UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Toxicología y Farmacología TESIS DOCTORAL Farmacocinética de oxitetraciclina en dosificación oral múltiple en cerdos. Análisis PK-PD MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Alonso Dupuy Mateos Directores Arturo Anadón Navarro María Aránzazu Martínez Caballero Irma Ares Lombán Madrid, 2016 © Alonso Dupuy Mateos, 2016 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA FARMACOCINÉTICA DE OXITETRACICLINA EN DOSIFICACIÓN ORAL MÚLTIPLE EN CERDOS. ANÁLISIS PK-PD. MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR ALONSO DUPUY MATEOS Bajo la dirección de los Profesores Doctores Arturo Anadón Navarro María Aránzazu Martínez Caballero Irma Ares Lombán Madrid, 2015 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA FARMACOCINÉTICA DE OXITETRACICLINA EN DOSIFICACIÓN ORAL MÚLTIPLE EN CERDOS. ANÁLISIS PK-PD. TESIS DOCTORAL ALONSO DUPUY MATEOS Madrid, 2015 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA FARMACOCINÉTICA DE OXITETRACICLINA EN DOSIFICACIÓN ORAL MÚLTIPLE EN CERDOS. ANÁLISIS PK-PD. Memoria presentada para optar al Grado de Doctor por la Universidad Complutense de Madrid Departamento de Toxicología y Farmacología ALONSO DUPUY MATEOS Madrid, 2015 ALONSO DUPUY MATEOS FARMACOCINÉTICA DE OXITETRACICLINA EN DOSIFICACIÓN ORAL MÚLTIPLE EN CERDOS. ANÁLISIS PK-PD. Directores: Prof. Dr. Arturo Anadón Navarro Catedrático de Toxicología y Legislación Sanitaria Facultad de Veterinaria Prof. Dra. María Aránzazu Martínez Caballero Profesora Titular de Toxicología Facultad de Veterinaria Prof. Dra. Irma Ares Lombán Profesora Contratado Doctor de Toxicología Facultad de Veterinaria UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID Trabajo financiado por el Proyecto Ref. UCM-BSGH/GR3/14 Universidad Complutense de Madrid, por el Proyecyo (ALIBIRD-CM Programa) Ref. S2013/ABI- 2728 de la Comunidad de Madrid. Deseo expresar mi agradecimiento: A mis Directores de Tesis Doctoral, el Prof. Dr. Arturo Anadón Navarro, Catedrático de Toxicología y Legislación Sanitaria, la Prof. Dra. María Aránzazu Martínez Caballero, Profesora Titular de Toxicología y la Prof. Dra. Irma Ares Lombán, Profesora Contratado Doctor de Toxicología por la dirección de esta Memoria, por todas sus enseñanzas, confianza y el apoyo recibido a lo largo de este periodo de mi formación que han conducido a la realización de esta Tesis Doctoral. A la Prof. Dra. María Rosa Martínez-Larrañaga, Catedrática de Toxicología, que de forma tan generosa ha contribuido con su permanente apoyo y estímulo a que esta Tesis Doctoral pueda ser presentada. A mis compañeros del Grupo de Investigación de Toxicología del Departamento de Toxicología y Farmacología de la Universidad Complutense de Madrid, por la ayuda recibida. A toda mi familia, muy especialmente a mis hijos, Alonso, Celia y James; a mi padre por su apoyo constante y sobre todo en estos años difíciles; a mi madre por su continuo cariño, amor y apoyo incondicional; a mis hermanas Paloma y Ana; a mi sobrina y ahijada Claudia; y a Jasmina por su cariño, comprensión y amor. A todos los seres queridos que por uno u otro motivo ya no puedan recibir mi agradecimiento; pero que han permitido en algún momento, con su apoyo, a la consecución de esta tesis. Prof. Dr. Arturo Anadón Navarro, Catedrático de Toxicología y Legislación Sanitaria del Departamento de Toxicología y Farmacología de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid, Prof. Dra. María Aránzazu Martínez Caballero, Profesora Titular de Toxicología del Departamento de Toxicología y Farmacología de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid, y Prof. Dra. Irma Ares Lombán, Profesora Contratado Doctor de Toxicología del Departamento de Toxicología y Farmacología de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid, CERTIFICAN que D. ALONSO DUPUY MATEOS Ha realizado bajo nuestra dirección su Tesis Doctoral titulada “Farmacocinética de Oxitetraciclina en Dosificación Oral Múltiple en Cerdos. Análisis PK-PD” en el Departamento de Toxicología y Farmacología de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid. Y para que conste a los efectos oportunos, se expide el presente certificado en Madrid, a 16 de octubre de dos mil quince. Prof. Dr. Arturo Anadón Navarro Prof. Dra. María Aránzazu Martínez Caballero Prof. Dra. Irma Ares Lombán Departamento de Toxicología y Farmacología Facultad de Veterinaria 28040 Madrid ÍNDICE 1. RESUMEN…………………………………………………………..………… 1 2. INTRODUCCIÓN………………………………………………………...….. 5 2.1. Origen y aspectos generales de la oxitetraciclina …………………..……. 6 2.1.1. Historia de la oxitetraciclina………………………………….…... 6 2.1.2. Estructura química de la Oxitetraciclina y propiedades fisicoquímicas……..……….…………………………………..…… 9 2.1.3. Relación estructura-actividad de la oxitetraciclina……………..... 11 2.2. Acción farmacológica………………………………………………….…… 15 2.2.1. Mecanismo de acción ………………………………………….…… 15 2.2.2. Espectro antimicrobiano……………………………………………. 16 2.2.3. Resistencias…………………………………..…………………..…. 18 2.3. Farmacocinética……………………………………………………….….… 21 2.3.1. Absorción…………… …………………………………………..….. 22 2.3.2. Distribución…………….…………………………………….……... 25 2.3.3. Metabolismo y eliminación………………………………..……..…. 25 2.4. Toxicidad y reacciones adversas……………………………………........... 28 2.5. Indicaciones terapéuticas………………………………….…………….…. 30 2.6. Integración farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD). Índices PK-PD………….…………………………………........................... 32 2.7. Justificación del trabajo y objetivos………………………………….…… 57 3. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………. 61 3.1 Protocolo y diseño experimental……………………………………………. 62 3.1.1. Estudio farmacocinético de oxitetraciclina tras administración única oral en cerdos…………..………………………………..….... 63 3.1.2. Estudio farmacocinético de oxitetraciclina tras administración múltiple oral en cerdos…………………………….……………...... 64 3.2. Método analítico de oxitetraciclina en plasma de cerdos..……………… 67 3.2.1. Procedimiento de extracción de oxitetraciclina. Condiciones cromatográficas…………………………………………………..… 68 3.2.2. Validación del método analítico de oxitetraciclina en plasma de cerdo………………………………………………………………… 70 3.3. Análisis de datos……………………………………………………………. 75 3.4. Fármacos y reactivos…………………………………………………..…… 80 4. RESULTADOS……………………………………………………………….. 81 4.1. Farmacocinética de oxitetraciclina tras administración única oral en cerdos………………………………………………………………….….… 82 4.1.1. Niveles plasmáticos de oxitetraciclina tras administración única oral…………………………………………………………..... 82 4.1.2. Parámetros farmacocinéticos de oxitetraciclina tras administración única oral…………………………………………………………… 85 4.2. Farmacocinética de oxitetraciclina tras administración múltiple oral durante 7 días en cerdos…………………………………………....... 87 4.2.1. Niveles plasmáticos de oxitetraciclina tras administración múltiple oral………………………………………..…..................... 87 4.2.2. Parámetros farmacocinéticos de oxitetraciclina tras administración múltiple oral…………..………………….……….. 92 4.3. Índices PK/PD correlacionados con la eficacia del antibiótico…………. 95 5. DISCUSIÓN…………………………………………………………............. 99 6. CONCLUSIONES…………………………………………......................... 104 7. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………. 107 1 1. RESUMEN Introducción. La oxitetraciclina, antibiótico de amplio uso en medicina veterinaria, pertenece al grupo de las tetraciclinas. Inhibe la síntesis de proteínas en la bacteria a nivel ribosomal. La oxitetraciclina presenta principalmente una acción bacteriostática frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, así como también frente a otros microorganismos tales como micoplasmas, espiroquetas, clamidias y rickettsias. Se clasifica en la actualidad de acuerdo con la cinética de muerte bacteriana como co- dependiente. En la bibliografía científica existen trabajos publicados de farmacocinética de oxitetraciclina en distintas especies animales, sin embargo hay escasos trabajos realizados en el cerdo. Dado que es necesario conocer la disposición de un fármaco en la especie animal estudiada para diseñar un adecuado régimen de dosificación, los objetivos del presente trabajo han sido: (i) describir el perfil farmacocinético de la oxitetraciclina tras administración oral única y múltiple en cerdos (Sus scrofa domestica) y (ii) realizar el análisis PK-PD para predecir la eficacia terapeútica del régimen de dosificación. Material y Métodos. Se utilizaron 10 cerdos sanitariamente sanos con un peso medio de 60 kg. El estudio se llevó a cabo de acuerdo a los requerimientos éticos de bienestar animal. Los animales fueron distribuidos en tres grupos (Grupo 1, 4 cerdos, Grupo 2, 4 cerdos y Grupo 3, 2 cerdos). A los animales del Grupo 1, se les administró un pienso que contenía una concentración de oxitetraciclina de 1 g/kg, equivalente a una dosis oral única de 5 mg/kg p.v. A los animales del Grupo 2, se les adminsitró durante 7 días un pienso que contenía una concentración de oxitetraciclina de 1 g/kg, equivalente a una dosis oral múltiple de 30 mg/kg p.v./día durante 7 días consecutivos. Los animales del Grupo 3, no recibieron tratamiento y se emplearon para recoger plasma blanco para utilizarlo en la validación del método analítico elegido. En los animales del Grupo 1 se tomaron muestras de sangre a diferentes intervalos de tiempo (15 y 30 min., 1, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 horas después de la administración de oxitetraciclina) a partir de la vena yugular de cada uno de los animales. En los animales del Grupo 2 durante el primer y último día de administración se tomaron muestras de sangre a diferentes intervalos de tiempo (15 y 30 min., 1, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 horas después de la administración) a partir la vena yugular de cada uno de los animales. Los días intermedios, es decir, días 2, 3, 4, 5 y 6 de tratamiento, se recogieron muestras de sangre a los 30 min., 2, 4, 8 y 24 h después de la administración. Las muestras de sangre se centrifugaron y se recogió individualmente el plasma que se almacenó a continuación a -45°C hasta el posterior análisis de las 2 concentraciones de oxitetraciclina. Los niveles plasmáticos de oxitetraciclina se analizaron con un sistema HPLC equipado con una columna Teknokroma, Nucleosil 120 C18 (5 μm; 12,5 x 0,4 cm). La fase móvil fue una mezcla de ácido oxálico 0,01M: acetonitrilo: metanol en una proporción de 855:120:25. La curva de concentraciones medias plasmáticas vs tiempo se analizó usando el programa Phoenix 32 Build 6.4.0.768 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA). El método analítico se validó cumpliendo los criterios recomendados por la Agencia Europea de Medicamentos (EMA). Las áreas de los picos en los cromatogramas de las muestras se cuantificaron usando la técnica del estándar externo mediante el uso de soluciones de referencia estándar de oxitetraciclina. Las curvas de calibrado para la oxitetraciclina fue lineal en un rango de 0,05-60 μg/ml (0,05-60 µg/g de tejido). El límite de cuantificación (LOQ) fue de 0,05 µg/ml. La recuperación media de oxitetraciclina en plasma fue > 84%. La precisión intra-día e inter-día presentó un coeficiente de variación < 5,5% Resultados y Discusión. Los parámetros farmacocinéticos se calcularon tomando en cuenta la media de las concentraciones plasmáticas de oxitetraciclina frente al tiempo usando el programa Phoenix 32 Build 6.4.0.768. Las curvas de las concentraciones plasmáticas de oxitetraciclina frente al tiempo después de la administración oral (30 mg/kg p.v./día durante 7 días consecutivos) obtenidas, se ajustaron adecuadamente a un modelo bicompartimental para su análisis cinético. La absorción oral fue rápida, como refleja la semivida de absorción (t1/2a) (1,371 ± 0,116 h) y el tiempo medio en el que se alcanzó la concentración máxima (Tmax) (2,816 ± 0,118 h). La concentración plasmática máxima (Cmax) fue 3,455 ± 0,143 µg/ml. La semivida plasmática de eliminación (t1/2β) fue 11,434 ± 0,438 h. Las concentraciones plasmáticas de oxitetraciclina disminuyeron lentamente presentándose niveles del antibiótico en un rango de 0,903 a 1,155 µg/ml a las 12 h después de la administración y en un rango de 0,401 a 0,576 µg/ml a las 24 h después de la administración. Los parámetros farmacocinéticos obtenidos en los estudios farmacocinéticos a dosis oral única y múltiple de oxitetraciclina se correlacionaron con el parámetro farmacodinámico in vitro concentración mínima inhibitoria (CMI) al objeto de realizar el análisis PK-PD. Conclusión. Este estudio presenta las propiedades farmacocinéticas y análisis PK-PD de oxitetraciclina en cerdos. El estudio aporta datos para un uso responsable de oxitetraciclina en la especie porcina sugiriendo un posible régimen de dosificación terapeútico. 3 ABSTRACT Introduction. The oxytetracycline is a broad spectrum antibiotic widely used in veterinary medicine. It inhibits bacterial protein synthesis at the ribosome level. The oxytetracycline has a bacteriostatic action against gram positive and gram negative bacteria as well as mycoplasmas, spirochetes, chlamidiae and rickettsiae. It is currently classified according to its kinetics as co-dependant. There is some published studies regarding oxytetracycline pharmacokinetics in different animal species, however there are very few published research in pigs. It is mandatory to have a good knowledge of the antimicrobial in the species subject of study in order to design an effective dosing regime, therefore, the aim of this study is: (i) to describe oxytetracycline pharmacokinetics following both single and multiple oral administration in pigs (Sus scrofa domestica) and (ii) to establish the PK-PD integration in order to predict an effective therapeutic regime. Material & Methods. 10 healthy pigs weighing an average of 60kg were used. The study was carried out following all ethical requirements regarding animal welfare. The animals were distributed in three groups (Group 1 with 4 pigs, Group 2 with 4 pigs and Group 3 with 2 pigs). Group 1 animals were treated with a single oral dose at 5mg/kg body weight in the pig feed. Group 1 animals received oxytetracycline in the pig feed at a concentration of 1g/kg, which represents a single oral dose of 5mg/kg body weight. Group 2 animals received oxytetracycline in the pig feed at a concentration of 1g/kg every 24 hours during 7 days, which represents a multiple oral dose of oxytetracycline at 30 mg/kg body weight/day for 7 consecutive days. Group 3 animals did not receive any treatment and were used to collect plain plasma in order to determine the validation of the analytical method. Blood samples from Group 1 animals were taken at different time intervals (15 and 30 minutes, 1, 2, 4, 6, 8, 12 and 24 hours after the administration) from the jugular vein in each one of the animals. Samples from Group 2 animals were taken on the first and last day of oxytetracycline administration at different time intervals (15 and 30 minutes, 1, 2, 4, 6, 8, 12 and 24 hours after the administration) from the jugular vein in each one of the animals. In the intermediate days (2, 3, 4, 5 and 6 days of treatment), blood samples were obtained at 30 minutes, 2, 4, 8 and 24 hours of oxytetracycline administration. Blood samples were centrifuged and plasma was individually separated and stored at -45°C until oxytetracycline concentrations were determined. Plasma concentrations of oxytetracycline were determined with a HPLC 4 system equipped with a Teknokroma column, Nucleosil 120 C18 (5 μm; 12,5 x 0,4 cm). The mobile phase was a mixture of oxalic acid 0.01M:acetonitrile:methanol at the proportion 855:120:25. The mean plasma concentrations curve vs time was analysed using the Phoenix 32 Build 6.4.0.768 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA). The analytical method was validated meeting the criteria recommended by European Medicines Agency (EMA). The peak areas in the chromatograms of the samples were quantified using the external standard technique by using standard referenced solutions of oxytetracycline. Calibrating curve for oxytetracycline was lineal in a range of 0.05-60 μg/ml (0.05-60 µg/g of plasma). The quantification limit (QL) was of 0.05 µg/ml for plasma or 0.001 µg/g. The mean oxytetracycline recovered in plasma was > 84%. The intra-day and inter-day accuracy showed a coefficient of variation < 5.5%. Results and Discussion. The pharmacokinetic parametres were calculated relating the mean of plasma concentrations of oxytetracycline against time using the Phoenix 32 Build 6.4.0.768 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA) program. The plasma concentration curves of oxytetracycline obtained against time following its oral administration (at 30 mg/kg body weight during 7 consecutive days) suited aproprietly a bicompartimental model for its kinetic study. The oral absorption was fast, as shown by the absorption half life (t1/2a) which was 1.371 ± 0.116 h and the mean time at which the maximum concentration was achieved (Tmax) was 2.816 ± 0.118 h. The maximum mean plasma concentration (Cmax) was 3.455 ± 0.143 µg/ml. The mean elimination half life (t1/2β) was 11.434 ± 0.438 h. The plasma concentrations of oxytetracycline decreased slowly showing antibiotic level at a concentration range of 0.903 to 1.155 µg/ml at 12 hours after administration and at a range of 0.401 to 0.576 µg/ml at 24 hours after the administration. The pharmacokinetic parametres obtained in the pharmacological study at a single dose and multiple doses of oxytetracycline were correlated with the in vitro pharmacodynamics parameter MIC (minimal inhibitory concentration) in order to perform the PK-PD analysis. Conclusion. This study presents the pharmacokinetic properties and PK-PD analysis of oxytetracycline in pigs. The study provides data for a responsible use of oxytetracycline in pigs suggesting a possible therapeutic dosing regimen. 5 INTRODUCCIÓN 6 2. INTRODUCCIÓN 2.1. Origen y aspectos generales de las tetraciclinas 2.1.1. Historia de la oxitetraciclina Las tetraciclinas son la segunda clase de antibióticos de amplio espectro descubierto después de la penicilina. La oxitetraciclina fue descubierta por Finlay y colaboradores en el año 1950 (FINLAY et al., 1950). Al contrario que el descubrimiento de la penicilina (descubierta por Fleming en el año 1929), el desarrollo de la oxitetraciclina fue consecuencia de un trabajo organizado en busca de un agente terapeútico frente a bacterias, ricketsias y espiroquetas y ciertos “virus y organismos protozoarios” (WRIGHT y TSCHAN, 1953). El programa de investigación consistió en la toma de 100.000 muestras de tierra de multitud de localizaciones en distintos continentes (KANE et al.,1950). Después de un prolongado periodo de muestreo de tierra, se obtuvo el antibiótico oxitetraciclina de un actinomicete llamado Streptomyces rimosus, llamado así por su aspecto “agrietado” al crecer sobre el medio agar. Fue el famoso químico americano R.B. WOODWARD el que dos años después formuló la estructura química de la oxitetraciclina (STEPHENS et al., 1952), posibilitando a los laboratorios Pfizer la producción del antibiótico, bajo el nombre de “Terramicina”. El descubrimiento de WOODWARD facilitó el descubrimiento de un derivado de la oxitetraciclina, la doxiciclina, que es uno de los antibióticos más comunes de uso actualmente en medicina humana y veterinaria. El descubrimiento de la oxitetraciclina supuso una revolución en el mundo de la Medicina. Pronto la oxitetraciclina se comenzó a utilizar para el tratamiento de una multitud de patologías como las enfermedades venéreas, estreptococos, pneumonía, disentería, difteria, tracomas y tifus entre otras enfermedades más. De esta manera las tetraciclinas se clasifican en tres generaciones. Las de primera generación (clortetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina, demeclociclina, rolitetraciclina, limeciclina, clomociclina); las de segunda generación (metaciclina, doxiciclina, minociclina); y las de tercera generación (glicilciclinas), como se muestra en la Tabla 1. La oxitetraciclina (producto de Streptomyces rimosus) fue tan solo la segunda tetraciclina descubierta tras la clortetraciclina. Más adelante se descubrieron la tetraciclina (año 1953), la demeclociclina o la demetilclortetraciclina (1957), la 7 rolitetraciclina (1958) y la limeciclina (1956) (CHOPRA y ROBERTS, 2001; BAEYENS y DEL POZO, 2008). La clortetraciclina y la oxitetraciclina son antibióticos naturales que sólo se pueden obtener mediante fermentación; por otro lado, la demetilclortetraciclina y la tetraciclina se pueden obtener por fermentación o semisíntesis. Las moléculas descritas hasta ahora forman el grupo de las denominadas tetraciclinas de primera generación, caracterizadas por tener una absorción reducida y una baja lipofilia, todas ellas pueden administrarse por vía oral con excepción de la rolitetraciclina (AGWUH y MACGOWAN, 2006). La metaciclina sintetizada en el año 1961, doxiciclina en el año 1966 y la minociclina en el año 1967, forman el grupo de las tetraciclinas de segunda generación, producto de reacciones de semisíntesis desarrolladas para aumentar la solubilidad y la absorción, y prolongar la semivida biológica de la molécula, y están disponibles en fórmulas orales e intravenosas. Se han desarrollado técnicas de regeneración protoplasmática en cultivos de Streptomyces rimosus y Streptomyces aureofaciens con el fin de mejorar las condiciones de producción de los antibióticos oxitetraciclina y clortetraciclina (ISAEVA y VOEIKOVA, 1990). Una nueva subfamilia, las tetraciclinas de tercera generación, está constituida por las glicilciclinas especialmente desarrolladas con el fin de vencer los problemas de resistencias y cuyo producto más utilizado es la tigecilina, de potente actividad antibacteriana y amplio espectro de acción (CHOPRA Y ROBERTS, 2001; BHATTACHARYA et al., 2009; MEDIAVILLA et al., 2008) (Tabla 1). 8 Tabla 1. Principales miembros de la clase de las tetraciclinas Nombre químico Nombre genérico (Generación) Nombre comercial Año de descubrimiento Vía de administración 7, Clortetraciclina Clortetraciclina (1ºgen) (a) Aureomicina 1948 Oral 5, Hidroxitetraciclina Oxitetraciclina (1ºgen) (a) Terramicina 1948 Oral y parenteral Tetraciclina Tetraciclina (1ºgen) (b) Acromicina 1953 Oral 6-demetil-7-clortetraciclina Demetilclortetraciclina (1ºgen) (b) Declomicina 1957 Oral 2-N- Pirrolidinometiltetraciclina Rolitetraciclina (1ºgen) (c) Reverin 1958 Oral 2-N-Lisinometiltetraciclina Limeciclina (1ºgen) (c) Tetralisal 1961 Oral y parenteral N-Metilol-7-clortetraciclina Clomociclina (1ºgen) (c) Megaclor 1963 Oral 6-Metileno-5- hidroxitetraciclina Metaciclina (2ªgen) (d) Rondomicina 1965 Oral 6-Deoxi-5-hidroxitetraciclina Doxiciclina (2ªgen) (d) Vibramicina 1967 Oral y parenteral 7-Dimetilamino-6-demetil-6- deoxitetraciclina Minociclina (2ªgen) (d) Minocin 1972 Oral y parenteral 9-(t-butilglicilamido)- minociclina Butilglicilamidominoci-clina (Glicilciclina) (3ªgen) (e) Tigeciclina 1993 Parenteral (a) Producidas por dos especies diferentes de Streptomyces; descubiertas a finales de los años 1940 (b) Obtenidas a partir de Streptomyces en la década de 1950 (c) Derivados semisintéticos caracterizados por su hidrosolubilidad (d) Derivados semisintéticos de las primeras (e) Grupo más reciente siendo la tigecilina el representante más importante. En la actualidad, la cría de ganado porcino es la que más antibióticos consume a nivel mundial, por encima del ganado bovino. Las tetraciclinas en general son los antibióticos más utilizados a nivel mundial en ganado porcino. Por ejemplo, en el Reino Unido, de acuerdo con el Veterinary Medicines Directorate (VMD) (BURCH, 2012) de las 387 toneladas de antibióticos utilizados en animales en 2007, el 45% fueron tetraciclinas, el 19% sulfonamidas/trimetoprim, el 19% beta-lactámicos y el 9% macrólidos. Según estimaciones realizadas por BURCH (2012), sólo en 2007 en el Reino Unido, la especie porcina supuso el consumo de unas 206 toneladas de antibióticos; siendo también la especie animal que más antimicrobianos consume. En el año 2009 en España, las ventas totales de antimicrobianos representaron un total de 1102,35 Tm; aproximadamente el 80% del total de las ventas corresponden a cuatro clases de antimicrobianos: tetraciclinas, sulfonamidas y trimetoprim, β- 9 lactámicos y lincosamidas. Las tetraciclinas (31,23%) son el grupo mayoritario (AEMPS, 2011) seguidas de las sulfonamidas y trimetoprim (22,29%), y de β- lactámicos (16,29%). A nivel Europeo, la venta de tetraciclinas para uso veterinario representa un 37%, los β-lactámicos un 23% y las sulfonamidas y trimetoprim un 11% (EMA, 2013). 