UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR II TESIS DOCTORAL Papel de las isoformas del receptor de insulina en la regulación de la homeostasia glucídica y lipídica en un modelo de diabetes experimental MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR Sabela Díaz-Castroverde Vicario DIRECTORES Manuel R. Benito de las Heras Óscar Escribano Illanes Madrid, 2017 © Sabela Díaz-Castroverde Vicario, 2016 Tesis Doctoral Papel de las isoformas del receptor de insulina en la regulación de la homeostasia glucídica y lipídica en un modelo de diabetes experimental Sabela Díaz-Castroverde Vicario Madrid, 2016 Tesis Doctoral Papel de las isoformas del receptor de insulina en la regulación de la homeostasia glucídica y lipídica en un modelo de diabetes experimental Esta memoria ha sido presentada por la licenciada Sabela Díaz-Castroverde Vicario para optar al grado de Doctor por el programa de doctorado RD1393/2007 de la Universidad Complutense de Madrid. Directores de la tesis Dr. Manuel R. Benito de las Heras Dr. Óscar Escribano Illanes Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid y financiado por una beca del consorcio MOIR y por los proyectos de investigación CAM S2010/BMD-2423, MINECO SAF2011/22555 y SAF2014­ 51795-R y CIBERDEM PIE14/00061. Gracias, A todos aquellos que han escalado a mi lado por la cara norte, especialmente a Pilatos, padres, Javi, Vane, Nuria, Tamara y Minutti. A todos aquellos que fueron poniendo amarres, especialmente a Gema, Silvia y Elena; Elisa y David e Irene. A todos aquellos que me enseñaron que la cara sur también existe, especialmente a Bea Gracillán, Alberto Bartolomé y Carmen Arce. A todos aquellos que me han presentado a la ciencia y me han acogido a su lado, especialmente a mis directores, al laboratorio de Gloria, al laboratorio de Becky, a los inmunitos originales, a BBMII y, como no, al laboratorio 21. A mi gran amiga Ale, que ha dejado este libro bien bonito. A mi madre, que se ha leído hasta los insufribles materiales y métodos. A Vane, otra vez. A todos, gracias. 00/ índice 16 01/ RESUMEN 25 02/ SUMMARY 33 03/ ABREVIATURAS 39 04/ INTRODUCCIÓN 1. 41 DIABETES TIPO 2 Y PAPEL DEL RECEPTOR DE INSULINA EN LA HOMEOSTASIA GLUCÍDICA 1.1 LA 41 DIABETES EN LA ACTUALIDAD 1.2 43 FISIOPATOLOGfA DE LA DIABETES TIPO 2 1.3 45 MODELOS ANIMALES EN LA INVESTIGACIÓN DE LA DIABETES TIPO 2: VÍA DEL RECEPTOR DE INSULINA Y DEL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO INSULÍNICO TIPO l. 1.3.1 MODELOS KNOCKOUT ESPECÍFICOS DE TEJIDO 1.3.2 LA NECESIDAD DE LOS MODELOS KNOCKOUT INDUCIBLES Y ESPECÍFICOS DE TEJIDO: MODELO iLIRKO. 1.3.3 MECANISMOS DE COMPENSACIÓN: OTROS MODELOS KNOCKOUT 48 2. RECEPTOR DE INSULINA E IGF-I 48 2.1 ESTRUCTURA DE LOS RECEPTORES, ISOFORMAS DEL RECEPTOR DE INSULINA Y RECEPTORES HIBRIDOS 51 2.2 VfAS DE SEf;IALIZACIÓN DE LA INSULINA Y EL IGF-I 53 2.2.1 RUTA Pl3K/PKB 2.2.2 RUTA RAS/MAPK 2.2.3 MODULACIÓN DE LA CAPTACIÓN DE GLUCOSA EN LOS HEPATOCITOS 53 2.3 FUNCIÓN DEL HfGADO EN EL CONTROL METABÓLICO 54 2.4 INTRODUCCIÓN AL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO: REGULACIÓN POR GLUCOSA-6-FOSFATO 2.4.1 GLUCÓGENO SINTASA HEPÁTICA 2.4.2 GLUCÓGENO SINTASA QUINASA 3 2.4.3 REGULACIÓN ESPECfFICA POR LA GLUCOSA-6-FOSFATO 2.4.4 DEGRADACIÓN DEL GLUCÓGENO 58 3. PAPEL DE LA CÉLULA p PANCREÁTICA EN LA HOMEOSTASIA METABÓLICA. PLASTICIDAD DE LA MASA DE CÉLULA p PANCREÁTICA 58 3. 1 APOPTOSIS EN LAS CÉLULAS ¡l PANCREÁTICAS 59 3.2 EFECTO GLUCOTÓXICO EN LAS CÉLULAS !} PANCREÁTICAS 60 4. EJE DE COMUNICACIÓN HÍGADO-PÁNCREAS 60 5. DESREGULACIONES EN EL METABOLISMO LIPfDICO ASOCIADOS A DIABETES TIPO 2 63 6. TERAPIA GÉNICA CON VIRUS ADENOASOCIADOS 63 6.1 DESCRIPCIÓN DE LOS VIRUS ADENOASOCIADOS 6.1.1 VECTOR VIRAL 6.1.2 SEROTIPOS VIRALES: TROPISMO CELULAR 64 6.2 RESPUESTA INMUNE FRENTE A LOS VIRUS ADENOASOCIADOS 65 6.3 CARACTERÍSTICAS DEL VIRUS ADENOASOCIADO SEROTIPO 8 66 6.4 ENSAYOS CLINICOS EN MARCHA CON VIRUS ADENOASOCIADOS 6.4.1 TERAPIA GÉNICA CON VIRUS ADENOASOCIADOS EN ENFERMEDADES METABÓLICAS 71 05/ OBJETIVOS 77 06/ MATERIALES Y MÉTODOS 1. TRABAJO CON MODELOS ANIMALES 79 80 1.1 CRfA Y GENOllPAJE DE ANIMALES 1.1.1 MANTENIMIENTO DEL MODELO iLIRKO 1.1.2 ÜBTENCIÓN DE ADN DE COLA DE RATÓN 1.1.3 GENOTIPAJE 1.2 GENERACIÓN DEL MODELO INDUCIBLE 80 1.2.1 PRUEBAS ADMINISTRACIÓN DEL TAMOXIFENO: VÍA ENTERAL O VÍA PARENTAL. 1.2.2 ESQUEMA DE DIETAS O ESQUEMA DEFINITIVO PARA LA GENERACIÓN DEL MODELO INDUCIBLE 82 1.3 TESTS METABÓLICOS in vivo 1.3.1 TEST DE TOLERANCIA A GLUCOSA 1.3.2 TEST DE TOLERANCIA A INSULINA 82 1.4 OBTENCIÓN DE PLASMA SANGUÍNEO 1.5 SACRIFICIO DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 83 83 2. CULTIVOS CELULARES 2.1 LINEAS CELULARES Y MEDIOS DE CULTIVO 83 83 2.2 CONDICIONES DE CULllVO, MANTENIMIENTO Y EXPERIMENTACIÓN 2.2.1 CONDICIONES DE CULTIVO 2.2.2 CONGELACIÓN, CRIOPRESERVACIÓN Y DESCONGELACIÓN DE LÍNEAS CELULARES 2.2.3 CONDICIONES DE EXPERIMENTACIÓN 2.2.3.1 M ICOPLASMA 84 3. TÉCNICAS DE ADN RECOMBINANTE 84 3.1. CULTIVO DE BACTERIAS 3.1.1 CULTIVO EN PLACA DE AGAR-LB 3.1.2 CULTIVO EN LB LfOUIDO 3.1.3 CONGELACIÓN (GLYCEROL-STOCK) 85 3.2 PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS Y TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS 3.2.1 PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS 3.2.2 TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS 86 3.3 CLONA.JE Y TRABAJO CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN 3.3.1 DIGESTIÓN CON ENZIMAS 3.3.2 PRECIPITACIÓN DEL ADN PLASMÍDICO CON ACETATO SÓDICO Y ETANOL 3.3.3 GENERACIÓN DE EXTREMOS ROMOS 3.3.4 DEFOSFORILACIÓN DE LOS EXTREMOS DEL VECTOR 3.3.5 PURIFICACIÓN DE BANDAS DE GELES DE AGAROSA 3.3.6 LIGACIÓN Y CRIBADO DE COLONIAS POSITIVAS 3.3.7 SECUENCIACIÓN 88 4. ANAus1s DE LA EXPRESIÓN GÉNICA 88 4.1 AISLAMIENTO DE ARN DE LfNEAS CELULARES Y TEJIDOS 88 4.2 RT-PCR 4.2.1 VALORACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 4.2.2 SíNTESIS DE ADNC POR RETROTRANSCRIPCIÓN 4.2.3 PCR Y ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA 4.2.4 PCR CUANTITATIVA 90 5. ANAus1s DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS 90 5.1 ExmACTOS PROTEICOS 5.1.1 ÜBTENCIÓN DE EXTRACTOS PROTEICOS 5.1.2 VALORACIÓN DE PROTEÍNAS 91 5.2 WESTERN BLOT 5.2.1 PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA ELECTROFORESIS 5.2.2 ELECTROFORESIS EN GELES DE SDS-PAGE 5.2.3 TRANSFERENCIA A MEMBRANAS DE PVDF 5.2.4 BLOQUEO E INCUBACIÓN CON ANTICUERPOS 5.2.5 DETECCIÓN DE ANTICUERPOS POR QUIMIOLUMINISCENCIA 5.2.6 BORRADO DE MEMBRANAS DE PVDF 94 5.3 INMUNOPRECIPITACIÓN 95 6. INMUNOHISTOQUÍMICA E INMUNOFLUORESCENCIA DE SECCIONES PANCREÁTICAS Y HEPÁTICAS 95 6.1 PREPARACIÓN DE LOS TEJIDOS PARA LAS TINCIONES 6.1.1 FIJACIÓN DE TEJIDOS Y OBTENCIÓN DE CORTES 6.1.2 DESPARAFINIZACIÓN E HIDRATACIÓN DE CORTES 96 6.2 TINCIÓN CON HEMATOXILINA Y EOSINA 96 6.3. INMUNOFLUORESCENCIA EN SECCIONES PANCREÁTICAS O HEPÁTICAS 97 6.4 INMUNOHISTOQUÍMICA EN SECCIONES HEPÁllCAS Y PANCREÁTICAS 97 7. ÜBTENCIÓN DE PARTfCULAS VIRALES 97 7.1. PRODUCCIÓN DE PARTÍCULAS VIRALES 7.1.1 PURIFICACIÓN DE LAS PARTÍCULAS VIRALES 99 7.2 TnuLACIÓN DE LAS PARTfCULAS VIRALES 100 7.3 ADMINISTRACIÓN DE LOS AAV A LOS ANIMALES 100 7.4 ENSAYOS DE BIOLUMINISCENCIA 100 8. TEST METABÓLICOS 100 8.1 ENZ'IME-LJNKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) DE INSULINA 100 8.2 METABOLISMO GLUCÍDICO 8.2.1 DETERMINACIÓN DE LA SÍNTESIS DE GLUCÓGENO EN CULTIVO CELULAR 8.2.2 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN GLUCóGENO EN CULTIVO CELULAR Y HEPÁllCO 8.2.2.1 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN GLUCÓGENO EN CULTIVO CELULAR 8.2.2.2 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN GLUCÓGENO HEPÁllCO 8.2.3 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA GLUCÓGENO SINTASA HEPÁTICA 8.2.4 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA GLUCÓGENO FOSFORILASA HEPÁTICA 102 8.3 METABOLISMO LIPÍDICO 8.3.1 AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DEL TOTAL DE LOS ÚPIOOS HEPÁTICOS 8.3.2 ENSAYOS COLORIMtr'RICOS PARA LA MEDIDA DE COLESTEROL Y mlGLICÉRIDOS 8.3.3 CROMATOGRAFfA LÍQUIDA DE SEPARACIÓN RÁPIDA DE PROTEÍNAS 103 9. OTRAS TÉCNICAS 103 9.1. CUANTIFICACIÓN 9.1.1. 8LOTS 9.1.2. IMAGENES DE INMUNOHISTOQUÍMICA E INMUNOFLUORESCENCIA 103 9.2. ESTADISTICA 104 9.3. TÉCNICAS BIOINFORMÁTICAS 9.3.1. TRABAJO CON SECUENCIAS DE ADN 9.3.2. TRABAJO CON IMÁGENES 104 10. MATERIALES 1 07 07 / RESULTADOS 145 08/ DISCUSIÓN 157 09/ CONCLUSIONES 163 1 O/ BIBLIOGRAFÍA 01/ resumen 19 PAPEL DE LAS ISOFORMAS DEL RECEPTOR DE INSULINA EN LA REGULACIÓN DE LA HOMEOSTASIA GLUCÍDICA Y LIPÍDICA EN UN MODELO DE DIABETES EXPERIMENTAL INTRODUCCIÓN La diabetes tipo 2 es una enfermedad metabólica compleja cuya patogénesis implica fallos tanto en la acción periférica de la insulina como en su secreción. En el estado postprandial, el hígado regula la homeostasia glucídica por medio de la captación de glucosa y su conversión a glucógeno y lípidos (von Wilamowitz- Moellendorff et al., 2013). La desregulación de los mecanismos por los cuales la glucosa y la insulina dirigen el metabolismo del glucógeno es una de las principales causas que provocan la diabetes tipo 2, la enfermedad metabólica más común entre la población mundial (Leibiger et al., 2001). El receptor de insulina pertenece a la superfamilia de receptores tirosina quinasa, concretamente a la subclase II, y juega un papel fundamental en el metabolismo de la glucosa. El receptor de insulina está estrechamente relacionado con otros miembros de la familia, como el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina, el cual está implicado en procesos de crecimiento y desarrollo (Benyoucef et al., 2007; Ward et al., 2009). En mamíferos, el splicing alternativo del exón 11 del gen del receptor de insulina da lugar a dos isoformas: A y B. Concretamente, la isoforma B posee 12 aminoácidos extra localizados inmediatamente después del dominio de unión a ligando, aunque no afecta a su afinidad por la insulina, la cual es muy similar entre las dos isoformas (Menting et al., 2013; Whittaker et al., 2002). Sin embargo, la isoforma A del receptor de insulina tiene, aproximadamente, 10 veces más afinidad por los factores de crecimiento insulínicos tipo I y II que la isoforma B (Malaguarnera et al., 2011). Además, la isoforma A del receptor de insulina se expresa predominantemente durante el desarrollo embrionario, favoreciendo así los efectos del factor de crecimiento insulínico tipo II (Frasca et al., 2009). Por el contrario, la isoforma B del receptor de insulina se expresa de forma predominante en tejidos adultos, incluido el hígado, en los cuales dirige los efectos metabólicos de la insulina (Malaguarnera y Belfiore, 2011). La conversión de glucosa a glucógeno es uno de los puntos clave por los cuales el hígado retira glucosa de la circulación en el estado postprandial (Agius 2008). La señalización de glucosa e insulina regu­ lan de forma precisa la síntesis de glu­ cógeno por diferentes mecanismos. La vía de señalización de síntesis de glucó­ geno más estudiada es aquella que está dirigida por la insulina, la cual inicia una cascada de eventos que dan lugar a la activación de la proteína quinasa B. Ésta fosforila y activa a la glucógeno sintasa quinasa-3 (en la Ser 21 de la glucógeno sintasa quinasa-3α y en la Ser 9 de la glu­ cógeno sintasa quinasa-3β) (Frame et al., 2001; McAulay et al., 2007). La glucógeno sintasa quinasa-3α/β fosforila cuatro de las nueve serinas reguladoras (Ser 641, Ser 645, Ser 649, Ser 653) que juegan un papel fundamental en la inhibición de la actividad de la glucógeno sintasa hepática y, en consecuencia, de la síntesis de glu­ cógeno (Roach et al., 2012). La glucógeno sintasa hepática, además de su regula­ ción covalente mediante fosforilación por la glucógeno sintasa quinasa-3α/β, está controlada por la glucosa-6-fosfato, que actúa como activador alostérico (Roach et al., 2012). La glucosa-6-fosfato se une a la glucógeno sintasa hepática, la regula a través de su activación alostérica y pro­ mueve su eficiente defosforilación, aco­ plado todo ello a una localización celular apropiada (Gomis et al., 2003; von Wila­ mowitz-Moellendorff et al., 2013). Aunque la insulina no estimula la captación de glucosa por los hepatocitos, estudios in vitro en hepatocitos neonatales demuestran que la isoforma A del receptor de insulina se asocia con el transportador de glucosa tipo 2, lo que favorece la captación de glucosa (Nevado et al., 2006). Por tanto, las diferencias en la captación de glucosa se podrían asociar con la presencia/ausencia de las isoformas del receptor de insulina o con cambios en la proporción en la que se expresan. Sin embargo, hasta la fecha no se conoce el papel específico que desempeña cada isoforma del receptor de insulina. Para tratar de profundizar en ello, aprovechamos la capacidad de los virus adenoasociados de expresar vectores recombinantes en el hígado durante un largo periodo de tiempo. En la pasada década, los virus adenoasociados se convirtieron en uno de los vectores de transfección más prometedores para el tratamiento de enfermedades humanas. Los virus adenoasociados son capaces de infectar células que puedan o no dividirse, obteniéndose una expresión mantenida durante largos periodos de tiempo y sin efectos adversos (Verma et al., 2005). Estudios preclínicos en ratones muestran que los virus adenoasociados son capaces de inducir, con gran eficiencia y de forma estable, la expresión de un gen provocando una baja inmunogenicidad. Además, su administración sistémica permite la transducción de un alto porcentaje de hepatocitos por vectores que se habían empaquetado en el serotipo 8, lo que ha 21 demostrado un verdadero potencial en el tratamiento de enfermedades hepáticas, relacionadas con el metabolismo de hidratos de carbono, en modelos animales. OBJETIVOS Glucosa e insulina regulan de forma precisa la síntesis de glucógeno mediante diversos mecanismos, los cuales se encuentran desregulados en la diabetes tipo 2. En esta tesis hemos utilizado el modelo knockout inducible para el receptor de insulina hepático como modelo de progresión a la diabetes tipo 2. Como se ha descrito anteriormente, la isoforma A del receptor de insulina favorece la captación de glucosa en hepatocitos in vitro en comparación con la isoforma B (Nevado et al., 2006). Por tanto, la expresión de la isoforma A del receptor de insulina en el modelo knockout inducible para el receptor de insulina hepático podría tener el mismo efecto y disminuir así la hiperglucemia e incrementar la síntesis de glucógeno. MÉTODOS Se estudió el papel de las isoformas del receptor de insulina in vitro en hepatocitos neonatales inmortalizados e in vivo en el modelo diabético murino knockout inducible para el receptor de insulina en el hígado. Para llevar a cabo este objetivo, generamos un modelo de progresión a la diabetes tipo 2 y severa resistencia a insulina hepática, ratones knockout inducibles para el receptor de insulina hepático. La expresión de las isoformas del receptor de insulina en estos animales se consiguió mediante el uso de virus adenoasociados. Éstas se colocaron bajo la regulación del promotor α1-antitripsina y, los vectores resultantes, se incluyeron en el serotipo viral 8, con el fin de estudiar la función hepática de cada isoforma en la reversión de la resistencia a insulina en los ratones knockout inducible para el receptor de insulina en el hígado. En estos animales estudiamos el papel de las isoformas del receptor de insulina tanto en la síntesis y almacenamiento de glucógeno como en la homeostasia glucídica, para lo que se realizaron diversos tests metabólicos, y su efecto en la distribución de la masa de célula β, que se estudió mediante técnicas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Para profundizar en el metabolismo del glucógeno, utilizamos líneas celulares de hepatocitos neonatales que expresaban la isoforma A o B del receptor de insulina. Estudiamos diversas proteínas de las cascadas de señalización relacionadas con la síntesis de glucógeno y, en alguno casos, sus actividades por medio de ensayos colorimétricos o de radiactividad. RESULTADOS En este estudio se utilizó el modelo murino knockout inducible para el receptor de insulina en el hígado como modelo experimental de diabetes tipo 2. Este modelo muestra una resistencia a insulina inicial, debido a la carencia del receptor de insulina en hígado, la cual se compensa con una marcada hiperinsulinemia e hiperplasia de la célula β pancreática. Nuestros resultados demuestran que la resistencia a insulina global y la homeostasia glucídica pueden modificarse de forma diferencial en función de la isoforma del receptor de insulina expresada en el hígado. La expresión selectiva de la isoforma A es capaz de restablecer totalmente la tolerancia a glucosa e insulina, mientras que la B tan sólo restablece parcialmente la sensibilidad a insulina. Estos efectos podrían deberse a la asociación entre el transportador de glucosa tipo 2 y el receptor de insulina en los ratones knockout inducibles para el receptor de insulina que expresan la isoforma A. La asociación específica del transportador de glucosa tipo 2 con la isoforma A del receptor de insulina sugiere que puede deberse a la estructura del receptor, es decir, a la ausencia del exón 11, más que a cambios estructurales inducidos por la unión del ligando, ya que ambas isoformas presentan igual afinidad por la insulina. Además, en los ratones knockout inducibles para el receptor de insulina que expresan la isoforma A se observa una recuperación de los niveles de insulina, acompañado de una disminución en la masa de célula β pancreática, hasta alcanzar valores similares a los de los ratones Control. Sin embargo, el caso de los ratones knockout inducibles para el receptor de insulina que expresan la isoforma B, estos parámetros se mantuvieron semejantes a los de los ratones knockout inducibles para el receptor de insulina. Estos resultados sugieren un papel diferencial de las isoformas del receptor de insulina en la regulación de la homeostasia glucídica. Nuestros resultados in vitro sugieren una fuerte correlación entre un incremento en la señalización por insulina y un incremento en la síntesis y contenido en glucógeno en los hepatocitos que expresan la isoforma A del receptor de insulina. Además de la captación de glucosa incrementada, el contenido de glucosa intracelular está favorecido en los hepatocitos que expresan la isoforma A del receptor de insulina, ya que expresan niveles mayores de glucoquinasa. Este aumento en la glucosa intracelular favorece también la actividad de la glucógeno sintasa hepática. Lo contrario ocurre en los hepatocitos que expresan la isoforma B del receptor de insulina, donde tanto la expresión de la glucoquinasa como la captación de glucosa se encuentran disminuidas. En ausencia del receptor de insulina, los hepatocitos muestran un incremento en la síntesis de glucógeno que se correlaciona con una mayor inhibición de la glucógeno sintasa quinasa-3α/β en comparación con las células Control en condiciones basales. Sin embargo, existe una activación significativa de la glucógeno fosforilasa que podría explicar la falta de un incremento significativo en los depósitos de glucógeno en los hepatocitos que carecen del receptor de insulina. Todo esto sugiere la presencia de un ciclo fútil en el punto de síntesis/ degradación de glucógeno. CONCLUSIONES En conclusión, esta tesis amplía el conocimiento en la regulación de la homeostasia glucídica y la síntesis de glucógeno en hepatocitos neonatales in vitro y en un escenario diabético específico in vivo en los ratones knockout inducibles para el receptor de insulina. Los datos aquí presentados sugieren que la isoforma A favorece la homeostasia glucídica, además de aumentar la síntesis y contenido de glucógeno. Así, la expresión de la isoforma A del receptor de insulina en el hígado podría ser una estrategia interesante para el control de la homeostasia glucídica y la resistencia a insulina. 02/ summary 27 ROLE OF THE INSULIN RECEPTOR ISOFORMS IN THE REGULATION OF GLUCOSE AND LIPID HOMEOSTASIS IN AN EXPERIMENTAL MODEL OF DIABETES INTRODUCTION Type 2 diabetes is a complex metabolic disease and its pathogenesis involves abnormalities in both peripheral insulin action and insulin secretion. In the postprandial state, liver regulates glucose homeostasis by glucose uptake and conversion to glycogen and lipids (von Wilamowitz-Moellendorff et al., 2013). The malfunction of these mechanisms, by which glucose and insulin regulate glycogen metabolism, is one of the major causes of type 2 diabetes, the most common metabolic disorder in the worldwide population (Leibiger et al., 2001). The insulin receptor is a member of subclass II of the tyrosine kinase receptor super-family that plays an essential role in glucose metabolism. Insulin receptor is closely related to other members of this family like the insulin-like growth factor receptor which is involved in normal growth and development (Benyoucef et al., 2007; Ward et al., 2009). In mammals, alternative splicing gives rise to two isoforms of insulin receptor: A and B. The isoform B has 12 additional amino acids encoded by the exon 11 (Whittaker et al., 2002). This sequence is located immediately downstream of the ligand binding domain but does not affect insulin binding affinity which is very similar between A and B (Menting et al., 2013; Whittaker et al., 2002). However, insulin receptor A isoform al., 2003; von Wilamowitz-Moellendorff et has approximately 10 fold higher affinity for insulin-like growth factor-I and II than insulin receptor B isoform (Malaguarnera et al., 2011). Moreover, insulin receptor A isoform is predominantly expressed during foetal development and embryogenesis where enhances insulin-like growth factor-II effects (Frasca et al., 1999). Conversely, insulin receptor B isoform is predominantly expressed in adult tissues, including liver, where it triggers the metabolic effects of insulin (Malaguarnera & Belfiore, 2011). The conversion of glucose into glycogen is one of the key pathways by which the liver removes glucose in the postprandial state (Agius 2008). Glucose and insulin signaling finely regulate glycogen synthesis by several mechanisms. The best-documented signalling pathway resulting in glycogen synthesis is triggered by insulin, which initiates a cascade of events that activate protein kinase B/Akt. Protein kinase B phosphorylatesglycogen synthase kinase-3 (Ser 21 of glycogen synthase kinase-3α and Ser 9 of glycogen synthase kinase-3β) resulting in its inactivation (Frame et al., 2001; MacAulay et al., 2007). Glycogen synthase kinase-3α/β phosphorylates four out of nine regulatory serine residues (Ser 641, Ser 645, Ser 649, Ser 653), which play a critical role in inhibiting hepatic glycogen synthase activity and hence glycogen synthesis (Roach et al., 2012). Hepatic glycogen synthase, in addition to a reversible phosphorylation by glycogen synthase kinase-3α/β, is controlled by the allosteric activator glucose-6-phosphate (Roach et al., 2012). Glucose-6-phosphate binding to hepatic glycogen synthase has composite effects in controlling glycogen synthesis through allosteric activation and efficient dephosphorylation coupled with appropriate cellular localization (Gomis et al., 2013). Although insulin does not stimulate glucose uptake in the liver, in vitro studies in neonatal hepatocytes demonstrate that insulin receptor isoform A plays a direct role favoring glucose uptake through its specific association with endogenous glucose transporter 2 (Nevado et al., 2006). Therefore, differences in the capability of glucose uptake can be associated with the presence/absence of insulin receptor isoforms or with changes in their ratio. However, nowadays the functional significance of each insulin receptor isoform remains unclear. In an effort to try to elucidate it we took advantage of the capacity of recombinant adenoassociated vectors to deliver recombinant genes to the liver that can be expressed long term. In the past decade, adenoassociated viruses have been shown as one of the most promising gene transfer vectors for treatment of human diseases. Adenoassociated viruses are able to infect dividing and non-dividing cells obtaining long-term expression without adverse effects (Verma et al., 2005). Preclinical studies in small animal models have shown that adenoassociated viruses are able to induce highly efficient and stable gene expression with low immunogenicity. Indeed, following systemic administration it has been possible to transduce a high proportion of mouse hepatocytes with vectors packaged into capsid 8 serotype, demonstrating an outstanding therapeutic potential in animal models for hepatic disorders of carbohydrate metabolism. AIMS In the postprandial state, liver regulates glucose homeostasis by glucose uptake 29 and conversion to glycogen and lipids. Glucose and insulin signaling finely regulate glycogen synthesis by several mechanisms, which are deregulated in type 2 diabetes. In the present study, we have used inducible liver insulin receptor knockout mice, as a model of progression of type 2 diabetes. As previously described, insulin receptor isoform A favors glucose uptake in hepatocytes as compared to isoform B (Nevado et al., 2006). Thus, we hypothesized that insulin receptor isoform A expressed in inducible liver insulin receptor knockout mice could decrease hyperglycemia and increase glycogen synthesis. METHODS We addressed the role of insulin receptor isoforms on glycogen metabolism in vitro in immortalized neonatal hepatocytes and in vivo in inducible liver insulin