UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA TESIS DOCTORAL Avances en la detección serológica de helmintosis olvidadas y emergentes. Aproximación genómica del ensamblaje de Gnathostoma spinigerum Advances in the serological diagnosis of neglected and emerging helminthosis. De-novo assembly of Gnathostoma spinigerum genome MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR Belén González Bertolín DIRECTORAS María Jesús Perteguer Ana Hernández González © Belén González Bertolín, 2024 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA Programa de Doctorado en Microbiología y Parasitología TESIS DOCTORAL Avances en la detección serológica de helmintosis olvidadas y emergentes. Aproximación genómica del ensamblaje de Gnathostoma spinigerum Advances in the serological diagnosis of neglected and emerging helminthosis. De-novo assembly of Gnathostoma spinigerum genome MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR Belén González Bertolín DIRECTORAS María Jesús Perteguer Ana Hernández González 2 Dña. María Jesús Perteguer Prieto, Doctora en Farmacia y Profesora del Departamento de Microbiología y Parasitología en la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid. Dña. Ana Hernández González, investigadora postdoctoral de la Unidad de Helmintos, Laboratorio de Referencia e Investigación en Parasitología, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III. CERTIFICAN: Que la presente memoria titulada “Avances en la detección serológica de helmintosis olvidadas y emergentes. Aproximación genómica del ensamblaje de Gnathostoma spinigerum/ Advances in the serological diagnosis of neglected and emerging helminthosis. De-novo assembly of Gnathostoma spinigerum genome” ha sido realizada bajo su dirección por Dña. Belén González Bertolín, y reúne las condiciones de originalidad y calidad requeridas para su presentación y defensa para optar al Grado de Doctor de la Universidad Complutense de Madrid. Y para que así conste a los efectos legales y oportunos, expiden y firman el presente certificado. María Jesús Perteguer Prieto Ana Hernández González 3 A mi madre, a mi hermana y a Sol. 4 AGRADECIMIENTOS Me gustaría agradecer a las dos personas que han hecho posible esta tesis, porque sin ellas no hubiera existido. Mis directoras, Chus y Ana o Ana y Chus, porque no creo que sea posible encontrar mejor tándem. Chus, gracias por estos cinco años de enseñanzas, por apostar por mí y por el proyecto. Por apoyarme en todas las decisiones que he tomado, y alentarme cuando lo he necesitado. Por enseñarme a hacer ciencia, a ver las cosas desde un punto crítico, por permitirme ser una científica buena. Por sacar tiempo para mí, tu dedicación, por enseñarme valores y a afrontar distintos tipos de situaciones. Por empeñarte en que hiciera una estancia en el Sudeste Asiático, que ha resultado ser una de las mejores experiencias de mi vida. Por todos los congresos, por todas las experiencias que hemos compartido. Por todos los buenos momentos e incluso los no tan buenos. Por guiarme, resolver mis problemas, por pasar más tiempo conmigo en reuniones que con tu propia familia. Así que gracias, porque parece que lo hemos conseguido y nos ha costado, pero es que las cosas bien hechas, requieren su dedicación. Gracias por ser un ejemplo, de científica y de persona. No todo el mundo tiene la suerte de tener una directora de tesis de tu altura. Ana, gracias por enseñarme desde el minuto uno con una amabilidad y paciencia insuperables. Por confiar en mí, por tu sinceridad y apoyo. Por ser mi mentora en el laboratorio, guiarme y saber cuándo dejarme volar sola. Por todas las horas dedicadas, por hacer del laboratorio un lugar donde querer estar, donde me he sentido como en casa. Por todas las comidas, por todas las risas, por escuchar mis problemas y buscar las mejores soluciones. Por tu humildad y generosidad. Así que gracias de corazón, porque estos años han pasado volando. Y como se suele decir, el tiempo pasa rápido cuando lo estás disfrutando. Y yo he tenido la fortuna de disfrutar esta tesis, y en gran parte, os lo debo a las dos; que me habéis acogido, cuidado y permitido crecer tanto desde el punto de visto profesional como personal. Me gustaría agradecer al laboratorio de Helmintos, Villa Helmintos, a todas y cada una de las personas con las que he coincidido en este viaje, los que están; a Javi, por estar disponible siempre que te he necesitado, por tus consejos, tu amabilidad, buen rollo y profesionalidad. A Esther, gracias por el apoyo en esta última etapa, por las risas y por los últimos experimentos que hemos tenido que afrontar. A Mónica, mi compa de 5 despacho, gracias por estar ahí, por los buenos momentos que hemos compartido, por transmitir calma y compartir las penas. A David Collar, Felisa, Patricia, Laura, Berta, Belén Mateo, Pamela, Juli, Lourdes, Jesús, Karen, Alejandro… A los vecinos de Malaria, Jose, JM, gracias por estar siempre dispuesto a resolver mis dudas, ayudarme con todos los problemas que han ido surgiendo a lo largo de estos años, desde pitidos de detectores hasta problemas con la qPCR. A Marta, que se ha convertido en parte de Villa Helmintos, por la cantidad de veces que ha estado ahí para resolver problemas y ayudar con todo lo que te hemos pedido. A Sandra, mi mentora, amiga y una de las personas más generosas que conozco. Gracias por inspirar a los que hemos tenido la suerte de trabajar a tu lado, no me cabe ninguna duda que vas a conseguir todo lo que te propongas. Me gustaría darle las gracias a todo el Área de Parasitología del ISCIII. A la reina del Chagas, María Flores, compañera de congresos, siempre pendiente y dispuesta a ayudarme con los problemas de extracciones, y cualquier inconveniente que ha surgido a lo largo de estos años. A Alejandro, que desde el minuto uno se ha querido leer y corregir la tesis, por tus ánimos, compañero de despacho. A Carol, por tu alegría. A Moncho, por tu espíritu científico que te hace estar presente en todas las aventuras que existen, gracias por convencernos para iniciar nuevos proyectos. A los vecinos de Leishmania; Ana, Carmen Sánchez, Javier, Eugenia, en especial a Lorena y Jose Carlos, gracias por vuestros consejos, disponibilidad y amabilidad. A David Carmena, Isabel Fuentes y Bego, gracias por vuestra simpatía y ayuda. A Ana Peña, por escuchar mis penas y convertirlas en alegrías. A Carmen Chicharro, Javier Nieto, Elena Dacal, Emi y Jose Saugar, gracias por ser los vecinos más lejanos, pero no por ello menos disponibles. A los vecinos de Entomología y Babesia, por vuestros consejos e ideas, Luismi, Estrella, Ramón, Maribel, Ricardo, Belén, Inés. A los nuevos vecinos, los del Centro Nacional de Medicina Tropical, Vicen, Pedro, Gema, Luz, Raquel Capote, Irene… gracias por todas las comidas y risas que hemos compartido. A la Unidad de Bioinformática del ISCIII, Isabel, Sara, Sarai, Guille, Erika, Alberto y Luis. Gracias por enseñarme bioinformática, permitirme integrarme con vosotros y apoyarme en los meses hemos compartido. A Cristina García Amil por todas las veces que me ha ayudado con la preparación de las librerías, todos los consejos y siempre con una sonrisa. A la Unidad de Genómica, en especial a Pilar y Ángel, gracias por los consejos y vuestra disponibilidad. 6 A los investigadores y compañeros de la Universidad de Mahidol en Bangkok, Profesor Poom, Profesor Paron, P’Pou, Maprang, Rina, Anna, Paopao, Game, June, Sally, Zai, Yok, Mayka. Por ser parte de mi aventura tailandesa, por enseñarme una nueva forma de vivir y de trabajar. Por integrarme en vuestra cultura y hacerme sentir como en casa a miles de kilómetros de la mía. Gracias por formar parte de una de las mejores experiencias de mi vida. Al Departamento de Parasitología de la UCM, Carmen Cuéllar, por todos los consejos a lo largo de estos años de tesis. A Manu y Cris Fonseca. A la Fundación Rafael Folch, por la beca que me ha permitido completar mi experiencia doctoral. A mis compañeros de facultad, con los que empezó el gusanillo por la ciencia y que hoy en día siguen formando parte de mi vida; Marta, siempre dispuesta a ayudarme y escucharme, por seguirme en todas las aventuras que hemos compartido. Andrea, gracias por todo tu cariño, porque nos funcionan los riñones. David, por todos los consejos de la tesis y tu generosidad. Nacho, Irene, Miguel, Coral. Y las últimas incorporaciones, Jorge y Bea. A mi familia, el pilar de mi vida. Gracias, hermana, por todas las horas que has estado apoyándome tanto científica como emocionalmente, eres impresionante. Gracias por ser una persona ejemplar en todos los sentidos. Gracias por llenar mi vida de alegría. A mi madre, porque esta tesis te la dedico a ti, no sólo por estos años que ha durado, sino por el apoyo incondicional que has sido a lo largo de mi vida. Porque no creo que en el mundo haya una economista que sepa más de Gnathostoma spinigerum que tú, porque el grado de implicación que le pones a todo lo que haces en la vida y el cariño con el que lo haces, no creo que haya manera de compensártelo. A mi padre, que siempre me ha exigido tanto como se ha exigido a sí mismo, gracias por creer en mí. A Ander gracias por tu disposición, confianza y por hacer tu magia. Y a Guille, el doblemente doctor, gracias por tu implicación. Me voy a tomar la licencia de pasar al lado más emocional para dedicarle la tesis a Sol, has sido un ejemplo de superación, por la manera que has llevado tu enfermedad, gracias por permitirme relativizar y enseñarme qué es lo realmente importante en esta vida, estoy segura de que allá donde estés seguirás con tu sonrisa. A Eugenio y a Ana Mari, por vuestra implicación y generosidad. A Caty, que siempre ha estado pendiente de mis publicaciones, implicándose en mi formación y estando para todo lo que he necesitado. A mi amiga Elia, que lleva toda la vida a mi lado y no ha parado ni un momento de enseñarme y demostrarme en qué consiste una amistad con mayúsculas. 7 A las chicas de Colonia, Estefi, Lucia y Paula, siempre dispuestas a sacarme una sonrisa. A Laus, por estar a mi lado desde los tres años y seguir maravillándome cada día, por todos los momentos que nos hemos dedicado a arreglar el mundo. A Sonia y a Dayana, las personas más intrépidas que conozco, gracias por todos los años de risas y alegrías. Por último, me gustaría dedicar la tesis a todas esas personas que padecen o han padecido alguna de las helmintosis objeto de estudio de la tesis. Tengo la esperanza de que nuestro proyecto contribuya a eliminar, o al menos a reducir la prevalencia de muchas de ellas, para que en un futuro estas parasitosis únicamente se estudien en los libros de historia. Gracias, de corazón, a todas y cada una de las personas que habéis estado a mi lado estos años, un pedacito de esta tesis os pertenece. Espero que os guste. El presente trabajo de investigación ha sido financiado por los proyectos PI17CIII/00019 y RD16CIII/0003/0004 concedidos por la Agencia de Investigación y Salud (AES/ISCIII). Belén González Bertolín ha disfrutado de una ayuda predoctoral de la Fundación “Rafael Folch”. ABREVIATURAS Ac Angiostrongylus cantonensis ADN ácido desoxirribonucleico AE equinococosis alveolar, Alveolar Echinococcosis AT adenina/timina ARN ácido ribonucleico AUC área bajo la curva, Area under the ROC Curve BAM Binary Alignment Map BCA ácido bicinconínico B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent BSA Albúmina Sérica Bovina, Bovine Serum Albumin CDC Centre for Disease Prevention and Control, USA CE equinococosis quística/ hidatidosis, Cystic Echinococcosis CHIP-seq Inmunoprecipitación de la Cromatina acoplada a secuenciación CYP ciclofilina DALY Disability Adjusted Life Years DBS Dry Blood Spots EC equinococosis quística o hidatidosis ECDC European Centre for Disease Prevention and Control EDTA ácido etilendiaminotetraacético ELISA ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima, enzyme-linked immunoassay EPIDAT programa de análisis epidemiológico de datos GC guanina/ citosina GP glicoproteína HiC high-throughput chromosome conformation capture HID hidatidosis 9 HPC clúster de computación de alto rendimiento HRP peroxidasa de rábano, horseradish peroxidase IC intervalo de confianza ICT test rápido inmunocromatográfico, rapid immunochromatography test Ig inmunoglobulina IL-5 interleucina 5 IMAC Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography INE Instituto Nacional de Estadística IPTG isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido ISCIII Instituto de Salud Carlos III Gal galectina GB gigabyte Gs Gnathostoma spinigerum GST glutatión-S-Transferasa kb kilobase kDa kilodalton LAMP Loop-mediated isothermal amplification LB tampón Laemmli Buffer LLGP-EITB Lentil-lectin glycoprotein enzyme-linked immunoelectrotransfer blot test L3 estadio larvario 3 L3A estadio larvario 3 avanzado Mb megabase (1 millón de bases) MBA Multiplex Bead Assay MFI mediana de intensidad de fluorescencia, median fluorescence intensity MMP metaloproteinasa de la matriz, matrix metalloproteinasa 10 NCC neurocisticercosis NGS Next Generation Sequencing NIH National Institutes of Health NTDs Neglected Tropical Diseases OMS Organización Mundial de la Salud ONT Oxford Nanopore Technologies pb pares de bases PBS tampón fosfato salino, Phosphate Buffered Saline PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa, Polymerase Chain Reaction qPCR quantitative Polymerase Chain Reaction RMN Resonancia Magnética Nuclear ROC Receiver Operating Characteristic SAM Sequence Alignment Map SAPE estreptavidina conjugada con R-ficoeritrina, Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugat SE error estándar, Standard Error SI índice serológico, Serological Index SDS dodecilsulfato sódico SNC Sistema Nervioso Central TC Tomografía Computarizada VIH Virus de la Inmunodeficiencia Humana WB Western Blot WHO-IWGE World Health Organization, Informal Working Groups on Echinococcosis 11 ÍNDICE Abreviaturas ................................................................................................................. 8 Índice .......................................................................................................................... 11 I. RESUMEN / SUMMARY.................................................................................. 16 II. INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 20 1. Generalidades de las helmintosis ...................................................................... 20 2. Helmintosis objeto de estudio ............................................................................. 20 2.1. Neurocisticercosis ......................................................................................... 22 2.1.1. Ciclo biológico ....................................................................................... 22 2.1.2. Manifestaciones clínicas y patogénesis ................................................... 23 2.1.3. Epidemiología ........................................................................................ 24 2.1.4. Diagnóstico ............................................................................................ 25 2.2. Hidatidosis .................................................................................................... 26 2.2.1. Ciclo biológico ....................................................................................... 27 2.2.2. Manifestaciones clínicas y patogénesis ................................................... 28 2.2.3. Epidemiología ........................................................................................ 29 2.2.4. Diagnóstico ............................................................................................ 30 2.3. Loasis ........................................................................................................... 31 2.3.1. Ciclo biológico ....................................................................................... 31 2.3.2. Manifestaciones clínicas y patogénesis ................................................... 32 2.3.3. Epidemiología ........................................................................................ 33 2.4.4. Diagnóstico ............................................................................................ 34 2.4. Angiostrongilosis .......................................................................................... 35 2.4.1. Ciclo biológico ....................................................................................... 36 2.4.2. Manifestaciones clínicas y patogénesis ................................................... 37 2.4.3. Epidemiología ........................................................................................ 38 2.4.4. Diagnóstico ............................................................................................ 38 2.5. Gnathostomosis ............................................................................................. 39 2.5.1. Ciclo biológico ....................................................................................... 40 2.5.2. Manifestaciones clínicas y patogénesis ................................................... 41 2.5.3. Epidemiología ........................................................................................ 42 2.5.4. Diagnóstico ............................................................................................ 43 3. Técnicas de multiplexado basadas en MBA ......................................................... 44 4. Tecnologías de secuenciación .............................................................................. 45 4.1. Secuenciación de segunda generación ........................................................... 46 4.2. Secuenciación de tercera generación ............................................................. 47 12 5. Genomas publicados en helmintos ....................................................................... 48 III. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ............................................................................. 50 IV. CAPÍTULO 1. Investigación histórica de las helmintosis objeto de estudio .... 52 1.1. Teniasis/cisticercosis ........................................................................................ 52 1.2. Hidatidosis........................................................................................................ 54 1.3. Loasis ............................................................................................................... 55 1.4. Gnathostomosis ................................................................................................ 56 1.5. Angiostrongilosis .............................................................................................. 58 V.CAPÍTULO 2. Optimización y validación de herramientas serológicas de multiplexado basadas en el antígeno recombinante T24H para la identificación de regiones de alta endemicidad de cisticercosis........................................................... 60 2.1. Diagnóstico serológico combinado de cisticercosis/hidatidosis. Comparación MBA frente a ensayos comerciales .......................................................................... 60 2.1.1. Introducción ............................................................................................... 60 2.1.2 Material y métodos ...................................................................................... 61 Obtención de antígeno recombinante T24H ...................................................... 61 Expresión proteica ........................................................................................ 61 Purificación del antígeno recombinante ......................................................... 62 Obtención de antígeno recombinante 2B2t........................................................ 63 Expresión proteica ........................................................................................ 63 Purificación del antígeno recombinante ......................................................... 63 Colecciones de sueros humanos ........................................................................ 64 Tecnología MBA .............................................................................................. 65 Test ELISA comerciales ................................................................................... 67 Controles de las técnicas................................................................................... 67 Análisis estadístico ........................................................................................... 67 2.1.3. Resultados .................................................................................................. 68 Antígenos recombinantes (T24H y 2B2t) .......................................................... 68 Tecnología MBA .............................................................................................. 69 Test comerciales ELISA ................................................................................... 70 Análisis comparativo entre las técnicas MBA y ELISA .................................... 76 2.1.4. Discusión ................................................................................................... 77 2.2. Evaluación serológica de la endemicidad de cisticercosis en Mozambique mediante XMAP-T24H ......................................................................................... 81 2.2.1. Introducción ............................................................................................... 81 2.2.2. Material y métodos ..................................................................................... 84 Colecciones de muestras biológicas humanas ................................................... 84 13 Muestras sanguíneas ..................................................................................... 84 Evaluación microscópica .................................................................................. 85 Elución de las muestras sanguíneas .................................................................. 85 Western blot ..................................................................................................... 85 Muestras de ADN ............................................................................................. 86 Técnicas de amplificación genómica ................................................................ 86 Tecnología MBA .............................................................................................. 87 Análisis estadístico ........................................................................................... 87 2.2.3. Resultados .................................................................................................. 88 2.2.4. Discusión ................................................................................................... 92 VI. CAPÍTULO 3. Evaluación de la utilidad de marcadores serológicos de loasis en zonas endémicas ................................................................................................ 97 3.1. Introducción .................................................................................................. 97 3.2. Material y métodos ........................................................................................ 99 Antígenos recombinantes de Loa loa ................................................................ 99 Obtención del antígeno recombinante Ll-15r3 ................................................ 100 Expresión proteica ...................................................................................... 100 Purificación del antígeno recombinante ....................................................... 100 Proteínas recombinantes Ll-SXP1, Ll-14221 y Ll-16297............................. 101 Colecciones de muestras biológicas humanas ................................................. 101 Microscopía y PCR cuantitativa ..................................................................... 102 Western blot ................................................................................................... 102 Test comercial ICT LSXP1............................................................................. 104 3.3. Resultados ................................................................................................... 104 Selección de muestras microafilarémicas ........................................................ 104 Antígeno recombinante Ll-15r3 ...................................................................... 105 Antígeno recombinante Ll-SXP1 .................................................................... 106 Antígeno recombinante Ll-14221 ................................................................... 107 Antígeno recombinante Ll-16297 ................................................................... 107 Estandarización de las condiciones ................................................................. 108 Comparación métodos de diagnóstico serológico de loasis ............................. 109 3.4. Discusión .................................................................................................... 110 VII. CAPÍTULO 4. Angiostrongylus cantonensis y Gnathostoma spinigerum: aportaciones preliminares en el campo serológico ............................................. 114 4.1 Evaluación de candidatos para el diagnóstico serológico de angiostrongilosis .. 114 4.1.1 Introducción .............................................................................................. 114 14 4.1.2. Material y métodos ................................................................................... 116 Antígeno recombinante GST-Gal2.................................................................. 116 Colecciones de sueros..................................................................................... 116 Western blot ................................................................................................... 118 Análisis estadístico ......................................................................................... 118 4.1.3 Resultados ................................................................................................. 118 4.1.4 Discusión .................................................................................................. 121 4.2 Evaluación de candidatos para el diagnóstico serológico de gnathostomosis .... 123 4.2.1 Introducción .............................................................................................. 123 4.2.2 Material y métodos .................................................................................... 124 Obtención de antígeno recombinante GST-MMP............................................ 124 Subclonación en vectores de expresión procariota ....................................... 124 Expresión proteica ...................................................................................... 125 Purificación del antígeno recombinante GST-MMP .................................... 126 Antígeno recombinante CYP .......................................................................... 127 Colecciones de sueros..................................................................................... 127 Western blot ................................................................................................... 127 4.2.3 Resultados ................................................................................................. 128 Antígeno recombinante MMP......................................................................... 128 Antígeno recombinante CYP .......................................................................... 130 4.2.4 Discusión .................................................................................................. 131 VIII. CAPÍTULO 5. Secuenciación y ensamblaje de novo del genoma de L3 de Gnathostoma spinigerum ......................................................................................... 134 5.1. Introducción ................................................................................................ 134 5.2. Material y métodos ...................................................................................... 136 5.2.1. Obtención del material parasitario y extracción del ADN ...................... 137 5.2.2. Preparación de librerías de secuenciación ............................................. 138 5.2.3. Secuenciación ....................................................................................... 138 5.2.4. Análisis bioinformático ......................................................................... 139 Análisis bioinformático de lecturas cortas ................................................... 140 Análisis bioinformático de lecturas largas ................................................... 142 Análisis bioinformático híbrido ................................................................... 144 Evaluación de los borradores de ensamblaje ................................................ 146 Análisis complementarios ........................................................................... 147 5.3. Resultados ................................................................................................... 148 5.3.1. Caracterización de las larvas de G.spinigerum ...................................... 148 15 Caracterización morfológica ....................................................................... 148 Caracterización molecular ........................................................................... 149 5.3.2. Extracción de ADN y evaluación de las librerías ................................... 150 5.3.3. Análisis bioinformático ......................................................................... 152 Secuenciación y preprocesamiento .............................................................. 152 Evaluación de los ensamblajes .................................................................... 157 Aproximación de lecturas cortas ................................................................. 157 5.4. Discusión .................................................................................................... 173 IX. CONCLUSIONES / CONCLUSIONS ............................................................. 178 X. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................ 181 XI.Glosario .............................................................................................................. 221 XII.ANEXO ............................................................................................................. 222 Resumen 16 I. RESUMEN / SUMMARY La presente memoria versa sobre el desarrollo de herramientas serológicas para cinco grupos de enfermedades producidas por helmintos, con características clínicas y epidemiológicas muy diferentes, pero con una peculiaridad común: carencia de métodos diagnósticos óptimos para implementar medidas de control y/o eliminación. La neurocisticercosis y la hidatidosis, enfermedades con una elevada morbilidad, son dos de las entidades que conforman las denominadas enfermedades tropicales desatendidas y cuyo control está contemplado en los objetivos de desarrollo sostenible. En ambos casos la disponibilidad de vacunas frente los hospedadores intermediarios facilitan que su control pueda ser una realidad. A pesar de que existen proteínas recombinantes con probada capacidad diagnóstica, no se han desarrollado técnicas serológicas aplicables a sistemas de alto rendimiento que permitan identificar las áreas de elevada endemicidad. En el caso de la loasis, helmintosis restringida geográficamente a regiones forestales del centro y oeste de África, su importancia no radica en su sintomatología, que suele ser leve, sino en las reacciones adversas graves que se desencadenan en individuos con una alta microfilaremia, cuando son tratados con ivermectina. Este constituye uno de los mayores impedimentos para alcanzar el objetivo de eliminación de la oncocercosis. Casos diferentes son la gnathostomosis y la angiostrongilosis, enfermedades importadas en España con potencial capacidad emergente. Solamente las especies Gnathostoma spinigerum y Angiostrongylus cantonensis ocasionan meningitis eosinofílicas. Ambos parásitos, originarios y endémicos del Sudeste Asiático, están en proceso de expansión geográfica, más marcado para el último de ellos. En España, la mayor parte de los casos son importados, y muy probablemente infradiagnosticados, debido a la falta de técnicas diagnósticas validadas en nuestro país. A esto se suma la posibilidad de que existan casos autóctonos, ya que la especie A. cantonensis ha sido identificada en diferentes hospedadores en nuestro país. Existe un vacío de conocimiento respecto a la especie G. spinigerum, de la cual no existe publicado su genoma de referencia; hecho que dificulta la búsqueda, optimización y validación de candidatos antigénicos para el diagnóstico. Los objetivos de la Tesis Doctoral han sido enfocados al desarrollo de técnicas serológicas para estas helmintosis asociadas a las necesidades demandadas en los actuales Resumen 17 programas de control; como métodos de multiplexado que permitan cribados epidemiológicos conjuntos e identificación de áreas de potencial endemicidad, especialmente de neurocisticercosis. El fin último ha sido aportar conocimiento aplicado desde el punto de vista del diagnóstico serológico de estas parasitosis, y conocimiento básico en aquellas que no han sido tan estudiadas, como es el caso de G. spinigerum. La consecución de estos objetivos ha implicado el empleo de metodologías de trabajo con antígenos recombinantes, técnicas moleculares, el desarrollo y puesta a punto de herramientas clásicas e innovadoras de diagnóstico serológico, así como métodos de extracción e identificación genómica. Además, se han realizado estudios en áreas endémicas para la validación de las técnicas diagnósticas. También se han utilizado diferentes tecnologías de secuenciación y herramientas bioinformáticas, lo que ha supuesto el empleo de una metodología muy diversa. La tecnología de multiplexado empleada para el diagnóstico de neurocisticercosis e hidatidosis ha permitido evaluar de manera combinada ambas parasitosis, proporcionando una herramienta útil para el cribado epidemiológico en áreas susceptibles. Se han validado diferentes marcadores para el análisis de seroprevalencia de la loasis en el marco del sistema “LoaScope” en zona endémica, descartando aquellos que no mostraban una reactividad suficiente; esto podría suponer una herramienta clave para aplicar previa a los programas de administración masiva de fármacos frente a la oncocercosis y filariasis linfáticas. La evaluación realizada con los candidatos para el serodiagnóstico de meningitis eosinofílicas ha permitido seleccionar un antígeno recombinante con potenciales propiedades diagnósticas, abriendo la posibilidad al desarrollo de un futuro diagnóstico serológico en España. Se ha realizado la primera aproximación para la obtención del ensamblaje de novo del genoma de G. spinigerum, empleando una tecnología de secuenciación híbrida basada en lecturas cortas y largas, lo cual supone el punto de partida para la obtención de un genoma de referencia de calidad. La Tesis Doctoral ha cumplido los objetivos marcados y supone un avance en el campo de las técnicas diagnósticas de helmintos, principalmente a nivel serológico. Si bien es cierto que los estudios realizados no están exentos de limitaciones, el trabajo realizado aporta herramientas y permite iniciar nuevas vías de investigación de las helmintosis desatendidas e importadas estudiadas. Summary 18 SUMMARY The present thesis deals with the development of serological tools for five helminth diseases with very different clinical and epidemiological characteristics. However, all these diseases have a common peculiarity: the lack of optimal diagnostic methods to implement control and/or elimination measures. Neurocysticercosis and echinococcosis, both diseases cause high morbidity, are included in the Neglected Tropical Diseases group, and their control is detailed in the Sustainable Development Goals. Control of both diseases could be achieved with the available vaccines. Serological techniques applicable to high-throughput systems have not been developed to identify areas of high endemicity, in spite of the availability of recombinant proteins with proven diagnostic capacity. Loiasis affects people in forest regions of Central and West Africa, despite its usually mild symptomatology, its importance resides on the severe adverse reactions that are triggered in individuals with a high Loa loa microfilaremia following administration of ivermectin. Gnathostomosis and angiostrongylosis are potentially emerging diseases in Spain. Gnathostoma spinigerum and Angiostrongylus cantonensis are the only species that cause eosinophilic meningitis. The geographical expansion of both parasites, which are endemic to Southeast Asia, is more significant in Angiostrongylus cantonensis. Most of cases are imported into Spain, and it is very likely that they are under-diagnosed, due to the lack of validated diagnostic techniques in our country. In addition, autochthonous cases could be possible since A. cantonensis has been identified in different hosts in Spain. There is a knowledge gap about Gnathostoma spinigerum, whose reference genome has not been published yet -this makes difficult to find, optimize and validate antigenic candidates for diagnosis. The objectives of the present thesis are focused on the development of serological techniques for these helminth infections. These techniques are demanded in current control programs, such as multiplex assays. They allow epidemiological screening and identification of hot spots, especially in neurocysticercosis. The main aim has been to provide knowledge from the point of view of serological diagnosis of these parasitoses. As well as to increase basic knowledge of those that have not been studied so exhaustively, such as G. spinigerum. The achievement of these objectives has involved the use of methodologies with recombinant antigens, molecular techniques, development Summary 19 and set-up of classical and innovative tools for serological diagnosis, as well as genomic extraction and identification methods. Furthermore, studies have been carried out in endemic areas for the validation of diagnostic techniques. A diverse methodology has been involved including different sequencing technologies and bioinformatics tools. The multiplex bead-based platform, used for the diagnosis of neurocysticercosis and hydatidosis, has allowed the combined assessment of both parasitoses, providing a useful tool for epidemiological screening in susceptible areas. Different recombinant antigens have been validated for the serological diagnosis of loiasis in endemic areas. Those candidates that were not sufficiently immunoreactive have been discarded. They could be a key tool to be applied prior to mass drug administration campaigns targeted toward elimination of onchocerciasis and lymphatic filariasis. The evaluation of candidates for serodiagnosis of eosinophilic meningitis has allowed the selection of those recombinant antigens with the best diagnostic properties, opening the possibility of serological diagnosis in Spain. The first draft of de novo assembly of G. spinigerum genome has been carried out, using a hybrid sequencing technology based on short and long reads. This starts the process to achieve a quality reference genome. The thesis has fulfilled these objectives and represents an advance in the field of helminth diagnostic techniques, mainly in the serological field. Although the studies conducted present limitations, the work has contributed by providing tools and future explorations in neglected and imported helminth diseases. Introducción 20 II. INTRODUCCIÓN 1. Generalidades de las helmintosis El término helminto deriva del griego helmins (“gusano parásito”) y originariamente hacía referencia al aspecto de verme (gusano) característico de las fases adultas de estos parásitos. Dentro de este grupo de organismos existen dos filos principales con interés médico: Platyhelminthes y Nematoda. A su vez, los platelmintos se subdividen en dos clases: Cestoda (cestodos) y Digenea (trematodos) (McVeigh, 2020). Tradicionalmente, la clasificación y diagnóstico de los helmintos se ha basado en su morfología, movilidad y características de sus ciclos biológicos. Los métodos diagnósticos varían en función del parásito. En las helmintosis intestinales, la observación macroscópica y/o microscópica del parásito eliminado por heces suele ser habitual y necesaria; sin embargo, en las helmintosis de órganos profundos, aunque en ocasiones se puede realizar el examen microscópico de una muestra del tejido afectado, suelen presentar una mayor complejidad. Debido a esto, las técnicas indirectas, principalmente de imagen y serológicas cobran una mayor importancia y son necesarias para el correcto diagnóstico de estas enfermedades (Prats, 2012). Las enfermedades ocasionadas por helmintos se pueden clasificar por sus características epidemiológicas en: desatendidas, importadas, autóctonas y emergentes/ reemergentes, cada una de ellas con distintos requerimientos diagnósticos. Las helmintosis desatendidas están ligadas a pobreza y se localizan en regiones poco desarrolladas del planeta, principalmente en zonas tropicales y subtropicales, donde suponen un grave problema de salud pública para los países que las padecen (World Health Organization, 2010). En estos casos existe la necesidad de desarrollar sistemas diagnósticos precisos y sensibles aplicables en zonas de bajos recursos. Son precisas herramientas diagnósticas que permitan el cribado masivo de grandes regiones endémicas Introducción 21 en estas parasitosis tanto para el control, la vigilancia y la eliminación de estas enfermedades (World Health Organization, 2010). Las helmintosis importadas son aquellas que no existen a nivel endémico en España, pero afectan a sus habitantes, ya sea debido a viajes a regiones afectadas o fenómenos migratorios (Vilajeliu Balagué et al., 2014). Este grupo de enfermedades pueden ser complejas de diagnosticar y los sistemas diagnósticos podrían presentan un mayor grado de desarrollo y sofisticación que en el caso de las enfermedades desatendidas. Los recursos sanitarios empleados pueden ser superiores ya que se realizan, fundamentalmente, en centros de referencia, al no formar parte de la rutina diagnóstica. Las helmintosis autóctonas son aquellas que presentan un mayor grado de desarrollo en el diagnóstico y comprensión de la patología. En este grupo es necesario continuar con una vigilancia epidemiológica, que permita conocer la situación real de la enfermedad, y tomar las medidas preventivas y de salud pública pertinentes. Finalmente, las enfermedades infecciosas emergentes/reemergentes son aquellas ocasionadas por un agente infeccioso recientemente identificado y anteriormente desconocido, capaz de causar problemas en salud pública a nivel local, regional o mundial. O aquellas que ya existían, pero han aumentado rápidamente su incidencia (Morse, 1995). En el caso de las helmintosis, el enfoque diagnóstico dependerá de las condiciones de la emergencia y del patógeno implicado. 2. Helmintosis objeto de estudio De las veinte entidades descritas como Enfermedades Tropicales Desatendidas, del inglés Neglected Tropical Diseases (NTDs) por la Organización Mundial de la Salud (OMS), once se corresponden con enfermedades de origen parasitario, siendo ocho de ellas enfermedades producidas por helmintos: dracunculiasis, equinococosis, trematodosis transmitidas por alimentos, filariasis linfáticas, oncocercosis, esquistosomosis, geo-helmintosis y teniosis /cisticercosis. La hoja de ruta de la OMS para 2021-2030 establece objetivos ambiciosos para abordar el control y eliminación de muchas de estas enfermedades de forma integrada, siendo la quimioterapia preventiva, una de las herramientas principales (World Health Organization, 2020a). La presente Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio de dos de estas helmintosis desatendidas: teniosis/cisticercosis e hidatidosis. Además, también hemos incluido la loasis por su Introducción 22 importancia a la hora de tomar decisiones en cuanto a la aplicación de tratamiento a la población frente a oncocercosis. Con respecto a las helmintosis importadas y emergentes, se ha estudiado la gnathostomosis y la angiostrongilosis, ya que en nuestro país, actualmente, existen casos importados de gnathostomosis y además existe riesgo de emergencia de casos de angiostrongilosis (Delgado-Serra et al., 2022; Herman & Chiodini, 2009; Martin-Alonso et al., 2015). Las principales características de estas enfermedades parasitarias seleccionadas son: 2.1. Neurocisticercosis La neurocisticercosis (NCC) se produce en el humano por la ingestión accidental de los huevos del cestodo Taenia solium Linnaeus, 1758. Es la enfermedad parasitaria más común del sistema nervioso central a nivel global (Bazan et al., 2016). Taenia solium pertenece a la clase Cestoda, orden Cyclophyllidea, familia Taeniidae (Schoch et al., 2020). El cisticerco, o fase larvaria de T. solium, también recibe el nombre de Cysticercus cellulosae. 2.1.1. Ciclo biológico A diferencia de la teniasis, donde el ser humano participa como hospedador definitivo, en la cisticercosis el ser humano actúa como hospedador intermediario al ingerir accidentalmente huevos de origen exógeno, o bien si un individuo infectado regurgita los huevos a los tramos superiores del intestino delgado o al estómago. Los huevos eclosionan en el tubo digestivo liberando las oncosferas. Estas atraviesan la pared intestinal y alcanzan por vía hemática diversos tejidos, donde dan lugar a cisticercos similares a los que se encuentran en el hospedador intermediario habitual (el cerdo). Según la localización de los cisticercos, distinguimos, cisticercosis subcutánea, cisticercosis ocular y neurocisticercosis (NCC), en la presente tesis nos centraremos en esta última por ser la más grave. En la NCC, la localización de los cisticercos es cerebral, llegando a alcanzar un tamaño aproximado de 5-8 mm o incluso mayor. Taenia solium es la única especie de tenia que produce neurocisticercosis en humanos (H. H. Garcia et al., 2020; Prats, 2012). Aunque algunos autores sugieren que Taenia asiatica también pudiera tener ese potencial (Galán-Puchades & Fuentes, 2013). Introducción 23 Figura 2.1.1. Ciclo biológico esquematizado de la especie Taenia solium causante de neurocisticercosis. Ilustración creada con Biorender ®. 2.1.2. Manifestaciones clínicas y patogénesis La enfermedad se presenta habitualmente en forma de convulsiones tónico-clónicas generalizadas o epilepsia parcial (Carabin et al., 2011; Del Brutto & Garcia, 2013). Es una de las parasitosis con afectación del sistema nervioso central más frecuentes, así como una de las causas prevenibles de epilepsia a nivel mundial (Raibagkar & Berkowitz, 2018). En las regiones endémicas, es la causa de uno de cada tres casos de epilepsia (Brizzi et al., 2016; H. H. Garcia et al., 2020; Melki et al., 2018; Rajshekhar, 2018; Singhi et al., 2018). Las manifestaciones clínicas y patogenia difieren según la localización de los cisticercos en el SNC (intra o extraparenquimales), el número de quistes (único o múltiples) y la viabilidad de los cisticercos (viables, degenerados o calcificados). Las formas de NCC con presencia de quistes intraparenquimales son las que presentan, con mayor frecuencia, crisis epilépticas; mientras que la presencia de quistes extraparenquimales (principalmente subaracnoideos o intraventriculares), se ha asociado a una mayor morbilidad y mortalidad (H. H. Garcia et al., 2020). En contraposición, también se ha descrito la presencia de cisticercos a nivel de tejido cerebral completamente asintomáticos, ya sea por hallazgos incidentales o Introducción 24 en autopsias (de Almeida & Torres, 2011; Teerasukjinda et al., 2016). La combinación de todos estos factores, así como la respuesta inmune del hospedador condicionan las manifestaciones clínicas, que son poco específicas, y pueden variar desde parestesias, anestesia localizada, afasia, hidrocefalia, vasculitis, amnesia, siendo la más común, la ya citada, epilepsia (Del Brutto & Garcia, 2013). Los cisticercos viables han mostrado múltiples mecanismos de evasión de la respuesta inmune, entre ellos, cabe destacar la secreción de moléculas capaces de bloquear al sistema de complemento, modificar la respuesta celular, aumentar las células T reguladoras, neutralizar el efecto de inmunoglobulinas. Algunas de las moléculas implicadas serían: proteasas, inhibidores de proteasas, factores de inmunosupresión, y otras moléculas similares a paramiosina, proteoglicanos sulfatados, prostaglandinas E2, taeniaestatina, y neuropéptidos como la sustancia P o la somatostatina (H. H. Garcia et al., 2020; Khumbatta et al., 2014). En el ser humano se induce la síntesis de anticuerpos específicos (IgG), aunque su producción depende de las características de los cisticercos (localización, número y viabilidad). En una etapa más avanzada de la infección, algunos pacientes pueden desarrollar una respuesta granulomatosa que resulte en la destrucción del parásito, el cual se calcifica en un periodo de dos a siete años. Cuando se observa una o más calcificaciones, sin ninguna otra lesión en otra fase, se describe como NCC inactiva (Becerril, 2014). En la mayoría de los casos, la respuesta inmunitaria es leve y crónica, por lo que no se destruye al parásito, pero se produce afectación de los tejidos adyacentes, ocasionado vasculitis, fibrosis y astrogliosis. En el caso de cisticercos en degeneración, cuando los mecanismos de evasión de la respuesta inmune de los cisticercos no son efectivos, pueden desencadenar una intensa reacción inflamatoria. Este es el motivo por el que el tratamiento farmacológico debe realizarse bajo supervisión médica, preferiblemente en un centro hospitalario. 2.1.3. Epidemiología La neurocisticercosis es la causa más frecuente de epilepsia prevenible a nivel mundial y supone el 30% de los casos de epilepsia en países endémicos. La carga de la enfermedad global se ha estimado en 1,61 millones de años de vida ajustados por discapacidad (DALY, Disability Adjusted Life Years) en 2017 (GBD Introducción 25 2017 DALYs and HALE Collaborators, 2018; World Health Organization, 2020b). La cisticercosis es endémica en zonas rurales de Asia, África Subsahariana y América Latina (Devleesschauwer et al., 2017; H. H. Garcia et al., 2020; Melki et al., 2018). Debido a la variabilidad en los estudios epidemiológicos, la falta de obligatoriedad en la notificación de los casos en muchos países y el miedo a la estigmatización, no es posible establecer el número de casos de manera rigurosa. En Estados Unidos, la cisticercosis es mayoritariamente una entidad importada, asociada a inmigración, con un incremento de los casos en los últimos años (Spallone et al., 2020). Lo mismo sucede en Europa, donde incluso se discute la posible reemergencia de la cisticercosis/neurocisticercosis (Abraham et al., 2020; Del Brutto, 2012; Devleesschauwer et al., 2017). La mayoría de los casos en la región europea son importados debido a fenómenos migratorios, aunque únicamente Hungría, Islandia y Polonia, presentan un sistema obligatorio de notificación de casos, por lo que el número total de casos en Europa podría estar subestimado. En el periodo de tiempo comprendido entre los años 2000 a 2016, se han reportado 3489 casos en Europa, siendo España el país con mayor número (2116), seguido de Italia (832), Portugal (357) y Suiza (176) (Abraham et al., 2020). 