LINFOMAS CANINOS Estudio óptico, electrónicoe inmunohistoquímico Pro«feraciónyploidía Tesispresentadapor: CannenSanzRivas Directores: Maña Castaño Horacio Oliva Dpto. de PatologíaAnimal II Facultadde Veterinaria UniversidadComplutensede Madrid Dpto. de AnatomíaPatológica FundaciónJimenezDíaz UniversidadAutónomade Madrid Facultadde Medicina Madrid, 1998 UNIVERSiDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA >Fundación Jiménez Díaz CLíNICA DE NUESTRA SEÑORA DE LA CONCEPCION Avda. de los Reyes Católicos, 2 (Ciudad Universitaria> 28040- MADRID INFORME SOBREEL TRABAJO: “LINFOMAS CANINOS. Estudio Proliferación y ploidía”. óptico, electrónico e inmunohistoquinnico. PresentadoporCarmenSanzRivasparaoptaral titulo de Doctoraen Veterinaria Los linfomasconstituyenunade lasneoplasiasfrecuentesen perros.Suestudio, al igual que en humanos,necesitade una metodologíamúltiple y de una correlación clínico-evolutiva. En el presentetrabajose han abordadolos distintos aspectosde diagnóstico morfológico e inmunofenotipico.Así mismo sehan estudiadodosfactorespronóstico interesantes,la proliferacióny la ploidiacon distintosanticuerposy diferentescitometrias. Dadala alta agresividaden el grupode tumoreselegido,la correlaciónclínico- evolutiva ha sido acordecon la presentadaen las neoplasiasagresivasy el estudio estadísticoha señaladopuntosde interésa consideraren nuevosenfoques. El presentetrabajoha sido realizadoconmetódicaactualizaday rigor científico, por lo que creemosquereúnelas condicionesexigidasparaserpresentadocomo Tesis Doctoral. Madrid, octubrede 1998 Ci Maria Castaño Catedráticade AnatomíaPatológica Directorade Tesis HoracioOJiva Catedráticode Patología Directorde Tesis AGRADECIMIENTOS Agradecimientos Esdificil, despuésderealizaruntrabajolargoy complejocanoesunaTESIS DOCTORAL,recordar y citar a todaslaspersonasque habríaqueincluir enlos agradecimientosfinales,ya quecualquierolvido podríasermalinterpretado. Poresarazónesquizásmásadecuadohacerloenprincipio alasInstitucionesquemehanpermitido y proporcionadomaterialy metodologíaparala realizacióndelestudio. La Facultadde Veterinariade la UCM y a su Departamentode PatologíaAnimal II, en especial AnatomíaPatológicaeHistologíacontodoslos facultativosy técnicos,comoElenade PatologíaMédica,han de serlos primeroscitados,por la facílitaciónen la realizaciónde necropsiasy la recogidade historias clínicas. Soyconscientedequesin elapoyodePedro,Pilar,Belén,Antonio,Eduardo,Lauray los demástodo hubierasidomáscostoso. EnsegundolugarelDepartamentodePatologíade la FundaciónJiménezDíazUAM, donderealicé todalametodologíaaplicada,al ServiciodeInmunologiaporlos datosdela CMF y a la FundaciónConchita Rábagoque fmanciópartedemi estanciaendichoCentro. En cuantoa las personas,sin olvidara los directoresde Tesis,HoracioOliva y María Castaño, quisierarecordaratodos: facultativosveterinarios,médicosy biólogos,técnicosdelaboratoriogenerale IHQ, sobretodo a Trinidad Carrizosa,porsusconsejos,enseñanzasy simpatía. A PilarRalicioporsueternasonrisa,cariño,constanciay confianzaincondicional.Sin ella elpaso porla Fundaciónno habríatenidotú puntode comparación. Mis mejoresdeseosy total gratitudparalasoncólogasAnaAgeitosy Lola PérezdeAlenza,lascuales me enseñarona comprenderla correlaciónclínico-patológicade la enfermedadcon seriedadcientíficay el respetoporel enfermo.Esperoquela Sanidad,tantohumanacomoanimal,sellenedepersonasasi. Un recuerdoespecialparalas amigasBeatrizy Gema(lasmejoresparael desarrollotécnico)y la familia, en especiala ini hermanaElena,porqueun trabajode Tesis estareaque a vecesdificulta las relacionesnormalesy sólogandesdosisdetoleranciay cariñopuedenllevarlaa buenfin. Tambiénrecordar a todosmis amigosquehan soportadomis rarezasdurantecasicuatroañoscon granpaciencia.Enconato, graciasa Macarenapordarformaa todosestostextosrealizandola ediciónfinal delmanuscritoy porestar siempreahí. Ami tía Fanfl porlaconfianzaquehapuestoenmi desdeel principio y todaslasenseñanzasenel “arte” dela citologíay dela vida Agradecimientos Mi madreesla última citada, porque no creoque existan palabraspara definir lo queha hechopor estelrabajoypormi.Hasidolaúnicaenconflarenquetodoesteesf’uerzoseplasmaraenalgo,yenpoder combinarconéxito la ecuaciónmadre-jefa-profesora.Fuemi principal impulsoray esperoque estatesis eonstituyalo queellahabríaesperado. Soyveterinariaporel amorquesientohacialos animales.Agradezcoatodosellos lo queme han enseñadoy esperoqueestetrabajo,unidoa los muchosactuales,les proporcionena cortoplazomejores posibilidadesde supervivencia. A todoslos quede algunaformahancooperadoconmigoy heolvidadonombrar. ABRE VIATURAS Abreviaturas Ag = Antígeno ABC> ComplejoABC: Avidina-Biotina. Ác = Anticuerpo. AcMo Anticuerpomonoclonal. AcPo= Anticuerpopoliclonal. ADN = Ácido desoxirribonucleico. El = CélulaB sinmemoriainmunológica. B2 = CélulaB con memonainmunológica bcl-l = Oncogen. bcl-2 Oncogen. CD= Centroblasto. CC = Centrocito. CME= Citrometriaestática. CMF Citometriadeflujo. C3b= Fracción3b delcomplemento. DRC= Célulasdendriticasdelcentrodel folículo. drc = Célulasdendriticasdelmantofolicular. EBV Virus de Ebstein-Barr. ELISA = Enzymelinked immunosorbentassay. FAIDS = VerSIDA. FeLV Virus de la Leucemiafelina. FeSV Virus del sarcomafelino. flV = Virus dela imnunodeficiencíafelina. FOCMA = Antígenodela membranacelulardeloncoinavirusfelino /.Felineoncornaviruscelí membrane antigen. HM = Célulashistiomonociticas. IB = Inmunoblasto. IDC= Célulasinterdigitantes. ff1 = mmunofiuorescenciaindirecta. lg = Inmunoglobulina. IgFC = Zonadefijación antigénicadelas inmunoglobulinas(fracciónconstante). ¡gil = Cadena pesadade Ig. IHQ = Inmunolústoquimica. IL = Interleukina. L = Linfoma. LO!! = Láctico-dehidrogenasa. LLA = Leucemiaagudalinfoblástica. al Abreviaturas LLC = Leucemialinfáticaerámea. LMF = Linfomadelmantofolicular. LNH-B = LinfoinasnoHodgkinB. LpI = Linfoplasmocitario. MALT Tejido linfoide asociadoa mucosas. ME = Microscopiaelectrónica. MF = Micosis fiangoide. PAAF= Punciónaspiraciónconagujafina. PI = indiceproliferativo(?Proliferationmdcx). PO= Peroxidasa. QDA= Programade AnálisisdelADN (QuantitativeDNA AnalysisProgramme). QT = Quimioterapia. RC = Remisióncompleta. RP= Remisiónparcial. RN = Receptoresnucleares. RER= Retículoendoplásmicorugoso. RP= Remisiónparcial. SIDA = Síndromede Inmunodeficienciaadquirida(FAJUS:PeIneadquiredimmunodefiiciencysyndrome -SIDA Felino). SNC= SistemaNerviosoCentral. SN?= SistemaNerviosoPeriférico. STABC=ComplejoStreptavidina-Biotina. TVT = Tumorvenéreotransmisible. VIII = Virus dela inmunodeficienciahumana(HlV: humanímmunodefficiencyvirus). a2 ÍNDICE Indice AGRADECIMIENTOS ABREVIATURAS 1.-PROPÓSITOSY OBJETIVOS . 1 11.-INTRODUCCIÓN: A.- SISTEMA LINFOIDE; ORGANIZACION B.- AREA B; FOLÍCULO LINFOIDE SECUNDARIO C.- EL ÁREA T O INTERFOLICULAR.. D.- CONTRAPARTIDAS TUMORALES Dl.LinfomasB D2. LinfoznasT E.- BIOPATOLOGÍA DE LAS NEOPLASIAS LINFOIDES F.- PROCESOSLINFOPROLIFERATIVOSEN ANIMALES DOMESTICOS F. 1. Presentaciónen e/perro F.2. Presentaciónen otrasespecies;linfoma-leucemiaen elgato F.3. Clasificaciónclínico-anatómicaenanimalesdomésticos F.4. Estadiosclínicosen mam4feros F.5. Historia clínicaydiagnóstico F.6. Tratamiento.Quimioterapia G.- TECNICAS ESPECIALESDE ESTUDIO III.- MATERIAL Y MÉTODOS A.- CASUISTICA B.- MORFOLOGIA ÓPTICA. C.- MICROSCOPIAELECTRÓNICA. . D.- INMIJNOHISTOQUÍMICA. .. Dl. Procedimientomanual D.2.Procedimientoautomático D.3. Consideracionestécnicasparala realizaciónyvaloraciónde laJHQ D.4.Anticuerposutilizadosen1119 3 4 8 lo lo 11 11 13 13 13 17 17 18 20 23 25 25 26 28 28 31 32 33 il Indice E.- ACTIVIDAD PROLIFERATIVANUCLEAR 35 E.1.Anticuerposinonoclonalesdeprohferacíón. 36 E.2.Analizadordeimagen 37 F.- ESTUDIOCITOMETRICO 39 F. 1. Citometriaestática 40 F.2. Citometriadeflujo 43 £3. Valoracióndelciclo celular encirometria .. 44 O.- ANÁLISIS ESTADíSTICO 45 IV.- RESULTADOS A.- HALLAZGOS CLíNICOS 46 B.- AFECTACIÓNNECRÓPSICATUMORAL 47 C.- MORFOLOGÍA ÓPTICO-ELECTRONICA 50 D.- PATRONESDE TINCIÓN EN INMUNOHISTOQUIMICA 51 E.- CINETICA TUMORAL 54 F.- ESTUDIOESTADÍSTICO 55 y.- ICONOGRAFíA A.- TABLAS 58 B.- FIGURAS . 65 VI.- DISCUSIÓN. A.- CONSIDERACIONESGENERALES 107 B.- CONSIDERACIONESDEL GRUPODE ESTUDIO 111 C.- CONSIDERACIONESBIODINÁMICAS ... . 113 VII.- CONCLUSIONES ... 118 VIII.- BIBLIOGRAFÍA 120 i2 1.- PROPóSITOSY OBJETIVOS Propósitosy Objetivos Los procesoslinfoproliferativos, dentrode las neoplasiasmalignas muestranuna incidencia ascendenteenlos humanos,queserolacionaenpartecon el aumentodela inmunodepresión,sobretodo la adquirida:trasplantesy SIDA. La dificultadque acompañaa estegrupotumoralenglobadistintosconceptos dediagnósticoy tratamiento;a pesardeunainvestigacióncontinua,loslinfomascontinúansiendoactualidad porquesuconocimientocompletoestáunidoal avanceinmunológicoy terapéutico. La semejanzadel sistemalinfoide humanoy animal,no sólo mamíferossino tambiénespecies inferiores,hacea priori muyinteresantela consideracióncomparativadesusneoplasias.Así mismopuede servirparaconstatarla ayudaque losdatosanivel humanoaportanencl conocimientodeestostumores. El presentetrabajoestudialos linfomasenla razacanina,de unaincidenciasuperiora la humanay con etiologíay epidemiologíano conocidas.No se han encontradoen ellos oncogenescausantesde traslocacionesrepetitivas,perosí una probableimplicaciónde los genessupresores.Ningunodelos virus linfotroposresponsablesde linfomas en el hombreactúaen el perro (tú el virus de Epstein-Barr(EBV) relacionadoconel linfoma endémicoafricanodc naturalezaB o linfoblásticotipo Burkitt, ni el HTLV-I, retroviruscondicionantedellinfoma-leucemiaagresivodelinfocitos T, endémicodelJapóne islasdel Caribe). Aunqueenel gatoseconocequelos virusdelaleucemiafelina (FeLV) y dela inmunodeficienciafelina (FW) estánimplicadosenlinfomasy leucemiasporlainducciónpreviadeun estadodeinmunodeficiencia,seduda deunaetiologíaviral relacionadaconlos tumoreslinfoides delperro. Paralaconsideracióndeestapatologíaanimal,interesantey dificil, seutilizan conceptossemejantes a los descritosenpatologíahumana.Existendiscretasvariantesenla clínica,estadiajey terapia,y parasu correctaevaluaciónmorfológicasehande incluir deformanecesarianuevasmetodologías. Encuantoalaclasificacióndc lostumores,enelpresentetrabajoseha seguidola modalidadhumana, quizásnototalmenteadecuada,porqueestasneoplasiasen la mayoríadelassedespublicadasy enlos casos que aquí seconsideran,soncasisiemprede alta agresividad.No obstante,las clasificacionesde Leí y Working-Fonnulation,que consideranlos linfomas segúnlos distintosgradosde malignidad,pareceque cumplendeformaadecuadalos objetivosdeestatesis. Dadoqueno hay queolvidarque partedelos linfomascaninosno sólosurgenenganglios,sinoen piel, timo o aparatodigestivo, serecogentambiénlos conceptosde la escuelainglesade los linfomas extraganglionares(Isaacson),la revisióneuropea-americanaREAL, y la últimapropuestade la OMS &ara clasificarlos linfomas)que englobanlinfomasnodalesy extranodales.No obstante,dadoque los distintos subtiposdescritosen lasclasificacionesgeneraleshumanas,resultanconfrecuenciapocosuperponiblescon los hallazgosencontradosa nivel animal, pareceque los linfomas animales,todos no Hodgkinianos,se deberíanconsiderarporel lugaranatómicodondesurgen,porla semejanzaconlascélulasquelos originan 1 Ikqp4sitasy Objetivos y por las característicasbiológicas de las mismas,las cualesincluyen métodosbiodinímicospara la valoraciónobjetivadela agresividad. Losestudiosdelinfomasanimalesrealizadoshastala actualidad,abarcanlascaracterísticasclínicas, morfológicase inmunohistoquimicas(1H03conanticuerposmonoclonales(AcMo) encongelación,dirigidos anti-anilgenos(Ag) animales.Faltantrabajosenlos quela IHQ serealicecon métodosy anticuerpos(Ac) en cortesparafinados,semejantesa los utilizadosen patologíahumana,casi todos comercialesy con alta definición,que por su probablereaccióncruzada,o porserextensivosa mamíferos,pennitanun mejor reconocimientocelulary asíunacorrectatipificacióndel tumor. El presenteestudiotienecomoobjeto entenderla biologíaneoplásicaen el anñnaly sabersilos distintos linfomas muestranrasgosdiferencialeso comunesen su presentaciónclínica, diagnóstico morfológico, inmunofenotípico,biodinámico y respuestaal tratamiento.Paraello sehanelegido casos representativosque aúnenmaterialidóneoparael diagnósticomorfológicomultidisciplinario, lo que exige tomasrápidaspostmortemo biópsicas,asícomoprotocoloscompletosclínico-evolutivos. El material procededel DepartamentodePatologíaAnimal II de la FacultaddeVeterinariade la UniversidadComplutensede Madrid-UCMSi lastécnicassehanrealizadoenel DepartamentodeAnatomía Patológicadela FundaciónJiménezDin, UniversidadAutónomadeMadrid-UAM, CentrodeReferencia dePatologíaLinfoide, conexperienciaadecuadaenel diagnósticoactualizadomorfológicoganglionar. Los objetivosconcretosespecificadossecitana continuación: 1.- Estudioclínico - evolutivo 2.- Estudio morfológico necrópsico, con técnicas de rutina, microscopia electrónica e inmunohistoquimica,conmarcadoresmonoy policlonales. 3.- Estudiobiodinámicodelasbiopsiasconmarcadoresproliferativosparaposteriorcuantificación enun analizadorde imagenCAS 200. 4.- EstudiodelADN concitometríadeflujo y estática. 5.- Estudioestadísticodelos resultados. 2 II. - INTRODUCCIÓN Introducción £- SISTEMA LINFOIDE; ORGANIZACIÓN. Para una correcta comprensiónde la inmunopatologíade los procesoslinfoproliferativos, se deben conocerlos cambiostantomorfológicoscomoinmunofenotípicosque ocurrendurantela transformación linfocitaria, laanbriogénesisy diferenciaciónfisiológicaasícomola división delos linfocitosensubgrupos fimcionales,conel patróndecirculacióny anidamientode losmismos/TaylorCR, 1982]. Desdequesehicieronlas primerasdescripcionesdel linfocito en 1774 hastalosúltimos años,seha avanzadomuchoenel conocimientodinámicodelsistemacelularlinfoide, no hayque olvidarquehacia1958 scdudabadela funciónlinfocitaria,o aquella“célulaconatributosmorfológicaspocodefinidos’ /Mñchell Jetal’, 1978]. Las célulasdel sistemainmune,sobretodo los linfocitos, sedistribuyenen órganoslinfoides, donde formanmicr~ambientesintercomunicadoscon altaespecialización,que facilitan el atrapamientoantigénico, sucatabolismo,cl tráfico linfocitario y la estimulacióny diferenciaciónordenadadecélulasefectoras[Kay NRa al, 1979; BanksWJ, 1993]. Sepuedendiferenciartrescompartimentosdc maduraciónlinfoide: A) célulasgerminales,B) órganos linfoidescentralesdemaduraciónlinfocitariaT oB antígeno-independientes(timo y equivalenteshumanos delaBm-sadeFabriciodelas aves)y C) órganoslinfoides periféricos,degeneracióny dúbsiánderespuesta inmunepost-estimuloantigénico(ganglioslinfáticos,bazoy sistemalinfoide asociadoa mucosas:MALT) [LinchPC etal, 1982; IsaacsonPGetaL 1983;SpencerJetal, 1986]. La célulamadre,totipotencialhematopoyéticao célulaSTEM, seoriginaenlos isloteshematopoyéticos del sacovitelino del embrión,en elhígadofetal y despuésdelnacimientoenla médulaósea(MO), dando lugaralasdiferentesserieshematopoyéticas,incluidalalinfoide, objetode estetrabajo[RyseriEetal, 1974; Mitchelliet al, 1978; KayNEetaL¡979; Miller JFA.P, ¡979; QuesenberryPetal, 1979;Magrithflj ¡981; SanchezFayosJetal, 1982;NicholsWSetal, 1983;KempinU 1984;SanchezFayosJetal, 1984; FialkowPj 1988;Ban/csWJ 1993]. La serielinfoide T maduraen el timo. El contactoprecozdelos linfocitos conlas célulasepiteliales timicasesfundamentalparala adquisicióndela autotolerancia.Alrededordeun 5%dela produccióndiaria tímica surgede la zonacórtico-medularparadespuéssalir a la sangrey serdistribuidaenlasregionesT- dependientesde los órganos linfoides periféricos. Esta distribución ocurre en virtud de factores microambientalesno totalmenteconocidos,queenpartedependendelas agresinaso moléculasdeadhesión y dela accióndelendoteliodelasvénulasdelas áreasT. Los linfocitosT constituyenun 70-80%del total linfocitario desangreperiféricay un 90%dc la linfa delconductotorácico[Lewne(3D etal, 1975;RosaiJ eta), 1976,Mflhler-HermelinkHx,1986,KnappWca), 1989;HenryX, 1992]. 3 Introducción Scdiscutecualesel equivalentedela Bursa,órganolinfOide centraldela serieB. En rasgosgenerales seaceptaquedebesula MO sobretodoniel individuo adulto. En ella maduranlinfocitosB queconstituyen un 12-15%de los linfocitoscirculantesensangreperiférica,un 50%dc loslinfocitosesplénicosy un 75% delesdelaMO /MitchellJflal, 1978;KayNAetal, 1979;MIIIerJFA.P,1979;NíeholsH’S e: aL 1983; ParksDE etal, 1983;Roitt1, 1988). Los órganoslinfoidesperiféricospresentanáreasB y T dependientes,conunadisposiciónespecífica encadaórgano.En el gangliolinfático el áreaT correspondea las zonasparacorticales,centradasporla vénulapostoapilar;el áreaB-dcpendientecorrespondea losfolículos linfoidesy alos cordonesmedulares, y enella las célulasB muestrandistintamorfología,modulacióny función.En el bazo(dentrodela pulpa blancao folículos de Malpighio) las áreas1’ sonlas varnascelularesperiarteriolares,y las B las rodean formandofolículos distintosa los delganglio, ya que presentanun cenizocon vascularizacióncapilaro- arteriolar,mantoy áreamarginal.Enel sistemaMALT los folículos o áreasB seestructurancomoenelbazo (sin vasosensuinterior)y eláreaT esperiféricaa los mismos,conunadisposiciónsemejantea la queexiste enlos ganglioslinfáticos[RivasC etaL 1975; RivasCetal, 1980;lsaacsonPC etal, 1983;RivasCetal, 1983; Fujita Tetal, 1985]. En cadaórganoseñalado,lascélulaslinfoidesestánenunamallao estromacon distintostiposcelulares, quea suveztienendiversasfunciones.La funciónde sosténcorrespondea elementosdehábito fibroblástico. Otrascélulas,deestirpemonocitaria,o fagocitano inducenla respuestay los cambioslinfoides dealrededor al atraparensusuperficielos antígenos;sonlascélulaspresentadorasde antígeno,dendríticasfoliculares (DRC)enel áreaB,olos complejosinterdigitantes-célulasdeLangerhans(DC) delasáreasT [LinchDC etaL 1982;RivasC etaL 1983;FellerAC’, 1985; Fujita Tetal, 1985]. B.- ÁREA B; FOLíCULOLINFOIDE SECUNDARIO. Comoya sehacomentado,losfolículos linfoides sonunosagregadosnodularessituadosenla cortical de los ganglioslinfáticos u otros órganoslinfoides. Parasudesarrollosenecesitaunapoblación1 timo- dependientenomial. Noocurreuna activacióncompletao correctaenestadoalteradodela inmunidad[Roía 1, 1988]. Cuandono haexistidoun estimuloantigénicoprevio,el folículo eshomogéneoy estáconstituidopor célulaslinfoidesdepequeñotamañoy aspectomaduro(celulasB 1 sinmemoriainmunológica),esel llamado folículoprimario.Postaccióndelantígenoseconstituyenlosfolículossecundarios,demayortamaño,con doszonasbiendefinidas:unaperiféricaestrechade célulaspequeñasconnúcleosdensos,queconstituyeel mantofolicular, y otra centralo núcleoclaro porposeercélulasmayores,denúcleosconmenordensidad cromatírúca,porlo que sedestacaclaramentedel restode la pulpa.Estazonasellamabaantesgerminal, porqueseinterpretabacomoel lugardondenacíanen sumayorpartelos linfocitosB [Fupta Te:al, 1985]. 