receptor knockout mice. For this purpose, we have generated an experimental model of progression of type 2 diabetes and severe hepatic insulin resistance. We have conducted and produced adenoassociated virus vectors expressing insulin receptor A or B isoform in order to study the hepatic function of each insulin receptor isoform in the reversion of insulin resistance in inducible liver insulin receptor knockout mice. For that, we expressed A and B isoforms specifically in the liver in vivo into the capsid 8 serotype and under the control of α-1 antitrypsin promote. We studied the role of insulin receptor isoforms on glycogen synthesis and storage and glucose homeostasis in these mice, by performing several metabolic tests, and their effect on the β cell mass distribution by immunohistochemistry. We went in deep in the glycogen metabolism by using neonatal hepatocytes cell lines which expressed A or B isoform of the insulin receptor. We studied several proteins related to glycogen metabolism signaling pathways and, in some cases, their activities performing colorimetric or radioactivity assays. RESULTS In this study, we used inducible liver insulin receptor knockout mice as a model of type 2 diabetes. This model has shown that initial hepatic insulin resistance induced by insulin receptor deletion is compensated by a marked hyperinsulinemia, achieved by an increased β cell mass. Our results demonstrate that global insulin resistance and therefore glucose homeostasis can be modified depending on the insulin receptor isoform expressed in the liver. Selective expression of insulin receptor isoform A was able to restore glucose and insulin tolerance while isoform B only partially improves insulin sensitivity. These effects could be because the association between glucose transporter 2 and insulin receptor A in inducible liver insulin receptor knockout mice expressing A isoform. Given that the hyperglycaemia is only decreased in inducible liver insulin receptor knockout mice expressing isoform A, this could be one of the mechanisms involved in the differential improvement of glucose intolerance. In fact, the favored association between glucose transporter 2 and insulin receptor in inducible liver insulin receptor knockout mice expressing isoform A mice suggests that it is a matter of insulin receptor structure, due to the presence/absence of exon 11, instead of structural changes induced upon ligand binding, given the fact that both isoforms present the same affinity for insulin. Moreover, we observed a maintained recovery of insulin levels in inducible liver insulin receptor knockout expressing isoform A mice which is accompanied by a decrease in β cell mass down to control values. In the case of insulin receptor B isoform injected mice, β cell mass and plasma insulin levels were similar to those observed in untreated inducible liver insulin receptor knockout mice. These results demonstrate that insulin resistance persists in inducible liver insulin receptor knockout expressing B isoform suggesting a differential role of both isoforms in the regulation of glucose homeostasis. Our in vitro results suggest a strong correlation between the enhanced insulin signaling and the increased glycogen synthesis and storage in response to insulin in hepatocytes, which expressed insulin receptor A isoform vs B isoform. In addition to glucose uptake, intracellular glucose disposal is favored because of the higher expression of glucokinase in insulin receptor A isoform cells and hence, hepatic glycogen synthase activity. The opposite was found in insulin receptor B isoform hepatocytes, where both, glucose uptake and glucokinase expression were significantly decreased. In the absence of insulin receptor, hepatocytes showed an increased glycogen synthesis correlated with higher glycogen synthase kinase-3α/β inhibition when compared to Control cells under basal conditions. In contrast, a remarkable activation of glycogen phosphorylase could explain the lack of significant glycogen storage in cells without insulin receptor, suggesting a glycogen synthesis/glycogen depletion futile cycle to compensate the loss of glucose input by the absence of insulin receptors. CONCLUSIONS In conclusion, our results highlight the central and complex role played by hepatic IR isoforms in the control of hepatic glucose metabolism. We now provide a new insight about the role of insulin receptor A isoform in the regulation of glycogen metabolism in cultured hepatocytes and in the liver in a diabetic scenario. Our data strongly suggest that insulin receptor A isoform, but not B isoform, not only increases glucose uptake, but also favors glycogen synthesis and storage and glucose homeostasis. Therefore, we suggest that insulin receptor A isoform expression in the liver could be an interesting gene therapy strategy for the treatment of hepatic insulin resistance and glucose intolerance. 03/ abreviaturas 35 ABCA1 transportador dependiente de la unión a ATP, familia A, miembro 1 ABCG1 transportador dependiente de la unión a ATP, familia G, miembro 1 Alb albúmina AMP adenosín monofosfato ATP adenosín trifosfato βIGFIRKO knockout específico del IR e IGF-IR en células β pancreáticas βIRKO knockout específico del IR en células β pancreáticas bp pares de bases BSA albúmina de suero bovino CE colesterol esterasa CETP proteína que transfiere los ésteres de colesterol CO colesterol oxidasa CT extremo carboxi-terminal DAPI 4',6'-diamidino-2-fenlindol ddH O agua bidestilada2 ER receptores de hormonas esteroideas F1P fructosa-1-fosfato FBS suero fetal bovino FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Associations FIRKO knockout específico del IR en tejido adiposo blanco FoXO FoxO Forkhead box clase O FPLC Fast Protein Liquid Chromatography iLIRKO knockout inducible específico del IR G1P glucosa-1-fosfato G6P glucosa-6-fosfato GCK glucoquinasa GK glicerol quinasa GLUT2 transportador de glucosa 2 GPa forma activa de la glucógeno fosforilasa GPb enzima en su conformación inactiva GPO glicerolfosfato oxidasa GSK3 glucógeno sintasa quinasa 3 GTT test de tolerancia a glucosa GYS1 glucógeno sintasa muscular GYS2 glucógeno sintasa hepática HDL partículas lipoproteicas de alta densidad HK hexoquinasa HRP peroxidasa de rábano HRs receptores híbridos ID dominio de inserción IGF-I factor de crecimiento insulínico tipo I IGF-II factor de crecimiento insulínico tipo II IGF-IR receptor del factor de crecimiento insulínico tipo I iLIRIGFIRKO knockout inducible específico del IR e IGF-IR en hígado en hígado IP inmunoprecipitación IR receptor de insulina IRA receptor de insulina isoforma A IRB receptor de insulina isoforma B IRS sustratos del receptor de insulina ITR repetición terminal invertida ITT test de tolerancia a insulina Km constante de Michaelis-Menten LB Lysogeny (Luria-Bertani) Broth LCAT lecitina colesterol aciltransferasa LDL partículas lipoproteicas de baja densidad LG2KO knockout para GLUT2 en hígado LIRKO knockout específico del IR en hepatocitos LP lipasa MAPK proteínas quinasa activadas por mitógenos MIRKO knockout específico del IR en músculo MODY Maturity Onset Diabetes of the Young mTOR mammamlian Target Of Rapamycin NIRKO knockout específico del IR en neuronas p70S6K p70S6 quinasa 37 PCR Polymerase Chain Reaction PDK1 proteína quinasa dependiente de fosfoinosítidos tipo 1 PEI polietilenimina PEG polietilenglicol PH dominios de homología a la pleckstrina Pi fosfato inorgánico PI3K fosfatidilinositol 3’-quinasa PIP fosfatidilinositol (4,5)-bifosfato2 PIP fosfatidilinositol (3,4,5)-trifosfato3 PKB proteína quinasa B PMSF fluoruro de fenilmetilsulfonilo POD peroxidasa PP1 proteína fosfatasa 1 PTB dominios de unión a fosfotirosina PYGB glucógeno fosforilasa cerebral PYGL glucógeno fosforilasa hepática PYGM glucógeno fosforilasa muscular PVDF polifluoruro de vinilideno RE retículo endoplásmico SA albúmina sérica SDS dodecilsulfato sódico SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SH2 dominios de homología de Src tipo 2 SRB1 scavenger receptor, clase B, miembro 1 TEMED N,N,N,N'-tetrametilnediamina Tm temperatura de melting TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling VLDL partículas lipoproteicas de muy baja densidad WB Western blot Los acrónimos se encuentran siempre definidos la primera vez que son mencionados en el texto. Esta lista recoge algunas de las abreviaturas que aparecen en múltiples ocasiones. 04/ introducción 41 1. DIABETES TIPO 2 Y PAPEL DEL RECEPTOR DE INSULINA EN LA HOMEOSTASIA GLUCÍDICA 1.1. LA DIABETES EN LA ACTUALIDAD La disponibilidad continua de alimentos, muchos de ellos de alta densidad calóri­ ca, unida a la proliferación de tecnologías que fomentan el sedentarismo, están pro­ vocando que la obesidad y sus comorbili­ dades sean la epidemia del siglo XXI en el mundo occidental. De entre las comorbilidades asociadas, la prevalencia de la diabetes está sufriendo un espectacular aumento. El número de diabéticos a nivel global en el año 2015 fue de 415 millones y se prevé que sean 642 millones en el 2040, lo cual supon­ dría un aumento de la prevalencia desde el 8,8 % al 10,4 %. Este porcentaje podría incrementarse aún más ya que 318 millo­ nes de adultos padecen intolerancia a la glucosa, lo que supone que tienen un alto riesgo de desarrollar diabetes en un futuro (International Diabetes Federation, 2015). Los resultados del estudio Di@bet sobre la diabetes en España (Marcuello et al., 2012) acreditan una prevalencia del 12 % en nuestro país en 2012, último año del que se tienen datos. El crecimiento de la población urbana en los países en desa­ rrollo, junto con el envejecimiento general de la población, son las principales causas demográficas que incidirán en la prevalen­ cia futura de la diabetes. En concreto, en áreas rurales la diabetes afecta a 145.1 millones de personas y casi al doble, 269.7 millones, en áreas urbanas (IDF, 2015). Este aumento de la prevalencia de la dia­ betes es un problema de salud pública de primer orden ya que incrementa nota­ blemente el riesgo de desarrollar otras enfermedades, en comparación con la población no enferma. Así, la diabetes aumenta el riesgo de enfermedad car­ diaca, infarto y complicaciones micro- vasculares como retinopatía, nefropatía y neuropatía periférica. Además, la propia enfermedad es una contraindicación para muchos tratamientos. Y, al dificultar estos tratamientos, surgen complicaciones que se convierten en la principal causa de mortalidad prematura en pacientes diabé­ ticos (Russel y Cooper, 2015) (Figura 1). es aproximadamente cuatro veces mayor que el de un paciente no diabético. La mayoría de los países gastan entre el 5 % y el 20 % de su presupuesto total de salud en el tratamiento de esta enfermedad (IDF, 2015). Debe tenerse en cuenta también que la prevalencia para los próximos años sigue aumentando. Así, con un coste tan alto, la enfermedad es un obstáculo para el desarrollo económico sostenible y un reto importante para los sistemas de asis­ tencia sanitaria. La aparición de diabetes tipo 2 entre indi­ viduos cada vez más jóvenes, junto con el cambio de hábitos de vida en los países en Figura 1. Mecanismos de las complicaciones diabéticas. Las complicaciones diabéticas surgen como combinación de procesos patológicos comunes. Figura adaptada de Russer y Cooper, 2015. Además de la carga económica que supo­ ne la compra de insulina y otras medicinas esenciales para los individuos o familia­ res de enfermos diabéticos, la diabetes produce también un impacto económico sustancial en los sistemas nacionales de salud. Las complicaciones provocadas por la diabetes son una de las principa­ les causas de consulta médica e ingreso hospitalario. Por lo que el coste para la sanidad nacional de un paciente diabético desarrollo, han convertido la obesidad y la diabetes en importantes problemas que la humanidad debe afrontar desde diferentes ámbitos. La educación y prevención son claves, aunque la modificación de hábi­ tos que lleven a una menor ingesta caló- rica y a un aumento de la actividad física resulta difícil de implementar en la pobla­ ción general. En muchos casos, la inter­ vención farmacológica se convierte en el único recurso. Por tanto, es necesario 43 establecer nuevas estrategias preventivas y tratamientos, guiados siempre desde la investigación científica. 1.2. FISIOPATOLOGÍA DE LA DIABETES TIPO 2 La diabetes es una enfermedad caracte­ rizada por un aumento de la glucosa en sangre asociada a resistencia a insulina o a la ausencia de ésta. Existen tres prin­ cipales tipos de diabetes: tipo 1 (8-10 % del total de pacientes diabéticos), tipo 2 (90 % del total de pacientes diabéticos) y gestacional. Otro tipo, menos común, en torno a un 2 %, es la diabetes de carác­ ter monogénico, producida a causa de la mutación en un gen. Ejemplos de ésta última son las llamadas MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young). Fundamen­ talmente, las mutaciones se producen en factores transcripcionales importantes en el desarrollo de la célula β pancreática o en la glucoquinasa (GCK). Alrededor de 15 genes diferentes han sido identifica­ dos como responsables de las diabetes monogénicas (Murphy et al., 2008). La principal diferencia entre diabetes tipo 1 y 2 se encuentra en la etiología. La diabe­ tes tipo 1 es una enfermedad autoinmune en la que se destruye de forma irreversi­ ble la célula β pancreática. La enfermedad comienza a manifestarse en la infancia o adolescencia y requiere de aporte externo de insulina diario. La diabetes tipo 2 aparece, generalmente, en la población adulta, pero su prevalencia en adolescentes y niños va en aumento. Se caracteriza por intolerancia a glucosa y resistencia a insulina. Aunque las causas exactas que dan lugar a esta enfermedad se desconocen, hay una serie de factores de riesgo relacionados. Los más impor­ tantes son el exceso de peso, el sedenta­ rismo y una dieta rica en calorías y grasas. Otros factores relacionados son la edad y el historial familiar. En las fases iniciales de la enfermedad, el control de los niveles de glucosa en sangre suele llevarse a cabo con medicamentos orales. Si la hiperglu­ cemia persiste, los pacientes diabéticos tipo 2 necesitan dosis diarias de insuli­ na. Debe tenerse en cuenta que existe un estado pre-diabético, caracterizado por la intolerancia a glucosa, que padece un alto porcentaje de la población. La intolerancia a glucosa puede derivar en diabetes tipo 2. Ésta, en combinación con un estado de resistencia a insulina, e independien­ temente de presentar hiperglucemia, son considerados como potenciales factores de riesgo para desarrollar también enfer­ medad cardiovascular (Russel y Cooper, 2015) (Figura 2). Son varios los tejidos que tienen un papel clave en el desarrollo de la resistencia a insulina y la diabetes (Figura 3). El teji­ do adiposo blanco, que fisiológicamen­ te sirve como depósito de lípidos, puede saturarse y provocar una redistribución anormal de los lípidos en otros tejidos. Además, produce multitud de hormonas denominadas adipocitoquinas (leptina, resistina, adiponectina, IL-6, TNFα, etc.), cuya presencia o carencia juega un impor­ tante papel en el desarrollo de la resisten­ cia a insulina (Muoio y Newgard, 2005). Otro tejido importante en la regulación de la homeostasia glucídica es el músculo esquelético, ya que es el tejido que más glucosa consume del organismo (Stum­ voll et al., 2005). Debido al papel funda­ mental que desempeña el hígado en el metabolismo, su correcto funcionamiento resulta clave para el mantenimiento de la homeostasia glucídica. Y, por descontado, es completamente fundamental la insulina secretada por las células β pancreáticas, tras la ingesta (Saltiel y Kanh, 2001). Figura 2 Comparación de la evolución de los niveles de glucosa en sangre, con la insulinemia, los ácidos grasos libres y la masa de célula β durante la progresión a la diabetes. El punto de inflexión lo representa el fracaso de la célula β, lo que conlleva una disminución de la insulina circulante y la manifestación de la diabetes. Figura adaptada de Lingohr et al., 2002. Figura 3 Esquema de los diferentes órganos implicados en la progresión a la diabetes. Figura adaptada de Stumvoll et al. 2005. 45 1.3. MODELOS ANIMALES EN LA INVESTIGACIÓN DE LA DIABETES TIPO 2: VÍA DEL RECEPTOR DE INSULINA Y DEL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO INSULÍNICO TIPO I La diabetes tipo 2 es una enfermedad poligénica que puede dar lugar a compli­ caciones en diversos tejidos (Neubauer y Kulkarni, 2006). Puesto que resulta complicado el estudio detallado de los mecanismos moleculares implicados con muestras humanas, se han utilizado dis­ tintos modelos murinos. Para investigar la fisiopatología de la diabetes tipo 2 y exa­ minar su potencial relación con la obesi­ dad, estos modelos incluyen diferentes aproximaciones para su inducción: gené­ tica, farmacológica, quirúrgica y alimen­ ticia (Islam y Wilson, 2012). La utilización de los modelos murinos ha cobrado rele­ vancia ya que son fáciles de manipular genéticamente, presentan un tiempo corto generacional y son relativamente baratos. Así, desde mediados de los años noventa, ratones transgénicos y knockout han sido importantes herramientas para estudiar el papel individual de diversas proteínas en el desarrollo de la diabetes (Neubauer y Kulkarni, 2006). La insulina y el factor de crecimiento insu­ línico tipo I (IGF-I) son conocidos por su papel fundamental en el metabolismo y en el desarrollo de casi todos los tejidos en mamíferos. Por tanto, no resulta sorpren­ dente que los estudios dirigidos hacia la creación de modelos murinos de diabetes se centrasen en estas proteínas y en algu­ nas de las principales dianas de su casca­ da de señalización (Neubauer y Kulkarni, 2006). Después de la síntesis y liberación de la insulina tras la estimulación por glucosa en las células β pancreáticas del islote, ésta se une a su receptor, presente en diferentes tejidos metabólicos como el hígado, el músculo esquelético y el órgano adiposo. Tras la unión a sus receptores, la insulina favorece la autofosforilación en tirosina, lo cual activa la ruta de los sustratos de receptor de insulina (IRS)/ fosfatidilinositol 3’-quinasa (PI3K) y la ruta de Ras/proteínas quinasa activadas por mitógenos (MAPK) (Backer et al., 1992; Folli et al., 1992; Sun et al., 1991). El knockout global para el receptor de insulina (IR) desarrolla hiperglucemia e hipercetonemia horas después del nacimiento y muere días después por cetoacidosis diabética (Accili et al., 1996). Este fenotipo contrasta con el que presentan los pacientes con mutaciones en el IR, los cuales muestran un severo retraso en el desarrollo y un fenotipo diabético poco marcado (Taylor 1992). Las diferencias en las manifestaciones clínicas pueden deberse a la severidad que provoca el defecto genético, a la capacidad del receptor mutante de formar híbridos con el receptor del factor de crecimiento insulínico tipo I (IGF-IR) y al background genético que module el estado de resistencia a insulina. Como la diabetes tipo 2 es de carácter poligénico, los enfermos diabéticos pueden presentar polimorfismos en múltiples genes que codifiquen para proteínas implicadas en la señalización de insulina, la secreción de ésta o el metabolismo que regula (Saltiel y Kahn, 2001). 1.3.1. Modelos knockout específicos de tejido Debido al fenotipo letal que presenta el knockout global del IR, surgió la necesidad de crear knockout específicos de tejido para proseguir la investigación de la diabetes. Para generar estos animales, la estrategia Cre-loxP fue fundamental. Brevemente, en el sistema Cre (procedente del bacteriófago P1) la recombinasa escinde fragmentos de DNA que están flanqueados por las secuencias loxP (Sauer y Henderson, 1989). Para generar los knockout tejido-específicos, los animales que portan el gen de interés flanqueado por las secuencias loxP se cruzan con animales que expresan la recombinasa Cre bajo un promotor específico del tejido de interés. Tras la activación de la recombinasa, el gen de interés se escinde en el tejido específico donde se expresa el promotor. bro es, además, la principal diana de la acción de la insulina (Bruning et al., 2000). Por tanto, la señalización de insulina en el cerebro es fundamental para mante­ ner la homeostasia glucídica y prevenir el desarrollo de la diabetes. La eliminación especifica del IR en la grasa blanca de los ratones (modelo FIRKO) provoca un feno­ tipo más delgado y protección frente a la obesidad derivada del envejecimiento, lo que sugiere que la alteración de la seña­ lización de insulina en los tejidos adipo­ sos blancos es crítica en la patogénesis subyacente a la obesidad (Bluher et al., 2002). En 2001, nuestro grupo describió que los ratones knockout para el IR en el tejido adiposo marrón desarrollaban un Tabla 1. Afinidad relativa para la unión de ligando de las isoformas del IR, IGF-IR y HRs que contienen IRA o IRB. Tabla adaptada de Malaguarnera y Belfiore, 2011. Ejemplos de knockout tejido-específicos para el IR se resumen en la Tabla 1. Por ejemplo, aunque la presencia de las molé­ culas de la cascada de señalización de la insulina se habían descrito en el cerebro (Folli et al., 1994), la eliminación especifi­ ca del IR en las neuronas de los ratones (modelo NIRKO) describe que el cere­ defecto en la secreción de insulina que daba lugar a una intolerancia a glucosa progresiva, pero sin generar resistencia a insulina (Guerra et al., 2001). Los ratones transgénicos que carecen del IR en mús­ culo (modelo MIRKO) no presentan cam­ bios en el peso ni, sorprendentemente, en los niveles de insulina circulantes, aunque 47 Tabla 1. Afinidad relativa para la unión de ligando de las isoformas del IR, IGF-IR y HRs que contienen IRA o IRB. Tabla adaptada de Malaguarnera y Belfiore, 2011. sí aumenta el contenido graso (Brüning et al., 1998). Otro modelo knockout tejido-es­ pecifico que muestra resultados sorpren­ dentes es el knockout del IR en las células β pancreáticas (βIRKO) (Kulkarni et al., 1999). Estos ratones presentan un desa­ rrollo normal de las células β pancreáticas aunque su capacidad para responder a los cambios en la concentración de gluco­ sa se encuentra dañada, lo que indica el papel fundamental del IR como sensor de glucosa en las células β pancreáticas. En este caso concreto, el modelo knockout para el IGF-IR en estas mismas células (βIGFIRKO) presenta este mismo fenotipo, por lo que ambos receptores serían sen­ sores fundamentales de glucosa (Kulkarni et al., 2002; Xuan et al., 2002). Sin embar­ go, sólo los ratones βIRKO muestran una disminución en la masa de célula β pan­ creática con la edad, lo que sugiere un papel clave del IR también en el mante­ nimiento de la masa de célula β pancreá­ tica adulta (Kulkarni et al., 1999). De los modelos knockout para el IR específicos de tejido, la deleción especifica del IR en hígado (LIRKO) es el único que muestra una marcada resistencia a insulina e into­ lerancia a glucosa, destacando así el papel metabólico fundamental de este órgano. Sin embargo, el fenotipo se pierde con la edad, ya que los animales desarrollan dis­ plasia celular a partir de los dos meses de vida, la cual revierte además la hipergluce­ mia (Michael et al., 2000). 1.3.2. La necesidad de los modelos knockout inducibles y específicos de tejido: modelo iLIRKO Los modelos animales knockout globales o específicos de un tejido muestran que la función de una proteína es altamente dependiente del tejido en el que se expre­ sa. Estas deleciones irreversibles ocurren en el momento en el que la recombinasa Cre se expresa. En concreto, tal y como se ha descrito anteriormente, la resistencia a insulina se manifiesta de forma diferencial según el tejido. Sin embargo, otro fac­ tor crucial en la determinación del papel específico de una proteína es el momen­ to en el que se deja de expresar, ya que muchas cuestiones acerca de los modelos de diabetes tipo 2 deben ser investigadas en modelos adultos y no durante el desa­ rrollo. Esto es lo que sucede precisamente con el modelo LIRKO, en el que la falta del IR durante el desarrollo favorece la gene­ ración de una marcada displasia celu­ lar durante la edad adulta (Michael et al., 2000). Por tanto, el control de la recombi­ nasa debe ser espacial, bajo un promotor específico de tejido, y temporal, es decir, una recombinasa inducible. La fusión de la Cre con los dominios mutados de unión a ligando de los receptores de hormonas esteroideas (ER), permite una respuesta específica de la Cre quimérica a tamoxi­ feno exógeno, sin respuesta a ligandos endógenos (Leone et al., 2003; Metzger y Chambon, 2001; Tannour-Louet 2002). Así, la inducción de la deleción del IR por expresión de la Cre bajo el promotor de la albúmina, específico de hepatocitos, cuando el animal se ha desarrollado com­ pletamente, modelo iLIRKO, resulta fun­ damental para el estudio de los efectos derivados puramente de la resistencia a la insulina hepática. 1.3.3. Mecanismos de compensación: otros modelos knockout Aunque en los animales knockout globa­ les el organismo es capaz de compensar y enmascarar el fenotipo, como ocurre, por ejemplo, en los ratones sin IRS-1 (Araki et al., 1994) o sin GLUT4 (Katz et al., 1995), en los knockout específicos de tejido pode­ mos observar también este efecto, aunque a menor escala. Como se ha comenta­ do anteriormente, IR e IGF-IR comparten cascada de señalización y muchos de sus efectos metabólicos o mitogénicos aso­ ciados. Al igual que ocurría con los rato­ nes knockout para el IR global, los ratones knockout para el IGF-IR mueren al nacer, en este caso por fallo respiratorio. Ade­ más, presentan una deficiencia severa en el crecimiento (en torno al 45 % del tama­ ño normal) (Liu et al., 1993). Sin embargo, los animales knockout para el receptor de IGF-I en hígado presentan un crecimiento y desarrollo normales (Yakar et al., 1999). Conocer si existe una compensación entre el IR y el IGF-IR resulta fundamental para discernir los efectos metabólicos específi­ cos de cada receptor. 