UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular IV TESIS DOCTORAL Factores neuroprotectores y redox en el desarrollo del fenotipo neurológico de la malaria cerebral murina MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR María Linares Gómez Directores José Manuel Bautista Santa Cruz Amalia Díez Martín Madrid, 2014 © María Linares Gómez, 2011 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular IV FACTORES NEUROPROTECTORES Y REDOX EN EL DESARROLLO DEL FENOTIPO NEUROLÓGICO DE LA MALARIA CEREBRAL MURINA TESIS DOCTORAL Memoria presentada para optar al grado de doctor por la Universidad Complutense de Madrid María Linares Gómez Madrid, 2011 D. José Manuel Bautista Santa Cruz, doctor en Veterinaria y Catedrático del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular IV de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid, y Dña. Amalia Diez Martín, doctora en Ciencias Biológicas y Profesora Titular del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular IV de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid, CERTIFICAN: Que la tesis doctoral titulada: "Factores neuroprotectores y redox en el desarrollo del fenotipo neurológico de la malaria cerebral murina" que presenta María Linares Gómez, licenciada en Biología por la Universidad Complutense de Madrid, ha sido realizada bajo su dirección, en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular IV de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid y cumple todas las condiciones exigidas para optar al grado de Doctor por la Universidad Complutense de Madrid con mención europea. De acuerdo con la normativa vigente, firmamos el presente certificado, autorizando su presentación como directores de la mencionada tesis doctoral. En Madrid, a 6 de Mayo de 2011 Dr. José Manuel Bautista Santa Cruz Dra. Amalia Diez Martín La realización de este trabajo de investigación ha sido posible gracias a la concesión de una beca predoctoral para la formación de personal universitario del Ministerio de Educación y Ciencia. Abreviaturas LISTADO DE ABREVIATURAS β1: subunidad del proteasoma β1 β2: subunidad del proteasoma β2 β5: subunidad del proteasome β5 2D oxyblot: Inmunodetección bidimensional BDNF: factor neurotrófico derivado del cerebro, del inglés "brain-derived neurotrophic factor" CAT: catalasa DNP: 2,4-dinitrofenilhidrazona DNPH: 2,4-dinitrofenilhidrazina E-selectina: del inglés, “endothelial selectin” FOXO1: del inglés, forkhead box O1 FOXO3: del inglés, forkhead box O3 GPX: glutation peroxidasa HO: hemoxigenasa HSP: proteína de choque térmico, del inglés, "heat shock protein" ICAM-1: molécula de adhesión intercelular-1, del inglés "intercellular adhesion molecule-1" IFN-γ: interferón-γ LMP2: subunidad del inmunoproteasoma β1i LMP7: subunidad del inmunoproteasoma β5i LT-α: linfotoxina-α MECL1: subunidad del inmunoproteasoma β2i NCAM: molécula celular de adhesión neural, del inglés "neural cell adhesion molecule" PARK7: del inglés, Parkinson disease 7 PDGF: del inglés, “platelet derived growth factor” PfEMP-1: del inglés, “erythrocyte membane protein 1” de P.falciparum) P-selectina: del inglés, platelet selectin SOD: superoxido dismutasa TNF-α: factor de necrosis tumoral-α, del inglés "tumor necrosis factor-α" TRX: tiorredoxina Abreviaturas _ VCAM-1: molécula de adhesión celular vascular-1, del inglés "vascular cell adhesion molecule-1" XBP1: del inglés, "X-box binding protein 1". Las abreviaturas de los nombres de los genes están representados en minúscula y cursiva, siendo las mismas utilizadas para las proteínas que codifican. Índice ÍNDICE 1. SUMMARY 1 2. INTRODUCCIÓN 7 2.1. El problema de la malaria 9 2.2. El ciclo de vida de Plasmodium 11 2.3. Manifestaciones clínicas de la malaria en el hombre 15 2.4. Malaria cerebral 19 2.4.1. Clínica y secuelas 19 2.4.2. Patogénesis de la malaria cerebral 23 2.4.2.1. Secuestro de glóbulos rojos infectados 24 2.4.2.2.Respuesta inmune del hospedador: neuroinflamación 31 2.4.2.3.Alteraciones en la neuroprotección 37 2.4.2.4.Estrés oxidativo 42 2.5. Modelos experimentales de la malaria cerebral 49 2.5.1. El modelo murino de P. berghei ANKA 51 3. OBJETIVOS/OBJECTIVES 55 4. TRABAJOS EXPERIMENTALES 61 Declined expression of brain-derived neurotrophic factor correlates with neurological stages of cerebral malaria in mice 63 Proteomic approaches to identifying carbonylated proteins in brain tissue 93 Oxidative stress responses in cerebral malaria maintain the redox balance in mouse brain 117 5. DISCUSIÓN GENERAL 151 5.1. Caracterización del fenotipo neurológico progresivo de la malaria cerebral murina 153 5.2. Factores neuroprotectores en la malaria cerebral 157 5.3. Metodología oxiproteómica para la caracterización de daño oxidativo en cerebro 171 5.4. Estrés oxidativo y daño neurocognitivo en la malaria cerebral 176 5.5. Moléculas neuroprotecotras y redox como dianas terapéuticas druante la malaria cerebral 188 6. CONCLUSIONES/CONCLUSIONS 191 7. BIBLIOGRAFÍA 195 1. SUMMARY Summary 3 Malaria is one of the most important global health problems and, together with tuberculosis and HIV/AIDS, is one of the three infectious diseases that has the highest impact worldwide in terms of morbidity, mortality and socioeconomic consequences. The vast majority of cases occur in Africa, where the bulk of the infections and deaths are caused by Plasmodium falciparum. This species is the only one producing cerebral malaria (CM) in humans, a life-threatening neurological syndrome, predominantly in children growing up in endemic areas of Africa. Among the survivors, more than 10% of the children affected by this complication develop neurological sequelae. The pathogenesis and triggering events of CM are not well understood, but today it is accepted that the onset and severity of CM are predominantly determined by an exacerbated host inflammatory response and the capacity of the parasite to adhere to the cerebral microvasculature. Two other biochemical features have been reported critical in CM development: the alteration of neuroprotective pathways and the oxidative stress. In order to study the implication of these events in the CM progression, a time-course protocol with four clinical stages of the disease, according to the neurological outcome, was established in a widely used experimental malaria model (C56BL6/mice infected with P.berghei ANKA). The neurological performance of infected mice was daily evaluated in individual mice by recording clinical symptoms of this syndrome. The test covered a wide range of behavioral and functional features and the analysis was complemented with an overall examination of the mice, including quantification of peripheral blood parasitemia. Since only motor function and coordination impairments were exhibited by 100% of the animals, these clinical features were then used to define the phases of disease progression in four stages as follows: STAGE I: no neurological symptoms in the first few days of infection; STAGE II: incipient symptoms of CM; STAGE III: appreciable neurological symptoms; and STAGE IV: severe symptoms. All animals at stage II exhibited mildly head deviation or hemi-paralysis. From this stage onwards, these symptoms worsened rapidly and at stages III and IV they were accompanied by reduced motility and weakness. The screening of mice with respect of the neurobehavioral phenotype offers a powerful tool to understand the etiology Summary _   4 and pathogenesis of cerebral malaria, avoiding any variation due to the heterogeneity in disease progression since mice did not present the same symptoms at the same time from the initial inoculation of P. berghei. Once the four-stage protocol was established, the potential alterations of neuroprotective pathways were studied. For this purpose, the role of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the neurological dysfunction of CM was studied. BDNF is an important regulator of neuronal survival and synaptic plasticity. CM and its sequelae course with neuronal damage and impaired cognitive functions. Thus, BDNF expression and distribution was analysed in several brain areas during the progress of disease. Quantitative-RT-PCR assays revealed a diminished bdnf mRNA expression in all brain regions analyzed in parallel with CM progression. Immunohistochemical studies showed an altered BDNF axonal transport. However, western blot analyses did not reveal any change at protein level. Since proteasome disfunction blocks bdnf transcription and drives the accumulation of misfolded proteins, which may mask bdnf downregulation at protein level, proteasome and immunoproteasome subunits were further analyzed. A switch of the decreased constitutive proteasome towards the induced immunoproteasome was observed during CM. In this context, some of the cytokines accepted to participate in CM have also been reported to increase the immunoproteasome subunits. Thus, the early up-regulation of the cytokines tumor necrosis factor-α and interferon-γ observed in our studies could have also a role in the immunoproteasome induction during CM progression. Finally, neural cell adhesion molecule (NCAM), which interacts with BDNF to modulate neuronal survival and plasticity, was caracterized. This molecule also presented a steadily downregulation, supporting a potential failure in the neuroprotective pathways but excluding its potential role in parasite adhesion to brain microvasculature. Together, these observations suggest a critical role of BDNF and other neuroprotective markers in the pathogenesis of CM. Carbonyl groups are well known markers of protein oxidation, a direct consequence of oxidative stress. Before starting the second part of the thesis, the most suitable method to detect carbonyl groups in brain tissues was established by comparison of the two most widely used oxyproteomic approaches. Briefly, the carbonyl contents of individual proteins may be assessed by reacting samples with Summary 5 dinitrophenylhydrazine (DNPH) before or after the two dimensional electrophoresis step. Then, carbonyl modified proteins are visualized using specific antibodies. As pre-treatment with DNPH before electrophoresis rendered a large number of carbonyl modified proteins in gels, a lower stained background and an improved reproducibility without modifying the mass spectrometry fingerprinting identification scores, this approach was chosen for further oxyproteomic analysis in brain tissues. Further, the scenario of host oxidative stress during cerebral malaria progression was analyzed. Although altered redox equilibrium has been suggested during CM pathogenesis, some authors fail to demonstrate its implication in murine CM. These data contrast with several reported anti-oxidant experimental treatments in mice that result in protection. In order to better understand the redox factors potentially involved in the development of CM, the antioxidant defense status of several regions of the host brain during CM was studied in detail. Quantitative PCR showed an important downregulation of mice superoxide dismutase (sod) and catalase (cat) mRNA expression in parallel with the onset of the disease in all brain areas analyzed. Furthermore, gel activity assays showed a significant decrease of both, SOD and CAT, activities at the most severe CM stage. A gradual diminished expression of the antioxidant proteins thioredoxin-1 and heat shock protein 70 was also observed during CM. Parkinson disease 7 (PARK7), X-box-binding protein 1 (XBP1) and the Forkhead box protein O (FOXO) family of transcription factors regulate the expression of antioxidant enzyme genes. Thus, the above observed mRNA downregulations could be explained by the reduced expression of park7, foxo1, foxo3 and xbp1 detected during the progression of the disease. Next, reactive oxygen species build up and carbonyl modified proteins were also explored. Nevertheless, both markers of oxidative stress failed to vary at the most severe stage of disease, suggesting a compensatory antioxidant activity. Finally, an up-regulation of two different antioxidant enzymes, heme oxygenase-1 and glutathione peroxidase, were observed in several tissues during CM, which suggest a role for them in the removal of reactive oxygen species generated during CM progression. Summary _   6 The results obtained in the present thesis pointed out to a central role of neuroprotectors and antioxidant mediators during cerebral malaria progression. The gradual changes observed along the outcome of the disease suggest a critical point for the development of neurological damage. In this context, earlier and specific treatment could ameliorate CM prognosis and reduce potential neurocognitive sequelae. Finally, it should be considered that some of these mediators could be potential targets for coadjuvant therapy to antimalarial treatment in CM. 2. INTRODUCCIÓN Introducción 9 2.1.- EL PROBLEMA DE LA MALARIA La malaria o paludismo es la enfermedad parasitaria más importante en el mundo debido a la alta morbilidad, mortalidad y al impacto socio-económico que ocasiona en la población humana (Enayati & Hemingway; Greenwood et al., 2005). Cada año se diagnostican alrededor de 200 a 300 millones de nuevos casos de malaria, de los cuales se calcula que mueren a consecuencia de la infección aproximadamente 1 millón de personas, con una elevada morbilidad y mortalidad en niños menores de cinco años (WHO, 2007; WHO, 2009). Esta elevada mortalidad se debe principalmente a las complicaciones que se derivan de la misma, responsables del desarrollo de la denominada malaria severa (Mackintosh et al., 2004), fundamentalmente por su forma más grave, la malaria cerebral, que es la responsable de alrededor del 80% de las muertes que suceden por esta patología infecciosa (Armah et al., 2005; Lou et al., 2001). Cerca del 50 % de la población mundial se encuentra en zonas con riesgo de transmisión (Hay, 2004; WHO, 2009), mayoritariamente distribuidas en los países más pobres del mundo (Figura 1). Aproximadamente el 90% del daño por malaria se produce en África (Bell et al., 2006; Breman et al., 2004; WHO, 2009), sobre todo en la zona subsahariana. Sin embargo, áreas de Asia, América Latina, Europa del Este y otras partes de Europa también están afectadas (WHO, 2007; WHO, 2009), tratándose por tanto, de una enfermedad endémica en más de 100 países del mundo (Puente, 2005; WHO, 2009). Esta patología es responsable tanto de un sufrimiento humano incalculable como de un elevado coste sanitario y económico (por pérdida productiva), lo cual contribuye a incrementar el ciclo vicioso pobreza-enfermedad en el que se encuentran muchos de los países afectados (Sachs & Malaney, 2002). A pesar de que el hospedador puede adquirir inmunidad frente a la malaria a través de la infección natural o experimental, aun no se ha conseguido desarrollar una vacuna eficaz contra esta enfermedad. Actualmente, se están llevando a cabo diferentes ensayos clínicos en humanos que se encuentran en distintas fases de evaluación, a partir de vacunas diseñadas frente a diversas formas del ciclo de vida de Plasmodium. Sin embargo, existen grandes dificultades en la obtención de una vacuna efectiva debido al complejo ciclo de vida del parásito y a su capacidad de Introducción _   10 variación antigénica, lo que le permite unos extraordinarios mecanismos de evasión inmunitaria (Crompton et al., 2011). De esta forma, el tratamiento actual de la malaria continúa siendo la administración de fármacos antimaláricos, basado fundamentalmente en el empleo de quinoleínas, antifolatos y artemisinas. Debido a la amplia y rápida aparición de resistencias en los parásitos frente a los dos primeros grupos de fármacos, en la actualidad se recomienda el uso de terapias combinadas con artemisinas para frenar el desarrollo de resistencias frente a las mismas (Sadanand, 2011). Este proceso adaptativo del parásito dificulta enormemente el control de la enfermedad (Greenwood et al., 2008) y ha favorecido el resurgimiento de la malaria en zonas de los trópicos y ciudades donde ya se había erradicado (Jamison, 2006). Además, con frecuencia el tratamiento no se realiza adecuadamente o se retrasa su administración desde la presentación de los síntomas (Smith et al.), lo cual puede ser fatal en los casos de malaria severa, que se producen sobre todo en niños. Por otro lado, también se ha acelerado el desarrollo de resistencia a insecticidas por parte de los vectores transmisores del parásito (Greenwood et al., 2008), lo que aumenta aún más las dificultades que existen para el control de la malaria. Figura 1.- Distribución global de la malaria: Incidencia de episodios clínicos de malaria a nivel mundial (por 1000 personas) en 2006 (WHO, 2008). Introducción 11 El agente etiológico causante de la malaria en mamíferos, reptiles y pájaros es un protozoo perteneciente al género Plasmodium que se transmite mediante vectores artrópodos de distintos géneros de dípteros, como Anopheles, Aedes y Culex (Hausmann, 2003). Estos parásitos pertenecen al Subphylum Apicomplexa y se caracterizan porque las fases que invaden a las células hospedadoras presentan el denominado complejo apical (un conjunto estructural subcelular de anillos, roptrias y micronemas implicados en la invasión) y una serie de gránulos densos que se vacían en la vacuola parasitófora donde se albergará el parásito (Hausmann, 2003). Aunque dentro del género Plasmodium existen más de cien especies, solamente cinco producen la enfermedad en humanos: P. vivax, P. malariae, P. ovale, P. falciparum y P. knowlesi. Esta última es la causante de la malaria en monos y ha sido recientemente descrita como la quinta especie responsable de producir casos de infección en humanos en el área del sureste asiático (Figtree et al.). Todas estas especies se transmiten al hombre por la picadura de mosquitos hembra del género Anopheles (Hoffman et al., 2002), aunque de forma ocasional se puede transmitir por transfusión sanguínea, transplante de órganos o congénitamente de la madre al feto. 2.2.- EL CICLO DE VIDA DE PLASMODIUM Los protozoos del género Plasmodium presentan un ciclo de vida complejo en el que adoptan distintos fenotipos parasitarios a lo largo de su desarrollo (Figura 2). Para que se complete este ciclo, Plasmodium necesita dos hospedadores: el mosquito, hospedador definitivo, en el cual se produce su reproducción sexual, a la par que es el vector de transmisión al mamífero, que actúa de hospedador intermediario y es donde tiene lugar la reproducción asexual del parásito. Esta fase del ciclo es la responsable de las manifestaciones clínicas de la enfermedad conocida como malaria o paludismo (Sleigh, 1979; Warrell, 2002). En mamíferos, la transmisión de los parásitos comienza por la picadura del mosquito infectado que inocula los esporozoítos (estadio invasivo con forma fusiforme) mayoritariamente en la dermis de su hospedador. Estos esporozoítos entran en el torrente sanguíneo, directamente o mediante la vía linfática. A su paso Introducción _   12 por el parénquima hepático cada esporozoíto invade a una célula hepática, donde se forma una vacuola parasitófora que alberga al parásito y lo separa del citoplasma de la célula hospedadora (Prudencio et al., 2006; Sleigh, 1979; Warrell, 2002). Allí, éste divide su núcleo miles de veces, formando una nueva forma celular parasitaria, el esquizonte, que contiene hasta 30.000 células hijas en su interior denominadas merozoítos (Good et al., 2005). El hepatocito infectado finalmente se lisa y libera los merosomas que contienen los merozoítos (Prudencio et al., 2006; Sturm et al., 2006). Esta fase, denominada ciclo exoeritrocítico o esquizogonia hepática, oscila entre 5 y 15 días dependiendo de la especie (Oaks, 1991; Warrell, 2002). En algunas especies, como es el caso de P. vivax y P. ovale, existen formas, denominadas hipnozoítos, que pueden permanecer latentes en el hígado durante largo tiempo antes de comenzar su desarrollo a nuevos estadios multiplicativos. Este fenómeno puede ocasionar una posterior recaída clínica (Daily & Waldron, 2003; Frevert & Nardin, 2005; Hausmann, 2003; Warrell, 2002). Una vez fuera del hepatocito, los merosomas se dirigen a los capilares pulmonares, donde en un periodo de 48-72 horas liberarán los merozoítos que contienen en su interior. Estas formas parasitarias invadirán definitivamente los glóbulos rojos del hospedador (Baer et al., 2007), donde comienza una nueva fase, denominada ciclo intraeritrocítico. El proceso de invasión del hematíe es extremadamente rápido (aproximadamente de unos 30 segundos) y transcurre mediante una serie de pasos sucesivos: (i) interacción del parásito con el eritrocito, (ii) reorientación de su extremo apical hacia la membrana del glóbulo rojo, (iii) formación de una unión estrecha entre parásito y eritrocito y (iv) entrada del merozoíto en el hematíe. Durante el proceso invasivo se forma nuevamente una vacuola parasitófora que aísla a Plasmodium del interior de la célula en la que se localiza (Silvie et al., 2008; Warrell, 2002). Una vez en el interior del eritrocito, el merozoíto comienza un proceso de multiplicación durante el cual se diferencia en distintos estadios según su estado nutricional. El proceso se inicia con una forma parasitaria joven, vacuolada, que recibe el nombre de anillo, y que crece hasta ocupar casi por completo el glóbulo rojo, originando así una nueva forma metabólicamente muy Introducción 13 activa, denominada trofozoíto, la cual ingiere el contenido citoplasmático del eritrocito a través del citostoma o microporo. Durante el estadio de trofozoíto se incrementa la maquinaria sintética de proteínas parasitarias que le permiten entrar en la fase de esquizogonia eritrocítica, en la cual los trofozoítos maduros dividen su núcleo originando formas más maduras, los esquizontes que contienen entre 6 y 32 nuevos merozoítos (Sleigh, 1979; Warrell, 2002; Winzeler, 2006). Figura 2.- Ciclo de vida de Plasmodium spp. en el hombre. A.-Ciclo exoeritrocítico. Un mosquito anofelino inocula los esporozoítos que se dirigen al hígado donde invaden las células hepáticas y producen su primera esquizogonia preeritrocítica. B.- Ciclo eritrocítico. La ruptura del esquizonte hepático libera los merozoítos al torrente sanguíneo donde invaden nuevos glóbulos rojos formándose un anillo que se transforma en trofozoíto. Posteriormente madura a esquizonte, cuya ruptura libera de nuevo merozoítos al torrente sanguíneo. Algunos merozoítos que invaden los eritrocitos pueden madurar a gametocitos que son ingeridos por el mosquito. C.-Ciclo esporogónico. Los gametocitos maduran a macrogametos y microgametos flagelados que, tras la fecundación, producen un ooquineto móvil que atraviesa la pared gástrica para formar un ooquiste que liberará miles de esporozoítos infectivos. (Rosenthal, 2008). Debido a que el desarrollo del esporozoíto sólo sucede a temperaturas superiores a 16ºC, la malaria se transmite sobre todo en las zonas templadas del planeta (Hausmann, 2003). Introducción _   14 La degradación de la hemoglobina, proteína mayoritaria del eritrocito, es una fuente nutricional esencial del parásito. Como resultado de este proceso catabólico se acumulan productos de desecho con carácter tóxico entre los que destaca el grupo hemo en forma de protoporfirina α. El parásito ha desarrollado una estrategia para defenderse de la acción de este metabolito altamente oxidante, así, en su citoplasma, lleva a cabo la polimerización de la hematina -producto de la degradación parcial de la hemoglobina- generando un compuesto inerte: el pigmento malárico o hemozoína, que permanece en la vacuola digestiva del mismo (Frosch et al., 2007; Warrell, 2002), evitando su toxicidad. La ruptura del eritrocito da lugar a que los merozoítos se liberen al torrente sanguíneo e invadan nuevos glóbulos rojos, donde se cierra y continúa el ciclo intraeritrocítico (Oaks, 1991). Aunque la mayoría de los merozoítos que invaden los eritrocitos desarrollan el ciclo asexual, una pequeña fracción puede diferenciarse en gametocitos, que son formas sexuales e infectivas para el mosquito vector. Así, tras la picadura del mosquito algunos de estos gametocitos serán capaces de iniciar la reproducción sexual en el aparato digestivo del mismo (Hausmann, 2003; Oaks, 1991; Warrell, 2002). El gametocito femenino abandona el eritrocito y se transforma en un macrogameto sin sufrir ninguna división, mientras que el microgametocito masculino sufre tres divisiones mitóticas y libera microgametos flagelados, que se mueven a través de la sangre ingerida en busca de un macrogameto. El desarrollo de estos gametos se ve favorecido debido a una disminución de la temperatura y a la presencia de ácido xanturénico en el estómago del mosquito. La fecundación, que se produce en el estómago del mosquito, genera un cigoto diploide, que habrá de sufrir un proceso de meiosis. Transcurridas entre 12 y 48 horas, el cigoto se transforma en un ooquineto que, tras atravesar las paredes del estómago, se localiza en la lámina basal y segrega una cubierta ooquística. Este ooquiste crece y experimenta una esporogonia que rinde un gran número de esporozoítos, por lo que a esta fase del ciclo en el interior del mosquito se la conoce como ciclo esporogónico. Cuando el ooquiste madura se va debilitando y desencadena la liberación de los esporozoítos entre la pared quística y la lámina Introducción 15 basal, por lo que la mayoría pasan al hemocele y se dirigen al interior de las glándulas salivales, desde donde se inyectarán a un nuevo hospedador vertebrado a través de una nueva picadura (Hausmann, 2003; Oaks, 1991; Sleigh, 1979; Warrell, 2002). 2.3.- MANIFESTACIONES CLÍNICAS DE LA MALARIA EN EL HOMBRE Los síntomas clínicos de la enfermedad se producen durante la fase intraeritrocítica del ciclo de Plasmodium y suelen manifestarse entre 10 y 35 días después de que el mosquito inyecte el parásito al ser humano. Por lo general, los primeros signos son fiebre leve e intermitente, dolor de cabeza y muscular y escalofríos acompañados con una sensación de malestar general. En otras ocasiones la malaria comienza su curso con escalofríos y temblores seguidos de fiebre más alta, dolor abdominal y tos, los cuales duran entre 2 y 3 días y con frecuencia se confunden con la sintomatología de la gripe común. Tras una semana de evolución infecciosa aparece el patrón clásico de fiebre paroxística periódica (a modo de ataques periódicos), momento en el que se sincroniza la esquizogonia hemática (López-Vélez, 2002). En el hombre, la duración del ciclo intraeritrocítico asexual varía dependiendo de la especie infectiva: 48-50 horas en P. vivax, P. ovale y P. falciparum y 72 horas en P. malariae, lo que resulta en la aparición de un patrón diferente de fiebres tercianas o cuartanas según los distintos tipos de malaria humana (Hausmann, 2003; Warrell, 2002). Estos ataques febriles periódicos se producen cuando los fragmentos y detritus celulares que resultan de la digestión celular del parásito se liberan a la circulación sanguínea durante la lisis de los eritrocitos (Figura 3) ya que inducen la liberación de citoquinas por parte del hospedador (Buffet et al.; Schumann, 2007). Los síntomas siguientes y los patrones que continúan caracterizando la enfermedad varían, para cada tipo de paludismo, en función de la especie infectiva de Plasmodium, la carga parasitaria y el estado inmune del paciente. De este modo, la sintomatología difiere desde la manifestación única de cuadros febriles leves (malaria no complicada) hasta la aparición de una malaria severa, que puede llegar a ser letal (Miller et al., 2002). Introducción _   16 Figura 3.-Relación entre los picos de fiebre del hospedador y el ciclo eritrocítico del parásito. Dibujo de Camilo Golgi que muestra la relación de las fiebres cuartanas (izquierda) y las tercianas (derecha) con el desarrollo del ciclo del parásito en los eritrocitos. El texto enfatiza la coincidencia entre el pico de fiebre con la multiplicación de los parásitos (Bentivoglio et al., 2010). La malaria no complicada en el hombre es típica de P. vivax, P. ovale y P. malariae. En algunas ocasiones, la infección crónica por P. malariae puede producir una glomerulopatía y la malaria por P. vivax puede ocasionar fiebre aguda y anemia (Schofield & Grau, 2005). Sin embargo, normalmente, y si un individuo no recibe tratamiento, los síntomas del paludismo causado por cualquiera de estas tres especies remiten espontáneamente en 10 a 30 días, pero pueden recurrir con intervalos variables. La mayoría de los casos de malaria severa y de las muertes se producen debido al paludismo ocasionado por Plasmodium falciparum (Schofield & Grau, 2005), que es la especie responsable de la forma más grave de malaria humana (Baird, 2005). La malaria grave es un trastorno multisistémico que afecta a varios tejidos y órganos, aunque sus manifestaciones clínicas más marcadas implican generalmente un solo órgano, como es el caso del cerebro en la malaria cerebral- (Miller et al., 2002). Ésta es una de las complicaciones más letales de la enfermedad que cursa con diversas ateraciones neurológicas y principalmente afecta a niños, mujeres embarazadas y turistas que visitan zonas de alto riesgo. Además de estos daños neurológicos, Plasmodium falciparum puede producir otras complicaciones como anemia severa, insuficiencia respiratoria, edema pulmonar, colapso circulatorio, acidosis con hiperlactacidemia, fallo renal, ictericia y malaria placentaria (López-Vélez, 2002; Schofield & Grau, 2005) (Figura 4). Introducción 17 La anemia severa se produce cuando hay una destrucción masiva de los eritrocitos infectados generados en cada invasión (Schofield & Grau, 2005). En algunos de estos casos se produce la fiebre hemoglobinúrica, donde la rotura de un gran número de glóbulos rojos libera gran cantidad de hemoglobina en el flujo sanguíneo, que luego es excretada con la orina y provoca la aparición de un color oscuro en la misma. Este tipo de estado febril ocurre casi exclusivamente en los enfermos con malaria crónica por Plasmodium falciparum, especialmente aquellos que han sido tratados con quinina (Bruneel et al., 2002). La gravedad de los síntomas de la enfermedad está determinada por varios factores asociados al hospedador: edad, sistema inmune, coinfecciones con otros organismos, estado nutricional, sexo y frecuencia de transmisión (Idro et al., 2005; Schofield & Grau, 2005; van der Heyde et al., 2006). También están implicados una serie de procesos relacionados con el parásito como son la liberación de productos y toxinas que originan y modulan los procesos patogénicos. Entre ellos, y de forma significativa, la formación de hemozoína (Schofield & Grau, 2005), que además de participar en el desarrollo de los procesos febriles del hospedador (Schumann, 2007), debilita su respuesta inmune al inhibir la interacción entre células dendríticas y células T (Millington et al., 2007). Otros factores relacionados con el parásito que aparecen implicados en la severidad de la malaria son su velocidad de multiplicación en los glóbulos rojos infectados, la destrucción tanto de eritrocitos infectados como no infectados, la marcada reducción de la deformabilidad de los glóbulos rojos no infectados y la unión de los eritrocitos parasitados al endotelio vascular (citoadherencia) o a glóbulos rojos no infectados (formación de rosetas) (Chen et al., 2000; Miller et al., 2002; Schofield & Grau, 2005). Estas uniones pueden producir la acumulación de hematíes en la microvasculatura capilar y bloquear el flujo sanguíneo, limitando así la suplementación de oxígeno local (Chen et al., 2000). De esta forma, los parásitos pueden localizarse en varios órganos incluyendo el corazón, los pulmones, el cerebro, el hígado, los riñones, tejidos subcutáneos y la placenta. La acumulación de parásitos en cerebro y placenta juega un papel importante en el desencadenamiento de la malaria cerebral y placentaria, respectivamente (Figura 4) (Miller et al., 2002). Introducción _   18 Figura 4.-Principales complicaciones producidas por el ciclo eritrocítico de P. falciparum en el hombre. Durante el ciclo eritrocítico, P. falciparum puede secuestrarse en los capilares del cerebro y de la placenta. Además, la masiva destrucción de los glóbulos rojos puede producir anemia severa. Otras complicaciones incluyen la acidosis metabólica, la hiperlactacidemia, el colapso circulatorio, el fallo renal y el edema pulmonar (López-Vélez, 2002; Schofield & Grau, 2005).GRIs: glóbulos rojos infectados. Por último, destacar que en el progreso de la malaria, la respuesta inmune del hospedador también juega un papel muy importante, a través de la producción sistémica o local de citoquinas y quimioquinas y la activación, secuestro e infiltración de las células inflamatorias (Chen et al., 2000; Miller et al., 2002; Schofield & Grau, 2005; van der Heyde et al., 2006). Introducción 19 2.4.- MALARIA CEREBRAL La malaria cerebral es una de las encefalopatías más comunes que existen a nivel mundial y la enfermedad parasitaria más importante del sistema nervioso central (Bentivoglio et al., 2010). Se trata de la mayor complicación de la infección producida por Plasmodium falciparum, responsable de un 80% de todas las muertes causadas por malaria, sobre todo en los que afectan a niños de dos a seis años del África subsahariana y adultos del sudeste asiático, aunque los rasgos clínicos en niños y en adultos son diferentes (Armah et al., 2007; Hunt et al., 2006; Idro et al., 2010b; Lou et al., 2001). La enfermedad se desarrolla preferentemente en aquellos pacientes que no han adquirido un grado suficiente de inmunidad protectora (Gitau & Newton, 2005). Aunque la malaria cerebral puede ser fatal en un 15-30% de los casos que la padecen, es potencialmente reversible (Bentivoglio et al., 2010). Generalmente, los pacientes que sobreviven a esta infección sufren una recuperación completa, restableciendo la consciencia tras 2-3 días de tratamiento antimalárico, aunque se ha observado que en muchos de ellos persisten secuelas neurológicas a largo plazo, particularmente en el caso de niños africanos (Bentivoglio et al., 2010; Idro et al., 2005; Idro et al., 2010a; Idro et al., 2010b). 2.4.1.- Clínica y secuelas La malaria cerebral cursa con síntomas que varían desde la confusión y aletargamiento hasta la obnubilación y el coma profundo. Esta variabilidad individual refleja que, a pesar de utilizar criterios clínicos estandarizados para su diagnóstico, la malaria cerebral es un síndrome clínico heterogéneo (Medana & Turner, 2006). Las manifestaciones neurológicas más características asociadas a la malaria cerebral incluyen irritabilidad, agitación psicomotora y signos de disfunción del tallo cerebral como son cambios en la postura, anormalidades motoras del tono y de los reflejos, rigidez, patrones respiratorios afectados, cambios de la pupila y de los movimientos oculares. Así, en los pacientes febriles e inconscientes es común Introducción _   20 encontrar mirada divergente, pupilas reactivas, hemorragias retinianas y reflejos oculocefálicos (Combes et al., 2010; Idro et al., 2005; Idro et al., 2010b; Lackner et al., 2006; Mishra & Newton, 2009; Newton et al., 2000). También son síntomas particulares la hiperventilación, fallo cardíaco y respiratorio, convulsiones, pérdida de la consciencia y coma (Combes et al., 2010; Lackner et al., 2006; Newton et al., 2000). Otro rasgo de la malaria cerebral es la aparición de acidosis metabólica causada por la insuficiencia renal aguda, por la acidosis láctica o por ambas. Por último existen otras alteraciones como son hipoglucemia, anemia, ictericia, acidosis respiratoria y edema pulmonar, que también están presentes en individuos que sufren malaria cerebral (Mishra & Newton, 2009; Zapata-Zapata & Blair-Trujillo, 2003). Por otra parte, también se ha visto que la sintomatología clínica de la malaria cerebral cursa con diferencias entre adultos y niños. Mientras que los niños desarrollan el estado de coma rápidamente tras la aparición de las primeras convulsiones, en adultos la adquisición del estado comatoso es más gradual y suele estar precedido de desorientación, delirio y agitación. Por otro lado, la presencia de convulsiones, estados epilépticos, alteraciones de la retina, fallos del tallo cerebral, presión intracraneal elevada, inflamación cerebral, deshidratación, dificultad respiratoria, cambios electrolíticos y complicaciones como anemia severa, acidosis metabólica, hiperlactemia, hiponatremia e hipoglucemia son más frecuente en niños. En adultos, la malaria cerebral suele estar acompañada de hemorragias, ictericia, edema pulmonar, fallo renal, acidosis láctica y hemoglobinuria (Idro et al., 2005; Idro et al., 2010a; Idro et al., 2010b; Newton et al., 2000; Patankar et al., 2002; Zapata-Zapata & Blair-Trujillo, 2003). Aunque, en una parte importante de los casos que la padecen, esta patología produce la muerte, especialmente si no se trata a tiempo, existen individuos que se recuperan completamente de la infección. No obstante, una proporción significativa de supervivientes (más del 10%) presentan complicaciones neurológicas permanentes (Idro et al., 2010a; Idro et al., 2010b). Los daños cognitivos a largo plazo son frecuentes en niños y se han reportado en uno de cada cuatro casos infantiles que sobreviven a la malaria cerebral (John et al., 2008). De hecho, esta infección podría ser la mayor causa de daños cognitivos en niños del África subsahariana Introducción 21 (Boivin et al., 2007). En adultos, las deficiencias se presentan en un menor número de casos (menos del 5%) y son menos graves (Gitau & Newton, 2005), estando asociadas principalmente a cambios de personalidad, depresión y ansiedad (Idro et al., 2005). Los daños neurológicos que aparecen en niños incluyen déficits en las áreas de la memoria, atención y desórdenes del lenguaje, problemas de comportamiento, daños en la vista, audición y tacto, pero también epilepsia y disfunciones motoras, como ataxia y parálisis (Bangirana et al., 2006; Boivin et al., 2007; Holding & Snow, 2001; Idro et al., 2010a; Idro et al., 2010b; John et al., 2008). Los niños que han sufrido coma profundo desarrollan los déficits cognitivos más severos (Bangirana et al., 2006). En algunos de los casos estas secuelas pueden llegar a ser fatales en unos pocos meses tras superar la enfermedad, incluyendo quadriparesis y estados vegetativos (Carter et al., 2005; John et al., 2008). Otras veces pueden ser transitorias en un corto periodo de tiempo (por ejemplo, la ataxia), mejorar rápidamente con el transcurso de los meses (por ejemplo, la ceguera cortical) o pueden persistir durante períodos de tiempo más prolongados (por ejemplo, la hemiparesis) (Mishra & Newton, 2009). Los daños neurológicos pueden presentarse ya durante la fase de recuperación, pero también pueden desarrollarse más tarde (John et al., 2008). Muchas veces las secuelas menos graves van haciéndose más aparentes según el niño avanza en edad y, de hecho, el daño cognitivo parece agravarse en el tiempo (Carter et al., 2005; John et al., 2008). Estos niños sufren dificultades en un entorno educacional sin un soporte específico, como ocurre en las zonas rurales de África. Además, se ha visto que presentan reducidas oportunidades futuras de encontrar un empleo o formar una familia (Carter et al., 2005). Es importante considerar que la mayoría de los pacientes con malaria cerebral, al ser niños menores de cinco años, se encuentran en proceso de maduración de este órgano. Por ello, alteraciones como las producidas en el lenguaje, función que puede estar ya establecida en el momento de la adquisición de la enfermedad, podrían atribuirse a lesiones ocurridas en localizaciones cerebrales específicas, mientras que otras disfunciones cognitivas asociadas con aspectos que todavía estaban por aprender, podrían ser consecuencia de un desarrollo subóptimo de la maduración del órgano (Holding & Snow, 2001). La observación clínica de Introducción _   22 patrones distintos en las secuelas producidas, podría ser debida a la extensión del daño o a una distinta afectación en zonas específicas del cerebro (Idro et al., 2010a). La Figura 5 muestra la localización de diversas regiones cerebrales en un corte sagital de cerebro humano. Figura 5.- Corte medial-sagital de un encéfalo humano. De hecho, exámenes histológicos realizados, tanto de muestras de cerebro post-mortem de pacientes como en cerebros de ratones afectados por malaria cerebral, han revelado que la afectación de esta enfermedad difiere según las zonas del cerebro. La Tabla 1 recoge las principales funciones de diversas áreas que podrían estar implicadas en las alteraciones de la malaria cerebral, así como las lesiones observadas durante el desarrollo de la misma. Es importante tener en cuenta que todas estas regiones, a excepción de unas pequeñas estructuras especializadas localizadas en el tallo, hipófisis y otras zonas del cerebro, están protegidas por la barrera hematoencefálica (Kandel et al., 2001), la cual separa la sangre del fluido intersticial del sistema nervioso central (Abbott et al., 2006). La barrera hematoencefálica está formada por células endoteliales adheridas mediante uniones estrechas, junto con la membrana basal y células perivasculares como pericitos, astrocitos, microglía y monocitos perivasculares, que limitan la difusión pasiva a través de las paredes vasculares (Abbott et al., 2006; Kandel et al., Introducción 23 2001; Medana & Turner, 2006; Zapata-Zapata & Blair-Trujillo, 2003). Se ha visto que la estructura de la barrera hematoencefálica también está alterada durante el progreso de la enfermedad (Medana & Turner, 2006). Tabla 1.-Regiones cerebrales posiblemente implicadas en el daño durante la malaria cerebral REGIÓN FUNCIÓN a ALTERACIONES EN LA MALARIA CEREBRAL b Córtex Pensamiento, memoria, aprendizaje, lenguaje y atención Lesiones con hemorragias o infartos no hemorrágicos Hipocampo Memoria, navegación espacial Daño en niños y pacientes recuperados que podría estar relacionado con trastornos en la memoria y convulsiones Bulbo olfativo Procesamiento de olores Alteraciones histopatológicas y hemorragias Tálamo Coordinación de las señales sensoriales y motoras Cambios isquémicos e hipoatenuación Hipotálamo Control de los reflejos y homeostasis No se ha relacionado de forma específica. Alteraciones en la hipófisis, con la que mantiene conexiones Tallo Respiración, presión arterial, equilibrio y postura Inflamación y alteraciones en niños Cerebelo Movimientos complejos, postura, orientación espacial y algunas funciones cognitivas Hemorragias, infartos no hemorrágicos, cambios isquémicos, desmielinización. Hipoatenuación relacionada con peor pronóstico a Tomado y adaptado de (Cunha et al., 2010; Guyton, 1994; Purves et al., 2001; Randall, 1999; Rhoades, 2003; Tórtora, 2002). b Alteraciones descritas en pacientes o modelos experimentales murinos de malaria cerebral. Tomado y adaptado de (Grote et al., 1997; Idro et al., 2005; Lackner et al., 2006; Patankar et al., 2002; Penet et al., 2005; Wiese et al., 2006). 