2.1.2. Estructura química de la oxitetraciclina y propiedades físico-químicas Las tetraciclinas son sustancias cristalinas ligeramente amarillas, inodoras y levemente amargas; son anfóteras ya que en solución acuosa forman sales tanto con ácidos como con bases. Las tetraciclinas son estables en forma de polvo pero no en solución acuosa, siendo particularmente inestables a pH superiores a 7,0. Se ionizan con soluciones ácidas de pH inferiores a 2. La tetraciclinas son poco solubles en pH ácido, pero pueden hacerse más solubles al combinarse con sodio o clorhidrato. En solución acuosa neutra, la clortetraciclina pierde la mayor parte de su actividad en un día, la oxitetraciclina en tres o cuatro días y la tetraciclina en unas tres semanas. La oxitetraciclina en particular es un polvo cristalino amarillo, soluble en agua y que se disuelve en soluciones diluídas de ácidos o bases. El peso molecular de la oxitetraciclina es de 460,434 g/mol. Existen dos partes en la molécula que contienen distintos grupos funcionales. La parte inferior de la molécula (como se muestra en la Figura 1), posee una serie de grupos funcionales de oxígeno (NELSON, 1998). La mayoría de las modificaciones sintéticas a lo largo de esta parte suponen una pérdida de la actividad biológica. Sin embargo, las modificaciones sintéticas de la parte superior de la molécula, dan lugar a nuevos compuestos con una mayor actividad biológica, y en algunos casos con capacidad de inhibir el crecimiento de bacterias resistentes a otras tetraciclinas. Además, la modificación de los grupos funcionales de esta parte puede inducir cambios en el tamaño, forma, carga, densidad electrónica y polaridad. Estas modificaciones pueden producir cambios en la solubilidad, lipofilia, y afinidad con las moléculas diana. No obstante, las tetraciclinas con mayor actividad antibacteriana, en general solo difieren entre ellas por sus características farmacocinéticas. 10 El nombre de la IUPAC para la oxitetraciclina es (4S,4aR,5S,5aR,6S,12aS)-4- (dimetilamino)-3,5,6,10,11,12a-hexahidroxi-6-metil-1,12-dioxo-1,4,4a,5,5a,6,12,12a- octahidrotetraceno-2-carboxamida; siendo su fórmula química abreviada C22H24N2O9 (Figura 1). Su número CAS (Chemical Abstract Service) es el 79-57-2. Figura 1. Fórmula química de la oxitetraciclina OH O OH OH O CONH2 OH NR4R1 R5 CH3CH3 R2 R3 1 2 3 4 4a 5 5a 6 6a 7 8 9 10 11 11a 12 12a D C B A La oxitetraciclina a valores de pH intermedios, se epimeriza en el carbono en posición 4 a epioxitetraciclina a través de la función dimetilamino que interacciona con el –OH del carbono en posición 12a. En medio acuoso esto ocurre rápidamente a pH 3-5 dando lugar a una mezcla en la que los dos epímeros se encuentran en igual proporción, sin embargo la proporción en estado de equilibrio entre la oxitetraciclina en estado natural y sus epímeros es de 2/3 y 1/3 respectivamente. Las 4-epitetraciclinas son poco activas como antibióticos, con una actividad antimicrobiana que oscila entre el 2 y el 5% con respecto a la tetraciclina madre (MITSCHER et al., 1972), como se muestra en la Figura 2. 11 Figura 2. Epimerización de la oxitetraciclina a pH entre 3 y 5 D C B A OH OH O CONH2 OH N(CH3)2OH OH H H OH CH3 H D C B A OH O OH O CONH2 OH N(CH3)2CH3 OH OH OH H H OH O OH O CONH2 OH N(CH3)2CH3 OH OH OH H HH OH O OH O CONH2 OH N(CH3)2OH OH H H CH3 D C B A ABCD anhidrooxitetraciclina 4-epioxitetraciclina 4-epianhidrooxitetraciclinaoxitetraciclina H + pH5 H +pH5 2.1.3. Relación estructura-actividad de la oxitetraciclina Las características estructurales que confieren la actividad antibacteriana a las tetraciclinas están bien determinadas (DAX, 1997; MITSCHER, 1978; ROGALSKI, 1985). Sin embargo, más recientemente, se han descubierto nuevos aspectos de la relación estructura-actividad. Se ha realizado un esfuerzo para extender la vida útil terapéutica de esta clase de antibióticos, ya que las bacterias desarrollan resistencia a tetraciclinas de primera y segunda generación a través de una protección ribosomal y mecanismos basados en bombas de exoflujo. Las moléculas de tetraciclina comprenden un núcleo linear de cuatro anillos fusionados. A los anillos designados como A, B, C y D (Figura 1) se adhieren grupos funcionales. La tetraciclina más sencilla que muestra una actividad antibacteriana 12 detectable es la 6-deoxi-6-demetiltetraciclina (Figura 3). A esta estructura se la podría considerar como el grupo farmacóforo (MITSCHER, 1978). Las características más importantes para la actividad antibacteriana de las tetraciclinas es el mantenimiento de los cuatro anillos lineares fusionados, las configuraciones α-estereoquímicas en las posiciones 4a, 12a (entre las uniones de los anillos A y B, y 4 (grupo dimetilamino) y la conservación del sistema keto-enol (posiciones 11, 12 y 12a) en la proximidad del anillo fenólico D. Las tetraciclinas son fuertes agentes quelantes (BLACKWOOD, 1985; CHOPRA et al., 1992) y ambas propiedades antibacterianas y farmacocinéticas están influenciadas por la quelación de iones metálicos (como se muestra a continuación). Los lugares de quelación incluyen: el sistema β-dicetona (posiciones 11 y 12) y el enol (posiciones 1 y 3) y grupos carboxamida (posición 2) del anillo A (BLACKWOOD, 1985; CHOPRA et al., 1992). Las glicilciclinas, como otros derivados de las tetraciclinas también forman complejos quelantes con cationes divalentes (SOMEYA et al., 1995). Al re-emplazar la unión carboxamida del C-2 con otros grupos generalmente da lugar a análogos de actividad antibacteriana inferior (MITSCHER, 1978), probablemente porque las bacterias acumulan pocas de estas moléculas (CHOPRA, 1986). Sin embargo la adición de sustituyentes al nitrógeno amido puede conferir una solubilidad al agua significativa, como en el caso de la rolitetraciclina y limeciclina (MITSCHER, 1978; ROGALSKI, 1985) (Tabla 1). De acuerdo con estas observaciones, las sustituciones en las posiciones 1, 3, 4a, 10, 11 o 12 son desventajosas para la actividad antibacteriana (MITSCHER, 1978). No obstante, pueden darse otras sustituciones en diferentes posiciones en los anillos B, C y D, dando lugar a las tetraciclinas de uso actual, además de las moléculas de glicilciclinas. Estudios más amplios de relación estructura-actividad revelan que, salvo una excepción, cada uno de los anillos del núcleo linear tetracíclico deben contener 6 miembros y en particular carbocíclicos para que las moléculas tengan actividad antibacteriana (ROGALSKI, 1985). Sin embargo, la 6-tiatetraciclina, que posee un átomo sulfuro en la posición 6 del anillo C, es una excepción a la regla de que una estructura de 6 miembros de anillos carbocíclicos es necesaria para la actividad antibacteriana, ya que las moléculas en estas series tienen una potente actividad antibacteriana (CHOPRA, 1994; ROGALSKI, 1985). No obstante, se ha establecido 13 que un número de otros análogos de las tetraciclinas, referidos colectivamente como tetraciclinas atípicas (CHOPRA, 1994; CHUNG et al., 1999), muestras una relación estructura-actividad diferente a la mayoría de las tetraciclinas. Estas moléculas, que también incluyen las anhidrotetraciclinas, 4-epi-anhidrotetraciclinas y quelocardina, parecen perturbar directamente la membrana citoplasmática de las bacterias, confiriéndoles un efecto bactericida (CHOPRA, 1994; OLIVA y CHOPRA, 1992; OLIVA et al., 1992). Esto contrasta con las tetraciclinas típicas, que interaccionan con el ribosoma para inhibir la síntesis de proteína bacteriana y producir un efecto bacteriostático reversible. La propiedad de disrupción de la membrana de las tetraciclinas atípicas está probablemente relacionada con la relativa planaridad de los anillos B, C, y D de manera que predomine una molécula lipofílica no ionizada. En la interacción con la célula, las tetraciclinas atípicas se quedan preferentemente atrapadas en el ambiente hidrofóbico de la membrana citoplasmática, interfiriendo en su función. Estas moléculas no tienen ningún interés como candidatos terapeúticos porque ocasionan efectos adversos en humanos (ROGALSKI, 1985) que están probablemente relacionados con su capacidad para interaccionar de manera no específica con las membranas celulares tanto eucarióticas como procarióticas. Ha habido un resurgir generalizado de resistencias a nivel ribosomal tanto en tetraciclinas de primera como de segunda generación (ACAR et al., 1977; ACAR, 1977; BIGGS y FRAMATICO, 1999; CHOPRA et al., 1992; FALKOU, 1975; GILLESPIE et al., 1986; HORAUD et al., 1991; KARIUKI el at., 1992; KEHRENBERG et al., 1998; LEVY et al., 1999; MANAVATHU et al., 1990; ROBERTS 1994, 1996 y 1997; WASTESON et al., 1994). Para intentar restaurar el potencial de las tetraciclinas como una clase eficaz de antibióticos de amplio espectro, se llevó a cabo una investigación a principios de los años 1990 para descubrir nuevos análogos que puedieran poseer actividad frente a microorganismos resistentes a miembros más antiguos de esta clase de antibióticos y que tuviesen actividad contra microorganismos susceptibles a las tetraciclinas. Así surgieron las 9-gliciniltetraciclinas (glicilciclinas) (BARDEN et al.,1994; SUM et al.,1994; SUM y PETERSEN, 1999; TESTA et al, 1993) (Tabla 1). Intentos anteriores a la introducción de sustituyentes en la posición 9 de la molécula, por ejemplo, 9-nitro, 9-amino, y 9-hidroxi conllevó a la síntesis de análogos con poca actividad antibacteriana (MITSCHER, 1978; ROGALSKI, 1985). Sin embargo, durante 14 los años noventa, un equipo de los laboratorios Lederle (ahora American Home Products), describió que los derivados 9-acilamido de la minociclina, mostraban actividades antibacterianas típicas de las primeras tetraciclinas pero sin actividad frente a organismos resistentes a tetraciclinas (BARDEN et al., 1994). No obstante, cuando el grupo acilo fue modificado para incluir una unión N-N-diacilamina, por ejemplo como en la 6-demetil-6-deoxitetraciclina y derivados de la minociclina (GAR-936), no solo se retuvo la actividad antibacteriana, sino que además los compuestos mostraron una actividad antibacteriana frente a bacterias que contenían genes tet responsables de la protección de mecanismos de exoflujo de las primeras tetraciclinas. [(Tet(A)-a Tet(D) y Tet(K)] y protección ribosomal [Tet(M)] (BARDEN et al., 1994; SUM et al., 1994; SUM y PETERSEN, 1999; TESTA et al., 1993). Estos hallazgos se extendieron al derivado de la minociclina 9-t-butilglicilamido (Tabla 1). Estos datos sugieren que las relaciones estructura-actividad puedan haberse definido por actividad frente a cepas bacterianas que expresan protección contra mecanismos de exoflujo o ribosomales que abarcan los requisitos anteriores para la actividad frente a cepas bacterianas susceptibles a tetraciclinas, pero además necesitan una sustitución N-alquil glicamido en la posición 9 de la molécula. Figura 3. Estructura de la 6-deoxi-6 demetiltetraciclina, el grupo farmacóforo (MITSCHER, 1978) http://mmbr.asm.org/content/65/2/232/F1.large.jpg 15 2.2. Acción farmacológica 2.2.1. Mecanismo de acción Las tetraciclinas son antibióticos de acción principalmente bacteriostática. Esta acción está mediada por una inhibición de la síntesis proteica bacteriana en el proceso de reproducción y crecimiento celular, al ligarse al ribosoma bacteriano 30S (CONNAMACHER y MANDEL, 1965) y evitar la llegada al complejo aminoacil ARNt al sitio receptor (A) en el complejo ARNm-ribosoma (Figura 4). Esta unión es irreversible, e impide la incorporación de los aminoácidos que constituyen la cadena peptídica, inhibiendo de esta forma la síntesis de proteínas (SCHNAPPINGER y HILLEN, 1996). Para que los antibióticos lleguen a los ribosomas son necesarios dos procesos: un primer proceso de difusión pasiva a través de los canales hidrófilos formados por las proteínas porinas (membrana del germen patógeno). La minociclina y la doxiciclina son más lipófilas que otras tetraciclinas y atraviesan la membrana lipídica de forma directa. El segundo proceso implica un transporte activo, que permite el paso a todas las tetraciclinas a través de la membrana citoplásmica interna. Este último proceso puede requerir un transportador proteico periplasmático. La síntesis de proteínas se inhibe de forma inmediata y total tras el tratamiento de los organismos sensibles a esta clase de antibióticos (GALE y FOLKERS, 1953; HASH et al., 1964). Existe mayor afinidad por la unión a la subunidad ribosómica 30S en comparación con la unión a la subunidad 50S (DAY 1966; MAXWELL; 1968). Se han realizado estudios utilizando técnicas de fluorescencia para discernir cuál de estas interacciones es la más significativa para la acción de las tetraciclinas, estimando el número de lugares de unión disponibles en los ribosomas de E.coli (FEY et al. 1973). La conclusión de estos estudios es que una molécula se une en una interacción fuerte con cada subunidad 50s y que tres moléculas se unen en una interacción débil a la subunidad 30S. Se ha sugerido que la unión fuerte no es la interacción inhibitoria, sino que la unión débil a la subunidad 30S es la unión que conduce al efecto antibacteriano. Las tetraciclinas no inhiben la unión del cloranfenicol (VAZQUEZ, 1964) o de la lincomicina (WEISBLUM y DAVIES, 1968) a los ribosomas, antibióticos que es 16 conocido se unen a la subunidad 50S del ribosoma, hecho que sugiere que las tetraciclinas se unen a la subunidad 30S (Figura 4). La unión está limitada por la presencia de iones magnesio, y se reduce a bajas concentraciones de éste (BODLEY y ZIEVE, 1969). Figura 4. Inhibición de la síntesis proteica bacteriana por tetraciclinas 2.2.2. Espectro antimicrobiano El espectro antimicrobiano de las tetraciclinas es muy amplio. Incluye a gran parte de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. También son efectivas contra algunos micro-organismos resistentes a agentes que ejercen sus efectos sobre la pared de la célula bacteriana, por ejemplo: Rickettsia, Mycoplasma, Chlamydia y algunos protozoos (BAXTER y McKELLAR, 1995). En general, las bacterias Gram positivas responden a menores concentraciones de tetraciclinas que las bacterias Gram negativas (KAPUSNIK-UNER et al., 1996), sin embargo, este grupo de fármacos rara vez está indicado en infecciones causadas por bacterias Gram positivas debido a las resistencias bacterianas que han desarrollado y a que actualmente se dispone de opciones más selectivas para estos microorganismos. 17 Las tetraciclinas en humanos están indicadas en las infecciones por Neisseria gonorrhoeae y a muchas cepas de Neisseria meningitidis (CMI90 = 1 - 2µg/ml), pero se ha observado que si se utiliza como agente único en la gonorrea, se desarrollan resistencias (KNAPP et al., 1987). Casi todas las cepas de enterococos son resistentes a las tetraciclinas; estreptococos del grupo B muestran sensibilidad en el 50% de los casos y sólo el 65% de los casos de infecciones producidas por Staphylococcus aureus son sensibles (STANDIFORD, 1995). Al igual que el cloranfenicol, todas las tetraciclinas son muy efectivas contra Rickettesia, responsable de la fiebre de las montañas rocosas o el tifus murino. Las tetraciclinas son mucho menos activas que el cloranfenicol, la clindamicina o ciertos antibióticos betalactámicos frente a Bacteroides fragilis, por lo que estos agentes han reemplazado a las tetraciclinas en el tratamiento de la mayoría de las infecciones producidas por bacterias anaeróbicas. Los microorganismos son considerados sensibles si la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de las tetraciclinas es igual o superior a 1 µg/ml, medianamente sensibles si la CMI está comprendida entre 2 y 8 µg/ml, y resistentes si la CMI es superior a 8 µg/ml (Tabla 2), siguiendo las normas del National Comitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Teniendo en cuenta este criterio, muchas especies de Micoplasmas son sensibles a la tetraciclina, si bien, algunas cepas de Mycoplasma hyopneumoniae y de Mycoplasma bovis han desarrollado resistencias (PRESCOTT y BAGGOT, 2000). Las infecciones causadas por bacilos (Brucelosis, Tularemia, Actinomicosis) son especialmente sensibles a estos fármacos. El espectro de actividad de las tetraciclinas incluye una gran cantidad de bacterias como Neisseria, Listeria, Shigella spp. Además las tetraciclinas en concentraciones elevadas presentan actividad antibiótica frente a los protozoos Balantidium coli, Entamoeba histolytica, Dientamoeba fragilis y Plasmidium falciparum. En cuanto al espectro antimicrobiano de la oxitetraciclina en las distintas enfermedades infecciosas producidas por bacterias en medicina porcina, vease el apartado 1.5 Indicaciones terapeúticas. 18 Tabla 2. Actividad antibacteriana in vitro de las tetraciclinas (PRESCOTT y BAGGOT, 2000) Microorganismo CMI50 (µg/ml) CMI90 (µg/ml) Aerobias grampositivas A.pyogenes 25 64 B. anthrais 0,12 4 C. pseudotuberculosis ≤ 0,25 ≤ 0.25 C. renal 3,1 4 E. rhusiopathiae 0,2 0,25 L. monocytogenes 0,25 1,0 R. equi 2,0 4,0 S. aureus 0,3 >64 S. dysgalactiae 4,0 >32 S. uberis 0,5 0,5 Estreptcocos de grupo 1,0 2,0 Anaerobias gram positivas Actinomyces spp 0,5 1.0 C. perfringens 0,1 32 Clostridium spp 0,1 8 Anaerobias gram negativas Actinobacillus spp ≤ 0,25 ≤ 0,25 A.pleurpneumoniae 0,8 ≥16 B. bronchiseptica 1,6 ≥16 B. canis 0,09 0,25 C. jejuni 0,12 >64 E. coli 4,0 >64 H equigenitalis ≤ 0,2 0,4 H somnus 1,6 2 K pneumoniae 2,0 >16 T. hyodysenteriae 0,4 50 Leptospira spp 1,0 4,0 P. multocida (bovino) 0,5 >128 P. multocida (porcino) 0,4 0,4 P. haemolytica 1,0 >128 Proteus sp >16 >16 Pseudomonas >16 >16 S. typhimurium >16 >16 Anaerobias gramnegativas B. fragilis 12,5 25 D. nodosus 0,12 B. asaccharolyticus 1,0 2,0 Micoplasmas M. bovirhinis 6,2 12,5 M. hyopneumoniae 0,16 0,8 M. hyorhinis 0,4 0,8 2.2.3. Resistencias A nivel global, las resistencias bacterianas se han convertido en uno de los mayores problemas tanto en medicina veterinaria como en medicina humana. El uso de los antibióticos en la cría animal se ha identificado como un factor de riesgo en el desarrollo de bacterias resistentes a tetraciclinas y que pueden transferirse al hombre mediante distintas rutas, por ejemplo, mediante el consumo humano de productos 19 animales, por exposición a microorganismos resistentes por contacto con los animales, y la contaminación del suelo y superficies acuáticas mediante residuos que contienen antibióticos y microorganismos resistentes. Se ha demostrado que la forma de almacenamiento de los residuos, el nivel de formación de los ganaderos, incluyendo el número de otros antibióticos utilizados de forma racional dependiendo de las enfermedades y el manejo de los residuos procedentes de la granja juegan un papel importante en la aparición de resistencias (ARIAS-ANDRÉS et al., 2014). La exposición a tetraciclinas no solo puede aumentar el nivel de resistencia a antibióticos entre bacterias de la flora intestinal del animal, sino que además este nivel de resistencia aumenta entre las bacterias patógenas. Cuando existen altos niveles de bacterias patógenas resistentes, el tratamiento con tetraciclinas puede no ser eficaz. La bacteria Escherichia coli (E. Coli) es un indicador de resistencia bacteriana. Para minimizar la aparición de resistencias bacterianas es necesario reducir el uso de las tetraciclinas, o alternativamente, reducir los niveles de bacterias resistentes en el tracto gastrointestinal del animal, lo que se traduciría en una reducción de la carga bacteriana en el ambiente, disminuyendo la transmisión de genes resistentes. Esto es particularmente importante en aquellas especies bacterianas comunes en animales y en humanos; por ejemplo, E. coli en los alimentos que ingieren los humanos a diario. Como las estirpes de E. coli resistentes a antibióticos son ubicuas tanto en humanos como en animales, esta bacteria se utiliza como indicador de problemas de resistencias tanto en animales como en humanos (ARIAS-ANDRÉS et al., 2014). Tanto en bacterias Gram-positivas como en bacterias Gram-negativas, el origen de las resistencias a tetraciclinas parece ser cromosómico o extracromosómico. En microorganismos Gram-negativos, la resistencia a tetraciclinas es debida a la presencia de plásmidos-R y es una resistencia inducida por una concentración inferior a la concentración mínima inhibitoria (CHOPRA y HOWE, 1978; LEVY y MCMURRY, 1978; CHOPRA y ROBERTS, 2001). Los estudios de vigilancia y monitorización de resistencias proveen información sobre la aparición de resistencias en cerdos en distintas partes del mundo. La aparición de resistencia de E. coli a antibióticos en el cerdo en distintas partes del mundo está siendo descrita por el AURES (Austrian Resistance Report), cada año desde el 2004 tanto para humanos como para el sector veterinario. Los límites de E. coli se determinan utilizando valores cutt-off o de corte epidemiológico basados en la distribución de la 20 concentración mínima inhibitoria (CMI) del antibiótico. Esto está determinado por el European Commitee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). La penetración de las tetraciclinas en el citoplasma bacteriano se realiza mediante difusión pasiva a través de los poros de la pared bacteriana y posteriormente por mecanismos de transporte activo (SCHNAPPINGER y HILLEN, 1996). Precisamente, la alteración del sistema del transporte activo provoca una disminución en la captación de las tetraciclinas por los microorganismos. Esta resistencia está mediada por plásmidos y es inducible. También se han descrito resistencias cruzadas entre las diferentes tetraciclinas. Esta resistencia parece ser menor para la doxiciclina y la minociclina que para otras tetraciclinas, debido a su mayor lipofilia, lo que les permite penetrar dentro de las bacterias sin necesidad de transporte activo. Han sido descritos otros mecanismos de resistencias como el menor acceso de las tetraciclinas al ribosoma debido a la existencia de proteínas que los protegen y por la síntesis de enzimas inactivadoras de las tetraciclinas (SPEER et al., 1992; SCHNAPPINGER Y HILLEN, 1996), pero estas resistencias son de aparición lenta. Muchas cepas de estafilococos y estreptococos e incluso de neumococos, son resistentes a tetraciclinas (SCHWARZ et al., 1998). En estafilococos existen dos modelos fenotípicos de resistencia a las tetraciclinas. Uno de ellos es inducido, por la presencia del antibiótico tetraciclina pero no minociclina y mediado por plásmidos de resistencia transmisibles por transducción (mediante bacteriófagos). El otro modelo es una resistencia constitutiva a ambos (minociclina y tetraciclina) y se encuentra integrado en el cromosoma bacteriano (CHOPRA et al., 1974; ASHESHOV, 1975) Las pseudomonas y enterobacterias en general son resistentes a tetraciclinas (LI et al., 1994). En enterobacterias, en las que han sido caracterizados distintos determinantes, la transmisión de resistencias se produce por un breve contacto entre distintas especies de microorganismos patógenas y no patógenas de E. coli y Salmonella aunque también con especies de Pseudomonas, Vibrio y Pasteurella. El proceso de transmisión entre células bacterianas donantes y receptoras, es posible dentro de un amplio margen de temperatura (15-45ºC) y de valores de pH (5,5 a 8). En el tracto gastrointestinal y en heces se producen las condiciones más favorables. El empleo fraudulento de tetraciclinas en animales como promotores del crecimiento ha originado 21 una presión selectiva en beneficio de la resistencia a estos antibióticos, así los gérmenes coliformes de la flora intestinal resistentes a las tetraciclinas predominan hasta llegar casi al 100% (SMITH y CRABB, 1957; LOKEN et al., 1971; SMITH, 1975; LEVY et al., 1976; AHART et al., 1978; SMITH y LOWELL, 1981; MARSHALL et al., 1986). Los gonococos y pneumococos que son resistentes a la penicilina suelen serlo también a las tetraciclinas (DOERN et al., 1998). También se ha demostrado que la bacteria Staphylococcus aureus resistente a meticilina (LA-MRSA) es 100% resistente a la clindamicina, oxitetraciclina y tetraciclina en cerdos (PATCHANEE et al., 2014). Muchas especies de micoplasmas son sensibles, aunque se han observado algunas cepas de Mycoplasma hyopneumoniae y de Mycoplasma Bovis que han desarrollado resistencia (PRESCOT y BAGGOT, 2000). Se han descubierto decenas de genes resistentes a las tetraciclinas (tet) y oxitetraciclinas (otr); y es un campo que está en continua evolución. Así mismo se han identificado genes que codifican para proteínas de exoflujo, genes que codifican las proteínas de protección ribosomal, y genes que codifican para enzimas inactivadoras de tetraciclinas (ROBERTS, 2005). 