./ REPERCUSION METABOLICA Y CINETICA DE DIFUSION DE AGENTES CRIOPROTECTORES A TRAVES DEL CARTILAGO ARTICULAR HUMANO. ESTUDIO MEDIANTE TECNICAS DE RMN. TESIS DOCTORAL BELEN CARSI LLUCH SERVICIO COT DEPARTAMENTO DE CIRUGIA ~53O9837266* UNIVERSIDAD COMPLUTENSE Justificación 1 JUSTIFICACION El cartílago es un tejido conectivo denso que actúa como material de soporte y transmisión de las cargas en las articulaciones sinoviales dotándolas de una superficie lisa y óptima para la congruencia de las superficies articulares. Cuando los avances en el tratamiento de los tumores musculoesqueléticos aumentan la demanda de injertos osteocondrales complejos, los grandes traumatizados se recuperan de sus lesiones hasta el punto de requerir superficies articulares útiles para reincorporarse a su vida diaria y las necrosis óseas y la patología artrósica exigen soluciones que vayan más allá de la sustitución protésica, con una expectativa limitada de duración, se delimita cada vez más clara e imperiosamente la necesidad de una solución biológica a la patología articular. El cartílago articular posee un potencial de regeneración muy limitado (MITCHELL Y COLS. , 1976; FURUKAWA Y COL. , 1980; MANKIN, 1982; SALTER Y COL. 1980). Los procedimientos que implican la resección de las superficies articulares dañadas con implantes artificiales poseen buenos resultados a corto plazo pero tienen importantes limitaciones, debidas sobre todo a la falta de propiedades biomecánicas (MOW Y MAK, 1987; BUCKWALTER Y COL. , 1990>, y a la duración limitada de los implantes en comparación con el cartílago articular, que deriva sobre todo de la fijación de las prótesis al hueso del paciente (CHANDLER Y COLS. , 1981; TSAO Y COLS. , 1993; SALVATI Y COLS. además de otras complicaciones • 1994; HERNANDEZ Y COLS., 1994), como infección, inestabilidad articular, Justificación 2 fractura del hueso o fatiga del implante (BOURNE Y COLS. 1984; CANNER Y COLS. , 1984; HAVELIN Y COLS. , 1994; CALLAGHAN, 1994; BLASER Y MATTHEWS, 1994; SHAWYGREER, 1994). La necesidad de hallar un método capaz de producir una cobertura biológica de las lesiones condrales justifica el interés generado por otras modalidades de tratamiento, basadas en la utilización de aloinjertos osteocondrales o injertos procedentes de otros tejidos blandos que puedan sustituir al cartílago en su función (constituyendo las denominadas “artroplastias de interposición”), como fascia, músculo, tendones, periostio o pericondrio. Estas últimas técnicas constituyen un intento de producir una nueva población de células capaces de imitar al tejido condral. Los resultados de estas técnicas son muy variables y dependen de multitud de factores (ENGKVIST Y OHLSEN, 1980; O’DRISCOLL Y COLS. 4988; ZARNETT Y SALTER, 1989; BUCKWALTER Y MOW, 1992>. La variabilidad de los resultados obtenidos con estas terapéuticas hace difícil su indicación. Otros procedimientos que intentan estimular la restauración de la superficie articular dañada quedan incluidos todavía en lo que podemos denominar “tratamientos experimentales”. Aquí se incluyen la implantación intraarticular de factores de crecimiento, células y matrices artificiales (SPEER Y COL. 1979; ASTON Y COL. 1986; ITAY Y COL. 1987; DAHLBERG Y KREICBERGS, 1991; CAPLAN Y COL.,1992; HUNZINGER Y ROSENBERG, 1994; WAKJTANI Y COL, 1994). Esta línea terapéutica está basada en los resultados satisfactorios obtenidos en la restauración de defectos agudos creados artificialmente en tas articulaciones de animales de experimentación, lo que no implica necesariamente resultados extrapolables a las articulaciones Introducción: caracteristicas histologicas ~funcionales 8 • CARACTERíSTICAS HISTOLOGICAS Y FUNCIONALES DEL CARTILAGO ARTICULAR El cartílago es un tejido avascular, aneural y alinfático, de actividad metabólica reducida y compuesto por células (condrocitos) y macromoléculas estructurales (fibras y matriz amorfa), con un claro predominio de este segundo componente. Dependiendo de su composición, se distinguen tres clases de cartílago: 1. Fibrocartílago; predominio del componente fibrilar colágeno y localizado en meniscos, anillo intervertebral, rodetes acetabulares y tejido de reparación de la superficie articular, así como en las articulaciones denominadas anfiartrosis (FIG. 2 A). 2. Cartílago elástico: gran cantidad de fibras elásticas, y localizado en pabellón auricular, epiglotis, cartílagos laríngeos, etc. (FIG. 2 a). 3. Cartílago hialino: traslúcido y de coloración blanquecina se localiza en extremos articulares, esqueleto fetal, placa de crecimiento, parrilla costal, y es el componente fundamental de las articulaciones sinoviales o diartrosis (FíO. 2 e). FíO. 1. Representación esquemática de una articulación sinovial. mnden Sinovial CaTtilago Capsuin Justificación 3 humanas. Hasta el momento, ninguno de estas aproximaciones al problema, aunque prometedoras, ha conseguido un tejido que duplique la estructura, composición, propiedades mecánicas y duración del cartílago articular normal. Los aloinjertos en fresco, con los que se han conseguido buenos resultados clínicos (McDERMOTT Y COL. , 1985; GROSS Y COL. , 1992; FLYNN Y COLS. , 1994), plantean importantes problemas de disponibilidad debido a la dificultad de coordinar la extracción y el implante de injerto. El almacenamiento durante períodos suficientemente largos es, por el momento, la única estrategia que puede asegurar una disponibilidad de tejido donante adecuada y segura, dado el tiempo que se requiere para comprobar la ausencia de enfermedades infecciosas en la pieza y la necesidad de adecuar las características específicas de tamaño, forma, grosor, etc. (LOCHT Y COL. 1984; MEYERS, 1985; McDERMOTT Y COL., 1985; OAKESHOTT Y COL. 1988; MEYERS Y COL. , 1989). La conquista de este tiempo se hace fundamentalmente a través de la criopreservación (FAHY, 1991>. La criopreservación (literalmente “conservar o mantener la integridad mediante el frío”) hace indefinido el tiempo de almacenamiento al detener el tiempo biológico pero se enfrenta al problema del enfriamiento hasta temperaturas criogénicas y calentamiento posterior con el mínimo daño posible del órgano o tejido. Los estudios sobre la criopreservación de la estructura y función de diversos tejidos y órganos se han individualizado y perfeccionado (FAHY Y COLS.,1991; KHIRABADI Y COLS.,1992; OKOUCHI Y COLS. 1993). Así, existen actualmente protocolos para la creación de un Banco de Huesos y distintos métodos para almacenar el tejido óseo durante varios años (AATB, Justificación 4 1984; TOMFORD Y COLS. 1983). En nuestro centro hospitalario, la creación del banco de huesos data de 1984 (LOPEZ-DURAN, 1985> y su protocolización (FERNANDEZ FERNANDEZ-ARROYO Y COLS.,1989) permite una utilización en la práctica clínica diaria. Sin embargo, el diseño de los protocolos de criopreservación del cartílago articular para su transplante se encuentra todavía en fase experimental. El mantenimiento de la viabilidad condrocítica aparece como uno de los condicionamientos principales para asegurar las propiedades biomecánicas del injerto de cartílago articular a largo plazo (McGANN Y COLS. 1987; HURTIG Y COLS. , 1992; MULDREW Y COLS. , 1993) y numerosos estudios demuestran que la viabilidad máxima se obtiene con protocolos de crioconservación de ritmo y temperatura controlados y con el uso de agentes crioprotectores (TOMFORD Y COLS. , 1985; McGANN Y COLS. , 1993; LOPEZ-OLIVA Y COLS. 1994) aunque los resultados distan mucho todavía para resultar alentadores en la práctica clínica. Uno de los problemas fundamentales en la criopreservación del cartílago articular es la dificultad de encontrar un modelo físico que permita predecir el comportamiento del cartílago ante la lesión crioinducida. La hipótesis de trabajo inicial que equiparaba la matriz cartilaginosa (que está constituida en un 80% por agua) a una solución ideal en la que los condrocitos se encuentran suspendidos en disolución no es válida (MULDREWY COL. ,1990). Existe una interacción entre las células y la matriz que las rodea que hace que la viabilidad celular tras la congelación varíe desde más de un 90% para los condrocitos aislados (TOMFORD Y COL. , 1981) a un 30-50% para el cartílago intacto (SCHACHARYCOL.,1986; LOPEZ-OLIVAY COL.,1995). Justificación 5 Estos resultados obligan a la introducción de más variables a considerar en los protocolos de crioconservación de piezas articulares de cartílago intacto. Además del daño celular producido por el gradiente de presión osmótica creado a ambos lados de la membrana celular y el resultante flujo de agua desde el interior hacia la solución hipertónica extracelular (MU LDREW Y COL. 1990); hay que considerar la capacidad del agente crioprotector para penetrar a través de la matriz extracelular y actuar durante el tiempo y a la concentración suficientes como para hacer efectiva su función crioprotectora. El hecho, experimentalmente comprobado (MU LDREW Y COL. 1992), de que sean los condrocitos pertenecientes a la capa intermedia los más dañados durante la congelación y descongelación de piezas de cartílago sometidas a protocolos optimizados de criopreservación (velocidad de enfriamiento de 10C/min, exposición previa a DMSO al 15% durante 1 hora) hace teorizar das explicaciones posibles: 1. Las capas morfológicas en las que se divide el cartílago articular indican diferencias en estructura y función de los condrocitos que las componen, siendo una de ellas la diferente susceptibilidad a la acción de los agentes crioprotectores, son así los condrocitos de la capa intermedia más sensibles a la lesión crioinducida (McGANN Y COL. 1993). 2. El agente crioprotector no difunde homogéneamente a través del cartílago y su velocidad de penetración es insuficiente para atravesar íntegramente su espesor, por lo que los protocolos actuales de criopreservación no permiten la exposición de la totalidad de las Justificación 6 células a su acción beneficiosa. Dado que la pieza de cartílago se sumerge en la solución preparada, las capas superficial y profunda quedan en contacto directo con el agente; no sucediendo lo mismo con la capa intermedia. El objetivo de nuestro estudio es medir la habilidad de los agentes crioprotectores más utilizados en la práctica ortopédica para difundir a través del cartílago articular humano usando técnicas de RMN. Para ello hemos estudiado: 1. Los coeficientes de autodifusión del DMSO y del glicerol. 2. La velocidad de penetración de dichas sustancias a través del cartílago articular. 3. La influencia en la difusión de la variación de la temperatura y la concentración del agente crioprotector. Con todo ello hemos optimizado la técnica para el estudio in vitro de otras sustancias que en el futuro puedan ser utilizadas para la crioprotección, con miras a su posible aplicación in vivo, abriendo nuevos horizontes con el fin de aumentar la viabilidad condrocitica tras la congelación y descongelación y añadiendo perspectivas nuevas como la monitorización de la penetración de sustancias, distintas a crioprotectores, a través del cartílago. Completamos nuestra investigación sobre la acción de crioprotectores en el cartílago humano con el estudio de la alteración metabólica que supone la exposición de los condrocitos a los agentes crioprotectores, ya sea incluidos en Justificación 7 su matriz o aislados y en cultivo, Utilizamos para ello la espectroscopia de 31P, herramienta de utilidad comprobada en los estudios metabólicos in vivo de otros tejidos del organismo (COHEN Y COLS. ,1983; MORRIS, 1988; DALY Y COHEN, 1989). A pesar de la amplia literatura sobre las aplicaciones de esta técnica, encontramos un relativo “vacío bibliográfico” en cuanto a su utilización sobre el cartílago articular. Sin embargo, creemos que la optimización de esta técnica para el estudio de piezas condrales hará posible la definición de parámetros que nos permitan estudiar la calidad biológica de un injerto de cartílago antes de proceder a su utilización como implante. Una de las principales líneas de investigación de nuestro servicio está representada así por el estudio de los fenómenos que ocurren a nivel óseo y condral tras la crioconservación y transplante sucesivo, y esta tesis representa la continuación a los estudios sobre auto y aloinjertos en fresco y crioconservados en animales de experimentación (MARCO, 1990> y a la optimización de los protocolos de criopreservación en el cartílago humano (LOPEZ-OLIVA, 1993), intentando estudiar los procesos de difusión de los agentes crioprotectores en piezas de cartílago intacto y la repercusión metabólica de estas sustancias químicas sobre el metabolismo celular. Para ello, hemos utilizado técnicas de resonancia magnética nuclear, no sólo por las ventajas metodológicas sino por su aplicabilidad a los estudios in vivo. La elaboración de este estudio ha sido posible gracias a la financiación de la beca del Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social (protocolo FIS 9510483), a la inestimable colaboración del personal y facilidades del Instituto Pluridisciplinar de la Universidad Complutense de Madrid. Introducción: características histologicas y funcionales 12 MATRIZ EXTRACELULAR O AMORFA La matriz del cartílago articular es un tejido conectivo especializado que consiste fundamentalmente en un gel de proteoglicanos hidratados reforzado por una malla tridimensional de fibras de colágeno, composición adaptada especialmente a la función doble de articular la superficie con una fricción baja y trasmitir cargas a través de la articulación hacia el hueso subcondral. La matriz extracelular está compuesta fundamentalmente por una mezcla de colágeno (fundamentalmente colágeno tipo II, a diferencia de otros —~ tipos de tejido del sistema musculoesquelético y que permite identificarlo y diferenciarlo de ellos en estudios in vitro e in vivo -ODRISCOLL Y COLS. 1995-) y agregados de proteoglicanos, con cantidades más pequeñas de otros tipos de colágeno, proteínas y glicoproteinas, en unas proporciones aproximadas de 50%, 30-35% y 15-20% del peso seco del tejido respectivamente (MANKIN Y COLS, 1994). En el cartílago articular normal, la malla de colágeno posee una estructura bien definida que determina la resistencia y fuerza tensional en cada capa del cartílago (BUCKWALTER Y MOW, 1992). Dado que el colágeno y los proteoglicanos forman un material compuesto por fibras reforzadas, la malla colágena es responsable también de la resistencia al cizallamiento del tejido. La textura de la capa superficial del cartílago articular normal es relativamente lisa y compuesta por láminas de colágeno firmemente entrelazadas (MEACHIM Y ROY, 1969; GHADIALLY, 1983; SCHENK Y COLS. 1986). Su superficie es acelular, la lámina splendens, bajo la que se agrupan numerosos condrocitos alargados. Introducción: caracteristicas histologicas y funcionales 14 • Zona III, profunda o radial: La red de fibras está apretada y con una disposición preferentemente perpendicular o radial a la superficie articular. Las células esféricas se disponen en grupos columnares de 4 a 8 elementos. • Zona IV o calcificada: Adyacente al hueso subcondral y separada de las anteriores por una limitante basófila (FAWNS Y LANDELLS, 1953> denominada en inglés “tide mark” por su semejanza a la huella de la mares y cuya estructura fue descrita por REDLER Y COL. en 1975. Esta limitante diferencia las capas anteriores, no calcificadas, de ésta y posee una importante función en el control del progreso de la calcificación y por tanto, el mantenimiento de la forma del extremo óseo (BULLOUGH Y JAGANNATH, 1983). Aunque el espesor relativo de cada zona varía mucho con cada articulación, en todas ellas podemos diferenciar siempre en la matriz dos zonas; la adyacente al condrocito o matriz pericelular y el resto, denominado matriz intercelular. La matriz pericelular tiene escasas o nulas fibras colágenas y abundancia de proteoglicanos y proteínas no colágenas (como condronectina o ancorina CII -BIDANSET Y COLS, 1992). La matriz intercelular posee la organización característica que dota a este tejido de sus propiedades biomecénicas (MEACHIM Y ROY, 1967>. Introducción: características histologicas y funcionales 16 FIG.6. Estructura del cartilago articular. Izquierda; distribución de los condrocitos en un esquema de un corte histológico. Derecha; distribución esquemática de la an~uitectura de fibras de colágeno. SUPERFICIE ARTIcULAR 7 _____ • ZONAl ZONAII é~ ZONA III ¡ •2 LIMITANTE BASOFIL.A ZONA IV En el cartílago articular normal, numerosas moléculas de proteínas y polisacáridos (proteoglicanos) se unen a una cadena de ácido hialurónico, siendo este enlace estabilizado por otra proteína de unión distinta. Los proteoglicanos están inmovilizados dentro de la malla colágena lo que produce una matriz fuerte y sólida (MUIR, 1983). Una molécula de proteoglicano está formada por muchas cadenas de glicosaminoglicanos (queratán sulfato y condroitín sulfato) unidas a la proteína central o retículo proteico. Los glicosaminoglicanos contienen a su vez numerosas cadenas de grupos carboxilo y sulfato cargados eléctricamente. Todo ello contribuye a la presión hidrostática del tejido, que tiene una importancia fundamental pues la hidratación del cartílago y sus propiedades de deformación y recuperación están directamente relacionadas (MOW Y COLS, 1992). HUESO Introducción: características histologicas y funcionales 18 (G2> y el dominio del extremo C-terminal (G3). El dominio N-terminal G1 es capaz de unirse específicamente al ácido hialurónico, siendo estabilizada por la proteína de unión. El peso molecular total de una molécula de proteoglicano varía entre 0.5 y 1.0 millón de daltons (ROSEMONT, 1994). FIG.8. Representación esquemática de un proteoglicano, constituido por una molécula central ramificada a la que se unen muchas cadenas laterales de glicosaminoglicanos. 