETA, tiene origen en un profago y está localizado en el cromosoma. Por el contrario, el gen etb, que codifica ETB, se encuentra localizado en un plásmido de 42 kb (Sakurai et al., 1995, Mohseni et al., 2018). Por último, es importante destacar los superantígenos, que originalmente fueron de- nominados enterotoxinas, ya que estaban asociados a síntomas típicos de intoxica- ción alimentaria por S. aureus, como vómitos y diarreas (Grumann et al., 2014). Este grupo se denominó finalmente de otra manera, ya que había toxinas que no tenían estas propiedades. Hay más de 23 superantígenos descritos en S. aureus, siendo los más destacables la toxina del síndrome del shock tóxico (TSST-1), las enterotoxinas estafilocócicas (como la SEA) y hasta 11 toxinas estafilocócicas tipo superantígeno (SSL) (Lina et al., 2004, Holtfreter y Bröker, 2005, Grumann et al., 2011, Grumann et al., 2014, Oliveira et al., 2018). Estas toxinas actúan uniendo directamente ciertos dominios Vβ de receptores de los linfocitos T con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHCII), activando de este modo, los linfocitos T (Fleischer y Schrezenmeier, 1988). Estos superantígenos actúan de manera sisté- mica, haciendo que un gran número de linfocitos T produzcan niveles elevados de INTRODUCCIÓN 36 citoquinas proinflamatorias (IL-2, INF- y TNF), causando una gran variedad de sín- tomas como fiebre, sarpullidos, descamación, vómitos, diarrea, hipotensión lo que puede resultar en fallo multiorgánico (McCormick et al., 2001). Después de la tor- menta de citoquinas, los linfocitos T no proliferan ni secretan IL-2 e incluso pueden sufrir apoptosis (Rellahan et al., 1990, Alderson et al., 1995). Tabla 1. Las principales toxinas de S. aureus. Las toxinas de S. aureus Grupo Toxinas Acción Toxinas formadoras de poros α-hemolisina Monómeros proteicos que oli- gomerizan formando barriles β y alteran la membrana celular formando poros β-hemolisina No se comprende su meca- nismo pero es citotóxica Leucotoxinas Consisten en dos componentes proteicos diferentes que se en- samblan para formar barriles β que forman poros. La PVL tiene especificidad por leucocitos y neutrófilos Modulinas solubles en fenol Unión no específica; llevan a la desintegración de la membrana Toxinas exfoliativas Cuatro tipos: ETA, ETB, ETC y ETD. ETA y ETB son las implicadas en el daño de la piel en humanos Reconocen e hidrolizan las uniones intercelulares, las ca- derinas desmosomales, de las capas superficiales de la piel INTRODUCCIÓN 37 Superantígenos Toxina del síndrome del shock tóxico (TSST-1) Los superantígenos actúan uniendo directamente ciertos dominios Vβ de receptores de los linfocitos T con moléculas del complejo mayor de histo- compatibilidad de clase II (MHCII), activándolos. Estos linfocitos T activados producen una tormenta de citoquinas pro- inflamatorias causando gran variedad de síntomas. Enterotoxinas estafilocóci- cas (SEA) Toxinas tipo superantígeno (SSL) 2.5. Sistema inmune y S. aureus 2.5.1. Sistema del complemento Una explicación detallada del sistema de complemento se comentó en el apartado 1.5.1. de esta Memoria; en el caso de S. aureus se centrará en sus mecanismos de evasión. Al igual que en neumococo y otras bacterias Gram-positivas, el comple- mento es esencial para la opsonización de la bacteria por su depósito de C3b y otras opsoninas en la superficie (de Jong et al., 2019). Uno de los principales mecanismos que tiene S. aureus para evadir la opsonofagocitosis es su CPS, que evitará su muerte (O'Riordan y Lee, 2004). Sin embargo, la cápsula no evita completamente la fijación del complemento o la unión de anticuerpos específicos (Cunnion et al., 2001). La metaloproteasa secretada por S. aureus (aureolisina), tiene la capacidad de hidro- lizar el componente central de C3 en C3a’ y C3b’, mimetizando a las C3 convertasas, para luego degradar el C3b’, el factor I y el factor H. Por tanto, su secreción crea un ambiente libre de C3 alrededor de la bacteria e impide el depósito del complemento (Laarman et al., 2011). Otro ejemplo de proteínas que interfieren con el complemento es el inhibidor estafilocócico del complemento (SCIN), que es capaz de inhibir las tres vías del complemento estabilizando e inhibiendo las C3 convertasas, por lo que se INTRODUCCIÓN 38 produce una disminución del depósito de C3b y liberación de C5a, cuya consecuencia es la inhibición de la fagocitosis (Rooijakkers et al., 2005a). También la proteína de unión a fibrinógeno extracelular de S. aureus (Efb), además de unirse a fibrinógeno, se puede unir a C3 y su producto C3d (Lee et al., 2004, Hammel et al., 2007b). Efb es capaz de bloquear la fagocitosis in vitro, ya que une la cascada de coagulación y el sistema del complemento, cubriendo la bacteria de fibrinógeno y evitando así el reconocimiento por C3b y anticuerpos funcionales (Ko et al., 2013, Kuipers et al., 2016). Homóloga a Efb es la proteína de unión al complemento extracelular de S. aureus (Ecb), que también puede unirse a C3d, bloqueando la C3 convertasa de la vía alternativa y también las C5 convertasas de las tres vías (Jongerius et al., 2007, Hammel et al., 2007a, Jongerius et al., 2010). S. aureus también tiene capacidad de reclutar el fH a su superficie con la proteína SdrE, que inhibe la vía alternativa del sistema del complemento (Sharp et al., 2012). Otros ejemplos son: la proteína de adherencia extracelular Eap, que puede evitar la extravasación del neutrófilo e inhibir la unión de C2 al C4b, evitando la formación de las C3 convertasas de las vías clásica y de las lectinas del complemento (Chavakis et al., 2002, Woehl et al., 2014); la estafiloquinasa, que al degradar plasminógeno a plasmina en la superficie bacteriana hace que degrade IgG y C3bf, disminuyendo la fagocitosis (Rooijakkers et al., 2005b); la SSL7 que interacciona con IgA y el compo- nente C5 (Langley et al., 2005); y Cna que se une a C1q e inhibe la vía clásica del complemento (Kang et al., 2013). 2.5.2. Fagocitosis y receptores celulares Este patógeno también posee proteínas capaces de interferir con el reconocimiento de anticuerpos por parte de los fagocitos. Una de ellas es la proteína estafilocócica A (SpA), que es una proteína unida a la pared celular mediante un motivo LPXTG, pero puede ser liberada por hidrólisis durante el crecimiento de la bacteria (Schneewind et al., 1992, Becker et al., 2014). Esta proteína es capaz de unirse al Fc de las IgGs bloqueando la fagocitosis mediada por FcR (Forsgren y Sjöquist, 1966). También SpA puede interferir con la inmunidad adaptativa interfiriendo con los linfocitos B (Falugi et al., 2013). Otro ejemplo, Sbi, es una proteína especial con doble función, ya que tiene cuatro dominios extracelulares globulares: los dominios I y II interaccio- nan con el Fc de IgG interfiriendo en su función (Atkins et al., 2008). Además, es INTRODUCCIÓN 39 capaz de unirse a la apolipoproteína H (Zhang et al., 1999); los dominios III y IV se unirán al C3 y al fH, formando el complejo C3:Sbi:fH (Burman et al., 2008, Haupt et al., 2008). La proteína SSL10, también puede unirse a IgG1, impidiendo la activación del complemento por la vía clásica e impidiendo la fagocitosis mediada por el receptor Fc (Itoh et al., 2010, Patel et al., 2010). En el caso del reconocimiento por receptores celulares, además de los generales descritos en el apartado 1.5.2., no se ha descrito previamente en la literatura el reco- nocimiento directo por PSGL-1 de S. aureus. 3. CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOFILMS BACTERIANOS 3.1. Características de los biofilms Tradicionalmente se han estudiado las bacterias como organismos individuales, en estado planctónico, hasta que se vio que realmente la mayoría se podían encontrar tanto en hábitats naturales como artificiales formando comunidades sésiles denomi- nadas biofilms. Un biofilm es una comunidad microbiana sésil muy estructurada que se caracteriza por células unidas a una superficie o interfase y embebidas en una matriz extracelular de sustancias producidas por ellas (Costerton et al., 1995). Las células en estos biofilms tienen un patrón de expresión completamente diferente y heterogéneo, formando micronichos en una comunidad microbiana compleja. Ade- más, es importante resaltar la estructuración de estos biofilms, ya que hay una ho- meostasis dentro del mismo, teniendo incluso un sistema de canales de intercambio de nutrientes y fluidos, cooperación metabólica e intercambio de genes. Estos micro- ambientes dentro del propio biofilm están diferenciados por pH, concentración de io- nes y tensión de oxígeno. El biofilm se caracteriza por ser genéticamente diverso, y el principal mecanismo para conseguirlo es una eficiente transferencia horizontal de genes dentro del mismo (Ehrlich et al., 2010, Hiller et al., 2010). Este proceso se dará más en regiones con mayor crecimiento que en las regiones más sésiles, con células persistentes, donde se acumulan productos metabólicos de desecho (Seoane et al., 2011). INTRODUCCIÓN 40 Los estudios basados en modelos de estado planctónico junto con el análisis de fac- tores de virulencia pueden explicar la mayoría de enfermedades infecciosas agudas, pero son inadecuados para entender las enfermedades crónicas (Costerton et al., 1999, Wolcott et al., 2013). Sin embargo, el modelo de biofilm de Costerton y Stewart podía explicar varios aspectos como la infectividad de los anticuerpos y linfocitos en combatir ciertas infecciones asociadas a biofilm (Lam et al., 1987, Leid et al., 2005). También permite comprender la falta de capacidad de los antibióticos a la hora de combatir una infección asociada a biofilm (Stewart y Costerton, 2001). Y, por último, entender su capacidad para inducir una respuesta hiperinmune en el hospedador con un aumento de citoquinas proinflamatorias (Trengove et al., 1996), de metaloprotea- sas de la matriz (Trengove et al., 1999) y de proporción de neutrófilos (Diegelmann, 2003). Los biofilms están implicados en más del 80% de las enfermedades infeccio- sas e inflamatorias crónicas incluyendo la otitis media, la periodontitis, la endocarditis, úlceras gastrointestinales, infecciones del sistema urinario e infecciones pulmonares en pacientes con fibrosis quística (Costerton et al., 1995, Costerton et al., 1999, Wolcott y Ehrlich, 2008, Schaudinn et al., 2009). Uno de los principales problemas en la práctica clínica con los biofilms es su menor susceptibilidad a los antibióticos, ya que hará falta hasta concentraciones 1000 veces superiores respecto a las que inhi- ben a la bacteria en forma planctónica (Stewart y Costerton, 2001, Mah y O'Toole, 2001, El-Azizi et al., 2005). Aunque parece que algunos antimicrobianos tienen difi- cultad en penetrar la matriz del biofilm (Farber et al., 1990, Jefferson et al., 2005, Singh et al., 2016), la alta tolerancia de los biofilms a agentes terapéuticos se debe principalmente al metabolismo alterado de las células embebidas en él (Stewart, 2002, Schilcher y Horswill, 2020). En general, las bacterias dentro de un biofilm mues- tran una actividad proliferativa y metabólica reducida, incrementando su tolerancia a los antibióticos dirigidos a la pared celular, y a la síntesis de ADN y proteínas (Hogan y Kolter, 2002, Waters et al., 2016, Bui et al., 2017). También, como se mencionó previamente, las poblaciones dentro del biofilm presentan una alta diversidad gené- tica debido a la transferencia horizontal de genes (Ehrlich et al., 2010, Hiller et al., 2010). Esta resistencia puede deberse a la presencia de células bacterianas persis- tentes dentro del biofilm, que pueden sobrevivir al tratamiento antibiótico sin volverse resistentes (Balaban et al., 2019). Otro de los problemas en clínica de estos biofilms bacterianos es que son capaces de evadir los sistemas de defensa inmune del hospedador (Domenech et al., 2013b, INTRODUCCIÓN 41 Scherr et al., 2014). Una de las primeras evidencias se observó en Mycoplasma pul- monis, en el que la formación de biofilm protegía de los efectos líticos de la inmunidad del complemento (Simmons y Dybvig, 2007) y en S. epidermidis, que en estado de biofilm era capaz de evitar la muerte bacteriana mediada por neutrófilos evadiendo el depósito de C3b (Kristian et al., 2008). En el caso de neumococo se observó que las células dentro del biofilm eran capaces de evadir el depósito de C3b en la superficie bacteriana (Domenech et al., 2013b). Además, estas podían evitar la activación tem- prana de la vía clásica del complemento, evitando el reconocimiento por el C1q y por la proteína de fase aguda CRP. Se observó que no sólo afectaba a la vía clásica, sino que el biofilm neumocócico recluta el regulador negativo de la vía alternativa fH en mayor cantidad, debido a una mayor expresión de PspC en la superficie bacteriana del biofilm (Domenech et al., 2013b). La consecuencia de todo esto es que la opso- nofagocitosis del biofilm neumocócico es menor que en un cultivo planctónico. Tam- bién se creyó que la resistencia al sistema inmune se debía al microambiente del biofilm actuando como una barrera física (Høiby et al., 2001), pero se observó que, en el caso de S. aureus, las células del sistema inmune eran capaces de adherirse y penetrar en los biofilms (Leid et al., 2002). S. aureus en forma de biofilm tiene diver- sos mecanismos para evadir el sistema inmune: los biofilms son capaces de evadir vías de reconocimiento como las mediadas por TLR 2 y 9 (Thurlow et al., 2011); pue- den secretar grandes concentraciones de leucocidinas como la PVL y la γ-hemolisina evitando su eliminación por neutrófilos (Bhattacharya et al., 2018); y se ha atribuido al exopolisacárido de la matriz extracelular, que comparte con S. epidermidis, la ca- pacidad de desacetilarse y evadir el sistema inmune (Vuong et al., 2004). 3.1.1. Formación de un biofilm La formación del biofilm es un proceso multifactorial y complejo, pero siempre empe- zará con una adhesión inicial reversible sobre una superficie abiótica, una superficie biótica o una interfase aire-líquido. Cuando la bacteria se adhiere a la superficie de forma irreversible, comienza a dividirse alrededor del sitio de unión formando una microcolonia. Estas bacterias empiezan a comunicarse por señales de quorum sen- sing (QS), ello regula la expresión de diferentes genes, y las bacterias adheridas se- cretan los componentes que formarán parte de la matriz extracelular del biofilm, como exopolisacáridos, proteínas y ácidos nucleícos. Posteriormente, el biofilm empieza a estructurase, formando sistemas de canales que facilitan el transporte de nutrientes INTRODUCCIÓN 42 y sustancias de desecho, y el biofilm continua su crecimiento hasta alcanzar la ma- duración (Figura 7). Por último, existe una fase de dispersión, donde parte de las bacterias que integran esa comunidad microbiana, se liberan y colonizan una nueva superficie, cerrando así el proceso de desarrollo del biofilm (Bryers, 2008, Moormeier y Bayles, 2017, Schilcher y Horswill, 2020). En 2014, Moormeier y colaboradores ob- servaron en un sistema de flujo continuo una fase previa al biofilm maduro de S. aureus a la que denominaron éxodo. Esta fase consiste en que el biofilm se reestruc- tura y dispersa y utiliza mecanismos diferentes a los usados para la fase de dispersión final una vez el biofilm es maduro (Moormeier et al., 2014, Moormeier y Bayles, 2017). Figura 7. Fases en la formación de un biofilm. Imagen realizada con BioRender (https://bio- render.com/). INTRODUCCIÓN 43 3.2. Biofilms de S. pneumoniae En los últimos años se ha visto incrementado el número de trabajos sobre el biofilm neumocócico usando diferentes aproximaciones in vitro que cada vez se asemejan más a las condiciones in vivo. El primer sistema que se diseñó fue en 1997 y se basaba un crecimiento estacionario en filtros de celulosa (Budhani y Struthers, 1997), simulando la colonización de la nasofaringe (Waite et al., 2001). Otra aproximación utilizó sistemas de flujo continuo, en el que se podía observar los diferentes fenotipos de S. pneumoniae durante el desarrollo del biofilm (Allegrucci et al., 2006). Otra al- ternativa consistió en el desarrollo de un sistema estático con placas multipocillo de poliestireno y placas con fondo de vidrio para el estudio in vitro de los biofilms neu- mocócicos. Este sistema permite ver la influencia de diferentes factores como nu- trientes, pH, osmolaridad y temperatura (Moscoso et al., 2006, Domenech et al., 2012), así como hacer una caracterización rápida de mutantes defectivos en la for- mación de biofilm (Muñoz-Elías et al., 2008, Domenech et al., 2009). El siguiente paso in vitro para aproximarse aún más a la formación de biofilms in vivo fue el desa- rrollo de un biofilm sobre cultivos celulares de células respiratorias por parte de Vidal y colaboradores (Vidal et al., 2013). Estos biofilms neumocócicos se han detectado en la superficie de las glándulas adenoides y mucosas en niños con infecciones re- currentes del oído medio, otitis media con otorrea (Hall-Stoodley et al., 2006, Coates et al., 2008, Hoa et al., 2009, Nistico et al., 2011) y en las mucosas de pacientes con rinosinusitis crónica. También en modelos animales se han detectado estos biofilms, como en la mucosa del oído medio de chinchillas infectadas con S. pneumoniae (Weimer et al., 2010, Perez et al., 2014), como en el oído medio, nasofaringe, tráquea y pulmones de los ratones (Sanchez et al., 2010, Perez et al., 2014). 3.2.1. Regulación del biofilm neumocócico La regulación del biofilm neumocócico es compleja y multifactorial. Uno de los siste- mas QS más estudiados en S. pneumoniae es el del péptido estimulador de la com- petencia (CSP) (Håvarstein et al., 1995). Este sistema tiene el péptido precursor CSP codificado por el gen comC y el receptor ComD, que autofosforila al regulador ComE cuando el CSP alcanza un umbral de concentración (Pestova et al., 1996). Además de inducir la competencia, este sistema de QS controla la virulencia y la formación de biofilm (Lau et al., 2001, Vidal et al., 2013). En concreto, se observó que al añadir INTRODUCCIÓN 44 CSP se incrementaba el biofilm en superficies de plástico (Oggioni et al., 2006), pero no en placas de poliestireno ni en los sistemas de flujo continuo (Trappetti et al., 2011a), aunque posteriormente se apreció que sí que regulaba el biofilm en las es- tructuras producidas en biorreactores sobre células (Vidal et al., 2013). Otro de los sistemas QS implicados en la formación de biofilm es el LuxS/AI-2 (Vidal et al., 2011, Trappetti et al., 2011c, Vidal et al., 2013). En este sistema la enzima LuxS, codificada por el gen luxS, presente tanto en cepas invasivas como en cepas de portadores, sintetiza el AI-2 (autoinductor 2) que es necesario para regular la expresión génica (Reading y Sperandio, 2006). El sistema de QS Rgg/SHP también contribuye a la formación del biofilm al regular la expresión del CPS (Junges et al., 2017). Además, se ha intentado estudiar la implicación de diferentes genes en la formación del biofilm neumocócico (Domenech et al., 2009, Domenech et al., 2012, Chan et al., 2018, Hu et al., 2019), entre ellos los genes capsulares, ya que una mayor capacidad de formar biofilms está directamente relacionada con una reducción tanto del tamaño de la co- lonia como de las cantidades relativas de CPS (Domenech et al., 2009, Domenech et al., 2012). Otros genes relacionados con la formación del biofilm son los que forman parte de sistemas toxina-antitoxina (Chan et al., 2018), del sistema de dos compo- nentes CiaRH (Trappetti et al., 2011b), del metabolismo de carbohidratos (Domenech et al., 2012) y otros muchos más. En cualquier caso, se ha puesto de manifiesto nu- merosas veces que el fondo genético de la cepa influye en la capacidad de formación de biofilm, encontrando fenotipos contradictorios en este proceso dependiendo de la cepa usada (Domenech et al., 2012). 3.2.2. Importancia del CPS en el biofilm neumocócico En el propio proceso de adhesión del neumococo la presencia y cantidad del CPS parece ser inversamente proporcional a la adhesión a células eucariotas (Selinger y Reed, 1979, Talbot et al., 1996, Adamou et al., 1998). Posteriormente se demostró que el CPS representa una barrera física en los primeros pasos de la formación de biofilm, ya que las cepas capsuladas usadas mostraban menor formación de biofilm in vitro que las no capsuladas (Moscoso et al., 2006) y en biofilms del serotipo 3 los mutantes que tenían colonias y cápsulas más pequeñas presentaban mejor capaci- dad de formación de biofilm (Domenech et al., 2009). INTRODUCCIÓN 45 Figura 8. Formación de biofilm por diferentes serotipos comparando con la cepa no capsulada M11 de fondo genético conocido. (A) Biofilm del serogrupo 19. (B) Biofilm por serotipos no VCN13. Imagen adaptada de (Domenech et al., 2015, Domenech et al., 2014). INTRODUCCIÓN 46 Esto es compatible con la hipótesis de que neumococo regula la expresión de su CPS en su transición de colonizador en la nasofaringe, donde está asociada la formación de biofilm, al desarrollo de enfermedad invasiva (Hammerschmidt et al., 2005). La falta de CPS hace que muchas proteínas de superficie asociadas a adhesión y viru- lencia queden expuestas y pueda facilitar la interacción del microorganismo con la superficie. Otro aspecto observado es que no todos los CPS impedían la formación de biofilm de la misma forma, mostrando que serotipos que eran buenos colonizado- res y tenían una alta incidencia en colonización y ENI como son el 19F y el 19A, formaban un buen biofilm in vitro (Domenech et al., 2014). Además, se observó que la formación de biofilm, podría considerarse como estrategia para predecir serotipos emergentes después de la introducción de las vacunas conjugadas neumocócicas (Domenech et al., 2014, Domenech et al., 2015) (Figura 8). 3.2.3. Matriz extracelular del biofilm neumocócico Como se definió al principio, las bacterias en un biofilm están embebidas en una ma- triz extracelular compuesta por las llamadas sustancias poliméricas extracelulares (EPS). Estas sustancias incluyen exopolisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y lí- pidos que, en su conjunto, determinarán la arquitectura del biofilm, dándole integridad estructural y cohesión. Se demostró la presencia de al menos un exopolisacárido en la matriz del biofilm neumocócico usando una cepa no capsulada (Domenech et al., 2013a). El análisis químico de este exopolisacárido junto con los resultados de la acción de diferentes enzimas indicó que el polisacárido de este biofilm tenía residuos de glucosa β(1→4) y N-acetilglucosamina β(1→4) con ramificaciones de Glucosa/Galactosa α(1→6) (Domenech et al., 2013a). También se demostró la presencia de ADN extracelular (ADNe) y proteínas extracelulares ya que al añadir DNasaI o proteasas antes o des- pués de la formación del biofilm este se vio afectado, demostrando la importancia del ADNe como las proteínas extracelulares tanto para la formación como para el man- tenimiento de la estructura del biofilm (Moscoso et al., 2006). Este ADNe siempre se creyó que procedía de la autolisis bacteriana dentro del biofilm, pero se demostró que en biofilms in vitro había mecanismos independientes de autolisis implicados en la producción del ADNe (Domenech y García, 2018). Además, este ADNe junto con INTRODUCCIÓN 47 proteínas extracelulares, específicamente las CBPs LytC, LytB y CbpD, pueden for- mar complejos intercelulares en la matriz, siendo un reconocimiento inespecífico del ADNe por parte de las proteínas (Domenech et al., 2013a). Una de las proteínas más esenciales para la formación de biofilm neumocócico es LytB (Domenech y García, 2020), que tiene una función activa y estructural clave en el biofilm. 3.3. Biofilms de S. aureus Staphylococcus aureus, junto a S. epidermidis, es uno de los patógenos más notorios por su biofilm, siendo de especial importancia por causar infecciones crónicas sobre dispositivos médicos invasivos y adquirir resistencia a tratamientos terapéuticos en este estado. Algunos de estos dispositivos son catéteres, tubos endotraqueales, ven- tiladores mecánicos, prótesis y válvulas (Ribeiro et al., 2012, Shoji y Chen, 2020). Estas infecciones relacionadas con el biofilm tienen una morbilidad y mortalidad in- crementada, requiriendo la retirada del dispositivo y aumentando el tiempo de hospi- talización. En España, un estudio sobre la prevalencia de las infecciones nosocomia- les en los diferentes hospitales indicó un aumento de incidencia de infección asociada a catéteres, dispositivos implantables, prótesis articulares y un aumento elevado de la mortalidad en el caso de válvulas prostéticas (SEMPSPH y ECDC, 2017). 3.3.1. Regulación del biofilm de S. aureus La regulación del biofilm de S. aureus es una de los aspectos más estudiados hasta la fecha, siendo un proceso que está estrictamente regulado desde la adhesión inicial hasta la diseminación del biofilm maduro (Parsek y Greenberg, 2005, Schilcher y Horswill, 2020). Uno de los principales reguladores del desarrollo del biofilm en S. aureus son los sistemas QS, señales ambientales y otros reguladores como Sae, SarA y Rot (Thoendel et al., 2011, Le y Otto, 2015, Wolska et al., 2016, Kavanaugh et al., 2019). El principal sistema de QS en S. aureus es el sistema Agr, que se encuentra codifi- cado en el cromosoma y está formado por dos unidades transcripcionales RNAII y RNAIII reguladas por dos promotores P2 y P3 (Novick et al., 1993, Ji et al., 1997). RNAII contiene los genes agrBDCA que sintetizan: el péptido autoinductor (AIP); la molécula a la que se unirá, AgrC, que se autofosforilará y empezará la cascada de INTRODUCCIÓN 48 transducción; y el regulador AgrA, que inducirá la expresión de RNAIII mediante el promotor P3 (Novick et al., 1995). RNAIII hace que se expresen proteínas secretadas como toxinas y exoenzimas y regula negativamente los genes que codifican adhesi- nas (Cheung et al., 2011). Por lo tanto, para el inicio de la formación de biofilm el sistema Agr tiene que estar reprimido o con actividad baja y, posteriormente, acti- varse en ciertas zonas del biofilm produciéndose la disgregación del mismo, dando lugar a la fase final de dispersión después del biofilm maduro (Saravia-Otten et al., 1997, Yarwood et al., 2004, Schilcher y Horswill, 2020). Además, hay factores am- bientales que afectan a la regulación del sistema de QS y de la formación del biofilm, por ejemplo, el pH y la disponibilidad de nutrientes. Una disminución de pH inhibe la transcripción de agr (Weinrick et al., 2004). La disponibilidad de nutrientes también es importante ya que una disminución de glucosa en biofilms ya formados activará el sistema Agr produciendo la dispersión del biofilm (Boles y Horswill, 2008). Esta glu- cosa hace que se active la proteína de control del catabolismo A (CcpA), que regula positivamente cidA — liberándose ADNe e icaA— un gen esencial para la producción del exopolisacárido (Seidl et al., 2008). Hay numerosos reguladores, aparte de sistemas QS, implicados en la formación de biofilms. El sistema de dos componentes Sae basado en el sensor SaeS y en el re- gulador SaeR también controla la expresión del biofilm mediante la regulación de varias exoproteinas como la α-hemolisina, las fibronectinas A y B y la termonucleasa extracelular Nuc (Liang et al., 2006, Rogasch et al., 2006, Olson et al., 2013, Flack et al., 2014). El regulador accesorio de S. aureus llamado SarA es un factor de trans- cripción que induce también la expresión de la α-hemolisina, las fibronectinas A y B y reprime la expresión de las proteasas extracelulares, por lo que es importante para la formación de biofilm (Chan y Foster, 1998, Xiong et al., 2006, Mrak et al., 2012, Zielinska et al., 2012). También el factor sigma SigB de respuesta a estrés contribuye a la formación de biofilm mediante la regulación positiva de diferentes adhesinas como fibronectina A y el sistema SarA, y regulación negativa de nucleasas y protea- sas, del sistema Agr (Ziebandt et al., 2001, Horsburgh et al., 2002, Atwood et al., 2015). Existen otros ejemplos de reguladores de la formación de biofilm como el re- presor transcripcional CodY, el sistema de dos componentes LytSR, el sistema de QS LuxS/AI-2 y el AMP cíclico (Schilcher y Horswill, 2020). INTRODUCCIÓN 49 3.3.2. Matriz extracelular del biofilm estafilocócico Los biofilms estafilocócicos se pueden dividir en dos categorías según su matriz ex- tracelular: biofilms que consisten en una matriz polisacarídica, denominados ica-de- pendientes, y los biofilms que poseen una matriz extracelular rica en proteínas y ADNe, llamados ica-independientes (Figura 9). En los biofilms que dependen de la síntesis del exopolisacárido, este representa el componente principal de la matriz. Este exopolisacárido en S. aureus se denomina poly-β(1-6)-N-acetilglucosamina (PNAG), también llamado PIA (Mack et al., 1996, Maira-Litrán et al., 2002), y es sin- tetizado por las proteínas codificadas en el operón icaADBC que está estrictamente controlado por los reguladores IcaR y TcarR (Jefferson et al., 2004). Además de estos biofilms dependiente de exopolisacárido, S. aureus puede formar biofilms basados principalmente en proteínas extracelulares, siendo la proteína asociada a biofilm (Bap), una de las más estudiadas (Cucarella et al., 2001) y relevantes, ya que está implicada en la adhesión al sustrato y en la acumulación del biofilm. Se ha observado que Bap puede construir estructuras tipo amiloides que promueven la formación de biofilm (Taglialegna et al., 2016, Ma et al., 2021). Estos biofilms ica-independientes se han asociado principalmente a aislados SARM y aislados clínicos de S. epidermi- dis, mientras que los SASM suelen poseer matrices ica-dependientes (Fitzpatrick et al., 2005, Rohde et al., 2005, Kogan et al., 2006, O'Neill et al., 2007). En cualquier caso, este proceso es más complejo de lo que podría parecer, ya que aislados con el operón icaADBC pueden formar biofilms ica-independientes (Cucarella et al., 2004). También se puede considerar un tercer tipo de matriz en los biofilms de S. aureus cuyo componente principal es el ADNe. La importancia del ADNe se puso en eviden- cia con un mutante en AtlA, la principal autolisina, al mostrar una reducida formación de biofilm (Bose et al., 2012), mientras que la mutación en la termonucleasa Nuc permitía una formación de biofilm incrementada (Kiedrowski et al., 2011). Además, muchos biofilms maduros son susceptibles a la acción de la DNasa I, demostrando la importancia del ADNe en la estructura de la matriz extracelular del biofilm (Mann et al., 2009). Asimismo, parece importante la interacción de proteínas con ADNe en esta matriz con, por ejemplo, lipoproteínas de la pared celular que contribuyen a la formación de biofilm (Kavanaugh et al., 2019). Además, se demostró que factores de virulencia secretados así como proteínas ribosomales se encontraban atrapadas en INTRODUCCIÓN 50 la matriz del biofilm, contribuyendo a su estabilidad, ya que mediaban las interaccio- nes electroestáticas entre componentes de la superficie y ADNe (Graf et al., 2019). Figura 9. Biofilms de S. aureus ica-dependientes/independientes. (A) Representación gráfica de ambos fenotipos sobre una superficie abiótica. (B) Imagen de microscopía electrónica de transmisión de ambos fenotipos. Adaptado de McCarthy et al., 2015. INTRODUCCIÓN 51 3.4. Biofilms mixtos La metagenómica ha demostrado que las bacterias que siguen la estrategia de formar un biofilm tienen muchos mecanismos para incluir diversidad microbiana (Wolcott et al., 2013). La participación de diferentes especies bacterianas (o fúngicas) dentro del biofilm, hace que este adquiera numerosas ventajas, como resistencia pasiva a anti- bióticos, cooperación metabólica, activación de sistemas de QS y, como ventaja prin- cipal, una mayor capacidad de intercambio de genes de diferente procedencia micro- biana. Se ha sugerido que, en biofilms polimicrobianos, la pluralidad genómica lleva a la producción de nuevas cepas, facilitando una infección persistente (Ehrlich et al., 2005). Debido a la heterogenidad microbiana en los diferentes nichos, se puede con- siderar que muchos de los biofilms que encontraremos son polimicrobianos, pudiendo tener desde diferentes cepas de la misma especie, diferentes especies del mismo género hasta incluso especies de diferentes reinos, como biofilms mixtos hongo-bac- teria (Donlan y Costerton, 2002, Harriott y Noverr, 2011, Rodrigues et al., 2019). Estos biofilms mixtos tendrán un tratamiento más complicado debido a la diversidad y com- plejidad de las relaciones interespecíficas, que afectarán tanto a la colonización, res- puesta del hospedador, resistencia a antimicrobianos y progreso de la enfermedad (Ribeiro et al., 2012, Mahajan et al., 2013). Los biofilms mixtos confirman la importancia de la interacción de diferentes patóge- nos con la microbiota normal de determinados lugares, como la nasofaringe, donde se encontrarán formando biofilm (Belkaid y Hand, 2014, Dunne et al., 2018). En la enfermedad respiratoria es relevante considerar la interacción de virus respiratorios y cuatro patógenos bacterianos predominantes: S. pneumoniae, H. influenzae no ti- pificable, S. aureus y M. catarrhalis. En este sentido, se ha visto una microbiota más rica en diversidad bacteriana en niños que han sufrido ENI (Camelo-Castillo et al., 2019). Se han realizado varias aproximaciones in vitro a estos biofilms mixtos, entre patógenos como S. pneumoniae y H. influenzae (Domenech y García, 2017), Pseu- domonas aeruginosa y S. aureus (Chew et al., 2018), S. pneumoniae y S. aureus (Reddinger et al., 2018), y el triple de S. pneumoniae, H. influenzae y M. catarrhalis (Bair y Campagnari, 2019). Sin embargo, aún quedan muchos aspectos por conocer de la interacción entre los diferentes patógenos que viven en comunidad. INTRODUCCIÓN 52 3.5. Terapias antibiofilms Debido al difícil y prolongado tratamiento que requieren los biofilms, que entre otras cosas podría potenciar el desarrollo de resistencias antibióticas, se requieren nuevas terapias específicas antibiofilm. Debido a que es muy complicado tratar el biofilm una vez se ha establecido, otra estrategia que se ha desarrollado se basa en modificar las superficies de biomateriales, como catéteres e implantes, para evitar la adhesión y la formación del biofilm (Bridgett et al., 1992, Peeters et al., 2019). Varias estrate- gias antibiofilm se han puesto a punto, entre ellas: interferir con los sistemas QS (Quave y Horswill, 2014); degradar la matriz del biofilm o inhibir componentes de esta matriz (Dieltjens et al., 2020); administración de compuestos con efecto bactericida frente a las bacterias que componen el biofilm (Domenech y García, 2017). Una po- sibilidad para eliminar biofilms de S. aureus afectando a sistemas QS consiste en la administración del autoinductor AIP, que activará el sistema QS Agr produciendo la dispersión del biofilm y la vuelta a un fenotipo susceptible a antibióticos (Boles y Horswill, 2008). A nivel de degradación de la matriz del biofilm, existen varias molé- culas que podrían hacerlo como es el caso de la dispersina B en S. aureus ica-de- pendiente o usando la DNAsa I en biofilms de S. aureus y S. pneumoniae (Moscoso et al., 2006, Donelli et al., 2007, Lauderdale et al., 2010). El problema de esta disper- sión del biofilm es que las bacterias liberadas del mismo, pueden infectar otras loca- lizaciones al no tener efecto bactericida, por eso estos agentes deberían adminis- trarse siempre con antibióticos para prevenir infecciones secundarias (Donelli et al., 2007, Fleming y Rumbaugh, 2018). Entre los compuestos con efecto bactericida que más se han usado han sido agentes mucolíticos como la N-acetil-L-cisteina, que tiene un marcado efecto sobre biofilms monoespecie y biofilms mixtos y podría usarse en combinación con antibióticos (Blasi et al., 2016, Domenech y García, 2017, Manoharan et al., 2020). Por último, una estrategia alternativa a los antibióticos sería el uso de bacteriófagos y productos derivados de estos. Las enzimas líticas derivadas de fagos llamadas enzibióticos son lisinas codificadas por fagos que infectan a las bacterias o enzimas líticas bacterianas capaces de hidrolizar la pared celular de las bacterias y que en el caso de las de origen fágico, se expresarán al final del ciclo de replicación del mismo (Vázquez et al., 2018). Un ejemplo es la LysCSA13 del bacte- riófago CSA13 que se ha visto que afecta hasta el 90% del biofilm formado por S. aureus en diferentes superficies (Cha et al., 2019). En el caso del neumococo, dife- rentes enzimas líticas como la Cpl-1 y Cpl-7 o la endolisina quimérica Cpl-711 son INTRODUCCIÓN 53 capaces de destruir gran parte del biofilm (Domenech et al., 2011, Vazquez y García, 2019). 3.6. Los biofilms en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el humo de tabaco La EPOC es una alteración de la funcionalidad de las vías aéreas debido a un pro- ceso inflamatorio sostenido. Esta se manifiesta como la coexistencia de dos enfer- medades pulmonares: bronquitis, viendo las vías aéreas inflamadas; y enfisema, con exceso de esputo y la destrucción del parénquima pulmonar (Rom et al., 2013). La EPOC se encuentra entre las principales causas de morbilidad y mortalidad, siendo la cuarta causa de muerte a nivel mundial (OMS, 2020). El principal factor de riesgo para el desarrollo de EPOC es el consumo de tabaco, tanto en los fumadores activos como en los pasivos (Nuorti et al., 2000). Una de las consecuencias de la EPOC es la infección crónica de las vías respiratorias bajas por diferentes patógenos. Estos pacientes sufren colonizaciones virales o bac- terianas que dan lugar a agudizaciones de la enfermedad, y que reciben el nombre de exacerbaciones (EAEPOC). Las bacterias más comúnmente asociadas a las EAEPOC son H. influenzae (20–30%), seguida de S. pneumoniae y M. catarrhalis (10–15% ambas) (Sethi y Murphy, 2008). Seguramente, estas bacterias que coloni- zan las vías respiratorias inferiores de los pacientes EPOC se encuentren en estado de biofilm (Weeks et al., 2021) y, al tratarse de ambientes polimicrobianos, estos bio- films no sean monoespecie, aunque se requieren más evidencias de este estado de biofilm en pacientes EPOC (Weeks et al., 2021). Por último, el humo de tabaco no sólo tiene un efecto en las vías respiratorias, sino que también afecta directamente a las bacterias que se encuentran en estas y, más específicamente, a su capacidad de formación de biofilm. En un reciente trabajo se ha observado que los niños expuestos a humo de tabaco de manera pasiva pueden desarrollar biofilms en la nariz, que podría llevar a infecciones persistentes como si- nusitis y otras enfermedades respiratorias (Elwany et al., 2021). La exposición de neumococo al extracto de humo de tabaco (EHT) aumenta la formación de biofilm por parte de la bacteria y afecta a la acción de la toxina Ply (Mutepe et al., 2013, Hutcherson et al., 2015). En S. aureus, este EHT también produce un aumento de la INTRODUCCIÓN 54 formación de biofilm, debido a mecanismos de estrés oxidativo (Kulkarni et al., 2012) y, además el EHT, redirige a S. aureus a un perfil de virulencia asociado a persisten- cia (Lacoma et al., 2019). II. OBJETIVOS OBJETIVOS 57 Una de las maneras más eficientes de luchar contra le enfermedad neumocócica es el uso de medidas profilácticas como las vacunas. Desde la introducción de las dife- rentes vacunas conjugadas se ha producido un reemplazo por serotipos no incluidos en las vacunas, entre los que destacan los serotipos 22F y 33F como serotipos co- munes incluidos en las dos nuevas vacunas conjugadas 15-valente y 20-valente. Va- rios de estos serotipos emergentes están asociados a resistencia a antibióticos, y es por ello, por lo que la vigilancia epidemiológica y el estudio de serotipos no vacunales emergentes en S. pneumoniae es de vital importancia. S. aureus es un microorganismo patógeno con alto impacto en infecciones comuni- tarias e intrahospitalarias en España, sobre todo SARM. El estado de biofilm es vital para la patogénesis de este microorganismo, cuya composición de la matriz depen- derá de factores genéticos y ambientales. Se han observado estadios de disgrega- ción y formación de biofilm en sistemas de flujo continuo, pero los estudios son esca- sos y, en su mayoría, se han utilizado cepas de laboratorio con poca relevancia clí- nica. S. aureus y S. pneumoniae pueden encontrarse colonizando juntos la nasofaringe, y produciendo infecciones vinculadas a la formación de biofilm. Esto es preocupante a nivel clínico y debido a la mayor resistencia a antibióticos asociada al estado de bio- film, es necesaria la búsqueda de nuevas terapias antibiofilm. Los biofilms también suelen estar ligados a enfermedades infecciosas crónicas en pacientes EPOC, donde se ha observado que el tabaco no sólo afecta a la respuesta del epitelio pulmonar frente a la infección sino también frente al propio patógeno. Teniendo en cuenta lo expuesto anteriormente, los objetivos que se plantean en esta tesis doctoral son los siguientes: 1. Caracterizar la epidemiología y patogénesis de los serotipos 22F y 33F en España y evaluar su capacidad de evasión del sistema inmune. 2. Estudiar la resistencia de aislados clínicos no susceptibles a penicilina frente a diferentes antibióticos comúnmente utilizados en el tratamiento de las in- fecciones producidas por S. pneumoniae. OBJETIVOS 58 3. Analizar el impacto de S. aureus en España y estudiar el estado de biofilm y evasión del sistema inmune en aislados clínicos. 4. Desarrollar sistemas de biofilm mixto in vitro de S. aureus y S. pneumoniae para el estudio de terapias antibiofilm. 5. Evaluar el impacto del humo de tabaco en biofilms de S. aureus y biofilms mixtos de S. aureus y S. pneumoniae. 6. Estudiar la capacidad de la vacuna VNC13 para inducir opsonopfagocitosis frente a los biofilms de S. aureus y S. pneumoniae utilizando sueros de indi- viduos vacunados. III. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 61 1. ESTIRPES BACTERIANAS Y OLIGONUCLEÓTIDOS Las estirpes bacterianas y los oligonucleótidos utilizados durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral están detallados en las Tablas 2, 3 y 4. Los aislados clínicos de S. pneumoniae proceden del Laboratorio de Referencia de Neumococos en el Centro Nacional de Microbiología, donde se identifica la especie, se determina el serotipo y la concentración mínima inhibitoria a una serie de antibióticos. Los aislados clínicos de S. aureus proceden del Laboratorio de Infecciones Intrahospitalarias en el Centro Nacional de Microbiología, donde se identifica la especie, se estudian si son produc- tores o no de toxinas, se analizan los genes mecA y mecC para confirmar la resisten- cia a meticilina y se estudian los mecanismos de resistencia a oxazolidinonas. En las Tablas 2 y 3 no se reflejan los aislados clínicos empleados para los análisis epide- miológicos. Tabla 2. Estirpes de S. pneumoniae utilizadas a lo largo de esta Memoria. Estirpe Descripcióna Referencia/Origenb 69 Serotipo 19F (Sangre) (Soriano et al., 2008) 100/08 Serotipo 22F (Ótico/Pediátrico) ST433/CC433 LRN 123/19 Serotipo 14 (Sangre/Adulto) LRN 194/17 Serotipo 22F (Sangre/Pediátrico) ST433/CC433 LRN 212/18 Serotipo 22F (Sangre/Adulto) ST698/CC698 LRN 223/11 Serotipo 22F (L-PL/Pediátrico) ST433/CC433 LRN 250/18 Serotipo 22F (Sangre/Adulto) ST433/CC433 LRN 306/18 Serotipo 22F (Sangre/Adulto) ST433/CC433 LRN 363/18 Serotipo 33F (L-PL/Adulto) ST717/CC717 LRN 523/18 Serotipo 22F (LCR/Adulto) ST13692/CC698 LRN 613/18 Serotipo 22F (Sangre/Adulto) ST7314/CC433 LRN 627/18 Serotipo 33F (Sangre/Adulto) ST717/CC717 LRN 644/18 Serotipo 33F (Sangre/Pediátrico) ST717/CC717 LRN 782/15 Serotipo 33F (Ótico/Pediátrico) ST1012/CC1012 LRN 800/18 Serotipo 33F (L-PL/Pediátrico) ST717/CC717 LRN 840/18 Serotipo 33F (Sangre/Adulto) ST717/CC717 LRN 854/12 Serotipo 18C (Sangre/Adulto) LRN MATERIALES Y MÉTODOS 62 934/19 Serotipo 33F (LCR/Adulto) ST717/CC717 LRN 1000/18 Serotipo 22F (Sangre/Adulto) ST13692/CC698 LRN 1018/18 Serotipo 33F (Sangre/Pediátrico) ST717/CC717 LRN 1088/16 Serotipo 33F (LCR/Pediátrico) ST717/CC717 LRN 1155/18 Serotipo 22F (LCR/Pediátrico) ST433/CC433 LRN 1228/19 Serotipo 19A (Sangre/Adulto) LRN 1285/18 Serotipo 22F (L-PL/Adulto) ST698/CC698 LRN 1407/18 Serotipo 22F (Sangre/Pediátrico) ST3134/CC1439 LRN 1732/19 Serotipo 11A (Sangre/Adulto) LRN 1734/19 Serotipo 8 (Sangre/Adulto) LRN 1743/19 Serotipo 3 (Sangre/Adulto) LRN 1766/18 Serotipo 22F (Sangre/Pediátrico) ST3134/CC1439 LRN 1833/18 Serotipo 33F (Sangre/Pediátrico) ST717/CC717 LRN 1897/18 Serotipo 33F (Sangre/Adulto) ST717/CC717 LRN 1945/15 Serotipo 33F (Ótico/Pediátrico) ST717/CC717 LRN 1950/18 Serotipo 33F (Sangre/Adulto) ST13320/CC717 LRN 1992/18 Serotipo 33F (Sangre/Pediátrico) ST4668/CC717 LRN 2027/18 Serotipo 33F (Sangre/Adulto) ST717/CC717 LRN 2153/17 Serotipo 22F (Sangre/Pediátrico) ST433/CC433 LRN 2316/17 Serotipo 33F (Sangre/Pediátrico) ST13320/CC717 LRN 2597/17 Serotipo 22F (Sangre/Pediátrico) ST433/CC433 LRN 2780/17 Serotipo 22F (Ótico/Adulto) ST13692/CC698 LRN M11 Mutante no capsulado derivado de R6 (Hex-, lytA+) (Domenech et al., 2014) P007 Transformante M11 con DNA de la cepa 406; serotipo 3 (Domenech et al., 2009) P017 Transformante M11 con DNA de la cepa SSISP33F/1; serotipo 33F (Domenech et al., 2015) P224 Transformante M11 con DNA de la cepa 3017/13; se- rotipo 24F (Domenech et al., 2014) P244 Transformante M11 con DNA de la cepa 3014/13; se- rotipo 22F (Domenech et al., 2014) YNM1 Transformante M11 con DNA de la cepa 1743/19 ; se- rotipo 3 Esta tesis YNM2 Transformante M11 con DNA de la cepa 1734/19; se- rotipo 8 Esta tesis MATERIALES Y MÉTODOS 63 YNM3 Transformante M11 con DNA de la cepa 1732/19; se- rotipo 11A Esta tesis YNM4 Transformante M11 con DNA de la cepa 1228/19; se- rotipo 19A Esta tesis a. ST, secuencitipo; CC, complejo clonal; L-PL, líquido pleural; LCR, líquido cefalorraquídeo. b. LRN, Laboratorio de Referencia de Neumococo del Instituto de Salud Carlos III. Tabla 3. Estirpes de S. aureus utilizadas a lo largo de esta Memoria. Estirpe Descripcióna Referencia/Origenb 60001/19 MRSA(EH/Adulto) PVL+, serotipo 5 LIH 60020/17 MSSA(EN/Pediátrico) ETA+ ETB+, serotipo 8 LIH 60021/17 MSSA(EN/Adulto) ETA+, serotipo 5 LIH 60025/18 MSSA(EH/Pediátrico) PVL+ ETB+, serotipo 8 LIH 60031/19 MSSA(Sangre/Adulto) serotipo 5 LIH 60031/20 MRSA(EN/Pediátrico) ETA+, serotipo 8 LIH 60032/17 MSSA(EH/Adulto) ETA+, serotipo 8 LIH 60032/20 MSSA(LB/Pediátrico) PVL+, serotipo 8 LIH 60033/19 MRSA(EH/Adulto) PVL+ TSST+, serotipo 5 LIH 60038/19 MSSA(EN/Pediátrico) ETA+, serotipo 5 LIH 60039/20 MRSA(Sangre/Adulto) PVL+, serotipo 5 LIH 60040/19 MSSA(NP/Pediátrico) ETA+, serotipo 5 LIH 60041/19 MSSA(EN/Pediátrico) TSST+, serotipo 8 LIH 60061/19 MRSA(EH/Adulto) serotipo 5 LIH 60078/20 MRSA(Sangre/Adulto) PVL+, serotipo 5 LIH 60085/19 MSSA(L-PL/Pediátrico) PVL+, serotipo 8 LIH 60093/20 MRSA(EH/Pediátrico) PVL+, serotipo 5 LIH 60107/20 MSSA(Sangre/Pediátrico) PVL+, serotipo 8 LIH 60207/18 MSSA(EN/Pediátrico) ETA+ ETB+, serotipo 8 LIH 60221/19 MSSA(EC/Pediátrico) ETA+, serotipo 8 LIH 60223/19 MSSA(EN/Pediátrico) ETA+, serotipo 8 LIH 60225/19 MSSA(EN/Adulto) ETA+, serotipo 8 LIH 60228/19 MSSA(EP/Pediátrico) ETA+, serotipo 8 LIH 60295/17 MSSA(EN/Pediátrico) ETA+ ETB+, serotipo 8 LIH 60335/19 MRSA(Sangre/Pediátrico) ETA+, serotipo 8 LIH MATERIALES Y MÉTODOS 64 60389/17 MSSA(EN/Pediátrico) ETA+, cap 8 LIH 60404/18 MSSA(EH/Pediátrico) ETA+ ETB+, serotipo 8 LIH 60412/19 MRSA(EH/Adulto) ETA+, serotipo 5 LIH 60433/18 MSSA(Sangre/Adulto) ETA+ ETB+, serotipo 8 LIH 60443/19 MRSA(EH/Adulto) PVL+ ETA+, serotipo 8 LIH 60533/18 MRSA(LCR/Pediátrico) TSST+, serotipo 5 LIH 60574/17 MSSA(EN/Pediátrico) ETA+, serotipo 8 LIH 60574/19 MRSA(EH/Adulto) ETB+, serotipo 5 LIH 60598/17 MSSA(GS/Pediátrico) ETB+, serotipo 5 LIH 60601/17 MSSA(L-PC/Pediátrico) ETB+, serotipo 5 LIH 60610/17 MSSA(EN/Pediátrico) ETB+, serotipo 8 LIH 60642/17 MSSA(Absceso/Adulto) ETA+, serotipo 5 LIH 61615/14 MRSA (EH/Adulto) ETA+, serotipo 5 LIH 61754/14 MRSA (Sangre/Pediátrico) ETB+, serotipo 5 LIH 61949/15 MSSA (EH/Adulto) ETA+ ETB+, serotipo 8 LIH 61950/15 MSSA(EH/Pediátrico) ETA+ ETB+, serotipo 8 LIH 62600/15 MSSA (EC/Pediátrico) ETA+, serotipo 5 LIH 62822/15 MRSA (Sangre/Adulto) ETA+, serotipo 8 LIH a. EC, exudado cutáneo; EH, exudado de herida; EN, exudado nasofaríngeo; EP, exudado perianal; GS, glándula suprarrenal; LB, lavado broncoalveolar; L-PC, líquido pericárdico; L-PL, líquido pleural; NP, necropsia pulmonar; ETA+, exfoliatina A+; ETB+, exfoliatina B+; LCR, líquido cefalorraquídeo; PVL+, leucocidina de Panton-Valentine+; TSST+, toxina del síndrome de shock tóxico+. b. LIH, Laboratorio de Referencia de Infecciones Intrahospitalarias del Instituto de Salud Car- los III. Tabla 4. Oligonucleótidos utilizados a lo largo de esta Memoria. Nombre Secuencia (5’→3’) Utilización aroE-F GCCTTTGAGGCGACAGC Para MLST S. pneumoniae aroE-R TGCAGTTCAGAAAACATATTTCTAA Para MLST S. pneumoniae Cap5 K1 GTCAAAGATT ATGTGATGCTACTGAG Serotipado S. aureus Cap5 K2 ACTTCGAATATAAACTTG AATCAATGTTA- TACAG Serotipado S. aureus Cap8 K1 GCCTTATGTTAGGTGATAAACC Serotipado S. aureus Cap8 K2 GGAAAAACACTATCATAGCAGG Serotipado S. aureus MATERIALES Y MÉTODOS 65 CST 01-M13-F TAAAACGACGGCCAGCATTCGCATA- TCGTTTTTG Serotipado S. pneumoniae CST 01-M13-R CAGGAAACAGCTATGAC- CTGAGCTCTTTTTTTCATGA Serotipado S. pneumoniae CST 02-M13-F GTAAAACGACGGCCAGCATTCTCACAT- TATTTTTGATGT Serotipado S. pneumoniae CST 02-M13-R CAGGAAACAGCTA- TGACGTAACTCGTTTCTTCATGA Serotipado S. pneumoniae CST 03-M13-F GTAAAACGACGGCCAGCATTCGCA- CATCGTCTTTG Serotipado S. pneumoniae CST 03-M13-R CAGGAAACAGCTATGAC- CCGAGCTCTCTTTTTCATAA Serotipado S. pneumoniae CST 04-M13-R CAGGAAACAGCTATGAC- CCTGAGCTCTCTTTTTCATGA Serotipado S. pneumoniae ddl-F TGCC/TCAAGTTCCTTATGTGG Para MLST S. pneumoniae ddl-R CACTGGGTGAAAACCATGGCAT Para MLST S. pneumoniae gdh-F ATGGACAAACCACGATCAGCTTT Para MLST S. pneumoniae gdh-R GCTTGAGGTCCCATGACTGATCCC Para MLST S. pneumoniae gki-F GGCATTGGAATGGGATCACC Para MLST S. pneumoniae gki-R TCTCCCGCAGCTGACAC Para MLST S. pneumoniae recP-F GCCAACTCAGGTCATCCAGG Para MLST S. pneumoniae recP-R TGCAACCGTAGCATTGTAAC Para MLST S. pneumoniae spi-F TTATTCCTCCTGATTCTGTC Para MLST S. pneumoniae spi-R GTGATTGGCCAGAAGCGGAA Para MLST S. pneumoniae xpt-F TTATTAGAAGAGCGCATCCT Para MLST S. pneumoniae xpt-R AGATCTGCCTCCTTAAATAC Para MLST S. pneumoniae 2. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVOS Las cepas se conservaron congeladas a −80°C en los diferentes medios de cultivo empleados a los que se añadió glicerol al 10-18% (v/v) (concentración final). Para el cultivo de las cepas de S. pneumoniae se utilizó rutinariamente el medio C ajustado a pH 8.0 (CpH8) (Lacks y Hotchkiss, 1960) suplementado (C+Y) o no con extracto de levadura (Difco) (0,08%). Para el cultivo en medio sólido se utilizaron placas de agar de Mueller-Hinton suplementadas con 5% de sangre desfibrinada de oveja (Becton Dickinson). Para el aislamiento de S. pneumoniae en los sistemas de MATERIALES Y MÉTODOS 66 biofilm mixto in vitro se utilizaron placas de agar de Mueller-Hinton (Thermo Scientific) suplementadas con 5% de sangre desfibrinada de oveja (Oxoid) y con una concen- tración de 2.5 µg/ml de gentamicina (Sigma-Aldrich). Para el cultivo de las cepas de S. aureus se utilizó rutinariamente el medio TSB (Tryptic Soy Broth) (Difco) suplementado con glucosa (0.4%) y extracto de levadura (0.3%)(TSBGY). Para el cultivo de S. aureus en los sistemas de biofilm mixto in vitro se utilizó el medio C+Y descrito previamente. Para el cultivo en medio sólido se utili- zaron placas de agar Mueller-Hinton suplementadas con 5% de sangre desfibrinada de oveja (Becton Dickinson) y placas de TSA (Tryptic Soy Agar) (Difco). Para el ais- lamiento de S. aureus en los sistemas de biofilm mixto in vitro se utilizaron placas de agar manitol sal (Oxoid). La multiplicación de los cultivos de S. pneumoniae y S. aureus se monitorizó por tur- bidimetría a 550 nm (A550) con un espectrofotómetro Thermo Scientific Genesys 20. 2.1. Estudios de susceptibilidad antibiótica En todos los aislados clínicos que reciben el Laboratorio de Referencia de Neumo- coco se realiza un antibiograma disco-placa con los antibióticos oxacilina, tetraciclina, cloranfenicol, eritromicina (ERY), clindamicina y levofloxacino (LVX) de la casa co- mercial BD (Becton Dickinson). La concentración mínima inhibitoria (CMI) de los ais- lados clínicos escogidos para el estudio del Capítulo 2 de esta Memoria se determinó por la técnica de dilución en agar (Fenoll et al., 1991), de acuerdo con los criterios del Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) y el European Committee on Antimi- crobial Susceptibility Testing (EUCAST). Se determinó la susceptibilidad antibiótica a la penicilina (PEN), amoxicilina (AMX), cefotaxima (CTX), ERY, LVX y tres cefalos- porinas orales incluyendo cefditoren (CDN), cefixima (CFX) y cefpodoxima (CFD). Para la interpretación de los resultados se siguió el criterio de EUCAST y, si para algún antibiótico no había ningún punto de corte definido por EUCAST o CLSI como la cefixima o cefditoren, se escogieron los mismos puntos de corte que para cefota- xima. Para la determinación de la CMI a otros compuestos utilizados a lo largo de esta Memoria, se utilizó la técnica de microdilución, de acuerdo con los criterios del CLSI. MATERIALES Y MÉTODOS 67 Los estudios de susceptibilidad antimicrobiana fueron repetidos un mínimo de tres veces para cada cepa. 3. REACTIVOS Y OTROS PRODUCTOS Los componentes de los medios de cultivo y reactivos de uso general fueron sumi- nistrados por las casas comerciales: Difco, Pronadisa, Oxoid, Sigma-Aldrich, Becton Dickinson y Merck. El péptido estimulador de la competencia, CSP1, de 17 aminoá- cidos (EMRLSKFFRDFILQRKK) fue sintetizado por el Servicio de Química de Proteí- nas del Centro de Investigaciones Biológicas Margaritas Salas del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CIBMS-CSIC). El azul tripán fue suministrado por Sigma-Aldrich. En la Tabla 5 se describen los diferentes compuestos usados para la prevención y tratamiento de los biofilms de S. pneumoniae y S. aureus. Los fluoro- cromos, lectinas y anticuerpos usados se detallan en la Tabla 6. Tabla 5. Compuestos usados para la prevención y tratamiento de los biofilms Compuesto Descripción Procedencia CHAPk Mureín hidrolasa truncada que rompe la pared bacteriana de S. aureus Dra. Auxiliadora Prieto (CIBMS- CSIC) Cisteamina Aminotiol que se usa principalmente para el trata- miento de la cistinosis y cistinuria. Antioxidante Sigma-Aldrich Cpl-711 Mureín hidrolasa quimérica que rompe la pared bacteriana de S. pneumoniae Dr. Pedro García (CIBMS-CSIC) ChiDENPs- 711 Nanopartículas de quitosano cargadas con el enzi- biótico Cpl-711 Dr. Pedro García (CIBMS-CSIC) ChiDENPs Nanopartículas de quitosano sin cargar Dr. Pedro García (CIBMS-CSIC) DNAsa I Desoxirribonucleasa I de páncreas bovino. Pureza de ≥85 %, ≥400 Kunitz units/mg Sigma-Aldrich Metaperyo- dato sódico Compuesto oxidante que hidroliza enlaces C-C cuando ambos átomos de carbono poseen un átomo de oxígeno Thermo Scientific MATERIALES Y MÉTODOS 68 N-acetil-L- cisteina Antioxidante con propiedades mucolíticas con ca- pacidad de romper enlaces disulfuro. Sigma-Aldrich Proteinasa K Proteasa recombinante. >600 U/mL (~20 mg/mL) Thermo Scientific Tabla 6. Fluorocromos, lectinas y anticuerpos utilizados. Compuesto Descripción Excitación/ Emisión (nm) Fabricante BacLight Kit para monitorizar la viabili- dad de la población bacte- riana en función de la integri- dad de la membrana celular (SYTO9/yoduro de propidio) Viables 480/500 No viables 535/617 Invitrogen BEAR1 anti-CD11b humano (conejo) Cedido por Dr. C. Bernabéu C3-FITC anti-C3b humano conjugado con FITC (Cabra) 495/519 Cappel (MP Biomedicals) DDAO 7-hidroxi-9H-(1,3-dicloro-9,9- dimetilacridina-2-ona). No permeable 400/650 Invitrogen Control Isotipo IgG Anti-IgG humano (ratón) Novus Biologi- cals KPL-1 Anti-PSGL-1 humano (ratón) MBL SYTO9 Se une a ácidos nucleicos. Permeable 480/500 Invitrogen SYTO59 Se une a ácidos nucleicos. Permeable 622/645 Invitrogen WGA-Alexa flúor 488 Aglutinina de germen de trigo (Triticum vulgare) conjugada al Alexa flúor 488. Se une a GINAc/ácido N-acetilneuramí- nico (Neu5Ac) 495/519 Invitrogen MATERIALES Y MÉTODOS 69 WGA-Alexa flúor 594 Aglutinina de germen de trigo (Triticum vulgare) conjugada al Alexa flúor 594. Se une a GINAc/ácido N-acetilneuramí- nico (Neu5Ac) 590/617 Invitrogen 3.1 Obtención de sueros humanos Para la realización de algunos de los procedimientos descritos más adelante se re- quirió de muestras de suero procedentes de voluntarios sanos antes de la vacunación con la VCN-13 y un mes después de la misma. Se obtuvo consentimiento informado de todos los individuos que participaron en el estudio. El comité ético de investigación clínica del Hospital Universitario La Paz en Madrid, aprobó el estudio para la obten- ción de estos sueros (códigos de autorización HUIGRI-2014-01, HULP: PI-1832). Una vez obtenida la sangre se centrifugó a 1000 rpm durante 10 min con el fin de separar el suero y guardar las alícuotas a −80°C. 3.2. Obtención del extracto de humo de tabaco El extracto de humo de tabaco (EHT) se preparó a partir de cigarrillos de investigación producidos por la Universidad de Kentucky en EE.UU. Estos contienen 0.73 mg de nicotina, 9.4 mg de alquitrán y 12 mg de CO, siendo equivalente al contenido de ci- garrillos comerciales como Malboro®. La extracción se realizó usando un dispositivo descrito previamente (Martí-Lliteras et al., 2009). La jeringa modificada dirige el humo del cigarrillo dentro de un frasco lavador de gases estéril que contiene C+Y o TSBGY (5 ml de medio de cultivo por cada cigarrillo). Cuando el humo llega al frasco lavador se agita vigorosamente de manera intermitente. El EHT obtenido, resultado de la combustión de 8 cigarrillos comerciales en 40 ml de medio de cultivo, fue designada como solución de EHT al 100% que se conservó en alícuotas a −80°C. MATERIALES Y MÉTODOS 70 4. CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES ISOGÉNICOS: TRANSFORMACIÓN GENÉ- TICA Para la transformación de neumococo se prepararon células competentes según el método descrito previamente con ligeras modificaciones (Tomasz, 1970): un cultivo exponencial en medio C+Y suplementado con 0.08% de seroalbúmina bovina (BSA) (C+Y+A) se diluyó 40 veces en un volumen final de 10 ml del mismo medio y se incubó hasta alcanzar una A550 de 0.18-0.2. Rápidamente se puso el cultivo en hielo, se centrifugó a 5000 rpm durante 10 min a 4°C y las células se concentraron 10 veces resuspendiéndolas en C+Y+A. Después, 0.1 ml de células competentes se incubaron con 0.9 ml de medio CpH8 suplementado con BSA al 0.08% (C+A) en presencia de 250 ng/ml de CSP1 durante 10 min a 37°C. A continuación, se añadió 1 µg del ADN donador de la cepa capsulada a un mínimo de 100 µl de células activadas y la mezcla se incubó durante 20 min a 30°C. Para la selección de mutantes se utilizó el suero anti-R que se une a las bacterias no capsuladas y estas aglutinan en el fondo del tubo (McCarty et al., 1946, Ravin, 1959). En este proceso, se dejó que se realizara la ex- presión fenotípica durante 90 min a 37°C, pasando toda la mezcla a un nuevo tubo con 2 ml de C+Y conteniendo 50 µl de suero anti-R y se incubó a 37°C hasta observar la formación de un precipitado celular en el fondo del tubo. Se retiraron 100 µl de la parte superior del tubo que se añadieron a un nuevo tubo con C+Y y anti-R que se incubó de nuevo a 37°C. Tras sucesivos pases, los transformantes capsulados de neumococo se recuperaron de la parte superior del tubo. Posteriormente, se aislaron distintas colonias en placa y se comprobó la presencia de CPS y el serotipo corres- pondiente utilizando la PCR y secuenciación del gen capsular wzh y la inmunoreac- ción de dot-blot. 5. TÉCNICAS DE ADN 5.1. Preparación de ADN cromosómico El ADN cromosómico de S. pneumoniae se preparó utilizando un procedimiento des- crito previamente con pequeñas modificaciones (Fenoll et al., 1994). Las células en un cultivo de C+Y con una A550 de 0.5-0.6 (10 ml) se sedimentaron por centrifugación a 10000 rpm durante 5 min a 4°C. Las células se resuspendieron en 0.4 ml de de MATERIALES Y MÉTODOS 71 tampón fosfato sódico 20 mM, pH 6.9 (tampón SP) y 25 mM EDTA (ácido etilendia- minotetraacético) y se incubaron a 37°C hasta observar la lisis del cultivo. A los culti- vos lisados se les añadió RNAsa (10 mg/ml) y se incubaron durante 1 h a 37°C. Pos- teriormente se trataron con proteinasa K (100-200 µg/ml) durante 1 h a 37°C. Las proteínas restantes se eliminaron mediante un tratamiento con fenol:cloroformo:al- cohol isoamílico (25:24:1) (0.5 ml) realizando una agitación leve y, posteriormente, centrifugándolo durante 15 min a 12000 rpm, de esta manera se separa la fase acuosa de la orgánica e interfase (proteínas y contaminantes) con ayuda de los tubos Phase Lock Gel light (PRIME). Se volvió a realizar un lavado con cloroformo:isoamí- lico (24:1) y, posteriormente, se centrifugó durante 10 min a 12000 rpm, la fase acuosa se separó en un tubo limpio. Para precipitar el ADN, se añadió etanol absoluto frío, manteniéndolo durante 30 min a −80°C. Para la eliminación de las sales conta- minantes del ADN, se realizó un lavado con 1 ml de etanol al 70% y se centrifugó de nuevo a 4°C, 10 min. El ADN sedimentado se dejó secar al aire para la eliminación completa del etanol de la muestra y se resuspendió en tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA). Los ADN cromosómicos de S. pneumoniae para la caracteri- zación de los aislados mediante MLST o secuenciación del gen capsular wzh se pu- rificaron mediante el kit de purificación de ADN genómico Wizard (Promega). El ADN cromosómico de S. aureus se preparó mediante una extracción simple utili- zando un tampón de lisis con lisostafina (Aguadero, V et al., 2014). Brevemente, se resuspendieron colonias de un cultivo sólido en TSA en un tampón de lisis (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA; 160 U/ml lisostafina) y se incubaron 30 min a 37°C. Posteriormente se incubó durante 10 min a 95°C. Se añadieron 900 µl de agua des- tilada y se centrifugó durante 10 min a 13200 rpm. Se retiró el sobrenadante y se lavó con isopropanol frío y, posteriormente, se centrifugó durante 10 min a 13200 rpm. Se realizó un posterior lavado con etanol al 70%. El ADN sedimentado se dejó secar para la eliminación completa del etanol de la muestra y se resuspendió en tampón TE. 5.2. Electroforesis de ADN en geles de agarosa Se utilizaron geles de agarosa al 1.5% en tampón TAE (Tris-HCl 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 2 mM, pH 8.1), utilizando el mismo tampón para el desarrollo de la electroforesis. A las muestras se les añadió 1/4 de su volumen de una solución de MATERIALES Y MÉTODOS 72 azul de bromofenol al 0.2% (p/v) como tampón de carga. La electroforesis se realizó a 150 V durante 20 min y, una vez finalizada, los geles se tiñeron con GelRed (Bio- tium) y los fragmentos de ADN se visualizaron con radiación ultravioleta. Como mar- cadores de tamaño molecular se utilizaron los marcadores de 100 pb de Invitrogen. 5.3. Reacción de la cadena polimerasa (PCR) y secuenciación Para llevar a cabo la amplificación de fragmentos de ADN se empleó un equipo Ge- neAmp PCR System 2700 de Applied Biosystems y la enzima Taq polimerasa (Eco- noTaq Plus®, Lucigen) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Para la PCR del gen capsular wzh de S. pneumoniae se utilizó una PCR múltiple con los oligonu- cleótidos descritos en la Tabla 4. La PCR del gen capsular cap5k o cap8I de S. au- reus se realizó según la metodología previamente descrita (Verdier et al., 2007). La secuenciación de los amplicones se realizó mediante secuenciación automática de Sanger (Elberse et al., 2011). Para realizar el MLST de las cepas de los serotipos 22F y 33F de S. pneumoniae se usaron los oligonucleótidos descritos en la Tabla 4. Posteriormente se ensamblaron las secuencias utilizando el programa SeqMan del paquete Lasergene 7 y se utilizó la base de referencia de MLST de neumococo para asignar los diferentes alelos (https://pubmlst.org/organisms/streptococcus-pneumoniae). Por último, para asignar los diferentes complejos clonales se utilizó eBURST (Feil et al., 2004). 5.4. Secuenciación masiva: preparación de genotecas, secuenciación y ensam- blaje La extracción de ADN cromosómico de las cepas utilizadas para secuenciación ma- siva se realizó usando el kit de purificación de ADN genómico Wizard (Promega) si- guiendo las indicaciones del fabricante. Posteriormente se construyeron las genote- cas de ADN para la plataforma de secuenciación Illumina usando el kit de preparación Nextera XT DNA sample preparation (Illumina Inc), y a continuación, se secuenciaron usando un aparato de Illumina NextSeq 500 con lecturas de 2 × 150 pares de base apareadas (Illumina Inc). https://pubmlst.org/organisms/streptococcus-pneumoniae MATERIALES Y MÉTODOS 73 El análisis de calidad y ensamblaje de las secuencias fue realizado por el Servicio de Bioinformática del Instituto de Salud Carlos III. Brevemente, la calidad de los datos de secuenciación masiva fue evaluada mediante FastQC, que proporciona informa- ción sobre la calidad de las lecturas. Se utilizó Trimmomatic para eliminar las lecturas que pertenecen a los adaptadores y recortar las regiones de baja calidad. El ensam- blaje se realizó usando Unicycler y se evaluó la calidad del mismo mediante QUAST usando un genoma de referencia de S. pneumoniae. Para obtener los datos de whole genome MLST y core genome MLST se utilizó chewBBACA para ser posteriormente representados usando GrapeTree. 6. BIOFILMS 6.1 Biofilms de S. pneumoniae Las condiciones óptimas para el crecimiento en biofilm de S. pneumoniae sobre su- perficies abióticas se han descrito previamente (Moscoso et al., 2006; Domenech et al 2014). Para la formación del biofilm se usaron placas multipocillo de poliestireno de 96 pocillos con fondo plano (Costar 3595; Corning Incorporated y Falcon 353072; Corning Incorporated). Brevemente, los cultivos de las diferentes cepas de S. pneu- moniae se incubaron en medio C+Y a 37°C hasta una A550 de 0.5–0.6. Posterior- mente, las células se sedimentaron por centrifugación y se diluyeron 100 veces en medio C+Y. A continuación, las placas se inocularon con 200 µl por pocillo (4.5 × 106 unidades formadoras de colonias (UFC)/pocillo) y por triplicado y se incubaron du- rante 5 h a 34°C. En el caso de los estudios de evolución de biofilms de S. pneumo- niae la incubación fue desde 2 h hasta 6 h. El crecimiento total bacteriano (bacterias adheridas y no adheridas) se determinó midiendo la A595 utilizando un lector de placas (Tecan Infinite F200; Tecan Group Ltd. y Epoch 2; BioTek). Posteriormente, se cuan- tificó el biofilm tiñendo cada pocillo con 50 µl de una solución de cristal violeta al 1% (CV) y se incubó 15 min a temperatura ambiente. Después, se realizaron 3 lavados con 200 µl de agua destilada y se dejó secar al aire. La formación de biofilm teñido con CV se cuantificó solubilizando éste con 200 µl de etanol al 96% por pocillo y midiendo la A595. En el caso del análisis del biofilm formado mediante recuento de viables, después de la incubación del biofilm, se retiró el cultivo planctónico, se realizó un lavado con agua MATERIALES Y MÉTODOS 74 destilada estéril y se resuspendió el biofilm en 100 µl de tampón SP (pH 6.9) estéril por pocillo. Posteriormente, se realizó un banco de diluciones y se sembraron en placas de agar sangre Mueller-Hinton que se incubaron a 37°C con 5% de CO2 du- rante 20 h. Al día siguiente se realizó el recuento de bacterias viables. 6.1.1. Inhibición y disgregación del biofilm de S. pneumoniae Los ensayos de inhibición del biofilm consisten en añadir desde el principio el com- puesto a ensayar junto con el inóculo bacteriano. Una vez finalizado el tiempo de incubación a 34°C se procesó el biofilm como se describe en el apartado 6.1. Los ensayos de disgregación del biofilm se realizaron una vez formado dicho biofilm, como se describe en el apartado 6.1 (se estandarizó en casi todos los casos 4 h de formación de biofilm), se realizó una medida de control de crecimiento total transcu- rrido el tiempo de formación del biofilm. Posteriormente se retiró el cultivo planctónico, se lavó el biofilm con agua destilada estéril y se añadieron 200 µl por pocillo del tam- pón SP o el tampón óptimo para el compuesto a probar y se añadió el compuesto a analizar. Se realizó una nueva medida de A595 y se incubó a 37°C durante el tiempo adecuado dependiendo del compuesto o enzima a probar, generalmente durante 1 h. Transcurrido ese tiempo, se realizó el análisis del biofilm por CV y/o el recuento de viables como se describe en el apartado previo. 6.2 Biofilms de S. aureus Las condiciones óptimas para el crecimiento en biofilm de S. aureus sobre superficies abióticas se realizaron siguiendo un protocolo modificado (Domenech et al., 2012). Para la formación del biofilm se usaron placas multipocillo de poliestireno de 96 po- cillos con fondo plano (Costar 3595; Corning Incorporated y Falcon 353072; Corning Incorporated). Brevemente, los cultivos de las diferentes cepas de S. aureus se incu- baron en medio TSBGY a 37°C hasta una A550 de 0.5-0.6. Posteriormente, las células se sedimentaron por centrifugación y se diluyeron 100 veces en medio TSBGY obte- niendo una concentración aproximada de 2 × 106 UFC/mL A continuación, se inocu- laron con 200 µl por pocillo y por triplicado y se incubaron durante 24 h a 37°C. En el caso de los estudios de evolución de cepas de S. aureus la incubación fue desde 5 h hasta 28 h. El crecimiento total bacteriano se determinó midiendo la A595 utilizando MATERIALES Y MÉTODOS 75 un lector de placas (Tecan Infinite F200; Tecan Group Ltd. y Epoch 2; BioTek). Pos- teriormente, se retiró el cultivo planctónico y se añadieron 200 µl de agua destilada más 50 µl de CV por pocillo y se incubó 15 min a temperatura ambiente. Se realizaron 2 lavados con 200 µl de agua destilada por pocillo y se dejó secar al aire. La formación de biofilm teñido con CV se cuantificó solubilizando este con 200 µl de etanol al 96% y midiendo la A595. Para el recuento de viables del biofilm, después de la incubación, se retiró el cultivo planctónico, se lavó con agua destilada estéril y se resuspendió el biofilm en 100 µl de tampón SP estéril. Finalmente, se realizó un banco de diluciones y se sembraron en placas de TSA que se incubaron a 37°C durante 20 h. Al día siguiente se realizó el recuento de bacterias viables. Para los experimentos de los biofilms mixtos S. aureus–S. pneumoniae, se puso a punto el protocolo de biofilm de S. aureus en C+Y (Sempere et al., 2021), descrito en el apartado 6.3. 6.2.1. Inhibición y disgregación del biofilm de S. aureus Los ensayos de inhibición consisten en añadir desde el principio el compuesto a en- sayar junto con el inóculo bacteriano, tal y como se describe en el apartado 6.1.1. Los ensayos de disgregación se realizaron después de 23 h de formación del biofilm de S. aureus, y posterior medida de control de crecimiento del biofilm. Después de retirar el cultivo planctónico, se lavó el biofilm con agua destilada y se añadieron 200 µl por pocillo del tampón SP o el tampón óptimo para el compuesto a probar y el compuesto a analizar. Se realizó una nueva medida de A595 y se incubó a 37°C du- rante el tiempo adecuado dependiendo del compuesto o enzima a probar, general- mente durante 1 h. Transcurrido ese tiempo, se realizó el análisis del biofilm por CV y/o el recuento de viables. MATERIALES Y MÉTODOS 76 6.3 Biofilms mixtos de S. aureus–S. pneumoniae. Para la formación del biofilm mixto se realizaro modificaciones del protocolo descrito en el apartado 6.1. Para ello, se usaron placas multipocillo de poliestireno de 96 po- cillos con fondo plano (Costar 3595; Corning Incorporated). Brevemente, los cultivos de las diferentes cepas de S. pneumoniae y S. aureus se incubaron en medio C+Y a 37°C hasta una A550 de 0.5-0.6. Posteriormente, las células se sedimentaron por cen- trifugación y se diluyeron 100 veces en medio C+Y. A continuación, las placas se inocularon con 200 µl por pocillo con una mezcla de diferentes proporciones de S. aureus y S. pneumoniae conteniendo desde 8 × 105 hasta 8 × 106 UFC/mL y se incu- baron de 2 a 6 h a 34°C. El resto del procedimiento se realizó como está descrito en el apartado 6.1. Las inhibiciones y disgregaciones se realizaron como están descritas en el apartado 6.1.1. 6.4. Microscopía de barrido láser confocal La microscopía de barrido láser confocal (CLSM) fue utilizada a lo largo de la Tesis para observar la arquitectura de los biofilms y el efecto de diferentes tratamientos. Para ello se utilizaron placas con fondo de vidrio (WillCo-dish; WillCo Wells B. V., Holanda) donde se inoculó 2 ml del cultivo bacteriano y se incubaron el tiempo y temperatura correspondiente a cada bacteria, descritos en los apartados anteriores. También se usaron las placas de fondo de vidrio de Ibidi µ-Slide 4 well y 8 well (ibidi; ibidi GmbG, Alemania) donde se inocularon 600 y 300 µl respectivamente. A conti- nuación, los biofilms se trataron (o no) con distintos compuestos para ver su efecto. El medio de cultivo se retiró y el biofilm se lavó con CpH8 y se tiñeron con el fluoro- cromo, la lectina o el compuesto o kit correspondiente. Los biofilms se observaron utilizando el microscopio Leica TCS-SP5-AOBS-UV CLSM y el objetivo 63× (HCX PL APO CS 63×/1.4). Las imágenes se adquirieron en un formato 512×512 a 700 Hz. Las imágenes se analizaron mediante el software de Leica LCS. Se obtuvieron las proyecciones de los planos x–y (imágenes individuales a intervalos de 0.5 µm) y x–z (imágenes a intervalos de 5 µm). MATERIALES Y MÉTODOS 77 7. ENSAYOS DE DEPOSICIÓN DEL COMPONENTE C3 Para el análisis del depósito del componente C3 del complemento se siguió el método descrito por Brown y cols. (2002) utilizando citometría de flujo. En el caso de S. pneu- moniae se siguió la metodología previamente mencionada, mientras que para com- parar el depósito de C3 en el planctónico frente al biofilm en S. aureus se adaptó el protocolo. Para ello se realizó un cultivo de S. aureus en medio TSBGY a 37°C hasta una A550 de 0.5–0.6. Se realizó una dilución 1/100 en medio TSBGY para el cultivo planctónico y otra para inocular 200 µl por pocillo en una placa de 96 pocillos para permitir la formación de biofilm. Ambos cultivos se incubaron durante 24 h a 37°C. Una vez finalizado el tiempo de incubación, el cultivo planctónico se concentró para tener una concentración de UFC/ml similar a la del biofilm (≈ 2×109 UFC/ml). En el caso del biofilm se retiró el cultivo planctónico, se lavó y resuspendió en 100 µl de tampón SP. Se enfrentaron 20 µl de biofilm o 20 µl de cultivo planctónico concentrado a 10 µl de suero humano diluido 1/5 o tampón SP, en el caso de los controles. Se incubaron a 37°C durante 20 min. Posteriormente, se centrifugaron a 13200 rpm a 4°C durante 10 min y el sedimento se lavó con 300 µl de tampón SP-Tween 20 (0.1%). Se añadieron 50 µl de una dilución 1/500 del C3b-FITC (Tabla 6) y se incubó 30 min en hielo y oscuridad. Transcurrido el tiempo de incubación, se centrifugó y lavó de nuevo. Finalmente, el sedimiento se resuspendió en una solución al 3% de paraformaldehído y se completó el volumen hasta 250 µl con tampón SP. Las mues- tras se analizaron en un citómetro FACS Calibur (Becton Dickinson). 8. OPSONOFAGOCITOSIS Para los experimentos de opsonofagocitosis se utilizó la línea celular HL-60 obtenida a partir de un paciente con leucemia promielocítica humana (CCL-240; ATCC) dife- renciada a neutrófilos. La diferenciación granulocítica inducida por N, N-dimetilforma- mida origina células que expresan los mismos receptores que los neutrófilos polimor- fonucleares humanos (Romero-Steiner et al., 1997). El estado de diferenciación de las células fue confirmado antes de los ensayos usando un anticuerpo monoclonal anti-CD11b (Ramos-Sevillano et al., 2016). Las células diferenciadas se lavaron dos veces con Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (sin Ca2+ ni Mg2+ pero suplemen- tado con 0.2% de BSA) y un lavado adicional con HBSS con Ca2+ y Mg2+ suplemen- tado con 0.2% de BSA. Para realizar el recuento de células viables se utilizó una MATERIALES Y MÉTODOS 78 cámara de Neubauer y se tiñeron las células con azul tripán. Se visualizó la propor- ción de células viables y sólo se realizaron los experimentos cuando la viabilidad celular era superior al 95%. Las células se mantuvieron a 0-4°C hasta su utilización. Todos los ensayos se realizaron por muerte bacteriana en placas multipocillo de po- liestireno de fondo redondo (Nunclon Delta Surface; Themo Fisher Scientific), basa- dos en el recuento de bacterias viables. 8.1. Opsonofagocitosis de cultivos planctónicos de S. pneumoniae y S. aureus En este caso se utilizaron las cepas conservadas en glicerol directamente, ya titula- das. Para la opsonofagocitosis se utilizaron 10 µl de la suspensión bacteriana a una concentración de 2.5 × 104 UFC/ml, y se pusieron en contacto con 10 µl de suero de conejo (como fuente de complemento) a una concentración de 1/5 durante 20 min a 37°C con agitación (150 rpm). Después del depósito del complemento sobre las cé- lulas, se enfrentaron las bacterias a 40 µl de fagocitos HL-60 a una concentración de 1 x 105 células/pocillo, quedando una proporción de 400 células/bacteria (multiplici- dad de infección (MDI) 400:1). Se incubaron durante 45 min a 37°C con una agitación de 150 rpm. Una vez enfrentada la bacteria a los neutrófilos, se sembraron 20 µl de cada pocillo en placas de agar sangre y se incubaron a 37°C con 5% de CO2 24 h para su posterior recuento de viables. Para S. aureus se empleó el mismo protocolo, pero utilizándose siempre cultivo fresco. Brevemente, se cultivaron las cepas correspondientes en medio TSBGY a 37°C hasta una A550 de 0.5-0.6. Posteriormente, las células se sedimentaron por cen- trifugación y se diluyeron 100 veces en medio TSBGY y se incubaron durante 24 h a 37°C en agitación. De aquí se hacen las diluciones para utilizar 10 µl de la suspensión bacteriana a una concentración de 2.5 × 104 UFC/ml. 8.2. Opsonofagocitosis de biofilms de S. pneumoniae y S. aureus Se cultivaron las cepas correspondientes en medio C+Y a 37°C hasta una A550 de 0.5-0.6. Posteriormente, las células se sedimentaron por centrifugación y se diluyeron 100 veces en medio C+Y. A continuación, las placas se inocularon con 200 µl por MATERIALES Y MÉTODOS 79 pocillo y se incubaron durante 5 h a 34°C. Se retiró el cultivo planctónico, se realizó un lavado con agua destilada estéril y se resuspendió el biofilm en 100 µl de tampón SP estéril. Se realizó un banco de diluciones hasta conseguir la necesaria para obte- ner una relación MDI 400:1. Posteriormente se pusieron en contacto con 10 µl de suero de conejo (como fuente de complemento) a una concentración de 1/5 durante 20 min a 37°C con agitación de 150 rpm. Después del depósito del complemento sobre las células, se enfrentaron estas a 40 µl de fagocitos HL-60 a una concentra- ción de 105 células/pocillo quedando la MDI 400:1 y se incubaron durante 45 min a 37°C con una agitación de 150 rpm. Una vez enfrentada la bacteria a los neutrófilos, se sembraron 20 µl de cada pocillo en una placa de agar sangre y se incubaron a 37°C con 5% de CO2 24 h para su posterior recuento de viables. Para S. aureus se utilizó el mismo protocolo, pero incubando las cepas de manera diferente. Brevemente, se cultivaron las cepas correspondientes en medio TSBGY a 37°C hasta una A550 de 0.5-0.6. Posteriormente, las células se sedimentaron por cen- trifugación y se diluyeron 100 veces en el mismo medio. A continuación, las placas se inocularon con 200 µl por pocillo y se incubaron durante 24 h a 37°C. Con el biofilm ya formado, se retiró el cultivo planctónico y se resuspendió en tampón SP estéril como indicamos arriba. 8.3. Fagocitosis mediada por el receptor PSGL-1 Para analizar la función del receptor PSGL-1 en el reconocimiento de los diferentes serotipos de neumococo y de S. aureus se utilizó la metodología previamente descrita (Ramos-Sevillano et al., 2016). La preparación de cultivos bacterianos se realizó como se describe en los apartados 8.1 y 8.3, la diferencia es que se utilizaba el anti- cuerpo KPL-1 para bloquear el receptor de las células HL-60. Estas células se incu- baron durante 1 h a 37°C con 25 mg/ml de dicho anticuerpo o un control de isotipo IgG. La interacción bacteria-célula se realizó como se describe arriba, utilizando una MDI 400:1 usando un grupo de células HL-60 con el receptor PSGL-1 bloqueado y un grupo de células HL-60 control incubadas con el control de isotipo. Una vez en- frentada la bacteria a los neutrófilos, se sembraron 20 µl de cada pocillo en placas de agar sangre o TSA y se incubaron a 37°C con o sin 5% de CO2 24 h para un posterior recuento de viables. MATERIALES Y MÉTODOS 80 8.4. Opsonofagocitosis de biofilms de S. pneumoniae, S. aureus y biofilms mix- tos S. aureus–S. pneumoniae con sueros pre y post VCN13 Primero se realizó una titulación o determinación de los anticuerpos funcionales de los sueros utilizados. El título se define como la dilución de suero que produce una reducción del 50% de las UFC por fagocitosis mediada por el complemento siguiendo las recomendaciones internacionales (Nahm et al., 2000). Para ello se utilizaron 10 µl de las suspensiones bacterianas de los diferentes serotipos en una concentración de 2.5 × 104 UFC/ml, y se pusieron en contacto con 10 µl de las diferentes diluciones de los sueros pre y post VCN13 inactivado durante 20 min a 37°C con agitación de 150 rpm. Después del depósito de los anticuerpos sobre las células, se enfrentaron las bacterias a 10 µl de suero de conejo a una concentración 1/5 que sirvió como fuente de complemento y a 40 µl de fagocitos HL-60 a una concentración de 1 × 105 células/pocillo, quedando una MDI 400:1. Se incubaron durante 45 min a 37°C con una agitación de 150 rpm. Una vez enfrentada la bacteria a los neutrófilos, se sem- braron 20 µl de cada pocillo en una placa de agar sangre y se incubaron a 37°C con 5% de CO2 24 h para un posterior recuento de viables. Después, estos sueros se utilizarán para la fagocitosis de los diferentes biofilms a probar. Para esto los diferentes biofilms de S. pneumoniae, S. aureus y biofilm mixto se incubaron en las condiciones descritas en los apartados anteriores. Posterior- mente se retiró el cultivo planctónico, se realizó un lavado con agua destilada estéril y se resuspendieron los biofilms en 100 µl de tampón SP estéril. Se realizó un banco de diluciones hasta conseguir la concentración necesaria para obtener una relación MDI 400:1. A continuación, se pusieron en contacto con 10 µl de suero pre o post VCN13 inactivado a una concentración de 1/5 durante 20 min a 37°C con agitación (150 rpm). Después del depósito de anticuerpos sobre las células, se enfrentaron las bacterias a 10 µl de suero de conejo a una concentración 1/5 que sirvió como fuente de complemento y 40 µl de fagocitos HL-60 a una concentración de 1 × 105 célu- las/pocillo quedando la MDI 400:1 y se incubaron durante 45 minutos a 37°C en agi- tación (150 rpm). Una vez enfrentadas las bacterias a los neutrófilos, se sembraron 20 µl de cada pocillo en una placa de agar sangre, agar sangre con gentamicina, manitol sal o TSA y se incubaron a 37°C con 5% de CO2 o 37°C 24 h para su posterior recuento. MATERIALES Y MÉTODOS 81 9. MODELOS ANIMALES Todos los procedimientos científicos con animales de experimentación se realizaron según el Real Decreto 53/2013 (ECC/566/2015) y las regulaciones de la Unión Euro- pea (2010/63/EU). Todos los procedimientos siguieron las guías y protocolos apro- bados por el Comité de Ética Animal del ISCIII y la Comunidad de Madrid (CBA PA 52-2011-v2 y PROEX 218/15 y PROEX 063.1/21). Los animales fueron criados en el animalario del CNM (ISCIII). Se utilizaron ratones macho C57BL/6 que pesaban alre- dedor de 20 g. Para evaluar la patogénesis de los serotipos emergentes 22F y 33F se realizó un modelo de sepsis inoculando 2 × 107 UFC/ratón por vía intraperitoneal de las cepas descritas en la Tabla 2: P244, P017, 1407/18, 1000/18, 1833/18 y 1950/18. Para evaluar la concentración de bacterias en sangre tras 24 h, se obtuvo la muestra a partir de la vena de la cola. Se realizó un banco de diluciones de la sangre extraída, se sembraron en placas de agar sangre y se incubaron a 37°C con 5% de CO2 24 h para su posterior recuento. El umbral de detección fue de 102 UFC/ml. Además, se realizaron curvas de supervivencia tras 7 días de seguimiento tras la infección que se analizaron mediante el test log-rank (Mantel-Cox) usando el programa GraphPad Prism 8.0. 10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los datos mostrados a lo largo de la Tesis Doctoral son representativos de, al menos, tres experimentos independientes. Además, cada dato muestra la media y desviación estándar (DS) de 3-6 réplicas. Para el análisis estadístico se empleó la t de Student de dos colas usando el programa GraphPad Prism 8.0. Para las comparaciones múl- tiples se usó un análisis de varianza (ANOVA) más un test post hoc Dunnet. Las diferencias fueron consideradas estadísticamente significativas con una *P < 0.05 y muy significativas con valores **P < 0.01 y *** P< 0.001. Los datos de incidencia fueron calculados considerando el número de casos dividido por la población usando los datos del Instituto Nacional de Estadística (INE). Las MATERIALES Y MÉTODOS 82 tendencias de los serotipos fueron obtenidas calculado los datos de la situación ac- tual versus los de diferentes periodos usando el índice relativo de incidencia (IRR) con intervalos de confianza del 95% usando modelos de regresión de Poisson. IV. RESULTADOS RESULTADOS 85 1. RELEVANCIA CLÍNICA Y EPIDEMIOLOGÍA DE LOS SEROTIPOS 22F Y 33F INCLUIDOS EN LAS NUEVAS VACUNAS NEUMOCÓCICAS CONJUGADAS La mejor estrategia para combatir las infecciones por S. pneumoniae, y específica- mente la ENI, es la aplicación de medidas profilácticas basadas en la administración de vacunas antineumocócicas en niños y adultos (Moore et al., 2015, Wahl et al., 2018, de Miguel et al., 2020). En España se utilizan: la vacuna VCN13 en población pediátrica a nivel nacional y, en población adulta, hay CCAA que utilizan esta vacuna mientras que otras CCAA siguen la recomendación del Ministerio de Sanidad y utili- zan la vacuna VNP23 (Redondo et al., 2019). La VCN13 ha mostrado su efectividad tanto en niños como adultos vacunados directamente en la prevención de la neumo- nía y la ENI (Bonten et al., 2015, Moore et al., 2015, McLaughlin et al., 2018, de Miguel et al., 2020), pero también ha mostrado efecto rebaño o de inmunidad indirecta en población adulta gracias a la vacunación pediátrica (Mackenzie et al., 2016). La VNP23 previene la ENI pero tiene poco efecto frente a la neumonía en adultos (Huss et al., 2009, Andrews et al., 2012, Russell et al., 2015). La principal limitación de las vacunas conjugadas es el fenómeno denominado reemplazo de serotipos, debido a la variabilidad antigénica de neumococo con hasta 101 serotipos descritos hasta la fecha y la emergencia de clones virulentos que evaden la vacuna al modificar la cáp- sula (Brueggemann et al., 2007, Weinberger et al., 2011). Este fenómeno se puede contrarrestar con el desarrollo de vacunas que incluyan más serotipos, como las nue- vas VCN15 y VCN20 (Greenberg et al., 2018, Thompson et al., 2019). Los serotipos 22F y 33F se encuentran entre los serotipos adicionales incluidos en estas recientes vacunas conjugadas, por lo que tanto su impacto en la ENI en España como su papel en patogénesis son los principales objetivos de estudio de este capítulo. 