UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Cirugía TESIS DOCTORAL Efecto de las plaquetas en la expresión proteica de segmentos de aorta sana y preinflamada: un abordaje proteómico MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Sara González Sánchez Directores Antonio José López Farré Francisco Javier Serrano Hernando Guillermo Moñux Ducajú Madrid, 2013 © Sara González Sánchez, 2013 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRUGÍA                                                                                       EFECTO DE LAS PLAQUETAS EN LA EXPRESIÓN PROTEICA DE SEGMENTOS DE AORTA SANA Y PREINFLAMADA: UN ABORDAJE PROTEÓMICO TESIS DOCTORAL SARA GONZÁLEZ SÁNCHEZ Servicio de Angiología y Cirugía Vascular Hospital Clínico San Carlos. Madrid DIRECTORES DE TESIS: ANTONIO JOSÉ LÓPEZ FARRÉ FRANCISCO JAVIER SERRANO HERNANDO GUILLERMO MOÑUX DUCAJÚ 2013 D. ANTONIO JOSÉ LÓPEZ FARRÉ, DOCTOR EN MEDICINA Y CIRUGÍA Y JEFE DE LA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR DEL HOSPITAL CLÍNICO SAN CARLOS DE MADRID CERTIFICA: Que Doña Sara González Sánchez ha realizado bajo su dirección y supervisión la tesis titulada “EFECTO DE LAS PLAQUETAS EN LA EXPRESIÓN PROTEICA DE SEGMENTOS DE AORTA SANA Y PREINFLAMADA: UN ABORDAJE PROTEÓMICO” con objeto de obtener el Grado de Doctor en Medicina. El presente trabajo reúne las condiciones de rigor y originalidad científica para ser presentada como tesis doctoral. Y para que conste a los efectos oportunos firmo la presente certificación en Madrid a de de 2013. D. Antonio José López Farré D. FRANCISCO JAVIER SERRANO HERNANDO, DOCTOR EN MEDICINA Y CIRUGÍA Y JEFE DE SERVICIO DE ANGIOLOGÍA Y CIRUGÍA VASCULAR DEL HOSPITAL CLÍNICO SAN CARLOS DE MADRID CERTIFICA: Que Doña Sara González Sánchez ha realizado bajo su dirección y supervisión la tesis titulada “EFECTO DE LAS PLAQUETAS EN LA EXPRESIÓN PROTEICA DE SEGMENTOS DE AORTA SANA Y PREINFLAMADA: UN ABORDAJE PROTEÓMICO” con objeto de obtener el Grado de Doctor en Medicina. El presente trabajo reúne las condiciones de rigor y originalidad científica para ser presentada como tesis doctoral. Y para que conste a los efectos oportunos firmo la presente certificación en Madrid a de de 2013. D. Francisco Javier Serrano Hernando D. GUILLERMO MOÑUX DUCAJÚ, DOCTOR EN MEDICINA Y CIRUGÍA Y MÉDICO ADJUNTO DEL SERVICIO DE ANGIOLOGÍA Y CIRUGÍA VASCULAR DEL HOSPITAL CLÍNICO SAN CARLOS DE MADRID CERTIFICA: Que Doña Sara González Sánchez ha realizado bajo su dirección y supervisión la tesis titulada “EFECTO DE LAS PLAQUETAS EN LA EXPRESIÓN PROTEICA DE SEGMENTOS DE AORTA SANA Y PREINFLAMADA: UN ABORDAJE PROTEÓMICO” con objeto de obtener el Grado de Doctor en Medicina. El presente trabajo reúne las condiciones de rigor y originalidad científica para ser presentada como tesis doctoral. Y para que conste a los efectos oportunos firmo la presente certificación en Madrid a de de 2013. D. Guillermo Moñux Ducajú Esta tesis doctoral ha sido dirigida por los doctores Antonio José López Farré, Francisco Javier Serrano Hernando y Guillermo Moñux Ducajú y financiada por el Fondo de Investigaciones de la Seguridad Social (Redes Temáticas de Cooperación Red Heracles RD06/0009/010 y FIS04/1205). A mi amigo el astronauta A Luis, mamá y Dani AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS Largo y escabroso es el camino que del infierno lleva a la luz. Me gustaría expresar mi agradecimiento infinito a todos aquellos que me han ayudado de alguna manera a llegar al final de este camino. A iÑo, LaCoSaMáSbOniTaDeLuNiVeRsO. A Javier Serrano, ¡chapeau!. A Willi (o Willy, aún no me he enterado), por estar ahí desde el primer día. A todos los integrantes del Instituto Cardiovascular, en especial a Antonio, Javi, Dani, Petra y Begoña, por darme la oportunidad de realizar esta tesis, su dedicación, trabajo y compañerismo. A Mamá, por enseñarme la importancia de ser constante. A Luis, por estar ahí siempre y para todo. A Dani, mi hermano favorito (je, je). A MiLuis, Rodrigo, Ángel, Antonio y Teresa, por ser el mejor servicio que un residente pueda soñar. A Isaquito, por aguantarme desde mi nacimiento como cirujana vascular. A Capi y Miguelit, mis mayores. A Manuelit, Aniti, Mordis y Manuela, mis pequeñines. A las Golden, en especial a Lola, mi fiel confidente. A Cari, por su modelo a seguir. A Iván, por esos artículos enviados. A mis compañeros de residencia. Al quirófano de la 7ª. A las enfermeras y auxiliares de la planta y a las de quirófano y a las de urgencias y las de la UVI. A mis amigos de toda la vida. A los miembros del tribunal. A los pacientes que desinteresadamente han colaborado en este estudio. A las vacas que desinteresadamente han colaborado en este estudio…. Gracias a todos                                                                                           ÍNDICE                                           ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1. BIOLOGÍA DE LA PARED ARTERIAL……………………………………3 1.1.1. Anatomía de la pared arterial…………………………………………..3 1.1.1.1. Capa íntima…………………………………………………….3 1.1.1.2. Capa media……………………………………….……………5 1.1.1.3. Capa adventicia………………………………………………..5 1.1.2. Principales tipos celulares…………………………………….………..6 1.1.2.1. Células endoteliales……………………………………….…...6 1.1.2.2. Células musculares lisas………………………………………6 1.1.3. Estructura y sistema contráctil de la pared vascular…………….……..7 1.1.3.1. Miofilamentos………………………………………………….7 1.1.3.2. Microtúbulos…………………………………………………..10 1.1.4. Metabolismo energético de la pared vascular………………………....10 1.1.5. Hemodinámica y biología de la pared vascular………………………14 1.1.5.1. Estrés circunferencial………………………………………...14 1.2. ARTERIOSCLEROSIS: UNA ENFERMEDAD INFLAMATORIA CRÓNICA……………………………………………………………...……14 1.2.1. Estrés oxidativo. Disfunción endotelial……………….……………...14 1.2.2. Arteriosclerosis: formación y progresión de la placa de ateroma……17 1.2.2.1. Inicio de la arteriosclerosis. Adhesión leucocitaria…………17 1.2.2.2. Disregulación del tono vascular……………….………….…19 1.2.2.3. Migración de los leucocitos………………………………….20 1.2.2.4. Transformación de los leucocitos y acumulación de lípidos...22 1.2.2.5. Progresión de la placa de ateroma…………………………..24 1.2.2.6. Rotura de la placa de ateroma…………..……………….…..26 1.3. FISIOLOGÍA DE LA PLAQUETA………………………………….……...29 1.3.1. Estructura plaquetaria………………………………………………...30 1.3.1.1. Glicoproteínas plaquetarias………………………………….31 1.3.1.2. Zona de los organelos………………………………………..32 1.3.2. Activación de la plaqueta…………………………………………….34 1.3.2.1. Agonistas de la activación plaquetaria………………………36 1.3.2.2. Fases de la activación plaquetaria…………………………..39 ÍNDICE 1.4. FUNCIÓN DE LAS PLAQUETAS MÁS ALLÁ DE LA HEMOSTASIA: INFLAMACIÓN Y ARTERIOSCLEROSIS……………………………….44 1.4.1. La plaqueta como productora de mediadores bioactivos…………….45 1.4.2. La plaqueta como célula inflamatoria………………………………..46 1.4.3. Interacción de la plaqueta con distintos tipos celulares…………...…47 1.4.3.1. Células endoteliales………………………………………….47 1.4.3.2. Leucocitos………………………………………………….…48 1.4.3.3. Células progenitoras endoteliales……………………………50 1.4.4. La plaqueta en el mantenimiento de la integridad vascular…………..51 1.5. PROTEÓMICA……………………………………………………………...51 1.5.1. Fundamentos de la técnica…………………………………….……...55 1.5.1.1. Preparación de las muestras…………………………………57 1.5.1.2. Primera dimensión…………………………………………...58 1.5.1.3. Segunda dimensión…………………………………………...59 1.5.1.4. Detección de las proteínas…………………….……………...59 1.5.2. Análisis de la imagen……………………………………….………...60 1.5.3. Espectrometría de masas……………….……………………………..61 1.5.4. Futuro de la proteómica………………………………………………63 1.5.5. La era proteómica en la investigación vascular……….………...…....64 1.6. INTERACCIÓN PLAQUETA-ENDOTELIO. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS…………………………………………………………67 1.7. CONSIDERACIONES GENERALES…………….…………………...……71 2. HIPÓTESIS 73 3. OBJETIVOS 77 4. MATERIAL Y MÉTODO 81 4.1. SELECCIÓN DE PACIENTES……………………………………………..83 4.2. OBTENCIÓN DE MUESTRAS…………………………………………….84 4.2.1. Sangre periférica humana…………………………………………….84 4.2.2. Muestras de aorta bovina……………………………………………..84 4.3. AISLAMIENTO DEL PLASMA RICO EN PLAQUETAS………………....85 4.4. INCUBACIÓN DE LAS MUESTRAS DE AORTA………………………..86 4.4.1. Medio de cultivo……………………………………………………...86 ÍNDICE 4.4.2. Protocolo de preincubación de las muestras………………………….88 4.4.3. Estimulación de las muestras de aorta………………………………..89 4.4.4. Protocolo de coincubación (cocultivos)………………………………89 4.5. DETERMINACIONES DE PROTEÍNAS MEDIANTE PROTEÓMICA……………………..……………………………………….93 4.5.1. Electroforesis bidimensional…………………………………………93 4.5.1.1. Material utilizado…………………………………………….94 4.5.1.2. Preparación de las muestras…………………………………94 4.5.1.3. Primera dimensión…………………………………….……...96 4.5.1.4. Segunda dimensión………………………………………….100 4.5.1.5. Tinción………………………………………………………101 4.5.1.6. Adquisición de imágenes y análisis…………………………103 4.5.2. Espectrometría de masas……………………………………………104 4.5.2.1. Material utilizado…………………………………………...104 4.5.2.2. Método………………………………………………………105 4.5.3. Western blot…………………………………………………………109 4.5.3.1. Material empleado…………………………………………..109 4.5.3.2. Preparación de las muestras………………………………..110 4.5.3.3. Electroforesis en gel………………………………………...111 4.5.3.4. Transferencia y bloqueo de las proteínas…………….……..112 4.5.3.5. Detección de proteínas……………………………………...115 4.5.3.6. Análisis……………………………………………………...118 4.6. DETERMINACIONES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA………………..119 4.6.1. Fructosa 1,6-bifosfato aldolasa……………………………………...121 4.6.2. Triosa fosfato isomerasa…………………………………………….121 4.7. DETERMINACIONES DEL CONTENIDO DE PIRUVATO…….……...122 4.8. ESTUDIO ESTADÍSTICO…………………………………………………124 5. RESULTADOS 127 5.1. CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS RELACIONADAS CON EL CITOESQUELETO Y SISTEMA CONTRÁCTIL……………....129 5.1.1. Cambios en la expresión proteica en los segmentos de aorta normales……………………………………………………………….133 ÍNDICE 5.1.2. Cambios en la expresión proteica en los segmentos de aorta preestimulados con TNF-α……………………………………….…...136 5.2. CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS RELACIONADAS CON EL METABOLISMO ENERGÉTICO………………………...…..…138 5.2.1. Cambios en la expresión proteica en los segmentos de aorta normales……………………………………………………………….140 5.2.2. Cambios en la expresión proteica en los segmentos de aorta preestimulados con TNF-α………………………………………....….142 5.2.3. Cambios en la expresión proteica mediante western blot…….……..143 5.3. DETERMINACIONES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA………………..145 5.4. DETERMINACIONES DEL CONTENIDO DE PIRUVATO…………….147 5.4.1. Contenido de piruvato en los segmentos de aorta sana……………..147 5.4.2. Contenido de piruvato en los segmentos de aorta preinflamados…..148 6. DISCUSIÓN 149 6.1. MODIFICACIÓN EN LA EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS RELACIONADAS CON EL CITOESQUELETO Y EL SISTEMA CONTRÁCTIL……………………………………………………………..153 6.2. MODIFICACIÓN EN LA EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS RELACIONADAS CON EL METABOLISMO ENERGÉTICO…………157 6.3. LIMITACIONES DEL ESTUDIO……........................................................162 7. CONCLUSIONES 165 8. BIBLIOGRAFÍA 169 9. APÉNDICES 211 A. NIVELES DE EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL CITOESQUELETO…………………………………………………………….213 B. NIVELES DE EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL METABOLISMO ENERGÉTICO…...219 C. ABREVIATURAS…………………………………………………………..223 D. ABSTRACT…………………………………………………………………230     1 “Reading maketh a full man; conference a ready man; but writing an exact man” Francis Bacon INTRODUCCIÓN                       2                             1. INTRODUCCIÓN 3 1. INTRODUCCIÓN 1.1. BIOLOGÍA DE LA PARED ARTERIAL 1.1.1. Anatomía de la pared arterial La pared arterial posee una estructura común en todo el árbol arterial, estando conformada por un tejido conectivo organizado en el que se incluyen células y una matriz de fibras dispuestas en tres capas: la íntima, la media y la adventicia (Fig. 1.1). CAPA ÍNTIMA CAPA MEDIA CAPA ADVENTICIA Figura 1.1. Anatomía de la pared vascular. Estructura de las capas íntima, media y adventicia. 1.1.1.1. Capa íntima La capa íntima es la capa más interna de la arteria y se extiende desde la luz del vaso hasta la lámina elástica interna. Está compuesta por el endotelio, una capa subendotelial de tejido conjuntivo y una capa elástica o fenestrada. 1. INTRODUCCIÓN 4 El endotelio está constituido por una serie de células poligonales, ovaladas o fusiformes, que se encuentran en contacto directo con el torrente sanguíneo. La superficie luminal es lisa y regular1. Esta capa constituye un revestimiento continuo con propiedades antitrombóticas debido a la existencia de una capa de glicoproteínas o glucocálix cubriendo dichas células endoteliales2. El glucocálix, además, reduce la fricción del flujo sanguíneo y sirve como barrera para evitar la pérdida de líquido a través de la pared vascular. En los procesos inflamatorios el glucocálix de las células se rompe para permitir el acceso de los leucocitos y puede ser el origen de lesiones ateroscleróticas3. Las células endoteliales (CE) se encuentran típicamente alineadas en la dirección del flujo sanguíneo y las uniones entre ellas son de gran importancia como fuerza mecánica y para la permeabilidad de la capa. De hecho, existen zonas de unión firme entre las células, la zona occludens (uniones herméticas) y la zona adherens (uniones adherentes). Estas uniones herméticas constituyen un barrera de transporte entre las células y ayudan a mantener la polaridad de la membrana2. Inmediatamente externa al endotelio se encuentra la lámina basal, que actúa como soporte mecánico y para la regeneración de las CE. Esta membrana posee un papel fundamental en la permeabilidad vascular, está involucrada en la formación del trombo y constituye un barrera para la migración celular4. La lámina basal está formada por glicoproteínas, moléculas de adhesión como la laminina y la fibronectina, proteoglicanos y microfibrillas de colágeno tipo IV y V5. La capa reticular subyacente al endotelio está compuesta por colágeno tipo I y III producido por las CE y las células musculares lisas (CML). 1. INTRODUCCIÓN 5 Durante el funcionamiento normal, la monocapa de endotelio se encuentra en un estado quiescente y las uniones célula-célula inhiben la proliferación, lo que resulta en un bajo índice mitótico y contribuye a la estabilidad e integridad de la pared vascular6. 1.1.1.2. Capa media La capa media se extiende desde la lámina elástica interna hasta la adventicia. Está constituida por CML, elastina y fibras de colágeno perfectamente ordenadas7. Las capas de CML forman grupos de células con una orientación similar, rodeados por una lámina basal común en íntima relación con un entramado de fibras de colágeno tipo III. Este sistema altamente integrado implica que un elemento no puede extenderse sin extensión de otro. 1.1.1.3. Capa adventicia La adventicia se extiende desde la lámina elástica externa hasta el tejido conectivo perivascular contiguo. Esta capa contiene los vasa vasorum y estructuras nerviosas, que proporcionan nutrición a la adventicia y contribuyen a la regulación de la función de la CML de la capa media, respectivamente. Las fibras vasomotoras inducen vasodilatación mediante receptores β adrenérgicos y vasoconstricción mediante α adrenérgicos. El estímulo nervioso se transmite a las CML más externas mediante uniones neuromusculares y, posteriormente, la señal es transmitida a las más internas por señales eléctricas entre células adyacentes (Fig. 1.1). 1. INTRODUCCIÓN 6 1.1.2. Principales tipos celulares 1.1.2.1. Células endoteliales La superficial arterial en contacto con el torrente sanguíneo, o superficial luminal, está cubierta por el endotelio, como se ha indicado con anterioridad. Las CE son muy activas metabólicamente, desempeñando un importante papel en muchas funciones fisiológicas como el control de tono vasomotor, adhesión de determinados tipos celulares, el balance hemostático, permeabilidad, proliferación y la inmunidad innata y adaptativa. Para mantener la fluidez de la sangre, las CE expresan un a serie de factores que mantienen los mecanismos de formación del trombo controlados mientras se mantenga la integridad de la pared. El carácter antitrombótico del endotelio se debe en parte a su superficie aniónica proporcionada por la alta proporción de heparán sulfato y condroitín sulfato. Las células previenen la agregación plaquetaria a través de la actividad ADP-asa de la superficie, la síntesis de prostaglandinas y la liberación de óxido nítrico (NO). El normal funcionamiento de este sistema permite un balance entre los mecanismos pro- y antitrombóticos a favor de la anticoagulación. 1.1.2.2. Células musculares lisas La principal función de las CML consiste en mantener una presión y flujo normales en los vasos sanguíneos mediante el control del calibre de los mismos por contracción y relajación. Son responsables de la remodelación vascular, proliferación, migración y expresión proteica. Sintetizan componentes como el colágeno, la elastina, 1. INTRODUCCIÓN 7 glicoproteínas y proteoglicanos, que contribuyen a la elasticidad de la pared vascular. Estos cambios ocurren en respuesta a situaciones crónicas, como la arterioesclerosis. 1.1.3. Estructura y sistema contráctil de la pared vascular La composición del citoesqueleto consiste principalmente en tres tipos de estructuras fibrosas: los miofilamentos, los microtúbulos y los filamentos intermedios. Estas estructuras mantienen la forma y polaridad celular, así como también contribuyen a otras funciones celulares fundamentales como la motilidad, el transporte de los organelos y la mitosis8. De hecho, se ha sugerido que el citoesqueleto de actina intacto es uno de responsables fundamentales de la organización celular9, ya que constituye un resistente soporte intracelular que permite organizar importantes proteínas de membrana en la célula. Tiene la capacidad de responder a estímulos extracelulares y llevar a cabo una reorganización10. Además, algunos estudios han demostrado que numerosas proteínas solubles pueden estar asociadas al citoesqueleto9. Todos estos datos sugieren una función del mismo como regulador del medio ambiente dentro de la célula, y no sólo una mera acción estructural. 1.1.3.1. Miofilamentos Los microfilamentos están constituidos en su mayor parte por la proteína actina, que constituye el 5-15% de las proteínas totales de la célula endotelial. El citoesqueleto de actina es altamente dinámico. Puede encontrarse como monómero en forma libre (actina G) o como parte de polímeros lineales denominados microfilamentos (actina F). En las células se conocen tres tipos principales de actina codificados por distintos 1. INTRODUCCIÓN 8 genes: α, β y γ10. A su vez, la actina α (la más ácida) presenta cuatro isoformas: la del músculo estriado, la del miocardio, la del músculo liso vascular y la del músculo liso no vascular. Las actinas β y γ se encuentran en todas las células, musculares y no musculares. La actina se acompaña de otras proteínas. Una de ellas es la tropomiosina, formada por una doble hélice de cadenas no globulares: la cadena α y la cadena β. La función principal de la tropomiosina es bien conocida en la contracción muscular: bloquear la unión de la miosina, pero no en el propio citoesqueleto. Estudios de manipulación genética y química de proteínas han confirmado la existencia de 40 isoformas funcionalmente distintas11. Cada isoforma parece constituir un potente mecanismo de diversidad de acción de los filamentos de actina12. Los filamentos gruesos están constituidos fundamentalmente de miosina, una proteína fibrilar con actividad ATPasa y, por tanto, capaz de hidrolizar el ATP en ADP y Pi (ión fosfato) y producir la contracción muscular13. La miosina está compuesta por dos cadenas pesadas idénticas y cuatro cadenas ligeras. En la pasada década, el dominio LIM (denominación proveniente de las tres primeras proteínas descritas: Lin-11, Isl-1 y Mec-3) surgió como un conjunto de dominios de proteínas de diferentes características y diversas funciones. Las proteínas LIM no forman una familia funcional, aunque presentan un denominador común, que es la actuación como mediadoras de la interacción entre proteínas del núcleo y del citoplasma. Los grupos 2 y 3 son de predominio citoplasmático y están asociados con el citoesqueleto de actina14. Se ha demostrado que modulan la interacción entre las 1. INTRODUCCIÓN 9 proteínas del citoesqueleto, representando un papel en la transducción de señales y en la organización de los filamentos de actina durante determinados procesos celulares15. Otras proteínas relacionadas con el citoesqueleto de actina son la familia de las anexinas. Se trata de una familia multigénica de proteínas de unión calcio- dependiente con una arquitectura única que les permite acoplarse a las membranas de manera reversible16. Se ha propuesto que las anexinas actúan como puntos de unión membrana-membrana o membrana-citoesqueleto, interviniendo en procesos de exocitosis calcio-dependiente, en algunos aspectos de procesos de endocitosis y en la estabilización de dominios específicos de la membrana de los organelos y de la membrana plasmática16. Monastyrskaya et al17 demostraron que estas proteínas interactúan con la membrana plasmática y otras membranas de los sistemas internos de una manera coordinada. Sin embargo, otras funciones potenciales son la capacidad de unión al DNA de algunas anexinas18 o la unión a nucleótidos específicos19. La anexina A1 es la que tiene una historia más larga de publicaciones de actividad extracelular. Está presente en el suero humano, especialmente en escenarios inflamatorios20,21. La anexina A2 se ha encontrado en la superficie de las células endoteliales y de los leucocitos, pudiendo actuar como receptora del plasminógeno y del tPA y actuando de modulador positivo en la cascada fibrinolítica22. Las funciones concretas de cada anexina son poco conocidas, en especial, la de las anexinas A4 y A5. Esta última parece estar relacionada con la inhibición de la coagulación sanguínea por competición con la trombina e inhibición de la actividad de la fosfolipasa A1. La transgelina/SM22 también es una proteína relacionada con los filamentos de actina del citoesqueleto. Esta calponina (proteína cuya función es la inhibición de 1. INTRODUCCIÓN 10 la ATP-asa de la miosina del músculo liso) se localiza en la pared vascular y en el músculo liso, siendo un marcador temprano de diferenciación del músculo liso. Aunque se desconoce su abanico de acción, parece estar relacionada con la contractilidad y se cree que presenta cierta actividad como supresora de tumores23. 1.1.3.2. Microtúbulos Los microtúbulos intervienen en diversos procesos celulares como el desplazamiento de vesículas, movimiento de orgánulos, transporte intracelular de sustancias y la división celular. Los microtúbulos son heteropolímeros de tubulina α y β. Estas proteínas se relacionan con la segregación de los cromosomas, la división celular, el mantenimiento de la forma celular y el transporte intracelular. Se han demostrado cambios cuantitativos en los componentes del citoesqueleto como mecanismo compensatorio durante condiciones patológicas24. El factor de necrosis tumoral α (TNF-α) es una citoquina pleiotrópica que ha demostrado ser capaz de reducir la barrera que constituye el citoesqueleto de las CE25,26 por inducción de la apoptosis27 y por mecanismos no apoptóticos28, reduciendo la transcripción de las proteínas de unión intercelulares29. 1.1.4. Metabolismo energético de la pared vascular El metabolismo energético está constituido por un conjunto de reacciones bioquímicas y procesos físicoquímicos que ocurren en la célula. Entre estos complejos procesos interrelacionados, la glucolisis constituye la principal fuente de 1. INTRODUCCIÓN 11 energía celular a través de la oxidación de la glucosa en el citosol (Fig. 1.2). Esta ruta universal consta de diez reacciones agrupadas en dos fases30: Figura 1.2. Esquema de las diez reacciones que constituyen la vía glucolítica, con los sustratos, productos y enzimas catalizadoras. Fuente: www.wikipedia.es. 1. Fase de gasto o aporte energético • Reacción 1. Fosforilación de la glucosa. El primer paso de la glucolisis consiste en la activación de la glucosa mediante la transferencia de un grupo fosfato del ATP por la enzima hexoquinasa. Como consecuencia se forma la glucosa-6-fosfato (G6P). • Reacción 2. Isomerización de la glucosa-6-fosfato. En esta fase la G6P se isomeriza a fructosa-6-fosfato (F6P) mediante una reacción de cuatro pasos, que implica la apertura del anillo de la G6P y posterior ciclado en la forma furanosa (F6P). 1. INTRODUCCIÓN 12 • Reacción 3. Fosforilación de la fructosa-6-fosfato. La fosfofructoquinasa- 1 fosforila el carbono 1 de la F6P (obteniendo la fructosa 1,6-bifosfato), constituyendo éste el principal punto de control de la glucolisis debido a su irreversibilidad. • Reacción 4. Fragmentación de la fructosa 1,6-bifosfato. Una enzima clave en la vía glucolítica es la fructosa 1,6-bifosfato aldolasa, que escinde la fructosa 1,6-bifosfato en dos triosas fosfato: la dihidroxiacetona-fosfato (DHAP) y el gliceradehído-3-fosfato (G3P). • Reacción 5. Isomerización de la dihidroxiacetona-fosfato. Otra enzima fundamental en el proceso de la glucolisis es la implicada en esta reacción: la triosa fosfato isomerasa (TPI). La TPI representa un importante papel en la producción de energía por la célula. Su función es isomerizar la DHAP en otra molécula de G3P. 2. Fase de obtención de energía • Reacción 6. Oxidación y fosforilación del D-gliceraldehído-3-fosfato. Esta reacción es catalizada por la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, oxidando el G3P mediante la utilización de NAD+ para añadir un ion fosfato a la molécula y obteniendo el 1,3-bifosfoglicerato. • Reacción 7. Cesión de un grupo fosfato del 1,3-bifosfoglicerato al ADP. En este paso la enzima fosfoglicerato quinasa transfiere el grupo fosfato del 1,3-bifosfoglicerato a una molécula de ADP, generando así la primera molécula de ATP de la vía (y el 3-fosfoglicerato). • Reacción 8. Isomerización del 3-fosfoglicerato. La enzima fosfoglicerato mutasa isomeriza el 3-fosfoglicerato procedente de la reacción anterior, dando el 2-fosfoglicerato. 1. INTRODUCCIÓN 13 • Reacción 9. Deshidratación del 2-fosfoglicerato. En este paso se produce una pérdida de una molécula de agua del 2-fosfoglicerato para dar lugar al ácido fosfoenolpirúvico (PEP). La enzima encargada de catalizar esta reacción es la enolasa. • Reacción 10. Cesión de un grupo fosfato al ADP. La última reacción de la glucolisis es catalizada por la piruvato quinasa y da lugar al piruvato por la cesión de un grupo fosfato del PEP al ADP. El anión piruvato es un compuesto orgánico clave en el metabolismo energético y puede seguir dos caminos: 1, si hay suficiente suministro de oxígeno, el ácido pirúvico es descarboxilado en la matriz de la mitocondria por el complejo enzimático piruvato deshidrogenasa rindiendo CO2 y acetil coenzima A, que es el inicio del ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa; 2, si no hay suficiente cantidad de oxígeno disponible, el piruvato sigue una ruta anaeróbica, la fermentación, que culmina en la producción de ácido láctico. En el proceso metabólico de obtención de energía mediante la fosforilación oxidativa adquiere gran importancia el complejo ATP sintasa, situado en la cara interna de la membrana interna de las mitocondrias. Su función fundamental es la de sintetizar ATP a partir del ADP y un grupo fosfato y de la energía suministrada por un flujo de protones (H+). Esta enzima está formada por dos principales complejos, el F0 y el F1. A su vez, el complejo F1 está formado por tres dímeros αβ. La mayor parte del sitio catalítico reside en la cadena β31. 1. INTRODUCCIÓN 14 1.1.5. Hemodinámica y biología de la pared vascular 1.1.5.1. Estrés circunferencial El estrés normal al que está sometida la pared vascular es la presión pulsátil y el flujo variable durante el ciclo cardíaco. Las CE son las afectadas en un primer tiempo, mientras que los cambios a largo plazo, por una agresión mantenida, pueden afectar a la totalidad de la pared vascular. Las CE se van alineando en la dirección del el estrés, y cuanto mayor es el estrés, mayor es la elongación de las células32,33. Estos cambios producen una redistribución de las fibras intracelulares así como variaciones de la cantidad. En áreas sometidas a gran estrés, las CE expresan mayores cantidades de actina, miosina y otras proteínas del sistema contráctil. 1.2. ARTERIOESCLEROSIS: UNA ENFERMEDAD INFLAMATORIA CRÓNICA 1.2.1. Estrés oxidativo. Disfunción endotelial Diferentes estudios han asociado al estrés oxidativo en la patogenia de muchas enfermedades cardiovasculares, como la hipertensión, la arteriosclerosis y la insuficiencia cardiaca congestiva. Esta situación es causada por un desequilibrio entre la producción de especies de oxígeno reactivo (del inglés ROS), que incluyen los radicales libres de oxígeno y los peróxidos, y la capacidad de detoxificar rápidamente los reactivos inmediatos o reparar el daño resultante. Durante el metabolismo aerobio se generan constantemente pequeñas cantidades de ROS, incluyendo radicales hidroxilo, aniones superóxido y peróxido de hidrógeno, como respuesta a estímulos internos y externos. Estas mínimas concentraciones de ROS pueden ser 1. INTRODUCCIÓN 15 indispensables en muchos procesos, como el sistema de señales intracelulares (proliferación celular, apoptosis…), la inmunidad y la defensa contra organismos. Todas las células mantienen un entorno reductor gracias a enzimas que sostienen este estado reducido a través de un constante aporte de energía metabólica. Las fuentes de ROS incluyen componentes de la cadena de transporte de electrones mitocondrial- xantina oxidasa, ciclooxigenasa, lipooxigenasa, hemooxigenasa, NADH/NADPH oxidasa y NO sintasa. Altas dosis o una eliminación inadecuada de ROS dan lugar a una situación de estrés oxidativo, que puede causar graves disfunciones metabólicas y daños en macromoléculas biológicas. Por ello, es necesario que se mantenga un estricto equilibrio en los niveles sistemas antioxidantes enzimáticos y varios tipos de mediadores (factores de crecimiento, prostaglandinas y NO). Entre las enzimas antioxidantes destacan la superóxido dismutasa, la glutatión peroxidasa y catalasa y el glutatión. La producción de ROS es una alteración comúnmente asociada a la arteriosclerosis. Bajo una situación de estrés oxidativo, la vida media del NO se reduce y la formación del anión peroxinitrito induce una peroxidación lipídica, disrupción de las membranas celulares, la señalización y la supervivencia celular34,35. La disfunción endotelial se considera una de las primeras manifestaciones de las enfermedades cardiovasculares, en especial la arteriosclerosis. Como se ha mencionado con anterioridad, el endotelio no es una mera capa de células que recubre la pared luminal de los vasos sanguíneos, sino una estructura altamente especializada, metabólicamente activa, que regula la interacción de las células y las proteínas circulantes con las células de la propia pared, ejerciendo un papel clave como sensor y 1. INTRODUCCIÓN 16 transmisor de señales. Diversos factores pueden producir una modificación en las funciones del endotelio y provocar lo que se ha denominado disfunción endotelial. La disfunción endotelial puede definirse como un desequilibrio en la biodisponibilidad de sustancias activas de origen endotelial que predispone a la inflamación, la vasoconstricción y al incremento de la permeabilidad vascular y que puede facilitar el desarrollo de arterosclerosis, agregación plaquetaria y trombosis36,37,38. El endotelio permite un tráfico selectivo de macromoléculas, pero cuando se produce este desequilibrio se observa una pérdida progresiva para controlar el paso de determinadas macromoléculas hacia el interior, como el fibrinógeno y las proteínas de baja densidad (LDL). Este incremento en la permeabilidad parece vinculado con un proceso de contracción celular mediado por calcio y con una desorganización del citoesqueleto celular39. El paso de LDL a través del endotelio se produce a favor de gradiente de concentración mediante un proceso de transcitosis no mediado por receptor40. Se cree que la desorganización de las fibras de actina y la inhibición de la fosfatasa de la cadena ligera de la miosina es el efecto que facilita este tránsito41. La disfunción endotelial implica una alteración profunda de su patrón de expresión génica, lo que conlleva la inducción de genes que, en condiciones fisiológicas, estarían reprimidos y la inhibición de otros expresados en condiciones 1. INTRODUCCIÓN 17 normales39. En este sentido, se produce una diferente modulación de la expresión proteica de las células endoteliales. 