4 Introducción En el sistemaMALT o en loo gangliosmesentéricosel folículo serodeade unaterceracapaconcéntrica semejanteala queprwannlaszonasB delosfolículos deMalpighio esplénicas,el áreamarginal/Millíkin PD, 1969;LínchDC e: al, 1982;FellerAC,1985;Fujila Tetal, 1985; WoJfBCe:aL 1989]. Centro Folicular Presentacélulas linfoides de gran tamañoresultadode la modulaciónde los elementosvírgenes linfocitariosB1, conunamorfologíacaracterísticaquelasidentificacomo“célulasdel centrofolicular”. Las máspequeñaso másmadurassonlos “cites” (centrocitosCC) que midende lOa 12 micras.Lasmayoreso “blastos”(centroblastosCB) miden de 15 a 25 micras. Los CC tienenun núcleohendidoo de contorno irregularconcromatinadensa,nucleolopequeñoy escasascisternasderetículoendoplásnúcorugoso(RER) intracitoplásmicas.Los CB tienennúcleosde contornoliso, forma ovalada,cromatinalan y nucleolos hiperplásicosgeneralmentemarginados;elcitoplasmaesescasoconmínimacuantíade RE [RivasC etal, 1980]. La inmunohistoquimicaen tejido humanodemuestrapositividadparalos anticuerposmonoclonales (AcMo) pan-B (CD19, CD2O, CD79a)así comoparalos Ac policlonales(Po): IgM, kappay lambda, expresandotambiénel AcMo CD10 . En tejido animal fimcionabastantebienelAcMo CD79ay los AcPo kappay Lambda. Lascélulasdeestirpehistiomonocítica(HM) modificadaconstituyenlasdendríticasdelcentroo DRC. Compartenmarcadoresconesaestirpeasícomootros específicos(CD2l-CD23).En tejido animalexhiben casiensutotalidadla proteínaS-100,yaqueotrosAc HM comoel MAC 387 tiñenhistiocitossinusales. Sonenlas DRC dondecomienzanlos cambiosdel centrofolicular. Ante la llegadade ciertosantígenos, cambiansumorfologíay sehacenestrelladas,concuerpopequeñoy largasprolongacionesqueatrapanen superficieabundantescomplejosantígeno-anticuerpo(graciasa que poseenreceptoresparaIgFc de las inmunoglobulinasy complementoC3b) los cualespermanecenlargotiempoensumembrana,y facilitan la transformacióndelos linfocitosa blastosdelcentro: centroblastosy centrocitos(CB y CC) comoun primer pasopara1» formacióndela célulaplasmáticao elementoespecializadoparala formacióndeanticuerpos. Probablementeexistenotrascélulasintermediasenla respuestaB, comosonlos inmunoblastos(IB) y lascélulaslinfoplasmocitarias(Lpl); tambiénhayunaseriedecélulasB quetrassu contactocon lasDRC quedansintransfonnar,peroconservandola memoriainmunológica(B2) y presentandola morfologíade linfocito maduro. Las célulasCB muerenrápidamentey sus restos apoptóticosson fagocitadospor macrófagos,responsablesdela imagenen “cielo estrellado”delcentroreactivo. En estosfoliculos secundariosocurrela activaciónB timo-dependiente.El macrófagocaptael antígeno (pormediodesusreceptoresdemembrana)y lo elaboraensucitoplasma,presentándolodespuésa la célula 5 Introducción CD4 a colaboradora,en susuperficieestáunido al complejode histocompatibilidadclaseII (clase1 silo presentaal linfocito CDS citotóxico).Conestosprocesosasícomoconlaproduccióndeinterleukina(IL)-!, cl macrófagoestimula al linfocito cooperador,quea suvezproducela IL-il, determinandola proliferación B y T. Esteesun mecanismoinmunológico general ¡Roitel, 1988;OrflzMasllorensF 1997],que está ausenteenestadosdeinmunodefletencía Tambiénse admite unaactivacióntimo-independientequeocurrecon algunostipos especialesde artígenos(polímerasD-aminoácidos,polisacáridos,polivinilpirrolidona,etc...)quesoncapacesde estimular las célulasE sin que las T esténinvolucradas.Pareceque enconcentraciónsuficiente,algunassustancias persistenduranteun tiempo prolongadoen la superficiede macrófagosespecializados(probablemente situadosenel senosubcapsularganglionary en la zonamarginalesplénica)consiguiendotransformaciones E efectivasperono cuantitativamentesuficientes. En el gangliolinfático no seconoceexactamentesilos cambiosdescritosseproducenen la pulpa subsinusalo enla periferiade los folículos,enla zonadelmanto,dondelascélulasHM (drc) constituyenla tramadendríticadel mismo,actuandotambiéncomocélulaspresentadorasantigénicas[RoJa!, 1988]. Manto Folicular En el folículo secundariola zonaclaracentral serodeade unaperiferiadensa,con peculiaridades morfológicase inmunofenotipicas.Si la morfologíaópticaerasuficienteparadefinir lascélulasCE,CC y DRC delcentro,no ocurrelo mismoconlos treselementosdel manto.Sucéluladendritica(clic) esmenos característicaquelaDRC,conprolongacionesmáscortasy gruesas,másvecinasa loshistiocitos;lascélulas linfoidesparecenelementosmayoresque un linfocito, connúcleodecontornoirregular,cromatinadensay nucleolollamativo. La inmunohistoquíniicaproporcionaentejido humanoun inmunofenotipodistintivodelmanto.Lasdrc sonpositivascon AcMo HM y negativaso débilmentepositivasconAcMo anti-DRCaunque,enocasiones muestranpositividadcondesminay vimentina,careciendo,comolasDRC,defenómenosdefagocitosis.Las célulaslinfoides sonpositivasparaIgM, peroademásmuestranIgD, así como kappay lambda,siendo negativasconCD1O. Dichascélulaslinfoidesdelmantopuedenmarcarseconel anticuerpoT restrictivoCD5 [VteisemburgerDet aL 1985]. La actividadproliferativa tras el estímulo antigénicodifiere en centroy manto: en el primerola positividadconciclinasMIB1 (Ki67 enparafma)oPdOpuedesercasideun 100%y enel segundode un 5a un 10%.Los valoresobtenidosentejidoanimalsonalgomásbajos[Gerdes.1, DallenbachFe:aL 1984; Cerdes¿LemkeHe:al, 1984; Gerdes¿Sabartiniketa¿1993]. 6 Introducción LaMicroscopiaElectrónica(ME)maltalasdiferenciascelularesentrecl centroy el manto.LasDRC son de cuerpopequeñoy triangular,a vecesdoble, con cromatinafina y nucleolo poco llamativo; su citoplasmaesescasoy no muestralisosomassecundarios,prolongándoseen finas extensionesunidaspor desinosomaso hemidesmosomasquerodeanestrechamentecadaCBy CC. Lasdendríticasdelmanto,drc, sonmenores,conprolongacionesanchasque siguena un citoplasmamásamplio que el de las DRC,con ocasionalesmicroflbrillaso cuerposdensosquerecuerdana mioflbrablastos;en laszonasmásperiféricas dichas prolongacionesse entremezclantanto con las extensionesde las DRC como con los procesos citoplásmicosdelascélulasinterdigitantes(DC) deláreaT. Lascélulaslinfoides delmanto(10micras)tienennúcleoredondoo hendido,cromatinadensay nucleolo llamativoconcitoplasmamoderadoy escasascisternasdeRER Sediferencianultraestructuralmentedelos CC del centro, que son mayores(12 micras), con cromatinamás dispersay nucleolo menor, siendo excepcionalelRER El CB delcentroeselblastomayor(15-18micras)connúcleolisodecromatinadispersa y nucleolosprominentes,únicos o múltiples, generalmentemarginados;su citoplasmaes escasocon abundantespolirribosomasy despolarizaciónmitocondrial [Man Y et aL 1966; Millikin PO, 1969; KaiserlingE. 1977; RivasC, 1980]. La formacióndel folículo secundarioesla expresiónmorfológicadela activacióndelsistemainmune en respuestaal contactocon el antígeno.La estimulaciónde la célula B suponeuna proliferacióny diferenciaciónhaciala célulaplasmática,especializadaenla formacióndeanticuerposespecificasparael antigenoencantidadsuficiente.La secuenciacelularque vadesdeun linfocito “virgen”, sincontactoconel antígeno,hastala plasmática,esdiscutida.Probablementeun linfocito B 1 pequeñodalugar a un CB que rápidamentemuere,siendosusrestoseliminadospormacrófagosdelcentroreactivo.Los inmunoblastos(IB) sonmuysimilaresa losCB peroposeenmáscisternasdeRERy nucleolocentral;parecequeestasdoscélulas estánmuy relacionadastanto porsumorfologíacomoporsu inmunofenotipo.El CC esprobablementela primeracélulaefectora,aunquedecortaduración.El siguienteescalónesla célulalinfoplasmocitaria.Las células del manto tienen un desarrollo inicial de retículo endoplásmicorugosoRER, adoptandouna morfologíasimilar a la linfoplasmocitaria. ExperimentosanimaleshandeterminadoqueenlasDRC permanecenlos complejosantígeno-anticuerpo quecondicionaríanlos cambiosCB y CC. CélulasB2 dememoriallegaríanal mantocontactandocon un nuevoantígenoenlasdrc, lo quea su vezestimularíalos cambioshaciacélulaplasmática.Estosresultados enconejosno parecentotalmenteextrapolablesal hombre[KaiserlingE 1977]. El mantoesunazonapolimorfadonde,ademásde las mencionadas,existenotrasB 1 y algunasB2 recirculantes.Podríaserel lugar de la transformaciónB timo-independiente,dondeantígenosespeciales permaneceríanenlas dic condicionandola diferenciacióna plasmática.Esevidenteque,enparteesun área residualdel folículoprimario,pero lamorfologíadescritaimplica unafunción activa,y queestantomayor 7 Introducción cuantomásgrandeesla respuestacentrofolicular. En cuantoa las célulasefectoraso plasmáticas,en ganglio son muy escasasen el folículo, más abundantesenelmantoy predominantesenlapulpaterciaria.Vandela corticalalos senosmedularesdonde, probablementeporunmecanismoholocrino,segreganinmunoglobulinasal sistemadesenosmedularesy de ahí al torrentelinfáticoy sanguíneo. El folículoespredominantementeB, perotambiéntienecélulasT. Éstassesitúanentrecentroy manto; lasCIX (Helperó cooperadoras)sonaproximadamenteel dobledelas CDB (Citotóxicas- supresoras)en respuestasganglionaresinespecificas,pudiendoinvertirseestecocienteen situacionesno tumoraleso tumorales.No seconoceexactamentecuál essufunción [Wo¡fBCetaL 1989]. Es importanterecordarque la activaciónmorfoinmunológicano essuperponiblea la inmunológicamenteconocida,delas célulasB oT [Roía 1, 1988; Ortíz-MasllorensF, 1997]. Area Marginal. En áreasextranodales,bazo(pulpablanca)y sistemaasociadoa mucosas(MALT -placasdePeyer), seobservaunatercerazonaexternaal manto:la zonamarginal[lsaacsonPCet al, 1983; Spenceri, Fínn Tet<4 1986;NononA,IsaccsonPC, 1994]. Estáformadaporcélulas8 recirculantesconfisiologíaaúnno totalmenteconocida.Sufommesredondeadao estrellada,sin dendríticasintennedias,monótonasenla óptica, de núcleoredondo,con citoplasmaclaro. La electrónicademuestraun contornoirregular, moderado citoplasma,conescasoRERy núcleopocoactivo. La ll-IQ del áreamarginalescompartidaparcialmenteconel centro,tomalos marcadores8 perono el CDIOy expresaIgM. EsnegativaconCD5 e IgD, marcadoresdelmanto folicular. C.- ÁREAT O INTERFOLICULAR En la zonacorticaly entrelos folículos seencuentrael áreatimo-dependienteo interfolicular.Está constituidapor linfocitos T de predominio maduro,con distintas formas blásticasintermedias,hasta inmunoblastosT. Enmuchosgangliosestazonatieneunaapariencianodularquerepresentauna reacción1con histiocitos nofagocitantesquerecuerdanal folículo, porello algunosautoresla llaman“folículo terciario”. Suhiperpíasia ocurreenmuchosprocesos,sobretodolos deorigenviral y enenfermedadesinmunológicas[KnappW aaL 1989]. En susenohaydosestructurasespecializadasquecondicionanla morfologíadeestazona:lavénula post-capilary el complejodecélulasinterdigitantes. 8 Introducción La vénulapost-capilarestárevestidaporcélulasendotelialesaltasde formatrapezoidal,conriquezaen orgánuloscitoplásmicosy microfibrillas semejantesa las de los elementosquerevistenlos sinusoides ganglionares.Parecequeestosendotelioscontienenun receptorde ubiquitina[Roía1. 1988]queactúacomo unalectmaquereconocecomplejosfosfatadosdela superficiedel linfocito, porlo cualexisteunainteracción entreellasy los linfocitos quelleva a un adhesiónde amboselementos.Despuésdela unióny merceda la formacióndepseudópodos,ellinfocito seintroduceenelcitoplasmaendotelial, serodeadelmismo,desciende a la basal,y salea la pulpapordebajodelpericito.Estepasointraendotelialo “emperipolesis”que ocurre tambiénenlos capilaresvenulares¡‘Rivas C, 1980], escaracterísticodel linfocito, ya quelos polinucleares atraviesanla paredporlasunionesinter-endoteiales. Los linfocitosllegadosporvíavenularcolonizanlapulpaT y semodificanporlos antigenosexpresados ensuperficieporlascélulasinterdigitantes. El complejodecélulasinterdigitantes-Langerhans(DC) sona la zona1 lo que lasDRCal centrodel folículo. Estánconstituidosporun grupodecélulasmonocitariastransformadascuyafunciónesmantener distintoscomplejosantigánicosenla superficiede susprolongaciones.Dichasproyeccionessongruesasy cortasy seextiendenenocasioneshastalos linfocitos delmantofolicular [RivasC, 1991]. El citoplasmaes amplio, conabundantesorganelas,lisosomassin signosdefagocitosisy cuerposde Birbeck(característicos de este elemento,de función discutida,situadosen las vecindadesde la membranaplasmáticao en las cercaniasdelCiolgi). LasDC expresanenmembranaelantígenoCDL que compartencon lostimocitoscorticales,y setiñen tambiénconel Ac anti-proteínaS- 100. Sudinámicaesgrandey cuandoseintroducenenla luz de los senos sehablade lascélulas“veiled” o escondidas,sólodetectadasporIHQ. FuedescritaporVeldman[Lennert Ka aL 1978]enconejosy sunombresedebea las interdigitacionesquerelacionanestoselementosentresi y con los lmfocitosvecinos. Entrelas células1 hayabundanteselementosB transformándosea plasmáticasquecaminana los senos medularesparavertir enelloslos anticuerpossecretados;hayunacélulano totalmenteconocida,la llamada célula T plasmocitoide,característicaen algunasrespuestasdel área 1 en linfadenitis (sobretodo la dermatopática),queseparecealas plasmáticasdesdeelpuntodevistaelectrónico,porel desarrollodelRER aunquenoformainmimoglobulinas,y que esunamodificacióndelos linfocitos 1, queexpresananticuerpos CD3 y CD4 [LennertK a aL 19781. 9 Intmducción O.- CONTRAPARTIDAS TUMORALES D.1)LINFOMASR En patologíahumanael centro,mantoy áreamarginaldanlugara distintasneoplasias: 1. Del centroy por la accióndeloncogenbcl-2, queenun porcentajealto lleva a la traslocaciónt(14,18), surgenlos linfomasCENTROFOLICULARESdebajoy alto grado[Peralta EetaL 1990]. Esprobableque puedantambiénoriginarselos linfomas II4MUNOBLASTICOS ya que CB e IB, comosehacomentado previamente,sondoscélulasrelacionadas.Asimismo, sehacuestionadosi los linfomasLB tipo Burkitt pudieranserdel centrofolicular, yaque losblastosEBV relacionadossonparecidosal CB demenortamaño que elreactivoconelmismoinmunofenotipo[LennerrK, 1978;RivasC, 1982]. 2. En el manto,debidoa la traslocación(11,14)por la accióndeloncogenbcl-1 surgenlas neoplasias aceptadassólo enhumanos[JaifeES 1987; WeisenburgerDD, 1987] conocidascomolinfomas delmanto, llamadosde “diferenciación intermedio“, no comprobadasen animales.Esta neoplasiacorrespondeal linfomacentrociticodela clasificaciónde Kiel [LennertK etaL 1983]. 3. Parecequeel áreamarginalesla responsabledelos linfomasextranodalesdelMALI (de los cualeslos gastrointestinalesson los más ftecuentes).De reaccionesextranodalesinflamatorias o inmunes que estructurantejido linfoide extranodalreactivoen el senode distintosórganos(como piel, tejido tiroideo, pulmonaretc..),surgenasímismolinfomas superponiblesa los MALI depredominioB. Suscélulasson diferentesa las del áreamarginalreactiva,modulándosedesdelinfocitos y plasmáticasa blastosmedianos hendidos(“CC-like”) y otros demayortarnalio(“CB-like”) querecibenesadenominaciónporquerecuerdan al centrocitoy al centroblastocon microscopiaóptica.No obstante,conME exhibenun desarrollodelRER superioracualquierlinfoma nodaldeesamorfología,siendolosblastosmayores,semejantesaplasmablastos. Las célulasmásmadurasmuestranepiteliotropismoen el cuello de las glándulas(estómagoe intestino) constituyendolas lesioneslinfoepiteliales,característicasparael diagnósticoflsaacsonetaL 1983; Spencer ji McDonaldTeraL 1986;IsaacsonPC eral, 1989; Castrillo .LVI el al, 1990 ; IsaacsonPC, 1990;Rivas CeraL 1990,RivasCeraL 1991; RivasCetaL 1991; Castrillo JMetaL 1992;NortonAieral, 1994; Norron XI etaL 1994;MontalbánCet aL 1995]. 4. CélulasB precursorassemejantesa las de la MO seríanlasresponsablesde los linfomas-leucemiasB linfoblasticas.El linfoma LB B tipo Burkitt seconsideróen un principio constituidopor estosmismo elementos;enla actualidady comoschacomentadopreviamente,parecerelacionadoconel centrofolicular [LennertKetal 1978y1981]. lo Introducción A2) LINFOMASE Los línlbmas 1 sonneoplasiaspolimorfasdecélulas1 periféricaso precursoras/SteinJI 2’olksdorfG er aL 1981;RivasCetaL 1982; VicenteJ, 1982;MontalbánC etal, 1993],de localizaciónprimitiva o nodal, o extranodal.Parasu identificaciónesimprescindibleel estudio inmunohistoquimico,ya que la morfologíacitológicapor sí mismapuedellevar a entresdiagnósticos.No sepuedehablardealto y bajo gradodeformacomparativaalos t2~lH-B, dadoqueglobalmentesonsiempremásagresivos.Entrelos LNH- 1 periféricos,CD4+y CDS+, hay que destacar:1) Los NODALES,demayoro menoragresividad,con célulassemejantesal linfocito 1 periféricopero con núcleoirregular, y 2) Los EXTRANODALES de predominiocutáneo,entreloscualeshayqueincluir enlaactualidadpartedeloslinfomascitotóxicos,algunos CDS [FranksPTetal,1986; WellmanMLetaL 1989;MoorePFetal,1994; WJJO1997]. E.- BIOPATOLOGIA DE LAS NEOPLASIAS LINFOIDES. Se dice que los procesoslinfoproliferativos,leucemiaso linfomas,suelenpresentarseexhibiendoun inmunofenotipoquereproduceenciertamaneraa la biologíadelas célulasnormales,dentrode la secuencia demodulaciónfuncional de los sistemaslinfoides B y 1. De ahipartenlas hipótesisde quelas neoplasias constituyenunaexpansiónclonal de un elementocelularmutadocon un “stop” madurativoa nivel de un momentodesuontogenia[SánchezFayosJetal, 1982; WrightDHetat1983;HabeshawiAeta! 