1.1. Evolución de la enfermedad neumocócica invasiva producida por los sero- tipos 22F y 33F en España en el periodo 2009-2021: impacto del SARS-CoV-2 En primer lugar, se evaluó la situación epidemiológica de casos de ENI por los sero- tipos 22F y 33F durante los últimos 13 años. En este periodo se contempla el año previo a la introducción de la VCN13 (2009), el efecto temprano de la VCN13 tras su introducción en 2010 en el mercado privado (2010-2012), el efecto a medio plazo de la VCN13 (2013-2016), el efecto tardío de la VCN13 (2017-2019) y ambos serotipos RESULTADOS 86 en el contexto de la pandemia producida por el virus SARS-CoV-2 (2020-2021) (Fi- gura 10). Figura 10. Esquema de los años evaluados para analizar el impacto de los serotipos 22F y 33F en la ENI en España. Los datos muestran los casos totales, la proporción de los serotipos 22F y 33F en función de los casos totales de ENI y las incidencias de ambos serotipos (Figura 11). El año 2021 contiene los casos notificados durante el primer semestre, teniendo en cuenta que la gran mayoría de muestras suelen llegar en el primer trimestre del año coincidiendo con el periodo invernal y la mayor incidencia de gripe. Las incidencias se calcularon considerando el número de casos dividido por la población usando los datos proporcionados por el Instituto Nacional de Estadística (INE). Los casos de ENI producidos por el serotipo 22F en población pediátrica mostraron una tendencia similar hasta 2016 (6 casos en 2009 vs. 8 casos en 2016), año en el que se introdujo la vacuna en el calendario pediátrico nacional (Figura 11A). A partir de 2016 se observa un crecimiento continuado alcanzando 16 casos en 2018, con una disminución en 2019 y, posteriormente, una caída acentuada tanto del número de casos como en la incidencia debido a la pandemia por SARS-CoV 2, aunque es importante matizar que el año 2021 representa únicamente los casos del primer se- mestre (Figura 11A y C). En la población pediátrica, el aumento de casos de ENI por estos serotipos se ve reflejado cuando se analizan los porcentajes, que suben del 0.89% en 2009 hasta llegar al máximo en 2018, siendo un 5.4% de los casos de ENI en la población de 0-17 años (Figura 11B). A pesar de la disminución del número de casos y la incidencia del serotipo 22F en la población pediátrica durante el contexto de la pandemia por SARS-CoV-2, la proporción del total de casos de ENI por este serotipo se mantiene estable (Figura 11B). RESULTADOS 87 En el caso del serotipo 33F, el aumento de casos de ENI en la población pediátrica ha sido más moderado pasando de 6 casos de 2009 a 8-11 casos en 2018−2019 (Figura 11A). Aunque el aumento en el número de casos e incidencia por el serotipo 33F pueda parecer poco llamativo (Figura 11A y C), la proporción de casos por este serotipo sí que ha aumentado en la población pediátrica subiendo del 0.89% en 2009 a representar un 4.1% en 2019 (Figura 11B). Como en el caso del serotipo 22F, a pesar de la disminución del número de casos y la incidencia del serotipo 33F en la población pediátrica, la proporción del total de casos de ENI por este serotipo se mantiene estable, incluso durante el contexto de la pandemia por SARS-CoV-2 (Fi- gura 11B). En la población adulta también se puede observar como, a partir de 2010, los casos de ENI producidos por el serotipo 22F aumentaron tanto en la población total de adul- tos (64 casos en 2009 a 133 casos en 2019), como en los grupos de edad de 18-64 años (27 casos en 2009 a 56 casos en 2019) y ≥ 65 años (37 casos en 2009 a 77 casos en 2019) (Figura 12A). Este incremento se dispara entre 2016 y 2019 donde los casos en ambos grupos de edad aumentan de forma muy marcada (Figura 12A). Esta misma tendencia se ve reflejada en las tasas de incidencia, donde el aumento del serotipo 22F en el grupo de edad ≥ 65 años es el más destacable (Figura 12C). La proporción de casos del serotipo 22F respecto al total de casos de ENI en adultos también aumentó, aunque a partir de 2014-2016 la situación de este serotipo parece estabilizarse (Figura 12B). Como ya se observó previamente en la población pediá- trica, a pesar de que tanto el número de casos como la incidencia de ENI por el se- rotipo 22F sufre una caída en los años 2020-2021 debido al SARS-CoV-2, el porcen- taje de casos de ENI por este serotipo no disminuyó (Figura 12B). Respecto al sero- tipo 33F, su aumento en la población adulta es aún más brusco (aumentando de 26 casos en población adulta total en 2009 a 70 casos en 2019), presentando un ligero ascenso en el número de casos de ENI desde 2010 y luego un incremento importante durante 2016−2019 (Figura 12D). Esto se ve acompañado por un aumento de hasta 3 veces en las tasas de incidencia, sobre todo en el grupo de ≥ 65 años (3.18 por 100 000 habitantes en 2019 vs. 1.16 por 100 000 habitantes en 2009) (Figura 12G). A pesar de los casi dos años de pandemia por SARS-CoV-2, el porcentaje de casos de ENI producidos por el serotipo 33F respecto al total de casos, no sólo no ha dismi- nuido, sino que ha aumentado en el grupo de edad de ≥ 65 años, manteniéndose estable en el grupo de 18-64 años (Figura 12F). RESULTADOS 88 Figura 11. Evolución de los serotipos 22F y 33F produciendo ENI en población pediátrica du- rante el periodo 2009-2021. (A) Número de casos de ENI de ambos serotipos. (B) Proporción de casos de ENI de ambos serotipos en función del total de casos de ENI en población pediá- trica. (C) Incidencia de casos de ENI por 100 000 habitantes de ambos serotipos. Las líneas verdes con círculos representan la evolución del serotipo 22F y las rojas con cuadrados repre- sentan la evolución del serotipo 33F. La primera línea negra discontinua representa la intro- ducción de la VCN13 en el mercado privado (año 2010), la segunda representa la introducción de la VCN13 en el calendario pediátrico (año 2016) y la línea amarilla discontinua representa el inicio de la pandemia por SARS-CoV-2. RESULTADOS 89 Figura 12. Evolución de los serotipos 22F y 33F produciendo ENI en población adulta durante el periodo 2009-2021. (A y D) Número de casos de ENI de ambos serotipos. (B y F) Proporción de casos ENI de ambos serotipos en función del total de casos de ENI en la población adulta. (C y G) Incidencia de casos de ENI por 100 000 habitantes de ambos serotipos. La línea negra con triángulos representa el total de los adultos, las líneas verdes con círculos representan adultos entre 18 y 64 años y las líneas rojas con cuadrados representan adultos ≥ 65 años. La primera línea negra discontinua representa la introducción de la VCN13 en el mercado privado (año 2010), la segunda representa la introducción de la VCN13 en el calendario pediátrico (año 2016) y la línea amarilla discontinua representa el inicio de la pandemia por SARS-CoV-2. RESULTADOS 90 Se analizaron estadísticamente los datos mediante la obtención de la razón de tasas de incidencia (IRR, incidence rate ratio), comparando diferentes periodos para ver el impacto de la vacunación. Para ello se estudió el efecto vacunal tardío (2017-2019) vs. el efecto vacunal a medio plazo (2013-2016), el efecto vacunal temprano (2010- 2012) y la era pre-VCN13 (2009). Los valores de IRR por encima de 1 indican que la vacunación ha tenido impacto aumentando las tasas de incidencia, mientras que los IRR por debajo de 1 indican que la vacunación ha tenido impacto disminuyendo esas tasas de incidencia. Para que el aumento o la disminución sean significativos, el in- tervalo de confianza (IC) del 95% no tiene que incluir el valor de 1. En la población pediátrica, los IRRs del serotipo 22F mostraron una tendencia ascen- dente, aunque sólo fue significativa cuando se compararon con el efecto vacunal a medio plazo (para el periodo 2017-2019 vs. 2009, IRR 2.06; IC 95% 0.88-4.93, para el periodo 2017-2019 vs. 2010-2012, IRR 1.59; IC 95% 0.95-2.65 y para periodo 2017-2019 vs. 2013-2016, IRR 1.64; IC 95% 1.02-2.64) (Tabla 7 y Figura 13). En relación al serotipo 33F, los IRRs muestran que la situación de este serotipo en la ENI pediátrica es relativamente más estable desde la introducción de la VCN13 (para el periodo 2017-2019 vs. 2009, IRR 1.32: IC 95% 0.54-3.22, para el periodo 2017- 2019 vs. 2010-2012, IRR 1.29; IC 95% 0.67-2.18 y para el periodo 2017-2019 vs. 2013-2016, IRR 1.07; IC 95% 0.63-1.83) (Tabla 7 y Figura 13). En adultos de todas las edades (total), cuando se compararon los diferentes periodos, se observó un claro y significativo ascenso en los valores IRR de ambos serotipos (Tabla 7 y Figura 13). Tanto en el serotipo 22F (para el periodo 2017-2019 vs. 2009, IRR 1.99; IC 95% 1.53-2.59, para el periodo 2017-2019 vs. 2010-2012, IRR 1.42; IC 95% 1.21-1.66 y para el periodo 2017-2019 vs. 2013-2016, IRR 1.39; IC 95% 1.21- 1.61) como en el serotipo 33F (para el periodo 2017-2019 vs. 2009, IRR 2.03; IC 95% 1.34-3.07, para el periodo 2017-2019 vs. 2010-2012, IRR 2.18; IC 95% 1.66-2.88 y para el periodo 2017-2019 vs. 2013-2016, IRR 1.66; IC 95% 1.42-1.94) hay una clara tendencia ascendente de casos desde el 2009 hasta el 2019, siendo mayor en el caso del serotipo 33F (Tabla 7 y Figura 13). Este aumento se da en ambos grupos de edad, destacando el mayor aumento del serotipo 22F en el rango de 18-64 años y significativo en todos los periodos, siendo para el serotipo 22F el IRR 2017-2019 vs. 2009 de 1.93; IC 95% 1.28-2.9 y no significativo para el serotipo 33F con un IRR 2017-2019 vs. 2009 de 1.41; IC 95% 0.77-2.59 (Tabla 7 y Figura 13). Mientras que RESULTADOS 91 en adultos ≥ 65 años se aprecia un aumento de ambos serotipos de manera signifi- cativa, pero en este grupo de edad el mayor aumento tiene lugar en el serotipo 33F con un IRR 2017-2019 vs. 2009 de 2.35; IC 95% 1.32-4.18 que el del serotipo 22F con un IRR 2017-2019 vs. 2009 de 1.82; IC 95% 1.28-2.57. En general, estos resultados indican que el uso de la vacuna VNC13 en la población pediátrica no ha tenido un impacto negativo en los serotipos 22F y 33F, mientras que, sobre todo en la población adulta, indican la existencia del fenómeno de reemplazo de serotipos. Figura 13. Representación de los IRRs de los serotipos 22F y 33F comparando el periodo 2017-2019 frente a los periodos vacunales previos. Los rombos amarillos representan la po- blación pediátrica <18 años, los triángulos negros representan la población adulta (total), los círculos verdes representan la población adulta de 18 a 64 años y los cuadrados rojos repre- sentan la población adulta ≥ 65 años. IRR, razón de tasas; IC, intervalo de confianza. RESULTADOS 3 R E S U L T A D O S Tabla 7. IRRs de los serotipos 22F y 33F en todos los grupos de edad comparando el periodo de efecto vacunal tardío (2017-2019) versus periodos anteriores. IRR, razón de tasas; IC, intervalo de confianza. 2009 2010-2012 2013-2016 2017-2019 IRR 2017-19 vs. 2009 IC 95% IRR 2017-19 vs. 2010-12 IC 95% IRR 2017-19 vs. 2013-16 IC 95% Pre- VCN13 Efecto vacunal temprano Efecto vacunal a medio plazo Efecto vacunal tardío casos incidencia (por 100 000) casos incidencia (por 100 000) casos incidencia (por 100 000) casos incidencia (por 100 000) <18 años <18 años 22F 6 0.07 24 0.10 31 0.09 38 0.15 2.08 0.88-4.93 1.59 0.95-2.65 1.64 1.02-2.64 33F 6 0.07 20 0.08 30 0.09 24 0.10 1.32 0.54-3.22 1.20 0.67-2.18 1.07 0.63-1.83 Adultos (total) Adultos (total) 22F 64 0.17 271 0.23 364 0.24 381 0.33 1.99 1.53-2.59 1.42 1.21-1.66 1.39 1.21-1.61 33F 26 0.07 73 0.06 127 0.08 158 0.14 2.03 1.34-3.07 2.18 1.66-2.88 1.66 1.42-1.94 18 - 64 años 18 - 64 años 22F 27 0.09 103 0.11 134 0.11 150 0.17 1.93 1.28-2.9 1.51 1.18-1.95 1.51 1.2-1.91 33F 13 0.04 33 0.04 53 0.04 53 0.06 1.41 0.77-2.59 1.67 1.08-2.58 1.35 0.92-1.98 ≥65 años ≥65 años 22F 37 0.48 168 0.69 230 0.68 231 0.86 1.82 1.28-2.57 1.25 1.02-1.52 1.28 1.06-1.53 33F 13 0.17 40 0.16 74 0.22 105 0.39 2.35 1.32-4.18 2.38 1.65-3.43 1.81 1.49-2.19 9 2 RESULTADOS 93 Por último, se decidió estudiar el impacto de la pandemia por el SARS-CoV-2 y la influencia de las diversas medidas no farmacológicas como el distanciamiento social, el uso generalizado de mascarillas, el confinamiento etc., en estos dos serotipos. Se comparó el año 2020 con el periodo vacunal tardío (2017-2019) y con el año 2019 (Tabla 8 y Figura 14). En población pediátrica, al comparar el año 2020 vs. el periodo 2017-2019 se observó una disminución significativa de casos ENI producidos por el serotipo 22F (IRR 0.24; IC 95% 0.07-0.77), pero no por el serotipo 33F (IRR 0.88; IC 95% 0.38-2.05). Al comparar los años 2020 vs. 2019, esta disminución no resultó significativa (para el 22F un IRR 0.33; IC 95% 0.09-1.24 y para el 33F un IRR 0.64; IC 95% 0.25-1.65) (Tabla 8 y Figura 14). En la población adulta, para el serotipo 22F, tanto al comparar 2020 vs. 2017-2019 como el año 2020 vs. 2019 se observaron disminuciones significativas en los valores de IRR en todos los grupos analizados (en el total de adultos para 2020 vs. 2017-2019 un IRR de 0.37; IC 95% 0.28-0.5 y para los años 2020 vs. 2019 un IRR de 0.36; IC 95% 0.26-0.5) (Tabla 8). En el caso del serotipo 33F también se observó una disminución en los valores IRR de todos los grupos de edad analizados, excepto para el grupo de edad de ≥65 años al comparar 2020 vs. 2017-2019 (IRR 0.71; IC 95% 0.46-1.08) (Tabla 8). Estos resultados de- muestran que la pandemia debido al SARS-CoV-2 ha tenido un impacto epidemioló- gico frente a estos dos serotipos, disminuyendo su incidencia en la población adulta. RESULTADOS 94 Tabla 8. IRRs de los serotipos 22F y 33F en todos los grupos de edad comparando el año 2020 con los años anteriores pre-SARS-CoV-2. IRR, razón de tasas; IC, intervalo de confianza. 2017-2019 2019 2020 IRR 2020 vs. 2017- 2019 IC 95% IRR 2020 vs. 2019 IC 95% Efecto vacunal tardío Pre- SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 casos indicen- dia (por 100 000) casos indicen- dia (por 100 000) casos indicen- dia (por 100 000) <18 años <18 años 22F 38 0.15 9 0.11 3 0.04 0.24 0.07-0.77 0.33 0.09-1.24 33F 24 0.10 11 0.13 7 0.08 0.88 0.38-2.05 0.64 0.25-1.65 Adultos (total) Adultos (total) 22F 381 0.33 133 0.34 48 0.12 0.37 0.28-0.5 0.36 0.19-0.59 33F 158 0.14 70 0.18 34 0.09 0.63 0.44-0.92 0.49 0.15-0.6 18 - 64 años 18 - 64 años 22F 150 0.17 56 0.19 19 0.06 0.38 0.23-0.61 0.34 0.2-0.57 33F 53 0.06 24 0.08 8 0.03 0.45 0.21-0.95 0.34 0.15-0.75 ≥65 años ≥65 años 22F 231 0.86 77 0.84 29 0.31 0.36 0.24-0.53 0.37 0.24-0.57 33F 105 0.39 46 0.50 26 0.28 0.71 0.46-1.08 0.56 0.34-0.9 RESULTADOS 95 Figura 14. Representación de los IRRs de los serotipos 22F y 33F comparando el año 2020 con los años previos al SARS-CoV-2. Los rombos amarillos representan la población pediátrica <18 años, los triángulos negros representan la población adulta (total), los círculos verdes re- presentan la población adulta de 18 a 64 años y los cuadrados rojos representan la población adulta ≥ 65 años. IRR, razón de tasas; IC, intervalo de confianza. 1.2. Análisis genético de los clones circulantes de los serotipos 22F y 33F La diversidad genética de los aislados clínicos de los serotipos 22F y 33F produ- ciendo ENI en España se determinó mediante MLST. Se eligieron aislados del pe- riodo vacunal tardío (2017-2019) para identificar los clones que circulaban en ese momento en el que ya se apreciaba el efecto en el reemplazo de serotipos tras la introducción de la VCN13. En la Tabla 9 se puede observar que el serotipo 22F es- taba representado por un total de cinco secuencitipos (ST), agrupados en tres com- plejos clonales (CC). El secuencitipo más frecuente de este serotipo fue el ST433 con un 53% de los aislados, seguido del ST1369 y ST7314 con un 12.5% cada uno (Tabla 9). Además, había dos genotipos agrupados en el CC433 representando un 71% de RESULTADOS 96 los aislados clínicos de 22F (Tabla 9). El serotipo 33F también tenía cinco ST dife- rentes, siendo el principal representante el ST717 formado por el 71% de las cepas, seguido del ST13320 con un 18% de las cepas (Tabla 9). Además, el 93% de los aislados pertenecen al CC717, confirmando que es un serotipo mucho más clonal que el 22F (Tabla 9). En resumen, los aislados clínicos de los serotipos 22F y 33F que producen ENI en la población española parecen conservados, siendo los ST43322F y ST71733F los más prevalentes. Tabla 9. Distribución genotípica de los aislados clínicos de los serotipos 22F y 33F del año 2018. a. CC,complejo clonal; ST, secuencitipo. Serotipo/ CC/ STa Número de aislados Porcentaje del total (%) Serotipo 22F 24 CC433 ST433 ST7314 17 14 3 70,83 58.33 12.5 CC698 ST698 ST13692 5 2 3 20,83 8,33 12.5 CC1439 ST3134 2 2 8,33 8,33 Serotipo 33F 28 CC717 ST717 ST13320 ST4668 26 20 5 1 92,86 71.43 17.86 3.57 CC1012 ST1012 1 1 3.57 3.57 CC433 ST7314 1 1 3.57 3.57 RESULTADOS 97 1.3. Caracterización del biofilm de aislados circulantes de los serotipos 22F y 33F Se realizó una selección aleatorizada de diferentes aislados clínicos de los serotipos 22F y 33F de diferentes orígenes para caracterizar su capacidad de formación de biofilm. Los orígenes de infección seleccionados fueron: sangre, LCR, L-PL y aislados óticos, tanto pediátricos como de adultos (excepto un aislado clínico de adulto con otitis del serotipo 33F, que no se pudo obtener). Se caracterizó la formación de biofilm de estos aislados clínicos (Figura 15). Para ello, se utilizaron una serie de controles de biofilm: la cepa no capsulada de S. pneumoniae M11 y mutantes isogénicos de los serotipos 22F y 33F, es decir, cepas de S. pneumoniae con el fondo genético de M11 con el CPS de los serotipos 22F (P244) o 33F (P017). Aunque tanto los mutantes isogénicos 22F y 33F, como todos los aislados clínicos, formaron menos biofilm que la cepa no capsulada M11, como era de esperar (Domenech et al., 2015), se encon- traron diferencias significativas en la formación de biofilm entre cepas pediátricas y de adultos independientemente del serotipo analizado (Figura 15). En todos los ca- sos, los aislados clínicos pediátricos formaron mejor biofilm que los de adultos, siendo estadísticamente significativo en los aislados de sangre y otitis para el serotipo 22F (Figura 15A) y de sangre y LCR para el serotipo 33F (Figura 15B). Además, en concordancia con lo observado anteriormente, los aislados clínicos de los diferentes serotipos formaban diferentes biofilms respecto a los controles utilizados (los mutan- tes isogénicos 22F y 33F), confirmando de nuevo que el fondo genético, y no sólo el CPS, contribuye en la adhesión de neumococo a superficies abióticas y a la formación de biofilm (Moscoso et al., 2006, Domenech et al., 2014, Domenech et al., 2015). En una segunda fase se incluyeron, de manera aleatoria, 16 aislados clínicos más de población adulta y pediátrica de los serotipos 22F y 33F para determinar si se man- tenía este patrón de mayor formación de biofilm en los aislados pediátricos (Figura 16). Al comparar globalmente todos los resultados, se observa que la formación de biofilm es mayor en aislados pediátricos (***P< 0.001, t de Student de dos colas) (Figura 16A). De forma adicional, analizando nuevos aislados clínicos de sangre pe- diátricos y de adultos, se observó, de nuevo, que los aislados clínicos pediátricos formaban mayor biofilm que los aislados clínicos procedentes de la población adulta (Figura 16B). RESULTADOS 98 Figura 15. Formación de biofilm de aislados clínicos pediátricos y de adultos de cuatro oríge- nes diferentes. (A) Representa el biofilm de los aislados clínicos del serotipo 22F. (B) Repre- senta el biofilm de los aislados clínicos del serotipo 33F. Las barras negras representan creci- miento, las barran blancas representan el biofilm del control no encapsulado (M11) y de los isogénicos (P244 o P017). Las barras de diferentes colores representan la formación de biofilm de los aislados clínicos según su origen. Las barras de error representan la desviación estándar y los asteriscos indican resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: *P< 0.05, ***P<0.001). M11, cepa no-encapsulada; P244, transformante isogénico 22F; P017, transformante isogénico 33F; P, pediátrico; A, adulto; LCR, líquido cefalorraquídeo; L-PL, lí- quido pleural. RESULTADOS 99 Figura 16. Análisis de la formación de biofilm de aislados clínicos pediátricos y de adultos de los serotipos 22F y 33F. (A) Representa la comparación de biofilms de aislados pediátricos y de adultos de cuatro orígenes diferentes: 22F (izquierda) y 33F (derecha). (B) Representa la comparación de biofilms de aislados pediátricos y de adultos de sangre: 22F (izquierda) y 33F (derecha). Las barras negras representan crecimiento, las barran blancas representan el bio- film del control no encapsulado (M11) y de los isogénicos (P244 o P017). Las barras en naranja claro (pediátrico) y oscuro (adulto) representan la formación de biofilm de los aislados clínicos. Las barras de error representan desviación estándar y los asteriscos indican resultados esta- dísticamente significativos (t de Student de dos colas: **P< 0.01, ***P<0.001). M11, cepa no- encapsulada; P244, transformante isogénico 22F; P017, transformante isogénico 33F. RESULTADOS 100 Estudios previos ya habían mostrado que hay serotipos con genotipos circulantes que forman diferentes niveles de biofilm (Aguinagalde et al., 2015). Por ello, se intentó comparar el ST y CC con la formación de biofilm basándonos en el origen clínico aunque no se encontró una posible relación entre genotipo del aislado, la formación de biofilm y el origen de la muestra (Tabla 2 y Figuras 15 y 16). Debido a la limitación de genes del MLST, se realizó la secuenciación masiva de las 16 cepas pediátricas y adultas de diferentes orígenes de los serotipos 22F y 33F para analizar más en detalle la posible asociación fenotipo-genotipo (Figura 15). Este análisis bioinformá- tico de los datos de secuenciación masiva, en el que se va a realizar una matriz de perfiles de ausencia/presencia de genes de virulencia asociados a biofilm frente al fenotipo, se está realizado en este momento, y por ello, no se ha podido incluir en la Memoria escrita de esta Tesis Doctoral aunque se mostrarían si estuvieran disponi- bles en la fase de defensa de la misma. A partir de los datos de secuenciación masiva lo que sí se ha obtenido es un árbol de distancias MST (minimum spanning tree) usando los datos de cgMLST (core genome MLST) creados con Chewbbaca (Figura 17). En este árbol no se puede observar una relación entre fenotipo (cepas pediátri- cas que forman mayor biofilm) y genotipo, pero sí que aporta información indicando que la mayoría de aislados clínicos de serotipo 33F (pediátricos y adultos) se encuen- tran agrupados y son cercanos filogenéticamente (Figura 16), perteneciendo todos al CC717 con los ST717 y ST13320 (Tabla 9). En cuanto al serotipo 22F se observan dos grupos más diferenciados. Un grupo compuesto por tres aislados de adultos (1000-18, 523-18 y 1285-18) y un aislado pediátrico (2780-17), que pertenecen al CC698 con los ST698 y ST13692 (Figura 17) y un grupo compuesto por dos aislados pediátricos (223-11 y 1155-18) y un aislado de adulto (100-18), perteneciendo todos al CC433, ST433 (Figura 17 y Tabla 9). RESULTADOS 101 RESULTADOS 102 Figura 17. Árbol de distancias MST representado usando GrapeTree. Los datos representados pertenecen al cgMLST obtenidos por Chewbbaca, y representan las distancias en alelos de los diferentes aislados clínicos. Los círculos azules con el número de la cepa representan ais- lados del serotipo 33F (pediátrico oscuro, adulto claro) y los círculos naranjas con el número de la cepa representan aislados del serotipo 22F (pediátrico oscuro, adulto claro). Los números entre los círculos representa el número de alelos diferentes entre las cepas. 1.4. Mecanismos de patogenicidad de aislados clínicos pediátricos y adultos de los serotipos 22F y 33F Teniendo en cuenta la diferente capacidad de formación de biofilm entre aislados pediátricos y de adultos de los serotipos 22F y 33F, sobre todo en los aislados de sangre (Figura 15), se decidió caracterizar estos aislados en mayor detalle. Se utilizó el control no capsulado M11, los mutantes isogénicos 22F (P244) y 33F (P017) y los aislados 22F (1407-18 Sangre/Pediátrico; 1000-18 Sangre/Adulto) y 33F (1833-18 Sangre/Pediátrico; 1950-18 Sangre/Adulto). Lo primero que se realizó fueron las curvas de crecimiento en medio C+Y (Figura 18). En las Figuras 18A y 19A se observa cómo el control no capsulado alcanza una OD550 máxima de 0.5 y luego se empieza a autolisar como es esperable. Se puede apreciar que los mutantes isogénicos 22F y 33F, P244 y P017 respectivamente, em- piezan la fase exponencial como la cepa M11 de la que se originan, pero alcanzan una OD550 más alta, siendo mayor la del 22F (≈0.6) y, posteriormente, se inicia la fase de autolisis de manera simultánea (Figura 18A). Los aislados clínicos pediátricos 22F y 33F tienen una fase exponencial más adelantada respecto al resto de aislados y llegan a una OD550 máxima por encima de 0.6, lisándose de manera esperable pos- teriormente (Figuras 18A y 19B). En estas curvas destacan los aislados clínicos de adultos, concretamente, el aislado 22F adulto en una etapa temprana con una fase exponencial adelantada con una OD550 máxima por encima de 0.6, posee una fase estacionaria anormalmente larga (Figuras 18A y 19B), que es poco característica de neumococo. La curva de crecimiento de este aislado clínico 22F de adulto se analizó a tiempos más largos, viendo como comenzaba la lisis del cultivo a las 8 h (Figura 18B). También la curva de crecimiento del aislado 33F adulto fue inusual ya que, la fase exponencial estaba más retrasada que en el resto de cepas y aislados estudia- dos, aunque se lisaba de manera típica (Figuras 18A y 19B). Estos resultados en RESULTADOS 103 los que se analiza tanto el biofilm como el crecimiento vuelven a confirmar que existen diferencias fenotípicas entre los aislados pediátricos y los de adultos para estos se- rotipos. Figura 18. Curvas de crecimiento de los aislados clínicos 22F y 33F. (A) Curvas de crecimiento a 37 °C de los aislados clínicos y cepas control. (B) Curvas de crecimiento a 37 °C del aislado clínico 22F adulto con el control no capsulado M11. M11, cepa no-encapsulada; P244, trans- formante isogénico 22F; P017, transformante isogénico 33F; P, pediátrico; A, de adulto. RESULTADOS 104 Figura 19. Curvas de crecimiento de los aislados clínicos 22F y 33F. (A) Curvas de crecimiento a 37 °C de la cepa no capsulada M11 y los transformantes isogénicos 22F (P244) y 33F (P017). (B) Curvas de crecimiento a 37 °C de los aislados clínicos 22F y 33F pediátricos y adultos. M11, cepa no-encapsulada; P244, transformante isogénico 22F; P017, transformante isogé- nico 33F; P, pediátrico; A, de adulto. RESULTADOS 105 Posteriormente, se estudiaron los mecanismos de evasión del sistema inmune de los aislados clínicos 22F y 33F analizados. Primero se analizó el reconocimiento de los aislados clínicos por células fagocíticas HL-60 diferenciadas a neutrófilos (Figura 20). Como ya mencionamos previamente, la fagocitosis de S. pneumoniae, en presencia o no de anticuerpos específicos, es el mecanismo más eficaz para luchar frente a la infección neumocócica (Standish y Weiser, 2009). Aunque el factor de virulencia prin- cipal para evadir la fagocitosis es el CPS, el fondo genético también contribuye sig- nificativamente a esta evasión (Hyams et al., 2011, McAllister et al., 2011). Además, se decidió estudiar también la evasión del biofilm de estos aislados clínicos, ya que se ha observado previamente que el biofilm de S. pneumoniae evade mejor la fago- citosis que el cultivo planctónico (Domenech et al., 2013). En la Figura 20 se puede observar la evasión del sistema inmune por los aislados clínicos pediátricos y de adultos de los serotipos 22F y 33F. En el caso de los cultivos planctónicos no se observan diferencias entre los aislados mientras que, en el caso del serotipo 33F, se observa que el aislado pediátrico evade mejor la opsonofagocitosis que el de adulto (Figura 20A). Además, se aprecia que los aislados clínicos del serotipo 22F evaden mejor la opsonofagocitosis que los aislados clínicos de serotipo 33F cuando se en- cuentran en estado planctónico (Figura 20A). Estas diferencias dejan de apreciarse cuando se analiza la fagocitosis de los cuatro aislados en estado de biofilm, donde todos los biofilms evaden de una manera similar la fagocitosis y no se encuentran diferencias entre aislados pediátricos o de adultos ni entre los serotipos 22F y 33F (Figura 20B). Por último, al comparar la evasión de la opsonofagocitosis de los culti- vos planctónicos frente a la de los biofilms, se pudo observar que los aislados clínicos en forma de biofilm evadieron mejor el sistema inmune que en estado planctónico (Figura 20C). RESULTADOS 106 Figura 20. Evasión de la opsonofagocitosis de los aislados clínicos de los serotipos 22F y 33F. (A) Supervivencia bacteriana de los aislados clínicos con origen pediátrico (P) o de adulto (A) crecidos como cultivos planctónicos. (B) Supervivencia bacteriana de los aislados clínicos con origen pediátrico o de adulto crecidos como biofilm. (C) Comparación de la fagocitosis de los aislados crecidos como cultivos planctónicos vs. crecidos como biofilm. Las barras de error representan la desviación estándar y los asteriscos indican resultados estadísticamente signi- ficativos (t de Student de dos colas: ***P<0.001). RESULTADOS 107 Para estudiar más a fondo la evasión del sistema inmune se analizó también el de- pósito del componente C3 del complemento en el cultivo planctónico de los diferentes aislados clínicos, junto a la cepa no capsulada M11 y los transformantes isogénicos 22F (P244) y 33F (P017) tomados como controles. Los resultados muestran de nuevo que el serotipo 22F evade mejor el sistema inmune que el serotipo 33F. En la Figura 21 se puede observar que existen mayores niveles de C3 en la cepa no capsulada M11 seguido del transformante isogénico 33F (P017). Por el contrario se observan niveles mucho más bajos de C3 en el transformante isogénico 22F (P244), confir- mando que la cápsula de tipo 22F evade mucho mejor la inmunidad del complemento que la cápsula de tipo 33F. Cuando se analizan los aislados clínicos, se observan resultados que confirman los hallazgos de fagocitosis demostrando que en el serotipo 33F, el aislado pediátrico evade mejor la inmunidad del complemento que el aislado de adulto (Figuras 20A y 21). Figura 21. Depósito del componente C3 en aislados clínicos 22F y 33F. Los resultados están expresados como índice relativo de fluorescencia. Las barras de error representan la desvia- ción estándar y los asteriscos indican resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: ***P<0.001). M11, cepa no-encapsulada; P244, transformante isogénico 22F; P017, transformante isogénico 33F; P, pediátrico; A, adulto. RESULTADOS 108 Por último, se decidió estudiar la virulencia de los aislados clínicos 22F y 33F en un modelo murino de sepsis neumocócica (Figura 22). Para ello, se inocularon intrape- ritonealmente los dos transformantes isogénicos y los cuatro aislados clínicos de se- rotipos 22F y 33Fen diferentes grupos de ratones, y se midieron las UFC/ml en sangre a las 24 h y la supervivencia a lo largo de una semana (Figura 22). Las infecciones utilizando los transformantes isogénicos de la cepa M11 expresando los CPS del se- rotipo 22F (P244) y 33F(P017) confirmaron que el CPS del serotipo 22F confiere una capacidad invasiva mayor que el CPS del serotipo 33F, ya que aquí el fondo genético es el mismo (Figura 22). El transformante isogénico 22F tiene mayor capacidad de replicarse en sangre (Figura 22A) y es más letal (Figura 22B) que el serotipo 33F. Respecto a los aislados clínicos, se pudo observar que el serotipo 22F fue muy letal independientemente del origen del aislado, matando a todos los ratones en las pri- meras 30 h (datos no mostrados) y presentando altos niveles de UFC/ml en sangre (Figura 22A). En relación al serotipo 33F se vuelve a observar la diferencia entre el aislado pediátrico y el de adulto, ya que se obtiene un mayor número de UFC/ml en sangre en el aislado pediátrico (Figura 22A) y su letalidad fue notablemente superior (Figura 22C). Estos resultados concuerdan con la mayor resistencia a la fagocitosis y menor depósito del componente C3 del complemento del aislado 33F pediátrico respecto al aislado 33F de adulto (Figuras 19A y 20). RESULTADOS 109 Figura 22. Virulencia de los aislados clínicos de los serotipos 22F y 33F en un modelo murino de sepsis neumocócica. (A) Recuentos de colonias expresados como Log10 UFC/ml de la san- gre de ratones infectados con los transformantes isogénicos o aislados clínicos 22F y 33F a las 24 h de infección. (B) Curva de supervivencia del transformante isogénico 22F (P244) y 33F (P017). (C) Curva de supervivencia de los aislados clínicos 33F pediátrico y 33F adulto. Las barras de error representan la desviación estándar y los asteriscos indican resultados es- tadísticamente significativos (t de Student de dos colas: *P<0.05; ***P<0.001 para los recuen- tos de viables y test Log-Ran: *P<0.05; **P<0.01 para las curvas de supervivencia). M11, cepa no-encapsulada; P244, transformante isogénico 22F; P017, transformante isogénico 33F; P, pediátrico; A, de adulto. RESULTADOS 110 1.5. Interacción del sistema inmune frente a nuevos serotipos vacunales En el último objetivo del primer capítulo de la presente Memoria nos propusimos ex- plorar la interacción de diferentes serotipos con el sistema inmune. Lo primero que se estudió fue cómo diferentes serotipos vacunales y no vacunales evaden la opso- nofagocitosis por neutrófilos humanos (Figura 23), ya que esto podría explicar las diferencias en su carga de enfermedad a nivel epidemiológico. Para que el único factor diferencial fuese el CPS, se utilizaron transformantes isogénicos que proceden de la cepa no capsulada M11 (Tabla 2, Figura 23). Se escogieron los serotipos va- cunales 3 y 19A de la VCN13 porque aún siguen siendo muy prevalentes en la epi- demiología actual (Ladhani et al., 2018, de Miguel et al., 2020, Ouldali et al., 2021, Mokaddas et al., 2021) y los serotipos 22F y 33F por estar incluidos en las nuevas vacunas VCN15 y VCN20. Los serotipos 8 y 11A se escogieron por su gran carga de enfermedad en la ENI y su asociación con la resistencia a los antibióticos, respecti- vamente (Aguinagalde et al., 2015, de Miguel et al., 2020), además de estar incluidos en la vacuna VCN20. Por último, como serotipo no incluido en ninguna de las nuevas vacunas conjugadas pero muy relevante en la ENI y en la resistencia a los antibióti- cos, se escogió el serotipo 24F (de Miguel et al., 2020, Ouldali et al., 2021). El uso de la cepa M11 para construir mutantes isogénicos en los que la única dife- rencia es el CPS es una buena estrategia para evaluar variaciones en la fagocitosis mediadas por el CPS y no por el fondo genético de las cepas. Como se realizó pre- viamente con los aislados clínicos 22F y 33F, se estudió la opsonofagocitosis de la bacteria creciendo como cultivo planctónico o en estado de biofilm (Figura 23). En cultivos planctónicos, el análisis de los dos serotipos VCN13 confirmó que la cepa con el CPS del serotipo 3 fue más resistente a la fagocitosis que la cepa del serotipo 19A (***P< 0.001, t de Student de dos colas) (Figura 23A). Los dos serotipos adicio- nales de la VCN15 (22F y 33F) mostraron niveles de opsonofagocitosis diferentes, siendo la cápsula del serotipo 22F más resistente que la del serotipo 33F, lo que confirma estudios previos en esta Tesis a nivel de interacción con el sistema inmune (***P< 0.001, t de Student de dos colas) (Figura 23A). Estos hallazgos, en su con- junto, podrían explicar por qué el serotipo 22F causa más casos de ENI y tanto en RESULTADOS 111 niños como en adultos, que el serotipo 33F (Figuras 11 y 12). Las cepas de los se- rotipos 8 y 11A incluidos en la VCN20 mostraron la mayor resistencia a la opsonofa- gocitosis (***P<, ANOVA unidireccional en ambos casos), mientras que el serotipo no-VCN 24F fue fagocitado a los mismos niveles que los serotipos 3 y 19A incluidos en la VCN13 (Figura 23A). El control no capsulado M11 fue la cepa que peor evadió la fagocitosis, resultado esperable por su carencia de CPS. El análisis de evasión de la fagocitosis utilizando estas mismas cepas, pero en estado de biofilm, mostraron que la cepa expresando el CPS del serotipo 3 sigue siendo más resistente a la fagocitosis que la cepa expresando el CPS del serotipo 19A (***P<0.001, t de Student de dos colas) (Figura 23B). Respecto a los serotipos 22F y 33F incluidos en la VCN15, el transformante isogénico del serotipo 22F evadió me- jor la fagocitosis que el 33F (***P<0.001, t de Student de dos colas) (Figura 23B). Estos resultados contrastan con lo observado anteriormente usando cepas clínicas donde no había diferencias en la fagocitosis (Figura 20B). En cuanto a los serotipos 8 y 11A, los transformantes isogénicos expresando estas cápsulas y crecidos en forma de biofilm se aprecia una mayor evasión de la fagocitosis del serotipo 11A respecto al serotipo 8 (***P<0.001, t de Student de dos colas) (Figura 23B) que con- trasta con los resultados de estas mismas cepas, pero crecidas en forma planctónica donde no se observaban diferencias. El biofilm del serotipo 24F fue de los más resis- tentes a la fagocitosis, con niveles similares a los obtenidos con los biofilms de los serotipos 3 y 11A (Figura 23B). Al comparar la resistencia a la opsonofagocitosis de cultivos planctónicos y biofilm se observó que, en casi todos los casos, el biofilm supone una ventaja a la hora de evadirla (Figura 23C), a excepción de los serotipo 8 y 11A, donde se puede ver que en el serotipo 8 el cultivo planctónico evadía mejor la fagocitosis (***P<0.001, t de Student de dos colas) y en el serotipo 11A donde no hubo diferencias significativas entre cultivo planctónico y biofilm (Figura 23C). RESULTADOS 112 Figura 23. Influencia del CPS en la evasión de la opsonofagocitosis. (A) Supervivencia bacte- riana de los transformantes isogénicos crecidos como cultivos planctónicos. (B) Supervivencia bacteriana de los transformantes isogénicos crecidos como biofilm. (C) Comparación de la fa- gocitosis de transformantes isogénicos crecidos como cultivos planctónicos vs. crecidos como biofilm. Las barras de error representan desviación estándar y los asteriscos indican resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: ***P<0.001). NC, cepa no capsulada M11. RESULTADOS 113 Por último, se evaluó el papel del receptor PSGL-1 en la fagocitosis de estos mismos serotipos incluidos o no en las vacunas conjugadas. Como ya se indicó en la intro- ducción de estaTesis Doctoral, el receptor PSGL-1 reconoce específicamente el CPS y la LytA de S. pneumoniae y la evasión del mismo podría ser un aspecto importante que explique el aumento de casos por determinados serotipos (Ramos-Sevillano et al., 2016). La fagocitosis mediada por el receptor PSGL-1 se realizó en ausencia de suero para evitar cualquier interferencia con los receptores del complemento. En au- sencia de cápsula, que utilizamos como control (cepa no capsulada M11), no se ob- servó diferencias en la fagocitosis independientemente del bloqueo o no del receptor PSGL-1 (Figura 24). Esto confirma que la presencia de cápsula es necesaria para la fagocitosis mediada por PSGL-1. Para los serotipos 3 y 19A, el bloqueo de PSGL-1 con el anticuerpo KPL1 incremento su viabilidad, confirmando que este receptor re- conoce el CPS de los serotipos 3 y 19A y está implicado en su fagocitosis (Figura 24). Los mismos resultados se obtuvieron con los serotipos adicionales 22F y 33F de la VCN15 y por el serotipo 8 incluido en la VCN20, ya que la inhibición del receptor PSGL-1 aumentó la resistencia a la fagocitosis, demostrando que este receptor es importante también para la fagocitosis de los serotipos 22F, 33F y 8 (Figura 24). Sin embargo, la fagocitosis de los serotipos 11A y 24F fue similar en presencia o ausencia de PSGL-1, sugiriendo que el CPS de estos dos serotipos no es reconocido por este receptor lo que podría explicar la emergencia de ambos serotipos en la ENI en los últimos años y que estén asociados a elevadas tasas de mortalidad (Figura 24). RESULTADOS 114 Figura 24. Fagocitosis de diferentes serotipos mediada por el receptor PSGL-1. Los resultados expresan las bacterias viables después de la fagocitosis de los diferentes transformantes iso- génicos. Las células fagociticas se incubaron con un control negativo de isotipo IgG que no bloquea PSGL-1 (barras de colores sin patrón) o se incubaron con el anticuerpo KPL1 que bloquea PSGL-1 (barras de colores rayadas). Las barras de error representan la desviación estándar y los asteriscos indican los resultados que son estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: ***P<0.001). NC, cepa no capsulada M11. RESULTADOS 115 2. EVOLUCIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A CEFDITOREN Y OTROS ANTIBIÓ- TICOS EN AISLADOS CLÍNICOS DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE EN ES- PAÑA DURANTE EL PERIODO 2004-2020 Como se comentó previamente, una de las principales preocupaciones respecto a la infección neumocócica es el aumento de serotipos no vacunales que causen ENI, algunos de estos relacionados con la resistencia a los antibióticos. Por ello, la vigi- lancia de los patrones de resistencia a antibióticos de S. pneumoniae resulta nece- saria para evaluar el impacto de las medidas profilácticas en la prevalencia de cepas resistentes de este patógeno. Para abarcar esto se diseñó un estudio para evaluar la evolución de la susceptibilidad a antibióticos en aislados clínicos de S. pneumoniae no susceptibles a penicilina (PEN) en España durante el periodo 2004-2020 (Figura 25). Los antibióticos evaluados fueron PEN, amoxicilina (AMX), cefotaxima (CTX), eritromicina (ERY), levofloxacino (LVX) y tres cefalosporinas orales incluyendo cefdi- toren (CDN), cefixima (CFX) y cefpodoxima (CFD). Figura 25. Esquema de la selección de aislados clínicos de S. pneumoniae no susceptibles a PEN. RESULTADOS 116 Este estudio incluye 3017 aislados clínicos de S. pneumoniae no susceptibles a PEN recibidos en el LRN. El estudio comienza con aislados clínicos recibidos en el año 2004 coincidiendo con la introducción en España de uno de los antibióticos de interés, la cefalosporina oral de tercera generación cefditoren. A partir de este año se inclu- yeron aislados clínicos cada 4 años (2008, 2012 y 2016) y los dos últimos años re- cientes de los que se disponía de datos epidemiológicos completos (2019 y 2020) (Figura 25). Se tuvo en cuenta el año en el que la VCN13 fue comercializada en el mercado privado (2010) e incluida en el calendario pediátrico (2016) para evaluar la evolución de serotipos vacunables y resistencia a antibióticos antes y después de introducir la VCN13 en el mercado. De cada año mostrado en la Figura 25 se inclu- yeron al menos 500 aislados no susceptibles a PEN escogidos de manera aleatoria por la herramienta de selección random de Microsoft Excel. Para su posterior análisis, se agruparon las cepas en tres categorías dependiendo del lugar de infección (neu- monías invasivas, neumonías no invasivas y no respiratorias invasivas). Durante el estudio se observó un patrón constante de baja susceptibilidad a penici- lina, cefotaxima y levofloxacino con valores similares de la CMI90 de 2 µg/ml (para PEN y CTX) y 1 µg/ml (para LVX) durante los 16 años investigados (Figura 26A). Sin embargo, para amoxicilina, nos encontramos con una reducción de la CMI90 de 8 µg/ml durante el periodo pre-VCN13 (los años 2004 y 2008) a 4 µg/ml después de la introducción de la VCN13 en 2010 (Figura 26A). La CMI90 de la eritromicina se man- tuvo en 128 µg/ml a lo largo del periodo de estudio (Tabla 10). Este patrón constante de baja susceptibilidad también se observó en los valores de la CMI50 de la penicilina, cefotaxima y levofloxacino (Tabla 10) y, en el caso de la CMI50, la reducción de este valor para la amoxicilina a partir de la introducción de la VCN13 no se ve tan clara. Respecto a las cefalosporinas orales, la cefixima fue la que mayores valores de CMI90 y CMI50 tuvo a lo largo del periodo de estudio, con valores de 32 µg/ml y 16/8 µg/ml respectivamente (Figura 26B y Tabla 10). La cefpodoxima fue la segunda cefalos- porina con mayores valores de CMI90 y CMI50 durante el periodo estudiado siendo estos de 4 µg/ml y 2 µg/ml respectivamente (Figura 26B y Tabla 10). RESULTADOS 117 Figura 26. CMI90 de los diferentes antibióticos estudiados frente a 3017 aislados clínicos de S. pneumoniae. (A) CMI90 de los diferentes agentes antimicrobianos usados comúnmente frente a S. pneumoniae. (B) CMI90 de tres cefalosporinas orales incluido el cefditoren (CDN). CMI90, concentración mínima inhibitoria en la que al menos el 90% de los aislados son inhibidos (µg/ml). Las barras blanca y negra indican la introducción de la VCN13 en el mercado privado (2010) y en el calendario pediátrico nacional (2016), respectivamente. RESULTADOS 118 Por otro lado, para el cefditoren, la CMI90 y CMI50 fueron de 1 µg/ml y 0.5/0.25 µg/ml respectivamente (Figura 26B y Tabla 10), mostrando los valores más bajos dentro del grupo de cefalosporinas orales de tercera generación estudiadas. Estos resultados indican que tanto la cefotaxima como el cefditoren fueron los anti- bióticos β-lactámicos con mayor actividad. Al comparar los valores de la CMI del cefditoren frente a los diferentes antibióticos β-lactámicos se obtienen diferencias es- tadísticamente significativas con las CMIs más bajas (***P< 0.001, t de Student de dos colas), incluyendo a la cefotaxima. Además, al realizar una comparación múltiple mediante un análisis de varianza (ANOVA) frente a las cefalosporinas orales como cefixima y cefpodoxima, también se obtienen diferencias estadísticamente significa- tivas con las CMIs más bajas (**P< 0.01, ANOVA unidireccional seguido de un test post hoc Dunnet). Tabla 10. Actividad in vitro de diferentes antibióticos frente a aislados clínicos de S. pneumo- niae durante el periodo 2004-2020. CMI50/90 = concentración mínima inhibitoria (µg/ml) en el que al menos el 50% o 90% de to- dos los aislados son inhibidos. Antibiótico 2004 2008 2012 2016 2019 2020 CMI50 CMI90 CMI50 CMI90 CMI50 CMI90 CMI50 CMI90 CMI50 CMI90 CMI50 CMI90 Penicilina 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Amoxicilina 2 8 1 8 1 4 1 4 0.5 4 1 4 Cefotaxima 1 2 0.5 1 1 2 0.5 2 0.5 2 0.5 2 Eritromicina 32 128 128 128 128 128 48 128 48 128 128 128 Levofloxacino 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Cefditoren 0.5 1 0.5 1 0.5 1 0.5 1 0.25 1 0.25 1 Cefixima 16 32 16 32 16 32 16 32 8 32 8 32 Cefpodoxima 2 4 2 4 2 4 2 4 0.5 4 1 4 RESULTADOS 119 Además, se evaluó la proporción de aislados clínicos basándonos en su susceptibili- dad, por los que se agruparon como susceptibles (S), susceptibles con exposición incrementada (I) y resistentes (R) siguiendo el criterio de EUCAST. De todos los an- tibióticos del estudio, de nuevo el cefditoren fue el antibiótico con el mayor porcentaje de aislados clínicos susceptibles durante el periodo de 16 años (Figura 27 y Tabla 11). Los antibióticos con la menor proporción de cepas resistentes durante el periodo estudio fueron cefditoren (< 0.4%), seguido de cefotaxima (< 5%), penicilina (< 6.5%) y levofloxacino (< 7%) (Figura 27 y Tabla 11). Al contrario, los antibióticos con mayor número de cepas resistentes fueron cefixima (> 68,4%), seguida de eritromicina (> 50,4%), cefpodoxima (> 49,8%) y amoxicilina (> 33,4%) (Figura 27 y Tabla 11). Figura 27. Distribución de la susceptibilidad de aislados clínicos de S. pneumoniae (no sus- ceptibles a PEN) a diferentes antibióticos usando el criterio de EUCAST. S, susceptible; I, sus- ceptible con exposición incrementada; R, resistente; CFX, cefixima; CFD, cefpodoxima; CDN, cefditoren; PEN, penicilina; AMX, amoxicilina; CTX, cefotaxima; ERY, eritromicina; LVX, levo- floxacino. RESULTADOS 117 R E S U L T A D O S Tabla 11. Distribución de la susceptibilidad de aislados clínicos de S. pneumoniae (no susceptibles a PEN) a diferentes antibióticos usando el criterio de EUCAST. Antibiótico 2004 2008 2012 2016 2019 2020 S (%) I (%) R (%) S (%) I (%) R (%) S (%) I (%) R (%) S (%) I (%) R (%) S (%) I (%) R (%) S (%) I (%) R (%) Penicilina 0 97.6 2.4 0 97.4 2.6 0 94.2 5.8 0 98.8 1.2 0 96.2 3.8 0 93.6 6.4 Amoxicilina 27.2 16.4 56.5 40.16 13.7 46.2 43.6 21.4 35 41.2 21 37.8 54.6 12 33.4 47.5 16.8 35.7 Cefotaxima 45.3 54.1 0.6 56.8 42.6 0.6 48.4 49.4 2.2 54.6 44.4 1 54.2 41.6 4.2 51.2 47.9 1 Eritromcina 44.9 0 55.1 40.7 0 59.2 36.8 0.4 62.8 49.4 0.2 50.4 43.8 1.6 54.6 40.5 0.8 58.7 Levoflox- acino 0 96.6 3.4 0 94.4 5.6 0 93.2 6.8 0 94 6 0 96.6 3.4 0 98.3 1.7 Cefpodoxima 11.6 8.4 80 25.7 8.2 66.1 28.8 4.4 66.8 29.2 7.2 63.6 46 4.2 49.8 41.9 2.5 55.6 Cefditoren 88.2 11.8 0 85.54 14.3 0.2 88 11.6 0.4 81.4 18.4 0.2 83.6 16.4 0 86.3 13.5 0.2 Cefixima 1.4 6.8 91.8 0.6 14.9 84.5 0.6 21.6 77.8 0.6 17.4 82 2.2 29.4 68.4 1.7 25.9 72.4 Cefpodoxima 11.6 8.4 80 25.7 8.2 66.1 28.8 4.4 66.8 29.2 7.2 63.6 46 4.2 49.8 41.9 2.5 55.6 1 2 0 RESULTADOS 121 Se analizó la relación entre el origen del aislado y su patrón de susceptibilidad, para los antibióticos anteriormente mencionados, incluyendo aislados procedentes de neu- monías invasivas, neumonías no invasivas y aislados invasivos no-respiratorios. Si nos fijamos en la Figura 28, que representa los valores de CMI90 a lo largo de todo el periodo del estudio, podemos observar que la CMI90 se mantiene para la mayoría de los antibióticos, independientemente de su lugar de origen. La amoxicilina disminuyó de 8 µg/ml a 4 µg/ml durante el periodo de 2012-2016 para todos los orígenes (Figura 28A-C), incrementando a 8 µg/ml en los aislados clínicos que corresponden a neu- monías no invasivas, pero manteniéndose en el resto de grupos. Respecto a las neu- monías no invasivas, podemos observar un aumento progresivo de la CMI90 de la penicilina (Figura 28B). Dentro de los β-lactámicos, la cefixima fue el antibiótico que mayor valor de CMI90 tiene tanto en aislados clínicos invasivos como no invasivos, seguido de la amoxicilina y la cefpodoxima (Figura 28). Por el contrario, cefditoren seguido de cefotaxima fueron los que mostraron valores de CMI90 menores en todo el periodo estudiado y esta actividad es independiente del origen clínico de las cepas. RESULTADOS 122 Figura 28. Actividad in vitro de los diferentes antibióticos usados frente a S. pneumoniae según el origen de los aislados clínicos. (A) CMI90 de los antibióticos frente a aislados clínicos de neumonías invasivas. (B) CMI90 de los antibióticos frente a aislados clínicos de neumonías no invasivas. (C) CMI90 de los antibióticos frente a aislados clínicos invasivos no respiratorios. (D) CMI90 de la cefixima frente a aislados de neumonías invasivas, neumonías no invasivas e in- vasivas no respiratorias. CMI90, concentración mínima inhibitoria en la que al menos el 90% de los aislados son inhibidos (µg/ml). RESULTADOS 123 Por último, se analizó el impacto de la vacunación neumocócica en la evolución de las resistencias para los diferentes antibióticos usados a lo largo del estudio e inclu- yendo cepas categorizadas como I y R (Figura 29). La proporción de serotipos inclui- dos en la VCN7 mostró una reducción constante para todos los antibióticos, demos- trando que las vacunas conjugadas neumocócicas son efectivas para controlar la en- fermedad neumocócica asociada a cepas con susceptibilidad antibiótica disminuida (Figura 29). Otro aspecto que se observa es el aumento de la resistencia desde el año 2004 en cepas de serotipos cubiertos por la VCN13 pero no por la VCN7 hasta 2012, año a partir del cual se observó una disminución del porcentaje de cepas re- sistentes, demostrando la eficacia de la VCN13 después de su introducción en la población pediátrica española en 2010 (Figura 29). Por otro lado, se observa un au- mento desde 2004 de cepas I/R que pertenecen a serotipos no vacunales para todos los antibióticos excepto para el cefditoren, que se mantuvo en proporciones muy ba- jas durante todo el periodo de estudio (Figura 29G). La penicilina, la eritromicina y la cefixima fueron los antibióticos con mayor proporción de cepas no susceptibles per- tenecientes a serotipos no vacunales. Respecto a cepas asociadas a susceptibilidad reducida (I/R) a penicilina y eritromi- cina, se observa que disminuyeron tanto los aislados que pertenecían a serotipos incluidos en la VCN7 como a la VCN13, mientras que serotipos no-VCN13 sufrieron un crecimiento constante a lo largo de los 16 años de estudio (Figura 29H). Esta situación es preocupante, ya que más del 50% de los aislados con susceptibilidad reducida a PEN y ERY no están incluidos en las vacunas conjugadas actuales. RESULTADOS 124 RESULTADOS 125 Figura 29. Evolución de los patrones de resistencia a distintos antibióticos durante el periodo 2004-2020. Los aislados clínicos susceptibles con exposición incrementada (I) y resistentes (R) fueron analizados en función del serotipo agrupándolos en tres categorías: serotipos inclui- dos en la VCN7 (VCN7, barras verdes), serotipos adicionales incluidos en la VCN13 pero no en la VCN7 (AD-VCN13, barras moradas) y serotipos no incluidos en la VCN13 (NO-VCN13, barras naranjas). (A) Aislados I/R frente a penicilina. (B) Aislados I/R frente a eritromicina. (C) Aislados I/R frente a cefotaxima. (D) Aislados I/R frente a levofloxacino. (E) Aislados I/R frente a cefpodoxima. (G) Aislados I/R frente al cefditoren. (H) Aislados multirresistentes a penicilina y eritromicina. PEN, penicilina; ERY, eritromicina. RESULTADOS 126 3. EPIDEMIOLOGÍA Y PATOGÉNESIS DE S. AUREUS SENSIBLE/RESISTENTE A METICILINA 3.1. S. aureus en España Como se resaltó en la introducción de esta Memoria, a pesar de que el género Sta- phylococcus incluye 52 especies y 28 subespecies, S. aureus es la especie que po- see mayor relevancia clínica (Lee et al., 2018). Este se encuentra habitualmente en la microbiota de la nasofaringe y piel de las personas, pero se puede romper el equi- librio e invadir otras localizaciones produciendo enfermedades mediadas por toxinas, piógenas o, incluso, llegar al torrente sanguíneo causando bacteriemia y muerte (Peacock y Paterson, 2015). La vigilancia de este patógeno es necesaria porque pro- duce graves infecciones en pacientes hospitalizados y también de manera comunita- ria, en niños y adultos previamente sanos. Además, la gran capacidad de S. aureus de adaptarse al huésped y adquirir nuevos mecanismos de resistencia a los antibió- ticos, obligan a realizar una vigilancia continuada de la resistencia. Por ello el Laboratorio de Referencia de Infecciones Intrahospitalarias (LIH) recibe aislados clínicos de estafilococos procedentes de pacientes con sospecha clínica con el fin de caracterizarlos mediante técnicas moleculares —tanto de brotes como casos individuales— y realizar un control constante de las cepas multirresistentes, sobre todo aquellas con susceptibilidad disminuida a la meticilina. La especie se confirma mediante el análisis de la secuencia génica del ARNr 16S. Además, se estudia si son productoras o no de toxinas como la PVL, TSST y las toxinas exfoliativas ETA y ETB. Para estudiar la resistencia a los antibióticos se analizan los genes mecA y mecC. En la Tabla 12 se puede observar la proporción de aislados recibidos en el LIH en los tres últimos años con datos epidemiológicos completos. Hubo un aumento de aisla- dos clínicos recibidos en 2019, pero en el año 2020, el año de la pandemia producida por el virus SARS-CoV-2, el número de aislados recibido disminuyó (Tabla 12). En los tres periodos mostrados en la tabla se puede observar que la proporción de ais- lados con origen intrahospitalario y con origen comunitario se mantiene, siendo de un 60-62% y 37-40% respectivamente. Dentro de los aislados de origen intrahospitalario, la proporción de aislados SASM y SARM recibidos es equitativa, aunque en 2018 y 2020 se recibieron más aislados SASM (55-58%) que SARM (Tabla 12). RESULTADOS 127 Tabla 12. Aislados clínicos de S. aureus recibidos. Laboratorio de Infecciones Intrahospitalarias (CNM) Nº de aislados (%) Origen 2018 2019 2020 Total 722 (100%) 886 (100%) 616 (100%) Intrahospitalario 452 (62,60%) 524 (59,14%) 379 (61,53%) Comunitario 270 (37,40%) 363 (40,86%) 237 (38,47%) Aislados intrahospitalarios Resistencia Nº de aislados (%) Total 452 (100%) 524 (100%) 379 (100%) SASM 251 (55,53%) 263 (50,20%) 220 (58,04%) SARM 201 (44,47%) 261 (49,80%) 159 (41,96%) Además, en la Tabla 13, se muestran los datos de la Red Nacional de Vigilancia de la Salud Pública (RENAVE) del Centro Nacional de Epidemiología incluyendo los da- tos disponibles hasta la fecha (años 2018 y 2019). En este caso, se observa un mayor número de aislados totales notificados, pero la proporción de aislados intrahospitala- rios y comunitarios es la inversa respecto a las cepas recibidas en el CNM (Tablas 12 y 13). En los dos años mostrados, el número de aislados es similar y hay un mayor porcentaje de aislados con origen comunitario (56-57%) que de origen intrahospita- lario (42-43%). Asimismo, la proporción de aislados SASM o SARM dentro de los aislados intrahospitalarios es diferente a la obtenida en el CNM, siendo una gran ma- yoría de aislados SASM (≈65%) y, en menor proporción, SARM (28-30%). Además, RESULTADOS 128 se pueden apreciar varios aislados notificados por los hospitales a la red RENAVE en los que no se identificó la resistencia a meticilina. Tabla 13. Cepas de S. aureus notificadas al RENAVE. Datos facilitados por Virginia Arroyo Nebreda y Pilar Gallego Berciano del CNE, ISCIII (RENAVE, 2021) RENAVE (Datos nacional) Nº de aislados (%) Origen 2018 2019 Total 990 (100%) 955 (100%) Intrahospitalario 435 (43,93%) 410 (42,93%) Comunitario 555 (56,07%) 545 (57,07%) Aislados intrahospitalarios Resistencia Nº de aislados (%) Total 435 (100%) 410 (100%) SASM 280 (64,37%) 264 (64,39%) SARM 126 (28,97%) 123 (30,00%) Sin identificar 29 (6,66%) 23 (5,61%) 3.2. Caracterización del biofilm de aislados clínicos SASM y SARM De la colección de aislados clínicos de S. aureus recibidos en el CNM, se seleccio- naron al azar una serie de aislados SASM y SARM para caracterizarlos con más detalle. El primer estudio que se realizó con estos aislados fue la formación de biofilm. Previamente, se había descrito que los factores de virulencia podían tener un peso en la formación del biofilm de S. aureus, ya que su carga positiva podía interactuar con la superficie celular aniónica y el ADNe formando puentes electroestáticos inter- celulares, proporcionando de este modo estabilidad al biofilm maduro (Graf et al., RESULTADOS 129 2019). Entre estos factores de virulencia se pueden mencionar las hemolisinas, mo- dulinas solubles en fenol, leucotoxinas, lipasas y las proteínas de adhesión extrace- lular (Graf et al., 2019). Aprovechando que en el LIH del CNM se caracteriza la dife- rente producción de toxinas, se caracterizó el biofilm de diferentes cepas productoras de toxinas para observar si había una asociación en la formación de biofilm (Figura 30). RESULTADOS 130 Figura 30. Formación de biofilm de aislados clínicos de S. aureus que expresan diversas toxi- nas. (A) Biofilm de los aislados clínicos SASM. Las barras negras indican el crecimiento total y las barras de diferentes colores indican el biofilm de los diferentes aislados clínicos produc- tores de toxinas (leyenda). (B) Biofilm de los aislados clínicos SARM. Las barras blancas ra- yadas muestran el crecimiento total y las de diferentes colores indican el biofilm de los distintos aislados clínicos productores de toxinas (leyenda). Como controles se utilizaron aislados clíni- cos SASM y SARM no productores de toxinas (barras blancas). Se analizó la capacidad de formación de biofilm de 28 aislados clínicos SASM (65%) y 15 aislados clínicos SARM (35%), representando la proporción de aislados notifica- dos en RENAVE que se observa a nivel nacional (Tabla 13). En la Figura 30 se muestra la formación de biofilm de los diferentes aislados clínicos. Existen aislados clínicos que producen sólo una toxina, pero también aislados con más de una. Se incluyeron dos controles, las cepas 60031/19 (SASM) y 60061/19 (SARM) que no producen ninguna toxina (Figura 30). No se observa ningún patrón claro en la capa- cidad de formación de biofilm con ninguna toxina, excepto que todos los aislados clínicos con la combinación ETA + ETB formaban poco (A595 ≤1.5) o intermedio biofilm (A595 >2 pero <3) y los que producían la TSST (sólo un aislado de cada tipo) o la PVL formaban todos muy buen biofilm (A595 ≥3.5). Además, no se observó una diferencia de cantidad de biofilm formado entre aislados SASM y aislados SARM que formaban buen o muy buen biofilm (A595 ≥3-3.5), pero había mayor proporción de aislados que formaban poco e intermedio biofilm en cepas SASM (12/28,42,9%) que en cepas SARM (2/15, 13,3%), aunque el número de aislados caracterizados es diferente (Fi- gura 30 y Tabla 14). Para estudiarlo más a fondo se decidió representar los diferen- tes factores de virulencia por separado respecto al control y eliminar aquellos aislados que tenían más de una toxina (Figura 31). En la Figura 31 se pueden observar los patrones de biofilm de los aislados clínicos con las cuatro principales toxinas analizadas. Respecto a ETA se apreció un patrón bimodal tanto en SASM como en SARM, con aislados que formaban muy buen biofilm (A595 ≥3.5) y aislados que formaban poco biofilm (A595 ≤1.5) (Figura 31). Además, en ETB se pudo ver que existían diferencias entre aislados SASM (ambos aislados for- maban poco biofilm) y aislados SARM (que formaban intermedio o buen biofilm), pero la muestra de aislados era muy pequeña (Figura 31). Todos los aislados con la toxina TSST y PVL formaban buen biofilm (A595 ≥3). RESULTADOS 131 Además, se caracterizó el serotipo capsular de los aislados clínicos estudiados, ya que se ha relacionado diferente formación de biofilm según el serotipo capsular de S. aureus (Salimena et al., 2016). En la Tabla 14 se puede observar cada aislado clínico, su resistencia a meticilina, las toxinas que contienen, su formación de biofilm, su se- rotipo capsular, el grupo de edad del paciente, el tipo de infección y su procedencia RESULTADOS 132 Cepa mecA PVL TSST ETA ETB BIOFILM CVa CPS Edad Tipo de infección Origen cepab 60031/19 - - - - - MB 5 Adulto Comunitaria Sangre 60085/19 - + - - - MB 8 Pediátrico Comunitaria L-PL 60032/20 - + - - - MB 8 Pediátrico Intrahospitalaria LB 60107/20 - + - - - MB 8 Pediátrico Comunitaria Sangre 60041/19 - - + - - MB 8 Pediátrico Comunitaria EN 60025/18 - + - - + B 8 Pediátrico Comunitaria EH 62600/15 - - - + - MB 5 Pediátrico Comunitaria EC 60021/17 - - - + - MB 5 Adulto Comunitaria EN 60032/17 - - - + - MB 8 Pediátrico Comunitaria EH 60389/17 - - - + - M 8 Pediátrico Comunitaria EN 60574/17 - - - + - M 8 Pediátrico Comunitaria EN 60642/17 - - - + - MB 5 Adulto Comunitaria Absceso 60038/19 - - - + - M 5 Pediátrico Comunitaria EN 60040/19 - - - + - M 5 Pediátrico Comunitaria Necropsia 60221/19 - - - + - MB 8 Pediátrico Intrahospitalaria+ (brote) EC 60223/19 - - - + - MB 8 Pediátrico Intrahospitalaria+ (brote) EN 60225/19 - - - + - MB 8 Adulto Intrahospitalaria+ (brote) EN 60228/19 - - - + - MB 8 Pediátrico Intrahospitalaria+ (brote) EP 60598/17 - - - - + M 5 Pediátrico Comunitaria GS 60601/17 - - - - + I 5 Pediátrico Comunitaria Necropsia 60610/17 - - - - + MB 8 Pediátrico Comunitaria EN 61949/15 - - - + + I 8 Adulto Intrahospitalaria EH 61950/15 - - - + + I 8 Pediátrico Intrahospitalaria EH 60020/17 - - - + + M 8 Pediátrico Comunitaria EN 60295/17 - - - + + M 8 Pediátrico Comunitaria EN 60207/18 - - - + + B 8 Pediátrico Comunitaria EN 60404/18 - - - + + I 8 Pediátrico Comunitaria EH 60433/18 - - - + + I 8 Adulto Comunitaria Sangre 60061/19 + - - - - MB 5 Adulto Intrahospitalaria EH 60001/19 + + - - - MB 5 Adulto Comunitaria EH 60039/20 + + - - - MB 5 Adulto Intrahospitalaria Sangre 60078/20 + + - - - MB 5 Adulto Comunitaria Sangre Figura 31. Formación de biofilm de aislados clínicos de S. aureus según el tipo de toxina. (A) Biofilm de los aislados clínicos SASM y SARM con ETA. (B) Biofilm de los aislados clínicos SASM y SARM con ETB. (C) Biofilm de los aislados clínicos SASM y SARM con TSST. (D) Biofilm de los aislados clínicos SASM y SARM con PVL. Las barras negras indican el creci- miento total de aislados SASM, las rayadas indican el crecimiento total de aislados SARM y las barras de diferentes colores indican el biofilm de los distintos aislados clínicos productores de toxinas (leyenda) y controles no productores de toxinas (barras blancas). Tabla 14. Cepas de S. aureus caracterizadas según sus factores de virulencia, formación de biofilm y serotipo capsular. También se indica el grupo de edad del paciente, el tipo de infección y el origen de la cepa. RESULTADOS 133 a. MB, muy buen formador de biofilm (A595 ≥3,5); B, buen formador de biofilm (A595 ≥3); I, inter- medio formador de biofilm (A595 >2 pero <3); M, mal formador de biofilm (A595 ≤1.5). b. EC, exudado cutáneo; EH, exudado de herida; EN, exudado nasofaríngeo; EP, exudado perianal; GS, glándula suprarrenal; LB, lavado broncoalveolar; L-PL, líquido pleural; NP, ne- cropsia pulmonar; LCR, líquido cefalorraquídeo. En la Tabla 14 se puede observar que todos los aislados clínicos con los que se trabajó pertenecían a los serotipos 5 y 8. La mayor parte de aislados SASM pertene- cían al serotipo 8, siendo un 71,5% del total, mientras que la mayoría de aislados SARM pertenecían al serotipo 5 (66,7%). Por otro lado, se observó que el 64% de los aislados clínicos del serotipo 8 y el 77% de los aislados clínicos de serotipo 5 forma- ban buen o muy buen biofilm (A595 ≥3 y A595 ≥3,5, respectivamente) (Tabla 14). En relación a si los aislados procedían de pacientes pediátricos o adultos, el 61,5% de los aislados clínicos pediátricos y el 76,5% de los de adultos formaban buen o muy buen biofilm aunque en estos últimos hay que tener en cuenta que la mayoría de aislados SARM analizados procedían de adultos (Tabla 14). Según el tipo de infec- ción, la mayoría de los aislados eran de origen comunitarios (31 de 43 aislados), aunque en líneas generales un porcentaje elevado de las cepas formaron buen o muy buen biofilm (61,3% en aislados comunitarios y 83,3% en aislados intrahospitalarios). Respecto al origen de la cepa, no se encontró relación alguna entre formación de biofilm y origen de la cepa, pudiendo deberse a la gran diversidad de localizaciones de donde se aisló el microorganismo. Cepa mecA PVL TSST ETA ETB BIOFILM CVa CPS Edad Tipo de infección Origen cepa 60031/19 - - - - - MB 5 Adulto Comunitaria Sangre 60085/19 - + - - - MB 8 Pediátrico Comunitaria L-PL 60032/20 - + - - - MB 8 Pediátrico Intrahospitalaria LB 60107/20 - + - - - MB 8 Pediátrico Comunitaria Sangre 60041/19 - - + - - MB 8 Pediátrico Comunitaria EN 60025/18 - + - - + B 8 Pediátrico Comunitaria EH 62600/15 - - - + - MB 5 Pediátrico Comunitaria EC 60021/17 - - - + - MB 5 Adulto Comunitaria EN 60032/17 - - - + - MB 8 Pediátrico Comunitaria EH 60389/17 - - - + - M 8 Pediátrico Comunitaria EN 60574/17 - - - + - M 8 Pediátrico Comunitaria EN 60642/17 - - - + - MB 5 Adulto Comunitaria Absceso 60038/19 - - - + - M 5 Pediátrico Comunitaria EN 60040/19 - - - + - M 5 Pediátrico Comunitaria Necropsia 60221/19 - - - + - MB 8 Pediátrico Intrahospitalaria+ (brote) EC 60223/19 - - - + - MB 8 Pediátrico Intrahospitalaria+ (brote) EN 60225/19 - - - + - MB 8 Adulto Intrahospitalaria+ (brote) EN 60228/19 - - - + - MB 8 Pediátrico Intrahospitalaria+ (brote) EP 60598/17 - - - - + M 5 Pediátrico Comunitaria GS 60601/17 - - - - + I 5 Pediátrico Comunitaria Necropsia 60610/17 - - - - + MB 8 Pediátrico Comunitaria EN 61949/15 - - - + + I 8 Adulto Intrahospitalaria EH 61950/15 - - - + + I 8 Pediátrico Intrahospitalaria EH 60020/17 - - - + + M 8 Pediátrico Comunitaria EN 60295/17 - - - + + M 8 Pediátrico Comunitaria EN 60207/18 - - - + + B 8 Pediátrico Comunitaria EN 60404/18 - - - + + I 8 Pediátrico Comunitaria EH 60433/18 - - - + + I 8 Adulto Comunitaria Sangre 60061/19 + - - - - MB 5 Adulto Intrahospitalaria EH 60001/19 + + - - - MB 5 Adulto Comunitaria EH 60039/20 + + - - - MB 5 Adulto Intrahospitalaria Sangre 60078/20 + + - - - MB 5 Adulto Comunitaria Sangre 60093/20 + + - - - MB 5 Pediátrico Comunitaria Absceso 60033/19 + + + - - I 5 Adulto Comunitaria EH 60443/19 + + - + - MB 8 Adulto Intrahospitalaria EH 60533/18 + - + - - B 5 Pediátrico Comunitaria LCR 61615/14 + - - + - MB 5 Adulto Intrahospitalaria EH 62822/15 + - - + - M 8 Adulto Comunitaria Sangre 60335/19 + - - + - MB 8 Pediátrico Comunitaria Sangre 60412/19 + - - + - MB 5 Adulto Comunitaria EH 60031/20 + - - + - MB 8 Pediátrico Comunitaria EN 61754/14 + - - - + B 8 Adulto Intrahospitalaria Sangre 60574/19 + - - - + MB 5 Adulto Comunitaria EH RESULTADOS 134 3.3. Caracterización de la matriz de los biofilms de aislados clínicos de S. au- reus Al no encontrar una asociación clara entre formación de biofilm y el factor de virulen- cia expresado (toxinas estudiadas), se decidió analizar más a fondo las matrices de los biofilms de los aislados clínicos. Para ello, se analizó el patrón bimodal de forma- ción de biofilm de aislados clínicos SASM y SARM que producen ETA, ya que algunos formaban muy buen biofilm (A595 ≥3,5) y, otros, mal biofilm (A595 ≤1.5) (Figura 31). Con este fin, seleccionamos aislados que sintetizaran ETA y que formasen buen o mal biofilm teniéndose en cuenta, además, el serotipo capsular. Asimismo, se inclu- yeron las cepas 60031/19 y 60061/19 como controles SASM y SARM, respectiva- mente (Tabla 15). Para analizar las matrices de los aislados clínicos seleccionados se realizaron expe- rimentos de inhibición del biofilm, donde se añadía la enzima o el compuesto desde el inicio y se incubaban durante 24 h a 37 °C, mientras que en los experimentos de disgregación del biofilm, se incubó el biofilm durante 23 h a 37 °C, realizando un lavado con H2O destilada seguido de tratamiento del biofilm durante 1 h a 37 °C. El análisis de estos tratamientos se realizó en placas multipocillo de poliestireno y tin- ción con CV. Tabla 15. Selección de aislados clínicos de S. aureus para la caracterización de la matriz. Aislados SASM Aislados SARM Nº cepa Biofilm CVa Serotipo capsular Factor de virulencia Nº cepa Biofilm CVa Serotipo capsular Factor de virulencia 60031/19 MB 5 - 60061/19 MB 5 - 62600/15 MB 5 ETA 60335/19 MB 8 ETA 60040/19 M 5 ETA 62822/15 M 8 ETA 60221/19 MB 8 ETA 60412/19 MB 5 ETA a. MB, muy buen formador de biofilm (A595 ≥3,5); M, mal formador de biofilm (A595 ≤1.5). Lo primero que se analizó fue el componente proteico de las matrices de los aislados clínicos, realizando ensayos de inhibición y disgregación del biofilm con proteinasa K RESULTADOS 135 (Figuras 32 y 33). La proteinasa K es una proteasa que escinde los enlaces peptídi- cos de aminoácidos alifáticos, aromáticos e hidrofóbicos. Esta enzima es de uso co- mún a la hora de estudiar el componente proteico de los biofilms bacterianos (Moscoso et al., 2006, Chaignon et al., 2007) y se había visto su importancia en bio- films de S. aureus, pero variaba en función de la composición de los mismos (Sugimoto et al., 2018). La inhibición con proteinasa K afectó a todos los aislados clínicos menos al SARM 62822/15, donde sólo se vio efecto significativo con 25 µg/ml (Figura 32). Los resultados confirman que el componente proteico de la matriz es esencial para la formación del biofilm de la mayoría de los aislados clínicos. Los en- sayos de disgregación del biofilm mostraron un efecto marcado de la proteinasa K en todos los aislados clínicos, por lo que el componente proteico de las matrices juega un papel crítico en el mantenimiento del biofilm (Figura 33) RESULTADOS 136 Figura 32. Inhibición del biofilm de los aislados clínicos de S. aureus con proteinasa K. Los biofilms fueron tratados con proteinasa K al comienzo de la formación del biofilm (tiempo cero) e incubados durante 24 h a 37 °C. (A) Inhibición de los aislados SASM. Las barras negras indican crecimiento total y las barras en diferentes tonalidades de azul, el biofilm formado en presencia de distintas cantidades de enzima. Las barras blancas y grises, representan el bio- film formado por los controles. (B) Inhibición de los aislados SARM. Las barras rayadas indican el crecimiento total y, las barras cuadriculadas en diferentes tonalidades de azul, el biofilm formado en presencia de distintas cantidades de enzima. Las barras blancas y grises, repre- sentan el biofilm formado por los controles. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: *P<0.05; **P<0.01; +P<0.001). C1, control del biofilm en ausencia de proteinasa K; C2, control del tampón. RESULTADOS 137 Figura 33. Disgregación del biofilm de los aislados clínicos de S. aureus con proteinasa K. Los biofilms fueron incubados durante 23 h a 37 °C y tratados con la enzima durante 1 h a la misma temperatura. (A) Disgregación de los aislados SASM. Las barras negras indican crecimiento total y las barras en diferentes tonalidades de azul, el biofilm tratado con distintas cantidades de enzima. Las barras blancas y grises, representan el biofilm formado por los controles. (B) Disgregación de los aislados SARM. Las barras rayadas indican el crecimiento total y, las ba- rras cuadriculadas en diferentes tonalidades de azul, el biofilm tratado con distintas cantidades de enzima. Las barras blancas y grises, representan el biofilm formado por los controles. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadística- mente significativos (t de Student de dos colas: +P<0.001). C1, control del biofilm en ausencia de proteinasa K; C2, control del tampón. RESULTADOS 138 Otro aspecto que se analizó fue la presencia de ADN extracelular (ADNe) en los bio- films utilizando DNasa I. La DNasa I se ha utilizado ampliamente en el estudio de las matrices de los biofilms de S. aureus, tanto en ensayos de inhibición como de disgre- gación del biofilm (Izano et al., 2008, Houston et al., 2011). Además, estudios previos habían mostrado la importancia del componente de ADNe (Sugimoto et al., 2018) tanto para la formación como para el mantenimiento de los biofilms de S. aureus, aunque, normalmente, se asociaba este efecto al tipo de biofilm [ica-dependiente o ica-independiente (Houston et al., 2011)]. En la Figura 34, se puede observar la inhibición del biofilm con DNasa I de los dife- rentes aislados SASM y SARM. Destaca el efecto de esta enzima en los aislados clínicos muy buenos formadores de biofilm, pero no se apreció ningún efecto de la DNasa I incluso a altas concentraciones en la inhibición del biofilm de las cepas SASM (60040/19) y SARM (62822/15) que eran malas formadoras de biofilm (Figura 34). Además, en los aislados 60221/19 (SASM), 60061/19 (SARM), 60335/19 (SARM) y 60412/19 (SARM) se veía más efecto con la concentración intermedia de 25 µg/ml que con la concentración máxima utilizada (100 µg/ml) (Figura 34). Estos resultados indican que la presencia de ADNe es esencial para la formación de biofilm de aquellos aislados considerados como buenos formadores de biofilm, mientras que no parece tener un papel relevante en la formación de biofilm de los S. aureus consi- derados como malos formadores de biofilm. En los estudios de disgregación de biofilm con DNasa I (Figura 35) se observa dis- gregación del biofilm de todos los aislados clínicos seleccionados, aunque esta dis- gregación fue menor que la producida por la proteinasa K (Figuras 33 y 35). Estos resultados confirman que el ADNe juega también un papel esencial en el manteni- miento de los biofilms aunque, en alguno de los aislados, puede tener menor rele- vancia que el componente proteico. RESULTADOS 139 Figura 34. Inhibición del biofilm de los aislados clínicos de S. aureus con DNasa I. Los biofilms fueron tratados con la enzima desde el tiempo inicial e incubados durante 24 h a 37 °C. (A) Inhibición de los aislados SASM. Las barras negras indican crecimiento total y las barras en diferentes tonalidades de verde, el biofilm formado en presencia de distintas cantidades de enzima. Las barras blancas y grises, representan el biofilm formado por los controles. (B) Inhi- bición de los aislados SARM. Las barras rayadas indican el crecimiento total y las barras cua- driculadas en diferentes tonalidades de verde, el biofilm formado en presencia de distintas cantidades de enzima. Las barras blancas y grises, representan el biofilm formado por los con- troles. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: *P<0.05; **P<0.01; +P<0.001). C1, control del biofilm en ausencia de DNasa I; C2, control del tampón. RESULTADOS 140 Figura 35. Disgregación del biofilm de los aislados clínicos de S. aureus con DNasa I. Los biofilms fueron incubados durante 23 h a 37 °C y tratados con la enzima durante 1 h a la misma temperatura. (A) Disgregación de los aislados SASM. Las barras negras indican crecimiento total y las barras en diferentes tonalidades de verde, el biofilm tratado con distintas cantidades de enzima. Las barras blancas y grises, representan el biofilm formado por los controles. (B) Disgregación de los aislados SARM. Las barras rayadas indican el crecimiento total y las barras cuadriculadas en diferentes tonalidades de verde, el biofilm tratado con distintas cantidades de enzima. Las barras blancas y grises, representan el biofilm formado por los controles. Se mues- tran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: **P<0.01; +P<0.001). C1, control del biofilm en ausen- cia de DNasaI; C2, control del tampón. RESULTADOS 141 Por último, se estudió el componente polisacarídico de la matriz de los biofilms de los aislados clínicos de S. aureus ya que se ha demostrado la existencia de exopolisa- cáridos en la matriz del biofilm de S. aureus denominado PIA o PNAG (Mack et al., 1996, Maira-Litrán et al., 2002). Para analizar la presencia de exopolisacárido en es- tos biofilms se utilizó metaperyodato sódico (NaIO4) que ya había sido utilizado pre- viamente en los biofilms de S. aureus (Seidl et al., 2008, Liesse Iyamba et al., 2011). Este compuesto oxidante hidroliza los enlaces carbono–carbono cuando poseen un átomo de oxígeno, ya sea en forma de grupo hidroxilo o carbonilo. Esto no sólo afec- tará a los polisacáridos, sino que también tiene efecto sobre glicoproteínas. Por todo esto, el NaIO4 ha sido utilizado para determinar la presencia de polisacáridos en las EPS de biofilms formados por diferentes especies bacterianas (Frank y Patel, 2007, Domenech et al., 2013a). Los resultados de la Figura 36, muestran que el NaIO4 fue capaz de disgregar el biofilm de todos los aislados clínicos ensayados, tanto SASM y como SARM, sobre todo a concentraciones ≥ 20 mM. Estos hallazgos indican la existencia de algún tipo de componente polisacarídico en las EPS de estos biofilms, aunque no se puede confirmar que se trate de PIA. Para esto haría falta utilizar la glicósido hidrolasa dis- persina B (Ramasubbu et al., 2005, Izano et al., 2008). RESULTADOS 142 Figura 36. Disgregación del biofilm de los aislados clínicos de S. aureus con NaIO4. Los bio- films fueron incubados durante 23 h a 37 °C y tratados con el compuesto durante 2 h a la misma temperatura. (A) Disgregación de los aislados SASM. Las barras negras indican creci- miento total y las barras en diferentes tonalidades de rojo, el biofilm tratado con distintas can- tidades de NaIO4. Las barras blancas y grises, representan el biofilm formado por los controles. (B) Disgregación de los aislados SARM. Las barras rayadas indican el crecimiento total y las barras cuadriculadas en diferentes tonalidades de rojo, el biofilm tratado con distintas cantida- des de NaIO4. Las barras blancas y grises, representan el biofilm formado por los controles. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadís- ticamente significativos (t de Student de dos colas: +P<0.001). C1, control del biofilm en ausen- cia de NaIO4. RESULTADOS 143 3.4. Evolución del biofilm de aislados clínicos de S. aureus Al realizar los tratamientos de los biofilms de los aislados clínicos de S. aureus se observa una diferencia notable en la biomasa cuantificada por CV (A595) de los aisla- dos que se consideraron como malos formadores de biofilm a las 24 h en el análisis inicial. Si se compara la biomasa de los controles de las cepas 60040/19 y 62822/15 tanto en las inhibiciones (Figuras 32 y 34) como en las disgregaciones del biofilm (Figuras 33, 35 y 36) se pueden observar variaciones de más de una unidad de A595. La única diferencia de estos procedimientos de biofilm es que en los tratamientos de inhibición se exponen 24 h a 37 °C seguidas y en los de disgregación son 23 h a 37 °C + 1 o 2 h a 37 °C de incubación con la enzima o el compuesto (en el caso de los controles será con H2O (C1) o con H2O + tampón de la enzima (C2)). En consecuen- cia, se consideró como muy poco probable que fuese la exposición a H2O durante esa hora lo que afectase al biofilm y formase una mayor biomasa. Para ver si eran los diferentes tiempos de incubación iniciales, se seleccionaron cuatro aislados clíni- cos que formaban mal biofilm a las 24 h (A595 ≤1.5) (Figura 30) y se realizaron ensayos en los que se incubaron los biofilms de estos aislados clínicos a 23 y 24 h a 37 °C (Figura 37). Figura 37. Formación del biofilm de aislados clínicos de S. aureus considerados como malos formadores de biofilm (A595 ≤1.5) a dos tiempos diferentes. Se escogieron dos cepas SASM y dos cepas SARM y se cuantificó su capacidad de formación de biofilm a 23 y 24 h. Las barras negras indican el crecimiento total (bacterias adheridas y no adheridas) de aislados SASM y las barras rayadas indican el crecimiento total (bacterias adheridas y no adheridas) de aislados RESULTADOS 144 SARM. Las barras de diferentes colores indican el biofilm de los distintos aislados clínicos productores de toxinas (leyenda). Se muestran las barras de desviación estándar y los asteris- cos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: ***P<0.001). En los cuatro aislados clínicos considerados como malos formadores de biofilm a las 24 h, se pudo comprobar que, al incubarlos 23 h, había mucha mayor biomasa de biofilm (Figura 37). Este cambio tan brusco en una hora de incubación fue llamativo por lo que se decidió estudiar más a fondo la evolución de cuatro aislados clínicos. Se seleccionaron dos parejas de aislados clínicos SASM (60600/15 y 60040/19) y SARM (60335/19 y 62822/15), y de cada pareja se escogieron un aislado muy buen formador de biofilm (A595 ≥3,5) a las 24 h (60600/15 y 60335/19) y mal formador de biofilm (A595 ≤1.5) a las 24 h (60040/19 y 62822/15). En primer lugar, se analizó el biofilm a diferentes tiempos, desde 5 h (un biofilm de S. aureus temprano) hasta 28 h de incubación (un biofilm de S. aureus maduro) (Fi- guras 38 y 39). En los dos aislados SASM se puede observar que el aislado consi- derado como buen formador de biofilm, es capaz de formar un biofilm muy marcado desde pases tempranas (5 h), estabilizándose a partir de las 8 h y sin sufrir cambios en las 28 h estudiadas (Figura 38A). Por el contrario, en el aislado considerado como mal formador de biofilm se apreció mucho menos biofilm en las 12 primeras horas hasta alcanzar un pico de biofilm a las 16-19 h, donde sufre una caída de biomasa a las 20-21 h que vuelve a repuntar hasta alcanzar un pico a las 23 h (Figura 38B). Aquí se vuelve a observar esa diferencia tan brusca entre 23 vs. 24 h que se da en este biofilm. En los aislados SARM se encontró el mismo fenómeno, donde la buena formadora de biofilm a partir de las 5 h forma ya su máximo de biofilm hasta las 28 h estudiadas (Figura 39A) mientras que la mala formadora alcanza un pico a las 16- 19 h, disminuyendo a las 20 h y volviendo a repuntar hasta las 23 h con una notable caída a las 24 h (Figura 39B). Estas diferencias de 19 vs. 20 h y 23 vs. 24 h en las cepas malas formadoras de biofilm 60040/19 y 62822/15 fueron estadísticamente significativas (***P<0.001, test t de Student de dos colas). RESULTADOS 145 Figura 38. Evolución del biofilm de dos aislados SASM de S. aureus. Se analizó la evolución del biofilm de una cepa buena formadora de biofilm a las 24 h (62600/15) (A) y una mala formadora de biofilm a las 24 h (60040/19) (B). Los biofilms se incubaron de 5 a 28 h a 37 °C y se analizó su biomasa por tinción con CV (A595). Las barras negras representan el crecimiento total (bacterias en estado planctónico y en biofilm) y las violetas el biofilm formado. Se mues- tran las barras de desviación estándar. RESULTADOS 146 Figura 39. Evolución del biofilm de dos aislados SARM de S. aureus. Se analizó la evolución del biofilm de una cepa buena formadora de biofilm a las 24 h (62600/15) (A) y una mala formadora de biofilm a las 24 h (60040/19) (B). Los biofilms se incubaron de 5 a 28 h a 37 °C y se analizó su biomasa por tinción con CV (A595). Las barras rayadas representan el creci- miento total y las barras cuadriculadas violetas el biofilm formado. Se muestran las barras de desviación estándar. RESULTADOS 147 Una vez se observaron estos patrones en los biofilms de los aislados clínicos consi- derados como peores formadores de biofilm (A595 ≤1.5 a 24 h) se caracterizó más a fondo sus matrices en los tiempos en los que el biofilm tiene menor biomasa (20 y 24 h), ya que se habían realizado las disgregaciones de estos aislados clínicos a las 23 h. Sobre esta base, se decidió repetir los mismos tratamientos con proteinasa K, DNasa I y NaIO4, pero realizando una incubación de 20 o 24 h + 1 o 2 h de tratamiento a 37 °C. Al tratar los biofilms de los cuatro aislados clínicos con proteinasa K se pudo observar que este compuesto tenía efecto frente a todos ellos tanto a las 20 h como a las 24 h (Figura 40). Estos resultados confirman la importancia de las proteínas extracelula- res para el mantenimiento en los aislados considerados como buenos formadores de biofilm pero también indican que son importantes para mantener el biofilm de los ais- lados considerados como malos formadores de biofilm cuando su biomasa es menor a las 20 h y 24 h (Figura 40). RESULTADOS 148 Figura 40. Disgregación de los biofilms de los aislados clínicos de S. aureus a diferentes tiem- pos con proteinasa K. Los biofilms fueron incubados durante 20 o 24 h a 37 °C y tratados con la enzima durante 1 h a la misma temperatura. (A) Disgregación de los aislados SASM. Las barras negras indican crecimiento total y las barras azules, el biofilm tratado con 50 µg/ml de proteinasa K. Las barras blancas y grises, representan el biofilm formado por los controles. (B) Disgregación de los aislados SARM. Las barras rayadas indican el crecimiento total y las barras con cuadrículas en azul, el biofilm tratado con 50 µg/ml de proteinasa K. Las barras blancas y grises con cuadrículas, representan el biofilm formado por los controles. Se muestran las ba- rras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significa- tivos (t de Student de dos colas: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001). C1, control del biofilm en ausencia de proteinasa K; C2, control del tampón. RESULTADOS 149 El tratamiento de los biofilms con DNasa I, confirmó que este compuesto seguía te- niendo efecto en los aislados clínicos considerados como buenos formadores de bio- film SASM y SARM, pero no tenía ningún efecto sobre los aislados clínicos que eran malos formadores de biofilm (Figura 41). Este nulo efecto de la DNasa I a las 20 h y 24 h en los aislados considerados como malos formadores de biofilm contrasta con el efecto observado a las 23 h, donde la DNasa I sí que disgregaba el biofilm (Figura 35). RESULTADOS 150 Figura 41. Disgregación de los biofilms de los aislados clínicos de S. aureus a diferentes tiem- pos con DNasaI. Los biofilms fueron incubados durante 20 h o 24 h a 37 °C y tratados con la enzima durante 1 h a la misma temperatura. (A) Disgregación de los aislados SASM. Las barras negras indican crecimiento total y, las verdes, el biofilm tratado con 50 µg/ml de DNasa I. Las barras blancas y grises, representan el biofilm formado por los controles. (B) Disgrega- ción de los aislados SARM. Las barras rayadas indican el crecimiento total y las cuadriculadas y verdes, el biofilm tratado con 50 µg/ml de DNasa I. Las barras blancas y grises cuadriculadas, representan el biofilm formado por los controles. Se muestran las barras de desviación están- dar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: **P<0.01; ***P<0.001). C1, control del biofilm en ausencia de DNasaI; C2, control del tampón. RESULTADOS 151 Por último, se trataron los biofilms con NaIO4 para observar la importancia el compo- nente de exopolisacárido en estos tiempos de exposición. En la Figura 42 se observa que el NaIO4 tiene efecto en los aislados considerados como buenos formadores de biofilm pero no en los aislados que eran malos formadores de biofilm, a excepción del aislado 60040/19 a las 24 h. Al igual que con la DNasa I, esto contrasta con el efecto disgregante visto en estos aislados a las 23 h. Si se analizan en conjunto estos resultados, se puede afirmar que los componentes de la matriz extracelular del biofilm son variables en función del tiempo. RESULTADOS 152 Figura 42. Disgregación de los biofilms de los aislados clínicos de S. aureus a diferentes tiem- pos con NaIO4. Los biofilms fueron incubados durante 20 o 24 h a 37 °C y tratados con el compuesto durante 2 h a la misma temperatura. (A) Disgregación de los aislados SASM. Las barras negras indican crecimiento total y las barras rosas, el biofilm tratado con 20 mM de NaIO4. Las barras blancas y grises, representan el biofilm formado por los controles. (B) Dis- gregación de los aislados SARM. Las barras rayadas indican el crecimiento total y, las cuadri- culadas rosas, el biofilm tratado con 20 mM de NaIO4. Las barras blancas y grises cuadricula- das, representan el biofilm formado por los controles. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: ***P<0.001). C1, control del biofilm en ausencia de NaIO4. RESULTADOS 153 Además de las aproximaciones experimentales mostradas anteriormente, se utilizó CLSM para estudiar con mayor detalle la evolución del biofilm de estos aislados. Para ello, se escogió una pareja de cepas SARM (60335/19 y 62822/15) y se utilizó SYTO59 o SYTO9 para teñir las células del biofilm, la lectina WGA (wheat germ ag- glutinin) conjugada a un fluorocromo y DDAO para observar los componentes de la matriz. Estos ensayos se realizaron a tiempos en los que se aprecian mayores dife- rencias en la cepa considerada como mala formadora de biofilm (16 y 23 h) y donde decae la biomasa del biofilm (20 y 24 h). Las lectinas son proteínas que se unen específicamente y de manera reversible a un carbohidrato, pero sin alterar la estructura covalente de los enlaces glicosídicos re- conocidos. El motivo de usar la lectina WGA (obtenida de Triticum vulgaris) es porque reconoce específicamente residuos de N-acetiglucosamina (GlcNAc) y ácido acetil- neuramínico (Neu5Ac) (Sharon, 2007). En la Figura 43 se puede observar que la lectina WGA-Alexa 433 es capaz de teñir el exopolisacárido de los dos biofilms de los aislados clínicos a distintos tiempos. En la cepa SARM 60335/19 (buena formadora de biofilm, A595 ≥3,5) se aprecia que la presencia de exopolisacárido es constante durante las cuatro horas estudiadas y mantiene un comportamiento homogéneo a lo largo de la evolución del biofilm, a excepción de las 24 h donde se ve mucha mayor señal (Figura 43). Por el contrario, en la cepa 62822/15 (mala formadora de biofilm) se observa un patrón evidente con elevada cantidad de polisacárido a las 16 h y 23 h y mucho menos a las 20 y 24 h. Además, se observaron cúmulos de la lectina en ciertas zonas del biofilm, sin mostrar una distribución homogénea de este polisacá- rido a las 20-24 h en los que incluso se apreciaban zonas libres de marcaje (Figura 43). Respecto a cantidad de células en el biofilm (marcaje con SYTO59), se puede observar que el biofilm de la cepa considerada como buena formadora es mucho más grueso y más estructurado, apreciándose acúmulos de células y zonas sin bacteria que contienen exopolisacárido. Por el contrario, el biofilm de la cepa 62822/15 fue mucho más débil, se observa una menor cantidad de células que parece mantenerse constante en los diferentes tiempos (Figura 43). Se realizó la misma observación utilizando la combinación WGA-Alexa 594 y SYTO9 obteniendo los mismos resulta- dos (datos no mostrados). RESULTADOS 154 Figura 43. Visualización del componente de exopolisacárido de la matriz del biofilm de los aislados clínicos SARM por CLSM. Los biofilms se incubaron a diferentes tiempos (16, 20, 23, o 24 h) a 37 °C. Las bacterias se tiñeron con SYTO59 (fluorescencia en rojo) y el componente exopolisacarídico con WGA-433 (fluorescencia en verde). Proyecciones x-y (captura de imá- genes a intervalos de 0,5 µm) y x-z (captura de imágenes a intervalos de 5,0 µm). Las barras indican la escala, 25 µm. B, biofilm. RESULTADOS 155 Se intentó observar el ADNe de los biofilms mediante tinción con fosfato de DDAO ((9H-(1,3-Dicloro-9,9-Dimetilacridina-2-uno-7-il) fosfato). El DDAO tiñe el ADN, no pe- netra en las bacterias debido a su masa molecular y es fácil de detectar (Dominiak et al., 2011). Además, ya ha sido utilizado previamente para caracterizar el ADNe en biofilms de otros microorganismos (Allesen-Holm et al., 2006, Dominiak et al., 2011, Domenech et al., 2013a, Domenech et al., 2016). En el caso de los dos aislados clínicos de S. aureus no se logró observar ningún tipo de señal a las mismas horas indicadas anteriormente (datos no mostrados). 