2. RECEPTOR DE INSULINA E IGF-I La insulina y el IGF-I controlan una amplia variedad de procesos biológicos a través de la acción de sus dos receptores tirosín quinasa: IR e IGF-IR (Boucher et al., 2014). Aunque los principales tejidos diana son el hígado, el órgano adiposo y el mús­ culo esquelético, la expresión del recep­ tor de insulina se ha encontrado también en cerebro, corazón, riñón, alveolos pul­ monares, acinos pancreáticos, endotelio vascular de la placenta, monocitos, granu­ locitos, eritrocitos y fibroblastos (Belfiore et al., 2009). El IGF-IR se expresa también en músculo esquelético y órgano adiposo. De hecho, su presencia supera a la del IR en células del músculo liso y células endo­ teliales vasculares (Bäck et al., 2011). La activación de estos receptores inicia una cascada de fosforilaciones que per­ mite la activación de numerosas enzimas implicadas en el control del metabolismo y desarrollo. Tanto la vía de señalización de la insulina como la del IGF-I compar­ ten numerosos puntos de control, que son regulados positiva o negativamente para asegurar una correcta duración e intensi­ dad de la señal. Perturbaciones en estas vías de señalización dan lugar a resisten­ cia a insulina (Boucher et al., 2014). 2.1. ESTRUCTURA DE LOS RECEPTORES, ISOFORMAS DEL RECEPTOR DE INSULINA Y RECEPTORES HÍBRIDOS El IR e IGF-IR son proteínas tetraméricas formadas por dos subunidades α extra- celulares y dos subunidades β transmem­ brana unidas por puentes disulfuro. La porción extracelular de cada heterodímero αβ del receptor está formada por 6 domi­ nios, representados en la Figura 4 (Menting et al., 2013). Ambas subunidades se gene­ ran desde un único precursor mediante rotura proteolítica. Aunque son produc­ tos de dos genes diferentes, IR e IGF-IR derivan de un gen ancestral común, por lo que presentan un alto grado de homología (Figura 5) (Malaguarnera y Belfiore, 2011). Figura 4. Estructura del receptor de insulina. CR: dominio rico en Cys; FnIII-1, FnIII-2, FnIII-3: dominios tipo fibronectina 1º, 2º y 3º respectivamente, ID: dominio de inserción; L1, L2: dominio rico en Leu 1º y 2º respectivamente, TK: Tyr quinasa, TM, JM: segmentos transmembrana y yuxtamembrana respectivamente. Figura adaptada de Menting et al., 2013. 49 Figura 5. Alineamiento de secuencias de las isoformas del receptor de insulina y el IGF-IR humanos. Los residuos conservados por los dos miembros de la familia de IR están subrayados en naranja. Los residuos recuadrados forman estructura helicoidal. Figura adaptada de Ward y Lawrence, 2009. El RNA mensajero del IR sufre un splicing alternativo del exón 11 que da lugar a dos isoformas que difieren en la ausencia (iso­ forma A o IRA) o presencia (isoforma B o IRB) de 12 aminoácidos en el extremo car­ boxi-terminal de las cadenas α (αCT) del dominio de inserción (ID) (Figura 6) (Men­ ting et al., 2013). IRA se expresa predomi­ nantemente en tejidos fetales y en cerebro, presenta alta afinidad por IGF-II, aumenta su expresión en cáncer y, estudios previos en hepatocarcinomas humanos, cáncer de mama y cáncer de colon, relacionan la sobreexpresión de esta isoforma con el desarrollo de la patogénesis de esta enfer­ medad (Frasca et al., 1999; Chettouh et al., 2013); mientras que IRB casi se podría considerar un receptor específico de insu­ lina y su expresión mayoritaria es en tejido adulto (Frasca et al., 1999) (Figura 7). Con­ cretamente, la expresión de IRB supone un 80 % de la expresión total de IR en el hígado (Belfiore et al., 2009). Las subunidades β del IR e IGF-IR con­ tienen una amplia región citoplasmática con actividad tirosina quinasa. Esta región constituye el dominio más conservado entre IR e IGF-IR, con casi un 85 % de similitud en cuanto a la secuencia de ami­ noácidos. La región estructural y funcio­ nalmente más divergente entre los dos receptores es el dominio citoplasmático carboxi-terminal de la cadena β (Mala­ guarnera y Belfiore, 2011). Como consecuencia de la alta homología entre los dos receptores, se pueden for­ mar receptores híbridos (HRs) compues­ tos por un dímero αβ del IR (IRA o IRB) y otro dímero αβ del IGF-IR (Figura 8). Su formación ocurre en tejidos que expre­ san ambos receptores y depende de los niveles de expresión relativa de cada tipo de receptor (Boucher et al., 2014). A dife­ rencia de otros receptores tirosina quina­ sa, cuya activación por ligando provoca la dimerización, IR e IGF-IR se encuentran en la superficie de la membrana como dímeros preformados (Benyoucef et al., 2007). Además, IR, IGF-IR y HRs unen los mismos ligandos, aunque con afinidades muy diferentes, tal y como se resume en la Tabla 2 (Malaguarnera y Belfiore, 2011). Figura 6. Diferencias estructurales entre la isoforma A y la isoforma B del receptor de insulina. Perspectiva de la estructura 3D de la subunidad α (dominios L1, CR, L2, FnIII-1/2) de cada isoforma del receptor de insulina y parte de la porción extracelular de la subunidad β (FnIII-3). El loop gris representa el dominio de inserción (ID-α). El fragmento representado en rojo del ID-α codificado por el exón 11 está presente en la isoforma B, pero no en la A (Belfiore et al., 2009). Knockout Insr Fenotipo Referencias Constitutivo Cetoacidosis diabética Accili et al., 1996 Músculo Dislipidemia Brüning et al., 1998 Músculo cardiaco Tamaño de corazón reducido Belke et al., 2002 Músculo/tejido adiposo Tolerancia a glucosa disminuida Lauro et al., 1998 Adipocitos Protección frente a obesidad Blüher et al., 2002 Tejido adiposo marrón Fallo célula β Guerra et al., 2001 Hígado Moderada resistencia a insulina, hiperglucemia transitoria Michael et al., 2000 Célula β Protección frente a la neovascularización inducida por hipoxia Kulkarni et al., 1999 Sistema nervioso central Obesidad, subfertilidad Bruning et al., 2000 Tabla 2. Resumen de los diferentes knockouts específicos de tejido para el receptor de insulina. Figura adaptada de Nandi et al., 2004. Figura 7. Presencia de cada isoforma del receptor de insulina en diferentes tipos de cáncer. Se compara la presencia de cada isoforma en tejidos cancerosos (C) en comparación con tejidos normales (N). En los tejidos, adquiridos mediante cirugía, se midió el contenido total de proteína por ELISA y la abundancia relativa de cada tránscrito de cada isoforma del IR por RT-PCR (Belfiore et al., 2009). Figura 8. Unión de insulina, IGF1 e IGF2 a las isoformas del IR, IGF-IR y HRs que contienen IRA o IRB. Los diferentes ligandos no son capaces de unirse a todas las combinaciones de IR e IGF-IR, sino que lo hacen como se indica en la figura. La afinidad de unión viene detallada en la Tabla 1. Figura adaptada de Taguchi y White, 2008. 51 2.2. VÍAS DE SEÑALIZACIÓN DE LA INSULINA Y EL IGF-I Insulina e IGF-I presentan efectos dife­ renciales in vivo que dependen de la con­ centración de hormonas y de los niveles de expresión relativa de los receptores más que de la capacidad del IR o IGF-IR de transmitir una señalización diferente (Siddle, 2012). La unión del ligando a las subunidades α provoca un cambio con­ formacional que induce la activación de la actividad quinasa en las subunidades β. Esto resulta en una transfosforilación a lo largo de las subunidades β que per­ mite el reclutamiento de los sustratos del receptor. Los sustratos mejor caracteriza­ dos son miembros de la familia de sustra­ tos del receptor de insulina (IRS), hasta el momento han sido caracterizados 6 miembros de esta familia (desde el IRS-1 hasta el IRS-6) (White, 2006). Por ejemplo, la regulación del metabolismo de los car­ bohidratos y los lípidos, requiere de IRS-1 e IRS-2 (Copps y White, 2012). Las proteí­ nas IRS se reclutan a la membrana por los receptores activados a través de los domi­ nios de homología a la pleckstrina (PH) y los dominios de unión a fosfotirosina (PTB) (Voliovitch et al., 1995) (Figura 9). Aunque todos estos sustratos se fosforilan en residuos de Tyr, presentan claramen­ te distintas funciones in vivo. Los ratones knockout para IRS-1 padecen retraso en el desarrollo y una cierta resistencia a insuli­ na, especialmente en músculo; sin embar­ go, tienen tolerancia normal a la glucosa (Araki et al., 1994). Los ratones knockout para IRS-2 exhiben un menor desarrollo Figura 9. Mecanismos de señalización de la insulina y puntos de feedback iniciados por los IRS. La fosforilación en Tyr de los IRS por la quinasa del IR permite la unión de los dominios SH2 de las proteínas p85, GRB2, SH2 y otras que no se muestran. Las señales metabólicas se consiguen gracias al reclutamiento de PI3K por los IRS, el cual estimula (Vía PDK1) la activación de los PKCs o PKB. En la ausencia de la fosforilación inhibitoria inducida por PKB, una serie de proteínas regulatorias clave: (1) regulan la captación de glucosa, (2) Inhiben la acumulación de glucosa como glucógeno (GSK3), (3) promueven la transcripción de genes gluconeogénicos (FoXO1) y bloquean la estimulación de la síntesis de proteínas por medio de la vía de señalización de mTORC1/S6K. Los IRS median también la activación de la cascada Ras/ p42p44MAPK. Figura adaptada de Copps y White, 2012. sólo en determinados tejidos como neuro­ nas e islotes pancreáticos, pero presentan también una señalización defectuosa de insulina en el hígado que, en combinación con la pérdida de masa de célula β pan­ creática, desemboca en el desarrollo de diabetes (Whiters et al., 1998). La deleción de IRS-3 en ratones no resulta deletérea, a no ser que se combine con IRS-1, lo que provoca un defecto severo en la adipogé­ nesis (Laustsen et al., 2002). Los ratones knockout para IRS-4 muestran un mínimo retraso en el desarrollo e intolerancia a glucosa (Fantin et al., 2003). Los sustratos IRS-5 e IRS-6 presentan una baja expre­ sión y sólo en determinados tejidos, y no se conoce que desempeñen un papel fun­ damental (Cai et al., 2003). Al contrario que la fosforilación en Tyr de los IRS, la fosforilación en Ser/Thr puede regular positiva o negativamente. Nume­ rosos mecanismos están implicados en defosforilar los residuos de tirosina de los IRS, disociarlos del IR, modificar su loca­ lización intracelular y regular su degrada­ ción (Copps y White, 2012). 2.2.1. Ruta PI3K/PKB La ruta que une de forma crítica a las proteínas IRS con las acciones metabólicas de la insulina es la ruta de la PI3K y de la proteína quinasa B (PKB) (Figura 9). El reclutamiento y activación de PI3K depende de la unión a través de dos dominios de homología de Src tipo 2 (SH2) presentes en su subunidad reguladora (subunidad α) con las Tyr fosforiladas de los IRS (Shaw et al., 2011). Esto resulta en la activación de la subunidad catalítica de la PI3K (subunidad β), que fosforilará rápidamente al fosfatidilinositol (4,5)-bifosfato (PIP2) para generar fosfatidilinositol (3,4,5)-trifosfato (PIP3). Éste recluta a PKB a la membrana a través del dominio PH, donde se fosforila por la proteína quinasa dependiente de fosfoinosítidos tipo 1 (PDK1) e induce la correspondiente señalización. La isoforma β de la PKB (Akt2) es la más abundante en los tejidos sensibles a la insulina, y parece tener un papel fundamental como mediador de la acción de la insulina en el metabolismo (Boucher et al., 2014). Además, el ratón knockout para PKB β es resistente a insulina y desarrolla diabetes, cosa que no ocurre con los knockout para las isoformas α (Akt1) o γ (Akt3) (Cho et al., 2001). De la activación de PKB depende a su vez la activación, a través del complejo diana de rapamicina en mamíferos (mTOR), de p70S6 quinasa (p70S6K), la cual regula diversos factores implicados en la síntesis de proteínas (Belfiore et al., 2009). 2.2.2. Ruta Ras/MAPK La estimulación por insulina provoca la unión de las proteínas adaptadoras GRB2/ SOS o SHP2 a los IRS (Figura 9). Esta unión conlleva a la activación de Ras y la correspondiente cascada dependiente de MAPK solo parcialmente, ya que otros sustratos pueden activarla (Copps y White, 2012). Ésta vía de señalización está implicada, fundamentalmente, en el crecimiento, supervivencia y diferenciación celular. Inicialmente se atribuyó una función similar a p44MAPK y p42MAPK, de hecho, p42MAPK es capaz de compensar la falta de p44MAPK en ratones knockout para esta proteína (Pagès et al., 1999). Además, ambas isoformas están implicadas en la regulación negativa de los IRS a través de su fosforilación en Ser (Bouzakri et al., 2003). Sin embargo, p44MAPK es esencial para la adipogénesis in vivo e in vitro y p42MAPK no es capaz de compensar en este caso (Taniguchi 53 et al., 2006). Por tanto, estas quinasas desempeñan un papel fundamental en las acciones de la insulina relacionadas con crecimiento y diferenciación celular, pero un papel secundario en cuanto a lo que al papel metabólico se refiere (Copps y White, 2012; Taniguchi et al., 2006). 2.2.3. Modulación de la captación de glucosa en los hepatocitos Los hepatocitos, junto con las células β, presentan un transporte de glucosa inde­ pendiente de insulina, gracias al trans­ portador de glucosa 2 (GLUT2). Una vez dentro de la célula, la isoforma VI de la hexoquinasa (HK, también denomina­ da glucoquinasa), expresada en híga­ do y célula β, cataliza la fosforilación de la glucosa a glucosa-6-fosfato. La alta Km (constante de Michaelis-Menten) de GLUT2 y glucoquinasa para la glucosa, aseguran que la captación y metaboliza­ ción de ésta sea proporcional a la con­ centración sanguínea, permitiendo que la célula β actúe como sensor de los nive­ les de glucosa (Newgard et al., 1990). La regulación del GLUT2 en el hígado está controlada de forma dosis dependiente en función de la concentración de glucosa, tanto en cultivo primario de hepatocitos de rata como en líneas celulares de hepa­ tocitos (Burkhardt et al., 2005). Además, la expresión hepática de GLUT2 disminuye durante los periodos de ayuno y recupera los niveles normales en el periodo de rea­ limentación de ratas previamente ayuna­ das. En las ratas diabéticas, la expresión del GLUT2 se encuentra aumentada, pero regresa a niveles normales cuando las condiciones de hiperglucemia se corrigen tras la administración de insulina exógena (Burcelin et al., 1992). La expresión dife­ rencial de las isoformas del receptor de insulina regulan también la captación de glucosa por GLUT2, ya que se ha descrito que la asociación de GLUT2 con IRA favo­ rece este proceso en hepatocitos neona­ tales (Nevado et al., 2006). Sin embargo, es desconocido el papel in vivo de las iso­ formas del IR en la diabetes tipo 2 y más concretamente en la regulación de la cap­ tación de glucosa hepática. 2.3. FUNCIÓN DEL HÍGADO EN EL CONTROL METABÓLICO A pesar de los periodos de alimentación y ayuno, los niveles de glucosa en plasma se mantienen en un margen estrecho de entre 4 y 7 mM en individuos sanos. Este control preciso se consigue con el balance entre la absorción de glucosa por el intes­ tino, la producción de glucosa por el híga­ do y su consumo y metabolismo por los tejidos periféricos (Saltiel y Kahn, 2001). Concretamente, el hígado juega un papel clave en la homeostasia metabólica. Durante el ayuno, mantiene los niveles de glucemia liberando glucosa desde los depósitos de glucógeno (glucogenolisis). Cuando estos depósitos se agotan, tiene lugar la síntesis de novo de glucosa (gluconeogénesis), proceso que utiliza como sustratos aminoácidos, glicerol y lactato (Naïmi et al., 2010). Si el periodo de ayuno persiste, el uso de la glucosa liberada por el hígado se limita a tejidos puramente glicolíticos, como el cerebro. Durante este periodo, otros tejidos dependen de la oxidación de ácidos grasos (β-oxidación) liberados por el tejido adiposo (Naïmi et al., 2009). Por último, el hígado produce cuerpos cetónicos (cetogénesis) como último sustrato energético para el cerebro. Durante el periodo de alimentación, los depósitos de glucógeno se reponen (glucogenosíntesis) y la glucosa se utiliza para la producción de energía (glucolisis). Figura 10. Regulación del metabolismo de la glucosa en el hígado. En los hepatocitos, la insulina estimula el uso y almacenamiento de la glucosa en forma de lípidos o glucógeno, a la par que inhibe la síntesis y liberación de glucosa. Estos procesos se coordinan mediante una regulación coordinada entre la síntesis y la actividad enzimática. La insulina estimula la expresión de genes que codifican enzimas que intervienen en la síntesis de ácidos grasos (rodeadas en azul) a la vez que inhibe la expresión de enzimas gluconeogénicas (rodeadas en rojo). Estos efectos están mediados por una serie de factores de transcripción como SREBP, HNF-4 o factores de transcripción de la familia FoXO. La insulina regula también las actividades de varias enzimas (rodeadas en verde) a través de cambios en su estado de fosforilación. GK: glucoquinasa, G6P: glucosa-6-fosfato, G-6-Pase: glucosa-6-fosfatasa, F-1,6-Pase: fructosa-1,6-bifosfatasa, PEPCK: fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, PFK: fosfofructoquinasa, PK: piruvato quinasa, ACC: acetil-CoA casboxilasa, FAS: sintasa de ácidos grasos. Figura adaptada de Saltiel y Kahn, 2001. Tanto el exceso de glucosa como de ácidos grasos provenientes de la dieta se empaquetan en partículas lipoproteicas de muy baja densidad (VLDL) y se exportan al tejido adiposo (lipogénesis) (Naïmi et al., 2009). 2.4. INTRODUCCIÓN AL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO: REGULACIÓN POR GLUCOSA-6-FOSFATO Como se acaba de describir, el hígado juega un papel central en el manteni­ miento de la homeostasia glucídica por medio de la captación de glucosa duran­ te la etapa postprandial, a través de la conversión a glucógeno o triglicéridos, y mediante la producción de glucosa duran­ te la etapa postabsortiva, a través de la glucogenolisis y la gluconeogénesis (von Wilamowitz-Moellendorff et al., 2013). Si se producen defectos en los mecanismos por los cuales la glucosa y la insulina regu­ lan el metabolismo hepático del glucóge­ no, la homeostasia glucídica se rompe, lo cual se asocia con enfermedades meta­ bólicas como la diabetes tipo 2 (Roach et al., 2012) (Figura 10). El glucógeno es un polímero ramificado de monómeros de glucosa presente en la mayoría de los mamíferos, cuya función es actuar como almacén de carbohidratos. Los residuos de glucosa están unidos por enlaces α(1-4) a lo largo de la cadena y por enlaces α(1-6) en los puntos de ramifica­ ción (Agius, 2015) (Figura 11). 55 Figura 11. Enlaces que participan en la polimerización de las moléculas de glucógeno. Figura adaptada de Roach et al., 2012. 2.4.1. Glucógeno sintasa hepática La enzima limitante en la síntesis de glu­ cógeno es la glucógeno sintasa (GS) que cataliza la adición de unidades de glucosa desde la UDP-glucosa, mediante enlaces α(1-4), a la cadena en formación de glucó­ geno (Figura 12). En mamíferos existen dos isoformas de la GS, la muscular (codifica­ da por GYS1) y la hepática (codificada por GYS2) (Roach et al., 2012). La actividad de ambas isoformas está regulada por fosfo­ rilación en múltiples residuos y efectores alostéricos, de los cuales el más importan­ te es la glucosa-6-fosfato (G6P) (Villar-Pa­ lasí y Guinovart, 1997). La G6P puede actuar como activador alostérico de la enzima fosforilada e incluso hiperfosforila­ da. La defosforilación de la GS también la activa y resulta en cambios en los paráme­ tros cinéticos (von Wilamowitz-Moellen­ dorff et al., 2013) (Figura 13). Tras décadas de investigación intensiva en este campo, seguimos desconociendo en profundi­ dad el control de la GS en hígado in vivo mediante su activación alostérica. Sin embargo, el mecanismo por el cual la insu­ lina activa a la GS y aumenta el almacena­ miento de glucógeno está bien descrito. La insulina activa a PKB, la cual fosforila e inhibe a la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3) (Frame y Cohen, 2001; Doble y Woodgett, 2003). En ausencia de insuli­ na, la GSK3 activa fosforila cuatro serinas en el extremo carboxi-terminal de la GS, lo que regula negativamente su actividad, disminuyendo la capacidad de sintetizar y almacenar glucógeno (Patel et al., 2008). Figura 12. Esquema del metabolismo del glucógeno. Glcout: glucosa extracelular; Glcin: glucosa intracelular; HK: hexoquinasa; G6Pase: Glocosa-6-fosfatasa; PGM: fosfoglucomutasa; UP: UDP-glucosa pirofosforilasa; GN: glucogenina; GS: glucógeno sintasa; BE: enzima ramificadora; PH: glucógeno fosforilasa; DBE: enzima desramificadora; GNG: gluconeogénesis. Figura adaptada de Roach et al., 2012. 2.4.2 Glucógeno sintasa quinasa 3 En mamíferos, la expresión de la GSK3 se regula por dos genes, gsk3α y gsk3β, que codifican para las dos isoformas de 51 y 47 kDa respectivamente (Medina y Wandosell, 2011). La diferencia de tama­ ño viene determinada por un dominio rico Figura 13. Representación esquemática de los diferentes estados de conformación que regulan la actividad de GYS2. Las subunidades están coloreadas de forma individual. R: hélices reguladoras que contienen Arg; A: aceptor de glucógeno. La fosforilación de la enzima en la Thr668 bloquea a ésta en el estado T. Se muestran los sitios de unión para la G6P en el estado R. Figura adaptada de Baskaran et al., 2010. en glicocola en el extremo amino-terminal de la GSK3α (Doble y Woodgett, 2003). La eliminación de la isoforma GSK3β en ratones da lugar a un fenotipo letal en la fase embrionaria (Hoeflich et al., 2000). Sin embargo, el knockout específico de hígado para esta isoforma presenta pará­ metros metabólicos normales (Patel et al., 2008). Los ratones GSK3α knockout mejo­ ran la tolerancia a glucosa, aumentan la sensibilidad a insulina hepática y aumen­ tan los depósitos de glucógeno en este órgano (MacAulay et al., 2007). La GSK3 tiene una preferencia inusual por proteínas diana que han sido previa­ mente fosforiladas en un residuo priming localizado hacia el extremo carboxi-termi­ nal del sitio de fosforilación de GSK3α/β. La secuencia consenso en los sustratos de GSK3 es Ser/Thr-X-X-X-Ser-P/Thr-P, donde la primera Ser/Thr es el residuo diana a fosforilar, X es cualquier aminoá­ cido y la última Ser-P/Thr-P es el sitio pri­ ming de fosforilación (Doble y Woodgett, 2003) (Figura 14). Más allá de su papel fun­ damental en el metabolismo, GSK3 inter­ viene en procesos neurodegenerativos y cáncer (MacAulay et al., 2007). Sin embargo, la regulación por medio de insulina-PKB-GSK3 no resulta imprescin­ dible para la síntesis de glucógeno tras la ingesta. McManus et al. generaron en 2005 el ratón knockin que expresa cons­ titutivamente mutaciones en GSK3 en los residuos susceptibles de ser fosforilados por PKB, concretamente, GSK3α (Ser 21) y GSK3β (Ser 9), se sustituyeron por Ala. Sorprendentemente, estos animales pre­ sentan niveles normales de glucógeno. Además, como se ha comentado anterior­ mente, los ratones knockout para subuni­ dad β o α hepáticas, de la GSK3 presentan también niveles de glucógeno normales tras la ingesta en ambos casos (Patel et al., 2008; 2011). 57 2.4.3. Regulación específica por la Glucosa-6-fosfato En el hígado, concentraciones elevadas de G6P intracelular se han propuesto como estímulo específico para la activa­ ción de la subunidad GL de la GYS2 (von Wilamowitz-Moellendorff et al., 2013). La GYS2 se desfosforila y activa por la proteí­ na fosfatasa 1 (PP1) la cual se une y forma un complejo con la GL. GL interactúa con la forma activa de la glucógeno fosforila­ sa (GPa), la cual antagoniza la activación de GS por medio de PP1-GL. Cuando los niveles de glucosa en sangre se elevan, la glucosa se une a la GPa hepática y estabi­ liza a la enzima en su conformación inac­ tiva, GPb. La glucogenolisis se para y la inhibición de la PP1-GL se bloquea, permi­ tiendo que la PP1-GL defosforile y active a la GS, promoviendo así el almacenamien­ to de glucógeno en el hígado. Además, la G6P unida a la GYS2 convierte a la proteí­ na fosforilada en un mejor sustrato para la PP1 (von Wilamowitz-Moellendorff et al., 2013). 2.4.4. Degradación del glucógeno En condiciones de ayuno, el glucógeno rápidamente se degrada para dar lugar a glucosa-1-fosfato (G1P) (Agius, 2015). Esta acción se cataliza por la enzima glucógeno fosforilasa la cual, en presencia de fosfato inorgánico (Pi), libera el residuo de glucosa terminal de las cadenas α(1-4) como G1P; y por la enzima desramificante, la cual transfiere una triosa desde el α(1-6) al α(1­ 4), para que la molécula de glucosa pueda ser liberada por la glucógeno fosforilasa (Agius, 2015). Existen tres isoformas de la glucógeno fosforilasa: PYGL, PYGM y PYGB, hepática, muscular y cerebral respectivamente. Las tres isoformas se regulan de forma alostérica por la unión de diversos metabolitos, por acetilación y por fosforilación covalente en la Ser 14. La forma fosforilada y desfosforilada se denominan GPa y GPb respectivamente. La glucógeno fosforilasa baila en un equilibrio de estados conformacionales que son: conformación activa (estado-R) o inactiva (estado-T). El estado-R presenta alta afinidad por los sustratos, glucógeno y Pi. La fosforilación en Ser 14 y la unión de AMP favorecen el estado-R, mientras que la unión de G6P, ATP o fructosa-1­ fosfato (F1P) estabilizan el estado-T. La unión de AMP o G6P es mutuamente excluyente ya que se unen a los mismos residuos. Además, la glucosa promueve la conversión de GPa a GPb lo que implica que, cuando los niveles de GPa disminuyen hasta un determinado umbral, la GS se activa por defosforilación (Stalmans et al., 1997). Figura 14. La selectividad de la GSK3 por sus sustratos viene determinada por la existencia de un residuo priming fosforilado previamente. Figura adaptada de Medina y Wandosell 2011. 