1.2.2. Arteriosclerosis: formación y progresión de la placa de ateroma 1.2.2.1. Inicio de la arteriosclerosis. Adhesión leucocitaria El inicio y progresión de la arteriosclerosis están caracterizados por la acumulación de monocitos y linfocitos-T en la pared arterial. La activación del endotelio conlleva la expresión/secreción de citoquinas, como la interleuquina 1 (IL-1), los factores de crecimiento derivados de las plaquetas (PDGF), el fibroblástico básico (bFGF) y los factores quimiotácticos (proteína 1 quimiotáctica para monocitos [MCP-1]), y la exposición de proteínas de superficie que actúan como moléculas de adhesión (CAM) para receptores específicos de leucocitos circulantes42,43. Los grupos de moléculas más importantes de CAM implicados en este proceso son las selectinas (denominadas así por su similitud con la familia de las lectinas) y la superfamilia de las inmunoglobulinas. Mientras que las selectinas median en la adhesión transitoria de los leucocitos con el endotelio, las inmunoglobulinas median en una unión más sostenida. Dentro de las selectinas destaca el papel de la P-selectina, la cual parece estar involucrada en procesos iniciadores de aterogénesis, ya que está sobreexpresada en placas de ateroma humanas44. Dentro de las inmunoglobulinas destaca la VCAM-1 (molécula de adhesión vascular -1), una molécula de adhesión endotelial-leucocitaria que parece ser una de las principales moléculas para la adhesión temprana de leucocitos al endotelio arterial en lugares de iniciación de la placa de ateroma45. Distintos estudios en animales muestran que la VCAM-1 se expresa temporalmente 1. INTRODUCCIÓN 18 en sitios de formación de lesiones ateromatosas, como ocurre en conejos alimentados con una dieta rica en colesterol y en ratones deficientes en apolipoproteína E46,47. El proceso de adhesión comienza con el deslizamiento de los leucocitos por la superficie endotelial, la posterior adhesión y, finalmente, la transmigración. La fase de rodamiento y adhesión es el resultado de una interacción específica entre los leucocitos y las moléculas de adhesión expresadas por el endotelio. El evento desencadenante de la expresión de receptores linfocitarios en las CE es la acumulación de lipoproteínas oxidadas de baja densidad (LDLox). Estas LDLox parecen ser uno de los factores proinflamatorios más importantes durante los procesos arterioscleróticos48. El efecto proinflamatorio de las moléculas de LDLox implica la aparición de peróxidos y otra serie de radicales libres. Las LDLox junto con aldehídos de cadena pequeña y citoquinas proinflamatorias como la IL-1 son capaces de producir una alteración profunda en el patrón de expresión génica de las CE, lo que conlleva la inducción de genes que en condiciones fisiológicas estarían inhibidos (Fig. 1.3). En los últimos años se han acumulado evidencias que subrayan la relevancia del factor de transcripción nuclear κB (NF-κB) como común denominador en la expresión coordinada de genes inducidos por estas moléculas proinflamatorias49,50. El NF-κB posee un papel fundamental en el desarrollo de la respuesta inflamatoria e inmunitaria, controlando la transcripción de genes que codifican para multitud de moléculas como interleuquinas (IL-1, IL-6 e IL-8), el TNF-α, factores estimuladores de la formación de colonias de granulocitos/macrófagos (G-CSF, M-CSF, GM-CSF), varias moléculas de adhesión (ICAM-1, VCAM-1)51, antígenos de clase II y anticuerpos52,53. 1. INTRODUCCIÓN 19 DISFUNCIÓN ENDOTELIAL INFLAMACIÓN LDLox ! peroxinitritos, radicales libres Aldehídos de cadena pequeña Citoquinas proinflamatorias Activación NF-kB Función vasodilatadora Función vasoconstrictora Activación endotelial Figura 1.3. Esquema de los procesos iniciadores de la aterogénesis. 1.2.2.2. Disregulación del tono vascular El NO, sintetizado por el endotelio, es una de las molécula que puede clasificarse como ateroprotectora, ya que posee un efecto vasodilatador, antiagregante plaquetario, inhibidor de la proliferación de las CML, antioxidante e inhibidor de la expresión de las CAM (IL-1 e interferón γ [INF-γ]54) y de la adhesión de monocitos a la pared arterial. A nivel transcripcional, el NO induce la expresión de IκB, el inhibidor endógeno de NF-κB, inhibiendo los efectos proinflamatorios de NF-κB. Por ello, al ser una molécula clave en numerosos procesos homeostáticos locales, cuando se produce una alteración en su producción se favorece el desarrollo de lesiones arterioscleróticas. La traducción más temprana de un endotelio disfuncionante es la disminución de la capacidad vasodilatadora, como se ha demostrado en pacientes con diversos 1. INTRODUCCIÓN 20 factores de riesgo cardiovascular55. Se piensa que la oxidación de moléculas de LDL puede ser modulada por el NO y sus productos. A su vez, las LDLox pueden inhibir la producción de NO por diferentes mecanismos: 1, disminución de la actividad de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), como se ha demostrado en estudios in vitro56; 2, aumento de la degradación del NO57; 3, aumento de la fracción de eNOS unida a caveolina (por tanto, insensible a la regulación por calcio-calmodulina58). La importancia in vivo de estos mecanismos de diminución del NO se demuestra por la menor expresión de la eNOS en lesiones arterioscleróticas59. En condiciones de flujo laminar, las CE están sometidas a un estrés continuo que promueve una actividad continua de la eNOS, produciendo una síntesis basal de NO. Diferentes autores afirman que esta producción basal de NO protegería al endotelio ante estímulos aterogénicos. Por el contrario, en aquellas zonas en las que existe un flujo turbulento, como en las bifurcaciones arteriales, se produciría una alteración en la actividad de la eNOS, predisponiendo a estas zonas a la formación de una lesión arteriosclerótica. Esta teoría podría explicar por qué las zonas de ramificación arterial están más predispuestas a la formación de placas de ateroma60,61. 1.2.2.3. Migración de los leucocitos Como se ha mencionado con anterioridad, la actividad inflamatoria desencadenada por la acumulación de LDLox estimula en las CE la producción de distintas moléculas proinflamatorias, como la ICAM-1, VCAM-1, P-selectina o E- selecina. El rodamiento representa la interacción entre los leucocitos y las selectinas, con la consiguiente adhesión, en la que toman parte las inmunoglobulinas (ICAM y 1. INTRODUCCIÓN 21 VCAM). La sobreexpresión de las CAM, junto con la inducción de sustancias quimioatrayentes como la MCP-1, facilita la unión y la migración de los monocitos al espacio subendotelial62,63. La consecuencia final es una acumulación de monocitos en la pared vascular secundaria a la situación proinflamatoria. Otras moléculas de adhesión importantes incluidas en los monocitos incluyen integrinas, la Mac-1 (CD11b/CD18) o el antígeno muy tardío 4 y la molécula celular 1 de adhesión a plaquetas/endotelio. Otras moléculas de la superfamilia de la C-X-C quimioquinas, como la IL-8, el factor de crecimiento regulador de oncogenes (GRO), el IFN-γ o el factor plaquetario 4 (PF4), son ampliamente reconocidas como predominantes quimioatrayentes de neutrófilos y/o linfocitos64,65. Boisvert et al66 demostraron que la IL-8 posee un papel fundamental en la localización de los macrófagos en las lesiones arterioscleróticas y su progresión. La eotaxina es una quimioquina CC cuya sobreexpresión en estas lesiones se relaciona con el reclutamiento de mastocitos67. Estudios previos han demostrado la presencia de linfocitos T CD4+ e IFN-γ tanto en lesiones arterioscleróticas humanas como de ratón68. El IFN-γ posee un papel crítico en la modulación de la respuesta inmune estimulando la producción de citoquinas proinflamatorias (IP-10, MIG, I-TAC y citoquinas CXC), moléculas de adhesión en las células endoteliales, CML y macrófagos. El IFN-γ también estimula la expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase II en las CML, activando a más linfocitos T y macrófagos y produciéndose así un feed-back positivo. Por tanto, una vez reclutados, los linfocitos pueden perpetuarse y amplificar la respuesta inflamatoria inicial. 1. INTRODUCCIÓN 22 1.2.2.4. Transformación de los leucocitos y acumulación de lípidos En los últimos años, el importante papel de la inflamación en la arteriosclerosis se ha centrado en el sistema inmune. La inmunidad innata representa el primer paso en la respuesta inflamatoria y está basada en los macrófagos y las células dendríticas69. Una vez los monocitos reclutados pasan al espacio subendotelial de la pared arterial adquieren las características morfológicas de los macrófagos y posteriormente sufren una serie de cambios que les llevan a la formación de células espumosas. En el desarrollo de la arteriosclerosis, los receptores más importantes para la inmunidad innata son los llamados receptores scavenger y los toll-like receptors (TLR)70. Rosenfeld et al71 demostraron la expresión de mRNA y la presencia de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) en lesiones ateroscleróticas en humanos y conejos. El M-CSF es una glicoproteína expresada por distintos tipos celulares como monocitos y macrófagos, CE, fibroblastos y linfocitos72,73,74,75 y constituye una de las principales moléculas en la transformación de los monocitos. En un primer tiempo, los receptores scavenger SR-A y CD-36 son los responsables del reclutamiento de las LDLox y la transformación de los macrófagos en células espumosas76,77. Además, se produce la activación del NF-κB, lo que desencadena un potente ciclo quimioatrayente de monocitos y formación de macrófagos/células espumosas (MCP-1, leucotrieno LTB4). El M-CSF aumenta la expresión de receptores scavenger SR-A, citoquinas y factores de crecimiento, promoviendo la diferenciación y proliferación de las células espumosas78. Junto con el incremento de SRA se produce un aumento en la expresión de CD36, lo que favorece la internalización por los monocitos de las lipoproteínas modificadas como ésteres de 1. INTRODUCCIÓN 23 colesterol de compartimentos celulares. Finalmente, estos macrófagos cargados de lípidos se denominan células espumosas y son característicos de las lesiones arterioscleróticas. A su vez, estos macrófagos modificados producen citoquinas que activan a las CML circundantes, resultando en formación de colágeno y fibrosis79 (Fig. 1.4). Figura 1.4. Etapas de la formación de la placa arteriosclerótica. 1 y 2, entrada de las lipoproteínas en el espacio subendotelial y oxidación. 3, 4 y 5, liberación de factores de crecimiento y citoquinas que promueven la diapédesis de monocitos y su diferenciación en macrófagos. 6, formación de células espumosas por la internalización de lipoproteínas modificadas y oxidadas. 7, establecimiento de la estría grasa por la acumulación de células espumosas (Modificado de Faxon et al80). El factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) también puede promover la inflamación en las lesiones arterioscleróticas, ya que ayuda a la supervivencia de fagocitos mononucleares que contienen mieloperoxidasa (MPO). La MPO es una enzima que da lugar a un aumento de un ácido prooxidante, el ácido hipocloruro, el cual es una importante fuente de estrés oxidativo e inflamación en la placa de ateroma humana81. Schönbeck et al82 demostraron la implicación del CD40 y su ligando CD40L (CD154) tanto en los estadios iniciales de la arteriosclerosis como en el desarrollo de lesiones avanzadas. El CD40 ligando no sólo está presente en los linfocitos B, sino 1. INTRODUCCIÓN 24 también en los monocitos, macrófagos y CE, sugiriendo una amplia función in vivo. Henn et al83 demostraron la expresión de CD40L en las plaquetas a los pocos segundos de su activación in vitro y durante la formación del trombo in vivo. Del mismo modo que el TNF-α y la IL-1, el CD40L en las plaquetas induce la secreción de quimioquinas por las CE y la expresión de moléculas de adhesión para el reclutamiento y extravasación de leucocitos en la zona de la lesión. Estos resultados indican que las plaquetas no sólo están implicadas en la hemostasia, sino directamente en la iniciación de la respuesta inflamatoria en la pared arterial. La inmunidad adaptativa es mucho más específica que la innata, pero puede tardar de días a semanas hasta estar completamente desarrollada. Se basa en la generación de receptores de linfocitos T y B e inmunoglobulinas que reconocen antígenos en la placa de ateroma. La inmunidad adaptativa constituye la base de grandes avances en el futuro cercano, como la inmunización y el desarrollo de fármacos inmunosupresores. 1.2.2.5. Progresión de la placa de ateroma Solo las CE, los macrófagos y algunas células T participan en el desarrollo de la estría grasa, la lesión arteriosclerótica más temprana y asintomática. La exposición continua a factores de riesgo crea un ambiente proaterogénico que produce un incremento mayor de la quimiotaxis de monocitos y por tanto una mayor acumulación de lípidos en la placa. En el progreso de la enfermedad, la respuesta inmunoinflamatoria se asocia a una respuesta inmunoproliferativa mediada por las CML, que son las encargadas de la reparación del daño arterial. Como ocurre habitualmente, el estímulo 1. INTRODUCCIÓN 25 se mantiene durante el curso de años, con lo que la respuesta reparadora puede hacerse muy voluminosa, ir invadiendo el lumen de la arteria y, finalmente, producir un cuadro de isquemia del territorio afectado84. Sin embargo, las CML y la matriz extracelular de colágeno que producen confieren estabilidad a las placas, protegiéndolas contra complicaciones como la rotura y trombosis85. Cuando se produce la descamación de CE vasculares las plaquetas se adhieren a la lesión, activándose y degranulando sustancias fibrogénicas, como el PDGF, promoviendo la proliferación de CML y la acumulación de matriz extracelular86,87. El PDGF aumenta la síntesis de colágeno y con ello se favorece un aumento de la capa fibrosa de la placa de ateroma. Los leucocitos infiltrados en la lesión y las CE también pueden producir PDGF. Las plaquetas también son capaces de sintetizar factor de crecimiento transformante β (TGF- β), el cual también fomenta la proliferación de CML y la producción de colágeno intersticial. Durante la progresión de la arteriosclerosis, las CE, los macrófagos y las CML van muriendo por apoptosis o necrosis. La apoptosis contribuye a la acción del factor tisular (TF) y a la trombogenicidad del core lipídico de la placa88. La calcificación focal en las placas de arteriosclerosis es muy común y se incrementa con la edad89. En los procesos de mineralización están implicadas las CML vasculares90, debido a su capacidad para producir osteopontina, una proteína involucrada en la formación de hueso y la mineralización91,92. Miembros de la familia del factor transformante también pueden favorecer la mineralización de la placa93. 1. INTRODUCCIÓN 26 1.2.2.6. Rotura de la placa de ateroma La rotura de una placa de ateroma, y la consiguiente trombosis, es la responsable del inicio de muchos síndromes isquémicos agudos. Existen dos mecanismos que independientemente o en conjunción determinan la rotura de la placa. El primero está relacionado con fuerzas físicas y acontece más frecuentemente cuando la capa fibrosa es más fina y cuando está más intensamente infiltrada por células espumosas. El segundo mecanismo se relaciona con la actividad intraplaca de los macrófagos94 y mastocitos95, que degradan la matriz extracelular por fagocitosis o liberación de enzimas proteolíticas (por ejemplo, metaloproteasas). Por tanto, se ha considerado que la composición y el estado de la placa, más que el grado de estenosis, son los principales responsables de la enfermedad aterotrombótica96,97,98. En las últimas décadas se han observado importantes avances en el estudio de los eventos isquémicos agudos, considerándose un factor muy importante el estudio de la lesión precursora de la trombosis. La interrupción del flujo sanguíneo en la arteria enferma puede producirse por tres mecanismos distintos99, como se observa en la Figura 1.5: Primero, la erosión de la placa, definida como la formación aguda de trombo en contacto directo con la matriz de proteoglicanos en un área carente de endotelio. Finalmente, esto provoca la adhesión y activación plaquetaria y promueve, por tanto, la formación del trombo100. 1. INTRODUCCIÓN 27 Segundo, la trombosis o hemorragia intraplaca. Existe una exuberante formación de microvasos en las placas de ateroma, probablemente inducida por el mismo proceso inflamatorio101. Una hemorragia intraplaca produce un aumento en la deposición de fibrina y hemosiderina y la trombosis in situ conduce a la generación de trombina, que, junto con el fibrinógeno adherido, puede estimular la migración y progresión del músculo liso. La trombina produce activación plaquetaria estimulando la liberación de factores de crecimiento contenidos en los gránulos α plaquetarios, como PDGF y TGF-β. Y en tercer lugar, la rotura de la capa fibrosa de la placa, que es el mecanismo más común de interrupción del flujo sanguíneo y desarrollo de un evento isquémico agudo. Estas placas poseen una escasa capa (incluso ausencia) de CML y un núcleo necrótico cubierto por una fina capa fibrosa infiltrada por macrófagos activados, que producen metaloproteinasas de matriz. Se trata de placas vulnerables con alto riesgo de rotura. Arteria normal Placa de ateroma “temprana” Placa estable Placa inestable Ruptura de la placa: Formación de trombo Arteria normal Placa de ateroma “temprana” Placa estable Placa inestable Ruptura de la placa: Formación de trombo Figura 1.5. Proceso de desarrollo de la placa de ateroma, tipos de placas y sus complicaciones. 1. INTRODUCCIÓN 28 También están asociados fenómenos de apoptosis en la rotura de la placa de ateroma. Cai et al102 demostraron que la apoptosis regulada por FAS/APO 1 está involucrada en el desarrollo de lesiones arterioscleróticas avanzadas y que probablemente determine el acúmulo de masa en los vasos enfermos. La apoptosis dentro de la placa de ateroma compromete a todas las líneas celulares, pero con un gran predominio de los macrófagos103. Estas células apoptóticas favorecen el reclutamiento de otras células inflamatorias y, por tanto, también contribuyen a todo el proceso inflamatorio. Mallat et al104 demostraron la íntima asociación entre apoptosis e inflamación, coexistiendo ambos procesos en áreas de rotura de la placa. Estos mismos investigadores también encontraron niveles elevados de micropartículas de membrana procedentes de células apoptóticas en la placa arteriosclerótica105 y cantidades elevadas de micropartículas de membrana con potencial procoagulante en sangre periférica. Cuando se produce la rotura de la placa, queda expuesto el core lipídico, altamente trombogénico por su contenido en TF. Por tanto, el TF es un elemento clave en la iniciación de la cascada de la coagulación, siendo esencial en la trombosis que sigue a la disrupción de la placa. La actividad es muy dependiente de la presencia de la fosfatidilserina, un fosfolípido aniónico que se redistribuye en la superficie de la membrana celular durante la muerte por apoptosis, confiriendo un potencial trombogénico a la célula apoptótica (principalmente los macrófagos). La mayoría del TF expresado dentro de la placa de ateroma se ha encontrado en áreas de alta densidad de células apoptóticas y de micropartículas106. Además de activar la cascada de la coagulación, el TF activa consecuentemente a las plaquetas circulantes y a los 1. INTRODUCCIÓN 29 leucocitos, tanto neutrófilos como monocitos107,108 , que interactúan llevando a la formación del trombo109. Además, moléculas de CD40-L unido a las plaquetas son capaces de incrementar aún más el estado proinflamatorio y protrombótico. Incluso en ausencia de fisuras en la placa, las citoquinas proinflamatorias (IL-1, IL-6 y TNF-α) pueden potenciar las propiedades procoagulantes de las CE y de los neutrófilos y contribuir así a las complicaciones trombóticas de la placa de ateroma110. 1.3. FISIOLOGÍA DE LA PLAQUETA Las plaquetas son fragmentos citoplásmicos pequeños (2-4 x 0.5 µm de diámetro), discoides111 y carentes de núcleo derivados de los megacariocitos, sus células precursoras de la médula ósea112. Son los segundos corpúsculos más numerosos del torrente circulatorio (150-450 x 109/l). El volumen plaquetario medio (VPM) es de 7,06 ± 4,85 fl; este VPM aumenta siempre que existe una mayor demanda de trombopoyesis, como ocurre en situaciones de trombocitopenia, y disminuye con la edad de las plaquetas. La producción de plaquetas desde los megacariocitos de la médula ósea está regulada por una sustancia llamada trombopoyetina113, que parece tener un papel importante en la reversión de la trombocitopenia (Fig. 1.6). El 70% de las plaquetas están en circulación y el 30% restante se localiza en el bazo. 1. INTRODUCCIÓN 30 CÉLULA HEMATOPOYÉTICA PROMEGACARIOCITO PLAQUETAS MEGACARIOCITO Figura 1.6. Sistema de producción de plaquetas. Fuente: internet. 1.3.1. Estructura plaquetaria Las plaquetas son estructuras morfológicamente muy sencillas, a pesar de que su actividad fisiológica es extraordinariamente compleja (Fig. 1.7). Con microscopía electrónica se reconocen cuatro zonas en su estructura: la zona periférica (membrana plasmática y diversas glicoproteínas), la zona gelatinosa (formada por la matriz citoplasmática), la zona de los organelos (mitocondrias, ribosomas, aparato de Golgi y diversos tipos de gránulos) y por último el sistema de membranas (formado por un sistema de canalículos y túbulos densos que le confieren a la plaqueta una estructura esponjosa). 1. INTRODUCCIÓN 31 Zona periférica: Membrana plasmática Glicoproteínas Zona gelatinosa Zona de orgánelos: Lisosomas Gránulos densos Golgi Reservorio de glucógeno Gránulos α Mitocondrias Sistema de membranas: Sistema canalicular abierto Actina Microtúbulos Zona periférica: Membrana plasmática Glicoproteínas Zona gelatinosa Zona de orgánelos: Lisosomas Gránulos densos Golgi Reservorio de glucógeno Gránulos α Mitocondrias Sistema de membranas: Sistema canalicular abierto Actina Microtúbulos Figura 1.7. Estructura y composición de la plaqueta. 1.3.1.1. Glicoproteínas plaquetarias La clasificación de las glicoproteínas plaquetarias se basa en su movilidad electroforética. Actualmente se utilizan nuevos sistemas de nomenclatura debido a que se han encontrado proteínas idénticas a las plaquetarias en otros tipos celulares. Estos nuevos sistemas incluyen las denominaciones VLA (antígenos tardíos), MEC (matriz extracelular) y AD (acúmulos de diferenciación). Entre las distintas glicoproteínas plaquetarias destacan: - Glicoproteína plaquetaria Ib La glicoproteína Ib (GPIb) se encuentra localizada en la superficie externa de la membrana plaquetaria, siendo responsable de la carga negativa de la superficie. Existen aproximadamente 25.000 moléculas por plaqueta. La GPIb constituye un punto clave en el proceso de formación del trombo, ya que forma parte de la porción 1. INTRODUCCIÓN 32 principal del sitio de unión para el factor de von Willebrand (vWF) durante la adhesión de las plaquetas al subendotelio. El complejo Ib tiene cuatro subunidades diferentes (GPIb-α, GPIb-β, GPIb-IX y GPIb-V). - Glicoproteína plaquetaria IIb/IIIa La glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), también llamada integrina αIIbβ3, es una integrina heterodimérica que se encuentra en la superficie de la plaqueta. Constituye el 2% de las proteínas plaquetarias totales, conteniendo aproximadamente 80.000 complejos en su superficie cuando están en reposo y en menor cantidad en la membrana de los gránulos α. Las subunidades α (GPIIb) y β (GPIIIa) son productos de genes diferentes. El complejo IIb/IIIa funciona como receptor del fibrinógeno y del vWF sólo después de la activación de la plaqueta, tras un cambio conformacional. - Glicoproteína plaquetaria Ia/IIa Es la glicoproteína receptora para el colágeno tipo I y tipo III114, fundamental en la adhesión de las plaquetas a la matriz subendotelial. 1.3.1.2. Zona de los organelos Las plaquetas contienen en la zona de los organelos cuatro tipos de gránulos de almacenamiento: los gránulos densos, los gránulos α, los lisosomas y las proteínas granulares de difícil localización (Fig. 1.8). 1. INTRODUCCIÓN 33 Enzimas lisosomales: Fosfatasa ácida β-galactosidasa β-glicerofosfatasa β-Acetilglucasaminidasa Catepsina Nucleasas Gránulos α: PF-4 Glicoproteína IIb/IIIa FCDP P-selectina Fibrinógeno IAP-1 FvW Proteína C Fibronectina Factores de crecimiento plaquetario Trombospondina Factor de crecimiento transformante - β Factor V Antiplasmina Albúmina α2-macroglobulina α-1 Antitripsina Proteínas granulares de difícil localización: Catepsina Endoglucosidasa 3-5-fosfodiesterasa ácida Colagenasa Factores de permeabilidad vascular Proelastasa y elastasa Inhibidor de proteinasa α α2-macroglobulina Antiplasmina Proteínas bactericidas Aril-sulfatasa Gránulos densos: ADP ATP Calcio Pirofosfato Serotonina Enzimas lisosomales: Fosfatasa ácida β-galactosidasa β-glicerofosfatasa β-Acetilglucasaminidasa Catepsina Nucleasas Gránulos α: PF-4 Glicoproteína IIb/IIIa FCDP P-selectina Fibrinógeno IAP-1 FvW Proteína C Fibronectina Factores de crecimiento plaquetario Trombospondina Factor de crecimiento transformante - β Factor V Antiplasmina Albúmina α2-macroglobulina α-1 Antitripsina Proteínas granulares de difícil localización: Catepsina Endoglucosidasa 3-5-fosfodiesterasa ácida Colagenasa Factores de permeabilidad vascular Proelastasa y elastasa Inhibidor de proteinasa α α2-macroglobulina Antiplasmina Proteínas bactericidas Aril-sulfatasa Gránulos densos: ADP ATP Calcio Pirofosfato Serotonina ENZIMAS LISOSOMALES Fosfatasa ácida ß-galactosidasa ß-glicerofosfatasa Catepsina Nucleasas GRÁNULOS DENSOS ADP ATP Calcio Pirofosfato Serotonina PROTEÍNAS GRANULARES DE DIFÍCIL LOCALIZACIÓN Catepsina Endoglucosidasa 3-5-fosfodiesterasa ácida Colagenasa Factores de permeabilidad vascular Proelastasa/elastasa Inhibidor de proteinasa α α2-macroglobulina Antiplasmina Proteínas bactericidas Aril-sulfatasa GRÁNULOS ALFA PF-4 Glicoproteína IIb-/IIIa FCDP P-selectina Fibrinógeno IAP-1 vWF Proteína C Fibronectina Factores de crecimiento plaquetario Trombospondina Factor de crecimiento transformante ß Factor V Antiplasmina Albúmina α2-macroglobulina α-1 antitripsina Figura 1.8. Tipos de gránulos plaquetarios y su composición. Los gránulos α contienen una serie de proteínas específicas de la plaqueta, cuya lista aún continúa creciendo115. Se incluyen varias proteínas: 1, de adhesión, como el vWF o la trombospondina; 2, plasmáticas, como inmunoglobulinas y albúmina; 3, mitógenos celulares, como los factores de crecimiento plaquetarios y el TGF-β; 4, factores coagulantes, como el factor V; 5, inhibidores de las proteasas, como la α2 macroglobulina y la α2 antiplasmina. Más recientemente se demostró que la membrana interna de los gránulos α contenían importantes receptores fisiológicos, como la glicoproteína IIb/IIIa y la P-selectina. El destino del contenido granular es su liberación durante la activación plaquetaria en los sitios de daño de la pared vascular, desarrollando un importante papel en la hemostasia, inflamación, reparación de la pared vascular y, por tanto, en la patogenia de la arteriosclerosis116. Los gránulos densos contienen nucleótidos de adenina, principalmente bajo la forma de ADP y ATP. Forman un complejo junto con iones de calcio y pirofosfato, 1. INTRODUCCIÓN 34 no siendo intercambiables con los nucleótidos que están implicados en el metabolismo general de la célula117. También se encuentra almacenada una gran cantidad de serotonina que actúa de forma sinérgica con otros agentes para activar a las plaquetas y modular el tono y la integridad vascular118. Los lisosomas se caracterizan por su contenido rico en enzimas hidrolíticas, principalmente hidrolasas ácidas, fosfatasa ácida, β-galactosidasa y distintos tipos de nucleasas. Probablemente la secreción de los gránulos de las plaquetas se produce mediante la fusión del gránulo con las membranas del sistema de conexión a la superficie, proceso para el que es necesaria la presencia de iones calcio y de una fosfolipasa dependiente de calcio. 1.3.2. Activación de la plaqueta En condiciones fisiológicas la función de las plaquetas es mantener la integridad de la pared vascular, evitando alteraciones de la permeabilidad vascular119. La hemostasia se consigue a través de la interacción de tres sistemas biológicos fundamentales: la pared vascular, las plaquetas y las proteínas de la cascada de la coagulación sanguínea. Como se ha mencionado anteriormente, la superficie endotelial inhibe la activación plaquetaria mediante la producción de diferentes sustancias. Cuando se produce una disrupción del endotelio se genera una respuesta contráctil de la pared 1. INTRODUCCIÓN 35 vascular y, al mismo tiempo, se produce una adhesión de las plaquetas al subendotelio (Fig. 1.9). En este sentido, el colágeno tiene un papel fundamental por tratarse de uno de los agonistas más intensos de la activación plaquetaria. DAÑO TISULAR ESPASMO VASCULAR ACTIVACIÓN SISTEMA COAGULACIÓN ACTIVADOR PROTROMBINA Ca2+ Ca2+ PLASMINA PLASMINÓGENO REPARACIÓN PARED VASCULAR RETRACCIÓN COÁGULO TROMBO PLAQUETARIO PROTROMBINA TROMBINA FIBRINA FIBRINÓGENO FIBRINOLISIS Figura 1.9. Esquema de la formación del trombo plaquetario y del proceso de reparación vascular. Cuando son expuestas a los diferentes agonistas, las plaquetas presentan diferentes respuestas, que se encuentran íntimamente asociadas in vivo, pero que in vitro pueden ser estudiadas separadamente: la adhesión y cambio de forma, la agregación y la secreción de sustancias procoagulantes120. En las fases más avanzadas, se libera ácido araquidónico, que es transformado en prostaglandinas y tromboxanos (potentes agonistas e inductores de la agregación y la secreción plaquetaria). Por tanto, se produce un feed-back positivo que resulta de las interacciones entre los receptores de superficie plaquetarios y sus correspondientes agonistas. 