UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Alfonso Javier Fernández García DIRECTORES: Manuel, dir Pujadas Cordero Francisco, dir Molero Menéndez Madrid, 2015 © Alfonso Javier Fernández García, 2016 Caracterización higroscópica del aerosol atmosférico mediante la técnica lidar Raman Departamento de Física de la Tierra, Astronomía y Astrofísica I (Geofísica y Meteorología) 5 329 9 7 1 4 6 9 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID ccuT FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÔGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Caracterizacion de los genes mbd de Azoarcus sp. CIB: Descripcion de una nueva ruta para la degradacion anaerobica de compuestos aromaticos TESIS DOCTORAL JAVIER FERNANDEZ JUAREZ M adrid, 2011 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÔGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR TESIS DOCTORAL Caracterizacion de los genes mbd de Azoarcus sp. CIB: Descripcion de una nueva ruta para la degradacion anaerobica de compuestos aromaticos JAVIER FERNANDEZ JUAREZ DIRECTORES: Dr. EDUARDO FERNANDEZ Dr. MANUEL CARMONA PEREZ C0NSEJO Sm^ERlOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÔGICAS M adrid, 2011 “/O/z amigos!, jSed hombres, mostrad que tenéis un corazôn pundonoroso, y avergonzaos de parecer cobardes en el dura combate! De los que sienten este temor, son mas los que se salvan que los que mueren; los que huyen, ni gloria alcanzan ni entre si se ayudan. ” Iliada, canto XV (verso 561) Homero (S. VIII a. C.) "\..muchas [...] cosas, si se las considéra aisladamente, estân lejos de ser bellas, y sin embargo, al ser consecuencia de los fenômenos naturales, cobran un aspecto bello y nos cautivan..."' Méditaciones de Marco Aurelio, Libro III (2) Marco Aurelio (121-180 d. C.) " ...considerando que aquel que codiciare el honor por premio de la ciencia, no debe despreciar ni huir el trabajo con el que se consigue; y que el ignorar el hombre lo no forzoso, no arguye culpa notable: pero el no saber lo necesario, es desprecio de si mismo; y sobre todo, que es torpeza de ingenio y falta de valor perder la esperanza de alcanzar aquello que cabe en la posibilidad de ser alcanzado. ” Modo fàcil y nuevo para examinarse los maestros en la Destreza de las armas (pg. 13) Luis Pacheco de Narvaez (1570-1640 d. C.) “L ahora y a sin bàrbaros iqué ser à de nosotros? / Esos hombres eran una cierta soluciôn’" Esperando a los bàrbaros Constantino P. Cavafis (1863-1933 d. C.) A M IS PADRES A M I HERM ANO A ISABEL Ag r a d e c im ie n t o s El verano de 2006 se extingma en un ultimo crépuscule vacacional e Isabel y yo nos trasladâbamos a Madrid para comenzar una nueva fase de nuestra vida. En aquel trayecto comencé a pergenar una lista compuesta por toda la gente que me habia ayudado a iniciar aquel viaje, una lista que a lo largo de los anos se ha enriquecido con multitud de nombres sin los que hubiera sido imposible el desarroUo de la Tesis Doctoral que aqui se présenta, tan to por su aportaciôn cientifica com o personal. Todo viaje comienza con un primer paso, por lo que comenzaré mencionando a las personas gracias a las cuàles Uegué al grupo de Biotecnologia Medioambiental del CIB. Asi pues, en primer lugar me gustaria agradecer su ayuda a los D octores Miguel Angel Ferrero, Leandro Rodriguez y Honorina Martinez (Nori) del Departamento de Bioquimica, y al Dr. José Luis Acebes del departamento de Fisiologia Vegetal, ambos de la Universidad de Léon. Quiero agradecerles sus continuos consejos y ensehanzas a lo largo de mis estudios de Biologia. Gracias a nuestras conversaciones adquiri una vision certera de la naturaleza de la Ciencia y de las opciones existentes para el desarroUo de una carrera cientifica. EUos contribuyeron a estimular la confianza en mi mismo y a garantizarme que para alguien inquieto siempre habria un lugar en el que investigar, sin su apoyo no habria tenido brüjula en este viaje. Gracias a los doctores Ferrero y Rodriguez contacté con el Dr. Baltasar IMihambres (Balta) de la EAE-CSIC, del que resalto su incomparable calidad humana y su capacidad de inventiva y sacrificio, asi com o la recomendaciôn de que contactara con el grupo en el que he desarroUado mi trabajo predoctoral. Con eUos conservo una amistad que perdura a lo largo de los arios. Recuerdo la entrevis ta con José Luis, Eduardo y Auxi una tarde de Mayo, bajo la adusta mirada del busto en bronce del D on Jaime Ferrân. En Septiembre nos incorporabamos al grupo, muchas gracias por confiar en nosotros. En este punto quiero hacer un primer alto en el camino para mostrar mi agradecimiento a mis directores de tesis, Eduardo y Manuel. Muchas gracias por enseharme a hacer Ciencia de calidad, a pensar com o un cientifico, a leer mucho y a plantear disehos expérimentales impecables. Si a partir de ahora soy capaz de seguir mi camino en esta carrera es gracias a vosotros. Gracias Eduardo por las rondas diarias, por tu saber enciclopédico (ganarias a D eep Blue en un concurso de plâsmidos), por poner todas tus capacidades al servicio de cada duda que te consultamos, gracias por ser un gran maestro. Gracias Manuel por tus puntos de vis ta altemativos, por la larga lucha con Geobacter, por tu vision hoHstica de la Ciencia, gracias por saber dis tender con una buena conversaciôn los momentos en los que la concentracion se convierte en ofuscacion. Muchas gracias José Luis por todas las ocasiones en las que en un momento généras toda una coleccion de posibüidades, gracias por aportar constantemente ideas y proyectos. Gracias Auxi por tus consejos y por las charlas a la puerta de tu despacho del 343. Recién llegado al laboratorio me acogiô bajo su ala la mamâ pato mejor que uno pudiera desear. Muchisimas gracias Tere, sin ti no habria Tesis. N o sôlo eres una arrojada pionera sino una magnifïca malabarista capaz de mantener en el aire un gran numéro de proyectos. Gracias por enseharme a darle valor a todos los aspectos del dia a dia del laboratorio, has ta los mas prosaicos. La frase manida de que si no existieras habria que inventarte se queda corta, con los pedazos de tu molde que quedaron tras romperlo se podrian fundir mil investigadores com o yo. Me gustaria hacer una menciôn especial a los Hderes del grupo de Genética Bacteriana, vulgo Pneumo, del CIB. Gracias Pedro por los consejos y tertulias al amor de un café y una naranja, espero que algun dia asimiles mis preferencias futboHsticas {Aliquando bonus dormitat Homerus). Muchas gracias Em esto por tener siempre abierta la puerta de tu despacho, por près tarte siempre a discutir cuestiones de cualquier materia (Ciencia, lengua, el m undo...) y por dejarme entrever tu inmensa sabiduria, ah, y gracias por el bien intelectual que me has hecho a base de Ciencia Ficciôn de calidad. Tampoco quiero olvidarme de Rubén, gracias por poner los cimientos de este gran grupo humano. Volviendo al hilo principal de la historia, una vez alistado en las filas del CIB comencé a conocer a las personas y personajes que pueblan los laboratorios de Pneumo y Biodegradacion, la fiel infanteria aün conocida por los campos de batalla de la Ciencia, y de las fiestas planeadas y sin planear, com o “los Rubenes”. Durante unos meses breves pero intensos tuve el honor de coincidir en el 342 con “el N in o”, encargado oficial de las dudas Quinucefa y extraordinario consejero. También me encontre alii con nuestros dos extremehos universales. Bias y Juan. Nadie com o Bias para enseharme los rituales del laboratorio en los que la Ciencia es hermosa, nadie com o el para romper el hielo con un tema de conversaciôn (he reservado tu regalo para el dia de la defensa). A Juan le agradezco especialmente su in fini ta paciencia para atender mis dudas de novato y los paseos cuesta arriba camino a casa arreglando la Ciencia. Y hablando de paciencia la de Maria, a la que nada mas llegar robe la mitad de la exigua esquinera que ocupaba para m on tar mi “oficina”, gracias por tu buen hacer en el laboratorio y tu capacidad para escuchar en cualquier conversaciôn. El equipo del 342 lo cerraba Gonn, inigualable maestro e incomparable amigo, gracias por todo, por tus consejos en la Ciencia y por compartir conmigo el “Sindrome CIB”, que obliga a dilatar adrede los ultimos experimentos del dia para polemizar sobre lo divtno y lo humano (literalmente), gracias por ser la hipotenusa que une a este cateto que ahora escribe, y a otro que mencionaré mas adelante, en el triangulo mas temido y desastre del 342 (gracias Saray y Samuel por aguantar la locura de este elemento). Gracias también a Gaelic y Noa por mantener a Gonn con los pies en la tierra y evitar que el fisico de corazôn de oro saiga volando a contar nubes. En el 343 me encontré con dos melenas revolucionarias, una color ala de cuen^o y otra rubia. Gracias Laura por los consejos sobre el '"̂ C, por retroahmentarnos en el gusto por los zombies, la épica.. . , y por orientarme para que siga los tortuosos caminos del metal. Gracias Isa por a)Tidarme a distinguir la infinita variedad de amariUos que puede existir en un [3-gal y por las charlas camino a Cuatro Caminos. En el 343 también habitaba una Dra. capaz de enseharte los arcanos de los experimentos in vitro y de ajoidarte a mantener una mentalidad positiva ante fracasos conocidos y por conocer, gracias Bea. La ahneaciôn titular del “laboratorio de las nihas” la cerraba Merche, la técnico-madre mas alegre de todo el CSIC. N o me olvido de los Pneumos que habia a mi Uegada. AUi estaba Dani LluU, el doctor- actor, o viceversa, mas pohfacético y atento del universo mundo. También estaba hlinam, a la que agradezco especialmente nuestras charlas al ser\"imos una taza de humeante café y el que siempre aporte su punto de vista. A Ana G. le agradezco su disponibilidad absoluta cuando necesitaba su a^uda y que conservara su sonrisa las largas noches de laboratorio. Gracias Elo por tu atenciôn y a}oada. Un capitulo aparté entre los veteranos se lo dedico a Iria, la pionera de los Mycobacterium y del 344. Gracias por estar siempre ahi, por tener siempre tiempo para una charla con el Sol y los resultados dândonos en la cara, por las frases certeras y por las fiestas a la luz de la medianoche sueca. A continuaciôn proseguiré con la gente que entrô en el laboratorio conm igo y con la que se ha ido incorporando durante el desarroUo de esta Tesis Doctoral. Gracias Vir por ser la alegria del 343, la zurdita que üena mi cupo diario en ausencia de mi hermano y por tener una de las sonrisas capaces de in fundir mas ânimo. Gracias Ana V. porque esta Tesis sin ti séria materialmente imposible, por tu inmensa capacidad de trabajo y tus ansias de aprender, gracias también por los m omentos de confidencias, especialmente en nuestro, desgraciadamente, tema favorito. Gracias Miri por las tardes de Coca-Cola y charla, gracias por estar siempre dispuesta a tender la mano y ofrecer el consejo apropiado, tu opiniôn siempre es tenida en cuenta. Gracias Nina por tu dulzura y tu mirada franca, gracias por aguantar mis diseurs os sobre historia de Espaha y por tu a fan de hacer grupo en las mas variopintas actividades. Ahora viene el cateto restante del triangulo, mi hermano de bataUa en el campo del honor de los A'c^oarcus. Gracias Andrés por intercambiar conmigo los papeles de cabaUero y escudero en cada experimento, por empuhar codo con codo las pipetas en la trinchera del dia a dia, gracias por tus vaciles en el laboratorio y fuera de él, gracias por ser un gran amigo. Gracias VaUe por hacem os ver la Ciencia con exactitud y, mucho mas importante, a ver la vida con alegria y optimismo, gracias por hacem os asociar tu melena rizada al amanecer de una sonrisa en el laboratorio. Gracias Elis a por tu amabilidad y por acordarte siempre de preguntar un “^Qué tal va esa tesis?”. Gracias Susana por tu insondable paciencia y por aportar siempre tu experiencia y punto de vis ta respecto a la soluciôn de nuevos problemas. Gracias Yuste por tu sentido del humor (desafortunadamente para ti tengo en mi poder videos que podrian hundir tu carrera poHtica si un dia tuviera lugar) y tu espiritu de grupo. Gracias Violeta por tu misiôn para tratar de desenganchar a este drogadicto reconocido del café y por acordarte de mi en los m om entos mas difîciles. Gracias Jose Ramos, Dr. Perrea, por tus consejos, por ser lo maximo, por a lot of ketchup, por A-M -I-G-O y por seguir contando con nosotros cada vez que vienes a Madrid. Gracias Maria del Mar por alegrarnos el dia con tu sonrisa angelical, el laboratorio no es el mismo sin tus tirabuzones rubios y tus suspiros a ultima bora. Gracias Esther por continuar el espiritu de unidad del grupo y por luchar por el orden del laboratorio, gracias por aguantar mis largas divagaciones a tus preguntas concretas y por transmitirnos a todos tu constancia. Gracias Beatriz Pineiro por las tardes de conversaciones apresuradas sobre hbros y juegos. En estas lineas he revivido recuerdos de muchos compaheros que, guiados por los jefes, forjaron el espiritu de este grupo. Pero la rueda del tiempo no cesa nunca de girar y las despedidas e incorporaciones son continuas. A continuacion mostraré mi gratitud a la autobautizada P\ew Generation, a la que animo a mantener el ahna que ha hecho unico a este laboratorio. Gracias Julia por apuntalar a la colonia leonesa y por tratar de integrarte desde tu primera visita. Gracias Loreine por proporcionar consejos cientiricos desde puntos de vista alternativos y por tu optimismo impénitente respecto a la finahzacion de esta Tesis. Gracias Carlos por tu ingente trabajo con el genoma de CIB que nos facilita la vida a todos, gracias por tus interesantes tertulias musicales y tus ânimos constantes. Gracias Roberto por tu franqueza y tu iniciativa para Harla en un minuto. Gracias Zulema por tu a}aida bioinformàtica, por tu sabiduria épico-bibhofila y por el in fini to interés por el dia a dia de los becarios. Gracias Carmen por tu saber estar y prudencia constantes y por contagiarnos tu valor ante las empresas difîciles. Gracias Zaira por traer aires nuevos al 342, por tolerar mi imperialismo en la poyata y por ser una encantadora caja de sorpresas. Gracias Eernando por tu sentido del humor, tus conocimientos analiticos y por el valor de trabajar en el gineceo del 344. En este apartado también quiero dar gracias a Begona, ya que si bien es veterana no he tenido la fortuna de coincidir con ella mas tiempo, muchas gracias por tu apoyo en situaciones complicadas. N o me olvido de las aves de paso con las que he compartido momentos en el laboratorio: Marta Tortajada, Ignacio, Dani, Marta Rojo {spicy), Stephanie, Joana, Serena, Rocio (te debo unas procesiones), N ico ... Muchas gracias a todos, vuestro paso por el laboratorio ha dejado, y dejarà, huella. Mas alla del ala ocupada por pneumos y biodegradadores también habitan, o habitaron, muchas personas con las que es toy en deuda. Gracias Luque por ser senciUamente genial, aportando la anécdota précisa en el m om ento adecuado. Gracias Rodri y Carlos porque sin vosotros los becarios despistados del centro, como un servidor, nunca nos hubiéramos conocido en un ambiente distendido y carnavalesco, nunca me olvidaré de los grandes momentos vividos con vosotros y gracias a vosotros. Gracias a los excepcionales compaheros de EEMS 2009: Fatima, Eli y el sin par Ramôn. Gracias a todos los dem is pobladores del centro, incluyendo a los futboleros: Marta Eierro (jviva RediUuera!), Javi Gayarre, Léo, Rafa, Carlos, Rubén, Amaya, A sier... Gracias Ana. En el aspecto cientifico quiero mostrar mi agradecimiento a todos los servicios del CIB (incluyendo a Secugen), y muy especialmente a Carlos A lfonso Botello (servicio de Ultracentrifugaciôn Analitica) y a Mario Lacoba (servicio de Informatica). Fuera del CIB pero dentro del CSIC he de dar las gracias a los doctores Victor Parro y Manuel Gômez por su ayuda en el proyecto de secuenciacion de Aî^oarcus sp. CIB. Un apartado especial lo ocupan las personas que componen el grupo de trabajo de la Universidad de Leipzig (Alemania) dirigido por el Profesor Matthias BoU, en el cual tuve el privilegio de disfrutar de una estancia de très meses. Gracias Matthias por acogerme com o uno mas, por tu interés y dedicaciôn y por tener siempre un rato de esparcimiento para intercambiar opiniones. Gracias a todos vosotros que me aceptasteis dentro y fuera del laboratorio desde el primer dia, con los que tuve mas contacto com o Kevin Kuntze (solucionador de problemas oficial), Johannes Kung (estimulador de mi vida social en Alemania), Jana (siempre pendiente y atenta, una amiga), Simon (gracias por tu paciencia), Christian (sin tu trabajo esta tesis hubiera sido imposible), José (el becario mas trabajador del mundo), Sebastian Sauter y Steffen (siempre dispuestos a echar una mano), Alex (historiador oficial del laboratorio), Agnieszka (tengo pendiente una visita a tu pais), Jorg (;animo en tu camino!) y con los que tuve menos contacto com o Christina, Sebastian, Claudia, Siegrid y Tobias. También me gustaria mostrar mi agradecimiento a las personas de la residencia que me hicieron la vida mas fàcil: Pezhman, Arianna, Vaida, Christina, Sukhu, Cihan, Asha, Lars, Ricardo, M éhssa... En otro orden de laudatorios quiero dar las gracias a mis hermanos de armas de la Asociacion Espahola de Esgrima Antigua (AEEA), gracias a cuya compania mi mente ha abandonado el laboratorio unas horas cada semana. Gracias al Maestro Alberto Bomprezzi por hacer que esta organizaciôn sea posible, porque devolver el honor y el esfuerzo a la Espaha del siglo XXI es una nueva forma de aguantar las quince cargas de los suecos en Nôrdlingen. Gracias al resto del cuerpo técnico: Oscar Torres, Rorro, Marc, Cat, Oscar Lopez, Rosa, Juan Carlos... Un agradecimiento especial para el Sehor Luis Miguel Palacio, al que debo la cita del Siglo de Oro que aparece al comienzo de esta Tesis. Gracias a los très mosqueteros con los que hice cuarteto nada mâs llegar a la sala: German (tan buen conversador com o generoso e incomparable amigo), Victor (jsuerte en las lejanas tierras, valiente!) y Hector (disehador de espadas, ingeniero en ciernes... jun partidazo!). Muchas gracias a todos, y os ruego disculpéis a todos los que me dejo en el tintero: Sixto, Côzar, Jaime Leôn, Jaime Carbô, Gabriel, Carnicero, Juanma... D e vuelta a mi patria chica voy a proseguir los agradecimientos con mis amigos de toda la vida en la capital del viejo Reino. Gracias al “N iicleo Duro” que me ha a^mdado a ser com o soy. Gracias Aldonza por tantos ahos de confidencias, charlas a media voz, cafés y amistad con majAsculas. Gracias Eduardo por casi un cuarto de siglo de amistad, por ser tan auténtico y por estar siempre ahi. Gracias Mtor por los “jorko!”, las cenezas y acciones de comando compartidas y por conseguir siempre estirar el tiempo sea com o sea para tomar algo juntos. Gracias Pablo por tu apoyo, especiahnente en la gloriosa época del instituto, y por ofrecerte constantemente com o sujeto experimental. Gracias Garcia por mantener el contacto a lo largo de los ahos y acordarte siempre de hacer una Uamada en el m om ento oportuno. Gracias Guillermo por hacer que cada vez que nos vem os parezca que no lo hacemos desde hace una centuria. También quiero agradecer a Bea la amistad compartida durante lustros y los emails que nos mantienen en contacto. Gracias Angel y Feh por \mestra amistad y por vuestro interés para acoplaros a nuestros horarios de cientifico para sacar un rato y cenar juntos. Gracias Ana Belén y Javi por vuestra grata y continuada amistad. Muchas gracias a todos los que por falta de espacio no puedo incluir aqui, gracias a vosotros que contribuis a que en mi cabeza sôlo asocie buenos pensamientos a Leôn: Larry, Raquel.... También en Leôn mi gratitud se dirige a mis compaheros de carrera, un grupo heterogéneo e incomparable. Gracias Rosaha por los paseos camino a la Facultad arreglando el mundo. Gracias Lety por esa sonrisa que hacia que un examen fuera sôlo un examen. Gracias Ahna por tus esfuerzos para reunimos a todos con la excusa de una partida de Risk. Gracias Tessier por ser todo un cabaUero y por enseharnos a todos el valor de la superaciôn (jun beso Lola y Pablo!). Gracias Nacho por tantas tardes compartidas a base de tomar apuntes y capuchinos de mâquina. Gracias Pablo Fuertes por conformar conmigo la extraha pareja abstemia de Biologia. Gracias Pabhto y Héctor por hacerme olvidar los artrôpodos con numerosas tardes de futbol. Gracias a todos: Dani, Luis, Helena, Nerea, Cueva, Maria de G odos, Diana, Marta... Gracias a mi famüia. Gracias Papa y Mamâ por inculcarme el valor del esfuerzo, por animarme siempre a dar un paso mâs, por todos \mestros sacrificios y desvelos, muchas gracias por entender mi vocaciôn y estimularla desde tiempos tan lejanos com o cuando en 2° de EGB D on Jésus me empezô a Uamar “el cientifico”. Gracias por \mestro in fini to amor y paciencia, si esta tesis busca que alguien esté orguüoso, esos sois vosotros. Gracias a mi hermano David porque por él entiendo a los Dioscuros, por hacerme sentir orguüoso cada dia y por aguantar a esta calamidad de hermano mayor. Gracias a mis abuelas Carmen y Mercedes por estar siempre preocupadas, gracias por vuestra sabiduria y por vuestro cariho. Quiero agradecer de forma general a todos mis tios y primos su apoyo constante, os ruego me perdonéis, pero si os citara a todos y todo lo que os debo esta tesis tendria que tener otro titulo, muchas gracias a todos. Gracias Paco y Esmeralda por darme a Isabel. Gracias Isabel, por todo. Gracias por convencerme para iniciar esta aventura. Gracias, porque haber sido compahera de carrera, y ahora ser compahera de laboratorio y novia a la vez es un asunto comphcado que manejas perfectamente. Gracias por ser el ancla que me mantiene en contacto con un mundo al que das sentido, gracias, porque cada vez que oigo tu voz, creo que Dios creô al Mundo con la palabra. Gracias a todos los que ya no estâis ente nosotros, por cada uno de vosotros hay una butaca vacia, gracias por ajmdar a construir lo que de bueno pueda haber en mi. II. O bjetfvos In d ic e A br ev ia tu r a s I. iNTRODUCClÔN................................................................................... i 1. La biodegtadacion de compuestos aromaticos 3 1.1. C atabolism e aerobico de com p u estos arom aticos 5 1.2. C atabolism o anaerobico de com p u estos arom aticos 6 1.2.1. Rutas periféricas del catabolismo anaerobico de com puestos aromaticos 10 1.2.1.1. Activacion de âcidos orgânicos aromaticos con tioésteres de CoA: rutas 10 anaerôbicas y rutas hibridas 1.2.1.2. Actividades CoA ligasa 11 1.2.2. Rutas centrales del catabolismo anaerobico de com puestos aromaticos 13 1.2.2.1. Bioquimica de la ruta central del benzoil-CoA 13 1.2.2.2. Genética de la ruta central del benzoü-CoA 19 2. Regulacion de la expresion de los genes responsables de la 23 biodegradacion anaerobica de compuestos aromaticos 2 .1. Regulacion especifica de elector 26 2.1.1. àe. cluster bad d t Rhodopseudomonaspalustris 26 2.1.2. Regulacion del cluster bsd de At^arcus sp. CIB 28 2.1.3. Otros reguladores del catabolismo anaerobico de com puestos aromaticos 29 2.1.3.1. \db2lK {Khodopseudomonaspalustris) 29 2.1.3.2. HdâS)K{Afy)arcusy Thauera 30 2.2. R egulacion sobreim puesta M 2.2.1. Regulacion dependiente de oxigeno 31 2.2.2. Regulacion dependiente de fuentes de carbono alternativas (represion 33 catabohca) 3. La degradacion anaerobica de tolueno y /w-xileno 35 3.1. La degradacion anaerobica de to lu en o 55 3.2. La degradacion anaerobica del w -xileno 58 3.3. La ruta central del 3 -m etilbenzoil-C oA 58 41 45 47 III. M ateriales y M é t o d o s .............................................................. 1. Cepas bacterianas, plâsmidos y oligonucleôtidos 2. Medios y condiciones de cultivo 52 2.1. M edios de cultivo empleados para Escherichia coli 52 2.2. M edios de cultivo empleados para A^oarcwt, sp. CIB 53 2.3. Antibioticos 54 2.4. O btencion de condiciones anaerobicas en los medios de cultivo 54 2.5. Condiciones de cultivo 55 2.6. Conservacion de las cepas bacterianas 56 3. Técnicas de manipulaciôn de DNA y RNA 56 3.1. Purificacion de D N A 56 3.2. Purificacion de RNA 56 3.3. Reaccion de ampHficaciôn en cadena con D N A polimerasa 57 term orresistente (PCR) 3.4. Secuenciacion de D N A 57 3.4.1. Secuenciacion automâtica 57 3.4.2. Secuenciacion manual 57 60 60 3.5. Determ inacion del sitio de inicio de la transcripcion 57 3.6. Ensayos de retrotranscripcion (RT-PCR) 58 4. Experimentos de transferencia genética 59 4.1. Transform acion de células de Escherichia co//mediante choque térmico y 59 electroporacion 4.2. Trans form acion de células de Apoarcus sp. CIB mediante electroporacion 4.3. Transferencia de plâsmidos mediante conjugacion 4.3.1. Protocolo de conjugaciôn 60 4.3.2. Construcciôn de mutantes de inserciôn por recombinacion hom ologa en 61 A'yoarcus sp.CIB 5. Técnicas de manipulaciôn de proteinas 61 5.1. Electroforesis en geles de poHacrilamida-SDS (SDS-PAGE) 61 5.2. Sobreproduccion y purificacion de proteinas 62 5.2.1. Sobreproduccion y purificacion de AlbdW-Hisf, 62 5.2.2. Sobreproduccion y purificacion de MbdR-Hisf, 63 5.3. Cromatografia de gel-filtracion 63 6. Ensayos de actividad enzimâtica 64 6.1. Ensayos de actividad [3-gaIactosidasa 64 6.2. Ensayos de actividad CoA-hgasa 64 6.2.1. Ensayo directo 65 6.2.2. Ensayo indirecto (acoplado) 65 6.3. Ensayos de actividad (3-metü)-benzoil-CoA reductasa 66 6.4. Ensayos de actividad (metil)-ciclohexa-l,5-dieno-carboniI-CoA hidratasa 67 6.4.1. Ensayo mediante HPLC 67 6.4.2. Ensayo espectrofotométrico 67 7. Ensayos de union de proteina a DNA 68 7.1. Marcaje de sondas radiacrivas 68 7.2. Ensayos de retardo en gel 7.3. Ensayos de protecciôn frente a digestion con DN asa I (footprintin^ 7.4. Ensayos de transcripcion in vitro 50 8. Ensayos de ultracentrifugaciôn analitica 50 9. Recursos informâticos 51 9.1. Anâhsis de secuencias 51 9.2. Construcciôn de ârboles filogenéricos 52 9.3. M odelado de la estructura tridimensional de proteinas 52 68 69 73 75 78 IV. Re s u l t a d o s ........................................................................................ 1. Identificaciôn del cluster gèmco responsable de la ruta central para el catabolismo anaerôbico de 3-metilbenzoato en Azoarcus sp. CIB 2. Conûrmaciôn de la implicaciôn del cluster m bd en la degradaciôn de 3-metilbenzoato y /n-xileno 2.1. Crecim iento anaerôbico dcApoarcus sp. CIB en 3-meriIbenzoato 58 2.2. Crecim iento anaerôbico de m utantes de A'cyarcus sp. CIB en disttntos 59 genes del cluster mbd utiHzando 3-meriIbenzoato y w-xileno como fuentes de carbono 3. Caracterizaciôn bioquimica de actividades enzimàticas clave de la ruta 81 mbd 3.1. Anâhsis de la actividad 3-metiIbenzoato-CoA Ugasa 81 3.1.1. Estudio y clonacion del gen 81 3.1.2. El gen codifica una 3-metilbenzoato-CoA ligasa 83 3.2. Anâhsis de la actividad 3-metübenzoil-CoA reductasa codificada por los 84 genes mbdOlAQP A n e x o 3.3. Analisis de la actividad metü-ciclohexa-l,5-dieno-carbonil-CoA hidratasa 87 3.3.1. Clonaciôn e hiperexpresiôn del gen mbdWy purificacion de la proteina MbdW 88 3.3.2. MbdW posee actiAdad metü-ciclohexa-l,5-dieno-carboniI-CoA hidratasa 90 4. Anâlisis transcripcional del cluster m bd 92 5. Caracterizaciôn de los promotores divergentes del cluster mbd. P^y 94 5.1. Identificaciôn del punto de inicio de la transcripcion de los genes mbdO y 94 mbdB1 5.2. Clonaciôn y actividad de los prom otores Pq y P,̂ ; en E. coli y Ac^oarcus sp. 96 CIB 6. Caracterizaciôn de la regulaciôn transcripcional especifica de los 98 promotores divergentes del cluster m bd 6.1. M bdR es un regulador transcripcional de los prom otores y 99 6.2. Caracterizaciôn del regulador M bdR 100 6.2.1. Anâlisis A r/Ao de la estructura de la proteina MbdR 100 6.2.2. Clonaciôn y purificacion de la proteina MbdR 102 6.2.3. Determinaciôn de la estructura nativa del regulador MbdR 103 6.3. E studios sobre la interacciôn del regulador M bdR con los p rom otores P^ 104 y Tm/ 6.3.1. Anâlisis A r/y/A de los promotores Pq y P /̂ 104 6.3.2. Estudios in vitro de la interacciôn entre MbdR y los promotores Pq y P,̂ , 105 6.4. Identificaciôn del inductor esp ecifico de la proteina M bdR 108 6.4.1. Estudio in vivo de la inducciôn del promotor Pg, por 3-m etilbenzoil-CoA 108 6.4.2. Estudio in vitro de la inducciôn de los promotores Pq y Pg, por 3-metilbenzoü- 110 CoA 7. Estudio de los promotores que controlan los elementos reguladores en H5 el cluster m bd 7.1. Identificaciôn y clonaciôn de los prom otores P .,y P̂ ĵ H5 7.2. Caracterizaciôn del prom otor catabôlico P,, 115 7.2.1. Estudios in vivo del promotor P.., 115 7.2.2. Estudio in vitro de la interacciôn entre MbdR y P^ 117 7.2.3. Papel de los promotores Pg, y P̂ ̂ en la expresiôn del gen mbdA en Asy)arcus sp. 118 CIB 7.3. Caracterizaciôn del prom otor P̂ ĵ que régula la expresiôn del gen mbdE H9 7.3.1. E stu d ios/« tiw del promotor P,n 119 7.3.2. Estudio A ti/w de la interacciôn entre MbdR y PjK 120 8. Estudio de la regulaciôn sobreimpuesta en el 122 8.1. A nâhsis de la represiôn catabôhca sobre los p rom otores Pg, y P^g 123 8.2. Infiuencia del regulador global A cpR en la expresiôn de los prom otores 124 Pfii y P3R 127 V . D is c u s i ô n ............................................................................................. 1. Identificaciôn y caracterizaciôn genética del cluster mbd, responsable de la ruta central para el catabolismo anaerôbico de 3-metilbenzoato y m-xileno en Azoarcus sp. CIB 2. Caracterizaciôn bioquimica del cluster m bd 2.1. Identificaciôn y caracterizaciôn de las actividades 3MBz-CoA hgasa, 3- 143 metilbenzoil-CoA reductasa y m etiI-ciclohexa-l,5-dieno-carboniI-CoA hidratasa 2.1.1. MbcL\ es la primera 3-metilbenzoato-CoA ligasa caracterizada 143 139 141 142 III V I. CONCLUSIONES V II. B ib l io g r a f îa .. 2.1.2. Identificaciôn de la actiAdad 3-metiIbenzoil-CoA reductasa, la etapa clave de 146 la nueva ruta central mbd 2.1.3. Purificaciôn y caracterizaciôn de la m etil-ciclohexa-l,5-dieno-carbonil-CoA 150 hidratasa (MbdVJ 2.2. Anâlisis del resto de los genes catabôlicos del cluster mhd\ propuesta de la 154 ruta m bd 3. Organizaciôn transcripcional del cluster m bd e identificaciôn de su 159 regulaciôn especifica 3.1. Organizaciôn transcripcional del cA/j'Ar 159 3.2. Identificaciôn del regulador transcripcional especifico del cluster mbd y de 161 su molécula inductora 3.3. Modelo de la regulaciôn transcripcional especifica del cluster mbd 168 4. Regulaciôn transcripcional sobreimpuesta del cluster m bd 151 5. Posible transferencia del 154 177 181 I V A b r e v ia t u r a s 3D 3MBz A A.600 aa ADP Ap' ATP b BCR Bq BSA C "C cDNA Ci Cm' CoA CRP Da dATP dCTP DEPC dGTP DMSO DNA dNTP DTT dTTP EDTA FAD FADH G Gm' GTP h HiS6 HTH IPTG kb tridimensional 3-m ctilbenzoato adenina dcnsidad optica mcdida a 600 nm aminoacido(s) adcnosina difosfato resistcncia a ampicilina adcnosina 5’-trifosfato base (s) bcnxoil-CoA reductasa Bequerelio (2.7x10 ” (d) seroalbumina bovina citosina grado centi'grado D N .\ complementario Curio (3.7x10'" Bq) resistcncia a cloranfenicol coenzima .\ proteina receptora de .\M Pc Dalton desoxiadenosina 5’-trifosfato desoxicitidina 5’-trifosfato dictilpirocarbonato desoxiguanosina 5'-trifosfato dimetilsulfoxido acido desoxirribonucleico desoxinucleotido trifosfato ditiotreitol dcsoxitimidina 5’-trifosfato acido etilendiaminotetracctico dinucleotido de flavina y adenina dinucleotido de flavina y adenina reducido guanina resistcncia a gentamicina guanosina 5’-trifosfato bora secuencia de aminoâcidos com puesta por 6 histidinas m otivo hélice-giro-hélice isopropil-^-D-tiogalatopiranôsido 1000 pares de bases Kd constante de disociaciôn aparente kDa 1000 Dalton Km' resistencia a kanamicina LB medio I .ysogeny Broth m /v relacion m asa/volum en M63 medio mfnimo M63 MA m edio basal para cultivos anaerobios MC m edio MA complementado min m inuto ml mililitro mM milimolar NAD nicotinamida-adenina-dinucleotido NADH(+H+) nicotinam ida-adenina-dinucleotido reducido NADP fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleotido NADPH(+H+) fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleôtido NCBI National Center for Biotechnologi' Information nm nanom etro nt nucleôtido(s) O f f open readingframe PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida pb pares de bases PCR reaccion de amplificaciôn en cadena con DN ' PDB Protein Data Bank RBS secuencia de union al ribosoma Rf' resistencia a rifampicina RNA acido ribonucleico mRNA RNA mensajero RNAt RNA de transferencia rpm revoluciones por m inuto RT-PCR reaccion de retrotranscripcion acoplada a P(]H a factor sigma de la RNA polimerasa SDS dodecüsulfato sôdico T timina TAE tam pon 'Pris-A cctato-ED T.\ TBE tam pon Tris-B orato-ED PA TE tam pon Tris-ED TA Tris tri(hidroximetil)aminometano U unidad de actividad enzimâtica UTP uridina trifosfato UV ultravioleta v /v relacion volumen-volumen X-gal 5-brom o-4-cloro-3-indolilA-D-galactopiran6sido V I I. INTRODUCClÔN 1. La biodegradacion de compuestos aromaticos Los compuestos aromaticos constituyen el segundo tipo de com puestos orgânicos mâs distribuido en la Naturaleza, solo por detrâs de los carbohidratos. Se trata de un grupo muy variado en su composicion, ya que entre ellos encontram os por ejemplo flavonoides, quinonas, aminoâcidos e hidrocarburos com ponentes de los combustibles fôsües. Tam bién son compuestos aromâticos los m onôm eros de la lignina (compuestos fenôlicos), que es el segundo polimero mâs abundante en la naturaleza tras la celulosa (Adler, 1977). Las actividades humanas estân relacionadas con la Hberacion en el medio ambiente de una im portante cantidad y variedad de compuestos aromâticos (dioxinas, nitroarom âticos, bifenilos policlorados, etc.) que no existian anteriorm ente en la biosfera en las concentraciones en las que se encuentran en el présente (xenobioticos) (Rieger et al, 2002). La categoria de com puesto aromâtico no se apHca sôlo al benceno y sus derivados, sino que tam bién se hace extensiva a compuestos cicHcos con dobles enlaces conjugados que poseen un num éro de âtom os de carbono diferente de 6 en el anillo aromâtico (por ejemplo el furano) y a los com puestos heterocichcos, com o por ejemplo sucede con los derivados de la piridina y el tiofeno. Todos estos com puestos siguen la régla de Hückel, segün la cual un com puesto aromâtico es una molécula cfchca, plana, conjugada y que posee 4/7+2 {n es un num éro entero positivo) electrones n deslocalizados (\^oILhardt y Schore, 1994). A pesar de la gran variedad existente de com puestos aromâticos, el m etabohsm o de las moléculas derivadas del benceno es el mâs estudiado en lo que se refïere a su degradaciôn. La elevada estabiüdad termodinâmica del anillo bencénico ha permitido su uso en m uchos campos de la industria (disolventes, insecticidas, poHmeros artificiales, etc.) asi com o la explotaciôn de m uchos com puestos naturales en cuya estructura estâ incluido (résinas, antibiôticos, etc.). Sin embargo, la cara negativa de esta estabiHdad es la elevada persistencia en el medio ambiente de los com puestos en los que se encuentra, tanto naturales como xenobioticos, que en muchas ocasiones poseen una elevada toxicidad (McLeod y Eltis, 2008). U n grupo de com puestos aromâticos arquetipico en cuanto a su estabiHdad y carâcter récalcitrante lo constituyen los denominados BTEX, mezcla de benceno, tolueno, etübenceno y xilenos. Estos cuatro com puestos se producen en elevadas cantidades y pueden ser contam inantes de acuiferos y de sedimentos, procedentes de filtraciones o vertidos de petrôleo o de derivados de este (Lin et a i, 2002). La toxicidad de estos com puestos es variable, pero las consecuencias adversas que puede experimentar un organismo cuando se expone a ellos van desde danos dermatolôgicos leves a efectos sobre el sistema nervioso central o leucemias (Chee-Sanford et a l, 1996). Dada la enorm e diversidad fisiologica microbiana, que représenta un papel clave en el ciclo del carbono, no résulta sorprendente que un gran num éro de bacterias baya evolucionado para degradar los compuestos orgânicos mâs frecuentes en el medio ambiente, entre los que se encuentran los persistentes compuestos aromâticos. La plasticidad de los clusters génicos apoyada por la promiscuidad funcional de muchas de las enzimas impHcadas en la degradacion de los compuestos aromâticos permite la adaptacion de los microorganismos al catabolismo de los nuevos xenobioticos que se Hberan en la naturaleza y guardan simüitud estructural con los com puestos naturales (Diaz, 2004; M cI.eod y Eltis, 2008). La Biologia Molecular es una herramienta fundamental que puede ser empleada para aumentar la capacidad de adaptacion de las bacterias en el m edio ambiente, realizando las modificaciones oportunas que les perm itan degradar mâs eficazmente los compuestos aromâticos que se liberan en grandes cantidades a este com o consecuencia de la actividad humana. La seleccion de microorganismos para reducir los vertidos toxicos (mineralizacion, acumulacion, biotransform acion), asi com o el diseno de biosensores perm ite disponer de nuevas herramientas para hacer frente a la contam inacion medioambiental (Cases y de Lorenzo, 2005b; de Lorenzo, 2008). Exis ten dos estrategias que los microorganismos emplean para la degradacion de compuestos aromâticos, en funcion de la presencia o ausencia de oxigeno en el proceso. E l catabolismo aerobico de compuestos aromâticos ha sido objeto de un extenso estudio (McLeod y Eltis, 2008). El m etabohsm o anaerôbico es primigenio respecto al aerôbico, pero sin embargo ha sido m ucho menos estudiado. E l estudio de las bases bioquimicas y genéticas de la degradaciôn anaerobica de com puestos aromâticos plantea la dificultad intrinseca del trabajo con microorganismos que m uestran dificultades para el crecimiento en medios de cultivo habituales y para su manipulaciôn genética (Moore, 1966). E n el m etabohsm o de com puestos aromâticos, tanto aerôbico com o anaerôbico, los compuestos se procesan a través de una gran variedad de “rutas periféricas” mediante la activacion de moléculas de diferente estructura que convergen en una serie limitada de m etabohtos intermediarios que a su vez se canahzan hacia el m etabohsmo central a través de unas pocas “rutas centrales” , lo que también se conoce con el nom bre de “em budo cataboHco” (Harayama y Timmis, 1989). p-xileno CH, 1.1. Catabolismo aerôbico de compuestos aromaticos Una de las caracteristicas del catabolismo 4-metilMtecol aerôbico de com puestos arom âticos es que el oxigeno no se com porta sôlo com o un aceptor final de electrones, sino que también actua com o cosustrato en algunas etapas clave. El oxigeno es imprescindible para procesos como la hidroxilaciôn y posterior ruptura del ardUo aromâtico por parte de enzimas de tipo oxigenasa (Parales y Resnick, 2006; Vaülancourt et a l, 2006). m-xileno ÇH, o - c r e s o l x 3-metilcatecol Tolueno m-cresol p-cresol Protocatecuato ÇH, COO- Bencilalcohol Benzaidehido Benzoato CH.OH CHO coo- Benceno Fenoxiacetato OCH,COO- Catecol ^ ,O H Fenol La estrategia mâs frecuente para la mineraUzaciôn aerôbica de los compuestos aromâticos se basa en la desestabilizaciôn de la molécula mediante rutas periféricas que incorporan grupos hidroxilo en el anillo. La adiciôn de estos grupos provoca una 4-hi^*ifenilacelalo Homoprotocatecuatc desestabüizadôn electrônica en el anillo, que ve r 'L i r ' n n - CHjCOO- alterado el num éro de sus pares de electrones 3-hidroxifenilacetato C H ,co a Gentisato coo- libres y por tanto se vuelve mâs inestable a la Homogentis^ par que reactivo. Bajo estas condiciones el com puesto aromâtico es sustrato de oxigenasas que cataHzan la apertura del anillo mediante la adiciôn de oxigeno. El com puesto alifâtico originado sufrirâ una oxidaciôn progresiva que terminarâ con la incorporaciôn de los metabolitos résultantes al ciclo de Krebs. Figura 1. Esquema de algunas de las rutas periféricas e Intermediaries centrales de! catabolismo aerôbico bacterlano de compuestos aromaticos La figura muestra algunos de los intermediarios centrales dihidroxilados mâs frecuentes: el catecol y sus derivados (3- metilcatecol, 4-metilcatecol, protocatecuato y homoprotocatecuato), el gentisato y el homogentisato. Los metabolitos centrales aparecen sombreados en gris (figura modificada de Blâzquez, 2009). 6 Saicilato 3-hidroxibenzoato coo Las oxigenasas que incorporan los grupos hidroxilo al anillo bencénico pueden ser monooxigenasas o dioxigenasas en funcion de que incorporen uno o dos grupos hidroxilo, respectivamente (Gibson y Parales, 2000). Los compuestos aromaticos derivados que se form an (catecol, protocatecuato, hom oprotocatecuato, gentisato, hom ogentisato, etc.) pueden portar uno, dos o tres grupos hidroxilo. E n la Figura 1 se m uestra un esquema de algunas rutas periféricas que generan los principales intermediarios catecoHcos que se originan por la actividad de las oxigenasas. Las enzimas que catahzan la transform acion inicial de los com puestos aromaticos en las rutas periféricas son mas o m enos especificas de sus sustratos y frecuentemente se inducen por ellos (Heider y Fuchs, 1997). O tra caracteristica frecuente de la degradacion de compuestos aromaticos es que un mismo compuesto puede degradarse a través de distintas rutas catabohcas com o ocurre, por ejemplo, con el tolueno (Fig. 1). Los intermediarios centrales en los que confluyen las diferentes rutas periféricas experimentan la apertura del anillo por parte de dioxigenasas especificas (Harayama y Rekik, 1989; Harayama y Timmis, 1992; van der Meer et a l, 1992; Harwood y Parales, 1996). El tipo de dioxigenasa que actua varia en funcion de la posicion del enlace de ruptura del anillo respecto a los grupos hidroxilo. Las intradiol dioxigenasas (dependientes de Fe^") catahzan la denomm ada “ruptura ortd' entre dos grupos hidroxilo. En cambio, las extradiol dioxigenasas (dependientes de Fe“ ) catahzan la “ruptura metd’’ adyacente a uno de los grupos hidroxilo. O tras dioxigenasas de ruptura son capaces de catahzar la apertura de compuestos m onohidroxhados, como el 2- aminofenol (Takenaka et al., 1997) y el 1-hidroxi-2-naftoato (Iwabuchi y Harayama, 1998). Tam bién existen dioxigenasas que actuan sobre com puestos trihidroxilados com o el hidroxiquinol (Armengaud et al, 1999) y el acido gahco (Nogales et al, 2005). 1.2. Catabolismo anaerobico de compuestos aromaticos A pesar de que el catabohsmo anaerobico de com puestos aromaticos esta m ucho m enos estudiado que el catabohsmo aerobico, un gran num éro de habitats de gran im portanca ecologica en los que no esta presente el oxigeno presentan contaminacion po r compuestos aromaticos. Acuiferos subterraneos, sedimentos acuaticos, lechos sumergidos y habitats acuaticos estaticos en los que existen abundantes fuentes de carbono representan buenos ejemplos de regiones de la biosfera en las que estân présentes com puestos aromâticos y en las que no abunda el oxigeno (Lovley, 2003). E n m uchos de estos entornos naturales contaminados, los microorganismos degradadores de com puestos aromâticos constituyen un püar fundamental de los ciclos biogeoquimicos (Evans y Fuchs, 1988; Lovley, 2001; W iddel y Rabus, 2001; Gibson y H arw ood, 2002; Lovley, 2003; Heider, 2007). La baja reactividad quimica de los com puestos aromâticos requiere la accion de una maquinaria bioquimica especializada que, ademâs de resultar de un gran interés a nivel de ciencia bâsica y estudios evolutivos, posee un gran interés industrial por sus potenciales aplicaciones biotecnologicas. De hecho, algunas reacciones que hasta hace unos pocos anos solo se conocian en el campo de la quimica orgânica, ahora se sabe que también se desarroUan en procesos bioquim icos de microorganism os anaerôbicos, com o la reduccion anaerobica del benzoato (conocida com o reduccion de Birch) y la carboxilacion anaerobica del fenol (carboxilaciôn de Kobe-Schmitt) (Fuchs, 2008). A pesar de que se han estudiado en profundidad algunos de los procesos bioquim icos propios de la degradacion anaerobica de com puestos aromâticos, los déterm inantes génicos y los mecanismos reguladores relacionados con ellos no se han estudiado con la misma profundidad. Las técnicas de secuenciacion de genomas han perm itido obtener en los ultimos tiempos una inform acion mâs com pléta del potencial catabôhco de diferentes proteobacterias que degradan anaerobicam ente compuestos arom âticos com o por ejemplo PJoodopseudomonas pa/ustris CGA009 (a-proteobacteria fototrofa; Larimer et a l, 2004), Magnetospirillum magneticum AMB-1 (a-proteobacteria desnitrificante; Matsunaga et a l, 2005), Aromatoleum aromaticum E b N l ((3-proteobacteria desnitrificante; Rabus et al, 2005), Thauera sp. M Z IT (P proteobacteria desnitrificante; CP001281), Geobacter metallireducens G S - \S (ô-proteobacteria reductora de hierro; Butler et ai, 2007), Sjntrophus aciditrophicus SB (ô-proteobacteria fermentadora; M clnerney et al, 2007). Las bacterias que degradan anaerobicam ente compuestos aromâticos pueden utüizar diferentes aceptores finales de electrones, que pueden ser moléculas como N O , (que se reduce a N O j o N ,; Sporm ann y Widdel, 2000), Fe^^ (reducido a Fe^ ; Coates et ai, 2001), 8 0 / (reducido a S O / o SO^ ; M orasch et al, 2004b; Peters et al, 2004), o de forma m enos frecuente M n^\ CIO^, Cr^ , ôxido de trimetilamina, dimetü sulfôxido (DM SO), fumarato, etc. (Coates et al., 2002; Gibson y Harwood, 2002; Lovley, 2003; Chakrabort}' y Coates, 2004). E n los procesos fermentativos la fuente de carbono se dégrada anaerobicam ente a través de una serie de reacciones en las que los aceptores de electrones son com puestos orgânicos y el A TP se forma mediante fosforilacion a nivel de sustrato. E l rendim iento energético de este proceso en muchas ocasiones no perm ite una mineralizacion total de los compuestos arom aticos, que se transform an en m etabolites cuya dégrada cion completaran microorganism os sintroficos (Evans y Fuchs, 1988; Elshahed et al. ̂ 2001). La identificacion de las cepas bacterianas présentes en los ambientes anoxicos revela la presencia frecuente de microorganismos encuadrados en el género A la r m s . Los prim eros m iembros de este taxôn se aislaron po r primera vez en la rizosfera de l^ptochloa fusca (L.) K unth (hierba de KaUar) y mediante los primeros anâüsis fisiologicos se definieron com o microorganismos no desnitrificantes (Reinhold-Hurek et al. ̂ 1993) con actividad nitrogenasa (Fries et al.̂ 1994). Los estudios posteriores aum entaron el num éro de especies identificadas dentro del género A:;oarcus y dem ostraron que muchas de estas m ostraban m etabolismo desnitrificante en presencia de diversos compuestos aromaticos suministrados com o ùnica fuente de carbono y energia. Algunas de las nuevas especies identificadas presentaban un m etabolism o anaerobio estricto, A la r m s anaerobius (Springer et a i, 1998), mientras que otras eran anaerobias facultativas, como At^arcus evansii (Anders et ai, 1995), Atparcus tolulyticus (Zhou et ai, 1995), Av^arcm toluvorans (Fries et al., 1994; Song et ai, 1999), A:^arcus toluclasticus (Song et al, 1999) y Aî^oarcus buckelii (Mechichi et ai, 2002). La bacteria Aromatoleum aromaticum E b N l (Rabus y Widdel, 1995) en un principio se identifico com o un m iem bro del género Av^arcus, pero en la actuahdad se clasifica com o un m iem bro del nuevo género Aromatoleum. Todos los m iem bros del género Aî^arcus poseen m otilidad, debida en la mayoria de los casos a un unico fiagelo polar (Anders et al., 1995; Song et al., 1999), y casi todos eüos presentan morfologia de diplobacüo, si bien algunas cepas cultivadas en w-xileno en condiciones desnitrificantes (Hess et al., 1997) presentan m orfologia de coco. E l trabajo realizado en esta tesis doctoral se ha llevado a cabo con la cepa Apoareus sp. CIB, que posee la capacidad de degradar anaerobicamente diversos com puestos aromaticos como por ejemplo w-xileno, tolueno, benzoato, fenilacetato y 3-hidroxibenzoato (Lôpez- Barragân et a l, 2004a). E n los siguientes apartados se analizarân de form a breve los principales clusters génicos que codifican las rutas periféricas y centrales de la degradacion anaerobica de los com puestos aromaticos. CH,OH Etilbenceno Bencilalcohol COO CHO COO OCH3 OH OH OH p-cresol Vainillina 4-h id roxi benzoato Tolueno L-Fenilalanina Fenilacetato n Hj 4-am inobenzoato COO coo B enzoato COO coo 2-hidroxibenzoato Anilina 3-clorobenzoato CH, COO COO )H p-hidroxifenilacetato Fenilpropionato p -cum arato COO coo Hidroquinona p-etilfenol OH CO O G entisato o-Ftalato Fenol Benzoil-CoA COSCoA I ^1 COO o-cresol OSCoA NH Triptôfano 2srne*benzot1-CaA COSCoA 2-am iaobenzoilCHo ^ 'CH 3-m etilbenzoato m-xileno 3 2-am inobenzoatoMetabolismo central HO" ^ OH FloroglucinolI I OH OH OH Pirogalol OH Galato Flidroxihidro-y OH quinona OH COO ^%^3-hidroxi H I benzoato M ^ = * ^ 0 H Ç 00 X)H 2.3-dihidroxi benzoato COO 6-hidroxi- nicotinato ^x^COO COO H 0 ^ , ^ / ^ 0 Resorcinol H O " ^ "OH a-R esorcilato COO HOv ç ^ H Resorcinol 'O H 3-hidroxi- , OH benzoato Hidroquinona OH OH Catecol P rotocatecuato m-cresol Nicotinato Y-resorcilato B-resorcilato Figura 2. Rutas periféricas del catabolisme anaerobico de los compuestos monoaromaticos. Un amplio rango de compuestos aromaticos (enmarcados en diferentes recuadros coloreados en la figura) se dégrada a través de diferentes rutas periféricas dando lugar a un nijmero limitado de intermediaries centrales (fléchas rellenas), taies como benzoil- CoA, 2-aminobenzoil-CoA, 3-hidroxibenzoil-CoA, 3-metilbenzoil-CoA, 6-hidroxinicotinato, resorcinol, floroglucinol e hidroxihidroquinona. Todos estes compuestos son desaromatizados y canalizados al metabolismo central de la célula a través de las denominadas rutas centrales. Como se puede apreciar, algunos de los compuestos aromaticos pueden ser degradados a través de diferentes rutas periféricas y centrales. El tipo de metabolismo respiratorio de la bacteria anaerobica es en muchos casos déterminante para la presencia de uno u otro tipo de ruta. 1.2.1. Rutas periféricas del catabolism e anaerobico de com puestos aromaticos Como se ha indicado anteriormente, las rutas periféricas son las encargadas de transform ar o eliminar grupos funcionales de los com puestos arom aticos para convertirlos en uno de los intermediarios centrales del catabolismo de este tipo de moléculas. Com o se muestra en la Figura 2, los principales intermediarios centrales del catabolismo anaerobico de los compuestos m onoarom aticos homocfclicos son: benzoil- CoA (y sus derivados 2-amino, 3-hidroxi y 3-metil), floroglucinol, hidroxihidroquinona y resorcinol (Heider y Fuchs, 1997; Harwood et a i, 1999; G ibson y H arw ood, 2002; Fuchs, 2008; Carm ona et al, 2009). E n algunos casos las rutas periféricas consisten en un ùnico paso de activaciôn, com o ocurre por ejemplo con el benzoato, el 3- hidroxibenzoato y el 2-am inobenzoato, que se activan a sus correspondientes aril-CoA ésteres. E n otros casos las rutas periféricas consisten en multiples reacciones encadenadas conducentes a transform ar el com puesto aromàtico en el metaboHto intermediario. Cualquier com puesto que vaya ser degradado a través de la ruta del benzoü-CoA debe poseer en su estructura un grupo carboxilo o un grupo alquilo capaz de ser oxidado para dar lugar al correspondiente carboxilo. E n los casos en los que esto no es asi, el com puesto sufre una carboxilacion para dar lugar al âcido aromàtico derivado, que sera activado com o un doéster de CoA (Gibson y H arwood, 2002; Schühle y Fuchs, 2004). 