200-400nm 1.200 nm La longitud de la cadena de ác. hialurónico determina el tamaño del proteoglicano. El peso molecular total puede alcanzar los 200 millones de daltons en el cartílago inmaduro; en el cartílago adulto y en el del anciano, el Introducción: caracteristicas histologicas y funcionales 19 proteoglicano disminuye progresivamente su tamaño (ROSEMONT, 1994). Del mismo modo, el contenido y tamaño de los proteoglicanos varia con la zona del cartílago estudiada. Así, en las áreas que soportan las mayores cargas de la articulación encontramos una concentración de proteoglicanos más alta que en las áreas sometidas a menor carga (SWEET Y COLS. 1977; MANICOURT Y COLS. ,1991). Estudios experimentales con anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al queratán sulfato (MZ15), demuestran que la distribución de éste en el cartílago articular no es homogénea, aumentando su cantidad de forma proporcional al aumento de la distancia a la superficie articular. Este anticuerpo permite reconocer dos subtipos de condrocitos: negativos para antígenos de superficie de queratán sulfato, localizados en las capas superficiales; y, positivos, localizados en sus capas más profundas (ZANETII, YCOLS, 1985). Los proteoglicanos cuya estructura ha sido descrita son los que predominan en el cartílago articular, denominados proteoglicanos agregantes, aunque existen otros, en menor cuantía, denominados proteoglicanos no agregantes, que son más pequeños y poseen sólo una clase de glicosaminoglicano, el condroitín sulfato, que suele encontrarse en forma de dermatán sulfato, con algunos residuos de glucuronato unidos a iduronato. (ROSENBERG Y COLS. ,1985). Los proteoglicanos agregantes dotan al tejido de sus potentes propiedades elásticas. Los proteoglicanos no agregantes parecen tener múltiples funciones, pues se unen al colágeno, fibronectina y otras macromoléculas regulando sus funciones biológicas (ROSENBERG, 1991). Dentro de la matriz colágena distinguimos, pues, dos tipos Introducción: características histologicas y funcionales 20 fundamentales de proteoglicanos: los agregantes o agrecanos y los no agregantes, cuya proporción es menor del 5% de peso en seco de la matriz. Los proteoglicanos agregantes (que incluyen fibronectina, laminina, vitronectina, fibrinógeno y colágeno tipo IX) participan en los procesos de adhesión celular a los substratos a través de proteínas receptoras de membrana específicas denominadas integrinas, a diferencia de los proteoglicanos no agregantes (trombospondina, tenascina, SPARC y dos clases del proteoglicano dermatán sulfato recientemente descritas: tipo 1 o biglicano y tipo II o decorina - ROSENBERG Y COLS. , 1985-) que parecen inhibir las fases iniciales de la adhesión celular mediante enlaces covalentes con la fibronectina. El conocimiento de esta diferencia tiene una proyección en la práctica clínica inmediata: solucionar los problemas de unión entre la porción condral de los aloinjertos osteocondrales al cartílago receptor (ASTON Y BENTLEY, 1986; MALININ Y COLS. , 1985; MARCO, 1990) mediante la adición de sustancias estimuladoras de la adhesión celular como el heparán sulfato (HEREMANS Y COLS. 1990>, la fibronectina (WEST, LANZA, ROSENBLOOM Y COLS. , 1979), el ácido retinoico (BENYAY PADILLA, 1986) y las citocalasinas 6 y D (ROSEN Y COLS. , 1986) o inhibición de los inhibidores con sustancias como la proteína central de los propios proteoglicanos del dermatán sulfato (BIDANSET Y COLS. , 1992), la vimentina (BEN-ZE’EV, 1984> y colchicina (BROWN Y BENYA, 1988). El estudio de los efectos de estas sustancias en los cultivos de condrocitos ha llevado a la hipótesis de una trasducción entre la forma celular y el genoma celular a través del estado de organización de los microtúbulos (BENYA Y COLS, 1988). La fibronectina parece ser la más directa responsable de los fenómenos de Introducción: características histologicas y funcionales 24 Los condrocitos representan tan sólo el 5-10 % del volumen tisular (HAMERMAN Y SCHUBERT; 1972). Esto representa una celularidad media de 15.000 células por milímetro cúbico, escasa con respecto a otros tejidos de nuestra economía (MAROUDAS Y COL; 1975). La densidad celular no varía con la edad. Se encuentra una relación entre el espesor y la densidad celular del cartílago: a mayor espesor del mismo, mayor densidad celular. Sin embargo, según STOCKWELL (1971), la densidad celular con relación a la unidad de superficie se mantendría constante. El número de células varía igualmente según la profundidad, como hemos visto, siendo la capa superficial la más celular. Estas células superficiales son elipsoidales y dispuestas en paralelo a la superficie. Constan de menos citoplasma y organelas lo que sugiere una menor actividad metabólica. Según WEISS Y COL. (1968) representan una población celular quiescente. Por el contrario, los condrocitos profundos tienen una forma esférica con gran cantidad de organelas responsables de una actividad de síntesis más intensa (STOCKWELL Y MEACHIM; 1979). ACTIVIDAD METABOLICA Se ha calculado que el ritmo de sustitución de los glícosaminoglicanos es aproximadamente de un 50% al año, mientras que el colágeno sólo alcanza esta tasa a los 10 años (MAROUDAS; 1975). En el cartílago están presentes todas las enzimas necesarias para su degradación, excepto la hialuronidasa, producida por la membrana sinovial. Además de las enzimas endógenas, las proteínas colagenolíticas de los polimorfonucleares, proteinasas, hialuronidasas y proteasas de los lisosomas de los sinoviocitos, y las Introducción: características histologicas y funcionales 26 TRUETA Y HARRISON en 1959 demostraron la existencia de capilares transversales en la placa ósea subcondral para atender los requerimientos nutricionales de la capa de cartílago calcificado. En el cartflago articular adulto se acepta clásicamente la ausencia de mitosis. Aunque éstas no se observan con microscopia óptica, esto no significa que el cartílago no renueve sus componentes celulares, si bien la división celular es un fenómeno infrecuente (MANKIN, 1963). SUPERFICIE ARTICULAR Es importante conocer su morfología normal puesto que muchas de las lesiones comienzan en la superficie para progresar hacia el interior. El aspecto liso que ofrece macroscópicamente o con microscopia óptica se demuestra como lleno de ondulaciones y crestas con la microscopia electrónica de barrido. Estas ondulaciones parecen jugar un papel importante en la lubricación y nutrición del cartílago al atrapar el liquido sinovial entre las superficies de fricción (REDLERYZIMNY; 1970). GARDNER Y COL. (1975> agrupan las ondulaciones de la superficie cartilaginosa en cuatro tipos, dependiendo del tamaño de dichas irregularidades: 1. Primarias; corresponden al contorno general de la articulación 2. Secundarias: de hasta 1 mm de tamaño, se relacionan con las asperezas del hueso subcondral; 3. Terciarias: de diámetro mucho menor, 20-40 micras, parecen en realidad, corresponder a artefactos, aunque en un principio se relacionaron con las improntas producidas por los condrocitos. Introducción: características h¡stolog¡cas y funcionales 28 FUNCIONES BIOMECÁNICAS DEL CARTíLAGO ARTICULAR La función del cartílago articular fue ya descrita de forma muy descriptiva por HUNTERen 1743: “Los cartílagos articulares son los que contribuyen de una forma más decisiva a la función de movimiento de dichas partes. Mediante su superficie uniforme, se mueven con facilidad una contra otra; por su blanda, suave y resbalosa superficie se previene la abrasión mutua; por su flexibilidad, las superficies contiguas están constantemente adaptadas la una a la otra, y la fricción se difunde por igual en el todo; por su elasticidad, la violencia de cualquier golpe, que puede ocurrir al corree saltar etc., se rompe y gasta de forma graduat pudiendo haber sido extremadamente perniciosa, si las superficies duras de los huesos hubieran estado inmediatamente contiguas”. Dos son las funciones fundamentales del cartílago: la transmisión de cargas y la facilitación de los movimientos. A estos requerimientos responden dos propiedades intrínsecas del cartílago, la resistencia a la compresión y a la tensión. • RESISTENCIA A LA COMPRESION La resistencia mecánica del cartílago a los esfuerzos de compresión ha sido estudiada por SOKOLOFF (1966) y KEMPSON (1970). El cartílago se puede asemejar a un cuerpo viscoelástico como el caucho, con un módulo de elasticidad de Young variable según la articulación y su espesor. Se calcula en unos 840 N/cm2 para la cadera y de 1530 N/cm2 para la rodilla (KEMPSON, 1975). La firmeza del cartílago parece depender del contenido en glicosaminoglicanos, existiendo una relación lineal entre éste y el módulo de elasticidad (CAMERON Y COL. ; 1975). Introducción: caracteristicas histologic,as y funcionales 29 Los glicosaminoglicanos pueden resistir a la compresión mediante varios mecanismos: 1. Repulsión electrostática entre las moléculas, cargadas negativamente; 2. Rigidez intrínseca de los agregados de glicosaminoglicanos; 3. Resistencia friccional del flujo de fluidos a través de los poros del espacio intramolecular. Su comportamiento ante una fuerza de compresión constante se describe como una “curva de indentación’ en función del tiempo, con relación a dos efectos: una respuesta elástica de la fase sólida y una respuesta de la fase fluida que se traduce por una deformación. Cuando las fuerzas de compresión cesan, el cartílago presenta una curva de recuperación bifásica, con una recuperación rápida al principio que se enlentece gradualmente en el tiempo. La primera representa la recuperación elástica y la segunda la reimbibición del agua perdida. • RESISTENCIA A LA TENSION Una tensión aplicada de forma paralela a la superficie ejerce una resistencia en el cartílago que disminuye significativamente desde ésta hacia la profundidad y es mayor en el eje preferencial de las fibras de colágeno (KEMPSON Y COL., 1973). Introducción: características histologicas y funcionales 30 LUBRICACION Esta propiedad es fundamental para la facilitación de los movimientos articulares. Según estudios industriales, el coeficiente de fricción de las articulaciones sinoviales es muy bajo. En la correcta lubricación articular intervienen tanto el líquido sinovial como las superficies cartilaginosas. Así, se pueden distinguir: 1. Lubricación fluida: se produce cuando una película de fluido separa completamente una superficie de otra. La resistencia al movimiento en este caso depende de la viscosidad del fluido. En el caso del líquido sinovial, se trata de un fluido no newtoniano”, es decir, su viscosidad disminuye al aumentar la viveza de los movimientos. Bajo una carga, la superficie cartilaginosa se deforma, creando una depresión que es menos estrecha en su periferia que en su centro, atrapando el fluido y dejando la lubricación a su cargo. 2. Lubricación limite: está creada por una fina capa de moléculas adheridas a la superficie que evita el contacto entre las superficies irregulares. Las fuerzas friccionales en este caso son proporcionales a la carga e independientes de la superficie de contacto y la velocidad de desplazamiento. Este tipo de lubricación actúa de forma óptima en condiciones de baja carga. 3. Lubricación por desagúe: es una forma de lubricación hidrostática que corresponde a la lubricación debida al paso de fluido a través de los poros del cartílago cuando está sometido a compresión. Este tipo actúa sobre todo ante fuerzas de compresión intensas. Introducción: lesión del cartílago 32 LESION DEL CARTíLAGO ARTICULAR LESIONES MECANICAS DEL CARTíLAGO ARTICULAR Las lesiones mecánicas del cartílago articular ocurren cuando la articulación se somete a un sobreesfuerzo repetitivo y prolongado, un impacto súbito produce una fuerza de compresión intensa a través del tejido, o una fuerza de cizallamiento a nivel de la unión con el hueso subcondral (FINERMAN Y NOYES; 1992). Estas fuerzas provocan lesiones que pueden ser diferenciadas en tres tipos: 1. Microlesión celular y lesión a la matriz sin que se produzca una interrupción visible en la superficie articular; 2. Disrupción macroscópica o aceración del cartílago articular (fractura condral), 3. Fractura del cartílago articular y del hueso subcondral (fractura osteocondral>. LESION CARTILAGINOSA SIN DISRUPCION TISULAR La lesión está provocada por un único impacto de intensidad moderada o varios microtraumatismos repetidos. Este tipo de lesión es identificable por un descenso en la concentración de proteoglicanos de la matriz, un aumento en la hidratación tisular y posiblemente, una alteración de la organización fibrilar del colágeno. Además, el traumatismo puede lesionar los condrocitos o alterar sus actividades sintéticas y degradativas (POOLE, 1994). La naturaleza exacta de este tipo de lesión no ha sido bien estudiada aunque las alteraciones citadas pueden corresponder sólo a una primera fase de lesión. Introducción: lesión del cartilago 33 Un impacto más severo puede producir anormalidades y muerte entre la población celular así como el debilitamiento de la malla colágena. Estas lesiones pueden ir acompañadas de daño a la unión ósea y pueden provocar un remodelado reactivo del hueso subcondral con aumento de la replicación a nivel de la lámina eosinófila (BULLOUGH Y JAGANNATH; 1983). La pérdida de proteoglicanos y el aumento del contenido acuoso están correlacionados de forma directa con una disminución de la rigidez del cartílago y un aumento de su permeabilidad hidráulica. Estos cambios en las propiedades del tejido provocan un descenso en la presurización de fluido en el intersticio y alteran la capacidad de transporte a través de éste (FINERMAN Y NOYES; 1992). Dichos efectos provocan, a su vez, un aumento en la sobrecarga de la matriz de colágeno y proteoglicanos y pueden aumentar la vulnerabilidad de la matriz extracelular ante nuevas lesiones. Además de estas lesiones cartilaginosas debidas al traumatismo, frecuentemente se asocia la rotura de la membrana sinovial, lo que deja a la superficie cartilaginosa expuesta a los factores inflamatorios de la sinovial, los cuales pueden añadir una lesión enzimática del cartílago. Al contrario, cuando las articulaciones sinoviales se inmovilizan o se encuentran en estado de desuso, en el cartílago tiene lugar un activo proceso de remodelación (HELMINEN Y COLS. , 1987). Estos cambios funcionales pueden resultar en una pérdida dramática de los proteoglicanos del cartílago. Sin embargo, al reutilizar la articulación, los condrocitos aparentemente dormidos despiertan y comienzan a sintetizar nueva matriz, siendo posible recuperar la antigua forma y función. Esto indica que los condrocitos tienen el potencial de reparar el cartílago, al menos en ciertos tipos de lesión. Sin Introducción: lesión del cartílago 34 embargo, este tipo de reparación puede llevar semanas o meses hasta la normalidad. Se cree que los condrocitos son capaces de detectar cambios en la composición matricial que desencadenan su respuesta reparadora (PALMOSKI Y COLS. , 1979). El mecanismo de trasducción de la señal que es detectado por las células y la forma en que los condrocitos la traducen en alteraciones metabólicas son todavía desconocidas. Después de lesiones intraarticulares, como una lesión meniscal o ruptura del ligamento cruzado anterior, la capacidad de los condrocitos para la reparación es insuficiente la mayoría de las veces para mantener un cartílago funcionalmente normal. Esto ocurre cuando las células son incapaces de reparar las microlesiones de la matriz extracelular de forma suficientemente rápida. Se desconoce el punto a partir del cual la lesión se hace irreversible. Presumiblemente, los condrocitos pueden restablecer la matriz perdida siempre que la pérdida no sobrepase la tasa de producción. Si además hay daño concomitante a la malla de colágeno o si un número suficiente de condrocitos ha sido destruido, se establece un proceso de degeneración irreversible. FRACTURAS CONDRALES De forma general, se admite que aquellas lesiones del cartílago que no sobrepasan la lámina limitante eosinófila no se reparan (CAMPBELL, 1969). Una compresión actuando sobre una superficie articular producirá toda una variedad de fuerzas (tensión, compresión, cizallamiento y presión hidrostática> dentro del cartílago. Estas fuerzas, cuando son suficientemente intensas, pueden provocar fisuras condrales, colgajos y fracturas, así como lesión de los condrocitos, que pueden necrosarse y formar células fantasma. La pérdida de Introducción: lesión del cartílago 35 segmentos significativos de la superficie articular pueden producir derrame articular, dolor y síntomas mecánicos como crepitación y bloqueos, y puede proseguir hacia la degeneración de la articulación (BUCKWALTER Y MOW, 1992). Debido a que el cartílago carece de vascularización, estas lesiones no provocan hemorragia, formación de coágulos de fibrina ni provocan respuesta inflamatoria. Los condrocitos responden proliferando y aumentando la síntesis de macromoléculas de la matriz cerca del lugar lesionado (MANKIN, 1982), es lo que FREEMAN Y MEACHIM (1979) denominaron reparación intrínseca. Desafortunadamente, la matriz sintetizada de nuevo y las células proliferantes no rellenan el defecto tisular cuando éste es grande, y por tanto, no se restablece la superficie articular. Además, si estos defectos son de gran tamaño, se produce una sobrecarga del cartílago adyacente y del hueso subcondral bajo el mismo, que puede conducir a la degeneración del cartílago previamente sano, y, con el tiempo, afectarse toda la articulación. CQNVERY Y COLS. (1972) establecieron en 3 mm el límite reparativo del cartílago en lesiones profundas provocadas en caballos. Cuando la lesión excedía los 9 mm, la artrosis era inevitable. Introducción: lesión del cartilago 37 líquido sinovial y el ambiente articular. Poco después de la lesión, la sangre que escapa de los vasos sanguíneos en el hueso dañado forma un hematoma, que temporalmente rellena el defecto creado. El coágulo de fibrina se extiende desde el hueso hasta una distancia variable en el espesor del cartílago. Las plaquetas atrapadas por el coágulo liberan mediadores vasoactivos y factores de crecimiento o citoquinas. Estos factores incluyen el factor de crecimiento y transformación beta (TGF- 13) y el factor de crecimiento plaquetario. La matriz ósea contiene asimismo numerosos factores de crecimiento, como el TGF- ¡3, BMP, factor de crecimiento plaquetario y otros factores de crecimiento semejantes a la insulina. La liberación de estos factores puede jugar un papel importante en la estimulación de la reparación de los defectos osteocondrales. En particular, estos factores estimulan la invasión vascular y la migración de células indiferenciadas, así como su proliferación y diferenciación en células semejantes a los condrocitos en la porción condral del defecto. Algunas de estas células mesenquimales indiferenciadas que migran al defecto se vuelven redondeadas como condrocitos y empiezan a sintetizar matriz que contiene colágeno de tipo II y concentraciones relativamente elevadas de proteoglicanos. Estas células producen zonas semejantes al cartílago hialino en las regiones condral y ósea del defecto. Las células de la zona condral sintetizan además abundante colágeno de tipo 1, mientras que las de la parte ósea sintetizan hueso inmaduro que es reemplazado de forma gradual por hueso maduro. La composición del tejido de reparación cartilaginoso no reproduce la estructura del cartílago normal (MANKIN Y COLS. ,1994). Sus fibras colágenas están orientadas al azar, y poseen un módulo de elasticidad menor que el tejido Introducción: reparación de lesiones 39 • REPARACION DE LESIONES ARTICULARES: CAPACIDAD INTRíNSECA, AUTOINJERTOS Y ALOINJERTOS OSTEOCONDRALES. Ya en 1853, SIR JAMES PAGET hace la siguiente afirmación: It no hay casos en los que una porción de cartílago perdida haya sido restaurada o una porción lesionada cicatrizada con un cartílago nuevo, bien formado y permanente en el sujeto humano.” Este punto de vista fue más tarde corroborado por CAMPBELL (1969) que examinó multitud de defectos cartilaginosos en varias especies animales no encontrando tejido normal en ninguna de ellas. GHADIALLY (1983), experimentando con animales estableció: “....Heridas superficiales o defectos de espesor parcial que no violan el hueso subcondral no cicatrizan nunca o de forma excepcional, mientras si pueden hacerlo fas lesiones profundas o de espesor completo que penetran hasta el hueso subcondral mediante un tejido de reparación que surge de los espacios medulares (y) . . . ni la forma ni el lugar del defecto, la madurez o inmadurez esquelética de individuo afecta de forma significativa el resultado final de dichas lesiones.” Considerando los métodos de restaurar una superficie articular lesionada o degenerada, es importante distinguir dos conceptos: 1. Reparación del cartílago articular, que hace referencia a la cicatrización de los tejidos lesionados o sustitución de los tejidos perdidos mediante la proliferación celular y la síntesis de nueva matriz extracelular. Desdichadamente, como hemos visto, el cartílago articular reparado no reproduce la estructura, composición o funciones del tejido normal. 