2.1.4. Diagnóstico El diagnóstico de la neurocisticercosis es complejo, ya que requiere de la combinación de una serie de técnicas diagnósticas y evidencias clínicas y epidemiológicas para establecer un diagnóstico definitivo (Del Brutto et al., 2017). Las técnicas de neuroimagen van a ser esenciales en el diagnóstico de la NCC, aportando información acerca de la localización, número y viabilidad del parásito. Entre las principales técnicas de neuroimagen cabe destacar la tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética nuclear (RMN) cerebral (Del Brutto et al., 2017). Las técnicas de inmunodiagnóstico basadas en la detección de anticuerpos y/o antígenos permiten confirmar el diagnóstico de imagen. Se han comercializado test tanto de ELISA como de western blot para la detección de Introducción 26 anticuerpos específicos, normalmente utilizando antígenos crudos o parcialmente purificados del parásito con valores limitados de sensibilidad y especificidad (H. H. Garcia, Castillo, Gonzales, Bustos, Saavedra, Jacob, Del Brutto, Wilkins, Gonzalez, Gilman, Tsang, et al., 2018). La técnica de inmunoelectrotransferencia ligada a enzimas empleando extractos antigénicos (glucoproteínas) purificados mediante afinidad con lectina de lenteja (EITB-LLGP) es el método de referencia y más fiable para la detección de anticuerpos específicos de T. solium en suero o en líquido cefalorraquídeo, alcanzando un 100% de especificidad y 98% de sensibilidad, en pacientes con dos o más cisticercos viables (Tsang et al., 1989). Sin embargo, en pacientes con un solo cisticerco o lesiones calcificadas, la sensibilidad se reduce (Proaño-Narvaez et al., 2002). También se han empleado anticuerpos monoclonales para la detección de antígenos del cisticerco mediante ELISA en muestras de suero o líquido cefalorraquídeo. Estas técnicas suelen obtener buenos resultados fundamentalmente en los casos de cisticercos viables ubicados en regiones extraparenquimales y son especialmente útiles para el seguimiento de la enfermedad una vez instaurado el tratamiento. Los antígenos detectados son: HP10 (Fleury et al., 2007), B158/B60 (Rodriguez et al., 2009) y TsG10 (Corda et al., 2022). En cuanto a las técnicas moleculares, se han empleado distintos tipos de PCR, convencional (Hernández et al., 2008) y cuantitativa a tiempo real (qPCR) normalmente sobre líquido cefalorraquídeo (Yera et al., 2011) y también en muestras de plasma (O’Connell et al., 2020a). Las técnicas moleculares, al igual que las de detección de antígeno, presentan una mayor utilidad para el diagnóstico y seguimiento del tratamiento de los casos extraparenquimatosos. La identificación directa del parásito tras la biopsia cerebral no es posible en la mayoría de los casos, al no estar indicada la extracción quirúrgica de los cisticercos. Además, este procedimiento invasivo no es una alternativa factible para el diagnóstico de rutina ni el cribado epidemiológico (Del Brutto et al., 2017). Sin embargo, los cisticercos extraídos permitirían confirmar el diagnóstico mediante estudios posteriores por microscopía y técnicas moleculares. 2.2. Hidatidosis La hidatidosis quística o equinococosis quística (CE) es una zoonosis causada por la fase larvaria de Echinococcus granulosus sensu lato, perteneciente Introducción 27 a la clase Cestoda, orden Cyclophyllidea, familia Taeniidae (Schoch et al., 2020), por lo que pertenece a la misma familia que el anterior parásito comentado en la presente Tesis Doctoral (Taenia solium). La transmisión en humanos está asociada al contacto con perros en zonas rurales donde se da el ciclo doméstico del parásito. Es una enfermedad crónica que puede pasar desapercibida debido a su lento desarrollo y falta de síntomas. España ha sido históricamente una región endémica y aunque ha descendido mucho su incidencia, aún se siguen diagnosticando casos (European Centre for Disease Prevention and Control., 2022; Herrador et al., 2016). 2.2.1. Ciclo biológico El ciclo de vida de Echinococcus spp. es un ciclo zoonótico dependiente de la relación depredador-presa de dos hospedadores mamíferos. El parásito se mantiene en la naturaleza por los hábitos alimenticios carnívoros de los hospedadores definitivos (cánidos como el perro, lobo, zorros…), y por los hospedadores intermediarios (ovejas, cabras, vacas…) los cuales albergan el estadio larvario del parásito (metacestodo o quiste hidatídico). El cestodo adulto se localiza en el intestino delgado de los cánidos (Agudelo Higuita et al., 2016; Salazar Schettino & Cabrera Bravo, 2014; Wen et al., 2019a; Woolsey & Miller, 2021), donde se liberan los huevos que salen vehiculizados con las heces contaminando el medio: pastos, verduras, agua, etc. (Salazar Schettino & Cabrera Bravo, 2014). Tras la ingesta de los huevos por el hospedador intermediario, se libera la oncosfera (embrión hexacanto) que penetra en la mucosa intestinal, difunde por vía portal hasta el hígado, pudiendo alcanzar el pulmón a través de venas suprahepáticas. Además, puede difundir a cualquier localización vía general una vez que supera el pulmón, aunque es menos frecuente. Finalmente, a partir de la oncosfera se desarrolla la forma larvaria o quiste hidatídico, de cuya capa germinal surgen los protoescólices, fase infectiva para el hospedador definitivo, quien adquiere la parasitosis al alimentarse de vísceras de los hospedadores intermediarios. Cada protoescólex dará lugar al estadio adulto en un periodo de 4 a 7 semanas en el hospedador definitivo (Agudelo Higuita et al., 2016; Salazar Schettino & Cabrera Bravo, 2014). Introducción 28 En el caso de los humanos, se considera que estos son hospedadores accidentales o aberrantes, ya que es altamente improbable que perpetúen el ciclo (Agudelo Higuita et al., 2016). En el humano los huevos ingeridos eclosionan en el tubo digestivo, liberando las oncosferas que siguen la misma ruta que la indicada para los hospedadores intermediarios, migrando a diferentes órganos, donde pueden llegar a formar quistes hidatídicos, siendo el hígado y el pulmón las localizaciones más habituales (Kern et al., 2017). Figura 2.2.1. Ciclo biológico esquematizado de la especie Echinococcus granulosus. Ilustración creada con Biorender ®. 2.2.2. Manifestaciones clínicas y patogénesis La hidatidosis quística es habitualmente asintomática, aunque presenta un periodo de incubación y una presentación clínica variable en función del órgano implicado, la localización del quiste en el propio órgano, el número de quistes, el tamaño y la integridad de la pared. Las principales complicaciones se producen tras la ruptura del quiste, resultando en una infección de la zona afectada, anafilaxia o diseminación de protoescólices produciendo una hidatidosis Introducción 29 secundaria. El efecto de compresión del quiste de las zonas adyacentes es otro de los mecanismos por los que el quiste puede ser sintomático (Agudelo Higuita et al., 2016). Los quistes pueden llegar a crecer entre 1-50 mm por año, o permanecer sin cambios durante años (Brunetti et al., 2010). A pesar de que las localizaciones más habituales son hígado (69-75%) y pulmón (17-22%) también se han descrito a nivel esplénico, renal, peritoneal, óseo y cerebral entre otras (Kern et al., 2017). Las manifestaciones clínicas de los quistes hepáticos se caracterizan por dolor abdominal, dispepsia, fiebre o reacciones alérgicas, aunque la mayoría de los casos permanecen asintomáticos durante años. La complicación más frecuente es la ruptura del quiste en la cavidad peritoneal. Esta puede resultar en un shock anafiláctico o un abdomen agudo, pudiendo desencadenar la muerte del individuo (Kern et al., 2017; Wen et al., 2019a). De manera similar, los quistes pulmonares se adquieren, generalmente, durante la infancia y permanecen asintomáticos hasta la edad adulta, o incluso se diagnostican de manera incidental tras una exploración radiológica. La compresión a nivel bronquial puede desencadenar neumonía, atelectasias o una reacción inflamatoria. La ruptura del quiste puede producir expectoración de componentes del quiste, membranas, vesículas y fluido vesicular (vómica), así como rash urticarial con o sin fiebre y anafilaxia sistémica (Kern et al., 2017; Santivanez & Garcia, 2010). Como resultado de la liberación de antígenos, se suele desarrollar inmunoglobulinas del tipo IgE, formando parte de una respuesta predominante tipo Th2, con altos niveles de interleucina 5 (IL-5) (Wen et al., 2019a). 2.2.3. Epidemiología La hidatidosis es una enfermedad con una distribución global: presenta una mayor prevalencia en regiones rurales de Asia Central, China Continental, Europa del Este, así como en los países del Este de África y América del Sur (Larrieu et al., 2019; Ohiolei et al., 2020; Wen et al., 2019a). Se ha declarado su eliminación en algunos países insulares como Nueva Zelanda (Craig et al., 2017). Según el último informe epidemiológico anual redactado por el ECDC correspondiente a 2020 (European Centre for Disease Prevention and Control., 2022), se reportaron 529 casos confirmados de EC procedentes de los países de la Unión Europea. Alemania fue el país que reportó mayor número de casos (152), seguido de Introducción 30 Bulgaria (95). Hay que considerar que la gran mayoría de los casos declarados en los países del norte de Europa, son importados. En España es una enfermedad de declaración obligatoria, donde se reportaron 8 casos de equinococosis en 2020 sin especificar especies ni genotipos implicados (European Centre for Disease Prevention and Control., 2022). Debido a su largo periodo de incubación y a las escasas medidas de vigilancia epidemiológica, es una enfermedad que se suele diagnosticar en la edad adulta, pese a que la infección es muy probable que se produzca durante la infancia. Debido a ello, junto a la mayor prevalencia en zonas rurales, esta zoonosis se caracteriza por una subestimación del número de casos (Lopez-Bernus et al., 2015). A nivel de epidemiología genética, dentro del complejo Echinococcus granulosus sensu lato hay una marcada variabilidad genética. El genotipo más frecuentemente asociado a hidatidosis humana es el G1 (88,4% de los casos) dentro de la especie Echinococcus granulosus sensu stricto, seguido de la especie Echinococcus canadensis (Larrieu et al., 2019; Maksimov et al., 2020). 2.2.4. Diagnóstico El diagnóstico de la hidatidosis se realiza de acuerdo con los hallazgos clínicos, hallazgos de imagen y resultados serológicos y moleculares. Las técnicas de imagen son esenciales en el diagnóstico ya que proporcionan información acerca del tamaño, número de quistes, localización y en ocasiones de la viabilidad del parásito. La técnica de imagen más empleada es la ecografía abdominal, aunque también se realiza la tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética nuclear (RMN) (Brunetti et al., 2010). El grupo de trabajo de la Organización Mundial de la Salud para Echinococcosis (WHO-IWGE) en 1995 clasificó en 3 grupos principales los diferentes quistes de acuerdo con las imágenes obtenidas por ecografía abdominal: activos (CE1 y CE2), transicionales (CE3) e inactivos (CE4 y CE5). En esta clasificación se basa la guía diagnóstica elaborada por Brunetti y colaboradores (Brunetti et al., 2016). Los métodos serológicos basados en la detección de anticuerpos circulantes se consideran una herramienta complementaria cuando el diagnóstico por imagen no sea concluyente. Hay una gran variedad de técnicas disponibles como son la hemaglutinación indirecta, aglutinación en látex, tiras inmunocromatográficas, Introducción 31 ELISAs, inmunofluorescencia, inmunoblots en diversas versiones para la detección de IgG principalmente frente a antígenos crudos del parásito y purificados. En la práctica clínica, se recomienda el empleo de dos ensayos; uno tipo ELISA de alta sensibilidad y después un test más específico como el inmunoblot, como prueba confirmatoria y discriminación entre CE y equinococosis alveolar en las regiones donde coexisten ambas parasitosis. La principal limitación de estas técnicas es la falta de sensibilidad, ya que la disponibilidad de anticuerpos circulantes va a estar asociada a las características del quiste (localización, tamaño, viabilidad, entre otros (Hernández-González et al., 2018; Sánchez-Ovejero et al., 2020). Existen también técnicas de detección directa del parásito como son: la detección histológica sobre biopsias y aspirados de líquido hidatídico del quiste, examen microscópico directo del contenido quístico para identificar protoescólices y PCR para detección de especie y cepa. Estas técnicas son de carácter confirmatorio, con una sensibilidad del 100%. Sin embargo, serían inviables como técnicas de diagnóstico rutinario debido a que conllevan un proceso invasivo. 2.3. Loasis La loasis es una enfermedad parasitaria producida por el nematodo Loa loa, perteneciente a la clase Chromadorea, orden Rhabditida, familia Onchocercidae (Schoch et al., 2020). Se transmite por los tábanos del género Chrysops (C. silacea y C. dimidiata) (Ndzeshang et al., 2020; Padgett & Jacobsen, 2008; Wanji et al., 2002). Se conoce de manera coloquial como la enfermedad del “gusano del ojo”. 2.3.1. Ciclo biológico L. loa se transmite al humano por las mordeduras de las especies hematófagas del tábano del género Chrysops: Chrysops silacea y Chrysops dimidiata. La larva infectiva (L3) penetra activamente en la piel a través de la herida provocada por el tábano. La larva en el humano evoluciona hasta el estadio adulto que permanece en el tejido subcutáneo. Los adultos pueden vivir hasta 15- 21 años y ocasionan una enfermedad crónica en los portadores. Las hembras Introducción 32 adultas liberan, en el tejido conectivo circundante, las microfilarias que rápidamente alcanzarán el torrente sanguíneo con periodicidad diurna, pudiendo localizarse también en esputo, orina, líquido cefalorraquídeo o pulmones (Boussinesq, 2006). Cuando la hembra Chrysops spp vuelve a alimentarse de un humano infectado podrá ingerir las microfilarias que se encuentran en la sangre periférica. En su interior pasarán por diferentes estadios larvarios hasta desarrollar la larva infectiva, que migra a la probóscide. Cuando los tábanos vuelvan a alimentarse, podrán inocular la L3 (Whittaker et al., 2018). Figura 2.3.1. Ciclo biológico esquematizado de la especie Loa loa. L3: estadio larvario 3. Ilustración creada con Biorender ® 2.3.2. Manifestaciones clínicas y patogénesis La gran mayoría de los casos de loasis en regiones endémicas son asintomáticos o presentan síntomas leves (Akue et al., 2018; Padgett & Jacobsen, 2008). Las principales manifestaciones clínicas, se deben a las filarias adultas, y son: edema de Calabar (angioedema subcutáneo como consecuencia de la reacción Introducción 33 de hipersensibilidad producida por la migración del adulto) y la visualización del estadio adulto de Loa loa en el ojo (hallazgo del parásito en la conjuntiva ocular) (Akue et al., 2018; Bouchaud et al., 2020; Padgett & Jacobsen, 2008; S. Puente et al., 2020). En pacientes de regiones no endémicas se evidencian manifestaciones alérgicas en mayor proporción con respecto a los pacientes residentes (Delabre et al., 2014). Otros síntomas asociados a la infección por L. loa son prurito, urticaria y eosinofilia. Además, puede provocar complicaciones como nefropatías o encefalitis, debido principalmente a deposiciones de complejos inmunes y a la presencia de microfilarias en el líquido cefalorraquídeo, respectivamente (Metzger & Mordmüller, 2014a). Sin embargo, la presentación clínica es muy variable y depende fundamentalmente de la respuesta inmune y de la carga parasitaria. También es importante mencionar las graves encefalopatías (meningoencefalitis) en individuos con elevada microfilaremia tras el tratamiento farmacológico con ivermectina o dietielcarbamazina aplicado a la población en los programas de control de oncocercosis (Akue et al., 2018; Chesnais et al., 2017; Gardon et al., 1997). 2.3.3. Epidemiología A nivel geográfico la loasis presenta una distribución limitada por la presencia del vector, el tábano del género Chrysops, siendo endémica en las regiones forestales del oeste y centro del continente africano, concretamente en los países de Guinea Ecuatorial, Angola, Chad, República Democrática del Congo, Camerún, República Centroafricana, Gabón, Nigeria, Sudán del Sur y la República del Congo (Zouré et al., 2011). Está entre la segunda y tercera causa de consulta médica en estas áreas (Metzger & Mordmüller, 2014a). Se estima que, de los 30 millones de personas residentes en estas regiones afectadas, en torno a 10 millones están infectadas de loasis, aunque es probable que este dato esté subestimado. En las regiones de mayor endemicidad la prevalencia en la población puede alcanzar el 60% con una media de microfilarias por mililitro de sangre elevada (Whittaker et al., 2018). Su distribución geográfica coincide con la de otras filarias, entre las que se encuentran Mansonella perstans, Mansonella streptocerca, Wuchereria bancrofti Introducción 34 y Onchocerca volvulus lo que dificulta el diagnóstico diferencial y el tratamiento adecuado para cada una de ellas (Ta et al., 2018). Existen fármacos antiparasitarios eficaces frente a Loa loa como la dietilcarbamazina (potente microfilaricida de efecto rápido y macrofilaricida) y la ivermectina (microfilaricida). Es necesario tener en cuenta que estos tratamientos no son seguros para los individuos que presentan un alto nivel de microfilarias, en los que es recomendable realizar tratamientos progresivos combinados con corticoides. Debido a ello resulta complejo realizar un programa eficaz para la reducción de la prevalencia y el control de esta filariosis en las áreas endémicas (Gardon et al., 1997; Herrick et al., 2017). En un estudio realizado en España sobre la loasis importada procedente de Guinea Ecuatorial, resalta que el 72,5% de los pacientes presentaron microfilaremia positiva y eran completamente asintomáticos, aunque sí que presentaron eosinofilia. De este modo, a la hora de establecer la pauta terapéutica de un paciente procedente de estas regiones con eosinofilia, sería conveniente determinar la microfilaremia, con el objetivo de evitar las reacciones adversas asociadas al uso de fármacos (S. Puente et al., 2020). 2.4.4. Diagnóstico Las principales técnicas diagnósticas de loasis se agrupan en: diagnóstico clínico, microscópico, serológico y molecular. El diagnóstico presuntivo se basa en la observación del gusano adulto en la conjuntiva ocular o de la evidencia del edema de Calabar. De este modo, la identificación microscópica del estadio adulto de Loa loa, ya sea tras su extracción ocular o cutánea, permite confirmar el diagnóstico de la enfermedad. También se realiza la identificación microscópica de las microfilarias en frotis de sangre; la muestra de sangre debe ser tomada a mediodía y se puede emplear un frotis fresco o con tinción de Giemsa (Rosenblatt, 2009). En caso de baja parasitemia se puede recurrir a métodos de concentración como la técnica de Knott (Melrose et al., 2000). Además, existe un dispositivo portátil basado en microscopia para la identificación y contaje de las microfilarias, es el denominado LoaScope, para aplicación en campo (D’Ambrosio et al., 2015). Sin embargo, hay que considerar las limitaciones de la microscopia, dado que una elevada proporción de pacientes de loasis presenta amicrofilaremia (Pinder et al., Introducción 35 1988), sumado a los requerimientos de personal cualificado para la realización y el hecho de que en infecciones recientes la liberación de las microfilarias no es inmediata (Rosenblatt, 2009). Estos motivos han provocado que se inviertan en el desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas. En cuanto a las técnicas serológicas, se ha empleado el antígeno crudo en ELISA (Akue et al., 1998) e inmunoblot (Egwang et al., 1989). Sin embargo, estos métodos se caracterizan por su baja especificidad, principalmente por la presencia de reactividad cruzada con otras helmintosis. Con el objetivo de aumentar la especificidad se desarrollaron antígenos recombinantes, entre ellos, cabe destacar el Ll-SXP1, en el dispositivo ELISA (Klion et al., 2003) y LIPS (Burbelo et al., 2008). Además, existe comercializado un test de inmunocromatografía de flujo lateral (LFA) con el mismo antígeno, Ll-SXP1 (Pedram et al., 2017). También el ELISA que emplea el antígeno recombinante 15r3, (Azzibrouck et al., 2010) mostró unos resultados prometedores. En cuanto a las técnicas moleculares para el diagnóstico, se ha empleado PCR convencional (Formenti et al., 2021; M. Jiménez et al., 2011; Nuchprayoon et al., 2005), PCR cuantitativa (Fink et al., 2011) y LAMP (del inglés, loop- mediated isothermal amplification) (Drame et al., 2014; Fernández-Soto et al., 2014; Poole et al., 2015; Ta-Tang et al., 2022). 2.4. Angiostrongilosis La angiostrongilosis humana es una enfermedad parasitaria que se transmite por el consumo de alimentos contaminados con la larva infectante (L3) del parásito. De las más de 20 especies del género Angiostrongylus, sólo dos producen patología en el humano, Angiostrongylus cantonensis y Angiostrongylus costaricensis. Pertenecen a la familia Angiostrongylidae, orden Strongylida, clase Chromadorea (Schoch et al., 2020). La presente Tesis Doctoral se va a focalizar en la especie Angiostrongylus cantonensis, ya que es la causante de la angiostrongilosis cerebral. Introducción 36 2.4.1. Ciclo biológico El ciclo biológico de A. cantonensis implica a especies de mamíferos, principalmente ratas, como hospedadores definitivos y diferentes especies de moluscos como hospedadores intermediarios (Thiengo et al., 2013). El estadio adulto de A. cantonensis se localiza en las arterias pulmonares del hospedador definitivo (habitualmente ratas, Rattus rattus y R. norvegicus), donde la hembra deposita los huevos. Tras su eclosión la larva L1 liberada migra a la faringe y es deglutida, recorriendo el tracto gastrointestinal siendo finalmente eliminada por las heces (Bhaibulaya, 1975; Thiengo et al., 2013). Los gasterópodos de agua dulce y terrestres son los principales hospedadores intermediarios. Entre las principales especies están: Achatina fulica, Bradybaena similaris, Subulina octona, Pomacea canaliculata, Pomacea lineata, Deroceras laeve… (Caldeira et al., 2007; Thiengo et al., 2010; Wallace & Rosen, 1969). Estos se infectan bien por ingestión o por penetración directa de estas larvas L1. En el molusco, la larva L1 muda dos veces (a L2 y a L3), en un periodo de unos 20 días. Los roedores se infectan tras ingerir los hospedadores intermediarios parasitados con el estadio larvario L3, que es la fase infectante. En el hospedador definitivo las larvas L3 penetran la pared intestinal, entran en el torrente sanguíneo y, a través de circulación pulmonar, son diseminadas a diferentes órganos. La mayoría alcanza el tejido cerebral, donde mudan a L4 y posteriormente a L5 en el espacio subaracnoideo. Desde allí, los adultos jóvenes (L5) migran a las arterias pulmonares, donde se encuentran tras 25 días de la infección. En esa localización, los adultos alcanzan la madurez sexual en unos 35 días. Las larvas L1 se liberan en las heces de los roedores en aproximadamente 42 días tras la infección primaria (Thiengo et al., 2013). Los humanos son hospedadores accidentales que se infectan tras la ingestión de moluscos o babosas, crudos o parcialmente cocinados, parasitados con las L3. También pueden infectarse por el consumo de hospedadores paraténicos parasitados como gambas, ranas, lagartijas, etc. o tras la ingestión de verduras crudas contaminadas (da Silva & Morassutti, 2021). Las larvas infectivas en el humano invaden el tejido intestinal, alcanzan la circulación sanguínea y finalmente, en aproximadamente dos semanas, alcanzan el sistema nervioso Introducción 37 central (Q.-P. Wang et al., 2008). La siguiente figura representa el ciclo biológico de manera esquemática: Figura 2.4.1. Ciclo biológico esquematizado de la especie Angiostrongylus cantonensis. L1: estadio larvario 1; L3: estadio larvario 3. Ilustración creada con Biorender®. 2.4.2. Manifestaciones clínicas y patogénesis La principal patología de la angiostrongilosis humana causada por A. cantonensis es la meningitis o meningoencefalitis eosinofílica. El tiempo de incubación de la enfermedad es variable en función del número de parásitos implicados ya que se han descrito casos desde varios días hasta varios meses tras la exposición (Q.-P. Wang et al., 2008). La larva no es capaz de abandonar el SNC debido a la reacción inflamatoria caracterizada por el infiltrado eosinofílico. Aunque la enfermedad puede ser asintomática o incluso se han descrito casos de desaparición espontánea de los síntomas en semanas, también existen casos con graves secuelas, desencadenando alguno la muerte del individuo. Los principales síntomas son las cefaleas y la rigidez de cuello. Otros síntomas comunes son: visión borrosa, vómitos, náuseas, debilidad muscular, dolor retro-orbital, ataxia, dolor abdominal, convulsiones, parálisis facial, somnolencia, retención e incontinencia urinaria. En los, poco frecuentes, casos descritos de infección ocular, esta causa visión borrosa y diplopía, pudiendo desencadenar daños permanentes y pérdida de la visión (da Silva & Morassutti, 2021; Q.-P. Wang et al., 2008) Introducción 38 2.4.3. Epidemiología A. cantonensis es una de las principales causas de meningitis eosinofílicas en las regiones endémicas en las que se distribuye. Los principales países endémicos son Tailandia (donde la incidencia es de 2 por cada 100.000 habitantes al año), China y Australia, con una incidencia menor (Barratt et al., 2016; Federspiel et al., 2020). También son países endémicos algunas zonas del Caribe (Dorta-Contreras et al., 2007; Slom et al., 2002). Se han descrito varios brotes en China, Taiwán y Estados Unidos (Q.-P. Wang et al., 2008). En Europa se han reportado un total de 22 casos desde 1988 (Federspiel et al., 2020). Sin embargo, la distribución geográfica y la prevalencia de los hospedadores intermediarios ha aumentado en las últimas décadas, lo que sugiere una expansión geográfica del parásito, y, por consiguiente, un aumento en los casos humanos (Barratt et al., 2016; da Silva & Morassutti, 2021). Se han reportado casos de moluscos infectados con A. cantonensis en Estados Unidos (Federspiel et al., 2020; Stockdale-Walden et al., 2015; Teem et al., 2013), en concreto en la Isla de Hawái, donde actualmente la angiostrongilosis es endémica (Khamsai et al., 2023), de hecho, el parásito ha sido detectado en 16 especies de moluscos (da Silva & Morassutti, 2021). En España, también se han identificado tres especies de moluscos parasitados por A. cantonensis en Tenerife (Martin-Alonso et al., 2015; Segeritz et al., 2021). 2.4.4. Diagnóstico La identificación de las formas larvarias de A. cantonensis resulta compleja, debido a su localización cerebral. En el líquido cefalorraquídeo, su detección es bastante infrecuente, dada la escasa proporción de larvas que penetran en el espacio subaracnoideo, y el pequeño volumen que se obtiene de las muestras de LCR (Graeff-Teixeira et al., 2009). Debido a ello, el diagnóstico parasitológico basado en la identificación de las formas parasitarias no es el método más empleado. Las técnicas serológicas y moleculares son habitualmente las de elección (da Silva & Morassutti, 2021). En cuanto al diagnóstico serológico, se ha empleado un test en formato ELISA con extracto crudo antigénico procedente de las hembras de A. cantonensis en estadio adulto, que es el test serológico de elección a nivel mundial para el Introducción 39 diagnóstico de la patología abdominal (Ben et al., 2010; da Silva & Morassutti, 2021). Los test serológicos de la angiostrongilosis cerebral se han basado en una glicoproteína de 31 kDa obtenida en un primer momento del extracto crudo somático de las hembras adultas de A. cantonensis. Sin embargo, se detectó que la proteína de 31kDa no purificada presentaba reactividad cruzada con otras parasitosis (gnathostomosis, toxocarosis, hidatidosis y estrongiloidosis), especialmente relevante con aquellas que también pueden producir meningitis eosinofílicas como la gnathostomosis (Morassutti et al., 2017). También se ha desarrollado un test de diagnóstico rápido AcQuickDx basado en la proteína purificada de 31 kDa con una especificidad mejorada (Eamsobhana et al., 2018). Recientemente se ha publicado el desarrollo de un test rápido inmunocromatográfico empleando el antígeno recombinante galectina-2 procedente del antígeno de 31kDa que ha mostrado valores de sensibilidad y especificidad de 87% y 96,5%, respectivamente (Somboonpatarakun et al., 2020). La técnica de diagnóstico molecular empleada es la PCR con muestras de LCR. Esta técnica puede ser especialmente útil en la fase aguda de la angiostrongilosis cerebral, cuando los anticuerpos aún no presentan niveles detectables (da Silva & Morassutti, 2021). La desventaja de las técnicas moleculares es que, en ocasiones, el DNA del parásito no está presente en la muestra o bien la concentración del mismo es inferior al límite de detección de la técnica. Se han desarrollado tanto PCRs convencionales como diferentes qPCRs (Qvarnstrom et al., 2016) que mejoran la sensibilidad de la técnica (Sears et al., 2021). 2.5. Gnathostomosis La gnatostomiasis o gnathostomosis humana es una zoonosis parasitaria que se trasmite con la ingestión de alimentos contaminados. Está causada por el nematodo Gnathostoma spp. de la familia Gnathostomatidae, orden Rhabditida y clase Chromadorea. (Schoch et al., 2020) Los humanos adquieren la infección consumiendo pescado crudo o carne poco cocinada que albergan el estadio larvario 3 avanzado de Gnathostoma spp. (Janwan et al., 2013). Existen múltiples especies en el género Gnathostoma, entre ellas G. spinigerum, G. hispidum, G doloresi, G nipponicum y G. malaysiae en Asia, y G. binucleatum en América que se han relacionado con parasitosis en humanos (G.-H. Liu et al., 2020). La Introducción 40 presente Tesis Doctoral se va a centrar en el estudio e investigación de la especie G. spinigerum. 2.5.1. Ciclo biológico Los principales hospedadores definitivos de G. spinigerum, son mamíferos silvestres o domésticos (félidos, cánidos, marsupiales…). Los parásitos adultos se encuentran en una especie de masa tumoral en la pared gástrica o del esófago formada por células hiperplásicas con exudado inflamatorio de la mucosa. Allí se produce la cópula y los huevos no embrionados se liberan a través de una apertura de la masa tumoral, para salir al exterior vehiculizados por las heces. Los huevos embrionan en ecosistemas de agua dulce a temperaturas entre 24 -28ºC. Tras la eclosión se libera la larva L1 que nada activamente hasta ser ingerida por el primer hospedador intermediario (diversas especies de crustáceos de los géneros Cyclops, Euyclops, Tropocyclops, Mesocyclops…), donde se desarrolla hasta el tercer estadio larvario temprano (L3 temprana). Cuando los copépodos infectados son ingeridos por un hospedador intermediario apropiado como son los peces de agua dulce o anfibios (segundo hospedador intermediario) la L3 temprana penetra a través de la mucosa gástrica y migra hacia el músculo esquelético, donde se enquista y se desarrolla un tercer estadio larvario avanzado (L3 avanzada, L3A). Este estadio constituye la forma infectiva en el humano, que se considera un hospedador accidental, en el que el parásito no es capaz de completar su ciclo biológico. Cuando el hospedador definitivo ingiere un hospedador intermediario segundo infectado las L3A se desarrollan en adultos en su estómago (Becerril, 2014; Janwan et al., 2011; G.-H. Liu et al., 2020). En la figura 2.5.1 se muestra esquematizado el ciclo biológico descrito: Introducción 41 Figura 2.5.1. Ciclo biológico esquematizado de la especie Gnathostoma spinigerum. L3A: Larva 3 en estadio avanzado. Ilustración creada con Canva®. Ciertas aves ictiófagas, reptiles y pequeños mamíferos, que actúan como hospedadores paraténicos, albergan la L3 en estadio avanzado, por lo que también pueden ser una vía de trasmisión al humano. Las posibles vías de transmisión de la gnathostomosis humana son: oral, transplacentaria y a través de heridas cutáneas (Lupi et al., 2015), aunque la principal vía es a través de la ingesta de alimentos procedentes de los hospedadores intermediarios infectados con la L3A (G.-H. Liu et al., 2020). También se sugiere la transmisión tras la ingesta de agua contaminada con copépodos infectados (Nithiuthai et al., 2004). 2.5.2. Manifestaciones clínicas y patogénesis Tras la ingestión de la L3A en el humano, esta se libera en el estómago, penetra a través de la mucosa gástrica e inicia el proceso migratorio hacia el hígado, provocando una sintomatología digestiva en el individuo (náuseas, Introducción 42 vómitos, dolor epigástrico…) (Becerril, 2014; G.-H. Liu et al., 2020; Rodríguez Pérez, 2013). Posteriormente, la larva puede migrar a prácticamente cualquier órgano. Los síntomas dependerán de la zona afectada; las manifestaciones varían desde cutáneas a viscerales, oculares, articulares, pulmonares, y neurológicas (G.- H. Liu et al., 2020). Las manifestaciones más comunes son las cutáneas; ocasionadas por el síndrome de larva migrans, se producen edemas migratorios intermitentes, indurados, pruriginosos con un aumento de la temperatura en la zona (Becerril, 2014; Herman & Chiodini, 2009; G.-H. Liu et al., 2020). Las gnathostomosis de afectación cerebral (neurognatostomosis) se presenta con un cuadro de meningitis eosinofílica, con presencia de al menos 10% de eosinófilos en líquido cefalorraquídeo total (Sawanyawisuth & Chotmongkol, 2013), siendo la forma más grave de afectación visceral. Entre los principales síntomas, cabe destacar: radiculomielitis, hemorragias subaracnoideas, cefalea intensa, pérdida transitoria de los reflejos osteotendinosos en miembros inferiores, paraplejia… pudiendo llegar a desencadenar la muerte del individuo. (Becerril, 2014; Diaz, 2015; G.-H. Liu et al., 2020; Rodríguez Pérez, 2013; Sawanyawisuth & Chotmongkol, 2013) La liberación de sustancias hemolíticas, enzimas proteolíticas (cisteinproteasas y metaloproteasas) y sustancias tóxicas, así como la reacción inflamatoria y el daño mecánico producidos tras la migración de la larva, son los principales responsables del cuadro clínico en el paciente, aunque los mecanismos concretos de patogenicidad no están aún esclarecidos (G.-H. Liu et al., 2020). Como resultado de la infección, se induce una respuesta inmunitaria Th2, la producción de inmunoglobulinas de las clases IgG e IgE, observando eosinofilia en un 40% de los casos (Rodríguez Pérez, 2013). 2.5.3. Epidemiología El género Gnathostoma presenta una distribución global, sin embargo la mayor parte de casos humanos de neurognathostomosis, todos ellos ocasionados por G. spinigerum, han sido reportados en Tailandia (Katchanov et al., 2011). La especie G. spinigerum se localiza en Japón, India, China y en la mayoría de los países del Sudeste Asiático (Tailandia, Laos, Myanmar, Indonesia, Malasia Introducción 43 y Filipinas). Además en el 2021 se ha publicado un estudio en que se identificaba la presencia de L3A en ranas y pescado de un mercado en Camboya (Sohn et al., 2021). La enfermedad es endémica en Japón y Tailandia, aunque se han reportado casos esporádicos en varios países europeos, Australia y América, procedentes de viajeros de zonas endémicas (Herman & Chiodini, 2009). En Japón se han descrito 3182 casos de gnathostomosis humana entre 1911 y 1995, y 73 casos entre 1996 y 2012 (G.-H. Liu et al., 2020). En Tailandia, la seroprevalencia frente a Gnathostoma en humanos fue 62,5% (531 casos de 849 pacientes), de acuerdo a los datos publicados en el estudio retrospectivo realizado en los años 2000 y 2005 (Bussaratid et al., 2010). Se considera una enfermedad emergente en países donde no es endémica (Herman & Chiodini, 2009). La presencia de L3A de G. spinigerum vivas en anguilas importadas en países no endémicos como EEUU, supone, además de una fuente potencial de infección, un riesgo de establecimiento autóctono de la enfermedad (Cole et al., 2014). 2.5.4. Diagnóstico El diagnóstico de la gnathostomosis humana resulta complejo. Los síntomas y signos clínicos (edemas migratorios intermitentes y los niveles elevados de eosinófilos en sangre), sumado a antecedentes de haber consumido alimentos crudos en zonas endémicas, permiten sospechar de la enfermedad (G.- H. Liu et al., 2020). Sin embargo, es necesario realizar un diagnóstico diferencial, puesto que algunos de los síntomas son comunes a la angiostrongilosis, triquinosis y otros nematodos relacionados con el síndrome de larva migrans como Ancylostoma caninum, Ancylostoma braziliense, y Uncinaria stenocephala (Herman & Chiodini, 2009; G.-H. Liu et al., 2020; Thiangtrongjit et al., 2021). El diagnóstico definitivo se establece tras la extirpación quirúrgica de la larva en estadio 3 avanzado (L3A) y su posterior identificación. Aunque las especies son diferenciables morfológicamente, G. binucleatum y G. spinigerum son muy parecidas, por lo que las técnicas moleculares pueden ser de ayuda para su clasificación (Bertoni-Ruiz et al., 2011; Cernotíková et al., 2011; Jongthawin et al., 2015). Introducción 44 Las técnicas de inmunodiagnóstico desarrolladas hasta el momento están basadas en: i) detección de antígeno circulante en suero siendo indicador de infección activa. Estas técnicas muestran unos valores muy bajos de sensibilidad ya que los niveles de antígeno circulantes son escasos (Chaicumpa, 2010; Thiangtrongjit et al., 2021), ii) detección de anticuerpos IgG frente a antígenos somáticos y antígenos de excreción-secreción de larva L3 indicando exposición. Con estos antígenos los valores de sensibilidad (59–87%) y especificidad (79– 96%) no han sido óptimos (Maleewong et al., 1988). Se ha empleado la técnica Western blot detectando IgG totales con reactividad frente a la proteína de 24kDa (Tapchaisri et al., 1991). Además, se ha conseguido obtener mejores valores diagnósticos al detectar únicamente la subclase IgG4, con una sensibilidad del 91,6% y especificidad de 87,8% (Laummaunwai et al., 2007). También, se ha desarrollado un test rápido de detección de IgG4 con reactividad frente a la proteína de 24kDa del extracto de las L3. El test puede aplicarse tanto a suero como a muestras de sangre total, por lo que esta herramienta podría ser de utilidad para el diagnóstico en campo y en la monitorización de pacientes en tratamiento. Su mayor limitante es el elevado porcentaje de reacciones cruzadas que presenta frente a otras helmintosis (Janwan et al., 2021; Y. Wang et al., 2021). Pese a obtener los mejores resultados con el antígeno crudo procedente de las larvas, el proceso de preparación de antígeno es complejo, largo, dependiente de las condiciones ambientales y de las fuentes naturales para obtener las larvas; además, no se puede asegurar la reproducibilidad interlote (Thiangtrongjit et al., 2021). 3. Técnicas de multiplexado basadas en MBA La técnica del multiplexado MBA, del inglés “multiplex bead assay”, es un método que permite analizar varios analitos de manera simultánea en una muestra usando microesferas. El sistema Luminex® 100/200™ se basa en los principios de la citometría de flujo, permitiendo detectar hasta 100 analitos en un único pocillo. Para ello se emplean microesferas magnéticas teñidas con una combinación de dos fluoróforos (rojo e infrarrojo) espectralmente diferentes definiendo cada set. Cada microesfera está recubierta con grupos carboxilos, que permiten acoplar diferentes analitos a las mismas Introducción 45 mediante un enlace covalente. Estas microesferas son identificadas tras la excitación de los colorantes internos por un láser de una longitud de onda de 635 nm (láser rojo), permitiendo distinguir el set. A continuación, otro láser de 532 nm (láser verde) excita el fluoróforo correspondiente al “reporter”, que permite detectar el analito objeto de estudio en el ensayo y cuantificarlo (intensidad de fluorescencia). En la presente Tesis Doctoral, los analitos empleados han sido antígenos recombinantes de distintas especies de helmintos, que se han acoplado a diferentes sets de microesferas para la detección de anticuerpos específicos en muestras de suero humano. El “reporter” utilizado en el inmunoensayo ha sido la estreptavidina conjugada con R- ficoeritrina (SAPE). El hecho de permitir multiplexar un elevado número de antígenos hace que esta tecnología sea especialmente útil a nivel epidemiológico. Otra de las fortalezas de esta tecnología es la posibilidad de hacer paneles sindrómicos, en los que se analizan y cuantifican varios agentes etiológicos que causan una sintomatología similar, permitiendo un cribado rápido, dirigido y ahorrando muestra analítica. Además, permite realizar un diagnóstico más exacto al permitir la detección de varios marcadores de una misma patología, aumentando la sensibilidad y especificidad diagnóstica. En el campo de la parasitología, esta tecnología ha sido utilizada con diferentes fines. Se ha empleado para la evaluación simultánea de múltiples candidatos para el diagnóstico serológico de la esquistosomiasis (Tanigawa et al., 2015), para analizar su utilidad frente a otras tecnologías en el diagnóstico serológico de neurocisticercosis (Hernández-González et al., 2017a; Moss et al., 2018), para valorar el impacto de uso de redes mosquiteras en la carga de filariasis linfáticas y malaria (Plucinski et al., 2018) para la detección de inmunoglobulinas en el diagnóstico de tripanosomiasis africana (Priest & Handali, 2021). Recientemente para evaluar la intensidad de la transmisión del paludismo y de los mecanismos de resistencia a los insecticidas en zonas endémicas (Boussougou- Sambe et al., 2022). 4. Tecnologías de secuenciación El desarrollo del método químico de terminación de cadena por Maxam y Gilbert en 1977 (Maxam & Gilbert, 1977), seguido del método de los didesoxinucleótidos o Sanger ese mismo año (Sanger et al., 1977), permitieron realizar la secuenciación del ADN. Este último método de secuenciación fue el empleado en el Proyecto Genoma Humano, que finalizó con la publicación del genoma en 2004 (van Dijk et al., 2014). El Introducción 46 método de Sanger se basa en la incorporación de didesoxinucleótidos terminadores de cadena mediante la ADN polimerasa. Los fragmentos de ADN resultantes se desnaturalizan por calor y se separan por tamaño empleando un gel de electroforesis (van Dijk et al., 2018). Hoy día, tras el desarrollo de las técnicas de electroforesis capilar y su automatización, la metodología de secuenciación automática de Sanger continúa siendo de gran utilidad para aquellas aplicaciones que no requieren un alto rendimiento como puede ser la secuenciación de regiones concretas de ADN, en la que se diseñan cebadores específicos, por ejemplo, para verificar construcciones de plásmidos o productos de PCR (Slatko et al., 2018b). La secuenciación ha avanzado notablemente en las últimas décadas, y el desarrollo de las tecnologías de secuenciación masiva han supuesto un antes y un después en el ámbito de la investigación genómica. 4.1. Secuenciación de segunda generación La secuenciación de segunda generación o Next Generation Sequencing (NGS), también conocida como secuenciación masiva, permite generar millones de reacciones de secuenciación por carrera, realizando una amplificación clonal de moldes de ADN en una única celda de flujo o flow cell. El rendimiento de esta tecnología es tal que permite secuenciar organismos completos en cuestión de horas o pocos días en función de la longitud de su genoma. Otra ventaja frente a la secuenciación Sanger, es que no requiere la separación electroforética de los productos secuenciados. Sumado a la disminución del precio de secuenciación, esto ha hecho de esta tecnología una herramienta clave en el campo de la biología básica, así como a nivel de la investigación clínica (van Dijk et al., 2018). Los métodos de secuenciación de segunda generación se pueden agrupar en dos categorías principales: 1) secuenciación por hibridación 2) secuenciación por síntesis. La segunda metodología, secuenciación por síntesis, es la que emplea la tecnología Illumina, siendo esta plataforma una de las líderes en la industria de la secuenciación masiva. La técnica de secuenciación de Illumina se conoce como “amplificación puente”, ya que las moléculas de ADN (con un tamaño de 500bp aproximadamente), ligadas a adaptadores en cada extremo, se emplean como sustratos en las reacciones de síntesis mediante amplificación por una ADN polimerasa en un soporte sólido de vidrio, que contiene secuencias de Introducción 47 oligonucleótidos complementarias al adaptador ligado al ADN. Los oligonucleótidos en el soporte están distribuidos espacialmente, de modo que, tras varias etapas de amplificación del ADN, se crean clústeres clonales consistentes en 1000 copias de cada fragmento de oligonucleótidos. En cada soporte de vidrio se producen millones de reacciones de clúster paralelas. Durante las reacciones de síntesis, se incorporan nucleótidos modificados que se corresponden con cada una de las cuatro bases, con una etiqueta fluorescente diferente, que permite su detección e identificación. Los nucleótidos también actúan como terminadores de síntesis en cada reacción, estos son liberados tras su detección para la siguiente etapa de síntesis. Las reacciones se repiten durante al menos 300 veces (Slatko et al., 2018a). En función del objetivo de la secuenciación masiva, existen diferentes protocolos (secuenciación genómica, metagenómica, ADN, ARN, CHIP-seq …), así como diferentes metodologías de preparación de librerías, y distintos equipos de secuenciación. Entre los equipos de Illumina cabe destacar NextSeq y NovaSeq. NextSeq puede proporcionar un máximo de 120 Gb con 400 millones de lecturas paired-end por carrera con una longitud de 150 pb (2x150). NovaSeq proporciona un máximo de 6000 Gb con 20 billones de lecturas paired-end por carrera con una longitud máxima de 250 pb (2x250) (Slatko et al., 2018b). Pese al enorme potencial y la gran utilidad de estas tecnologías de secuenciación de segunda generación, presentan ciertas limitaciones: una de las principales es la longitud relativamente corta de las lecturas generadas, lo cual dificulta el ensamblaje de genomas altamente repetitivos, de gran tamaño o que presentan un alto grado de complejidad. 4.2. Secuenciación de tercera generación La secuenciación de lecturas largas o secuenciación de tercera generación ha sido desarrollada por varias tecnologías, las dos más populares son Pacific Biosciences (PacBio) y Oxford Nanopore Technologies (ONT). PacBio desarrolló la tecnología SMRT, las siglas en inglés de ‘single-molecule real-time’, mientras que ONT emplea un nanoporo proteico para realizar la secuenciación (van Dijk et al., 2018). La principal diferencia con los de segunda generación es que no requiere amplificación clonal. En la tecnología de ONT, las bases del ADN se identifican mediante los cambios en la conductividad eléctrica que se generan Introducción 48 tras el paso de la cadena de ADN a través de un poro proteico (Lu et al., 2016). La aplicación de esta tecnología ha permitido avanzar tanto en el campo de la investigación básica como a nivel clínico, ya que se ha podido realizar la secuenciación completa de pequeños genomas utilizando únicamente lecturas procedentes de la secuenciación ONT (Loman et al., 2015; Miller et al., 2018). Las principales limitaciones de la secuenciación de lecturas largas, en comparación con la secuenciación de segunda generación, son: la mayor cantidad de ADN de partida requerido para la preparación de la librería y la mayor tasa de error de las lecturas generadas (van Dijk et al., 2018). En cuanto a los dispositivos comercializados para realizar la secuenciación, el más popular es el MiniION y, en el caso de requerir un mayor rendimiento, el PromethION, obteniendo un tamaño de lectura enmarcado en el rango de 10-100 kb (De Coster et al., 2019). 5. Genomas publicados en helmintos A pesar de la importancia a nivel clínica y económica de las enfermedades producidas por helmintos, la investigación genómica en estas especies presenta un desarrollo mucho menor en comparación con otros agentes etiológicos responsables de enfermedades infecciosas. Desde la publicación del genoma de referencia de la especie Caenorhabditis elegans en 1998, el genoma de este nematodo se ha refinado y mejorado tras numerosas actualizaciones (Davis et al., 2022). Actualmente, en la base de datos de genomas del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (Genome Database NCBI, 2022), tras realizar el filtrado empleando los campos “Nematoda (roundworms)” y “Reference genomes”, existen 176 genomas de nematodos disponibles. Entre ellos y en relación con la temática de la presente tesis se puede descargar el genoma de Loa loa, cuyo tamaño es 91,37 Mb y cuya fecha de publicación fue 2012. Otro de los genomas publicados es el de Angiostrongylus cantonensis, con un tamaño de 293,3 Mb, publicado en 2019. En el caso del género Gnathostoma no existe ningún genoma publicado. En platelmintos, tras filtrar por los campos “Platyhelminthes (flatworms)” y genoma de referencia, el número total de genomas obtenidos es 52. Entre ellos, se encuentra el genoma de Taenia solium, con un tamaño de 129,8 Mb, publicado en 2016. La base de datos WormBase ParaSite también recoge los datos publicados referentes a ensamblaje, anotación y las diferentes métricas de los genomas publicados de nematodos y platelmintos (WormBase Parasite, 2022). Introducción 49 5.1. Proyecto “50 genomas de helmintos” El Instituto Wellcome Sanger del Reino Unido, en colaboración con Instituto Genómico McDonnell de la Universidad de Washington (EE. UU) y Edinburgh Genomics de la Universidad de Edimburgo, crearon el proyecto “50 genomas de helmintos” para estudiar e investigar los genomas de helmintos con mayor repercusión en enfermedades humanas, agrícolas y veterinarias. El proyecto tiene como objetivo producir borradores de genomas de las principales especies parasitarias de humanos y animales, llenar el vacío filogenético en torno a las especies de helmintos e identificar las principales diferencias entre los distintos linajes parasitarios. Fruto de este proyecto de colaboración, se publicó en el año 2019 un artículo con la mayor comparación genómica entre helmintos parásitos y no parásitos realizada hasta el momento. Combinaron 36 genomas de nematodos ya publicados con 31 nuevos ensamblajes de nematodos y 14 nuevos ensamblajes de platelmintos y con la información generada identificaron familias de genes y procesos asociados a los principales grupos parasitarios. Finalmente extrajeron los datos de más de 1,4 millones de genes para predecir nuevos fármacos y posibles dianas farmacológicas (International Helminth Genomes Consortium, 2019). Este proyecto ha permitido sentar las bases para aumentar la información genómica disponible sobre los helmintos, sin embrago, aún queda un largo camino por recorrer, especialmente en aquellas enfermedades que se consideran olvidadas. Olvidadas no porque los casos sean esporádicos, sino porque no afectan a países desarrollados, aunque no dejan de suponer la muerte de miles de individuos. Esta Tesis Doctoral pretende ampliar y contribuir a disminuir la falta de información genómica relativa a helmintos para que, en un futuro, se puedan desarrollar herramientas diagnósticas y alternativas terapéuticas, que contribuyan a disminuir la prevalencia e incluso eliminar estas parasitosis. Hipótesis y objetivos 50 III.HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipótesis de trabajo planteadas: 1. Ensayos serológicos basados en el antígeno recombinante T24H sugieren la utilidad potencial de este marcador en la identificación de áreas activas de cisticercosis. 2. La presencia de filarias del género Mansonella en zonas endémicas de loasis podría afectar a la eficacia de los sistemas empleados actualmente para la detección de anticuerpos frente a Loa loa. 3. La existencia de ratas (Rattus rattus, Rattus norvegicus) y moluscos (Plutonia lamarckii, Cornu aspersum y Theba pisan) naturalmente infectados con Angiostrongylus cantonensis, junto con la ausencia de herramientas de diagnóstico/vigilancia en humanos hacen muy probable la aparición de casos autóctonos de neuroangiostrongilosis en nuestro país. 4. La ausencia de información genómica de Gnathostoma spinigerum, agente productor de meningoencefalitis eosinofílicas, supone un impedimento para el desarrollo de técnicas de diagnóstico y vigilancia. El objetivo principal de la Tesis Doctoral es aportar conocimiento al desarrollo e innovación de las herramientas actuales para la vigilancia y /o el diagnóstico serológico de las siguientes helmintosis de interés sanitario: cisticercosis, loasis y meningoencefalitis eosinofílicas de origen parasitario. Para la consecución del objetivo general se formulan los siguientes objetivos específicos: 1. Realizar una investigación histórica de las helmintosis objeto de estudio. 2. Optimizar y validar herramientas serológicas de multiplexado basadas en el antígeno recombinante T24H para identificar regiones de alta endemicidad de cisticercosis en diferentes áreas geográficas. 3. Evaluar la utilidad de marcadores serológicos de loasis en zonas endémicas de oncocercosis. Hipótesis y objetivos 51 4. Valorar candidatos para el diagnóstico serológico de meningoencefalitis eosinofílicas producidas por Angiostrongylus cantonensis y Gnathostoma spinigerum. 5. Secuenciar y ensamblar de novo el genoma de Gnathostoma spinigerum. Capítulo 1 52 IV. CAPÍTULO 1. Investigación histórica de las helmintosis objeto de estudio Las enfermedades producidas por helmintos ya fueron descritas en la época de la terapéutica pretécnica; de hecho, en el papiro de Ebers, ya se cita la extracción de un gusano enrollando su extremo en un palo y estirando suavemente, haciendo referencia a Dracunculus medinensis, helminto al que algunos autores asocian con el símbolo de la farmacia y la profesión farmacéutica (Prats, 2012). En el presente capítulo se ha realizado una búsqueda bibliográfica plasmando la historia de las helmintosis objeto de estudio de la Tesis Doctoral. 