2.3. Farmacocinética Cuanto mayor es la liposolubilidad de una tetraciclina, mayor es su velocidad e índice de absorción, mayor será su unión a proteínas plasmáticas y más lenta su biotransformación, y como consecuencia, más prolongada su semivida biológica. Según su liposolubilidad, las tetraciclinas se pueden clasificar en tres grupos: 1. Hidrosolubles: clortetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina y limeciclina -tienen una absorción oral incompleta. 2. Solubilidad media: como demeclociclina y metaciclina. 3. Liposolubles: doxiciclina y minociclina (que se absorben por completo) 22 2.3.1. Absorción Todas las tetraciclinas administradas por vía oral se absorben en el estómago y en la primera porción del intestino delgado, siendo ésta mayor y más completa en estado de ayuno. Las tetraciclinas más hidrosolubles presentan una absorción relativamente lenta (Tmax 2 a 4 horas) e incompleta (biodisponibilidad del 40 al 85) siendo Tmax el parámetro farmacocinético que representa el tiempo necesario para alcanzar la concentración máxima (Cmax) del fármaco en sangre después de su administración por vía extravascular. La doxiciclina y la minociclina se absorben más rápidamente y de forma casi completa (Tmax 0,5 a 1 hora), sin que apenas se afecte su biodisponibilidad en presencia de alimentos (STEIGBIEGEL et al., 1968). La absorción de las tetraciclinas puede verse disminuída por la ingestión simultánea de productos lácteos, hidróxido de aluminio, y distintas sales (calcio, magnesio, hierro o zinc) (ERICSSON et al., 1982). La absorción también puede verse disminuída por la formación de complejos y cationes divalentes y trivalentes en el medio (ARONSON, 1980). La quelación del catión por parte del antibiótico provoca la alteración de la estructura química (CASWELL y HUTCHISON, 1971), reduciéndose la absorción hasta niveles mínimos, sobre todo en tetraciclinas de acción prolongada. La clortetraciclina no se debe utilizar por vía intramuscular ya que es bastante irritante con una absorción pobre e irregular desde el punto de inyección. Esto no es así para la oxitetraciclina y la tetraciclina, ya que ambas poseen una mejor absorción intramuscular, detectándose en el plasma en unos 15 minutos, alcanzando su concentración máxima en 1 hora. Se mantiene en márgenes terapeúticos durante 12 horas, declinando posteriormente hasta ser indetectables transcurridas 24 horas de la administración. También influye el vehículo utilizado por esta vía y la formulación. Las distintas formulaciones dan lugar a velocidades de absorción diferentes, con la consiguiente variación en los parámetros farmacocinéticos (DAVEY et al., 1985; FOURTILLAN et al., 1989; ESCUDERO et al., 1994). La oxitetraciclina (como casi todas las tetraciclinas) después de la administración oral se absorbe en el estómago y al comienzo del intestino delgado, observándose una biodisponibilidad ≥ 70%. La absorción disminuye cuando se administra junto con alimentos (sobre todo leche o derivados lácteos). Normalmente tras la administración 23 oral, se alcanza una concentración plasmática máxima (Cmax) entre 1 y 3 horas (Tmax) (VICENTE y PEREZ-TRALLERO, 2010). En un estudio realizado en cerdos, a los que se administró 20 mg/kg de oxitetraciclina por vía intramuscular, se pudo observar que las concentraciones plasmáticas alcanzaron valores de 6,7 ± 3,4 µg/ml a los 90 minutos de la inyección. En el mismo estudio, otro grupo de cerdos fue tratado con pienso con tetraciclina pura (0,55 mg/kg de pienso). En este grupo, la concentración plasmática observada, fue de 0,5 µg/ml a las 48 horas (Tmax), disminuyendo a las 96 horas a niveles de 0,25 µg/ml. Para comparar los parámetros farmacocinéticos plasmáticos de absorción de la oxitetraciclina en animales domésticos (Tabla 3). 24 Tabla 3. Parámetros farmacocinéticos plasmáticos de absorción de la oxitetraciclina en animales domésticos Especie Dosis (mg/kg) Vía de administración Cmax (µg/ml) Tmax (h) AUC (mg x h /l) F (%) Referencias Conejos 10 IM 3,20 1,25-3 - 71,4 SCHIFFERLI, et al., 1982 Bovino 10 IV - - 61,86 - TOUTAIN y RAYNAUD, 1983 10 IM 3,01 4,01 61,78 99,87 50 PO 4,99 9,16 - 100 Bovino 20 IM 4 1 - 51,50 DAVEY et al., 1985 Bovino 20 IM 6,50 - 166 76,80 HORSPOOL y McKELLAR, 1990 Equino 10 IV - - 155,80 - PAPICH et al., 1995 Equino 50 IV - - 351,42 - PIJPERS et al, 1991b Porcino 20 IM 6,7 1,5 104,4 - HALL et al., 1989 20 IM-LA 6,0 0,5 101,8 - 20 PO ayunas - - - - 0,55mg/kg alimento PO alimento - - - - Porcino 10 IM 6,70 1,30 104,70 - NIELSEN Y GYRD-HANSEN, 1996 Porcino 10 IV - - 43,44 - PIJPERS et al.,1990 45 PO ayunas 0,7 3,8 6,3 3 45 PO alimento 0,4 4,3 5,9 3 Porcino 10 IV - - 46,3 - MEVIUS et al., 1986, 50 IV - - 253,2 - Porcino 20 IV 81,2 PIJPERS et al., 1991a 20 PO ayunas 1,27 3 7,33 9 29 PO alimento 0,20 - 3,6 3,69 Porcino 10 IV - - 57,5 PIJPERS et al., 1991b 50 PO ayunas 1,87 1,74 13,7 - Cmax (Concentración máxima en plasma); Tmax (Tiempo en el que se alcanza la concentración máxima); AUC (Area bajo la curva); F (Biodisponibilidad). PO (Vía oral, en cerdos, cuando especifica en “ayunas” se administra con agua en los estudios descritos); IM (Intramuscular); IV (Intravenosa), LA (Oxitetraciclina de larga duración) 25 2.3.2. Distribución Las tetraciclinas se distribuyen rápidamente por todos los tejidos y líquidos del organismo. El grado de unión a proteínas plásmaticas es variable. El grado de unión depende de la tetraciclina, por ejemplo, la doxiciclina, se une a proteínas entre un 80 y un 95%; mientras que para la demeclociclina es del 65 al 90% y un 80% para la metaciclina; la minociclina se une en un 75%; la tetraciclina en un 65%, y la oxitetraciclina entre un 20 y un 40% (MERLE et al., 1991). Las tetraciclinas se concentran en el hígado, y se excretan por vía biliar. La concentración de las tetraciclinas en la bilis es de 5 a 10 veces superior a la concentración plasmática (incluyendo a la clortetraciclina y la oxitetraciclina), mientras que para la demeclociclina, la doxiciclina y la minociclina las concentraciones biliares son entre 10 y 30 veces superiores a las concentraciones plasmáticas. Tras la excreción biliar, las tetraciclinas sufren procesos de reabsorción enterohepática (BARRIGON et al., 1993). Las tetraciclinas tienen tendencia a depositarse en los huesos y dientes, donde forman quelatos. Este efecto se evidencia más cuanto mayor duración tenga el tratamiento, aunque también existe una capacidad individual para formar quelatos más o menos estables (GROSSMAN et al., 1971). La oxitetraciclina atraviesa sin mucha dificultad pero en pequeña cantidad la barrera hematoencefálica (HUNT et al 1953). Su penetración en otros líquidos corporales y tejidos es excelente; por ejemplo, tras la administración sistémica de tetraciclinas se alcanzan concentraciones en la pared y lumen uterinos (tanto en úteros sanos como enfermos) que son similares a las concentraciones plasmáticas. Incluso al administrar dos dosis de 10 mg/kg de tetraciclina por vía intramuscular se alcanzan concentraciones superiores a las CMI de la mayor parte de los microorganismos sensibles a estos fármacos (BRETZLAFF et al., 1982; 1983). 2.3.3. Metabolismo y eliminación Las tetraciclinas se metabolizan en el hígado en diferente medida (dependiendo de la tetraciclina de que se trate). No obstante, en la mayoría de los casos, el compuesto detectado con más frecuencia en heces, orina y tejidos es la tetraciclina inalterada, y el 26 grado de biotransformación es mínimo. Existe un epímero, que es la 4- epioxitetraciclina, que no puede considerarse metabolito ya que la oxitetraciclina no sufre biotransformación y es un producto de degradación que proviene de la formulación de la oxitetraciclina. La eliminación de las tetraciclinas es fundamentalmente por vía renal (filtración glomerular), y en menor medida por la bilis. El estado de la función renal afecta de forma significativa la excreción, ya que la depuración renal de estos fármacos se realiza por filtración glomerular (KUNIN, 1967). La minociclina se recupera en orina y heces considerablemente metabolizada y en cantidades significativamente menores a otras tetraciclinas. El fármaco persiste en el organismo después de su administración, por su retención en el tejido adiposo. También se excretan en la leche materna, siendo el nivel aproximadamente la mitad que el plasmático. La difusión a través de la barrera hematomamaria se realiza mediante un mecanismo de transporte pasivo dependiente del pH que determinará la fracción no ionizada así como la solubilidad en lípidos lácteos. La concentración alcanzada en la leche es superior para tetraciclina que para oxitetraciclina. La vía intramamaria se utiliza en ganado vacuno de leche, donde se ha demostrado que existe difusión de oxitetraciclina (BLOBEL y BURCH, 1960; ZIV y SULMAN, 1974) En general, los estudios realizados muestran diferencias significativas entre especies en la semivida plasmática de eliminación de la oxitetraciclina, por ejemplo tras la administración de oxitetraciclina por vía intravenosa, algunos autores observaron una semivida de eliminación entre 6,4 y 11,8 horas en terneros de 1 a 3 meses de edad (SCHIFFERLI et al., 1982, AMES et al., 1983; NOUWS y VREE, 1983; BURROWS et al., 1987) 9 horas en vacas (YODER y PACKER, 1954; PILLOUD, 1973), 10 horas en caballos (PILLOUD, 1973), 2,8 a 3,8 horas en cerdos jóvenes (MERCER et al., 1978; XIA et al., 1983; MEVIUS et al., 1986), 3,8 horas en cabras (ELSHEIKH et al., 1997) y de 6,3 horas en ovejas (ELSHEIKH et al., 1997). Tras su administración por vía intramuscular, la semivida de eliminación fue de 15 horas en terneros (AMES et al., 1983; NOWUS Y VREE, 1983; BANTING et al., 1985), de 11 horas en vacas lecheras y de 10 horas en cerdos (BANTING y BAGGOT, 1996). Las diferencias en la semivida de eliminación, se deben a factores como la vía de administración utilizada, formulación, especie animal y edad de los animales tratados.. 27 MEIJER et al., (1993) observaron una semivida de eliminación muy prolongada en vacas al administrar oxitetraciclina por vía intramuscular e intravenosa. Estos autores concluyeron que la lenta eliminación de la oxitetraciclina podía atribuirse probablemente a la liberación de oxitetraciclina desde el tejido óseo donde se acumula. En la Tabla 4 se muestran los parámetros farmacocinéticos de la oxitetraciclina en distintas especies. Tabla 4. Parámetros farmacocinéticos plasmáticos de distribución y eliminación de la oxitetraciclina en distintas especies domésticas Especie Dosis (mg/kg) Via de administración t1/2α (h) t1/2β (h) Vd (área) (l/kg) Vss (l/kg) Cl (l/kg/h) Referencias Caprino 10 IV - 6,28 1,44 - 0,156 ESCUDERO et al., 1994 10 IM - 10,38 - - - 20 IV - 6,03 - - - 20 IM - 29 - - - Conejos 10 IV 0,06 1,32 0,861 0,66 0,434 McELROY et al., 1987 Bovino 20 IV 0,48 9,24 - - - ZIV y SULMAN, 1974 Bovino 22 IV 1,03 6,5 0,53 - - BRETZLAFF et al., 1982 Bovino 11 IM - 10 - - - BLACK, 1982 Bovino 10 IV 0,38 7,16 2,84 1,55 0,16 SCHIFFERLI, 1982 10 IM 1,52 9,83 - - - 50 PO 4,43 10,66 - - - Bovino Bovino 11 IV 1,60 11,80 3,33 2,32 0,201 AMES et al., 1983 11 IV 1,20 14,70 4,99 3,602 0,241 Bovino 20 IV 0,22 9,04 0,868 - - TOUTAIN y RAINAUD, 1983 Equino 2.5 IV - 10,5 - - - TESKE et al., 1973 Equino 10 IV 0,96 14,94 1,04 0,46 0,06 HORSPOOL y McKELLAR, 1990 Equino 10 IV 0,66 7,30 2,19 2,17 0,19 PAPICH et al., 1995 28 Especie Dosis (mg/kg) Via de administración t1/2α (h) t1/2β (h) Vd (área) (l/kg) Vss (l/kg) Cl (l/kg/h) Referencias Porcino 11 IV - 3,87 1,26 - 0,183 MERCER et al, 1978 Porcino 10 IV - 6,5 1,4 0,22 NIELSEN y GYRD-HANSEN et al., 1996 45 PO en ayuno - 10,3 - - - 45 PO en pienso - 11,5 - - - Porcino 10 IV 0,49 5,86 1,84 - 0,281 PIJPERS et al., 1990 50 IV 0,75 6,21 1,78 - 0,202 Porcino 10 IV 0,46 5,99 1,49 - 0,173 PIJPERS et al, 1991a 50 PO en ayuno 2,86 5,92 1,44 - 0,0030 Ovino 20 IV 0,38 6,77 1,045 - 0,06 DROUMEV et al., 1992 70 PO 8,87 22,48 - - - Terneros 22 IV - 9,12 - - - PILLOUD, 1973 t1/2α (Semivida de distribución); t1/2β (Semivida de eliminación); Vd (Volumen de distribución); Vss (Volumen de distribución en estado estacionario); Cl (Aclaramiento plasmático); PO (Vía oral, en cerdos, cuando especifica en “ayunas” se administra con agua en los estudios descritos); IM (Intramuscular); IV (Intravenosa). 2.4. Toxicidad y reacciones adversas Las tetraciclinas son generalmente irritantes, y es este carácter al que se atribuyen muchas de sus reacciones adversas. Por ejemplo: si se administra por vía oral puede provocar vómitos, y si se administra por vía parenteral puede producir lesiones tisulares. La oxitetraciclina es extremadamente irritante en tejidos, aunque esto puede variar dependiendo de la especialidad farmaceútica. En general se puede afirmar que cuanto más irritante es un preparado, menor es la biodisponibilidad del fármaco, y mayor será el tiempo que permanece en el lugar de la inyección (NOUWS y VREE, 1983). También las tetraciclinas tienen capacidad de modificar la flora intestinal, ocasionando diarreas y gastroenteritis. También pueden formar quelatos con el calcio, por lo que puede ocasionar efectos cardiovasculares, formación de depósitos en los dientes, en los huesos y en otros órganos como hígado y el riñón (COHLAN et al., 1963; OWEN, 1963). Las reacciones adversas cutáneas pueden ser: erupciones cutáneas, urticaria, y dermatitis exfoliativa generalizada. La mayor expresión de reacción alérgica es el 29 angioedema y la anafilaxia. También pueden desarrollarse reacciones de hipersensibilidad en algunos individuos, como irritación ocular, y glositis hipertrófica o atrófica. La dimeclociclina, doxiciclina, y otros derivados pueden producir reacciones de hipersensibilidad leves o graves de la piel en personas tratadas y expuestas a la luz solar (KAPUSNIK-UNER et al., 1996). En ganado vacuno se ha observado que la administración de dosis elevadas de tetraciclinas (33 mg/kg por vía IV o superiores) causa esteatosis hepática (infiltración de grasa en el hígado) y necrosis grave de los túbulos renales proximales (GRIFFIN, 1979; LAIRMORE et al., 1984). Se han reportado en ovinos efectos cardiovasculares cuando la administración de la tetraciclina se efectúa por vía intravenosa rápida. Además el 20% de los preparados de acción prolongada provocan un aumento de la acción irritante del principio activo. Por otra parte, en caballos, al administrar tetraciclinas por vía oral, puede producir una supresión de la microflora propia del animal, dando lugar al crecimiento de algunas cepas de Salmonella resistentes a las tetraciclinas o de otros patógenos, por lo que pueden aparecer graves diarreas (PRESCOTT y BAGOTT, 2000). En cuanto a toxicidad cardiovascular, los efectos tóxicos observados, suelen ser dosis-dependiente y también dependiendo de la frecuencia de su administración. Por vía intravenosa rápida, se puede producir el síndrome del colapso agudo, así como arritmias cardiacas graves, trastornos de la conducción, hipotensión y efecto inotrópico negativo (GYRD-HANSEN et al., 1981). El efecto inotrópico negativo puede ser neutralizado si se administra cloruro cálcico antes de administración del antibiótico y si la infusión intravenosa se realiza lentamente (al menos durante cinco minutos). A nivel gastrointestinal las tetraciclinas al ser administradas por vía oral, pueden originar una irritación directa sobre la mucosa digestiva. Estos efectos pueden ser consecuencia de la acción directa de los quelatos formados por tetraciclinas con iones metálicos di y trivalentes sobre la mucosa gástrica e intestinal (LIEBER y LEFEBVRE, 1959). El tratamiento oral prolongado con dosis altas de tetraciclinas en terneras (33 mg/kg) puede ocasionar una sobreinfección en el abomaso. También se han descrito úlceras esofágicas al ingerir tetraciclinas con poco volumen de agua (CROWSON et al., 1976). 30 Se han observado también lesiones hepáticas (degeneración grasa aguda) (DOWLING y LEPPER, 1964) y necrosis renal a nivel de los tubulos proximales cuando se usan tetraciclinas en el tratamiento de enfermedades respiratorias en ganado vacuno de engorde (STEVENSON, 1980; VAALA et al., 1987). Además, las tetraciclinas pueden agravar la uremia en animales con nefropatías mediante el bloqueo de la síntesis de proteínas. También inducen el metabolismo de aminoácidos, provocando uremia (SHILS, 1963). De todas las tetraciclinas, la oxitetraciclina y la doxiciclina son los antibióticos menos hepatotóxicos. La mayoría de los casos de toxicidad hepática se han observado en humanos que recibían 2 g/día de fármaco por vía parenteral, aunque también se han observado después de la administración oral de dosis elevadas. Además en cerdos se han observado las siguientes reacciones adversas a la oxitetraciclina: inflamación en el lugar de inyección, agitación, ataxia, temblores, inflamación de los párpados, orejas, hocico, ano y vulva (o escroto en el verraco), anormalidades respiratorias (como un aumento del esfuerzo respiratorio), hipersalivación, colapso y muerte. Algunas de estas reacciones pueden ser debidas a anafilaxis o colapso cardiovascular de causa desconocida (NORBROOK LABORATORIES, 2015). 2.5. Indicaciones terapéuticas Las infecciones bacterianas más frecuentes en el cerdo se pueden categorizar en tres grupos: infecciones entéricas y respiratorias. Dentro de las infecciones entéricas destacan las infecciones por Escherichia coli (diarrea del lechón, diarrea neonatal y diarrea post-destete), que suelen ser resistentes a las tetraciclinas (y se tratan mejor con polimixina u otros antibióticos, preferiblemente dependiendo de los resultados del cultivo. Clostridium perfringens (Tipo C: enteritis necrótica; Tipo A: diarrea); Clostridium difficile (diarreas), donde la oxitetraciclina puede ser eficaz observándose solo un 25% de resistencias, lo que contrasta con el 78% de resistencias en granjas de cerdos donde se añade al alimento (POST y SONGER, 2004). Salmonella spp (Tiphimurium: diarrea ocasional, septicemia y muerte; Derby: diarrea ocasional; Choleraesuis: septicemia, diarrea, muerte), al igual que con E. coli es bastante resistente a las tetraciclinas, y también debe basarse en la experiencia local o en 31 pruebas de susceptibilidad (MADSON, 2008); Lawsonia intracelullaris (ileitis porcina proliferativa, ileitis regional necrótica, enteropatía porcina hemorrágica) se trata de forma muy efectiva con tetraciclinas; no obstante WATTANAPHANSAK et al., 2007 mostró un valor de CMI elevado para la clortetraciclina (lo que significa que podrían desarrollarse resistencias); y en Brachyspira hyodysenteriae (disentería porcina); Brachyspira pilosicoli (espiroquetosis intestinal, colitis), siempre se deben realizar pruebas de susceptibilidad debido a las resistencias encontradas (pudiendo llegar a erradicarse con un adecuado control). En cuanto a las infecciones bacterianas respiratorias destacan las producidas por los siguientes microorganismos: Pasteurella multocida (rinitis atrófica); es predeciblemente susceptible a tetraciclinas y también a otros antibióticos como penicilinas, ceftiofur, gentamicina, macrólidos, fluoroquinolonas, sulfamidas/trimetoprim y florfenicol (YOSHIMURA et al., 2001; LIZARAZO et al., 2006; WALLMANN, 2006); Bordetella bronchiseptica, suele ser bastante sensibles, hasta ahora, a las tetraciclinas; y también a ampicilinas, cloranfenicol y sulfonamidas (KADLEC et al., 2004); Mycoplasma hyopneumoniae (neumonía enzoótica); puede ser susceptible a la oxitetraciclina pero también se han desarrollado resistencias al igual que ocurre con las fluoroquinolonas y macrólidos; sin embargo es siempre sensible a la tiamulina (AARESTRUP y KEMPF, 2006) y Actinobacillus pleuropneumoniae (pleuropneumonía necrotizante aguda, con muerte en algunos casos en 24 horas), siempre ha tenido una buena susceptibilidad antimicrobiana a la mayoría de los antibióticos de amplio espectro; pero se han descubierto resistencias a tetraciclinas y otros antibióticos, aunque la mayoría de las bacterias patógenas aisladas son aún susceptibles a fluoroquinolonas, ceftiofur y florfenicol (AARESTRUP et al., 2008). En cuanto a las infecciones bacterianas sistémicas y otras infecciones, destacan las producidas por: Escherichia coli (bacteriemia, artritis, infecciones umbilicares, cistitis y nefritis), que como se señaló anteriormente, suelen ser resistentes a las tetraciclinas; Streptococcus suis (meningitis, endocarditis, artritis y peritonitis) aunque de baja morbilidad y mortalidad, es normalmente resistente a las tetraciclinas y a los macrólidos en la mayoría de los estudios, pero ha sido históricamente sensible a las penicilinas, aunque se están observando resistencias en algunos países, llegando a constituir un verdadero problema (AARESTRUP et al, 2008); Haemophilus parasuis [Enfermedad de Gläser (poliserositis): artritis, pericarditis, peritonitis] es sensible a las 32 oxitetraciclinas y a la mayoría de los antibióticos; Mycoplasma hyosinoviae (artritis micoplásmica) puede ser susceptible a la oxitetraciclina pero sobre todo a la lincomicina y tiamulina; Staphylococcus aureus (bacteriemia, artritis, osteomielitis, mastitis y metritis) suele ser oportunista y ha adquirido importancia en medicina humana y salud pública por el riesgo de contagio a humanos a partir de infecciones en cerdos (MRSA C398)(VAN DUIJKEREN et al., 2007) siendo frecuentemente resistente a las tetraciclinas y otros antibióticos como macrólidos y estreptomicina y frecuentemente sensible a sulfamidas/trimetoprim y fluoroquinolonas (VAN DER WOLF, et al., 2008); Staphylococcus hyicus (epidermitis exudativa), Erysipelothrix rhusiopathiae (erisipelas, dermatitis, artritis y endocarditis) pueden ser tratadas con oxitetraciclina, pero se han generado algunas resistencias (YAMAMOTO et al., 2001); son sensibles a la penicilina y el control fundamental es a través de la vacunación. En general, en cerdos, y dentro de las tetraciclinas, la oxitetraciclina y la clortetraciclina se utilizan para el tratamiento de las enfermedades ocasionadas por M. hyopneumoniae P. multocida y A. pleuropneumoniae. Mientras que la tetraciclina y la doxiciclina se utilizan más para el tratamiento de infecciones originadas por H. parasuis y L. intracellularis; y en ocasiones, se han descrito resistencias frente a E. coli y Salmonella spp. Para las infecciones susceptibles en cerdos se recomiendan dosis de oxitetraciclina desde 4,4 mg/kg hasta 20 mg/kg, dependiendo de la vía de administración utilizada y la indicación. Por ejemplo para anthrax se administra 4,4 mg/kg IM o IV (KAUFFMAN, 1986); aunque las dosis más habitual en ganado porcino para infecciones susceptibles oscila entre 6 - 11 mg/kg por vía IV o IM, y de 10 - 20 mg/kg por vía oral cada 6 horas (HOWARD, 1986). Otras dosis descritas en la literatura es de 40 mg/kg IM a los 3, 6 y 12 días de edad en lechones para tratar la rinitis atrófica porcina (DEJONG y OOSTERWOUD, 1977). 