2. Regeneración del cartílago articular, representa la formación de una enteramente nueva superficie articular, que duplica el cartílago original. Introducción: reparación de lesiones 40 Las células de cuerpo humano se han clasificado en tres grupos según su capacidad de regeneración: lábiles, estables y permanentes. Las células lábiles siguen proliferando durante toda la vida del sujeto. Las células estables conservan esta capacidad, aunque en estado normal no se duplican. Las células permanentes no pueden reproducirse después del nacimiento (LEBLOND Y WALKER, 1956). Las células que constituyen el cartílago articular se consideran células estables. Este grupo, en estado normal, muestra un nivel bajo pero claro de duplicación. Sin embargo, las células pueden experimentar divisiones rápidas como reacción a diversos estímulos y son capaces de reconstituir el tejido de origen. La mayor parte de las lesiones corporales experimentan reparación por regeneración de células parenquimatosas, acompañada de mayor o menor cicatrización de tejido conectivo. La calidad y suficiencia de estos procesos en el tejido está determinada por la capacidad de regeneración de las células afectadas, la extensión de la lesión y la actividad proliferativa del estroma de tejido conectivo que llena los defectos restantes después de cesar la regeneración parenquimatosa. Introducción: reparación de lesiones 42 Además de esta distinción, no hay que olvidar que el fin fundamental de la reparación de lesiones articulares es restaurar la movilidad articular y conseguir un arco de movilidad completo e indoloro. Los resultados de las series clínicas que comparan unos métodos con otros presentan el inconveniente fundamental de no distinguir entre el grado de lesión inicial en muchos casos, lo que lleva a valorar resultados equiparando lesiones extensas y profundas con otras mucho más leves, y lesiones de origen traumático con lesiones degenerativas. La diferencia fundamental entre las lesiones de origen traumático y las degenerativas es que el daño provocado por un traumatismo suele dar lugar a defectos articulares aislados que con frecuencia dejan el resto de la superficie articular intacta. Además, suelen acontecer en pacientes más jóvenes con mayor demanda funcional. Si estas lesiones son graves y no se tratan, pueden conducir a la degeneración articular, como ya hemos visto. Las lesiones de origen traumático más leves presentan el problema, al igual que los estadios iniciales de la artrosis, de la falta de desarrollo de métodos para detectar la lesión articular en ausencia de interrupción de la superficie, pero la identificación del descenso de la rigidez y resistencia tisular durante la cirugía representa un modo de aproximarse al diagnóstico. La gammagrafía ósea y la RMI pueden detectar alteraciones en el hueso subcondral siguiendo a la lesión articular, pero la relación entre estos hallazgos y el daño cartilaginoso no se ha establecido con precisión. El uso de marcadores bioquímicos para analizar el líquido sinovial, suero y orina ofrece un medio potencial para determinar el metabolismo del cartílago y su degeneración (POOLE, 1994), pero estas pruebas no están todavía disponibles en la clínica de manera rutinaria. Si esto lograra hacerse de forma rutinaria, se podrían Introducción: reparación de lesiones 43 detectar las fases más tempranas de la lesión cartilaginosa, se instauraría un tratamiento precoz y su efectividad podría ser seguida con estos marcadores. Los tratamientos actuales de las fracturas condrales incluyen el desbridamiento de los bordes de la fractura y la extracción de los fragmentos libres de la articulación. Cuando la pérdida de cartílago es importante, algunos cirujanos aconsejan la abrasión o la perforación del hueso subcondral adyacente. Los estudios sobre el relleno de los defectos con fragmentos de cartílago o con aloinjertos condrales u osteocondrales serán comentados más adelante. Las grandes fracturas osteocondrales en las que el cartílago permanece intacto junto con el hueso pueden ser tratadas mediante la reducción abierta precoz y la fijación interna. Si la fractura no se trata de forma temprana, los fragmentos se remodelan, lo que provoca una reducción completa más difícil. La evidencia disponible indica que la superficie articular también cicatriza y se remodela en el lugar donde ocurrió la fractura osteocondral, especialmente en el esqueleto inmaduro. Las fracturas osteocondrales más pequeñas y aquellas en las que el cartílago no está en condiciones de ser restituido se tratan actualmente con desbridamiento. Los aloinjertos osteocondrales han sido utilizados con éxito en determinadas fracturas osteocondrales en las que la región lesionada forma parte de la zona de carga de la articulación. El potencial de reparación de las lesiones cartilaginosas aumenta con la movilización pasiva continua de la articulación para autores como SALTER Y COL. (1979). Las articulaciones con problemas degenerativos del cartílago articular representan un problema mucho más complejo que los defectos focales en articulaciones por Jo demás, normales. No está claro todavía si el estimular la Introducción: reparación de lesiones 44 formación de una nueva superficie articular en las regiones con artrosis localizada producirá beneficios clínicos a largo plazo. METODOS DE ESTIMULAR LA REPARACION DE UNA SUPERFICIE ARTICULAR El éxito de un método determinado para restaurar una superficie articular dañada o degenerada se ha estudiado con frecuencia comparando el tejido de reparación que rellena el defecto condral, tanto en su composición como propiedades mecánicas con el cartílago articular normal. Sin embargo, el relleno de un defecto con tejido de reparación no siempre se acompaña en la clínica de una disminución o desaparición del dolor o de una movilidad articular mejor, que deberían ser los criterios fundamentales para medir el éxito de una u otra técnica. Hay numerosos estudios experimentales y clínicos que prueban la existencia de métodos que estimulan la formación de tejidos de reparación. Algunos de ellos incluyen la alteración de la transmisión de las cargas en la articulación, la introducción de nuevas células formadoras de cartílago mediante su penetración desde el hueso subcondral y las denominadas artroplastias biológicas. Dada la capacidad limitada de los condrocitos maduros para reparar los defectos cartilaginosos, uno de los acercamientos potencialmente más productivos parece ser la introducción de una nueva población celular en un defecto condral u osteocondral. Estas células pueden ser obtenidas de poblaciones crecidas en cultivo en combinación con matrices artificiales y factores condrogénicos que estimulen la formación de cartílago nuevo. Introducción: reparación de lesiones 45 • ALTERACION DE LAS CARGAS APLICADAS A UNA ARTICULACION Las cargas y el movimiento de una articulación pueden tener un impacto considerable en la progresión de la degeneración articular y en la reparación del cartílago (RADIN Y COLS., 1990). Las sobrecargas en una articulación dañada pueden acelerar la degeneración y destruir el tejido reparado. La inmovilización prolongada y descarga de una articulación contribuirán también a la degeneración articular y acelerarán el proceso degenerativo al recibir cargas de nuevo. Sin embargo, reducir el nivel de sobrecarga del cartílago degenerado puede estimular la reparación, y la carga y movilidad controladas, incluyendo la movilización pasiva, pueden facilitar la reparación y mantenimiento de la movilidad articular (SALTER Y COLS., 1980). Clínicamente se usan dos métodos para alterar la transmisión de fuerzas a través de una articulación: las osteotomías y liberaciones musculares. Sin embargo, los resultados clínicos son impredecibles a pesar de la evidencia experimental de la reparación cartilaginosa, ya que la relación entre la alteración de cargas y formación de cartílago no está bien definida. El mayor beneficio de esta cirugía se obtiene con una indicación correcta. Los pacientes obesos o con afectación multicameral, en el caso de la rodilla, deben ser tratados con otro método, ya que sus resultados son sistemáticamente desalentadores. Las liberaciones musculares, en mayor uso hace algún tiempo, se reservan hoy para algunos casos de afectación del cartílago de la articulación femoro-patelar, en los que se realizan liberaciones de los alerones rotulianos si la etiología responde a un desequilibrio ente éstos. Introducción: reparación de lesiones 48 • ESTIMULACION DE LA FORMACION DEL COAGULO DE FIBRINA En los tejidos vascularizados, la formación de coágulos de fibrina (incluyendo la liberación de factores de crecimiento por parte de las plaquetas) tiene un papel importante en la iniciación del proceso de reparación. Las citoquinas liberadas por el coágulo producen un estímulo quimiotáctico y mitogénico para las células mesenquimales que migrarán hacia el coágulo que actúa como una matriz temporal para estas células. Potencialmente, un coágulo podría tener un efecto similar en los tejidos no vascularizados como el cartílago (BUCKWALTER Y COLS.,1992). Dado que los proteoglicanos de la matriz extracelular pueden inhibir la formación del coágulo en los defectos condrales, los investigadores han propuesto la irrigación de los defectos con soluciones salinas o enzimáticas que degraden los proteoglicanos de forma que permitan a la fibrina formar un coágulo adherido al defecto que provocaría la migración celular que rellena el defecto con material celular (SPEER, 1979). Sin embargo, NEVO Y COLS. (1987) en su trabajo experimental con BRIV (biological resorbable immobilization vehicle, vehículo de inmovilización biológica reabsorbible, derivado de fibrinógeno y trombina) no encuentran reparación en los defectos rellenos sólo con este compuesto. Esta técnica se puede utilizar también como adyuvante en los procesos de regeneración cartilaginosa, al igual que los que vienen a continuación. Introducción: reparación de lesiones 49 • FACTORES ESTIMULADORES DE LA CONDROGÉNESIS Una multitud de factores de crecimiento polipeptídicos (como TGF—¡3 BMP, FGF o insuline-likeGF) influyen en los condrocitos y en otras funciones de células mesenquimales, como la migración celular, proliferación, síntesis de matriz, o diferenciación. Los efectos de estos factores pueden también modificar directamente la matriz extracelular y por tanto, modular las señales trasmitidas a las células desde la matriz que las rodea (por ejemplo, fuerzas, presión osmótica, flujo, etc.). Trabajos experimentales muestran que determinados factores de crecimiento pueden estimular la formación de tejido cartilaginoso in vivo e in vitro (HUNZINGER Y ROSENBERG, 1994). Todos los factores de crecimiento han demostrado tener una actividad mitogénica para los condrocitos in vitro; y el FGF, TGF—13 y el insulin-likeGF han demostrado estimular la producción de matriz in vivo. Además, algunos factores de crecimiento potencian los efectos metabólicos de otros factores. Por ejemplo, el TGF—j3 puede potencial la actividad mitogénica del PGF o del il-GF, que a su vez actúan de forma sinérgica para estimular la síntesis de matriz. • IMPLANTACION DE MATRICES SINTETICAS Rellenar los defectos cartilaginosos con matrices sintéticas puede proveer de una malla de soporte que promueva la migración celular y otorgue a estas células de un soporte hasta que éstas sinteticen nueva matriz. Este soporte orgánico permite el relleno de defectos de mayor tamaño. Estas matrices pueden ser fabricadas con fibras de colágeno, fibras de carbono (FREED Y COLS.,1991, HEMMEN Y COLS, 1991, VACANTI Y COLS.,1991, Introducción: reparación de lesiones 50 VON SCHROEDER Y COLS. , 1991) , geles de glicosaminoglicanos (ITALY Y COLS. ,1987, WAKITANI Y COLS. ,1989), para rellenar específicamente los defectos en las superficies articulares y regenerando un contorno articular normal. In vitro, el crecimiento celular depende de la densidad celular inicial, del grosor de la malle tridimensional y de las condiciones de cultivo (FREED Y COLS. , 1994>. In vivo, se observa una condrogénesis asociada debida al aporte de células del huésped que migran hacia el defecto, que se objetiva en animales de experimentación (FREED Y COLS. , 1993). VERBRUGGEN (1996) propone esta técnica como método de reparar defectos articulares profundos, que alcanzan el hueso subcondral, pues sostiene que el tejido de reparación puede conservarse como cartílago hialino (como en sus primeras etapas) sin transformarse en fibrocartílago gracias a la presencia de estas mallas que permiten a los neocondrocitos la síntesis de una nueva matriz extracelular. Otro acercamiento probable puede ser el utilizar estas matrices como medios tridimensionales de sustento de condrocitos o células mesenquimales que pueden ser sembradas en su interior. • CAMPOS ELECTROMAGNETICOS Las células mesenquimales responden a los campos electromagnéticos mediante la alteración de sus actividades sintéticas y proliferativas. Los estudios in vitro han demostrado que los campos estimulan la proliferación condrocítica y la síntesis de proteoglicanos. Limitados estudios in vivo sugieren que el tratamiento de los defectos osteocondrales con campos electromagnéticos pulsátiles estimula el volumen y calidad del tejido de reparación (BUCKWALTER Y MOW, 1992>. Introducción: reparación de lesiones METODOS DE REGENERACION DEL CARTíLAGO ARTICULAR • TRATAMIENTO CON ALOINJERTOS: La sustitución del cartílago articular lesionado por aloinjertos presenta las ventajas sobre los autoinjertos propias de estos materiales: cantidad de injerto suficiente, morbilidad del sitio donante inexistente, y posibilidad de modelar el injerto según la localización y forma del defecto. Se pueden distinguir varios tipos de aloinjerto con respecto a su estructura macroscópica: aloinjertos osteocondrales en cáscara y aloinjertos osteocondrales masivos o hemiarticulaciones (CZITROM Y GROSS, 1992). Los aloinjertos osteocondrales “en cáscara” consisten en cartílago articular con una fina lámina de hueso subyacente. Pueden utilizarse en fresco, en cuyo caso presentan problemas de coordinación entre el donante y receptor y de posible transmisión de enfermedades, además de la respuesta inmunológica del receptor. Tanto el hueso como el cartílago son fuentes potenciales de inmunogenicidad (FRIEDLANDER, 1983). Estos aloinjertos se han utilizado clínicamente con éxito variable según las series (GROSS Y COLS. 1975; LOCHT Y COLS. , 1984; MEYERS Y CHATTERJEE, 1978; OUTERBRIDGE, 1971). Debido a su privilegiado medio de nutrición, los condrocitos pueden sobrevivir el trasplante mediante la difusión de nutrientes desde el líquido sinovial. Se requieren condrocitos viables después del procedimiento para mantener la matriz, sobre todo su componente de proteoglicanos. El hueso subcondral, sin embargo, es resorbido y reemplazado por hueso del receptor (LANE Y OOLS. ,1977). Es en este proceso de invasión 51 Introducción: reparación de lesiones 52 vascular y reemplazamiento por hueso nuevo en el que el huésped es sensibilizado a los antígenos celulares del injerto. Experimentalmente, el cartílago de los aloinjertos en cáscara sufre fibrilación, fragmentación y erosión. Se puede encontrar incluso un pannus inflamatorio y se han identificado anticuerpos contra antígenos del donante y contra antígenos de la matriz cartilaginosa (CAMPBELL Y COLS. , 1963; RODRIGO Y COLS. , 1978; YABLON Y COLS. 1977). Los mediadores de la inflamación parecen también jugar un papel en la destrucción inmune del cartílago, por colagenasas y proteasas producidas por macrófagos, monocitos y otras células. Estos mediadores parecen estimular a los fibroblastos de la membrana sinovial y a los condrocitos del cartílago que a su vez producen enzimas que degradan activamente su propia matriz (KRANE Y AMENTO, 1983). Sin embargo, el principal problema de los aloinjertos osteocondrales en cascara está representado por la unión injerto-huésped, en la que se pueden encontrar tres tipos de comportamiento fundamentales, según refiere MARCO (1990): 1. Aposición entre tejidos con intentos de continuidad entre los mismos, con frecuencia objetivándose una zona hipertrófica procedente del huésped que, a modo de espolón, se superpone al implante; 2. Persistencia de una hendidura única o múltiples fisuras entre ambos tejidos o; 3. Relleno de esta hendidura con tejido cicatricial fibroso. Introducción: reparación de lesiones 54 Los aloinjertos osteocondrales masivos consisten en hueso cortical, hueso esponjoso metafisario y cartílago articular con su correspondiente hueso subcondral. Estos injertos son casi siempre preservados o conservados de diferentes formas, de modo que puedan ser mantenidos vivos y trasplantados según las necesidades. Generalmente son criopreservados con un agente crioprotector como el DM50 o el glicerol, que ayuda a mantener la viabilidad de los condrocitos durante el proceso de congelación y descongelación. Estos crioprotectores no son muy efectivos en el cartílago intacto, obteniéndose con su uso unas viabilidades máximas del 40-50% (SCHACHAR Y McGANN, 1991; TOMFORD Y MANKIN, 1983). Tras el trasplante, el cartílago hialino ha demostrado, tanto clínica como experimentalmente, que sufre un proceso de degeneración, transformándose en fibrocartílago (CAMPBELL, 1972; AHLO, 1973; KANDEL Y COLS. , 1984). Además, estos aloinjertos masivos sensibilizan al huésped, aunque en menor grado que los injertos frescos; del 15 al 100 % de los pacientes desarrollan una respuesta humoral en forma de anticuerpos contra antígenos del tejido donante que es mensurable (LANGER Y COLS. ,1978; RODRIGO Y COLS. 1979; FRIEDLANDER Y COLS. 1984). Experimentalmente, se han documentado respuestas humorales tanto locales como sistémicas, así como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y citotoxicidad celular contra antígenos de superficie del injerto (STEVENSONS, 1987). En un estudio sobre aloinjertos osteocondrales masivos en perros, todos los aloinjertos, tanto los que tenían histocompatibilidad cruzada o no-cruzada y tanto frescos como congelados tuvieron resultados pobres en comparación con los autoinjertos. Sin embargo, se objetivó una respuesta diferente de forma constante. Los injertos en fresco con histocompatibilidad cruzada fueron los que Introducción: reparación de lesiones 55 obtuvieron mayores tasas de éxito, los aloinjertos en fresco sin histocompatibilidad cruzada fueron los segundos y los de peor resultado, los aloinjertos congelados (STEVENSON Y COLS. , 1989). Algunos efectos se pueden atribuir al proceso de congelación de la pieza; mientras que otros parecen atribuibles a la respuesta del huésped al tejido histoincompatible. Todos los aloinjertos que habían sido congelados presentaban, en peso seco, una cantidad considerablemente menor de glicosaminoglicanos por miligramo, más hidroxiprolina y menor relación galactosamina-glucosamina que los injertos implantados sin criopreservación. La respuesta del huésped al tejido histoincompatible se manifestó como una pérdida de masa o sustancia cartilaginosa. Tras 11 meses in vivo, el peso en seco del cartílago de injertos incompatibles, como grupo, era significativamente menor que los injertos histocompatibles (STEVENSON Y COLS. , 1989). Los cambios degenerativos que se observaron en el cartílago articular eran similares a los de la artrosis, esto es, formación de osteofitos, pérdida de proteoglicanos, descenso en el cociente galactosamina-glucosamina, pocos cambios en el contenido de colágeno, medido éste como la concentración de hidroxiprolina y una sinovitis variable (MANKIN Y COLS. , 1970; MANKIN, 1974). La alteración de la transmisión de cargas secundaria a la inestabilidad postoperatoria resulta en una degeneración cartilaginosa, incluso en los autoinjertos (ENTIN Y COLS. 1968; KETTLEKAMP, 1972>. Sin embargo, en este modelo animal no se observaron cambios degenerativos en los autoinjertos, lo que lleva a pensar que los cambios degenerativos provienen de la respuesta del huésped a los aloinjertos más que a las fuerzas biomecánicas anormales que atraviesan la articulación. La apariencia histológica de las membranas sinoviales, con Introducción: reparación de lesiones 56 acumulación de células plasmáticas y linfocitos, parece apoyar la inmunogenicidad de los injertos. Además, los títulos de anticuerpos en las articulaciones que habían recibido los injertos frescos histocompatibles eran cuatro o cinco veces mayores que los títulos sistémicos de los mismos perros. Otros han documentado in vivo la síntesis intraarticular de lgM e lgG (MIMS Y COLS. , 1985). Esta respuesta inflamatoria-inmune puede desencadenar la cascada que ha sido descrita para los injertos osteocondrales en cáscara. Tras el implante, los aloinjertos osteocondrales masivos no pueden ser completamente protegidos de la carga y pueden sufrir colapso durante la incorporación, revascularización y sustitución. Además, éstos incluyen no sólo hueso cortical sino también hueso esponjoso en el área metafisaria. Esta zona presentaba un hueso con trabéculas más gruesas en los aloinjertos que en los autoinjertos (SIEVENSON Y COLS. , 1991), encontrándose directamente proporcional la cantidad de tejido fibroso intertrabecular a la inmunogenicidad del injerto, mientras que la superficie formadora de hueso presentaba una relación inversa. La porción metafisaria de un aloinjerto sujeto a cargas en el postoperatorio, presenta mayor número de trabéculas necrosadas y no reparadas que contribuye al colapso subcondral y la degeneración articular detectada en la clínica (MANKIN, 1983). No podemos dejar el capítulo de los aloinjertos osteocondrales sin recordar las precisas conclusiones del estudio experimental en conejos llevado a cabo por MARCO (1990). Este autor hace un minucioso estudio clínico e histológico de una numerosa serie de defectos osteocondrales tratados con autoinjertos inmediatos, aloinjertos inmediatos, aloinjertos refrigerados y Introducción: reparación de lesiones 57 aloinjertos congelados con y sin crioprotección, comparándolos con defectos sin injertar y concluyendo: 1. Los defectos osteocondrales sin injerto no se rellenan nunca con cartílago hialino, objetivándose solamente fibrocartílago. 