2.4.2.- Patogénesis de la malaria cerebral Aunque la patogénesis de la malaria cerebral no se conoce completamente, la presencia de parásitos en el cerebro y la respuesta del sistema inmune del hospedador adquieren especial relevancia. Muchos autores sugieren que en esta forma complicada de la enfermedad existe una combinación de ambos mecanismos, así como la influencia de otros concomitantes (Combes et al., 2006; de Souza & Riley, 2002; van der Heyde et al., 2006), entre los que se incluyen alteraciones en los sistemas de neuroprotección (Delahaye et al., 2007) y el estrés oxidativo (Pino et al., 2005; Pino et al., 2003a; Postma et al., 1996; Wiese et al., 2006). Introducción _   24 2.4.2.1.- Secuestro de glóbulos rojos infectados El secuestro de formas maduras del parásito en la microvasculatura cerebral se ha postulado como una de las causas principales de esta forma severa de malaria (White & Ho, 1992). Estos datos se evidencian por la ausencia de trofozoítos maduros y esquizontes en los frotis de sangre periférica realizados en pacientes con malaria causada por P.faciparum (Miller et al., 2002) lo cual sugiere su acúmulo en otros órganos. Además, los estudios histopatológicos llevados a cabo en muestras obtenidas a partir de biopsias de pacientes con malaria cerebral (adultos o niños), ponen de manifiesto la presencia de los glóbulos rojos infectados por el parásito en la microvasculatura del cerebro (Idro et al., 2005). Aunque son diversos los estudios que indican que hay un mayor secuestro vascular en los casos de malaria con complicaciones cerebrales que en pacientes con malaria no cerebral (Pongponratn et al., 2003), existen también algunos que no observan tales diferencias (Franke-Fayard et al., 2005; Medana et al., 2001), por lo que el papel del secuestro eritrocitario es aun materia de debate (Pongponratn et al., 2003). Ya en 1887 Marchiafava y Celli proporcionaban la primera ilustración de la presencia de eritrocitos parasitados en los vasos sanguíneos del cerebro (Marchiafava & Celli, 1887) (Figura 6) y en 1894, se formulaba la primera hipótesis de secuestro de los glóbulos rojos parasitados, en la que se afirmaba que los eritrocitos infectados se unen a las vénulas postcapilares (Marchiafava & Bignami, 1894). Este fenómeno provocaría así una obstrucción considerable en el flujo sanguíneo, disminuyendo la perfusión de los tejidos y la eliminación de productos de desecho (van der Heyde et al., 2006), lo que ocasionaría la aparición de hemorragias (Idro et al., 2005; Schofield & Grau, 2005). Además, podría producir efectos adversos en el endotelio, disrupción de la barrera hematoencefálica, daño neuronal, diversas alteraciones metabólicas y liberación de mediadores inflamatorios deletéreos (Franke-Fayard et al., 2010; Idro et al., 2005; Medana & Turner, 2006; Medana & Turner, 2007; Pino et al., 2005; Rowe et al., 2009). También se ha visto que la obstrucción microvascular está asociada al riesgo de padecer secuelas neurológicas tras sufrir malaria cerebral (Holding & Snow, 2001). Introducción 25 Figura 6.- Secuestro de glóbulos rojos en los capilares sanguíneos. Dibujo del estudio pionero de Marchiafava y Celli en 1887 mostrando parásitos causantes de la malaria en los capilares del cerebro en casos de malaria. Se pueden observar imágenes de replicación del parásito, ilustraciones del pigmento malárico y alteraciones de los eritrocitos (Marchiafava & Celli, 1887). La razón última por la que los parásitos se secuestran en los capilares sanguíneos se desconoce por el momento, aunque se cree que esta circunstancia proporcionaría a los parásitos un medio más adecuado para su desarrollo debido al relativo grado de hipoxia a la vez que prevendría su aclaramiento y eliminación en el bazo (Brian de Souza et al., 2009; Chen et al., 2000; Newton et al., 2000). Tampoco se conoce si la aparición de los parásitos en el cerebro tiene lugar antes o después de la inducción del coma (Clark et al., 2006), aunque la hipótesis más aceptada es que su presencia allí sea una de las causas que lo desencadenen (Chen et al., 2000). Sin embargo, aunque el secuestro parasitario parece necesario para que se produzca la complicación cerebral, no resulta ser suficiente para su desarrollo (Combes et al., 2006; Schofield & Grau, 2005). Actualmente existen varias hipótesis complementarias que tratan de explicar cómo se produce el secuestro parasitario en los tejidos endoteliales. Se ha visto que las propiedades de los glóbulos rojos infectados cambian, y especialmente su membrana que se hace menos flexible, lo que dificulta su paso a través de la microvasculatura y produce la obstrucción de los capilares (van der Heyde et al., 2006). También se ha visto que los eritrocitos infectados tienen capacidad de autoaglutinarse (Idro et al., 2005; Idro et al., 2010b; Mishra & Newton, 2009) y que proteínas adhesivas del parásito exportadas a la membrana de la célula hospedadora permiten que los eritrocitos parasitados interaccionen con múltiples Introducción _   26 receptores humanos (Schofield & Grau, 2005). Pero además, los eritrocitos no parasitados también pueden perder flexibilidad debido al estrés oxidativo producido durante la infección (van der Heyde et al., 2006). Distintas variantes de la proteína PfEMP-1 (del inglés, “erythrocyte membane protein 1” de P.falciparum), codificada por la familia de genes var del parásito y asociada a diferentes fenotipos adhesivos (Idro et al., 2005), son responsables de algunas propiedades de adherencia de los glóbulos rojos infectados. Aunque cada hematíe parasitado parece expresar sólo una variante de esta proteína al mismo tiempo, en cada nueva reproducción asexual se puede producir un reordenamiento en el gen responsable de su síntesis, dando lugar a un nuevo fenotipo adhesivo diferente. Además, existen otras variantes antigénicas derivadas del parásito expuestas en la membrana de los eritrocitos infectados que potencialmente podrían estar implicadas en la adhesión, como las proteínas RIFINs y STREVORs, aunque, por el momento se desconocen sus funciones (Chakravorty et al., 2008; Rowe et al., 2009). Estas moléculas cambian significativamente la naturaleza de los glóbulos rojos. El cambio ultraestructural más prominente es la aparición de unas protrusiones denominadas “knobs”, compuestas por varios polipéptidos, entre ellos la proteína PfEMP1 (Fujioka & Aikawa, 1996; Luse & Miller, 1971). Estos “knobs” parecen ser sitios donde los eritrocitos infectados se unen a otras superficies celulares, como otros glóbulos rojos no infectados y células endoteliales (Aikawa, 1988; Aley et al., 1984; MacPherson et al., 1985). Sin embargo, la presencia de “knobs” no es absolutamente esencial para el secuestro de hematíes infectados. Células rojas que no presentan “knobs” pueden ser también muy adhesivas y expresar PfEMP-1 así como otras proteínas del parásito que se exportan a su superficie, mediando su unión a diversos receptores (Chen et al., 1998; Fernandez et al., 1998). Hasta la fecha se han descrito tres mecanismos de adhesión de glóbulos rojos infectados (Figura 7): (i) agregación mediada por plaquetas, (ii) adhesión a eritrocitos no infectados, con la consecuente formación de rosetas y (iii) citoadherencia a las células endoteliales (Pain et al., 2001; Udeinya et al., 1981; Introducción 27 Udomsangpetch et al., 1989). Sin embargo, todavía no se ha resuelto qué proporción de parásitos acumulados en el cerebro está asociada con la inducción de las moléculas de adhesión mediante interacciones clásicas ligando-receptor y qué proporción está asociada a la deposición no específica de plaquetas activadas (Schofield & Grau, 2005). (i) Adhesión mediada por plaquetas: las moléculas de adhesión presentes en los glóbulos rojos infectados pueden interaccionar con receptores plaquetarios que servirían como "puentes" entre los distintos eritrocitos infectados, favoreciendo así su agregación. Se han descrito tres receptores implicados en estas uniones: CD36, el receptor globular C1q y la P-selectina (del inglés, "platelet selectin"). Este fenómeno de agregación inducido por plaquetas se ha observado in vitro, pero podría contribuir a la obstrucción microvascular que aparece in vivo. Además, las plaquetas también podrían favorecer la citoadherencia actuando como nuevos "puentes" entre las células endoteliales y los glóbulos rojos infectados, contribuyendo al secuestro incluso en lechos endoteliales que no expresen los receptores adecuados para la interacción directa con los hematíes infectados (Rowe et al., 2009). (ii) Formación de rosetas: los glóbulos rojos infectados también pueden unirse a otros no infectados formando agregados denominados rosetas, lo que causaría una mayor resistencia al flujo microvascular (Pongponratn et al., 2003). La capacidad de formación de rosetas difiere según los aislados clínicos de Plasmodium y se asocia frecuentemente con la gravedad de la malaria en pacientes africanos (Pain et al., 2001). Así, se ha visto que la formación de rosetas en sangre infectada con parásitos procedentes de pacientes afectados por malaria cerebral es mucho mayor que aquellos aislados obtenidos a partir de casos de malaria no complicada (Carlson et al., 1990). Además, la agregación de eritrocitos en rosetas está íntimamente relacionada con el fenómeno de citoadherencia, ya que algunos de los receptores implicados en la formación de las mismas también se expresan en las células endoteliales pudiendo presentar un papel dual en ambos mecanismos (Vogt et al., 2003). Por el momento, se han identificado cuatro tipos de receptores en célula roja con capacidad de unirse a ligandos del parásito: el receptor del complemento 1, glicosaminoglicanos de heparán-sulfato, el receptor CD36 y los grupos antigénicos sanguíneos A y B (Handunnetti et al., 1992). Introducción _   28 Figura 7.- Mecanismos implicados en el secuestro de glóbulos rojos parasitados (Rowe et al., 2009). (iii) Citoadherencia a las células endoteliales: se ha visto que los glóbulos rojos infectados tienen el potencial de unirse a una gran diversidad de receptores del endotelio, como el CD36. Sin embargo, el papel que juega este receptor en la patogénesis de la malaria severa presenta controversia (Serghides et al., 2003) y se considera que es difícil que medie en el secuestro a nivel cerebral ya que sus niveles de expresión son bajos en este órgano y no se induce durante la infección malárica (Brian de Souza et al., 2009). La molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1, del inglés, “intercellular adhesion molecule-1”) es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas que se expresa en células endoteliales y leucocitos y se ha propuesto como principal Introducción 29 mediadora del secuestro de eritrocitos parasitados en el cerebro del hospedador (Armah et al., 2005; Brian de Souza et al., 2009; Rowe et al., 2009). Estudios inmunohistoquímicos han revelado que los glóbulos rojos parasitados y los receptores ICAM-1 colocalizan en los cerebros de pacientes que mueren de malaria cerebral y se ha demostrado su inducción en este órgano durante el desarrollo de esta patología (Idro et al., 2005; Turner et al., 1994). Además, aislados clínicos obtenidos de pacientes que sufren malaria cerebral presentan una mayor preferencia por la adhesión in vitro a la molécula ICAM-1 (Chakravorty et al., 2008), a la par que hay polimorfismos en el gen que codifica este receptor capaces de modificar su capacidad de unir eritrocitos infectados, y que se asocian con la susceptibilidad a la malaria cerebral sufrida por niños de Kenia (Fernandez-Reyes et al., 1997). Por otro lado, modelos murinos de malaria experimental han puesto de manifiesto el importante papel de ICAM-1 en el desarrollo de esta patología, ya que ratones deficientes en dicho receptor no desarrollan esta complicación cerebral (Brian de Souza et al., 2009; Combes et al., 2010). Sin embargo, hay otros estudios que proponen que esta molécula de adhesión únicamente interviene en la primera interacción con los glóbulos rojos infectados y que su unión estable ocurre en sinergismo con otros receptores, es más, algunos autores no observan diferencias en cuanto a la unión glóbulo rojo infectado-receptor entre pacientes con malaria leve y severa (Craig et al., 1997; McCormick et al., 1997; Newbold et al., 1997). Además de ICAM-1, se han propuesto otras moléculas receptoras como mediadoras del secuestro de eritrocitos parasitados en el cerebro. Durante la patogénesis de la malaria cerebral se ha visto la inducción de receptores como la molécula de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1, del inglés “vascular cell adhesion molecule-1”), la E-selectina (del inglés, “endothelial selectin”) y la P- selectina (Armah et al., 2005; Brian de Souza et al., 2009; Pongponratn et al., 2003; Turner et al., 1994). La proteína de adhesión VCAM-1 es otro miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas que se expresa en el endotelio activado por citoquinas. Se ha demostrado la unión de células parasitadas a este receptor, aunque en aislados clínicos africanos es débil y no parece estar asociada a la aparición de malaria severa (Newbold et al., 1997). Introducción _   30 La molécula de adhesión P-selectina es una glicoproteína que se expresa en plaquetas activadas y en células endoteliales, siendo fundamental para el tráfico de leucocitos. Por un lado, se ha visto su capacidad de adhesión en aislados clínicos procedentes de Asia (Ho et al., 1998) y además parece ser una molécula fundamental para el desarrollo de la malaria cerebral ya que ratones deficientes en ella están protegidos (Weiser et al., 2007). La proteína E-selectina es otra glicoproteína que se expresa en células endoteliales en aquellos lugares donde aparece inflamación. Su papel en el proceso de citoadherencia también presenta controversia, ya que, mientras algunos trabajos demuestran que parásitos procedentes de cepas de laboratorio se adhieren a esta molécula, muchos aislados clínicos no producen esta unión o se unen débilmente (Newbold et al., 1997; Ockenhouse et al., 1992; Sherman et al., 2003). Aunque todavía no existe un consenso en el papel que juegan los cuatro receptores anteriormente descritos en la patogénesis de la malaria cerebral (Brian de Souza et al., 2009), estas moléculas parecen ayudar a los glóbulos rojos a adherirse a los vasos sanguíneos (Armah et al., 2005; Pino et al., 2005). El fracaso en encontrar un único receptor crítico, que medie el secuestro de los eritrocitos infectados en el cerebro durante la malaria cerebral, puede indicar que existen uniones redundantes por el parásito a distintos receptores. Esto sustenta la hipótesis que apoya que el fenómeno de citoadherencia implica múltiples pasos (Brian de Souza et al., 2009). Recientemente se ha visto que la molécula de adhesión neural (NCAM, del inglés, "neural cell adhesion molecule") tiene capacidad de adhesión in vitro a los glóbulos rojos infectados (Pouvelle et al., 2007). Por tanto, este receptor localizado en neuronas, glía, astrocitos y células endoteliales microvasculares (Gingras et al., 1995; Murphy et al., 2007) podría también estar implicado en el fenómeno de citoadherencia. Sin embargo, hasta la fecha no se conocen estudios in vivo de su posible implicación en la malaria cerebral. Introducción 31 2.4.2.2.-Respuesta inmune del hospedador: neuroinflamación La hipótesis inflamatoria, propuesta por primera vez por Maegraith en 1948, defiende que en la malaria complicada, el daño multiorgánico y la muerte se producen por una respuesta inflamatoria sistémica del hospedador (Maegraith, 1948). Años después se postuló la hipótesis de que la elevada producción de citoquinas pro-inflamatorias era la responsable del coma (Clark et al., 1992b). Otros estudios más recientes ponen de manifiesto la relevancia de sucesos inflamatorios intravasculares como mediadores esenciales de la patología (Bentivoglio et al., 2010). Sin embargo, la inflamación por sí sola tampoco podría explicar todo el proceso patogénico observado (van der Heyde et al., 2006). El concepto de que una respuesta inmune proinflamatoria excesiva predispone hacia el desarrollo de la malaria cerebral es consistente con la idea de que la susceptibilidad a la misma en las zonas endémicas de malaria está ciertamente relacionada con la edad. Así, los niños menores de 6 meses que aun tienen que adquirir una respuesta inmune específica son relativamente resistentes frente esta patología; sin embargo, en niños un poco más mayores (6 meses a 5 años) que han sufrido infecciones previas, prima una respuesta adaptativa que les hace más susceptibles de desarrollar malaria cerebral (Brian de Souza et al., 2009; Warrell, 1989). Existen moléculas del parásito (e. g. , el glicosil-fosfatidil-inositol) que actúan como toxinas pudiendo unirse a los receptores del sistema inmune innato del hospedador y desencadenar la liberación de citoquinas proinflamatorias como interleukina-1, interleukina-6, factor estimulador de colonias de macrófagos, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interferón gamma (IFN-γ) y linfotoxina-α (LT-α), así como la producción de superóxidos y óxido nítrico (Engwerda et al., 2002; van der Heyde et al., 2006). La superproducción de óxido nítrico parece tener un papel central en el desarrollo de la malaria cerebral ya que presenta funciones pleiotrópicas que afectan al secuestro, la inflamación y la homeostasis (van der Heyde et al., 2006). Además, puede ser también un efector crítico para la secreción de TNF-α durante la patogénesis de la misma (Idro et al., 2005). Introducción _   32 Las citoquinas, a su vez, pueden producir la alteración de la permeabilidad en la barrera hematoencefálica (Randall & Engwerda, 2010), suprimir la producción de eritrocitos en la médula ósea (Chen et al., 2000), ocasionar daño de la función neuronal, viabilidad y plasticidad del cerebro (Di Filippo et al., 2008), e incrementar la expresión de moléculas de adhesión en el endotelio, facilitando el secuestro de glóbulos rojos infectados (Chen et al., 2000; Schofield & Grau, 2005; van der Heyde et al., 2006) y la aparición de fiebre (Chen et al., 2000). La fiebre puede producir, a su vez, un incremento en la expresión de moléculas como PfEMP-1 en los eritrocitos infectados, lo que también favorecerá su secuestro (Brian de Souza et al., 2009; Combes et al., 2010). Sin embargo, hay autores que proponen que es el secuestro el agente desencadenante capaz de producir la activación endotelial y la producción de citoquinas (Armah et al., 2005; Franke-Fayard et al., 2005; Medana et al., 2001). Por otro lado, el daño tisular tras la liberación de citoquinas parece ser un factor de riesgo en el desarrollo de secuelas neurológicas (Holding & Snow, 2001). La malaria cerebral se asocia también con un fallo en la función de los macrófagos y a una respuesta inmune tipo TH-1, en la que, además de las citoquinas proinflamatorias IFN-γ y TNF-α, los linfocitos T colaboradores (CD4+), los linfocitos T citotóxicos (CD8+) y las células NK “natural killer” juegan el papel más importante (Bentivoglio et al., 2010; Combes et al., 2010; Hansen & Schofield, 2010). En la Figura 8 se resumen los principales mecanismos que se han postulado como implicados en el desarrollo de la malaria cerebral. Los individuos que desarrollan malaria cerebral presentan elevadas concentraciones de IFN-γ y TNF-α en plasma (Brian de Souza et al., 2009; Idro et al., 2005) y en órganos como el cerebro (Chen et al., 2000). Su neutralización previene del desarrollo de malaria cerebral en modelos de ratón susceptibles, por lo que sus niveles parecen jugar un papel crítico en la patogénesis de la malaria experimental murina (Brian de Souza et al., 2009). Sin embargo, estas citoquinas parecen tener un papel dual. Por un lado, son necesarias para que el hospedador pueda combatir los parásitos, pero por otro, su sobreproducción puede ser deletérea para el hospedador (Chen et al., 2000; de Souza & Riley, 2002; Vigario et al., 2007), ya que parece que estas citoquinas podrían alterar la transmisión sináptica (Beattie et al., 2002; Vikman et al., 2001). Algunos estudios proponen que IFN-γ puede tanto promover como Introducción 33 inhibir el desarrollo de la malaria cerebral, dependiendo de la interacción específica celular y el momento de la infección (Amante et al., 2007). Algo similar ocurre con TNF-α, donde polimorfismos en la región promotora del gen que la codifica se han asociado con un aumento del riesgo de padecer malaria cerebral y muerte (Idro et al., 2005), favoreciendo la ruptura de vasos sanguíneos y la aparición de hermorragias (Lou et al., 2001; Miller et al., 2002), además de la degeneración neuronal (Mishto et al., 2006). Por tanto, ambas citoquinas podrían tener efectos deletéreos tanto en la protección del cerebro como en la plasticidad sináptica (Di Filippo et al., 2008; Lisak et al., 2007). Figura 8.-Procesos neuroinflamatorios situados en la interfase entre el espacio intravascular y el sistema nervioso central. En la parte superior se muestra un esquema representativo de esta interfase, donde las células endoteliales del cerebro que forran los microvasos cerebrales constituyen la barrera hematoencefálica. En la inferior, aparece un esquema representativo de los principales factores implicados en el proceso inflamatorio durante la malaria cerebral (Francis et al., 2003; Randall & Engwerda, 2010). Introducción _   34 Estudios recientes proponen que la protección frente al desarrollo de malaria cerebral está más asociada al papel que juega LT-α que al de TNF-α, como se consideró inicialmente (Engwerda et al., 2002; Weiser et al., 2007). Así, mientras que ratones deficientes en LT-α e IFN-γ no adquieren síntomas cerebrales cuando se infectan con Plasmodium, los ratones deficientes solamente en TNF-α sucumben a la enfermedad (Parekh et al., 2006). Es más, el tratamiento con anticuerpos monoclonales frente a TNF-α de niños que padecen malaria cerebral no favorece su recuperación (Kwiatkowski et al., 1993). Sin embargo, aunque también se han observado elevados niveles LT-α en sueros de pacientes de malaria (Clark et al., 1992a), su papel en la malaria cerebral necesita confirmación (Combes et al., 2010). Por otro lado, se ha visto que estas citoquinas pueden tener capacidad de intercomunicarse y por tanto un potencial efecto sinérgico. Así, IFN-γ puede incrementar los niveles de TNF-α (Weiser et al., 2007) y tanto LT-α como TNF-α incrementar también los niveles de IFN-γ (Engwerda et al., 2002). Por último, se han descrito estas tres citoquinas proinflamatorias como principales mediadores de la inducción de algunas moléculas de adhesión como son ICAM-1, VCAM-1, P-selectina y E-selectina (Chen et al., 2000; Engwerda et al., 2002; Hunt & Grau, 2003; Lou et al., 2001; Weiser et al., 2007) las cuales parecen participar en el fenómeno de citoadherencia. TNF-α induce la expresión de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina y P-selectina (Chakravorty et al., 2008; Chen et al., 2000; Pino et al., 2005; Weiser et al., 2007), LT-α puede inducir ICAM-1 y VCAM-1 (Engwerda et al., 2002; Weiser et al., 2007) y IFN-γ lo hace con ICAM-1 (Chen et al., 2000). Además de estos efectos se ha descrito que existe uno sinérgico entre todas ellas (Weiser et al., 2007). Sin embargo, ya que no se ha encontrado una asociación clara entre la producción de estas citoquinas y los sitios de secuestro de parásitos (Idro et al., 2005; Mishra & Newton, 2009), también se ha propuesto que los glóbulos rojos parasitados puedan incrementar los niveles de moléculas de adhesión como ICAM-1, directamente (Chakravorty et al., 2008). Muchas de estas moléculas también están presentes en leucocitos, por lo que los parásitos igualmente podrían interaccionar con estas células y activar el sistema inmune del hospedador favoreciendo el aclaramiento de los mismos. Además, se sabe que tanto los leucocitos como las células NK “natural killer” expresan NCAM, Introducción 35 aunque su funcionalidad en la infección no se ha investigado aun (Rowe et al., 2009). Se debe también considerar que el incremento en la expresión de moléculas de adhesión en el endotelio puede facilitar el secuestro de leucocitos y plaquetas en la microvasculatura del mismo. Así, por ejemplo, ICAM-1 está implicada en el reclutamiento de leucocitos (Sherman et al., 2003) y la ausencia de esta molécula previene del secuestro de estas células en modelos murinos (Brian de Souza et al., 2009; Chakravorty et al., 2008), aunque este resultado contrasta con otros estudios que por el contrario sí observan una acumulación de leucocitos en ratones deficientes de esta molécula (Vigario et al., 2007). Sin embargo, el papel de la P- selectina en el desarrollo de la malaria cerebral no parece estar relacionado con el secuestro de leucocitos, ya que ratones carentes de esta proteína están protegidos de sufrir esta patología independientemente de su capacidad de adhesión (Weiser et al., 2007). De hecho, se ha visto que en tejido cerebral aparecen leucocitos, monocitos y fagocitos con pigmento malárico entremezclados con los glóbulos rojos (Pongponratn et al., 2003). Sin embargo, parece probable que a este nivel, haya diferencias sustanciales entre la malaria cerebral en adultos y niños con una acumulación de leucocitos intravasculares más pronunciada en niños (Schofield & Grau, 2005). La acumulación de estas células en los microcapilares puede influir tanto directa como indirectamente en el desarrollo de la patología a través de la producción de mediadores potencialmente deletéreos (Schofield & Grau, 2005; van der Heyde et al., 2006). A pesar de la gran cantidad de información que existe relativa a la neuroinflamación producida durante la malaria cerebral, por el momento no hay un consenso sobre la secuencia de eventos que se producen en su patogénesis. Por ejemplo, se desconoce si la inflamación cerebral precede o sigue al secuestro y si es la causa o la consecuencia de las lesiones que se producen (Brian de Souza et al., 2009; Combes et al., 2010). Tampoco se conoce la importancia de los sucesos localizados en el tejido cerebral frente a los sistémicos. Lo que sí parece más probado es que el incremento en la expresión de las moléculas de adhesión inducido por citoquinas es Introducción _   36 dependiente de tejido (van der Heyde et al., 2006) y que el microambiente específico de los tejidos donde se produce este aumento de citoquinas tiene un mayor impacto en el pronóstico de la enfermedad (Amante et al., 2007), siendo más importante la producción de éstas a nivel local que la que se ha encontrado en la circulación (Hunt & Grau, 2003; Schofield & Grau, 2005). Finalmente, parece ser que células específicas del cerebro, como son la microglia y astrocitos podrían también estar implicadas en el aumento de la secreción de citoquinas proinflamatorias en este órgano (de Souza & Riley, 2002). Los procesos neuroinflamatorios producidos durante la infección son capaces de aumentar también la expresión de las subunidades catalíticas del inmunoproteasoma (Gavilan et al., 2009; Konstantinova et al., 2008; Nguyen et al., 2010), que pueden sintetizarse en diversas regiones del cerebro y en distintos tipos celulares incluyendo neuronas, astrocitos, microglía y células endoteliales (Mishto et al., 2006; Stohwasser et al., 2000). Estas subunidades pueden desplazar a las correspondientes subunidades del proteasoma constitutivo (Figura 9), alterando así sus funciones. Mientras que el proteasoma constitutivo está principalmente implicado en el procesamiento de las proteínas mal plegadas, el inmunoproteasoma media la presentación antigénica durante la inflamación y no puede realizar el procesamiento rutinario de proteínas (Groettrup et al., 2010; Nguyen et al., 2010). La actividad del proteasoma se controla a nivel de la expresión e incorporación de las subunidades que conforman su centro catalítico, que está formado por cuatro anillos (Figura 9). Los anillos externos contienen las subunidades α (α1-α7), por donde entran los sustratos y se liberan los productos. Los anillos internos contienen las subunidades β (β1-β7), de las cuales β1, β2 y β5 contienen los sitios activos (Seifert & Kruger, 2008). En el cambio al inmunoproteasoma, estas subunidades están sustituidas por las correspondientes β1i (o LMP2), β2i (o MECL1) y β5i (o LMP7), (Kloetzel, 2004). Esta transformación podría inducir la acumulación de proteínas mal plegadas, pudiendo ocasionar daño en el funcionamiento neuronal y en la función sináptica, contribuyendo así a distintas alteraciones neurocognitivas (Gavilan et al., 2009; Nguyen et al., 2010). Introducción 37 Se ha visto que mediadores proinflamatorios como IFN-γ y TNF-α son capaces de inducir la expresión de las subunidades del inmunoproteasoma, probablemente a nivel local y dependiente de tejido (Gavilan et al., 2009; Groettrup et al., 2010; Kloetzel, 2004; Nguyen et al., 2010). Por tanto, se podría esperar un aumento de las mismas debido al incremento de estas dos citoquinas durante la malaria cerebral (Chen et al., 2000). Aunque se ha puesto de manifiesto la inducción del inmunoproteasoma en alteraciones del sistema nervioso central (Ferrer et al., 2004; Gavilan et al., 2009; Nguyen et al., 2010), sin embargo, por ahora no existen estudios que lo asocien a la patogénesis de la malaria cerebral. Figura 9.- Estructura del centro catalítico del proteasoma constitutivo y del inmunoproteasoma. Tres subunidades son responsables del cambio funcional que sufre el proteasoma constitutivo (Kloetzel, 2004). 2.4.2.3.-Alteraciones en la neuroprotección El balance entre las vías neuroprotectoras y neurotóxicas parece ser crítico en el desarrollo de la malaria cerebral (Delahaye et al., 2007; Idro et al., 2010b). La plasticidad sináptica, responsable de que el cerebro adapte su respuesta a la experiencia y al entorno (Lu, 2003), también parece estar implicada en su desarrollo, ya que en niños jóvenes se ha visto que tienen una mejor recuperación de la enfermedad debido a una mayor plasticidad neuronal (Holding & Snow, 2001). Así, diversos estudios llevados a cabo, tanto en muestras post-mortem como en modelos murinos de malaria cerebral, han permitido observar daños en distintas poblaciones celulares que conforman el sistema nervioso central, como son las Introducción _   38 células endoteliales, neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y microglía (Bentivoglio et al., 2010; Medana et al., 2007; Medana et al., 2001; Miu et al., 2008; Penet et al., 2005). Estudios con cerebros procedentes de pacientes afectados por esta enfermedad han puesto de manifiesto que células hemáticas extravasadas se entremezclan con todos estos tipos celulares (Pongponratn et al., 2003). Durante la malaria cerebral se ha observado que las células endoteliales pueden sufrir apoptosis (Miu et al., 2008). Además de la implicación en el secuestro y en la respuesta inmune del hospedador, la propia presencia del parásito parece jugar un papel importante en el daño producido durante la malaria cerebral. Así, estirpes de Plasmodium procedentes tanto de laboratorio como de aislados clínicos humanos han mostrado tener capacidad potencial de producir la muerte de células endoteliales (Pino et al., 2003b; Toure et al., 2008). De igual forma, existen proteínas del parásito que son capaces por sí mismas de producir la disrupción de la barrera hematoencefálica (Chakravorty et al., 2008). Además del daño en las células endoteliales, también se ha visto muerte de astrocitos durante la malaria cerebral (Miu et al., 2008). Los astrocitos son el tipo celular más numeroso en el sistema nervioso central con diversas propiedades que les permite contribuir al mantenimiento de la función cerebral normal. Estas células promueven la supervivencia de las neuronas, interaccionan con éstas determinando los procesos cognitivos y la memoria y se adhieren a las células del endotelio contribuyendo a la formación de la barrera hematoencefálica (Hunt et al., 2006). Algunos autores sugieren que durante la malaria cerebral se produce daño en los astrocitos (Figura 10) como consecuencia de la producción de factores citotóxicos por los leucocitos (Bentivoglio et al., 2010). En estudios llevados a cabo con muestras post-mortem de cerebros obtenidos a partir de individuos con malaria cerebral así como durante la malaria cerebral experimental murina, se ha demostrado que la microglía sufre un proceso de activación (Figura 10) (Bentivoglio et al., 2010; Medana & Turner, 2006). Esta activación se ha relacionado con disfunciones cognitivas observadas en la malaria cerebral murina (Brian de Souza et al., 2009), ya que la microglía contribuye a diferentes formas de plasticidad sináptica (Di Filippo et al., 2008). Introducción 39 Tanto en pacientes como en modelos murinos de malaria cerebral, se ha descrito daño y muerte neuronal (Idro et al., 2010a; Miu et al., 2008). Un estudio retrospectivo con niños kenianos ha puesto de manifiesto que existe una relación inversa entre el daño axonal y algunos parámetros indicativos de gravedad de la infección (Medana et al., 2007). Así, algunos autores sugieren que el daño neuronal puede ser un proceso clave en el desarrollo de la malaria cerebral (Rao et al., 2010). La activación de la microglía y la producción de citoquinas en el sistema nervioso central también produce daño en las neuronas que se manifiesta clínicamente como un daño cognitivo a largo plazo (John et al., 2008). Además, la ruptura de la barrera hematoencefálica podría exponer a neuronas perivasculares y otras poblaciones celulares, como astrocitos y microglía, a proteínas plasmáticas y distintos mediadores intercelulares, como citoquinas (Idro et al., 2005; Zapata-Zapata & Blair- Trujillo, 2003). Figura 10.- Alteraciones histopatológicas del sistema nervioso central producidas en la malaria cerebral. Durante la malaria cerebral se producen cambios en los astrocitos y especialmente en la microglía. La microglía se activa y las terminaciones de los astrocitos, que en condiciones normales contribuyen a la formación de la barrera hematoencefálica, tras la aparición de hemorragias, se ven alteradas. La barrera hematoencefálica puede verse afectada, favoreciéndose así un incremento de mediadores en la zona perivascular, que podría conducir a un daño neuronal (Bentivoglio et al., 2010; Idro et al., 2010b; John et al., 2008). Las neurotrofinas son una familia de factores de crecimiento del sistema nervioso central sintetizadas por las neuronas y otras células nerviosas (Ebadi et al., 1997) que participan en la supervivencia, proliferación y diferenciación celular en el cerebro, modulando así la plasticidad sináptica (Ebadi et al., 1997; Poo, 2001) y Introducción _   40 ejerciendo profundos efectos en el sistema nervioso, tanto en estados normales como patológicos. Las neurotrofinas están implicadas en la respuesta al daño que se produce por estrés oxidativo en el cerebro (Ebadi et al., 1997) y juegan un papel regulatorio importante en el desarrollo y función de la sinapsis. De esta manera, modulan la eficacia de la transmisión sináptica (Lu, 2003). El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, del inglés “brain-derived neurotrophic factor”) es una de las neurotrofinas más abundantes del mismo (Cunha et al., 2010). Se trata de una proteína homodimérica que es sintetizada y liberada por las neuronas, microglía activada, células endoteliales y leucocitos (Enstrom et al., 2008; Lessmann & Brigadski, 2009; Madri, 2009; Ruprecht et al., 2002). En las neuronas de regiones cerebrales con abundante expresión de BDNF, como son hipocampo y cerebelo, este marcador neurotrófico se transporta tanto hacia las fibras dendríticas como hacia los axones (Figura 11) (Lessmann & Brigadski, 2009). Figura 11.- Transporte del BDNF en las neuronas. El BDNF sintetizado en el núcleo se dirige hacia el Golgi y red trans Golgi para transportarse hacia los axones y dendritas a través de las vesículas secretoras (Lessmann & Brigadski, 2009). El BDNF actúa sobre neuronas, astrocitos y endotelio (Ebadi et al., 1997; Enstrom et al., 2008). Entre sus funciones está proteger a las neuronas (Enstrom et al., 2008) y promover su supervivencia, proliferación, crecimiento, y diferenciación. Además está implicado en la regeneración de axones y en la transmisión sináptica (Cunha et al., 2010; Greenberg et al., 2009; Muller et al., 2000; Santos et al., 2010; Introducción 41 Waterhouse & Xu, 2009; Winkelstein & Kras, 2010), regulando las propiedades de las neuronas (Enstrom et al., 2008). También promueve la supervivencia de otras tipos celulares como las endoteliales (Madri, 2009; Ruprecht et al., 2002). El BDNF ha emergido como un importante regulador de la plasticidad sináptica capaz de controlar funciones cognitivas como el aprendizaje y la memoria en el sistema nervioso central (Cunha et al., 2010; Greenberg et al., 2009; Muller et al., 2000; Zuccato & Cattaneo, 2009), mediante la activación de múltiples vías de señalización que actúan de manera concertada (Cunha et al., 2010; Santos et al., 2010). También se ha viso que protege al cerebro de la apoptosis que se produce como resultado de la inflamación (Enstrom et al., 2008). Por tanto, en condiciones de daño cerebral, como es la interrupción del flujo sanguíneo, se promueve la activación de proteínas de plasticidad como el BDNF para inducir una recuperación funcional del órgano (Nagy et al., 2002). Por ello, se ha sugerido que cambios en el nivel o distribución del BDNF pueden ser cruciales en la patogénesis de diversas enfermedades neurodegenerativas en humanos (Zuccato & Cattaneo, 2009). Hasta la fecha, se han puesto de manifiesto variaciones en la expresión de este marcador en enfermedades como Alzheimer y Parkinson (Zuccato & Cattaneo, 2009), sin embargo su expresión durante la patogénesis de la malaria cerebral no se ha estudiado todavía. El BDNF puede interaccionar con la NCAM para mediar la supervivencia neuronal y la plasticidad sináptica (Kiss et al., 2001; Murphy et al., 2007; Vutskits et al., 2001). La NCAM forma parte de una familia de glicoproteínas de superficie celular y juega un papel importante en el desarrollo normal del cerebro (Aisa et al., 2010). Se localiza en neuronas, glía, astrocitos, células endoteliales y células sensoriales (Gingras et al., 1995; Muller et al., 2000; Murphy et al., 2007), y se le atribuyen funciones en la migración celular, supervivencia neuronal, crecimiento axonal y dendrítico, regeneración axonal, sinaptogénesis, estabilización sináptica y, la plasticidad sináptica. Por tanto, al igual que el BDNF, esta molécula está implicada en la regulación de procesos neurocognitivos como la memoria y el aprendizaje. (Aisa et al., 2010; Bisaz et al., 2009; Gingras et al., 1995; Muller et al., 2000; Murphy et al., 2007). También parece que sensibiliza a las neuronas frente a la acción de BDNF (Muller et al., 2000) y que interacciona con sus cascadas de Introducción _   42 señalización (Gingras et al., 1995; Muller et al., 2000; Murphy et al., 2007). Al igual que el marcador neurotrófico, podría estar implicada en la recuperación funcional del cerebro tras el daño (Kiss et al., 2001). Por último, el BDNF también puede interaccionar con el proteasoma e incluso parece que su regulación está muy relacionada con la funcionalidad del mismo. Además, se piensa que la inhibición de ambos actúa de forma sinérgica en la muerte neuronal (Seo et al., 2008). El proteasoma también está implicado en la supervivencia, diferenciación, desarrollo y muerte celular (Ferrer et al., 2004; Konstantinova et al., 2008), así como en la plasticidad sináptica (Dong et al., 2008; Santos et al., 2010) y, por tanto, en la formación del aprendizaje y memoria (Bingol & Sheng, 2011; Nguyen et al., 2010). 2.4.2.4.-Estrés oxidativo El estrés oxidativo que se produce en un ambiente celular es el resultado de un desequilibrio entre los antioxidantes y los oxidantes generados de forma natural y tiene lugar por un incremento en los niveles de especies reactivas de oxígeno o por una disminución en la actividad de los sistemas antioxidantes (Postma et al., 1996). Entre todos los órganos del cuerpo, el cerebro es particularmente vulnerable al daño oxidativo debido a su elevada demanda de oxígeno, a los elevados niveles de ácidos grasos poliinsaturados, elevados niveles de iones metálicos de transición redox y bajos niveles de antioxidantes (Butterfield et al., 2007). Se ha descrito que este tipo de daño juega un papel crucial en la progresión de diversos desórdenes neurodegenerativos. Los altos niveles de lactato asociados al desarrollo de la malaria cerebral, junto con la reducida deformabilidad de los eritrocitos, podrían atribuirse a un estado redox alterado durante el desarrollo de esta complicación neurológica (van der Heyde et al., 2006). Sin embargo, existen autores que cuestionan la importancia de las especies reactivas de oxígeno en la malaria cerebral (Sanni et al., 1999). Durante la malaria cerebral se acumulan especies reactivas de oxígeno producidas tanto por el hospedador como por el parásito (Figura 12), conduciendo a un equilibrio redox alterado (Pino et al., 2005; Pino et al., 2003a; Postma et al., 1996; Introducción 43 Wiese et al., 2006). Grandes cantidades de estas moléculas reactivas se generan a partir de leucocitos activados, como neutrófilos y monocitos (Hunt et al., 2006; Postma et al., 1996). También se ha descrito en estudios in vitro que las células endoteliales durante la adhesión de los parásitos pueden ser otra fuente de especies reactivas de oxígeno (Pino et al., 2005; Taoufiq et al., 2006). En el parásito se producen este tipo de moléculas durante el proceso de degradación de la hemoglobina del eritrocito (Kumar et al., 2008; Postma et al., 1996; Taoufiq et al., 2006), en el que, además, se genera hemo libre (Becker et al., 2004). En el ambiente ácido de la vacuola digestiva del parásito, el hierro del grupo hemo se oxida de Fe(II) a Fe(III) con la consecuente producción de anión superóxido, que genera peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo, altamente reactivos. Por ello, la mayor parte del hemo libre se detoxifica mediante su cristalización a hemozoína. Sin embargo, una pequeña cantidad escapa del proceso de neutralización (Becker et al., 2004; Muller, 2004; Postma et al., 1996). En presencia de especies reactivas de oxígeno, la hemoglobina se oxida, liberando más hemo libre. Por otro lado, el incremento en los niveles de hierro en un ambiente rico en oxígeno como el cerebro puede aumentar la producción de radicales libres (Butterfield et al., 2007; Ferreira et al., 2008; Hunt & Stocker, 2007; Pamplona et al., 2007) y un consecuente daño a nivel local. Especies reactivas de oxígeno Células del hospedador HO. O2 -. H2O2 Hb Hz Parásito Hemo libre Adhesión de GRIs Leucocitos Endotelio Figura 12.