1.2.1.1. Activaciôn de àcidos orgànicos aromaticos con tioésteres de CoA: rutas anaerôbicas y rutas hibridas Varios de los metaboHtos intermediarios presentados en la Figura 2 son compuestos activados con un grupo CoA, que représenta un elemento de desestabüizacion del aniUo arom àtico similar al ejercido po r los grupos hidroxilo en la degradacion aerobica de com puestos aromaticos (Heider y Fuchs, 1997). Los modelos bioquimicos propuestos sugieren que la doesterificacion con CoA no solo supondda una dismtnucion del potencial redox de la molécula sustrato, sino que podria jugar un im portante papel en el transporte y acumulacion de los àcidos arom àdcos en el interior de la bacteria (Harwood y G ibson, 1986), asi com o facilitar su reconocim iento por las enzimas impHcadas en su degradacion (Heider y Fuchs, 1997). 10 La tioesterificaciôn de àcidos orgànicos con CoA es un paso clave en la degradacion anaerobica de m ultitud de compuestos aromàticos, pero no se trata de un paso exclusivo de este tipo de mtas. Se ban descrito rutas aerobicas para el catabolismo de com puestos aromàticos en las que el sustrato para las reacciones de oxigenacion es un tioéster de CoA del com puesto arom àtico (Gescher et a l, 2005). Estas rutas se denom inan “rutas aerobicas hfbridas” y se ban identificado en la degradacion de los àcidos fenilacético, benzoico y aminobenzoico, entre otros, en numerosos microorganism os (Altenschmidt y Fuchs, 1992; Ferràndez et ai, 1998; Bains y Boulanger, 2007). E n algunos casos, com o en el de la degradacion del benzoato, se cree podrian representar una ventaja adaptativa para los microorganismos anaerobios facultativos que habitan en medios en los que se producen oscüaciones frecuentes en la concentracion de oxigeno, puesto que el tioéster de CoA del com puesto aromàtico puede ser sustrato tanto de rutas aerobicas com o anaerôbicas (Niemetz et al, 1995; Fuchs, 2008) 1.2.1.2. Actividades CoA ligasa Las enzimas encargadas de la tioesterificaciôn con CoA de los àcidos aromàticos se conocen com o CoA Hgasas. D e forma genérica podem os decir que se trata de enzimas formadas p o r un ùnico tipo de subunidad cuyo tam ano oscüa entre los 48 y los 65 kDa (Heider y Fuchs, 1997). Para Uevar a cabo su catàHsis requieren un cofactor, el M g"\ asi com o dos sustratos, CoA y ATP. El CoA se incorpora al com puesto aromàtico y el ATP se hidroliza a AM P + 2Pi. Algunos ejemplos représenta tivos de enzimas CoA-ligasas que han sido caracterizadas y cuyos genes ban sido clonados y secuenciados son los siguientes: • Benzoato-CoA ligasas: R palustris (Egland et al, 1995), T. aromatica (Schühle et al, 2003), As^arcus sp. CIB (Lôpez-Barragàn et al, 2004a), Burkholderia xenovorans LB400 (Bains y Boulanger, 2007). • 4-hidroxibenzoato-CoA ligasas: K palustris (Biegert et a l, 1993), T. aromatica (G ibson et a l, 1994). • Fenüacetato-CoA ligasas: A . evansii (M ohamed y Fuchs, 1993), Pseudomonasputida U (Minambres et a l, 1996), Escherichia coli (Ferràndez et a l, 1998). 11 En algunos m icroorganismos, como por ejemplo T. aromatica, ademâs de las CoA ligasas citadas anteriorm ente se han caracterizado otras CoA ligasas, taies como la 3- hidroxibenzoato-CoA ligasa implicada en el catabolismo anaerobico de 3- hidroxibenzoato (Laempe et a i, 2001) y la 2-am inobenzoato-CoA ligasa implicada en el catabolismo aerobico y anaerobico de 2-am inobenzoato (Schühle et ai, 2003). E n A . evansii se han caracterizado dos benzoato-CoA ligasas (Mohamed et ai, 2001) y dos 2- am inobenzoato-CoA ligasas (Schühle et ai, 2001) cada una de estas isoenzimas implicada en la degradacion aerobica o anaerobica de benzoato y 2-am inobenzoato, respectivamente. Por otro lado, en R. palustris tam bién se ha purificado y caracterizado una 3-clorobenzoato-CoA ligasa (Samanta y Harwood, 2005), implicada en la degradacion de dicho derivado halogenado. Por lo tanto, existen diferentes CoA ligasas codificadas en los genomas de los microorganismos. E n la Tabla 1 se présenta una seleccion de enzimas CoA-hgasas que actuan sobre el benzoato y algunos de sus derivados. C om o se puede observar estas enzimas presentan unas caracteristicas similares en cuanto su masa molecular y pl. La benzoato- CoA ligasa BCL,^, de B. xenovorans LB400 (Bains y Boulanger, 2007) es la primera CoA ligasa que ha sido cristaHzada y cuya estructura tridimensional ha sido desentranada (PDB 2V7B). La estructura de la proteina ha perm itido ubicar los aminoâcidos necesarios para la actividad catalitica y proponer un m odelo de interacciôn de las benzoato-CoA ligasas con sus sustratos (Bains y Boulanger, 2007). Sustrato preferente M icroorganismo Nombre proteina T (aa) Mm (kDa) pi Réf. GenBanK Publicaciôn Benzoato K palustris QCi .\QQ9 BadA 523 57 6.5 CAI:26105 Egland et al, 1995 Benzoato A., evansii Bel A 529 58 5.6 .\AN39371 Gescher et al, 2002 Benzoato T. aromatica BclA 527 57 5.3 CAD21683 Schühle et al, 2003 Benzoato Aspanus sp. CIB BzdA 533 57 5.7 .\AQ08820 Lôpez-Barragan et al, 2004a Benzoato D. multivorans BcL\ 516 58 5.6 ACP50613 Peters et al, 2004 Benzoato G. metallireducens BamT 523 59 5.7 ABB32372 Wischgoll et al, 2005 Benzoato Magneto spirillum sp. TS-6 BclA 528 58 6.0 BAE91925 Kawaguchi et al, 2006 Benzoato B. xenovorans LB400 BCU: 531 57 5.8 ABK36771 Bains y Boulanger, 2007 Benzoato B. xenovorans I .B400 BCLa, 530 57 5.6 ABE31536 Bains y Boulanger, 2007 3-liidroxibenzoato T. aromatica HbcL 523 58 5.4 CAC28158 Laempe et al, 2001 4-ltidfoxibenzoato R palustris Hba.3 539 59 5.5 CAE26113 Gibson et al, 1994 2-aminobcnzoato A . evansii .\bmCi 542 59 6.0 Æ3L02069 Schühle et ai, 2001 3-clorobenzoato R palustris KCBIOO A1L\i(hi 547 60 5.8 - Samanta y Harwood, 2005 Tabla 1. Caracteristicas principales de una seleccion de actividades CoA iigasas que actuan sobre ei benzoato y sus derivados. En la tabla se muestran diferentes actividades CoA ligasas que han sido identificadas en rutas catabôlicas de compuestos aromaticos, junto a su sustrato preferente y a los microorganismos en los que se identificaron, asi como algunos parâmetros bâsicos de las protemas responsables de estas actividades: tamano, T (en aa); masa molecular. Mm (en kDa); punto isoeléctrico (pl). 12 Las actividades CoA ligasa poseen una gran interés biotecnologico, ya que los tioésteres de CoA constituyen un grupo de intermediarios activados que poseen papeles clave en diferentes rutas bioquimicas. El benzoil-CoA, por ejemplo, es sustrato en las plantas de diferentes actividades enzimaticas relacionadas con la transferencia de grupos benzoüo en rutas biosintéticas de com puestos tales com o la cocaina y el taxol (Beuerle y Pichersky, 2002). 1.2.2. Rutas centrales del catabolismo anaerobico de com puestos aromaticos Las diversas rutas periféricas canaHzan la degradacion de los compuestos aromaticos hacia un num éro reducido de metaboHtos (Fig. 2). Estos metaboHtos continuan su incorporacion al metaboHsmo bacteriano central a través de las denominadas rutas centrales, encargadas de la desaromatizacion y apertura del anHlo. La ruta central m ejor caracterizada es la de la degradacion del benzoil-CoA (Breese et al, 1998; Egland et al, 1997; H arw ood et al, 1999; Lôpez-Barragàn et al, 2004a; Shinoda et al, 2005; WischgoU et a l, 2005; M clnem ey et al, 2007). Las rutas de degradaciôn del 3- hidroxibenz oil-C o A , 2-aminobenzoil-CoA, resorcinol, floroglucinol, hidroxi­ hidroquinona y 6-hidronicotinato han sido m ucho m enos estudiadas (Lochmeyer et al, 1992; Heider et al, 1998; Phüipp y Schink, 1998; Schink et al., 2000; Laempe et a l, 2001; BoU, 2005a; W ohlbrand et al, 2007; Darley et al, 2007). 1.2.2.1. Bioquimica de la ruta central del benzoll-CoA El benzoato posee ciertas ventajas respecto a otros com puestos aromàticos a nivel de manejo en el laboratorio, com o por ejemplo una mayor solubiHdad y m enor toxicidad. Por eUo, el benzoato se ha utiHzado com o el com puesto m odelo para el anàHsis de la degradaciôn anaerôbica de compuestos m onoarom àticos, y la ruta central del benzoil-CoA ha sido la màs esmdiada. E l cataboHsmo anaerôbico del benzoato se ha estudiado a nivel bioquimico en gran num éro de microorganism os anaerobios taies com o T. aromatica (Breese et al, 1998), Ae^oarcus spp. (Harwood et al, 1999; Lôpez- Barragàn et a l, 2004a; Fuchs, 2008), Magnetospirillum spp. (Lôpez-Barragàn et al, 2004b; Shinoda et al, 2005), K palustris CGA009 (Egland et al, 1997), Desulfococcus multivorans (Peters et al, 2004), G. metallireducens GS-15 (WischgoU et a l, 2005) y S. aciditrophicus (Mcinerney et a l, 2007). La degradaciôn de benzoato en todos estos casos tiene lugar a través de una ruta periférica consistente en un ùnico paso cataHzado por una benzoato- 13 CoA ligasa que activa el benzoato a benzoil-CoA. El benzoil-CoA es postetiorm ente degradado hasta acetil-CoA y CO^ mediante una serie de reacciones enzimaticas que constituyen la ruta central del benzoil-CoA. La ruta central del benzoü-CoA se organiza en dos tramos catabolicos: a) ruta central propiam ente dicha o ruta alta, que convierte el benzoil-CoA en un com puesto alifatico C7-dicarboxil-CoA; b) ruta baja, que transform a el producto de la ruta alta en acetil-CoA y CO^ mediante reacciones similares a las de la p-oxidacion de àcidos dicarboxUicos (Carmona et al, 2009) (Fig. 3). ,S C o A ^S C oA ^SC oA Q j ^ S C o A JOH BadH JL X ) BadI AliAB 4 NAD+ NADH+H 3Acetil-CoA 2ATP + NAD+ AMP + PPi 2ADP + 2Pi NADH+H BadDEFGbadB BcrCBADFdx BzdNOPQBzdM Dch BzdW BamR BadA BclA BzdA BamY Had BzdX BamQ Oah BzdY BamA BamB-l DESAROMATIZACION P-OXIDACIÔN MODIFICADA ACTIVACION RUTA CENTRAL RUTA BAJA Figura 3. Reacciones enzimaticas de la ruta del catabolismo anaerobico dei benzoato en diversas bacterias. En la parte inferior de la figura se indican las diferentes fases de la degradacion: (I) Ruta periférica o activaciôn del benzoato a benzoil-CoA por medio de la benzoato-CoA ligasa (flecha roja); (II) Ruta central, o alta, del benzoil-CoA (flecha naranja) donde tiene lugar la reduccion del anillo aromàtico por medio de la benzoil-CoA reductasa (fléchas azul oscuro) y la (3-oxidacion modificada (flecha verde oliva) mediante hidratacion (fléchas verde claro), deshidrogenacion (fléchas azul claro) e hidrolisis (fléchas amarillas) del compuesto aliciclico; (III) Ruta baja del benzoil-CoA (fléchas grises) que genera 3 moléculas de acetil-CoA y una de COg.También se muestra la ruta convergente del ciclohexanocarboxilato, que es activado por una CoA ligasa (AliA) y seguidamente deshidrogenada por una ciclohexanocarboxil-CoA deshidrogenasa (AliB) (flecha morada). Se indican también las enzimas implicadas en cada una de las etapas sehaladas en R. palustris (Bad), Thauera / Magnetospririllum (Ber), Azoarcus (Bzd), Geobacter / Syntrophus / Desulfitobacterium (Bam). Los metaboHtos representados en la figura se indican a continuaciôn: (1) benzoato; (2) benzoil-CoA; (3) ciclohex-1,5-dieno-1 -carbonil-CoA; (4) ciclohex-1 -eno-1 -carbonil-CoA; (5) 6-hidroxiciclohex-1 -eno-1 -carbonil-CoA ;(6) 2- hidroxiciclohexano-1-carbonil-CoA; (7) 6-cetociclohex-1-eno-1-carbonil-CoA; (8) 2- cetociclohexano-1-carbonil-CoA; (9) 3-hidroxipimelil-CoA; (10) pimelil-CoA; (11) ciclohexanocarboxilato. La serie de metaboHtos (4, 6, 8, 10) solo se ha descrito en R. palustris, microorganismo en el que la benzoil-CoA reductasa BadDEFG realiza una reducciôn extra del anillo aromàtico, mientras que la serie (3, 5, 7, 9) està présente en bacterias de los géneros Thauera, Azoarcus, Magnetospirillum, Geobacter y Syntrophus. 14 La ruta central del benzoil-CoA se puede subdividir a su vez en dos etapas: Reducciôn del anillo aromàtico del benzoil-CoA; Consiste en la eürninaciôn del carâcter arom àtico del anillo de carbono, por lo que se trata del paso clave en el proceso de degradacion anaerobica del benzoü-CoA. La actividad enzimàtica encargada de la catàHsis es la benzoil-CoA reductasa (BCR), que constituye el ùnico paso de la ruta sensible a oxigeno (BoU y Fuchs, 1995). La maquinatia enzimàtica necesatia para la reduccion del aniUo aromàtico es compleja y requiere una gran cantidad de energia. El proceso de reduccion del benzoü-CoA sigue un mecanismo anàlogo a la reaction de Birch, de tal forma que se produce una transferencia de electrones y protones en unas condiciones en las que los potenciales redox son muy bajos (BoU et al, 2002; BoU, 2005a y b). El grupo tioéster del benzoü-CoA facüita la reduccion, razon que expHca la activaciôn de àcidos orgànicos aromàticos con CoA (Fuchs, 2008). Las benzoü-CoA reductasas descritas en la Hteratura se clasifican en dos grandes grupos en funciôn de su dependencia de ATP: a) Benzoü-CoA reductasas independientes de ATP: pertenecen a organismos anaerobios estrictos com o G. metallireducens y L. aciditrophicus (Kung et ai, 2009; Lôffler et ai, 2011). Son complejos multiproteicos Bam BCD EFG H I cuyo nùcleo cataHtico està constituido por las proteinas BamBC organizadas com o un heterotetràm ero b) Benzoü-CoA reductasas dependientes de ATP: pertenecen a bacterias anaerobias facultativas taies com o T. aromatica (BoU y Fuchs, 1995), K palustris (G ibson y G ibson, 1992), A'c^arcus spp. (Ebenau-Jehle et ai, 2003; Lôpez-Barragàn et a i, 2004a). P or otro lado, las benzoü-CoA reductasas se pueden clasificar en fùnciôn de las dos variantes de la reducciôn que se han descrito, y que se diferencian en el producto final (Fig. 3): a) Tipo Thauera'. en T. aromatica, Aî^oarcus spp, Magnetospirillum spp., Desulfococcus multivorans, G. metallireducens y S. aciditrophicus el benzoü-CoA se reduce a ciclohex-1,5-dieno-l-carbonü-CoA (dienoü-CoA). b) Tipo PJoodopseudomonas-. en R. palustris se produce una reducciôn extra que impHca dos electrones adicionales y que da lugar a ciclohex-1-eno-1- carbonü-CoA (enoü-CoA) (Egland et al., 1997; BoU, 2005a y b; Carmona y Diaz, 2005). 15 La ùnica benzoil-CoA reductasa purificada hasta la fecha en un m icroorganism o desnitrificante es la de T. aromatica (BoU y Fuchs, 1995), un heterotetràm ero (BcrABCD). Las subunidades a y ô constituyen un m odulo de activaciôn que posee dos sitios de uniôn para A TP y un cluster [4Fe-4S]^^^^^ que perm ite la entrada de electrones al sistema. Por otro lado, las subunidades (3y definen el m ôdulo cataHtico que coordina dos sitios [4Fe-4S]^’ ̂ “ màs y une una molécula de benzoil-CoA (Môbitz y BoU, 2002; BoU, 2005a y b). La reducciôn del benzoü-CoA en m icroorganismos anaerobios facultativos es un proceso gravoso a nivel energético que requiere el consum o de dos moléculas de ATP por cada aniUo que se reduce (BoU, 2005a y b). Ademàs, se requiere la donaciôn de poder reductor por parte de una ferredoxina, cuya capacidad reductora ha de ser regenerada por una maquinaria enzimàtica especifica. E n T. aromatica se ha descrito una actividad a-cetoglutarato:ferredoxina ôxido-reductasa, com puesta por dos subunidades y codificada por los genes ÂorAB (D orner y BoU, 2002). Sin embargo, en las especies del género Agoarcus las actividades a- cetoglutaicato; ferredoxina ôxido-reductasa que han sido identificadas son dependientes de N A D PH +H ^ y se relacionan con sistemas de très com ponentes, como los codificados por los genes korABC (Ebenau-Jehle et ai, 2003; Rabus et ai, 2005).. La actividad conjunta de la ferredoxina y la actividad ôxido-reductasa es indispensable para el funcionamiento de la reductasa. La reducciôn del benzoü-CoA en los microorganismos anaerobios estrictos parece impHcar la participaciôn de un sistema de transporte de electrones diferente del caracterizado para anaerobios facultativos. E n G. metallireducens se ha detectado) mediante experimentos proteôm icos una elevada expresiôn de protemas de membrana relacionadas con la producciôn de energia (Heintz et aL, 2009), qme podrian jugar un papel relevante en una transferencia de electrones dependiemte del potencial de m em brana a B am D EFG H I, que a su vez donarian los electrones al nùcleo cataHtico BamBC (Kung et al., 2009). p-oxidaciôn modificada: El producto aHcicHco résultante de la actividad BCR expertmemta una serie de reacciones en cadena que se asemejan a una (3- oxidaciôm. El compuesto aHcicHco sufre la incorporaciôn sucesiva de una molécula de agua por la acciôn de una acü-CoA hidratasa, una deshidrogenaciôn cataHzadai por una hidroxiacil-CoA deshidrogenasa y, finalmente, la hidrôHsis por una oxoa(CÜ-CoA hidrolasa, que genera un com puesto aHfàtico dicarboxH-CoA de 16 siete carbonos. D epend iendo de la naturaleza del p roducto de la reduccion del benzoil-C oA , se ban definido dos vias alternativas: a) p-oxidacion tipo Thauera-. descrita p o r prim era vez en esta bacteria, em plea com o sustrato el dienoil-CoA ciclico p roducto de la BCR y genera 3- bidroxipim elil-CoA (Laem pe et a i, 1998; Laem pe et al, 1999; H arw ood et a l, 1999). b) P'Oxidacion tipo BJjodopseudomonas-. descrita en R. palustris, cataliza la transform aciôn del enoü-C oA ciclico p roducto de la BCR y da lugar a pimeHl-CoA (Pelletier y H arw ood, 1998; H arw ood et a l, 1999; Pelletier y H arw ood, 2000). SCoA O: PimE O (hidroxiacil-CoA HO- O; PimF (enoil-C oA h id ra ta sa ) SCoA NAD+ NADH+H+ o O 'G 3-hidroxi-pim elil-CoA 3-ceto-pim elil-C oA /AAcetil-CoA SCoA PimB (p -ce to tio lasa ) SCoA GcdH (glutaril-CoA DH) q 2 H + + C 0, C rotonil-C oA G G lutaril-CoA Crotonil*CoA| hidratasa -H ,0 AcetoacetlI-CoA tiolasa G A cetil-CoA SCoA 3-hidroxibutlril-CoA DH G SCoA CoA X / NAD+ A cetoacetil-C oA NADH+H+ 3-hidroxibutiril-CoA Figura 4. Ruta baja del benzoil-CoA. A través de la ruta central, el benzoil-CoA se transforma en pimelil-CoA (fî. palustris, rectanguio morado) o 3-hidroxipimelil-CoA (en otras bacterias, rectanguio amarillo), dos intermediarios de la ruta de degradacion del àcido graso dicarboxilico pimelato. El compuesto C7-dicarboxil-CoA se dégrada a través de la serie de reacciones que se muestran hasta dar lugar a très moléculas de acetil-CoA y una de CO2. La ruta baja consiste en una (3-oxidaciôn de àcidos grasos dicarboxilicos de cadena larga (fléchas verdes), una glutaril-CoA deshidrogenasa (flecha roja) y una (3-oxidaciôn de àcidos grasos de cadena corta (fléchas azules). Las actividades de tipo deshidrogenasa se abrevian en la figura como DH. 17 El anâlisis comparativo de las enzimas impHcadas en las dos variantes de la ruta muestra diferencias significativas, tanto en las especificidades de sustrato de cada una de eUas como en su estructura primaria (Carmona et al, 2009). La ruta baja del benzoü-CoA prosigue con la degradacion de los derivados aHfàticos dicarboxil-CoA hasta générât très moléculas de acetü-CoA y una de C O 2 (GaUus y Schink, 1994; Harrison y Harwood, 2005) (Fig. 4). La degradaciôn del pimeHl- CoA continua con un proceso (3-oxidativo que da lugar a 3-hidroxipimeHl-CoA, por lo que tanto en la ruta tipo PJoodopseudomonas com o en la tipo Thauera se forma finalmente 3-hidroxipimeHl-CoA (Harrison y Harwood, 2005). Este com puesto sufre una nueva p- oxidaciôn en la que se acaba produciendo glutarü-CoA con la Hberaciôn de una molécula de acetü-CoA. En la mayoria de microorganismos la oxidaciôn y descarboxilaciôn del glutaril- CoA a crotonil-CoA esta mediada por una glutaril-CoA deshidrogenasa bifuncional que genera glutaconü-CoA com o intermediario de la reacciôn (Gomes et al, 1981; Eu et al, 2004). La proteina G cdH responsable de la actividad glutaril-CoA deshidrogenasa bifuncional se ha identificado en Agoarcus sp. CIB (Blâzquez et al, 2008) y G. metallireducens (WischgoU et al, 2009). En algunos organismos que tienen un bajo rendim iento energético en su metaboHsmo, com o por ejemplo las bacterias fermentadoras o reductoras de sulfato com o D. multivorans, el glutaril-CoA sufre una oxidaciôn por una glutaril-CoA deshidrogenasa dependiente de NAD^ que Ueva a cabo la deshidrogenaciôn pero no la descarboxilaciôn (WischgoU et a l, 2009; WischgoU et al, 2010) y posteriorm ente una descarboxUaciôn po r una glutaconü-CoA descarboxUasa anclada a la membrana. Esta ultima actividad es dependiente de sodio y acopla la descarboxUaciôn con el paso de iones de sodio a través de la m em brana, proceso en el que se produce ATP (D im roth y Schink, 1998). Este paso de glutarü-CoA a crotonU-CoA acoplado a la sintesis de ATP perm ite m antener un balance energético positivo en el proceso de degradaciôn de compuestos aromàticos en microorganismos ferm entadores y reductores de sulfato (Elshahed y M clnem ey, 2001; WischgoU et al, 2009). Las actividades enzimàticas encargadas de la reacciôn de conversiôn del crotonU- CoA en acetü-CoA, com o por ejemplo la de la crotonU-CoA hidratasa (3-hidroxibutiril- CoA deshidratasa), 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa y acetoacetU-CoA tiolasa, se han descrito en diversas bacterias, y se trata de actividades pertenecientes a la ruta general de degradacion de àcidos grasos de cadena corta (GaUus y Schink, 1994; Auburger y W inter, 1996; Elshahed et ai, 2001; Elshahed y M cinerney, 2001). Los supuestos genes codificantes de dichas enzimas se han identificado en el genoma de varios microorganismos biodegradadores anaerôbicos (Harrison y H arwood, 2005; Rabus, 2005). 1.2.2.2. Genética de la ruta central de! benzoil-CoA Los estudios sobre los clusters codificantes de la ruta central del benzoil-CoA se iniciaron en T. aromatica y K palustris (Egland et ai, 1997; Breese et a l, 1998). E n la Figura 5 se muestra la organizacion de los clusters génicos relacionados con la degradacion anaerobica del benzoato en diferentes microorganismos (Carmona et al, 2009). En K palustris se encuentran asociados en una ùnica agrupaciôn génica de 25.4 kb los genes necesarios para el catabolismo anaerobico de varios com puestos aromàticos: genes bad {bengoic acid degradation, degradacion de benzoato), genes ali (degradacion de àcidos aüciclicos com o el ciclohexanocarboxilato) y genes hba (ruta periférica de degradacion del 4-hidroxibenzoato). Los genes badDEFG se inducen especificamente por benzoato y codifican las cuatro subunidades de la benzoU-CoA reductasa (Egland et al, 1997), mientras que badB aparentem ente codifica la ferredoxina implicada en la donation de electrones necesaria para la reduccion del anillo aromàtico. El gen badA codifica la benzoato-CoA ligasa necesaria para la activation del benzoato y pertenece a la misma unidad transcriptional que badB (Fig. 5). Los genes badK y badEl codifican una enoil-CoA hidratasa y una deshidrogenasa, respectivamente, que estàn relacionadas con la p-oxidation modificada del ciclohex-1-eno-l-carbonil-CoA a 2-cetociclohexano-l - carbonil-CoA (Fig. 3). La apertura del anillo ahticlico la realizaria el producto proteico de badl mediante una actividad 2-cetociclohexano-l-carbonil-CoA hidrolasa. Los genes badH, badK, badl, junto a los genes aliA y aliB impHcados en el catabolismo del ciclohexanocarboxilato, se organizan en una unidad transcripcional, divergente a la del resto de los genes bad. Los estudios realizados hasta el m om ento indican que en el genoma de un m icroorganism o suelen existir mùltiples genes y clusters génicos que podrian estar imphcados en la ruta baja de catabolismo de los intermediarios dicarboxUicos (pimvato, 3-hidroxipimelato) producto de la ruta de p-oxidation modificada. E n R. palustris se ha identificado un cluster génico, pim FABCD E, organizado com o un operon cuya expresion 19 * I y (rpaoeso) (amb2146) ^ ̂ " 1 .. 1 ^ 11 Magnetospirillum spp. (amb2137) (amb2869) .5 (ebA527B) 6 c = 3 " « 1 1 1 ■§ I, T. aromatica (abA5311) Azoarcus spp. (ebA1954) (ebA1961) cluster IB y, j jS |S .5 " 4 # # w (gmet2073) P (gmet2142) (bamO)(bamA) (bamR) Q (gmet20B9) (gmet2153) ^ ^ g G. metallireducens cluster II I P z # - # " (bamtXbamHXbamGXbamF) (bamE) (bamOXbamC) (bamB) (bamY) S. aciditrophicus Figura 5. Organizacion génica de la ruta de degradaciôn anaerôbica del benzoato en a, p y 5-proteobacterias. Rhodopseudomonas palustris CGA009 (NC_005296), Magnetospirillum spp. [M. magneticum AMB-1 (NC_007626); M. magnetotacticum MS-1 (AAAPOOOOOOOO) y Magnetospirillum sp. TS-6 (AB-167726 y AB243675)], Thauera aromatica (AJ224959), Azoarcus spp. [Azoarcus sp. CIB (AF515816), A. evansii (AJ428529) y Aromatoleum aromaticum EbNl (NC_006513)], Geobacter metallireducens GS-15 (NC_007517) y Syntrophus aciditrophicus SB (NC_007759). Los genes han sido representados con fléchas de diversos colores: rojo, genes que codifican benzoato-CoA ligasas; azul oscuro, genes que codifican las subunidades a-p-y-5 de la benzoil-CoA reductasa; rayado azul, genes que codifican las ferredoxinas asociadas a las benzoil-CoA reductasas; amarillo, genes KGOR; rayado negro, genes que codifican posibles ôxido- reductasas dependientes de NADPH y ferredoxina; verde claro, genes que codifican enoil- GoA hidratasas; azul claro, genes que codifican hidroxiacil-CoA deshidrogenasas dependientes de MAO'"; naranja, genes que codifican oxoacil-CoA hidrolasas; negro, genes reguladores; verde oscuro, genes que codifican posibles acil-transferasas; marron, posibles genes transportadores; rosa, genes que codifican la ciclohexanocarboxilato-CoA ligasa (AliA) y la ciclohexanocarboxil-CoA deshidrogenasa (AliB); punteado, genes pertenecientes a otras rutas catabôlicas de compuestos aromàticos; blanco, genes de funciôn desconocida. Dos rayas verticales separan los genes no adyacentes en el genoma. 20 se ve inducida cuando el microorganism o crece anaerobicamente en benzoato (o pimelato), y en el que se encontrarian codificadas todas las actividades necesarias para transform ar los àcidos dicarboxilicos hasta dar lugar a glutarü-CoA (Larimer et al, 2004; H arrison y Harwood, 2005; VerBerkmoes et al, 2006). Sin embargo, la ausencia de los genes pim en cepas m utantes de R. palustris no les impide el crecimiento anaerobico en benzoato, por lo que muy probablem ente otros paràlogos de los genes pim présentes en el genoma podrian participar también en la ruta baja. E n T. aromatica los genes necesarios para la ruta central del benzoü-CoA se ubican en una agrupaciôn génica de 7.9 kb, en la que se encuentran dos operones divergentes. El operon ber agrupa en el mismo senrido de la transcripciôn a los genes codificantes de las cuatro subunidades de la benzoil-CoA reductasa (bcrCBAD), una ferredoxina las actividades hidratasa (<71:7))/deshidrogenasa (/;<^<7)/hidrolasa (pah) necesarias para la P- oxidaciôn modificada del anillo alicicHco, y las otj3 y oîf4 de funciôn desconocida. E l gen codificante de la benzoato-CoA ligasa (bclA) se localiza en otra posiciôn del genoma, asociado al cluster box, responsable de la degradaciôn aerôbica del benzoato (Schühle et ai, 2003). El operôn divergente de la agrupaciôn génica responsable de la ruta central del benzoil-CoA agrupa a los genes korA y korB, que codifican las dos subunidades necesarias para la actividad a-cetoglutarato ôxido-reductasa, conocida com o K G O R {ketoglutarato oxido-reductasè), encargada de la regeneraciôn del estado reducido de la ferredoxina acoplada a la benzoil-CoA reductasa (Dorner y BoU, 2002). Los genes ber necesarios para la degradaciôn anaerôbica del benzoato tam bién se han identificado en diferentes cepas del género Magnetospirillum (Lôpez-Barragàn et al, 2004b; Matsunaga et ai, 2005; Shinoda et al, 2005; Kawaguchi et al, 2006), y exhiben una identidad de secuencia y organizaciôn génica similar ala de los genes ber de T. aromatica. (Fig. 5). Ademàs, el gen bclA tam bién se localiza fuera del cluster ber en las bacterias desnitrificantes del género Magnetospirillum. El anàlisis del genom a de G. metallireducens GS-15 perm itiô detectar très clusters relacionados con la degradaciôn del benzoato y localizados dentro de una posible isla metabôUca (WischgoU et al, 2005) (Fig. 5). El cluster lA codifica las diferentes subunidades (bamB-I) que form an parte de la benzoü-CoA reductasa propia de los microorganismos anerobios estrictos (Kung et al, 2009) asi com o la actividad hidrolasa del aniUo aUcicUco, bamA (Kuntze et al, 2008). E n el denom inado cluster II se han locaUzado los genes codificantes de la benzoato-CoA Ugasa {bamY) (WischgoU et al. 21 2005) y de la deshidrogenasa {bamQ) (Wischgoll et ai, 2005) e hidratasa {bamK) (Peters et al, 2007) implicadas en la p-oxidacion modificada del producto de la reduccion del benzoil-CoA. Ademàs se identifico el denom inado duster IB, que contiene genes presuntam ente implicados en la ruta baja de degradaciôn del benzoato en este m icroorganism o anaerobio estricto (Wischgoll et al, 2005). La diversidad de actividades enzimàticas que podrian estar codificadas en el duster IB de G. metallireducens, sugiere que la ruta baja en los microorganism os anaerobios estrictos implica sistemas enzimàticos màs complejos que en los m icroorganismos anaerobios facultativos (Carmona et a l, 2009). E l estudio del genom a de J. additrophicus révéla la existencia de un cluster en el que se encontrarian los genes codificantes para la activaciôn del benzoato, y la reducciôn y p- oxidaciôn modificada subsiguientes (îvlclnerney et al, 2007). Todos estos genes m uestran similitud con los de G. metallireducens, pero en lugar de estar dispersos en diferentes clusters se organizan en un unico cluster (Fig. 5). E n los géneros As^arcusjAromatoleum se ha identificado un grupo de genes, hgd, responsable de la degradaciôn anaerôbica del benzoato (Lôpez-Barragàn et a l, 2004a; Rabus et a l, 2005) (Fig. 5). E n el cluster b-pd se halla un gen regulador {bf:plR) seguido por el operôn catabôHco {bgdNOPQAiSTUlAVXYTAï). Los genes bgdNOPQ codifican las subunidades de la benzoil-CoA reductasa, bgdM una ferredoxina presuntam ente asociada a dicha reductasa y bpdV una hipotética ôxido-reductasa implicada en la regeneraciôn del estado reducido de BzdM. Las actividades necesarias para la p- oxidaciôn modificada (hidratasa/deshidrogenasa/hidrolasa) estarian codificadas por los genes bs^dW, bpcîX y bî^dY, respectivamente. Los productos de los genes bpdW, bi^dX y bf(dY m uestran m ayor similitud con las protem as correspondientes de T. aromatica que con las de R. palustris, lo que sugiere que el tipo de P-oxidaciôn que tendria lugar seguiria el m ism o patrôn que en T. aromatica, lo que se traduce en la form aciôn de 3- hidroxipimeHl-CoA com o producto final. Merece la pena destacar que el gen codificante de la benzoato-CoA ligasa (bï^dA) se ubica en el propio cluster bgd y no fiiera de él, como ocurria en T. aromatica. E n el extrem o 3 ' del cluster bgd se han identificado seis genes que constituirian dos sistemas transportadores, uno de tipo ABC {bgdBIB2B3B4BS) y otro de tipo MFS {bgdK), posiblem ente implicados en el transporte de benzoato (Rabus et al, 2005) (Fig. 5). 22 2. Regulaciôn de la expresiôn de los genes responsables de la biodegradaciôn anaerôbica de compuestos aromàticos La capacidad de los microorganismos para degradar com puestos aromàticos no se circunscribe exclusivamente a las actividades enzimàticas necesarias para la catàlisis y el transporte, sino que depende en gran medida del control de la expresion de los genes responsables de estas actividades. Diferentes senales medioambientales influyen en la expresion de los genes relacionados con el catabolismo arom àtico como, por ejemplo, la tension de oxigeno, la presencia o ausencia de luz, las variaciones en el pH , la propia disponibilidad del com puesto aromàtico, etc. La integraciôn de todas estas senales y la m odulation de las actividades necesarias para degradar los com puestos aromàticos son fundam en ta ls para el éxito de los microorganismos en su medio. A pesar de que los sistemas reguladores pueden actuar a nivel transcripcional, traduccional y post- traduccional, el primero de ellos es el màs estudiado en los clusters catabolicos (Diaz y Prieto, 2000; Shingler, 2003; Tropel y van der Meer, 2004; Cases y de Lorenzo, 2005a; Carmona et ai, 2008; Crosby et ai, 2010). Las proteinas que controlan especificamente la expresion de los genes de catabolismo de compuestos aromàticos m uestran una gran variedad en cuanto a su origen evolutivo, lo que sugiere que los genes catabolicos y los reguladores han sufrido un proceso evolutivo independiente (de Lorenzo y Pérez-M artin, 1996; Cases y de Lorenzo, 2005a). Al igual que ocurre con las enzimas, los reguladores de las rutas cataboHcas aerobicas han sido m ucho màs estudiados que los de las rutas anaerôbicas. N o obstante, los escasos trabajos relacionados con la regulaciôn de las rutas anaerôbicas sugieren que los fundam entos que rigen los sistemas reguladores son en esencia los mismos en ambos tipos de metaboHsmo (Carmona et al, 2009). Hasta la fecha sôlo unos pocos reguladores especificos de rutas anaerôbicas se han caracterizado, pero se han propuesto otros asociados a cluster?, anaerôbicos identificados (Tabla 2). Las bacterias en su m edio natural estàn expuestas a un sinnùmero de estimulos y variables medioambientales que afectan a su crecimiento. Ademàs de las senales fisico- quimicas (luz, temperatura, pH , etc.) variables en cualquier medio, la existencia de diferentes fuentes de carbono y la presencia/ausencia de oxigeno resultan de vital importancia para los microorganismos que poseen un alto potencial catabôHco. Estas senales afectan a nivel global a todo el metaboHsmo bacteriano, ya que exigen una — Regulador Familia Microorganismo Actividad Ruta N" Acceso Con efector especi'fïco BzdR O R F ll (1) PdcR (1) CjLmctl542 (1) EbA324 (1) TutC:i/Bl TduS/R (1) 'I'duS/R (1) 'I'diS/R (I) 'I'cs2/Tcr2 (1) T csl/T c rl (1) BamWW HbaR CprK GcdR NicR (1) PadR (1) Rpdl521 (1) ORI-'l (1) PcmQ (1) BadR Rpal794 (1) EbA715 (1) ( I met 1520 (1) BadM BzdR XylR/DmpR XylR/DmpR XylR/DmpR XylR/DmpR ICR (2) TCR (2) ICR (2) I'CR (2) TCR (2) TCR (2) PCR (2) KNR/CRP PNR/CRP LysR IasR CntR GntR MarR MarR MarR MarR TetR TetR Rfr2 A 'oanus sp. CIB 7'. ammalicj K172 A. unmiatiium I'TNT G. metullin'ducvns GS-15 .1. jromalicum TbN 1 7. ummalica 'W 1. aromatica K l72 A. aromaticum I 'TN 1 Ap>arcus sp. T , 1. aromaticum 1 'T N 1 .1. aromaticum I'TNT (,. metallireducens GS-15 R.palustris i'.C,M W D. halniensc A:;;oarcus sp. CIB T. barkeri A. aromaticum I'TNI R palustris BisB5 7 . aromatica K172 metallireducens CAAS R. palustris CX,MA9 R. palustris C.G \ W ) A. aromaticum I'TNI (i. metallireducens ,\MB-1 Rcpresora Desconocida Desconocida Desconocida Desconocida .\ctivadora .\ctivadora .\ctivadora .\ctivadora Desconocida Desconocida .\ctiv adora •Xctivadora .Xctivadora .Xctivadora Desconocida Desconocida Desconocida Desconocida Desconocida Xctivadora Desconocida Desconocida Desconocida Benzoato I'enol i'enoi Tolueno /)-etilfenol 1 olueno Tolueno Tolueno Tolueno 1 'itilbenceno .Xcetofenona Benzoato /)-hidroxibenzoato o-clorofenol Ruta baja del Benzoil-GoA Nicotinato T'enilacetato T’enilacetato /vhidro.xibenzoato yvhidroxibenzoato Benzoato />-cumarato w-bidroxibenzoato Tolueno Benzoato A.XQOmiS CAC12685 Q5P474 .XBB31776 Q5P8R7 AAD12187 X.XD12186 (;.XA05048 (;AA05049 CAI07156 CAI07155 AAK50.369 .XAK50.368 (;.XI07438 C.XI07439 G.XIII7436 GARI7437 ABB32375 XBB32374 .XAF'04013 .XAL87770 ABM69269 ABG88392 CAKI9182 ABE38758 033817 ABB32362 A,\(:23923 Q6N8\'9 GAI06487 ABB31754 007465 Dependientes de O2 XaJR l'NR/CRP R. palustris î.X(KI9 .Xctivadora Benzoato /viiidroxibenzoato B4.3334 AcpR FNR/CRP Aiĉ oarcus sp. GIB Acthadora Benzoato AXX'81959 Tabla 2. Protemas reguladoras implicadas en el control de la degradacion anaerôbica de compuestos aromaticos (Modificado de Carmona et al., 2009). La Tabla esquematiza la principal informacion de interés referente a las proteinas reguladoras implicadas en la regulation del catabolismo anaerobico de compuestos aromàticos, o a las que por su pertenencia a clusters génicos que codifican las actividades necesarias para la degradaciôn de un compuesto aromàtico podrian tomar parte en su regulaciôn (1). Se muestra la familia de reguladores a la que se adscribe la proteina, entre las que se incluyen los sistemas reguladores histidin-quinasa/regulador de respuesta (TCR, two-component regulatory system) (2). También se muestra el microorganismo al que pertenece el producto proteico, asi como su actividad (en los casos en los que se conoce) y su numéro de acceso en GenBank. reprogram acion de la expresion de un amplio num éro de genes para hacer frente a los cambios medioambientales. Asi, los microorganismos han desarroUado una serie de m ecanismos fisiologicos de control que ejercen una regulation superpuesta a la regulation especifica de los operones catabolicos, y que depende de los estados fisiologico y metabolico générales de la bacteria (Cases y de Lorenzo, 2001; Shingler, 2003; Prieto et a l, 2004; Carm ona et al, 2008; Silva-Rocha et al, 2011). E n la Figura 6 se esquematizan los diferentes niveles de regulaciôn que m odulan el catabolismo de com puestos aromàticos en bacterias. Se ha docum entado la existencia de una serie de 24 reguladores que m odulan redes globales de con tro l que im plican a num erosos reguladores especificos. E se tipo de sistemas reguladores encaja en un esquem a en el que existiria una conectividad y una integraciôn de las senales percibidas en una red general de regulation transcripcional, lo que explica que unos cuantos reguladores especificos in teractuen con un num éro lim itado de genes y un num éro màs reducido de reguladores globales influya en un gran num éro de genes (Cases y de L orenzo , 2005a). La m ayoria de los reguladores globales im plicados en la degradaciôn de com puestos arom àticos han sido descritos en rutas aerôbicas (Diaz y Prieto, 2000; Shingler, 2003; T ropel y van der M eer, 2004; Prieto et a l, 2004; Rojo y D inam arca, 2004; M arqués et a l, 2006; M oreno y Rojo, 2008; C arm ona et a l, 2008), pero existen ejem plos conocidos y caracterizados en procesos anaerôbicos, com o las protem as A adR de R. palustris (D ispensa et a l, 1992; Egland y H arw ood, 1999) y A cpR de Agoarcus sp. CIB (D urante- Rodriguez et a l, 2006), que con tro lan la expresiôn génica en ausencia de oxigeno (Eigs. 7 y 8). Regulaciôn sobreimpuesta Promotor ivadûr Genes catabolicos Ciclo de Krebs -süstratD~de la Tuta -interin|di •inductires Regulaciôn especifica Figura 6. Esquema de los dos niveles de regulaciôn transcripcional del catabolismo de compuestos aromàticos en bacterias. En la degradaciôn de un compuesto aromàtico, la interacciôn regulador/promotor es el mecanismo de regulaciôn especifico en presencia de la molécula inductora de la ruta (sombreado naranja). Un segundo nivel de control està constituido por la regulaciôn global o sobreimpuesta (sombreado morado), en la que participan reguladores y factores transcripcionales como UHF (Integration Host Factor), CRP (çAMP Receptor Protein), Fnr (Pumarate nitrate reductase regulator), factores o alternatives de la RNAP, CyoB (citocromo ô ubiquinol oxidasa), PtsN (proteina IIANtr), etc. (Adaptado de Diaz y Prieto, 2000). 25 2.1. Regulaciôn especifica de efector La expresiôn de los clusters responsables de la degradaciôn de com puestos aromàticos expérimenta una estricta regulaciôn dependiente de sus respectivos sustratos (Tropel y van der Meer, 2004; W ohlbrand et al., 2007). Los circuitos reguladores responsables de la regulaciôn de clusters catabôlicos anaerôbicos de com puestos aromàticos que han sido m ejor estudiados son los del catabolismo del benzoato en los microorganism os m odelo K palustris CGA009 (fotôtrofo) y Agoarcus sp. CIB (desnitrificante) (para revisiôn ver Carmona et ai, 2009). 2.1.1. Regulaciôn de cluster bad de R. palustris El cluster especifico para la degradaciôn anaerôbica del benzoato, cluster bad, de K palustris CGA009 està organizado en, al menos, cinco operones diferentes: badDEFGAB, badHlaliBAbadK, badC, badR y badM (Egland et al., 1997; Egland y Harwood, 1999; Pelletier y Harwood, 2000; Peres y Harwood, 2006; VerBerkmoes et al, 2006; Pan et a i, 2008). El producto del gen badR, perteneciente a la familia MarR de reguladores, actua com o activador transcripcional del p rom otor del operôn badDEFGAB (Fig. 7), si bien todavia no se ha dem ostrado la uniôn especifica de BadR a dicha regiôn prom otora (Egland y Harw ood, 1999). A unque no se conoce el efector especifico que interactua con BadR, se ha propuesto al benzoato o al benzod-CoA com o posibles inductores (Egland y Harw ood, 1999). E l p rom otor del gen badD ademàs de estar controlado por BadR està sujeto al control ejercido po r AadR. El producto del gen aadR es un regulador que actua en respuesta a la situaciôn de anaerobiosis. AadR fue el prim er regulador descrito relacionado con el catabolismo anaerôbico de compuestos aromàticos (Dispensa et al., 1992; Egland y H arwood, 1999). Mediante el anàHsis del fenotipo de cepas de R. palustris defectivas para aadK se estableciô una relaciôn con la producciôn de las CoA Hgasas de benzoato y 4-hidroxibenzoato (Dispensa et al., 1992). Estudios posteriores (Egland y H arwood, 1999) confirm aron la participaciôn de AadR en la regulaciôn de la expresiôn de rutas del cataboHsmo anaerôbico de compuestos aromàticos en respuesta a la presencia o ausencia de oxigeno, dada la simHitud de la proteina con el regulador Fnr de E . coli (Unden et a i, 1995; U nden et al, 2002). La acciôn conjunta de BadR y AadR 26 perm ite unos niveles de expresion de los p rom oto res catabolicos, que es im prescindible para el crecim iento en benzoato , de tal form a que cepas de R. palustris m utantes en badK y aadK son incapaces de crecer anaerobicam ente en benzoato (Egland y H arw ood , 1999). Regulaciôn sobreimpuesta (control por oxigeno) Ciciohexano carboxilato COSCoA COQ BCD_ E il _ A r II 4-hfdroxi ^ J b enzoato AadR A adR Figura 7. Organizaciôn y regulaciôn de! cluster bad-ali-hba de R. palustris. Los genes ali, bad y hba se muestran en amarillo, azul y verde, respectivamente. Las enzimas codificadas por estos genes, asi como las reacciones catalizadas por estas han sido recuadradas en los mismos colores. Los genes reguladores badR, badM y hbaR y sus correspondientes productos BadR, BadM y HbaR se muestran en color rojo (regulaciôn especifica de sustrato, recuadro sombreado en naranja). El regulador AadR, que no se encuentra codificado en este cluster, se muestra en morado (regulaciôn dependiente de oxigeno, recuadro sombreado en morado). Las fléchas marrones situadas encima del cluster indican que los genes que abarcan constituyen un operôn (fléchas sôlidas) o un posible operôn (fléchas discontinuas). Los promotores de badD, hbaA y hbaR se representan como fléchas curvas de color marrôn. Los simbolos (-) y (+) indican represiôn y activaciôn transcripcional, respectivamente. La regulaciôn del cluster bad es aùn m às com pleja, puesto que en tra en juego un tercer regulador transcripcional que actua sobre el p ro m o to r de badD, la p ro te ina BadM . L os esm dios realizados hasta la fecha revelan el papel represor de BadM (familia Rrf2) m ediante su un ion al p rom o to r, y p ro p o n en al benzoato com o la h ipotética m olécula inductora (Peres y H arw ood, 2006). N o obstan te , todavia quedan m uchas incognitas pendientes para com pletar la caracterizacion del sistema que régula el catabolism o anaerobico del benzoato en K pabdstris. Asi, p o r ejem plo, se desconoce la regu la tion del o peron badHlaliBAbadK, sobre el que no parecen inten^enir BadR ni BadM . 27 2.1.2. Regulaciôn del cluster bzd de Azoarcus sp . CIB A^oarc'us sp. CIB, la cepa bacteiiana con la que se ha reahzado esta Tesis D octoral, posee el cluster bs(d para la degradacion anaerôbica del benzoato (Lôpez-Barragàn et a l, 2004a). E n este cluster \os genes catabôHcos bs^dNOPOJM STUlAFXYZAl, se organizan en un operôn regulado p o r el p ro m o to r P^. E n posiciôn 5 ' del o perôn catabôHco se encuentra el gen bi(dR, que codifica la proteina reguladora BzdR. La p ro teina BzdR es un represor transcripcional del p ro m o to r que inhibe la expresiôn de los genes catabôHcos bi^d cuando Azoarcus sp. CIB no està creciendo anaerôbicam ente en benzoato y su inducto r especifico es el benzoH-CoA, in term ediario central de la ruta (Barragàn et a l, 2005). E n la Eigura 8 se puede obsen^ar u n esquem a del circuito regulador que contrôla la expresiôn del cluster byd en Ayoarcus sp. CIB. COSCoA Regulaciôn ' especifica de sustrato OSCoA B zd A 3-hidroxipimelil-CoABenzoato Benzoil-CoA Figura 8. Organizaciôn y regulaciôn transcripcional del cluster bzd de Azoarcus sp. CIB. Los genes se encuentran agrupados en dos operones, el gen regulador bzdR (rojo) y el operôn catabôHco bzdNOPQMSTUVWXYZA (azul), controlados por los promotores y P/v, respectivamente. El promotor Pn esta reprimido por la proteina BzdR (elipse roja). La activaciôn del promotor Pn se produce por medio de la molécula inductora, benzoil-CoA, que se une a BzdR e impide la interacciôn de éste con el promotor. Algunas fuentes de carbono, taies como àcidos orgànicos no aromàticos, causan represiôn catabôlica del promotor P^ por medio de un factor aün desconocido. La activaciôn del promotor P/v en condiciones de anaerobiosis es dependiente de la proteina AcpR, codificada por un gen que no està ubicado en el cluster bzd. Los simbolos (-) y (+) indican represiôn y activaciôn transcripcional, respectivamente. La regiôn operadora del p ro m o to r i \ , sobre la que in teractua la p ro teina BzdR posee repeticiones de la secuencia T G C A incluidas en palindrom os m às largos, y su posiciôn s olap ante con la caja -10 para el reconocim iento p o r parte de la subunidad de la R N A poHmerasa justifica el papel de B zdR com o represor transcripcional del p ro m o to r (Barragàn et a l, 2005). BzdR ejerce adem às una acciôn au torrepresora de su expresiôn, puesto que interactua con el p ro m o to r que dirige su transcripciôn, Pp̂ , im pidiendo la transcripciôn del gen mbdK (D urante-R odriguez et a l, 2008). 28 La proteina BzdR posee una arquitectura m odular no descrita en la bibliografîa previamente, lo que la convierte en el m iem bro que da nom bre a una nueva sub familia de reguladores transcripcionales (Barragàn et al., 2005; Durante-Rodriguez et al, 2010). BzdR posee un dom inio arnino-terrninal similar al de los reguladores transcripcionales de la famüia H T H -X R E , que se define por la presencia de un caracteristico m otivo héHce-giro-hélice (HTH) de union a D N A équivalente a los de las proteinas Cro y CI del fago A. (Sauer et al, 1982). El dom inio carboxilo-terminal muestra similitud con enzimas que poseen actividad siquimato quinasa, las cuales cataüzan la fosforüacion de siquimato a 3P-siquimato consum iendo A TP com o cosustrato en la ruta central de biosintesis de com puestos arom àticos (Vogels y Van der Drift, 1976). La proteina BzdR no es el ùnico regulador que m odula la expresiôn del prom otor i \ . Ayoarcus sp. CIB posee un gen, acpR, cuyo producto proteico muestra una elevada simiHmd de secuencia con la proteina Fnr de E. coli (Unden et ai, 1995; Unden et ai, 2002). La proteina A cpR de Ayoarcus sp. CIB es un activador estrictamente necesario para la actividad de Py y un m utante de Ayoarcus sp. CIB defective para el gen acpK puede ser com plem entado con el gen fn r de E. coli de forma que se restaura el crecimiento anaerôbico en benzoato (Durante-Rodriguez et al, 2006). AcpR participa en la regulaciôn sobreim puesta del cluster byd, y es responsable del control por oxigeno (ver los pàrrafos siguientes). 2.1.3. Otros reguladores de! catabolismo anaerôbico de com puestos aromàticos 2.1.3.1. HbaR {Rhodopseudomonas palustris) El cluster hba de K palustris codifica las actividades enzimàticas necesarias para la ruta periférica que convierte el 4-hidroxibenzoato en benzod-CoA. La organizaciôn génica del cluster hba perm ite proponer la existencia de cuatro unidades transcripcionales: hbaR (operôn regulador), hbaA (4-hidroxibenzoato-CoA ligasa), hbaBCD (4- hidroxibenzoil-CoA reductasa) y hbaEFGH (presunto transportador de tipo ABC) (Egland et a l, 1997) (Fig. 7). La proteina H baR reconoce y une 4-hidroxibenzoato com o molécula efectora, activando la transcripciôn de hbaA, pero no parece controlar la expresiôn de los genes para la degradaciôn aerôbica de 4-hidroxibenzoato (Egland y Harwood, 2000) (Fig. 7). La proteina H baR pertenece a subfarmHa D nr dentro de la famüia F n r/C rp (Kôrner et 29 ai, 2003). Con la exception de HbaR, todos los miembros del grupo D nr son reguladores globales que controlan la expresion de genes implicados en procesos de desnitrificacion (Egland y H arw ood, 2000). El hecho de que la expresion de hbaA no se active en condiciones aerobicas presupone la existencia de un regulador sensible a la anaerobiosis (Egland y Harwood, 2000). Se ha detectado una posible caja de union para la proteina Fnr de E . coli en el p rom otor del gen hbaB^ lo que podria suponer la activation de la trancripcion de hbaR en ausencia de oxigeno, mediada a través de un ortologo de Fnr (Egland y Harwood, 2000). AadR es el candidato màs plausible para ser el ortologo de Fnr, puesto que pertenece a la superfamilia de reguladores F n r/C rp y es necesario para la expresion de hbaA en respuesta a 4-hidroxibenzoato (Egland y Harwood, 2000). Esta red de control del gen hbaA basada en dos reguladores diferentes constituiria una estrategia para evitar fenomenos de regulaciôn cruzada y lograr asi un control especifico màs preciso bajo condiciones de ausencia de oxigeno (Egland y Harwood, 2000). Hasta la fecha se desconoce el mecanismo de control de la expresion de los operones hbaBCD y 2.1.3.2. TdiSR (Azoarcus y Thauera spp.) En T. aromatica K l 72 los genes tdiSR se transcriben en el mismo sentido que los genes catabôHcos bss impHcados en la m ta periférica del tolueno, y se ha dem ostrado la capacidad de TdiR para urdrse in vitro a la regiôn 5 ' del operôn bss (Leuthner et ai, 1998). E l estudio de la degradaciôn anaerôbica de tolueno en A-goarcus sp. T perm itiô identificar los genes tdiSR, adyacentes a los genes bss pero con orientaciôn divergente respecto a estos ùltimos (Achong et a i, 2001). Experim entos posteriores en E aromatica T1 revelaron que la m utaciôn de tutB1 (pdiR) tmpedia el crecimiento anaerôbico en tolueno de la cepa, asi com o la expresiôn de tutE (bssD), lo que concuerda con el papel activador de este regulador sobre los prom otores catabôHcos bss (Coschigano, 2000; Coschigano y Bishop, 2004). Los genes tdiSR dan lugar a dos productos, la hisddin-quinasa sensora TdiS que se encargaria del reconocim iento de la molécula inductora, y el regulador transcripciom l TdiR, que séria activado (fosforilado) por TdiS (Leuthner et a l, 1998). La presencia de un dominio H T H caracteristico de la famüia de reguladores F ixJ/N arL (Leuthner et d., 1998) permite clasificar a TdiR dentro de este grupo de reguladores. Los dos 30 com ponentes del sistema regulador, TdiS y TdiR, m uestran similitud significativa con protem as hom ologas que regulan las rutas cataboHcas aerobicas del tolueno (TodST) (Tau et a i, 1997) y del estireno (St)^SR) (Velasco et al, 1998), por lo que todos ellos se pueden agrupar en una nueva subfamiHa de sistemas reguladores de dos com ponentes relacionados con el control de rutas cataboHcas de com puestos aromàticos (Busch et al, 2007). 