1. INTRODUCCIÓN 36 1.3.2.1. Agonistas de la activación plaquetaria Las plaquetas pueden ser activadas por un gran número de sustancias, a las cuales reaccionan en pocos segundos. La activación plaquetaria comprende : 1, la formación y liberación de sustancias vasoactivas o agonistas plaquetarios que favorecen el proceso de agregación, induciendo a su vez la activación de otras plaquetas (reacción en cascada) y 2, la activación de receptores de proteínas en la membrana plaquetaria, entre los que se encuentra el responsable de la fijación de las plaquetas a la zona lesionada (factor de von Willebrand) y, el más importante, el receptor GPIIb/IIIa, que reconoce y fija las cadenas de fibrinógeno, formando la trama final del tapón hemostático. Los agonistas plaquetarios actúan fundamentalmente por tres mecanismos: liberación de ADP, generación de endoperóxidos e ionosfera de calcio y acción de la trombina. Entre los múltiples agonistas que intervienen en el proceso de activación plaquetaria destacan: - Adenosín difosfato (ADP) El ADP plaquetario se encuentra localizado fundamentalmente en los gránulos densos, aunque también existe en el citosol y unido a la actina-F. El ADP liberado desde el endotelio dañado o secretado por plaquetas previamente activadas induce agregación por reacción con los receptores de membrana. La exposición al ADP produce un rápido influjo de Ca2+ e inhibición de la adenilciclasa, causando el cambio 1. INTRODUCCIÓN 37 de forma de la plaqueta, la activación del receptor del fibrinógeno, agregación y secreción121. Los efectos del ADP en las plaquetas son mediados por tres subtipos de receptores P2. Según Kunapuli et al122, un receptor está acoplado por Gi a la inhibición de la adenilciclasa (P2TAC), otro acoplado por Gq a la activación de la fosfolipasa C (P2Y1) y el tercero, es un receptor ionotrópico, P2X1, mediador del influjo rápido de Ca2+. El receptor P2Y1 media en el cambio de forma inducido por el ADP (movilización de calcio en el citosol a través de la activación de la fosfolipasa C), mientras que el receptor P2TAC es esencial para la agregación, aunque esta respuesta resulte de la señalización a través de P2TAC y P2Y1123,124. El antagonismo de cada uno de estos receptores es suficiente para inhibir la agregación, lo que sugiere que todos los receptores interactúan para obtener una respuesta completa. - Ionóforo del calcio Transporta cationes bivalentes a través de la membrana plaquetaria y desencadena la reacción de agregación por un aumento de calcio citoplasmático. - Colágeno El colágeno es un potente estímulo para la activación plaquetaria, como se ha indicado anteriormente. Sin embargo, esto ocurre fundamentalmente con los tipos I, III y VI y no con el colágeno monomérico y el tipo IV, que causan nula o mínima activación. Una vez las plaquetas entran en contacto con el colágeno fibrilar o los otros cuatro tipos, y tras un tiempo de retraso de aproximadamente un minuto, se 1. INTRODUCCIÓN 38 inicia la agregación plaquetaria. Este retraso refleja el tiempo necesario para iniciar la síntesis de prostaglandinas y secretar ADP durante la reacción de degranulación. - Trombina La trombina es un fuerte agonista e importante activador de las plaquetas in vivo. Esta serinproteasa interviene en el cambio de forma y la secreción de los gránulos densos, gránulos α y los lisosomas. También activa la GPIIb/IIIa, lo cual da lugar a la unión del fibrinógeno y vWF. Los cambios producidos por la trombina son mediados principalmente por una familia de receptores acoplados a la proteína G y llamados PAR. Han sido identificados cuatro PAR (PAR1, PAR2, PAR3 Y PAR4), de los cuales el PAR3 no ha sido detectado en plaquetas humanas. La trombina se une a diferentes proteínas plaquetarias pero sólo hidroliza la proteína V (GPV). Como la actividad proteolítica de la trombina es requerida para iniciar la agregación plaquetaria, parece que la GPV está involucrada en el mecanismo de translación plaquetario. En concentraciones fisiológicas, la trombina reacciona con 1.000 sitios de unión por plaqueta, la mayoría en la GPIb. Los agentes que bloquean la agregación por ADP también previenen la agregación inducida por la trombina, lo que sugiere un mecanismo común a través de los receptores de fibrinógeno. - Adrenalina Esta hormona potencia el efecto de otros agonistas plaquetarios125 y, a concentraciones elevadas, inicia respuestas plaquetarias, incluyendo agregación, producción de tromboxano A2 (TXA2) y secreción. Las plaquetas humanas poseen 1. INTRODUCCIÓN 39 receptores adrenérgicos α2 (200-300 lugares de unión por plaqueta)126. La adrenalina inicia las funciones plaquetarias por unión a estos receptores adrenérgicos de la superficie, pero las concentraciones de adrenalina requeridas para producir agregación in vitro son muy altas, tanto que nunca se alcanzan in vivo. 1.3.2.2. Fases de la activación plaquetaria Cuando son expuestas a los agonistas, las plaquetas presentan diferentes respuestas íntimamente relacionadas: la adhesión y cambio de forma, la agregación y la secreción. - Adhesión plaquetaria y cambio de forma En condiciones fisiológicas, las plaquetas circulan preferentemente en la proximidad de la pared vascular127. Cuando la continuidad de la capa endotelial se ve interrumpida y queda expuesta la matriz subendotelial, se pierden las propiedades antitrombóticas del endotelio y se produce la adhesión plaquetaria en respuesta al daño de la pared vascular (Fig. 1.10). Las plaquetas ya activadas liberan factores vasoconstrictores y trombogénicos, como el TxA2, la serotonina y el ADP128. SUBENDOTELIO FvW GPIb-V-IX SUBENDOTELIO FvWColFn Lam GPIb-V-IX α6β1α2β1α5β1 SUBENDOTELIO FvWColFn Lam AA TxA2 TxA2 ADP ADP GPIIb-IIIa 1) ADHESIÓN 2) ACTIVACIÓN Y AGREGACIÓN PLAQUETA PLAQUETA SUBENDOTELIO FvW GPIb-V-IX SUBENDOTELIO FvWColFn Lam GPIb-V-IX α6β1α2β1α5β1 SUBENDOTELIO FvWColFn Lam AA TxA2 TxA2 ADP ADP GPIIb-IIIa 1) ADHESIÓN 2) ACTIVACIÓN Y AGREGACIÓN PLAQUETA PLAQUETA 1. INTRODUCCIÓN 40 Figura 1.10. Proceso de adhesión plaquetaria al endotelio denudado. El primer contacto entre las plaquetas y el vaso dañado se realiza a través del factor de von Willebrand (FvW) y su receptor GPIb-V-IX. La estabilización de la adhesión se consigue a través de los receptores plaquetarios para fibronectina (Fn), colágeno (Col) y laminina (Lam). El término “adhesión” se refiere a la unión de la plaqueta con cualquier otra célula diferente a otra plaqueta. La adhesión inicial al vaso lesionado es un proceso pasivo que finalmente resulta en la activación plaquetaria. En zonas de la circulación sanguínea donde hay bajo coeficiente de cizallamiento las plaquetas se adhieren al colágeno, la fibronectina y laminina del subendotelio a través de receptores específicos de membrana. En condiciones en las que el coeficiente de cizallamiento es alto, como en gran parte del territorio arterial y en la microcirculación, la interacción de las plaquetas con los componentes del subendotelio anteriormente mencionados requiere un cofactor adicional, que es el vWF. El complejo GP Ib/V/IX es el principal receptor implicado en la adhesión en estas condiciones de flujo y origina señales para la activación de la GP IIb/IIIa129. En el proceso de adhesión intervienen factores de la superficie lesionada, bien frenando directamente las plaquetas circulantes o haciendo que éstas expresen proteínas de frenado en su superficie, que se engloban dentro del grupo de proteínas de adhesión130. Entre estas proteínas de frenado cabe destacar las denominadas selectinas, familia de proteínas de la que se han descrito tres miembros (E, L y P). La P-selectina se encuentra en los gránulos alfa plaquetarios y también en los cuerpos de Weibel-Palade de las CE. La expresión en la superficie plaquetaria de P-selectina se produce en el curso del proceso de degranulación trombocitaria inducida por múltiples factores, como el colágeno, la adrenalina, el ADP, etc. Estas moléculas 1. INTRODUCCIÓN 41 intervienen en la interacción de las plaquetas con los leucocitos, induciendo la activación de éstos y la liberación de mayor cantidad de citoquinas, radicales libres y expresión de TF131,132 . Todo ello da lugar a la formación y crecimiento del trombo133. A la adhesión de la plaqueta le siguen diversas modificaciones en su morfología que favorecen la interacción celular: primero pierden la forma discoide inicial con la que circulan por el torrente sanguíneo y adquieren una forma esferoide y, segundo, se produce una expansión de la plaqueta con emisión de pseudópodos como resultado de la reorganización del citoesqueleto de actina. En las plaquetas en reposo el 40-50% de la actina es actina F (filamentosa) y el resto es actina G (monomérica). Tras la activación, la actina F aumenta hasta el 70-80%, con el correspondiente descenso de la actina G. Esta polimerización es controlada por la profilina plaquetaria. Así mismo, a medida que la actina G se transforma en actina F se incorporan troponina y tropomiosina134. - Agregación plaquetaria La agregación es un proceso energético que consiste en la unión de las plaquetas activadas unas con otras. La activación, que ocurre después del contacto con el subendotelio, con agonistas liberados por otras plaquetas o con trombina inicia la expresión de receptores funcionales de la membrana, los cuales determinan la interacción plaqueta-plaqueta. Este proceso es dependiente de Ca2+ extracelular y del fibrinógeno, que hace de puente entre las plaquetas. En la fase inicial de la agregación, la unión del 1. INTRODUCCIÓN 42 fibrinógeno a su receptor, el complejo IIb/IIIa (αIIbβ3) es reversible, pero enseguida se hace irreversible debido a la estabilización de los puentes de fibrinógeno por diferentes factores (Fig. 1.11). La interacción de las plaquetas, como consecuencia de la agregación, induce una reacción de liberación que facilita el reclutamiento de más plaquetas. SUBENDOTELIO FvW GPIb-V-IX SUBENDOTELIO FvWColFn Lam GPIb-V-IX α6β1α2β1α5β1 SUBENDOTELIO FvWColFn Lam AA TxA2 TxA2 ADP ADP GPIIb-IIIa 1) ADHESIÓN 2) ACTIVACIÓN Y AGREGACIÓN PLAQUETA PLAQUETA SUBENDOTELIO FvW GPIb-V-IX SUBENDOTELIO FvWColFn Lam GPIb-V-IX α6β1α2β1α5β1 SUBENDOTELIO FvWColFn Lam AA TxA2 TxA2 ADP ADP GPIIb-IIIa 1) ADHESIÓN 2) ACTIVACIÓN Y AGREGACIÓN PLAQUETA PLAQUETA Figura 1.11. Agregación plaquetaria. Se forman pseudópodos plaquetarios y se libera el contenido de los gránulos. La liberación de tromboxano A2 (TxA2) y ADP refuerza la activación plaquetaria. La unión entre plaquetas es mediada por la activación del receptor de fibrinógeno (GPIIb/IIIa). (FvW: factor de von Willeband; Fn: fibronectina; Col: colágeno; Lam: laminina; α5β1: receptor de fibronectina; α2β1: receptor de colágeno;α6β1: receptor de laminina; GPIb/V/IX: receptor del factor de Von Willebrand; AA: ácido araquidónico). Estos mecanismos de reconocimiento de la lesión son altamente eficaces en condiciones fisiológicas, aunque inespecíficos. De esta manera, en situaciones patológicas, como en la rotura de una placa de ateroma, las plaquetas circulantes se comportan del mismo modo que cualquier lesión en la pared vascular normal, pudiendo condicionar un evento isquémico agudo en el territorio de irrigación del vaso135. La agregación plaquetaria llevada a cabo por los agregantes primarios (ADP, trombina, colágeno…) se considera bifásica, ya que producen una acción inicial 1. INTRODUCCIÓN 43 directa sobre la plaqueta y, posteriormente, una agregación secundaria a la liberación de distintas sustancias, como el ADP y el ácido araquidónico (AA). Se inicia así la vía eicosanoide de las plaquetas, con la liberación de AA a partir de fosfolípidos plaquetarios y mediada por fosfolipasas. El araquinodato es metabolizado por una ciclooxigenasa y una lipooxigenasa citoplásmica (Fig. 1.12). PG G2 Tromboxano sintasa TROMBOXANO A2 PG D2 PG H2 PG E2 Ciclooxigenasa PG H2 OOH COOHO O OH COOHO O PGI sintasa PROSTACICLINA (PGI2) COOH OHO O OH COOH O O ACIDO ARAQUIDONICO PG G2 Tromboxano sintasa TROMBOXANO A2 PG D2 PG H2 PG E2 Ciclooxigenasa PG H2 OOH COOHO O OH COOHO O PGI sintasa PROSTACICLINA (PGI2) COOH OHO O OH COOH O O ACIDO ARAQUIDONICOÁCIDO ARAQUIDÓNICO PG G2 Tromboxano sintasa TROMBOXANO A2 PG D2 PG H2 PG E2 Ciclooxigenasa PG H2 OOH COOHO O OH COOHO O PGI sintasa PROSTACICLINA (PGI2) COOH OHO O OH COOH O O ACIDO ARAQUIDONICO PG G2 Tromboxano sintasa TROMBOXANO A2 PG D2 PG H2 PG E2 Ciclooxigenasa PG H2 OOH COOHO O OH COOHO O PGI sintasa PROSTACICLINA (PGI2) COOH OHO O OH COOH O O ACIDO ARAQUIDONICO PG G2 Tromboxano sintasa TROMBOXANO A2 PG D2 PG H2 PG E2 Ciclooxigenasa PG H2 OOH COOHO O OH COOHO O PGI sintasa PROSTACICLINA (PGI2) COOH OHO O OH COOH O O ACIDO ARAQUIDONICO PG G2 Tromboxano sintasa TROMBOXANO A2 PG D2 PG H2 PG E2 Ciclooxigenasa PG H2 OOH COOHO O OH COOHO O PGI sintasa PROSTACICLINA (PGI2) COOH OHO O OH COOH O O ACIDO ARAQUIDONICO PG G2 Tromboxano sintasa TROMBOXANO A2 PG D2 PG H2 PG E2 Ciclooxigenasa PG H2 OOH COOHO O OH COOHO O PGI sintasa PROSTACICLINA (PGI2) COOH OHO O OH COOH O O ACIDO ARAQUIDONICO PG G2 Tromboxano sintasa TROMBOXANO A2 PG D2 PG H2 PG E2 Ciclooxigenasa PG H2 OOH COOHO O OH COOHO O PGI sintasa PROSTACICLINA (PGI2) COOH OHO O OH COOH O O ACIDO ARAQUIDONICO PG G2 Tromboxano sintasa TROMBOXANO A2 PG D2 PG H2 PG E2 Ciclooxigenasa PG H2 OOH COOHO O OH COOHO O PGI sintasa PROSTACICLINA (PGI2) COOH OHO O OH COOH O O ACIDO ARAQUIDONICO PG G2 Tromboxano sintasa TROMBOXANO A2 PG D2 PG H2 PG E2 Ciclooxigenasa PG H2 OOH COOHO O OH COOHO O PGI sintasa PROSTACICLINA (PGI2) COOH OHO O OH COOH O O ACIDO ARAQUIDONICO TROMBOXANO A2 PROSTACICLINA (PGI2) Ciclooxigenasa PG G2 PG H2 PG E2 PG H2 PG D2 Figura 1.12. Metabolismo del ácido araquidónico secretado por las plaquetas para la formación de prostanoides. La ciclooxigenación del AA da lugar a compuestos intermedios transitorios, los endoperóxidos PG G2 y PG H2, que son transformados en tromboxano A2 (TxA2) por la tromboxano sintetasa136. El TxA2 es liberado por las plaquetas activadas, interacciona con receptores específicos de superficie y potencia la agregación plaquetaria mediante la hidrólisis del fosfoinositósido y elevación del calcio citosólico. La movilización de calcio implica una inhibición de la adenilato ciclasa y un descenso de adenosín monofosfato cíclico plaquetario (AMPc). El TxA2 también posee un potente efecto vasoconstrictor, lo que condiciona modificaciones en el flujo sanguíneo, que a su vez favorecen la adhesión plaquetaria por aumento del rozamiento. 1. INTRODUCCIÓN 44 - Secreción plaquetaria: factores liberados por la plaqueta Cuando las plaquetas son activadas se produce la secreción de numerosas sustancias contenidas en los gránulos. El ensamblaje y contracción del sistema actina-miosina es responsable de la centralización y de la secreción activa del contenido granular. Durante el proceso de secreción las membranas de los gránulos se funden con las del sistema canalicular abierto mediante la intervención del Ca2+ 118 . Los gránulos densos secretan, entre otras sustancias, ADP y serotonina, que van a activar a otras plaquetas que se encuentren en proximidad. Los gránulos α liberan proteínas tales como el vWF, el PF4, la β-tromboglobulina, la fibronectina y el fibrinógeno. Los lisosomas liberan principalmente hidrolasas ácidas. 1.4. FUNCIÓN DE LAS PLAQUETAS MÁS ALLÁ DE LA HEMOSTASIA: INFLAMACIÓN Y ARTERIOSCLEROSIS. Las plaquetas representan un papel fundamental en la hemostasia y prevención del sangrado. Sin embargo, es probable que contribuyan en otros procesos distintos de este, como el desarrollo de respuestas inflamatorias e inmunes, mantenimiento de la integridad vascular y curación de lesiones. Las plaquetas son capaces de reclutar leucocitos y células progenitoras en los sitios de lesión de la pared vascular y trombosis, ya que producen, almacenan y liberan factores proinflamatorios, antiinflamatorios y angiogénicos a la circulación. En modelos experimentales se ha 1. INTRODUCCIÓN 45 demostrado que estas funciones contribuyen a la aterogénesis, sepsis, hepatitis, reestenosis y rechazo a trasplantes137. 1.4.1. La plaqueta como productora de mediadores bioactivos La capacidad de producir, almacenar y liberar mediadores bioactivos permite a las plaquetas ejercer un importante papel en la modulación de otras células, como leucocitos o las CE. Cuando es estimulada por la trombina, la plaqueta secreta más de 300 tipos de proteínas138. Y, además de la liberación de sustancias bioactivas, se producen cambios en la composición de la membrana plaquetaria, resultando en la expresión de P-selectina y de GPIIb/IIIa. La expresión de P-selectina es especialmente importante en la interacción de la plaqueta con los leucocitos, aunque también sirve como proteína de unión al complemento (C3b)139. Las plaquetas no son meros almacenes de moléculas bioactivas, sino que también sintetizan mediadores lipídicos como el TxA2 y participan en el metabolismo transcelular, que resulta en la producción de ambos tipos de moléculas, proinflamatorias y antiinflamatorias. Han demostrado ser células más complejas de lo que en un principio se consideró, capaces de sintetizar proteínas mediante mecanismos únicos y extranucleares de traslación del mRNA dependientes de diferentes estímulos o señales140. Entre otras proteínas (ya mencionadas previamente), la plaqueta puede sintetizar componentes directamente implicados en los procesos inflamatorios, como es la IL-1β141, quimioquinas (RANTES, PF4), la gelatinasa B (MMP-9) o el CD40L142. 1. INTRODUCCIÓN 46 1.4.2. La plaqueta como célula inflamatoria En la última década se han realizado grandes avances en el estudio de la arteriosclerosis como una enfermedad inflamatoria143. Poseemos una creciente evidencia de la contribución de las plaquetas en este proceso tras las observaciones publicadas por autores como Massberg144 y otros145. Las plaquetas activadas interaccionan con diferentes tipos celulares en la pared vascular mediante receptores y mecanismos paracrinos y aoutocrinos que condicionan un círculo de amplificación de la respuesta inflamatoria146. Todos estos procesos forman parte de múltiples enfermedades cardiovasculares y patologías inflamatorias, como el infarto agudo de miocardio o la angina inestable, pero también en la enfermedad inflamatoria intestinal147, la artritis148 o la sepsis149,150,151. Por tanto, la plaqueta puede considerarse una célula con una actividad proinflamatoria propia gracias a la síntesis de numerosas proteínas que actúan de manera ordenada sobre diferentes funciones biológicas, como la agregación, la proliferación y supervivencia celular, la quimiotaxis o la proteólisis, cada una de las cuales acelera el proceso inflamatorio y el reclutamiento celular (Fig. 1.13). PLAQUETA CÉLULA ENDOTELIAL GPIIb-IIIa Fibrinógeno CD40L CD40 P-selectinaIL-1β NF-κB MCP-1 VCAM-1 ICAM-1 MMPs Factor tisular CD40L Adhesión Secreción Quimiotaxis Adhesión, migración Proteolisis Trombolisis PLAQUETA CÉLULA ENDOTELIAL GPIIb-IIIa Fibrinógeno CD40L CD40 P-selectinaIL-1β NF-κB MCP-1 VCAM-1 ICAM-1 MMPs Factor tisular CD40L Adhesión Secreción Quimiotaxis Adhesión, migración Proteolisis Trombolisis Figura 1.13. Esquema de la plaqueta como célula inflamatoria que interacciona con la célula endotelial. 1. INTRODUCCIÓN 47 1.4.3. Interacción de la plaqueta con distintos tipos celulares El conocimiento del papel de las plaquetas en el desarrollo y severidad de diferentes enfermedades, más allá de la clásica hemostasia, continúa emergiendo, particularmente en el área de la inflamación y de la respuesta inmune. 1.4.3.1. Células endoteliales En condiciones fisiológicas se ha considerado que las plaquetas no se activan ni interactúan con el endotelio intacto, ya que normalmente las CE controlan la reactividad plaquetaria a través de señales inhibitorias. Sin embargo, un endotelio inflamado adquiere propiedades que permiten la interacción con la plaqueta. Y, al contrario, estudios in vitro han demostrado cómo las plaquetas activadas son capaces de interactuar con el endotelio intacto152,153. Estudios in vivo parecen demostrar que las plaquetas podrían intervenir en el desarrollo de la disfunción endotelial. La adhesión de las plaquetas al endotelio acontece incluso cuando existe un alto estrés de cizallamiento, aunque no haya lesión de la pared vascular154,155,156. Se ha demostrado que las plaquetas liberan diferentes agonistas, como la serotonina, el ADP y el ATP, que estimulan la producción de NO en el endotelio en los momentos iniciales y de forma transitoria. Sin embargo, en exposiciones prolongadas se produce el efecto contrario: disminuyen la capacidad del endotelio de liberar NO, favoreciendo, por tanto, la disfunción endotelial. Se desconoce actualmente el mecanismo por el que las plaquetas pueden potenciar o reducir la eNOS en la disfunción endotelial, pero entre todas las sustancias que son 1. INTRODUCCIÓN 48 capaces de liberar, la IL-1β parece tomar gran importancia. De hecho, esta interleuquina es uno de los mediadores más potentes en la interacción de la plaqueta activada con el endotelio157. Adicionalmente, estudios in vitro han demostrado que la coincubación de CE con plaquetas activadas con trombina inducen la secreción de IL- 6 e IL-8 y de la quimioquina MCP-1 mediada por IL-1β plaquetaria158. La IL-1β no sólo es capaz de modificar la liberación de factores quimiotácticos por el endotelio, sino que además puede incrementar la expresión de moléculas de adhesión, como la ICAM-1 y la αvβ3 159, promoviendo la adhesión de neutrófilos y monocitos al endotelio. 1.4.3.2. Leucocitos El reclutamiento de leucocitos tras el daño endotelial requiere múltiples pasos de adhesión y señalización celular, incluyendo uniones mediadas por selectinas y rodamiento, activación leucocitaria, adhesión firme por integrinas y diapédesis. Todo ello resulta en la infiltración de células inflamatorias en la pared vascular160. Las plaquetas activadas promueven el reclutamiento de leucocitos, punto clave en el desarrollo de la arteriosclerosis161. Las plaquetas interactúan físicamente con ambas células, el endotelio y los leucocitos. Esta interacción puede realizarse de dos formas: primero, uniéndose las plaquetas a los leucocitos y mediando en la unión de éstos con la pared vascular por la activación de receptores para la adhesión de leucocitos y, segundo, ejerciendo como puente entre el endotelio y los leucocitos, previa adhesión de las plaquetas a la pared vascular. La familia de las selectinas intervienen en los estadios iniciales de la 1. INTRODUCCIÓN 49 interacción162, siendo la P-selectina la que representa un papel fundamental en el contacto plaqueta-leucocito. Uno de los principales candidatos del reclutamiento de monocitos es RANTES, ya que se ha demostrado que actúa como iniciador del arresto de los leucocitos en el endotelio163 mediado por P-selectina164. La liberación de CD40L (CD154) derivado de las plaquetas induce respuestas inflamatorias en el endotelio. El receptor CD40 se expresa en varios grupos celulares, entre ellos plaquetas, células B maduras y algunos linfocitos Tc y Th165,166,167. Por ello, la interacción entre CD40 y CD40L está relacionada principalmente con la respuesta inmune mediada por linfocitos B y T, aunque también incluye la interacción plaqueta-endotelio y plaqueta-leucocito. Henn et al83 demostraron que las plaquetas almacenan grandes cantidades de CD40L y las liberan en pocos segundos tras su activación in vitro. La unión del CD40L plaquetario con el CD40 de las CE produce un aumento en la liberación endotelial de IL-8 y MCP-1 y la expresión de receptores de adhesión como E-selectina, VCAM e ICAM-183, promoviendo la adhesión de monocitos y linfocitos. La interacción plaqueta-leucocito también promueve el estado inflamatorio: el CD40L expresado por linfocitos T y la captación de CD40L soluble por las plaquetas inducen la activación de la plaqueta aumentando la expresión de P- selectina y la liberación de RANTES plaquetarios168. La liberación de RANTES induce además la adhesión de células T al endotelio168 y el reclutamiento de monocitos mediado por P-selectina164,169. Existen evidencias de que la respuesta inflamatoria mediada por la interacción de CD40-CD40L entre linfocitos y plaquetas puede mediar en el desarrollo de arteriosclerosis y la progresión de la misma, ya que se ha visto una correlación entre 1. INTRODUCCIÓN 50 los niveles de CD40L en plaquetas y linfocitos con la aparición de síndrome coronario agudo170. 1.4.3.3. Células progenitoras endoteliales Actualmente, uno de los principales aspectos en estudio es la contribución de las células progenitoras endoteliales (EPC) en el desarrollo de la arteriosclerosis. Las EPC de la médula ósea expresan típicamente CD34 y CD13 y tienen la capacidad de diferenciarse en CE y así reparar un daño en la pared vascular171,172,173. Existen múltiples estímulos físicos y químicos que potencialmente pueden movilizar EPC de la médula ósea, incluyendo el ejercicio, la edad, el tabaquismo, la diabetes y los síndromes coronarios agudos174,175. Como se ha indicado anteriormente, estas EPC pueden contribuir a la reparación vascular diferenciándose en CE, sin embargo, también pueden contribuir a la progresión de la arteriosclerosis debido a que también son capaces de diferenciarse en CML o células espumosas176,177. Cuando se produce una lesión en la pared vascular, la matriz extracelular queda expuesta. Sin embargo, las EPC no son capaces de expresar las moléculas necesarias para la interacción con el colágeno, la fibronectina o la vimentina y, por tanto, no pueden adherirse directamente a la pared vascular. Las plaquetas son capaces de actuar como células puente entre las EPC y el endotelio178. La adhesión de las EPC CD34+ con las plaquetas ya inmovilizadas en el endotelio puede realizarse por β1 y β2 integrinas de las EPC o P-selectinas de las plaquetas177,179. Además, las plaquetas no sólo reclutan a las EPC, sino que apoyan su proceso de diferenciación180,181. 1. INTRODUCCIÓN 51 1.4.4. La plaqueta en el mantenimiento de la integridad vascular Las plaquetas también representan un papel crucial en el mantenimiento de la pared vascular. Aproximadamente un 18% de todas las plaquetas está involucrado en el mantenimiento de la integridad vascular182. Estudios in vitro183 han demostrado que al almacenar glándulas tiroideas para trasplante mantienen el endotelio íntegro si se perfunden con plasma rico en plaquetas. El papel de las plaquetas en el mantenimiento de la pared vascular puede diferir mucho en condiciones patológicas: la adhesión plaquetaria es necesaria para la estabilización en las zonas de endotelio dañado, pero no en vasos tumorales184 o en el contexto de un proceso inflamatorio185. 1.5. PROTEÓMICA La proteómica es una técnica que permite el estudio a gran escala de las proteínas de una muestra, constituyendo uno de los más útiles y potentes métodos de separación de proteínas que existe actualmente. El término proteómica fue introducido por Marc R. Wilkins para hacer referencia al conjunto de proteínas identificadas mediante 2-DE en una muestra biológica compleja en un momento determinado186. La tecnología utilizada para la separación de las proteínas es relativamente reciente: en la década de los 70 la electroforesis en dos dimensiones se utilizaba como una potente herramienta para la separación y cuantificación de proteínas187. Su alta resolución, su sensibilidad y reproducibilidad hicieron a esta técnica cada vez más popular en la década de los 80, principalmente tras la aparición de las membranas PVDF (del inglés polyvinylidene difluoride)188 y la creación de la primera base de datos para geles bidimensionales. Posteriormente, con la aparición y mejora de diversos métodos de 1. INTRODUCCIÓN 52 preparación y extracción de proteínas de la muestra, así como de las distintas herramientas de secuenciación (método de secuenciación EDMAN189), comenzó a tener una mayor importancia como método de análisis de las proteínas presentes en los distintos tipos de muestras. El proteoma de un organismo es el conjunto de proteínas complementarias del genoma funcional. El proteoma en altamente dinámico, varía acorde al tipo de célula y su estado funcional y puede reflejar cambios inmediatos y característicos en respuesta a determinadas enfermedades o estímulos externos. Este conjunto de proteínas presentes en un fluido corporal, un tejido o un organismo en realidad es un subcojunto de todos los posibles productos del genoma en un momento dado, por lo que el proteoma no puede predecirse directamente a partir de la información estática del genoma. Una proteína puede existir en múltiples formas según modificaciones postraduccionales o procesos de degradación que modifican la estructura de la misma, su localización, función y recambio (Fig. 1.14). ADN ARN PROTEÍNA TRANSCRIPCIÓN TRADUCCIÓN SPLICING: aumento de la variabilidad FENOTIPO MODIFICACIONES postraducionales, modificaciones ambientales, modificaciones por fármacos: aumento de la variabilidad. ADN ARN PROTEÍNA TRANSCRIPCIÓN TRADUCCIÓN SPLICING: aumento de la variabilidad FENOTIPO MODIFICACIONES postraducionales, modificaciones ambientales, modificaciones por fármacos: aumento de la variabilidad. DNA RNA Transcripción SPLICING variabilidad Tranducción PROTEÍNA MODIFICACIONES post-traduccionales, ambientales: variabilidad FENOTIPO Figura 1.14. Esquema en el que se muestran los diferentes pasos en la expresión de proteínas y su variabilidad. 