- Origen de la producción de especies reactivas de oxígeno durante la malaria cerebral. Las especies reactivas de oxígeno se pueden generar a partir de células del hospedador como leucocitos y células endoteliales durante la adhesión de glóbulos rojos infectados. El parásito también genera especies reactivas de oxígeno en el proceso de degradación de la hemoglobina a hemozoína (Pino et al., 2005; Postma et al., 1996; Taoufiq et al., 2006). GRIs: glóbulos rojos infectados; Hb: hemoglobina; Hz: hemozoína. Introducción _   44 Los efectos de las especies reactivas de oxígeno en la infección malárica podrían ser tanto beneficiosos como patológicos, dependiendo de la cantidad y el lugar de producción. Así, aunque pueden combatir la infección, también pueden estar implicados en cambios patológicos que acontecen en tejidos del hospedador (Pino et al., 2005; Postma et al., 1996). Ya en los años 80, Gilbert y colaboradores sugirieron que las especies reactivas de oxígeno jugaban un papel importante en muchas patologías humanas y que la malaria podría ser una de ellas (Gilbert, 1981). Este daño oxidativo parece afectar sobre todo a las células endoteliales y a la barrera hematoencefálica, contribuyendo a las manifestaciones clinícas características de la malaria cerebral (Becker et al., 2004; Buffinton et al., 1988; Chakravorty et al., 2008; Pino et al., 2005; Pongponratn et al., 2003; Postma et al., 1996). De hecho, se ha puesto de manifiesto que existe estrés oxidativo en células endoteliales de cerebro obtenidas a partir de pacientes que fallecen por esta enfermedad (Wiese et al., 2006). En presencia de especies reactivas de oxígeno, el hemo libre puede ser altamente citotóxico para las células endoteliales (Ferreira et al., 2008; Hunt & Stocker, 2007; Pamplona et al., 2007). Por último, las especies reactivas de oxígeno pueden contribuir también al daño neuronal (Becker et al., 2004; Hunt et al., 2006) y a la degeneración de la neuroglía (Wiese et al., 2006). La peroxidación lipídica, un tipo de oxidación de lípidos mediada principalmente por especies reactivas de oxígeno aparece incrementada en el líquido cerebroespinal en pacientes de malaria cerebral (Postma et al., 1996), en cerebros de ratones que sufren esta complicación (Reis et al., 2010) y en glóbulos rojos infectados con P. berghei (Postma et al., 1996). Este hecho parece indicar que estas moléculas median el daño neurológico en esta enfermedad, lo que a su vez está avalado por el efecto protector frente al desarrollo de malaria cerebral de diversas sustancias antioxidantes (Becker et al., 2004; Postma et al., 1996; Taoufiq et al., 2006; Thumwood et al., 1989). Recientemente se ha observado también que el tratamiento de ratones susceptibles a esta complicación con antioxidantes previene el desarrollo de un daño cognitivo permanente (Reis et al., 2010), por lo que las especies reactivas de oxígenos parecen estar también asociadas a la aparición de secuelas neurológicas. Introducción 45 Las proteínas son las principales dianas del efecto oxidante de las especies reactivas de oxígeno y de sus productos secundarios (Dalle-Donne et al., 2006a). La oxidación en las proteínas puede producir cambios conformacionales, dimerizaciones o agregaciones de las mismas capaces de inducir una pérdida estructural o funcional. Estas proteínas oxidadas podrían acumularse formando inclusiones citoplasmáticas, alterando funciones celulares como son los procesos enzimáticos, el mantenimiento de la estructura celular, el recambio proteico, la expresión y regulación génica, la modulación de la señalización celular y la inducción de apopotosis y necrosis, entre otras (Butterfield et al., 2007; Cecarini et al., 2007). Por todo ello, la oxidación de proteínas desempeña un papel fundamental en el desarrollo de múltiples enfermedades neurológicas (Cecarini et al., 2007). A pesar de las distintas modificaciones oxidativas que pueden sufrir estas moléculas, la carbonilación representa el producto mayoritario de la oxidación proteica (Cecarini et al., 2007; Shacter, 2000b). Una de las consecuencias más destacables de la presencia de carbonilos en ellas es que éstos pueden reaccionar con los grupos α-amino de las lisinas de cadenas adyacentes. De esta forma, se pueden producir entrecruzamientos intra o intermoleculares que promueven la formación de agregados proteicos, que no son degradados por los mecanismos normales de degradación e inhiben los mecanismos proteolíticos (Cecarini et al., 2007). Recientemente se han visto elevados niveles de carbonilación proteica en la membrana de eritrocitos infectados por P. falciparum (Mendez et al., 2011), incluso las proteínas del parásito también son altamente susceptibles a la carbonilación (Radfar et al., 2008). Para defenderse del estrés oxidativo y del daño que éste puede ocasionar, la célula cuenta con un gran número de sistemas de defensa antioxidante, entre los que se incluyen las enzimas superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y el ciclo reductor del glutation (Figura 13). Las propias especies reactivas de oxígeno son capaces de inducir la expresión de enzimas antioxidantes y mecanismos de defensa relacionados (Calabrese et al., 2007). Sin embargo, hay autores que sugieren que estos sistemas antioxidantes deben fallar durante la malaria cerebral (Postma et al., 1996). Introducción _   46 La enzima SOD es una defensa celular fundamental frente al estrés oxidativo mediante la reducción del radical superóxido a peróxido de hidrógeno. En mamíferos existen tres tipos de isoenzimas: (i) SOD-1, dependiente de cobre y zinc, que se localiza sobre todo en el citoplasma, aunque también se puede encontrar en peroxisomas y núcleo y representa una gran parte de la fracción proteica celular; (ii) SOD-2, dependiente de manganeso, que se localiza en la mitocondria y (iii) SOD-3, también denominada EC-SOD, dependiente de cobre y zinc, que se localiza principalmente en el espacio extracelular. En cerebro se ha visto la expresión de las tres isoenzimas (Maier & Chan, 2002; Ookawara et al., 1998). El peróxido de hidrógeno, producto de las reacciones que catalizan estas enzimas, es posteriormente transformado a agua por las enzimas catalasa o glutation peroxidasa (GPX), que parecen formar parte de dos sistemas antioxidantes diferentes (Cisneros et al., 1997). Figura 13.- Sistemas antioxidantes de la célula hospedadora. Entre los mecanismos antioxidantes celulares destacan las superóxidos dismutasas; la catalasa; el ciclo del glutation, el sistema tiorredoxina, la hemo oxigenasa-1 y las proteínas de choque térmico, como la HSP70 (Calabrese et al., 2007; Dringen et al., 2005). GPR: glutation peroxidasa; PRX: peroxiredoxina; TXR-r: tiorredoxina reductasa; GSH/GSSG: glutation reducido/oxidado. Las reacciones que favorecen la producción de especies reactivas de oxígeno y el estrés oxidativo se representan en rojo, mientras que aquellas con efectos antioxidantes se representan en verde. Introducción 47 La CAT es una enzima localizada en los peroxisomas que acepta como sustrato el peróxido de hidrógeno, pero no hidroperóxidos orgánicos. Esta enzima, expresada en todo tipo de células cerebrales, es particularmente efectiva a altas concentraciones de peróxido de hidrógeno (Dringen et al., 2005) y parece actuar de forma coordinada con la SOD (Cisneros et al., 1997). La GPX utiliza el tripéptido glutation reducido como donador de electrones para reducir el peróxido de hidrógeno, aunque también reduce hidroperóxidos orgánicos (Dringen et al., 2005). El glutation oxidado es rápidamente reducido por la glutation reductasa, utilizando el NADPH generado en varias reacciones intracelulares (Pino et al., 2005; Pino et al., 2003a; Postma et al., 1996). Aunque existen diferentes isoformas de glutation peroxidasa, la GPX-1, localizada en el citosol, parece ser crítica para la defensa antioxidante del cerebro (Dringen et al., 2005). Además de todas las anteriores, el cerebro cuenta con otro conjunto de moléculas implicadas en la eliminación del estrés oxidativo, como las proteínas de choque térmico, las hemo oxigenasas y el sistema tiorredoxina (Figura 13) (Calabrese et al., 2007). Este último, constituido por la tiorredoxina (TRX) y la tiorredoxina reductasa está implicado en la reducción de puentes disulfuro de las proteínas. La tiorredoxina reductasa puede reducir directamente a hidroperóxidos lipídicos y al peroxinitrito, mientras que la TRX secuestra directamente especies reactivas de oxígeno como el radical hidroxilo. Cuando se acopla a peroxiredoxinas, TRX es capaz de reducir peróxidos. Este sistema también puede interaccionar con el sistema del glutation y parece estar implicado en la transducción de señales, la regulación génica y en acciones neuroprotectoras. La TRX-1 (citosólica) se expresa ampliamente en cerebro y parece mediar la supervivencia neuronal en condiciones de estrés oxidativo (Calabrese et al., 2007; Patenaude et al., 2005). Las proteínas de choque térmico (HSPS, del inglés “heat shock proteins”) facilitan el correcto plegamiento del resto de las proteínas, previniendo su agregación, situación asociada, entre otras, a una excesiva producción de especies reactivas de oxígeno. Las HSPS son capaces de romper los agregados y asistir en el proceso de re-plegamiento. Sin embargo, en aquellos casos en los que las proteínas no pueden ser rescatadas, las dirigen hacia el proteasoma para su reciclaje. La más estudiada es la forma inducible HSP70, que media acciones citoprotectoras Introducción _   48 (Calabrese et al., 2007; Giffard et al., 2008). La hemo oxigenasa-1 (HO-1) pertenece a la familia de las HSPS. Su inducción es una de las primeras respuestas celulares frente al daño tisular. Ejerce su papel neuroprotector mediante la degradación del grupo hemo, la producción de monóxido de carbono, que puede secuestrar hierro, y la producción de biliverdina, posteriormente reducida a bilirrubina, que protege frente a los efectos citotóxicos causados por el peróxido de hidrógeno y el peroxinitrito (Calabrese et al., 2007; Hunt et al., 2006). El parásito también contribuye a la detoxificación de las especies reactivas de oxígeno que él mismo está produciendo. De hecho, induce una respuesta transcripcional antioxidante temprana en él como consecuencia del incremento en estas moléculas (Nogueira et al.). Por un lado, se ha demostrado que tanto P. falciparum como P.berghei presentan dos isoformas de la SOD. Sin embargo, es capaz de adoptar la SOD-1 del hospedador, que podría contribuir a la detoxificación de aniones superóxido producidos en su metabolismo (Becker et al., 2004; Muller, 2004; Postma et al., 1996). Por otro lado, el parásito carece de catalasa y su glutation peroxidasa utiliza preferentemente la tiorredoxina como cofactor (Becker et al., 2004; Muller, 2004). Aunque Plasmodium carezca de catalasa y de una eficiente glutation peroxidasa, contiene numerosas peroxidasas con gran variedad de sustratos. También posee un sistema de tiorredoxina funcional, pero curiosamente, su tiorredoxina típica (PfTRX1) es mejor sustrato para la tiorredoxina reductasa humana (Becker et al., 2004). Por último, cabe destacar que los niveles de varias moléculas antioxidantes como HSP70, HO-1, TRX-1, GPX, CAT y SOD se han visto alterados en cerebro a lo largo de otras enfermedades neurodegenerativas (Calabrese et al., 2007). La administración de enzimas como la SOD, la CAT y la HO-1 protege frente al daño oxidativo en diferentes modelos in vitro e in vivo de malaria cerebral (Hunt et al., 2006; Postma et al., 1996). Son varios los estudios que sugieren que algunas de estas moléculas podrían ser factores importantes en el desarrollo de esta enfermedad, aunque su inducción y papel fisiológico son aún objeto de debate (Medana et al., 2001; Pamplona et al., 2007; Postma et al., 1996; Takeda et al., 2005). Introducción 49 2.5.- MODELOS EXPERIMENTALES DE MALARIA CEREBRAL Las principales estrategias para el estudio de la patogénesis de la malaria cerebral se basan en el uso de muestras post-mortem obtenidas a partir de biopsias de pacientes afectados, estudios in vitro con células animales o bien modelos animales (Idro et al., 2005). Solamente estos últimos permiten un estudio experimental completo del proceso así como un seguimiento temporal detallado y una suficiente casuística estadística. Por ello, se han desarrollado distintos modelos animales infectados con eritrocitos parasitados por distintas estirpes de Plasmodium, que permiten una gran reproducibilidad, fácil manejo y elevada semejanza con las características patológicas que se producen en la malaria humana (Lackner et al., 2006; Lou et al., 2001). Sin embargo, muchos autores defienden la idea de que no existe ningún modelo animal fiable para el estudio de la malaria cerebral, ya que las características clínicas de la enfermedad humana aún no se han logrado reproducir en su totalidad (Idro et al., 2005). Por un lado, los modelos en primates, que se acercan más en términos clínicos a la patología en humanos, no son útiles para confirmar los eventos moleculares específicos que se producen en la malaria cerebral humana, debido a su naturaleza impredecible (de Souza & Riley, 2002; Lou et al., 2001) ya que sólo un número limitado de animales desarrollan las complicaciones cerebrales (de Souza & Riley, 2002; Idro et al., 2005; Lou et al., 2001) y, además por razones éticas, los experimentos con estos animales están restringidos a un pequeño número de individuos (Brian de Souza et al., 2009). Los modelos murinos de malaria experimental son más versátiles y permiten el análisis de las interacciones moleculares y los cambios patológicos que ocurren en ella. Sin embargo, en la patología murina se observan algunas diferencias con respecto a la patología humana. Los parásitos no desarrollan “knobs”, el secuestro vascular de los eritrocitos infectados es escaso y aumenta en el caso de los leucocitos, y se considera que son los monocitos y las citoquinas inflamatorias los principales causantes de la enfermedad (Idro et al., 2005; Lou et al., 2001). De hecho, existe relación entre algunos signos clínicos como son ataxia, convulsiones y coma con el secuestro de leucocitos en la microvasculatura del cerebro (Rest, 1982). La Introducción _   50 idea de que no existe un modelo animal murino adecuado para el estudio de la malaria cerebral humana debido a que en ratones se muestra un secuestro preferente de leucocitos puede replantearse en la actualidad, ya que en pacientes pediátricos también se ha visto la presencia de secuestro leucocitario (Idro et al., 2005; Lou et al., 2001). Además, existen algunos estudios que sí describen acumulación de eritrocitos infectados en el cerebro en distintos modelos murinos (Amante et al., 2007; Hearn et al., 2000; Jennings et al., 1997; Lou et al., 2001). Existen otras relaciones entre la patología humana y la murina que justifican el uso experimental de estos modelos animales. La clínica comparte varios fenotipos de disfunción del sistema nervioso central, como parálisis, convulsiones, coma y un rápido deterioro una vez que se alcanzan los síntomas neurológicos (Carroll et al., 2010). Tanto las lesiones anatomopatológicas más significativas, como son la alteración de la barrera hematoencefálica y las microhemorragias, como las principales células alteradas, son las mismas en ambas especies. Por otro lado, la respuesta inmune es también similar en ambas especies (Brown et al., 2001; Lou et al., 2001; Rest, 1982). Así, modelos experimentales murinos utilizando P. berghei como agente infeccioso han resultado muy útiles para estudiar el papel de diferentes factores inmunológicos como no inmunológicos del hospedador durante el desarrollo de la malaria cerebral (Brian de Souza et al., 2009; Lou et al., 2001). En los estudios con modelos animales hay que tener en cuenta que además de las diferencias en la patogénesis de la enfermedad, el desarrollo de la misma también varía de acuerdo con las interacciones parásito-hospedador. Por ejemplo, los ratones de la estirpe CBA exhiben una patología vascular cerebral cuando se infectan con P. berghei ANKA, que no se produce cuando la infección es por P. yoelii o P. vinckei, aunque con este último los animales presentan otras características que son propias de la malaria grave de P. falciparum. Además, una misma especie de parásito también induce diferentes respuestas dependiendo de la cepa de ratón utilizada. Por ejemplo, la cepa CBA infectada con P. berghei ANKA desarrolla una forma de malaria cerebral fatal que ni siquiera puede prevenirse con tratamiento, lo que excluye este modelo en los ensayos de fármacos antimaláricos. Por el contrario, la cepa DBA/2 desarrolla un síndrome cerebral no fatal y BALB/c no desarrolla ninguna patología en el cerebro (Idro et al., 2005; Lou et al., 2001). Introducción 51 Uno de los modelos más utilizados por numerosos laboratorios y aceptado como el más manejable es la infección de ratones de la estirpe CBA o C57BL/6 con P. berghei ANKA, los cuales tras adquirir malaria cerebral desarrollan ataxia, convulsiones, fallo respiratorio, coma y muerte (Brian de Souza et al., 2009; Idro et al., 2005; Jennings et al., 1997). Sin embargo, a pesar de ser el más aceptado para estudios de malaria cerebral, el uso de este modelo genera controversia ya que algunos autores sostienen que no es del todo adecuado, pues se observa mayor secuestro de glóbulos blancos que de glóbulos rojos infectados (White et al., 2010). La infección por Plasmodium yoelii en otras estirpes de ratones, como los ratones Swiss, produce un marcado secuestro cerebral de eritrocitos infectados (Brian de Souza et al., 2009; Lou et al., 2001). Sin embargo, la hiperparasitemia en sangre periférica asociada con esta infección no es típica en la malaria cerebral humana. P. berghei K173 también induce signos típicos de la malaria cerebral pero su dependencia de la dosis infecciosa limita su uso para el estudio de la misma (Brian de Souza et al., 2009). En la Tabla 2 se describen distintos ejemplos de modelos in vivo utilizados para el estudio de la malaria cerebral murina. Tabla 2. Modelos in vivo usados para el estudio de la malaria cerebral en ratón* PARÁSITO RATÓN CARACTERÍSTICAS P.yoelii 17XL Ratón Swiss Secuestro de eritrocitos infectados e hiperparasitemias P.berghei ANKA CBA/Ca CBA/T6 DBA/2 C57BL/6 Malaria cerebral fatal + secuestro de leucocitos Malaria cerebral no fatal + secuestro de leucocitos Malaria cerebral fatal + secuestro de leucocitos P. berghei K173 C57BL/6 Dosis-dependiente P.falciparum SCID Secuestro de eritrocitos infectados *Tomada y adaptada de (Brian de Souza et al., 2009; Lou et al., 2001; Willimann et al., 1995). 2.5.1.- El modelo murino de P. berghei ANKA La infección de ratones susceptibles de desarrollar malaria cerebral con Plasmodium berghei ANKA resulta un modelo interesante para el estudio de la histopatología del cerebro y la expresión clínica de la enfermedad durante la fase Introducción _   52 asexual sanguínea dado el gran número de similitudes que se han descrito entre la patología murina y la humana (Brian de Souza et al., 2009; Carvalho, 2010; Hunt et al., 2006; Hunt & Grau, 2003; Hunt et al., 2010; Lou et al., 2001; Medana & Turner, 2006; Pierrot et al., 2003; Riley et al., 2010; Stevenson et al., 2010). Así, por ejemplo, la presencia de células mononucleares y leucocitos en vénulas del cerebro animal se ha demostrado también en la malaria cerebral de niños (Lou et al., 2001). Por otro lado, tanto en pacientes humanos como en modelos murinos se han visto elevados niveles de citoquinas así como la activación y daño del endotelio (Carvalho, 2010; Lou et al., 2001). Otro paralelismo es la acumulación de plaquetas en vasos sanguíneos cerebrales que se ha demostrado en niños (Lou et al., 2001; White et al., 2010). Además, la disminución del flujo sanguíneo, el aumento de lactato en sangre y la alteración de las propiedades de la barrera hematoencefálica se ha puesto de manifiesto tanto en el modelo murino como en la malaria cerebral humana (Carvalho, 2010; Hunt et al., 2010; Lou et al., 2001; Medana & Turner, 2006). Sin embargo, la principal diferencia de este modelo experimental con respecto a la malaria cerebral humana parece ser el hecho de que los eritrocitos infectados se secuestran principalmente en los pulmones y en el tejido adiposo más que en el cerebro, donde se secuestran preferencialmente leucocitos y plaquetas (Franke-Fayard et al., 2010; Franke-Fayard et al., 2005; White et al., 2010). Esto contrasta con otros estudios que demuestran que el modelo de P. berghei ANKA produce un secuestro de eritrocitos infectados en el cerebro (Amante et al., 2007; Brian de Souza et al., 2009; Jennings et al., 1997), por lo que todavía se necesitan estudios más detallados sobre la cantidad de parásitos acumulados en el cerebro y otros órganos, así como a cerca de la naturaleza del secuestro en este modelo (Brian de Souza et al., 2009; Franke-Fayard et al., 2010). Por otro lado, el receptor CD36, uno de los principales mediadores del secuestro de P. falciparum en órganos periféricos en el hombre, no parece mediar la adhesión de P. berghei ANKA en el cerebro, sino que media su adhesión principalmente en pulmones y tejido adiposo (Brian de Souza et al., 2009; Franke- Fayard et al., 2010; Franke-Fayard et al., 2005). El hecho de que este receptor no Introducción 53 intervenga en el secuestro de glóbulos rojos infectados en el modelo murino no excluye que otros receptores puedan estar implicados en este fenómeno. Como sucede en humanos, se ha observado un aumento en la expresión de receptores como ICAM-1, VCAM-1 y P-selectina en el endotelio vascular de cerebro en el modelo de malaria cerebral producido por P. berghei ANKA (Brian de Souza et al., 2009). Sin embargo, se desconoce la proteína derivada del parásito que mediaría estas interacciones, ya que el genoma de P. berghei ANKA carece de genes homólogos a los genes var responsables de esta función en humanos (Franke-Fayard et al., 2010) y tampoco se conoce la naturaleza de las interacciones entre P. berghei ANKA y las células endoteliales (Amante et al., 2010). La Tabla 3 resume distintas similitudes y diferencias existentes entre el modelo murino infectado con P. berghei ANKA y la malaria cerebral humana desarrollada por Plasmodium falciparum, lo que justifica que el modelo de ratones C57BL/6 infectado con esta especie de Plasmodium se utilice con frecuencia para el estudio experimental de la malaria cerebral. Tabla 3.- Histopatología de la malaria cerebral en humanos y en el modelo murino de P. berghei ANKA* CARACTERÍSTICAS COMUNES HUMANOS P. berghei ANKA Hemorragia cerebral ++ ++ Taponamiento de microvasos ++ ++ Secuestro de plaquetas ++ ++ Necrosis de microvasos + + CAM inducidas ICAM-1, VCAM-1, E-selectina, P- selectina, CD36, trombospondina ICAM-1, VCAM- 1, P-selectina CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES HUMANOS P. berghei ANKA Secuestro de eritrocitos infectados +++ + Formación de Knobs ++ - Secuestro de leucocitos ++ +++ * Tomada y adaptada de (Brian de Souza et al., 2009; Lou et al., 2001). Introducción _   54 A este respecto, la infección por P. berghei ANKA produce en ratones un síndrome neurológico que se manifiesta entre los días 6 y 14 post-infección con una mortalidad muy elevada, sin embargo, la parasitemia sanguínea en el momento de la muerte del animal es baja (Lou et al., 2001). Un elevado porcentaje de los animales desarrolla síntomas de malaria cerebral entre el día 5 y 7 post-infección con bajos niveles de parasitemia sanguínea y la muerte les sobreviene en pocas horas o días más tarde (2-3). Los síntomas neurológicos más frecuentes son erizamiento del pelo, hipotermia, ausencia de respuestas frente a estímulos, disminución de la movilidad, encorvamiento, debilidad, desviación de la cabeza, giros sobre sí mismos, ataxia, convulsiones, parálisis y coma. El tono muscular, la fuerza y la función autónoma (sobre todo la temperatura y tasa respiratoria) se ven afectados exclusivamente en animales con malaria cerebral (Amante et al., 2007; Brian de Souza et al., 2009; Carroll et al., 2010; Jennings et al., 1997; Lacerda-Queiroz et al., 2010; Lackner et al., 2006; Lou et al., 2001). En los ratones C57BL/6 con 4-5 semanas de edad infectados con P.berghei ANKA la pérdida de peso es acelerada, desarrollan la patología de forma rápida y la mortalidad es muy elevada. En este modelo, de forma similar a lo que sucede en la malaria humana, la susceptibilidad a desarrollar malaria cerebral es dependiente de la edad del animal e inversamente proporcional a la misma (Adam et al., 2003; Pierrot et al., 2003). Además, los síntomas clínicos durante el curso de la malaria experimental murina varían entre individuos (Amante et al., 2007; Bagot et al., 2002; Brian de Souza et al., 2009; Carroll et al., 2010; Lackner et al., 2006; Vigario et al., 2007), como sucede en la malaria cerebral humana (Brian de Souza et al., 2009; Medana & Turner, 2006; Schofield & Grau, 2005; van der Heyde et al., 2006). Por ello, resulta de especial interés su empleo para estudiar la fisiopatología de esta patología ya que, aunque se hayan observado algunas diferencias con la enfermedad humana, imita fielmente la sintomatología y susceptibilidad del hombre frente al desarrollo de la malaria cerebral. 3. OBJETIVOS/ OBJECTIVES Objetivos 57 La malaria es todavía uno de los problemas sanitarios más importantes a nivel mundial debido a la alta morbilidad, mortalidad y al impacto socio-económico que ocasiona en la población humana, de la cual cerca de la mitad se encuentra en zonas con riesgo de transmisión. La mayor parte de esta mortalidad se produce en África debido a las complicaciones surgidas de la infección por Plasmodium falciparum, única especie capaz de ocasionar una de las formas más severas de la enfermedad: la malaria cerebral. Esta complicación neurológica es responsable de hasta el 80% de los casos fatales y afecta predominantemente a niños menores de cinco años. Aunque puede ser mortal en un 15-30% de los casos, la malaria cerebral es potencialmente reversible con un tratamiento adecuado. Sin embargo, más del 10% de los supervivientes presentan secuelas neurológicas que pueden llegar a ser muy graves pocos meses después de haber superado la enfermedad. Aunque la patogénesis de la malaria cerebral ha sido ampliamente investigada, muchos de los aspectos celulares y moleculares de la misma aun no están completamente definidos. La complejidad multifactorial de este síndrome se relaciona con el secuestro de parásitos y la respuesta inmune del hospedador, como eventos principales, así como con otros mecanismos concomitantes. Esta complejidad ha sido puesta de manifiesto mediante observaciones clínicas y experimentales algunas de las cuales incluyen modelos animales. Las respuestas patofisiológicas que caracterizan la malaria cerebral se asocian con alteraciones en el metabolismo del cerebro que median, entre otros procesos, daño celular. Estos datos sugieren que daños ocasionados en regiones específicas del cerebro debido a la infección por Plasmodium falciparum podrían ser los responsables de las alteraciones neurológicas y las secuelas cognitivas observadas en esta complicación. Por otro lado, la acción protectora que ejercen algunas moléculas antioxidantes frente al desarrollo de la malaria cerebral y sus secuelas cognitivas, indica, que el estrés oxidativo también está jugando un papel importante en la evolución de esta enfermedad. Sin embargo, aún se desconoce la implicación de marcadores específicos asociados a mecanismos de neuroprotección y plasticidad sináptica, así como el entorno de estrés oxidativo en el cerebro del hospedador durante el progreso de esta patología infecciosa. Por todo ello sería conveniente llevar a cabo estudios que puedan esclarecer los mecanismos implicados en los daños del sistema nervioso central que Objetivos _   58 aparecen en la forma cerebral de la malaria, como paso previo al desarrollo de estrategias terapéuticas efectivas para prevenir esta fatal complicación. Teniendo en cuenta estos antecedentes, los objetivos propuestos en el presente trabajo fueron los siguientes: 1.- Estandarizar, en un modelo murino de malaria cerebral, un protocolo basado en el análisis del comportamiento de los animales que permita caracterizar e identificar de forma sistemática el fenotipo neurológico asociado al progreso de la enfermedad. 2.- Analizar el papel potencial que pudiesen tener factores neurotróficos y otros marcadores asociados a los mecanismos de plasticidad sináptica y supervivencia neuronal, en el desarrollo de las alteraciones neurológicas producidas en la malaria cerebral. 3.- Establecer el método oxiproteómico más adecuado para la detección e identificación de proteínas oxidadas en tejidos cerebrales. 4.- Caracterizar el entorno de estrés oxidativo en el cerebro del hospedador infectado y su implicación en el desarrollo del daño neurocognitivo asociado a la malaria cerebral. Objectives 59 The aims established for this study were: 1.- Standardize, in a murine model of cerebral malaria, a protocol based in animal neurobehaviour to establish the neurological phenotype associated to the disease progression. 2.- Analyze the potential role of neurotrophic factors and other biomarkers associated to synaptic plasticity and neuronal survival in the course of the neurological alterations produced in cerebral malaria. 3.- Establish the most suitable method for detection of protein oxidation and subsequent identification by mass spectrometry in cerebral tissues. 4.- Characterize the oxidative stress status in the infected host brain and its implication in the course of neurocognitive damage associated to cerebral malaria. 4. TRABAJOS EXPERIMENTALES Declined expression of brain-derived neurotrophic factor correlates with neurological stages of cerebral malaria in mice María Linaresa,b,*, Patricia Marín-Garcíaa,b,c,*, Susana Pérez-Benaventea, Jesús Sánchez-Nogueirod, Antonio Puyeta,b, José M. Bautistaa,b, ‡, and Amalia Dieza,b aDepartamento de Bioquímica y Biología Molecular IV, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid, Ciudad Universitaria, 28040 Madrid, Spain. bInstituto de Investigación Hospital 12 de Octubre. Madrid. cDepartamento de Ciencias Morfológicas y Biomedicina, Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Europea de Madrid, Campus de Villaviciosa de Odón, 28640, Madrid, Spain. dDepartamento de Toxicología y Farmacología, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid, Ciudad Universitaria, 28040 Madrid, Spain. *Both authors have contributed equally; ‡ Corresponding Author e-mails: marialinares@vet.ucm.es; patricia8149@bio.ucm.es; susipz@vet.ucm.es; nogueiro@vet.ucm.es; apuyet@vet.ucm.es; jmbau@vet.ucm.es; adiez@vet.ucm.es; Submitted to PLOS One Trabajo Experimental I 65 ABSTRACT Neuronal damage is a key process in cerebral malaria (CM) infection and in the long-standing neurocognitive sequelae often observed in children after antimalarial treatment. Neurotrophic factors modulate the integrity of the central nervous system (CNS) including neuronal survival and synaptic plasticity. Here we report the brain distribution and expression of the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) during the progression of experimental cerebral malaria in mice. As the severity of symptoms developed, mRNA expression of BDNF progressively decreased in several brain regions, most early in thalamus-hypothalamus, cerebellum, brainstem and cortex and correlated with a four-stage disease sequence. Immunohistochemical confocal miscroscopy revealed changes in the BDNF distribution pattern, suggesting altered axonal transport. Along CM progression, molecular markers of neurological infection and inflammation from the parasite and the host, respectively, were accompanied by a switch in the brain constitutive proteasome towards the induction of the immunoproteasome that impedes normal protein turnover and contributed to the BDNF abnormal distribution and its divergent expression at mRNA/protein levels. In parallel to the BDNF downregulation, the expression of neural cell adhesion molecule also diminished with increased CM severity. Together, these data point out to a role of BDNF in the pathogenesis of CM sequelae and suggest that rescue efficiency from CM might decrease with disease duration. Thus, BDNF could be a novel potential target for coadjuvant therapy to antimalarial treatment in CM. Trabajo Experimental I _   66 INTRODUCTION Cerebral malaria (CM) is the most important parasitic central nervous system (CNS) disease worldwide, accounting for 80% of all malaria fatal cases. Although CM could be lethal in 15-30% of the cases, is potentially reversible 1, 2. Most patients that survive CM make a full recovery, though long-standing neurocognitive sequelae are often observed, particularly in African children. Post- CM impairment is associated with deficits in the areas of working memory, attention, language, hearing and vision and can attend with ataxia, hemiparesis or quadriparesis and epilepsy 3-5. CM sequelae seem to be multifactorial although their causes are largely unknown. The microvascular obstruction by parasite adhesion and the exacerbated host inflammatory response seem to play a major role in triggering CM 6. A retrospective study has associated the severity of the clinical picture with axonal injury 7 and neuronal damage has arisen recently to be a key process in CM 8. To this respect, brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is emerging as an important regulator of synaptogenesis and synaptic plasticity underlying learning and memory in the adult CNS. Moreover, BDNF promotes the survival and differentiation of neurons, axon regeneration and it is involved in synaptic transmission 9-11. Neuroprotection/neurotoxicity balance has been reported critical in CM development 12 and damaged synaptic transmission is also observed in CM 13, suggesting that BDNF could play a major role in the CM syndrome. Moreover, this central neurotrophin interacts with the proteasome system and the neural cell adhesion molecule (NCAM), both endorsed with significant roles in neuronal survival and synaptic plasticity 14-17. Altered levels of any of these molecules give rise to CNS and behavioral impairments 18-21. Host NCAM could also contribute to the sequestration of parasitized red blood cells (pRBC) eliciting CM since it is capable of in vitro interacting with pRBC 22, though its expression changes during CM progress has not yet been examined. Trabajo Experimental I 67 Because of the meaningful role of BDNF in several neurocognitive disorders 23, this neurotrophin was examined, in parallel with the proteasome and NCAM, during the disease progression of experimental CM (ECM) in mice. Here, a new approach of clustering the animals by their neurological outcome was used to avoid heterogeneity in disease onset and progress 24, 25. In addition, the physiological functions of the different brain regions were experimentally considered by independently analyzing them, since specific damage in any region could lead to recognizable neurological symptoms and sequelae 13, 26, 27. In the present study we demonstrate that the brain-derived neurotrophic factor, the constitutive proteasome and the neural cell adhesion molecule diminish expression in Plasmodium berghei-infected mouse brain in a clinical severity dependent manner. Locally, inflammation markers as well as adhesion molecules precede the opening of parasite accumulation in the brain. Together with the finding that molecular markers studied in brain follow a 4-stage progress of cerebral malaria, our results demonstrate that neurological signs correlate with them. MATERIALS AND METHODS Ethics statement All experiments were conducted at the Universidad Complutense de Madrid in accordance with national and international guidelines for animal care, using protocols approved by the Animal Experimentation Committee at UCM. All efforts were made to minimize animal suffering. Animals and experimental infection Five-week old male C57BL/6 mice were purchased from Harlan Ibérica (Barcelona, Spain). All animals were pathogen-free and were kept in our facilities at the Complutense University of Madrid, with free access to food and water. Twenty four mice were intraperitoneally injected with 5x106 pRBC obtained from P. berghei (ANKA)-infected mice. Six uninfected mice served as controls. Trabajo Experimental I _   68 Infection progress was monitored daily by staining blood smears with Wright’s eosin methylene blue solution (Merck) followed by counting under the microscope. Neurological symptoms in the animals were also monitored daily including ruffled fur, abnormal gait, tremor, reduced grip strength, affected startle/touch response, abnormal visual response, reduced motility, head deviation, hemi- or paraplegia, tendency to roll over on stimulation, back elevation, ataxia and convulsions. Infected animals were assigned to one of four disease stages (I-IV) depending on the severity of their neurological signs. At each stage, mice were sacrificed by cervical dislocation, decapitated and specimens obtained of peripheral tissue (lung, liver and kidney) and CNS tissue (olfactory bulb, frontal cortex, hippocampus, thalamus-hypothalamus, brainstem and cerebellum). To allow potential comparison of mice pRBC levels with human samples data, perfusion was not performed as recently suggested 28. RNA expression analysis Total RNA was isolated from the olfactory bulb, hippocampus, frontal cortex, thalamus-hypothalamus, brainstem and cerebellum of control and CM mice using an ABI PRISM® 6100 Nucleic acid Prepstation following the manufacturer’s instructions (Applied Biosystems). Reverse transcriptase reactions were performed using the High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems). A 1:1 proportion of reverse transcriptase buffer to RNA was used. Cell adhesion molecule, BDNF and cytokine mRNA levels were determined by quantitative reverse transcriptase-PCR. Relative abundances of these molecules were determined using the 5’ fluorogenic nuclease assay (TaqMan) of the ABI 7700 Prism Sequence Detector system (Applied Biosystems). In separate PCR reactions, a commercial mixture of mouse specific primers and probes for intercellular adhesion molecule (icam-1), vascular cell adhesion molecule (vcam-1), ncam, p-selectin, e- selectin, bdnf, tumor necrosis factor-α (tnf-α), interferon-γ (ifn-γ), lymphotoxin-α (lt- α), immunoproteasome Psmb9 (lmp2) and Psmb8 (lmp7) subunits, proteasome Psmb1 (β1) and Psmb5 (β5) subunits and the housekeeping β-actin gene (TaqMan Trabajo Experimental I 69 MGB probes) were used. All PCR reactions were prepared with TaqMan PCR master Mix, No Amperase UNG (all from Applied Biosystems). The specificity of the primers and probes used was verified by basic local alignment search tool (BLAST) analysis comparing the mouse genes selected to the Plasmodium berghei genome and no significant similarity was found. The β-actin gene served as an endogenous control to check for slight variations in the initial concentration, the total RNA quality and the conversion efficiency of the reverse transcription reaction. PCR reactions involved an initial incubation of 10 min at 95ºC for polymerase activation, followed by 40 cycles (melting 15 s at 95ºC, annealing and extension 1 min at 60ºC) using an ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Relative amounts of RNA were calculated by the comparative Ct method (2-ΔΔCT method) 29. Western Blot Analysis Total protein was extracted from brainstem and cerebellum of control and CM mice and 25 μg of each protein extract were separated in a 10% SDS-acrylamide gel and transferred to nitrocellulose transfer membranes (Protran, Whatman). Membranes were blocked in a 5% milk phosphate buffer saline (PBS)-Tween 0.05% solution and probed with antibodies against BDNF (1/200, Santa Cruz Biotechnology) overnight at 4ºC. Membranes were then washed with PBS-tween solution, incubated with horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit-Ig secondary antibody (1/2000, GE Healthcare), reacted in SuperSignal solution (Pierce) for 5 min, and exposed to a medical x-Ray film (Agfa). Densitometry of blots was performed using the Quantity-One 1-D analysis software (Bio-Rad). The housekeeping used to normalize the data was chosen after analyze the specificity of several antibodies (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GADPH), 1/4000, Applied Biosystems; α-Tubulin, 1/10000, Sigma-Aldrich; β- Actin, 1/5000, Sigma-Aldrich) by comparing their reactivity with 9 μg of a mouse or Plasmodium berghei protein extract. Trabajo Experimental I _   70 Immunofluorescence assays Control and infected mice were sacrificed and whole brains removed and fixed overnight at 4ºC in 4% paraformaldehyde in PBS (w/v). After fixation, brain was submitted to a cryoprotective process. Sections of 10 µm were made using a Leica 3050 M cryostate. Brain sections were incubated using the following primary antibodies: polyclonal antibody rabbit anti-BDNF at 1:25 dilution from Santa Cruz Biotechnology and monoclonal mouse anti-β-tubulin at l:500 dilution from Sigma. Subsequently, the brain sections were washed with PBS buffer and incubated with secondary antibodies at the following dilutions: goat anti-rabbit IgG labeled with Indocarbocianine, Cy3, (Jackson Immunoresearch Laboratories) (1:400) and goat anti-mouse IgG labeled with Alexa Fluor 488 from Invitrogen (1:400). Finally, the brain sections were washed with PBS, stained with 4’-6-diamino-2-phenylindole (DAPI), washed with PBS and mounted following the standard procedures. Controls were carried out by following the same procedures but the primary antibody was substituted by the same volume of PBS. Both markers were analyzed by confocal microscopy taking successive Alexa Fluor and Cy3 fluorescent images using a Leica CTR 6500 fluorescence microscope (Leica Microsystems). Alexa Fluor was monitored by excitation with the 488-nm wavelength laser, Cy3 was excited at 561-nm wavelength and DAPI was excited at 405-nm wavenlengtn. To evaluate correlation between BDNF, α-tubulin and DAPI distribution pattern, Pearson analysis was performed using the LAS-AF Lite software (Leica Microsystems). Quantifying tissue infection levels by quantitative PCR Tissue parasite loads are expressed as the number of pRBC per milligram of host tissue and were determined by quantitative PCR as previously described 13. Briefly, genomic DNA from the different peripheral tissue and brain regions was isolated using TransPrep chemistry in the ABI PRISM® 6100 Nucleic acid Prepstation, following the manufacturer’s protocol (Applied Biosystems). Parasite and host DNA quantification was conducted by quantitative PCR, amplifying P. berghei (ANKA) 18S and mouse β-actin genes in the same DNA sample in separate tubes using specific pairs of primers designed in our laboratory 13 and using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Amplification, data acquisition and Trabajo Experimental I 71 data analysis were carried out using the ABI 7700 Prism Sequence Detector system. The amplification conditions were 20 s at 95°C for enzyme activation and 40 cycles of 10 s at 95°C and 30 s at 60°C. Statistical analysis Data are presented as the mean ± standard error. Statistical analyses were performed using the SPSS 15.0 statistics package. The non-parametric tests U-Mann Whitney and Kruskal-Wallis were used to compare two groups or more than two groups respectively. Statistical analyses were performed independently for each molecule and brain region. Differences between means were considered significant when the p value was < 0.05. RESULTS Neurological progression of CM in mice Since, for obvious reasons, time-course studies during CM infection cannot be conducted in humans, the use of ECM models becomes necessary. Although ECM might not reproduce all the features of human disease, models, such as infection of C56BL6/mice with Plasmodium berghei ANKA, are commonly used since they recapitulate most of features of human CM 28, 30-34. Most investigations define the severity or disease in terms of the number of days post infection 12, 35, 36. However, in view of the heterogeneity observed in disease onset 24, 25, 28, we classified the animals accordingly to neurological outcome. In our study, infection levels and CM progression were assessed daily in individual mice by quantifying peripheral blood parasitemia and recording characteristic clinical symptoms of this syndrome. ECM mice showed progressive clinical changes, starting with early symptoms and later developing more specific neurological signs. Finally, animals lapsed into the most severe symptoms (Figure 1 and Movie 1). Trabajo Experimental I _   72 D E A B C F No neurological symptoms Incipient symptoms Appreciable symptoms Severe symptoms 0 3 6 9 12 Days D E A B C F No neurological symptoms Incipient symptoms Appreciable symptoms Severe symptoms 0 3 6 9 12 Days Figure 1.