1.1. Teniasis/cisticercosis En la Grecia Antigua, Aristóteles (384-322 a .C) hizo mención a los cisticercos en su tratado “Historia de los animales”, sin embargo, los describió como una enfermedad de los cerdos y no se asociaba a una posible parasitosis en humanos (Fabiani & Bruschi, 2013). En los textos de Hipócrates, tampoco se encuentra ninguna descripción que permita asociar los cisticercos a la patología humana. A lo largo del siglo XVI y XVII, varios autores (Rumler, Panaroli, Wharton), hicieron referencia a la existencia de los cisticercos, pero no asociaron estas estructuras con ninguna enfermedad parasitaria. La primera vez que se reportó esta asociación fue en 1688 por Hartmann y en 1697 por Malpighi. En paralelo, en 1683, Tyson describe el escólex de las tenias, iniciando la identificación morfológica de los estados adultos. No fue hasta 1784, cuando Johann Goeze estableció en sus estudios que los cisticercos se correspondían con estadios larvarios del cestodo Taenia solium (Cox, 2002). Van Beneden demostró de manera experimental en 1853, que esta especie es la causante de la cisticercosis, al alimentar a cerdos con huevos de Taenia solium. En 1855, Küchenmeister confirmó el desarrollo de cestodos adultos a partir de los cisticercos, al realizar un ensayo éticamente cuestionado, tras introducir cisticercos en la comida de un preso condenado a muerte. Tras la ejecución, se encontraron los cestodos adultos en el intestino del condenado. En 1856, Ransom examinó microscópicamente muestras de heces, localizando huevos de T. solium, y de esta manera estableció la observación microscópica como técnica diagnóstica de teniasis intestinal (Grove, 1991). La cisticercosis, como patología, se definió por primera vez en 1858. El descubrimiento de los Rayos X por Roentgen en 1895, y su posterior presentación en 1896, que le permitió obtener el premio Nobel de Física en 1901 (Marcelo Capítulo 1 53 Gálvez, 2013), fueron claves para que Roth en el año 1926 identificara los cisticercos calcificados empleando radiografías (Grove, 1991). Yoshino realizó un seguimiento de la teniasis en humanos, para ello se autoadministró cisticercos provenientes del cerdo en 1933, y reportó que todos los días expulsaba hasta cinco proglótides en sus heces (Rodríguez Pérez, 2013). La comprensión del ciclo biológico de T. solium proporcionó las bases para establecer unas medidas de control efectivas. Küchenmeister, en 1855, describió la implicación del hábito de comer carne de cerdo cruda en la patología y recomendó como método para prevenir la infección, cocinar la carne de cerdo. Otros de los aspectos contemplados fueron mejoras de las condiciones de higiene, especialmente relacionadas con la eliminación de excrementos humanos. Se determinó que se debía evitar fertilizar los huertos con heces de origen humano, debido al riesgo de transmisión tras el consumo de vegetales contaminados. El tratamiento con antihelmínticos efectivos, medidas de higiene personal, la adecuada eliminación de las aguas residuales, las inspecciones y vigilancia de la carne de cerdo, la eliminación adecuada de los especímenes infectados, y el mantenimiento de la cadena del frío, permitieron reducir los casos de teniasis y cisticercosis, en aquellos países en lo que instauraron estas medidas (Grove, 1991). Las técnicas de imagen avanzaron desde la aplicación de los rayos X en 1896. En 1946, los físicos Edward Purcell y Felix Bloch describen la técnica de la resonancia magnética nuclear, hito que les permitió obtener el premio Nobel de Física en el año 1952 (Marcelo Gálvez, 2013). En ese mismo año, Herman Carr empleando un gradiente de campo magnético, dio un paso decisivo para la obtención de imágenes por resonancia magnética. En 1970, Godfrey Housfield consiguió la primera imagen de la tomografía computada, modificando la manera de visualizar las estructuras internas, en 1972 se obtuvieron las primeras imágenes cerebrales (Marcelo Gálvez, 2013), claves para el diagnóstico por imagen de las parasitosis cerebrales. En 1973 se publicó la primera imagen de RMN por Paul Lauterbur. Instalándose escáneres de resonancia magnética en hospitales a principios de 1980 en EE.UU. El diagnóstico de la neurocisticercosis avanzó sustancialmente en la época de los años 90 (1990), cuando se desarrolló el actual método de referencia serológico el denominado LLGP- EITB (Tsang et al., 1989). El desarrollo de las técnicas moleculares, fundamentalmente la PCR, cuya primera publicación se remonta a 1971 (Kaunitz, 2015), han permitido realizar un diagnóstico más preciso, sobre todo aumentar el conocimiento genómico-genotípico de la especie Taenia solium. Capítulo 1 54 Además, se desarrollaron varias vacunas TSOL18, SP3Vac, KETc7 y TSOL45 de aplicación en el ganado porcino, con buenos resultados en los ensayos clínicos (Kaur et al., 2021). Actualmente hay disponible una versión la proteína TSOL18, producida en Pichia pastoris comercializada como Cysvax™, que puede utilizarse en combinación con el antihelmíntico oxfendazol para controlar la cisticercosis porcina. Sin embargo, aún es necesario explorar mecanismos de financiación y de suministro de la vacuna y del fármaco (Ouma et al., 2021), además de desarrollar herramientas para la detección de portadores y enfermos en zonas endémicas, para poder hacer efectivo el control de la enfermedad. 1.2. Hidatidosis La hidatidosis o equinococosis quística (CE) fue descrita por Hipócrates (460- 379 a.C), el cual considera al quiste hidatídico como una vejiga con agua (traducción del griego hydatidos). En sus Aforismos se menciona: “A todos aquellos, cuyo hígado, tras llenarse de agua, revienta dirigiéndose hacia el “epiplón”, a esos se les llena de agua el vientre, y entonces mueren” (Tratados hipocráticos, Volumen I, 1990). El Talmud de Babilonia (siglos IV- VI d.C) hace referencia a la existencia de vesículas en hígado de rumiantes (Rodríguez Pérez, 2013). Galeno (129-206 d.C) también describió esta enfermedad tras realizar necropsias en animales. Redi en el siglo XVII fue el primero en determinar la naturaleza parasitaria de los quistes hidatídicos, aunque se reconoció el mérito del descubrimiento al clínico e historiador alemán Pierre Simon Palla en 1766. Carl von Siebold demostró en 1853 que los quistes de Echinococcus de las ovejas daban lugar al estadio adulto en los perros, al alimentar a los perros con estos quistes. En 1863 Bernhard Naunyn determinó la presencia de adultos de Echinococcus en perros, que habían sido alimentados con quistes hidatídicos humanos, desmintiendo el error que consideraba que los humanos y perros eran parasitados por especies distintas. (Cox, 2002). En 1855, Küchenmeister argumentó uno de los puntos cardinales en el control de la hidatidosis, había que evitar alimentar a animales domésticos con vísceras procedentes del ganado, especialmente aquellas en las que se evidenciaba la presencia de vesículas (Grove, 1991). El primer programa de control de hidatidosis se realizó en Islandia en Capítulo 1 55 1863. Se reconoció a la enfermedad como relevante para la salud humana, y se establecieron comités de expertos que elaboraron informes con medidas para prevenir la transmisión, como el que se redactó en Argentina en el año 1906 (Lightowlers, 2013). No fue hasta mediados de siglo, tras el éxito de las medidas tomadas en Islandia, cuando empezó a preocupar la enfermedad y se instauraron medidas en otras regiones (Lightowlers, 2013). El programa de control implementado en España en el año 1986 en la Rioja, consistió en documentar la prevalencia de hidatidosis en el ganado ovino y en humanos, sensibilizar a la población informando sobre los riesgos de esta enfermedad y el tratamiento de todos los perros registrados con praziquantel a intervalos de 45 días (S. Jiménez et al., 2002). Tras la implementación de estas medidas, la información epidemiológica derivada concluyó que los perros callejeros suponían el mayor reservorio de E. granulosus, por lo que era necesario controlar estas poblaciones de cánidos. Otra de las medidas a implementar fue la administración de fármacos para el tratamiento de E. granulosus en perros dedicados al pastoreo, así como promover los medios para la eliminación segura de despojos de ganado u ovejas muertas en fosas sanitarias. Estas medidas permitieron reducir la prevalencia tanto en perros, en el ganado ovino, así como en humanos (S. Jiménez et al., 2002). En los últimos años, las pruebas diagnósticas han mejorado en la detección de hidatidosis en perros (Lightowlers, 2013). Además, en el año 2005 se desarrolló una vacuna para el hospedador intermediario (oveja), la vacuna emplea el antígeno recombinante EG95, procedente de la oncosfera. Esta permite interrumpir el ciclo de vida de E. granulosus, previniendo la transmisión de perros a humanos (Gauci et al., 2005). 1.3. Loasis El primer caso documentado y publicado de loasis lo realizó en 1770 el cirujano francés, Mongin, quien describió un gusano recorriendo la conjuntiva del ojo en una mujer en Santo Domingo (Cox, 2002). Previamente había sido reconocido por habitantes de las regiones de África Central y Occidental, en las que es endémica, pero no se llegó a documentar. La primera extracción ocular de un adulto de Loa loa realizada con éxito se atribuye a William Loney en 1848. Las microfilarias fueron identificadas gracias a la colaboración entre el oftalmólogo Stephen McKenzie y Patrick Manson en 1890, tras examinar una muestra de sangre de un paciente que se pensaba que padecía la enfermedad del sueño (Manson, 1891). A diferencia de las previamente descritas de W. bancrofti, Capítulo 1 56 estas microfilarias presentaban periodicidad diurna. En un principio se denominaron Filaria sanguinis hominis diurna, posteriormente F. diurna y finalmente, tras estudiar Low y Huffman los embriones de un adulto vivo de L. loa, se consideró la misma especie, pasando a denominarse microfilaria de Loa loa. En 1895, el cirujano y oftalmólogo Douglas Argyll-Robertson junto con Manson describieron la morfología de las hembras y machos de Loa loa en su fase adulta (Grove, 1991). El denominado edema de Calabar fue descrito por primera vez en ese mismo año, en la región de Viejo Calabar en Nigeria, por Argyll-Robertson, aunque no fue hasta 1910 cuando Manson lo asoció con la parasitación por Loa loa. La implicación de los tábanos del género Chrysops en la transmisión, fue esclarecida por el helmintólogo británico Robert Thompson Leiper en 1912 (Cox, 2002). Aunque el diagnóstico se basa en la observación del adulto de Loa loa en la conjuntiva ocular, no se evidencia su presencia en el ojo en todos los pacientes con loasis, en 1914, Smith y Rivas realizaron la primera técnica de concentración para la detección de microfilarias en muestras de sangre aplicada a casos de loasis (Grove, 1991). En el año 1997 se publicaron los primeros artículos en relación a la loasis y los graves efectos adversos tras la administración masiva de fármacos para el tratamiento de oncocercosis (Gardon et al., 1997). En la actualidad, la loasis no se incluye dentro de la lista prioritaria de enfermedades tropicales desatendidas de la OMS (World Health Organization, 2020a), pese a que los informes indican que la loasis es una enfermedad de importancia en salud pública con una elevada mortalidad en individuos altamente parasitados (Whittaker et al., 2018). Este es uno de los motivos por los que sigue existiendo una alta prevalencia de la enfermedad, especialmente importante en regiones donde la oncocercosis y las filariasis linfáticas son co-endémicas, aunque no exclusivamente (Metzger & Mordmüller, 2014b; Whittaker et al., 2018). De este modo, es clave desarrollar técnicas diagnósticas que permitan conocer la situación real de esta parasitosis para poder realizar las estrategias de control. 1.4. Gnathostomosis Richard Orwen en 1836 describió el género Gnathostoma tras el hallazgo de parásitos adultos en el estómago de un tigre de Bengala (Felis tigris), denominando a la especie G. spinigerum (Herman & Chiodini, 2009). El nombre proviene de las palabras griegas γνάθο (GNATHOS) y στόμα (STOMA), que significan mandíbula y boca, Capítulo 1 57 respectivamente; mientras que “spinigerum” hace referencia al anillo de espinas que presenta el parásito en la parte posterior. El primer caso de gnathostomosis en humanos fue descrito por Levinson en 1889. El parásito fue identificado en un tumor abdominal de una mujer en Tailandia por el doctor Deunzer (Daengsvang, 1949; Grove, 1991). El helminto se envió a Levinson, el cual lo denominó Cheiracanthus siamensis. Posteriormente, se transfirió al género Gnathostoma, convirtiéndose en G.siamense en 1893 por Railliet y fue finalmente Leiper quien demostró que era la misma especie que G. spinigerum (Grove, 1991). El primer caso mortal fue reportado por Chitanondh y Rosen en 1967, la mujer de origen tailandés con meningitis eosinofílica desarrolló una parálisis progresiva ascendente, y tras realizar la autopsia, se localizó la forma parasitaria en la médula espinal (Chitanondh & Rosen, 1967). Aproximadamente cien años después de haber descrito el género, se logró dilucidar el ciclo de vida del parásito. En 1912, Mitter localizó al helminto en un perro, un gato y un leopardo. Posteriormente, en 1925 Chandler publicó haber encontrado al parásito en el 10-30% de los gatos examinados post mortem en la India. También describió la presencia de larvas enquistadas en el mesenterio de serpientes procedentes de la India. Heydon detalló la eclosión espontánea de los huevos de G. spinigerum en el agua, obtenidos de un gato infectado. Prommas y Daengsvang demostraron experimentalmente la implicación del copépodo del género Cyclops como primer hospedador intermediario en 1933, describieron que en este hospedador la larva mudaba a su segundo estadio. Sus intentos de infectar gatos con copépodos infectados fracasaron, pero establecieron que se requería un segundo hospedador intermediario. Se observó en la especie Clarias batrachus (pez de agua dulce) que tras la ingestión de los Cyclops infectados, la larva en el segundo estadio migraba a los tejidos del pez, donde volvía a mudar, alcanzando el tercer estadio larvario (forma infectiva). Completaron el ciclo de vida experimentalmente infectando a los gatos con el pescado parasitado (Grove, 1991). En la publicación realizada por África y colaboradores (Africa et al., 1936), localizaron larvas en otras especies de peces de agua dulce naturalmente infectados, además del estadio adulto en un gato alimentado con un pescado infectado de la especie Glossobius giurus. Daengsvang y Tansurat demostraron que el 90% de las infecciones se producían en ranas (Rana rugulosa), 80% en anguila (Monopterus albus) y 30-40% en peces de agua dulce como Ophiocephalus striatus y Clarias batrachus. En 1954, Miyakazi reportó haber localizado larvas infectivas en cangrejos de río, anfibios, reptiles y múltiples Capítulo 1 58 mamíferos que se habían alimentado de pescado infectado, aunque el estadio adulto sólo se había localizado en el estómago de cánidos y félidos. Se reportó que el modo de transmisión en el humano sería mediante el consumo de pescado crudo o parcialmente cocinado (plato típico tailandés basado en pescado fermentado crudo) o de aves domésticas (pato o pollo) (Daengsvang, 1949; Grove, 1991). Actualmente, el diagnóstico de Gnathostoma spinigerum sigue muy focalizado en regiones donde la parasitosis es endémica, Sudeste Asiático, y en la mayoría de los centros se basan en el empleo de técnicas serológicas con preparados del antígeno crudo del parásito. En España, no se realiza el diagnóstico de laboratorio de esta parasitosis, teniendo que recurrir al envío de muestras a otros países. En este sentido, urge validar y desarrollar herramientas diagnósticas basadas en antígenos recombinantes sensibles y específicos que permitan realizar un diagnóstico serológico menos invasivo para el control de las infecciones importadas a nuestro país. 1.5. Angiostrongilosis En 1935 Chen aisló al helminto procedente del tracto respiratorio de dos especies de rata (Rattus norvegicus y Rattus rattus) en Canton (actual Guangzhou) en el sur de China (H.-T. Chen, 1935). El parásito se denominó Pulmonema cantonensis. En 1937, Yokogawa describió la misma especie, denominándola Haemostrongylus ratti, sin ser consciente de que era la misma previamente identificada por Chen. En 1946, Doughery transfirió la especie al género Angiostrongylus de Kamensky, nombrando a la especie como Angiostrongylus cantonensis. El primer caso humano se reportó en Taiwan en 1945, aunque permaneció enterrado en la literatura japonesa varios años. En este caso describían una meningitis en un varón de 15 años en el que encontraron formas parasitarias en el líquido cefalorraquídeo (Grove, 1991). El primer caso documentado data de 1962, Rosen y colaboradores describieron un caso de meningitis eosinofílica que provocó la muerte del individuo en Hawái (Rosen et al., 1962). En 1979, se reportó un brote de 259 casos en Taiwan (Graeff-Teixeira et al., 2009; Grove, 1991). En 1980 se reportó en Cuba uno de los primeros casos notificados en el continente americano de meningitis eosinofílica por este parásito (Dorta-Contreras et al., 2007). De acuerdo con los datos recopilados por Wang y colaboradores en 2008, el mayor número de casos humanos de angiostrongilosis se localizaron en Tailandia (1337 casos), seguido de China con 769 casos, Tahití (256 Capítulo 1 59 casos), Estados Unidos (116), seguido de Cuba (114), Nueva Caledonia (72) y Japón (63), entre los principales países (Q.-P. Wang et al., 2008) Mackerras y Sandars describieron el ciclo biológico de A. cantonensis en 1955. Identificaron muchas especies de babosas y varias especies de caracoles de tierra infectadas con el tercer estadio larvario. Además, encontraron las larvas infectivas en otras especies no pertenecientes a los moluscos; cangrejos, gambas de agua dulce, ranas… y estas se consideraron hospedadores paraténicos. Los autores concluyeron que la mayor parte de las infecciones en humanos, descritas en ese momento, se debían al consumo del caracol gigante africano, Achatina fulica, parcialmente cocinado (Grove, 1991; Mackerras & Sandars, 1954). En 2021, se reportó la presencia de ratas parasitadas por A. cantonensis en Valencia (Galán-Puchades et al., 2022), lo que indica la presencia del parásito y el posible riesgo de exposición de la población española. Además, en el caso de la angiostrongilosis, los brotes reportados en humanos no se delimitan a áreas exclusivas del Sudeste Asiático o a regiones menos desarrolladas con peores condiciones de saneamiento o de seguridad alimentaria. Al igual que sucede con G. spinigerum, las pruebas serológicas son de gran utilidad en el diagnóstico de esta parasitosis, aunque en nuestro país no están disponibles. Es necesario realizar la búsqueda de proteínas recombinantes con adecuadas propiedades diagnósticas que permitan realizar el cribado serológico para el control de los posibles brotes y el diagnóstico a nivel hospitalario. Capítulo 2 60 V. CAPÍTULO 2. Optimización y validación de herramientas serológicas de multiplexado basadas en el antígeno recombinante T24H para la identificación de regiones de alta endemicidad de cisticercosis Para la consecución de este objetivo se plantearon dos bloques de trabajo experimental que se muestran a continuación: 2.1. Diagnóstico serológico combinado de cisticercosis/hidatidosis. Comparación MBA frente a ensayos comerciales 2.1.1. Introducción La cisticercosis/neurocisticercosis (NCC) y la hidatidosis (CE) son infecciones parasitarias causadas por los estadios larvarios (metacestodos) de dos cestodos pertenecientes a la familia Taeniidae, Taenia solium y Echinococcus granulosus sensu lato, respectivamente. Ambas zoonosis están incluidas en la lista de enfermedades tropicales desatendidas. La cisticercosis es endémica en Asia, Latinoamérica y África Subsahariana, aunque también se diagnostica en regiones donde no se considera endémica debido a fenómenos migratorios (Trevisan et al., 2018). La hidatidosis presenta una distribución global, con una mayor prevalencia en zonas rurales de Asia Central, países de la cuenca mediterránea de Europa, Europa del Este, América del Sur y el Este de África (Larrieu et al., 2019). Su importancia en salud pública, así como el impacto económico, han sido reconocidas, a nivel global, en la lista elaborada por la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (ONUAA/FAO), como la primera y la segunda causa de mortalidad, respectivamente, dentro de las enfermedades vehiculizadas por alimentos contaminados con parásitos (FAO/WHO (Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization), 2014). Uno de los objetivos de la OMS para el control de la cisticercosis (NTD 2021–2030 roadmap) se basa en intensificar el control de esta patología en áreas hiperendémicas de 17 países endémicos (CystiTeam Group for Epidemiology and Modelling of Taenia solium Taeniasis/Cysticercosis, 2019; Dixon et al., 2021). Para ello, es necesario invertir en el desarrollo de técnicas de diagnóstico, que permitan realizar estudios epidemiológicos de calidad para identificar dichas áreas. Capítulo 2 61 Aunque las técnicas de imagen son las que permiten establecer un diagnóstico definitivo tanto de NCC como CE, (Brunetti et al., 2018; Del Brutto et al., 2017), los métodos de diagnóstico serológico también están incluidos entre los criterios diagnósticos de NCC (H. H. Garcia, O’Neal, et al., 2018). Estas pueden ser una herramienta útil para un cribado primario de áreas susceptibles de realizar programas de control. Sin embargo, las actuales técnicas serológicas comercializadas no presentan los formatos, ni las propiedades diagnósticas adecuadas (H. H. Garcia, Castillo, Gonzales, Bustos, Saavedra, Jacob, Del Brutto, Wilkins, Gonzalez, Gilman, & Cysticercosis Working Group in Peru, 2018). Respecto a esta última, una de las causas es la reactividad cruzada que existe entre las dos enfermedades parasitarias (CE y NCC), así como con otros parásitos, especialmente relevante en áreas donde coexisten ambas parasitosis (Montenegro et al., 1994; Tappe et al., 2009). El objetivo del estudio desarrollado en este capítulo fue evaluar las propiedades diagnósticas de los antígenos recombinantes T24H frente a neurocisticercosis y 2B2t frente a hidatidosis, mediante una técnica de inmunodiagnóstico combinada que permite el diagnóstico simultáneo de ambas patologías, empleando la misma muestra de suero. Además de la comparación de los resultados obtenidos con los de dos técnicas serológicas comerciales para el diagnóstico de las mismas parasitosis. 2.1.2 Material y métodos Obtención de antígeno recombinante T24H Expresión proteica La proteína de fusión se obtuvo a partir de bacterias Escherichia coli de la cepa BL21 (F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB –mB –) [malB+ ]K-12(λ S)) transformadas con el plásmido pGEX6P (Cytiva) conteniendo la secuencia correspondiente a T24H (GenBank: AY211879.1) junto a 6 residuos de histidinas (18 nucleótidos adicionales en el extremo carboxilo terminal). Este plásmido recombinante había sido obtenido previamente en el laboratorio de Helmintos del Centro Nacional de Microbiología. La cepa recombinante se inoculó en 400 ml de medio de cultivo Luria Bertani (LB) en presencia de ampicilina, a una temperatura de 37°C, en agitación constante a 220 rpm. Como inductor de la expresión se utilizó IPTG (isopropil-β-D-1- Capítulo 2 62 tiogalactopiranósido, (IPTG, I6758, Sigma-Aldrich)) a una concentración final de 0,5 mM cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica de 0,7 a 600 nm. La inducción se mantuvo alrededor de 16 horas a 16ºC en agitación a 220 rpm. La expresión de la proteína recombinante se verificó mediante electroforesis en gel de acrilamida al 12,5% de una alícuota del medio de cultivo antes y después de añadir el inductor. Purificación del antígeno recombinante Tras la incubación, las bacterias se separaron del medio de cultivo por centrifugación a 4ºC a una velocidad de 11.000 rpm durante 30 minutos. Tras desechar el sobrenadante, el sedimento bacteriano se resuspendió en 20 ml de tampón de lisis (B- PER, Thermo Scientific). Después de una hora en agitación a temperatura ambiente, el lisado se centrifugó a 18.000 rpm durante 30 minutos a 4°C para separar la fracción soluble de la insoluble. La purificación de la proteína presente en la fracción soluble se realizó mediante un sistema de cromatografía de afinidad en dos pasos aprovechando las dos etiquetas fusionadas a la proteína: 1) Glutatión-S-Transferasa (GST) y 2) una cola de seis histidinas. El primer tipo de cromatografía realizada fue a través de una columna de sefarosa de glutatión con afinidad por la GST, (Glutathione Sepharose 4B, GE Healthcare) y el segundo tipo, dada la elevada afinidad selectiva que presenta el ion Ni2+ por las histidinas, empleó una columna de níquel sefarosa (Ni Sepharose 6 Fast Flow, GE Healthcare), lo que se denomina cromatografía de afinidad de metal iónico inmovilizado, IMAC (del inglés, Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography). Se siguió el protocolo de purificación descrito por Hernández-González y colaboradores (Hernández- González et al., 2017b). Primero se pasó el lisado por una columna de glutatión-sefarosa. Como tampón de lavado se utilizó PBS. La proteína retenida se eluyó de la columna con L-glutationa reducida a 10 mM (Sigma-Aldrich). La proteína eluida se pasó a continuación por la columna de sefarosa de níquel. El tampón de lavado de la columna contenía NaH2PO4 a 50 mM, NaCl a 300 mM e imidazol a concentración de 40 mM. La proteína fue eluida a una concentración de imidazol de 500 mM. El antígeno recombinante purificado se dializó frente a PBS en cassetes Slide-A-Lyzer™ Dialysis Cassettes (ThermoFisher Scientific) con un poro de membrana de 20 kDa. Tras la diálisis se cargó una alícuota en un gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 12% para confirmar la presencia de la proteína con un peso de 36 kDa y así poder corroborar el éxito de la purificación (Figura 4.1.1). Capítulo 2 63 La concentración de la proteína se calculó mediante el método colorimétrico el kit Pierce BCA Protein Assay Kit (ThermoScientific), y con una curva patrón de albúmina sérica bovina (BSA) en gel de acrilamida al 12%. Posteriormente, se mantuvo congelada a -80ºC hasta su utilización. Obtención de antígeno recombinante 2B2t Expresión proteica El plásmido recombinante con el gen de la proteína 2B2t (Hernández-González et al., 2012) fue cedido por la Dra. Siles-Lucas del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología (IRNASA) de Salamanca. La subclonación del gen, al que se añadió la secuencia correspondiente a 6 residuos de histidina en el extremo carboxi terminal (etiqueta His), se había realizado previamente en el Laboratorio de Helmintos del Centro Nacional de Microbiología empleando el vector de expresión pGEX-6P1 (Cytiva). Las células competentes utilizadas para la transformación de esta construcción fueron BL21-CodonPlus-RIL de Escherichia coli (Agilent Technologies). La expresión proteica se indujo con IPTG a 0,1 mM sobre el cultivo, en medio LB con ampicilina, de la cepa recombinante cuando este alcanzó una densidad óptica de 0,7 medida a 600 nm. La inducción se mantuvo a 37ºC con agitación a 220 rpm durante tres horas. Purificación del antígeno recombinante Al igual que en la anterior proteína rT24H, se realizó una doble purificación basada en cromatografía de afinidad de la fracción soluble obtenida tras la lisis bacteriana siguiendo el mismo protocolo de doble purificación: una primera purificación mediante columna de glutatión sefarosa y una segunda en columna de níquel sefarosa. Tras la elución de la proteína retenida en la columna Ni Sepharose 6 Fast Flow con 500 mM de imidazol, el producto eluido se sometió a diálisis frente a PBS en cassetes Slide-A- Lyzer™ Dialysis Cassettes (ThermoFisher Scientific) con un poro de membrana de 20 kDa. Posteriormente, se comprobó la pureza e integridad de la proteína r2B2t expresada y producida, mediante SDS-PAGE con geles de poliacrilamida al 12%. La concentración proteica se cuantificó mediante el método colorimétrico BCA y por comparación con una curva patrón de BSA. La proteína se conservó congelada a -80ºC hasta su utilización. Capítulo 2 64 Colecciones de sueros humanos Los sueros empleados en la realización de este capítulo proceden de diferentes hospitales o centros de referencia. Aquellos de pacientes con neurocisticercosis y los procedentes de pacientes con otras enfermedades infecciosas se obtuvieron del Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía de México. Se obtuvo el consentimiento informado escrito de todos los pacientes para el almacenamiento y uso con fines de investigación de las muestras de suero. En el caso de los sueros de hidatidosis, estos se obtuvieron de pacientes atendidos en el Servicio de Enfermedades Infecciosas y Tropicales del Hospital “Fondazione I.R.C.C.S. Policlinico San Matteo” de Pavia (Italia). Todos los sueros fueron anonimizados. El comité de ética para el uso de estos sueros es: “Acceptance Report 2015041 06/07/2015”. Todas las muestras se almacenaron en el repositorio C.0003989 del Biobanco del Instituto de Salud Carlos III. El número total de muestras con el que se realizó el estudio fue 356: 126 de pacientes con neurocisticercosis, 151 de pacientes con hidatidosis y 79 controles negativos. El diagnóstico de los pacientes con neurocisticercosis se basó en las imágenes radiológicas, y se dividieron en casos activos (con quistes viables) e inactivos (quistes no viables). Los pacientes con hidatidosis se diagnosticaron mediante el hallazgo de signos patognomónicos en ecografía (estándar de referencia). El estadio quístico se estableció de acuerdo con los criterios de clasificación descrito por el grupo de trabajo de equinococosis (WHO Informal Working Group on Echinococcosis (WHO-IWGE)) (Brunetti et al., 2010). A la hora de realizar el análisis, se agruparon las muestras de hidatidosis en activas (CE1-CE3b) e inactivas (CE4-CE5). Las muestras negativas de pacientes no infectados procedían de: 49 donantes sanos sin signos ni síntomas clínicos de NCC ni CE, y habían sido cribados para la donación de sangre (incluida la ausencia de otras enfermedades infecciosas de transmisión sanguínea); 15 procedían de pacientes mexicanos sin síntomas neurológicos, ni CE, y 15 se correspondían con sujetos con otros trastornos neurológicos, entre ellos neuritis óptica (n=6), esclerosis múltiple (n=3), aneurisma (n=1), tumor cerebral (n=2), paraparesia espástica (n=1), fístula de líquido cefalorraquídeo (n = 1) e hidrocefalia crónica (n = 1). Capítulo 2 65 En la siguiente tabla se resumen los sueros empleados y la clasificación dentro de cada set de sueros: Tabla 2.1.1. Muestras de sueros humanos. Características y división de los sueros evaluados. Categorías N NCC (set 1) Quistes viables (activos) 48 Quistes no viables (inactivos) 63 Desconocidos 15 Total NCC 126 CE (set 2) CE1-CE3b (activos) 77 CE1 4 CE2 2 CE3a 19 CE3b 52 CE4-CE5 (inactivos) 74 CE4 54 CE5 20 Total CE 151 Negativos a NCC y CE (set 3) 79 Nº total de sueros 356 CE= Hidatidosis NCC= Neurocisticercosis; N= número de sueros. Tecnología MBA Las proteínas recombinantes expresadas y purificadas se acoplaron a la superficie de microesferas magnéticas (Bio-Plex Magnetic COOH Beads, Bio-Rad), siguiendo el protocolo realizado por Hernández-González y colaboradores (Hernández-González et al., 2017a). La proteína rT24H se acopló a la concentración previamente establecida de 1 μg de proteína por 1.25*10E6 microesferas. En el caso de la proteína r2B2t, se probó un rango de concentraciones de 2 μg a 25 μg de proteína por 1.25*10E6 de microesferas, con el objetivo de seleccionar aquella con la que se consiguiera mayor fluorescencia con Capítulo 2 66 los controles positivos. Cada proteína se acopló a un tipo de microesfera diferente, cada una con un código de referencia: la proteína rT24H se acopló a microesferas con el código 72 (MC10072-01) y la proteína r2B2t a microesferas con el código 35 (MC10035-01). En el inmunoensayo ambas esferas se probaron en el mismo pocillo. En cuanto al inmunoensayo, se emplearon las placas negras de fondo plano de 96 pocillos (Costar, Fisher Scientific) y se siguió el protocolo descrito por Anderson et al (Anderson et al., 2015, p. 1) añadiendo una etapa previa de preadsorción de los sueros con extracto de E. coli. Las muestras de suero se aplicaron en una dilución 1:100 en PBS- Tween al 0,3% con leche desnatada al 5% y lisado de E. coli al 5% (procedente de las células BL21 CodonPlus RIL), se incubaron las muestras a 37ºC durante una hora con agitación. El lisado de E. coli se obtuvo según el procedimiento descrito por Crestani y colaboradores (Crestani et al., 2016). Las muestras se testaron por duplicado aplicando 50 μl de los sueros diluidos en dos pocillos. Sobre cada pocillo con las muestras se añadieron 50 μl de PBS-Tween20 al 0,3% junto con leche desnatada 5% conteniendo 2500 μl de microesferas acopladas a r2B2t y 2500 μl de microesferas acopladas a rT24H. Se incubaron con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las placas se lavaron en el lavador automático Biotek Magnetic Washer ELX50 mediante dos ciclos de lavado con 100 µl de PBS-Tween al 0,3% cada uno. A continuación, se añadieron 50 μl de anticuerpo anti-IgG humano biotinilado (Southern Biotech) a una dilución 1:200 en PBS, 1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,05% de azida sódica (NaN3). Las placas se incubaron en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras el lavado de la placa, se añadieron 50 μl de estreptavidina conjugada con R- ficoeritrina (SAPE) (Invitrogen) a una dilución 1:250 en PBS, BSA al 1%, NaN3 al 0,05%. Una vez finalizados la incubación y los lavados, tras añadir 100 μL de PBS, BSA 1% y NaN3 0,05% se leyeron los resultados en el equipo Bio-Plex™ 200 System (BioRad). Los valores de intensidad de fluorescencia correspondientes a los dos tipos de microesferas acopladas empleadas se analizaron empleando el software BioPlex manager software, version 5.0.0.531 (BioRad) y el equipo Luminex 200 platform (BioRad). Los parámetros seleccionados fueron: mínimo de 100 esferas con una firma fluorescente única por región; los resultados de intensidad de fluorescencia se reportaron con la mediana de intensidad de fluorescencia, del inglés median fluorescence intensity (MFI) por muestra. A partir del valor de MFI se calculó el índice serológico (MBA-SI) de acuerdo con la siguiente fórmula: Capítulo 2 67 Í𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑠𝑒𝑟𝑜𝑙ó𝑔𝑖𝑐𝑜 (𝑆𝐼) = 𝑀𝐹𝐼 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 – 𝑀𝐹𝐼 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑀𝐹𝐼 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 – 𝑀𝐹𝐼 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 Test ELISA comerciales Se realizaron dos ensayos serológicos disponibles comercialmente en formato ELISA con los mismos sueros seleccionados: Novalisa Taenia solium IgG (NovaTec Immundiagnostica GmbH, Dietzenbach, Alemania) para el diagnóstico de NCC y Ridascreen Echinococcus IgG (R-Biopharm AG, Darmstadt, Alemania) para el diagnóstico de EC. Ambas técnicas se realizaron siguiendo las indicaciones del fabricante. Los resultados de índice serológico obtenido (ELISA-SI) se interpretaron siguiendo lo establecido por el fabricante que considera 3 posibilidades de resultado: positivos, negativos y dudosos. Controles de las técnicas En cada placa de MBA, además de los sueros testados, se incluyeron otros sueros evaluados previamente, empleados como controles intra e inter-ensayo de MBA, para asegurar la repetitividad entre placas y la detección de controles positivos bajos. Se empleó un pool de sueros negativos humanos, un suero de paciente con NCC con un título medio de anticuerpos y un suero con título medio de anticuerpos procedente de un paciente de CE. Con cada uno de los sueros positivos se hicieron diluciones. El suero confirmado de NCC fue donado por el Dr. Handali del Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Division of Parasitic Diseases and Malaria (Atlanta, EE.UU ). El suero confirmado de CE había sido donado por el Hospital Universitario La Paz (Madrid, España). Análisis estadístico Los valores del índice serológico obtenidos con cada antígeno recombinante en MBA y los resultados como SI (índice serológico en Ridascreeen) y NTU (NovaTec Units) obtenidos con los ELISAs comerciales, se emplearon para elaborar las curvas ROC, del inglés, receiver operating characteristic (ROC) con el objetivo de: 1) determinar los puntos de corte, la sensibilidad y la especificidad de cada antígeno en el ensayo MBA, 2) comparar los resultados del ensayo MBA con los resultados de los Capítulo 2 68 ELISAs comerciales. La especificidad se calculó considerando todos los sueros (donantes sanos, pacientes con enfermedades neurológicas y los respectivos NCC o CE, en función de la patología que estaba siendo evaluada). Los resultados se analizaron empleando la aproximación no paramétrica de DeLong (DeLong et al., 1988). La prueba de homogeneidad de áreas Chi cuadrado fue la empleada para el cálculo de los p-valores (p), considerando como significativo p<0,05. Los datos se analizaron empleando los programas SSPP (versión 22) y EPIDAT (versión 3.1). Debido a que los resultados de las técnicas comerciales en formato ELISA se clasificaban como negativo, positivo y dudoso, a la hora de realizar el análisis estadístico se realizaron las tres aproximaciones posibles: 1) incluyendo los resultados dudosos en el grupo de los positivos, 2) incluyendo a los dudosos en el grupo de los negativos, 3) descartando los resultados dudosos. 2.1.3. Resultados Antígenos recombinantes (T24H y 2B2t) Tras la expresión y purificación de las proteínas recombinantes T24H y 2B2t se confirmó que la masa molecular de cada una se correspondía con la esperada; 36 kDa en el caso de la proteína rT24H y 45,6 kDa en el caso de la proteína r2B2t. Con respecto a la concentración final de cada una, la proteína rT24H se obtuvo a la concentración de 2,5 mg/ml y r2B2t a 0,1 mg/ml. La figura 2.1.1 muestra la integridad de ambas proteínas, así como la concentración de estas mediante la comparación con la curva estándar de BSA y la confirmación de sus masas moleculares. Figura 2.1.1. Integridad y concentración de las proteínas recombinantes rT24H y r2B2t. MK: marcador estándar de masa molecular en kDa. 1-7: Curva estándar de albúmina sérica bovina Capítulo 2 69 a concentraciones decrecientes (1: 1 mg/ml. 2: 0,5 mg/ml. 3: 0,25 mg/ml. 4: 0,125 mg/ml. 5: 0,062 mg/ml. 6: 0,0031 mg/ml. 7: 0,0015 mg/ml). 8: proteína rT24H a una dilución 1:20. 9: proteína r2B2t sin diluir. Tecnología MBA La concentración de proteína rT24H a la que se acoplaron las esferas fue 1μg/1,25*10E6 microesferas. El punto de corte (cut-off) para esta técnica MBA (SI- MBA) se estableció en el valor de índice serológico de 4,23, basándose en el análisis estadístico realizado con las curvas ROC. En este valor de corte, el resultado de sensibilidad para el diagnóstico de NCC fue 63,49%; la especificidad calculada con los sueros negativos tanto a NCC como CE (tabla 2.1.1, set 3) fue del 100%. Al incluir los sueros positivos a CE (tabla 2.1.1, set 2 y set 3) el valor de especificidad fue 91,3% (tabla 2.1.2). El valor de AUC de la curva fue 0,783 (figura 2.1.2, A). Tabla 2.1.2. Propiedades diagnósticas de las proteínas rT24H y r2B2t en MBA. Antígeno recombinante T24H Categorías de sueros N (+/-) Sensibilidad (%) IC 95% Especificidad (%) IC 95% Positivos NCC (set 1) 126 80/46 63,49 54,69 - 72,30 - - Activos NCC 48 37/11 77,08 64,15 - 90,02 - - Inactivos NCC 63 30/33 47,62 34,49 - 60,75 - - Negativos (sets 3 y 2) 230 20/210 - - 91,3 87,45 - 95,16 Sanos (set 3) 79 0/79 - - 100 99,37 - 100 CE (set 2) 151 20/131 - - 86,75 81,02 - 92,49 Antígeno recombinante 2B2t Categorías de sueros N (+/-) Sensibilidad (%) CI 95% Especificidad (%) IC 95% Positivos CE (set 2) 151 104/47 68,87 61,16 - 76,59 - - CE1-CE3b 77 59/18 76,62 66,52 - 86,73 - - Capítulo 2 70 CE4-CE5 74 45/29 60,81 49,01 - 72,61 - - Negativos (sets 3 y 1) 205 15/190 - - 92,68 88,87 - 96,49 Sanos (set 3) 79 0/79 - - 100 99,37 - 100 NCC (set 1) 126 15/111 - - 88,1 82,04 - 94,15 Abreviaturas: NCC: neurocisticercosis; CE: hidatidosis; N: número de sueros; +/- : número de sueros con resultado positivo (+) y con resultado negativo (-); IC: intervalo de confianza. En cuanto a la proteína r2B2t, tras probar un rango de concentraciones diferentes, se seleccionó la concentración 12,5 μg/1,25*10E6 microesferas. El punto de corte de SI- MBA elegido fue 4,07, al ser el valor óptimo tras realizar el análisis de las curvas ROC. Los resultados obtenidos, a ese punto de corte, fueron: 60,87% de sensibilidad, y una especificidad, al considerar los sueros negativos a ambas patologías (tabla 2.1.1, set 3), del 100%. Al incluir los sueros de NCC para el cálculo de la especificidad (tabla 2.1.1, set 1 y set 3), el valor obtenido fue 92,68% (tabla 2.1.2). El valor de AUC para la proteína r2B2t fue 0,717 (figura 2.1.2, B). Test comerciales ELISA Con los dos kits comerciales ELISA empleados, Ridascreen y Novalisa, se obtuvieron resultados dudosos. Entre los sueros positivos a hidatidosis, 15 obtuvieron un resultado dudoso con el test Novalisa y 10 obtuvieron un resultado dudoso con el test Ridascreen. Con respecto a los sueros procedentes de pacientes con diagnóstico de neurocisticercosis, 7 obtuvieron un resultado dudoso con Novalisa y 14 con Ridascreen. La tabla 2.1.3 recoge los resultados dudosos obtenidos con todas las técnicas serológica realizadas de los sueros procedentes de las dos patologías. Los valores de AUC obtenidos para Novalisa y Ridascreen fueron 0,619 y 0,760, respectivamente. Tabla 2.1.3. Resultados dudosos. Resultados dudosos 1 Resultados dudosos 2 N rT24H Novalisa r2B2t Ridascreen CE 151 0 15 0 10 NCC 126 0 7 0 14 Capítulo 2 71 N: número de sueros; CE: hidatidosis; NCC: neurocisticercosis Las propiedades diagnósticas (sensibilidad y especificidad) de cada técnica, agrupadas por las categorías de sueros, están resumidas en la tabla 2.1.4, en ella se han eliminado los resultados dudosos obtenidos mediante las técnicas ELISA. La tabla 2.1.5 recoge la misma información, pero considerando los resultados dudosos como positivos o negativos. Capítulo 2 72 Tabla 2.1.4. Propiedades diagnósticas de las técnicas rT24H-MBA, r2B2t-MBA, Novalisa-ELISA y Ridascreen-ELISA excluyendo los resultados dudosos. Antígeno recombinante T24H NOVALISA Grupos de sueros N* (+/-) Sensibilidad (%) IC 95% Especificidad (%) IC 95% (+/-) Sensibilidad (%) IC 95% Especificidad (%) IC 95% Positivos NCC (set 1) 107 62/45 57,94 48,12 - 67,76 - - 45/62 42,06 32,24 - 51,88 - - Activos NCC 38 28/10 73,68 58,37 - 89 - - 21/17 55,26 38,14 - 72,39 - - Inactivos NCC 55 22/33 40 26,14 - 53,86 - - 14/41 25,45 13,03 - 37,88 - - Negativos (sets 3 y 2) 208 19/189 - - 90,87 86,71 - 95,02 51/157 - - 75,48 69,39 - 81,57 Sanos (set 3) 79 0/79 - - 100 99,37 - 100 1/78 - - 98,73 95,64 - 100 CE (set 2) 129 19/110 - - 85,27 78,77- 91,77 50/79 - - 61,24 52,45 - 70,04 Antígeno recombinante 2B2t RIDASCREEN Grupos de sueros N* (+/-) Sensibilidad (%) IC 95% Especificidad (%) IC 95% (+/-) Sensibilidad (%) IC 95% Especificidad (%) IC 95% Positivos CE (set 2) 129 90/39 69,77 61,45 - 78,08 - - 70/59 54,26 45,28 - 63,25 - - CE1-CE3b 66 52/14 78,79 68,17 - 89,41 - - 51/15 77,27 66,4 - 88,14 - - CE4-CE5 63 38/25 60,32 47,44 - 73,19 - - 19/44 30,16 18,03 - 42,29 - - Negativos (sets 3 y 1) 186 14/172 - - 92,47 88,41 - 96,53 37/149 - - 80,11 74,1 - 86,11 Capítulo 2 73 * los resultados dudosos obtenidos de los kits comerciales se han excluido del análisis y de la comparación. N: número de sueros; CE: hidatidosis; NCC: neurocisticercosis, IC: intervalo de confianza. Sanos (set 3) 79 0/79 - - 100 99,37 - 100 1/78 - - 98,73 95,64 - 100 NCC (set 1) 107 14/93 - - 86,92 80,06 - 93,77 36/71 - - 66,36 56,94 - 75,78 74 Tabla 2.1.5. Propiedades diagnósticas de las técnicas rT24H-MBA, r2B2t-MBA, Novalisa-ELISA y Ridascreen-ELISA considerando los resultados dudosos como positivos o negativos. Antígeno recombinante T24H NOVALISA dudosos como positivos NOVALISA dudosos como negativos Sueros N (+/-) S(%) 95% IC E(%) 95% IC (+/-) S (%) 95% IC E (%) 95% IC (+/-) S(%) 95% IC E (%) 95% IC Positivos NCC (set 1) 126 80/46 63.49 54.69 - 72.30 - - 58/68 46.03 36.93 -55.13 - - 51/75 40.48 31.51- 49.44 - - Activos NCC 48 37/11 77.08 64.15 - 90.02 - - 29 /19 60.42 45.54 – 75.29 - - 25/23 52.08 36.91 - 67.26 - - Inactivos NCC 63 30/33 47.62 34.49 - 60.75 - - 18/ 45 28.57 16.62 – 40.52 - - 15/48 23.81 12.50 - 35.12 - - Negativos (sets 3 y 2) 230 20/210 - - 91.3 87.45 - 95.16 68/132 - - 70.43 64.32 – 76.55 53/177 - - 76.96 71.30 - 82.62 Set 3 79 0/79 - - 100 99.37 - 100 1/79 - - 98.73 95.64 - 100 1/78 - - 98.73 95.64 - 100 CE (set 2) 151 20/131 - - 86.75 81.02 - 92.49 67/84 - - 55.63 47.37 – 63.88 52/99 - - 65.56 57.65 - 73.47 Antígeno recombinante 2B2t RIDASCREEN dudosos como positivos RIDASCREEN dudosos como negativos Sueros N (+/-) S(%) 95% IC E (%) 95% IC (+/-) S (%) 95% IC E(%) 95% IC (+/-) S (%) 95% IC E (%) 95% IC Positivos CE (set 2) 151 104/47 68.87 61.16 - 76.59 - - 87/64 57.62 49.40 – 65.83 - - 77/74 50.99 42.69 – 59.30 - - CE1-CE3b 77 59/18 76.62 66.52 - 86.73 - - 60 /17 77.92 68.01 – 87.84 - - 56/21 72.73 62.13 - 83.32 - - CE4-CE5 74 45/29 60.81 49.01 - 72.61 - - 27/47 36.49 24.84 – 48.13 - - 21/53 28.38 17.43 – 39.33 - - Negativos (sets 3 y 1) 205 15/190 - - 92.68 88.87 - 96.49 53/152 - - 74.15 67.91- 80.38 39/166 - - 80.98 75.36 - 86.59 75 N: número de sueros; CE: hidatidosis; NCC: neurocisticercosis; IC: intervalo de confianza; E: especificidad; S: sensibilidad. Set 3 79 0/79 - - 100 99.37 - 100 1/79 - - 98.73 95.64 - 100 1/79 - - 98.73 95.64 - 100 NCC (set 1) 126 15/111 - - 88.1 82.04 - 94.15 52 /74 - - 58.73 49.74 – 67.72 38/88 - - 69.84 61.43 - 78.25 Capítulo 2 76 Al excluir los resultados dudosos (tabla 2.1.4), para el test Novalisa el valor de sensibilidad fue 42,06%, y la especificidad total (negativos frente NCC (sets 3 y 2), incluyendo sanos y pacientes diagnosticados con CE) fue 75,48%. Para Ridascreen, la sensibilidad obtenida fue 54,26%, y la especificidad total (sets 3 y 1) fue 80,11%. En este análisis en el que se excluyeron los resultados dudosos, la sensibilidad del r2B2t-MBA fue 69,77% para el diagnóstico de CE, y la especificidad total (sets 3 y 1) fue 92,47%. El resultado de sensibilidad del rT24H-MBA fue 57,94% para el diagnóstico de NCC, mientras que la especificidad total (sets 3 y 2) fue 90,87%. Los valores de sensibilidad y especificidad en la técnica MBA fueron superiores a los obtenidos mediante los test comerciales ELISA en las diferentes aproximaciones de análisis realizadas: al excluir los resultados dudosos, al considerarlos negativos y al considerarlos como positivos (tabla 2.1.5). Análisis comparativo entre las técnicas MBA y ELISA Las características diagnósticas, referidas a sensibilidad y especificidad, de los antígenos recombinantes con la técnica MBA fueron mejores que las obtenidas con las pruebas comerciales en formato ELISA evaluados en paralelo. En la figura 2.1.2, están representadas las curvas ROC de cada técnica diagnóstica agrupadas según la patología a diagnosticar, esto es, Novalisa frente a rT24H-MBA para NCC y Ridascreen frente a r2B2t-MBA para CE. Al realizar la prueba de homogeneidad de áreas del Chi cuadrado, se encontraron diferencias significativas entre las técnicas MBA-rT24H y Novalisa (p <0.001). Entre Ridascreen y r2B2t-MBA no se evidenciaron diferencias significativas al comparar índices serológicos. Hay que destacar que una modificación del valor de corte a la hora de asignar los resultados en el test Ridascreen, disminuyendo el valor a 0,6, permitiría mejorar los valores de sensibilidad y especificidad de la técnica, lo cual explica las discrepancias entre el valor elevado de AUC de Ridascreen y los valores calculados de especificidad y sensibilidad. Capítulo 2 77 Figura 2.1.2. Análisis de curvas ROC de las diferentes técnicas. AUC: Área bajo la curva, CI: Intervalo de confianza; SE (DeLong): error estándar, X2: chi cuadrado. 