1. INTRODUCCIÓN 53 Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las biomoléculas más versátiles y más diversas. Se considera que en el ser humano hay entre seis y siete veces más proteínas que genes (entre 200.000 y 250.000 proteínas). Las proteínas, a diferencia de los genes, tienen una complejidad y variabilidad mayores. Dado que poseen una función estructural, enzimática, inmunológica, contráctil, homeostática, transductora de señales, etc, son indispensables para todas las funciones biológicas. Por ello, la investigación centrada en estos productos derivados del genoma, modificables en condiciones de enfermedad, es fundamental y probablemente nos permitirá entender la fisiopatología de enfermedades tan prevalentes como la arteriosclerosis. En el momento actual nos encontramos en la era postgenómica, en la que la proteómica va a contribuir al entendimiento de la función de los genes190. Precisamente porque frecuentemente es difícil predecir la función de una proteína basándose en la homología con otras proteínas, e incluso su estructura tridimensional, la determinación de los componentes de un complejo proteico o de una estructura celular es primordial en el análisis funcional. En este sentido, la proteómica es la tecnología más prometedora para avanzar en este área de interés. La integración genómica-proteómica permitirá comprender los mecanismos implicados en la aparición y desarrollo de una enfermedad. Se estima que el genoma humano contiene entre 20.000 y 25.000 genes codificantes de proteínas, número muy inferior a las estimaciones iniciales. Sin embargo, las células humanas recurren ampliamente al splicing y a las modificaciones 1. INTRODUCCIÓN 54 postraducionales para producir varias proteínas distintas a partir de un único gen191,192. De forma práctica, el genoma tan solo porta la información necesaria para una expresión perfectamente coordinada y regulada del conjunto de proteínas que conforman el proteoma. Mientras que el genoma es relativamente constante (incluso podría considerarse un componente estático de la célula), el proteoma está continuamente cambiando, muchas veces simplemente por la interacción del genoma con el entorno. Todas estas modificaciones y otros cambios secundarios a estímulos ambientales (enfermedades, fármacos…) condicionan el desarrollo de diferentes mapas de expresión proteica, o lo que es lo mismo, diferentes fenotipos (Fig. 1.14), que, a su vez, proporcionan una gran diversidad y diferente susceptibilidad a determinadas enfermedades. La proteómica utiliza la combinación de diferentes técnicas sofisticadas, incluyendo la 2-DE en gel de poliacrilamida, análisis de imagen, espectrometría de masas, secuenciación de aminoácidos y bioinformática para separar, identificar y caracterizar las proteínas193. Con todo ello, la proteómica permite la obtención de una información cualitativa y cuantitativa: es posible determinar la existencia o no de una proteína y, además, cambios cuantitativos en su expresión comparando los resultados en la muestra basal y tras un estímulo o condición patológica, por ejemplo. Otra ventaja de esta técnica es la capacidad de detectar las distintas isoformas de una misma proteína (derivadas de las distintas modificaciones bioquímicas postraduccionales), circunstancia que no es posible utilizando el resto de técnicas de análisis e identificación de proteínas. Este punto es de gran importancia, ya que es posible que las isoformas de una determinada proteína tengan propiedades funcionales distintas a las de la proteína original. 1. INTRODUCCIÓN 55 La proteómica, sin embargo, va más allá de la mera catalogación de proteínas, pretendiendo establecer, en último término, su estructura, actividad biológica, modo de acción, localización celular, modificaciones postraduccionales e interacción con otras proteínas o moléculas. De esta manera, la comprensión de las situaciones fisiológicas nos permiten acercarnos al conocimiento de las condiciones patológicas. Desde un punto de vista práctico son muchas las aplicaciones que se pueden vislumbrar en diversos terrenos científicos y biotecnológicos, pero la aplicación más llamativa (y con más impacto comercial) es el descubrimiento de fármacos, el diagnóstico molecular y la medicina personalizada. De hecho, este aspecto de la proteómica está haciendo que la industria farmacéutica invierta grandes cantidades en el desarrollo de esta metodología y se esté avanzando rápidamente. Finalmente, se buscará construir un completo mapa tridimensional celular, con la localización de cada proteína y los procesos o cambios a los que pueden verse sometidas, ayudándonos todo ello a la mejor comprensión de los mecanismos moleculares implicados en cualquier proceso metabólico o patológico. 1.5.1. Fundamentos de la técnica La electroforesis bidimensional (2-DE, del inglés 2-dimensional electrophoresis) es la base fundamental para desarrollar los mapas de expresión proteica. A pesar de que el nombre sugiere que se trata de un proceso de dos pasos, en realidad es algo más complejo e, incluso, pueden considerarse hasta cinco pasos: 1, la preparación de la muestra para la primera separación; 2, la primera separación de la muestra; 3, la interfase entre la primera y segunda separación; 4, la segunda separación; 5, la 1. INTRODUCCIÓN 56 detección de proteínas. Esta técnica nos permite separar las proteínas de cualquier muestra en dos dimensiones, el peso molecular (tamaño) y el punto isoeléctrico (pH en el cual la carga neta de la proteína es cero), lo que dará lugar a un mapa de expresión proteica en el que cada proteína (y sus isoformas) estarán distribuidas en la coordenada formada por las dos variables de separación. En principio, esta coordenada será única para cada proteína, por lo que puede considerarse como el documento de identidad de la misma194. El concepto básico de la técnica se esquematiza en la Figura 1.15. 8.4 8.8 3.9 7.1 8.8 8.8 7.1 5.3 5.3 7.1 3.9 3.7 3.7 8.4 8.4 8.8 8.4 7.1 5.3 3.9 3.7 2.7 8.4 8.8 7.1 2.9 5.3 8.8 8.8 8.4 8.4 7.1 7.1 5.3 3.9 3.7 MUESTRA TEJIDO SEPARACIÓN POR PUNTO ISOELÉCTRICO SEPARACIÓN POR PESO MOLECULAR PRIMERA DIMENSIÓN SEGUNDA DIMENSIÓN peso molecular pH3 pH10 + _ + _ Figura 1.15. Esquema del principio de la electroforesis bidimensional. El proceso comienza con la extracción de las proteínas desde la muestra biológica. Dicha muestra es separada en dos dimensiones, primero por punto isoeléctrico y segundo por peso molecular. Generalmente, el orden de separación es primero por el punto isoeléctrico y posteriormente por el peso molecular. Sin embargo, este esquema de actuación no es obligatorio, y se han publicado trabajos con el orden inverso195,196. Realmente, el 1. INTRODUCCIÓN 57 orden clásico es el que casi exclusivamente se realiza, tanto por motivos económicos (la segunda y mayor separación es mejor que sea la más barata, como lo es la electroforesis SDS) y por razones técnicas, ya que los geles SDS de electroforesis son mucho más fáciles de teñir que los isoeléctricos y de manejar en las técnicas de análisis197. Esta técnica posibilita la identificación de proteínas que hayan sufrido algún tipo de modificación postraduccional, ya que cuando una proteína sufre una modificación postraduccional (fosforilación, glicosilación, etc.) ésta suele conferirle un cambio tanto de carga como de peso molecular. Los cambios que ocurren tras la traducción son, por tanto, reflejados en el mapa proteico, apareciendo la proteína en una localización distinta a la normal. 1.5.1.1. Preparación de las muestras La situación ideal consiste en solubilizar todas las proteínas de la muestra, sin ninguna modificación añadida durante todo el proceso y eliminando otros componentes biológicos que puedan interferir en la separación de las proteínas. La carga de proteínas que contiene la muestra no debe alterarse en ningún momento, por lo que se deben utilizar sustancias químicas no cargadas que desnaturalicen las proteínas y las mantengan en solución198. Por razones prácticas, como constituye una mínima interferencia con los geles que contienen el SDS unido a las proteínas y una mínima interferencia con los métodos de ensayo, el detergente CHAPS es de los más utilizados199. 1. INTRODUCCIÓN 58 Otro punto de gran importancia es que para conseguir el punto isoeléctrico se requieren campos eléctricos de gran fuerza. Dado que la carga de las proteínas constantemente va disminuyendo hasta alcanzar el punto isoeléctrico, se requieren estos campos potentes para que en los últimos milímetros las proteínas migren a una velocidad decente. De hecho, es muy común utilizar hasta 170 V/cm en el punto isoeléctrico, números mucho mayores que los empleados en la electroforesis SDS (15 V/cm). En contrapartida, la utilización de estos campos de gran fuerza obliga a trabajar con muy bajas fuerzas iónicas, por el calentamiento. 1.5.1.2. Primera dimensión En comparación con la fase de preparación de las muestras, la separación por punto isoeléctrico en la primera dimensión generalmente es más sencilla. Para esta fase se utilizan tiras de gel de poliacrilamida con un gradiente de pH inmovilizado (IPG, del inglés Isoelectric Phocusing Gradient). La introducción de los IPG por Bjellqvist et al200 tuvo un impacto significativo en la primera dimensión de la electroforesis para separar mezclas complejas en un amplio rango de pH. Estos geles permiten una formación estable y reproducible de gradientes de pH capaz de focalizar proteínas ácidas y básicas en un único gel201. En la primera dimensión se aplica una corriente eléctrica que consigue que las proteínas presentes en el extracto migren a lo largo de la tira IPG y se distribuyan por toda su longitud hasta alcanzar su punto isoeléctrico, es decir, el punto donde su carga neta sea cero, y en ese momento se detienen. Así pues, en la primera dimensión las proteínas se separan según carga (Fig. 1.15). 1. INTRODUCCIÓN 59 1.5.1.3. Segunda dimensión La segunda dimensión se realiza sobre geles SDS-PAGE (del inglés sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) para la separación de las proteínas en función de su peso molecular (Fig. 1.15). El SDS es un detergente aniónico utilizado para alinear las proteínas y aplicar una carga negativa a cada proteína proporcional a su masa. La realización de esta segunda dimensión aporta la identificación de nuevas proteínas y, además, la medición de la abundancia relativa comparando entre diferentes muestras. 1.5.1.4. Detección de las proteínas Una vez realizada la segunda dimensión, las proteínas presentes en el gel deben visualizarse para poder cuantificarlas y analizarlas. Existen distintos tipos de tinción del gel que, fundamentalmente, se diferencian según la sensibilidad para la detección de proteínas. Destacan la tinción con azul Coomassie, la tinción radiactiva, la fluorescente y, por último, la tinción con nitrato de plata. Los métodos más empleados son la tinción con plata y con el azul de Coomassie202, en especial la primera por su sensibilidad203,204, su durabilidad en el tiempo y la buena calidad de imagen que ofrece. Además, este tipo de tinción es compatible con el análisis por espectrometría de masas. Sin embargo, el método más recomendado de tinción para realizar la identificación de las proteínas mediante espectrometría de masas es el azul de Coomassie, ya que, a pesar de su moderada sensibilidad, tiene buena homogeneidad y la compatibilidad con la espectrometría es excelente205. 1. INTRODUCCIÓN 60 1.5.2. Análisis de la imagen Una vez obtenido el gel bidimensional o mapa de expresión proteica hay que analizar la imagen. Actualmente poseemos programas informáticos (PD-QUEST, MELANIE, etc.) que facilitan mucho el estudio de este tipo de imágenes. De hecho, este software realiza un análisis completo de los mapas de expresión proteica y permite una posterior comparación entre diferentes mapas. Adicionalmente, existe la posibilidad de realizar comparaciones visuales con mapas proteómicos integrados en bases de datos disponibles en internet. En este sentido, la base de datos suiza Swiss-Prot (http//:www.expasy.ch) es una de las más conocidas y empleadas (Fig. 1.16). Figura 1.16. Ejemplo de ventanas utilizando la base de datos Swiss-Prot. 1. INTRODUCCIÓN 61 Para el análisis cuantitativo de las diferentes proteínas del mapa proteómico disponemos de otras herramientas informáticas que facilitan la detección de variaciones en la expresión de las proteínas, siendo de especial utilidad en estudios patológicos. Un ejemplo es el programa denominado QUANTITY-ONE (Bio-Rad Laboratories). 1.5.3. Espectrometría de masas La aplicación de la espectrometría de masas (MS) para el análisis cuantitativo y cualitativo del proteoma derivado de muestras complejas ha tenido un gran impacto en la comprensión de la función celular206. Hoy en día se estima que mediante esta técnica se pueden detectar proteínas en geles bidimensionales en el rango fentomolar (10-15 M/L). La MS es muy sensible, tolera el análisis de mezclas proteicas y permite la realización de múltiples análisis, por lo que poco a poco ha reemplazado a la secuenciación por el método de EDMAN. La MS proporciona información sobre la estructura de la proteína: la masa peptídica y la secuencia de aminoácidos. Posteriormente, se utilizarán estos datos para identificarlas con las bases de datos. De esta manera, se determina el tipo y la localización de una modificación postransduccional, por ejemplo. Las mediciones en la EM se llevan a cabo en fase gaseosa, con los analitos ionizados. Por definición, un espectrómetro de masas consiste en una fuente ionizante, un analizador de masa, que mide la ratio masa/carga (m/z) de los analitos, y un detector que registra el número de iones en cada valor de m/z. Las dos técnicas 1. INTRODUCCIÓN 62 más utilizadas son las llamadas ESI (del inglés, ElectroSpray Ionization) y MALDI (del ingles, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)207,208. El analizador de masa es la tecnología fundamental del instrumento y en el terreno de la proteómica sus claves son la sensibilidad, la resolución, la precisión en la medida de la masa y la capacidad de generar espectros a partir de fragmentos peptídicos (en tándem o espectros MS/MS)209,210. Hay cuatro tipos básicos de analizadores de masa utilizados actualmente en proteómica: la trampa de iones (ion trap), el tiempo de vuelo o TOF (del inglés, time of flight), el cuádruplo y el FT-MS (del inglés, Fourier Transform ion cyclotron). Cada uno de ellos es diferente, variando en relación a su fuerza. Por lo general, MALDI se utiliza conjuntamente con analizadores TOF (MALDI-TOF) por su simplicidad, la precisión en la medición de la masa y su sensibilidad. Con este último método se obtiene la llamada huella peptídica como resultado del emparejamiento de la lista de masas experimentales con la lista de masas calculadas de todos los péptidos de una base de datos. El proceso habitual consta de cuatro pasos. El primer paso consiste en el aislamiento de las proteínas de la muestra. La MS es menos sensible en el análisis de toda la proteína que en el estudio de los péptidos y, además, la masa de una proteína intacta por sí sola no es suficiente para su identificación. Por ello, las proteínas son degradadas en el segundo paso, generalmente con tripsina, que rompe dichas proteínas en la zona carboxílica de los residuos de lisina y arginina (a no ser que estén seguidos por una prolina), formando huellas peptídicas de péptidos predecibles. En el tercer paso los péptidos son ionizados tras el tratamiento con el láser, que les confiere una carga, y son separados según la ratio m/z. En el cuarto paso se obtiene el espectro de masas de péptidos y el ordenador genera una lista priorizada de estos péptidos por 1. INTRODUCCIÓN 63 fragmentación y una serie de experimentos en tándem posteriores, que consisten en el aislamiento de un péptido dado, fragmentación por colisión con gas y recopilación de un espectro tándem o MS/MS (Fig. 1.17). the traditional, three-dimensional ion traps, allowing increased sensitivity, resolution and mass accuracy. The FT-MS instrument is also a trapping mass spectrometer, although it captures the ions under high vacuum in a high magnetic field. Its strengths are high sensitivity, mass accuracy, resolution and dynamic range8–11. But in spite of the enormous potential, the expense, operational complexity and low peptide-fragmentation efficiency of FT-MS instruments has limited their routine use in proteomics research. MALDI is usually coupled to TOF analysers that measure the mass of intact peptides, whereas ESI has mostly been coupled to ion traps and triple quadrupole instruments and used to generate fragment ion spectra (collision-induced (CID) spectra) of selected precursor ions4. More recently, new configurations of ion sources and mass analysers have found wide application for protein analysis. To allow the fragmentation of MALDI-generated precursor ions, MALDI ion sources have recently been coupled to quadrupole ion-trap mass spec- trometers12 and to two types of TOF instruments. In the first, two TOF sections are separated by a collision cell (‘TOF-TOF instrument’)13, whereas in the second, the hybrid quadrupole TOF instrument, the collision cell is placed between a quadrupole mass filter and a TOF analyser14. Ions of a particular m/z are selected in a first mass analyser (TOF or quadrupole), fragmented in a collision cell and the fragment ion masses are ‘read out’ by a TOF analyser. These instruments have high sensitivity, resolution and mass accuracy, and the quadrupole TOF instrument can be used interchangeably with an ESI ionization source. The resulting fragment ion spectra are often more extensive and informative than those generated in trapping instruments. Although TOF, ion-trap and hybrid TOF instruments dominate proteomics today, other configurations including linear ion traps and FT-MS instruments could become widespread in the near future. As a result of its simplicity, excellent mass accuracy, high resolution and sensitivity, MALDI-TOF is still much used to identify proteins by what is known as peptide mapping, also referred to as peptide-mass mapping or peptide-mass fingerprinting. In this method, proteins are identified by matching a list of experimental peptide masses with the calculated list of all peptide masses of each entry in a database (for example, a comprehensive protein database). Because mass mapping requires an essentially purified target protein, the technique is commonly used in conjunction with prior protein fractionation using either one- or two-dimensional gel electrophoresis (1DE and 2DE, respectively). The addition of sequencing capability to the MALDI method should make protein identifications by MALDI-MS/MS more specific than those obtained by simple peptide-mass mapping (see below). It should also extend the use of MALDI to the analysis of more complex samples, thereby uncoupling MALDI-MS from 2DE. However, if MALDI-MS/MS is to be used with peptide chromatography, the effluent of a liquid chromatography run must be deposited on a sample plate and mixed with the MALDI matrix, a process that has thus far proven difficult to automate. In general, it can be expected that the trend towards the combination of liquid chromatography with ESI- or MALDI- MS/MS (Fig. 1) will continue. Protein identifications using peptide CID spectra are more clear- cut than those achieved by mass mapping because, in addition to the peptide mass, the peak pattern in the CID spectrum also provides information about peptide sequence. This information is not readily convertible into a full, unambiguous peptide sequence, that is, the ‘de novo’ sequencing problem via MS is still not generally solved. Instead, the CID spectra are scanned against comprehensive protein sequence databases using one of a number of different algorithms, each with its strengths and weaknesses. The ‘peptide sequence tag’ approach extracts a short, unambiguous amino acid sequence from the peak pattern that, when combined with the mass information, is a specific probe to determine the origin of the peptide15. In the cross-correlation method, peptide sequences in the database are used to construct theoretical mass spectra and the overlap or ‘cross- correlation’ of these predicted spectra with the measured mass spectra determines the best match16. In the third main approach, ‘probability based matching’, the calculated fragments from peptide sequences in the database are compared with observed peaks. From this comparison a score is calculated which reflects the statistical significance of the match between the spectrum and the sequences contained in a database17. In each of these methods the identified peptides are compiled into a protein ‘hit list’, which is the output of a typical proteomic experiment. Because protein identifications rely on matches with sequence databases, high-throughput proteomics is currently restricted largely to those species for which comprehensive sequence databases are available. Protein identification and quantification No method or instrument exists that is capable of identifying and quantifying the components of a complex protein sample in a simple, single-step operation. Rather, individual components for separating, insight review articles NATURE | VOL 422 | 13 MARCH 2003 | www.nature.com/nature 199 q2 Excised proteins (2) Trypsin digestion Peptide mixture LLE AAAQSTK (5) MS/MS 516.27 (2+) y9 y8y7 LEA AQS y5 y4 y3 L y6 0 100 200 200 600 1000 0 200 400 400 600 800 (4) MS 516.27 (2+) (3) Peptide chromatography and ESI q1 a2 b2 (1) Sample fractionation SDS– PAG E In te ns ity (a rb itr ar y un its ) m/z m/z Figure 1 Generic mass spectrometry (MS)-based proteomics experiment. The typical proteomics experiment consists of five stages. In stage 1, the proteins to be analysed are isolated from cell lysate or tissues by biochemical fractionation or affinity selection. This often includes a final step of one-dimensional gel electrophoresis, and defines the ‘sub-proteome’ to be analysed. MS of whole proteins is less sensitive than peptide MS and the mass of the intact protein by itself is insufficient for identification. Therefore, proteins are degraded enzymatically to peptides in stage 2, usually by trypsin, leading to peptides with C-terminally protonated amino acids, providing an advantage in subsequent peptide sequencing. In stage 3, the peptides are separated by one or more steps of high-pressure liquid chromatography in very fine capillaries and eluted into an electrospray ion source where they are nebulized in small, highly charged droplets. After evaporation, multiply protonated peptides enter the mass spectrometer and, in stage 4, a mass spectrum of the peptides eluting at this time point is taken (MS1 spectrum, or ‘normal mass spectrum’). The computer generates a prioritized list of these peptides for fragmentation and a series of tandem mass spectrometric or ‘MS/MS’ experiments ensues (stage 5). These consist of isolation of a given peptide ion, fragmentation by energetic collision with gas, and recording of the tandem or MS/MS spectrum. The MS and MS/MS spectra are typically acquired for about one second each and stored for matching against protein sequence databases. The outcome of the experiment is the identity of the peptides and therefore the proteins making up the purified protein population. © 2003 Nature Publishing Group MEZCLA PEPTÍDICA DIGESTIÓN CON TRIPSINA PROTEÍNAS SDS-PAGE FRACCIONA MIENTO DE LA MUESTRA ESPECTROMETRÍA Figura 1.17. Esquema de un experimento genérico de proteómica basado en la espectrometría de masas. Fuente: internet, modficada por el autor. 1.5.4. Futuro de la proteómica Después de más de tres décadas de investigación en este campo, la 2-DE es ya una técnica madura, que ofrece gran flexibilidad y resolución modulable211. Por tanto, no son esperables grandes avances en la pura realización de la electroforesis. Sin 1. INTRODUCCIÓN 64 embargo, en un futuro sí podrán objetivarse importantes consecuencias en el diagnóstico clínico y tratamientos derivados de la proteómica. El objetivo último de la medicina moderna es poder ofrecer una medicina personalizada a cada paciente. Actualmente, el centro de muchas investigaciones va dirigido a conocer la etiología de la enfermedad en cada paciente, la respuesta concreta de cada paciente a un determinado factor de riesgo, los factores que facilitan la progresión de la enfermedad, los factores genéticos que hacen a ese paciente susceptible a una enfermedad, su perfil metabólico y, concretamente, cuáles son las proteínas que expresa, para poder así identificar el pronóstico del paciente y su susceptibilidad al tratamiento. Estos objetivos requieren de la utilización de nuevas tecnologías, entre las que se encuentra la proteómica, ya que estudia la base biológica racional, los productos de la interrelación entre unos determinados factores de riesgo y la expresión génica: las proteínas. 1.5.5. La era proteómica en la investigación vascular Las enfermedades cardiovasculares son la causa más importante de mortalidad en el mundo occidental y, además, se está produciendo un incremento progresivo también en las sociedades menos desarrolladas. La carga económica de estas enfermedades, incluyendo los gastos en cuidado de la salud y las pérdidas en productividad, se ha calculado en 45.6 billones de euros anuales en la Unión Europea212 y de 142.5 billones de dólares en Estados Unidos213. 1. INTRODUCCIÓN 65 La proteómica aplicada a las células vasculares o a las placas arterioscleróticas, cuya expresión proteica se modifica a lo largo de la evolución de la enfermedad, constituyen hoy en día una diana en la investigación en el área cardiovascular, siendo en este terreno una técnica de aplicación relativamente reciente. La mayoría de los estudios proteómicos realizados inicialmente en las enfermedades cardiovasculares consistieron fundamentalmente en modelos descriptivos y han permitido la creación de las bases de datos de las que disponemos. Brunnel et al214 publicaron el mapa de expresión proteica de CE de vena umbilical humana, en el que identificaron 53 proteínas relacionadas con el citoesqueleto, coagulación, apoptosis, presentación de antígenos y funciones enzimáticas. Del mismo modo, en 2001, McGregor et al215 describieron el proteoma de las CML de la vena safena humana sana, identificando 130 proteínas. Más recientemente, se publicó también el proteoma de 83 proteínas de las CML de la arteria mamaria interna216. Progresivamente, la proteómica vascular ha ido evolucionando para intentar proporcionar dos tipos de datos: la determinación de proteínas que participan activamente en la fisiopatología de la arteriosclerosis y la búsqueda de nuevas proteínas que potencialmente sirvan como biomarcadores de enfermedad217. De hecho, la tendencia es utilizar la proteómica para la comparación de los niveles de expresión de una determinada proteína en diferentes condiciones experimentales. Hace más de 20 años Stastny et al218 compararon extractos de estría grasa con segmentos de íntima sana de aorta humana. Esta comparación se realizó de forma visual, ya que en esa época todavía no había programas informáticos para el análisis de los geles, por lo que solo se identificaron los cambios más evidentes. 1. INTRODUCCIÓN 66 En la arteriosclerosis se considera fundamental la disfunción endotelial y la proliferación y migración de las CML. Por otro lado, todo ello ocurre en un marco inflamatorio, en el que factores de crecimiento y citoquinas están involucrados en los cambios de expresión de determinadas proteínas específicas. Este es el caso del TNF- α, citoquina implicada en diferentes procesos críticos de la iniciación y la progresión de la lesión vascular. La utilización de este mediador inflamatorio en cultivos de arterias sanas puede inducir cambios inflamatorios en la pared vascular, modificando por tanto la expresión proteica. Un estudio reciente219 demostró, utilizando la 2D-E y MS, que la incubación de CML con TNF-α conducía a la infraexpresión o sobreexpresión de determinadas proteínas. Zamorano-León et al220 observaron en segmentos preincubados con TNF-α una mayor expresión de moléculas proinflamatorias (CD40L, PECAM) en el endotelio y una sobreexpresión de la eNOS concentración dependiente. Otros autores han centrado sus investigaciones en los mecanismos de señalización celular. Molero et al221 demostraron modificaciones en la expresión proteica en células de músculo liso vascular inducidas por el 17β-estradiol, confirmando que los estrógenos pueden modular un amplio rango de vías de señalización en este tipo de células. Soskic et al222 estudiaron los cambios en la vía de señalización de fibroblastos de ratón en respuesta al factor de crecimiento derivado de plaquetas. La información que puede aportar la proteómica en la búsqueda de nuevos biomarcadores en las enfermedades cardiovasculares, sumada al análisis del fenotipo clínico, cambios metabólicos y al haplotipo genético, puede informar del perfil de 1. INTRODUCCIÓN 67 riesgo cardiovascular para cada paciente223,224. Sin embargo, actualmente a nivel cardiovascular la identificación de las modificaciones postraduccionales es prácticamente nula y menos aún se sabe sobre modificaciones en el nivel de expresión de diferentes isoformas de proteínas. Probablemente, con la introducción de la proteómica, en pocos años el conocimiento de las enfermedades cardiovasculares aumente de forma considerable. En resumen, la proteómica tiene el potencial de revolucionar el modo de diagnosticar, determinar el riesgo y el pronóstico clínico así como las estrategias terapéuticas en individuos con enfermedades cardiovasculares. Incluso ya se ha creado el término farmacoproteómica, que consiste en el estudio de la respuesta farmacológica de un paciente en función de las proteínas que expresa. Sin embargo, todavía no hay muchos estudios que analicen los efectos de los fármacos en el proteoma225,226,227. 1.6. INTERACCIÓN PLAQUETA-ENDOTELIO. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS Hasta no hace mucho tiempo, el concepto de las plaquetas dentro de la arteriosclerosis era el de una célula involucrada en la iniciación de la cascada de la coagulación y como participante de los estadios finales en la evolución de la placa de ateroma, es decir, en la rotura de la placa precedente a la oclusión aguda de la arteria por material trombótico228. Theilmeier et al229 demostraron cómo en conejos hipercolesterolémicos la plaquetas se reclutan en sitios propensos a la lesión arteriosclerótica antes de que ésta aparezca y pueden agravar o perpetuar el daño endotelial. Además, estos investigadores observaron que las plaquetas adheridas al endotelio disfuncionante 1. INTRODUCCIÓN 68 proporcionanban un punto para el reclutamiento de monocitos en el espacio subendotelial, considerando siempre que esta fuerte interacción con el endotelio es mediada por el vWF, la GPIb y la P-selectina. Sin embargo, los nuevos avances que se han ido realizando progresivamente en el estudio de los procesos de arteriosclerosis y aterotrombosis han cambiado este dogma. En diferentes estudios se ha comprobado la existencia de plaquetas en todos los estadios de formación de la placa de ateroma, por lo que cada vez ha tomado más relevancia el papel de las mismas en los primeros estadios y no sólo después de la rotura de la placa230,231. El endotelio constituye una barrera activa entre el torrente sanguíneo y los tejidos subyacentes, conteniendo los componentes de la sangre en el espacio intravascular. La integridad de esta monocapa constituye un requisito para el control de la permeabilidad vascular. Como ya ha sido ampliamente demostrado, la actividad plaquetaria está modulada por múltiples factores expresados y liberados por la pared vascular153,232. Esta barrera antiadhesiva y antitrombótica que constituye el endotelio sano inhibe la actividad plaquetaria233. Existe un equilibrio dinámico entre estos dos estados, modulado a nivel de transcripción genética y a nivel de integridad celular234. Sin embargo, bajo un estado inflamatorio, como ocurre en los eventos isquémicos arteriales, las condiciones antitrombóticas de la pared vascular se pierden, promoviendo un estado protrombótico que favorece la activación plaquetaria235,236. Diferentes estudios sugieren a las plaquetas como contribuyentes importantes en el proceso inflamatorio que promueve la formación de placas de ateroma. De hecho, las plaquetas se pueden adherir al endotelio intacto en ausencia de una disrupción del mismo. 