1988]. Estaideaqueresultadeutilidadparalacomprensióndelos linfomas,no essiempreexacta.Esbien conocidoqueenlamayoríadelas neoplasiaslinfoidesdecélulaspequeñaso biendiferenciadas,loselementos tumoralessuelenreproducirla morfoinmunologianormalo reactiva(aunquesedemuestraque lascélulas presentanalteracionescitogenéticasimportantes),perono sucedeasí enlasmásagresivaso desdiferenciadas, donde se observanfenotiposaberranteso defectivos.Así mismo la citogenéticaexpresaalteraciones cromosómicasimportantesinclusoenlas másdiferenciadas[Gardo RetaL 1994]. Paraconsiderartodasestasneoplasias,durantemuchotiemposehanestablecidodistintasclasificaciones [Rappapor¡H,1966; Gerard-MarchantRetaL1974; KimHetal, 1974;LennertKetal, 1975;LukesRi, 1975;DorfmanR~ 1977; Lennert1< eta!. 1978;WeissmanIL eta!, 1978;LennertK etaL 1981;Robb- Smith AHetaL 1981;WeisenburgerDDetaL 1981; WorkingFormulation. Un¡infamodebajogradoo& evoluciónfavorableesaquelque,desdesudiagnósticohastaque causa la muerte,tieneunaevolucionlenta; sepresentacon extensiónconsiderabley enestadiosavanzados.Los portadores(datosen medicinahumana)no respondentotalmentea la terapiamúltiple; los casosde edad avanzadao mal estadogeneralpuedenmanejarsecontratamientospocoagresivoso sintomáticos,dadoque el paciente“puedeconvivir” consuneoplasia. El lmnfoina de alto grado sin tratamientoprovocalamuerteenun plazocorto;puedeestarlocalizado enelmomentodel diagnóstico,si el individuoacudepronto a consulta(estadiosbajos),responderápidamente a las terapias,pero tiendea recidivarsi no se utilizan protocolosagresivos.Puedealcanzarremisiones completasenun 60%de los casos. El gradointermedioremnedaenlaclínica másalos linfomasdebajogrado,conunadinámicamayorque ellosy pocarespuestaaterapiasconvencionales,con recidivasmúltiplesy cursotórpido. El conocimientode estoslinfomas en la actualidad,sehaperfeccionadograciasa la aportacióndel mmunofenotipoo expresiónen suscélulasdemarcadoresmonoclonalesdenúcleoy citoplasma,indicativos dela estirpey agresividadtumoralasicomodela proliferacióny diferenciación.Muchoscasos,sobretodo en los de bajo grado sepuedeconservarel inmunofenotipohabitualde las contrapartidascelularesno tumorales,peroenel alto grado,los tumorespresentanun inmunofenotipovariablequepuedeonorecordar a las célulasoriginariaso tansóloexpresarlaestirpeB, 1 y signosproliferativosdeagresividad. La dinámicatumoral estudiadacon marcadoresproliferativos[CenSesji DallenbachEn aL 1984; Gerdesi,LemkeHeal, 1984; SreinH, GerdesJetal, 1987;GarciaRLeraL 1989;¡ial! PA eraL 1990; Kame¡OFVeral, 1991; GerdesiSabaninlEetaL1993;Fournel-FleuryCetaL1991] esimportantepara conocerla respuestaa la terapia,la tendenciaa lasrecidivasy la correlaciónconel estudiodelADN. Esta parte,másexperimentalseconsiderarácon citometríadeflujo y estática[JoensuuHetal, 1990;Manen£4 eraL 1993; BraylanRC,1993;MarcosB etal, 1993; WojcikEMetal, 1993;GarciaRetaL 1994; LeeS a aL 1994;MarcosRetaL1998; SanzCetaL1998]. A priori, si serelacionanlos conocimientosy avances delasdiploidíasy aneuploidiasenel pronósticodeestoslinfomas,intuiríamospeorpronósticoenlos casos aneuploidesy mejorenlos diploides,pensandoquedeberíancorrespondera tumoreslinfoidesmáso menos agresivosrespectivamente. La correlacióny los valoresestadísticosdeagresividad,morfologíay posiblesupervivenciaserándatos consideradosy valoradosdadoquesuconocimientoesimprescindiblecomofactorpronósticoenla evolución 12 Introducción delaenfermedad. F) PROCESOSLINFOPROLIFERATIVOS EN ANIMALES DOMÉSTICOS FJ) PRESENTAClON ENEL PERRO El linfoma enel perroes unade las neoplasiasmás ftecuentesconunapresentaciónanualde 30: 100.000,lo que suponeel doblede la incidenciahumanay 2/3 dela presentadaengatos.Segúnlos datos publicadosfl-Jardyir WDa aL 1989;MoultonJEeta?, 1990;Keller E?’, 1992; TeskeE, 1993; Vallí VEO etaL 1993; ContoGCetaL 1995], existeunapredisposiciónracialenelcasodelBoxer,BassetHound,San Bernardo,ScottishTen-ier,Airedale terriery Bulldogs.La edadmediade presentaciónesde6-7años(edad mediaadulta)a diferenciade lapresentaciónjovendelgato,conunrangodesdelos 6 meseshastalos 15 años. No seobservaunamayorincidenciaporsexoque seaconclusiva,conunapresentaciónsimilar enambos [1-lardyir WDa al, 1989;MmdfonJEeta!, 1990;TesteE, 1993; Va/li VEOaal, 1993]. Aunquela etiologíaexactadel linfomay leucemialinfoide caninaesaúndesconocida,sehanhechonumerosashipótesis desusdistintasposibilidades:infecciosas(sobretodovíricas),ambientales(carcinógenosy co-carcinógenos: herbicidasen linfomas [CotranR et aL 1990; TeskeE etaL 1993]), deficienciasen el sistemammune, genéticas,etc....Parecequelos retrovirusestánimplicadosenel desarrollodelinfoma/leucemiaennumerosas especiescomo peces,serpientes,aves, roedores,gatos, vacas,primatesy humanos.Diversosestudios muestrancon ME partículasretrovíricasy nivelessuperioresa los normalesde transeriptasainversaen cultivos celularesde estos linfomas,hallazgosque podríanrelacionarseconunaposibleetiologíavírica, aunqueno de forma concluyente[1-Jardyir 7/1) et aL 1989; TeskeE, 1993], ya que parecenhaberse encontradotambiénentejido linfoidedeanimalessanos. E2) PRESENTACIÓNENOTRASESPECIES;LINFOMA/LEUCEML4ENGATO. La presentacióndel linfoma enotrasespecieses,enunoscasosespontanea,y enotrosinducidaporvirus. Vamosa centrarel interésenla especiefelina, la cual,junto a la humanaha sido tomadacomoelemento comparativo,paraasí intentarencontrarsemejanzasmorfológicas,clínicaso cinéticas,conrespectoa tumores linfoidescaninos[Hardyir WD eta), 1989; CoutoGCeta), 1995]. En elgatolaetiologíadellinfoma/leucemiavienedadaporla infecciónpersistente,e incluso latente,del virus de laLeucemiaFelina (EeLV),pertenecientea lafamilia Retroviridae,quesecaracterizaportenerla capacidadde copiarsu cadenasimple de ARN a unadoblede ADN graciasa la acción de unaenzima conocidacomorranscriptasainversa.La copiade ADN vírico seintegradentrodel genomadela célula infectada.Hay dossubfamiliascon trascendenciaclínica,losoncovirusy los lentivirus. La subfamiliade oncovirusincluyevirus inductoresdeleucemiasy sarcomasendiversasespeciescomoaves,múridos,félidos 13 Intrtducción (FeLVy FeSV),primatesy hombre,y tambiéncarcinomasenmúridosy primates.Los lentivirusengloban distintasacciones:ananiogénica(équidos),nairotrópica(virusVisna&Maedienóvidos)einmunosupresora, degranimportanciaactualporel síndromedeinmunodeficíencraadquirida(SIDA) porelvirus H1V humano [Cui LX etal, 1995],con suhomónimoen félidos,primatesy bóvidos. El cuadrode inmunodeficrencia adquiridasepresentaengatosasociadoa lainfecciónpordosretrovirus,aisladoso combinados:el oncovirus FeLVy el lentivirusflV. NOCIONESGENERALESDEL VIRUS FeLV * VIROLOGIA DEL FeLV: Existendosgruposde formasvíricas: lasformasendógenasy exógenas. Las secuenciasendógenassetransmitengenéticamentey no tienenciclo dereplicaciónenel hospedador, perosepuedencombinarconla formamáscomúndel virus (FeLVA) paradarlasotrasvariantes(B,C). Están presentesen el genomad.c todos los individuos. Las formas infectivas exógenasdel virus probablementeseformaronporinfeccióncruzadadeun retrovirusderataconun ancestrodel gatodoméstico, comoya sehademostradoenmedicinahumana.Haytresformasprincipalesde virusFeLV, identificadaspor la proteinagp7Odela envuelta.Seformanporrecombinaciónde la formaA con lassecuenciasendógenas relacionadas,El virus, en sí mismo,no tieneun oncogentransformadorconocido.El genomaestáformado por tres grupos de genesque transcribenlas proteínasestructurales,Iranscriptasainversay envuelta, respectivamente/1-Jardyir 7/1)etal, ¡989; MoultonJEetal, 1990;Buracco1> etaL 1992; TesteE, 1993; Va/Ii VEOeta?, 1993; Cal/unanJier aL 1996]. * CICLO BIOLÓGICO: Lasformasdeexposición,y tipos deinfecciónsedetallanen el siguiente esquema[Hardyir 7/1) etal, 1989]: VIRUS F.LV Fonesde apoaioiMr aalivu, Ihgtn alón nasal EXPOSICIÓN DEL CATO - Multwlioación en linfocito. dcl ganglioregional GATO INMUNIZADO INFECCION ACNV,ACFQCMA en .anglt PERSISTENTE LATENTE .Extansióna MOy ganglio.. ?to,in,a; ,mdt~linción ncéluis ¿LINFOMA FLV .2 nucleadasd. la amia linfoide. anieblasy«tolde. aalh~ aacnoñ,nasal— EXTENSION GENERALIZADA - útu~ ledas TRMSMISION HORIZONTAL TRANSMISION VERTICAl. Parala detecciónde Acen sangreseutilizan dosmétodos:la IFI (inmunofluorescenciaindirecta)y la 14 Introducción ELISA (enzimelinked immunosorbcnt assay).La ff1 indica positividad (infecciosidad)enun 97% de los casos,y la ELISA produceun 30-50%de falsospositivos,ya queno tienenel virusenplasmani ensaliva, porlo queno setransmite. * RESPUESTA INMUNE AL FeLV: Para una correctavaloraciónde la respuestainmune del hospedadorfrentea la infecciónporFeLV,hayquetenerencuentalos títulosdelanticuerponeutralizador delvirus y del antígenoFOCMA. aAn&wapofrenteal antígenoFOCMA (Felineoncornavirusce]] membraneantigen/ Antígenoen membranacelulardelonconiavirusfelino): Se aislódela superficiedecélulasdel linfoma B y T (FeLV+/-), leucemialinfoide,nneloidey entroíde,y tambiénenla superficiedelascélulasdel fibrosarcomainducidopor FeSV(FemeSarcomavirus). No seencontróenloslinfocitos normalesni inclusoenlos infectadospor FeLV A/B. Se supusoquedichoAg sepodríaconsiderarcomoun Ag especificotumoral inducidoporel FeLV 1 FeSV. Serológicamenteeradistinto, aunquerelacionado,a la glicoproteinagp7O de la envolturadelvirus. ParecíaquealtostítulosdeAc frentealFOCMA producíaresistenciafrenteal desarrollodetumorFeLV- o FcSV-inducido,perono frentea las infeccionesvirus-dependientesy enfennedadesno neoplásicas.Hoy en diatambiénsehan aisladoentejidosdelanimalmfectado(deformaactivao latente)entejidosno tumorales [Hardyir 7/1)etal, 1989;Mou/íonJEe:al, 1990; ValIl VEOe:al, 1993]. ¡it Anticuerpo neutralizador del virus (VNÁntihody): correspondealAc contra la glicoproteinaviral gp7O.Títulos altosgeneranresistenciaal efectoinmunosupresory, portanto,a las infeccionessecundarias, perono frenteal desarrollodetumorvirus-inducido. * ENFERMEDADESPRODUCIDASPOREL FeLV: En la siguientetablascdetallanlasposibles enfermedadesproducidaspor el FeLV, tanto prohferativascomodegenerativasy los órganosque más frecuenteimplica. a. Mecanismode inducción tunsoral del FeL¡4 No esdel todo conocido;estudiosmoleculares muestranque los FeLV aisladosdel tumor contienengenescelularesprogenitoresc-myc(proto-oncogen) transducidoso transformadosa Y-mr (con secuenciasde codificación parael gen celular). Ya que e] retrovirusen sí tieneunatransformaciónlentay quecarecedeoncogenpropio paraunatumorogénesis,la capacidaddeadquirironcogenescelularesadquieregranimportanciaparala posibletranformaciónmaligna sin que necesariamenteproduzcainmunosupresión,asimismoocurrecon el lugarde inserciónen el ADN celular,activacióndegenesvecinosy tipo de secuencias(p.c. altamenterepetitivas,regionesconstantes,que seexpresenen granmedida,..etc). Dicho procesoseha verificadoen el casode linfomas B tipo Burkitt humanoEBV relacionadoy plasmocitomasde ratón;en el casode linfomas B humanosseconocenlas traslocacionesqueenvuelvenal cromosoma8 dondeselocalizael c-mycy losque contienenlos genespara lascadenaspesadasy ligeraslambday kappadelas inmunoglobulinas(14, 2 y 22 respectivamente).El c-myc 15 Introducción se sitúa en la bandaq24 del cromosoma8; la proteínacodificada(mycprotein) tiene una función desconocida;seha visto que aumentaen célulasen estadoquiescentepor estimulaciónconfactoresde accnmento,aunquepermanececonstanteendivisión celular.Lainducciónturnoral seproduceconvarios mecanismos,comola transduccióndelc-myc a un ¡cusno funcionalde la cadenapesadadelas Ig. Otra explicaciónseríaporla accióndela proteínamyc,nuncaalteradaenlastraslocacionesy encontradaaaltos mvelesen los linfomas tipo Burkitt, y que escapazde estimulara las célulasen estadoquiescente;otro supuestoesla proximidaddelc-myc a los genesdelasIg: asípodríaninfluenciarsedelospuntosderotura de la traslocación,la orientaciónde los genes,usode los promotoresde las Ig parael c-myc,... etc. La explicaciónmásplausibledela implicaciónconstantedelos genesde las Ig con el c-mycen la inducción tumoral es que dichos genessonmuy activosa nivel transcripcional,y las traslocacionesocurrenmuy frecuentementeenlos mecanismosderecombinaciónparala reconstruccióndelos genesdelas Ig [Hopkins N~ 1988;Hardy ir WD etal, 1989; MangeAPetal, 1990;Mou/ton iR etal, 1990; Va/li VEOa al, 1993]. El virus de la LeucemiaT humanoHTLV 1 estambiénun oncovinis,pero tiene un mecanismode mduccióntumoraltotalmentedistinto;no seintegraenzonasconcretasdelADN ni cercadeproto-oncogenes, sinopormediodeungentransformadorconocidocomo¡0<0 br [HopkinsNH, 1988; CotranRetaL 1990; MangeAPa aL 1990]. tipo celular saL proliferetáva enf degenentiva linfocitos liafon atrofie tínúcsflínfopenia./SDA felino Médula ósea: pranídva mesenquinial retsculocndotel¡oaus- h,st,ocsto.is mene euitroide «toleucenis. Hipe’- /.plauia /.peruias meas nueloade lencennanueloade .30 megacsnobáatzca mene n,onocit¡es leucemia mnonocitoide .stent-ffibrobláatoa 4- oateoblaaroa síndrome ostco,nieloprolifeostzvo riñón glonienilonefiitis por EcLV.úraunoconwle,oe útero Alnto/reabuorcuone. b. Las enfermedades no neoptósicas inducidas por el virus serían secundariasal estadode inmunosupresiónen la que se sume cl animal infectado con FeLV y FN. El mecanismode dicha inmunosupresiónFAIDS-FeLV asociadanoestotalmenteconocido,perosecreequetienedistintasbases: 1. El procesodereplicaciónviraly exocitosisen el queel virus serecubredela membranacelular,produce la lisis o sensibilizaciónde la célulaparasu posteriordestrucciónpor el sistemainmune.Las célulasT dependientesdel timo sonlasprimerascélulasdiana. 2. Los Ag solubles,así comolos inmunocomplejosque circulanensangrepuedencausarporsí mismosla 16 Introducción inmunosupresión;in vito lasproteínasdela envueltacomola piSEdisminuyenlatransformaciónblástica emtatenenlaproducciónde1L2, conconsiguientesupresióndelas célulasT helper.¡HardyJrWD etal, 1989] Aunqueelmecanismoexpuestosehademostradosóloengatos,noshaparecidointeresanteinsistiren sudinámicaya quelasespeciescaninay felina estáníntimamenterelacionadas,a pesardequecomoyaseha comentado,no estádemostradoanivel canino. F.3) CLASIFICACIÓN CLÍNICO-ANATÓMICA ENANIMALES DOMÉSTICOS. * Multicéntrico * Alimentaria * Tímico o mediastiruco * leucemiaverdadera(médulaósea-sangresólamente) * Solitario(Cutáneo,renal,SNC-SNP,ocular,...) Orden según frecuencia de aparición: PERRO:multicéntrico,Alimentario,Timicoy extranodal(cutáneo GATO: tímico, alimentario,multicéntrico,formaleucémicay restode presentacionesextranodales: ocular, del tractorespiratoriosuperior,renal,cutánea,SNCy SNP,.. etc[CautoCGa al, 1989; Hardyir *7) a al, 1989;MoukoniRel al, 1990;TeskeE, 1993; Va/li VEOe:al, 1993; Couto CGelal, 1995]. E4) ESTADIOSCLÍNICOSENMJ4MÍFERO& ESTADIAJE EN VETERINARIA: 1: Afectación de un ganglio,o tejido linfoide de un órgano, sin incluir la médula ósea. II: Afectacióndevarios gangliosdentrodeun árearegional(con/sinafectaciónamigdalar). III: Mectacióngeneralizadadeganglioslinfáticos. IV: Afectaciónde hígadoy/o bazo(con/sinestadioIII). V: Extensióna sangrey médulaósea(con/sinlos estadios1-1V). Ycadaestadiosedivide a suvezen:A) sin síntomassistémicos,B) consíntomassistémicos[Hardy ir ¡VI) etaL 1989;MaultonJI?etal, 1990; TeskeE, 1993; ValIl VEOetal, 1993; CautoCG ejaL 1995]. ESTADIAJE ENMEDICINA: (Clasificaciónde AnnArbor) 1: Enfermedadlimitadaa unaúnicaregiónganglionaro unalocalizaciónextralinfática(‘E). II: Enfermedadqueafectaa doso másregionesganglionaresa unladodeldiafragmao conafectaciónlimitada deun órganoo tejidoextralinfáticoadyacente. 17 Intmduooión III: Enfermedadqueafectaa regionesganglionaresa ambosladosdeldiañagina(110,lo quepuedeincluir afectacióndelbazo(lll~) o afectaciónlimitadadeuntejido u órganolinfático adyacente(ffl~). IV: Enfermedaddiseminada,queafectaa unoo másórganosexlralinfáticos,cono sin afectaciónlinfática [CarbonePPetal, 1971;PetoR gral, 1977; Fis/ter RL 1981;DIaz RubioEetal, 1991; GonzálezBaron AL 1992;EspañaP, 1993;SauhamíRL etal, 1993]. ES)HISTORL4 CLÍNICA YDL4GNÓSTICO Paraeldiagnósticocorrectodeestaneoplasiay sufbrmadepresentación,sevalorala exploraciónfisica, la citologíaporpunciónaspiraciónconagujafina(PAAF) [CarterRFetal, 1988;Delverd¡erMetal, 1988; HawkinsEGetaL 1993;flsherD.JetaL 1995; CannianiMeral, 1996], la analíticasanguínea,radiografla, ecograflaabdominaly enúltimo casola biopsia. Lasformasmu¡ticdJdrica, alimentariaymediastin¡ca del linfoma sonlasmásfrecuentes,suponiendo cl 90%de todaslaspresentaciones[DobsonJMetal, 1993]. Las fonnascutánea,epiduralyrenalsonpoco frecuentesenambasespecies,constituyendoun 10%detodaslas formasdepresentación.En sutotalidadlas localizacionesextranodalesque aparecenenperroy gatoson: cutánea,renal,ocular,del tractorespiratorio superior, del sistemanervioso central y periférico -linfoma epidural- [Spodnic/c0.1a al, ¡992], o de cualquierórganoo tejido delorganismo. En la exploraciónfísica,e! animalcon la formamulucéntrica del linfoma presenta¡infadenopatía superficial generalizadade todos los gangliospalpables(submandibular,cervical, preescapular,axilar, inguinaly poplíteo,y másexcepcionalmentedel facial, retrofaríngeoe ilíaco) con extensiónfrecuentea amígdalasincluidaslaspalatinas.Al tactolosgangliossondurose indoloros,conun aumentode 5 a 10 veces sutamañooriginal, contemperaturanormal(“linfadenopatíafría”) y frecuentementesepresentanadheridos aplanosprofundos.La linfadenopatiageneralizadapuedeasociarsea otros síntomascomoapatía,cansancio, anorexia,pérdidadepesoy actividadfisicaEnla necropsiade un linfoma multicéntricoseobservaque los gangliosmesentéricos,sublumbaresy frecuentementeel bazosuelentenerlasmismascaracterísticas,aunque suafectacióndependedelestadioclínico delinfoma enel que seadiagnosticado.Es frecuentequeel animal acudaa consultaenun estadiofilo IV, dondetodoslos gangliosinternos,bazoe hígadoestánafectados,o inclusoen estadioy, con extensióna órganosvecinos,médulaóseay/o sangre[Dobson.JMetal, 1993; TeskeEetal, ¡994]. La formaalimentariao digestivasuelepresentarmalabsorción,obstrucciónintestinal,vómitos,y diarrea(enun 80%de los casos,incluso hemorrágicacon sangreenheces).Los gangliossuperficiales y el bazopuedenno estarinvolucrados.En estadiosavanzadospuedeafectartodoel tactodigestivo, bazo,hígado,riñón, corazón,amígdalas,páncreasy médulaósea.Haydescritasmetástasisenpiel, ojo, músculoesquelético,SNC,...etc[CouroCGeral, 1989;HartiR eraL 1994]. 