3. PAPEL DE LA CÉLULA β PANCREÁTICA EN LA HOMEOSTASIA METABÓLICA. PLASTICIDAD DE LA MASA DE CÉLULA β PANCREÁTICA Las células β pancreáticas son las encar­ gadas de sintetizar y secretar la hormo­ na insulina, esencial para mantener la homeostasis metabólica. La función más importante de estas células es la secre­ ción de insulina en respuesta al estado nutricional del organismo (Holst y Groma­ da, 2004). El papel clave de la hipertrofia celular en la dinámica de la masa de célula β a lo largo de la vida fue descrito en ratas por Montanya et al. en el año 2000. Su estudio demostró que tanto la hipertrofia como la hiperplasia son responsables del aumento de masa de célula β en anima­ les jóvenes. Sin embargo, en la población adulta, la hipertrofia cobra un papel prin­ cipal. Estas observaciones permitieron conciliar los estudios que demuestran el aumento de masa de célula β en adultos (Butler et al., 2003), con los ya descritos que hacen hincapié en la baja prolifera­ ción tras la juventud, poniendo de relieve la especial relevancia de la hipertrofia de célula β. Son diversos los estudios que demuestran la alta plasticidad de la masa de célula β en diversas condiciones. Por ejemplo, el embarazo supone un aumento de la demanda de insulina, lo cual resul­ ta, entre otros cambios adaptativos, en un aumento del número y volumen de célu­ las β (Sorenson y Brelje, 1997). La com­ pensación ante situaciones patológicas, como la resistencia a la insulina sistémica observada en el modelo nulo heterocigo­ to para el IR e IRS-1, es capaz de produ­ cir un aumento de hasta 15-20 veces en la masa de célula β y en la secreción de insulina (Brüning et al., 1998). Otros mode­ los clásicos de aumento compensatorio de masa de célula β incluyen los anima­ les carentes de leptina (ob/ob) (Edvell y Lindström, 1995) o de su receptor (db/db) (Chick y Like, 1970). Ambos son modelos de obesidad por hiperfagia que acaban desarrollando diabetes debido a pérdida de la masa de célula β. 3.1. APOPTOSIS EN LAS CÉLULAS β PANCREÁTICAS Es importante mencionar la apoptosis como mecanismo fisiológico para el man­ tenimiento de la masa de célula β. Si la finalidad de los mecanismos que conlle­ van a una mayor masa de célula β es el aumento de los niveles de insulina, una subsiguiente disminución de la demanda de la hormona debe de ir acompañada de reducción de la masa de célula β. En estos casos, una reducción deficiente de la masa de célula β podría llevar a hipo­ glucemia, potencialmente letal. Por lo que de forma fisiológica, siguiendo al aumento de masa de célula β observado durante el embarazo, la masa disminuye por muerte celular programada tras el parto (Scaglia et al., 1995). De igual manera, la apoptosis de célula β participa de forma fisiológica en la remodelación del islote en neonatos (Scaglia et al., 1997). La apoptosis como proceso responsable de la disminución de la masa de célula β en la diabetes tipo 2 se identificó por primera vez en ratas obesas Zucker. En estos animales, la masa de célula β se incrementa dramáti­ camente para hacer frente a la resisten­ 59 cia a insulina provocada por la obesidad. Pero, al aumentar el peso de los animales y agudizarse la resistencia a la hormona, la función y masa de la célula β acaban decayendo. Esto no es debido a una falta de proliferación o neogénesis, sino a un aumento de la apoptosis, tal y como se observó en las secciones de tejido pan­ creático (Pick et al., 1998). En humanos también se ha comprobado que el meca­ nismo que lleva a una pérdida de masa de célula β es la apoptosis. En un estudio a partir de muestras de autopsias, se com­ probó que los pacientes obesos con into­ lerancia a glucosa mostraban una pérdida de hasta el 40 % de la masa de célula β y, en individuos que desarrollaron diabetes, el porcentaje aumentaba hasta el 60 %. No se encontraron diferencias en cuanto a los niveles de proliferación, que fueron bajos en todos los casos. Sin embargo, la apoptosis cuantificada por TUNEL (ter­ minal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling), resultó mayor en los pacientes diabéticos (Butler et al., 2003). La apoptosis es el mecanismo final encar­ gado de la disminución de la masa de célu­ la β, pero las causas que desencadenan apoptosis son múltiples: acumulación de proteínas defectuosas, estrés del retículo endoplásmico (RE), autofagia o el propio efecto glucotóxico (Bartolomé A, 2012). 3.2. EFECTO GLUCOTÓXICO EN LAS CÉLULAS β PANCREÁTICAS La glucotoxicidad puede definirse como el daño causado por exposición crónica a concentraciones suprafisiológicas de glu­ cosa que, en islotes, puede llevar a una disminución de función y a la apoptosis. Dependiendo de la especie estudiada, el efecto “glucotóxico” es diferente, mientras que los islotes humanos son muy sensibles a concentraciones de glucosa por encima de 5.6 mM (Leibowitz et al., 2001; Maedler et al., 2001), los islotes murinos son más resistentes o incluso están protegidos por concentraciones de glucosa más eleva­ das (Hoorens et al., 1996). La glucosa en célula β puede ejercer su potencial efecto negativo a través de diferentes mecanis­ mos (Robertson, 2004). La mayoría de los estudios se han llevado a cabo in vitro, con líneas celulares, o ex vivo, en islotes, por lo que sería especialmente interesante un estudio en profundidad in vivo. La posibilidad de que la propia hiperglucemia pudiese acelerar la muerte de las células β remanentes en animales diabéticos no ha sido tratada convenientemente. Sin embargo, hay evidencias que indican que podría ser todo lo contrario ya que, tras inducción de diabetes por la estreptozotocina, los animales presentan células β hiperproliferativas de manera dependiente de hiperglucemia (Pechhold et al., 2009). Varios autores coinciden en que parte del papel nocivo de la glucosa puede estar causado por aumento de estrés del RE. Estudios in vitro demuestran cómo, en principio, concentraciones altas de gluco­ sa de manera crónica aumentan la sínte­ sis de proinsulina por parte del RE. Pero, finalmente, se produce estrés de RE y dis­ minución de síntesis de proinsulina (Lip­ son et al., 2006). 4. EJE DE COMUNICACIÓN HÍGADO-PÁNCREAS El principal objetivo de la terapia de la dia­ betes en cuanto a la célula β es la identifi­ cación de nuevos factores que promuevan su regeneración, con el objetivo final de aumentar la masa de célula β en pacien­ tes con diabetes tipo 1 ó 2. Como se ha comentado anteriormente, las células β tienen la capacidad de compensar en dos casos diferentes de resistencia a insulina: fisiológica (embarazo) o resistencia a insu­ lina patológica (obesidad) (Van Assche et al., 1978; El Ouaamari et al., 2013). El crecimiento de la masa de célula β tanto en humanos como en roedores ocurre por la propia duplicación de las células β ya existentes (Meier et al., 2008; Teta et al., 2007), aunque se han descrito factores de crecimiento putativos que median en este proceso, especialmente en el contexto de resistencia a insulina. Varias moléculas producidas por el hígado se han postu­ lado como candidatas para participar en este proceso, como la conflictiva betatro­ fina (Yi et al., 2013; Gusarova et al., 2014; Abu-Farha et al., 2015; Cox et al., 2015), el factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) (Emanuelli et al., 2014) o el IGF-I (Escribano et al., 2009). Recientemente se ha descrito a la serpina B1 como uno de estos factores (El Ouaamari et al., 2016), apoyando así la teoría que defiende la existencia de un eje de comunicación hepato-pancreático, descrito ya previa­ mente (Escribano et al., 2009; El Ouaamari et al., 2013). Este campo debe explorarse todavía a fondo para poder identificar fac­ tores adicionales que puedan regularse/ administrarse, por sí mismos o combina­ dos, con el objetivo final de poder res­ tablecer la normoglucemia en pacientes diabéticos. 5. DESREGULACIONES EN EL METABOLISMO LIPÍDICO ASOCIADOS A DIABETES TIPO 2 Aunque todas las formas de la diabetes se caracterizan por la hiperglucemia incon­ trolada, otros parámetros hormonales se encuentran frecuentemente desregulados y contribuyen a la patología de la enferme­ dad. Estos parámetros incluyen insulina, glucagón, triglicéridos, etc. Por ejemplo, un acúmulo anormal de lípidos se ha aso­ ciado con una disminución de la sensibi­ lidad a la insulina (Neubauer y Kulkarni, 2006). La interacción entre la glucosa y el metabolismo lipídico no está totalmente caracterizada: el papel que juegan el IR y el IGF-IR en la dislipidemia asociada a la diabetes tipo 2 se desconoce. Lo que sí está completamente establecido es una relación directa entre la diabetes tipo 2 y un aumento de triglicéridos en plasma, la disminución de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y un aumento de las lipo­ proteínas de baja densidad (LDL) (Neu­ bauer y Kulkarni, 2006). En concreto, la lipogénesis, la cual se regula positivamen­ te por insulina, está aumentada en situa­ ciones de diabetes tipo 2 (Biddinger et al., 2008). Esto podría ser porque la lipogé­ nesis se mantiene dirigida por la insulina pero de forma excesiva, debido a la hiper­ insulinemia que se produce en estados de resistencia a insulina (Biddinger et al., 2008). Otra opción es que la lipogénesis se mantenga resistente a insulina, pero sea dirigida también por otros factores, como una excesiva ingesta de carbohi­ dratos (Schwarz et al., 2003). Una tercera opción, descrita recientemente por Cook et al., es la idea de la resistencia a insulina selectiva en hepatocitos, capitaneada por PKB/factores de transcripción Forkhead Apolipoproteínas Fuente primaria Asociación lipoproteína Función Apo A-I Hígado Intestino HDL, quilomicrones Proteína estructural de las HDL Activador LCAT Apo A-II Hígado HDL, quilomicrones Proteína estructural de las HDL Activador de la lipasa hepática Apo A-IV Intestino HDL, quilomicrones Deconocida Apo A-V Hígado HDL, quilomicrones, VLDL Lipólisis de TG Apo B-48 Intestino Quilomicrones Proteína estructural de los quilomicrones Apo B-100 Hígado VLDL, LDL Proteína estructural Ligando del receptor de LDL Apo C-I Hígado HDL, quilomicrones, VLDL Activa LCAT Apo C-II Hígado HDL, quilomicrones, VLDL Cofactor del LPL Apo C-III Hígado HDL, quilomicrones, VLDL Inhibe LPL Apo E Hígado HDL, quilomicrones remanentes Ligando del receptor de LDL Tabla 3. Tabla resumen de las apolipoproteínas y sus funciones. Tabla adaptada de Feingold y Grunfeld, 2015. (FoxO) hacia la producción de glucosa hepática (HGP), y por PKB/ proteína de unión a elementos regulados por estero­ les 1c (SREBP-1c) hacia la lipogénesis de novo (DNL). El colesterol y los triglicéridos son de carácter apolar y, por tanto, deben ser transportados en sangre asociados a pro­ teínas. Las lipoproteínas son partículas complejas, con un núcleo central de coles­ terol y triglicéridos rodeado de colesterol libre, fosfolípidos y apolipoproteínas. Ade­ más de su función estructural, las apoli­ poproteínas actúan como ligandos para los receptores de lipoproteínas, dirigen la formación de las vesículas y actúan como activadores o inhibidores de las enzimas implicadas en el metabolismo de las lipo­ proteínas. Las lipoproteínas plasmáticas se dividen en siete clases en función de su tamaño, composición lipídica y las apoli­ poproteínas que las integran, las cuales se resumen en la Tabla 3 (Feingold y Grunfeld, 2015). La vía exógena de las lipoproteínas comienza con la incorporación de los lípi­ dos procedentes de la dieta a los quilo­ micrones del intestino. Los triglicéridos y colesterol son transportados por los qui­ lomicrones que se metabolizan en tejidos periféricos por la lipoproteína lipasa (LPL), dando lugar a los quilomicrones remanen­ tes. Los quilomicrones remanentes son ricos en colesterol y se captan por el híga­ do (Feingold y Grunfeld, 2015). La vía endógena de las lipoproteínas comienza en el hígado con la formación de las VLDL. Cada molécula de VLDL con­ tiene una molécula de Apo B-100. Cuando aumenta la producción de triglicéridos en el hígado, las partículas VLDL que secre­ ta son de mayor tamaño. Los triglicéri­ dos transportados por estas partículas se 61 metabolizan en el músculo y en el tejido adiposo por la LPL, dando como resul­ tado las partículas IDL. Éstas se convier­ ten a LDL, ricas en colesterol, tanto que transportan la mayoría de colesterol que se encuentra en circulación. Cada partícu­ la de LDL contiene una molécula de Apo B-100 que es reconocida por el receptor de LDL, expresado en diversos tejidos. La mayoría de estas partículas las capta el hígado. El número de receptores de LDL en la membrana depende del contenido de colesterol en la célula, es decir, si éste disminuye, aumenta el número de recep­ tores para incrementar así la captación. Las partículas de LDL de pequeño tamaño se asocian con hipertrigliceridemia y dia­ betes tipo 2. Además se consideran proa­ terogénicas ya que permanecen mayor tiempo en circulación por varios motivos: tienen menor afi nidad por el receptor LDL, entran mejor en la pared arterial y son más susceptibles de ser oxidadas (Feingold y Grunfeld, 2015). El transporte reverso del colesterol comien­ za con la formación de las partículas nacientes de HDL por el hígado, las cuales juegan, en principio, un papel antiaterogé­ nico (Figura 15). Apo A-I forma su núcleo estructural proteico y, cada una de estas partículas, posee múltiples moléculas de Apo A-I. Las partículas nacientes de HDL pueden captar colesterol y fosfolípidos de otras células, proceso mediado por el transportador dependiente de la unión a ATP, familia A, miembro 1 (ABCA1); por el transportador dependiente de la unión a ATP, familia G, miembro 1 (ABCG1) o por el scavenger receptor, clase B, miembro 1 (SRB1) para dar lugar así a las partículas maduras de HDL. El colesterol moviliza­ do desde otras células es colesterol libre que se localiza en la superficie de las par­ tículas de HDL. Para poder generar par­ tículas de HDL maduras, con un núcleo de colesterol, el colesterol de la superficie debe ser esterificado. Para ello, la leciti­ na colesterol aciltransferasa (LCAT) cata- Figura 15. Metabolismo de las partículas HDL y transporte reverso del colesterol. El hígado secreta proteínas ApoA-I pobres en lípidos, las cuales adquieren rápidamente colesterol por medio del transportados ABCA1 presente en hepatocitos. Estas partículas promueven la entrada de colesterol libre desde los macrófagos a través del transportador ABCA1. LCAT esterifica el colesterol libre a ésteres de colesterol para formar las partículas HDL maduras, lo cual promueve el flujo de colesterol desde los macrófagos vía ABCG1, así como desde otros tejidos periféricos por mecanismos a fecha de hoy no del todo conocidos. En macrófagos, ABCA1 y ABCG1 están regulados por LXR. Las partículas maduras de HDL pueden transferir su colesterol al hígado directamente vía SR-BI o indirectamente por la vía mediada por CETP de transferencia a lipoproteínas que contienen ApoB, con la subsecuente captación de éstas a través del receptor LDL. El colesterol hepático puede ser excretado directamente a la bilis como colesterol o tras su conversión a ácidos biliares, a no ser que sea absorbido en el intestino y se secrete entonces por las heces. Figura adaptada de Duffy y Rader 2009. 63 liza el proceso de transferencia de ácidos grasos provenientes de los fosfolípidos al colesterol libre. Esta enzima está asociada a las partículas de HDL. Las HDL maduras devuelven el colesterol principalmente al hígado por su interacción con el receptor SRB1. La partícula de HDL se une a SRB1 y el colesterol se transporta al interior del hígado, sin la internalización de ésta. En humanos, ya que poseen la proteína que transfiere los ésteres de colesterol (CETP), podría volver también a las partículas de VLDL (Feingold y Grunfeld, 2015). Los ratones deficientes en SRB1 presentan un aumento significativo en los niveles de colesterol en las partículas HDL. Además, el transporte reverso de colesterol está reducido en estos animales (Trigatti et al., 1999). 6. TERAPIA GÉNICA CON VIRUS ADENOASOCIADOS La terapia génica consiste en la introduc­ ción de material genético ajeno en las célu­ las con un fin terapéutico. Este proceso se realiza gracias a la ayuda de los vectores, los cuales permiten el acceso del gen al entorno intracelular y lo protegen de su degradación. Cada caso requiere del uso de un vector y transgén concretos, que se seleccionan de acuerdo a la estrategia terapéutica que se va a utilizar. Para ello existen dos tipos de estrategias: terapia génica in vivo, la cual consiste en la libe­ ración directa de los vectores en los teji­ dos o en sangre y terapia génica in vitro, donde las células se aíslan de pacientes para ser modificadas in vitro y se trasplan­ tan de nuevo al mismo individuo (Gonzá­ lez-Aseguinolaza y Prieto, 2011). En nuestro caso, para introducir las iso­ formas del IR en los ratones iLIRKO, opta­ mos por el abordaje in vivo, utilizando como vehículos los virus adenoasociados (AAVs). 6.1. DESCRIPCIÓN DE LOS VIRUS ADENOASOCIADOS 6.1.1. Vector viral Los virus adenoasociados son virus de DNA de cadena simple, cuyo genoma es de aproximadamente 4.7 kb de longitud. Forman parte del género de los Dependovirus, perteneciente a la familia de los Parvoviridae (Wu et al., 2010). Para su replicación es necesaria la coinfección con un virus ayudante, generalmente adenovirus o herpes simplex virus (Wu et al., 2006, 2010). En ausencia de un virus ayudante, los AAVs establecen una infección latente en la célula permaneciendo en forma episomal, ya que su integración en sitios específicos del genoma resulta ineficiente (McCarty et al., 2004; Wu et al., 2006). Los vectores recombinantes derivados de los AAVs son atractivos para el desarrollo de terapias humanas porque mantienen una expresión génica a largo plazo en diversos tejidos y, a pesar de su alta seroprevalencia, no se conoce ninguna patología en humanos causada por ellos (Arruda et al., 2007; Gonçalves, 2005; Raupp et al., 2012; Vance et al., 2015; Wu et al., 2010). Además, generalmente presentan una baja inmunidad y existe una gran riqueza de serotipos disponibles con diferente tropismo tisular (Raupp et al., 2012). Su DNA genómico de aproximadamente 5 kb está constituido por los ITRs, que flan­ quean a los dos genes virales rep (replica­ ción) y cap (cápside) los cuales codifican proteínas no estructurales y estructurales respectivamente (Gonçalves, 2005). Una limitación sustancial de los vectores de los AAVs es su reducida capacidad de empaquetamiento, restringida a vectores menores de 5 kb, independientemente del serotipo, ya que su límite de empaqueta- miento viene definido por el tamaño del genoma del AAV wildtype. El empaque­ tamiento de vectores genómicos con un tamaño superior a 5 kb resulta heterogé­ neo en cuanto a longitud, ya que parte del extremo 5’ se pierde (Wu et al., 2010). 6.1.2. Serotipos virales: tropismo celular Hasta la fecha, un gran número de serotipos y más de 100 variantes de AAVs han sido aisladas de stocks de adenovirus o de tejidos humanos o de primates no humanos Figura 16 (Vance et al., 2015). Teóricamente, la capacidad para generar un pseudoserotipo de AAV recombinante se conseguiría combinando, bien la cápside, bien las secuencias de DNA (ITRs) de diferentes serotipos de AAVs, lo que permitiría la creación de un número ilimitado de nuevos vectores (Arruda et al., 2007). La utilización de otros serotipos no sólo podría disminuir la carga viral, si potencialmente tuviese una eficiencia de transducción mayor, sino que ayudaría a evadir anticuerpos neutralizantes preexistentes generados a causa de una infección natural o un tratamiento previo basado en la administración de AAVs (Wu et al., 2006). 6.2. RESPUESTA INMUNE FRENTE A LOS VIRUS ADENO­ ASOCIADOS En diversos ensayos clínicos se ha generado respuesta inmune humoral y linfocitos T CD8+ de memoria. Para sortear esta cuestión, se han aislado numerosas variantes de las cápsides de primates no humanos, las cuales se caracterizan por presentar mayor porcentaje de transducción en algunos de los tejidos y, potencialmente, una menor seroprevalencia, ya que se disminuye la probabilidad de una respuesta inmune preexistente frente a esa cápside (Vance et al., 2015). Además, se han explorado diversas modificaciones en la cápside para mejorar la eficiencia de transducción y la llegada al tejido diana (Raupp et al., 2012) como, por ejemplo, generar cápsides mediante la inserción de péptidos ligando o, partiendo de serotipos ya existentes como molde, generar virus quimera o mosaicismos (McCarty et al., 2004). El reconocimiento de diversos epítopos de los AAVs por los linfocitos T podría evitarse variando los serotipos. Sin embargo, en el caso del AAV2, el serotipo más común, los linfocitos T de memoria que reconocen su cápside podrían reconocer también epítopos derivados de otros serotipos, como consecuencia de la alta homología en la secuencia entre el AAV2 y otros serotipos (Arruda et al., 2007). A pesar de ello, los vectores AAV2 recombinantes han sido probados en estudios preclínicos para diversas enfermedades como hemofilia, deficiencia en α1-antitripsina, fibrosis quística o distrofia muscular de Duchenne obteniéndose resultados positivos (Vance et al., 2015; Wu et al., 2006). 65 Figura 16. Enfermedades tratadas en animales con AAVs de distintos serotipos. Los ensayos incluyen primates no humanos, cerdos, gatos, perros, conejos y ovejas. Figura adaptada de Vance et al., 2015. Figura 17. Enfermedades que estaban siendo testadas a fecha de Julio de 2015 (últimos datos publicados) según el serotipo del AAV ensayado. AADC: déficit aromático descarboxilasa de L-aminoácidos; DMAE: degeneración macular asociada a la edad; LCA: amaurosis congénita de Leber. Figura adaptada de Vance et al., 2015. 6.3. CARACTERÍSTICAS DEL VIRUS ADENOASOCIADO SEROTIPO 8 Uno de los AAVs aislado y caracterizado más prometedor es el AAV8, ya que tiene una eficiencia de transfección en el híga­ do superior a la del serotipo 2 (Raupp et al., 2012). Debe tenerse en cuenta que el AAV8 en dosis elevadas no sólo trans­ duce de forma eficiente al hígado, sino a otros órganos como el músculo esquelé­ tico. (Nakai el al., 2005). El uso de la luci­ ferasa como transgén, permite evaluar la actividad de la proteína transgénica tras una inyección intraperitoneal de su sus­ trato (luciferina) en el mismo animal y de forma secuencial, de modo que se puede conocer el tropismo viral (Zincarelli et al., 2008). Además, si se genera un vector con un promotor hepatoespecífico que con­ fiera especificidad adicional, en conjunto con las proteínas de la cápside del AAV8, se disminuye la respuesta inmunitaria ya que sortea la expresión en los macrófagos residentes en el hígado, o células de Kup­ ffer (Sands, 2011). Por ejemplo, los AAV8 se han utilizado recientemente en ensayos clínicos para expresar el factor de coagu­ lación IX en hígados humanos con resulta­ dos positivos (Raupp et al., 2012). La falta de este factor se conoce también como hemofilia B, y se caracteriza principalmen­ te por las hemorragias incontroladas. En la Figura 17 se resumen las enfermedades que estaban siendo testadas a fecha de Julio de 2015 (últimos datos publicados) en función del serotipo del AAV ensayado. 6.4 ENSAYOS CLÍNICOS EN MARCHA CON VIRUS ADENOASOCIADOS Los datos referentes a los ensayos clíni­ cos en marcha se encuentran recogidos en la página web perteneciente al NIH clinicaltrials.gov, y han sido publicados recientemente por Vance et al., en 2015. Según el NIH, 137 ensayos clínicos con AAVs se han llevado a cabo desde su des­ cubrimiento en 1960, a fecha de julio del 2015 (última fecha de actualización de los datos de esta página web). Estos ensayos conforman el 6.2 % del total de los ensa­ yos clínicos con terapia génica. Tradicio­ nalmente, el serotipo más usado ha sido el AAV2. Sin embargo, su uso entre los años 2010 y 2015 se ha reducido casi a la mitad (89 % vs. 54 %). En 2015, serotipos menos comunes han aumentado su presencia en estos ensayos respecto al 2010, Figura 18. Por ejemplo, el número de estudios que han utilizado el AAV8 asciende de 2 en 2010 a 7 en 2015 (Vance et al., 2015). Como muestra la Figura 19, en 2010 un 62 % de los ensayos clínicos con AAVs esta­ ban en fase I y, sólo un 17 % de los estu­ dios del mismo ensayo, en fases I y II. En 2015, los estudios sólo en fase I se redu­ jeron un 20 % y aumentaron los de fase I y II, probablemente debido al alto coste que genera el desarrollo de un ensayo clínico. Además, el número de estudios en fase III se redujeron, ya que las terapias con resultados favorables empezaron a salir al mercado (Vance et al., 2015). Por ejemplo, en octubre de 2012, la Comisión Europea autoriza la venta del primer tratamiento de terapia génica con AAVs, Glyberia. Éste compensa la deficiencia en lipoproteína lipasa, cuyo principal síntoma es una pan­ creatitis severa. Hasta el momento es el Figura 18. Las gráficas muestran los ensayos clínicos realizados mediante terapia génica con AAVs en 2010 y en 2015 clasificados según el serotipo ensayado. Figura adaptada de Vance et al., 2015. http:clinicaltrials.gov 67 Figura 19. Las gráficas muestran los ensayos clínicos realizados mediante terapia génica con AAVs en 2010 y en 2015 clasificados según la fase clínica en la que se encontraban en el momento del análisis. Figura adaptada de Vance et al., 2015. tratamiento más caro jamás administrado, con un coste de 1.1 millones de euros por paciente. Los numerosos ensayos clíni­ cos que se han llevado a cabo con AAVs confirman que la liberación del vector es segura, que el sistema inmune humano los tolera y que transfieren eficientemente el gen terapéutico (Vance et al., 2015). La Figura 20 resume el espectro de las enfermedades en las que se ha probado la terapia génica con AAVs a fecha de 2015. Las estadísticas muestran que las enfer­ medades neurológicas y oculares están ganando mayor interés ya que son tejidos inmunológicamente privilegiados (Vance Figura 20. Las gráficas muestran los ensayos clínicos realizados mediante terapia génica con AAVs en 2010 y en 2015 clasificados según enfermedad tratada. Figura adaptada de Vance et al., 2015. et al., 2015). 