1. INTRODUCCIÓN 69 Actualmente poseemos un amplio conocimiento de los efectos que ejerce la pared vascular sobre las plaquetas236, pero son muy escasos y limitados los estudios que examinan el efecto contrario, el de las plaquetas sobre la expresión proteica de la pared vascular. Las plaquetas son fuente de numerosos mediadores, incluyendo factores de crecimiento y otras sustancias que pueden influir en la expresión de proteínas de la pared vascular. Massberg et al237 demostraron que la incubación de monocapas de CML con plaquetas activadas producía un aumento significativo de la secreción de MCP-1 y promovía la migración de CML. Las plaquetas también han mostrado la capacidad de activar factores de transcripción como el NF-κB, que participa en el desarrollo de la arteriosclerosis. Gawaz et al238 encontraron que las plaquetas activadas con ADP inducían la secreción de MCP-1 y la expresión en la superficie de las CE por un mecanismo mediado por NF-κB. Adicionalmente, encontraron un incremento de la secreción de MCP-1 en presencia de plaquetas no estimuladas, aunque significativamente menor. En este sentido, existen estudios in vitro que sugieren que las plaquetas pueden inducir un proceso inflamatorio en cultivos de CE236. Del mismo modo, existen estudios in vivo que demuestran cómo las plaquetas, bajo condiciones inflamatorias, pueden modular la expresión de proteínas asociadas al proceso inflamatorio. González-Fernández et al239 demostraron una marcada disminución de la sintasa inducible de NO (iNOs) por las plaquetas tras la denudación del endotelio de arteria carótida de ratas, efecto que podía ser bloqueado por los inhibidores de la GPIIb/IIIa . Las alteraciones en la función de la pared vascular son el origen de muchas enfermedades cardiovasculares, como la arteriosclerosis. Además del control del proceso inflamatorio, hay una amplia evidencia de que el mantenimiento de dicha 1. INTRODUCCIÓN 70 función vascular está particularmente relacionado con el metabolismo energético240. En concreto, se ha demostrado una dependencia específica del metabolismo de la glucosa241. Ya en 1996, Zhang y Paul242 investigaron la importancia de la glucosa, sustrato primario de la glucolisis, en el mantenimiento de la tensión y del proceso de excitación/contracción en arterias carótidas porcinas. Otro punto importante es que durante el proceso de producción energética, en condiciones fisiológicas de aerobiosis, las células de la pared vascular forman ROS, por lo que es de suma importancia un potente sistema antioxidante. El citoesqueleto y el sistema contráctil son otros componentes críticos de la pared vascular, ya que contribuyen directamente en la modulación de la hemodinámica arterial y mantenimiento de la integridad vascular243. La estructura del vaso sanguíneo, incluyendo el citoesqueleto, parece estar regulada por factores mecánicos244, aunque otros factores y células circundantes como las plaquetas pueden estar también involucrados en esta regulación. Así, la interacción entre las células de la pared vascular y las plaquetas puede ser más compleja de lo que inicialmente habríamos pensado. Todo ello apunta a la necesidad de más estudios e investigaciones relacionados con este tema. Hasta ahora había una gran dificultad para la monitorización de los cambios en la expresión proteica al mismo tiempo en una única muestra. Por ello, la nueva tecnología basada en la proteómica, basada a su vez en la 2-DE y la MS, ha emergido con gran fuerza para la cuantificación e identificación de cambios en la expresión proteica de múltiples proteínas e isoformas proteicas en una misma muestra. 1. INTRODUCCIÓN 71 1.7. CONSIDERACIONES GENERALES Como se ha detallado anteriormente, más allá del papel en la hemostasia, las plaquetas son capaces de regular una gran variedad de respuestas inflamatorias y han demostrado ser unas células clave en la arteriosclerosis. Debido a que la arteriosclerosis es una causa mayor de morbilidad y mortalidad en los países desarrollados, el entendimiento del papel real de las plaquetas en la inflamación de la pared vascular y la aterogénesis es un tema en auge. Se han alcanzado grandes avances en cuanto al conocimiento del papel de la pared vascular y, más específicamente, del endotelio sobre la regulación de la actividad plaquetaria. Sin embargo, solamente existen datos puntuales sobre qué proteínas son modificadas en su expresión en la pared vascular por la presencia de las plaquetas. En este sentido, aún es necesario penetrar más profundamente en los mecanismos moleculares modificados en la interacción plaqueta-pared vascular para poder desarrollar estrategias terapéuticas. La proteómica se ha ido introduciendo como una herramienta cardinal de investigación y nos puede ayudar a aclarar el papel de las plaquetas en la arteriosclerosis.                                                             2 “Las ciencias tienen las raíces amargas, pero muy dulces los frutos” Aristóteles HIPÓTESIS   2. HIPÓTESIS 75 Como se ha detallado en la introducción de la tesis, es bien conocido que el endotelio en condiciones fisiológicas es un inhibidor de la activación plaquetaria. Sin embargo, en condiciones patológicas, en las que existe un alto componente inflamatorio, la célula endotelial pierde su capacidad inhibitoria sobre la plaqueta y se convierte en una célula que estimula la actividad plaquetaria. Pero, mientras que la relación endotelio-plaqueta está muy analizada, poco se conoce sobre la relación o influencia que pueden tener a su vez las plaquetas sobre el endotelio intacto en condiciones fisiológicas o en condiciones en las que exista un componente inflamatorio similar al que ocurre durante la enfermedad vascular. En este sentido, hay que recordar que las plaquetas tienen la capacidad de producir, almacenar y liberar mediadores vasoactivos que podrían contribuir al desarrollo de la disfuncionalidad de la pared vascular afectando a sistemas como el metabolismo energético o el citoesqueleto. Por tanto, las plaquetas podrían estar directamente involucradas en mecanismos de disfunción vascular que se producen durante el desarrollo de la placa de ateroma y, así, podrían inducir cambios en la expresión proteica de las células endoteliales en función del estado inflamatorio de la pared vascular.   3 “Quizá la existencia de una respuesta dependa solamente de que se haga la pregunta adecuada” Richard Whately OBJETIVOS 3. OBJETIVOS 79 Los principales objetivos de la presente tesis son: 1. Evaluar si las plaquetas son capaces de modificar la expresión proteica de la pared vascular normal, particularmente de aquellas proteínas relacionadas con el citoesqueleto y el sistema contráctil. 2. Determinar si las plaquetas son capaces de modificar la expresión de las proteínas relacionadas con el metabolismo energético de la pared vascular sana. 3. Evaluar si en condiciones en las que la pared vascular se encuentra en un ambiente inflamatorio las plaquetas son capaces de modificar la expresión proteica de las proteínas relacionadas con el sistema contráctil y el citoesqueleto. 4. Evaluar si en condiciones en las que la pared vascular se encuentra en un ambiente inflamatorio las plaquetas son capaces de modificar la expresión proteica de las proteínas relacionadas con el metabolismo energético. 4 “No existe una cantidad suficiente de experimentos que muestren que estoy en lo correcto; pero un simple experimento puede probar que me equivoco” Albert Einstein MATERIAL Y MÉTODO                                       4. MATERIAL Y MÉTODO 83 4. MATERIAL Y MÉTODO En la presente tesis se realizaron experimentos in vitro para estudiar el efecto de las plaquetas sobre la pared vascular observando los cambios en la expresión proteica en segmentos de aorta bovina incubados con plasma rico en plaquetas en dos concentraciones diferentes: una semejante a la fisiológica (105 plaquetas/pocillo) y otra concentración más elevada semejante a la encontrada cuando las plaquetas se activan y forman el trombo (107 plaquetas/pocillo). Además, para intentar simular un estado inflamatorio (como ocurre en la arteriosclerosis), se realizaron estas mismas determinaciones en segmentos de aorta preestimulados con TNF-α y posteriormente incubados con plasma rico en plaquetas. 4.1. SELECCIÓN DE PACIENTES Se seleccionaron voluntarios sanos con una edad de 35±8 años para obtener plasma rico en plaquetas (PRP). Se consideró como criterio de exclusión la toma de aspirina u otros antiagregantes plaquetarios o antiinflamatorios en los 15 días anteriores a la obtención de la muestra de sangre. Los voluntarios fueron informados del estudio y firmaron su consentimiento. 4. MATERIAL Y MÉTODO 84 4.2. OBTENCIÓN DE MUESTRAS 4.2.1. Sangre periférica humana La extracción de sangre se realizó por venopunción en antebrazo de una cantidad de 10 ml. La muestra se depositó en tubos estériles con el anticoagulante citrato-dextrosa (10% ACD, del inglés Acid-Citrate-Dextrose), que inhibe la activación plaquetaria. Los componentes del tampón ACD son los siguientes, con un pH de 7.4: • Ácido cítrico………………………………….………39 mM • Citrato sódico……………………………..………….75 mM • Dextrosa………………………………………….….135 mM 4.2.2. Muestras de aorta bovina Se obtuvieron segmentos de aorta torácica descendente de vacas procedentes del matadero municipal (Colmenar Viejo). Cada segmento fue cuidadosamente aislado para preservar el endotelio intacto. El aislamiento y manipulación de las muestras se realizaron en condiciones de esterilidad. Se mantuvieron en tampón salino fosfatado del tipo Dulbecco atemperado a 37ºC. El tampón Dulbecco se preparó en el laboratorio en condiciones de esterilidad con los siguientes componentes y concentraciones: 4. MATERIAL Y MÉTODO 85 • Cloruro potásico (ClK)……………………………2.6 mmol/l • Fosfato potásico (KH2PO4)………………….…… 1.5 mmol/l • Cloruro sódico (NaCl)…………………….………137 mmol/l • Fosfato sódico (NaH2PO4)……………………….......8 mmol/l • Glucosa (C6H12O6)…………………....……………5.5 mmol/l • Agua (H2O) hasta un litro 4.3. AISLAMIENTO DEL PLASMA RICO EN PLAQUETAS La preparación del PRP requiere la separación de las plaquetas y el plasma de los elementos formes sanguíneos. El protocolo para la obtención del PRP ya ha sido publicado con anterioridad239,245,246. Para prevenir la activación de las plaquetas, durante el procedimiento se evitaron grandes fuerzas mecánicas como agitación o un pipeteo rápido. La muestra de sangre se centrifugó durante 15 minutos a 800 g y a 20 ºC en la centrífuga tipo Hettich Universal 320R® (Hettich Zentrifugen). Posteriormente, se recolectó el PRP (Fig. 4.1) y se cuantificó el número de plaquetas con un contador celular. Cuando fue necesario, se utilizó plasma pobre en plaquetas (PPP) para diluir el PRP. A su vez, el PPP se obtuvo mediante centrifugación del PRP durante 10 minutos a 2500 rpm. 4. MATERIAL Y MÉTODO 86 10 cc de sangre humana Plasma Rico en Plaquetas Centrifugado •  800 g •  15’ •  20 ºC Leucocitos Eritrocitos Plasma concentración intermedia de Plaquetas Plasma Pobre Plaquetas Figura 4.1. Proceso de obtención del plasma rico en plaquetas 4.4. INCUBACIÓN DE LAS MUESTRAS DE AORTA Los segmentos de aorta se cortaron con bisturí en piezas de aproximadamente 1 cm de longitud y fueron preincubadas en placas de Petri con medio RPMI 1640 durante una hora, tanto los segmentos controles como los que posteriormente serían estimulados con TNF-α. 4.4.1. Medio de cultivo El medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 fue inicialmente diseñado para el crecimiento de linfoblastos y líneas celulares leucémicas en suspensión, pero con los suplementos adecuados tiene un amplio rango de aplicaciones en células de mamíferos. El medio RPMI empleado pertenece a la compañía Invitrogen Corporation: Gibco® RPMI 1640 (nº catal.11835-063), sin rojo fenol, para evitar alteraciones posteriores en los análisis en los que se utilizan métodos colorimétricos. Este medio 4. MATERIAL Y MÉTODO 87 está constituido por la formulación basal estándar recogida en publicaciones previas247, suplementado con aminoácidos no esenciales y piruvato sódico. Además se suplementó con un 1% de suero fetal bovino (SFB) (al tratarse de tejidos requieren menos SFB que los cultivos celulares), 5 mmol/l de glutamina, 2x10-5 µg/l de penicilina y 2x10-5 µg/l de estreptomicina. La formulación del medio se indica en la Tabla 4.1. Tabla 4.1. Formulación del medio RPMI 1640 Gibco® COMPONENTES PESO MOLECULAR CONCENTRACIÓN (mg/dl) MOLARIDAD (mM) AMINOÁCIDOS Glicina 75 10 0.133 L-Arginina 174 200 1.150 L-Asparagina 132 50 0.379 Ácido L-Aspártico 133 20 0.150 L-Cistina 2HCl 313 65 0.208 Ácido L-Glutámico 147 20 0.136 L-Glutamina 146 300 2.050 L-Histidina 155 15 0.0968 L-Hidroxiprolina 131 20 0.153 L-Isoleucina 131 50 0.382 L-Leucina 131 50 0.382 L-Lisina 146 40 0.274 L-Metionina 149 15 0.101 L-Fenilalanina 165 15 0.0909 L-Prolina 115 20 0.174 L-Serina 105 30 0.286 L-Treonina 119 20 0.168 L-Triptófano 204 5 0.0245 L-Valina 117 20 0.111 4. MATERIAL Y MÉTODO 88 VITAMINAS Biotina 244 0.2 0.000820 Cloruro de colina 140 3 0.0214 A. pantoténico 477 0.25 0.000524 Ácido fólico 441 1 0.00227 i-Inositol 180 35 0.194 Niacinamida 122 1 0.00820 P-aminobenzoico 137 1 0.00730 Piridoxina 206 1 0.00485 Riboflavina 376 0.2 0.000532 Tiamina 337 1 0.00297 Vitamina B12 1355 0.005 0.0000037 SALES Nitrato de calcio 236 100 0.424 Sulfato magnésico 120 48.84 0.407 Cloruro potásico 75 400 5.33 Bicarbonato sódico 84 2000 23.81 Cloruro sódico 58 5300 91.38 Fosfato disódico 142 800 5.63 OTROS D-Glucosa 180 2000 11.11 Glutation reducido 307 1 0.00326 HEPES 238 5958 25.03 HEPES: ácido 4-(2-HidroxiEtil)-1-PiperacinaEtanosulfónico. 4.4.2. Protocolo de preincubación de las muestras Los segmentos de aorta fueron cultivados en atmósfera de 95% de oxígeno (O2), 5% de dióxido de carbono (CO2), a 37 ºC durante 1 hora y con 1 ml de RPMI. Posteriormente, se lavaron dos veces y se procedió a la incubación con PRP. 4. MATERIAL Y MÉTODO 89 4.4.3. Estimulación de las muestras de aorta Con el objetivo de inducir un estado inflamatorio, como podría ser el que acontece en la arteriosclerosis, en el mismo experimento, y previo a la incubación con PRP, 33 fragmentos de aorta bovina fueron estimulados (se indujo un estado inflamatorio) incubándolos con 10 ng/ml de TNF-α (Sigma-Aldrich, St Louis, MI, USA) durante 6 horas a 37ºC en una atmósfera de 95% de O2 y 5% de CO2. Este proceso de estimulación se realizó como se ha demostrado en publicaciones previas220 . Tras el proceso de incubación se procedió al lavado de las muestras en dos ocasiones consecutivas y a la coincubación con PRP. 4.4.4. Protocolo de coincubación (cocultivos) En el experimento de coincubación se utilizaron dos concentraciones de plaquetas: 105 plaquetas por pocillo (105 plaq/poc), considerada una concentración fisiológica, y 107 plaquetas por pocillo (107 plaq/poc), que simularía la concentración de plaquetas del trombo plaquetario y, por tanto, una situación patológica. La concentración plaquetaria final se obtuvo diluyendo el PRP con PPP. De esta manera, 105 plaquetas se consiguieron diluyendo la concentración de 107 plaquetas con PPP. Se utilizaron 31 segmentos aórticos como controles (18 en el grupo de pared vascular normal y 13 con la pared preestimulada con TNF-α), los cuales fueron 4. MATERIAL Y MÉTODO 90 incubados con la misma cantidad de PPP que el volumen final de PRP+PPP añadido a los segmentos de aorta incubados con 105 plaq/poc. El sistema de coincubación se preparó utilizando membranas de tipo Corning®-Transwell®-COL (Corning incorporated, COSTAR 3491, NY). Los sistemas Corning®-Transwell®-COL contienen membranas transparentes estériles de PTFE tratadas con colágeno que promueven la fijación y crecimiento celular a la vez que permiten visualizar el proceso de cultivo. Contienen una mezcla equimolar de colágeno tipo I y III derivado de placenta bovina. La descripción de las características se detalla en la Tabla 4.2. Tabla 4.2. Características del sistema Corning®-Transwell®-COL. Este sistema, que contenía las plaquetas, se introdujo en los pocillos donde se depositaron previamente los segmentos de aorta bovina (Fig.4.2). El tamaño del poro utilizado fue de 0.4 µm para evitar la interacción física de las plaquetas con las muestras de aorta, ya que las plaquetas poseen un diámetro medio de 1-3 µm248. CARACTERÍSTICA Forma pocillo Redonda Área de crecimiento celular 4.67 cm2 Material PTFE Tamaño del poro 0.4 µm Grosor de la membrana 50 µm Diámetro de la membrana 24 mm 4. MATERIAL Y MÉTODO 91 Membrana semipermeable Sistema Corning Transwell®-COL Muestra de aorta bovina Plaquetas Figura 4.2. Sistema Corning®-Transwell®-COL. Esquema del experimento desarrollado con este tipo de sistema en el que no hay contacto directo entre las muestras. De esta manera, en el sistema de coincubación las plaquetas y las muestras de aorta bovina para el cultivo no estaban en contacto físico, lo que permitió estudiar la interacción entre ellas a través de la liberación de marcadores bioactivos (y no por contacto directo) e hizo posible el posterior procesado sólo de los fragmentos de arteria249 sin contaminación por las plaquetas. Finalmente, en el experimento que fue llevado a cabo se establecieron las siguientes coincubaciones (Fig. 4.3): • 18 pocillos con segmentos de aorta bovina normal + PPP (control) • 10 pocillos con segmentos de aorta bovina normal + 105 plaq/poc. • 9 pocillos con segmentos de aorta bovina normal + 107 plaq/poc. • 13 pocillos con segmentos de aorta bovina preestimulados con TNF-α + PPP (control) • 10 pocillos con segmentos de aorta bovina preestimulados con TNF-α + 105 plaq/poc. 4. MATERIAL Y MÉTODO 92 • 10 pocillos con segmentos de aorta bovina preestimulados con TNF-α + 107 plaq/poc. Segmentos de aorta torácica bovina Segmentos de aorta torácica bovina ESTIMULADOS Segmentos de aorta torácica bovina SANOS TNF-α PRP 105 PRP 107 PPP PRP 105 PRP 107 PPP Figura 4.3. Resumen esquemático del modelo experimental. Todos los experimentos se realizaron con el medio RPMI (Tabla 4.1) suplementado con:  Suero fetal bovino (SFB)..……………........1%  Glutamina……………………...…….3 mmol/l  Penicilina……………………..….2 x 10-5 µg /l  Estreptomicina………………...….2 x 10-5 µg/l La coincubación de cada experimento fue de 1 hora. El hecho de incubar con PRP sólo durante una hora se basó en observaciones previas en las que tiempos 4. MATERIAL Y MÉTODO 93 superiores a 1 hora favorecen la activación espontánea de las plaquetas250. Transcurrido ese tiempo se retiró el sistema Corning®-Transwell®-COL que contenía las plaquetas. Los segmentos aórticos aislados fueron entonces incubados a 37ºC durante otras 23 horas más y congelados inmediatamente a -80ºC para el posterior análisis proteómico. 4.5. DETERMINACIONES DE PROTEÍNAS MEDIANTE PROTEÓMICA Para llevar a cabo este análisis se utilizó la proteómica, que, como ya se ha indicado con anterioridad (ver apartado 1.5. PROTEÓMICA), es una nueva tecnología que permite analizar la expresión de múltiples proteínas a la vez en una única muestra. En un estudio proteómico es necesario integrar una serie de tecnologías, como la 2-DE, el análisis de la imagen, la MS y la bioinformática, como se muestra a continuación. 4.5.1. Electroforesis bidimensional La 2-DE es la base fundamental para el desarrollo de los mapas de expresión proteica o proteomas. Esta técnica permite separar las proteínas en dos dimensiones: el peso molecular y el punto isoléctrico. Esta separación bidimensional de las proteínas da lugar a un mapa de expresión proteica en el que cada proteína y sus isoformas están distribuidas en la coordenada formada por el peso molecular y el punto isoeléctrico. Esta coordenada es única para cada proteína, es decir, es el documento de identidad de la misma. 4. MATERIAL Y MÉTODO 94 4.5.1.1. Material utilizado • Homogeneizador Ultra-Turrax® T8 (IKA®-Werke) • Tampón de rehidratación • kit Pierce® BCA Protein Assay • Geles de gradiente de pH inmovilizado (IPG) (Bio-Rad ReadyStrip™). • Sistema PROTEAN® IEF cell (Laboratorios Bio-Rad) • Geles de electroforesis de poliacrilamida y dodecil sulfato sódico (SDS- PAGE) al 10% • Sistema PROTEAN® II XL (Laboratorios Bio-Rad) • Fixative Enhance Concentrate (Laboratorios Bio-Rad) • Kit Silver Stain Plus (Laboratorios Bio-Rad) • Escáner UMAX POWERLOOK III • Software ScanMagic V 4.5 • Programa Quantity One 4.2.3 (Laboratorios Bio-Rad) 4.5.1.2. Preparación de las muestras Las muestras de aorta fueron aisladas y homogeneizadas con el homogeneizador Ultra-Turrax® T8 (IKA®-Werke). Dicho homogeneizador es una unidad de dispersión para conseguir emulsiones y dispersiones con un alto rendimiento. El Ultra-Turrax® T8 (Fig. 4.4) es un instrumento de mano de alta calidad, con una potencia de hasta 100 watios y unas velocidades de 5000 a 25000 rpm. Gracias al 4. MATERIAL Y MÉTODO 95 amplio rango de velocidades y que el elemento dispersor tiene un diámetro de 5-8 mm, incluso pequeñas cantidades se procesan y dispersan rápidamente. Figura 4.4. Ejemplo del instrumento Ultra-Turrax® T8. Fuente: internet. Las muestras se homogeneizaron en una solución tampón (rehydratation buffer) que contenía un agente desnaturalizante (urea), un agente detergente (CHAPS y anfolitos) y un agente reductor (ditiotreitol) en las concentraciones que se exponen a continuación (Tabla 4.3): • Urea……………………………………………………….8 mol/l • CHAPS w/v…………………………………………………...2% • Ditiotreitol……………………………………………..40 mmol/l • Anfolitos Bio-Lyte (Laboratorios Bio-Rad, Hercules, Cal)…0.2% • Azul de bromofenol w/v……………………………………0.01% Tabla 4.3. Componentes, función y concentración de la solución de rehidratación. COMPONENTE FUNCIÓN CONCENTRACIÓN Urea Desnaturaliza y solubiliza las proteínas 8 M/l Detergente (CHAPS) Solubiliza las proteínas y ayuda a mantenerlas en solución durante la 2% 4. MATERIAL Y MÉTODO 96 Posteriormente, los tejidos homogeneizados se centrifugaron a 6000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se congeló a -80 ºC hasta su análisis. 4.5.1.3. Primera dimensión La concentración de proteínas se estimó utilizando el kit Pierce® BCA Protein Assay. Se trata de una formulación basada en el ácido bicinconínico (BCA), compatible con detergentes, para la detección colorimétrica y cuantificación de las proteínas totales. El principio del método del ácido bicinconínico (BCA), patentado por Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA), es similar al procedimiento de Biuret, en cuanto que ambos se basan en la formación de un complejo Cu2+-proteína bajo condiciones alcalinas, seguido de la reducción del Cu2+ en Cu1+ 251. La cantidad de reducción es proporcional a la proteína presente. El BCA forma un complejo azul púrpura con el Cu1+ por proteínas en medios alcalinos, de modo que permite monitorizar la reducción de Cu2+ por las proteínas a un máximo de absorbancia de 562 nm y de este modo cuantificar las proteínas. La estructura macromolecular de la proteína, el número de uniones peptídicas y la presencia de cuatro aminoácidos en particular (cisteína, rehidratación y 2-DE Agente reductor (ditiotreitol) Rompe los puentes disulfuro en las proteínas 40 mM Anfolitos Ayudan a solubilizar las proteínas y a mantener el gradiente de pH entre 0.2- 2% 0.2% 4. MATERIAL Y MÉTODO 97 cistina, triptófano y tirosina) han sido descritos como los responsables de la formación de color con BCA. La concentración de proteínas se determina en referencia generalmente a una proteína estándar común, como la albúmina bovina. El ensayo BCA es más sensible y aplicable que los métodos de Biuret o de Lowry. Además, tiene menos variabilidad que el método de Bradford. Entre otras características del ensayo BCA encontramos: • Método colorimétrico, se lee a 562 nm • Compatible con la mayoría de los detergentes iónicos y no iónicos • Más rápido y fácil que el método de Lowry • Todos los reactantes son estables a temperatura ambiente durante 2 años • El rango de trabajo varía de 20 a 2000 µg/ml • El complejo de color es estable • Adaptable a microplatos • Menor variación proteína-a-proteína que con los métodos de tinción • Es aplicable a un amplio rango de concentraciones de proteínas La concentración de proteínas se determinó con referencia al estándar, la albúmina bovina (Fig. 4.5). Concentración de proteína (µg/ml) 4. MATERIAL Y MÉTODO 98 Figura 4.5. Ejemplo de curva de comparación de concentración de proteínas frente a la albúmina bovina. BSA: albúmina de suero bovino. BGG: gammaglobulina bovina. Fuente: internet. La cuantificación de las proteínas se realizó siguiendo los pasos que se indican a continuación: 1. Preparación de las diluciones estándar de BSA (albúmina de suero bovino). Las diluciones de BSA se prepararon a partir de ampollas de BSA de 2.0 mg/ml, según el siguiente esquema (Tabla 4.4): Tabla 4.4. Diluciones de BSA indicando el volumen de disolvente, la relación volumen/fuente de BSA y la concentración final de BSA. BSA: albúmina de suero bovino. 2. Preparación del reactivo de trabajo BCA Se empleó como reactivo el kit Pierce® BCA Protein Assay. Para determinar el volumen total de reactivo de trabajo se empleó la siguiente fórmula: (x estándar + x muestras problema) x (nº duplicados) x (volumen de reactivo de trabajo por muestras= 200 µl)= volumen total. El reactivo de trabajo se prepara mezclando 50 VIAL VOLUMEN DE DISOLVENTE VOLUMEN/FUENTE DE BSA CONCENTRACIÓN FINAL BSA A 700 µl 100 µl del estándar 250 µg/ml B 400 µl 400 µl del vial A 125 µg/ml C 450 µl 300 µl del vial B 50 µg/ml D 400 µl 400 µl del vial C 25 µg/ml E 400 µl 100 µl del vial D 5 µg/ml F 400 µl 0 0 µg/ml (blanco) 4. MATERIAL Y MÉTODO 99 partes de reactivo A (carbonato sódico, bicarbonato sódico, ácido bicincinínico y tartrato sódico en hidróxido sódico 0.1 M) con una parte de reagente B (sulfato cúprico 4%). 3. Se pipetearon 25 µl de cada estándar o muestra problema por triplicado en pocillos 4. Se añadieron 200 µl de reactivo de trabajo a cada pocillo y se mezcló el platillo en un agitador durante 30 segundos. 5. Se tapó el platillo y se incubó a 37 ºC durante 30 minutos 6. Se dejó enfriar hasta temperatura ambiente 7. Se midió la absorbancia a 562 nm 8. Se restó la absorbancia de la muestra blanco al resto de muestras 9. Se preparó la curva estándar: en el eje de ordenadas la medida de absorbancia; en el eje de abscisas, la concentración conocida de BSA. A continuación, en esta curva se interpolan los valores obtenidos en el resto de muestras problema. Para la primera dimensión de la 2-DE se cargaron muestras de 250 µg de proteína total en tiras de geles de gradiente de pH inmovilizado (IPG) con un pH de 3 a 10 (Bio-Rad ReadyStrip™). El foco isoeléctrico se realizó con el sistema PROTEAN® IEF cell (Laboratorios Bio-Rad) durante tres días y a temperatura ambiente (20ºC). Este sistema está diseñado para llevar a cabo la primera dimensión y consiste en una fuente de alimentación programable con una plataforma Peltier que mantiene la temperatura constante para asegurar la reproducibilidad. El rango de temperaturas varía desde 10 a 25 ºC, lo que permite trabajar con un rango más amplio de muestras de proteínas y condiciones. Dicho sistema permite acomodar hasta 24 4. MATERIAL Y MÉTODO 100 tiras de 7 cm o 12 de 17 cm para realizar el foco isoeléctrico. Puede ser programado completamente para una rehidratación pasiva o activa (50 V). Las especificaciones técnicas se listan en la Tabla 4.5. Tabla 4.5. Especificaciones técnicas del sistema PROTEAN® IEF cell (Laboratorios Bio-Rad). Como se ha publicado con anterioridad221,227, los geles fueron rehidratados activamente a 50 V durante 60 horas, seguido de rápidas subidas lineales de tensión y voltaje, limitados por una corriente máxima de 50 µA por gel252. 4.5.1.4. Segunda dimensión En la segunda dimensión las proteínas de las tiras se separaron según su peso molecular en geles de electroforesis de poliacrilamida y dodecil sulfato sódico al 10% (SDS-PAGE) utilizando el sistema PROTEAN® II XL (Laboratorios Bio-Rad). Esta unidad proporciona una gran área de separación de las proteínas, lo que permite analizar muestras con mayor carga y, finalmente, también obtener una mejor RENDIMIENTO Voltaje 50-10000 V, incrementos de 10 V Corriente 0-2.4 mA, incrementos de 1.0 µA Potencia 0-24 W PLATAFORMA Peltier Capacidad 24 tiras de 7 cm o 12 toras de 11,17,18 o 24 cm. Temperatura de operación 10-25 ºC Dimensiones 28 x 30 x 14 cm 4. MATERIAL Y MÉTODO 101 resolución respecto a los formatos de gel más pequeños. Las especificaciones técnicas se incluyen en la Tabla 4.6. Tabla 4.6. Especificaciones técnicas del sistema PROTEAN® II XL (Laboratorios Bio-Rad). 4.5.1.5. Tinción Posteriormente, los geles fueron fijados en una solución con Fixative Enhance Concentrate (Laboratorios Bio-Rad), etanol y ácido acético en agua destilada durante 20 minutos. Después se utilizó una solución de sensibilización compuesta por acetato sódico y tiosulfato sódico en agua destilada y se lavaron dos veces de 10 minutos con agua destilada. Entonces los geles fueron teñidos con plata utilizando el kit Silver Stain Plus (Laboratorios Bio-Rad), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, durante 25 minutos. SISTEMA PROTEAN® II XL Número de geles 1-4 Tamaño del gel 18.3 x 20 cm (altura x longitud) TAMAÑO del PLATO Interno 20 x 20 cm Externo 20 x 22.3 cm Longitud del espaciador 22.3 cm Volumen superior de tampón 350 ml Volumen inferior de tampón 1.2 L TIEMPOS para el SDS-PAGE Sin enfriamiento 5 h Con enfriamiento 3.5 h 4. MATERIAL Y MÉTODO 102 El Silver Stain Plus es un sistema rápido y sencillo para detectar proteínas en los geles de poliacrilamida tras la electroforesis. Esta tinción con plata es muy sensible, pudiendo detectar incluso cantidades de nanogramos de proteínas. El kit Silver Stain Plus contiene los siguientes componentes: • Concentrado potenciador del fijador • Solución de complejo de plata, que contiene NH4NO3 y AgNO3 • Ácido tungstosicílico, compuesto por silicio y tunsgteno (H4[Si(W3O10)4]·H2O) y que a 20 ºC es completamente soluble • Formaldehído • Carbonato de sodio (Na2CO3) como agente acelerador de la tinción • Un bote de 1 L vacío Para la correcta tinción de los geles los contenedores se limpiaron con 50% de ácido nítrico después del detergente de laboratorio. Además, las superficies de los geles estuvieron completamente sumergidas y se evitaron temperaturas superiores a 25 ºC. Los geles teñidos se lavaron dos veces con agua destilada durante 5 minutos cada vez. Es muy importante destacar que la tinción con plata utilizada fue compatible con posteriores pasos de MS. El siguiente paso fueron dos lavados con agua destilada de un minuto de duración cada uno para seguidamente aplicar la solución de revelado compuesta de carbonato sódico y formaldehído en agua destilada. Una vez que los 4. MATERIAL Y MÉTODO 103 geles alcanzaron el grado de tinción deseado se paró el proceso mediante el empleo de una solución con EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) en agua destilada. 