18 Introducción La forma timica o meátastinicaes poco frecuenteen el perroperomáshabitualen gato; ensu extensiónpuedenafectarselos gangliosestemalesy mediastínicos,la pleuraadyacentey el pulmón. Presentansíntomasgenerales:abatimiento,anorexiay pérdidadepeso,así comorespiratorios:tos, disneao taquipnea.Muestrandisminución de la toleranciaal ejercicio, disfagiao regurgitacióny compromisocardio-circulatodoconcianosis,desplazamientodel sonidocardiacodorso-caudal,liquido serohemorrágico/hemorrágico,distintos gradosde hidrotóraxo quilotórax como resultadode la infiltracióny ocupacióndelespaciotorácicoporel crecimientotumoralen la regiónantero-superiordel mediastino[ShimodaT, 1993]. En la formacuráneasediferenciandosgrupossegúnsulocalizacióntopográfica:dermorrópicoso epidermotrópicos. Los primerosestáncaracterizadospor lesionesen piel a modo de placasque englobanla dermispapilary en ocasionesla reticular,con inclusionesfocalesen la epidermispara formarlos abscesosde Pautriercaracterísticosdela micosisfungoides(MF) descritaenpatología humana.Los linfomasconepidermotropismocausanunmarcadoadelgazamientodela capaepidérmica con infiltración difusa de la capacórneacomoen la enfermedadde WoringerPolopp en medicina humana/RivasC, 1980;BurgGetaL1983;LeverWF 1990;NortonAetal, 1994]. El cuadroclínico varíadependiendodelestadioy delanimal.Generalmentesepresentacomoeritrodenniageneralizada, dennatitisexfoliativa,placasdérmicaso nódulos,y úlcerasmucocutineasconfluentesquepuedendarse encualquierfasedelaenfermedad[BakeriLetaL 1989;MoorePFetal, 1994; Couto CGetal, 1995; DayMj 1995; FrenchRA eral, 1996]. La forma epidural se presentacon parálisisdel tercio posterior(síndromede neuronamotora supenor,...etc)porinfiltración de médulaespinalo espacioepidural[TurnerJL etal, 1989; Spodniclc GieraL 1992]. La forma solitaha renal puededarseen ambasespeciesaunquecon mayorincidenciaen el gato. Presentasíntomas asociadosa obstrucción urinaria renal y postrenal, insuficiencia renal aguda/crónica,...etc,ya que suelecrecerde forma difusa sin respetarla fisiología del parénquima [MoultonJI? etal, 1990]. La analíticasanguíneaquecomprendafórmulasleucocitariay eritrocitaria,perfil bioquímico,enzimas hepáticasy renales,así comoun aspiradodemédulaósea,puedepresentarunagrangamade alteraciones hematológicas.La leucocirosisesun signode apariciónrelativamenteconstante,avecescomoneurrofihia haciala izquierdaporun incrementodeneutrófiloscirculantes,o como linfocitosis,debidaa unaleucemia linfocitica sin masatumoralreconocible(representamenosdel 10%de loslinfomasenelpeno);enestadios avanzadospuedeobservaitunapoblaciónlinfoide inmaduraensangreenpeno,engatostambiénsedadicha formaleucémicaenun 12%delos casos.Tambiénesposibleencontrarunamarcadalinfopeniaenun 50% de los linfomasfelinos. La anemiaesel signomás comúndentrodelsíndromeparaneoplásicoasociadoa 19 Introducción procesos lmfoprohferabvos. Suele ser no regenerativa, normocrómica y normocítica en perro y iam&maerocíticaengato;enla fonnadigestivaesfácil hallarlaporulceracióndelamucosadigestiva,y a vecescon neutrofilia; se acompañade trombocitopeniaen casosde reemplazode la médulaóseapor infiltración tumoral,e inclusopancitopenia.La anemiaautoinmunese da en casosde infeccionespor retrovirus en gatoso en neoplasiasprimariasde médulaóseaen ambasespecies.La patogeniade la hipercalcemia(20%;pacofrecuenteengatos)esconfusaporqueno presentahiperpíasiadela paratiroides, ni hipervitaminosisD ni rupturaóseapormetástasisóseas;puededebersea laproducciónendógenadeuna pseudohormonaparatiroidea(parathonnonaectópica)con acciónhipercalcerniante;seasociaa las formas mediastínicay multicéntrica,y conmayorfrecuenciaa linfomasdeestirpeT. La nefropatíaporhipercalcemia con posteriorinsuficienciarenalesun cuadromuyfrecuenteenlos gatoscon linfoma, queproduce,entre otros,sintoniascomopolidipsiay poliuria. La hiperglobulinemiamonoclonalocurreen penosconleucemia linfática crónicay ocasionalmenteenperrosconlinfoma. La policlonal tambiénpuededarseenlinfomas [CornoCG, 1985; TeskeE etal, 1990; DobsoniMel al, 1993; Furie WS,1993; TeskeE, 1993; TeskeE, ¡994; TesArEe aL ¡994; CotilaCG eta!, 1995]. Las pruebasdiagnósticasdemtina bajola sospechadeun linfoma sonla radiografia,sobretodo la torácicalatero-lateral,paraevaluarposible compromisomediastínicoo pulmonarademásde posibles desplazamientosdelesófago,tráqueao corazón;la ecografiaabdominal,parael estudiodel tractodigestivo, gangliosmesentéricos,periportales,etc..,cualquierórganocon ecogenicidadanormalen e] quepuedaestar metastatizandoel linfoma. La citologia sueleserla forma más fiableparaun diagnósticodefinitivo de linfoma, caracterizándoseen la mayoríade los casospor un infiltrado monomorfode células linfoides inmadurasde tamañosuperioral linfocito maduro,con la cromatinamáslaxa,y uno o varios nucleolos evidentes.La biopsiadeganglioseutiliza cuandola citologíaha sidopococonclusiva,y pararealizarel diagnósticohistológicoexacto,basenecesariaparaaplicarun posibletratamientoquiniioterápico[I-Jardyir WD et al, 1989; TesArE, 1994; CoutoCG elal, 1995]. E6) TRATAMIENTO.QUIMIOTERÁPL4 La quimioterapia(QT) ha sidoelprincipalmétododetratamientodelcánceren losúltimascincuenta años.Más dc cincuentaagentes(incluidaslas hormonas)tienengranutilidadenmedicinahumana,peroel númeroutilizado enla prácticaveterinariaesmuchomenor[CrowSE, 1982;Hardy ir WC> etal, 1989; EspazaP, 1993; TesAreE, 1993;Rosen¡ha) RCeta!, 1995]. La cirugíaeseltratanilentodeelecciónparamuchostumoressólidosy enalgunaocasiónla radioterapia esefectivaparaneoplasiaslocalizadas,peroenningúncasopuedenaplicarseenenfermedadesgeneralizadas o con metástasis. 20 Introducción La finalidaddelaQTescuraral paciente,perolaobtenciónde unacurarealenmedicinaveterinariaes muy dudosaEl TumorVenéreoTransmisible(TVT) pareceserla excepcióna estaafirmaciónporobtenerse unacuracióntotal condistintasdrogasantí-cáncer[Rosenthai RC,1995]. En medicinaVeterinariala QTse aplicaparaobtenerotrosbeneficioscomoelcontroldeenfermedadesgeneralizadasimposiblesdeoperaro radiaraumentandoel periodolibredeenfermedad,prevencióndela progresióndeunaneoplasiatratandode evitar lasmetástasistempranas,y produceuna mejoría sintomáticadel pacientequepresentaun síndrome paraneoplásicoañadido. Los farmacosanti-cáncersesuelenutilizarcombinados,yaquecadaunoproducela destruccióndeuna fracción constantede las células tumoralesque esindependientea la destruidapor otro fármaco,así se combinanlasdrogasparaqueactúenenlasdistintasfasesdelciclo celular.Conello tambiénseintentaevitar la apariciónpormutación,de cepasresistentesa los fármacosantitumorales(resistenciarumorao. Este fenómenose desarrollapor vanasrazones,entreotras se creedebidoa la desactivaciónde las células tumorales,impermeabilidadde las mismasa los fármacos,así como apariciónde rutas alternativasde metabolismoy reparacióncelular. A lahoradediseñarun protocolodequimioterapiahay queaplicarlos siguientesprincipiosbásicosen lautilizacióndefánnacos:queseanefectivosensolitario,condistintosmecanismosdeacción,con diferente toxicidady conprotocolodetratamientointermitente. Previamentea laaplicacióndel tratamientoquimioterápico,hayque valorarunaseriede factorescomo: 1. Historiaclínicay exploraciónfisicadetallada. 2. Diagnósticohistológicodemalignidad. 3. Seleccióndedrogasefectivasfrenteal tumory conocimientodesumecanismode acción(factores comoconcentraciónnecesaria,ruta deadministración,biotransformación,interacciones,resistenciasy toxicidades,así comosu eliminación). 4. Análisisdeefectosadversos;toxicidad; dosisenlasespeciescaninay felina. 5. Entendimientoy cooperacióndeldueño. Paraobtenereléxito terapéuticohayquehacerentenderaldueñoquela curación(RC) no esla finalidad del tratamiento,sino inducir remisionesprolongadas,parciales(Rl’) o totales, que conllevenla menor toxicidadposible,intentandoconservarla calidaddevida delpacienteoncológico.Estacalidaddevida,más que lacantidad,seconvierteen laconsideraciónprimordial enla prácticaveterinariaa la horade aplicarla QT comométodorealistade tratamientocontraelcáncer[CoutoCG, ¡985; Hardyir WDeta!, ¡989; Couto CG etal, 1995]. 21 Introducción Laestrategiaquiniioterápicasedivide encuatrofasesprincipales: 1. Inducciónala remisión, 2. Intensificación, 3. Mantenimiento, 4. Reinduccióndela remisióno rescate. En lainducciónseutiliza unaterapiaintensivaporcombinacióndedrogasencaminadasaconseguiruna remisióncompleta(RC) reduciéndode froma significativa la masatumoral. Es un tratamientofuertey frecuentecomparadocon elimpuestoenel peñadodemantenimiento.Si no seproducela RC, el animalse sometea la terapiade intensificación.En medicinaveterinariase utilizan distintosprotocolospara la inducciónen los linfomas, comolas terapiasCOl> (ciclofosfamidaPO, vincristinaIV y prednisonaPO), COAI> (ciclofosfamida PO, vincristina IV, citosina arabinósidoIV/SQ y prednisanaPO), CHO? (ciclofosfamidaPO,adriamicinaIV, vincristinaIVy prednisona o basadosenPEG-L-Asparaginasa/L- Asparaginasaen el perro,y COAP,CHOPoDOMAC (dexametasonaPO,vincristinaIV, mitoxantrona IV, citosinaarabinósidoPOy ciclofosfamidaPO)enel gato[CautoCG, 1985; I-Iardy ir WDetal, 1989; McEwenEG, 1990; TeskeEetal, 1990; TesAreE, 1994; TesAreEetal, 1994;CautoCG etal, 1995]. La intensificaciónseaplicacuandono seobtieneuna RC en el peñadoanterior;esun tratamiento agresivocontinuadonormalmenteabasedeL-asparaginasaSQ y Doxonubicina,siemprebajocontrolde toxicidadesparalelas-fármacosno mielotóxicoso queataquena unafasecelulardistinta- [Hardyir WC> et al, 1989; Cauto CGet al, 1995]. La fase de mantenimientoseaplicacuandoseha alcanzadola RC y sebasaen un protocolode agresividadmoderada,comoel LMP (clorambucil,metotrexatey prednisona;oral y más cómodo)o el COAP,ambosparapenosy gatos. En elcasode quela enfennedadsereproduzcadeformaprogresiva(recidiva),seempiezala siguiente fasedela QT,la reinduccióndela remisióno rescate,dondeseaplicanlas mismasdrogasutilizadaspara la inducciónsi hubo RC (o combinacionescon doxormbicinao adriamicina)aunqueesmucho másfácil mentenerla primera remisión que producir la segunda.Si la RC no se alcanza,debeseguir el mismo tratamientohastaque no hayauna evidenciaclarade la progresióntumoral. En el perronormalmentese utilizanlos protocolosADIC y O-MAC. ambosefectivosperoconmayortoxicidadqueel COAP [Hardyir WC> er aL 1989; Teskeketal, 1990; TeskeE, 1994;TeskeEetal, 1994; Cauto CGetal, 1995; Rosenthal RCetal,1995]. 22 Introducción G) TÉCNICAS ESPECIALES DE ESTUDIO Unodelos objetivosprincipalesdeestatesisesel conocimientodela cinéticay delciclocelulardelos linfomascaninasparacomprendersucomportamientobiológicoy, portanto,clínicorresfrE etal, 1993; TeskeE 1994]. La agresividadpodrácondicionarla terapiaadministradaasícomoorientaral pronósticode la enfermedad[GarcíaR etal, 1989;MarcosB etal, 1993; GarcíaR etal, 1994; ObesoOetal, 1994; MarcosBetaL 1997]. Así puesseutiliza la proliferacióntunioraly la citometria. Laproliferación deun tumorseexpresaporel tantoporcientodecélulasqueseconsideraqueestán dividiéndoseo bienestánpróximasa ello (Gb, G~, M); dichoporcentajeseobtienegraciasa los marcadores proliferativosPC10y MIB 1, ciclinasnuclearesqueseexpresanentodaslasfasesdelciclo celulara excepción de (JO (fasede reposo).La cuantificacióndel áreanuclearpositiva a estosmarcadoresserealizacon el programa“proliferation índex” delanalizadordeimagenCAS-200sobrela preparación,conello sepretende reducirel tiempoempleadoy elposibleerrorde medidaa mano,yaqueelnúmerototal decamposestudiados (10camposanalizadasporcadapreparación)hacela laborantluay densa;ademásofrecela expresióndelos resultadosestadísticosdeformaautomática. El estudiocitométricoinformasobreelcontenidodeAUN deunamuestraproblema.Es sabidoquelas célulasdiploidesen fase0~G~ poseenunacantidadde AUN que va aumentandoa medidaque la célula progresahaciala faseS, hastaquellegaa la 02-vM. Enestaúltimafase,la célulatieneeldobledecantidad deADN queenlafase01.Atendiendoa los distintoscontenidosdeAUN, el citómetropermiteidentificarla proporcióndecélulasen cadafasedelciclo celular,asícomola ploidia. El usoprácticode la citometríasebasaentres principiosbásicos:1) quelas célulastienendistintas cantidadesde AUN encadaestadiodel ciclo celular;2) la disponibilidaddetécnicasen las que seutilizan reactivosqueseunenestequiométricamenteconal ADN; 3)la granmayoríadc célulasnormalessondiploides [LeeSetal,1994]. Actualmente,la citometria(de flujo y estática)de tumoressólidospuedeefectuarsesobrecélulas recuperadasdel material parafinado[Hedley0W etal, 1985] ademásdel tejido frescoconvencionalcon prácticamenteel mismoresultado,lo quesuponeunagranventajaala horadeutilizar materialretrospectivo [¿VanenKA, eta!, 1989; C!audRDetat1989;BauerTWera¿¡990;Alanen£4 eta!, 1993;RowmanR elaL 1993;Bray!anRC,1993; BóclóngAeLaL 1995;BoudryReL aL 1997j. La citometria deflujo sebasaenunasuspensióncelulardondelos núcleossonteñidosconlodurode propidio,fluorocromoqueseune a los paresdebasesdelAUN. Al pasarloal citómetro,un hazdeluz láser excitalafluorescenciadelos núcleosteñidos,dondela intensidadde la fluorescenciaemitidaesdirectamente proporcionalalcontenidode ADN, queesrecogiday medidaporun ordenador.Losresultadosseexpresan 23 Intmduoción ccxx curvasqueequivalenal porcentajede célulasconcontenidosdeAUN diferentes[FriersonMF 1988y 1991]. Enla citonuesria estática separtedeextensionescelulareso improntas,cuyosnúcleossemareanenla tinción de Feulgen,dondeel ácidoclorbidricohidroliza las bandasnbosa-purinadandoresiduosazúcar- aldehído;El reactivode Schiff(coloranteazul)reaccionacon dichoresiduo,dandoun precipitadodecolor azul (Mure A) queesreconocidopor el analizadorde imagenCAS-200(programade ploidia QUNA - quantitativeDNA analysis-).Los resultadossonexpresadosconcurvassemejantesa las de citometriade flujo, nubesdepunto5~..ete¡MascaselaL 19971 En ambascitometríaslos valoresestánreferidosa los degangliocontroldeperroy degatoprocesados al mismotiempo,ya que ambosprogramasestándiseñadospearalinfocitoshumanos,y sehatratadode mminuzaral maximoelposibleerror /MarcosB etal, 1993;MarcosB etal, ¡997; SanzCet al, 1998]. 24 III.- MATERIAL Y MÉTODOS Materialy Métodos A..- CASUÍSTICA El material utilizado procededel archivo del servicio de Anatomía Patológicae Histología del departamentodePatologíaAnimal II delaFacultaddeVeterinariadela UniversidadComplutensedeMadrid; asimismotambiénsecuentaconbiopsiasllegadasaldepartamentodeAnatomíaPatológicadela Fundación JiménezDíezdeMadrid (UniversidadAutónomadeMadrid). Partimosde 30 linfomascaninos(TablaIV), de los cuales4 sonsólobiopsias,y 26 sonnecropsias seriadas,delperiodo 1995-1997.Los casosen quesehapodidorealizarnecropsiaprocedendedosfuentes distintas:19 casosdel serviciodePatologíaMédica(PatologíaAnimal II) dela facultaddeVeterinariade Madrid,y los 7 restantesdecentrosprivados(los cualescuentancon unahistoriaclínicareducida).Todaslas necropsiasserealizanenel serviciodeAnatomíaPatológicadeldpto. de PatologíaAnimal 11 dela Facultad deVeterinariadeMadrid. En ellasserecogetejido linfoide y tejido hamatopyético,y distintosórganosen funcióndela afectaciónporel linfoma. Posterionnentesefijan enformaldehidotamponadoal 10%e incluyen enbloquesdeparafma. Parael estudioproliferativoy comprobacióndesufiabilidad, serecogenademás15 biopsiasya incluidas enparafma,pertenecientesal periodo89-94. Uela historiaclínicaserecogela informaciónposiblesobredistintosfactoresrelativosalanimalo a la propiaenfermedad,comoedad,sexo,sintomatología(asociadao no al linfoma), tumoressecundarios,estadio clínico, analíticasanguíneabásica,posibilidaddetratamiento,contipo derespuestay supervivencia. Comocontrolesseutilizan 8 linfomasfelinosparaverificaranalogíaso diferenciasconlas contrapartidas caninas.Se utilizan 7 ganglios control de perro y 3 de gato paraconsideraciónmorfológica, óptica emmunohistoquímica. B.- MORFOLOGIA ÓPTICA EJ estudiomorfológicoderutinaserealizótrasla inclusióndel tejidoenparaflnay enseccionesdecuatro micrasteñidascontécnicasde: HematoxilinaEosina(HE) convencionaly Qienisamodificado(LennertK, 1978). TINCIÓNDE GIEMSJ4MODIFICADO (LENNER2’) Reactivos: 1. SoluciónGiemsa:80%aguadestilada,20%Oiemsapuro (Merk,Alemania,ref. 9204) 2. 100 ml H20 destiladacon 5 ó 6 gotasdeácidoacéticoglacial. 3. Alcohol Isopropílico. 25 Materialy Métodos Procedindento: 1. Desparafinarlos corteshistológicos(paséndolosporxilol, alcoholal 100%- 96% - 70% sucesivamente) ehidratarlosenaguadestilada. 2. SesumergmenlasolueióndeGiansaduranteunahora(laduracióntieneunrangovariableentre20min. y 1 h. enmodificacionesposteriores). 3. Sesacanloscortesdela soluciónde Giemsaparapasaral H20destiladaacetilada,agitandounos2 ó 3 segundosparasudiferenciación(sedebecontrolarmuy bienestepaso). 4. Se pasaninmediatamenteporalcoholde 960,dejándoloshastaobtenerel colordeseado(controlarcon microscopioóptico). 5. El procesode diferenciaciónse parasumergiéndo3 veces(2 mm. cadavez) los cortesen alcohol isopropílico. 6. Se pasanporxilol tresveces(2 mm. cadavez) 7. SemontanenEukitt. C.- MICROSCOPIA ELECTRÓNICA Todoscorteselectrónicosestudiadoshansidoseleccionadossobreseccionesópticasde controldeuna micradc grosor,teñidasconGiemsa. Materialy Reactivos: 1. Gelatinecapsules.(size l/6.Smmdianxetro/0.5m1).Cod. C089. TAAB. 2. Acetona. 3. Vestopal-Wresin. Cod. VOOS. TAAB. Solucióndetrabajo: SoluciónmadredeVestopal: Vestopal-W 10 ce Iniciador alce Activador 0.2 ce Mezclarel Vestopal-Wconel iniciador,agitarcon unavarilia devidrio antesdeañadirelactivador. 4. IniciadordelV-W: Tert-butylperbenzoate.Cod. 8035. TAAB. 5. ActivadordelV-W: Cobaltnapthenate(6%cobalt). Cod. C031.TAAB. 6. Rejillas: (speciniengrids-PKT/100).Ccxi. 4629A-4.LKB. 7. Tetróxidode osmio. Cod. 24505.Merck. 8. BuiferCacodilato: Cacodilatosódico 85.6gr Aguadestilada 400ce Soluciónde trabajo: Dela soluciónanteriorsetoman400ce,en 1.600ccde aguadestilada.pH 7.3. 26 Materialy Métodos 9. 120destilada;pFh7.2-7.8)y ya están listasparala técnicadeinmunohistoqurnuca. Los anticuerposquerequierenla olla apresióncomométodorecuperadorantigénicodelos aquíutilizados son el MIEL, CD3, CD79a,5100 (aunquetambiénrespondesin tratamiento)y J Chain. La mayoria se utilizabanantesconmicroondas,peroseobtienemejorpatróndetinción sometiéndolosal calorporpresión dela olla. Microondas En estecaso,lascestillas(decristalo plástico)dondesecolocanlaspreparacionesalternas,tienenque ir en un contenedorde plásticorellenadocon buifer Citrato SódicopH 6 (el mismobuifer que parala olla a presión)quedebecubrirenexcesolasmismas.El contenedordebeir tapadoparaevitarenlo posiblela salida delbuifer,aunqueno hennéticamenteparaque puedasalirel vapor. Se utiliza un microondasdeusodomésticocon la máximapotencia,y el númerodepulsosdependerádel AcMo utilizado. Paralos AcKAPPA y LAMBDA setratadetrespulsosde 10, 10 y 5 minutosrespectivamente.Se controla entrecadapasoparaevitarla evaporacióndelbuifer conel consiguientesecadodelas preparaciones. 3.-Incubación con el anticuerpo primario a. Anticuerpomonoclonal:incubardirectamenteel anticuerpoprimario, a la dilución óptimadelmismo 29 Materialy Métodos enT.B.S., durante40-60míadependiendodelAcMo quesetrate. b. Ac poiclonal: si el anticuerpoprimarioespoliclonal, incubarenNormalSwineSerian(NSS) 1:10 (DAKO, X901) durante10 minutos,paraevitarinespecificacionesy fondo.Decantarlosin lavaren T.B.S. e incubarel anticuerpoasudilución especificadurante40-60mm. 4.- Incubación con el anticuerpo secundario Tipo deanticuerposecundario: a. Si elAc primarioesmonoclonal: Biotinylatedaffinity isolatedrabbitimnumoglobulinsTO MOUSEIMMUNOGLOBULINS. 1 ML. Cod. E354.Dúo. Solucióndetrabajo: 1:250. b. Si el Acprimarioespoliclonal: Biotinylated alflnity isolatedswineininitmog]obulinsTO RA?BBITIMMUNOGLOBULINS. 1 ML. Cod. E353.Dako.Solucióndetrabajo: 1:250. Duración: seincubanlas preparacionesde 40-60minutosconposteriorlavadoenTES. 5.-incubación con el anticuerpo terciaño: Reactivos: a.TécnicadeAvidina-Biotina (ABC); ABComplex/HRP(Dako. CodeNo. K355)quecontiene: l.Reactivoa: Avidin lml. en 0,01 M Phosphatebuifer,0,15 M NaCí, 15 mM NaN3,pH 7.2. 2.Reactivob:Biotinylatedhorseradishperoxidaseimlen0,01 M Phosphatebuffer,0,15MNaCIpH 7,2, 15 mM NaN3. 3. Unabotellapararealizarla mezcla(1 xnixing / storagebottle). Soluciónde trabajo:unagotadea+ otrade b+ SmI buiferTES. b. Técnicade Streptavidina-Biotina(STABC» StreptABComplex/HRP(Dúo. CodeNo. K377) que contiene: iReactivoa: Streptavidunlml. en0,01 M Phosphatcbuffer,0,15 MNaCl, 15 niMNaN3,pH 7.2. 2.Rcactivob.BiotinylatedhorseradishperoxidaseImlen 0,01 M Phosphatebuffer,0,15 MNaClpH 7,2, 15 mMNaN3. 3. Unabotellapararealizarlamezcla(1 mixing ¡ storagebottle). Solucióndetrabajo: unagotades+otradeb + 5 ml buiferT.B.S. Técnica: Los pasospreviossonigualesenambastécnicas;enteeflossedebenhacerintensoslavadosen buiferT.B.S. deal menos5 miii. deduracion. Se incubanlas preparacionescon el anticuerpoterciariode 40-60minutosy posteriormenteselavanen lBS. 30 Materialy Métodos 6-Revelado con Diamino-Ben ¡¡dina (hAB» contraste final Cromógeno: D.A.B. (3,3a-Diamino-benzidin-tetrahydroclorid)(25gr). Cod. 32750.Fluka. Soluciónde trabajo: BuiferTRIS paraD.A.B. pH 7.6: TRIS 0,2 molar 12 cc Acido clorhídrico0,1 N 19 cc Aguadestilada l9cc SolucióndeD.A.B.: a. D.A.B. 5 mgr +10cc buiferD.A.B. b. Aguadestilada2,9 ce+0,1 >1202. Mezclary filtrar. DAB comercialDAS TABLETS. (SIGMAFAST,D-4293): 1 tabletade DAS + 1 tabletade UREAH202+ 5 ml H20destilada Técnica: Las preparacionesseincubanenDAB durante2 a 10 mm. (controlcon microscopio)y posteriormentese lavanenTBS y sepasanal aguacorrienteparasercontrastadascon HematoxilinadeCarazzi.Sedeshidratan y montanenmediono acuoso(Eukitt). HematoxilinadeCarazz¡: Hematoxilina 2 gr Yodatopotásico 0,4 gr Alumbrepotásico 100 gr Glicerina 400 gr Aguadestilada 1.600cc D.2.