2. Las condiciones fundamentales para la buena evolución de un aloinjerto osteocondral viable son una fijación estable, una alineación correcta de la superficie y una movilización precoz de la articulación. 3. Estas condiciones se obtienen preferentemente por encaje a presión y la actividad libre del animal de experimentación. 4. Cualquier alteración del ambiente pericartilaginoso provoca en el cartílago articular alteraciones demostrables sobre todo en microscopia electrónica. 5. No han existido diferencias estadisticamente significativas entre el grupo de aloinjertos y autoinjertos inmediatos. 6. Ninguno de los protocolos de conservación utilizados ha sido capaz de igualar los resultados obtenidos con los autoinjertos y aloinjertos inmediatos. 7. Los aloinjertos osteocondrales han demostrado una capacidad antigénica indiscutible. Esta antigenicidad disminuye con los procedimientos de congelación de las muestras. 8. La refrigeración y la congelación previa exposición a glicerol ha ofrecido los mejores resultados frente a las series control de auto y aloinjertos inmediatos. 9. El mejor protocolo de refrigeración resulta ser la conservación en suero salino isotónico a 40C durante 48 horas. Introducción: reparación de lesiones 58 10. Los agentes crioprotectores mejoran la viabilidad del cartílago postcongelación del mismo modo que en otras series. El glicerol demuestra superiores ventajas como agente crioprotector frente al DMSO. Del mismo modo, la velocidad de congelación influye en el resultado final. Debe ser lenta y controlada. 11. La temperatura de almacenamiento no afecta el resultado de la utilización posterior del cartílago, siempre que sea por debajo de -200C. 12. La pauta de congelación de mejores resultados es el pretratamiento de la muestra con el agente crioprotector escogido al 15% durante 60 minutos, enfriamiento lento hasta la temperatura de almacenamiento y descongelación a temperatura ambiente. Con respecto a la aplicación clínica de estos estudios, nuestro equipo presenta el estudio histológico y ultraestructural de un aloinjerto osteocondral fallido tras 20 meses de evolución (MARCO Y COLS., 1992) demostrando la conservación de la viabilidad del cartílago hialino tras este tiempo, sin mostrar alteraciones marcadas. Se objetiva una falta de paralelismo entre la evolución ósea y condral de la pieza, puesto que la porción subcondral del injerto estaba necrótica y en fase de sustitución por el lecho receptor, proceso interrumpido por la falta de incorporación completa a este nivel. En este trabajo, no se observa reacción inmune contra el injerto, sin sinovitis marcada ni pannus articular, así como una conservación del contenido de proteoglicanos de la matriz, demostrada por tinción con safranina O. Estos resultados nos hacen unirnos al grupo de autores que postulan que los factores mecánicos son más importantes que los biológicos en la supervivencia de los injertos (KANDEL Y COLS., 1977; OAKESHOTTYCOLS., 1988; RODRIGO, 1984). Introducción: reparación de lesiones 59 A modo de resumen, podemos decir que los aloinjertos osteocondrales son todos inmunogénicos, puesto que el cartílago es vulnerable a los mediadores de la inflamación de la respuesta inmune. La criopreservación reduce la inmunogenicidad (por mecanismos no del todo conocidos> pero reduce también la tasa de viabilidad celular condrocítica. Los aloinjertos en fresco histocompatibles son los que poseen el mínimo efecto inmunogénico y se incorporan bien. Por último, simplemente nombrar la liofilización de los injertos. Este método disminuye mucho su capacidad inmunogénica pero las propiedades biomecánicas de estos injertos los hacen poco útiles en la cirugía. • TRATAMIENTO CON TEJIDO AUTOLOGO: Constituyen la llamada artroplastia biológica, que reemplaza la pérdida cartilaginosa por injertos de tejidos, incluyendo fascia, músculo, tendón, periostio o pericondrio. • AUTOINJERTOS CONDRALES: MOSAICOPLASTIA Se denomina mosaicoplastia a la técnica de rellenar defectos condrales focales de espesor completo con discos de autoinjerto obtenidos de regiones alejadas de la zona de carga de esa misma articulación. STONE (1997) es pionero en esta técnica, presentando resultados preliminares en la articulación de la rodilla de 60 pacientes con defectos de diámetro medio de 213 mm. Los discos de autoinjerto son obtenidos de la zona intercondílea y peñcapsular En 11 biopsias posteriores a la cirugía, con un año de seguimiento medio, el autor encuentra cartílago hialino puro en 4 casos, una mezcla entre fibrocartílago y cartílago hialino en 5 y tejido fibrocartilaginoso en las dos restantes. Introducción: reparación de lesiones 61 Estudios recientes de cirugía experimental en animales han utilizado injertos osteoperiósticos y osteopericondrales, como el obtenido de la cobertura de los cartílagos costales (RITSILA Y COLS. ,1994) como fuente en grandes defectos osteocondrales creados en la rótula y cóndilos femorales en la zona de carga. Los resultados indican que es posible formar un tejido que rellene el defecto y tiene la apariencia macroscópica de cartílago hialino, compartiendo también sus características histológicas. Los estudios biomecánicos y bioquímicos indican también una gran semejanza. La neocondrogénesis se ha demostrado, mediante trazadores, provenir del injerto y no del hueso subcondral (RUBAK Y COLS. 1982). RITSILÁ Y COLS. (1994) demostraron algunos puntos importantes en la condrogénesis, determinando el ambiente como factor fundamental que determina la diferenciación de las células mesenquimales hacia la producción de hueso o de cartílago, siendo éste más importante que el fenotipo de las células trasplantadas. Parece ser que la tensión de oxígeno forma parte de este mecanismo, de modo que con una tensión de oxígeno baja se favorece el desarrollo de cartílago, mientras que si ésta es elevada, hay mayores probabilidades de obtener tejido óseo. Algún movimiento y transmisión de cargas normal a través de la articulación parecen ser importantes también en el proceso de regeneración. Los resultados clínicos de estos injertos varían considerablemente según los individuos y las articulaciones, siendo evidente que este tratamiento obtiene mejores resultados en pacientes jóvenes. Parece importante la selección previa de los candidatos a este tipo de injertos, por ejemplo, jóvenes con lesiones osteocondrales focales. La primera experiencia clínica con los injertos pericondrales fue llevada a cabo por HOMMINGA Y COLS. (1990), en una serie de 25 pacientes Introducción: reparación de lesiones 62 portadores de 30 lesiones condrales sintomáticas, de un grado de OUTERBRIDGE 111/1V. El autoinjerto fue obtenido de los arcos costales y adherido al defecto mediante un pegamento de fibrina. Una artroscopia de control fue realizada a los 10 meses, encontrándose 27/30 defectos rellenos de tejido semejante al cartílago. Tres biopsias obtenidas al año mostraron células parecidas a los condrocitos. Dos de las muestras mostraban una disrupción entre el cartílago y la unión ósea y una de ellas exhibía continuidad. Los inconvenientes fundamentales de esta técnica son: la morbilidad del sitio donante, la limitación del material (que a veces hace necesario el uso de varios sitios donantes en defectos grandes), la delaminación del cartílago del hueso subcondral y la posibilidad de osificación encondral del injerto. O’DRISCOLL (1996) presenta una serie de 1 2/20 pacientes tratados con injertos periósticos con resultados buenos o excelentes, resaltando la importancia de la selección preoperatoria de los pacientes y de una rigurosa técnica quirúrgica, puesto que pequeñas diferencias en la obtención del periostio alteran de forma dramática el número de células viables tras el procedimiento, y por tanto, la posibilidad de obtener un buen resultado. Introducción: reparación de lesiones 64 • IMPLANTACION DE CONDROCITOS O CELULAS MESENQUIMALES Consiste en la introducción de células formadoras de cartílago en los defectos condrales. Las células trasplantadas pueden sobrevivir y sintetizar matriz extracelular que toma la apariencia de un cartílago más normal que el tejido fibroso que rellena los defectos a los que no se añaden células. Los defectos condrales de pequeño tamaño pueden ser también rellenados con células indiferenciadas, mesenquimales o pluripotenciales, expandidas en cultivo in vivo o in vitro (TAKIGAWA Y COLS. , 1987, GRANDE Y COLS. 1989). Las células trasplantadas pueden sobrevivir y sintetizar matriz extracelular que toma la apariencia de un cartílago más normal que el tejido fibroso que rellena los defectos a los que no se añaden células. En el pasado, los resultados obtenidos con el implante de condrocitos aislados han sido poco alentadores por la falta de adherencia celular a los lugares de lesión (BENTLEY Y GRECI, 1971), o la formación de fibrocartílago o islotes de cartílago hialino rodeados de un magma fibroso (BENTLEY Y COLS. ,1978). Este problema se soluciona con la vehiculación de los condrocitos en matrices o mediante su mantenimiento dentro del defecto usando plastias pericondrales (PETERSON, 1996). Destacan en este campo los experimentos de GRANDE Y COLS. (1982) que utilizan cultivos de condrocitos para rellenar defectos condrales en conejos, encontrando la regeneración del cartílago en el 82% de los casos trasplantados en comparación con el 18% de relleno que mostraba el grupo control, no injertado. Un método posible de aplicación a humanos implica la obtención de células mesenquimales pluripotenciales o condrocitos, expandirlos en cultivo e implantarlos en una matriz artificial, colocándolo todo después en forma de Introducción: reparación de lesiones 65 relleno del defecto condral PETERSON Y COLS. 1982). Este autor presenta sus resultados de nuevo en Agosto de 1996, con una serie de 7 años de seguimiento y un 80% de resultados buenos y excelentes. El autor describe su técnica, consistente en la obtención de una muestra de tejido condral del paciente sin hueso subyacente, su cultivo in vitro tras la digestión enzimática del cartílago que separa los condrocitos de la matriz, con un medio de cultivo al que añade un 10% de suero del propio paciente. La implantación se hace mediante un procedimiento abierto, en el que se rellena el defecto condral y se recubre de una capa de periostio para mantener los condrocitos trasplantados en su lugar. Un grupo del Brigham and Womens Hospital (MINAS, SPECTOR, SHORTROFF Y COLS., en colaboración con BARONE, WRENN, GAGNE Y COLS. de la compañía Genzyme Tissue Repair de Cambridge, Massachussets, que comercializa la técnica cultivando los condrocitos extraídos dei paciente) publican en 1996 un estudio comparativo sobre el relleno de defectos condrales en perros, tratándolos con injertos periósticos, injertos periósticos + células cultivadas y grupos control; encontrando mejores resultados a corto plazo (6 meses) en el grupo que añade los condrocitos autólogos, que finalmente se equipara a los tratados sólo con injerto periostal al año. Los autores atribuyen estos malos resultados al modelo más que a la técnica, afirmando que los resultados en humanos son buenos hasta la fecha. Introducción: reparación de lesiones 67 TABLA.3. REVISION DE RESULTADOS BIBLIOGRAFICOS SOBRE EL TRATAMIENTO DE LOS DEFECTOS CONDRALES AUTORES N0 RESULTADOS EXCISION DEL CARTiLAGO DAÑADO Y HUESO COMENTARIOS SUBYACENTE Usado en el tto. de lesiones patelares FICAT Y 85 67 (79%> COLS. buenos o excelentes DESBRIDAMIENTO Y ABRASION EWING 223 163 (73%) mejoraron A >severídad< prob de buen resultado FRIEDMAN Y 73 44 (60%) mejor COLS 25 (34%) sin cambio 4 (5%> peor <40 años mejores resultados JOHNSON >400 75% satisfactorios 12% sin síntomas tras 2 a. SPRAGUE 9 51(74%) buenos 11(16%) malos 7 (10%) regulares INJERTOS PERICONDRALES HOMMINGA 25 pac. 28 (93%) mejor Y COLS 30 def. funcionalidad en defectos Biopsias mostrando tj. hialino. Resultados rellenos indep. de edad INJERTOS OSTEOCONDRALES MEYERS Y 40 31(78%) injertos COLS. cicatrizaron No recomendado para artritis. 1 3/3 1 (42%) excelente 14/31 (45%) bueno 4/31 (13%) regulares GROSS Y 92 69 (75%) éxito a 5 años COLS. 59 (64%) a 10 años 58 <63%) a 14 a. Mejores resultados en < 60 años ;necesaria fijación rígida del injerto MATRIZ DE FIBRA DE CARBONO MUCKLE Y 47 36 (77%) satisfactorios COLS. No sinovitis BRITTBERG 37 30/36 (83%) buenos o Y COLS. excelentes Alivio sintomático no efectos 2arios. TRASPLANTE DE BRITTBERG 23 Y COLS. Eliminación de bloqueos, reducción de dolor e inflamación CONDROCITOS AUTOLOGOS 14/16 (88%) femorales 2/7 (29%) patelares buenos o excelentes 47 (7 1%) mejorPETERSON 66 Introducción: métodos de conservación 68 • METODOS DE CONSERVACION DEL CARTILAGO el problema del injerto de órganos y tejidos no se puede resolver con éxito si no se crean métodos efectivos de conserveci6n’~ 8. PETRASCHEW, 1913. Conservación significa mantenimiento de la integridad, lo que supone la preservación de las cualidades biológicas de los tejidos. Desde finales del siglo XIX hasta el presente, múltiples estudios han intentado preservar condrocitos metabólicamente activos, bien en situación de aislamiento, bien incluidos en su matriz, de forma que constituyan un tejido viable capaz de ser trasplantado y mantener un cartílago articular resistente. ANTECEDENTES HISTORICOS El deseo de sustituir partes lesionadas o enfermas de nuestro organismo, incluyendo el aparato locomotor, ha sido constatado en multitud de documentos antiguos (BICK, 1968>. Los experimentos más antiguos sobre la conservación del cartílago se hacen sobre todo con cartílago hialino costal. Así, PRUDDEN en 1881 trasplanta cartílago hialino procedente de cabeza femoral y costal al tejido subcutáneo del conejo, exponiéndolas previamente a alcohol de 950 y objetivando la reabsorción completa de los injertos. También destacan las tempranas aportaciones prácticas de OLLIER (1867) y MACEWEN (1881). Sin embargo, las directrices contemporáneas fueron predichas e inspiradas por el trabajo de LEXTER (1908, 1925). Este autor realiza un trasplante hemiarticular completo (osteoarticular) informando de buenos resultados en el 50% de sus seguimientos. Introducción: métodos de conservación 69 Es CARREL en 1912 el que obtiene cartílago viable tras la implantación de cartílago costal en perros, habiéndolo almacenado previamente a 00C durante un máximo de 28 horas. OCONNOR Y PIERCE en 1938 publican que el cartílago conservado en suero salino y merthiolate no mostraba signos de reabsorción cinco años después de su implante. PEER en 1938 y 1939 contrasta la reabsorción del cartílago septal y costal humano trasplantado y conservado en alcohol en dos años con autoinjertos en fresco que presentaban apariencia normal tras seis años. BROWN concluye en 1940 que el aloinjerto cartilaginoso conservado es inferior al trasplante en fresco. En una larga serie, DUPERTUIS en 1941 publica la utilización de injertos cartilaginosos conservados en alcohol al 95%, merthiolate y suero salino; o bien, refrigeración durante 5 días, seguida de congelación y deshidratación. Los injertos procedían de pabellón auricular y costilla y fueron colocados heterotópicamente en tejido subcutáneo, describiendo la práctica destrucción completa de los mismos. En cambio, los auto y aloinjertos condrales en fresco de animales inmaduros crecían en los receptores. La publicación de varias series clínicas utilizando aloinjertos osteoarticulares masivos congelados (OTTOLENGHI, 1961; PARRISH, 1966; VOLKOV, 1970) evalúa positivamente la utilización de aloinjertos en la práctica diaria. Estas series se completan con los trabajos de GROSS Y COL. (1975) sobre el trasplante de pequeñas laminillas cartilaginosas en defectos de origen artrósico, los de MANKIN Y COLS. (1976) en grandes defectos tras la cirugía Introducción: métodos de conservación 70 tumoral o los de MEYERS (1978), que utiliza injertos osteocondrales en fresco para el tratamiento de defectos debidos a necrosis ósea. Muchas de estas series clínicas son todavía revisadas, destacando la serie del argentino OTTOLENGHI, que en 1982 presenta casos con 32 años de seguimiento, y que apunta a la degeneración cartilaginosa como principal causa del fallo a largo plazo de los injertos osteocondrales. METODOS DE CONSERVACION DEL CARTíLAGO Los métodos de conservación del cartílago están determinados por el uso clínico de los mismos. En la actualidad los aloinjertos osteocondrales de utilizan en dos situaciones muy diferentes. Así, en la cirugía de reconstrucción de grandes defectos, por ejemplo la cirugía tumoral, cuando se pretende conservar la superficie articular se precisa de piezas óseas con su correspondiente recubrimiento cartilaginoso. En otros casos, se trata de defectos o lesiones limitadas, como en el caso de las osteocondritis y osteonecrosis, requiriéndose una pequeña superficie condral con una mínima capa ósea de soporte que son los llamados “injertos en cáscara’, o el relleno con tejido con capacidad condrogénica que constituye la denominada “artroplastia biológica”. Por ello distinguiremos las técnicas de conservación de piezas de cartílago intacto de la conservación de células aisladas en forma de cultivo. En cualquier caso, el objetivo fundamental de todos los métodos de conservación del cartílago es la obtención de un material con un alto potencial de supervivencia y función una vez implantado. Ya desde 1960, HAGERTY Y COLS. concluyen de una serie de experimentos con ovejas, que los aloinjertos Introducción: métodos de conservación 71 de cartílago viable se comportaban mucho mejor que los no viables tras su implante quirúrgico. Ha habido muchos intentos de optimizar y evaluar la viabilidad de los condrocitos articulares de Jos injertos osteoarticulares de espesor completo antes de ser trasplantados (BEROGREN Y COLS. , 1981; BLACK Y COLS.,1979; BRAID Y COLS.,1966; BRIGHTON Y COLS.,1979; LANCE, 1972; SCHACHAR Y McGANN, 1986; SCHWARTZ Y COLS.,1981; THOMAS Y COLS. 1984; TOMFORD, 1986; TOMFORD Y MANKIN, 1983; YABLON Y COVALL, 1978). De forma general, estos estudios sugieren que la preservación óptima del cartílago intacto requiere condiciones diferentes a las habituales para el cultivo de condrocitos aislados. Por ejemplo, GROSS Y COLS. (1975) sugieren que sólo los aloinjertos articulares condrales en fresco sobre una fina cáscara de hueso subcondral aseguran el máximo de viabilidad cartilaginosa. YABLON Y COVALL (1978), trabajando sobre la hipótesis de que el almacenamiento del cartílago es una alternativa necesaria, informaron sobre la supervivencia celular óptima de piezas de cartílago intacto conservadas a 400. Otros autores han sugerido el uso de técnicas de cultivo tisular con vitaminas enzimas o inhibidores de proteasas para aumentar la viabilidad condrocítica durante el almacenamiento a 40C (BLACK Y COLS. , 1979; BRIGHTON Y COLS. , 1979; THOMAS Y COLS. 1984). El principal inconveniente de estas técnicas es su difícil adaptación a la conservación de grandes piezas osteocondrales. Otros autores preconizan la preservación a bajas temperaturas de los aloinjertos osteocondrales (SCHACHAR Y COLS. 1988, 1990, 1993). Hasta la fecha sin embargo, no hay estudios sobre el tiempo que perdura la viabilidad del cartílago articular tras la muerte del donante, especialmente durante las condiciones de refrigeración usuales en el estadio Introducción: métodos de conservación 72 postmortem. Tampoco está claro si la viabilidad celular tras el almacenaje es afectada por las condiciones habituales de éste, como es el sumergir las muestras en medio nutriente con antibióticos. El interés de trasplantar cartílago viable y funcionalmente intacto hace buscar marcadores que nos permitan conocer el potencial de una pieza antes de ser trasplantada. La síntesis de proteoglicanos se puede utilizar como indice específico de la actividad metabólica. Este parámetro puede ser calculado mediante la incorporación de radiosulfatos y se correlaciona de forma bastante lineal con otros marcadores de viabilidad y función articular como son el test de diacetato de fluoresceína y bromuro de etidio (FDA/EB) (CURRAN Y GIBSON, 1956). Introducción: métodos de conservación 73 CONSERVACION DEL CARTíLAGO INTACTO Los protocolos en uso para el almacenamiento y conservación del cartílago intacto incluyen: 1. REFRIGERACION. 2. CULTIVO DE CARTíLAGO INTACTO. 3. CONGELACIÓN. 