2.1.4. Discusión Se ha realizado la estandarización de un método de diagnóstico serológico simultáneo para neurocisticercosis (NCC) e hidatidosis (CE), empleando la tecnología de multiplexado MBA con antígenos recombinantes. Ambos antígenos recombinantes, 2B2t y T24H, habían sido previamente evaluados para el diagnóstico individual de CE y NCC respectivamente, obteniendo resultados satisfactorios y prometedores para su aplicación en otras técnicas diagnósticas (Dermauw et al., 2018; Hernández-González et al., 2012, 2017a; Sánchez-Ovejero et al., 2020). La técnica MBA empleada ha permitido realizar el diagnóstico serológico de dos parasitosis de manera simultánea. Además, se ha logrado evaluar un elevado número de sueros con mejores valores de sensibilidad que los obtenidos con dos técnicas comerciales en formato ELISA, ampliamente empleados en Europa, para el diagnóstico de CE y NCC. Cabe destacar la reducción de la reactividad cruzada, que ya ha sido descrita entre ambas patologías, al validar otros métodos de diagnóstico serológico (Liance et al., 2000). Las dos enfermedades parasitarias desatendidas objeto de estudio en el presente capítulo, NCC y CE, presentan una distribución geográfica coincidente en áreas de Asia, América del Sur y África (Cho, 2018; Grosso et al., 2012). Ambas patologías suponen costes económicos derivados de su diagnóstico, tratamiento y seguimiento. En cuanto al Capítulo 2 78 diagnóstico, este se basa en pruebas de imagen, las cuales se complementan con técnicas serológicas, sobre todo en aquellos casos en los que el diagnóstico por imagen presenta resultados no concluyentes. Pese a que ambas enfermedades son potencialmente eliminables, en el caso de T. solium, no existen, actualmente, programas de control establecidos en áreas endémicas (Dixon et al., 2021). De hecho, uno de los objetivos de la OMS, establecido en su hoja de ruta para 2030, es la implementación de medidas de control en áreas hiperendémicas. Sin embargo, una de las actuales limitaciones para instaurar estas medidas, es la ausencia de métodos diagnósticos adecuados, tanto serológicos como de otras modalidades, que permitan delimitar la extensión de estas áreas hiperendémicas, que, actualmente, aún resulta desconocida (CystiTeam Group for Epidemiology and Modelling of Taenia solium Taeniasis/Cysticercosis, 2019). El éxito de la implementación, monitorización y evaluación de los programas de control depende de la disponibilidad de técnicas sensibles, específicas y reproducibles. Estas técnicas deben permitir evaluar un elevado número de muestras a un coste asumible. En este aspecto, los métodos de diagnóstico inmunológico disponibles deben mejorar sus propiedades diagnósticas para asegurar la identificación de focos de transmisión activa y determinar seroprevalencia. Un punto clave a exigir a estas técnicas serológicas es la disminución, idealmente la ausencia, de reactividad cruzada con otros parásitos filogenéticamente relacionados, como sucede entre T. solium y E. granulosus (Liance et al., 2000; Montenegro et al., 1994). La tecnología MBA xMAP, del inglés, multiplex bead assay, se basa en las técnicas clásicas de detección de anticuerpos, como el ELISA; sin embargo, el uso de microesferas magnéticas con una concentración de fluoróforos diferente, permite la detección simultánea de varios antígenos y así realizar el diagnóstico serológico de varias patologías en un único ensayo, ahorrando tiempo y volumen de muestra. El sistema múltiple de detección de anticuerpos para varias patologías hace de esta una herramienta especialmente útil en salud pública. Hay publicados estudios donde emplean la tecnología MBA para diferentes aplicaciones, entre ellos, Fuji y colaboradores (Fujii et al., 2014) realizaron un estudio para detectar la presencia de anticuerpos frente a seis enfermedades utilizando ocho antígenos recombinantes (Entamoeba histolytica [C-IgL], Leishmania donovani [KRP42], Toxoplasma gondii [SAG1], Wuchereria bancrofti [SXP1], HIV [gag, gp120, y gp41], y Vibrio cholerae [cholera toxin])). En otro estudio publicado, empleaban diferentes antígenos de varias especies de Plasmodium para el diagnóstico de Capítulo 2 79 malaria (PfMSP1, PvMSP1, PmMSP1, PfCSP, PfAMA1, PfLSA1, PfGLURP-R0, PfHRP2) (Rogier et al., 2019). El éxito de la tecnología MBA depende de la calidad diagnóstica de los antígenos recombinantes empleados. En el caso de la neurocisticercosis, se empleó el antígeno recombinante T24H dado que había sido previamente testado en la tecnología MBA. En el estudio realizado había obtenido valores similares a los del LLGP (método diagnóstico serológico de referencia) (Hernández-González et al., 2017a). El antígeno T24H, se corresponde con el dominio extracelular de 92 aminoácidos de la tetraspanina T24, proteína formada por 4 dominios transmembrana. Los dominios correspondientes a 24 kDa y 42 kDa en el antígeno nativo son los que se observan en la técnica LLGP-EITB (Hancock et al., 2006). Para el diagnóstico de hidatidosis, se seleccionó el antígeno r2B2t, este se corresponde con dos repeticiones en tándem del antígeno rB2t, el cual es un truncado del extremo C-terminal del antígeno B2 (Ag B2). Este antígeno r2B2t se eligió por su ya probado valor diagnóstico en ELISA (Hernández-González et al., 2012). Este estudio supone la primera estandarización de la proteína recombinante r2B2t en la tecnología MBA para el diagnóstico de hidatidosis. Es necesario enfatizar en la utilización combinada de esta tecnología con los antígenos recombinantes específicos de T. solium y E. granulosus, dada su relación filogenética, por la cual se explica la reactividad cruzada existente entre las dos especies (Ishida et al., 2003). Teniendo en cuenta que el 73% de la secuencia del antígeno T24H se comparte con dos secuencias de E. granulosus (GenBank: BI244014 y BF643023) (Hancock et al., 2006) el porcentaje de reactividad cruzada con los sueros testados, es relativamente bajo. De manera similar ha sucedido con los valores de reactividad de las muestras de NCC con el antígeno r2B2t. De hecho, la reactividad cruzada fue similar incluso más baja que la descrita en otras proteínas recombinantes de T. solium con utilidad diagnóstica, como por ejemplo AgTs8B (Ferrer et al., 2007; Hernández-González et al., 2017a), y muy inferior a la obtenida con el antígeno crudo y los productos de excreción-secreción empleados habitualmente y disponibles a nivel comercial. En este estudio, en los dispositivos comerciales en formato ELISA, una de cada tres muestras presentaba reactividad cruzada. La especificidad en individuos sanos fue similar a la publicada en otros artículos con estos antígenos (en torno al 92% en ambos casos) (Hernández-González et al., 2017a, 2018; Sánchez-Ovejero et al., 2020). Además, en el caso de pacientes sin la patología https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BI244014 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BF643023 Capítulo 2 80 objeto de estudio, pero con otras patologías neurológicas, la especificidad alcanzó el 100%. El valor de sensibilidad del antígeno rT24H para el diagnóstico de NCC es significativamente superior a la del test comercial Novalisa, pero inferior al descrito en otros estudios. La sensibilidad de las técnicas serológicas para la NCC varía en función de la localización de los cisticercos, así como del número y de la viabilidad de estos (H. H. Garcia, O’Neal, et al., 2018). Los anticuerpos circulantes se detectan en mayor proporción en pacientes con múltiples lesiones viables o con NCC extraparenquimal. Por el contrario, se evidencia una marcada disminución de la sensibilidad en pacientes con una única lesión o con cisticercos inactivos. En este estudio, sólo se pudo estratificar a los individuos en función de la viabilidad. Es necesario considerar que el panel de sueros empleado está formado por una elevada proporción de sueros de pacientes con NCC inactiva frente a los que presentan la patología activa, lo cual podría explicar los valores bajos de sensibilidad obtenida. Con respecto a la sensibilidad en el caso de la CE, esta depende de múltiples factores, entre ellos: el estadio quístico, el número de quistes, el tamaño de los mismos, el órgano afectado y la administración previa de tratamiento (Carmena et al., 2006; Mariconti et al., 2014). Al agrupar las muestras de suero en función de la información clínica disponible de cada estadio quístico, se evidencia que la sensibilidad es mayor en aquellos pacientes con estadio CE3a y CE3b, lo que coindice con otros artículos publicados (Mariconti et al., 2014). La situación ideal habría sido analizar los datos de acuerdo con el estadio quístico de manera individual, y en particular evaluar los tests en las muestras procedentes de los quistes CE1 uniloculares, sin embargo, el tamaño muestral en este estadio era bastante reducido, por lo que no se ha podido obtener la información de manera estratificada. El antígeno recombinante T24H se ha empleado en formato MBA en muestras procedentes de sangre completa recogidas en papel de filtro, mostrando su potencial aplicabilidad en áreas donde las muestras no se pueden analizar debido a la falta de recursos y, por tanto, posible objeto de aplicación de programas de control (Moss et al., 2018). La incorporación del antígeno recombinante 2B2t en formato MBA junto con el recombinante T24H, permitiría realizar estudios epidemiológicos más completos sobre la prevalencia de cisticercosis. Esta tecnología combinada, no sólo mejoraría los resultados de sensibilidad, sino que disminuiría la reactividad cruzada. En el caso de la hidatidosis, el empleo de esta tecnología MBA en programas de control no estaría indicada en el Capítulo 2 81 contexto de control epidemiológico único, dado que las técnicas serológicas no muestran resultados adecuados en estadios tempranos de la parasitosis ni en aquellos que presentan una localización extrahepática (Brunetti et al., 2010; Tamarozzi et al., 2021; Torgerson & Deplazes, 2009). Las nuevas tecnologías ómicas aumentarán el conocimiento sobre antígenos putativos, y su aplicación en la técnica MBA permitirá evaluar simultáneamente la capacidad diagnóstica de varios antígenos para diferentes patologías ahorrando tiempo y costes. En el caso concreto de la equinococosis, hay disponibilidad de antígenos recombinantes (Em2, Em18, EM13) previamente testados para el diagnóstico serológico especie-específico de la equinococosis alveolar (AE), cuyo agente etiológico es Echinococcus multilocularis (Siles-Lucas et al., 2017), por lo que la técnica MBA podría valorar estas patologías (CE y AE) en un solo ensayo. En el presente trabajo no fue posible al carecer de muestras séricas de esta tercera patología, lo que supone una limitación del estudio. La tecnología MBA empleada en el estudio supone una mejora en el diagnóstico serológico de CE y NCC en comparación con las técnicas ELISAs comercialmente disponibles. La utilización de esta tecnología ha permitido evaluar un mayor número de muestras, proporcionando una alternativa rápida y efectiva para el estudio epidemiológico en áreas susceptibles de trasmisión activa de NCC, y donde los programas de control deben ser implementados. Además, está metodología tiene el potencial de incorporar nuevos antígenos para el diagnóstico simultáneo de varias patologías y, de este modo, mejorar el actual diagnóstico serológico. 2.2. Evaluación serológica de la endemicidad de cisticercosis en Mozambique mediante XMAP-T24H 2.2.1. Introducción El agente etiológico de la cisticercosis es la especie Taenia solium. Los humanos son hospedadores accidentales que se infectan tras la ingestión de los huevos eliminados por un portador de la fase adulta del mismo parásito (teniásico). A continuación, se desarrollan los quistes (cisticercos) en sus tejidos y órganos; el sistema nervioso central puede ser uno de los afectados, produciendo la patología conocida como neurocisticercosis (NCC). Las diferentes localizaciones de los cisticercos en el SNC, explicaría el abanico de manifestaciones clínicas asociadas a la NCC. Además, otros factores relacionados con la patogenia son: el número de quistes implicados, el estado de Capítulo 2 82 desarrollo del quiste, la duración de la infección y el estado inmunitario del hospedador (Carabin et al., 2011). Mozambique está formado por once provincias, a su vez estas se subdividen en diferentes distritos. La población total de Mozambique, de acuerdo con los datos publicados en el censo de 2017, es 27,9 millones habitantes (Instituto Nacional de Estatística (INE), 2019). El municipio de Manhiça se localiza en el distrito del mismo nombre, al sur del país, y forma parte de la provincia de Maputo, la cual cuenta con 1,9 millones de habitantes (Instituto Nacional de Estatística (INE), 2019). Mozambique se considera un área endémica de T. solium según la última actualización de endemicidad de esta especie publicada por la OMS (Donadeu et al., 2022). Estudios publicados en la ciudad de Beira (Mozambique), detectaron una seroprevalencia de cisticercosis de 10,2% (61 positivos de un total de 601) en pacientes positivos a VIH (Noormahomed et al., 2014). La proporción de anticuerpos específicos de cisticercosis reportada por el estudio serológico de Langa y colaboradores, en el distrito de Mocuba (provincia de Zambézia, Mozambique), fue 6,6% (72 positivos de 1086 individuos), aunque en este estudio se empleó población con patología asociada a NCC como epilepsia, dolor de cabeza crónico y otros trastornos neuropsiquiátricos (Langa et al., 2022). En el estudio realizado en provincia de Maputo, la prevalencia serológica de cisticercosis fue 12,1% (Vilhena et al., 1999). Este estudio fue realizado en el año 1993 y emplearon como técnica diagnóstica un ELISA comercial, en que se indicaba la posible reactividad cruzada con muestras de hidatidosis. El estudio fue realizado en un hospital, y una de las cohortes de pacientes pertenecía al área de neurología y otra al de psiquiatría. En cuanto a la hidatidosis, apenas existen estudios sobre la prevalencia de esta patología en Mozambique (Grau-Pujol et al., 2019). Uno de los estudios serológicos realizado mostró una seroprevalencia de 17,3%, aunque debido a limitaciones económicas no pudieron confirmar mediante imagen la patología, ni tampoco instaurar un tratamiento (Noormahomed et al., 2014). La inmunoelectrotransferencia ligada a enzimas empleando extractos antigénicos (glucoproteínas) purificados mediante afinidad con lectina de lenteja (LLGP-EITB, del inglés, lentil-lectin glycoprotein enzyme-linked immunoelectrotransfer blot test) se considera la técnica de referencia para el diagnóstico serológico de cisticercosis, dada la alta especificidad y sensibilidad de esta (Hancock et al., 2003). Este método de diagnóstico serológico ha sido reconocido por la OMS para confirmar los casos Capítulo 2 83 sospechosos en zonas endémicas, tras obtener un resultado negativo por otras técnicas serológicas, ya sea por la sintomatología asociada o por disponer de imágenes diagnósticas sugerentes de la enfermedad (World Health Organization et al., 2015). En la actualidad, sigue empleándose como técnica serológica de diagnóstico de cisticercosis en el Departamento de Enfermedades Parasitarias y Malaria, del CDC de Atlanta, EE. UU y en el Centro Nacional de Microbiología en el Laboratorio de Referencia e Investigación en Parasitología del Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España, entre otros centros de referencia. Esta técnica emplea antígenos parcialmente purificados de metacestodos. Un resultado se considera positivo si aparece cualquiera de las siete bandas en la tira de nitrocelulosa (GP42, GP24, GP21, GP18, GP14 y GP13) (Tsang et al., 1989). Los antígenos correspondientes a cada una de las bandas se han caracterizado con el objetivo de obtener proteínas recombinantes que permita emplear técnicas diagnósticas aplicables a campo, disminuir los costes de producción del western blot, así como una fabricación de dispositivos diagnósticos no dependiente de cerdos naturalmente infectados. Además, la preparación de los antígenos purificados del LLGP requiere un aprendizaje y cierto dominio a nivel técnico, y presenta el inconveniente de no ser adecuado para la utilización en formato ELISA (Hancock et al., 2003). El antígeno T24 es una proteína integral de membrana perteneciente a la superfamilia de las tetraspaninas, a su vez se corresponde con la banda de 24 kDa (GP-24) de la técnica LLGP. Un fragmento de esta proteína, el loop correspondiente a un dominio extracelular, conforma la denominada proteína recombinante T24H. Las propiedades diagnósticas de esta proteína fueron: 94% de sensibilidad y un 98% de especificidad (Hancock et al., 2006). El antígeno recombinante 2B2t se corresponde con una repetición en tándem del antígeno B2t (Hernández-González et al., 2012). Este a su vez es un truncado de la isoforma 2 del antígeno B (Hernández-González et al., 2008), una lipoproteína termoestable de 120-160 kDa procedente del protoescólex, compuesta por diferentes moléculas que difieren unas de otras en 8 kDa (Rott et al., 2000). El estudio realizado tuvo por objetivo determinar retrospectivamente la seroprevalencia de neurocisticercosis en un distrito al sur de Mozambique, mediante dos técnicas de diagnóstico serológico (LLGP y MBA). Adicionalmente, dado que el sistema MBA empleado ha sido estandarizado para la detección simultánea de anticuerpos frente al antígeno 2B2t, se estimó la seroprevalencia de hidatidosis en la misma área de estudio. Capítulo 2 84 2.2.2. Material y métodos Colecciones de muestras biológicas humanas El estudio de seroprevalencia fue realizado con muestras recogidas en un trabajo anterior en el distrito de Manhiça, situado al sur de Mozambique. Previamente a su recolección se obtuvo el consentimiento informado de cada uno de los participantes. El empleo de estas muestras se aprobó por el comité de ética 517/CNBS/17 (National Bioethics Committee for Health in Mozambique). Las especificaciones relativas al diseño inicial de la población de estudio y la selección están recogidas en un artículo previamente publicado (Grau-Pujol et al., 2021). En el estudio de seroprevalencia se emplearon muestras de sangre capilar y ADN previamente extraído de muestras fecales. El estudio de reactividad del LLGP frente a otros patógenos empleó muestras de sangre capilar de individuos africanos infectados con diferentes parasitosis, procedentes de la zona continental de Guinea Ecuatorial. Las muestras fueron recogidas siguiendo los protocolos de muestreo para programas de control de oncocercosis. Muestras sanguíneas Todas las muestras de sangre capilar, obtenidas tras punción digital, se recogieron empleando el papel de filtro tipo Whatman en el formato de tarjetas, Whatman® protein saver cards (Merck KGaA). Las muestras se secaron a temperatura ambiente. La duración mínima del secado fue de 4 horas, aunque el secado se realizó preferiblemente durante toda la noche. Posteriormente, las tarjetas se almacenaron a una temperatura de -20ºC hasta su utilización. El número de muestras de sangre seca (DBS, del inglés, dry blood spots) empleado para la realización del estudio fue 486: i) 28 para el estudio previo de la reactividad del LLGP y ii) 457 para el análisis de seroprevalencia. De estas últimas, 452 correspondían a muestras de individuos de Mozambique para la determinación de anticuerpos específicos frente a T. solium, y 5 a muestras de individuos de origen africano con un diagnóstico positivo a malaria (P. malariae o P. falciparum) y negativo a neurocisticercosis mediante LLGP, que sirvieron como controles negativos del ensayo. Capítulo 2 85 Como control positivo del ensayo se utilizó una muestra sérica de un individuo con un diagnóstico confirmado de neurocisticercosis. Los 28 DBS empleados para el estudio previo de la reactividad del LLGP estaban integrados por: seis muestras con un resultado serológico positivo a W. bancrofti (ELISA WB123), seis positivas a Loa loa mediante microscopia, seis positivas a M. perstans empleando microscopia, y 10 negativas, por microscopia y serología, a cualquier filaria. El estudio también incluyó los controles negativos y positivos anteriormente indicados. Evaluación microscópica Se examinaron las muestras de heces de los mismos individuos a los que se realizó la encuesta de seroprevalencia, para la identificación de formas parasitarias de geohelmintos (Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura y uncinarias (Ancylostoma duodenale y Necator americanus)). Las especificaciones relativas a las técnicas se detallan en el artículo previamente publicado (Grau-Pujol et al., 2021). Elución de las muestras sanguíneas A partir de cada una de las tarjetas, se perforaron seis discos de 3,2 mm de diámetro. Cada disco se correspondería con 10 μl de sangre completa (5 μl de suero asumiendo un hematocrito del 50%). Aquellas muestras en las que el número de discos obtenidos fue inferior a cinco se descartaron. Los discos se mantuvieron sumergidos en 300 μl de PBS-Tween 20 al 0,3%, durante 24h a una temperatura de 4ºC y agitación. A continuación, se añadieron 300 μl de leche desnatada en polvo al 5% en PBS-Tween al 0,3% y azida sódica (NaN3) a una concentración de 0,05%. Las muestras se sonicaron durante 15 minutos utilizando un baño sonicador. Aquellos discos que permanecieron coloreados tras la elución fueron descartados y se perforaron nuevos, repitiendo el procedimiento. En el caso de no conseguir la elución o que esta fuera parcial, se descartó la muestra. Western blot La técnica de inmunoelectrotransferencia ligada a enzimas empleando extractos antigénicos (glucoproteínas) purificados mediante afinidad con lectina de lenteja (LLGP- Capítulo 2 86 EITB, del inglés, lentil-lectin glycoprotein enzyme-linked immunoelectrotransfer blot test) se empleó siguiendo las condiciones descritas por Tsang y colaboradores (Tsang et al., 1989). La preparación del antígeno, así como la transferencia a las tiras de nitrocelulosa, fue realizada por el Departamento de Enfermedades Parasitarias y Malaria, del CDC de Atlanta, EE. UU. Las tiras se procesaron en placas de canales con una capacidad de ocho muestras. Las placas se procesaron de cuatro en cuatro simultáneamente, conformando un lote, y en cada uno se incluyeron un control positivo y uno negativo. Cada una de las muestras eluidas (~ 500 μl/muestra) se dispensó en un canal de la placa donde se incubó con una tira de nitrocelulosa de LLGP en movimiento de vaivén suave durante toda la noche a 4ºC. La muestra de suero se utilizó a una dilución 1:100 en leche desnatada en polvo al 5% en PBS-Tween al 0,3% en las mismas condiciones. El siguiente paso consistió en realizar tres lavados de las tiras de cinco minutos cada uno con PBS-Tween al 0,3%. A continuación, se añadieron 500 μl del anticuerpo secundario, anticuerpo de cabra frente a IgG totales humanas conjugado con peroxidasa (IgG (H+L) Goat anti-Human, HRP, Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific), a una dilución 1:1000 en PBS-Tween al 0,3%. Las tiras se incubaron con el anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente en vaivén. Posteriormente, se realizaron dos lavados con PBS-Tween, y dos lavados adicionales únicamente con PBS, de cinco minutos de duración cada uno. Los resultados se revelaron mediante el sistema de sustrato basado en peróxido de hidrógeno (H202) al 30% (Sigma-Aldrich) y diaminobencinidina (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, Sigma-Aldrich). La presencia de una banda coincidente con alguna del patrón de bandas del control (50, 42- 39, 24, 21, 18, 14 y 13 kDa), se consideraba como un resultado positivo. Muestras de ADN Las muestras de ADN procedían de muestras fecales extraídas con el kit PowerFecal Pro DNA kit (Qiagen), siguiendo las indicaciones del fabricante, se empleó 250 mg de material fecal, tal y como se indica en el artículo previamente publicado (Grau- Pujol et al., 2021). El ADN extraído se conservó a -20ºC hasta su utilización. Técnicas de amplificación genómica Se realizó la qPCR TsolR13 publicada por O’Connell (O’Connell et al., 2020b), específica de T. solium, con las siguientes secuencias de cebadores (directo (5’- Capítulo 2 87 AGTCAGTCAGTCAGTCAGTCA-3’) y reverso (5’- CTGTCAAGCTGTCAGGCTGT- 3’)) y como secuencia de la sonda TGTCAGTGAZENGGCGTGTGACAAGA, con la siguiente estructura FAM-5’—ZEN™—3’IABkFQ. Se emplearon 10 µl de Quantimix HotSplit Probes kit (Biotools, B&M Labs), 5 µl de la muestra de ADN y un 1 µl de la sonda y los cebadores, se completó con agua para uso molecular hasta obtener un volumen final de 20 µl. Las muestras se procesaron por duplicado. Se empleó el dispositivo Rotor- Gene Q MDx 5plex HRM (QIAgen) con el software correspondiente. La lectura se realizó en el canal verde y las condiciones empleadas fueron 95ºC durante 10 minutos, 40 ciclos a 95ºC durante 10 segundos y 60ºC durante 30s. Antígenos recombinantes Las proteínas recombinantes seleccionadas fueron las mismas que las empleadas en la anterior sección del capítulo (2.1. Ensayo serológico combinado para el diagnóstico de cestodosis humanas olvidadas): proteína recombinante T24H (diagnóstico serológico de neurocisticercosis) y proteína recombinante 2B2t (diagnóstico serológico de hidatidosis). En el punto 2.1.3 de la presente Tesis Doctoral se detalla la subclonación de los antígenos en sistemas de expresión procariotas, así como su expresión, purificación y cuantificación. Tecnología MBA Los antígenos recombinantes T24H y 2B2t se acoplaron a la superficie de las microesferas magnéticas (Bio-Plex Magnetic COOH Beads, Bio-Rad). El código de referencia de las esferas fue MC10072-01(rT24H) y MC10035-01(r2B2t). Las concentraciones utilizadas fueron: 1 μg/1,25*10E6 esferas magnéticas para el antígeno rT24H, y 12,5 μg/1,25*10E6 microesferas magnéticas para el antígeno r2B2t. Se siguió el mismo protocolo indicado en el apartado Tecnología MBA de la sección 2.1.3. Material y métodos. Análisis estadístico Para la realización del análisis estadístico, así como la representación gráfica se empleó el entorno y lenguaje de programación R. Para determinar si los datos obtenidos presentaban una distribución normal, se empleó el test de Kolmogorov -Smirnov (con la Capítulo 2 88 corrección Lilliefors). El método no paramétrico empleado para contrastar las distribuciones de las muestras fue la prueba de Mann-Whitney (Álvarez Cáceres, 2007). 2.2.3. Resultados La investigación previa de reactividad cruzada de la técnica LLGP con muestras de origen africano, tanto negativas como con otras patologías, mostró ausencia de reactividad. Respecto al estudio de seroprevalencia, el número de muestras finales analizadas fue 345. En un inicio, el número de muestras fue 457, de las que se excluyeron 54 en las que el número de discos obtenidos fue inferior a cinco. De las restantes, únicamente se incluyeron aquellas con una elución completa, por lo que se descartaron otras 50 muestras más (figura 2.2.1). Figura 2.2.1. Diagrama de flujo de la relación de muestras y las técnicas empleadas en el estudio serológico de neurocisticercosis (NCC) e hidatidosis (EC) con los antígenos recombinantes rT24H y r2B2t. Capítulo 2 89 Tabla 2.2.1 Resultados de microscopía de las geohelmintosis en la población de estudio (N=345). Especies + / - Prevalencia (%) Ascaris lumbricoides 13 / 331 3,77 Trichuris trichiura 24 / 321 6,96 Uncinarias 51 / 294 14,78 Un 2,61% de los individuos presentaban coinfecciones. En la siguiente figura se representan los porcentajes de cada coinfección según los geohelmintos implicados. Figura 2.2.2. Diagrama sectorial de las muestras analizadas coinfectadas con varios geohelmintos. Ascaris: A. lumbricoides; Trichuris: T. trichiura. Nota: porcentajes referidos a la totalidad de las coinfecciones. Los resultados globales de las geohelmintosis se representan en la figura 2.2.3. 34% 22% 33% 11% Ascaris / Trichuris Ascaris / Uncinarias Trichuris / Uncinarias Ascaris / Trichuris / Uncinarias Capítulo 2 90 Figura 2.2.3. Gráfico de barras de los resultados de geohelmintosis obtenidos por microscopía. Nota: se han segregado en función de las diferentes coinfecciones. Los resultados del LLGP y MBA-T24H indican la ausencia de anticuerpos específicos frente a cisticercosis en las muestras analizadas. No se ha obtenido ninguna banda positiva en el LLGP, ni tampoco ninguna muestra ha superado el valor de corte fijado de índice serológico para rT24H con la tecnología MBA. En la figura 2.2.4 se han representado en un gráfico de violines los resultados de intensidad de fluorescencia de la tecnología MBA con los dos antígenos empleados. Las pruebas de amplificación genómica de T. solium en las 101 muestras de ADNs disponibles, obtenidos de muestras fecales, fueron negativas. La seroprevalencia de hidatidosis con el antígeno recombinante 2B2t ha sido 4,64% (16 resultados positivos) en las muestras analizadas (figura 2.2.1). 7 18 46 3 2 1 33,8 5,2 13,3 0,9 0,6 0,3 0,9 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ascaris Trichuris Uncinarias Ascaris Trichuris Ascaris Uncinarias Ascaris Trichuris Uncinarias Trichuris Uncinarias Casos Prevalencia (%) Capítulo 2 91 Figura 2.2.4. Diagrama de violín de los resultados de la mediana de intensidad fluorescencia para el diagnóstico de hidatidosis y neurocisticercosis. Abreviaturas: MBA-HID: tecnología MBA empleando el antígeno 2B2t para el diagnóstico de hidatidosis; MBA-NCC: tecnología MBA empleando el antígeno T24H para el diagnóstico de neurocisticercosis; MFI: mediana de intensidad de fluorescencia. Nota: se ha empleado la escala logarítmica (log10) para facilitar la visualización de los resultados. Tabla 2.2.2. Descripción de las características y resultados de MBA con el antígeno 2B2t de los participantes del estudio (N=345). N / % MBA r2B2t (+/-) Seroprevalencia total (%) Seroprevalencia segregada (%) Género Femenino 164 (50,77) 10/154 2,90 6,10 Masculino 159 (49,23) 5/154 1,45 3,14 Sin datos 22 (6,37) 1/21 0,29 4,55 Edad 5 -15 años 266 (77,10) 7/259 2,03 2,63 16 - 64 años 39 (11,30) 5/34 1,45 12,82 ≥ 65 años 18 (5,21) 3/15 0,87 16,67 Sin datos 22 (6,37) 1/21 0,29 4,55 Capítulo 2 92 Total 345 (100) 16/329 4,64 - Nota: MBA 2B2t: Multiplex Bead Assay para la detección de antígeno 2B2t frente a hidatidosis. Prevalencia total (%) referida a la totalidad de muestras (N=345); prevalencia segregada (%) referido a cada uno de los grupos. Existen diferencias significativas en la edad de los individuos que presentan un resultado serológico positivo de hidatidosis frente a los que presenta un resultado negativo (p=0,006 en el test de Wilcoxon). De las 16 muestras que habían obtenido resultados positivos a hidatidosis (MBA- r2B2t), una había presentado un resultado positivo a Schistosoma mansoni empleando la PCR cuantitativa. Ocho muestras también habían obtenido un resultado positivo a uncinarias, tanto por PCR cuantitativa de N. americanus, como por microscopía. También empleando la microscopía se había obtenido un resultado positivo a T. trichuria, dentro de este grupo con un diagnóstico serológico positivo de hidatidosis (figura 2.2.5). Figura 2.2.5. Distribución de resultados de coinfecciones de las muestras con un resultado serológico positivo a hidatidosis empleando el antígeno 2B2t. 2.2.4. Discusión Los estudios realizados muestran una ausencia de infección por T. solium en la zona muestreada y una prevalencia de anticuerpos del 4,6% de hidatidosis. La ausencia de anticuerpos específicos de cisticercosis y la no detección de portadores de T. solium puede deberse a varios motivos: el área geográfica, la población estudiada, el intervalo temporal entre los diferentes estudios y/o las estrategias basadas en la administración masiva de fármacos. En la zona muestreada (distrito de Manhiça, provincia de Maputo, sur de Mozambique) es posible que no exista exposición a Taenia solium, ya sea por motivos religiosos, culturales, socioeconómicos o por las intervenciones sanitarias realizadas en las últimas décadas. Hasta la fecha actual, no hay artículos publicados con 8 1 1 6 N.americanus + E.granulosus T. trichuria + E.granulosus S.mansoni + E.granulosus E.granulosus Capítulo 2 93 datos de seroprevalencia de cisticercosis en el distrito de Manhiça. En el estudio realizado por Vilhena y colaboradores (Vilhena et al., 1999), en un hospital de la provincia de Maputo, la seroprevalencia de cisticercosis fue del 12,1%. Hay que tener en cuenta que este estudio se corresponde al año 1993 y no emplearon la técnica LLGP (utilizaron el ELISA comercial Melotest for cysticercosis, técnica que no se comercializa en la actualidad y cuya eficacia diagnóstica en zonas endémicas ha sido cuestionada (Das et al., 2005)), por lo que los datos podrían estar sobreestimados, además de no coincidir con los actuales. Otro motivo de discrepancia podría atribuirse a la población estudiada; en nuestro estudio no se seleccionó una población con patología previa relacionada con neurocisticercosis, por el contrario, en el anterior estudio mencionado (Vilhena et al., 1999) seleccionaron entre los grupos principales pacientes de neurología y psiquiatría. En otros estudios de regiones diferentes del país, la prevalencia de cisticercosis se encuentra en el intervalo de 5- 10% (Langa et al., 2022; Noormahomed et al., 2014). En cuanto a la administración masiva de fármacos en Mozambique, se han realizado ensayos clínicos basados en la administración de praziquantel durante un periodo de cuatro años con el fin de evaluar la eficacia para la esquistosomiasis (Kittur et al., 2019). Al ser este fármaco uno de los empleados en el tratamiento de la teniosis /cisticercosis, no es descartable que su administración masiva haya influido en la prevalencia de las enfermedades asociadas a T. solium. En cuanto otros factores socioeconómicos y sanitarios no podemos olvidar que la teniosis /cisticercosis es una enfermedad que afecta principalmente a poblaciones vulnerables con malas prácticas de cría de cerdo, higiene y sistemas de saneamiento deficientes (Del Brutto & Garcia, 2013; Fogang et al., 2015). El distrito de Manhiça ha sido beneficiario, entre otros, de los programas WASH, que han introducido mejoras sustanciales en los sistemas de acceso al agua y saneamiento, y que ha producido un efecto beneficioso directo en la reducción de enfermedades infecciosas (Morgan et al., 2017). En este sentido, la implementación de estos programas produjo una reducción de la proporción de personas sin acceso a fuentes de agua del 65% en 1990 al 49% en 2015 (Morgan et al., 2017; UNICEF et al., 2023). Sin embargo, la inestabilidad producida por los conflictos armados en la zona norte del país podría suponer un estancamiento de estos programas, y un empeoramiento de los sistemas de saneamiento ya implantados, pese a estar recibiendo ayuda humanitaria (UN Office for the Coordination of Humanitarian Affairs, 2023). La cisticercosis/teniasis se caracteriza por presentar áreas de alta endemicidad (World Health Organization, 2020a), por lo que es necesario delimitar estas Capítulo 2 94 regiones con el objetivo de instaurar aquellas medidas que permitan reducir la prevalencia e incluso, en un futuro, llegar a erradicar la enfermedad. La ausencia de seroprevalencia de neurocisticercosis podría implicar que las medidas tomadas están siendo efectivas en el área de estudio, aunque es necesario continuar con el cribado serológico en el resto del país. La elevada especificidad de la técnica del LLGP-EITB ya había sido demostrada por Tsang y colaboradores (Tsang et al., 1989), empleando un elevado número de muestras de otras patologías: oncocercosis, amebiasis, paragonimosis, esquistosomiasis… así como muestras cuyo agente infeccioso era: E. granulosus, E. multilocularis, Fasciola hepatica, W. bancrofti, Strongyloides spp. Sin embargo, no se habían testado muestras de pacientes infectados con Loa loa, Mansonella perstants, ni Plasmodium spp. Los resultados obtenidos han confirmado la ausencia de reactividad cruzada con estas especies, reafirmando la adecuada especificidad de la técnica. Por otro lado, la sensibilidad general del LLGP-EITB, como ya se ha indicado anteriormente, es muy elevada. En población africana también ha obtenido muy buenos resultados, mostrando mejores resultados en comparación con un western blot comercial. El estudio se realizó en pacientes subsaharianos epilépticos con NCC (corroborada por técnicas de imagen), y demostró la adecuada sensibilidad de la técnica especialmente en pacientes epilépticos con cisticercos calcificados (Blocher et al., 2011). La seroprevalencia obtenida de hidatidosis es superior a la de cisticercosis, pese a no ser un estudio dirigido. La hidatidosis se ha caracterizado por la ausencia de estudios epidemiológicos en Mozambique (Karshima et al., 2022). Únicamente, en el estudio realizado por Noormahomed y colaboradores describieron una seroprevalencia de 17,3% de esta enfermedad (Noormahomed et al., 2014). La prevalencia media de hidatidosis en las regiones de África subsahariana fue 1,7% (Karshima et al., 2022), siendo este valor inferior al 4,6% del estudio realizado en el presente capítulo. Este dato puede sugerir un claro infradiagnóstico de esta enfermedad en Mozambique. Entre los resultados serológicos positivos a hidatidosis, se evidencia como el género femenino presenta una mayor prevalencia (2,90%) que el masculino (1,45%), estando las cifras de ambos géneros bastante equilibradas (50,77% mujeres, 49,23% hombres). La posible razón de esta diferencia en los resultados de seroprevalencia podría atribuirse a la organización de las tareas domésticas y actividades que realiza cada grupo (Agudelo Higuita et al., 2016). En el estudio realizado en Sudán del sur (Stewart et al., 2013), únicamente las mujeres Capítulo 2 95 resultaron infectadas de hidatidosis, y lo atribuían a que ellas eran las responsables de realizar la limpieza de los restos de animales, basuras, heces de perros y demás desperdicios, por lo que la manipulación de estos residuos supondría un riesgo de contraer la parasitosis. En lo relativo a la edad, los rangos de edades de los participantes en el estudio presentaron unas distribuciones dispares en cada grupo, siendo el rango de 5-15 años el que presentó mayor número de individuos (77,10%). Al comparar el número de positivos a hidatidosis de manera segregada, la prevalencia es superior en aquellos individuos que pertenecen al grupo con edad superior a 65 años (16,67%), existiendo diferencias significativas en la edad de aquellos que presentan un resultado positivo a hidatidosis frente a los que presentan un resultado negativo (p < 0,05). La hidatidosis normalmente es una patología asintomática, (Agudelo Higuita et al., 2016), esto sumado al lento crecimiento de los quistes (Wen et al., 2019b), y la mayor exposición a edades más avanzadas podrían ser los motivos del mayor número de resultados positivos en el rango de edad de mayores de 65. Las coinfecciones con hidatidosis diagnosticadas fueron: uncinarias (por N. americanus), tricurosis y esquistosomiasis (S. mansoni), en orden de mayor prevalencia. La mayor prevalencia de coinfección entre uncinarias e hidatidosis (50% de las coinfecciones) no resulta inesperada, puesto que dentro de las helmintosis diagnosticadas en la población de estudio, la ocasionada por N. americanus es la más prevalente (14,78%). Los resultados obtenidos coinciden con otros reportados en diferentes regiones de África: el metaanálisis realizado por Boltena y colaboradores (Tadesse Boltena et al., 2022) en África subsahariana, se centró en mujeres embarazadas, considerando aquellos casos que presentaban coinfección con malaria y helmintosis. De los 24 estudios analizados, las helmintosis más prevalentes fueron las ocasionadas por las uncinarias, seguidas de las parasitosis por A. lumbricoides y finalmente por T. trichiura. El cribado serológico de hidatidosis permite realizar un screening previo con el objetivo de conocer la prevalencia aproximada de le enfermedad. Siendo importante delimitar las áreas de estudio a aquellas que tienen riesgo potencial, ya sea por la presencia de ganado y perros en aquellas áreas rurales con medidas limitadas de saneamiento. Sin embargo, es necesario realizar pruebas de imagen que permitan confirmar el diagnóstico de la patología, ya sea con un ecógrafo portátil u otros dispositivos disponibles a nivel hospitalario. Hay que considerar que las pruebas serológicas no presentan una sensibilidad del 100%, en el caso del antígeno 2B2t, la sensibilidad se reduce en aquellos casos en los que los quistes están calcificados, por lo que, si se cuenta con los suficientes recursos económicos, sería ideal realizar las pruebas Capítulo 2 96 de imagen a cierto porcentaje de la población estudiada y no únicamente a aquellos con un resultado serológico positivo. Capítulo 3 97 VI. CAPÍTULO 3. Evaluación de la utilidad de marcadores serológicos de loasis en zonas endémicas 3.1. Introducción La loasis es una enfermedad parasitaria transmitida tras la picadura de la mosca del género Chrysops, portadora de las formas parasitarias de la especie Loa loa. La prevalencia de esta patología se estima en 13 - 15 millones de personas en las regiones central y oeste de África, únicos lugares donde la enfermedad está circunscrita (Drame et al., 2014; Metzger & Mordmüller, 2014a). La principal patología que produce esta parasitosis es el denominado edema de Calabar, causado tras la migración de los adultos a través del tejido subcutáneo y la subsiguiente muerte de estos. Otra de las manifestaciones clínicas más habituales es la presencia de la forma adulta de Loa loa en la conjuntiva ocular. Pese a que la parasitosis mantenida puede provocar afectación renal, cardiaca, pulmonar y neurológica, asociada a pérdida de calidad de vida, también existen múltiples casos que cursan de manera asintomática. Una de las principales causas, que ha motivado el desarrollo de técnicas diagnósticas de loasis, ha sido los graves efectos adversos (encefalitis en ocasiones mortales) que se producen en pacientes con una alta parasitemia de Loa loa (pacientes hipermicrofilarémicos), tras la administración masiva de ivermectina para el tratamiento, dentro de los programas de control y eliminación, de otras enfermedades parasitarias como la oncocercosis (Gardon et al., 1997). El diagnóstico de Loa loa se realiza mediante la observación e identificación microscópica de las microfilarias en frotis de sangre. También se identifica el estadio adulto de Loa loa tras la extirpación cutánea u ocular. Entre las técnicas moleculares empleadas, se distinguen: la PCR convencional, PCR a tiempo real y LAMP (Drame et al., 2014; Formenti et al., 2021; Nuchprayoon et al., 2005; Poole et al., 2015; Ta-Tang et al., 2022). El empleo de estas pruebas requiere un equipamiento y unas instalaciones que no son económicamente viables, ni en trabajos de campo, ni en muchos países del continente africano, donde es necesario realizar el cribado epidemiológico. Debido a ello, se insta al desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas aplicables a campo. Entre ellas Capítulo 3 98 las basadas en la detección de anticuerpos. Estas técnicas suponen un coste menor, requieren un personal menos cualificado y son adecuadas para realizar cribados epidemiológicos a gran escala. Con respecto a los antígenos de Loa loa evaluados en la presente memoria, el antígeno de 15 kDa, formado por varias regiones repetitivas, fue identificado en las distintas etapas del ciclo biológico de Loa loa (Ajuh et al., 1995). Algunas de las repeticiones presentaron una marcada homología con antígenos de Brugia spp., mientras que otras como la región R3, parece ser específica de la especie Loa loa (Toure et al., 1997). El ensayo ELISA realizado por Azzibrouck y colaboradores con el antígeno recombinante 15r3 expresado en un vector procariota (Azzibrouck et al., 2010), mostró reactividad con las subclases IgG1, IgG2 e IgG3, pero ausencia de reactividad frente a IgG4 en muestras de sueros humanos. La sensibilidad obtenida fue 88% (con IgG1), 70% (con IgG2) y 33% (con IgG3). Para la determinación de la especificidad se emplearon muestras de sueros diagnosticados con otras filarias: M. perstans, O. volvulus y W. bancrofti. Los valores de especificidad obtenidos fueron: 60% (con IgG1), 91% (con IgG2) y 83% (con IgG3) (Azzibrouck et al., 2010). El antígeno Ll-SXP1 pertenece a la familia de proteínas de nematodos Sxp1/λRAL. Dentro de esta familia se han identificado otras proteínas de B. malayi, W. bancrofti y O. volvulus. El estudio realizado con este antígeno recombinante en formato ELISA mostró una sensibilidad del 56% y una especificidad del 98% detectando IgG4 (Klion et al., 2003). Se ha desarrollado un test rápido con esta misma proteína recombinante con una sensibilidad del 94% al realizar la lectura empleando el ojo humano, sin hacer uso de ningún dispositivo. La especificidad alcanzada fue 82% frente a muestras de O. volvulus, 87% frente a muestras de W. bancrofti y 88% frente a M. perstans (Pedram et al., 2017). El antígeno Ll-14221fue identificado como potencial biomarcador tras la realización del transcriptoma de L. loa y el posterior análisis bioinformático. Se desarrolló una técnica de detección de antígeno en muestras de plasma/suero empleando anticuerpos IgG monoclonales y policlonales. La especificidad obtenida fue del 100% (empleando muestras de O. volvulus y W. bancrofti), mientras que la sensibilidad fue 36% con los anticuerpos policlonales y del 67,9% al utilizar los monoclonales (Drame et al., 2017). Capítulo 3 99 El antígeno Ll-16297 fue identificado como biomarcador tras el análisis proteómico de la orina de pacientes microfilarémicos infectados de Loa loa. Se empleó en el sistema de inmunoprecipitación con luciferasa reversa (LIPS), la especificidad obtenida fue 96% y la sensibilidad del 77% (Drame et al., 2016). Actualmente, se realiza la detección de IgG e IgG4 empleado el antígeno Ll-SXP1, tanto en formato ELISA, como en ICT y LIPS (Burbelo et al., 2008; Klion et al., 2003; Pedram et al., 2017). Por otro lado, existe un dispositivo portátil, denominado LoaScope, capaz de identificar y cuantificar las microfilarias en muestras de sangre, empleando un dispositivo móvil (D’Ambrosio et al., 2015). Esta herramienta es muy útil, sin embargo, la disponibilidad de dispositivos es limitada y, además, su aplicación a gran escala no es operativa. Recientemente, se ha propuesto aplicar una estrategia híbrida basada en serología-LoaScope, para delimitar las comunidades que son seguras para la administración de ivermectina (Johnson et al., 2022). Técnicamente esta estrategia está determinada por la calidad de las pruebas de determinación de anticuerpos empleadas. En este sentido, el presente capítulo tiene como objetivo la evaluación de diferentes antígenos candidatos para el diagnóstico serológico de loasis, así como la comparación de estos con los actualmente disponibles. 3.2. Material y métodos Antígenos recombinantes de Loa loa Los antígenos recombinantes seleccionados, tras realizar una búsqueda bibliográfica de candidatos antigénicos, fueron: Ll-15r3, Ll-SXP1, Ll-14221 y Ll-16297. Salvo el antígeno Ll-15r3, los candidatos restantes se obtuvieron comercialmente La estrategia de clonación se diseñó, previamente, con base a las etiquetas que se pretendían incorporar y las secuencias de los sitios de corte de las enzimas de restricción. En la tabla 3.1 se resumen las referencias de las secuencias de los antígenos en GenBank, las etiquetas con las que han sido producidos y las referencias bibliográficas de cada antígeno. Capítulo 3 100 Tabla 3.1. Características de las secuencias de los antígenos recombinantes de Loa loa seleccionados. Antígeno recombinante GenBank Etiquetas Referencias Ll-15r3 U03103 Hisa (Ajuh et al., 1995) Ll-SXP1 EFO21235 Hisa (Klion et al., 2003; Pedram et al., 2017) Ll-14221 NW_018108188 Hisa, GSTb (Drame et al., 2017) Ll-16297 EFO12236 Hisa, GSTa (Drame et al., 2016) Nota: La secuencia del Ag Ll-15r3 se corresponde con la región R3 de la secuencia U03103 (Azzibrouck et al., 2010); a (extremo amino terminal); b (extremo carboxilo terminal). Obtención del antígeno recombinante Ll-15r3 La secuencia del antígeno Ll-15r3 había sido previamente subclonada en el vector PQE-30, que proporciona una etiqueta de polihistidinas en el extremo amino terminal, y con esta construcción se habían transformado células Escherichia coli M15 (pREP4 [F-, Φ80ΔlacM15, thi, lac-, mtl-, recA+, KmR)], para estandarizar las condiciones de la expresión proteica. Partiendo de este clon, se llevó a cabo la expresión de dicha proteína siguiendo el protocolo que se describe a continuación. Expresión proteica Las células de E. coli M15, transformadas con el plásmido con la secuencia de interés, se cultivaron en medio LB con ampicilina a 37ºC y agitación hasta conseguir una densidad óptica medida a 600 nm, dentro del intervalo de 0,6 -0,8. En este punto se añadió al cultivo IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido), a una concentración final de 0,1 mM, y se mantuvieron las condiciones de 37ºC en agitación durante 4 horas más. El resultado de la expresión se verificó visualizando alícuotas de 20 µl de cultivo en un gel de poliacrilamida al 15% (SDS-PAGE). Purificación del antígeno recombinante Dada la naturaleza insoluble de la proteína recombinante, esta se purificó en condiciones desnaturalizantes. Así, tras la centrifugación, a 12.000 rpm, durante 15 minutos, del medio de cultivo celular se desechó el sobrenadante. Después, el sedimento obtenido se resuspendió en el tampón de lisis B-PER conteniendo lisozima y ADNasa I a https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U03103 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/EFO21235.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NW_018108188.1?report=fasta&from=689366&to=689655 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/EFO12236.1 Capítulo 3 101 las concentraciones finales de 200 µg/ml y 10 µg/ml, respectivamente y se incubó en agitación durante 30 minutos. El proceso de centrifugación y resuspensión en B-PER se repitió dos veces. Tras la última centrifugación, el sedimento se resuspendió en un tampón de solubilización (10 mM imidazol, 6 M hidrocloruro de guanidina, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 1 mM betamercaptoetanol a pH 8). Aprovechando que la proteína recombinante presentaba una cola de seis histidinas, se realizó la purificación mediante cromatografía de afinidad, empleando columnas con resina de níquel-sefarosa. Se realizó un gradiente con urea (partiendo de una concentración 6M hasta eliminar la urea completamente) con el tampón de renaturalización (6 M urea, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 10 mM imidazol, 1 mM betamercaptoetanol a pH 8). Las proteínas recombinantes retenidas se eluyeron en un tampón 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 500 mM imidazol, 1 mM betamercaptoetanol a pH 8. Los eluidos se dializaron empleando las membranas de diálisis Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette (ThermoScientific) a 4ºC con el tampón 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl a pH 8, cambiando la solución cada 2 horas. La concentración de la proteína recombinante producida se determinó inicialmente utilizando el kit Pierce™ BCA Protein Assay (ThermoScientific) y, posteriormente, por comparación frente a una curva estándar de albúmina sérica bovina (BSA) y visualización en un gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). La proteína se mantuvo a -80ºC hasta su uso. Proteínas recombinantes Ll-SXP1, Ll-14221 y Ll-16297 Las concentraciones de las proteínas recombinantes obtenidas comercialmente se verificaron mediante el método colorimétrico de BCA utilizando el kit Pierce BCA Protein Assay Kit (ThermoScientific, Pierce, IL, USA), junto con una curva patrón de albúmina sérica bovina (BSA). Además, la integridad de las proteínas recombinantes fue visualizada en geles de poliacrilamida al 12% (SDS-PAGE). Colecciones de muestras biológicas humanas Se ha realizado un análisis retrospectivo con muestras procedentes de la región insular (isla de Bioko) y continental de Guinea Ecuatorial. Las muestras (sangre y suero de cada individuo) fueron tomadas en el año 2006 (M. Jiménez et al., 2009). Los criterios de selección fueron: individuos mayores de 15 años procedentes de Guinea Ecuatorial, sin tratamiento previo con ivermectina. El número inicial de muestras disponibles fue 240. Además, para el estudio previo de la reactividad de los antígenos, se emplearon Capítulo 3 102 como controles: muestras de suero con patología confirmada de Loa loa, con un alto título de anticuerpos, sueros negativos de origen europeo previamente cribados para la donación de sangre y sueros de otras helmintosis con potencial reactividad cruzada relevante para el estudio (Onchocerca volvulus). Todas las muestras de suero se almacenaron en el repositorio C.0003989 del Biobanco del Instituto de Salud Carlos III. Microscopía y PCR cuantitativa La clasificación de las muestras por especies de Loa loa, Mansonella perstans o negativo (muestras en las que no se encontraron ninguna de las especies anteriores) fue realizada por el personal de Parasitología del ISCIII, mediante microscopía y PCR, a partir de las muestras de sangre. En el caso de la microscopía, las muestras fueron concentradas por el método de Knott (Knott, 1939), y a partir del sedimento obtenido, tras realizar la tinción de Giemsa, las microfilarias se identificaron microscópicamente. La PCR cuantitativa en tiempo real empleada para la caracterización fue realizada siguiendo el protocolo publicado por Ta y colaboradores en 2018 (Ta et al., 2018). Dado que el estudio inicial se realizó en el año 2006, no todas las muestras presentaban un volumen suficiente para su análisis por las diferentes técnicas, además en algunos casos existían discrepancias en cuanto a los resultados obtenidos por microscopía y PCR, debido a ello, se realizó una selección final, eliminando aquellas muestras discrepantes, así como las que presentaban un volumen de muestra insuficiente. Western blot Los antígenos recombinantes previamente descritos (Ll-15r3, Ll-SXP1, Ll-14221 y Ll-16297) se sometieron a dos tipos de tratamientos: en condiciones reductoras y en ausencia de ellas. Para el tratamiento reductor, se empleó el tampón Laemmli buffer (LB) a una concentración 2X (1,25 ml 1M Tris-HCl pH 6,8, 0,4 g de SDS, 0,2 ml de β- mercaptoetanol a 14,7 M, 0,5 ml de EDTA 0,5 M, 4 mg de azul de bromofenol y agua tipo II hasta un volumen final de 10 ml) donde se diluyó el antígeno recombinante. La disolución resultante se mantuvo a 100ºC durante 5 minutos. En el tratamiento no reductor, la proteína recombinante se diluyó con el tampón tracking dye 1:50 (8 ml glicerol, 0,05 g azul bromofenol, 0,5 M Tris-HCl) y SDS 10 %. Se mantuvo a 65ºC Capítulo 3 103 durante 15 minutos. Posteriormente, se añadió glicerol al 6% hasta completar el volumen necesario para obtener la proteína a la concentración calculada. Las proteínas recombinantes se cargaron en los geles de poliacrilamida probando diferentes concentraciones (el rango utilizado fue 4 ng/µl a 100 ng/µl) y dos tipos de geles según su aplicación: de pocillo único y geles de 10 pocillos. Los porcentajes de separación de los geles de poliacrilamida fueron seleccionados según la masa molecular del antígeno recombinante. También se incluyó un marcador de peso molecular de 10 a 250 kDa (Precision Plus Protein Dual Color Standards, Bio-Rad). En la electroforesis se utilizó el tampón de migración electroforética, running buffer (25 mM Tris, 190 mM glicina, 0,1% de SDS). Las intensidades de corriente seleccionadas fueron 80 V al inicio, y 100V una vez transcurridos los 10 primeros minutos. La transferencia de las proteínas recombinantes desde el gel a la membrana de nitrocelulosa (Amersham™ Protran™ Premiun NC, Thermo Fisher Scientific) se realizó en un sistema en formato húmedo (Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell, Bio- Rad) a 4ºC y en agitación en el tampón de transferencia (25mM Tris, 190 mM glicina, 20% metanol). Se utilizó una intensidad de corriente de 350 mA durante 1 hora. Una vez completada la transferencia, se realizaron 4 lavados con PBS-Tween 0,3%. En el caso de los geles de pocillo único, se cortó la membrana en tiras de 4 mm de ancho empleando el dispositivo Accutran Strip Cutter (Gasser Apparatebau). La membrana se bloqueó e incubó con los sueros a una dilución 1/100 en PBS-Tween 0,3% y leche desnatada en polvo 5% con un volumen final de 0,5 ml y agitación durante 12 horas a 4ºC. Se realizaron 4 lavados de 5 minutos con PBS-Tween 0,3% templado. A continuación, se incubaron con 0,5 ml del anticuerpo secundario correspondiente: anticuerpo de cabra frente a IgG totales humanas conjugado con peroxidasa (IgG (H+L) Goat anti-Human, HRP, Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific) o anticuerpo de ratón frente a IgG4 humanas (Mouse Anti-Human IgG4 Fc-UNLB (HP6025), SouthernBiotech). Se probaron diferentes concentraciones de anticuerpo secundario en función del antígeno recombinante empleado (diluciones de 1/250 a 1/1000). Se realizó la dilución del anticuerpo secundario en PBS-Tween 0,3% y se mantuvo en agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizaron dos lavados con PBS-Tween 0,3% y dos lavados únicamente con PBS. El revelado de las membranas se realizó con 0,5 ml por tira de la dilución de 10 mg tetrahidrocloruro de 3,3´- diaminobencidina (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, Sigma-Aldrich) junto con Capítulo 3 104 12 µl de peróxido de hidrógeno al 30% y 15 ml de PBS. Se incubó durante 10 minutos en agitación y finalmente se detuvo la reacción con agua tipo II. Test comercial ICT LSXP1 Se empleó el test comercial inmunocromatográfico Loa Antibody Rapid Test (Drugs and Diagnosis for Tropical Diseases (DDTD), California, USA), sobre las muestras de suero. Se siguieron las indicaciones establecidas por el fabricante. Visualización de los datos y análisis estadístico Con los resultados obtenidos con cada antígeno recombinante se calculó la sensibilidad, especificidad e intervalo de confianza al 95%, para ello se utilizó el programa EPIDAT (versión 3.1). Para la realización de las gráficas y visualización de los datos se emplearon el lenguaje de programación R (versión 4.2.1) y el programa de software de hojas de cálculo Microsoft Excel (versión 2307). Además, para elaboración de las ilustraciones se empleó la herramienta web BioRender. 3.3. Resultados Selección de muestras microafilarémicas De las 240 muestras iniciales a evaluar en el presente capítulo, se descartaron aquellas con un volumen de muestra insuficiente, así como aquellas de las que no se disponían de datos de microscopía, ni qPCR. Tras realizar este filtrado, el total de muestras obtenido fue 95. En la siguiente tabla se resume la clasificación de las muestras: Tabla 3.2. Muestras humanas empleadas clasificadas por especie según las técnicas de referencia. Muestras N inicial N final Microscopía 234 95 Mansonella perstans 61 16 Loa loa 33 10 L. loa / M. perstans 2 0 Negativos 138 69 RT-PCR 177 95 Capítulo 3 105 Mansonella perstans 67 16 Loa loa 13 10 L. loa / M. perstans 0 0 Negativos 89 69 Total 240 95 N= número de muestras; N inicial: muestras iniciales evaluadas; N final: muestras finales con las que se ha realizado el análisis. La siguiente figura esquematiza el proceso de selección de las muestras y las técnicas diagnósticas que se emplearon para la realización del estudio: Figura 3.1. Diagrama de flujo de la relación de muestras procedentes de Guinea Ecuatorial y técnicas serológicas de diagnóstico de loasis. WB: western blot; ICT: test inmunocromatográfico. Antígeno recombinante Ll-15r3 La masa molecular del antígeno LL-15r3 se confirmó tras su expresión y purificación. En la imagen se muestra la curva de BSA con diferentes concentraciones y la proteína con un tamaño de 15kDa. La concentración estimada de la proteína fue 0,07 mg/ml. Capítulo 3 106 Figura 3.2. Integridad y concentración de la proteína recombinante Ll-15r3. MK: marcador estándar de masa molecular en kDa. 1-6: Curva estándar de albúmina sérica bovina a concentraciones decrecientes 1: 1 mg/ml. 2: 0,75 mg/ml. 3: 0,5 mg/ml. 4: 0,250 mg/ml. 5: 0,125 mg/ml. 6: 0,062 mg/ml). 7: proteína recombinante Ll-15r3. 8: dilución 1/2 de la proteína recombinante Ll-15r3. Antígeno recombinante Ll-SXP1 Se confirmó que el antígeno recombinante Ll-SXP1 presentaba una masa molecular de 17,85 kDa y una concentración de 2,93 mg/ml. En la imagen se muestra la integridad de la proteína tras la visualización en gel de poliacrilamida al 12%. Figura 3.3. Integridad y concentración de la proteína recombinante Ll-SXP1. MK: marcador estándar de masa molecular en kDa. 1-6: Curva estándar de albúmina sérica bovina a concentraciones decrecientes (1: 1 mg/ml. 2: 0,75 mg/ml. 3: 0,5 mg/ml. 4: 0,250 mg/ml. 5: 0,125 Capítulo 3 107 mg/ml. 6: 0,062 mg/ml).7: marcador estándar de masa molecular en kDa. 8: dilución 1/2 de la proteína recombinante Ll-SXP1. 9: dilución 1/4 de la proteína recombinante Ll-SXP1. Antígeno recombinante Ll-14221 Se confirmó la masa molecular de 34,9 kDa en la proteína recombinante Ll-14221. La concentración obtenida fue 40 ng/µl. Figura 3.4. Integridad y concentración de la proteína recombinante Ll-14221. MK: marcador estándar de masa molecular en kDa. 1: dilución 1/2 de la proteína recombinante Ll-14221. 2- 8: Curva estándar de albúmina sérica bovina a concentraciones decrecientes (2: 1 mg/ml. 3: 0,5 mg/ml. 4: 0,25 mg/ml. 5: 0,125 mg/ml. 6: 0,062 mg/ml. 7: 0,0031 mg/ml. 8: 0,0015 mg/ml). Antígeno recombinante Ll-16297 La concentración obtenida de la proteína recombinante Ll-16297 fue 0,57 mg/ml, tras la visualización en el gel de poliacrilamida se confirmó el peso molecular de 43 kDa. Capítulo 3 108 Figura 3.5. Integridad y concentración de la proteína recombinante Ll-16297. MK: marcador estándar de masa molecular en kDa. 1-6: Curva estándar de albúmina sérica bovina a concentraciones decrecientes 1: 1 mg/ml. 2: 0,75 mg/ml. 3: 0,5 mg/ml. 4: 0,250 mg/ml. 5: 0,125 mg/ml. 6: 0,062 mg/ml). 7: proteína recombinante Ll-16297, 8: dilución 1/2 proteína recombinante Ll-16297. Estandarización de las condiciones Las diferentes concentraciones y condiciones empleadas mediante la técnica western blot se esquematizan en la siguiente tabla: Tabla 3.3. Especificaciones de las condiciones empleadas en el western blot con cada antígeno recombinante. Antígeno recombinante Concentración antígeno Dilución sueros Anticuerpo secundario Dilución anticuerpo secundario Condiciones Ll-15r3 5 ng/µl 1/100 IgG* 1/1000 Reductoras Ll-SXP1 4 ng/µl 1/100 IgG4** 1/250 Reductoras Ll-14221 100 – 6,25ng/µl 1/100 IgG 1/1000 Ambas testadas Ll-16297 100 – 6,25ng/µl 1/100 IgG 1/1000 Ambas testadas *Ll-15R3 no se detectaron IgG2 ni IgG4. **Ll-SXP1 también se testaron IgG totales. Capítulo 3 109 Comparación métodos de diagnóstico serológico de loasis La evaluación de las muestras con loasis confirmada por PCR y microscopía produjo unos valores de sensibilidad del 100% en el caso del western blot con el antígeno recombinante Ll-15r3, y con la prueba comercial inmunocromatográfica. El valor de sensibilidad fue algo inferior (80%) con el western blot con el antígeno recombinante Ll- SXP1. En cuanto a los valores de especificidad total, el antígeno recombinante Ll-15r3 en western blot alcanzó el valor de 76,47%, seguido por el western blot del antígeno Ll- SXP1, con un valor de 50,59%. Mientras que la prueba comercial inmunocromatográfica (ICT) con el mismo antígeno, obtuvo el menor valor de especificidad (17,86%). La tabla siguiente muestra los resultados detallados. Los antígenos recombinantes Ll-14221 y Ll- 16297, fueron descartados como candidatos para el diagnóstico serológico de loasis, al no presentar la suficiente reactividad en los estudios preliminares. Tabla 3.4. Propiedades diagnósticas de las técnicas serológicas de loasis. Técnica / Ag.recombinante N (+/-) Sensibilidad IC 95% Especificidad IC 95% WB Ll-15r3 95 30/65 100% 95 - 100 76,47% 66,86 - 86,08 WB Ll-SXP1 95 31/37 80% 50,21 - 100 50,59% 39,37 - 61,81 ICT Ll-SXP1 95 79/15 100% 95 - 100 17,86% 9,07 - 26,64 WB Ll-14221 10 - No reactiva - No reactiva - WB Ll-16297 10 - Insuficiente reactividad - Insuficiente reactividad - WB: western blot; ICT: test inmunocromatográfico; IC: intervalo de confianza; N: número de muestras. La reactividad cruzada con las muestras positivas de M. perstans fue evidente con la técnica ICT Ll-SXP1, ya que, salvo una, todas las muestras de M. perstans fueron positivas. Al emplear la técnica WB Ll-SXP1, la reactividad cruzada fue menor, pese a que 11 de las 16 muestras de M. perstants, presentaron un resultado positivo. En el caso de la técnica WB Ll-15r3 presentó también cierta reactividad cruzada, aunque fue el test diagnóstico con menor proporción, 5 de las 16 muestras de Mansonella perstants, presentaron un resultado positivo. Los resultados obtenidos están resumidos en la tabla 3.5. Capítulo 3 110 Tabla 3.5. Resultados de las técnicas serológicas en el estudio de candidatos serológicos de loasis. WB: western blot; ICT: test inmunocromatográfico. La siguiente gráfica muestra la distribución de los resultados positivos con las diferentes técnicas y antígenos: Figura 3.6. Porcentaje de resultados positivos con cada técnica de diagnóstico serológico de loasis. WB: western blot; ICT: test inmunocromatográfico. 3.4. Discusión De todos los candidatos probados, los antígenos recombinantes Ll-15r3 y Ll- SXP1 han sido los únicos que han presentado reactividad para el diagnóstico serológico de loasis. Los candidatos Ll-14221 y Ll-16297, que mostraron falta de reactividad, habían sido seleccionados por su utilidad como bioanalitos en sistemas de detección de antígeno (Drame et al., 2016, 2017). La sensibilidad reportada por el antígeno Ll-14221 mediante la técnica de captura de antígeno empleando anticuerpos monoclonales fue 67,9% (Drame et al., 2017), por lo que cabría esperar una adecuada reactividad del antígeno. Estos ensayos presentaron los mejores resultados cuando los sueros fueron tratados con glicina, lo que implica que los antígenos (Ll-14221 y Ll-16297) y sus anticuerpos específicos circulan mayoritariamente como inmunocomplejos y sería una posible explicación para la ausente o débil reactividad encontrada en nuestros experimentos. El antígeno Ll-16297 0 20 40 60 80 100 120 140 L. loa M. perstans Negativos WB Ll-15r3 WB Ll-SXP1 ICT-Ll-SXP1 WB Ll-15r3 WB Ll-SXP1 ICT Ll-SXP1 N Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo M. perstans 16 5 11 11 5 15 1 Loa loa 10 10 0 8 2 10 0 Capítulo 3 111 sí que presentó cierta reactividad con las muestras de sueros infectados con Loa loa, sin embargo, también se evidenció la misma reactividad en los controles negativos, motivo por el que se descartó su utilización. De todos los antígenos testados en la presente memoria, el antígeno Ll-16297 fue el que presentó, con diferencia, un menor grado de purificación (55 %), por lo que no podemos descartar que la contaminación por E. coli interfiriera en el resultado. Probablemente el factor más determinante, en esta diferencia de reactividad, haya sido el uso un sistema de expresión procariota en vez del sistema de expresión en células de mamíferos aplicado en el estudio publicado con esta molécula (Drame et al., 2016). El antígeno Ll-SXP1 presentó una mayor sensibilidad (100%) en el dispositivo ICT frente a la mostrada con la técnica del western blot (80%). Sin embargo, la especificidad de la técnica con el test rápido fue muy inferior (17,86%) a la del western blot (50,59%). Si bien, los actuales sistemas de recogida de muestras en papeles whatmann (Biswas, 2004), permiten una elución posterior para su utilización en un laboratorio con los requerimientos necesarios para realizar la técnica del western blot, los test comerciales presentan la ventaja de su portabilidad y fácil manejo en campo. Dado que las dos tecnologías tienen, pese a presentar múltiples diferencias, base similar en cuanto a que se trata de la visualización de la banda correspondiente al antígeno tras una reacción específica antígeno-anticuerpo, los resultados obtenidos con el western blot hacen pensar que es posible mejorar las condiciones de especificidad de la técnica comercial optimizando las condiciones del antígeno Ll-SXP1 en el dispositivo ICT. El antígeno Ll-15r3 fue el candidato con las mejores propiedades diagnósticas en las condiciones estudiadas; la sensibilidad obtenida fue del 100% y la especificidad del 76,47%. Esta especificidad fue muy superior a la del antígeno Ll-SXP1 en las diferentes técnicas utilizadas. El antígeno recombinante Ll-15r3 presentó el menor número de positivos con sueros de M. perstants, por lo que fue la técnica con menor reactividad cruzada. Dado que el objetivo de estas técnicas es realizar un cribado serológico de loasis, previo la administración masiva de fármacos para el tratamiento de oncocercosis (Gardon et al., 1997), la baja reactividad cruzada frente a otras patologías, como Mansonella perstants, supone un punto clave a la hora de seleccionar el antígeno serológico más adecuado. Capítulo 3 112 El estudio planteado presenta ciertas limitaciones, sería necesario aumentar el número de muestras positivas con un diagnóstico confirmado de Loa loa. Los criterios de inclusión han sido bastante restrictivos, seleccionando únicamente aquellas muestras con resultado positivo a Loa loa tanto por microscopia como por PCR. Es cierto que la técnica diagnóstica basada en la identificación microscópica de microfilarias presenta como inconveniente que no todos los casos de loasis presentan microfilaremia (A. Garcia et al., 1999; Pinder et al., 1988), sin embargo, dado que el objetivo final es la identificación y cribado de individuos con alta microfilaremia (susceptibles de desarrollar reacciones adversas graves a ivermectina (Gardon et al., 1997)), se ha preferido seguir una estrategia más conservadora para asegurar que las muestras fueran verdaderos casos microfilarémicos. Otro de los aspectos a considerar al ser una evaluación de técnicas serológicas, es posible que los valores de las especificidades obtenidos no sean reales. Pueden existir positivos serológicos, que no presenten microfilaremia detectada ni por microscopia ni por técnicas moleculares; esto es, pacientes que hayan padecido loasis y que aún presenten títulos de anticuerpos, pero que podrían recibir el tratamiento farmacológico sin desarrollar reacciones adversas. Esta última limitación no sería atribuible al estudio en sí mismo, sino a las limitaciones intrínsecas de las técnicas serológicas. El estudio se ha realizado en muestras procedentes de un área endémica como es Guinea Ecuatorial, lo que ha permitido estandarizar y optimizar las técnicas con muestras similares a las que está destinada su utilización. Hay que considerar que los individuos de regiones endémicas están en contacto con otras helmintosis, que pueden suponer cierto fondo inmunológico a la hora de realizar pruebas de diagnóstico serológico. Los antígenos recombinantes Ll-15r3 (Ajuh et al., 1995; Azzibrouck et al., 2010) y Ll-SXP1(Klion et al., 2003; Pedram et al., 2017) ya habían sido testados en publicaciones anteriores, el estudio realizado ha permitido comparar las propiedades diagnósticas de cada uno en un área endémica empleando las mismas muestras. El antígeno Ll-15r3 había sido probado en formato ELISA detectando diferentes subclases de IgG (Azzibrouck et al., 2010), pero en el estudio realizado en la presente Tesis Doctoral, no se ha obtenido una adecuada reactividad frente a IgG2 ni IgG4. La ausencia de reactividad frente a IgG4 coincide con el resultado publicado por Azzibrouck y colaboradores, sin embargo, los resultados son discrepantes con respecto a la IgG2. Ese Capítulo 3 113 fue el motivo por el que se decidió determinar la reactividad frente a IgG totales y no cada una de las subclases de manera individualizada. Con respecto al antígeno recombinante Ll-SXP1, los resultados de sensibilidad son similares a los reportados por los estudios previos realizados con esta proteína recombinante para el diagnóstico serológico de loasis (Klion et al., 2003; Pedram et al., 2017). En el caso de la especificidad los resultados han sido discrepantes, obteniendo un valor bastante inferior (17,9% en el caso del ICT y 50,6% en el western blot detectando IgG4), siendo los valores de especificidad superiores al 80% en los estudios publicados con la misma proteína recombinante (Klion et al., 2003; Pedram et al., 2017). Probablemente esta discrepancia se debe a la preponderancia de individuos con mansonelosis en el presente estudio, causante del mayor porcentaje de reacciones cruzadas en relación con otros grupos de enfermedades. La posible aplicación combinada de las pruebas de determinación de anticuerpos evaluadas y la tecnología LoaScope (estrategia híbrida serología-LoaScope), permitiría delimitar las comunidades que son seguras para la administración de ivermectina. El western blot con el antígeno recombinante Ll-15r3 obtuvo los mejores resultados. Esta estrategia requiere de sensibilidades muy altas que incluyan a todos los individuos microfilarémicos y aunque lo ideal es que la especificidad también lo sea, puede aceptarse un “cierto error”, ya que todos lo positivos son reevaluados con el dispositivo LoaScope. Por lo que, de manera alternativa, también sería factible emplear la proteína recombinante Ll-SXP1 en western blot detectando IgG4, dado que el dispositivo ICT actualmente comercializado presenta ciertas limitaciones en sus propiedades diagnósticas, siendo especialmente bajo su valor de especificidad. Para su aplicabilidad real en campo, lo que se recomienda, a raíz de estos resultados, es mejorar dispositivo SXP1-ICT y /o desarrollar un dispositivo basado en el antígeno Ll-15r3. Capítulo 4 114 VII. CAPÍTULO 4. Angiostrongylus cantonensis y Gnathostoma spinigerum: aportaciones preliminares en el campo serológico 4.1 Evaluación de candidatos para el diagnóstico serológico de angiostrongilosis 4.1.1 Introducción La neuroangiostrongilosis está causada por la especie A. cantonensis, parásito en proceso de expansión. Pese a que Europa se considera una zona no endémica de A. cantonensis, se han reportado casos de hospedadores parasitados en Mallorca, Tenerife y Valencia (Delgado-Serra et al., 2022; Galán-Puchades et al., 2022; Martin-Alonso et al., 2015). Estos casos ponen de manifiesto el potencial de esta parasitosis de convertirse en una patología emergente en España. El diagnóstico de angiostrongilosis requiere la evaluación de datos basados en la sintomatología y evolución clínica del paciente, pruebas bioquímicas orientativas como el aumento de eosinófilos en sangre y/o líquido cefalorraquídeo, la evidencia de haber consumido el hospedador intermediario o paraténico, y el resultado de pruebas serológicas. El diagnóstico confirmatorio de A. cantonensis se realiza mediante identificación microscópica directa de larvas en LCR o mediante PCR, sin embargo es extremadamente infrecuente obtener el diagnóstico confirmatorio (Melo et al., 2022; Sawanyawisuth & Chotmongkol, 2013). En ambos métodos la tasa de acierto diagnóstico depende de la carga parasitaria y del estadio de la infección (Murphy & Johnson, 2013). El diagnóstico serológico se realiza con diferentes técnicas, entre ellas, las más ampliamente empleadas son: ELISA y western blot. Sin embargo, los valores de sensibilidad y especificidad varían en función de los antígenos utilizados en cada técnica (Melo et al., 2022). Actualmente se emplean los antígenos de bajo peso molecular, 29kDa y 31kDa, procedentes del extracto crudo somático de hembras de Angiostrongylus cantonensis (Nuamtanong, 1996), considerados los marcadores serológicos con las mejores propiedades diagnósticas (Eamsobhana & Yong, 2009; Vitta, 2012). Sin embargo, una limitación de estas técnicas diagnósticas es la reactividad cruzada que muestran con otras helmintosis, algunas de ellas con similar sintomatología. Al analizar estos antígenos de manera individual, el de 29 kDa presentó reactividad cruzada con la mayoría de sueros de otras parasitosis, sin embargo, el antígeno de 31 kDa presentó Capítulo 4 115 mejores propiedades diagnósticas, en concreto, una mayor especificidad frente a otras parasitosis (Nuamtanong, 1996). Con el fin de caracterizar este antígeno de 31 kDa, Morassutti y colaboradores clonaron y expresaron cuatro proteínas recombinantes, tras realizar una aproximación en electroforesis 2D y espectrometría de masas del antígeno de 31 kDa. Los autores sugerían que la reactividad del antígeno de 31 kDa podría implicar más de una proteína (Morassutti et al., 2012). Los mismos autores mostraron la existencia de reactividad cruzada del antígeno de 31 kDa con sueros de pacientes infectados con gnathostomosis, toxocariosis, hidatidosis y estrongiloidosis (Morassutti et al., 2017). Una proteína de 31 kDa que ha dado lugar a resultados prometedores es la galactina 2 (Gal2). Esta se aisló de un gel de SDS-PAGE, tras realizar un inmunoblot, que enfrentaba el antígeno crudo extraído de una hembra joven adulta de A. cantonensis a un suero humano con diagnóstico confirmado de A. cantonensis. La proteína Gal2 se identificó tras realizar un análisis mediante cromatografía líquida en tándem con espectrometría de masas (LC-MS/MS). Una vez conocida su secuencia aminoacídica, fue obtenida de forma recombinante (rGal2). La sensibilidad obtenida en ensayos serológicos con rGal2 alcanzó el valor de 95%, junto con una especificidad del 93,3% (Somboonpatarakun et al., 2019). La utilización de proteínas recombinantes con fines diagnósticos presenta varias ventajas; por una parte, el hecho de no tener que obtener el material parasitario, el cual presenta variabilidad en función de la temporada en la que se recoja y el hospedador o el área geográfica del que proceda el parásito. Además, permite reducir la reactividad cruzada, al no emplear todo el parásito, sino una proteína en concreto, dado el alto porcentaje de similitud antigénica que presentan los helmintos. También se consigue mejorar la trazabilidad y la reproducibilidad inter-lote, sumado al menor coste que supone la producción de las proteínas recombinantes (Daipert-Garcia et al., 2022). Puesto que esta ha sido la única proteína presente en la literatura con buenas expectativas a priori para ser utilizada como marcador diagnóstico, fue seleccionada para nuestro estudio. El objetivo del presente capítulo fue comprobar la inmunogenicidad y reactividad de la proteína recombinante GST-Gal2 para el diagnóstico serológico de angiostrongilosis mediante la técnica western blot. Capítulo 4 116 4.1.2. Material y métodos Antígeno recombinante GST-Gal2 La proteína recombinante GST-Gal 2 fue expresada en un sistema procariota (E. coli). Previamente, la secuencia correspondiente a la proteína recombinante Galectina 2 (GenBank: AEK98124.1), obtenida por síntesis artificial (GenScript), más la secuencia correspondiente a seis histidinas, fue subclonada en el vector de expresión pGEX-4T. Este vector da lugar a proteínas de fusión con la etiqueta GST en posición amino terminal que, en este caso, además, producirá a continuación la etiqueta de histidinas. La inducción de la expresión con IPTG y la posterior purificación de la proteína, se llevó a cabo siguiendo el mismo protocolo descrito en el apartado 2.1.2 de esta Tesis Doctoral para la purificación de la proteína rGST-T24H, mediante columna de níquel y columna de GST. La integridad y concentración de la proteína se verificó mediante el método colorimétrico con el kit Pierce BCA Protein Assay Kit (ThermoScientific) y con una curva patrón de albúmina sérica bovina (BSA). La proteína también se visualizó en gel de poliacrilamida al 12% (SDS-PAGE). Colecciones de sueros Para la evaluación del antígeno GST-Gal2 como marcador diagnóstico de angiostrongilosis, el número total de muestras de suero empleado fue 120: 8 muestras diagnosticadas con angiostrongilosis, 31 con otras enfermedades parasitarias y 81 muestras negativas. La tabla 4.1.1 resume las características y clasificación de las muestras de suero humanas utilizadas. Tabla 4.1.1. Muestras de suero empleadas en el estudio. Categorías N Angiostrongilosis (set 1) 8 Identificación parasitaria 2 Confirmación serológica 6 Otras parasitosis (set 2) 31 Gnathostomosis 7 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AEK98124.1 Capítulo 4 117 Neurocisticercosis 6 Cisticercosis 2 Estrongiloidosis 5 Esparganosis 3 Filarias linfáticas (W. bancrofti) 8 Negativos (set 3) 81 Total 120 N: número de muestras. Todas las muestras procedían de la seroteca del departamento de Helmintología de la Universidad de Mahidol, Facultad de Medicina Tropical de Bangkok (Tailandia). De las muestras con diagnóstico de angiostrongilosis, en dos de ellas el diagnóstico se había confirmado mediante la identificación microscópica de la especie tras la extracción del parásito. Las seis muestras restantes fueron clasificadas como positivas a angilostrongilosis por la presencia de síntomas y circunstancias epidemiológicas compatibles junto a un resultado positivo en western blot frente al antígeno crudo de A. cantonensis. En todas las muestras positivas se realizó la técnica serológica del western blot con el antígeno crudo, siendo todas positivas, salvo una que resultó dudosa con una señal muy débil, apenas imperceptible, pero en la que se identificó microscópicamente al parásito. Entre las muestras de suero con otras patologías parasitarias seleccionadas, se eligieron aquellas cuya sintomatología fuera similar, esto es, que produzcan meningitis eosinofílicas o patologías cerebrales. En el caso de Gnathostoma spinigerum, todas las muestras utilizadas fueron positivas en western blot empleando el antígeno crudo de G. spinigerum, y en dos de ellas se confirmó el diagnóstico mediante identificación microscópica. Tanto las muestras de neurocisticercosis como cisticercosis, el resultado positivo a estas patologías se confirmó por serología. En el caso de Strongyloides stercolaris y esparganosis, se identificó microscópicamente al parásito. Las muestras de W. bancrofti fueron diagnosticadas tras la detección de microfilarias en muestras de sangre. Capítulo 4 118 Western blot El protocolo empleado para la realización del western blot fue el mismo que se siguió en el capítulo 2 de la Tesis Doctoral. El antígeno fue testado bajo condiciones desnaturalizantes y reductoras y condiciones desnaturalizantes no reductoras. Se testaron diferentes concentraciones del antígeno GST-Gal2: 62,5 ng/µL, 31,2 ng/µL, 20 ng/µL, 15,6 ng/µL y 10 ng/µL. Para el proceso de optimización de la técnica, se seleccionó un suero positivo a A. cantonensis (diagnóstico confirmado tras la identificación de la larva y con resultado serológico positivo frente al antígeno crudo) y un suero negativo. La dilución de los sueros en el ensayo fue 1/100 en PBS-Tween 0,3% y leche desnatada en polvo 5%. El anticuerpo secundario empleado fue un anticuerpo de cabra que reconocía las Fc de IgG totales humanas, conjugado con peroxidasa (IgG (H+L) Goat anti-Human, SouthernBiotech). Para el anticuerpo secundario se testaron dos diluciones: 1:1000 y 1:2000. Para la visualización de las bandas en la membrana de nitrocelulosa (Amersham™ Protran™ Premiun NC, Thermo Fisher Scientific), se empleó 2,6- dicloroindofenol (2,6-Dichloro-4-((dimethylamino)methyl) phenol hydrochloride, Sigma Aldrich) con 10 µL de peróxido de hidrógeno al 40%, y 10 ml de PBS1X. Análisis estadístico El análisis estadístico basado en el cálculo de la sensibilidad, especificidad e intervalo de confianza al 95%, se realizó empleando el programa EPIDAT (versión 3.1). 4.1.3 Resultados La proteína recombinante GST-Gal2 presentó una masa molecular de 59,7 kDa. La concentración obtenida mediante el kit Pierce BCA Protein Assay Kit fue 0,21 mg/ml. En la figura 4.1.1 se observa la integridad de la proteína en el gel de poliacrilamida al 12%. Capítulo 4 119 Figura 4.1.1. Integridad y concentración de la proteína recombinante GST-Gal2. MK: Marcador estándar de masa molecular en kDa. 1-6: curva estándar de BSA a concentraciones decrecientes (1: 1mg/ml, 2: 0,5mg/ml, 3: 0.5mg/ml, 4: 0,25 mg/ml, 5: 0,02 mg/ml), 6: proteína recombinante GST-Gal2, 7: GST-Gal2 dilución ½. La concentración seleccionada de antígeno recombinante GST-Gal2 en western blot fue 20 ng/µL en condiciones desnaturalizantes y reductoras. En la figura 4.1.2 se representan dos de las concentraciones empleadas (10 ng/µL y 20 ng/µL). En ella puede observarse como a la segunda concentración las bandas en los sueros positivos aparecen con una mayor definición, mientras permanecen ausentes en los sueros negativos. En cuanto a la dilución del conjugado, esta se fijó a 1/1000. Figura 4.1.2. Resultados del western blot con diferentes concentraciones de antígeno GST-Gal2. A: 10 ng/µL del antígeno recombinante. B: 20 ng/µL antígeno recombinante. Mk: marcador de masa molecular en kDa. Capítulo 4 120 Tras procesar todas las muestras del estudio, algunas bandas se mostraban difusas en la membrana de nitrocelulosa, por lo que definimos tres tipos de resultados: positivo, negativo y dudoso. Los resultados de sensibilidad y especificidad, considerando a los resultados dudosos como negativos, se resumen en la tabla 4.1.2: Tabla 4.1.2. Resultados de las propiedades diagnósticas GST-Gal2 considerando los resultados dudosos como negativos. Propiedad diagnóstica N (+/-) Valor (%) IC 95% Sensibilidad 8 5/3 62,50 22,70 - 100 Especificidad 112 25/87 77,68 69,52 - 85,84 Valor predictivo positivo - - 16,67 1,66 - 31,67 Valor predictivo negativo - - 96,67 92,40 - 100 Nota: N: número de muestras; +/- : número de muestras con resultado positivo (+) y con resultado negativo (-); IC: intervalo de confianza. En la tabla 4.1.3 se resumen las características diagnósticas de la proteína recombinante GST-Gal2, al considerar los resultados dudosos como positivos: Tabla 4.1.3. Resultados de las propiedades diagnósticas GST-Gal2 considerando los resultados dudosos como positivos. Propiedad diagnóstica N (+/-) Valor (%) IC 95% Sensibilidad 8 6/2 75 38,74 - 100 Especificidad 112 46/66 58,93 49,37 - 68,49 Valor predictivo positivo - - 11,54 1,89 – 21,18 Valor predictivo negativo - - 97,06 92,31 - 100 Nota: N: número de muestras; +/- : número de muestras con resultado positivo (+) y con resultado negativo (-); IC: intervalo de confianza. Capítulo 4 121 Al considerar los resultados dudosos como negativos se alcanzó un valor de especificidad mayor (77,68%) en detrimento de la sensibilidad (62,50%). Por el contrario, al considerar los resultados dudosos como positivos, el valor de sensibilidad aumenta al 75%, y la especificidad disminuye al 58,93%. Tabla 4.1.4. Resultados reactividad cruzada con muestras de sueros de otras patologías y negativos. Muestra de suero N (+/ -) Dudosos Gnathostomosis 7 2/3 2 Neurocisticercosis 6 0/4 2 Cisticercosis 2 1/1 0 Estrongiloidosis 5 1/4 0 Esparganosis 3 0/3 0 Filariosis linfáticas (W. bancrofti) 8 3/5 0 Negativos 81 18/46 17 Nota: N: número de muestras; +/- : número de muestras con resultado positivo (+) y con resultado negativo (-). La reactividad cruzada del antígeno recombinante GST-Gal2 fue mayor con los sueros diagnosticados de gnathostomosis y con los de filariosis linfáticas. También presentaron resultados dudosos varias muestras de neurocisticercosis (2/6). 4.1.4 Discusión El diagnóstico de la neuroangiostrongilosis resulta complejo, además del inconveniente que entraña la identificación de la larva, dada su localización cerebral, hay que sumarle el hecho de que la sintomatología (meningitis/encefalitis eosinofílica) es coincidente con otras enfermedades parasitarias. Esto realza la necesidad de emplear diferentes enfoques diagnósticos para confirmar el agente etiológico en los casos sospechosos. Hay establecidas categorías de diagnóstico (sospecha, probable y confirmado) basado en una combinación de criterios (menores, mayores o confirmatorios) en los que las técnicas serológicas tiene un papel relevante (Graeff- Teixeira et al., 2023). Entre las herramientas de detección de anticuerpos actuales Capítulo 4 122 destacan las basadas en la proteína Gal2 desarrollados por Somboonpatarakun y colaboradores (Somboonpatarakun et al., 2019), con unos valores de sensibilidad del 95%, y una especificidad del 93,3%. Estos valores fueron muy superiores a los que se han obtenido en el presente estudio (sensibilidad del 75% y especificidad del 77,7%); si bien es cierto que la proteína es la misma, en la presente Tesis Doctoral, se ha incluido la secuencia de la proteína GST. Aunque esta proteína GST es originaria de Schistosoma japonicum, dada la alta tasa de homología entre diferentes helmintos, existiría la posibilidad de que la reactividad cruzada se debiera a la presencia de esta etiqueta. Sin embargo, este hecho no explicaría el valor inferior de la sensibilidad. En el artículo citado, el número de muestras diagnosticadas de angiostrongilosis es superior, un total de 30. Sin embargo, podría existir cierto sesgo, dado que 24 de esas muestras no son casos confirmados, sino que consisten en pacientes con meningitis eosinofílicas en las que los síntomas son compatibles con angiostrongilosis, pero no han identificado el parásito, por lo que son casos sospechosos. Es importante remarcar la dificultad que entraña la obtención de muestras correctamente diagnosticadas de angiostrongilosis, siendo este uno de los motivos por lo que las muestras proceden de zona endémica, Tailandia. En este sentido, en el presente estudio hemos preferido de nuevo optar por una estrategia más conservadora, incluyendo aquellas muestras con un diagnóstico confirmado de la enfermedad, aunque esto haya supuesto un número no tan elevado de casos. La reactividad cruzada obtenida con la proteína recombinante GST-Gal2 se observó con sueros diagnosticados con gnathostomosis, neurocisticercosis y filariasis linfáticas. Estas últimas presentan una sintomatología que dista de la ocasionada por la angiostrongilosis cerebral, aunque hay que tenerlo en cuenta, sobre todo a la hora de realizar el diagnóstico serológico, en el caso de pacientes procedentes de regiones donde haya una alta prevalencia de filariosis linfáticas. La similitud encontrada entre Gal2 y su ortólogo en B. malayi (89,5 %) apoya la posibilidad de una interferencia diagnóstica por comunidad antigénica, si bien las zonas reactivas de la proteína no han sido definidas. Cabe destacar que en el artículo publicado por Somboonpatarakun y colaboradores (Somboonpatarakun et al., 2019), no evidencian la existencia de reactividad cruzada entre el antígeno recombinante rAcGal2 y los sueros de cisticercosis, aunque no se especifica el tipo de método realizado para confirmar el diagnóstico, ni tampoco especifican que se incluyan sueros de neurocisticercosis. No se han encontrado similitudes entre el antígeno recombinante rAcGal2 y otras galactinas en T. solium. Capítulo 4 123 Otra de las causas que podría haber afectado a la especificidad real de esta proteína es que en el trabajo realizado por Somboonpatarakun y colaboradores, los sueros fueron preadsorbidos con un lisado de E. coli, antes de valorar su antigenicidad frente a Angiostrongylus, lo que a priori, disminuiría los falsos positivos o fondos elevados por reactividad de los sueros con antígenos bacterianos. Una de las limitaciones de la tecnología empleada, no asociada al antígeno recombinante GST-Gal2, es la ausencia de anticuerpos específicos en la fase aguda de la neuroangiostrongilosis; este hecho compromete la eficacia de las técnicas inmunológicas para el diagnóstico temprano de la enfermedad (Melo et al., 2022; Murphy & Johnson, 2013; Slom et al., 2002; Wilkins et al., 2013). Esto explicaría la relativamente baja sensibilidad obtenida, dado que es posible que las muestras se correspondieran con la fase inicial de la enfermedad, por lo que no existirían IgG que detectar. Esta limitación pone en evidencia la necesidad de emplear una combinación de técnicas moleculares o basadas en NGS que permitan diagnosticar la enfermedad en una fase temprana, (cuando se disponga de líquido cefalorraquídeo) y técnicas serológicas, que permiten un diagnóstico menos cruento, cuando los síntomas sean posteriores a las dos primeras semanas. 4.2 Evaluación de candidatos para el diagnóstico serológico de gnathostomosis 4.2.1 Introducción La gnathostomosis humana es otra de las enfermedades parasitarias que causan meningoencefalitis eosinofílicas, aunque es menos común que la angiostrongilosis (Sawanyawisuth & Chotmongkol, 2013). Si bien tanto A. cantonensis como G. spinigerum generan cuadros que afectan al SNC, provocan diferencias clínicas sustanciales. Estas son debidas al mayor tamaño de la larva de Gnathostoma que, junto con la presencia de varias coronas de espinas en su zona apical, provoca un daño neurológico mayor, con una enfermedad más grave que puede ocasionar la muerte (Khamsai et al., 2021). Los pacientes presentan principalmente síntomas de radiculomielitis o radiculomieloencefalitis, meningitis eosinofílica o meningoencefalitis, hemorragia subaracnoidea e incluso hemorragia intracerebral (G.-H. Liu et al., 2020). El diagnóstico es muy similar al de la patología anterior, en el que, además de los síntomas neurológicos y la eosinofilia, hay que considerar el consumo de alimentos crudos o poco Capítulo 4 124 cocinados contaminados (suelen suceder brotes). Para su diagnóstico se recurre a estudios radiológicos y diagnóstico serológico sobre suero y LCR (Sawanyawisuth & Chotmongkol, 2013). El gold standard para el diagnóstico es la detección e identificación de la larva de G. spinigerum, aunque en contadas ocasiones se consigue. En lo que respecta a las técnicas serológicas, se han desarrollado ELISAs, aunque los valores de sensibilidad y especificidad no han resultado óptimos (G.-H. Liu et al., 2020). En los centros de diagnóstico de Tailandia, emplean el extracto crudo de la larva y la técnica del western blot para confirmar el diagnóstico, mediante la detección de una banda de 24 kDa. También se ha desarrollado un test intradérmico con resultados similares al western blot en términos de sensibilidad y especificidad (Maek-A-Nantawat et al., 2014). Respecto a la disponibilidad de candidatos recombinantes para diagnóstico, Janwan y colaboradores publicaron un artículo con la proteína recombinante MMP, una metaloproteinasa con buenas propiedades diagnósticas, sensibilidad del 100% y una especificidad de 94,7% (Janwan et al., 2013). También, la ciclofilina fue considerada como proteína recombinante con propiedades inmunodiagnósticas adecuadas tras la realización de un estudio 2-DE con sueros de gnathostomosis humana (Laummaunwai et al., 2010). Sin embargo, en el estudio únicamente emplean cuatro sueros con gnathostomosis confirmada. El objetivo de este trabajo ha sido comprobar la validez diagnóstica de dos proteínas recombinantes para el diagnóstico serológico de gnathostomosis: la proteína MMP y la ciclofilina (CYP), seleccionadas por su potencial reactividad descrita en la bibliografía. 4.2.2 Material y métodos Obtención de antígeno recombinante GST-MMP Subclonación en vectores de expresión procariota La secuencia de la proteína recombinante MMP (GenBank: AAF82802.1), junto con 6 residuos de histidina (18 nucleótidos adicionales en el extremo carboxi terminal, etiqueta His) se subclonó en el vector pGEX-6P1 (Cytiva). Para ello, la secuencia de interés se amplificó, a la vez que se introdujeron las secuencias correspondientes a los sitios de restricción de las enzimas XhoI y BamHI, mediante PCR. Tras la digestión https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAF82802 Capítulo 4 125 enzimática del producto amplificado y del vector, así como la defosforilación de este último, se realizó la ligación de ambos. Los productos resultantes de la ligación se transformaron en las células competentes E. coli XL1Blue (Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB- hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F’ proAB lacIq ZΔM15 Tn10 (Tet’)] mediante choque térmico. La selección de colonias recombinantes se realizó mediante la presencia del antibiótico ampicilina en las placas con medio LB (Luria Bertani). Tras el crecimiento de las unidades formadoras de colonias (UFC) en las placas a 37 ºC, se realizó una PCR (directamente de las colonias) para confirmar que la clonación había sido efectiva, y que el inserto estaba presente en el vector. Tras la extracción y purificación de las moléculas de ADN plasmídico empleando el kit QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAgen), estas se secuenciaron por el método de Sanger, en el secuenciador 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems), con el objetivo de comprobar que las secuencias nucleotídicas eran correctas. Expresión proteica La expresión proteica se realizó en las células de E. coli la cepa BL21 (F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB –mB –) [malB+ ]K-12(λ S) transformadas con el plásmido recombinante que portaba la secuencia de la proteína MMP más las 6 histidinas. Para ello, estas fueron cultivadas en medio LB con antibiótico a 37ºC y agitación hasta conseguir una densidad óptica dentro del intervalo de 0,7 – 0,8 medida a 600 nm. Se empleó como inductor de la expresión IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido, (Sigma-Aldrich)). A partir de este punto, se probaron diferentes condiciones en la inducción de la expresión proteica con el fin de seleccionar aquellas en las que se obtuviera mayor concentración de proteína soluble. Las diferentes concentraciones de IPTG testadas fueron: 0,01 mM, 0,1 mM, 0,5 mM y 1mM. También se probaron diferentes condiciones de incubación tras la adición del IPTG: a 37ºC a 220 rpm de agitación durante 4 horas y a 16ºC en agitación durante toda la noche. Tras la incubación, se centrifugó el medio de cultivo a 4ºC a 11 000 rpm durante 30 minutos y se desechó el sobrenadante. Los sedimentos bacterianos se trataron con tampón de lisis B-PER durante 1 hora y a continuación se separó la fracción soluble de la insoluble (sedimento) mediante centrifugación a 18.0000 rpm en frío durante 30 minutos. Una alícuota de ambas fracciones fue tratada para su visualización en un gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 12% (figura 5.2.1) con el fin de determinar la expresión de la proteína y el estado de solubilidad de la misma en las diferentes condiciones ensayadas. Capítulo 4 126 Para la confirmación de la presencia de la proteína MMP en la fracción soluble, se realizó un western blot empleando como conjugado el anticuerpo monoclonal de ratón anti His (His-Tag(27E8), mouse mAb, Cell Signaling), a una dilución 1/3000 en PBS- Tween (0,3%) y leche (5%). Purificación del antígeno recombinante GST-MMP La purificación se realizó mediante cromatografía de afinidad utilizando el equipo automatizado ӒKTA pure™ (Cytiva Life Sciences). Se partió del sedimento bacteriano obtenido a partir de 400 ml de cultivo tratado bajo las condiciones que dieron el mejor resultado en la expresión. La fracción soluble se obtuvo tras la lisis bacteriana en 15 ml del tampón A (100 ml PBS 10x, 17,32g de NaCl, 800mlde agua MiliQ, pH 8) mediante 3 ciclos de congelación a -80ºC y descongelación en baño a 42ºC. Posteriormente, se realizaron 11 ciclos de sonicación con pulsos de 10 segundos y descansos de 30 segundos. El lisado se centrifugó en frío a 18.000 rpm durante 30 minutos. La fracción soluble fue diluida ½ en tampón A, y finalmente fue filtrada mediante un filtro de 0,22 µm, quedando la muestra lista para la inyección, a través de un superloop, recorriendo posteriormente la columna de níquel sefarosa (HisTrap HP, 1ml, GE Healthcare) previamente acoplada al equipo ӒKTA pure™. Del mismo modo que en capítulos anteriores, la purificación realizada se basó en la afinidad de los iones Ni2+ por las histidinas terminales de la proteína. La proteína fue eluida mediante un gradiente de imidazol. Para la realización del gradiente, se empleó el tampón B (50 ml PBS10x, 400ml de agua MiliQ, 8,66g de NaCl y 17,01 g de imidazol, pH 8). Se recogieron fracciones de 2 ml durante el proceso de elución que posteriormente fueron visualizadas en geles de poliacrilamida. Las fracciones, que contenían la proteína en mayor concentración y pureza, se filtraron y concentraron empleando el dispositivo Amicon Ultra-15, membrana PLTK Ultracel-PL, 30 kDa (Sigma Aldrich), con PBS1X. A continuación, se calculó la concentración de la proteína mediante un método colorimétrico, con el kit Pierce BCA Protein Assay Kit (ThermoScientific), y por visualización en un gel de poliacrilamida al 12%; en ambos casos se empleó una curva patrón de albúmina sérica bovina (BSA). Posteriormente, se mantuvo congelada a -80ºC hasta su utilización. Capítulo 4 127 Antígeno recombinante CYP La proteína ciclofilina (CYP) de Gnathostoma spinigerum (GenBank: ACX47902.1) fue producida de forma recombinante junto con la etiqueta GST en su extremo amino terminal y 6 residuos de histidina en su extremo carboxi terminal, en un sistema procariota (E. coli), empleando el vector pGEX-6P-1. La inducción y purificación de este antígeno recombinante fue encargado a una empresa externa (GenScript), que llevó a cabo una doble purificación: por cromatografía de afinidad, empleando una columna de níquel, y mediante cromatografía de exclusión por tamaño empleando una columna Superdex 2000. Una vez recibida la proteína, se comprobó la concentración mediante el kit Pierce BCA Protein Assay Kit (ThermoScientific) en placa, y también mediante la comparación con una curva patrón de albúmina sérica bovina (BSA) en un gel de poliacrilamida (SDS- PAGE) al 12%. Colecciones de sueros Las muestras de suero con diagnóstico de gnathostomosis pertenecían a la colección del Laboratorio de Helmintos, repositorio C.0003989 del Biobanco del Instituto de Salud Carlos III. Las muestras procedían de viajeros con síntomas y signos clínicos compatibles con gnathostomiasis y resultado positivo en western blot (empleando el antígeno crudo de G. spinigerum) realizado en el departamento de Helmintología de la Universidad de Mahidol, Facultad de Medicina Tropical de Bangkok (Tailandia), donde fue enviada una alícuota. Como controles negativos se empleó un pool de muestras de sueros de donantes sanos sin signos ni síntomas clínicos de gnathostomosis, que cumplían los requerimientos y habían sido cribados para la donación de sangre (incluida la ausencia de otras enfermedades infecciosas de transmisión sanguínea). Además, se emplearon de manera individual muestras de suero de donantes sanos de origen español que no habían realizado ningún viaje a zona endémica. Western blot El protocolo empleado para la realización del western blot fue el mismo que se siguió en el capítulo 3 y en el capítulo 4.1 de la presente Tesis Doctoral. Se utilizaron dos tratamientos: un desnaturalizante reductor y otro desnaturalizante no reductor. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/260666124 Capítulo 4 128 La proteína recombinante MMP, se testó a diferentes concentraciones: 50 ng/µL, 25 ng/µL, 12,5 ng/µL y 6,2 ng/µL. El anticuerpo secundario empleado fue un anticuerpo de cabra que reconocía las Fc de IgG totales humanas, conjugado con peroxidasa (IgG (H+L) Goat anti-Human, SouthernBiotech) e IgG4 (Mouse Anti-Human IgG4 Fc-UNLB (HP6025), SouthernBiotech) a una dilución 1/1000. En el caso de la proteína recombinante CYP, las concentraciones empleadas fueron: 130 ng/µL, 65 ng/µL, 32,5 ng/µL. 4.2.3 Resultados Antígeno recombinante MMP La proteína se expresó mayoritariamente en la fracción insoluble, sin embargo, también se visualizó en la fracción soluble, con un mayor rendimiento a 16ºC a una concentración de 1mM de IPTG, por lo que se seleccionaron estas condiciones para su expresión a gran escala. Figura 4.2.1. Geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) de las fracciones solubles e insolubles tras la expresión de la proteína recombinante MMP en diferentes condiciones de temperatura y concentraciones de IPTG. A. Fracción soluble a 37ºC a distintas concentraciones de IPTG (1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM y 0,0 1mM). B. Fracción soluble a 16ºC distintas concentraciones de IPTG (1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM y 0,01 mM). C. Fracción insoluble a 37ºC distintas concentraciones de IPTG (1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM y 0,01 mM). D. Fracción insoluble a 16ºC distintas concentraciones de IPTG (1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM y 0,01 mM). Capítulo 4 129 La figura 4.2.2 muestra las alícuotas iniciales previas a la purificación y las diferentes fracciones eluidas tras la purificación, visualizadas en un gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 12%. Figura 4.2.2. Visualización de las distintas fracciones recogidas durante la purificación de la proteína MMP empleando el equipo ÄKTA pure. 1: alícuota del sedimento. 2: muestra inicial sin purificar.3: fracción desechada. 4-9; cada una de las fracciones seleccionadas tras la purificación. MK: marcador estándar de masa molecular en kDa. La proteína recombinante MMP presentó tamaño de 52,3 kDa, peso molecular correspondiente a la proteína MMP junto con la etiqueta GST (Glutatión-S-Transferasa) en el extremo amino terminal y la cola de histidinas en el extremo carboxilo terminal (Figura 4.2.3). La concentración obtenida de la proteína fue 1,5 mg/ml. Figura 4.2.3. Integridad y concentración de la proteína recombinante MMP en comparación con la curva estándar de albúmina sérica bovina a concentraciones decrecientes (1: 1 mg/ml. 2: 0,5 mg/ml. 3: 0,25 mg/ml. Capítulo 4 130 4: 0,125 mg/ml. 5: 0,06 mg/ml. 6: 0,03 mg/ml, 7: 0,015 mg/ml). 8: dilución 1:10 de la proteína recombinante MMP. 9: dilución 1:5 de la proteína recombinante MMP. MK: marcador estándar de masa molecular en kDa. La proteína recombinante MMP mostró reactividad frente a los sueros con un diagnóstico de gnathostomosis, tanto en el tratamiento reductor como no reductor a las concentraciones de 50ng/µL, 25 ng/µL y 12,5 ng/µL. Sin embargo, también presentó reactividad frente al pool de sueros negativos con los dos tipos de tratamiento y las mismas concentraciones. Al disminuir la concentración del antígeno a 6,25 ng/µL, la banda obtenida presentaba menor intensidad tanto en los sueros positivos como en los negativos. Figura 4.2.4. Resultados del western blot con diferentes concentraciones de la proteína recombinante MMP (1: 50 ng/µL, 2: 25 ng/µL, 3: 12,5 ng/µL). A: muestra de suero positiva a G. spinigerum. B: pool de sueros negativos. Mk: marcador de masa molecular en kDa. Antígeno recombinante CYP Se confirmó la masa molecular de 45,97 kDa de la proteína recombinante ciclofilina (CYP) junto con la etiqueta GST y la cola de histidinas. La concentración con el método colorimétrico fue 0,13 mg/ml. La integridad de la proteína fue comprobada tras la realización del gel de poliacrilamida SDS-PAGE en condiciones reductoras (Figura 4.2.5). Capítulo 4 131 Figura 4.2.5. Integridad y concentración de la proteína recombinante CYP en comparación con la curva estándar de albúmina sérica bovina a concentraciones decrecientes (1: 1 mg/ml. 2: 0,75 mg/ml. 3: 0,5 mg/ml. 4: 0,25 mg/ml. 5: 0,125 mg/ml. 6: 0,06 mg/ml, 7: 0,015 mg/ml). CyP 1/2: dilución 1:2 de la proteína recombinante. CyP 1/5: dilución 1:5 de la proteína recombinante). 8: dilución 1:2 de la proteína recombinante CYP. 9: dilución 1:5 de la proteína recombinante CYP. MK: marcador estándar de masa molecular en kDa La proteína recombinante CYP no presentó reactividad frente a los sueros diagnosticados de gnathostomosis a las distintas concentraciones testadas en ninguno de los tratamientos empleados en el western blot. Tampoco presentó reactividad con el pool de sueros negativos, ni a las mayores concentraciones empleadas. 