2.2. Regulaciôn sobreimpuesta Las dos senales ambientales que constituyen modelos de esmdio de la regulation sobreimpuesta son la presencia/ausencia de oxigeno y la disponibüidad de fuentes de carbono preferentes. Estas senales son integradas por reguladores transcripcionales globales que modifican la expresiôn de los dusters catabôHcos anaerôbicos actuando de forma directa sobre eUos o indirectamente al modificar la expresiôn de reguladores transcripcionales especificos. 2.2.1. Regulaciôn dependiente de oxi'geno El oxigeno représenta uno de los principales factores medioambientales que contrôla la expresiôn de las rutas anaerôbicas de com puestos aromàticos. Com o se ha senalado al com entar los principales com ponentes del sistema regulador del duster bad para la degradaciôn anaerôbica de benzoato en R. palustris, los genes badDEFG (codifica la benzoü-CoA reductasa) y badA (codifican la benzoato-CoA Hgasa) experimentan una significativa reducciôn de su expresiôn en condiciones aerôbicas (Egland et al, 1997; Peres y H arw ood, 2006). E n T. aromatica se detectô una im portante disminuciôn de la actividad benzoü-CoA reductasa cuando la bacteria se cultivaba en presencia de oxigeno (Heider et a l, 1998). E n M. magnetotacticum sp. TS-6 los genes bss codificantes de la actividad bencilsuccinato sintasa encargada de la prim era etapa del cataboHsmo anaerôbico del tolueno sôlo se transcriben en presencia de tolueno en condiciones anôxicas (Shinoda et a l, 2005). Los estudios proteôm icos realizados en A . aromaticum E b N l (W ohlbrand et a l, 2007) m uestran la inducciôn de un bajo num éro de protem as relacionadas con la degradaciôn anaerôbica de benzoato cuando la bacteria se cultiva anaerôbicam ente en esta fuente de carbono aromàtica. N o obstante, se ha docum entado la expresiôn en condiciones aerôbicas de genes que codifican enzimas sensibles a la presencia de oxigeno, com o por ejemplo la BCR de M. magnetotacticum TS-6 (Shinoda et al, 2005) o la bencilsuccinato sintasa de Thauera sp. 3Ï" DNT-1 (Shinoda et ai, 2004). P or lo tanto, cada microorganismo parece haber adoptado una estrategia reguladora diferente para la expresion dependiente de oxigeno de los dusters catabolicos de compuestos aromaticos. La expresion de enzimas sensibles a oxigeno en condiciones aerobicas puede expUcarse com o un cierto escape de la regulation especifica o com o un mecanism o de los m icroorganism os anaerobios facultativos para m antener niveles basales de ciertas enzimas ante la evenmalidad de un cambio en la tension de oxigeno (Fuchs, 2008). O tro ejemplo que justifica la ausencia de una regulaciôn dependiente de los niveles de oxigeno se halla en T. aromatica y Magnetospirillum spp., m icroorganismos en los que una unica benzoato-CoA ligasa inicia tanto el metabolismo aerôbico com o el anaerôbico del benzoato (Schühle et a i, 2003; Kawaguchi et al, 2006). Como hemos indicado anteriorm ente, en K palustris y Agoarcus sp. CIB existen proteinas ortôlogas de Fnr, Uamadas respectivamente AadR y AcpR, que juegan un papel esencial en la regulaciôn de los clusters catabôHcos de com puestos aromàticos dependiente de la presencia/ausencia de oxigeno (Dispensa et al, 1992; Egland y Harwood, 1999; Durante-Rodriguez et a l, 2006) (Figs. 7 y 8). A pesar de la simüitud existente a nivel de secuencia aminoacidica y de mecanismo de acciôn entre AadR, AcpR y Fnr, parece que las très proteinas no juegan el mismo papel en los correspondientes microorganismos hospedadores. La ausencia de Fnr en E. coli se caracteriza por producir efectos pleiotrôpicos que conducen, por ejemplo, a la incapacidad de la cepa m utante para crece empleando N O / o fumarato com o aceptores finales de electrones (Unden et a l, 1995). Sin embargo, la ausencia de AadR y de AcpR en R. palustris y Ayoarcus sp. CIB, respectivamente, no parece acarrear ninguna desventaja que impida el crecimiento anaerôbico en fuentes de carbono no aromàticas. Este fenotipo podria ser indicativo de que AadR y AcpR son reguladores dependientes de oxigeno que estàn especiaHzados en el control de la expresiôn de los genes responsables del cataboHsmo anaerôbico de compuestos aromàticos, en lugar de ser reguladores globales que controlen la expresiôn de diferentes ciccuitos génicos, como ocurre con otros m iem bros de la superfamiHa Fnr (K ôm er et al, 2003). Esta aparente especiaHzaciôn de funciones podria ser caracteristica de m icroorganismos capaces de degradar com puestos aromàticos com o R. palustris y Agoarcus sp. CIB, en los que el anàHsis de su genom a révéla la presencia de un im portante num éro de genes reguladores de la superfamiHa F n r/C rp , m ientras que en E. coli sôlo se ha identificado un gen de este irpo,fnr, en su genom a (Kôrner et a l, 2003; Rabus, 2005). 32 Recientem ente se ha identificado en K palustris un nuevo regulador global, FixK, relacionado con el crecimiento en condiciones de microaerofilia y con la adaptacion del m etabolism o desde estas condiciones a la anoxia. La proteina FixK funciona en coordinacion con un sistema sensor transm em brana codificado por los genes JixJh, y activa la expresion de aadR (Rey y Harwood, 2010). Ademas, se ha reahzado un analisis transcriptom ico que demuestra que AadR contrôla la expresion de otros genes ademas de regular los operones bad y bba (Egland y Harwood, 1999; Egland y Harwood, 2000), activando por ejemplo la expresion del cluster pirn y reprim iendo la expresion de diversas dioxigenasas que emplean oxigeno com o cosustrato para su cataHsis (Rey y Harwood, 2010X 2.2.2. Regulacion dependiente de fuentes de carbono alternativas (represion catabolica) La existencia en los habitats bacterianos de diferentes fuentes de carbono que pueden ser empleadas por un mismo microorganismo convierte en una ventaja adaptativa a los mecanismos reguladores asociados a la eleccion selectdva del orden en el que se van a utilizar los diferentes sustratos. El térm ino represion catabolica, o represion por catabolito, agrupa al conjunto de procesos reguladores que perm iten que la expresion de las rutas catabolicas para la degradacion de com puestos no preferenciales esten silenciadas cuando las bacterias estan expuestas a una fuente de carbono preferencial, incluso cuando el inductor especffico de la ruta esta presente (Carmona, 2008; Cases y de Lorenzo, 2005a; Diaz y Prieto, 2000; Rojo y Dinamarca, 2004). Podem os considerar fuentes de carbono preferenciales a las que son de facil asimilacion e incorporacion al metabolismo bacteriano, y que no requieren una inversion energética inicial muy elevada para su catabolismo, com o si ocurre con los compuestos aromaticos. El estudio del catabolismo aerobico de com puestos aromaticos ha perm itido identificar alguno de los mecanismos que participan en el proceso de represion catabolica (CoUier et al, 1996; Shingler, 2003; Prieto et a l, 2004; Rojo y Dinamarca, 2004; Marqués et a l, 2006; O htsubo et al, 2006; Carmona et a l, 2008; M oreno y Rojo, 2008). E n E. coli la represion catabolica de las rutas de degradacion de compuestos arom aticos esta mediada por la proteina Crp, un activador global de la transcripcion en presencia de AM Pc (Prieto et a l, 2004). E n el crom osom a de P. putida se ha haUado un gen cuyo producto génico muestra una alta similitud de secuencia con la proteina Crp de E. coli pero no parece estar relacionada con los procesos de represion catabolica (Suh et 33 al, 2002; Morales et a l, 2004; Rojo y Dinamarca, 2004; Milanesio et ai, 2011). E n bacterias no entéricas se ban identificado varias proteinas relacionadas con la regulacion por catabolito, com o por ejemplo Crc {Catabolite repression control) (Morales et al., 2004; Rojo y Dinamarca, 2004; M oreno y Rojo, 2008; M oreno et a l, 2010; Linares et al, 2010), P tsN y P tsO (sistema fosfotransferasa relacionado con el m etabolism o del nitrogeno; Marqués et a l, 2006; Pflüger y de Lorenzo, 2008; Pflüger-Grau et al, 2011), algunas oxidasas terminales (CyoB) capaces de detectar el estado redox de la bacteria (Petruschka et a l, 2001; Morales et al, 2006) y el regulador de respuesta B phQ (O htsubo et al, 2006). Todos estos reguladores globales contribuyen a m odular la expresion de rutas de acumulaciôn de carbono y nitrogeno en la célula (Daniels et a l, 2010). N o obstante, diferentes cepas de la misma especie pueden utilizar el m ismo factor transcripcional para controlar distintas funciones celulares, lo que refieja que los sistemas reguladores han evolucionado independientem ente de las funciones que regulan (Milanesio e/ 2011). En ocasiones la represion catabolica no se ejerce directam ente sobre el prom otor de los genes catabolicos, sino que se ejerce a través de la variaciôn en los niveles de expresion de los reguladores especificos correspondientes. U n ejemplo de este sistema de control se ha descnto en P. putida G p o l, cepa en la que cuando aumenta la represion catabolica de la ruta para la degradacion de alcanos (genes all^ disminuye la expresion del gen regulador que codifica el activador transcripcional especifico AlkS (Canosa et al, 2000). En P. putida H se observ a un fenom eno similar sobre la expresion de los genes phi, responsables de la degradacion de fenol, mediante la m odulaciôn de la expresion del activador especifico PhlR (Müller et al, 1996). A pesar de que los trabajos relativos a la represion catabolica son m ucho mas abundantes en el catabolismo aerobico de com puestos aromaticos, tam bién se han docum entado ejemplos en microorganismos anaerobios com o T. aromatica y Aî^arcus sp. CIB (Heider et a l, 1998; Lôpez-Barragân et a l, 2004a). E n estos microorganismos la ruta para la degradacion anaerobica del benzoato esta reprimida en presencia de àcidos orgânicos com o succinato, malato y acetato. Por o tro lado, com puestos que no pueden ser m etabolizados po r estas cepas bacterianas, com o gHcerol, fructosa y maltosa, no causan represion de la ruta. Los mecanismos moleculares de la represion catabolica en estos microorganism os anaerobicos se desconocen hasta la fecha. Solo los experimentos preliminares Uevados a cabo en A^oarcus sp. CIB revelan que la represion catabolica 34 tiene lugar a nivel de la actividad del prom otor catabolico que contrôla la expresion de los genes pero no sobre el prom otor que contrôla la expresion del regulador BzdR (Lôpez-Barragân et a i, 2004a; Durante-Rodriguez et al., 2008). 3. La degradacion anaerobica de tolueno y m-xileno U no de los grupos de com puestos aromaticos mas contam inantes es el denom inado BTEX, form ado por los hidrocarburos benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos (isomeros orto, meta y para). Estos compuestos aromaticos se producen en las industrias petroquimicas y se caracterizan por poseer una elevada hidrofobicidad y volatilidad. El extensivo uso de estos productos los convierte en unos contam inantes de prim er orden, présentes por ejemplo en acuiferos, sedimentos, vertidos petroliferos y productos derivados de la gasolina (Lin et a l, 2002). La biodegradacion anaerobica de los com puestos BTEX es la m ejor estudiada en comparacion con la de otros hidrocarburos aromaticos, com o pueden ser los hidrocarburos aromaticos polidclicos (PAHs) o heterociclicos. 3.1. La degradacion anaerobica de tolueno D entro de los com puestos B T EX el tolueno ha sido el mas estudiado tanto en bacterias anaerobias facultativas com o estrictas. El estudio del catabolismo anaerobico del tolueno ha perm itido identificar una nueva estrategia general de activacion de hidrocarburos aromaticos (y tam bién alifaticos) que se fundam enta en la adiciôn covalente de dichos hidrocarburos a una molécula de fumarato. Los âcidos aromaticos que se generan son sustrato adecuado para reacciones similares a las de la p-oxidaciôn en la formaciôn, finalmente, de benzoil-CoA o sus derivados (Fuchs, 2008; Foght, 2008). Los genes relacionados con la degradacion anaerobica del tolueno se identificaron inicialmente en T. aromatica K l 72 y se denom inaron bss {bencjlsuccinate ^nthasé) y bbs (^- oxidation of bencghuccinatè). Los genes bss codifican la actividad responsable de la activacion del tolueno a bencilsuccinato (Leuthner et al., 1998; Coschigano et al, 1998), mientras que los bbs dan lugar a los productos que canaHzan la degradacion del bencilsuccinato a benzoil-CoA (Leuthner y Heider, 2000) (Fig. 9). 35 < 9 5 1 N J CO < Ü (/) O Ü 8Î U II o D r a 00 UJ C5 t i t&& o o O c CO C ~ CD 0 E -Z w o o Î ' - ' e r a ̂8 g I I I 0 - 0 0 E . 5 - 0 0 CO 0 W —' ' II m Ns s (/) c 'Oi l ^ 0 0 O E „ 0 "D 1 8 (0 0 0 w O C c o c U 0 « 1 o 9 g i (/) 0 □Û -D CO o 8 ^ Ô E 2 CO Q. 0j'i ._ CDâj 0 ^ I ' i Î: -5, — CD 0 < ^ O 8 S S - CO °œ ( j ro _2 V o Ç ^ — Ü O o 0 TD O o CO -o è 5s = ■O . _ IPiti1*1g s ° COo 8 2 o ~ 0 ÜIÎ O C 0 Æ 1 LU iÇ o — ^ œ CO R co CO a o E CO E . - i TO :go O -CD O) 0 02^ g i l l CD CO -o cQill III IIIIII 36 El proceso se inicia con la adicion po r parte de la bencilsuccianto sintasa del grupo metilo del tolueno a una molécula de âcido fumàrico, para dar lugar a (R)- bencilsuccinato. La bencilsuccianto sintasa es un complejo multiproteico ((X2P2Y2) codificado po r los genes bssA.BC en T. aromatica K l 72 y por sus ortôlogos tutDGF en T. aromatica T1 (Li et al., 2009). La m utacion de cualquiera de estas subunidades impide la accion enzknâtica (Achong et a l, 2001; Coschigano, 2002). E n presencia de oxigeno la subunidad a se fragmenta, lo que conduce a una inactivacion irreversible de la enzima (Leuthner et a l, 1998). La [3-oxidaciôn del (R)-bencilsuccinato se inicia mediante su activacion con CoA, mediada por el complejo cataHtico BbsEF, responsable de la actividad succinil-CoA;(R)- bencüsuccinato CoA-transferasa (Leutwein y Heider, 2001). A continuaciôn el producto del gen bbsG Ueva a cabo una deshidrogenaciôn que da lugar a (E)-fenil-itaconil-CoA (Leutwein y Heider, 2002). Los pasos restantes hasta la form acion del benzoh-CoA no se han caracterizado bioquimicamente. La tercera enzima de la ^-oxidacion podria ser una hidroxiacü-CoA hidratasa codificada por el gen bbsH, que transformaria el producto de la reaccion anterior en 2-[hidroxi(fenil)metil]-succinh-CoA (Leuthner y Heider, 2000). E n cuarto lugar una hidroxiacü-CoA deshidrogenasa formada por dos unidades, o dos isoenzimas con actividad hidroxiacü-CoA deshidrogenasa, codificadas por los genes bbsCD darian lugar a benzoü-succinil-CoA (Leuthner y Heider, 2000). La ruta periférica terminaria con la accion de una tiolasa, hipotéticamente codificada por los genes bbsAB, que escidiria el producto de la reaccion anterior en benzoil-CoA y succinil-CoA (Kühner et al, 2005). Los genes responsables de la ruta periférica de degradacion anaerobica de tolueno en bacterias desnitrificantes de los géneros Thauera, As^arcusjAromatoleum y Magnetospirillum se ubican en una misma agrupacion génica que incluye a los genes catabôhcos bss (o sus correspondientes ortologos tut) y bbs y a un sistema regulador de dos com ponentes tdiSK (subfamüia T odS/T odT ) (Kube et a l, 2004) (Fig. 9B). La organizaciôn transcripcional de los genes bss!tut se ha estudiado en T. aromatica K l 72, T. aromatica T1 y Aî^arcus sp. T (Coschigano, 2000; A chong et a l, 2001; H erm uth et al, 2002). E n Agoarcus sp. CIB se ha identificado el cluster bbs-bss completo, y se ha caracterizado su organizaciôn transcripcional, asi com o el sistema regulador especifico m ediado por el sistema de dos com ponentes TdiSR (Blazquez, 2009). E n la cepa T. aromatica K l 72 existe ademas un control post-transcripcional de los genes bss, que 37 implica un procesam iento del RNA m ensajero que da lugar a transcritos de diferente vida media, corta en el caso de bssDCABE y larga en el caso de bssCABE. Este mecanism o modularia los niveles de la bencilsuccinato sintasa BssCAB y de su activador BssD en la célula (Herm uth et a i, 2002). El analisis del genoma de m icroorganismos anaerobios estrictos com o G. metallireducens GS-15 ha permitido la identificaciôn de genes que m uestran similitud con bss-bbs, pero se han hallado diferencias en los sistemas reguladores asociados, que pertenecen a las famihas XylR y TetR en lugar de m ostrar similitud con TdiSR (Kühner et ai, 2005; Butler et ai, 2007) (Fig. 9B). 3.2. La degradacion anaerobica del m-xileno Al comienzo de este trabajo se conocian diferentes cepas bacterianas capaces de emplear anaerobicam ente el w-xileno com o ünica fuente de carbono y energia, tanto 3- proteobacterias desnitrificantes com o Agoarcus toluvorans T d l5 (Fries et a i, 1994), Agoarcus sp. M (Hess et al., 1997), A ^arcus sp. T (Krieger et al., 1999; A chong et d., 2001), Thauera sp. m X yN l (Rabus y Widdel, 1995) y Ac^oarcus sp. CIB (Blazquez, 2009), ô-proteobacterias reductoras de sulfato com o la cepa mXySl (Harms et a i, 1999), como la bacteria Gram-positiva reductora de sulfato Desulfotomaculum sp. 0 X 3 9 (Morasch et d., 2004). La ruta periférica para la degradacion anaerobica del w-xileno coincide con la ruta periférica del tolueno. El w-xheno se activa con âcido fumàrico para dar lugar a 3- metilbencilsuccinato (Krieger y et a l, 1999). La reaccion esta catahzada por la misma bencilsuccinato sintasa que activa al tolueno en Agoarcus sp. T (Achong et al., 2001; Verfürth et al, 2004). Las cepas de Aî^arcus sp. CIB m utantes en los genes bss y bbs se m uestran incapaces de crecer anaerobicam ente empleando tanto tolueno com o m-xûeio com o fuentes de carbono (Blazquez, 2009), lo que confirma la imphcacion de la misma ruta periférica Bss-Bbs en el m etabohsm o anaerobico del tolueno y w-xileno. La degradacion del w-xileno a través de su ruta periférica com ün con el tolueno dada l u ^ a 3-metilbenzoil-CoA en lugar de a benzoil-CoA (Krieger et a i, 1999; Blazquez, 20(9) (Fig. 9A). 3.3. La ruta central del 3-metllbenzoll-CoA Com o se ha tndicado anteriormente, el 3-metübenzoü-CoA se genera en la m a periférica de la degradacion anaerobica del w-xileno (Fig. 9A) y es muy probablem ente el 38 prim er intermediario de la degradacion anaerobica del 3MBz (Carmona et al, 2009). Los estudios Uevados a cabo con Agoarcus huckeln U120 han dem ostrado que el 3- merilbenzoU-CoA puede producirse com o intermediario en otra ruta diferente, la responsable de la degradacion anaerobica del o-cresol (Rudolphi et al, 1991). El mecanismo propuesto sugiere que el o-cresol podria sufrir una carboxilacion que daria lugar a 4-hidroxi-3-m etübenzoato, un intermediario que se activaria a su correspondiente tioéster de CoA y posteriorm ente se deshidroxilaria a 3-metilbenzoü- CoA. A pesar de que el 3-metilbenzoil-CoA constituye, por lo tanto, un intermediario central en la degradacion anaerobica de com puestos aromaticos metüados (Fig. 2), su ruta de degradacion era desconocida al comienzo de esta Tesis Doctoral. El hecho de que cepas de A la r m s sp. CIB m utantes en la ruta central bzd o en la actividad glutaril- CoA deshidrogenasa (gcdH), esencial para la incorporacion de los productos de la degradacion del benzoil-CoA al m etabolismo central bacteriano, puedan crecer anaerobicam ente empleando w-xileno com o fuente de carbono (Blazquez et al, 2008; Blazquez, 2009) apoya la hipotesis de la existencia de una ruta central y una ruta baja especificas para la degradacion de 3-metübenzoil-CoA y distintas de las ya caracterizadas para la degradacion de benzoil-CoA. La necesidad de una ruta central especifica del 3-metilbenzoil-CoA, distinta de la am pham ente extendida ruta central del benzoil-CoA, perm ite expHcar que si bien se han aislado num erosos m icroorganism os degradadores de tolueno solo unos pocos sean capaces de m inerahzar también w-xileno. D ado que Agoarcus sp. CIB es un m icroorganism o m odelo para el estudio de las rutas catabôHcas que perm iten la degradacion de com puestos aromaticos en condiciones anaerôbicas (Lopez-Barragân et a l, 2004a; Barragân et al, 2005; Durante-Rodriguez et al, 2006; Blazquez et al, 2008; D urante-Rodriguez et a l, 2008; Durante-Rodriguez et al, 2010), es capaz de utilizar w-xileno com o ünica fuente de carbono y energia en condiciones desnitrificantes (Lôpez-Barragân et a l, 2004a), y su genoma ha sido recientem ente secuenciado, en esta Tesis D octoral se ha procedido a la identificaciôn y caracterizaciôn molecular de la ruta central del 3-metilbenzoil-CoA en este organismo modelo. 39 II. O bjetivos 41 Com o se ha com entado en la Introducdôn, Agoarcus sp. CIB es un m icroorganismo modelo para el estudio del catabohsmo anaerobico de compuestos aromaticos. La capacidad de la cepa para crecer en diferentes com puestos contam inantes, la existencia de herramientas para su manipulacion genética y la reciente secuenciacion de su genom a facüitan la reahzacion de estudios genéticos y bioquimicos en este m icroorganismo biodegradador. Al inicio de esta Tesis D octoral se habia caracterizado la ruta periférica de degradacion del tolueno y w-xileno, pero no se ténia ninguna inform acion sobre la hipotética ruta central del 3-metilbenzoü-CoA que canalizaria el producto de la ruta periférica del w-xileno al m etabohsm o central bacteriano. Tam bién se desconocia la ruta periférica que podria activar 3MBz a 3-metilbenzoil-CoA. Ninguna de estas rutas habia sido caracterizada hasta la fecha en ningun microorganismo. En esta Tesis se propuso identificar los déterminantes genéticos relacionados con la degradacion del 3-metilbenzoil-CoA, caracterizar bioquimicamente sus pasos enzimàticos clave, e investigar los posibles sistemas reguladores que modularian su expresion. De esta forma, se definieron los siguientes objetivos: • O bjetivo 1: Identificar los genes responsables de la ruta central del 3- metilbenzoü-CoA y la ruta periférica del 3MBz gxi A's^arcus sp. CIB {cluster mbd). • O bjetivo 2: Clonar los genes codificantes de las actividades enzimâticas clave de la ruta y caracterizar bioquimicamente sus productos proteicos. • O bjetivo 3: Estudiar la organizaciôn transcripcional de los operones que form an parte del cluster mbd. • O bjetivo 4: Caracterizar la regulaciôn transcripcional especifica del cluster mbd. • O bjetivo 5: Identificar la existencia de sistemas de regulaciôn sobreimpuesta que m odulen la expresiôn del cluster mbd. 43 III. M atew a les y M étodos 45 1. Cepas bacterianas, plàsmidos y oligonucleôtidos Las cepas de bacterias que se han utüizado en este trabajo se detallan en la Tabla 3 junto con sus genotipos y caracteristicas mas relevantes. Los plàsmidos utüizados en este trabajo se describen en la Tabla 4 donde se muestra el nom bre de cada plasmido y sus caracteristicas mas relevantes. Los oUgonucleotidos empleados en este trabajo se m uestran en la Tabla 5. Todos los oHgonucleôtidos fueron adquiridos a Sigma-Genosys. Tabla 3. Cepas bacterianas empleadas en este trabajo. Cepa Genotipo / Fenotipo Referencia E. coli DIIlOB ]•', mcrA, A{mrr, bsdRAIS-mcrBC), (|)80d/arAM15, AlacX74, deoR, reA1, araDI39, A{ara-leu)7697,gadJ,galK'k, /psL, endA1, nupG I âfe Technologies BL21 (DE3) E , ompT, hsdSii{rB-mji'),gal, dcm, ÀDE3 (portador del gen / de la RN,\ polimerasa del fago T7 bajo el control del promotor PlaclJVS) Sambrook y Russel, 2001 MC4100 araD139, A(ar^F-/af)U169, tpsLISO, reA1, f/bBS?>0\, deoCI, ptsF25, rbsR Casadaban, 1976 S \l-\)p ir 'Lpf, Sm‘, recA, tbi, bsdRAi+, RP4::2-Tc::Mu;;Km, Tn7, Xpir lisogcnico de Lorenzo y Timmis, 1994 Azoarcus sp. CIB silvestre degradadora de compuestos CIB mutante por inserciôn en el gen CIB mutante por inserciôn en el gen CIB mutante por inserciôn en el gen CIB mutante por inserciôn en el gen CIB mutante por inserciôn en el gen CIB mutante por inserciôn en el gen CIB mutante por inserciôn en el gen CIB mutante por inserciôn en el gen ^^^nu^nt^)omnserciôn^n^e^ei^ Azoarcus sp. CIB Cepa A:^oarcus sp. CA^àmbdO Cepa A^^oarms sp. CABdmbifi'' Cepa A::^arcus sp. ClBàmbdA Cepa Azoarcus sp. C IB d o ^ Cepa Azoarcus sp. CYBdorfô Cepa Azoarcus sp. CIBdè^ÆV Cepa A^^oarcus sp. CABàmbdK Cepa Ai:^arcus s[>. ClBàmbdBI Cepa aromaticos Lôpez-Barragân e/ ai, 2004 mbdO Este trabajo mbdY Este trabajo mbdA Este trabajo orf5 Este trabajo orfô Este trabajo bi^dN Lôpez-Barragân et ai, 2004 mbdK Este trabajo mbdBI Este trabajo a^^^^^^^^^^^^^^^urant^^odrigue^EaZ^OO^ 47 Tabla 4. Plàsmidos empleados en este trabajo. P lasm ido D esc rip c iô n R eferenc ia pK18/iJoA Km ^ oriGoW'A, Mob+, lac/.ci, vector suicida para la construcciôn de mutantes por inserciôn mediante recom binaciôn homôloga Schâfer et a l, 1994 pK lSbcrB Km% derivado de pK \^m ob que incluye un fragmente) HindlW / Xba\ de 787 pb del gen mbdO Liste trabaje) pK lSm bdY Km'", derivado de pKX^mob que incluye un fragmente) H in d \\\/X b a \ de 709 pb del gen mbdY Este trabajo pK lSm bdA Km% derivade) de p)A\%mob que incluye un fragmente) H in d \\\/X b a \ de 736 pb del gen mbdA Este trabaje) pK lSorfS KmL derivade) de pK\%mob que incluye un fragmente) HindXW/ Xba\ de 585 pb del gen orj5 l iste trabaje) pK18orf6 Km"", derivado de pKXBmob que incluye un fragmente) HindWX/ Xba\ de 723 pb del gen orfô Este trabaje) pK lSm bdR new K m \ derivade) de p¥.\9>mob que incluye un fragmente) H/>/dlll/£eflRI de 524 pb del gen mbdK Este trabaje) pK lSm bdB l K m \ derivade) de p¥.\%mob que incluye un fragmente) EcoK \/Xba\ de 728 pb del gen mbdBI Este trabaje) pU C 18/19 ,\pL o/7Cie)llil, lac/.ct Sambre)e)k y Russel, 2001 pUCmbdA ApL derivade) de p U (il9 que ce)ntiene el gen mbdA bajo el ce>ntre)l del pre)me)tor Plac 1 iste trabaje) pLICBZDA Ap% derivade) de pLK]18 que ce)ntiene el gen bpdA baje) el contre)l del prejme)te)r Plac Le')pez-Barragân et al, 2004 p E T -2 9 a KmL vecte)r de cle)naciôn e hipercxpresiein, oriYoWA Ne)vagen p li'l’mbdW Km% derivade) de pE l'-29a que expresa la pre)teina MbdW cejn una fusiein de 6 histidinas en su extreme) carbe)xile) terminal Este trabaje) p liTm bdR K m \ derivade) de plèT-29a que expresa la pre)teina MbdR ce>n una fusiein de 6 histidinas en su extreme) carbe)xile) terminal Liste trabajo pSJ3 A p \ onGe)lEl, 'lacZ, vecte)r para la bûsqueda de pre)me)te)res ce)n el gen testige) lacZ flanqueade) ce)n dianas de restricciein X ot\ Lerrândez et a l, 1998 pSJ31\) A p \ derivade) de pSJ3 que contiene pre)me)te)r Po con el gen lacZ una fusiein traduccie)nal del Liste trabajo pSpPni A p \ derivade) de pS)3 que ce)nHene prome)te)r Pni con el gen lacZ una fusiein traduccional del Este trabaje) pS j3P \ ApL derivado de pSJ3 que contiene pre)me)te)r P i con el gen lacZ una fusiem traduccional del Liste trabaje) pSJ3P)R ApL derivado de pS)3 que contiene promote)r P jr con cl gen lacZ una fusiein traduccie)nal del Liste trabajo p IZ lO lô G m \ derivado del vector de clonaciôn y expresiôn de amplio Moreno-Ruiz a/., 2003 cspectro de hospedador pBBRlM CS-5 con el prom otor P/acy el gen /ac/C de pMM40_______________________________________________________________________________ pIZm bdA Gm% derivado de p IZ lO lô que contiene el gen mbdA bajo el control Hstc trabajo de p rom otor Ptac pIZ Po Gm% derivado de p IZ lO lô en el que se ha sustituido el prom otor liste trabajo Ptac p o t la fusion traduccional Po::/acZ procedente del vector pSJ3Pf> plZPm GmL derivado de p lZ lO lô en el que se ha sustituido el prom otor liste trabajo Ptac por la fusion traduccional P Bi::lacZ procedente del vector PSJ3Pb; p IZ P \ GmL derivado de p lZ lO lô en el que se ha sustituido el prom otor liste trabajo Ptac p o t la fusiôn traduccional PAt'-lacZ procedente del vector pSJ3P^9 pIZPsR GmL derivado de p IZ lO lô en el que se ha sustituido el p rom otor liste trabajo Ptac p o r la fusiôn traduccional P^t'-locZ procedente del vector pSJ3PiR pIZ-ENR* Gm% derivado de p IZ lO lô que contiene el gen fnr* bajo el control Durante-Rodriguez et al, 2006 de p rom otor Ptac. El producto proteico résultante es una variante de pCKOl Cm"", onrpSClOl, vector de clonaciôn de bajo num éro de ce)pias con polylinker flanqueado por dianas Not\ Fernandez et al, 1995 pCKm bdR CmL derivado de pCKOl que contiene el gen mbdK baje) el control del prom otor Plac Este trabajo pJCD Ol Ap"", onG olEl; polylinker de pUC19 flanqueade) por le)s terminadores rpoC y rmBT1T2 Marschall et al, 1998 pJCD Po PJCDPbi Ap'', derivade) de pJCDOl que ce)ntiene un fragmente) ScaX/EcoKl de Este trabajo 271 pb que incluye al p rom otor Pq y\pT derivado de pJCDOl que contiene un fragmento Scal/EcoRl de Liste trabajo 251 pb que incluye al prome)te)r Pbi 48 Tabla 5. Oligonucleôtidos utüizados. Las regiones subrayadas pertenecen a la diana de restricciôn incluida en el nombre del oliqonucleôtido. oifômut H indIII 5 ' 4fjlëi0xt Xkaï X orpm ut H indU l 5 ' oiptant Xba\ 3 mbdYmut HindX 115' mbdYmut XbcA X 5 ' Z'mriut (EfoRI) X bcrpaa.tÇCbdi) m bdAm ut HindWX 5 '.2 mbdAcaax Xbàï 3'.2 mbdA H/z/dlII 5 ' mbdA Xbdl X mbdW^NdeX 5 ' mbdlVNoA X orfô RI xitpYX orp RI korB2V\ korA2 RI 3MBzFed FI 3M BzFcd RI mbdW'Vr GGG.Y\G(:TTCGGGÆ\AGGGATrGCGTGAG C CCC Y \G (: r F C C G A C C C G G C C rC C A TG GCTCTAGAGCACCTTCGCCATCGATG CCXL A A G C rrCC'rACAGCG'rCGACA'FGC'rCA.X G GCTCTAGAGCTCITGGTCAGGCTATCCGGG G C G G A 'rC C G TG A A A A 'I'C G G C G TA G C A C ITC AG GCTCTAGACACGCTATCGGAACCCGACGCA C C C A A G C rrG G C 'F G C T G C G G A T G A C G A 'rrG GCTCTAGAGCCATCGGTATGGGGGTAATAG G ■ CGC A A G C r r rG ACC'FAG CG( : A'FFG AG G A AA GGGAGG GGTGTAGATGAGTGATGAGGGGGATITG G G G A A TFG G A lA T G AGGGAGAGAGGGGiTG AAGTC ATAAGAATGGGGGGGGGGGATITTTGGAAG GGGGAGG G T rG G G G G G G G G A G T A G lG GGGATTGGTGATTGGAGGTG GGATGATTGGGGGGAGATAAG GGAGTIGGGAGGAGCTGAAGG G G C 'riT C G C G A C C G C T C G GGAGGTGTGTGCGGTAGAGTGG GAGGGGA.AGTAGTGGACrGATG GGÂAGGCGTGGACGAAGTGG Fragm ente interno de orfô para construcciôn m utante Apoarcus sp. C IB d o ^ Fragmenta interne d t oifô ptu» Oèdorfè Fragm ente interne de o p para construcciôn mutante Apoarcus sp. C A B dop Fragmento intomo de sifS para construcciôn mütânte Armanus sp. TXBdop ' ' \ ̂ ^ " Fragm ento interne de mbdY construcciôn m utante Ar^arcus sp. YABdmbdY Fragmento intemo de mbdX^zn. cônstruedôn iautaote Azoarciu sp. CmdrnbdY Fragm ente interne de mbdO para construcciôn mutante Apoarcus sp. YABdmbdO Fragmento intemo de /wM) para eoüstruûcion mutante Aŝ oanus sp. ClBdmbdO Fragm ento interne de mbdA para construcciôn mutante Apoarcus sp. CABdmbdA Fragmento interno de mbdA para construcciôn mutante As^amrs sp. CT&dmbdA Clonaciôn mbdA en pUC19. Incluye RBS del gen mbdA. Glonaciôn mbdA en pUG19. Clonaciôn mbÆ " en pFi'F-29a. Glonaciôn mbdlF en pET-29a. Extrem e 3 ' de un fragmento de 536 pb com prendido entre o fô y o p . Analisis transcripcional. Extreme 5' de un Etagmento de 536 pb comprendido entre o p y o p . Analisis transcripcional. Extrem e 3 ' de un fragmento de 485 pb com prendido entre o p y korB2. Analisis transcripcional. Extremo 5 ' de un fr^nento de 485 pb comprendido entre o p y An&sis tcmècripcional. Extrem e 3 ' de un fragmento de 500 pb com prendido entre korA2 y mbdAi. Analisis transcripcional. Extremo 5 ' de un fragmento de 500 pb comprendido entre korAl y mbdM. Analisis transcripcional Extrem o 3 ' de un fragmento de 791 pb com prendido entre mbdhî y mb(W. Analisis transcripcional. Extremo 5' de un fca^ento de 791 pb comprendido entre y m b ^ . Anaüsis transcripcional. 49 mbdXRA o p R1 isifM VFl bcrB R2 mbdBI R1 mbdB5 I’l mbdARZ mbdK-A3 (EcoRI) rnb(^-A5{Bmm) CIB +lPmW o3' GIF +lPh)bdBi3' Intcrno Pdiv>0 Seal 5'.2 Pdiv>0E cd»iy.2 Intcrno Pdiv>B1 Sca\ 5'.2 pà»>BiBcoUy GGGAGGGA'IGCGAGGGAGAG GCGÔAATCGACGTGTCGTATG C A G A 'rrG C A G T G A A A A ’I’C G A T rG C g g a g t t t a g c g g g g c g c t g ' TG C G C C A 'I'C G TA C A C rC C TC G g g g a a a g t g g g g g g g g a g g G G G 'rrA G C G C C A A 'l'C A T C l’GCC GGTTGGGGTAGGGGTTGAGG C G G A A r r C C G G C lT A G T C A C C C GGGGATCCGAGGCAAATCCATT C A 'r r r G A C G 'n 'c r c c r c c r c A c r r G GATGTCrGGGTGGTGGAGGATGAAG A G \ A G TA C TG G TA 'ITA C G G 'lA A G TG C ri'C C A CG GGGGAATTGTrAATGGAAAGGGGGTrGGG AAG \G T A C T C G 'rG G A G C A C T TA C C G 'I\A \TA CG GCGGAATrGGGTGGGGGGGGGAGTATG 5 'mbdK mut2 (H/«dIII) G C G AAG CTTACCG 'rGCGA C.A ACG AT 3"iwWRinut2 (fî»RI) CGGAÀTTCGGCATrGAGAAGTAGGG mbdBlmut EcoKl 5 ' G G A A T T Ç C G G C C G C G A G G TTG A G TA C G mbÆlmat XbeAX PmbdO }f)n\ 5 ' g g t g t a g a g g tg g a g g g g g t a g a g g tg g G G G G TA C C CATCTCTCCCTCCTGGA CGA TG ÆAG E xtrem o 3 ' de un fragm ento de 704 pb com prendido entre mbdX y otf4. ;\nalisis transcripcional. Actremo 5' de u# ba^n^en^ de 704 pb compfentfidp exiixe^tdX y. 4)^. An#sis tfiUi&CÊ xxod̂ L E xtrem e 3 ' de un fragm ento de 739 pb com prendido entre o p y mbdN. Analisis transcripcional. Ex^femo 5' de on fkagpieoto dé 739 pb comprendido eatte'op y wMV. Anâliâs transcripcional. E xtrem o 3 de un fragm ento de 203 pb com prendido entre Po y mbdO. Analisis transcripcional. Extremo 3 ' de un fra^entp dé 278 pb comprendido entfe Fg/ y mWB/. Analisis transcripcional E xtrem o 5 ' de un fragm ento de 637 pb com prendido entre mbdB5 y mbdA. Analisis transcripcional. Extremo 3' de un fragmento de 637 pb comprendido entre mbeBS y mbdA. Analisis transcripcional. E xtrem o 3 ' de un fragm ento de 365 pb com prendido entre mbdK y la region intergénica mbdK-tdiK Analisis transcripcional. Extremo 5 de un frs ;̂mento dé 3é5fpb ç(#p#endido ep%re y Anâisis tianscrqxdonal. Region intergénica mbdO-mbdBI. Primer extension prom otor Pq. Re^ôn intergénica rnbdQ-mbdBI. Primer extenmn promotor Pg». Extrem o 5 ' de la sonda P q (271 pb) para experim entos in vitro de interacciôn proteina-D N A Extremo 3 ' de là sonda Po (271 pb) para exp#imentos in vitro de interacciôn proteina-DNA E xtrem o 5 ' de la sonda Pi37 (251 pb) para experimentos in vitro de interacciôn proteina-D N A Extremo 3 ' de là sp r^ f^j (251 pb) para experûnentôs/« Hfifrg de interacciôn protdîna-DNA Fragm ento interno de mbdK para construcciôn m utante Apoarcus sp. ClBdmbdK Pra^eato intemô de nAM. para cc^Stèucciôn mutante At^arcuts sp. & M m hæ Fragm ento interno de mbdB 1 para construcciôn m utante Apoarcus sp. E'\S>dmbdB1 Fragmento interno de mbdBI para construcciôn muAmte GIBdgyWB/ Extrem o 5 ' de un fragm ento de 563 pb que se corresponde con la region intergénica mbdO-mbdBI. Clonaciôn prom oto r Poen pSJ3 50 3' PmbdBI Xba\ 3 ' PmbdO ¥ \ PmbdBI M mbÆ. Sa& 5' mbdR Pst\ 3 ' mbdSLNdel 5' mbdK Xho\ 3 ' Intergénica mbÆS-mbdA Intergénica mbdB5-mbdA X W 3 .2 PmbdKKpnlB' PmbdKXbal 3 PmbdA S cal S' PmbdA EroRI 3 ' PmbdKS^lX PmbdK EroRI 3 F24 G C rC T A G A G G C A 'lT rG A C G T rC T rC C T C C rC A c r r G G C TC TA G A G G C A 'rC rc rC C C rC C rG G A C G A T GAAC; GCTGGTATGTTGTGCGGAGTGG GGCCGTnTCCGCAATGACrG ACGCG-rCGACTGACCTAAGGAGGTAAATAA TGAGAAAGCTGAACAAGAAGGAAG AXC iG C A G TC A G A A TG TC G G V rn X T G C A G G GGAATTCCATATGAGAAAGCTGAACAAGAA GGAAGAGCAGAG GGGGTCGAGGAA'lG'ICGGAnTiTGGAGGA GGC GGGGTACCAAGTnTGATTATCTCTAGTAGC GG GCrGTAGAGGGATClGTGGGlTrGGl'GAATGG GG GGGGTAGCATGGTGGAAGTGAGGTATGGAT G GGTGTAGAG G G A T G A TG TG T G G A G A TG TIG C AAAAGTAGTGAGGGGGGGGGGAAGTTITG C G G A A TTÇ C C TC yA \l’GCGCATC.\AC:ATAGTG AAAAGTAGTGAGAAGTGITGACGAGCAAGGG G C G G A A T T C G T T C C yA X lX iG A m X ÎC C T C rC G G GGGGAGGGmTGCCAGTGAGGAG Extrem o 3 ' de un fragmento de 563 pb que se corresponde con la region intergénica mbdO-mbdBI. Clonaciôn prom otor Pq en pSJ3 Extremo 5 ' de tm fiagmento de %i3p1) (XffEéspondeiEçn h mbéQ̂ /â>ièJ. " Clonaciod promotor Pm en pSJ3 Extrem o 3 ' de un fragmento de 563 pb que se corresponde con la region intergénica mbdO-mbdB1. Clonaciôn prom otor Pbi en pSJ3 Extreme 5 ' de un fragmento de 203 pb comprendido entre Po y mbdO. Aaÿdsis transcripcional. Extrem o 5 ' de un fragmento de 278 pb com prendido entre Pbi y mbdBI. Analisis transcripcional. Glonaciôn mbdK en pGKOl. Las bases con subrayado doble sen^an una secuencia RBS consensopara E. nié'acQmpanada de codones de fin en los très marcos de lectura. Clonaciôn mbdK en pCKO l. Glonaciôn mbÆ. en pET-29a Clonaciôn mbdK en pE T-29a. Extreme 5 ' de un fragmente de 238 pb de la r^ ôn intergénica mbMS-mbdA que incluye al promoter Pa - Glonaciôn Pa en pSJ3 Extrem o 3 ' de un fragmento de 238 pb de la region intergénica mbdB5-mbdA que incluye al prom otor Pa- Clonaciôn P a en pSJ3 Extremo 5 de un fragmento de 451 pb de la regiôn iutergénica mbdK-tdtK que incluye al promotor Pig. Glonacion P;k en pSJ3 Extrem o 3 ' de un fragmento de 451 pb de la regiéin intergénica mbdK-tdiK que incluye al prom otor Pm- Clonaciôn Pm en pSJ3 Extremo 5 ' de la sonda Pa (225 pb) para experimentos /» «éiw de interacciôn proteina-DNA Extrem o 3 ' de la sonda Pa (225 pb) para experimentos in vitro de interacciôn protefna-DN.A. Primer extension P a Extremo 5 'de la sonda PiR (352 pb) para experimentos r* ni&r de interacciôn proteina-DNA Extrem o 3 ' de la sonda Pm (352 pb) para experimentos in vitro de interacciôn proteina-D N .\. Primer extension Pm Secuenciaciôn fragmentes DNA donados en plàsmidos que portan elgenéwZa 51 1124 T? TT7 5 'POL III HK 3 ' PO L 111 LIK AOCOCLVLAACAATnCACACAOOA TAATACGACTCACTATAGGG G C T A G T L A T L G C rC A O C O G GGACGCAGTCmTGCGTGGTAAC G 'i'G C G 'l'C A A A G 'L C G C rG C rG 'l'C G Secuenciaciôn fragm entes D N A clonados en plàsmidos que portan el prom otor Vlac o derivados I ^ A doaados edplâsaàdos qeé ^ tboiicûea dpaMnotof T7 , % Secuenciaciôn fragm entes de D N A clonados en plàsmidos que contienen el term inador transcripcional 17 Extremo 5 ' de un fragmento intemo de 220 del gen himse- ke^ng dndE, codifrcante de la subunidad a de k DNA polimerasa III Extrem o 3 ' de un fragmento in terne de 220 pb del gen house­ keeping dnaE, codificante de la subunidad a de la DN A polimerasa III______________________ 2. Medios y condiciones de cultivo Todas las soluciones y medios de cultivo utüizados en este trabajo se esterilizaron por calor hùm edo en autoclave a 121 °C y 1 atmosfera de presiôn, o m ediante fütraciôn utüizando fütros estériles MiUipore de 0.2 pm de diâmetro. Para los crecimientos de E. coli y Agoarcus sp. CIB se utilizaron diferentes medios de cultivo cuya composicion aparece resenada a continuaciôn. 2.1. Medios de cultivo empleados para Escherichia coii El m edio rico empleado fue Eysogeuj Broth (LB) (Sambrook y Rusell, 2001; Bertani, 2004). Los cultivos de E. coli en medio sôlido se realizaron con m edio LB com plem entado con agar al 1.5% (masa/volum en). En los casos en los que se considerô necesario, se anadiô 5-brom o-4-cloro-3-indolü p-D-galactopiranôsido (X-gal) a una concentraciôn de 0.08 mM, asi com o isopropü-1 -tio- p -D -galactopiranôsido (IPTG) a una concentraciôn de 0.5 mM. El medio rninimo empleado para E. coli fue M63 (Miller, 1972), al que se anadiô agar al 1.5% (m asa/volum en) para los crecimientos en m edio sôlido. E l m edio rninimo se com plem entô con glicerol (30 mM) com o fuente de carbono, asi com o con las vitaminas y aminoacidos necesarios para cada cepa a las concentraciones recom endadas por G erhardt et al (1994). Para los cultivos en condiciones anôxicas se anadiô K N O , 10 52 mM com o aceptor final de electrones. Cuando fueron requeridos, los antibioticos se utilizaron a las concentraciones que se indican en el apartado 2.3. 2.2. Medios de cultivo empleados para Azoarcus sp. CIB El medio m inimo empleado en este trabajo para cultivar las cepas de Af(oarcus sp. CIB esta basado en el medio basal MA (pH 7.5), cuya com posicion se detaUa a continuaciôn: KH ^PO, 0.33 g Na2HPO^ 1.2 g NH,C1 0.11 g MgSO^ 7 H 2O 0.1 g CaCl2 0.04 g H 2O destilada (hasta 1 1) Este medio basal fue suplementado con una soluciôn de elementos traza (pH 6.5), cuya com posiciôn (1 OOOx) se detaUa a continuaciôn: Acido nitrilotriacético (NTA) 1.5 g M gSO, 7 H 2O 3.0 g M nSO , 2 H 2O 0.5 g N a C ll.O g FeSO , 7 H 2O 0.1 g C 0 SO 4 7 H 2O 0.18 g N aSeO , 5 H 2O 0.3 g ZnSO^ 7 H 2O 0.18g CuSO^' 5 H 2O 0.01 g K A I(S 0 J2 'I2 H 2 0 0.02 g H 3B O 3 0 . 0 1 g N a2M oO ' 2 H 2O 0 . 0 1 g NiCl2-6H20 0.025 g H 2O destilada (hasta 1 1) 53 Tam bién se suplementô el medio îvlA con una soluciôn de vitaminas cuya composiciôn (lOOOx) es la siguiente: Biotina 20 mg Piridoxina-HCl 10 mg Riboflavina 50 mg D -Pantotenato câlcico 50 mg Acido Y^-aminobenzoico 50 mg Acido fôHco 2 0 mg Tiamina-HCl - 2 H 2O 50 mg Acido nicotinico 50 mg Vitamina B ,2 50 mg H 2O destilada (hasta 1 1) Para el crecimiento anaerôbico de Apftarcus sp. CIB se anadiô KNO3 10 mM , com o aceptor final de electrones, al m edio MC (medio basai com plem entado con vitaminas y elementos traza). Ademas, para asegurar el ambiente reductor, se anadiô al medio MC una soluciôn de sulfuro ferroso a una concentraciôn final de 0.044 m g/m l. 2.3. Antibioticos Los antibiôticos se prepararon en soluciones 1000 veces concentradas en agua, excepto el cloranfenicol y la rifampicina que se disolvieron en etanol 100% y en D M SO 100%, respectivamente. Estas soluciones se esterihzaron por filtraciôn y se ahnacenaron a -20 °C. Los antibiôticos se utihzaron a las concentraciones finales que se indican: Ampicüina (Ap) 100 p g /m l Cloranfenicol (Cm) 34 pg /m l Kanamicina (Km) 50 p g /m l Rifampicina (Rf) 50 p g /m l Gentamicina (Gm) 7.5 pg /m l 2.4. Obtenciôn de condiciones anaerôbicas en los medios de cultivo Para obtener condiciones de anaerobiosis, el m edio de cultivo asf com o las soluciones de elementos traza, nitrato potâsico, sulfuro ferroso y todos los com puestos que fueron utüizados com o fuente de carbono, se dispensaron en frascos de vidrio, los 54 cuales se taparon con tapones de gom a y se sellaron con arandelas de aluminio. A través del tapon de goma se inyecto una aguja conectada a un deposito de nitrogeno (Air Liquide), perm itiendo pasar un flu jo de este gas al m edio Hquido durante varios minutos con el objeto de eliminar el oxigeno. Finalmente, todos los frascos fueron autoclavados. Para obtener una solucion anaerobica y estéril de vitaminas (las cuales son sensibles al calor) se realizo la m ism a operacion descrita anteriorm ente pero con frascos de vidrio vacios en los que, después de ser esterilizados por autoclave, se inyecto la solucion de vitaminas m ediante una jeringa conectada a un filtro estéril MiUipore (de 0.2 pm de diâmetro de poro). Una vez preparadas estas soluciones, fueron anadidas al medio basai MA para obtener asi el medio MC com plem entado con las correspondientes fuentes de carbono. Tanto la filtraciôn de las soluciones de vitaminas como la inoculaciôn de los medios de cultivo con las distintas cepas bacterianas, se realizaron en una câmara de anaerobiosis (Forma Scientific). 2.5. Condiciones de cultivo Para los cultivos aerobicos las cepas de E . coli y At^oarcus sp. CIB se cultivaron a 37 y 30 °C, respectivamente, con una agitaciôn de 250 rpm. Ambas estirpes bacterianas fueron incubadas a 30 °C sin agitaciôn para su crecimiento anaerobico. Cuando se utilizaron com puestos aromâticos com o fuente de carbono, éstos fueron anadidos al medio MC a una concentraciôn de 3 mM, si no se especifica otra concentraciôn. El m- xileno se anadiô a una concentraciôn de 250 mM en 2 ml de una fase orgânica de 2,2,4,4,6,8,8-heptametilnonano (HM N) que fue anadida al medio de cultivo (15 ml). A tendiendo al coeficiente de reparto octanol/agua del w-xUeno (K^ ,̂ = 3.2), la concentraciôn del com puesto en la fase acuosa cuando se anade a una concentraciôn de 250 mM en H M N es de 0.15 mM. Las fuentes de carbono no aromâticas, com o por ejemplo sales de âcidos orgânicos (succinato, glutarato, etc.) y casaminoâcidos, fueron anadidos a los medios de cultivo en una relaciôn 0 .2 % (m /v) salvo que se indique lo contrario. El crecimiento de los cultivos fue m onitorizado m idiendo la absorbancia a 600 nm {A(,o(̂ empleando un espectrofotôm etro Shimadzu UV-260. La morfologia celular se anaüzô con un m icroscopio de contraste de fase N ikon O PTIPH O T-2. La desnitrificaciôn en cultivos anaerôbicos fue m onitorizada midiendo los niveles de N O , y N O , con el Test N itrates (Merck). El consum o de benzoato en el medio de cultivo 55 fue m onitorizado espectrofotom étricam ente a 273 nm tras la acidificacion del m edio con HCl. 2.6. Conservaciôn de las cepas bacterianas Durante cortos periodos de tiempo (inferiores a un mes) E. coli se conserve a 4 °C en plaças de medio LB o de m edio minimo. Los cultivos anaerobicos de Agoarcus sp. CIB se conservaron adecuadamente durante un periodo aproxim ado de un mes a 4 en viales de vidrio. Para su conservaciôn a largo plazo, las bacterias se congelaron en el medio de cultivo correspondiente con glicerol al 15% (v/v) y se m antuvieron a -80 °C. 3. Técnicas de manipulacion de DNA y RNA La manipulaciôn del D N A asi com o la m ayor parte de las técnicas de biologia molecular utiüzadas en este trabajo fueron apHcadas esenciaknente tal y com o describen Sambrook y Rusell (2001). Las endonucleasas de restricciôn fueron suministradas por New England Biolabs y Takara. La D N A ligasa T4 y la RNA polimerasa utilizada en los ensayos de transcripciôn in vitro (E. coli R A A Folymerase Holoenpyme 1 U /p l) fueron suministradas por USB. La D N A polimerasa I y la Pfu polimerasa fueron suministradas por Biotools B. M. Labs. Todas las enzimas se em plearon atendiendo a las especificaciones de las diferentes casas comerciales. Los fragmentos de D N A se purificaron mediante los productos GeneClean Turbo (Q-BIOgene) o High Pure PCR Product Purication Kit (Roche). 3.1. Purificaciôn de DNA La purificaciôn de D N A plasmidico se realizô m ediante el uso de High Pure Plasmid Purification Kit (Roche). Para obtener may ores volumenes de preparaciones plasmidicas, se utüizô el Plasmid M idi Kit (Qiagen). E l D N A crom osôm ico se extrajo empleando el procedim iento descrito por W üson (1997). 3.2. Purificaciôn de RNA La purificaciôn del RNA se realizô resuspendiendo las células bacterianas en una soluciôn de lisozima 50 m g /m l (Sigma) en tam pôn T E (Tris-HCl 10 mM pH 8.0, ED TA 1 mM). El RNA total del cultivo se obtuvo m ediante el RNeasy M ini kit (Qiagen), siguiendo las indicaciones del proveedor. 56 Para la eliminaciôn del D N A contam inante se empleo el D N Ase and Removal treatment k it (Ambion), siguiendo las especificaciones del fabricante. 3.3. Reaccion de amplificaciôn en cadena con DNA polimerasa termorresistente (PCR) La amplificaciôn del D N A se realizô en un equipo Mastergcler Gradient (Eppendorf) y las enzimas que se emplearon fueron la D N A polimerasa I y la polimerasa PJu, ambas proporcionadas po r Biotools B. M. Labs. Las mezclas de reacciôn contenfan MgCl, 1.5 mM, oligonucleôtidos 0.5 pM y dN TPs 0.25 mM. Los productos amplificados se purificaron con el sistema High Pure PCR Product Purification Kit (Roche). 3.4. Secuenciaciôn de DNA 3.4.1. Secuenciaciôn automàtica La secuenciaciôn se llevô a cabo utüizando un secuenciador automâtico m odelo A B I Prism 37 automated D N A sequencer (Apphed Biosystems Inc), en el Servicio de Secuenciaciôn Autom àtica de D N A gestionado por la empresa Secugen S. L. en el Centro de Investigaclones Biolôgicas. Para la reacciôn de secuenciaciôn se utüizô el Dje Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), y la D N A polimerasa AmpHTaq FS, siguiendo las recom endaciones de los proveedores. Las reacciones se Uevaron a cabo con un term ociclador Gene A m p PCR System 2400 (Perkin-Elmer). 3.4.2. Secuenciaciôn manual E n el caso concreto de los experimentos de extensiôn por cebador {primer extension), la secuenciaciôn del D N A patrôn se Uevô a cabo segun el m etodo de term inaciôn de la poUmerizaciôn por didesoxinucleôtidos (Sanger et ai, 1977) utüizando el T7 Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech), y [a-^^P]dATP (6000 C i/m m ol 20m Ci/m I; Perkin-ELmer) com o desoxinucleôtido trifosfato m arcado radiactivamente, siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. 3.5. Determinaciôn del sitio de inicio de ia transcripciôn D urante el transcurso de esta Tesis D octoral se determinô el punto de inicio de la transcripciôn (+1) de cuatro prom otores: P^, P^j, P ^y P,j .̂ Para eüo se empleô la técnica de extensiôn por cebador o primer extension. La extensiôn se reahza mediante un cebador 57 que hibrida con el m RNA en una posiciôn cercana al supuesto punto de inicio de la transcripcion. E n la Tabla 5 se indica la secuencia de les oligonucleotidos udlizados. Para la determinaciôn del punto de inicio de la transcripcion de los prom otores y se empleo la cepa At^parcus sp. CIB. E n el caso de los prom otores P , y se reaüzo un prim er intento con la cepa Af^oan'us sp. CIB, pero el nivel de actividad de los prom otores no perm ida la deteccion de la posiciôn +1, por lo que finalmente se recurriô a las cepas A^oarcus sp. CIB (pIZP J y A^parcus sp. CIB (pIZP^^, en las que se expresaban los prom otores P,j y P^^, respectivamente, en un vector multicopia derivado de p IZ lO lô (Tabla 4). Las cepas se cultivaron anaerôbicamente en m edio MC com plem entado con benzoato o 3MBz, con ambos com puestos a una concentraciôn final 3 mM, hasta que la absorbancia del cultivo a 600 nm alcanzô un valor de 0.3. A partir de este cultivo se extra)o el RNA total tal y com o se indica en el apartado 3.2. Las reacciones de extension se Uevaron a cabo con la transcriptasa reversa del virus de la mieloblastosis aviar (AIVIV 1 OU/ pi; Promega) y 15 pg de RN A total, tal y com o se ha descrito previamente (Martin et al, 1995). Los oUgonucleôtidos CIB + lP„/,^/o^', CIB +IP^M)/3', PmbdA Et'oRl 3 ' y PmbdR EcoRl 3 ' (Tabla 5) se m arcaron con "P en su extremo 3 ' con la enzima polinucleôtido quinasa del fago T4 (New England Biolabs 10 U /p l) empleando com o donador del grupo fosfato [y-^P] A TP (3000 C i/m m ol, lOm Ci/m l; Perkin-Ekner). Con el fin de determ inar el tam ano de los productos obtenidos en la reacciôn de extension, se Uevaron a cabo en paralelo reacciones de secuenciaciôn de los plâsmidos pSJ3Pq, pSJ3Pb^, pIZP^ y pIZP^^^, con los mismos oligonucleotidos detaUados mas arriba. Los productos obtenidos en las reacciones se analizaron mediante electroforesis en geles de poHacrilamida 6% - urea 8 M. Los geles se secaron al vacio sobre papel W hatm an 3MM y se expusieron en peHculas HyperfUm MP (Amersham GE) con pantaUas ampUfïcadoras (Cronex Lightning Plus DuPont). 