4. LIOFILIZACIÓN. En este apartado trataremos el tema de la refrigeración de cartílago intacto, dejando las técnicas de cultivo y congelación para sus apartados correspondientes y exponiéndolas en comparación con la utilización de las mismas con condrocitos aislados. Dentro del apartado de refrigeración se incluyen los denominados ‘aloinjertos en fresco”, puesto que todo material donante se somete, al menos durante el tiempo necesario para la preparación del lecho receptor, a las condiciones que definen este método. REFRIGERACION : La refrigeración o conservación del injerto en hipotermia ( +4~ C, sumergiendo los fragmentos en suero salino generalmente) se plantea sólo en piezas pequeñas y con escaso soporte óseo. LOPEZ-OLIVA confirma en 1993 la utilidad de este método, limitado por el descenso de la viabilidad celular con el tiempo, sobre todo pasadas las primeras 48 horas. Este trabajo aporta la novedad de medir la viabilidad condral mediante citometría de flujo frente a métodos que la valoran sólo mediante la integridad de la membrana celular y Introducción: métodos de conservación 74 señala un descenso de 81.61% a 57.36% al pasar de 48 a 72 horas de refrigeración. Los resultados de esta serie son más optimistas que los publicados previamente. Así, RODRIGO Y COL. en 1980 realizan una serie conservando piezas osteocondrales a 40C valorándolas por autorradiografía y objetivando una viabilidad similar a los controles a las 6 horas, pero con una disminución al 79% a las 24 horas y 47% a las 48 horas de refrigeración. Estos mismos autores confirman sus resultados en ratas en 1987, marcando el límite de extracción de los injertos de los posibles donantes a las 12 horas. El inconveniente principal de la refrigeración como método de conservación es pues, su limitada durabilidad, añadiéndose un mayor riesgo de transmisión de enfermedades y una mayor respuesta inmunitaria. El relativo buen resultado clínico hace que este método siga utilizándose. McDERMOTT y COL. (1985) analizan los aspectos clínicos de 100 pacientes intervenidos a lo ¡argo de once años, con un seguimiento medio de 3.8 años. La mayor parte de los injertos fueron de la zona de carga de la rodilla, obteniéndose en condiciones estériles, e implantándose en menos de 24h. Durante este tiempo, permanecieron en suero salino con antibióticos. Estos autores obtienen un 75% de éxitos en los pacientes en los que la etiología del defecto articular era traumática, no siendo tan alentadores los resultados en los casos de artrosis u osteonecrosis. Dentro del mismo grupo anterior, OAKESHOTT Y COL. (1988) publican los resultados del análisis histológico de los aloinjertos frescos fallidos. De 18 casos estudiados y a pesar de que 15 casos presentaban desaxación de la interlínea articular, con progresión degenerativa, y 14 de ellos mostraban defectos técnicos, objetivo en 12 cartílago viable a pesar de las condiciones Introducción: métodos de conservación 75 adversas. Para estos autores, los parámetros básicos asociados con el fallo del injerto fresco son: patología previa del receptor, alteraciones en la alineación del miembro y defectos de técnica (inestabilidad en la fijación, incongruencia anatómica o tamaño inadecuado) CZITROM Y COLS. en 1990 determinan unas viabilidades del 66 al 99% en 3 aloinjertos osteocondrales en rodilla y codo, comprobadas por biopsia posterior a los 12, 24 y 41 meses del implante. La persistencia de condrocitos vivos fue sólo de 37% para otro caso de la misma serie con 72 meses de evolución. En una posterior publicación de este equipo ( BEAVER Y COL. 1992) se revisan las intervenciones postraumáticas obteniendo resultados buenos en el 75% de los casos a los cinco años, 64% a los diez años y 63% a los 14 años en una serie de 92 rodillas intervenidas. Por ello, recomiendan el uso de este tipo de aloinjertos en pacientes jóvenes y activos, considerando la supervivencia del injerto dependiente más de la técnica que del rechazo inmunológico. MEYERS Y COL. publican en 1989 una serie con una tasa de éxitos del 77%, independientemente del diagnóstico. En una serie de once casos llevada a cabo en nuestro servicio, y revisada a los tres años, el porcentaje de buenos resultados se elevó al 80% (MARCO Y COL, 1993). Como prueba de la popularidad de este método, existe en el mercado un instrumental diseñado para la extracción ortotópica del donante y después implantarla en el receptor. Su diseñador (GARRETT, 1994) publica 16 éxitos de 17 casos tratados, con un seguimiento de 3.5 años. Otro inconveniente a tener en cuenta, aparte de la biodisponibilidad de estos injertos, es su capacidad inmunogénica. El cartílago, desde LOEB (1926), Introducción: métodos de conservación 76 se ha considerado un tejido privilegiado desde el punto de vista inmunológico, considerándose pues, el hueso subcondral el responsable de la respuesta inmune por parte del huésped, ya que éste debe ser reabsorbido y reemplazado por hueso del lecho circundante. Es durante este proceso de invasión vascular y osteogénesis cuando el huésped se sensibiliza a los antígenos del injerto (LANE Y COL, 1977). Experimentalmente, el cartílago sobreyacente experimenta fibrilación, fragmentación y erosión produciéndose un pannus inflamatorio sinovial (ELVES, 1974; FRIEDLAENDER Y COLS. 1976; HALLORAN Y COLS. 1979>. SCHACHAR Y COLS. definen en 1994 el tiempo durante el cual permanecen los condrocitos articulares metabólicamente activos tras la muerte del donante, almacenando piezas de cartílago intacto en condiciones de refrigeración, comparándolas con las condiciones de las articulaciones in vivo, bañadas en un medio nutriente. Estos autores establecen entre 4 horas y 7 días el intervalo durante el que, de una forma razonable, pueden ser almacenados los aloinjertos a 40C para su uso clínico. Este periodo es suficiente para determinar la adecuada viabilidad del injerto, su tamaño y ausencia de patología o enfermedades transmisibles. Durante este tiempo, los injertos permanecen viables y retienen parcialmente su actividad sintética, en comparación con los aloinjertos frescos. De hecho, en la mayoría de los casos, se produce una estimulación de la actividad metabólica que tiene su pico a los 3 días de almacenamiento. Este aumento puede deberse a varias razones, entre ellas, a la exposición a un medio con nutrientes, que en estudios in vitro demuestra estimular la síntesis condrocítica (TOMFORD, 1986). Otra razón puede ser el simple “hinchado” del cartílago, que aumenta la superficie por la que puede introducción: cultivos celulares 78 • CULTIVOS CELULARES Los primeros intentos de cultivo de células de mamífero datan de principios de nuestro siglo, en una tentativa de mantener injertos tisulares in vitro (HARRISON, 1907; CARREL, 1912; ROUS Y JONES, 1916). El desarrollo consecuente de fórmulas complejas de medios de cultivo en los 50 estableció rápidamente una amplia variedad de líneas celulares (MORGAN, 1950; HEALY Y COLS. 1954) dando lugar a una herramienta de investigación de valor incalculable en los campos del desarrollo normal y la enfermedad de humanos y animales. Hoy, la disponibilidad de miles de líneas celulares animales y vegetales ofrece una fuente de material reproducible para todas las investigaciones médicas, veterinarias y del campo de la agricultura. Existen disponibles en todo el mundo colecciones de cultivos celulares, como la European Coilection of Animal Celí Cultures (ECACC; Salisbury; Reino Unido). Las células humanas cultivadas in vitro están incluidas en un ambiente artificial que se diferencia en muchos aspectos, algunos conocidos y otros no, de su hábitat normal in vivo. No existe un medio de cultivo que pueda imitar el ambiente in vivo y existen muchos y diferentes tipos de medio que experimentalmente se asocian con un mejor crecimiento de una determinada estirpe celular. Algunas células mueren inevitablemente y otras persisten a costa de perder o ganar características no observables in vivo. Ejemplos de estos cambios observados frecuentemente son la contaminación microbiana, anormalidades cromosómicas, pérdida de antígenos, pérdida de la capacidad proliferativa o muerte de la célula en cultivo. Introducción: cultivos celulares 79 TIPOS DE CULTIVOS Los sistemas de cultivo se dividen básicamente dependiendo de la densidad de población celular, el tiempo de cultivo desde el aislamiento de las células y de sí éstas crecen adheridas a un sustrato o en suspensión. Los cultivos de células recién aisladas se denominan cultivos primarios. Estos generalmente son heterogéneos y con una tasa de crecimiento baja, aunque suelen mantener las características celulares específicas mejor que los cultivos ya expandidos. El subcultivo o cultivo fraccionado permite un crecimiento celular más rápido y más uniforme, pero puede provocar una pérdida de la especialización debido a la desdiferenciación celular o inclusión de varias líneas celulares (FRESHNEY, 1992). Cuando la densidad celular es baja y los descendientes de las células únicas forman colonias pequeñas, el procedimiento se denomina “clonal”. El término “donación” hace referencia a los experimentos en los que un nuevo cultivo se establece desde una única célula progenitora. Todos los demás experimentos que impliquen la formación de colonias desde una sóla célula se llaman “crecimiento clonal”. Ambos tipos de experimento se pueden realizar tanto con células en suspensión como con células incluidas en substratos sólidos o semisólidos como el agar blando (MORRIS, 1995). Tras varios subcultivos una línea celular puede morir (línea celular finita) o transformarse en una línea celular continua, con una esperanza de vida infinita. Dado que esta transformación generalmente requiere mucho tiempo y conlíeva la aparición de propiedades diferentes, así como la evidencia de que existen células inmortales per se, como la mayoría de las células neoplásicas, se cree que la senectud y muerte es la norma mientras que la inmortalización es el resultado de una o más mutaciones genéticas . Los cultivos celulares densos (con muchas células incluidas en un sustrato) se denominan frecuentemente “cultivos en monocapa”. El crecimiento celular en los cultivos monocapa está limitado por la superficie disponible para dicho crecimiento (inhibición por contacto). Esta superficie puede aumentarse utilizando botellas rotadoras, que giran de tal modo que toda su superficie interna está tapizada por medio de cultivo, o mediante el uso de sistemas capilares de perfusión o con suspensiones de partículas microtransportadoras a las que las células pueden adherirse y multiplicarse. Los verdaderos cultivos en suspensión son aquellos en los que las células no están adheridas a un sustrato. Presentan la ventaja de manejar fácilmente volúmenes grandes de células y poder separarlas sin el uso de enzimas, haciendo subcultivos simplemente por dilución, así como la posibilidad de alcanzar un estado quiescente fenotípicamente estable si se precisa. Para ciertos tipos de células que no se unen unas a otras o a substratos, es imprescindibles este tipo de cultivos, como las células hematopoyéticas. Sin embargo, existen tipos celulares que precisan el contacto para crecer, como los fibroblastos o 3T3 (células embrionarias de ratón), que son incapaces de sobrevivir en medios tridimensionales. Introducción: cultivos celulares 82 celulares y la diferenciación histológica y bioquímica del tejido. En general, tras la extracción, se objetiva cierta necrosis central por el traumatismo inicial, y el tejido se mantiene en un estado de no crecimiento durante bastante tiempo. Los cultivos celulares alteran la organización estructural y alteran muchas veces las propiedades bioquímicas, pero generalmente pueden expandirse en replicados idénticos, pudiendo caracterizarse la población celular, purificarse y ser criopreservada. TABLA. 4. Ventajas de los cultivos celulares y de órganos Cultivo de órganos Cultivos celulares Histología Expansión Diferenciación Clonaje, selección y purificación Interacción celular (homo y heterotípica) Caracterización y preservación Interacción con la matriz Replicación y cuantificación CULTIVOS PRIMARIOS Se denominan así los cultivos de células recién aisladas, crecidas in vitro y antes de ser subcultivadas. El primer paso de estos cultivos es el aislamiento, llevado a cabo mediante disección estéril de la pieza de origen celular seguida de disgregación enzímática o mecánica. El tejido puede ser simplemente troceado en fragmentos del mm3 y las piezas dispuestas en bandejas donde se fijan por su adhesividad propia o usando plasma coagulado. En estos casos, las células crecerán hacia afuera del fragmento y pueden ser usadas directamente o subcultivarse. El fragmento de tejido o explante también puede ser tripsinizado y las células resembradas en un nuevo soporte constituyendo Introducción: cultivos celulares 83 un cultivo secundario y siendo técnicamente una línea celular, pues la disociación supone una selección celular. ELECCION DEL MEDIO DE CULTIVO La elección del medio para cada tipo celular es frecuentemente empírica. El medio no importa demasiado en las líneas celulares continuas, una de cuyas características es ésta, la independencia del medio. Pero las líneas celulares especializadas y los cultivos primarios suelen tener unos requerimientos específicos. El medio debe intentar otorgar a las células unas condiciones medioambientales lo más parecidas posible a los existentes en su ambiente in vivo de origen. De entre todos los fluidos utilizados para el cultivo celular, es el suero el que tiene una más amplia aceptación. En general, cualquier tipo celular requiere de un 5-20 % de suero para un óptimo crecimiento celular. Algunas de las funciones del suero son el proveer a las células de: 1. nutrientes básicos, en solución o unidos a proteínas; 2. hormonas y factores de crecimiento que estimulan la proliferación y las funciones especificas celulares, 3. proteínas de transporte (albúmina, transferrina, etc.), vitaminas, minerales, lipidos, etc. 4. factores de protección no específicos frente al daño mecánico; viscosidad (fuerzas de cizallamiento durante la agitación de las suspensiones celulares) 5. inhibidores de proteasas; 6. Tamponamiento del pH (MAURER, 1995). Introducción: cultivos celulares 85 Existen actualmente pocos estudios sobre el cultivo de condrocitos humanos, debido sobre todo a la yatrogenicidad de obtención. El súbito interés surgido en la comunidad científica ortopédica debido a la posibilidad de reparación de lesiones condrales con condrocitos autónomos expandidos in vitro (PETERSON, 1996> ha estimulado la investigación en este terreno, hasta entonces escasa. La obtención se realiza bien de las articulaciones diartrodiales recubiertos de cartílago, fácilmente obtenible rasurándolos con un bisturí, en cuyo caso son condrocitos maduros y diferenciados, o bien de la zona de crecimiento de los huesos largos de animales inmaduros, obteniéndose así condrocitos de mayor capacidad de reproducción, son los condrocitos de la placa de crecimiento. El aislamiento de los condrocitos se lleva a cabo mediante la incubación con distintas enzimas que digieren la matriz, siendo filtrados y centrifugados para eliminar residuos celulares. Desdichadamente, la simple exposición a enzimas proteolíticas puede dañar las células de mamífero (HEFLEY Y COLS., 1981; LAWS Y COLS., 1984). Para obtener el máximo número de células de una porción cartilaginosa es necesario llevar a cabo una digestión que permita aislarlas de la matriz extracelular sin lesionar su membrana. Los métodos publicados para el aislamiento de condrocitos se basan en la experiencia empírica e implican la exposición aislada, seriada o simultánea a varios enzimas. La concentración de los enzimas, duración de la digestión, composición del medio de digestión, silos recipientes donde se realiza deben ser o no agitados y otros detalles varian ampliamente de unos autores a otros. Las distintas técnicas deben ser evaluadas sobre la base del número de células obtenidas y al ritmo de crecimiento en cultivo. Introducción: cultivos celulares 88 En general, los cultivos de condrocitos se caracterizan por varios criterios que incluyen una alta absorción de SO4 y transformación de éste en condroitín sulfato, la tinción metacromática con azul de toluidina y la capacidad de los condrocitos de sobrevivir en cultivos en suspensión. Los condrocitos deberían ser la única célula capaz de sintetizar colágeno tipo II. Sin embargo, el tipo de colágeno producido por los condrocitos en cultivo se ha demostrado dependiente de las condiciones extracelulares. Como norma, los condrocitos en cultivos en monocapa producen colágeno tipo 1 (BENYA Y COLS 1978; BENYA Y SCHAPFER 1982) y en cultivos en suspensión, colágeno de tipo II. Sin embargo, cuando los cultivos en monocapa se manipulan, impidiendo la adhesión celular, tratándolos con citocalasina B o dejándolos crecer en gel de agarosa o alginato, los condrocitos se redondean y recuperan su fenotipo habitual (BENYA Y SCHAFFER 1982, BENYA Y BROWN, 1986, BASSLEER Y COLS, 1986 ; AULTHOUSE Y COLS, 1989), apareciendo tras 3 ó 4 semanas formando colonias y rodeadas de un halo de matriz que rodea las células. Estos condrocitos reexpresan marcadores propios del cartílago, como los proteoglicanos sulfatados o la tinción con Safranina O. Este proceso de rediferenciación ocurre tanto in vitro como in vivo en la articulación, y parece ser la clave de la regeneración con éxito del cartílago articular mediante condrocitos autólogos cultivados, puesto que los condrocitos cultivados en monocapa proliferan rápidamente, mientras que los incluidos en matrices semisólidas forman grupos celulares y sólo las células situadas en la periferia muestran divisiones celulares. Los condrocitos situados en el centro de estas agrupaciones son pronto rodeados de matriz extracetular y entran en un periodo Introducción: cultivos celulares 89 quiescente. La síntesis de nuevo colágeno tipo II parece empezar a las dos semanas de la resuspensión (BARONE, 1996). Sin embargo, aunque con una tasa de proliferación menor, los condrocitos en cultivos tridimensionales son capaces de crecer y proliferarse en mayor medida que en el cartílago in vivo. FIG.28. Medida de la proliferación de los condrocitos en alginato usando Ac. monoclonales anti- bromodeoxyuridina que detecta la Uridina marcada que se incomora al DNA celular. Se observa una caída de la proliferación el primer dia, probablemente debida a la adaptación celular al nuevo medio. 