- PROCEDIMIENTOAUTOMÁTICO. INMUNOTEÑIDOR: DAKO TECH.Mate~ 4500/1000. Reactivos:DAKO Cbem-Mate~DetectionKit. CodeNo. K 5001. El funcionamientodel inmunoteifidorestábasadoen reaccionesde capilaridadque haceascenderel reactivo dispuestoen bandejasespecialesen cadapaso del proceso,automatizadopor un programa informático,por preparacionesenfrentadasverticalmentecreandounacámaravirtual entreellas. Asi se homogeneizanlas condicionesde manejodurantetodo el procesado,y por consiguientese igualanlos resultados. 31 MaterialyMétodos El TECHMATE constade 89 pasosautomáticos.El ¡A Z4 las fitcuenciasdeaparicióndelasdistintasrazasesde8/30(26.6%)parael PastorAlemán;3/30 (10%)paraCocker,Boxery crucesdiversos;2/30 (6.6%)en el Labrador,y 1/30 (3.3%) paralasrazas SpanielBreton,Pequinés,WestHighland, Chow-Chow,PastorBelga,Airdale Terrier, Caniche,Ciriffon, PastorAlsaciano,Podencoy Bulldog. * ANALÍTICASANGUINEA:La anemiaseobservóen 9 casosde los 21 análisisestudiados(42.8%), aunquesóloen6 deesos9 casoshabíaunaclaraafectacióntumoralmedular.En 7/21 ocasiones,serecogió un leucogramade stresscon neutrofiliay linfopenia,pero sólo 4 casosmostrabanafectaciónmedular neoplásica.Los glóbulosblancoselevadossepresentaronen 10/21 casos,concorrespondenciamedularen 8 (origendiverso:casosseverosdedisneay tos, infecciones...). Los 6 casosdelinfocitosis (deun total de 17 análisisconposibihdaddevalorar¡oslinfocitosensangre;35.2%)coincidieroncon6 afectacionesmedulares, y en 4 de ellos sepresentóun cuadroleucémicocon blastoslinfoides en sangre.Neutrofihiaseprodujoen 14/17casos(82.3%)y deellos sólo 8 presentabanla médulainfiltrada. ‘ESTADIO CLINICO: La valoracióndelestadiajeclínico& estegrupodelinfomas seexpresabajoe!perfil veterinarioy médico,ya queelestadioIV enveterinariaincluyebazoy/o hígadodentrodeun mismobloque porconsiderarambosórganosparalelosenla evolucióndel tumor,y enmedicinahumanasegradúanpor separadopordarmásimportanciaal hígadocomoórganohematógeno(111 bazoy ganglios;LV hígadoy otros órganos).El estudioestadísticodemostróquela supervivenciaglobal delos animaleshesignificativamente superiorenelcasodeno estarelhígadoafecto,factorqueno sereflejaenel estadíajeenveterinaria,ya que seconsideraríanen estadioIV. Delos 26 casosen¡oscualeselestadioclínico pudoserevaluado,un 76.9% (20/26)presentabanun estadioV (IV en medicinahumana),un 19.2%(5/26)estadioIV (III enpatología humana)y un 3.8%(1/26)fue estadio1V (tambiénIV en humana). * TRATAMIENTO: Sólo nuevede los 30 animalesrecibieronpolíquimioterapiapor combinaciónde vuncristina,ciclofosfamiday prednisona(COP), con metotrexateo adriamicinaintercaladoenocasiones.Las supervivenciasglobalesdetratadosy no tratados,oscilaronenun rangodeO días(sacrificioen elmismodía del diagnóstico)hastaun totalde203 días.Los tratadostuvieronun rangode duraciónde 12 a 203días,con 46 Resultados un valormedio de92.4días.El tipo derespuestaenla inducciónfuecompleta(RC) en5/9,parcialen l/9y nohuborespuestaen 3/9. * FORMAS CIÁNICAS ENCONTRADAS: A)perro:20 multicéntricos(66.6%),4 multicéntricosconexpresiónprincipalmenteleucémica(13.3%), 4 timicos (13.3%),un cutáneo(3.3%)y un intestinal(3.3%). B) casosfelinoscontwl: De los 8 casosrecogidoscomocontrol,2/8 (25%) fueronlinfomasprimarios renalesdenaturalezaB, 3/8 (37.5%)primariostínúcosdenaturaleza1, 1/8 (12.5%)del SNCB y los dos últimosmulticóntricosB (25%). B. AFECTACIÓNNECRÓPSICATUMORAL: Macroscopiadelos distintosórganoscon infiltración porlinfama 1. (24NGLIO: 30/30 (100%)delos casosenperroestáninfiltrados. Seobservaun marcadoincrementode tamaño,de 3 a 10 vecesel original. El gangliocon linfoma esfácilmentepalpable,firme, bien definido, indoloro,fijo (Pcorporal)y generalmentemóvil pornoestaradheridoa piel o a planosprofundos.La cápsula estátensay lisa,y al corteprotuyeel interior, que secaracterizaportenerun patróndecrecimientosólido difuso con coloraciónblanquecino-rosácea;esuntejido carnosomable,menosestructuradoy firme queel ganglionormal,quedesprendegrancantidaddematerial“lechoso”denso.Si eltamañoesmuy grande,suele habernecrosiscentralconmuchamenorconsistencia,inclusosemisó¡ida. En mediastinoy mesenterio,cuando variosgangliosvecinosestáninfiltrados,puedenunificarsea unasolamasagrande(bulkymass).El tipo de infiltración tumoral es difuso con permanenciamayor o menor de la estructuranormal del ganglio dependiendodelgrado,estadioy tipo histológico. De los 8 gatoscontroles,en6 casossehapodidovalorarel ganglio,dondeel crecimientoeradifuso,y en un casoconnaturalezaT todavíaestabanlos folículosconservados(Figurait). 2. BAZO: Todos los casosdondeel bazoha sidovalorable(26/26)haestadoimplicadoporel linfoma. Se caracterizaporun aumentodetamañoenmayoro menorgrado- esplenomegalia- queenocasionespuede hastahacersepalpable,pennaneciéndoindoloro. La cápsulase presentatensa,con superficie rugosa (‘grumosa”)que dejaver pequeñosnódulosmúltiples.Al corteprotuyeal exterior;el tejido esfiable, sin estructura,blandoy carnoso,quedesprendeabundantematerial“barros?.Muestraun claroincrementode la pulpablancaformandonódulosmúltiplesde5-10-20mm, conincrementotambiéndela pulparoja, que tomaun aspectocarnosohúmedoconcoloraciónrosácea(6/26); encortehistológicoseobservaun infiltrado homogéneoblásticodifuso (14/26)0tambiénenpulpablancaqueseextiendea senosdela pulparoja(6/26); cuandoéstaúltimano estácomprometidapresentahemorragia,congestión,edemay fibrosismuy avanzada (5/26). Puedehaberinfiltración difusacon un aumentohomogéneodel parénquimasin diferenciarpulpa 47 Resultados blancay roja (15/26).Raramentehacenódulosmacroscópicos(2/26),aunquepuedenidentíficarseencabeza y cola, concoloraciónblanquecinay tamañosde incluso5 ó 6 centímetros.En ocasionesseproduceima Sofiatotaldelapulpablancaconinfiltración parcialde la roja(1/26)(FigurasId y le). El bazoenel gato control seha comportadode forma similar, concrecimientodifusonodular (dosocasiones),atrofiatotal esplénica(1 caso)o parcialdela pulpablanca(1 caso)o delapulparoja(doscasos)conhemorragiay edema, paraleloaun incrementodela blanca. 3. HIGADO:Aumentodetamaño- Hepatomegalia- generaly uniforme,inclusopuedehacersepalpablepor debajodelarcocostal.Lainfiltración masivadibujaelpatrónlobulillar, portaly periacinardelparénquima hepáticohastahacerseclaramentevisible (16/26).Aunqueesmuy rara,sehavisto unainfiltración difusa parenquimatosacon la fonnaciónde nódulosmacroscópicossubcapsulares.En los casosde no haber infiltraciónneoplásica,sí sueledarseunamarcadadegeneracióngrasacontipico aspectoamarillentoifiable (10/26). En el gato se han dado dos casosde inmtraciónperiportal,con ademásinfiltración difusa parenquimatosa,connódulomacroscópico,en 3 ocasiones(Figura ib). 4. AMÍGDAL.4S: En todoslos casosestudiados(16/16 - 100%)al igual queen el ganglio, tambiénse produceun aumentode tamañogeneralizado,con crecimientodifuso sólido que protuye hastahacer desaparecerlascriptas,desplazandocompletamentela glándulasalivaraccesoria.La superficieestátensa, y al cortescobservaunacoloraciónblanquecina.En cortehistológicoseobservaun infiltrado difuso,donde enocasionespermanecenfolículos,mantoso trabéculas(2/16) (Figura2a). 5. MÉDUL4 ÓsEA: Toma el aspectohomogéneode “médula empaquetada”:macroscópicamente correspondeaunamédularica,carnosa,blanday máspálidade lo habitual.Histológicamenteesun infiltrado difuso intraparenquimatoso(11/18),que enocasionesconservaciertaproporcióndetejido hematopoyético normaltodavíafuncionantey tejido grasohabitual(5/ls). Puedeno estarinfiltrada(2/18). En el gatosólo dospresentanincrementodetamañoconcrecimientodifbso,y enun casolos foliculos estanconservados.Las cincomédulasrecogidasdegatopresentaninfiltración porel linfoma enmayoro menorgrado. 6 INTESTINO:No hapresentadoafectaciónen 14/21 delos casos.Lamacroscopíadel intestinoafectado en la formaprimaria de linfoma intestinal(1/30) muestranódulosblanquecinosaisladosde 5-10cm, o inclusosegmentos/tramosenterosde20-30cm,dondetodoel grosordela paredestácomprometido,desde mucosaa serosa,protuyendoen la forma severaa amboslados,conulceraciónde la mucosa(con diarrea hemorrágicaenla mayoríade loscasos)y rigidezcaracterística.Dependiendodelgradode compromisode laparedproduceo no obstrucciónintestinal.LasplacasdePeyerdel tejido intestinaladyacentesuelenestar claramentevisiblesporafectacióntumoral.Cuandono esla forma intestinaldel linfoma, puedehaberun infiltrado tumoral con unamarcadadíferenciaciónplasmacítica-plasmablásticasobrela láminabasal,o inclusorompiéndola,queseextiendeenmayoro menormedidaa la submucosadelepitelio,o a musculary serosa(6/21 enperro- 1/8 engatocontrol).El páncreasvecinosueleestartambiéncomprometidocuandohay 48 Rtsultados infiltraciónen digestivo(4/5 páncreasrecogidosenperro).En gatosóloun timico T presentabainfiltración del páncreas,queno coincidíaconinfiltración intestinal(Figuraslb,2c,2dy 2e). 7. RIÑÓN: El riñón conlaformaprimariadelinfomarenal (0/30;2/8 enloscontrolesfelinos) aparececon ciatoaumentodetamaño,dependiendodelgradodeinfiltración. La frecuenciaenperroesmuy inferiora la presentadaenel gato.Muestranódulospálidosencorteza,elevadosconrespectoa la superficierenalnormal. Al cortemuestraáreas/segmentosblanquecinos,generalmentecorticales,quesedilbndenal interiormedular. El riñóntambiénpuedeaumentardeformaglobalporinfiltración difusa,dandoun aspectopálido. Lacápsula queda adherida y se desprendecon dificultad. En linfomas generalizadosencontramosinfiltrados perivasculareso intraparenquimatosos,tantoenmédulacomoen cápsula(10/21).No hahabidoafectación algunaen 11/21 delos casoscaninos. & FORMA TIMICA (MEDL4STZNO); (4/30penos). La formatimica T secaracterizaporserunamasa firme, blanquecina-pálidaqueocupala regióntorácicacraneo-ventral.En gatospuedesertan grandeque desplacedorsalmentela tráqueay esófago,y caudalmentecorazóny pulmón.En estoscasospuedepresentar implantesblanquecinosmúltiplesen pleuraparietaly visceral,periy miocardio,diafragma.con incluso metástasisnodularesenpulmóny atelectasias.En los linfomasfelinos deestirpeT sehainfiltrado cl pulmón adyacente.En en perro el desplazamientono es tan llamativo. El mediastinotambién puedeestar comprometidoen linfomas generalizadosde naturalezaB por la cadenaganglionary presentartambién extensióna estructurasvecinas. 9. FORMA EPIDURAL: el espacioepidural aparecepuntualmenterellenode un material blanquecino setnisólidocon compresiónmedular(presentael cuadroclínico correspondiente),LCR algoaumentadopor deformacióndelespaciovirtual normal.No sesueleencontrarla masaprimariaqueoriginala metástasis,así queseconsideraprimario. La formaprimariade linfoma epiduralsóloseha presentadoen uncasode gato control. ¡O. PIEL:El linfonia primariocutáneo(1/30enperro)presentadesdeun engrosamientodela piel enplacas coneritema-mácula-pápula,hastala formacióndenódulostumoralesverdaderoscon ulceracióny posibles piodennassecundarias.La formamuiticéntricapresentacon frecuenciaun edemasubcutáneomarcadocon aspectogelatinosoporcompromisodel sistemalinfático.Ningúngatocontrolhapresentadoni formaprimaria ni extensióna piel deotra formadelinfonia. 11. GENITALES/PRÓSTATA:Dos perrospresentanademástumoresde Leidig testiculares,y de las 6 próstatasrecogidas,3 mostrabaninfiltración por el linfoma, ademásde unahiperpíasiamarcada.No ha habidoinfiltraciónporlinfoma enningúncasodelinfoma felino. 49 Resultados 12. OTROSÓRGANOS:El páncreassueleestarcomprometidodeformaparalelaal duodeno,yaseacon afectaciónprimariao gweralinda,enuncasopresentaunquisteasintoniáticoencabeza,perono corresponde coninfiltración clara duodenal.La glándulaadrenalhaestadoinfiltrada enel casodeinfiltración masiva renal,no enun riñón coninfiltración inicial. La vejigapresentóémbolostumoralesenun casodelos cinco estudiados;endoscasoshubo unamarcadadisplasiaepitelial concistitis agudaabscesiflcada.La mama estuvoinfiltradadeformadifusaenun casode linfomamulticéntricogeneralizado.Un hallazgodenecropsia tite la calcificacióndistróficadela epiglotisenencasoconmarcadocompromisorespiratorio. * TUMORESSECUNDAMOS:Envariasocasionesel linfoma seve acompañadoporla presenciadeotros tumores:un casocon un hepatocarcinoma;otro con un tumor mamariopreviamenteextirpado;en dos ocasionesel perropresentaunapatologíapolitumoral con adenocarcinomabronquiolo-alveolary tumorde células de Leidig testicular; u otro casocon 2 mastocitomas,tumor de célulasde Leidig testiculary adenocarcinomadeglándulasperianales. C. MORFOLOGIAÓPTICO - ELECTRÓNICA Todos los casosestudiadoshansido de alto grado, dondesediferenciancitologíasde los distintos subtipos: 13/30(43.3%)linfoblásticosLB - delos cuales5 sonB (Figuras3 a6) y 7 sonT (Figuras7 a 9), 10/30(33.3%)inmunoblásticosIB (FiguraslOa 12), 5/30(16.66%)centroblásticosCB (Figuras13 a 15), y 2/30 (6.6%) extranodales,uno cutáneo T (Figuras 16 a 18) y otro un MALT intestinal plasmablásticoB dealto grado(Figuras19 y 20).Portratarsedeneoplasiasde alto grado,el patróndecielo estrelladose encuentrade forma constantesin relaciónalgunacon los distintossubtiposhistológicos (Figura 21). El linfoblasto LB esun blastolinfoide mediano(10micras)connúcleoredondou oval enla estirpeB y convolutoo cerebriformeenla estirpeT. Los E muestrannucleolosmúltiplese hiperplásicosy cromatina dispersa, enpartemarginada.Los T exhibencromatinaen acúmulosdensosirregularessiendolos nucleolos pequeñosy múltiples, lo que lesconfiereun aspectodenúcleodenso,hipercromáticoe hiperlobuladocon MO. El citoplasmaesmedianoy basófiloporla cuantíapolirribosómica,asímismoconescasasorganelas, aunquedestacanlas mitocondriasdespolarizadas,algunosacúmuloslipoides, centriolosy excepcionales lisosomas.Puedeobservarseciertadiferenciaciónaplasmáticaenla estirpeE. Sueleir acompañadoconun patrónde cielo estrelladopor lisis celulardebidoa la dinámicatumoral con mitosis abundantesy a la fagocitosisde restosnuclearespor histiocitos. Se diferenciandos gruposprincipales:el tipo Burkitt B (Figuras3, 4, 5 y 6) y eltipo convolutoT (Figuras7, 8 y 9). El inmunoblastoIB tieneuntamañogrande(aprox. 12 micras),connúcleode 8 a 10 micras,cromatina de predominiodispersa,escasamarginadaa membrananucleary nucleolohiperplásicoennúmerovariable (1-3) másftecuenteenel centrodelnucleolema;el citoplasmaes amplioy basófilocon pocadensidadde 50 Resultados crganelas,abnndantcsribcsomas~escasasmitocondriasyenla estirpeB, frecuentediferenciaciónplasmacitica con grandesarrollodel RER.,paraleloalamembranacelular,condilataciónde lascisternasrellenasde materialproteico,formandoestructurasdeaspecto“enstaloide”,visiblesalM.O. comoacúmulosgutulares (Figura20). En algunoscasos(Figuras11 y 12), cl crecimientotumoral se acompañade un notorio desarrollode célulasplasmáticascon distinto gradode diferenciación(plasmablastos).En la estirpeT el citoplasmaexhibeunaclaridadcaracterísticaporimbibición desolutos(Ib decélulasclaras). El centroblastoCB es similar al fisiológico delcentrogerminalperomásanaplásico;tambiénesuna céluladetamañogrande(10-12micras)connúcleosimilar alIB, másclaroporla cromatinaaúnmásdispersa y los nucleolossuelenestaren la periferia;excepcionalmenteel contornonuclearpuedeestarhendido.El citoplasmaesescaso,tambiénbasófiloporlacuantíadepolirribosomas,conmuy escasasorganelasentrelas que sonconstanteslasmitocondriasdespolarizadas,siendomínimoel RER (Figuras14 y 15). El linfoma centroblásúcorecibeladenominaciónmonomorfoopolimorfo(Figura13)si dichalíneacelularseencuentra mezcladaconinmunoblastoso cenírocitosenmayoro menorcuantía.En estaseriecorrespondenalinfomas centroblásticospolimorfos,siempreacompañadosno sólo por inm~moblásticossino tambiénporcélulas plasmáticas. No sehan observadosignoscaracteristicosultraestructuralesnuclearesen relacióncon los cambios neoplásicos.No obstanteexistencambiosnucleolarescompatiblescon “nuclearbodies” o segregación: separacióndelos componentesproteicoy fibrilar. En cuantoa lasimágenesdemuertecelularprogramada o apoptosisno sehanvisto aumentadasy exhibendisminucióndel tamaño,desnaturalizacióndelasorganelas y picnosisnuclear,sin signosinflamatoriosvecinos(Figura22). Entodoslos casosla arquitecturaganglionarestáborrada,mostrandoel linfoma un patróndifuso, a veces ‘pseudonodular”porinfiltración medulary sinusalquesólamenterespetaparcialmentelastrabéculas(Figura 23 c); la arquitecturageneralno seconservay presentaciertoaumentode latramareticulínica,y suelehaber infiltración de la cápsulaenlos estadiosmásavanzados. D. PATRONES DE TINCIÓN EN INMUNOHISTOQIJÍMICA Un 80%delos linfomasdeestaseriehasidoB y un 20%T. 1.-CD79a(donHMSY):Reaccionaconel antígeno(dímeromb-l/B29) demembranatempranodela estirpe B y quepersistedesdeel estadiopre-B al de célulaplasmáticaen el que aparecea nivel citoplasmático. Apareceenhumanosy endistintasespeciesdemamíferos.EnpatologíahumanamarcaleucemiasB decélulas precursoras,linfomas B y algunosmielomas.En ganglioreactivoanimalmarcalas célulasB del folículo, senosmedularesy manguitosperivasculares.Dentrodel folículo, lascélulasdelmantolo expresanconuna 51 Resultados clara positividad encitoplasma, en forma de anillos perinuclearesy/o acúmulosen RLER y Golgi; el centro germinal marca losblastos B preferentementeen forma de anillo pednuclear,y el citoplasmade lascélulas plasmáticasfuertementeteflido. En linfomas animales(penoy gato)marcadel 60 al 70%de las células tumoralesB, conunaintensidaddetinciónvariable(débil-moderada-intensa),quedependedela fijación y condicionesdel material.La positividada estemarcadorcoincideconlapositividadala cadenaLambdade las Ig aunqueelCD79aenperroesmuchomásespecífico.En gatopresentatambién,enmuchoscasos,una reaccióncruzadaconproteínasnucleares,no sólodel tejido linfoide, lo quedificultasulectura(Figura23). De los 24 linfomas B enpeno,el Ac HMS7 (CD79a)hasidopositivoen22, delos cuales10 casoshan presentadopositividadmuy fuerte,y 12 deligera amoderada. 2.-KAPPAUGITT CHJ4INS/L4MBDA LIGHT CIL4INS: cadenasligerasKAPPA /LAMBDA humanas. Se utilizan parahacer diagnósticodiferencial entre infiltrados homogéneosde naturalezaB: tumoral monoclonalque sóloexpreseunacadena(Kappao Lambda),o reactivopoliclonal que expreseambas.En hombrelamayorpwporcióndetumoresdeestirpeB esKappa+/Lambda-,a excepcióndelos linfomasMALT digestivosquesonLambda+/Kappa-.Nuestraexperienciaen animalesesla contraria:todoslos linfomas B sonLambda+/Kappa-,y el únicocasodelinfoma intestinalesKappa+/Lambda-.El Ac reaccionacon las cadenasKappa/Lambdalibres, asícomolas unidasamoléculasdeinmunoglobulinas.Tiñepreferentemente la lg intracitoplasmática.Se aplicapara tipificar las cadenasKAPPA/LAMBDA libres o unidasa Igs presentes,por separado,en las células linfoides B en distinto gradode maduración.En nuestrostejidos animalesmarcacon gran intensidaden las plasmáticassinusales,folicularesy en el manto; con menor intensidady enacúmulosintracitopíasmáticosy/o anillo perinuclearsedisponeel Ac enlosblastoslinfoides del folículoy manto.En losblastostumoralesdibuja un haloalrededordelnúcleo,y enocasionesformade acúmulosdediferentetamañoenla zonadel aparatodeGolgi y del retículorugoso(Figuras24,25y 26). Delos 24 casosdelinfomasB enpeno,23/24hanmostradopositividadparala cadenaLambda,delos cuales 6 muestranpositividadexcesivano valorada,y sólo 1/24muestraunaclarapositividada la cadenaKappa. 