- Definition of the neurological stages of ECM. A, controls. B, mice with no neurological signs at stage I. C, mice with incipient neurological symptoms at stage II (head deviation or hemi-paralysis). D, remarkable neurological symptoms observed in animals at stage III. E, neurological symptoms worsen at stage IV and include severe paralysis. F, clinical heterogeneity in the CM progression of three representative mice (horizontal bars) within an experimental group. Vertical green bar illustrates heterogeneity at a given time (e.g. day 6). Stage I was defined as producing no neurological manifestations in the first few days of infection. Animals at this stage were neurologically indistinguishable from controls, although they presented parasitemia (Figure 1B and 1A respectively, Movie 1). Stage II was defined as the incipient symptoms of CM: head deviation or hemi-paralysis (Figure 1C). Some of these animals also presented ruffled fur, altered motility, weakness, tremor, rollover reaction and anemia. From this stage, symptoms worsened rapidly. At stage III, neurological manifestations were appreciable: head deviation and or hemi-paralysed/paralysed, motionless, weakness and ruffled fur (Figure 1D). Finally, the most severe symptoms were observed in stage IV and included severe head deviation, acute hemi- paralysis/paralysis, motionless, intense weakness and ruffled fur (Figure 1E). Some animals assigned to stages III and IV also presented anemia, pelvic elevation, no Trabajo Experimental I 73 response upon stimulation and tremor. Neurological outcome at each stage was also denoted by the contingency response and spatial orientation displayed upon swimming (Movie 1, right frame). It should be emphasized that, individually, ECM mice did not present the same symptoms at the same time (Figure 1F). Although initial symptoms were observed from day 6 as previously reported 31, temporal heterogeneity was observed in the appearance of stage II. Most severe stages (stages III and IV) were most often observed within 6-30 h after the first neurological symptoms appeared (stage II). BDNF expression pattern during the time-course of ECM bdnf mRNA levels were determined during the course of cerebral malaria in the main brain regions (olfactory bulb, hippocampus, frontal cortex, thalamus- hypothalamus, brainstem and cerebellum). bdnf was significantly and steadily downregulated until stage IV in all the cerebral regions examined (ranging from 2 to 7 fold depending on the cerebral region), being thalamus-hypothalamus, cerebellum, brainstem and cortex the most affected areas (Figure 2). The observed downregulation inversely correlated with the increased neurological outcome of infection. C I II III IV * -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n CB O.B. BS CX HIP T-H C I II III IV * -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n CB O.B. BS CX HIP T-H Figure 2.- Brain mRNA expression of bdnf. N-fold changes in the expression of bdnf mRNA in the different brain regions: cerebellum (CB), olfactory bulb (O.B.), brainstem (BS), frontal cortex (CX), hippocampus (HIP) and thalamus-hypothalamus (T-H) of control mice (C) and mice at different CM stages (I-IV). Data are the mean ± standard error of determinations in 5-7 animals. N-fold change was calculated by the quotient between mRNA amount of each mouse vs. mRNA mean amount of control mouse. P values for comparisons in O.B., BS, CX, P<0.001 and CB, HIP, T-H, P<0.005. *P<0.005. Trabajo Experimental I _   74 These results suggested determining BDNF expression also at protein level. Care was taken to avoid antibody cross-reactivity between Plasmodium and mouse housekeeping proteins used to normalize the data. Antibodies against mouse GADPH, α-tubulin and β-actin were tested with a P. berghei protein extract and only anti-mouse GADPH did not show any band at the expected size (Figure 3A) and consequently it was the housekeeping protein used for analysis of protein expression. BDNF expression at protein level revealed no significant changes between control and cerebral malaria stage IV (Figure 3B). Cerebellum 0 0.5 1 1.5 C IV Re la tiv e O D Brainstem 0 0.5 1 1.5 C IV Re la tiv e O D B C IV BDNF GADPH C IV BDNF GADPH NSNS NSNS BS iBS Pb GADPH α-TUBULIN β-ACTIN GADPH A Figure 3.- Protein expression of BDNF. P. berghei cross-reactivity of the antibodies against several murine housekeeping genes (A): Western blot showing GADPH, α-Tubulin and β-Actin immunoreactivity at the expected size of protein extracts from brainstem (BS), infected brainstem (iBS) and blood isolated P. berghei (Pb). BDNF protein expression analysis (B): Western blot and densitometry analysis to determine BDNF and GADPH protein content in cerebellum and brainstem of control (C) and stage IV-CM (IV) mice. Relative optical density (OD) values given are the mean ± standard error in 4 different animals, calculated as normalized expression of BDNF in each mouse relative to the mean value of control mice. NS, not significant. Then, we conducted immunohistochemical analyses to compare BDNF distribution pattern between control and CM mice at the most severe stage of the disease (stage IV). Trabajo Experimental I 75 C IV BDNF MERGE BDNF-αTUB MERGE BDNF-DAPI MERGE BDNF-DAPI-αTUB GL GL GL GL GL GLGL GL GL GL GL GL GL GL GL GL C IV BDNF MERGE BDNF-αTUB MERGE BDNF-DAPI MERGE BDNF-DAPI-αTUB GL GL GL GL GL GLGL GL GL GL GL GL GL GL GL GL GL GL GL GL GL GLGL GL GL GL GL GL GL GL GL GL Figure 4.- BDNF distribution in brain. Immunohistochemical distribution profiles of BDNF in brain slices obtained from control (C) and CM mice at stage IV (IV). Images show the co-localization between BDNF (red), DAPI (blue) and α-Tubulin (green) in the cerebellum. Arrows point axodendritic fibers. Granule layer, GL. Scale bar: 25 μm. Trabajo Experimental I _   76 BDNF was detected in all analyzed regions. BDNF signal intensity was particularly high in cerebellum and preferentially located at the axodendritic fibers of granule neurons in both control and CM mice (Figure 4). A significant higher co- localization signal of BDNF and DAPI (P< 0.05) was observed in infected mice (Pearson’s correlation = -0.13 ± 0.03) vs. control mice (Pearson’s correlation = -0.21 ± 0.02). On the contrary, control animals showed a higher co-localization signal of BDNF and α-Tubulin (P< 0.005) in control mice (Pearson’s correlation = 0.52 ± 0.02) vs. infected mice (Pearson’s correlation = 0.41 ± 0.02). Proteasome and immunoproteasome subunits expression switching BDNF could interact with the proteasome system in such a way that proteasome inhibition blocks transcription of neurotrophins including bdnf 14. Furthermore, diminished proteasome expression drives to the accumulation of misfolded proteins 37, which may mask bdnf downregulation at protein level. On the other hand, inflammation generated by infectious diseases increases the expression of the immunoproteasome subunits inducing the switching from the constitutive proteasome, involved in the normal protein processing through the ubiquitin system, to the immunoproteasome complex, specialized in processing polypeptides for antigen presentation 38, leading to the accumulation of misfolded proteins. To investigate switching from proteasome to immunoproteasome during CM progression, mRNA levels of the proteasome subunits β1 and β5 and their replacing immunoproteasome subunits lmp2 and lmp7 were analyzed. Early at the asymptomatic stage I the immunoproteasome subunits lmp2 and lmp7 were 10-fold significantly upregulated in all brain areas, but more remarkable in cerebellum (Figure 5), persisting along the CM progression. Conversely, the constitutive proteasome subunits β1 and β5 were gradually downregulated (approx. from 2- to 6-fold, depending on the cerebral region and stage) and cerebellum and brainstem showed the most decreased values (Figure 5). This progressive downregulation of proteasome subunits β1 and β5 correlated with the mRNA expression of bdnf and with the increased neurological signs in ECM mice. Trabajo Experimental I 77 protβ 5 -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in Ex pr es si on lmp2 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Lo g n- Fo ld C ha ng e in Ex pr es si on lmp7 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Lo g n- Fo ld C ha ng e in Ex pr es si on prot β 1 -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in Ex pr es si on C I II III IV * C I II III IV * C I II III IV * C I II III IV * CB O.B. BS CX HIP T-H protβ 5 -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in Ex pr es si on lmp2 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Lo g n- Fo ld C ha ng e in Ex pr es si on lmp7 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Lo g n- Fo ld C ha ng e in Ex pr es si on prot β 1 -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in Ex pr es si on C I II III IV * C I II III IV * C I II III IV * C I II III IV * CB O.B. BS CX HIP T-H Figure 5.- Brain mRNA expression of proteasome and immunoproteasome. N-fold changes in the expression of mRNA of the immunoproteasome subunits lmp2 and lmp7 and the proteasome subunits β1 (prot β1) and β5 (prot β5) in the cerebellum (CB), olfactory bulb (O.B.), brainstem (BS), frontal cortex (CX), hippocampus (HIP) and thalamus-hypothalamus (T-H) of control mice (C) and mice at different disease stages (I-IV). Data are the mean ± standard error of determinations in 5-7 animals. N-fold change for each subunit was calculated by the quotient between mRNA amount of each mouse vs. mRNA mean amount of control mouse. P values for comparisons of prot β1: in CB, O.B., BS, CX, P<0.001; T-H, P<0.005; HIP, P<0.05; prot β5: CB, O.B., T-H, P<0.001; BS, CX, HIP, P<0.005; lmp2: CB, BS, CX, HIP, TAL, P<0.005; O.B., P<0.01; lmp7: BS, T-H, P<0.001; CB, O.B., CX, HIP, P<0.005. *P<0.05. Early pro-inflammatory cytokine expression changes in the brain Overall, IFN-γ, TNF-α and LT-α are pro-inflammatory cytokines accepted to participate in the pathogenesis of CM 31, 39-42. Moreover, IFN-γ and TNF-α have also been reported to increase the expression of the immunoproteasome subunits 43. To determine potential association of proteasome switching and local inflammation, mRNA expression of these three cytokines was examined in the different brain areas at clinical stage I, when the expression of the immunoproteasome subunits utterly changed. At this asymptomatic stage, all brain areas exhibited almost identical cytokine mRNA expression pattern. Thus, with respect to the control mice, ifn-γ and tnf-α significantly increased between 10- and 20-fold and lt-α maintained identical expression values (Figure 6). The ifn-γ gene was the most upregulated, showing around double the level of tnf-α in the cortex, hippocampus, thalamus- hypothalamus and brainstem. Trabajo Experimental I _   78 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 C I C I C I C I C I C I CB O.B. BS CX HIP T-HLo g n- Fo ld c ha ng e in E xp re ss io n * * * * * * ө ө ө ө ө ө Ifn-γ tnf-α lt-α -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 C I C I C I C I C I C I CB O.B. BS CX HIP T-HLo g n- Fo ld c ha ng e in E xp re ss io n * * * * * * ө ө ө ө ө ө Ifn-γ tnf-α lt-α Figure 6.- Brain mRNA expression of cytokines. mRNA expression levels of cytokines in the different brain regions. N-fold changes in mRNA expression for ifn-γ, tnf-α and lt-α in the cerebellum (CB), olfactory bulb (O.B.), brainstem (BS), frontal cortex (CX), hippocampus (HIP) and thalamus- hypothalamus (T-H) of control mice (C) and mice in stage I (I). Data are the mean ± standard error of determinations in 3-6 animals. N-fold change for each cytokine was calculated by the quotient between mRNA amount of each mouse vs. mRNA mean amount of control mouse. Minor expression levels of lt-α were detected that did not differ between the C and CM mice. * indicates a significant difference in ifn-γ expression; Ɵ indicates a significant difference in tnf-α expression. *, ƟP< 0.01. NCAM expression pattern and brain parasite load during ECM progression NCAM is a cell-surface glycoprotein member of the immunoglobulin superfamily that plays key roles in normal brain development, including axonal/dendritic growth, branching and synaptic plasticity 44. NCAM has been reported to interact with BDNF to mediate neuronal survival and plasticity 15, 16, 45. The in vitro ability of this adhesion molecule to adhere pRBC 22 suggests that it might be also involved in cytoadherence. Nevertheless, NCAM induction and potential role in cytoadherence events or brain dysfunction during CM progress has not yet been examined. Cytoadherence is a specific CM outcome that consists in preferentially localize pRBC in the deep vascular beds of body organs (mainly brain) and prevents its removal by the spleen 2. The upregulation of other inducible adhesion molecules such as ICAM-1, VCAM-1, P-selectin and E-selectin in CM brains 1, 28, 46 suggests a composite attendance of elements interacting in pRBC adhesion to blood vessels 1, 47. However there is no consensus on the sequence and timing of cytoadherence events in CM 28, 48. Hence, to investigate NCAM in association with the other known cytoadherence players, mRNA expression levels of ncam, icam-1, vcam-1, p-selectin and e-selectin in parallel to parasite load were determined during the course of infection in the CNS. Trabajo Experimental I 79 Olfactory Bulb -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 C I II III IV Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Frontal cortex -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 C I II III IV Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Hippocampus -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 C I II III IV Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Thalamus-Hypothalamus -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 C I II III IV Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Brainstem -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 C I II III IV Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n * * * * * * (E-SEL; P-SEL; ICAM-1; VCAM-1) NS (NCAM) Cerebellum -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 C I II III IV Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Olfactory Bulb -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 C I II III IV Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Frontal cortex -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 C I II III IV Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Hippocampus -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 C I II III IV Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Thalamus-Hypothalamus -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 C I II III IV Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Brainstem -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 C I II III IV Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n * *** ** ** ** * * (E-SEL; P-SEL; ICAM-1; VCAM-1) NS (NCAM)** * (E-SEL; P-SEL; ICAM-1; VCAM-1) NS (NCAM) Cerebellum -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 C I II III IV Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n e-sel p-sel icam-1 vcam-1 ncame-sel p-sel icam-1 vcam-1 ncam Figure 7.- Brain mRNA expression of adhesion molecules. N-fold changes in the expression of mRNA for e-selectin (e-sel), p-selectin (p-sel), icam-1, vcam-1 and ncam adhesion molecules in the cerebellum, olfactory bulb, brainstem, frontal cortex, hippocampus and thalamus-hypothalamus of control mice (C) and mice at different CM disease stages (I-IV). Data are the mean ± standard error of determinations in 5-7 animals. N-fold change for each adhesion molecule was calculated by the quotient between mRNA amount of each mouse vs. mRNA mean amount of control mouse. P values for comparisons in the cerebellum: icam-1, p-sel, P<0.001; vcam-1, ncam, P<0.005; E-SEL, P<0.01; olfactory bulb: e-sel, P<0.001; icam-1, vcam-1, p-sel, ncam, P<0.005; brainstem: icam-1, vcam-1, P<0.001; e-sel, p-sel, ncam, P<0.005; frontal cortex: icam-1, ncam, P<0.001; vcam-1, e-sel, P<0.005; p-sel, P<0.01; hippocampus: icam-1, P<0.001; e-sel, P<0.005; ncam, P<0.01; vcam-1, p-sel, P<0.05; thalamus-hypothalamus: icam-1, P<0.001; e-sel, P<0.005; p-sel, P<0.01; vcam-1, P<0.05. *P<0.05; NS, not significant. In infected mice, each adhesion molecule exhibited a similar expression pattern in all the brain areas (Figure 7). As expected, the expression of e-selectin, p- selectin, icam-1 and vcam-1 was significantly upregulated during CM progression. This event was observed early from asymptomatic stage I in all brain areas, most remarkable in cerebellum and brainstem (Figure 7). Upregulation of these molecules persisted along all neurological stages (stages II-IV). Trabajo Experimental I _   80 The order of adhesion molecule expression upregulation levels was e-selectin > icam-1 > p-selectin ~ vcam-1, and the maximum increase observed from baseline levels were 40-, 10-, 5- and 4-fold respectively, depending on cerebral region and disease stage. Conversely, in the brain areas examined, ncam was significantly downregulated predominantly in stages III and IV (from 2- to 4-fold, depending on the cerebral region), and again its downregulation was especially noticeable in the cerebellum and brainstem (Figure 7). Data available in the literature revealing pRBC accumulation in brain and peripheral tissues in ECM in mouse have also raised debate on their pathophysiological relevance 2, 49-51. Hence to compare pRBC accumulation during ECM progression in brain regions and peripheral tissues (including liver, lung and kidney) accurate parasite load was determined by quantitative PCR. Peripheral blood samples obtained from the ECM mice on the day of sacrifice according to the clinical stage (Figure 8A) revealed a low parasitemia level during the course of infection. Although parasitemia increased significantly from controls to stage IV (P<0.001), the largest rise between neurological stages was produced from stages I to II (two-fold) and no significant differences were observed from stages II to IV, which is the time-period when the most severe symptoms develop. Parasite loads detected by quantitative PCR in peripheral tissues behaved similarly, including liver, lung and kidney (C-IV in lung, P<0.005; in liver and kidney, P< 0.001). In these tissues, parasite loads failed to vary significantly once neurological symptoms appeared (Figure 8B) unlike the behaviour observed in the different cerebral regions (Figure 8C). Thus, during the course of ECM, parasite loads increased in all brain regions (C-IV in all regions except thalamus-hypothalamus, P<0.001; thalamus- hypothalamus, P< 0.05). In most brain areas, the build up of parasites was detected from stage II onwards, and increases were significant in the cerebellum (P<0.05), brainstem (P<0.05) and olfactory bulbs (P<0.05). Greatest accumulations of the parasite were observed at stage III (in the cerebellum, brainstem and thalamus- Trabajo Experimental I 81 hypothalamus) or IV (in the olfactory bulbs and cortex) depending on cerebral region. The highest numbers of pRBC per milligram of tissue were detected in the cerebellum (161,1 ±31,9) and brainstem (196,2 ±70,9) at stage III. The significant parasite accumulation, observed from stage II and thereafter, correlated with the appearance of the most prominent neurological symptoms and therefore with the neurological outcome of infection, inversely to the declined BDNF expression. Remarkably, comparison of absolute amounts of parasite load (pBRC/mg) showed up to 10 fold higher values in peripheral tissues than in brain (Figure 8). PERIPHERAL BLOOD PARASITEMIA 0 5 10 15 20 C I II III IV % p ar as ite m ia A PARASITE LOAD IN PERIPHERAL TISSUES 0 500000 1000000 1500000 2000000 C I II III IVpR B C s pe r m g of ti ss ue LIVER LUNG KIDNEY PARASITE LOAD IN BRAIN 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 C I II III IVpR B C p er m g of ti ss ue CB O.B. BS CX HIP T-H * NS C * ө (CB; O.B.;BS) NS (CX; HIP; T-H) B * NS pR B C pe r m g of ti ss ue Figure 8.- Parasite accumulation in brain, blood and peripheral tissues. Parasite load quantification in peripheral blood (A), peripheral tissue (B) and brain tissue (C) during CM progression. Brain areas analyzed: cerebellum (CB), olfactory bulb (O.B.), brainstem (BS), frontal cortex (CX), hippocampus (HIP) and thalamus-hypothalamus (T-H). Data are the mean ± standard error of determinations in 4-6 animals. pRBC, infected red blood cells. C, control mice; I, stage I; II, stage II; III, stage III, IV, stage IV. * indicates a significant difference between groups C-IV; Ɵ indicates a significant difference between groups II-IV. *, ƟP<0.05; NS, not significant. Trabajo Experimental I _   82 DISCUSSION Neurological sequelae are frequently observed in African children who survive CM 4, 5. Since BDNF is critical for neuronal survival, synaptic plasticity and cognitive processes 52-54, BDNF expression was analyzed in this study within a new approach of clustering ECM animals by their neurological outcome. At mRNA level, a gradual decrease of bdnf expression was observed in parallel with the progression of neurological symptoms. bdnf downregulation could be responsible of altered pathways modulating cell survival, proliferation and differentiation in brain. BDNF expression is critical for survival after injury 55 and for axon regeneration 10. Detailed studies of CM in human and mouse reveal an array of neurological alterations including axonal injury and loss of endothelial cells and neurons 7, 27, 56. Since bdnf transcription rely upon neuronal activity 11, the lost of neurons in CM could mediate the observed bdnf downregulation. Furthermore, the role of BDNF in vascular endothelium organization 57 suggest also that it diminished expression might be associated to the blood-brain barrier modifications produced during CM progression 32. Moreover, mice at the most severe stage of the disease showed a differential pattern of BDNF distribution, which suggests that the transport system to the axodendritic fibers is disrupted. This is in agreement with the axonal transport modifications observed in human CM 58. Although, changes of BDNF at protein level were not observed, a plausible explanation is the observed downregulation of the proteasome subunits β1 and β5, delaying protein turnover via the ubiquitin- proteasome pathway 59. The downregulation of other key molecules involved in the ubiquitin-proteasome pathway, such as the ubiquitin ligase complex, which mediates the polyubiquitination of misfolded proteins has been recently observed in CM 60. The hijacking of the constitutive proteasome by induction of the immunoproteasome is an inflammatory response in brain to human immunodeficiency virus infection that impedes normal protein turnover 38. TNF-α and IFN-γ are main inductors of the proteasome immunosubunits 43 and thus, the early mRNA upregulation of these two pro-inflammatory cytokines observed in our model before any neurological symptoms in infected mice suggest that inflammation could play a major role in the proteasome switching described here. Trabajo Experimental I 83 The proteasome also participates in neuronal survival and plasticity 14, 37, 61-63 and its dysfunction contribute to neurocognitive disturbances as a consequence of the altered protein turnover that interferes synaptic function 18, 38. Thus, the association of BDNF transcriptional blockade with proteasome inhibition reported also in diverse neurological malfunctioning 14, 17 can also be responsible for the accelerated neurological deterioration during the progress of ECM in mouse. Furthermore, spatial memory training upregulates the constitutive proteasome subunits and downregulates the inducible ones 61 suggesting that the inflammatory induction of the immunoproteasome in CM underlies, at least in part, the cognitive impairment sequelae as a consequence of protein aggregation. This is in agreement with the observation that TNF-α and INF-γ have inhibitory effects in brain protection and synaptic plasticity 64, 65. In our model, the expression of ncam was downregulated with increasing CM severity. NCAM plays a key role in neural development, cell migration, differentiation, survival, synaptogenesis, synaptic stabilization, and neuroplasticity 16, 66. In addition, NCAM contributes to functional recovery and survival after injury 15, 16 and it is involved in learning and memory 15, 45, 66, interacting with BDNF to mediate neuronal survival and plasticity 15, 16, 45, 67. Interfering with NCAM functions lead to cognitive impairment, learning deficits, including spatial learning, memory and emotional alterations 15, 66, which could explain the memory and language complications observed in children who recover from CM 49, 68. In vitro studies suggest that NCAM might participate in pRBC adhesion 22. However, in our in vivo model, the mRNA downregulation of ncam contrast with the early upregulation of icam-1, vcam-1, e-selectin and p-selectin along the ECM progress and brain parasitemia accumulation suggesting that NCAM is unlikely to collaborate in pRBC adhesion to the vascular endothelium in brain. In addition, the upregulated adhesion molecules seem to be early required for subsequent brain sequestration of pRBC, confirming previously reported findings 1, 28, 46, 69. The pRBC sequestration in the brain of mice showing neurological signs of CM observed by us and other authors 26, 28, 35, 40, 49, 50, 70 contrasts with another study in which the build up of pRBC was only detected in peripheral tissues 51. Whole body imaging and multi- organ comparisons could under-estimate pRBC accumulation since the signal from Trabajo Experimental I _   84 pRBC is likely to be much lower in the brain than in highly vascularised organs, where we also detected the largest parasite amounts but not their progressive increase. According to our results, the inflammatory TNF-α and IFN-γ response seems to elicit pRBC accumulation by upregulating expression of icam-1, vcam-1, e-selectin and p-selectin 1, 31, 35, 42, 46, 47, 71-73. Moreover, the early involvement of local cytokines could explain why blocking antibody therapy against cytokines is able to prevent but not reverse ECM 28. Conversely, although a major role in icam-1 upregulation has been advocated for LT-α, this cytokine does not appear to mediate the early upregulation of adhesion molecules in our 4-stage neurological model. Hence, the reported high levels of LT-α in the last stage of ECM 30, 40 could be the consequence of later brain alterations. In our four-stage ECM model, major alterations were observed in cerebellum and brainstem, as previously reported 26, 27, 74, which is in agreement with the neurological symptoms of CM including ataxia and impairment of movement and balance 27, 68. Cerebellum is also one of the brain regions with highest basal BDNF expression and is a key region responsible for cognitive functions 9. Furthermore, the greatest parasite accumulation during ECM was detected in cerebellum, as reported elsewhere 13, 35, 75. Since human CM shows also a peak expression of adhesion molecules in cerebellar sections 1 this region emerges as the most importantly damage in both human and mouse CM. In conclusion, early changes detected in neuroinflammation and later changes in neuroplasticity mediators in parallel with pRBC sequestration in CM mice (Fig. 9) might suggest the existence of a critical point of non-return for the neurocognitive deterioration observed in recovered patients. Early treatment may provide a way to reduce cognitive sequelae in children surviving CM. As BDNF administration exerts substantial protective effects preventing cell death and reduces the neuronal signs of several CNS diseases 23, it can be a prospective therapeutic agent to modify or reverse the neurodegenerative process in CM. To this respect, glatiramer acetate, a compound that augments the expression of BDNF inmice 76, has been demonstrated to reduce the risk for developing ECM 77. Trabajo Experimental I 85 Accumulation of misfolded proteins IFN-γ TNF-α Antigenic proteins Immuno- proteasome Misfolded proteins Peptides for MHCI Survival Neuroplasticity Survival Neuroplasticity Survival Neuroplasticity Misfolded proteins Constitutive Proteasome Oligopeptides Survival Neuroplasticity Microglia Activated Microglia CONTROL STAGE I STAGE II STAGE III-IV Cellular dysfunction EC VCAM P-SEL Leukocyte NCAM ICAM E-SEL RBC Neuron BDNF pRBC Misfolded proteins Figure 9.- Physiopathological markers of ECM progression. The cartoon summarizes events hypothetically connected along the 4-stages of ECM. The early inflammatory cytokines TNF-α and IFN-γ trigger pRBC accumulation by modulating the expression of ICAM-1, VCAM-1, E-selectin and P-selectin. Expression switching from constitutive to immune subunits of the proteasome promotes accumulation of misfolded proteins. Finally, BDNF, NCAM and proteasome downregulation impair neural cell survival and neuroplasticity. E-SEL: E-selectin; P-SEL: P-selectin; EC: endothelial cell;RBC: red blood cell. SUPPORTING INFORMATION Movie 1 (Available in the CD) Definition of the four neurological stages of ECM. Animals at stage I are neurologically indistinguishable from controls. At stage II animals present incipient head deviation or hemi-paralysis. These symptoms worsen at stage III, when these neurological symptoms are more appreciable, including head deviation and/or paralysis, motionless, weakness and ruffled fur. At stage IV, animals acquire the most severe symptoms: severe head deviation, acute paralysis, motionless, intense weakness and ruffled fur. Finally, animals develop coma and later die. Trabajo Experimental I _   86 ACKNOWLEDGMENTS Research supported by grants BIO2007-67885 and BIO2010-17039 from the Spanish Ministry of Science and Innovation and by the Program of Consolidated Research Teams from UCM-Comunidad de Madrid (Research Team 920267). M. L. holds a research FPU fellowship from the Spanish Ministry of Education and Science (AP20061576). We thank Dr. Ruth Gil Prieto (URJ) for statistical assistance, Ana Burton for reading and commenting on the manuscript and Rodrigo Del Cid for video edition. LIST OF ABREVIATIONS β1: proteasome Psmb1 subunit β5: proteasome Psmb5 subunit BDNF: brain-derived neurotrophic factor CM: Cerebral malaria CNS: central nervous system DAPI : 4’-6-diamino-2-phenylindole ECM: experimental cerebral malaria GADPH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ICAM-1: intercellular adhesion molecule IFN-γ: interferon-γ LMP2: immunoproteasome Psmb9 subunit LMP7: immunoproteasome Psmb8 subunit LT-α: lymphotoxin-α NCAM: neural cell adhesion molecule PBS: phosphate buffer saline pRBC: parasitized red blood cells TNF-α: tumor necrosis factor-α VCAM-1: vascular cell adhesion molecule Genes names are given as low-case italics abbreviations of the corresponding protein abbreviation specified above. 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Bautistaa,b,* aDepartment of Biochemistry and Molecular Biology IV, Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Veterinaria, Ciudad Universitaria, 28040 Madrid, Spain. bInstituto de Investigación Hospital 12 de Octubre, Universidad Complutense de Madrid. cDepartment of Morphological Sciences and Biomedicine, Universidad Europea de Madrid, Facultad de Ciencias Biomédicas, Campus de Villaviciosa de Odón, 28640, Madrid, Spain. ¶Permanent address: Department of Biology - Universidad de Cartagena (CO). * Corresponding author e-mails: marialinares@vet.ucm.es; patricia8149@bio.ucm.es; dmmendez@vet.ucm.es; apuyet@vet.ucm.es; adiez@vet.ucm.es; jmbau@vet.ucm.es Published in Journal of Proteome Research 10 (4): 1719-1727 Trabajo Experimental II 95 ABSTRACT Oxidative stress plays a critical role in the pathogenesis of a number of diseases. The carbonyl end products of protein oxidation are among the most commonly measured markers of oxidation in biological samples. Protein carbonyl functional groups may be derivatized with 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) to render a stable 2,4- dinitrophenylhydrazone-protein (DNP-protein) and the carbonyl contents of individual proteins then determined by two-dimensional electrophoresis followed by immunoblotting using specific anti-DNP antibodies. Unfortunately, derivatization of proteins with DNPH could affect their mass spectrometry (MS) identification. This problem can be overcome using non-treated samples for protein identification. Nevertheless, derivatization could also affect their mobility, which might be solved by performing the derivatization step after the initial electrophoresis. Here, we compare two-dimensional redox proteome maps of mouse cerebellum acquired by performing the DNPH derivatization step before or after electrophoresis, and detect differences in protein patterns. When the same approach is used for protein detection and identification, both methods resulted useful to identify carbonylated proteins. However, whereas pre-DNPH derivatized proteins were successfully analyzed, high background staining complicated the analysis when the DNPH reaction was performed after transblotting. Comparative data on protein identification using both methods are provided. Trabajo Experimental II _   96 INTRODUCTION Reactive oxygen species (ROS) build up in different physiological and disease conditions as a consequence of an imbalance between their formation and neutralization by antioxidant systems. This situation causes oxidative stress, which in turn promotes cell alterations such as accumulation of oxidized-damaged molecules, increased levels of dysfunctional macromolecules and severely compromised cell homeostasis 1-4. Brain tissue is particularly vulnerable to oxidative damage because of its high oxygen requirements, low antioxidant levels and high polyunsaturated fatty acid and redox transition metal ion contents 1. Several types of molecules are directly affected by oxidative damage. However, the oxidation of proteins is of particular concern since it leads to aggregation, polymerization, unfolding or conformational changes that may confer a loss of structural or functional activity 1. Although several protein oxidative modifications exist, most oxidized proteins exhibit carbonyl groups (aldehydes and ketones) 2, 4, 5. These groups are introduced into the proteins through a variety of oxidative pathways 6. ROS can react directly with the protein (Figure 1A, B) or can react with other molecules, generating products capable of reacting with proteins 6. A consequence of this modification is that they can react with lysine residues, cross- link and generate protein aggregates. These oxidized aggregates are not readily degraded in the cell and their build up causes cell dysfunction 2. Carbonyl groups are good markers of protein oxidation since they are one of the final byproducts of multiple oxidation pathways that occur in the cell 7. Moreover, since carbonyl groups are chemically stable, they are very useful for laboratory analysis 3, 4, 7-9. The carbonyl contents of individual proteins may be assessed using the following procedures, in which the order of steps a and b may be inverted: (i) incorporation of a dinitrophenyl group through reaction of the carbonyl with dinitrophenylhydrazine (DNPH), which leads to the formation of a stable dinitrophenylhydrazone (DNP) product (Figure 1C), (ii) two-dimensional (2D) electrophoresis and (iii), immunoblotting using anti-DNP antibodies 3-5, 7, 9. A third alternative incorporates the DNPH derivatization step after the isoelectric focusing (IEF) 10, 11. Trabajo Experimental II 97 2,4-dinitrophenyl hydrazone products +180 Da Prolyl residue 2-pyrrolidone cleavage NH NH2 NO2 NO2 Arginyl residue Glutamic semialdehyde -42 Da Aminoadipic semialdehyde 0 Da Lysyl residue Threonyl residue 2-amino-3-ketobutyric acid -1 Da ROS DNPH O N CO NH N CO O A B C NH N O2N NO2 N CO O NH HN OC OH CH3 NH O NH NH2 NH OC HN O NH NH2 HN OC O NH HN OC CH3 O O NH OC HN O O NH HN OC O O NH CH3 HN NH N O2N NO2 OC O NH CO NH NH N NO2 NO2 O NH HN OC NH N O2N NO2 NH2 COOH α α α α α α αα α α α α NH2 NH2 2,4-dinitrophenyl hydrazone products +180 Da Prolyl residue 2-pyrrolidone cleavage NH NH2 NO2 NO2 Arginyl residue Glutamic semialdehyde -42 Da Aminoadipic semialdehyde 0 Da Lysyl residue Threonyl residue 2-amino-3-ketobutyric acid -1 Da ROS DNPH O N CO NH N CO O A B C NH N O2N NO2 N CO O NH HN OC OH CH3 NH O NH NH2 NH OC HN O NH NH2 HN OC O NH HN OC CH3 O O NH OC HN O O NH HN OC O O NH CH3 HN NH N O2N NO2 OC O NH CO NH NH N NO2 NO2 O NH HN OC NH N O2N NO2 NH2 COOH α α α α α α αα α α α α NH2 NH2 Figure 1.