3.6. Ensayos de retrotranscripciôn (RT-PCR) Una vez purifïcado el RNA y eliminado el D N A contam inante, se obtuvo el D N A complementario (cDNA) m ediante una reacciôn de retrotranscripciôn mediada po r la transcriptasa reversa SuperScript II (Invitrogen). Cada reacciôn de retrotranscripciôn (20 pl) contenia 400 ng de RNA, 200 U de transcriptasa reversa, ditiotreitol (DTT) 10 mM, dN TPs 0.5 mM y 5 mM de pd(N)^ random hexamer 5 'phosphate (Amersham Biosciences). 58 Los hexâmeros se emplearon com o cebadores para poder utilizar las mismas aHcuotas de cD N A com o molde para reacciones de PCR en las que se emplean divers os pares de oligonucleotidos. El RNA y los hexâmeros se incubaron a 65 °C durante 5 min para la hibridaciôn, y tras enfriar en hielo se anadieron los restantes com ponentes de la reacciôn, que se incubo a 42 °C durante 2 h. La reacciôn se finalizo con una incubacion de 15 min a 70 °C. Se empleo 1 pl del cD N A asi obtenido com o molde para la PCR posterior. E n los casos en los que fue necesario, el cD N A se diluyô 1 /10 previamente a la PCR. E l cD N A se ampUficô utilizando los oligonucleotidos requeridos en cada caso a concentraciôn final 0,5 pM y 1 U de la D N A poUmerasa I (Biotools). E n cada una de las reacciones de PCR se incluyô un control con 1 pl de la reacciôn de RT en la que no se empleô la transcriptasa reversa. Con este control se corroborô que no existia ninguna banda de ampUficaciôn indicativa de que la preparaciôn de RNA contuviera D N A contaminante. El volumen total de la reacciôn de PCR fue de 50 pl y 30 fueron los ciclos de amplificaciôn. E n los casos en los que se com parô la expresiôn génica en diferentes condiciones metabôlicas se empleô com o patrôn in tem o en las reacciones de PCR la pareja de oHgonucleôtidos 5 ' PO L III H K / 3 ' PO L III HK. Esta pareja de oHgonucleôtidos ampHfica una regiôn interna del gen dnaE, codificante de la subunidad a de la D N A polimerasa III, cuya expresiôn se ha dem ostrado constitutiva a lo largo del ciclo celular (NoUer et ai, 2003). 4. Experimentos de transferencia genética 4.1. Transformaciôn de células de E. coli mediante choque térmico y electroporaclôn Las células de E. coli se transform aron utilizando dos procedimientos distintos: choque térm ico y electroporaciôn. La transform aciôn po r choque térmico requiere la preparaciôn previa de células com pétentes con RbCl (Sambrook y Rusell, 2001). La transform aciôn por electroporaciôn (Wirth et al, 1989) se Uevô a cabo en un equipo Gene Pulser/Pulse Controller (Bio-Rad), segun las recom endaciones del fabricante. 59 4.2. Transformaciôn de células de Azoarcus sp. CIB mediante electroporaciôn Em pleando com o preinôculo un cultivo anaerôbico de Azoarcus sp. CIB en benzoato, se prépara un cultivo aerôbico de 300 ml de medio MC com plem entado con succinato 0.2% (m /v) en un matraz Erlenmeyer de 500 ml. E l cultivo se incuba 12 h en agitaciôn a 30 °C hasta que alcanza una absorbancia a 600 nm de ~0.2, y las células se recogen por centrifugacion (1500g, 25 min) a 4 °C. A continuacion, las células se resuspenden en 8 ml de gücerol 10% y se lavan 2 veces centrifugândolas a 4 °C (1300g, 15 min). Finalmente, las células se resuspenden en 50 pl de gücerol 10% y se electroporan con 1 pg de D N A plasmidico en un electroporador Gene Pulser/Pulse Controller (Bio-Rad) a 2.5 kV, 200Q y 25 pFa. Las células se traspasan a m edio MC com plem entado con glutarato 10 mM y se incuban 1 h a 30 ®C en agitaciôn. Finalmente las bacterias transform antes se seleccionan en m edio sôüdo MC com plem entado con glutarato 10 mM mas el antibiôtico correspondiente. 4.3. Transferencia de plâsmidos mediante conjugaciôn 4.3.1. Protocolo de conjugaciôn Los plâsmidos se moviüzaron a A:parc'us sp. CIB y sus derivados por conjugaciôn biparental utiüzando la cepa E. coli S \l-\X p ir com o donador, segun el protocolo establecido por de Lorenzo y Timmis (1994) con algunas modificaciones. Se utiüzô una cantidad de células de la cepa donadora E. coli S17-1 correspondiente a una A^^^j de 5, y de la cepa receptora {Asparcus sp. CIB) cultivada en medio nainimo MC con succinato 0.2% se utüizô una cantidad de células correspondiente a una de 35. Los exconjugantes fueron seleccionados aerôbicamente en plaças de medio m inimo MC mâs glutârico 10 mM (contraselecciôn de la cepa donadora) y el correspondiente antibiôtico cuya resistencia porta el plâsmido y, en su caso, el de la cepa receptora (cuando se emplearon derivados de sp. CIB). Este protocolo de conjugaciôn se empleô tanto para la transferencia de plâsmidos repücativos com o de plâsmidos suicidas. 60 4.3.2. Construcciôn de mutantes de inserciôn por recombinaciôn homôloga en Azoarcus sp. CIB El vector elegido para la construcciôn de mutantes por recom binaciôn hom ôloga en A^parcus sp. CIB lue el plâsmido p K l (Tabla 4), que se com porta com o una plâsmido suicida en esta cepa. Fragm entes internes (con un tam ano aproxim ado de 700 pb) de los genes que se deseaban m utar se clonaron en el vector p K l %moh, dando lugar a los plâsmidos derivados que aparecen en la Tabla 4. E stes vectores se introdujeron en la cepa donadora E. coli A l- \X p ir mediante transform aciôn por choque térmico o electroporaciôn. Las cepas derivadas de E. coli A lA X p ir que se obtuvieron fueron utüizadas para la reahzaciôn de conjugaciones biparentales con Acparcus sp. CIB tal y como se detalla en el apartado 4.3.1 de esta secciôn. D ebido a la naturaleza suicida del vector ^¥lA%mob en Acparcus la ùnica forma de que los exconjugantes sobrevivan a la presiôn selectiva de la kanamicina (cuya resistencia porta el plâsmido) es que se baya producido una recom binaciôn hom ôloga entre la regiôn génica clonada en el vector y la copia crom osôm ica del gen, de tal forma que el plâsmido se inserta en el interior de éste impidiendo la form aciôn de un transcrito com pleto de la ORF. Para com probar si la recom binaciôn se ha producido en las cepas exconjugantes se valida mediante PCR que el gen diana esté truncado, com probando la imposibüidad de la amplificaciôn de una banda de D N A équivalente al tam ano del gen en la estirpe süvestre y la form aciôn de fragmentos de D N A recom binantes constituidos por parte del gen truncado y parte del plâsmido insertado. 5. Técnicas de manipulaciôn de protemas 5.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS- PAGE) Las electroforesis analfticas de proteinas se reaHzaron en todos los casos en condiciones desnaturalizantes en presencia de dodecilsulfato sôdico (SDS). La técnica utilizada fue la descrita por LaemmH (1970) utilizando geles de poHacrilamida en plaça (PAGE) a una concentraciôn del 10-15%. Las muestras se hirvieron a 100 °C durante 10 min en presencia del tam pôn de ruptura (Tris-HCl 62.5 mM pH 6.8, SDS 2%, m ercaptoetanol 5%, gücerol 10% y azul de brom ofenol 0.005%). Las electroforesis se reaüzaron a tem peratura ambiente y a 50 mA (corriente constante), utiüzando un electroüto que contenia Tris-HCl 25 mM pH 8.8, gücina 192 mM y SDS 0.1%. Las 6Ï" protemas de los geles se tineron con azul brillante de Coomassie R-250 (Swank y Munkres, 1971). Las protem as empleadas com o m arcadores de masa m olecular (fosforilasa B, 97.4 kDa; BSA, 66.2 kDa; ovoalbùm ina, 45 kDa; anhidrasa carbônica, 31 kDa; inhibidor de tripsina. 21.5 kDa) se adquirieron en Bio-Rad. 5.2. Sobreproducciôn y purificaciôn de proteinas 5.2.1. Sobreproduccion y purificaciôn de MbdW-Hiss La cepa E. coli BL21 (DE3) (pETmbdW ) se empleô para la sobreproducciôn de la proteina MbdW-His^,. Todos los cultivos se reaHzaron en m edio LB con Km (50 pg/1) incubados en agitaciôn a 37 °C. A partir de un preinôculo de células, se inocularon 100 ml de medio a una absorbancia a 600 nm de 0.05-0.10. Una vez el cultivo alcanzô una de 0.5, se adicionô el inductor IPTG 0.5 mM. El cultivo se incubô 5 h y pcsteriorm ente se recogiô por centrifugaciôn. E n los casos en los que no se realizô diiectamente la purificaciôn, las células se conservaron a -20 °C. Para la purificaciôn se empleô el siguiente buffer de trabajo: Tris-HCl 20 mM, KCl 250 mM, gücerol 10%, imidazol (diferentes concentraciones), pH 7.9. Las células se resuspendieron en 10 ml de buffer de. trabajo com plem entado con imidazol 20 mM y a continuaciôn se dividieron en aücuotas de 2 ml. Las células se rompieron por sonicaciôn (5 rondas de pulsos cada 0.5 segundos a lo largo de 30 segundos, ampütud 70%; Bandeün Sonoplus). E l extracto obtenido se centrifugô a 4 °C y 20000 g durante 20 min recuperândose el sobrenadante com o la fracciôn de extracto celular. La purificaciôn de la proteina MbdW-His^ se reaüzô em pleando una columna de afinidad que contenia niquel (HisTrap H P 1 ml N i Sepharose High Performance-, G E Healthcare) en un equipo ÀKTA (G E Healthcare). Una vez equiübrada la columna con el bîffer de resuspensiôn, se hizo pasar el extracto celular a través de la misma. Para eluir la proteina MbdW-His^ se utiüzô un gradiente ascendente de concentraciôn de imidazol (de 20 mM a 500 mM) durante 30 min. Se recogieron fracciones de 2 ml, de las cuales las que presentaban una mayor absorbancia a 280 nm se anaüzaron m ediante geles de SDS-PAGE. Las fracciones que contenian proteinas del tam ano esperado se diaüzaron y concentraron empleando columnas de exclusiôn molecular Vivaspin 6 (membrana 10000 M CW O; Sartorius), de tal form a que al final del proceso la proteina purificada se 62 encontraba disuelta en buffer de trabajo con imidazol 20 mM. La proteina purificada se conserv é a -20 °C, m anteniendo su actividad a lo largo de varios meses. 5.2.2. Sobreproducciôn y purificaciôn de MbdR-Hise La cepa E. coli BL21 (DE3) (pETm bdR) se empleo para la sobreproducciôn de la proteina. La hiperproducciôn de la proteina se realizô en las mismas condiciones descritas para la purificaciôn de MbdW-His^^ (ver apartado 5.2.1). Para la purificaciôn se empleô el siguiente buffer de trabajo: NaH^PO^ 50 mM, KCl 300 mM, imidazol (diferentes concentraciones), pH 8. La preparaciôn de los extractos celulares parte de la resuspensiôn de las células en 10 ml de buffer de trabajo con imidazol 20 mM. Las células se rom pieron reaHzando dos pases sucesivos a través de una prensa de French (20000 psi; A m inco Corp.). El extracto obtenido se centrifugô a 4 °C y 20000 g durante 20 min, recuperândose el sobrenadante como la fracciôn de extracto celular. Las columnas de afinidad empleadas para la purificaciôn (Ni-NTA Spin Kit, Qiagen) se utilizaron segun las instrucciones del fabricante. Las columnas se equüibran primero con el buffer de resuspensiôn de las células y mediante centrifugaciôn se hacen pasar 5 ml de extracto celular. A continuaciôn se realizan cuatro lavados con buffer de trabajo com plem entado con concentraciones crecientes de imidazol (20 mM, 75 mM y 100 mM). La proteina se eluye con buffer de trabajo com plem entado con imidazol 250 mM, 500 mM y 1000 mM. E n los casos en los que fue necesario, la proteina se dializô y concentrô em pleando columnas de exclusiôn molecular Vivaspin 500 (membrana 10000 îvIWCO; Sartorius). La proteina purificada se hace pasar a través de la columna y se lava cinco veces con buffer de trabajo com plem entado con imidazol 20 mM. La proteina se conservô a 4 °C durante mâs de seis meses sin pérdida de su atividad. 5.3. Cromatografia de filtraciôn en gel El câlculo de la masa m olecular de la proteina MbdW-Hisg nativa se realizô con 0.11 mg de proteina purificada. Para la cromatografia de filtraciôn en gel se empleô una columna FPLC Superdex 200 H R 10/30 (10 m m de diâmetro, volum en interior 24 ml; G E Elealthcarè) en un equipo A K TA (G E Elealthcarê). Com o patrones de masa molecular se em plearon las siguientes moléculas: dextrano azul (2000 kDa, Sigma); apoferritina de 63 bazo de caballo (443 kDa, Sigma); catalasa de higado bovino (232 kDa; Sigma); albumina serica bovina, BSA (dos estados de asociacion de 67 kD a y 134 kDa; Sigma); anhidrasa carbonica de eritrocitos bovinos (29 kDa; Serva); acetona (0.058 kDa). El buffer de desarroUo de la cromatografia es el buffer de trabajo descrito para la purificaciôn de MbdW-HiS(^ sin imidazol. Para el câlculo de la masa molecular nativa de MbdW-His^ se emplearon 0.11 m g de proteina purificada. 6. Ensayos de actividad enzimatica 6.1. Ensayo de actividad p-galactosidasa Para los ensayos de actividad [3-galactosidasa se emplearon células tanto de E . coli com o de A^parcus sp. CIB portadoras de diferentes fusiones traduccionales con el gen testigo lacZ. Las células se cultivaron a 30 °C hasta alcanzar la densidad optica deseada en cada caso (mitad de la fase exponencial de crecimiento). La actividad ^-galactosidasa se anahzo perm eabüizando las células, y las unidades de actividad enzimâtica (Unidades Miller) se determ inaron segun el m étodo descrito por Miller (1972). 6.2. Ensayos de actividad CoA ligasa Las actividades CoA ligasa se ensayaron en extractos de E. coli DHIOB (pUCmbdA) y E. coli DHIOB (pUCBZDA) en los que las enzimas MbdA y BzdA, respectivamente, estaban sobreproducidas. Los cultivos se reaHzaron en medio LB (50 ml) com plem entado con Ap y 3MBz (0.5 mM) a partir de una colonia unica, y se incubaron 12 h a 20 °C en agitaciôn suave. Una vez el cultivo adquiere una densidad optica a 600 nm de ~ 0 .15-0.20 las bacterias se recogen por centrifugacion y se resuspenden en 600 pl de tam pon Tris-HCl 100 mM pH 8.5 al que se le anadio una mezcla de inhibidores de proteasas (Protease Inhibitor Cocktail Tablets Complete Mini EDTA-free, Roche) segun las especificaciones del fabricante. Las células se Hsaron por sonicaciôn (3 pulsos de 10 segundos en un sonicador Branson) y los restos celulares se eHminaron por centrifugaciôn. Los sobrenadantes fueron utiHzados com o extractos crudos en los ensayos de actividad CoA Hgasa. La concentraciôn de proteina total en los extractos se determ inô por el m étodo de Bradford (Bradford, 1976), utilizando BSA 64 como patron. La actividad CoA ligasa fue monitorizada espectrofotom etricam ente a 30 °C m ediante dos tipos de ensayo; directo y acoplado. 6.2.1. Ensayo directo E n el ensayo directo se determ ino la actividad CoA ligasa mediante la m onitorizacion espectrofotom etrica de la formaciôn de derivados de CoA (Niemetz et al. 1995). La mezcla estândar de ensayo (600 pl) contenia Tris-HCl 100 mM pH 8.5, D T T 2 mM, MgCl, 5 mM, ATP 1 mM, CoA 0.4 mM, sustrato aromatico 1 mM y un volumen variable de extracto crudo celular. La form aciôn del benzoü-CoA se siguiô espectrofotom etricam ente a 290 nm (s = 3.9 mM ' cm ’) (Niemetz et al., 1995). Al inicio de esta tesis se desconocia el coeficiente de extinciôn m olar del 3-metilbenzoü-CoA, que se calculô experimentalm ente para una longitud de onda de 290 nm a partir del com puesto sintetizado y purifïcado en el laboratorio del Prof. Matthias BoU (Universidad de Leipzig, Alemania), y resultô tener un valor de 3.9 mM ’ cm ’. 6.2.2. Ensayo indirecto (acoplado) E n el ensayo indirecto (acoplado) se determinô la actividad CoA ligasa midiendo la formaciôn de AM P m ediante su acoplamiento al sistema enzimâtico form ado por la mioquinasa, piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa, y la consecuente monitorizaciôn espectrofotom etrica de la desapariciôn de N A D H a 365 nm (Ziegler et a l, 1989). La catâüsis de las enzimas con actividad CoA Hgasa de âcidos aromâticos genera com o uno de los productos de la reacciôn AM P, que es fosforilado con A TP por la mioquinasa para dar lugar a dos moléculas de ADP. El AD P es utiHzado por la piruvato quinasa para foforilar el fosfoenolpiruvato y dar lugar a piruvato. Finalmente, la lactato deshidrogenasa transform a el piruvato en lactato consum iendo N A D H , que es la senal que se m onitoriza espectrofotom étricam ente. La mezcla de reacciôn (600 [il) contenia Tris-HCl 100 mM (pH 8.5), MgClj 5 mM, A TP 2 mM, CoA 1 mM, fosfoenolpiruvato 2 mM, sustrato arom atico 0.5 mM, N A D H 0.5 mM, 1.2 [il de una mezcla de piruvato quinasa (1 U) y lactato deshidrogenasa (1 U) de musculo de ratôn (Roche), 0.6 [il de mioquinasa (0.6 U) de musculo de poHo (Sigma- Aldrich) y un volum en variable de extracto crudo celular. 65 6.3. Ensayos de actividad (3-metil)-benzoil-CoA reductasa Los ensayos de actividad reductasa se reaHzaron en el laboratorio del Prof. Matthias BoU de la Universidad de Leipzig (Alemania). Los ensayos de la actividad reductasa se reaHzaron segun se describe en BoU y Fuchs (1995), y BoU y Fuchs (1998). Para el anâUsis de la actividad reductasa se reaHzaron cultivos anaerobicos de Aparcus sp. CIB, o sus cepas derivadas, en las fuentes de carbono correspondientes. D ebido a la extrema sensibUidad de la actividad reductasa a la presencia de oxigeno, todo el proceso ha de reaHzarse en condiciones anaerôbicas. Inicialmente, se resuspende 1 g de células en 2 ml de buffer de ruptura (Trietanolamina 20 m M /K O H pH 7.8, MgCl, 4 mM, ditionito 0.5 mM, gHcerol 10 %), previamente burbujeado con nitrôgeno, y se anade 1-2 m g de D N asa I. Las células se rom pieron mediante una prensa de French (20000 psi; Aminco Corp.) y el Hsado celular résultante fue ultracentrifugado 1 h a 1 0 0 0 0 0 g bajo condiciones anaerôbicas, com o se describe en Brackmann y Fuchs (1993). El sobrenadante résultante es el extracto celular crudo que se empleo para los ensayos de la actividad reductasa. La mezcla de reacciôn (200 pl) contiene buffer (MOPS 100 mM pH 7.3, MgCl^ 15 mM) com plementado con ATP 5 mM, 3-metUbenzoü-CoA o benzoü-CoA 0.2 mM, citrato de titanio (III) 7.5 mM y un volum en variable de extracto celular. El ATP y el derivado CoA son cosustratos en el proceso de reducciôn, mientras que el citrato de titanio (III) es un donador artificial de electrones que reemplaza in vitro la funciôn de las ferredoxinas acopladas a las reductasas in vivo. Las reacciones se incuban a 30 ®C y transcurren en anaerobiosis estricta. A lo largo de diferentes tiempos de reacciôn se retiraron muestras en las que las protem as se precipitaron mediante la adiciôn de m etanol (50 pl m etanol para 25 pl muestra) y centrifugaciôn (13000 rpm, 4 °C, 10 min) en una minifuga refrigerada. El sobrenadante obtenido se trasvasa a un nuevo tubo E ppendorf y se centrifuga una vez mâs en las mismas condiciones. El sobrenadante de esta segunda centrifugaciôn se anaHzô m ediante HPLC. E l anâHsis de los productos generados se Uevô a cabo en un sistema HPLC W aters con una columna de fase reversa Eurospher 100-5 C l 8 em pleando com o solvente para las muestras acetonitrilo y como buffer de desarroUo (flujo 0.75 ml min ’) K 2H P O 4 25 mM, KH^^O^ 25 mM, pH 6.7. Los picos cromatogrâficos debidos a los com puestos m etüados derivados del 3-metübenzoü- CoA se identifïcaron por com paraciôn con los com puestos no metüados, ya que su espectro UV de 210-400 nm es el m ism o y su tiem po de retenciôn respecto al 3- 66 metilbenzoil-CoA es el m ism o que el de los com puestos no metüados respecto al benzoü-CoA. 6.4. Ensayos de actividad (metil)-ciciohexa-1,5-dieno- carbonil-CoA hidratasa 6.4.1. Ensayo mediante HPLC Los ensayos de actividad (m etü)-ciclohexa-l,5-dieno-carbonü-CoA hidratasa se reaHzaron en las condiciones descritas en Peters et al. (2007). La reaccion (500 pl) contenia Tris-HCl 100 mM pH 7.5, sustrato 0.5 mM y u n volum en variable de proteina MbdW-HiSf, purificada. Los sustratos empleados fueron (metü)-ciclohexa-l ,5-dieno- carbonü-CoA (metü-dienoü-CoA), ciclohexa-1,5-dieno-carbonü-CoA (dienoü-CoA) y, dado que la reaccion es reversible, los productos hidratados (metü)-6-hidroxi- m onoenoü-CoA (m etü-60H -m onoenoü-C oA ) y 6-hidroxi-m onoenoü-CoA (6 0 H - monoenoü-CoA) tam bién se em plearon com o sustrato para m onitorizar la reacciôn reversa. E n el transcurso de la reacciôn se extrajeron m uestras (50 pl) para su anâHsis por HPLC. La proteina présente en las muestras se précipita con m etanol y se eHmina por centrifugaciôn (13000 rpm , 4 °C, 10 min) en una minifuga refrigerada. El sobrenadante obtenido se centrifuga una vez mâs en las mismas condiciones. El sobrenadante de esta segunda centrifugaciôn se anaHza m ediante HPLC con una columna de fase reversa E urospher 100-5 C l 8 en las m ism as condiciones que se detaUan en el apartado 6.3. El consum o del sustrato se siguiô m onitorizando la absorciôn de los ésteres de CoA a 260 nm, y anaHzando los perfües U V / visible caracteristicos tanto de sustratos com o de productos (Laempe et al, 1998; Laempe et al, 1999) empleando un detector W aters (Waters photodiode array detector 996). Los sustratos y productos utiHzados com o patrôn fueron gentüeza de Christian Eberlein (Universidad de Leipzig, Alemania). Com o control positivo de los ensayos se m onitorizô la conversiôn dienoü- CoA —̂ 60H -m onoenoü-C oA mediada po r la proteina BamRg^^ purificada, gentüeza de Johannes Kung (Universidad de Leipzig, Alemania). 6.4.2. Ensayo espectrofotométrico El anâHsis espectrofotom étrico de la actividad de MbdW-His^^ se reaüzô m onitorizando la reacciôn reversa 60H -m onoenoü-C oA “ ^dienoü-CoA. Se siguiô la 67 reacciôn reversa de deshidrataciôn empleando el derivado m onoenoil no medlado com o sustrato debido a su mayor disponibüidad y facüidad de purificaciôn. En este ensayo se mide el aum ento de absorbancia a 320 nm (s = 1700 M ’ cm ') debido a la form aciôn del dienoü-CoA (Laempe et a l, 1998; Peters et ai, 2007). Las condiciones de la reacciôn empleadas fueron las mismas que las descritas para el anâHsis de la actividad (metil)- ciclobexa-1,5-dieno-carbonil-CoA hidratasa mediante HPLC (apartado 6.4.1). 7. Ensayos de union de proteina a DNA 7.1. Marcaje de las sondas radiactivas Las sondas se ampHficaron a partir de D N A genômico de Aparcus sp. CIB m ediante PCR empleando D N A polimerasa Pfu (Biotools B. M. Labs) y los siguientes pares de oHgonucleôtidos especificos (Tabla 5): Sonda Pq (271 pb): Interno Pdiv>0 Seal 572 / Pdiv>0 EcoRl 372 Sonda (251 pb): In tem o Pdiv>B1 Seal 572 / Pdiv>B1 EeoRl 3 ' Sonda P., (225 pb): PmbdA Seal 5 ' / PmbdA EeoRl 3 ' Sonda P^^ (352 pb): PmbdR Seal 5 ' / PmbdR EeoRl 3 ' Los fragmentos de PCR se purificaron m ediante el kit GeneClean Turbo (Q- BlOgene) y se digirieron con las enzimas Seal y EeoRl. Los productos obtenidos se m arcaron radiactivamente en el extremo 3 ' generado po r EeoRl utiHzando el fragmento Klenow de la D N A poHmerasa I de E. coli (5 U /g l, Promega) y [a-^^P]dATP (6000 C i/m m ol, 20m Ci/m l; Perkin-Elmer). Los fragmentos marcados se purificaron empleando el kit GeneClean Turbo (Q-BIOgene). 7.2. Ensayos de retarde en gel Para los ensayos de retardo en gel se utiHzaron las sondas radiactivas obtenidas tal y com o se detalla en el apartado anterior. Las mezclas de reacciôn contenian la proteina purificada MbdR-Hisg a diversas concentraciones, asi com o la sonda correspondiente marcada radiactivamente a una concentraciôn de 0.5 nM en un volum en final de reacciôn de 9 pl. E l tam pôn de retardo utüizado contenia Tris-HCl 20 mM, pH 7.5, gHcerol 10%, KCl 50 mM, ^-m ercaptoetanol 2 mM, BSA 250 pg /m l y D N A inespecifïco de esperma de saHnôn a una concentraciôn de 50 pg/m l. El resultado de la reacciôn se anaHzô por electroforesis en geles de poHacrilamida al 5 % con tam pôn TB E 68 0.5x (Tris-borato 45 mM, ED TA 1 mM). El gel se seco sobre papel W hatm an 3MM y los productos de la reaccion se detectaron por autorradiografia con peHculas Hyperfilm M P (Amersham Biosciences) con pantaUas ampHficadoras (Cronex Lightning Plus DuPont). La intensidad de las bandas se densitom etrô em pleando el program a Quantity O ne (BioRad). 7.3. Ensayos de protecciôn trente a digestion con DNasa I (footprinting) Las mezclas de reaccion para el ensayo de protecciôn frente a la digestiôn con D N asa I se reaHzaron en tam pôn FP (Tris-HCl 20 mM pH 7.5, KCl 50 mM, gHcerol 10%, p-mercaptoetanol 2 mM ), al que se anadiô BSA (500 pg/m l) en presencia de la sonda correspondiente (Pq, P^;, P.„ P^J a una concentraciôn de 2 nM y 10 pl de MbdR- HiS(̂ a diversas concentraciones. Las muestras (en un volum en final de reacciôn de 15 pl) se incubaron a temperatura ambiente durante 20 min, transcurridos los cuales se anadieron 3 pl (0.05 U) de D N asa I (FPLCpure Roche) diluida en un tam pôn Tris-HCl 10 mM pH 7.5, CaCl^ 10 mM, MgCl^ 10 mM y KCl 125 mM. La digestiôn con DNasa I se reaHzô a 37 °C durante 25 segundos y se detuvo por la adiciôn de 180 pl de soluciôn D N asa STO P (acetato sôdico 0.4 M, ED TA 2.5 mM, D N A de esperma de salmôn 50 p g /m l y gHcôgeno 0.3 pl/m l). Las muestras se sometieron a una extracciôn proteica con fenol y el D N A fue precipitado con 3 volùmenes de etanol absoluto (tras una incubaciôn de al menos 1 h a -80 °C) mediante centrifugaciôn a 14000 rpm y 4 °C en una mimfuga refrigerada. Las muestras se lavaron con etanol al 70% y, posteriorm ente, se secaron y se resuspendieron en tam pôn de carga (Tris-HCl 10 mM pH 8.0, formamida 80%, ED TA 20%, azul de brom ofenol 0.05% m /v y azul de xilencianol 0.05% m /v). Finalmente, las muestras fueron desnaturaHzadas por incubaciôn a 95 °C durante 3 min. E n paralelo a las reacciones de footprinting, las correspondientes sondas se secuenciaron mediante el m étodo A + G de Maxam y G ilbert (1980) y se anaHzaron junto a las reacciones de protecciôn frente a la digestiôn con D N asa I en geles desnaturaHzantes de poHacrilamida 6% - urea 8 M, los cuales se secaron al vacio sobre papel W hatm an 3 MM y, po r ultimo, se expusieron en peHculas Hyperfilm MP (Amersham Biosciences) con pantaUas ampHficadoras (Cronex Lightning Plus DuPont). 69 7.4. Ensayos de transcripcion in vitro Todas las soluciones se prepararon con agua destilada que contenia el inhibidor de RNasa dietüpirocarbonato (DEPC, Sigma) y se filtraron previamente a su uso. El buffer utüizado para la reaccion contenia Tris-HCl 40 mM pH 7.5, MgClj 10 mM y KCl lOO mM. El D N A molde utüizado correspondia a los plâsmidos pJCDPq y pJCDP{,i (Tabla 4). El volum en final de la mezcla de reaccion fue de 50 pl, que contenian DNA plasmidico 0.25 nM y BSA a 500 pg/m l. Se anadio RNA polimerasa holoenzima de E. coli (1 U /p l, USB) a una concentraciôn final de 30 nM y, a continuaciôn, se anadiô la proteina MbdR-His^, düuida previamente en el tam pôn anteriormente m encionado que contenia ademâs D T T 2 mM y BSA a 500 pg /m l, a diferentes concentraciones. Ademis, se anadieron en diversas ocasiones diferentes inductores (3-metüenzoü-CoA, benzcü- CoA, feniacetü-CoA, CoA, 3MBz) a las concentraciones descritas en cada ensayo. Esta mezcla se incubô a 37 °C durante 10 min. La elongaciôn de la cadena de RNA nacier.te com enzô al ahadir 5 pl de una mezcla que contenia ATP (1 mM), CTP (1 mIM), GTP (1 mM), UTP (0.2 mM) y 1 pCi de [a-^^P] UTP (3000 C i/m m ol, lOmCi/ml; Hartmann Analytic). Se parô la reacciôn al cabo de 15 min con 50 pl de una soluciôn STOP que contenia NaCl 350 mM, ED TA 50 mM y RNA de transferencia (salmôn) 100 pg/nü. El m RNA fue precipitado con 3 volùmenes de etanol absoluto durante al menos 1 li a -SO °C. Posteriorm ente, las muestras fueron centrifugadas en una minifuga refrigerada a 14000 rpm a 4 ®C. Las muestras se secaron y se resuspendieron en 25 pl de tam pôn de carga (formamida 80% v /v , ED TA 20 mM, azul de brom ofenol y azul de xüencianol), antes de ser calentadas a 90 °C y cargadas en un gel desnaturalizante de poHacrüamida 4% - urea 8 M. La electroforesis se desarroUô a 300 V. Los geles se secaron al vacio sobre papel W hatm an 3MM y se expusieron en peHculas Hyperfilm MP (Amersham Pharmacia Biotech) con pantaUas ampHficadoras (Cronex Lightning Plus DuPont). 8. Ensayos de ultracentrifugaciôn analftica Los experimentos de velocidad de sedimentaciôn y de equüibrio de sedimentaciôn se Uevaron a cabo en una ultracentrifuga anaHtica m odelo Optim a XL-A (Beckman) equipada con un espectrofotôm etro UV-visible y con un ro tor An50Ti con celdis de doble sector de cuarzo. Para la detecciôn de la proteina, las medidas fueron Uevadas a cabo utüizando una longitud de onda de absorciôn de 280 nm. E n los diversos ensayos se UtiHzaron diferentes concentraciones de proteina MbdR-His^, que variaban entre 11 y 70 46 pM. E n todos los casos, la proteina se encontraba disuelta en un tam pôn NaH^PO^ 50 mM, KCl 300 mM, imidazol 20 mM pH 8.0. La velocidad a la que se sometieron las m uestras (400 pl) fue de 48000 rpm. La distribuciôn de coeficientes de sedimentaciôn se calculô mediante el programa SED FIT (Schuck y Rossmanith, 2000; Schuck et ai, 2002). Los coeficientes de sedimentaciôn fueron corregidos por la composiciôn del tam pôn utilizando el programa SED N TE R P (Laue, 1992) para obtener los valores estândares correspondientes (en agua y a 20 °C). La masa molecular aparente de MbdR-His^^ en soluciôn se determinô mediante el ajuste de los datos expérimentales a la ecuaciôn que describe la distribuciôn de concentraciones radiales de un soluto ideal. El volumen especifico parcial de MbdR-His^^ se calculô a partir de la secuencia de aminoâcidos de la proteina usando el programa de acceso publico SED N TE R P (Laue, 1992). 9. Recursos informàticos 9.1. Anàlisis de secuencias El anàlisis de las secuencias nucleotidicas se realizô con los siguientes programas y ser\idores: Chromas 2.01 (Technelysium Pt) ̂ Ltd.), anàlisis cromatogramas procedentes de reacciones rutinarias de secuenciaciôn; Bioedit Sequence Alignment Editor v7.0.3 (Hall, 1999), anâHsis de cromatogramas procedentes de reacciones rutinarias de secuenciaciôn; Biosupport (h ttp ://b io in fo .h k u .h k /), obtenciôn de secuencias reversas y complementarias de D N A , traducciôn de secuencias de D N A a proteina; Institut Pasteur (h t tp : / / m obyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py#w elcom e), traducciôn de secuencias de D N A en los seis marcos de lectura simultâneamente ; Expasy (h t tp : / / www.expasy.ch/to o ls /dna.htm l), traducciôn de secuencias de DN A. Las secuencias de nucleôtidos y las secuencias deducidas de aminoâcidos se com pararon con las existentes en las bases de datos mediante el uso de los algoritmos BlastN y BlastP, respectivamente (Altschul et a l, 1990). E l servidor seleccionado para ejecutar estos algoritmos fue el del National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://ww w.ncbi.nH n.nih.gov/BLAST/BLAST.cgi). La comparaciôn de parejas de secuencias proteicas se reaHzô con el programa Blast2sequences a través del servidor del NCBI, mientras que para los alineamientos multiples de secuencias se empleô el programa ClustalW (Thom pson et al, 1994) m ediante el servidor EM BL-EBI (h t tp : / / w w w .ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). 71 http://bioinfo.hku.hk/ http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py%23welcome http://www.expasy.ch/tools/dna.html http://www.ncbi.nHn.nih.gov/BLAST/BLAST.cgi http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html Las propiedades teoricas de los productos proteicos se determ inaron con la apHcacion ProtParam tool (ExPASy Proteom ics Ser\^er, Swiss Institute o f Bioinformatics)a través del servddor h t tp : / /expasy .o rg /to o ls /protparam .htm l. El Codon Adaptation Index (CAI; Sharp y Li, 1987) de algunos genes [mbd, bss-bbs) se calculô empleando la apHcaciôn ECAI {Expected C A I Calculation', Puigbô et a i, 2008) a través del servidor h ttp ://genom es.u rv .es/C A Ica l/E -C A I/ (Departam ento de Bioquimica y Biotecnologia, Universidad Rovira i Virgili), utilizando la in form aciôn de secuencia del genoma de Afparcus sp. CIB disponible en nuestro grupo. Los oHgonucleôtidos se disenaron empleando el programa Gene Runner 3.05 (Hastings Software Inc.) 9.2. Construcciôn de àrboles filogenéticos Para la construcciôn de ârboles filogenéticos se partiô de aHneamientos de multiples secuencias aminoacidicas mediante el program a ClustalW, tal y com o se indica en el apartado anterior. El alineamiento obtenido, mediante el “m étodo del vecino mâs prôxim o” {neighbour-joininf), se procesô con el program a P H ^T IP (Phylogenetic Interface Package) versiôn 3.5.1. por j. Felsenstein (Brodskiï, 1995) a través del servidor TreeTop-GeneBee (h ttp :// ww w.genebee.m su.su/services / phtree_reduced.htm l) del Instituto Belozersky de Biologia Fisica-Quimica (Universidad Estatal de Moscü). El ârbol obtenido se visuaHzô con el program a Tree View X 0.5.1 (Universidad de Glasgow). 9.3. Modelado de la estructura tridimensional de protemas Los m odelos tridimensionales de protemas se generaron con las apHcaciones web 3D-Jigsaw (Cancer Research UK, http ://bm m .cancerresearchuk.org /~3djigsaw /) y SwissModel (h t tp : / / swissmodel.expasy.o rg /workspace/ index.phpPfunc= modelling_sim plel). La visuaHzaciôn de los m odelos 3D se reaHzô con el programa PyMol (DeLano Scientific, h ttp ://pym ol.sourceforge .net/). Para la predicciôn de la estructura secundaria de las protemas se empleô el programa PSIpred (h ttp ://b io in f.cs.ucy l.ac .uk /psip red /, UCL D epartm ent o f Com puter Science). 72 http://expasy.org/tools/protparam.html http://genomes.urv.es/CAIcal/E-CAI/ http://www.genebee.msu.su/services http://bmm.cancerresearchuk.org/~3djigsaw/ http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.phpPfunc=modelling_sim http://pymol.sourceforge.net/ http://bioinf.cs.ucyl.ac.uk/psipred/ IV. R esultados 73 1. Identificaciôn del cluster génico responsable de la ruta central para el catabolisme anaerôbico de 3-metilbenzoato en Azoarcus sp. CIB C om o se ha indicado en la Introducciôn, el cluster hbs-hss de A .’s^arcus sp. CIB es responsable de la m ta periférica de degradacion anaerobica de to lueno y w-xileno (Fig. 9) (Blâzquez, 2009). Si b ien la ru ta periférica bbs-bss transfo rm a el to lueno en el m etabo lito central benzoil-C oA , la degradacion anaerobica del w-xileno a través de la ru ta bss-bbs genera 3-m etilbenzoil-C oA com o m etabo lito (K rieger et al.\ 1999; A chong et al., 2001). La degradacion anaerobica de este m etabo lito central, el 3-m etilbenzoil- C oA , no se habia descrito en la Uteratura cientifica con an terio ridad a la reahzaciôn de esta Tesis D octoral. La secuenciaciôn del genom a de ^is(oarcus sp. CIB perm itio anahzar las inm ediaciones del cluster bss-bbs, p o r lo que se p u d o detectar la presencia de una agrupacion génica que podria codificar una nueva ru ta central para la degradacion anaerobica de com puestos arom aticos, ya que m uchos de estos genes p resen tan una no tab le identidad de secuencia con los de la ruta central del benzoil-C oA en la cepa CIB y en o tros m icroorganism os anaerobios facultativos (Tabla 6) (G ibson y G ibson , 1992; Breese et a l, 1998; L opez-B arragân et a l, 2004). E l nuevo cluster de genes se p o stu lé im phcado en una nueva ru ta central para la degradacion de 3-m etilbenzoil-C oA y su p recu rso r 3M Bz. P o r analogia con el cluster bs(d (acronim o de benzoate degradation) la nueva agrupacion génica se denom inô cluster mbd {methjlbengoate degradation). E n la Figura 10 se puede obser\rar u n esquem a de la d isposicion de los genes del cluster mbd y, jun to a él, el cluster bss-bbs necesario para la degradacion anaerobica de to lueno y w-xileno a benzoil- C oA y 3-m etilbenzoil-C oA , respectivam ente. P-oxidaciôn y Activaciôn ' R egeneraciôn d e apertu ra del Reducciôn del del anillo Ruta baja poder reductor anillo Ruta baia anillo arom atico 433 pb ffd/W b s s D C A D C r m J K t b b s lH G or fA b b s F E D C B A Figura 10. Esquema modular del cluster mbd. Representacion del c/tvster mbd propuesto para la ruta central del 3-metilbenzoil-CoA, necesaria para la degradacion anaerobica de 3MBz y m-xileno. El cluster se ha dividido en modules funcionales propuestos para las diferentes etapas bioquimicas de la ruta central o para otras actividades necesarias para la degradacion, como el transporte y la regulaciôn (Reg.). Adyacente al cluster mbd se encuentra el cluster bss-bbs que codifica la ruta periférica de degradacion anaerobica del tolueno y el m-xileno. Dicho cluster se esquematiza con très fléchas alargadas que representan los operones tdlRS (regulador; flécha amarilla), bss (catabôlico; flécha azul claro) y bbs (catabôlico; flécha morada)._____________________________________________ 75 # Eg# z ^ 5 z 3 i 9' q: § g § ÏP 2 i s % % i I ' j J J J J g s I I ^ 9 ^ B < < < < < < 5 3 vS P!P! P! 5 2 5 SI #% !?I à X < .= i £ ^ £ =; CX< O'C' 3 Pi%S3 -ë4i c E - 5 5£' Î œ t 2 f , 3: f , < -S -S 3-S-S = = R Û jo SÎ S E% S CO W O CO O CO ^ S ■§ £ COfl is li CO Q- O CO Q) -5"D CD CO "OIIo CO il(0 -%; III u CD W III H i ■Si s Hio Ü tr ~ s_ 0) CO CO Q. — CO ^ II c o CD N E CD o 8 CO T3a& c - 2 111 ^ . -9W CLo ^o CO ■— CD■II <0 * Q.23 S B c =* o -B> O) CO « 03O -a (D 8 O O) CD TJ§° CD O?lî CO o uIÎ! O) CO CD«5 o -c H I S . 2 “ 3 CT CO s i COCD C - ■ “ i III Ë 'cO -D Hi z E :g (0 "o ■“ s 2 2 . « w =1< dmbdY, Acy^arcus sp. ÇA^dmbdA, A'c^arcus sp. C IB d o ^ y Azoarcus sp. CYÿ>doîf6 se m ostraron incapaces de crecer anaerôbicamente en m edio minimo MC utilizando 3MBz com o ùnica fuente de carbono, lo que confirma su impHcaciôn en el cataboHsmo de este com puesto arom âdco. Ademâs, todas estas cepas mutantes, excepto As^oarcws, sp. (A ^dm bdA , se m ostraban incapaces de crecer anaerôbicamente em pleando w-xileno com o ùnica fuente de carbono, lo que estâ de acuerdo con el papel propuesto para M bdA com o una 3MBz- CoA ligasa encargada de la activaciôn del 3MBz y, por tanto, no necesaria para la degradaciôn del w-xileno, que genera 3-metübenzoil-CoA com o producto final de la ruta periférica bss-bbs. Com o cabria esperar, todos los m utantes generados en el cluster mbd eran capaces de utilizar anaerôbicam ente benzoato com o ùnica fuente de carbono (Fig. 79 12B) y un m utante en la ruta bzd, Azoarcus sp. CTBdb^dN, era capaz de crecer en 3MBz (datos no m ostrados). Estas evidencias indican que la ruta m bd es dis tinta e independiente de la ruta central bzd. I Cromosoma de Azoarcus sp. CIB | pK18mob (3.8 kb) Amplificaciôn por PCR M M (2 ) Digestiôn + Ligaciôn N S S 5 S S 3 - ori (pUC) I Cromosoma de Azoarcus sp. CIB | inserciôn en el cromosoma g Q m ediante recombinaciôn I firV W / V l ._)>— [ lacZa NVVWSa- ori (pUC) I pK18mbd/orf\ M L&D OD L/ ^ l a c ^ K m R n r i T ( R P a t n r i tn l I C t ^ 'orrT (RP4) orr (pUC) 1 Cromosoma cepas mutantes Azoarcus sp. CIB | Gen Oligonucleotidos Fragmento Cepa Crecimiento mutado (1) (2) PCR (pb) résultante 3MBz m-xileno Bz orf6 orfftnut (H/ndlII) 5' orffimut (Xbal) 3' 723 pKI Sorte A zoarcus sp. C\B6orf6 + orts orfSmut (H/ndlII) 5' orfSmut (Xba\) 3' 585 pK18orf5 A zoarcus sp. CIBdorfS + m bdY mbdYmuX (HindlW) 5' mbdYmuX (Xba\) 3' 709 pK18m6cfy A zoarcus sp. C \B dm bdY + m bdO 5' ôc/mut (EcoRI) 3 bcrmul (Xbal) 787 pK18bcrS A zoarcus sp. C \Bdm bdO + mbdA mbdAmuX (H/ndIII) 5 .2 mbdAmuX (Xba\) 3 .2 736 pKX Sm bdA A zoarcus sp. C\Bdm bdA B Figura 12. Representacion esquemàtica de la construcciôn de los mutantes por inserciôn en los genes del cluster mbd en Azoarcus sp. CIB. A) Mediante PCR a partir de DNA genômico se amplificaron fragmentos internos de algunos genes del cluster mbd, el nombre de los genes mutados y el de los oHgonucleôtidos empleados (su secuencia se detalla en la Tabla 5) para la amplificaciôn de los fragmentos internos se muestran en la tabla del panel B). Los fragmentos résultantes se clonaron en el vector suicida pKISmob (Tabla 4) no replicativo en Azoarcus sp. CIB, previa digestiôn mediante las enzimas de restricciôn indicadas en cada caso. Los plâsmidos pKI Smôd/orf fueron transferidos a Azoarcus sp. CIB mediante conjugaciôn biparental empleando como cepa donadora E. coli S17-1Ap/r, tal y como se indica en el apartado 4.3 de Materiales y Métodos. La recombinaciôn homôloga subsiguiente origina la disrupciôn de los genes correspondientes y las cepas mutantes mostradas en el panel B). Las abreviaturas indicadas en el esquema son: lacZa (fragmento que codifica la subunidad a de la (3-galactosidasa), Km^ (gen que confiere resistencia a la kanamicina), oriT (origen de transferencia conjugativa del replicôn RP4), ori (origen de replicaciôn colE1 de los plâsmidos de la familia pUC) y MCS {Multiple Cloning Site del plâsmido pKISmob); A indica gen truncado. B) Tabla resumen de los genes mutados, los oHgonucleôtidos empleados para la amplificaciôn del fragmento interno del gen mutado, su tamano y el plâsmido en el que se clonô. Ademâs, se indica el nombre de la cepa obtenida y su capacidad para crecer anaerôbicamente en medio minimo MC con 3MBz, m-xileno o benzoato (Bz) como fuente de carbono (-, indica ausencia de crecimiento; +, indica crecimiento). 80 3. Caracterizaciôn bioqufmica de algunas actividades enzimâticas clave de la ruta mbd Com o se ha indicado en el apartado 1.2.2.1 de la Introducciôn, très de los pasos clave en las rutas centrales de degradacion anaerobica de âcidos aromâticos son: a) la activaciôn del com puesto m ediante la adiciôn de una molécula de CoA; b) la subsiguiente reducciôn del anillo aromâtico mediante una reductasa multicom ponente; c) el procesam iento y la apertura del anillo mediante una serie de reacciones similares a las de la [3-oxidaciôn de los âcidos grasos. Los resultados de la com paraciôn de secuencia del cluster mbd (Tabla 6) m uestran que los genes candidatos para codificar los productos proteicos responsables de estas actividades enzimâticas serian: mbdA (posible 3MBz-CoA ligasa), mbdONQP (posible 3- m etilbenzoü-CoA reductasa) y mbdXYW^ (posible sistema de p-oxidaciôn modificado). Para tratar de confirmar y caracterizar estas actividades enzimâticas se procediô a su estudio bioquimico. 3.1. Anàlisis de la actividad 3-metilbenzoato-CoA ligasa 3.1.1. Estudio y clonaciôn del gen mbdA El anâHsis de la secuencia aminoacidica del producto del gen mbdA senalô su simiHtud con proteinas CoA Hgasas de com puestos aromâticos (Tabla 6). La proteina M bdA présenta un tam ano (526 aa, 57.9 kDa) y p l (5.9) similar al de las benzoato, 3- hidroxibenzoato, 4-hidroxibenzoato y 2-am inobenzoato CoA ligasas que han sido descritas en diferentes m icroorganism os (Tabla 1). Ademâs, en todas estas proteinas se identifican dom inios de uniôn a AM P (Pfam00501), una caracteristica tipica de esta famiHa de CoA Hgasas. La simiHtud del producto del gen mbdA con miembros conocidos de la famiHa de las CoA Hgasas de com puestos arom âticos, sugeria su posible funciôn com o una 3MBz-CoA Hgasa. P or otro lado, tal y com o aparece reflejado en el apartado 2.2 de Kesultados, la cepa Af^oarcus sp. ClV>dmbdA es incapaz de crecer anaerôbicam ente en 3MBz como unica fuente de carbono, pero si es capaz de crecer empleando m-xileno (Fig. 12B). Este resultado tam bién sugeria que el producto del gen mbdA era el responsable de la actividad 3MBz-CoA Hgasa, puesto que esta actividad séria la ùnica del cluster mbd 81 prescindible para la degradaciôn del w-xileno, ya que en su cataboHsmo periférico se forma directamente 3-metilbenzoü-CoA (Krieger et ai, 1999) (Fig. 9). Para confirmar que el gen mbdA codifica la 3MBz-CoA Hgasa se procediô inicialmente a su clonaciôn. E l gen mbdA se ampHficô m ediante PCR y posteriorm ente se clonô bajo el control del prom otor Plac en el vector de expresiôn pUC19, dando lugar al plâsmido pU Cm bdA (Tabla 4, Fig. 13). D ado que pU Cm bdA no es capaz de repHcar en Aî^arcus sp. CIB, el gen mbdA se subclonô en el vector de ampHo rango de hospedador pIZ1016 bajo el control del p rom otor Ptac, de forma que se generô la construcciôn pIZ m bdA (Fig. 13). Cuando el plâsmido p lZ m bdA se introdujo en la cepa Aiy)arcus sp. CVPtàmbdA mediante electroporaciôn, la cepa résultante, A'^arcus sp. (A&dmbdA (plZm bdA), recuperô la capacidad de crecimiento anaerôbico en m edio minimo empleando 3MBz com o fuente de carbono, lo que indicaba que el gen mbdA clonado se expresaba, era funcional y podia ser utiHzado para confirm ar su actividad 3MBz-CoA Hgasa. I C ro m o so m a d e Azoarcus sp . CIB | m bdB1-B5 mbdA mbdR MCS {H/ndlII/Xbal) Plac iacZa Amplificaciôn por PCR on (pUC) H/ndIM X ba \ mbdA H/ndlII/Xbal + Ligaciôn Ap" p U C 19 (2 .7 kb) 1620 pb MCS (H/ndiii/Xbal) H m dlll mbdA HindWUXbai I S X S X Ligacion (pBBRI)pU C m bdA (4.3 kb) |p lZ 1 0 1 6 (6 .0 k b ) | H indm X oal mbdA SXSSK (pBBRI pIZm bdA (7 .6 kb) | Figura 13. Representacion esquemàtica de la clonaciôn del gen mbdA en los vectores de expresiôn pUC19 y plZ1016. El gen mbdA se amplifico mediante PCR a partir de DNA genômico, empleando la pareja de oHgonucleôtidos: (1) mbdA H/ndlII 5' y (2) mbdA Xba\ 3' (Tabla 5). Las abreviaturas indicadas en el esquema son : lacZa (fragmento que codifica la subunidad a de la p-galactosidasa), Ap^ (gen que confiere resistencia a la ampicilina), Gm" (gen que confiere resistencia a la gentamicina), ori (origen de replicaciôn), MCS {Multiple Cloning Site de los diferentes plâsmidos), mob (regiôn para la movilizaciôn), lacF (gen que codifica el represor Lad del operôn lac), Plac y Ptac (promotores lac y tac). Se indican también las enzimas de restricciôn utilizadas. 8 2 3.1.2. El gen mbdA codifica una 3-m etilbenzoato-CoA iigasa Para determ inar si el gen m bdA codificaba una 3M Bz-CoA ligasa se realizaron ensayos co n la fracciôn soluble de extractos celulares de E . coli D H IO B (pU C m bdA ) siguiendo el p ro toco lo que aparece resenado en el apartado 6.2 de Aiaterialesj Métodos. Los extractos celulares p roceden tes de E . rt»//DHIOB (pU C m bdA ) rnostraron una actividad 3M Bz-CoA ligasa significativa tan to u tilizando el ensayo de actividad d irecto (0.31 [im ol m in^ mg"^) co m o el acoplado (0.11 gm ol m in^ m g \ y que n o se de tec to con un ex tracto con tro l p roceden te de células de E . D H IO B (pUC19). Para la realizacion de los ensayos directos se calculo experim entalm ente el coeficiente de extincion m olar (e) del 3-m etübenzoil-C oA , que résu lté tener el m ism o valo r que el del benzoil-C oA (3.9 mM'^ cm"^). E stos resu ltados confirm aron que el gen m bdA se expresa en E . coli y que su p ro d u cto es la 3M B z-C oA ligasa, responsable de la activacion del 3M Bz a 3- m etübenzoil-C oA . C on el objetivo de determ inar sobre que com puestos arom âticos puede ejercer su acciôn enzim âtica la p ro te ina M bdA , se em plearon com o sustra to diferentes m oléculas de estrucm ra similar al 3M Bz. E n la Figura 14 se m uestra u n resum en de los ensayos de actividad C oA Ligasa reaüzados. La m axim a actividad C oA Ligasa se logro cuando se CD 80 ra 70 2 30 COO"& COO" Ôr' COO" i f COO" COO" 3MBz Bz 2- 4- / /y rjTj 3- 4- 2- 3- 4- 2- MBz FBz CIBz COO"&Il :i II :i ly 3HBz PP 3HPP AFA Figura 14. Actividad CoA ligasa de la enzima MbdA empleando como sustrato diferentes compuestos aromâticos. Valûtes de actividad CoA ligasa obtenidos utilizando el ensayo acoplado descrito en el apartado 6.2 de Materiales y Métodos. Los valûtes se teptesentan como un potcentaje de la actividad maxima obtenida en 3MBz, que se corresponde con 0.11 pmol min'^ mg'^ proteina. Los compuestos utilizados en el ensayo fueron: 3MBz; benzoato (Bz); 2 y 4 metilbenzoato (2-/4-MBz); 2, 3 y 4 fluorobenzoato (2-/3-Z4- FBz); 2, 3 y 4 clorobenzoato (2-/3-/4-CIBz); 3-hidroxibenzoato (3HBz); fenilpropionato (PP): 3- hidroxifenilpropionato (3HPP); fenilacetato (AFA). Los valûtes representados son la media de très experimentos independientes con una desviaciôn estândar inferior al 10%. 83 empleo com o sustrato 3MBz (100%). E l derivado no metilado, benzoato, genero también un elevado nivel de actividad (93%). P o r el contrario, el cambio en la posicion del sustituyente metilo redujo en un 50% (2-metilbenzoato) y en un 70% (4- m etübenzoato), la actividad maxima. Tam bién se obtuvieron actividades destacables con diferentes derivados fluorados y dorados del benzoato, especialmente cuando el grupo funcional se encuentra en posicion meta (40% para el 3-fluorobenzoato y 77% para el 3- clorobenzoato). E n cambio, no se detecto actividad catalitica con otros compuestos anâlogos del benzoato, como el 3-hidroxibenzoato o los âcidos fenilpropiônico, 3- hidroxiferdlpropionico y ferûlacético. Los resultados obtenidos m ostraron que la proteina M bdA era capaz de catalizar de forma optima la adiciôn de CoA tanto a una molécula de 3MBz com o a una de benzoato, por lo que se trata de la segunda benzoato-CoA ligasa que se describe en Af(oarcus sp. CIB. La proteina BzdA, codificante de la actividad benzoato-CoA Ligasa previamente descrita en A^oarcus sp. CLB, es incapaz de catalizar la reaccion CoA ligasa empleando 3MBz com o sustrato (Lopez-Barragan et al., 2004a). Por lo tanto, M bdA y BzdA son isoenzimas capaces de activar benzoato a benzoü-CoA pero M bdA es la ùnica de las dos proteinas que reconoce al 3MBz. 3.2. Anàlisis de la actividad 3-metiibenzoii-CoA reductasa codificada por los genes mbdONQP Com o se ha indicado en el apartado 1.2 de la Introducciôn, el paso clave en la degradaciôn anaerobica de los com puestos aromâticos activados con CoA es la pérdida de aromaticidad del anillo bencénico a través de un proceso de reduccion. La importancia que tiene esta actividad para la degradaciôn de los compuestos aromâticos en ausencia de oxigeno convirtiô en un objetivo prioritario la identificacion de una posible actividad 3-metilbenzoil-CoA reductasa codificada en el cluster mbd. La significativa similitud de secuencia de los producto s de los genes mbdQ, mbdO, mbdN y mbdP con las cuatro subunidades que conform an la benzoil-CoA reductasa de T. aromatica y K palustris sugeria que se trataba de las correspondientes subunidades de una posible 3-metilbenzoil-CoA reductasa. Ademâs, en el cluster mbd se han identificado los genes codificantes de una presunta ferredoxina {mbdM) y de un sistema a-cetoglutarato:ferredoxina ôxido- reductasa de dos com ponentes (korA2B2), que podrian ser los encargados de aportar el 84 poder reductor a la 3-metilbenzoil-CoA reductasa. La existencia de todos los genes necesarios para la actividad 3-metilbenzoil-CoA reductasa de la ruta m bd, m otivo el estudio de dicha actividad. 