0.7 0.5 0.3 0.1 abs 414nm El consumo de glucosa en las células en cultivo aumenta en relación directa con el tiempo transcurrido. Las células en gel muestran un consumo menor probablemente debido a la tasa metabólica restringida por el sustrato gel, por lo que esta forma de cultivo facilita el almacenamiento y el uso de las células en situaciones hostiles o inusuales (RAMDI Y COLS. , 1993). De esta forma, el cultivo en monocapa permite la rápida expansión celular y los cultivos en agarosa permiten estudiar mejor determinados procesos, como la síntesis de proteoglicanos y colágeno tipo II. 2 4 tiempo (días) Introducción: cultivos celulares 90 El uso de alginato (polisacárido lineal compuesto por n moléculas de ácido L-manurónico + ácido D-glucurónico, que forma geles en presencia de calcio u otros cationes divalentes) ofrece la ventaja de poder ser solubilizado mediante la adición de quelantes y obtener las células sin precisar una nueva digestión enzimática, de modo que se pueden estudiar la distribución y renovación de los proteoglicanos en cultivos tan prolongados como de 8 meses (HAUSERLMANN Y COLS., 1994). Este método de cultivo ha permitido demostrar que los condrocitos mantienen su capacidad de sintetizar moléculas específicas del cartílago, tales como colágeno tipo II o proteoglicanos ricos en queratán sulfato. Los condrocitos mantenidos en monocapa sintetizan cantidades crecientes de colágeno tipo 1 y de proteoglicanos no agregantes (VON DER MARK, 1986). La importancia de este descubrimiento reside en la participación de los proteoglicanos agregantes (que incluyen fibronectina, laminina, vitronectina, fibrinógeno y colágeno tipo IX) en los procesos de adhesión celular a los substratos a través de proteínas receptoras de membrana específicas denominadas integrinas, a diferencia de los proteoglicanos no agregantes (trombospondina, tenascina, SPARC y dos clases del proteoglicano dermatán sulfato recientemente descritas: tipo 1 o biglicano y tipo II o decorina - ROSENBERG Y COLS., 1985-) que parecen inhibir las fases iniciales de la adhesión celular mediante enlaces covalentes con la fibronectina. La síntesis de ambos tipos de proteoglicanos por parte de los condrocitos explica su capacidad de supervivencia tanto en cultivos monocapa como tridimensionales. Su proyección en la práctica clínica consistiría en solucionar los problemas de unión entre la porción condral de los aloinjertos osteocondrales al cartílago receptor (ASTON Y BENTLEY, 1986; MALININ Y Introducción: cultivos celulares 91 COLS., 1985; MARCO, 1990) mediante la adición de sustancias estimuladoras de la adhesión celular como el heparán sulfato (HEREMANS Y COLS. 1990), la fibronectina (WEST Y COLS. ,1979), el ácido retinoico (BENYA Y PADILLA, 1988> y las citocalasinas B y D (ROSEN Y COLS. 1986); o inhibición de los inhibidores con sustancias como la proteína central de los propios proteoglicanos del dermatán sulfato (BIDANSET Y COLS. 1992), la vimentina (BEN-ZE’EV, 1984) y la colehicina (BROWN Y BENYA, 1988). El estudio de los efectos de estas sustancias en los cultivos de condrocitos ha llevado a la hipótesis de una trasducción entre la forma celular y el genoma celular a través del estado de organización de los microtúbulos (BENYA, Y COLS. 1988>. Esto ha permitido desarrollar cultivos de condrocitos en monocapa que aunque fenotípicamente aplanados, sigan sintetizando colágeno tipo II como los condrocitos diferenciados, mediante la adición de sustancias como ácido ascórbico, hidrocortisona, FGF, y otras, sin precisar de los cultivos tridimensionales (ADOLPHE Y COLS. ,1984; LAYMAN Y COLS. ,1972). El cultivo de condrocitos humanos posee inconvenientes adicionales a los cultivos de otras células humanas, como tasas de infección que alcanzan del 25% al 68% (Dl BARTOLOMEO Y COLS.; 1990, TAYLOR Y COLS.; 1994; CORLETT Y LACY, 1988), o la disminución de la viabilidad celular sin subeultivos. RAMD¡ Y COLS. demuestran en 1993 la disminución de la viabilidad condrocítica medida con el test de Azul tripán desde un 94.5% a un 67% en 7 días de cultivo. El almacenamiento de los cultivos a 40C durante 20 días arroja unas viabilidades del 60%, lo que sugiere este método como ideal para la preservación a largo plazo de los cultivos. El uso de estimuladores del Introducción: cultivos celulares 92 crecimiento y proliferación celulares, como el factor crecimiento transformador beta (TGF-I3) puede ser útil en el mantenimiento de los cultivos a largo plazo. El efecto de este factor parece dependiente del tiempo de cultivo de los condrocitos además de mostrar una actividad dependiente de la dosis. Así, el TGF-13 inhibe la síntesis de DNA y proteoglicanos en los condrocitos recién aislados cuando se halla en cantidades superiores a 1 ng/mí, mientras que estimula su proliferación y síntesis de componentes matriciales en los cultivos en monocapa y en concentraciones inferiores a 1 ng/mí, que es el máximo a partir del que, tiene menor efecto estimulante a mayor dosis (O’KEEFE Y COLS., 1988; HIRAKI Y COLS. 1988). En la clínica, este factor se encuentra en concentraciones muy elevadas (hasta 3.6ng/ml) en el líquido sinovial de las articulaciones artrósicas (FAVA Y COLS. ; 1989). Introducción: cultivos celulares 93 CULTIVO DE ORGANOS El cultivo de cartílago intacto se puede considerar dentro de los cultivos de órganos. Estos, como ya hemos apuntado, consisten en la explantación y crecimiento in vitro de órganos o parte de ellos en los que los componentes del tejido, como el estroma y el parénquima, y su relación anatómica y función, se preservan de forma que el tejido explantado se asemeja mucho a su tejido de origen in vivo (LASNITZKI, 1995). Fue LOEB (1897) el primero que cultivó fragmentos de hígado de rata, riñón, tiroides y ovario sobre coágulos de plasma dentro de un tubo de laboratorio encontrando que éstos mantenían su estructura histológica normal al menos 3 días. Este trabajo se adelanta en 10 años a la introducción de los cultivos de órganos por HARRISON (1907). Los cultivos de órganos poseen el factor negativo de su corto período de vida. Incluso en las situaciones más óptimas, el cultivo de órganos no ha sobrepasado los pocos meses, y depende en gran medida del tejido cultivado. CULTIVO DE CARTíLAGO INTACTO En el caso de cartílago intacto, se denomina en general tejido fresco a aquel que ha sido mantenido fuera de su lugar de extracción menos de 72 horas, y tejido conservado al que ha sido mantenido in vitro durante un período de tiempo mayor. Mediante técnicas de cultivo de tejidos, fragmentos de cartílago se han mantenido en medios de cultivo y con temperaturas por encima de los 00C con la adición de varios aditivos nutricionales y antibacterianos, como vitamina E, aminoácidos esenciales, suero de ternera fetal, y otros, hasta 6 meses tras su extracción (BRIGHTON, 1979). Dada la importancia clínica de los injertos osteocondrales, piezas de cartílago con fragmentos de hueso Introducción: cultivos celulares 94 subcondral se han cultivado también con éxito (BLACK Y COLS. 1979>, observándose además un descenso de la inmunorreacción siguiente al trasplante si el tejido osteocondral fue mantenido a 40C (RODRIGO Y TRAVIS, 1987). Como en otros tipos de tejido, el cartílago humano ha demostrado mantener su polaridad con el cultivo (LAFEBER Y COLS. , 1993), observándose una correlación lineal entre el contenido de glicosaminoglicanos, captación de ~~SO4y contenido en DNA con el peso en seco de la muestra y con los días de cultivo transcurridos. La elección del medio de cultivo es crucial para la supervivencia del cartílago. BULSTRA Y COLS. (1994> encuentran una inhibición del metabolismo condrocítico con tan sólo 1 hora de incubación de rótulas intactas de rata en distintos medios (suero salino, Ringer lactato, solución de Ringer, Ringer con 5% de glucosa y Betadine) a 3700 en una atmósfera de 5% de C02. Los porcentajes de inhibición metabólica con respecto a los controles (incubados en medio M199 con 10% de suero de ternera fetal, además de glutamina, ácido ascórbico, penicilina, anfotericina y estreptomicina) varian desde un 5% (solución de Ringer) hasta un 55% (Betadine, que además era la única solución que provocaba un reblandecimiento macroscópico del cartílago). Sin embargo, el cultivo de explantes de cartílago incubados en medio con suero de ternera fetal estimula la síntesis y disminuye la degradación de proteoglicanos de la matriz por parte de los condrocitos (CAMPBELL Y COLS. ,1984; HASCALL Y COLS. 1983). El cultivo de tejido osteocondral en óptimas condiciones, con cambios frecuentes del medio, permite mantener la viabilidad condrocítica y las Introducción: cultivos celulares 95 propiedades biomecánicas del injerto, haciéndolo adecuado para el trasplante y relleno de defectos. Si comparamos piezas de tejido mantenido en cultivo a 40C durante 3, 7,14 y 28 días, con piezas osteocondrales recién extraídas, destaca el mantenimiento de la arquitectura normal incluso con tinción de Safranina O (KWAN Y COLS. ; 1979); objetivándose como diferencia fundamental con los controles un aumento de la tinción pericelular. Este aumento de la coloración parece ser debido a una población más densa de glicosaminoglicanos alrededor de las células, aunque los resultados bioquímicos indican un contenido total de colágeno y glicosaminoglicanos semejante a las piezas frescas. La mayor parte del colágeno era tipo II y las células estaban vivas, con un aumento de la captación de 355 con el tiempo. Estudios biomecénicos de las piezas almacenadas indican diferencias estadísticamente no significativas con respecto a los controles tanto en lo que a permeabilidad como rigidez de la matriz ante las cargas de compresión. Aunque no son numerosas las referencias bibliográficas sobre los estudios in vitro de la capacidad de reparación del cartílago, SCULLY Y COLS. (1991) examinaron el potencial de cicatrización de explantes cartilaginosos mantenidos en cultivo. Así, objetivan un material de relleno acelular que se repuebla de células a las 3-6 semanas. Este proceso posee también una dependencia estrecha del medio utilizado, siendo una combinación de PBS, TGF-l31 y BFGF el que se correlaciona con una mayor capacidad regenerativa. Basándose en estos resultados, REINDEL Y COLS. (1995) diseñan un modelo para el estudio del fenómeno de reparación in vitro, colocando dos piezas de cartílago intacto yuxtapuestas (con un área de contacto en ambas superficies de 4 x 5 mm) y en un sistema de cultivo, demostrando que el proceso de Introducción: cultivos celulares 96 reparación ocurre en la interfase de las dos piezas cartilaginosas y depende del metabolismo celular y del tiempo durante el que se mantiene el sistema en cultivo. A estos estudios in vitro se añaden otros llevados a cabo por el mismo grupo (OATES Y COLS. , 1995) que prosiguen el experimento mediante la implantación en un modelo in vivo del tejido conservado en condiciones de cultivo, comparándolo con piezas semejantes en forma de autoinjerto y aloinjerto en fresco. Estos autores no encuentran diferencias significativas en cuanto al contenido de glicosaminoglicanos o propiedades biomecánicas en los distintos tipos de injerto tras 14 días de cultivo, aunque no han sido capaces de prolongar el experimento hasta 60 días. Los autores defienden el cultivo frente a otros métodos de conservación del cartílago hasta su implante. Este optimismo se justifica, frente a los resultados menos alentadores de otros autores (JIMENEZ Y BRIGHTON, 1983; BRIGHTON, 1990) por la falta de consideración de la reversibilidad de los cambios objetivados in vitro cuando los injertos se recolocan en su entorno sinovial normal. Otras razones aludidas para el fallo de los aloinjertos son defectos técnicos, inclusión de excesivo espesor de hueso subcondral en la pieza o trasplante de ambas superfIcies articulares, factores que experimentalmente se relacionan con una tasa de fallos mayor (PAP Y KROMPECHER, 1961; BEAVER Y COLS. , 1992; CONVERYYCOLS. ,1991>. Introducción: criopreservación del cartílago 97 • CRIOPRESERVACION DEL CARTILAGO La reproducibilidad de resultados y la continuidad en la investigación de los procesos biomédicos depende, en gran medida, de la obtención de células vivas genéticamente estables. El cultivo celular seriado conlíeva un gasto de tiempo considerable y puede complicarse con la contaminación o la mutación genética según se seleccionan porciones de la población celular inicial progresivamente más pequeñas. Estabilizar las células a temperaturas criogénicas, que, a efectos prácticos, detienen el tiempo, se denomina criopreservación. La criopreservación es la técnica preferida para trasplantes en el sistema musculoesquelético, hematológico y reproductivo en humanos. Consiste en la congelación de tejido vivo para su almacenamiento y utilización posterior La influencia de las temperaturas por debajo de 00C en los tejidos orgánicos es estudiada por la criobiología, especialidad cuyo objetivo fundamental es el mantenimiento de la viabilidad celular en los tejidos durante su almacenamiento a bajas temperaturas. Han pasado más de 40 años desde que se demostró la forma efectiva de congelar reversiblemente tejido biológico, realizándose por primera vez en espermatozoides (POLGE, 1949) y extendiéndose posteriormente su uso a eritrocitos (SMITH, 1950), cultivos celulares vegetales (LATTA, 1951), microorganismos (HECKLEY, 1978) y muchas otras especies y tejidos distintos. Tanto los organismos uni o pluricelulares sufren lesiones más o menos reversibles cuando son sometidos a cambios de temperatura o a procesos de congelación. La destrucción de células y tejidos se ha limitado mediante el uso Introducción: criopreservación del cartílago 98 de congelaciones programadas, ritmos de congelación controlados y el uso de agentes crioprotectores. MECANISMOS DE LESION CELULAR EN LA CONGELACION Los mecanismos por los que una célula es lesionada por los cambíos de temperatura son sólo parcialmente conocidos, aunque se sabe que la lesión celular crioinducida tiene un origen multifactorial. A las jesiones provocadas por el descenso de temperatura, que se concentran fundamentaimente a nivel de la membrana celular, siendo éstas irreversibles alcanzado determinado punto, se añaden las lesiones provocadas por el cambio de estado del agua (MAZUR, 1984) y el estrés osmótico que coníleva. Para la supervivencia de una célula o ser vivo a la congelación son necesarias tres condiciones básicas: que la formación de hielo sea controlada, que la estructura y función celulares, sobre todo su membrana, no sufran daños irreparables y por último, que la viabilidad celular se mantenga tras la congelación (STOREYY STOREY, 1992). Contrariamente a lo que se supone, el reto de las células durante la congelación no reside en la duración de su almacenamiento a bajas temperaturas sino el efecto letal que supone una zona intermedia de temperatura, situada entre -15 y -600C aproximadamente, en la que la célula debe atravesar en dos ocasiones (durante la congelación y la sucesiva descongelación). No existen reacciones químicas en los sistemas acuosos a temperaturas de nitrógeno líquido (-1960C) puesto que el agua líquida no existe por debajo de los -1300C. El único estado físico que pueden tener lugar es el sólido, amorfo o cristalino, y en él, la viscosidad es tan alta (> 1013 poises) que Introducción: criojxeservación del cartílago 99 la difusión es despreciable en tiempos inferiores a los geológicos (McGEE Y MARTIN, 1962). En un sistema biológico acuoso, el fenómeno de la cristalización tiene lugar de forma preferente en el espacio extracelular. Todas las soluciones acuosas tienen un punto de congelación de equilibrio, que corresponde a la temperatura a la que un cristal de hielo colocado en la solución empieza a crecer. Pero todas las soluciones acuosas pueden ser también sobreenfriadas; es decir, pueden enfriarse muy por debajo del punto de congelación de equilibrio sin que por ello el agua cristalice espontáneamente en forma de hielo. Así, el plasme humano tiene el punto de congelación a ~8oC;ahora bien, cuando lo enfriamos de forma controlada, puede ser sobreenfriado hasta -16~C. La velocidad de congelación, es pues, fundamental en el proceso de lesión celular crioinducida (MAZUR, 1977). Si la velocidad es demasiado rápida, producirá enfriamiento de las soluciones intracelulares y cristalización del hielo celular, factor más letal en este proceso. Así ocurre con la congelacián rápida hasta -1 500C, que provoca la microcristajización del espacio intracelular, mientras que la congelación progresiva hasta temperaturas comprendidas entre -15 y -6O~C (que es el rango de temperaturas que alcanzan la mayoría de los congeladores comerciales) conduce a la formación de hielo extracelular que destruye las membranas citoplasmáticas y la arquitectura del medio ext racel ular. Sin embargo, la presencia de nucleadores limita la extensión del sobreenfriamiento. Llámanse nucleadores los compuestos que provocan el crecimiento del hielo al proporcionar puntos de enlace que ordenan las moléculas de agua en la estructura reticular del hielo. El propio hielo es el mejor Introducción: criopreservación del cartílago 100 nucleador, pero las proteínas plasmáticas, bacterias extrañas y partículas alimenticias actúan asimismo como eficaces nucleadores. El comienzo de la formación de hielo en el fluido extracelular hace que el ritmo de congelación se mantenga lento y controlado y el tamaño de los cristales de hielo, relativamente pequeño. Los nucleadores actúan favoreciendo el control del proceso de cristalización. La acción de las proteínas nucleadoras del hielo asegura que el proceso de congelación inicial provoque la dispersión de miles de pequeños cristales de hielo, termodinámicamente inestables. Esta inestabilidad hace que los cristales de hielo tiendan a reconstituirse, con el tiempo o con un descenso mayor de la temperatura. La recristalización da lugar a mayores cristales y a una lesión tisular más extensa. Esto explica que la supervivencia celular sea mayor a velocidades rápidas de descongelación pues se evita la recristalización (MAZUR, 1970). La observación de insectos tolerantes a la congelación dio lugar al descubrimiento de la existencia de proteínas anticongelantes en estos animales, que controlan el tamaño de los cristales de hielo, y cuya existencia se predice en muchos sistemas biológicos. Así, la estructura del hielo es controlada por dos tipos de proteínas: las proteínas nucleadoras del hielo, que inician la formación de hielo extracelular y las proteínas anticongelantes, que estabilizan los cristales en un tamaño pequeño e inofensivo. La membrana celular, semipermeable, que separa los compartimentos extra e intracelulares, permite el libre trasiego de agua y de algunos solutos, pero restringe el movimiento de otros compuestos, de modo que cuando se forma hielo fuera de las células, esto cambia el equilibrio de agua y solutos en el interior de aquellas (FARRANT, 1980). Introducción: criopreservacidn del cartílago 101 El hielo es un cristal de agua pura. A medida que el hielo extracelular se va formando, excluye de su estructura solutos tales como sales, azúcares y proteínas. Así, el fluido extracelular restante se hace cada vez más concentrado. Este proceso supone un estrés osmótico para la célula (LOVELOCK, 1965), puesto que la concentración total de solutos a ambos lados de la membrana celular debe equilibrarse siempre, por lo que fluye agua del interior de las células y los solutos penetran en su interior. La lesión más grave durante la congelación afecta a la membrana celular, puesto que la salida de agua provoca un descenso del volumen celular. Si éste disminuye por debajo de un mínimo crítico, la bicapa de fosfolípidos de la membrana se comprime tanto que se rompe, perdiéndose las funciones de transporte y creándose una puerta de entrada para que el hielo se propague al interior celular al tiempo que se vierte el contenido celular al exterior. El volumen celular crítico para la mayoría de las células se alcanza cuando el 65% del agua se encuentra en forma de hielo (MARYMAN, 1971). Este volumen es bastante constante y depende únicamente de la presión osmótica externa, mientras que el ritmo en el que sucede la contracción celular depende intensamente de la temperatura y se calcula experimentalmente en un período de 2 minutos el tiempo que tarda la célula en responder al aumento de la presión osmótica externa mediante el flujo de agua intracelular (McGANN Y COLS., 1988). Introducción: criopreservación del cartilago 104 3. Alteración de las propiedades físicas de la solución residual: pH, viscosidad, etc. 4. Generación de burbujas gaseosas y campos eléctricos en la interfase hielo- solución que pueden interactuar con la membrana; 5. Concentración extracelular de solutos con efectos sobre el potencial de agua; 6. Reducción de volumen del citoplasma; 7. Concentración de los solutos citoplasmáticos y 8. Efectos de un citoplasma concentrado sobre los compartimentos intracelulares. Las estrategias creadas para minimizar el daño producido por estos factores son: 1. El uso de crioprotectores; 2. La utilización de protocolos de congelación que controlan la velocidad de enfriamiento. CRIOPROTECTORES Los agentes crioprotectores son compuestos que contrarrestan estas tensiones sobre la estructura celular. Tradicionalmente se dividen en dos grupos: 1. Los crioprotectores no penetrantes o de membrana interactúan con los fosfolípidos de la misma para extender la bicapa y estabilizar su estructura. 