3.5. Evasión del sistema inmune en S. aureus Otro aspecto importante de estudio en esta Tesis con el patógeno S. aureus consistió en caracterizar el papel del receptor de neutrófilos PSGL-1 en la fagocitosis de S. aureus y en determinar la capacidad de los biofilms de S. aureus para evadir el sis- tema inmune. Con relación al primer aspecto, se utilizó la línea celular HL-60 diferen- ciada a granulocitos que expresaban o no, el receptor PSGL-1 mediante tratamiento farmacológico con el anticuerpo KPL-1 (Ramos-Sevillano et al., 2016). Se probaron diferentes aislados de SASM y de SARM de distintos serotipos capsulares en estado planctónico sin observar diferencias en ninguno de los aislados clínicos independien- temente de que el receptor PSGL-1 estuviera activo o no (Figura 44). Estos resulta- dos confirman que este receptor no participa en la fagocitosis de S. aureus, a dife- rencia de lo descrito para otro patógeno importante como S. pneumoniae (Ramos- Sevillano et al., 2016). RESULTADOS 156 Figura 44. Importancia del receptor PSGL-1 en la fagocitosis de S. aureus en estado planctó- nico. Se utilizaron aislados de cepas SASM y SARM con diferentes cápsulas (60031/19, cap5; 60642/17, cap5; 60574/17, cap8; 60061/19, cap5; 60615/14, cap5; 62822/15, cap8). Las célu- las HL-60 diferenciadas a neutrófilos tenían el receptor bloqueado (KPL1) o no (control isotipo IgG1). Una de las principales características de los biofilms bacterianos es que son capaces de evadir los sistemas de defensa inmune del hospedador. En S. aureus, se han descrito diversos mecanismos para evadir el sistema inmune (Vuong et al., 2004, Thurlow et al., 2011, Bhattacharya et al., 2018). Pero ningún trabajo ha dilucidado un mecanismo de evasión del sistema inmune del biofilm por evasión del depósito de C3b como en S. epidermidis o S. pneumoniae o en la opsonofagocitosis comparado con el cultivo planctónico. Por ello, el segundo aspecto que se analizó en este apar- tado, consistió en estudiar la capacidad del biofilm de S. aureus para evadir el sistema inmune. Se utilizaron dos aislados clínicos control 60031/19 (SASM) y 60061/19 (SARM) que no expresasen ningún factor de virulencia. Los aislados fueron incuba- dos en paralelo utilizando agitación para estudiar el cultivo planctónico o en una placa multipocillo de poliestireno para estudiar la evasión del biofilm in vitro. RESULTADOS 157 Los experimentos de fagocitosis para comparar la evasión del cultivo planctónico y del biofilm se realizaron en presencia, o no, de complemento de conejo (Figuras 45A y 46A), observándose que, en ambas situaciones, el biofilm de las cepas SASM y SARM evadían mejor la fagocitosis por neutrófilos, por un mecanismo independiente de la presencia de complemento. Para confirmar este hallazgo se analizó el depósito del componente C3 en los cultivos planctónicos y los biofilms (Figuras 45B-C y 46B- C). Los resultados confirmaron que el depósito del componente C3 del complemento fue similar en el cultivo planctónico y en el biofilm, tanto en la cepa SASM como en la cepa SARM (Figuras 45B-C y 46B-C). Estos resultados sugieren que en S. aureus la formación de biofilm le permite evadir el sistema inmune pero, a diferencia de neu- mococo, es independiente de la inmunidad mediada por el sistema del complemento. RESULTADOS 158 Figura 45. Comparación de la evasión de la fagocitosis del cultivo planctónico vs. biofilm del aislado SASM 60031/19. (A) Viabilidad después de la fagocitosis del cultivo planctónico y bio- film en presencia o no de complemento de conejo. (B) Depósito del componente C3 del com- plemento en cultivo planctónico y biofilm expuestos previamente a suero. (C) Histograma de citometría del análisis del depósito del componente C3 del complemento en cultivo planctónico (PK) o biofilm (B). RESULTADOS 159 Figura 46. Comparación de la evasión de la fagocitosis del cultivo planctónico vs. biofilm del aislado SARM 60061/19. (A) Viabilidad después de la fagocitosis del cultivo planctónico y bio- film en presencia o no de complemento de conejo. (B) Depósito del componente C3 del com- plemento en cultivo planctónico y biofilm expuestos previamente a suero. (C) Histograma de citometría del análisis del depósito del componente C3 del complemento en cultivo planctónico (PK) o biofilm (B). RESULTADOS 160 4. BIOFILMS MIXTOS DE S. AUREUS Y S. PNEUMONIAE Antes de la introducción de las vacunas conjugadas y después de la introducción de la VCN7, diferentes estudios mostraron una asociación negativa entre los patógenos S. pneumoniae y S. aureus en la colonización de la nasofaringe, llegando algunos trabajos a describir que la portación de serotipos vacunales por la VCN7 impedía la colonización por S. aureus (Regev-Yochay et al., 2004, Spijkerman et al., 2012, Chien et al., 2013, Dunne et al., 2013). En contraste a estos trabajos, en modelos de coco- lonización con ambas bacterias patógenas tanto sobre células como en modelos ani- males, esta asociación negativa no parecía tener lugar (Reddinger et al., 2018, Park et al., 2008, Margolis, 2009). Además, varios estudios epidemiológicos habían mos- trado que hasta un 24% de los pacientes estaban colonizados por ambas especies (Quintero et al., 2011, Ebruke et al., 2016, Melles et al., 2007) y que las vacunas conjugadas no modificaban la colonización nasofaríngea por S. aureus (Cohen et al., 2007, Lee et al., 2009). Debido a estas discrepancias en la literatura, se propuso investigar en esta Tesis la interacción entre S. aureus y S. pneumoniae y desarrollar para ello un modelo de biofilm mixto in vitro. Además, se ensayaron posibles terapias para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el estado de biofilm, que puedan afectar a ambos patógenos. 4.1. Desarrollo de un biofilm mixto de S. aureus y S. pneumoniae Para poner a punto el biofilm mixto se usó una cepa de S. pneumoniae serotipo 19A (YNM4), ya que se trata de uno de los serotipos que mejor forman biofilm y es de los más prevalentes en colonización, con una incidencia significativa en ENI a pesar de encontrarse incluido en la VCN13 (Laufer et al., 2010, Domenech et al., 2014, Ladhani et al., 2018, de Miguel et al., 2020, Ouldali et al., 2021). Esta cepa es un mutante isogénico construido en esta Memoria de Tesis con fondo genético conocido, para evitar efectos asociados a otras diferencias genéticas mediante el uso de aislados clínicos diversos. Respecto a S. aureus, se emplearon dos aislados clínicos, un SASM (60031/19) y un SARM (60061/19), que permitieron analizar el posible impacto de la variación de susceptibilidad a meticilina y ver si, por una parte, el patrón de resistencia a meticilina afectaba o no a la interacción con neumococo en el biofilm RESULTADOS 161 mixto y a la actividad antimicrobiana de diferentes terapias. Sobre la base de lo ante- rior, se desarrollaron dos sistemas de biofilm mixto in vitro, incluyendo un sistema SASM–Sp y un sistema SARM–Sp. Figura 47. Influencia de las proporciones en el inóculo de SASM y S. pneumoniae para la formación de biofilms mixtos in vitro. S. aureus y S. pneumoniae se combinaron en diferentes proporciones y se usaron alícuotas con 200 µl de volumen final que contenían de 8 × 105 a 8 × 106 UFC/ml que se dispensaron en una placa multipocillo de poliestireno y se incubaron durante 5 h a 34 °C. La viabilidad de SASM (cuadrados rojos) y S. pneumoniae (triángulos verdes) se determinó mediante recuento de viables. Las barras grises indican formación de biofilm mixto determinada por tinción con CV. Lo primero que se hizo fue caracterizar las diferentes proporciones de inóculo de ambos patógenos para establecer las condiciones óptimas para la supervivencia de ambas especies en el biofilm mixto (Figuras 47 y 48). Se incubaron todos los biofilms RESULTADOS 162 durante 5 h a 34 °C y se determinó la biomasa del biofilm por tinción con CV y densi- dad óptica (A595) analizando la proporción de ambas especies dentro del biofilm me- diante recuento de viables (Figuras 47 y 48). Figura 48. Influencia de las proporciones en el inóculo de SARM y S. pneumoniae para la formación de biofilms mixtos in vitro. S. aureus y S. pneumoniae se mezclaron en diferentes proporciones y se usaron alícuotas con 200 µl de volumen final que contenían de 8 × 105 a 8 × 106 UFC/ml que se dispensaron en una placa multipocillo de poliestireno y se incubaron durante 5 h a 34 °C. La viabilidad de SARM (círculos rojos) y S. pneumoniae (triángulos verdes) se determinó mediante recuento de viables. Las barras grises indican formación de biofilm mixto determinada por tinción con CV. En ambos sistemas se observó que, para obtener unos niveles similares de ambas especies en el biofilm mixto a tiempo final, el número de células de S. pneumoniae en el inóculo tenía que ser mayor que el de S. aureus (Figuras 47 y 48). Esto ocurría tanto en el biofilm mixto con la cepa SASM como con la cepa SARM, por lo que era RESULTADOS 163 independiente del perfil de susceptibilidad a meticilina. Las proporciones del inóculo de S. aureus–S. pneumoniae más adecuadas para obtener la misma proporción en el biofilm mixto a tiempo final fueron de 1:11 en el caso del sistema SASM:Sp y entre 1:7 y 1:11, en el del sistema SARM:Sp. Además, se observó un aumento en la bio- masa del biofilm (A595) en ambos sistemas cuando la cantidad de neumococos en el inóculo era mayor (proporciones 1:2, 1:5, 1:7, 1:8, 1:11 y 1:16). Estas diferencias comparadas con la biomasa del biofilm cuando S. aureus predominaba en el inóculo (proporciones 5:1 y 2:1) en ambos sistemas fueron significativas (***P< 0.001, ANOVA unidireccional) (Figuras 47 y 48). Para los siguientes experimentos, se eligieron las proporciones 1:1 y 1:11 para am- bos sistemas de biofilm mixto (SASM:Sp y SARM:Sp) y el periodo de incubación total de 5 h. El motivo de utilizar este periodo de tiempo relativamente corto se justifica en la observación de que los biofilms individuales de ambas especies mostraban una reducción en biomasa tras 5-6 h de incubación (Figura 49), fenómeno que ya se ha descrito previamente en los biofilms in vitro de neumococo (Domenech y García, 2016). La proporción 1:1 del inóculo permite realizar ensayos de inhibición del biofilm mixto, ya que, al inicio de este, ambas poblaciones serán iguales, condición ideal para ensayar posibles terapias preventivas. Por otro lado, se seleccionó la proporción 1:11 para estudiar los efectos terapéuticos de los diferentes compuestos a probar en biofilms mixtos formados, en el que la población de ambos patógenos era muy similar a las 4-5 h (Figuras 47, 48, 50 y 51). Una vez establecidas las condiciones óptimas, se analizó la evolución de los biofilms individuales de las tres cepas utilizadas en los biofilms mixtos (Figura 49). También se estudió la evolución de los dos sistemas de biofilm mixto in vitro utilizando las proporciones 1:1 y 1:11 (Figuras 50 y 51). Como era de esperar en S. pneumoniae, el tiempo de incubación del biofilm in vitro en el que se alcanza el máximo de bacte- rias viables (UFC/ml) y de biomasa (A595) fue 5 h (Figura 49A). A partir de las 5 h, se observa una disminución tanto de la viabilidad como de la biomasa en el biofilm neu- mocócico. En el caso de las cepas SASM y SARM, el biofilm a 5-6 h alcanza el má- ximo de viabilidad (en el periodo estudiado), pero a las 6 h se observó un fenómeno de disminución de biomasa en el biofilm al cuantificar con CV (Figura 49B-C). Por todo ello, las condiciones de biofilm mixto in vitro de 5 h fueron las escogidas, como se comentó previamente. RESULTADOS 164 Figura 49. Evolución de los biofilms individuales de las cepas S. pneumoniae 19A, SASM, y SARM. (A) Biofilm de la cepa S. pneumoniae YNM4 (S19A). El panel superior muestra las células viables del biofilm de S. pneumoniae (verde). El panel intermedio muestra las células viables del cultivo planctónico de S. pneumoniae (verde claro). En el panel inferior se repre- senta el crecimiento total (barras negras) y el biofilm (barras grises) determinados por tinción con CV. (B) Biofilm de la cepa S. aureus 60031/19 (SASM). El panel superior muestra las células viables del biofilm de S. aureus (rojo). En el panel intermedio se incluyen las células viables del cultivo planctónico de S. aureus (rojo claro). En el panel inferior se representa el crecimiento total (barras negras) y el biofilm (barras grises) determinados por tinción con CV. (C) Biofilm de la cepa S. aureus 60061/19 (SARM). En el panel superior se representan las células viables del biofilm de S. aureus (rojo con patrón). El panel intermedio muestra las cé- lulas viables del cultivo planctónico de S. aureus (rojo con patrón claro). En el panel inferior se representa el crecimiento total (barras negras) y el biofilm (barras grises) determinados por tinción con CV. Los datos representan una media de seis experimentos. Las barras represen- tan la desviación estándar. RESULTADOS 165 Respecto a la evolución de los sistemas SASM:Sp (Figura 50) y SARM:Sp (Figura 51) se observa un crecimiento similar al observado en los biofilms individuales (Fi- gura 49.). En ambos sistemas, cuando se utiliza en proporción 1:1, en la que las cantidades de S. aureus y S. pneumoniae son iguales en el inóculo, se puede obser- var un claro predominio de S. aureus en el biofilm mixto a tiempo final (Figuras 50A y 51A) en comparación con S. pneumoniae. Este predominio del número de viables del biofilm no ocurre cuando se analiza el número de viables de bacterias en forma planctónica del biofilm, donde ambas poblaciones bacterianas son similares (Figuras 50A y 51A). Por el contrario, en la proporción 1:11, se alcanza un número de viables en el biofilm similar en ambas poblaciones bacterianas a las 4-5 h, como ya se ob- servó previamente (Figuras 47 y 48). Además, estos resultados muestran que S. pneumoniae requiere también un predominio en el número de bacterias viables del cultivo planctónico del biofilm respecto a S. aureus para poder mantener esa pobla- ción similar en el biofilm mixto (Figuras 50B y 51B). Un hallazgo interesante es que S. aureus puede mantener una población mayor en el biofilm mixto con una propor- ción similar en el cultivo planctónico (Figuras 50A y 51B). Generalmente, se observa que a partir de las 5 h la viabilidad de neumococo en el biofilm mixto disminuye (Fi- guras 50 y 51). RESULTADOS 166 Figura 50. Evolución del biofilm mixto SASM–S. pneumoniae usando dos proporciones. (A) Biofilm mixto SASM–Sp (1:1). En el panel superior se representan las células viables del biofilm mixto de SASM (rojo) y S. pneumoniae (verde). En el panel intermedio se muestran las células viables del cultivo planctónico de SASM (rojo claro) y S. pneumoniae (verde claro). En el panel inferior se representa el crecimiento total (barras negras) y el biofilm (barras grises) determi- nados por tinción con CV. (B) Biofilm mixto SASM–Sp (1:11). El panel superior muestra las células viables del biofilm mixto de SASM (rojo) y S. pneumoniae (verde). En el panel interme- dio se encuentran las células viables del cultivo planctónico de SASM (rojo claro) y S. pneu- moniae (verde claro). En el panel inferior se representa el crecimiento total (barras negras) y el biofilm (barras grises) determinados por tinción con CV. Los datos representan una media de seis experimentos. Las barras representan la desviación estándar. RESULTADOS 167 Figura 51. Evolución del biofilm mixto SARM–S. pneumoniae usando dos proporciones. (A) Biofilm mixto SARM–Sp (1:1). El panel superior muestra las células viables del biofilm mixto de SARM (rojo con patrón) y S. pneumoniae (verde). En el panel intermedio se indican las células viables del cultivo planctónico de SARM (rojo con patrón claro) y S. pneumoniae (verde claro). El panel inferior representa el crecimiento total (barras negras) y el biofilm (barras grises) determinados por tinción con CV. (B) Biofilm mixto SARM–Sp (1:11). El panel superior muestra las células viables del biofilm mixto de SARM (rojo con patrón) y S. pneumoniae (verde). En el panel intermedio se indican las células viables del cultivo planctónico de SARM (rojo con patrón claro) y S. pneumoniae (verde claro). El panel inferior representa el crecimiento total (barras negras) y el biofilm (barras grises) determinados por tinción con CV. Los datos representan una media de seis experimentos. Las barras representan la desviación estándar. RESULTADOS 168 4.2. Terapias frente a biofilms mixtos de S. aureus y S. pneumoniae 4.2.1. Los efectos bactericidas de NAC y Cys en los biofilms mixtos SASM–Sp y SARM–Sp Dos de los primeros candidatos como terapia antibiofilm frente a biofilms mixtos S. aureus–S. pneumoniae que se analizaron fueron los antioxidantes N-acetil-L-cisteína (NAC) y cisteamina (Cys). Ya previamente se había probado la NAC frente a biofilms individuales de S. aureus (Manoharan et al., 2020) y de S. pneumoniae (Domenech et al., 2012) y el efecto de Cys en biofilms individuales de S. pneumoniae (Domenech y García, 2017), siendo estos compuestos efectivos. Sin embargo, no había datos previos del efecto de Cys en la prevención y tratamiento de biofilms individuales de S. aureus por lo que, en esta Tesis Doctoral, se estudió su efecto tanto en el biofilm individual de S. aureus como frente a los biofilms mixtos. Lo primero que se realizó fueron los ensayos de inhibición (prevención) sobre los biofilms individuales tanto del aislado clínico SASM como del SARM (Figura 52A-B). En este modelo de prevención, se observó un efecto antimicrobiano significativo de Cys cuando se aplicaron dosis por encima de la CMI, mostrando una reducción drás- tica tanto en el crecimiento total como en el biofilm, independientemente del perfil de susceptibilidad a meticilina (tanto en el biofilm de la cepa SASM como en el de la cepa SARM) (Figura 52A-B). Este efecto fue significativo en ambos sistemas al rea- lizar una comparación múltiple (***P< 0.001, ANOVA unidireccional). Además, en el caso de la cepa SARM, cuando se expuso el biofilm a concentraciones subinhibitorias de Cys (0.1 mg/ml) se observó más efecto tanto en el crecimiento como en el biofilm, en comparación con la cepa SASM (Figura 52B), donde sólo se pudo observar una reducción en el crecimiento, pero no en el biofilm (Figura 52A). El tratamiento de los biofilms de ambas cepas de S. aureus con Cys mostró actividad antimicrobiana a partir de concentraciones superiores a 2.5 mg/ml (***P< 0.001, ANOVA unidireccional) (Figura 52C-D). Se probaron concentraciones inferiores a esta cantidad, pero no mostraron ningún efecto en el biofilm ya formado (datos no mostrados). Esta reducción de la viabilidad con ≥ 2.5 mg/ml de Cys fue mayor en el biofilm de la cepa SARM que en el de la cepa SASM (Figura 52C-D). Sin embargo, RESULTADOS 169 no aumentó la actividad antimicrobiana del antioxidante con concentraciones crecien- tes de este, obteniéndose los mismos niveles de reducción de viabilidad con dosis hasta 20 mg/ml (datos no mostrados). El tratamiento con Cys mostró una efectividad limitada frente a biofilms de S. aureus, mostrando una reducción de hasta un 45% para el biofilm de la cepa SASM (Figura 52C) y hasta un 65%, para el biofilm de la cepa SARM (Figura 52D). Figura 52. Prevención y tratamiento de biofilms monoespecíficos de S. aureus con Cys. (A y B) Diferentes concentraciones de Cys se añadieron al inicio con el inóculo y se incubaron durante 5 h a 37 °C. Después se realizó la tinción con CV. Las barras grises oscuras represen- tan el crecimiento total y las blancas representan el biofilm. (C y D) Tras 4 h de incubación, los biofilms de S. aureus fueron lavados con agua destilada e incubados con diferentes concen- traciones de Cys durante 1 h a 37 °C. La viabilidad se determinó mediante recuento de viables. Las barras rojas representan la viabilidad del biofilm SASM (C) y las rojas con patrón repre- sentan la viabilidad del biofilm SARM (D). Los datos corresponden a la media de, al menos, tres experimentos. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los RESULTADOS 170 resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001). Para comparaciones múltiples se realizó un ANOVA unidireccional seguido de un test de Dunnet post hoc obteniendo una significación estadística de ***P<0.001 en todos los casos. Una vez probado el efecto de Cys en biofilms individuales de S. aureus, se analizó el efecto de los dos antioxidantes, NAC y Cys, en la prevención de los biofilms mixtos de S. aureus y S. pneumoniae creciendo en la proporción inicial 1:1 (Figura 53). En estos experimentos se demostró que el efecto preventivo de NAC en ambos modelos de biofilms mixtos es mucho menor que el efecto de Cys. El uso de concentraciones subinhibitorias de NAC en el biofilm mixto redujo tanto el crecimiento como la forma- ción de biofilm en ambos sistemas (Figura 53A-B), pero no fue hasta alcanzar 2.5 mg/ml de NAC cuando este efecto fue mayor, logrando casi la desaparición total del biofilm a 10 mg/ml de la NAC en ambos sistemas (***P< 0.001, ANOVA unidireccio- nal). Al contrario que NAC, Cys volvió a revelar buenos resultados, como ya se ob- servó en los biofilms monoespecíficos de S. aureus. El uso de concentraciones subin- hibitorias de Cys en el biofilm mixto redujo el crecimiento y la formación de biofilm en ambos sistemas, viéndose un efecto mayor en el sistema SARM–Sp a 0.1 mg/ml (Figura 53D) que en el SASM–Sp a esta misma concentración (Figura 53C). Estos resultados confirman hallazgos previos relacionados con el efecto preventivo de bio- films monoespecíficos de S. aureus (Figura 52A-B). Además, al usar concentracio- nes por encima de la CMI, tanto el crecimiento como el biofilm fueron casi erradicados (***P< 0.001, ANOVA unidireccional) (Figura 53C-D). Estos resultados indican que Cys es un candidato idóneo para la prevención de biofilms mixtos de S. aureus–S. pneumoniae, independientemente de la susceptibilidad de S. aureus a la meticilina. Como se mencionó previamente, los tratamientos se realizaron en la proporción 1:11 en ambos sistemas de biofilm mixto (SASM/SARM:Sp, 1:11). El tratamiento con NAC fue efectivo para reducir ambas poblaciones en el biofilm mixto, independientemente del perfil de susceptibilidad (***P< 0.001, ANOVA unidireccional) (Figura 54A-B). Los biofilms mixtos expuestos a una concentración muy por debajo de la CMI de 0.5 mg/ml de NAC mostraron una reducción del 50% en la viabilidad de SASM, siendo de más del 20% en la viabilidad de SARM, pero hasta un 99% en la viabilidad de S. pneumoniae en ambos sistemas (Figura 54A-B). Esta disminución de la viabilidad RESULTADOS 171 de S. aureus (tanto SASM y SARM) fue aumentando con concentraciones crecientes hasta llegar a la concentración máxima probada de NAC, de 5 mg/ml, en el que se observó una reducción del 94% en la viabilidad de SASM en el biofilm mixto SASM– Sp, una reducción del 99% de la viabilidad de SARM en el biofilm mixto SARM–Sp y la casi completa desaparición de S. pneumoniae en ambos sistemas de biofilm mixto. Estos resultados indican que la NAC es un candidato prometedor para el tratamiento de los biofilms mixtos S. aureus–S. pneumoniae. Figura 53. Prevención de la formación de biofilms mixtos de SASM/SARM–S. pneumoniae en la proporción 1:1 con los antioxidantes NAC y Cys. Diferentes concentraciones de NAC (A y B) o Cys (C y D) se añadieron al inicio con el inóculo y se incubaron durante 5 h a 37 °C. (A) y (C) Niveles de absorbancia después de la tinción por CV del biofilm mixto SASM–Sp. (B) y RESULTADOS 172 (D) Niveles de absorbancia después de la tinción por CV del biofilm mixto SARM–Sp. Las barras grises oscuras representan el crecimiento total y las blancas representan el biofilm. Los datos representan la media de, al menos, tres experimentos. Se muestran las barras de des- viación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001). Para comparaciones múltiples se realizó un ANOVA unidireccional seguido de un test de Dunnet post hoc obteniendo una significancia de ***P< 0.001 en todos los casos. Figura 54. Tratamiento de biofilms mixtos de SASM/SARM–S. pneumoniae en proporción 1:11 con NAC y Cys. Los biofilms mixtos se incubaron 4 h a 34 °C, seguidos de un lavado con agua destilada e incubación con diferentes concentraciones de NAC (A y B) o Cys (C y D) durante RESULTADOS 173 1 h a 37 °C. (A) y (C) Viabilidad del biofilm mixto SASM–Sp. (B) y (D) Viabilidad del biofilm mixto SARM–Sp. Las barras rojas representan la viabilidad de SASM, las barras verdes repre- sentan la viabilidad de S. pneumoniae y las barras rojas con patrón representan la viabilidad de SARM. Los datos corresponden a la media de, al menos, tres experimentos. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente sig- nificativos (t de Student de dos colas: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001). Para comparaciones múltiples se realizó un test de ANOVA unidireccional seguido de un test de Dunnet post hoc obteniendo una significancia de ***P< 0.001 en todos los casos. Al igual que en los biofilms monoespecíficos de S. aureus, para el tratamiento con Cys, se ensayaron concentraciones ≥ 2.5 mg/ml para comprobar si existía algún efecto en la viabilidad de este compuesto en el biofilm mixto. El tratamiento con Cys mostró una reducción de la población de neumococo en el biofilm mixto del 99% para todas las concentraciones mostradas en ambos sistemas de biofilm mixto (con SASM o SARM) (***P< 0.001, ANOVA unidireccional) (Figura 54C-D). A pesar de esto, Cys no fue tan efectiva respecto a la viabilidad de S. aureus dentro del biofilm mixto, obteniéndose niveles similares en reducción de la población de SASM o SARM a la obtenida en los tratamientos de los biofilms monoespecíficos (***P< 0.001, ANOVA unidireccional) (Figura 54C-D). La reducción fue de un 40-50% para el SASM que formaba parte del biofilm mixto y de un 50-55% para el SARM en el biofilm mixto (Figura 54C-D), sin obtener ningún aumento usando concentraciones crecientes de Cys hasta 20 mg/ml (datos no mostrados). Para confirmar el efecto de ambos antioxidantes como tratamiento frente al biofilm mixto se utilizó CLSM. Los biofilms SASM–Sp y SARM–Sp en proporción 1:11 se incubaron en placas de fondo de vidrio durante 4 h a 34 °C, se lavaron y se trataron con 2.5 mg/ml de NAC o Cys (Figura 55). Las imágenes muestran el efecto de NAC y de Cys en ambos sistemas de biofilm mixto, viendo un efecto mayor de NAC en ambos, en concordancia con los resultados del recuento de viables (Figuras 54 y 55). Se puede observar que la NAC es capaz de destruir activamente las células dentro del biofilm, pero no tiene un efecto significativo en la densidad del mismo, ni tampoco produce su disgregación (Figura 55). Por el contrario, el efecto de 2.5 mg/ml de Cys sí que parece tener un efecto disgregante, pero hay muchas más bacterias RESULTADOS 174 viables en concordancia con lo observado en viables, observándose un efecto mayor en el sistema SASM–Sp en este caso, que en el sistema SARM–Sp (Figura 55). Figura 55. Imágenes de CLSM de los biofilms mixtos SASM–Sp y SARM–Sp en proporción 1:11 tras la exposición a NAC y Cys. Los sistemas de biofilm mixto fueron incubados durante 4 h a 34 °C, lavados con H2Od y tratados (o no) con 2.5 mg/ml de NAC o Cys durante 1 h a 37 °C. Las células dentro del biofilm se tiñeron con el kit de viabilidad BacLight LIVE/DEAD que muestra las células viables (fluorescencia verde) y no viables (fluorescencia roja). Proyeccio- nes x–y (captura de imágenes a intervalos de 0.5 µm) y x–z (captura de imágenes a intervalos de 5.0 µm). Las barras indican un tamaño de 25 µm. RESULTADOS 175 4.2.2. Efecto bactericida de los enzibióticos Cpl-711 y CHAPk en los biofilms mixtos SASM–Sp y SARM–Sp La búsqueda de terapias alternativas a los antibióticos convencionales ha sido una de las prioridades de los últimos años debido al incremento de las resistencias anti- bióticas. Uno de los tratamientos que surgió para sustituir a los antibióticos conven- cionales es la terapia fágica y, a principios del presente siglo, las enzimas líticas de fagos y bacterias han sido ampliamente estudiadas como antibacterianos (Vázquez et al., 2018). Dos de estas endolisinas o enzibióticos (Nelson et al., 2001), se proba- ron en esta Tesis frente a los dos sistemas de biofilms mixtos desarrollados. El primer candidato ensayado fue el enzibiótico Cpl-711, una proteína quimérica de las lisozimas Cpl-7 y Cpl-1, siendo una de las candidatas con mayor actividad antimi- crobiana frente a S. pneumoniae (Diez-Martinez et al., 2015), aunque no poseen ac- tividad bactericida frente a S. aureus (Díez Martínez, 2014). Si nos fijamos en la Fi- gura 56, se observa el efecto esperado de Cpl-711 y con concentraciones pequeñas (de ≥ 0.1 µg/ml). Cpl-711 tiene un efecto sobre la población de S. pneumoniae en ambos sistemas de biofilm mixto hasta alcanzar casi la erradicación de la población de neumococo a concentraciones ≥ 2 µg/ml (***P< 0.001, ANOVA unidireccional) (Fi- gura 56). Estos resultados indican la gran eficacia de este enzibiótico a la hora de matar S. pneumoniae, incluyendo su estado en biofilm y en biofilm mixto con otro patógeno bacteriano. Por otro lado, como cabía esperar, no hubo ningún tipo de efecto de la lisina en la población de S. aureus que integra el biofilm mixto, cuya viabilidad no disminuyó a ninguna de las concentraciones probadas, independiente- mente del perfil de susceptibilidad a meticilina (Figura 56). Debido a lo patógeno-específico de las endolisinas, la segunda candidata que se de- cidió probar fue la lisina fágica truncada CHAPk (Fenton et al., 2010). El motivo de usarla es porque previamente había presentado actividad frente a S. aureus tanto en estado planctónico como en biofilm (Fenton et al., 2011, Fenton et al., 2013), pero también presentaba cierta actividad frente a la cepa de S. pneumoniae probada (Fenton et al., 2011). RESULTADOS 176 Figura 56. Tratamiento de biofilms mixtos de SASM/SARM–Sp en proporción 1:11 con Cpl- 711. Los biofilms mixtos se incubaron 4 h a 34 °C, seguidos de un lavado con agua destilada e incubación con diferentes concentraciones de Cpl-711 durante 1 h a 37 °C. (A) Viabilidad del biofilm mixto SASM–Sp. (B) Viabilidad del biofilm mixto SARM–Sp. Las barras rojas represen- tan la viabilidad de SASM, las verdes, la viabilidad de S. pneumoniae y las rojas con patrón representan la viabilidad de SARM. Los datos corresponden a la media de, al menos, tres experimentos. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los re- sultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001). Para comparaciones múltiples se realizó un test de ANOVA unidireccional se- guido de un test de Dunnet post hoc obteniendo una significancia de ***P< 0.001 en el caso de la viabilidad de S. pneumoniae en ambos sistemas. RESULTADOS 177 Antes de ensayar el efecto de la CHAPK en el biofilm mixto, el enzibiótico se probó sobre biofilms individuales de S. aureus para estudiar su actividad con la metodología que aplicamos (Figura 57), ya que en el trabajo previo se emplearon tratamientos de 4 h de duración (Fenton et al., 2013), tiempo de tratamiento imposible para nuestros sistemas de biofilm mixto donde, a partir de 5 h, empezará a verse afectada la viabi- lidad de S. pneumoniae y la biomasa total (Figuras 4.4 y 4.5). En las condiciones experimentales utilizadas en esta Memoria, CHAPK no presentó actividad alguna en concentraciones en el rango utilizado normalmente en endolisinas (0-10 µg/ml) (datos no mostrados), por lo que se determinó su CMI frente a los aislados clínicos SASM y SARM utilizados. Se observó que la CMI para ambos aislados clínicos de S. aureus fue de 50 µg/ml. Por lo tanto, para los tratamientos, se emplearon tanto una concen- tración subinhibitoria (la mitad de la CMI) como la CMI (Figura 57) y se obtuvo una reducción del 80-85% de la viabilidad de SASM y del 70% de la viabilidad de SARM en los biofilms monoespecíficos de S. aureus (Figura 57.) tras 1 h de incubación a 37 °C. Figura 57. Tratamiento de biofilms monoespecíficos de S. aureus con CHAPk. Después de 4 h de incubación los biofilms de S. aureus fueron lavados e incubados con diferentes concen- traciones de CHAPk durante 1 h a 37 °C. La viabilidad se determinó mediante recuento de viables. Las barras rojas representan la viabilidad del biofilm SASM y las barras rojas con pa- trón representan la viabilidad del biofilm SARM. Los datos corresponden a la media de, al menos, tres experimentos. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: ***P<0.001). RESULTADOS 178 Para comparaciones múltiples se realizó un test de ANOVA unidireccional seguido de un test de Dunnet post hoc obteniendo una significancia de ***P<0.001 en todos los casos. Con las mismas condiciones probadas para biofilms monoespecíficos de S. aureus, se llevó a cabo el tratamiento de los biofilms mixtos SASM–Sp y SARM–Sp con CHAPk. En la Figura 58 se puede observar que la población tanto de SASM como de SARM en el biofilm mixto se vio afectada (***P< 0.001, ANOVA unidireccional). In- cluso en el biofilm mixto se obtiene una disminución superior a la observada en los biofilms monoespecíficos usando 50 µg/ml en ambos casos, disminuyendo más del 90% la población de SASM y casi el 90% la de SARM (Figura 58). A pesar de los resultados previos (Fenton et al., 2011), bajo las condiciones estudiadas en esta Me- moria no se vio afectada en ningún momento la viabilidad de S. pneumoniae en los biofilms mixtos (Figura 58). Figura 58. Tratamiento de biofilms mixtos SASM–Sp y SARM–Sp en proporción 1:11 con CHAPk. Después de 4 h de incubación, los biofilms de S. aureus–S. pneumoniae, fueron lava- dos con agua destilada e incubados con diferentes concentraciones de CHAPk durante 1 h a 37 °C. La viabilidad se determinó mediante recuento. Las barras rojas representan la viabilidad de SASM, las verdes representan la viabilidad de S. pneumoniae y, las rojas con patrón, re- presentan la viabilidad de SARM. Los datos corresponden a la media de, al menos, tres expe- rimentos. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: ***P<0.001). Para comparaciones múltiples se realizó un test de ANOVA unidireccional seguido de un test de Dunnet post hoc RESULTADOS 179 obteniendo una significancia de ***P< 0.001 en el caso de la viabilidad de S. aureus en ambos sistemas. 4.2.3. Los efectos bactericidas del enzibiótico de tercera generación ChiDENPs-711 Las lisinas fágicas tienen un marcado potencial antimicrobiano aunque una de las principales limitaciones es que su vida media in vivo es muy corta, entre 20 y 60 min, y las formulaciones y manera de administrarlas están aún investigándose (De Maesschalck et al., 2020). Una de las aproximaciones a este problema fue la encap- sulación y la liberación controlada, que podría mejorar las propiedades farmacociné- ticas y farmacodinámicas de estos antimicrobianos. En este sentido, Vázquez y cols. han desarrollado recientemente nanopartículas basadas en quitosano (ChiNPs) que incorporan grupos dietilaminoetil (DEAE) (ChiDENPs) los cuales funcionan como re- siduos de colina, uniendo estas nanopartículas de forma no covalentemente al enzi- biótico previamente usado Cpl-711 (ChiDENPs-711) (Vázquez et al., 2021). Este grupo de investigación del CIB Margaritas Salas nos proporcionó estas nanopartícu- las para enfrentarlas a los biofilms mixtos desarrollados en esta tesis y comprobar si la nueva formulación tendría efecto también sobre la viabilidad de S. aureus, ya que no habíamos observado efecto del enzibiótico Cpl-711 sobre este microorganismo (Figura 56). En la Figura 59 se puede observar el efecto antimicrobiano de las nanopartículas basadas en quitosano-DEAE sin cargar (ChiDENPs en concentración 1:10, denomi- nadas también nanopartículas “blancas”), las nanopartículas de quitosano sin cargar más la adición exógena de 5 µg/ml de Cpl-711 y las nanopartículas cargadas con Cpl-711 (ChiDENPs-711). Estas tres opciones se probaron para ver si afectaban a la viabilidad de las bacterias que integran tanto el biofilm SASM–Sp como el biofilm SARM–Sp. Lo primero que se observó es que las ChiDENPs sin cargar mostraban un efecto sobre la viabilidad de S. aureus en ambos biofilms mixtos (Figura 59). De manera notable, no se observó este efecto de las nanopartículas blancas en la viabi- lidad de S. pneumoniae. Al añadir a estas nanopartículas sin cargar, 5 µg/ml de Cpl- 711 exógeno, se observó un efecto similar en la viabilidad de S. aureus, el cual se puede atribuir a las nanopartículas blancas (de manera notable, en el biofilm SASM– Sp este efecto disminuyó) pero se puede ver casi una completa erradicación de S. pneumoniae, debida a la actuación de la Cpl-711 que previamente se mostró efectiva RESULTADOS 180 en eliminar la población de este patógeno en el biofilm mixto (Figuras 56 y 59). Por último, al añadir las nanopartículas cargadas con Cpl-711, se pudo ver el efecto en la viabilidad de S. aureus que ya se observó con las nanopartículas blancas, pero, además se observó un efecto en la viabilidad de S. pneumoniae (alrededor del 80% en ambos biofilms SASM–Sp y SARM–Sp), aunque no tan acentuado como con el tratamiento con la Cpl-711 exógena (Figura 59) Figura 59. Tratamiento de biofilms mixtos SASM–Sp y SARM–Sp en proporción 1:11 con Chi- DENPs (cargadas o no). Después de 4 h de incubación, los biofilms mixtos, fueron lavados e incubados con ChiDENPs, ChiDENPS + Cpl-711 o ChiDENPs-711 durante 1 h a 37 °C. La viabilidad se determinó mediante recuento en placa. Las barras rojas representan la viabilidad de SASM, las verdes representan la viabilidad de S. pneumoniae y las rojas con patrón repre- RESULTADOS 181 sentan la viabilidad de SARM. Los datos corresponden a la media de, al menos, tres experi- mentos. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: *P<0.05; ***P<0.001). Además, se completó el estudio visualizando el tratamiento mediante CLSM. Los bio- films SASM–Sp y SARM–Sp en la proporción 1:11 se incubaron en placas de fondo de vidrio durante 4 h a 34 °C, se lavaron con agua destilada y se trataron con Chi- DENPs en proporción 1:10, ChiDENPs en proporción 1:10 + Cpl-711 y ChiDENPs- 711 en proporción 1:10 (Figura 60). Las imágenes muestran un efecto de las nano- partículas no cargadas en la viabilidad de ambos sistemas de biofilm mixto, en con- cordancia con los resultados del recuento de viables (Figuras 59 y 60). El tratamiento que tuvo mayor efecto en la pérdida de viabilidad de los biofilm mixtos fue la combi- nación de nanopartículas no cargadas más la Cpl-711 exógena, donde se encuentra una gran parte de la población muerta (Figura 60). El tratamiento con nanopartículas cargadas (ChiDENPs-711) afectó muy levemente a la viabilidad de los sistemas, siendo más notable en el sistema SARS–Sp, y contrario a lo observado en el ensayo de recuento de viables (Figuras 59 y 60). Un fenómeno que se observó en todos los tratamientos es un cambio en la estructura y biomasa del biofilm al añadir las Chi- DENPs o ChiDENPs-711 debido, posiblemente, a la capacidad de las ChiDENPs de inhibir las CBPs de neumococo y producir ciertas acumulaciones o agregaciones en el biofilm mixto (Figura 60). RESULTADOS 182 Figura 60. Imágenes de CLSM de los biofilms mixtos SASM–Sp y SARM–Sp en proporción 1:11 tras la exposición a ChiDENPs cargadas o no. Los sistemas de biofilm mixto fueron incu- bados durante 4 h a 34 °C, luego lavados y tratados o no con ChiDENPs cargadas o no durante 1 h at 37 °C. Las células dentro del biofilm se tiñeron con el kit de viabilidad BacLight LIVE/DEAD que muestra las células viables (fluorescencia verde) y no viables (fluorescencia roja). Proyecciones x–y (captura de imágenes a intervalos de 0.5 µm) y x–z (captura de imá- genes a intervalos de 5.0 µm). Las barras indican 25 µm. RESULTADOS 183 5. EFECTO DEL EXTRACTO DE HUMO DE TABACO EN BIOFILMS DE S. AU- REUS Y BIOFILMS MIXTOS DE S. AUREUS–S. PNEUMONIAE Uno de los mayores problemas sanitarios al que nos enfrentamos en los últimos tiem- pos es el elevado número de patologías clínicas que se ven afectadas por el consumo de tabaco siendo responsable de unas 8 millones de muertes anuales, según estima- ciones de la Organización Mundial de la Salud (https://www.who.int/news-room/fact- sheets/detail/tobacco). Además, el consumo de tabaco está asociado al 90% de los casos de cáncer de pulmón (Proctor, 2012), al 50% de las enfermedades cardíacas (Ambrose and Barua, 2004) y es la principal causa de la EPOC (Zuo et al., 2014). El consumo de tabaco también aumenta el riesgo de infección por diversos patógenos víricos y bacterianos (Nuorti et al., 2000, Feng et al., 2011, Huvenne et al., 2011, Yageta et al., 2011), entre los que se encuentran S. aureus y S. pneumoniae. Un aspecto interesante desde la perspectiva microbiológica es que el humo de tabaco (HT) no sólo tiene efecto perjudicial en el propio ser humano, sino que también, al contener componentes químicos bioactivos, puede alterar microorganismos patóge- nos o comensales que forman parte de la microbiota humana (Kulkarni et al., 2016). Diversos estudios demuestran como el HT aumenta la resistencia al sistema inmune, la formación de biofilm y otros mecanismos de patogenicidad (Mutepe et al., 2013, Kulkarni et al., 2016, Lacoma et al., 2019, Chien et al., 2020). 5.1. Efecto del EHT en biofilms de S. aureus Existen trabajos previos que han analizado el efecto de utilizar extracto de humo de tabaco (EHT) en la virulencia y, específicamente, en el biofilm de cepas SARM (Kulkarni et al., 2012, Lacoma et al., 2019), donde aparecen fenotipos de virulencia alterados con aumento en la formación del biofilm, mayor resistencia a la fagocitosis e incremento en la adhesión e invasión (Kulkarni et al., 2012, McEachern et al., 2015, Kulkarni et al., 2016). Parece ser que el HT redirige el perfil de virulencia de S. aureus a un fenotipo de persistencia (Lacoma et al., 2019). Sin embargo, una de las mayores limitaciones de estos trabajos es la elevada cantidad de EHT que se usó, llegándose a probar un 50–100% de EHT para ver su efecto en los biofilms (Kulkarni et al., 2012, Lacoma et al., 2019), forzando así una situación artificial. En estos trabajos previos no se determinó el efecto del EHT ni en la estructura de los biofilms ni en la viabilidad bacteriana. Debido a este vacío de información, se decidió caracterizar el efecto del RESULTADOS 184 EHT en concentraciones más bajas (1–10%) a las estudiadas previamente. Para ello, se analizó su efecto en aislados clínicos SASM y SARM a diferentes tiempos (20 y 24 h), estudiando también su impacto en la biomasa medida con CV (A595), en la viabilidad mediante recuento de viables y, a nivel estructural del biofilm, por CLSM. Se realizaron los ensayos con cuatro aislados clínicos SASM y SARM cuya capaci- dad de formación de biofilm había sido caracterizada durante un periodo de 28 h y caracterizada su matriz a las 20, 23 y 24 h (Capítulo 3 de esta Memoria). Se analizó así el efecto del EHT en aislados clínicos que formaron siempre buen biofilm (62600/15-SASM y 60335/19-SARM) y en otros que formaron mal biofilm a las 20 y 24 h (60040/19-SASM y 62822/15-SARM). Lo primero que se hizo fue observar el efecto de diferentes concentraciones del EHT en el biofilm mediante tinción con CV (Figuras 61 y 62). Se puede observar que en las cepas consideradas como buenas formadoras de biofilm no hay efecto del EHT en el biofilm cuando se utiliza este sis- tema de cuantificación porque el sistema está saturado al haberse alcanzado su má- ximo de absorbancia, lo que supone un impedimento para determinar correctamente el efecto del EHT (Figuras 61A y 62A). Sin embargo, sí que se observó que, en ambas cepas y a los dos tiempos estudiados, a partir de 1% de EHT, hay un aumento en el crecimiento total (planctónico + biofilm) (Figuras 61A y 62A). En el caso de las cepas clínicas consideradas como malas formadoras de biofilm, el EHT produjo un aumento del biofilm en ambos aislados clínicos tanto a 20 h como a 24 h (Figuras 61B y 62B). Con un 1% de EHT no parece haber efecto significativo en el biofilm pero, a partir de 5% de EHT, sí que se observa un aumento claro en la formación del biofilm con respecto al control sin EHT. En este caso no se observa efecto en el crecimiento total que si se observó en las cepas clínicas que eran buenas formadoras de biofilm (Figuras 61B y 62B). Una vez analizados los diferentes biofilms con tinción CV, se realizó recuento de viables de los biofilms de los aislados clínicos SARM (60335/19 y 62822/15) expuestos durante 20 y 24 h a diferentes concentraciones de EHT (Figuras 63 y 64). Además, se realizó el recuento de viables del cultivo planc- tónico de esos biofilms. En el aislado clínico SARM considerado como buen formador de biofilm se pudo comprobar que, a pesar de no haber visto un efecto significativo en la capacidad de formación de biofilm en presencia de EHT analizado por CV de- bido a las limitaciones del sistema (Figura 62A), sí que se observó un aumento sig- nificativo de hasta un 50% con 10% de EHT en las bacterias viables del biofilm (Fi- gura 63 A y C). Esto ocurría tanto a las 20 h como a las 24 h de incubación. RESULTADOS 185 Figura 61. Análisis de los efectos del EHT en el biofilm de aislados clínicos SASM. Los biofilms se expusieron a diferentes concentraciones de EHT (1, 5 y 10%) y se incubaron durante 20 o 24 h a 37 °C. (A) Efecto del EHT en el aislado clínico SASM 62600/15 que es buen formador de biofilm. (B) Efecto del EHT en el aislado clínico SASM 60040/19 que es mal formador de biofilm. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: *P<0.05; ***P<0.001). RESULTADOS 186 Figura 62. Análisis de los efectos del EHT en el biofilm de aislados clínicos SARM. Los biofilms se expusieron a diferentes concentraciones de EHT (1, 5 y 10%) y se incubaron durante 20 o 24 h a 37 °C. (A) Efecto del EHT en el aislado clínico SARM 60335/19 que es buen formador de biofilm. (B) Efecto del EHT en el aislado clínico SARM 62822/15 que es mal formador de biofilm. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: ***P<0.001). RESULTADOS 187 Se observó también un aumento significativo en la viabilidad de las bacterias planc- tónicas del biofilm, siendo este aumento mayor que el observado en las bacterias integrantes del propio biofilm cuando se expusieron a 10% de EHT con respecto al control (Figura 63B y D). El efecto del EHT en el aislado clínico considerado como buen formador de biofilm fue similar en ambos tiempos de incubación del biofilm. Figura 63. Efecto del EHT en la viabilidad del biofilm del aislado clínico SARM 60335/19 que es buen formador de biofilm. Los biofilms se expusieron a diferentes concentraciones de EHT (1, 5 y 10%) y se incubaron durante 20 o 24 h a 37 °C. (A y C) Efecto del EHT en el biofilm del aislado clínico SARM 60335/19 a las 20 y 24 h. (B y D) Efecto del EHT en el cultivo planctónico del aislado clínico SARM 60335/19 a las 20 y 24 h. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001). RESULTADOS 188 Figura 64. Efecto del EHT en la viabilidad del biofilm del aislado clínico SARM 62822/15 que es mal formador de biofilm. Los biofilms se expusieron a diferentes concentraciones de EHT (1, 5 y 10%) y se incubaron durante 20 o 24 h a 37 °C. (A y C) Efecto del EHT en el biofilm del aislado clínico SARM 62822/15 a las 20 y 24 h. (B y D) Efecto del EHT en el cultivo planctónico del aislado clínico SARM 62822/15 a las 20 y 24 h. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: **P<0.01; ***P<0.001). Por otro lado, con el aislado clínico que era mal formador de biofilm a las 24 h, se observa a las 20 y 24 h, un efecto significativo del EHT en la viabilidad del biofilm, aumentando su viabilidad hasta un 70–100%, respecto al control con 5–10% de EHT (Figura 64A y C). Con esta cepa clínica se observó un efecto significativo con 1% de EHT en la viabilidad de las bacterias del biofilm, efecto que no se obtuvo cuando se analizó la biomasa mediante CV (Figuras 62 y 64). También, al contrario que en los RESULTADOS 189 resultados obtenidos con CV, se obtuvo efecto en las células viables del cultivo planc- tónico por el EHT con concentraciones superiores al 5%, sobre todo a las 24 h (Fi- gura 64B y D). Estos resultados demuestran que, en la cepa clínica considerada como buena formadora de biofilm, el mayor aumento en viabilidad respecto al control se producía en el cultivo planctónico del biofilm, aunque también se producía en el biofilm (Figura 63). Mientras que en el aislado clínico que era mal formador de biofilm se produce un incremento principalmente en el biofilm, aunque también se producía en el cultivo planctónico del biofilm (Figura 64). Por último, se caracterizó el efecto del EHT en la estructura y viabilidad de estos biofilms mediante CLSM. Se utilizaron los mismos aislados clínicos SARM (buenos y malos formadores de biofilm) con los que se caracterizó el efecto del EHT en las células viables. En el aislado clínico SARM 60335/19 (buen formador de biofilm) se puede observar un biofilm muy estructurado en los controles a 20 y 24 h (Figura 65). Cuando se exponen a 1% de EHT comienzan a perder estructura estos biofilms, y se observan biofilms con menor espesor y más homogéneos (Figura 65). Posterior- mente, con 5% y 10% de EHT se observan biofilms homogéneos, sin agrupaciones bacterianas y mayor densidad celular (Figura 65). En la Figura 66 se muestran las proyecciones ortogonales de los biofilms a ambos tiempos y con las diferentes pro- porciones de EHT. Se puede observar que, según aumenta la concentración de EHT, el biofilm incrementa su densidad celular en cada plano y su grosor (Figura 66). Respecto al aislado clínico 62822/15 (mal formador de biofilm), se puede visualizar cómo sus controles son menos estructurados y más finos a las 20 y 24 h respecto a al biofilm de la cepa anterior que es buena formadora de biofilm (Figuras 65 y 67). En la cepa 62822/15 (mala formadora de biofilm), el EHT incrementa la densidad celular y el grosor del biofilm (Figura 67). Este incremento es más llamativo que en la cepa 60335/19 (buena formadora de biofilm). Esto también se corrobora en las proyecciones ortogonales, donde con 5–10% de EHT el biofilm tuvo una densidad celular y grosor mayores (Figura 68). Este fenómeno se observa tanto a las 20 como a las 24 h, momentos en el que este aislado es cuando forma menos biofilm (Capítulo 3 de esta Memoria). RESULTADOS 190 Figura 65. CLSM del aislado clínico SARM 60335/19 (buen formador de biofilm) en presencia de diferentes concentraciones de EHT. Los biofilms se expusieron a diferentes concentracio- nes de EHT (1, 5 y 10 %) y se incubaron durante 20 o 24 h a 37 °C. Las células del biofilm se tiñeron con el kit de viabilidad BacLight LIVE/DEAD siendo las células viables de color verde (Syto9) y las no viables rojas [yoduro de propidio (IP)]. Proyecciones x–y (captura de imágenes a intervalos de 0.5 µm) y x–z (captura de imágenes a intervalos de 5.0 µm). Las barras indican 25 µm. RESULTADOS 191 Figura 66. CLSM del aislado clínico SARM 60335/19 (buen formador de biofilm) en presencia de diferentes concentraciones de EHT. Los biofilms se expusieron a diferentes concentracio- nes de EHT (1, 5 y 10 %) y se incubaron durante 20 o 24 h a 37 °C. Las células del biofilm se tiñeron con el kit de viabilidad BacLight LIVE/DEAD siendo las células viables de color verde (Syto9) y las no viables, rojas (IP). Proyecciones ortogonales x–y (captura de imágenes a in- tervalos de 0.5 µm) y x–z (captura de imágenes a intervalos de 5µm). RESULTADOS 192 Figura 67. CLSM del aislado clínico SARM 62822/15 (mal formador de biofilm) en presenica de diferentes concentraciones de EHT. Los biofilms se expusieron a diferentes concentracio- nes de EHT (1, 5 y 10 %) y se incubaron durante 20 o 24 h a 37 °C. Las células del biofilm se tiñeron con el kit de viabilidad BacLight LIVE/DEAD siendo las células viables de color verde (Syto9) y las no viables, rojas (IP). Proyecciones x–y (captura de imágenes a intervalos de 0.5 µm) y x–z (captura de imágenes a intervalos de 5.0 µm). Las barras indican 25 µm. RESULTADOS 193 Figura 68. CLSM del aislado clínico SARM 62822/15 (mal formador de biofilm) en presencia de diferentes concentraciones de EHT. Los biofilms se expusieron a diferentes concentracio- nes de EHT (1, 5 y 10 %) y se incubaron durante 20 o 24 h a 37 °C. Las células del biofilm se tiñeron con el kit de viabilidad BacLight LIVE/DEAD siendo las células viables de color verde (Syto9) y las no viables, rojas (IP). Proyecciones ortogonales x–y (captura de imágenes a in- tervalos de 0.5 µm) y x–z (captura de imágenes a intervalos de 5.0 µm). RESULTADOS 194 5.2. Efecto del EHT en biofilms mixtos de S. aureus- S. pneumoniae Como se mencionó anteriormente, existen trabajos previos que han investigado el efecto del EHT en los biofilms de S. aureus (Kulkarni et al., 2012, Lacoma et al., 2019) y S. pneumoniae (Mutepe et al., 2013). Sin embargo, no hay en la literatura resultados previos del efecto del EHT en biofilms multiespecie. Se ha descrito una relación oxi- dativa en la interacción entre S. aureus y S. pneumoniae, ya que neumococo puede generar radicales hidroxilo procedentes del H2O2 (Wu et al., 2019). Adicionalmente, se observó que para que el EHT tuviese un efecto positivo sobre el biofilm de S. aureus, era necesario que se produjese estrés oxidativo producido por las diferentes especies reactivas de oxígeno O2 -, NO, ·OH, y H2O2 (Kulkarni et al., 2012). Por tanto, resulta de gran interés estudiar la interacción entre estos patógenos en las condicio- nes oxidativas del EHT. Al igual que con los biofilms monoespecíficos de S. aureus, se empezó caracteri- zando el efecto del EHT en los biofilms mixtos mediante tinción por CV usando como soporte placas multipocillo de poliestireno (Figura 69). Para estos ensayos se esco- gieron los dos sistemas SASM/SARM:Sp con ambas proporciones 1:11 y 1:1. Al rea- lizar los ensayos con tinción por CV se encontró que el EHT no tenía un efecto sobre el biofilm, en ninguno de los casos (Figura 69), pudiendo deberse a la saturación del sistema y, por lo tanto, a la capacidad limitada de detección por absorbancia, como ocurría en el caso de los aislados clínicos de S. aureus que eran buenos formadores de biofilm (Figuras 61 y 62). En cambio, se observó el efecto contrario en el creci- miento total al observado con los biofims individuales de S. aureus, ya que, a con- centraciones crecientes de EHT, se observó una disminución del crecimiento total de hasta la mitad de A595 (Figura 69). En un paso posterior se caracterizó el efecto del EHT en la viabilidad de los sistemas de biofilm mixto y, de esta manera, poder observar tanto los cambios en el biofilm como en el cultivo planctónico del biofilm (Figuras 70 y 71). En el biofilm del sistema 1:11 SASM:Sp se puede observar que la viabilidad de los dos patógenos aumentaba con concentraciones crecientes de EHT respecto al control (Figura 70A), llegando la población de neumococo a ser del doble con 10% de EHT en comparación al control. RESULTADOS 195 Figura 69. Análisis de los efectos del EHT en los biofilms mixtos SASM/SARM:Sp en las pro- porciones 1:11 y 1:1. Los biofilms se expusieron a diferentes concentraciones de EHT (1, 5 y 10%) y se incubaron durante 5 h a 34 °C. (A) Efecto del EHT en el aislado clínico SARM 60335/19 que es buen formador de biofilm. (B) Efecto del EHT en el aislado clínico SARM 62822/15 que es mal formador de biofilm. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: *P<0.05; ***P<0.001). RESULTADOS 196 Por el contrario, en el cultivo planctónico del biofilm se aprecia que la población de S. aureus empieza a decaer a partir de 5% de EHT y se observa una disminución de hasta casi la mitad en ambas poblaciones cuando se exponen al 10% (Figura 70B) que podría ser la causa de la caída de A595 del crecimiento total observada anterior- mente (Figura 69). En el sistema SARM:Sp 1:11 también se observa este aumento en la viabilidad de ambas poblaciones en el biofilm aunque de forma más leve (Figura 70C), observando la misma disminución en el cultivo planctónico del biofilm tanto en S. aureus como en S. pneumoniae (Figura 70D). Figura 70. Análisis de los efectos del EHT en la viabilidad de los biofilms mixtos SASM/SARM:Sp 1:11. Los biofilms se expusieron a diferentes concentraciones de EHT (1, 5 y 10%) y se incubaron durante 5 h a 34°C. (A y C) Efecto del EHT en el biofilm de los sistemas SASM/SARM:Sp 1:11. (B y D) Efecto del EHT en el cultivo planctónico de los sistemas SASM/SARM:Sp 1:11. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001). RESULTADOS 197 Figura 71. Análisis de los efectos del EHT en la viabilidad de los biofilms mixtos SASM/SARM:Sp 1:1. Los biofilms se expusieron a diferentes concentraciones de EHT (1, 5 y 10%) y se incubaron durante 5 h a 34°C. (A y C) Efecto del EHT en el biofilm de los sistemas SASM/SARM:Sp 1:1. (B y D) Efecto del EHT en el cultivo planctónico de los sistemas SASM/SARM:Sp 1:1. Se muestran las barras de desviación estándar y los asteriscos indican los resultados estadísticamente significativos (t de Student de dos colas: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001). En la Figura 71 se puede observar el efecto del EHT sobre la viabilidad de los biofilms mixtos SASM/SARM:Sp con la proporción 1:1. En todos los casos se aprecia el mismo fenómeno de aumento de viabilidad de ambas poblaciones en el biofilm mixto, alcanzando su máximo con 10% de EHT (Figura 71A y C), asociado a una disminu- ción de más de la mitad de las poblaciones en el cultivo planctónico del biofilm con esa concentración (Figura 71B y D). Este efecto de la viabilidad en el cultivo planc- tónico del biofilm fue más marcado en la población de S. aureus que en la de S. pneumoniae en todos los casos menos en el sistema SASM:Sp 1:11 (Figuras 70 y 71). RESULTADOS 198 Por último, se caracterizó este efecto del EHT en los biofilms mixtos mediante CLSM. Al exponer al sistema SASM:Sp 1:11 a las diferentes concentraciones de EHT (1, 5 y 10 %) no se observaron diferencias con un 1% o 5% de EHT (datos no mostrados), así que, posteriormente, se observaron todos los sistemas comparando el control con el tratado con 10% de EHT (Figuras 72, 73 y 74). En ambos sistemas de biofilm mixto, analizando las diferentes proporciones, se pudo observar un aumento del bio- film al exponerlo al EHT (Figuras 72, 73 y 74). Uno de los fenómenos que ocurrieron al exponer ambos sistemas de biofilm mixto con las proporciones 1:11 a 10% de EHT fue la aparición de múltiples cadenas de neumococo que no se habían observado previamente en los controles (Figuras 72 y 73). En la Figura 72 se observa con más detalle en el sistema SASM:Sp 1:11 en el que no sólo se ve un aumento de la densi- dad celular en el biofilm y en su grosor, sino que se apreciaba como se crean ciertos acúmulos. Además, con 10% de EHT aparecían cadenas de neumococo a lo largo del biofilm (Figura 72A y B). En la Figura 73 se puede observar un aumento en la densidad y grosor en el biofilm mixto SARM:Sp 1:11 y cómo aparecen esas cadenas en todo el biofilm. En el caso de los sistemas SASM/SARM:Sp 1:1 se puede apreciar una mayor cantidad de biofilm en el control que en los sistemas 1:11 y cómo aumenta con 10% de EHT tanto en densidad como en grosor en las proyecciones máximas (Figura 73) y las proyecciones ortogonales (Figura 74). Por último, en las proyeccio- nes ortogonales de todos los sistemas se puede apreciar que, en presencia de EHT, se produce una mayor acumulación bacteriana y un aumento del grosor del biofilm (Figuras 72C y 74). RESULTADOS 199 Figura 72. CLSM del biofilm mixto SASM:Sp 1:11 expuesto a 10% de EHT. El biofilm se expuso a 10% de EHT y se incubó durante 5 h a 34°C. Las células del biofilm se tiñeron con el kit de viabilidad BacLight LIVE/DEAD siendo las células viables de color verde (Syto9) y las no via- bles, rojas (IP). (A) Proyecciones x–y (captura de imágenes a intervalos de 0.5 µm) y x–z (cap- tura de imágenes a intervalos de 5.0 µm). Las flechas rojas señalan las cadenas de S. pneu- moniae observadas. Las barras indican 25 µm. (B) Detalle de las cadenas de la proyección máxima x-y mostrada en el panel A. (C) Proyecciones ortogonales x–y (captura de imágenes a intervalos de 0.5 µm) y x–z (captura de imágenes a intervalos de 5.0 µm). RESULTADOS 200 Figura 73. CLSM de los biofilms mixtos SARM:Sp 1:11 y SASM/SARM:Sp 1:1 expuestos a 10% de EHT. Los biofilms se expusieron a 10% de EHT y se incubaron durante 5 h a 34°C. Las células del biofilm se tiñeron con el kit de viabilidad BacLight LIVE/DEAD siendo las células viables de color verde (Syto9) y las no viables, rojas (IP). Proyecciones x–y (captura de imá- genes a intervalos de 0.5 µm) y x–z (captura de imágenes a intervalos de 5.0 µm). Las barras indican 25 µm. RESULTADOS 201 Figura 74. CLSM de los biofilms mixtos SARM:Sp 1:11 y SASM/SARM:Sp 1:1 expuestos a 10% de EHT. Los biofilms se expusieron a 10% de EHT y se incubaron durante 5 h a 34°C. Las células del biofilm se tiñeron con el kit de viabilidad BacLight LIVE/DEAD siendo las células viables de color verde (Syto9) y las no viables, rojas (IP). Proyecciones ortogonales x–y (cap- tura de imágenes a intervalos de 0.5 µm) y x–z (captura de imágenes a intervalos de 5.0 µm). RESULTADOS 202 6. EFECTO DE LA VACUNA CONJUGADA NEUMOCÓCICA 13-VALENTE EN LA COLONIZACIÓN DE S. PNEUMONIAE Y S. AUREUS La eficacia de las vacunas conjugadas neumocócicas para reducir la ENI en pobla- ción pediátrica y adulta ha sido demostrada (de Miguel et al., 2020, Ouldali et al., 2021). Además, desde la introducción de las VCN en población pediátrica, se ha ob- servado un efecto indirecto en la población adulta (Moore et al., 2015). La coloniza- ción nasofaríngea en neumococo es un prerrequisito para la diseminación a zonas estériles y producir ENI y es interesante destacar que este estado portador está aso- ciado a la formación de biofilm (Domenech et al., 2015). Con la VCN13 se ha visto que no sólo tiene efecto frente a la ENI sino que también disminuye la neumonía neumocócica y el estado del portador (Dagan et al., 2015, Bonten et al., 2015, McLaughlin et al., 2018). Como ya se había demostrado, el estado de biofilm evade mejor la inmunidad mediada por el complemento que cuando los neumococos se encuentran en estado planctónico (Domenech et al., 2013). A pesar de la vacunación con la VCN13, se siguen diagnosticando infecciones por serotipos incluidos en esta vacuna (Mokaddas et al., 2021), siendo el más frecuente el serotipo 3 (Ladhani et al., 2018, Sings et al., 2021), pero también los serotipos 14, 19F y 19A (Moore et al., 2015, Ladhani et al., 2018, Glikman et al., 2018). Además, pocos estudios han determinado el impacto en la colonización de la pauta vacunal utilizada en cada país por estos serotipos vacunales, y muchos tienen la limitación de basarse únicamente en datos epidemiológicos (Lewnard et al., 2020). En la biblio- grafía, hay algún trabajo en el que no encuentran efectividad de la VCN13 frente a la colonización nasofaríngea por el serotipo 3 (Lewnard et al., 2020). 6.1. Estudio de la evasión del sistema inmune por biofilms de serotipos vacu- nales de neumococo incluidos en la vacuna antineumocócica VCN13 Debido a la falta de estudios no epidemiológicos sobre cómo afecta la vacunación a la colonización por S. pneumoniae y la relación de la colonización con el estado de biofilm se probó una mezcla de sueros de pacientes vacunados con la VCN13 frente a biofilms de serotipos vacunales (14, 18C, 19F, 19A y 3) y serotipos no VCN13 (8, 11A y 24F) (Figura 75). Los sueros utilizados en esta Memoria, pertenecen a adultos jóvenes sanos (media de edad 22–45 años) no vacunados frente a S. pneumoniae RESULTADOS 203 (suero preinmune o P) y después de un mes de vacunación con la VCN13 (suero inmune o I). Figura 75. Serotipos VCN13 seleccionados para el presente estudio. Los cinco serotipos VCN13 marcados en malva son los seleccionados para el estudio de biofilm junto con los tres serotipos no-VCN13 de color verde. Antes de la realización de los ensayos de evasión del sistema inmune por biofilms de serotipos VCN13, se realizó una titulación o determinación de anticuerpos funciona- les de los sueros utilizados. Estos títulos se definieron como la dilución de suero que produce una reducción del 50% de las UFC por fagocitosis mediada por el comple- mento siguiendo las recomendaciones internacionales (Romero-Steiner et al., 1997) (Tabla 16). En los sueros preinmiunes, se puede observar que sólo los sujetos 1, 2 y 4 no presentaban ningún tipo de inmunidad previa frente a los serotipos estudiados, mientras que los sujetos 3 y 5 sí que tenían título de anticuerpos frente a los serotipos 3, 19A y 24F y frente a los serotipos 11A y 24F, respectivamente (Tabla 16). Res- pecto a la inmunidad posterior a la vacunación, todos los sujetos respondieron a los serotipos 19F y 19A, 4 sujetos de 5 respondieron frente al serotipo 3, 3 sujetos de 5 frente al serotipo 18C y sólo 2 de 5 sujetos frente al serotipo 14. Sólo el sujeto 2 no RESULTADOS 204 tenía inmunidad previa a ningún serotipo de los probados y respondió a todos los serotipos una vez vacunado (Tabla 16). Tabla 16. Título de anticuerpos funcionales frente a los serotipos VCN13 y no VCN13 utilizados durante el estudio. P, suero preinmune; I, suero inmune; N, sin título. Sueros Serotipo P1 I1 P2 I2 P3 I3 P4 I4 P5 I5 3 N 4 N 4 8 4 N N N 4 14 N N N 4 N N N 4 N N 18C N N N 4 N 8 N N N 4 19F N 4 N 4 N 4 N 4 N 4 19A N 8 N 4 4 32 N 32 N 4 8 N N N N N N N N N N 11A N N N N N N N N 4 4 24F N N N N 4 4 N N 4 4 Tras la titulación, se seleccionaron 3–4 sueros para probar la respuesta de sueros inmunes al biofilm de cada serotipo. Se cuantificó la opsonofagocitosis (OPA) por recuento de viables de los biofilms de serotipos descritos, expuestos a sueros inacti- vados humanos de individuos sanos antes y después de ser vacunados con VNC13. En la Figura 76 se puede observar el efecto de los sueros inmunes y preinmunes de tres sujetos en un biofilm producido por una cepa multirresistente de S. pneumoniae serotipo 19F. Se representó el porcentaje relativo de OPA, donde a mayor porcentaje, mayor supervivencia a la opsonofagocitosis. Se observa que la vacuna VCN13 pro- tege entre un 60–80% a los individuos vacunados frente al biofilm producido por el serotipo 19F y, por tanto, frente a la posible colonización por este serotipo (Figura 76). Esto mismo se realizó utilizando al menos tres sueros pre y posinmunes de dife- rentes sujetos para los serotipos mostrados en la Figura 75, cuyos resultados se muestran en la Figura 77. RESULTADOS 205 Figura 76. Opsonofagocitosis del biofilm del serotipo 19F con diferentes sueros. Los sueros de los sujetos se inactivaron y se añadió una fuente de complemento de conejo. C, control de complemento; P, suero preinmune; I, suero inmune. Figura 77. Opsonofagocitosis del biofilm de los serotipos VCN13 y no-VCN13 con diferentes sueros. Los sueros de los sujetos se inactivaron y se añadió una fuente de complemento de conejo. C, control de complemento; P, suero preinmune; I, suero inmune. RESULTADOS 206 Con la VCN13 se obtuvo inmunidad frente a los biofilms de todos los serotipos VCN13 menos para el serotipo 14 y no se obtuvo inmunidad frente a ninguno de los serotipos no-VCN13 (Figura 77). Los sueros inmunes que se utilizaron pertenecían a sujetos que no poseían anticuerpos protectores previamente a la vacunación. 6.2. Evaluación de sueros de pacientes con tratamientos de metotrexato y ritu- ximab vacunados con la VCN13 o PPV23 Una vez analizada la respuesta inmune a la colonización por serotipos vacunales y no vacunales de pacientes sanos, se evaluaron sueros de dos pacientes con artritis reumatoide (AR), una enfermedad autoinmune, sometidos a tratamientos sintéticos y biológicos con metotrexato y rituximab. Estos pacientes con artritis reumatoide no sólo tienen más riesgo relativo de sufrir ENI (Wotton y Goldacre, 2012, Backhaus et al., 2016), sino que el tratamiento con terapias biológicas está asociado a una res- puesta inmune defectuosa que podría llevar a una pérdida de la eficacia de las vacu- nas antineumocócicas (Loubet et al., 2015). De los dos sueros estudiados, el paciente A estaba vacunado sólo con VNP23, mien- tras que el paciente B se vacunó con la pauta secuencial recomendada VNP23 + VCN13. En este caso, se analizaron sólo tres serotipos VCN13 y VNP23 (3, 19F y 19A) y un serotipo no VCN13, pero sí VNP23 (8) (Figura 78). Para estos ensayos solo se disponía de suero posvacunación. Al realizar los ensayos de opsonofagocito- sis con estos sueros frente a los biofilms de los cuatro serotipos probados se pudo comprobar que los sueros inmunes no protegieron frente a la colonización de ningún serotipo excepto del serotipo 19F, con un valor de protección de 50–55% en este biofilm (Figura 78). Ninguno de los dos pacientes mostró protección frente a los bio- films de los serotipos 3, 19A y 8 por lo que, en teoría, no estarán protegidos frente a la colonización o frente a infecciones crónicas asociadas a biofilms, como podría ser la EPOC producida por estos serotipos. RESULTADOS 207 Figura 78. Opsonofagocitosis del biofilm de los serotipos VCN13 y VNP23 con dos sueros de pacientes con artritis reumatoide sometidos a tratamiento con metotrexato y rituximab. Los sueros inmunes de los pacientes se inactivaron y se añadió una fuente de complemento de conejo. C, control de complemento; IA, suero inmune paciente A; IB, suero inmune paciente B. 6.3. Impacto de la vacunación con la VCN13 en la colonización de S. aureus Previamente en esta Memoria se comentó acerca de la cocolonización por S. aureus y S. pneumoniae. Desde la introducción de la VCN7 se han publicado estudios epi- demiológicos que mostraron una relación negativa entre serotipos VCN7 y S. aureus, describiéndose una disminución por serotipos vacunales de S. pneumoniae y un au- mento de la colonización por S. aureus (Regev-Yochay et al., 2004, Spijkerman et al., 2012, Chien et al., 2013, Dunne et al., 2013). Por otro lado, han aparecido estudios RESULTADOS 208 mostrando que la vacunación frente a neumococo no modificaba la colonización de la nasofaringe de S. aureus en la población vacunada (Cohen et al., 2007, Lee et al., 2009). También se han publicado estudios observando que la implantación de la VCN13 en niños disminuyó la colonización por S. aureus no sólo de la nasofaringe sino también del oído medio (Leach et al., 2016). Debido a estos resultados contradictorios, se analizó si VCN13 tendría efecto sobre los biofilms de S. aureus, que pudieran asociarse a la colonización. Se observó que la vacunación con VCN13 no redujo el biofilm monoespecífico de S. aureus, ya que el suero inmune post VCN13 no afectaba al biofilm de S. aureus (Figura 79). Además, se probó si este suero inmune afectaba a S. aureus y a S. pneumoniae cuando se encontraban formando un biofilm mixto, utilizando el sistema SARM:Sp 1:11 donde ambas poblaciones de patógenos son similares a las 5 h de formación del biofilm mixto. Además, este biofilm mixto está formado por una cepa de S. pneumoniae 19A, serotipo incluido en la VCN13. Como se observa en la Figura 80, el suero inmune VCN13 no aumentó la fagocitosis de la población de S. aureus en el biofilm mixto, pero sí que hubo una reducción de la viabilidad de, aproximadamente, el 60% de S. pneumoniae 19A en el biofilm mixto, similares a lo observado en el biofilm individual (Figura 77). Estos resultados indican que la vacunación con VCN13 reduce el biofilm monoespecie de S. pneumoniae 19A (Figura 77) pero también el biofilm de neumo- coco cuando forma un biofilm mixto con S. aureus, sin afectar a la población de S. aureus (Figura 80). RESULTADOS 209 Figura 79. Opsonofagocitosis del biofilm monoespecífico de S. aureus con sueros pre e inmu- nes VCN13. Los sueros inmunes de los sujetos vacunados se inactivaron y se añadió una fuente de complemento de conejo. Figura 80. Opsonofagocitosis del biofilm mixto SARM:Sp 1:1 con sueros pre e inmunes VCN13. Los sueros de los pacientes se inactivaron y se añadió una fuente de complemento de conejo. Las barras rojas con patrón representan a S. aureus y las barras verdes a S. pneu- moniae. V. DISCUSIÓN DISCUSIÓN 213 1. RELEVANCIA CLÍNICA Y EPIDEMIOLOGÍA DE LOS SEROTIPOS 22F Y 33F INCLUIDOS EN LAS NUEVAS VACUNAS NEUMOCÓCICAS CONJUGADAS La efectividad de las actuales vacunas conjugadas frente a los serotipos que se in- cluyen en las mismas ha sido más que demostrada, disminuyendo la carga de enfer- medad neumocócica producida por estos serotipos (Liñares et al., 2010, Ladhani et al., 2013, Mackenzie et al., 2016, Ladhani et al., 2018, de Miguel et al., 2020). Sin embargo, desde la introducción de estas vacunas conjugadas, se ha producido el fenómeno denominado como reemplazo de serotipos (Weinberger et al., 2011), y muchos países han notificado un incremento de casos ENI por serotipos no vacuna- les en los últimos años (Feikin et al., 2013, Savulescu et al., 2017, Ladhani et al., 2018, Lewnard y Hanage, 2019, de Miguel et al., 2020, Ouldali et al., 2021). Este es el caso de los serotipos 22F y 33F en diferentes países, que han mostrado un au- mento de casos por ambos serotipos tanto en niños como en adultos después de la introducción de la VCN13 (Kaplan et al., 2013, Pichon et al., 2013, Moore et al., 2015, Golden et al., 2016, Balsells et al., 2017, Cui et al., 2017, Golden et al., 2021, Amin- Chowdhury et al., 2021). Estos serotipos también tienen importancia en términos de años de vida ajustados por calidad (QALY), ya que produjeron la principal pérdida de QALY en niños entre todos los serotipos no-VCN13 (van Hoek et al., 2012). En España, hasta el último año preSARS-CoV-2 (2019), los datos muestran un incre- mento de casos ENI por los serotipos 22F y 33F, siendo significativo sólo en adultos, mientras que, en la población pediátrica, aunque se aprecia también un aumento, no es estadísticamente significativo para ninguno de los dos serotipos. Resulta intere- sante que el serotipo 22F en adultos no sólo ha aumentado significativamente en adultos ≥ 65 años, sino que también lo ha hecho en el grupo de edad de hasta 64 años, mientras que, para el serotipo 33F, el aumento de casos sólo es significativo en la población ≥ 65 años. El hecho de que el serotipo 22F esté siendo capaz de producir ENI en adultos independientemente de la edad puede explicar por qué el aumento de este serotipo está teniendo un mayor impacto que el del 33F en otros países (Golden et al., 2016, Ladhani et al., 2018). En Reino Unido, los casos por serotipos 22F y 33F aumentaron rápidamente al introducir la VCN7 y VCN13, repre- sentando actualmente el 7% y 3.5% del total de casos de ENI, respectivamente (Amin-Chowdhury et al., 2021). La mayor carga de enfermedad se producía en adul- DISCUSIÓN 214 tos ≥ 65 años, similar a los datos que hemos obtenido en España, y de hecho, obser- varon que dos tercios de los casos se producían en pacientes con otras comorbilida- des como enfermedades respiratorias crónicas (Amin-Chowdhury et al., 2021). Otros países europeos con diferentes pautas vacunales, han reportado una mayor carga de enfermedad en ENI por estos dos serotipos en niños y adultos (Balsells et al., 2017, Levy et al., 2019). En EE. UU., que tiene implementada una pauta vacunal 3 + 1 para la VCN13 en niños, los serotipos 22F y 33F fueron los principales serotipos no-VCN13 causando ENI en niños < 5 años y adultos ≥ 65 años (Gonzalez et al., 2006, Jacobs et al., 2008, Pilishvili et al., 2010, Moore et al., 2015). Todos estos ha- llazgos confirman que sigue siendo necesaria la vigilancia activa de ambos serotipos para conocer el futuro impacto que pueden tener la implantación de VCN15 y VCN20 en los calendarios vacunales. Desde la llegada de la pandemia producida por el virus respiratorio SARS-CoV-2, la incidencia de otros patógenos como S. pneumoniae ha disminuido notablemente, ha- biéndose observado una caída importante en la incidencia de ENI en muchos países (Casanova et al., 2021, Brueggemann et al., 2021). Por ello es interesante analizar cómo las medidas frente al SARS-CoV-2 han afectado a la epidemiología de la ENI. Ya se conoce que S. pneumoniae puede coinfectar a pacientes con COVID-19 (mo- derado o severo) (Soto et al., 2021, Cohen et al., 2021) pero, apenas hay datos re- cientes de cómo ha afectado a la ENI en diferentes países. En los serotipos 22F y 33F hemos visto una caída significativa en la incidencia de ambos serotipos en po- blación pediátrica y adulta al comparar 2020 vs. 2017–2019 y esta tendencia descen- dente de casos se podría seguir observando en 2021 donde sólo se disponían de datos epidemiológicos del primer semestre. Aun así, dentro del total de casos de ENI, el porcentaje de ambos serotipos en las diferentes poblaciones se mantiene, por lo que una vuelta a la normalidad cuando ya no se apliquen medidas no farmacológicas como distancia social, uso de mascarilla, etc., podría implicar de nuevo un aumento de casos ENI causados por estos dos serotipos incluidos en las futuras vacunas VCN15 y VCN20. La diseminación de clones de neumococo en la población implica el aumento de ge- notipos hipervirulentos o asociados a resistencia antibiótica que puede llevar a la ex- pansión de ciertos serotipos y genotipos (Brueggemann y Spratt, 2003, Ardanuy et al., 2014, Aguinagalde et al., 2015, Azarian et al., 2018). Nuestros datos sobre los DISCUSIÓN 215 clones circulantes de ambos serotipos, demuestran que el genotipo ST433 es la causa más frecuente de ENI en aislados clínicos del serotipo 22F. Esto es consistente con los datos de otros países, como en Canadá, donde más del 90% de casos del serotipo 22F pertenecen al ST433 (Golden et al., 2021) y en Reino Unido donde se observa una situación similar (Amin-Chowdhury et al., 2021). A pesar de esto, los datos con las cepas de nuestro estudio muestran menos clonalidad en este serotipo que la encontrada en estudios previos (Golden et al., 2016, Golden et al., 2021). Estos resultados contrastan con un estudio en Brasil donde solo se encontró el clon ST6403, no relacionado con el ST433, como único causante de casos del serotipo 22F (Christophe et al., 2018). Para el serotipo 33F, se encontraron cinco genotipos diferentes pero la mayoría pertenecientes al CC717, siendo por lo tanto muy clonal, algo parecido a la situación de Reino Unido (Amin-Chowdhury et al., 2021). En Ca- nadá se observó otra situación diferente, donde el ST100 era el más predominante y encontraron que el serotipo 33F era muy poco clonal y, por tanto, más diverso (Golden et al., 2016, Golden et al., 2021). Esto demuestra la existencia de diferencias geográficas respecto a la clonalidad de los serotipos de S. pneumoniae. Como ya previamente se había mencionado en esta Memoria, la formación de biofilm es una buena herramienta para predecir el impacto clínico y la emergencia de nuevos serotipos con capacidad de colonizar la nasofaringe después de la introducción de las nuevas vacunas (Domenech et al., 2014, Domenech et al., 2015). En este sentido, se ha observado que el serotipo 19A era muy buen formador de biofilm y tenía una capacidad muy elevada para colonizar la nasofaringe (Domenech et al., 2014). Esta habilidad de formar biofilms densos puede contribuir a la patogénesis del serotipo 19A y podría explicar por qué es uno de los serotipos más predominantes a pesar de estar incluido en la VCN13 (Domenech et al., 2014, Ladhani et al., 2018, de Miguel et al., 2020). Esto mismo podría explicar el incremento del serotipo 11A, un serotipo buen formador de biofilm y asociado a resistencia antibiótica (Domenech et al., 2015, Aguinagalde et al., 2015). Aun así, serotipos que forman un biofilm intermedio/malo como los serotipos 3 y 8, siguen siendo de los principales causantes de ENI, siendo el serotipo 8 el más predominante en Europa y el primero en población adulta en España (de Miguel et al., 2020). Los serotipos 22F y 33F también contribuyen a la ENI (Golden et al., 2021, Amin-Chowdhury et al., 2021), a pesar de ser malos forma- dores de biofilm (Domenech et al., 2015). Estos resultados, sugieren que la formación DISCUSIÓN 216 de biofilm no es el único factor a tener en cuenta cuando se pretende determinar el impacto clínico de los serotipos y su contribución en la incidencia de la ENI. Como se había observado previamente (Domenech et al., 2015), los serotipos 22F y 33F, que se encuentran colonizando y produciendo ENI y pueden ser altamente in- vasivos, produjeron muy poca cantidad de biofilm in vitro. Se determinó la capacidad de formación de biofilms en aislados clínicos de ambos serotipos, obteniendo en la mayoría de los casos un biofilm débil, en concordancia con las observaciones previas con transformantes isogénicos 22F y 33F (Domenech et al., 2015). Además, este fenotipo de mal formador de biofilm no explica el aumento del 22F y 33F en la ENI. Sin embargo, teniendo en cuenta que la colonización de la nasofaringe es un proceso multifactorial y que hay numerosos factores de virulencia que contribuyen a la pato- génesis en la ENI, puede ser que otros factores de virulencia y no exclusivamente la formación de biofilms tengan un papel predominante en el estado de portador de los serotipos 22F y 33F (Geno et al., 2015). El CPS determina la carga neta de la super- ficie de neumococo, y este también es un aspecto a tener en cuenta en la coloniza- ción, ya que cargas netas negativas se asocian a una mejor colonización (Weinberger et al., 2009). La mayor parte de CPSs de neumococo son aniónicas y tienen una carga neta negativa (Geno et al., 2015, Morais et al., 2018). Esta carga anionica evita el aclaramiento de neumococo por el mucus y ayuda a repeler la fagocitosis. Como ejemplo ilustrativo, el serotipo 19A tiene una carga-negativa, es buen colonizador (Adler et al., 2019), forma buen biofilm (Domenech et al., 2014) y es uno de los prin- cipales serotipos VCN13 causantes de ENI (de Miguel et al., 2020). Hay CPSs con carga negativa que forman buen biofilm además del 19A, como el 35B y otros que forman mal biofilm, como el 24F (Domenech et al., 2015). El fenómeno de carga ne- gativa y cómo contribuye a la colonización y a evitar el aclaramiento por el mucus podría explicar por qué el serotipo 22F es más prevalente en la población que el 33F, ya que su carga neta de superficie es negativa en el caso del serotipo 22F mientras que la del CPS 33F es neutra (Geno et al., 2015). Estas diferencias podrían explicar también que el serotipo 22F sea mejor colonizador y favorezca el que se produzcan mayores tasas de enfermedad. Respecto a la formación de biofilms en aislados clínicos, la heterogeneidad encon- trada entre los diferentes aislados clínicos no es una sorpresa, ya que confirma evi- dencias previas sobre que el fondo genético, y no sólo el CPS, modula la adhesión DISCUSIÓN 217 de neumococo y la formación de biofilm sobre superficies artificiales (Moscoso et al., 2006, Domenech et al., 2009, Domenech et al., 2014). La novedad de los resultados obtenidos se correlaciona con el fenotipo diferencial encontrado entre los biofilms de aislados pediátricos y los formados por aislados de adultos, específicamente la mayor capacidad de formar biofilm de los aislados pediátricos. Estos resultados son compa- tibles con el hecho de que la población pediátrica es el principal portador de neumo- coco con una colonización asintomática del 20–40% (Chaguza et al., 2020), sugi- riendo que neumococo puede modular su interacción con el epitelio nasofaríngeo mediante un mecanismo relacionado con el incremento de la activación de factores intrínsecos asociados a la formación de biofilm. El origen pediátrico o adulto de la cepa no es la única diferencia entre los fenotipos de estos aislados y, aunque el ge- notipo no aclaró nuestros resultados (pendiente de un análisis más profundo utili- zando datos de secuenciación masiva que se están analizando actualmente), otros factores no relacionados podrían estar afectando a este fenotipo. Dentro de los aislados clínicos de serotipos 22F y 33F, se escogieron los que proce- dían de sangre para estudiar más a fondo sus mecanismos de patogenicidad. El cre- cimiento in vitro en neumococo es muy importante y se ha relacionado con su preva- lencia en modelos murinos in vivo (Bättig et al., 2006). Uno de los determinantes de este crecimiento in vitro es la producción del CPS, ya que interfiere con el crecimiento de neumococo y se ve especialmente afectado en condiciones limitantes de nutrien- tes (Hathaway et al., 2012). Por lo tanto, uno de los determinantes del crecimiento será el serotipo capsular de S. pneumoniae. En nuestro caso, se incluyeron aislados de dos serotipos diferentes, pero comparando entre aislados pediátricos o adultos del mismo serotipo, por lo que el CPS no debería ser crítico en las diferencias, y ya pre- viamente se ha observado que los aislados de neumococo pueden mostrar variacio- nes en las que la producción del CPS no es el factor diferencial (Tóthpál et al., 2019). En esta Memoria se observó que los aislados de adultos mostraban un comporta- miento diferencial respecto a los pediátricos. En concreto, el aislado 22F de adulto mostraba una fase estacionaria anormalmente larga, que podría asemejarse a lo ob- servado en mutantes deficientes en LytA o en el sistema de dos componentes CiaRH (Moscoso et al., 2010). Este fenotipo va a ser estudiado más a fondo con los datos de secuenciación masiva obtenidos y en los que se está trabajando actualmente. Aun así, este patrón anómalo de crecimiento no afectó a su virulencia ya que no se ob- DISCUSIÓN 218 servaron diferencias respecto al aislado pediátrico ni en la evasión de la opsonofago- citosis ni en la virulencia en el modelo murino de sepsis. Por otro lado, se observó que la fase exponencial del aislado 33F adulto, empieza más tarde que el resto de aislados clínicos y su pareja pediátrica y la OD550 alcanzada es menor. Esto se co- rresponde con una menor evasión de la opsonofagocitosis cuando crece en estado planctónico, un mayor depósito del componente C3 del complemento y una menor virulencia en el modelo animal. Estos hallazgos confirman resultados previos en los que el crecimiento in vitro se correlacionaba con la virulencia en un modelo animal de ratón (Bättig et al., 2006, Hathaway et al., 2012). Respecto a los transformantes isogénicos 22F (P244) y 33F (P017), se pudo observar un mayor crecimiento in vitro cuando la cepa M11 expresaba el CPS 22F que cuando expresaba el CPS 33F. El mayor impacto en virulencia del serotipo 22F también se explica por presentar una mejor evasión de la opsonofagocitosis por parte del transformante 22F, un menor depósito del componente C3 del complemento y una mayor virulencia en el modelo animal de ratón. Todo esto es consistente con los datos epidemiológicos presentados en nuestro estudio mostrando una mayor carga en la enfermedad del serotipo 22F y podría explicar por qué este serotipo también es más prevalente que el 33F en otros países (Moore et al., 2015, Golden et al., 2016, Ladhani et al., 2018). La resolución de la ENI depende del reconocimiento y aclaramiento de S. pneumo- niae por fagocitos profesionales (Standish y Weiser, 2009, van der Poll y Opal, 2009). Como ya se mencionó previamente, el CPS de neumococo es el factor de virulencia más importante a la hora de estudiar la evasión de la fagocitosis, pero el fondo gené- tico también contribuye significativamente al proceso de patogénesis (Hyams et al., 2011, McAllister et al., 2011). El uso de transformantes isogénicos con el mismo fondo genético es útil a la hora de realizar comparaciones ya que se evitan las diferencias observadas en cada aislado clínico (Domenech et al., 2015). Para analizar la influen- cia del CPS en la evasión del sistema inmune, es necesario el uso de cepas con el mismo fondo genético. Nuestro estudio con los transformantes isogénicos de seroti- pos incluidos en la VCN13 o los que están incluidos en las nuevas vacunas VCN15 y VCN20 así como serotipos no vacunales mostró que la cepa expresando el CPS del tipo 3 era más resistente a la opsonofagocitosis que la cepa expresando la cápsula del serotipo 19A. Esto es interesante porque el serotipo 3 sigue siendo uno de los principales causantes de ENI en adultos (Moore et al., 2015, Ladhani et al., 2018, de DISCUSIÓN 219 Miguel et al., 2020). Esta mayor resistencia puede deberse a que la cápsula del se- rotipo 3 tiene un mayor tamaño y los aislados de este serotipo suelen sintetizar mayor cantidad de CPS (Choi et al., 2016). Además, este serotipo tiene la capacidad de liberar CPS libre al medio interfiriendo, entre otras cosas, con la fagocitosis (Choi et al., 2016). Los serotipos 8 y 11A también destacaron—ambos incluidos en la VCN20 pero también en la PPV23 y con una alta prevalencia en la ENI— en particular des- tacando el serotipo 8 ya que es la primera causa de ENI en adultos en España (de Miguel et al., 2020). Además, ni el serotipo 8 ni el 11A fueron más resistentes a la fagocitosis al formar biofilm, pudiendo deberse a que no necesitan la ventaja que otorga esta estrategia para evadir la fagocitosis. La formación de biofilm es un estado crítico en la patogénesis de S. pneumoniae. Estudios previos han identificado la presencia de biofilms en el tracto respiratorio su- perior (Wu et al., 2017, Iverson et al., 2019, Silva y Sillankorva, 2019) relacionados con la colonización nasofaríngea que es un prerrequisito para el desarrollo de ENI (Bogaert et al., 2004). Es también interesante que los biofilms están implicados en infecciones activas como la meningitis, uniéndose a las células endoteliales micro- vasculares del cerebro y también en enfermedades respiratorias persistentes en pa- cientes con fibrosis quística o EPOC (Orihuela et al., 2009, Vidal et al., 2013, Vandevelde et al., 2014, Dennis et al., 2018). En estado de biofilm, las células de S. pneumoniae expresan mayor cantidad de PspC, uno de los ligandos del regulador negativo del complemento factor H, y por lo tanto, degrada el C3 depositado sobre la superficie bacteriana con mayor eficiencia (Domenech et al., 2013). Esta mayor ex- presión de PspC es interesante en términos de virulencia porque favorecen el desa- rrollo de ENI (Yuste et al., 2010). Respecto a los transformantes isogénicos en estado de biofilm, los serotipos 3, 11A y 24F fueron los más refractarios a la fagocitosis. Los serotipos 3 y 11A son de los más frecuentes en pacientes con EPOC (Shoji et al., 2018), que suelen sufrir recidivas por diferentes patógenos, entre ellos S. pneumo- niae, y podría deberse a la formación de biofilm por estos patógenos (Weeks et al., 2021). Adicionalmente, el serotipo 24F