0 ^ 0.4(h E xtracto: | Azoarcus sp . CIB (3MBz) S u stra to : I 3-m etilbenzoil-CoA "'1 COSCoA B Extracto: | Azoarcus sp . CIB (3MBz) S u stra to : I Benzoil-CoA ( l^ COSCoA i CM, \ Tiempo (min) c\l 0,4(H ^ J (|& 10.00 1Z00 16.00 Tiempo (min) 0,2(H Extracto: | Azoarcus sp . CIB (Bz) S u stra to : I 3-m etilbenzoil-CoA 0 .20] 0,00- - - Extracto: | A zo a rcu s sp . CIB (Bz) S ustra to : I Benzoil-CoA COSCoA • COSCo* C08C 12.00 14.00 16.00 18.00 Tiempo (min) \ 00 8,00 10,00 IZOO Tiempo (min) 14,00 16.00 E xtrac to : \Azoarcus sp . CIBdmbofO (Bz)| S u stra to : I 3-m etilbenzoil-CoA I C»A , As, '■1 ■ 'C M , 0,804 Extracto: |A zo arcu s sp . CIBdm bafO(Bz)| S u stra to : I Benzoil-CoA I COSCoA [1^ S J 0.40- 10.00 1Z00 14,00 16.00 Tiempo (min) g o 0.4(H 10.00 12.00 Tiempo (min) 85 Extracto: \A zoarcus sp . C\B6bzdN (3MBz) S ustra to : I 3-m etilbenzoil-CoA Tiempo (min) 40- i 1 1 1' '1 0.80 0.20- 60; . COSCoA • ço#c^ œsco* ............... « A , i l ^ 040; E xtracto: | Azoarcus sp . CIBdbzcfA/ (3MBz) S u stra to : I Benzoïl-CoA ÇOSCoA COSCoA ÇOSCoA \ Tiempo (min) Figura 15 (comienza en la pagina anterior). Anàlisis mediante HPLC de la conversion de 3-metilbenzoil-CoA y benzoil-CoA en extractos celulares de distintas cepas de Azoarcus sp. CIB. Las cepas Azoarcus sp. CIB, Azoarcus sp. CIBdmtiafO y Azoarcus sp, C\BdbzdN se cultivaron en presencia de SMBz o benzoato (Bz). La obtenciôn de los extractos celulares y el ensayo de la actividad reductasa se realizaron como se detalla en el apartado 6.3 de Materiales y Métodos. Se monitorizo la actividad de los extractos tras cinco minutos de incubaciôn con los sustratos 3-metilbenzoil-CoA (paneles A, G, E y G) y benzoil- CoA (paneles B, D, F y H). Las gràficas representan el perfil de retenciôn en HPLC de los derivados CoA generados mediante el seguimiento de la absorbancia a 260 nm ( eo)- En cada uno de los paneles, la mitad superior (rojo) représenta el perfil de retenciôn de la molécula usada como sustrato en el ensayo, mientras que la mitad inferior (negro) représenta la desapariciôn de los sustratos y la generaciôn de los productos tras la adiciôn de los extractos. Los paneles A, B, G y D muestran los ensayos realizados con extractos de Azoarcus sp. CIB. Los paneles E y F muestran los ensayos realizados con Azoarcus sp. C\BàmbdO. Los paneles G y H se corresponden con los ensayos realizados con Azoarcus sp. ClBdbzdN. En el interior de las gràficas los picos del cromatograma correspondientes con los diferentes compuestos se indican con el siguiente côdigo: OA, 3-metilbenzoil-CoA; 1A, metil-ciclohexa-1,5-dieno-carbonil-CoA (metil-dienoil-CoA); 2A, metil-6-hidroxiciclohex-1-eno- 1-carbonil-CoA (metil-6-hidroxi-monoenoil-CoA); OB, benzoil-CoA; 1B, ciclohexa-1,5-dieno- carbonil-CoA (dienoil-CoA); 2B, 6-hidroxiciclohex-1 -eno-1 -carbonil-CoA (6-hidroxi-monoenoil- CoA). Las cepas Azoarcus sp. CIB y Azoarcus sp. ClBàmhdO, m utante en la subunidad p de la hipotética 3-metilbenzoil-CoA reductasa, se cultivaron anaerôbicamente en medio rninimo y condiciones de inducciôn del cluster mbd. Se empleo 3MBz como fuente exclusiva de carbono para A^^arcus sp. CIB y una mezcla de 3MBz y glutarato para A:^arcus sp. CIBdwWO (dada su imposibilidad para crecer em pleando 3MBz com o ùnica fuente de carbono, ver Fig. 12B). A partir de los cultivos se obtuvieron extractos celulares en condiciones anôxicas y se reaüzo un ensayo enzimâtico empleando 3- metilbenzoil-CoA com o sustrato (ver el apartado 6.3 de Materiales y Métodos). E n estos experimentos se observé que los extractos celulares procedentes de la cepa As^arcus sp. CIB cultivada en 3MBz poseian una actividad especifica de 16.5 nm ol min^ mg ’ para la conversién del 3-metübenzoil-CoA y de 7.5 nm ol min ’ mg^ para el benzoil-CoA (Figs. 86 15A y B), mientras que los extractos de Asparcus sp. CIBdwWO cultivados en presencia de 3MBz no m ostraron actividad 3-metilbenzoil-CoA reductasa detectable (< 0.1 nmol min^ mg^). Por otro lado, extractos de A:(oarcus sp. CIB culûvado en glutarato (condiciones de no inducciôn de la ruta m bd) presentaron tan solo un 10% de la actividad m ostrada en condiciones de inducciôn. Estos resultados confirman la existencia de una actividad 3-metilbenzoil-CoA reductasa inducible en Azoarcus sp. CIB y sugieren que los genes mbdONQP son los responsables de dicha actividad. Curiosamente, extractos de Azoarcus sp. CIB obtenidos de células cultivadas anaerôbicam ente en benzoato y que, po r lo tanto, expresaban la benzoil-CoA reductasa (BzdN O Q P) m ostraron una significativa actividad reductasa no sôlo cuando se utüizô benzoil-CoA com o sustrato sino tam bién en presencia de 3-metilbenzoil-CoA (Figs. 15C y D). Estos resultados sugerian que las benzoil-CoA y 3-metilbenzoil-CoA reductasas eran capaces de reducir eficazmente tanto el benzoil-CoA como el 3- metilbenzoil-CoA. Para confirmarlo, se procediô al estudio de la actividad reductasa en cepas de Asytarcus sp. CIB que presentaban una benzoil-CoA reductasa {A'sparcus sp. ClBdb^dN) (Lôpez-Barragân et ai, 2004) o una 3-metilbenzoil-CoA reductasa {Asparcus sp. CIBdwWO) inactivas. La cepa Azoarcus sp. CIBdwWO cultivada anaerôbicamente en benzoato, condiciôn en la que se expresa el complejo benzoil-CoA reductasa B zdN O PQ , era capaz de catalizar indistintam ente la reducciôn de 3-metilbenzoil-CoA (Fig. 15E) y de benzoil-CoA (Fig. 15F). A su vez, la cepa A la r m s sp. CIBd^y;^iN cultivada anaerôbicamente en 3MBz, condiciôn en la que sôlo se expresa la reductasa M bdO N Q P, también podia catalizar la reducciôn de ambos derivados CoA (Figs. 15G y H). Estos resultados sugieren que la benzoil-CoA reductasa (BzdNO PQ) y la 3- metilbenzoil-CoA reductasa (M bdO N Q P) de Ar^arcus sp. CIB son capaces de reducir indistintam ente benzoü-CoA y 3-metiIbenzoil-CoA. 3.3. Anàlisis de la actividad metil-ciciohexa-1,5-dieno- carbonii-CoA hidratasa El anâHsis del cluster mbd revelô la presencia de très genes adyacentes injbdXYW) que podrian codificar las actividades enzimâücas conducentes a la (3-oxidaciôn y apertura del anillo del 3-metiIdienoil-CoA form ado por la actividad 3-metilbenzoil-CoA reductasa (Tabla 6). E l producto del gen mbdW m uestra similitud con proteinas de tipo 87 ciclohexa-1,5-dieno-carbonil-CoA hidratasa, com o D ch de T. aromatica (Breese et a i, 1998; Laempe et al, 1998), BamR^;^,, de G. metallireducens (Peters et al, 2007) y BamRgy^ de S. aciditrophicus (Peters et a i, 2007). Este tipo de enzimas con actividad hidratasa actua sobre el producto de la reduccion del anillo aromâtico generado por la acti\idad benzoil- CoA reductasa, ehminando una de las dos insaturaciones e introduciendo un grupo hidroxilo; ademâs pueden catalizar también esta reaccion en el sentido reverso. M bdW podria realizar una funciôn similar sobre el derivado metilado del ciclohexa-1,5-dieno- carbonil-CoA que se generaria po r la acciôn del complejo M bdO N Q P sobre el 3- metilbenzoil-CoA. A continuaciôn actuaria el producto del gen mbdX, puesto que muestra similitud con la proteina Had de T. aromatica (Laempe et a i, 1999), la 6-hidroxiciclohex-l-eno-1- carbonil-CoA deshidrogenasa que transform a el grupo enol résultante en el paso anterior en un grupo ceto. Finahnente, se produciria la apertura del anillo ahciclico por parte de MbdY, una m etil-6-cetociclohex-l-eno-1-carbonil-CoA hidrolasa que jugaria un papel similar al desem penado por la proteina Oah de T. aromatica (Laempe et ai, 1999), hidrolasa con la que présenta similitud de secuencia (Tabla 6). D urante la realizaciôn de esta Tesis D octoral se iniciô la caracterizaciôn de la primera de estas très actividades, todas eUas clave para la [3-oxidaciôn del com puesto aHcicHco y la form aciôn de un âcido dicarboxûico ahfâtico (metil-hidroxipimelil-CoA). 3.3.1. Clonaciôn e hiperexpresiôn del gen mbdW y purificaciôn de la proteina MbdW El producto del gen mbdW présenta una elevada identidad de secuencia (60%) con ciclohexa-1,5-dieno-carboxil-CoA hidratasas (Tabla 6), lo que hacia sospechar que era responsable de la actividad hidratasa encargada de introducir un grupo hidroxilo en la molécula de metil-dienoil-CoA derivada de la reducciôn del 3-metilbenzoil-CoA. El gen mbdW se clonô en el vector de hiperexpresiôn pET-29a siguiendo la estrategia que aparece reflejada en la Figura 16A de tal forma que se generô una fusiôn que codifica seis histidinas en el extremo 3 ' del gen mbdW. El plâsmido résultante, pETm bdW , se introdujo en la cepa hospedadora E. coli BL21 (DE3), que fiie cultivada aerôbicamente en medio LB para favorecer la hiperproducciôn de la proteina recombinante MbdW - Hisg (29.0 kDa). E l proceso seguido para la purificaciôn de la proteina MbdW-Hisg (Fig. 16B) se detalla en el apartado 5.2.1 de Materiales y Métodos. 88 C on el objetivo de determ inar el estado de oligom erizacion de M bdW se reaüzo una crom atografia de filtraciôn en gel y se com paré el tiem po de elucion de la p ro teina M bdW -Hisg purificada con el de p ro teinas de m asa m olecular conocida (ver el apartado 5.3 de Materiales j Método^. La m asa m olecular aparente calculada fue de aprox im adam ente 86 kD a. D ad o que la m asa m olecular del m o n o m ero M bdW -Hisg es de (29.0 kD a), la confo rm acion nativa de la p ro te ina M bdW en soluciôn podria ser la de un trim ero , si b ien no se puede descartar la confo rm acion dimérica. IC rom osom a d e Azoarcus sp . CIB| MCS B mbdW m b d Y m bdX orf4m bdM ori f1 Amplificaciôn por PCR ori (C0IEI) -K.VVVV Nde\ Nofi p E T -2 9 a (5 .4 kb) NdeUNofi + Ligaciôn Vm b d W 779 pb I l - < KmR m b d W ori f1 O - v v v v v pE Tm bdW (6 .2 kb) kD a MW E 116 — — —__ 66 - 45 - 35 - 25 - MW -MbdW-His. Figura 16. Clonaciôn e hiperproducciôn de MbdW. A) Representaciôn esquemàtica de la clonaciôn del gen mbdW en el vector de expresiôn pET-29a. El gen mbdW se amplificô mediante PCR a partir de DNA genômico de Azoarcus sp. CIB, empleando la pareja de oligonucleotides: (1) mbdW Nde\ 5 ' y (2) mbdW Not\ 3 ' (Tabla 5). Las abreviaturas indicadas en el esquema son: PT7 (promoter del gen 10 del bacteriôfago 17), Km^ (gen que confiere resistencia a la kanamicina), ori f1 (origen de replicaciôn del bacteriôfago F1), ori (origen de replicaciôn C0 IEI), MCS {Multiple Cloning Site), lacP (gen que codifica el represor Lad del operôn lac). B) Purificaciôn de la proteina MbdW-HISe en extractos de E. coli BL21 (DES) (pETmbdW). Gel SDS-PAGE (12.5%) en el que se analizô la proteina purificada mediante el método descrito en la secciôn correspondiente de Materiales y métodos. Calle MW, marcadores de masa molecular (Fermentas). En el lado izquierdo de la imagen se detallan los tamanos de los marcadores (en kDa). Calle E, fracciôn soluble de un extracto de E. coli BL21 (DES) (pETmbdW) en el que la proteina MbdW-HiSe se ha hiperproducido. Calle F, proteina MbdW-HiSe parcialmente purificada (29.0 kDa), cuya posiciôn en el gel se sehala con una flécha. 89 3.3.2. MbdW p osee actividad metil-ciclohexa-1,5-dieno-carbonil- CoA hidratasa Com o se ha com entado anteriormente, las dienoil-CoA hidratasas caracterizadas poseen la capacidad de catalizar tanto la reaccion de hidratacion (reaccion directa) com o la de deshidratacion (reaccion reversa) de forma que se puede valorar su actividad en ambos sentidos de la reaccion. |Metil-Dienoil-GoA| B |Meti l-60H -m onoenoil-CoA| -6^ i S 1 j i i T ie m p o (m in ) |Dienoil-CÔÂl 0.50-: ^ 3 I ' ' ' I ' ' ' I ' ' ' I : : ! 1 ' ..................................... i r ' L T ie m p o (m in ) |6-OH-monoenoil-CoA| g 4 '1 1 020' 0 ,»; ' “ ' y ------- ' .............................. C 0 8 C * , : | 1 g - " COSCA T ie m p o (m in ) T ie m p o (m in ) Figura 17. Anàlisis mediante HPLC de la actividad enzlmatica de la proteina MbdW. Se monitorizo la actividad de la proteina MbdW-HiSe purificada (0.68 pM) tras un minute de incubaciôn con los siguientes sustratos: A) metil-ciclohexa-1,5-dieno-carbonil-CoA 0.2 mM (metil-dienoil-CoA); B) metil-6-hidroxiciclohex-1-eno-1-carbonil-CoA 0.2 mM (metil-60H- monoenoil-CoA); G) ciclohexa-1,5-dieno-carbonil-CoA 0.2 mM (dienoil-CoA); D) 6- hidroxiciclohex-1-eno-1-carbonil-CoA 0.2 mM (6OH-monoenoil-(0oA). Las gràficas representan el perfil de retenciôn de los compuestos CoA generados mediante la monitorizaciôn de la absorbancia a 260 nm ( go). En cada uno de los paneles, la mitad superior représenta el perfil de retenciôn de la molécula usada como sustrato en el ensayo (en rojo), mientras que la mitad inferior représenta la desapariciôn de los sustratos y la generaciôn de los productos tras la adiciôn de MbdW-Hisg (azul y verde). Los paneles A) y B) muestran la transformaciôn de los sustratos metilados de la enzima, en ambos sentidos de la reacciôn catalizada. Los paneles G) y D) muestran la acciôn de MbdW-Hisg sobre sus sustratos no metilados, es decir, los sustratos équivalentes en la ruta bzd de degradaciôn anaerôbica del benzoato. En el interior de las gràficas los picos del cromatograma correspondientes con los diferentes compuestos se indican manteniendo la clave empleada en la Figura 15: OA, 3-metilbenzoil-CoA; 1A, metil-ciclohexa-1,5-dieno-carbonil-CoA (metil- dienoil-CoA): 2A, metil-6-hidroxiciclohex-1-eno-1-carbonil-CoA (metil-60H-monoenoil-CoA); 08, benzoil-CoA; 1B, ciclohexa-1,5-dieno-carbonil-CoA (dienoil-CoA); 28, 6-hidroxiciclohex- 1-eno-1-carbonil-CoA (60H-monoenoil-CoA). El llamativo pico que se observa a los 16 min en el panel G) se corresponde con el compuesto ciclohex-1-eno-1-carbonil-GoA, un subproducto que se genera como resultado de una reducciôn adicional en la smtesis del dienoil-GoA. 90 En la Figura 17 se pueden obser\ ar los cromatogramas con los que se siguiô la hidratacion del (metil)-dienoil-CoA a (metil)-6-hidroxi-monoenoil-CoA y la reaccion reversa de deshidratacion del (metil)-6-hidroxi-monoenoil-CoA a (metil)-dienoil-CoA. En el ensayo se muestra que la proteina M bdW ejerce la actividad dienoil-CoA hidratasa y la reaccion reversa tanto con el sustrato metilado com o con el sustrato sin metüar. Dada la dificultad para purificar el metü-dienoü-CoA y los elevados niveles de 3- metilbenzoil-CoA que contam inaban el com puesto purificado (Fig. 17A), se reahzo un experimento control con m etü-60H -m onoenoil-C oA mas una cantidad de 3- metilbenzoil-CoA équivalente a la que contamina al metil-dienoil-CoA. E l objetivo del ensayo consistia en com probar mediante HPLC si la elevada concentracion de 3- m etilbenzoü-CoA podia afectar a los niveles de actividad hidratasa MbdW. Los resultados del ensayo (datos no m ostrados) dem ostraron que no existia un efecto inhibidor del 3-metübenzoil-CoA sobre la actividad de la proteina MbdW. El 6-hidroxi-monoenoil-CoA es el com puesto que se aislo con m ayor pureza y en mayor abundancia, por lo que se usb com o sustrato en ensayos de actividad hidratasa m onitorizados espectrofotom étricam ente (ver el apartado 6.4.2 de Materiales y Métodos) y en los que se com paré la actividad de las proteinas purificadas M bdW y la hidratasa équivalente BamR^^^ de S. aciditrophicus (Peters et ai, 2007). La actividad especifica calculada para la reaccién reversa 6-hidroxi-m onoenoü-CoA—»dienoil-CoA mediante este ensayo fue de 478.90 pmol mrn^ mg^ para M bdW y de 462.99 pm ol min ’ mg ' para BamRs^„. Los ensayos de actividad enzimâtica Uevados a cabo con la proteina MbdW purificada han confirmado su participacién en la etapa inicial de la P-oxidacién impHcada en la degradacién del producto de la reduccién del 3-metilbenzoil-CoA. Ademâs, se ha demostrado que tam bién puede ejercer su actividad catalitica sobre el derivado dienoü-CoA del benzoil-CoA. Al igual que hem os observado con la reductasa M bdO N Q P, la proteina M bdW podria Uevar a cabo su funcién tanto en la ruta bzd (degradacién de benzoato) com o en la ruta m bd (degradacién de 3MB z). Presum iblemente mecanismos de regulacién especifica determinarân la produccién de estas proteinas en condiciones en las que sea necesario degradar 3-metilbenzoil-CoA, mientras que las proteinas del cluster bï^d se producirân cuando se necesite degradar benzoil-CoA. Por eUo, y com o continuacién del trabajo de Tesis, se procedié a estudiar la regulacién de la expresién de los genes mbd. 91 4. Anàlisis transcripcional del duster mbd El anàlisis de la organizaciôn genética del cluster mbd révéla que los genes catabolicos, de transporte y reguladores se disponen en al menos très operones controlados por los prom otores P^, P̂ j; y P^^ (Fig. 18A) y estân separados po r distancias que oscilan entre los 636 y los 0 nucleotidos. Las mayores regiones intergémcas son mbdW-mbdM (636 pb), mbdP-ojfl (621 pb), orf5-orf6 (481 pb), mbdB5-mbdA (231 pb), mbdM-korA2 (202 pb) y korB2-orf5 (158 pb). Con el objetivo de com probar la existencia de las unidades transcripcionales propuestas controladas po r los prom otores P̂ ̂ y P^/ y si su expresiôn era indudble po r 3MBz, se procediô a cultivar Azoarcus sp. CIB en condiciones desnitrificantes en medio rninimo MC, empleando com o ùnica fuente de carbono y energia 3MBz, succinato (condiciôn control de crecimiento en una fuente de carbono no aromatica) o benzoato (condiciôn control de crecimiento en una fuente de carbono aromatica). Se extrajo RNA total de los cultivos y se analizô la expresiôn de diferentes regiones intergéricas del mediante RT-PCR. (Fig. 18B) El anâHsis de los productos de las reacciones de RT-PCR relacionadas con los genes mbd catabôHcos y de transporte sôlo revelô unos niveles de expresiôn significativos cuando la bacteria Acparcus sp. CIB era cultivada en 3MBz, pero no cuando la misma cepa era cultivada en succinato o benzoato (Fig. 18B). Estos resultados confirman que la expresiôn de los genes mbd catabôHcos y de transporte es inducible y dependiente del metaboHsmo de 3MBz en Af^oarcus sp. CIB. El benzoato, sustrato de la ruta central bzd y cuyas actividades enzimâticas son équivalentes a las de la ruta mbd, no es capaz, sin embargo, de inducir la expresiôn de los genes mbd catabôHcos. Por o tro lado, el anâHsis del gen mbdK revelô su expresiôn constitutiva en las condiciones anaHzadas, ya que m antenia un nivel constante de expresiôn independientem erte de la fuente de carbono en la que se hubieran reaHzado los cultivos. El estudio de la cotranscripciôn de diferentes parejas de genes que flanqrean las mayores regiones intergénicas del cluster mbd a través del anâHsis de los productos de las reacciones de RT-PCR, sugiere la existencia de los dos operones divergentes proiuestos: un operôn controlado por el p rom otor Pq y que se extenderia desde el gen mbcD hasta, al menos, oîf6, y un operôn controlado por el prom otor que se extenderia desde el 92 gen mbdB1 hasta m bdA (Fig. 18A). A dem âs de estos dos opero n es divergentes, el p resun to gen regulador mbdK constituye un operôn m on o cis trô n ico con tro lado p o r el p ro m o to r # # # # # # # # # # # ^ _b1 b2 d1 d2 a1 a2 c1c2 e1e2 f1 12 gi g2 B1 h1h2 i1 Î2 B a , b c d I e f g h M 3M S I M 3M S 3M S 3M S I M 3M S 3M S 3M S 3M S 3M S a I b I C l d e f g h | i M B 3M I M B 3M I M B 3M I M B 3M B 3M B 3M B 3M B 3M I M B 3M Figura 18. Organizaciôn transcripcional del d u s te r mbd. A) Esquema de la organizaciôn transcripcional del cluster mbd que muestra los dos posibles operones divergentes que contienen a los genes catabôHcos (fléchas azules) y de transporte (fléchas amarillas) y el operôn regulador mbdR (flécha negra). Los promotores Pq, Pbi y Psr se indican con fléchas curvadas. Las regiones intergénicas cuya expresiôn ha sido analizada se representan con una letra y la secuencia de los oligonucleôtidos empleados para su amplificaciôn se incluye en la Tabla 5: a l, orf6 R1 ; a2, orfS F1 ; b1, orf5 R1 ; b2, korB2 F1 ; c l, korA2 R1 ; c2, SMBzFed F1 ; d1, SMBzFed R1 ; d2, mbdW F1 ; e l , mbdX RI ; e2, orf4 F1 ; f1 , orf1 R1 ; f2, mbdN F1 ; g1, bcrB R2; g2, mbdB1 R1; h1, mbdB5 F1; h2, mbdA R2; il, mbdR-AS; \2, mbdR-A5. B) Electroforesis en geles de agarosa de los productos de RT-PCR obtenidos con los oligonucleôtidos reflejados en el panel A. Las células de Azoarcus sp. CIB utilizadas para la extracciôn del RNA total se cultivaron en condiciones desnitrificantes en medio minimo MC hasta alcanzar la mitad de la fase exponencial de crecimiento empleando SMBz S mM, (calles 3M), succinato 0.2% (calles S) o benzoato S mM (calles B). La extracciôn de RNA y las reacciones de RT-PCR fueron realizadas tal y como se indica en el apartado S de Materiales y Métodos. Las calles M contienen DNA del fago OX-174, digerido con la enzima de restricciôn Haelll, como indicador de masa molecular. En el margen izquierdo de las imagenes de los geles se indican los tamanos de los marcadores (en pb). 93 5. Caracterizaciôn de los promotores divergentes dei cluster mbd: Po y Pbi El anàlisis transcripcional revelô la presencia de, al menos, dos unidades transcripcionales en las que se incluyen los genes responsables de las enzimas implicadas en la ruta central mbd. Para caracterizar los prom otores Pq y P^, se procediô a determinar el sitio de inicio de la transcripciôn de los correspondientes operones asi com o a la clonaciôn de los prom otores en un vector apropiado para el estudio de su actividad. 5.1. Identificacion de! punto de inicio de la transcripciôn de los genes mbdO y mbdB1 Para determ inar el punto de inicio de la transcripciôn (+1) de los genes mbdO (prom otor P^^ y mbdB1 (prom otor se extrajo RNA total a partir de células de Acparcus sp. CIB cultivadas en 3MBz y en benzoato (condiciôn control). E n el apartado 3.5 de Materiales y Métodos se indica el protocolo de extensiôn por cebador {primer extension) empleado. En la Figura 19A se m uestra el punto de inicio de la transcripciôn de los genes mbdO y mbdB1. E n ambos casos, la posiciôn +1 de los prom otores se ubica en una G, locaHzada a 137 pb del codôn de inicio del gen mbdO (prom otor P^) y a 138 pb del codôn de inicio del gen mbdB1 (prom otor P^y). E n el caso del prom otor Pq, la existencia de productos de extensiôn mas pequenos podria ser la evidencia de reacciones parciales de extensiôn po r parte de la retrotranscriptasa. La identificaciôn del sitio de inicio de la transcripciôn permitiô proponer las cajas -10 y -35 de interacciôn con la subunidad o^" de la RNA polimerasa (Fig. 19B). Mientras que las cajas -35 m antienen la secuencia consenso (TTGACA), las cajas -10 se diferencian en dos (Pgy) y très (Pq) bases respecto al consenso TATAAT (Dom broski, 1997). E n el caso del prom otor Pq la distancia que sépara las cajas -10 y -35 es de 17 pb, mientras que en el prom otor Pgy es de 16 pb. La distancia (268 pb) que sépara las posiciones +1 de los genes mbdO y mbdBI sugiere que Pq y P̂ y son dos prom otores divergentes pero no solapantes (Fig. 19C). 94 3M B -35 -10 Po +1 3M B -35 -10 Pbi +1 B ATGCGG TTGACyjoCAACAAGATTTTGCTC TTAGAl ACTGGGCAGC AGTCG FTGACA CATACCAGCCAGCCGG TATATG GTAGCCGCATG Pdiv>0 EcoRI 3'.2 1 C A T T T G A C G T T C T C C T C C T C A C T T G l IC œ C T T T C C G C G T T 6 0 1 ^^A A C T G (tA ^A G G A G G A (^G A A C A A A T T A C C T T T G C G C G A A G C G G G C G A A A G G C G C A A 6 0 mbdO 6 1 CA CTTCCG CTTTG A TA CCG TCA G A G CA TCG A G A G G CG CA G G CTCCCG CX 5G CTCTTCCA CT 1 2 0 . I ; I : I - I - I - I 6 1 G TG AA G GCG A AA CTA TG G CAG TCTCGTAG CTCTCCGCG TCCG A GG G CGCCG A GA A GG TG A 1 2 0 1 2 1 CCG CA CA A C A TA C C A G C TG C C C A G TA TC TA A C A G C A A A A TC TTG TTG C TG TC A A C C G C A T 1 8 0 121 j4i "r----- 1—1 - I • I—I----- 1 - I ■ d œ G T C A Œ A G A n GTCGTTTTA GA A CAA CC ACAGT* PGGCGTA 1 8 0 1 8 1 1 8 1 2 4 1 2 4 1 3 0 1 3 0 1 GGCGTG TTGTATGG TCG AC + 1 P q TTA G TG CG CCTG TA G G G A G C A C A TA A A C TG TC C G A A C TTG TA G C A C G TG TC TG A TC A C A A 2 4 0 -10 -35 A A TC A C G C G G A C A TC C C TC G TG TA TT TG A C A G G C T TG A A C A TC G TG C A C A G A C ÏA G TG TT 2 4 0 Intprno PH iv> B1 BntA R ' 9 CGTAGAGAGTCACGGAAGGATGAGG ZT CCTCG CC 3 0 0 G C A T C T C T C A G T G C C T T C C T A C T C Q Z S B ^ ^ I ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ T A G A G G A G C G G 3 0 0 Interne Pdiv>0 Seal 5'.2 A T G C G C C G T C C A T G C T C T C A A A G G T C C T T T T C C C A T T T T C C T C C C T C C G A T T T C G A G G T C 3 6 0 - - - - - - - - - ; - - - - - - - - - - I - - - - - - - - - - : - - - - - - - - - - I - - - - - - - - - - ; - - - - - - - - - - 1 - - - - - - - - - - : - - - - - - - - - - I - - - - - - - - - - - : - - - - - - - - - | - - - - - - - - - - : - - - - - - - - - - - - | TA CG CGG CA GG TACGAGAGTTTCCAGGAAAAGGGTAAAAGGAGGGAGGCTAAAGCTCCAG 3 6 0 -35 ■10 +1 P 3 6 1 T T C C C T A T C A G T C G {rrG A C 4C A T A C C A G C C A G C C G C }rA T A T ^T A G C : - - - - - - - - - - I — 3 6 1 A AG G CA TA G TCA G CA A CTG TG TA TG G TCG G TC G G CCA .TA TA CCA TCG G CG TA CA CCCCTG 4 2 0 B1 .TGTGGGGAC 4 2 0 : -----------I 4 2 1 CG G G G CTG TCA G A CCTTTTG TTG G CG A G CTCG CG G A A A CG CCG TTTTCCG CA A O ?G A CTG A 4 8 0 : - - - - - - - - - - I - - - - - - - - - - : - - - - - - - - - I : - - - - - - - - - - - - 1 - - - - - - - - - - : - - - - - - - - - j - - - - - - - - - - - : - - - - - - - - - - | - - - - - - - - - - : - - - - - - - - - - - j 4 2 1 GCCCCGA CA G TCTG G A A A A CA A CC G CTCG A G CG CCTTTG CG G CA A A A G G CG TTA CTG A CT 4 8 0 4 8 1 A T T T C C C C C G A C A T A G T G C C G C G C G C A G G G G C G C C G G T G C C C G T C T T G A T C G T ol^G A G _ 5 4 0 * ̂ I ' I • I • I B ^ ^ j i m ^ ^ ^ ^^ C C G C G G C C A C G G G C A G A A G T A G C A G G T C C T C 5 4 0 Pdiv>B1 EcoR\ 3 4 8 1 TAAAGGGGGC m bdB I ^ 5 4 1 _ G G f^ G A G ^ | 5 4 9 5 4 1 C C T C T C T A C 5 4 9 Figura 19. A) Determlnacion del punto de inicio de la transcripciôn de los promotores Po y Pb i’ El RNA total se extrajo a partir de células de Azoarcus sp. CIB cultivadas anaerôbicamente en medio MC con 3MBz (3 mM) o benzoato (3 mM) como ünicas fuentes de carbono. El tamano de los productos de la extensiôn se determinô por comparaciôn con el patrôn de secuenciaciôn de los promotores Pq y Pbi (calles A, T, C, G). Las calles marcadas como 3M y B muestran los productos de extensiôn bajo condiciones de inducciôn (cultive en 3MBz) y de no inducciôn (cultive en benzoato), respectivamente. La banda correspondiente al producto de extensiôn mas largo aparece senalada con una flécha naranja. Tanto para realizar la reacciôn de extensiôn como para la reacciôn de secuenciaciôn de los promotores Po y Pbi se emplearon los oligonucleôtidos CIB4-I PmbdoS' y CIBPmbdBi3', respectivamente, cuya secuencia se detalla en la Tabla 5. A la izquierda de cada imagen se muestra la secuencia de la regiôn en la que se encuentran los nucleôtidos de inicio de la transcripciôn (sehalados con un circulo naranja). La secuencia mostrada se corresponde con la hebra no codificante. 95 Figura 19 (Continuaciôn). B) Secuencia de la region -10/-35 y del inicio de la transcripciôn en los promotores Po y Pbi- Las cajas -10 y -35 de los promotores Pq y Pbi aparecen recuadradas en verde. Los sitios de inicio de la transcripciôn (4-I) se detallan subrayados en verde en la hebra codificante. C) Secuencia de la regiôn intergénica mbdO-mbdB1. Se mantiene el côdigo de colores del panel B) para las cajas -10/-35 y el punto de inicio de la transcripciôn. El codôn de inicio de los genes mbdO y mbdBI aparece sehalado en azul, y la secuencia de uniôn al ribosoma (RBS) se ha recuadrado con una linea negra discontinua. Los oligonucleôtidos utilizados para la amplificaciôn mediante PCR de las sondas empleadas para los experimentos de interacciôn in vitro protema-DNA aparecen sombreados en naranja, y su secuencia detallada en la Tabla 5. La secuencia que se extiende desde las cajas -35 de cada promotor hacia cada codôn de inicio aparece sombreada en amarillo. 5.2. Clonaciôn y actividad de los promotores Po y Pbi en E. coli y Azoarcus sp. CIB C on el objetivo de con tinuâ t con el estudio de los p rom oto res divergentes del cluster mbd se p roced iô a clonar la regiôn intergénica situada en tre los genes mbdO y mbdBI en el p lasm ido de bùsqueda de p rom oto res pSJ3 (Tabla 4). D e esta form a se construyeron los vectores pSJSPy y pSJSP^^, en los que la regiôn que contiene los p rom oto res ob jeto de estudio, Pq y Pj ĵ, queda fusionada traduccionalm ente con el gen testigo lacZ (Fig. 20). I C rom osom a d e A zo a rc u s sp . CIB ^ m bdO 3 . . m bdB I ----------------- Amplificaciôn por PCR (0.6 kb)...- ( 2 , 4 ) rpnl Kpnl (KpnI/Xbal) |pSJ3 (6 .2 kb)| Kpn\/Xba\ + Ligacion kpnl ( H /n d i i i ) PIZ 1016 (6 .0 kb) kpnl . JCPfll lacP (pBBRf) p S J3P o (6.8 kb) K p n i /H /n d i i l + L ig a c io n Kpnl Xbal pSJ3P g.j (6 .8 kb) Kpnl Xbal pIZP (9.2 kb)(pBBRf) Kpnl Xbal pIZP (9.2 kb)(pBBR1 96 Figura 20 (pagina anterior). Esquema de la estrategia empleada para la construcciôn de las fusiones traduccionales Po::lacZ y PsiidacZ. La region intergénica localizada entre los genes mbdO y mbdBI se amplificô mediante PCR a partir de DNA genômico. Los oligonucleôtidos empleados fueron (1) PmbdO Kpn\ 5', (2) PmbdO Xba\ 3', (3) PmbdBI Kpn\ 5' y (4) PmbdBI Xba\ 3 ' (secuencia detallada en la Tabla 5). Estos cebadores introducen dianas de restricciôn Kpn\ y Xba\ en los extremos 5' y 3' del fragmente amplificado, de tal forma que la diana Xba\ de ambos fragmentes permite generar una fusiôn traduccional de los primeros 3 nt del gen estructural mbdO y mbdBI con el gen testigo lacZ en el vector de bùsqueda de promotores pSJ3. Dado que el vector pSJ3 no es capaz de replicar en Azoarcus sp. CIB, se procediô a subclonar las fusiones traduccionales como un fragmente Kpnl-H/ndlII de aproximadamente 3.7 kb en el vector de amplio range de hospedador plZ1016 y de forma que el promotor Ptac del plasmido plZ1016 es eliminado, evitando asi cualquier interferencia en el estudio del promotor clonado. La regiôn intergénica clonada se représenta en color gris, los promotores Pq (naranja ) y Pm (verde) con fléchas curvadas, los genes responsables de las resistencias a antibiôticos (Ap , Gm^) y del represor del promotor lac (iacF) con fléchas blancas. El gen lacZ se représenta con un flécha azul, los origenes de replicaciôn or/(pL)C) y or/(pBBR1) con rectângulos ray ad os y el de movilizaciôn de los plàsmidos {mob) con fléchas rayadas. D ado que el plâsmido pSJ3 no es capaz de replicar en A.r^arcus sp. CIB, se procediô a subclonar las fusiones traduccionales P^idacZ y P^^::lacZ en el plasmido de amplio rango de hospedador p IZ lO lô (Tabla 4), lo que dio lugar a los plàsmidos p IZ P ^ {J^QidacZ) y pIZP,^] ÇP, ,̂:dacZ) (Fig. 20). La actividad de los prom otores Pq y se determ inô iniciahnente en la cepa E. coli DHIOB, portadora de los plàsmidos p IZ P ^ o pIZP^,. Para ello se analizô la actividad (3-galactosidasa de ambas cepas y se com probô que los prom otores Pq y P^, eran activos en este sistema heterôlogo, de tal forma que Pq es significativamente mas activo que P̂ ;̂ (Fig. 21 A). Estos resultados ademâs sugerian que am bos prom otores no estaban sometidos a un control dependiente de un activador especifïco de A.^arcus sp. CIB. Cabe destacar que la actividad del p rom otor Pq estaba sujeta a signifïcativas variaciones en diferentes experimentos, y que el crecimiento de la cepa portadora del plâsm ido pIZ Po se veia claramente afectado (datos no m ostrados). Este fenotipo se observô en diferentes cepas de E. coli (por ejemplo DHIOB y MC4100) y en diferentes condiciones de cultivo (por ejemplo m edio rico, m edio rninimo, presencia de oxigeno y anoxia). Ademâs, no se consiguiô m antener con éxito la construcciôn p IZ Po cuando se transfiriô a A.i^arcus sp. CIB. Com o hem os visto en el apartado 4 de Kesultados, el p rom otor Pq es responsable de la transcripciôn de una serie de genes que se extiende a lo largo de, al menos, 21.7 kb. La actividad prom otora necesaria para formar un transcrito de tal envergadura podria generar inestabihdad genética cuando dicho prom otor se encuentre en multicopia en la cepa hospedadora. A causa de esta inestabihdad, los estudios in vivo reahzados en esta Tesis D octoral se han centrado en la caracterizaciôn del prom otor P̂ y. 97 El plâsm ido pIZPj^, se introdujo en A la r m s sp. CIB mediante conjugacion biparental. La realizacion de ensayos ^-galactosidasa en la cepa A la r m s sp. CIB (pIZPgJ m ostro que el p rom otor es mâs activo en el sistema hom ôlogo que en un sistema heterôlogo, y que su actividad se ve significativamente incrementada en células que han sido cultivadas en presencia de 3MBz (Fig. 21 B), lo que estâ de acuerdo con la inducciôn observada mediante ensayos de RT-PCR (Fig. 18B). E. coli B Azoarcus sp. CIB 8 0 0 0 Pa-,::lacZPr^y.lacZ 7 0 0 0 (0 W 6 0 0 0 5 0 0 0 ïô 4 0 0 0 2000 8000 PsiiuacZ 7000 - W 6 0 0 0 - B 5000 - g j 4000 - en. "O 3000 - (0 p > 2000 - I 1000 1 3MBz Figura 21. Expresiôn de las fusiones traduccionales PoiilacZ^ Peir-lacZ. A) Medida de la actividad p-galactosidasa (Unidades Miller, U.M.) en células de E. coli DHIOB que contienen las fusiones traduccionales Po::lacZ (plâsmido pIZPo) y Pep-'IacZ (plasmido PIZPbi). Las células fueron cultivadas en medio LB. B) Medida de la actividad P- galactosidasa (Unidades Miller, U.M.) en células de Azoarcus sp. CIB portadoras del plâsmido plZPei- Las células han sido cultivadas anaerôbicamente en medio minimo MC suplementado con benzoato 3 mM (Bz) o 3MBz 3 mM (3MBz) como ünicas fuentes de carbono. Los ensayos de actividad p-galactosidasa se realizaron tal y como se indica en el apartado 6.1 de Materiales y Métodos. Los datos mostrados son el resultado de un solo experimento, pero los valores fueron reproducidos en très experimentos independientes y presentaron una desviaciôn estândar inferior al 10% (salvo en el caso de la cepa de E. coli portadora del plâsmido pIZPo, en la que la desviaciôn estândar fue del 20%). 6. Caracterizaciôn de ia reguiaciôn transcripcional especifica de ios promotores divergentes dei cluster mbd El extrem o 3 ' del cluster mbd contiene el gen mbdK que codifica un presunto regulador transcripcional de la famiha TetR (Tabla 6). Con el objetivo de profundizar en la reguiaciôn transcripcional especifica del cluster mbd se procediô a estudiar el gen mbdK y su producto proteico. 98 6.1. MbdR es un regulador transcripcional de los promotores Po y Pbi Com o primera aproximacion para evaluar la fiincion del gen mbdK se procediô a generar un m utante en dicho gen siguiendo el esquema descrito en la Figura 12. Para ello se amplificô un fragmento in tem o (524 pb) del gen mbdK con los oligonucleôtidos y mbdK m ut2 y y mbdK m ut2 (Tabla 5) que fue clonado en el vector suicida ipK.\3mob, dando lugar al plâsmido pK 18m bdRnew (Tabla 4). D icho plâsmido se transfiriô por conjugaciôn a A la r m s sp. CIB y, mediante recombinaciôn homôloga, se generô una inserciôn en la copia cromosômica del gen mbdK que dio lugar a la cepa m utante As^arcus sp. ClBàmbdK. La cepa mutante Azoarcus sp. QIKàmbdK se cultivô anaerôbicamente en medio m inimo MC complementado con 3MBz com o ùnica fuente de carbono y su crecimiento fue similar al observado con la estirpe silvestre Aî:ioarcus sp CIB. Este resultado sugeria que el gen mbdK no codificaba un activador transcripcional necesario para la expresiôn de los genes mbd. Para confirmar que el producto del gen mbdK contrôla la actividad de los prom otores Pq y se procediô a cultivar anaerôbicamente las cepas Ac^arcus sp. CIB y As^arcus sp. ŒBdmbdK en benzoato (condiciôn de no inducciôn) o 3MBz (condiciôn de inducciôn del cluster mbd). A partir de estos cultivos se extrajo RNA total y, siguiendo el protocolo indicado en la secciôn 3 de Materiales y Métodos, se analizô la actividad de los prom otores mediante RT-PCR (Fig. 22). Mientras que la actividad de los prom otores Pq y Pg; es inducible en la cepa A ^arcus sp. CIB cultivada en 3MBz, en A ^arcus sp. ÇyK>dmbdK la actividad se vuelve constitutiva, observândose niveles similares de transcrito tanto en condiciones de inducciôn (crecimiento en 3MBz) com o de no inducciôn (crecimiento en benzoato). Ademâs, mediante ensayos de actividad ^-galactosidasa se observô que la actividad de la fusiôn Pg,::lacZ en la cepa m utante A ^arcus sp. (MKdmbdK era similar en células cultivadas en benzoato o en 3MBz (datos no mostrados). Com o conclusiôn, estos resultados estân de acuerdo con la hipôtesis de que el producto del gen mbdK es un represor transcripcional de los prom otores Pq j Pqj. 99 B1 dmbdR B 3M B 3M dmbdR B 3M B 3M 310 281 234 Figura 22. Electroforesis en geles de agarosa de los productos de RT-PCR obtenidos a partir de los promotores divergentes del cluster mbd de Azoarcus sp. CIB. Las células de Azoarcus sp. CIB (ivf) y de Azoarcus sp. ClBdmbdR (dmbdR) utilizadas para la extracciôn del RNA total se cultivaron en condiciones desnitrificantes hasta alcanzar la mitad de la fase exponencial de crecimiento empleando benzoato 3 mM (calles B) o 3MBz 3 mM (calles 3M) como fuentes de carbono. La extracciôn de RNA y las reacciones de RT-PCR fueron realizadas tal y como se indica en el apartado 3 de Materiales y Métodos. Los oligonucleôtidos empleados para amplificar los productos de PCR fueron las parejas PmbdO F1 / bcrB R2 (Po) y Pm bdBI F1 / m bdBI R1 (Pbi), cuya secuencia se detalla en la Tabla 5. Las calles M contienen DNA del fago 0X-174, digerido con la enzima de restricciôn Haelll, como indicador de masa molecular. En el margen izquierdo de las imagenes de los geles se indican los tamanos de los marcadores (en pb). 6.2. Caracterizaciôn del regulador MbdR 6.2.1. A nàlisis in silico de ia estructura de la protema MbdR La com parac ion de la secuencia de am inoâcidos del regu lado r M bdR (214 aa, 23.8 kD a) con las bases de datos de p ro te inas revelô su p ertenenc ia a la familia de reguladores transcripcionales T e tR (para revisiôn sobre esta familia ver R am os et al., 2005 y Y u et al., 2010). La p ro te ina M bdR posee en su ex trem o aniino-terrn inal (residuos 1 al 64) una secuencia de reconocim ien to de D N A p rop ia de esta fam üia de reguladores (H inrichs et al., 1994). Sin em bargo , el ex trem o carboxilo-term inal de la p ro te ina M bdR n o p résen ta una iden tidad de secuencia significativa con p ro te inas reguladoras caracterizadas, lo que perm ite h ipo te tizar que este es u n dorn im o de reconocim ien to para u n in d u c to r especifico. La p ro te in a caracterizada que posee una m ayor iden tidad de secuencia de am inoacidos (23%) co n M bdR es el regu lador transcripcional A crR de E . coli (Fig. 23A), que con trô la la expresiôn del tran sp o rtad o r A crA B im plicado en la resistencia fren te a d iferen tes com puesto s tôxicos para la bacteria (Li et a l, 2006). U tü izando la estructu ra trid im ensional (3D) del regu lador A crR , se p roced iô a realizar un m o delado de la estructu ra de la p ro te ina M bdR (Fig. 23B). Sôlo fo rm an parte del m odelo los am inoâcidos que se ex tienden desde la posic iôn 18 a la 158 deb ido a la escasa sim ilitud de secuencia del ex trem o carboxilo-term inal de la p ro te ina M bdR con el co rrespond ien te de la p ro te ina A crR . Segùn el m odelo , la p ro te in a p résen ta très hélices 100 alfa localizadas en el ex trem o anaino-term inal que con fo rm an el dom in io de in teracciôn con D N A , en el cual se localiza la region H T H que contiene las hélices a2 y a3 que in terac tuan directam ente con el D N A (Yu et al., 2010). E l resto de la p ro te ina que se incluye en el m odelo se organiza en très hélices a (a4-a6) d ispuestas de form a antiparalela. q2 a3 AcrR - - M&RKTKQEAQETRQEILDVALRlFSQQGVSST^LGEIMa;iGVh:RGAIYWiiFKDKSDl 58 MbdR >îPJaNKKEEQRE p E T m b d R (6 .1 k b) Figura 24. Representaciôn esquemàtica de la clonaciôn del gen mbdR en los vectores de expresiôn pCKOI y pET-29a. El gen mbdR fue amplificado mediante PCR a partir de DNA genômico de Azoarcus sp. CIB, empleando los oligonucleôtidos: (1) mbdR Sa/l 5', (2) mbdR PsÜ 3', (3) mbdR Nde\ 5' y (4) mbdR Xho\ 3'. Las secuencias de los oligonucleôtidos se muestran en la Tabla 5. Las abreviaturas indicadas en el esquema son : Plac (promotor lac), PT7 (promotor del gen 10 del bacteriôfago 17), lacZa (fragmento que codifica la subunidad a de la p-galactosidasa), Km^ (gen que confiere resitencia a la kanamicina), Cm^ (gen que confiere resistencia al cloranfenicol), /ac/° (gen que codifica el represor Lad del operôn lac), ori f 1 (origen de replicaciôn del bacteriôfago F1), or/(pSC101) (origen de replicaciôn del plasmido pSCIOI), or/(pBR322) (origen de replicaciôn de la familia de plàsmidos derivados de pBR322), MCS {Multiple Cloning Site de los diferentes plàsmidos). 102 La pro tem a MbdR-His^^ (223 aa) tiene una m asa m olecular de 24.9 kD a y su purificaciôn se realizô a partir de cultivos de la cepa E . coli BL21 (D E3) (pE T m bdR ) (Fig. 25), tal y com o se detalla en el apartado 5.2.2 de Materiales y Métodos. Ea p ro teina M bdR purificada (5 m g /m l) p resen tô una vida superio r a los seis m eses alm acenada a 4^'C. kDa ■MbdR-HiSf Figura 25. Purificaciôn de la protema MbdR-Hise a partir de extractos de E. coli BL21 (DE3) (pETmbdR). Gel SDS-PAGE (12.5%) en el que se analizô la proteina purificada mediante el método descrito en la secciôn correspondiente de Materiales y métodos. Las calles M se corresponden con los marcadores de masa molecular Broad Range de BioRad. En el lado izquierdo de la imagen se detallan los tamanos de los marcadores (en kDa). En la calle 1 se muestra un extracto control (12 pg protema total) de la cepa E. coli BL21 (DE3) pET-29a. En la calle 2 se muestra un extracto (8 pg proteina total) de la cepa E. coli BL21 (DES) (pETmbdR) en condiciones de hiperproducciôn de la protema MbdR-HiSe. La calle 3 muestra la proteina MbdR-HiSe purificada (3.3 pg), cuya posiciôn en el gel se sehala con una flécha. 6.2.3. Determinaciôn de la estructura nativa del regulador MbdR Ea técnica seleccionada para el esm dio del estado oligom érico de la p ro tem a M bdR fue la u ltracentrifugacion analitica. Para ello se realizaron experim entos de velocidad de sedim entaciôn y de equilibrio de sed im en taciôn con la p ro tem a M bdR - Hisg, tal y com o se detalla en el apartado 8 de Materiales y Métodos. E l coeficiente de sedim entaciôn calculado es de 2.9 S. E l indice de fricciôn / / ^ posee un valor de 1.46, lo que indica que se trata de u n a p ro tem a ligeram ente elongada. L os resultados ob ten idos en equilibrio de sed im en taciôn m o stra ro n especies com patib les con un estado de asociaciôn dim érico en so luciôn para la p ro tem a M bdR - H is, (Fig. 26). 103 0,280.10A 0,26 0,24 1 0-22 0 ,08 - ' Dimero 0,20 Monomero0,18 0.18 0,14 0,12 0,10 0,080,00 6,96 6,98 7,00 7,02 7,04 7,06 7,08 7,10 7.12 7.1453 Coeficiente d e sed im en taciôn (S) Radio (cm) Figura 26. Estudio del estado oligomérico del regulador MbdR. A) Anàlisis mediante velocidad de sedimentaciôn de la protema purificada MbdR-Hise. Se représenta el perfil de distribuclôn de concentraciones (eje de ordenadas) frente al coeficiente de sedimentaciôn (eje de abscisas). No se observaron variaciones en el coeficiente de sedimentaciôn (2.9 S) con la concentraciôn de proteina en los rangos de concentraciones analizados (de 11 a 46 pM). También aparece indicado el indice de fricciôn determinado. B) Anàlisis mediante equilibrio de sedimentaciôn de la proteina purificada MbdR-Hise. G radiante en equilibrio de sedimentaciôn de la protema MbdR-HiSe- Se représenta la A280 frente al radio (cm). Los circulos rellenos en gris representan las medidas realizadas, la linea continua représenta el gradiente teôrico correspondiente con un dimero de la proteina y la linea discontinua représenta el gradiente teôrico para un monômero. Los detalles expérimentales de los estudios de velocidad y equilibrio de sedimentaciôn se indican en el apartado 8 de Materiales y Métodos. 6.3. Estudios sobre la interacciôn de! regulador MbdR con los promotores Po y Pbi 6.3.1. Anàlisis in sliico de los promotores PoV Pbi El estudio detallado de la secuencia de los prom otores divergentes y P,̂ , del cluster mbd revelô la presencia de una secuencia paündrômica, ATAC-10 pb-G TA T, conservada en ambos. Entre las cajas palindrômicas conservadas, ATAC y OTAT, se localizan otros nucleôtidos que extienden el palindromo pero algunos de ellos no estân conservados en los dos prom otores (Fig. 27). Cabe destacar que las cajas palindrômicas detectadas solapan con regiones imprescindibles para el inicio de la transcripciôn dependiente de la subunidad de la RNA polimerasa. E n el caso del prom otor P(̂ , la regiôn palindrômica ocupa la regiôn -10 y el punto de inicio de la transcripciôn, mientras que en el caso del prom otor Pg ̂ solapa con la caja -10 y se extiende hacia la caja -35. D ado que la posiciôn de estas secuencias es compatible con la zona de reconocim iento del D N A por parte de un represor transcripcional, y que el gen mbdK codifica un represor especifico en el cluster mbd., la secuencia ATAC-10 pb-G TA T parecia una buena candidata para ser considerada com o la regiôn operadora de la protem a M bdR en los prom otores P^ y Pg/. 104 B Q ATGCGqTTGAC/|GCAACAAGATTTTGCTG TTAG AT AC TGGGCAGCTC GTAT GTT -35 -10 +1 ATAC TGGGCAGCTC GTAT M A AAA P q 1 AGTCC[rTGAC^c [\TAG|GAGCCAGCCGjc TAT ATC GTAGCCGCATGTGGGGACCG ATAçjcAGCCAGCCGjGTAT -35 -10 +1 A AA AA A Figura 27. Anàlisis in s ilico de las regiones promotoras Pq y Pbi- A) Esquema ampliado de las regiones promotoras Po y Pbi- Recuadradas en verde aparecen las cajas -10 y -35 de ambos promotores. El punto de inicio de la transcripciôn aparece marcado en naranja y subrayado. Las secuencias palindrômicas detectadas en los promotores aparecen recuadradas en azul y su orientaciôn senalada por una flécha del mismo color. B) Esquema comparative de las regiones palindrômicas halladas en los promotores divergentes del cluster mbd y de la regiôn comprendida entre ellas. Las cajas palindrômicas aparecen recuadradas en azul y su orientaciôn senalada por una flécha del mismo color, las bases conservadas se sehalan con un asterisco y las bases situadas fuera de las cajas, y que extienden el palindromo, estân sehaladas por triângulos rojos. 6.3.2. Estudios In vitro de la interacciôn entre MbdR y los promotores Po y P b i Los prom otores divergentes del cluster mbd se utüizaron para generar las sondas Pq (271 pb, se extiende desde la posiciôn -113 a +150 respecto al inicio de la transcripciôn) y Pg; (251 pb, se extiende desde la posiciôn -100 a +143) (Fig. 19C), empleadas en los experimentos de interacciôn in vitro con la proteina M bdR purificada. M ediante ensayos de retardo en gel se observaron complejos de uniôn entre las sondas empleadas y la protem a M bdR (Fig. 28). La sonda Pq es retardada en su totaüdad a una concentraciôn de M bdR de ~5 nM (Xj, ~1.8 nM), mientras que la sonda Pg, es retardada a ~25 nM (K^ ~3.7 nM). D e esta forma se confïrmô la existencia de una interacciôn directa entre la protem a M bdR y los prom otores objeto de estudio. El anàlisis de los ensayos de retardo en gel revelô la existencia de dos complejos de interacciôn. E l complejo mayoritario y de mayor tam ano (complejo II) responde al aum ento en la concentraciôn de protem a de tal forma que el aum ento de la cantidad de D N A unido a la protema es proporcional a la disminuciôn de la cantidad de sonda libre. El segundo complejo (complejo I) es minoritario, se localiza entre el complejo mayoritario y la sonda libre y desaparece cuando se alcanzan concentraciones de protem a superiores a la fQ. 105 [MbdR] nM - 0.25 0.5 1 2.5 5 10 25 -Complejo II -Complejo I B [MbdR] nM - 0.5 1 2.5 5 10 25 50 B1 -Complejo II -Complejo I Figura 28. Ensayo in vitro de interacciôn de la protema MbdR con los promotores Pq y Pb i- Ensayos de retardo en gel en los que se empleo la proteina MbdR-HISe purificada y la sonda Pq (271 pb), que contiene al promotor Pq (panel A), y la sonda Psi (251 pb), que contiene al promotor Pbi (panel B), segùn se detalla en el apartado 7.2 de Materiales y Métodos. Las calles de los geles aparecen rotuladas con la concentraciôn (nM) de proteina MbdR-HiSe purificada que se ha ahadido a cada una de las reacciones de retardo. Las calles rotuladas con un signo corresponden a reacciones control de retardo, a las que no se les ha ahadido protema MbdR-HiSe. Las sondas Pq y Pbi y los complejos MbdR-Po y MbdR-Pe? se sehalan con fléchas a la izquierda y derecha de las imagenes, respectivamente. C on el objetivo de p ro fund izar en el estudio de la in teracciôn existente entre el regulador M bdR y los p ro m o to res Pq y Pg;, se Uevaron a cabo ensayos de p ro teccion fren te a la digestion p o r D N asa I (ensayos de footprintin^. Para ello se em plearon las sondas Pq y Pg; asi com o la p ro te ina M bdR purificada (MbdR-Hisg) (Fig. 29; Pq panel izquierdo, calles A a G ; Pg;, panel derecho , calles A a F). La huella de p ro teccion frente a la digestion que se observô en el p ro m o to r Pq se extiende en tre las bases + 18 y -16 e im plica tam bién una banda de b ipersensibihdad a la d igestiôn en la posiciôn -18. P o r o tro lado en el p ro m o to r Pg; se détecta una regiôn de p ro tecciôn en tre las posiciones -4 y -34 y una banda de h ipersensibilidad a la digestiôn en la posiciôn -37. Las zonas de p ro tecciôn engloban a las secuencias paHndrôm icas identificadas durante el anâHsis in silico de los p rom o to res , y su posic iôn es solapante con la caja -10 y la regiôn que rodea al inicio de la transcripciôn (p rom o to r P q ) o con las cajas -10 y -35 (p rom o to r Pg;). Estas hueUas de p ro tecciôn son com patib les con la hipôtesis de que M bdR sea u n represor de la transcripciôn que im pida la correcta un iôn de la R N A polim erasa a los p rom oto res. 106 T odos estos resultados co rro b o ran la existencia de una in teracciôn especifica en tre la p ro te ina M bdR y los p ro m o to res Pq y Pg;. MbdR [M b d R ] nM A + G A MbdR [M b d R ] nM 100 50 A + G A Figura 29. Ensayo de protecciôn frente a la digestiôn por DNasa I de la protema MbdR sobre los promotores Po y P b i ’ En cada ensayo se ha empleado la sonda correspondiente (Pq para el estudio del promotor Pq, panel izquierdo; Pg; para el promotor Pg;, panel derecho). En las calles marcadas como A+G se han cargado las correspondientes reacciones de secuenciaciôn de las sondas segûn el método de Maxam y Gilbert, llevadas a cabo tal y como se indica en el apartado 7.3 de Materiales y Métodos. Los numéros localizados sobre cada una de las calles indican la concentraciôn (nM) de proteina MbdR- Hise empleada para cada ensayo. Las calles marcadas con el signo indican reacciones a las que no se les ha adicionado protema MbdR. En las calles situadas mâs a la derecha de cada panel se ha ahadido 3-metilbenzoil-CoA (250 pM). A la izquierda de cada panel se indica la secuencia del promotor, incluyendo las cajas -10/-35 y el punto de inicio de la transcripciôn (en verde). Las cajas azules sehalan las secuencias palindrômicas conservadas detectadas en los promotores y las fléchas azules la orientaciôn de dichas cajas. El reçu ad ro sombreado en naranja indica la secuencia protegida frente a la digestiôn por DNasa I. Las fléchas naranjas indican regiones de hipersensibilidad frente a la digestiôn por DNasa I. 107 6.4. Identificaciôn del Inductor especffico de la protema MbdR Los resultados presentados en los apartados anteriores demuestran que el represor transcripcional M bdR contrôla la expresion de los dos operones divergentes del cluster mhd. La identificaciôn de la molécula que actua com o inductor especifico del regulador transcripcional se planted com o el siguiente objetivo. 