2.6. Integracion de farmacocinética (PK) y farmacodinamia (PD): Índices PK-PD Para poder establecer una dosis óptima para un antimicrobiano lo ideal es que la terapia antimicrobiana no solo debe proveer una cura clínica, sino además erradicar los micro-organismos patógenos para llegar a alcanzar una cura bacteriológica total. Si esto no se consiguiera, la sub-población de organismos que son menos susceptibles podrían 33 multiplicarse durante o al final de la terapia, por lo que se establecería una población de organismos con unos valores de CMI aumentados, y por tanto, potencialmente resistentes incluso a concentraciones altas del antimicrobiano. Por tanto, es un hecho reconocido que uno de los objetivos de la terapia, además de optimizar la eficacia, es minimizar las oportunidades que se puedan crear para la selección y desarrollo de organismos resistentes (LEES y SHOJAEE ALIABADI, 2002; TOUTAIN et al., 2002; McKELLAR et al., 2004). Los datos publicados indican que los índices con resultado clínico son insuficientemente sensibles para determinar un régimen de dosis óptimo para una cura bacteriológica. Este criterio es fundamental para estrategias diseñadas para minimizar la selección de organismos resistentes. El uso de PK/PD provee una nueva herramienta para resolver este problema. Modelos a base de pulmones y fibras musculares de roedores han generado índices PK/PD empíricos, que han sido utilizados para predecir la efectividad de la terapia (LEGGET et al., 1991; CRAIGG, 1998). En antibioterapia, se han utilizado tres índices: el índice AUC/CMI (es decir, el Área bajo la curva/Concentración Mínima Inhibitoria) para quinolonas; el índice Cmax/CMI (es decir, Concentración máxima/Concentración Mínima Inhibitoria) para aminoglicósidos, y T›CMI, que es el tiempo para el que la concentración plasmática excede la CMI para antibióticos betalactámicos. Éstos índices han sido propuestos como los índices PK/PD de eficacia, ya que comprenden un parámetro farmacocinético (AUC, T›CMI, Cmax), junto con un parámetro farmacodinámico (CMI). Por tanto ambos incorporan la susceptibilidad microbiológica y la disposición farmacocinética del antibiótico (SCHENTAG et al., 1985; HYATT et al., 1995). Cada uno de los tres índices predictivos PK/PD de eficacia in vivo, está basado en una concentración plasmática del medicamento no-unido a proteínas y no en una concentración total plasmática o tisular. Puesto que los patógenos de relevancia clínica están normalmente localizados extracelularmente, la biofase para productos antimicrobianos está más frecuentemente presente en el fluído extracelular (SCHENTAG, 1989). Sin embargo, para patógenos intracelulares y cuando hay barrera para la difusión del medicamento (por ejemplo en el sistema nervioso central, en la próstata, ojo y abscesos entre otros), la concentración plasmática puede no ser tan útil para predecir la concentración del antibiótico en el lugar de la infección. Cada uno de los tres índices PK/PD es un marcador sustitutivo de lo que se requiere clínicamente, ya 34 se llame curación clínica o erradicación bacteriana. La validez clínica de estos marcadores sustitutos está actualmente basada en la evidencia de dos fuentes: datos prospectivos o pruebas clínicas retrospectivas y los vínculos mecanísticos entre los marcadores sustitutivos y la erradicación bacteriana, que es el objetivo final de la terapia antibiótica. Cuando se confirma la validez de estos índices sustitutivos en medicina veterinaria, se deben establecer los puntos de corte (“breakpoints”). Estos “breakpoints” PK/PD aún no están validados de forma clara en medicina veterinaria. Sin embargo, como los índices reflejan diferencias en la farmacocinética de las especies hospedadoras y los valores de CMI de las distintas especies bacterianas, es probable que los “breakpoints” no difieran demasiado entre las distintas especies animales (CRAIG, 1998). Por tanto, los datos derivados de pruebas clínicas o modelos de infección en animales pueden ser una buena base para el diseño de un régimen de dosificación para nuevos antibacterianos y nuevas especies. Para que el veterinario pueda mejorar su éxito clínico, debe comprender bien el uso de los antibióticos examinando las relaciones básicas de los distintos parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos (PK/PD) en comparación con la respuesta clínica. En cuanto a las infecciones respiratorias porcinas más comunes, hay una relación PK/PD entre la concentración plasmática del antibiótico utilizando el área bajo la curva (AUC) y la concentración mínima inhibitoria (CMI) de Mycoplasma hyopneumoniae. Con antibióticos bactericidas como la enrofloxacina (fluoroquinolona), donde una relación AUC/CMI >100 pueda ser conseguida, la respuesta clínica será buena. Con los antibióticos bacteriostáticos (en el caso que nos ocupa, como la oxitetraciclina), esta relación parece ser menos clara hasta que se empezó a utilizar la “concentración mínima bactericida” (CMB). Al utilizarse en bacterias del tracto respiratorio, en particular Actinobacillus pleuropneumoniae, con aquellos antibióticos que no se concentran excesivamente en el tejido pulmonar (como las fluoroquinolonas y las tetraciclinas), había una predecible relación AUC/CMI en cuanto a la eficacia. Sin embargo, con otros antibióticos como la tilmicosina, tiamulina y tulatromicina que se concentran en el pulmón y en los leucocitos fundamentalmente, no se podía establecer una relación con la concentración plasmática. Por tanto en estos antibióticos, la concentración de antibiótico en los leucocitos es más significativa. En cuanto a las infecciones entéricas en cerdos, se ha desarrollado un modelo para estimar las concentraciones de un antimicrobiano determinado en el intestino delgado. 35 Los datos de las concentraciones colónicas (o fecales) de antimicrobianos de este modelo estiman que, aproximadamente, el 29% de las concentraciones colónicas fue utilizado para determinar las concentraciones en el íleo, además del AUC; y un 29% de las concentraciones colónicas para determinar las concentraciones en el yeyuno, además del AUC. Las concentraciones microbianas en el yeyuno corresponden bien a patrones de susceptibilidad de Escherichia coli comparando investigaciones y aislados clínicos de CMI. Más recientmente se ha desarrollado una nueva CMI intracelular para Lawsonia intracellularis. En ésta se demostró una buena correlación entre las concentraciones del íleo y las AUCs derivadas del modelo y las CMI intracelulares y los patrones de susceptibilidad que han surgido. Brachyspira hyodysenteriae y B. pilosicoli también han sido evaluados en relación con las concentraciones del contenido colónico (CCC) y el AUC. El método de determinación de CMI, dependiendo del medio de cultivo, tenía un impacto en el valor de la CMI, siendo la CMI determinada en agar la que mayor correlación guardaba con la CMB. La CCC y la relación AUC/CMI se correlacionaban bien con el resultado clínico, especialmente al utilizarse la proporción de unión a proteínas derivadas del plasma. A pesar de las deficiencias de los datos publicados y la variabilidad en la determinación de la CMI, los principios PK/PD pueden ser aplicados tanto para las enfermedades respiratorias como para las entéricas del cerdo. Hay un número de aspectos clave dentro de la medicina porcina, que son importantes y específicos. La mayor parte de los antibióticos utilizados en cerdos se administran en el pienso; por tanto, la dosis ingerida va a estar determinada por la cantidad de alimento ingerido por el cerdo. Uno de los mayores problemas al que se enfrenta el veterinario en cuanto a la eficacia, es el de infradosificar. Por ejemplo, si el animal está enfermo o con una temperatura alta, normalmente el animal deja de comer. Además, la edad del cerdo también es importante. La mayor parte de las dosis, están establecidas en base a un cerdo de 20 kg que ingiere 1 kg de alimento por día (o un 5% de su peso). Los cerdos en la fase final de engorde, normalmente se les restringe el alimento para evitar la deposición de grasa, sobre todo en los machos castrados, en los que se puede reducir a la mitad (2,5% en 80 kg o más). Las cerdas lactantes normalmente se les alimenta en un 2,5% de su peso al día, y las secas a tan solo un 1%. Por tanto, para alcanzar una dosis “diana” en cerdas secas para tratar una infección de útero, se debe aumentar cinco veces la cantidad del fármaco en el alimento. La mayor 36 parte de los antibióticos orales producen unos niveles plasmáticos inferiores a los de la administración parenteral/inyección, especialmente con medicamentos que se metabolizan en el hígado (como los macrólidos y las pleuromutilinas), lo que reduce la biodisponibilidad total. Dentro de las tetraciclinas, dependiendo de la formulación y de la forma de administración (inyección parenteral, o vía oral ya sea en alimento o en agua), hasta ahora se han utilizado las dosis representadas en la Tabla 5 (BURCH, 2012). Tabla 5. Tetraciclinas utilizadas en cerdos según las dosis utilizadas (en mg/kg de peso vivo) y la formulación TETRACICLINA INYECCIÓN EN AGUA EN PIENSO Oxitetraciclina 10 (L.D. 20-30) 10-30 20 Clortetraciclina 20 10-20 Tetraciclina 20-40 Doxiciclina 4-6 5 5 L.D.- Larga duración El valor de Cmax al dividirse por la concentración mínima inhibitoria (CMI) del antibiótico frente a la bacteria patógena, normalmente necesita ser de 10 a 12 para que el antibiótico tenga un efecto bactericida y eliminatorio. La CMI es la concentración mínima de antibiótico que inhibe el crecimiento de la bacteria cuando se cultiva in vitro y se espera que este sea el mismo efecto in vivo. Por ejemplo, un producto que alcanza una concentración plasmática (Cmax) de 6 μg/ml, dividida por una CMI de 0,5 μg/ml dará un Cmax/CMI de 12. La concentración en plasma debe ser de antibiótico libre, no unido a proteínas plasmáticas para que sea preciso; pero este dato no siempre está disponible (BURCH, 2012). Este concepto es válido para aquellos antibióticos bactericidas donde la razón entre la concentración mínima bactericida/ concentración mínima inhibitoria (CMB/CMI) es cercano a 1. Desafortunadamente, la mayoría de los antibióticos que se utilizan en medicina porcina son bacteriostáticos, y la razón CMB/CMI es mayor de 1, por lo que sólo se consiguen efectos inhibitorios. 37 El área bajo la curva durante 24 horas (AUC24h) es otro parámetro útil en la integración PK/PD y comprende una concentración y una función de tiempo o de exposición. De nuevo, este parámetro es útil para los antimicrobianos bactericidas y el AUC24h dividido por la CMI, da un valor de 100 a 125 horas para que haya eficacia terapeútica (SCHENTAG, 2000; TOUTAIN, 2003; LEES et al., 2006; LEES et al., 2008). La razón AUC/CMI también se puede utilizar para penicilinas y sulfamidas/trimetoprim, que tienen un componente particular de tiempo para ejercer su efecto bactericida y un efecto post-antibiótico (EPA) limitado. El PAE es el tiempo que necesitan las bacterias para volver a crecer una vez que la concentración de antibiótico está por debajo de la concentración mínima inhibitoria y normalmente es cuestión de horas. La razón AUC/CMI puede también aplicarse a antibióticos co-dependientes, que son normalmente antibióticos bacteriostáticos, como las tetraciclinas (y también macrólidos y pleuromutilinas) y tanto el factor tiempo como el factor concentración son detrminantes en su efecto bactericida. 38 Figura 5. Parámetros farmacocinéticos y farmacocinéticos-farmacodinámicos básicos tras la administración de una sola dosis o dosis oral de un antibiótico en agua o comida (ERRECALDE, 2004) Se observan los parámetros farmacocinéticos: concentración máxima (Cmax), área bajo la curva (AUC), el parámetro farmacodinámico concentración mínima inhibitoria para la cepa estudiada (CMI) y los parámetros farmacocinético-farmacodinámicos relación concentración plasmática máxima/concentración mínima inhibitoria (Cmax/CMI), la relación área bajo la curva/concentración mínima inhibitoria (AUC/CMI) y el tiempo durante el cual las concentraciones de antimicrobiano se encuentran por encima de la CMI (t>CIM). Normalmente, para antibióticos bacteriostáticos, la CMI debe ser re-emplazada por la concentración mínima bactericida (CMB) para llegar a conseguir índices mayores, ya que los ratios CMB/CMI pueden ser sustancialmente superiores a 1-2. Para animales con buen estado inmunológico, y para el hombre la razón bactericida óptima puede ser tan baja como AUC/CMI de 50, mientras que en humanos inmuno- comprometidos el índice AUC/CMI se ha aumentado a 200 para obtener el control de mutantes (TAM et al., 2005). La relación AUC/CMI puede ser útil para productos administrados por vía oral tanto en el pienso como en el agua de bebida. Otro parámetro útil es el de la concentración en el estado estacionario (Css). Tras la ingesta o la bebida del agua medicada, la concentración plasmática es bastante plana comparada con la obtenida por inyección. La Css puede calcularse dividiendo el AUC24h por 24 y la cifra debe ser entre 4-5 veces la de la CMI para un efecto bactericida o 1 vez para un efecto 39 bacteriostático. También se ha descubierto que es aplicable a concentraciones antimicrobianas en el intestino; pero la unión a proteínas fecales y el pH pueden tener influencia. Además las tetraciclinas pueden unirse al calcio, reduciendo su biodisponibilidad. El tiempo de la CMI es importante no solo para los antibióticos como las penicilinas y las cefalosporinas; sino también para determinar el intervalo entre dosis. De nuevo, en medicina porcina, esto no es tan importante en productos administrados por vía oral al cerdo ya sea en el pienso o en el agua, y es a menudo dependiente del sistema utilizado y la frecuencia de alimentación y de bebida. La mayoría de los sistemas de alimentación y de bebida son ad-libitum. El método por el que la concentración de antimicrobiano es determinada también es importante. La Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC o High Pressure Liquid Chromatography) a menudo junto con Espectrometría de Masas (MS) determina la concentración de una sustancia específica. Sin embargo el sistema debe también tener en cuenta los metabolitos activos de los antibióticos, que también deben ser medidos en plasma. La determinación de las concentraciones de los antibióticos en los lugares de infección (diferentes a las concentraciones plasmáticas) es bastante difícil, por tanto muchas veces se depende de un índice de predicción mediado por la concentración plasmática. Algunos científicos han intentado calcular las concentraciones tisulares de los antibióticos (como por ejemplo en la mucosa bronquial o en la mucosa del colon; pero generalmente, si el organismo está fuera de la célula o del intestino, es poco probable que sean representativas del efecto antibacteriano. Como ejemplo se puede utilizar el método de microdiálisis descrito por CRONEBERGER et al., (2009) para determinar la concentración de cefpiroma en el líquido extracelular del pulmón y la fracción no unida a proteína en cerdos anestesiados, para determinar de forma más exacta la concentración en el lugar de la infección. Sólo hay datos limitados y normalmente depende de la concentración plasmática. La farmacodinamia (PD) es la acción del antibiótico en el organismo y normalmente está representado por la concentración mínima inhibitoria (CMI) del antibiótico; la concentración que inhibe el crecimiento bacteriano. Por otro lado, la farmacocinética (PK) refleja la concentración del antibiótico que se alcanza en un tejido 40 diana, normalmente sangre o plasma durante un tiempo. Este dato tiene limitaciones, ya que no describe necesariamente la concentración a la que se eliminan las bacterias; por lo que se observa mejor la concentración mínima bactericida (CMB). Hay varias formas de determinar la CMI, la más frecuente es determinarla utilizando diluciones que van dividiendo a la mitad la concentración del antimicrobiano, determinando al final la concentración más baja de antibiótico que inhibe el crecimiento de una bacteria. Esto se realiza normalmente en un sistema de tubos de ensayo, en el que a medida que el organismo crece, aparece turbidez en la solución. Se pueden añadir sustancias marcadoras que pueden indicar un cambio de pH, si el organismo creciera. Si el organismo no crece, el marcador no cambia de color, este método se utiliza más frecuentemente para Mycoplasma spp. También se pueden utilizar placas de ágar que contienen el antibacteriano, donde la hemólisis en agar-sangre o la prevención de crecimiento de la colonia pueden ser marcadores útiles. En laboratorios de diagnóstico, se utiliza el método de Kirby-Bauer para que crezca el organismo utilizando una placa con discos de sensibilidad antimicrobiana con distintas concentraciones específicas del antibiótico en el disco. De esta manera se toma observa si hay crecimiento de la bacteria alrededor del disco o no y también de los diámetros de la zona de inhibición. También se puede utilizar el método Etest, que consiste en una pequeña porción de papel con concentraciones de antibiótico en aumento. En ella, la inhibición del crecimiento bacteriano coincide con la concentración en el papel e indica la CMI aproximada. Otro de los factores es la cantidad del inóculo bacteriano utilizado, a mayor cantidad, mayor deberá ser la CMI. Se han establecido métodos estándar por la CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) y suelen dar resultados consistentes, pero hay otros factores como la sensibilidad del antimicrobiano al pH y la estabilidad del antimicrobiano en solución (especialmente después de varios días de cultivo como en el caso de la clortetraciclina) Existen muy pocos datos disponibles de las CMBs para antibióticos bacteriostáticos y muy pocos datos sobre curvas bactericidas, que son concentración y tiempo dependientes y que pueden tener un impacto en la duración del tratamiento. 41 Las variaciones entre los distintos modos de acción de los antimicrobianos en el intestino y en el tracto respiratorio del cerdo se han establecido, especialmente para antibióticos bacteriostáticos, como las tetraciclinas, macrólidos y pleuromutilinas. La integración de la relación PK/PD con una respuesta clínica o bacteriológica, puede ofrecer una explicación sobre la situación actual y puede utilizarse en el futuro para determinar las dosis óptimas que sirven para el control de las infecciones. Se espera que con una aplicación de estos principios, los antibióticos se utilicen de una forma más eficiente además de observarse una mejora en la respuesta clínica y una posible reducción en el número de resistencias. Integración PK/PD para infecciones respiratorias del ganado porcino A pesar del amplio uso de vacunas para la pneumonía enzoótica, el agente causal de M. hyopneumoniae se encuentra en granjas de cerdos y estudios clínicos demuestran que de un 38 a un 100% de los cerdos tienen lesiones pulmonares en el sacrificio (GUERRERO, 1990). P. multocida se aisla frecuentemente con M. hyopneumoniae como se ha descrito anteriormente, como bacteria secundaria invasora. A. pleuropneumoniae también puede ser primario. Otros microorganismos importantes son H. parasuis, responsable de la enfermedad de Glässer, que ocasiona enfermedad respiratoria y bacteriemia con efectos secundarios severos como peritonitis, pericarditis y artritis infecciosa. Este capítulo se ha dividido a su vez en dos secciones. La pneumonia enzoótica es una enfermedad respiratoria crónica causada por Mycoplasma hyopneumoniae causando lesiones características en el pulmón en el 40- 50% de todos los cerdos sacrificados en matadero. Ocasiona una enfermedad ligera, con tos, menor crecimiento y una baja tasa de mortalidad. En grupos que no han sido nunca expuestos, la pneumonía enzoótica puede tener consecuencias más graves. Es frecuente que haya infecciones bacterianas secundarias y víricas; lo que puede dificultar su tratamiento y control. En definitiva, la enfermedad puede dar lugar a un complejo de enfermedades respiratorias porcinas (CRP). Entre las infecciones bacterianas secundarias destaca la P. multocida, debido tanto a una disminución del mecanismo de aclaramiento ciliar como a un debilitamiento del sistema inmune. Se ha llegado a demostrar que las co-infecciones por P. multocida pueden llegar a doblar en tamaño las lesiones del pulmón (CIPRIAN et al., 1986). La pneumonía enzoótica también puede 42 agravar otras infecciones bacterianas como las causadas por A. pleuropneumoniae. Con la propagación de las enfermedades víricas, como el complejo vírico reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) y el síndrome del desmedro post-destete (PMWS) asociado con el circovirus porcino tipo 2 (PCV2); se ha observado un aumento de las infecciones bacterianas, particularmente por H. parasuis y S. suis en las que prácticamente todos los lóbulos pulmonares pueden afectarse. Para poder establecer unas bases para la evaluación de la eficacia tanto de antibacterianos como de vacunas, se han desarrollado distintos métodos, siendo los más frecuentes la inspección visual y la asignación de una puntuación, que es rápido y relativamente consistente (Tabla 6). Tabla 6. Comparación de los distintos métodos de puntuación para categorizar las lesiones pulmonares en cerdos. Lóbulo pulmonar Máxima puntuación por lóbulo (GOODWIN et al., 1969) Sistema porcentual – máxima puntuación por lóbulo Ajuste porcentual –máxima puntuación basada en el tamaño del lóbulo pulmonar (THACKER et al, 1988) Craneal Izqdo. (apical) 10 10 4 (100 x 0,04) Segmento caudal izquierdo (cardiaco) 10 10 9 (100 x ,09) Caudal izqdo. (diafragmático) 5 25 25 (100 x 0,25) Intermedio derecho 5 10 5 (100 x 0,05) Craneal derecho (apical) 10 10 7 (100 x 0,07) Medio derecho (cardiaco) 10 10 15 (100 x 0,15) Caudal dcho. diafragmático) 5 25 35 (100 x 0,35) Máximo total 55 100 100 (100 x 1) En las pruebas de eficacia se establecerá una comparación de la reducción porcentual de las lesiones pulmonares entre el control (animales no tratados) y los animales tratados. La mayoría de los antimicrobianos utilizados en cerdos para tratar infecciones respiratorias, incluídas las pleuromutilinas, macrólidos y fluoroquinolonas, tienen una CMI relativamente baja y un nivel de resistencia bajo (VICCA et al., 2004). En el caso de las tetraciclinas, las CMIs tienden a ser más altas, especialmente para la clortetraciclina en Japón; pero menos para la oxitetraciclina; esto puede ser secundario a su amplio uso durante tantos años. 43 Las variaciones