- Protein carbonyls produced by direct oxidation of amino acid side chains after its reaction with ROS. The structure of several amino acid residues is shown in the backbone of a “hypothetical” protein (A). After its interaction with ROS, oxidation produces a carbonyl derivative which could modify its molecular weight (B). Carbonyl groups and molecular weight modifications are shown in red. Dinitrophenylhydrazine (DNPH) reacts with the carbonyl groups generating a stable dinitrophenylhydrazone product (C). The molecular weight modification produced by this reaction is indicated in blue. Trabajo Experimental II _   98 Spots detected in the 2D Western blots (2D oxyblots) and 2D stained gels can be matched by computer assisted image analysis. The carbonyl content of each protein is normalized to its total protein quantity through a relation between the chemiluminescence signal intensity detected in the immunoblots and the signal of the same protein in a stained gel. Once a spot is identified as modified by DNPH, it is excised from the gel, digested with trypsin and then analysed by mass spectrometry (MS) 12. Biological samples can be derivatized with DNPH before the 2D electrophoresis step 7, 13-17. However, since this pre-treatment could affect subsequent MS identification 18, 19, some authors advocate the use of non-treated samples for protein identification 18, 20, 21. DNPH derivatization can alter the molecular weight and/or isoelectric point of proteins 3, 5, 22, 23. Thus, the use of non-treated proteins in gels for protein identification and DNPH-treated proteins for Western blotting could lead to potential mismatching of carbonylated spots in the 2D gel for MS. To minimize this, samples can be derivatized with DNPH once the proteins have been transferred to the membrane 22, 24, and this will also improve the low MS scores attributed to molecular weight modifications due to derivatization. Since the correct MS identification of a protein also depends on the correct “matching” of spots detected in the Western blot with those observed in the gels, we compared the two most contrasting situations: this is, comparison of the use of DNPH-treated samples to prepare the 2D gels followed by Western blotting, with the use of untreated samples for 2D electrophoresis followed by DNPH- derivatization. This is the first side-by-side comparison of two of the most popular oxyproteomics approaches used today. Trabajo Experimental II 99 MATERIALS AND METHODS Materials 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), decanoyl-N-methylglucamide (MEGA 10), L-α-lysophosphatidylcholine (LPC), DNPH, anti-2-4-DNP primary antibody (Ref. D9656) and α-cyano-4- hydroxytranscinnamic acid matrix were obtained from Sigma (Saint Louis, USA). Immobilized pH gradient (IPG) strips and horseradish peroxidase-conjugated anti- rabbit-Ig secondary antibody were purchased from GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) free protease inhibitor cocktail and sequencing grade trypsin were from Roche Diagnostics (Manheim, Germany), polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes from Millipore (Massachusetts, USA) and SuperSignal from Pierce (Rockford, USA). Sample preparation All experiments were performed at the Universidad Complutense de Madrid according to the guidelines of the International Council for Laboratory Animal Science. Six adult male C57Bl/6 mice were sacrificed by cervical dislocation and decapitation. The brain was removed and the cerebellum dissected on ice and stored at -80ºC until needed. Cerebella were pooled and homogenized in modified RIPA lysis buffer [50 mM Tris-HCl, pH 8 and 50 mM NaCl, supplemented with detergents: 3% (w/v) CHAPS; 0.5% (w/v) MEGA 10; 0.5% (w/v) LPC, and EDTA free protease inhibitor cocktail]. For protein extraction, the cerebellum suspension was vortexed for 1 h in intervals of 10 min and centrifuged twice (13,000 xg, 30 min). After centrifugation, the pellet was discarded and the extracted proteins recovered in the supernatant and quantified using the Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories Inc, Munich, Germany) following the manufacturer’s instructions. Four out of 25 mg of protein were derivatized with DNPH as previously described 7 with some modifications. Briefly, proteins were denatured at 100ºC for 3 min at 100º C in the presence of sodium dodecyl sulphate (SDS) 6%. Derivatization was performed adding one volume of a solution containing 10 mM DNPH in 10% Trabajo Experimental II _   100 trifluoroacetic acid and incubating 10 min at 25ºC. The mixture was neutralized adding one volume of stopping solution (2M Tris, 30% glycerol and 15% β- mercaptoethanol). Derivatized and non derivatized proteins were precipitated using acetone at room temperature and resuspended in a buffer containing 7 M urea, 2 M thiourea, 3% (w/v) CHAPS, 0.5% (w/v) MEGA-10, 0.5% (w/v) LPC, and 10 mM dithioerythritol. Proteins were quantified using the Bio-Rad Protein Assay to adjust the protein loss. Two-dimensional gel separation of cerebellar proteins 200 μg of protein were cup loaded onto IPG strips (pH 3-11, 18 cm.) previously hydrated overnight with a buffer containing 7 M urea, 2 M thiourea, 2% (w/v) CHAPS, 100 mM DeStreak and 2% ampholites at pH 3-11. For first- dimensional separation, IEF was performed using the IPGphor 3 IEF system (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) at 20ºC. The voltage was gradually ramped in a step-and-hold manner to 1000 V in three steps: 1 h 120V, 1 h 500 V, and 2 h 500-1000 V. This voltage was increased to 4000V in a linear gradient (1000-4000V) over the next 9 h. The run was terminated after ∼70.000 V h. The focused strips were equilibrated in equilibration solution (100 mM Tris 6.8, 6 M urea, 30% glycerol, 2% SDS) containing 0.5% dithiothreitol (DTT) reducing agent for 12 min, and transferred to 4.5% iodoacetamide equilibration solution for a further 5 min. The second-dimension SDS-polyacrilamide gel electrophoresis (SDS- PAGE) was run on homogeneous 12% T and 2.6% C casted polyacrylamide gels. Electrophoresis was carried out at 20ºC, 2 W/gel for 30 min and 20 W/gel for 4 h using an Ettan-Dalt six unit. For each experimental condition, 5 gels were run in parallel under identical 2D electrophoresis conditions. Two gels were stained with colloidal Coomassie brilliant blue 25 to visualize total proteins and for subsequent protein identification. Trabajo Experimental II 101 Western blot analysis Three of the five gels prepared for each experimental condition were transferred to PVDF membranes. Transfer efficiency was checked to observe that it was similar in both methods. Carbonyl groups in the transferred membranes containing derivatized proteins were immunodetected as previously described 15. After blocking, membranes were incubated for 2 h with a 1/4000 dilution of the anti-2-4-DNP primary antibody in PBS -0.05% Tween containing 10% skimmed milk powder (w/v). The blots were then washed 3-4 times in PBS-Tween solution for 5 min and one more time in PBS-Tween containing milk (as above) for 15 min. Next, the membranes were incubated with horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit- Ig secondary antibody at 1/5000 dilution in PBS-Tween containing milk for 1 h. Membranes were washed twice for 5 min in PBS-Tween containing milk, followed by 2 washes in PBS-Tween solution and finally 2 washes using PBS solution prior to visualization. Membranes containing the non derivatized samples were derivatized as previously described 22 with minor modifications as follows: membranes were equilibrated in 20% (v/v) methanol-80% TBS for 5 min and incubated in 2N HCl for 5 min. Next, membranes were incubated in a DNPH solution (0.5 mM) in 2N HCl for 5 min. Membranes were washed 10 times in HCl 2 N, 30 times in methanol 100%, once in PBS-Tween and 5 times in PBS. The greater the number of washings, the lower the background induced by DNPH excess. Then, blocking and immunodetection was performed as previously described using a 1/40,000 dilution of the anti-2,4-DNP antibody. SuperSignal was used as the chemiluminescent substrate for visualization. Trypsin digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry Spots of interest were manually excised from the 2D gels, in-gel reduced, alkylated and then digested with trypsin as described elsewhere 26. Briefly, spots were washed twice in water, shrunk 15 min with 100% acetonitrile and dried in a Savant SpeedVac for 30 min. The samples were then reduced using 10 mM DTT in Trabajo Experimental II _   102 25 mM ammonium bicarbonate for 30 min at 56ºC and subsequently alkylated with 55 mM iodoacetamide in 25 mM ammonium bicarbonate for 20 min in the dark. Finally, samples were digested with 12.5 ng/μl sequencing grade trypsin in 25 mM ammonium bicarbonate (pH 8.5) overnight at 37ºC. After digestion, the supernatant was collected and 1 μl was spotted onto a MALDI target plate and allowed to air- dry at room temperature. Next, 0.4 μl of a 3 mg/ml of α-cyano-4- hydroxytranscinnamic acid matrix in 50% acetonitrile was added to the dried peptide spots and allowed, again, to air-dry at room temperature. MALDI time-of-flight (TOF) MS analyses were performed in a 4800 Proteomics Analyzer MALDI-TOF/TOF mass spectrometer (Applied Biosystems, Warrington, UK) operated in positive reflector mode, with an accelerating voltage of 20.000 V. Mass spectra were then acquired for peptide mass fingerprinting (PMF). Proteins were identified by comparing the trypsin-digested peptide masses with the data provided in two databases (NCBI Date 080626 with 6640940 sequences, 2276975120 residues and UniprotKB-SwissProt v.56.6) separately using MASCOT 1.9 (http://www.matrixscience.com) through the Global Protein Server v3.5 from Applied Biosystems. The parameters for the PMF search were as follows: modification on cysteine residues by carboxyamidomethylation was set as the fixed modification; methionine oxidation was considered as a variable modification; the maximum number of missed tryptic cleavages was one; peptide mass tolerance was set to 50 ppm and monoisotopic masses were considered. In some cases, taxonomy was restricted to Mus musculus. All the identified proteins fulfilled the criterion of being significant (P<0.005) according to probability based on the Mowse score. Image and statistical analyses. Gel and immunoblot images were analyzed using PDQuest software, version 8.0.1 (BioRad Laboratories Inc, Munich, Germany). Statistical analyses were performed using the Statgraphics Plus 5.1 software package. Trabajo Experimental II 103 RESULTS Protein separation Our comparative analysis of images of Coomasie blue-stained gels obtained using derivatized and non-derivatized samples revealed adequate resolution and spot differentiation across the two dimensions (Figure 2). However, differences were observed in the number of protein spots and their distribution pattern. A 3 11 B 75 50 37 25 20 75 50 37 25 20 pI kDa kDa 3 11pI A 3 11 B 75 50 37 25 20 75 50 37 25 20 pI kDa kDa 3 11pI Figure 2.- Bidimensional SDS-PAGE of mouse cerebellum extracts stained with Coomasie brilliant blue. Samples derivatized with 2-4-dinitrophenylhydrazine before electrophoresis (A) or after transfer (B). In the gels containing pre-treated samples, enrichment of the basic range was observed while in those loaded with untreated samples, the acid range was enriched. Gels shown are representative of two independent experiments. Pre-treatment with DNPH led to a greater number of spots. Automated analysis identified 1157 common spots between gel replicates (out of 1428 ± 75 total spots/gel) when pre-treated proteins were used (Figure 2A). In contrast, 802 spots were reproducibly detected in gel replicates containing non DNPH-treated proteins (out of 955 ± 67 total spots/gel) (Figure 2B). When the gel images obtained using the two technical approaches were compared, we detected 577 common spots. For both types of sample, gels exhibited specific areas of significant protein spot enrichment. However, in gels containing DNPH-treated proteins, this enrichment was observed in the basic range, while in gels loaded with non-DNPH-treated samples, protein spot enrichment appeared in the acid range. Vertical streaking was observed for Trabajo Experimental II _   104 both sample types (Figure 2A, B) while horizontal streaking was reduced in gels containing non-treated proteins (Figure 2B). Carbonyl modified proteins In samples pre-derivatized or derivatized after membrane transfer with DNPH, carbonyl modified proteins were identified by Western blotting using the anti-DNP antibody (Figure 3). The minimal level of protein detection was similar in both methods (0.01-0.05 µg). A B 3 11pI 3 11pIkDa kDa 75 50 75 50 A B 3 11pI 3 11pIkDa kDa 75 50 75 50 Figure 3.- Carbonyl modified proteins detected by Western blotting of the gels shown in Figure 2A and 2B, corresponding to samples previously derivatized with DNPH (A) or samples derivatized after transfer (B). Images are representative of three independent experiments. 2D oxyblots obtained from samples pre-derivatized with DNPH displayed 218 common modified spots among technical replicates (out of 311 ± 86 total spots) (Figure 3A), while samples derivatized with DNPH after membrane transfer, showed 303 common modified spots among replicates (out of 391 ± 51 total spots) (Figure 3B). Although a higher number of carbonyl modified protein spots was detected when the proteins were treated with DNPH after transfer to the blot, the samples pre-treated with DNPH showed improved reproducibility and reduced background staining (Figure 3). To determine the number of spots that could be matched for potential MS identification in the gels, images of the 2D oxyblots and 2D gels stained with Coomasie blue were matched using PDQuest. Since automated matching was only Trabajo Experimental II 105 possible for gel-to-gel or blot-to-blot images –and not gel-to-blot images– the manual PDQuest option was used to identify the carbonylated protein spots in the preparative gels. The Coomasie blue-stained gels yielded 155 out of the 218 modified spots (71%) in the 2D oxyblots of pre-treated samples. In contrast, only 134 of the 303 modified spots (44%) could be matched when the samples were treated after transfer to the blot. Computer assisted image analysis comparing images of the gels and 2D oxyblots obtained using the two approaches revealed only 37 common carbonyl modified protein spots identified by both methods. To assess whether these 37 common carbonyl modified spots were identified as the same proteins, a selection of 14 protein spots were excised and subjected to MS. These spots were heterogeneously distributed across the isoelectric point and molecular weight ranges obtained in the 2D oxyblot (Figure 4A, B). The MS data revealed that all the excised spots were identified as the same proteins using either method (Table 1). kDa B 5 8.5pIkDa 50 75 A 5 8.5pI 75 50 1 2 3 4 5 13 6 7 8 11 10 9 14 12 2 3 4 5 1 6 7 8 10 9 11 12 13 14 kDa B 5 8.5pIkDa 50 75 A 5 8.5pI 75 50 1 2 3 4 5 13 6 7 8 11 10 9 14 12 2 3 4 5 1 6 7 8 10 9 11 12 13 14 B 5 8.5pIkDa 50 75 A 5 8.5pI 75 50 1 2 3 4 5 13 6 7 8 11 10 9 14 121 2 3 4 5 13 6 7 8 11 10 9 14 12 2 3 4 5 1 6 7 8 10 9 11 12 13 14 2 3 4 5 1 6 7 8 10 9 11 12 13 14 Figure 4.- Fourteen common carbonyl modified protein spots heterogeneously distributed across the isoelectric point and molecular weight ranges selected for subsequent protein identification by mass spectrometry in pre-derivatized gels (A) and non-treated gels (B). Trabajo Experimental II _   106 Table 1. Identification of carbonylated proteins in mouse cerebellum Post- blot 1* Vimentin sp|P20152| VIME_MOUSE 34/65 40/65 64 67 337 382 53.7/5.1 48.5/5.2 50.3/5.3 2* γ-enolase sp|P17183| ENOG_MOUSE 21/37 28/65 49 55 237 215 47.6/5.0 49.8/5.4 52.4/5.4 3 Unnamed protein product gi|74211333 32/65 39/65 48 53 299 363 68.2/5.3 68.4/5.8 73.6/5.9 4 Unnamed protein product gi|74211333 37/65 44/65 53 55 387 448 68.2/5.3 67.7/5.9 72.9/6 5* ATPase, H+ transporting, lysosomal V1 subunit A gi|31560731 36/65 32/65 56 46 293 221 68.6/5.4 66.5/6 70.4/6 6 Creatine kinase, brain gi|10946574 30/65 38/65 70 71 330 356 43.0/5.4 47.9/6.1 46.0/6.3 7* Dihydropyrimidinase- related protein 2 sp|O08553| DPYL2_MOUSE 19/54 38/65 36 69 150 398 62.6/6.0 63.3/6.8 66.8/7.0 8* Dihydropyrimidinase- related protein 2 sp|O08553| DPYL2_MOUSE 35/65 37/65 68 65 375 359 62.6/6.0 63.1/6.9 66.9/7.1 9* Dihydropyrimidinase- related protein 2 sp|O08553| DPYL2_MOUSE 35/65 38/65 65 72 375 411 62.6/6.0 62.6/7.1 66.2/7.3 10* Alpha-enolase sp|P17182| ENOA_MOUSE 33/65 32/65 72 73 343 329 47.5/6.4 50.0/7.0 52.5/7.2 11* Malate dehydrogenase, cytoplasmic sp|P14152| MDHC_MOUSE 23/65 24/65 49 52 209 222 36.7/6.2 37.3/6.9 37.6/7.1 347 (m) 309 (m) 275 (p) 166 (p) 347 (m) 309 (m) 94 (p) 145 (p) 13* Pyruvate kinase isozymes M1/M2 sp|P52480| KPYM_MOUSE 18/65 31/65 38 49 120 262 58.4/7.2 61.8/7.9 62.3/8.0 14* Pyruvate kinase isozymes M1/M2 sp|P52480| KPYM_MOUSE 36/65 39/65 61 63 358 383 58.4/7.2 64.4/8.2 64.5/8.3 46.9/7.8 Long-chain specific acyl- CoA dehydrogenase, mitochondrial sp|P51174| ACADL_MOUSE 14/65 20/65 36 40 48.3/8.5 12† Glutamine synthetase sp|P15105| GLNA_MOUSE 27/65 20/65 56 35 42.8/6.6 46.9/7.6 % coverage(e) score(f) MW (kDa)/ pI(g) MW (kDa)/ pI (PDQuest)(h) Pre- blot Post- blot Pre- blot Post- blot Pre- blot Spot No.(a) Protein ID(b) Accession No.(c) No. peptides searched(d) Pre- blot matched/ predicted Post- blot (a) Spot number as indicated in Figure 4. (b) Protein ID from NCBInr database. (c) Accession numbers from NCBInr database. (d) Number of matched peptides versus total number of peptides. (e) Coverage of the matched peptides in relation to the full-length sequence. (f) Probability-based MOWSE score. (g) Theoretical molecular mass (MW) (kDa) and isoelectric point (pI) from NCBInr database. (h) Theoretical molecular mass (MW) (kDa) and pI from PDQuest analysis. (m) Probability-based MOWSE score for the protein mix. (p) Probability-based MOWSE score for the indicated protein. (*) Identification confirmed by MS/MS sequencing. (†) Spot 12 was identified as a mix of two different proteins. This spot was not used for statistical analyses. These 14 protein spots were identified as encoded by 11 different mouse genes. Seven of the proteins were related to metabolism and energy processes: γ and α enolase and pyruvate kinase (glycolytic enzymes), malate dehydrogenase (citric acid cycle enzyme), long chain specific acyl-CoA dehydrogenase (involved in fatty acid and branched chain amino-acid metabolism), glutamine synthetase (essential role in nitrogen metabolism) and creatine kinase (an important energy reservoir). Trabajo Experimental II 107 Other proteins identified were structural proteins such as vimentin, an intermediate filament, and dihydropyrimidinase-related protein 2, necessary for remodelling of the cytoskeleton. A further protein identified was the ATPase, H+ transporting, lysosomal V1 subunit A, which is responsible for acidifying the intracellular compartments. The last oxidized protein identified was a hypothetical protein related to heat shock protein 8, which contributes to producing the proper protein conformation. In our experimental conditions, no significant differences (p=0.220) were observed between MS scores when DNPH pre-treated or post-treated samples were used (Table 1). To clarify whether DNPH pre-treatment modifies the isoelectric focusing or relative mobility of proteins during electrophoresis, we compared the isoelectric points and molecular weights calculated by the PDQuest software with the theoretical value predicted in the NCBInr 080626 database (Table 1). Statistical analysis revealed no significant additive effect of DNPH pre-treatment causing a molecular weight change (p= 0.983) or significant differences in isoelectric point (p=0.249). c* c bb* a a* c* b* a* 7 8pI 7 8pI 50 50 kDa kDa A B c* c bb* a a* c* b* a* 7 8pI 7 8pI 50 50 kDa kDa A B Figure 5.- Carbonyl modified spots in pre-treated gels not matching in the PDQuest analysis but close to a carbonyl modified spot in non-treated gels which were identified as the same protein. (A): A DNPH pre-treated gel. Spots matched by PDQuest analysis with spots in the untreated gel are indicated by circles. Spots identified as the same as spots in the non-treated gel are indicated by squares. (B): Spots in the non-treated gel. Carbonyl modified spots are indicated with an asterisk in both images. Spots with the same letter represent each pair of PDQuest-matched or coinciding spots. Trabajo Experimental II _   108 Table 2. Identification of non-PDQuest matched carbonylated spots in both types of gel Spot. No(a) Protein ID(b) Accession No.(c) No. peptides matched/ searched (d) % coverage(e) score(f) MW (kDa)/ pI(g) MW(kDa)/ pI predicted (PDQuest)(h) Electron transfer flavoprotein- ubiquinone oxidoreductase, mitochondrial sp|Q921G7| ETFD_MOUSE 14/65 27 199(m) 90(p) 68.9/7.3 a* (Pre) NAD-dependent malic enzyme, mitochondrial sp|Q99KE1| MAOM_MOUSE 16/65 29 327(m) 100(p) 66.4/7.5 b* (Post) Pyruvate kinase isozymes M1/M2 sp|P52480| KPYM_MOUSE 24/65 43 186 58.4/7.2 63.5/7.7 Pyruvate kinase isozymes M1/M2 sp|P52480| KPYM_MOUSE 14/65 26 402(m) 82(p) 58.4/7.2 402(m) 164(p) 402(m) 117(p) c* (Post) Glutamate dehydrogenase 1, mitochondrial sp|P26443|DHE3_ MOUSE 42/65 53 365 61.6/8.1 57.9/7.9 379(m) 79(p) 379(m) 172 (p) 327(m) 139(p) 327(m) 104(p) 379(m) 97(p) a* (Post) Dihydropyrimidinase-related protein 1 sp|P97427| DPYL1_MOUSE 15/65 24 62.5/6.6 68.3/7.7199(m) 96(p) Dihydropyrimidinase-related protein 1 sp|P97427| DPYL1_MOUSE 19/65 32 62.5/6.6 64.0/7.6 Dihydropyrimidinase-related protein 4 sp|O35098| DPYL4_MOUSE 15/65 34 62.5/6.5 b* (Pre) 59.4/6.6 62.7/7.6 Dihydropyrimidinase-related protein 1 sp|P97427| DPYL1_MOUSE 20/65 37 62.5/6.6 Tyrosyl-tRNA synthetase, cytoplasmic sp|Q91WQ3| SYYC_MOUSE 17/65 32 c* (Pre) Glutamate dehydrogenase 1, mitochondrial sp|P26443| DHE3_MOUSE 14/65 15/65 57.7/7.7 ATP synthase subunit alpha, mitochondrial sp|Q03265| ATPA_MOUSE 23/65 43 59.8/9.2 Succinyl-CoA:3-ketoacid- coenzyme A transferase 1, mitochondrial sp|Q9D0K2| SCOT_MOUSE 39 56.4/8.7 29 61.6/8.1 (a) Spot letter as indicated in Figure 5. The type of gel is indicated in brackets: pre-blot DNPH treatment (Pre) and post-blot DNPH treatment (Post). (b) Protein ID from NCBInr database. (c) Accession numbers from NCBInr database. (d) Number of matched peptides versus total number of peptides. (e) Coverage of the matched peptides in relation to the full-length sequence. (f) Probability- based MOWSE score. (g) Theoretical molecular mass (MW) (kDa) and isoelectric point (pI) from NCBInr database. (h) Theoretical molecular mass (MW) (kDa) and isoelectric point (pI) from PDQuest analysis. (m) Probability-based MOWSE score of the protein mix. (p) Probability-based MOWSE score of the indicated protein. The low number of common modified spots detected by both methods could be attributed to slight variations in the migration properties of treated and untreated proteins, which could affect correct matching by the PDQuest software. To address this question, we conducted a MS analysis of some of the carbonyl modified spots in the DNPH pre-treated gels that appeared around the non-modified spots matched by PDQuest analysis to the modified spots in the gels containing non pre-treated samples. This MS analysis indicated that 50% of the surrounding spots excised from gels containing DNPH pre-treated samples coincided with the ones identified in the Trabajo Experimental II 109 gels containing non-treated samples (Figure 5 and Table 2). These results suggest that minor differences in migration between pre-treated and untreated extracts could affect matching of gel images obtained using the two procedures. DISCUSSION In this study, we compared the two most commonly used 2D PAGE oxyproteomic methods for identifying carbonylated proteins: (i) the widely used method of derivatizating samples with DNPH followed by 2D electrophoresis, in which carbonyl groups are subsequently detected in corresponding 2D Western blots using specific anti-DNP antibodies 7, 13-17 and (ii) derivatization of the blot with DNPH after 2D electrophoresis 22, 24. Because of the complexity of this methodology, we ensured that optimal conditions were fulfilled for all the gels/blots analyzed. First, we focused on sample preparation, trying to solubilise most proteins in the sample. To do this, we modified the RIPA buffer by adding the zwitterionic detergent MEGA 10 and the zwitterionic lipid LPC. These zwitterionic detergents improve the resolution of the membrane protein fraction in the sample 27. After extraction, samples were differentially derivatized or not with DNPH and then processed in the same electrophoretic and transfer conditions. The use of gels loaded with untreated samples for protein identification and DNPH treated samples run in parallel for 2D oxyblot analysis has been reported to solve the potential problems caused by the DNP moiety in MS identification 18-21, 28. To investigate how protein matching and identification could be affected by these procedures, direct comparisons were made between 2D Coomasie blue-stained gels containing untreated and DNPH-treated samples. In our hands, both sample treatments led to adequate separation of membrane proteins from the cerebellum, a tissue rich in these proteins. However, differences were detected in the protein patterns produced in the 2D gels. Thus, the different sample treatments led to differential areas of protein distribution Trabajo Experimental II _   110 enrichment, and this precluded matching of 2D oxyblots of pre-treated samples with the 2D Coomasie-stained gels of untreated samples, as previously suggested 22. Some authors 11 claim that differences in protein patterns produced by 2D electrophoresis are the consequence of differential protein precipitation or protein mobility (see below). A loss of proteins due to sample processing during DNPH- derivatization has also been reported 11, though this contrasts with our results in that we detected more spots using the pre-DNPH-derivatized samples. Since 50% of these spots were also present in the gels prepared using non-treated samples, it could be that the derivatization step might differentially precipitate proteins. The Western blot images of the oxidized proteins rendered by the two oxyproteomic approaches were also compared. Thus, although more carbonyl modified spots were detected when the proteins were derivatized with DNPH after electrophoresis, an improved background enhancing reproducibility between replicates was observed in the samples treated with DNPH before electrophoresis. Moreover, when Coomasie blue-stained gels were compared with Western blots for each method, more matching spots were detected when samples were treated before electrophoresis, consistent with reports that post-electrophoresis derivatization might produce high background staining 29, which highlights the importance of clear backgrounds to define and identify oxidized proteins. High background staining not only hinders comparisons between 2D oxyblots but also complicates spot matching between Western-blot spots and preparative gels. However, the solvents used to remove background staining tend to wash off the proteins and several washings in aggressive chemicals were required in our experiments to decrease background staining. When we compared the number of common spots detected by the two methods it was found that only 37 common spots appeared oxidized. MS analysis of a representative number of these spots confirmed that the same proteins were identified by both methods. Although some authors suggest that pre-treatment of proteins with DNPH gives rise to MS misidentification or unresolved data 18, 19, in our experimental conditions, these protein spots were successfully identified by MS fingerprinting as described by others 23. The fact that both methods yielded a sufficient number of peptides guarantees good protein identification, which could Trabajo Experimental II 111 depend on the protein size and its level of oxidation. High oxidation in small proteins is expected to generate a lower amount of non-modified peptides. Conversely, protein modification and derivatization could make difficult MS- identification in the cases where the complete genome is not still annotated in the databases. Several authors claim that DNPH treatment modifies isoelectric focusing and/or molecular weight, which produces a change in protein mobility 11, 22, 23, 29. However, we observed no major differences between isoelectric points or molecular weights predicted automatically by the PDQuest software and the real values predicted after MS identification. This is in agreement with the views of other authors, who also fail to observe major differences in protein electrophoretic positions after DNPH treatment 18, 19. Thus, although we cannot exclude minor differences in the positions of DNPH treated and non-treated proteins, major changes in the molecular weight isoelectric point did not seem to affect protein matching in our brain tissue samples. The low level of correspondence between the number of spots detected by the two methods could justify a combined approach to redox proteomics. In each method, missing spots could perhaps be attributed to their different capacity for carbonyl detection or to the different patterns observed in the preparative gels. This low correspondence could also be explained by a protein positioning effect that prevents correct matching by the PDQuest software in some areas. To address this potential effect, carbonylated spots rendered by both methods that were not matched by PDQuest analysis but appeared in nearby positions in the gel were subjected to mass spectrometry (MS). Since some of the spots (50%) were identified as the same proteins by both methods, it is possible that minor differences between pre-treated and non-treated extracts could affect matching of the gel images. As indicated above, although no major effects on molecular weight and isoelectric point were observed, differences in protein patterns have been suggested by us and other authors 11. Considering that (i), oxidative modifications per se often slightly alter a protein’s electrophoretic properties such that it migrates as a satellite of the unmodified protein and (ii), a Trabajo Experimental II _   112 single protein can undergo more than one type of oxidative modification 5, small differences between DNP spots and their unmodified protein counterparts could hinder comparisons between the modified spots detected by both methods. CONCLUSIONS In conclusion, although more horizontal streaking was produced when brain tissue extracts were DNPH-treated before their 2D electrophoretic separation, a larger number of spots was obtained. In addition, since a highly biased pattern was observed for the two methods, the use of non-treated extracts for identifying modified protein spots in DNPH pre-treated 2D oxyblots is not recommended for routine analysis. The DNPH pre-treated 2D oxyblots showed low background staining and improved reproducibility, which made it easier to compare the modified spots in the 2D oxyblots with the Coomasie-stained gels. This comparison yielded the largest number of matching spots. Given that the use of pretreated samples rendered similar MS fingerprinting identification scores, in our opinion, this approach seems the most appropriate for redox proteomics of brain tissue. Moreover, this method prevents further oxidative processes during the storage and manipulation, the washing is less aggressive and its handling shortened. However, before selecting any procedure for a given tissue, we would suggest a comparative analysis such as the present. Moreover, since these two methods do not show 100% efficiency, whenever possible, the combined use of the two redox-proteomics approaches guarantee identification of carbonylated proteins that match in both methods. ACKNOWLEDGEMENTS This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Science and Innovation (BIO2007-67885 and BIO2010-17039) and by the Research Teams Consolidation Programme of the UCM (Research Team 920267-Comunidad de Madrid). M.L. holds a FPU fellowship from the Spanish Ministry of Education and Science (AP20061576). D.M was supported by the Universidad de Cartagena (CO), Trabajo Experimental II 113 the Alban Programme of High Level Scholarships for Latin America, European Union scholarship No. E06D101036CO and Colfuturo. We are particularly indebted to Dr. Montserrat Martínez-Gomariz, Lola Gutiérrez and María Luisa Hernáez from the Proteomics Facility of the Universidad Complutense de Madrid-Parque Científico de Madrid, Spain (UCM-PCM), which is a node of the ProteoRed-Genoma España Network. We thank Ana Burton for reading and commenting on the manuscript. LIST OF ABBREVIATIONS CHAPS: 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate 2D: two-dimensional DNP: 2,4-dinitrophenylhydrazone DNPH: 2,4-dinitrophenylhydrazine 2D oxyblot: 2D Western blot DTT: dithiothreitol EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid IEF: isoelectric focusing IPG: immobilized pH gradient LPC: L-α-lysophosphatidylcholine MALDI: matrix-assisted laser desorption/ionization MEGA 10: decanoyl-N-methylglucamide MS: mass spectrometry SDS-PAGE: SDS-Polyacrilamide gel electrophoresis PVDF: polyvinylidene fluoride PMF: peptide mass fingerprinting ROS: reactive oxygen species SDS: sodium dodecyl sulphate TOF: time-of-flight. Trabajo Experimental II _   114 REFERENCES 1. Butterfield, D. A.; Reed, T.; Newman, S. F.; Sultana, R., Roles of amyloid beta-peptide-associated oxidative stress and brain protein modifications in the pathogenesis of Alzheimer's disease and mild cognitive impairment. Free Radic Biol Med 2007, 43, (5), 658-77. 2. 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Anal Biochem 1998, 263, (1), 31-8. Oxidative stress responses in cerebral malaria maintain the redox balance in mouse brain María Linaresa,b,*, Patricia Marín-Garcíaa,b,c,*, Susana Pérez-Benaventea, Antonio Puyeta,b, Amalia Dieza,b and José M. Bautistaa,b, ‡ aDepartamento de Bioquímica y Biología Molecular IV, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid, Ciudad Universitaria, 28040 Madrid, Spain. bInstituto de Investigación Hospital 12 de Octubre. Madrid. cDepartamento de Ciencias Morfológicas y Biomedicina, Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Europea de Madrid, Campus de Villaviciosa de Odón, 28640, Madrid, Spain. *Both authors have contributed equally; ‡ Corresponding Author e-mails: marialinares@vet.ucm.es; patricia8149@bio.ucm.es; susipz@vet.ucm.es ; apuyet@vet.ucm.es; adiez@vet.ucm.es; jmbau@vet.ucm.es Submitted to Free Radical Biology and Medicine Trabajo Experimental III 119 ABSTRACT Oxidative stress has been attributed both a key pathogenetic and rescuing role in cerebral malaria (CM). In a 4-stage Plasmodium berghei ANKA murine model of CM, redox signalling and functioning were examined during the course of neurological damage. Host antioxidant defences were early altered at the transcriptional level indicated by the gradually diminished expression of sod-1, sod- 2, sod-3 and cat genes. In disease stage IV, this led to the dysfunctional activity of superoxide dismutase and catalase in damaged brain regions. Vitagene associated markers (hsp70 and trx-1) also showed a decaying expression pattern that paralleled the reduced expression of the transcription factors park7, foxo3 and xbp1 with a role in preserving brain redox status. However, the oxidative stress markers ROS/RNS were not accumulated in the brains of CM mice and redox proteomics and immunohistochemistry failed to detect quantitative or qualitative differences in protein carbonylation. Thus, the loss of antioxidant capacity was compensated in all cerebral regions by progressive upregulation of ho-1 from disease stage I to IV, and in specific regions by early gpx-1 upregulation. Our findings reconcile the apparent inconsistency between the lack of oxidative metabolite build up and reported protective effect of antioxidant therapy against CM. Trabajo Experimental III _   120 INTRODUCTION Malaria is possibly the most serious human tropical disease that affects 5- 10% of the world population 1 and is responsible for some 300 million clinical cases 2. Malaria caused by Plasmodium falciparum has the highest rates of mortality in children because of its most life-threatening complication cerebral malaria (CM). This is an acute neurological condition characterized by seizures, metabolic acidosis, hypoglycaemia and coma 3. CM has a mortality rate of 10-14% and causes 1-2 million annual deaths among young children predominantly in sub-Saharan Africa and Southeast Asia 4, representing some 80% of fatal cases of malaria 5. Moreover, child survivors often show long-standing neurocognitive sequelae, particularly in Africa 3, 6. The precise mechanisms leading to the onset of this neuropathy are unclear but seem to be triggered by several coexisting pathogenic factors including parasite sequestration in the brain microvasculature, an exacerbated host immune response, metabolic dysfunction, hypoxia and a neuroprotection/neurotoxicity imbalance 7-11. Prior studies have attributed an important role in CM development to an altered redox equilibrium 12-15. Some authors have suggested that reactive oxygen species (ROS), produced by both host and parasite, accumulate during the development of this acute neurological condition promoting oxidative stress 12-15. The increased production of free radicals (e.g. superoxide anion and hydroxyl radical) has been observed in activated leucocytes 13, 16, endothelial cells during parasitized red blood cell (pRBC) adhesion 12, 17 and, most strikingly, during haemoglobin digestion in the parasite food vacuole 13, 18, 19. During this latter process, part of the free haem population escapes its crystallisation to haemozoin and is oxidised generating intracelullar ROS 13, 18, 20. This, in turn, causes protein oxidation in the parasite and host membranes 21, 22. In addition, increased iron levels in an oxygen-rich environment, such as that of the brain, can further enhance the production of free radicals 23-26. Trabajo Experimental III 121 Indeed, enhanced ROS production during the course of CM is thought to play both a beneficial and pathological role depending on the amount and place of release 12, 13. Beneficial ROS effects contest parasite growth 12, 13 whereas prolonged ROS exposure in the host brain tissue damages endothelial cells 12-14, 27, 28, neurons and glia 16, 18. In addition, several antioxidant treatments have shown protection against experimental CM 14, 17, 29-31 and prevention of persistent cognitive damage 14. Notwithstanding, some studies have failed to observe ROS accumulation and oxidative stress during CM 32, questioning the role played by these molecules in the pathogenesis of this disease 16. On the other hand, intra and extracellular antioxidant defences exist in the host to prevent oxidative stress, whereby the superoxide radical is reduced by superoxide dismutase (SOD) to hydrogen peroxide. Three types of SOD isoenzymes have been identified in brain: the widely expressed cytosolic Cu/Zn-SOD (SOD-1), mitochondrial Mn-SOD (SOD-2) and copper- and zinc- extracellular SOD (SOD-3) 33, 34. Hydrogen peroxide is reduced to water by both catalase (CAT), a peroxisomal enzyme with a central function in brain cells, and glutathione peroxidase (GPX). Among the eight different mammalian GPX isoforms, cytosolic GPX-1 is essential for brain antioxidative defence 35. Thus, host defence systems impede the transformation of both superoxide radicals and hydrogen peroxide into the very reactive hydroxyl radical, and the reaction between superoxide anion and nitric oxide to form peroxynitrite. These two reactive products rapidly react with lipids, proteins or nucleic acids to produce cell damage 12, 13, 27. Brain cells overcome oxidative stress through additional antioxidant pathways such as those involving heat shock proteins (HSP), heme oxygenase (HO), and thioredoxin (TRX). Like other HSP, the inducible HSP70 acts as chaperone binding and regulating the activity of other proteins; inducible HO-1 is responsible for detoxifying free haem; and TRX-1, the cytoplasmic TRX isoform widely expressed in brain, cooperates with TRX reductase to reduce disulfide bridges in proteins, detoxify peroxides in concert with peroxyredoxins and TRX reductases and also acts alone as an antioxidant or ROS scavenger 36, 37. Trabajo Experimental III _   122 As in other neurological diseases 33, 36, it is postulated that host antioxidant systems fail during the course of CM 13. Indeed, the findings of several studies point to the idea that antioxidant systems in the host brain could be involved in the development of CM, although their pathophysiological role is still a matter of debate 13, 26, 38, 39. In the present study, we examined the state of host antioxidant defences and their role in oxidative damage during the course of CM in a mouse experimental cerebral malaria model (ECM). Here we report the dysfunction of several host antioxidant systems associated with the reduced expression of transcription factors involved in preserving brain host redox status. Oxidative stress markers failed to accumulate in brain regions in parallel with the compensatory induction of two major antioxidant enzymes. Our results reconcile the controversial idea of a lack of oxidative stress build up with the known protective effect of antioxidant therapy against CM. METHODS Induction of experimental cerebral malaria and disease assessment All experiments with animals were conducted at the Universidad Complutense de Madrid in accordance with national and international guidelines for animal care. The study protocol was approved by the Animal Experimentation Committee of the Complutense University. The experimental mice used were 44 five-week-old male C57BL/6 mice, as a CM susceptible strain. The animals were purchased from Harlan Ibérica (Barcelona, Spain) and housed under standard conditions and supplied with food and water ad libitum. The drinking water of infected mice was supplemented with p-amino- benzoic acid. Animals were allowed to accommodate to their new environment for at least 2 days before infection. Trabajo Experimental III 123 In 32 mice, CM was induced by intraperitoneal (i.p.) injection of 5x106 pRBC obtained from P. berghei (ANKA) infected mice. Twelve uninfected mice were used as healthy controls. Infection progression was monitored daily by inspection of clinical signs including ruffled fur, abnormal gait, tremor, reduced grip strength, affected startle/touch response, abnormal visual response, reduced motility, head deviation, hemi- or paraplegia, tendency to roll over on stimulation, back elevation, ataxia and convulsions. Parasitaemia was monitored daily (from day 2 post- infection) by microscope counts conducted on thin film blood smears of tail vein blood stained with Wright’s eosin methylene blue solution (Merck). The infected mice developing CM were classified into 4 stages using the method of clustering animals by neurological symptoms as previously described 9. After their sacrifice by cervical dislocation, the olfactory bulb, frontal cortex, hippocampus, thalamus-hypothalamus, cerebellum and brainstem were immediately removed. Mouse antioxidant system and transcription factor expression assays Total RNA was isolated from the olfactory bulb, hippocampus, frontal cortex, thalamus-hypothalamus, cerebellum and brainstem in control and CM mice using an ABI PRISM® 6100 Nucleic acid Prepstation according to the manufacturer’s instructions (Applied Biosystems). Contaminating DNA was removed using the DNA-freeTM Kit (Ambion). Reverse transcriptase (RT) reactions were performed using High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems) at a 1:1 proportion of isolated RNA and RT master mix. The thermal cycling conditions were: 25ºC: 10 min, 37ºC: 2 h and 85ºC: 5 min. Antioxidant molecules and transcription factor (TF) messenger RNA (mRNA) levels were determined by quantitative RT-PCR (qRT-PCR). The relative abundance of mouse antioxidant enzymes was assessed by the 5’fluorogenic nuclease assay (TaqMan) of the ABI 7700 Prism Sequence Detector system (Applied Biosystems). In separate PCR reactions, a commercial mixture of mouse specific primers and probes for sod-1, sod-2, sod-3, gpx-1, cat, trx-1, ho-1, hsp70, Parkinson disease 7 (park7), forkhead box O1 (foxo1), forkhead box O3 (foxo3), X-box binding Trabajo Experimental III _   124 protein 1 (xbp1) and the house keeping β-actin genes (Assays-on-DemandTM Gene Expression products, TaqMan MGB probes) were used, all of which were prepared as a TaqMan PCR master Mix, No Amperase UNG (all from Applied Biosystems). The specificity of the primers and probes used was verified by basic local alignment search tool (BLAST) analysis, comparing the mouse genes selected to the Plasmodium berghei genome and no significant similarity was found. The β-actin gene served as an endogenous control to check for any slight variation in the initial concentration, the total RNA quality and the conversion efficiency of the reverse transcription reaction. PCR reactions were conducted as an initial incubation of 10 min at 95ºC for polymerase activation, followed by 40 cycles (melting 15 s at 95ºC, annealing and extension 1 min at 60ºC) using an ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). The relative amount of RNA was determined by the comparative Ct method (2-ΔΔCT method) 40. N-fold changes were calculated by expressing the quantity of mRNA for each molecule present in each mouse vs. the mean quantity of mRNA for the molecule detected in control mice. Western blot analysis Total tissue protein was extracted from the brainstem of control and CM mice in all stages classified. 