4.5.1.6. Adquisición de imágenes y análisis Los geles teñidos fueron escaneados utilizando un escáner UMAX POWERLOOK III operado por el software ScanMagic V 4.5. El análisis de la imagen se realizó utilizando el programa Quantity One 4.2.3 (Laboratorios Bio-Rad) (Fig. 4.6). Dicho software permite la adquisición, cuantificación y análisis de gran variedad de datos, incluyendo muestras teñidas adquiridas mediante sistemas de geles. Las imágenes fueron configuradas, marcadas y, posteriormente, editadas. A la intensidad del volumen de cada punto le fue sustraída la intensidad correspondiente al fondo y el volumen resultante fue normalizado in situ con el valor densitométrico correspondiente a la actina α. Figura 4.6. Ejemplo de pantalla de análisis con el programa Quantity One. 4. MATERIAL Y MÉTODO 104 La identidad de cada punto de realizó por comparación con la base de datos Swiss Prot (ExPASy). La densidad de los puntos estudiados más importantes se confirmó con MS. En el mapa proteómico de los segmentos de aorta bovina se analizaron densitométricamente y se identificaron por comparación con aquellos encontrados en la vena safena humana, publicado por McGregor et al (2001)215. Los spots en los que se observaron diferencias significativas se identificaron con MS. 4.5.2. Espectrometría de masas La MS es una tecnología analítica esencial en el contexto de la proteómica actual debido a su alta capacidad de análisis, su sensibilidad y su precisión en la determinación de masas moleculares proteicas. 4.5.2.1. Material utilizado • Agua Milli-Q (Merk Millipore) • Acetonitrilo (CH3CN) al 100% • Sistema SpeedVac (Thermo Scientific) • Ditioeritritol (C4H10O2S2) • Bicarbonato amónico (NH4HCO3) • Iodoacetamida (C2H4INO) • Tripsina (Promega®) • Ácido trifluoroacético (TFA, CF3COOH) • Puntas mmol-18 Zip (Millipore) 4. MATERIAL Y MÉTODO 105 • Matriz de α-ciano 4-hidroxi-trans-cinámico (Sigma) • Placa de MALDI (Pro MS MALDI Genomic Solutions) • 4700 Proteomic Analyzer (Applied Biosystem) • Calibradores estándar (Applied Biosystem) 4.5.2.2. Método Para la identificación de las proteínas de interés, los puntos se extrajeron manualmente de los geles utilizando un punzón para biopsias253,254. La identificación de cada proteína se llevó a cabo extrayendo el mismo punto de interés en tres geles diferentes. La tinción de plata fue solubilizada y eliminada y los puntos fueron lavados tres veces con agua Milli-Q (Merk Millipore). Con este sistema se puede obtener agua ultrapura para este tipo de aplicaciones en el laboratorio, teniendo las siguientes características: un nivel de resistividad de 18,2 MegaOhmios.cm a 25 ºC y un nivel de carbonato orgánico total inferior a 10 ppb. Los sistemas Milli-Q constan de varias etapas de purificación, cada una de ellas diseñada para eliminar una determinada gama de contaminantes. Se utilizó el múdulo Gradient A10 (Tabla 4.7). Tabla 4.7. Especificaciones del agua producida por el sistema Milli-Q Gradient A10. ESPECIFICACIONES Resistividad (MΩ .cm) a 25 ºC 18.2 Nivel de COT (valores típicos) 1-5 Nivel de pirógenos (Eu/ml) NE Bacterias (UFC/ml) <1 4. MATERIAL Y MÉTODO 106 Después las muestras se incubaron con acetonitrilo (CH3CN), utilizado como disolvente, al 100% durante 5 minutos y otros 30 minutos con ácido trifluoroacético (TFA, del inglés TriFluoroAcetic acid, con la fórmula CF3COOH) al 5% y acetonitrilo al 50% y se secaron con un sistema SpeedVac (Thermo Scientific). Como se ha publicado previamente252, las muestras se redujeron con ditioeritritol (C4H10O2S2) en bicarbonato amónico (NH4HCO3) y posteriormente fueron alquiladas con iodoacetamida (C2H4INO), un inhibidor irreversible de todas las cisteína peptidasas (mediante el mecanismo de alquilación de los residuos catalíticos de la cisteína), en bicarbonato amónico. Finalmente, las muestras fueron digeridas con 12.5 ng/µl de tripsina (Promega®) en 25 mM de bicarbonato de amonio (pH 8.5) a 37ºC durante toda la noche. La tripsina utilizada es una enzima peptidasa de origen porcino, modificada mediante metilación, que hidroliza específicamente los enlaces peptídicos del extremo carboxilo de los residuos lisina (Lys) y arginina (Arg). Su actividad máxima se establece a un pH entre 7 y 9 y se inactiva de forma reversible a un pH de 4. Tras la digestión, los péptidos se extrajeron del gel mediante una solución de 100 mmol/l de bicarbonato amónico. Estos extractos se liofilizaron y resuspendieron en TFA al 0.1%. Los péptidos se purificaron usando puntas mmol-18 Zip (Millipore). Partículas > 0.22 µm (P/ml) <1 Caudal (L/min) 1.5 4. MATERIAL Y MÉTODO 107 Para la MS se mezcló 1 µl de los extractos purificados con 1 µl de matriz de α-ciano 4-hidroxi-trans-cinámico (Sigma) en acetonitrilo al 50%. Un microlitro de esta mezcla se cargó en una placa de MALDI (Pro MS MALDI Genomic Solutions, del inglés Matriz-Assisted Laser Desorption/Ionization) y se dejó secar al aire a temperatura ambiente. Los espectrómetros de masas utilizados en el análisis de proteínas o péptidos pueden ser divididos básicamente en dos partes: la fuente de iones y el detector. La fuente de ionización MALDI se asocia a un analizador de tiempo de vuelo (TOF-Time of Flight) en el que los iones se separan en función de su relación masa/carga tras ser acelerados en un campo eléctrico o a un analizador TOF/TOF que proporciona un mejor enfoque de los iones y, por tanto, mayor resolución y precisión másicas. En el primer TOF los iones son acelerados a bajo voltaje, favoreciendo la fragmentación metaestable. Mediante un pulsador se selecciona un determinado ion padre y sus iones fragmento, que son acelerados a un potencial mayor y separados en el segundo TOF. La MS se realizó utilizando el aparato 4700 Proteomic Analyzer (Applied Biosystem) y el análisis se efectuó en modo reflector positivo. Todos los espectros de masas se calibraron usando una mezcla de calibradores estándar (Applied Biosystem). Con el análisis en modo MS obtuvimos un espectro de masas denominado “huella peptídica” (Fig. 4.7), y algunos de los péptidos observados se analizaron en modo MS/MS, como se ha publicado anteriormente252. El modo MS/MS obtiene espectros de fragmentación de las 3-5 masas mayoritarias dentro de cada una de las huellas peptídicas. Los péptidos con una relación señal-ruido mayor de 20 se consideraron en la base de datos Mascot (MatrixScience, UK) para la identificación de la proteína. 4. MATERIAL Y MÉTODO 108 Para llevar a cabo dicha identificación se utilizó la base de datos Mascot 1.9 (http://www.matrixscience.com) como algoritmo para comparar los péptidos obtenidos por MS. 400 740 1080 1420 1760 2100 Mass (m/z ) 2444.0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % In ten sit y 4700 MS/MS Precursor 2083.08 Spec #1[BP = 878.4, 2444] 878.3978 779.3199 1120.5449 664.2969 991.5036 1420.6929 1808.9785 1695.8964621.3411 1094.5851 1549.7975 1465.6584 551.2075 1594.8947 1823.9960 1291.6388832.4175593.3781 1922.8845979.5194 1265.6508636.2925 1667.9066 1532.7229850.4159 989.4983 1909.00701693.92831423.62551110.5839862.3640 1259.1381437.1631 1589.6849619.8976 1805.9308983.4829852.2409 1169.1587 1353.7184590.2913 1892.61081649.8701 Figura 4.7. Ejemplo de espectro de masas moleculares de la anexina A2: huella peptídica. La base de datos Mascot (MatrixScience, UK) es una potente máquina de búsqueda para identificar proteínas de bases de datos primarias. Nos permitió integrar todos los métodos de búsqueda probados: la huella peptídica o los fragmentos derivados del modo MS/MS. Tras analizar la mezcla de péptidos mediante MS obtuvimos un conjunto de valores de masas moleculares que cruzamos con la base de datos Mascot. Para cada entrada en la base de datos de proteínas la máquina simula la rotura de los enlaces específica de la tripsina utilizada en la digestión de las proteínas, calcula las masas de los péptidos previstos y compara el conjunto de valores de masas calculadas con los obtenidos de forma experimental. Para realizar la búsqueda se introdujo el espectro y después de un corto período de tiempo se recibieron los resultados. 4. MATERIAL Y MÉTODO 109 4.5.3 Western blot Se analizó mediante western blot (WB) la expresión de las proteínas triosa fosfato isomerasa, fructosa 1,6-bifosfato aldolasa y la cadena α de la ATP sintasa mitocondrial en las muestras de aorta bovina, como se detalla a continuación. El WB, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada, como puede ser una mezcla compleja de proteínas (un extracto tisular). Mediante la electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Posteriormente las proteínas son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática o fluorescencia, entre otros métodos. De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas. 4.5.3.1. Material empleado • Papel de filtro • Tampón Laemmli (1x) • SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfato PolyAcrylamide Gel Eletrophoresis) al 15% • PBS para lavado • Ácido bicinconínico (BCA) 4. MATERIAL Y MÉTODO 110 • Azul de Coomasie • Membrana de nitrocelulosa de polifluoruro de vinilideno (PVDF) • Albúmina de suero bovino (BSA) • Tampón TBS-T (Tris-Buffered Saline Tween 20) • Anticuerpos primarios o Anti-Triosa-fosfato isomerasa (TIM (FL-249):sc-30145) o Anti-Fructosa 1,6-bifosfato aldolasa (Aldolasa A (N-15):sc:12059) o Anti-α-ATP sintasa mitocondrial (ATP5A (15H4):sc-58613) • Anticuerpos secundarios o IgG anti-ratón (General Electric Healthcare®) o IgG anti-conejo (Santa Cruz Biotechnology®) o IgG anti-cabra (General Electric Healthcare®) • Kit ECL plus (Amersham, cod. RPN 2132) • Marcadores de peso molecular (Sigma-Aldrich, St Louis, MI, USA) 4.5.3.2. Preparación de las muestras Los tejidos homogeneizados se solubilizaron en el tampón Laemmli, que contiene 2- mercaptoetanol. El tampón Laemmli está especialmente formulado para la preparación de muestras proteicas en los geles de poliacrilamida. La formulación de dicho tampón es la siguiente, con un pH de 6.8, aproximadamente: • SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)......……………………...4% • Glicerol…………………………………………………20% 4. MATERIAL Y MÉTODO 111 • 2-mercaptoetanol……………………………………….10% • Azul de bromofenol………………………………....0.004% • M Tris-HCl……………………………………….…125 mM El agente detergente SDS dota a todas las proteínas de carga positiva en un intervalo regular, confiriendo a cada proteína la misma carga negativa total. De esta manera podemos separar las proteínas por su tamaño y no por su carga. El SDS también desnaturaliza las proteínas y sus subunidades para ayudar a la separación en base al tamaño y no a la forma. Al añadir glicerol en el tampón se incrementa la densidad, consiguiendo que la muestra descienda hasta el fondo y minimizando, por tanto, pérdidas de proteína en el tampón. El 2-mercaptoetanol se utiliza para reducir los enlaces disulfuro intra e intermoleculares y permitir una adecuada separación no por forma sino por tamaño. A su vez, el azul de bromofenol sirve como indicador de la muestra de proteínas, haciendo más fácil su visualización. El Tris, es un componente habitual de los tampones y representa la abreviación del compuesto orgánico conocido como tris(hidroximetil)aminometano, con la fórmula (HOCH2)3CNH2. Posee una constante de disociación (pKa) de 8.07 a 25 ºC, lo que implica que dicho tampón va a tener una gran efectividad para mantener un determinado rango de pH y así simularemos las condiciones fisiológicas del animal o del cuerpo humano. 4.5.3.3. Electroforesis en gel Las proteínas se separaron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida o SDS-PAGE al 15% (w/v). 4. MATERIAL Y MÉTODO 112 En cada pocillo se cargó la misma cantidad de proteína (20 µg/pocillo), calculado mediante la reacción colorimétrica basada en la reacción del BCA (Pierce) (Véase apartado 3.5.1.3. Primera dimensión). Para asegurarnos de que cargábamos la misma cantidad de proteínas en el gel, se elaboró otro gel paralelo con muestras idénticas que posteriormente se tiñó con azul de Coomassie (colorante derivado del fenilmetano, C47H49N3NaO7S2). La solución de tinción contenía los siguientes componentes: • Azul de Coomassie……………………………….……0.5 g • Metanol…………………………………….………...250 ml • Ácido acético…………………………….………..…..50 ml • Agua destilada hasta 500 ml. Tras dos horas en contacto con la solución se procedió a desteñir la membrana con ácido acético y metanol. 4.5.3.4. Transferencia y bloqueo de las proteínas La transferencia de proteínas o blotting consiste en la inmovilización de dichas proteínas sobre membranas sintéticas para, a continuación, detectarlas mediante sistemas de tinción. En la técnica WB, después de la separación mediante electroforesis en geles de poliacrilamida, se transfieren mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel. 4. MATERIAL Y MÉTODO 113 Cualquier procedimiento de blotting consta de 5 etapas: 1. Inmovilización de las proteínas sobre la membrana, ya sea mediante trasferencia (electroforética, aspiración, presión…) o mediante aplicación directa. 2. Saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados para evitar la unión no específica de anticuerpos, que son proteínas. 3. Incubación del blot con anticuerpos primarios contra la/s proteína/s de interés. 4. Incubación del blot con anticuerpos secundarios, o reactivos, que actúan de ligando del anticuerpo primario unidos a enzimas u otros marcadores. 5. Incubación con los sustratos apropiados en aquellas bandas de proteínas marcadas con enzimas para formar productos coloreados insolubles en el lugar donde se encuentran las bandas de proteína. El trabajo con proteínas fijadas sobre una membrana, en lugar de gel, tiene una serie de ventajas: son más rápidas de teñir y desteñir, se detectan cantidades menores de proteínas (pues se concentran en la superficie) y no se diluyen en todo el espesor del gel. Además, las membranas son más fáciles de manipular que el propio gel. Las proteínas fueron transferidas por electrotransferencia semihúmeda desde el gel de poliacriamida a una membrana de nitrocelulosa (Immobilion-P, Millipore), para lo que se utilizó un tampón de transferencia (250 mM de glicina, 15% de metanol, 25 mM de Tris y agua destilada). Las membranas de tipo Immobilion-P presentan una gran adsorción a las proteínas, por lo que se evita la perdida de las mismas durante la transferencia. Su estructura es de poro abierto, lo que facilita el 4. MATERIAL Y MÉTODO 114 acceso a las proteínas unidas o eliminar las que no lo han hecho. Los poros tienen un diámetro de 0.45 µm, por lo que pueden utilizarse en la mayoría de los WB, especialmente para proteínas de > 20 kD (Fig. 4.8). Se sometieron a 20 V durante una hora. Posteriormente, las membranas de nitrocelulosa fueron lavadas con metanol seguido de un tampón neutro (PBS), depositándose sobre el papel de filtro. Figura 4.8. Imagen de una membrana de nitrocelulosa (Immobilion-P, Millipore). Dado que la membrana necesita poder unirse a proteínas de forma inespecífica, dichas membranas fueron bloqueadas (se bloquearon los lugares de unión que quedaron libres tras la transferencia) durante toda la noche a 4 ºC con un 5% (w/v) de leche en polvo no grasa en TBS-T (Tris-Buffered Saline Tween-20). En caso contrario, los anticuerpos empleados en la detección, de naturaleza proteica, podrían unirse a ellos dificultando la distinción del complejo antígeno-anticuerpo que se forma con la proteína que se busca. El TBS-T es un tampón utilizado para mantener el pH en un rango relativamente estrecho. La formulación utilizada fue la siguiente: • Tris-HCl (pH 5.2)…………………………………...20 mmol/l 4. MATERIAL Y MÉTODO 115 • NaCl………………………………………………..137 mmol/l • Tween-20………………………………………………….0.1% El Tris, como se ha mencionado anteriormente, tiene una gran efectividad para mantener un determinado rango de pH y así simular las condiciones fisiológicas del animal o del cuerpo humano. Al añadir ácido clorhídrico (HCl) podemos ajustar el pH hasta 5.2. El NaCl proporciona una concentración de sal isotónica. El polisorbato 20 o monooleato de Polioxietileno Sorbitan, conocido comercialmente como Tween 20, es un surfactante polisorbato cuya estabilidad y relativa ausencia de toxicidad permiten que sea utilizado como detergente y emulsionante. En el experimento actual, lo utilizamos para evitar las uniones no específicas de los anticuerpos, reduciendo así el ruido de fondo y los falsos positivos. 4.5.3.5. Detección de proteínas Tras el bloqueo, las membranas fueron incubadas durante 12 horas a 4º C con anticuerpos monoclonales específicos unidos a una enzima que, en presencia de su sustrato, catalizó una reacción colorimétrica, haciendo patente la unión con el antígeno (la proteína) y su localización. Las proteínas de interés y los anticuerpos (Santa Cruz Biotechnology, CA, EEUU) utilizados se resumen en la Tabla 4.8. Tabla 4.8. Proteínas analizadas y sus anticuerpos específicos. 4. MATERIAL Y MÉTODO 116 La triosa fosfato isomerasa (TPI), enzima implicada en la glucolisis, cataliza la interconversión entre el gliceraldehído-3-fosfato y la dihidroxiacetona fosfato. Se utilizó el anticuerpo TIM (FL-249): sc-30145 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EEUU), una IgG policlonal de conejo obtenida contra los aminoácidos 1-249 (que representan la total longitud de la TPI de origen humano). Cada vial contiene 200 µg/ml de IgG en 1.0 ml de PBS con < 0.1% de sodio y 0.1 % de gelatina. La fructosa 1,6-bifosfato aldolasa, otra enzima implicada en la glucolisis, cataliza la escisión del fructosa-1,6-bifosfato en dos triosas, la dihidroxiacetona fosfato y el gliceraldehído-3-fosfato. También cataliza la rotura reversible de la fructosa-1-fosfato en gliceraldehído y dihidroxiacetona fosfato. En el ser humano se conocen tres isoenzimas (A-muscular, B-hepática y C-cerebral) codificadas por tres genes diferentes, que se expresan de forma diferente durante el desarrollo y resultan en diferentes actividades sobre los dos sustratos (fructosa-1,6-bifosfato y fructosa-1- fosfato). En nuestro experimento, para la detección de la enzima se utilizó una IgG policlonal de cabra (Aldolasa A (N-15): Santa Cruz Biotechnology, CA, EEUU) como anticuerpo específico para la isoforma A (muscular). Cada vial contiene 200 µg/ml. ENZIMA ANTICUERPO DILUCIÓN Triosa fosfato isomerasa TIM (FL-249): sc-30145 1:500 Fructosa 1,6-bifosfato aldolasa Aldolasa A (N-15): sc-12059 1:500 α-ATP sintasa mitocondrial ATP5A (15H4): sc-58613 1:2000 4. MATERIAL Y MÉTODO 117 El complejo ATP sintasa es una enzima situada en la membrana interna de las mitocondrias encargada de sintetizar ATP a partir de ADP, un grupo fosfato y la energía suministrada por un flujo de protones (fosforilación oxidativa). Para su detección se utilizó la IgG2b monoclonal de ratón cuyo antígeno es la ATP5A (cadena α) de origen bovino. Cada vial contiene 100 µg de IgG2b in 1.0 ml de PSB con > 0.1% sodio y 0.1% de gelatina. Las membranas se lavaron con PBS al 0.5% de Tween (tres veces durante 5 minutos) para eliminar el anticuerpo primario no unido y, después, fueron incubadas con anticuerpos secundarios durante una hora a temperatura ambiente, que reconocían de forma específica una región concreta del anticuerpo primario. Los anticuerpos secundarios fueron de origen animal: Ig G anti-ratón, anti-conejo o anti-cabra, conjugados con HRP (peroxidasa de rábano) a una dilución de 1:2000 (Fig. 4.9). Figura 4.9. Detección de proteínas mediante la técnica Western Blot. HRP: peroxidasa de rábano. 4. MATERIAL Y MÉTODO 118 4.5.3.6. Análisis Las proteínas se detectaron por quimioluminiscencia mejorada y se evaluaron por densitometría255. Para la detección de proteínas por quimioluminiscencia se utilizó el sistema ECL(Amersham Biosciences), previo lavado con PBS. Consiste en un sustrato Lumigen PS-3 que es convertido en un éster de acridinio cuando es catalizado por la peroxidasa de rábano. El éster reacciona con el peróxido en condiciones alcalinas y emite luz. El kit incluye la Solución A (sustrato que contiene el tampón Tris) y la Solución B (sustrato del acridinio con dioxano y etanol). Las dos soluciones se mezclan en una proporción 40:1 (Fig. 4.10). Figura 4.10. Esquema del proceso químico de la quimioluminiscencia. Inmediatamente después de la oxidación se leyó a 428 nm, con un máximo de emisión entre 15 y 20 minutos después de iniciada la reacción. Para la quimioluminiscencia se requirió la incubación de las membranas con el sustrato (ECL o luminol), para la posterior emisión de luminiscencia al ser expuesto 4. MATERIAL Y MÉTODO 119 al reporter que trae unido el anticuerpo secundario. La luz emitida fue captada por una cámara CCD, que tomó una imagen digital del WB. La imagen se analizó por densitometría para evaluar la cantidad relativa de mancha y cuantificar el resultado en términos de densidad óptica (Quantity One, Laboratorios Bio-Rad). Dicho software permite la adquisición, cuantificación y análisis de gran variedad de datos, incluyendo muestras teñidas adquiridas mediante sistemas de geles. Las imágenes fueron configuradas, marcadas y, posteriormente, editadas. Se utilizaron marcadores de peso molecular (Sigma-Aldrich, St Louis, MI, USA) para el cálculo de la masa molecular, para monitorizar el progreso en la electroforesis y como control positivo para el análisis. Existe una gran variedad de marcadores de peso molecular para numerosas proteínas. En nuestro experimento utilizamos marcadores preteñidos, que contenían una mezcla liofilizada de proteínas con un rango de peso molecular entre 10.000-250.000 Da. 4.6. DETERMINACIONES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La actividad de la fructosa 1,6-bifosfato aldolasa se determinó en la propia pared vascular siguiendo el método descrito por Misset y Opperdoes256. El método de Misset y Opperdoes fue publicado en 1984 para la purificación simultánea de la hexoquinasa, la fructosa bifosfato aldolasa, la triosa fosfato isomerasa y la fosfo-glicerato quinasa del Trypanosoma brucei. Todas las enzimas 4. MATERIAL Y MÉTODO 120 fueron estudiadas a 25ºC en un volumen final de 1 ml utilizando cubetas de plástico (Kartell-Milan). Utilizaron un tampón con trietanolamina/HCl 0.1 M (pH 7.6) en todos los casos, mientras los otros reactantes se añadieron 20 veces más concentrados y se congelaron a -30ºC. Las concentraciones de los reactantes en cada ensayo para las respectivas enzimas fueron los siguientes: Fructosa 1,6-bifosfato aldolasa: • Enzima……………………………………………….1 mM • NADH…………………………………………......300 µM • EDTA………………………………………………...1 mM • Triosa fosfato isomerasa/ml…………………………...5 µg • Glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (NAD+)/ml............50 µg Triosa fosfato isomerasa: • D-gliceraldehído fosfato…………………………...0.4 mM • NADH……………………………………………...300 µM • Glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (NAD+)/ml………50 µg Se midió el cambio de absorbancia a 340 nm durante un máximo de diez minutos. Se consideró una unidad enzimática como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de un micromol de sustrato por minuto a 25ºC. 4. MATERIAL Y MÉTODO 121 4.6.1. Fructosa 1,6-bifosfato aldolasa Se tomaron 240 µg de proteínas totales de los segmentos vasculares y se incubaron con los siguientes elementos: • Tris-HCl (pH7.4)………………………………………..100 mmol/l • Solución de fructosa 1,6-bifosfato………...……………..58 mmol/l • β-nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) ………....4.0 mmol/l • α-glicerofosfato deshidrogenasa/triosa fosfato isomerasa….50U/ml El Tris-HCl (T-1503, Sigma-Aldrich) se utilizó para mantener el pH en 7.4. La actividad aldosa se determinó a 340 nm y 25ºC en cubetas de plástico con la solución formada por la fructosa 1,6-bifosfato (F-0752, Sigma-Aldrich), el sustrato β- NADH (N-8129, Sigma-Aldrich) y la α-glicerofosfato deshidrogenasa/triosa fosfato isomerasa (G-6755, Sigma-Aldrich) para evitar que se saturase la muestra. Para ello se utilizó el espectrofotómetro BioAquarius (CECIL®), observando cada 30 segundos el cambio en la absorbancia hasta completar diez minutos. De esta manera se determinó la disminución progresiva del sustrato NADH en el tiempo. 4.6.2. Triosa fosfato isomerasa Se tomaron 240 µg de proteínas totales de los segmentos vasculares y se incubaron con los siguientes elementos: 4. MATERIAL Y MÉTODO 122 • Tris-HCl (pH7.4)………………………………100 mmol/l • Gliceraldehído-3-fosfato………...………...…….58 mmol/l • β-nicotinamida adenina dinucleótido (NADH)...4.0 mmol/l • α-glicerofosfato deshidrogenasa/aldolasa………..500 U/ml El Tris-HCl (T-1503, Sigma-Aldrich) se utilizó para mantener el pH en 7.4. La actividad triosa-fosfato se determinó a 340 nm y 25ºC en cubetas de plástico con la solución formada por la gliceraldehído-3-fosfato (G-5251, Sigma-Aldrich), el sustrato β-NADH (N-8129, Sigma-Aldrich) y la α-glicerofosfato deshidrogenasa/aldolasa (A- 2714, Sigma-Aldrich) para evitar que se saturase la muestra. Para ello se utilizó el mismo espectrofotómetro, observando cada 30 segundos el cambio en la absorbancia hasta completar diez minutos. De esta manera se determinó la disminución progresiva del sustrato NADH en el tiempo. 4.7. DETERMINACIONES DEL CONTENIDO DE PIRUVATO El contenido de piruvato presente en los segmentos de aorta bovina fue cuantificado utilizando el Pyruvate Assay Kit (K609-100, BioVision Research Products, USA). En el ensayo el piruvato es oxidado por la piruvato oxidasa mediante reacciones enzimáticas que generan color (λ=570 nm) y fluorescencia (Ex/Em=535/587 nm). El color/fluorescencia es proporcional al contenido de piruvato de la muestra. Las principales características del Pyruvate Assay Kit son: • Detección basada en la absorbancia (570 nm) o fluorescencia 4. MATERIAL Y MÉTODO 123 • Permite utilizar muestras de cultivos celulares y tisulares, orina, plasma, suero, así como otros fluidos. • Detección de 1 a 200 µM de piruvato. • Método sencillo con una duración de unos 40 minutos El Pyruvate Assay Kit contiene los componentes que se especifican en la tabla a continuación: Tabla 4.9. Componentes del Pyruvate Assay Kit. COMPONENTES 100 ENSAYOS COLOR NÚMERO Buffer Pyruvate Assay 25 ml WM K609-100-1 Sonda Pyruvate 200 µl Rojo K609-100-2A Mezcla enzimática Pyruvate Liofilizado Verde K609-100-4 Piruvato estándar (100 nmol/µ l) 100 µl Amarillo K609-100-5 Para medir la concentración de piruvato mediante el ensayo colorimétrico se utilizaron 80 µg de cada homogeneizado de proteínas y se siguieron las instrucciones del fabricante: 1. Preparación de los reactivos: - La sonda Pyruvate se calentó hasta los 37 ºC durante 1-2 minutos hasta fundir la solución. Se mezcló bien y se evitó la exposición a la luz y humedad. - La mezcla enzimática Pyruvate se disolvió con 220 µl del buffer Pyruvate Assay. 2. Protocolo del ensayo: 4. MATERIAL Y MÉTODO 124 - Primero se preparó la curva estándar del ensayo colorimétrico, diluyendo el piruvato estándar hasta 1 nmol/µl al añadir 10 µl del estándar a 990 µl del tampón. Posteriormente, se mezcló bien. - Después se prepararon las muestras para el ensayo en 50 µl/pocillo de tampón en un plato de 96 pocillos. Se extrajeron las muestras con un volumen cuatro veces mayor de tampón y se centrifugó hasta obtener el extracto de piruvato. - Para cada pocillo se preparó un total de 50 µl de Reaction Mix, que contenía los siguientes componentes: 46 µl de tampón, 2 µl de sonda y 2 µl de mezcla enzimática. Esta cantidad se añadió a cada pocillo con las muestras. - Se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, evitando la luz. - Se midió a 570 nm en un microplato de lectura. - El cálculo de la cantidad de piruvato se realizó utilizando la siguiente fórmula: C=Py/Sv (nmol/µl o mM), donde Py era la cantidad de piruvato (nmol) de la muestra en relación con la curva estándar y Sv era el volumen de la muestra (µl) añadido en el pocillo. 4.8. ESTUDIO ESTADÍSTICO Los datos densitométricos, tanto proteómicos como de los WB, se expresaron en unidades arbitrarias de densitometría (UAD), que son valores relativos de una unidad de medida mostrando el ratio de una determinada cantidad de sustancia, intensidad u otras cantidades respecto a un valor de referencia. El valor de referencia se establece en el laboratorio y sirve como referencia a múltiples medidas realizadas en un entorno 4. MATERIAL Y MÉTODO 125 similar. Dado que las UAD expresan el ratio entre una medida y la referencia, son cantidades adimensionales. Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar. El estudio estadístico se realizó con el programa SPSS versión 16.0 (SPSS Inc., CA, USA). Para determinar el nivel de significación estadística se utilizó el test de Mann-Whitney. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p ≤ 0.05. 5 “El que no sabe lo que busca, no ve lo que encuentra” Claude Bernard RESULTADOS 5. RESULTADOS   129 5. RESULTADOS 5.1. CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS RELACIONADAS CON EL CITOESQUELETO Y SISTEMA CONTRÁCTIL Se identificaron las siguientes proteínas asociadas al citoesqueleto y sistema contráctil: • Glicoproteína 4 asociada a las microfibras • Actina α asociada al dominio LIM • Actina α, isoformas 1 y 2 • Actina β, isoformas 1 y 2 • Tubulina β • Anexina A2 • Anexina A4 • Anexina A5, isoformas 1 y 2 • Cadena β de la tropomiosina , isoformas 1 y 2 • SM22/transgelina La Figura 5.1 muestra el mapa proteómico de los segmentos de aorta con las proteínas que se identificaron y se cuantificaron en los experimentos. Los puntos detectados se encontraban en un rango de peso molecular de 15 a 200 kDa y con un pI entre 3 y 10. 