tiene tendencia a causar meningitis y producir cuadros clínicos graves (Balsells et al., 2018), pudiendo preocupar esta evasión del sistema inmune incrementada cuando forma biofilm. Finalmente, en esta Tesis se confirma la mayor evasión del sistema inmune de los biofilms de S. pneumoniae res- pecto al cultivo planctónico (Domenech et al., 2013), ya que se ha observado este DISCUSIÓN 220 fenómeno por parte tanto de cepas capsuladas de diferentes serotipos como de ais- lados clínicos de los serotipos 22F y 33F. El repertorio de receptores celulares involucrados en la fagocitosis de patógenos in- vasivos como S. pneumoniae y su correcto funcionamiento es crítico para el desen- lace de la infección. El receptor de leucocitos PSGL-1 juega un papel importante en la defensa del hospedador frente a la infección neumocócica (Ramos-Sevillano et al., 2016). Debido al reconocimiento por PSGL-1, las células neumocócicas son fagoci- tadas de manera correcta y eliminadas intracelularmente, reduciendo la carga bacte- riana y la diseminación en el hospedador, lo que contribuye a un mayor control en la severidad de la ENI (Ramos-Sevillano et al., 2016). Los resultados de este capítulo muestran que el receptor PSGL-1 es importante en la fagocitosis de diferentes sero- tipos, incluyendo los incluidos en las nuevas vacunas VCN15 y VCN20. Sin embargo, no se observó este aumento de la viabilidad en los serotipos 11A y 24F ya que, las células que expresaron PSGL-1, no eliminaron de manera eficiente estos serotipos. Esto sugiere que los CPS de ambos serotipos tendrán una capacidad incrementada de producir ENI, y concuerda con los datos que muestran una fatalidad elevada por ambos serotipos, con un 21 % el serotipo 11A y un 22.7% el serotipo 24F en la C. A. de Madrid (De Miguel et al., 2021). Además, también es consistente con la emergen- cia de variantes resistentes a amoxicilina del serotipo 11A con el genotipo ST6521 que evaden de manera eficiente el proceso de fagocitosis y forman buen biofilm (Aguinagalde et al., 2015) y con las infecciones severas que pueden llegar a causar los neumococos del serotipo 24F (Balsells et al., 2018). Los resultados de este capítulo pueden ser relevantes a la hora de entender aspectos críticos de la patogénesis de diferentes serotipos prevalentes como los cubiertos por las nuevas vacunas VCN15 y VCN20. Además, se refuerza la importancia de los es- tudios de vigilancia y caracterización de aislados de neumococo emergentes, para poder explicar cuáles son las posibles causas que favorecen la expansión y mayor diseminación de diferentes serotipos y genotipos. DISCUSIÓN 221 2. EVOLUCIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A CEFDITOREN Y OTROS ANTIBIÓ- TICOS EN AISLADOS CLÍNICOS DE S. PNEUMONIAE EN ESPAÑA DURANTE EL PERIODO 2004–2020 El empleo de tratamientos efectivos frente a las enfermedades infecciosas ha sido uno de los mayores retos de la humanidad. Antes del descubrimiento del primer an- tibiótico se disponía de pocas armas para combatir a los agentes infecciosos, siendo la utilización de terapias basadas en anticuerpos una de las primeras estrategias (Casadevall, 1996). La sueroterapia se utilizó frente a numerosas infecciones, inclu- yendo las producidas por S. pneumoniae (Casadevall y Scharff, 1995), consiguiendo reducir hasta en un 50% la mortalidad de la infección (Casadevall y Scharff, 1994). Sin embargo, la clave de la lucha frente a la enfermedad neumocócica fue la quimio- terapia antibiótica, que surgió en la década de los 30 del pasado siglo, desapare- ciendo la sueroterapia. Sin embargo, la efectividad de esta quimioterapia antibiótica se vio mermada por la aparición de aislados clínicos resistentes, surgiendo de hecho, al poco tiempo del uso generalizado de antibióticos (Spagnolo et al., 2021). En el caso de S. pneumoniae, el uso de estrategias profilácticas basadas en la inmuniza- ción parece ser la mejor medida para el control del desarrollo de la ENI y neumonía, además de reducir el impacto de la resistencia a antibióticos (Lipsitch y Siber, 2016, Atkins et al., 2018). Aunque el uso de los antibióticos disponibles es la opción prefe- rente para tratar las infecciones neumocócicas una vez están establecidas, la apari- ción de cepas multirresistentes puede agravar el desenlace de la infección, en mu- chos casos (Ardanuy et al., 2014, Aguinagalde et al., 2015, Azarian et al., 2018). La prevalencia de la resistencia a antibióticos en S. pneumoniae aumentó global- mente en la era preVCN y, a pesar de las vacunas actuales, el aumento de serotipos asociados a resistencia a antibióticos es un fenómeno preocupante (Fenoll et al., 2009, Aguinagalde et al., 2015, Cassiolato et al., 2018). Estos patrones de resistencia frente a los antibióticos varían dependiendo del serotipo y las regiones geográficas, ya que varios factores pueden influir en la aparición y aumento de cepas resistentes entre los que se encuentran: ratios de vacunación bajos, el fenómeno de reemplazo de serotipos por serotipos no vacunales y el uso inadecuado de antibióticos (Reinert, 2009, Song et al., 2012, Chávez et al., 2021). DISCUSIÓN 222 En este capítulo se investigaron los patrones de resistencia de S. pneumoniae a una amplia variedad de antibióticos incluyendo penicilinas, cefalosporinas, macrólidos y fluoroquinolonas. Además, se analizaron estos patrones de resistencia según el ori- gen del aislado y se observó la evolución según serotipos incluidos en vacunas con- jugadas o no. Uno de los mayores problemas del patógeno S. pneumoniae es la apa- rición de cepas resistentes a penicilina que contienen mutaciones en las PBPs, dis- minuyendo la actividad intrínseca de muchos β-lactámicos incluyendo penicilinas y cefalosporinas (Nagai et al., 2002). Como se comentó en Resultados, el cefditoren fue el antibiótico con la mayor proporción de aislados susceptibles (con más del 80% de los aislados susceptibles a este antimicrobiano durante el periodo estudiado). Ya previamente se había demostrado que esta cefalosporina mantiene una buena acti- vidad frente a cepas no susceptibles a penicilina debido a una gran afinidad por la PBP2x, por lo que su actividad antimicrobiana se ve aumentada y por eso se obser- varon valores de CMI50 y CMI90 bajos y estables (0.5 y 1 µg/ml en los aislados clínicos analizados en esta Tesis Doctoral) (Yamada et al., 2007, Yang et al., 2012). Anali- zando los 16 años que abarca el estudio, se confirmó que el cefditoren fue la cefa- losporina oral con las CMI50 y CMI90 más bajas, desde su introducción en 2004 y a pesar de su amplio uso en la práctica clínica, la aparición de cepas no susceptibles a este antibiótico es muy baja. En cambio, la cefixima y cefpodoxima, dos cefalospori- nas orales de tercera generación, fueron de los antibióticos con menor proporción de cepas susceptibles durante el periodo de estudio. De todos los antibióticos analizados en los 16 años del estudio, el cefditoren seguido de cefotaxima fueron los fármacos con mayor actividad antimicrobiana, independien- temente del origen del aislado clínico. Esto es importante a la hora de tratar una in- fección neumocócica, ya que el cefditoren está indicado en el tratamiento de la neu- monía adquirida en comunidad (Granizo et al., 2006, Di Marco et al., 2014) y puede ser usado como tratamiento oral tras la administración parental de cefalosporinas de tercera generación como cefotaxima o ceftriaxona (Monmaturapoj et al., 2012). Esto también resulta interesante porque se ha demostrado que un cambio temprano de terapia intravenosa a terapia oral de antibióticos en pacientes con neumonía severa adquirida en comunidad, es más seguro y disminuye el tiempo de hospitalización (Mandell et al., 2007), y es recomendado por diferentes organismos como la Infec- tious Diseases society of America (IDSA) y la American Thoracic Society (ATS). En este sentido, el cefditoren ha sido el candidato recomendado como la opción más DISCUSIÓN 223 adecuada en este cambio temprano de terapia intravenosa con cefalosporinas de tercera generación a terapia oral, ya que tiene un espectro de acción similar y la ac- tividad intrínseca es mayor (Blasi et al., 2016). Este cambio no sólo va a beneficiar al paciente, sino que va a tener implicaciones económicas en los sistemas de salud ya que no sólo reduce el tiempo y el coste de hospitalizaciones, sino que reduce el riesgo de adquirir infecciones intrahospitalarias, uno de los mayores problemas sanitarios hoy en día. Es interesante tener en cuenta que la manera de interactuar de los antibióticos con la bacteria in vivo es más compleja que cuando se ensayan en condiciones in vitro, debido a la presencia de las proteínas séricas. Previamente, se ha demostrado que la actividad del cefditoren a concentraciones fisiológicas y bajo condiciones de unión a proteínas similares a las encontradas en humanos, no se veía afectada, sugiriendo que, en modelos in vivo, no se debilitaba la actividad antineumocócica de esta cefa- losporina (Sevillano et al., 2007, Sevillano et al., 2008). Posteriormente, se demostró que concentraciones subinhibitorias de cefditoren en presencia de sueros hiperinmu- nes (que contenían anticuerpos específicos frente a cepas resistentes a antibióticos) estimulaban la inmunidad mediada por el sistema del complemento (Ramos-Sevillano et al., 2012). Este efecto está relacionado con un aumento del depósito de C1q y reconocimiento por la pentraxina CRP, que tiene consecuencias funcionales en tér- minos de opsonización por el componente C3b. Además, estos hallazgos explican por qué también se veía aumentada la fagocitosis en presencia de suero y concen- traciones subinhibitorias de antibióticos β-lactámicos (Ramos-Sevillano et al., 2012). Este efecto inmunomodulador producido por ciertos antibióticos, que provoca un au- mento de la respuesta inmune del hospedador, es una estrategia alternativa y pro- metedora a la hora de luchar frente a cepas multirresistentes en la práctica clínica (Domenech et al., 2018). Otro aspecto de interés del estudio consistió en evaluar el impacto de la vacunación en la evolución de aislados de neumococo con susceptibilidad reducida a los diferen- tes antibióticos. Las medidas preventivas frente a la infección producida por S. pneu- moniae han modificado las resistencias de este patógeno. La VCN7, que incluía los CPS de los principales serotipos responsables de ENI y tenían la mayor carga de aislados no susceptibles a penicilina, eritromicina o ambos, se licenció a principios del presente siglo para la inmunización de la población infantil. El uso generalizado DISCUSIÓN 224 de esta vacuna conjugada llevó a una disminución drástica de la incidencia de la ENI causada por los serotipos vacunales y redujo la prevalencia creciente de serotipos de neumococo no susceptibles a PEN. Además, el uso de esta vacuna en la pobla- ción pediátrica hizo que la población adulta se beneficiara también, teniendo un efecto en la epidemiología de los aislados clínicos de adulto (Fenoll et al., 2009). A pesar de que la introducción de estas vacunas conjugadas redujo claramente los casos de ENI por los serotipos vacunales y ayudó a controlar la diseminación de cepas multirresis- tentes, muchos países han notificado el fenómeno de reemplazo de serotipos inclu- yendo serotipos asociados a multirresistencia (Ladhani et al., 2018, Cassiolato et al., 2018, de Miguel et al., 2020, Ouldali et al., 2021). De todos los antibióticos del estudio, el aumento de serotipos no-VCN13 asociados a susceptibilidad reducida (I/R) en el periodo estudiado fue mucho menor en el caso del cefditoren (<13%). Esto es impor- tante epidemiológicamente y en la práctica clínica. Sin embargo, resulta preocupante que la mayoría de antibióticos estudiados incluyendo cepas multirresistentes con baja susceptibilidad tanto a PEN como a ERY, haya una carga de enfermedad ascendente producida por serotipos no vacunales. Esta mayor incidencia de ENI por serotipos que no están cubiertos por la VCN13 se conseguirá paliar con la llegada de las nue- vas vacunas conjugadas de espectro más amplio como la VCN15 y VCN20 (Stacey et al., 2019, Hurley et al., 2020), pero al igual que sus predecesoras tendrá el incon- veniente de la cantidad limitada de serotipos que cubren y su efectividad se podrá ver amenazada, una vez más, por el reemplazo de serotipos (Weinberger et al., 2011). DISCUSIÓN 225 3. EPIDEMIOLOGÍA Y PATOGÉNESIS DE S. AUREUS SENSIBLE/RESISTENTE A METICILINA Durante esta Tesis se ha resaltado la importancia clínica de S. aureus. Aunque este patógeno pueda causar infecciones en el ámbito comunitario y tanto en niños como adultos previamente sanos, es un patógeno realmente importante en el ámbito de las infecciones intrahospitalarias. Estas infecciones son las adquiridas por el paciente durante el ingreso en una institución sanitaria y puede deberse a múltiples causas como complicaciones postquirúrgicas, transmisión entre pacientes y sanitarios, dis- positivos médicos implantados, etc. Estas infecciones adquiridas en el hospital supo- nen más de 2,5 millones de casos anuales en Europa (Cassini et al., 2016) y es uno de los principales problemas sanitarios de España, siendo los estafilococos los prin- cipales causantes de bacteriemias e infecciones quirúrgicas en los últimos años (RENAVE, 2021). En el caso de las infecciones producidas por S. aureus, estas patologías se agravan cuando los aislados son SARM, uno de los principales culpables de los brotes intra- hospitalarios en el mundo (Chambers y Deleo, 2009), aunque también se asocian con infecciones adquiridas en la comunidad (Faoagali et al., 1992, Fridkin et al., 2005) y relacionadas con el ganado (Voss et al., 2005). Uno de los principales problemas de estos aislados SARM es su capacidad para adquirir resistencia a muchos otros anti- bióticos alternativos, por lo que el tratamiento de la infección se complica notable- mente (Rodvold y McConeghy, 2014, Stryjewski y Corey, 2014). Un aspecto desta- cable en S. aureus es su gran adaptación al huésped y la posibilidad de adquirir me- canismos de resistencia a los nuevos antimicrobianos, lo que obliga a que sea nece- sario establecer sistemas eficaces de vigilancia de la resistencia frente a los diferen- tes antimicrobianos. Al comparar los datos de los aislados de S. aureus recibidos en el LIH del CNM con los datos del estudio RENAVE se pudo observar que la proporción de aislados de S. aureus de origen comunitario notificados al estudio RENAVE es mayor (56–57% de aislados comunitarios vs. 42–24% de aislados intrahospitalarios) en los años 2018 y 2019 que la proporción en los aislados recibidos en el LIH del CNM (37–40% de asi- lados comunitarios vs. 60–62% de aislados intrahospitalarios). Estos resultados con- DISCUSIÓN 226 firman la importancia clínica de S. aureus y otros estafilococos asociados a infeccio- nes intrahospitalarias. Esta variación también se observó con aislados SASM o SARM, ya que la proporción publicada en la red RENAVE indica una mayoría de aislados SASM intrahospitalarios (64%), si se comparan con los aislados caracteri- zados en el CNM donde se recibieron una proporción bastante similar de aislados SASM (50–58%) y SARM (42–50%). Una posible explicación a esta diferencia entre los datos de la red RENAVE y los aislados caracterizados en el CNM sería que las cepas enviadas al CNM suelen ser de pacientes con las patologías más graves y, por tanto, asociadas a una mayor expresión de toxinas y factores de virulencia que son aspectos que no suelen caracterizarse en los hospitales de origen. En los datos procedentes del último estudio RENAVE de infecciones intrahospitala- rias (RENAVE, 2021), los aislados de S. aureus procedían según planta o unidad asistencial: 1º quirúrgica, 2º médica, 3º mixta y 4º cuidados intensivos (UCI). Esto último podría explicar por qué el impacto de la pandemia producida por SARS-CoV- 2 no ha sido tan grande en el número de aislados clínicos recibidos, ya que este patógeno sigue siendo relevante en las infecciones intrahospitalarias y las hospitali- zaciones y uso de UCIs en 2020 se intensificó debido al SARS-CoV-2 (Pollán et al., 2020). Respecto a la situación mundial, las cepas SARM son muy prevalentes en los hospi- tales en casi todos los países (Stefani et al., 2012). Aunque muchas veces los datos epidemiológicos difieren según el diseño y tipo de estudio y la muestra de población, se han observado mayores proporciones de SARM asociado a hospitales (SARM- AH) (>50%) en América del Norte y América del Sur, algunos países asiáticos y Malta (Mejía et al., 2010, Song et al., 2011, Stefani et al., 2012). En China, Australia, África y algunos países europeos es frecuente encontrar una situación intermedia (25–50%) como, por ejemplo, en Portugal (49%), Grecia (40%) o Italia (37%) (Grundmann et al., 2010, Stefani et al., 2012). En esta última situación se encontraría España, con aproximadamente un 30% de aislados SARM dentro de los aislados intrahospitala- rios, si se tiene en cuenta los datos del estudio RENAVE. Considerando los aislados recibidos en el CNM, la situación de España sería más parecida a la de Portugal y Grecia, con, aproximadamente, el 40–49% de aislados SARM procedentes del ám- bito hospitalario. DISCUSIÓN 227 Además de la existencia o no de resistencia a antibióticos, uno de los principales problemas con los estafilococos y, en especial, con S. aureus es la formación de biofilms. S. aureus es un patógeno oportunista que puede producir biofilms robustos tanto en superficies bióticas como abióticas. Uno de los factores principales de la patogénesis de S. aureus es el cambio de estado planctónico a biofilm para causar diferentes enfermedades como endocarditis, osteomielitis e infecciones en prótesis (Vestby et al., 2020, Schilcher y Horswill, 2020). Entre los principales problemas aso- ciados a estos biofilms destacan una elevada evasión del sistema inmune y una ma- yor resistencia a los antibióticos debido, seguramente, a la baja actividad metabólica dentro del biofilm y a la existencia de células persistentes (Hogan y Kolter, 2002, Schilcher y Horswill, 2020). La regulación y composición del biofilm de S. aureus son complejos; los procesos de formación y disgregación del biofilm están controlados de forma sutil por diferentes sistemas de regulación que dependen de la fisiología de la célula, factores ambien- tales y dinámicos dentro del propio biofilm (Schilcher y Horswill, 2020). Además, esta regulación también depende de la composición del biofilm. En este sentido, es común encontrar biofilms que son más dependientes de polisacárido y que, por tanto, ten- drán como componente clave el exopolisacárido PIA o PNAG (ica-dependientes) que está regulado por el operón ica (Cramton et al., 1999) y su regulador principal, el represor IcaR (Jefferson et al., 2004). También existen biofilms basados de forma mayoritaria en componentes proteicos (ica-independientes) que están más asociados a aislados SARM, siendo la proteína de superficie Bap su principal componente (Cucarella et al., 2001, Cucarella et al., 2004), pudiendo formar estructuras amiloides que promueven la formación de biofilm (Taglialegna et al., 2016). Por último, se ha observado recientemente la importancia del ADNe en la formación del biofilm estafi- locócico (Sugimoto et al., 2018), denominando incluso un último grupo de biofilms en las que sus EPS se basan mayoritariamente en ADN. Además, el ADNe parece im- portante a la hora de mantener los biofilms estafilocócicos maduros, demostrando su importancia como componente estructural de los mismos (Mann et al., 2009). Se ha observado que el ADNe puede interaccionar mediante cargas electroestáticas con proteínas celulares produciendo un efecto de moonlight (un efecto de protección me- diante recubrimiento) en la matriz del biofilm (Kavanaugh et al., 2019). Dentro de estas proteínas se observó que factores de virulencia secretados y proteínas riboso- males están atrapadas en la matriz del biofilm contribuyendo a su estabilización (Graf DISCUSIÓN 228 et al., 2019). Este fue uno de los objetos de estudio de esta Memoria ya que, entre los factores de virulencia detectados, estaban las leucotoxinas (Graf et al., 2019). En esta Tesis se realizó un análisis de diferentes cepas en las que se estudió la capaci- dad de formación de biofilm de diversos aislados clínicos que expresaban distintas toxinas como ETA, ETB, PVL y TSST aunque no se observó un patrón claro. Nuestros resultados mostraron que todos los aislados que producían la leucotoxina PVL for- maron buen biofilm, lo que podría deberse a un efecto de moonlight por este factor de virulencia lo que ayudaría a estabilizar el biofilm maduro y, por tanto, se corres- pondería a lo descrito por Graf y colaboradores (Graf et al., 2019). A pesar de estas evidencias observadas, nuestro estudio tiene la limitación de tener un número pe- queño de aislados clínicos estudiados que presentasen esta toxina. Otro aspecto lla- mativo observado fue el patrón bimodal de buena o mala formación de biofilm de los aislados SASM y SARM capaces de producir ETA, por lo que se decidió estudiar más a fondo las matrices de estos biofilms, aspecto que se discutirá más adelante. Se evaluó la posible asociación entre la formación de biofilm y el serotipo capsular, ya que, como se ha comentado anteriormente, en otros microorganismos como S. pneumoniae no todos los serotipos tiene la misma capacidad de formar biofilm (Domenech et al., 2014, Domenech et al., 2015) y, además, varios estudios han mos- trado una asociación entre tipo de cápsula y cantidad de biofilm formado (Bardiau et al., 2014, Salimena et al., 2016). Los resultados obtenidos muestran que el 77% de los aislados clínicos del serotipo 5 y el 64% de los aislados de serotipo 8 formaron buen o muy buen biofilm (A595 ≥ 3 y A595 ≥ 3.5). Estos resultados se corresponden con hallazgos previamente observados por otros autores que mostraban que los aislados de serotipo 8 contenían mayor número de malos formadores de biofilm y que los aislados de serotipo 5 tendían a producir mayor biofilm (Bardiau et al., 2014, Salimena et al., 2016). Aun así, es difícil asociar un fenotipo a la cápsula de S. aureus, ya que su expresión va a depender de las condiciones ambientales a las que estén someti- das las cepas. En este sentido, se ha visto que aislados de los serotipos 5 y 8 de S. aureus en cultivo líquido con condiciones aerobias o crecidos en placas de cultivo sí que suelen expresar cápsula (O'Riordan y Lee, 2004). Por ello, a veces, es frecuente encontrar estas variaciones en los resultados que intentan dilucidar la influencia de la cápsula en diferentes fenotipos como el biofilm (Salimena et al., 2016). Otro as- pecto que también podría afectar es la sensibilidad antibiótica, ya que también se ha asociado la resistencia a meticilina con la capacidad de las cepas para formar biofilm. DISCUSIÓN 229 En aislados clínicos SARM se notó una asociación positiva entre cantidad de biofilm producido, cantidades de PBP2a en la superficie bacteriana, valores de CMI a la me- ticilina y expresión del gen mecA (Côrtes et al., 2015). Además, en una cepa de S. aureus negativa en el gen mecA se sobreexpresó la PBP2a, reprimiendo el regulador negativo de biofilm agr, lo que favoreció la formación de biofilm (Pozzi et al., 2012). Durante esta Tesis no se han observado diferencias entre las cepas buenas forma- doras de biofilm SASM y SARM, pero sí que se apreció una mayor proporción de aislados buenos formadores de biofilm SARM, correspondiéndose a lo observado previamente (Côrtes et al., 2015), aunque también hay que tener en cuenta que la mayoría de aislados SARM eran serotipo 5 y SASM serotipo 8, lo que podría contri- buir a este fenotipo a nivel de formación de biofilm. Como se ha explicado en la Memoria, se decidió estudiar más a fondo las matrices de los biofilms de los aislados productores de toxina ETA que presentaban un patrón bimodal. Los resultados obtenidos con los diferentes tratamientos sugieren que las matrices de los aislados clínicos seleccionados son más complejas de lo que podría parecer en un principio. En ningún momento, tras los experimentos de disgregación, se pudo encontrar un patrón en el efecto de la proteinasa K y DNasaI en los biofilms, lo que explicaría que su composición principal son proteínas y ADNe (ica-indepen- dientes) y biofilms que se vieran afectados sólo por el NaIO4 lo que supondría que estarían compuestos principalmente de exopolisacáridos (ica-dependientes). Los re- sultados mostraron que en todos los aislados de S. aureus estudiados, la matriz se veía afectada por las diferentes enzimas y compuestos lo que indica la importancia del componente proteico, del ADNe y del exopolisacárido en el mantenimiento de los biofilms maduros. La disgregación del componente proteico por la proteinasa K es inespecífica ya que escinde enlaces de aminoácidos alifáticos, aromáticos e hidrofó- bicos. Al igual que en esta Tesis, se ha observado previamente que los biofilms de aislados clínicos pueden ser susceptibles a más de una enzima, ya que la integridad estructural de los biofilms se mantiene por diversas moléculas (Sugimoto et al., 2018). La redundancia de mecanismos que existen para la formación del biofilm en este patógeno hace que sea difícil distinguir los procesos involucrados en esta formación (Zapotoczna et al., 2016). DISCUSIÓN 230 En todos los aislados clínicos estudiados en esta Tesis se confirmó que la proteinasa K fue activa en el proceso de disgregación del biofilm, demostrando que el compo- nente proteico juega un papel clave en su mantenimiento. En la inhibición del biofilm, afectó a todos los aislados cínicos menos al considerado como mal formador de bio- film (62822/15) en el que solo se vio efecto con la concentración 25 µg/ml. Se podría, por tanto, afirmar que las proteínas extracelulares también son importantes en el desarrollo del biofilm en general. Aunque el componente proteico principal de los bio- films de S. aureus es la proteína Bap (Cucarella et al., 2001), es importante destacar que existen otras proteínas con un papel tanto en la adhesión inicial como en la acumulación del biofilm (Schilcher y Horswill, 2020). Por ejemplo, las proteínas FnBPA, FnBPB y SdrC, ayudan a la adhesión inicial y promueven las interacciones célula-célula en el biofilm, aumentando su formación (Figueiredo et al., 2017, Schilcher y Horswill, 2020). Además, SasG también promueve la formación de biofilm mediante dimerización mediada por zinc (Geoghegan et al., 2010). El estudio del ADN extracelular en la formación y mantenimiento del biofilm con los diferentes aislados clínicos permitió diferenciar entre aislados que eran buenos for- madores de biofilm de los considerados como malos formadores de biofilm. La pre- sencia de ADNe en todos los aislados no es extraña, ya que se ha observado previa- mente que este es uno de los componentes principales de los EPS en la mayoría de biofilms cuantiosos de S. aureus, independientemente de si se tratan de aislados ica- dependiente o ica-independiente, aunque los aislados ica-dependiente tendrían me- nor cantidad de ADNe (Sugimoto et al., 2018). También se han descrito casos en los que se mostraba una mayor resistencia al tratamiento por DNasaI en aquellos aisla- dos ica-dependientes (Houston et al., 2011). En esta Memoria, se observó que la DNasaI disgregaba los biofilms de todos los aislados a las 23 h de formación, lo que demostraba la importancia del ADNe para el mantenimiento, y confirmaba hallazgos previos por otros autores que mostraban que el ADN juega un papel central en el mantenimiento del biofilm maduro de estafilococo (Mann et al., 2009, Sugimoto et al., 2018). La importancia del ADNe en el desarrollo del biofilm de S. aureus se observó en aquellos aislados clínicos clasificados como buenos formadores de biofilm a las 24 h (A595 ≥ 3), en cambio, en el resto de aislados clínicos no se observó un efecto significativo. Sugimoto y colaboradores, demostraron que el ADNe es muy importante para formar un buen biofilm (Sugimoto et al., 2018). DISCUSIÓN 231 La presencia de exopolisacáridos se analizó mediante tratamiento con NaIO4, que es un compuesto que se ha utilizado previamente para detectar componentes polisaca- rídicos en los biofilms bacterianos (Stevens et al., 2009, Domenech et al., 2013a, Domenech et al., 2016). Los resultados obtenidos mostraron que todos los aislados fueron susceptibles al tratamiento con este compuesto lo que indicaba la presencia de, al menos, un exopolisacárido en la matriz del biofilm, aunque no se pudo confir- mar si se trataba de PNAG o PIA ya que este compuesto no permite su diferenciación. Para abordar este aspecto, se podría utilizar la enzima dispersina B producida por la bacteria oral Gram-negativa Aggregatibacter actinomycetemcomitans que degrada específicamente este poli-β-1,6-GlcNAc (Ramasubbu et al., 2005, Izano et al., 2008). Una de las limitaciones de esta Memoria es que no disponíamos de esta proteína así que no se pudieron realizar los ensayos pertinentes para confirmar si estos exopoli- sacáridos degradados por el NaIO4 eran PIA o no. Tampoco se realizó caracterización mediante el anticuerpo policlonal anti-PIA por no disponer del mismo (Joyce et al., 2003). En las inhibiciones y disgregaciones de los biofilms de S. aureus se observaron dife- rencias por primera vez en el patrón de biofilm formado cuando estos se incubaban 23 h y se trataban una hora más, en comparación a cuando se incubaban 24 h. Los resultados mostraron que aislados clínicos que eran malos formadores de biofilm (a las 24 h), a las 23 h, tenían una mayor biomasa. Por ello, al estudiar aislados SASM y SARM buenos y malos formadores de biofilm se pudo observar que los aislados considerados como malos formadores de biofilm a las 24 h tenían diferentes patrones de biofilm según evolucionaba el biofilm, encontrando picos de buena formación de biofilm (16–19 h y 23 h) y valles de mala formación de biofilm (20 h y 24 h). Estas diferencias tan evidentes en tan poco tiempo son llamativas, y podrían estar asocia- das a que los biofilms entrasen en la llamada fase de éxodo previa a la maduración final y la fase de dispersión final como han descrito otros autores (Moormeier et al., 2014). Ya previamente se había descrito la fluctuación en biofilms de S. aureus en flujo continuo, donde se describió una fase de éxodo previa a las fases de biofilm maduro y dispersión (Moormeier et al., 2014), pero no se ha descrito previamente este fenómeno en biofilms estáticos. Esta fase de éxodo es un proceso independiente a la fase de dispersión del biofilm maduro, que está regulada por el sistema de QS Agr que, a su vez, depende de la acumulación del péptido autoinductor (Yarwood et al., 2004) e inducirá a una mayor actividad de las proteasas (Boles y Horswill, 2008), DISCUSIÓN 232 una mayor regulación de factores transcripcionales (Mootz et al., 2015) y a la produc- ción de modulinas solubles en fenol (Periasamy et al., 2012). Este éxodo está produ- cido por la actuación de la nucleasa, Nuc, producida por la propia bacteria que de- gradará el ADNe de la matriz y reducirá la biomasa total del biofilm, fenómeno que se había observado previamente (Mann et al., 2009, Kiedrowski et al., 2011). Ade- más, está regulado de forma sutil durante el desarrollo del biofilm y sólo subpoblacio- nes de las células en el biofilm expresaban nuc lo que resultaba en una liberación de células de esas zonas por la degradación del ADNe por la nucleasa (Moormeier et al., 2014). Este proceso complejo podría explicar el fenómeno observado en los ais- lados considerados como malos formadores de biofilm aunque metodológicamente hay diferencias, ya que Moormeier y colaboradores lo observaron en biofilms de flujo continuo y, en esta Tesis, se realizaron biofilms estáticos en placas multipocillo. Ade- más, el hecho de que que este fenómeno de dispersión esté mediado por Nuc que degrada la matriz, podría explicar por qué al tratar un biofilm de 23 h con DNasaI en los aislados formadores de biofilm se observaba un efecto de dispersión pero, al tratar los biofilms a las 20 h y 24 h, en ninguno de los dos casos la matriz se veía afectada por la DNasaI. Estos resultados podrían sugerir que en la matriz del biofilm hay un componente de ADNe a las 23 h que se degrada a las 24 h produciendo una altera- ción en su estructura en determinadas zonas del biofilm y una disminución de la bio- masa observada. El marcaje con la lectina WGA, permitió observar claramente que a las 16 h y 23 h había mucha mayor cantidad de exopolisacárido que a las 20 h y 24 h, donde había acúmulos de la lectina, pero apenas estaba el biofilm recubierto de polisacárido. Esta reestructuración de la matriz observada mediante CLSM, y que afecta al exopolisacárido, podría deberse a este mecanismo de desprendimiento de la matriz por degradación de ADNe por parte de Nuc, ya que el ADNe es un compo- nente esencial en el mantenimiento de la estructura del biofilm (Mann et al., 2009). Se intentó visualizar el ADNe también por CLSM usando DDAO, ya que, por sus propiedades, era factible observarlo de forma sencilla (Domenech et al., 2016). Sin embargo, no se consiguió marcar el ADNe con este compuesto. En un futuro sería interesante realizar otras aproximaciones basadas en la utilización de otros fluorocro- mos afines a ADNe como TOTO-1 y DAPI (Zatorska et al., 2017, Graf et al., 2019) o un marcaje con anticuerpos monoclonales anti ds-DNA (Domenech et al., 2016). Por último, este fenómeno de dispersión observado en los aislados malos formadores de biofilm también puede recordar a las “olas” de disgregación y recrecimiento mostra- das en el aislado USA300 WT después de 72 h de incubación en un sistema de flujo DISCUSIÓN 233 continuo (Yarwood et al., 2004). Este fenómeno que suele apreciarse en fases de incubación muy largas, se debe a la expresión de las modulinas solubles en fenol, reguladas por agr, que tienen una implicación en la estructuración (formación de ca- nales, superficies irregulares) y en la expansión y dispersión del biofilm (Periasamy et al., 2012). En nuestro caso, los tiempos estudiados fueron más cortos, pero al tratarse de aislados clínicos distintos y un sistema de biofilm estático, estas deses- tructuraciones con pérdidas de biomasa y recuperaciones podría deberse a este fe- nómeno y no a los fenómenos de éxodo antes explicados. El último objetivo del presente capítulo consistió en estudiar los mecanismos de eva- sión del sistema inmune por parte de S. aureus. Una de las primeras líneas de lucha que tiene nuestro sistema inmune frente a este patógeno es la fagocitosis por parte de neutrófilos y otros fagocitos profesionales. S. aureus tiene diversos mecanismos para evitar esta fagocitosis siendo uno de ellos la producción de cápsula, que evade la opsonofagocitosis impidiendo el depósito de complemento o unión de anticuerpos específicos (O'Riordan y Lee, 2004). Esta bacteria tiene además, diversos factores de virulencia que impiden la activación del sistema del complemento y la fagocitosis como son: la metaloproteasa; el inhibidor estafilocócico del complemento o Efb; la proteína Eap, que evita la extravasación del neutrófilo; SpA, Sbi y SSL10 que blo- quean la fagocitosis mediada por los receptores FcR y otros muchos (Lee et al., 2004, Rooijakkers et al., 2005, Atkins et al., 2008, Patel et al., 2010, Laarman et al., 2011, Woehl et al., 2014, Becker et al., 2014). El receptor de neutrófilos PSGL-1, que tiene una función principal de extravasación, también ha demostrado ser un receptor de leucocitos que participa en el reconocimiento y aclaramiento de patógenos invasivos como S. pneumoniae (Ramos-Sevillano et al., 2016). Al realizar una aproximación experimental similar con aislados de S. aureus en estado planctónico de distintos orígenes, expresando diferentes cápsulas y factores de virulencia no se observó una implicación del receptor PSGL-1 en el reconocimiento de este patógeno. Estos resul- tados confirman que el PSGL-1 no parece reconocer ninguna de estas estructuras como reconoce algunos CPS de neumococo y su autolisina LytA. Por otro lado, ya se ha comentado previamente que una de las principales ventajas de los biofilms es su evasión del sistema inmune. Se han observado diversos meca- nismos de evasión del sistema inmune en S. aureus. Uno de los más estudiados radica en que el biofilm enmascara los patrones moleculares de reconocimiento a DISCUSIÓN 234 patógenos (PAMPs) evitando así su reconocimiento (Scherr et al., 2014). También es capaz de impedir la entrada de los fagocitos y su función normal, aunque ya se observó que había casos en los que estos fagocitos sí que podían adherirse y pene- trar en el biofilm (Leid et al., 2002). Un aspecto que también es importante, consiste en que las bacterias formando biofilm son capaces de dirigir la respuesta inmune hacia rutas antiinflamatorias induciendo respuestas que favorezcan la persistencia bacteriana (Scherr et al., 2014), pudiendo llegar a interferir con la polarización de macrófagos M1 o la expresión de citoquinas y mediadores proinflamatorios (Thurlow et al., 2011, Hanke et al., 2013, Scherr et al., 2014). Previamente, en esta Memoria se ha explicado como los biofilms de S. pneumoniae son capaces de evadir la opso- nofagocitosis evitando el depósito de componentes del complemento —como C3— y reclutando reguladores negativos —como el factor H— (Domenech et al., 2013b). En esta Tesis se estudió si este mecanismo observado en neumococo también era apli- cable a S. aureus. Para ello, se siguió una metodología similar llevando en paralelo un cultivo planctónico con un biofilm in vitro de un aislado SASM y un aislado SARM, realizando ensayos de opsonofagocitosis y depósito de C3 para comparar cultivos en estado biofilm vs. planctónico. Los resultados obtenidos mostraron que, S. aureus en forma de biofilm evade la fagocitosis más eficazmente que en estado planctónico, pero a diferencia de neumococo, la evasión de la fagocitosis por parte de los biofilms de S. aureus es independiente del complemento. Esta supervivencia aumentada del biofilm respecto al planctónico se mantenía en ausencia de suero sugiriendo que en S. aureus, la evasión de la fagocitosis es un mecanismo mucho más eficiente que en neumococo. DISCUSIÓN 235 4. BIOFILMS MIXTOS DE S. AUREUS Y S. PNEUMONIAE Como se explicó en la introducción de esta Memoria, las bacterias que persiguen la estrategia de formar un biofilm tienen mecanismos que favorecen la diversidad mi- crobiana (Wolcott et al., 2013). Estos potenciales biofilms polimicrobianos tienen una rica pluralidad genómica, que puede facilitar las infecciones persistentes (Ehrlich et al., 2005). Además, el contacto estrecho entre sus integrantes que facilita el biofilm, contribuye al intercambio de genes de virulencia y resistencia, incrementado la im- portancia de los biofilms en la práctica clínica (Schilcher y Horswill, 2020, Domenech et al., 2013, Domenech et al., 2012, Bair y Campagnari, 2019). En 2004, Cryer y colaboradores demostraron la existencia de biofilms de P. aeruginosa en la mucosa sinusal de pacientes con rinosinusistis crónica recalcitrante. Posteriormente, se ha demostrado la existencia de infecciones mixtas relacionadas con el estado de biofilm como otitis, rinitis y sinusitis entre patógenos como S. aureus, S. pneumoniae y otros (Brook, 2016, Welp y Bomberger, 2020, Davcheva-Chakar et al., 2015, Hamilos, 2019). Todas estas evidencias ponen de manifiesto que la existencia de biofilms po- limicrobianos de patógenos relevantes en la práctica clínica como S. aureus y S. pneumoniae es un fenómeno frecuente, además de preocupante, desde la perspec- tiva de las enfermedades infecciosas. Tradicionalmente, S. aureus y S. pneumoniae se han visto como especies excluyen- tes, ya que diferentes estudios mostraron una asociación negativa en la colonización de S. aureus y S. pneumoniae (Regev-Yochay et al., 2004, Spijkerman et al., 2012, Chien et al., 2013, Dunne et al., 2013). Además, algunos de estos estudios parecían indicar que la colonización por serotipos neumocócicos vacunales VCN7 impedía la colonización por S. aureus. El mecanismo descrito de esta asociación negativa se debía a la muerte de S. aureus por el peróxido de hidrógeno producido por S. pneu- moniae. Sin embargo, estudios posteriores demostraron que la presencia de H2O2 no era lo que se requería para producir dicha muerte (Khan et al., 2016). Estudios in vitro indicaron que la muerte de S. aureus se producía por radicales hidroxilo (·OH) que se formaban en presencia de neumococo (Wu et al., 2019). Estos radicales hidroxilo inducen la degradación del ADN de S. aureus, produciendo su intoxicación y muerte. Este fenómeno se produce cuando la proporción de S. pneumoniae es mayor que la de S. aureus, ya que, al inocular cantidades similares, S. aureus sobrevive cuando se enfrente a la población de S. pneumoniae (Wu et al., 2019). En el estudio descrito DISCUSIÓN 236 en la Tesis, usamos proporciones SASM/SARM:Sp 1:1 y 1:11, donde la cantidad de S. pneumoniae era once veces mayor que la de S. aureus, y no se observó esta relación negativa. Por otro lado, hay estudios epidemiológicos que no han observado esta asociación, y algunos muestran que hasta el 24% de los pacientes están colonizados por ambas especies (Quintero et al., 2011, Ebruke et al., 2016, Melles et al., 2007), por lo que esta colonización exclusiva no se observó. Además, hay estudios que han analizado cómo afectaban la vacuna conjugada antineumocócica y los serotipos VCN7 en la colonización de S. aureus, demonstrando que la vacunación no modifica la coloniza- ción nasofaríngea de S. aureus (Cohen et al., 2007, Lee et al., 2009). Estudios con modelos animales han demostrado que S. aureus y S. pneumoniae pueden cohabitar en las cavidades nasales de ratas inoculando ambas bacterias a la misma densidad celular (Park et al., 2008, Margolis, 2009). La colonización de neumococo en estos modelos no afectó a la colonización de S. aureus (Park et al., 2008, Margolis, 2009). Otros autores, en un modelo de biofilm mixto sobre células epiteliales, no observaron esta asociación negativa pero se discute que la cocolonización con S. pneumoniae puede producir que S. aureus no realice correctamente la transición de colonización a enfermedad que se da tras una infección vírica (Reddinger et al., 2018). Los resul- tados obtenidos en esta Tesis, en los que se produce una interacción entre ambas especies, también contradicen la existencia de la relación antagónica. En el sistema desarrollado de biofilm mixto in vitro, se observa que S. aureus tiene ventaja en el crecimiento, con respecto a S. pneumoniae, ya que neumococo requiere una mayor proporción en el inóculo inicial para conseguir una proporción final en el biofilm mixto similar a la de S. aureus. Esto puede deberse a diferentes motivos, entre ellos la naturaleza innata del estafilococo para formar fácilmente biofilms tanto en superficies bióticas como abióticas (Figueiredo et al., 2017). En esta Memoria, se utilizó una superficie abiótica para realizar el ensayo de formación de biofilm (placas multipocillo de poliestireno para los ensayos de recuento de viables y tinción con CV, y placas con fondo de vidrio para el análisis mediante microscopía confocal); en este tipo de superficies tanto las interacciones electroestáticas como hidrofóbicas juegan un papel importante. Es importante destacar que S. aureus tiene una ventaja en este tipo de superficies, ya que también usa los ácidos teicoicos cargados negativamente de su pared y su principal autolisina AltA para unirse a superficies de poliestireno y DISCUSIÓN 237 de vidrio (Moormeier y Bayles, 2017, Gross et al., 2001, Biswas et al., 2006). En el caso de neumococo, este paso de adhesión inicial a superficies abióticas sólo se ha visto mediado por interacciones electroestáticas e hidrofóbicas débiles (Domenech et al., 2012, Chao et al., 2014). Además, como ya se explicó previamente, el CPS de neumococo es un impedimento a la hora de formar biofilm (Domenech et al., 2014). Aunque los neumococos que expresan el serotipo 19A sean considerados buenos formadores de biofilm, este CPS puede interferir con la adhesión inicial de neumo- coco a la superficie y S. aureus puede aprovechar y tomar ventaja dominando la ad- hesión inicial y formación del biofilm mixto. Aun así, se observa que, cuando la pro- porción de neumococo es mayor en el inóculo y, por lo tanto, su proporción dentro del biofilm mixto a tiempo final se asemeja a la de S. aureus, la biomasa del biofilm es mayor, pudiendo deberse a que la interacción de ambas especies en proporciones iguales sea más estable y formen un mayor biofilm en placas de poliestireno. En este estudio se han utilizado dos aislados clínicos de S. aureus, un aislado SASM y otro SARM y se ha analizado si la resistencia a meticilina pudiera ser un factor que influyera en la interacción con S. pneumoniae. Como se comentó anteriormente en el apartado de Introducción, diferentes trabajos han relacionado el nivel de resistencia a antibióticos en aislados SARM con el fenotipo de biofilm (Côrtes et al., 2015, Figueiredo et al., 2017). Las cepas que sobreexpresan mecA y presentan mayores niveles de resistencia a meticilina forman más biofilm. En esta Memoria, ambos ais- lados clínicos de S. aureus presentaban un patrón de