3.-JCHÁlfVpotidonalpredilzdda:LacadenaJ esun componenteunidoa lasmmunoglobulinaspoliméricas y estáunidaporpuentesdisulfuroa lassubunidadesIgA eIgM enrelacióndeunacadena1 porpolimero, independientementedel tamañode éste.Las célulaspositivasa esteanticuerpoen ganglioreactivoson preferentementeplasmáticassinusales,folicularesy delmanto;engatohamarcadoocasionalesplasmáticas sinusales.En linfomas las plasmáticaspositivassedisponenpobrementeen el tejido conjuntivoy restos sinusalesque quedanentre los nódulos tumoraleslinfoides (Figura 27), Sólo 5 casoshan mostrado positividadparciala esteAc. * Un ensayocon IgM e lgD específicasde perro marcó en ganglio reactivo las células plasmáticas excepcionalmente.El resultadoesperadoen célulasB inmadurasfueescasoy defectuoso,inferior inclusoa lascadenasK y L, y con elinconvenientedeencontrarun granfondobase. 52 Resul~dos 4.- CD3, PAN T: Reaccionacon el receptorde membranade célulasT timicasy de tejidos linfoides periféricos.Enpatologíahumanareaccionaconla mayariadelos linfomasT, aexcepcióndepartedelos anaplásicosde altogrado.En ganglioreactivodeperromarcala zonaT interfolicular; en ocasionesdicho infiltradoT colonizael mantoadyacentey disponedeformadispersa(15%)dentrodelcentrogerminaldel folículo B. En ganglioreactivodegatoel infiltradoT sobrelaszonasB (folículoy senosmedulares)esmás numeroso(25%)dondelos folículossedisponendeformamásdesordenadaen la arquitecturadelganglio, no solo enla corteza.Tantoenperrocomoengato,hateflido casiel 100%de lascélulasdelos linfomasT; en los linfomas B las célulasT sehandispuesto‘salpicadas”,dispersasde forma intermitentedentrodel infiltradohomogéneoB (Figuras28 y 29). Los 6 casosde linfoma T en penoy 3 engatopresentan100% depositividadparael Ac CD3. 5.-. S-100:El anticuerporeaccionaconla 5-100A y B bovina,humana,de ratay canguro.El Ac sehatestado envariostejidosincluidosenparafinay mostraronserespecíficosdeformaestrictaa la 5100; también son positivas las células de Schwanndel sistemanerviosoperiférico, en piel los melanocitos,tumores melanocíticosy las célulasde Langerhans.En ganglio linfático, las célulasreticularesinterdigitantesson positivasa esteAc. En ganglio reactivo animal marcalas dendríticasfoliculares y del manto con sus prolongacionescitoplasmáticas,y enmenormedidalas dendríticasmedulares.En linfomascaninosmarca célulasdeestirpemonohistiocitariaredondasy estrelladasdeformavariable:monocitossinusales,dendríticas interfolicularesy sinusales.No sigueun patrónconstante;dependede la agresividad,gradodefibrosis, cielo estrellado,etc...(Figura30). Sólohasidonegativoen2 de los30 linfomas,y elrestopresentabadistintos gradosde positividaddeleve-moderado-altoenfunción delpatrónquepresentaraencadacaso. 6-MAC3S7RISTIOCITARJO:El Ac MAC 387 reaccionacon el antígenoleucocitarioLi expresadoen neutrófilos,monocitos,algunosmacrófagosreactivos,epitelio escamosoen mucosay epidennisreactiva.Se encuentraen citoplasmademuchascélulasniielomonocíticas.En tejidos humanosel Ac reaccionacon el sustratopredominantedc macrófagosreactivosy tambiénseobservaenhistiocitosis(malignao sindrome bemofagocitico).En ganglio reactivode perroy gatomarcahistiocitos sinusalescon fuertepositividad (célulasmonocitariasredondas).En el linfoma caninoy felino pareceestarrelegadoa monocitos-histiocitos sinusalesconmenorpositividadqueel anterior(Figura31).Hamarcadoen25 delos 30 linfomasdepeno. 7.-MIR) (Ki-ó7enparafina):Reaccionaconcélulasproliferantes(fases01, 5, 02 y M) de todoslos tejidos. En el timo, la mayoría de los timocitos corticaleslo expresan,mientras que los de la médulasólo ocasionalmente.En el tracto gastrointestinalreaccionacon lascélulasepitelialesmucosasen el cuelloy la regiónbasal(lascélulasmássuperficialessonnegativas).En el epitelio escamososeunenpreferentemente alas célulasbasales.Eneltejido linfoide: los centrosgerminaleslo expresanengrancantidadde suscélulas, siendoinferiorel númeroenotrasáreas.En ganglioreactivoanimal,dentrodel áreaB, el centrogerminal parecemostrarunapositividaddel 60%(notablementeinferior a la descritaenhumana,que escasideun 1000/o),elmantodeSa 10%,y los senosmedularesun 20%enperroy un 30%engato.El áreaT expresael 53 Resultados Acaiun10%delascélulas.En linfomassedetectanvaloresfalsamenteinferioresaIAcPClOporel patrón de tinciónheterogéneo,ennuclealoy cromatinamarginada,que es captadocon mayordificultad porel analizadorde imagenCAS 200 (Figura 32).Ha tefiido todas las muestras,aunque en unaocasiónno hasido valorableporestarretraídoel tejido. &- PCNA/PC-1O:El Ac PC-lo reaccionacon célulasproliferantesen todos los tejidos (el Ac PC-lo reaccionacon el Ag dela ciclinaPCNA de todaslasespeciesdevertebrados,insectosy levaduras).En la práctica,aunquela ciclina PCNA alcanzasu síntesismáxima en la fase 5 del ciclo celular,los niveles detectadosentejidosnormalesytumoralesigualano inclusoexcedena los detectadoscon elAc MIBí, el que marcatodaslas fasesdel ciclo celularconexcepcióndela G0. Detodasformas,ambosmarcadorestienenuna relaciónlineal de los valoresdel Ac. El patróndetinción eshomogéneo,nuclear-nucleolar,y no permite visualizarlas estructurasnucleares(Figura33).Hapresentadopositividadentodoslos cortes,aunqueentres casosno ha alcanzadola intensidadnecesariaparael sensordel CAS 200. E) CINÉTICA TUMORAL: IROLIFERACIÓN Y CITOMETRÍA Todoslos resultadosobtenidosenproliferacióny ambascitometriasdelos 30 casossedetallanenla tablaVII. El patrónde tinción con ambosmarcadoresproliferativos(PC10 y MIB 1) es nucleary nucleolar, homogéneoen el casodel PC10 y marginado-irregularen el casodel MIB 1, con positividad variable dependiendodelcasoa considerar. El estudioproliferativoconestosmarcadoresseharealizadoenun analizadorde imagenCA.S-200.Los resultadosfmalessehanagrupadosegúnvarioscriterioscomo: * Histología: Primeradivisión en los distintosgruposhistológicosdescritosen la clasificaciónde Kiel (Lennert, 1990)paracorroborarla similar cinética: - Los linfomaslinfoblásticos(13/30)tienenun rangode25 a 42%,conun valormedio de33.75%y una medianade34%conelmarcadorPClO. ConelmarcadorMIBí tienenun rangode25 a 47%,unamedia de36.75%y unamedianade38.5%. - Loslinfomascentroblásticos(5/30) tienencon el marcadorPClOun rangode21 a 43%,unamediade 32%y unamedianade 32%.ConMIBí tienenunrangode25 a 39%,un valor mediode33.6%y una medianade 35%. - Los linfomasinmunoblásticos(10/30)muestranun rangode 19 a42%,unamediade34.375%y una medianade 35.5%conel Ac PCl0; conel AcMIBí tienenunamediade38.1%,unamedianadc 40% y un rangode26 a 46%. 54 Resultados - Loslmfomasexlranodales(2/30)tienenun valormedio(y mediana)dc38%y unrangode26850% conelAcPCIO.ConelAcMlBltiencnunamcdia(ymediana)de3O.5%yunrangodcl7a44<>4 * Estirpe tumoral: B 1 T: - Losl¡nfomasB (24/30)tienenunrangode 19 a50%,unamediade34.72%y unamedianade 35%con el PClO,yun rangode25 a 46%,mediade 35.75ymedianade41 conel MIBí. -LoslinfoniasT(6/30)tienenunrangodevaloresde2sa42’>4unamediade30.4%,yunamedianade 26%conelPClO;con el MBl los linfomas1 tienenun rangode 17 a 47%,unamediade29.8%yuna medianade27%. Si consideramoslos 30casosenconjunto,conel Ac PClOtieneun valormedio de33.92%y con el MIBí tieneun valormedio de36.24%. Laproliferaciónenel grupode 15 casosconstituidopormaterialantiguo(TablaVIII) tieneun intervalo devaloresde20a 73%,mediade29.7%ymedianade27%conel PCIO; conel MIBI tieneunrangode26 a 72%,mediade 36.46%y medianade33%. En elestudiocitométrico,conCME(programaquantitativeDNA analysisdelanalizadordeimagenCAS 200),delos 30 casosdelinfoma estudiados,40%erandiploides(12/30)y 53.3%aneuploides(16/30),con 2/30novalorables(Figura34). ConCNff (programaPARA- 1 delcitómetrodeflujo EPICS-C)la diploidía sehaencontradoen46.6%(14/30)dc los casosy aneuploidiaen 43.3%(13/30)delos casos,con3/30 no valorables(pornecrosis,manejoinadequadodelmaterialo excesivafijación enformol) (Figura35). Los ochocasosfelinoscontrolhanpresentadoun comportamientomuchomásagresivoe inestable:la aneuploidiaconCMF haestadopresenteen6/7 (uncasono hapodidovalorarseporlisis dela muestra)y con CME en6/8. La proliferaciónconPCIOtieneun rangode 53 a 26%,conunamediade 38.8y una mediana de37%.Conel marcadorMIBí tieneun rangode54 a 37%,conmediade45.4y medianade 47%. F. ESTUDIO ESTADÍSTICO: Todos los datoshansido analizadoscon el programadeestadísticaSPSSparavariablesbiológicas. Ademásde la estadísticabásica,realizalas curvasde supervivenciade Kaplan-Meier,para las cuales consideraunnuevogrupoformadoportodosaquellosanimalesquehayansuperadoendíasdevidael día 1, esdecir,desechatodoslos animalesquehansidosacrificadosel mismodía deldiagnóstico(Figura36).Se consideradía 1 laentradao admisiónenel centroveterinario,descartandola visión subjetivadeldueñosobre la fechadecomienzodelasintomatologíapropiadel linfoma,paraintentarhomogeneizartodoslos resultados. El otro problemaañadidoesque todoslos animaleshan sido sacrificados,porlo que la supervivenciase transformaenundatorelativo. Lasdistintasvariablesrecogidascomoedad,sexo,raza,estadio,tratamiento 55 Resultados (si/no),... seanalizanconrespectoa la posiblesupervivenciaobservada.Los casosfelinosno hansido consideradosenel estudioestadísticoporsersóloochoennúmero. * La ditbrenciaentrelasupervivenciadelos animalestratadosfrentea la delos no tratadossí fue claramente significativa(p=t.0002),porlo queobviamentela variabletratamientosí tienevalorpronóstico.La variable tratamientocon el protocoloCOPno seanalizadesdeun puntode vistacualitativo,esdecir,no sebusca conocerni el tipo de respuestaque puedaproducir ni la fiabilidad del mismo,sólo si ha variadola supervivenciatotal enalgunamedidaconrespectoal grupode animalesno tratados(Figura37). * Al dividir el gmpototal enfuncióndevaloresmediosdela edad comomediay mediana(8, 9)y enfunción decadatipo deedad,no sehanencontradodiferenciassignificativasentrelascurvasdesupervivenciadelos intervalosresultantes,porlo queno sepuededecirque laedaddepresentacióntengavalorpronósticoeneste grupodeestudio(Figura38). * Conrespectoa la variablesexo,las curvasdesupervivenciatienenun comportamientosimilarenambos, porlo queno sehaencontradosuvalorpronóstico.La proporcióndepresentaciónsegúnel sexoesde2:1 demachosfrenteahembras,perono tienesignificaciónestadísticacomodatoaislado(Figura39). * AunqueelPastorAlemántieneuna frecuenciamuysuperioralrestode razas,sucurvade supervivenciaes similarconrespectoa la de losdemás,consideradosenconjuntoportenertodosfrecuenciasmuy bajas.Por noencontrardiferenciassignificativas,no sepuededecirquela razatengavalorpronósticoenestegrupode estudio. * No seencontróvalorpronósticoenla variableinmunofenotipoya quelascurvasdesupervivenciade los casosB y T fueronsimilares;enpartepudoserdebidoal escasonúmerode casosT (6) frentea los B (24) (Figura40). * La afectaciónhephticasi tienevalorpronósticoenestegrupodeanimales,ya que la supervivenciaglobal delos casosenlos queel hígadono estabaimplicadoessignificativamentemayor(p=0.0009)quela de los casosenlos queel hígadosi estabaafecto,Porlo tanto,no sedebeconsideraralbazoy al hígadoenel mismo estadioclínico,no sóloporla diferenciaensu supervivencia,sinoporla mayorimportanciadelhígadocomo órganohematógeno(Figura41). * El valordelaproliferaciónconel marcadorPC1Oresultótenervalorpronósticofrentea la supervivencia global;La proliferaciónconelmarcadorPC10 dividida endosintervalossegúnla mediana(> 34; có= 34), mostrósupervivenciassignificativamentediferentes(p=O.017)(Figura42). Inclusoenel grupodeanimales tratadosconquimioterapia,lasupervivenciafuesignificativamentesuperiorparael intervaloPC10: <ó 34 (p=O.016) (Figura 43).No fue así con el marcadorMIBX, dondela divisiónporintervalodevaloressegún 56 Resultados la mediana(> 38; có= 38) no dio supervivenciassignificativamentedistintas(Figura44). * Nohaydi~mciassignificativasentelosvaloresdela proliferaciónconambosmarcadoresenlasdistintas divisionesaajñestablecidas(globalmente,porgrupohistológico,inmunofenotipo,tiempodefijación...). La correlaciónpor los métodosPearson,Kendall y SpearmandelprogramaSPSSesde 0.61, 0.429 y 0.61 respectivamente,connivel desinificanciade0.01 (Figura 45).Aunque los indicesconel PC10 parecenmás altosconsiderandocadacasoporseparado,ambasmediaspermanecenhomólogas.Aunquea simplevista tienevaloresabsolutosinferiores,elmarcadorMB1 muestraun mejorpatróndetinción inmunohistoquimico, con independenciaal tiempode fijación en formol y mejor respuestaa la olla a presióncomométodo recuperadorantigénico. * Existecorrelaciónestadísticaentreel indicedeproliferaciónconPC10 y el indice numéricodecontenido de ADN por citometríade flujo, con valoresde 0.54, 0.323 y 0.426por Pearson,Kendall y Spearman respectivamente,connivel designificanciade 0.01y 0.05 (Figura 46). * Si consideramoslaploidíacomounavariablecualitativa,existeunacorrelaciónprecisaentreambastécnicas citornéiricasen25/27-92.6%-(ya quetres casosde los 30 no fueronvalorables).La correlaciónesde0.862 porPearson,Kendally Spearman,connivel de significanciade 0.01(Figura47). No hubocorrelaciónentre losvaloresconambastécnicasen 2/27-7.4%-. Los doscasosde discordanciaentreambastécnicaserande estirpe7, aunqueno sepuedeestablecerningunarelaciónporel escasonúmerodecasos(TablaIX). * No existecorrelaciónalgunaentrela fase5 y la proliferación,gradohistológicoe inmunofenotipo,porlo queseconsideraunavariableindependiente.Sí serelacionala fase5 conla valoraciónglobal cualitativade laploidíaconambosmétodoscitométricos(conelaciónestadísticade0.6, 0.5 y 0.6 con nivel designificancia de0.01)(Figura48).En esteestudiolos altosvaloresdefase5 sehanrelacionadocon la aneuploidia(Fase 5 > 15%), aunqueno todas las aneuploidiastienen fase 5 alta. Los altos valoresde fase5 no sehan relacionadoscon los valoresmásaltosdeproliferacion. * No hay correlaciónestadísticasignificativaentrela ploidiay la proliferación,ni tampococon el grupo histológico.La proliferaciónmantuvoun rangomedioindependientementedela ploidíaquepresentabacada caso;no hubodiferenciassignflcativasentrelos valoresmediosdeproliferaciónde los casosdiploidesy aneuploidestomadosporseparado.La posibleasociaciónentrediploidia con bajo indice proliferativoo aneuploidiaconalto índiceproliferativono hapodidodemostrarse,ya queelnúmerototal decasosestudiados esmuy pequeño,y ademásla medianaseaproximamuchoalvalormedio,lo quesignifica quela mayoríade los valoressesitúanalrededordelamedia(sonsimilares). 57 y.- ICONOGRAFÍA Iconografla TABLA 1 LINFOMAS NO-HODOJUNDE BAJO GRADO E - t~hn ~ Lenoesís LinSdm c’tnice (LLC) lsn~ olíntc~te l.a¡cede de células Peludas • LinEen. Linfoplwnsdlioo (innnsncciflm> • Planocúonss - Linfas,. CesifrocIlico (CC) - - Linfrma Céntoblástico.Ceítocltico (OB-CC> Nodul.rol)ifoao LINIQEAS No HODGRIN DEBAJO GRADO T • Lính ~ Lawende línatia atcic Lasñ jxolistc#im IM,foens de célula pequsfia webeifcnne Micaela furunide. síndrome de Sézaxy • Linfas,. Iñ,faepitelioid. (hobus do Lennert) Listen. An~ioinnn.a,oblásúco • Linfas de 1. zote t LINFOMAS NO-HODOION DE ALTO GRADO E • Li-Jan Cénfroblés*ico Lñffomn Inhlmoblástico • Linfas,. Ax¡aplásico de Células Grandes (Ki.lfl - Lisian,. Linfoblaslico LizdoetiadeBuxkitt LINFOMAS NO HODGICIN DE ALTO GRADO T diÁnfomapleoínort de odiula mcdiai~aygrende (HflV-l +-) Linfom. lmnunoblásúco (HTLV.l 4-.j • Linfas. An~,IÉaioo de célula pande (Ki.l+) • Linfas. Linfohlá.tico • Cotesdesdohoy semejan,al Lmfos,sda Células delManto (WeuasenbwrDD eta], 1981) TABLA II 58 cLASIFICAcIÓN DE MIELREVISADA Clan:. 1913) CLASIFICACIÓN DE LA WORICINGFORMULATION LII4FOMAS DR BAJO ORADO: 1. L4adttca deefluía pequsIla .ConLLC Plasn,ocitoide 2. Folicular, vox, predominio de células pequefla.hendidas • Aras. difinas • Escl&csla 3. Fallador de célula pequefiahedida y célulagrande .Ánadifl,as • Esclerosis LINFOMAS DE GRADO U4TERMEDIO Folicular canpendoxoinio decélulaspandes asclerosis 2.DíJlao con célula pequefeshendida • Esclerosis 3. D 4frsa.matocon célula pequefiasy pandes Esclerosis • Célulaseptelioldea 4 Dtfzcsade célulasg,andn Célulashendidas Célula no hendidas LINFOMAS DE ALTO GRADO 1 lmnunoblatico de célula pande • Plasinocitoido • De célulasclaras • Polimorfo • Can célulasepiteltoidas) 2. Linfobléstico • Convolssto • No convolulo) 3. Dc célula pequeS.no hendid. Tipo Buáitt Conárea.folículerea) MISCELÁNEOS Micaela F,m~ida Plsnocitomn.Ex,ramnedular lnclaificables Oteas Icopprafia TABLA III CLASIFICACIÓN DE LNH (REAL 1994 -OMS. 1997) L LlmIcassa E 1 • Les,caniaiLinfcnsaLinfoblástico E pennor 2. Tumoresde cálsulasE puriférias: LaiscensiaLiufocliios adeticaE /Linfoenade linfocilos peqtseftcsE - Laicemis Proliotclña • LiofocsaLinfoplasnsocitoide • Lñffs,enadelMsstofoliculr • LinEena Centro Folicul. • Linfoma Bde la — mn.¡inai: Eriras,odai (MALT de bajogrado B> 1 Nodsl¡ Esplánios • Leucemiade CélsslasPeludas • Linfoena E da Célula .ndu • Lisifamna E pnsnadode mediastino • BSrhO¶ • Linfo,na E da alto grado, BusláIr-lére • Linfosna decélulasgrandesas,aplásico,Te Nulos. 3 Enfens,edadentinunosecretosus(varsasitasolimos. o nsorfolágsca) .Mielan. flasmociton. Qannapatia mossoclonai • Mscroglobulissemiade Waldasatron, (bnwsocitosna) Enfennedadde la. cadenaspesadas - Enfennedadde depósitode Ip II. lÁaf.masT • Linfas,.! leoocenisLinfoléstios decélulaT preosna 2. Ttnsneade célulasT peuifénicesy célulasWC 2a.Formaspndcmst.sa,stsmanss!eucé,sícos¡dnemíssadas: • Leucemia prolinfocltica T (célulapeqs.efiao coefriftmnne> • Leucemia linteina panular • Leucemia sgrca~aNK • Sindroenedesémy • LinfomMeucensssde células Tdel adulto (FILVI4> • Linfo.s.a T bepatocaplénicagmsussaldelta Zb. Formar predoestno¡sremeneegaaglsanans Linfoena T angsonnsunoblástico • L¡nfasna de célula. T periféricas no especifico 1.2 FASE SALTA DNA <0.8: HpD (5> 15%) DNA> 1.2:HrD (HpD:Hipodiploide;HrD:Hiperdiploide) 61 * Iconocatla TABLA Vil PLOmIA YPROLIFERACIÓN NDEAP CMF — LADN FASE5 PLOIDIA CME I’ROLIFERACIÓN LADN PLOIDIA Poe MiEl 1.87.455 0.69 28.2 A 0.99 .4 43 39 2.87.461 N.y NV N.y. 0.5 N.y. N.y 44 3.95.448 1.55 111 .4 0.51 .4 42 44 4.95A49 1.11 11.9 D 1 D 36 39 5.95.470 0.95 158 0 0.8 0 26 27 6.95.486 0.95 13.6 D 0.91 D 31 43 7.95.4197 0.98 8 0 090 0 29 26 • 8.95.4238 0.97 123 0 109 0 35 38 9.95A248 0.71 173 A 1 02 A 21 25 10.95.4264 12 104 A 121 A 34 25 11.95.4266 1.3 163 A 096 .4 32 29 1296.46 1.19 201 A 103 .4 35 46 13.96A7 1.28 188 A 1.35 A 42 37 14.96.423 1.29 107 A 138 A 38 32 15.96.428 1.03 75 D 094 0 40 41 16.96A30 0.99 204 A 088 A 25 32 17.96A32 N.y. N.y. N.y. N.y. N.y. 25 16 18.96A50 0.96 7.2 0 085 0 26 17 19.96.451 1.01 2.4 0 092 0 16 27 20.96.452 1.05 6.9 0 0.84 0 19 34 21.96.453 1.02 13 0 0.81 0 39 45 22.96A105 1.2 33.9 A 0.53 A 34 46 23.96A108 1.87 0 A 1.21 A 50 44 24.96.4109 1.13 13.2 D 2.29 A 42 47 25.97.46 1.09 11 D 0.85 A 33 31 26.97.411 0.97 7.3 D 0 98 D 39 35 27.97.412 0.94 10.8 D 1.09 0 33 41 28.97.413 0.96 6 0 1.04 0 35 39 29.97.445 0.97 16.6 0* 1.09 D* 32 37 30.96.448 =2L N.y. .flY~ N.y. fly~. N.y. 41 CMF: CitometriadeFlujo. CME: CitometriaEstática.Proliferacién:IndiceProliferativoenel Analizadorde ImagenCAS-200con los marcadoresMIB 1 y PC10. Ploidía:Valoracióncualitativadelos índicesdeADN enambosmétodoscitométricos. 