5. RESULTADOS   130 experimental mass and IP of some of the above-mentioned proteins identified using mass spectrometry. In normal healthy vascular wall, the presence of PRP reduced the protein expression of mitochondrial aldehyde dehydrogenase isotype 1 and glutathione-S-transferase (Table III and Fig. 1). The reduction of glutathione-S-transferase was only observed with the presence of 107 platelets/well (Table III). In 10 ng/ml TNF-a- preincubated aortic segments, the presence of 107 platelets/well Fig. 1. Representative bidimensional gel electrophoresis (2-DE) of bovine aortic proteins in a pH range between 3 and 10. The bidimensional gel shows the different proteins analyzed in the proteomic study. Proteins were identified by comparison with the human saphenous vein published by McGregor et al. [2001]. TABLE II. Expression of the Cytoskeleton-Associated Proteins in the Bovine Vascular Wall (Modifications Induced by Platelets) Protein Normal vascular wall Pre-inflammated vascular wall Control n! 18 105 Platelets/ well n! 10 107 Platelets/ well n! 9 Control n! 13 105 Platelets/ well n! 10 107 Platelets/ well n! 10 Microfibril-associated glycoprotein 4 17.1" 2.6 17.3" 2.9 25.1" 3.0# 11.0" 3.0 17.8" 3.6 14.5" 5.8 a-Actinin-associated LIM protein 6.0" 1.1 2.4" 0.6# 1.9" 0.2# 3.5" 1.1 2.3" 0.5 3.3" 0.9 a-Actin Isotype 1 3.9" 0.5 3.5" 0.6 3.5" 0.4 3.8" 0.6 5.5" 1.3 4.5" 1.2 Isotype 2 6.7" 1.3 1.6" 0.2# 2.0" 0.4# 4.2" 0.6 7.6" 1.4# 7.5" 1.4# b-Actin Isotype 1 76.0" 11.5 245.9" 40.6# 186.4" 30.6# 92.5" 34.9 184.6" 73.0 322.5" 53.8# Isotype 2 8.2" 1.5 5.3" 1.2 3.9" 0.8 2.6" 1.0 3.6" 0.8 3.3" 1.3 b-Tubulin 8.5" 1.7 3.5" 0.6 2.9" 0.5# 7.7" 1.4 8.7" 1.6 4.0" 1.4 Annexin A2 7.1" 1.3 7.5" 1.4 7.3" 1.1 7.9" 1.8 11.8" 5.0 16.8" 4.4 A4 6.5" 0.9 4.9" 1.2 4.8" 1.1 6.5" 1.7 6.4" 1.3 10.2" 2.9 A5 (isotype 1) 8.0" 2.0 3.3" 0.7# 3.3" 0.6# 3.2" 0.6 7.5" 2.4 3.1" 0.9 A5 (isotype 2) 5.5" 1.1 3.1" 0.7 2.3" 0.4 6.4" 1.3 5.1" 1.5 3.2" 0.8# Tropomyosin b-chain Isotype 1 10.0" 2.0 2.7" 0.6# 0.8" 0.2# 5.4" 1.1 4.5" 1.6 2.3" 0.7# Isotype 2 8.6" 1.5 6.0" 1.1 4.2" 1.0 6.3" 1.1 6.1" 1.8 6.5" 1.5 SM22/transgelin 11.2" 2.7 3.5" 0.9# 3.0" 0.5# 2.5" 1.0 1.5" 0.5 1.9" 0.7 AU, arbitrary units. Results are represented as mean" SEM. The number of experiments for each experimental condition is shown in the table (n). #P< 0.05 with respect to the corresponding control situation. JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY PLATELETS AND PROTEIN EXPRESSION IN VASCULAR WALL 893 ! Figura 5.1. Mapa proteómico tisular. Las proteínas analizadas aparecen recuadradas y las distintas isoformas de cada proteína numeradas. A: anexina A5. B: aldehído deshidrogenasa mitocondrial. C: cadena β ATP sintasa. D: cadena β tropomiosina. E: actina α del músculo liso. F: tubulina β. G: anexina A4. H: anexina A2. I: glicoproteína 4 asociada a las microfibras. J: actina α asociada a proteínas LIM. K: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. L: fosfoglicerato mutasa. M: actina β. N: SM22/transgelina. O: glutation S tranferasa. Como se ha indicado en el apartado 4. MATERIAL Y MÉTODO, cuando se observaron diferencias significativas entre los distintos puntos de los controles y la pared vascular coincubada con PRP, se confirmó la identificación de las proteínas con MS. En la Tabla 5.1 se detallan las masas experimentales y los pI de las proteínas identificadas mediante MS. 5. RESULTADOS   131 Tabla 5.1. Masas teóricas, experimentales y puntos isoeléctricos. PROTEÍNA Nº Acceso base de datos* Masa teórica (kDa/pI) Masa experimental (kDa/pI) Anexina A2 P04272 38.74/6.90 40.1/6.90 Actina α Músculo Liso P62736 42.38/5.23 41.25/5.70 Actina α Músculo Liso P62736 42.38/5.23 41.25/5.70 Actina β P84336 42.05/5.29 42.00/5.45 Tropomiosina P58776 32.93/4.60 33.12/4.80 Tropomiosina P58772 32.71/4.60 32.90/4.80 * El número de acceso representa el número asignado en la base de datos Mascot 1.9 (http://www.matrixscience.com) utilizado como algoritmo para asociar los péptidos obtenidos mediante espectrometría de masas. Los péptidos asociados a cada proteína en función del número de acceso de la base de datos fueron los que se expresan en la Tabla 5.2. Tabla 5.2. Relación del péptido asociado con la proteína detectada. PROTEÍNA PÉPTIDO ASOCIADO Anexina A2 QDIAFAYQR Actina α Músculo Liso AGFAGDDAPR/GYSFVTTAER/GYSFVTTAER/AVFPSIVGRPR/ AVFPSIVGRPR/QEYDEAGPSIVHR/SYELPDGQVITIGNER/ SYELPDGQVITIGNER Actina α Músculo Liso GYSFVTTAER/GYSFVTTAER/AVFPSIVGRPR/AVFPSIVGRPR/ QEDEAGPSIVHR/IWHHSFYNELR/IWHHSFYNELR/SYELPDGQVITIGNER/ 5. RESULTADOS   132 SYELPDGQVITIGNER/DLYANNVLSGGTTMYPGIADR Actina β AGFAGDDAPR/AVFPSIVGRPR/AVFPSIVGRPR/IWHHTFYNELR/ IWHHTFYNELR/SYELPDGQVITIGNER/SYELPDGQVITIGNER/ VAPEEHPVLLTEAPLNPK/VAPEEHPVLLTEAPLNPK/ DLYANTVLSGGTTMYPGIADR/DLYANTVLSGGTTMYPGIADR Tropomiosina IQLVEEELDR Tropomiosina LVIIESDLER/IQLVEEELDR/KLVIIESDLER/RIQLVEEELDR Los métodos seguidos para la identificación de las proteínas de la pared vascular tras la electroforesis bidimensional se resumen en la Tabla 5.3. Tabla 5.3. Métodos seguidos para identificar las proteínas de la pared vascular. PROTEÍNA MÉTODO DE CONFIRMACIÓN SCORE de la PROTEÍNA SECUENCIA CUBIERTA (%) Anexina A2 MS/MS - 2 Actina α Músculo Liso MS+MS/MS 111 15 Actina α Músculo Liso MS+MS/MS 49 21 Actina β MS+MS/MS 115 37 Tropomiosina MS/MS - 3 Tropomiosina MS/MS - 7 MS: espectromatría de masas. MS/MS: espectrometría de masas en tándem. 5. RESULTADOS   133 5.1.1. Cambios en la expresión proteica en los segmentos de aorta normales En los segmentos de aorta bovina normales (no estimulados con TNF-α), la presencia de PRP cambió significativamente la expresión de la actina α asociada a las proteínas/dominio LIM, la isoforma 2 de la actina α, la tubulina β, la isoforma 1 de la anexina A5, la isoforma 1 de la cadena β de la tropomiosina y la SM22/transgelina, así como de la isoforma 1 de la actina β y la glicoproteína 4 asociada a las microfibras (Tabla 5.4). Tabla 5.4. Análisis densitométrico de la expresión de las proteínas relacionadas con el citoesqueleto y sistema contráctil en la aorta bovina normal al coincubarla con PRP. PARED VASCULAR NORMAL PROTEÍNA CONTROL n=18 105 plaq/poc n=10 107 plaq/poc n=9 UAD UAD p UAD p Glicoproteína 4 (µfibras) 17.1±2.6 17.3±2.9 0.109 25.1±3.0 0.043 Actina α (LIM) 6.0±1.1 2.4±0.6 0.033 1.9±0.2 0.027 Actina α Isoforma 1 Isoforma 2 3.9±0.5 6.7±1.3 3.5±0.6 1.6±0.2 0.225 0.042 3.5±0.4 2.0±0.4 0.284 0.043 Actina β Isoforma 1 Isoforma 2 76.0±11.5 8.2±1.5 245.9±40.6 5.3±1.2 0.050 0.655 186.4±30.6 3.9±0.8 0.048 0.593 Tubulina β 8.5±1.7 3.5±0.6 0.465 2.9±0.5 0.048 5. RESULTADOS   134 Anexina A2 A4 A5 (isoforma 1) A5 (isoforma 2) 7.1±1.3 6.5±0.9 8.0±2.0 5.5±1.1 7.5±1.4 4.9±1.2 3.3±0.7 3.1±0.7 0.688 0.990 0.045 0.715 7.3±1.1 4.8±1.1 3.3±0.6 2.3±0.4 0.689 0.715 0.043 0.715 Tropomiosina (cadena β) Isoforma 1 Isoforma 2 10.0±2.0 8.6±1.5 2.7±0.6 6.0±1.1 0.019 0.273 0.8±0.2 4.2±1.0 0.009 0.273 SM22/transgelina 11.2±2.7 3.5±0.9 0.048 3.0±0.5 0.045 Unidades arbitrarias de densitometría (UAD). Los resultados se expresan en media ± DE. El número de muestras por cada experimento se muestra en la tabla (n). Como puede observarse en la Figura 5.2, se produjeron cambios en la expresión de muchas de las proteínas al coincubarlas con las dos concentraciones de plaquetas de los experimentos realizados. experimental mass and IP of some of the above-mentioned proteins identified using mass spectrometry. In normal healthy vascular wall, the presence of PRP reduced the protein expression of mitochondrial aldehyde dehydrogenase isotype 1 and glutathione-S-transferase (Table III and Fig. 1). The reduction of glutathione-S-transferase was only observed with the presence of 107 platelets/well (Table III). In 10 ng/ml TNF-a- preincubated aortic segments, the presence of 107 platelets/well Fig. 1. Representative bidimensional gel electrophoresis (2-DE) of bovine aortic proteins in a pH range between 3 and 10. The bidimensional gel shows the different proteins analyzed in the proteomic study. Proteins were identified by comparison with the human saphenous vein published by McGregor et al. [2001]. TABLE II. Expression of the Cytoskeleton-Associated Proteins in the Bovine Vascular Wall (Modifications Induced by Platelets) Protein Normal vascular wall Pre-inflammated vascular wall Control n! 18 105 Platelets/ well n! 10 107 Platelets/ well n! 9 Control n! 13 105 Platelets/ well n! 10 107 Platelets/ well n! 10 Microfibril-associated glycoprotein 4 17.1" 2.6 17.3" 2.9 25.1" 3.0# 11.0" 3.0 17.8" 3.6 14.5" 5.8 a-Actinin-associated LIM protein 6.0" 1.1 2.4" 0.6# 1.9" 0.2# 3.5" 1.1 2.3" 0.5 3.3" 0.9 a-Actin Isotype 1 3.9" 0.5 3.5" 0.6 3.5" 0.4 3.8" 0.6 5.5" 1.3 4.5" 1.2 Isotype 2 6.7" 1.3 1.6" 0.2# 2.0" 0.4# 4.2" 0.6 7.6" 1.4# 7.5" 1.4# b-Actin Isotype 1 76.0" 11.5 245.9" 40.6# 186.4" 30.6# 92.5" 34.9 184.6" 73.0 322.5" 53.8# Isotype 2 8.2" 1.5 5.3" 1.2 3.9" 0.8 2.6" 1.0 3.6" 0.8 3.3" 1.3 b-Tubulin 8.5" 1.7 3.5" 0.6 2.9" 0.5# 7.7" 1.4 8.7" 1.6 4.0" 1.4 Annexin A2 7.1" 1.3 7.5" 1.4 7.3" 1.1 7.9" 1.8 11.8" 5.0 16.8" 4.4 A4 6.5" 0.9 4.9" 1.2 4.8" 1.1 6.5" 1.7 6.4" 1.3 10.2" 2.9 A5 (isotype 1) 8.0" 2.0 3.3" 0.7# 3.3" 0.6# 3.2" 0.6 7.5" 2.4 3.1" 0.9 A5 (isotype 2) 5.5" 1.1 3.1" 0.7 2.3" 0.4 6.4" 1.3 5.1" 1.5 3.2" 0.8# Tropomyosin b-chain Isotype 1 10.0" 2.0 2.7" 0.6# 0.8" 0.2# 5.4" 1.1 4.5" 1.6 2.3" 0.7# Isotype 2 8.6" 1.5 6.0" 1.1 4.2" 1.0 6.3" 1.1 6.1" 1.8 6.5" 1.5 SM22/transgelin 11.2" 2.7 3.5" 0.9# 3.0" 0.5# 2.5" 1.0 1.5" 0.5 1.9" 0.7 AU, arbitrary units. Results are represented as mean" SEM. The number of experiments for each experimental condition is shown in the table (n). #P< 0.05 with respect to the corresponding control situation. JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY PLATELETS AND PROTEIN EXPRESSION IN VASCULAR WALL 893 ! CONTROL 105 PLAQ/POC 107 PLAQ/POC A1 B1 D1 E2 F I J N M1 O Figura 5.2. Proteínas expresadas en la pared de la aorta sana con diferencias significativas al incubarlas con PRP. A1: anexina A5. B1: aldehído deshidrogenasa mitocondrial. D1: cadena β tropomiosina. E2: actina α del músculo liso. F: tubulina β. I: glicoproteína 4 asociada a las microfibras. J: actina α asociada a LIM. M: actina β. N: SM22/transgelina. O: glutation S tranferasa.   5. RESULTADOS   135 La mayoría de las proteínas del citoesqueleto y del sistema contráctil de la pared vascular sana experimentaron una disminución en su expresión. Este efecto se observó con la incubación de las dos concentraciones de plaquetas (105 y 107 plaquetas/pocillo) en la actina α, la actina α asociada a las proteínas LIM, la anexina A5, la tropomiosina y la SM22/transgelina. Sin embargo, a pesar de observarse una clara disminución, no se alcanzó la significación estadística con la isoforma 2 de la anexina A5 y la isoforma 2 de la cadena β de la tropomiosina. Otras proteínas, como la tubulina β, sólo se infraexpresaron significativamente al coincubar la pared vascular con la concentración más alta de PRP (107 plaquetas/pocillo). Dos proteínas presentaron un aumento en su expresión tras la incubación con PRP. La isoforma 1 de la actina β se sobreexpresó significativamente en las muestras de aorta sana tanto en la incubación con 105 plaquetas/pocillo como 107 plaquetas/pocillo. Por el contrario, la isoforma 2 presentó una disminución no significativa con las dos concentraciones de plaquetas. La glicoproteína 4 asociada a las microfibrillas también aumentó significativamente su expresión, aunque sólo al coincubar la pared vascular con 107 plaquetas/pocillo. En el Apéndice A. NIVELES DE EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL CITOESQUELETO se encuentra la relación de diagramas de barras que muestran los cambios en la expresión de las proteínas analizadas relacionadas con el citoesqueleto y el sistema contráctil. 5. RESULTADOS   136 5.1.2. Cambios en la expresión proteica en los segmentos de aorta preestimulados con TNF-α En los segmentos de aorta preestimulados con TNF-α, la presencia de PRP cambió de forma significativa la expresión en la pared vascular de un menor número de proteínas del citoesqueleto y del sistema contráctil respecto a la pared vascular sana (Tabla 5.5.). Tabla 5.5. Análisis densitométrico de la expresión de las proteínas relacionadas con el citoesqueleto y sistema contráctil en la aorta bovina preinflamada al coincubarla con PRP. PARED VASCULAR PREINFLAMADA PROTEÍNA CONTROL n=13 105 plaq/poc n=10 107 plaq/poc n=10 UAD UAD p UAD p Glicoproteína 4 (µfibras) 11.0±3.0 17.8±3.6 0.080 14.5±5.8 0.180 Actina α (LIM) 3.5±1.1 2.3±0.5 0.180 3.3±0.9 0.180 Actina α Isoforma 1 Isoforma 2 3.8±0.6 4.2±0.6 5.5±1.3 7.6±1.4 0.225 0.048 4.5±1.2 7.5±1.4 0.465 0.048 Actina β Isoforma 1 Isoforma 2 92.5±34.9 2.6±1.0 184.6±73.0 3.6±0.8 0.068 0.068 322.5±53.8 3.3±1.3 0.037 0.068 Tubulina β 7.7±1.4 8.7±1.6 0.655 4.0±1.4 0.109 Anexina 5. RESULTADOS   137 A2 A4 A5 (isoforma 1) A5 (isoforma 2) 7.9±1.8 6.5±1.7 3.2±0.6 6.4±1.3 11.8±5.0 6.4±1.3 7.5±2.4 5.1±1.5 0.900 0.068 0.144 0.715 16.8±4.4 10.2±2.9 3.1±0.9 3.2±0.8 0.180 0.068 0.273 0.043 Tropomiosina (cadena β) Isoforma 1 Isoforma 2 5.4±1.1 6.3±1.1 4.5±1.6 6.1±1.8 0.465 0.593 2.3±0.7 6.5±1.5 0.045 0.285 SM22/transgelina 2.5±1.0 1.5±0.5 0.068 1.9±0.7 0.109 Unidades arbitrarias de densitometría (UAD). Los resultados se expresan en media±DE. El número de muestras por cada experimento se muestra en la tabla (n). Así, en los segmentos preincubados con TNF-α se modificó la expresión de las siguientes proteínas: la actina α, la actina β, anexina A5 y la tropomiosina (Fig. 5.3). experimental mass and IP of some of the above-mentioned proteins identified using mass spectrometry. In normal healthy vascular wall, the presence of PRP reduced the protein expression of mitochondrial aldehyde dehydrogenase isotype 1 and glutathione-S-transferase (Table III and Fig. 1). The reduction of glutathione-S-transferase was only observed with the presence of 107 platelets/well (Table III). In 10 ng/ml TNF-a- preincubated aortic segments, the presence of 107 platelets/well Fig. 1. Representative bidimensional gel electrophoresis (2-DE) of bovine aortic proteins in a pH range between 3 and 10. The bidimensional gel shows the different proteins analyzed in the proteomic study. Proteins were identified by comparison with the human saphenous vein published by McGregor et al. [2001]. TABLE II. Expression of the Cytoskeleton-Associated Proteins in the Bovine Vascular Wall (Modifications Induced by Platelets) Protein Normal vascular wall Pre-inflammated vascular wall Control n! 18 105 Platelets/ well n! 10 107 Platelets/ well n! 9 Control n! 13 105 Platelets/ well n! 10 107 Platelets/ well n! 10 Microfibril-associated glycoprotein 4 17.1" 2.6 17.3" 2.9 25.1" 3.0# 11.0" 3.0 17.8" 3.6 14.5" 5.8 a-Actinin-associated LIM protein 6.0" 1.1 2.4" 0.6# 1.9" 0.2# 3.5" 1.1 2.3" 0.5 3.3" 0.9 a-Actin Isotype 1 3.9" 0.5 3.5" 0.6 3.5" 0.4 3.8" 0.6 5.5" 1.3 4.5" 1.2 Isotype 2 6.7" 1.3 1.6" 0.2# 2.0" 0.4# 4.2" 0.6 7.6" 1.4# 7.5" 1.4# b-Actin Isotype 1 76.0" 11.5 245.9" 40.6# 186.4" 30.6# 92.5" 34.9 184.6" 73.0 322.5" 53.8# Isotype 2 8.2" 1.5 5.3" 1.2 3.9" 0.8 2.6" 1.0 3.6" 0.8 3.3" 1.3 b-Tubulin 8.5" 1.7 3.5" 0.6 2.9" 0.5# 7.7" 1.4 8.7" 1.6 4.0" 1.4 Annexin A2 7.1" 1.3 7.5" 1.4 7.3" 1.1 7.9" 1.8 11.8" 5.0 16.8" 4.4 A4 6.5" 0.9 4.9" 1.2 4.8" 1.1 6.5" 1.7 6.4" 1.3 10.2" 2.9 A5 (isotype 1) 8.0" 2.0 3.3" 0.7# 3.3" 0.6# 3.2" 0.6 7.5" 2.4 3.1" 0.9 A5 (isotype 2) 5.5" 1.1 3.1" 0.7 2.3" 0.4 6.4" 1.3 5.1" 1.5 3.2" 0.8# Tropomyosin b-chain Isotype 1 10.0" 2.0 2.7" 0.6# 0.8" 0.2# 5.4" 1.1 4.5" 1.6 2.3" 0.7# Isotype 2 8.6" 1.5 6.0" 1.1 4.2" 1.0 6.3" 1.1 6.1" 1.8 6.5" 1.5 SM22/transgelin 11.2" 2.7 3.5" 0.9# 3.0" 0.5# 2.5" 1.0 1.5" 0.5 1.9" 0.7 AU, arbitrary units. Results are represented as mean" SEM. The number of experiments for each experimental condition is shown in the table (n). #P< 0.05 with respect to the corresponding control situation. JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY PLATELETS AND PROTEIN EXPRESSION IN VASCULAR WALL 893 ! ! CONTROL 105 PLAQ/POC 107 PLAQ/POC A2 D1 E2 K M1 Figura 5.3. Proteínas expresadas en la pared de la aorta preinflamada con diferencias significativas al incubarlas con PRP. A2: anexina A5. D1: cadena β tropomiosina. E2: actina α del músculo liso. K: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa . M1: actina β.   5. RESULTADOS   138 La mayoría de las proteínas analizadas presentaron un mayor o menor aumento en su expresión tras la incubación de los segmentos preestimulados con el PRP, aunque en pocos casos este cambio fue significativo. La actina α se sobreexpresó de forma significativa con las dos concentraciones plaquetarias estudiadas. Sin embargo, el incremento de la isoforma 1 de la actina β sólo se observó al coincubar las muestras con 107 plaquetas/pocillo. En la pared vascular preestimulada con TNF-α, sólo se observó una disminución en la expresión de la anexina A5 y de la cadena β de la tropomiosina. Esta infraexpresión fue significativa únicamente tras la coincubación con la mayor concentración de plaquetas (107 plaquetas/pocillo) para estas dos proteínas del citoesqueleto. En el Apéndice A. NIVELES DE EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL CITOESQUELETO se encuentra la relación de diagramas de barras que muestran los cambios en la expresión de las proteínas analizadas relacionadas con el citoesqueleto y el sistema contráctil. 5.2. CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS RELACIONADAS CON EL METABOLISMO ENERGÉTICO Se identificaron las siguientes proteínas en relación con el metabolismo energético en el mapa proteómico de los segmentos de aorta (Fig. 5.1): • Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 5. RESULTADOS   139 • Fosfoglicerato mutasa • Aldehído deshidrogenasa mitocondrial, isoformas 1 y 2 • Cadena β de la ATP sintasa • Glutation S transferasa En la Tabla 5.6 se detallan las masas teóricas, experimentales y los pI de las proteínas identificadas mediante MS. Tabla 5.6. Masas experimentales y puntos isoeléctricos. * El número de acceso representa el número asignado en la base de datos Mascot 1.9 (http://www.matrixscience.com) utilizado como algoritmo para asociar los péptidos obtenidos mediante espectrometría de masas. DH: deshidrogenasa. ATP: adenosín trifosfato. Los péptidos asociados a cada proteína en función del número de acceso de la base de datos fueron los que se expresan en la Tabla 5.7. Tabla 5.7. Relación del péptido asociado con la proteína detectada. DH: deshidrogenasa. ATP: adenosín trifosfato. PROTEÍNA Nº Acceso base de datos* Masa teórica (kDa/pI) Masa experimental (kDa/pI) ATP sintasa (cadena β) Q9MEI6 81.18/9.76 82.00/9.80 Aldehído DH mitocondrial P12762 54.53/5.70 54.53/5.75 PROTEÍNA PÉPTIDO ASOCIADO ATP sintasa (cadena β) KIYLPLLLPQQ Aldehído DH mitocondrial EDVDRAVK/YYAGWADK/TFPTVNPSTGEVICQVAAGDK/ KTFPTVNPSTGEVICQVAAGDK 5. RESULTADOS   140 Los métodos seguidos para la identificación de las proteínas de la pared vascular tras la electroforesis bidimensional se resumen en la Tabla 5.8. Tabla 5.8. Métodos seguidos para identificar las proteínas de la pared vascular. PROTEÍNA MÉTODO DE CONFIRMACIÓN SCORE de la PROTEÍNA SECUENCIA CUBIERTA (%) ATP sintasa (cadena β) MS/MS - 16 Aldehído DH mitocondrial MS 34 7 MS: espectrometría de masas. MS/MS: espectrometría de masas en tándem. 5.2.1. Cambios en la expresión proteica en los segmentos de aorta normales En los segmentos de aorta sanos (no preestimulados con TNF-α), se redujo la expresión de la aldehído deshidrogenasa mitocondrial (isoforma 1) y de la glutatión S transferasa (Tabla 5.9). Tabla 5.9. Análisis densitométrico de la expresión de las proteínas relacionadas con el metabolismo energético en aorta bovina normal al coincubarla con PRP. PARED VASCULAR NORMAL PROTEÍNA CONTROL n=18 105 plaq/poc n=10 107 plaq/poc n=9 5. RESULTADOS   141 UAD UAD p UAD p G3PDH 1.8±0.6 2.1±0.5 0.089 1.2±0.1 0.068 Fosfoglicerato mutasa 6.9±0.8 5.5±1.2 0.999 3.8±0.6 0.138 ADH mitocondrial Isoforma I Isoforma II 7.9±1.1 7.5±1.4 3.7±0.7 11.2±2.9 0.041 0.109 2.3±0.3 5.5±0.8 0.028 0.109 Cadena β ATP sintasa 5.4±0.9 4.6±0.9 0.593 3.6±0.6 0.493 Glutation S transferasa 7.9±1.2 5.4±1.5 0.465 3.8±0.8 0.043 Unidades Arbitrarias de Densitometría (UAD). Los resultados se expresan en media±DE. El número de muestras por cada experimento se muestra en la tabla (n). G3PDH: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. ADH: aldehído deshidrogenasa. ATP: adenosín trifosfato. La mayoría de las enzimas relacionadas con el metabolismo energético de la pared vascular presentaron una diminución de su expresión. Sin embargo, esta disminución únicamente fue significativa para la isoforma 1 de la aldehído deshidrogenasa mitocondrial con las dos concentraciones plaquetarias y para la glutation S tranferasa solo al coincubar las muestras con la concentración plaquetaria mayor (107 plaquetas/pocillo). En el Apéndice B. NIVELES DE EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL METABOLISMO ENERGÉTICO se encuentra la relación de diagramas de barras que muestran los cambios en la expresión de las proteínas analizadas relacionadas con el metabolismo energético. 5. RESULTADOS   142 5.2.2. Cambios en la expresión proteica en los segmentos de aorta preestimulados con TNF-α Como se muestra en la Tabla 5.10, la expresión de la mayoría de las proteínas identificadas en la pared vascular preinflamada no se modificó tras la incubación con PRP. Tabla 5.10. Análisis densitométrico de la expresión de las proteínas relacionadas con el metabolismo energético en aorta bovina preinflamada al coincubarla con PRP. PARED VASCULAR PREINFLAMADA PROTEÍNA CONTROL n=13 105 plaq/poc n=10 107 plaq/poc n=10 UAD UAD p UAD p G3PDH 2.0±0.7 3.6±0.8 0.080 6.7±1.8 0.043 Fosfoglicerato mutasa 3.6±0.7 4.0±0.8 0.180 2.5±0.5 0.068 ADH mitocondrial Isoforma I Isoforma II 7.8±1.8 5.5±0.6 3.2±0.7 3.9±0.7 0.109 0.180 5.3±1.7 7.3±2.0 0.593 0.109 Cadena β ATP sintasa 10.4±2.3 6.1±1.3 0.593 8.1±2.5 0.715 Glutation S transferasa 5.0±2.1 4.0±0.9 0.715 3.7±0.7 0.068 Unidades arbitrarias de densitometría (UAD). Los resultados se expresan en media±DE. El número de muestras por cada experimento se muestra en la tabla (n). G3PDH: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. ATP: adenosín trifosfato. DH: deshidrogenasa. 5. RESULTADOS   143 La coincubación de los segmentos preestimulados con 107 plaquetas/pocillo produjo una sobreexpresión significativa de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. El nivel de expresión del resto de enzimas identificadas no se modificó tras la incubación con PRP. En el Apéndice B. NIVELES DE EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL METABOLISMO ENERGÉTICO se encuentra la relación de diagramas de barras que muestran los cambios en la expresión de las proteínas analizadas relacionadas con el metabolismo energético. 5.2.3. Cambios en la expresión proteica mediante western blot Para tener un conocimiento más profundo de los efectos del PRP en la expresión de las proteínas relacionadas con el metabolismo energético, se determinó mediante la técnica WB la expresión total de la triosa fosfato isomerasa y la fructosa 1,6-bifosfato aldolasa, dos enzimas clave en glucolisis, y la cadena α de la ATP sintasa (proteína asociada con la fosforilación oxidativa). En los segmentos de aorta sana el PRP no modificó la expresión proteica de ninguna de las enzimas estudiadas. En la Tabla 5.11 se muestran los valores medios ± DE de las tres enzimas estudiadas mediante WB. Tabla 5.11. Modificaciones en la expresión de las enzimas ATP sintasa (cadena α), fructosa 1,6-bifosfato aldolasa y triosa fosfato isomerasa mediante WB. 5. RESULTADOS   144 PROTEÍNA Normal Preinflamada Control 107 p Control 107 p ATPasa (cadena α) 102.4±31,7 94.8±29,3 0.695 103.2±28.7 110±31.7 0.712 F 1,6-bifosfato A 177.7±41.3 158.1±43.4 0.167 191.4±45.3 85.1±27.8 0.021 TPI 115.1±35.1 103.0±30.7 0.743 98.7±26.4 100.3±27.3 0.825 Los resultados se expresan en media±DE. F 1,6-bifosfato A: fructosa 1,6-bifosfato aldolasa. TPI: triosa fosfato isomerasa. Sin embargo, en los segmentos de aorta bovina sometidos previamente a una situación inflamatoria la expresión de la fructosa 1,6-bifosfato aldolasa disminuyó tras la incubación con las plaquetas. La presencia del PRP no modificó la expresión proteica de la triosa fosfato isomerasa ni de la cadena α de la ATP sintasa en los segmentos de aorta preincubados con TNF-α (Fig. 5.4). Normal! TNF-α! Control''''''''''107' Control''''''''''107' 40 kDa * 5. RESULTADOS   145 60 kDa Normal! 30 KDa TNF-α! Control'''107' Control'''107' Figura 5.4. Representación del western blot y diagramas de barras mostrando los efectos de las plaquetas humanas (107 plaquetas/pocillo) y valores controles en la expresión de la fructosa 1,6- bifosfato aldolasa, triosa fosfato isomerasa y cadena α de la ATP sintasa en las muestras de aorta normal (barra blanca) y preincubadas con 10 µg/ml de TNF-α (barra negra). * : p=0.021 5.3. DETERMINACIONES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Se determinó la actividad de la fructosa 1,6-bifosfato aldolasa y de la triosa fosfato isomerasa en los segmentos de aorta bovina preincubados con TNF-α. 5. RESULTADOS   146 La presencia de 107 plaquetas/pocillo disminuyó significativamente la actividad de la fructosa 1,6-bifosfato aldolasa (Fig. 5.5). Los valores medios fueron de 1.00•10-5 ± 0.420 unidades enzimáticas/µg en el grupo control preinflamado versus 0.100•10-5 ± 0.039 unidades enzimáticas/µg en el grupo coincubado con 107 plaquetas/pocillo (p=0.017). ! Control + TNF-α 107 plaq/poc + TNF-α Tiempo (minutos) A ct iv id ad F ru ct os a 1, 6- bi fo sf at o A ld ol as a (1 0-5 u ni da de s e nz im át ic as /µ g de p ro te ín a) Figura 5.5. Gráfica que muestra la actividad de la fructosa 1,6-bifosfato aldolasa en la pared aórtica preinflamada. La actividad fue determinada durante 10 minutos. Los resultados se representan como 10-5 unidades enzimáticas/µg de proteína aórtica. Sin embargo, no se observó modificación de la actividad de la triosa fosfato isomerasa (Fig. 5.6). Los valores medios fueron de 2.42•10-5 ± 0.91 unidades enzimáticas/µg en el grupo control preinflamado versus 2.10•10-5 ± 0.93 unidades enzimáticas/µg en el grupo coincubado con 107 plaquetas/pocillo (p=0.848). 5. RESULTADOS   147 0 1 2 3 0 5 10 Control + TNF-α 107 plaq/poc + TNF-α A ct iv id ad T ri os a F os fa to I so m a¡ er as a ( 10 -5 u ni da de s en zi m át ic as /µ g de p ro te ín a) Tiempo (minutos) Figura 5.6. Gráfica que muestra la actividad de la triosa fosfato isomerasa en la pared aórtica preinflamada. La actividad fue determinada durante 10 minutos. Los resultados se representan como 10-5 unidades enzimáticas/µg de proteína aórtica. 5.4. DETERMINACIONES DEL CONTENIDO DE PIRUVATO Se determinó la cantidad de piruvato contenido en los segmentos de aorta. 5.4.1. Contenido de piruvato en los segmentos de aorta sana En los segmentos sanos de aorta el contenido de piruvato no se modificó por la presencia de 107 plaquetas/pocillo (Fig. 5.7). Los valores medios fueron de 0.016 ± 0.005 mmol/L en el grupo control versus 0.012 ± 0.007 mmol/l en el grupo coincubado con 107 plaquetas/pocillo (p=0.317).                                                             5. RESULTADOS   148 0 0,05 0,1 Py ruv ate co nc en tra tio n (m mo l/L ) Contenido de piruvato aorta bovina TNF$α NORMAL Control 1073 Control 1073 C on ce tr ac ió n de p ir uv at o (m m ol /L ) * Figura 5.7. Barras de error mostrando el efecto de las plaquetas (107 plaquetas/pocillo) en el contenido de piruvato en los segmentos de aorta sana y preinflamados con 10 µg/ml de TNF-α. Los resultados se expresan en media ± desviación estándar. * p=0.024. 5.4.2. Contenido de piruvato en los segmentos de aorta preinflamados Al contrario de lo que ocurría con los segmentos de aorta sanos, los que fueron preincubados con TNF-α presentaron una reducción significativa del contenido de piruvato en presencia de 107 plaquetas/pocillo (Fig. 5.7). Los valores medios fueron de 0.08 ± 0.008 mmol/l en el grupo control estimulado versus 0.02 ± 0.006 mmol/l en el grupo estimulado coincubado con 107 plaquetas/pocillo (p=0.024).   6 “…ciencia es la opinión verdadera acompañada de razón” Platón DISCUSIÓN   6. DISCUSIÓN 151 6. DISCUSIÓN La presente tesis muestra cómo en la pared vascular normal (sana), en presencia de plasma rico en plaquetas, se modifica la expresión de distintas proteínas relacionadas con el citoesqueleto, el sistema contráctil y con el metabolismo energético. Asimismo, cuando la pared vascular es sometida a un estado preinflamatorio, la presencia del plasma rico en plaquetas modifica la expresión de un menor número de proteínas de estos sistemas. En nuestro conocimiento, se establece por primera vez en un sistema in vitro el efecto de la plaqueta sobre la expresión proteica relacionada con el citoesqueleto, aparato contráctil y metabolismo energético en la pared vascular. La interacción entre el endotelio y la plaqueta juega un papel fundamental en los mecanismos de hemostasia e inflamación dentro de la pared vascular257-259. Cualquier alteración en la interacción plaqueta/endotelio puede, por tanto, contribuir a una gran variedad de enfermedades, como la arterioesclerosis y las reestenosis y otras enfermedades inflamatorias259-262. Existe un conocimiento extenso de la regulación que ejerce la pared vascular, tanto sana como estimulada, sobre la actividad plaquetaria. En 1998 Bombeli et al153 demostraron la interacción de las plaquetas activadas con células endoteliales de vena umbilical mediada por un mecanismo dependiente de la glicoproteína IIb/IIIa y de los receptores endoteliales ICAM-1, la integrina αvβ3 y la GPIbα. Las consecuencias fisiopatológicas de la activación de las plaquetas en la circulación aún no han sido 6. DISCUSIÓN 152 totalmente descifradas pero, a pesar de ello, sí está bien establecida la relación entre el incremento de la activación plaquetaria y el aumento del riesgo de complicaciones trombóticas en diferentes enfermedades como la diabetes, la preeclampsia, la angina inestable, la enfermedad vascular periférica y el ictus, así como tras los procedimientos de angioplastia y terapia fibrinolítica263. Precisamente por tratarse de plaquetas activadas, y no en estado de reposo, se sugirió que el trombo plaquetario podía también formarse en ausencia de una denudación de las células endoteliales, particularmente en la microcirculación264-267. Sin embargo, mientras que los receptores plaquetarios involucrados en la formación del agregado plaquetario y la matriz de adhesión han sido ampliamente estudiados, los mecanismos responsables de la interacción de las plaquetas y del endotelio aún no están del todo aclarados. Numerosas líneas de investigación indican que las sustancias liberadas por las plaquetas en la proximidad de la pared vascular inducen cambios en los genes de la misma262. La expresión génica de la MCP-1 y la ICAM-1 está regulada por factores de transcripción del NF-κB49,268,269. A su vez, se ha observado que las plaquetas pueden inducir dicha expresión en leucocitos270,271. En este sentido, existen trabajos que han mostrado cómo las plaquetas pueden modificar la expresión de proteínas inflamatorias en la pared vascular. Gawaz et al238 incubaron células endoteliales de vena umbilical humana con plaquetas no estimuladas o estimuladas con ADP durante seis horas y determinaron la secreción de MCP-1 y la expresión en superficie de ICAM-1 mediante ELISA y citometría de flujo, respectivamente. Observaron que las plaquetas activadas modulaban las propiedades quimiotácticas (MCP-1) y de adhesión (ICAM-1) de las CE mediante un mecanismo dependiente de NF-κB, contribuyendo todo ello a un estado inflamatorio precoz relacionado con el proceso de aterogénesis y 6. DISCUSIÓN 153 reestenosis. González-Fernández et al239 estudiaron el papel de las plaquetas activadas en la modulación de la proteína iNOS durante los dos primeros días después de la denudación in vivo del endotelio de arteria carótida de ratas Wistar. Los autores demostraron un papel fundamental de las plaquetas en la disminución de la expresión de la proteína iNOS, efecto que podía ser bloqueado con los inhibidores de la GPIIb/IIIa. En todos estos trabajos se ha estudiado el efecto de las plaquetas activadas, y no en reposo. Como ya se ha demostrado en el pasado, las plaquetas activadas tienen una función primordial en el desarrollo de la arterioesclerosis262, pero el conocimiento del efecto que ejercen las plaquetas no activadas como reguladoras de la expresión de proteínas involucradas en otros mecanismos como el citoesqueleto, el sistema contráctil y las relacionadas con el metabolismo energético es escaso. En este sentido, sería interesante conocer si las plaquetas pueden modificar estas proteínas, tanto en la pared vascular sana como en una situación inflamatoria, como ocurre en las enfermedades cardiovasculares. 