biofilm similar tanto individual- mente como en el biofilm mixto con S. pneumoniae. Uno de los principales retos a abordar respecto a las infecciones causadas por bio- films de S. aureus es la inutilidad del tratamiento antibiótico a la hora de tratarlos, especialmente si están causados por cepas SARM (Hogan et al., 2017, Schilcher y Horswill, 2020). Además de no funcionar la terapia antibiótica, esta tiene el potencial de agravar la situación imponiendo una presión selectiva e inducir que proliferen más cepas resistentes a los antibióticos (Ma et al., 2012, Domenech et al., 2018). Una de las alternativas terapéuticas a las enfermedades tanto víricas como bacterianas que ha surgido a lo largo de los últimos años es el uso de agentes mucolíticos, como la NAC y la Cys, caracterizados por presentar grupos tioles (Cazzola et al., 2021). Ade- más de las propiedades antimicrobianas que se aprovecharon posteriormente, estos compuestos pueden tratar un rango amplio de enfermedades respiratorias entre las DISCUSIÓN 238 que se encuentra la EPOC y el asma (Cazzola et al., 2019). Estas potentes propie- dades antioxidantes y antinflamatorias también han servido para tratar la tormenta de citoquinas y el estrés respiratorio en pacientes con neumonía por SARS-CoV-2 (CO- VID-19) (Cazzola et al., 2021). NAC, uno de los fármacos mencionados previamente que sirve de precursor de la síntesis de glutatión, se ha probado previamente para prevenir y tratar biofilms de S. aureus, como tratamiento único o en combinación con antibióticos y enzimas (Manoharan et al., 2020). Se ha sugerido que esta actividad antibacteriana de NAC se debe a la competición por la utilización de cisteína con la bacteria, la reducción de los puentes disulfuro de diversas proteínas impidiendo la adhesión bacteriana y la formación de biofilm, o la perturbación del equilibrio redox intracelular de la bacteria (Dinicola et al., 2014, Blasi et al., 2016). También se ha sugerido que NAC podría actuar como un ácido débil en el biofilm, penetrando en la matriz de este y la pared celular de las bacterias que lo componen y, una vez llega al citoplasma bacteriano, se disociaría y acidificaría el biofilm (Kundukad et al., 2017). Cys es otro agente mu- colítico que ha sido usado como agente preventivo y terapéutico de biofilms de diver- sos patógenos incluyendo P. aeruginosa, Enterococcus faecalis, H. influenzae y S. pneumoniae (Charrier et al., 2014, Guo et al., 2016, Domenech y García, 2017). Una de las principales limitaciones de este compuesto es que se oxida rápidamente en solución, generando un disulfuro inactivo, la cistina (Rushworth y Megson, 2014). Por ello, NAC tiene dos principales ventajas frente a Cys: el grupo -SH de NAC se man- tiene reducido más tiempo que el grupo -SH de Cys y el transporte de NAC a través de las membranas celulares se da más fácilmente (Rushworth y Megson, 2014). En esta Memoria, se ha demostrado el efecto antibacteriano de diferentes concentra- ciones de Cys en los biofilms de S. aureus, confirmando que este compuesto es un buen agente preventivo de la formación de biofilm de SASM y SARM. Cys parece un mejor tratamiento preventivo de biofilms monoespecíficos de S. aureus que NAC (Manoharan et al., 2020), aunque las condiciones probadas en este estudio no son las mismas que las utilizadas en nuestro trabao. Además, el tratamiento de biofilms monoespecíficos de esta bacteria disminuyó en un 50–60% su viabilidad en el biofilm, mostrando, en este caso, un efecto menor que NAC (Manoharan et al., 2020). Una de las ventajas de nuestro estudio es el uso de aislados clínicos de S. aureus y con DISCUSIÓN 239 diferente susceptibilidad a meticilina (un aislado SASM y un aislado SARM). Los re- sultados obtenidos en esta Tesis Doctoral revelan que la resistencia a meticilina no cambia el efecto del agente mucolítico Cys, como ya observaron previamente con NAC (Manoharan et al., 2020). Actualmente, no se han identificado cepas de S. au- reus tolerantes o resistentes a NAC o Cys. La prevención de la formación de biofilms mixtos por estos patógenos y el tratamiento de biofilms polimicrobianos asociados a ciertas enfermedades, como otitis media aguda y sinusitis, son estrategias que se deben priorizar. NAC y Cys se han confir- mado previamente como buenos candidatos al tratamiento de biofilms polimicrobia- nos de S. pneumoniae y H. influenzae no tipificable (Domenech y García, 2017). En esta Memoria se describe el efecto antimicrobiano de ambos antioxidantes en los biofilms mixtos de S. aureus y S. pneumoniae. Como terapia preventiva, se puede observar que el agente mucolítico Cys fue más efectivo que NAC. Con este último antioxidante se usaron concentraciones por encima de la CMI para conseguir la inhi- bición del crecimiento y formación del biofilm. Esto también se correlaciona con el bajo valor de CMI de Cys para los tres aislados utilizados, comparado con el de la NAC. Esta diferencia de actividad se puede deber a la oxidación rápida de la Cys comparada con la de la NAC (Rushworth y Megson, 2014) lo que supondría una ven- taja a la hora de realizar un ensayo de inhibición del biofilm con el compuesto desde tiempo 0, logrando así que actúe más rápido frente a la población bacteriana inicial del inóculo y evitar la adhesión inicial. Sin embargo, como terapia terapéutica la NAC mostró una actividad antimicrobiana mayor que la de Cys, ya que sólo con 0.5 mg/ml prácticamente se erradicó a la población de S. pneumoniae, y con 5 mg/ml de NAC ambas poblaciones de S. aureus disminuyeron en un 94–99%, independientemente del fondo de resistencia a meticilina. Cys sólo logró una reducción de, aproximada- mente, el 50%. Este menor efecto de Cys ya se había observado previamente en el tratamiento de biofilms mixtos de S. pneumoniae y H. influenzae no tipificable (Domenech y García, 2017). Este efecto predominante de NAC seguramente se deba a la ventaja que tiene para mantener el puente disulfuro reducido y penetrar tanto la matriz del biofilm como la membrana bacteriana para, posteriormente, ejercer su ac- tividad antibacteriana (Kundukad et al., 2017, Cazzola et al., 2021). Otra ventaja ob- servada en el tratamiento del biofilm con NAC ha sido que este compuesto no dis- persa las células bacterianas del biofilm pero sí las mata, lo que supone una ventaja en la práctica clínica ya que al evitar que se dispersen estas células se impide que DISCUSIÓN 240 remanentes de células bacterianas vivas puedan colonizar otros hábitats en el hos- pedador produciendo infecciones secundarias. Como se ha comentado a lo largo de la Memoria, la búsqueda de terapias alternativas a los antibióticos ha sido una de las prioridades de los últimos años debido al incre- mento de resistencia a los antimicrobianos. Una de las terapias propuestas para sus- tituir a los antibióticos convencionales consistió en la terapia con fagos y, a principios del presente siglo, las enzimas líticas de fagos han sido ampliamente estudiadas como antibacterianos (Vázquez et al., 2018). Las endolisinas, o simplemente lisinas, son enzimas codificadas por fagos que se sintetizan al final del ciclo de replicación fágico y son capaces de hidrolizar la pared celular bacteriana. Esta actividad enzimá- tica se empezó a explorar como agente antibacteriano y se les empezó a denominar enzibióticos (Nelson et al., 2001), los cuales incluyen también a las enzimas líticas bacterianas, que tendrán varias ventajas sobre los antibióticos convencionales como: matar rápidamente a la bacteria nada más producirse el contacto; pueden ser pató- geno-específicas, sobre todo contra bacterias Gram-positivas (Loessner et al., 2002, Fenton et al., 2011) y que es poco probable que se desarrollen resistencias (Briers et al., 2014). Otra de las ventajas de estas lisinas es su arquitectura modular, compues- tas normalmente de un dominio con actividad enzimática (romperá el peptidoglicano de la pared) y un dominio de unión a la pared (Pastagia et al., 2013). Esto ha permitido que la actividad antibacteriana de las lisinas se haya ido mejorado mediante biología sintética, en la que se han fabricado lisinas con sus propiedades bioquímicas mejo- radas (actividad bactericida, estabilidad, etc.) mediante construcción de proteínas quiméricas y otras estrategias. A estas lisinas sintéticas se les ha denominado lisinas de segunda generación (De Maesschalck et al., 2020) y, en esta Memoria, se han utilizados dos de ellas (Cpl-711 y CHAPk). Por último, las de tercera generación, son aquellas lisinas o productos basados en lisinas o formulaciones que sirven para au- mentar su actividad antimicrobiana in vivo (De Maesschalck et al., 2020). Entre sus principales desventajas, las lisinas tienen problemas de biodisponibilidad en el sitio de infección, la vida media in vivo es corta (de 20 a 60 min) y pueden producir una respuesta inmune indeseada cuando se administran sistémicamente (Loeffler et al., 2003, Jado et al., 2003, Doehn et al., 2013, Jun et al., 2017). La formación de nano- partículas de quitosano con residuos de DEAE (ChiDENPs) unidas no covalente- mente al enzibiótico Cpl-711 (ChiDENPs-711) constituyen una lisina de tercera ge- neración (Vázquez et al., 2021) con la que se ha trabajado en esta Tesis Doctoral. DISCUSIÓN 241 Cpl-711, una de las lisinas frente a S. pneumoniae con mayor capacidad bactericida hasta la fecha, ya había sido previamente utilizada frente a biofilms in vitro de neu- mococo y frente a neumococos de distintos serotipos adheridos a células epiteliales humanas (Diez-Martinez et al., 2015, Corsini et al., 2018). Este efecto bactericida se mantuvo para S. pneumoniae en el sistema del biofilm mixto y mantuvo su gran efi- cacia ya que, a concentraciones muy pequeñas, ya presentaba actividad bactericida. Los enzibióticos individulaes de esta quimera, Cpl-1 y Cpl-7, no presentaban activi- dad frente a S. aureus (Díez Martínez, 2014). Como era esperable, la quimera de ambas lisinas, Cpl-711, no presentó actividad frente a S. aureus en el biofilm mixto, independientemente de la resistencia a meticilina. Una de las principales ventajas de las lisinas es su especificidad que, entre otras cosas, permitirá preservar la microbiota normal, pero esta especificidad también hará que su espectro de acción sea reducido (Vázquez et al., 2018). Por otro lado, se estudió el efecto de CHAPk, que es un enzibiótico procedente de una deleción artificial de la enzima LysK, conteniendo los primeros 162 aminoácidos de la misma (Fenton et al., 2010, Fenton et al., 2011). Este dominio truncado presen- taba mayor actividad que la proteína LysK en sí (Fenton et al., 2011). Esta lisina ha sido efectiva a la hora de disminuir la viabilidad de S. aureus en cultivo planctónico (Fenton et al., 2011), de eliminar eficazmente a S. aureus de las fosas nasales de ratones (Fenton et al., 2010) y de disminuir la viabilidad de biofilms de S. aureus tras un tiempo de exposición de 3–4 h (Fenton et al., 2013). Una de las principales limita- ciones de esta endolisina es su alto valor de CMI para las cepas de S. aureus proba- das en trabajos anteriores (Fenton et al., 2011) y en los aislados clínicos utilizados en esta Memoria. Además, para ver los efectos de disgregación de un biofilm, las condiciones utilizadas en trabajos previos fueron tratamientos muy largos y con altas concentraciones del enzibiótico (Fenton et al., 2013), cuando se compara con las concentraciones de este tipo de lisinas que se suelen utilizar (Domenech et al., 2011, Diez-Martinez et al., 2015). Los resultados experimentales en esta Tesis Doctoral, mostraron que CHAPK redujo la viabilidad de los biofilms monoespecíficos de S. au- reus a una concentración subinhibitoria de 25 µg/ml, pero no mostró un mayor efecto usando la CMI (50 µg/ml). En cambio, este efecto se incrementó de forma moderada en la viabilidad de la población de S. aureus que formaba parte del biofilm mixto con DISCUSIÓN 242 S. pneumoniae. Respecto a neumococo, Fenton y colaboradores mostraron una re- ducción en la turbidez acompañada de una reducción en la viabilidad de 3 × 107 a 1.6 × 107 UFC/ml después de 15 min de tratamiento con 10 µg/ml de CHAPk usando la cepa S. pneumoniae DSM 11865 (Fenton et al., 2011), una cepa del serotipo 9V aislada en España. Este efecto en la viabilidad de S. pneumoniae no se observó en el biofilm mixto con la cepa de serotipo 19A usada (YNM4) realizando el tratamiento con 25 o 50 µg/ml de CHAPk durante 1 h. La importancia de la biodisponibilidad de un tratamiento a la hora de la práctica clínica ha hecho que se desarrollen nuevas técnicas de administración de este tipo de lisi- nas, que tienen alta actividad bactericida pero un tiempo de vida media in vivo bas- tante reducido (De Maesschalck et al., 2020). El uso de nanopartículas poliméricas para incrementar la biodisponibilidad de estas lisinas y así suplir una de sus principa- les desventajas es una de las opciones más interesantes. Varios materiales, entre ellos el quitosano, se han utilizado para la construcción de nanopartículas que hagan de vehículos y puedan acceder a localizaciones concretas del organismo, como el pulmón (de Maesschalck et al., 2020). Previamente a este Memoria, se habían utili- zado vendas que contenían estas nanopartículas de quitosano cargadas con lisosta- fina —una hidrolasa del peptidoglicano de estafilococos— mostrando actividad anti- bacteriana y obteniendo buenos resultados in vitro e in vivo (Szweda et al., 2014, Nithya et al., 2018). En este sentido, Vázquez y colaboradores estudiaron la actividad antimicrobiana de nanopartículas de quitosano que incorporaban grupos DEAE, que actúan como análogos estructurales de la colina y por lo tanto, unen CBPs (Vázquez et al., 2021). Esta unión de CBPs tiene dos funciones: secuestro de las CBPs de neumococo impidiendo procesos fisiológicos normales de la bacteria y unir enzibióti- cos como Cpl-711, pudiendo liberarla posteriormente de manera controlada (Vázquez et al., 2021). Estas nanopartículas cargadas ChiDENPs-711 a 37°C y pH 7.4 liberaron más de la mitad de la Cpl-711 que contenían durante las 2–3 primeras horas (hasta el 55% de la carga de lisina) y liberaban el 82% del producto hasta 12 h después (Vázquez et al., 2021). Como ya se ha comentado, una de las limitaciones de nuestro sistema de biofilm mixto es el tiempo de incubación de los tratamientos ya que, a partir de 5 h, había una disminución de viabilidad y de biomasa en el biofilm mixto. Con todo ello, se observa un efecto claro de las ChiDENPs, las ChiDENPS + 5 µg/ml de Cpl-711 y las ChiDENPs-711 a 1 h a 37°C en el biofilm mixto. DISCUSIÓN 243 El resultado de las ChiDENPs en la viabilidad de S. aureus era esperable, ya que previamente se había probado el quitosano como antimicrobiano y, específicamente, frente a esta bacteria (Asli et al., 2017). Normalmente, el efecto del quitosano en la viabilidad depende de la masa molecular, grado de polimerización y grado de desace- tilación, pero se vio que un rango amplio de moléculas de quitosano afectaban a S. aureus (Asli et al., 2017). En el caso de la viabilidad de S. pneumoniae, no se observó efecto de las ChiDENPs, al igual que un trabajo previo (Vázquez et al., 2021). Esto parece deberse a que las ChiDENPs, al tener incorporados grupos DEAE, interfieren con la fisiología normal de las CBPs, por lo que protegen a neumococo de la autolisis y no se aprecia una disminución de la viabilidad (Vázquez et al., 2021). En ese mismo artículo, observaron que al interferir con las CBPs se produce formación de cadenas, fenómeno que no se demuestra en el biofilm mixto maduro al tratarlo durante 1 h con estas nanopartículas, pero sí se observa una acumulación de biomasa que podría deberse a esta interferencia con el funcionamiento normal de las CBPs de neumo- coco. Por otro lado, al añadir Cpl-711 exógena, se ve que las ChiDENPs no interfieren con la acción de la endolisina ya que erradican casi toda la población de S. pneumo- niae, atribuyendo la disminución en la viabilidad de S. aureus a las nanoparticulas “blancas”. Finalmente, el tratamiento con ChiDENPs-711 resultó en una disminución en la viabilidad de ambas especies según los recuentos de viables, aunque la acción sobre la población de S. pneumoniae fue menor que usando la Cpl-711 individuale- mente. Esto era esperable ya que el rango de liberación de estas nanoparticulas es de hasta 3 h para liberar el 55% y hasta 12 h para casi la totalidad de su contenido, por lo que 1 h de tratamiento es un tiempo breve. Además, ya se observó que la encapsulación producía cierta pérdida de actividad (Vázquez et al., 2021), que era compensada por otras ventajas (De Maesschalck et al., 2020). El efecto de las Chi- DENPs-711 en los biofilms mixtos observados por CLSM fue menor del esperado, obteniéndose un resultado diferente al obtenido en el recuento de viables, pudién- dose deber a una interferencia del material con fondo de vidrio (CLSM) respecto al material con fondo de poliestireno (recuento de viables), este fenómeno ha sido ob- servado previamente con otros biofilm mixtos (Roig-Molina et al., 2019). La búsqueda de nuevos tratamientos frente a bacterias integrantes de un biofilm es necesaria y está siendo un campo muy activo para apoyar a la práctica clínica. El desarrollo de nuevos fármacos es caro y lento por lo que el reposicionamiento de fármacos suponen una alternativa de gran interés y, de hecho, ha sido promovida por DISCUSIÓN 244 prestigiosos organismos institucionales como los National Institutes of Health (Cragg et al., 2014). Los resultados de esta Tesis Doctoral confirman que el uso de NAC y Cys como candidatos para la prevención y tratamiento de biofilms de S. aureus mo- noespecíficos y biofilms mixtos de S. aureus–S. pneumoniae, resultan efectivos in- dependientemente de la resistencia a meticilina. Ofrecer nuevos usos a fármacos ya aprobados en clínica por las diferentes agencias reguladoras del medicamento es un proceso mucho más rápido y eficiente que el desarrollo de nuevos fármacos antimi- crobianos. Respecto al desarrollo de terapias innovadoras, el uso de enzibióticos su- ponen una gran ventaja, ya que el desarrollo de resistencias parece bastante impro- bable, debido a que se dirigen a un componente estructural y esencial de las bacterias como el peptidoglicano, que no se puede modificar fácilmente sin comprometer la viabilidad bacteriana (Kusuma et al., 2007, Vázquez et al., 2018). Además, la relativa facilidad para aplicar la ingeniería genética en estos compuestos y trabajar con sus diferentes módulos los hace un recurso a tener en cuenta y el más prometedor para desarrollar futuros agentes antimicrobianos (Vázquez et al., 2021). DISCUSIÓN 245 5. EFECTO DEL EXTRACTO DE HUMO DE TABACO EN BIOFILMS DE S. AU- REUS Y BIOFILMS MIXTOS DE S. AUREUS–S. PNEUMONIAE Como se ha mencionado previamente, el tabaquismo es uno de los mayores proble- mas de salud global. Además de las consecuencias más reconocidas como favorecer el desarrollo de cáncer, enfermedades crónicas como la EPOC y enfermedades car- diovasculares, el consumo de tabaco es uno de los mayores factores de riesgo para sufrir infecciones bacterianas (Hutcherson et al., 2015). Este aumento de riesgo no sólo se produce a nivel de enfermedades invasivas como la ENI (Nuorti et al., 2000), sino que también aumenta el riesgo de sufrir enfermedades asociadas a biofilms como otitis media, vaginosis y periodontitis crónica (Bagaitkar et al., 2008). Los me- canismos de la mayor susceptibilidad a infecciones en fumadores no están del todo claros, pero varios estudios los han asociado a una alteración en la regulación del sistema inmune (Arcavi y Benowitz, 2004, Domagala-Kulawik, 2008, Stämpfli y Anderson, 2009). El humo de tabaco puede afectar a la función normal de los neutró- filos, disminuyendo la fagocitosis (Stringer et al., 2007) y la quimiotaxis (Corberand et al., 1979). Además, el HT puede inducir la sobreexpresión de mediadores proinfla- matorios, especies reactivas de oxígeno y enzimas, produciendo daño celular y una función inmune incorrecta (Russell et al., 2002). También se ha visto que el HT dis- minuye el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), generando un estado de inmunosupresión y colonización microbiana crónica (Laan et al., 2004). Además, se ha observado que produce daño en el parénquima pulmo- nar, reduciendo el movimiento mucociliar, provocando así una incorrecta eliminación de los microorganismos patógenos (Dye y Adler, 1994). El HT no sólo tiene efecto en el propio ser humano, sino que sus compuestos incluyendo, compuestos químicos bioactivos, pueden afectar también a los microorganismos patógenos que están co- lonizando la microbiota humana (Kulkarni et al., 2016). En este sentido, hay diversos estudios que han demostrado cómo el EHT aumenta la virulencia de diversos pató- genos o microorganismos comensales (Mutepe et al., 2013, Kulkarni et al., 2016, Lacoma et al., 2019, Chien et al., 2020). El biofilm en la mayoría de los microorganismos se ve influenciado por estímulos ambientales simples como la temperatura, pH, disponibilidad de hierro, etc. Por ello, no resulta sorprendente que el HT, que contiene cientos de sustancias bioactivas y componentes químicos, contribuya afectando de forma significativa en la fisiología DISCUSIÓN 246 bacteriana y la formación de biofilm (Hutcherson et al., 2015). Cada vez hay más evidencias de que los biofilms de diversos patógenos y comensales se ven afectados por el HT. Esto se ha documentado en Klebsiella pneumoniae (Goldstein-Daruech et al., 2011), P. aeruginosa (Goldstein-Daruech et al., 2011, Antunes et al., 2012), Porphyromonas gingivalis (Bagaitkar et al., 2011, Bagaitkar et al., 2008), Proteus vul- garis (Goldstein-Daruech et al., 2011), S. aureus (Kulkarni et al., 2012), S. pneumo- niae (Mutepe et al., 2013, Cockeran et al., 2014), Streptococcus mutans (Baboni et al., 2010), Streptococcus gordonii (Bagaitkar et al., 2011) y Streptococcus sanguinis (Li et al., 2014). Respecto al efecto que tiene el HT sobre la colonización de S. aureus, hay resultados contradictorios y poco concluyentes. Algunos asociaron un efecto protector del HT a la colonización de S. aureus (Olsen et al., 2012), mientras que otros no encontraron ninguna asociación significativa (Wang et al., 2010). Diferentes grupos observaron que el HT aumentaba la colonización (Bogaert et al., 2004, Melles et al., 2007, Ramakrishnan y Frank, 2015). En estudios in vitro sí que se ha observado cómo el EHT aumenta la formación de biofilm de cepas tipo y aislados clínicos de S. aureus (Kulkarni et al., 2012, Lacoma et al., 2019). Kulkarni y colaboradores observaron que la exposición a EHT aumentaba la formación de biofilm de diferentes aislados de S. aureus, incluso si esta exposición era breve (Kulkarni et al., 2012). Además, se ha visto un aumento de la regulación transcripcional de sarA y rbf, que son reguladores positivos del operón ica (Beenken et al., 2003, Luong et al., 2009). También se ha demostrado que había una disminución de la expresión de agrC en las células trata- das con EHT, siendo el sistema de QS Agr uno de los reguladores de factores de virulencia más importantes y que actúa como regulador negativo del biofilm de S. aureus (Boles y Horswill, 2008). Esta regulación negativa de agr se producía por el estrés oxidativo mediado por el EHT en los aislados estudiados, ya que AgrA se ve afectado por el estrés oxidativo induciendo la formación de un enlace disulfuro en su dominio de unión a ADN (Cys-199) e impidiendo su unión al promotor de agr (Sun et al., 2012). Posteriormente Lancoma y colaboradores demostraron que era necesario un sistema Agr funcional para que hubiese esa formación de biofilm incrementada tras la exposición a EHT (Lacoma et al., 2019). Esto autores demostraron que mu- tantes en agr o aislados clínicos con una actividad de agr reducida no se veían afec- tados por el EHT ni en la formación de biofilm ni en invasión (Lacoma et al., 2019). En los aislados que tenían alta actividad de agr sí que se veía el biofilm aumentado DISCUSIÓN 247 y su expresión se encontraba reducida, limitando además, la expresión de otros fac- tores de virulencia como diferentes toxinas (Lacoma et al., 2019). En nuestro caso se observó que, en todos los aislados clínicos estudiados, se veía afectado el biofilm, aumentado la densidad celular y el grosor del mismo, pero este aumento observado tanto en biomasa (A595), como recuento de viables y mediante microscopía confocal, fue mayor en los aislados que eran malos formadores de biofilm a las 20 y 24 h (60040/19 y 62822/15). Los aislados considerados como buenos formadores de bio- film (62600/15 y 60335/19) se vieron más afectados en su crecimiento total y la es- tructura del biofilm, aunque no tanto en el grosor. Anteriormente se discutió el posible papel de Nuc produciendo éxodos (Moormeier et al., 2014), o del sistema agr produ- ciendo las ondas características de formación y disgregación en biofilms tardíos (Yarwood et al., 2004). Esto se ha visto en esta Tesis Doctoral en los aislados que eran malos formadores de biofilm a las 24 h, en los que tenían periodos donde for- maban buen biofilm (16–19 y 23 h) y periodos donde formaban mal biofilm (20 y 24 h). La explicación de que haya un mayor efecto del EHT en los aislados que formaban mal biofilm a las 20 y 24 h, que es cuando tienen menos biomasa, podría deberse a que, en estos aislados clínicos, el sistema QS Agr está más activo. De hecho, ya se observó que en aislados clínicos con agr más activo, el efecto del EHT sobre el biofilm era mayor (Lacoma et al., 2019). Sobre la base de todas estas observaciones, es muy probable que estas disgregaciones que ocurren en los aislados mal formadores de biofilm a las 20 y 24 h sean producidas por este sistema de QS Agr. En esta Tesis también se ha demostrado que el EHT afecta al crecimiento total, produciendo un aumento del mismo que, posteriormente, se corroboró mediante recuento de viables, siendo un hallazgo novedoso que no se había descrito previamente. También hay que destacar que, a diferencia de otros trabajos que sólo estudian los efectos del EHT en el biofilm mediante análisis de la biomasa por tinción con cristal violeta u otros colorantes, en esta Memoria se emplearon varias aproximaciones experimen- tales para analizar el efecto del HT. Estos resultados aportan información adicional que no se podía apreciar solo con la cuantificación del biofilm por medición de la biomasa por CV. Los biofilms monoespecie no suelen encontrarse normalmente en condiciones in vivo y, como se ha comentado previamente, las bacterias que siguen la estrategia de for- mar un biofilm tienen mecanismos para incluir diversidad microbiana (Wolcott et al., 2013). Existen diversos estudios que han demostrado la existencia de infecciones https://docs.google.com/document/d/1v0ZTsHm2eJG5lAeihvicOrglIhMcFDfr/edit#heading=h.34g0dwd https://docs.google.com/document/d/1v0ZTsHm2eJG5lAeihvicOrglIhMcFDfr/edit#heading=h.34g0dwd DISCUSIÓN 248 mixtas relacionadas con el estado de biofilm como otitis, rinitis y sinusitis producidas por patógenos como S. aureus, S. pneumoniae y otros (Brook, 2016, Welp y Bom- berger, 2020, Davcheva-Chakar et al., 2015, Hamilos, 2019). En esta Memoria se han desarrollado varios sistemas in vitro de biofilm mixto entre S. aureus y S. pneu- moniae (Capítulo 4 de esta Memoria) por lo que se decidió investigar el efecto del EHT en estos sistemas multiespecie. En S. pneumoniae se había observado previa- mente que el EHT aumentaba su biofilm, aunque no afectaba al crecimiento y al cul- tivo planctónico y disminuía la expresión de Ply (Mutepe et al., 2013). En S. aureus como se comentó al inicio, se produce una regulación hacia perfiles de persistencia y respuesta a estrés oxidativo (Kulkarni et al., 2012, Lacoma et al., 2019). En esta Tesis se observó que el EHT no producía un aumento de la biomasa (A595) del biofilm mixto, pero sí que hubo un aumento de bacterias viables en ambas poblaciones inte- grantes en los diferentes biofilms mixtos y un aumento del biofilm visualizado por CLSM. También es destacable que se observó una disminución del crecimiento total y de la viabilidad de ambas poblaciones en el cultivo planctónico del biofilm. Además, se pudo comprobar que existe una mayor disminución en las células de S. aureus que en las de S. pneumoniae, disminuyendo la viabilidad hasta más de la mitad de ambas poblaciones cuando se usó EHT al 10%. Estos hallazgos contrastan con lo observado en las poblaciones formando biofilms mixtos, donde la viabilidad de ambas poblaciones aumentaba en todos los casos y, también, en lo observado en los bio- films monoespecies de S. aureus, donde aumentaba la viabilidad del cultivo planctó- nico del biofilm. El EHT tiene altas concentraciones de radicales libres y especies reactivas de oxí- geno como NO-, radicales OH-, H2O2, etc. que alteran vías de señalización y producen efectos inmunomoduladores (Vassallo et al., 2008, Birrell et al., 2008, McMaster et al., 2008). Uno de los mecanismos antagónicos entre S. aureus y S. pneumoniae era la muerte de S. aureus por radicales hidroxilo (·OH) que se formaban en presencia de neumococo a partir de H2O2 y otras especies (Wu et al., 2019). Estos radicales hidroxilo inducen la degradación del ADN del estafilococo, produciendo su intoxica- ción y muerte. Puede que este efecto nocivo en la viabilidad en el cultivo planctónico cuando están presentes ambas poblaciones se deba a esta competencia para sobre- vivir al estrés oxidativo que va a producir el EHT y que S. aureus se vea más afectado al inicio porque S. pneumoniae esté contribuyendo a que el estafilococo se muera. https://docs.google.com/document/d/1v0ZTsHm2eJG5lAeihvicOrglIhMcFDfr/edit#heading=h.3dy6vkm https://docs.google.com/document/d/1v0ZTsHm2eJG5lAeihvicOrglIhMcFDfr/edit#heading=h.kgcv8k https://docs.google.com/document/d/1v0ZTsHm2eJG5lAeihvicOrglIhMcFDfr/edit#heading=h.kgcv8k https://docs.google.com/document/d/1v0ZTsHm2eJG5lAeihvicOrglIhMcFDfr/edit#heading=h.1ksv4uv https://docs.google.com/document/d/1v0ZTsHm2eJG5lAeihvicOrglIhMcFDfr/edit#heading=h.41mghml https://docs.google.com/document/d/1v0ZTsHm2eJG5lAeihvicOrglIhMcFDfr/edit#heading=h.1jlao46 DISCUSIÓN 249 En el biofilm mixto no se observa esta disminución de la viabilidad, sino que se apre- cia un aumento de la viabilidad de ambas especies. Este estado ya de por si es ven- tajoso para la supervivencia de ambos patógenos pero, además, se ha visto que los biofilms de S. aureus en presencia de este estrés oxidativo, aumentan la transcripción de oxidoreductasas como ahpC y sod, y se produce una disminución del regulador negativo del biofilm agr (Kulkarni et al., 2012). Estas evidencias sugieren que la po- blación de S. aureus del biofilm no es igual de susceptible al estrés oxidativo como parece ser la del cultivo planctónico y, además, se favorezcan mecanismos encarga- dos de aumentar su viabilidad. Por último, se observó previamente que el EHT tiene un efecto de respuesta al estrés y persistencia en los biofilms de S. pneumoniae pro- duciendo un aumento del biofilm (Mutepe et al., 2013, Cockeran et al., 2014, Cockeran et al., 2020). Estos resultados sugieren que esta población en el biofilm mixto también puede tener mecanismos de persistencia que sean diferentes a los del cultivo planctónico. El hecho de que el EHT aumente la formación y viablidad de bio- films mixtos es preocupante en la práctica clínica, ya que puede favorecerse la proli- feración de otras especies en el biofilm, dificultando su eliminación. DISCUSIÓN 250 6. EL EFECTO DE LA VACUNA CONJUGADA 13-VALENTE EN LA COLONIZA- CIÓN DE S. pneumoniae y S. aureus El estado de colonización es esencial para la patogénesis de S. pneumoniae. Esta colonización comienza poco después del nacimiento, donde el 20–40% de los niños sanos se encuentran colonizados por este microorganismo (Loughran et al., 2019) y, posteriormente, estas tasas de colonización se van reduciendo encontrando tan sólo entre el 5–10% de los adultos colonizados. Además, este estado es un prerrequisito para que el patógeno pueda luego invadir nichos estériles y no estériles causando diferentes patologías como la ENI, neumonía no invasiva, otitis y sinusitis (Weiser et al., 2018). En los últimos años se ha observado que la propia colonización por neu- mococo predispone al hospedador a sufrir una infección vírica de las vías respirato- rias inferiores (Madhi et al., 2004, Gessner et al., 2019, Lewnard et al., 2021), debién- dose principalmente a una modificación de nuestra respuesta inmune tanto en muco- sas como a nivel pulmonar y sistémico a estos virus respiratorios, como el virus de la gripe o el SARS-CoV-2 (Carniel et al., 2021, Mitsi et al., 2021). Se ha observado un efecto claro de las vacunas conjugadas en la colonización por S. pneumoniae en la población infantil (Cohen et al., 2012, Moore et al., 2015). Pero además, la mayoría de estudios de vigilancia de diferentes países han detectado una reducción de la ENI causada por serotipos vacunales por la VCN13 en adultos, de- bido a la vacunación de la población pediátrica, por lo que se refuerza la idea de que la VCN13 previene la colonización de la nasofaringe (Moore et al., 2015, Ladhani et al., 2018, de Miguel et al., 2020). Además, esto deja claro el papel de la población pediátrica como reservorio de neumococo, ya que la colonización por este patógeno se concentra en la población infantil y cómo afecten las vacunas a la colonización en esta población será clave. Otro factor a tener en cuenta es que las pautas vacunales difieren en cómo afectan a la colonización, ya que no se ha identificado en ningún momento protección frente a la colonización con sólo una o dos dosis de la VCN13, mientras que las pautas 2+1, 3+0 y 3+1 (dosis primaria + refuerzo) sí que confieren protección frente a esta (O'Brien et al., 2007, Nicholls et al., 2016, Lewnard et al., 2020). DISCUSIÓN 251 Aun así, la vacunación directa del adulto parece importante a la hora de evitar los casos de ENI por serotipos vacunales, y también ayudará aún más a reducir los va- lores de colonización por S. pneumoniae en esta población (Milucky et al., 2019). Un estudio en EE. UU. que analizó el impacto de la VCN13 en la colonización en el adulto, mostró unos ratios de portación de neumococo muy bajos debido, segura- mente, a una acción conjunta de la vacunación directa y el efecto de rebaño indirecto por la vacunación de la población pediátrica (Milucky et al., 2019). De los serotipos vacunales que se encontraron colonizando la nasofaringe en este estudio, los tres más frecuentes fueron el 19F, 19A y el 3, que son los serotipos vacunales que causan más casos de ENI en adultos mayores de 65 años en EE. UU. (Milucky et al., 2019). En EE. UU. y Reino Unido no encontraron una reducción en los casos de ENI produ- cidos por el serotipo 3 (Moore et al., 2015, Andrews et al., 2014). Esto se correlaciona con datos del estudio de colonización que valoró la eficacia de la VCN7 vs. la VCN13 y encontraron que la VCN13 no afectaba a la colonización nasofaríngea por el sero- tipo 3 (Dagan et al., 2013), lo que ha sido corroborado por otros trabajos recientes (Lewnard et al., 2020). Por otro lado, hay países que sí han notificado una reducción en la ENI causada por el serotipo 3 tanto en población pediátrica como en población adulta directamente vacunada (Sings et al., 2019, McLaughlin et al., 2019, de Miguel et al., 2020). Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral se corresponden más con esta última situación, en la que el suero postVCN13 de adultos sanos sí que protege frente al biofilm del serotipo 3, asociado al estado de colonización. Además de demostrar que la vacuna VCN13 produce anticuerpos funcionales en los pacientes vacunados. No sólo el serotipo 3 es el único serotipo vacunal que aún sigue causando ENI de manera destacada, los serotipos 14, 19F y 19A tampoco han sido eliminados del todo en los países que usan la VCN13 (Moore et al., 2015, Glikman et al., 2018, Ladhani et al., 2018). Los serotipos 19F y 19A son muy buenos formadores de biofilm con una capacidad remarcable de colonizar la nasofaringe (Domenech et al., 2014), lo que podría explicar por qué siguen teniendo tanta carga en la ENI. El estudio realizado en esta Memoria permite observar que diferentes sueros de sujetos sanos vacunados con la VCN13 son efectivos, al aumentar la opsonofagocitosis de los biofilms de estos dos serotipos, por lo que podríamos sugerir que la vacuna es efectiva frente a la colonización por estos serotipos. La prevalencia de estos serotipos de S. pneumoniae DISCUSIÓN 252 podría deberse a las bajas o insuficientes coberturas vacunales de la población con VCN13 (Milucky et al., 2019, de Miguel et al., 2020). El único serotipo vacunal cuyo biofilm sobrevivió a la OPA a niveles del control fue el del serotipo 14, lo que podría explicar su elevada carga en ENI. La vacunación ya se ha demostrado como la mejor estrategia para evitar la ENI en pacientes con enfermedades autoinmunes y tratamientos inmunosupresores (Fernandez-Martinez et al., 2016, Richi et al., 2021). Desafortunadamente, se ha des- crito que los pacientes con estas enfermedades y con terapia biológica tienen una menor respuesta a las vacunas antineumocócicas y, sobre todo, a las vacunas con- jugadas ya que tienen una respuesta celular alterada (van Aalst et al., 2018). El uso de rituximab sólo o en combinación con metotrexato se ha asociado previamente a una respuesta inmune defectuosa a la vacunación en pacientes con artritis reuma- toide (Bingham et al., 2010). El metotrexato produce esta respuesta porque este fár- maco y sus metabolitos bloquean la síntesis de novo de purinas y afectan a la proli- feración de linfocitos B y T (Visser, 2011, Subesinghe et al., 2018). Al contrario, Richi y colaboradores observaron que los pacientes con artritis reumatoide y sometidos a estas terapias biológicas sí que respondían produciendo anticuerpos funcionales que ayudaban a la fagocitosis de seis de los serotipos de S. pneumoniae que analizaron (1, 3, 7F, 14, 19A y 19F) (Richi et al., 2021). Posiblemente esto se deba a que los pacientes que estudiaron siguieron la administración recomendada de la vacuna an- tineumocócica cuatro semanas después de la dosis de la terapia biológica y con una espera de seis meses hasta que se reanude el tratamiento, podría ser la causa que explicara esta diferencia respecto a estudios previos (Pham et al., 2008). En esta Tesis Doctoral, de los tres serotipos vacunales estudiados (3, 19F y 19A), sólo se obtuvo protección frente a los biofilms del serotipo 19F, no habiendo respuesta frente a los biofilms de los serotipos 3 y 19A, a diferencia de lo obtenido por Richi y colabo- radores (Richi et al., 2021). Esto no es contradictorio, ya que nosotros evaluamos el efecto de los sueros de pacientes con artritis reumatoides sometidos a terapias bio- lógicas y vacunados con VCN13 o/y VNP23 frente a la colonización por estos seroti- pos, el estado de biofilm, no frente al estado planctónico que se evaluó en el estudio previo (Richi et al., 2021). Adicionalmente, nuestro estudio tiene la limitación de haber utilizado solo dos sueros y el número de serotipos evaluados, además de que no disponemos de los sueros prevacunales de los pacientes evaluados. DISCUSIÓN 253 Una de las principales preocupaciones de las vacunas que afectan a la colonización de patógenos que se encuentran en la microbiota es el incremento de la colonización por otros patógenos invasivos. Cuando se elimina una población bacteriana de su nicho puede dejar un hueco que sea ocupado por patógenos que produzcan enfer- medades similares o más graves (McDaniel y Swiatlo, 2016, Sempere et al., 2021), lo que justificaría que la inmunización esterilizante no siempre sea un efecto positivo o beneficioso. Una de las principales preocupaciones que surgió desde la introduc- ción de las vacunas conjugadas, que afectaban la colonización de S. pneumoniae, es que fuese sustituido por patógenos invasivos respiratorios que colonizan el tracto respiratorio superior como S. aureus. Varios estudios indicaban desde principios del actual siglo que la colonización por S. aureus y S. pneumoniae es antagonista, y que la introducción de las VCN7 podía influir en un aumento de la colonización por el estafilococo (van Gils et al., 2011, Chien et al., 2013, Dunne et al., 2013). Un ensayo clínico evaluando el efecto de la VCN7 en la colonización en niños de los Países Bajos, observó que los sujetos vacunados tenían el doble de posibilidades de ser colonizados por S. aureus a los 12 meses de edad comparado con el control de no vacunados, pero este efecto podía ser transitorio (van Gils et al., 2011). En estudios epidemiológicos, esta asociación negativa entre S. aureus y S. pneumoniae se ob- servó con serotipos vacunales de la VCN7 (Regev-Yochay et al., 2004, Spijkerman et al., 2012, Chien et al., 2013, Dunne et al., 2013). Por el contrario, numerosos es- tudios encontraron que no había ninguna asociación negativa entre ambos patógenos y que la vacunación no modificaba la portación en nasofaringe del estafilococo (Cohen et al., 2007, Lee et al., 2009, Jacoby et al., 2007, Jourdain et al., 2011). Por último, un estudio de colonización en nasofaringe y oído medio de grupos vacunados con la VCN10 o la VCN13 encontró que, en el grupo de niños vacunados con la VCN13, disminuyó la colonización por S. aureus, no sólo de la nasofaringe sino tam- bién del oído medio (Leach et al., 2016). En esta Memoria, no se encontró ningún efecto perjudicial con los sueros de sujetos vacunados con la VCN13 en el sentido de afectar a la población de S. aureus formando parte de los biofilms tanto monoes- pecíficos como en el biofilm mixto con neumococo. Además, la vacunación con VCN13 reduce el biofilm monoespecie de neumococo, pero también a la población de neumococo cuando forma un biofilm mixto con S. aureus. El hecho de que la va- cuna disminuya solamente la población de neumococo en el biofilm mixto, podría indicar que, el efecto de la VCN13 reduciendo la colonización de S. pneumoniae no afecte al reemplazo de este por otro patógeno respiratorio como S. aureus. VI. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 257 1. Los serotipos 22F y 33F causantes de ENI han aumentado en los últimos años en la población adulta, siendo los clones ST43322F y ST71733F los pre- dominantes en España. 2. El porcentaje de casos de ENI por los serotipos 22F y 33F se mantiene esta- ble en los últimos años independientemente de que la ENI en España haya disminuido como consecuencia de la pandemia producida por SARS-CoV-2. 3. La mayor formación de biofilm en los aislados clínicos pediátricos de los se- rotipos 22F y 33F les podría otorgar una ventaja para colonizar la nasofaringe pediátrica favoreciendo de este modo su posible transmisión a la población adulta. 4. Los neumococos de serotipo 22F son más virulentos que los de 33F ya que evaden mejor el sistema inmune, lo que explicaría su mayor prevalencia en España. 5. El cefditoren es una cefalosporina oral que presenta una elevada actividad antimicrobiana con niveles muy bajos de CMI50 y CMI90 sin que apenas exis- tan cepas de neumococo resistentes a este antibiótico. 6. Existe un aumento de casos por serotipos no incluidos en la vacuna VNC13 con sensibilidad disminuida a penicilina y a otros antibióticos β-lactámicos. 7. El ADNe, las proteínas extracelulares y los exopolisacáridos, parecen ser im- portantes para el mantenimiento y formación del biofilm de la mayoría de los aislados clínicos de S. aureus estudiados. 8. El biofilm in vitro de S. aureus es un proceso dinámico, mostrando fases de disgregación y de mayor formación que parecen asociarse al ADNe y exopo- lisacárido. 9. El biofilm de S. aureus evade mejor la fagocitosis que el cultivo planctónico, por un mecanismo independiente de la inmunidad mediada por el sistema del complemento. CONCLUSIONES 258 10. La elevada capacidad que tiene S. aureus para formar biofilm, hace que sea necesario utilizar una mayor proporción de neumococo para obtener un bio- film mixto homogéneo de ambas bacterias in vitro. 11. La cisteamina y la N-acetil-L-cisteína son buenos candidatos para el trata- miento de los biofilms mixtos de S. aureus y S. pneumoniae. 12. El uso de compuestos como la endolisina CHAPK, el enzibiótico Cpl-711, o nanopartículas de ChiDENPs, con o sin enzibiótico, pueden ser alternativas terapéuticas frente a biofilms de patógenos respiratorios. 13. El extracto de humo de tabaco favorece la formación de biofilms por S. au- reus y neumococo lo que podría favorecer fenómenos de persistencia y cro- nicidad por ambos patógenos. 14. La vacunación con VCN13 estimula la eliminación de los biofilms neumocó- cicos producidos por serotipos vacunales lo que podría explicar por qué es eficaz generando inmunidad indirecta al prevenir el estado de portador. VII. BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 261 AARESTRUP, F. M., LARSEN, H. D., ERIKSEN, N. H., ELSBERG, C. S. & JENSEN, N. E. 1999. Frequency of α- and β-haemolysin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin. A comparison between pheno- and genotype and variation in phenotypic expression. APMIS, 107, 425-30. ADAMOU, J. E., WIZEMANN, T. M., BARREN, P. & LANGERMANN, S. 1998. 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