2. Agentes penetrantes: suelen ser de bajo peso molecular que evitan de diversas maneras las lesiones provocadas por los cambios de volumen durante la congelación son también denominados coligativos. CRIOPROTECTORES NO PENETRANTES O DE MEMBRANA. Introducción: criopreservación del cartílago 105 Son moléculas que pueden ejercer su acción protectora en pequeñas cantidades. Compuestos naturales que realizan esta función son la trehalosa y la prolina. Para SHIER (1986), la estabilización de las membranas celulares se produce por fluidificación de las mismas. Al aumentar la fluidez, los orificios producidos por los cristales de hielo que se propagan a través de las membranas pueden volver a sellarse durante el proceso de descongelación. Su acción beneficiosa es óptima en los ritmos de congelación rápidos. La adición de un agente crioprotector extracelular reduce el ritmo máximo de congelación y aumenta el porcentaje de recuperación celular, En el caso de eritrocitos humanos, por ejemplo, se puede aumentar el ritmo de congelación hasta 200C por segundo y conseguir un 97% de células viables al añadir polivinilpirrolidona (PVP) en una concentración tan baja como 3 mM (RINFRET Y COLS. , 1962). Otros compuestos con capacidad semejante son sacarosa, lactosa, glucosa, manitol, sorbitol o el polímero hidroxietil-almidón. Las observaciones experimentales de MERYMAN (1971) sobre el aumento de la concentración intracelular de potasio en eritrocitos tratados con estas sustancias hace postular a este autor un segundo método protector al permitir un flujo reversible intra-extracelular de solutos durante la congelación y descongelación, con la contrapartida de incapacitar la defensa celular ante los efectos irreversibles de los gradientes osmóticos excesivos. Este tipo de crioprotectores se utilizan de forma preferente como “criofijadores” de tejidos para su estudio estructural y microscópico. En este sentido presentan las ventajas de un bajo nivel de interferencia con las membranas y estructuras celulares y su acción rápida, de modo que con 15-30 Introducción: criopreservación del cartilago 106 minutos de incubación de la muestra, ésta se halla en condiciones de estudio (SKAER Y COLS., 1978). CRIOPROTECTORES PENETRANTES O COLIGATIVOS Los crioprotectores coligativos ayudan a limitar, mediante la acción osmótica, la cantidad de hielo que puede formarse, el agua que las células pueden perder y, por tanto, la constricción del volumen celular durante la congelación. Actúan, por tanto, disminuyendo la temperatura de nucleación del hielo y son especialmente útiles en los ritmos de congelación lentos. Por ejemplo, en embriones de rata, esta temperatura desciende de -150C en suero salino a -440C en soluciones que contengan tanto DM50 como glicerol (RALL Y COLS., 1983). Este efecto tiene lugar gracias a la impermeabilización de la membrana al hielo extracelular (RULE Y COLS., 1980), la reducción o eliminación de los mecanismos heterogéneos de formación de hielo (RASMUSSEN Y McKENZIE, 1972) y/o el mantenimiento de una distancia de seguridad entre la membrana plasmática y el hielo extracelular (RALL Y COLS., 1983). Dos inconvenientes al uso generalizado de estas sustancias son: 1. La penetración en las células debe ser uniforme y sin implicar mayores gradientes osmóticos en sí mismos, 2. Se requieren concentraciones multimolares de estas sustancias para llevar a cabo su acción crioprotectora (generalmente de 2 a 4 molar) por lo que resultan tóxicos para muchos sistemas celulares. Los polihidroxialcoholes, como el glicerol, realizan esta función. Estas sustancias se encuentran de forma natural en la sangre de algunos anfibios tolerantes a la congelación, como la ranita arbórea gris (HyIa vers¡color) y Introducción: criopreservación del cartílago 107 fueron introducidos en la criopreservación por POLGE Y SMITH en 1949. Estos compuestos no cristalizan espontáneamente a bajas temperaturas y atraviesan las membranas con facilidad. Entre los crioprotectores artificiales destaca el dimetilsulfóxido (DMSO), que ofrece una protección física excelente, aunque presenta efectos tóxicos sobre el metabolismo celular. En las temperaturas cercanas a la congelación, estos compuestos actúan como moléculas intracelulares adicionales, ejerciendo un efecto físico o coligativo, aumentando la concentración de solutos intracelulares y reteniendo agua dentro de la célula y aumentando su viscosidad, lo que previene la disminución brusca del tamaño celular (MERYMAN Y COL, 1977). La supervivencia celular mediada por el agente crioprotector se produce al mantener el estrés osmótico dentro de los límites tolerables (TAKAHASHI Y COL, 1988), propiedad que ostenta el DMSO debido a su alta afinidad para puentes de hidrógeno (DOEBBLER Y RINFRET, 1962). Estas uniones retendrían el agua en la célula durante más tiempo conservando un medio intracelular más normal durante la congelación. El mejor grado de protección para los sistemas celulares de mamíferos se ha conseguido utilizando DM80 o glicerol al 5-10%. Tanto para el DM80 como para el glicerol se atribuyen ciertas propiedades de estabilización de membrana, semejante a las de los crioprotectores no penetrantes, además de las coligativas propias (LEIBO Y COLS., 1970). Parece ser que el DM80 difunde a través de las membranas celulares con mayor rapidez combatiendo el gradiente osmótico en la congelación y también en la dilución por descongelación, compensando el shock por dilución debido a la hipotonicidad creciente del medio (ASHWOOD SMITH Y COL. 1964). Introducción: criopreservación del cartilago 108 La toxicidad de este compuesto parece deberse a su actuación sobre los sistemas enzimáticos intracelulares (SCHLAFER, 1977) y las membranas celulares (WEINER Y COL. 1972>. El glicerol, sin embargo, resultó experimentalmente mejor tolerado en la congelación del cartílago en un estudio llevado a cabo en nuestro Departamento (MARCO Y COL., 1990). A elevadas concentraciones, puede tener también un efecto letal por la variación que produce en los potenciales eléctricos intracelulares (BAKER Y SCHORK, 1972). Su principal inconveniente reside en la lentitud de su difusión a través de las membranas celulares y la cantidad de tejidos que parecen impermeables a esta sustancia. TECNICAS DE CRIOPRESERVACION Los distintos tipos celulares se ven alterados en forma variable en función del tiempo de exposición, temperatura y concentración del crioprotector (KAROW, 1974). TABLA.5. TIPO CELULAR NUMERO GEL. GRIOPROTECTOR MIN. P ALMACENAMIENT O Bacterias 101 lmL Glicerol al 10% -600C Bacteriófagos 1 0~ pfu/mL Glicerol al 10% -600C Hongos 1 0b /mL Glicerol al 10% -1 50 0C Levaduras io~ mImL Glicerol al 10% -1500C Protozoos 1Qb ~~Qí ImL DM80 (5-10%) o Glicerol (10-20%) -150 0C Algas i& -10” lmL DM50 (5-10%) -1500C Introducción: criopreservacián del cartilago Cél. Vegetales * DM50 (5-10%)+ Glicerol al 10% ~15OoC Cél. Animales lOb ~10~/mL DM50 <5-10%) o Glicerol al 10% -1500C Virusvegetales lObImL NINGUNO -1500C Virus animales lOb /mL DM80 (7%)+ FBSQIO%) -1500C Plásmidos lO6ImL Glicerol al 10% -1500C * las células vegetales se “empaquetan” hasta 3-20% de su volumen para ser congeladas. La viabilidad y una estimación del porcentaje de recuperación se deben determinar tanto antes como después de la congelación. La viabilidad es una medida de la capacidad de un cultivo celular u organismo de crecer y reproducirse, resultando la mayoría de las veces inferior al porcentaje de células recuperadas, puesto que éstas pueden estar dañadas aunque vivas. El porcentaje de células viables postcongelación y descongelación está determinada por varios factores: 1. Ritmo de congelación y descongelación (MAZUR, 1970), 2. Especie y tipo celular (KAJARAMAN Y COLS., 1974), 3. Fase del ciclo celular en que se encuentren las células en el momento de la exposición (KOCH Y COLS., 1970), 4. Tipo de sustrato celular (HETZEL Y COLS., 1973), 5. Número inicial de células e interacciones entre ellas (McGANN Y COLS., 1972). 109 Introducción: criopreservación del cartílago 110 Para la mayoría de las células de animales mamíferos, se requiere una concentración celular inicial del rango de 106 -io~ /mL determinan de forma precisa la toxicidad de los crioprotectores sobre los condrocitos concluyendo que: 1. El DM50 es tóxico para los condrocitos, aumentando la toxicidad al tiempo que aumenta la concentración del crioprotector más allá del 12% y con exposiciones superiores a los 90 minutos. 2. El glicerol resulta ser tan tóxico como el DMSO. Esta toxicidad disminuye al enfriar el agente, pues se mejora la supervivencia celular cuando la temperatura disminuye de 37 a 40C. 3. Los condrocitos congelados y descongelados muestran un choque térmico que se traduce en una incapacidad para sintetizar glicosaminoglicanos durante 72 horas. El cultivo posterior de estas células muestra resultados semejantes al cultivo de células en fresco. 4. La viabilidad celular tras el proceso es mayor cuando se utilizan protocolos de congelación lentos. Introducción: criopreservación del cartílago 114 5. Los resultados con condrocitos aislados no son aplicables al cartílago intacto debido a la irregular penetración del crioprotector a través de la matriz cartilaginosa. • PRESERVACION DE CARTíLAGO INTACTO El cartílago intacto, por su estructura y diferenciación, actúa como un órgano entero en cuanto a su criopreservación. El almacenamiento de órganos enteros durante largos períodos de tiempo para su siguiente trasplante requiere igualmente el uso de temperaturas bajo cero y de crioprotectores. Sin embargo, la aplicación directa de los procedimientos de crioconservación convencionales, incluyendo la perfusión de una concentración única e inicial de crioprotector, seguida de enfriamiento lento hasta -60 ó -I960C, ha obtenido resultados muy poco esperanzadores (DIETZMAN Y COLS., 1973; HALASZ Y COLS., 1967). La crioconservación de órganos enteros encuentra un obstáculo importante en el aumento de la resistencia vascular provocado por los efectos osmóticos de los crioprotectores. La perfusión de riñones de conejo con glicerol 2 M, por ejemplo, colapsa por completo la luz vascular al reperfundirlos con medio libre de glicerol (PEGG, 1973). Este problema es inexistente en el caso del cartílago articular, por su estructura avascular, de forma que, su inclusión en soluciones con concentraciones variables de crioprotectores elude el uso de sofisticados sistemas de perfusión intratisular. La ventaja que representa el uso de cartílago articular criopreservado frente a los injertos en fresco es una aparente disminución de la inmunogenicidad y de la respuesta injerto-huésped (CURTISS Y COLS., 1959; Introducción: criopreservación del cartílago 115 LANGER Y GROSS, 1974; SCHACHAR Y COLS., 1989) aparte de las ventajas de biodisponibilidad y detección de enfermedades transmisibles. El cartílago articular intacto utilizado para trasplante se suele utilizar en forma de aloinjertos osteocondrales, manteniéndose el tejido adherido a una fina capa de hueso subcondral, que permite un mejor anclaje posterior. El crioprotector preferido en la bibliografía internacional para la conservación bajo 00C del cartílago es el dimetilsulfóxido en concentraciones variables, entre 5 y 15%. A pesar de ello, MARCO (1990) encuentra mejores resultados con la utilización de glicerol como preservante. El período de equilibrio se prefiere hacer a 40C durante 1 hora, puesto que parece disminuirse a esta temperatura el efecto citotóxico del DM80 (SCHACHAR Y McGANN, 1986). • PROTOCOLOS DE CONGELACION Un error de concepción frecuente en la criobiología es universalizar un método de crioconservación adecuado para una línea celular o especie a todas las células u organismos semejantes. Una biología distinta condiciona una respuesta diferente a los crioprotectores y a la congelación en general. La formulación de protocolos de congelación está basada en estudios empíricos, hasta la optimización del ritmo de congelación de cada estirpe celular. La mayoría de las líneas celulares de mamíferos, como hemos señalado, precisan de un enfriamiento lento y progresivo, a un ritmo de -1 a - 30CImin, y una descongelación rápida. La optimización de los protocolos de crioconservación del cartílago humano ha sido una de las líneas de investigación de nuestro departamento, llegándose a la conclusión de que el Introducción: criopreservación del cartílago 116 mejor protocolo para el cartílago intacto es un ritmo de congelación de -l0CImin, con un choque térmico de -600C cuando el tejido llega a su punto de cristalización, que experimentalmente se situó en -80C, para contrarrestar el aumento brusco de temperatura de la muestra debida al calor de fusión (LOPEZ-OLIVA, 1993). Con este protocolo, se alcanzan viabilidades del 50% tras la descongelación, medidas mediante citometría de flujo. Otras técnicas de determinación de la viabilidad condrocítica tras la congelación, más fiables que el test de exclusión de azul tripán y que informan sobre su estado metabólico son la captación de 3H-hidroxiprolina y ~ y estudios bioquímicos sobre el contenido de agua, hidroxiprolina, hexosamina y ácido urónico. La captación de 35~ informa sobre tasa de recambio de los proteoglicanos mientras que la prolina está implicada en el proceso de reparación del colágeno. El contenido de hexosamina es indicador del número total de proteoglicanos y el contenido de ácido urónico, por su parte, señala el contenido de condroitín-sulfato Todos estos indicadores indirectos de la viabilidad condrocítica aunque presentes, aparecen disminuidos con relación a autoinjertos controles (SCHACHAR Y COLS:, 1992) indicando funcionalidad del tejido, hasta 1 año después del trasplante en animales de experimentación. Introducción: principios RMN 118 e PRINCIPIO DE LA RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR DEFINIGION E IMPORTANCIA BIOMEDICA La resonancia magnética nuclear consiste en detectar las variaciones de estado energético de los núcleos de una sustancia bajo la acción de campos magnéticos estáticos o variables y de ondas de radiofrecuencia. La resonancia magnética nuclear como técnica de imagen (IRM) aplicada al diagnóstico clínico, ha sufrido un ascenso vertiginoso en los últimos años, considerándose imprescindible en el diagnóstico de muy diversas patologías, sobre todo en el Sistema Nervioso y Sistema Músculo-Esquelético. Su éxito se debe a muchos factores entre los que debemos citar en primer lugar; poder obtener imágenes tomográficas fácilmente interpretables. Es además la técnica con la que podemos obtener un mayor contraste tisular, sobre todo en tejidos blandos. Esto radica en la esencia misma del fenómeno de resonancia magnética, sensible a las variaciones en las estructuras bioquímicas, además de ofrecer la posibilidad de manipulación de la señal de forma que nos permita objetivar distintas características intrínsecas de los tejidos estudiados. El principio de la RMN es publicado simultáneamente por dos equipos americanos en 1946. Por este descubrimiento, BLOCH Y PURCELL recibieron en 1952 el Premio Nobel de Física. El gran auge de la RMI dejó en segundo lugar en el campo médico sus posibilidades como instrumento de análisis bioquímico, que fue su punto de arranque. El desarrollo de los imanes actuales permiten realizar análisis espectroscópicos “in vivo”, estudiando de forma directa algunos procesos metabólicos sin interferir en ellos ni utilizar técnicas agresivas. La Espectroscopia por Resonancia Magnética (ERM) aplicada “in Introducción: principios RMN 119 vivo” es una herramienta de trabajo en fase de exploración y que ofrece enormes posibilidades en el diagnóstico médico. Prácticamente desde su descubrimiento, los químicos han utilizado la RMN como una técnica rutinaria para el análisis estructural de los compuestos. Posteriormente, se extendió al campo de la bioquímica y, en 1957, se publicó el primer estudio mediante RMN sobre la estructura de una macromolécula, la ribonucleasa. El desarrollo de la RMN como técnica tomográfica surgió en 1973 debido a una idea de LAUTERBUR, quien, utilizando gradientes magnéticos y análisis de frecuencia, logró la primera imagen tomográfica. Los años posteriores fueron de un gran desarrollo tecnológico, tanto en el aspecto informático como en el desarrollo de potentes imanes como los que se utilizan en la clínica actual, de 1.5 Tesla. BASES FíSICAS DE LA RMN Se conoce desde hace siglos la propiedad de ciertos cuerpos naturales (como el óxido de hierro, Fe3O4), llamados imanes> de atraer partículas de limaduras de hierro. Esta propiedad se manifiesta por la aparición de fuerzas que no pueden explicarse por la interacción gravitatoria ni por la interacción electrostática. Es, pues, necesario introducir un nuevo tipo de interacción a distancia, la interacción magnética. Las interacciones magnéticas y las electrostáticas representan dos aspectos diferentes de los efectos de las cargas eléctricas. Así, las propiedades magnéticas de la materia dependen de las propiedades de sus constituyentes atómicos, electrones y núcleos, partículas cargadas que por sus movimientos crean campos magnéticos. El espacio es, Introducción: principios RMN 120 pues, la sede de un campo de fuerzas electrostático creado por las cargas en reposo y de un campo magnético cuando se desplazan. Desde los años 20, se sabia que muchos núcleos atómicos tenían un momento angular derivado de su propiedad intrínseca de rotación, el spin, s. El 5pm es una propiedad fundamental de la naturaleza como puede ser la carga eléctrica o la masa. Por estar los núcleos eléctricamente cargados, el 5pm corresponde a un flujo de corriente en torno al eje de giro, que genera a su vez un pequeño campo magnético, de manera que los núcleos con propiedad de 5pm se comportan igual que una pequeña pila o magneto, con un polo N y otro 5. Las características de este magneto se representan por medio de un vector llamado “momento magnético” M, que define simultáneamente la dirección y sentido del eje magnético de orientación de cada pequeño magneto y su grado de magnetización. Estos dos vectores no son independientes, sino que para un determinado núcleo se cumple M = y. s (donde y es el cociente giromagnético nuclear que depende de la carga/masa, característico de cada tipo de núcleo). En ausencia de un campo magnético externo, los momentos magnéticos de los protones estarán orientados de forma aleatoria. La suma de los momentos magnéticos individuales se conoce como magnetización neta. HG .32. Momento magnético Introducción: principios RMN 121 Para entender un experimento de RMN, podemos hacer una comparación: los núcleos en rotación se comportan de forma similar a pequeños giroscopios. Si se inclina el eje en rotación, alejándolo de la vertical, el giroscopio describirá un movimiento semejante a la pared de un cono. Este movimiento recibe el nombre de “precesión”. Asimismo, si la magnetización neta de un conjunto de núcleos en rotación en un campo magnético, se aleja de la dirección de su eje, este momento magnético global efectuará un movimiento de precesión alrededor de su propio eje. Si aplicamos un campo magnético externo muy intenso y perpendicular al campo estático, conseguimos esta inclinación. Para inclinar el vector del spin macroscópico y alejarlo de su eje, la frecuencia de radiación electromagnética debe ser igual a la frecuencia de la precesión natural de los núcleos de la muestra, de ahí la expresión “resonancia magnética nuclea< De la misma forma que en un conjunto de diapasones de diferente frecuencia, podemos hacer vibrar uno específicamente emitiendo una onda en una determinada frecuencia, y el diapasón de esa determinada frecuencia “resonará” al sintonizarse con ella, es como, mediante una selección apropiada de la frecuencia, pueden sintonizarse especies nucleares especificas y observar su respuesta individual. FIG.33. PRECESIO’ Introducción: principios RMN 122 campo magnetico aplicado >r de magnetizacion Dicho de otra forma, el momento magnético de una población de núcleos colocados en un campo magnético constituye un verdadero oscilador, caracterizado por una frecuencia propia. Al someter este oscilador a la acción de una onda electromagnética, absorbe energía y esta absorción es máxima cuando la frecuencia de la onda es igual a la frecuencia propia del oscilador. La energía absorbida por el sistema magnético es enseguida disipada por relajación, lo cual hace al fenómeno observable spin FI G.34. ~ al azar de los spins en ausencia de campo magnetico Introducción: principios RMN 123 FIG. 35. Movimientos de pmcesión de los espines bajo un campo magnético Aplicando un campo magnético externo, B~, se produce una orientación de los momentos magnéticos particulares de cada protón, de forma paralela o antiparalela a la dirección de este campo. La orientación paralela es un estado de menor energía, por lo que el número de protones que se orientan de esta forma es mayor, y esto hace que la magnetización neta sea de la misma dirección que el campo magnético externo. Existe por tanto, una relación directa entre la distribución de los núcleos y el valor del campo magnético B0 B FIG. 36. ji Orientacion antiparalela Orientacion paralela la magnetización neta, se orientarán en dicha dirección. El ángulo