4.2.4 Discusión La confirmación del diagnóstico clínico de la gnathostomosis depende en gran medida de las pruebas serológicas, sin que hasta el momento haya reconocido un candidato recombinante que permita su normalización. En esta Tesis Doctoral hemos evaluado la capacidad diagnóstica de dos candidatos descritos en la literatura GST-MMP y GST-CYP (Janwan et al., 2013; Laummaunwai et al., 2010). En las condiciones de trabajo implementadas, ninguna de las dos proteínas recombinantes testadas ha presentado unas características diagnósticas adecuadas. En el caso de la proteína GST-MMP, el motivo ha sido la falta de especificidad puesto que presentó reactividad frente a los sueros de pacientes sanos, que no han padecido la patología a diagnosticar. Los controles negativos pertenecían a pacientes de origen español, y no han presentado sintomatología asociada a meningitis eosinofílica u otras manifestaciones clínicas relacionadas con la gnathostomosis; por lo que se descarta la exposición previa al parásito y la presencia de anticuerpos específicos. Una posible explicación de esta ausencia de especificidad es la reactividad cruzada que ha sido Capítulo 4 132 descrita entre nematodos (Iglesias et al., 1996). En España existe una alta prevalencia de anisakiosis (Pravettoni et al., 2012; P. Puente et al., 2008), por lo que una elevada proporción de la población presenta anticuerpos frente al complejo Anisakis simplex sensu lato. Esta exposición previa a Anisakis spp. podría explicar la falta de especificidad. La selección de controles negativos de origen español se basó en que los casos diagnosticados hasta el momento son importados, mayoritariamente de viajeros de origen español. Los resultados obtenidos previamente con esta proteína recombinante alcanzaron unos valores de especificidad del 94,7%, sin embargo, en el estudio los 30 controles sanos testados probablemente fuesen de origen asiático (Janwan et al., 2013). Otra posibilidad sería que la etiqueta GST estuviera contribuyendo a aumentar la reactividad. Sin embargo, en esta memoria se han empleado otras construcciones (T24H, 2B2t…) con esta misma etiqueta que no han mostrado reactividad frente a los mismos sueros negativos, por lo que disminuye la probabilidad de que esta sea la causa. En relación con la proteína recombinante GST-CYP, los resultados fueron radicalmente opuestos. Ninguna concentración de las testadas presentó reactividad con ninguno de los tratamientos en western blot. El estudio publicado con esta proteína recombinante (Laummaunwai et al., 2010) afirma que existe reactividad, pero el número de sueros testados fue bastante reducido, únicamente 4 muestras presentaban gnathostomosis. De hecho, este mismo antígeno no ha sido publicado de nuevo en ningún estudio posterior. Se han publicado varios artículos en los que describen un test rápido para la detección de IgG4 o IgG totales empleando muestras de sangre para el diagnóstico de gnathostomosis, con el antígeno recombinante rGslic18. En los artículos no especifican la secuencia del antígeno recombinante ni está depositada en la base de datos del NCBI (Janwan et al., 2016, 2021). Además, el dispositivo tampoco se encuentra disponible en el mercado para su adquisición. Es evidente que existe un vacío de conocimiento en cuanto a los candidatos diagnósticos de Gnathostoma spp. Este hecho complica el diagnóstico, siendo este dependiente de las técnicas basadas en el antígeno crudo, cuyos valores de reactividad cruzada son relativamente altos. Además, hay que sumarle la desventaja de la obtención del material parasitario, dado la estacionalidad de este. Otra de las limitaciones a la hora de encontrar candidatos diagnósticos es la ausencia de un genoma de referencia. Existe publicado el transcriptoma (Nuamtanong et al., 2019), pero Capítulo 4 133 este ha sido realizado de novo, por lo que la precisión del mismo puede ser cuestionable, al no presentar un genoma de referencia en el que basarse. Pese a que los resultados del presente capítulo no han sido los esperados, nos han permitido descartar los candidatos diagnósticos evaluados y evidenciar la falta de información sobre este parásito. Capítulo 5 134 VIII. CAPÍTULO 5. Secuenciación y ensamblaje de novo del genoma de L3 de Gnathostoma spinigerum 5.1. Introducción La infección parasitaria por Gnathostoma spinigerum puede llegar a causar un cuadro grave de afectación cerebral visceral, pudiendo desencadenar meningitis eosinofílica debido al tropismo cerebral que presenta la larva L3A. Tal y como se ha desarrollado en el anterior capítulo de la presente Tesis Doctoral, los intentos por dilucidar moléculas con propiedades diagnósticas adecuadas han fracasado. Uno de los motivos es la falta de información genómica del parásito, del que no existe genoma de referencia. El proceso de ensamblaje a nivel genómico (del inglés, whole genome) consiste en fusionar las diferentes lecturas generadas tras la secuenciación, encontrando regiones compartidas, para obtener el genoma completo de un organismo (Ji & Jw, 2018). La generación de un ensamblaje de novo supone que no existe una secuencia de referencia que sirva como molde para orientar el proceso de ensamblado. Los ensamblajes de genomas eucariotas suponen un reto debido a la presencia de ADN repetitivo y, en concreto en nematodos, debido a regiones satélite de DNA (Katti et al., 2001). Esto hace que las técnicas de secuenciación masiva habituales, como la desarrollada por Illumina, presenten ciertas limitaciones a la hora de resolver el genoma de estos organismos. La tecnología Illumina se basa en fragmentar el ADN, por lo que las zonas altamente repetitivas presentan un mayor complejidad, que hace que la mayoría de los ensambladores desarrollados para esta tecnología no sean capaces de resolverlas, obteniendo un genoma incompleto (Yoshinaga et al., 2018). Aparte del tamaño de lectura obtenido por cada tipo de secuenciación, una de las principales diferencias entre las plataformas Oxford Nanopore (ONT) e Illumina es la cantidad de ADN que requiere cada tecnología. En el caso de Illumina la concentración es muy inferior, llegando a obtenerse resultados adecuados con 100 ng de ADN. Mientras que con ONT, la cantidad de DNA de partida necesaria para obtener un resultado de la suficiente calidad es superior. Otro de los aspectos a considerar es la integridad del ADN, dado que se requieren lecturas largas, es importante que no esté fragmentado. Existen diferentes parámetros que permiten determinar la calidad de las secuencias obtenidas tras la secuenciación con la tecnología Illumina, uno de ellos es el Capítulo 5 135 score o puntuación de calidad Phred. Este se emplea para medir la calidad de las bases del ADN secuenciado. Un valor de Phred Score de 20, indica que la precisión obtenida es del 99%, esto es que la tasa de error es del 1% (Goswami & Sanan-Mishra, 2022). La mayor parte de los ensambladores de lecturas cortas se basan en el modelo de grafos de Bruijn (Pevzner et al., 2001), este modelo descompone las lecturas en una serie de subsecuencias solapantes denominadas k-mers (donde la k hace referencia a la longitud de la secuencia) (Swat et al., 2021). Entre los principales ensambladores que emplean este modelo cabe destacar: SPAdes (Prjibelski et al., 2020), Soap de novo 2 (Luo et al., 2012), Velvet (Zerbino & Birney, 2008), ABySS (Simpson et al., 2009) y Platanus (Kajitani et al., 2014). El segundo modelo en el que se basan los ensambladores es el de los grafos de cadena, del inglés string graph, esta aproximación no requiere fragmentar las lecturas en k-mers, en este modelo se crea un grafo de solapamiento entre las lecturas, que es computacionalmente más exigente y menos eficiente (Bonizzoni et al., 2017; Simpson & Durbin, 2012). Este es el modelo que utiliza el ensamblador SGA (Simpson & Durbin, 2012). El programa emplea frecuencias de k-mers a la hora de construir los índices en la primera fase de filtrado y corrección de errores de las lecturas (error correction), pero no se utiliza esa aproximación a la hora de realizar el ensamblaje propiamente dicho (assembly). Los ensambladores pueden cometer errores, esto hace que sea necesario evaluar la calidad de los ensamblajes generados. Dentro de las herramientas descritas para evaluar los borradores de ensamblaje, BUSCO es un método de medida de calidad del ensamblaje realizado por la universidad de Ginebra. Se basa en la búsqueda de ortólogos de genes de copia única que están presenten en más del 90% de los individuos que forman la base de datos. Los genes obtenidos coincidentes se clasifican como “completos” cuando sus longitudes están dentro de dos veces la desviación estándar de la longitud media del grupo BUSCO. Dentro de este grupo de genes “completos”, se clasifican como “duplicados” cuando existe más de una copia. La presencia de un elevado número de duplicados implica un ensamblaje erróneo, porque como ya se ha comentado, BUSCO se basa en la búsqueda de ortólogos de copia única. Aquellos genes que son parcialmente cubiertos se clasifican como “fragmentados”. Y los que no están presentes como “ausentes” (Simão et al., 2015). Capítulo 5 136 Uno de los principales retos a la hora de abordar el proyecto ha sido la falta de información que existe de esta especie, e incluso a nivel de género. Los datos publicados relativos a relaciones filogenéticas son escasos. Se publicó el genoma mitocondrial (G.- H. Liu et al., 2015) de Gnathostoma spinigerum y el transcriptoma (Nuamtanong et al., 2019). En este último realizaron una aproximación sin emplear un genoma de referencia, realizando un ensamblaje basado en lecturas de RNA-seq, empleando únicamente lecturas cortas con la plataforma Illumina HiSeq y con una longitud máxima de contig de 22386 nucleótidos, lo que sugiere que la calidad obtenida pueda cuestionarse, debido principalmente a la complejidad del genoma. Si bien es cierto, que es un intento de aportar información acerca del parásito, y de hecho establecieron que el mayor grado de homología se correspondía con el clado Bilateria, y dentro de las especies de helmintos las que presentaron una mayor homología fueron: Toxocara canis (16%), Ascaris suum (14.1%) y Anisakis simplex (5%). 5.2. Material y métodos Para la realización del ensamblaje de novo del genoma de las larvas en estadio L3 avanzado de Gnathostoma spinigerum se siguieron las siguientes etapas: 1) Obtención de las larvas del hospedador intermediario, extracción del material genómico e identificación de la especie, 2) preparación de librerías, 3) secuenciación y 4) análisis bioinformático. El esquema general del proceso realizado está representado en la figura 5.1. Figura 5.1. Diagrama de flujo general del proceso de generación del genoma de G. spinigerum. Capítulo 5 137 5.2.1. Obtención del material parasitario y extracción del ADN Las larvas de Gnathostoma spinigerum se obtuvieron de los hígados de anguilas (Monopterus albus) infectadas naturalmente en Tailandia. Se identificaron y extrajeron los hígados, se digirieron con ácido clorhídrico y pepsina al 1% a 37ºC durante 2 horas. Las larvas fueron identificadas mediante microscopia, y se lavaron varias veces empleando solución salina al 85% y agua destilada. Se extrajeron un total de 250 larvas en estadio 3 avanzado (L3A), estadio que se corresponde con las formas infectivas para el ser humano, y se mantuvieron en etanol al 70%. Las larvas fueron extraídas por el equipo del departamento de Helmintología de la facultad de Medicina Tropical de la Universidad de Mahidol, Bangkok, Tailandia. La confirmación molecular de la especie se realizó en las larvas de G. spinigerum de manera individual mediante PCR convencional, empleando el protocolo previamente publicado por Jongthawin y colaboradores. Se realizaron las dos PCR descritas con amplificación de genes mitocondriales, COI, y ribosomales, ITS (Jongthawin et al., 2015). Con ambas PCRs se obtuvo producto amplificado que se secuenció mediante la técnica de Sanger en el secuenciador 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems). Se realizaron diferentes pruebas de extracción del ADN: tanto manual como en equipo automatizado. Se utilizaron 3 kits de extracción diferentes: 1) el kit de extracción mediante columnas QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) con el equipo QIAcube (Qiagen) y mediante un protocolo manual. 2) El kit QIAsymphony DSP DNA Midi Kit (Qiagen) con el equipo QIAsymphony (QIAGEN). Para aumentar la cantidad de ADN extraído también se emplearon esferas de 1,4 mm de diámetro (matrix D) y el equipo TissueLyser LT (Qiagen) con una frecuencia de 50 Hz durante 3 minutos. Con estos dos kits, las muestras fueron tratadas inicialmente con 180 µL del tampón ATL, 20 µL de proteinasa K, 4 µL de RNAasa e incubadas a 56ºC en un termobloque con agitación durante 48h. 3) Se empleó otro kit de extracción sin columnas PicoPure™ DNA Extraction Kit (ThermoFisher Scientific) siguiendo las indicaciones del fabricante, tal y como indica el procedimiento, que no incluye etapa de purificación. Capítulo 5 138 5.2.2. Preparación de librerías de secuenciación Una vez extraído el ADN se cuantificó empleando el fluorómetro Quantus Fluorometer (Promega) con el kit QuantiFluor® dsDNA System (Promega). Se aplicaron dos tecnologías de secuenciación: Illumina y Oxford Nanopore Technologies. En el caso de Illumina, se prepararon un total de 4 muestras y se emplearon dos kits diferentes de preparación de librerías: el kit Nextera DNA Flex Library Prep (Illumina) con 8 ciclos de amplificación siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras empleadas con esta librería fueron HE22-36 y HE22-37 (se seleccionaron 10 larvas por cada muestra). Los índices (CD index) utilizados fueron: H701 y H505 para la muestra HE22-36 y H702 y H517 en la muestra HE22-37. Tras la realización de las librerías, estas fueron cuantificadas con el bioanalizador, 2100 Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis (Agilent). El segundo kit de secuenciación que se empleó fue DNA PCR-Free Prep, Tagmentation (Illumina), en esta ocasión no hubo amplificación. Las muestras empleadas para esta segunda modalidad de Illumina fueron HE22-70 y HE22-71 (empleando 51 larvas previamente identificadas). Los índices (IDT) utilizados fueron set D, posición C1 (HE22-70) y set D, posición D1 (HE22-71). Se empleó el reactivo basado en esferas magnéticas AMPure XP (Beckman Coulter Life Science) para incluir un paso adicional de purificación y reducir el volumen de muestra y, de esta manera, obtener el volumen indicado por el fabricante en la preparación de la librería. En cuanto a la preparación de las librerías previa a la secuenciación de las lecturas largas, se emplearon los kits Ligation Sequencing Kit SQK-LSK110 (Oxford Nanopore Technologies) y NEBNext Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (New England Biolabs), siguiendo las indicaciones especificadas por el fabricante. Se empleó una única muestra (HE22-57) con 162 larvas. 5.2.3. Secuenciación Se realizaron dos tecnologías de secuenciación: ONT (lecturas largas) e Illumina (lecturas cortas). Las lecturas obtenidas con la tecnología Illumina presentaron una longitud de 150 pb, siendo estas lecturas paired end. El secuenciador empleado con las dos primeras muestras, HE22-36 y HE22-37, fue NextSeq 550 (Illumina), el kit de secuenciación fue NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (300 ciclos) (Illumina). Capítulo 5 139 Para la segunda aproximación de Illumina se empleó el secuenciador NovaSeq (Illumina) y el kit de secuenciación fue NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit v1.5 (300 ciclos) (Illumina), las muestras obtenidas fueron HE22-70 y HE22-71. En cuanto a la aproximación de lecturas largas, el secuenciador empleado fue MinION MK1C (Oxford Nanopore Technologies), la flow cell que se utilizó fue Flow Cell (R9.4.1) FLO-MIN106D (Oxford Nanopore Technologies) con el kit de ligación, Ligation Sequencing Kit SQK-LSK110 (Oxford Nanopore Technologies). La muestra obtenida fue HE22-57. En la figura 5.2 se esquematizan cada una de las tecnologías empleadas y las muestras derivadas de cada una. Figura 5.2. Tecnologías de secuenciación, características y relación de muestras. 5.2.4. Análisis bioinformático El análisis bioinformático se realizó en un clúster de computación de alto rendimiento (HPC) del Instituto de Salud Carlos III, XTutatis, que tiene instalado el sistema operativo Linux CentOS-8 (4.18.0-305.19.1el8_4.x86_64). Los nodos principales desde los que se operó fueron Ivy Bridge (Xeon ES-2670v2) con 16 nodos y una memoria RAM de 256 GB y Cascade Lake (Xeon Gold 6242) con 16 nodos y memoria RAM de 384 GB, 512GB y 2048 GB (únicamente uno de los nodos). Se emplearon dos protocolos de análisis diferentes en función de la tecnología de secuenciación utilizada: Illumina (lecturas cortas) y ONT (lecturas largas). Capítulo 5 140 Análisis bioinformático de lecturas cortas Una vez realizada la secuenciación, se comprobó la calidad de las lecturas crudas obtenidas. Se empleó el programa FastQC (versión 0.11.9) (Babraham Bioinformatics, 2019), el cual permite detectar problemas potenciales de la secuenciación y proporciona la salida de resultados en forma de diferentes gráficas y con un resumen de parámetros como la calidad de la secuencia por base, el contenido de GC, el contenido de indeterminaciones, la distribución de longitudes de las secuencias… Tras comprobar una adecuada calidad de las secuencias crudas, se realizó el preprocesamiento de estas. Para ello se empleó el programa fastp (versión 0.20.0), los parámetros que se establecieron fueron los siguientes: 1) Un tamaño mínimo de lectura de 100 pb (length_required=100), 2) Puntuación de calidad Phred mínima de 15 (qualified_quality_phred=15), 3) Eliminación de las regiones desde el extremo 3’ con una calidad media por debajo de 15 (cut_mean_quality=15, cut_tail), 4) Eliminación de las regiones homopoliméricas en el extremo 3’(--trim_poly_x), 5) Eliminación de las secuencias correspondientes a los adaptadores (incluido por defecto). Una vez realizado el preprocesamiento, se volvió a emplear el programa FastQC, para comprobar la calidad de las secuencias procesadas. Existe un elevado número de ensambladores disponibles, algunos de ellos son específicos de una tecnología concreta de secuenciación. En el caso de la tecnología Illumina se emplearon los siguientes ensambladores: SGA (versión 0.10.15), SPAdes (versión 3.15.4), Soap de novo 2 (versión 2.04), Velvet (versión 1.2.10), Platanus (versión 1.2.4), ABySS (versión 2.3.5) y Unicycler (versión 0.5.0). En todos los ensamblajes realizados, se emplearon las lecturas previamente procesadas con el programa fastp (S. Chen et al., 2018). En el caso del ensamblador SGA (Simpson & Durbin, 2012), el ensamblaje se realizó en tres pasos: corrección de errores, ensamblaje de contigs y scaffolding. En el primer paso se seleccionó 41 como valor kmer (CK =41). Otros de los parámetros fueron: mínima cobertura de kmer en el filtrado fue 2 (COV_FILTER=2); parámetro de solapamiento empleado en la fusión de lecturas fue 55 (MOL=55), el parámetro de solapamiento del ensamblaje final fue 75 (OL=75). https://github.com/s-andrews/FastQC https://github.com/OpenGene/fastp https://github.com/jts/sga https://github.com/ablab/spades https://github.com/aquaskyline/SOAPdenovo2 https://github.com/dzerbino/velvet http://platanus.bio.titech.ac.jp/platanus-assembler/platanus-1-2-4 https://github.com/bcgsc/abyss https://github.com/rrwick/Unicycler Capítulo 5 141 El ensamblaje realizado con el programa SPAdes (Prjibelski et al., 2020), se emplearon las opciones “-careful” y sin este parámetro, así como los valores de kmer 41, 63, 81, 107 y 127. El parámetro careful permite minimizar el número de discordancias en los contigs finales. En el caso de Soap de novo 2 (Luo et al., 2012), los parámetros establecidos fueron: tamaño máximo de lectura (max_rd_len=150), media del tamaño del inserto (avg_ins=223), ensamblaje a nivel de contig y scaffold, y longitud mínima de alineamiento de los contigs (map_len=32). Los valores de kmer fueron 51, 63,127 y 143. El programa Velvet (Zerbino & Birney, 2008), se empleó con velvelth y velvetg con los parámetros correspondientes a lecturas cortas paired end , ins_length 232, ins_length_sd 56 , exp_cov 66 y min_contig_lgth 1000. El borrador del ensamblaje realizado con Platanus (Kajitani et al., 2014) se realizó en dos pasos, el primero fue el ensamblaje de contigs, el segundo el scaffolding. A la hora de realizar el ensamblaje de contigs se estableció un tamaño de kmer inicial de 32. Los parámetros seleccionados para el scaffolding fueron: media de tamaño del inserto (a1=232), desviación estándar del tamaño del inserto (d1=56). El ensamblador ABySS (Simpson et al., 2009) se empleó seleccionando los siguientes parámetros: modo paired-end, 30 procesos MPI (np=30), un valor de tamaño de kmer de 107 (k=107), y 5 de bloom filter mode (B=5G). El programa Unicycler (R. R. Wick et al., 2017) se seleccionaron los parámetros por defecto, en este modo, los valores de kmer seleccionados fueron 27, 53, 71, 99 y 111. Capítulo 5 142 La figura 5.3 esquematiza el análisis realizado con las secuencias obtenidas de la secuenciación mediante la tecnología Illumina. Análisis bioinformático de lecturas largas Tras la secuenciación empleando el dispositivo MinION, se obtuvieron las lecturas en formato “.fastq” a partir de los archivos “.fast5”, siguiendo el protocolo de análisis de ONT (MinION). Los programas empleados, así como las versiones de cada uno, fueron: MinKNOW (versión 21.11.6), MinKNOW Core (versión 4.5.4), Bream (versión 6.3.5) y Guppy (versión 5.1.12). El preprocesamiento de los archivos “.fastq” se realizó empleando el programa Porechop (R. Wick, 2017/2023) (versión 0.2.4), con el objetivo de eliminar las secuencias correspondientes a los adaptadores. Los programas empleados para realizar el ensamblaje de novo con lecturas largas procedentes de la tecnología ONT, fueron: Flye (Kolmogorov et al., 2019) y NECAT (Y. Chen et al., 2021). El ensamblador Flye (versión 2.9) se ejecutó empleando tres modalidades, obteniendo un resultado de ensamblaje para cada una de ellas; 1) con las lecturas crudas, sin realizar ningún tipo de corrección, con el parámetro nano-raw. 2) Lecturas corregidas, Figura 5.3. Diagrama de flujo del análisis de las secuencias cortas procedentes de la tecnología Illumina. Capítulo 5 143 por lo que se obtuvo un procesamiento de las lecturas, el parámetro empleado fue nano- corr. 3) Lecturas crudas, pero indicando un tamaño estimado del genoma, con el parámetro nano-raw y un tamaño de genoma de 260 Mb (genome-size=260m). El programa NECAT (versión 0.0.1) fue ejecutado realizando las etapas indicadas por los desarrolladores: necat correct, necat assemble y necat bridge. Indicando un tamaño mínimo de lectura de 500 pb y una cobertura mínima de 20, entre los principales parámetros. El proceso de análisis realizado con las lecturas largas obtenidas tras la secuenciación con la plataforma ONT está esquematizado en la siguiente figura: Figura 5.4. Diagrama de flujo del análisis de las secuencias largas procedentes de la tecnología ONT. Capítulo 5 144 Análisis bioinformático híbrido Una vez obtenidos los borradores de cada una de las tecnologías de secuenciación de forma individual, se realizaron combinaciones de estas; es decir, se fusionaron las lecturas cortas con las largas, realizando ensamblajes híbridos. Para ello, se realizaron dos aproximaciones: en la primera se empleó el ensamblador SPAdes (Prjibelski et al., 2020) en la modalidad híbrida con las lecturas de cortas (Illumina) e incluyendo el parámetro --nanopore con las lecturas largas procedentes de la tecnología ONT. La segunda aproximación se basó en el ensamblaje obtenido con las lecturas largas (borrador del ensamblaje con el programa Flye (Kolmogorov et al., 2019)). A continuación, se realizó el alineamiento utilizando las lecturas cortas (Illumina) y el ensamblaje obtenido con Flye como referencia (ensamblaje de las lecturas largas), el programa empleado para ello fue Bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012). Se obtuvo el formato BAM a partir del archivo obtenido de cada alineamiento en formato SAM con el paquete SAMtools (Li et al., 2009). En la siguiente etapa se utilizó la herramienta Pilon (Walker et al., 2014), con el objetivo de mejorar la calidad del ensamblaje identificando inconsistencias entre el genoma de partida y las lecturas generadas. Además se incluyó una etapa adicional optativa, previa al análisis con Pilon, para eliminar los duplicados, para ello se utilizó el programa Picard (Broad Institute, 2019). El proceso está esquematizado en la figura 5.5. Capítulo 5 145 Figura 5.5. Proceso del análisis combinado de las muestras con las dos tecnologías de secuenciación: Illumina y Oxford Nanopore Technologies (ONT). Ref: referencia. El ensamblador SPAdes en la modalidad híbrida se ejecutó empleando los valores de kmer 63,81,107 y 127. Se incluyeron diferentes parámetros opcionales: --nanopore, - -untrusted-contigs y --careful. Se ejecutaron diferentes alternativas, algunas sin incluir la Capítulo 5 146 totalidad de los parámetros opcionales. En el caso del parámetro --untrusted-contigs, se empleó como fichero cada uno de los borradores de ensamblajes obtenidos, diferentes de la muestra de secuenciación que se estaba ejecutando. Un ejemplo sería: la muestra de secuenciación empleada fue HE22-36 (Illumina-NextSeq), --nanopore con las lecturas en el archivo .fastq de la muestra HE22-57 y el parámetro --untrusted-contigs con el fichero correspondiente al ensamblaje híbrido de la muestra HE22-70 y HE22-57 .fasta. El software Bowtie2 (versión 2.4.2) se empleó para construir el índice del ensamblaje de las lecturas de ONT, se ejecutó el modo bowtie2-build y el parámetro -- large-index. El alineamiento se realizó con bowtie2, con los archivos .fastq de las lecturas cortas y el ensamblaje de las lecturas de ONT. El paquete SAMtools (versión 1.12) se ejecutó para obtener el archivo BAM correspondiente, para generar el fichero ordenado y para obtener el índice. Las respectivas opciones utilizadas fueron: samtools view –Sb, samtools sort y samtools index. El programa Pilon (versión 1.23) se ejecutó con los parámetros por defecto, incluyendo en la opción –genome, el ensamblaje de Flye realizado con las lecturas de ONT. El software Picard (versión 2.25.1) se lanzó con el parámetro MarkDuplicatesWithMateCigar y la opción de eliminar duplicados habilitada (REMOVE_DUPLICATES=true). Evaluación de los borradores de ensamblaje Una vez obtenidos los ensamblajes, las métricas de cada uno de los borradores se analizaron con los programas QUAST (Gurevich et al., 2013) y BUSCO (Simão et al., 2015). QUAST (versión 5.0.2), se ejecutó con los parámetros por defecto, reportando entre las principales métricas: número de contigs, N50, longitud total del ensamblaje, N75, L50, L75, porcentaje en guanina-citosina (GC (%)). Para realizar el análisis, todas las estadísticas se han basado en los contigs con un tamaño superior a 500 pb. Y BUSCO (versión 5.3.2), se lanzó empleando el modo euk-genome-met, con el predictor de genes metaeuk, y la base de datos de nematodos (nematoda_db), creada en agosto de 2020, formada por 7 genomas y 3131 BUSCOs. Para la representación gráfica de los resultados de ensamblaje se utilizó el código descrito por Richard Challis (Challis, 2015/2016). Capítulo 5 147 Análisis complementarios El programa Kraken2 (Wood & Salzberg, 2014) (versión 2.1.2) se empleó con el objetivo de descartar la contaminación de las secuencias de lecturas cortas de otras especies. El programa se basa en asignar etiquetas taxonómicas a secuencias cortas de ADN. La principal especie cuya contaminación podría interferir, fue la anguila (Monopterus albus), dado que es el hospedador intermediario del que se extrajeron las larvas. Además, para descartar otras posibles contaminaciones, también se emplearon bases de datos de bacterias, arqueas, virales y de humano, procedentes de la base de datos Minikraken v2 (https://benlangmead.github.io/aws-indexes/k2), y se lanzaron frente a las lecturas obtenidas tras la secuenciación de las muestras con la tecnología Illumina. La representación gráfica de los resultados se realizó empleando el programa KronaTools (versión 2.8.1)(Ondov et al., 2011). Tabla 5.1. Especies empleadas para la generación de las bases de datos con el programa Kraken2. Especie GenBank TAXID Monopterus albus GCA_001952655.1 43700 Toxocara canis GCA_000803305.1 6265 GenBank: número de GenBank; TAXID: identificador taxonómico en la base de datos del NIH. Al estar realizando un ensamblaje de novo, no se disponía información preliminar sobre las características del genoma. Para estimar el tamaño del genoma, se empleó el programa GenomeScope (Vurture et al., 2017), con las secuencias cortas procedentes de la tecnología Illumina. Previamente se empleó el software jellyfish (Marçais & Kingsford, 2011) (versión 2.2.10) para realizar el contaje de kmers, indicando los parámetros count e histo. Otra aproximación realizada se basó en los rangos de tamaños de los genomas de otras especies de nematodos, en concreto aquellas familias con mayor grado de homología. Para establecer el rango de posibles tamaños se seleccionaron las familias Anisakidae, Ascarididae, Oxyuridae y Toxocaridae. Se obtuvieron los datos de ensamblajes de las diferentes especies pertenecientes a cada familia de la base de datos de NCBI. Se calculó el máximo, mínimo y la desviación estándar del tamaño del genoma Capítulo 5 148 de las diferentes especies dentro de cada familia. Se empleó el programa R (versión 4.2.1) para realizar el análisis estadístico y la representación gráfica. Comparación con el genoma mitocondrial Se realizó una comparación con el genoma mitocondrial previamente publicado de G. spinigerum (G.-H. Liu et al., 2015) con el objetivo de cuantificar la calidad del ensamblaje obtenido. Para ello, se realizó un alineamiento entre el borrador del ensamblaje con las mejores métricas y la secuencia correspondiente del genoma mitocondrial, empleando la herramienta BLAST mediante línea de comandos (Camacho et al., 2009) (versión 2.11.0). 5.3. Resultados 5.3.1. Caracterización de las larvas de G. spinigerum Caracterización morfológica La observación microscópica, realizada por parasitólogos experimentados de la Facultad de Medicina Tropical de la Universidad de Mahidol, permitió confirmar la especie Gnathostoma spinigerum. Capítulo 5 149 Figura 5.6. Larva de Gnathostoma spinigerum en estadio 3A, observación microscópica, aumento 4x. Figura 5.7. Bulbo cefálico de larva de Gnathostoma spinigerum en estadio 3A, observación microscópica aumento 20x. Caracterización molecular Los resultados de la PCR ribosomal (ITS2) determinaron que el ADN amplificado presentó una masa molecular de 650 pb. En el caso de la PCR mitocondrial (COI), la Capítulo 5 150 masa molecular del producto amplificado fue 250 pb. Tras realizar la secuenciación, los resultados del BLAST obtuvieron un 100% de identidad con la especie Gnathostoma spinigerum (número de acceso en el GenBank MK033974.1). 5.3.2. Extracción de ADN y evaluación de las librerías Los resultados de extracción de ADN obtenidos con las diferentes técnicas se resumen en la siguiente tabla: Tabla 5.2. Concentraciones tras la extracción de ADN con diferentes procedimientos. Tecnología Muestra/ larvas Nanodrop C (ng/µL) Fluorómetro C (ng/µL) QIAcube HE21-24 /1 5,4 - QIAcube HE21-29 /1 2,5 - QIASymphony HE21-31/1 -1,3 - Manual HE21-19/1 1,7 - Arcturus PicoPure HE21-158/1 68,35 0,183 QIAcube HE21-163 /1 0,8 0,009 Abreviaturas; C: concentración. Los mejores resultados de extracción se obtuvieron con el procedimiento automatizado con el dispositivo QIAcube, en ausencia de esferas, empleando un pistón para homogenizar, siendo este el protocolo seleccionado. Los valores más altos de concentración fueron los del kit Arcturus PicoPure, no se escogió este procedimiento de extracción debido al mayor grado de impurezas de este método, dado que no presentaba un paso previo de purificación. Los resultados de la extracción obtenidos con las muestras a emplear en la elaboración de las librerías fueron los siguientes: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/MK033974.1?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=67A8M726016 Capítulo 5 151 Tabla 5.3. Características de las muestras empleadas en las librerías de la tecnología Illumina. Muestra Larvas Fluorómetro C (ng/µL) Librería C (ng/µL) Ciclos de amplificación HE22-36 10 0,539 9,5 8 HE22-37 10 0,882 2,8 8 HE22-70 51 0,7 0,243 - HE22-71 51 2,4 0,975 - Abreviaturas; C: concentración. En la muestra HE22-70 se partía de una concentración inicial de 2,5 ng/µl, tras la utilización de las esferas magnéticas AMPure XP, la concentración se redujo considerablemente. Los resultados del bioanalizador de las muestras HE22-36 y HE22-37 de Illumina empleando la librería Nextera DNA Flex Library Prep con amplificación se muestran en la figura 5.6. En la primera muestra (HE22-36) se evidenció una distribución de fragmentos en el rango de 300 a 900 pb, siendo el tamaño medio 500 pb. En la segunda muestra (HE22-37) el perfil de distribución de fragmentos fue similar (rango 400 pb a 1000 pb), y un tamaño medio de 600 pb. Capítulo 5 152 Figura 5.6. Resultados de electroforesis en el bioanalizador con las librerías de las muestras HE22-36 y HE22-37. A. Resumen de las muestras procesadas. L: Ladder, marcador de peso molecular en pares de bases (bp), 1: Librería de la muestra HE22-36, 2: Librería de la muestra HE22-37, 3 y 4: controles positivos de electroforesis, 5: control negativo. B: Distribución del tamaño de los fragmentos de las librerías de la muestra HE22-36 (superior) y HE22-37 (inferior). En el caso de las muestras HE22-70 y HE22-71, se empleó el kit de preparación de las librerías DNA PCR-Free Library Prep, sin amplificación. El ADN obtenido, debido a la particularidad de la librería y la técnica en la que se basa, no se pudo visualizar tras la preparación de las librerías mediante electroforesis capilar en el bioanalizador. La muestra HE22-57 empleada para la preparación de la librería previa a la secuenciación ONT, obtuvo una concentración final de 5,5 ng/µL tras el paso de limpieza y purificación previa con las esferas magnéticas AMPure XP. La cantidad de DNA genómico empleada para la realización de la librería fue 258,5 ng. 5.3.3. Análisis bioinformático Secuenciación y preprocesamiento De las cinco muestras procesadas, cuatro de ellas (HE22-36, HE22-37, HE22-70 y HE22-71) fueron secuenciadas mediante la tecnología Illumina, generando lecturas paired-end 2x150 pb. La quinta muestra (HE22-57) se secuenció empleando la tecnología ONT. En la tabla 5.4 se recogen las lecturas crudas obtenidas y tras el preprocesamiento Capítulo 5 153 Tabla 5.4. Resultados crudos de secuenciación pre y tras el preprocesamiento en las dos plataformas. Muestra Plataforma Secuenciador Librería Nº de lecturas crudas Nº de lecturas procesadas HE22-36 Illumina NextSeq Nextera 143.645.727 85.416.369 HE22-37 Illumina NextSeq Nextera 347.533.174 164.176.444 HE22-70 Illumina NovaSeq DNA PCR- Free 74.552.910 58.166.056 HE22-71 Illumina NovaSeq DNA PCR- Free 323.025.557 253.928.440 HE22-57 ONT MinION Kit SQK- LSK110 2.178.642 1.731.866 Las muestras HE22-36 y HE22-37 secuenciadas con la tecnología Illumina- NextSeq obtuvieron un porcentaje de contenido de guanina-citosina del 37% y la longitud de las secuencias estaba incluida en el rango 35 -151 pb. La calidad, referida en valores PhredScore, en función de la posición de la base de las lecturas está representada a en la figura 5.7. Capítulo 5 154 Figura 5.7. Gráficas de calidad de las secuencias por base con el programa FastQC y las muestras Illumina-NextSeq. A: Muestra HE22-36 Read 1 (R1). B: Muestra HE22-36 Read 2 (R2). C: Muestra HE22-37 Read 1 (R1). D: Muestra HE22- 37 Read 2 (R2). Nota: el eje Y se corresponde con el valor Phred Score, el eje X se corresponde con la posición de la lectura en pares de bases (pb). Las muestras HE22-70 y HE22-71 secuenciadas con la tecnología Illumina- NovaSeq, obtuvieron un porcentaje del contenido de guanina-citosina en el intervalo del 37-39%. El rango de longitud de las lecturas secuenciadas fue 35-151 pb. En la figura 5.8 se representa la calidad de las lecturas secuenciadas en función de la posición de la base de las lecturas. Capítulo 5 155 Figura 5.8. Gráficas de calidad de las secuencias por base con el programa FastQC y las muestras Illumina-NovaSeq. A: Muestra HE22-70 Read 1 (R1). B: Muestra HE22-70 Read 2 (R2). C: Muestra HE22-71 Read 1 (R1). D: Muestra HE22- 71 Read 2 (R2). Nota: el eje Y se corresponde con el valor Phred Score, el eje X se corresponde con la posición de la lectura en pares de bases (pb). En la muestra HE22-57, procedente de la tecnología ONT, el número total de bases de calidad (del inglés, passed bases) fue 2,19 Gb, las bases que no superaron este control de calidad (del inglés, failed bases) fue 541,65 Mb. El rango de longitud del tamaño de lectura fue 89 - 55.853 pb. El porcentaje del contenido de guanina-citosina fue 35%. Tras realizar el preprocesamiento de las muestras de Illumina con el programa fastp, las muestras secuenciadas empleando el secuenciador NextSeq, HE22-36 y HE22- 37, presentaron el mismo valor del porcentaje de contenido en guanina-citosina que previo al procesamiento, 37%, el rango de longitudes de las secuencias fue de 100 -151 pb, lógicamente el número de lecturas disminuyó (tabla 5.4). En la figura 5.9 se representa la calidad de las lecturas secuenciadas en función de la posición de la base de las lecturas tras el preprocesamiento. Capítulo 5 156 Figura 5.9. Gráficas de calidad de las secuencias por base con el programa FastQC y las muestras Illumina-NextSeq tras el preprocesamiento con el programa fastp. A: Muestra HE22-36 Read 1 (R1). B: Muestra HE22-36 Read 2 (R2). C: Muestra HE22-37 Read 1 (R1). D: Muestra HE22-37 Read 2 (R2). Nota: el eje Y se corresponde con el valor Phred Score, el eje X se corresponde con la posición de la lectura en pares de bases (pb). Las lecturas procesadas de las muestras de Illumina HE22-70 y HE22-71, mostraron un rango de porcentaje de contenido en guanina-citosina del 37-38 %. El número total de lecturas tras el preprocesamiento está recogido en la tabla 5.4. En la figura 5.10 está representada la calidad de las lecturas secuenciadas en función de la posición de la base de las lecturas tras el preprocesamiento. Capítulo 5 157 Figura 5.10. Gráficas de calidad de las secuencias por base con el programa FastQC y las muestras Illumina-NovaSeq tras el preprocesamiento con el programa fastp. A: Muestra HE22-70 Read 1 (R1). B: Muestra HE22-70 Read 2 (R2). C: Muestra HE22-71 Read 1 (R1). D: Muestra HE22-71 Read 2 (R2). Nota: el eje Y se corresponde con el valor Phred Score, el eje X se corresponde con la posición de la lectura en pares de bases (pb). EVALUACIÓN DE LOS ENSAMBLAJES Aproximación de lecturas cortas Se obtuvieron diferentes borradores de ensamblajes con cada una los ensambladores empleados en la aproximación basada en la tecnología Illumina-NextSeq, salvo en el caso del ensamblador Velvet que reportaba un error asociado a la memoria disponible. Tras múltiples intentos modificando parámetros asociados a la memoria del servidor, no se solventó el error. Las métricas de ensamblaje de los borradores obtenidos se resumen en la siguiente tabla: Tabla 5.5. Métricas de los borradores de ensamblaje de las muestras Illumina-NextSeq de QUAST y BUSCO. Muestra Ensamblador Nº de contigs Longitud total (pb) N50 (pb) GC (%) BUSCO*(%) HE22-36 SPAdes 73.799 254.431.934 6.747 37,91 54,1 Capítulo 5 158 HE22-36 SoapDeNovo2 35.667 25.836.549 687 38,87 1,2 HE22-36 Platanus 52.833 84.533.917 2.118 38,6 20,6 HE22-36 SGA 104.106 77.372.582 695 38,87 2,7 HE22-36 AbySS 155.591 138.089.355 851 38,48 8,3 HE22-36 Unicycler 180.012 257.638.835 1.752 38 19,3 HE22-37 SGA 36935 24.302.369 624 38,57 0,6 HE22-37 SPAdes 188.774 320.734.975 2.477 38,02 31,1 HE22-37 SoapDeNovo2 31.720 23.225.428 691 38,9 1,2 *BUSCOs completos (%) empleando la base de datos de nematodos. El ensamblador que obtuvo el mejor resultado fue SPAdes de acuerdo con las métricas, mayor valor de N50 con la muestra HE22-36 (6.457) y con la muestra HE22- 37 (2.477). Los resultados de BUSCO de mayor calidad también fueron los resultantes del ensamblaje de SPAdes (54,1% muestra HE22-36 y 31,1% con la muestra HE22-37). La tabla 5.6 muestra los resultados detallados BUSCO de HE22-36 y HE22-37, secuenciadas mediante Illumina-NextSeq. Tabla 5.6. Resultados de BUSCO de los ensamblajes obtenidos con las muestras Illumina-NextSeq procedentes de distintos ensambladores. Ensamblaje Resultados BUSCO Completos C-Únicos* C-Duplicados* Fragmentados Ausentes % n % n % n % n % n HE22-36 SPAdes 54,1 1696 53,1 1664 1 32 8,7 273 37,2 1162 HE22-36 SoapDeNovo 2 1,2 40 1,2 39 0 1 1,3 42 97,5 3049 HE22-36 Platanus 20,6 643 20,4 638 0,2 5 6,7 210 72,7 2278 HE22-36 SGA 2,7 83 2,2 68 0,5 15 2,8 87 94,5 2961 Capítulo 5 159 HE22-36 AbySS 8,3 259 7,9 248 0,4 11 5,1 159 86,6 2713 HE22-36 Unicycler 19,3 604 18,8 588 0,5 16 7,1 222 73,6 2305 HE22-37 SGA 0,6 21 0,6 20 0 1 1 32 98,4 3078 HE22-37 SPAdes 31,1 973 29,4 921 1,7 52 8,7 272 60,2 1886 HE22-37 SoapDeNovo 2 1,2 40 1,2 39 0 1 1,3 42 97,5 3049 *Las subcategorías únicos y duplicados proceden de la categoría completos El ensamblador que obtuvo los mejores resultados fue SPAdes, por lo que se seleccionó para analizar el resto de las muestras procedentes de lecturas cortas; así en el caso de las muestras procedentes de la secuenciación Illumina-NovaSeq, estas sólo se analizaron con SPAdes. En la tabla 5.7 se resumen las estadísticas principales de los borradores de ensamblaje con el programa SPAdes. Tabla 5.7. Métricas de los borradores de ensamblajes obtenidos con SPAdes y las muestras de secuenciación de Illumina. Muestra Secuenciador Nº de contigs Longitud total (pb) N50 (pb) GC (%) BUSCO*(% ) HE22-70 SPAdes NovaSeq 72.841 225.114.680 5.733 37,5 50,2 HE22-71 SPAdes NovaSeq 120.494 316.541.976 5.442 37,62 54,8 HE22-36 SPAdes NextSeq 73.799 254.431.934 6.747 37,91 54,1 HE22-37 SPAdes NextSeq 188.774 320.734.975 2.477 38,02 31,1 *BUSCOs completos (%) empleando la base de datos de nematodos. Capítulo 5 160 El rango de longitud total del genoma obtenido con las diferentes muestras ha sido 225 Mb – 321 Mb. La muestra HE22-37 es la que presenta los resultados más discrepantes. Los resultados detallados de BUSCO con la totalidad de muestras procedentes de Illumina y ensambladas empleando el programa SPAdes se detallan en la tabla 5.8. Tabla 5.8. Resultados de BUSCO de los ensamblajes procedentes de la tecnología Illumina con SPAdes. Ensamblaje Resultados BUSCO Completos C-Únicos* C-Duplicados* Fragmentados Ausentes % n % n % n % n % n HE22-70 SPAdes 50,2 1574 49,6 1554 0,6 20 8,8 277 41 1280 HE22-71 SPAdes 54,8 1714 53,2 1665 1,6 49 8,1 254 37,1 1163 HE22-36 SPAdes 54,1 1696 53,1 1664 1 32 8,7 273 37,2 1162 HE22-37 SPAdes 31,1 973 29,4 921 1,7 52 8,7 272 60,2 1886 *Las subcategorías únicos y duplicados proceden de la categoría completos. Aproximación de lecturas largas Las estadísticas de los borradores de ensamblajes procedentes de las muestras de secuenciación de lecturas largas están resumidas en la tabla 5.9: Tabla 5.9. Métricas de los borradores de ensamblajes tras la secuenciación de lecturas largas, obtenidas con QUAST y BUSCO. Muestra Ensamblador Nº de contigs Longitud total (pb) N50 (pb) GC (%) BUSCO* (%) HE22-57 Flye Raw 16.809 154.920.998 12.953 37,61 29,8 HE22-57 Flye Corrected 12.259 113.832.431 13.127 37,92 23,3 HE22-57 Flye Genome 16.806 154.973.578 12.969 37,6 29,8 Capítulo 5 161 HE22-57 NECAT 27 161.598 5.471 40,13 0 *BUSCOs completos (%) empleando la base de datos de nematodos. El ensamblador Flye Raw, Corrected y Genome hace referencia a los parámetros seleccionados para realizar el ensamblaje, previamente descritos en el apartado de metodología (5.2.3. Secuenciación. Aproximación de lecturas largas). El ensamblador Flye es el que consigue resolver el ensamblaje de manera más eficiente, y el parámetro Raw se considera el más adecuado, dado que se obtienen mejores resultados que con Corrected y similares a los de Genome. La diferencia entre Raw y Genome radica en que el primero no se basa en una suposición del tamaño del genoma. Los resultados de BUSCO de los ensamblajes resultantes tras la secuenciación de lecturas largas se detallan en la siguiente tabla: Tabla 5.10. Resultados de BUSCO de los ensamblajes procedentes de la secuenciación de lecturas largas. Ensamblaje Resultados BUSCO Completos C-Únicos* C-Duplicados* Fragmentados Ausentes % n % n % n % n % n HE22-57 Flye Raw 29,8 934 29,5 925 0,3 9 4,2 130 66 2067 HE22-57 Flye corrected 23,3 727 23,1 722 0,2 5 3,3 102 73.4 2302 HE22-57 Flye Genome 29,8 932 29,5 923 0,3 9 4,2 132 66 2067 HE22-57 NECAT 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 *Las subcategorías únicos y duplicados proceden de la categoría completos. n=número total. Los mejores resultados de BUSCO fueron los obtenidos en el ensamblaje Flye Raw, dado que se obtuvo el mayor valor de BUSCO completos (934) y mayor valor de únicos (925). Aproximación híbrida Capítulo 5 162 Las métricas de ensamblaje de secuenciación de lecturas cortas y lecturas largas empleando el ensamblador SPAdes en la modalidad híbrida (basado en lecturas cortas) están resumidos en la siguiente tabla: Tabla 5.11. Métricas de los borradores de ensamblajes aproximación híbrida, obtenidas con QUAST y BUSCO. Muestras Ensamblador Nº de contigs Longitud total (pb) N50 (pb) GC (%) BUSCO* (%) HE22-36 HE22-57 SPAdes híbrido 98.961 280.179.417 6.919 37,83 57,4 HE22-37 HE22-57 SPAdes híbrido 122.834 307.278.749 6.084 37,92 57,2 HE22-70 HE22-57 SPAdes híbrido 72.960 262.129.574 9.834 37,71 59,9 HE22-71 HE22-57 SPAdes híbrido 120.847 317.915.880 4.929 37,57 54,7 HE22-36 HE22-70 HE22-71 HE22-57 SPAdes híbrido 264.035 374.321.587 1.907 37,71 35,8 *BUSCOs completos (%) empleando la base de datos de nematodos. Los resultados detallados de BUSCO de los ensamblajes híbridos entre las lecturas de los dos tipos de secuenciación se recogen en la siguiente tabla: Tabla 5.12. Resultados de BUSCO de los ensamblajes procedentes de la aproximación híbrida basada en lecturas cortas. Ensamblaje Resultados BUSCO Completos C-Únicos* C-Duplicados* Fragmentados Ausentes % n % n % n % n % n HE22-36/ HE22-57 SPAdes Híb. 57,4 1.796 56,1 1.756 1,3 40 7,7 241 34,9 1.094 HE22-37/ HE22-57 SPAdes Híb. 57,2 1792 55,5 1739 1,7 53 8,4 262 34,4 1077 Capítulo 5 163 HE22-70/ HE22-57 SPAdes Híb. 59,9 1.878 58,7 1.839 1,2 39 8 249 32,1 1004 HE22-71/ HE22-57 SPAdes Híb. 54,7 1.711 53,1 1.662 1,6 49 8,8 274 36,5 1146 HE22-36 HE22-70 HE22-71 HE22-57 SPAdes Híb 35,8 1.121 34,3 1.073 1,5 48 8,8 276 55,4 1734 *Las subcategorías únicos y duplicados proceden de la categoría completos. n=número total. SPades Híb: SPades híbrido. La combinación que ha obtenido el mejor resultado ha sido la muestra HE22-70 (Illumina-NovaSeq) y la muestra HE22-57 (ONT), presentando el menor número de contigs (72.960), el mayor valor de N50 (9.834), mayor porcentaje de BUSCOs únicos (58,7%), y menor porcentaje de duplicados, fragmentados y ausentes. La combinación de muestras procedentes de lecturas cortas no ha obtenido un resultado mejor que cada una de manera individualizada. En la tabla siguiente se resumen las estadísticas de ensamblaje tras la aproximación híbrida basada en lecturas cortas y empleando el parámetro untrusted- contigs y los ensamblajes obtenidos de otras muestras con lecturas cortas y/o largas. En cursiva se indican las muestras utilizadas para obtener el borrador de ensamblaje que se especifica tras el parámetro untrusted-contigs). Tabla 5.13. Métricas de los borradores de ensamblajes, aproximación híbrida (basada en lecturas cortas) y el parámetro untrusted-contigs, obtenidas con QUAST y BUSCO. Muestras Ensamblador Nº de contigs Longitud total (pb) N50 (pb) GC (%) BUSCO* (%) HE22-71 HE22-36/57 SPAdes Untrusted SPAdes 114.178 281.458.871 4.650 37,56 50,5 HE22-70 HE22-57 SPAdes Untrusted Flye 74.058 263.961.864 9.910 37,66 60 HE22-71 HE22-57 SPAdes Untrusted Flye 207.499 331.298.066 2.174 37,63 28,5 Capítulo 5 164 HE22-70 HE22-57 HE22-36/57 SPAdes híbrido Untrusted SPAdes 82.139 272.400.619 8.603 37,74 58,7 HE22-36 HE22-57 HE22-70/57 SPAdes híbrido Untrusted SPAdes 97.537 287.764.672 8.299 37,81 60,1 *BUSCOs completos (%) empleando la base de datos de nematodos. Los resultados detallados de BUSCO se describen en la siguiente tabla: Tabla 5.14. Resultados de BUSCO de los ensamblajes procedentes de la aproximación híbrida basada en lecturas cortas y el parámetro untrusted-contigs. Ensamblaje Resultados BUSCO Completos C-Únicos* C-Duplicados* Fragmentados Ausentes % n % n % n % n % n HE22-71 HE22-36/57 50,5 1.581 49,2 1.540 1,3 41 8,6 269 40,9 1.281 HE22-70 HE22-57 60 1.879 58,6 1.834 1,4 45 8 252 32 1.000 HE22-71 HE22-57 28,5 892 27 845 1,5 47 8,6 268 62,9 1.971 HE22-70 HE22-57 HE22-36/57 58,7 1.836 57,4 1.796 1,3 40 8 251 33,3 1.044 HE22-36 HE22-57 HE22-70/57 60,1 1.883 58,7 1.838 1,4 45 7,8 243 32,1 1.005 *Las subcategorías únicos y duplicados proceden de la categoría completos. n=número total. Los ensamblajes con mejores resultados fueron HE22-70 SPAdes (untrusted- contigs HE22-57 de Flye) y HE22-36 /HE22-57 híbrido de SPades (untrusted-contigs HE22-70/57 de SPAdes), aunque el segundo obtuvo mejor valor de BUSCO, el resto de métricas, son mejores en el primer borrador de ensamblaje. Dado que el valor de BUSCO presenta una discrepancia muy ligera entre ambos, se seleccionó HE22-70 SPAdes (untrusted-contigs HE22-57 de Flye) como el mejor ensamblaje. Capítulo 5 165 Los resultados de ensamblaje obtenidos con la aproximación híbrida basada en lecturas largas con los programas Bowtie/Samtools/Pilon, se resume en la siguiente tabla: Tabla 5.15. Métricas de los borradores de ensamblajes, aproximación híbrida (basada en lecturas largas), obtenidas con QUAST y BUSCO. Muestras Software Nº de contigs Longitud total (pb) N50 (pb) GC (%) BUSCO* (%) HE22-57 HE22-70 Flye Bowtie2 Pilon 16.806 154.906.995 12.962 37,44 38,4 HE22-57 HE22-36 Flye Bowtie2 Pilon 16.806 154.890.617 12.953 37,45 38,6 HE22-57 HE22-70 Flye Bowtie2 Pilon Picard 16.806 154.911.257 12.962 37,44 38,4 HE22-57 HE22-36 Flye Bowtie2 Pilon Picard 16.806 154.891.890 12.954 37,45 38,9 *BUSCOs completos (%) empleando la base de datos de nematodos. Los resultados detallados de BUSCO de la aproximación híbrida basada en lecturas largas se recogen en la siguiente tabla: Tabla 5.16. Resultados de BUSCO de los ensamblajes procedentes de la aproximación híbrida basada en largas. Ensamblaje Resultados BUSCO Completos C-Únicos* C-Duplicados* Fragmentados Ausentes % n % n % n % n % n HE22-57 HE22-70 Flye Bowtie2 Pilon 38,4 1.205 37,9 1.188 0,5 17 6,5 204 55,1 1.722 HE22-57 HE22-36 Flye Bowtie2 Pilon 38,6 1209 38 1.190 0,6 19 6,6 207 54,8 1.715 HE22-57 HE22-70 Flye Bowtie2 Pilon Picard 38,8 1.215 38,2 1.196 0,6 19 6,4 201 54,8 1.715 Capítulo 5 166 HE22-57 HE22-36 Flye Bowtie2 Pilon Picard 38,9 1217 38,2 1195 0,7 22 6,6 206 54,5 1.708 *Las subcategorías únicos y duplicados proceden de la categoría completos. n=número total. La aproximación híbrida ha mejorado las métricas de los ensamblajes individuales tanto de aquellos basados en lecturas cortas como en lecturas largas. En la aproximación basada en lecturas largas el mejor resultado se obtiene con las muestras HE22-57 y HE22- 36 con los programas Flye, Bowtie2, Samtools, Pilon y Picard. Aunque las métricas tanto de BUSCO como de QUAST son muy similares entre los distintos ensamblajes. La tabla siguiente resume las métricas de los ensamblajes tras combinar las muestras de Illumina con los ensamblajes procedentes de la aproximación híbrida basada en lecturas largas y en cortas, empleando el programa SPAdes con o sin la modalidad híbrida (junto con la muestra HE22-57 (ONT)) y con los parámetros opcionales untrusted contigs o trusted contigs. Tabla 5.17. Métricas de los borradores de ensamblajes aproximación híbrida (basada en lecturas cortas) con ensamblajes procedentes de otras aproximaciones y parámetros opcionales como untrusted contigs/ trusted contigs, obtenidas con QUAST y BUSCO. Muestras Software Nº de contigs Longitud total (pb) N50 (pb) GC (%) BUSCO* (%) HE22-36 Pilon/Picard HE22-57-36 SPAdes Untrusted 105.154 288.742.554 6.608 37,77 58,1 HE22-70 Pilon/Picard HE22-57-36 SPAdes Untrusted 80.021 269.148.826 8.645 37,67 58,3 HE22-70 Pilon HE22-57-36 SPAdes Untrusted 80.014 269.151.703 8.646 37,67 59,1 HE22-36 Pilon HE22-57-36 SPAdes Trusted 100.998 299.435.360 7.492 37,8 57,5 HE22-70 HE22-57 Pilon/Picard HE22-57-36 SPAdes híbrido Untrusted 70.253 264.481.023 11.416 37,64 61,4 *BUSCOs completos (%) empleando la base de datos de nematodos. Capítulo 5 167 En la siguiente tabla se detallan los resultados de BUSCO correspondientes a los ensamblajes resultantes de combinar las muestras de Illumina con los ensamblajes procedentes de la aproximación híbrida basada en lecturas largas y en cortas. Tabla 5.18. Resultados de BUSCO de los ensamblajes procedentes de la aproximación híbrida (basada en lecturas cortas) con ensamblajes procedentes de otras aproximaciones y parámetros opcionales como untrusted contigs/ trusted contigs. Ensamblaje Resultados BUSCO Completos C-Únicos* C-Duplicados* Fragmentados Ausentes % n % n % n % n % n HE22-36 Pilon/Picard HE22-57-36 58,1 1.819 56,8 1.777 1,3 42 7,9 247 34 1.065 HE22-70 Pilon/Picard HE22-57-36 58,3 1.827 57,1 1.788 1,2 39 8,3 261 33,4 1.043 HE22-70 Pilon HE22-57-36 59,1 1.849 57,8 1.809 1,3 40 7,9 247 33 1.035 HE22-36 Pilon HE22-57-36 57,5 1.802 55,5 1.738 2 64 8,1 255 34,4 1.074 HE22-70 HE22-57 Pilon/Picard HE22-57-36 61,4 1.924 60 1.879 1,4 45 7,8 145 30,8 962 *Las subcategorías únicos y duplicados proceden de la categoría completos. n=número total. El borrador del ensamblaje que ha obtenido las mejores métricas ha sido la muestra HE22-70 (Illumina-NovaSeq) con el ensamblador SPAdes en la modalidad híbrida, incluyendo las lecturas largas ONT (HE22-57), y empleando el parámetro untrusted-contig con el ensamblaje resultante de Flye con la muestra HE22-57 corrigiendo con la muestra HE22-36 (Illumina-NextSeq) tras realizar la aproximación híbrida basada en lecturas largas con los programas Pilon y Picard. Las estadísticas de este ensamblaje fueron: 70.253 contigs/scaffolds, una longitud de genoma 264 Mb, 11 kb de valor de N50, 37,64% de contenido en guanina-citosina y un 61,4% de BUSCOs completos. En la tabla siguiente se resumen las métricas de la totalidad de los ensamblajes que han obtenido un valor de BUSCO (porcentaje de completos) superior al 50%: Capítulo 5 168 Tabla 5.19. Resumen de las métricas de los ensamblajes obtenidas mediante QUAST y BUSCO, con un valor de BUSCO completos superior al 50%. Muestras Software Nº de contigs Longitud total (pb) N50 (pb) GC (%) BUSCO* (%) HE22-70 SPAdes 72.841 225.114.680 5.733 37,5 50,2 HE22-71 SPAdes 120.494 316.541.976 5.442 37,62 54,8 HE22-36 SPAdes 73.799 254.431.934 6.747 37,91 54,1 HE22-36 HE22-57 SPAdes híbrido 98.961 280.179.417 6.919 37,83 57,4 HE22-37 HE22-57 SPAdes híbrido 122.834 307.278.749 6.084 37,92 57,2 HE22-70 HE22-57 SPAdes híbrido 72.960 262.129.574 9.834 37,71 59,9 HE22-71 HE22-57 SPAdes híbrido 120.847 317.915.880 4.929 37,57 54,7 HE22-70 HE22-57 HE22-36/57 SPAdes híbrido Untrusted SPAdes 82.139 272.400.619 8.603 37,74 58,7 HE22-36 HE22-57 HE22-70/57 SPAdes híbrido Untrusted SPAdes 97.537 287.764.672 8.299 37,81 60,1 HE22-71 HE22-36/57 SPAdes Untrusted SPAdes 114.178 281.458.871 4.650 37,56 50,5 HE22-70 HE22-57 SPAdes Untrusted Flye 74.058 263.961.864 9.910 37,66 60 HE22-36 Pilon/Picard HE22-57-36 SPAdes Untrusted 105.154 288.742.554 6.608 37,77 58,1 HE22-70 Pilon/Picard HE22-57-36 SPAdes Untrusted 80.021 269.148.826 8.645 37,67 58,3 HE22-70 Pilon HE22-57-36 SPAdes Untrusted 80.014 269.151.703 8.646 37,67 59,1 Capítulo 5 169 HE22-36 Pilon HE22-57-36 SPAdes Trusted 100.998 299.435.360 7.492 37,8 57,5 HE22-70 HE22-57 Pilon/Picard HE22-57-36 SPAdes híbrido Untrusted 70.253 264.481.023 11.416 37,64 61,4 *BUSCOs completos (%) empleando la base de datos de nematodos. Las muestras que han obtenido las mejores estadísticas han sido HE22-70 y HE22- 36 (Illumina) con el ensamblador SPAdes. La combinación con la muestra de lecturas largas (HE22-57, ONT), mejora las métricas de ensamblaje, al igual que emplear el parámetro untrusted con ensamblajes procedentes de la aproximación híbrida (combinación de lecturas largas y cortas, basándose en lecturas largas) y posterior curado con otros programas. La siguiente figura esquematiza los resultados del ensamblaje HE22-70/ HE22-57 Pilon/Picard HE22-57-36, considerando la totalidad de los contigs, no únicamente aquellos con un tamaño superior a 500 pb. Es una figura dinámica, se encuentra disponible en el siguiente enlace: https://belengb.github.io/assembly-stats/. https://belengb.github.io/assembly-stats/ Capítulo 5 170 Figura 5.11. Gráfico de caracol en el que se esquematizan las métricas del ensamblaje HE22-70/HE22-57 Pilon/Picard HE22-57-36. Assembly base composition: composición de bases del ensamblaje; GC: Guanina/ Citosina; AT: Adenina/Timina; N: indeterminaciones. Contig statistics: estadística de los contigs. Análisis complementarios El programa GenomeScope se empleó para estimar el tamaño del genoma con las lecturas procedentes de la tecnología Illumina. Hay que tener en consideración que se realiza una estimación aproximada y que el programa tiende a subestimar el tamaño del genoma (Eccles et al., 2018). Los resultados obtenidos de longitud de genoma único fueron: 54 Mb, 175,8 - 176 Mb y 107 - 108 Mb. Dado que las primeras muestras de Illumina (Illumina-NextSeq) habían sido sometidas a amplificación, únicamente se consideraron los resultados del tamaño del genoma total de las muestras Illumina- NovaSeq: 202 Mb. Por lo que el tamaño aproximado de genoma se fijó en 250-260 Mb. El rango de tamaño establecido está incluido en el intervalo de 150 Mb – 350 Mb descrito para las especies del orden Rhabditida relacionados con el género Gnathostoma. Capítulo 5 171 En la figura 5.12 se muestra mediante un gráfico de violines el rango de tamaños del genoma de las especies agrupadas por familias relacionadas con Gnathostoma spp. Figura 5.12. Rangos de tamaños de genomas de especies relacionadas con Gnathostoma spp. agrupadas por familias. Los resultados de Kraken no mostraron la presencia ni de contaminación por Homo sapiens, ni Monopterus albus, ni por otras especies bacterianas ni víricas. El porcentaje de similitud con humano fue 1%, con Monopterus albus del 0,5%, con Toxocara canis 0,8% y con bacterias 0,2%. La figura 5.13 representa los resultados obtenidos con la base de datos minikraken. El 98% de las secuencias no presentaron homología con ninguna especie presente en la base de datos. Capítulo 5 172 Figura 5.13. Representación del grado de homología de las secuencias de Illumina frente a la base de datos minikraken. Genoma mitocondrial El genoma mitocondrial publicado presenta un tamaño de 14.079 pb. Un total de 17 scaffolds del ensamblaje de la muestra HE22-70 de SPAdes (corregida por nanopore y con untrusted-contig HE22-36-57 pilon-picard) alinearon frente al genoma mitocondrial publicado. Prácticamente el 90% del genoma mitocondrial de referencia se ha cubierto. En la figura 5.14 se representa el alineamiento de los scaffolds del borrador del ensamblaje con los mejores resultados frente al genoma de referencia mitocondrial. Capítulo 5 173 Figura 5.14. Gráfico de circos del alineamiento del ensamblaje con el genoma mitocondrial de referencia. Nota: La línea azul externa representa el genoma mitocondrial de referencia. La segunda y tercera capa son los resultados de anotación automática con la muestra (el borrador de ensamblaje obtenido, segunda capa) y el de genoma mitocondrial referencia (tercera capa). La cuarta capa y la quinta capa representan dos opciones de alineamientos locales de las secuencias de los scaffolds de nuestro ensamblaje con el genoma mitocondrial. Los números (1,2,3…) representan aquellos scaffolds seleccionados cuyo porcentaje de cobertura es superior a 47. 