10 μg of each protein extract were separated on a 12% sodium dodecyl sulphate (SDS)-acrylamide gel and transferred to nitrocellulose membranes (Protran, Whatman) and then blocked for 1 h using phosphate buffer saline (PBS)-Tween 0.05% solution containing 5% non fat skimmed milk. Next, the commercial polyclonal antibodies anti-SOD-1 (1/2500, Assay designs), anti-CAT (1/5000, GeneTex) or anti-glyceraldehyde 3-phospate dehydrogenase (GADPH) (1/4000, Applied Biosystems) were probed overnight at 4ºC. Finally, membranes were incubated 1 h at room temperature with horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit-IgG (1/5000) and visualised by the ECL method (Super Signal Substrate Western Blotting kit, Amersham Biosciences). Trabajo Experimental III 125 Chemiluminescence images were quantified by densitometry using Quantity-One 1-D analysis software (Bio-Rad). Relative optical density was calculated as the normalized expression of the enzyme in each mouse relative to the mean value obtained in control mice. CAT and SOD activity 100 μg of total brainstem and cerebellum protein extract from animals at the most severe stage of CM 9 were loaded onto a 15 % or 8 % native acrylamide gel (for SOD or CAT activity, respectively) in Tris-glycine running buffer and run at 120V. SOD-1 and 2 were visualized as described previously 41. Briefly, gels were stained with 2,4 mM nitrobluetetrazolium containing 28 µM riboflavin and 28 mM N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) in the dark for 30 min. The gels were then observed under bright fluorescent light and scanned. Both SOD-1 and 2 enzyme activities were visualized as achromatic bands against a dark background. For CAT activity analysis, following electrophoresis, the gels were stained as previously described 42, 43 with minor modifications. Briefly, gels were extensively rinsed in deionized water. After a 10 min soak in 0.003% hydrogen peroxide, a staining solution consisting of 1% potassium ferricyanide and ferric chloride was added. Areas of CAT activity appear as clear bands on a blue green background. In both assays, protein loading was determined by Coomasie Brilliant Blue staining. Bands were quantified using Quantity-One 1-D analysis software (Bio-Rad). Relative optical density was calculated as the normalized enzyme activity in each mouse relative to the mean value obtained in control mice. Reactive oxygen species Cerebella and brainstems from animals at stage IV of CM 9 were homogenized in cold phosphate buffer and total reactive oxygen species and/ or reactive nitrogen species (ROS/RNS) contents (including hydrogen peroxide, peroxyl radical and peroxynitrite anion) were determined using the OxiSelectTM In Vitro ROS/RNS Assay Kit (Cell Biolabs, INC) following the manufacturer's instructions. Trabajo Experimental III _   126 Protein carbonylation Oxyblot analysis Cerebella from control and CM at stages III-IV were pooled and homogenized in modified RIPA lysis buffer [50 mM Tris-HCl, pH 8 and 50 mM NaCl, supplemented with detergents: 3% (w/v) 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS); 0.5% (w/v) decanoyl-N- methylglucamide (MEGA 10); 0.5% (w/v) L-α-lysophosphatidylcholine (LPC), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) free protease inhibitor cocktail and butylated hydroxytoluene (BHT)]. Protein was extracted and derivatized before 2D- electrophoresis as previously described 44. Derivatized proteins were precipitated using trichloroacetic acid (TCA)-acetone and resuspended in a buffer containing 7 M urea, 2 M thiourea, 4% (w/v) CHAPS, 0.5% (w/v) MEGA-10, 0.5% (w/v) and 10 mM dithioerythritol. Proteins were cup-loaded onto immobilized PH gradient (IPG) strips (pH 3- 11 NL, 18 cm) that had been previously hydrated overnight in a buffer containing 7 M urea, 2 M thiourea, 4% (w/v) CHAPS, 1.2%(v/v) DeStreak and 0.5% ampholites, pH 3-11. First-dimensional separation was by isoelectric focusing (IEF) using the IPGphor 3 IEF system (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) at 20ºC. The voltage was gradually ramped: 3 h 300 V, 6 h 300-1000 V, 3 h 1000-8000 V, and a final step- n-hold at 8000 V for the next 7 h. The run was terminated after ∼70.000 V h. The focused strips were equilibrated in equilibration solution (50 mM Tris 8.8, 6 M urea, 30% glycerol, 2% SDS) containing 1% dithiothreitol reducing agent for 10 min, and transferred to 4% iodoacetamide equilibration solution for a further 10 min. The second-dimension SDS-PAGE was run on homogeneous 12.5% T and 2.6% C casted polyacrylamide gels. Electrophoresis was carried out at 4ºC, 2 W overnight using two Hoeffer units. For each experimental condition (CM or control), 4 gels were run in parallel under identical 2D electrophoresis conditions. Two gels (loaded with 200 μg of protein/gel) were stained with Sypro Ruby to visualize total proteins and the other two gels (loaded with 40 μg of protein/gel) were used for subsequent carbonyl Trabajo Experimental III 127 modified protein detection. These two gels prepared for CM and control animals were transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes and transfer efficiency was confirmed by: (i) gel staining with Sypro Tangerine before transfer and (ii) membrane staining with Sypro Ruby. Any potential interference of Sypro Tangerine during immunodetection was previously discarded. Carbonyl groups in the transferred membranes containing derivatized proteins were immunodetected as previously described 44 using the anti-2,4- dinitrophenylhydrazone (2,4-DNP) primary antibody (1/10000 Sigma). Gel and immunoblot images were analyzed using Quantity-One 1-D and PDQuest analysis software (BioRad Laboratories Inc, Munich, Germany). The total amount of protein carbonylation was normalized to total protein content and referred to the mean value obtained in control mice. Immunohistochemistry Control and infected mice were sacrificed and whole brains removed and subjected to a cryoprotection process. 10-µm sagittal sections of brain tissue were cut using a Leica 3050 M cryostat and incubated as described previously 45. Briefly, slides were fixed in ethanol:diethylether (1:1 v/v) for 15 min and then reacted with 2,4-dinitrophenylhydrazine (2,4-DNPH) by immersing in 15 mM 2,4-DNPH in absolute ethanol containing 1.5% concentrated sulphuric acid overnight at room temperature. Sections were washed in absolute ethanol containing 1.5% (v/v) concentrated sulphuric acid for 5 min, rehydrated in a graded series of ethanol solutions (95, 70, 50, 30%) for 3 min each, and washed twice in PBS for 5 min. Endogenous peroxidase was inactivated with 1% hydrogen peroxide for 45 min. Slides were blocked in PBS containing 1% bovine serum albumin, 5% foetal bovine serum and 0.2% TritonX-100 for 1 h and then incubated with anti-2,4-DNP primary antibody (1/200, Sigma) for 1 h at room temperature. Next preparations were incubated in avidin-biotin complex using the Elite Vectastain kit (Vector Laboratories) following the manufacturer’s instructions. Trabajo Experimental III _   128 Chromogen reactions were performed with diaminobenzidine (Sigma) and 0.003% hydrogen peroxide for 10 min. Finally brain sections were coverslipped with FluorsaveTM Reagent and visualised using a Nikon YS2-H microscope. Statistical analysis Data are presented as the mean ± standard deviation. The Mann Whitney U and Kruskal-Wallis non-parametric tests were used to compare two or more groups respectively. Analyses were performed independently for each molecule and region. All statistical tests were performed using the SPSS 15.0 statistics package. The level of significance was set at a P ≤ 0.05. RESULTS SOD and CAT expression during the clinical course of ECM During the course of cerebral malaria, ROS may accumulate in the brain as a consequence of vigorous haemoglobin degradation by the parasite, pRBC endothelial adhesion and the host immune response 12, 13. Since increased ROS production can affect brain function 14, 16, host antioxidant systems are likely to play a major role in ROS detoxification during CM. This action especially involves removal of the superoxide radical and hydrogen peroxide to hinder their transformation into the very reactive hydroxyl or peroxynitrite radicals by reaction between the superoxide anion and nitric oxide 13, 27. In this environment, the three SOD isoenzymes reduce the superoxide radical to hydrogen peroxide, which is then reduced to water by CAT 33-35. To examine the roles of these enzymes during cerebral malaria, mRNA expression levels of sod-1, sod-2, sod-3 and cat genes were determined by qRT-PCR during the course of infection. Transcription levels of all these enzymes were significantly and steadily downregulated until stage IV in all brain regions examined (from 2-6 fold depending on the region), and were most remarkably reduced in the brainstem, olfactory bulb and cerebellum (Figure 1). Trabajo Experimental III 129 sod-1 sod-2 sod-3 gpx-1 Cerebellum -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Brainstem -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Hippocampus -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n * * * * C I II III IV C I II III IV C I II III IV C I II III IV * * C I II III IV C I II III IV Olfactory Bulb -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Frontal Cortex -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Thalamus-Hypothalamus -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e Ex pr es si on Figure 1.- Expression of sod and cat mRNA. sod-1, sod-2, sod-3 and cat mRNA levels in the cerebellum, olfactory bulb, brainstem, frontal cortex, hippocampus and thalamus-hypothalamus detected in control (C) and CM mice at different disease stages (I-IV). Data are the mean ± standard error of determinations in 5-7 animals. P values for significant differences observed in the cerebellum: sod-1, sod-2, cat, P ≤ 0.001; sod-3, P ≤ 0.005; olfactory bulb: sod-1, sod-2, sod-3, cat, P ≤ 0.001; brainstem: sod-1, sod-2, sod-3, cat, P ≤ 0.001; frontal cortex: sod-1, sod-2, cat, P ≤ 0.001; sod-3, P ≤ 0.005; hippocampus: sod-2, P ≤ 0.001; cat, P ≤ 0.01; sod-1, sod-3, P ≤ 0.05; and thalamus-hypothalamus: cat, P ≤ 0.001; sod-1, sod-2, P ≤ 0.005; sod-3, P ≤ 0.05. * P ≤ 0.05. According to these results, we then determined the expression of SOD and CAT at the protein level. Being one of the regions most affected by CM 9, 46, the brainstem was analyzed for the protein expression of both SOD and CAT during the course of disease. Plasmodium berghei expresses two SOD forms which show 94% and 64% sequence identity with the SOD-2 mouse enzyme. Commercial antibodies raised against mouse SOD-2 showed cross-reactivity with the P. berghei SOD protein and revealed the same molecular weight in SDS-electrophoresis (data not shown). Trabajo Experimental III _   130 Thus, only the cytosolic Cu/Zn-SOD isoenzyme (SOD-1), which is widely expressed in mammalian brain, was examined by Western blotting. No significant variations were detected in SOD-1 or CAT protein levels in control and CM mice at any stage of disease (Figure 2). NS 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 C I II III IV R el at iv e O D CAT GADPH C I II III IV NS 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 C I II III IV R el at iv e O D SOD-1 GADPH C I II III IV A B Figure 2.- Expression of SOD and catalase. Western blot analysis of SOD-1 (A) and CAT expression (B) in the brainstems of control (C) and infected mice at different disease stages (I-IV). Anti-GADPH antibody was used to demonstrate equal loading of protein samples. Relative optical density (OD) values given are the mean ± standard error for determinations in 4 to 7 animals. NS, not significant. Diminished enzyme activities of SOD and CAT in ECM The altered turnover of proteins has been recently reported in CM 9. Thus, the build up of misfolded proteins could mask gene downregulation at the protein level. The functionality of SOD and CAT proteins was addressed by native gel electrophoresis and differential activity staining in two of the most affected regions, brainstem and cerebellum at the most severe disease stage. Once again, these experiments revealed a band corresponding to parasite SOD at the expected size for mammalian SOD-2 (data not shown). However, despite the possible contribution of parasite SOD activity, both SOD-1 and SOD-2 activities were significantly reduced up to 3-fold in CM stage IV, depending on the brain region examined (Figure 3A). In parallel, CAT activity was reduced up to 1.5-fold (Figure 3B). These findings support the mRNA downregulation observed earlier for the genes encoding these antioxidant enzymes. Trabajo Experimental III 131 A B Brainstem 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 C IV C IV SOD-1 SOD-2 R el at iv e O D Cerebellum 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 C IV C IV SOD-1 SOD-2 R el at iv e O D CAT Cerebellum 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 C IV R el at iv e O D CAT Brainstem 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 C IV R el at iv e O D * * ** * * Figure 3.- Activity of SOD and catalase. Activity analysis of SOD-1 and SOD-2 (A) or CAT (B) activities in the brainstem and cerebellum of control (C) and stage IV CM mice. Values given are the mean ± standard error for 4 to 5 animals. P values for significant differences in SOD-1, SOD-2 and CAT activity observed in the brainstem and cerebellum, P≤0.05. *P≤0.05. Expression of hsp-70 and trx-1 during the clinical course of ECM It has been recently proposed that HSP are part of an extended network of stress response genes and cytoprotection genes called the vitagene system, which also includes thioredoxins 36. These molecules not only exert different antioxidant functions but also act as key regulators of essential cell processes 37, 47. Particularly, it has been reported that HSP70 regulates sod-1 gene expression and the enzyme activities of SOD-1, SOD-2 and CAT 48, 49. Moreover, diminished hsp70 gene expression leads to the build up of misfolded proteins 36. In this context, we examined possible vitagene system modifications during CM progression by determining hsp70 and txr-1 mRNA expression. Thus, hsp70 mRNA was significantly and gradually downregulated until disease stage IV in all brain regions (from 3 to 6-fold, depending on the region) (Figure 4A) and txr-1 expression was also downregulated (from 1.5 to 5.0-fold) (Figure 4B), the reduction being significant in all regions except the frontal cortex. The two molecules were mostly downregulated in the brainstem and cerebellum (Figure 4). Trabajo Experimental III _   132 * C I II III IV * (CB; O.B.; BS; HIP; T-H) NS (CX) C I II III IV A B hsp70 -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n txr1 -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n CB O.B. BS CX HIP T-H CB O.B. BS CX HIP T-H Figure 4.- Expression of hsp70 and txr-1 mRNA. Changes in the expression of hsp70 (A) and txr-1 (B) mRNA in the cerebellum (CB), olfactory bulb (O.B.), brainstem (BS), frontal cortex (CX), hippocampus (HIP) and thalamus-hypothalamus (T-H) observed in control (C) and CM mice at different disease stages (I-IV). Data are the mean ± standard error of determinations in 5-7 animals. P values for significant differences detected in hsp70: in all analyzed regions, P≤0.001; txr-1: in O.B., P≤0.005; BS, P≤0.01; CB, HIP, T-H, P≤0.05. *P≤0.05. Expression of transcription factors in brain controlling antioxidant host defences PARK-7, XBP-1 and the FOXO family of transcription factors regulate the expression of several antioxidant enzyme genes. To investigate the potential role of these TF in the observed downregulation of antioxidant molecules, we examined park7, foxo1, foxo3 and xbp1 mRNA expression. Host brain park7, foxo3 and xbp1 genes showed significant steady downregulation until stage IV from 1.6 to 5.0-fold depending on the brain region. Again, greatest variation was observed in the cerebellum and brainstem (Figure 5). Trabajo Experimental III 133 The foxo1 expression pattern varied according to brain region. Thus, besides the significant gradual downregulation observed in the olfactory bulb (up to 2-fold at stage IV), an early up-regulation was observed in the frontal cortex and cerebellum (up to 1 fold at stage II) which then decreased as neurological symptoms progressed (Figure 5). This pattern was only statistically significant for the cortex. Although significant changes were not observed in any other region, a downregulation tendency was observed in the brainstem, hippocampus and thalamus-hypothalamus (up to 1.5-fold at stages III-IV) (Figure 5). Cerebellum -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Olfactory Bulb -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Brainstem -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Hippocampus -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Thalamus-Hypothalamus -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n Frontal Cortex -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n * (PARK7; FOXO3; XBP1) NS (FOXO1) * * C I II III IV C I II III IV C I II III IV C I II III IV C I II III IV C I II III IV * (PARK7; FOXO3; XBP1) NS (FOXO1) * (PARK7; FOXO3; XBP1) NS (FOXO1) * (PARK7; FOXO3; XBP1) NS (FOXO1) park7 foxo1 foxo3 xbp1 Figure 5.- Expression of park7, foxo1, foxo3 and xbp1 mRNA. Expression of mRNA for park7, foxo1, foxo3 and xbp1 in the cerebellum, olfactory bulb, brainstem, frontal cortex, hippocampus and thalamus- hypothalamus observed in control (C) and CM mice at different CM disease stages (I-IV). Data are the mean ± standard error of determinations in 5-7 animals. P values for significant differences detected in the cerebellum: park7, xbp1, P≤0.001; foxo3, P≤0.005; olfactory bulb: park7, foxo1, xbp1, P≤0.001; foxo3, P≤0.005; brainstem: park7, xbp1, P≤0.001; foxo3, P≤0.005; frontal cortex: park7, xbp1, P≤0.001; foxo3, P≤0.01; foxo1, P≤0.05; hippocampus: xbp1, P≤0.001; park7, P≤0.005; foxo3, P≤0.05; and thalamus- hypothalamus: park7, xbp1, P≤0.001; foxo3, P≤0.05. *P≤0.05; NS, not significant. Trabajo Experimental III _   134 ROS/RNS production and protein carbonylation are not elevated in CM To determine if the altered levels of antioxidant enzymes observed could lead to higher ROS production and intracellular oxidative stress, we quantified reactive oxygen and/or nitrogen species and protein oxidation. ROS/RNS production (including the catalase substrate, hydrogen peroxide and the superoxide by-product, peroxynitrite anion) was evaluated in the two most affected regions, brainstem and cerebellum, at the most severe stage of infection (stage IV). However, no significant differences were observed between CM mice and uninfected animals (Figure 6). Figure 6.- ROS/RNS levels. ROS/RNS levels detected in control mice (C) and infected mice at disease stage IV (IV) in the brainstem (BS) and cerebellum (CB). Data are the mean ± standard error of determinations made in 3-5 animals calculated as nmol of ROS/RNS normalized to each milligram of tissue in each animal. NS, not significant. Protein carbonylation is one of the most common oxidation markers in biological systems. We thus explored the carbonyl contents of individual proteins and the distribution pattern of protein carbonyls in the brains of CM mice at the most severe disease stages by 2D oxyblot and immunohistochemical analyses. Similar 2D oxyblot patterns and spot numbers were observed for cerebellum specimens obtained from CM or uninfected mice (Figure 7A). Thus, between technical replicates control mice showed 69 common spots and CM samples yielded 53 common spots. More than 90% of these CM spots were also present among the spots to control mice. According to this analysis, it can be considered that protein carbonylation in brain did not vary significantly between infected and uninfected mice (Figure 7B). To confirm this, protein carbonylation distribution patterns were investigated by immunolabelling carbonyl groups in all analyzed regions and again no differences were observed between experimental and control animals (Figure 7C). NS NS 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 C IV C IV BS CB nm ol p er m g of ti ss ue NSNS NSNS 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 C IV C IV BS CB nm ol p er m g of ti ss ue Trabajo Experimental III 135 A B 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 C III-IV R el at iv e O D NS C III-IV C GL GL GL GL C V Figure 7.- Carbonyl modified proteins detected by Western blotting. Oxyblot images (A) and total carbonyl modified proteins (B) for cerebellum specimens obtained from control (C) or infected mice at disease stages III and IV (III-IV). Images are representative of two independent experiments. Relative optical density (OD) values given are the mean ± standard error of two independent experiments using a pool of 2-3 different animals. NS, not significant. C: Immunohistochemical distribution profiles of protein carbonylation in brain slices prepared from control (C) and stage IV CM mice (IV). Images show the localization of carbonyl modified proteins in the cerebellum. Trabajo Experimental III _   136 Upregulation of ho-1 and gpx-1 during the clinical course of ECM The lack of correlation between the diminished functionality of the antioxidant systems analyzed and oxidative stress production suggests the compensatory antioxidant activity of other antioxidant systems. Since ho-1 upregulation is modulated by inflammatory cytokines induced during CM 16, 50 and GPX could compensate the partial lack of peroxide detoxification by CAT and TXR, we then examined the corresponding mRNA expression level of ho-1 and gpx-1 genes during CM progression. A B C I II III IV * (CB; BS; T-H) NS (O.B; CX; HIP ) gpx-1 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n * C I II III IV ho-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 Lo g n- Fo ld C ha ng e in E xp re ss io n CB O.B. BS CX HIP T-H CB O.B. BS CX HIP T-H Figure 8.- Expression of ho-1 and gpx-1 mRNA. mRNA expression of heme oxygenase (A) and glutathione peroxidase (B) in the cerebellum (CB), olfactory bulb (O.B.), brainstem (BS), frontal cortex (CX), hippocampus (HIP) and thalamus-hypothalamus (T-H) detected in control mice (C) and CM mice at different disease stages (I-IV). Data are the mean ± standard error of determinations in 5-7 animals. P values for significant differences detected in ho-1: in all analyzed regions, P≤0.001; and gpx- 1: in BS, P≤0.005; CB, T-H, P≤0.05. *P≤0.05; NS, not significant. Trabajo Experimental III 137 Remarkably, ho-1 mRNA expression was progressively and significantly upregulated from disease stage 0 (controls) to IV by 8 to 15-fold depending on the brain area. Greatest expression was observed in the olfactory bulb, frontal cortex and brainstem (Figure 8A). In contrast, the gpx-1 expression pattern was not homogeneous across all brain regions. Thus, although significant downregulation was detected in the brainstem (up to 2-fold at stage IV), an early up-regulation was observed in most brain areas (up to 2-fold, depending on the region), and significantly higher gpx-1 mRNA levels were detected in the cerebellum and thalamus-hypothalamus. Greatest increases were observed at stage II (cerebellum, frontal cortex and hippocampus) or stage I (thalamus-hypothalamus) since expression levels fell in later disease stages (Figure 8B). DISCUSSION A known feature of malaria infection is that it causes oxidative stress in pRBC as a consequence of the parasite’s metabolism and the host response 11, 18, 20. However, the generation of local oxidative stress factors during cerebral malaria is still a matter of debate. Some authors suggest that ROS accumulation promotes oxidative stress 12-15 whereas others have failed to detect any markers of oxidative stress in this disease 32. Further, there is no general consensus as to the precise role played by oxidative stress in cerebral malaria. Although it could combat parasites and is essential for maintaining host homeostasis, oxidative stress could also activate signal transduction pathways and cause cell damage in the brain, both of which will significantly impact the pathophysiology and progression of CM 12, 13, 27, 28, 51. Mechanistically, many of these effects of oxidative stress involve the activation of specific transcription factors to control the expression of target genes mediating responses against this stress 51. On the other hand, several studies have demonstrated the protective effects of antioxidants in the neurological and cognitive alterations produced during murine cerebral malaria 14, 17, 29-31, suggesting the failure of host antioxidant mechanisms during CM 13. Trabajo Experimental III _   138 To address the oxidative stress status of the infected host brain and its implications in the neurocognitive damage produced by cerebral malaria, we examined a broad set of oxidative stress markers and antioxidant defence systems in host brain regions during the course of experimental CM. The unfeasibility of analysing the time-course of the clinical and molecular events that take place during human CM has determined a need to rely on experimental murine models of cerebral malaria 52. The P. berghei (ANKA) model of infection in 4-5 week-old C57BL/6 mice has been the most frequently used model because of its similarities with most of the pathophysiological features of human CM 5, 53-55. Since clinical symptoms during the course of experimental CM vary between individuals 53, 56, 57, animals were classified accordingly to the onset time of given neurological symptoms, as previously described 9. In this experimental setting, we observed the functional failure of host antioxidant defence system at the level of superoxide dismutase and catalase enzyme activities in brain. Moreover, at the mRNA level, the gradually reduced expression of the three sod isoenzyme and cat genes was seen to parallel the progression of neurological symptoms. Altered expression levels and the diminished activity of these enzymes has been reported in other neurological disorders 33, 58. Further, low CAT levels have also been detected in human malaria patients and murine pRBC while diminished SOD activity has been reported in P. falciparum pRBC 18. Abnormalities in the activities of these antioxidant enzymes have been suggested to cause neuronal cell death 58. SOD regulates several genes and proteins involved in apoptosis 33 and both SOD and catalase mediate neuroprotective effects 33, 59, 60. Thus, treatment with SOD and CAT can prevent cell damage in vivo 13. Further, SOD supplementation in vitro reduces the oxidative stress induced by the parasite 12, 17, 61. In experimental mouse models, treatment with SOD or CAT prolongs survival or prevents CM 13, 17, 33. During the pathogenesis of CM, the cytosolic form of SOD (SOD-1), besides preventing oxidative stress and upregulating the host’s antioxidant armature to enhance the activity of other antioxidants such as catalase, could also increase anti- inflammatory actions and induce nitric oxide production. The latter reduces the Trabajo Experimental III 139 adhesion of pRBC by ICAM-1 downregulation and exerts anti-plasmodial effects 12, 17. Because of all these functions, even moderate reductions in SOD-1 could have important functional consequences 62. Changes in SOD and CAT were not observed at the protein level. A plausible explanation is the dysfunction of the ubiquitin-proteasome, as proposed by others 9, 63. Misfolded aggregates of proteins have been demonstrated in other neurological diseases 33. In this context, the diminished expression of the antioxidant hsp70 gene observed here during CM progression could also contribute to the build up of misfolded proteins, since HSP prevent protein misfolding and aggregation after a variety of central nervous system insults such as oxidative stress 36, 47. Reduced SOD- 1 and SOD-2 activities have been observed in hsp70 knockout mice 48. HSP-70 might also modulate the cell response to toxic insult by increasing CAT activity 49. Thus, the SOD and CAT alterations detected in this study could be explained, at least in part, by the hsp70 downregulation observed during CM progression. HSP also play a role in neuroprotection through an array of pro-survival effects 47, 48 such as apoptotic signalling inhibition and inflammatory damage prevention by downregulating pro-inflammatory cytokines, which could also be responsible for cerebral damage during CM. In parallel with cat, sod and hsp70 downregulation, the expression of txr-1, another component of the host antioxidant defence system, was also reduced during CM progression. Diminished TRX-1 levels have been observed in the brains of patients with Alzheimer’s disease 37 and their upregulation has been linked to neuron survival following injury 36. Thus, TRX-1 promotes brain regeneration and neuroprotection in the normal brain and its deficiency could lead to the neurodegeneration produced in CM. The beneficial effects of TRX-1 could be attributed to its ability to enhance ROS detoxification and/or modulate signalling functions 37. These observed changes could explain why antioxidants protect against CM 14, 17, 29-31 and suggest the use of these antioxidant molecules as complementary therapeutic agents for the management of cerebral malaria and to reduce its neurological sequelae. Trabajo Experimental III _   140 In the last 20 years, a number of transcription factors that mediate critical transcription responses to oxidative stress have been identified 51. Thus, PARK7, XBP1 and the FOXO family of transcription factors regulate several antioxidant related genes 51, 64, 65. In our study, the expression of foxo3, xbp1 and park7 was downregulated in all the brain regions and, in general, foxo1 also showed this tendency. Therefore, the mechanism underlying reduced antioxidant gene expression during CM appears to be related to a decline in these TF. Diminished foxo expression has been described to lower sod-2 and cat expression 51, 66 and xbp1 knockdown has been found to decrease cat, sod-1 and trx-1 expression. As these molecules are not direct targets of XBP-1, these genes are probably regulated indirectly by this TF. Among these antioxidant genes, that encoding catalase appears to be especially crucial, since its expression has been closely linked to XBP1 64. In addition, XBP1 also regulates genes involved in protein folding 67. PARK7 is a regulator of antioxidant transcription responses that could act as an antioxidant protein and a molecular chaperone to inhibit aggregates in Parkinson’s disease 68. Moreover, it can also upregulate hsp70 to block protein aggregation in this disease 65, 69. Recently, it has been shown that PARK7 mediates cytosolic SOD-1 activation 70. Uncontrolled oxidative stress could damage host antioxidant defences 13. Peroxynitrite inhibits the function of SOD 33. Hence, we examined ROS production and protein carbonylation, as markers of oxidative stress. Oxidative stress has been observed both in P. falciparum and P. berghei pRBC 13, 21, 22. The endothelial cells of mice suffering ECM show oxidative DNA damage 15. In addition, cerebral malaria causes lipid peroxidation to a greater extent in human cerebrospinal fluid 71 than in mouse brain 14. However, we were unable to detect differences in the accumulation of ROS in mice brain with severe stage CM and uninfected controls. ROS rapidly react with proteins causing carbonylation. Carbonyl groups are excellent markers of intracellular oxidative stress because they are the final byproducts of multiple oxidation pathways that occur within the cell 72. However, neither total carbonylated proteins nor the number of individual carbonylated proteins in CM mice differed from those detected in control mice. The lack of alterations in total protein carbonyl contents in CM has been reported 32, and along with our results Trabajo Experimental III 141 suggests that ROS overproduction, if present, is well controlled in ECM and plays no major role in its pathogenesis. Given the oxidative modification of proteins predisposes them to proteolysis, some increased protein carbonylation might not be readily detected 32, 73. On the other hand, local ROS production 74 can be masked when analysing whole regions 32. It should be emphasized that according to our results, different antioxidant levels exist in different brain locations, in agreement with the findings of others 33. Thus, the lack of changes in the protein carbonylation distribution patterns in all the brain regions analyzed suggests that protein carbonylation cannot be used as a specific brain marker of cerebral malaria, probably due to an adaptation effect in all regions, independently of expression level differences in antioxidant defence genes. Among the differences in local antioxidant responses observed in the present study, the brainstem and cerebellum were the most affected regions, as previously detected for other dysfunctional factors 9, 57, 75, 76. Alterations in these specific regions could explain some of CM’s symptoms and sequelae, such as ataxia and impaired movement and balance 3, 6, 46, 76, 77. Globally, our results could also be explained by the compensatory induction of ho-1 and gpx-1 genes in several brain regions. HO-1 production is one of the earlier cellular responses to tissue damage 36. Bilirubin, one of the final products of haem degradation by HO-1, protects against the cytotoxic effects of the strong oxidants hydrogen peroxide and peroxynitrite 25, 36. Carbon monoxide, another by- product of the actions of HO-1, limits the production of free haem, exerts anti- inflammatory actions 25 and suppresses the pathogenesis of cerebral malaria in mice 26. Increased levels of HO-1 have also been observed in other neurological diseases 36 but expression levels of this molecule determined in the brains of CM patients and mice have been inconsistent 16, 24, 26, 38, 78. In humans, HO-1 has been detected in CM, but in some reports it is only observed in some patients and is not specific of CM 16, 38, 78. In mice, HO-1 shows a protective effect against ECM 24, 26, 79 and its elevated expression has been observed in moribund CM mice 80. ho-1 expression could be induced by several factors such as free haem and cytokines 16, which are early Trabajo Experimental III _   142 induced in ECM 9. GPX reduces hydrogen peroxide and organic hydroperoxides. As mentioned above, xbp1 deletion reduces several antioxidant enzymes but not gpx expression 64, supporting the different gpx-1 expression pattern observed in our ECM model. Elevated GPX activity has been observed in other neurological diseases such as Alzheimer’s 36 but, until now, its induction in CM had not been described. In conclusion, although we were unable to detect the build up of oxidative stress metabolites, a central role of antioxidant systems during the advance of cerebral malaria could not be excluded. The changes observed in these systems during the course of CM open new perspectives for the treatment of this disease. The pharmacological or nutritional manipulation of endogenous cellular defence mechanisms is an innovative approach to therapeutic intervention 36. In this context, the recently reported protective effect of curcumin against ECM 81 could be mediated by inducing the heat-shock response coupled to other antioxidant activities 36. Finally, our results also help reconcile the ongoing controversy over the lack of build up of oxidative stress metabolites during CM and the protective effects of some antioxidants against this devastating disease. ACKNOWLEDGEMENTS This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Education and Science (BIO2006-12355 and BIO2007-67885) and by the Research Teams Consolidation Programme of the UCM (Research Team 920267-Comunidad de Madrid). M.L. holds a FPU fellowship from the Spanish Ministry of Education and Science (AP20061576). We are particularly indebted to Dr. Montserrat Martínez- Gomariz and Marisol Fernández from the Proteomics Facilities UCM-PCM and CNB-PCM and which are components of the ProteoRed Network. We thank Ana Burton for reviewing the English and commenting on the manuscript. Trabajo Experimental III 143 LIST OF ABBREVIATIONS 2,4-DNP: 2,4-dinitrophenylhydrazone 2,4-DNPH: 2,4-dinitrophenylhydrazine BHT: butylated hydroxytoluene BLAST: basic local alignement tool CAT: catalase CHAPS: 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate CM: cerebral malaria ECM: experimental cerebral malaria EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid FOXO1: forkhead box O1 FOXO3: forkhead box O3 GADPH: glyceraldehyde 3-phospate dehydrogenase GPX: glutathione peroxidase HO: heme oxygenase HSP: heat shock protein IEF, isoelectric focusing LPC: L-α-lysophosphatidylcholine IPG: immobilized PH gradient MEGA 10: decanoyl-N-methylglucamide mRNA: messenger RNA PARK7: Parkinson disease 7 PBS: phosphate buffer saline pRBC: parasitized red blood cells PVDF: polyvinylidene fluoride qRT-PCR: quantitative reverse transcriptase-PCR RNS: reactive nitrogen species ROS: reactive oxygen species RT: reverse transcriptase SDS: sodium dodecyl sulphate SOD: superoxide dismutase TCA: trichloroacetic acid TEMED: N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine Trabajo Experimental III _   144 TF: transcription factor TRX: thioredoxin XBP1: X-box binding protein 1 Gene names appear as low-case italics of the corresponding protein abbreviations specified above. 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Por ello, los modelos animales constituyen una herramienta imprescindible y extraordinariamente útil para el estudio del desarrollo de la malaria cerebral. De hecho, gran parte de los hallazgos que se han visto tanto en pacientes como en muestras post-mortem, han sido observados originalmente en este tipo de modelos (Combes et al., 2005). Los modelos experimentales de malaria cerebral más utilizados son los murinos, ya que, aunque los modelos en primates muestran cambios patológicos similares a los de los humanos, también presentan inconvenientes como son la imprevisibilidad de la incidencia de esta complicación cerebral, la determinación del momento en el que comienza, los protocolos éticos y la falta de animales genéticamente modificados (Brian de Souza et al., 2009; Combes et al., 2005; de Souza & Riley, 2002; Lou et al., 2001). Así, para el estudio de la fisiopatología de la malaria cerebral, los modelos murinos son los de elección, debido a las numerosas similitudes que presentan con la enfermedad humana (Hunt & Grau, 2003). Entre todos los modelos murinos de malaria cerebral, la infección de ratones de la estirpe C57BL/6 con Plasmodium berghei ANKA ha sido nuestro modelo de elección para llevar a cabo los estudios del presente trabajo ya que reúne la mayoría de los síntomas con los que cursa la malaria cerebral en el hombre (Brian de Souza et al., 2009; Combes et al., 2005; Hunt Discusión general _   154 et al., 2006; Lou et al., 2001; Medana & Turner, 2006; Pierrot et al., 2003; White et al., 2010). Al igual que sucede en humanos, en este modelo la gravedad y mortalidad en los individuos infectados se incrementa de manera inversa con la edad, siendo más letal en los animales de 4 a 5 semanas de edad (Pierrot et al., 2003). Hasta la fecha no existe un consenso sobre la secuencia de eventos que se suceden durante la malaria cerebral (Brian de Souza et al., 2009; Combes et al., 2010), por lo que resulta de crucial importancia establecer un protocolo experimental que permita estudiar el desarrollo de esta patología. Para este propósito, la mayoría de investigadores definen la severidad de la enfermedad y sus manifestaciones en términos de días post-infección (Delahaye et al., 2007; Jennings et al., 1997; Lovegrove et al., 2006). Sin embargo, en vista de la heterogeneidad que presentan los animales en el desarrollo de los primeros síntomas y el consecuente progreso de la misma (Bagot et al., 2002; Brian de Souza et al., 2009; Cabrales et al., 2010; Carroll et al., 2010; Lackner et al., 2006; Vigario et al., 2007), parece más indicado clasificar a los animales de acuerdo con las manifestaciones neurológicas que van adquiriendo. Algunos autores han comenzado ya a establecer la clasificación de los individuos en dos grupos según si éstos desarrollaban sintomatología “leve” o “grave” (Penet et al., 2005), a la par que otros estudios sugieren la importancia de clasificar los síntomas de la malaria cerebral asignando puntuaciones que se establecen según diferentes tests que evalúan el comportamiento de los ratones (Amante et al., 2007; Carroll et al., 2010; Lacerda-Queiroz et al., 2010; Lackner et al., 2006; Reis et al., 2010). Por todo ello, un primer objetivo de este estudio fue el diseño de un nuevo protocolo de ensayo que permitiera clasificar los animales durante el desarrollo de la malaria cerebral murina atendiendo a su fenotipo neurológico mediante la evaluación de distintas funciones neurocognitivas y motoras. Con este fin, se justifica el uso del modelo de infección de ratones C57BL/6 con P. berghei ANKA porque, además de sus similitudes con la patología humana, la sintomatología clínica se adquiere de una forma más progresiva que en otros modelos de malaria cerebral, como es el caso de la infección con esta misma especie de Plasmodium en ratones CBA (Oakley et al., 2010). Discusión general 155 En nuestra clasificación de progreso de la enfermedad en cuatro estadios observamos que los animales infectados desarrollaban malaria cerebral a la par que mostraban diversas alteraciones características como lateralización, parálisis, motilidad alterada, debilidad, temblor, giros sobre sí mismos, elevación pélvica, falta de respuesta tras la estimulación, anemia, y erizamiento del pelo, síntomas que también han sido descritos en otros estudios de esta misma patología (Amante et al., 2007; Carroll et al., 2010; Lackner et al., 2006; Lou et al., 2001; Marin-Garcia et al., 2009). Sin embargo, en nuestro trabajo, no todos los animales mostraron todos esos signos clínicos, tan sólo la lateralización, la parálisis de las extremidades y la debilidad se observaron en el 100% de los mismos y, por tanto, fueron éstos los que se utilizaron para definir los distintos grupos de ensayo. En este contexto, cabe destacar que las alteraciones de la coordinación, la función motora y la fuerza se han visto asociadas de manera específica a la malaria cerebral. Además, al igual que sucede en nuestra clasificación, se ha puesto de manifiesto que la debilidad predomina en los animales que tienen alteraciones más severas (Lackner et al., 2006). Todos estos síntomas se manifiestan también en la patología asociada a la raza humana. En este caso, cuando la enfermedad se desarrolla en niños, también se ven afectadas las funciones motoras y las posturales (Idro et al., 2005). La lateralización incipiente y/o la parálisis parcial de alguna de las extremidades fueron los primeros síntomas neurológicos que se manifestaron en los animales infectados y que se definieron como patognomónicas del estadio II. Al igual que en trabajos anteriores estos primeros signos se observaron en nuestros animales a partir del día 6 post-infección (Bagot et al., 2002; Carroll et al., 2010; Lacerda-Queiroz et al., 2010; Lou et al., 2001), aunque en nuestro ensayo no todos los individuos presentaron los síntomas iniciales al mismo tiempo. Paralelamente al establecimiento de este tiempo de infección se definió el estadio I (estadio asintomático) como la ausencia de síntomas neurológicos en animales infectados hasta el momento en que éstos comienzan a aparecer en los otros ratones (aproximadamente hasta el día 6 del mismo ensayo). A partir del estadio II, los síntomas iniciales se agravaron progresivamente y dan lugar a los estadios III y IV, acompañándose de un incremento en la debilidad y una motilidad cada vez más reducida. Los síntomas más graves se manifestaron transcurridas entre 6 y 30 horas después de que apareciesen los primeros síntomas neurológicos (Figura 14). La Discusión general _   156 rápida complicación de los síntomas neurológicos observada en nuestro trabajo coincide con la descrita previamente por otros autores (Brian de Souza et al., 2009; Carroll et al., 2010; Lackner et al., 2006), aunque en éstos los animales no sean clasificados en estadios. Figura 14.