6.4.1. T erapia génica con virus adenoasociados en enfermedades metabólicas Las enfermedades congénitas relaciona­ das con el metabolismo afectan, aproxima­ damente, a uno de cada 500 nacimientos. En la mayoría de los casos, la causa es la deficiencia funcional en una determina­ da enzima, subunidad enzimática o pro­ teína transportadora asociada a una ruta metabólica (Alexander et al., 2008). Ade­ más, teniendo en cuenta que una enor­ me cantidad de proteínas se sintetizan y metabolizan en el hígado, la capacidad de conseguir una expresión estable y eficien­ te en los hepatocitos de un vector tera­ péutico resulta de enorme interés (Sands, 2011). Por tanto, los AAVs se presentan como una terapia prometedora para el tra­ tamiento de enfermedades metabólicas y, más concretamente, las enfermedades metabólicas hepáticas. Hasta la fecha, se han ensayado diferentes abordajes con vectores de AAVs para más de 30 enfermedades metabólicas en dife­ rentes animales, resumidas en la Tabla 4. En un número significativo de casos, los Tabla 4. Enfermedades en las que se ha ensayado un abordaje terapeútico con AAVs. Figura adaptada de Vance et al., 2015.. resultados han sido positivos ya que el fenotipo que presentase la enfermedad se ha corregido total o parcialmente (Alexan­ der et al., 2008). Muchas de ellas aparecen también en la Figura 17, la cual resume las enfermedades que están siendo tratadas actualmente mediante terapia génica con AAV según el serotipo (Vance et al., 2015). El conocimiento de los factores y las vías de señalización necesarias para mantener los niveles de glucosa en el rango ade­ cuado resultan esenciales para entender las bases fisiopatológicas de la diabetes y planear estrategias terapéuticas para prevenir y/o limitar estas complicaciones (Neubauer y Kulkarni, 2006). Así, la asociación del GLUT2 con IRA se postula como un posible mecanismo in vivo para el mantenimiento de la gluco­ sa que daría lugar a una posible estrate­ gia terapéutica para prevenir la diabetes tipo 2 en su fase de prediabetes. El uso de AAVs podría conducir a un camino eficaz para conseguir este objetivo, con­ cretamente como vectores que transpor­ ten las isoformas del IR al hígado. Pese a no existir un modelo animal que repro­ duzca tal cual cómo se produce la diabe­ tes tipo 2 en humanos, el modelo iLIRKO se presenta como el candidato ideal, ya que desarrolla hiperglucemia y resisten­ cia a insulina mantenidas en el tiempo, ambas características fundamentales de la diabetes tipo 2 en humanos. Además, puesto que la cascada de señalización de la insulina presenta numerosos entresijos moleculares, desgranar esa red a nivel de sus receptores, tanto in vitro como in vivo, resulta fundamental para profundizar en el entendimiento del papel exacto que des­ empeñan las proteínas que componen esa cascada y sus puntos de crosstalk (inte­ racción). 05/ objetivos 73 La diabetes tipo 2 es una enfermedad de carácter poligénico cuya etiología en humanos a día de hoy no se conoce espe­ cíficamente. Para profundizar en el estu­ dio de esta enfermedad se han generado numerosos modelos animales knockout, centrados principalmente en la vía de señalización de la insulina e IGF-I. Sólo la deleción constitutiva específica del IR en hígado (LIRKO) muestra una marcada resistencia a insulina e intolerancia a glu­ cosa, destacando así el papel metabólico fundamental de este órgano. Sin embargo, el fenotipo diabético de estos ratones se pierde con la edad, ya que los animales desarrollan daño hepático a partir de los dos meses de vida que se acentúa con la edad (Michael et al., 2000). Este efecto se debe a la pérdida del receptor de insulina durante el desarrollo embrionario y, aun­ que la vía de señalización con IGF-I es común en diversos puntos, en este caso, el receptor de IGF-I no es capaz de com­ pensar la carencia. Por tanto, los objetivos relativos a esta primera parte de la tesis son: 1. Generación del modelo inducible knockout específico del IR en hígado (iLIRKO) mediante el cruce de ratones transgénicos que expresan la recom­ binasa Cre-ERT2 bajo el control del promotor de albúmina, específico de hepatocitos, (Alb-Cre-ERT2) con ratones InsrloxP/loxP. 2. Generación del modelo iLIRIGFIRKO (DKO) mediante el cruce de ratones transgénicos que expresan la recombinasa Alb-Cre-ERT2 con ratones InsrloxP/loxP e igf1rloxP/loxP. 3. Puesta a punto de las condiciones de inducibilidad para el funcionamiento de la recombinasa en los modelos iLIRKO y DKO con el fin de generar la resistencia a insulina hepática deseada sin producir daño hepático en los ratones iLIRKO. 4. Caracterización del fenotipo diabéti­ co del modelo iLIRKO. Diversas cuestiones referentes al papel fisiológico de las isoformas del receptor de insulina permanecen inconclusas. Por tanto, el modo mediante el cual se activan de forma diferencial las distintas cascadas de señalización en respuesta a insulina debe estudiarse más a fondo. Resultados previos in vitro de nuestro grupo describen una regulación diferencial de las isoformas en la captación de glucosa a través de su asociación con el GLUT2 en hepatoci­ tos neonatales (Nevado et al., 2006). Por tanto, la expresión hepática diferencial de las isoformas in vivo resulta fundamental para conocer el efecto fisiológico global de éstas. Este estudio se realizó median­ te un abordaje de terapia génica con virus adenoasociados que contenían la isofor­ ma A o B del receptor de insulina. Así, los objetivos referentes a este apartado eng­ loban tanto la generación de las partículas virales y sus correspondientes estudios relativos a su especificidad y no patogeni­ cidad hepática; así como los efectos de la expresión hepática diferencial de las iso­ formas en cuanto a la tolerancia a glucosa y regulación de la masa de célula β. 5. Generación de las partículas de virus adenoasociados que contienen las iso­ formas del receptor de insulina así como la determinación de la dosis idónea a administrar. 6. Estudio del efecto de la expresión diferencial de las isoformas del receptor de insulina en el hígado de los ratones iLIRKO referente al metabolismo glucí­ dico y en los mecanismos compensato­ rios a nivel pancreático. El hígado juega un papel central en el mantenimiento de la homeostasia glucídi­ ca por medio de la captación y producción de glucosa. Durante la etapa postpran­ dial, parte de la glucosa captada pasa a formar parte del glucógeno. Si se produ­ cen defectos en los mecanismos por los cuales la glucosa y la insulina regulan el metabolismo hepático del glucógeno, la homeostasia glucídica se rompe, lo cual se asocia con enfermedades metabóli­ cas como la diabetes tipo 2. Puesto que las isoformas del receptor de insulina podrían regular la homeostasia glucídica y la glucosa modifica el metabolismo celu­ lar mediante regulación alostérica y trans­ cripcional (von Wilamowitz-Moellendorff et al., 2013), centramos nuestro estudio en la vía de la síntesis de glucógeno. Así, los objetivos fundamentales que conciernen a este apartado fueron: 7. Determinación del glucógeno hepá­ tico y estudio de las vías de señaliza­ ción del metabolismo del glucógeno en ratones en función de la isoforma del receptor de insulina expresada, tanto en ratones como en hepatocitos neonata­ les, así como los mecanismos molecu­ lares implicados. Aunque todas las formas de la diabetes se caracterizan por una hiperglucemia incon­ trolada, otros parámetros hormonales se encuentran frecuentemente desregulados en esta enfermedad (Neubauer y Kulkar­ ni, 2006). La interacción entre la glucosa y el metabolismo lipídico no está caracte­ rizada totalmente. Además, el papel que juegan el IR y el IGF-IR en la dislipidemia asociada a la diabetes tipo 2 está poco explorado. Por tanto, el objetivo de este último apartado se centró en el estudio de los principales puntos clave que se des- regulan en el metabolismo lipídico en los ratones iLIRKO y DKO. 8. Estudio de los niveles de colesterol y triglicéridos circulantes y hepáticos en los ratones iLIRKO y DKO, así como el perfil lipoproteico correspondiente. 9. Estudio preliminar de los principa­ les genes implicados en la lipogénesis de novo y en el transporte reverso del colesterol en los ratones iLIRKO y DKO. 06/ materiales y métodos 79 1. TRABAJO CON MODELOS ANIMALES Para el desarrollo del trabajo in vivo de esta tesis se generaron dos modelos ani­ males. Por un lado, un modelo inducible para la deleción del receptor de insulina específicamente en hepatocitos, iLIRKO (inducible Liver Insulin Receptor Knoc­ kOut), y para ahondar en los estudios del papel del receptor de insulina en el meta­ bolismo hepático, se generó el ratón doble knockout para el IR e IGF-IR, iLIRIGFIRKO (inducible Liver Insulin Receptor and Insu­ lin-like Growth Factor I Receptor Knoc­ kOut), también inducible y específico para hepatocitos. A este último, para simplifi­ car, nos referiremos como DKO. Para ello se recurrió al sistema Cre-loxP, derivado del bacteriófago P1 (Sauer y Henderson, 1988), que permite la circularización y escisión del genoma de la secuencia flan­ queada por secuencias loxP, de manera tejido-específica al expresar la recombina­ sa Cre bajo promotores específicos (Gu et al., 1994). Los ratones InsrloxP/loxP se crea­ ron por recombinación homóloga para introducir secuencias loxP flanqueando el exón 4 del Insr convirtiéndolo en diana de la recombinasa (Brüning et al., 1998). Para que la deleción fuese hepato-específica, se utilizaron ratones transgénicos cuya recombinasa Cre-ERT2 está situada bajo el control del promotor de la albúmina (Alb), específico de hepatocitos (Schuler et al., 2004). Concretamente, la actividad indu­ cible por tamoxifeno de la recombinasa Cre-ERT2 se obtiene como resultado de la fusión de la Cre recombinasa y el dominio de unión triplemente mutado del receptor de estrógenos humano (ERα) (Metzger et al. 2011). Las crías Alb-Cre+/- InsrloxP/loxP o InsrloxP/loxP igf1rloxP/loxPAlb-Cre+/- se usaron como control. Para los estudios sólo se han utilizado ratones macho. Los animales fueron mantenidos en microaisladores de tipo II L (con 4 anima­ les como máximo en cada uno), en racks ventilados individualmente con ciclos de luz/oscuridad de 12 h, alimentación y bebida ad libitum desde el destete (realiza­ do a los 21 días). El estado microbiológico de los animales fue controlado sanitaria- mente siguiendo los criterios de FELASA (Federation of European Laboratory Ani­ mal Science Associations) y no se reveló la presencia de patógenos. El estado de salud de los animales se controló rutina­ riamente mediante análisis en animales centinelas. Todo el trabajo descrito en la presente tesis doctoral se realizó según las normas del Comité de Experimenta­ ción Animal de la Universidad Compluten­ se de Madrid. 1.1. CRÍA Y GENOTIPAJE DE ANIMALES 1.1.1. Mantenimiento del modelo iLIRKO El alelo Alb-Cre se mantuvo en heteroci­ gosis (Alb-Cre+/-) en hembras (Alb-Cre+/-, InsrloxP/loxP). Los alelos de Insr con el exón 4 flanqueado con secuencias loxP fue man­ tenido siempre en homocigosis (InsrloxP/ loxP). Para la obtención del modelo iLIRKO , InsrloxP/loxP)se cruzaron machos (Alb-Cre-/­ , InsrloxP/loxP), obte­con hembras (Alb-Cre+/­ niéndose un 50 % de animales Control (Alb-Cre-/-, InsrloxP/loxP) y un 50 % de ani­ , InsrloxP/loxP) segúnmales iLIRKO (Alb-Cre+/­ las leyes mendelianas. Para la obtención del modelo DKO fueron cruzados machos , InsrloxP/loxP(Alb-Cre-/- , igf1loxP/loxP)con hem­ InsrloxP/loxP igf1rloxP/loxP),bras (Alb-Cre+/-, , obteniéndose un 50 % de animales con­ , InsrloxP/loxP, igf1rloxP/loxP) y untrol (Alb-Cre-/­ , InsrloxP/50 % de animales DKO (Alb-Cre+/­ loxP , igf1rloxP/loxP). 1.1.2. Obtención de ADN de cola de ratón Un pequeño fragmento de la cola de rato­ nes de entre 3 y 4 semanas de edad se incubó en 300 μL de un tampón compues­ to por [Tris-HCl 10 mM, EDTA 100 mM, SDS 0.5 % (p/v), pH 7.4] y proteinasa K a 20 mg/mL (Life Technologies, Carlsbad, EE.UU.) durante toda la noche a 55 ºC. Al día siguiente, se extrajo el ADN con 300 μL de una mezcla de fenol, cloroformo e isoamilalcohol (25:24:1) y, tras agitación intensa seguida de centrifugación (4 ºC, 10 min, 15000 x g), se recogió la fracción superior. El ADN se precipitó por adición de 500 μL de etanol absoluto y se centrifu­ gó en dos pasos (5 min, 15000 × g, 4 ºC). El precipitado se dejó secar durante 5 min. A continuación, se resuspendió en 300 μL de ddH2O calentada a 65 ºC. 1.1.3. Genotipaje El genotipaje de los animales se realizó por PCR (ver sección 4.2) con 1 μL de la solución anterior (ver sección 1.2.2). Los primers y condiciones de PCR quedan recogidos en la Tabla 5. 1.2 GENERACIÓN DEL MODELO INDUCIBLE 1.2.1 Pruebas administración del tamoxifeno: vía enteral o vía parental. Uno de los usos del tamoxifeno en el labo­ ratorio es el de activar enzimas que posean dominios de unión a estrógenos, por ejem­ plo Cre-ERT2. El tamoxifeno es un análogo de los estrógenos que se une con mayor afinidad que éstos a los dominios de unión a estrógenos alterados (Tannour-Louet et al., 2002). Existen numerosas vías para la 81 administración de este compuesto a los ratones, cada una de ellas presenta venta­ jas e inconvenientes. Los métodos testa­ dos se resumen en la Tabla 6. Ya que en este caso una dosis precisa no es lo primordial y que los resultados obte­ nidos en cuanto a activación de la recom­ binasa son similares con dieta que con 4-OHT intraperitoneal (Andersson et al., 2010), la administración de tamoxifeno a través de la comida parece el protocolo menos agresivo para el animal. El tamoxifeno se administró a los ratones iLIRKO a partir de las 6 semanas de edad, siempre que hubiesen superado los 20 g de peso, según dos protocolos diferentes: 1.- Inyecciones intraperitoneales de la suspensión de tamoxifeno en aceite 100 μL (1 mg/día) durante (3 ó 5 días consecutivos o alternos). El tamoxifeno Gen Secuencia Producto Condiciones (Tm y ciclos) Alb-Cre S: 5’-ATTTGCCTGCATTACCGGTC-3’ Cre-ERT2 444 bp 57°C, 34 ciclos AS: 5’-ATCAACGTTTTGTTTTCGGA-3’ Igf1rloxP S: 5’-ATGAATGCTGGTGAGGGTTGTCTT-3’ loxP/loxP 310 bp 60°C, 34 ciclos AS: 5’-ATCTTGGAGTGGTGGGTCTGTTTC-3’ WT 250 bp InsrloxP S: 5’-CTGAATAGCTGAGACCACAG-3’ loxP/loxP 300bp 57°C, 34 ciclos AS: 5’-GATGTGCACCCCATGTCTG-3’ WT 270 bp Tabla 5. Primers utilizados para el genotipaje de los animales. Tabla 6. Ventajas e inconvenientes de diferentes métodos para la administración de tamoxifeno a ratones. Método de administración Pros-contras Inyección intraperitoneal Administración de una dosis controlada Menor tiempo de inducción Alto estrés para el animal Infecciones en la cavidad peritoneal Cánula intragástrica Dosis semicontrolada Alto estrés para el animal Necesaria alta experiencia Dieta Sin estrés para el animal La dosis depende de la ingesta Dieta poco apetitosa Mayor tiempo de inducción (T5648, Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE.UU.) base se disolvió en aceite de girasol (Sigma-Aldrich) y fue preparado mediante sonicación según lo descrito por (Kühbandner et al., 2000). 2.- Cánula intragástrica: tamoxifeno a 100 mg/mL en solución hidroalcohólica al 10 %. El tamoxifeno se disolvió en etanol absoluto hasta alcanzar una concentración de 1 mg/μL y se completó con solución salina filtrada (NaCl al 0,9 % en dH2O) hasta alcanzar la concentración final deseada. Para disolver bien el tamoxifeno, se utilizó el vortex durante el proceso de dilución y, posteriormente, se sonicó a baja intensidad durante 5 ciclos de 30 s con descanso de 30 s. La administración de tamoxifeno fue de 2 dosis de 20 mg seguida de 1 dosis de 10 mg, siempre en días alternos (Whitfield et al., 2015). 1.2.2. Esquema de dietas o esquema definitivo para la generación del modelo inducible Tras el destete a las tres semanas, los animales fueron alimentados durante dos semanas con dieta libre en soja (RMS­ 0909-US-EN-02-DS-2016, Harlan Teklad, Indianápolis, IN, EE.UU.) ad libitum para evitar la competencia entre los estróge­ nos propios del animal y el tamoxifeno por la unión al receptor de estrógenos acoplado a la recombinasa. Tras la dieta libre en soja, los ratones fueron alimen­ tados durante 2 semanas con dieta de tamoxifeno (TD.09327, Harlan Teklad) ad libitum para inducir la translocación de la recombinasa Cre al núcleo. Después de la dieta de tamoxifeno, los animales fueron alimentados con dieta estándar ad libi­ tum. Tanto los animales Control como los animales iLIRKO y los DKO fueron alimen­ tados según las condiciones descritas anteriormente. 1.3. TESTS METABÓLICOS in vivo 1.3.1. Test de tolerancia a glucosa Los animales se ayunaron toda la noche, durante 16 h aproximadamente. Se midió la glucemia en ayunas, punto 0, y se les administró, por inyección intraperitoneal, una dosis de glucosa de 2 g/kg de peso. La glucosa en sangre de la vena de la cola se midió a los 30, 60 y 120 min después de la inyección con glucómetro y tiras reactivas para la medición de la glucemia de Accu-Check (Roche, Penzberg, Alema­ nia). 1.3.2. Test de tolerancia a insulina Se realizó en animales sin ayunar a las 11 am. Se midió la glucemia en ayunas, punto 0, y se les administró, por inyección intra­ peritoneal, una dosis de insulina (Humulin regular, Eli Lilly, Indianápolis, IN, EE.UU.) de 1 U/kg de peso. La glucosa en sangre de la vena de la cola se midió a los 15, 30 y 60 min después de la inyección con glucó­ metro y tiras reactivas para la medición de la glucemia de Accu-Check (Roche, Penz­ berg, Alemania). Los resultados de los test de toleancia a insulina (ITT) se represen­ taron como porcentaje respecto a la con­ centración de glucosa inicial en sangre. 1.4. OBTENCIÓN DE PLASMA SANGUÍNEO Para la obtención del plasma, la sangre se extrajo bien con una jeringuilla ligera­ 83 mente bañada en enoxaparina sódica 60 mg (6000 UI), bien de la cola del ratón a un tubo eppendorf también ligeramente bañado enoxaparina sódica. La sangre se dejó sedimentar por gravedad en hielo durante 30 min y, posteriormente, se cen­ trifugó a 1500 rpm (con deceleración sin freno) durante 10 min y a 4 ºC. 1.5. SACRIFICIO DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN En todos los casos que se describen en la presente tesis, los animales fueron sacri­ ficados tras 24 h de ayuno seguidas de 1 h de realimentación. Los ratones fue­ ron sacrificados por dislocación cervical y desinfectados con etanol 70 % (v/v). El abdomen se abrió mediante incisión en forma de "V" desde el abdomen inferior extendiéndose hacia las porciones latera­ les del diafragma, con objeto de exponer todos los órganos de la cavidad perito­ neal. Los órganos recogidos se utilizaron bien para congelar directamente, bien para incluir en parafina. En los casos en los que se quería recoger un gran volu­ men de sangre, los animales se anestesia­ ron mediante inyección intraperitoneal de 2,2,2-tribromoetanol en 2-metil-2-buta­ nol y dH2O 1:40 (Sigma-Aldrich). Una vez alcanzada la ausencia del reflejo podal, la sangre se extrajo de la vena yugular. 2. CULTIVOS CELULARES 2.1. LÍNEAS CELULARES Y MEDIOS DE CULTIVO Las líneas de hepatocitos neonatales fue­ ron establecidas según el método previa­ mente descrito por Nevado et al., 2006. Todos los medios de cultivo y suplemen­ tos fueron obtenidos de Life Technologies, salvo excepciones indicadas. Los medios fueron suplementados con antibióticos: penicilina G (12 μg/mL), estreptomicina (10 μg/mL), anfotericina B (0.25 μg/mL) y MycoZap® (Lonza, Basilea, Suiza). Tanto los hepatocitos neonatales como las células HEK293T, utilizadas para la producción de partículas virales, fue­ ron cultivados en DMEM glucosa 4.5 g/L suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % y HEPES 20 mM, pH 7.4. 2.2. CONDICIONES DE CULTIVO, MANTENIMIENTO Y EXPERIMENTACIÓN 2.2.1. Condiciones de cultivo Las células se cultivaron en placas de poliestireno tratado para cultivo (Bec­ ton Dickinson, Franklin Lakes, EE.UU.) y mantuvieron en incubador a 37 ºC en una atmósfera controlada con alta humedad y CO2 al 5 %. Las células se subcultivaron tras lavado con PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 4.3 mM, KH2PO4 1.47 mM, pH 7.4) e incubación con una solu­ ción de tripsina 0.25 % y EDTA 0,02 % en PBS. La tripsina permite levantar las célu­ las adherentes de la placa al digerir pro­ teínas que mantienen a las células unidas entre sí y a la placa. La digestión se paró mediante adición de medio completo con suero. El subcultivo se realizó dos veces por semana. 2.2.2. Congelación, criopreservación y descongelación de líneas celulares Para congelar una línea celular, las células se tripsinizaron y, una vez parada la reac­ ción, se centrifugaron (3 min, 110 × g) para ser resuspendidas en FBS suplementado con dimetilsulfóxido 10 % (v/v) e introdu­ cidas en criotubos debidamente etiqueta­ dos (Thermo Fisher, Waltham, EE.UU.). El proceso de congelación fue llevado a cabo enfriando desde Tª ambiente hasta −80 ºC a un ritmo de -1 ºC/min. Para ello, los criotubos se colocaron sobre un soporte de polietileno bañado por isopropanol (Mr. Frosty, Thermo Fisher) que fue introduci­ do en un congelador a −80 ºC. Las célu­ las así congeladas pudieron mantenerse a −80 ºC durante meses. Para periodos más largos, los criotubos se transladaron a un tanque de nitrógeno líquido (−190 ºC). La descongelación fue realizada de forma rápida, pasando los viales directamente de −80 ºC o nitrógeno líquido a un baño a 37 ºC, con agitación manual. Una vez des­ congeladas, las células fueron sembradas en placas de cultivo con medio completo suplementado con FBS al 10 %. 2.2.3. Condiciones de experimentación Las células se sembraron el día anterior al comienzo del experimento. Las depri­ vaciones de suero y glucosa previas a los estímulos se realizaron durante 5 h en medio sin suero y con diferentes concen­ traciones de glucosa, según el experimen­ to. 2.2.3.1. Micoplasma Los efectos de la contaminación por micoplasmas en las líneas celulares sigue siendo uno de los mayores problemas encontrados en investigación con culti­ vos celulares. Esta contaminación puede producir grandes cambios en los cultivos que infecta (Russell et al., 1975). Por ello, todas las líneas fueron ensayadas para presencia de micoplasma tras su descon­ gelación y, de forma rutinaria, 1 ó 2 veces al mes. Para ello, el sobrenadante de célu­ las cultivadas durante al menos 48 h se recogió y analizó por PCR para comprobar la presencia de una secuencia específica de Mycoplasma sp. (S: 5’-GGCGAATGG­ GTGAGTAACACG-3’; AS: 5’-CGGATAAC­ GCTTGCGACCTATG-3’) 3. TÉCNICAS DE ADN RECOMBINANTE 3.1. CULTIVO DE BACTERIAS 3.1.1. Cultivo en placa de agar-LB Las bacterias se cultivaron en placas Petri con agar bacteriológico 1.5 % (p/v) en medio LB, Lysogeny (Luria-Bertani) broth: NaCl (10 g/L), triptona (10 g/L), extracto de levadura (5 g/L) (Bertani, 1951). El medio se autoclavó y enfrió hasta 55 ºC para la adición de ampicilina (100 μg/mL). Cada placa Petri porta 20-25 mL de medio LB sobre la cual, una vez solidificado, se sem­ braron las bacterias por estrías utilizando un asa de Kolle. Se dejaron crecer no más de 15 h, con el fin de evitar la aparición de colonias satélite en las placas de agar con ampicilina. Se trabajó en condiciones asépticas, en la proximidad de un meche­ ro Bunsen, con el que además se esterilizó el asa de Kolle. 3.1.2. Cultivo en LB líquido Todas las inoculaciones para la amplifica­ ción de plásmidos provinieron de colonias únicas seleccionadas de placas de agar 85 con antibiótico. Se inocularon primera­ mente en un volumen de 3,5 mL de LB con antibiótico (miniprep) y se crecieron en un incubador a 37 ºC en tubos de polipro­ pileno no cerrados herméticamente para permitir el intercambio de gases, con agi­ tación vigorosa (250 rpm) hasta la satura­ ción del cultivo (10-15 h). En los casos de interés, la miniprep se pasó directamente a un volumen de 100-200 mL de LB con antibiótico (maxiprep), y se cultivó en agi­ tación durante 15 h. 3.1.3. Congelación (glycerol-stock) El mantenimiento de las bacterias E. coli que expresaban las construcciones de interés en medio LB (glycerol-stock), se realizó a −80 ºC en criotubos que con­ tienen una mezcla de 500 μL de medio LB con 500 μL de una solución estéril de glicerol 50 % (v/v). Para recuperar las construcciones, se raspó la superficie del gycerol-stock con un asa de Kolle, sin lle­ gar a descongelarlo para ello, y se sembró en placas de agar. 3.2. PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS Y TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS Los plásmidos recombinantes que portan los virus adenoasociados recombinan- tes generados (AAV-AAT-IRA y AAV-AAT­ IRB) contienen el transgén del receptor de insulina humano, bien la isoforma A o isoforma B (Número de acceso de Gene- Bank NM_001079817.2 y NM_000208.3 respectivamente) bajo el control transcrip­ cional del promotor humano α1-antitrip­ sina (Vanrell et al.,2011; Zolotukhin et al., 1999). En el inserto se incluye una cola de 19 adeninas [poly(A)]. Para generarlos, los plásmidos pUC57-IRA-sPolyA y pUC57­ IRB-sPolyA, cedidos por el Dr. Ronald Kahn (Joslin Diabetes Center, Boston, EE.UU), se subclonaron dentro del p-AAV­ MCS. El cassette fue flanqueado por dos repeticiones terminales invertidas (ITR) pertenecientes a la forma wildtype del AAV de serotipo 2 (AAV2). Como control, INSR se reemplazó por el gen reportero lucife­ rasa, proveniente del plásmido pdLucFXR cedido por el Dr. Tomás Aragón (Centro de Investigación Médica Aplicada, Pamplona, España) (número de acceso a GenBank AY603759) o proteína verde fluorescente para generar AAV-AAT-luc y AAV-AAT-GFP, respectivamente. 