5.4. Discusión El planteamiento inicial se basó en la secuenciación de un único individuo para la realización del genoma, sin embargo, finalmente se realizó un pool con diferentes larvas; todas ellas pertenecientes a la misma especie, Gnathostoma spinigerum. El planteamiento final con un pool se centró en que la publicación de un genoma de referencia debe ser un modelo representativo de la totalidad de individuos, al igual que sucedió en el Proyecto Capítulo 5 174 Genoma Humano, en el que emplearon muestras de varios individuos (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001). Sumado a esto, la concentración obtenida con una única larva fue bastante reducida, de hecho, no se obtuvo la concentración mínima requerida para la preparación de las librerías. Se testaron diferentes técnicas y procedimientos de extracción de ADN, pese a que la mayor concentración se obtuvo con el kit Arcturus PicoPure, al no presentar un paso previo de purificación, la calidad del ADN extraído era cuestionable, por lo que se decidió emplear el método basado en columnas con el equipo automatizado QIAcube. Un mayor tiempo de incubación (48 horas), y el empleo de proteinasa k, fueron pasos decisivos a la hora de extraer el ADN genómico, debido a la presencia de la cutícula en los nematodos, etapas críticas ya descritas por otros autores (Seesao et al., 2014). El perfil de distribución de las librerías de lecturas fue adecuado, ajustándose al modelo de las librerías indicado por Illumina (especificado en el protocolo de preparación de la librería), con un tamaño medio de fragmentos de 600 pb. La calidad de la secuenciación mediante Illumina fue apropiado, presentando un valor medio de PhredScore superior a 20 en las lecturas crudas. Tras el preprocesamiento, se eliminaron aquellas secuencias con un valor inferior a 15, así como las secuencias correspondientes a los adaptadores, mejorando lógicamente la calidad tras el preprocesamiento. Aunque los dos tipos de secuenciación mediante Illumina obtuvieron valores adecuados, la calidad obtenida tras la secuenciación NovaSeq fue superior a la de NextSeq. También hay que tener en consideración los diferentes métodos de preparación de las librerías; la empleada en la secuenciación NextSeq, presentó ciclos de amplificación, mientras que en la secuenciación NovaSeq no existieron. Esto repercutió en una menor proporción de artefactos en el segundo tipo de secuenciación empleada, y, por tanto, en una mayor calidad de lectura. SPAdes ha sido el ensamblador que ha proporcionado las mejores métricas de ensamblaje, resolviendo el ensamblaje de cada muestra, y de la combinación de estas. El ensamblaje seleccionado presentó 70.253 contigs, un valor de N50 de 11,4 kb, una longitud total de 264 Mb y un valor de BUSCO de 61,4%. Se ha estimado un tamaño de genoma de 260 Mb, el cual se incluye en el amplio rango de tamaño descrito para nematodos; 42 Mb – 700 Mb (International Helminth Genomes Consortium, 2019). Capítulo 5 175 Pese a que se ha conseguido mejorar la calidad de los ensamblajes tras el procesamiento bioinformático realizado, el genoma obtenido sigue estando bastante fragmentado. El número de bases procedentes de lecturas largas obtenidas ha sido relativamente bajo, alcanzando únicamente 2,19 Gb, lo que implicaría una profundidad de cobertura aproximada de 8,4X para un tamaño estimado de genoma de 260 Mb, por lo que sería insuficiente para resolver regiones altamente repetitivas. Otra posible aproximación para el ensamblaje de regiones altamente repetitivas sería la construcción de librerías mate pair y la posterior secuenciación con la tecnología Illumina (van Heesch et al., 2013), sin embargo, las lecturas largas son más económicas e informativas. Lo ideal sería disponer de lecturas largas de la suficiente calidad, para realizar un ensamblaje basado en las mismas, y poder depurar los posibles errores derivados de esta tecnología con las lecturas cortas. El siguiente nivel consistiría en obtener un ensamblaje a nivel de cromosomas, sin embargo, es complejo conseguir este nivel con la tecnología empleada y requeriría el empleo de HiC (high-throughput chromosome conformation capture), ya que permite conservar las secuencias y las estructuras tridimensionales. Por tanto, se obtendría un ensamblaje más contiguo, dado que proporciona información sobre la proximidad de las secuencias obtenidas. De esta manera, se ordenarían y orientarían los contigs en el cromosoma en el orden correcto. Esta tecnología presenta el inconveniente de que requiere una elevada cantidad de ADN de partida (Belton et al., 2012). Los genomas mitocondriales son componentes indispensables del genoma completo de un organismo y deberían incluirse en la evaluación de los ensamblajes de genoma completo (P. Wang & Wang, 2023). Aunque supone un reto el hecho de realizar el ensamblaje mitocondrial sin la purificación específica de este orgánulo, los resultados obtenidos en el ensamblaje final han sido esperanzadores. Pese al número relativamente alto de scaffolds (17) que alinearon frente al genoma mitocondrial, se ha cubierto prácticamente la totalidad del genoma; este hecho vuelve a poner en evidencia la necesidad de obtener una mayor calidad y cantidad de secuencias de lecturas largas, aunque también se evidencia la adecuada calidad de las lecturas cortas. Este aspecto se ve reforzado con la ausencia de contaminación de las muestras, ya que no se ha reportado ni contaminación procedente de humano, ni del hospedador (la anguila), ni de organismos de origen bacteriano ni vírico. Capítulo 5 176 La secuenciación del genoma de Gnathostoma spinigerum supone un paso decisivo para aportar conocimiento básico sobre el parásito y la gnathostomosis, pudiendo ayudar en el diseño de herramientas diagnósticas y terapéuticas para esta enfermedad en el futuro. Se han desarrollado técnicas de secuenciación metagenómicas para el diagnóstico de meningitis y encefalitis empleando como muestra el líquido cefalorraquídeo (Wilson et al., 2019). La obtención del genoma de Gnathostoma spinigerum permitiría incluir esta patología en el panel de análisis. De hecho, ya se ha realizado el diagnóstico de varios casos de A. cantonensis empleando tecnologías de secuenciación masiva, especialmente relevante en población pediátrica, debido a la inmadurez de su sistema inmunitario (J. Liu et al., 2022; Xie et al., 2019) El desarrollo continuo de las tecnologías genómicas disminuirá los costes de secuenciación y preparación de las librerías, haciendo posible el screening de muestras mediante secuenciación genómica de rutina, tal y como se realiza en estudios poblacionales de virus y bacterias. Esto permitiría determinar tanto las tasas como las zonas de trasmisión del parásito a nivel humano como de los diferentes hospedadores y esta información se podría emplear en el diseño de estrategias de control (Doyle et al., 2019). Para ello, es necesario disponer de un genoma de referencia. Además, permitiría la realización de un transcriptoma de la suficiente calidad, lo cual sería crucial para la búsqueda de candidatos diagnósticos e incluso terapéuticos (desarrollo de fármacos y vacunas). La publicación de un genoma no es el hito final, sino que es un paso adicional para intentar resolver la estructura y composición funcional del genoma (Doyle, 2022). Sin embargo, en el momento de publicar un genoma, y sobre todo de aquellas especies en las que la investigación genómica no está tan desarrollada como en el caso de los helmintos, hay que considerar que este se empleará como referencia. Sumado a que la investigación destinada a mejorar estos recursos genómicos puede que no avance al mismo nivel que otras especies infecciosas con mayor repercusión, es por ello necesario asegurar la calidad del genoma obtenido, consiguiendo una óptima utilización de los recursos disponibles. Este ha sido uno de los motivos por los que, en lugar de realizar la siguiente etapa de anotación, y la posterior publicación de un genoma sin la suficiente calidad, se ha preferido obtener un mejor borrador, pese a que esto suponga un retraso a la hora de obtener el resultado final. Capítulo 5 177 El ensamblaje de Gnathostoma spinigerum generado supone un importante avance hacia la obtención del genoma de referencia. En nuestro estudio y con la tecnología que disponemos, se podría obtener un mejor resultado; por ello, previo a realizar la fase de anotación, nos planteamos realizar una nueva secuenciación de lecturas largas, aumentando la concentración del material parasitario de partida. No obstante, el ensamblaje de novo realizado no deja de ser la primera aproximación genómica de esta especie parasitaria y el punto de partida para obtener el genoma de referencia. Conclusiones - Conclusions 178 IX. CONCLUSIONES / CONCLUSIONS 1. La revisión histórica realizada sobre las helmintosis demuestra que definir las diferentes entidades clínicas, su asociación con las especies implicadas y el descubrimiento de sus ciclos biológicos, han sido pilares fundamentales para instaurar medidas de control con la consecuente reducción de su prevalencia. En algunas de ellas, el grado de conocimiento alcanzado ha permitido desarrollar herramientas diagnósticas y vacunas claves para este objetivo. En otras aún es necesario reforzar los recursos disponibles. 2. Las propiedades diagnósticas de la técnica MBA-T24H para el diagnóstico de neurocisticercosis han sido confirmadas. Esta técnica supone una mejora respecto al método comercial de diagnóstico de la enfermedad en formato ELISA. 3. La tecnología MBA con los antígenos 2B2t y T24H proporciona una alternativa a los sistemas clásicos individuales empleados en los estudios de cribado epidemiológico serológico, economizando tiempo y recursos. 4. Los datos de seroprevalencia de neurocisticercosis, en el municipio de Manhiça (Mozambique), sugieren la ausencia de transmisión de Taenia solium, aunque es necesario ampliar el cribado con mayor muestra poblacional. Además, los datos de hidatidosis sugieren que existe un claro infradiagnóstico de esta patología. Sería necesario combinar los estudios de seroprevalencia con estudios de imagen (con ecógrafos portátiles) para determinar la prevalencia real de la enfermedad. 5. Los antígenos Ll-15r3 y Ll-SXP1 han mostrado una adecuada reactividad en cribados serológicos de loasis para su aplicación en la estrategia “serología- LoaScope”. La técnica con el antígeno Ll-15r3 fue la más precisa en el cribado de pacientes microfilarémicos de L. loa, por ello se recomienda el desarrollo de un prototipo basado en este antígeno. 6. El antígeno recombinante Gal2 muestra unas características prometedoras para su utilidad en el diagnóstico serológico de angiostrongilosis, aunque es necesario ampliar los estudios relativos a su reactividad cruzada. Conclusiones - Conclusions 179 7. El ensamblaje de novo de la especie Gnathostoma spinigerum establece las bases para obtener el genoma de referencia, punto clave para mejorar las técnicas transcriptómicas, diagnósticas y terapéuticas. 8. Se requiere la combinación de tecnologías de secuenciación de segunda y tercera generación junto con HiC (high-throughput chromosome conformation capture) para obtener un genoma con la calidad necesaria que permita el análisis a nivel cromosómico. CONCLUSIONS 1. A historical review of helminth infections demonstrates that defining clinical entities, associating them with involved species, and discovering their biological cycles have been fundamental pillars in establishing control measures, resulting in reduced prevalence. In some cases, the knowledge gained has led to the development of pivotal diagnostic tools and vaccines for this purpose. However, additional reinforcement of available resources is still required for others. 2. The diagnostic accuracy of MBA-T24H technique for the diagnosis of neurocysticercosis has been confirmed. The technique has exhibited superior performance compared to commercial ELISA formats. 3. MBA technology with the 2B2t and T24H antigens provides an alternative to classical single systems used in seroprevalence studies, saving time and resources. 4. Seroprevalence data on neurocysticercosis in Manhiça District (Mozambique) suggest the absence of Taenia solium transmission, although broader population screening is necessary. Furthermore, hydatidosis data indicate a clear underdiagnosis of this pathology. Combining seroprevalence studies with imaging studies (using portable ultrasound devices) would be crucial in determining disease prevalence. 5. Antigens Ll-15r3 and Ll-SXP1 have exhibited adequate reactivity in serological screenings for loiasis, suitable for application in the "serology- LoaScope" strategy. The Ll-15r3 antigen-based technique displayed the highest precision in screening Loa loa microfilaremic patients, therefore development of a prototype based on this antigen is recommended. Conclusiones - Conclusions 180 6. Recombinant antigen Gal2 shows promising characteristics for serological diagnosis of angiostrongyliasis. However, further studies regarding its cross- reactivity are needed. 7. First de novo genome assembly of Gnathostoma spinigerum establishes the basis for obtaining the reference genome, a crucial point for improving transcriptomic, diagnostic and therapeutic techniques. 8. Combining second and third generation sequencing technologies with HiC (high-throughput chromosome conformation capture) is required to obtain a genome of sufficient quality that allows detailed chromosomal-level analysis. Bibliografía 181 X. BIBLIOGRAFÍA Abraham, A., Schmidt, V., Kaminski, M., Stelzle, D., De Meijere, R., Bustos, J., Sahu, P. S., Garcia, H. H., Bobić, B., Cretu, C., Chiodini, P., Deksne, G., Dermauw, V., Devleesschauwer, B., Dorny, P., Fonseca, A., Gabriël, S., Gómez-Morales, M. A., Kucsera, I., … Winkler, A. S. (2020). Epidemiology and surveillance of human (neuro)cysticercosis in Europe: Is enhanced surveillance required? Tropical medicine & international health, 25,5, 566-578. https://doi.org/10.1111/tmi.13384 Africa, C., Refuerzo, P., & Garcia, E. (1936). Further observations on the life cycle of Gnathostoma spinigerum. Philippine Journal of Science, 61, 221-225. Agudelo Higuita, N. I., Brunetti, E., & McCloskey, C. (2016). Cystic Echinococcosis. Journal of Clinical Microbiology, 54(3), 518-523. https://doi.org/10.1128/JCM.02420-15 Ajuh, P. M., Akue, J. P., Boutin, P., Everaere, S., & Egwang, T. G. (1995). Loa loa: Structural diversity of a 15-kDa repetitive antigen. Experimental Parasitology, 81(2), 145-153. https://doi.org/10.1006/expr.1995.1103 Akue, J. P., Eyang-Assengone, E.-R., & Dieki, R. (2018). Loa loa infection detection using biomarkers: Current perspectives. Research and Reports in Tropical Medicine, 9, 43-48. https://doi.org/10.2147/RRTM.S132380 Akue, J. P., Hommel, M., & Devaney, E. (1998). IgG subclass recognition of Loa loa antigens and their correlation with clinical status in individuals from Gabon. Parasite Immunology, 20(8), 387-393. https://doi.org/10.1046/j.1365-3024.1998.00172.x Álvarez Cáceres, R. (2007). Estadística aplicada a las ciencias de la salud. Díaz de Santos. Anderson, J. P., Rascoe, L. N., Levert, K., Chastain, H. M., Reed, M. S., Rivera, H. N., McAuliffe, I., Zhan, B., Wiegand, R. E., Hotez, P. J., Wilkins, P. P., Pohl, J., & Handali, S. (2015). Development of a Luminex Bead Based Assay for Diagnosis of Toxocariasis Using Recombinant Antigens Tc-CTL-1 and Tc-TES-26. PLoS Neglected Tropical Diseases, 9(10), 1-14. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004168 Bibliografía 182 Azzibrouck, G. B., Akue, J. P., & Lenoble, D. R. (2010). Production and immunological characterization of a recombinant subunit of a Loa loa polyprotein antigen. Parasitology, 137(7), 1119-1128. https://doi.org/10.1017/S0031182009991740 Babraham Bioinformatics. (2019, enero 8). FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ Barratt, J., Chan, D., Sandaradura, I., Malik, R., Spielman, D., Lee, R., Marriott, D., Harkness, J., Ellis, J., & Stark, D. (2016). Angiostrongylus cantonensis: A review of its distribution, molecular biology and clinical significance as a human pathogen. Parasitology, 143(9), 1087-1118. https://doi.org/10.1017/S0031182016000652 Bazan, R., Filho, P. T. H., Luvizutto, G. J., Nunes, H. R. de C., Odashima, N. S., Santos, A. C. dos, Júnior, J. E., Zanini, M. A., Fleury, A., & Takayanagui, O. M. (2016). Clinical Symptoms, Imaging Features and Cyst Distribution in the Cerebrospinal Fluid Compartments in Patients with Extraparenchymal Neurocysticercosis. PLOS Neglected Tropical Diseases, 10(11), e0005115. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005115 Becerril, M. A. (2014). Parasitología médica (4a). McGraw-Hill. Belton, J.-M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y., & Dekker, J. (2012). Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods (San Diego, Calif.), 58(3), 268-276. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.05.001 Ben, R., Rodrigues, R., Agostini, A. A., & Graeff-Teixeira, C. (2010). Use of heterologous antigens for the immunodiagnosis of abdominal angiostrongyliasis by an enzyme-linked immunosorbent assay. Memorias Do Instituto Oswaldo Cruz, 105(7), 914-917. https://doi.org/10.1590/s0074-02762010000700013 Bertoni-Ruiz, F., Lamothe y Argumedo, M. R., García-Prieto, L., Osorio-Sarabia, D., & León- Régagnon, V. (2011). Systematics of the genus Gnathostoma (Nematoda: Gnathostomatidae) in the Americas. Revista Mexicana de Biodiversidad, 82(2), 453-464. Bhaibulaya, M. (1975). Comparative studies on the life history of Angiostrongylus mackerrasae Bhaibulaya, 1968 and Angiostrongylus cantonensis (Chen, 1935). International Journal for Parasitology, 5(1), 7-20. https://doi.org/10.1016/0020-7519(75)90091-0 Bibliografía 183 Biswas, S. (2004). Inter-test comparison between filter paper absorbed blood eluate and serum for malaria serology by enzyme immunoassay: An operational feasibility. Journal of Immunoassay & Immunochemistry, 25(4), 399-410. https://doi.org/10.1081/ias- 200033853 Blocher, J., Schmutzhard, E., Wilkins, P. P., Gupton, P. N., Schaffert, M., Auer, H., Gotwald, T., Matuja, W., & Winkler, A. S. (2011). A cross-sectional study of people with epilepsy and neurocysticercosis in Tanzania: Clinical characteristics and diagnostic approaches. PLoS Neglected Tropical Diseases, 5(6), e1185. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001185 Bonizzoni, P., Vedova, G. D., Pirola, Y., Previtali, M., & Rizzi, R. (2017). FSG: Fast String Graph Construction for De Novo Assembly. Journal of Computational Biology: A Journal of Computational Molecular Cell Biology, 24(10), 953-968. https://doi.org/10.1089/cmb.2017.0089 Bouchaud, O., Matheron, S., Loarec, A., Dupouy Camet, J., Bourée, P., Godineau, N., Poilane, I., Cailhol, J., & Caumes, E. (2020). Imported loiasis in France: A retrospective analysis of 167 cases with comparison between sub-Saharan and non sub-Saharan African patients. BMC Infectious Diseases, 20(1), 63. https://doi.org/10.1186/s12879-019-4740- 6 Boussinesq, M. (2006). Loiasis. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 100(8), 715-731. https://doi.org/10.1179/136485906X112194 Boussougou-Sambe, S. T., Woldearegai, T. G., Doumba-Ndalembouly, A. G., Ngossanga, B., Mba, R. B., Edoa, J. R., Zinsou, J. F., Honkpehedji, Y. J., Ngoa, U. A., Dejon-Agobé, J. C., Borrmann, S., Kremsner, P. G., Mordmüller, B., & Adegnika, A. A. (2022). Assessment of malaria transmission intensity and insecticide resistance mechanisms in three rural areas of the Moyen Ogooué Province of Gabon. Parasites & Vectors, 15(1), 217. https://doi.org/10.1186/s13071-022-05320-9 Brizzi, K., Pelden, S., Tshokey, T., Nirola, D. K., Diamond, M. B., Klein, J. P., Tshering, L., Deki, S., Nidup, D., Bruno, V., Dorny, P., Garcia, H. H., Mateen, F. J., & Bhutan Epilepsy Project. (2016). Neurocysticercosis in Bhutan: A cross-sectional study in people with Bibliografía 184 epilepsy. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 110(9), 517-526. https://doi.org/10.1093/trstmh/trw066 Broad Institute. (2019). Picard Toolkit (https://broadinstitute.github.io/picard/) [Software]. https://github.com/broadinstitute/picard/wiki/Home Brunetti, E., Heller, T., Richter, J., Kaminstein, D., Youkee, D., Giordani, M. T., Goblirsch, S., & Tamarozzi, F. (2016). Application of Ultrasonography in the Diagnosis of Infectious Diseases in Resource-Limited Settings. Current Infectious Disease Reports, 18(2), 6. https://doi.org/10.1007/s11908-015-0512-7 Brunetti, E., Kern, P., Vuitton, D. A., & Writing Panel for the WHO-IWGE. (2010). Expert consensus for the diagnosis and treatment of cystic and alveolar echinococcosis in humans. Acta Tropica, 114(1), 1-16. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2009.11.001 Brunetti, E., Tamarozzi, F., Macpherson, C., Filice, C., Piontek, M., Kabaalioglu, A., Dong, Y., Atkinson, N., Richter, J., Schreiber-Dietrich, D., & Dietrich, C. (2018). Ultrasound and Cystic Echinococcosis. Ultrasound International Open, 04(03), E70-E78. https://doi.org/10.1055/a-0650-3807 Burbelo, P. D., Ramanathan, R., Klion, A. D., Iadarola, M. J., & Nutman, T. B. (2008). Rapid, novel, specific, high-throughput assay for diagnosis of Loa loa infection. Journal of Clinical Microbiology, 46(7), 2298-2304. https://doi.org/10.1128/JCM.00490-08 Bussaratid, V., Dekumyoy, P., Desakorn, V., Jaroensuk, N., Liebtawee, B., Pakdee, W., & Wattanagoon, Y. (2010). Predictive factors for Gnathostoma seropositivity in patients visiting the Gnathostomiasis Clinic at the Hospital for Tropical Diseases, Thailand during 2000-2005. The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health, 41(6), 1316-1321. Caldeira, R. L., Mendonça, C. L. G. F., Goveia, C. O., Lenzi, H. L., Graeff-Teixeira, C., Lima, W. S., Mota, E. M., Pecora, I. L., Medeiros, A. M. Z. de, & Carvalho, O. dos S. (2007). First record of molluscs naturally infected with Angiostrongylus cantonensis (Chen, 1935) (Nematoda: Metastrongylidae) in Brazil. Memorias Do Instituto Oswaldo Cruz, 102(7), 887-889. https://doi.org/10.1590/s0074-02762007000700018 Bibliografía 185 Camacho, C., Coulouris, G., Avagyan, V., Ma, N., Papadopoulos, J., Bealer, K., & Madden, T. L. (2009). BLAST+: Architecture and applications. BMC Bioinformatics, 10, 421. https://doi.org/10.1186/1471-2105-10-421 Carabin, H., Ndimubanzi, P. C., Budke, C. M., Nguyen, H., Qian, Y., Cowan, L. D., Stoner, J. A., Rainwater, E., & Dickey, M. (2011). Clinical Manifestations Associated with Neurocysticercosis: A Systematic Review. PLoS Neglected Tropical Diseases, 5(5), e1152. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001152 Carmena, D., Benito, A., & Eraso, E. (2006). Antigens for the immunodiagnosis of Echinococcus granulosus infection: An update. Acta Tropica, 98(1), 74-86. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2006.02.002 Cernotíková, E., Horák, A., & Moravec, F. (2011). Phylogenetic relationships of some spirurine nematodes (Nematoda: Chromadorea: Rhabditida: Spirurina) parasitic in fishes inferred from SSU rRNA gene sequences. Folia Parasitologica, 58(2), 135-148. Chaicumpa, W. (2010). Immunodiagnosis of Gnathostomiasis. Siriraj Medical Journal, 62(2), Article 2. Challis, R. (2016). Assembly-stats. Https://github.com/rjchallis/assembly-stats [JavaScript]. https://github.com/rjchallis/assembly-stats (Obra original publicada en 2015) Chen, H.-T. (1935). Un nouveau nématode pulmonaire, Pulmonema cantonensis, n. G., n. Sp. Des rats de Canton. Annales de Parasitologie Humaine et Comparée, 13(4), 312-317. https://doi.org/10.1051/parasite/1935134312 Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., & Gu, J. (2018). fastp: An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics, 34(17), i884-i890. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty560 Chen, Y., Nie, F., Xie, S.-Q., Zheng, Y.-F., Dai, Q., Bray, T., Wang, Y.-X., Xing, J.-F., Huang, Z.-J., Wang, D.-P., He, L.-J., Luo, F., Wang, J.-X., Liu, Y.-Z., & Xiao, C.-L. (2021). Efficient assembly of nanopore reads via highly accurate and intact error correction. Nature Communications, 12(1), 60. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20236-7 Bibliografía 186 Chesnais, C. B., Takougang, I., Paguélé, M., Pion, S. D., & Boussinesq, M. (2017). Excess mortality associated with loiasis: A retrospective population-based cohort study. The Lancet. Infectious Diseases, 17(1), 108-116. https://doi.org/10.1016/S1473- 3099(16)30405-4 Chitanondh, H., & Rosen, L. (1967). Fatal eosinophilic encephalomyelitis caused by the nematode Gnathostoma spinigerum. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 16(5), 638-645. https://doi.org/10.4269/ajtmh.1967.16.638 Cho, T. A. (2018). Helminthic Infections of the Central Nervous System. CONTINUUM Lifelong Learning in Neurology, 24(5, Neuroinfectious Disease), 1489-1511. https://doi.org/10.1212/CON.0000000000000646 Cole, R. A., Choudhury, A., Nico, L. G., & Griffin, K. M. (2014). Gnathostoma spinigerum in live Asian swamp eels (Monopterus spp.) from food markets and wild populations, United States. Emerging Infectious Diseases, 20(4), 634-642. https://doi.org/10.3201/eid2004.131566 Corda, M., Sciurba, J., Blaha, J., Mahanty, S., Paredes, A., Garcia, H. H., Nash, T. E., Nutman, T. B., & O’Connell, E. M. (2022). A recombinant monoclonal-based Taenia antigen assay that reflects disease activity in extra-parenchymal neurocysticercosis. PLoS Neglected Tropical Diseases, 16(5), e0010442. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010442 Cox, F. E. G. (2002). History of Human Parasitology. Clinical Microbiology Reviews, 15(4), 595- 612. https://doi.org/10.1128/CMR.15.4.595-612.2002 Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., & Wang, Q. (2017). Echinococcosis: Control and Prevention. Advances in Parasitology, 96, 55-158. https://doi.org/10.1016/bs.apar.2016.09.002 Crestani, S., Leitolis, A., Lima, L. F. O., Krieger, M. A., & Foti, L. (2016). Enhanced target- specific signal detection using an Escherichia coli lysate in multiplex microbead immunoassays with E. coli-derived recombinant antigens. Journal of Immunological Methods, 435, 17-26. https://doi.org/10.1016/j.jim.2016.05.002 Bibliografía 187 CystiTeam Group for Epidemiology and Modelling of Taenia solium Taeniasis/Cysticercosis. (2019). The World Health Organization 2030 goals for Taenia solium: Insights and perspectives from transmission dynamics modelling. Gates Open Research, 3. https://doi.org/10.12688/gatesopenres.13068.2 da Silva, A. J., & Morassutti, A. L. (2021). Angiostrongylus spp. (Nematoda; Metastrongyloidea) of global public health importance. Research in Veterinary Science, 135, 397-403. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2020.10.023 Daengsvang, S. (1949). Human Gnathostomiasis in Siam with Reference to the Method of Prevention. The Journal of Parasitology, 35(2), 116-121. https://doi.org/10.2307/3273112 Daipert-Garcia, D., Virginio, V. G., Oliveira, F. B., Siqueira, N. G., Ferreira, H. B., & Rodrigues- Silva, R. (2022). Evaluation of two heterologous recombinant antigens for the serological diagnosis of human polycystic echinococcosis. Journal of Helminthology, 96, e21. https://doi.org/10.1017/S0022149X22000086 D’Ambrosio, M. V., Bakalar, M., Bennuru, S., Reber, C., Skandarajah, A., Nilsson, L., Switz, N., Kamgno, J., Pion, S., Boussinesq, M., Nutman, T. B., & Fletcher, D. A. (2015). Point-of- care quantification of blood-borne filarial parasites with a mobile phone microscope. Science Translational Medicine, 7(286), 286re4. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aaa3480 Das, A., Goyal, R., Saxena, S., & Singh, N. P. (2005). Diagnosis of neurocysticercosis by enzyme- linked immunosorbent assay. Journal of the Indian Medical Association, 103(10), 528- 529. Davis, P., Zarowiecki, M., Arnaboldi, V., Becerra, A., Cain, S., Chan, J., Chen, W. J., Cho, J., da Veiga Beltrame, E., Diamantakis, S., Gao, S., Grigoriadis, D., Grove, C. A., Harris, T. W., Kishore, R., Le, T., Lee, R. Y. N., Luypaert, M., Müller, H.-M., … Sternberg, P. W. (2022). WormBase in 2022-data, processes, and tools for analyzing Caenorhabditis elegans. Genetics, 220(4), 1-11. https://doi.org/10.1093/genetics/iyac003 Bibliografía 188 de Almeida, S. M., & Torres, L. F. B. (2011). Neurocysticercosis—Retrospective study of autopsy reports, a 17-year experience. Journal of Community Health, 36(5), 698-702. https://doi.org/10.1007/s10900-011-9389-z De Coster, W., De Rijk, P., De Roeck, A., De Pooter, T., D’Hert, S., Strazisar, M., Sleegers, K., & Van Broeckhoven, C. (2019). Structural variants identified by Oxford Nanopore PromethION sequencing of the human genome. Genome Research, 29(7), 1178-1187. https://doi.org/10.1101/gr.244939.118 Del Brutto, O. H. (2012). Neurocysticercosis in Western Europe: A re-emerging disease? Acta Neurologica Belgica, 112(4), 335-343. https://doi.org/10.1007/s13760-012-0068-3 Del Brutto, O. H., & Garcia, H. H. (2013). Neurocysticercosis. Handbook of Clinical Neurology, 114, 313-325. https://doi.org/10.1016/B978-0-444-53490-3.00025-X Del Brutto, O. H., Nash, T. E., White, A. C., Rajshekhar, V., Wilkins, P. P., Singh, G., Vasquez, C. M., Salgado, P., Gilman, R. H., & Garcia, H. H. (2017). Revised diagnostic criteria for neurocysticercosis. Journal of the Neurological Sciences, 372, 202-210. https://doi.org/10.1016/j.jns.2016.11.045 Delabre, S., Parola, P., Thiberville, D., Brouqui, P., Delmont, J., & Gautret, P. (2014). Non- ophthalmological presentation of imported loiasis. Travel Medicine and Infectious Disease, 12(4), 406-409. https://doi.org/10.1016/j.tmaid.2014.04.012 Delgado-Serra, S., Sola, J., Negre, N., & Paredes-Esquivel, C. (2022). Angiostrongylus cantonensis Nematode Invasion Pathway, Mallorca, Spain. Emerging Infectious Diseases, 28(6), 1163-1169. https://doi.org/10.3201/eid2806.212344 DeLong, E. R., DeLong, D. M., & Clarke-Pearson, D. L. (1988). Comparing the areas under two or more correlated receiver operating characteristic curves: A nonparametric approach. Biometrics, 44(3), 837-845. Dermauw, V., Carabin, H., Cissé, A., Millogo, A., Tarnagda, Z., Ganaba, R., Noh, J., Handali, S., Breen, K., Richter, V., Cissé, R., Preux, P.-M., Boncoeur-Martel, M.-P., Winkler, A. S., Van Hul, A., Dorny, P., & Gabriël, S. (2018). Evaluating the Recombinant T24H Enzyme-Linked Immunoelectrotransfer Blot Assay for the Diagnosis of Bibliografía 189 Neurocysticercosis in a Panel of Samples from a Large Community-Based Randomized Control Trial in 60 Villages in Burkina Faso. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 98(2), 565-569. https://doi.org/10.4269/ajtmh.17-0541 Devleesschauwer, B., Allepuz, A., Dermauw, V., Johansen, M. V., Laranjo-González, M., Smit, G. S. A., Sotiraki, S., Trevisan, C., Wardrop, N. A., Dorny, P., & Gabriël, S. (2017). Taenia solium in Europe: Still endemic? Acta Tropica, 165, 96-99. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2015.08.006 Diaz, J. H. (2015). Gnathostomiasis: An Emerging Infection of Raw Fish Consumers in Gnathostoma Nematode-Endemic and Nonendemic Countries. Journal of Travel Medicine, 22(5), 318-324. https://doi.org/10.1111/jtm.12212 Dixon, M. A., Winskill, P., Harrison, W. E., & Basáñez, M.-G. (2021). Taenia solium taeniasis/cysticercosis: From parasite biology and immunology to diagnosis and control. Advances in Parasitology, 112, 133-217. https://doi.org/10.1016/bs.apar.2021.03.003 Donadeu, M., Bote, K., Gasimov, E., Kim, S., Lin, Z., Lucianez, A., Mwinzi, P., Nicholls, R., Warusavithana, S., Yajima, A., & Abela-Ridder, B. (2022). WHO Taenia solium endemicity map – 2022 update. WEEKLY EPIDEMIOLOGICAL RECORD, 17. Dorta-Contreras, A. J., Núñez-Fernandez, F. A., Pérez-Martín, O., Lastre-González, M., Magraner-Tarrau, M. E., Bu-Coifiú Fanego, R., Noris-García, E., Padilla-Docal, B., Interián-Morales, M. T., Martínez-Delgado, J. F., & Sánchez-Zulueta, E. (2007). [Peculiarities of meningoencephalitis caused by Angiostrongylus cantonensis in America]. Revista De Neurologia, 45(12), 755-763. Doyle, S. R. (2022). Improving helminth genome resources in the post-genomic era. Trends in Parasitology, 38(10), 831-840. https://doi.org/10.1016/j.pt.2022.06.002 Doyle, S. R., Sankaranarayanan, G., Allan, F., Berger, D., Jimenez Castro, P. D., Collins, J. B., Crellen, T., Duque-Correa, M. A., Ellis, P., Jaleta, T. G., Laing, R., Maitland, K., McCarthy, C., Moundai, T., Softley, B., Thiele, E., Ouakou, P. T., Tushabe, J. V., Webster, J. P., … Holroyd, N. (2019). Evaluation of DNA Extraction Methods on Bibliografía 190 Individual Helminth Egg and Larval Stages for Whole-Genome Sequencing. Frontiers in Genetics, 10, 826. https://doi.org/10.3389/fgene.2019.00826 Drame, P. M., Bennuru, S., & Nutman, T. B. (2017). Discovery of Specific Antigens That Can Predict Microfilarial Intensity in Loa loa Infection. Journal of Clinical Microbiology, 55(9), 2671-2678. https://doi.org/10.1128/JCM.00513-17 Drame, P. M., Fink, D. L., Kamgno, J., Herrick, J. A., & Nutman, T. B. (2014). Loop-mediated isothermal amplification for rapid and semiquantitative detection of Loa loa infection. Journal of Clinical Microbiology, 52(6), 2071-2077. https://doi.org/10.1128/JCM.00525-14 Drame, P. M., Meng, Z., Bennuru, S., Herrick, J. A., Veenstra, T. D., & Nutman, T. B. (2016). Identification and Validation of Loa loa Microfilaria-Specific Biomarkers: A Rational Design Approach Using Proteomics and Novel Immunoassays. mBio, 7(1), e02132- 02115. https://doi.org/10.1128/mBio.02132-15 Eamsobhana, P., Tungtrongchitr, A., Wanachiwanawin, D., & Yong, H.-S. (2018). Immunochromatographic test for rapid serological diagnosis of human angiostrongyliasis. International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of the International Society for Infectious Diseases, 73, 69-71. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2018.06.005 Eamsobhana, P., & Yong, H. S. (2009). Immunological diagnosis of human angiostrongyliasis due to Angiostrongylus cantonensis (Nematoda: Angiostrongylidae). International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of the International Society for Infectious Diseases, 13(4), 425-431. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2008.09.021 Eccles, D., Chandler, J., Camberis, M., Henrissat, B., Koren, S., Le Gros, G., & Ewbank, J. J. (2018). De novo assembly of the complex genome of Nippostrongylus brasiliensis using MinION long reads. BMC Biology, 16(1), 6. https://doi.org/10.1186/s12915-017-0473-4 Egwang, T. G., Dupont, A., Leclerc, A., Akué, J. P., & Pinder, M. (1989). Differential recognition of Loa loa antigens by sera of human subjects from a loiasis endemic zone. The American Bibliografía 191 Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 41(6), 664-673. https://doi.org/10.4269/ajtmh.1989.41.664 European Centre for Disease Prevention and Control., E. C. for D. P. and C. (2022). Echinococcosis Annual Epidemiological Report for 2020. Fabiani, S., & Bruschi, F. (2013). Neurocysticercosis in Europe: Still a public health concern not only for imported cases. Acta Tropica, 128(1), 18-26. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2013.06.020 FAO/WHO (Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization). (2014). Multicriteria-Based Ranking for Risk Management of Food-Borne Parasites: Report of a Joint FAO/WHO expert meeting, 3-7 September 2012, FAO Headquarters, Rome, Italy. Federspiel, F., Skovmand, S., & Skarphedinsson, S. (2020). Eosinophilic meningitis due to Angiostrongylus cantonensis in Europe. International Journal of Infectious Diseases, 93, 28-39. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2020.01.012 Fernández-Soto, P., Mvoulouga, P. O., Akue, J. P., Abán, J. L., Santiago, B. V., Sánchez, M. C., & Muro, A. (2014). Development of a highly sensitive loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for the detection of Loa loa. PloS One, 9(4), e94664. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094664 Ferrer, E., Bonay, P., Foster-Cuevas, M., González, L. M., Dávila, I., Cortéz, M. M., Harrison, L. J. S., Parkhouse, R. M. E., & Gárate, T. (2007). Molecular cloning and characterisation of Ts8B1, Ts8B2 and Ts8B3, three new members of the Taenia solium metacestode 8 kDa diagnostic antigen family. Molecular and Biochemical Parasitology, 152(1), 90-100. https://doi.org/10.1016/j.molbiopara.2006.12.003 Fink, D. L., Kamgno, J., & Nutman, T. B. (2011). Rapid molecular assays for specific detection and quantitation of Loa loa microfilaremia. PLoS Neglected Tropical Diseases, 5(8), e1299. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001299 Fleury, A., Hernández, M., Avila, M., Cárdenas, G., Bobes, R. J., Huerta, M., Fragoso, G., Uribe- Campero, L., Harrison, L. J. S., Parkhouse, R. M. E., & Sciutto, E. (2007). Detection of Bibliografía 192 HP10 antigen in serum for diagnosis and follow-up of subarachnoidal and intraventricular human neurocysticercosis. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry, 78(9), 970-974. https://doi.org/10.1136/jnnp.2006.107243 Fogang, Y. F., Savadogo, A. A., Camara, M., Toffa, D. H., Basse, A., Sow, A. D., & Ndiaye, M. M. (2015). Managing neurocysticercosis: Challenges and solutions. International Journal of General Medicine, 8, 333. https://doi.org/10.2147/IJGM.S73249 Formenti, F., Tang, T.-H. T., Tamarozzi, F., Silva, R., La Marca, G., Pajola, B., Piubelli, C., Perandin, F., Rubio, J. M., Escolar, E. M., Bisoffi, Z., & Gobbi, F. (2021). Preliminary comparison between an in-house real-time PCR vs microscopy for the diagnosis of Loa loa and Mansonella perstans. Acta Tropica, 216, 105838. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2021.105838 Fujii, Y., Kaneko, S., Nzou, S. M., Mwau, M., Njenga, S. M., Tanigawa, C., Kimotho, J., Mwangi, A. W., Kiche, I., Matsumoto, S., Niki, M., Osada-Oka, M., Ichinose, Y., Inoue, M., Itoh, M., Tachibana, H., Ishii, K., Tsuboi, T., Yoshida, L. M., … Hirayama, K. (2014). Serological Surveillance Development for Tropical Infectious Diseases Using Simultaneous Microsphere-Based Multiplex Assays and Finite Mixture Models. PLoS Neglected Tropical Diseases, 8(7). https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0003040 Galán-Puchades, M. T., & Fuentes, M. V. (2013). Taenia asiatica: The most neglected human Taenia and the possibility of cysticercosis. The Korean Journal of Parasitology, 51(1), 51-54. https://doi.org/10.3347/kjp.2013.51.1.51 Galán-Puchades, M. T., Gómez-Samblás, M., Osuna, A., Sáez-Durán, S., Bueno-Marí, R., & Fuentes, M. V. (2022). Autochthonous Angiostrongylus cantonensis Lungworms in Urban Rats, Valencia, Spain, 2021. Emerging Infectious Diseases, 28(12), 2564-2567. https://doi.org/10.3201/eid2812.220418 Garcia, A., Abel, L., Cot, M., Richard, P., Ranque, S., Feingold, J., Demenais, F., Boussinesq, M., & Chippaux, J. P. (1999). Genetic epidemiology of host predisposition microfilaraemia in human loiasis. Tropical Medicine & International Health: TM & IH, 4(8), 565-574. https://doi.org/10.1046/j.1365-3156.1999.00442.x Bibliografía 193 Garcia, H. H., Castillo, Y., Gonzales, I., Bustos, J. A., Saavedra, H., Jacob, L., Del Brutto, O. H., Wilkins, P. P., Gonzalez, A. E., Gilman, R. H., & Cysticercosis Working Group in Peru. (2018). Low sensitivity and frequent cross-reactions in commercially available antibody detection ELISA assays for Taenia solium cysticercosis. Tropical Medicine & International Health: TM & IH, 23(1), 101-105. https://doi.org/10.1111/tmi.13010 Garcia, H. H., Castillo, Y., Gonzales, I., Bustos, J. A., Saavedra, H., Jacob, L., Del Brutto, O. H., Wilkins, P. P., Gonzalez, A. E., Gilman, R. H., Tsang, V. C. W., Rodriguez, S., Martinez, M., Alvarado, M., Porras, M., Vargas, V., Ccjuno, A., Verastegui, M., Zimic, M., … Friedland, J. (2018). Low sensitivity and frequent cross-reactions in commercially available antibody detection ELISA assays for Taenia solium cysticercosis. Tropical Medicine and International Health, 23(1), 101-105. https://doi.org/10.1111/tmi.13010 Garcia, H. H., Gonzalez, A. E., & Gilman, R. H. (2020, julio). Taenia solium cysticercosis and its impact in neurological disease. Clinical Microbiology Reviews, 33. https://doi.org/10.1128/CMR.00085-19 Garcia, H. H., O’Neal, S. E., Noh, J., Handali, S., Gilman, R. H., Gonzalez, A. E., Tsang, V. C. W., Rodriguez, S., Martinez, M., Gonzales, I., Saavedra, H., Verastegui, M., Bustos, J. A., Zimic, M., Mayta, H., Castillo, Y., Castro, Y., Lopez, M. T., Gavidia, C. M., … Friedland, J. (2018). Laboratory diagnosis of neurocysticercosis (Taenia solium). Journal of Clinical Microbiology, 56(9). https://doi.org/10.1128/JCM.00424-18 Gardon, J., Gardon-Wendel, N., Demanga-Ngangue, null, Kamgno, J., Chippaux, J. P., & Boussinesq, M. (1997). Serious reactions after mass treatment of onchocerciasis with ivermectin in an area endemic for Loa loa infection. Lancet (London, England), 350(9070), 18-22. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(96)11094-1 Gauci, C., Heath, D., Chow, C., & Lightowlers, M. W. (2005). Hydatid disease: Vaccinology and development of the EG95 recombinant vaccine. Expert Review of Vaccines, 4(1), 103- 112. https://doi.org/10.1586/14760584.4.1.103 GBD 2017 DALYs and HALE Collaborators. (2018). Global, regional, and national disability- adjusted life-years (DALYs) for 359 diseases and injuries and healthy life expectancy Bibliografía 194 (HALE) for 195 countries and territories, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet (London, England), 392(10159), 1859-1922. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(18)32335-3 Genome Database NCBI. (2022). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ Goswami, K., & Sanan-Mishra, N. (2022). Chapter 7—RNA-seq for revealing the function of the transcriptome. En D. B. Singh & R. K. Pathak (Eds.), Bioinformatics (pp. 105-129). Academic Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-323-89775-4.00002-X Graeff-Teixeira, C., da Silva, A. C. A., & Yoshimura, K. (2009). Update on eosinophilic meningoencephalitis and its clinical relevance. Clinical Microbiology Reviews, 22(2), 322-348, Table of Contents. https://doi.org/10.1128/CMR.00044-08 Graeff-Teixeira, C., Sawanyawisuth, K., Lv, S., Sears, W., Rodríguez, Z. G., Álvarez, H. H., Arias, P. C., Schultz, L. K. W., Rojas, A., Jacob, J., Jarvi, S., & Kramer, K. (2023). Neuroangiostrongyliasis: Updated Provisional Guidelines for Diagnosis and Case Definitions. Pathogens, 12(4), 624. https://doi.org/10.3390/pathogens12040624 Grau-Pujol, B., Martí-Soler, H., Escola, V., Demontis, M., Jamine, J. C., Gandasegui, J., Muchisse, O., Cambra-Pellejà, M., Cossa, A., Martinez-Valladares, M., Sacoor, C., Van Lieshout, L., Cano, J., Giorgi, E., & Muñoz, J. (2021). Towards soil-transmitted helminths transmission interruption: The impact of diagnostic tools on infection prediction in a low intensity setting in Southern Mozambique. PLoS Neglected Tropical Diseases, 15(10), e0009803. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009803 Grau-Pujol, B., Massangaie, M., Cano, J., Maroto, C., Ndeve, A., Saute, F., & Muñoz, J. (2019). Frequency and distribution of neglected tropical diseases in Mozambique: A systematic review. Infectious Diseases of Poverty, 8(1), 103. https://doi.org/10.1186/s40249-019- 0613-x Grosso, G., Gruttadauria, S., Biondi, A., Marventano, S., & Mistretta, A. (2012). Worldwide epidemiology of liver hydatidosis including the Mediterranean area. World Journal of Gastroenterology, 18(13), 1425-1437. https://doi.org/10.3748/wjg.v18.i13.1425 Bibliografía 195 Grove, D. (1991). A History of Human Helminthology. (Vol. 65). C·A·B International: Wallingford, UK,. https://www.cambridge.org/core/journals/journal-of- helminthology/article/abs/history-of-human-helminthology-d-i-grove-1990-cab- international-wallingford-uk-1990-848-pp-price-55-isbn- 0851986897/5481DD4C5604443BC4AB3C59EBC3235E Gurevich, A., Saveliev, V., Vyahhi, N., & Tesler, G. (2013). QUAST: Quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics (Oxford, England), 29(8), 1072-1075. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt086 Hancock, K., Khan, A., Williams, F. B., Yushak, M. L., Pattabhi, S., Noh, J., & Tsang, V. C. W. (2003). Characterization of the 8-kilodalton antigens of Taenia solium metacestodes and evaluation of their use in an enzyme-linked immunosorbent assay for serodiagnosis. Journal of Clinical Microbiology, 41(6), 2577-2586. https://doi.org/10.1128/JCM.41.6.2577-2586.2003 Hancock, K., Pattabhi, S., Whitfield, F. W., Yushak, M. L., Lane, W. S., Garcia, H. H., Gonzalez, A. E., Gilman, R. H., & Tsang, V. C. W. (2006). Characterization and cloning of T24, a Taenia solium antigen diagnostic for cysticercosis. Molecular and Biochemical Parasitology, 147(1), 109-117. https://doi.org/10.1016/j.molbiopara.2006.02.004 Herman, J. S., & Chiodini, P. L. (2009). Gnathostomiasis, Another Emerging Imported Disease. Clinical Microbiology Reviews, 22(3), 484-492. https://doi.org/10.1128/CMR.00003-09 Hernández, M., Gonzalez, L. M., Fleury, A., Saenz, B., Parkhouse, R. M. E., Harrison, L. J. S., Garate, T., & Sciutto, E. (2008). Neurocysticercosis: Detection of Taenia solium DNA in human cerebrospinal fluid using a semi-nested PCR based on HDP2. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 102(4), 317-323. https://doi.org/10.1179/136485908X278856 Hernández-González, A., Muro, A., Barrera, I., Ramos, G., Orduña, A., & Siles-Lucas, M. (2008). Usefulness of four different Echinococcus granulosus recombinant antigens for serodiagnosis of unilocular hydatid disease (UHD) and postsurgical follow-up of patients Bibliografía 196 treated for UHD. Clinical and Vaccine Immunology: CVI, 15(1), 147-153. https://doi.org/10.1128/CVI.00363-07 Hernández-González, A., Noh, J., Perteguer, M. J., Gárate, T., & Handali, S. (2017a). Comparison of T24H-his, GST-T24H and GST-Ts8B2 recombinant antigens in western blot, ELISA and multiplex bead-based assay for diagnosis of neurocysticercosis. Parasites and Vectors, 10(1), 1-11. https://doi.org/10.1186/s13071-017-2160-2 Hernández-González, A., Noh, J., Perteguer, M. J., Gárate, T., & Handali, S. (2017b). Comparison of T24H-his, GST-T24H and GST-Ts8B2 recombinant antigens in western blot, ELISA and multiplex bead-based assay for diagnosis of neurocysticercosis. Parasites and Vectors, 10(1), 1-11. https://doi.org/10.1186/s13071-017-2160-2 Hernández-González, A., Sánchez-Ovejero, C., Manzano-Román, R., González Sánchez, M., Delgado, J. M., Pardo-García, T., Soriano-Gálvez, F., Akhan, O., Cretu, C. M., Vutova, K., Tamarozzi, F., Mariconti, M., Brunetti, E., Vola, A., Fabiani, M., Casulli, A., & Siles- Lucas, M. (2018). Evaluation of the recombinant antigens B2t and 2B2t, compared with hydatid fluid, in IgG-ELISA and immunostrips for the diagnosis and follow up of CE patients. PLoS Neglected Tropical Diseases, 12(9). https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006741 Hernández-González, A., Santivañez, S., García, H. H., Rodríguez, S., Muñoz, S., Ramos, G., Orduña, A., & Siles-Lucas, M. (2012). Improved serodiagnosis of cystic echinococcosis using the new recombinant 2B2t antigen. PLoS Neglected Tropical Diseases, 6(7). https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001714 Herrador, Z., Siles-Lucas, M., Aparicio, P., Lopez-Velez, R., Gherasim, A., Garate, T., & Benito, A. (2016). Cystic Echinococcosis Epidemiology in Spain Based on Hospitalization Records, 1997-2012. PLoS Neglected Tropical Diseases, 10(8), e0004942. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004942 Herrick, J. A., Legrand, F., Gounoue, R., Nchinda, G., Montavon, C., Bopda, J., Tchana, S. M., Ondigui, B. E., Nguluwe, K., Fay, M. P., Makiya, M., Metenou, S., Nutman, T. B., Kamgno, J., & Klion, A. D. (2017). Posttreatment Reactions After Single-Dose Bibliografía 197 Diethylcarbamazine or Ivermectin in Subjects With Loa loa Infection. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America, 64(8), 1017-1025. https://doi.org/10.1093/cid/cix016 Iglesias, R., Leiro, J., Ubeira, F. M., Santamarina, M. T., Navarrete, I., & Sanmartín, M. L. (1996). Antigenic cross-reactivity in mice between third-stage larvae of Anisakis simplex and other nematodes. Parasitology Research, 82(4), 378-381. https://doi.org/10.1007/s004360050131 Instituto Nacional de Estatística (INE). (2019). Resultado do Censu Populacional 2017. Instituto Nacional de Estatística (INE) Mozambique. https://www.ine.gov.mz/senso-2017/- /document_library/pfpz/view/44367?_com_liferay_document_library_web_portlet_DL Portlet_INSTANCE_pfpz_redirect=http%3A%2F%2Flocalhost%3A8080%2Fsenso- 2017%3Fp_p_id%3Dcom_liferay_document_library_web_portlet_DLPortlet_INSTAN CE_pfpz%26p_p_lifecycle%3D0%26p_p_state%3Dnormal%26p_p_mode%3Dview International Helminth Genomes Consortium. (2019). Comparative genomics of the major parasitic worms. Nature Genetics, 51(1), 163-174. https://doi.org/10.1038/s41588-018- 0262-1 International Human Genome Sequencing Consortium. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 409(6822), 860-921. https://doi.org/10.1038/35057062 Ishida, M. M. I., Rubinsky-Elefant, G., Ferreira, A. W., Hoshino-Shimizu, S., & Vaz, A. J. (2003). Helminth antigens (Taenia solium, Taenia crassiceps, Toxocara canis, Schistosoma mansoni and Echinococcus granulosus) and cross-reactivities in human infections and immunized animals. Acta Tropica, 89(1), 73-84. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2003.09.005 Janwan, P., Intapan, P. M., Sadaow, L., Rodpai, R., Yamasaki, H., Boonroumkaew, P., Sanpool, O., Thanchomnang, T., Sadee, P., & Maleewong, W. (2021). Development of Immunochromatographic Test Kit for Rapid Detection of Specific IgG4 Antibody in Whole-Blood Samples for Diagnosis of Human Gnathostomiasis. Diagnostics (Basel, Switzerland), 11(5), 862. https://doi.org/10.3390/diagnostics11050862 Bibliografía 198 Janwan, P., Intapan, P. M., Sanpool, O., Sadaow, L., Thanchomnang, T., & Maleewong, W. (2011). Growth and development of Gnathostoma spinigerum (Nematoda: Gnathostomatidae) larvae in Mesocyclops aspericornis (Cyclopoida: Cyclopidae). Parasites & Vectors, 4, 93. https://doi.org/10.1186/1756-3305-4-93 Janwan, P., Intapan, P. M., Yamasaki, H., Laummaunwai, P., Sawanyawisuth, K., Wongkham, C., Tayapiwatana, C., Kitkhuandee, A., Lulitanond, V., Nawa, Y., & Maleewong, W. (2013). Application of Recombinant Gnathostoma spinigerum Matrix Metalloproteinase- Like Protein for Serodiagnosis of Human Gnathostomiasis by Immunoblotting. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 89(1), 63-67. https://doi.org/10.4269/ajtmh.12-0617 Janwan, P., Intapan, P. M., Yamasaki, H., Rodpai, R., Laummaunwai, P., Thanchomnang, T., Sanpool, O., Kobayashi, K., Takayama, K., Kobayashi, Y., & Maleewong, W. (2016). Development and usefulness of an immunochromatographic device to detect antibodies for rapid diagnosis of human gnathostomiasis. Parasites & Vectors, 9, 14. https://doi.org/10.1186/s13071-016-1294-y Ji, S., & Jw, N. (2018). The present and future of de novo whole-genome assembly. Briefings in Bioinformatics, 19(1). https://doi.org/10.1093/bib/bbw096 Jiménez, M., González, L., Bailo, B., Prieto, I., Iborra, A., Sima, A., Cano, J., Sánchez, I., & Gárate, T. (2009). A pilot study on the prevalence of loiasis in Equatorial Guinea using an accurate Nested PCR. Enfermedades Emergentes, 11, 16-21. Jiménez, M., González, L. M., Carranza, C., Bailo, B., Pérez-Ayala, A., Muro, A., Pérez-Arellano, J. L., & Gárate, T. (2011). Detection and discrimination of Loa loa, Mansonella perstans and Wuchereria bancrofti by PCR-RFLP and nested-PCR of ribosomal DNA ITS1 region. Experimental Parasitology, 127(1), 282-286. https://doi.org/10.1016/j.exppara.2010.06.019 Jiménez, S., Pérez, A., Gil, H., Schantz, P., Ramalle, E., & Juste, R. (2002). Progress in control of cystic echinococcosis in La Rioja, Spain: Decline in infection prevalences in human Bibliografía 199 and animal hosts and economic costs and benefits. Acta Tropica, 83(3), 213-221. https://doi.org/10.1016/s0001-706x(02)00091-8 Johnson, O., Giorgi, E., Fronterrè, C., Amoah, B., Atsame, J., Ella, S. N., Biamonte, M., Ogoussan, K., Hundley, L., Gass, K., & Diggle, P. J. (2022). Geostatistical modelling enables efficient safety assessment for mass drug administration with ivermectin in Loa loa endemic areas through a combined antibody and LoaScope testing strategy for elimination of onchocerciasis. PLoS Neglected Tropical Diseases, 16(2), e0010189. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010189 Jongthawin, J., Intapan, P. M., Sanpool, O., Sadaow, L., Janwan, P., Thanchomnang, T., Sangchan, A., Visaetsilpanonta, S., Keawkong, W., & Maleewong, W. (2015). Three Human Gnathostomiasis Cases in Thailand with Molecular Identification of Causative Parasite Species. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 93(3), 615- 618. https://doi.org/10.4269/ajtmh.15-0284 Kajitani, R., Toshimoto, K., Noguchi, H., Toyoda, A., Ogura, Y., Okuno, M., Yabana, M., Harada, M., Nagayasu, E., Maruyama, H., Kohara, Y., Fujiyama, A., Hayashi, T., & Itoh, T. (2014). Efficient de novo assembly of highly heterozygous genomes from whole- genome shotgun short reads. Genome Research, 24(8), 1384-1395. https://doi.org/10.1101/gr.170720.113 Karshima, S. N., Ahmed, M. I., Adamu, N. B., Magaji, A. A., Zakariah, M., & Mohammed, K. (2022). Africa-wide meta-analysis on the prevalence and distribution of human cystic echinococcosis and canine Echinococcus granulosus infections. Parasites & Vectors, 15(1), 357. https://doi.org/10.1186/s13071-022-05474-6 Katchanov, J., Sawanyawisuth, K., Chotmongkol, V., & Nawa, Y. (2011). Neurognathostomiasis, a Neglected Parasitosis of the Central Nervous System. Emerging Infectious Diseases Journal - CDC, 17(7). https://doi.org/10.3201/eid1707.101433 Katti, M. V., Ranjekar, P. K., & Gupta, V. S. (2001). Differential distribution of simple sequence repeats in eukaryotic genome sequences. Molecular Biology and Evolution, 18(7), 1161- 1167. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.molbev.a003903 Bibliografía 200 Kaunitz, J. D. (2015). The Discovery of PCR: ProCuRement of Divine Power. Digestive Diseases and Sciences, 60(8), 2230-2231. https://doi.org/10.1007/s10620-015-3747-0 Kaur, R., Arora, N., Rawat, S. S., Keshri, A. K., Sharma, S. R., Mishra, A., Singh, G., & Prasad, A. (2021). Vaccine for a neglected tropical disease Taenia solium cysticercosis: Fight for eradication against all odds. Expert Review of Vaccines, 20(11), 1447-1458. https://doi.org/10.1080/14760584.2021.1967750 Kern, P., Menezes da Silva, A., Akhan, O., Müllhaupt, B., Vizcaychipi, K. A., Budke, C., & Vuitton, D. A. (2017). The Echinococcoses: Diagnosis, Clinical Management and Burden of Disease. Advances in Parasitology, 96, 259-369. https://doi.org/10.1016/bs.apar.2016.09.006 Khamsai, S., Howe, K., & Sawanyawisuth, K. (2023). Clinical Characteristics of Long-Term Complications of Severe Rat Lung Worm Disease in Hawai’i: A Survey of 4 Cases. Hawai’i Journal of Health & Social Welfare, 82(5), 107-111. Khamsai, S., Sawanyawisuth, K., Senthong, V., Limpawattana, P., Chindaprasirt, J., Maleewong, W., Tiamkao, S., & Chotmongkol, V. (2021). Predictive models for Angiostrongylus cantonensis and Gnathostoma spinigerum infection in pathologically or serologically proved eosinophilic meningitis. American Journal of Translational Research, 13(9), 10413-10420. Khumbatta, M., Firozgary, B., Tweardy, D. J., Weinstock, J., Firozgary, G., Bhatena, Z., Bulsara, T., Siller, R., & Robinson, P. (2014). Somatostatin negatively regulates parasite burden and granulomatous responses in cysticercosis. BioMed Research International, 2014, 247182. https://doi.org/10.1155/2014/247182 Kittur, N., King, C. H., Campbell, C. H., Kinung’hi, S., Mwinzi, P. N. M., Karanja, D. M. S., N’Goran, E. K., Phillips, A. E., Gazzinelli-Guimaraes, P. H., Olsen, A., Magnussen, P., Secor, W. E., Montgomery, S. P., Utzinger, J., Walker, J. W., Binder, S., & Colley, D. G. (2019). Persistent Hotspots in Schistosomiasis Consortium for Operational Research and Evaluation Studies for Gaining and Sustaining Control of Schistosomiasis after Four Bibliografía 201 Years of Mass Drug Administration of Praziquantel. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 101(3), 617-627. https://doi.org/10.4269/ajtmh.19-0193 Klion, A. D., Vijaykumar, A., Oei, T., Martin, B., & Nutman, T. B. (2003). Serum immunoglobulin G4 antibodies to the recombinant antigen, Ll-SXP-1, are highly specific for Loa loa infection. The Journal of Infectious Diseases, 187(1), 128-133. https://doi.org/10.1086/345873 Knott, J. (1939). A method for making microfilarial surveys on day blood. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 33(2), 191-196. https://doi.org/10.1016/S0035-9203(39)90101-X Kolmogorov, M., Yuan, J., Lin, Y., & Pevzner, P. A. (2019). Assembly of long, error-prone reads using repeat graphs. Nature Biotechnology, 37(5), 540-546. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0072-8 Langa, I., Padama, F., Nhancupe, N., Pondja, A., Hlashwayo, D., Gouveia, L., Stelzle, D., da Costa, C. P., Schmidt, V., Winkler, A. S., & Noormahomed, E. V. (2022). The burden of T. solium cysticercosis and selected neuropsychiatric disorders in Mocuba district, Zambézia province, Mozambique. PLoS Neglected Tropical Diseases, 16(7), e0010606. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010606 Langmead, B., & Salzberg, S. L. (2012). Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods, 9(4), 357-359. https://doi.org/10.1038/nmeth.1923 Larrieu, E., Gavidia, C. M., & Lightowlers, M. W. (2019). Control of cystic echinococcosis: Background and prospects. Zoonoses and Public Health, 66(8), 889-899. https://doi.org/10.1111/zph.12649 Laummaunwai, P., Intapan, P. M., Wongkham, C., Lulitanond, V., Tayapiwatana, C., & Maleewong, W. (2010). Gnathostoma spinigerum: Molecular cloning, expression and characterization of the cyclophilin protein. Experimental Parasitology, 126(4), 611-616. https://doi.org/10.1016/j.exppara.2010.06.004 Laummaunwai, P., Sawanyawisuth, K., Intapan, P. M., Chotmongkol, V., Wongkham, C., & Maleewong, W. (2007). Evaluation of human IgG class and subclass antibodies to a 24 Bibliografía 202 kDa antigenic component of Gnathostoma spinigerum for the serodiagnosis of gnathostomiasis. Parasitology Research, 101(3), 703-708. https://doi.org/10.1007/s00436-007-0538-3 Li, H., Handsaker, B., Wysoker, A., Fennell, T., Ruan, J., Homer, N., Marth, G., Abecasis, G., Durbin, R., & 1000 Genome Project Data Processing Subgroup. (2009). The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics (Oxford, England), 25(16), 2078- 2079. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp352 Liance, M., Janin, V., Bresson-Hadni, S., Vuitton, D. A., Houin, R., & Piarroux, R. (2000). Immunodiagnosis of Echinococcus infections: Confirmatory testing and species differentiation by a new commercial Western Blot. Journal of Clinical Microbiology, 38(10), 3718-3721. https://doi.org/10.1128/jcm.38.10.3718-3721.2000 Lightowlers, M. W. (2013). Cysticercosis and echinococcosis. Current Topics in Microbiology and Immunology, 365, 315-335. https://doi.org/10.1007/82_2012_234 Liu, G.-H., Shao, R., Cai, X.-Q., Li, W.-W., & Zhu, X.-Q. (2015). Gnathostoma spinigerum Mitochondrial Genome Sequence: A Novel Gene Arrangement and its Phylogenetic Position within the Class Chromadorea. Scientific Reports, 5, 12691. https://doi.org/10.1038/srep12691 Liu, G.-H., Sun, M.-M., Elsheikha, H. M., Fu, Y.-T., Sugiyama, H., Ando, K., Sohn, W.-M., Zhu, X.-Q., & Yao, C. (2020). Human gnathostomiasis: A neglected food-borne zoonosis. Parasites & Vectors, 13. https://doi.org/10.1186/s13071-020-04494-4 Liu, J., Tao, J., Chen, W., Wang, T., Chen, X., Shen, M., Ou, Q., Zhang, Y., Ding, Y., Wu, J., Cheng, X., Lu, G., & Yan, G. (2022). The application of metagenomic next-generation sequencing for Angiostrongylus eosinophilic meningitis in a pediatric patient: A case report. Frontiers in Public Health, 10, 1003013. https://doi.org/10.3389/fpubh.2022.1003013 Loman, N. J., Quick, J., & Simpson, J. T. (2015). A complete bacterial genome assembled de novo using only nanopore sequencing data. Nature Methods, 12(8), 733-735. https://doi.org/10.1038/nmeth.3444 Bibliografía 203 Lopez-Bernus, A., Belhassen-García, M., Carpio-Perez, A., Perez Del Villar, L., Romero-Alegria, A., Velasco-Tirado, V., Muro, A., Pardo-Lledias, J., Cordero-Sánchez, M., & Alonso- Sardón, M. (2015). Is cystic echinoccocosis re-emerging in western Spain? Epidemiology and Infection, 143(15), 3351-3357. https://doi.org/10.1017/S0950268815000618 Lu, H., Giordano, F., & Ning, Z. (2016). Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 14(5), 265-279. https://doi.org/10.1016/j.gpb.2016.05.004 Luo, R., Liu, B., Xie, Y., Li, Z., Huang, W., Yuan, J., He, G., Chen, Y., Pan, Q., Liu, Y., Tang, J., Wu, G., Zhang, H., Shi, Y., Liu, Y., Yu, C., Wang, B., Lu, Y., Han, C., … Wang, J. (2012). SOAPdenovo2: An empirically improved memory-efficient short-read de novo assembler. GigaScience, 1(1), 18. https://doi.org/10.1186/2047-217X-1-18 Lupi, O., Downing, C., Lee, M., Pino, L., Bravo, F., Giglio, P., Sethi, A., Klaus, S., Sangueza, O. P., Fuller, C., Mendoza, N., Ladizinski, B., Woc-Colburn, L., & Tyring, S. K. (2015). Mucocutaneous manifestations of helminth infections: Nematodes. Journal of the American Academy of Dermatology, 73(6), 929-944; quiz 945-946. https://doi.org/10.1016/j.jaad.2014.11.034 Mackerras, M. J., & Sandars, D. F. (1954). Life-history of the Rat Lung-worm and its Migration through the Brain of its Host. Nature, 173(4411), Article 4411. https://doi.org/10.1038/173956a0 Maek-A-Nantawat, W., Bussaratid, V., Phonrat, B., Pakdee, W., Nuamtanong, S., & Dekumyoy, P. (2014). Diagnosis of gnathostomiasis by skin testing using partially purified specific antigen and total IgE levels. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 108(2), 71-76. https://doi.org/10.1093/trstmh/trt118 Maksimov, P., Bergmann, H., Wassermann, M., Romig, T., Gottstein, B., Casulli, A., & Conraths, F. J. (2020). Species Detection within the Echinococcus granulosus sensu lato Complex by Novel Probe-Based Real-Time PCRs. Pathogens, 9(10), 791. https://doi.org/10.3390/pathogens9100791 Bibliografía 204 Maleewong, W., Morakote, N., Thamasonthi, W., Charuchinda, K., Tesana, S., & Khamboonruang, C. (1988). Serodiagnosis of human gnathostomiasis. The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health, 19(2), 201-205. Manson, P. (1891). The filaria sanguinis hominis major and minor, two new species of hæmatozoa. The Lancet, 137(3514), 4-8. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(02)15666- 2 Marçais, G., & Kingsford, C. (2011). A fast, lock-free approach for efficient parallel counting of occurrences of k-mers. Bioinformatics (Oxford, England), 27(6), 764-770. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr011 Marcelo Gálvez, M. (2013). Algunos hitos históricos en el desarrollo del diagnóstico médico por imágenes. Revista Médica Clínica Las Condes, 24(1), 5-13. https://doi.org/10.1016/S0716-8640(13)70123-8 Mariconti, M., Bazzocchi, C., Tamarozzi, F., Meroni, V., Genco, F., Maserati, R., & Brunetti, E. (2014). Immunoblotting with human native antigen shows stage-related sensitivity in the serodiagnosis of hepatic cystic echinococcosis. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 90(1), 75-79. https://doi.org/10.4269/ajtmh.13-0341 Martin-Alonso, A., Abreu-Yanes, E., Feliu, C., Mas-Coma, S., Bargues, M. D., Valladares, B., & Foronda, P. (2015). Intermediate hosts of Angiostrongylus cantonensis in Tenerife, Spain. PloS One, 10(3), e0120686. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0120686 Maxam, A. M., & Gilbert, W. (1977). A new method for sequencing DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74(2), 560-564. https://doi.org/10.1073/pnas.74.2.560 McVeigh, P. (2020). Post-genomic progress in helminth parasitology. Parasitology, 147(8), 835- 840. https://doi.org/10.1017/S0031182020000591 Melki, J., Koffi, E., Boka, M., Touré, A., Soumahoro, M.-K., & Jambou, R. (2018). Taenia solium cysticercosis in West Africa: Status update. Parasite (Paris, France), 25, 49. https://doi.org/10.1051/parasite/2018048 Bibliografía 205 Melo, L. C. V. de, Souza, F. C. R. de, Baccin, A. de O., Mota, D. J. G. da, Pereira-Chioccola, V. L., & Pinto, P. L. S. (2022). Immunoanalysis of different antigenic preparations of Angiostrongylus cantonensis for neuroangiostrongyliasis diagnosis improvement. Memorias Do Instituto Oswaldo Cruz, 117, e220086. https://doi.org/10.1590/0074- 02760220086 Melrose, W. D., Turner, P. F., Pisters, P., & Turner, B. (2000). An improved Knott’s concentration test for the detection of microfilariae. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 94(2), 176. https://doi.org/10.1016/s0035-9203(00)90266-9 Metzger, W. G., & Mordmüller, B. (2014a). Loa loa-does it deserve to be neglected? The Lancet. Infectious Diseases, 14(4), 353-357. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(13)70263-9 Metzger, W. G., & Mordmüller, B. (2014b). Loa loa-does it deserve to be neglected? The Lancet. Infectious Diseases, 14(4), 353-357. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(13)70263-9 Miller, D. E., Staber, C., Zeitlinger, J., & Hawley, R. S. (2018). Highly Contiguous Genome Assemblies of 15 Drosophila Species Generated Using Nanopore Sequencing. G3 (Bethesda, Md.), 8(10), 3131-3141. https://doi.org/10.1534/g3.118.200160 Montenegro, T., Gilman, R. H., Castillo, R., Tsang, V., Brandt, J., Guevara, A., Sanabria, H., Verastegui, M., Sterling, C., & Miranda, E. (1994). The diagnostic importance of species specific and cross-reactive components of Taenia solium, Echinococcus granulosus, and Hymenolepis nana. Revista Do Instituto De Medicina Tropical De Sao Paulo, 36(4), 327- 334. https://doi.org/10.1590/s0036-46651994000400005 Morassutti, A. L., Levert, K., Perelygin, A., da Silva, A. J., Wilkins, P., & Graeff-Teixeira, C. (2012). The 31-kDa antigen of Angiostrongylus cantonensis comprises distinct antigenic glycoproteins. Vector Borne and Zoonotic Diseases (Larchmont, N.Y.), 12(11), 961-968. https://doi.org/10.1089/vbz.2011.0957 Morassutti, A. L., Rascoe, L. N., Handali, S., DA Silva, A. J., Wilkins, P. P., & Graeff-Teixeira, C. (2017). Cross-reactivity of the 31 kDa antigen of Angiostrongylus cantonensis— Dealing with the immunodiagnosis of meningoencephalitis. Parasitology, 144(4), 459- 463. https://doi.org/10.1017/S0031182016001918 Bibliografía 206 Morgan, C., Bowling, M., Bartram, J., & Lyn Kayser, G. (2017). Water, sanitation, and hygiene in schools: Status and implications of low coverage in Ethiopia, Kenya, Mozambique, Rwanda, Uganda, and Zambia. International Journal of Hygiene and Environmental Health, 220(6), 950-959. https://doi.org/10.1016/j.ijheh.2017.03.015 Morse, S. S. (1995). Factors in the emergence of infectious diseases. Emerging Infectious Diseases, 1(1), 7-15. https://doi.org/10.3201/eid0101.950102 Moss, D. M., Handali, S., Chard, A. N., Trinies, V., Bullard, S., Wiegand, R. E., Doumbia, S., Freeman, M. C., & Lammie, P. J. (2018). Detection of immunoglobulin G antibodies to Taenia solium cysticercosis antigen glutathione-s-Transferase–rT24H in Malian children using multiplex bead assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 98(5), 1408-1412. https://doi.org/10.4269/ajtmh.17-0310 Murphy, G. S., & Johnson, S. (2013). Clinical Aspects of Eosinophilic Meningitis and Meningoencephalitis caused by Angiostrongylus cantonensis, the Rat Lungworm. Hawai’i Journal of Medicine & Public Health, 72(6 Suppl 2), 35-40. Ndzeshang, L. B., Fombad, F. F., Njouendou, A. J., Chunda, V. C., Gandjui, N. V. T., Akumtoh, D. N., Chounna, P. W. N., Steven, A., Pionnier, N. P., Layland, L. E., Ritter, M., Hoerauf, A., Taylor, M. J., Turner, J. D., & Wanji, S. (2020). Generation of Loa loa infective larvae by experimental infection of the vector, Chrysops silacea. PLoS Neglected Tropical Diseases, 14(8), e0008415. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0008415 Nithiuthai, S., Anantaphruti, M. T., Waikagul, J., & Gajadhar, A. (2004). Waterborne zoonotic helminthiases. Veterinary Parasitology, 126(1-2), 167-193. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2004.09.018 Noormahomed, E. V., Nhacupe, N., Mascaró-Lazcano, C., Mauaie, M. N., Buene, T., Funzamo, C. A., & Benson, C. A. (2014). A Cross-sectional Serological Study of Cysticercosis, Schistosomiasis, Toxocariasis and Echinococcosis in HIV-1 Infected People in Beira, Mozambique. PLoS Neglected Tropical Diseases, 8(9), e3121. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0003121 Bibliografía 207 Nuamtanong, S. (1996). The evaluation of the 29 and 31 kDa antigens in female Angiostrongylus cantonensis for serodiagnosis of human angiostrongyliasis. The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health, 27(2), 291-296. Nuamtanong, S., Reamtong, O., Phuphisut, O., Chotsiri, P., Malaithong, P., Dekumyoy, P., & Adisakwattana, P. (2019). Transcriptome and excretory-secretory proteome of infective- stage larvae of the nematode Gnathostoma spinigerum reveal potential immunodiagnostic targets for development. Parasite (Paris, France), 26, 34. https://doi.org/10.1051/parasite/2019033 Nuchprayoon, S., Junpee, A., Poovorawan, Y., & Scott, A. L. (2005). Detection and differentiation of filarial parasites by universal primers and polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism analysis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 73(5), 895-900. O’Connell, E. M., Harrison, S., Dahlstrom, E., Nash, T., & Nutman, T. B. (2020a). A Novel, Highly Sensitive Quantitative Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Subarachnoid and Ventricular Neurocysticercosis and for Assessing Responses to Treatment. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America, 70(9), 1875-1881. https://doi.org/10.1093/cid/ciz541 O’Connell, E. M., Harrison, S., Dahlstrom, E., Nash, T., & Nutman, T. B. (2020b). A Novel, Highly Sensitive Quantitative Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Subarachnoid and Ventricular Neurocysticercosis and for Assessing Responses to Treatment. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America, 70(9), 1875-1881. https://doi.org/10.1093/cid/ciz541 Ohiolei, J. A., Yan, H.-B., Li, L., Zhu, G.-Q., Muku, R. J., Wu, Y.-T., & Jia, W.-Z. (2020). Review of Cystic Echinococcosis in Nigeria: A Story of Neglect. Acta Parasitologica, 65(1), 1- 10. https://doi.org/10.2478/s11686-019-00124-x Ondov, B. D., Bergman, N. H., & Phillippy, A. M. (2011). Interactive metagenomic visualization in a Web browser. BMC Bioinformatics, 12, 385. https://doi.org/10.1186/1471-2105-12- 385 Bibliografía 208 Ouma, E., Dione, M., Mtimet, N., Lule, P., Colston, A., Adediran, S., & Grace, D. (2021). Demand for Taenia solium Cysticercosis Vaccine: Lessons and Insights From the Pig Production and Trading Nodes of the Uganda Pig Value Chain. Frontiers in Veterinary Science, 8, 611166. https://doi.org/10.3389/fvets.2021.611166 Padgett, J. J., & Jacobsen, K. H. (2008). Loiasis: African eye worm. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 102(10), 983-989. https://doi.org/10.1016/j.trstmh.2008.03.022 Pedram, B., Pasquetto, V., Drame, P. M., Ji, Y., Gonzalez-Moa, M. J., Baldwin, R. K., Nutman, T. B., & Biamonte, M. A. (2017). A novel rapid test for detecting antibody responses to Loa loa infections. PLoS Neglected Tropical Diseases, 11(7), e0005741. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005741 Pevzner, P. A., Tang, H., & Waterman, M. S. (2001). An Eulerian path approach to DNA fragment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98(17), 9748-9753. https://doi.org/10.1073/pnas.171285098 Pinder, M., Dupont, A., & Egwang, T. G. (1988). Identification of a surface antigen on Loa loa microfilariae the recognition of which correlates with the amicrofilaremic state in man. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950), 141(7), 2480-2486. Plucinski, M. M., Candrinho, B., Chambe, G., Muchanga, J., Muguande, O., Matsinhe, G., Mathe, G., Rogier, E., Doyle, T., Zulliger, R., Colborn, J., Saifodine, A., Lammie, P., & Priest, J. W. (2018). Multiplex serology for impact evaluation of bed net distribution on burden of lymphatic filariasis and four species of human malaria in northern Mozambique. PLoS Neglected Tropical Diseases, 12(2), e0006278. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006278 Poole, C. B., Ettwiller, L., Tanner, N. A., Evans, T. C., Wanji, S., & Carlow, C. K. S. (2015). Genome Filtering for New DNA Biomarkers of Loa loa Infection Suitable for Loop- Mediated Isothermal Amplification. PloS One, 10(9), e0139286. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139286 Prats, G. (2012). Microbioloía y parasitología médicas (1a). Médica Paramericana, DL. Bibliografía 209 Pravettoni, V., Primavesi, L., & Piantanida, M. (2012). Anisakis simplex: Current knowledge. European Annals of Allergy and Clinical Immunology, 44(4), 150-156. Priest, J. W., & Handali, S. (2021). Multiplex Bead Assay for the Detection of Human IgG Antibody Responses to African Trypanosomes. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 105(5), 1193-1197. https://doi.org/10.4269/ajtmh.21-0479 Prjibelski, A., Antipov, D., Meleshko, D., Lapidus, A., & Korobeynikov, A. (2020). Using SPAdes De Novo Assembler. Current Protocols in Bioinformatics, 70(1), e102. https://doi.org/10.1002/cpbi.102 Proaño-Narvaez, J. V., Meza-Lucas, A., Mata-Ruiz, O., García-Jerónimo, R. C., & Correa, D. (2002). Laboratory diagnosis of human neurocysticercosis: Double-blind comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and electroimmunotransfer blot assay. Journal of Clinical Microbiology, 40(6), 2115-2118. https://doi.org/10.1128/JCM.40.6.2115- 2118.2002 Puente, P., Anadón, A. M., Rodero, M., Romarís, F., Ubeira, F. M., & Cuéllar, C. (2008). Anisakis simplex: The high prevalence in Madrid (Spain) and its relation with fish consumption. Experimental Parasitology, 118(2), 271-274. https://doi.org/10.1016/j.exppara.2007.07.002 Puente, S., Ramírez-Olivencia, G., Lago, M., Subirats, M., Bru, F., Pérez-Blazquez, E., Arsuaga, M., de Guevara, C. L., de la Calle-Prieto, F., Vicente, B., Alonso-Sardón, M., Belhassen- Garcia, M., & Muro, A. (2020). Loiasis in sub-Saharan migrants living in Spain with emphasis of cases from Equatorial Guinea. Infectious Diseases of Poverty, 9(1), 16. https://doi.org/10.1186/s40249-020-0627-4 Qvarnstrom, Y., Xayavong, M., da Silva, A. C. A., Park, S. Y., Whelen, A. C., Calimlim, P. S., Sciulli, R. H., Honda, S. A. A., Higa, K., Kitsutani, P., Chea, N., Heng, S., Johnson, S., Graeff-Teixeira, C., Fox, L. M., & da Silva, A. J. (2016). Real-Time Polymerase Chain Reaction Detection of Angiostrongylus cantonensis DNA in Cerebrospinal Fluid from Patients with Eosinophilic Meningitis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 94(1), 176-181. https://doi.org/10.4269/ajtmh.15-0146 Bibliografía 210 Raibagkar, P., & Berkowitz, A. L. (2018). The Many Faces of Neurocysticercosis. Journal of the Neurological Sciences, 390, 75-76. https://doi.org/10.1016/j.jns.2018.04.018 Rajshekhar, V. (2018). Evolution of concepts in the management of cysticercosis of the brain: Then (1970) and now (2018). Neurology India, 66(4), 919-927. https://doi.org/10.4103/0028-3886.236969 Rodríguez Pérez, Elba. G. (2013). Parasitología médica (1a). El Manual Moderno. Rodriguez, S., Dorny, P., Tsang, V. C. W., Pretell, E. J., Brandt, J., Lescano, A. G., Gonzalez, A. E., Gilman, R. H., Garcia, H. H., & Cysticercosis Working Group in Peru. (2009). Detection of Taenia solium antigens and anti-T. solium antibodies in paired serum and cerebrospinal fluid samples from patients with intraparenchymal or extraparenchymal neurocysticercosis. The Journal of Infectious Diseases, 199(9), 1345-1352. https://doi.org/10.1086/597757 Rogier, E., Van Den Hoogen, L., Herman, C., Gurrala, K., Joseph, V., Stresman, G., Presume, J., Romilus, I., Mondelus, G., Elisme, T., Ashton, R., Chang, M., Lemoine, J. F., Druetz, T., Eisele, T. P., Existe, A., Boncy, J., Drakeley, C., & Udhayakumar, V. (2019). High- throughput malaria serosurveillance using a one-step multiplex bead assay. Malaria Journal, 18(1), 1-10. https://doi.org/10.1186/s12936-019-3027-0 Rosen, L., Chappell, R., Laqueur, G. L., Wallace, G. D., & Weinstein, P. P. (1962). Eosinophilic meningoencephalitis caused by a metastrongylid lung-worm of rats. JAMA, 179, 620- 624. https://doi.org/10.1001/jama.1962.03050080032007 Rosenblatt, J. E. (2009). Laboratory diagnosis of infections due to blood and tissue parasites. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America, 49(7), 1103-1108. https://doi.org/10.1086/605574 Rott, M. B., Fernández, V., Farias, S., Ceni, J., Ferreira, H. B., Haag, K. L., & Zaha, A. (2000). Comparative analysis of two different subunits of antigen B from Echinococcus granulosus: Gene sequences, expression in Escherichia coli and serological evaluation. Acta Tropica, 75(3), 331-340. https://doi.org/10.1016/s0001-706x(00)00069-3 Bibliografía 211 Salazar Schettino, P. M., & Cabrera Bravo, M. (2014). Capítulo 21. Hidatidosis. En Parasitología médica (pp. 187-210). McGraw-Hill. Sánchez-Ovejero, C., Akdur, E., Manzano-Román, R., Hernández-González, A., González- Sánchez, M., Becerro-Recio, D., González-Miguel, J., Akhan, O., Cretu, C. M., Vutova, K., Tamarozzi, F., Mariconti, M., Brunetti, E., Vola, A., Fabiani, M., Casulli, A., & Siles- Lucas, M. (2020). Evaluation of the sensitivity and specificity of GST-tagged recombinant antigens 2B2t, Ag5t and DIPOL in ELISA for the diagnosis and follow up of patients with cystic echinococcosis. PLoS Neglected Tropical Diseases, 14(11), e0008892. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0008892 Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74(12), 5463-5467. https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5463 Santivanez, S., & Garcia, H. H. (2010). Pulmonary cystic echinococcosis. Current Opinion in Pulmonary Medicine, 16(3), 257-261. https://doi.org/10.1097/MCP.0b013e3283386282 Sawanyawisuth, K., & Chotmongkol, V. (2013). Eosinophilic meningitis. Handbook of Clinical Neurology, 114, 207-215. https://doi.org/10.1016/B978-0-444-53490-3.00015-7 Schoch, C. L., Ciufo, S., Domrachev, M., Hotton, C. L., Kannan, S., Khovanskaya, R., Leipe, D., Mcveigh, R., O’Neill, K., Robbertse, B., Sharma, S., Soussov, V., Sullivan, J. P., Sun, L., Turner, S., & Karsch-Mizrachi, I. (2020). NCBI Taxonomy: A comprehensive update on curation, resources and tools. Database: The Journal of Biological Databases and Curation, 2020. https://doi.org/10.1093/database/baaa062 Sears, W. J., Qvarnstrom, Y., Dahlstrom, E., Snook, K., Kaluna, L., Baláž, V., Feckova, B., Šlapeta, J., Modry, D., Jarvi, S., & Nutman, T. B. (2021). AcanR3990 qPCR: A Novel, Highly Sensitive, Bioinformatically-Informed Assay to Detect Angiostrongylus cantonensis Infections. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America, 73(7), e1594-e1600. https://doi.org/10.1093/cid/ciaa1791 Bibliografía 212 Seesao, Y., Audebert, C., Verrez-Bagnis, V., Merlin, S., Jérôme, M., Viscogliosi, E., Dei-Cas, E., Aliouat-Denis, C. M., & Gay, M. (2014). Monitoring of four DNA extraction methods upstream of high-throughput sequencing of Anisakidae nematodes. Journal of Microbiological Methods, 102, 69-72. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2014.05.004 Segeritz, L., Cardona, A., Taubert, A., Hermosilla, C., & Ruiz, A. (2021). Autochthonous Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus vasorum and Aelurostrongylus abstrusus infections in native terrestrial gastropods from the Macaronesian Archipelago of Spain. Parasitology Research, 120(7), 2671-2680. https://doi.org/10.1007/s00436-021-07203-x Siles-Lucas, M., Casulli, A., Conraths, F. J., & Müller, N. (2017). Laboratory Diagnosis of Echinococcus spp. In Human Patients and Infected Animals. Advances in Parasitology, 96, 159-257. https://doi.org/10.1016/bs.apar.2016.09.003 Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., & Zdobnov, E. M. (2015). BUSCO: Assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics (Oxford, England), 31(19), 3210-3212. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btv351 Simpson, J. T., & Durbin, R. (2012). Efficient de novo assembly of large genomes using compressed data structures. Genome Research, 22(3), 549-556. https://doi.org/10.1101/gr.126953.111 Simpson, J. T., Wong, K., Jackman, S. D., Schein, J. E., Jones, S. J. M., & Birol, İ. (2009). ABySS: A parallel assembler for short read sequence data. Genome Research, 19(6), 1117-1123. https://doi.org/10.1101/gr.089532.108 Singhi, P., Malhi, P., Suthar, R., Deo, B., & Khandelwal, N. K. (2018). Long-term Cognitive Outcome of Children With Parenchymal Neurocysticercosis: A Prospective Observation Study. Journal of Child Neurology, 33(7), 468-473. https://doi.org/10.1177/0883073818766985 Slatko, B. E., Gardner, A. F., & Ausubel, F. M. (2018a). Overview of Next Generation Sequencing Technologies. Current protocols in molecular biology, 122(1), e59. https://doi.org/10.1002/cpmb.59 Bibliografía 213 Slatko, B. E., Gardner, A. F., & Ausubel, F. M. (2018b). Overview of Next-Generation Sequencing Technologies. Current Protocols in Molecular Biology, 122(1), e59. https://doi.org/10.1002/cpmb.59 Slom, T. J., Cortese, M. M., Gerber, S. I., Jones, R. C., Holtz, T. H., Lopez, A. S., Zambrano, C. H., Sufit, R. L., Sakolvaree, Y., Chaicumpa, W., Herwaldt, B. L., & Johnson, S. (2002). An outbreak of eosinophilic meningitis caused by Angiostrongylus cantonensis in travelers returning from the Caribbean. The New England Journal of Medicine, 346(9), 668-675. https://doi.org/10.1056/NEJMoa012462 Sohn, W.-M., Jung, B.-K., Hong, S., Ryoo, S., Lee, K. H., Khieu, V., & Chai, J.-Y. (2021). Detection of Gnathostoma spinigerum Advanced 3rd-Stage Larvae in the Chinese Edible Frog, Hoplobatrachus rugulosus, from Local Markets in Phnom Penh, Cambodia. The Korean Journal of Parasitology, 59(5), 519-522. https://doi.org/10.3347/kjp.2021.59.5.519 Somboonpatarakun, C., Intapan, P. M., Sadaow, L., Rodpai, R., Sanpool, O., & Maleewong, W. (2020). Development of an immunochromatographic device to detect antibodies for rapid diagnosis of human angiostrongyliasis. Parasitology, 147(2), 194-198. https://doi.org/10.1017/S0031182019001495 Somboonpatarakun, C., Intapan, P. M., Sanpool, O., Wongkham, C., & Maleewong, W. (2019). Application of Recombinant Angiostrongylus cantonensis Galectin-2 Protein for Serodiagnosis of Human Angiostrongyliasis by Immunoblotting. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 101(4), 851-858. https://doi.org/10.4269/ajtmh.19- 0208 Spallone, A., Woroch, L., Sweeney, K., Seidman, R., & Marcos, L. A. (2020). The Burden of Neurocysticercosis at a Single New York Hospital. Journal of Pathogens, 2020, 8174240. https://doi.org/10.1155/2020/8174240 Stewart, B. T., Jacob, J., Finn, T., Lado, M., Napoleon, R., Brooker, S., Sidhu, P. S., & Kolaczinski, J. (2013). Cystic echinococcosis in Mundari tribe-members of South Sudan. Bibliografía 214 Pathogens and Global Health, 107(6), 293-298. https://doi.org/10.1179/2047773213Y.0000000111 Stockdale-Walden, H. D., Slapcinsky, J., Qvarnstrom, Y., McIntosh, A., Bishop, H. S., & Rosseland, B. (2015). Angiostrongylus cantonensis in Introduced Gastropods in Southern Florida. The Journal of Parasitology, 101(2), 156-159. https://doi.org/10.1645/14-553.1 Swat, S., Laskowski, A., Badura, J., Frohmberg, W., Wojciechowski, P., Swiercz, A., Kasprzak, M., & Blazewicz, J. (2021). Genome-scale de novo assembly using ALGA. Bioinformatics, 37(12), 1644-1651. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btab005 Ta, T.-H., Moya, L., Nguema, J., Aparicio, P., Miguel-Oteo, M., Cenzual, G., Canorea, I., Lanza, M., Benito, A., Crainey, J. L., & Rubio, J. M. (2018). Geographical distribution and species identification of human filariasis and onchocerciasis in Bioko Island, Equatorial Guinea. Acta Tropica, 180, 12-17. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2017.12.030 Tadesse Boltena, M., El-Khatib, Z., Kebede, A. S., Asamoah, B. O., Yaw, A. S. C., Kamara, K., Constant Assogba, P., Tadesse Boltena, A., Adane, H. T., Hailemeskel, E., & Biru, M. (2022). Malaria and Helminthic Co-Infection during Pregnancy in Sub-Saharan Africa: A Systematic Review and Meta-Analysis. International Journal of Environmental Research and Public Health, 19(9), 5444. https://doi.org/10.3390/ijerph19095444 Tamarozzi, F., Silva, R., Fittipaldo, V. A., Buonfrate, D., Gottstein, B., & Siles-Lucas, M. (2021). Serology for the diagnosis of human hepatic cystic echinococcosis and its relation with cyst staging: A systematic review of the literature with meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases, 15(4), e0009370. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009370 Tanigawa, C., Fujii, Y., Miura, M., Nzou, S. M., Mwangi, A. W., Nagi, S., Hamano, S., Njenga, S. M., Mbanefo, E. C., Hirayama, K., Mwau, M., & Kaneko, S. (2015). Species-Specific Serological Detection for Schistosomiasis by Serine Protease Inhibitor (SERPIN) in Multiplex Assay. PLoS Neglected Tropical Diseases, 9(8), e0004021. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004021 Tapchaisri, P., Nopparatana, C., Chaicumpa, W., & Setasuban, P. (1991). Specific antigen of Gnathostoma spinigerum for immunodiagnosis of human gnathostomiasis. International Bibliografía 215 Journal for Parasitology, 21(3), 315-319. https://doi.org/10.1016/0020-7519(91)90033- 4 Tappe, D., Grüner, B., Kern, P., & Frosch, M. (2009). Banding pattern indicative of echinococcosis in a commercial cysticercosis Western blot. European Journal of Medical Research, 14(10), 451-452. https://doi.org/10.1186/2047-783x-14-10-451 Ta-Tang, T.-H., Berzosa, P., Rubio, J. M., Romay-Barja, M., Ncogo, P., Agudo, D., Herrador, Z., Cerrada-Gálvez, L., & Benito, A. (2022). Evaluation of LAMP for the diagnosis of Loa loa infection in dried blood spots compared to PCR-based assays and microscopy. Memorias Do Instituto Oswaldo Cruz, 116, e210210. https://doi.org/10.1590/0074- 02760210210 Teem, J. L., Qvarnstrom, Y., Bishop, H. S., da Silva, A. J., Carter, J., White-McLean, J., & Smith, T. (2013). The occurrence of the rat lungworm, Angiostrongylus cantonensis, in nonindigenous snails in the Gulf of Mexico region of the United States. Hawai’i Journal of Medicine & Public Health: A Journal of Asia Pacific Medicine & Public Health, 72(6 Suppl 2), 11-14. Teerasukjinda, O., Wongjittraporn, S., Tongma, C., & Chung, H. (2016). Asymptomatic Giant Intraventricular Cysticercosis: A Case Report. Hawai’i Journal of Medicine & Public Health, 75(7), 187-189. Thiangtrongjit, T., Nogrado, K., Ketboonlue, T., Malaitong, P., Adisakwattana, P., & Reamtong, O. (2021). Proteomics of Gnathostomiasis: A Way Forward for Diagnosis and Treatment Development. Pathogens, 10(9), 1080. https://doi.org/10.3390/pathogens10091080 Thiengo, S. C., de Oliveira Simões, R., Fernandez, M. A., & Júnior, A. M. (2013). Angiostrongylus cantonensis and Rat Lungworm Disease in Brazil. Hawai’i Journal of Medicine & Public Health, 72(6 Suppl 2), 18-22. Thiengo, S. C., Maldonado, A., Mota, E. M., Torres, E. J. L., Caldeira, R., Carvalho, O. S., Oliveira, A. P. M., Simões, R. O., Fernandez, M. A., & Lanfredi, R. M. (2010). The giant African snail Achatina fulica as natural intermediate host of Angiostrongylus cantonensis Bibliografía 216 in Pernambuco, northeast Brazil. Acta Tropica, 115(3), 194-199. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2010.01.005 Torgerson, P. R., & Deplazes, P. (2009). Echinococcosis: Diagnosis and diagnostic interpretation in population studies. Trends in Parasitology, 25(4), 164-170. https://doi.org/10.1016/j.pt.2008.12.008 Toure, F. S., Egwang, T. G., Wahl, G., Millet, P., Bain, O., & Georges, A. J. (1997). Species- specific sequence in the repeat 3 region of the gene encoding a putative Loa loa allergen: A diagnostic tool for occult loiasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 56(1), 57-60. https://doi.org/10.4269/ajtmh.1997.56.57 Trevisan, C., Sotiraki, S., Laranjo-González, M., Dermauw, V., Wang, Z., Kärssin, A., Cvetkovikj, A., Winkler, A. S., Abraham, A., Bobić, B., Lassen, B., Cretu, C. M., Vasile, C., Arvanitis, D., Deksne, G., Boro, I., Kucsera, I., Karamon, J., Stefanovska, J., … Devleesschauwer, B. (2018). Epidemiology of taeniosis/cysticercosis in Europe, a systematic review: Eastern Europe. En Parasites and Vectors (Vol. 11). BioMed Central Ltd. https://doi.org/10.1186/s13071-018-3153-5 Tsang, V. C., Brand, J. A., & Boyer, A. E. (1989). An enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay and glycoprotein antigens for diagnosing human cysticercosis (Taenia solium). The Journal of Infectious Diseases, 159(1), 50-59. https://doi.org/10.1093/infdis/159.1.50 UN Office for the Coordination of Humanitarian Affairs. (2023). Humanitarian response plan Mozambique. https://reliefweb.int/report/mozambique/2023-mozambique-humanitarian- response-plan-february-2023 UNICEF, JMP, & WHO. (2023). Progress on household, drinking water, sanitation and hygene 2000 -2022. van Dijk, E. L., Auger, H., Jaszczyszyn, Y., & Thermes, C. (2014). Ten years of next-generation sequencing technology. Trends in Genetics: TIG, 30(9), 418-426. https://doi.org/10.1016/j.tig.2014.07.001 Bibliografía 217 van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., & Thermes, C. (2018). The Third Revolution in Sequencing Technology. Trends in Genetics: TIG, 34(9), 666-681. https://doi.org/10.1016/j.tig.2018.05.008 van Heesch, S., Kloosterman, W. P., Lansu, N., Ruzius, F.-P., Levandowsky, E., Lee, C. C., Zhou, S., Goldstein, S., Schwartz, D. C., Harkins, T. T., Guryev, V., & Cuppen, E. (2013). Improving mammalian genome scaffolding using large insert mate-pair next-generation sequencing. BMC Genomics, 14, 257. https://doi.org/10.1186/1471-2164-14-257 Vilajeliu Balagué, A., de Las Heras Prat, P., Ortiz-Barreda, G., Pinazo Delgado, M. J., Gascón Brustenga, J., & Bardají Alonso, A. (2014). Imported parasitic diseases in the immigrant population in Spain. Revista Espanola De Salud Publica, 88(6), 783-802. https://doi.org/10.4321/S1135-57272014000600010 Vilhena, M., Santos, M., & Torgal, J. (1999). Seroprevalence of human cysticercosis in Maputo, Mozambique. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 61(1), 59-62. https://doi.org/10.4269/ajtmh.1999.61.59 Vitta, A. (2012). Diagnosis of human angiostrongyliasis. Asian Biomedicine, 6(2), 141-150. Vurture, G. W., Sedlazeck, F. J., Nattestad, M., Underwood, C. J., Fang, H., Gurtowski, J., & Schatz, M. C. (2017). GenomeScope: Fast reference-free genome profiling from short reads. Bioinformatics, 33(14), 2202-2204. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btx153 Walker, B. J., Abeel, T., Shea, T., Priest, M., Abouelliel, A., Sakthikumar, S., Cuomo, C. A., Zeng, Q., Wortman, J., Young, S. K., & Earl, A. M. (2014). Pilon: An integrated tool for comprehensive microbial variant detection and genome assembly improvement. PloS One, 9(11), e112963. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0112963 Wallace, G. D., & Rosen, L. (1969). Studies on eosinophilic meningitis. V. Molluscan hosts of Angiostrongylus cantonensis on Pacific Islands. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 18(2), 206-216. Wang, P., & Wang, F. (2023). A proposed metric set for evaluation of genome assembly quality. Trends in Genetics: TIG, 39(3), 175-186. https://doi.org/10.1016/j.tig.2022.10.005 Bibliografía 218 Wang, Q.-P., Lai, D.-H., Zhu, X.-Q., Chen, X.-G., & Lun, Z.-R. (2008). Human angiostrongyliasis. The Lancet Infectious Diseases, 8(10), 621-630. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(08)70229-9 Wang, Y., Ma, A., Liu, X.-L., Eamsobhana, P., & Gan, X.-X. (2021). Evaluation of Rapid IgG4 Test for Diagnosis of Gnathostomiasis. The Korean Journal of Parasitology, 59(3), 257- 263. https://doi.org/10.3347/kjp.2021.59.3.257 Wanji, S., Tendongfor, N., Esum, M. E., & Enyong, P. (2002). Chrysops silacea biting densities and transmission potential in an endemic area of human loiasis in south-west Cameroon. Tropical Medicine & International Health: TM & IH, 7(4), 371-377. https://doi.org/10.1046/j.1365-3156.2002.00845.x Wen, H., Vuitton, L., Tuxun, T., Li, J., Vuitton, D. A., Zhang, W., & McManus, D. P. (2019a). Echinococcosis: Advances in the 21st century. Clinical Microbiology Reviews, 32(2), 1- 39. https://doi.org/10.1128/CMR.00075-18 Wen, H., Vuitton, L., Tuxun, T., Li, J., Vuitton, D. A., Zhang, W., & McManus, D. P. (2019b). Echinococcosis: Advances in the 21st Century. Clinical Microbiology Reviews, 32(2). https://doi.org/10.1128/CMR.00075-18 Whittaker, C., Walker, M., D.S. Pion, S. D. S., Chesnais, C., Boussinesq, M., & Basáñez, M.-G. (2018). Loa loa: More Than Meets the Eye? Trends in Parasitology, 34(4), 261-263. https://doi.org/10.1016/j.pt.2018.02.002 Wick, R. (2023). Porechop (https://github.com/rrwick/Porechop) [C++]. https://github.com/rrwick/Porechop (Obra original publicada en 2017) Wick, R. R., Judd, L. M., Gorrie, C. L., & Holt, K. E. (2017). Unicycler: Resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads. PLoS Computational Biology, 13(6), e1005595. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005595 Wilkins, P. P., Qvarnstrom, Y., Whelen, A. C., Saucier, C., da Silva, A. J., & Eamsobhana, P. (2013). The current status of laboratory diagnosis of Angiostrongylus cantonensis infections in humans using serologic and molecular methods. Hawai’i Journal of Bibliografía 219 Medicine & Public Health: A Journal of Asia Pacific Medicine & Public Health, 72(6 Suppl 2), 55-57. Wilson, M. R., Sample, H. A., Zorn, K. C., Arevalo, S., Yu, G., Neuhaus, J., Federman, S., Stryke, D., Briggs, B., Langelier, C., Berger, A., Douglas, V., Josephson, S. A., Chow, F. C., Fulton, B. D., DeRisi, J. L., Gelfand, J. M., Naccache, S. N., Bender, J., … Chiu, C. Y. (2019). Clinical Metagenomic Sequencing for Diagnosis of Meningitis and Encephalitis. The New England Journal of Medicine, 380(24), 2327-2340. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1803396 Wood, D. E., & Salzberg, S. L. (2014). Kraken: Ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology, 15(3), R46. https://doi.org/10.1186/gb-2014- 15-3-r46 Woolsey, I. D., & Miller, A. L. (2021). Echinococcus granulosus sensu lato and Echinococcus multilocularis: A review. Research in Veterinary Science, 135, 517-522. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2020.11.010 World Health Organization. (2010). Working to overcome the global impact of neglected tropical diseases: First WHO report on neglected tropical diseases. WHO/HTM/NTD/2010.1. https://apps.who.int/iris/handle/10665/44440 World Health Organization. (2020a). Ending the neglect to attain the Sustainable Development Goals: A road map for neglected tropical diseases 2021–2030. https://www.who.int/publications-detail-redirect/9789240010352 World Health Organization. (2020b, marzo 23). Taeniasis/Cysticercosis. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/taeniasis-cysticercosis World Health Organization, Food and Agriculture Organization of the United Nations, World Organisation for Animal Health, & International Livestock Research Institute. (2015). Assembling a framework for intensified control of taeniasis and neurocysticercosis caused by Taenia solium: Report of an informal consultation, WHO Headquarters, Geneva, 17-18 July 2014. World Health Organization. https://apps.who.int/iris/handle/10665/153237 Bibliografía 220 WormBase Parasite. (2022). https://parasite.wormbase.org/species.html Xie, M., Zhou, Z., Guo, S., Li, Z., Zhao, H., & Deng, J. (2019). Next-generation sequencing specifies Angiostrongylus eosinophilic meningoencephalitis in infants: Two case reports. Medicine, 98(35), e16985. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000016985 Yera, H., Dupont, D., Houze, S., Ben M’rad, M., Pilleux, F., Sulahian, A., Gatey, C., Gay Andrieu, F., & Dupouy-Camet, J. (2011). Confirmation and follow-up of neurocysticercosis by real-time PCR in cerebrospinal fluid samples of patients living in France. Journal of Clinical Microbiology, 49(12), 4338-4340. https://doi.org/10.1128/JCM.05839-11 Yoshinaga, Y., Daum, C., He, G., & O’Malley, R. (2018). Genome Sequencing. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 1775, 37-52. https://doi.org/10.1007/978-1-4939- 7804-5_4 Zerbino, D. R., & Birney, E. (2008). Velvet: Algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs. Genome Research, 18(5), 821-829. https://doi.org/10.1101/gr.074492.107 Zouré, H. G. M., Wanji, S., Noma, M., Amazigo, U. V., Diggle, P. J., Tekle, A. H., & Remme, J. H. F. (2011). The geographic distribution of Loa loa in Africa: Results of large-scale implementation of the Rapid Assessment Procedure for Loiasis (RAPLOA). PLoS Neglected Tropical Diseases, 5(6), e1210. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001210 Bibliografía 221 XI.GLOSARIO Contig: fragmento continuo de secuencias de ADN que se obtiene tras el ensamblaje de múltiples secuencias solapantes, dando lugar a una secuencia consenso sin espacios. BUSCO: Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs, métrica cuantitativa que permite describir la calidad de un ensamblaje o anotación basado en la presencia o ausencia de genes ortólogos conservados evolutivamente. Kmer: subcadena de longitud k contenida en una secuencia de ADN. Lecturas paired-end: lecturas empleadas en la tecnología Illumina, basadas en la secuenciación de cada uno de los fragmentos de la librería por ambos extremos. Supone una mayor complejidad que las lecturas single-end, consiguiendo una mayor calidad de secuenciación. N50: métrica de ensamblaje genómico normalmente utilizada para describir la contigüidad de los ensamblajes. El valor del N50 se calcula ordenando por tamaño los contigs o scaffolds del más largo al más corto, siendo este valor N50 la longitud (en pares de bases) del contig más corto en el que el 50% de la longitud del genoma está cubierto. N90: métrica de ensamblaje genómico, su valor indica la longitud del scaffold más corto tal que la suma de los scaffolds de longitud igual o superior sea al menos el 90% del tamaño del genoma. Scaffold: fragmento del ensamblaje genómico que se genera a partir de los contigs, existiendo espacios intercalados entre ellos. Los contigs que conforman un scaffold se ordenan a partir de datos complementarios, aunque no se rellenan las secuencias ausentes entre ellos. Anexos 222 XII.ANEXO Publicaciones realizadas durante la duración de la Tesis Doctoral: Anexos 223 Anexos 224 Anexos 225 Anexos 226 Anexos 227 Anexos 228 Anexos 229 Anexos 230 Anexos 231 Anexos 232 Anexos 233 Anexos 234 Anexos 235 Anexos 236 Anexos 237 Anexos 238 Anexos 239 240 PORTADA AGRADECIMIENTOS ABREVIATURAS ÍNDICE I. RESUMEN / SUMMARY II. INTRODUCCIÓN 1. Generalidades de las helmintosis 2. Helmintosis objeto de estudio 3. Técnicas de multiplexado basadas en MBA 4. Tecnologías de secuenciación 5. Genomas publicados en helmintos III.HIPÓTESIS Y OBJETIVOS IV. CAPÍTULO 1. Investigación histórica de las helmintosis objeto de estudio 1.1. Teniasis/cisticercosis 1.2. Hidatidosis 1.3. Loasis 1.4. Gnathostomosis 1.5. Angiostrongilosis V. CAPÍTULO 2. Optimización y validación de herramientas serológicas de multiplexado basadas en el antígeno recombinante T24H para la identificación de regiones de alta endemicidad de cisticercosis 2.1. Diagnóstico serológico combinado de cisticercosis/hidatidosis. Comparación MBA frente a ensayos comerciales 2.2. Evaluación serológica de la endemicidad de cisticercosis en Mozambique mediante XMAP-T24H VI. CAPÍTULO 3. Evaluación de la utilidad de marcadores serológicos de loasis en zonas endémicas 3.1. Introducción 3.2. Material y métodos 3.3. Resultados 3.4. Discusión VII. CAPÍTULO 4. Angiostrongylus cantonensis y Gnathostoma spinigerum: aportaciones preliminares en el campo serológico 4.1 Evaluación de candidatos para el diagnóstico serológico de angiostrongilosis 4.2 Evaluación de candidatos para el diagnóstico serológico de gnathostomosis VIII. CAPÍTULO 5. Secuenciación y ensamblaje de novo del genoma de L3 de Gnathostoma spinigerum 5.1. Introducción 5.2. Material y métodos 5.3. Resultados 5.4. Discusión IX. CONCLUSIONES / CONCLUSIONS X. BIBLIOGRAFÍA XI.GLOSARIO XII.ANEXO