- Caracterización del fenotipo neurológico asociado al progreso de la malaria cerebral en un modelo murino. Los animales infectados se clasificaron en cuatro estadios (I-IV) según los síntomas neurológicos que desarrollaban (eje horizontal superior). Tanto la adquisición como el progreso de las manifestaciones clínicas mostraron gran variabilidad temporal entre los distintos animales ensayados (eje horizontal inferior). Estos resultados sostienen que la sintomatología clínica que aparece durante el curso de la enfermedad se desarrolla de forma heterogénea entre los ratones infectados (Amante et al., 2007; Bagot et al., 2002; Brian de Souza et al., 2009; Cabrales et al., 2010; Carroll et al., 2010; Lackner et al., 2006; Vigario et al., 2007). Dicha heterogeneidad clínica de la malaria también ha sido observada en humanos (Brian de Souza et al., 2009; Medana & Turner, 2006; Schofield & Grau, 2005; van der Heyde et al., 2006). Es por tanto que esta nueva clasificación en estadios agrupados en función de la gravedad del cuadro neurológico de los individuos infectados resulta esencial para llevar a cabo estudios que ayuden a elucidar los procesos patológicos y clínicos claves de la enfermedad humana reduciendo al mínimo la variabilidad producida por la heterogeneidad en el desarrollo de la malaria cerebral experimental murina. Por otro lado, nuestra organización del modelo en estadios según el comportamiento puede resultar muy útil para la evaluación de terapias preventivas del desarrollo de las complicaciones neurológicas en enfermos de malaria. La Discusión general 157 administración rápida de antimaláricos es, hoy en día, el único tratamiento efectivo para que esta enfermedad no progrese hacia la forma cerebral (Oakley et al., 2010) y, sin embargo, un 15-20% de los pacientes desarrollan esta complicación (Newton & Krishna, 1998; Taylor, 2009). Además, debido a la dificultad de su diagnóstico, éste es incorrecto en un 25% de los casos que la sufren (Taylor et al., 2004). Por todo ello, es necesario establecer de forma temprana terapias más específicas para su tratamiento y nuevos métodos para el pronóstico. Así, este protocolo basado en la caracterización fenotípica de la malaria cerebral puede resultar útil en la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas y marcadores específicos de esta complicación en fases tempranas de la enfermedad, lo que presumiblemente podría contribuir a que el efecto de los tratamientos que se desarrollan en la actualidad sean más efectivos. 5.2.- FACTORES NEUROPROTECTORES EN LA MALARIA CEREBRAL Estudios recientes llevados a cabo en modelos animales de malaria cerebral han puesto de manifiesto la existencia de alteraciones en las vías de neuroprotección (Delahaye et al., 2007). Así, se ha visto que en el transcurso de esta patología se producen ateraciones neurocognitivas de diversa gravedad que pueden ser de carácter temporal o permanente como se deduce de las secuelas neurológicas que presentan algunos de los pacientes que se recuperan de la misma, especialmente en niños menores de 5 años (Boivin et al., 2007; Idro et al., 2010a; Idro et al., 2010b). La plasticidad sináptica, fenómeno mediante el cual las conexiones en las sinapsis se modifican en respuesta a la actividad y experiencia (Bingol & Sheng, 2011; Lu, 2003), parece estar jugando un papel crítico en la malaria cerebral, ya que los procesos cognitivos dependen del correcto establecimiento de estas conexiones. Por otro lado, el daño neuronal parece también ser un suceso clave de la misma (Medana & Turner, 2007; Rao et al., 2010), que podría estar acompañado por el daño en otras poblaciones celulares del sistema nervioso central (Bentivoglio et al., 2010; Medana et al., 2007; Medana et al., 2001; Miu et al., 2008; Penet et al., 2005). Por todo ello, un segundo objetivo de este estudio fue evaluar el papel que juegan distintos factores neuroprotectores en el desarrollo de esta patología. Discusión general _   158 El BDNF es una importante neurotrofina que se expresa de forma abundante en cerebelo, hipocampo y cortex y modula la integridad del sistema nervioso central, incluyendo los procesos de plasticidad sináptica y supervivencia neuronal. Este factor neurotrófico, capaz de actuar sobre distintos tipos celulares (Ebadi et al., 1997; Enstrom et al., 2008), está implicado en la regeneración de axones, el crecimiento y la diferenciación neuronal (Cunha et al., 2010; Gordon, 2009; Lu, 2003) y la supervivencia de otras células (Madri, 2009; Ruprecht et al., 2002). En diversas situaciones patológicas que comprometen al sistema nervioso central, se ha observado que variaciones en el nivel o en la distribución del BDNF pueden ocasionar alteraciones fisiológicas de la función cerebral (Zuccato & Cattaneo, 2009). Por ello, y debido a la creciente importancia clínica que está adquiriendo este factor neurotrófico (Fumagalli et al., 2006a), nos propusimos evaluar su posible implicación en el desarrollo de la malaria cerebral. Los análisis de PCR cuantitativa a tiempo real llevados a cabo en ratones infectados con P. berghei ANKA mostraron una expresión disminuida de los niveles de ARN mensajero de bdnf a lo largo del progreso de la enfermedad en las distintas regiones cerebrales ensayadas, siendo especialmente notable la disminución del mismo en el tallo y en el cerebelo. Las alteraciones observadas en los niveles de expresión de esta neurotrofina podrían ser responsables de los daños ocasionados en las poblaciones celulares cerebrales durante la malaria cerebral. Sin embargo, no se puede descartar un proceso inverso, donde el daño neuronal producido durante esta complicación esté mediando la disminución en sus niveles de expresión, ya que la transcripción de bdnf depende de la actividad neuronal (Lu, 2003). Debido a que el BDNF también juega un importante papel en la organización del endotelio (Donovan et al., 2000), la disminución de sus niveles de expresión podría ser responsable de las alteraciones que se producen en la barrera hematoencefálica durante el desarrollo de la malaria cerebral (Medana & Turner, 2006), lo que podría contribuir a acelerar el daño en otras poblaciones celulares del sistema nervioso (Hunt et al., 2006; Medana et al., 2001) y determinar así las alteraciones observadas en los procesos posteriores relacionados con la atención que aparecen como secuelas de la enfermedad en humanos (John et al., 2008). Discusión general 159 Alteraciones en los niveles de expresión de bdnf también pueden ser responsables de los cambios en la neurotransmisión descritos durante la malaria cerebral (Combes et al., 2005; Marin-Garcia et al., 2009) dada la capacidad de estas neurotrofinas de modular la eficacia de la transmisión sináptica (Lu, 2003). El BDNF es crítico para la supervivencia neuronal tras el daño cerebral (Ebadi et al., 1997), lo que sugiere que la alteración en sus niveles de expresión observada en nuestro estudio podría determinar un punto crítico de no retorno para el deterioro neurocognitivo observado en los pacientes que se recuperan. La reducción de los niveles de expresión de bdnf también ha sido descrita en la patogénesis de otros desórdenes neurológicos que afectan al aprendizaje y la memoria, como en el Alzheimer y a la capacidad motora como en el Parkinson o en la enfermedad de Huntington (Zuccato & Cattaneo, 2009). Esta neurotrofina facilita el proceso de plasticidad sináptica, de forma que niveles de BNDF inferiores a los requerimientos fisiológicos pueden alterar estos procesos mencionados (Cunha et al., 2010). Así, la interferencia de la función del BDNF puede producir daños cognitivos, déficits en el aprendizaje y alteraciones en la memoria (Cunha et al., 2010; Zuccato & Cattaneo, 2009), que se podrían relacionar con los trastornos en lenguaje y memoria observados en niños que se recuperan de la malaria cerebral (Amante et al., 2007; Boivin et al., 2007; Idro et al., 2005). Por todo ello, el BDNF podría estar jugando un papel crucial en la patogénesis de la malaria cerebral y/o en sus secuelas. En este sentido, cabe destacar que los ratones C57BL/6, susceptibles a desarrollar la enfermedad, presentan niveles basales de BDNF más bajos que otras cepas de ratones y se ha visto que no son capaces de restaurar los niveles originales tras una situación de estrés, al contrario de lo que sucede con otras cepas resistentes como es el caso de BALB/c (Lewitus et al., 2008; Madri, 2009). En el presente trabajo, los análisis de expresión de bdnf se determinaron en aquellas regiones cerebrales que parecen alteradas durante la malaria cerebral. En nuestro modelo, las mayores disminuciones en los niveles de expresión de esta neurotrofina se encontraron en tálamo-hipotálamo, cerebelo, tallo y cortex. Estudios previos, también llevados a cabo en modelos de malaria cerebral murina, han Discusión general _   160 puesto de manifiesto que existe un daño neuronal en estas mismas regiones (Lovegrove et al., 2006; Penet et al., 2005), lo que, teniendo en cuenta nuestros resultados, podría relacionarse con la disminución en los niveles de expresión de bdnf observada. El BDNF es particularmente abundante en el cerebelo, región central para el desarrollo de las funciones cognitivas (Cunha et al., 2010; Lessmann & Brigadski, 2009). Allí, se expresa abundantemente en los axones terminales de las células granulares que contactan con las células de Purkinje (Lessmann & Brigadski, 2009). Sin embargo, en este trabajo, el uso de técnicas inmunohistoquímicas puso de manifiesto que, en el estadio más avanzado de la enfermedad, el BDNF queda retenido en los cuerpos neuronales, reduciéndose su presencia en la red de fibras axodendríticas del cerebelo de los ratones infectados. Esto podría explicarse por una disfución en el sistema de transporte axonal, mecanismo que se ha visto alterado durante el desarrollo de la malaria cerebral humana (Medana & Esiri, 2003). Así mismo, una variación en el sistema de recambio proteico vía proteasoma, podría contribuir a la distribución anormal que presenta el BDNF y explicaría que la disminución transcripcional del bdnf no se vea correspondida con cambios a nivel de proteína. La Figura 15 esquematiza estas hipótesis y recoge los posibles mecanismos de acción mediante los cuales la disminución en la expresión transcripcional del bdnf puede contribuir al desarrollo de la malaria cerebral. Figura 15.- Esquema explicativo de los resultados obtenidos en cuanto a expresión y distribución del BDNF. Nuestros resultados señalan que durante la malaria cerebral se produce una disminución del proceso de transcripción del bdnf. La acumulación de proteínas no funcionales podría estar enmascarando su disminución a nivel proteico. Un transporte alterado impediría al BDNF llegar hasta las fibras axodendríticas. La alteración en los niveles de transcripción y distribución del BDNF provocaría disfunciones en los procesos en los que dicho factor está implicado. BHE: barrera hematoencefálica. Discusión general 161 El proteasoma, como sistema que regula la degradación de proteínas, juega un papel primordial en todos los procesos fisiológicos y en especial en aquellos que requieran un mayor recambio proteico, siendo su misión crítica en la supervivencia neuronal y en la plasticidad sináptica, debido a que puede interaccionar con el BDNF (Dong et al., 2008; Seo et al., 2008). En el sistema nervioso central se ha visto, por un lado, que el BDNF tiene un efecto sobre la expresión del sitema proteasoma (Santos et al., 2010) y, por otro lado, que el sistema del proteasoma bloquea la transcripción de bdnf en el sistema nervioso central (Dong et al., 2008). Teniendo en cuenta estos antecedentes, y dada la alteración a nivel cerebral del BDNF que observamos durante el desarrollo de la malaria cerebral murina, procedimos al estudio de la expresión de dos de las subunidades constitutivas del proteasoma, β1 Y β5, a fin de conocer si este sistema también sufre alguna variación asociada al transcurso de la enfermedad. Los resultados obtenidos mostraron una paulatina disminución en ambas subunidades a lo largo del progreso de la misma, siendo cerebelo y tallo donde aparecieron los valores más bajos observados. Recientemente se ha visto que en la malaria cerebral murina se produce la disminución de otra molécula clave implicada en el sistema ubiquitina-proteasoma, el complejo ubiquitina ligasa, que media la poliubiquitinación de proteínas mal plegadas (Desruisseaux et al., 2010), lo que apoya nuestros resultados de un efecto patogénico en el sistema proteasoma del cerebro, que impide un recambio proteico adecuado. Esta disfunción transcripcional del sistema del proteasoma podría producir una acumulación de proteínas mal plegadas y enmascarar la disminución de los niveles de proteína funcional que se observa en nuestro trabajo, ya que los complejos del ligando BDNF con su receptor pueden ser internalizados para su degradación vía sistema ubiquitina-proteasoma (Sommerfeld et al., 2000). Además, una alteración en este sistema de degradación proteica también podría contribuir en la disminución de los niveles de esta neurotrofina a nivel de mensajero (Dong et al., 2008). La inhibición de ambos se ha considerado potencialmente sinergístico en la disfunción neuronal de alteraciones neurológicas como la enfermedad de Hungtington (Seo et al., 2008) Discusión general _   162 La alteración del recambio proteico interfiere con la función sináptica y los mecanismos de aprendizaje y memoria (Bingol & Sheng, 2011; Nguyen et al., 2010). El impedimento de un recambio normal de proteínas en localizaciones como las sinapsis puede ser especialmente devastador debido a que las moléculas proteicas implicadas en la formación de la memoria se recambian a gran velocidad (Nguyen et al., 2010). Además, se ha visto que, tanto la expresión reducida del proteasoma como su inhibición, conducen a la muerte neuronal (Konstantinova et al., 2008; Kwak et al., 2003). Esto podría deberse a la inhibición de la degradación o el procesamiento de reguladores específicos (Konstantinova et al., 2008) o a la propia acumulación de proteínas disfuncionales, que induciría apoptosis (Kwak et al., 2003). La actividad del proteasoma se ha visto afectada por distintos factores ambientales como el estrés oxidativo, diversos estados patológicos y enfermedades neurológicas (Konstantinova et al., 2008). Así, niveles alterados del sistema proteasoma han sido ya descritos en distintas enfermedades del sistema nervioso central, como son el Alzheimer, Parkinson y Huntington (Bingol & Sheng, 2011; Dong et al., 2008; Ferrer et al., 2004; Nguyen et al., 2010; Zuccato & Cattaneo, 2009). La agregación y deposición de proteínas mal plegadas es un distintivo de las enfermedades neurodegenerativas y puede reflejar el fallo del mecanismo de recambio proteico, que además tampoco sería capaz de eliminar proteínas que hayan sufrido alguna modificación, como por ejemplo la oxidación (Bingol & Sheng, 2011; Nguyen et al., 2010). Todavía se desconoce si la disminución del proteasoma es una causa o una consecuencia tardía de la enfermedad ya que en muchos modelos animales de enfermedades neurodegenerativas no se observan cambios en etapas tempranas (Rubinsztein, 2006). Sin embargo, en nuestro modelo de malaria cerebral murina se observó una disminución progresiva desde el primer estadio asintomático de esta patología, por lo que el proteasoma podría contribuir al desarrollo de alteraciones más tardías. Discusión general 163 Por otro lado, se ha propuesto que las subunidades del proteasoma se pueden degradar mediante la acción de caspasas, las cuales también se han visto inducidas en la malaria cerebral (Medana et al., 2001; Wiese et al., 2006), lo que favorecería una mayor disminución en el sistema proteasoma durante esta enfermedad. Una de las hipótesis más aceptadas en la patogénesis de la malaria cerebral apoya que uno de los principales factores implicados en ella es la respuesta inmune exacerbada que se produce en el hospedador y que es responsable de la inflamación observada. Se ha descrito que este fenómeno inflamatorio puede incrementar la expresión de las subunidades del inmunoproteasoma induciendo el cambio del proteasoma constitutivo hacia el complejo del inmunoproteasoma, especializado en el procesamiento de polipéptidos para la presentación de antígenos (Nguyen et al., 2010). Estudios in vitro han demostrado que esta inducción se regula a nivel transcripcional (Gavilan et al., 2009). Por ello, y con el fin de investigar si en nuestro modelo existe este intercambio de subunidades proteasoma/ inmunoproteasoma, se analizó la expresión de dos de las subunidades inducibles, lmp2 y lmp7, del inmunoproteasoma. Los resultados obtenidos demostraron que ambas subunidades se indujeron muy tempranamente, desde el estadio I (asintomático) de la enfermedad, alcanzando de nuevo valores máximos de expresión en el cerebelo. Estos resultados indican que en las células del cerebro, durante la malaria cerebral, se está produciendo un cambio del proteasoma constitutivo a favor del inmunoproteasoma, lo que dificultará aún más la función del proteasoma en el correcto recambio de proteínas. Una inducción del inmunoproteasoma acompañada de una expresión anormal del proteasoma constitutivo y la consecuente acumulación de proteínas mal plegadas y agregados proteicos se ha observado en otras enfermedades neurológicas (Ferrer et al., 2004; Gavilan et al., 2009). Curiosamente, el potenciamiento de la memoria induce las subunidades constitutivas y disminuye las inducibles (Gavilan et al., 2009), lo que nos sugiere que la inducción del inmunoproteasoma observada en nuestro modelo experimental contribuye al daño cognitivo, probablemente mediante la agregación de proteínas. Discusión general _   164 Por último, las subunidades del inmunoproteasoma parecen estar implicadas en la proliferación de las células T CD8+ (Groettrup et al., 2010). El secuestro de estas células en el cerebro parece ser un factor crucial en el desarrollo de la malaria cerebral y también se ha sugerido que estas células podrían estar implicadas en la inducción de la expresión de moléculas de adhesión, favoreciendo la acumulación de glóbulos rojos infectados (Baptista et al., 2010). De esta manera, la inducción del inmunoproteasoma también podría contribuir a la patología de la malaria cerebral potenciando el secuestro de este tipo de células. Figura 16.- Disfunción del proteasoma durante el progreso de la malaria cerebral y su posible implicación en las alteraciones cognitivas asociadas. La disminución de la expresión del proteasoma y su intercambio a favor del inmunoproteasoma, inducido por las citoquinas TNF-α e IFN-γ, produce una alteración en el recambio proteico que interfiere con la función sináptica normal y los mecanismos de aprendizaje y memoria. Entre los procesos afectados se encontraría la síntesis y degradación del BDNF. βis: subunidades catalíticas responsables del cambio del proteasoma hacia inmunoproteasoma. TNF-α e IFN-γ son dos citoquinas que inducen la expresión del inmunoproteasoma (Groettrup et al., 2010), las cuales, junto con la LT-α, se ha postulado que participan en la patogénesis de la malaria cerebral (Chen et al., 2000; Engwerda et al., 2002; Hunt & Grau, 2003; Lou et al., 2001; Weiser et al., 2007). Con el fin de estudiar si dichas citoquinas están relacionadas temporalmente en la inducción del inmunoproteasoma observada en nuestro modelo experimental murino, analizamos su expresión en los animales que se encontraban en el estadio I, todavía asintomático de la enfermedad. Discusión general 165 Los resultados obtenidos mostraron que mientras los niveles de expresión de tnf-α e ifn-γ ya estaban incrementados en esta fase temprana de la patología, los niveles de expresión de lt-α se mantenían inalterados en este estadio. Este resultado sugiere que la inducción temprana de tnf-α e ifn-γ como respuesta inflamatoria podría ser desencadenante del intercambio de las subunidades del proteasoma durante la malaria cerebral. En este sentido, se ha postulado que la regulación de la función del proteasoma mediante la incorporación de las subunidades inducibles es debida al microambiente local de citoquinas (Kloetzel, 2004). La Figura 16 resume las alteraciones que sufre el proteasoma durante el desarrollo de la malaria cerebral y su posible relación con los trastornos observados en los niveles de BDNF. De esta manera, la neuroinflamación emerge como un factor clave en el desarrollo de las alteraciones cognitivas (Gavilan et al., 2009). Se ha observado que el sistema inmune influyen también en la inducción del fenómeno de plasticidad sináptica y que las citoquinas pro-inflamatorias tienen un efecto deletéreo en las funciones neuronales, la viabilidad y la plasticidad sináptica (Di Filippo et al., 2008; Lisak et al., 2007). Además, se ha observado que las citoquinas secretadas por la microglía en el sistema nervioso, aun pudiendo ser neuroprotectoras inicialmente, pueden posteriormente llegar a ser citotóxicas (Sawada et al., 2006). En este sentido, las citoquinas de la vía TH-2, predominantes en modelos resistentes frente al desarrollo de la malaria cerebral inducen la expresión de bdnf, mientras que citoquinas de la vía TH-1, predominantes en los modelos susceptibles de malaria cerebral disminuyen su expresión (Lisak et al., 2007). Por otro lado, la disminución de la expresión de esta neurotrofina observada en nuestro modelo experimental dificultará la protección del cerebro frente al daño producido por la inflamación (Enstrom et al., 2008) durante el desarrollo de esta patología. TNF-α e IFN-γ tienen efectos inhibitorios en la protección del cerebro y la plasticidad sináptica (Di Filippo et al., 2008; Lisak et al., 2007; Pino et al., 2005). De hecho, el incremento de la expresión de tnf-α se ha relacionado con niveles disminuidos de expresión de bdnf en el sistema nervioso central (Sawada et al., 2006) y con daños neurológicos y cognitivos (Di Filippo et al., 2008; Mishra & Newton, 2009). En niños con malaria cerebral, se observan niveles elevados de TNF-α en el Discusión general _   166 líquido cefalorraquídeo, que además se han relacionado con daños en la memoria y atención, sugiriendo que el TNF-α afecta negativamente al pronóstico cognitivo a largo plazo (Idro et al., 2010b). Además, el TNF-α también puede producir la muerte de células endoteliales con la consecuente producción de hemorragias (Jennings et al., 1997), lo que también se ha asociado con el daño cognitivo (Brian de Souza et al., 2009). En este sentido, cabe destacar que es la localización tisular de las hemorragias, más que el número de ellas, lo que condiciona la gravedad del daño en el cerebro (Carroll et al., 2010). Por otro lado, estas dos citoquinas parecen estar implicadas también en la inducción de distintas moléculas que median procesos de adhesión entre los glóbulos rojos infectados y el endotelio vascular (Armah et al., 2005; de Souza & Riley, 2002; Jennings et al., 1997; Lou et al., 2001; Pino et al., 2005; Schofield & Grau, 2005; Turner et al., 1994; van der Heyde et al., 2006; Weiser et al., 2007), aunque aún no existe un consenso en cuanto a la secuencia de estos eventos responsables de la citoadherencia que se produce en el transcurso de la patología (Brian de Souza et al., 2009; Combes et al., 2010). En este contexto, NCAM, miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas que juega un papel importante en el desarrollo normal del cerebro (Aisa et al., 2010), podría estar también implicada en este fenómeno de citoadherencia, ya que se ha descrito su capacidad in vitro de adherir eritrocitos infectados (Pouvelle et al., 2007). Así, con el fin de comprobar su posible papel en la adhesión de los hematíes infectados en la microvasculatura cerebral, se procedió en el presente trabajo a estudiar la acumulación de glóbulos rojos en el cerebro en paralelo con los niveles de expresión de ncam y de otras moléculas de expresión que previamente se han visto inducidas en el cerebro durante la patología de la malaria cerebral, como son ICAM-1, VCAM-I, P-selectina y E-selectina (Armah et al., 2005; Brian de Souza et al., 2009; Turner et al., 1994). En primer lugar, nuestros resultados revelaron una relación temporal entre la aparición de los síntomas neurológicos y la acumulación de parásitos en el tejido cerebral -pero no en sangre ni en órganos periféricos-, sugiriendo que el secuestro de eritrocitos infectados ocurre selectivamente en el cerebro de ratones con malaria Discusión general 167 cerebral. Aunque este fenómeno ha sido también observado por otros autores (Amante et al., 2007; Baptista et al., 2010; Brian de Souza et al., 2009; Engwerda et al., 2002; Hearn et al., 2000; Jennings et al., 1997; Lackner et al., 2006), contrasta con otros resultados donde la acumulación de glóbulos rojos infectados tan sólo se detecta en los órganos periféricos (Franke-Fayard et al., 2005). Estos datos contradictorios pueden explicarse debido a que las técnicas de imagen empleadas en este último estudio pueden subestimar la acumulación de glóbulos rojos infectados en cerebro (Baptista et al., 2010; Brian de Souza et al., 2009). Como muestran nuestros resultados, el número de parásitos detectado en tejidos periféricos altamente vascularizados es mucho más alto que en cerebro, aunque no se produzca su incremento progresivo de forma paralela al desarrollo de los síntomas neurológicos de la enfermedad. Este fenómeno podría enmascarar el incremento de eritrocitos infectados en el cerebro, por lo que se requiere el uso de técnicas con mayor resolución para clarificar el mecanismo del secuestro que se produce durante la malaria cerebral. De todos los tejidos analizados en nuestro estudio, la mayor acumulación de parásitos se observó en cerebelo (Jennings et al., 1997; Marin-Garcia et al., 2009; Sein et al., 1993) y en tallo. En segundo lugar, de los estudios realizados en este trabajo se observó que se produce una inducción temprana de los niveles de expresión de icam-1, vcam-1, e- selectina y p-selectina desde el estadio asintomático de la enfermedad. Estos resultados sugieren que es necesario que aumente la expresión de estas moléculas en los primeros estadios de la enfermedad para que se produzca la posterior acumulación de los hematíes infectados en el endotelio cerebral (Armah et al., 2005; Brian de Souza et al., 2009; Ho & White, 1999; Turner et al., 1994). Aunque algunos autores (Clark et al., 2006) han sugerido la existencia de dos etapas de inducción en la expresión de estas moléculas de adhesión, en este trabajo sólo se observa una temprana y que se mantiene durante el curso de la enfermedad. Al analizar los resultados de expresión en las distintas regiones, los valores más altos se obtuvieron nuevamente en cerebelo y tallo, regiones donde también se produjo una mayor acumulación de parásitos. En pacientes afectados de malaria cerebral también se observa una mayor expresión de estas moléculas en secciones de Discusión general _   168 cerebelo (Armah et al., 2005), lo que apoya nuestra hipótesis de que la inducción en estadios iniciales de moléculas de adhesión facilitarían la consecuente acumulación de eritrocitos infectados. Algunos autores han sugerido que el secuestro de glóbulos rojos infectados en el cerebro puede ser el evento responsable de la inducción de citoquinas (Armah et al., 2005), no obstante, nuestros resultados sugieren que es la expresión temprana de tnf-α e ifn-γ la que dispara la acumulación de los glóbulos rojos infectados mediante la regulación de la expresión de las moléculas de adhesión (Armah et al., 2005; de Souza & Riley, 2002; Jennings et al., 1997; Lou et al., 2001; Pino et al., 2005; Schofield & Grau, 2005; Turner et al., 1994; van der Heyde et al., 2006; Weiser et al., 2007). Aunque también se ha sugerido que la LT-α media la inducción de las moléculas de adhesión durante la malaria cerebral (Hunt & Grau, 2003; Weiser et al., 2007), en nuestro modelo no se observaron cambios tempranos de esta citoquina, lo que sugiere que no participa en la inducción precoz de estas moléculas. Sin embargo, debido a que en estadios terminales de malaria cerebral murina se han observado elevados niveles de LT-α (Engwerda et al., 2002; Hunt et al., 2006; Rae et al., 2004), quizás como consecuencia de alteraciones cerebrales más tardías, no podemos descartar que esta citoquina juegue un papel relevante en la patogenia de los estadios más avanzados de la enfermedad. En tercer lugar, nuestros resultados mostraron que los niveles de expresión de ncam sufrían una disminución asociada a la severidad de los síntomas neurológicos. Al igual que sucedía con las otras moléculas de adhesión, las mayores variaciones en la expresión de ARN mensajero se obtuvieron en cerebelo y tallo. Estos resultados sugieren que esta molécula de adhesión no participaría en el fenómeno de citoadherencia (Pouvelle et al., 2007), sino que su disminución podría estar contribuyendo, junto con la de BDNF y el proteasoma, a los cambios neurológicos que aparecen en la malaria cerebral (Figura 17). En este sentido, niveles alterados de la NCAM se han visto asociados a diversos trastornos del sistema nervioso central (Aisa et al., 2010; Fukami et al., 2000). Discusión general 169 Entre las distintas clases de moléculas de adhesión, la NCAM muestra particularidades en varios aspectos. Por un lado, contribuye a la supervivencia, migración y diferenciación celular; participa en la supervivencia neuronal y el crecimiento axonal (Bisaz et al., 2009; Muller et al., 2000; Murphy et al., 2007); y, además, puede producir la regeneración de axones y contribuir a la recuperación tras el daño (Bisaz et al., 2009; Kiss et al., 2001; Murphy et al., 2007). Por otro lado, la NCAM está implicada en la formación y estabilización de las sinapsis, contribuyendo a la plasticidad sináptica y a los procesos de aprendizaje y memoria (Bisaz et al., 2009; Kiss et al., 2001; Vutskits et al., 2001). De esta forma, cambios en los niveles de NCAM podrían estar implicados en las alteraciones cerebrales y daños cognitivos observados durante las secuelas de la malaria cerebral (Bentivoglio et al., 2010; Idro et al., 2010b; Medana et al., 2007; Medana et al., 2001; Miu et al., 2008; Penet et al., 2005). Además, como NCAM puede interaccionar con BDNF y potenciar su acción, promoviendo la plasticidad sináptica y la supervivencia neuronal (Kiss et al., 2001; Muller et al., 2000; Murphy et al., 2007; Vutskits et al., 2001), la disminución observada de la expresión de ncam podría contribuir a una menor efectividad funcional de esta neurotrofina. Figura 17.- Esquema hipotético de la implicación de NCAM y otras moléculas de adhesión durante el progreso de la malaria cerebral. TNF-α e IFN-γ inducen una expresión temprana de distintas moléculas de adhesión como ICAM-1, VCAM-1, E-selectina (E-SEL) y P-selectina (P-SEL), lo cual facilita el secuestro de glóbulos rojos en el endotelio del cerebro (panel izquierdo). Sin embargo, la disminución de los niveles de NCAM sugiere que esta molécula no está implicada en dicho proceso de citoadherencia, sino más bien en las alteraciones producidas durante esta complicación al no poder mediar la supervivencia y diferenciación celular, modular la plasticidad sináptica ni interaccionar correctamente con el BDNF (panel derecho). GRIs: glóbulos rojos infectados; GRs: glóbulos rojos. Discusión general _   170 Finalmente, cabe destacar que la secuencia de eventos moleculares observados en nuestro modelo durante el desarrollo de la malaria cerebral es similar a la respuesta que se produce tras un daño en el flujo cerebral, donde primero se activan "genes de respuesta temprana" como citoquinas y moléculas de adhesión; y otros sucesos como la muerte celular, la necrosis y la apoptosis ocurren más lentamente. Sin embargo, en este caso, factores de crecimiento y plasticidad se activan para la rehabilitación (Nagy et al., 2002), al contrario de lo que hemos visto que puede estar ocurriendo en la malaria cerebral, donde estos mecanismos parecen estar dañados y su respuesta protectora dificultada. La variabilidad observada en la naturaleza, gravedad y duración de las secuelas neurocognitivas que aparecen en los pacientes que sobreviven a la malaria cerebral, especialmente en niños menores de 5 años, sugiere que el daño cerebral que se produce afecta a distintas regiones y núcleos cerebrales. Por ello, en este trabajo se analizaron diferentes regiones de este órgano debido a las diferentes funciones fisiológicas que ejercen, ya que un daño específico regional puede conducir a un síntoma o secuela diferente (Lackner et al., 2006; Marin-Garcia et al., 2009; Penet et al., 2005). Los resultados obtenidos en nuestro modelo mostraron que las mayores alteraciones se observan en las regiones de cerebelo y tallo, de forma similar a lo descrito por otros autores (Lacerda-Queiroz et al., 2010; Lackner et al., 2006; Penet et al., 2005), lo que podría explicar la elevada prevalencia de síntomas neurológicos en los individuos que la padecen como son ataxia, dificultades en el movimiento y equilibrio y alteraciones en el aprendizaje cognitivo (Armah et al., 2005; Idro et al., 2005; Penet et al., 2005). Trastornos en otras regiones como córtex, tálamo e hipocampo también pueden contribuir al desarrollo de convulsiones, anormalidades motoras y alteraciones en los procesos relacionados con la memoria, lenguaje y atención asociados a la malaria cerebral y sus secuelas cognitivas (Guyton, 1994; Idro et al., 2005; Purves et al., 2001; Randall, 1999; Tórtora, 2002). Discusión general 171 5.3.- METODOLOGÍA OXIPROTEÓMICA PARA LA CARACTERIZACIÓN DE DAÑO OXIDATIVO EN CEREBRO La malaria se caracteriza por la generación de estrés oxidativo debido a la actividad metabólica del parásito y a la respuesta del hospedador frente a la infección (Becker et al., 2004; Muller, 2004; van der Heyde et al., 2006). Sin embargo, todavía existe gran controversia sobre la implicación que tiene el estrés oxidativo en el desarrollo de la malaria cerebral. Aunque algunos autores sugieren que durante la malaria cerebral se produce una acumulación de especies reactivas de oxígeno que conduciría a una situación de estrés oxidativo (Pino et al., 2005; Postma et al., 1996; Reis et al., 2010; Wiese et al., 2006), otros autores no observan diferencias en los niveles de marcadores este tipo de estrés en esta patología (Sanni et al., 1999). Tampoco se conoce el papel que el estrés oxidativo podría jugar en esta complicación cerebral, ya que, por un lado, podría ser beneficioso para combatir el crecimiento parasitario y mantener la homeostasis del hospedador, pero, por otro, también podría causar un importante daño celular en el cerebro (Ma, 2010; Pino et al., 2005; Pino et al., 2003a; Pongponratn et al., 2003; Postma et al., 1996), ya que este órgano es especialmente vulnerable al daño oxidativo debido a sus elevada demanda de oxígeno y sus bajos niveles de moléculas antioxidantes (Butterfield et al., 2007). Un entorno de estrés oxidativo en el cerebro puede producir daño en todo tipo de moléculas biológicas (Dalle-Donne et al., 2003), siendo las proteínas una de sus principales dianas (Dalle-Donne et al., 2006a). La oxidación de proteínas desempeña un papel fundamental en el desarrollo de múltiples enfermedades neurológicas, pudiendo estar también implicada en la malaria cerebral. Las proteínas pueden sufrir numerosas modificaciones covalentes tras la exposición a oxidantes. Algunos de estos cambios resultan del ataque directo de un radical libre a la molécula proteica, mientras que otros se producen indirectamente a través del ataque covalente de los productos resultantes de la oxidación (Shacter, 2000b). Entre las distintas modificaciones oxidativas que pueden sufrir las proteínas, la carbonilación es su producto mayoritario (Cecarini et al., 2007; Shacter, 2000b). Discusión general _   172 La detección de grupos carbonilo como marcador del daño oxidativo se ha extendido en investigación biomédica debido a su acumulación en diversas enfermedades (Dalle-Donne et al., 2003). Así, dado que la identificación de grupos carbonilo puede ser un candidato idóneo como marcador del daño oxidativo (Dalle- Donne et al., 2006b), el tercer objetivo de este trabajo fue caracterizar el método más adecuado para la detección de proteínas carboniladas en muestras de cerebro, para, posteriormente, analizar el entorno de estrés oxidativo en el contexto de la malaria cerebral e investigar potenciales marcadores que aparezcan en esta enfermedad. El contenido de grupos carbonilo en proteínas individuales puede analizarse mediante la derivatización del extracto proteico con 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH), que induce la formación de un producto derivado de la 2,4- dinitrofenilhidrazona (DNP-proteína carbonilada), capaz de ser detectado mediante inmunotransferencia, donde las proteínas se separan en una electroforesis bidimensional, se transfieren a una membrana y los grupos DNP presentes son detectados mediante el uso de anticuerpos anti-DNP específicos (2D-oxyblot) (Dalle-Donne et al., 2003; Levine et al., 1994; Shacter, 2000a; Shacter, 2000b). Para la identificación de las proteínas oxidadas portadoras de grupos carbonilo, la imagen del 2D-oxyblot obtenida tras el inmunoensayo se compara, con la ayuda de programas informáticos, con la imagen que aparece cuando las proteínas se separan en un gel preparativo bidimensional teñido con azul de Commasie coloidal. Una vez que se determina la correspondencia de las proteínas del gel con las proteínas modificadas que se detectan en el 2D-oxyblot, éstas se escinden del gel preparativo, se digieren con tripsina y se analizan por espectrometría de masas (Butterfield et al., 2006). Teniendo en cuenta que el proceso de derivatización con DNPH podría afectar a la correcta identificación de las proteínas por espectrometría de masas, produciendo valores de confianza más bajos (Castegna et al., 2002; Tezel et al., 2005), muchos autores han utilizado muestras no tratadas con DNPH en los geles preparativos para la identificación proteica (Castegna et al., 2002; Korolainen et al., 2006; Sultana et al., 2006). Sin embargo, el proceso de derivatización también podría alterar el peso molecular y el punto isoeléctrico de las proteínas (Dalle-Donne et al., Discusión general 173 2003), dificultando la correcta correspondencia de éstas entre el gel preparativo no tratado y el 2D-oxyblot procedente de muestras derivatizadas. Por ello, en un primer lugar nos planteamos si el uso de 2D-oxyblots de muestras derivatizadas se podría combinar con la utilización de geles preparativos procedentes de muestras no tratadas para la identificación proteica en el análisis oxiproteómico de tejidos cerebrales. Con este fin se comparó, a partir de extractos de cerebelo de ratón, el perfil proteico obtenido mediante la separación bidimensional en gel de muestras derivatizadas con DNPH y muestras sin derivatizar. Aunque ambos tipos de aproximaciones produjeron una separación electroforética adecuada, se detectaron diferencias en el patrón proteico según el método utilizado, ya que cada tratamiento generó distintas áreas de enriquecimiento proteico, lo que dificultará seriamente la identificación por correspondencia entre las muestras del gel preparativo y las del 2D-oxyblot. Estos resultados excluyen por tanto la utilización de muestras no derivatizadas en el gel preparativo para la identificación de proteínas detectadas en 2D-oxyblots procedentes de muestras previamente derivatizadas. Estos problemas podrían resolverse, en principio, si se procede a la derivatización de las proteínas con DNPH tras los procesos de electroforesis y posterior transferencia de los geles a la membrana (Conrad et al., 2000). Con el fin de comprobar si efectivamente este protocolo mejoraba la detección e identificación de las proteínas carboniladas, se comparó esta aproximación con el método clásico en el que las muestras se tratan con DNPH antes de la electroforesis (Figura 18). Los resultados obtenidos mostraron que los 2D-oxyblots procedentes de muestras proteicas derivatizadas una vez transferidas a las membranas eran menos reproducibles y presentaban un mayor fondo cuando se compararon con aquellos procedentes de muestras pre-tratadas con DNPH en el extracto proteico, lo que también se ha visto cuando se realizan estos ensayos en muestras no procedentes de cerebro (Talent et al., 1998). Debido a que el mayor fondo del 2D-oxyblot complicaba la identificación de las proteínas modificadas en los geles preparativos, el mayor número de proteínas carboniladas se detectó cuando el extracto proteico se trataba con DNPH antes de la electroforesis. Discusión general _   174 Figura 18: Esquema comparativo de los dos protocolos de oxiproteómica empleados. En la parte superior se representa el método de derivatización de la muestra con DNPH en el extracto proteico, mientras que la parte inferior esquematiza el método de derivatización proteica tras la separación electroforética. Teniendo en cuenta que los mejores resultados se obtuvieron cuando se derivatizan las muestras proteicas antes de su separación mediante electroforesis y con el fin de estudiar si ese pre-tratamiento produce alteraciones en la identificación de las proteínas por espectrometría de masas, procedimos a comparar estadísticamente la calidad de la identificación de un grupo de proteínas idénticas que aparecieron carboniladas en ambos tipos de geles, pre-tratados y no tratados. Ambas aproximaciones produjeron una identificación correcta con valores de confianza similares, como han observado otros autores en muestras de adipocitos (Singh et al., 2007). Sin embargo, el número de proteínas carboniladas comunes detectadas por ambos métodos era bajo, lo cual podría justificar la utilización combinada de ambas aproximaciones en proteómica redox. No obstante, pensamos que esta diferencia de cantidad podría ser debida a los distintos patrones observados en ambos tipos de geles, más que a una diferente capacidad de detección de cada método. Esta variabilidad entre los patrones obtenidos para cada una de las aproximaciones Discusión general 175 experimentales utilizadas puede ser resultado de una diferente precipitación proteica (Reinheckel et al., 2000) o de diferencias en su movilidad electroforética según las proteínas estén o no unidas a DNP. En este contexto, varios autores sugieren que el tratamiento de las proteínas con DNPH modifica su punto isoeléctrico y su peso molecular (Conrad et al., 2000; Reinheckel et al., 2000; Singh et al., 2007; Talent et al., 1998), lo cual justificaría una baja correspondencia entre las proteínas carboniladas detectadas por cada uno de los métodos. Sin embargo, en nuestro caso no observamos que el proceso de derivatización afecte a la electroforesis bidimensional, ni el punto isoeléctrico, ni el peso molecular de las proteínas modificadas pre-derivatizadas cuando se comparan con las no tratadas, lo que concuerda con resultados descritos por otros autores (Castegna et al., 2002; Tezel et al., 2005). Aun así, no podemos descartar que un pequeño efecto de posición prevenga la correcta correspondencia de determinadas proteínas entre geles procedentes de muestras derivatizadas y no derivatizadas. Con el fin de analizar este potencial efecto, se procedió a identificar mediante espectrometría de masas distintas proteínas que aparecieran modificadas por ambos métodos en regiones cercanas del gel preparativo pero que no presentaran correspondencia mediante los programas de imagen empleados. Los resultados de espectrometría de masas mostraron a que al menos la mitad de estas proteínas correspondían con la misma molécula, por lo que parece probable que pequeñas diferencias de posición entre ambos tipos de geles sí afecten a la correspondencia de proteínas mediante los programas de imagen utilizados. Este hecho podría explicar el reducido número de proteínas comunes detectadas por ambos métodos. Por tanto, y en base a los resultados obtenidos en nuestro trabajo, la derivatización de las muestras antes de la separación electroforética parece ser el mejor método para analizar la carbonilación proteica en tejidos cerebrales. Esta aproximación, además de presentar las ventajas expuestas anteriormente, es menos agresiva para la muestra y previene los procesos oxidativos durante el almacenaje y manipulación de las mismas. Discusión general _   176 5.4.