3.2.1. Purificación de plásmidos Una vez que el crecimiento de las bacterias fue el adecuado, se procedió a la extrac­ ción del ADN con el Qiagen Maxi plasmid kit (Qiagen, Hilden, Alemania). Para ello, el contenido del matraz se pasó a tubos de centrífuga de 200 mL de capacidad que previamente habían sido lavados con etanol 70 % y tratados con luz ultraviole­ ta. Las bacterias se centrifugaron a 3.000 rpm (centrífuga refrigerada Sorvall móde­ lo RC-5, Sorvall, Dupont Inst., Alemania), durante 15 min, a 4 ºC. A partir de este momento se inició la fase de extracción del ADN plasmídico propiamente dicha, de acuerdo al método de la lisis alcalina descrita por (Sambrook et al., 1989) según las instrucciones del fabricante (Qiagen). El precipitado de bacterias se resuspen­ dió en 10 mL de la solución de resuspen­ sión que contenía 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 μg/mL ribonucleasa A. A continuación, se añadieron 10 mL de la solución de lisis (200 mM NaOH, SDS 1 %), se mezcló bien por inversión de los tubos y se dejaron en reposo durante 5 minu­ tos a temperatura ambiente para que se produjera la lisis alcalina de las bacterias. Seguidamente, se añadieron 10 mL de la solución de neutralización (3 M KOAc, pH 5.5), se mezcló rápidamente para evitar la precipitación del SDS e incubó en hielo 20 min. Posteriormente se centrifugó a 9000 rpm, durante 30 min a 4 ºC. El sobrena­ dante, que contenía el ADN plasmídico, se pasó a través de una columna de inter­ cambio aniónico, columna que contenía una resina de intercambio aniónico pre­ viamente equilibrada con tampón 750 mM NaCl, 50 mM MOPS, pH 7.0, 15 % iso­ propanol, 0.15 % Triton X-100. La resina de la columna (de carga positiva) retiene los ácidos nucleicos (de carga negativa). A continuación, la columna se lavó dos veces con un tampón que mantenía el pH (1.0 M NaCl, 50 mM MOPS, pH 7.0, 15 % isopropanol). Posteriormente se añadió un tampón de pH superior (1.25 M NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 8.5, 15 % isopropanol), el cual modifica la carga neta de la resina y permite la salida de los ácidos nucleicos. Para precipitar el ADN, al eluido se le aña­ dieron 0.7 volúmenes de isopropanol que se mezclaron por inversión y se dejaron precipitar a –20 ºC (durante varias horas). A continuación, los tubos se centrifuga­ ron a 15000 x g, durante 1 h, a 4 ºC. El sobrenadante se lavó con 2 mL de etanol al 75 % y se centrifugó de nuevo a 15000 x g, durante 10 min. El precipitado se dejó secar hasta que se hubo evaporado todo el etanol. Una vez seco, el precipitado se resuspendió en 400-600 μL de ddH2O calentada a 65 ºC y se procedió a su valo­ ración espectrofotométrica. El ADN plas­ mídico así obtenido se conservó a –20 ºC. 3.2.2. Transformación de bacterias Los vectores se transformaron en bacte­ rias E. coli cepa XL10-Gold® ultracompe­ tentes (Stratagene, San Diego, CA, EE.UU.) o One Shot® TOP10 electrocompetentes (Thermo Fisher). 100 μL de bacterias E. coli cepa XL10-Gold® ultracompetentes (Stra­ tagene) enriquecidas con 2-mercaptoeta­ nol 25 mM fueron transformadas con 3 μL de ADN (50-100 ng), mediante un pulso de calor a 42 ºC, siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, se enfria­ ron en hielo durante 5 min. Para aumentar la eficiencia de transformación, se añadie­ ron 250 μL de medio SOC (Sigma-Aldrich) (Hanahan, 1983) y se mantuvieron a 37 ºC, durante 1 h en agitación. Las células se sembraron con un asa de Drigalski en una placa de LB-agar con antibiótico. En el caso de E. coli One Shot® TOP10 electrocompetentes (Thermo Fisher), 100 μL de bacterias fueron transformadas con 3 μL de ADN (50-100 ng). Previamen­ te, el ADN plasmídico fue purificado con acetato sódico y etanol y resuspendido en ddH2O para eliminar restos de sales. La mezcla se introdujo en una cubeta de electroporación previamente enfriada en hielo. La electroporación se realizó a 1.8 kV - 25 μF y se añadieron 250 μL de medio SOC. La mezcla se transfirió a un tubo eppendorf y se mantuvo a 37 ºC durante 1 h en agitación. Al igual que en el caso anterior, las células se sembraron con un asa de Drigalski en una placa de LB-agar con antibiótico. 3.3. CLONAJE Y TRABAJO CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN 3.3.1 Digestión con enzimas Las enzimas de restricción fueron usa­ das de manera rutinaria para comprobar la correcta identidad de plásmidos ampli­ ficados y para la generación de los vec­ tores virales. Las enzimas de restricción utilizadas fueron AfeI, AflII, BamHI, BstXI, 87 EcoRI, HinCII, PmlI, PspOMI, XmaI (New England Biolabs, Ipswich, EE.UU.). 3.3.2. Precipitación del ADN plasmídico con acetato sódico y etanol En los casos en los que no fue posible la utilización de enzimas de digestión con tampones compatibles y el cambio de tampón era absolutamente necesario o previo paso a la transformación en bac­ terias electrocompetentes, el DNA plas­ mídico fue precipitado con una mezcla de acetato sódico 3 M pH 5.2 (0.1 volúme­ nes) y etanol absoluto (2.5 volúmenes). La mezcla se congeló a -80 ºC durante 1 h y se centrifugó a 14000 rpm durante 30 min. Posteriormente se lavó con etanol al 75 %, el precipitado se dejó secar y, final­ mente, se resuspendió en ddH2O para su posterior cuantificación. 3.3.3. Generación de extremos romos En algunos casos hubo que generar extre­ mos romos a partir de extremos cohesivos para que la ligación de plásmido e inserto fuese posible. En estos casos se recurrió al fragmento Klenow de la ADN polimerasa I (New England Biolabs), la cual mantiene la actividad polimerasa 5’→3’ y la exonu­ cleasa 3’→5’. Para ello se añade la enzima a la disolución y dNTP a 33 µM cada uno. Se calienta a 25 ºC durante 15 min. La reacción se para en hielo. Para inactivar la enzima completamente, se calienta a 75 ºC durante 20 min. 3.3.4. Defosforilación de los extremos del vector La fosfatasa alcalina intestinal de ternera, Calf Intestinal alkaline Phosphatase, (CIP) (New England Biolabs) cataliza la desfos­ forilación de forma no específica de los extremos 5' y 3' del ADN del vector de clonación. La eliminación de extremos fosforilados, impide la recircularización del ADN del plásmido linealizado durante la ligación. La enzima debe incubarse duran­ te 30 min a 37 ºC según las instrucciones del fabricante. 3.3.5. Purificación de bandas de geles de agarosa Las bandas de los geles de agarosa al 1 % con el ADN linearizado fueron cortadas en un transiluminador UV (Vilber Lourmat, TF-35M, Francia) y digeridas usando el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ADN fue eluido en 50 μL de ddH2O. La cuan­ tificación del inserto se realizó mediante valoración espectrofotométrica. El inserto una vez purificado se guardó a -20 ºC. 3.3.6. Ligación y cribado de colonias positivas Para la ligación se probaron diferentes proporciones de inserto y plásmido linea­ lizado (1:1, 1:4, 1:6). La ligación se realizó con la T4 DNA ligasa (New England Bio­ labs), siguiendo las instrucciones del fabri­ cante. La reacción de ligación se llevó a cabo durante toda la noche a 16 ºC y la posterior transformación en bacterias se realizó con 3 μL de la mezcla final. Se seleccionaron entre 10 y 20 colonias positivas por construcción, las cuales se amplificaron por miniprep. Todas las ino­ culaciones para la amplificación de plás­ midos provinieron de colonias únicas seleccionadas de placas de agar con anti­ biótico. Como primer paso, se inocularon en un volumen de 3.5 mL de LB con ampi­ cilina 100 μg/μL (miniprep) y se cultiva­ ron en un incubador a 37 ºC, en tubos de polipropileno no cerrados herméticamente para permitir el intercambio de gases, con agitación vigorosa (~250 rpm) hasta que se alcanzó la saturación del cultivo (10-15 h). La miniprep se realizó con 2 mL del cul­ tivo y según las instrucciones del fabrican­ te del kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). El ADN se utilizó para comprobar las colo­ nias, es decir, saber si habían incluido o no el vector de interés. El 1.5 mL restante se guardó a 4 ºC como preinóculo para la maxiprep (glycerol-stock). Los plásmidos de interés se amplificaron vertiendo direc­ tamente 1.5 mL proveniente de la mini­ prep, a un volumen de 100-200 mL de LB con antibiótico (maxiprep), el cual se culti­ vó en agitación durante 15 h. 3.3.7. Secuenciación Los plásmidos, obtenidos de diversas fuentes, fueron secuenciados rutinaria­ mente para comprobar su integridad y la presencia de mutaciones puntuales espe­ cíficas. Los plásmidos pBABE con los insertos AAT-IRA/B fueron secuenciados para comprobar que habían introducido la secuencia de forma correcta. Para su secuenciación se utilizaron 6 μL/reacción (100 ng ADN/μL) y 2 μL/reacción de pri­ mer a 5 pmol/μL, en un secuenciador ABI Prism 3730 (Life Technologies). 4. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA 4.1. AISLAMIENTO DE ARN DE LÍNEAS CELULARES Y TEJIDOS Se siguió el método de Chomczynski y Sacchi el cual consiste en la extracción de ARN con una mezcla de tiocianato de guanidinio, fenol y cloroformo (Chomc­ zynski y Sacchi, 1987). Las células se lavaron una vez con PBS frío, y en una campana extractora de gases, y sobre hielo, se añadió Trizol (Life Technologies) 170 μL por placa de 60 mm, con el fin de conseguir la lisis celular y solubilizar el ARN. Las muestras se homogeneizaron y se trasladaron a tubos eppendorf, a los que se añadieron 35 μL de cloroformo. Se agitaron las muestras con la ayuda de un agitador mecánico y se dejaron reposar 15 min en hielo para seguidamente centrifu­ garlos (15 min, 15000 × g, 4 ºC). Tras la centrifugación, se obtienen dos fases, la inferior, orgánica, contiene las proteínas y el ADN y la superior, acuosa, contiene el ARN, el cual se trasladó a un nuevo tubo eppendorf. El volumen obtenido con el ARN solubilizado se mezcla con un volu­ men igual de isopropanol, se agita por inversión y se mantiene a −20 ºC durante más de 1 h para la precipitación de los áci­ dos nucleicos. A continuación, se centri­ fuga durante 15 min a 15000 × g y a 4 ºC. El sobrenadante se elimina por inversión y el precipitado se lava con 1 mL de etanol frío al 70 % (v/v). Se vuelve a centrifugar y el precipitado de ARN se resuspende en 20 μL de ddH2O-dietilpirocarbonato 0.1 % (v/v). En al caso de la extracción de RNA de teji­ dos, los 200 mg de tejido se homogenei­ zaron en 1 mL de Trizol con Ultra-Turrax T10 basic (IKA, Stanfen, Alemania) a baja velocidad y durante, aproximadamente, 20 s en hielo. A continuación se siguió el mismo protocolo que con las células. 4.2. RT-PCR 4.2.1. Valoración de ácidos nucleicos El contenido de ácidos nucleicos se valora por una lectura espectrofotométrica doble 89 a 260 y 280 nm en cubeta de cuarzo. A 260 nm los ácidos nucleicos tienen un máximo de absorción, mientras que a 280 nm presentan un máximo los aminoácidos aromáticos de las proteínas. El ratio A260/ A280 da una idea del grado de contamina­ ción de las muestras con proteínas que, en condiciones óptimas, debe situarse entre 1.8 y 2. Para valorar el contenido de los ácidos nucleicos, hay que tener en cuen­ ta que cada unidad de densidad óptica a 260 nm se corresponde con 20 μg/mL de oligonucleótidos, 40 μg/mL para ARN de cadena sencilla y a 50 μg/mL para ADN. 4.2.2. Síntesis de ADNc por retrotranscripción Para eliminar posibles contaminaciones con ADN, se incubaron 2-3 μg de ARN con 10 U de ADNasa I (Roche) en un tampón de incubación (Tris-HCl 40 mM, NaCl 10 mM, MgCl2 6 mM, CaCl2 1 mM, pH 7.9) y 20 U de inhibidor de ARNasas, RNasin (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.) 30 min a 37 ºC. Posteriormente la ADNasa se inactivó por calor, 5 min a 95 ºC. Para la síntesis del ADNc, la solución resultante de la reacción anterior fue sometida a transcripción inversa con ayuda del High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies). Se utilizaron cebadores aleatorios, retrotranscriptasa (50 U/μL) e inhibidor de ARNasa (1 U/μL) según las instrucciones del fabricante. La solución se incubó durante 2 h a 37 ºC y, posteriormente, la retrotranscriptasa se inactivó por calor a 95 ºC durante 5 min. 4.2.3. PCR y electroforesis en geles de agarosa La PCR fue realizada a partir de ADN extraído de cola de ratón o bien de ADNc. Se usaron reactivos de Biotools, Madrid, España; salvo excepciones indicadas. Para la reacción se utilizó 1 μL de ADN en un volumen final de 25 μL compues­ to de tampón de reacción [Tris-HCl 75 mM, MgCl 2 mM, KCl 50 mM, (NH ) SO2 4 2 4 20 mM, pH 9.0], cebadores 0.2 μM (cada uno), dNTPs 0.2 mM (cada uno) y 1 U de ADN polimerasa. Las PCR se desarrollaron en un termoci­ clador Veriti 96-well (Life Technologies). En la etapa de hibridación, la tempera­ tura utilizada fue la temperatura de mel­ ting (Tm) teórica de los primers (ajustada por la concentración de sales y calculada con Primer-BLAST) restándole 5 ºC. Los primers utilizados están recogidos en la Tabla 7 en la que se especifica tanto la Tm como el número de ciclos. En los casos en los que fue posible se diseñaron primers tales que uno de la pareja hibridase con uniones exón-exón (específicos de ARNm maduros). El producto de la PCR se completó con un tampón de carga, concentración final [Tris-HCl, 1.7 mM, azul de bromofenol 0.005 % (p/v), xilano cianol 0.005 % (p/v), glicerol 10 % (v/v), EDTA 10 mM, pH 7.6], y fue resuelto mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1-3 % (p/v) en TAE (Tris-HCl 40 mM, ácido acético 20 mM y EDTA 1 mM, pH 8.0), suplementado con GelRed (Biotium, Hayward, EE.UU.) tras la disolución de la agarosa. La electrofore­ sis se llevó a cabo en tampón TAE. Como marcadores para electroforesis de ADN se utilizaron los siguientes: para PCR, Phi­ X174/HaeIII (Promega) y para plásmidos o fragmentos grandes 1 Kb Plus Ladder (Life Technologies). El resultado fue visua­ lizado mediante un transiluminador UV, y las imágenes captadas con una cámara CCD (charged coupled device), ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad, Hercules, EE.UU.). 4.2.4. PCR cuantitativa El contenido de ADNc obtenido a partir del ARN del hígado fue evaluado en un ABI Prism 7900 (Life Technologies) con primers específicos, recogidos en la Tablas 8 y 9, y SYBR Green PCR Master Mix (Life Tech­ nologies). La abundancia relativa de los ARNm fue calculada tomando el ARNm de β-actina como control invariante. Las medidas fueron realizadas por triplicado en las siguientes condiciones: 94 ºC 5 min 30 ºC (Tm) 60 s 72 ºC 25 s 80 ºC 10 s 4 ºC final 5. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS 5.1. EXTRACTOS PROTEICOS 5.1.1. Obtención de extractos proteicos Las células fueron lavadas 2 veces con PBS frío, colocadas sobre hielo y raspa­ das con 50-500 μL de tampón de lisis según el formato y densidad celular [Noni­ det-P40 1 % (v/v), Tris-HCl 50 mM, EDTA 5 mM, EGTA 5 mM, NaCl 150 mM, NaF 20 mM, pH 7.5] y añadidos extemporánea- mente PMSF 1 mM, aprotinina 10 μg/mL y leupeptina 2 μg/mL. El lisado se trasladó a tubos eppendorf y tras 5-10 min en hielo y un ligero agitado fueron centrifugados (15 min, 15000 × g, 4 ºC). Se recogió el sobrenadante con el lisado proteico, y se descartaron los restos celulares del pellet. 35 ciclos Gen Secuencia Producto Condiciones (Tm y ciclos) Insr (exón 4) S: 5‘-CTGTTCGGAACCTGATGAC-3’ IR 512 pb 58°C, 35 ciclos AS: 5’-ATACCAGAGCATAGGAG-3’ IRKO 363 pb Insr (exón 11) S: 5’-TAGGAAGACGTTTGAGGATT -3’ IRB 316 pb 58°C, 30 ciclos AS: 5’-CACCGTCACATTCCCAACAT-3’ IRA 280 pb Tabla 7. Primers utilizados para RT-PCR. Tabla 8. Primers utilizados para Q-PCR. Tabla 9. Primers utilizados para la secuenciación de los vectores AAV-AAT-IRA y AAV-AAT-IRB. Gen Secuencia Insr (intrón-exón) S: 5‘-CGTACCCCGATTCAGGTGAT-3’ AS: 5’-TTGAGCAGAAGAGCTGCTACGT-3’ Actb S: 5’-CGCCACCAGTTCGCCATGGA-3’ AS: 5’-TACAGCCCGGGGAGCATCGT-3’ Gen Secuencia Serpina1 5’-CCCTGTTTGCTCCTCCGATAA-3’ INSRA/B 5’-CGCATCGAGAAGAACAATGAGC-3’ 5’-CAACATTCGAGGAGGCAACAATC-3’ 5’-CCCACTACCTGGTTTTCTGG-3’ 5’-CAATGGTCTGATCGTGCTGT-3’ 5’-CTACCCTTCAAGAGATGATTC-3’ 91 Los hígados y riñones usados para Wes­ tern blot e inmunoprecipitaciones se cor­ taron en trozos de aproximadamente 200 mg y se lavaron 3 veces con PBS frío 1X para eliminar contaminantes externos, principalmente sangre, y se centrifugaron (2 min, 290 × g, 4 ºC). La homogenización del tejido se llevó a cabo con Ultra-Turrax T10 basic (IKA, Stanfen, Alemania) a baja velocidad y durante, aproximadamente, 20 s en hielo y en el tampón de lisis ya descri­ to. Los extractos fueron centrifugados (15 min, 15000 × g, 4 ºC) y el sobrenadante se traspasó a nuevos tubos eppendorf. 5.1.2. Valoración de proteínas Las proteínas se determinaron por el método de Bradford (Bradford, 1976). Este ensayo se basa en la observación del cambio de absorbancia (de 465 a 595 nm) que se produce cuando se añaden proteínas a una solución ácida de Coomassie Brilliant Blue G-250. Las interacciones hidrofóbicas e iónicas producidas por aminoácidos básicos (principalmente arginina) estabilizan la forma aniónica del reactivo indicador, causando un cambio de color visible. Como control, se prepara una curva de calibrado de 0-10 μg/mL a partir de una solución estándar de BSA de 2 mg/mL (Bio-Rad). Para el ensayo se cuantifica la absorbancia a 595 nm de una mezcla de 2 μL de la muestra a analizar en 1 mL de la solución de Bradford (Bio-Rad) diluida en ddH2O (1:5). 5.2. WESTERN BLOT 5.2.1. Preparación de muestras para electroforesis Las muestras se prepararon a igual con­ centración 1 μg/μL de proteína total, dilu­ yendo en tampón de lisis, en un volumen total determinado el cual incluye también tampón de Laemmli concentrado (Laem­ mli, 1970) para una concentración final [Tris-HCl 100 mM, glicerol 5 % (v/v), SDS 2 % (p/v), 2-mercaptoetanol 1 % (v/v), azul de bromofenol 0,004 % (p/v), pH 6.8]. Las muestras se desnaturalizaron (5 min, 95 ºC). Se cargaron entre 10-50 μg de muestra por pocillo en geles de SDS-PA­ GE (sodium dodecyl sulfate polyacryla­ mide gel electrophoresis). En cada gel se cargó también un estándar de marcador del peso molecular Precision Plus Protein Standards All Blue (Bio-Rad). 5.2.2. Electroforesis en geles de SDS-PAGE El fraccionamiento del componente pro­ teico de los extractos celulares, se realizó por electroforesis en geles discontinuos de SDS-PAGE, según el método descrito por Laemmli (Laemmli, 1970), empleando un equipo de electroforesis Miniprotean II o TetraSystem (Bio-Rad). Se prepararon geles con dos zonas de diferente concentración de poliacrilamida: 4 % para el gel superior concentrante y entre 6-15 % para el gel inferior separa­ dor. El primero, que contiene los pocillos de depósito de muestras, sirve para con­ centrar y alinear las muestras; el segundo, para separar las proteínas según su peso molecular. La concentración de poliacrila­ mida final en el gel utilizada varió en fun­ ción del peso molecular de las proteínas a analizar. Los geles contienen: solución al 30 % que contiene acrilamida y bis-acrila­ mida en proporción 29:1 (Bio-Rad); SDS, que confiere a las proteínas una carga negativa uniforme, Tris-HCl pH 8.8 en el gel separador y pH 6.8 en el concentran- te; persulfato amónico y TEMED (Panreac, Barcelona, España), que catalizan la poli­ merización del gel. Las proporciones de los diferentes componentes varían según el tipo de gel. Para el desarrollo de la electroforesis se utilizó el siguiente tampón: Tris-base 25 mM, glicina 190 mM y SDS 0.1 % (p/v), pH 8.3, con una fuente Powerpac HC de Bio-Rad, a un voltaje constante de 80 V para el gel concentrante y de 110-150 V para el gel separador durante 1.5-2 horas. 5.2.3. Transferencia a membranas de PVDF Una vez finalizada la separación de proteí­ nas, éstas se transfirieron de los geles de SDS-PAGE a membranas de PVDF (poli­ fluoruro de vinilideno) Immobilon-P 0.45 μm (Merck Millipore, Billerica, EE.UU.). Previo a la transferencia, las membranas de PVDF, altamente hidrofóbicas, se acti­ varon por un breve paso por metanol y se mantuvieron en tampón de transferencia. El gel se colocó sobre la membrana de PVDF y, el conjunto, entre 2 capas de papel Whatman y 2 almohadillas. El sistema se introdujo en una carcasa, de tal forma que las proteínas migraran hacia el polo positivo. El tampón de transferencia usado fue 25 mM Tris, 192 mM glicocola, metanol 20 % (v/v). La electrotransferencia fue llevada a cabo con el equipo Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad), con un voltaje constante de 100 V y una resistencia inicial de 350 mA, durante 1 h y en frío. 5.2.4. Bloqueo e incubación con anticuerpos Finalizada la transferencia, se bloquearon los sitios de unión inespecíficos a proteí­ nas. Para ello, las membranas se incu­ baron durante 1 h, a Tª ambiente y con agitación suave, en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5) más Tween-20 0.05 % (v/v) (TTBS); suplementado con 5 % (p/v) de leche en polvo desnatada o BSA al 3 % (p/v), según el anticuerpo de interés con el que se fuese a incubar posterior­ mente. Generalmente, si se iba a incubar con anticuerpos fosfo-específicos, las membranas se bloqueaban con BSA, ya que la leche en polvo contiene grandes cantidades de fosfo-proteínas como la caseína. Posteriormente, se retiró la solución de bloqueo y se incubó con el anticuerpo pri­ mario diluido en TTBS hasta el día siguien­ te a 4 ºC y con agitación suave. Algunos anticuerpos fueron incubados en solución de bloqueo para reducir el fondo que mos­ traban durante el revelado. En la Tabla 10 se especifican los anticuerpos utilizados y sus diluciones. Al día siguiente, la membrana se lavó 3 veces con TTBS durante 30 min en agi­ tación fuerte. Tras los lavados, se incubó con el anticuerpo secundario frente a la fracción constante de la especie corres­ pondiente en la que se hubiese genera­ do el anticuerpo primario, preparado en una solución de TTBS durante 1 h, a Tª ambiente y con agitación suave. Final­ mente, se volvió a lavar con TTBS otras 3 veces durante, aproximadamente, 30 min y con agitación fuerte. 5.2.5. Detección de anticuerpos por quimioluminiscencia Para detectar los anticuerpos secunda­ rios, los cuales están conjugados a peroxi­ dasa de rábano (HRP), las membranas se incubaron con reactivos de quimioluminis­ cencia (Tabla 11). La detección se basa en 93 Anticuerpo Casa comercial Origen Dilución Uso Apo A Abcam, ab7613 IgG rabbit 1:1000 WB Apo B Abcam, ab20737 IgG rabbit 1:1000 WB Apo E Abcam, ab1906 IgG rabbit 1:1000 WB β-actina (AC-74) Sigma-Aldrich, A2228 IgG mouse 1:5000 WB GCK Santa Cruz, sc-7908 IgG rabbit 1:500 WB GFP Santa Cruz, sc-8334 IgG rabbit 1:100 IF GLUT1 Millipore, 07-1401 IgG rabbit 1:500 WB GLUT2 Santa Cruz, sc-7580 IgG goat 1:500 IP GLUT2 Santa Cruz, sc-9117 IgG rabbit 1:500 WB GSK3α/β Cell Signaling, #5676 IgG rabbit 1:1000 WB P-GSK3α/β (Ser21/9) Cell Signaling, #9331 IgG rabbit 1:1000 WB GYS2 Cell Signaling, #3893 IgG rabbit 1:1000 WB p-GYS2 (Ser641/645) Millipore, #07-817 IgG rabbit 1:1000 WB IGF-I Santa Cruz, sc-9013 IgG rabbit 1:200 WB IGF-II Santa Cruz, sc-7435 IgG rabbit 1:200 WB IGF-IRβ Santa Cruz, sc-713 IgG rabbit 1:500 WB Insulina Dako, A0564 IgG guinea pig 1:100 IH, IF IR (cadena β) Santa Cruz, sc-711 IgG rabbit 1:1000 WB IRS1 Millipore, #06-248 IgG rabbit 1:500 WB IRS2 Millipore, #06-506 IgG rabbit 1:500 WB KI-67 Dako, M7240 IgG mouse 1:200 IH p44/p42 MAPK Cell Signaling, #9102 IgG rabbit 1:1000 WB p-p44/p42 MAPK (Thr202/ Tyr204) Cell Signaling, #9101 IgG rabbit 1:1000 WB p70S6K Cell Signaling, #2972 IgG rabbit 1:1000 WB p-p70S6K (Thr389) Cell Signaling, #2971 IgG rabbit 1:1000 WB PCNA Santa Cruz, sc-56 IgG mouse 1:100 IF PKB Cell Signaling, #9272 IgG rabbit 1:1000 WB p-PKB (Ser473) Cell Signaling, #9271 IgG rabbit 1:1000 WB p-Tyr Millipore, 05-947 IgG rabbit 1:500 WB, IP PYGL Acris, bs-5011R IgG rabbit 1:1000 WB p-PYGL Universidad de Dundee IgG rabbit 1:1000 WB SRB1 Abcam, ab52629 IgG rabbit 1:1000 WB Tabla 10. Listado de anticuerpos primarios. WB: Western blot, IF: Inmunofluorescencia, IH: Inmunohistoquímica, IP: inmunoprecipitación la reacción catalizada por la HRP, es decir, en la oxidación del luminol en presencia de H2O2 y un catalizador a 3-aminoftala­ to, el cual decae a su estado fundamental emitiendo luz visible (432 nm). Como reac­ tivos se usaron ECL Plus Western Blotting Detection (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) o bien Western Lighting ECL Plus (Perkin Elmer, Waltham, EE.UU.), según las instrucciones del fabricante. Para fijar la señal, se utilizaron las placas de autorradiografía Hyperfilm-ECL (GE Healthcare) y un aparato revelador CURIX 60 (Agfa, Mortsel, Bélgica). Los films fue­ ron posteriormente digitalizados con un escáner. Alternativamente, se utilizó ChemiDoc XRS+ y el reactivo Immun-Star WesternC (Bio-Rad), un sistema de detección de quimioluminiscencia por cámara CCD, el cual permite la digitalización directa de los resultados. 