en la CMI se producen en función del medio utilizado; las placas de agar proporcionan valores superiores que en los medios de cultivo. También la cantidad de inóculo puede aumentar los valores de la CMI. El pH puede también tener un impacto en la CMI. También el punto de corte o (“end point”) puede afectar la CMI si se decide considerar el cambio de color al primer cambio de color o después de un día (por ejemplo) (Tabla 7). Tabla 7. Comparación de las CMI50, CMI90 y Rango para las distintas tetraciclinas frente a M. hyopneumoniae Antimicrobiano CMI de la estirpe de referencia CMI50 (μg/ml) CMI90 (μg/ml) Rango (μg/ml) Referencia Clortetraciclina 12,5 - 12,5 0,39 ≥100 1,56 0,78-≥100 <0,024-3,125 INAMOTO et al.,1994 THONGKAMKOON et al., 2002 Oxitetracicina 0,78 0,25 - 0,12 0,78 0,25 0,078 0,12 6,25 1 0,31 1,0 0,1-12,5 0,025-1 0,039-0,63 0,015-0,12 INAMOTO et al.,1994 HANNAN et al., 1997 AITKEN et al., 1999 VICCA et al, 2004 En la mayoría de los estudios de lesiones de pneumonía enzoótica se han utilizado inóculos homogeneizados por vía intranasal (a veces intratraqueal). La infección por pneumonía enzoótica a menudo se sobrepone por otra infección bacteriana, a veces por contaminación y otras veces por infección natural. Esta contaminación puede dar lugar a una mala interpretación de los resultados. En los estudios preventivos, la medicación normalmente comienza justo antes o en el momento de la infección, y en los estudios de tratamiento, la medicación normalmente comienza 10-28 días después de la infección, cuando las lesiones han empezado a desarrollarse (BURCH, 2012). A menudo se puede obtener información farmacocinética de un número de fuentes; pero no siempre está completa. Existe información que correlaciona la concentración de antimicrobiano en plasma con la concentración de antibiótico en el tejido pulmonar para varios antibióticos. La administración de antibióticos en el pienso puede tener un efecto perjudicial en la concentración requeridas en el plasma si la substancia se metaboliza y se excreta por heces, reduciendo su aparente biodisponibilidad. Muchos compuestos pueden aún detectarse en el pulmón, cuando las concentraciones plasmáticas están por debajo del límite de detección, ya que se concentran en plasma, debido a gradientes de difusión (por ejemplo macrólidos y 44 pleuromutilinas). Los antibióticos que se excretan fundamentalmente por vía renal, como las tetraciclinas, lincomicina y fluoroquinolonas, normalmente tienen niveles detectables en sangre y en pulmón. La mayoría de las relaciones PK/PD se han basado en datos de concentración plasmática, Cmax y AUC y estos valores se dividen por la CMI. Estas relaciones han sido bien descritas por TOUTAIN (2003). Para antibióticos bactericidas como los aminoglicósidos, un valor de 10-12 se ha cuantificado para la relación Cmax/CMI para administrar una dosis efectiva en una infección. Para fluoroquinolonas, ha sido propuesto un valor AUC/CMI ≥100 y <30 para bacteriostasis. Para antimicrobianos bacteriostáticos, no se han determinado cifras similares. Con la administración en el pienso o agua, la absorción del antibiótico es intermitente y ocurre de forma irregular sobre un período de 24 horas pero la absorción en el tracto gastrointestinal es prolongada. Consecuentemente la concentración en el plasma y en el pulmón es relativamente constante, en comparación con dosis en bolo (ya sea por vía oral o intravenosa). Para las tetraciclinas y macrólidas se establece una relación Cmax/CMI90 que debe ser mayor a 25. El área bajo la curva (AUC) se calcula por la concentración plasmática o pulmonar durante 24 horas lo que se muestra en la Tabla 8 y 9 (BURCH, 2012). Tabla 8. Integración del área bajo la curva durante 24 horas (AUC24h) de distintos antimicrobianos en plasma con el CMI50 y el CMI90 frente a Mycoplasma hyopneumoniae (BURCH, 2012) Antimicrobiano Pienso (ppm) CMI50 (μg/ml) CMI90 (μg/ml ) Concentración plasmática (μg/ml) AUC24h (μg.h/ml) AUC/CMI50 (h) AUC/CMI 90 (h) Plasma : CMI90 Índices Clortetraciclina 550 0,39 1,56 0,25 6 15 4 0,16 Tilmicosina 400 0,1 0,39 0,18 4,32 43 11 0,46 Tilosina 110 0,1 0,25 <0,04 <0,96 9,6 3,8 0,16 Lincomicina 220 0,025 0,1 0,14 3,36 134 33,6 1,4 Enrofloxacina 150 0,025 0,05 0,24 5,76 230 115 5,0 Tabla 9. Integración del área bajo la curva durante 24 horas (AUC24h) de distintos antimicrobianos en pulmón con el CMI50 y el CMI90 frente a Mycoplasma hyopneumoniae (BURCH, 2012) Antimicrobiano Pienso (ppm) CMI50 (μg/ml) CMI90 (μg/ml) Concentración pulmón (μg/ml) AUC (μg.h/ml) AUC/CMI50 (h) AUC/CMI90 (h) Índices Clortetraciclina 550 0,39 1,56 0,55 13,2 34 8 Tiamulina 220 0,04 0,08 1,99 47,76 1194 597 Valnemulina 200 0,0025 0,005 0,23 5,52 2208 1104 Tilosina 110 0,1 0,25 <0,05 1,2 12 5 Tilmicosina 400 0,1 0,39 1,97 47,28 473 121 Tilvalosina 100 0,0125 0,0125 0,14 3,36 269 269 Lincomicina 220 0,025 0,1 1,13 27,12 1085 271 Enrofloxacina 150 0,025 0,05 0,65 15,6 624 312 45 Es difícil tomar conclusiones de este estudio sobre la pneumonía enzoótica que ha servido de modelo del estudio del índice PK/PD a partir de datos farmacocinéticos y valores de CMI. La elección del medio de cultivo, placa de agar, además del tamaño de inóculo, duración de la incubación después de varios días (como con la clortetraciclina) pueden influir. En algunos casos, por ejemplo, después de la incubación prolongada con tilosina, la CMI continúa subiendo hasta alcanzar valores de “concentración mínima micoplasmicida (CMM=CMB) (GOODWIN, 1979). Por el momento no existe una metodología CLSI estandarizada (Clinical and Laboratory Standards Institute). El efecto de los antibióticos puede dividirse en tres categorías, bacteriostático, bactericida y eliminación del microorganismo; y esto puede a su vez autodividirse en prevención y tratamiento. Por ejemplo, las fluoroquinolonas son consideradas como antimicrobianos bactericidas y la eliminación es posible, como se ha demostrado con la fluoroquinolona ofloxacina. Como se describe más adelante las tetraciclinas son tiempo y concentración dependiente. Algunos de los estudios de tratamiento son prácticamente de prevención tardía, empezando a las cuatro semanas post-infección. Se puede conseguir una buena remisión al tratamiento con fluoroquinolonas, como enrofloxacina (92%) en una infección mixta (SIMON et al., 1990); pero se redujo después de un período de observación de 14 días al 79%, lo que sugiere que tiene un efecto bactericida; pero sin conseguir eliminar la infección completamente. Una vez que el tratamiento se haya iniciado, las lesiones desarrolladas pueden alterar los parámetros farmacocinéticos; por ejemplo, concentración en la lesión. Es interesante observar que las pleuromutilinas y tetraciclinas (tiamulina y clortetraciclina 76% y valnemulina y clortetraciclina un 86-93%) proveyó un aumento de las mejorías que simplemente con la clortetraciclina sola (36%). Además, BURCH et al. (1986) demostraron una superioridad clínica en el campo combinando la tiamulina y la clortetraciclina gfrente a P. multocida, lo que puede explicar este fenómeno. Relacionar los parámetros farmacocinéticos con efecto clínico, no siempre es tan sencillo. Existe controversia sobre si se debe utilizar los niveles de antimicrobiano en tejido pulmonar o si se debe utilizar el nivel plasmático. Mycoplasma hyopneumoniae vive primariamente en la superficie del epitelio bronquiolar; por tanto, la importancia de la concentración pulmonar, que presumibemente es intracelular en los alveólos, es cuestionable, por lo que las concentraciones plamáticas pueden ser más significativas. MOUTON et al. (2008) opina que el uso de la concentración de antibióticos en tejidos no se justifica, ya 46 que la mayoría de las infecciones bacterianas son intracelulares, además resulta difícil establecer los niveles de antibióticos en estos compartimentos, a menudo por debajo de los niveles detectables. En cuanto a la oxitetraciclina en particular hay una serie de referencias que describe la concentración plasmática de oxitetraciclina en cerdos tras su administración en el pienso; pero el trabajo más completo fue realizado por PIJPERS et al., 1991. En este estudio se midieron concentraciones de oxitetraciclina en plasma después de la administración en la comida durante seis días a la concentración de 400, 800, 1600 y 2400 ppm, lo que equivale a una proporción de dosis de 12,1; 26,4; 54,5; 81,5 y 111,3 mg/kg/día respectivamente, utilizando ambos métodos: HPLC y microbiológico, encontrándose cantidades similares por ambos métodos. Las concentraciones máximas de oxitetraciclina fueron 0.22, 0.5, 1.43 y 2.14 μg/ml respectivamente. Las tasas de mejoría clínica oscilaron entre 57-72%. PIJPERS et al., (1994) determinaron las concentraciones plasmáticas y en pulmón tras la administración de oxitetraciclina en el pienso a la concentración de 400, 800, y 1600 ppm (que equivale respectivamente a las dosis de 14, 29 y 60 mg/kg/p.v./día) durante seis días. Los cerdos también fueron infectados con Actinobacillus pleuropneumoniae, como parte de un estudio de infección experimental. En este estudio se determinaron concentraciones superiores en el pulmón comparadas con las del plasma; pero concentraciones ligeramente inferiores que en el primer estudio (Tabla 10). La razón concentración pulmonar/ concentración plasmática osciló entre 1,09 – 1,36 :1. 47 Tabla 10. Concentraciones antimicrobianas en pulmón y en plasma y Cmax plasma/pulmón (P/L) (BURCH, 2012) Antibiótico Formulación Dosis mg/kg Cmax Pulmón Cmax Plasma Cmax L/P razón AUC Pulmón AUC Plasma AUC L/P razón Referencia Enrofloxacina Iny (24h) 2,5 2,7 0,8 3,4:1 15,5 7,2 2,2:1 SCHEER, 1987 (M) Pienso 150ppm 7,5 0,92 0,3 3,1:1 22,1 7,2 3,1:1 Premix brochure data (Anónimo) Ceftiofur Iny Na Cef Iny Cef HCl (72h) 3 3 15,8 11,8 196 216 BROWN et al., 1999 (H) Tiamulina Iny. (72h) 15 9,6 0,61 15,7:1 231,5 12,8 18,1:1 McKELLAR et al., 2004 (M) Agua: 60 ppm 120 ppm 180 ppm 6,2 13,2 20,9 1,1 4,3 8,5 0,06(E) 0,24(E) 0,47(E) Usado 18,1:1 ANDERSON et al., 1994 (M) Pienso: 110ppm 220ppm 6,6 13,2 1,5 2,0 0,08(E) 0,11(E) ANDERSON et al., 1994 (M) PM/P 4,9-18.2:1 NIELSEN y SZANCER, 1998 Tilosina Iny. (24h) 10 3,37 3,49 0,96:1 21,3 16,1 1,3:1 HOFFMAN et al., 1983 (M) Pienso: 110ppm 5,5 ‹0,05 ‹0,04(E) Usado 1,3:1 IBAYASHI et al, 1994 (M) Tilmicosina Pienso: 200ppm 400ppm 10 20 1,43 2,59 ‹0,1 0,23 11,3:1 THOMSON et al., 1994a (H) Pienso: 400ppm 20 1,69 MPs 7,2 0,039 43:1 MP/P 184:1 *STOKER et al., 1996 MP/P 75:1 BLAIS Y CHAMBERLAND, 1994 48 Antibiótico Formulación Dosis mg/kg Cmax Pulmón Cmax Plasma Cmax L/P razón AUC Pulmón AUC Plasma AUC L/P razón Referencia Tulatromicina Iny: LD 15 días 2,5 3,47 0,62 5,6:1 615 12,0 51,3:1 BENCHAOUI et al., 2004 (H) PM/P 16,6:1 MP/P 8.1:1 EVANS, 2005 Lincomicina Iny 11 12,5 7,03 1,8:1 *SWENSON y BARBIERS, 1976 (M) Pienso: 110ppm 220ppm 5,5 11 0,66 1,13 0,16 0,14 4,1:1 8,1:1 *DeGEETER et al., 1980 (M) Oxitetracilina Iny LD (48h) 20 4,68 86,6 BANTING y BAGGOT, 1996 (M) Pienso: 400 ppm 20 0,15 0,11 1,4:1 2,36 2,0 1,2:1 ASANUMA et al., 1986 (M) Pienso: 400ppm 800ppm 1600ppm 20 40 80 0,23 0,42 0,78 0,25 0,57 0,83 1,09:1 1,36:1 1,06:1 PIJPERS et al., 1994 (M) Clortetraciclina Pienso: 1000ppm 50 0,56 0,44 1,3:1 *JACOBSON et al., 1994 (M) Pienso: 400ppm 20 0,66 0,35 1,9:1 11,75 5,78 2:1 ASANUMA et al., 1986 (M) (BURCH, 2012). Abreviaturas: Iny (inyección); M (método microbiológico); H (método HPLC); E (estimación); MPs (macrófagos); PMs (polimorfonucleares); P (plasma); L (pulmón); Cmax (concentración máxima); AUC (Área bajo la curva); LD (Larga duración). 49 Con los antimicrobianos bacteriostáticos, el tiempo durante el cual la concentración sanguínea excede la CMI es un parámetro importante de eficacia, asumiendo que la CMI es un parámetro in vitro. Por tanto, el AUC dividido por 24 horas da el equivalente de un efecto estable sostenido. Para las penicilinas (principalmente tiempo-dependientes), un AUC de 100-120/24h equivale a 4.2-5.0 y normalmente como “regla” se toma que se necesita unas 4 veces la CMI para conseguir un buen efecto bactericida clínico. Con los antimicrobianos bacteriostáticos, un AUC de 24 puede ser considerado inhibitorio (normalmente 1 vez la CMI); pero un efecto inhibitorio o eliminatorio dependerá de la razón CMB/CMI, lo que varía en función del microorganismo y los antimicrobianos y puede ser bastantes veces superior a uno. Concentración mínima inhibitoria de distintos antimicrobianos para infecciones respiratorias en cerdos Normalmente, la concentración mínima inhibitoria (CMI) frente al microorganismo responsable de la enfermedad es la medida más importante de la actividad antimicrobiana y de su potencial eficacia. Para varios aislados (normalmente superiores a 10) pueden detrminarse la CMI50 para una población, la CMI90 y el rango. Esto da una indicación de la susceptibilidad de una población; pero se debe poner en contexto de lo que son las concentraciones de antimicrobiano en plasma o en pulmón o en otro órgano diana, posiblemente en leucocitos y fluídos. A. pleuropneumoniae: Existe un alto nivel de susceptibilidad al ceftiofur y también a la enrofloxacina en la mayoría de los trabajos; aunque en Taiwan existe cierto grado de resistencia a la enrofloxacina. Los datos de las CMI de la tiamulina son particularmente variables y se deben a los distintos métodos de cultivo usados, como por ejemplo el medio, la densidad del inóculo y el pH (CASAL et al, 1990; AARESTRUP y JENSEN, 1999, SIDOLI et al., 1984; MATTER et al., 2007). Aparentemente no parece que se estén desarrollando patrones de resistencia (Tabla 11). EVANS (2005) y GODINHO et al., (2005) también describieron una amplia variación de las CMI para la tulatromicina (32μg/ml a 0,25μg/ml), dependiendo del pH, la presencia de CO2 y suero en el medio. 50 La susceptibilidad a la tetraciclina es también muy variable. Se han documentado altos niveles de resistencia en Taiwan (CHANG et al., 2002) y en España (GUTIERREZ-MARTIN et al., 2006), probablemente asociado a la utilización de dosis altas de tetraciclina en comparación con Suiza (MATTER et al, 2007) e Italia (SIDOLI et al., 1984) donde los datos tienen más de 20 años de antigüedad. La tilosina tiene unos valores de CMI altos, especialmente en comparación con las concentraciones alcanzadas en plasma y pulmón en el rango de las dosis clínicas, y de forma similar con la lincomicina. La tilmicosina también tiene unas CMIs altas; pero no existe una CMI comparativa disponible. La eritromicina tiene una CMI de aproximadamente la mitad de la tilmicosina (SHRYOCK et al., 2002). Tabla 11. CMIs de distintos antimicrobianos frente a A. pleuropneumoniae Antimicrobiano / referencia CMI50 (μg/ml) CMI90 (μg/ml) Rango (μg/ml) AARESTRUP y JENSEN, 1999 – Dinamarca – 40 aislamientos (Agar-chocolate) Ceftiofur ≤0,03 ≤0,03 ≤0,03 Enrofloxacina ≤0,03 ≤0,03 ≤0,03 Tiamulina 4,0 4,0 0,5-4,0 Tilosina 8,0 16 4,0-16 CASALS et al., 1990 – Dinamarca – 26 aislados (agar-sangre danés) Tiamulin 4,0 4,0 1,0-8,0 CHANG et al, 2002 – Taiwan – 60 aislados (“Veterinary fastidious ágar” – NCCLS)) Ceftiofur 0,03 0,03 0,03-0,12 Enrofloxacina 0,5 8,0 0,03-16 Lincomicina 16 32 4,0-64 Tetraciclina 8 16 0,25-64 MATTER et al, 2007 – Suiza – 83 aislados (Veterinary fastidious medium - NCCLS) Ceftiofur ≤0,5 ≤0,5 ≤0,5 Enrofloxacina 0,03 0,03 0,03-1,0 Tiamulina 16 32 8-64 Tilmicosina 16 16 8-64 Eritromicina 8,0 8,0 4,0-8,0 Tetraciclina 0,5 0,5 0,5-32 Pasteurella multocida: Existen relativamente pequeños cambios de la susceptibilidad de Pasteurella multocida en los últimos 14 años en España, con la excepción de las tetraciclinas, donde parece ser que están apareciendo resistencias. Basándose en las concentraciones alcanzadas después de dosis parenterales, muchos organismos aislados pueden ser susceptibles; pero básandose en las concentraciones conseguidas tras la administración 51 de antibióticos en el pienso, hay potencialmente un alto riesgo de resistencia a las tetraciclinas (>10%). Las CMIs50 para la tiamulina ha disminuído en el mismo período; pero todavía son muy altas (Tabla 12). Tabla 12. CMIs de distintos antimicrobianos frente a P. multocida Antimicrobiano / referencia CMI50 (μg/ml) CMI90 (μg/ml) Rango (μg/ml) VERA-LIZARAZO et al., 2006 – España – 63 aislados (1987-1988) Ceftiofur ≤0,5 ≤0,5 ≤0,5 Enrofloxacina ≤0,12 ≤0,12 ≤0,12 Oxitetraciclina 1,0 1,0 ≤0,25-16 Clortetraciclina 0,5 1,0 ≤0,5-16 Tiamulina 32 32 ≤4,0-64 Tilosina 10 20 Tilmicosina ≤4 ≤4 ≤4,0-64 VERA-LIZARAZO et al,, 2006 – España – 132 aislados (2003-2004) Ceftiofur ≤0,5 ≤0,5 ≤0,5-1,0 Enrofloxacina ≤0,12 ≤0,12 ≤0,12 Oxitetraciclina 2,0 8,0 0,5-16 Clortetraciclina 2,0 8,0 ≤0,5-16 Tiamulina 16 32 ≤4,0-64 Tilosina 10 20 Tilmicosina ≤4,0 8,0 ≤4,0-16 52 Haemophilus parasuis: Las CMIs Danesas fueron inferiores que las del Reino Unido; pero en España fueron superiores que en el Reino Unido. Los valores de CMI90 para ceftiofur, enrofloxacina, oxitetraciclina, tiamulina y tilmicosina fueron todos superiores en los aislados en España (Tabla 13). Tabla 13. CMIs de antimicrobianos frente a H, parasuis: Antimicrobiano / referencia CMI50 (μg/ml) CMI90 (μg/ml) Rango (μg/ml) AARESTRUP et al,, 2004 – Dinamarca – 52 aislados (“Veterinary fastidious médium”, (VFS)) Ceftiofur 0,03 0,03 0,03 Ciprofloxacina 0,015 0,06 0,015-0,5 Tetraciclina 1,0 2,0 0,06-2,0 Tiamulina 4,0 8,0 1,0-16 Tilmicosina 2,0 2,0 2,0-4,0 MARTIN-DE LA FUENTE et al,, 2007 – Reino Unido – 30 aislados (VFS) Ceftiofur ≤0,5 1,0 ≤0,5-2,0 Enrofloxacina ≤0,12 0,25 ≤0,12-1,0 Oxitetraciclina 0,5 4,0 0,25-16 Tiamulina ≤4,0 16 ≤4,0-32 Tilmicosina ≤4,0 8 ≤4,0-8,0 MARTIN-DE LA FUENTE et al, 2007 – España- 30 aislados (VFS) Ceftiofur ≤0,5 4,0 ≤0,5-16 Enrofloxacina 0,25 4,0 ≤0,12-4,0 Oxitetraciclina 2,0 16 0,25-16 Tiamulina ≤4,0 64 ≤4,0-64 Tilmicosina 16 64 ≤4,0-64 53 Mycoplasma hyopneumoniae: Existen algunos incrementos de los valores de la CMI con el tiempo para algunos antimicrobianos; y resistencias a la tilosina, tilmicosina y lincomicina en Bélgica; pero inferiores al 10%, Por comparación, las CMIs para la tiamulina, tilosina, tilmicosina y lincomicina frente a Mycoplasma hyopneumoniae eran bastante inferiores que frente a otras bacterias respiratorias como A. pleuropneumonia, P. multocida y Hh parasuis (Tabla 14). Tabla 14. CMIs de antimicrobianos frente a M, hyopneumoniae Antimicrobiano/ referencia CMI50 (μg/ml) CMI90 (μg/ml) Rango (μg/ml) INAMOTO et al,, 1994 – 40 aislados - Japón Clortetraciclina 3,1 >100 0,2-≥100 Oxitetraciclina 0,2 3,13 0,025-12,5 Lincomicina 0,025 0,1 ≤0,0125-0,39 Tiamulina ≤0,0125 0,025 ≤0,0125-0,05 Tilmicosina 0,2 0,39 ≤0,0125-0,78 Tilosina 0,025 0,1 ≤0,0125-0,2 VICCA et al,, 2004 – 21 aislados - Bélgica Enrofloxacina 0,03 0,5 0,015->1,0 Doxicicline 0,12 0,5 0,03-1,0 Oxitetraciclina 0,12 1,0 0,03-2,0 Lincomicina ≤0,06 ≤0,06 ≤0,06->8,0 Tiamulina ≤0,015 0,12 ≤0,015-0,12 Tilmicosina 0,25 0,5 ≤0,25->16 Tilosina 0,03 0,06 ≤0,015->1,0 Eficacia clínica de la oxitetraciclina frente a las infecciones bacterianas respiratorias Para establecer las correlaciones de los índices PK/PD con efecto clínico, es importante establecer las CMIs del organismo utilizado en el estudio. Desafortunadamente las CMIs no siempre son conocidas. En la Tabla 15 se establecen las dosis de oxitetraciclinas indicadas para infecciones respiratorias en cerdos. La oxitetraciclina ha sido utilizada en numerosos estudios de determinación de dosis. Por ejemplo, en un estudio realizado por PIJPERS et al., (1994), se administraron las siguientes concentraciones (profilácticamente) a cerdos en pienso: 0, 400, 800 y 54 1600 ppm en el pienso, a los que se les inoculó A, pleuropneumoniae con una CMI de 1,0 μg/ml. El porcentaje de cerdos con pneumonía fue del 100%, 67%, 27% y 0%, respectivamente; como se indica en la Tabla 16. Las CMIs de los aislados oscilan entre > 0,5 a 1,0 μg/ml; por lo que el valor de AUC/CMI se aproxima a 24 (18,7 h a 19,9 h) para plasma y para pulmón respectivamente; lo que sugiere que hay muy poca diferencia entre ambos, y que la concentración de 1600 ppm de oxitetraciclina provee una buena protección bacteriostática, como se ha demostrado por la reducción de las lesiones pulmonares (PIJPERS et al., 1991). En un estudio farmacocinético anterior donde la recuperación de la oxitetraciclina fue de 57-72%, utilizando un método HPLC en comparación con las muestras puntuales, por lo que los cálculos de concentración plasmática final, podrían haber sido subestimadas. Tabla 15. Dosis de oxitetraciclina y clortetraciclina utilizadas en el Reino Unido (Anónimo, 2007). App (A, pleuropneumoniae); Pm (P, multocida); Bp (B, bronchyseptica); G+ (Gram positivos); Organismos sensibles (organismos no especificados en registros antiguos). BURCH, 2012. Antibiótico Rango de dosis (mg/kg) Bacteria Oxitetraciclina Inyección 10 / día Pm, App, Bb Inyección (LA ) 20 / una vez Pm + organismos sensibles Agua 10-30 / por 3-5 días Organismos sensibles Comida 400-1000ppm 20 / por 15 días Organismos sensibles Clortetraciclina Agua 20 / por 5 días Pm, Ss, Bb Comida 300ppm 10-20 / por 5-7 días Organismos sensibles Tabla 16. Relaciones PK/PD en plasma y pulmón de la Oxitetraciclina para la prevención de pneumonía por Actinobacillus pleuropneumoniae (App), PIJPERS et al., 1994. Tratamiento Oxitetraciclina (ppm) Cerdos con lesiones por App (%) CMI (μg/ml) Cmax plasma / CMI Cmax pulmón / CMI AUC plasma / CMI (h) AUC pulmón / CMI (h) 0 100 1,0 0 0 0 0 400 67 1,0 0,23 0,25 5,5 6,0 800 27 1,0 0,42 0,57 10,1 13,7 1600 0 1,0 0,78 0,83 18,7 19,9 55 En cuanto a las resistencias; existen dos picos de susceptibilidad para M. hyopneumoniae, lo que sugiere algún tipo de mutación al nivel aproximado de 0,39 μg/ml, por lo que este valor puede considerarse como el valor de cutt-off epidemiológico (ECOV) o “break point”. El siguiente ECOV es aproximadamente de 1,56 μg/ml, que corresponde con el punte de corte las bacterias respiratorias, especialmente P, multocida. El ECOV es considerado como el valor normal de la CMI para el micro-organismo antes de la exposición del antibiótico. Cuando existe una verdadera resistencia al antibiótico, el valor de la CMI suele ascender a valores superiores de 50 μg/ml. Como se observa en la Figura 6, la concentración plasmática parece ser el parámetro farmacocinético más importante para la oxitetraciclina. No obstante, BURCH (2012) concluye que al comparar la concentración leucocitaria, pulmonar y plasmática de un antibiótico, junto con su valor cut-off epidemiológico para distintos antibióticos de uso frente a distintas bacterias pulmonares; que para los antimicrobianos que se acumulan en pulmón, la farmacocinética pulmonar puede aún jugar un importante papel como un marcador a la hora de establecer los índices PK/PD y la eficacia clínica frente a infecciones bacterianas respiratorias. El papel de las concentraciones en macrofágos alveolares también parece tener un efecto importante, cuando el antimicrobiano se concentra en éstos a elevadas concentraciones (como es el caso de la tilmicosina y la tiamulina); pero es menos fácil de medir. Se producen dudas sobre los distintos métodos a la hora de determinar las CMIs (PRIDMORE et al., 2011). Por tanto, son necesarios más estudios y clarificaciones antes de probar con toda certeza que el antimicrobiano libre en plasma es una vía de éxito para la mejora de la integración PK/PD. 56 Figura 6. Patrones de susceptibilidad para la oxitetraciclina frente los patógenos respiratorios más comunes (INAMOTO et al., 1994 –M. hyopneumoniae; PIJPERS et al., 1994 –A. pleuropneumoniae, P. multocida; MARTIN-DE LA FUENTE et al., 2007 –H. Parasuis).Pm (Pasteurella multocida). En cuanto a la oxitetraciclina para patógenos intestinales, destaca el uso para ciertas diarreas por E. coli, HANSEN et al., (2002), registraron la concentración bioactiva de clortetraciclina; primariamente un antibiótico bacteriostático, en las heces del cerdo después de la administración oral en el pienso a 800 ppm. El residuo bioactivo fue de 112 μg/g de clortetraciclina en las heces. La tasa de incorporación normal de la clortetraciclina es normalmente de 300-400 ppm, lo que proveería 42-56 μg/g de clortetraciclina en heces y aproximadamente 13-17 μg/g en contenido del intestino delgado (concentración fecal x 30%, basado en los modelos de CLEMENS et al., 1975 y BURCH 2006), Estas cifras justifican el patrón de susceptibilidad y además el desplazamiento hacia la derecha, lo que puede esperarse después del tratamiento y un aumento de las resistencias. 