6.4.1. Estudio in vivo de la inducciôn del promotor Pbi por 3- metilbenzoil-CoA Com o prim er paso para la identificaciôn del inductor de los genes catabdlicos del cluster mbd se analizô la expresiôn de la fusion traduccional V^^^dacZ en una cepa hospedadora portadora del gen regulador mbdK e incapaz de metabolizar el 3MBz. Para ello se evaluô la actividad (3-galactosidasa en células de E. coli MC4100 (pIZ P ^, pCKm bdR) cultivadas anaerdbicamente en medio rnfnimo con gHcerol com o fuente de carbono. C om o se muestra en la Figura 30A, la presencia del gen mbdK reducia significatdvamente la actividad del prom otor Pyj,, confirm ando su funcion com o represor transcripcional. Por otro lado, la adicion de 3MBz al medio de cultivo no alteraba significativamente la represion que el regulador M bdR ejercia sobre la fusion P^fdacZ (Fig. 30A), lo que suponia que el 3MBz, sustrato de la ruta m bd, no era capaz de actuar com o inductor del prom otor P, ,̂. En una segunda aproximacion se estudio si el intermediario central de la ruta m bd, el 3-metilbenzoil-CoA, producto de la activacion del 3MBz y com puesto final que se genera en la ruta periférica de degradacion de w-xüeno, ténia actividad inductora sobre el sistema regulador MbdR-P^,. Para eUo, se construyo la cepa E. coli MC4100 (plZPg^, pC K m bdR , pUCmbdA) que porta la fusion traduccional P^,::lacZ, expresa el regulador M bdR y ademas es capaz de producir 3-metilbenzoü-CoA en presencia de 3MBz por la accion de la 3MBz-CoA ligasa codificada por el gen mbdA. Los cultivos anaerobicos de la cepa E. coli MC4100 (pIZPgy, pCKm bdR, pUCmbdA) solo m ostraron una recuperacion significativa en la expresiôn del prom otor Pgy cuando se anadia 3MBz al m edio de cultivo (Fig. 30B). Este resultado sugeria que el 3-metübenzoü-CoA formado a partir del 3MBz anadido al medio de cultivo de células de E . coli que expresan el gen mbdA, es el responsable de la activacion (por cese de la represion) del p rom otor Pĵ ,. El hecho de que no se restaure totalm ente la actividad 108 galactosidasa observada en ausencia del gen regulador probablem ente se deba a la dosis multicopia del gen mbdK en el sistema de estudio. 100 2 90 CO 3 w i g> 60 ca %■g > B 80 70 50 40 Ü 30 < o 20 0^ 10 - +3MBz -3MBz 1 +3MBz -3MBz Pn.y.lacZ J Pgp-.lacZlmbdR Pn,::lacZ PgpdacZ / mbdR / mbdA Figura 30. Control de la fusion traduccional Pgir.lacZ en E. coli. Las células E. coli MC4100 (plZPei, pCKmbdR) (panel A) y E. coli MC4100 (plZPei, pCKmbdR, pUCmbdA) (panel B) y la cepa control E. coli MC4100 (plZPsi, pCKOI) (paneles A y B), utllizadas en los ensayos de actividad p-galactosidasa, se obtuvieron a partir de cultivos anaerobicos en medio minimo M63 empleando glicerol 30 mM como fuente de carbono. La fusion traduccional Pe,;.7acZse encuentra incluida en el plàsmido plZPei. El gen regulador mbdR se expresa a partir del promotor Plac en la construccion pCKmbdR. La actividad 3MBz-CoA ligasa esta codificada por el gen mbdA, que se expresa en la construccion pUCmbdA bajo el control del promotor Plac. Dado que el gen regulador lacP esta incluido en plZPei, se ha ahadido IPTG 0.5 mM a los cultivos para permitir la expresion de los genes mbdR y mbdA. Las barras se corresponden con la actividad del promotor Pg, en ausencia de MbdR (rayado), en presencia de MbdR (negro), y en presencia de MbdR y 3MBz (bianco). Se représenta el tanto por ciento de actividad beta-galactosidasa respecte al valor maximo obtenido (-4000 U. Miller). Los dates mostrados son el resultado de un experimento, pero los valores fueron reproducidos en très expérimentes separados e independientes y presentaron una desviaciôn estàndar inferior al 10%. El siguiente paso consistio en evaluar la actividad p-galactosidasa de la fusion P^^r.lacZ en una cepa m utante de A^oarcus sp. CIB que contiene el gen mbdA inactivo. Para ello se introdujo mediante electroporacion la construccion plZPgj en Aï(oarcus sp. CYKdmbdA (Tabla 3). Las cepas A la r m s sp. CIB (plZPgj) y Aî^arcus sp. ClKàmbdA (pIZPgJ se cultivaron anaerdbicamente en presencia o ausencia de 3MBz. En la Figura 31 se puede observar que en presencia de 3MBz (condiciones de inducciôn) la actividad P galactosidasa de la cepa Aï^arcus sp. ClKàmbdA (pIZPgJ es sensiblemente inferior a la observada en la cepa parental A^oarcus sp. CIB (pIZPgJ. N o obstante, a pesar de la inactivacidn el gen mbdA se signe apreciando un nivel detectable de inducciôn del 109 prom otor que podria deberse a que estamos trabajando en un sistema en el que el prom otor se encuentra en multicopia, a la expresion de otras enzimas de la célula con capacidad CoA ligasa que no permitirian la producciôn de suficiente 3-metilbenzoil-CoA com o para crecer anaerdbicam ente en 3MBz pero si com o para perm itir la actividad de P;/ en el sistema de estudio, o a que la m utacidn del gen mbdA revierte en algunas células de la poblacidn y se régénéra el gen mbdA activo. Todos estos resultados sugieren que el 3-metilbenzoil-CoA es el inductor especifico de la proteina M bdR que permite la expresidn de los genes mbd. 3500 3000 - S 2500 (0 •g 0 20001 a 1500 C2. -O 1000 ■g I 500 < B Azoarcus sp. CIB +3M Bz -3M Bz Azoarcus sp. Cl Bd mbdA +3MBZ -3M Bz Figura 31. Expresiôn de la fusion Rgir-lacZ en Azoarcus sp. CIB y Azoarcus sp. C\B6 mbdA. La figura muestra la actividad (3-galactosidasa en las cepas Azoarcus sp. CIB (pIZPsi) (panel A) y Azoarcus sp. Cl Bd mbdA (plZPei) (panel B) cultivadas anaerdbicamente en medio minimo MO complementado con àcido glutàrico 7 mM y en presencia (barras blancas, +3MBz) o en ausencia (barras negras, -3MBz) de SMBz 3 mM. La fusion traduccional Pgy/./acZ se encuentra incluida en el plàsmido plZPgi. El gen mbdA se encuentra mutado en el cromosoma de Azoarcus sp. Cl Bd mbdA (Tabla 3). Los datos mostrados son el resultado de un experimento, los valores fueron reproducidos en très experimentos separados e independientes y presentaron una desviaciôn estàndar inferior al 10%. 6.4.2. Estudio in vitro de la inducciôn de los promotores Po y P b i por 3-metilbenzoil-CoA Con el objetivo de confirm ât la identidad del inductor especifico del duster mbd se realizaron experimentos in vitro de interaccion entre la protem a M bdR y los prom otores P,) y Pj), en presencia de 3-metilbenzoil-CoA. 110 Para evaluar la in teraccion existente en tre la p ro tem a M bdR purificada (TMbdR- H isJ y el in d u c to r 3-m etilbenzoil-C oA se Uevaron a cabo experim entos de re tardo en gel co n las sondas de los p ro m o to res Pq y Pg; (Fig. 32A). Se p u d o observar que la fo rm acion de los com plejos de re tardo M bdR -P^ y M bdR-Pg/ dism inuye a m edida que se increm en ta la concen trac ion de 3-m etilbenzoil-C oA y dejan de obsen^arse a una concen trac ion de 3- m etilbenzoil-C oA de 250 pM (iÇ ~ 5 5 pM para Pq; ~ 36 pM para Pg,), lo que indica que existe una in teraccion en tre el 3 -m etilbenzoil-C oA y el regulador M bdR que im pide la u n ion de este a los p ro m o to res Pq y Pg;. 0 12.5 25 50 70 100 250 500 0 12.5 25 50 70 100 250 500 B1 B Figura 32. Ensayo in vitro de union de la protema MbdR a los promotores Pq y Pbi en presencia de 3-metilbenzoil-CoA y otros compuestos anàlogos. A) Ensayos de retardo en gel de la protema MbdR-Hise purificada con las sondas Pq (panel izquierdo) y Pbi (panel derecho). Galles sondas en ausencia de regulador. En el reste de calles se ha anadido protema MbdR-HiSe a una concentracion de 30 nM. Sobre cada calle se muestra la concentracion (en pM) de 3-metilbenzoil-GoA que se ha adicionado. B) Ensayo de retardo en gel con la proteina MbdR-HiSe sobre la sonda Pq en presencia de diferentes compuestos aromâticos. Galle sonda Pq en ausencia de proteina. En las calles A-F se adicionô protema MbdR-HiSe (20 nM). Las calles B-F se complementaron con diferentes compuestos: B, 3-metilbenzoil-GoA 250 pM; G, benzoil-GoA 2 mM; D, fenilacetil-GoA 2 mM; E, 3MBz 2 mM; F, 3MBz 2 mM + GoA 2 mM. Para co m p ro b a r si la inducciôn p o r parte del 3-m etilbenzoil-C oA sobre M bdR era especifïca o si, en cam bio, podia ser ejercida p o r o tros derivados C oA de com puestos arom âticos anàlogos, se anaüzo la fo rm acion del com plejo M bdR -P^ en ensayos de re ta rdo en gel a los que se anad ieron benzoil-C oA y fenilacetil-C oA (Fig. 32B). E n estos ensayos se evidenciô que n inguno de estos anàlogos (a concen traciones de 2 mM ) era capaz de im ped ir la fo rm acion del com plejo M bdR-P^. P o r o tro lado, n i el 3M Bz ni el C oA p o r separado , o cuando am bos estân présentés a la vez, son capaces de im pedir la fo rm acion del com plejo de retardo . T odos estos resu ltados dem uestran la especificidad com o in d u c to r del 3-m etilbenzoil-C oA . 111 D ad o que m edian te experim entos de p ro tecc iô n frente a la d igestion p o r D N a sa I (ensayos de footprintin^ se habia identificado la reg ion operadora de la p ro te in a M bdR en los p ro m o to res Pq y Pg;, se p roced io a rep ro d u c ir dichos experim en tos anad iendo 3- m etilbenzoil-C oA (Fig. 29; P q panel superior, caUe H ; Pg;, panel in ferio r, calle G ). E n estos ensayos se o b se rv é que la hueUa de p ro tecc io n debida a la p ro te in a M bdR desaparecia en presencia de 3-m etilbenzoil-C oA , recuperândose el p a tro n de d igestion observado en las sondas con tro l, lo que confïrm aba la ausencia de in teraccion en tre M bdR y los p ro m o to res Pq y Pg; en presencia del in d u c to r 3-m etilbenzoil-C oA . '^o — (227 nt) 3M B z — (224 nt) g: 3MB B B Pb i - (224 nt) Figura 33. Efecto in vitro de la protema MbdR y el 3-metilbenzoil-CoA sobre la actividad de los promotores Pq y Pb i- Se llevaron a cabo reacciones de transcripciôn in vitro en las que se utilizaron como molde los plâsmidos pJCDPo y pJCDPei, que contienen los promotores Pq y Pbi, los cuales generan transcritos de 227 y 224 nt, respectivamente. Las reacciones se llevaron a cabo adicionando RNA polimerasa de E. coli 30 nM, tal y como se indica en el apartado 7.4 de Materiales y Métodos. Las calles marcadas con el signe son reacciones control a las que no se ha adicionado proteina MbdR. Al reste de las reacciones se les ha ahadido MbdR-HiSe 100 nM. A) Efecto de concentraciones crecientes de 3- metilbenzoil-CoA sobre la represion de la transcripciôn ejercida por MbdR sobre Pq (panel izquierdo) y Pbi (panel derecho). Sobre cada calle se indica la concentraciôn ahadida de inductor (en pM). B) Efecto de diferentes compuestos sobre la represiôn de la transcripciôn ejercida por MbdR sobre Pb{. A, sin efector; B, 3-metilbenzoil-CoA 10 pM; C, 3MBz 1 mM + CoA 1 mM; D, benzoil-CoA 1 mM; E, fenilacetil-CoA 1 mM; F, CoA 1 mM. C on el fin de com p lem en tar el estudio de la rep resiôn ejercida p o r M bdR sobre los p ro m o to res Pq y Pg;, asi co m o el e fec to in d u c to r del 3 -m etilbenzoil-C oA , se realizaron experim entos de transcripciôn in mtro. Para eUo, se em p learon la p ro te ina M bdR purificada (M bdR -F fisJ, R N A polim erasa de E . coli y, co m o D N A m olde para la 112 transcripciôn, las construcciones pJC D P^ y pJCDPg^, que contienen los prom otores Pq y Pg;, respectivamente, clonados com o fragm entes EcoRl/Scal en el vector pJCD (Tabla 4). E n la Figura 33A se puede observar que la cantidad de transcrito del tamano esperado que se genera a partir de Pq y Pg; disminuye tras la adicion de M bdR, y que al anadir concentraciones crecientes de 3-metilbenzoil-CoA a la mezcla de reacciôn, la actividad de los prom otores Pq y Pg; se récupéra. Estos resultados revelan que es posible observar in vitro el efecto inductor del 3-metübenzoü-CoA sobre la accion represora de M bdR en los prom otores Pq y Pg;. Adem as, se com probo que la adicion de otros com puestos, com o benzoü-CoA, fenilacetil-CoA, 3MBz y CoA, en la reaccion de transcripciôn in vitro no implicaba un efecto inductor similar al detectado al anadir 3- metübenzoil-CoA, confirm ando la especificidad de dicha inducciôn (Fig. 33B). 7. Estudio de los promotores que controlan los elementos reguladores en el cluster mbd 7.1. identificaciôn y clonaclôn de los promotores Pa y Pan Los resultados reflejados en los apartados anteriores perm itieron caracterizar la regulacion de los prom otores divergentes Pq y Pg;. E n este sistema regulador, la protema M bdR y el inductor 3-metilbenzoil-CoA poseen un papel fundamental. D ado que el gen mbdK no esta controlado por ninguno de los prom otores divergentes Pq y Pg,, se procedio a identificar su propio p rom oto r (P^J. Por otro lado, el inductor 3- m etübenzoil-CoA es producido a partir de 3MBz por el producto del gen mbdA. Aunque el gen mbdA se localiza al final del operôn controlado por el prom otor Pg;, el espacio intergénico existente entre los genes mbdB5 y mbdA (231 pb. Tabla 6) podria albergar un p rom otor adicional especifico para el gen mbdA, que controlaria los niveles de 3-metilbenzoil-CoA necesarios para inducir la expresion de los genes del cluster mbd. Al posible p rom otor adicional del gen mbdA se le denom ino P^. Cuando se realizô un anàlisis de la secuencia de nucleôtidos de la region intergénica mbdB5-mbdA y del p rom otor P^g se observé la presencia de sendos pares de secuencias palindromicas simdares a las reconocidas por la proteina M bdR en los prom otores P^ y Pg; (Fig. 34), lo que sugeria la inclusion de los hipotéticos prom otores P 4 y PjR en el circuito regulador controlado po r MbdR. 113 10b P q ( M A C { r G G G C A G C T c j G T A l | MA AM 10b P B i |ATAc]cAGCCAGCCCfGTAT| A AA M A ^ 10b ^___ P a |ATAcfrATCCGGTTA|3 T A | M MAA M ^ 9 b ^___ P3 R |#\cjGGTGGCCGC|3TA0 A A A A Figura 34. Comparativa de las cajas operadoras de MbdR en los promotores Pq y Pbi con secuencias palindromicas similares detectadas en los promotores Pa y PsR- Las cajas palindromicas aparecen recuadradas en azul y su orientaciôn sehalada por una flecha del mismo color. Los nucleôtidos no conservados en las cajas de los promotores Pa y P3R se muestran sombreados en azul. Los nucleôtidos que extienden las cajas palindrômicas en cada uno de los promotores se sehalan con triàngulos rojos. Las regiones intergenicas mbdB5-mbdA y îdiK-mbdK se amplificaron por PCR incluyendo los codones de inicio de los genes mbdA y mbdK, y se clonaron en el vector de busqueda de prom otores pSJ3, dando lugar a las construcciones pSJ3P,^ (P,^::lac7) y pSJ3P^R (P^^::lacZ), respectivamente (Tabla 4). D ado que el vector pSJ3 no es capaz de replicar en Ar^arcus sp. CIB, se procedio a subclonar las fusiones traduccionales PydacZ y P^ÿidacZ en el plàsmido de amplio rango de hospedador p IZ lO lô , de forma que el prom otor Ptac de dicho plàsmido es delecionado y sustituido por la fusion traduccional. E n la Figura 35 se esquematiza la estrategia seguida para la construccion de los plâsmidos pSJ3P \, pSJ3P,j^, p IZ P \ y pIZP^,^. ICromosoma de Azoarcus sp. CIB| mbdBS. ^ mbdA . mbdR tm MCS {Kpn\/Xba\) |p S J3 (8T2kb)i PIZ1016 (6.0 kb) I ŒSX3 s on (pBBR1) (1) \ Amplificacion por PCR Kpn\/Xba\ + Ligaciôn Kpm (H/ndIII) 238 pb 451 pb Kpn\ r AXba\ psusp* (6.5 kb) Kpn[/Hind\\\ + Ligacion pKpn\ — X b a l pSJSPgpi (6.7 kb) Kpnt ' A Xba P'ZPa (8.8 kb)(pBBRI) KpnlP̂Xbai (9.1 kb)(pBBR1Gm" ^ 114 Figura 35 (pagina anterior). Esquema de la estrategia empleada para la construccion de las fusiones traduccionales PA::lacZ y Pa^r.lacZ. Las regiones intergenicas mbdB5-mbdA y tdiR-mbdR se amplificaron mediante PCR. Los oligonucleôtidos empleados fueron; (1) Intergénica mbdB5-mbdA Kpn\ 5% (2) Intergénica mbdBS-mbdA Xbal3'.2, (3) PmbdR Kpnl 5 ' y (4) PmbdR Xba\ 3'. Estos cebadores introducen dianas de restricciôn Kpn\ y Xba\ en los extremos 5' y 3' del fragmente amplificado, de tal forma que la diana Xba\ de ambos fragmentes permite generar una fusion traduccional de los primeros 3 nt de los genes estructurales mbdA y mbdR con el gen testigo lacZ en el vector de bûsqueda de promotores pSJ3. Las fusiones traduccionales se subclonaron como fragmentes Kpnl-/7/ndlll de aproximadamente 3.3 kb (P/,;.7acZ) y 3.5 kb {PsR-lacZ} en el vector de amplio rango de hospedador plZ1016. Las regiones intergénicas clonadas se representan en color gris, los promotores Pa (rojo) y PsR (negrcÿ con fléchas curvadas, los genes responsables de las resistencias a antibioticos (Ap' ,̂ Gm ) y del represor del promotor lac [lacP) con fléchas blancas. El gen /acZ se représenta con un flecha azul, los origenes de replicaciôn or/(pUC) y or/(pBBR1) con rectàngulos rayados y el de movilizaciôn de los plâsmidos {mob) con fléchas rayadas. 7.2. Caracterizaciôn del promotor catabôllco Pa 7.2.1. Estudios in wVodel promotor Pa Los ensayos de actividad ^-galactosidasa llevados a cabo con la cepa E. coli MC4100 (pIZP.y) en medio m inimo M63 confirm aron la existencia de un prom otor en la region intergénica mbdB5-mbdA, aunque los bajos niveles de actividad detectados (~150 Unidades Miller) sugieren que es un prom otor débil. Una vez corroborada la existencia del prom otor P,^, se procedio a determinar el sitio de inicio de la transcripciôn mediante el protocolo de extension por cebador {primer extension). Para ello se extra)o RNA de células de A^^oarcus sp. CIB (p IZ P ^ cultivadas anaerôbicamente en medio minimo com plem entado con benzoato o con 3MBz com o unicas fiientes de carbono. La identificaciôn del sitio de inicio de la transcripciôn (Fig. 36A) perm itiô proponer las cajas de interacciôn con la subunidad de la RNA polimerasa (ver Fig. 36B). Las secuencias -10 y -35 del prom otor P^ estân separadas entre si por 18 n t y difieren en très nucleôtidos de las secuencias consenso TATAAT (-10) y TTG A C A (-35) (Dombroski, 1997). E n la Figura 36C se puede observar un esquema de la regiôn intergénica mbdB5-mbdA en la que se detaUa la posible regiôn operadora para el reconocimiento de M bdR y otros elementos reguladores del prom otor Pa- 115 A T c G 3M B © B -35 -10 +1 G TTAGTA CGTCTTTTG ACC A ATTG AiTCTACA CG AGGGG A A A C C A mbdBS GCCCCGCCCAAGTTTTCATTATCTCTAGTACCGGCAAAGAAGGGCC AAAGAGATCTATTGClATAClTATCCGd T T /J G T /lâ GTCTTTTGACCAATTG4fi -10 +1 -35 C TA C dCGAGGGGAAACCATGTTCGAGAATTTCAACCATAGTGCTCTGCGT CTTGGAGCGCCAGGCGCTTTAGCGCAGCGTTTGCTGCCGAAGCATCAGG G T C A C T A T G T T G A T G C G C A T T t G G  ^ C G A C C ^ g m bdA Figura 36. A) Determinaciôn del punto de inicio de la transcripciôn en el promotor Pa- El RNA total se extra]o a partir de células de Azoarcus sp. CIB ( p I Z P a ) cultivadas anaerdbicamente en medio MO con 3MBz (3 mM) o benzoato (3 mM) como ünicas fuentes de carbono. El tamano de los productos de la extension se déterminé por comparaciôn con el patron de secuenciaciôn del promotor Pa (calles A, T, C, G). Las calles marcadas como 3M y B muestran los productos de extension a partir de los cultivos en los que se empleô 3MBz o benzoato como fuente de carbono, respectivamente. La banda correspondiente al producto de extension aparece sehalada con una flecha naranja. Tanto para realizar la reacciôn de extensiôn como para la reacciôn de secuenciaciôn se empleô el oligonucleôtido PmbdA EcoR\ 3 ' (Tabla 5). A la izquierda de la imagen se muestra la secuencia de la regiôn en la que se encuentra el punto de inicio de la transcripciôn (cfrculo naranja). La secuencia mostrada se corresponde con la hebra no codificante. B) Secuencia de la region -10/-35 y del inicio de la transcripciôn en el promotor Pa. Las cajas -10 y -35 del promotor Pa aparecen recuadradas en verde. El sitio de inicio de la transcripciôn (+1) se detalla subrayado en verde en la hebra codificante. C) Secuencia de la regiôn promotora Pa. Se mantiene el côdigo de colores del panel B) para las cajas -10/-35 y el punto de inicio de la transcripciôn. El codôn de inicio del gen mbdA aparece sehalado en verde claro, y la secuencia RBS reconocida por los ribosomas se ha recuadrado con una linea negra discontinua. El codôn stop del gen mbdBS aparece sombreado en rojo. Las cajas palindrômicas presuntamente reconocidas por la proteina MbdR se muestran recuadradas en azul y su orientaciôn sehalada por fléchas del mismo color. 116 7.2.2. Estudio in vitro de la Interacciôn entre MbdR y Pa C on el ob jetivo de p ro fund izar en la posible regulacion del p ro m o to r p o r parte de M bdR se realizaron experim entos de in teraccion p ro te in a-D N A in vitro. M ediante experim entos de re ta rd o en gel se observo la form acion de com plejos de re ta rdo M bdR - en condiciones similares a las obsen^-adas para Pq y Pg, (Fig. 37A). Asi, la sonda P^ se retarda en presencia de M bdR a una concen trac ion de ~ 25 nM (iC^;~5.9 nM ) (Fig. 37A) y n o se form a el com plejo de re tardo cuando a la m ezcla de reacciôn se anade 3- m etilbenzoil-C oA (Fig. 37B). [MbdR] nM 0 .5 1 2 .5 5 10 2 5 50 100 -Complejo -Complejo B Figura 37. Ensayos in vitro de interacciôn entre la protema MbdR y el promotor Pa. A) Ensayo de retardo en gel de la sonda Pa (225 pb) en presencia de un gradiente de concentraciôn de la proteina MbdR-HiSg. Calle sonda Pa en ausencia de protema. Sobre el reste de calles aparece reflejada la concentraciôn de MbdR-Hisg (en nM) empleada en cada reacciôn de retardo. B) Ensayo de retardo en gel en el que se muestra el efecto que tiene la adiciôn de 3-metilbenzoil-CoA sobre la formaciôn del complejo MbdR-P/,. Calle sonda Pa a la que no se le ha ahadido MbdR-HiSg purificada. Calles A y B, reacciones de retardo en las que se ahadiô MbdR-Hisg a una concentraciôn de 25 nM.En la reacciôn de retardo de la calle B se ahadiô ademas 3-metilbenzoil-CoA 250 pM. (Continua en la pagina siguiente). [MbdR] nM A+G - 10 25 50 25 MbdR 117 Figura 37 (continuaciôn). C) Ensayo de protecciôn frente a la digestiôn por DNAsa I de la interacciôn de la proteina MbdR con el promotor Pa- En la calle marcada como A+G se ha cargado la reacciôn de secuenciaciôn de la sonda segûn el método de Maxam y Gilbert, llevada a cabo tal y como se indica en el apartado 7.3 de Materiales y Métodos. Los numéros localizados sobre cada una de las calles indican la concentraciôn (nM) de proteina MbdR- HiSe empleada para cada ensayo. La calle marcada con el signo indica una reacciôn a la que no se les ha adicionado protema MbdR. En la calle situada mâs a la derecha del panel se ha ahadido 3-metilbenzoil-CoA 250 pM. A la izquierda del panel se indica la secuencia del promotor, incluyendo las cajas -10/-35 y el punto de inicio de la transcripciôn (sehalados en color verde). Las cajas azules sehalan las secuencias palindrômicas de interacciôn con MbdR detectadas en los promotores y las fléchas azules la orientaciôn de dichas cajas. El recuadro sombreado en naranja indica la regiôn protegida por MbdR frente a la digestiôn por DNasa I. Las sondas Pq y Pbi y los complejos MbdR-Po y MbdR-Pgy se sehalan con fléchas a la izquierda y derecha de las imàgenes, respectivamente. La realizaciôn de experimentos de proteccion frente a la digestiôn por DN asa I corroboraron los resultados observados en los experimentos de retardo en gel. (Fig. 37C). La proteina M bdR genera una huella especifica de protecciôn frente a la digestiôn en el prom otor P ,. D entro de la zona protegida se encuentran las cajas operadoras de M bdR postuladas tras el anàlisis de la secuencia del prom otor. Ademas, se observô la recuperaciôn del patrôn de digestiôn en las zonas protegidas por M bdR al anadir 3- metilbenzoil-CoA a las mezclas de reacciôn (Fig. 37C), lo que indica la ausencia de interacciôn entre M bdR y P , en presencia del inductor 3-metilbenzoil-CoA. Todos estos resultados del anàlisis in vitro sugieren que el prom otor P , esta controlado por el represor M bdR, y que el 3-metilbenzoü-CoA es la molécula que impide la formaciôn del complejo M bdR-P ,. 7.2.3. Papel de los promotores Pbi y Pa en la expresiôn del gen mbdA en Azoarcus sp. CIB Los resultados m ostrados en los apartados anteriores indican que el gen nibcLA se transcribe a partir de los prom otores Pg, y P^ en el catabolismo anaerôbico de 3MBz. Para com probar si Af^arcus sp. CIB era capaz de crecer anaerôbicamente en 3MBz cuando la transcripciôn a partir del p rom otor Pg, se encuentra interrum pida, se procedio a la construcciôn de un m utante por inserciôn en el gen mbdB1. Para eUo se siguiô el esquema representado en la Figura 12. Se ampHticô mediante PCR un fragmento intem o del gen mbdB1 (728 pb) con los oligonucleôtidos mbdBImut EcoRl 5 ' y mbdBImut Xbal 3% que se clonô en el vector pK\3mob. E l plàsmido résultante, pK 18m bdB l (Tabla 4), se introdujo en Azoarcus sp. CIB mediante conjugaciôn biparental, de tal forma que mediante recom binaciôn hom ôloga se generô la cepa m utante Aîcparcus sp. CYKdmbdBI (Tabla 3). Esta cepa se m ostrô incapaz de crecer anaerôbicamente en medio minimo 118 empleando 3MBz como ùnica fuente de carbono, pero en cambio era capaz de crecer em pleando w-xileno, un com puesto que genera directamente 3-metilbenzoil-CoA en su degradacion. Para dilucidar si el fenotipo observado se debia a un efecto sobre la expresiôn del gen mbdA, cuyo producto proteico es imprescindible para la activaciôn del 3MBz, o si por el contrario se debia a la inactivacidn del presunto sistema transportador de 3MBz codificado por los genes mbdB1-B5, se com plem entô la cepa m utante con el plàsmido pIZm bdA que expresa eficientemente el gen mbdA desde un prom otor heterôlogo (Tabla 4; Fig. 13). D ado que la cepa Aîparcus sp. CIBdmbdBI (pIZmbdA) recuperô la capacidad de crecimiento anaerôbico en medio minimo empleando 3MBz 3 mM com o ùnica fuente de carbono, se pudo descartar que el transportador de tipo ABC codificado por los genes mbdB1-B5 fuera estrictamente necesario para el catabolismo anaerôbico del 3MBz (a las concentraciones empleadas para el crecimiento en el laboratorio), y se puso en evidencia la importancia del prom otor Pg, para una eficiente expresiôn del gen mbdA. 7.3. Caracterizaciôn del promotor P3R que régula la expresiôn del gen mbdR 7.3 .1. Estudios in vivo del promotor P3R Com o hemos com entado al inicio de este apartado, la regiôn situada en posiciôn 5 ' del gen mbdK se clonô com o una fusiôn traduccional con el gen testigo lacZ, lo que dio lugar a la construcciôn plZP^g^ (Fig. 35). Para confirmar la existencia del prom otor Pjg en la regiôn clonada se realizaron ensayos de actividad [3-galactosidasa con células de E . coli DHIOB (pIZP^^, en los que se observô una baja actividad prom otora (~75 Unidades Miller). Para determinar el punto de inicio de la transcripciôn controlada po r el p rom otor Pjg m ediante el protocolo de extensiôn por cebador {primer extension), se procediô a extraer RN A total a partir de células de Asparcus sp. CIB (pIZP^^ cultivadas anaerôbicam ente en medio minimo com plem entado con benzoato o con 3MBz com o unicas fuentes de carbono. La identificaciôn del sitio de inicio de la transcripciôn, que se encuentra situado a 120 pb del codôn de inicio del gen mbdK (Fig. 38A), perm itiô proponer las cajas de interacciôn con la subunidad A*’ de la RN A polimerasa (Fig. 38B). La regiôn -35 del prom otor Pjg difiere en dos bases de la secuencia consenso TTGACA, mientras que la regiôn -10 no m uestra ninguna coincidencia con la secuencia consenso TATAAT (Dombroski, 1997). E n la Figura 38C se puede observar un esquema de la regiôn intergénica îdiK-mbdK en la que se detallan las presuntas cajas operadoras para el reconocim iento por parte de M bdR en el prom otor A pesar de que en un prim er m om ento solo se habia identificado la regiôn operadora mâs conservada situada entre las cajas -10 y -35 (Fig. 34), un anàlisis exhaustivo de la regiôn mâs alejada del punto de inicio de la transcripciôn revelô la presencia de posibles secuencias operadoras adicionales, si bien m enos conserv’̂ adas, para la uniôn de MbdR. En los experimentos de extensiôn por cebador realizados a partir de células cultivadas tanto en benzoato com o en 3MBz se observa formaciôn del transcrito mbdR, si bien éste es Hgeramente mâs abundante en 3MBz (Fig. 38), lo que sugiere el carâcter eminentem ente constitutivo del prom otor com o ya se habia obsen^ado en ypparcus sp. CIB en los experimentos de expresiôn del gen mbdK mediante RT-PCR (Fig. 18). 7.3.2. Estudio in vitro de la interacciôn entre MbdR y Psr A pesar de que los resultados reflejados en los apartados anteriores parecian indicar que la actividad del prom otor P^p era fundam entahnente constitutiva bajo las condiciones de estudio, la existencia de hipotéticas secuencias operadoras para M bdR en Pm (Fig- 38C) nos hizo plantearnos si podriam os detectar in vitro una interacciôn entre M bdR y el prom otor, que podria dar cuenta de la Hgera activaciôn de éste en presencia de 3MBz (Fig. 38A). E l hecho de que la hipotética secuencia operadora para M bdR mâs conservada, la solapante con la caja -10, presentara sustituciones de algunos nucleôtidos conservados en las cajas consenso (Fig. 38C) podria indicar una interacciôn mâs débü entre M bdR y Pjp que la observada con los otros prom otores del cluster mbd. Mediante ensayos de retardo en gel con la sonda P^p y la proteina MbdR purificada (MbdR-His^), se observô la formaciôn de multiples complejos de retardo cuya masa molecular aumentaba conform e lo hacia la concentraciôn de proteina M bdR empleada en el ensayo (Fig. 39A). La concentraciôn de proteina M bdR necesaria para que toda la sonda viera retardada su migraciôn electroforética era de ~1 pM, significativamente superior a la observada para los otros prom otores del cluster mbd {Pq, ~5 nM; Pg,, ~25 nM; P^, ~25 nM). Por otro lado, se observô una significativa reduccôn en la formaciôn de los complejos de retardo cuando a la mezcla de reacciôn se anadia 3- metilbenzod-CoA (Fig. 39B), lo que sugiere que esta molécula impide la interacciôn entre M bdR y P^p. l2 0 A T c G 3 M B (S) B -35 -1 0 +1 T rCGCCA ATCCGCGGAGACGGTGGC CGCGT/ CCGCTT 11 b CACAACTCTTCACCACCAACGCGCCGACCGAAlA T A fcCATTGACCTTM 10 b 3CACTTACACCAAG C(1ÂïgrAAACTCAGC|G T  #AATGCGTCTACTCTTA CAGTTTGGGTGACCGATTGGCGACGAAGGCCTGGGTGGCGGAGGAATTTT CGGGGATGGCGCTGGGTGACGAGAAACTGGACAAGCGGGCGAAGGTGCT -35 9 b +1 GATGGAATGGTTGTiTGGCCAKTCCGCGGr o  c b GTGGCjCGCiGTdteGCTT -10 TCTGGACAACCCGAGGTCGACTGGCTGGCGAACGTTCAGAATGCGGCGTT CTCACTTAAAATTGCCAACCTTCTCTGAAGTGCCGAGAGGCAAATCCATT iGG^ÇATpTCCAGACATCl mbdR Figura 38. A) Determinaciôn del punto de inicio de la transcripciôn en el promotor Psp. El RNA total se extrajo a partir de células de Azoarcus sp. CIB (plZPsp) cultivadas anaerôbicamente en medio MO con 3MBz (3 mM) o benzoato (3 mM) como unicas fuentes de carbono. El tamano de los productos de la extensiôn se determinô por comparaciôn con el patrôn de secuenciaciôn del promotor Pgp (calles A, T, G, G). Las calles marcadas como 3M y B muestran los productos de extensiôn a partir de los cultivos en los que se empleô 3MBz o benzoato como fuente de carbono. La banda correspondiente al producto de extensiôn aparece sehalada con una flecha naranja. Tanto para realizar la reacciôn de extensiôn como para la reacciôn de secuenciaciôn del promotor Pgp se empleô el oligonucleôtido PmbdR EcoR\ 3', cuya secuencia se detalla en la Tabla 5. A la izquierda de la imagen se muestra la secuencia de la regiôn en la que se encuentra el punto de inicio de la transcripciôn (circule naranja). La secuencia mostrada se corresponde con la hebra no codificante. B) Secuencia de la regiôn -10/-35 y del inicio de la transcripciôn en el promotor Pgp. Las cajas -10 y -35 del promotor aparecen recuadradas en verde. El sitio de inicio de la transcripciôn (+1) se detalla subrayado en verde en la hebra codificante. C) Secuencia de la regiôn 5' del gen mbdR. Se mantiene el côdigo de colores del panel B) para las cajas -10/-35 y el punto de inicio de la transcripciôn. El codôn de inicio del gen mbdR aparece sehalado en verde claro y la secuencia RBS reconocida por los ribosomas se ha recuadrado con una linea negra discontinua. Las cajas palindrômicas presuntamente reconocidas por la proteina MbdR se muestran recuadradas en azul, su orientaciôn sehalada por fléchas del mismo color y la distancia que las sépara se indica con una barra negra y se detalla su longitud en bases (b). Las bases que difieren de la secuencia consenso para la regiôn operadora de MbdR en los promotores Pq y Pbi aparecen sombreadas en azul. 121 La deteccion de m ultiples com plejos de re tardo MbdR-P^,^ (Fig. 39) esta de acuerdo co n la existencia de distintas regiones operadoras para M bdR e el p ro m o to r P^p (Fig. 38C). Las très regiones operadoras predichas difieren en tre si y de la secuencia consenso deducida para M bdR en Pq y Pg, (ATA C-10 pb-G T A T ). E stas diferencias podrian ser la causa de la d iferen te afinidad del regulador p o r cada una de estas regiones operadoras, lo que daria cuenta de la form acion de d iferentes com plejos de retardo segùn la concen traciôn de p ro te ina M bdR utilizada. [MbdR] |jM - 0.05 0.1 0.5 1 1.5 3R - C o m p l e j o VI - C o m p l e j o V - C o m p l e j o IV - C o m p l e j o III - C o m p l e j o II - C o m p l e j o I B A B 3R Figura 39. Ensayos in vitro de interacciôn entre la protema MbdR y el promotor Pgp. A) Ensayo de retardo en gel de la sonda Pgp (352 pb) en presencia de un gradiente de concentracion de la proteina MbdR-Hise. Las diferentes calles aparecen rotuladas con la concentraciôn (pM) de proteina MbdR-HiSe purificada que se ha ahadido a cada una de ellas, salvo la marcada con un signo a la que no se le ha ahadido proteina. La sonda Pgp y los diferentes complejos MbdR-Pgp se marcan con fléchas negras. B) Ensayo de retardo en gel en el que se muestra el efecto que tiene la adiciôn de 3-metilbenzoil-CoA sobre la formaciôn de los complejos MbdR-Pgp. Calle sonda Pgp a la que no se le ha ahadido MbdR-HiSg purificada. Calles A y B, reacciones de retardo a las que se les ahadiô MbdR-Hisg a una concentraciôn de 0.5 pM. En la reacciôn de retardo de la calle B se ahadiô ademas 3- metilbenzoil-CoA 250 pM. 8. Estudio de la regulacion sobreimpuesta en ei clustermbd E n la bibliografîa cientifïca aparecen ejem plos de bacterias anaerobias facultativas que poseen clusters génicos que adem as de m ostrar una regulacion transcripcional especifica estân sujetos a un nivel de regulacion superior m ediado p o r reguladores générales del m etabolism o bacteriano (para revision ver C arm ona et a l, 2009). E n tre las m ultiples senales que influyen sobre el m etabolism o bacteriano a través de reguladores globales destacan la p resenc ia /ausenc ia de oxigeno y la represiôn p o r catabolito 122 (apartado 2.2 de Introducdôn). Entre los reguladores frecuentemente relacionados con frecuencia con la m odulacion de este tipo de procesos se encuentran los de la familia F n r/C rp (Green et a l, 2001), alguno de cuyos miembros ya ha sido identificado en Arparcus sp CIB (Durante-Rodriguez et a i, 2006). 8.1. Anàlisis de la represiôn catabôlica sobre los promotores Pbi y Pan Una vez establecida la regulacion especifica del cluster mbd a través del sistema M bdR/3-m etilbenzoil-CoA , se planted detectar la existencia de una posible represion catabôlica sobre la expresiôn de los genes mbd por parte de fuentes de carbono preferentes. Para tratar de determ inar la existencia de represiôn catabôlica sobre los genes mbd, se m onitorizô la expresiôn de la fusiôn traduccional Pp^rJacZ en la cepa A'^^arcus sp. CIB (plZPg,), cultivada anaerôbicam ente en m edio minimo com plem entado con 3MBz mâs otros compuestos metabolizables por la bacteria. Com puestos com o el piruvato, el ciclohexanocarboxilato y las mezclas que contienen todos los aminoâcidos (casaminoâcidos), ejercen represiôn catabôlica. Por otro lado, el benzoato, la alanina y el âcido glutàrico no ejercen una represiôn catabôlica tan patente sobre la actividad del prom otor Pg, (Fig. 40). I î 8000 7000 6000 - 5000 - 4000 ■ 3000 - 2000 - 1000 ■ 0 Pp,;.7acZ - 3 M B z - 3 M B z + 3 M B z -m -3MgF % n Kl Bz Ala GIt Caa PIr Ciclo 3 M B z Figura 40. Expresiôn de la fusiôn PbixIbcZ en Azoarcus sp. CIB cultivado en diferentes fuentes de carbono. La figura muestra la actividad (3-galactosidasa en la cepa Azoarcus sp. CIB (pIZPsi) cultivada anaerôbicamente en medio minimo MO complementado con diferentes fuentes de carbono: Bz, benzoato 3mM; Ala, alanina 0,2%; GIt, glutarato 7 mM; Caa, casaminoâcidos 0,4%; Pir, piruvato 0.2%; Ciclo, ciclohexanocarboxilato 3 mM; 3MBz 3mM. Las barras blancas representan cultivos en una de las fuentes de carbono mencionadas. La barra negra indica el cultivo en 3MBz. Las barras rayadas indican un cultivo en una de las fuentes de carbono, a la concentraciôn resehada, mâs 3MBz 3 mM. Los ensayos de actividad p-galactosidasa se realizaron tal y como se indica en el apartado 6.1 de Materiales y Métodos. Los datos mostrados son el resultado de un solo experimento, pero los valores fueron reproducidos en très experimentos separados e independientes y presentaron una desviaciôn estàndar inferior al 10%. P o r o tro lado, se analizo si el p ro m o to r del gen regu lador mbdK era tam bién sensible a rep resion catabôlica. M ediante experim entos de R T -P C R se co m p aré la activ idad del p ro m o to r P^p en células de At(oarcus sp. CIB cultivadas en 3M Bz, p iruvato y una m ezcla de am bos com puestos. C om o podem os obser\?-ar en la Figura 41, el p iruvato n o ejerce rep resion cataboHca sobre la actividad del p ro m o to r P^p a pesar de que si lo hace sobre el p ro m o to r cataboUco Pg, (Fig. 40). M 3M P P+3M Figura 41. Electroforesis en geles de agarosa de los productos de RT-PCR obtenidos a partir del promotor Pgp de Azoarcus sp. CIB. Las células de Azoarcus sp. CIB utllizadas para la extraccion del RNA total se cultivaron en condiciones desnitrificantes hasta alcanzar la mitad de la fase exponencial de crecimiento empleando 3MBz 3 mM (calle 3M), piruvato 0.2% (calle P) o una mezcla de 3MBz 3 mM y piruvato 0.2% (calle P+3M) como fuentes de carbono. La extraccion de RNA y las reacciones de RT-PCR se realizaron tal y como se indica en el apartado 3 de Materiales y Métodos. Los oligonucleôtidos mbdR-A3 / mbdR-AS (Tabla 5) se emplearon para amplificar el cDNA. La calle M contiene DNA del fago OX-174, digerido con la enzima de restricciôn Haelll, como indicador de masa molecular. En el margen izquierdo de las imàgenes de los geles se indican los tamahos de los marcadores (en pb). 8 .2. Influencia del regulador global AcpR en la actividad de los promotores Pq, Pbi y Psr La im posib ilidad de Azoarcus sp. CIB para crecer aerob icam en te en 3M Bz, ju n to al hecho de que o tros clusters anaerob icos relacionados con la degradacion de com puestos arom âticos m uestren una regulacion depend ien te de la p resen c ia /au sen c ia de oxigeno, com o ocurre p o r e jem plo con los clusters que codifican la ru ta central del benzoil-C oA en R. palustris y A î^arcus sp. CIB (E gland et a l, 1997; Peres y H arw ood , 2006; D u ran te - R odriguez et a l, 2006), p lan ted el in te rrogan te de la existencia de u n m ecan ism o de co n tro l sim ilar que operara sobre el cluster mbd. C om o se ha ind icado en la Introducdôn, en A^^oarcus sp. CIB se ha descrito la existencia de A cpR , una p ro te in a o rto loga de F n r (D uran te-R odriguez et al., 2006), que en condiciones anoxicas se co m p o rta com o u n activador transcripcional im prescindib le para que se p roduzca la transcripciôn de los genes bî^d, codificantes de la ru ta central del T24 .... ....................... . . .... ..... benzoil-C oA en A l a r m s sp. CIB, a partir del p ro m o to r i \ r (D uran te-R odriguez et a l, 2006). C o m o u n prim er paso para detec tar si la p ro te ina A cpR pod ria estar impHcada en el co n tro l del cluster mbd se p roced io a cultivar anaerôb icam ente la cepa m u tan te Ascparcus sp. CIBd^^pR (Tabla 3; D uran te-R odriguez et a l, 2006) en m edio M C con 3M Bz com o ùnica fuen te de carbono. La cepa se m o strô incapaz de crecer en 3M Bz, pero cuando se com plem en tô con la construcciôn p IZ -F N R * (Tabla 4), que expresa la p ro te ina Fnr*, capaz de suplir el efecto activador de A cpR sobre tan to en experim entos in vivo com o in vitro (D uran te-R odriguez et a l, 2006), el feno tipo obsen^ado revirtiô. E ste resu ltado confïrm aba la impHcaciôn del gen acpK en el m etabo lism o anaerôbico del 3- m etilbenzoil-C oA enA ^oa trus sp. CIB. a?; wt dacpR wt dacpR wt dacpR Figura 42. Electroforesis en geles de agarosa de los productos de RT-PCR obtenidos a partir de los promotores Pq, Pbi y Pan en Azoarcus sp. CIB y Azoarcus sp. CIBdacpR Las células de Azoarcus sp. CIB {wt) y Azoarcus sp. CIBdacpR {àacpR) utllizadas para la extraccion del RNA total se cultivaron en condiciones desnitrificantes hasta alcanzar la mitad de la fase exponencial de crecimiento empleando alanina 0.2% como fuente de carbono y en presencia de 3MBz (3 mM) como inductor de la expresiôn a partir de los promotores Pq, Pbi y Pgfl. La extracciôn de RNA y las reacciones de RT-PCR se realizaron tal y como se indica en el apartado 3 de Materiales y Métodos. Los oligonucleôtidos empleados para la amplificaciôn de los productos de PCR fueron: PmbdO F1 / bcrB R2 {Pq), Pm bdBt F1 / mbdB1 R1 {Pbi) y mbdR-A3 / mbdR-A3 {Psr)] su secuencia se detalla en la Tabla 5. Las calles M contienen DNA del fago OX-174, digerido con la enzima de restricciôn Haelll, como indicador de masa molecular. En el margen izquierdo de las imàgenes de los geles se indican los tamahos de los marcadores (en pb). C o n el objetivo de anaHzar si la inactivaciôn del gen acpR suponia u n cam bio en la actividad de los p ro m o to res del cluster mbd, se p roced iô a realizar experim entos de RT- P C R para evaluar la transcripciôn desde los p ro m o to res P q , Pg, y P^p en las cepas Aqvarcus sp. CIB y Azoarcus sp. (AP>dacpK. La actividad de los p ro m o to res P q , P g , y P^p d ism inuyô en la cepa defectiva para el gen acpR (Fig. 42). E l anàlisis de la secuencia de los p ro m o to re s P q , Pg, y P^p revelô la existencia de posibles regiones operadoras para la un iôn de A cpR . La secuencia paH ndrôm ica reconocida p o r F n r es T T G A T N ^ATCAA (Spiro y G uest, 1990). E n Pq la secuencia T T G A C A G C A M CAA difiere en dos bases de 125 la secuencia consenso y la separacion entre ambas cajas palindrômicas es de très bases en vez de cuatro. Por otro lado, en Pg, la secuencia T T G A CACATACCAG difiere en très posiciones respecto al consenso. E n ambos prom otores estas regiones se localizan entre las cajas -10 y -35 solapando con la caja -35 (Fig. 27). E n el prom otor P^p se localiza la secuencia T G G 7T G T T G G CCAA. que solapa con la caja -35 del prom otor. E n conjunto, todos estos resultados sugieren que el c'/uster mbd esta sujeto a un control por oxigeno m ediado por la proteina AcpR. 126 A n e x o 127 CTACTCAAAGCGCGGCGAGCGTTTTTCGAGGAATGCCGCGACAGCCTCCTCATGCTCGGA 6 0 | E F R P S R K E L F A A V A E E H E S AGTCTTGTGCGCTAGTGCTTGGTAGGTTGCTGAAAGCTCCAATAGGGACTCCAAGCGCAC T K K A L A Q Y T A S L E L L S E L R V GTACTGCCCCTCCCGCAGAAGTCGTTTCGTCATACGTAGTGCAGGGCCAGGATTGCAAAC y o g e r l l r k t m r l a p g p n c v AATACGCTGGGCCAACTTGTTAGCCACATCCAGCAACTCCTCACCAGGCACTACACGAGA I R Q A L K N A V D L L E E G P V V R S CACCAGACCGCACTCGAGAGCCTCTTGCGCGGAAATTGGATCGCCCGTAAAGGACATTTC V L G C E L A E Q A S I P D G T F S M E CGCCGCCCGCGATTGACCTACTACACGCGGCAGTAACCAAGCCCCCCCATCGCCCGGAAC A A R S Q G V V R P L L W A G G D G P V AATCCCGAGCTTCACAAAGGACTCCGCGAAATATGCTGACGTAGCGGCGATCCGGATATC AGCAGTTGCTCTATCGCGTCGGATATGATTTCTTGCATGACCGCTGTCCTCTACCGAAGTg|ggggg||g|ggĝ ĝggggg|̂ mCTGGCGACAGGA0g|̂ gg L L Q E I A D S I I E Q l | R L CCGAGCCCACGGGCGATCATTCCACGCAGGATTTCCCGCGTGCCGCCTCGCAGAGAGAAT G L G R A I M G R L I E R T G G R L S F GAAGGAGAAATTTGTGTCACGTATGCCAGGGTTTTCAACAAGACGGATGGCACCGGACGA S P S I Q T V Y A L T K L L V S P V P R TCCGGATCGCCCCCCAGGCTGTCAGCAATCAGCAGCGGCATCTGCTGCTCGAATTCCGTT D P D G G L S D A I L L P M Q Q E F E T CCCAAGTCCTTGACTAGCGCGGCCTCAATCACCGGACTCTCACCCCGCGCTAGTTTTTCC G L D K V L A A E I V P S E G R A L K E GTGACCGAAATGGCCATCGCACGCAGCACGCATAGTTGGCTCGCCATGCGCCCGAGTAAC T V S I A M A R L V C L Q S A M R G L L GCGACACGCCCATCATCGACACGCGTATCACGACAGAGGAAAGCAAGCCACTCGTCAAAG I G L K V F S E A F Y A S T A A I R I D GCACATGCATGCTAGGTCGCATCCTGCGCCGATCGCCCCTCCATTTACTGCCGCAATCAC C M C A L D C G A G I A G G N V A A I V GGGCACCTCAAGATTGTAGAGTGCCAGCGGGAGCCGCTGAATTCCCCGCCGATATTCGTC P V E L N Y L A L P L R Q I G R R Y E D GCTGATCGTGATCGGATCCACTTTCTCCTTCGAATAGCGCTGCATGTCCTTCAAATTTCC A V R G D D V R T D R C L F A L W E D F AGAACCAGCGTGGAATAAATGCGCTCGGGCCCACTGCGTTCGAACGCAAGTTCCGCCGTC L V L T S Y I R E P G S R E F A L E A T ACTTGCTCCCAACCGGACCCCTCTGCACCGATCAGCGCATCGTGACCTAGCATCACGTCG V Q E W G S G E A G I L A D H G L M V D TCGAAAAAGACTTCACAGAAATGAGCATCCCCCGTGATATCGTGAATCGGCCGCACAGTC S I T I P D V K E K S Y R Q M D K L N G GCCCGCGCAAAACATCGTTCCCGCACCAGTAAGGATGACGGCACGAACCGTCGGATCACG G A C F M T G A G T L I V A R V T P D R GGCGATTCGGGAACATGCATCGACGAAGTCTTCGACGGCGGAATTGCCTGTCAGCACATT A I R S C A D V F D E V A S N G T L V N CCGGAGTTCGGGCTGATTCATGGTCATCGTGATCACGGGCCCGTTCTTATCGACCAGCAG R L E P Q N M T M T I V P G N K D V L L GAAACTACCCATTATTCGTCTCTCAATATCAAATTGGATTGGACAGATCAACCGGCAAGG miMĵ HATAAGCAGAGAGTTATAGTTTAACCTAACCTGTC7|BB|BHI F S G I I G A L CTCCGACGTACGAAATCCAGAGTTCGTGACGCACCGGTGGCAAGGAGTTCGCGCCCGACG S R R V F D L T R S A G T A L L E R G V ACCTTTGACCAATATACCTCCGTGCCATACGCGAGGCGCCACTCGTGCATCCGGCGTGTG V K S W Y V E T G Y A L R W E H M R R T AAAAGTTGCAAATCATATTCCTCTGTAAACCCCATTGCGCCGTGGACGGAATGCGCAATT D F F V E C F H A D G T I D H I P R V T ACGCCCTGCAAAGAGAGATCAACGATCATCTGGGACAAGCCCTTGTTCCGATCCGCCGGT V G Q L S L D V I M Q S L G K N R D A P TCCCCCGATGTGCGCACAAGTGCAATCATGTAGTGGGAACGGTAAGCGTTTGTCGTCCAG E G S T R V L A I M Y H S R Y A N T T W ATCTTGCGTCCGTTCAGCTTCCAGCCGCTATCCGTCCTCACCGCCCGAGTTGTCACGCTG I K R G N L K W G S D T R V A R T T V S GCGAGATCCGAACCCGAGTTAGGCTCACTCATACCGATGCAAAAAAAaGCTTCCGCGCGG A L D S G S N P E S M G I C F F A E A R CAGATCCTAGGCAGATAGTATTTCTTCTGCGCTTCGGACCCATATTTATGGATCAAGGGG C I R P L Y Y K K Q A E S G Y K H I L P CCGCTCTGGCGGTCGGCAATCCAGTGAGCGGTGACGGGAGCCCCTGCAGAGAGCAGCTCC G S Q R D A I W H A T V P A G A S L L E TCCACGACGACAAAGCGCGCGAACGAACTTCGTCCGCCGCCGCCGTATTCCTTCGGCAGA F L Q L D Y E E T F G M A G H V S H A I GACGACACTGTGCCGACCACCTCGCTGGTACGTTGCTTTGCCACAGCGGCAGCCATCAAT S S V T G V V E S T R C K A V A A A M L TTTGGACTTATCCCGTCGGCACTGAAACCGATCTGGGCCGACATTCGGGCCGCAAAAACC K P S I G D A S F G I Q A S M R A A F V TGCTCTGCCATGACACTGATCTGCTGCTGGATGATTTGAAGCTTTGCGATCGGCCTGCCG Q E A M V S I O Q Q I I Q L K A I P R G AATTGCACTCGATCATTGGCATACCCTATCGTCATTTGCAGAATCCGCGCCATGGATCCG F Q V R D N A Y G I T M Q L I R A M S G GCGAGCATTGCAGAGATCAGACACGCTCCATATGCCCGCCAGTTGGATCCAGGAAGTTCG A L M A S I L C A G Y A R W N S G P L E TTGCCAGAAATCGGCTGTTTCGCCCATCGCATTCGGGCATTGACGCTCCCGCACCCCCCG N G S I P Q K A W R M R A N V S G C G G GCAATGTGCCTTTGGGCACCGGTCGCAGGCAATAGCTGCGCCCGATCGCCGAAATCCACC a i h r q a g t a p l l o a r d g f d v AAGACCCAGTCAGCCACTTCACCAAACGGCACGTAATTCGATATGATTGTTCCGTCCGGA L V W D A V E G F P V Y N S I I T G D P GTCACCGCGACGTCTCCAGCAATCGTTATAGACCCCTCTGGAAGCTCGGCGTTGGTCTCG T V A V D G A I T I S G E P L E A N T E GACATGATTCCTCGGACCAATATGGTCTGTATTAACGGTAGCGGCAAGGCATGGCGACCA S M I G R V L I T Q I L P L P L A H R G GCAACAAAGGCGATCGGATAGACATCGGACAGACTCAATCCTGCCCCCCCCATCGCTTCA A V F A I P Y V D S L S L G A G G M A E GCCACCAAGGCGTCGGTAAAGCCGGACTCCTGTAATGCCCCCCAAAGTGCGGCACGTTCC A V L A D T F G S E Q L A G W L A A R E TTCGTGCCGCCCTCTCCCCTCTCGATACGGCGCACATGATTCGGCGTACAGCAATGAGCG K T G G E G R E I R 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CAGGTGCTGCGTCTCAAGCGGCCGCCTAGCCTACCGTACGAGTAGTACAACTTCGGGCTT A V I F G W K P F D L N S P A H F Y Y V CGCCACTATAAGCCTACCTTCGGGAAGCTGGAGTTGTCAGGCCGGGTGAAGATGATGCAC v l a v m l g v y f l l r a v l r s s f CAAGACCGTCACTACGAACCTCAGATGAAAGACAACGCCCGACACGACGCTAGCTCGAAA G H A L A G I K S N E H R W R S L G F P CCGGTGCGGAACCGTCCGTAGTTCAGGTTGCTCGTGGCGTACGCAAGCGACCCAAAAGGC V Y R Y K L A A F T L A G T V A G L A G CAGATAGCAATGTTCGAGCGGCGGAAATGGGAGCGGCCGTGGCACCGGCCGAACCGGCCG Y L G A L Q F G F V N P E L L G W H Q S ATAGACCCGCGCGACGTCAAGCCGAAGCAGTTGGGCCTCAACGACCCGACCGTGGTCAGC G N V L M M V I L G G M G S L T G P V T CCGTTGCAGGACTACTACCACTAGGACCCGCCGTACCCATCGGAGTGCCCCGGACAGTGC G A F T L V L L Q E F L T G L T K H W Q CCTCGCAAGTGGGATCACGACGAAGTTCTCAAGAATTGGCCGGAGTGGTTCGTAACCGTT V L M G S F I V L V A L M L P H G L S G CAGGACTACCCGTCGAAGTAGCACGACCAACGCAACTACGAAGGGGTACCGGACTCACCG F S L T R Y R L R A H T D T R T T P E K AAAAGGGAATGTGCTATGGCTAACTCCCGCGTGTGGCTATGAGCTTGGTGTGGCCTTTTC CTGGTACAGACTTGGGTAAGAAGCGTGGTGGCTCAACTGGTTCGTGAAACCACCCGAACG | S E P I L R T T E L T K H F G G L A mbdB4 GCGTCAGTTGGTTCACAGGGAGCTGAAAATGCGCCCCGTTCACGTGCGCGACGAGCCGGG A V N Q V S L D F Y A G Q V H A L L G P GTTACCCCGCCCGTTCAGGTGGAAGTAG'rrGGAAGAGAGCCCGCTAGATTTCGGTTCGCC N G A G K S T F I N L L S G D L K P S G ACCTCTTCACTCGGACCGGCCCACGCGCTAGCTCCCTGACAGAGGCCTCTTTTAAAGCGC G E V S L A G C A I E G L S P E K I S R GTACCCGCACCCCGCTTGGATGGTCTTCTGCTTATAGAAAGGGCGTAAATGCCATAAGCT M G V G R T Y Q K T N I F P A F T V F E 135 CTTGCGCGCGGAACGACGGGTCAGCGCGGCGGGCGTACGCAAAGTGGACAAGGCGGTGCG 2 58 00 N A R L A A Q S R R P H A F H L F R H A TGAGCGAACACCGCTGTGGAACCTTGACCGGCTCTTCCACGAACGGTACCCCCTCGACTG 2 5 8 6 0 L A C G D T L E L A E K V L A M G E L T TGTGGCGTCCTTACTGTACCGTCGGTATGACAGGGTACCGCTCGTCGCGGrTGAGCTTTA 2 5 9 2 0 h r r n d m a a i l s h g e c r q l e i GCGGTACCGCGAGCGGTGACTTGGGGTCCACGATAACGAACTACTTGGGAACCGGCCTTA 2 59 8 0 A M A L A T E P C V L L L D E P L A G M CCCCCGGTGCCTCAGCCGCCGGTACCACGCCAACGAGTTCTTTGAGCGTCTCCTAGTGCG 26 04 0 G A T E S A A M V R L L K K L A E D H A CTAAAATGACCAGCTTGTGCTGTACCTACGGCACAAACGCCAGCGGCTACAGCACTGACA 2 6 1 0 0 I L L V E H D M D A V F A V A D V V T V GTACCAGTTGCCGTGTCACGACCTCAGCCCGTCGGGGC M V N G T V L E S G S P G GCGTTAGGCACGCTCACGGCG 2 6 1 6 0 A I R A £ A A mbdBS I N H S L L E BHHHMHHH 26220 GCAAGTCCTTCGGATAGAGCCACGTCTCCTCCTACTCTCGGTACTTGGTGAGCAACGAAC 2 6 2 2 0 V C E A Y L G A E E C E S H E P L V A * F2 A R G I H T Y Y G A S H I L R G I D F T TTCGAGCGCCCTAGGTATGAATAATACCGCGATCAGTGTAGGAGGCACCGTAACTGAAAT 2 62 8 0 V R R G E T V G L M G R N G M G K T T L WKKÊÊÊÊÊÊÊÊIÊÊttÊtÊIÊKlÊÊÊÊKÊBÊÊlIÊÊÊtÊtÊKÊÊUÊÊIBÊÊlÊiÊtÊIÊÊM 25340 CCACGCGGCGCCGCTCTGCCAGCCAGATTACCCGGCTTTGCCGTACCCATTTTGTTGCG 2 6 34 0 ACAACTTCTGCGACTACCCCCAGCACGGGAGCGTGTTCCCGCTCTAGGCCTAGTTGCCAG 2 6 4 0 0 v t t r s q p c r i a r h g v a y v p e TGCAGTGATGGGCGAGGGTCGGCACAGCTTAACGAGCGGTGCCGCAGCGTATGCACGGCC 2 6 4 6 0 g k g i f p n l s v r e n L V m a a r p TCCCCGCCCCTTAAAAGGGATTGGAGAGCCACGCGCTCTTAGAGCAGTACCGTCGGGCCG 2 6 52 0 g v g g r r d w t f e r a l k t f p r l GGCCGCACCCGCCAGCCGCCCTGACCTGGAAGCTCGCACGTGACTTTTGAAAGGGCGCAG 2 6 5 8 0 G E R L G H G G G Q L S G G E Q Q M L T .AACCACTTGCCGATCCGGTA'^CGCf^GCCTGTCGAAAGCCCGCCGf'TCGTCGTCTACGACT 2 6 64 0 i g r a l m t n p d l l i l d e a t e g GGTAGCCGGCGCGTAACTACTGGTTAGGCCTGGACGAGTAAGAGCTGCTCCGATGGCTTC 2 6 7 0 0 m b d B 5 F I I W T V I G A I R D T G CCAATCGCGGTTAGTAGACGGCGCTCTAGACCTGACATTAACCACGGTAGTCCCTGTGGC 2 6 7 6 0 è â l A T I I V D K N F R A I S S I T D R N 2 6 8 2 0 CATAGCGGTGCTAGTAGCAGCTGTTCTTGAAAGCGCGGTAGAGCAGCTAGTGGCTAGCGT 2 6 82 0 V I L V K G N V V F E G D R E A L R S Q TACATTAAGACCACTTTCCGTTGCACCACAAGCTCCCGCTGGCGCTCCGCGATGCCAGCG 2 6 8 80 PffdPdA SCàl S' g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g l ^ g G G C C C C G C C C A A G T T T T C A f T A T C T 2 6 9 4 0 TTGGCCTTCACAACTTTTTAAAAGAGCCGCAAACTCCGGGGCGGGTTCAAAAGTAATAGA 2 6 9 4 0 I n t e r g é r n c a m b d B S -m b d A K p n l 5 ' L"lAO'iALÇÇiiCAAAGAAGGGCCAAACAGATCTATTGCATACTATCCGGTTAGTACGTCTT 2 7 0 0 0 GATCATGGCCGTTTCTTCCCGGTTTGTCTAGATAACGTATGATAGGCCAATCATGCAGAA 2 7 0 00 TTGACCAATTGATCTACACGAGGGGAAACCATGTTCGAGAATTTCAACCATAGTGCTCTG 2 7 0 6 0 AACTGGTTAACTAGATGTGCTCCCCTTTGGTACAAGCTCTTAAAGTTGGTATCACGAGAC 2 7 0 6 0 CGTCTTGGAGCGCCAGGCGCTTTAGCGCAGCGTTTGCTGCCGAAGCATCAGGGTCACTAT 2 7 1 2 0 GCAGAACCTCGCGGTCCGCGAAATCGCGTCGCAAACGACGGCTTCGTAGTCCCAGTGATA 2 7 12 0 mbdA PrSS^ E c o R I 3 ' m bdA H i n d i 11 5 ' ^ É R O V R I N O G N N G gttgatgcgcattgaggaââcc !