5.2.6. Borrado de membranas de PVDF El borrado de la membrana se realizó para poder ver proteínas totales tras haber revelado con anticuerpos fosfoespecífi­ cos. Este proceso consiste en eliminar el anticuerpo primario y secundario unido a la membrana y dejar libres los epítopos para una nueva hibridación. Para ello, las membranas de PVDF se incubaron con un tampón de borrado (Tris-HCl 62.5 mM, SDS 0.5 % y 2-mercaptoetanol 100 mM, pH 6.8) durante 20 min a 55 ºC. Posterior­ mente se lavaron varias veces en TTBS antes de ser incubadas con un nuevo anti­ cuerpo. 5.3. INMUNOPRECIPITACIÓN Esta técnica tiene como finalidad la sepa­ ración de una proteína específica de un extracto de proteínas totales. Una vez realizada la separación, se puede emplear para determinar la actividad enzimática si la proteína aislada es una enzima o bien para detectar posibles interacciones con otras proteínas presentes en la célula. Para las inmunoprecipitaciones se utiliza­ ron los extractos proteicos obtenidos de la manera antes descrita. Se prepararon Anticuerpo Casa comercial Conjugado Dilución Uso Sheep anti-rabbit GE Healthcare NA931V HRP 1:5000 WB Sheep anti-mouse GE Healthcare NA934V HRP 1:5000 WB Rabbit anti-guinea pig Abcam, ab-6771 HRP 1:200 IH Goat anti-mouse Dako, P0447 HRP 1:200 IH Donkey anti-guinea pig Jackson (706605148) Alexa Fluor 647 1:200 IF Donkey anti-rabbit Jackson (711545152) Alexa Fluor 488 1:200 IF Donkey anti-mouse Jackson (715095150) FITC 1:200 IF Tabla 11. Listado de anticuerpos secundarios. WB: Western blot, IH: inmunohistoquímica, IF: inmunofluorescencia 95 alícuotas de extractos totales que con­ tenían entre 200-1000 μg de proteína (la misma cantidad de proteína total en todas las muestras a analizar en un mismo expe­ rimento) en un volumen final de 600-800 μL ajustado con tampón de lisis. A cada muestra se le añadió el anticuerpo corres­ pondiente para inmunoprecipitar (1-2 μg de anticuerpo por cada 1 mg de proteína) y se incubaron en rotación durante toda la noche a 4 ºC. Al día siguiente, para poder recuperar toda la proteína unida al anticuerpo, se aña­ dió al extracto proteico 20-30 μL de una mezcla de proteína A o proteína G-agaro­ sa (Roche) preparada en tampón de lisis (1:1, previamente lavada varias veces con el tampón) y se incubó 2 h a 4 ºC en rota­ ción. La proteína A/G se une a las IgG por la fracción constante y, al estar conjugada con bolas de agarosa, sedimentan rápida­ mente y se pueden separar del resto del sobrenadante, el cual contiene las proteí­ nas que no han sido reconocidas por el anticuerpo utilizado durante la inmunopre­ cipitación. A continuación, se centrifugaron a 13.000 rpm durante 15 s para separar los inmu­ nocomplejos de la fracción líquida. La fase sedimentada, que contiene las bolas de agarosa, se lavó varias veces con 500 μL de tampón de lisis y, en el último lava­ do, se retiró el máximo posible de sobre­ nadante y se añadió tampón de Laemmli. Las muestras ya preparadas se hirvieron durante 5 min a 95 ºC, para eliminar unio­ nes entre proteínas, y se sometieron a un golpe de centrífuga. Los sobrenadantes se cargaron en geles de SDS-PAGE para su detección por WB. Los anticuerpos uti­ lizados se especifican en las Tablas 10 y 11. 6. INMUNOHISTOQUÍMICA E INMUNOFLUORESCENCIA DE SECCIONES PANCREÁTICAS Y HEPÁTICAS 6.1. PREPARACIÓN DE LOS TEJIDOS PARA LAS TINCIONES 6.1.1. Fijación de tejidos y obtención de cortes Los animales fueron sacrificados como se describe en la sección 1.6. Los páncreas fueron sacados de una pieza, lavados en PBS y fijados en formaldehído al 4 % durante toda la noche. De los hígados, sólo una porción fue fijada en formalde­ hído. Al día siguiente, los tejidos se lava­ ron en etanol al 70 % para precipitar las sales formadas por el tampón en el que se encuentra el formaldehído. El tejido se incluyó en bloques de parafina según el protocolo estándar. La fijación del tejido se consiguió mediante su deshidratación en alcoholes de gradación creciente hasta alcohol de 100°. Posteriormente, el tejido se transfirió a xileno, miscible tanto con el alcohol de 100° como con la parafina. Por último se pasó el tejido a parafina previa­ mente licuada en una estufa regulada a 42 ºC. Se dieron tres pasos por parafina líquida para favorecer una completa sus­ titución del líquido intermediario por para­ fina. Tras la parafinización completa de la muestra, la parafina líquida se vertió en un molde en el que se introdujo la muestra y se dejó solidificar a temperatura ambiente. Los bloques de parafina fueron conserva­ dos a 4 ºC. Los bloques de parafina pertenecientes a los páncreas, previamente enfriados, fueron procesados con un microtomo MICROM HM325 (Thermo) obteniéndose cortes de 5 μm que fueron depositados en la superficie de un baño de agua a 55 ºC para su completa extensión y, seguida­ mente, colocados sobre los portaobjetos. Se obtuvieron alrededor de 10 cortes por cada región del bloque. Las secciones se establecieron en intervalos fijos, es decir, para acceder a la siguiente región se des­ cartaron 72 cortes. En total se obtuvieron cortes de 5-6 regiones por páncreas, lo cual posibilitó la aproximación estereoló­ gica para el cálculo de masa de célula β. En el caso de los hígados, siguiendo el mismo protocolo que con los páncreas, sólo se fijó un fragmento del tejido. Se rea­ lizaron cortes de 7 μm para las tinciones de hematoxilina y eosina y de 5 μm para las inmunofluorescencias. 6.1.2. Desparafinización e hidratación de cortes Para eliminar el medio de inclusión, los portaobjetos con los cortes se introduje­ ron en xilol (2 incubaciones de 10 min), a continuación en etanol absoluto (2 incu­ baciones de 2 min) y, por último, en una serie de etanoles a concentración decre­ ciente 90, 80, 70 % (v/v), 1 min por cada solución. Seguidamente, los portaobjetos fueron lavados extensivamente con agua corriente. Posteriormente, en los casos es los que se fuese a realizar un inmunomar­ caje, el tejido se rodeó con un rotulador hidrófobo (pap-pen). 6.2. TINCIÓN CON HEMATOXI­ LINA Y EOSINA Una vez desparafinado el tejido, se tiñen las estructuras ácidas con hematoxilina durante 15 min. Se realizan 3 lavados de 5 min en H2O y se tiñen las estructuras básicas con eosina durante 10 segundos. A continuación se deshidratan y montan en DPX. 6.3. INMUNOFLUORESCENCIA EN SECCIONES PANCREÁTICAS O HEPÁTICAS Las secciones se colocaron en una cáma­ ra húmeda y se bloquearon con BSA 4 % (p/v) en PBS a Tª ambiente durante 1 h. En el caso de las secciones pancreáticas, se incubaron con anticuerpo anti-insulina (Dako, Glostrup, Dinamarca) y anticuer­ po anti-PCNA F2 (Santa Cruz, Dallas, TX, EE.UU.) diluido en 4 % BSA (p/v) en PBS a 4 ºC durante toda la noche (Tabla 10). Al día siguiente, se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron con anticuerpo secunda­ rio FITC anti-ratón y Alexa 647 anti-co­ baya (Jackson ImmunoResearch, West Groove, EE.UU.) a Tª ambiente durante 1 h (Tabla 11). Las secciones fueron lavadas de nuevo en PBS e incubadas con DAPI (1:1000) a Tª ambiente durante 10 s. Las preparaciones se montaron con medio de montaje Mowiol (Idibi, Martinsried, Ale­ mania) y fueron observadas en el periodo de una semana. El cálculo de células β en proliferación se expresa como porcentaje de células β PCNA positivas. Se contaron al menos 1500 células β por páncreas. En el caso de las inmunofluorescencias de GFP en las secciones hepáticas y pan­ creáticas, el proceso básico fue el mismo, pero fueron incubadas con un solo anti­ cuerpo primario, anti GFP (Santa Cruz), y su correspondiente secundario, Alexa 488 anti-conejo (Jackson ImmunoResearch) (Tablas 10 y 11). 97 En todos los casos se realizaron controles positivos y negativos para descartar ines­ pecificidades, descontar el ruido de fondo y calibrar los láseres. Para la toma de imágenes se utilizó un microscopio de fluorescencia semi-auto­ mático Biozero BZ-8000 (Keyence, Osaka, Japón). 6.4 INMUNOHISTOQUÍMICA EN SECCIONES HEPÁTICAS Y PANCREÁTICAS Las secciones se incubaron durante 10 min en una solución de H2O2 al 3 % (v/v) con el fin de bloquear las peroxidasas endógenas. Posteriormente se lavaron 2 veces con ddH2O y se bloquearon con BSA al 4 % (p/v) en PBS a Tª ambiente durante 1 h y en cámara húmeda. Segui­ damente, la solución de bloqueo se reem­ plazó por anticuerpo primario anti-insulina en el caso del páncreas o Ki-67 en el caso del hígado (Dako) diluido en BSA al 4 % (p/v) en PBS (Tabla 10). Las preparaciones se incubaron a 4 ºC durante toda la noche. Al día siguiente, las secciones se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron con anti­ cuerpo secundario anti-cobaya o anti-ra­ tón conjugado con peroxidasa (Abcam, Dako respectivamente) diluido en BSA al 4 % (p/v) en PBS a Tª ambiente durante 1 h (Tabla 11). Las secciones fueron lava­ das de nuevo en PBS antes de proceder al desarrollo de la imagen mediante el uso de 3,3’-diaminobenzidina en solución de cromógeno (Dako) siguiendo las instruc­ ciones del fabricante. La 3,3’-diamino­ benzidina forma un precipitado marrón local al oxidarse en presencia de H2O2 y peroxidasa. La reacción se para a los 2-5 min bajo el microscopio, introduciendo las preparaciones en H2O. Posteriormente, las secciones se contratiñen con una solución de hematoxilina y se lavan con H2O. Tras su deshidratación, se montaron en medio DPX. Durante el proceso, se realizaron al mismo tiempo tanto controles negativos como positivos. 7. OBTENCIÓN DE PARTÍCULAS VIRALES 7.1. PRODUCCIÓN DE PARTÍCULAS VIRALES Para obtener las partículas virales se utilizaron las células empaquetadoras HEK293T (Dharmacon, Lafayette, EE.UU.). La línea HEK293T deriva de la HEK293 (Human embryonic kidney). T significa que expresan al antígeno T del SV40 (Simian Vacuolating Virus 40) que está implicado en la replicación del genoma viral y es capaz de aumentar la replicación del plás­ mido en las células transfectadas, obte­ niéndose de este modo títulos más altos que si se transfectase en células HEK293. Estas células se transfectaron con el vec­ tor de interés rAAV junto con el vector de expresión pDG8, el cual contiene elemen­ tos críticos para el empaquetamiento de los rAAV como los genes rep2, que codi­ fica para las proteínas de replicación, y cap8, responsable del empaquetamiento del genoma viral en la cápside de serotipo 8; y los genes E2A y E4 del adenovirus 5 implicados en la replicación y transcrip­ ción viral respectivamente (Grimm et al., 2003). Se sembraron, aproximadamente, 9 × 106 células por placa de 150 mm en medio DMEM completo enriquecido con FBS al 10 %. Al día siguiente, una vez alcanzado un 60-70 % de confluencia, se cambia el medio por DEMEN completo enriquecido con FBS al 2 %. Siguiendo las recomendaciones del grupo del Dr Mulligan, el ADN se introdujo en las células HEK293T por medio de transfección con polietilenimina (PEI), un polímero catiónico estable (Boussif et al., 1995). El PEI condensa el ADN en partículas cargadas positivamente que se une a superficies aniónicas de la célula. En consecuencia, los complejos ADN:PEI son endocitados por las células y el ADN se libera en el citoplasma (Sonawane et al., 2003). Las células se transfectaron con los complejos DNA:PEI formados por una mezcla de plásmidos, 20 μg del plásmido pro-AAV y 55 μg del plásmido pDP8.ape (Plasmid Factory GmbH & Co. KG, Bielefeld, Alemania) y PEI 25 kDa (Polysciences, Warrington, PS, EE.UU.) diluido en suero fisiológico y previamente incubados a Tª ambiente durante 30 min (Vanrell et al.,2011). Como control positivo para confirmar que la transfección se había producido y poder calcular además su eficiencia, se transfectó con el plásmido AAV-GFP ya que resulta muy fácil su monitorización. Se consideraron condiciones óptimas cuando se alcanzaba, en 2 días, al menos un 80 % de eficiencia de transfección. Las células se mantuvieron a 37 ºC y, 72 h después de la transfección, se rasparon las células con una espátula y se centrifu­ garon a 3000 rpm durante 15 min. El preci­ pitado se resuspendió en 7 mL de tampón de lisis (Tris 0.5 M, NaCl 1.5 M, MgCl2 20 mM, Triton X-100 al 1 %, pH 8.5). El sobre­ nadante se incubó con polietilenglicol (PEG) (Sigma-Aldrich) al 8 % preparado en NaCl 2.5 M durante 72 h a 4 ºC. Trans­ currido este tiempo, se centrifugó a 2500 rpm durante 20 min a 4 ºC. El precipitado obtenido se resuspendió en 7 mL del tam­ pón de lisis mencionado anteriormente. La purificación de sobrenadante y preci­ pitado se realizó por separado. Los 7 mL de sobrenadante o precipitado obtenidos se sometieron a 3 ciclos de congelación/ descongelación para liberar los virus del interior de las células, y se centrifugaron a 2500 rpm durante 15 min a 4 ºC. El sobre­ nadante se trató con nucleasas a 50 U/ mL, Benzonase® (Sigma-Aldrich) durante 1 h a 37 ºC. Posteriormente se centrifugó a 2500 rpm durante 10 min. Los virus fue­ ron purificados a partir del sobrenadante obtenido tras esta centrifugación. 7.1.1. Purificación de las partículas virales La purificación de las partículas virales se realizó con gradientes de iodixanol (Opti- Prep™ Density Gradient Medium, Sig­ ma-Aldrich) según el método descrito por Zolotukhin et al. 1999. Las soluciones de iodixanol se prepararon según los siguien­ tes porcentajes: • 17 % (p/v) iodixanol en PBS-MK (MgCl2 1 M, KCl 2.5 M en PBS, pH 7.4) con NaCl 5 M. • 25 % (p/v) iodixanol en PBS-MK con rojo fenol 0.01 μg/μL. • 40 % (p/v) iodixanol en PBS-MK. • 60 % (p/v) iodixanol en PBS con rojo fenol 0.01 μg/ μL. El NaCl 5 M incluido en la solución de iodixanol al 17 % previene la agregación de los rAAV con proteínas y permite que se puedan aislar como solo una banda inclui­ da en la capa de iodixanol al 40 %. El rojo fenol debe ir incluido en capas alternas del gradiente para facilitar la visualización de las bandas del gradiente. 99 Se centrifugó a 69000 rpm, a 16 °C duran­ te 2 h (rotor 70.Ti, Beckman). Se utilizó un programa de aceleración y deceleración lenta (hasta y por debajo de 2000 rpm). Se introdujo una jeringa de 1.2 mm en la interfase de los gradientes 40-60 % para aspirar aproximadamente 4 mL de la capa de la solución al 40 % de iodixanol (frac­ ción transparente entre dos fases colorea­ das). La Figura 21 ilustra de los gradientes de iodixanol antes y después de la centri­ fugación. Figura 21. Ilustración de los gradientes de iodixanol antes y después de la centrifugación. Los rAAV se aislaron de la interfase situada entre los porcentajes 40-60 con una jeringa. Para facilitar la extracción, se realizó un agujero también en la parte superior. Modificado de Grieger et al., 2006. La fracción viral recogida se concentró por ultracentrifugación con tubos Amicon Ultra-15 (Merck Millipore), que contienen membranas PLHK Ultracel-PL, con un límite de hasta 100 kDa. Para ello, la frac­ ción viral recogida se lavó con PBS con sacarosa al 5 % y se centrifugó a 4000 rpm a 16 °C durante 15 min. El rAAV se concentró en un volumen final de apro­ ximadamente 1 mL, del cual, 20 μL, se destinaron a la titulación de las partículas virales y, el volumen restante, fue conser­ vado a -80 °C en alícuotas de 200 μL. 7.2. TITULACIÓN DE LAS PARTÍCULAS VIRALES El aislamiento de los ácidos nucleicos virales se realizó utilizando el High pure viral nucleic acid kit (Roche) según las instrucciones del fabricante. 20 μL del rAAV se completaron con suero fisiológico hasta alcanzar un volumen final de 200 μL. A la mezcla se añadieron 200 μL de binding buffer (guanidina-HCl 6 M, Tris- HCl 10 mM, Triton X-100 (p/v) al 20 %, pH 4.4 suplementado con poli-A a 1 mg/ mL) y 50 μL de proteinasa K 20 mg/mL en ddH2O. Se incubó a 72 °C durante 10 min. Posteriormente se añadieron 100 μL de binding buffer y se centrifugó a 8000 x g durante 1 min. Al tubo de polipropileno se le añadieron 500 μL del inhibitor removal buffer (guanidina-HCl 5 M, Tris- HCl 20 mM, etanol absoluto al 36 %, pH 6.4) y se centrifugó a 8000 x g durante 1 min. Se hicieron 2 lavados con 450 μL de wash buffer (NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, etanol absoluto al 80 %, pH 7.5). Se centrifugó una última vez en seco a 13000 x g durante 10 s y se eluyó con 50 μL de ddH2O centrifugando a 8000 x g durante 1 min. Los primers de la Q-PCR hibridan con el promotor α1-antitripsina. Los resultados obtenidos por Real-time Q-PCR se estan­ darizaron con el ADN plasmídico también contenido en los rAAV, con cinco muestras estándar entre 103-1010 copias por reac­ ción. Se probaron 4 diluciones (1-, 10-, 100-, 1000-veces diluidas) de cada mues­ tra de Q-PCR. Se ensayaron 2 μL tanto de cada estándar como de cada muestra por triplicado, con primers a 0.3 μM cada uno, en un volumen total de reacción de 20 μL con 10 μL de SYBR Green PCR Mas- ter Mix (Life Technologies). La Q-PCR se desarrolló en un StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied) y en las siguientes condiciones: 95 ºC 10 s 60 ºC (Tm) 60 s 72 ºC 25 s 40 ciclos 80 ºC 10 s 4 ºC final Los títulos del genoma del vector se calcu­ laron multiplicando las copias por pocillo por el factor de dilución correspondien­ te y asumiendo que una copia de doble cadena de ADN plasmídico es equivalente a dos cadenas sencillas del genoma del vector (Sommer et al., 2003). 7.3. ADMINISTRACIÓN DE LOS AAV A LOS ANIMALES Los AAVs se administraron a ratones de 5 meses de edad por medio de una inyección intravenosa. Para este procedimiento, los animales se anestesiaron con una mezcla de xilacina (Rompun 2 %, Bayer, Leverkusen, Alemania) y ketamina (Imalgene 50, Merial, Lyon, France) al 1:9 v/v y administrada mediante inyección intraperitoneal. 7.4. ENSAYOS DE BIOLUMINISCENCIA Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de xilacina y ketamina (apartado 7.3). El sustrato, luciferina (Promega) disuelta en PBS, se administró por inyección intrape­ ritoneal a una dosis de 150 µg/kg de peso. Tras 10 min, los animales se introdujeron en una habitación oscura para visualiza­ ción no invasiva de la luz producida por la luciferasa en el ratón a tiempo real (Xeno­ gen IVIS Lumia, Alameda, CA). Las imá­ genes se cuantificaron y analizaron con el software asociado (Living Image 2.20 software Xenogen). El tiempo de exposi­ ción varió entre 1 s y 5 min en función de la intensidad de la luz. La luz emitida se cuantificó como γ/s. 8. TEST METABÓLICOS 8.1 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Para la cuantificación de la cantidad de insulina en plasma se utilizaron 10 μL de plasma de ratones ayunados durante toda la noche, aproximadamente 16 h. Las muestras se analizaron por duplicado. Para la realización del ELISA siguieron las instrucciones del fabricante (Merck Millipore). 8.2. METABOLISMO GLUCÍDICO 8.2.1 Determinación de la síntesis de glucógeno en cultivo celular Se sembraron 8x105 células en placas de 6 cm con DMEM alto en glucosa (25 mM) suplementado con FBS al 10 %. Al día siguiente, cuando las células habían alcanzado en torno a un 70-80 % de con­ fluencia, se deprivaron de suero durante 6 h con medio DMEM a 5 mM de glucosa suplementado con BSA al 0.2 % (p/v). A continuación, el medio se cambió a medio alto en glucosa sin suero y suplementado 101 con [U-14C] glucosa (11.1 GBq/μmol) a 10 mmol/L (PerkinElmer, Walthaman, EE.UU.) (Alonso-Chamorro et al., 2011). Las célu­ las se estimularon con cantidades cre­ cientes de insulina (10-100 nM). Tras 6 h de incubación, las placas se congelaron. Para precipitar el glucógeno, el homoge­ nado se transfirió a papeles Whatman 3 MM (Sigma-Aldrich) con etanol al 66 % (Alonso-Chamorro et al., 2011). Posterior­ mente, los papeles Whatman se secaron a 40 ºC en una estufa. La radiactividad se cuantificó en un contador de radiación β (KB Wallac Rackbeta Liquid Scintillation Counter, Model 1209 from Abbot Labora­ tories, Libertyville Township, EE.UU.) 8.2.2. Determinación del contenido en glucógeno en cultivo celular y hepático 8.2.2.1. Determinación del contenido en glucógeno en cultivo celular Se sembraron 2.2x106 células en placas de 10 cm con DMEM alto en glucosa (25 mM) suplementado con FBS al 10 %. Al día siguiente, cuando las células habían alcanzado en torno a un 70-80 % de con­ fluencia, se deprivaron de suero durante 6 h con medio DMEM a 5 mM de glucosa suplementado con BSA al 0.2 % (p/v). A continuación, el medio se cambió a medio alto en glucosa sin suero y las células se estimularon con dosis crecientes de insu­ lina (10-100 nM). Tras 6 h de incubación, las placas se congelaron. Para su análisis, las células se rascaron con un rascador en KOH al 30 % (p/v). Para precipitar el glucógeno, el homogenado se transfirió a papeles Whatman 3 MM (Sigma-Aldrich) con etanol al 66 % (Alonso-Chamorro et al., 2011). Para liberar los monómeros de glucosa del precipitado de glucógeno, las muestras se incubaron con α-amilogluco­ sidasa (Sigma-Aldrich) a 1.6 mg/mL duran­ te 4 h a 37 ºC en tampón acetato al 0.4 M, pH 4.8. La medición de glucosa se realizó mediante la medida indirecta a 340 nm del NADPH sintetizado con el kit Biosystems D-glucose (Barcelona, España) y según las instrucciones del fabricante. 8.2.2.2. Determinación del contenido en glucógeno hepático En el caso de la medición de glucosa en hígado, 25 mg de tejido de cada animal se homogeneizaron en KOH al 30 % (p/v) y se calentaron a 100 ºC. A continuación se llevó a cabo el mismo protocolo que en el apartado anterior. Para la realización de estos experimentos, los animales se sacri­ ficaron tras ser ayunados 16 h seguido de 1 h de alimentación. 8.2.3 Determinación de la actividad de la glucógeno sintasa hepática Se sembraron 2.2x106 células en placas de 10 cm con DMEM alto en glucosa (25 mM) suplementado con FBS al 10 %. Al día siguiente, cuando las células habían alcanzado en torno a un 70-80 % de con­ fluencia, se deprivaron de suero durante 6 h con medio DMEM a 5 mM de glucosa suplementado. A continuación, el medio se cambió a medio alto en glucosa sin suero y las células se estimularon insulina a 10 nM durante 15 min. Se midió la for­ mación de glucógeno en situación basal y tras 15 min de estimulación con insulina a 10 nM según se describe en el aparta­ do 8.2.2.1. La actividad se halló según los moles generados por minuto (U) referi­ dos a los mg de proteína total. Para los cálculos se tuvo en cuenta la fracción de glucosa presente previo a la digestión con α-amiloglucosidasa. 8.2.4. Determinación de la actividad de la glucógeno fosforilasa hepática Se sembraron 2.2x106 células en placas de 10 cm con DMEM alto en glucosa (25 mM) suplementado con FBS al 10 %. Al día siguiente, cuando las células habían alcanzado en torno a un 70-80 % de con­ fluencia, se deprivaron de suero durante 6 h con medio DMEM a 5 mM de glucosa suplementado durante 4 y 6 h. Se midió por colorimetría la formación de gluco­ sa-1-fosfato en ambas condiciones según las instrucciones del kit Glucose-1-Phos­ phate Colorimetric Assay Kit (BioVision, Milpitas, CA, EEUU). La actividad se halló según los moles generados por minuto (U) referidos a los mg de proteína total. 8.3. METABOLISMO LIPÍDICO 8.3.1. Aislamiento y purificación del total de los lípidos hepáticos Se pesaron 100 mg de tejido hepático. Se homogeneizaron en 3 mL de PBS duran­ te 45 s con ayuda de un Ultra-Turrax T10 basic (IKA). El aislamiento se llevó a cabo según el método de extracción de Folch (Folch et al., 1957). Se agregaron 12 mL de una mezcla de 2:1 cloroformo:metanol y se agitó. Se centrifugaron para separar las fases a 3000 rpm durante 10 min. La fase orgánica (inferior) se transfirió a un vial de centelleo de 20 cm3. El cloroformo se eva­ poró con gas nitrógeno y se resuspendió en Triton X-100 al 15 % en cloroformo. El cloroformo se evaporó de nuevo con nitró­ geno gas y los lípidos se resuspendieron en 2 mL de ddH2O. 8.3.2. Ensayos colorimétricos para la medida de colesterol y triglicéridos Para la determinación de colesterol se uti­ lizaron 20 μL de suero o de la mezcla total de lípidos hepáticos extraída. La medida se realizó mediante un ensayo colorimé­ trico con el kit de colesterol total de Wako (Saitama, Japón) según las instruccio­ nes del fabricante. La determinación de colesterol total de este kit se basa en el uso de tres enzimas: colesterol esterasa (CE), colesterol oxidasa (CO) y peroxidasa (POD). El colesterol esterificado, se des­ esterifica por la CE y, al ser oxidado por la CO, se desprende una molécula de H2O2. La mezcla de fenol y 4-aminoantipirina (4-AA) se condensa por acción del H2O2, formando una quinonaimina coloreada proporcional a la concentración de coles­ terol en la muestra. Para la determinación de los triglicéridos se utilizaron 3 μL de suero o de la mezcla total de lípidos hepáticos extraída diluida 10 veces. La medida se realizó mediante un ensayo colorimétrico con el kit de trigli­ céridos (Infinity, Thermo Fisher) según las instrucciones del fabricante. La determina­ ción de triglicéridos de este kit se basa en el uso de tres enzimas: lipasa (LP), glice­ rol quinasa (GK) y glicerolfosfato oxidasa (GPO). Los triglicéridos son hidrolizados por la lipasa a glicerol y ácidos grasos libres. Como resultado de la acción de la GK, el glicerol pasa a ser fosforilado en su posición 3. Cuando el glicerol-3-fosfato es oxidado por la GPO se desprenden 2 moléculas de H2O2. La mezcla de fenol y 4-aminoantipirina (4-AA) se condensa por acción del H2O2, formando una quinonai­ 103 mina coloreada 2 veces concentrada en relación a la cantidad de triglicéridos de la muestra. 