- ESTRÉS OXIDATIVO Y DAÑO NEUROCOGNITIVO EN LA MALARIA CEREBRAL La producción de especies reactivas de oxígeno es esencial para la activación de ciertas vías de señalización, el mantenimiento de la homeostasis celular, la estimulación de la proliferación celular, la defensa frente a patógenos y, quizás, para la eliminación de restos celulares. Por el contrario, su acumulación excesiva en un momento determinado puede dañar la estructura celular y alterar la función de los tejidos. Así, el equilibrio homeostático del estrés oxidativo es un factor crítico en el desarrollo de diferentes enfermedades neurológicas (Calabrese et al., 2007), aunque su implicación en el desarrollo de la malaria cerebral todavía plantea serias dudas. Cuando las especies reactivas de oxígeno se acumulan en el cerebro pueden producir alteraciones cognitivas (Serrano & Klann, 2004), de ahí que un aumento en la presencia de estas moléculas podría explicar algunos de los síntomas y secuelas que aparecen en la malaria cerebral. En otras enfermedades neurológicas, donde también se ven afectadas funciones cognitivas como el aprendizaje y la memoria y funciones motoras como la fuerza, equilibrio y coordinación, se ha observado que existe una acumulación de especies reactivas de oxígeno (Droge & Schipper, 2007). Así, las alteraciones neurológicas asociadas a la malaria cerebral podrían estar mediadas por las propiedades neuromoduladoras de las especies reactivas de oxígeno (Allen & Tresini, 2000) o su capacidad de producir daño en distintas poblaciones celulares del cerebro (Becker et al., 2004; Buffinton et al., 1988; Chakravorty et al., 2008; Hunt et al., 2006; Pino et al., 2005; Pongponratn et al., 2003; Postma et al., 1996; Wiese et al., 2006). La idea de que las especies reactivas de oxígeno pueden contribuir al desarrollo de los trastornos cognitivos producidos durante la malaria cerebral se ve apoyada por el papel protector que el tratamiento con distintos antioxidantes ejerce frente al progreso de dicha patología, algunos de los cuales incluso tienen capacidad de prevenir las alteraciones cognitivas asociadas a las secuelas de esta enfermedad (Becker et al., 2004; Postma et al., 1996; Reis et al., 2010; Taoufiq et al., 2006; Thumwood et al., 1989). Discusión general 177 Entre los distintos fenómenos descritos que podrían producir la acumulación de especies reactivas de oxígeno durante el desarrollo de la malaria cerebral, en nuestro modelo observamos liberación de citoquinas, inducción de moléculas de adhesión endotelial (Bartosz, 2009; Hensley et al., 2000; Tripathi et al., 2006; Zapata- Zapata & Blair-Trujillo, 2003) y adhesión de glóbulos rojos infectados a las células endoteliales (Pino et al., 2005; Taoufiq et al., 2006). Por otra parte, también hay que tener en cuenta que las propias especies reactivas de oxígeno producidas y el estrés oxidativo pueden inducir directamente citoquinas como TNF-α y moléculas de adhesión como ICAM y VCAM (Allen & Tresini, 2000; Ma, 2010). Por último, y al igual que sucede en otras enfermedades neurológicas (Maier & Chan, 2002), los sistemas de defensa antioxidante podrían fallar durante el transcurso de la malaria cerebral (Postma et al., 1996) por un exceso de producción local de especies reactivas de oxígeno. Por todo ello, nuestro cuarto objetivo fue evaluar el escenario de estrés oxidativo durante el curso del daño cognitivo asociado a la malaria cerebral mediante el análisis de distintos marcadores de estrés y sistemas de defensa presentes en distintas regiones del cerebro del hospedador en nuestro modelo experimental en cuatro estadios, clasificado según el desarrollo de los síntomas neurológicos característicos de la enfermedad. En primer lugar, se llevaron a cabo estudios de expresión y actividad del sistema superóxido dismutasa/catalasa. Las tres isoformas de la SOD reducen el anion superóxido a peróxido de hidrógeno, el cual, a su vez, es reducido a agua mediante la acción de la catalasa. De esta forma, ambas enzimas impiden la transformación de sus sustratos en el radical hidroxilo y la formación de peroxinitrito mediante la reacción entre el anión superóxido y el óxido nítrico (Pino et al., 2003a; Postma et al., 1996). Los estudios llevados a cabo en nuestro trabajo pusieron de manifiesto una disminución progresiva en la expresión de ambos sistemas que cursa de forma paralela a la adquisición de los síntomas neurológicos de la enfermedad. Esta disminución transcripcional se observó en todas las regiones cerebrales analizadas, siendo, cerebelo y tallo las áreas más afectadas. Sin embargo, a pesar de los cambios Discusión general _   178 significativos a nivel de transcripción, no se detectaron variaciones en el contenido proteico de las mismas enzimas, lo que podría explicarse por la disfunción del proteasoma y secuestro por parte del inmunoproteasoma observados en nuestro modelo de malaria cerebral experimental. Así, si ambas enzimas se estuvieran acumulando como proteínas mal plegadas o agregadas, su variación a nivel proteico no se detectaría con las técnicas utilizadas pero serían disfuncionales. Con el fin de investigar si efectivamente los niveles de SOD y CAT funcionales estaban disminuidos durante el desarrollo de la malaria cerebral, se procedió a ensayar la actividad enzimática de ambas proteínas en el cerebelo y el tallo de los animales infectados cuando se encuentran en el estadio más severo de la enfermedad. Los valores de actividad de ambas enzimas mostraron una disminución significativa en las dos regiones analizadas, lo que apoya la disminución observada a nivel transcripcional y traduccional y la posible acumulación de proteínas a consecuencia de la disfunción del proteasoma, que dificultaría el recambio proteico cerebral en una situación de emergencia. Alteraciones similares en la expresión y actividad de ambas enzimas se han descrito en otras situaciones patológicas asociadas a una disfunción neurológica, por lo que cabe pensar que las variaciones en la actividad catalítica de cualquiera de ellas podrían ser una de las posibles causas de la muerte neuronal observada en este tipo de enfermedades (Brown-Borg & Rakoczy, 2000; Maier & Chan, 2002; Marcus et al., 1998), lo cual se haría extensivo en la malaria cerebral. Además, también se ha visto que su administración terapéutica o sobreexpresión ejerce funciones protectoras en distintas situaciones patológicas (Huang et al., 2001; Maier & Chan, 2002; Noshita et al., 2001), al prevenir el daño celular (Postma et al., 1996) y prolongar la supervivencia in vivo (Maier & Chan, 2002) gracias a sus acciones neuroprotectoras (Gaspar et al., 2009; Maier & Chan, 2002). La SOD-2 protege también frente a la citotoxicidad inducida por citoquinas como TNF-α (Mates, 2000) y se ha demostrado que tanto la SOD-2 como la SOD-3 son capaces de potenciar la memoria y el aprendizaje (Dumont et al., 2009; Hu et al., 2006; Levin, 2005). Por ello, la disfunción observada en estos sistemas antioxidantes podría estar relacionada con los síntomas asociados a la malaria cerebral y sus secuelas. Discusión general 179 En el contexto de esta complicación neurológica, la disfunción de la SOD podría ser fundamental. Su suplementación protege frente al estrés oxidativo inducido por el parásito in vitro (Chakravorty et al., 2008; Pino et al., 2005; Taoufiq et al., 2006) y presenta distintos mecanismos protectores frente a esta patología cerebral debido a sus propiedades antioxidantes, anti-parasíticas, anti-inflamatorias, y anti-citoadherentes (Ma, 2010; Pino et al., 2005; Taoufiq et al., 2006). Con respecto a esta última cualidad, al disminuir los niveles de moléculas de adhesión, reduciría también la adhesión de eritrocitos infectados al endotelio. La catalasa, al igual que la SOD, además de ejercer acciones antioxidantes, también está implicada en procesos de señalización celular, pudiendo inhibir la transducción de señales vía factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, del inglés, “platelet derived growth factor”) (Hensley et al., 2000). En este sentido, durante la malaria cerebral, se detectan alteraciones en los niveles de PDGF a nivel cerebral (Armah et al., 2007). Debido a que la administración de ambas enzimas ha mostrado un efecto protector frente al desarrollo de la malaria cerebral murina gracias a su actividad antioxidante (Postma et al., 1996; Taoufiq et al., 2006), su suplementación o inducción podría mejorar el pronóstico y las complicaciones de esta enfermedad. Estudios recientes ponen de manifiesto que tanto la actividad de la SOD como de la CAT están relacionadas con los niveles de la HSP70 (Choi et al., 2005; Romero et al., 2010), por lo que esta última molécula podría estar influyendo en las variaciones que observamos en ambas enzimas antioxidantes. Las proteínas de choque térmico funcionan como chaperonas que ayudan al ensamblaje, plegamiento y translocación de otras proteínas en la célula. Bajo condiciones de estrés, esta familia de proteínas parece ser crítica para prevenir la acumulación y agregación de moléculas proteicas mal plegadas, así como para facilitar el plegamiento y eliminación de las dañadas (Ma, 2010). Con el fin de estudiar si HSP70 está relacionada con estos procesos, procedimos a analizar sus niveles de expresión en distintas regiones cerebrales de los animales infectados durante el curso de la malaria cerebral murina. Los resultados obtenidos mostraron una disminución gradual de la expresión de esta proteína en todas las regiones analizadas, siendo, nuevamente, las regiones más afectadas el cerebelo y el tallo. Discusión general _   180 La disminución de la expresión de hsp70 observada durante el desarrollo de la malaria cerebral podría contribuir a la disminución en la actividad de la SOD y CAT descritas en este estudio, ya que se ha visto que ratones deficientes en hsp70 muestran una disminución en la actividad de las isoformas SOD-1 y SOD-2 (Choi et al., 2005) y se ha sugerido que HSP70 podría modular la respuesta al daño incrementando la actividad de la CAT (Romero et al., 2010). Por otro lado, también se ha descrito que cambios en la expresión de sod se correlacionan con la inducción a nivel de ARN mensajero de hsp70 (Allen & Tresini, 2000). Debido a que una de las funciones de esta chaperona es prevenir la acumulación y agregación proteica (Calabrese et al., 2007; Giffard et al., 2008), su disminución podría estar contribuyendo, junto con los cambios en el proteasoma, a la acumulación de proteínas mal plegadas. Este fenómeno ayuda a explicar la falta de correspondencia entre la disminución de hsp70 a nivel de ARN mensajero que observamos y el aumento de la misma descrito a nivel de proteína en cerebros de pacientes de malaria cerebral y no cerebral mediante inmunohistoquímica (Medana et al., 2001), a pesar que este efecto en humanos podría ser causa post-mortem, o bien diferencial entre ambas especies. La disminución de la expresión de hsp70 podría contribuir a la patogénesis de la malaria cerebral mediante otras vías, como es el caso de la muerte celular, ya que esta proteína parece mediar efectos cito y neuroprotectores (Choi et al., 2005; Giffard et al., 2008). Así, su disminución podría favorecer también el daño observado en algunas poblaciones cerebrales durante la malaria cerebral y de esta forma estar relacionada con las alteraciones cognitivas producidas en ella. Además, como esta familia de proteínas puede disminuir la producción de citoquinas pro- inflamatorias y mediar en la respuesta frente a la inflamación (Giffard et al., 2008), la disminución de esta molécula en nuestro modelo de estudio podría estar jugando un papel indirecto secundario al daño producido por la neuroinflamación durante la malaria cerebral. Las HSPs forman parte de un grupo de genes de respuesta frente al estrés oxidativo denominado “vitagenes”, en el que también se incluyen las tiorredoxinas (Calabrese et al., 2007). La TRX-1 es la forma citosólica de esta enzima, se expresa Discusión general 181 ampliamente en cerebro y tiene diversas funciones antioxidantes: (i) es capaz de actuar por sí misma como detoxificador de especies reactivas de oxígeno, eliminando el oxígeno singlete, el radical hidroxilo y el peróxido de hidrógeno; (ii) elimina peróxidos de forma concertada con peroxiredoxinas y TRX reductasas; y (iii) ayuda a estas últimas a reducir los puentes disulfuro de las proteínas (Calabrese et al., 2007; Patenaude et al., 2005). Con el fin de estudiar si esta enzima también se ve alterada durante el transcurso de la malaria cerebral, en este trabajo procedimos a analizar sus niveles de expresión en diversas regiones cerebrales, durante los cuatro estadios neurológicos de la enfermedad. Los resultados obtenidos pusieron de nuevo de manifiesto, y al igual que en las proteínas hasta ahora analizadas, una reducción gradual en sus niveles de ARN mensajero de forma más acusada en cerebelo y tallo. La tiorredoxina parece ser un factor importante en el desarrollo de diversas situaciones patológicas (Patenaude et al., 2005), ya que juega un papel esencial en los procesos de transducción de señales, transcripción (Allen & Tresini, 2000), crecimiento celular, apoptosis, diferenciación y proliferación (Patenaude et al., 2005), además de que se ha asociado con la supervivencia neuronal (Calabrese et al., 2007) y se ha sugerido su implicación en la regeneración cerebral después del daño sufrido (Patenaude et al., 2005). Así, su disminución transcripcional podría contribuir al daño celular y a la neurodegeneración observada durante la malaria cerebral, ya que se verían afectados una amplia variedad de procesos funcionales. Todos los cambios de expresión observados podrían estar mediados por una serie de factores de transcripción implicados en regular la respuesta antioxidante de las células. En este contexto, el factor de transcripción XBP1 (del inglés, "X-box- binding protein"), PARK7 (del inglés, "Parkinson disease 7") y la familia de factores de transcripción FOXO, subgrupo de la familia de factores de transcripción “Forkhead box”, son los encargados de regular la expresión de distintos genes antioxidantes (Liu et al., 2009; Ma, 2010; Zhou et al., 2011). Con el fin de estudiar si estos factores de transcripción pueden estar implicados en las alteraciones de los sistemas antioxidantes observadas en nuestro modelo, se determinaron sus niveles de ARN transcripcionales en diferentes Discusión general _   182 regiones cerebrales del hospedador durante el transcurso de la patología. Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto una disminución de xbp1, park7 y foxo3 progresiva y concomitante con la aparición de los síntomas en todas las regiones analizadas y, en la mayor parte de ellas en el caso de foxo1. El factor de transcripción XBP1 también confiere resistencia frente al estrés oxidativo, al menos, a través de la inducción de la catalasa. Debido a que la delección de xbp1 produce la disminución de esta proteína así como la de SOD-1 y TRX-1 (Liu et al., 2009), la disminución observada durante la malaria cerebral podría ser responsable de la menor expresión vista en estos genes, sobre todo en el caso del que codifica para la catalasa, ya que su transcripción está muy vinculada a la de este factor. Sin embargo, como al parecer estos genes no son dianas directas de xbp1, la regulación de los mismos por parte de XBP1 podría llevarse a cabo de forma indirecta (Liu et al., 2009). Por otro lado, XBP1 también parece ser un factor clave en la respuesta frente a proteínas mal plegadas, facilitando el correcto plegamiento, procesamiento, exportación y degradación de las mismas (Glimcher, 2010). Por tanto, su disminución también podría estar contribuyendo a la acumulación de proteínas mal plegadas que pensamos ocurre durante esta patología. La disminución de XBP1 también podría estar implicada en el desarrollo de la malaria cerebral mediante la intervención en dos mecanismos adicionales: (i) disminuyendo los niveles de BDNF de forma acoplada a la disminución de HSP70 (Gupta et al., 2010)) y (ii) contribuyendo al mantenimiento de elevados niveles de TNF-α durante el transcurso de la enfermedad (Glimcher, 2010). PARK7 puede inducirse en condiciones de estrés oxidativo y funciona como chaperona, antioxidante y co-activador transcripcional (Ma, 2010; Thomas & Beal, 2007), por lo que su disminución puede contribuir directamente a la acumulación de especies reactivas de oxígeno (Thomas & Beal, 2007) y por tanto, a las lesiones observadas en la malaria cerebral ya que se ha visto que ratones deficientes en esta proteína desarrollan déficits motores (Chen et al., 2005; Goldberg et al., 2005) y que su sobreexpresión protege frente a una gran variedad de daños producidos por el estrés oxidativo gracias a su papel neuroprotector (Moore et al., 2005; Thomas & Beal, 2007). Por otro lado, y puesto que esta proteína también funciona como chaperona en la prevención de formación de agregados proteicos (Batelli et al., 2008; Discusión general 183 Thomas & Beal, 2007; Zhou et al., 2011), su disminución podría estar mediando la acumulación de proteínas propuesta a través de una menor inducción de hsp70 (Batelli et al., 2008; Zhou et al., 2011). Finalmente, PARK7 también podría estar implicado en la disminuida actividad de la SOD-1, ya que recientemente se ha visto que media la activación de esta enzima (Xu et al.). La disminución de foxo3 y foxo1 que observamos podría estar contribuyendo a la disminución de la expresión de sod-2 y cat, procesos que también se han propuesto en otras enfermedades (Collins et al., 2009; Ma, 2010). La Figura 19 resume la posible implicación en el desarrollo de la malaria cerebral que sugerimos para estas moléculas, junto con los sistemas antioxidantes que regulan. Figura 19.- Esquema de la regulación del sistema antioxidante en la malaria cerebral. A partir de la descripción experimental de efectos de FPXP, XBP1 y PARK7 se propone un modelo de señalización y control de los genes involucrados en la respuesta antioxidante que han sido estudiados en el presente trabajo. Los defectos detectados en algunos componentes del sistema antioxidante del hospedador podrían estar conduciendo a una situación de acumulación de especies reactivas de oxígeno y estrés oxidativo (Postma et al., 1996). Con el fin de analizar a qué nivel las alteraciones observadas en estos mecanismo de defensa están perturbando el equilibrio redox intracelular durante la malaria cerebral, procedimos a analizar la acumulación de especies reactivas de oxígeno y la carbonilación de proteínas en los estadios más avanzados de la enfermedad como Discusión general _   184 marcadores de daño oxidativo. Para llevar a cabo estos análisis se eligieron sólo las regiones cerebrales de cerebelo y tallo, debido a que en los ensayos previamente descritos realizados con nuestro modelo fueron las que mostraron un mayor acúmulo de carga parasitaria y las variaciones más elevadas en los niveles de expresión tanto de factores antioxidantes como neuroprotectores. Sin embargo, los resultados obtenidos en nuestro estudio no mostraron diferencias significativas a nivel de acumulación de especies reactivas de oxígeno entre animales control y animales infectados en ninguna de las regiones analizadas. Sospechando que la potencial acumulación de especies reactivas de oxígeno podría estar enmascarada por su rápida reacción con algunas de sus dianas celulares como lípidos, ácidos nucleicos y proteínas (Pino et al., 2005; Pino et al., 2003a; Postma et al., 1996), procedimos a analizar el patrón de carbonilación proteica como marcador de daño oxidativo más estable. Los ensayos de oxiproteómica pusieron de manifiesto la ausencia de diferencias en este patrón de carbonilación proteico, número de proteínas carboniladas o contenido total de proteínas modificadas por DNPH cuando se comparan extractos procedentes de cerebros de animales infectados con los animales control. Nuestros resultados concuerdan con los descritos por otros autores que tampoco ven diferencias en contenido total de carbonilación proteica de ratones con malaria cerebral (Sanni et al., 1999). Estos datos sugieren que al menos la carbonilación de proteínas no parece jugar un papel importante durante esta patología severa. Aunque estudios previos han descrito que existen niveles elevados de peroxidación lipídica en el líquido cefalorraquídeo de pacientes que sufren de malaria cerebral (Postma et al., 1996), en el modelo experimental murino solamente se han observado, a nivel cerebral, discretas alteraciones en los niveles de peroxidación lipídica (Reis et al., 2010) y un mayor grado de oxidación del ADN en las células endoteliales (Wiese et al., 2006). La producción de especies reactivas de oxígeno puede producirse de forma localizada (Siegel et al., 1999), proceso que puede verse favorecido por una distribución celular diferencial de los distintos sistemas antioxidantes (Maier & Chan, 2002). De esta forma, algunos autores sugieren que los efectos perjudiciales de Discusión general 185 las especies reactivas de oxígeno no sólo dependen de la cantidad acumulada, sino del lugar donde se generan (Pino et al., 2005; Postma et al., 1996). Así, los cambios que pudieran estar produciéndose en la carbonilación proteica, lo harían también a nivel local, dificultando su detección mediante las aproximaciones empleadas. Con el fin de comprobar si existen cambios locales a nivel de oxidación proteica, analizamos, mediante técnicas inmunohistoquímicas la distribución de las proteínas carboniladas en cerebro de ratones infectados. Las imágenes obtenidas no mostraron cambios en el patrón de distribución de la carbonilación proteica, lo que prácticamente descarta una acumulación intracelular de especies reactivas de oxígeno. Dado que las especies reactivas de oxígeno son requeridas para algunos procesos fisiológicos normales, cuando se produce la activación de las defensas antioxidantes y el contenido de las mismas se reduce a niveles subóptimos, la célula utiliza factores reguladores negativos que contrarrestan estos mecanismos (Mates, 2000). A la vista de los resultados obtenidos en nuestros ensayos, donde se pone de manifiesto una disminución transcripcional y funcional en varios de los sistemas antioxidantes que no aparece acompañada de una situación de estrés oxidativo, nos planteamos si en el desarrollo de la malaria cerebral pudiera estar sucediendo que la disminución de algunos sistemas antioxidantes estuviera acompañada de la inducción compensatoria de otros mecanismos, que evitaran la acumulación de especies reactivas de oxígeno. Debido a la importancia del sistema de defensa dependiente de glutation (Mates, 2000), cabe pensar que la GPX pudiera participar compensando la disminución de las enzimas TXR y CAT, al presentar una mayor afinidad por el peróxido de hidrógeno que ésta última. Por otro lado, el mismo efecto podría estar sucediendo con la HO-1, enzima que elimina el hierro libre y cuyos productos, bilirrubina y monóxido de carbono, ejercen también acciones antioxidantes, protegiendo frente a los efectos citotóxicos de diversos oxidantes (Calabrese et al., 2007). Por ello, teniendo en cuenta el papel que ejercen ambas enzimas, nos propusimos estudiar su expresión en el transcurso de la malaria cerebral en distintas regiones del cerebro de los ratones infectados en nuestro modelo. Discusión general _   186 Los resultados obtenidos mostraron que en el caso de la GPX existe una gran variabilidad en el comportamiento de esta enzima dependiendo de la región cerebral analizada. Algunos autores han observado resultados similares en muestras de cerebro bajo situaciones de estrés oxidativo inducidas por metales pesados (Hussain et al., 1997). En nuestro estudio, exceptuando la marcada disminución observada en el tallo, la mayoría de las regiones cerebrales ensayadas mostraron una inducción temprana de expresión de la enzima, lo que podría contribuir a detoxificar las especies reactivas de oxígeno y a que la cantidad total de éstas no varíe durante la enfermedad, ya que la GPX puede reducir también otros hidroperóxidos orgánicos además del peróxido de hidrógeno (Dringen et al., 2005). El distinto patrón de expresión que presenta este gen cuando se compara con el observado en el resto de las enzimas antioxidantes estudiadas podría explicarse a la vista de nuestros propios resultados, ya que el déficit de xbp1 disminuye los niveles de txr-1, sod y cat sin afectar la expresión de gpx (Liu et al., 2009). Se conocen casos de otras enfermedades neurológicas, como la enfermedad de Alzheimer, donde también se ha descrito un efecto compensatorio de esta enzima (Calabrese et al., 2007). Los ensayos realizados con la HO-1 también mostraron un incremento progresivo en la expresión del gen que la codifica asociado al desarrollo de la patología y en todas las regiones analizadas. Su inducción también se ha visto en otras enfermedades neurológicas, como las enfermedades de Alzheimer, Parkinson y Huntington (Orozco-Ibarra et al., 2006) y podría suponer un efecto compensatorio frente al entorno de estrés oxidativo. En este sentido, cabe resaltar que la inducción de esta enzima es una de las respuestas celulares más tempranas frente al daño tisular, debido a su importante papel neuroprotector (Calabrese et al., 2007). Por otra parte, la expresión de la HO-1 se puede inducir también por citoquinas (Hunt et al., 2006) con el fin de prevenir procesos neuroinflamatorios (Hunt & Stocker, 2007; Pamplona et al., 2007). Durante el transcurso de la malaria cerebral esta enzima parece jugar un papel importante ya que en pacientes que la sufren se ha visto una sobreexpresión de la misma, aunque algunos estudios indican que este hecho sólo se observa en una parte de los pacientes y no parece ser específica de la complicación cerebral (Hunt et Discusión general 187 al., 2006; Medana et al., 2001; Schluesener et al., 2001). En modelos murinos de malaria cerebral experimental que cursan esta patología, también se ha descrito una mayor expresión de esta enzima (Oakley et al., 2008; Pamplona et al., 2007) y se ha demostrado que su inducción ejerce un papel protector frente al desarrollo de la enfermedad (Ferreira et al., 2008; Pamplona et al., 2007), siendo central en el mecanismo protector de individuos con anemia falciforme (Ferreira et al., 2011). Figura 20.- Esquema de las alteraciones en el sistema redox intracelular durante la malaria cerebral. La disminución de SOD, CAT, TXR-1 y HSP70 del hospedador se ve compensada mediante la inducción de la expresión de ho-1 y gpx. TXR-r: tiorredoxina reductasa; GPR: glutation reductasa; PRX: peroxiredoxina; GSH/GSSG: glutation reducido/oxidado. Las reacciones que favorecen la producción de especies reactivas de oxígeno y el estrés oxidativo se representan en rojo, mientras que aquellas con efectos antioxidantes se representan en verde. El mayor o menor grosor de las flechas indica si la reacción está más o menos favorecida en nuestro estudio de malaria cerebral. El mayor o menor tamaño de letra representa el aumento o disminución observado de las moléculas antioxidantes. Una visión global de nuestros estudios parece indicar que, durante el curso de la malaria cerebral, se está produciendo un efecto compensatorio entre los mecanismos de defensa antioxidante, que impide la acumulación de especies reactivas de oxígeno (Figura 20). Aunque en el presente trabajo no observemos un incremento de las mismas, el daño que producen puede ser debido a que sus mecanismos de acción son complejos y que median diversas situaciones patológicas Discusión general _   188 dependiendo tanto de la dosis como del contexto celular (Ma, 2010), de forma que pequeños cambios en su nivel podrían contribuir a las alteraciones observadas en la expresión génica de otras enzimas. Por ello, es necesario un mayor conocimiento de la interacción entre las especies reactivas de oxígeno y estas vías transcripcionales en la patogénesis de esta enfermedad. Finalmente, nuestros resultados pueden explicar, tanto el efecto protector de los sistemas antioxidantes previamente descrito (Becker et al., 2004; Postma et al., 1996; Reis et al., 2010; Taoufiq et al., 2006; Thumwood et al., 1989), como la falta de acumulación de especies reactivas de oxígeno también descrita por otros (Sanni et al., 1999). 5.5.- MOLÉCULAS NEUROPROTECTORAS Y REDOX COMO DIANAS TERAPÉUTICAS DURANTE LA MALARIA CEREBRAL Estudios previos llevados a cabo en modelos animales afectados de diversas enfermedades asociadas a alteraciones motoras y a procesos de aprendizaje y memoria han demostrado que la administración del factor neuroprotector BDNF reduce los procesos neurodegenerativos que acontecen, lo que le confiere un potencial terapéutico considerable (Zuccato & Cattaneo, 2009), que podría extenderse a ser utilizado como terapia coadyuvante durante el tratamiento antimalárico de la malaria cerebral. Recientemente, se ha descrito que el acetato de glatiramer, un compuesto que aumenta la expresión de BDNF en el cerebro de ratones (Aharoni et al., 2005) reduce el riesgo de desarrollo de malaria cerebral cuando se utiliza en un modelo murino experimental de esta patología (Lackner et al., 2009). Las estrategias utilizadas para potenciar el efecto neuroprotector del BDNF están dirigidas hacia el desarrollo de fármacos capaces de aumentar la biosíntesis y liberación de esta neurotrofina en el paciente. Entre ellos se encuentran, por ejemplo, ampakinas, memantina, riluzol (Fumagalli et al., 2006a; Fumagalli et al., 2006b), antidepresivos como la paroxetina y sertralina (Duan et al., 2008) y agonistas de los receptores de dopamina D3, como el pramipexole. Además, si tenemos en cuenta que este último compuesto también media en los procesos neuroprotectores mediante la regulación del proteasoma (Albrecht & Buerger, 2009; Le & Jankovic, 2001), su uso frente a la Discusión general 189 malaria cerebral tendría un valor añadido ya que según nuestros ensayos este sistema celular también está alterado durante el curso de esta enfermedad. Otro candidato idóneo para su estudio con potencial aplicación clínica en la malaria cerebral sería un mimético que se ha desarrollado a partir de la molécula NCAM (Klementiev et al., 2007) cuyo uso terapéutico en humanos ha superado ya la fase I de ensayos clínicos (Anand et al., 2007) y que actualmente se está evaluando en pacientes que sufren la enfermedad de Alzheimer. Finalmente, y a la vista de los resultados obtenidos en nuestro trabajo, la potenciación de los mecanismos de actividad antioxidante también podría utilizarse como posible tratamiento para prevenir la malaria cerebral. Iones como el litio y el zinc inducen la expresión de genes antioxidantes como sod-1, sod-2, catalasa, thiorredoxina peroxidasa y hsp70 (Chiu & Chuang, 2010; Wu et al., 2011), además de potenciar la acción del BDNF (Corona et al., 2010; Fumagalli et al., 2006a), por lo que podrían resultar compuestos interesantes para el tratamiento de esta enfermedad. Por el momento, se ha descrito que el suplemento de SOD y catalasa puede resultar protector durante la malaria cerebral murina (Postma et al., 1996; Taoufiq et al., 2006). Debido a que la SOD es inestable, no penetra las células y provoca una importante respuesta inmune, se han desarrollado una amplia variedad de conjugados de esta enzima que presentan una vida media en circulación más alta, así como compuestos que mimetizan su actividad (Mates, 2000). Algunos de éstos ya han mostrado un efecto protector frente al desarrollo de esta forma severa de malaria en un modelo experimental murino (Taoufiq et al., 2006). Por otro lado, también se han desarrollado compuestos que mimetizan la actividad de la catalasa (Mates, 2000), con potencial para el tratamiento de esta patología. Recientemente se ha visto que la curcumina ejerce un papel protector en el desarrollo de la malaria cerebral (Waknine-Grinberg et al., 2010), efecto que podría estar justificado por el potencial de incrementar la HO-1 y la respuesta de choque térmico que tiene este compuesto (Calabrese et al., 2007). Por ello, otras moléculas antioxidantes con efectos similares, como son la acetilcarnitina y el ácido ferrúlico, podrían resultar drogas interesantes para prevenir la malaria cerebral. Discusión general _   190 Con estos antecedentes y según los resultados mostrados en este trabajo, nuestro estudio abre nuevas vías para el tratamiento de la malaria cerebral y sus secuelas mediante el descubrimiento de moléculas neuroprotectoras y factores redox que desempeñen un papel importante en el desarrollo de la malaria cerebral y podrían ser utilizadas como potenciales dianas terapéuticas. Además, a partir de nuestro modelo de enfermedad clasificado en cuatro estadios según la sintomatología neurológica, se puede caracterizar de forma más precisa el momento en el que comienzan a producirse dichas alteraciones, lo que ayudaría a determinar la pauta de administración farmacológica más adecuada para cada tratamiento específico experimental. Estos ensayos permitirán seleccionar de forma más eficiente las fases de tratamiento de la enfermedad y potenciar el efecto de los que se utilizan en la actualidad, impidiendo su desarrollo o minimizando las secuelas que padecen. 6. CONCLUSIONES/ CONCLUSIONS Conclusiones 193 1.- En el modelo murino de malaria cerebral utilizado (ratones C57BL/6 infectados con P. berghei ANKA), la caracterización fenotípica del comportamiento de los animales permite establecer un protocolo de análisis del progreso clínico de la enfermedad definido en cuatro estadios en función de las manifestaciones neurológicas que aparecen. Este protocolo proporciona el marco experimental adecuado para una valoración fenotípica del daño asociado por la infección y reduce la variabilidad resultante de la heterogeneidad individual que hay en el progreso de la enfermedad. 2.- La disminución en la transcripción de marcadores neuronales implicados en sinaptogénesis, plasticidad sináptica y supervivencia neuronal, como el factor neurotrófico derivado del cerebro y la molécula de adhesión neural, está asociada al desarrollo progresivo de los síntomas neurológicos característicos de la malaria cerebral. Este hallazgo indica que los procesos fisiopatológicos en los que dichos factores están implicados juegan un papel clave en la neuroprotección del SNC frente al daño neurocognitivo que aparece durante esta patología. 3.- La derivatización de proteínas con DNPH antes de su generación mediante electroforesis bidimensional es la aproximación metodológica más adecuada para analizar la oxidación proteica en tejidos de cerebro debido a que el número de proteínas modificadas detectadas en el gel es mayor, a su menor fondo y a una mejor reproducibilidad. 4.- Los estudios de expresión génica de enzimas y factores de transcripción claves en el mantenimiento del estado redox del hospedador infectado ponen de manifiesto que el desarrollo de la malaria cerebral se ve acompañado de una disminución en los niveles transcripcionales de los genes que los codifican, lo que sugiere su implicación en las alteraciones neurológicas y posibles disfunciones cognitivas en la malaria cerebral murina. Por otro lado, la inducción compensatoria de las enzimas hemo oxigenasa-1 y glutation peroxidasa observada en esos mismos animales puede explicar que, ni las especies reactivas de oxígeno ni las proteínas oxidadas, se acumulen durante la malaria cerebral. Conclusions _   194 1.- In the murine model of cerebral malaria used (P. berghei ANKA in C57BL/6 mice), the phenotypical characterization of animal neurobehavior allows establishing a protocol for disease progression analysis in four stages according to the neurological outcome. This protocol provides an adequate experimental framework for the phenotypic assessment of the damage associated with the malaria infection to reduce variability due to individual heterogeneity in disease progress. 2.- Decreasing in transcriptional levels of neural markers involved in synaptogenesis, synaptic plasticity and neuronal survival, such as brain-derived neurotrophic factor and neural cell adhesion molecule, is associated with the progressive development of the neurological symptoms of cerebral malaria. This finding suggests that physiopatological processes in which these factors are involved play a key role in SNC neuroprotection against neurocognitive damage produced in this pathology. 3.- Protein DNPH-derivatization before bidimensional electrophoresis is the methodological approach of choice to analyze protein oxidation in brain tissues due to the larger number of modified proteins detected in gels, its lower stained background and improved reproducibility. 4.- The analyses of expression of the enzymes and transcription factors involved in preserving the redox status of the infected host highlight that cerebral malaria progression is associated with a transcriptional downregulation of the corresponding encoded genes. These results suggest their implication in neurological alterations and potential cognitive damage during murine cerebral malaria. On the other hand, compensatory induction of heme oxygenase-1 and glutathione peroxidase could explain the absence of reactive oxygen species accumulation or protein oxidation build up during cerebral malaria. 7. BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 197 ABBOTT, N. J., RONNBACK, L. and HANSSON, E. (2006). Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci, 7, 41-53. ADAM, E., PIERROT, C., LAFITTE, S., GODIN, C., SAOUDI, A., CAPRON, M. and KHALIFE, J. (2003). The age-related resistance of rats to Plasmodium berghei infection is associated with differential cellular and humoral immune responses. Int J Parasitol, 33, 1067-1078. AHARONI, R., EILAM, R., DOMEV, H., LABUNSKAY, G., SELA, M. and ARNON, R. (2005). The immunomodulator glatiramer acetate augments the expression of neurotrophic factors in brains of experimental autoimmune encephalomyelitis mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 19045-19050. AIKAWA, M. (1988). Human cerebral malaria. Am J Trop Med Hyg, 39, 3-10. 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