57 Figura 7. Patrones de CMI de la oxitetraciclina frente a E. coli en matadero (n= 208) y ensayos diagnósticos enviados a laboratorio (BURCH, 2012) 2.7. JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO Y OBJETIVOS El sector porcino es el primer sector ganadero español (Figura 8) con una producción anual de más de 4.000 millones de euros, resultados que sitúan a España como el segundo productor de ganado porcino de la Unión Europea. Figura 8. Producción nacional de carne por especies en el año 2014 (Asociación Nacional de Industrias de la Carne de España ANICE, 2015) La Comunidad Autónoma que más cerdos produce es Cataluña, seguido por las Comunidades Autónomas de Castilla y León, Castilla-La Mancha, Aragón, Andalucía y Porcino Ovino Bovino Conejo Aves Caprino y equino 58 Murcia. Más de la mitad de la producción de carne de cerdo en España se localiza en Cataluña y en Castilla y León (Figura 9). Figura 9. S.G. Estadística del Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (MAGRAMA, 2014) La utilización responsable de antimicrobianos en medicina humana y en medicina veterinaria es uno de los principales ámbitos de la política de la Unión Europea, pertinentes para abordar el problema de la resistencia antimicrobiana. No cabe duda en la necesidad de aplicar acciones para prevenir y reducir la necesidad de utilizar antimicrobianos en producción de ganado porcino que se puedan resumir en (1) fomentar sistemas de producción que proporcionen condiciones ambientales apropiadas para los animales en las explotaciones (2) fomentar la utilización de antibiogramas antes del tratamiento antibiótico, siempre que sea posible; (3) fomentar el desarrollo de determinados programas de vigilancia de enfermedades para identificar y ayudar a prevenir posibles brotes de enfermedades y (4) aplicar medidas concretas para impedir la introducción y propagación de infecciones, tales como fomentar el buen uso de antimicrobianos en base a los datos específicos en cerdos obtenidos a partir de estudios de eficacia y seguridad de los antimicrobianos implicados (CE, 2015) Para fomentar el buen uso de antimicrobianos se necesita conocimientos de la farmacocinética del agente terapéutico, de forma que su utilización se haga bajo unas bases definidas de eficacia y seguridad. De hecho, la falta de conocimiento de la farmacocinética de un medicamento, puede conllevar que un compuesto 59 farmacológicamente idóneo, se someta a un régimen terapéutico que no sea racional, y provoque una falta de actividad o ineficacia, o bien dé lugar a una toxicidad adversa inaceptable. Esta farmacocinética debe de estar integrada con la farmacodinamia a partir de bacterias procedentes de la propia especie animal y que estén implicadas en las indicaciones que se pretenden tratar con la oxitetraciclina. Desde el punto de vista clínico y toxicológico la farmacocinética es el estudio de los factores que deben considerarse para conseguir niveles de un fármaco óptimos, predecibles, terapéuticamente eficaces y seguros, a partir de la forma de administración del medicamento veterinario. La oxitetraciclina, antibiótico objeto de nuestro estudio, juega un papel importante por su amplio espectro de actividad antimicrobiana y buena distribución orgánica. Es un antibiótico bacteriostático y co-dependiente, es decir, que su eficacia depende tanto de su concentración como del tiempo. Uno de estos parámetros puede dominar sobre el otro pero ambos son determinantes en la eficacia del antimicrobiano. Teniendo en cuenta las indicaciones terapéuticas de la oxitetraciclina en la especie porcina, se ha hecho imprescindible a efectos de su eficacia el conocimiento previo de la farmacocinética de la oxitetraciclina. El interés terapéutico de este agente antimicrobiano se basa en tres aspectos fundamentales: 1. La recomendación de uso de antimicrobianos en medicina veterinaria para animales productores de alimentos. 2. El creciente aumento de resistencias frente a antibióticos existentes en el mercado. 3. La escasez de datos científicos sobre farmacocinética en el caso de la oxitetraciclina en cerdos, especie de consumo humano. En función de todo lo expuesto, la presente memoria tiene por objeto realizar (1) un estudio farmacocinético y (2) el análisis PK/PD en cerdos integrando parámetros cinéticos y farmacológicos, valores de CMI, con el fin de predecir eficacia frente a Streptococcus suis, Clostridium perfringens, Bordetella bronchiseptica, Brucella mellitensis, Haemophilus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella 60 multocida, Campylobacter spp y Mycoplasma hyopneumoniae en el campo de la terapéutica porcina. Este índice PK/PD es fundamental para realizar posteriormente un estudio clínico para comprobar indicaciones previstas y así fijar un régimen posológico óptimo para una eficacia y seguridad de la oxitetraciclina. 61 MATERIAL Y MÉTODOS 62 3. MATERIAL Y MÉTODOS Se utilizaron un total de 10 cerdos (5 machos y 5 hembras) de la raza híbrida comercial: Ladrance - Large White x Pietrain-Duroc de 60 ± 5 kg entre 4,5 y 5 meses de edad, clínicamente sanos. Los animales fueron divididos en 3 grupos. Grupo 1 (4 cerdos) utilizados para investigar la cinética plasmática de oxitetraciclina tras la administración única de 5 mg/kg p.c; Grupo 1 (4 cerdos) utilizados para investigar la cinética plasmática de oxitetraciclina tras la administración única de 5 mg/kg p.c; Grupo 2 (4 cerdos) utilizados para investigar la cinética plasmática de oxitetraciclina tras la administración múltiple de 30 mg/kg p.c durante 7 días consecutivos; Grupo 3 (2 cerdos) no recibieron tratamiento y se emplearon para recoger plasma blanco para determinar la validación del método analítico elegido. Los animales seleccionados para este estudio se identificaron mediante un crotal de color en la oreja. Las muestras sanguíneas para el análisis procedieron de Clinobs S. L. (Banyoles, Gerona), donde se realizó el estudio clínico. El antibiótico oxitetraciclina administrado a los animales fue oxitetraciclina clorhidrato procedente de Sigma-Aldrich de una pureza ≥ 95%. 3.1. Protocolo y diseño experimental Los animales seleccionados se alojaron en la zona de experimentación de la Granja Experimental Clinobs distribuidos en jaulas individuales habiendo realizado previamente una limpieza exhaustiva de las mismas. Se inició entonces el periodo de adaptación de 7 días antes del inicio del experimento al objeto de eliminar el factor estrés producido por el cambio de ubicación y transporte, y para que todos los animales empezaran el estudio en idénticas condiciones. Durante este periodo de adaptación, los animales dispusieron de pienso y agua ad libitum. En la fase de adaptación, los animales fueron controlados en cuanto al peso inicial y final y la ganancia de peso media diaria. El pienso consumido durante este periodo fue el pienso estándar completo para cerdos de engorde comercial. Durante este periodo de adaptación no se observó en los cerdos ningún síntoma de enfermedad. 63 3.1.1. Estudio farmacocinético de oxitetraciclina tras administración única oral en cerdos A los animales del Grupo 1 (4 cerdos, 2 machos y 2 hembras) se les administró oralmente vía pienso una dosis de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v. Durante el tratamiento, los animales seleccionados siguieron condiciones normales de cría. Se pesó a los animales al inicio del tratamiento. También se hicieron observaciones de control del estado de salud general (aspecto, tonalidad de la piel, erupciones...). En el período de tiempo indicado no se observó en los animales ningún indicio de alteraciones zootécnicas o de enfermedad que aconsejara su exclusión. Para el tratamiento, los animales fueron alimentados con el mismo pienso basal al que se incorporó la cantidad necesaria de oxitetraciclina para conseguir que cada animal recibiera una dosis de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v. Antes de realizar el experimento se verificó la concentración de oxitetraciclina en el pienso medicado mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Se preparó un pienso medicado, incorporando la cantidad necesaria de oxitetraciclina al pienso basal estándar, de forma que, cada cerdo recibió una dosis exacta de 5 mg de oxitetraciclina/kg p.v. en función de su peso corporal y su consumo medio durante la fase de adaptación. La concentración del pienso administrado fue de 1 g oxitetraciclina/kg pienso. A cada cerdo de 60 kg de peso se le suministró diariamente una cantidad de pienso igual al 0,5% del peso vivo medio, es decir, 300 g de pienso medicado, tomando como 60 kg el peso vivo medio, por lo tanto cada animal recibe oralmente 300 mg oxitetraciclina/60 kg p.v. Este pienso medicado se preparó en forma de bolo apetecible y se comprobó que fue consumido en su totalidad. Antes de la administración, los animales se sometieron a un ayuno de 12 horas. Después del tratamiento y una vez comprobado que todos los animales consumieron el pienso medicado, los animales volvieron a disponer de pienso blanco basal y agua ad libitum. Se eligió para este estudio la dosis de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v. para obtener datos farmacocinéticos preliminares de oxitetraciclina que ayudaran a elegir una dosis terapéutica. Tras el tratamiento, de cada animal se tomaron muestras de sangre (4ml) a diferentes intervalos de tiempo de la vena yugular previa cateterización de la misma y 64 manteniéndola con un tapón heparinizado para evitar la continua venopunción. Se recogieron muestras de sangre a los 15 y 30 min., 1, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 horas tras la administración. Estas muestras de sangre se recogieron individualmente en tubos heparinizados y debidamente etiquetados; seguidamente se centrifugaron las muestras a 10.000 r.p.m. a 4ºC durante 10 minutos y se aisló el plasma que se congeló a -45 ºC hasta el posterior análisis de la concentración de oxitetraciclina por HPLC. 3.1.2. Estudio farmacocinético de oxitetraciclina tras administración múltiple oral en cerdos A los animales del Grupo 2 (4 cerdos, 2 machos y 2 hembras) se les administró oralmente vía pienso una dosis de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v./día durante 7 días consecutivos. Durante el tratamiento, los animales seleccionados siguieron condiciones normales de cría. Se pesó a los animales al inicio y al final del periodo de adaptación (correspondiente al primer día de tratamiento), todos los días de tratamiento y el día antes del sacrificio. También se hicieron observaciones diarias de control del estado de salud general (aspecto, tonalidad de la piel, erupciones...). En el período de tiempo indicado no se observó en los animales ningún indicio de alteraciones zootécnicas o de enfermedad que aconsejara su exclusión. Para el tratamiento, los animales fueron alimentados con el mismo pienso basal al que se incorporó la cantidad necesaria de oxitetraciclina para conseguir que cada animal recibiera una dosis de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v./día. Antes de realizar el experimento se verificó la concentración de oxitetraciclina en el pienso medicado mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Se preparó un pienso medicado, incorporando la cantidad necesaria de oxitetraciclina al pienso basal estándar, de forma que, cada cerdo recibió una dosis exacta de 30 mg de oxitetraciclina/kg p.v./día durante 7 días en función de su peso corporal y su consumo medio durante la fase de adaptación. La concentración del pienso administrado fue de 6 g oxitetraciclina/kg pienso. A cada cerdo de 60 kg de peso se le suministró diariamente una cantidad de pienso igual al 0,5% del peso vivo medio, es decir, 300 g de pienso medicado/día, tomando como 60 kg el peso vivo medio, por lo tanto cada animal recibe oralmente 1,8 g oxitetraciclina/60 kg p.v./día, durante siete días 65 consecutivos. Este pienso medicado se preparó en forma de bolo apetecible y se comprobó que fue consumido en su totalidad. Antes de la administración, los animales se sometieron a un ayuno de 12 horas. Después del tratamiento y una vez comprobado que todos los animales consumieron el pienso medicado, los animales volvieron a disponer de pienso blanco basal y agua ad libitum. Se eligió para el estudio la dosis de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v. en base a los datos cinéticos preliminares obtenidos tras la administración de 5 mg/kg, al objeto de obtener datos farmacocinéticos mas apropiados para predecir una eficacia clinica. Durante el primer día de tratamiento y el último día de tratamiento o séptima administración se recogieron muestras de sangre (4 ml) a los 15, 30 min., 1, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 h, después de la administración de la dosis diaria oral, de manera que la toma de muestra de las 24 h se realizó siempre inmediatamente antes de administrar a las 8 h a.m. la dosis oral diaria del día siguiente. Durante los días intermedios, días 2, 3, 4, 5 y 6 de tratamiento, se recogieron muestras de sangre (4 ml) a los 30 min., 2, 4, 8 y 24h, de manera que la toma de muestra de sangre de las 24 h se realizó siempre inmediatamente antes de administrar a las 8 h a.m. la dosis oral diaria del día siguiente. Las muestras de sangre se tomaron a diferentes intervalos de tiempo de la vena yugular previa cateterización de la misma y manteniéndola con un tapón heparinizado para evitar la continua venopunción. Las muestras de sangre se recogieron individualmente en tubos heparinizados y debidamente etiquetados; seguidamente se centrifugaron las muestras a 10.000 r.p.m. a 4ºC durante 10 minutos y se aisló el plasma que se congeló a -45 ºC hasta el posterior análisis de la concentración de oxitetraciclina por HPLC. La Tabla 17 expresa el esquema del muestreo de sangre realizado para el estudio farmacocinético tras administración múltiple oral de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v./día, durante 7 días consecutivos. 66 Tabla 17. Muestreo de sangre realizado para el estudio farmacocinético tras administración múltiple oral de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v./día, durante 7 días consecutivos DÍA DE MUESTREO Tiempo de muestreo Tiempo de muestreo (acumulado) Día 1 Tratamiento 1ª dosis 30 mg oxitetraciclina/kg p.v. vía oral pienso 0,25 h 0,50 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h 12 h 24 h 0,25 h 0,50 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h 12 h 24 h Día 2 Tratamiento 2ª dosis 30 mg oxitetraciclina/kg p.v. vía oral pienso 2 h 4 h 8 h 24 h 26 h 28 h 32 h 48 h Día 3 Tratamiento 3ª dosis 30 mg oxitetraciclina/kg p.v. vía oral pienso 2 h 4 h 8 h 24 h 50 h 52 h 56 h 72 h Día 4 Tratamiento 4ª dosis 30 mg oxitetraciclina/kg p.v. vía oral pienso 2 h 4 h 8 h 24 h 74 h 76 h 80 h 96 h Día 5 Tratamiento 5ª dosis 30 mg oxitetraciclina/kg p.v. vía oral pienso 2 h 4 h 8 h 24 h 98 h 100 h 104 h 120 h Día 6 Tratamiento 6ª dosis 30 mg oxitetraciclina/kg p.v. vía oral pienso 2 h 4 h 8 h 24 h 122 h 124 h 128 h 144 h Día 7 Tratamiento 7ª dosis 30 mg oxitetraciclina/kg p.v. vía oral pienso 0,50 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h 12 h 24 h 144,5 h 145 h 146 h 148 h 150 h 152 h 156 h 168 h 67 3.2. Método analítico de oxitetraciclina en plasma de cerdos En la literatura existen numerosos métodos para el análisis de tetraciclinas (KORSRUD Y McNEIL, 1988; CHARM y CHI, 1988; McNEIL et al., 1989; TERHUNE y UPSON, 1989a; CALDERÓN et al., 1994; YOSHIDA y KONDO, 1994; ANDERSON et al., 1995), así como por HPLC (SHARMA y BEVILL, 1978; MOUROT et al., 1980; ONJI et al., 1984; OKA et al., 1985; MOATS, 1986a; MOATS, 1986b; KHAN et al., 1987; MARTÍNEZ y SHIMODA, 1988; KONDO et al., 1989; MULDERS y VAN DE LAGEMAAT, 1989; BLANCHFLOWER et al., 1989; HAAGSMA y MENGELERS, 1989; RIOND et al., 1989; THOMAS, 1989; LONG et al., 1990; FLETOURIS et al., 1990; FARRINGTON et al., 1991; KIJAT et al., 1991; KRAMER-HORACZYNSKA, 1991; HASSELBERGER, 1991; CARLSSON y BJORCK, 1992; UENO et al., 1992; BRYAN et al., 1992; WALSH et al., 1992; AGASOSTER, 1992; IWAKI et al., 1992; BARKER y WALKER, 1992; WHITE et al., 1993; CROUBELS et al., 1994; TSAI y KONDO, 1994; SONG et al., 1994; YOSHIDA y KONDO, 1994; SOKOL y MATISOVA, 1994; McCRACKEN et al., 1995, MALVISI et al., 1996; BERMÚDEZ-ALMADA et al., 1999; SUNDERLAND et al., 2003; SALEHZADEH et al., 2006; FRITZ y ZUO, 2007; KOWALSKI y POMORSKA, 2007; SHAHID et al., 2007; VARGAS et al., 2009 y ZHOU et al., 2009) y por HPLC acoplado a espectrometría de masas (HPLC-MS) (ZURHELLE et al., 2000; LYKKEBERG et al., 2004; DE RUYCK et al., 2007; CETINKAYA et al., 2012;LOPES et al., 2012; CHIESA et al., 2015. En nuestro laboratorio, tras estudiar los métodos disponibles para la cuantificación de oxitetraciclina y en función de su sensibilidad y reproducibilidad, seleccionamos para nuestro trabajo el método descrito por WALSH et al., (1992) e IKAI et al. (1987). Se realizó el análisis de oxitetraciclina en muestras plasmáticas siguiendo el método descrito por WALSH et al. (1992) e IKAI et al. (1987), con algunas modificaciones introducidas por nosotros en el proceso de extracción. El ensayo demostró ser un método que cumple con los criterios de validación especificidad, linealidad, reproducibilidad, repetibilidad, precisión y sensibilidad (EMEA, 1998). 68 3.2.1. Procedimiento de extracción de oxitetraciclina. Condiciones cromatográficas El procedimiento de extracción de oxitetraciclina en plasma descrito por WALSH et al. (1992) llevado a cabo con modificaciones introducidas en nuestro laboratorio fue el siguiente: Se tomó cada muestra de plasma y se midió el volumen de plasma de cada una de ellas a las que se les adicionó 1,5 ml de buffer EDTA-MacIlvaine pH 4. Tras su mezcla se sometió a una agitación suave mediante un agitador Heidolph Reax 2000 durante 5 minutos. Se centrifugó a 3000 r.p.m. en centrífuga refrigerada (4 ºC) Sorwall, modelo RC-5B, durante 10 minutos. A continuación se separó y se recogió el sobrenadante que se situó en cartuchos Bond-Elut, C18, (6cc/g) previamente acondicionados con 5 ml de metanol, 5 ml de buffer EDTA-MacIlvaine pH 4 y 5 ml de agua ultrapura Milli-Q desechando los eluyentes. Los cartuchos se situaron en un sistema de filtración Vac- Elut, Analytical Internacional, conectado a una bomba de extracción Heron. Una vez los cartuchos fueron acondicionados, se filtró el sobrenadante obtenido de la centrifugación y la oxitetraciclina se eluyó a una velocidad no mayor de 10 ml/min, con 1 ml de una mezcla de acetonitrilo y buffer EDTA-MacIlvaine (50:50). El eluyente se recogió en viales de vidrio topacio y una alícuota de 50 µl se inyectó en el sistema cromatográfico de HPLC para el análisis de oxitetraciclina. El buffer EDTA-MacIlvaine pH 4 se preparó disolviendo 15 g de fosfato disódico dihidratado, 13 g de ácido cítrico monohidratado y 3,72 g de EDTA en un litro de agua ultrapura Milli-Q. El sistema cromatográfico HPLC utilizado fue un Shimadzu modelo LC-10AD, equipado con detector ultravioleta diodo-array Shimadzu modelo SPD-M10A, dos sistemas de bombeo Shimadzu modelo LC-10AD, auntoinyector Shimadzu modelo SIL-10AD y un procesador para el tratamiento de datos Class-VP software. El detector ultravioleta se fijó a una longitud de onda de 350 nm. La columna utilizada fue de fase reversa, Teknokroma, Nucleosil 120 C18 (5 μm; 12,5 x 0,4 cm), equipada con una precolumna Teknokroma TR-C-160-1. El flujo se mantuvo a una velocidad de 1 ml/min. La fase móvil consistió en una mezcla de ácido oxálico 0,01Macetonitrilometanol en una proporción de 855:120:25 (vol/vol). 69 Las áreas de los picos en los cromatogramas de las muestras se cuantificaron usando la técnica del estándar externo por el uso de soluciones estándar de referencia de oxitetraciclina. La solución stock de los estándar de referencia se preparó disolviendo 10 mg de oxitetraciclina en 10 ml de ácido clorhídrico 0,01M y almacenando en la oscuridad a - 45º C. Las soluciones de trabajo se prepararon diariamente a partir de estas soluciones stock diluidas en buffer EDTA-MacIlvaine a pH 4, obteniendo soluciones de trabajo con concentraciones entre 0,050 g/ml a 60 g/ml. Los resultados de la validación del método fueron los siguientes: las curvas de calibrado para la oxitetraciclina fueron lineales en un rango de 0,050-60 μg/ml, el coeficiente de correlación R fue de 0,9999. El límite de cuantificación fue 0,050 μg/ml. La recuperación media de oxitetraciclina en plasma fue > 84%. La precisión intra-día e inter-día presentó un coeficiente de variación < 5,5%. No existió ninguna interferencia con los compuestos endógenos propios del tejido estudiado lo que evidencia la especificidad del método. El método utilizado fue específico para la sustancia analizada y no se observó en el cromatograma (Figura 10) ninguna interferencia con las sustancias endógenas propias de los fluidos y tejidos estudiados. 70 Figura 10. Cromatograma de una muestra de plasma blanco enriquecido con 1500 ng/ml de oxitetraciclina, 1ml de plasma se enriquecen con 1 ml de 1500 ng/ml de oxitetraciclina y se extraen en un volumen final de 1 ml (1500 ng/ml). El volumen de inyección es 100 l (143.117 ng/100 l). 3.2.2. Validación del método analítico oxitetraciclina en plasma de cerdo Para la validación de la técnica se ha utilizado el plasma obtenido de la toma de muestras de sangre de 2 cerdos sanos de la raza híbrida comercial: Ladrance - Large White x Pietrain-Duroc de 60 ± 5 kg que no recibieron tratamiento. Se ha llevado a cabo un método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para evaluar concentraciones en plasma de cerdo de oxitetraciclina, siguiendo el proceder de WALSH et al. (1992) y de IKAI et al. (1987) con modificaciones introducidas. El 71 método utilizado cumple con los criterios de validación linealidad, recuperación, precisión (repetibilidad de la recuperación), exactitud, sensibilidad, especificidad, estabilidad y robustez.  Preparación de las soluciones estándar de oxitetraciclina. Tomamos la medida del factor de pureza pesando exactamente la cantidad requerida de para tener una solución stock de 1 mg/ml. Mediante esta solución stock se preparan diferentes soluciones de oxitetraciclina en rangos de 50 ng/ml-60000 ng/ml (es decir, 50 ng/ml, 75 ng/ml, 750 ng/ml, 1500 ng/ml, 15000 ng/ml, 25000 ng/ml y 60000 ng/ml de oxitetraciclina.  Procedimiento de enriquecimiento y determinación de la recuperación. La determinación se efectuó en 7 niveles de concentración en plasma: 50 ng/ml, 75 ng/ml, 750 ng/ml, 1500 ng/ml, 15000 ng/ml, 25000 ng/ml y 60000 ng/ml de oxitetraciclina.. Utilizando las soluciones estándar de oxitetraciclina, se procedió por separado al enriquecimiento de las muestras de plasma blanco, individualmente en la forma siguiente: en un tubo de policarbonato se sitúa 1 ml de plasma, se enriquece con 1 ml de la solución correspondiente de oxitetraciclina para obtener la concentración deseada, y a continuación se adiciona 5 ml de buffer-Mc Ilvaine pH 4 para proceder a su homogenizado y seguidamente llevar a cabo el proceso de extracción.  