de desplazamiento a entre el vector de magnetización global y la dirección del campo magnético estático, aumenta de forma continua durante todo el tiempo que se aplica la onda de radiofrecuencia. La tasa y el incremento de este cambio dependen de la potencia del campo. Esto constituye el “ángulo de inclinación o fIip angle” y así se llama “pulso de 900’> al que tiene las características necesarias para inclinar el momento global desde su posición inicial hasta que gire justamente en un plano perpendicular La duración del pulso de radiofrecuencia determina la magnitud de la rotación del vector de magnetización global con respecto a su alineación original. Por ejemplo, un pulso de 9Q0 produce una rotación de 9Q0, y de manera similar, un pulso de 1800 produce una rotación de 1800. FIG.37. M 4’, Bo Introducción: principios RMN 125 Movimiento del vector de magnetización al entrar en resonancia con la emisión de ondas electromagnéticas de frecuencia fp. Inmediatamente después de aplicar un pulso de 900, el vector de magnetización global continúa girando libremente en el plano perpendicular, de forma que genera una pequeña fuerza electromotriz, detectable por la misma bobina o por otra bobina receptora. La señal emitida de denomina “señal de inducción libre” o “amortiguación de inducción libre”. En términos mecánico- cuánticos, es la señal que se produce al caer los núcleos del nivel energético excitado al estado fundamental o nivel de menor energía. FIG. 38. Introducción: principios RMN 126 Finalizado el pulso de excitación, el valor de magnetización global acabará por volver a su posición original. Esta vuelta al equilibrio se debe a numerosas interacciones, entre los núcleos excitados o entre ellos y el resto de la materia. Estos fenómenos están regidos por la ley del azar, y su evolución temporal puede describirse por una ley exponencial. El retorno al equilibrio se caracteriza por dos tiempos principales de relajación: Ti y T2 Tiempo de relajación TI Llamado también tiempo de relajación spin-red, spin-medio, spin-látex o longitudinal, corresponde al retorno al estado inicial por transferencia energética entre el sistema de espines y el medio del entorno llamado red. Es la constante de tiempo en el movimiento de retorno al equilibrio del vector de magnetización macroscópica después de un pulso. Tiempo de relajación T2 Tiempo de relajación spin-spin o transversal, caracteriza las interacciones entre los diversos espines de la muestra. Traduce la pérdida de coherencia de fases entre los espines después de parar el campo magnético externo aplicado. Cada núcleo genera un campo magnético que afecta a sus núcleos vecinos. Si esta relación es alterada por la aplicación de un campo externo, entran en fase de coherencia. El retorno a la fase de incoherencia que caracteriza el estado de equilibrio está señalado por la constante de tiempo T2 que caracteriza la velocidad de desaparición de la magnetización macroscópica en el plano xy después de un pulso. Introducción: principios RMN 127 IMAGENES POR RESONANCIA MAGNETICA El principio de la obtención de imágenes por RMN es crear una codificación espacial que permita atribuir a cada seña su lugar en un plano o en un volumen y, de esta forma, reconstruir las imágenes. En la rutina clínica, pedir una RM significa obtener una serie de cortes tomográficos por resonancia magnética de los núcleos de Hl. Para realizar la imagen tomográfica, el ordenador recogerá la señal que proviene de los distintos elementos de volumen (vóxeles) en que se supone dividido al paciente. Los vóxeles se definen por la matriz de adquisición y el espesor del corte. La imagen por resonancia magnética está compuesta por varios elementos pictóricos denominados p¡keles, en los que la intensidad de cada pixel es proporcional a la intensidad de señal de RMN del contenido del vóxel correspondiente del objeto sometido a estudio. La idoneidad de esta técnica en la práctica clínica se debe sencillamente a que el cuerpo humano está compuesto principalmente por agua y grasa. Estos dos componentes tienen muchos átomos de hidrógeno que hacen al cuerpo humano compuesto de hasta el 63% de átomos de hidrógeno. Al colocar a un individuo bajo un campo magnético Bo, en cada uno de sus vóxeles aparecen, debido a los núcleos de hidrógeno, propiedades magnéticas que definen la magnetización del vóxel M, que es también una magnitud vectorial orientada en la dirección del campo magnético Bo. El valor de M depende de la densidad de núcleos de H que se encuentren en el vóxel. En estas condiciones, si sometemos el vóxel a ondas electromagnéticas de radiofrecuencia RF y vamos variando la frecuencia de emisión, observamos Introducción: principios RMN 128 que a una frecuencia determinada, el vector de magnetización se desvía de su posición de equilibrio. Diremos entonces que se ha producido el fenómeno de resonancia, es decir, que los núcleos de H han entrado en resonancia con la emisión de radiofrecuencia, cuyo valor concreto se denomina fr, frecuencia de resonancia. El valor de fr depende directamente del valor de Bo. El vector M realiza un movimiento de giro sobre la dirección del campo magnético a la frecuencia de la radiación absorbida. El ángulo de inclinación a depende, entre otros factores, de la duración de la emisión. Normalmente es de microsegundos, por lo que hablamos de pulsos de radiofrecuencia. La importancia de un pulso se constata por el valor de a que consigue (pulso de 900, pulso de 1800, etc.). Las imágenes de RM se obtienen enviando pulsos de RF de diversos valores, separados a intervalos de tiempo adecuados, lo que constituye las secuencias de pulsos. Después de enviar un pulso de a, los núcleos de H van a liberar el exceso energético que han absorbido de la RF mediante la relajación energética, proceso en el que la magnetización del voxel vuelve a su posición de equilibrio alineada con Bo. Esta variación de posición representa una variación magnética que induce sobre la antena receptora una corriente eléctrica que servirá para realizar la imagen. Estudiando la señal de relajación podemos obtener, para cada vóxel, información relacionada con su densidad de núcleos de H e información relacionada con el entorno bioquímico en el que los núcleos de H se encuentran. Mediante la programación de secuencias de pulsos adecuadas podemos hacer prevalecer una u otra información, lo que se describe como potenciación de la imagen. Introducción: principios RMN 129 SECUENCIAS DE PULSOS En cualquier imagen tomográfica por RMN, aparte del valor básico de la densidad D del vóxel, existe en mayor o menor grado la influencia de los parámetros de relajación. Mediante el uso de secuencias de pulsos podemos hacer que prevalezca uno de estos parámetros en el contraste de la imagen, lo que hemos llamado potenciar la ¡magen en un parámetro determinado. Estas secuencias de pulsos consisten en módulos básicos formados por pulsos de RF de valores concretos, separados a intervalos de tiempo adecuados. Estos módulos se repiten a lo largo de la obtención de la imagen con un tiempo de repetición (TR). Una secuencia básica en la obtención de imágenes es la “secuencia saturación-recuperación” (SR) que consiste en enviar pulsos de 900 separados por un tiempo de repetición (TR) suficientemente largo para que la magnetización se restablezca. Esto nos permite obtener imágenes “potenciadas en densidad, D” en las que la intensidad de la imagen es directamente proporcional a la densidad de núcleos de hidrógeno de cada vóxel. La “secuenc¡a inversión-recuperación” (IR) consiste en enviar módulos constituidos por dos pulsos distintos: un pulso inversor de 1800 y, después de dejar relajar durante un cierto tiempo (“tiempo de inversión” TI), sin dejar que se recupere la magnetización, enviar un pulso de 900. Esta secuencia permite relacionar la imagen con la movilidad y el tipo de molécula de la que forma parte el H, puesto que identifica la mayor o menor facilidad de estos núcleos para liberar energía, es decir, su relación con el medio (tiempo de spin-medio, Introducción: principios RMN 130 spin-látex o T 1). El H en una molécula grasa tiene facilidad de liberar energía (Ti codo>, mientras que en una molécula de agua libre tiene dificultad en hacerlo (Ti largo).’ La intensidad de la señal es inversamente proporcional al valor de Ti y directamente proporcional a la facilidad de la relajación energética. Así, la grasa aparece hiperintensa mientras que los líquidos en reposo aparecen en negro y las imágenes obtenidas se denominan “imágenes potenciadas en TI”. La secuencia más utilizada en la potenciación de imagen es la denominada “secuencia spin-echo” (SE). Consisten en enviar un pulso de 900, dejar un tiempo de relajación, durante el cual los espines se desfasan al relajarse de forma diferente> y enviar un nuevo pulso de 1800, recogiéndose la señal una vez transcurrido un tiempo. De esta forma, la señal se recoge a modo de eco del primer pulso respecto al de 1800. El tiempo entre el tiempo inicial de 90~ y la recogida de la señal se llama TE. Este módulo se repite cada TR. Al ir repitiendo el proceso, obtenemos multitud de ecos. Cada uno de estos ecos tiene un TE más largo. El valor del campo magnético percibido por cada núcleo del vóxel depende del entorno bioquímico en que se encuentra ya que todas las cargas eléctricas de su alrededor modifican el valor del campo magnético externo. Esta influencia del entorno se conoce como interacción spin-spin. Si el vóxel estuviera aislado (interacción spin-spin nula) sus núcleos percibirían sólo el campo magnético externo creado por el imán y se relajarían al mismo tiempo (relajación sincrónica o coherente). Al contrario, si los H del vóxel pertenecen a radicales químicos distintos, los campos localmente percibidos son ligeramente distintos y liberan energía en frecuencias distintas, originándose una relajación Introducción: principios RMN 131 asincrónica o incoherente. El sincronismo en la relajación da idea de la estructuración molecular dentro del vóxel. A mayor coherencia en la relajación, mayor señal procede de la imagen, proporcional a T2 y traduce menor influencia entre las estructuras, mayor desestructuración. La ventaja de esta secuencia SE es que permite corregir las heterogeneidades del campo magnético puesto que la variación de intensidad que se recoge es sólo debida a las influencias spin-spin y no a las heterogeneidades del campo magnético. Esto permite tener “imágenes potenciadas en T2”. En las imágenes obtenidas mediante las secuencias de pulsos se puede establecer, como norma general: - una imagen con TE corto, TR corto está potenciada en Ti - una imagen con TE largo, TR largo está potenciada en T2 GRADIENTE DE CAMPO MAGNETICO Un gradiente magnético es una variación lineal del valor del campo magnético en una dirección. Hemos visto que la frecuencia de resonancia es directamente proporcional al campo magnético que percibe el núcleo. Por lo tanto, basta con que los núcleos de H del plano deseado perciban el mismo campo magnético y éste sea distinto del resto. Para lograr este objetivo se utilizan los gradientes de campo magnético. La misión de los gradientes de campo magnético es modificar el campo Bo de forma que la señal emitida en un punto dependa de su posición en el espacio. En la práctica, estos gradientes están producidos por Introducción: principios RMN 132 electroimanes que modifican de una forma lineal el campo Bo en las tres direcciones del espacio. Producen una variación uniforme del campo magnético según la dirección perpendicular a los planos elegidos. Su valor varía según los aparatos entre 0,05 y 1 gausslcm y condiciona el espesor mínimo del corte y la resolución espacial. Estos gradientes no funcionan de forma permanente, sino que son conmutados rápidamente durante las secuencias de adquisición, por ello se habla normalmente de “pulsos de gradiente’~ FIG.39. Bobinas de gradiente. Los tres pares de bobinas están colocadas generalmente sobre un cilindro, ilamado cilindro de gradientes, dentro del cual se coloca al paciente o muestra a analizar. t2~ Introducción: principias RMN 133 Cuando se establece un gradiente magnético durante un tiempo t, los núcleos sometidos a un campo mayor se relajan a una mayor frecuencia y por tanto, sus espines se adelantan respecto a los núcleos bajo campos magnéticos menores. Se produce un “defase” entre los espines, y esto se denomina “gradiente defase” . Si transcurrido un tiempo sustituimos este gradiente por otro igual en valor pero en sentido contrario (“gradiente de refase’) se produce el efecto contrario y si dejamos transcurrir el mismo tiempo t, los espines estarán de nuevo en fase, obteniéndose un eco que llamamos eco de gradiente. FIG. 40. A u BA aA a B G * Be ti ae B t Introducción: principios RMN 134 Supongamos dos núcleos A y 8, separados y sometidos a un gradiente G, de manera que el campo magnético sobre B es mayor que sobre A. Aunque sobre el plano transversal sus proyecciones están orientadas en la misma dirección, a medida que pasa el tiempo, el ángulo que forma B (aB) respecto a la posición inicial es mayor que aA. El desfase en el plano transversal a aumenta con el tiempo. FIG.41. 1 2 a -G u A u B t 2< 1 DESFASE REFASE -G ECO La aplicación de una inversión de gradiente +G y -G constituye un gradiente bí~oIar Después de un gradiente bipolar, los espines estacionarios se encuentran en fase. Si un núcleo es móvil y se mueve de A a B, al cambiar el valor del campo magnético que percibe a lo largo de su trayectoria, no logra al llegar a B refasarse con los espines estacionarios y por tanto, acumula un desfase que es proporcional a la velocidad con que se mueve, al valor del Introducción: principios RMN 135 gradiente y al tiempo de aplicación. Fijados G y t, el desfase entre los espines móviles y los espines estacionarios es proporcional a la velocidad con que se mueven los espines móviles. HG. 42. 1 2 a -G u .4—U u A c B t EEII IIZ~ B DESFASE DE I~ac UJO El establecimiento de un gradiente magnético implica que existe una variación de frecuencias en el vóxel. Por tanto, cada vóxel vendrá determinado por una frecuencia de resonancia media y un intervalo de frecuencias centrado alrededor de ella. Cuando enviamos el pulso excitador> éste lleva implícito una amplitud de banda alrededor de la frecuencia principal. La amplitud del pulso excitador determina el tamaño del vóxel y, por tanto, lo que denominamos “grosor del plano de cole”. 1 Introducción: principios RMN 136 Otra de las grandes ventajas que ha aportado la IRM es la obtención de imágenes tomográficas en cualquier dirección del espacio> con campos de visión variables y situados en cualquier punto del organismo. Ello es debido a la selectividad del fenómeno de resonancia y a la aplicación de los gradientes de selección de plano. Al estar éstos activados durante tan poco tiempo, permiten que durante la relajación del plano y dentro del tiempo TR de la secuencia puedan ser activados otros planos, con lo que nos encontramos con una técnica multiplanar y a su vez, multidireccional dentro de una misma adquisición. Además de esta ventaja, la IRM permite realizar tomografías con dimensiones ajustadas a las zonas a explorar, lo que se conoce como “FOV variable o campo de visión variable”. SECUENCIAS RAPIDAS En las secuencias SE, el tiempo de adquisición (t) viene dado por: tDMxTRxNA Siendo: DM, la dimensión de fase de la matriz de obtención, en general entre 128 y 256; NA, el número de adquisiciones necesarias para aumentar el cociente señal/ruido a fin de obtener una buena imagen; y TR, el tiempo de repetición de la secuencia. Las secuencias rápidas se caracterizan por utilizar pulsos iniciales más cortos y sustituir el pulso de 1800 y obtener la señal de eco mediante un juego de gradientes magnéticos. A las secuencias con un a—pulso inicial y un eco de gradiente se las denomina “secuencias gradiente-eco” (GE). En ellas, el valor del TE continúa siendo el tiempo entre el pulso inicial y la recogida de ecos del gradiente. La Introducción: principios RMN 137 obtención de la señal de eco mediante una inversión de gradientes (gradiente bipolar; defase y refase) permite la recogida de la señal con TE muy cortos, con lo que también los tiempos TR pueden ser más cortos. Resumiendo, la imagen de RMN se obtiene mediante una adecuada combinación de pulsos de radiofrecuencia y pulsos de gradiente. Los pulsos de radiofrecuencia se precisan para la excitación selectiva del plano y la obtención de un eco en las secuencias SE, mientras que los pulsos de gradiente intervienen en la selección del plano, en la codificación por frecuencia y por fase y en la obtención del eco en secuencias GE. Todo ello tiene que estar perfectamente sincronizado ya que la planificación de los tiempos de eco, el ángulo de pulso inicial y el valor de TR fijarán la potenciación de la imagen. Esquemáticamente 900 ]~,1800 ¡ ~ G z J seleccion de plan Gy ffícaciondefa -U- Gx J~ficaciondefre :rja Ji recogida de la se~aI Se TEI2 FIG. 43. TR La resonancia magnética de imagen a resolución microscópica es una técnica no invasiva que se utiliza de forma específica en el estudio de los introducción: principios RMN 138 materiales biológicos espacialmente heterogéneos en la muestra. Además, los tiempos de relajación Ti yT2 se determinan mediante el movimiento molecular, y por tanto, reflejan el estado dinámico de los alrededores. Consecuentemente, la IRM puede dar lugar a mapas, no sólo del contenido acuoso de las muestras, sino también de la variación espacial de parámetros moleculares como Ti, T2 o O con una resolución del orden de 10 micras. ABRIR PRINCIPIO DE LA... ESPECTROSCOPÍA... REPERCUSIÓN METABÓLICA Y CINÉTICA DE DIFUSIÓN DE AGENTES CRIOPROTECTORES A TRAVÉS DEL CARTÍLAGO ARTICULAR HUMANO. ESTUDIO MED JUSTIFICACIÓN CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS Y FUNCIONALES DEL CARTÍLAGO ARTICULAR COMPOSICIÓN DEL CARTÍLAGO HIALINO MATRIZ EXTRACELULAR O AMORFA CONDROCITOS ACTIVIDAD METABÓLICA SUPERFICIE ARTICULAR FUNCIONES BIOMECÁNICAS DEL CARTÍLAGO ARTICULAR RESISTENCIA A LA COMPRESIÓN RESISTENCIA A LA TENSIÓN LUBRICACIÓN LESION DEL CARTÍLAGO ARTICULAR LESIONES MECÁNICAS DEL CARTÍLAGO ARTICULAR LESIÓN CARTILAGINOSA SIN DISRUPCIÓN TISULAR FRACTURAS CONDRALES LESIONES OSTEOCONDRALES REPARACIÓN DE LESIONES ARTICULARES: CAPACIDAD INTRÍNSECA, AUTOINJERTOS Y ALOINJERTOS OSTEOCONDRALES MÉTODOS DE ESTIMULAR LA REPARACIÓN DE UNA SUPERFICIE ARTICULAR ALTERACIÓN DE LAS CARGAS APLICADAS A UNA ARTICULACIÓN LAVADO ARTICULAR PERFORACIÓN, ABRASIÓN O FRACTURA DEL HUESO SUBCONDRAL ESTIMULACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL COAGULO DE FIBRINA FACTORES ESTIMULADORES DE LA CONDROGÉNESIS IMPLANTACIÓN DE MATRICES SINTÉTICAS CAMPOS ELECTROMAGNÉTICOS MÉTODOS DE REGENERACIÓN DEL CARTÍLAGO ARTICULAR TRATAMIENTO CON ALOINJERTOS TRATAMIENTO CON TEJIDO AUTÓLOGO MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DEL CARTÍLAGO MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DEL CARTÍLAGO CONSERVACIÓN DEL CARTÍLAGO INTACTO CULTIVOS CELULARES TIPOS DE CULTIVOS ELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO CULTIVO DE CONDROCITOS CULTIVO DE ÓRGANOS CRIOPRESERVACIÓN DEL CARTÍLAGO MECANISMOS DE LESIÓN CELULAR EN LA CONGELACIÓN CRIOPROTECTORES CRIOPROTECCIÓN DEL CARTÍLAGO ARTICULAR PRINCIPIO DE LA RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR IMÁGENES POR RESONANCIA MAGNÉTICA ESPECTROSCOPÍA POR RESONANCIA MAGNÉTICA FASES DE OSTENCIÓN DE UN ESPECTRO ERM DEL FÓSFORO EL FENÓMENO DE LA DIFUSIÓN DIFUSIÓN DE SOLUTOS A TRAVÉS DEL CARTÍLAGO ARTICULAR RMN DE DIFUSIÓN HIPÓTESIS DE TRABAJO MATERIAL Y MÉTODOS OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ESTUDIO PROCESADO DE LAS MUESTRAS OBTENCIÓN DE IMÁGENES ANÁLISIS DE DATOS OBTENCIÓN DE ESPECTROS RESULTADOS 1. PENETRACIÓN DE SUERO SALINO DEUTERADO 2. PENETRACIÓN DE DM80 AL 100% 4. PENETRACIÓN DE DM80 AL 15% 5. PENETRACIÓN DE GLICEROL AL 100% 6. PENETRACIÓN DE GLICEROL AL 10% ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS DE DIFUSIÓN ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS COEFICIENTES DE AUTODIFUSIÓN RESULTADOS DEL ANÁLISIS ESPECTRAL ANÁLISIS DE RESULTADOS DISCUSIÓN 1 VALIDEZ DE LA METODOLOGÍA INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DE DIFUSIÓN DISCUSIÓN 2 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS VALIDEZ DE LA METODOLOGÍA CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA DDD: DD: