UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 
 

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 
Departamento de Microbiología III   

 
 

 
 
 

IDENTIFICACIÓN DE LA QUINASA HaIA Y EL 
ESTUDIO DE SU PAPEL EN LA REGULACIÓN DE 

LA HOMEOSTASIS DE CATIONES EN 
“ASPERGILLUS NIDULANS”. 

 
 

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR 

PRESENTADA POR 

 
Laura Cobeño Fariñas 

 
 

Bajo la dirección del doctor 
 

Eduardo A. Espeso Fernández  
 
 

 Madrid, 2011 
 
 

ISBN: 978-84694-2675-3                                                                         © Laura Cabeño Fariñas, 2010                             
                                                                                                                                                                   
                                                                                                                                                                   



                        UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA III 

 

Identificación de la quinasa HalA y el estudio de su papel 

en la regulación de la homeostasis de cationes en 

Aspergillus nidulans. 

 

 

 

 

Memoria presentada por Laura Cobeño Fariñas para optar al grado de Doctor. 

 

 

Director de Tesis:     Tutora: 

Eduardo A. Espeso Fernández    Mª José Valderrama Conde 

Científico Titular del CSIC    Departamento de Microbiología III 

Centro de Investigaciones Biológicas   Facultad de Ciencias Biológicas 

       Universidad Complutense de Madrid 

 

TESIS DOCTORAL 

LAURA COBEÑO FARIÑAS 

2010 





 

 

 

 

 

 

  

 

Esta Tesis Doctoral ha sido realizada en el Centro de Investigaciones Biológicas 

(C.I.B) del CSIC bajo la supervisión del Dr. Eduardo A. Espeso Fernández, Científico 

Titular del CSIC.  

 El trabajo recogido en esta memoria ha sido financiado por fondos públicos de la 

Dirección General de Investigación a través de los proyectos BFU2009-08701 y 

BFU2006-04185. 



 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A mis padres y a mi hermano 

 

 

 

A Miguel 



 



AGGRRAADDEECCIIMMIIEENNTTOOSS  

  

 “Camina confiado en la dirección de tus sueños. Vive la vida que habías 

imaginado” (Henry David Thoreau). Esta tesis es uno de mis sueños. El camino no fue 

fácil, pero he tenido la suerte de encontrar en él muchas personas que me han apoyado. 

Hoy que cumplo este sueño, es el momento de agradecérselo a todos aquellos que me 

han ayudado a conseguirlo. 

 

En primer lugar quiero dar las gracias al “culpable” de esta tesis, la persona que 

ha hecho posible todo esto, Eduardo. Gracias por confiar en mí desde el primer 

momento, por darme todo tu apoyo. Estuviste presente en mis primeros pasos en el 

laboratorio y a ti te debo el haber llegado hasta aquí. Gracias por tu paciencia infinita, 

por tus clases magistrales de casi cualquier cosa, por tus consejos, por tu dedicación, 

pero sobre todo gracias por devolverme la ilusión por la ciencia. 

También quiero dar las gracias a todos mis compañeros de laboratorio por 

recibirme tan maravillosamente en mi vuelta al CIB y por haberme hecho sentir en casa 

otra vez desde el primer momento. Gracias a Antonio, Juanfran, Areti, Patri, Oier y por 

supuesto a todas las personas pasaron por el laboratorio en mi primera etapa: Silvia, 

Lidia, Javi, Juanqui, América y Olga. Pero quiero aprovechar para dar las gracias de 

manera especial a las dos personas que más me han ayudado en esta aventura y sin las 

cuales esta tesis no hubiera sido lo mismo: Ane y Erika, gracias chicas por estar siempre 

ahí para ayudarme con cualquier técnica y por echarme una mano siempre que lo he 

necesitado. Gracias a Elena, porque aunque no nos hemos visto todo lo que me hubiera 

gustado, eres un pilar del laboratorio tanto a nivel técnico como personal. Quiero 

agradecer también al grupo del Profesor Herb Arst del Imperial College de Londres su 

inestimable colaboración en este trabajo y la cesión de varias de las cepas que he 

utilizado. 

Dicen que quién tiene un amigo tiene un tesoro, y yo tengo la suerte de tener mi 

“cofre” lleno de buenos amigos a los que también debo parte de esta tesis. En primer 

lugar a mis biólogas, gracias por todos los momentos que hemos vivido y por seguir ahí 

tantos años después, a Miguel y Estefi por su apoyo y a Pilar por esas tardes de cine y 

Mac para desconectar un poco. Gracias también a Bárbara y Antonio por abrirme las 

puertas de su casa como si fuera uno más de la familia. De entre todos los amigos hay 

cuatro personas que son muy especiales en mi vida y que han estado ahí siempre, 

amigos con mayúsculas. Ellos que me han apoyado en los momentos difíciles, 

prestando siempre su hombro para lo que hiciera falta, y por supuesto celebrando los 

éxitos y las cosas maravillosas que han sucedido en mi vida. Vosotros cuatro, Nacho y 

Paula; María y Carlos, gracias de todo corazón por formar parte de mi vida, os quiero y 

espero teneros a mi lado siempre. 

 Gracias a mis abuelos, por estar pendientes de nosotros, por desvivirse, por 

malcriarnos y por estar siempre ahí para echar una mano, os quiero yayos. 



 Y ahora llegan los párrafos que estaba deseando escribir desde que comencé esta 

tesis. Ahora es el momento de dar las gracias a las cuatro personas más importantes de 

mi vida. A ellos que son mi motor. A mi hermano, Rober, por ser el perfecto compañero 

de juegos y porque me has enseñado muchas cosas, aunque no lo creas. Gracias por 

darme siempre un empujón para seguir adelante. A mis padres, que son mi modelo a 

seguir. No hay páginas suficientes para agradeceros todo lo que hacéis por mí. Todo lo 

bueno que consiga en esta vida os lo debo a vosotros. Gracias por los valores que nos 

habéis enseñado y por ser como sois, os quiero. 

 No puede estar más agradecida a la vida que no solo me ha dado unos padres y 

un hermano maravillosos, sino que además ha puesto en mi camino a la mejor persona 

del mundo, mi alma gemela, Miguel. Gracias por ayudarme y comprenderme en todas y 

cada una de mis decisiones y animarme a luchar por mis sueños. Gracias por apoyarme 

desde el principio con esta aventura, todas las horas invertidas en esta tesis te las he 

robado a ti y espero poder devolvértelas con creces. Eres mi mitad y no comprendo la 

vida sin ti. Gracias por estar a mi lado. Te quiero. 



ABREVIATURAS 

 
 

 

 

aa:   Aminoácido 

BLAST  “Basic Local Alignment Search Tool” 

CDS:   Secuencia codificante 

cDNA:  DNA codificante 

cM:  CentiMorgan 

DEPC:  Dietilpirocarbonato 

DNA:   Ácido desoxirribonucleico 

DNAg:  Ácido desoxirribonucleico genómico 

DNAsa:  Desoxirribonucleasa 

DO:   Densidad óptica 

DTT:   1,4-ditiotreitol 

EDTA:  Ácido etilén diamino tetracético 

Fig.:   Figura 

FT:   Factor de transcripción 

GABA:  Ácido γ-aminobutírico 

GFP:   Proteína fluorescente verde 

HA:  residuos 98-106 de la hemaglutinina del virus de la gripe humana 

HEPES:  Ácido N-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico 

Hxk:  Hexoquinasa 

IgG:   Inmunoglobulina G 

kb:   kilo base 

kDa:   kilo Dalton 

MCA:   Medio completo de Aspergillus 

MFA:   Medio de fermentación para Aspergillus 

MMA:  Medio mínimo de Aspergillus 

MMR:  Medio mínimo de regeneración de Aspergillus 

MOPs:  Ácido 3-(N-morfo) propanosulfónico 

mRFP:  Proteína fluorescente roja monomérica 

mRNA:  RNA mensajero 

myc:  residuos 408-439 de la proteína p62c-myc humana 

NES:   Señal de exportación nuclear 

NLS:   Señal de localización nuclear 

pb:   Par de bases 

PBS:   Tampón fosfato-salino 

PCR:   Reacción en cadena de la polimerasa 

PEG:   Polietilenglicol. 

RNA:   Ácido ribonucleico 

r.p.m.:   Revoluciones por minuto 

rRNA:   RNA ribosómico 

SDS:   Sodio dodecil sulfato 

SSC:  Citrato salino 

TCA   Ácido tricloroacético 

Tris:   Tris(hidroximetil)-aminometano 

UV:   Ultravioleta 

UTR:   Región no traducida (“untranslated region”) 



WMM:  “Watch minimal medium” 

 

 

Las abreviaturas que no se indican siguen el código de la IUPAC 

 

 

 

Las tablas y figuras contenidas en este trabajo se citan seguidas de una letra, (I: 

Introducción; M: Materiales y Métodos; R. Resultados; D; Discusión) que hace 

referencia a la sección en que aparecen, y de un número que indica el orden que ocupan 

dentro de dicha sección. 



  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

ÍÍNNDDIICCEE  

  

  

 





ÍNDICE 

 

1.- INTRODUCCIÓN                                                                                 1 

 

1.1 Aspergillus nidulans………………...………………………………………………1 

1.2 Homeostasis de cationes……………………………………………………………5 

1.2.1 Generalidades……………………………………………………………..5 

1.2.2 Homeostasis de cationes en levaduras…………………………………….6 

1.2.3 Homeostasis de cationes en Aspergillus…………………………………..9 

1.3 Transportadores de potasio………………………………………………………13 

1.3.1 Generalidades…………………………………………………………….13 

1.3.2 Transportadores de potasio en levaduras…………………………………18 

1.4 Regulación del transporte de potasio………………………………………….…22 

1.4.1 Regulación del transporte en levaduras…………………………………..22 

1.4.2 Regulación mediada por las quinasas Hal4/Hal5 en levaduras…………..24 

1.4.3 Regulación en A. nidulans…………………………………..……………25 

1.5 Antecedentes a esta tesis……………………………………………..……………27 

2.- OBJETIVOS                                                                                         33 

3.- MATERIALES Y MÉTODOS                                                           37 

3.1 Condiciones y medios de cultivo………………………………………………….37 

3.1.1 Medios y suplementos para Aspergillus nidulans……………..…………37 

3.1.2 Ensayos de resistencia/sensibilidad a cationes…………………...………42 

3.1.3 Otras soluciones utilizadas……………………………………….………43 

3.2 Cepas de Aspergillus, plásmidos y oligonucleótidos utilizados…………..……..46 

3.2.1 Cepas de Aspergillus nidulans……………………………………...…….46 

3.2.2 Plásmidos utilizados en Aspergillus………………………………….…..47 



3.2.3 Oligonucleótidos………………………………………………………….48 

3.2.4 Generación de casetes mediante PCRs de fusión………………………...49 

3.3 Técnicas en Aspergillus nidulans………………………………………………...53 

3.3.1 Mantenimiento y cultivo de estirpes……………………………………...53 

3.3.2 Transformación de A. nidulans…………………………………………...53 

3.3.3 Análisis fenotípicos mediante crecimiento en medio sólido……………..55 

3.3.4 Cruces entre estirpes de Aspergillus……………………………………...55 

3.4 Técnicas de biología molecular, bioquímica y proteómica……………………..56 

3.4.1 Extracción de proteínas totales de A. nidulans…………………………...56 

3.4.2 Ensayos de inmunodetección de proteínas, “Western blot”…………...…57 

3.4.3 Fraccionamiento celular………………………………………………….58 

3.4.4 Extracción de DNA en Aspergillus………………………………………61 

3.4.5 Análisis de DNA por el método de Southern blot………………………..62 

3.4.6 Análisis del RNA por el método de Northern blot……………………….63 

3.5 Microscopía de fluorescencia y análisis de las imágenes………………………..65 

3.6 “Kits” de biología molecular y bioquímica y otros componentes  

comerciales utilizados en esta tesis…...………………………………………………66 

3.6.1 “Kits” de biología molecular y bioquímica………………………………66 

3.6.2 Productos radiactivos……………………………………………………..67 

3.6.3 Reactivos y enzimas de biología molecular……………………………...67 

3.7 Herramientas bioinformáticas……………………………………………………68 

4.- RESULTADOS                                                                                     71 

4.1 Selección de supresores del fenotipo de sensibilidad al molibdato             

causado por la mutación pacC
+/-

70001………………………………………………71 

4.2 Mutante MoR24…………………………………………………………………...75 

4.3 Análisis genético del mutante MoR24……………………………………………76 

4.4 Identificación de MoR24, AN8830……………………………………………….77 



4.5 Análisis funcional de HalA………………………………………………………..90 

 4.5.1 Estrategia para la generación de la cepa nula de halA……………………90 

 4.5.2 Papel de HalA en la respuesta a estrés catiónico…………………………93 

 4.5.3 Papel de HalA en la utilización de fuentes de nitrógeno…………………94 

 4.5.4 Modelado de la proteína mutante y silvestre HalA………………………96 

4.6 Papel de la proteína quinasa HalA en la homeostasis de potasio y sodio…….100 

 4.6.1 Efecto de la ausencia de sodio y potasio en el crecimiento……………..100 

 4.6.2 Efecto de la ausencia de potasio en el crecimiento de las cepas………102 

 4.6.3 Estudio del transporte de sodio y potasio en A. nidulans……………….103 

4.7 Regulación por potasio de HalA………………………………………………...105 

4.8 Localización subcelular de HalA……………………………………………..…108 

4.9 Identificación y estudio de los transportadores de potasio……………………114 

 4.9.1 Identificación de transportadores de potasio en A. nidulans……………114 

 4.9.2 Análisis de la expresión de los Trk…………………………………...…116 

 4.9.3 Construcción de cepas nulas para los distintos transportadores………...118 

 4.9.4 Mantenimiento del potencial de membrana, papel de HalA y TrkB……120 

 4.9.5 Papel de los transportadores Trk en la respuesta a estrés catiónico…….122 

 4.9.6 Localización subcelular de TrkB……………………………………..…124 

5.- DISCUSIÓN                                                                                       133 

5.1 HalA es un factor importante en la respuesta a estrés catiónico………...……133 

5.2 HalA y el sistema de regulación de pH ambiental…………………………..…137 

5.3 Genética clásica versus genética en reverso para el estudio de la        

homeostasis de cationes……………………………………………………………...140 

5.4 Sistema quinasa-fosfatasa en la respuesta a estrés salino……………………..143 

5.5 Sistema de transporte de potasio en A. nidulans…………………………….…147 

6. - CONCLUSIONES                                                                             157 

7. - BIBLIOGRAFÍA                                                                               161 



 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

  

  

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[1] 

1.- INTRODUCCIÓN 

1.1 Aspergillus nidulans 

 

Aspergillus nidulans es un hongo filamentoso perteneciente a la familia 

Trichocomaceae, phylum Ascomycota [1]. Este hongo presenta un tipo de crecimiento 

hiperpolarizado formando largos filamentos denominados hifas y muestra ramificación 

lateral en los compartimentos celulares más posteriores de la hifa. Las células 

vegetativas de A. nidulans son sincitios multinucleados. Los núcleos de cada sincitio 

contienen la misma información genética, salvo en el caso de los heterocariontes (ver 

más adelante). Las hifas están divididas por septos perforados a través de los cuales se 

produce el intercambio de nutrientes y efectores entre los diferentes compartimentos o 

células. A. nidulans es un hongo homotálico cuyas hifas pueden entrar en contacto y 

fusionarse (anastomosis) intercambiando así material citoplásmico y nuclear [2]. 

En el ciclo de vida de este hongo (esquematizado en la figura I1) se pueden 

diferenciar tres fases de desarrollo: vegetativa, sexual y parasexual [3]. La fase de vida 

vegetativa comienza con la germinación de una espora asexual (conidiospora) o sexual 

(ascospora) que da lugar a la formación de hifas tubulares que crecen de manera 

hiperpolarizada por extensión apical y ramificación lateral, formando un entramado de 

hifas interconectadas denominado micelio. Sobre un medio sólido el micelio del hongo 

se expande simétricamente formando colonias de forma más o menos radial, y necesitan 

de al menos 18 horas de crecimiento para alcanzar la plena competencia para comenzar 

a producir las estructuras de esporulación asexual que se denominan conidióforos. El 

proceso de esporulación asexual ha sido estudiado en detalle en este hongo [4] y es 

interesante resaltar que cada conidiospora es uninucleada y que todas comparten la 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[2]   

misma dotación genética que el micelio homocariótico. La finalización de la formación 

de las estructuras reproductoras asexuales suele venir seguida de la iniciación del ciclo 

de reproducción sexual del hongo [1].  

Los cuerpos fructíferos se denominan cleistotecios o peritecios y en su interior 

se encuentran una gran cantidad de sacos denominados ascas, que contienen las esporas 

sexuales o ascosporas. Las ascosporas son siempre haploides y contienen dos núcleos 

idénticos que proceden de una mitosis sin división celular. La tercera fase de vida de A. 

nidulans es la denominada parasexual. Durante la fase vegetativa, A. nidulans es 

generalmente haploide pero sus hifas tienen la capacidad de fusionarse (anastomosis) e 

intercambiar material celular por anastomosis y dar lugar, en el caso de que las hifas 

fusionadas pertenezcan a cepas genéticamente diferentes, a individuos heterocariontes 

que poseen núcleos haploides de distinta dotación genética [1]. 

Adicionalmente, tras la anastomosis, se puede producir la fusión de los núcleos 

haploides para dar lugar a núcleos diploides. Esta capacidad de formar cepas diploides 

así como la posibilidad de inducir su haploidización mediante la utilización de drogas 

como el benomilo que interfieren en la segregación cromosómica en la mitosis [5], 

supone una potente herramienta genética que permite la localización cromosómica de 

genes [2]. 

Aspergillus nidulans es un microorganismo saprofito que posee una gran 

capacidad para adaptarse y vivir en ambientes muy diversos tanto en el aspecto físico-

químico como en el biológico. Esta extrema variabilidad de nichos se corresponde con 

la elevada versatilidad metabólica de este hongo filamentoso que le permite, por 

ejemplo, crecer en un amplísimo rango de pH ambiental, desde pH 2.5 hasta 10.5  [6]. 

Para poder sobrevivir en estos rangos de valores de pH, los genes cuyos productos de 

traducción hayan de desarrollar sus funciones en el medio extracelular o en la interfase 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[3] 

con el medio intracelular, como es el caso de enzimas extracelulares, enzimas 

implicadas en la producción de metabolitos secundarios y toxinas, o permeasas, han de 

estar sometidos a una regulación transcripcional en respuesta a la variación del pH 

ambiental, puesto que normalmente estos metabolitos y enzimas poseen un rango de pH 

óptimo de actuación.  

 

 

 

 
Figura I1: Ciclo de vida de Aspergillus nidulans. Imagen tomada de [3]. 

 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[4]   

La secuencia del genoma de A. nidulans se publicó en diciembre de 2005. 

Contiene 30 Mpbs organizadas en ocho cromosomas y se ha estimado un número de 

10.000 genes [7]. La disponibilidad de dicha información es una nueva e importante 

herramienta de trabajo y supone un avance significativo que permitirá seguir utilizando 

A. nidulans como organismo modelo, genéticamente manipulable, en estudios de 

genética y biología celular y molecular en eucariotas.  

Como organismo homotálico, con un ciclo sexual bien caracterizado, constituye 

el modelo genético de referencia para otras especies asexuales y heterotálicas del género 

Aspergillus de gran interés en industria, como A. oryzae o A. flavus, o en medicina, 

como A. fumigatus. A esta característica se une su enorme versatilidad metabólica, que 

ha permitido identificar numerosas rutas del metabolismo primario y secundario, 

además de la identificación de los genes implicados en enfermedades metabólicas de 

origen genético en humanos [8]. Las técnicas de biología molecular aplicables a este 

hongo son diversas y permiten realizar cualquier abordaje experimental: etiquetado, 

reemplazamientos génicos [9], análisis de la localización subcelular de proteínas 

[10,11], análisis proteómicos [12,13], etc. 

El crecimiento hiperpolarizado, el diseño celular sincitial con múltiples núcleos 

y la existencia de citoesqueletos de microtúbulos y actina, son características 

diferenciales y le hacen ser un modelo de estudios de estos procesos celulares y de sus 

interrelaciones, y en algunos casos aproximan a este hongo a modelos y tipos celulares 

de metazoos. 

 

 

 

 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[5] 

1.2 HOMEOSTASIS DE CATIONES 

1.2.1 Generalidades 

 

La homeostasis de las concentraciones intracelulares de iones es una propiedad 

fundamental de las células. Consecuentemente, los transportadores de iones y sus 

sistemas de regulación, tanto positivos como negativos, tienen funciones fisiológicas de 

gran importancia. Estos sistemas se ocupan principalmente de mantener las 

concentraciones de iones dentro de un rango óptimo para los sistemas celulares. En 

general este rango consiste en concentraciones relativamente altas de potasio (10
-1

 M) y 

magnesio (10
-3

 M), concentraciones bajas de sodio (10
-2

 M) y concentraciones muy 

bajas de protones (10
-7

 M) y calcio (10
-7

 M) todas en relación a la concentración 

extracelular [14]. Además, las concentraciones de potasio son el principal determinante 

de algunos parámetros fisiológicos tan importantes como el volumen celular, la 

turgencia o la fuerza iónica del citoplasma en hongos y plantas, que determinan 

conjuntamente la óptima hidratación de macromoléculas y membranas [15]. 

El mantenimiento de las concentraciones internas de iones frente a un amplio 

rango de condiciones extracelulares está mediado por complejas rutas homeostáticas. 

Las señales que disparan las respuestas de adaptación pueden ser cambios en la 

turgencia detectados en la membrana plasmática, o cambios en las concentraciones 

intracelulares de cationes como el potasio, el sodio o el calcio, que son detectados por 

proteínas citosólicas [15]. Un mejor entendimiento de estos sistemas y de su regulación 

puede tener un considerable valor práctico, así, por ejemplo, en medicina, la 

caracterización de transportadores de iones y su regulación, ha contribuido a la 

demostración de que los defectos en la homeostasis iónica contribuyen al riesgo de 

padecer alta presión arterial [16].  



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[6]   

 

Por otra parte, en agricultura, el estudio de la homeostasis de iones podría 

facilitar el desarrollo de plantas con mayor tolerancia a sequía o salinidad por medio de 

técnicas de ingeniería genética [15]. 

 

1.2.2 Homeostasis de cationes en levaduras 

 

S. cerevisiae está considerada como la levadura modelo por excelencia y existe 

gran cantidad de información sobre numerosos procesos celulares en este organismo. 

Así, se han identificado diferentes transportadores de potasio y/o sodio en esta levadura 

(figura I2). En S. cerevisiae los dos sistemas específicos de transporte de potasio están 

mediados por Trk1 y Trk2. Ambos transportadores están finamente regulados y pueden 

funcionar tanto a baja como a alta afinidad [17,18,19]. Alternativamente a la ausencia 

de Trk existe un proceso de transporte de potasio no específico, sin caracterizar 

plenamente, en el que podrían estar implicados transportadores de otros sustratos como 

aminoácidos o azúcares [20], o un canal no específico de cationes (denominado NSC1) 

cuyo gen no ha sido aún identificado [21]. 

En Schwanniomyces occidentalis se ha identificado un sistema de transporte de 

potasio de alta afinidad constituido por el gen HAK1 [22], presente también en otras 

especies como Debaryomyces hansenii o Neurospora crassa que no existe en S. 

cerevisiae.  

 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[7] 

 
 

 

 

 

 

 

En S. cerevisiae se han caracterizado diversos genes cuyos productos están 

relacionados con la salida de potasio de la célula: YCK1/TOK1 [23], NHA1 [24] y 

ENA1-4 [28]. El gen TOK1 podría codificar para el primer miembro de una familia de 

canales selectivos de potasio dependientes de voltaje [25]. La proteína codificada por 

NHA1 se identificó como un antiportador Na
+
/H

+
 de la membrana plasmática, aunque 

se ha demostrado que también es capaz de llevar a cabo un proceso de intercambio 

K
+
/H

+
 [24]. Los genes ENA también pueden estar implicados en la salida de K

+
 de la 

célula.  

En S. cerevisiae no parecen existir transportadores específicos para la entrada de 

sodio en las células, sino que éste entra por otros transportadores como los de potasio o 

inespecíficos [26]. Un ejemplo de la entrada de sodio a través de un canal inespecífico 

Figura I2: Principales transportadores de cationes en las membranas de S. 

cerevisiae. Adaptado de [32]. 
 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[8]   

es el transportador Pho89, que es un cotransportador de sodio y fosfato que funciona 

principalmente en la fase activa del crecimiento y está regulado por las concentraciones 

de fosfato inorgánico. También se han encontrado evidencias de la existencia de este 

transportador en N. crassa [26]. La entrada de sodio y potasio a través de Trk1 y Trk2 

es competitiva, aunque estos transportadores presentan una mayor afinidad por el 

potasio permitiendo la entrada selectiva del mismo cuando ambos cationes están 

presentes [27].  

La tolerancia a sal en S. cerevisiae, asociada a la capacidad de mantener bajos 

niveles de sodio en el citoplasma, dificultando su entrada y expulsando eficazmente el 

sodio que entra, es posible gracias al sistema de expulsión formado por Na
+
-ATPasa 

codificadas por los genes ENA1-4 [28], aunque también por el antiportador Na
+
/H

+
 

Nha1. ENA2, 3 y 4 se expresan de forma constitutiva [29] mientras que la expresión de 

ENA1 es inducida por sodio, litio y pH alcalino, y está regulada por la actividad de la 

fosfatasa calcineurina [30]. Una mutación de pérdida de función en ENA1 causa 

sensibilidad a pH alcalino, siendo un fenotipo que se acentúa tras la adición de sodio 

[31]. Además Ena1 y Nha1 actúan de manera complementaria en función del pH medio 

para mantener las concentraciones intracelulares de sodio y potasio  [24]. 

La concentración de cationes dentro de las células de la levadura probablemente 

no es homogénea, y existen diferencias significativas en los niveles de sodio y potasio 

entre el citosol y los orgánulos celulares [32]. La necesidad fisiológica de un transporte 

intracelular de cationes a través de las membranas de los orgánulos está conectada con 

el mantenimiento de una homeostasis de potasio y una detoxificación de sodio del 

citosol, así como la regulación de pH y el volumen de los orgánulos. El transporte de 

iones a la mitocondria se realiza a través del antiportador Mkh1 (K
+
/H

+
), también 

denominado Mdm38 [33]. El gen KHA1 codifica un transportador intracelular K
+
/H

+
 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[9] 

localizado en el aparato de Golgi, que es importante en la regulación del pH intracelular 

y la homeostasis de potasio [34]. Otro antiportador Na
+
/H

+
 es el codificado por el gen 

NHX1, implicado en la regulación del pH citoplasmático mediante la internalización de 

sodio en la vacuola, que funciona introduciendo el sodio en este orgánulo con el fin de 

mantener también un nivel citoplasmático de Na
+
 que permita un desarrollo normal del 

metabolismo celular (10
-2

-10
-3

M) [35]. En la vacuola se localiza un antiportador de K
+
, 

Na
+
/H

+
 Vnx1 que está implicado en la regulación de la homeostasis iónica y en el 

mantenimiento del volumen celular [36]. 

 

1.2.3 Homeostasis de cationes en A. nidulans 

 

A. nidulans es el organismo donde el sistema de regulación por pH ambiental ha 

sido estudiado en mayor profundidad. Los genes que se expresan preferentemente a pH 

ácido se les denomina genes “ácidos”, como por ejemplo la permeasa de GABA (gabA), 

o la fosfatasa ácida, pacA [37]. Los genes que se expresan preferentemente a pH 

alcalino se les denomina genes “alcalinos”, como los genes de la fosfatasa alcalina palD 

[38] o los genes acvA e ipnA, que codifican para la δ−(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-

valina sintetasa y la isopenicilina N-sintasa, respectivamente, las dos primeras enzimas 

de la ruta de biosíntesis de la penicilina [39,40]. 

Los estudios pioneros que posteriormente condujeron al análisis de la regulación 

por pH en A. nidulans fueron llevados a cabo por el Dr. Gordon Dorn [41]. En ellos, 

seleccionó un gran número de mutaciones que afectaban la actividad de las fosfatasas 

ácida y/o alcalina, y a los que denominó con el acrónimo pac- y pal-, respectivamente. 

  



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[10]   

La revisión de este trabajo por el grupo del Dr. Herbert Arst permitió establecer 

que parte de los genes descubiertos por Dorn pertenecían a un sistema de regulación de 

la expresión génica en respuesta al pH ambiental [37,42,43]. 

Los datos genéticos permitieron generar un modelo de este sistema regulador 

por pH ambiental, en el que el producto del gen pacC es el regulador directo de la 

expresión génica, funcionando como represor de los genes que se expresan 

preferentemente a pH ácido (pacA y gabA) y como activador de los genes que se 

expresan preferentemente a pH alcalino (palD, ipnA y prtA). Los productos de los genes 

pal formarían parte de la vía de transducción de señal encargada de activar a PacC en 

respuesta a la alcalinización del medio. De esta manera, en medio a pH ácido, PacC se 

encontraría en una forma inactiva, produciéndose una falta de represión de los genes 

“ácidos”. Al alcalinizarse el medio, los productos de los genes pal activarían a PacC, el 

cual pasaría a reprimir la expresión de los genes “ácidos” y a activar la de los 

“alcalinos” [43]. 

Se han detectado homólogos de PacC en todos los genomas de hongos 

filamentosos y levaduras conocidos hasta ahora, lo que da una idea de la importancia 

del sistema regulador controlado por PacC. PacC es un factor de transcripción que posee 

un dominio de unión a DNA formado por tres dedos de zinc del tipo Cys2His2 [44,43]. 

Al igual que la gran mayoría de factores de transcripción, la actividad transcripcional de 

PacC está regulada. En condiciones de ausencia de señal (pH ácido) PacC está 

aparentemente inactivo [45,46], siendo necesarios mecanismos moleculares que ayuden 

a mantener esa situación a pH ácido y que posteriormente, tras la alcalinización del 

medio, activen las funciones transcripcionales de PacC [45,47]. Estos mecanismos han 

sido estudiados en detalle, e incluyen interacciones intramoleculares, interacciones con 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[11] 

otras proteínas, cortes proteolíticos regulados [45,47,48] y cambios de la localización 

subcelular de PacC [49]. 

 

 

 

 

Figura I3: Modelo de la regulación de los genes implicados en el crecimiento bajo condiciones 

extremas de pH. A) Regulación en condiciones de pH ácido en el medio. B) Regulación en 

condiciones de pH alcalino del medio. 
 

 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[12]   

En el estudio de la homeostasis de cationes en A. nidulans se han identificado 

dos genes que codifican para factores de transcripción implicados en la resistencia a 

elevadas concentraciones de distintas sales. En primer lugar se ha identificado al gen 

sltA cuya deleción da lugar a una elevada sensibilidad a diferentes cationes y a pH 

alcalino [94]. Además se identificó un homólogo al gen que codifica para la proteína 

CRZ1 en S. cerevisiae, CrzA [50]. Esta proteína se trata de un factor de transcripción 

que modula la regulación de genes mediada por calcio. La deleción de este gen también 

da lugar a una sensibilidad a pH alcalino.    

La alcalinización del medio debe ser un estímulo muy agresivo para A. nidulans 

al que debe responder con, al menos, tres rutas reguladoras mediadas por estos factores 

transcripcionales. Este nexo establece la relación entre el control sobre la homeostasis 

de iones en el hongo y el pH extracelular, algo que se sospechaba desde los primeros 

momentos del estudio del sistema regulado por PacC. 

Como muchos microorganismos, el ascomiceto A. nidulans necesita solo 

pequeñas cantidades de calcio para crecer, fácilmente suplementadas por trazas de 

contaminación de los componentes del medio de cultivo. Este hecho causa que la 

manipulación de la disponibilidad de calcio sea difícil y complica el estudio de la 

señalización y homeostasis de calcio. Sin embargo, una combinación de mutaciones de 

pérdida de función en los genes halA y sltA que codifican para una proteína quinasa 

(HalA) y un factor de transcripción (SltA) da lugar a un fenotipo en la cepa de elevado 

requerimiento de calcio, que se ha denominado auxotrofía de calcio [50]. Este 

requerimiento de calcio no es total, y puede verse aumentado por elevadas 

concentraciones de sodio y potasio. Como se describe en esta tesis, HalA se descubrió 

como un supresor del sistema de pH ambiental y establece una relación con el sistema 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[13] 

de respuesta a altos niveles de sal también a través de una interacción genética con SltA, 

a nivel de la homeostasis de calcio. Respecto a la homeostasis de calcio, el 

descubrimiento que mutaciones de pérdida de función en NhaA, un homologo del 

antiportador Na+ /H + de membrana Nha1 de S. cerevisiae o una mutación, 

posiblemente de ganancia de función, en un transportador de potasio (trkB, ver esta 

tesis) suprimen la auxotrofía de calcio establece una clara relación entre la regulación de 

los niveles internos de ciertos cationes monovalentes y el calcio en A. nidulans [50]. En 

ausencia de calcio añadido, las mutaciones en sltA dan lugar a una hipertrofia del 

sistema vacuolar, incrementando los niveles de pmcA y pmcB, genes codificantes para 

ATPasas de calcio de la membrana vacuolar [50].  

1.3 TRANSPORTADORES DE POTASIO 

1.3.1 Generalidades 

 

Los canales iónicos son proteínas integrales de membrana que forman poros 

permitiendo la difusión pasiva de iones a través de las membranas biológicas. Los 

canales de potasio están constituidos por 4 subunidades  que se encargan de formar 

físicamente dicho poro. A menudo estas subunidades  pueden estar acompañadas de 

otras subunidades auxiliares . Las subunidades auxiliares intervienen en la modulación 

de la actividad del canal y también en la correcta expresión del canal en la superficie de 

la membrana [51]. En cada genoma secuenciado hasta el momento existe al menos un 

gen que codifica para un canal de potasio, incluso en los microorganismos más simples 

como Escherichia coli [52]. Se hipotetiza que el resto de canales iónicos se han 

originado mediante divergencia evolutiva de los canales de potasio [53]. Los canales de 

potasio forman la familia de canales iónicos más diversa en mamíferos, habiéndose 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[14]   

descrito hasta 75 genes implicados. Además, mediante mecanismos como el 

procesamiento diferencial del ARN mensajero en la trascripción y como las variaciones 

en las subunidades que forman el canal, incluyendo sus proteínas accesorias, se 

consigue aun más diversidad en la capacidad y especificidad de transporte de este catión 

[54]. 

Debido a que, por norma general, las células mantienen la concentración de 

potasio en el interior de la membrana mucho más alta que en el exterior, la apertura de 

los canales de potasio produce un cambio eléctrico a través de la membrana, 

produciendo una hiperpolarización de la célula. Esta hiperpolarización tiene unas 

consecuencias muy obvias en las células eléctricamente excitables, ya que finalizan el 

potencial de acción en neuronas, en células cromafines adrenales, en músculo y en 

células pancreáticas b. Pero además los canales de potasio intervienen en otras múltiples 

funciones en células no excitables eléctricamente. En células del epitelio renal 

intervienen en el balance osmótico. En linfocitos T y B la hiperpolarización es un 

requisito para la mitosis y la proliferación en la respuesta inmune [55]. En los eritrocitos 

sirven para mantener la forma de la célula y para regular el volumen. Y en plantas 

regulan el flujo osmótico para el intercambio de gas y agua de las hojas [53]. 

Los canales de potasio se pueden dividir según los mecanismos de apertura del 

canal en canales dependientes de voltaje y canales dependientes de ligando. En los 

canales dependientes de ligando, el poro se abre por la unión de: (1) un ion (por ejemplo 

calcio), (2) pequeñas moléculas orgánicas o (3) una proteína. Por esta razón los canales 

dependientes de ligando tienen un dominio citoplasmático o extracelular para unirse a 

estos efectores. En los canales de potasio dependientes de voltaje la energía para abrir el 

poro proviene del movimiento dentro de la membrana de un sensor con carga eléctrica. 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[15] 

Los canales dependientes de voltaje poseen dominios transmembrana que se encargan 

de detectar las diferencias en el voltaje [56]. 

 

La Unión Internacional de Farmacología (IUPHAR) ha propuesto una 

nomenclatura estándar basándose en los árboles filogenéticos [57]. La nueva propuesta 

de nomenclatura agrupa los canales de potasio en primer lugar por su estructura y en 

segundo lugar por sus relaciones filogenéticas. Así existirían hasta 4 grupos diferentes: 

(1) canales de potasio dependientes de voltaje, (2) canales de potasio sensibles a calcio, 

(3) los canales de potasio con 2 poros y (4) los canales de potasio rectificadores internos 

(“inward rectifier”).  

 

Estructura de los canales de potasio  

 

En 1998 Doyle y colaboradores publicaron la estructura del canal de potasio 

KcsA procedente de Streptomyces lividans, mostrando la estructura del poro del canal 

de potasio en tres dimensiones [58]. Se ha comprobado que esta estructura 

tridimensional del poro está evolutivamente muy conservada entre los diferentes 

organismos y que es, además, la que determina la enorme selectividad de estos canales 

por el ión potasio.  

Casi al mismo tiempo Kreusch y colaboradores (1998) presentaron la estructura 

de otro dominio muy importante para los canales de potasio [59]. Se trata del dominio 

de tetramerización que permite la asociación de las 4 subunidades necesarias para 

formar canales de potasio funcionales. A partir de este momento se consiguió la 

estructura de otros 3 canales de potasio más. En primer lugar fue la estructura de un 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[16]   

canal de potasio activado por calcio y la de un canal dependiente de voltaje [60] y por 

último se presentó la estructura de un rectificador interno [61]. 

 

 

 

 

 

 

 

Figura I4: A) Estructura del canal de potasio con sus 4 subunidades a representadas en cuatro colores 

diferentes. Cada una de estas subunidades está formada por dos dominios transmembrana. B y C) 

Estructura del poro de conducción de iones y del filtro selectivo de los canales de potasio (imagen 

tomada de [56]). En B se muestra la estructura del poro representando 2 de las 4 subunidades que lo 

forman y con la parte extracelular en la parte superior. Cada subunidad contiene (desde el lateral hacia 

el centro de la figura) una hélice externa cercana a la membrana, una hélice interna cercana al poro, la 

hélice del poro y el filtro selectivo. En C se muestra una imagen ampliada del filtro, donde se pueden 

observar los iones de potasio y como se ajusta la estructura proteica sobre ellos, estabilizándolos en el 

interior de la membrana. En la parte interior se observa cómo se rehidratan los iones al alcanzar la 

cavidad central del poro que se encuentra llena de agua. 
 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[17] 

Las dos partes principales de los canales de potasio son: 

- Dominio de agrupación de subunidades T1: Éste es un dominio que 

determina las subunidades que se asocian para formar los canales 

funcionales, en él reside la capacidad de las subunidades para unirse entre sí. 

Tiene una gran importancia funcional puesto que el ensamblaje heteromérico 

de subunidades de canales de potasio es un mecanismo muy importante para 

producir diversidad en estos canales [62]. Basándose en la estructura 

cristalina de este dominio se piensa que puede tener una función en la 

permeabilidad del canal. Los 4 dominios T1 procedentes de las 4 

subunidades que forman el canal se unen formando una estructura similar a 

un embudo (figura I4B, en color rojo), con un ensanchamiento previo a lo 

que sería el canal del poro en sí mismo. De ser así, los iones de potasio 

tendrían que pasar este supuesto embudo en primer lugar para salir de la 

célula. 

- Poro de conducción de los iones: Hay que hacer constar que la fuerte 

selectividad de los canales de potasio por su ion se consigue sin 

comprometer la velocidad de conducción del poro, que se aproxima al límite 

de difusión para ese ion [56]. El poro de los canales de potasio se forma por 

la unión de 4 subunidades que forman una vía de conducción de iones en el 

centro (figura I4). La parte central de esta vía consiste en una cavidad 

ocupada por moléculas de agua. Hacia el exterior de la cavidad central se 

sitúa el filtro que condiciona la selectividad por los iones de potasio (figura 

I4B), este filtro se forma por una región del canal que está muy conservada a 

lo largo de la evolución. En este filtro los iones se encuentran deshidratados 

y se mantienen estabilizados por 8 átomos de oxigeno que forman una 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[18]   

estructura a su alrededor similar a la que forma el agua, así el ion se 

encuentra como si estuviera en solución. El filtro posee 4 lugares de unión 

para iones de potasio situados en fila. Los iones se unen a estos lugares de 

forma alternada con moléculas de agua, de modo que en el filtro siempre se 

encuentran como máximo 2 iones. Los iones y las moléculas de agua se van 

desplazando en fila y cuando sale un ion del filtro entra otro por la parte 

opuesta. Por supuesto la dirección del flujo de iones viene determinada por el 

gradiente electroquímico para potasio. 

 

1.3.2 Transportadores de potasio en levaduras 

 

La toma de potasio en la levadura Saccharomyces cerevisiae está mediada 

principalmente por el sistema TRK, codificado por dos genes parcialmente redundantes, 

TRK1 y TRK2 [63,27]. Además se conoce que el sistema TRK es uno de los principales 

determinantes del potencial eléctrico de la membrana plasmática [64]. El gen TRK1 

codifica el transportador más activo, una proteína de 1.235 aminoácidos, con 8 

dominios transmembrana y 4 estructuras MPM (membrana-poro-membrana) [63] 

(figura I5). Trk1 es una proteína integral de la membrana plasmática. Como muchos 

transportadores de la membrana plasmática, se encuentra asociada a las fracciones de 

membrana resistentes a detergentes [65]. Estas fracciones de membrana están 

enriquecidas en esfingolípidos que contienen inositol y en ergosterol, el principal esterol 

estructural de los hongos [66]. Se ha descrito que estos esfingolípidos participan en el 

tráfico de proteínas a la membrana plasmática [67]. 

El gen TRK1 de Saccharomyces cerevisiae fue el primer gen codificante de un 

transportador de potasio clonado en células eucariotas [63]. El gen TRK2 fue 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[19] 

identificado y clonado en S. cerevisiae posteriormente [18]. Las proteínas Trk1 y Trk2 

son idénticas en un 55% de su secuencia aminoacídica, y el grado de similitud es aún 

mayor en los segmentos hidrofóbicos, donde puede alcanzar el 90%. Sin embargo, el 

papel del gen TRK2 solo parece ser importante en el mutante nulo para el gen trk1, a 

pesar de que ambos sistemas tienen afinidades similares por el ión potasio (Km= 20 – 

50 μM) y por el ión rubidio (Km= 0,1 – 0,3 mM) [27]. 

 

 

 

 

 

Utilizando una sonda correspondiente a la región conservada de los genes TRK1 

y TRK2 de S. cerevisiae se identificó un gen homólogo en Schizosaccharomyces pombe 

[68]. En el proyecto de secuenciación del genoma de S. pombe se identificó un segundo 

gen de la misma familia, correspondiente a TRK2. Los genes TRK1 y TRK2 de S. pombe 

codifican proteínas de 841 y 881 aminoácidos respectivamente, mostrando un mayor 

parecido al gen TRK2 que al gen TRK1 de S. cerevisiae. También se han encontrado 

transportadores del tipo TRK en Neurospora crassa [69], Schwanniomyces occidentalis 

Figura I5: Representación esquemática de los transportadores TRK-HKT basada en la 

estructura MPM de los dominios trans-membrana. La parte superior se corresponde 

con la cara externa de la membrana plasmática.  

 
 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[20]   

[22] y Debaryomyces hansenii [70]. En estas especies, además de los sistemas de 

transporte del tipo TRK, también están presentes otro tipo de transportadores de potasio, 

los HAK (High- Affinity K
+
-transporter), que no existen en S. cerevisiae. En los 

proyectos genoma, tanto de arroz, como de Arabidopsis thaliana, se han encontrado 

transportadores del tipo HKT/TRK. En arroz se ha visto que hay 8 transportadores 

HKT/TRK, mientras que en Arabidopsis sólo se ha encontrado uno, y se ha visto 

también que los distintos transportadores de esta familia pueden variar su afinidad por 

sodio o potasio [29]. También se ha observado que los transportadores TRK de levadura 

están relacionados con un gran número de transportadores de bacteria, los 

transportadores llamados KtrB (anteriormente NtpJ) y los transportadores TrkH [71].  

En S. cerevisiae, se han identificado otros transportadores de la membrana 

plasmática que contribuyen a la regulación de las concentraciones intracelulares de 

potasio [23]. En condiciones específicas, por ejemplo estrés por KCl, el potasio puede 

ser exportado de las células de forma activa a través de las ATPasas Ena/Pmr2, o por el 

antiportador Nha1. Estos sistemas de extrusión de potasio también son capaces de 

transportar otros cationes además del sodio, como por ejemplo el litio  [22,31]. 

Existe otro transportador en la membrana plasmática que es específico para 

potasio, el canal Tok1. Las propiedades biofísicas de este canal de potasio han sido 

descritas con detalle [72], pero su papel fisiológico aún no se ha caracterizado 

completamente. Tok1 es un canal de potasio dependiente de voltaje con dos dominios 

de poro en tándem [73]. Normalmente tiene una fuerte actividad de extrusión, pero se ha 

descrito que bajo ciertas condiciones también es capaz de mediar la toma de potasio 

[72,25]. Tok1 se activa por despolarización de la membrana plasmática [21], y 

probablemente libera el potasio acumulado en las células para regenerar el potencial de 

membrana [74]. También se ha demostrado que Tok1 puede ser fosforilado por la 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[21] 

quinasa Hog1, lo que sugiere que este canal está participando en la respuesta a estrés 

osmótico, probablemente mediando la salida de potasio durante la fase inicial del estrés 

[75]. La regulación de la actividad del sistema TRK afecta a la concentración 

intracelular de potasio y a la turgencia de las células [76], al potencial eléctrico de 

membrana [77], y al pH intracelular [78]. 

La principal diferencia entre Trk1 y Trk2 se encuentra entre el primer y el 

segundo motivo MPM, in Trk1 el lazo tiene una longitud de 642 aminoácidos mientras 

que en Trk2 la longitud es de 326. Curiosamente la mayoría de los transportadores Trk 

identificados en otras levaduras se parecen más a la estructura de Trk2 que a la de Trk1 

[32]. En principio no se ha demostrado la existencia de un complejo entre los dos Trks 

aunque siempre se hable de un sistema Trk1-Trk2.  Trk2 se propone como responsable 

de la entrada de potasio [18]. Se asume que Trk1 es el responsable del transporte de alta 

afinidad y Trk2 del de baja afinidad [18], sin embargo este modelo está muy 

simplificado ya que se ha demostrado que Trk2 puede ser responsable de transporte de 

afinidad moderado/alto [19] y por otro lado existe un transporte residual de potasio en 

cepas carentes de ambos transportadores [64]. En cepas silvestres, la mayoría de la 

entrada de potasio está mediada por Trk1, que puede funcionar como transportador de 

alta/baja afinidad dependiendo del estado de potasio en la célula. Trk2 puede transportar 

potasio también de forma de alta y baja afinidad, pero el gen está pobremente expresado 

en condiciones estándar [32].  

Esta tesis doctoral aporta información sobre la identidad de los posibles 

transportadores de potasio en el organismo modelo A. nidulans y sobre los mecanismos 

que regulan el transporte de este catión en el hongo. 

 

 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[22]   

1.4 REGULACIÓN DEL TRANSPORTE DE POTASIO 

1.4.1 Regulación del transporte en levaduras 

Estudios genéticos llevados a cabo en levadura han identificado varias proteínas 

implicadas en la regulación del transporte de potasio. Por ejemplo, la proteína fosfatasa 

Ppz1 desactiva Trk1, y es a su vez desactivada por una subunidad inhibidora, Sis2/Hal3 

[79,78]. Se ha descrito otra fosfatasa, calcineurina (Cnb1), como necesaria para la 

activación de Trk1 y Trk2 por estrés causado por sodio [76]. Otras proteínas implicadas 

en la regulación del transporte de potasio son la proteína quinasa Sky1 [80], la proteína 

inducida por estrés osmótico Hal1 [81], la proteína G de la superfamilia Ras Arl1 [82], 

y las proteínas quinasas Hal4 y Hal5 [77] cuya función parece estar relacionada con la 

regulación positiva del sistema Trk1-Trk2 y que van a ser descritas con mayor detalle a 

continuación. Cada uno de estos transportadores de la membrana plasmática debe ser 

regulado de manera específica para permitir la viabilidad de las células en respuesta a 

los cambios que se producen en el medio ambiente. Esta regulación puede darse a 

distintos niveles. Algunos transportadores se regulan a nivel transcripcional, mientras 

que para otros son más importantes las modificaciones post-traduccionales, como la 

fosforilación o la ubiquitinación. 

Una de las estrategias de señalización de las células eucariotas en respuesta a 

estrés es utilizar cascadas de fosforilación de MAPK (mitogen activated protein kinase). 

La adaptación al estrés osmótico requiere la activación de una cascada de fosforilación 

que termina con la activación de la MAPK Hog1. Esta forma activa de la proteína Hog1 

se desplaza hasta el núcleo, donde por fosforilación de al menos tres factores de 

transcripción distintos (Sko1, Hot1 y Smp1), promueve la modificación en el patrón de 

expresión de más del 10% del genoma de la levadura S. cerevisiae [83]. 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[23] 

Otro proceso clave de regulación de los transportadores de la membrana 

plasmática es la ubiquitinación. La ubiquitinación es una modificación post-

traduccional en la que se adiciona a la proteína una unidad o una cadena de ubiquitina, 

un polipéptido de 76 aminoácidos, marcando así su destino en la célula o su posterior 

degradación [84]. Así, la ubiquitinación es un paso necesario para la degradación de 

algunas proteínas de la membrana plasmática como el receptor del factor α, Ste2 [85], y 

la permeasa de uracilo Fur4 [86]. La ubiquitinación promueve la regulación negativa de 

estas proteínas, ya que sirve como señal para su internalización en la vía endocítica que 

finaliza con la degradación en la vacuola. Del mismo modo que la actividad de las 

permeasas de nutrientes está regulada por el entorno, debe producirse también una 

estricta regulación de los transportadores de iones. El mantenimiento de la homeostasis 

iónica en respuesta a los cambios que se producen en el medio ambiente es vital para las 

células. En muchos casos, el delicado balance entre los distintos iones está determinado 

por la expresión específica de los genes que codifican los canales, las bombas y los 

transportadores iónicos. Sin embargo, en los últimos años, se ha visto que la 

modificación post-traduccional de estas proteínas, especialmente la fosforilación, 

también juega un papel fundamental en la regulación de la homeostasis iónica [87,75]. 

Se han descrito algunos ejemplos de regulación dependiente de fosforilación 

para las actividades de algunos canales y bombas de iones, como por ejemplo los 

canales dependientes de voltaje Kv3.4 y los rectificadores internos de potasio IKr, pero 

en el caso de transportadores la información es menor [88,89]. Recientemente se ha 

mostrado que un transportador de anión nitrato de Arabidopsis puede cambiar su 

afinidad mediante la fosforilación de un residuo de treonina [90]. Este papel de la 

fosforilación en la regulación de la homeostasis iónica implica la existencia de rutas de 

transducción de señales, en las que quinasas y fosfatasas actúan sobre sustratos en 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[24]   

respuesta a distintos estímulos percibidos por las células. En la mayoría de los casos 

estas rutas de transducción de señales no se han caracterizado, pero parecen tener una 

importancia vital en el mantenimiento de la homeostasis iónica, especialmente en 

respuesta a los cambios producidos en el medio ambiente. 

 
 

 

 

 

1.4.2 Papel de las quinasas Hal4 y Hal5 en levaduras. 

 

La regulación de la actividad del sistema Trk afecta a la concentración 

intracelular de potasio y a la turgencia de las células [91], al potencial eléctrico de 

membrana [77], y al pH intracelular [78].  La actividad de los transportadores Trk1 y 

Trk2 está regulada positivamente por las proteínas quinasas Hal4 y Hal5 [92].  

Las proteínas Hal4/Sat4 y Hal5 son dos serina/treonina quinasas parcialmente 

redundantes que fueron identificadas por su capacidad de conferir tolerancia a salinidad 

(halotolerancia) por sobre-expresión en S. cerevisiae [77]. 

Figura I6: Mecanismos conocidos de regulación de los diferentes transportadores de membrana. Las 

líneas discontinuas indican interacciones que no están totalmente documentadas. Adaptado de [32].  
 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[25] 

Estudios genéticos han postulado que estas dos quinasas actúan regulando de 

forma positiva el sistema de transporte de potasio Trk1-Trk2. Esta hipótesis está basada 

en la observación de que la disrupción de los genes HAL4 y HAL5 da lugar a un 

fenotipo muy parecido al del mutante trk1 trk2, y de que el mutante hal4 hal5 requiere 

la adición de potasio para crecer en medio mínimo. Además, la sobreexpresión de los 

genes HAL4 y HAL5 sólo es capaz de conferir tolerancia a salinidad en cepas en las que 

estén presentes los transportadores de potasio Trk1 y Trk2 [77]. 

El aumento de la actividad transportadora de potasio producido por estas 

quinasas, incrementa la entrada de potasio y reduce el potencial de membrana, lo que 

reduce a su vez la captación de cationes tóxicos e incrementa la tolerancia a sal [77]. 

También se ha observado como existe una regulación de la actividad 

transportadora de potasio mediada por estas proteínas quinasas en la levadura S. pombe. 

En esta levadura se ha identificado un homólogo a la proteína quinasa Hal4 de S. 

cerevisiae, denominado igualmente Hal4 [93]. La deleción de esta proteína da lugar a 

una hiperpolarización de la membrana plasmática, sugiriendo una función conservada 

en homeostasis salina y en el mantenimiento del potencial de membrana. En esta 

levadura se ha visto como los transportadores Trk son fosforilados cuando en el medio 

de cultivo la concentración de potasio es baja, y esta fosforilación se mantiene en 

mutantes nulos para la proteína quinasa Hal4, sugiriendo la implicación de otras 

quinasas adicionales en este proceso [93].  

 

1.4.3 Regulación transcripcional frente a estrés catiónico en A. nidulans. 

 

Para investigar la homeostasis de cationes en A. nidulans se caracterizaron dos 

genes que codificaban para factores de transcripción. El ortólogo del gen crz1 en S. 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[26]   

cerevisiae, crzA, que codifica un factor de transcripción que media la regulación de 

genes por calcio fue identificado y caracterizada su función [94]. Los fenotipos de la 

deleción de crzA incluyen extremada sensibilidad a pH alcalino y toxicidad por calcio. 

Una versión funcional de CrzA etiquetada en el extremo C-terminal con GFP fue 

analizada al microscopio de fluorescencia. Esta proteína es excluida del núcleo en 

ausencia de calcio añadido, pero rápidamente se acumuló en el núcleo tras la adición de 

calcio extracelular. Además, el gen previamente caracterizado sltA, que no tiene 

homologo identificado en levaduras, fue delecionado y el fenotipo resultante incluía 

sensibilidad a un número de cationes además de a la alcalinización del medio de cultivo. 

Una baja expresión de la ATPasa de sodio ENA puede explicar parcialmente la 

sensibilidad a cationes de las cepas nulas de sltA [94].  

Los dos factores de transcripción analizados están implicados en la prevención 

de la toxicidad de ciertos cationes. En ausencia de SltA, un factor de transcripción 

específico de hongo filamentosos, A. nidulans es extremadamente sensible a la 

toxicidad por sodio, potasio, litio, cesio y magnesio, pero no a elevadas concentraciones 

de calcio [94]. Mientras que la ausencia de CrzA incrementa la sensibilidad al calcio. 

Estos resultados ponen de manifiesto diferencias significativas entre A. nidulans y S. 

cerevisiae en la regulación del estrés catiónico [50,94]. SltA parece tener un doble 

papel, por un lado positivo en la regulación de EnaA y por otro lado negativo sobre la 

expresión de VcxA, un putativo transportador vacuolar de calcio [94]. El factor de 

transcripción PacC, que media el control de la expresión de genes dependientes de pH, 

actúa como activador y como represor, pero su homólogo en S. cerevisiae, Rim101p, no 

actúa en ese modo [42].  



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[27] 

El papel concreto de estos reguladores transcripcionales sobre la expresión de la 

batería de canales y transportadores de cationes descrita en A. nidulans se desconoce en 

su mayor parte. Este estudio constituye una primera aproximación a la identificación de 

elementos reguladores y estructurales (transportadores) del sistema de homeostasis de 

cationes en este hongo filamentoso modelo.  

1.5.- Antecedentes al trabajo elaborado en esta tesis doctoral. 

 

El trabajo de investigación realizado en la tesis doctoral del Dr. Fernández-

Martínez [95] se centró en los mecanismos y señales que gobernaban la localización 

nuclear del factor de transcripción PacC [96]. Durante un proceso de selección de 

mutantes en el sistema de regulación por pH ambiental utilizando la denominada 

“Técnica del GABA” [97] se aislaron cepas mutantes en las que se alteraba la 

localización celular de PacC. Estos mutantes eran supresores del fenotipo constitutivo 

que causaba el alelo pacC
c
700. El fundamento de esta técnica es la regulación directa, 

negativa, por PacC de la expresión del gen gabA, que codifica para la permeasa del ω-

aminoácido γ- aminobutirato (GABA). El GABA puede ser utilizado como única fuente 

de carbono o de nitrógeno por A. nidulans, y esta capacidad depende de la correcta 

expresión y funcionalidad de la permeasa codificada por gabA. El alelo pacC
c
700 

reprime constitutivamente la expresión de gabA imposibilitando así el crecimiento de 

esta cepa mutante en el medio conteniendo GABA como única fuente de nitrógeno.  

La proteína codificada por este alelo mutante de PacC, pacC
c
700, consta de la 

proteína fluorescente verde (GFP) unida al extremo amino terminal de una forma 

truncada de PacC en el aminoácido 250 que mimetiza la forma PacC27kDa. 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[28]   

 

 

 

 

 

La cepa MAD1400 expresa la quimera fluorescente GFP::PacC(5-250) y 

conidias de esta cepa fueron sometidas a un proceso de mutagénesis por irradiación con 

luz ultravioleta y se seleccionaron los mutantes de pérdida de función en PacC 

utilizando la técnica del GABA. GFP::PacC5-250 tiene una localización 

preferentemente nuclear (figura I7, PacC
c
700). Entre los mutantes supresores obtenidos 

Figura I7: A) Representación esquemática de la quimera PacC
c
700 y del mutante PacC

+/-

70001 obtenido a partir de esta. B) Imágenes de microscopía de fluorescencia de la cepa que 

expresa la forma funcional constitutiva de PacC, PacC27kDa=PacC
c
700 (MAD1400), en la que 

se aprecia acumulación de fluorescencia en los núcleos, y de la cepa mutante PacC
+/-

70001 

(MAD997) que tiene afectada la localización preferentemente nuclear de PacC, y la 

fluorescencia se encuentra dispersa en el citoplasma. 

 



IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN  

 

[29] 

se observaron algunos que pertenecían a una de las clases esperadas, la que debía 

mostrar afectada la localización preferentemente nuclear de PacC (figura I7, PacC
+/-

70001).  

De entre los supresores de pacC
c
700 seleccionados se identificaron y 

caracterizaron en mayor detalle tres cepas que mostraban la pérdida de la preferente 

localización nuclear de la quimera GFP::PacC27kDa. Posteriormente se determinó la 

presencia de sustituciones en determinados aminoácidos que forman parte del dominio 

de unión al DNA. Los alelos pacC
+/-

70001 (K159M), pacC
c/-

70010 (F151S) y pacC
+/-

70011 (K158E) portan mutaciones que causan la sustitución de residuos del tercer dedo 

de zinc de PacC, el más conservado en secuencia entre todos los homólogos de PacC. 