Cálculo de resultados y validación del método analítico. La presencia de oxitetraciclina está supeditada al tiempo de retención del analito en la muestra a estudio en el sistema HPLC, en relación al tiempo de retención de cada uno de estos en la muestra estándar de referencia (método del estándar externo).  Soluciones preparadas en el laboratorio a. Solución 0,01 M de ácido clorhídrico: en un matraz aforado de 50 ml añadir agua destilada y desionizada y 44,1 μl de ácido clorhídrico y finalmente enrasar con agua hasta 50 ml. b. Solución 0,01 M de ácido oxálico (Na2HPO4 2H2O): pesar 1,26 g y llevarlo en matraz aforado a 1000 ml con agua destilada y desionizada. c. Buffer EDTA-Mc Ilvaine (pH 4): pesar 15 g de sodio fosfato dibásico dihidratado (Na2HPO4 2H2O), 13 g de ácido cítrico (C6H8O7 H2O) y 3,72 g de etilen diamino tetra acético disódico 72 (C10H14N2Na2O8.2.H2O), llevarlo a 900 ml con agua destilada y desionizada, y se ajustar la solución a pH 4 con ácido clorhídrico de 35 % de riqueza (aproximadamente se necesita 0,5 ml), para a continuación en matraz aforado enrasar al volumen final de 1000 ml con agua destilada y desionizada. d. Fase móvil (HPLC): La fase móvil consistió en una mezcla de ácido oxálico 0,01 M, acetonitrilo y metanol en proporción 855:120:25 respectivamente. Se mezcla bien y la solución resultante se desgasifica en un baño de ultrasonidos durante 15 minutos.  Cuantificación y expresión de los resultados. La cantidad de oxitetraciclina en la muestra de plasma se determina, utilizando la recta de calibrado correspondiente de plasma blanco fortificado, por la medida de la concentración correspondiente al área del pico en el tiempo de retención: Oxitetraciclina en la muestra de plasma: C (ng/g) = (Área de pico –a) b Siendo A = área de pico encontrada en el cromatograma del análisis de la solución de la muestra tisular (100 µl) a = termino independiente de la recta de regresión b = pendiente de la recta de regresión (2 g de tejido se extraen finalmente en 2 ml de fase móvil) (Volumen de inyección 100 µl)  Curva de calibración, linealidad y recuperación. Curvas de calibración [incluyendo el porcentaje del coeficiente de variación (CV) y tiempo de retención] fueron construidas a partir de concentraciones estándar de oxitetraciclina para los rangos de soluciones estándar de oxitetraciclina de 50 a 60000 ng/ml y para muestras plasmáticas enriquecidas a concentraciones en un rango de 50 a 60000 ng/ml de plasma. La representación de esta curva, concentración en el eje de abcisas y las áreas de los picos en el eje de ordenadas, demuestra que fue lineal. La recta de calibración fue 73 obtenida por análisis de regresión lineal de mínimos cuadrados. El coeficiente de correlación R fue 0,9999 (Tablas 18 y 19). Tabla 18. Linealidad de soluciones estándar de oxitetraciclina Concentración (ng/100 µl) Concentración (ng/ml) Área Valor medio  DS n = 6 CV Tiempo de retención (min) Valor medio  DS n = 6 5 50 4553,33 ± 108,25 2,38 8,686  0,155 7,5 75 6711,67 ± 241,10 3,59 8,200  0,100 75 750 66439 ± 2669,40 6,36 8,257  0,232 150 1500 132383,67 ± 3559,16 8,51 8,284  0,204 1500 15000 1316314,17 ± 9253,37 6,20 8,287  0,206 2500 25000 2228573,83 ± 15988,60 3,22 8,208  0,122 6000 60000 5289093 ± 52639,16 2,61 8,136  0,119 TABLA 19. Linealidad del plasma de cerdo fortificado con oxitetraciclina Concentración (ng/100 µl) Concentración (ng/ml) Área Valor medio  DS n = 6 CV Tiempo de retención (min) Valor medio  DS n = 6 5 50 4498,50 ± 151,59 3,37 8,686  0,155 7,5 75 6660,50 ± 174,64 2,62 8,413  0,091 75 750 63757,83 ± 1102,99 6,36 8,500  0,088 150 1500 126021 ± 1697,38 8,51 8,473  0,118 1500 15000 1289381 ± 12516,00 6,20 8,453  0,152 2500 25000 2142089,5 ± 41040,57 3,22 8,510  0,110 6000 60000 4984471,5 ± 69825,48 2,61 8,458  0,027 CV = porcentaje del coeficiente de variación SD = desviación estándar La recuperación fue determinada en base la recta de regresión correspondiente a las soluciones estándar de oxitetraciclina y también en base a la recta de regresión de las muestras tisulares fortificadas (Tablas 20 y 21). 74 TABLA 20. Recuperación de oxitetraciclina en base a la recta de regresión de soluciones estándar de oxitetraciclina Concentración nominal (ng/ml) Concentración recuperada (ng/ml) Valor medio  DS % Recuperación Valor medio  DS CV 50 47,43  1,13 94, 86  2,25 2,37 75 70,63  2,54 94,169  3,38 3,59 750 692,36  12,50 92,315  1,667 1,81 1500 1399,19  18,69 93,279  1,246 1,33 15000 14586,89  141,89 97,246  0,946 0,97 25000 24253,79  465,26 97,015  1,861 1,92 60000 56477,02  791,59 94,128  1,319 1,40 TABLA 21. Recuperación de oxitetraciclina en plasma en base a la recta de regresión de muestras de plasma fortificadas Concentración nominal (ng/ml) Concentración recuperada (ng/ml) Valor medio  DS % Recuperación Valor medio  DS CV 50 31, 02  1,04 62,048  2,09 3,37 75 58,42  1,53 77,901  2,04 2,62 750 499,61  13,28 66,615  1,770 2,66 1500 1250,11  1984 83,341  1,323 1,59 15000 15252,60  1150,66 101,684  1,004 0,99 25000 25516,77  494,01 102,067  1,976 1,94 60000 59730,91  840,50 99,552  1,401 1,41 Como se demuestra, en los resultados obtenidos, la recuperación del compuesto oxitetraciclina alcanzó un rango de 62,048 a 102,067% y un valor medio de 84,744% para la recta de calibrado de plasma fortificado. 75 3.3. Análisis de datos La curva de las concentraciones medias plasmáticas de oxitetraciclina obtenidas tras la administración oral única de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v. y tras la administración oral múltiple de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v./día durante 7 días consecutivos se fijaron secuencialmente a un modelo compartimental, monocompartimental, bicompartimental y múltiple por el uso del programa Phoenix 32 Build 6.4.0.768 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA). El modelo elegido fue aquél que obtuviera el valor más pequeño del Criterio de Información de Akaike (YAMAOKA et al., 1978). El modelo bicompartimental fue el mejor estimado. Este modelo fue utilizado para establecer los parámetros farmacocinéticos. Las curvas de las concentraciones plasmáticas vs tiempo declinaron biexponencialmente y los datos se ajustaron a la siguiente ecuación (WAGNER, 1975; 1976):  Cp = A1  e -t + A2  e -t – A3  e –Kat (vía oral) Siendo: Cp Concentración plasmática del fármaco. A1, A2, A3 Coeficientes matemáticos, (es decir A1 y A2 son las concentraciones plasmáticas extrapoladas tiempo cero de la primera y segunda fase de eliminación del fármaco y A3 de la fase de absorción).  Constante híbrida de la fase inicial de distribución.  Constante híbrida de la fase terminal de eliminación. Ka Constante de absorción, constante de primer orden. t Tiempo. El modelo farmacocinético bicompartimental considera al organismo dividido en dos compartimientos: central y periférico. El compartimiento central está formado por el plasma, los fluidos intersticiales y el agua intracelular asequible (tejidos bien irrigados). Por definición, la distribución de un medicamento en todos los elementos del compartimiento central sería instantánea, y su concentración uniforme e igual a la existente en el plasma. Por otro lado, el compartimiento periférico lo constituyen el agua intracelular profunda (tejidos poco vascularizados) y los depósitos no acuosos (proteínas, ácidos nucleicos y lípidos 76 intracelulares). En este caso, un fármaco accedería a este compartimiento más lentamente desde el plasma, transcurriendo un tiempo antes de la consecución del equilibrio de la concentración del fármaco en el organismo. En el seno del compartimiento central se materializan los procesos de eliminación del fármaco por metabolismo y excreción, regidos por una constante de eliminación (K10). Este compartimiento canalizaría además el proceso de distribución de fármaco al compartimiento periférico (K12), y en el caso de administración extravasal, también el proceso de absorción, caracterizado por la constante de absorción (Ka). En el compartimiento periférico, desprovisto de mecanismos metabólicos y excretores de importancia, el fármaco permanece depositado pasivamente y su retorno al plasma (regido por la constante de retorno K21) depende del grado de eliminación del compartimiento central y de la afinidad que presente el fármaco hacia los depósitos no acuosos. Aunque la velocidad de acceso del fármaco a los diferentes elementos del compartimiento periférico no es la misma y la velocidad de retorno al compartimiento central tampoco lo es, en la práctica los retrasos en la distribución y en el retorno se consideran aditivos y están cuantificados globalmente por las constantes K12 y K21. Del mismo modo, la constante de absorción (Ka) engloba las de liberación y absorción, y la constante de eliminación (K10) engloba las de metabolismo y excreción. Se asume que los procesos de distribución y eliminación asociados con este modelo obedecen a cinéticas de primer orden (Figura 11), lo que significa que la velocidad con la que un fármaco se absorbe y se elimina a partir del compartimiento central es proporcional a la concentración del fármaco en dicho compartimiento. Las curvas concentración-tiempo (Figura 12), presentadas en forma semilogarítmica, demuestran una fase de absorción en la concentración plasmática del fármaco (1) y una fase de eliminación (2) en la concentración plasmática del fármaco que principalmente se debe a una distribución (por difusión pasiva) del fármaco desde el compartimiento central al compartimiento periférico. Una vez se ha alcanzado un equilibrio de pseudo-distribución, la velocidad de eliminación en la concentración plasmática se reduce y viene determinada principalmente por la eliminación del fármaco del compartimiento central. Esta porción terminal lineal de la curva de disposición se denomina fase β de “eliminación” y a partir de su pendiente (-β/2,303) se deriva la 77 semivida de eliminación (t1/2β) del fármaco. Resolviendo la curva de disposición en sus componentes por el método de residuales, se obtienen los segmentos lineales denominados fase de “absorción” y fase de “distribución” (GIBALDI et al., 1969; WAGNER, 1975; 1976). Figura 11. Diagrama esquemático de un modelo abierto bicompartimental. El fármaco, una vez localizado en el compartimiento central se distribuye instantáneamente. La distribución entre el compartimiento central y el compartimiento periférico tiene lugar más lentamente; K12, K21, son constantes de primer orden para la transferencia del fármaco entre los dos compartimientos. La eliminación se asume que tiene lugar exclusivamente desde el compartimiento central; K10 es una constante de primer orden para la eliminación del fármaco a partir del compartimiento central CENTRAL PERIFERICO (1) (2) K12 K21 K10 Ka ELIMINACIÓN 78 Figura 12. Distintas fases de los perfiles de concentración plasmática de un fármaco tras administración de una dosis oral (1) e intravenosa (2) K12 K21 K10 1 2 TIEMPO Ae -Kat Fase de absorción (1)A3 K12 K21 K10 1 2 TIEMPO Fase de distribución (2) 0.5 0.1 1 2 3 0 20 40 60 -ß /2,303 Fase de eliminación-a /2,303 Co A1 A2 79 En los estudios de disposición, los coeficientes A1, A2 y A3 y las constantes de disposición ,  y Ka se calculan a partir de datos experimentales por análisis de regresión por mínimos cuadrados y se usan para calcular los diferentes parámetros farmacocinéticos asociados con el modelo bicompartimental, como indicamos a continuación. Los parámetros farmacocinéticos investigados tras la administración oral del fármaco oxitetraciclina fueron: A1, A2, A3 Concentraciones del fármaco extrapoladas a tiempo 0.  y  Constantes de disposición. Ambas son constantes híbridas y respectivamente gobiernan en conjunto los procesos de distribución del fármaco al compartimiento periférico, de retorno al central y de eliminación del mismo por biotransformación y excreción. Ka Constante de absorción. t1/2 Semivida plasmática para la fase inicial de distribución (). t1/2 Semivida plasmática para la fase terminal de eliminación (). t1/2a Semivida plasmática de absorción. AUC Área bajo la curva concentración vs tiempo AUC = A + A A K 1 a  2 3  CL Aclaramiento plasmático total (“Clearance”) * AUC F Dosis. CL  = V1 Volumen de distribución en el compartimiento central* V1 = (dose kg -1 )(F)/ A1 + A2 V2 Volumen aparente de distribución en el compartimiento secundario* V2 = (V1)(F)  (K12/K21) 80 K12 Constante de distribución desde el compartimiento central al compartimiento periférico 12 21 10K = + - K - K  K21 Constante de retorno desde el compartimiento periférico al compartimiento central 21K = (A K A K A ) A (K ) A (K ) 1 a 2 a 3 1 a 2 a           K10 Constante de eliminación. 10 21 K = . K   Tmax Tiempo necesario para alcanzar la Cmax. Cmax Concentración máxima en plasma tras administración oral. * La biodisponibilidad (F) o fracción de dosis absorbida no fue calculada por falta del estudio tras administración IV. 3.4. Fármacos y reactivos - Acetonitrilo (CH3CN, Grado HPLC) Ref: AC03292500 (Sharlau). - Ácido etilen diamino tetracético sal disódica dihidrato (C10H14N2O82H2O). Ref: 1.00495.0100 (Merck). - Ácido oxálico 0,01M (C2H2O4) Ref: 1.00495.0100 (Merck). - Ácido cítrico monohidratado (C6H8O7 ·H2O) Ref: 1.00244.1000 (Merck) - Ácido clorhídrico 37% (HCl) Ref: 141020 (Panreac). - Fosfato disódico dihidratado (Na2HPO42H2O) Ref: 1.06580.1000 (Merck). - Metanol (CH3OH, Grado HPLC) Ref: ME03062500 (Sharlau). - Oxitetraciclina clorhidrato (C22H24N2O9Cl, CAS: 2058-46-0) Ref: O-5875 (Sigma). 81 RESULTADOS 82 4. RESULTADOS 4.1. Farmacocinética de oxitetraciclina tras administración única oral en cerdos 4.1.1. Niveles plasmáticos de oxitetraciclina tras administración única oral Los niveles plasmáticos de oxitetraciclina obtenidos de cada animal tras la administración única oral de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v. se representan en la Tabla 22. Las Figuras 13 a 16 ilustran los niveles plasmáticos de oxitetraciclina frente al tiempo, calculados tras administración oral de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v. en cerdos. Tabla 22. Niveles plasmáticos (μg/ml) de oxitetraciclina tras administración única oral de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v. en cerdos Tiempo tras dosis (h) Oxitetraciclina (µg/ml) Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Valor medio ± DS 0,25 h 0,070 0,065 0,061 0,063 0,065 ± 0,0038 0,5 h 0,314 0,317 0,231 0,232 0,273 ± 0,048 1h 0,420 0,410 0,471 0,445 0,437 ± 0,028 2h 0,797 0,810 0,811 0,842 0,815 ± 0,019 4h 0,576 0,570 0,588 0,582 0,579 ± 0,0075 6h 0,367 0,320 0,321 0,380 0,347 ± 0,031 8h 0,260 0,269 0,251 0,261 0,260 ± 0,0076 12h 0,186 0,188 0,178 0,182 0,183 ± 0,0044 24 h 0,066 0,071 0,063 0,069 0,067 ± 0,0036 83 Figura 13. Niveles plasmáticos (μg/ml) de oxitetraciclina tras administración única oral de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v. en el animal 1 Figura 14. Niveles plasmáticos (μg/ml) de oxitetraciclina tras administración única oral de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v. en el animal 2 Animal 1 Animal 2 84 Figura 15. Niveles plasmáticos (μg/ml) de oxitetraciclina tras administración única oral de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v. en el animal 3 Figura 16. Niveles plasmáticos (μg/ml) de oxitetraciclina tras administración única oral de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v. en el animal 4 Animal 3 Animal 4 85 4.1.2. Parámetros farmacocinéticos de oxitetraciclina tras administración única oral Los niveles plasmáticos de oxitetraciclina vs tiempo obtenidos tras administración única oral de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v., se fijaron secuencialmente a 1-, 2- y múltiple- modelo compartimental usando el programa Phoenix 32 Build 6.4.0.768 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA). El modelo fue determinado por el mejor ajuste en base al valor más pequeño del Criterio de Información de Akaike (YAMAOKA et al., 1978). La curva de las concentraciones plasmáticas de oxitetraciclina frente al tiempo tras administración única oral obtenida, se ajustó adecuadamente a un modelo bicompartimental para su análisis cinético de acuerdo a la siguiente ecuación exponencial: C = A1· e -αt + A2 · e -βt – A3 · e –Kat donde C es la concentración plasmática de oxitetraciclina; A1, A2 y A3 son coeficientes matemáticos; α es la constante híbrida de velocidad para la fase de distribución, β es la constante híbrida para la fase de eliminación terminal y Ka es la constante de velocidad de absorción, constante de primer orden. Los valores de los parámetros farmacocinéticos de la oxitetracicina de cada animal calculados a partir de la administración única oral de 5 mg oxitetraciclina/ kg p.v. se presentan en la Tabla 23. Tras la administración oral de oxitetraciclina (Tabla 23) se observó que el fármaco fue absorbido y más lentamente eliminado obteniéndose una semivida de absorción media de (t1/2a) de 1,227 ± 0,154 h, y alcanzando una concentración máxima media (Cmax) de 0,593 ± 0,009 μg/ml en un tiempo medio (Tmax) de 2,538 ± 0,140 h. Tras la administración única oral de oxitetraciclina se observó un valor medio de la semivida de eliminación (t1/2) de 11,206 ± 1,770 h. 86 Tabla 23. Parámetros farmacocinéticos de oxitetraciclina tras administración única oral de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v. en cerdos Parámetros* Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Valor medio ± DS A (μg/ml) 2,850 1,102 3,852 3,872 2,919 ± 1,302 B (μg/ml) 0,241 0,429 0,314 0,256 0,310 ± 0,085 C (μg/ml) 3,091 1,531 4,166 4,128 3,229 ± 1,237 α (h -1 ) 0,333 0,309 0,427 0,380 0,362 ± 0,052 β (h -1 ) 0,054 0,076 0,066 0,055 0,063 ± 0,010 K01 (h -1 ) 0,511 0,683 0,572 0,524 0,573 ± 0,078 K10 (h -1 ) 0,174 0,142 0,193 0,185 0,174 ± 0,022 K12 (h -1 ) 0,109 0,077 0,154 0,137 0,119 ± 0,034 K21 (h -1 ) 0,104 0,166 0,147 0,113 0,133 ± 0,029 AUC (μg. h/ml) 6,935 6,928 6,454 6,958 6,819 ± 0,243 t1/2a (h) 1,355 1,015 1,212 1,324 1,227 ± 0,154 t1/2α (h) 2,080 2,243 1,620 1,824 1,942 ± 0,275 t1/2 β (h) 12, 714 9,060 10,448 12,602 11,206 ± 1,770 Tmax (h) 2,697 2,568 2,357 2,528 2,538 ± 0,140 Cmax (μg/ml) 0,590 0,585 0,591 0,606 0,593 ± 0,009 * Parámetros farmacocinéticos obtenidos a partir de la curva de niveles medios plasmáticos vs tiempo 87 4.2. Farmacocinética de oxitetraciclina tras administración múltiple oral durante 7 días en cerdos 4.2.1. Niveles plasmáticos de oxitetraciclina tras administración múltiple oral Los niveles plasmáticos de oxitetraciclina obtenidos en cada animal tras administración múltiple oral de 30 mg oxitetraciclina/ kg p.c./ día durante 7 días consecutivos se representan en la Tabla 24 y Tabla 25. Los niveles plasmáticos de oxitetraciclina tras administración múltiple oral de 30 mg oxitetraciclina/kg p.c./día durante 7 días se recogen para cada animal en las Figuras 17 a 20 durante el periodo completo de dosificación (7 días). La Figura 21 ilustra los niveles plasmáticos de oxitetraciclina de los cuatro animales, tras administración múltiple oral de 30 mg oxitetraciclina/ kg p.c./ día durante 7 días consecutivos 88 Tabla 24. Niveles plasmáticos de oxitetraciclina en cerdos (n=4) tras dosis oral de oxitetraciclina de 30 mg/kg/día durante 7 días consecutivos NIVELES PLASMÁTICOS DE OXITETRACICLINA EN CERDOS (n=4) TRAS DOSIS ORAL (30 mg OTC/kg/día) OXITEVALL PREMEZCLA, 7 DíAS Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Tiempo tras dosis (h) Area cromatograma (vol. Inyección 100μl) ng/ml plasma Area cromatograma (vol. Inyección 100μl) ng/ml plasma Area cromatograma (vol. Inyección 100μl) ng/ml plasma Area cromatograma (vol. Inyección 100μl) ng/ml plasma 0,25h D1 15060 178,994 15285 181,628 16835 199,772 16006 190,068 0,5h D1 141142 1654,886 131666 1543,961 161708 1895,627 160456 1880,971 1h D1 198803 2329,854 183592 2151,797 196439 2302,181 217126 2544,339 2h D1 347056 4065,275 346873 4063,133 357541 4188,010 378558 4434,031 4h D1 284216 3329,682 281444 3297,233 290888 3407,783 304226 3563,915 6h D1 203970 2390,338 218982 2566,065 228661 2679,366 221636 2597,133 8h D1 160450 1880,901 168880 1979,581 173381 2032,269 175829 2060,925 12h D1 76895 902,823 81357 955,054 84095 987,104 86142 1011,066 24h D1 34008 400,796 38084 448,509 35316 416,107 38490 453,261 2h D2 329177 3855,987 363432 4256,969 357971 4193,044 355409 4163,053 4h D2 294818 3453,787 294583 3451,036 277846 3255,116 281178 3294,120 8h D2 173168 2029,776 179946 2109,118 190476 2232,380 229553 2689,807 24h D2 39801 468,608 42156 496,175 37892 446,261 36035 424,523 2h D3 364855 4273,626 365131 4276,857 368648 4318,026 341773 4003,433 4h D3 308915 3618,804 316008 3701,833 310515 3637,533 306730 3593,226 8h D3 198762 2329,374 198215 2322,971 171551 2010,847 193440 2267,076 24h D3 38806 456,960 40066 471,710 38306 451,107 45984 540,985 2h D4 350659 4107,451 346230 4055,606 355534 4164,516 374594 4387,629 4h D4 292379 3425,236 300467 3519,913 315304 3693,592 308027 3608,409 8h D4 179502 2103,920 183536 2151,141 210782 2470,078 176281 2066,216 24h D4 37680 443,780 41462 488,051 38664 455,298 43343 510,070 2h D5 360530 4222,999 343251 4020,734 362726 4248,705 372815 4366,805 4h D5 292460 3426,185 303750 3558,343 291366 3413,378 307753 3605,201 8h D5 163585 1917,599 159328 1867,767 172852 2026,077 171551 2010,847 24h D5 40750 479,716 41614 489,830 41891 493,073 45960 540,704 2h D6 363668 4259,732 364350 4267,715 370833 4343,604 396199 4640,533 4h D6 292545 3427,180 295745 3464,638 295556 3462,426 319572 3743,552 8h D6 183342 2148,871 187706 2199,955 191404 2243,243 173123 2029,249 24h D6 39279 462,497 40317 474,648 40342 474,940 40491 476,685 0,5h D7 123022 1442,776 121616 1426,318 156472 1834,336 141643 1660,750 1h D7 195194 2287,608 190924 2237,624 187289 2195,073 180871 2119,945 2h D7 343633 4025,206 356679 4177,920 397122 4651,338 355498 4164,095 4h D7 292092 3421,877 312373 3659,282 282663 3311,503 303704 3557,805 6h D7 206055 2414,744 226825 2657,874 229224 2685,956 208453 2442,815 8h D7 166217 1948,409 185463 2173,699 194930 2284,517 175705 2059,473 12h D7 77066 904,824 77192 906,299 98409 1154,661 81231 953,579 24h D7 37246 438,699 34624 408,007 45616 536,677 48995 576,231 89 Tabla 25. Niveles plasmáticos de oxitetraciclina en cerdos (n=4) tras dosis oral de oxitetraciclina de 30 mg/kg/día durante 7 días consecutivos Tiempo tras dosis (h) Tiempo acumulado (h) Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Valor medio ± DS μg/ml plasma μg/ml plasma μg/ml plasma μg/ml plasma μg/ml plasma 0,25h D1 0,25 0,179 0,182 0,200 0,190 0,188 ± 0,0094 0,5h D1 0,5 1,655 1,544 1,896 1,881 1,744 ± 0,173 1h D1 1 2,330 2,152 2,302 2,544 2,332 ± 0,162 2h D1 2 4,065 4,063 4,188 4,434 4,188 ± 0,174 4h D1 4 3,330 3,297 3,408 3,564 3,400 ± 0,119 6h D1 6 2,390 2,566 2,679 2,597 2,558 ± 0,122 8h D1 8 1,881 1,980 2,032 2,061 1,988 ± 0,079 12h D1 12 0,903 0,955 0,987 1,011 0,964 ± 0,047 24h D1 24 0,401 0,449 0,416 0,453 0,430 ± 0,025 2h D2 26 3,856 4,257 4,193 4,163 4,117 ± 0,178 4h D2 28 3,454 3,451 3,255 3,294 3,364 ± 0,104 8h D2 32 2,030 2,109 2,232 2,690 2,265 ± 0,295 24h D2 48 0,469 0,496 0,446 0,425 0,459 ± 0,031 2h D3 50 4,274 4,277 4,318 4,003 4,218 ± 0,144 4h D3 52 3,619 3,702 3,638 3,593 3,638 ± 0,046 8h D3 56 2,329 2,323 2,011 2,267 2,233 ± 0,150 24h D3 72 0,457 0,472 0,451 0,541 0,480 ± 0,041 2h D4 74 4,107 4,056 4,165 4,388 4,179 ± 0,146 4h D4 76 3,425 3,520 3,694 3,608 3,562 ± 0,115 8h D4 80 2,104 2,151 2,470 2,066 2,198 ± 0,185 24h D4 96 0,444 0,488 0,455 0,510 0,474 ± 0,030 2h D5 98 4,223 4,021 4,249 4,367 4,215 ± 0,144 4h D5 100 3,426 3,558 3,413 3,605 3,501 ± 0,096 8h D5 104 1,918 1,868 2,026 2,011 1,956 ± 0,076 24h D5 120 0,480 0,490 0,493 0,541 0,501 ± 0,027 2h D6 122 4,260 4,268 4,344 4,641 4,378 ± 0,179 4h D6 124 3,427 3,465 3,462 3,744 3,524 ± 0,147 8h D6 128 2,149 2,200 2,243 2,029 2,155 ± 0,092 24h D6 144 0,462 0,475 0,475 0,477 0,472 ± 0,006 0,5h D7 144,5 1,443 1,426 1,834 1,661 1,591 ± 0,194 1h D7 145 2,288 2,238 2,195 2,120 2,210 ± 0,071 2h D7 146 4,025 4,178 4,651 4,164 4,255 ± 0,273 4h D7 148 3,422 3,659 3,312 3,558 3,488 ± 0,152 6h D7 150 2,415 2,658 2,686 2,443 2,550 ± 0,141 8h D7 152 1,948 2,174 2,285 2,059 2,117 ± 0,145 12h D7 156 0,905 0,906 1,155 0,954 0,980 ± 0,119 24h D7 168 0,439 0,408 0,537 0,576 0,490 ± 0,079 90 Figura 17. Niveles plasmáticos (μg/ml) de oxitetraciclina tras administración oral múltiple de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v./día durante 7 días en el animal 5 Figura 18. Niveles plasmáticos (μg/ml) de oxitetraciclina tras administración oral múltiple de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v./día durante 7 días en el animal 6 0.1 1.0 10.0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Time (hr) Animal=1 0.1 1.0 10.0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Time (hr) Animal=1 Animal 5 Animal 6 91 Figura 19. Niveles plasmáticos (μg/ml) de oxitetraciclina tras administración oral múltiple de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v./día durante 7 días en el animal 7 Figura 20. Niveles plasmáticos (μg/ml) de oxitetraciclina tras administración oral múltiple de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v./día durante 7 días en el animal 8 0.1 1.0 10.0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Time (hr) Animal=1 0.1 1.0 10.0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Time (hr) Animal=1 Animal 7 Animal 8 92 Figura 21. Niveles plasmáticos (μg/ml) de oxitetraciclina tras administración oral múltiple de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v./día durante 7 días en 4 cerdos 4.2.2. Parámetros farmacocinéticos de oxitetraciclina tras administración múltiple oral Los niveles plasmáticos de oxitetraciclina obtenidos en cada animal tras administración múltiple oral de 30 mg oxitetraciclina/ kg p.v., se fijaron secuencialmente a 1-, 2- y múltiple- modelo compartimental usando el programa Phoenix 32 Build 6.4.0.768 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA). El modelo fue determinado por el mejor ajuste en base al valor más pequeño del criterio de información Akaike (YAMAOKA et al., 1978). Las curvas de disposición plasmática de oxitetraciclina tras administración oral múltiple (Figuras 17 a 20) se ajustaron adecuadamente a un modelo bicompartimental para su análisis cinético de acuerdo a la siguiente ecuación exponencial: C = A1· e -αt + A2 · e -βt – A3 · e -Kat donde C es la concentración plasmática de oxitetraciclina; A1,A2 y A3 son coeficientes matemáticos; α es la constante híbrida de velocidad para la fase de distribución, β es la constante híbrida para la fase de eliminación terminal, y Ka es la constante de velocidad de absorción, constante de primer orden. 