̂P^BHÉHHHHHIHBIIHHI 27100 ■ r_AArTAf^y ^ ^ ^ ^ - y g ( pTTTGGCTGGTACGCTGTTCACGCATAATTGGTTCCGTTGTTAC 2 7 1 0 0 I n t e r g é n i c a m b d B S -m b d A X b a l 3 ' . 2 P E L Q F P H T F N V A S A L I D R H L CAGGCCTCGACGTTAAGGGTGTGTGGAAGTTACACCGTTCACGGAACTAGCTAGCGGTAG 2 7 2 4 0 D E G R G K K T A I L T V D E T V N Y E ACCTGCTCCCTGCCCCTTTTTTCTGACGCTAGGAATGGCAGCTACTTTGACAGTTAATGC 2 7 3 0 0 Q I T A A I M A E T P L Q H V L P A R H TGGTCTAGTGGCGACGCTAGTACCGGCTTTGAGGCGACGTCGTACATAATGGCCGCGCAG 2 7 6 0 0 V A G S L A E L A R D E S P T L A A S P TGCAACGGCCTTCAGACCGGCTTGACCGCGCGCTACTCAGTGGTTGCGACCGGCGTTCAG 2 7 6 6 0 m bdA m ut H i n d I I I 5 ' . 2 A A A D D D C F W L Y S S G T T G R P K GCCGACGACGCCTACTGCTAACAAAAACCGACATAAGGAGGCCTTGGTGACCGGCCGGCT 27 7 2 0 G V V H A H R D I V A T S Q L Y N V G I TCCCTCACCAGGTGCGGGTGGCGCTATAACAGCGGTGGTCAGTCGAGATATTGCAGCCTT 2 7 7 8 0 L G G N V S D I Y Y S I P R L F F A Y G AAGAGCCACCTTTGCACTCGCTATAGATAATGAGCTAGGGGTCCGAAAAGAAGCGGATGC 2 7 8 4 0 L G C G M T F P L W V G G T A V L D A R CTGACCCCACGCCGTACTGCAAGGGCGAAACCCAGCCGCCGTGTCGTCACGAACTGCGGG 27 9 00 R P L P P I T A E L F A R F K P T I F A CAGCAGGGGACGGCGGCTAATGGCGGCTCGAAAAGCGGGCTAAGTTCGGCTGGTAAAAGC 2 7 96 0 A V P T Y F S A L E A S S L L K S E H V GGCGCCACGGCTGGATGAAGAGACGTAACGACCGAAGTAGGGACAACTTCAGCCTTGTGC 2 3 0 2 0 V T L R R C V S G G E A L P E E L p R R ACCACTGCGACGCAGCGACGCAAAGGCCGCCACTTCGCAACGGACTTCTTAACGTCGCTG 2 9 0 8 0 W R Q I A P A P I T D G I G S T E A L H CGACCTCCGTTTAGCGTGGGCGTGGGTAGTGGCTACCGTAGCCGAGCTGTCTTCGGGAGG 2 9 1 4 0 I Y I S N T I D D I R P N S S G R A V P TATAGATATATAGTTTGTGTTAGCTGCTGTAAGCAGGGTTAAGGTCGCCAGCACGTCAAG 2 9 2 0 0 G Y Ç L R I I D E N G D A I L D D S P G GGCCGATGGTTGACGCTTAATAACTGCTTTTGCCTCTACGTTAAGAGCTGCTGTCGGGGC 2 9 2 6 0 R L L V K G P S V T R R Y W N N P A K T CAGCGGACAACCAGTTCCCCGGTAGCCACTGGGCCGCGATGACCTTGTTAGGCCGCTTTT 23 3 2 0 A S S I V D G W L D T G D T Y Y R D S D 2 8 3 8 0 GAGGTAGGAGrTAArAGGTAGCGArrGAGrTATGGCCGrTATGGAJAATGGCGCTATCGC 29 3 8 0 bdA m uc X b a l 3 ' G Y Y Y Y C G R N D D M L K V G G I W V WÊÊKÊÊÊtÊÊÊÊfÊÊÊÊÊÊÊÊÊÊÊIÊIIÊÊiÊÊÊKÊÊÊtÊÊÊKÊÊtÊÊÊÊÊÊÊÊtÊÊIÊÊÊÊl 2 9 4 4 0 TACCGATAATAATGATGACGCCTGCATTACTACTGTACGAGTTTCAGCCCCCTTAGACCC 2 94 4 0 S P F E I E A A L I S H P D V L E A A V ATAGAGGTAAGCTCTAGCTTCGCCGGGACTAAAGGGTAGGCCTGCATGAGCTCCGCCGCC 2 9 5 0 0 T G R A D D A G L I K P E A W I V L K I ATTGGCCAGCCCGCCTGCTACGCCCAGAGTAGTTCGGGCTCCGTACCTAGCATGAGTTCT 2 3 5 6 0 A A Y A G E L L A E D I R T L C K T A L AACGCCGTATGCGGCCTCTTGACGAACGGCTCCTATAGGCTTGAGAGACGTTCTGGCGGG 2 9 6 2 0 A P Y K Y P R W I H F V D E L P K T A T AGCGCGGTATGTTCATAGGGGCTACCTAGGTAAAACAACTACTCAACGGCTTCTGGCGCT 29 6 8 0 G K I Q R F K L R N A A K D * g g g g g g g g g g g g g 0 g g g g g g g g g g g g | g | 0 T C C C G C A G G C A A C 2 9 7 4 0 GACCGTTCTAGGTCGCGAAATTCGAGTCTTTACGCCGAGTACTGACTAGGGCGTCCGTTG 2 9 7 4 0 m bdA X b a l 3 ' TCAACAGCAAGCGCTCCACGAACCCCATCCTTACGTAGCCACGGGTGAGCCCATTCCATT 23 8 00 AGTTGTCGTTCGCGAGGTGCTTGGGGTAGGAATGCATCGGTGCCCACTCGGGTAAGGTAA 2 9 8 0 0 ACACACATCTCAAAGCTCACCGAGCTCACGGGAGTGACGCAGGCCCGCGGCGAAGTCGGT 29 8 6 0 TGTGTGTAGAGTTTCGAGTGGCTCGAGTGCCCTCACTGCGTCCGGGCGCCGCTTCAGCCA 23 86 0 GACGCGCTGTAATCCGAGCCAGAGGGACATGCGTCCAACCGAAATCCCGCTCTCGGCGGG 23 9 2 0 CTGCGCGACATTAGGCTCGGTCTCCCTGTACGCAGGTTGGCTTTAGGGCGAGAGCCGCCC 23 92 0 m b d P P s c i 3 " — jJ ib d R X h o l 3 " CAAACGCCTCACATTT C A U À A Ï^ T C Ü ^ ^ ^ n % X G G j# JL T C T A T C C A C A A T C A A G C C 2 3 9 8 0 G T T T G C G G A G T G T A A | | | | | B B B H H H H I i i H ^ H H i H i H H H H H H I l i 2 9 9 8 0 * f t p n k c s g r d v i l g 3 'm b d R m u t2 ( E c o R I ) A ri'G AGAAGiAiPUATCTCAATGCTTTGGTAAGGGTCTTTCCCGTTAGTTCGTTCGGCCT 2 9 0 4 0 N L L V S R L A K T L T K G T L E N P R CCGATACCAITCAATGAGTACTCCGTCATGGGCCGCCATCACGATTGATGCCAGTTCATC 2 9 1 0 0 R Y W E I L V G D H A A M V I S A L E D ACTACCGGAATCGGACCGAAATACACCTTCGGTTTGGCCTTGTGCGATCAACTGTTCGAC 2 9 1 6 0 m bdA R2 G D R V L M V I K D A P E F Y Y V F W G GCCCTCTGGCCCACGACTACCAGTAGTTCCTACGCGGCCTTAAGATGATGCACAAGACCC 2 7 4 2 0 S G S D S R F V G E T Q G Q A I L Q E V GTGCCCATACATCCGACGGTAAATGGCCTTAGCCCTTTTCTCAATATCATCTCCGGTACC 2 9 2 2 0 H G Y M R R Y I A K A R K E m b d R -A 3 ( E q c R I ) GGAAAAATCGATGGACACAAGAATAAGCAATAGGACATGCTGCGGCTTÂGTC^ÇfCTAG 2 9 2 8 0 C I K T G I I P V P L N T M L T S E D Y CTACGTAGTTTTGCCCCTAGTAGGGCCACGGGGAATTGTGGTACGACTGTAGCCTTCTGA 2 7 4 8 0 S F D I S V L I L L L V H Q P K T V G L GAGTGCTTGCATGTTGATGAATTTCACCAGCTTCGCGTCGGCGAGCGGACCCGCGTTCGC 2 934 0 K F I I A D S G A N V L V Y S E E F K D TGTTCAAGTAGTAACGGCTAAGCCCGCGCTTACACGACCACATAAGGCTTCTCAAGTTTC 2 7 5 4 0 L A Q M N I F K V L K A D A L P G A N A CATGTACTCATCGATCGGATCAACAATGTACTTTTCTGCTTCCTCAAGGAGCATCAGCAT 2 9 4 0 0 P D V I Y K E A E E L L M L M 136 GATTGCGTCTTTGGTCTTGAAATAGAAATAGATCGCACCCTTGGTCAATCCTGCTCTTGC 2 9 4 6 0 CGCGATCATGTCGATCGTTGTCGCACGGTAACCATTTTTQACGAAAAGATCGAGCGCACA 2 9 5 2 0 m " T T A R Y G N K V F L D L A C S 'm b d R m u t2 ( H i n d l l l ) ________ GCCCAGTATATTCTCGGTACTGGCCTTCCTCTGCTCTTCCTTCTTGTTCAGCTTTCTCAT 2 9 5 6 0 Pm bdR X b a l 3 ' P m b d R E c o R l 2 'm b d R Nd e l ÜA1 u 1L J.'GCAC%T?̂f!̂^̂ÂTGGA'lïrTGCCTĈ̂RGCPm bdR X b a l 3 ' P m bdR E c o R l 3 'm b d R U d e l 5 ' m bdR S a i l 5 ' mbdR GGCACTTCAGAGAAGGTTGGCAATTT 2 96 4 0 CTA CA G A CCTC TA C A A G G ™ CCTAAACGGAGAGCCGTGAAGTCTCTTCCAACCGTTAAA 2 9 6 4 0 n̂ R-A5 (fiamHi) TAAGTGAGAACGCCGCATTCTGAACGTTCGCCAGCCAGTCGACCTCGGGTTGTCCAGAAA 2 97 0 0 ATTCACTCTTGCGGCGTAAGACTTGCAAGCGGTCGGTCAGCTGGAGCCCAACAGGTCTTT 2 97 00 GCGGTACGCGGCCACCGTCTCCGCGGATTGGCCAACAACCATTCCATCAGCACCTTCGCC 2 9 7 6 0 CGCCATGCGCCGGTGGCAGAGGCGCCTAACCGGTTGTTGGTAAGGTAGTCGTGGAAGCGG 2 9 7 6 0 CGCTTGTCCAGTTTCTCGTCACCCAGCGCCATCCCCGAAAATTCCTCCGCCACCCAGGCC 2 9 8 2 0 GCGAACAGGTCAAAGAGCAGTGGGTCGCGGTAGGGGCTTTTAAGGAGGCGGTGGGTCCGG 2 9 8 2 0 TTCGTCGCCAATCGGTCACCCAAACTGTAAGAGTAGACGCATTTTACGCTGAGTTTACAA 2 9 8 8 0 AAGCAGCGGTTAGCCAGTGGGTTTGACATTCTCATCTGCGTAAAATGCGACTCAAATGTT 2 9 8 8 0 TCG'CTTGGTGTAAGTGATTGAAGGTCAATGGATATTTCGGTCGGCGCGTTGGTGGTGAAG 2 9 9 4 0 A G rG a a r rA v -A -T rA rT A A rT T rrA G T T A rG T A T A A A G rrA G rrG ^ A A r c A C C A C T T C 2 9 94 0 AGTTGTGTATAATAATATAAATTACAAGAGTATTTCGTGATGTACGGAATTGATGGATAC 3 0 0 00 TCAACACATATTATTATATTTAATGTTCTCATAAAGCACTACATGCCTTAAC^ C T A T G 3 0 00 0 Pm bdR S e a l 5 ' CTGACTTCGAGCAT 3 0 0 1 4 GACTGAAGCTCGTA 3 0 0 1 4 P m bdR K p n I 5 ' 137 V. D iscusiôn 139 1. Identificaciôn y caracterizaciôn genética del cluster mbd, responsable de la ruta central para el catabolismo anaerobico de 3-metilbenzoato y m-xileno en Azoarcus sp. CIB Com o se ha indicado en el apartado 3.2 de la Introducciôn la ruta periférica encargada de la biotransform acion anaerobica del w-xileno conduce a la formaciôn del m etabolito intermediario 3-metilbenzoil-CoA. Por otro lado, el 3MBz podria activarse con un gm po CoA para form ar tam bién 3-metilbenzoil-CoA siguiendo un proceso de activacion paralelo al seguido por el benzoato (Krieger et a l, 1999; para revision ver Carm ona et a i, 2009). E l objetivo principal de esta Tesis ha sido la identificaciôn por prim era vez de los déterminantes génicos responsables de la ruta central del 3-metilbenzoil-CoA. yli:(oarcus sp. CIB constituye uno de los pocos ejemplos descritos de m icroorganismos capaces de crecer anaerobicamente em pleando 3MBz como ûnica fuente de carbono (Fig. 11), una habüidad que solo se habia docum entado en algunas bacterias desnitrificantes taies com o A^vtparcus sp. T (Verfürth et a i, 2004) y A :̂;parcus sp. M3 (Leutwein y Heider, 2002) y en la cepa reductora de sulfato mXySl (Harms et a i, 1999). E l analisis in silico del genom a de A.t^arcus sp. CIB revelo la existencia de una agrupacion de 26 genes localizada junto al cluster bss-bbs responsable de la ruta periférica para la degradaciôn anaerobica del tolueno y w-xileno (Fig. 10) (Blâzquez, 2009). E l anâüsis de la secuencia de algunos de los genes incluidos en el nuevo cluster (Tabla 6) sugeria su impHcacion en una nueva ruta anaerobica central similar a la ruta central del benzoil-CoA (ruta bzd) en A ^arcus sp. CIB (Lopez-Barragan et a l, 2004), y que se denom ino ruta m bd (de methyl-ben’c^ate degradation). La ruta m bd tendria com o intermediario central al 3-metiIbenzoiI-CoA, que puede formarse a partir de la degradaciôn del m-xHeno por la ruta periférica bss-bbs o mediante la tioesterifiacion directa del 3MBz con un grupo CoA en una ruta periférica constituida por la 3MBz- CoA Hgasa. A continuacion se postula la pérdida de la aromaticidad del aniUo bencénico del 3-metilbenzoil-CoA por la accion de la 3-metilbenzoil-CoA reductasa. El com puesto aliciclico résultante experimentaria un proceso similar al de una [3-oxidaci6n para form ar un acido graso alifatico dicarboxQico. O tros genes incluidos en el cluster mbd, y cuyos productos se identifican con actividades hidratasas, deshidrogenasas y tiolasas, podrian 141 estât implicados en la incorporacion del com puesto alifatico dicarboxil-CoA al m etabolismo central bacteriano. La dem ostraciôn experimental de que los genes del cluster mbd estân implicados en el catabolismo anaerobico del /^-xileno y el 3MBz se obtuvo construyendo y analizando las estirpes m utantes Agoarcus sp. CIBdwWO, At^arcus sp. ÇA^àmbdY, Agoarcus sp. CYQàmbdA, Agoarcus sp. CW>dotf5 y Agoarcus sp. C i^àoîfô , las cuales se m ostraron incapaces de crecer anaerobicamente empleando 3MBz o w-xileno (a excepcion del m utante mbdA) com o ünicas fuentes de carbono (Fig. 12B). La observacion de que los genes mbd se inducen especificamente en presencia de 3MBz (Figs. 18 y 21) y que ciertas actividades enzimaticas M bd (taies como la 3-metilbenzoil-CoA reductasa) son también inducibles por 3MBz (apartado 3.2 de Kesultados), corroboran la implicacion del cluster mbd en el catabolismo anaerobico del 3MBz. D ado que todos los m utantes mbd eran capaces de utüizar benzoato anaerobicamente (Fig. 12B), se confirma la existencia de una ruta central distinta de la ruta bzd para la degradaciôn de w-xileno y 3MBz en Agoarcus sp. CIB. Com o se ha indicado en la Introducciôn, una gran variedad de compuestos aromâticos son canalizados metabôlicam ente a través de las denominadas rutas periféricas hacia unas pocas rutas centrales anaerôbicas que tienen com o sustrato a los com puestos benzoil-CoA, 2-aminobenzoil-CoA, 3-hidroxibenzoil-CoA, 6- hidroxinicotinato, resorcinol, floroglucinol e hidroxihidroquinona (para revision ver Carmona et al., 2009). Este trabajo es el prim ero que identifïca y demuestra la existencia de una nueva ruta central, mbd, de degradaciôn anaerôbica de compuestos aromaticos (como w-xileno, 3MBz, o-cresol) a través del intermediario 3-metilbenzoil-CoA. 2. Caracterizaciôn bioqufmica del cluster mbd Una vez identificado el cluster mbd, se profundizô en el analisis bioquimico de la actividad enzimâtica inicial necesaria para la activaciôn del 3MBz, asi com o en los dos primeros pasos del catabolismo anaerôbico del 3-metilbenzoil-CoA. 142 2.1. Identificaciôn y caracterizaciôn de las actividades 3MBz-CoA ligasa, 3-metilbenzoil-CoA reductasa y metil- ciclohexa-1,5-dieno-carbonii-CoA hidratasa 2.1.1. MbdA e s la primera 3-metilbenzoato-CoA ligasa caracterizada El analisis de la secuencia del producto del gen mbdA revelo su similitud con las enzimas benzoato-CoA Ugasas (Tabla 6). Ademâs, aunque la cepa m utante Agoarcu's> sp. C I^dm bdA fue incapaz de utüizar 3MBz, sin embargo, se m ostrô capaz de crecer en m- xüeno. Este resultado esta de acuerdo con el papel propuesto para el gen mbdA com o responsable de la activaciôn del 3MBz a 3-metübenzoü-CoA, una reacciôn no necesaria cuando el microorganismo crece en w-xüeno puesto que el 3-metübenzoü-CoA procédé directam ente de la ruta periférica de degradaciôn anaerôbica de este com puesto (Krieger et a l, 1999). La funciôn del gen mbdA se confirmô experimentalm ente mediante la detecciôn de una actividad 3MBz-CoA ligasa en extractos de una cepa de E . coli que hiperexpresaba el gen mbdA. Curiosamente, la proteina M bdA también presentaba unos niveles de actividad CoA ligasa simüares cuando se empleaba benzoato com o sustrato (Fig. 14). La benzoato-CoA Ligasa anaerôbica (BzdA) de Agoarcus sp. CIB posee un 47% de identidad de secuencia con MbdA y una significativa actividad especifica sobre el benzoato (8.9 pm ol min^ mg^ m ediante el ensayo directo; 1.6 pm ol min ’ mg^ mediante el ensayo indirecto) si bien no utüiza 3MBz como sustrato (Lôpez-Barragan et a l, 2004). El hecho de que MbdA m uestre una actividad CoA-Hgasa (0.31 pm ol min^ mg ’ mediante el ensayo directo, 0.11 pm ol min ’ mg ’ mediante el ensayo indirecto) significativamente inferior a la de BzdA podria deberse en parte a una m enor producciôn de MbdA, que no pudo ser detectada cuando los extractos de E . coli DHIOB (pUCmbdA) se anaüzaron m ediante SDS-PAGE (datos no m ostrados), al contrario de lo que se habia observado con BzdA (Lôpez-Barragan et a l, 2004). A diferencia de las benzoato-CoA ligasas, las cuales son capaces de actuar sobre un ampHo rango de sustratos que incluye a distintos anâlogos del benzoato (como por ejemplo cloro y fluorobenzoatos, derivados hidroxüados, etc.) pero no al 3MBz, MbdA tiene un rango de sustratos que se limita al benzoato y a derivados metüados y halogenados de éste (principahnente con los sustituyentes en posiciôn metd). Por eUo, la proteina M bdA es, hasta la fecha, la primera 3MBz-CoA ligasa descrita, por lo que su utüizaciôn para la sintesis de derivados CoA del 3MBz podria resultar de interés 143 b io tecno log ico en la p roducc iôn industria l de nuevos poliquétidos y o tro s com puesto s de in terés farm acéutico (Borejsza-W ysocki y H razdina, 1996; G ard a -B ern a rd o et al., 2004). E l analisis filogenético de las principales C oA ligasas de benzoato y sus derivados révéla que éstas se agrupan en subfam ilias segun el sustrato de la ru ta en la que in tendenen ; 3 -h id rox ibenzoato-C oA ligasas, benzoato -C oA ligasas, 4 -h id rox ibenzoato - C oA ligasas y 2 -am inobenzoato-C oA ligasas (Fig. 43). La 3 MB z-C oA Hgasa (M bdA) esta relacionada filogenéticam ente con el g rupo de las benzoato-C oA Hgasas, si b ien rep résen ta una ram a evolutiva claram ente diferente. P ro te in a M ic ro o rg a n is m o 0.1 C { N o m b re R éf. N o m b re C la s e S u s t r a t o AbmgI AAL02069 A. ev a n sii P 2ABz (4O 2) Abmgll AAL02077 A. ev a n sii P 2ABz (+O 2) HbcL C A C 28158 T. arom atica P 3 H B z ( -0 2 )* H bcL GAI06492 A. a rom aticum EbN 1 P 3 H B z ( - 0 2 ) p HcrL GAI09172 A. a rom aticum EbN 1 P 4 H B z (-0 2 )* BzdA A A Q08820 A zo arcu s s p . GIB P Bz {-02)* BzdA G A D21640 A. eva n sii P Bz (-0 2 )* BzdA GAI09137 A. a ro m a ticu m EbN 1 P B z ( -0 2 ) BclA AAN39371 A. e va n sii P Bz ( + 0 2 ) p Bel A GAI07674 A. a rom aticum EbN 1 P Bz (+O 2) BclA G A D21683 r. arom atica P B z ( -0 2 /+ 0 z ) ' BclA BAE91925 M agnetospirillum s p .T S - 6 BzC-OjZ+Oa)* BamY ABB32372 G. m eta ilireducens G S - 15 5 B z (-O z ) ' Bel A G P50613 D. m ultivorans 5 B z (-O z ) ' B C L m A BE31536 B. x e n o v o ra n s LB400 P Bz (+Ü 2)* B C L c ABE36771 8. x e n o v o ra n s LB400 P Bz (+ 0 2 )* B ad A GA E26105 R. palustris G G A 009 Bz (-0 2 )* M bdA - A zo a rc u s s p . GIB P 3M Bz(-O z)* HbaA G A E26113 R. palustris G G A 009 4 H B z (-0 2 )* G a ie ABQ44579 P se u d o m o n a s s p . GBS3 Y 4 G IB z(40a)* C alC AAF16406 P se u d o m o n a s s p . D J -12 V 4 G IB z (+ 0 2 ) F cbA I P86831 A rth ro b a c te rs p .J M -^ A ct(G + ) 4G IB z(+02)* Figura 43. Ârbol filogenético de las principales CoA ligasas del benzoato y sus derivados. El alineamiento multiple de las proteinas se realizô con el programa ClustalW y el ârbol filogenético se ha realizado y visualizado como se indica en el apartado 9.2 de Materiales y Métodos. La barra que indica la escala équivale a una sustituciôn de un aminoâcido por cada 10. Cada proteina se identifica por su nombre y por su côdigo de GenBank. Ademâs se detalla el nombre de la bacteria en la que se ha identificado y, dado que la mayoria son microorganismos Gram-negativos del filo Proteobacterias, se indica a que clase pertenecen. Las cepas Gram-positivas se indican especificamente (G+). Por otro lado, se indica el compuesto aromâtico que actûa como sustrato de la ruta catabôlica, si esta actùa en presencia de oxigeno (+O2) o en condiciones anôxicas (-O2), y si la proteina se caracterizô bioquimicamente (*) o se identified mediante estudios proteômicos (P). Las abreviaturas de los compuestos aromâticos que aparecen en la figura son: Bz (benzoato), 3HBz (3-hidroxibenzoato), 4HBz (4-hidroxibenzoato), 4CIBz (4-clorobenzoato), 3MBz (3- metilbenzoato), 2ABz (2-aminobenzoato). Los rectângulos sombreados en diferentes colores sehalan diferentes grupos de CoA ligasas: violeta, 3HBz-GoA ligasas; azul, Bz-CoA ligasas; verde, 2ABz-CoA ligasas; rojo, 4CIBz-CoA ligasas; gris, 3MBz-GoA ligasa. 144 H asta la fecha la ûnica benzoato -C oA hgasa cuya estructura trid im ensional ha sido dilucidada (PD B 2V7B) es la p ro te ina BCL^ ,̂ pertenecien te a la ru ta aerôbica de degradaciôn de b en zo a to (ruta box) de la (3-proteobacteria Burkholderia xenovorans LB400 (G oris et al., 2004; Bains y Boulanger, 2007). C om o se ha ind icado en la Introducciôn, algunos m icroorgan ism os anaerobios facultativos son capaces de degradar aerob icam ente el b en zo a to m edian te su activaciôn con u n g rupo C oA a través de la ru ta aerôbica h ibrida b o x (Ferrândez et al., 1998; G escher et a l, 2002; Schühle et a l, 2003; G escher et a l, 2006). Las benzoato -C oA hgasas de las ru tas aerôbicas hibridas de degradaciôn del ben zo a to son srmilares a las rm phcadas en ru tas anaerôbicas (Fig. 43) (Fuchs, 2008). La p ro te ina BCL;^^ posee un 43% de iden tidad de secuencia con M bdA , que se refleja p o r ejem plo en la consen^aciôn de los am inoâcidos clave para la in teracciôn con el sustra to (Bains y B oulanger, 2007): Phe236, A la237, Tyr238, Ile332, Gly333, Ser334, T hr335, H is339, Ile340 y Lys519 (en posic iôn 520 en BCL^^J. E n la Figura 44 se m uestra un m odelo de la estructura trid im ensional p red icha para M bdA y la locahzaciôn de los am inoâcidos catahticos resenados an terio rm ente . MbdA P h e 2 3 6 A la 2 3 7 T y r2 3 8 L y s5 1 9 \ M J 1 3 1 4 H is3 3 9 Il 6 3 4 0 h N e332 G Iy 3 3 3 S e r 3 3 4 T h r3 3 5 Figura 44. Modelo de la estructura tridimensional propuesta para MbdA. Para la obtenciôn del modelo se ha empleado la aplicaciôn 3D-Jigsaw (ver la secciôn 9.3 de Materiales y Métodos) utilizando como molde la proteina BCL^ de B. xenovorans LB400 (PDB 2V7B). Los residuos presuntamente implicados en la interacciôn con el 3MBz aparecen recuadrados con diferentes colores y sehalados en el modelo. 145 Las bacterias anaerobias facultativas de los géneros Agoarcus, Thauera, Khodopseudomonas y Magnetospirillum poseen en su genom a un num éro variable de genes codificantes de actividades benzoato-CoA ligasas. Sin embargo, el rango de sustratos de estas CoA Hgasas y los factores que determinan su expresiôn, varian sensiblemente entre los diferentes géneros. E n R. palustris CGA009 existen très CoA Hgasas que activan el benzoato, pero asi com o BadA (CAE26105) es altamente especifica para este compuesto aromâtico (Geissler et a l, 1988; Egland et a l, 1995), HbaA (CAE26113) también actûa sobre el 4-hidroxibenzoato (Gibson et a l, 1994; Egland et a l, 1995) y AHA (AAC23919) sobre el ciclohexanocarboxüato (com puesto aHcicHco; Egland et a l, 1995; Egland et a l, 1997). Por el contrario, en T. aromatica en lugar de existir varias proteinas con actividad benzoato-CoA Hgasa existe una sola proteina, BclA (CAD21683), capaz de transform ât el benzoato en benzoü-CoA en presencia o en ausencia de oxigeno, y ademâs es capaz de actuar sobre el 2-am inobenzoato (Schühle et a l, 2003). E n Magnetospirillum sp. TS-6 también existe solo una proteina BclA (BAE91925) que interviene en la degradaciôn del benzoato tanto en condiciones aerôbicas como anaerôbicas (Kawaguchi et a l, 2006). La presencia en cepas del género Agoarcus de varias isoenzimas capaces de activar benzoato a benzoil-CoA, com o por ejemplo la benzoato- CoA Hgasa anaerôbica BzdA (AAQ08820; Lôpez-Barragân et a l, 2004), la benzoato- CoA Hgasa aerôbica BclA (AAN39371; Gescher et a l, 2002) y la 3MBz-CoA Hgasa M bdA sugiere una estrategia similar a la descrita en R palustris CGA009 en donde cada cluster catabôHco codifica la correspondiente actividad CoA Hgasa que inicia la ruta catabôHca. La presencia de mûltiples isoenzimas que tengan un nivel de expresiôn basai podria suponer una venta j a adaptativa para facüitar una buena actividad CoA Hgasa en la célula y com o salvaguarda en el caso de que alguna de eUas se inactive mediante mutaciôn. 2.1.2. Identificaciôn de la actividad 3-metilbenzoil-CoA reductasa, la etapa clave de la nueva ruta central mbd El paso esencial para la degradaciôn anaerôbica de los com puestos aromâticos activados con CoA es la pérdida de la aromaticidad del anillo bencénico mediante una actividad reductasa. Los genes mhdOMQP m uestran srmiHtud con los genes que codifican las cuatro subunidades de las benzoü-CoA reductasas dependientes de ATP de otros microorganismos anaerobios facultativos (Tabla 6). E l hecho de que la cepa m utante A ^arcus sp. CVBdmbdO no posea actividad 3-metübenzoü-CoA reductasa 146 S ubunidad a Proteina Nombre/Ref. M icroorganismo Ruta BcrA/087876 T. aromatica{^) BcrA/BAD42373 tvtagnetospiriiiumsp. JS-& (a) ' BadF/CAE26103 R. palustris CGA009 (a) MbdQ/- Azoarcus sp . CIB 0 ) 3MBz-CoA Bzd Q/AAQ 08809 Azoarcus s p . Cl B (|3 ) BzdQ/CAD21631 A. evansii{^) BcrA/CAI09127 A. aromaticumBbUt B S ubunidad p Nombre/Ref. M icroorganism o Ruta Proteina c BzdO/AAQ08807 Azoarcus sp . CIB O ) BcrB/CAI09125 A. aromaticumBbN^ (P) BzdO/CAD21629A. evansii{^) HbrB/CAI06502 A. aromaticum EbN 1 (p)3HBz-CoA BcrB/CAA12248 T. aromatica{^) BadE/CAE26102 R.palustrisCGAQ09(a) BcrB/BAD42372 lvlagnetospirillumsp.TS-6{a) ' MbdO/- Azoarcus sp . CIB (P) 3MBz-CoA S ubunidad y Proteina Nombre/Ref. M icroorganism o Ruta BzdN/AA008806 Azoarcus sp . CIB (P) BzdN/CAD21628 A. evansii(^) L- BcrC/CAI09124 A. aromaf/curn EbN 1 ( p ) i— HbrC/CAI06503 ,4.arom afcum EbN I (P) 3HBz-CoA BcrC/C/\A12247 T. aromatica (P) BadD/CAE26101 R. palustris CG A009 (a) BerC/BAD42371 tVtagnetospiriiiumsp .T S -6 (a) Mbd N/- Azoarcus sp . CIB (P) 3MBz-CoA Subunidad 5 Proteina Nombre/Ref. M icroorganismo Ruta BcrD/CAAl 2250 T. aromatica (p ) Bad G/CAE26104 fl. pa/usfr;s CGA009 (a) BcrD/BAD42374 tvlagnetospirHlumsp.JS-6(a) BzdP/AAQ08808 Azoarcus sp . CIB (P) BzdP/CAD21630 A. evansii{^) BcrD/CAI09126 A. aromaticumBbNi (P) MbdP/- Azoarcus sp . CIB (p) 3MBz-CoA Figura 45. Ârbol filogenético de cada una de las subunidades que conforman las reductasas de compuestos aromâticos activados con CoA en microorganismos anaerobios facultativos. El alineamiento multiple de las proteinas se realizô con el programa ClustalW y el ârbol filogenético se ha realizado y visualizado como se indica en el apartado 9.2 de Materiales y Métodos. La barra que indica la escala équivale a una sustituciôn de un aminoâcido por cada 10. Junto a cada rama del ârbol filogenético se indica la proteina y su côdigo de GenBank. También se indica el nombre del microorganismo al que pertenece la proteina y, dado que todos los microorganismos son Gram-negativos del filo Proteobacteria, se especifica la clase a la que pertenecen (a o p). A la derecha de cada panel se indica la ruta en la que estân implicadas las reductasas descritas: benzoil-CoA (Bz- CoA), 3-hidroxibenzoil-CoA (3HBz-CoA), 3-metilbenzoil-CoA (3MBz-CoA). Cada panel muestra el ârbol filogenético de cada una de las subunidades de la reductasa: A) subunidad a; B) subunidad p; C) subunidad y; D) subunidad 5. Los rectângulos sombreados indican diferentes grupos de proteinas: amarillo, grupo Azoarcus-, verde, grupo Thauera; gris, reductasa del cluster mbd. Las benzoil-CoA reductasas de T. aromatica, R. palustris, A. evansii y Azoarcus sp. CIB se han caracterizado bioquimicamente (Boll y Fuchs, 1995; Gibson y Gibson, 1992; Ebenau-Jehie et al., 2003; Lôpez-Barragân et al., 2004a); las benzoil-CoA reductasas de A. aromaticum EbNI y Magnetospirillum sp. TS-6 se han detectado por comparaciôn de secuencia con las ya descritas; la 3-hidroxibenzoil-CoA (3HBz-CoA) reductasa de A. aromaticum EbNI pertenece a un cluster que muestra una inducciôn especifica en presencia de 3-hidroxibenzoato (Wôhibrand et al., 2007). Las subunidades a y 5 de la 3-hidroxibenzoil-CoA reductasa son idénticas a las correspondientes subunidades de la benzoil-CoA reductasa de A. aromaticum EbNI. sugiere que el gen mbdO, al m enos, y m uy p robab lem en te los genes m bdNPQ , codifican el com plejo enzim âtico encargado de la reducciôn del 3-m etilbenzoil-C oA . M erece la pena destacar que la 3-m etilbenzoil-C oA reductasa tam bién reconoce eficazm ente el benzo il-C oA com o sustra to y viceversa, la benzo il-C oA reductasa tam bién reconoce el 3 -m etilbenzoil-C oA com o sustra to (Fig. 15). E s te resu ltado esta 147 de acuerdo con obseiw aciones previas que dem uestran que la benzo il-C oA reductasa purificada de T. aromatica es capaz de reducir n o solo el benzo il-C oA sino tam bién, aunque con m en o r eficiencia, a algunos de sus derivados m etüados e liid roxüados taies co m o el 3 -m etübenzoü-C oA y el 3 -h id rox ibenzoü-C oA (Laem pe et a l, 2001; M ôbitz y BoU, 2002). La existencia de una 3 -m etübenzoü-C oA reductasa y una 3-h idroxibenzoü- C oA reductasa (Rabus et al., 2005) d iferen tes a la benzoü-C oA reductasa en cepas del género Apoarcus pod ria deberse a una m ayor activ idad especifica de estas reductasas por sus co rrespond ien tes sustra tos y al hech o de una inducc iôn diferencial de estas enzim as cuando las células se cultivan en los d iferen tes derivados del b enzoato , tal y co m o se ha dete rm inado en esta Tesis co n la inducc iôn de la 3 -m etübenzoü-C oA reductasa en presencia de 3M Bz. E l anâhsis füogenético de las cuatro subunidades de las C oA reductasas depend ien tes de A T P im phcadas en ru tas catabôHcas de com puestos arom âticos révéla la existencia de très g rupos evolutivos: a) benzoü-C oA reductasas de los géneros Thauera ! BJoodopseudomonas! lS/Iagnetospirillum\ b) benzoü-C oA reductasas y 3- h id rox ibenzoü-C oA reductasa de los géneros A ‘goarcus! Aromatoleum\ c) 3 -m etübenzoü- C oA reductasa (Fig. 45). 0.1 Protema M icroorganism o C lu s te r / sustratoNom bre Réf. Nom bre Clase B adB C A E 26106 R. p a l u s t r i s CG A 009 a b a d {B z ) F d x C A D 21632 T . a r o m a t i c a 3 b e r ( B z ) F d x BA D 42375 M a g n e t o s p ir ii iu m s p . T S - 6 a b e r ( B z ) M bdM - A z o a r c u s s p . CIB 3 m b d { 3 M B z ) BzdM A A Q 08810 A z o a rc u s s p . CIB 3 b z d ( B z ) F d x C A I09128 A . a r o m a t i c u m EbN 1 3 b e r ( B z ) BzdM C A D 21632 A . e v a n s i i 3 b z d ( B z ) ferredoxinas asociadas a benzoil-CoA reductasas dependientes de ATP. El alineamiento multiple de las proteinas se realizô con el programa ClustalW y el ârbol filogenético se ha realizado y visualizado como se indica en el apartado 9.2 de Materiales y Métodos. La barra que indica la escala équivale a una sustituciôn de un aminoâcido por cada 10. Junto a cada rama del ârbol filogenético se indica la proteina y su côdigo de GenBank. También se indica el nombre del microorganismo al que pertenece la proteina y, dado que todos los microorganismos son Gram-negativos del filo Proteobacteria, se indica la clase a la que pertenecen (a o (3). A la derecha se detalla el cluster en el que se localizan los genes y entre paréntesis el compuesto aromâtico sustrato de la ruta catabôlica. Los rectângulos sombreados indican diferentes grupos de proteinas: amarillo, grupo Azoarcus; verde, grupo Thauera; gris, ferredoxina del cluster mbd. 148 Los clusters génicos responsables de las rutas anaerôbicas de degradaciôn de com puestos aromâticos contienen frecuentemente genes codificantes de las ferredoxinas encargadas de suministrar el poder reductor al complejo reductasa (Fig. 5). E n la Figura 46 se m uestra el ârbol filogenético résultante de la comparaciôn de diversas ferredoxinas présentes en los clusters catabôlicos de As^arcus sp. CIB, T. aromatica, R palustris, A . evansii, A . aromaticum E bN I y Magnetospirillum ST-6. Podem os observar que al igual que sucede con las reductasas, las ferredoxinas asociadas a benzoil-CoA reductasas de los géneros As^arcusjAromatoleum form an un grupo evolutivo diferente (grupo Agoarcus) al constituido por las ferredoxinas asociadas a benzoil-CoA reductasas de los géneros Thauera! Thodopseudomonas/Magnetospirillum (grupo Thauera). Curiosamente, la ferredoxina M bdM asociada a la 3-metübenzoiI-CoA reductasa estâ mâs prôxima filogenéticamente al grupo Thauera. Esta similitud se podria corresponder con la existencia en el cluster mbd de sistemas de regeneraciôn de poder reductor, que ceden los electrones a la ferredoxina, simüares a los descritos en Thauera (D ôm er y BoU, 2002). Los sistemas de regeneraciôn de poder reductor transfieren electrones a las ferredoxinas, que a su vez se los transfieren a las reductasas de com puestos aromâticos. Las actividades enzimâticas descritas hasta el m om ento que cumplen la funciôn regeneradora del poder reductor son la a-cetoglutarato:ferredoxina ôxido-reductasa de T. aromatica (D ôm er y BoU, 2002) y la a-cetoglutarato:NADP^ ôxido-reductasa de A . evansii (Ebenau-Jehle et a i, 2003). Ambas actividades catalizan la transform aciôn de a- cetoglutarato a succinü-CoA, por lo que se conocen com o K G O R {keto-glutarate oxido- reductases), y se diferencian, entre otras cosas, en el num éro de subunidades que las com ponen. La actividad K G O R descrita en T. aromatica estâ codificada por los genes korAB, incluidos en el cluster ber para la degradaciôn anaerôbica del benzoato, al igual que en Magnetospirillum y algunas cepas de Bhodopseudomonas. La actividad K G O R de A . evansii estâ constituida por très subunidades diferentes codificadas por los genes korCAB, no ligados al cluster bt(d, y se acopla a una N A D PH:ferredoxina ôxido-reductasa posiblemente codificada por el gen b t^ V (para revisiôn Carmona et a l, 2009). El anâhsis del genoma de A ^arcus sp. CIB révéla la existencia de très posibles sistemas K G O R , dos de eUos de tipo Thauera {korA1B1 y korA2B2) y uno de tvpo As^arcus (korCAB). Los genes korA2B2 se localizan en el cluster mbd inmediatamente adyacentes al gen mbdM, lo que estâ de acuerdo con la hipôtesis de que la 3-metübenzoü-CoA reductasa utüiza un sistema regenerador de poder reductor simüar al caracterizado en T. aromatica y diferente al de la benzoü-CoA reductasa de la cepa CIB. Esta observaciôn tam bién estâ de 149 acuerdo con el hecho de que un m utante en la ruta bzd, A:y)arcus sp. CIBd^^ÆV, es capaz de utilizar 3MBz com o ûnica fuente de carbono, lo que sugiere que la reducciôn del 3-metilbenzoil-CoA no depende del sistema regenerador KorAB C que involucra también al gen bt(dV del cluster bgd. N o obstante, la confirmacion de que la actividad 3- m etübenzoil-CoA reductasa requiere la participacion de la ferredoxina MbdM y la enzima K G O R (KorA2B2) necesita un estudio bioquimico adicional. 2.1.3. Purificaciôn y caracterizaciôn de la metil-ciclohexa-1,5- dieno-carbonil-CoA hidratasa (MbdW) El analisis del cluster mbd révéla la presencia de très genes cuyos productos m uestran similitud de secuencia con las enzimas necesarias para la (3-oxidacion modifïcada del com puesto alicfcHco producto de la reducciôn del benzoü-CoA (Fig. 3). Estos très genes se denom inaron mbdW, m bdX y mbdY, atendiendo a la nom enclatura de los genes équivalente en el cluster bgd y presuntam ente codifican las actividades metil- ciclohexa-1,5-dieno-carbonil-CoA hidratasa (MbdW), m etü-6-hidroxiciclohex-l-eno-l- carbonil-CoA deshidrogenasa (MbdX), y m etü-6-cetociclohex-l-eno-l-carbonil-CoA hidrolasa (MbdY), respectivamente (Tabla 6). La actividad metil-ciclohexa-1,5-dieno-carbonil-CoA hidratasa es la encargada de iniciar la ^-oxidacion del com puesto aliciclico generado tras la reducciôn del 3- metilbenzoil-CoA. E n el transcurso de esta Tesis D octoral se clonô el gen mbdW, se purificô la proteina M bdW y se caracterizô su actividad enzimâtica. Los ensayos de actividad enzimâtica m ostraron que M bdW es capaz de catalizar la reacciôn de hidrataciôn (metil-dienoil-CoA~+metil-60H-monoenoil-CoA) y la reacciôn reversa (m etil-60H -m onoenoü-C oA —►metil-dienoil-CoA). Ademâs M bdW reconoce como sutrato tanto los derivados m etüados com o los no metüados (ver Fig. 17). M bdW posee una actividad especifica simüar a la de hidratasas ortôlogas taies com o BamR^ ,̂„ (apartado 3.3 de Kesultados). La caracterizaciôn de la proteina M bdW com o una metil-ciclohexa-1,5-dieno- carbonü-CoA hidratasa ha perm itido confirm ât la ruta anaerôbica de degradaciôn de 3MBz via reducciôn del anülo arom âtico con dos electrones, simüar a la descrita para la degradaciôn anaerôbica del benzoato en bacterias anaerobias no fotosintéticas (Fig. 3). La conform aciôn nativa de la proteina M bdW recom binante purificada se defïniô com o un dimero-trimero m ediante experimentos de fütraciôn en gel. Un estado 150 oligom érico sim ilar tam b ién habia sido determ inado para la p ro te ina BamR^,^.^,, la cual ejerce la actividad c ic lohexa-l,5 -d ieno-carbon il-C oA hidratasa en la ru ta de degradaciôn anaerobica del b en zo a to en G. metailireducens (Peters et a l, 2007), y esta de acuerdo con el estado dim érico determ inado para la hidratasa D ch de T. aromatica (Laem pe et a l, 1998). 0.1 P ro te in a M ic ro o rg a n ism o C lu s te r/ s u s t r a toN o m b re Réf. N o m b re C la se BzdW AAQ08815 A zoarcus s p. CIB P b zd / d ien o il BzdW CAD21636 A. evansii P b zd / d ieno il BzdW CAI09133 A. arom aticum EbN 1 P b e r /d ie n o il BamRsyn ABC78906 S. aciditrophicus 5 bam l d ienoil BamRgn^ei ABB32379 G. m etailireducens G S -15 5 bam / d ienoil Dch 0 8 7 8 7 3 T. arom atica P b e r /d ie n o il Dch BAD42370 Magnetospirillum s p .T S -6 a b e r /d ie n o il MbdW - A zoarcus 8 p. CIB P m bd/ d ienoil BadK AAC23918 R. palustris CGA009 a b a d / m onoenoil BadK C Al07207 A. arom aticum EbN 1 P b a d / m onoenoil Ûrf6 CAC28159 T. arom atica P h b c /m o n o e n oil? Figura 47. Ârbol filogenético de diferentes acil-CoA hidratasas présentes en clusters de degradaciôn anaerôbica de compuestos aromâticos. El alineamiento multiple de las proteinas se realizô con el programa ClustalW y el ârbol filogenético se ha realizado y visualizado como se indica en el apartado 9.2 de Materiales y Métodos. La barra que indica la escala équivale a una sustituciôn de un aminoâcido por cada 10. Junto a cada rama del ârbol filogenético se indica el nombre de la proteina y su côdigo de GenBank. También se indica el nombre del microorganismo al que pertenece la proteina y, dado que todos los microorganismos son Gram-negativos del filo Proteobacteria, se indica la clase a la que pertenecen (a, |3 o 5). A la derecha de cada panel se muestra el cluster en el que que se localizan los genes y el sustrato de la hidratasa; dienoil hace referencia a compuestos de tipo ciclohex-1,5-dieno-1 -carbonil-CoA, que en algunos casos pueden presentar sustituciones de tipo metilo en posiciôn meta-, monoenoil hace referencia al compuesto ciclohex-1-eno-1- carbonil-CoA, que sôlo posee una insaturaciôn en su estructura ciclica; monoenoil? sehala que se desconoce la naturaleza del compuesto que se forma pero por la similitud de los genes hbc (ruta del 3-hidroxibenzoil-GoA) con los genes bad se cree que puede tratarse de un compuesto monoenoil. Los rectângulos sombreados indican diferentes grupos de proteinas: amarillo, dienoil-CoA hidratasas grupo Azoarcus] verde, dienoil-CoA hidratasas grupo Thauera] rojo, enoil-CoA hidratasas grupo Rhodopseudomonas. Con letras azules se représenta la 3-metilbenzoil-CoA hidratasa MbdW. La F igura 47 m uestra un estudio filogenético de las p ro te inas acil-CoA hidratasas asociadas a clusters para la degradaciôn anaerôbica de com puestos arom âticos que tienen la funciôn de iniciar el p roceso de (3-oxidaciôn encam inado a degradar el p ro d u c to de la reducciôn del anülo arom âtico . Se puede observ^ar que las dienoil-C oA hidratasas fo rm an dos grandes grupos: a) el g rupo Thauera que incluye a 151 las hidratasas de T. aromatica (D ch), G. metailireducens (BamR) y Magnetospirillum (D ch), asi com o a M bdW ; b) el g rupo Msparcus que incluye a las liidratasas de bacterias de los géneros Msparcus, Mromatoleum y Syntrophus. P o r el contrario , la ciclohex-1-eno-1- carbonil-C oA (m onoenoil-C oA ) hidratasa de K palustris (BadK) se agrupa con las hidratasas relacionadas con la ru ta del 3-hidroxibenzoil-C oA (ruta hbc) en Thauera y Agoarcus (Fig. 47). P o r analogia con la ru ta bzd (Fig. 3), el p roducto de la catahsis de M bdW sufrira sucesivam ente una deshidrogenacion y una hidrohsis. M bdX codificaria una actividad m etil-6 -h id rox ic ic lohex-l-eno-l-carbon il-C oA deshidrogenasa, m ientras que M bdY seria responsable de la actividad m etil-6 -ce tociclohex-l-eno-l-carbon il-C oA hidrolasa que actuaria a continuacion, p rovocando una rup tura hidrohtica del anillo ahcichco que daria lugar al com puesto ahfatico hidroxi-m etil-pim ehl-CoA . E l anâhsis filogenético de M bdX , M bdY y las correspondientes pro teinas con una funcionahdad similar p résen tés en los clusters anaerobicos para la degradaciôn del benzoato revelo, de nuevo, que tan to M bdX com o M bdY m uestran una sim ihm d m ayor con el g rupo evolutivo Thaidera que con el grupo Agoarcus (Fig. 48). A m bos grupos estân alejados filogenéticam ente de las desliidrogenasas e liidrolasas que actuan en la ru ta del 3-h idroxibenzoato o en la ru ta del benzoil-C oA de K palustris (Fig. 48). Hidroxiacil-CoA deshidrogenasas Protema Microorganismo Nombre Ref. Nombre Clase AAQ08816 Azoarcus sp.C \Br BzdX CAD21637 A. evansiiBzdX CAI09134 A. aromaticum EbN 1^ BzdX BamQsvn ABC78904 S. aciditrophicus CAA12244 T. aromaticaHad BamQ ABB32380 G. metailireducens G S-15 Azoarcus sp . CIBMbdX CAE26098 R. palustris CG A009BadH CAI07203 Aaromaticum EbWBadH CAC28154 T. aromaticaOrf1 EbA723 CAI06490 A. aromaf/cum EbN 1 CAC28156 T. aromaticaOrf3 EbA738 CAI06497 A. aromaticum EbNt Cluster/ sustrato b zd / e n o b zd / e n o P e r/en o bam / eno bcr/en o bam / eno m bd/ eno bad/ saturado bad/ saturado /ib c /sa tu rad o ? /ib c /sa tu rad o ? A)£>c/saturado? /ib c /sa tu rad o ? 152 B Oxoacil-CoA hidrolasas Protema Microorganismo Nombre Réf. Nombre Cluster/ Clase Sustrato O ah BamA MbdY — Bzd Y — O ah Bzd Y BamA[ BadI BadI CAA12245 T. arom atica A zo arcu s s p . CIB CAI09135 A. arom aticum EbW GAI07202 A. arom aticum EbN 1 b c r /e n o bam i e n o m bd! e n o bzd! en o b c r/e n o bzd / e n o bam / e n o - / e n o a bad / sa tu ra d o (3 b a d / s a tu ra d o Figura 48 (comienza en la pagina anterior). Ârboles filogenéticos de diferentes hidroxiacil-CoA deshidrogenasas, (A) y oxoacil-CoA hidrolasas, (B), présentes en c lus te rs de degradaciôn anaerôbica de compuestos aromâticos. El alineamiento multiple de las protêt nas se realizô con el programa ClustalW y el ârbol filogenético se ha realizado y visualizado como se indica en el apartado 9.2 de Materiales y Métodos. La barra que indica la escala équivale a una sustituciôn de un aminoâcido por cada 10. Junto a cada rama del ârbol filogenético se indica el nombre de la proteina y su côdigo de GenBank. También se indica el nombre del microorganismo al que pertenece la proteina y, dado que todos los microorganismos son Gram-negativos del filo Proteobacteria, se indica la clase a la que pertenecen (a, (3 o 5). A la derecha de cada panel se muestra el cluster en el que se localizan los genes y el tipo de hidroxiacil-CoA/oxoacil-CoA sustrato de las deshidrogenasas/hidrolasas. La abreviatura eno hace referencia a la existencia de enlaces insaturados en el compuesto ciclico sustrato de la deshidrogenaciôn/hidrôlisis, mientras que saturado indica su carencia; saturado? indica que se desconoce la naturaleza del derivado formado, pero por la similitud de los genes hbc con los bad se considéra mâs probable la formaciôn del compuesto saturado. Los compuestos insaturados son el 6-hidroxiciclohex-1- eno-1 -carbonil-CoA (sustrato de las deshidrogenasas) y 6-cetociclohex-1 -eno-1 -carbonil-CoA (sustrato de las hidrolasas) que en algunos casos pueden presentar sustituciones de tipo metilo. Saturado hace referencia a los compuestos 2-hidroxiciclohexano-1-carbonil-GoA (sustrato de las deshidrogenasas) y 2-cetociclohexano-1-carbonil-CoA (sustrato de las hidrolasas). Los rectângulos sombreados indican diferentes grupos de proteinas: amarillo, grupo Azoarcus] verde, grupo Thauera] rojo, grupo R. palustris] violeta, Desulfococcus. Con letras azules se représenta la 3-metilbenzoil-CoA hidratasa MbdW. Los diferentes analisis filogenéticos p resen tados en esta Tesis sugieren que tan to el sistem a regenerador de p o d e r red u c to r de la reductasa (TvIbdM y K orA 2B 2) com o las enzim as im plicadas en la (3-oxidacion del p ro d u c to de reducciôn del anillo arom atico {m bdW XY) en la ru ta m b d tienen un origen evolutivo m as p rox im o al de los co rrespond ien tes sistem as de la ru ta del benzoü-C oA de Thauera/Magnetospirillum que al de los sistem as de la ru ta del benzoü-C oA de las cepas del p ro p io género M sparcus/ylromatoleum. La adquisiciôn de los genes mbdAikorM 2B2 y m b d W X Y p o r la ru ta m b d de Mgoarcus sp. CIB a partir de los genes équivalentes de la ru ta del 153 benzoil-CoA de Thauera/Magnetospirillum mediante procesos de transferencia horizontal de D N A y su posterior adaptacion para un m etabolismo eficaz del 3-metdlbenzoil-CoA, supone una hipotesis plausible que deberia ser estudiada en el futuro. 2.2. Analisis dei resto de los genes catabôlicos dei cluster mbd: propuesta de la ruta mbd Las evidencias expérimentales obtenidas del analisis de la actividad de la 3MBz- CoA ligasa (MbdA), la 3-metilbenzoil-CoA reductasa (M bdO N Q P) y la dienoil-CoA hidratasa (MbdW), asi com o la similitud de secuencia de las proteinas M bdW XY con las proteinas équivalentes de la ruta central del benzoil-CoA en Thauera/Magnetopirillum, nos perm iten proponer un esquema de las transform aciones bioquimicas que expérimenta el 3-metilbenzoil-CoA hasta el producto de la apertura del anillo (hidroxi- metil-pimelil-CoA) (Fig. 49). Sin embargo, se requieren datos expérimentales para identificar cual es exactamente el derivado dienoil-CoA generado por la accion de la 3- metdlbenzoil-CoA reductasa. La pérdida de la arom aticidad del 3-metilbenzoü-CoA debido a la actividad reductasa impHca la existencia de dos posibles productos diferentes segun la posicion del grupo metilo respecto a los dos dobles enlaces generados: 3-metil- ciclohexa-1,5-dieno-carbonil-CoA (3a) y 5-m etil-ciclohexa-l,5-dieno-carbonil CoA (3b) (Fig. 49). La accion sucesiva de M bdW , M bdX y M bdY sobre uno de los dos intermediarios form ados, presum iblemente conduciria a la apertura del anillo con la formaciôn de un 3-hidroxi-pimelil-CoA que contendria un grupo metilo ubicado en las posiciones 6 (6a) ô 4 (6b) (Fig. 49). El producto résultante de la apertura del anillo ahcichco derivado de la reducciôn del benzoato en K palustris, el pimehl-CoA, sufre una ^-oxidaclôn que conduce a la formaciôn de glutarü-CoA y en la que interviene el cluster pim que codifica una acü-CoA deshidrogenasa (PimCD), una enoil-CoA hidratasa (PimF), una hidroxiacil-CoA deshidrogenasa (PimE) y una p-cetotiolasa (PimB) (Harrison y H arwood, 2005). El cluster thn, responsable de la degradaciôn de la tetralina (1,2,3,4-tetrahidronaftaleno) en Sphingomonas macrogolitahida TEA, codifica las proteinas T hnJK L IN que guardan simihmd con Pim C D FEB de K palustris y participan en la incorporaciôn del pimehI-CoA generado en la degradaciôn del com puesto bicichco al m etabohsm o central de la bacteria (Lôpez-Sânchez et a l, 2010). E n ambos microorganismos, la generaciôn de m utantes en estos genes no supone la pérdida de la capacidad de crecimiento en los com puestos aromâticos en cuya ruta participan, lo que sugiere que otros clusters génicos que codifican 154 . A E X in hr E (/) A s CO. CM CM < CM CM Q_ Q_ E o Ü Ü N m S CO o■a o o !5 20) s (0 o Ew 01Q) c. c‘O 'o (0_> Ü (0 (0 CO o c0 c 0 %3 c 00 CO 0 1 _C0 20Q. 0 CO CÔ c 0 _co 30 o E 0 2 o o EoÜ 00 cg Üo 0 2 0 0 Î E U Ü jg-L O ^ -2 0 -Q O " 5 ill Ü- 0 O o) z 2 0 P E 0 0I? II < -2 Ü Yil 1 È II f g "—" "O < f E 9 CD ^ = O 0 0 _L 0 0 - ^ 0 —I 0 "O « -8 2 - 2 III ijs- ifiill i é | E o E s i 8 9 S ( D o . , 0 E 9 E E I 0 03 ^ | s ^;#! >> I—I X E 0 II >- 0 S § 03o- 0 0 "2 0 _g o o§o CO CO #! COI ̂ 0 0 jO 0 2 E "O 0 E c 0 E 2 ^ CO J: Ij CO CO 0 " 3 O’ Vi UJ Ü 0 0 0 < 0 O __ Ü 0) c 0 O) 2 3O) ? 9 'Eo Y6c 0 T3 ^ 8 S 8 A 0 Ô §■ 0 0 ' 3 T o- g § " I 3 20c 0O) c 0 T3 0 3 Q . 0 0 0 3 O ’ 0 20 E ' O 0 o Ü Ü g s If C O Q - 155 rutas de (3-oxidacion de âcidos dicarboxüicos y que estân présentes en el genom a de estas bacterias pueden suplir a los genes pim y thn involucrados en las rutas bajas de incorporacion al metabolismo central (Harrison y Harwood, 2005; Lôpez-Sânchez et al., 2010). El genoma de A., aromaticum E bN 1 también contiene multiples clusters que agrupan genes que podrian estar relacionados con la [3-oxidaciôn de âcidos dicarboxilicos, por lo que son candidatos para participar en la degradaciôn del 3-hidroxi-pimelil-CoA generado en la ruta central del benzoil-CoA (Rabus et a l, 2005). E l anâhsis de la secuencia del genoma de Acparcus sp. CIB tam bién ha revelado la presencia de diversas agrupaciones de genes que m uestran simihtud con los genes pim. La existencia de varios clusters pim en el genoma de Acparcus sp. CIB podria suponer que alguno de ellos se ha especiahzado en la conversiôn del 3-hidroxi-metil-pimehl-CoA a metil-glutaril-CoA (Fig. 50) si bien, com o se detaUa en pârrafos anteriores, la existencia de clusters pim relacionados con la degradaciôn de ciertos com puestos aromâticos no excluye la posibüidad de que otros clusters simüares suplan su funciôn en un m om ento dado. El glutaril-CoA sufre una deshidrogenaciôn y una descarboxüaciôn a crotonü- CoA por parte de una actividad glutarü-CoA deshidrogenasa (GcdH), que ha sido caracterizada en At^oarcus sp. CIB (Blâzquez et al., 2008) y G. metailireducens (WischgoU et a l, 2009). E n D. multivorans la glutaril-CoA deshidrogenasa sôlo Ueva a cabo la deshidrogenaciôn y se requiere una glutaconü-CoA descarboxüasa adicional para la form aciôn de crotonü-CoA (WischgoU et a l, 2009; WischgoU et a l, 2010). Al contrario de lo que ocurre con los genes que codifican las rutas de p-oxidaciôn de âcidos dicarboxüicos, el gen gcdH suele estar présente en el crom osom a de los diferentes m icroorganism os en una sola copia (Carmona et a l, 2009). E l producto de la acciôn de las glutarü-CoA deshidrogenasas descarboxüantes sobre el glutarü-CoA es el crotonü- CoA, que continua siendo oxidado a través de una (3-oxidaciôn de âcidos dicarboxüicos de cadena corta hasta dar lugar a dos moléculas de acetü-CoA (GaUus y Schink, 1994). La cepa Apoarcus sp. CY2>àgcdH (mutante por inserciôn en el gen gcdH) es capaz de utüizar w-xüeno com o ûnica fuente de carbono y energia (Blâzquez et a l, 2008), por lo que el gen gcd¥i no parece estar impUcado en la degradaciôn anaerôbica de 3- m etübenzoü-CoA y se posmla la existencia de una actividad enzimâtica especifica encargada de la transform aciôn del metü-glutarü-CoA en Ac^arcus sp. CIB. E l anâhsis de los productos proteicos del cluster mbd révéla la existencia de una protem a (Orf5) que 156 ? ü i ^ o < ? o c g ■q . o I Q I g Ece u S CO CM O O O O 11 0) e l n X T J E o CD ^ |î CO ü o> « 1 : E £ =5à. N O CO CO eo S ^ -o cI T 3 c:= CD c CD CO ü1 - a■O CO CO o ■D »- W CD CO _(0 -Q B 3 g ^ (0 O ■o c r _ CD CD CD CO cO I s l m % E il ■D 0) "O ^ g j s c CD 3 O" O ! 5 CD > ü CD i § CD y î î c oCL ^ O CO 2 CD CO E ^ CL § < - s p - g c 8 : 6 2 LU é l g | — mCD -a - J < il CO ECO CO Ô 3 8 E O) CD ^ 1 1 c --- - ü iii cô - 2 8 157 m uestra una identidad significativa (~ 30%) con enzimas glutaril-CoA deshidrogenasas de distintos microorganismos y que, p e r tanto, podria ser la encargada de la descarboxilacion oxidativa del metil-glutaril-CoA (Fig. 50). E n la Figura 50 se pueden observ^ar los dos productos propuestos résultantes de la oxidaciôn y descarboxilacion del metil-glutarü-CoA. La transform aciôn del 4-metil- glutaril-CoA podria generar 2-pentenoil-CoA, molécula identificada como un intermediario de la ferm entacion de 5-aminovalerato en Clostridium aminovalericum (Barker et al., 1987). Por otro lado, la descarboxilacion oxidativa del 2-metil-glutaril-CoA daria lugar a 2-metil-crotonil-CoA, un intermediario de la degradacion de la isoleucina (Conrad et al, 1974) y de la degradacion de âcidos grasos ramificados en las mitocondrias anaerobias (insensibles al cianuro, carecen de la cadena de transporte de electrones) de Ascaris suum (Komuniecki et ai, 1984; Ma et ai, 1993). E n ambos casos, la (3-oxidacion del 2-pentenoil-CoA o del 2-metil-crotonil-CoA generarà propionü-CoA y acetü-CoA. U n anâlisis detallado del cluster mhd révéla que los productos Orf3/O r£9 (posible enoü-CoA hidratasa), O rf4 (posible hidroxiacil-CoA deshidrogenasa^ y Or£2 (posible P-cetotiolasa) (Tabla 6) podrian ser los encargados dicha (3-oxidaci6n (Fig. 50). El propionil-CoA sufriria sucesivamente una carboxilacion para dar lugar a 2- metil-malonil-CoA y, posteriorm ente, una actividad mutasa dependiente de la vitamina B , 2 transferiria el grupo carboxilo al carbono 4, con la consiguiente formacion de succinil-CoA, intermediario del metaboHsmo central (Weissbach et al, 1959; Lengyel et al, 1960). La confirmaciôn experimental de la identidad de los genes implicados en la ruta baja del 3-metübenzoü-CoA sera objeto de esmdio en el futuro. E n conclusion, el analisis de los genes cataboHcos mbd para la degradacion anaerôbica de 3MBz en As(oarcus sp. CIB que se ha realizado en esta Tesis Doctoral evidencia la existencia de una nueva ruta metaboHca central cuyas etapas enzimaticas bâsicas son anâlogas a las de la ruta bzd para la degradacion anaerôbica del benzoato, pero que difiere de esta en los intermediarios m etabôlicos formados y en las enzimas implicadas. E n ocasiones las actividades enzimaticas équivalentes de ambas rutas podrian ser intercambiables, pues las proteinas son capaces de reconocer tanto las moléculas derivadas del benzoü-CoA com o las procedentes del 3-metilbenzoil-CoA, com o es el caso de la benzoü-CoA reductasa B zdN O PQ y la 3-metilbenzoil-CoA reductasa M bdO N Q P. E n otros casos, este intercam bio de funciones no séria posible, com o ocurre con la benzoato-CoA ligasa BzdA que es incapaz de reconocer el derivado 158 metilado del benzoato (Lopez-Barragan et al., 2004), mientras que su protem a homologa, MbdA, puede reconocer tanto el com puesto metilado com o el no metilado. Esta posible com plementacion de funciones a nivel bioquimico se ve, sin embargo, restringida por la regulacion transcripcional especifica de ambos clusters, que solo se expresan en presencia del derivado CoA especifico de cada ruta (ver siguientes apartados). 3. Organizacion transcripcional del cluster mbd y estudio de su regulacion especffica El analisis de las capacidades que tienen las bacterias para emplear compuestos aromaticos como fuente de carbono y energia ha de conjugar el esmdio de las reacciones bioquimicas necesarias para el cataboHsmo con el de los mecanismos de regulacion necesarios para que las actividades enzimaticas apropiadas se expresen. A pesar de que la regulacion de un proceso metabolico puede ejercerse a través de diferentes niveles de control (transcripcional, traduccional y post-traduccional) en este trabajo nos hem os centrado en el esmdio de la regulacion a nivel transcripcional, que constimye el mecanismo mas comûn, o al m enos el mas estudiado por ser el prim er nivel de regulacion, para el control de la expresiôn de los clusters cataboHcos de com puestos aromaticos (Shingler, 2003; Tropel y van der Meer 2004; Diaz y Prieto, 2000; Carmona et al., 2008; Carmona et al, 2009). 3.1. Organizacion transcripcional del cluster mbd El anâhsis de la organizacion de los genes mbd en el genoma de At^oarcus sp. CIB sugeria la existencia de, al m enos, dos operones cataboHcos divergentes, mbdO-orf9 y mbdB1 -mbdA, y de un gen regulador, mbdK, que se transcribiria en orientacion contraria al operon mbdB1 -mbdA (Fig. 18). Esta organizacion se corroboré de forma experimental y se confirm é la induccién de los operones mbd cuando A^oarcus sp. CIB utiHzaba 3MBz com o ùnica fuente de carbono (Fig. 18). M ediante experimentos de RT-PCR en los que se com paraba la expresién de los operones catabéHcos en Ar^arcus sp. CIB y A'^arcus sp. (lYRàmbdR, se com probé que mbdK codificaba un represor transcripcional especifico del cluster mbd (Fig. 22). Ademâs, el anâHsis in silico del cluster mbd y el posterior esmdio experimental perm itieron detectar un tercer operén catabéHco que integra exclusivamente al gen mbdA, y que por tanto séria solapante con el operén mbdK 1 -mbdA. 159 E n la F igura 51 se m uestra un esquem a resum en de la organizacion transcripcional del 7 7 ..................................................................................................... 0̂ o V V °"' / / > V ° % ;.................. Figura 51. Esquema de la organizacion transcripcional del cluster mbd de Azoarcus sp. CIB. Los promotores que se han identificado aparecen representados con fléchas curvadas. Las fléchas correspondientes a los promotores divergentes Pq y Pbi se muestran en color azul y amarillo, y las que representan a los promotores Pa y Psr en rojo y negro, respectivamente. La longitud del transcrite deducida de los experimentos de RT-PCR se indica con una linea punteada del mismo color que el promoter correspondiente. M ediante experim en tos de ex tension p o r cebador (primer extension) se d é te rm in é el p u n to de inicio de la tran sc rip c ién en los p ro m o to res que con tro lan la expresién de los cuatro operones (Figs. 19, 36, 38). M ediante ensayos de actividad (3-galactosidasa en los que se u tilizaron fusiones traduccionales con el gen testigo lacZ, asi co m o m ed ian te experim en tos de R T -P C R y primer extension, se concluyé que los p ro m o to res Pq y Pg ̂ eran inducib les cuândo A^parcus sp. CIB se cultivaba en presencia de 3M Bz (Figs. 18, 19 y 21). E xperim en tos sim ilares m o stra ro n que y P^^ eran p ro m o to res débiles y de exp resién bâsicam ente constim tiva en las condiciones de estudio , si b ien se o b se rv é u n Hgero in crem en to en la activ idad de cuando las células se cultivaban en presencia de 3M Bz (Fig. 38). La o rgan izacién del cluster mhd en el c rom osom a de Acparcus sp. CIB difiere de la del cluster b^^d del p ro p io m icroorgan ism o. M ientras que en el cluster b:(d los genes cataboHcos y de tran sp o rte se d isp o n en en un ùn ico o p e ré n que codifica la ru ta central del benzoü -C oA y la ru ta periférica del b en zo a to (gen bs(dA', L épez-B arragân et a l, 2004), en el caso del cluster mbd existen dos operones divergentes con tro lados p o r los p ro m o to res Pq y Pg/. E l o p e ré n co n tro lado p o r el p ro m o to r Pq agrupa a todos los genes que cod ifican la ru ta cen tral del 3-m etilbenzoil-C oA : a) las cuatro subunidades de la reductasa , b) las très activ idades encargadas de la (3-oxidacién m odificada del p ro d u c to de la red u cc ién del aniUo, y c) u n sistem a K G O R de dos co m ponen tes (tipo Thauerd) y la ferredox ina que apo rta los e lectrones a la reductasa. E n el o p e ré n con tro lado p o r Pq se locaHzan adem âs dos g rupos de genes que podrian codificar actividades necesarias para la ru ta baja del 3 -m etilbenzoil-C oA . P o r o tro lado, el o p e ré n con tro lado p o r el p ro m o to r Pg, codifica la ru ta periférica del 3M Bz que incluye al p resu n to tra n sp o rtad o r 160 de 3MBz y la 3MBz-CoA ligasa. D ado que el gen mbdA posee ademâs su propio p rom otor (Pp y que el gen que codifica la benzoato-CoA ligasa de la ruta periférica del benzoato no se encuentra ligado a los genes de la ruta central del benzoü-CoA en algunos microorganismos taies com o cepas de los géneros Magnetospirillum y Thauera, (Fig. 5), podria pensarse que el operon mbdB1 -mbdA que codifica la ruta periférica del 3MBz en Agoarcus sp. CIB, baya sido el resultado de la adquisicion independiente de los genes mbdB 1-B5 por un lado y del gen mbdA, por otro. 3.2. Identificaciôn del regulador transcripcional especffico del duster mbd'y 6e su molécula inductora El anâlisis de la secuencia del producto del gen mbdK revelo su pertenencia a la familia TetR de reguladores transcripcionales (para revision, Ramos et al., 2005 y Yu al., 2010). El 80% de los genomas de bacterias secuenciados hasta la fecha codifica, al m enos, un regulador del tipo TetR, lo que hace que esta familia de reguladores transcripcionales sea la tercera mâs frecuente en bacterias (Yu et a l, 2010). La familia TetR toma su nom bre del regulador transcripcional TetR que contrôla la expresiôn de los genes tet, que confieren resistencia a la tetracicHna en E. coli (George y Levy, 1983). La familia TetR se encuentra distribuida prâcticamente en todos los grupos taxonom icos bacterianos, tanto en bacterias Gram-positivas com o Gram - negativas, y forma parte de los circuitos de regulacion que controlan una gran variedad de procesos celulares, taies com o los de diferenciacion celular, virulencia y quorum-sensing (Ramos et a i, 2005). La protem a TetR ha sido caracterizada a nivel genético y bioquim ico (Tovar et al., 1988; HiUen y Berens, 1994; Hinrichs et al, 1994). Su mecanism o de accion consiste en la union al D N A en una region palindromica operadora especffica del prom otor, lo que bloquea la union de la RNA polimerasa impidiendo la transcripcién (Bertrand et a l, 1983; O rth et a l, 2000). Las estructuras tridimensionales elucidadas hasta el m om ento (Tabla 7) indican que las proteinas de la familia TetR form an dimeros (Yu et a l, 2010), si bien su interaccién con el prom otor que controlan puede originar la form acién de tetrâm eros, que son en realidad la asociacién de dos dimeros, com o ocurre con la proteina QacR (Schumacher et a l, 2002), la cual reconoce dos secuencias palindrémicas en el prom otor sobre el que actua. Los experim entos de ultracentrifiigacién analitica reahzados con la proteina M bdR purificada revelaron una conform acién nativa dimérica para la proteina en solucién (Fig. 26). 161 I s - y3 0 1 I CQ g 1 « E t I ! il •cs a ! 1c 'S< f + £ îi îi æ % + u n M > < X Tr E S b « 72 3 g E 13 H l II J - S i 1 .0 'E # U T' I Iîl Xi cT il cy I + il II < II il r i I s < 3= f 5 (0 P “Iü 2 ^ Ô 3 o ^ f « o g 3 3 w "5 ce 2s | â - 2E -S f i IS ' E a ;g — 5 (D 03 i ï il (0 D )ii 0 Q. 0 ■D d 2 c 0 0 0 0 Ô) g 0 ô 0o 0 0 0 E - g $ m a S cd - 3 i5 I si I s = CD « -D II— 3 i l ■ 2 | i ;g m N o c 8 (D CO I I - CD O -Q O 8 â u Z CD -O s :8 I! . CD N» (/)|-S.o CO .« w c — il § 8 1: II a 3 <5 CO ^ E i 8 o £ I °es "D O ) COn En= t CD 162 Los reguladores de la familia TetR estan tipicamente constituidos po r nueve hélices alfa, de las cuâles las très primeras constituyen la region de union al D N A , en la que se encuentra el dom inio H T H (Yu et a l, 2010). Esta region es la mâs conservada entre los distintos m iem bros de la familia TetR, tanto a nivel de estructura primaria com o terciaria. El dominio carboxilo-terminal, conform ado por las hélices alfa que siguen al dominio H T H , présenta una baja identidad de secuencia entre las proteinas de la familia TetR, y se ha postulado com o una region im portante para el proceso de dimerizaciôn de la proteina y el reconocim iento del inductor especifico que inhibe su accion represora de la transcripcién (Hinrichs et a l, 1994; O rth et al., 1998). E n ocasiones, los reguladores de la familia TetR pueden reconocer un ampHo rango de compuestos, tal y com o se puede observar en la Tabla 7. Cada molécula de regulador suele presentar una cavidad para la unién con el ligando, la cual posee una cierta flexibüidad, tiene form a triangular y estâ definida por las hélices a5, a6 y a7 (Alguel et al., 2007; G u et a l, 2007; Yu et al, 2010). E n la Figura 52 se présenta un ahneamiento de la secuencia de la proteina M bdR con proteinas de la familia TetR cuya estructura tridimensional se conoce. La proteina M bdR posee una estructura de hélices alfa arquetipica de la familia de reguladores TetR. Podem os observar la elevada conser\ acién de la secuencia de aminoâcidos en el extremo atnino-terrninal de la proteina, en el cual se encuentran las très hélices alfa necesarias para la interaccién del regulador con el D N A a través de una estructura de tipo H T H (hélices a2 y a3). Por el contrario, la regién carboxilo-terrninal estâ m ucho menos conserv^ada; su presunta funcién estaria relacionada con la dimerizacién de la proteina y el reconocim iento de su efector especifico, el 3-metilbenzoil-CoA. La prediccién de la estructura tridimensional de M bdR realizada con el program a 3D- Jigsaw (Fig. 23B) sélo perm ite modelar las primeras seis hélices alfa de la proteina, con lo que no disponem os de un m odelo tridimensional com pleto que nos permita reconstruir in silico el hom odim ero M bdR y tratar de delimitar su sitio de interaccién con el efector. Los experimentos de retardo en gel reahzados con la proteina M bdR purificada sobre sondas que contenian los prom otores Pq y m ostraron una interaccién directa entre el regulador y los prom otores, con unas estimadas de ~ L 8 nM para MbdR-Py y ~3.7 nM para MbdR-P;^, en las condiciones de ensayo empleadas. Algunos reguladores, taies com o TetR, se unen a su operador, tetO, con una afinidad de 1 nM, mientras que 163 R— I< m u j < I T a - - I (A z 0: 0) X z >- - < CO Û UJ i t Z , j t Z - g Z UJ0 z#g (0 0 0 0: 1 O -J § Z Z u. > _J -J g z - # o (0 u. _j < ü: z z t o T _J u. < > iC t o ; z o j- < Ü X < # # O o UJ X X U) c> < u> X ^ > a a. >■ o > E a j H q- ' q. O - E M 0 œ ■o o O ^ Z Z J - < ■ Z K S ^ o UJ (0 ^ < o (0 z o > (0 UJ o K u . o y UJ UJ < < (0 > _j - z o :ji _ j to > I UJ > H B u j r # n < UJ o a 0 . u . - J < O O U X X - (0 X to z z ” <œa or?~̂ _J UJ ^ - > 5 0 * j t , ' a j to m _J UJ > _i > J - J- s or» UJ Z UJ o — z y < j - _ j z — o u . l i > : i u i UJ t F 3 z f a z u . z ■ i : & ^ UJ < o c t o ! K UJ UJ A c < 0 ) wo a x c/3 ro z E CL - u . _J c/3 w w ■g Y u . Z O < X Z Z o Z H C < UJ - D. < (L O - y t o o 6 o _j UJ O o t >o © <5 UJ ©I a ‘L l È m m m c o i k < | c a O > O » o : z - j o y I - o * o _j O V U J U . — — l E Z o 0 : UJ UJz < m < < O UJ 0 'TO to & y y z > y > - z z y z u j z y u j m u j z u u o y j - y j - o ©1 % ^ UJ UJ UJ Û 1 1 UJ O O o O (D 5 < X ^ O UJ < UJ _i o UJ - I 4 Û: <0 i [ & < ^ g w O < m o z < ^ UJ 0: UJ^CHûS-iOUJUJ > [ S < ÛC ^ 0 )® < -J ccm (/> cc fr . i/> ^ tn a : ifi X ui UJ < (0 z K o Kl -J] ■ _ J U J ^ _ l > - - _ J ^ O C O U J ü ^ O - J U J U J _ i z _ i û : û : _ i 4 z 0 0 am (A >: < < C3 UJ _J UJ to z m t o < u j u j > z y f c i ; UJ o z | o ) to j - to — UJ < > cc >- 1 3 ujC C B Z __ o UJ o > UJ < J ; ^ fL^J__ >- 4 < >- _ J [M n m u j H < UJ z . u. z r = UJ > < : f t y o > _ 5 H- oam 4 5 1- o o 4 0 > J- J - -J (0 4 4 © 0 0(0 0 z u j t * _ z 4 4 z U J/K 4 4 z y o _j _ j I _i > UJ - J - z ©EBE UJ UJ > ( k z 5 z M " = | | | | i * l S i | | p | r 0 œ 0 0 0 3 c r 0 C a o 0 0 0> 0 □Q ÿ 0 O X B 0̂3 E œ CL 3 0 OD o _0 CL 0 0 0 T3 X E 8 c X 2 03 % oÜ 2 C33 X! X N 2 "0 0 CL T= 0 o C Ü _C 3 o 0 X X (0"0 o B 0 L— 0 3 3 E c 0 Ü 0 X 0 O Q. g 3 0 X O TD 0 03 0 0 0 _0 0 CL 0 0 E X 0 0 o U 0 0 E _0 o " c o GC Ü 0 X 0 T3 X 0 Q. X O _0 0 O) X xs c 0O LU X Q 0 0 ■Q O ) c O ) 0 0 0 c ^ c . 2 0 o ' I s tz O 8 1 0 = 0 c 0 3 0 - 0 ^ y U) g p- ^ Ô JÔ J CM CM CM ?M — CM RIcM - r ^ ^ _____ 0 ^ 00 0 0 0 *2 CÔ ( N 0 0 0 O 0 164 otros miembros de la familia com o Sco4025 y Sco7222 presentan unas afinidades inferiores por sus respectivos prom otores (para revision ver Ramos et a i, 2005 y Yu al, 2010). M ediante experimentos de protecciôn frente a la digestion por D N asa I (Jootprintin^ se deterrnino la region de interaccién (operadora) de MbdR, la cual solapa con la caja -10 y la regién de inicio de la transcripcién en el prom otor Pq y con las cajas -10 y -35 en el prom otor Pg;. La huella de proteccién identificada mediante los experimentos de footprinting estaba centrada en dos secuencias palindrémicas de 4 n t separadas por 10 nt: A TA C-[10 nt]-G T A T. E n la Tabla 8 podem os observar una com paracién de las secuencias palindrémicas incluidas en las diferentes regiones operadoras que son reconocidas por proteinas de la familia TetR. Las secuencias palindrémicas de reconocim iento oscüan entre 12 pb (Sco7704, EF0787) y 30 pb (QacR, ADK23698). La secuencia reconocida por QacR représenta una excepcién para la mecanistica de interaccién entre una proteina de la familia TetR y su operador especifico, puesto que contiene una secuencia paHndrémica muy extendida que a su vez posee dos secuencias internas parciaknente palindrémicas (Tabla 8). D ado que de los reguladores de tipo TetR conocidos sélo QacR y CgmR interaccionan con el D N A mediante la unién de dos dimeros (Schumacher et al., 2001; Itou et al., 2005), siendo las secuencias de D N A necesarias para dicho reconocim iento de 26 y 30 pb respectivamente, y dado que la secuencia palindrémica reconocida por M bdR tiene una longitud (18 pb) similar a la longitud prom edio de las secuencias reconocidas por los reguladores TetR (Tabla 8), podem os sugerir que la interaccién de M bdR con el D N A tiene lugar mediante la unién especifica de un solo hom odim ero del regulador. En este contexto, la aparicién del Complejo I MbdR-PQ/Pg, (Fig. 28) podria expHcarse como un estado de transicién en el que una sola molécula de M bdR se ha unido a una de las mitades de la secuencia palindrémica. La secuencia operadora de M bdR se usé para la bùsqueda in silico de secuencias hom élogas en el cluster mbd. Se détecté una posible secuencia palindrémica de reconocim iento de M bdR en la regién situada entre los genes mbdB1 y mbdA (ATAC-[10 nt]-G T A Q y varias secuencias anâlogas en el prom otor P;g, siendo la mâs conservada de eUas A GAG-[9 nt]-G T A G (Figs. 36C y 38C). Mediante experimentos de retardo en gel se confirm é la existencia de una interaccién especifica entre la proteina M bdR y los prom otores (K^ ~5.9 nM) (Fig. 37) y P^g (Fig. 39). E n el caso del prom otor P^g, se observaron numerosas bandas de retardo, lo que estaria de acuerdo con la existencia de varias regiones operadoras para M bdR en dicho prom otor (Fig. R38C), aunque la 165 afinidad de la interaccién (~100 nM para que el 50% de la sonda forme algùn complejo de unién) era claramente inferior a la observada en los prom otores Pq, Pg; y P L o s experimentos de footprinting confirmaron la unién de la proteina M bdR a la secuencia operadora predicha en el prom otor P B a s â n d o n o s en los resultados obtenidos en los experimentos de retardo en gel se procedié a realizar ensayos de proteccién frente a la digestién por D N asa I en el p rom otor P^g, pero résulté imposible detectar huellas de proteccién o regiones de hipersensibRidad a la digestién (datos no mostrados). E n el futuro se optim izaran las condiciones de footprinting para tratar de identificar las huellas de proteccién de M bdR en el p rom otor P^g. La existencia de un prom otor, P „ que présenta bajos niveles de actividad y dirige en exclusiva la transcripcién del gen mbdA pero que, sin embargo, tam bién interacciona con M bdR, junto con la existencia de diversas cajas operadoras para el regulador en el prom otor P^g que contrôla su propia transcripcién, plantea la existencia de un complejo circuito regulador estrechamente dependiente de las variaciones de concentracién de M bdR y de la estequiometria de la interaccién con su inductor especifico. Regulador Secuencia palindromica Longitud total (pb) Longitud espaciador (pb) Refeiencia M b d R A T A C n n n n n n n n n n C j T A T 1 8 1 ( 1 T e t R ■ I C I A T O n l C ' . A T A C F A 1 5 1 G r t h e/ al, 2 ( K l ( l E t h R T C A A f . ' n n n n n C ! I C C î A 1 5 5 E n g o h a n g - N d o n g e/ai. 2 ( K 1 4 C p r B C C F G C F A n n n l C C A C ; 1 3 3 S u a v a m a ( - / 1 9 9 8 Y c d c . V \ C ( X r i n n n n A f ; A C V I T 1 6 4 W Y b ü l r i A A ' I - C A . A n n r n i ' r i C ' . A I T A A 3 1 4 ( a ) Y s i A / Y c d ) A A ' l ' G A A T n n n n A ' n C A T I ' 1 8 4 ( a ) B C 5 I K H I A A A C T A A I ' n n n y \ l ' l A C T r i ' I ' 1 9 3 ( a ) P s r A C A A A C M n T C T J I T G 1 4 2 ( a ) P A 3 1 3 3 A ( ; ( ; C X ; C A r ' P C C n n n n n C ! C ; A A r C : C ' . C C C I 2 7 5 (a) RH A 1_ it)()4212 C Î C Î l C F A A n n n n n n I I T A C C 1 8 6 ( a ) R h a 0 6 7 8 Ô i C C T A C A n n C ü ' I A G A G 1 6 2 (a) D h a S ( X i A C A C A l Y m n n n n A T r r G T C C 2 2 6 C h n s t c n e/a/., 2 ( 1 ( 1 6 Q a c R r i A l A G A C C G A T C G A T C G G T C T A I A A ( 2 D ) 2 6 S c h u m a c h e r e/ al, 2 ( 1 ( 1 2 C g m R O T A A C l C î l A C C G A n n n n T C X r r X A C A G ' l T A C ( 2 1 3 ) 3 ( 1 4 1 t o u ei a!., 2 ( N 1 5 H l v l l R 1 1 1 A . A A n n n n n r m i l ’ I A . ' \ A 1 9 7 B u d a n n a et ai, 2 ( 1 ( 4 R F A 1 7 8 7 I T T A ' l n A A A A A 1 1 1 ( a ) R l i a ( H 6 2 ( i A A T C G A A n n n n n T l C G A l l 1 9 5 ( a ) S c o 7 7 H 4 C G A A C n n G T T C G 1 2 2 ( a ) l ’ I c s A G C G C A C n n n n n n n n G T G C G C 3 1 8 ( a ) R I I A l _ r o 0 3 4 6 8 T T G T T T G X n n n A C A A A C A A 1 9 3 ( a ) S c 0 7 2 2 2 I G G A A C G n C G T T C C A 1 5 1 ( a ) P h a D r I T A G A n n n n n n n n T C I A A A 3 1 8 ( a ) Tabla 8. Regiones paiindrômicas reconocidas por diferentes proteinas reguladoras de la familia TetR. La tabla refleja las secuencias de DNA palindrémicas reconocidas especificamente por varias proteinas de la familia TetR de reguladores transcripcionales en las correspondientes regiones operadoras. Los nucleotidos localizados entre las secuencias palindrémicas se representan mediante “n”. La longitud total de la regién y la del espaciador situado entre las secuencias palindrémicas se indica en pares de bases (pb). Los palindromos senalados como 2D son reconocidos por dos dimeros de la proteina reguladora, ya que estàn constituidos, a su vez, por dos palindromos menos conservados y situados en cada mitad de la regién palindrémica compléta. Las secuencias palindrémicas no validadas experimentalmente se identifican como (a) y fueron propuestas por Yu et al., (2010). 166 Los reguladores transcripcionales que controlan la expresiôn de las rutas catabolicas de degradacion de compuestos aromaticos suelen interactuar especificamente con una molécula inductora que habitualmente es un m etabolito perteneciente a la propia ruta (para revision ver Carmona et al, 2008). El 3MBz se considéré prim eramente la molécula candidata para ser el inductor del cluster mbd, pero los experimentos in vivo de actividad de (Fig. 30A) descartaban esta hipétesis. D ado que en la ruta bzd para la degradacién anaerébica de benzoato en A:(oarcus sp. CIB (Lépez-Barragân et al, 2004) se ha identificado un regulador transcripcional, BzdR, que reconoce de forma especifica benzoü-CoA, el intermediario m etabélico principal de la ruta (Barragân et ai, 2005), se traté de determinar si el 3-metübenzoü-CoA podria cumplir esta funcién en el cluster mbd. Experim entos in vivo de expresién de la fusién traduccional Pi^,::lacZ estaban de acuerdo con esta hipétesis (Fig. 30B). Con el objetivo de corroborât los resultados obtenidos con los sistemas in vivo, se Uevaron a cabo experimentos in vitro de interaccién D N A -proteina entre M bdR y los prom otores del cluster mbd. Los experimentos de retardo en gel (Figs. 28, 32, 37 y 39), proteccién frente a la digestién por la DN asa I (Figs. 29 y 37) y transcripcién in vitro (Fig. 33) m ostraron que la interaccién especifica de los prom otores con el regulador M bdR se impedia especificamente en presencia de 3-metilbenzoil-CoA, pero no en presencia de otros anâlogos taies como fenilacetil-CoA, benzoil-CoA, o compuestos no conjugados con CoA taies com o el 3MBz. Aunque se habia propuesto que el regulador PhaD de Pseudomonas putida KT2442 (también perteneciente a la familia TetR) reconoce un hidroxiacü-CoA como inductor (de Eugenio et al, 2010), los estudios reahzados en esta Tesis con M bdR y el 3-metilbenzoil-CoA suponen la primera dem ostracién experimental de la interaccién entre un regulador de la familia TetR y un com puesto derivado de CoA. La induccién de una ruta catabéhca central por el intermediario en el que convergen distintas rutas periféricas se ha hipotetizado com o un mecanismo de control adicional que evitaria la expresién de un gran num éro de genes catabéhcos necesarios para la degradacién de un com puesto aromâtico por parte de anâlogos del m encionado com puesto aromâtico que no son canahzados hasta dicha ruta central (Carmona et al, 2009). E n el caso concreto que nos ocupa, la induccién de los genes mbd por 3- m etübenzoü-CoA y no por los sustratos aromâticos que son canahzados hasta este intermediario central, por ejemplo w-xüeno y 3MBz, évita que otros anâlogos com o tolueno y benzoato, puedan activar la ruta m bd de forma gratuita. E n As/parcus sp. CIB Ï67 la ruta periférica de degradacion del w-xileno (y tolueno) estâ controlada po r un sistema regulador de dos com ponentes, llamado TdiSR (Blâzquez, 2009). La histidm-quinasa sensora TdiS détecta el 3-metilbencilsuccinato (bencüsuccinato), prim er intermediario de la ruta, y fosforila a la protem a reguladora TdiR, la cual actua como un activador de la transcripcién de los genes bss-bbs indispensables para el crecimiento de la bacteria en anaerobiosis em pleando w-xileno (y tolueno) com o ùnica fuente de carbono. Los genes bss-bbs codifican las actividades enzimâticas necesarias para la conversién del w-xileno en 3-metübenzoil-CoA. Cuando se alcanza una concentracién determinada de 3- m etilbenzoil-CoA en el interior de la bacteria, bien sea por la degradacién del w-xReno o por la activacién directa del 3MBz por parte de la protem a MbdA, cesa la represién que M bdR ejerce sobre los prom otores del duster mbd, perm itiendo la expresién de las actividades enzimâticas necesarias para el catabolismo anaerébico del 3-melilbenzoil- CoA y su incorporacién al metabolismo central. 3.3. Modelo de la regulacion transcripcional especffica del cluster mbd La integracién de los diferentes resultados obtenidos en esta Tesis permite proponer un m odelo de la regulacién transcripcional especifica del duster mbd. Los prom otores Pq y Pg, son los responsables de la transcripcién de todos los genes catabéhcos y de transporte del duster mbd. D ado que su activacién supone la produccién de, al m enos, 23 productos proteicos, su actividad estâ regulada de form a estricta por el represor MbdR. La presencia de 3-metilbenzoil-CoA en la célula permitiria la hberacién de la protem a M bdR unida a los prom otores Pq y Pg„ los cuales iniciarian la expresién de los genes catabéhcos mbd, lo que permitiria el catabohsmo del 3-metübenzoil-CoA hasta su incorporacién al m etabohsm o central de la bacteria. E n este circuito regulador, la produccién de una cierta canùdad de 3-metübenzoil- CoA es clave para iniciar la activacién del sistema. La expresién del gen mbdA, codificante de la proteina necesaria para la activacién del 3MBz y la form acién del inductor 3-metilbenzoil-CoA, estâ dirigida por dos prom otores, Pg, y P^. La actividad del p rom otor P,, ensayada en las mismas condiciones que la del prom otor Pg, es unas 20 veces inferior. Los experimentos de retardo en gel y de proteccién frente a la digestién por D N asa I evidencian que ambos prom otores estân controlados por M bdR y que las interacciones MbdR-Pg; y M bdR-P^ tienen lugar con unas similares (~3.7 nM para Pg, y ~ 5.9 nM para P f . Tam bién se ha observado que una cepa m utante por insercién 168 oo* 3MBz CH M b d B 1 2 3 4 5 3-m eti I b en zoi l-CoA COSCoAOO' M bd 5) Metabolismo central ► CH CH Mbd R/3- meti Ibenzo il-CoA M bdR orf9-mbdO mbclB 12345 Figura 53. Esquema del modelo propuesto para la Induccién especifica de la expresiôn del cluster mbd de Azoarcus sp. CIB cuando la bacteria crece anaerobicamente en 3MBz. (1) En ausencia de 3MBz, el regulador MbdR mantendna reprimidos (Imesas rojas) a los promotores P^, y, parcialmente, a P^ y P^ .̂ En presencia de SMBz, la expresiôn basal de los genes de transporte {mbdB1-B5) y del gen mbdA a partir de los promotores Pbi y Pa, respectivamente, permitiria su entrada en la célula (2) y la formacion de una cierta cantidad del inductor 3-metilbenzoil-CoA (3). La presencia de 3-metilbenzoil-CoA en el interior de la célula permitiria su interaccién con el represor MbdR, desbloqueando la expresiôn (fléchas verdes) de los genes catabéhcos (ruta central) a partir del promotor Pq (linea discontinua azul) y la de los genes de transporte (linea discontinua amarilla) y activacién (linea punteada roja) a partir de los promotores P^ ̂y P^ (4). en el gen mbdB1 {Azoarcus sp. CYBdmbdBI), el p rim er gen del op ero n mbdB1B2B3B4B3mbdA, es incapaz de crecer anaerob icam en te em p lean d o 3M Bz com o ùnica fuente de ca rbono , si b ien es capaz de u tilizar z^;-xileno. P o ste rio rm en te se co m p ro b é que si se com plem en taba la cepa m utan te co n u n p lâsm ido que expresaba el gen m bdA el feno tipo revertia y la cepa era capaz de crecer de n uevo en 3M Bz. E stos resultados sugerian que los efectos polares de la m u tac ién en el gen mbdB 1 afectaban a la expresién del gen m bdA y que la expresién a partir del p ro m o to r es esencial para el crecim iento en 3M Bz. E n este sen tido , la tran scripcién del gen m bdA a pa rtir del p ro m o to r P^ en exclusiva m uy p ro b ab lem en te no sea suficiente para p ro p o rc io n arle a la célula los niveles de M bdA necesarios para el c rec im ien to en 3M Bz. A unque el 169 prom otor P,, posee una secuencia operadora para M bdR muy conservada (Fig. 34), m antiene su actividad cuando At^arcus sp. CIB se cultiva anaerobicamente en fuentes de carbono no inductoras, taies com o el benzoato (Fig. 36). Se podria proponer que el p rom otor P , ha evolucionado para m antener unos niveles basales de expresiôn del gen mbdA que perm itan que, tras la entrada de 3MBz a la célula, se produzca una râpida respuesta a nivel regulador, generândose el 3-metilbenzoil-CoA necesario para que M bdR cese su represion sobre la expresiôn de los genes cataboHcos de la ruta central necesarios para degradar el 3-metilbenzoü-CoA y sobre los genes de transporte (mbdBI- BS) y el propio gen mbdA de la ruta periférica, lo que facüitaria la entrada de mâs 3MBz al interior celular y su posterior activacién a 3-metilbenzoH-CoA, favoreciendo el consum o del mismo. E n la Figura 53 se esquematiza la situacién metabéHca de la bacteria cuando encuentra 3MBz en el m edio de cultivo. La entrada de 3MBz al interior de la bacteria podria producirse de forma facüitada, ya que en el cluster mbd se incluyen los genes mbdB12345 que codifican un presunto transportador especifico de la famüia ABC {ATB-Binding Casettê) (Fath y Kolter, 1993; Davidson et ai, 2008; Kos et ai, 2009). La presencia de genes codificantes de sistemas transportadores asociados a los clusters para la degradacién anaerébica de compuestos aromâticos es frecuente en muchos géneros bacterianos, com o Azoarcus, Aromatoleum, Rkodopseudomonas, Magnetospirillum y Geobacter (para revisién ver Carmona et a i, 2009). A pesar de este hecho, hasta la fecha todavia no se han realizado estudios en profiindidad encaminados a la caracterizacién de estos sistemas transportadores. Por otro lado, el prom otor tam bién parece estar regulado por la propia proteina MbdR, ya que su actividad es Hgeramente mayor cuando las células se cultivan en 3MBz (Fig. 38) y se ha demostrado la form acién de complejos MbdR-P^j^ mediante ensayos in vitro de retardo en gel (Fig. 39). Sin embargo, la afinidad que muestra M bdR por el prom otor sensiblemente inferior a la que m uestra por P q, Pgy y P,,. El prom otor P^^ posee una posible secuencia operadora para M bdR solapante con la caja -10, y ademâs dispone de otras cuatro posibles secuencias operadoras situadas aguas arriba de la caja -35 (Fig. 38C). La caja operadora situada entre las secuencias -10 y -35 séria necesaria para que M bdR ejerciera un efecto represor sobre su propia expresién, tal y com o ocurre con m uchos otros reguladores, com o por ejemplo BzdR, que reprime el operén catabéHco bi^d para la degradacién anaerébica del benzoato y también su propia expresién (Durante-Rodriguez et al, 2008). Sin embargo, se desconoce el papel que pueden jugar las diferentes cajas operadoras de M bdR locaHzadas en la regién 5 ' de Pjp̂ , si bien su naturaleza degenerada respecto a la secuencia consenso, ATAC-[10 b]-GTAT, sugiere que la interaccién con dichas cajas sélo se produciria a elevadas concentraciones de M bdR, lo que facilitaria la autorregulacién de la protem a reguladora, de tal forma que cuando en la célula hubiera un exceso de regulador bajaria su nivel de expresién. El estudio detallado de la autorregulacién del gen mbdK y del control del prom otor seràn objeto de trabajo en el futuro. 4. Regulacion transcripcional sobreimpuesta del cluster mbd Com o se ha com entado en la întroducciôn, las bacterias son capaces de detectar un gran num éro de senales extemas que ejercen un papel im portante sobre su fisiologia. Algunas de estas senales, com o por ejemplo la presencia/ausencia de oxigeno o la existencia de fuentes preferenciales de carbono, tienen una gran repercusién en el metabolismo bacteriano. Entre los sistemas que tienen las células para integrar esta in form acién y modificar su metabolismo destacan los reguladores globales de la transcripcién, capaces de ejercer su influencia sobre un gran num éro de clusters catabéhcos y otros genes reguladores. La expresién del cluster mbd estâ modulada, al igual que ocurre en m uchos otros clusters para el catabohsmo de compuestos aromâticos, por la presencia de fuentes preferenciales de carbono. E l esfuerzo energético necesario para la biodegradacién anaerébica de los compuestos aromâticos, sumado al gran num éro de productos proteicos necesarios para este catabohsmo, hace que la represién de los clusters catabéhcos sea una herramienta fundamental para que las bacterias ahorren recursos en situaciones en las que en el medio estâ présente la fuente de carbono aromâtica junto a otra fuente de carbono cuya incorporacién al m etabohsm o central es mâs eficiente. Mediante ensayos de actividad P galactosidasa en los que se anahzaba la actividad del p rom otor P^, en A ^arcus sp. CIB, se observé que algunas fuentes de carbono (casaminoâcidos, pim vato y ciclohexanocarboxilato) ocasionaban represién catabéhca sobre el p rom otor mientras que otras no lo hacian (benzoato, alanina y glutarato) (Fig. 40). D ebido a que Pq y son ambos prom otores que controlan la expresién de sendos operones catabéhcos, suponem os que el prom otor Pq se com portarâ de forma similar a P^,. Por otro lado, mediante experimentos de RT-PCR se dem ostré que el prom otor Pjj(, que dirige la expresién del regulador M bdR, no sufre represién catabéhca por parte de fuentes de carbono preferentes como el pim vato (Fig. 41). Esta situacién en la que Regulacion especifica etabolism central Ruta periférica Activacién Transporte 3-metilbenzoil-CoA OSCoA 3MBz MbdA MbdR orf9-mbdO Regulacion sobreim puesta (D [ l a mbdB12345 Fuentes de carbono preferentes ( p i r u v a t o , c i c l o h e x a n o c a r b o x i l a t o , e t c . ) Figura 54. Esquema general de los diferentes niveles de regulacién, estudiados en esta Tesis, sobre la expresién del cluster mbd de Azoarcus sp. CIB cuando la bacteria crece anaerébicamente en 3MBz. En la mitad superior de la figura se muestra un resumen de la regulacion especifica (Fig. 53). En la mitad inferior de la figura se muestra la regulacion sobreimpuesta dependiente de la presencia/ausencia de oxigeno y fuentes de carbono adicionales. Las fléchas verdes indican activacién de la transcripcién (+), mientras que los martillos rojos sehalan represién de la transcripcién (-). Las flechas/martillos de linea continua indican una relacién directa que se ha comprobado experimentalmente. Las flechas/martillos punteados reflejan que no se ha confirmado experimentalmente el control directo sobre los promotores correspondientes. Los rectângulos morados representan a la protema AcpR. En ausencia de oxfgenp AcpR se comportant como la protema Fnr de E. coli, dimerizando y activando la transcripcién. En presencia de oxigeno, AcpR cambia de conformacién, monomeriza, y no es capaz de unirse y activar los promotores correspondientes. El rombo naranja indica un regulador, desconocido hasta la fecha, que responde a fuentes de carbono preferentes y que contrôla la regulacién por catabolito de los genes mbd. los p ro m o to res cataboHcos son sensibles a la rep resién p o r catabolito pero los p ro m o to res de los genes reguladores son insensibles a la m ism a, es paralela a la observada en el cbdster b!(d de A l a r m s sp. C IB , en el que el p ro m o to r catabéHco sufre rep resién pero el p ro m o to r del regulador, (P J no la expérim enta (Lépez-B arragân et a i, 2004; D uran te-R odriguez et a l, 2008). 172 Las evidencias de las que disponemos hasta el m om ento no perm iten afirmar que la represion catabolica de los genes m b d sea ejercida de forma directa sobre y P q . Asi, no se puede descartar que el prom otor P,j, encargado de la expresiôn de la enzima que genera el inductor del sistema de regulacion especifica, sufra también represion por catabolito. Si esto fuera asi, los efectos observados sobre el prom otor podrian deberse a la incapacidad de que cese la represion ejercida por M bdR ante la imposibilidad de que se genere suficiente 3-metilbenzoil-CoA que induzca en sistema. El prom otor P,, podria ejercer un papel clave en el control de la expresiôn de todo el cluster m b d y sera objeto de esmdio en el fumro. Aunque la base molecular de la represion catabolica todavia es desconocida, en fechas recientes se ha identificado en Azoarcus sp. CIB un sistema regulador que parece estar implicado en la represion catabolica de los clusters para la degradacion anaerôbica de compuestos aromaticos (A. Valderrama, Tesis D octoral en preparacion). Una de las senales ambientales fundamentales para las bacterias anaerobias facultativas es la presencia o ausencia de oxigeno. Estas bacterias viven en medios en los que se producen variaciones en la tension de oxigeno y, por tanto, han de responder rapidamente expresando rutas aerobicas o anaerohicas. La proteina AcpR juega un papel fundamental en la expresiôn dependiente de oxigeno del cluster bs(d de Azoarcus sp. CIB, acmando com o un activador imprescindible del prom otor cataboHco Py en condiciones anoxicas (Durante-Rodriguez et ai, 2006). D e la misma forma, un m utante en el gen acpP ̂ Agoarcus sp. ClBàacpP^ es incapaz de utilizar 3MBz anaerobicamente, lo que confirma que la expresiôn de los genes m b d es dependiente de AcpR. El anâlisis de la actividad de los prom otores P q, P ^; y P̂ p̂ mediante experimentos de RT-PCR révéla que ésta disminuye en la cepa Azoarcus sp. C IB d^^R en com paracién con la cepa parental A'^arcus sp. CIB (Fig. 42). Sin embargo, el control ejercido por AcpR sobre los prom otores Pq y P^, podria ser indirecto. Las fusiones traduccionales PQ::lacZ y Pp^r.lacZ muestran una gran actividad ^-galactosidasa en cultivos aerébicos de E. coli (~5000 y ~1000 Unidades Miller, respectivamente), lo que dénota que no existe una dependencia tan estricta de la ausencia de oxigeno para la activacién de dichos prom otores. Por otro lado, en los experimentos de transcripcién in vitro de los prom otores P q y Pg, no es necesario anadir Fnr* (capaz de sustituir in vitro a AcpR) para observar form acién de transcrito (Fig. 33). Ademâs, estudios prehminares de interaccién D N A -proteina indican que Fnr* no se une de forma eficaz a los prom otores P q y Pg, (datos no mostrados). Al 173 igual que se ha indicado para la represion por catabolito, en el futuro se pretende dilucidar la posible interaccién de AcpR con P ,̂ mecanism o que explicaria el control indirecto de AcpR sobre P^y Pg,. En la Figura 54 se présenta un esquema del modelo global de regulacién del cluster mbd segun los resultados presentados y discutidos en esta Tesis. 5. Origen évolutive de! cluster mbd Com o hem os podido com probar en apartados anteriores, las proteinas implicadas en la ruta m bd m uestran simüitud con las proteinas que cumplen una funcién similar en el metabolismo anaerébico de compuestos aromâticos de microorganismos pertenecientes a diferentes géneros bacterianos com o As^arcus, Thauera, Magnetospirillum y PJoodopseudomonas. Este hecho podria sugerir un origen del cluster mbd a partir de la transferencia horizontal de diferentes genes o grupos de genes procedentes de bacterias pertenecientes a otros grupos taxonémicos. El anâlisis del CAI {Codon Adaptation Index; Sharp y Li, 1987) de los genes permite in férir el grado de adaptacién del cluster al genoma del microorganismo. Segün este indice, los valores préxrm os a 1 revelan una mayor identidad en el uso de codones del gen analizado con el uso de codones prom edio del genoma (calculado a partir de todas las ORFs codificantes de proteinas del genoma), lo que sugiere una mayor adaptacién al hospedador. La Tabla 9 m uestra el CAI de los genes mbd (asi com o el contenido en G + C de cada uno de eUos). Teniendo en cuenta que el % GC de las regiones codificantes de As^arcus sp. CIB es de un 66%, podem os observar que todos los genes del cluster mbd se encuentran po r debajo de este valor y oscüan entre un 49.1% (mbdRl) y un 64.9% {korA2). D ado que los valores del CAI para los distintos genes mbd son significativamente inferiores a los calculados para otros genes de Azoarcus sp. CIB (cuyo CAI es superior a 0.76) parece légico asumir que el cluster mbd de Agparcus sp. CIB procédé de otro genom a diferente (perteneciente a un microorganismo con un contenido en G + C inferior al de las cepas de los géneros Thauera jAs^arcus) y que habria sido adquirido por la cepa CIB mediante un proceso de transferencia horizontal de DN A . E n este sentido, resultados recientes obtenidos tras el ensamblaje del genoma de As(oarcus sp. CIB revelan que el cluster mbd se locaHza en un elemento integrativo/ conjugativo (elemento XTD) que incluiria tam bién al cluster bss-bbs (codificante de la ruta periférica del tolueno/ w-xüeno). El anâlisis del CAI y del contenido en G + C de los L74 genes del cluster bss-bbs (Blâzquez, 2009) muestra que estos estân mâs adaptados al genoma de Azoarcus sp. CIB que los del cluster mbd. Asi, el contenido medio en G + C de los genes bss-bbs es de 62%, frente a un 58% del cluster mbd. N o obstante, los genes bss- bbs presentan un valor medio de CAI de 0.65, superior al proedio de los genes mbd (0.53) pero inferior al que presentan otros genes de Asparcus sp. CIB (superior a 0.76). Este disparidad en los valores de CAI de los clusters bss-bbs y mbd podria sugerir que el cluster bss-bbs paso a integrarse en el elemento X T D procedente de una especie cercana a Agoarcus sp. CIB. Una posibüidad es que el elemento X T D portador del cluster bbs-bss se integrara en el genoma de una especie del género As;parcus o afin, com o Thauera, aportândole la capacidad de crecer anaerobicamente en tolueno, ya que para el crecimiento en esta fuente de carbono no se requiere la ruta m bd sino la ruta central del Nombre CAI %GC Funcién predicha OTp 0.43 57.1 Ruta baja: enoil-CoA hidratasa. orjS 0.39 56.9 Acil-CoA deshidrogenasa orJ7 0.46 59.1 Acil-CoA deshidrogenasa orj6 0.44 58.1 Acetü-CoA hidrolasa/transferasa orfS 0.48 59.1 Posible (metil)-^utaril-CoA dedûdrogenasa korB2 0.68 64.3 KGOR subunidad p korA2 0.69 64.9 KGOR subunidad a mbdM 0.43 50.8 Ferredorina mhdW 0.48 60.4 (metil)-ciclohexa-l,5-dieno-carboniI-CoA hidratasa mbdY 0.66 62.5 (met3)-6-oxociclohex-l -eno- 1-carbonil-CoA hidiolasa mbdK 0.61 63.5 (metil)-6-hidroxidiohex-l -eno-1 -catbonil-CoA deshidrogenasa otfl 0.58 59.6 Ruta baja: enoil-CoA deshidrogenasa. Offi 0.62 61.0 Ruta baja: enoü-CoA hidratasa. otfi 0.55 61.4 Ruta baja: P-cetotiolasa. orfl 0.62 56.0 Amidohidrolasa 2 mbdP 0.49 55.5 3 -metübenzoil-CoA reductasa, subunidad ô mbdQ 0.51 58.4 3 -metübenzoil-CoA reductasa, subunidad a mbdN 0.49 527 3 -metübenzoil-CoA reductasa, subunidad y mbdO 0.46 51.7 3-metilbep2oil-CoA reduçtas% Subunidad p mbdBI 0.58 60.4 Transportador ABC, subunidad periplâsmica mbdB2 0.51 57.5 Transportador ABC, subunidad transmembrana mbdB3 0.57 59.2 Transportador ABC, subunidad transmembrana mbdB4 0.52 60.4 Transportador ABC, Aibunidad ATPasa mbdBS 0.52 59.5 Transportador ABC, subunidad ATPasa mbdA 0.50 56.2 3MBz-CoA ligasa mbdR 0.45 49.1 Regulador transcripcional Tabla 9. Comparacién del uso de codones de los diferentes genes del cluster mbd con el uso de codones promedio del genoma de Azoarcus sp. CIB. La Tabla resume el valor del CAI {Codon Adaptation Index-, Sharp y Li, 1987), calculado segun se detalla en el apartado correspondiente de Materiales y Métodos, para cada gen del cluster mbd, tomando como referenda la tabla de uso de codones de todas las orf codificantes de proteinas de Azoarcus sp. CIB. También se detalla el contenido en G+C (%) para cada gen. El valor de G+C medio de las orfs codificantes de Azoarcus sp. CIB es de un 66%. Se detalla también la funcién predicha para cada gen en la ruta mbd. Los genes para los que no se ha hipotetizado su funcién en la ruta mbd aparecen en blanco. — benzoil-CoA presente en el genoma de todas estas cepas. Asi, A . aromaticum E b N l y T. aromatica, por ejemplo, presentan la ruta central para la degradacion del benzoil-CoA y la ruta periférica bss-bbs que les perm iten degradar tolueno, pero son incapaces de degradar w-xileno (Leuthner y Heider, 2000; K ube et al, 2004). E n la historia evolutiva del elemento X T D y mediante procesos de transferencia horizontal, éste pudo transferirse a una bacteria perteneciente a un género diferente y que presentase un porcentaje de G + C sensiblemente inferior al de Agoarcus o Thauera, adquiriendo el cluster mbd. En un proceso posterior, el elemento X T D pudo ser transferido a Asparcus sp. CIB aportândole la capacidad de crecimiento anaerobico en tolueno y w-xileno. Este tipo de elementos génicos moviles constituye un sistema m uy eficaz para la transferencia horizontal de inform acion entre diferentes cepas bacterianas. El elemento X T D de As;varcus sp. CIB es el prim ero que se describe capaz de conferir la capacidad de utilizar anaerobicamente hidrocarburos aromâticos com o el tolueno y el w-xileno, y su caracterizacién detallada estâ siendo objeto de esmdio en la acmahdad. 176 VI. CONCLUSIONES 177 El trabajo descrito a lo largo de esta Tesis D octoral ha dado lugar a las siguientes conclusiones: • E l cluster mbd, responsable de la activacién del 3MBz y de la degradacién anaerébica del 3-metilbenzoil-CoA en A ^arcus sp. CIB, se ha identificado y caracterizado. D e esta forma se ha descrito una nueva ruta central para el catabolismo anaerébico de com puestos aromâticos que no habia sido identificada hasta la fecha en ningùn microorganismo. • El cluster mbd se organiza en, al m enos, cuatro operones; a) Un operén {mbdO-orfd) que agrupa a los genes catabéhcos de la ruta central y, posiblemente, de la ruta baja, controlado por el prom otor Pq. b) Un operén que codifica un presunto sistema de transporte (mbdBIB2B3B4BS) y el gen catabéHco mbdA que interviene en la activacién del 3MBz (ruta periférica), controlado por el p rom otor Pg,. c) Un operén catabéHco que contiene en exclusiva el gen mbdA, controlado por el prom otor P ,. d) Un operén m onocistrénico que contiene el gen regulador mbdP., controlado por el p rom otor P^p. • El producto del gen mbdA, responsable de la ruta periférica de activacién del 3MBz a 3-metilbenzoil-CoA, es la prim era 3MBz-CoA Hgasa descrita, y define un nuevo grupo de proteinas CoA-Hgasas de âcidos aromâticos emparentado con el de las benzoato-CoA Hgasas. • Se ha caracterizado la actividad 3-metilbenzoil-CoA reductasa, que estaria codificada por los genes mbdONQP y que supone el paso clave de la degradacién anaerébica del 3-metilbenzoil-CoA puesto que es la encargada de la reduccién del aniUo aromâtico. La reductasa M bdO N Q P représenta el prim er m iembro de un nuevo subgrupo de reductasas que présenta simüitud con las benzoü-CoA reductasas dependientes de ATP, y cuyo sistema de aporte de poder reductor estaria constituido por la ferredoxina M bdM y la a-cetoglutarato éxido-reductasa bicom ponente KorA2B2. • La proteina M bdW purificada es una metü-ciclohexa-l,5-dieno-carbonü-CoA hidratasa responsable del prim er paso de la [3-oxidacién modificada del com puesto aHcicHco producto de la reduccién del 3-metübenzoü-CoA. 179 El gen mbdK codifica un regulador transcripcional de la familia TetR que reprime la expresiôn de los cuatro operones del cluster mbd en ausencia de inductor. El represor transcripcional M bdR purificado interactua con una region operadora palindromica solapante con la de reconocim iento por parte de la subunidad A" de la RNA polimerasa en los prom otores Pq, Pg,, P_, y P^p. El 3-metilbenzoil-CoA es la molécula inductora responsable de la activacion de los prom otores del cluster mbd mediante su interaccién con MbdR, el primer m iem bro de la familia TetR que tiene com o molécula inductora un com puesto aromâtico derivado de CoA. La expresién de los genes catabéhcos mbd estâ sometida a represién catabéhca cuando Asparcus sp. CIB se cultiva en fuentes de carbono preferentes (âcidos orgânicos). Esta regulacién sobreimpuesta actua, al menos, sobre el prom otor catabéHco Pg, y parece no actuar sobre el prom otor regulador O tro sistema de regulacién sobreimpuesta que responde a la presencia/ausencia de oxigeno contrôla la actividad de los prom otores Pq, Pg, y P,p, y estâ mediado, de forma directa o indirecta, por el activador transcripcional AcpR. El anâhsis del contenido en G + C y el uso de codones de los genes mbd, asi como la locahzacién de éstos en un elem ento integrativo/conjugativo, sugiere su adquisicién por Agoarcus sp. CIB mediante transferencia génica horizontal y com o un mecanismo de adaptacién a nuevas fuentes de carbono taies com o m- xileno y 3MBz. 180 VII. B iblio g rafia 181 c i i i c i Achong, G.R., Rodriguez, A M. y Spormann, A M. (2001). Benzylsuccinate synthase o f A la r m s sp. strain T: cloning, sequencing, transcriptional organization, and its role in anaerobic toluene and w-xylene mineralization. J Bacteriol 183, 6763-6770. Adler, E. (1977). Lignin chemistry past, present and future. W ood Science and Technology 11, 169-218. Alguel, Y., Meng, C., Teran, W., KreU, T., Ramos, J.L., Gallegos, M.T. y Zhang, X. (2007). Crystal structures o f m ultidrug binding protein TtgR in complex with antibiotics and plant antimicrobials. J Mol Biol 369, 829-840. Altenschmidt, U. y Fuchs, G. (1992). Novel aerobic 2-aminobenzoate metabolism. 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