62 Iconografia TABLA VIII PROLIFERACIÓNENMATERIAL RETROSPECTIVO N” BIOPSIA MIBX PC1O 1.-94.4197 31 21 2.-94.4199 43 32 3.- 94.4200 26 21 4.- 94.4204 26 20 5.- 94.4209 40 48 6.- 94A224 36 25 7.- 94.4226 31 20 8.- 94.4231 38 28 9.- 94.4232 33 27 10.- 94.4234 30 30 11.-94.4239 72 73 12.-94.4240 42 22 13.- 94.4244 31 24 14.- 94.4260 29 28 15.-94.4261 39 27 63 Iconograifa TABLA IX LA CITOMETRIA ESTÁTICA FRENTE A LA CITOMETRIA DE FLUJO VENTAJAS INCONVENIENTES * Métodomuy simple. * Problemasenmanejo los cambiosenla intensidaddetincionpuededarfalsos * Serequieremuy pocacantidadde material. resultados * Posibilidaddeutilizarmaterialparafmado. * La objetividadpuededisminuiral elegir lascélulas;esprecisomedirlos * laparafinano interfiereconel manejodel suficientescamposparaevitarel sesgo. equipo. * Al seruna curvacontinuademenor * Elige las celulasquevana seranalizadas resolución,esdificil identificarlas directamente. distintasfasesdel ciclo celular<~~,Q1,S y G2+M. * Puedeclasificarlascélulasenfuncióndesu forma, tamaño,...etc. * Los coeficientesdevariaciónson mayoresconmaterialparafinado,porlo * Capacidadparaeliminardirectamentenucicos quesedesestimanenel casodela rotos,debris,dobletes,elementos citometriaestática. mflamatonos,...etc. * El númerototal decélulasnecesariaspara * Posibilidaddeidentificarpoblaciones el análisisdelADN esmuchomenor,lo pequeñasaneuploidesenmascaradasporuna quesuponeun ahorrodetiempoy de diploidemayoritaria, material,aunquepodríadisminuirsu eficacia(CME:300células aproximadamente;CMF:50000). 64 eon9grafla Distribution ot DNA Mass Distribution al DNA Mass 20 40 III’ 4 -H II II~Is..IIs. a DNA Man P¡cogiams 12 Distribulion of DNA Mass t20 40 --A 11111.1.1. 5 8 DNA Man Picog¡ams i• • 12 Gel Ciasses Dis~vcd 12345 rkst Peal< Man: 4.3 pg. DNA índex: 0.84 Asca 30.2 u2 Cok44 Second Peak N4ass: 0.Oog DNA ¡Mex 0.00 Aiea: 0.0 u2 Ccls: O rEid Coajnt 13 Total Col Ocuní: 165 16 tekD’iso~Jed165 Oeb 014 7 a 0.2 10~• a 7~7.7 AS.WL. CICLE II..’. Ola 57.2 • 0.501 allZ >‘ Ci. a >h.n 0. 7~7.3 0.> 0 a 12.2 MC a ¶ — ¶ a 17.3 0/01 aZ.575 S.l. 5 .712 Sn. ‘4.. ±5.2 M 5.». a .1 OS St.. 1.4 250 200 150 100 so 1o u 99 Iconografia Fase S va Valoraclon de CME 40 35 - 30- 25 Ci, u. 20- u- o 15 10 5 0 Aneuploide Diplolde CME ( Valoraclon) Fase 8 va Valoraclon de CMF 40 • CMFvSCMFS 35 e 30 25 u E. u. 20 u- es 15 lo u 5 e Meuplolde Díploido CiAP (valoraclon> Figura48: Correlaciónestadísticade la fase S conambosmétodoscitométricosconlos métodosde Pearson,Kendally Spearman.Se apreciaqueen ambascitometrias,los valoresbajosde fase5 seagrupan enla columnadiploide,y los valoresaltosenlos aneuploides. 106 • e e e eu • 3u u e VI.- DISCUSIÓN Discusión A.- CONSIDERACIONES GENERALES Apesardelabajafl-ccueneiadeloslinfomasenelpeno(meuiosdeunl%áun11-24%porcada100.000 animales)¡Maulton JE el a!, 1990;Valí! VEOeta!, 1993]estapatologíaesdegraninterésporsuaumento crecienteenlos últimos años,tantoanivel animalcomohumano.En el penolaetiologíano estotalmente conocida;enelhombreserelacionaconlos estadossecundariosdeinmunodeficiencia(SIDA y transplantes [Rivas C era!, 1989;Alba/ateMa al, 1998]),hechotambiénaceptadoen la especiefelina pordistintas virosis [Hardyir WDeta!1989;Moulron .JEel aL 1990]. El presentetrabajorepresentabaun retodentrodelestudiodela patologíaveterinariayaque,porlas característicasdel tejido linfoide tanto en reaccionescomo en tumores, necesitabaun enfoque multidisciplinario.Estecomprende,no sólouna correctaconsideraciónmorfológicamacroy microscópica, sino inmunohistoquimicay dinámicaglobal (proliferacióny citometría)pararelacionardeformacorrectalos datosobtenidoscon laclínicay evolución[LindenMD elal, 1992]. Pararealizarlas nuevasmetódicas(IHO, ME y CITOMETRIA) ha sido imprescindibleun control minuciosodelos tejidos afectosen todosu manejo,prefiriendomaterialreciente(nomásde 4 horaspost- mortem)y fijacionesinferioresa48horasenformol tamponado[FriersonHE 1988; KallionemiOt 1988; EstebanAl et aL 1991; Frierson HE 1991]. Como el tejido linfoide es muy lábil, presentavarios inconvenientesenestudiosretrospectivosalahoradetrabajarconmaterialpostmortem,dadoqueala posible autolisispuedeañadirseunasobrefijaciónformólicaconretraccióntisulary celular,quedificulta unacorrecta tipificaciónhistológica[EstebanJMetal. 1991;AlanenKA eta!, 1993]. Cuidandoademástodoslos pasos delprocesodeinclusiónenparafma,y controlandosobretodola temperatura,sepuede a priori’ asegurar un buenresultadoenlastécnicasespecialesposteriores. El material retrospectivopor tanto, no ha cumplido las exigenciasrequeridasy no ha respondido adecuadamenteanteestasnuevastécnicas,siendoen ocasionesimposibletanto su tratamientocomo la interpretacióndelos resultados.Así pues,las conclusionessehanbasadosobretodoenel grupoobtenidode formamáscorrectayhomogénea-30linfomasenperroy Sengato-recogidosenel periodo1995-1997.Los 15 linfomas retrospectivoscaninosdel periodo 1987-1994sólo hanservidoparaverificardiagnósticode neoplasiaslinfoides malignasdifusasy paraelestudioproliferativo. Uno de los objetivosdeestetrabajoha sido reconsiderary aceptarunaclasificacióndc los linfomas caninosdesdeunpuntode vistamorfológicoe imnunofenotípico,relacionandolos datoscon la agresividad, valoradacon marcadoresproliferativos.En patologíahumana,la controversiaexistentepor la diferente semánticautilizada en los distintossubtipos,ha ocasionadodurantemuchasdécadasun retrasoen el entendimientode estos tumores.La agrupacióndc subtiposdiferentescomoenfermedadesidénticaspor rasgosmorfológicoscelularesmáso menosparecidosha complicadola concepciónpatogénica,dadoquelas 107 Discusión evolucionesylasterapiasno eranacordes.Las distintasclasificaciones(Rappaport,Lukes-Collins,Kiel, Woiidng Formulation,REAL u OMS /RappaportII, 1966;LenneríK el aL 1975;Lukes¡U 1975;Ro»- SmithARTnal, 1981;LennertKetal, ¡990; HarrisNetat 1993; ChanJKetaL1994; WHO ¡997]) demuestranunamultituddeopiniones,peroparalos estudiososen linfomassonbastanteunitariasy, gracias a las nuevasmetodologías,sepuedeestablecerla estirpey la agresividadconmayorseguridad. Dadoqueel altoy bajogradomorfológicodelos linfomasB enla clasificacióndeLeíseconelacioná conbajay altaagresividadclínica,noshaparecidoque estecamino,la demostracióndelos distintosgrados deagresividad,eraquizásel másadecuadoparala consideracióndelpresentetrabajo.Así puesestegrupo ha quedadoreducidoa linfomas de alto grado, de celularidadblásticavariable,nodalesy extranodales [Lennerí K el al 1990]. Es importanteincluir enlas clasificacioneslasentidadesextranodalesqueseempiezana presentaren animalesdomésticosy, queenunprincipionoestabancontempladasporsupocafrecuenciao rareza;algunas sondenaturalezaB [IsaacsonPGeta),1983;SpencerJetal, 1986] perohoy seconocenotras,porejemplo las 1 denaturalezaCDS+, hoy incluidoscomovariantes1 citotóxicas[H’HO,1997], algunasde células granulares[Eran/cv¡‘Tel aL 1986; WelltnanMiel aL 1989;Moare¡‘FetaL 1994;FrenchRAel aL 1996]. Con respectoalas clasificacioneshistológicasdepatologíahumanaque sehanasumidocomocorrectas porla OMS [WHO1997/,y asuvezhansido adaptadasapatologíaveterinaria[ParodiAL, 1988; Carter REel al, 1986; GreenieePCel al, 1990; TeskeE, 1993; Fournel-FleuryC el al, 1997,/),~ nuntualizar~n~: * Lamayoríade losblastoslinfoidesenperrosonmáspeque5osqueenelhombre,especialmentelos inmunoblastosy los centroblastostantoreactivoscomotumorales[Carterel aL 1986; TeskeE, 1993]. * La claradiferenciaciónentre IB y CB esdudosaen algunoscasos,datoasímismocomentadoen humanosy queha llevadoa considerarlos linfomas de ambascélulascomo “B de célulasgrandes” [Lennerí 1<, 1978;Nahona!CancerInshlute,1982; RK4L: Harris NL elaL 1993; ChanJK elaL ¡994]. * En cualquierforma histológica,el sustratoacompañanteesmuchomásrico enplasmáticasque su homónimoenpatologiahumana,hechoaúnmásllamativoengatos[FederBMet al, ¡990; HulsonCA etaL 1991; ParodiALeta!, 1994;PollA el al, 1994; CallananJi el aL 1996]. Estoshechoshacendificil presuponerapriori unatotalcorrelaciónentrelossubtiposcaninosy humanos aunqueseha tratadodehacerunaaproximaciónlo másacertadaposible. los Discusión Lamorfologíaópticadcrutinapamiteun diagnósticoconectodelpatrónnodularo difusa,laexistencia o no de cielo estrellado,la blastosiscelulary las mitosis. En muestrasbienfijadas conbuenacitología ahadida,proporcionaun diagnósticopreciso. La ME, abandonadapormuchospatólogosen la actualidad,haaportadograndesventajasenel estudio morfo-citológico,sobretodoenejemplosincorrectamentefijados,conlisis celularo artefactoderetracción (casostratadosconquimioterapia).Teniendoencuentala semejanzaópticay el altogradodemalignidadde toda la serie, la ultraestructuraha tenido un papelmuy importantecomo complemento,detallandolas característicasnúcleo-citoplasmáticasde lascélulasneoplásicasy ofreciendoasímaticesdediferenciación celular que pennitendiferenciar IB de CB y LB. Se confinnapues,como ocurrió antesde la era inmunohistoquimica,quelos hallazgosde ME aportandatosfidedignos,y queporello ayudanencasosen los quelaIHQ no hapodidorealizarseo susresultadosno hansidocompletos[HenryK, 1975;Kaiserling E, 1977; RivasC et aL 1980;RozrnanCelaL 1993J. Hay que resaltarla importanciadel inmunofenotipo,hechoampliamentedemostradoen patología veterinariay humana.Deunladopermitela exactacaracterizacióndela estirpey conello delpronóstico,y deotro laagresividad.Aunquesehadefinidoun peorpronósticoenlosIinfomasdenaturalezaT (de forma global) y biologíacambianteen losextranodales[Castrillo JAlelaL 1992; TesArE, 1993; TeskeEelaL 1994], en esteestudio,estoshallazgosno hanpodidoverificarse,quizásporelmenornúmerodelinfomas T en nuestrageografiay en la serie(20%),en contrade lasreferenciasdedistintosartículosdepatología veterinaria,dondelos linfomas T sonmuchomásfrecuentes¡TesteEelal, 1993]. Porello, lacorrelación estadísticano hapodidoresultarsignificativa,otrohechoobjetivoquedenotaladificultaddecomparación deforma absolutade loslinfomas deperroy hombre¡Montalbán C ela), 1993; TeskeE, 7993-1994dos artículos]. Siguiendoconla IHQ, el inmunofenotipotampocoescomparableal delos linfomashumanosya queel númerototal efectivodeAc Moy Poparafinadoshasidomuchomenor.Porello distintossubtipos1 oB han exhibido caracterescitológicoscompartidos,lo que ha llevado al solaparnientode algunoscasos,con dificultadde interpretaciónpor la IHQ aislada(CB-IB-LB). La inmunohistoquimicafacilita la agrupacióndesubtiposporestirpey agresividad[LindenMD elal, 1992], siendofácil entenderque los linfomassonnodaleso extranodales,B, 1 o milos,de alto,intermedio o bajogradosegúnlos valoresdelos marcadoresproliferativos.No seha consideradola nf Q en congelación, comenzadaenpatologíahumanaen 1981 (entonceslasbateríasdeAcMo eranmásespecíficasy numerosas, pero la visualizacióne interpretaciónde los resultadoseradificil y conposibilidadde erroresenmuchos casos),aunquehayaevolucionadomuchoenla actualidady existanmayornúmerodeAc anti Aganimales [SíeinH, MasonDT 1985; TesteE, 1993y 1994; FisherDi el aL 1995;Rabanal¡?A’f el aL 1995]. 109 Discusión Estetrabajoseharealizadosólo conmaterialparafinadoparaunificarlos hallazgos.Con losAeMo de parafina,cadavezmásabundantesy específicos,losresultadoshansidofiablesy fácilmentevulorables.Se han utilizado .AcMo y Pohumanos que producen reacción cruzada con antígenos animales y aún así ofertan buenas haigenes. El marcadorT-CD3 sehautilizadopoliclonalpor subuenapositividadenlos linfocitosT animales.La estirpeB no cuentacon buenosmarcadoresmonoclonales,peroel CD79a(clon HMS7) y las cadenasligeraspoliclonalesKappay Lambdahansidosatisfactorios(apesarde lo publicadoenpatología veterinariasobretodoconlascadenasligeraspoliclanales[BreuerWetaL ¡993; TesKeE,¡993; FisherDJ et al, 1995; CaniathAl et al, 1996]. El AcPo 1-chain,no ha proporcionadopositividadmás que en plasmáticas,alcontrarioqueentejido humano,dondeescapazdeteflir célulasB productorasde Ac, sobre todo las IB. De los AcMo histiocitarios,se ha desechadoel CD6S, de macrófagos,por la negatividad constante a pesar de los métodos recuperadores antigénicosporcalorutilizados/NorlonAJela!, 1994; BuderDeta!, ¡997]. ElMAC 387y la proteína5-100handetectadocélulasde la estirpeHM endistintos momentosfuncionales.Pararesumir:el conocimientodel inmunofenotipoconCD79ay CD3comobatería rápida, es suficiente y fiable, algo ya plasmado en estudios anteriores[A’fllnerRielal, 1996]. Otro de los objetivosha sido probary cuantificarla acciónde los marcadoresproliferativossobre linfoniascaninos.Esteestudiobiodinámicanohapresentadoexcesivosproblemas,yaquedichosmarcadores MIB 1 y PC10, sehanconservadointactosen la mayoríade los casos,incluso en los expuestosa una sobrefijación,sobretodoel MIB 1. Porla cinéticay clínica,todoslos casoshansidodc alto grado. Parececonvenienterecordaraquíquetantoenperrocomoen gatohayocasionesenlas queun linfoma, porsualtaactividadproliferativasepresentadeinicio canextensiónperiférica.Estehechoseftaladotambién anivel humano/SuchiTeto!,1979] sirveparahacerénfasisenla dificultad dedistinguirentreleucemiacon afectaciónganglionarmúltipleolinfoma conextensiónaMO y sangre;sonlos casosdenominadosleucemia- linfoma,yaqueno esposibleladistinciónentreunay otro,yqueentrañanun pronósticodesfavorable[Suc/ii Ter al, ¡979; RosernbergMiPgr al, 1991; DobsoniMer al, ¡993; Morris JSeral 1993,]. Otro hechoparacomentares la ideade estudiarcomo“controles’ un grupode linfomas de gato,de etiologíaconociday aceptada,comparadosasuvezcongangliosfelinosreactivosinespecíficoso en animales portadoresdelFeLV. Nonosparecepasiblehacercomparaciónentreambasespecies.Deun ladolos ganglios reactivos inespecíficos pueden ser semejantes,perolosportadoresdeFeLVmuestranmayorplasmocitosis ylinfocitosisintrasinusaldificil de valorar [FederBMer al, 1990;HursonCA eral, 1991;Parodi AL eta!, 7994; ¡‘oh A el a), 1994;CallananJi eta), 1996]. Los linfomas felinos difieren en subtipo histológico, inmunofenotipo,ME, proliferacióny ciclo celular.La morfologíarecuerdaalos LNH eninmunosuprimidos ¡RivasC, 1989;Alba!aeeMeta¿1998]y los gangliospuedenafectarsedeformatotal o parcial,planteando en el segundo caso problemas de diagnóstico diferencial con reacciones benignas. 110 Discusión B.- CONSIDERACIONESDEL GRUPODEESTUDIO La edaddepitsentaciónnoharesultadotenervalor pronóstico,siendolasquemásserepitendocey diez dos,aunqueel rangogeneralsemueveentelos dosy los docedos. El sexo del animalha seguidola proporción2:1 de machosfrentea hembras,aunquelas curvasde supervivenciadelos dosgruposno mostrarondiferenciassignificativas,porlo quela variablesexono es factorpronósticoenestaserie,datoqueyasehabiacomentadoconanterioridadenla bibliografla/jTeskeE, eraL 1994]. La razatampocoha mostradodiferenciassignificativasni en cuanto a la presentaciónni a la supervivenciahahabidomarcadasdiferenciasenlasfrecuencias,quizásmásatribuibleamodassocialesque a factoresgenéticosensí f1’eskeEelal, 1993-1994]. Losvaloresdelaanalíticasanguíneay bioquímicano hansidodeutilidadparaeldiagnóstico[Dobson iMetaL 1993] El estadioclínico ha sido expresadobajoelperfil médicoy veterinario,ya quesegúnlos resultados evolutivosenmedicinahumanaantelaafectacióndel bazoy el hígado,el pronósticoesdiferente[Carbone PP. 1971]. En esta serie, con sólo bazoafectoe hígadolibre de enfennedad,la evoluciónha sidomás favorable, por lo que deberían definirse por separado los casos con y sin afectaciónhepática(diferencias estadisticamentesignificativasconp=O.0002).Cabedestacarla altafrecuenciadeestadioV (IV enmedicina humana)nl diagnóstico,datossemejantesalospublicados[DobsonJA4elal, 1993; TeskeE el aL 1994]. Seria por tanto, necesario el desanollo de distintos métodos de diagnóstico precoz como citología y aspiración /liawlónsEC eta?, 1993]como medidainicial, dadoquepor larápidaprogresióndel linfomay estadiostan avanzadosel tratamientopaliativocon quimioterapiatienepocautilidad. El estudionecrópsicocorroboralaextensióngeneralizada;segúnelbaremoveterinario,veintecasos mostsamnE-y,cuatroE-TV y ningúncasoE-mo inferiores (cl 80%Ñeron linfomasmulticéntricos,delos cualesel 13.3%tuvoafectaciónleucémicacomoforma clínicaprincipal; 13.3%presentólinfomas con la formamediastinicadenaturalezaT, y sólo el6.6%fueron linfomasextranodales).Sóloencuatrocasoshan existidotumoresdeotraestirpe,porlo queseconsideraindependientea la presentacióndel linfoma. Según elestadiajedemedicinahumana,queseparalaafectaciónesplénicay hepática,seencontraroncincocasos conafectaciónganglionary esplénica(E-II!), y el restotuvo,además,afectaciónhepáticao deotros órganos (E-IV). En estaseriede tumoresel estadioclínico al diagnósticotienevalorpronóstico(con significación estadística;r 0.0009),porlasuperiorsupervivenciadelestadioIII frenteal IV, lo quehacoincididoconuna diseminacióngeneralizadaconpeorevolución. 