0.1 1.0 10.0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Time (hr) 1 2 3 4 93 Los parámetros farmacocinéticos obtenidos para cada animal y estimados en el primer día (D1) y tras la administración múltiple oral de 30 mg/kg p.v./ día se presentan en las Tabla 26 y Tabla 27, respectivamente. La oxitetraciclina presenta una absorción oral rápida como lo refleja la semivida de absorción t1/2a de 1,371 ± 0,116 h para el periodo completo de dosificación. Tras la administración múltiple oral de 30 mg oxitetraciclina/ kg p.v./ día se obtuvo una concentración máxima (Cmax) de 3,455 ± 0,143 μg/ml en un tiempo (Tmax) de 2,816 ± 0,118 h. Tras la administración múltiple oral, la oxitetraciclina se elimina rápidamente del organismo, siendo la semivida plasmática de eliminación (t1/2) 11,434 ± 0,438 h. Tabla 26. Parámetros farmacocinéticos plasmáticos de oxitetraciclina tras la primera administración oral de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v./día en cerdos Parámetros tras el primer día de administración Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Valor medio ± DS A (μg/ml) 10,429 7,561 8,249 10,354 9,148 ± 1,463 B (μg/ml) 1,537 1,757 1,979 1,888 1,790 ± 0,192 C (μg/ml) 11,966 9,318 10,228 12,242 10,939 ± 0,020 α (h -1 ) 0,300 0,267 0,275 0,309 0,288 ± 0,020 β (h -1 ) 0,059 0,058 0,066 0,063 0,062 ± 0,004 K01 (h -1 ) 0,569 0,590 0,614 0,596 0,592 ± 0,019 K10 (h -1 ) 0,158 0,134 0,147 0,155 0,149 ± 0,011 K12 (h -1 ) 0,089 0,075 0,070 0,092 0,082 ± 0,011 K21 (h -1 ) 0,112 0,116 0,125 0,125 0,120 ± 0,007 AUC (μg. h/ml) 39,773 42,559 43,038 43,074 42,111 ± 1,576 t1/2 a (h) 1,219 1,174 1,129 1,162 1,171 ± 0,037 t1/2 α (h) 2,310 2,597 2,518 2,240 2,416 ± 0,169 t1/2 β (h) 11,751 11,836 10,411 11,063 11,265 ± 0,666 V1 (L/kg) 4,759 5,238 4,750 4,496 4,811 ± 0,310 V2 (L/kg) 3,788 3,371 2,670 3,306 3,284 ± 0,461 Tmax (h) 2,691 2,828 2,716 2,632 2,717 ± 0,082 Cmax (μg/ml) 3,372 3,290 3,627 3,639 3,482 ± 0,178 94 Tabla 27. Parámetros farmacocinéticos plasmáticos de oxitetraciclina tras la administración múltiple oral de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v./día, durante 7 días consecutivos en cerdos Parámetros Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Valor medio ± DS 5-VALL 6-VALL 7-VALL 8-VALL A (μg/ml) 14,356 16,443 15,851 11,438 14,447 ± 2,374 B (μg/ml) 1,406 1,541 1,723 1,816 1,621 ± 0,183 C (μg/ml) 15,762 17,984 17,574 13,254 16,143 ± 2,155 α (h -1) 0,312 0,309 0,318 0,313 0,313 ± 0,004 β (h -1 ) 0,057 0,061 0,062 0,062 0,060 ± 0,002 K01 (h -1 ) 0,505 0,465 0,493 0,571 0,508 ± 0,045 K10 (h -1 ) 0,171 0,171 0,171 0,159 0,168 ± 0,006 K12 (h -1 ) 0,094 0,089 0,093 0,094 0,093 ± 0,002 K21 (h -1 ) 0,105 0,109 0,116 0,122 0,113 ± 0,007 AUC (μg .h/ml) 39,175 39,851 41,794 42,584 40,851 ± 1,602 t1/2a (h) 1,373 1,491 1,407 1,213 1,371 ± 0,116 t1/2α (h) 2,218 2,239 2,182 2,214 2,213 ± 0,023 t1/2 β (h) 12,051 11,436 11,087 11,162 11,434 ± 0,438 V1 (L/kg) 4,466 4,391 4,204 4,419 4,370 ± 0,115 V2 (L/kg) 3,993 3,583 3,365 3,399 3,585 ± 0,288 Tmax (h) 2,791 2,953 2,850 2,669 2,816 ± 0,118 Cmax (μg/ml) 3,348 3,322 3,537 3,614 3,455 ± 0,143 95 4.3. Índices PK / PD correlacionados con la eficacia del antibiótico Los datos farmacocinéticos (PK) son una herramienta útil usada para describir y predecir los perfiles de concentración de un fármaco en los fluidos biológicos (usualmente plasma) y combinarlos con datos farmacodinámicos (PD), en nuestro caso con datos de susceptibilidad bacteriana al antibiótico oxitetraciclina, ello constituye la modelización PK/PD en relación con la eficacia del antibiótico, además de minimizar el desarrollo de resistencias. Las tetraciclinas han sido clasificadas como concentración y tiempo dependiente, es decir, co-dependiente (la acción antimicrobiana depende de la duración de la exposición y de la concentración mantenida del fármaco) (TOUTAIN, 2003a). Se analizan tomando en consideración AUC>CMI y T>CMI. Si bien, el índice PK / PD más representativo para seleccionar y optimizar la dosis, es decir predecir la eficacia clínica, es el índice AUC 0-24 h / CMI >25, en animales inmunocompetentes (KAYS y DENYS, 2001). La Tabla 28 recoge los CMIs descritos en la literatura para microorganismos patógenos comunes en cerdos. La Tabla 29 muestra la integración PK/PD para oxitetraciclina en plasma de cerdos tras administración oral, vía pienso medicado, dosis única de 5 mg oxitetraciclina / kg p.v. La Tabla 30 muestra la integración PK/PD para oxitetraciclina en plasma de cerdos tras administración oral, vía pienso medicado, dosis múltiples de 30 mg oxitetraciclina / kg p.v./día, durante 7 días consecutivos. 96 Tabla 28. Agentes patógenos comunes en cerdos; CMI para la oxitetraciclina MICROORGANISMO ESPECIE ANIMAL OTC Referencia CMI50 μg/ml CMI90 μg/ml Streptococcus suis Porcino 0,06- 0,25 - PIJPERS et al. 1989 Clostridium perfringens Varias especies 0,1 - PRESCOTT y BAGGOT, 1991 Bordetella bronchiseptica Porcino 0,25-0,5 - PIJPERS et al. 1989 KADLEC et al. 2004 WALLMANN et al. 2004 Brucella spp Varias especies 0,06 - FARRELL et al., 1976 MATEU DE ANTONIO y MARTIN, 1995 BAYRAM et al., 2011 Haemophilus pleuropneumoniae Porcino 0,25-0,5 - PIJPERS et al. 1989 Haemophilus parasuis Porcino 0,5 - MARTÍN DE LA FUENTE et al. 2007 Pasteurella multocida Porcino 0,25-0,5 - PIJPERS et al. 1989 FALES at al., 1990 YOSHIMURA et al. 2001 WALLMANN et al. 2004 VERA-LIZARAZO et al., 2006 Campylobacter spp Varias especies 0,2-0,5 - PRESCOTT y BAGGOT, 1991 Mycoplasma hyopneumoniae Porcino 0,04- 0,25 - YAMAMOTO et al. 1986 HANNAN et al. 1989 LE CARROU et al., 2006 97 Tabla 29. Integración PK/PD a partir del estudio farmacocicnéticos de oxitetraciclina tras administración única oral de 5 mg oxitetraciclina/ kg p.v. en cerdos Parámetros cinéticos Cmax (g/ml) AUC (g h /ml) 0,593 6,819 Índices PK / PD AUC/ CMI Cmax/ CMI Tiempo ≥ CMI (0,183 ± 0,004 µg/ml, nivel plasmático observado a las 12 h) Tiempo ≥ CMI (0,067 ± 0,004 µg/ml, nivel plasmático observado a las 24 h ) a 114-27; b 68; c,e,g 27-14 ; d 114; f 14; h 34-14, i 170-27 a 10-2; b 6; c,e,g 2-1; d 10; f 1; h 3-1; i 15-2 50% del intervalo de dosis 100% del intervalo de dosis (tomando como intervalo de dosis cada 24 h) (a) Streptococcus suis; (b) Clostridium perfringens; (c) Bordetella bronchiseptica (d) Brucella mellitensis; (e) Haemophilus pleuropneumoniae; (f) Haemophilus parasuis (g) Pasteurella multocida; (h) Campylobacter spp; (i) Mycoplasma hyopneumoniae 98 Tabla 30. Integración PK/PD a partir del estudio farmacocicnéticos de oxitetraciclina tras administración múltiple oral de 30 mg oxitetraciclina/ kg p.v./día durante 7 días consecutivos en cerdos Parámetros cinéticos Cmax (g/ml) AUC (g h/ ml) 3,455 40,851 Índices PK / PD AUC/ CMI Cmax/ CMI Tiempo ≥ CMI (0,964 ± 0,047 µg/ml, nivel plasmático observado a las 12 h tras la primera dosis, y 0,980±0,119 µg/ml, nivel plasmático observado a las 12 h tras la última dosis) Tiempo ≥ CMI (0,430 ± 0,025 µg/ml, nivel plasmático observado a las 24 h tras la primera dosis, y 0,490 ± 0,079 µg/ml, nivel plasmático observado a las 24 h tras la última dosis) a,i 680 - 163; b 408; c,e,g,h 163 - 82; d 680; f 82 a,i 57-14; b 34; c,e,g,h 14-7; f 7; 50% del intervalo de dosis 100% del intervalo de dosis (tomando como intervalo de dosis cada 24 h) (a) Streptococcus suis; (b) Clostridium perfringens; (c) Bordetella bronchiseptica (d) Brucella mellitensis; (e) Haemophilus pleuropneumoniae; (f) Haemophilus parasuis (g) Pasteurella multocida; (h) Campylobacter spp; (i) Mycoplasma hyopneumoniae 99 DISCUSIÓN 100 5. DISCUSIÓN Las tetraciclinas suponen una importante herramienta antibiótica para el tratamiento frente a infecciones causadas por bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. El uso inadecuado de estos antibióticos puede llevar al desarrollo de resistencias bacterianas lo que podría provocar la retirada de estos antibióticos del arsenal de fármacos veterinarios. Por lo tanto, se deben considerar en la propia especie animal de destino las características farmacocinéticas de estos antibióticos combinadas con su ensayo de susceptibilidad microbiológica en la elección de los tratamientos terapéuticos para maximizar la eficacia del fármaco y minimizar el desarrollo de resistencias bacterianas. La oxitetraciclina, antibiótico objeto de nuestro estudio, compuesto bacteriostático con amplio espectro de actividad antibacteriana frente a microorganismos Gram-positivos y Gram-negativos, especies aeróbicas y anaeróbicas (NEU, 1978), es ampliamente utilizado para el tratamiento de enfermedades sistémicas bacterianas en medicina porcina, principalmente para enfermedades respiratorias e intestinales causadas por Pasteurella spp, Salmonella spp, y E. coli. En la literatura científica existe limitada información sobre la cinética plasmática de oxitetraciclina, la mayoría de los estudios fueron realizados determinando los niveles plasmáticos del antibiótico por ensayo microbiológico suministrando datos cinéticos muy diversos e incompletos, datos que son difíciles para sustentar un régimen de dosificación que señale una eficacia clínica y controle el desarrollo de la aparición de resistencias. El presente estudio establece la farmacocinética plasmática de oxitetraciclina en cerdos tras administración múltiple oral de 30 mg/kg durante 7 días consecutivos, a la vez que realiza un análisis PK/PD para poder predecir una potencial eficacia de la oxitetraciclina con el régimen de dosificación estudiado. Las tetraciclinas se absorben adecuadamente aunque incompletamente, del tracto gastrointestinal. El estómago e intestino son los principales lugares de absorción. Cuando las tetraciclinas se administran oralmente, la fracción de dosis absorbida es inversamente proporcional a la dosis administrada, y a la concentración de calcio y otros cationes divalentes que pueden estar contenidos en el tracto gastrointestinal, por ello nuestro estudio fue diseñado con la administración de oxitetraciclina en animales en ayuno. En el presente estudio se demuestra que la oxitetraciclina a dosis orales de 5 y 30 mg/kg, las curvas de niveles plasmáticos vs tiempo se ajustaron adecuadamente a un modelo bicompartimental para su análisis cinético, con una fase de absorción y distribución rápida seguida de una fase de eliminación más lenta, comportamiento también observado en cerdos por otros 101 investigadores (MERCER et al., 1978; MEVIUS et al., 1986; PIJPERS et al., 1990). En nuestra investigación, se demuestra en cerdos que la oxitetraciclina se absorbe y se distribuye rápidamente en el organismo corporal. La velocidad de absorción de oxitetraciclina tras su administración oral no fue dosis dependiente, tras dosis oral de 5 mg/kg la semivida de absorción (t1/2a) fue 1,227 ± 0,154 y tras dosis de 30 mg/kg fue 1,371 ± 0,116 horas, semividas menores que la descrita por PIJPERS et al., (1991a) donde cerdos con pleuroneumonía presentan una t1/2a de 3,03 horas, probablemente debido a un menor vaciado del contenido gástrico. Se conoce que durante estados febriles, las condiciones de la función gástrica pueden ser inhibidas por un descenso de la velocidad de vaciamiento gástrico y por el aumento del pH que hace además que las tetraciclinas precipiten y la velocidad y grado de absorción en el tracto intestinal disminuya (VAN MIERT, 1980). En nuestro estudio, tras dosis única oral de oxitetraciclina de 5 mg/kg, se obtiene una concentración plasmática máxima de 0,593 ± 0,009 μg/ml en un tiempo (Tmax) de 2,538 ± 0,140 horas; tras dosis múltiple oral de oxitetraciclina de 30 mg/kg, se obtiene una concentración plasmática máxima de 3,455 ± 0,143 μg/ml en un tiempo (Tmax) de 2,816 ± 0,118 horas, demostrando que el grado de absorción fue dosis-dependiente, pero no la velocidad de absorción. MEVIUS et al. (1986) observaron en cerdos una Cmax de 1,27 μg/ml en un Tmax de 3 horas tras dosis oral de oxitetraciclina de 20 mg/kg. HALL et al. (1989) establecen en cerdos tras administración intramuscular de 20 mg/kg de oxitetraciclina una Cmax de 6,7 ± 3,4 μg/ml en un tiempo (Tmax) de 1,5 horas. La oxitetraciclina fue rápidamente distribuida en el organismo presentando una semivida de distribución (t1/2α) de 1,942 ± 0,275 horas y de 2,213 ± 0,023 horas tras dosis oral de 5 mg/kg y tras dosis oral múltiple de 30 mg/kg, respectivamente. MERCER et al. (1978) observan una menor velocidad de distribución de la oxitetraciclina en cerdos jovenes de 8-10 semanas de edad, con una t1/2α de 6,71 ± 1,13 min. En cerdos, la oxitetraciclina presenta altos valores de volumen de distribución en el compartimento central (V1) 4,370 ± 0,115 L/kg, y en el compartimento secundario (V2) 3,585 ± 0,288 L/kg, resultado similar al observado por MERCER et al. (1978), MEVIUS et al. (1986) y KNIFFEN et al. (1989) lo que sugiere que se distribuye ampliamente a los tejidos. 102 La eliminación de oxitetraciclina en cerdos es equiparable a la de otras especies de animales domesticos (TESKE et al., 1973; ZIV y SULMAN, 1974). En nuestro estudio, la oxitetraciclina fue eliminada del organismo corporal lentamente, la semivida de eliminación (t1/2β) fue de 11,206 ± 1,770 h y de 11,434 ± 0,438 h tras dosis oral única de 5 mg/kg, y tras dosis múltiple oral de 30 mg/kg, respectivamente, más prolongada que la observada también en cerdos por MERCER et al. (1978) de 3,87± 0,62 h, probablemente debido a que estos investigadores utilizaron para el análisis de oxitetraciclina un método microbiológico. Otros investigadores también describen una lenta eliminación de la oxitetraciclina. MEVIUS et al. (1986) tras dosis oral de 20 mg/kg en cerdos observaron una semivida de eliminación en un rango de 11,6-17,2 horas. KNIFFEN et al. (1989) describen para la tetraciclina una semivida de eliminación en cerdos de 16 horas. Se conoce que la oxitetraciclina sufre circulación enterohepática (HUBER, 1977), lo que puede contribuir a altos valores del volumen de distribución y de semividas de eliminación encontrados. Nuestros resultados de forma satisfactoria demuestran que tras el régimen terapéutico de dosis oral de 30 mg/kg durante 7 días no se aprecian procesos de saturación en la eliminación del fármaco, ya que la semivida de eliminación (t1/2β) en el primer día tras la dosis presenta un valor de 11,265 ± 0,666 h, y tras 7 días de dosificación la (t1/2β) 11,434 ± 0,438 h. El régimen de dosificación elegido, dosis oral de 30 mg/kg/día durante 7 días proporciona valores de Cmax y de AUC óptimos para una eficacia clínica adecuada, además también proporciona concentraciones de oxitetraciclina superiores a 0,490 ± 0,079 μg/ml durante un periodo al menos de 24 horas, periodo de tiempo más largo que el observado por otros investigadores (XIA et al., 1983). Una concentración plasmática mínima de 0,5 μg/ml es recomendada como la CMI que debe ser alcanzada en sangre después de dosis terapéuticas para el caso de las tetraciclinas. Es deseable que la concentración plasmática de un antibiótico co-dependiente tenga un valor igual o mayor que la CMI del organismo infectante que causa la enfermedad. El perfil de la concentración plasmática de un antimicrobiano es más informativo que la propia dosis. La dosis solo es nominal, pero en cambio el perfil de la concentración plasmática vs tiempo es controlado por la dosis (la dosis la controla el veterinario) y por el animal (a través de su estado fisiológico). El conocimiento de la concentración plasmática nos permitirá determinar no solo la dosis sino también el intervalo de la dosis (TOUTAIN, 2003). De cualquier forma, en aquellos casos en que el organismo infectante este localizado intracelularmente, la concentración plasmática podría ser de menos utilidad para predecir de forma correlativa concentraciones en el lugar de infección. 103 El presente estudio demuestra la utilidad de la integración de los índices PK/PD para el desarrollo de regímenes de dosificación frente a patógenos específicos para el caso del antibiótico oxitetraciclina en cerdos. En general se admite que para predecir la eficacia de un fármaco la razón AUC(CMI, índice usado para quinolonas, la razón Cmax/CMI, índice usado para aminoglucósidos, y T CMI), demuestran que el régimen de dosificación estudiado, dosis oral de oxitetraciclina 30 mg/kg, 7 días, predice eficacia clínica frente a los patógenos Streptococcus suis;Clostridium perfringens, Brucella mellitensis, Mycoplasma hyopneumoniae, Bordetella bronchiseptica, y en menor grado frente a Haemophilus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Campylobacter spp. y Mycoplasma hyopneumoniae 104 CONCLUSIONES 105 6. CONCLUSIONES 1. El presente estudio establece la farmacocinética plasmática de oxitetraciclina en cerdos tras administración múltiple oral de 30 mg/kg durante 7 días consecutivos, a la vez que realiza un análisis PK/PD para poder predecir una potencial eficacia de la oxitetraciclina con el régimen de dosificación estudiado. 2. La curvas concentración plasmática-tiempo de oxitetraciclina encontradas experimentalmente en cerdos tras la administración de dosis única oral, 5 mg oxitetraciclina/ kg p.v., se ajustan adecuadamente a un modelo abierto bicompartimental para su análisis cinético, obteniéndose para la curva de niveles medios-tiempo la siguiente ecuación exponencial: Cp = 2,919  e -0,362 t + 0,310  e -0,063 t – 3,229  e –0,573 t 3. La curvas concentración plasmática-tiempo de oxitetraciclina encontradas experimentalmente en cerdos tras la administración dosis multiple oral, 30 mg oxitetraciclina/ kg p.v., se ajustan adecuadamente a un modelo abierto bicompartimental para su análisis cinético, obteniéndose para la curva de niveles medios-tiempo la siguiente ecuación exponencial: Cp = 14,447  e -0,313 t + 1,621  e -0,060 t – 16,143  e –0,508 t 4. En cerdos, la oxitetraciclina se absorbe de forma rápida tras administración de dosis única oral de 5 mg oxitetraciclina/kg p.v., con una semivida plasmática de absorción (t½a) de 1,227 ± 0,154 h; alcanzándose una concentración máxima plasmática (Cmax) de 0,593 ± 0,009 μg/ml en un tiempo (Tmax) de 2,538 ± 0,140 h. Tras su absorción, la oxitetraciclina se distribuye con una semivida plasmática de distribución (t½α) de 1,942 ± 0,275 h seguido de una eliminación lenta con una semivida plasmática de eliminación (t½β) de 11,206 ± 1,770 h. 106 5. En cerdos, la oxitetraciclina tras la administración múltiple oral de 30 mg oxitetraciclina/ kg p.v./ día, durante 7 días, no presenta acumulación y/o saturación en base a los parámetros de absorción AUC y también en base a la semivida plasmática de eliminación (t½β) en comparación con los valores de estos parámetros obtenidos tras la administración de dosis única. 6. Tras la administración múltiple oral de 30 mg oxitetraciclina/ kg p.v./día, 7 días, se obtuvo una semivida plasmática de absorción rápida (t½a) de 1,371 ± 0,116 h, una concentración plasmática máxima (Cmax) de 3,455 ± 0,143 μg/ml en un tiempo (Tmax) de 2,816 ± 0,118 h. Tras la administración múltiple oral de 30 mg oxitetraciclina/kg p.v./día, durante 7 días, la oxitetraciclina se elimina lentamente del organismo, siendo la semivida plasmática de eliminación (t½β) de 11,434 ± 0,438 h. 7. El presente estudio demuestra la utilidad de la integración de los índices PK/PD para el desarrollo de regímenes de dosificación frente a patógenos específicos para el caso del antibiótico oxitetraciclina en cerdos. Para el caso de las tetraciclinas, clasificadas como antibióticos co-dependientes, una concentración plasmática de 0,5 μg/ml es recomendada como la CMI que debe ser alcanzada en sangre tras dosis terapéuticas. Además, el índice PK/PD más recomendado es AUC/CMI ≥ 25 y T>CMI, es decir en el periodo de tiempo de todo el intervalo de dosis, las concentraciones plasmáticas del antibiotico deben ser ≥ CMI del patógeno infectante. 8. Tras la administración múltiple oral de 30 mg oxitetraciclina/ kg p.v./día, 7 días, se obtuvo un AUC de 40,851 ± 1,602 (μg. h/ml), y durante todo el intervalo de dosis (24 horas) la concentración plasmática fue > 0,490 ± 0,079 μg/ml. 9. En función de los resultados de nuestro estudio farmacocinético y teniendo en cuenta la integración PK/PD, se sugiere que, un régimen de dosificación oral de 30 mg oxitetraciclina/ kg p.v./día, durante 7 días, podría ser de valor terapéutico en cerdos frente a infecciones comunes, aconsejándose no utilizar nunca dosis menores para minimizar el desarrollo de resistencias antimicrobianas. 107 BIBLIOGRAFÍA 108 7. BIBLIOGRAFIA AARESTRUP, F.M. & JENSEN, N.E. (1999) Susceptibility testing of Actinobacillus pleuropneumoniae in Denmark. 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