Las mutaciones pacC
+/-

70001 y pacC
+/-

70011 permitieron definir la señal de 

localización nuclear presente en el tercer dedo de zinc [98,96]. 

Este trabajo tiene como origen un segundo proceso de selección de mutaciones 

supresoras, esta vez, del fenotipo de pérdida de función causado por el alelo pacC
+/-

70001 (ver descripción en el primer apartado de resultados y esquema del proceso en la 

figura R1). 

  

  

  

  

  

  



 

   

  

  

  

  

  

  



 

   

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

OOBBJJEETTIIVVOOSS  

  

  

 



 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



OOBBJJEETTIIVVOOSS  

 

[33] 

2.- OBJETIVOS 

 

En esta tesis doctoral se aborda el estudio de uno de los posibles mecanismos de 

regulación implicado en la homeostasis de cationes en Aspergillus nidulans. Éste es un 

proceso básico para la supervivencia del hongo en ambientes con concentraciones 

anormales, normalmente elevadas, de cationes. El trabajo realizado en esta memoria es 

pionero en este campo puesto que solo se habían realizado estudios "in sílico" sobre la 

maquinaria genética implicada en la homeostasis de cationes en este organismo modelo.  

 

Para llevar a cabo este estudio, se fijaron tres objetivos concretos: 

- Estudio de la mutación que causa resistencia al anión molibdato, MoR24, para 

determinar así el papel del gen en el que se localiza, halA, en el sistema de 

regulación por pH ambiental en A. nidulans. 

 

- Caracterización del papel de la proteína quinasa HalA en la homeostasis de 

cationes. 

 

- Identificación de los transportadores de potasio extracelular, Trk, en A. nidulans, 

análisis por genética en reverso de su función y estudio de su regulación por 

HalA. 



 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  



 

 

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

  

  

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[37] 

3.- MATERIALES Y MÉTODOS 

3.1. CONDICIONES Y MEDIOS DE CULTIVO 

 

3.1.1.) Medios y suplementos para Aspergillus nidulans. 

La solución de sales, elementos traza y suplementos utilizados en los medios de 

cultivo se describen en este apartado 1 de materiales y métodos. Los cultivos se 

incubaron a 37ºC, salvo indicación en contra, y con agitación orbital de 250 r.p.m. en el 

caso realizarse con medio líquido. Los cultivos en medio líquido se inocularon con 

3x10
6
 conidiosporas/mL. Los conidios se recolectaron rascando la superficie de las 

colonias con una espátula estéril y se resuspendieron en una solución acuosa de 

TWEEN 80 al 0,01% (v/v). 

 

3.1.1.1.) Medio Mínimo de Aspergillus (MMA). 

Para 1 litro de medio mínimo de Aspergillus (MMA) se diluyeron 20mL de 

solución de sales con agua Mili-Q y se ajustó el pH a 6,5 añadiendo una solución 

concentrada (10M) de NaOH. El medio se esterilizó en autoclave durante 20 minutos a 

110ºC. Para preparar el medio mínimo sólido se añadió agar Oxoid al 1% (p/v) antes de 

su esterilización. Tanto al medio sólido como líquido, justo antes de ser utilizados, se 

añadieron los suplementos necesarios para el crecimiento de cada estirpe, así como la 

fuente principal de carbono y la de nitrógeno, generalmente D-glucosa 1% (p/v) y 

tartrato de amonio 5mM, respectivamente.  

Para preparar medio de cultivo a pH ácido, se añadió NaH2PO4 a las 

concentraciones finales de 50 ó 100 mM, según se indique en el experimento resultando 

en un valor de pH en el rango de 5-5,5. El medio de cultivo tamponado a pH alcalino se 

obtuvo añadiendo Na2HPO4 hasta una concentración final de 100 mM, resultando el pH 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[38]   

del medio ajustado a valor a un valor aproximado de 8.  El medio de cultivo a pH neutro 

se obtuvo mediante la adición de fosfato monosódico y fosfato disódico a una 

concentración final de 50 mM cada uno, resultando el valor final de pH en el medio de 

6,5.  

Para el análisis al microscopio de fluorescencia de las distintas estirpes, se 

utilizó una versión del MMA líquido denominada “watch minimal medium” (WMM) 

[99]. Para prevenir la formación de precipitados de sales que interfieren en microscopía, 

este medio carece de sales de fosfato antes de ser autoclavado y por lo tanto se 

suplementa con 25 mM NaH2PO4 antes de su utilización.  

 

3.1.1.2.) Medio Mínimo de Aspergillus sin potasio (MMA-K
+
). 

Se preparó este medio de la misma forma que el MMA, pero eliminando el 

potasio presente en la solución de sales (Ver composición solución sales en el apartado 

3.1.1.5). Para compensar el balance iónico del medio se añadió sodio en lugar de 

potasio en esta solución, sustituyendo el KCl por NaCl y el KH2PO4 por NaH2PO4 

manteniendo la molaridad. 

 

3.1.1.3.) Medio completo de Aspergillus (MCA). 

Composición por litro: 20mL de solución de sales, 10mL de solución de 

casaminoácidos, 10g de D-glucosa, 2g de bactopeptona y 1g de extracto de levadura. Se 

añadió agua hasta un litro y se ajustó el pH a 6,5 con una solución 10M de NaOH. Para 

el medio sólido se añadió agar al 1% (p/v). El medio de cultivo se esterilizó en 

autoclave durante 20 minutos a 110ºC. Antes de ser utilizado, se le añadió 10mL de 

solución de vitaminas/litro, la fuente principal de nitrógeno y, en caso de necesitarse, 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[39] 

los requerimientos adicionales específicos de cada estirpe ausentes de la solución de 

vitaminas. 

 

3.1.1.4.) Medio de fermentación (MFA). 

Este medio incluye como principal componente el CSL (Corn Steep Liquor). Se 

utilizaron los lotes Cerestar-2062 o Laisa-60015 a una concentración de 25 g/l. Antes de 

pesarse el CSL, se mezclaron bien las fases acuosa y sólida. Una vez pesado el CSL, se 

añadió el agua destilada y la solución de sales (20mL/l). Se agitó durante 20 minutos y 

se filtró a través de papel de filtro utilizando vacío. El pH se ajustó a valor 6,8 con 

NaOH (10M) y el medio se esterilizó en autoclave a 121ºC durante 30 minutos. 

Posteriormente se le añadió como fuente de carbono principal 3% de sacarosa, como 

fuente de nitrógeno principal 5mM de tartrato de amonio y los suplementos específicos 

de cada estirpe. 

 

3.1.1.5) Medio de regeneración (MMR) 

En este medio se utilizan 20 mL de soluciones de sales y 342 g sacarosa (1M). 

Se añadió agua hasta un litro y se ajustó el pH a 6,8 con NaOH. Antes de esterilizar el 

medio en el autoclave se añadió agar Oxoid al 1,5%. En el momento que el medio fue 

utilizado se añadieron la D-glucosa 1%, el tartrato de amonio a 5mM y los suplementos 

necesarios para el crecimiento de las cepas. 

  

3.1.1.6) Medio de regeneración-TOP (MMR-TOP) 

En este medio se utilizan 20 mL de soluciones de sales y 342 g sacarosa (1M). 

Se añadió agua hasta un litro y se ajustó el pH a 6,8 con NaOH. Antes de esterilizar el 

medio en el autoclave se añadió agar Oxoid al 1,5%. En el momento que el medio fue 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[40]   

utilizado se añadieron la D-glucosa 1%, el tartrato de amonio 5mM y los suplementos 

necesarios para el crecimiento de las cepas. 

 

3.1.1.7) Soluciones y suplementos para medios de A. nidulans. 

- Solución de sales (solución concentrada 50x) 

Para 1 litro: 

KCl                                                       26g 

MgSO4·7 H2O                                      26g 

KH2PO4                                                76g 

-Solución de elementos traza sin sales de fosfato (solución concentrada 1000x) 

Para 1 litro: 

Na2B4O7·10H2O    40 mg 

CuCl·2H2O    400 mg 

FeCl3     800 mg 

ZnCl2             8.000 mg 

MnCl2·4H2O    800 mg 

-Solución de sales baja en concentración de fosfatos 

Para 1 litro (solución concentrada 50x): 

KCl       26 g 

MgSO4·7 H2O                                         26 g 

KH2PO4      76 g 

Solución de elementos traza sin fosfatos  50 mL 

 

 

 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[41] 

-Solución de casaminoácidos. 

Hidrolizado de caseína 150g/l. Esterilizar en autoclave 110ºC, 20 minutos. Se utilizó 

como solución concentrada 10x. 

-Solución de vitaminas*. 

Para 1 litro (solución concentrada 100x):  

Tiamina……..................................…50 mg 

Biotina…….......................................10 mg 

Ácido nicotínico……................…..100 mg 

Pantotenato de calcio…...................200 mg 

Piridoxina-HCl………................…..50 mg 

Riboflavina…………..…................100 mg 

Ác. p-aminobenzoico (PABA)........100 mg 

Inositol........................................24.000 mg 

* Esta solución se esterilizó mediante filtración y se guardo a 4ºC protegida de la luz. 

-Suplementos: 

Se prepararon en agua a en una solución concentrada 100x, excepto para la biotina que 

fue de 10.000x. 

Biotina: 100mg/l. Esterilizada por filtración. 

Ácido p-aminobenzoico (PABA): 100mg/l. Autoclave, 20 minutos a 110ºC. 

Pantotenato de calcio: 200mg/l. Esterilizado por filtración. 

Piridoxina-HCl (Vitamina B6): 5g/l. Esterilizada por filtración. 

Inositol: 1,2g/l. Esterilizado por filtración. 

 

 

 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[42]   

3.1.2 Ensayos de resistencia/sensibilidad a cationes. 

En los experimentos de resistencia a la posible toxicidad de distintos cationes se 

utilizaron diferentes concentraciones de los cationes de interés, siendo añadidos al 

medio de cultivo como sales de cloro. A continuación se encuentra una lista con las 

concentraciones finales (cf) utilizadas para cada compuesto: 

 

KCl   cf=1 M 

KCl   cf=10 mM 

KCl   cf=100 mM 

LiCl   cf=0,3 M 

KH2PO4  cf=1 M 

CsCl   cf=0,3 M 

NaCl   cf=1 M 

NaCl   cf=100 mM 

MgSO4  cf=200 µM 

MgSO4  cf=1 mM 

NaH2PO4  cf=200 µM 

NaH2PO4  cf=1 mM 

FeCl2   cf=5 mM 

FeCl3   cf=5 mM 

MgCl2   cf=0,2M 

CaCl2   cf=0,1 M 

Na2MoO4  cf=25 mM 

 

 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[43] 

3.1.3 Otras soluciones utilizadas 

Tampón de protoplastos 

MgSO4………………………. 1,2M 

NaH2PO4…………………… 10mM, pH 5,8 

Colchón de flotación  

D-Sorbitol……………………. 0,6M 

Tris-HCl………………………. 0,1M, pH 7,5 

Solución ST 

D-Sorbitol………………………. 1M 

Tris-HCl……………………... 10mM, pH 7,5 

Solución STC 

D-Sorbitol……………………….. 1M 

Tris-HCl……………………… 10mM 

CaCl2…………………………. 10mM, pH 7,5 

Solución PEG 

PEG 6000.…………………...…10mM 

Tris-HCl………………………. 10mM 

CaCl2………………………….. 10mM, pH 7,5 

Tampón de extracción de proteínas NP40 

EDTA…………………………....1mM 

KCl……………………………..20mM 

NP40…………………………...0,1mM 

DTT………………………..….. 0,5mM  

1 pastilla de inhibidores de proteasas de Roche por 50mL de tampón. 

 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[44]   

Tampón de carga de geles SDS (TGCS) 

Tris-HCl……………………...…0,06M. pH6,8 

Dodecil sulfato sódico (SDS)…………0,007M  

Β-mercaptoetanol……………………….0,06M 

Urea………………………………………...6M 

Azul de bromofenol…………………7,5x10
-5

M 

Tampón de lisis de protoplastos 

Sorbitol………………………………..200mM 

Acetato potásico……………………..…50mM 

Hepes……………………………20mM pH7,2 

EDTA…………………………………….2mM 

“Cocktail” inhibidor de proteasas (Roche) 

Solución de extracción de DNA 

Tris HCl.……………………….... 25mM pH=8 

Sacarosa……………………………...…250mM 

EDTA……………………………………20mM 

Solución Fenol/SEVAG 

Para preparar 50mL de esta solución utilizamos: 

Fenol………………………………………25mL 

Cloroformo………………………………..24mL 

Alcohol isoamílico………………………….1mL 

Tampón 2xSSC 

NaCl………………………………………..3M 

Citrato sódico…………………………….0,3M 

 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[45] 

 

Tampón CHURCH (para 100mL) 

BSA……………………………………..…1g 

EDTA…………………………………..200µL 

SDS 20%..................................................35mL 

H2O……………………...……………....15mL 

Na2HPO4………………………..………30mL 

NaH2PO4………………………………..20mL 

Ajustar a pH 7 con hidróxido sódico si es preciso. 

H2O-DEPC 

2 litros H2O 

2mL DEPC 

Agitar previamente durante 12 horas a temperatura ambiente y posteriormente 

autoclavar a 121ºC durante 30 minutos. 

MOPS 

33,49G MOPs……………………………………….   cf = 0,4M 

3,28g AcNa (o 5,43g si es x 3H2O)………………...   cf =  0,1M 

0,75g EDTA………………………………………... cf =  0,01M 

H2O-DEPC hasta 400mL 

Ajustar a pH 7,2 y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 30 min 

 

 

 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[46]   

3.2. CEPAS DE Aspergillus, PLÁSMIDOS Y OLIGONUCLEÓTIDOS 

UTILIZADOS. 

3.2.1 Cepas de Aspergillus nidulans. 

Las cepas utilizadas en esta tesis doctoral se enumeran en la Tabla M1. Todas 

las estirpes portan la mutación veA1 de pérdida de función en VeA (Velvet), que causa 

la conidiación profusa en ausencia de luz [100]. Los marcadores se describen en [101]. 

 

Nombre Características Origen 

MAD782 pygG89, yA2, pabaA1 Dr.Herb Arst 

MAD997 pantoB100, PacC
c
700, PacC

+/-
70001 Dr.Herb Arst 

MAD1065 MoR19, PacC
c
700, PacC

+/-
70001, pantoB100 Dr.Herb Arst 

MAD1066 MoR21, PacC
c
700, PacC

+/-
70001, pantoB100 Dr.Herb Arst 

MAD1067 MoR24, PacC
c
700, PacC

+/-
70001, pantoB100 Dr.Herb Arst 

MAD1123 pabaA1, pyrG89, MoR24, sltA Dr.Herb Arst 

MAD1124 MoR24, pabaA1, pyrG89 Dr.Herb Arst 

MAD1151 yA2, adE20, phenA2, MoR24, pantoB100 Dr.Herb Arst 

MAD1400 glrA, PacC
c
700::GFP, pantoB100 Dr.Herb Arst 

MAD1440 inoB2, glrA Dr.Herb Arst 

MAD1739 pyroA4, pyrG89, nkuA::argB Dr.Herb Arst 

MAD2471 argB2((argB*-gpdA
p 
GFP(pHdomPLCδ1)2) pabaA1, yA2 Dr.Herb Arst 

MAD2736 yA2, pabaA1, trkB::pyrG
AF

 Dr.Herb Arst 

MAD2922 pyroA4, ckiA2, yA2 Ane Markina 

MAD3112 biA1, yA2, pabaA1, pyrG89, nkuA::argB, niiA4, halA24, sltA1 Dr.Herb Arst 

MAD3210 pabaA1, trkB::GFP::pyrG89
AF

, MoR24 Ane Markina 

MAD3231 halA::pyr-4 (HF27c) Dr.Herb Arst 

MAD3232 inoB2, pyroA4, trkA::paba
AF

, niiA4 Dra.Helen Findon 

MAD3233 yA2, halA::pyr-4, trkA::paba
AF

, niiA4 Dra.Helen Findon 

MAD3234 halA::GFP::pyrG
AF

, pyroA4, nkuA::argB Esta tesis 

MAD3235 halA::(HA)3::pyrG
AF

, pyroA4, nkuA::argB Esta tesis 

MAD3236 halA::GFP::pyrG
AF

, hhoA::mch::pyroA
AF

, nkuA::argB Esta tesis 

MAD3237 pyroA4, trkC::pyrG
AF

, nkuA::argB Esta tesis 

MAD3238 trkB::(Myc)3::pyrG
AF

, pyroA4 Esta tesis 

MAD3239 trkB::(Myc)3::pyrG
AF

, pabaA1, halA24 Esta tesis 

MAD3240 trkB::GFP::pyrG
AF

, wA4, inoB2, pyroA4, (Myc)3-PacC(pacC900) Ane Markina 

MAD3241 MoR24, pabaA1, pyrG89, pAMA Esta tesis 

MAD3242 MoR24, pabaA1, pyrG89, pAMA-trkA Esta tesis 

MAD3243 MoR24, pabaA1, pyrG89, pAMA-halA Esta tesis 

MAD3244 pyroA4, pyrG89, nkuA::argB, pAMA Esta tesis 

MAD3245 pyroA4, pyrG89, nkuA::argB, pAMA-trkA Esta tesis 

MAD3246 pyroA4, pyrG89, nkuA::argB, pAMA-halA Esta tesis 

 

 

Tabla M1. Cepas de Aspergillus nidulans utilizadas en esta tesis doctoral.  

 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[47] 

3.2.2 Plásmidos utilizados en Aspergillus nidulans. 

 

Los plásmidos indicados a continuación se utilizaron como moldes para obtener 

los DNAs codificantes para las distintas etiquetas con las que poder marcar 

fluorescentemente o con epítopos a las proteínas de interés. Estos fragmentos se 

obtuvieron mediante PCR utilizando los oligonucleótidos específicos para cada gen, 

normalmente denominados GFP 1-2 + nombre del gen.  

 p1439: Plásmido utilizado para hacer el etiquetado carboxilo terminal con GFP de una 

proteína cualquiera. Es un vector TOPO en el que se ha clonado un conector de 

5xglicina-alanina, seguido de GFP en fase y de un fragmento genómico en el que se 

encuentra el locus pyrG de Aspergillus fumigatus. Este plásmido fue cedido por el Prof. 

S. Osmani (Ohio University. USA). 

p1503: Plásmido construido para etiquetar proteínas en el extremo carboxilo terminal 

con el epítopo HA3x. Basado en los plásmidos de S. Osmani para realizar 

reemplazamientos génicos. Tiene las mismas regiones flanqueantes que p1439. Este 

plásmido fue obtenido por el Dr. E. Espeso (CIB-CSIC-Madrid). 

p1827: Plásmido utilizado para hacer el etiquetado carboxilo terminal con CherryRed 

de una proteína cualquiera. Basado en los plásmidos del Prof. S. Osmani para realizar 

reemplazamientos génicos. Tiene las mismas regiones flanqueantes que p1439. Este 

plásmido fue cedido por la Dra. H. Findon (Imperial College, London). 

p1874: Plásmido utilizado para hacer el etiquetado carboxilo terminal con Myc3x de 

una proteína cualquiera. Basado en los plásmidos de S. Osmani para realizar 

reemplazamientos génicos. Tiene las mismas regiones flanqueantes que p1439. Este 

plásmido fue obtenido por la Dra. A. Hervás (CIB-CSIC-Madrid). 

 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[48]   

3.2.3 Oligonucleótidos utilizados en esta tesis doctoral. 

 

Los oligonucleótidos sintéticos se diseñaron con el programa informático Vector 

NTi 8 y fueron suministrados por Sigma. Los oligonucleótidos utilizados en esta tesis se 

describen en la Tabla M2. 

NOMBRE SECUENCIA 5´- 3 SECCIÓN 

DHalA1 AGGCGGCCGCCATCGTCAATGCACAGCC 4.5 

DHalA2 GGGGATCCGTGCGGTGAGTAGTAATGAAACAGG 4.5 

DHalA3 GGGGATCCTATTCCCTTGCATTTCAG 4.5 

GSP1HalA GCAACGTCACAGATCTCTAGC 4.7/4.8 

GSP2HalA GAAGCCTTCCTCACCCGC 4.7/4.8 

GSP3HalA TATTCCCTTGCATTTCAGATAGC 4.7/4.8 

GSP4HalA ATGGCTAGATATGCTGCGAGTC 4.7/4.8 

GFP1HalA GCGGGTGAGGAAGGCTTCGGAGCTGGTGCAGGCGCTGG 4.7/4.8 

GFP2HalA GCTATCTGAAATGCAAGGGAATACTGTCTGAGAGGAGG

CACTGATGC 

4.7/4.8 

SA1 CAGCCTTGCGCTGTAGGCT 4.4 

SA2 CGTCCTTCATTGTGCGTTC 4.4 

SA3B CACCATCTGAAGAGTACCC 4.4 

SA5 CTCATGGTTAAGTTGGACG 4.5 

PP1TrkB ATTCCACCACGGCGAGCTGCTGAATAAGG 4.9.3 

PP2TrkB CGGACCAGGACGAGAAGTGGTGTGGACTTG 4.9.3 
GSP1TrkB CGACCAATCTGAGCCTCG 4.9.6 
GSP2TrkB TCGCTGCGACTGTTGCG 4.9.6 
GFP1TrkB CGCAACAGTCGCAGCGGAGCTGGTGCAGGCGCTGGAGC 4.9.6 
GFP2TrkB GTTGGAGTTGTGTCGGCCTCGTGAGCGTAAGTCTGAGA

GGAGGCACTGATGCG 

4.9.6 

GSP3TrkB TTACGCTCACGAGGCCGACACAACTCCAAC 4.9.6 
GSP4TrkB ACGCCTCCATTAGTCGCGAGAGGAGACAGA 4.9.6 
SMP1TrkB CAAGTCCACACCACTTCTCGTCCTGGTCCGACCGGTCGC

CTCAAACAATGCTCT 

4.9.3 

GSP1H1 CTACAGTTGAGCCTATGCACAAG 4.8 
GSP2H1 GGCCTTCTTGTTCTTAGCAGTC 4.8 
GFP1H1 GACTGCTAAGAACAAGAAGGCCGGAGCTGGTGCAGGCG

CTGGAGCC 

4.8 

GFP2H1 CCAAGCCAGGCTGCCTGTCTGTCTGAGAGGAGGCACTG

ATGC 

4.8 

GSP3H1 ACAGGCAGCCTGGCTTGG 4.8 
GSP4H1 GCAACAGTCGACAGCACAGC 4.8 
PP1TrkC CTGACGCTCTCTTCGATCGAACCC 4.9 
PP2TrkC CTTGGGCCTGGAATTGTTTGAGTTCTT 4.9.3 

SMP1TrkC AAGAACTCAAACAATTCCAGGCCCAAGACCGGTCGCCT

CAAACAATGCTCTTCACC 

4.9.3 

GFP2TrkC CCCTCCATGACCCGTGAGTGTTTCCGTCTGAGAGGAGGC

ACTGATGCGTGATGCC 

4.9.3 

GSP3TrkC GGAAACACTCACGGGTCATGGAGGG 4.9.3 
GSP4TrkC TTATTGGCATGGCAGTGAAGCGG 4.9.3 

TrkCNorthUP CCGATGCCTTGTTTATGTGCG 4.9.2 
TrkCNorthD CTCCACAGAATGACAGATCCC 4.9.2 

 

 
Tabla M2: Oligonucleótidos utilizados en esta tesis doctoral. 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[49] 

3.2.4 Generación de casetes mediante PCRs de fusión. 

 

Los fragmentos de DNA utilizados para generar las cepas mutantes con los 

alelos nulos o que expresen proteínas fusionadas a distintas etiquetas fueron obtenidos 

mediante PCRs de fusión según el protocolo descrito por Yang [13]. A continuación se 

detallan las diferentes construcciones realizadas junto con los oligonucleótidos 

utilizados en cada caso. 

 

3.2.4.1 Construcciones utilizadas para la generación de alelos nulos. 

La figura M1 es un esquema representativo del proceso seguido para generar los 

diferentes casetes de transformación. Un casete de transformación para generar un alelo 

nulo se compone de una región 5’ no codificante, de aproximadamente 1 kb del gen 

diana y de una región 3’ no codificante, del mismo tamaño (terminador) de dicho gen, 

fusionadas ambas al gen marcador de selección (se utilizó el gen pyrG de A. fumigatus).  

En los casetes para el etiquetado con epítopos o proteínas fluorescentes se substituye el 

fragmento 5’UTR por un fragmento genómico correspondiente a la región 3´ de la 

secuencia codificante del gen diana, donde se ha eliminado el codón de parada. En todos 

los casos, cada fragmento de DNA fue amplificado por separado (figura M1) y después 

se realizó la fusión de los fragmentos. Para llevar a cabo estas amplificaciones se utilizó 

la polimerasa Prime Star® HS DNA polimerase (Takara). Las condiciones de PCR 

fueron las indicadas en la tabla M3, con ligeras variaciones en función de los 

oligonucleótidos empleados y el tamaño esperado del “amplicón”. Todas las 

construcciones se transformaron en la cepa MAD1739. 

 

 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[50]   

DNAs ………….………………………..0,5 µg de cada uno de ellos 

Oligonucleótidos…………………….….0,5 µM de cada uno de ellos 

Mezcla de dNTPs…………………………………………….200 µM 

Tampón de la enzima……………………………………………10µL 

Enzima polimerasa……………………..…….0,3µL (2,5 unidades/µL) 

H2O……………………………..……………………….…hasta 50µL 

 

Condiciones generales de los ciclos de PCR: 

 

98ºC  2min 

 

98ºC             10seg |  

55ºC               5seg |  x10 ciclos 

72ºC              4min | 

 

98ºC                10seg | 

58ºC                 5seg |  x15 ciclos 

72ºC              4min* | 

 

72ºC        5min 

 

4ºC     mantenimiento  

  

 *  +20sec de extensión en cada ciclo 

 

 

• ΔtrkC: La región correspondiente al promotor de trkC se amplificó con los 

oligonucleótidos PP1trkC y PP2trkC, la región correspondiente al terminador de trkC se 

TablaM3: Condiciones generales para generar fragmentos de fusión por PCR 

 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[51] 

amplifico con los oligonucleótidos GSP3trkC y GSP4trkC, y el gen pyrGAfum
 se 

amplificó con los oligonucleótidos SMP1trkC y GFP2trkC, utilizando como molde el 

plásmido 1439. Para realizar la fusión de los tres fragmentos se añadieron a la mezcla de 

reacción los oligonucleótidos de los extremos, PP1trkC y GSP4trkC. 

 

 

 

 

 

Figura M1: Estrategia para generar casetes de transformación mediante PCR de fusión. A) 

Casete para generar alelos nulos. B) Casete para generar formas etiquetadas. Cada uno de los 

fragmentos es amplificado por separado mediante PCR con una pareja de oligonucleótidos 

específicos (con las siglas GSP, GFP y SMP-1). El fragmento central, pyrGAfum o 

gfp::pyrGAfum, es amplificado con una pareja de oligonucleótidos que llevan una región 

complementaria a los fragmentos con los que se va a fusionar.  
 



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[52]   

3.2.4.2 Construcciones utilizadas para la generación de cepas que expresan 

proteínas fusionadas diferentes etiquetas. 

 

• HalA::GFP: La región correspondiente al extremo 3’ de la región codificante de halA 

se amplificó con los oligonucleótidos GSP1HalA y GSP2HalA, la región 

correspondiente al terminador de halA se amplifico con los oligonucleótidos GSP3HalA 

y GSP4HalA, y el fragmento gfp::pyrGAfum se amplificó con los oligonucleótidos 

GFP1HalA y GFP2HalA, utilizando como molde el plásmido 1439. Para realizar la 

fusión de los tres fragmentos se añadieron a la mezcla de reacción los oligonucleótidos 

que aparean en las posiciones más extremas de los fragmentos flanqueantes, GSP1HalA 

y GSP4HalA. 

• HalA::3xHA: La región correspondiente al extremo 3’ de la región codificante de 

halA se amplificó con los oligonucleótidos GSP1HalA y GSP2HalA, la región 

correspondiente al terminador de halA se amplificó con los oligonucleótidos GSP3HalA 

y GSP4HalA, y el fragmento 3xHA::pyrGAfum se amplificó con los oligonucleótidos 

GFP1HalA y GFP2HalA, utilizando como molde el plásmido 1503. Para realizar la 

fusión de los tres fragmentos se añadieron a la mezcla de reacción los oligonucleótidos 

de los extremos, GSP1HalA y GSP4HalA. 

• Histona HHO::CH: La región correspondiente al extremo 3’ de la región codificante 

de hhoA (AN2765), codificante de la histona H1 se amplificó con los oligonucleótidos 

GSP1H1 y GSP2H1, la región correspondiente al terminador de hhoA se amplifico con 

los oligonucleótidos GSP3H1 y GSP4H1, y el fragmento cherry::pyroA4 se amplificó 

con los oligonucleótidos GFP1H1 y GFP2H1 utilizando como molde el plásmido 1827. 

Para realizar la fusión de los tres fragmentos se añadieron a la mezcla de reacción los 

oligonucleótidos de los extremos, GSP1H1 y GSP4H1. 



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[53] 

• TrkB::3xMyc: La región correspondiente al extremo 3’ de la región codificante de 

trkB se amplificó con los oligonucleótidos GSP1trkB y GSP2trkB, la región 

correspondiente al terminador de trkB se amplifico con los oligonucleótidos GSP3trkB 

y GSP4trkB, y el fragmento 3xmyc:: pyrGAfum se amplificó con los oligonucleótidos 

GFP1trkB y GFP2trkB, utilizando como molde el plásmido 1874. Para realizar la fusión 

de los tres fragmentos se añadieron a la mezcla de reacción los oligonucleótidos de los 

extremos, GSP1trkB y GSP4trkB. 

 
 

3.3. TÉCNICAS DE Aspergillus nidulans. 

3.3.1 Mantenimiento y cultivo de estirpes. 

 

El medio MCA sólido (véase Materiales y Métodos, apartado 3.1.1.2), con los 

requerimientos necesarios, se utilizó para el mantenimiento vegetativo de las cepas y la 

obtención de conidiosporas.  

 

3.3.2 Transformación de A. nidulans. 

 

La transformación se realizó siguiendo el protocolo descrito por Tilburn y 

colaboradores [102]. Se inocularon 2x10
6
 conidiosporas en 400mL de medio mínimo 

que contenían como fuente de nitrógeno tartrato amónico 5mM y D-glucosa al 1% 

como principal fuente de carbono, añadiendo los requerimientos apropiados para cada 

cepa. El cultivo se incubó durante 16-18 h a 30ºC y el micelio se recolectó por filtración 

y se lavó con agua destilada estéril. Se resuspendió 1g de micelio en 20mL de tampón 

de protoplastos frío y estéril. El tratamiento para destruir la pared celular se realizó con 

la mezcla de enzimas Vinoflow® (Novozymes) a la concentración de 150mg de 



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[54]   

Vinoflow por cada gramo de micelio.  La mezcla de digestión se incubó durante 5 

minutos en hielo y posteriormente a 30ºC durante 1 a 2 h con agitación suave. A partir 

de los 90 minutos de digestión la formación de protoplastos se comprobó con un 

microscopio en diferentes momentos. Para purificar los protoplastos se depositó la 

suspensión en dos tubos estériles de 50mL y se cubrió, sin mezclar, con un volumen 

igual de la solución estéril colchón de flotación enfriada a 0ºC. Los tubos con la 

solución bifásica se centrifugaron a 4ºC durante 10 minutos a 4000g en el rotor 

basculante A-4-44 (Eppendorf 5810R). Los protoplastos, que forman una banda en la 

interfase, se recogieron con una pipeta Pasteur estéril. A partir de este punto se 

realizaron diferentes lavados de los protoplastos, diluyéndolos inicialmente con 2 

volúmenes de solución ST y centrifugando posteriormente a 2800g durante 10 minutos 

a 4ºC en el rotor A-4-44. Se eliminó el sobrenadante por decantación y se lavó el 

sedimento de protoplastos con 1mL de solución ST, resuspendiéndolos y 

centrifugándolos nuevamente a 5.000 r.p.m., repitiendo este proceso tres veces. Después 

de estos lavados, se determinó la concentración de protoplastos ajustándola a 5x10
8
 

protoplastos/mL mediante concentración o dilución con solución STC. En un tubo de 

50mL estéril se mezclaron cuidadosamente 200 μl de esta suspensión con 1 a 3 μg DNA 

añadiéndose a continuación 50μl de la solución de PEG. La mezcla de transformación 

se incubó 20 minutos en hielo y a continuación se añadió 1mL de solución PEG 

mezclando enérgicamente e incubando a temperatura ambiente durante 5 minutos 

adicionales.  

Finalmente se añadieron 5mL de solución STC a cada tubo, se mezcló 

suavemente y se añadieron 15mL de “Top agar” fundido y atemperado a 48ºC a cada 

tubo, mezclándose las dos soluciones mediante inversión y repartiendo 5mL de la 



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[55] 

mezcla por la superficie de cada placa de medio de regeneración con los requerimientos 

adecuados. 

 

3.3.3 Análisis fenotípicos mediante crecimiento en medio sólido. 

 

Estos análisis se realizaron sobre MMA sólido (ver apartado 3.1.1.1 de esta 

sección) con agar (Oxoid), suplementos adecuados. Los resultados se evaluaron tras 1-2 

días de crecimiento a 37ºC. 

 

3.3.4 Cruces entre estirpes de Aspergillus 

Para favorecer la anastomosis entre hifas de dos estirpes parentales distintas, los 

cruces se realizaron mediante inóculos puntuales de ambas estirpes en una misma placa 

de MCA suplementado con los requerimientos de las dos cepas. Los parentales tenían 

distintos requerimientos nutricionales e, idealmente, distintos marcadores de color de 

las esporas para facilitar la identificación de los cleistotecios híbridos una vez observada 

la progenie. Una vez favorecida la anastomosis, 2-3 días de crecimiento a 37 ºC, se 

recortaron pequeñas porciones de medio sólido en las zonas donde habían entrado en 

contacto las hifas de ambos parentales. Estas porciones se traspasaron a placas de MMA 

selectivo, que permite sólo el crecimiento de los heterocariontes, suplementado con 

glucosa al 1% como fuente de carbono y tartrato amónico 5 mM y nitrato sódico 10 

mM como fuentes de nitrógeno.  

Las placas se incubaron a 37 ºC hasta que se formaron sectores heterocarióticos. 

Para favorecer la entrada en ciclo sexual, las placas de MMA con los sectores 

heterocarióticos se sellaron con cinta de celo con la finalidad de inducir estrés por 



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[56]   

anaerobiosis. Los cleistotecios se formaron a lo largo de los 10-15 días de incubación a 

37 ºC. Estos se recogieron de la placa con una aguja estéril utilizando una lupa. Los 

cleistotecios se limpiaron de las células de Hülle que poseen adheridas a su superficie 

rodándolos sobre agar al 1,5% solidificado. Posteriormente, cada cleistotecio se 

introdujo en un tubo de 1,5mL con 100 μl de agua estéril y se rompió contra las paredes 

del tubo para liberar las ascosporas. Para comprobar si el cleistotecio era híbrido se 

inocularon 5 μl de esta solución de ascosporas sobre una placa de MMA selectivo para 

ambas cepas parentales en busca de progenie recombinante. Las placas se analizaron 

tras cultivarlas dos días a 37 ºC. Los cleistotecios que no procedían de un evento de 

cruzamiento sexual entre las dos cepas parentales fueron descartados.  

3.4. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR, BIOQUÍMICA Y 

PROTEÓMICA. 

 
3.4.1 Extracción de proteínas totales de A. nidulans. 

 

Los extractos proteicos totales de las distintas cepas de A. nidulans se obtuvieron 

a partir de 200-250mg de micelio húmedo. El micelio de las diferentes cepas fue filtrado 

con un filtro Miracloth (Calbiochem 475855), congelado en nieve carbónica y 

liofilizado durante 18h en un liofilizador Cryodos (Telstar). El micelio liofilizado, 

depositado en un tubo de tapón de rosca de 2mL se trituró con una bola de cerámica de 

0,55 cm utilizando un molino (FP120 Fast Prep Cell Disruptor de BIO101/Savant) con 

un pulso de 10 segundos a fuerza 4,0. A continuación se añadió 1 mL de tampón de 

extracción de proteínas NP40, se resuspendió el polvo de micelio y se incubó durante 

1,5 horas a 4ºC con agitación por inversión utilizando una rueda giratoria. Las muestras 

se centrifugaron durante 30 minutos a 14.000g y 4ºC, se recogió el sobrenadante y se 



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[57] 

midió la concentración de proteína mediante el método de Bradford [103]. Los extractos 

proteicos se guardaron a -80ºC hasta su utilización.  

Para los ensayos de “Western-blot” se precipitaron 50μg de proteína con ácido 

tricloroacético (TCA), concentración final 10% (v/v), y se lavaron con 1mL de la 

mezcla Etanol/Éter 1:1 y con 1mL de la mezcla 1:3 sucesivamente. Una vez 

precipitadas se resuspendieron en 40µL de tampón de carga de geles de 

poliacrilamida/SDS y se desnaturalizaron por calentamiento a 100ºC durante 5 minutos. 

 

3.4.2 Ensayos de inmunodetección de proteínas, “Western Blot”. 

 

Las muestras precipitadas se resuspendieron en 40 μl de tampón de carga de 

geles de SDS y se desnaturalizaron hirviéndolas a 100ºC durante 5 minutos. La 

separación electroforética se realizó en geles desnaturalizantes de SDS-poliacrilamida 

[104].  

El protocolo de “Western Blot” utilizado fue el descrito por Orejas y 

colaboradores [46]. Las proteínas etiquetadas se detectaron, según el caso, con los 

anticuerpos primarios detallados en la tabla 3. Se utilizó el anticuerpo secundario 

adecuado a la especie en la que se generó el anticuerpo primario. En todos los casos los 

anticuerpos secundarios utilizados estaban conjugados a la peroxidasa de rábano (Tabla 

3). La actividad peroxidasa se detectó utilizando el sistema de quimioluminiscencia 

ECL (Amersham). Las imágenes se obtuvieron mediante un analizador de imágenes de 

quimioluminiscencia 06-LAS3000Q (TDI) y se analizaron con el programa Multi 

Gauge V3.0 (Fujifilm). 

 



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[58]   

 

 

 

 

 

3.4.3 Fraccionamiento celular. 

Los primeros pasos son comunes con el proceso de obtención de protoplastos 

para transformación, aun así se repiten aquí para describir el protocolo completo. Las 

soluciones también son las mismas y están descritas anteriormente. 

Se inocularon 2x10
6
 esporas en 400 mL de medio mínimo con fuentes de 

carbono y nitrógeno así como con los suplementos necesarios en un matraz de 2L (ver 

sección 3.3.2). El cultivo se incubó durante 16h a 30ºC con agitación orbital. Se recogió 

el micelio usando un filtro miracloth estéril y se lavó con agua estéril, secándose 

Tabla M4: Anticuerpos primarios y secundarios utilizados en esta tesis doctoral. En 

la tabla se indica tanto la dilución del anticuerpo como la fuente y la referencia del 

mismo. 
 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[59] 

posteriormente. A continuación se resuspendió 1 g de micelio en 20 mL de solución TP 

y se añadió 150 mg/g de enzima Vinoflow. La mezcla se agitó vigorosamente utilizando 

un “vortex” y se incubó 5 minutos a 0ºC. El micelio se depositó en un matraz de 100mL 

y se incubó a 30ºC en agitación suave hasta la obtención de protoplastos, 

aproximadamente 90 minutos adicionales. La suspensión de protoplastos se dispuso en 

tubos adecuados para una posterior centrifugación y se añadió el mismo volumen de 

solución colchón lentamente si mezclar. La solución bifásica se centrifugó a 4000 r.c.f 

durante 10 minutos a 4ºC. Se recogió el halo de protoplastos localizados en la interfase 

formada, se depositaron en un tubo adecuado y se añadió 2 volúmenes de solución ST 

mezclando por inversión. Los protoplastos fueron recolectados centrifugando a 2800 

r.c.f durante 10 minutos a 4ºC. Se decantó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 

1mL de solución STC.  

A partir de este punto se desarrolla el protocolo específico de fraccionamiento 

celular. Se añadió 1mL de tampón de lisis de protoplastos frío y los protoplastos se 

lisaron utilizando un “Dounce” mediante 20 pasos enérgicos del émbolo. Del mililitro 

de lisado se separó 50µL que fueron mezclados con 80 µL de tampón de carga de geles 

de SDS, denominándose a esta mezcla como extracto total, indicada como ET en los 

experimentos. El resto de lisado se centrifugó a 300g durante 5 minutos a 4ºC. Se 

separó el sobrenadante del sedimento y a este último se resuspendió en 100µL de 

tampón de carga de geles de SDS. De esta forma se obtuvo la fracción correspondiente a 

las membranas y a los grandes agregados celulares, denominada como P0,3k. El 

sobrenadante se centrifugó nuevamente a 13.000g durante 15 minutos a 4ºC. Al 

sedimento obtenido se resuspendió en 400µL de tampón de lisis de protoplastos y 40µL 

de TCA y se precipitaron las proteínas siguiendo el protocolo descrito en el apartado 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[60]   

3.4.1. En este extracto proteico se encuentran proteínas procedentes de membranas y del 

interior de los distintos orgánulos, y se le denominó P13k. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

El sobrenadante de la centrifugación anterior se pasó a un tubo de policarbonato 

indicado para un rotor de ángulo fijo TLA-100.2. El nuevo paso de sedimentación se 

realizó centrifugando a 100.000g durante 1 hora y 5 minutos a 4ºC usando una 

ultracentrífuga Beckman TL100. El sobrenadante fue recogido y las proteínas presentes 

se precipitaron utilizando el protocolo de precipitación con TCA. De esta forma se 

obtuvo la fracción correspondiente a las proteínas solubles citoplasmáticas, identificada 

como SB100k. El sedimento obtenido se resuspendió en 400µL de tampón de lisis de 

Figura M2: Representación de los pasos a seguir en un fraccionamiento celular. Tras 

cada centrifugación se van obteniendo las distintas fracciones celulares indicadas en la 

figura. 
 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[61] 

protoplastos y las proteínas se precipitaron con TCA. En esta fracción se encuentran, 

principalmente, vesículas de transporte y restos de membranas endosomales y del 

complejo de Golgi. A esta fracción se la denominó P100K. La presencia de las proteínas 

de interés en cada una de las diferentes fracciones se caracterizó siempre mediante la 

técnica de “Western-blot” (ver apartado 3.4.2). 

 

3.4.4 Extracción de DNA en Aspergillus.  

 

El protocolo de aislamiento de DNA se inició con un cultivo en medio mínimo 

del hongo. Cada cepa se creció inoculando 20mL de MMA con 1mL de una solución de 

2x10
6
 conidiosporas en Tween 10

-4
, e incubando a 37ºC durante 16 hrs. El micelio se 

recogió con un filtro de miracloth, se eliminó el medio residual prensándolo y 200mg se 

liofilizaron en tubos de tapón de rosca de 2mL. El micelio liofilizado se pulverizó 

utilizando una bola de cerámica de 0,55cm y el molino FastPrep Cell Disruptor de 

BIO101/Savant con un pulso de 20 segundos y potencia 4,0 de agitación. El micelio 

pulverizado se resuspendió en 1mL de la solución de extracción de DNA. Una vez 

resuspendido se añadieron 100μl de SDS al 10%, para evitar la formación de excesiva 

espuma durante el proceso y a continuación se incubó 15 minutos a 65ºC para liberar 

los ácidos nucléicos al medio. El lisado obtenido se trasvasó a otro tubo para realizar 

una extracción fenólica de proteínas y restos celulares adicionando 1mL de la solución 

denominada Fenol/SEVAG e incubándolo durante 15 minutos con fuerte agitación a 

temperatura ambiente. Tras esta incubación se centrifugaron las muestras 5 minutos a 

temperatura ambiente a máxima velocidad. Posteriormente se recogió la fase superior y 

se transvasó a otro tubo donde se repitió el proceso de fenolización añadiendo 1mL de 

la solución fenol/SEVAG e incubando nuevamente durante 15 minutos con agitación 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[62]   

fuerte a temperatura ambiente. Después de la segunda fenolización se adicionaron 3M 

acetato sódico (pH= 6) en una proporción 1/10 y 0,6 volúmenes de isopropanol respecto 

al volumen recogido previamente para precipitar los ácidos nucléicos presentes en la 

muestra. Tras una incubación de 15 minutos se centrifugó la muestra y se lavó el pellet 

por inversión con 1mL de etanol a 80%. A continuación se procedió a eliminar el RNA 

presente en la muestra. Para ello se resuspendieron los ácidos nucléicos en 300-500μl de 

agua Milli-Q y 1 μl/100μl de RNAsa (libre de DNAsa) 5mg/mL y se incubó a 37ºC 

durante 1 hora. Como último paso se añadieron acetato sódico 3M (pH= 6) en una 

proporción 1/10 y 0,6 volúmenes de isopropanol para recoger el DNA precipitado. Este 

DNA se lavó con 500μl de etanol al 80% para ser resuspendido finalmente en 200μl de 

agua Milli-Q. 

 

3.4.5 Análisis de DNA por el método de Southern. 

 

Una vez aislado el DNA de las cepas a analizar (siguiendo el protocolo descrito 

en el apartado 3.4.3) se digirió el DNA con una enzima de restricción que permitía 

diferenciar unas cepas de otras por los diferentes tamaños de bandas obtenidos (ver 

detallado el apartado de resultados) y con el tampón correspondiente a esa enzima 

completando el volumen final con agua hasta 40μl. Esta digestión se llevó a cabo a 37ºC 

durante aproximadamente 16 horas. El producto de la digestión se corrió en un gel de 

agarosa al 0,8% con una diferencia de potencial de 90-110 voltios. El gel se sumergió 

en una solución de bromuro de etidio (0,5 µg/mL) durante 15 minutos, se fotografió y 

después se rompió el DNA con una exposición de 10 minutos en un transiluminador de 

UV (BioRad GelDoc System). Tras este proceso el gel se incubó con solución 

desnaturalizante (NaCl 1,5M, NaOH 0,5M) durante 45 minutos a temperatura ambiente 



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[63] 

y en agitación. Después se lavó con agua y se incubó con solución neutralizante 

(TrisHCl 0,5M pH7,5, NaCl 3M) durante 40 minutos a temperatura ambiente y en 

agitación. Tras esta segunda incubación se lavó el gel con tampón 2xSSC y se preparó 

una transferencia del DNA a una membrana de Nylon. Una vez que el DNA se había 

transferido a la membrana, aproximadamente 16 horas, se fijó el DNA a la membrana 

exponiendo ésta 5 minutos a luz UV utilizando un transiluminador (Biorad modelo 

GelDoc). A continuación la membrana se hidrató en 2xSSC y se incubó en 50 mL de 

tampón “Church” (ver apartado 3.1.3) durante 2 horas a 55º C en un horno de 

hibridación Red Roller II (Pharma Biotech). Transcurridas esas 2 horas se retiró el 

tampón Church y se añadió 50mL de solución Church fresca que contenía la sonda 

marcada radiactivamente la cuál había sido previamente desnaturalizada a 95ºC durante 

10 minutos. La membrana se incubó con la sonda radioactiva durante aproximadamente 

16 horas a 55ºC. Finalmente se lavó el filtro durante 15 minutos a 55ºC con 60mL de 

2xSSC/0,1 % SDS y posteriormente con 60 mL de 0,2xSSC/0,1 % SDS. Para visualizar 

las bandas de hibridación se utilizó un sistema de análisis de imágenes Phosphorimager 

Fujifilm FLA-3000. 

 

3.4.6 Análisis del RNA por el método de Northern Blot. 

 

Se recogieron 10
6
 conidiosporas en Tween 10

-4
 y se inocularon en el medio 

necesario durante toda la noche a 30ºC en agitación. Para todo el proceso de extracción 

del RNA total se recomienda siempre realizar todo el proceso refrigerado con hielo para 

evitar la degradación del RNA. 



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[64]   

Se recogió el micelio en condiciones estériles mediante filtración a través de 

miracloth, se eliminó el medio sobrante y se el hongo se congeló con nitrógeno líquido 

durante, al menos, 10 minutos. En caso de no utilizarse inmediatamente, las muestras 

así congeladas se guardaron a -80ºC. En un mortero previamente enfriado con nitrógeno 

líquido se trituró el micelio congelado y se transfirieron aproximadamente 300mg de 

micelio a un tubo de 2mL. A cada tubo se le añadió 1mL de solución TriReagent 

(Fluka-Sigma) siendo posteriormente incubados los tubos 5 minutos a temperatura 

ambiente. Se añadieron 0,2mL de cloroformo y se incubó durante tres minutos a 

temperatura ambiente. A continuación se procedió a centrifugar los tubos durante 15 

minutos a 12000g a una temperatura de 4ºC y se transfirió la fase acuosa otros tubos 

nuevos. A continuación se añadieron 0,75mL de solución TriReagent (Fluka-Sigma) y 

se incubaron los tubos 5 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 0,2mL de 

cloroformo y se incubo durante tres minutos a temperatura ambiente. A continuación se 

procedió a centrifugar los tubos durante 15 minutos a 12.000g a una temperatura de 4ºC 

y se transfirió la fase acuosa otros tubos nuevos. A esta segunda fase acuosa se le 

añadieron 0,5mL de isopropanol y se incubó a temperatura ambiente durante 10 

minutos, mezclando periódicamente los tubos por inversión. Finalmente, se 

centrifugaron los tubos a 12.000g, durante 10 minutos a 4ºC, tras los cuales, precipitó el 

RNA. Como último paso en la extracción, se eliminó el sobrenadante por vacío y se 

añadió 1mL de una solución de etanol en agua al 75% la cual está tratada con DEPC 

(Dietilpirocarbonato, Sigma). Tras mezclar y disolver el pellet de RNA, se centrifugaron 

las muestras a 7.500g, durante 5 minutos, a 4ºC. Se volvió a eliminar el pellet con vacío 

y se redisolvieron las muestras en 20-200µL de agua tratada con DEPC (libre de 

RNAsa). Se incubó a 55-60ºC para ayudar a disolver el pellet. Rápidamente se 

congelaron los tubos en nitrógeno líquido y posteriormente se guardan a -80ºC. 



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[65] 

Las muestras se prepararon añadiendo a cada muestra, 12,5µL formamida 

(MERCK), 2,5µL 10xMOPs, 4µL formalina (formaldehido al 33%), 10µL RNA. Se 

desnaturalizaron las muestras durante 10 minutos a 65ºC. A continuación se corrieron 

las muestras de RNA en un gel de agarosa al 0,8% con H2O-DEPC, 10mL 10xMOPS y 

18mL de formalina a 30V. El gel se tiñó durante 15 minutos con bromuro de etidio y se 

lavó con H2O destilada. A continuación se preparó la transferencia del gel a una 

membrana de nylon y se siguieron los mismos pasos para generar la sonda, hibridación, 

lavados y visualización de las bandas de hibridación que los descritos en el protocolo de 

Southern Blot (apartado 3.4.5). 

3.5. Microscopía de fluorescencia y análisis de las imágenes. 

 

Las muestras se observaron mediante un microscopio de epifluorescencia Nikon 

80i, equipado con objetivos de 60 x y 100 x aumentos con 1,4 de apertura numérica, una 

lámpara de mercurio de 100 W, un filtro GFP-3035B (Semrock Brigthline) para la 

detección de la fluorescencia emitida por GFP y un filtro TXRED-4040B (Semrock 

Brigthline) para la detección de la fluorescencia emitida por mRFP, CherryFP o FM4-

64. Las imágenes fueron obtenidas con una cámara digital ORCA-ER (Hamamatsu 

Photonics) y se utilizaron los programas de obtención y tratamiento de imágenes 

Wasabi (Hamamatsu Photonics) y Metamorph (Molecular Devices). 

Para la observación de las muestras se inocularon 10μl de la solución de 

conidioesporas sobre la superficie de un cubre-objetos de vidrio redondo de 14mm de 

diámetro o cuadrado de 20x20mm (Menzel-Glaser), sumergido en 3mL de WMM, con 

D-glucosa 1% (p/v), tartrato amónico 5mM y los requerimientos necesarios, con objeto 

de evitar la precipitación de las sales de fosfato presentes en los elementos traza y su 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[66]   

interferencia en la observación al microscopio (véase Materiales y Métodos, apartado 

3.1.1.1) suplementada, de no indicarse lo contrario, con 25 mM NaH2PO4, quedando así 

ajustado el pH del medio en un valor próximo a 5,2. Los cubreobjetos se colocaron en 

placas de 12 ó 6 pocillos (Falcon) y se incubaron a temperatura ambiente (25ºC) durante 

aproximadamente 18 horas. Las células crecieron sobre la superficie del cubreobjetos 

quedándose fijadas a éste por la capacidad de adherencia de las células del hongo y, 

para su observación, el exceso de medio del cubreobjetos se escurrió sobre una 

servilleta y se dispuso éste sobre un portaobjetos para la observación directa al 

microscopio del hongo.  

 

3.6 KITS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y BIOQUÍMICA Y OTROS 

COMPONENTES COMERCIALES UTILIZADOS EN ESTA TESIS. 

3.6.1 Kits de Biología molecular y Bioquímica. 

 

Los ensayos realizados con los “kits” que a continuación se detallan fueron 

llevados a cabo siguiendo las instrucciones de los fabricantes, con mínimas 

modificaciones. 

FastDNA® Kit BIO101® Systems (Q-BIOgene): se utilizó para la extracción de DNA 

genómico de A. nidulans. 

QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen): se utilizó para la purificación de 

productos de PCR. 

QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen): se utilizó para la purificación de fragmentos 

de DNA procedentes de electroforesis en geles de agarosa. 



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[67] 

RediprimeTM II Random Prime Labelling System (Amersham Biosciences): se 

utilizó para el marcaje de fragmentos de DNA con dCTP [32P] que fueron 

posteriormente utilizados como sondas en ensayos de Southern-Blot. 

ProbeQuantTM G-50 Micro Columns (Amersham Biosciences): se utilizó para la 

limpieza de las sondas marcadas radiactivamente con el kit anterior. 

ECLTM Western Blotting Detection Reagents (Amersham Biosciences): se utilizó 

para la detección de anticuerpos conjugados a la peroxidasa de rábano en ensayos de 

Western Blot. 

 

3.6.2 Productos radioactivos. 

 

En las hibridaciones DNA-DNA se empleó [α-
32

P]-dCTP con una actividad 

específica de 3000Ci/mmol (“Amersham Biosciences Redivue Deoxycitidine 5´-

triphosphate, [α
32

P]”).  

 

3.6.3 Reactivos y Enzimas de biología molecular. 

 

Los reactivos químicos utilizados y los suplementos de los medios de cultivo 

fueron de calidad analítica, generalmente de las marcas Sigma, Fluka y Merck. Los 

componentes de origen microbiológico de los medios de cultivo utilizados fueron 

suministrados por Oxoid, Difco Laboratories o Pronadisa. Las enzimas de restricción 

utilizadas procedían de New England Biolabs, Roche o Takara. Los reactivos 

empleados en las reacciones de PCR fueron suministrados por Takara (Prime Star® HS 

DNA polimerase).  

 



MMAATTEERRIIAALLEESS  YY  MMÉÉTTOODDOOSS  

 

[68]   

3.7. Herramientas Bioinformáticas. 

Para la búsqueda de secuencias tanto genómicas como proteicas se usaron las 

bases de datos de A. nidulans, S. cerevisiae y S. pombe, Instituto Broad de Cambridge, 

Base de datos SGD e Instituto Sanger de Cambridge respectivamente. Los análisis de 

secuencias, tanto de nucleótidos como de aminoácidos, se realizaron mediante software 

de libre acceso. Las búsquedas en bases de datos se realizaron con el algoritmo BLAST 

[105]. Los alineamientos múltiples fueron realizados con el programa ClustalX [106] y 

el programa Genedoc facilitado por el Sistema de Recursos de Supercomputación 

Biomédica de Pittsburgh y corregidos manualmente. Para la realización de los árboles 

filogenéticos se utilizó el programa Mega 4. Para la realización y análisis de las distintas 

construcciones utilizadas en esta tesis se empleó el programa Vector NTI (Invitrogen). 

Finalmente para el modelado de proteínas se utilizó el programa Swiss-Model y la 

predicción de dominios transmembrana se realizó usando el programa TMHMM 

versión 2.0 facilitado por el Centro para Análisis de Secuencias Biológicas de la 

Universidad de Dinamarca. Para el análisis de los sitios de fosforilación se utilizó el 

programa informático NetPhos 2.0. 

Direcciones web utilizadas: 

Base de datos de A. nidulans: www.broad.mit.edu/annotation/fungi/aspergillus 

Base de datos de S. cerevisiae: www.yeastgenome.org 

Base de datos de S. pombe: www.sanger.ac.uk/Projects/S_pombe 

Genedoc: www.nrbsc.org/gfx/genedoc 

Mega4: www.megasoftware.net 

Swiss-Model: http://swissmodel.expasy.org 

 

http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/aspergillus
http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_pombe


 

 

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

RREESSUULLTTAADDOOSS  

  

  

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[71] 

4. RESULTADOS 

4.1 SELECCIÓN DE SUPRESORES DEL FENOTIPO DE 

SENSIBILIDAD AL MOLIBDATO CAUSADO POR LA 

MUTACIÓN pacC
+/-

 70001 

 

Uno de los fenotipos que exhiben las cepas con mutaciones de pérdida de 

función tanto en PacC como en los componentes de la ruta de señalización Pal es la 

sensibilidad a determinadas concentraciones del anión molibdato, MoO4
2-

. La cepa 

mutante pacC
+/-

70001 no es una excepción y de hecho es muy sensible a partir de una 

concentración de 10-20mM del anión molibdato en el medio de cultivo (25mM MoO4
2-

 

mostrado en figura R1 B).  

Utilizando como herramienta el fenotipo sensibilidad al molibdato causado por 

la mutación pacC
+/-

70001, se elaboró un sistema de selección de mutantes para la 

búsqueda de supresores extra- o intragénicos (esquematizado en figura R1 A). El 

objetivo principal fue el aislamiento de mutaciones que suprimieran específicamente la 

localización citoplásmica de la proteína mutante PacC70001 dando lugar a su 

acumulación nuclear y, por lo tanto, de nuevo un fenotipo de ganancia de función para 

PacC, dado que la proteína mutante PacC70001 es capaz de unir al DNA y así mediar su 

función transcripcional [96]. Se pronosticaron dos clases mayoritarias de mutantes, en 

primer lugar aquellos que portarían mutaciones en cis, entre las que se encontrarían 

aquellas que afectarían al residuo mutagenizado previamente (reversión intragénica) o 

en otras regiones de PacC5-250. En segundo lugar mutantes en trans.  



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[72]   

 

 

 

 

 

Figura R1: A) Esquema del proceso de mutagénesis y selección utilizado. B) Análisis del 

fenotipo de resistencia a una concentración de 25 mM de molibdato sódico por una cepa 

silvestre (MAD1440), una cepa que expresa de forma constitutiva PacC (MAD1400), una cepa 

con pérdida de función de PacC (MAD997) y los diferentes mutantes resistentes a molibdato 

obtenidos a partir de MAD997 (cepas MAD1065, MAD1066 y MAD1067). C) Localización 

celular de PacC en MAD1400 y en los diferentes mutantes MoR seleccionados. En la tabla M1, 

se detallan los fenotipos de las cepas indicadas en esta figura. 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[73] 

Entre estos últimos estarían mutantes en el posible importador nuclear de PacC 

cuyos cambios en su estructura primaria podrían promover el reconocimiento de la 

secuencia de localización nuclear (NLS) mutante en PacC70001 y así dar lugar a la 

recuperación de la acumulación nuclear de esta proteína.  

El proceso de selección de mutantes supresores de la mutación K159M se llevó a 

cabo en el laboratorio del Profesor H. Arst. Para ello, se irradiaron con luz UV esporas 

de la cepa MAD997 que portaba la mutación K159M en PacC700 y se seleccionaron 

supresores en medio mínimo de Aspergillus suplementado con 25 mM de molibdato 

sódico. En este proceso se seleccionaron 17 cepas y se les designó con el nombre MoR 

(Molybdate-Resistant) y un número. De entre estos mutantes se seleccionaron 6 y se 

continuó su estudio mediante técnicas genéticas clásicas. Finalmente el trabajo se redujo 

a 3 mutantes, MoR19, MoR21, y MoR24. Como se observa en la figura R1 B las cepas 

que portan cada uno de estas mutaciones muestran diferentes grados de resistencia al 

ion molibdato.  

La secuenciación del locus pacC permitió determinar rápidamente que las tres 

mutaciones supresoras son extragénicas a PacC y posteriormente se comprobó que 

tampoco alteraban a ninguno de los diferentes genes pertenecientes a la ruta Pal. Así 

mismo, se determinó que las mutaciones MoR no afectaban a la localización 

citoplásmica de PacC
+/-

70001 (figura R1 C), por lo tanto se concluyó que eran mutantes 

en el sistema de detoxificación de molibdato, del cual se desconocía su base molecular. 

Sin embargo, es pertinente indicar que en la actualidad poco se ha avanzado en este 

aspecto.  

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[74]   

Para proceder a la caracterización de las mutaciones MoR se determinó en el 

laboratorio del Prof. Arst (Imperial Collage, Londres), la localización cromosómica 

utilizando para ello el ciclo parasexual de hongo y cepas que portaban mutaciones en 

cada uno de los ocho cromosomas de A. nidulans. En la figura R2 se muestra de forma 

esquemática el posicionamiento de MoR24 y MoR19 en el brazo derecho del 

cromosoma III y a MoR21 en el brazo derecho del cromosoma IV. El gen pacC se 

localiza en el cromosoma VI y como se menciona anteriormente, ya se evidenció por la 

secuenciación del locus pacC, que los mutantes MoR son mutaciones extragénicas a 

este gen.  

 

 

 

Debido al excepcional fenotipo mostrado por la cepa mutante MoR24 se 

determinó seguir adelante con su caracterización lo que ha permitido profundizar en el 

mecanismo de respuesta a estrés catiónico en Aspergillus nidulans.  

Figura R2: Localización de las mutaciones MoR analizadas en el genoma de 

Aspergillus nidulans. 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[75] 

4.2 MUTANTE MoR24 

De entre todos los mutantes seleccionados en molibdato destacaba el número 24, 

MoR24, que siendo una mutación extragénica a PacC, presentaba además otros 

fenotipos de diferente sensibilidad a cationes y mostraba afectada su morfología 

colonial en el fondo genético pacC
+/-

70001. Ninguno de los otros mutantes presentaba 

un fenotipo similar al de MoR24.  

Trabajos anteriores del grupo demuestran que las cepas pacC
-
 crecen muy bien 

en medios ajustados a valores de pH ácido (pH 4-5) [47], de hecho es la técnica 

habitualmente utilizada para el mantenimiento y propagación de cepas con pérdida de 

función en el sistema de regulación por pH ambiental. Para conseguir estas condiciones 

de acidificación del medio se añade NaH2PO4 (figura R3) o KH2PO4 (datos no 

mostrados) a la concentración final de 1 M para cada compuesto en el medio de cultivo 

MCA. Como se observa en la (Figura R3), la cepa MoR24 pacC
+/-

70001 presentaba una 

notable inhibición del crecimiento en medio completo tamponado a valores de pH 

ácidos (incubación a 37ºC durante 48 horas).  

 

 

 

 

Figura R3: Crecimiento de una cepa silvestre y del mutante MoR24 en MCA con 

fosfato sódico. El fenotipo observado se debe exclusivamente a la ausencia de un 

HalA funcional y no a PacC
+/-

 ya que la cepa halA posee un PacC funcional. Nota: 

la cepa halA no se cita en esta parte del texto, ver más adelante en sección 4.4. 

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[76]   

La resistencia al ion molibdato, y la incapacidad del mutante MoR24 para crecer 

normalmente a pH ácido, nos hizo hipotetizar que se había encontrado una nueva clase 

de mutantes en el sistema de regulación por pH ambiental. MoR24, podría tratarse de un 

mutante extremo de mimesis de crecimiento en alcalinidad “mutantes-alcalinos”, pero 

en este caso careciendo de un PacC funcional. Por lo tanto se decidió continuar con el 

estudio del mutante MoR24 para comprobar la anterior hipótesis o verificar si estaba 

afectado un circuito regulador alternativo al de pH ambiental.  

 

4.3 ANALISIS GENÉTICO DEL MUTANTE MoR24. 

 

El libre acceso y posterior publicación de la secuenciación del genoma de A. 

nidulans [7], ofreció una nueva y potente herramienta para la búsqueda y rápida 

identificación de genes de interés. En el caso de la identificación del locus donde se 

localizaba la mutación MoR24 ofreció la posibilidad de realizar un trabajo adicional 

sobre la relación o conversión entre distancias genéticas y moleculares [107]. Para este 

trabajo se contó de nuevo con la inestimable colaboración del Prof. H. N. Arst del 

Imperial Collage que fue quien realizó el análisis genético. 

Usando técnicas genéticas clásicas mediante la utilización de los ciclos de 

reproductivos parasexual y sexual del hongo [108], se procedió al “mapeo” de la 

mutación MoR24, utilizando para ello, entre otros fenotipos asociados, la resistencia al 

molibdato de estas cepas. Mediante el ciclo de vida parasexual, donde existe 

intercambio genético entre dos cepas sin existir recombinación entre cromosomas, o con 

una muy baja probabilidad debido a sobrecruzamientos mitóticos, se realizó el estudio 

para la localización cromosómica de MoR24. Para ello se usaron cepas denominadas 

“master strains” que contenían un marcador fácilmente seleccionable en cada uno de los 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[77] 

ocho cromosomas del hongo. De esta forma se localizó MoR24 en el brazo derecho del 

cromosoma III.  

Una vez localizada la posición de la mutación MoR24 en el cromosoma III se 

trató de delimitar entre qué genes se encontraba esta mutación. Utilizando cepas que 

contenían diferentes mutaciones en el cromosoma III y mediante el ciclo reproductivo 

sexual del hongo se pudo verificar que la mutación MoR24 se encontraba entre los 

genes phenA y cbxA del brazo derecho del cromosoma III (figura R4).  

 

4.4 IDENTIFICACION DE MoR24, AN8830. 

 

Una vez localizada la región en la que se encontraba la mutación se procedió a la 

identificación del gen que contenía la mutación MoR24. Se abordaron dos técnicas 

diferentes para la identificación del gen: 

 

Técnica 1: Complementación del fenotipo del doble mutante MoR24, sltA1. 

Para la identificación de MoR24 se utilizó un primer abordaje experimental 

consistente en la complementación del fenotipo del doble mutante MoR24, sltA1. SltA 

es un factor de transcripción implicado en la homeostasis de cationes [94]. Una cepa 

nula para este factor de transcripción presenta una elevada sensibilidad frente a una gran 

variedad de cationes y frente a un pH alcalino (pH=8). Una cepa doble mutante pérdida 

de función para sltA, alelo sltA1, y MoR24 muestra un requerimiento de elevadas 

concentraciones de calcio en el medio, fenotipo que se ha denominado posteriormente 

como “auxotrofía de calcio” [50]. Para identificar el locus en el que se localiza MoR24 

se trató de complementar ese doble mutante utilizando una genoteca de DNA genómico 

(DNA-g) construida en el plásmido autorreplicativo pRG3-AMA-NotI.  



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[78]   

Se realizaron experimentos de transformación utilizando diferentes cantidades 

de la genoteca de DNA-g y una cepa pyrG89, MoR24, sltA1 (MAD3112). Se 

seleccionaron transformantes que portaban plásmidos autorreplicativos utilizando el 

marcador pyrG89, dado que el plásmido tiene el gen homólogo en Neurospora crassa 

pyr-4, y que fuesen capaces de crecer en bajas concentraciones de calcio. De los 

diferentes transformantes se aisló DNA genómico, que contiene también DNA 

plasmídico, y con una fracción de este aislado se transformó E. coli seleccionando los 

diferentes clones mediante la resistencia al antibiótico β-lactámico ampicilina que 

confiere el plásmido. Se obtuvieron plásmidos con insertos de DNA-g de diferentes 

tamaños y se procedió a determinar los límites del inserto en cada uno de los aislados 

mediante secuenciación del mismo utilizando oligonucleótidos que apareaban en las 

regiones flanqueantes al sitio de multiclonaje. Se determinó que la mayoría de los 

plásmidos contenían, en mayor o menor medida, la región genómica del locus sltA. A 

destacar que uno plásmidos recuperados contenía la región genómica del locus trkA que 

codifica para un homólogo de los transportadores de potasio, TRKs, de Saccharomyces 

cerevisiae (este plásmido se ha utilizado posteriormente en este estudio).  

Los diferentes plásmidos se transformaron por separado en la cepa doble 

mutante MoR24, sltA1 para verificar que complementaban el fenotipo de “auxotrofía de 

calcio”. Todos los plásmidos que contenían el gen sltA silvestre complementaban dicho 

fenotipo, sin embargo el plásmido aislado con el gen trkA no complementó al doble 

mutante MoR24, sltA1. Ya que en nuevos intentos se obtuvieron mayoritariamente 

plásmidos que contenían al gen sltA, determinados mediante PCRs diagnóstico, se 

abandonó este abordaje experimental.  

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[79] 

Técnica 2: Amplificación y secuenciación de loci candidatos. 

Dado que el análisis genético limitaba la posición de MoR24 entre phenA y cbxA 

en primer lugar se procedió a identificar a dichos loci y posteriormente considerar 

cuales serían los posibles candidatos dentro de esa región del cromosoma III. Se utiliza 

la nomenclatura de locus actual, versión 4 de la base de datos. 

phenA, se identificó a este gen como el locus AN11135 que codifica para la prefenato 

hidratasa, enzima perteneciente al metabolismo de la fenilalanina. Se caracterizaron 

varios mutantes clásicos en este locus [107] y se determinaron los cambios que 

causaban cada mutación, los cuales se indican en la tabla R1. Este locus se localiza 

entre AN8852 y AN8853 y fue anotado en la base de datos posteriormente a su 

publicación [107], por lo que posee un número de identificación no correlativo a los 

anteriores. El locus AN11135/phenA marcaba por lo tanto el límite “inferior” más 

próximo al centrómero respecto a MoR24 y cbxA el límite “superior”. 

cbxA(carC) se asoció al locus AN8739. Se identificó mediante gen candidato dado que 

la predicción de la base de datos lo identificaba como una subunidad de la succinato 

deshidrogenasa (ubiquinona). Mutaciones en diferentes subunidades confieren, en esta 

enzima mitocondrial, resistencia a carboxina (Pestanal), un pesticida con acción 

antifúngica utilizado para prevenir plagas. Hasta este estudio no se había caracterizado 

una mutación en esta subunidad que generase resistencia a este compuesto. Hay que 

reseñar que estas subunidades se han utilizado como marcadores de selección en 

transformación en diferentes hongos [109]. Las mutaciones identificadas se muestran en 

la tabla R1. 

Entre los loci AN11135 y AN8739, los límites del análisis genético, se extienden 

~190 kb, entre los cuales se debe encontrar el locus en que se localiza MoR24 (figura 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[80]   

R4). Para determinar dicho locus se amplificó la región genómica que contenía los 

siguientes loci utilizando para ello dos oligonucleótidos localizados respectivamente en 

la región 5’ y 3’ UTR de cada gen.  

 

Los fragmentos amplificados por PCR se secuenciaron utilizando diferentes 

oligonucleótidos que cubrían la región codificante pronosticada en la base de datos. Se 

verificó la secuencia de cada loci en fragmentos amplificados mediante PCR que habían 

utilizado como molde DNA-g procedentes de cepas silvestre y mutante MoR24.  

 

 

Tabla R1: Mutaciones en cambios de secuencia estudiadas. 
a 
Alteración en la secuencia del 

intrón, 
b 

Marco de lectura, 
c 
Codón “stop”. 

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[81] 

 

 

 

Dado el fenotipo del doble mutante MoR24, sltA1, se atendió primero a verificar 

las secuencias de los genes cuyos productos podrían estar relacionados con la 

homeostasis del calcio: 

Figura R4: A) Distancias moleculares entre los loci de nuestro interés. B) Mapa 

genético de la región situada entre los loci AN11135 y AN8739 del brazo derecho 

del cromosoma III. Se indica mediante flechas los loci analizados.  



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[82]   

AN8842, es el posible homólogo de S. cerevisiae Mid1p, MidA, que actualmente se está 

caracterizando en mayor detalle en el laboratorio. El gen midA codifica para una de las 

unidades que junto al homologo de Cch1p en A. nidulans, denominado CchA y que es 

codificado por AN1168, han de componer un canal de calcio activado por potencial de 

membrana (calcium gated channel). Sin embargo, no se encontraron diferencias en la 

secuencia de este locus en la cepa mutante MoR24 respecto a la base de datos. El 

análisis posterior en el laboratorio ha permitido determinar que cepas nulas cchA o midA 

no muestran un fenotipo de “auxotrofía de calcio” (Marquina y Espeso, sin publicar). 

AN8820, cnaA, gen que codifica la subunidad catalítica de la calcineurina, la fosfatasa 

que señaliza diferentes rutas de forma calcio dependiente. No se encontraron diferencias 

respecto a la base de datos. 

AN8827, cmkC, codificante para una quinasa C dependiente de calcio/calmodulina. En 

este locus si se observaron diferencias entre la secuencia publicada [110], la secuencia 

esta actualmente corregida en la base de datos. 

Una vez verificada las secuencias de los candidatos más relacionados con la 

homeostasis de calcio, se abordaron a continuación aquellos genes que podrían 

participar en diferentes procesos de transporte de iones o de señalización. En los 

restantes loci secuenciados no se encontraron cambios respecto a la información 

descrita en la base de datos. 

AN11138, situado entre los loci AN8842 y AN8843, codifica para una proteína similar a 

ALR1p y ALR2p de S. cerevisiae los cuales participan en la homeostasis o resistencia al 

aluminio. 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[83] 

AN8844, gen sin caracterizar posible homólogo de S. cerevisiae HRT1, con un papel en 

el catabolismo de proteínas ubiquitina dependiente. En el momento de realizar la 

caracterización de MoR24 este locus estaba clasificado como codificante de una 

proteína involucrada en estrés por “hiper-osmosis”. 

AN8846, gen sin caracterizar similar a Smi1p de S. cerevisiae, gs-1 en N. crassa, 

codificante para una posible 1,3-β-glucansintasa.  

AN8847 gen sin caracterizar con similitud a PLP1 de S. cerevisiae, que codifica para 

una proteína similar a una Phosduccina.  

AN8848, gmtA que codifica para un posible transportador de GDP-Manosa. Mutantes en 

el homólogo de este gen en S. cerevisiae, VRG4, dan lugar a resistencia a vanadato. 

AN8851, swoC, que codifica para una pseudouridilato sintasa y participa en el 

establecimiento de la polaridad en las células vegetativas del hongo.  

El análisis mediante candidatos finalizó con la caracterización del locus 

AN8830, anotado como un gen codificante para una proteína señalizadora involucrada 

en estrés salino que causaba halotolerancia. 

En el locus AN8830 se identificó un cambio en la secuencia nucleotídica en el DNA 

genómico aislado de dos cepas independientes MoR24, respecto a otras dos cepas 

silvestre utilizadas como control. El cambio de nucleótidos que se observó en este caso 

fue la inserción de ATCAACTCGTCC en la posición 1566. 

Para verificar que este cambio era el causante del fenotipo MoR24 se realizó un 

experimento de complementación con el locus AN8830. Para ello se amplificó el locus 

AN8830 (incluyendo regiones 5’ y 3’UTR) con los oligonucleótidos SA4 y SA5 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[84]   

utilizando como molde DNA-g de las cepas silvestre y MoR24, cepa MAD1151 

(phenA2 MoR24). Cada fragmento se introdujo en plásmidos autoreplicativos y se 

transformó con ellos a la cepa MAD1123 (pabaA1, pyrG89, MoR24, sltA1) y se verificó 

si complementaba el fenotipo de auxotrofía de calcio manteniendo el plásmido en cada 

transformante mediante crecimiento en medio selectivo para el marcador pyrG89. Los 

transformantes que portaban el plásmido con el gen AN8830 silvestre crecieron en 

condiciones limitantes de calcio mientras que los transformantes con el plásmido con el 

gen AN8830 procedente de la cepa MoR24 siguieron mostrando el fenotipo del doble 

mutante MoR24, sltA1 de igual forma que los transformantes que contenían el plásmido 

autorreplicativo vacío. Estos experimentos demostraban que AN8830 era el gen donde 

se localizaba la mutación MoR24. 

Para documentar mejor la relación desigual existente entre la frecuencia de 

recombinación y la distancia física en el intervalo phenA-cbxA, se analizaron 329 

descendientes al azar del cruce biA1; phenA2; cbxA17 x MoR24; inoB2; fwA1 (ver 

Clutterbuck [101], para los símbolos de los genes). De este análisis obtenemos una 

distancia de 1,8 ± 0,7cM entre phenA2 y MoR24 y 13,5 ± 1,7cM entre MoR24 y 

cbxA17, una diferencia de 7,5 veces. Las distancias físicas son 67.765bp y 124.414bp 

respectivamente, una diferencia de 1,84 veces. Entre phenA2 y MoR24 1cM 

corresponde a 37,6 kb y entre MoR24 y cbxA17 1cM corresponde a 9,2 kb (figura R5). 

Para descartar que este fenómeno se debiera a una reorganización de los loci no descrito 

previamente en el cromosoma III, se analizó mediante PCR y Southern blot correcta 

organización de la región comprendida entre phenA y cbxA no habiéndose encontrado 

diferencias respecto al mapa genómico y la organización génica en la base de datos.  



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[85] 

 

 

 

 

 

La explicación más plausible para esta relación no lineal entre la frecuencia de 

recombinación y la distancia física era la proximidad del centrómero. En el año 1930 se 

describió por primera vez este fenómeno en Drosophila melanogaster, en donde se 

observó una reducción de la recombinación en las proximidades del centrómero [111]. 

Con nuestros resultados conseguimos determinar que en la cercanía del centrómero 1cM 

corresponde a aproximadamente 50 kb mientras que esta relación se reduce a menos de 

2 kb por cada cM a una distancia de 240 kb de los centrómeros [112]. 

De esta forma conseguimos identificar el locus donde se localizaba la mutación 

MoR24, el gen AN8830 como se detalla más extensamente en la siguiente sección.  

 

 

Figura R5: Frecuencias de recombinación y distancias genéticas entre las diferentes 

mutaciones utilizadas en el cromosoma III de A. nidulans. Frecuencias de 

recombinación de los marcadores según su posición respecto al centrómero. 
 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[86]   

Caracterización del locus AN8830, halA. 

 

Para verificar experimentalmente la estructura primaria de la proteína codificada 

por el locus AN8830, se procedió a la caracterización del cDNA de este locus. Se 

obtuvo una genoteca de cDNA mono hebra a partir de la reacción de la transcriptasa 

inversa y oligo-dT sobre RNA total purificado de una cepa silvestre. Posteriormente se 

amplificó de forma específica el cDNA de AN8830, usando el sistema 2 de la 

polimerasa Expand (Roche) y los oligonucleótidos SA1 y SA2. El fragmento de 

aproximadamente 1,9 kb se introdujo en el vector pCR-TOPO y se seleccionaron los 

plásmidos recombinantes. La secuencia nucleotídica del cDNA se determinó en dos 

plásmidos recombinantes utilizando los oligonucleótidos SA1, SA2 y SA3B. La 

secuenciación de ambos cDNAs mostró que la secuencia en la base de datos era 

correcta, así como la predicción de la metionina inicial, y confirmó la presencia de un 

intrón de 56 pb canónico (con extremos –GT y AG- a ambos lados del intrón y del 

tamaño previsible en Aspergillus) en la secuencia codificante. A partir de estos datos se 

dedujo la secuencia aminoacídica de AN8830 que, como se indicaba anteriormente, 

corroboraba la predicción automática de la base de datos.  

La región codificante de AN8830 posee 2.490 nucleótidos y codifica para un 

polipéptido de 524 aminoácidos. Con la secuencia deducida de aminoácidos realizamos 

una búsqueda Blastp (Blast proteína-proteína) en la base de datos de secuencias de 

proteínas no redundantes de la aplicación informática de NCBI 

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). 

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi


RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[87] 

 

 

 

 

 

 

 

 
Figura R6: Alineación de la secuencia de AN8830 con las secuencias de hal4 (A) y hal5 (B) de S. 

cerevisiae. (C) Regiones conservadas encontradas en AN8830. 

 

D C 

A 

B 

C D 

130 245 520 

Dominio  

motor 
motor 

Dominio quinasa 

AN8830 

A 

B 

C 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[88]   

Las búsquedas realizadas mostraban que AN8830 codificaba para una posible 

proteína quinasa, perteneciente a la familia de las proteínas quinasas C (PKc) y que 

mostraba una gran similitud (figura R6A y R6B) con las quinasas Hal4/Sat4p y Hal5p, 

que están implicadas en la respuesta a estrés salino en S. cerevisiae y también en los 

homólogos de otras levaduras y hongos [77], por este motivo se designó al locus 

AN8830 como halA.  

El dominio quinasa comprende aproximadamente desde el aminoácido 245 hasta 

el 520. También presenta un dominio motor de quinesina desde el aminoácido 130 al 

245 semejante al que poseen las quinesinas KISc y KLP2 [113,114]. La secuencia entre 

aminoácidos 240-520 se utilizó para realizar nuevas búsquedas tipo Blastp para 

encontrar posibles homólogos y proteínas cercanas en hongos levaduriformes y 

filamentosos.  

Los alineamientos múltiples generados a partir de las diferentes proteínas 

similares a HalA muestran que estos posibles homólogos presentan una región N-

terminal pobremente conservada. La región más conservada es el dominio Ser-Thr 

quinasa (figura R7) y un alineamiento múltiple permitió identificar los posibles residuos 

que formarían parte del sitio de unión a ATP (residuos 245-255, 271-273, 386-388), de 

las zonas de unión de sustrato (residuos 330, 371, 407-414) y lazos catalíticos (residuos 

367-376) y de activación (residuos 387-396, 405-418)  presentes en una proteína 

quinasa están también altamente conservados en AN8830 (figura R7) [115].  

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[89] 

 

 

Figura R7: A) Resultado de las búsquedas realizadas usando las secuencias de aminoácidos de HalA, 

Hal4p y Hal5p en las bases de datos de Aspergillus y S. cerevisiae. Existe una gran similitud con tres 

proteínas quinasas, dos de ellas presentes en el hongo. B) Alineamiento de las distintas quinasas 

encontradas en Aspergillus nidulans y S. cerevisiae indicando además los residuos cuya presencia es 

esencial para la función quinasa. Las coordenadas indicadas se refieren al dominio quinasa. 

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[90]   

  Las búsquedas usando las secuencias de aminoácidos de HalA, Hal4p y Hal5p 

en las bases de datos de Aspergillus y S. cerevisiae revelan la presencia de, al menos, 

tres quinasas muy relacionadas. AN8830, halA, y el gen AN2943 codifican proteínas con 

gran similitud a la proteína de levadura Hal4/Sit4p (similitud del 57% y el 37%, 

respectivamente) y con menor grado a Hal5p (ambas en torno al 28% de similitud). Sin 

embargo, también presentan niveles significativos de similitud con una quinasa putativa 

de función desconocida llamada KKQ8p de S. cerevisiae. La tercera quinasa 

estrechamente relacionada encontrada en las búsquedas está codificada por AN10019, 

que presenta similitud con Hrk1p, una quinasa que regula la activación de la H
+
-ATPasa 

de membrana Pma1p en respuesta al metabolismo de glucosa [116] (figura R7). 

La mutación halA24 debe generar una proteína mutante con una duplicación de 

4 residuos, 
500

INSS
503

, en la región C-terminal del dominio quinasa, distante, en 

términos de estructura primaria, de los dominios funcionales citados anteriormente en 

este dominio. Todos estos hallazgos apoyan la teoría de que HalA es un proteína 

quinasa y que uno de sus papeles en la célula es la regulación de la actividad de los 

transportadores de cationes de membrana igual que sus putativos homólogos Hal4/5p. 

4.5 Análisis funcional de HalA 
 

 

4.5.1 Estrategia para la generación de la cepa nula halA 

Para el estudio de la función de la proteína HalA se generó una cepa nula para el 

gen halA. Para ello se construyó un plásmido que contenía una región de 1,5kb 

correspondiente al extremo 5’UTR del gen halA (AN8830) seguido del marcador de 

selección pyr-4 de Neurospora crassa, procedente del plásmido pFB6, y a continuación 

un fragmento de 1kb de la region 3’UTR del gen. La región 5’UTR se amplificó a partir 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[91] 

de DNA-g con los oligonucleótidos DHALA1 y DHALA2 que portan dianas de 

restricción NotI y BamHI, respectivamente, y que conjuntamente amplifican un 

fragmento de 1,5kb. Un fragmento de 1.280 pb correspondiente a la región 3’UTR de 

halA se amplificó con los oligonucleótidos DHALA3 y SA5, añadiendo el primer 

oligonucleótido una diana de restricción BamHI. El fragmento de la región 5’UTR se 

digirió con los enzimas de restricción NotI y BamHI y el fragmento de la región 3’UTR 

con los enzimas BamHI y EcoR1 (diana interna del fragmento). Ambos fragmentos 

digeridos fueron purificados y ligados al plásmido pBS-SK+ abierto con los enzimas 

NotI y EcoRI, dando lugar así al plásmido pBS-UTRs-HalA. Este plásmido se digirió 

con el enzima BamHI y se introdujo el fragmento que contiene el gen pyr-4 de 

Neurospora crassa [117]. El plásmido resultante se denominó pBS-ΔhalA. El gen pyr-4 

se orientó respecto a las dos regiones UTR y se seleccionaron plásmidos recombinantes 

con ambas orientaciones. Para reemplazar la secuencia codificante del gen halA se 

transformó el hongo con el fragmento NotI-EcoRI del plásmido que contiene la 

construcción 5’UTR::pyr-4::3’UTR  (ver figura R8). Se realizaron diversos 

experimentos de transformación pero no se obtuvieron transformantes con un 

reemplazamiento limpio del gen halA por el marcador de selección.  

Consecuentemente, para obtener cepas nulas halA se siguió otra aproximación 

experimental. Se procedió a dividir el casete de transformación en dos fragmentos 

solapantes en la región del gen pyr-4. Cada fragmento contiene una región de pyr-4 que 

no complementa por sí sola la mutación pyrG89. Así los transformantes pyrG
+
 tendrían 

que haber reclutado la maquinaria de recombinación para reparar el gen pyr-4 y este 

evento favorecería la recombinación entre las regiones homólogas 5’ y 3’UTR de la 

construcción con las respectivas genómicas del locus halA.  



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[92]   

Mediante PCR, utilizando el plásmido pBS-ΔhalA como molde, se generaron los 

dos fragmentos solapantes en una región de 150 pb dentro del marcador de selección 

pyr-4 (figura R8) y se transformó la cepa MAD782 (yA2, pabaA1, pyrG89). Se 

obtuvieron transformantes en las placas de regeneración y tras su purificación a 

homocariosis se analizaron por southern blot. En esta ocasión un número elevado de 

transformantes portaban un alelo nulo de halA, por lo tanto se concluyó que dicha 

deleción era viable y que los anteriores resultados se debían a un problema de 

recombinación del casete de deleción en dicho locus.  

Las diferentes cepas ΔhalA aisladas mostraron un fenotipo similar al observado 

con la cepa halA24 (ver a continuación) por lo que se puede concluir que la mutación 

halA24 es una mutación de pérdida de función de la proteína. 

 

Figura R8: Esquema de 

las dos estrategias 

utilizadas para construir 

la cepa nula para la 

proteína HalA. A partir 

del plásmido pBS-

ΔHalA se transformó 

directamente la cepa 

silvestre del hongo (A) 

o bien se realizaron 

fragmentos solapantes 

del gen pyr-4 para 

favorecer la 

recombinación entre 

regiones homólogas. 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[93] 

4.5.2 Papel de HalA en la respuesta a estrés catiónico 

 

 En el apartado 4.4 se mostraba la similitud de HalA con las quinasas de levadura 

Hal4p/Hal5p. A continuación se procedió a determinar si HalA tenía funciones 

equivalentes en Aspergillus a las que desempeñaban Hal4p/Hal5p en la levadura S. 

cerevisiae.  

Una vez que teníamos construida la cepa nula de esta proteína se analizó el 

fenotipo que presentaban la cepa silvestre halA (MAD1440), el mutante halA24 

(MAD1124) y la cepa nula, ΔhalA (MAD3231), frente a sensibilidad o resistencia a 

diferentes concentraciones de cationes, tanto monovalentes como divalentes, para tratar 

de analizar el papel de esta proteína en la homeostasis iónica del hongo (figura R9). 

 

  

Figura R9: Test de 

crecimiento en placa 

tras 48h a 37ºC de las 

cepas silvestre 

(MAD1440), mutante 

(MAD 1124) y nula de 

halA (MAD3231) en 

MMA (A) y MCA (B) 

suplementados con 

diferentes cationes. 
 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[94]   

En medio mínimo se observó una mayor sensibilidad a los diferentes cationes y 

nos permitió observar de manera más clara las diferencias entre los crecimientos con los 

distintos cationes. Se analizaron concentraciones superiores a las presentes en la célula 

de forma normal (ver introducción apartado 1.2.1). En este análisis se utilizó tanto 

medio mínimo como medio complejo. En medio mínimo, la cepa halA24 fue sensible a 

niveles elevados Na
+
, K

+
 (1M) y extremadamente sensible a Li

+
 y Cs

+
 (300mM), 

mientras que tan solo se observó un leve efecto inhibitorio en el crecimiento en medio 

suplementado con el catión bivalente Mg
2+

 (200mM) o con Ca
2+

 (100mM). Respecto al 

ion ferroso (Fe
2+

) o férrico (Fe
3+

) no se observan cambios en la sensibilidad o 

resistencia a estos cationes hierro respecto a la cepa silvestre. 

Indicar que todos los compuestos se usaron como sales de cloro. El fenotipo de 

sensibilidad a Li
+
 observado en medio mínimo fue atenuado cuando se utilizó medio 

completo. Sin embargo, los altos niveles de Na
+
 y K

+
 en medio completo causaron un 

crecimiento colonial compacto para la cepa mutante halA24 mientras que no se observó 

ningún efecto cuando se suplementó el medio completo con Mg
2+

 o Ca
2+

. El fenotipo de 

la cepa mutante halA24 es muy similar al mostrado por las cepas mutantes de levadura 

en ambos genes hal4 y hal5 [92].  

4.5.3 Papel de HalA en la utilización de fuentes de nitrógeno 

La proteínas Hal4p/Hal5p pertenecen a la familia de las proteínas quinasas 

reactivadoras de la permeasa de nitrógeno, NPR [118]. Esta familia de proteínas se 

encargan de estabilizar numerosos transportadores de membrana de aminoácidos 

impidiendo su degradación mediada por proceso de ubiquitinación. 

Pérez-Valle y colaboradores demostraron como cepas de levadura S. cerevisiae 

deficientes en el sistema de quinasas Hal4/Hal5 mostraban una alteración de la 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[95] 

localización de transportadores de nutrientes como Can1p (permeasa de arginina), 

Fur4p (permeasa de uracilo) y Hxt1p (transportador de glucosa) [92]. En la cepa 

silvestre los transportadores se localizaron mayoritariamente en la membrana plasmática 

mientras que en una cepa mutante hal4/hal5 los transportadores se acumulaban en la 

vacuola, viéndose afectado el transporte al interior de la célula y por tanto la capacidad 

de crecimiento en medios conteniendo los compuestos anteriormente citados como 

únicas/preferenciales fuentes de nitrógeno.  

Dado que habíamos comprobado que HalA participaba en la regulación de la 

homeostasis de cationes del mismo modo que Hal4p/Hal5p estaba implicada en esta 

regulación, decidimos analizar si también tenía un papel en la utilización de distintas 

fuentes de nitrógeno. Para ello analizamos la capacidad de crecimiento de las cepas 

mutantes halA24 y ΔhalA en medio mínimo conteniendo diferentes fuentes de 

nitrógeno, tanto de origen orgánico como inorgánico (figura R10). 

 

 

 

Figura R10: Crecimiento de las distintas cepas en placas con medio mínimo sólido 

después de una incubación de 48h a 37ºC. A este medio se le añadieron diferentes 

compuestos como principales fuentes de nitrógeno según se indica en la parte superior 

de la  figura. 
 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[96]   

Como se aprecia en la figura R10, no se detectó defectos en el crecimiento radial 

de las colonias de las cepas halA24 y halA frente a la cepa MAD1440 utilizada como 

control de fenotipo silvestre halA. Las cepas mutantes halA
-
 pueden utilizar tanto las 

distintas fuentes de nitrógeno origen mineral: NH4
+
, NO3

-
, NO2

-
, como las fuentes de N 

orgánicas: tartrato amónico, urea o los aminoácidos Gln, Pro, Arg o ácido γ-

aminobutírico, β-alanina. Por lo tanto, existe una notable diferencia entre el fenotipo 

halA
-
 en A. nidulans y el fenotipo descrito en el doble mutante Δhal4, Δhal5 en S. 

cerevisiae [92] ya que en ausencia de estas quinasas se altera tanto el transporte de 

diferentes cationes como la utilización de distintas fuentes de nitrógeno, mientras que en 

los mutantes halA
-
 sólo se observan fenotipos relacionados con la respuesta al estrés 

ocasionado por exceso de cationes.  

4.5.4 Modelado de la proteína mutante y silvestre HalA. 

Para intentar determinar un posible efecto estructural de la mutación halA24 se 

realizó un modelado de la estructura terciaria de HalA en ambas formas silvestre y 

mutante. Como primer paso se realizó una predicción de la estructura secundaria de las 

dos formas de HalA utilizando el programa Polyview (www.polybytes.com) (figura 

R11). En la predicción de estructura secundaria no aparecen diferencias significativas, 

tan solo se aprecia que en el modelo de la proteína mutante se forma una nueva -hélice 

en la zona de la inserción, dando lugar a una proteína con 12 -helices que según estos 

modelos no tiene alterada la estructura tridimensional de la quinasa (figura R11 panel 

B). Esta nueva porción de -hélice aparece representada en la figura R11 panel A con 

un recuadro amarillo. Tanto las predicciones de β-láminas como las regiones 

desorganizadas en ambas proteínas se mantienen inalteradas. En estas predicciones de 

estructuras secundarias no se detectaban cambios significativos que pudieran explicar el 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[97] 

fenotipo de pérdida de función observado en HalA24. Para el análisis de la estructura 

terciaria de la proteína se realizó un modelado de la secuencia tanto de la proteína 

silvestre como de la mutante usando como molde la estructura de la proteína CG17176 

de D. melanogaster. El programa (Swiss-model) elige de forma automática la proteína 

que utilizará como molde.  

 

 

 

Figura R11: A) Predicciones de secuencia secundaria para la proteína HalA y para la 

proteína con la mutación halA24. Las flechas verdes indican regiones de β-láminas y las 

zonas coloreadas en rojo representan regiones de α-hélices. B) Modelado de la estructura 

tridimensional de la proteína silvestre y de la mutante indicando la zona donde se localiza 

la mutación (en color verde) así como los principales dominios de la proteína quinasa (en 

un círculo rojo).  

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[98]   

Solo se observaron modificaciones menores en la estructura terciaria de la 

proteína al estar presente la mutación halA24, (figura R11 panel B), pero en ningún caso 

estas modificaciones parecen estar afectando a los principales dominios funcionales de 

la proteína quinasa (señalados en un círculo rojo en el panel B de la figura R11).  

HalA es muy probablemente una proteína quinasa, y por tanto tiene la función 

de fosforilar otras proteínas. Es posible que la propia proteína quinasa sea susceptible de 

ser fosforilada a su vez por otra quinasa como parte de su regulación o incluso que la 

misma proteína quinasa se fosforile a sí misma como un mecanismo de autorregulación. 

Para analizar si la mutación halA24 estaba alterando alguna de estas dianas de 

fosforilación se realizó una predicción de los sitios de fosforilación de serina, treonina y 

tirosina de la proteína, utilizando para ello el programa NetPhos 

(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/). La predicción mostró que los residuos 

insertados por la mutación halA24 generaban una nueva diana donde se pronosticaba un 

residuo de serina candidato para ser fosforilado (figura R12). Por lo tanto en futuros 

experimentos se tendrá en cuenta determinar el grado de fosforilación de HalA y de la 

forma mutante HalA24 y se analizará mediante técnicas de “western-blot” si existe una 

diferencia en la migración de estas proteínas que pueda estar indicando la implicación 

de un proceso de fosforilación.  

Aunque aparentemente el efecto de esta mutación es local, ésta debe causar un 

efecto general mayor en el dominio quinasa, ya que halA24 presenta un fenotipo de 

pérdida de función idéntico al alelo nulo.  

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[99] 

Las predicciones realizadas no han permitido establecer una correlación firme 

entre pérdida de función y una posible alteración estructural, la naturaleza molecular de 

la mutación halA24 es muy interesante dado que proporciona información adicional 

para esta familia de quinasas sobre dominios funcionales alejados de los residuos 

implicados en la actividad quinasa. 

 

 

 

 

 

Figura R12: Gráficos de predicción de sitios de fosforilación. En azul aparecen los 

posibles sitios de fosforilación de la serina, en verde los de la treonina y en rojo los de 

la tirosina. La línea horizontal marca el umbral que han de sobrepasar los aminoácidos 

para ser considerados como sitios de fosforilación. La figura muestra la predicción 

obtenida para la proteína silvestre (A) y para la proteína mutante (B).   

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[100]   

4.6 PAPEL DE LA PROTEINA QUINASA HalA EN LA 

HOMEOSTASIS DE POTASIO Y SODIO. 
 

4.6.1 Efecto de la ausencia de sodio y potasio en el crecimiento de las cepas. 

La concentración de potasio es el principal determinante de parámetros 

fisiológicos y morfológicos tales como el volumen celular, la turgencia y la fuerza 

iónica citoplasmática. Estos factores además juegan un papel clave en la capa de 

hidratación óptima de macromoléculas y membranas. El catión potasio se encuentra 

presente en el interior celular en concentraciones muy altas de forma prácticamente 

constante. El umbral de toxicidad para cationes monovalentes como el sodio y el litio es 

comparativamente mucho menor que para el potasio (ver Introducción). La rígida 

regulación de los niveles sodio y litio en el citosol tiene como objetivo la protección de 

enzimas intracelulares esenciales, como es el caso de las fosfatasas [119,120]. 

Puesto que las cepas mutantes halA muestran sensibilidad a altas 

concentraciones de sodio o en potasio, especialmente en medio complejo (ver figura 

R9), se decidió analizar si la función de la proteína HalA sería necesaria ante un defecto 

en la concentración de estos cationes. Para generar condiciones limitantes de potasio se 

modificó el medio de cultivo estándar utilizando una solución de sales diluida diez 

veces. De esta forma se obtiene una concentración aproximada de 1,7mM de cloruro 

potásico, 1mM de fosfato potásico y 0,3M de molibdato sódico en el medio. La figura 

R13 muestra que las cepas mutantes halA24 y halAcomparadas con la cepa silvestre, 

poseen un crecimiento colonial menos vigoroso y su capacidad de esporulación también 

se ve mermada. En esas condiciones suplementamos los medios con concentraciones de 

potasio (en forma de cloruro potásico) similares a las que encontramos fisiológicamente, 

10mM, o bien una concentración de potasio elevada, 100mM, para analizar si la 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[101] 

presencia del catión en el medio extracelular era capaz de revertir el efecto observado en 

el medio con 1/10 de la concentración de sales de potasio original.  

 

 

 

Observamos que el potasio por sí solo no era capaz de recuperar el crecimiento 

silvestre en las cepas mutantes de HalA y nos planteamos estudiar el comportamiento de 

estas cepas en ese medio con una concentración 1/10 de sales suplementado bien con 

Figura R13: Crecimiento de la cepa silvestre (MAD1440), mutante halA24 (MAD1124) 

y nula halA (MAD3231) en MMA en el cual la concentración de las distintas sales está 

reducida a la décima parte (MMA 1/10). Este MMA 1/10 fue suplementado con 10mM 

de sulfato amónico (B) y con 10mM de sulfato magnésico (C).  



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[102]   

sulfato amónico 10mM, bien con sulfato magnésico 10mM tratando de revertir esa 

reducción del crecimiento de los mutantes. Además añadíamos las concentraciones de 

10mM y 100mM de potasio para estudiar si el potasio en combinación con alguno de 

estos suplementos (sulfato amónico o sulfato magnésico) era capaz de recuperar el 

crecimiento silvestre de las cepas mutantes (figura R13). 

Ninguna de las tres composiciones de medio lograba revertir completamente el 

crecimiento anómalo de las cepas mutantes en HalA. La solución de sales proporciona 

la cantidad adecuada de iones que precisa una cepa halA silvestre para promover su 

crecimiento vegetativo y conidial. La reducción en la cantidad de potasio no es la causa 

única del crecimiento limitado de las cepas halA
-
, por lo tanto hay que realizar 

experimentos en los que se elimine el K
+
 de la solución de sales manteniendo las 

concentraciones de los otros iones. 

 

4.6.2. Efecto de la ausencia de potasio en el crecimiento de las cepas halA
-
. 

Para intentar comprender el efecto de la ausencia de K
+
, se reemplazaron las 

sales de potasio por sales de sodio (concentración de 27 mM de Na
+
 en medio mínimo) 

(figura R14). 

En este medio con bajo contenido en potasio, donde la única fuente de potasio 

era la contaminación química de los constituyentes del medio, las cepas halA24 y la 

cepa nula de halA presentaban una inhibición de su crecimiento radial, y este fenotipo 

fue suprimido con la adición de este catión al medio (figura R14). Por lo tanto, HalA se 

debe precisar para el correcto desarrollo el hongo a una baja concentración de potasio. 

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[103] 

 

 Tanto un exceso como un defecto en la concentración de potasio en el medio 

tiene un efecto negativo sobre el crecimiento de las cepas mutantes en halA. Esta 

observación sugiere una deficiencia en el transporte de potasio de alta afinidad. La 

sensibilidad a cationes de Na
+
 y K

+
 podría deberse a deficiencias de transporte en 

ausencia de un halA activo. Como los niveles intracelulares de Na
+
 y K

+
 no son 

independientes, la sensibilidad a sodio podría ser entonces una consecuencia directa de 

una tasa de absorción limitada o reducida de iones potasio debida, muy probablemente, 

a una alteración en el sistema de transporte de potasio de alta afinidad. 

 4.6.3. Estudio del transporte de sodio y potasio en A. nidulans. 

Para comprobar esta hipótesis se analizó la toma de K
+
 midiendo los niveles 

intracelulares de su análogo Rb
+
 [50,82]. Las medidas de transporte de rubidio y litio se 

llevaron a cabo en el laboratorio del Dr. Ramos en  la Universidad de Córdoba, expertos 

en esta técnica de medida. La toma de rubidio no se vio afectada cuando el medio 

contenía 10 mM K
+
, sin embargo bajo condiciones limitantes de K

+
 (10 µM) la toma de 

rubidio se redujo en la cepa halA
-
 comparada con la cepa silvestre para un rango de 

concentraciones de rubidio, 0,3 mM-0,8 mM (figura R15). En todos los casos, la cepa 

Figura R14: Crecimiento de 

la cepa silvestre (MAD1440), 

mutante halA (MAD1124) y 

nula halA (MAD3231) en 

MMA carente de potasio y con 

distintas concentraciones de 

potasio añadido. 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[104]   

mutante halA
-
 mostró menores niveles intracelulares de rubidio que la cepa silvestre, 

reflejando una posible reducción en el transporte intracelular de rubidio y, por extensión 

de K
+
, lo que fue confirmado midiendo la cinética de la toma de rubidio en la cepa 

mutante halA24 y en la silvestre (figura R15). 

 

 

El efecto tóxico de los altos niveles de Li
+
 en las cepas halA

-
 indican un defecto 

en la regulación de las reservas intracelulares de Na
+
, ya que un bajo flujo de Na

+
 

normalmente da lugar a toxicidad en las células fúngicas [32]. Determinamos los 

niveles intracelulares de Li
+
, como indicador análogo de Na

+
, en una cepa halA

-
después 

de crecerla en medio con niveles no tóxicos de Li
+
 (10 mM). La concentración 

intracelular de Li
+
 fue tres veces superior en la cepa halA24 que en la cepa silvestre 

(figura R16). La disminución en el flujo de Li
+
 medida en la cepa mutante halA24 frente 

a los valores obtenidos con la cepa silvestre coincide con el incremento de niveles 

Figura R15: A) Estudio de la toma de potasio usando rubidio como su análogo en la cepa 

silvestre MAD1440 y en la cepa mutante MAD1124. B) Cinética de la toma de rubidio. 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[105] 

intracelulares de Li
+
. Consecuentemente, la sensibilidad mostrada por el mutante halA

- 
a 

altas concentraciones de sodio, podría ser debida a una exportación reducida de los 

cationes Na
+
 (medidos como iones Li

+
) lo que originaría la acumulación intracelular de 

estos cationes a niveles que causasen toxicidad. 

 

 

 

 

4.7 REGULACIÓN POR POTASIO DE HalA 

 

Para comprender los mecanismos de respuesta a diferentes niveles de potasio 

extracelular se analizó si HalA mostraba una modificación a nivel post-transduccional o 

un cambio en los niveles de expresión como respuesta a este catión. Para  estudiar los 

niveles de HalA se construyó una cepa que expresaba a esta quinasa unida al epítopo 

3xHA que permitiría su rápida identificación en “Western-blots” con anticuerpos 

específicos -HA. Para realizar el marcaje de la proteína se utilizó el protocolo descrito 

Figura R16: A) Determinación de los niveles intracelulares de sodio usando litio como 

análogo en una cepa silvestre y en una mutante de halA. B) Cinética de la acumulación 

de litio en la célula.  



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[106]   

en el apartado 3.2.4.2 de materiales y métodos. Utilizando los oligonucleótidos GSP1-

4HalA se amplificaron las regiones de la parte final y del terminador (F1) (F2) del gen 

así como el epítopo unido al marcador de selección que se extrajo con GFP1, 2 del 

plásmido 1503 (figura R17). Después se fusionaron los tres fragmentos (figura R17) y 

con el fragmento resultante se transformó la cepa MAD1739 según el protocolo descrito 

en el apartado 3.3.2 de materiales y métodos. La correcta integración de la construcción 

se verificó por PCR o “Southern-blot”.  

Para verificar la funcionalidad de la proteína HalA marcada con el epítopo 

3xHA se analizó el fenotipo de la cepa que expresa esta construcción, MAD3235. A 

continuación se procedió a la detección mediante Western blot de HalA. Todos los 

transformantes caracterizados previamente expresaban niveles similares de una proteína 

etiquetada con el epítopo HA y del tamaño esperado.  

A continuación, se analizó el efecto de diferentes concentraciones de Na
+
 y K

+
  

sobre los niveles de HalA en extractos proteicos del hongo. 

Para el estudio del posibles efecto del Na
+
 se creció la cepa MAD3235 en MMA 

durante 18h a 37ºC, a continuación se añadió 100mM sodio al medio (NaCl) y se 

recogió el micelio tras 15 minutos de incubación en estas nuevas condiciones. Para 

determinar el efecto del potasio, se cultivó la cepa MAD3235 en MMA-K
+
 (18hrs a 

37ºC) y de forma similar al experimento anterior se añadieron dos concentraciones de 

potasio, 10 y 100mM (como KCl), recogiendo el micelio para la extracción de proteínas 

tras 15 minutos de incubación en estas condiciones. Como control en ambos casos se 

recogió micelio de un cultivo inicial sin adición de sodio o potasio.  

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[107] 

 

 

 

 

La figura R18 muestra “western-blots” en los que se detecta la proteína 

HalA::3xHA y en los que no se observaron cambios evidentes en los niveles de 

expresión de esta proteína de fusión cuando se modificaron las concentraciones externas 

Figura R17: Marcaje de la proteína HalA con el epítopo 3xHA. A) Estrategia de marcaje. B) 

Fragmentos obtenidos tras las respectivas PCRs. Ver teto para la nomenclatura. C) 

Transformantes aislados. Estrategia empleada en el southern. Comprobación por “southern 

blot” de la correcta integración del fragmento generado. T1-T8 representan los 

transformantes analizados. D) Verificación de la funcionalidad de la cepa obtenida por 

comparación de fenotipo con una cepa silvestre.   



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[108]   

de los iones sodio o potasio. Los niveles de HalA se comparan con los niveles de actina, 

detectados con un anticuerpo primario contra la actina de S. cerevisiae. 

 

 

La movilidad de las bandas de detección era muy similar entre las diferentes 

condiciones indicando la ausencia de cambios postraducionales en HalA, como pudiera 

ser fosforilación, en respuesta inmediata a cambios en los niveles de Na
+
 o K

+
 en el 

medio de cultivo. 

4.8 LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE HalA 

 

Alternativamente a modificaciones postraduccionales es posible que HalA esté 

sujeta a una regulación de su localización subcelular como mecanismo de respuesta al 

estrés catiónico y al mantenimiento de la homeostasis de estos iones.  

Para localizar en la célula a HalA se procedió a su etiquetado con la proteína 

fluorescente verde (GFP) en el extremo C-terminal. Para realizar el marcaje de la 

proteína se utilizó el protocolo descrito en el apartado 3.2.4.2 de materiales y métodos. 

Utilizando los oligonucleótidos GSP1-4HalA para amplificar el gen y GFP1, 2 del 

plásmido 1439 para el epítopo (figura R18).  

Figura R18: Estudio de la expresión de la proteína HalA en diferentes concentraciones 

de potasio (A) y de sodio (B) usando la cepa marcada con 3xHA (MAD3235). 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[109] 

 

 

 

 

La fusión de fragmentos resultante se transformó la cepa MAD1739 según el 

protocolo descrito en el apartado 3.3.2 de materiales y métodos. Se verificó la 

incorporación del fragmento mediante “Southern Blot” y a continuación se analizó la 

funcionalidad de la proteína HalA etiquetada en aquellas cepas que mostraban la 

correcta integración de la construcción (seleccionada para esta tesis la cepa MAD3234) 

Figura R19: Marcaje de la proteína HalA con el epítopo GFP. A) Fragmentos obtenidos tras 

las respectivas PCRs. Ver texto para abreviaturas. B) Transformantes aislados. Estrategia 

empleada en el southern. Comprobación por southern blot de la correcta integración del 

fragmento generado. T1-T8 representan los transformantes analizados. C) Verificación de la 

funcionalidad de la cepa obtenida por comparación de fenotipo con una cepa silvestre.  

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[110]   

de la misma forma que se hizo para MAD3235 (HalA::3xHA), mediante el análisis 

fenotípico en diferentes condiciones de estrés.  

HalA::GFP muestra una distribución citoplasmática prácticamente uniforme que 

permanece, aparentemente, inalterada cuando la cepa se creció en medio mínimo 

estándar con niveles reducidos (medio sin sales de K
+
), estándar (10 mM) y elevados 

(100 mM) de K
+ 

(figura R20 panel B). En el citoplasma se apreciaban zonas donde la 

fluorescencia estaba ausente, y que dada su forma, sugerían que eran muy 

probablemente los núcleos de cada compartimento celular (figura R20 panel A). Para 

determinar este hecho, se visualizaron los núcleos utilizando una versión etiquetada de 

la histona H1 con la proteína fluorescente Cherry-RFP. Para dicho etiquetado se 

amplificó la región correspondiente al extremo 3’ de la región codificante de hhoA 

(AN2765), codificante de la histona H1. Esta región se marcó con el epítopo Cherry-

RFP, proteína fluorescente roja, extraída del plásmido 1827. Para ello se siguió el 

protocolo descrito en el apartado 3.2.4.2 y los oligonucleótidos GSP1-4H1 y GFP1,2H1. 

Con el fragmento obtenido se transformó la cepa MAD3234 que expresa HalA::GFP y 

de esta forma observar la localización simultanea de HalA y la de los núcleos. Se 

confirmó que debe existir exclusión nuclear de HalA y que dicha localización no se 

modificaba tampoco por los cambios de concentración de K
+
 en el medio extracelular.  

 La exclusión nuclear observada también permite hipotetizar sobre la existencia 

de un mecanismo de exportación nuclear actuando sobre HalA o bien el posible anclaje 

de HalA a orgánulos o estructuras citoplasmáticas. En primer lugar se verificó la 

presencia de una señal de exportación nuclear (NES) clásica en HalA. Estas señales son 

reconocidas por las exportinas de la familia Exp-1/Crm como KapK [121]. Sin 

embargo, no pudo identificarse ninguna señal de este tipo por lo que se investigó la 

segunda opción. 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[111] 

 

 

 

 

Para determinar la existencia de una localización orgánulo-dependiente, se 

realizaron fraccionamientos celulares utilizando la cepa que expresaba la quimera 

HalA::3xHA. Los fraccionamientos celulares se realizaron siguiendo el protocolo 

descrito en el apartado 3.4.3. En este tipo de fraccionamiento celular se separan grandes 

complejos, diferentes orgánulos y membranas de proteínas solubles. La fracción ET 

Figura R20: Estudio de la localización celular de la proteína HalA mediante el uso de 

microscopía de fluorescencia. Se analizó la fluorescencia de la cepa MAD3236 en 

condiciones normales (A), a diferentes concentraciones de potasio (B) y a diferentes 

tiempos de incubación con potasio (C). Las flechas blancas señalan los núcleos 

celulares. 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[112]   

representa el extracto total de proteína presente en la muestra. En la fracción P0,3K se 

encuentran grandes agregados y fragmentos de la membrana plasmática. En las 

fracciones P13K y P100K sedimentan diferentes orgánulos membranosos y restos de 

membranas. Finalmente en la fracción SB100K se concentran las proteínas 

citoplasmáticas solubles.  

 

 

 

Figura R21: (A) Esquema del proceso de fraccionamiento celular. Resultado del 

fraccionamiento de la cepa MAD3235 en concentraciones normales de potasio (B) y 

con concentraciones elevadas de potasio (C), junto con el fraccionamiento de una 

proteína que se conoce que se localiza en la membrana plasmática celular, (PH
PLC

)2x 

y que se detecta con GFP..  



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[113] 

Inicialmente en estos experimentos de fraccionamiento se utilizaron micelios 

crecidos en medios con 10mM de K
+
, las condiciones estándar. Como muestra la figura 

R20, HalA pudo ser detectada en dos fracciones diferentes. Una subpoblación de HalA 

puede ser considerada como proteína soluble citoplasmática dado que colocaliza con la 

hexoquinasa, nuestro estándar de proteína soluble [49]. HalA fue también detectada en 

la fracción donde sedimentan grandes complejos proteicos asociados a membranas y la 

propia membrana plasmática. Para verificar que esta fracción contenía membrana 

plasmática se detectó al marcador GFP-2x(PH
PLC

), una repetición en tándem del 

dominio plecstrina de la fosfolipasa humana fusionado a GFP y que se ha demostrado 

que se localiza de forma exclusiva en la membrana plasmática de A. nidulans [122] 

(figura R21).  

El análisis de la localización de HalA en condiciones de crecimiento con una 

concentración elevada de potasio mostró un cambio en la distribución de esta quinasa en 

los experimentos de fraccionamiento. Así, con la adición al medio de 100mM de KCl 

HalA se localizó de forma prácticamente exclusiva en la fracción soluble (figura R21). 

Estos resultados muestran una distribución potasio dependiente de HalA en la célula, y 

sugieren un posible mecanismo regulatorio de la actividad de HalA a través de su 

aproximación a la membrana plasmática o su localización puramente citoplásmica y 

soluble. Es posible entonces que en condiciones limitantes de potasio en el medio, HalA 

podría dirigirse hacia la membrana plasmática para desempeñar un papel, por ejemplo, 

en la activación de transportadores de membrana de este catión. Es posible que este 

papel regulador sea llevado a cabo bien directamente o a través de la interacción con 

otros factores, como por ejemplo otras quinasas.  

 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[114]   

4.9 IDENTIFICACIÓN Y ESTUDIO DE LOS TRANSPORTADORES 

DE POTASIO 

4.9.1 Identificación de transportadores de potasio en Aspergillus nidulans. 

Dado que HalA puede localizarse asociada a la membrana plasmática y que en 

las cepas mutantes halA
-
 la toma de K

+
 está afectada era razonable plantear un estudio 

de la implicación de HalA en la regulación de los transportadores de potasio de 

Aspergillus. 

 Para abordar este trabajo en primer lugar se identificaron los posibles 

transportadores en A. nidulans, dado que se carecía de información previa acerca de los 

posibles transportadores de potasio existentes en este hongo. Utilizando la herramienta 

de WU-BLAST2 Search y las secuencias aminoacídidas de los transportadores de 

potasio Trk1 y Trk2 de S. cerevisiae y S. pombe [17,19] se buscó en la base de datos de 

Aspergillus utilizando el algoritmo Blastp. Se obtuvieron tres loci candidatos que 

codificarían para proteínas con un notable elevado de similitud en todos los casos 

(figura R22). Estos fueron denominados como trkA al locus AN5636, trkB al locus 

AN8029 y trkC al locus AN10136.  

Basándose en la comparación entre las secuencias de los diferentes Trks (figura 

R22A) no se pudo determinar el posible homólogo más próximo de los genes de A. 

nidulans a los de levaduras. Para caracterizar la estructura de estos transportadores de 

potasio se procedió a la realización de alineamientos múltiples con otros posibles 

transportadores de cationes y a la predicción de dominios transmembrana, utilizando en 

este último caso los recursos en la red http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM. 

 

http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM


RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[115] 

 

 

 

Figura R22: A) Resultados de la búsqueda de proteínas similares a los transportadores Trk 

de S. cerevisiae y S. pombe en A. nidulans. B) Predicción de la estructura de los Trks 

encontrados en A. nidulans y estructura propuesta para los canales Trk-HKT de S. 

cerevisiae. 

Lazo 
TrkA 300 aa 
TrkB 300 aa 
TrkC 150 aa 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[116]   

Las predicciones se muestran en la (figura R22 panel B) y coinciden en asignar 

ocho dominios transmembrana a cada transportador. Además todos los transportadores 

presentan en uno de sus dominios transmembrana posición carboxilo terminal, el 7º o el 

8º, una “secuencia firma” del canal de potasio. Esta secuencia es común a todos los 

canales de potasio y se compone de tres residuos consecutivos de glicina, tirosina y 

glicina (GYG), que por sus características físico-químicas confieren la especificidad del 

poro por los iones potasio discriminando estos de cationes con un volumen atómico 

similar y dando lugar a que estos iones pasen deshidratados a través del poro de forma, 

circunstancias que aumentan la selectividad del canal [123]. 

4.9.2 Análisis de la expresión de los transportadores Trks 

Puesto que estos transportadores Trk se encargan del transporte de potasio a 

través de la membrana plasmática, se analizó la expresión de los tres transportadores 

encontrados en Aspergillus en diferentes concentraciones de potasio en el medio. 

Además se estudió la influencia de la proteína HalA en los niveles de transcripción de 

estos transportadores, usando la técnica de “Northern-blot” descrita en el apartado 3.4.6 

de materiales y métodos.  

El patrón de expresión encontrado fue diferente para cada transportador Trk. 

Mientras que la expresión de trkA era dependiente de la concentración externa de K
+
, 

trkB y trkC codifican transportadores de potasio que se expresan de forma constitutiva 

(figura R23). En condiciones de crecimiento con elevadas concentraciones de potasio, la 

expresión de trkA es mucho menor que cuando el medio de crecimiento presenta unas 

concentraciones bajas (trazas) de potasio. En la cepa halA
-
 la regulación transcripcional 

de trkB y trkC es constitutiva al igual que en la cepa silvestre, pero la expresión de trkA 

no está reprimida por la presencia de altos niveles de K
+
 en el medio. 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[117] 

También se analizó el papel del regulador transcripcional SltA que media la 

respuesta a estrés salino en Aspergillus nidulans. Se analizaron los niveles de 

transcripción en una cepa mutante sltA1 sin que se observasen diferencias significativas 

en la expresión de los tres genes trk respecto a la cepa silvestre. El hecho de que la cepa 

doble mutante halA
-
 sltA

-
 muestre un patrón de expresión de trkA similar al que muestra 

la cepa halA
-
 sugiere que el mecanismo regulador en el que participa HalA es 

independiente de SltA. 

 

 

 

 

Figura R23: Patrón de expresión de los distintos transportadores de potasio de A. 

nidulans. En el panel A se muestran los niveles estacionarios de mRNA detectados para 

trkA y en el panel B para los genes trkB y trkC. Como control de carga de RNA total, en 

ambos paneles se muestran imágenes de los RNAs ribosomales mayoritarios (rRNAs) y 

de los niveles de transcripción de la actina, gen acnA. 

. 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[118]   

Los datos de los niveles de expresión de trkA en el fondo silvestre y mutante 

halA24 indican que los niveles intracelulares de K
+
 han de ser medidos para dar lugar a 

la síntesis de TrkA en condiciones de bajo potasio. Como primera hipótesis, esta 

observación implicaría la presencia de un sistema regulador por K
+
 sobre el que HalA, 

opcionalmente, podría actuar. Alternativamente, sería posible que los niveles de K
+
 

intracelular se viesen reducidos dado que HalA actuaría durante su localización próxima 

a la membrana plasmática como un activador de los canales de K
+
.  

Para analizar esta posibilidad se introdujeron mediante transformación copias 

extra de trkA utilizando un plásmido autorreplicativo. También se generaron cepas con 

copias extra de halA. Estas cepas, junto con otra que portaba el plásmido 

autorreplicativo vacio, se crecieron en medios con 0,1 M KCl, 1 M KCl, 0,3 M LiCl, 

MMA-K
+
 y 1 M KH2PO4. Contrariamente al efecto supresor de la introducción de 

copias extra de halA, las copias extra de trkA no prevenían del efecto inhibitorio del 

crecimiento causado por los bajos niveles de K
+
 en la cepa halA

- 
(figura R24). Sin 

embargo se observó un efecto mínimo por la expresión de trkA en condiciones de baja 

concentración de potasio donde el radio de crecimiento del mutante HalA24 aumenta. 

Todos estos datos sugieren que la funcionalidad de los transportadores Trk puede estar 

reducida en la ausencia de esta quinasa causando una deficiencia en los niveles 

intracelulares de K
+
. 

4.9.3 Construcción de cepas nulas para los distintos transportadores. 

 

 Para profundizar en el estudio de la regulación de los transportadores de potasio 

por HalA se construyeron las cepas nulas para cada uno de los genes trk. Para ello se 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[119] 

siguió el protocolo descrito en el apartado 3.2.4.1 de esta tesis y fue llevado a cabo por 

diferentes componentes del grupo. 

 

  

La cepa trkA fue construida por la Dra. Helen Findon en el Imperial College de 

Londres y la cepa trkB fue construida por Ane Marquina en este laboratorio. Para la 

construcción de la cepa nula de trkC se amplificó la región correspondiente al promotor 

de trkC con los oligonucleótidos PP1trkC y PP2trkC, la región correspondiente al 

terminador de trkC se amplifico con los oligonucleótidos GSP3trkC y GSP4trkC, y el 

Figura R24: Crecimiento de 

las cepas que sobreexpresan el 

plásmido vector (pAMA), 

TrkA (pTrkA) y HalA (pHalA) 

en MMA suplementado con 

diferentes cationes.  



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[120]   

gen pyrG de Aspergillus fumigatus se amplificó con los oligonucleótidos SMP1trkC y 

GFP2trkC, utilizando como molde el plásmido 1439. Para realizar la fusión de los tres 

fragmentos se añadieron a la mezcla de reacción los oligonucleótidos de los extremos, 

PP1trkC y GSP4trkC. 

Ese fragmento se transformó en la cepa MAD1739 siguiendo el protocolo 

descrito en el apartado 3.3.2 de Materiales y Métodos. Para verificar que los 

transformantes habían incorporado de forma correcta el fragmento construido en su 

genoma se analizaron utilizando la técnica de “Southern Blot” descrita en el apartado de 

materiales y métodos. Se generaron las cepas nulas y se verificó que ninguno de estos 

genes por separado son genes esenciales en A. nidulans. También se comprobó que en 

MMA estándar las cepas nulas no muestran un fenotipo apreciable (figura R25, control) 

 4.9.4 Mantenimiento del potencial de membrana, papel de HalA y TrkB. 

Además de analizar el papel de HalA en la regulación transcripcional y post-

transcripcional de los transportadores de potasio, se estudió el papel de esta proteína en 

el mantenimiento del potencial de membrana. Para ello se analizó la sensibilidad de las 

cepas halA
-
 tanto al mono- como al tetrametil-amonio (TMA). Ambas formas de metil-

amonio son responsables de despolarizar la membrana plasmática ya que introducen 

cargas positivas en el interior celular (figura R25 panel A). En el caso de mono-

metilamonio se observó una gran sensibilidad de todas las cepas a concentración de 

20mM, pero se inhibe sobre todo el crecimiento de cepas halA
-
. Respecto a la 

sensibilidad al TMA, como ya se ha descrito en S. pombe [93] se precisan elevadas 

concentraciones de TMA para observar inhibición del crecimiento. Mientras que la cepa 

silvestre presentó una resistencia moderada frente a 0,6M TMA se observó una elevada 

sensibilidad de los mutantes halA
-
 a concentraciones de 0,4M TMA (figura R25B).  



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[121] 

 

 

Figura R25: A) Esquema del mecanismo de acción del metilamonio. B) Crecimiento de las 

diferentes cepas carentes de alguno de los transportadores de potasio o de la proteína HalA 

en distintas concentraciones de mono (MMA) y tetrametil amonio (TMA) así como a pH 8.  



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[122]   

Respecto al papel de los transportadores de potasio Trk en la polarización de la 

membrana, las cepas nulas de trkA y trkC mostraron un fenotipo semejante al de la cepa 

silvestre tanto en mono como tetrametilamonio, mientras que la cepa trkB mostró una 

sensibilidad al TMA similar a la que se observó con las cepas halA
-
. Paralelamente se 

analizó el crecimiento de todas las cepas en un medio de pH alcalino (pH=8 usando 

Na2HPO4), para asegurar que la posible alcalinización del medio causada por los 

elevados niveles de TMA no fuera la causa de la inhibición del crecimiento mostrada 

por la cepa nula de trkB y cepas halA
-
 (figura R25 panel B). Los mutantes nulos trk no 

evidenciaron sensibilidad al pH alcalino. 

Estos resultados sugieren que HalA se necesita para el mantenimiento del 

potencial de membrana y que en esta función debe de estar ayudada por la actividad de 

TrkB, sugiriendo una posible acción de la quinasa HalA en la activación de este 

transportador iónico.  

4.9.5 Papel de los transportadores Trks en la respuesta a estrés catiónico. 

Para analizar la implicación de los Trks y de la proteína HalA en la homeostasis 

de cationes en primer lugar se analizó el crecimiento de cepas nulas en estas proteínas 

en MMA con bajo potasio (MMA-K
+
) y con la adición de elevadas concentraciones de 

diferentes cationes: K
+
, Na

+
 y Li

+
 (figura R26). De acuerdo con las observaciones 

previas (figura R14) halA se requiere a bajas concentraciones de K
+
. Observamos el 

mismo fenotipo de inhibición del crecimiento tanto en la cepa ΔtrkA como en la ΔtrkB, 

mejorando el crecimiento con la adición al medio de 10 mM de KCl. Estos resultados 

sugieren un papel de halA en la activación de ambos sistemas de transporte. 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[123] 

Así como ya se ha determinado la sensibilidad a Li de las cepas halA
-
, se 

observó en este caso, la completa inhibición del crecimiento de la cepa nula trkB, pero 

no de la cepas nulas trkA y trkC (figura R26) . El litio es un análogo del sodio y este 

catión resulta tóxico para estas cepas posiblemente porque se ha observado como el 

transporte de sodio en cepas carentes de la proteína quinasa HalA es deficiente.  

 

 

 

Figura R26: A) Crecimiento de las cepas nulas de los diferentes transportadores de 

potasio en MMA suplementado con distintos cationes. B) Crecimiento de las cepas en 

MMA suplementado con litio y con litio y potasio a la vez. 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[124]   

Cuando a este medio con litio se le añadió potasio en una concentración 100mM 

la cepa nula trkB redujo su sensibilidad al litio (figura R26). El experimento sugiere que 

esos niveles de K
+
 extra son capaces de suprimir la ausencia de TrkB  hasta un cierto 

punto, a un estado similar al que se observa con la ausencia de HalA. Sin embargo, la 

ausencia de HalA no puede ser suprimida por el exceso de K
+
, lo que indicaría que ese 

K
+
 no está entrando o compitiendo en su entrada con el Li

+
, si ese fuera el sistema de 

detoxificación. 

También se analizó el comportamiento de las diferentes cepas nulas de los 

diferentes transportadores de potasio Trks en MMA suplementado con diferentes 

cationes. Solo se observó un crecimiento diferente al crecimiento de la cepa silvestre en 

la cepa nula trkB, lo que indica que TrkB parece ser un transportador de potasio 

necesario para la regulación de homeostasis de cationes en A. nidulans.  

4.9.6 Localización subcelular de TrkB. 

 Los anteriores experimentos muestran que TrkB sería el principal implicado en 

la regulación de la homeostasis de cationes. Para poder analizar en profundidad el papel 

de este transportador se decidió estudiar su localización subcelular. Para ello se 

realizaron experimentos de fraccionamiento al igual que se hizo para el estudio de 

localización de la quinasa HalA.  

Para realizar este estudio  se construyó un fragmento mediante PCR que incluía 

a TrkB unido a tres copias del epítopo Myc que serviría para localizar esta proteína 

gracias a un anticuerpo específico. Para ello se usaron los oligonucleótidos GSPTrkB1-

4 y GFP1,2. A continuación se transformaron con este fragmento las cepas MAD1739 y 

MAD1124 siguiendo el protocolo descrito en el apartado 3.3.2. De esta forma se podría 

comparar la localización del transportador de potasio en presencia (MAD1739) y en 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[125] 

ausencia (MAD1124) de la proteína quinasa de interés, HalA. Para verificar que el 

fragmento se había integrado correctamente se analizaron los transformantes utilizando 

el método de Southern blot descrito en el apartado 3.4.5. Mediante esta técnica se 

comprobó como todos los transformantes de la cepa MAD1739 habían integrado el 

fragmento, pero no lo habían hecho los transformantes de la cepa MAD1124.  

Para estudiar la localización de TrkB en el fondo genético halA24 se generó la 

cepa correspondiente (MAD3210) mediante el cruce de las cepas TrkB::Myc 

(MAD3240) y la cepa halA24 (MAD1124), siguiendo el protocolo del apartado 3.3.4. A 

continuación se realizaron experimentos de fraccionamiento para visualizar TrkB en el 

fondo silvestre y mutante halA24 utilizando las cepas anteriormente citadas. Además se 

incluyeron en los experimentos condiciones de elevada y baja concentración de potasio 

para poder analizar posibles cambios de localización del transportador dependientes de 

K
+
 (figura R27). 

La figura R27, panel A, muestra que en el fondo halA silvestre (WT) TrkB se 

detecta en las fracciones P0,3K y P13K tanto en condiciones de alta como de baja 

concentración de potasio. Por lo tanto TrkB muestra localización en la membrana 

plasmática y en grandes agregados y membranas de orgánulos intracelulares. Se midió 

la intensidad de las bandas detectadas en “western-blot” con anticuerpo -Myc y se 

normalizó frente a la cantidad de proteína cargada, medida por tinción con Coomassie 

en el gel,  y se encontraron diferencias entre las dos concentraciones de potasio. A una 

concentración extracelular baja de potasio la cantidad de TrkB detectada en la fracción 

que contiene la membrana plasmática (P0,3K) es superior a la que se detecta en la 

fracción de membranas intracelulares y orgánulos (en el experimento mostrado 126% 

frente a 82%, 1,5 veces mayor). En condiciones de cultivo de alto potasio la relación se 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[126]   

invierte y aunque TrkB se detecta de nuevo en ambas fracciones, esta vez se detecta más 

en la fracción membranosa intracelular que en la que contiene la membrana plasmática 

(77% frente a 122%). Estos datos sugieren la existencia de un mecanismo regulatorio 

dependiente de potasio en la localización del transportador en la membrana.  

La ausencia de HalA determina cambios en la localización de TrkB. En 

condiciones de baja concentración de potasio en un fondo halA24 TrkB tiende a 

acumularse menos en la fracción correspondiente a la membrana plasmática comparado 

con la fracción de membranas intracelulares, y lo contrario ocurre en condiciones de 

alto potasio.  

Estos cambios de localización de TrkB se confirmaron mediante microscopía de 

fluorescencia. Para ello se construyeron cepas que expresaban TrkB fusionado a GFP. 

Se siguió la misma estrategia que para otros etiquetados, generando un fragmento que 

contenía a trkB fusionado al gen codificante de la proteína fluorescente verde, 

transformando en este caso las cepas MAD1739 y MAD1124. Estas cepas fueron 

construidas por Ane Marquina en el laboratorio siguiendo los protocolos descritos 

anteriormente en este mismo apartado. En primer lugar se puedo observar como en la 

cepa silvestre para la proteína HalA, el transportador de potasio TrkB se localiza a lo 

largo de toda la hifa. Parte de la fluorescencia aparece en el citoplasma y parte en la 

membrana plasmática de forma irregular. Cuando en el medio extracelular existe una 

baja concentración de potasio, el transportador tiende a localizarse en mayor medida en 

la membrana plasmática y en pequeños agregados a lo largo de la hifa (figura R28 panel 

A), pero sigue estando presente también en el citoplasma aunque en menor medida. 

Cuando la concentración de potasio en el medio extracelular aumenta, la distribución 

del transportador tiende a ser más citoplasmática que localizada en la membrana.  



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[127] 

 

 

 

Figura R27: Fraccionamiento celular. A) Cepa silvestre MAD 1739 en medio sin potasio (bajo 

potasio)  y con una concentración de 100mM de potasio (alto potasio). B) Crecimiento en las 

mismas condiciones que la anterior de la cepa portadora de la mutación halA24, MAD1124. 

También se realizaron geles teñidos con coomassie, para verificar la igualdad en las cargas de cada 

uno de los extractos utilizados. De esta forma se aseguró que las diferencias observadas entre 

extractos se debían a diferencias en la localización de la proteína y no por diferencias en la cantidad 

de proteínas cargadas. Se determinó la relación entre la intensidad de la banda detectada en cada 

fracción y experimento frente a los niveles de proteína cargados (medidos por la intensidad de 

tinción con Coomassie). 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[128]   

 

 Figura R28: Microscopía de flourescencia para analizar la localización subcelular de TrkB 

en la cepa silvestre (A) y en la mutante HalA24 (B). (C) Estudio por “western blot” de la 

expresión de TrkB en distintas condiciones de cultivo. Las flechas blancas en A y B señalan 

las zonas de acumulación de TrkB (membrana celular y septos). 



RREESSUULLTTAADDOOSS  

 

[129] 

Además se observa que no existe una acumulación de TrkB en el ápice de la hifa 

en contra de lo esperado, al ser esta parte de la célula más rica en ergosterol [124] y por 

tanto favorecer la acumulación de transportadores de membrana en los denominados 

“lipid rafts”. A pesar de que la endocitosis y exocitosis estan polarizadas [125,126] no 

se observa acumulación de TrkB en el ápice de la celula. De hecho, TrkB parece 

ausente de la región más apical y se observa en las zonas más maduras de la hifa. 

Cuando analizamos lo que ocurre con la localización del transportador TrkB en 

una cepa portadora de la mutación halA24 observamos como ocurre justamente lo 

contrario a lo observado en una cepa silvestre de HalA (figura R28 panel B). Cuando en 

el medio extracelular la concentración de potasio es baja, la distribución del 

transportador es mayoritariamente citoplasmática, mientras que cuando la concentración 

aumenta, TrkB tiende a localizarse en la membrana plasmática y en pequeños agregados 

a lo largo de la hifa. También en esta cepa mutante hal24 observamos que no existe una 

acumulación en la parte apical de la hifa. Los resultados observamos en la distribución 

del transportador TrkB gracias a la microscopía de fluorescencia están en concordancia 

con los obtenidos utilizando la técnica del fraccionamiento celular (figura R27) 

Finalmente se analizó mediante la técnica de “western-blot” descrita en el 

apartado 3.4.2 los niveles de proteína presentes en cada una de las condiciones (figura28 

panel C). Se observó que no existían cambios post transduccionales en ninguna de las 

condiciones. Este hecho no demuestra que TrkB no sea un sustrato fosforilable por 

HalA, sin embargo los resultados obtenidos por el grupo del Profesor Herb Arst de 

Londres apoyan esta posibilidad (ver Discusión).  

 



 

 

 

 

 

 

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  



 

 

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

  

  

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[133] 

5.- DISCUSIÓN 

 

Durante el trabajo experimental realizado en esta tesis doctoral se han 

identificado y caracterizado algunos de los componentes de los procesos de señalización 

y respuesta implicados en la homeostasis y resistencia a cationes, principalmente de 

sodio y potasio, del hongo Aspergillus nidulans. Se ha determinado el papel de la 

proteína quinasa HalA ambos procesos mencionados previamente y se han identificado 

TrkA, TrkB y TrkC, tres transportadores de potasio de la membrana plasmática del 

hongo, estudiándose su función en el hongo. Además se ha establecido el papel que 

desempeña HalA en la regulación de estos transportadores de membrana, actuando esta 

quinasa a dos niveles diferentes: mediante la modulación de  la expresión del 

transportador TrkA y definiendo la localización subcelular del transportador TrkB. 

1.- HalA es un factor importante en la respuesta a estrés catiónico. 

En comparación con el trabajo realizado en levaduras, especialmente en S. 

cerevisiae [32,127,128], los mecanismos que gobiernan la homeostasis de cationes y la 

respuesta adaptativa al estrés salino están muy poco estudiados en los hongos 

filamentosos. Las quinasas Hal4 y Hal5 participan tanto en el proceso de halotolerancia 

en S. cerevisiae (en la discusión se añadirá a cada proteína las iniciales de la especie 

citada para facilitar así la comprensión del texto, ScHal4 y ScHal5) como en la 

asimilación de determinadas fuentes de nitrógeno [32,92]. Utilizando A. nidulans, 

hemos determinado que la quinasa HalA es homóloga a las quinasas ScHal4 y ScHal5, 

ya que se precisa para la resistencia a elevadas concentraciones de cationes 

monovalentes en el medio extracelular. Cationes monovalentes como el Na
+
, K

+
, Li

+
, 

Cs
+
 y TMA son tóxicos, a partir de ciertas concentraciones, para una cepa deficiente 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[134]   

para HalA, sin embargo esta quinasa no se requiere para la resistencia a elevadas 

concentraciones de cationes divalentes. El papel de HalA parece ser aún más complejo, 

dado que también se necesita a esta quinasa el correcto crecimiento del hongo en 

medios con bajas concentraciones de potasio.  

Las proteínas ScHal4 y ScHal5 poseen una función redundante [127]. En el 

genoma de A. nidulans hemos identificado un gen que codificaría para un posible 

ortólogo de estas quinasas, el locus AN2943. La función de la proteína codificada por 

este gen no se ha estudiado en esta tesis doctoral, sin embargo los datos obtenidos en 

este trabajo permiten concluir que en el caso de A. nidulans HalA media las funciones 

realizadas por la dos quinasas Hal de S. cerevisiae. Sin embargo, HalA no posee el 

papel asignado a ScHal4 y ScHal5 intervienen en el metabolismo del nitrógeno 

modulando la localización subcelular de determinados transportadores de aminoácidos 

tales como la permeasa de arginina, la permeasa de uracilo o el transportador de glucosa 

[92], derivada posiblemente de su relación con la familia de quinasas NPR. Es 

especulativo, pero posible que la putativa quinasa AN2943 podría participar de forma 

específica en este proceso de regulación del metabolismo del nitrógeno, no obstante 

pese al enorme trabajo genético realizado por numerosos grupos en el estudio de la 

asimilación del nitrógeno, no se han obtenido mutantes en dicho locus [129,130]. 

Estudios de nuestro grupo demuestran la existencia de una relación genética 

entre HalA y el factor transcripcional SltA sobre la homeostasis del catión divalente 

calcio. La cepa doblemente nula halA sltA muestra un elevado requerimiento de calcio, 

aproximadamente de 10mM Ca
2+ 

en el medio para una completa supresión del fenotipo 

[94]. Este requerimiento de calcio puede acentuarse si en el medio extracelular se eleva 

la concentración de sodio o de potasio [50]. El doble mutante nulo halA sltA muestra 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[135] 

además hipertrofia vacuolar observándose un incremento en el número y el tamaño de 

las vacuolas, las cuales pueden llegar a acumularse incluso en la zona más apical de la 

célula, situación que no es habitual en las silvestres [50]. Para explicar este 

requerimiento excesivo de calcio, también denominado “auxotrofía de calcio”, se ha 

hipotetizado un excesivo e inadecuado almacenamiento de este catión en el interior 

celular debido al gran contenido vacuolar del mutante (figura D1). Aunque no se ha 

podido determinar la concentración de calcio en vacuolas, se ha demostrado el papel de 

dicho orgánulo en la homeostasis de calcio en A. nidulans mediante el estudio de la 

actividad de la ATPasas de calcio vacuolares PmcA y PmcB. En cepas nulas halA sltA, 

los niveles transcripcionales de pmcA y pmcB están elevados seis y doce veces 

respectivamente [50], mostrando así el papel concertado de la quinasa HalA y el factor 

transcripcional SltA en la regulación de los transportadores vacuolares de calcio. El 

cuádruple mutante nulo halA, sltA, pmcA, pmcB, no muestra el fenotipo de “auxotrofía 

de calcio”, aunque muestra hipersensibilidad a concentraciones altas o moderadas de 

otros cationes. Estos resultados avalan la hipótesis anterior. 

Además de la excesiva vacuolización y acumulación intracelular de calcio se 

debe sumar el efecto de HalA sobre el transporte intracelular de calcio. En un mutante 

sltA
-
 el transporte de calcio no está regulado. El transporte de calcio radiactivo en un 

mutante sltA
-
 no es competido por la adición de calcio “frío”, como ocurre en la cepa 

silvestre. La ausencia de la quinasa HalA en el fondo sltA
-
 restaura la cinética de 

transporte de Ca
2+

 a los de la cepa silvestre. Este papel de HalA podría ser directo sobre 

un determinado transportador de calcio, o un conjunto de ellos, o indirecto a través del 

efecto de la ausencia de halA en el potencial de membrana, que alteraría la capacidad de 

apertura de ciertos canales activados por carga, como el heterodímero Mid/Cch. 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[136]   

En resumen, la quinasa HalA se precisa para la correcta respuesta a altos y bajos 

niveles de cationes monovalentes teniendo, además, un efecto menor o posiblemente 

indirecto en la homeostasis del calcio. Esta función contrasta con la descrita para 

ortólogos de esta quinasa en otros hongos.  

De nuevo experimentos de genética clásica han proporcionado resultados tras los 

experimentos de supresión del fenotipo de auxotrofía de calcio en el doble mutante 

halA
-
 sltA

-
. La caracterización de estos supresores mostró la presencia de mutaciones en 

dos de los transportadores de Na
+
 y K

+
 de este hongo. El posible antiportador de Na

+
/H

+
 

NhaA y el posible transportador de K
+
, TrkB [50]. Se aislaron ocho mutaciones en el 

gen nhaA, homólogo de NHA1 y una en trkB. El fenotipo supresor de las mutaciones en 

nhaA se debían a pérdidas de función en este transportador, como se verificó mediante 

la construcción del triple mutante nulo halA; sltA; nhaA. Sin embargo, la mutación 

trkB1 no debía de representar una pérdida de función de este transportador de potasio 

dado que el alelo nulo trkB, generado por genética en reverso, no suprimió la auxotrofía 

de calcio del doble mutante nulo halA; sltA.  

En el alelo trkB1, el residuo de serina 373 es substituido por un residuo de 

leucina, Ser372Leu. En las predicciones HMMTOP, TrkB presenta ocho dominios 

transmembrana y la mutación Ser372 se localiza en un lazo muy conservado entre el 

segundo y el tercer dominio transmembrana. Este residuo conservado de serina podría 

ser una diana de fosforilación, la cual tendría un papel regulador al modular 

negativamente la actividad de este transportador. Esta hipótesis se fundamenta en los 

resultados obtenidos de la selección de mutantes supresores de la auxotrofía de calcio 

anteriormente mencionada y por la evidencia del papel regulador de la fosforilación 

obtenidos por Yenush y colaboradores en 2005 en Trk1p [131]. Estos investigadores 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[137] 

observaron una interacción fisiológica en S. cerevisiae entre Trk1p y la fosfatasa Ppz1p 

y han demostrado la existencia de estados fosforilados de Trk1p. Sin embargo, en el 

caso de TrkB no hemos podido detectar modificaciones en el patrón de migración de la 

banda detectada en geles de SDS-PAGE tanto en diferentes condiciones de estrés o en 

los fraccionamientos subcelulares. La presencia de HalA en la célula no cambia 

tampoco este patrón de detección, por lo tanto es una línea de interés para el laboratorio 

el determinar el papel de la fosforilación tanto en el sistema TRK como en la activación 

de otros elementos reguladores del sistema de respuesta a estrés salino u homeostático.  

 

 

 

2.- HalA y el sistema de regulación a pH ambiental. 

 

El proceso de obtención del mutante halA24, MoR24, establecía una relación 

funcional entre HalA y el sistema de pH ambiental. La mutación de pérdida de función 

Figura D1: Mecanismo propuesto para el transporte de calcio al interior celular y su 

posterior almacenaje en la vacuola [50]. 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[138]   

en halA suprime el fenotipo de sensibilidad al anión molibdato causado tanto por el 

fondo genético pacC
+/-

70001 y otros fondos mutantes en los que el sistema de 

señalización del pH ambiental está interrumpido, como en un mutante palA1. También 

se han observado supresión del fenotipo de utilización de GABA en un fondo mutante 

disfuncional de AreA, areA
r
, el regulador del metabolismo de nitrógeno (Arst y Espeso, 

sin publicar), de forma similar al fenotipo que muestran los mutantes pacC de pérdida 

de función. Estos resultados sugerían una relación entre el sistema de pH ambiental y la 

función de la quinasa HalA. Sin embargo, como se describe en la sección de resultados, 

los fenotipos mostrados por el alelo halA24 o el nulo halA, mostraban un rango de 

acción de HalA fuera del sistema regulador por pH ambiental. Los fenotipos de halA 

no son congruentes ni con una pérdida total de la función PacC, como es la supresión de 

una mutación areA
r
, ni con una ganancia extrema de su función, resistencia al 

molibdato, sensibilidad a neomicina o sensibilidad a pH ácido generado por altos 

niveles de fosfato en el medio, que iría mas allá de la mostrada por los alelos de 

ganancia de función en PacC, pacC
c
. Además, la supresión de HalA no requiere de la 

función PacC, como muestra el hecho de que suprima al mutante pacC
+/-

70001 que 

carece de transporte nuclear.  

En este trabajo se han establecido diferentes nexos entre HalA y los factores 

transcripcionales PacC y SltA. Se ha demostrado en el laboratorio que tanto SltA como 

PacC, se precisan para el crecimiento del hongo a pH alcalino [94,43]. HalA, sin 

embargo, no tiene una relación directa con la respuesta a la alcalinización del medio, 

dado que un mutante halA
-
 no incrementa la sensibilidad a pH o suprime los fenotipos 

causados por las mutaciones de pérdida de función en estos dos factores 

transcripcionales. En relación con otros sistemas, en S. cerevisiae no se ha establecido 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[139] 

ninguna relación entre las quinasas Hal4 y Hal5 y el homólogo de PacC, Rim101, y no 

existe homólogo de SltA en hongos levaduriformes.  De hecho, el estudio 

transcriptómico de la respuesta a la alcalinización del pH ambiental en S. cerevisiae no 

ha mostrado a los genes Hal4 o Hal5 como dianas de respuesta [132], de hecho las 

cepas mutantes hal4 hal5 no muestran afectado su crecimiento a pH alcalino [133]. 

La búsqueda de supresores del fenotipo de sensibilidad a molibdato causado por 

la mutación pacC
+/-

70001 proporcionó 17 cepas con mutaciones extragénicas a PacC. 

En ningún caso los componentes de la ruta de señalización Pal están afectados. De estos 

17 mutantes 3 han sido caracterizados con un poco de más detalle y lo único que ha 

podido establecerse es que deben participar en el sistema de detoxificación del anión 

molibdato. En el caso de HalA (MoR24), dicha acción podría deberse a una 

modificación del transportador de molibdato mediante fosforilación, o quizás sea el 

resultado de la modificación del potencial de membrana o contenido catiónico 

intracelular. Se desconoce la identidad de los genes en los que residen las mutaciones 

MoR21 y MoR19. Debido a la localización de la mutación MoR19 en el cromosoma III 

se han revisado genes candidatos de los ya caracterizados en este trabajo y otros 

posibles candidatos relacionados con el transporte de molibdato, sin éxito alguno. Los 

mecanismos de resistencia a molibdato permanecen aún desconocidos, aunque el 

presente estudio evidencia un carácter poligénico de este proceso. La resistencia a 

molibdato requiere de al menos 3 genes/loci además de la ruta PacC. El futuro permitirá 

definir cuáles son y cuál es su relación con la señalización a pH ambiental. 

En resumen, mutaciones en halA alteran el sistema de homeostasis de cationes y 

que este fenotipo puede repercutir en la respuesta normal del hongo al pH ambiental y a 

procesos asociados, como es el caso de la resistencia al ion molibdato. La actividad 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[140]   

HalA, hasta el momento, queda delimitada en la correcta regulación del circuito de 

homeostasis y respuesta a estrés salino, y su alteración causa efectos pleiotrópicos.  

3.- Genética clásica versus genética en reverso para el estudio de la homeostasis de 

cationes. 

En este estudio se han utilizado dos enfoques genéticos diferentes. La genética 

clásica ha permitido la identificación del gen halA y la relación genética entre la 

homeostasis de calcio y la de cationes monovalentes a través de sltA, nhaA y trkB. 

Debido al acceso generalizado a las bases de datos, una gran parte del trabajo se ha 

basado en la utilización de la genética en reverso. Ambos enfoques presentan ventajas e 

inconvenientes para el futuro de esta línea experimental.  

En el caso de la genética en reverso somos capaces de identificar los genes de 

interés, pero obviamente, estos son buscados sobre una base de la conservación en 

función o similitud de secuencias. En algunos casos es muy posible que se obtenga una 

visión muy parcial del sistema, basada en elementos ya identificados en otros 

organismos con la consiguiente pérdida en la novedad en los resultados, pero puede que 

no encontremos los puntos importantes implicados en algunos procesos, ya que de 

alguna forma estamos dirigiendo la búsqueda hacia unos genes determinados. 

Utilizando la genética en reverso ha sido posible caracterizar en el laboratorio a los 

genes que codifican para CrzA [94], factor de transcripción implicado en la homeostasis 

de cationes, así como a los que codifican para las ATPasa de membrana PmaA y PmaB 

o a dos de los tres transportadores de potasio, TrkA y TrkC. La metodología habitual ha 

sido generar alelos nulos, reemplazando completamente la secuencia codificante por un 

marcador fácilmente seleccionable, lo que permite concluir con relativa facilidad cual es 

el fenotipo que causa la total ausencia de esta proteína en la célula. La posibilidad de 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[141] 

combinar los diferentes alelos nulos generados con otros alelos hipofuncionales en otros 

genes mediante técnicas de genética clásica permite establecer las relaciones de 

epistasia o hipostasia entre ellos. En esta memoria se ha recogido el trabajo realizado 

principalmente entre halA y los genes trkA y trkC. La identificación de AN2943, un gen 

que codifica una proteína de características semejantes a las proteínas quinasas del tipo 

Hal, es un próximo objetivo del laboratorio para determinar su implicación en la ruta de 

homeostasis de cationes en A. nidulans.  

La genética clásica presenta como principal ventaja que nos ayuda a identificar 

genes cuyos productos son clave en la función celular que se está analizando. De esta 

forma se han identificado a halA [107], objeto principal de este trabajo, sltA [50,134], y 

a los transportadores de cationes nhaA y trkB.. HalA constituye un ejemplo de un 

resultado inesperado a partir de un análisis genético clásico. Como ya se ha mencionado 

reiteradamente un mutante en halA se aisló durante la búsqueda de supresores del 

fenotipo de pérdida de localización nuclear del factor de transcripción PacC pero no 

participa en su señalización. Así mismo, las quinasas ScHal4 y ScHal5 fueron halladas 

en experimentos de supresión de fenotipos mediante sobreexpresión [77]. La genética 

clásica pone de manifiesto la relación entre el sistema de pH y la homeostasis de 

cationes y la existencia de fenotipos cruzados en mutantes ambas rutas o la existencia de 

efectos pleiotrópicos en determinadas mutaciones. Como ya se indica arriba, la genética 

clásica ayuda a posteriori a la mejor clasificación de los alelos mutantes encontrados y 

en delimitar el rango de acción de cada uno de ellos.  

Nuevamente, un resultado interesante fue obtenido mediante la supresión del 

fenotipo del doble mutante halA sltA para la auxotrofía de calcio, permitiendo 

identificar los homólogos de NHA1, nhaA, y de TRK1, trkB. En este caso, la 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[142]   

identificación de estos transportadores fue determinada por métodos de búsqueda in 

sílico [135]. En este caso, la genética formal revela un papel de la homeostasis de 

cationes monovalentes como el sodio y el potasio en la homeostasis del calcio. En el 

caso del transportador de sodio/protones NhaA, la pérdida de función de este 

transportador supone la supresión del fenotipo mutante halA sltA. La mutación aislada 

en el transportador de potasio TrkB es más interesante dado que posiblemente sea una 

ganancia de función y su futuro estudio en mayor detalle posiblemente ayudará a 

establecer las bases de la regulación de estos transportadores en A. nidulans y el papel 

de la fosforilación en dicho proceso. La relación entre el nivel de K
+
 y el mantenimiento 

del nivel de Ca
2+

 intracelular parece ser un hecho en A. nidulans.  

Este estudio nos ayudó además a tener en cuenta que si las utilizábamos por sí 

solas las técnicas de genética clásica podían llevarnos a error dependiendo de la zona 

del cromosoma en la que nos encontremos [107]. En la era de la secuenciación de 

genomas una forma rápida para identificar genes es utilizar las frecuencias de 

recombinación entre mutaciones. Este trabajo muestra las dificultades en la 

identificación de un gen próximo al centrómero, el gen halA. El mapeo genético de la 

mutación halA24 determina que el gen mutante está localizado en el brazo derecho del 

cromosoma III de Aspergillus nidulans y muy próximo, 1.8 cM, al gen phenA. En 

primer lugar identificamos el gen phenA (situado a 59 kb del centrómero), y a 

continuación, utilizando la base de datos del genoma de Aspergillus y el análisis del 

fenotipo causado por la mutación halA24, intentamos identificar al gen halA en la 

proximidad del locus phenA, fracasando en nuestra búsqueda. Utilizando la técnica del 

“paseo cromosómico” finalmente pudimos identificar al gen que portaba la mutación 

halA24 y determinar que la distancia física entre las mutaciones phenA2 y halA24 es de 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[143] 

más de 66 kb. Extendimos nuestra búsqueda a otros marcadores genéticos 

frecuentemente utilizados en A. nidulans. Hemos determinado la distancia física entre 

siete loci diferentes, caracterizando una mutación en cada locus, cuatro en el brazo 

derecho del cromosoma III y tres en el brazo derecho del cromosoma IV. Nuestro 

trabajo muestra que la frecuencia de recombinación entre mutaciones en genes 

próximos al centrómero se reduce considerablemente en A. nidulans. Hemos 

determinado que en la cercanía del centrómero 1 cM corresponde a aproximadamente 

50 kb, mientras que esta relación se reduce a menos de 2 kb por cM a una distancia de 

240 kb de los centrómeros [107]. Este resultado tiene implicaciones importantes en las 

búsquedas de genes de Aspergillus que estén situados en las regiones pericentroméricas 

basándose en los datos existentes de genética clásica. Además nos avisa sobre el posible 

exceso de trabajo que puede ocasionar el verificar la integridad de genes candidatos 

basándose en la clasificación realizada por la base de datos. Es necesario un apoyo 

mutuo entre la genética clásica y la genética en reverso para proporcionar resultados 

definitivos y comprensibles que permitan avanzar en la comprensión de los diferentes 

sistemas regulatorios del hongo. En ningún caso se puede minusvalorar un abordaje  

respecto al otro. 

4.- Sistema quinasa-fosfatasa en la respuesta a estrés salino. 

 

En todas las células eucariotas, la fosforilación reversible de proteínas es el 

principal mecanismo de regulación de importantes procesos que ocurren en el interior 

celular tales como el metabolismo, el transporte a través de membranas o la división 

celular. El estado de fosforilación de las proteínas que intervienen en estos procesos es 

el resultado del equilibrio existente entre la acción específica de las proteínas quinasa y 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[144]   

las proteínas fosfatasa que fosforilan, respectivamente, los residuos aminoacídicos 

(serina, treonina, tirosina o histidina) de dichas proteínas [136]. En A. nidulans se han 

identificado 28 genes que codifican subunidades fosfatasa [137]. 

En eucariotas existen tres tipos principales de proteínas fosfatasa, las Ser/Thr 

fosfatasas que desfosforilan residuos serina y treonina de proteínas, las Tyr fosfatasas 

que desfosforilan residuos tirosina, y las proteínas fosfatasas de especificidad dual, que 

son capaces de desfosforilar los tres tipos de residuos [136]. 

En cuanto a la implicación de estas fosfatasas en la regulación de la homeostasis 

salina, se sabe que células carentes de algunas Ser/Thr fosfatasas presentan 

hipertolerancia a sodio y litio [138]; esto es debido al incremento de la expresión del 

gen ENA1 que codifica una ATPasa de sodio [31]. Existen evidencias bioquímicas y 

genéticas que apuntan al hecho de que los transportadores de potasio Trk1 y Trk2, 

implicados en la homeostasis iónica estarían también regulados por las fosfatasas 

Ser/Thr [131]. Todas las funciones en las cuales intervienen proteínas fosfatasas Ser/Thr 

del tipo Ppz (proteínas que desfosforilan preferentemente la subunidad β de la 

fosforilasa quinasa) están reguladas por la subunidad proteica Hal3. El gen HAL3/SIS2 

ha sido identificado como capaz de conferir tolerancia a altas concentraciones de 

cationes sodio y litio cuando se sobreexpresa en cepas silvestres, mientras que la falta 

de este gen incrementa la sensibilidad a sal [79]. La implicación de los mecanismos de 

fosforilación/desfosforilación en la regulación de la toma de potasio se descubrió a raíz 

de la identificación de Hal3 como modulador de la salida de sodio y litio y de la entrada 

de potasio [139]. Hal3 se identificó como regulador negativo de la fosfatasa Ppz1 [79], 

una proteína Ser/Thr fosfatasa conocida por su influencia en los mecanismos de 

tolerancia a sal [138]. Yenush y colaboradores demostraron como la pareja Hal3/Ppz1 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[145] 

está implicada en la correcta regulación de las concentraciones internas de potasio y la 

regulación del pH de forma dependiente de los canales Trk [78]. Recientemente se ha 

mostrado como Trk1 está presente en la membrana plasmática en unas estructuras 

denominadas balsas lipídicas [32] donde interactúan con Ppz1 y con Hal3 en una forma 

dependiente de pH, lo que podría indicar que la interacción Hal3-Ppz1 actuara como 

sensor intracelular de pH que modulara la homeostasis de potasio mediante la 

regulación de la actividad de Trk. No se ha observado aún la desfosforilación directa de 

Trk1 por Ppz1. 

Para analizar el papel de las fosfatasas en A. nidulans Son y colaboradores en 

2009 [137] llevaron a cabo una deleción sistemática de todos estos genes.  La deleción 

de bimG, pphA, nimT y AN29024 resulta letal para el hongo. nimT y bimG son 

necesarios para la entrada y progresión, respectivamente, en el ciclo mitótico [140,141]. 

Además se piensa que pphA regula la morfogénesis de la hifa. La fosfatasa activada por 

calcio, calcineurina, ha sido clasificada como esencial hasta que recientemente un 

estudio ha demostrado que el nulo es viable aunque con un fenotipo de alteración 

morfológica muy severa. Se ha propuesto recientemente a esta fosfatasa como un 

elemento necesario para la transición del sistema de transporte Trk al estado de alta 

afinidad por potasio inducido por el estrés catiónico [142].  

HalA es una proteína quinasa y por lo tanto estará implicada en este sistema 

reversible de fosforilación y desfosforilación. Una parte muy importante de nuestro 

estudio es analizar el posible sustrato de fosforilación de esta quinasa. Uno de los 

posibles candidatos a ser fosforilados es la misma proteína quinasa en un proceso de 

autofosforilación. En este estudio y con las técnicas empleadas no hemos sido capaces 

de detectar la existencia de una autofosforilación de la proteína HalA, lo que nos llevó a 

buscar otros posibles candidatos para ser fosforilados por la quinasa. Otra posibilidad 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[146]   

sería que HalA fosforilara a su vez a otra proteína quinasa, participando así en una 

cascada señalizadora de quinasas. En esta opción debemos tener en cuenta al gen 

previamente identificado, AN2943, similar a una quinasa, que podría estar implicado en 

la ruta de homeostasis de cationes y ser el sustrato de fosforilación de la quinasa HalA. 

Esta posibilidad abre una futura línea de investigación en el laboratorio a la hora de 

esclarecer la ruta de señalización de la resistencia a elevadas concentraciones de 

cationes monovalentes en A. nidulans. En otros organismos, más concretamente en las 

levaduras S. cerevisiae o S. pombe se ha visto como las quinasas Hal4/Hal5 están 

fosforilando transportadores de potasio de membrana denominados Trks [92]. En 

nuestro caso nos planteamos si los transportadores de potasio son el sustrato de la 

proteína quinasa HalA. 

Para analizar la implicación de HalA en la modulación de los transportadores 

Trk se estudió en primer lugar la localización subcelular de la quinasa. Para ello usamos 

en primer lugar la microscopía de fluorescencia para estudiar su ubicación. Marcamos la 

proteína con un epítopo fluorescente que somos capaces de detectar por su emisión al 

ser excitado con una determinada longitud de onda. Con esta técnica no fuimos capaces 

de ver diferencias en la localización de la quinasa dependientes de la concentración 

extracelular de potasio. Pese a ello decidimos realizar otro tipo de experimento para 

analizar su localización subcelular. En segundo lugar utilizamos el fraccionamiento 

celular y con el fuimos capaces de detectar un cambio de localización de la proteína que 

no éramos capaces de ver con la microscopía de fluorescencia. Esta técnica de 

microscopía normalmente nos permite estudiar la diferente localización subcelular de 

distintas proteínas, como por ejemplo el factor de transcripción CrzA, cuya localización 

pasa a ser nuclear en presencia de calcio en el medio extracelular [94]. Aún así hemos 

de ser cuidadosos a la hora de elegir las técnicas y a la hora de realizar conclusiones, ya 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[147] 

que en el caso de HalA hemos necesitado utilizar dos técnicas diferentes para poder 

conocer la localización de la proteína en función de la concentración de potasio 

extracelular. Cuando existe potasio en el medio extracelular la proteína se localiza parte 

en la membrana plasmática y parte en el citoplasma, mientras que cuando el potasio se 

vuelve limitante en el exterior celular la proteína se localiza principalmente en la 

membrana plasmática de la célula. 

 

5.- Sistema de transporte de potasio en A. nidulans. 

HalA se localiza a dos niveles diferentes, en la membrana plasmática y en el 

citoplasma. Esta proteína presenta 2 poblaciones diferentes que pueden estar llevando a 

cabo funciones distintas dentro de la célula. Por un lado puede estar modulando el 

transporte de cationes a través de la membrana plasmática y por otro lado regulando el 

almacenamiento de cationes en orgánulos intracelulares. Se conoce como el hongo 

almacena cationes en el interior de sus orgánulos celulares para ayudar al 

mantenimiento del equilibrio catiónico celular [50]. Además hemos podido comprobar 

cómo esta localización a dos niveles del sistema de transporte de potasio es uniforme a 

lo largo de toda la hifa.  

Los canales Trk son factores clave en el transporte de potasio [32]. Frente a los 

dos transportadores encontrados en las levaduras S. cerevisiae y S. pombe, en el genoma 

de A. nidulans se han identificado tres posibles transportadores de la familia Trk. La 

presencia de un transportador adicional sugiere la existencia de un sistema más 

complejo de transporte de potasio. TrkA y TrkB se han propuesto como los posibles 

homólogos funcionales de Trk1, mientras que TrkC lo sería de Trk2 [50]. Teniendo en 

cuenta la comparativa de secuencias que hemos llevado a cabo no podemos confirmar 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[148]   

que exista esa correlación ya que según sus secuencias TrkB es el más parecido a todos 

los Trk de otros organismos, a continuación TrkA es el que más se parece al resto de 

Trk y por último TrkC es el menos parecido a todos ellos. En la bibliografía 

encontramos como la principal diferencia entre scTrk1 y scTrk2 está en la longitud del 

lazo que se sitúa entre el primer y el segundo dominio transmembrana, que es mayor en 

el caso de scTrk1 [32]. El lazo de longitudes similares en Aspergillus se sitúa entre el 

segundo y el tercer dominio transmembrana predichos. En el caso del hongo la longitud 

de este lazo es similar en TrkA y TrkB (301 aa y 294 aa respectivamente), mientras que 

es ligeramente menor en el caso de TrkC (150 aa), lo que no es suficiente para 

compararlos con las estructuras predichas en S. cerevisiae. A la vista de estos resultados 

no podemos proponer a los posibles homólogos de ScTrk1 y ScTrk2 basándonos en sus 

secuencias. Futuros estudios funcionales de cada uno de los diferentes transportadores 

de A. nidulans podrán darnos esa información. Podría ocurrir algo parecido a lo que se 

ha visto en S. pombe que al contrario de lo visto en otras levaduras ambos 

transportadores contribuyen por igual en el transporte de potasio [93]. El análisis 

transcripcional de los genes trk en A. nidulans muestra distintos patrones de regulación 

para estos tres genes. El potasio inhibe la expresión de TrkA, esto sugiere que TrkA es 

el responsable del transporte de alta afinidad, pero la deleción de trkA no modifica el 

crecimiento en bajas concentraciones de potasio y la sobreexpresión de este canal 

mejora muy poco el crecimiento con respecto a la cepa silvestre. trkC y trkB no están 

regulados por potasio, pero solo TrkB juega un papel importante en la resistencia a la 

toxicidad catiónica. En la levadura se propone la formación de un complejo 

heteromérico entre diferentes proteínas Trk [32] y en A. nidulans podría estar 

ocurriendo algo parecido formando complejos di/triméricos con los diferentes Trk. En 

este modelo TrkB es el núcleo del transporte y distintas combinaciones TrkA/B/C serían 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[149] 

responsables del transporte de alta o baja afinidad de potasio. HalA tiene un doble papel 

en la regulación de los transportadores Trk. En primer lugar HalA regula de forma 

negativa la expresión de TrkA por un exceso de potasio y esta es una regulación 

transcripcional. Este mecanismo regulador no está descrito anteriormente puesto que no 

se ha descrito una modificación de la regulación transcripcional de los transportadores 

TRK1 y TRK2 en fondos genéticos mutantes hal4/hal5 en S. cerevisiae [32,77]. 

Para comprender el papel “transcripcional de HalA” sobre TrkA, en el futuro se 

deberá determinar si existe una regulación directa sobre un factor de transcripción que 

mediase la regulación de la homeostasis de cationes o si se da una regulación indirecta a 

través de la concentración intracelular de potasio afectando así a otras rutas de 

señalización que medien la respuesta a este y otros cationes. La preferente localización 

citoplasmática de HalA en concentraciones extracelulares elevadas de potasio nos puede 

sugerir la existencia de un mecanismo regulatorio, muy probablemente una 

fosforilación, actuando sobre un factor de transcripción. Esta fosforilación podría estar 

activando o inhibiendo el factor de transcripción y este a su vez puede tratarse de un 

supresor o un activador, por lo que existen varias posibilidades de regulación a este 

nivel. Nuestros estudios descartan que SltA sea ese factor de transcripción y por lo tanto 

se abren nuevas líneas de investigación para su búsqueda. Existe un candidato para este 

papel, el factor de transcripción MsnA, que está regulado por elevadas concentraciones 

de sal [143] y que será objeto de futuros estudios. También los factores 

transcripcionales PbsA y PtpA son posibles candidatos dado que participan en rutas de 

estrés salino y son regulados en presencia de elevadas concentraciones de sales, 

sugiriendo un mecanismo de retroalimentación específico para sales [143]. Podría 

pensarse que esta regulación se diera en determinados momentos del ciclo celular, como 

por ejemplo durante la conidiación. Vemos la existencia de un sistema de regulación de 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[150]   

la expresión de un transportador Trk por la concentración de potasio, algo que no se 

había visto hasta este momento. 

Por otro lado HalA está implicada en la localización del transportador de potasio 

TrkB. Cuando en el medio extracelular existe una baja concentración de potasio, la 

proteína HalA se distribuye próxima a la membrana plasmática Trabajos recientes como 

el mostrado por [92] han demostrado que la presencia de ScHal4 es necesaria para la 

estabilización del transportador en la membrana plasmática en condiciones de baja 

concentración de potasio extracelular.  

 

 

 

Las proteínas ScHal4p ScHal5p son efectores positivos necesarios para el 

funcionamiento de Trk1 y Trk2, ya que mutantes hal4 hal5 no son capaces de crecer en 

medios con bajas concentraciones de potasio, posiblemente debido a una mala toma de 

potasio [77]. En este trabajo demostramos el efecto de la proteína HalA en la 

localización de uno de los transportadores de potasio. La localización de TrkB en 

Figura D2: Posible mecanismo de regulación del factor de transcripción 

implicado en la ruta de homeostasis catiónica. 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[151] 

presencia de una proteína HalA funcional difiere ligeramente en medio con elevada 

concentración de potasio, donde se localiza en la membrana plasmática y en mayor 

medida en otros grandes agregados, y en medio con baja concentración de potasio, 

donde su localización es mayoritaria en la membrana plasmática.  

 

 

 
Figura D3: Esquema de los posibles mecanismos propuestos para la actuación de la 

proteína HalA en presencia de altas o de bajas concentraciones de potasio. 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[152]   

La ausencia de HalA modifica este patrón de distribución en sentido contrario a 

lo esperado o a lo que se observa en S. cerevisiae [92], cuando aumenta la 

concentración de potasio en el medio extracelular también aumenta la cantidad de 

proteína HalA que se localiza en la membrana plasmática y por el contrario cuando el 

medio extracelular presenta una menor concentración de potasio, la proteína tiende a 

localizarse en la fracción que contiene grandes agregados proteicos no solubles, 

generalmente asociados con la membrana plasmática  

La distinta distribución de TrkB en cepas que carecen de una proteína HalA 

funcional puede explicar los fenotipos de toxicidad a elevadas concentraciones de 

potasio y el requerimiento de este catión cuando su concentración es baja en el medio.  

Según parecen indicar los resultados de los experimentos de fraccionamiento, 

cuando el transportador es requerido en la membrana para llevar a cabo su función, es 

decir, en condiciones en las que la concentración de potasio extracelular es baja, este 

transportador no se localiza principalmente en la membrana, sino en otros complejos o 

grandes agregados. Por el contrario, cuando la concentración extracelular es elevada y 

no es necesario transportar más potasio al interior celular, los transportadores TrkB se 

localizan en la membrana plasmática de la célula. 

La diferente localización de los transportadores de potasio en la membrana o en 

grandes agregados en función de la concentración extracelular de potasio podría estar 

indicándonos un posible papel de la ruta endocítica en la retirada de transportadores de 

la membrana en endosomas cuando estos transportadores no son requeridos, por 

ejemplo en el caso de un exceso de potasio en el medio extracelular. La localización de 

los transportadores varía en función de si existe un  HalA funcional o no, lo que podría 

estar indicándonos que HalA bien directamente o bien a través de una ruta más 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[153] 

compleja estaría mediando la señalización para la internalización de TrkB mediante el 

sistema clásico de endocitosis. 

Esta hipótesis de la diferente localización subcelular de los transportadores de 

potasio, no excluye que el transportador TrkB pueda ser activado en ausencia de la 

proteína HalA, por ejemplo, por otra proteína del tipo Hal, codificada por el gen 

AN2943. En S. cerevisiae se conoce como Trk1 es fosforilado por Hal4p/Hal5p 

[77,131]. En S. pombe existe la evidencia de una fosforilación de Trk1 pero, de acuerdo 

a nuestros resultados, la fosforilación de Trk1 como respuesta a las bajas 

concentraciones de potasio extracelular no es dependiente de Hal4 [93]. En este trabajo 

no hemos sido capaces de detectar formas modificadas o fosforiladas de HalA o de 

TrkB como respuesta a altas o bajas concentraciones externas de sodio o potasio. 

Tampoco nos fue posible detectar modificaciones postransduccionales en las diferentes 

fracciones subcelulares, sugiriendo la existencia de o bien modificaciones transitorias o 

bien un mecanismo regulatorio alternativo. Hay que tener en cuenta que las condiciones 

en las que aislamos y estudiamos las proteínas de Aspergillus ya se han usado para ver 

fosforilaciones y han funcionado [144,145]. 

Este trabajo presenta evidencias de una divergencia en la homeostasis de 

cationes entre hongos filamentosos y levaduras. Los componentes de transporte y 

regulatorios están presentes en ambos grupos, pero su número y su función varían entre 

ellos. El trabajo que se nos plantea en el futuro es el de analizar los mecanismos 

regulatorios responsables de la halotolerancia en A. nidulans ya que estos pueden 

proveer otros mecanismos alternativos o específicos en otros hongos relacionados ya 

que la homeostasis catiónica tiene un gran interés comercial y clínico. 



DDIISSCCUUSSIIÓÓNN  

 

[154]   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS  

  

  

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS  

 

[157] 

6.- CONCLUSIONES 

 

1.-  La búsqueda de supresores en un mutante deficiente en la respuesta a pH ambiental 

ha permitido la identificación y caracterización de HalA como una proteína quinasa 

implicada en la regulación de la homeostasis de cationes monovalentes en A. nidulans. 

Sin embargo, HalA no pertenece a la ruta de señalización del pH extracelular. 

2.- Al contrario del papel descrito para las quinasas de la familia Hal en otros 

organismos, HalA no participa directamente en la homeostasis de cationes bivalentes ni 

en la ruta de asimilación de nitrógeno. 

3.- La proteína quinasa regula, al menos, a dos niveles la homeostasis de cationes 

monovalentes: por un lado modulando la expresión del gen que codifica para el canal de 

potasio TrkA y por otro determinando la localización subcelular del canal TrkB. 

4.- La localización en la célula de HalA está regulada por potasio y puede ser un 

elemento clave en su función quinasa, posiblemente modificando efectores en la 

proximidad de la membrana plasmática y en el citoplasma.  

5.- Tomando como ejemplos a S. cerevisiae y A. nidulans, se evidencia una notable 

divergencia entre la regulación de la homeostasis de cationes entre hongos 

levaduriformes y filamentosos. El papel de HalA en combinación con el factor de 

transcripción SltA específico de hongos filamentosos indica la compleja regulación 

cruzada entre cationes monovalentes y divalentes existente en A. nidulans, donde los 

resultados obtenidos sugieren que la actividad de HalA sobre los transportadores Trk 

puede no ser directa.  

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFÍÍAA  

  

  

 



 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFÍÍAA  

 

[161] 

6.- BIBLIOGRAFÍA 

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	Dedicatoria
	AGRADECIMIENTOS
	ABREVIATURAS
	ÍNDICE
	1.- INTRODUCCIÓN
	1.1 Aspergillus nidulans
	1.2 HOMEOSTASIS DE CATIONES
	1.3 TRANSPORTADORES DE POTASIO
	1.4 REGULACIÓN DEL TRANSPORTE DE POTASIO
	1.5.- Antecedentes al trabajo elaborado en esta tesis doctoral

	2.- OBJETIVOS
	3.- MATERIALES Y MÉTODOS
	3.1. CONDICIONES Y MEDIOS DE CULTIVO
	3.2. CEPAS DE Aspergillus, PLÁSMIDOS Y OLIGONUCLEÓTIDOS UTILIZADOS.
	3.3. TÉCNICAS DE Aspergillus nidulans
	3.4. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR, BIOQUÍMICA Y PROTEÓMICA
	3.5. Microscopía de fluorescencia y análisis de las imágenes.
	3.6 KITS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y BIOQUÍMICA Y OTROS COMPONENTES COMERCIALES UTILIZADOS EN ESTA TESIS
	3.7. Herramientas Bioinformáticas

	4. RESULTADOS
	4.1 SELECCIÓN DE SUPRESORES DEL FENOTIPO DE SENSIBILIDAD AL MOLIBDATO CAUSADO POR LA MUTACIÓN pacC+/- 70001
	4.2 MUTANTE MoR24
	4.3 ANALISIS GENÉTICO DEL MUTANTE MoR24.
	4.4 IDENTIFICACION DE MoR24, AN8830
	4.5 Análisis funcional de HalA
	4.6 PAPEL DE LA PROTEINA QUINASA HalA EN LA HOMEOSTASIS DE POTASIO Y SODIO.
	4.7 REGULACIÓN POR POTASIO DE HalA
	4.8 LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE HalA
	4.9 IDENTIFICACIÓN Y ESTUDIO DE LOS TRANSPORTADORES DE POTASIO

	5.- DISCUSIÓN
	1.- HalA es un factor importante en la respuesta a estrés catiónico
	2.- HalA y el sistema de regulación a pH ambiental
	3.- Genética clásica versus genética en reverso para el estudio de la homeostasis de cationes
	4.- Sistema quinasa-fosfatasa en la respuesta a estrés salino
	5.- Sistema de transporte de potasio en A. nidulans

	6.- CONCLUSIONES
	6.- BIBLIOGRAFÍA