111 Discusión El tipo derespuestaaJfratandeutoCOPnohasido undatovaloradoensi, sinocomounavariablepara poderclasificarlos linfomasenIhncióndesucomportamientoclínicoconrespectoaun protocolocomún.La respuestaha sido uniforme: en la mayoríade los casosseproduceunaremisióntotal en el periodo de inducciónparaluegorecaerenelmantenimiento,comportamientohabitualenlos liafomasagresivos¡Vicente J, 1980; TeslceE el al, 1993;Ar¡’rníage Jo, 1993;TeskeEel aL 1994]. Aún así la diferenciaentrela supervivenciadc los animalestratadosfrentea los no tratadosfue claramentesignificativa(r0.0009),por lo queparececonvenienteconsiderarla variabletratamientocomofactorpronóstico, pese a sus limitados resultados. En la práctica de esta serie, el tratamiento no ha variado la supervivencia global en más de 203 días; esto contrasta con los datos publicados en veterinaria sobre supervivencias medias de un linfoma tratado con quimioterapia, de 8 meses aproximadamente fTeskeE elaL ¡990; TeskeEel aL 1993;RoseníhalRC el al, 1995; Hardy WD el aL 1989]. Esto podría deberse al estadio tan avanzado de la enfermedad al diagnóstico,o tambiéna la falta en su composición de la adriamicina como principal droga frente a los procesos linfoproliferativos, descrito en medicina humana [Diaz RubioEel aL 1991; GonzálezBarónM, 1992; EspaRa¡‘, 1993; Wllson WH’elal, 1998]. Como conclusión, en esta serie no se puede saber si la respuestaal tratamientoesonodependientedelgradohistológicodemalignidadfl’eskeEelaL 1994]. Dada la ausenciade subtiposde bajogradoqueofrecieranotro patrónderespuestay ennúmerosuficiente,no se puedencompararresultados. Desdeun puntodc vistamorfológico,todoslos casosestudiadoshansido linfomasno Hodgkinde alto grado-LNH- /MaedaHna¿1993], conunaproporciónaltadeinmunoblásticosLB (33.3%) y linfoblásticos LB (43.3%), mostrando los centroblósticos menor porcentaje (16.6%); sólo ha habido dos casos de linfomas extranodales (6.6%). Estos resultados en morfología no concuerdan con la mayoría de los datos publicados anterionnente en patología veterinaria canina, donde se describentodoslos subtiposhistológicosde la clasificación de Leí (alto, intermedio y bajo grado), aunquepredominael alto grado[Parodiel al, 1988; MonítoniE el aL 1990; TeskeE, 1993; TeskeEelaL 1993; ValIz VEOelaL 1993], aunque sí coincide con otros [Dobson.JMeíaL 1993]. El subtipo histológico no ha sido un factor pronóstico en sí, sino el grado de malignidadsegúnla clasificaciónde Leí, datoque coincidecon lo anteriormentepublicadoal sertodos linfomas de alto grado¡7’eskeE, 1993]. La morfologíadelos casosfelinoscontrolno ha coincididoconla presentadaenelpeno,ya queelgatoFeLV+parececompartirunamorfologíacompatiblecon “centroblástico polimorfo” en lamayoríadecasos,yadefinidaporotros autores[1’eskeEeta!, 1993;Fournel-PluryC eí al, 1997]. En nuestraserielos casoscon positividadal virus de la leucemiafelina FeLV+ hanpresentadouna morfologíadepredominioinmuno-plasmablástico,querecuerdaa las neoplasiasB humanasenestadosde inmunodeficienciaadquiridaSIDA y trasplantes[RivasC, 1989; SpodnickCi el aL 1992; CuíLXelaL 1995;AlbalateMelal, 1998]. 112 Discusión Conrespectoa laestirpetuinorai,el 80%delos linfomascaninoshasidodenaturalezaB, y cl 20%de naturalezaT, frecuenciasdiferentesa lascitadasenbibliografla(res/ceEeíaL 1993].En los gatoscontrol 3/8 fueron B (37.5%) y 5/8 T (62.5%).No se ha podido encontrarvalor pronósticode la variable inmunofenotipoenestaserieporel escasonúmerodecasosT paraconfrontarresultados. El patróndecrecimientohasidodifuso entodoslos casos,aexcepciónde unoconpatrónparcialmente nodular(posibleCB postCB-CC).El patróndecielo estrellado(respuestafagocitariadelos histiocitosa una tasaelevadademuertecelularo apoptosis)sehaencontradoen todoslos subtiposcelulares,aunquemás frecuenteenelsubtipolinfoblástico,comosedescribeenpatologíahumana/li,ennerlK, 1978;RivasCelaL 1980]. El cielo estrelladono guardarelacióndirectani conlahistologíani con elnúmerode mitosispor campo,datoanteriormentepublicado(res/ceE etaL 1993]. La ME se correlacionó con la óptica, mostrando en general rasgos comunes con cambios celulares polimorfosconinmunoblastosy plasmáticas,o caracterblásticomedianopocodiferenciado.Comohallazgos especialesnuclearesy celulareslos signosdeapoptosis,lasegregaciónnucleolary los “cuerposnucleares” no son específicos;podríanindicar activaciónnucícolarmáxima, signostóxicosy morfologíade muerte programada,que enestostumoresno hasidoexagerada. C.- CONSIDERACIONES BIODINÁMICAS Existe unacorrelaciónprecisaentrela ópticade alto gradoencontraday la proliferación[Faurnel- FleuryC eíal, ¡997]. Ambasciclinasmuestranuna clarapositividad,queha sido evaluadacualitativay cuantitativamente.ElAc MIB 1 combinadoconrecuperaciónantigénicaporcalor[NorlonA.! JordanASel aL 1994; Buller Del al, 1997] mejoranotablementela positividad,de formaindependienteal tiempode fijación, así que debeanteponerseal PC10. La distribucióndel marcajeesmásfiable enel MIBí ya que perfila ladisposicióncromatínicay nucleolardelnúcleo,mientrasqueel patróndetinción con PC10 hasido máshomogéneoeindefinido. Los valores proliferativos límite para los rangos de agresividad han seguido el patrón aplicado en patología humana [RivasCelaL 1992]: menos de 15%, entre 15 y 25 y más de 25% para grados bajo, intermedio y alto respectivamente; aunque también se ha tenido en cuentalo anteriormentepublicadoen patologia vetennaria [Fournel-FleuryC elaL 1997] en la que se utiliza como valor limite entre bajo y alto grado un 21%. Según esto todoslos linfomas de esta serie corresponden al alto grado de malignidad. Los valores proliferativosobtenidos con ambos marcadores han sido cualitativamente iguales, aunque los valores cuantitativos absolutos cambien y fueronsimilaresa nuestraexperienciapreviaen linfomas humanos /Marcosel aL 1993]. Se puede estableceruna relaciónentrevalores obtenidos con un mismo marcador, pero no con los valoresobtenidosa partirdelotro. De la misma forma, los valores PC 10 y ME 1 113 Discusión fueronsimilaresparacadacasodelinfonia canino,felino y ganglioreactivo El valorproliferativoglobalen¡infamascaninosy gruposcontrolhasidomfenoral encontradoenlos mismossubtiposenpatologíahumana[¡‘iris elal, 1988;Marcoselal, 1993;Obesoeta!, 1994]. Hay que afladir además que la prolii~ración global de los subtipos linfoblásticos no fue superior a los del grupo CB-IB (enpatologíahumana la pwliI~ración en el linfoblástico tipo Burkitt está próxima a 90O/o~100%; [¡‘iris eta), 1988]). Estasvariacionespuedendebersea la mayorespecificidadparaAg humanos,o bien a problemas técnicos relacionados con la sobrefijación del material con tinciones débiles o muy fuertes, cuya valoración con el analizador de imagen se ha limitado por las característicasqueparala misma exige el aparato, y que posteriormentesecomentan[CrockerJ, 1993]. ExisteunabuenacorrelaciónentreambosmarcadorcsproliferativosPC10 Y ME 1 [SabatfiníEelaL 1993], aunquenosparece,comoyasehacomentadoparcialmente,queespreferibleelME 1 porsumejor respuestaIHQ: mejorpatróndetinción, independenciaal tiempodefijación en formol y secomportamejor conla ollaapresióncomométodorecuperadorantigénico[SabaniníEelaL 1993;MazerollesC el aL 1994; OstrowskiM el aL 1995]. No existierondiferenciassignificativasde forma global entre los valores proliferativos con ambosmarcadores,según los distintos baremosconsiderados(subtipo histológico, inmunofenotipo, tiempo de fijación, etc...), pero el marcador más estable a cualquier cambio enel manejo ordinariodelametódicahasidoelMIBI, por lo queopinamosdebeserelmarcadorproliferativodc elección [Gerdesi,DallenbachFetal, 1984; Gerdesi,LemkeHetal, 1984; GerdesJetal, 1991; Gerdesietal 1993;RossVietaL 1995]. Sin embargoun dato importanteencontradoha sido poder relacionarel valor proliferativo con el marcadorPC10 comofactorpronósticodesdeunpuntodevistaestadisticofrentea la supervivenciaglobal. Sedefineasicon el valordel PC10 superioro igual a34%,un grupode alto riesgodentrodelapoblación total. Creemosque este hallazgopodría constituir el punto baseparala aplicación de protocolosde quimioterapiamás agresivos,comovienehaciéndoseen medicinahumana. Parauncompletoentendimientodel métododevaloracióncuantitativaparecenecesariocomentareltipo de funcionamientoque tieneel programa“proliferation index” del analizadorde imagenCAS-200. Está preparadoparacaptarel contrasteentredoscolorescon longitudesdeondaopuestas,comosonelmarróny el verde.El marrónindicalapositividadaAc porreveladocon diamino-benzidina;elverdedebeserelcolor de elecciónde contrasteen el campode la preparaciónde IHQ. El problemapuedesurgir al utilizar la hematoxilinacomométododecontrasterutinario,ya que latécnicade tinciónverdedemetilo sueleserlarga y pesada; esta hematoxilina debe ser muydébil para evitar la formación de falsos positivos, ya que un azul muy intensopodriaconfundiral sensor,yalestarel azulmáspróximo enla escaladecolores,podríacaptarse comoun positivo final. 114 Discusión En estasmiesehanrealizadocontrastesdébilesamano(el inmunoteflidorsuelecontrastarintensamente porgustodelpatólogo)paraevitarestosproblemasde manejoe igualarlos resultadosal vadedemetilo requerido,ajustandoadecuadamentelos umbralesnuclearesnegativosy positivos.Lasmedicionesdeben realizarsesiempreporlamismapersonaparaevitarcambiossubjetivosendichosumbralesquemodifiquen considerablementelos resultadosfinalesdela serie.Tambiénel tipo de funcionamientodeesteprograma puedeexplicarlavariacióndevaloresentreambosmarcadoresproliferativos,constatadayaenla bibliografla [VtiedGLetaL ¡989; HalíPelal, 1990; ViaseemNilelal, 1990]. El tipo de tinción del PClOes continuo y homogéneo, por lo quees captadoporel sensordel analizador comoun áreacompletacircular [SeboTi etal, ¡993]. El Mifil marcael núcleode forma discontinua, dibujandolacromatinamarginadaalamembrananuclear,por lo queel sensorno captaun círculo positivo sino, en ocasiones, una circunferencia. Esto hace queel áreatotal positivadel Mffl 1 seamenoren valor absolutoqueladel PC10,y tambiénexpliqueladiferenciadel valorcaptadoa simplevistaporelojohumano, a la expresadaporel ordenador. La parafmay los tejidospostmortemno hansupuestoningúnproblemaparalosresultadosdeambas técnicascitométricas[FriersonHE 1988; Kallionerní OF, ¡988; FriersonHP 1991]. Requiereprestar especialatenciónaltiempode fijado en formol [Esteban£4el al, 1991],revisarlaspiezasconmicroscopia ópticaparaelegirunbloqueadecuado,tiempoderecogidademuestrasinferiora5 horasdespuésdelamuerte del animal[Atanen£4 el al, ¡993] y undesparafinadointensivo. La frecuenciade apariciónde aneuploidíafue deun 44%con CMFy deun 56%con CME, un tanto superioresa lo estudiospreviosen linfomascaninosy humanos(res/ceE elal, ¡993] peropodríadeberse alaconstitucióndel grupoporlinfomasdealtogradoen sutotalidad. La aneuploidianoseharelacionadoconlosaltosvaloresproliferativostú ladiploidíaconlosbajoscomo ya lo han expuesto otros autores(JBauerTWet aL 1990;Minke.JMHMelaL 1990; Tes/ceEetal, ¡993; García R elal, 1994]). Tampocoguardarelaciónconel alto gradocitológicopresenteenestaserie,dato estudiado conanterioridad[RuttemanGRelal. 1988; BauerTWetal, 1990;A-fin/ceJMHMeIaL ¡990; RuitemanGR el al, 1991; TeskeEelaL 1993; GarcíaR elaL 1994]. Si existe correlación estadística entre el índice de proliferación del marcador PClOy el índice numérico del contenido de AUN por citometria de flujo. La fracción en fase S presente en CMF no se relaciona con ningún otro parámetro como cabria esperar (proliferación[WoodsAL etal, 1991; TesIceLetal, 1993; Jf’ojdkElvfeíaL 1993; Ostrows/aMel al, 1995], ploidía[FriersonHE 1991; ScanzianiLetaL 1991; OstrowskiMeíal, 1995]); no guarda relación ni con laproliferaciónconMlBí yPClO,ni con la ploidia con ambos métodos citométricos fTeskeEeíal, 1993]. De los 8 valores de faseS alta, 7 fueron aneuploides y 1 diploide con fase 5 alta, perono se puede establecer 115 Discusión unacorrelaciónestadísticaportratarsedeun númeropequefiodecasos.Sin embargola aneuploidíaparece scun marcadorbastantefiable dealteracionescitogenéticas[SeckingerDelal, 1989;MinAreJMHMeIaL 1990;GardoR elaL 1994; ObesoG elaL ¡994/. La tasaproliferativapareceaproximarsemása la agresividadtumoral quela fase5, yaque si parece presentarun valor intermedio-altoque guardarelacióncon el alto gradocitológico presenteenestaserie [WoodsALelal, 1993]. Sólopartedeestoscasospresentanun alto valordefase5 [GarcíaRel al, 1994; ObesoGelal, 1994]. Un datoindiscutibleesque losmarcadoresMB 1 y PC10marcanmáscélulasenel tejido queel %expresadoporla fase5 deFCM [GarcíaR elal, 1994; ObesoGelaL 1994]. Existemuy buenacorrelaciónentreambosmétodoscitométricos[BowmanR elaL 1993;ClaudRDel al, 1993; MarcosB el al, ¡9980; WojcikEM elaL 1993] por lo que puedenconsiderarsehomólogos (coincidenciadevaloresen22/25casos). La citometriaestáticaCMB esunmétodoeficazparaelestudiodel ADN [BoudryC etaL 1989; Wojcik EMe aL 1993]. Comparadaconlacitometríadeflujo, comosedetallaenla tablaIX [C¡audRDelaL 1989; MarcosBelaL 1997], esun métodomuysencillodemanejarquerequieremuypocomaterial (500células frentelas 10000necesariasenCMF con elconsiguienteahorrodelmismo.El usodematerialparafinadono interfiereen losresultadosdeambastécnicas,aunquehay queconsiderarqueloscoeficientesdevariación establecidosparaCMF enfrescoaumentan,y en CMB sondificilmentevalorablesportratarsedegráficas continuas de menor resolución (en las que no son claramente diferenciables los ditintos periodos del ciclo celular) aunque los resultados finales sean ugualmente fiables a los de CMF. Antes de medir las células, como la imagen captada del microscopio queda digitalizada, permite elegir las celulas conservadas, clasificarlas en función de su forma o tamailo, eliminar nucleos rotos, debris, dobletes, tripletes, células inflamatorias, etc..., algo no posible con CMF,porque toda la solución se analiza al mismo tiempo. Es importante sobre todo en tumores heterogéneos, con apoptosis o necrosis en los que es necesario escoger las células a analizar [Doudry C et al, 1997]. Se puedenidentificar poblacionesaneuploidespequeñasinmersasen unagran poblaciondiploide,quepuedenpasardesapercibidasenFCM [ClaudRDelaL 1989], En la serie considerada, y tal vez por el número de los casos, no se ha podido establecer diferencias estadisticamentesignificativasentre las distintasmorfologías celularescon el restode los parámetros considerados, sobre todos los dinámicos. Al tratarse de linfomas de alto grado en su totalidad, han presentado valores medios similares en proliferacián, ploidía, estadio clínico, comportamiento (con o sin tratamiento) y supervivencia,consideradosindividualmente,porsubtiposo en total. En cuanto a que todos los casos sean de alto grado, y a pesar que algunas publicaciones también apuntan a la mayoría de linfomas agresivos animales, no se puede infravalorar el hecho de que probablemente en series mayores tal vez se podría haber encontrado algún caso de linfoma de bajo grado [CarterRE’ el aL 1986; 116 Discusión PamdiAl, 1988; GreenleePGel al, 1990; TesAreE, 1993; FisherDiel aL ¡995; Fourne¡-fleu,yCelal, 1997].Porotrapartey conociendoquecualquierlinfoma pocoagresivodejadoa suevoluciónnaturalpuede cambiaraunaltogrado,[LennertK el al, 1978], tal vezla sintomatologíaque llevaa consultaa los perros portadores de linfomas ocurre en estados muy avanzados, cuando ya han pasado a ser agresivos, quizás por ima mayor tolerancia del animal a neoplasias de bajo grado o intermedio. Lanecesidaddeun diagnósticoprecoz¡CarterREelal, 1986;CarterREelal, 1988;JacobsRAj 1988; HawkinsEGel al, 1993;Fisherfiel aL 1995; Caníatn.U, elaL 1996] con promoción de los métodos citolágicos y biópsicos se perfila como imprescindible en esta patología porque con estadios tan avanzados eltratamientopaliativo conquimioterapiatienepocautilidad. Porotrapartehabríaque concienciaral dueño de la realidad de un animal geriátrico, donde la aparición de cualquier masa ganglionar debe ser consultada. 117 VII.- CONCLUSIONES Conclusiones 1. Todoslos linfomascaninosestudiadossonLHN dealto grado. 2. El estadio tumoral necrópsico corrobora la extensiónavanzadaporla afectaciónde: 20 casosenestadio y, 6 enestadioNy ningúncasoenestadioDI (26casosnecropsiados:23 muiticéntricos,5 timicos, 1 cutáneo y ¡intestinal).Conel estadiajehumano,21 presentaronun estadioNy 5 un Di. 3. La macroscopiade los órganoshematopoyéticos(ganglio, bazo, médula e hígado) demuestra organomegaliadifusa,sin tumorni úniconi múltiple. La presentaciónextranoda]cutáneae intestinalexhibió tumores nodulares macroscópicos. 4. La citologíano estotalmentesuperponiblea lossubtiposhumanos,porlo quelas clasificaciones aplicables a los animales deberían ser simplificadas. 5. Desde el pinito de vista citológico se hanencontradosubtiposlinfoblásticos(43.33%),inmunoblásticos (33,33%)y menorcuantíadecenfroblásticos(16.66%)y extranodales(6.66%).Parala subtipificación ha sido imprescindible la ME, aunqueaisladanientenoexistencaracteres ultraestructurales específicos de malignidad linfoide. 4. Los hnfomascaninossonensumayorpartedenaturalezaE (80%) existiendo sólo un 20% de neoplasias T. Veintiochocasosfueronnodales(93.33%)y 2 extranodales(6.6%). El panel de anticuerpos humanos utilizados, de fácil adquisición y apto paramaterialparafinado,hamostradoresultadossatisfactorios. ‘7. En relación con la agresividad neoplásica comprobada por la morfología y el estudio con marcadores proliferativos, con el marcador MIEL sólo el linfomacutáneofue degradointermedioy cl 96.66% restante dealto grado. Conel PC10 un caso de linfoma IB tuvo agresividadintermediay el resto de linfomas fije de alto grado. Este hecho difiere de otros estudios previos, que consideran subtipos de alto, bajo y grado intermedio. 8. El estudio del ciclo celular con citometría demostró aneuploidia en 53.3%delos casoscon CMB y en 43.3%conCMF. La ploidíano secorrelacionacon los subtiposhistológicos,escomúny uniformeentodos loscasosy seconfinnacomoun factor de agresividad. Ambas técnicas citométricas sonhomólogas,conuna correlaciónde 0.8 y un nivel de significanciade 0.01. La fase 5 no guardarelacióncon ningunode los parametrosestudiados,porlo queseconsideraunavariableindependiente.Sóloserelacionaconla definición deancuploidia. 9. En estadios IV la afectaciónhepáticademostróserestadísticamentesignificativa como signo de mal pronóstico (p=O.OOO9). Por ello, sedeberíapensarconsiderarbazoe hígadoporseparadoenel estadiaje. 118 Conclusiones 10. El thctortratamientoconquimioterapiamejoróestadísticamentela supervivenciaglobaldelos animales (p=’0.0002). 11.Los altosvaloresdelaprolifuacióncon elmarcadorPC1Oresultaronserun signodenia]pronósticocon significación estadística (p0.017), incluso dentro del grupo de animalestratadoscon quimioterapia (px=O.OlG). El valorproliferativodelmarcadorMIBI no espronóstico desde el punto de vista estadística. 12. Existe correlaciónestadísticaentre los valores de proliferaciónobtenidoscon ambosmarcadores (correlaciónde 0.6, nivel de signiticancia0.01). El MIEl muestramejorpatrónde tinción IHQ, mayor independencia a la fijación y mejor respuesta al tratamiento por calor como recuperador antigénica. No hay correlación estadística entre la proliferación y el grupo histológico. El indice proliferativo con PCIO tiene correlación estadística con el indice numérico de ADN (CMF) (p”’O.$4; nivel de significancia 0.01). 13. No seencontróvalorpronósticoalas variables edad, raza, sexo o inmunofenotipo,seguramentedebido al pequeño tamaño de esta serie. 14. Los controles felinos no deben utilizarse como comparativos ya que difieren en subtipo histológico, inmunofenotipo, ME y ciclo celular. La morfología recuerda a los LNH secundarios a inmunodeficiencia. 15. El mal pronóstico de la enfermedad en pequeños animales, con o sin terapia, en los casos tan avanzados sirve para enfatizar la necesidad de un diagnóstico precoz. 119 VIII.- BIBLIOGRAFÍA Bibliografia Abbott CD. Mi evahiationof imunocytochemicaldetectionsystemusinaprediluted antibodieson an automatedimmunostainer.3 Ccli Pathol1997;2:155-158. Manen KA, Joensun H, Kiwi Pi. Autolysis is a potential source of false aneuploid peaks in flow cytometnc DNA histograms. Cytometry 1989;l0:417-425. 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