6.1. MODIFICACIÓN EN LA EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS RELACIONADAS CON EL CITOESQUELETO Y SISTEMA CONTRÁCTIL La primera observación derivada de esta tesis fue que en la pared vascular sana, la presencia de PRP disminuyó la expresión de diferentes proteínas relacionadas con el citoesqueleto y el sistema contráctil. Se determinó una modificación significativa en la expresión de la actina α asociada a las proteínas LIM, la isoforma 2 de la actina α, la tubulina β, la isoforma 1 de la cadena β de la tropomiosina y la SM22/transgelina. 6. DISCUSIÓN 154 En concordancia con nuestra observación, Li et al272 demostraron previamente que los factores liberados por las plaquetas, como el factor de crecimiento plaquetario PDGF, podía inhibir la expresión de la actina α del músculo liso de la pared vascular. En esta misma línea, en 2007 Je and Sohn273 presentaron un estudio con preparados de segmentos de aorta que expusieron a agentes contráctiles, como la adrenalina. Estos autores demostraron que los ratones con deficiencia de la SM22 α presentaban un incremento en la expresión de la SM22 β, pero no cambiaba la expresión de la actina, desmina o calponina. Esta ausencia de SM22/transgelina en los ratones disminuía la capacidad contráctil de los vasos, obteniendo así una evidencia inicial sobre el papel de la SM22 α en la regulación de la contractilidad no dependiente del calcio. Es interesante apuntar que las plaquetas pueden liberar sustancias que producen vasoconstricción en una pared enferma, mientras que pueden promover la vasodilatación en los vasos sanos274. El efecto relajante de las plaquetas es mediado por la liberación de nucleótidos adenina, que a su vez induce liberación de un factor relajante derivado del endotelio, mientras que el efecto constrictor es mediado por el tromboxano A2 y la serotonina274,275. El estudio de Houston et al275 mostró que las plaquetas humanas provocaban la contracción de arterias coronarias caninas cuyo endotelio había sido denudado por medio de la liberación de serotonina y tromboxano A2. Moulds et al276 alcanzaron conclusiones similares con arterias digitales humanas. Raymenants et al277 evaluaron los efectos del verapamilo y la aspirina, que disminuyen la liberación de TxA2 y serotonina, en la modulación del tono vascular. Como se esperaba, encontraron que en los sujetos controles las plaquetas inducían vasodilatación en las muestras con endotelio intacto y vasoconstricción en las que lo 6. DISCUSIÓN 155 tenían denudado. El tratamiento con verapamilo incrementó la vasodilatación mediada por las plaquetas en los segmento de aorta con endotelio intacto y abolió la vasoconstricción en las muestras denudadas. Por otra parte, la aspirina también abolió la vasoconstricción mediada por las plaquetas en los segmento arteriales sin endotelio. El hecho de que el PRP disminuya la expresión de proteínas relacionadas con el sistema contráctil en la pared vascular sana podría estar relacionado con una reducción de la contractilidad vascular por las plaquetas. Por otro lado, la sobreexpresión de otras dos proteínas del sistema contráctil en la pared sana, como son la glicoproteína 4 asociada a las microfibras y la isoforma 1 de la actina β, puede indicar un mecanismo de compensación por la infraexpresión de las otras proteínas del sistema contráctil mencionadas con anterioridad. En los experimentos de esta tesis, cuando se indujo un estado preinflamatorio en la pared vascular, la presencia de PRP también produjo una modulación de la expresión de las proteínas del sistema contráctil pero en menor número que en los segmentos de aorta sanos. Proteínas como la glicoproteína 4 asociada a las microfibras, la tubulina β y la SM22/transgelina fueron infra o sobreexpresadas en la pared sana, no siendo así el los segmentos incubados con TNF-α. Otras proteínas, como la isoforma 1 de la actina β y la isoforma 1 de la cadena β de la tropomiosina, se modificaron tanto con la incubación con 105 plaquetas por pocillo como con 107 plaquetas por pocillo en la pared vascular sana. Sin embargo, solo se modificaron con 107 plaquetas por pocillo en los segmentos estimulados con TNF-α. Es difícil determinar la importancia de los cambios observados en la 6. DISCUSIÓN 156 expresión de las proteínas sobre la funcionalidad del endotelio. Sabemos que éste representa un papel muy importante como barrera selectiva para el paso de líquidos y solutos278. Las uniones adhesivas entre las CE regulan la permeabilidad del endotelio y muchos estudios han indicado la importante contribución del citoesqueleto de actina para mantener la integridad de la unión279-283. Así, Kurth et al284 describieron que la unión de la gelsolina a la actina es un evento específico de activación muy relacionado con los flujos intracelulares de calcio que podría ser fundamental en los procesos de polimerización de los filamentos de actina. La tropomiosina es un componente integral de los filamentos de actina en todas las células eucariotas. Los resultados de esta tesis mostraron que la cadena β de la tropomiosina se modificó tanto con la incubación con 105 plaquetas por pocillo como con 107 plaquetas por pocillo en la pared vascular sana. Sin embargo, solo se modificó con 107 plaquetas por pocillo en los segmentos estimulados con TNF-α. Tomados en conjunto, estos resultados aparentemente pueden sugerir un efecto dual de las plaquetas a nivel molecular sobre el sistema contráctil, dependiendo de la situación inflamatoria de la pared vascular. Esto estaría en concordancia con la extensa literatura existente sobre la observación de que las plaquetas inducen vasodilatación en las arterias sanas, pero vasoconstricción en las arterias enfermas. La presencia de PRP disminuyó la expresión de la isoforma 1 de la anexina A5 en la pared vascular sana y con 107 plaquetas por pocillo se redujo la expresión de la isoforma 2 en los segmentos de aorta preestimulados con TNF-α. La familia de las anexinas intervienen en la organización del citoesqueleto asociado a la membrana y también se han identificado como unas importantes reguladoras del balance 6. DISCUSIÓN 157 hemostático285. A su vez, las CE desempeñan un papel crítico en la hemostasia, proceso por el cual se regula la fluidez y la coagulación de la sangre234,286. En condiciones normales, el endotelio constituye una barrera antitrombótica; sin embargo, la ausencia de endotelio conlleva la formación de un trombo intravascular y depósito de fibrina, incluso en ausencia de un estímulo protrombótico287,288. La anexina A2 se ha propuesto como un correceptor de las CE para el plasminógeno y el t-PA289. Ling et al290 demostraron que los ratones con deficiencia de anexina A2 presentaban depósitos de fibrina y un incompleto aclaramiento del trombo arterial. Estos animales demostraban una lisis normal del coágulo de fibrina, pero la generación de plasmina dependiente del t-PA en la superficie de las CE estaba marcadamente disminuida. Se han descrito numerosas funciones de otras anexinas, especialmente de la anexina A5 en estudios in vitro, aunque el papel de esta proteína in vivo aún no es del todo conocido. Se ha propuesto como un potencial marcador de apoptosis en las placas de arterioesclerosis291. De hecho, se ha encontrado una mayor acumulación de anexina A5 en las placas de ateroma grado IV que en otras lesiones más estables y se ha correlacionado con la severidad de la lesión292. De hecho, se ha considerado que la anexina A5 podría ser un marcador de lesiones avanzadas o de placas vulnerables. 6.2. MODIFICACIÓN EN LA EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS RELACIONADAS CON EL METABOLISMO ENERGÉTICO El metabolismo de la glucosa parece desempeñar una función determinante en la reactividad vascular. Los pacientes con diabetes mellitus frecuentemente presentan una deficiencia en la vasodilatación endotelio-dependiente en respuesta a 6. DISCUSIÓN 158 acetilcolina293,294, al igual que ocurre en animales de experimentación295-299. Lund et al300 demostraron cómo la transferencia genética de eNOS puede mejorar el deterioro de la función vascular en diabéticos. En el presente estudio, se observó un incremento en la expresión de la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) y, sin embargo, una disminución de la expresión, y por tanto de la actividad, de la fructosa 1,6 bifosfato aldolasa, enzima clave en la fase glicolítica301, en los segmentos de aorta preestimulados con TNF-α y coincubados con PRP. Por el contrario, otra enzima clave en la vía glicolítica, la triosa fosfato isomerasa301, no cambió su expresión ni su actividad en los segmentos preincubados con TNF-α y coincubados con PRP. El incremento en la expresión de la G3PDH observado en los segmentos preestimulados con TNF-α podría reflejar un mecanismo compensatorio en la vía glicolítica debido a la reducción en la expresión y actividad de la fructosa 1,6- bifosfato aldolasa. En este sentido, el contenido de piruvato en la pared vascular, que es el producto final de la vía glicolítica, se encontró reducido en los segmentos preestimulados con TNF-α, sugiriendo una disminución de la actividad de la vía glicolítica. Hasta hace poco se pensaba que la G3PDH se expresaba continuamente en una cantidad constante en las células. De hecho, la expresión del mRNA de la G3PDH ha sido utilizado frecuentemente como un indicador estándar en los estudios de transcripción genética. Sin embargo, múltiples evidencias demuestran que la G3PDH puede modificar significativamente sus niveles en determinadas circunstancias y posee otras actividades además de la vía glicolítica. Se la ha relacionado con numerosas funciones distintas: como proteína modelo para el análisis 6. DISCUSIÓN 159 de la estructura proteica y mecanismos enzimáticos, fusión de la membrana, unión de los microtúbulos, actividad fosfotransferasa, exportación del RNA nuclear, replicación del DNA y reparación del mismo302. Estas nuevas actividades pueden deberse a la localización subcelular y a la estructura oligomérica de la G3PDH in vivo. Además, la G3PDH se ha relacionado con las enfermedades neurodegenerativas, cáncer de próstata y patogenia de enfermedades virales302. Ranganna et al303 encontraron que la sobreexpresión de la G3PDH se relacionaba con la proliferación de las CML. En los resultados de esta tesis existió un aumento de la expresión de dicha enzima sólo cuando los segmentos de aorta fueron sometidos a una situación preinflamatoria. Algo bien conocido es que la formación de las placas de arteriosclerosis conlleva diferentes eventos sincronizados como la adhesión, migración, proliferación y transformación celular, y estos eventos son mediados por factores de crecimiento y citoquinas. La proliferación vascular de las CML es un paso clave en enfermedades como la hipertensión304-306, arteriosclerosis305-307 y la restenosis postangioplastia307-311. Diferentes estudios han revelado que la expresión de la G3PDH altera su expresión sustancialmente y de forma independiente por algunas actividades celulares312-317. Estudios posteriores de Ranganna et al318 evidenciaron un aumento de la expresión de la G3PDH por el factor de crecimiento plaquetario BB. Las CML presentaron de 2.5 a 3.9 veces más cantidad de mRNA de la G3PDH y un incremento de 2.5 a 3.0 veces en la actividad catalítica de esta enzima después de 20- 24 horas de tratamiento con PDGF-BB. Además, cuando la pared vascular está estimulada, como ocurre en los estados inflamatorios, la secreción plaquetaria, incluyendo el factor de crecimiento BB, puede favorecer la sobreexpresión de la 6. DISCUSIÓN 160 G3PDH. Estas observaciones sugieren una relación entre la proliferación de las CML, la demanda energética celular y la expresión de la G3PDH, basándose en que la proliferación celular es un proceso demandante de energía a causa de un aumento en el metabolismo y requiere una generación de energía que parece proporcionarse por la sobreexpresión de la G3PDH. Se ha observado una relación similar entre la proliferación celular, la demanda de energía y la expresión de la G3PDH en células normales, cancerosas y trasformadas312-314,319-323. La enzima aldehído deshidrogenasa mitocondrial (ADHm) es la responsable de la oxidación de los aldehídos a ácidos carboxílicos. Esta enzima posee una actividad reductasa324 que cataliza específicamente la formación de 1,2-glicerol dinitrato y nitritos a partir de la nitroglicerina en la mitocondria324,325, produciendo una vasodilatación dependiente de GMP cíclico. Zhang et al326 evidenciaron que la inhibición de la ADHm atenuaba la respuesta hemodinámica a la nitroglicerina, tanto sistémica como del lecho coronario, y acortaba la duración de su acción. Del mismo modo, múltiples estudios han mostrado que la glutatión S transferasa potencia la inhibición plaquetaria mediante la nitroglicerina, sugiriendo que esta enzima pueda estar involucrada en la transformación de la nitroglicerina en NO327. En los experimentos de coincubación, las plaquetas indujeron una reducción de la expresión de ambas, la ADHm (isoforma 1) y de la glutatión S transferasa en la pared vascular sana, lo que sugiere que las plaquetas podrían modular la respuesta vasodilatadora a los nitrovasodilatadores. Miller et al328 demostraron el papel de las plaquetas en la respuesta constrictora de las arterias coronarias in vivo a la acetilcolina tras un daño endotelial. Este efecto podía ser inhibido al bloquear la función plaquetaria, lo que sugiere que las plaquetas participan en la vasoconstricción inducida por la 6. DISCUSIÓN 161 acetilcolina. Sin embargo, hasta donde alcanza nuestro conocimiento no existen publicaciones sobre el posible efecto de las plaquetas en la respuesta vasodilatadora mediada por nitratos. Una función importante de la glutatión S transferasa es su efecto protector en la degradación de las membranas biológicas por la reducción no específica de fosfolípidos peroxidados mediada por el glutatión. La hipertensión arterial es una entidad asociada con el estrés oxidativo y, por tanto, con una producción incrementada de radicales libres de oxígeno329-332. De hecho, la inducción de un estado de estrés oxidativo mediante la deplección del glutatión causa hipertensión severa mantenida333. Vaziri et al334 demostraron en ratas con hipertensión inducida cómo el estrés oxidativo estaba asociado a una sobrerregulación de las enzimas generadoras de superóxido, la NADPH oxidasa, sin evidencia de deficiencia de la glutatión peroxidasa, catalasa o dismutasa. La alteración de los sistemas antioxidantes, como ocurre en la insuficiencia renal crónica, culminan en un estrés oxidativo que puede contribuir al desarrollo de una arterioesclerosis acelerada y otras complicaciones a largo plazo. Ceballos-Picot et al335 encontraron una importante disminución de la actividad de la glutatión S transferasa en los pacientes con insuficiencia renal crónica. Esta alteración en los sistemas antioxidantes incrementaba gradualmente con el grado de enfermedad renal. La reducción de la expresión de la glutatión S transferasa en la pared vascular sana puede estar asociada a una disminución de las defensas del vaso contra los agentes oxidantes. Así, las plaquetas por sí mismas podrían intentar promover su activación en contra de las propiedades antitrombóticas de la pared vascular normal. 6. DISCUSIÓN 162 En resumen, el principal hallazgo de esta tesis fue que en la pared vascular normal las plaquetas pueden modificar la expresión de proteínas asociadas con el sistema contráctil y con el metabolismo energético por sí mismas. Sin embargo, bajo una situación inflamatoria las plaquetas cambian la expresión de un menor número de proteínas asociadas con estos dos sistemas previamente mencionados. Por tanto, los resultados proporcionan nuevas evidencias sobre la implicación principal de las plaquetas en la regulación de la expresión de proteínas en la pared vascular, particularmente en condiciones de ausencia de enfermedad y de inflamación, teniendo un importante papel en los procesos isquémicos. 6.3. LIMITACIONES DEL ESTUDIO Una limitación de los experimentos de esta tesis podría ser la heterogeneidad interespecie al incubar las plaquetas humanas con los segmentos de aorta bovina. Las plaquetas de origen bovino no pudieron utilizarse, ya que las muestras de sangre para obtener el PRP deben ser inmediatamente aisladas para minimizar la activación plaquetaria. La distancia entre el matadero y el laboratorio de investigación hizo imposible la utilización de las plaquetas de origen bovino. Sin embargo, es importante destacar que la presencia de plaquetas no modificó la expresión de otras proteínas en la pared vascular bovina, lo que apoya la especificidad de los cambios observados. En condiciones fisiopatológicas las plaquetas pueden interaccionar físicamente con la pared vascular. Sin embargo, en nuestro diseño experimental, las plaquetas y la pared vascular fueron separadas por una membrana, sólo pudiendo interaccionar a través de las sustancias liberadas por cada uno de ellos. La cuestión que surge es 6. DISCUSIÓN 163 cómo las plaquetas no activadas pueden regular la expresión de proteínas en la pared vascular. Una explicación sobre ésto podría ser que las plaquetas no activadas pueden liberar una serie de factores vasoactivos que probablemente pueden afectar a la síntesis de proteínas en la pared vascular e, incluso, en otras células sanguíneas336. Zhou et al337 cuantificaron la liberación de NO en plaquetas en estado de reposo y plaquetas activadas con colágeno. Obtuvieron que ambos grupos liberaban NO, siendo esta liberación lineal con respecto al tiempo en las plaquetas no activadas. Estos autores concluyeron que considerando la cantidad de NO derivada de las plaquetas en comparación con la liberada por el endotelio sugiere que éstas tienen un papel fundamental en el mantenimiento del tono vascular y el flujo sanguíneo. Por otra parte, Raiden et al338 estudiaron los mecanismos por los cuales las plaquetas contribuyen a la acumulación selectiva de eosinófilos en los sitios de inflamación alérgica en virtud de su capacidad de producir factor quimiotáctico de neutrófilos. Los autores comprobaron por primera vez el efecto antiapoptótico de las plaquetas, aumentando, por tanto, la supervivencia de los eosinófilos. Demostraron que este efecto antiapoptótico dependía de la liberación de productos solubles de origen plaquetario que eran neutralizados de forma significativa por anticuerpos dirigidos contra el GM-CSF. Estudios realizados mediante citometría de flujo dirigidos a analizar el origen celular de esta citoquina, mostraron la existencia de GM-CSF intracitoplásmico en las plaquetas en estado de reposo. Otra limitación del estudio, como ocurre en todos los experimentos en los que se utiliza PRP, es que durante la centrifugación para la obtención del PRP existe la posibilidad de un cierto grado de activación plaquetaria, lo cual podría favorecer la liberación de diferentes factores de origen plaquetario. Es por esto por lo que en los 6. DISCUSIÓN 164 experimentos se utiliza el PRP en lugar de plaquetas aisladas. La utilización de PRP es más fisiológica debido a que la utilización de plaquetas aisladas requiere centrifugados adicionales y, por tanto, se incrementa la posibilidad de activación espontánea de las mismas. También es plausible que algunos de los cambios observados en el experimento fueran atribuidos a las plaquetas y pudieran ser influidos por el plasma contenido en el PRP. Sin embargo, no podemos descartar el efecto de las plaquetas contenidas en ese plasma. De cualquier manera, los experimentos control se realizaron con la misma cantidad de PRP que el volumen final de PRP + PPP contenido en los pocillos con 105 plaquetas, habiendo una mayor cantidad de plasma en estos experimentos que el los que contenían 107 plaquetas por pocillo. Este hecho minimiza el posible efecto del plasma en los cambios proteicos observados. 7 CONCLUSIONES 7. CONCLUSIONES 167 7. CONCLUSIONES 1. La incubación de segmentos de aorta sana con plasma rico en plaquetas produce una disminución significativa de la expresión de diferentes proteínas del citoesqueleto y sistema contráctil celular, como son la actina α asociada al dominio LIM, la actina α, la tubulina β, la anexina A5, la cadena β de la tropomiosina y la SM22/transgelina. 2. Sin embargo, la incubación de segmentos de aorta sana con plasma rico en plaquetas produce un aumento significativo de la expresión de otras, como la actina β y la glicoproteína 4 asociada a las microfibras, posiblemente como mecanismo compensatorio. 3. El efecto sobre el citoesqueleto de la pared vascular observado con las plaquetas es menor en la pared vascular preinflamada que en la pared vascular sana. 4. La incubación de segmentos de aorta sana con plasma rico en plaquetas produce una disminución significativa de la expresión de enzimas relacionadas con el metabolismo energético. Sin embargo, cuando los segmentos de aorta están preinflamados no se producen cambios significativos en la expresión proteica. 7. CONCLUSIONES 168 5. En la arteria sometida a una situación preinflamatoria e incubada con plaquetas, el cambio más significativo observado con respecto al metabolismo energético es la reducción de la expresión y actividad de la fructosa 1,6- bifosfato aldolasa y la ausencia de modificaciones en la triosa fosfato isomerasa, dos enzimas clave en el metabolismo de la glucosa, acompañadas de una reducción del contenido de piruvato. 6. Los resultados sobre la reducción de piruvato en la pared vascular preinflamada coincubada con plasma rico en plaquetas sugieren que en estas condiciones hay una reducción de la glucolisis. 8 BIBLIOGRAFÍA 8. BIBLIOGRAFÍA 171 1. Clark JM, Glagov S. Luminal surface of distended arteries by scanning electron microscopy: eliminating configurational and technical artefacts. Br J Exp Pathol 1976;57:129-35. 2. Levy B, Tedgui A (ed). Biology of the arterial Wall. Norwell, MA: Kluwer Academic; 1999. 3. Smith ML, Long DS, Damiano ER, Ley K. 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(ISOFORMA 1) ACTINA β! (ISOFORMA 2) * TUBULINA β! ANEXINA A2 9. APÉNDICES 217 ANEXINA A4 ** ANEXINA A5 (ISOFORMA 1) * ANEXINA A5 (ISOFORMA 2) * * * CADENA β! TROPOMIOSINA (ISOFORMA 1) CADENA β! TROPOMIOSINA (ISOFORMA 2) ** SM22/TRANSGELINA APÉNDICE B 9. APÉNDICES 221 B. NIVELES DE EXPREISÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL METABOLISMO ENERGÉTICO Diagramas de barras de la expresión de las proteínas relacionadas con el metabolismo energético de la pared vascular sana (barra blanca) y coincubada con TNF-α (barra negra) en la pared vascular control y tras la incubación con PRP. UAD: Unidades arbitrarias de densitometría. 10^5: concentración plaquetaria de 105 plaquetas/pocillo. 10^7: concentración plaquetaria de 107 plaquetas/pocillo. * p ≤ 0.05. * GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO DESHIDROGENASA FOSFOGLICERATO MUTASA * * ALDEHÍDO DESHIDROGENASA MITOCONDRIAL (ISOFORMA 1) ALDEHÍDO DESHIDROGENASA MITOCONDRIAL (ISOFORMA 2) CADENA β!!DE LA ATP SINTASA * GLUTATION S TRANSFERASA   9. APÉNDICES 222 * GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO DESHIDROGENASA FOSFOGLICERATO MUTASA * * ALDEHÍDO DESHIDROGENASA MITOCONDRIAL (ISOFORMA 1) ALDEHÍDO DESHIDROGENASA MITOCONDRIAL (ISOFORMA 2) CADENA β!!DE LA ATP SINTASA * GLUTATION S TRANSFERASA APÉNDICE C 225 C. ABREVIATURAS 2-DE: Electroforesis bidimensional AA: Ácido araquidónico ACD: Ácido citrato dextrosa ADHm: Aldehído deshidrogenasa mitocondrial ADP: Adenosín difosfato AMPc: Adenosín monofosfato cíclico ATP: Adenosín trifosfato BCA: Ácido bicinconínico BSA: Albúmina de suero bovino CD40L: CD40 ligado CE: Célula endotelial CHAPS: 3-(3-colamidopropil)dimetilamonio-1-propenosulfonato CML: Célula de músculo liso DHAP: Dihidroxiacetona fosfato DNA: Ácido desoxirribonucleico DO: Densidad óptica EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay eNOS: Enzima óxido nítrico sintasa endotelial F6P: Fructosa 6 fosfato FT: Factor tisular G3P: Gliceraldehído 3 fosfato G3PDH: Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa G6P: Glucosa 6 fosfato GM-CSF: Factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos GP Ib: Glicoproteína Ib plaquetaria GP IIb/IIIa: Glicoproteína IIb/IIIa plaquetaria ICAM: Molécula de adhesión intercelular-1 IFN-γ: Interferón gamma IL-1: Interleuquina-1 IL-6: Interleuquina-6 IL-8: Interleuquina-8 IL-10: Interleuquina-10 iNOS: Óxido nítrico sintetasa inducible IPG: Gradiente de pH inmovilizado IκB: Inhibidor kappa beta LDL: Lipoproteínas de baja densidad LDLox: Lipoproteínas oxidadas de baja densidad MCP-1: Proteína quimiotáctica de monocitos 1 M-CSF: Factor de crecimiento estimulante de colonias de macrófagos MMP: Metaloproteinasas de matriz MS: Espectrometría de masas NAD: Nicotinamida adenín dinucleótido NADH: Nicotinamida adenín dinucleótido reducido NF-κB: Factor de transcripción nuclear kappa beta NO: Óxido nítrico PBS: Tampón fosfato-salino PCR: Proteína C reactiva PDGF: Factor de crecimiento derivado de las plaquetas PLT: Plaquetas PPP: Plasma pobre en plaquetas PRP: Plasma rico en plaquetas PVDF: Polifluoruro de vinilideno ROS: Especies reactivas de oxígeno 226 RPMI: Roswell Park Memorial Institute SDS-PAGE: Gel de electroforesis de poliacrilamida-SDS SFB: Suero fetal bovino TBS-T: Tris-Buffered saline Tween-20 TGF-β: Factor de crecimiento transformante beta TNF-α: Factor de necrosis tumoral alfa TOF: Time of flight TPI: Triosa fosfato isomerasa TxA2: Tromboxano A2 UAD: Unidades arbitrarias de densitometría VCAM-1: Molécula 1 de adhesión vascular vWF: Factor de von Willebrand WB: Western blot w/v: Weigth/volume 227 APÉNDICE D 9. APÉNDICES D. ABSTRACT BACKGROUND Although much is known about the effects of the vascular wall on platelets, studies examining the effect of platelets on the expression of proteins in the vascular wall are sparse. Platelets are source of several mediators including growth factors and other substances that may influence the expression of proteins in the vascular wall. In this regard, in vitro studies have suggested that platelets may induce inflammation on endothelial culture. Until now, it has been difficult to monitor changes in the expression of several proteins at the same time in a single sample. A technology termed as proteomics, which it is based in the use of two dimensional electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry (MS) analysis has emerged providing us a useful methodology to quantify and identify changes in the expression of multiple proteins and proteins isotypes in a single sample. OBJECTIVES The aim of the present study was then to analyze, using proteomics, whether platelets may modified the expression of proteins in the vascular wall particularly those associated with vascular cytoskeleton and energetic metabolism. For this purpose, we used an in vitro model coincubating platelet rich plasma with isolated healthy aortic segments and with aortic segments submitted to a pre-inflammatory situation prior to be coincubated with the platelets. 230 9. APÉNDICES MATERIALS AND METHODS We analyzed whether platelets may modify the protein expression in the vascular wall. We used an in vitro model coincubating human platelet rich plasma (PRP) with control and 10 ng/ml TNF-α-preincubated bovine aortic segments. Two different platelet concentrations (105 and 107 platelets/well) were used in the coincubation experiments. The coincubation system was prepared by placing sterile Transwell- COL (Corning incorporated, COSTAR 3491, NY) inserts of 24 mm diameter and 0.4 mm pore size, containing the platelets, into wells containing the bovine aortic segments. 2-DE, MS and western blot analysis were used to determine changes in the expression of proteins associated with the cytoskeleton and energetic metabolism in the aortic segments. In the bovine aortic proteomic map the spots were densitometrically analyzed and identified by comparison with those found in the human saphenous vein. The spots in which statistical differences were observed were further identified by MS. The enzymatic activity was determined in the vascular wall following the method described by Misset and Opperdoes. The content of pyruvate present in the bovine aortic segments was also quantified using a Pyruvate Assay Kit(K609-100, BioVision Research Products, USA). RESULTS In control healthy vascular wall, only the cytoskeleton-related proteins expression was modified by PRP. However, when PRP was coincubated with TNF-α pre-stimulated aortic segments lesser number of cytoskeleton-related proteins were modified. With respect to energetic metabolism, in control segments PRP failed to modify any of the analyzed energetic-related proteins. However, in TNF-α-preincubated segments the presence of PRP upexpressed glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase. Moreover, 231 9. APÉNDICES by western blot experiments it was observed that in TNF-α-preincubated segments the expression of fructose 1,6-bisphosphate aldolase was downregulated by platelets. However, no differences were found in the expression of triosephosphate isomerase and ATP synthase α-chain. In addition, the activity of fructose 1,6-bisphosphate aldolase and piruvate content was significantly reduced without modification on triosephosphate isomerase activity. CONCLUSIONS The main finding of the present study was that in the control vascular wall platelets by themselves affected the expression of a number of proteins associated with contractile system and the energetic metabolism. However, under vascular pre-inflammatory state, platelets modified the expression of a lesser number of proteins associated with contractile system and energetic metabolism. The crosstalk between platelets and vascular wall is bidirectional and platelets regulated in the vascular wall the expression of proteins associated with the cytoskeleton and energetic metabolism, particularly in the healthy vascular wall. Therefore, the present study provides new evidences about the main implication of platelets in the regulation of the expression of vascular proteins particularly under healthy and inflammatory vascular conditions which they may have importance in the setting of ischemic processes. 232   Portada AGRADECIMIENTOS ÍNDICE INTRODUCCIÓN HIPÓTESIS OBJETIVOS MATERIAL Y MÉTODO RESULTADOS DISCUSIÓN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA APÉNDICES