8.3.3. Cromatografía líquida de separación rápida de proteínas (Fast protein liquid chromatography, FPLC) Por cada grupo de animales (n=5 por grupo) se utilizó un pool de plasma (volu­ men total de 250 μL). Para la cromatogra­ fía se utilizaron 2 columnas en serie de Sepharose 6 con un tamaño de partícula de entre 45 y 165 µm (Amersham Bios­ ciences, Little Chalfont, Reino Unido). El tampón de elución utilizado fue Tris a 100 mM y NaN3 al 0.04 %, pH 7.5. La veloci­ dad de elución (flow rate) fue de 0.7 mL/ min. 9. OTRAS TÉCNICAS 9.1 CUANTIFICACIÓN 9.1.1. Blots Los blots fueron cuantificados usando la herramienta Analyze\Gels de ImageJ. Se seleccionaron regiones rectangulares de igual área para todos los puntos del blot, de tal forma que se obtuvieron represen­ taciones de la densidad de la señal a lo largo de la región seleccionada. Se dibujó una línea base y se calculó el área bajo la curva, indicativa de la señal relativa a cada punto. Los resultados fueron siempre nor­ malizados con la señal del control invaria­ ble en cada caso. 9.1.2. Imágenes de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia Las imágenes de las inmunohistoquímicas de las secciones pancreáticas se adquirie­ ron con una cámara digital (XCD-U100CR, Sony, Tokyo, Japón) acoplada a un microscopio invertido (Eclipse 8i, Nikon, Tokio, Japón). Los análisis morfométricos se realizaron con un software de análisis automático de imágenes (Histolab, Micro­ vision Instruments, Gotenburgo, Suecia). La selección automática fue corregida manualmente para eliminar defectos o áreas de tejido graso. La fracción del área total de célula β se determinó calculando la relación entre el área de células positi­ vas para la tinción de insulina frente al área total de células pancreáticas. Se contó el número total de islotes por sección. La medida del área de los islotes (en μm2) y su clasificación en función de ésta permi­ tió el estudio de su distribución según su tamaño. 9.2. ESTADÍSTICA Los datos se representan como media ± SEM de, al menos, 3 experimentos inde­ pendientes. En cuanto a los experimentos in vivo, se utilizaron como mínimo 4 rato­ nes. Las pruebas estadísticas entre valo­ res medios fueron determinadas mediante el test t de Student para comparación de dos muestras independientes (prueba-t desapareada, usada en la práctica totali­ dad de análisis realizados en esta tesis). El análisis simple de la varianza mediante ANOVA de una vía fue utilizado para com­ paraciones múltiples seguido del test de Bonferroni. Las diferencias fueron consi­ deradas estadísticamente significativas para P < 0.05. 9.3. TÉCNICAS BIOINFORMÁTICAS 9.3.1. Trabajo con secuencias de ADN • BLAST (National Institutes of Health, Bethesda, EE.UU.) http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/ Primer-BLAST (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) Diseño de primers y comparación de secuencias con las bases de datos del NIH. • LabLife (http://www.lablife.org) Trabajo con enzimas de restricción, pre­ dicción de puntos de corte dentro de una secuencia. • Vector NTI, ThermoFisher. Alinea­ miento de secuencias de ADN y ami­ noácidos. 9.3.2 Trabajo con imágenes • Adobe Photoshop CS6 (Adobe, San José, EE.UU.) Ajustes de imágenes. • ImageJ (National Institutes of Health) Software gratuito usado para análisis de imágenes (área), y densitometría de blots. • Image Analysis Software (Histolab). Análisis morfométricos. 10. MATERIALES Los reactivos comunes de laboratorio son de las siguientes casas comerciales: • Merck Millipore: Triton X-100 y Tween-20. • panreac: ácido acético, etanol, glicerol, glicina, HCl, isopropanol, metanol y NaCl. • pronadisa (Torrejón de ardoz, españa): agar bacteriológico, agarosa, extracto de levadura y triptona. • roche: aprotinina, leupeptina y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). •sigMa-aldrich: anfotericina B, ampicilina, DAPI, DMSO, EDTA, estreptomicina, HEPES, kanamicina, 2-mercaptoetanol, NaF, paraformaldehido, penicilina G, SDS y Tris base (Trizma). http:http://www.lablife.org http://www.ncbi http://blast.ncbi.nlm 07/ resultados 109 MODELO iLIRKO COMO MODELO DE PROGRESIÓN A LA DIABETES TIPO 2 El modelo iLIRKO se generó para estudiar el papel específico del receptor de insulina en hígado en la resistencia a insulina y, por tanto, en la progresión a la diabetes tipo 2. El abordaje inducible evita los efectos colaterales que supone la eliminación del receptor durante el desarrollo embrionario del animal ya descritos por Michael et al. en el 2000 en el modelo LIRKO. El modelo iLIRKO se obtuvo cruzando animales que portaban el exón 4 del gen que codifica para el receptor de insulina flanqueado por secuencias loxP con animales en los que la recombinasa Cre, fusionada con recep­ tores de estrógenos truncados y depen­ dientes de tamoxifeno para su activación (Cre-ERT2), se encontraba localizada bajo el control del promotor de albúmina (Alb), específico de hepatocitos. Así, mientras en el alelo Alb-Cre se expresaba funda­ mentalmente en hepatocitos, también había un mínimo de expresión en tejidos extrahepáticos. Sin embrago, la fusión de Alb-Cre-ERT2 se detecta únicamente en el hígado (Schuler et al., 2004) (Figura 22). El alelo Alb-Cre-ERT2 fue mantenido en heterocigosis (Alb-Cre+/-) en hembras (Alb- Cre+/-, InsrloxP/loxP). Los alelos de IR con el exón 4 flanqueado por secuencias loxP fueron mantenidos siempre en homocigo­ sis (InsrloxP/loxP). Por tanto, para la obtención del modelo iLIRKO se cruzaron machos (InsrloxP/loxP) con hembras (Alb-Cre+/-, Insr­ loxP/loxP), obteniéndose un 50 % de machos control InsrloxP/loxP y un 50 % de machos Alb-Cre+/-; InsrloxP/loxP según las leyes men­ delianas (Figura 23). La inducción de la translocación de la Cre-ERT2 al núcleo se consigue en 2004 mediante la administración, por inyeccio­ nes intraperitoneales, de 1 mg de tamoxi­ feno (Schuler et al., 2004) (Figura 24). A a b Figura 22. Análisis de la expresión génica y proteica de Cre-ERT2. a: Detección del ARNm de la albúmina sérica (SA) del transcrito fusionado SA-Cre-ERT2 por RT-PCR del ARN de diferentes órganos de los animales SACre-ERT2 de 8 semanas de edad. Se indican los primers utilizados para la amplificación. Li: hígado, skm: músculo esquelético, cm: músculo cardiaco; WAT: tejido adiposo blanco, st: estómago, in: intestino, sp: bazo, ki: riñón, li –RT: control hepático sin transcriptasa reversa. b: Análisis inmunohistoquímico de la expresión de la Cre-ERT2 en el hígado. El análisis se realizó en secciones hepáticas de ratones de 8 semanas tratados con tamoxifeno wildtype (paneles superiores) o SACre-ERT2 (paneles inferiores). El color rojo corresponde a la tinción de la recombinasa Cre-ERT2, el color azul corresponde a la señal del DAPI. El color magenta es la superposición de rojo y azul de la señal de la Cre y del DAPI, respectivamente. Modificado de Schuler et al., 2004. , InsrloxP/loxP o Igf1rloxP/loxPFigura 23. Análisis de la expresión génica de Cre-ERT2 . a: Detección del ADN del Cre-ERT2 por PCR en al ADN de la cola de los ratones ratones Alb-Cre+/- o Alb-Cre-/-. b: Detección de las secuencias loxP por PCR en al ADN de la cola de los ratones ratones InsrloxP/loxP o wild type. c: Detección de las secuencias loxP por PCR en al ADN de la cola de los ratones ratones Igf1rloxP/loxP o wild type. En todos los casos, el ADN de la cola se extrajo a las 6 semanas de edad. Los primers utilizados para la amplificación se especifican en la Tabla 5. 111 lo largo de los años, se han publicado diferentes abordajes: diferentes vías de administración del tamoxifeno o 4-hidroxi­ tamoxifeno, oral o intraperitoneal, en varias dosis y diferentes tiempos resumi­ dos en la Tabla 12 (Kühbandner et al., 2000; Madisen et al., 2010; Schuler et al., 2004; Whitfield et al., 2015). Así, para inducir la translocación de la Cre-ERT2 citoplasmáti­ ca al núcleo e inducir la escisión del exón 4 del Insr, se probaron diferentes protoco­ los resumidos en la Figura 25. Para examinar los efectos que provocan las distintas dosis, número de administra­ ciones y modo de preparación del tamoxi­ feno y 4-OHT, variamos estos parámetos en ratones de 8 semanas (Schuler et al., prueban que la deleción es independiente de la edad del animal, Figura 24b), nunca más pequeños de 20 g, y examinamos el resultado de la actividad de la recombina­ sa Cre. Se analizaron los hígados de los ratones 30 días después de la adminis­ tración intraperitoneal de 1 mg de 4-OHT preparado en aceite de girasol durante 5 días consecutivos o 3 días alternativos. Los resultados de la RT-PCR muestran que la deleción del exón 4 del Insr es de aproximadamente un 50 % en compara­ ción con los ratones control inyectados sólo con el vehículo. Sin embargo, los niveles de IRβ en hígado son similares a los del control. Lo mismos resultados se obtienen cuando inyectamos con tamoxi­ feno, en vez de 4-OHT, en las mismas con­ diciones. Aunque está descrito que una dosis intraperitoneal de tamoxifeno de 0.1 mg/día durante 5 días induce una esci­ sión eficiente en la mayoría de los genes diana flanqueados por secuencias loxP, para loci de difícil acceso son necesarias Tabla 12. Resumen de los tratamientos probados para la activación de la Cre-ERT2. Figura 24. Cre-ERT2 media la escisión del ADN flanqueado por secuencias loxP. a: Análisis del DNA genómico de los tejidos indicados de ratones SACre-ERT2/af2 tratados con aceite de girasol o con 1 mg de tamoxifeno. Se muestran los productos de la PCR específicos para Cre-ERT2. b: Análisis por Southern blot del ADN del hígado y la cola en animales tratados con 1 mg de tamoxifeno. Se indica la edad del ratón al comienzo del tratamiento con tamoxifeno. Modificado de Schuler et al., 2004. TRATAMIENTO COMPUESTO DOSIS (mg) NÚMERO DE DOSIS PREPARACIÓN Inyección intraperitonea l 4OHT 1 3 (alternativas) Aceite girasol 5 10% EtOH, Aceite girasol Tamoxifeno 1 3 (alternativas) Aceite girasol 5 Aceite girasol Cánula Tamoxifeno 10(x2) 5(x1) 3 (alternativas) 10% EtOH, Aceite girasol Dieta Tamoxifeno 14 Figura 25. Abordajes ensayados para la activación de la Cre-ERT2. a b c d e f En todos los casos, tras el destete se alimenta a los ratones durante 2 semanas con dieta libre en soja. Si la administración del 4OH-tamoxifeno o tamoxifeno es mediante inyección, tras la dieta libre en soja los animales pasarán a alimentarse con dieta estándar hasta su sacrificio. a: Se administran 3 dosis alternas de 4OH-tamoxifeno. Sumadas las 3 dosis se inyecta en total 1 mg de 4OH-tamoxifeno. b: Se administran 5 dosis consecutivas de 4OH-tamoxifeno. Sumadas las 5 dosis se inyecta en total 1 mg de 4OH-tamoxifeno. c: Se administran 3 dosis alternas de tamoxifeno. Sumadas las 3 dosis se inyecta en total 1 mg de tamoxifeno. d: Se administran 5 dosis consecutivas de tamoxifeno. Sumadas las 5 dosis se inyecta en total 1 mg de tamoxifeno. e: Se administran 3 dosis alternas de tamoxifeno. Sumadas las 3 dosis, el animal ingiere en total 5 mg de tamoxifeno. (a-e) La administración de 4OH-tamoxifeno y tamoxifeno mediante inyección se realizó a los animales Cre-ERT2 positivos, mientras que a los controles se les inyectó el vehículo en que se había disuelto el 4OH-tamoxifeno o tamoxifeno. e: Tras 2 semanas de dieta libre en soja, los animales se alimentaron con dieta de tamoxifeno durante otras 2 semanas. A continuación y hasta su sacrificio, se alimentaron con dieta estándar. En este caso todos los animales, incluidos los Control, se alimentaron con los tres tipos de dietas. 113 dosis más altas. Este problema puede sortearse mediante la administración de tamoxifeno durante un periodo más largo, mejor que aumentando la dosis diaria ya que dosis mayores a 0.8 mg de tamoxi­ feno vía intraperitoneal han sido descritas como saturantes para algunas proteínas acopladas a ERT2 (Metzger y Chambon, 2011; Wilson et al., 2014). Sin embargo, las inyecciones continuadas causan pro­ blemas derivados de la acumulación de aceite en la cavidad intraperitoneal (Wilson et al., 2014). Por tanto, teniendo en cuen­ ta nuestros resultados en los que parece go, los niveles de proteína se reducen en, aproximadamente, un 80 % respecto a los ratones Control (Figura 26). Una vez más, teniendo en cuenta los resultados debía­ mos recurrir a periodos de administración más largos. Para ello decidimos recurrir a la administración de tamoxifeno por medio de la dieta, aproximación más fisiológica, saludable y éticamente correcta. Los ani­ males se alimentaron durante 15 días con dieta de tamoxifeno, para minimizar cual­ quier efecto nocivo de éste, aunque rato­ nes alimentados durante 18 semanas con dieta de tamoxifeno no presentan altera- Figura 26. Evaluación de los diferentes métodos para la inducción de Cre-ERT2. a: Deleción del exón 4 del Insr mediante RT-PCR en homogeneizados totales hepáticos de ratones de 5 meses de edad Control e iLIRKO. Se prueba la inyección intraperitoneal en 3 ó 5 dosis de 4OH-tamoxifeno (4-OHT) o tamoxifeno (Tam). b: Evaluación de los niveles de IRβ en homogeneizados totales hepáticos por Western blot de los mismos ratones descritos en el apartado anterior (a). Se utiliza la β-actina como control de carga. c: Deleción del exón 4 del Insr mediante RT-PCR en homogeneizados totales hepáticos de ratones de 5 meses de edad Control y iLIRKO. Se prueba la administración de 3 dosis de tamoxifeno (Tam) con cánula intragástrica. b: Evaluación de los niveles de IRβ en homogeneizados totales hepáticos por Western blot de los mismos ratones descritos en el apartado anterior (c). Se utiliza la β-actina como control de carga. que la dosis administrada era insuficien­ te, decidimos recurrir a la administración oral mediante una cánula intragástrica. En este caso, los ratones se sacrificaron 30 días después de la última inyección. Los resultados de la RT-PCR muestran que los niveles de deleción del exón 4 del Insr en extractos hepáticos totales son de apro­ ximadamente el 50 % respecto al con­ trol al cual se administró exclusivamente el vehículo, aceite de girasol. Sin embar­ ciones en ninguno de sus tejidos (Wilson et al., 2014). Previamente y tras el destete, los animales fueron alimentados con dieta libre en soja para disminuir los niveles de fitoestrógenos que podrían competir con el tamoxifeno por la unión a los recepto­ res de estrógenos. A continuación de la dieta de tamoxifeno, los animales fueron alimentados con dieta estándar hasta su sacrificio (Figura 25f). Para cuantificar el grado de deleción del exón 4 del Insr alcanzado en los hepato­ citos tras 15 días de dieta con tamoxife­ no, se diseñó una pareja de primers en la cual el forward hibridaba en el intrón 3-4 y el reverse en el exón 4 dando lugar a un producto de 126 pb. Esta aproximación nos permitió cuantificar cuánto IR total expresaban los animales en el hígado. El ADN genómico del pool total del hígado se analizó mediante qPCR para la expre­ sión del Insr. Los resultados muestran un descenso significativo de, aproximada­ mente, el 75 % en ratones iLIRKO en com­ paración con ratones Control. La deleción del exón 4 del Insr es hepatoespecífica ya que está bajo el control del promotor de la albúmina, por lo que no se produce dele­ ción en el resto de células presentes en el hígado, como las células de Kupffer, Ito o endoteliales. Este hecho explica en parte el porcentaje de células no delecionadas que encontramos en los animales iLIRKO (Figura 27). La deleción del exón 4 del Insr se comprobó también por RT-PCR en RNA mensajero de animales Control e iLIRKO. Tal y como se esperaba, no hay escisión del exón 4 del Insr flanqueado por secuen­ cias loxP en los hígados de animales Con­ trol. Sin embargo, en animales iLIRKO se produce la escisión del exón 4 del Insr exclusivamente en el hígado de animales tratados con tamoxifeno, pero no en otros tejidos (Figura 28). Por tanto, la expresión de la Cre-ERT2 específicamente en un tipo celular en ratones transgénicos permi­ te una eficiente recombinación mediada por la Cre e inducida por tamoxifeno sin recombinación espontánea en ausencia de tamoxifeno (Metzger et al., 2011). Analizamos los niveles de expresión de IR en homogeneizados totales hepáticos de animales Control e iLIRKO mediante Western blot utilizando anticuerpo frente a la cadena β del IR. Los resultados muestran de nuevo la eliminación específica del IR Figura 27. La dieta con tamoxifeno causa la deleción del exón 4 del Insr en hepatocitos. El ADN genómico de ratones de 5 meses de edad se aisló del hígado y se analizó mediante qPCR. Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo. La significación estadística se representa como Control vs iLIRKO *** (p< 0.001). Figura 28. La dieta con tamoxifeno es el método más efectivo para la inducción de Cre-ERT2. a: Análisis de la deleción del exón 4 del Insr mediante RT-PCR en homogeneizados totales hepáticos de ratones de 5 meses de edad Control e iLIRKO. Se sigue el esquema de dietas explicado en la Figura 4f. b: Evaluación de los niveles de IRβ en homogeneizados totales hepáticos musculares o renales por Western blot en ratones de 5 meses de edad Control e iLIRKO. Se utiliza la β-actina como control de carga. 115 en el hígado de los ratones iLIRKO, pero no en otros tejidos. Como control de carga se utilizó la β-actina (Figura 28). La inducción de la pérdida del receptor de insulina no está asociada con cambios en la morfología hepática. Los análisis histo­ lógicos con hematoxilina/eosina a los 5 meses de edad muestran una arquitectura hepática normal, con signos no evidentes de núcleos hiperproliferativos o esteatosis en ratones iLIRKO. Estos resultados fue­ ron validados por el servicio de anatomía patológica del hospital Santa Cristina de Madrid. Además no hay cambios signifi­ cativos en el peso de los hígados de los ratones control en comparación con los ratones iLIRKO (Figura 29). Figura 29. La deleción inducible del receptor de insulina tras el desarrollo embrionario no causa daño hepático. Se muestra una tinción con hematoxilina/eosina representativa de secciones hepáticas de ratones Control (panel izquierdo) e iLIRKO (panel derecho). Aumento 20X. LA DEFICIENCIA DEL RECEPTOR DE INSULINA EN HÍGADO PROVOCA UNA MARCADA INTOLERANCIA A GLUCOSA Y RESISTENCIA A INSULINA Los efectos fisiológicos que provoca la deficiencia del receptor de insulina en hígado son patentes ya a los 3 meses de edad. El test de tolerancia a glucosa (GTT) muestra una significativa intolerancia a la glucosa a los 3 meses de edad que se mantiene a los 6 y 9 meses, en animales iLIRKO en comparación con animales Control. En cuanto al test de tolerancia a insulina (ITT), los ratones iLIRKO a los 3 meses de edad eran resistentes a la insulina administrada de forma exógena. Igual que ocurría en la GTT, los efectos significativos en las ITT de los ratones iLIRKO persistían a los 6 y 9 meses de edad en comparación con los ratones Control (Figura 30). Además, estos animales desarrollan una severa hiperinsulinemia, debido a la secre­ ción compensatoria de insulina por parte del páncreas y a la falta de eliminación de ésta de la circulación debido a la falta de receptores de insulina en hígado. Por ello, decidimos caracterizar la masa de célula β en ratones Control e iLIRKO de 9 meses de edad. De acuerdo con la hiperinsuline­ mia descrita, las tinciones de las seccio­ nes pancreáticas con insulina muestran un incremento significativo, aproximada­ mente de un 50 %, de la masa de célula β de los ratones iLIRKO en comparación con los ratones Control ya que aumenta significativamente el número de islotes, aunque no se modifica la distribución por tamaños en comparación con los ratones Control (Figura 31). De acuerdo con traba­ jos previos, estos resultados indican que la señalización del IR hepático es necesa­ ria para el mantenimiento de la homeosta­ sia glucídica (Michael et al., 2000). GENERACIÓN DE LOS rAAVs QUE CONTIENEN LAS ISOFORMAS DEL RECEPTOR DE INSULINA Para conocer la importancia de cada iso­ forma del IR en el hígado en la regulación de la homeostasia glucídica total, genera­ mos virus adenoasociados del serotipo 8 Figura 30. Efectos metabólicos de la eliminación del receptor de insulina en el hígado. a: Test de tolerancia a glucosa intraperitoneal en ratones Control e iLIRKO de 3, 5 y 9 meses de edad (n=10-12 animales por grupo). b: Test de tolerancia a insulina intraperitoneal en ratones Control e iLIRKO de 3, 5 y 9 meses de edad (n=10-12 animales por grupo). Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo. La significación estadística se representa como Control vs iLIRKO * (p< 0.05), ** (p< 0.01), *** (p< 0.001). Figura 31. Los ratones iLIRKO desarrollan una marcada compensación por parte de la célula β pancreática. a: Niveles de insulina en plasma en ratones Control e iLIRKO de 5 meses de edad (n=10-12 ratones por grupo). b: Área media del islote. c: Densidad de islotes. d: Distribución de los islotes por tamaño, en ratones Control e iLIRKO de 9 meses de edad (n=5 ratones por grupo). Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo. La significación estadística se representa como Control vs iLIRKO * (p< 0.05), *** (p< 0.001). 117 que contenían las isoformas humanas del receptor de insulina INSR A o INSR B o los genes marcadores luciferasa (luc) o proteí­ na verde fluorescente (GFP). Estos genes se encontraban bajo la regulación de un promotor hepatoespecífico, α1-antitripsi­ na (AAT) y flanqueados por repeticiones terminales invertidas (ITR) del serotipo 2 (Figura 32). El vector que contiene el gen de la luciferasa se obtuvo del plásmi­ do pdLucFXR, cedido por la Dra. Gon­ zález-Aseguinolaza (número de acceso Gene Bank AY603759) utilizando EcoRI y PmlI. Lo mismo para la obtención del vec­ tor que contiene GFP (número de acceso Gene Bank L29345). Figura 32. Diagrama esquemático de los vectores de los AAV utilizados en esta tesis. pAAT: promotor α-1 antitipsina humano, GFP: gen de la proteína verde fluorescente, IRA/B: INSR A o B, ITR: repeticiones terminales invertidas, luc: gen de la luciferasa, poliA: señales de poliadenilación. d: Distribución de los islotes por tamaño, en ratones Control e iLIRKO de 9 meses de edad (n=5 ratones por grupo). Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo. La significación estadística se representa como Control vs iLIRKO * (p< 0.05), *** (p< 0.001). Para generar los virus adenoasociados que contenían una u otra isoforma del receptor de insulina llevamos a cabo numerosas estrategias ya que el gran tamaño de los receptores (4146 pb IRA y 4182 pb IRB) supuso una dificultad a la hora de insertarlos entre las secuencias ITR. Además, a las secuencias propias de los receptores debe sumársele, como mínimo, las bases correspondientes al promotor y la cola polyA. El primer paso fue caracterizar el material de partida. Así, secuenciamos el ADN plasmídico de IRA e IRB con los primers especificados en la Tabla 9. También digerimos los plásmidos con endonucleasas de restricción para cerciorarnos de que la secuencia con la que trabajábamos era la correcta. Así, digerimos 10 µg de cada plásmido con BamHI (20 U/µL) o BstXI (10 U/µL). Los fragmentos generados al cortar el ADN con las enzimas de restricción se separaron en base a su tamaño mediante electroforesis en un gel de agarosa. De este modo se comprobó que los tamaños obtenidos al digerir con BamHI (7050 pb + 2016 pb para IRA y 7086 pb + 2016 pb para IRA) eran los esperados, los cuales habían sido calculados con ayuda del programa VectorNTI. Lo mismo ocurrió con los fragmentos generados tras la digestión con BstXI (5694 bp + 2544 bp + 828 bp para IRA y 5730 bp + 2544 bp + 828 bp para IRB) (Figura 33). La primera estrategia a seguir fue intentar incluir los plásmidos en el vector viral con un tamaño superior a las 5 kb: secuencia stuffer de 670 pb, promotor AAT asociado a una secuencia de potenciación (enhancer) de 665 pb, PolyA insulator de 426 pb, IRA 4146 pb o IRB 4182 pb, cola poli-A 426 pb. Las estrategias diferían entre sí en las enzimas de restricción con las que se cortaban vector e inserto para su posterior ligación. En los casos en los que hubo éxito en la ligación realizamos su transformación en bacterias E. Coli TOP10 quimiocompetentes y eletrocompetentes. Ninguna de las colonias obtenidas conservaba los ITRs. Teniendo en cuenta estos antecedentes, decidimos retirar la secuencia stuffer y la secuencia enhancer asociada al promotor. Es decir, reducir el promotor a únicamente la secuencia del promotor AAT (311 pb), sin secuencia de potenciación y minimizar el poli-A a 19 adeninas. Con todos estos Figura 33. Comprobación de la identidad de los plásmidos pUC57-IRA y pUC57-IRB amplificados. Los fragmentos generados al cortar 10 µg de cada plásmido, pUC57-IRA o pUC57-IRB, con las enzimas de restricción BamHI (20 U/µL) o BstXI (10 U/µL) se separaron en base a su tamaño en un gel de agarosa. Se comprobó que los tamaños obtenidos al digerir con BamHI (IRA: 7050 pb + 2016 pb, IRB: 7086 pb + 2016 pb,) o BstXI (IRA: 5694 bp + 2544 bp + 828 bp, IRB: 5730 bp + 2544 bp + 828 bp ) eran los esperados. Figura 34. Digestión de los plásmidos pUC57-IRA y pUC57- IRB para retirar las secuencias stuffer y enhancer. Los fragmentos generados al cortar 5 µg de cada plásmido, pUC57-IRA o pUC57-IRB, con las enzimas de restricción PspOMI, AfeI y AflII se separaron en base a su tamaño en un gel de agarosa. Se comprobó que los tamaños obtenidos, 4379 bp + 3137 bp + 1667 bp en el caso de IRA y 4414 bp + 3137 bp + 1667 bp en el caso de IRB, eran los esperados. Figura 35. Digestión del plásmido AAV-AAT-ATP7B para retirar el inserto ATP7B. Los fragmentos generados al cortar 10µg del plásmido AAV- AAT-ATP7B, por duplicado, con las enzimas de restricción PspOMI y AfeI se separaron en base a su tamaño en un gel de agarosa. Se comprobó que los tamaños obtenidos al digerir con PspOMI y AfeI (4137 + 3318 + 214 pb) eran los esperados ya que las bandas pertenecientes a los tamaños de 4137 pb y 3318 pb se resuelven en el sexto pocillo. 119 cambios se reducía el tamaño del inserto aproximadamente en 1,5 kb. Para ello, cor­ tamos 5 µg de cada plásmido pUC57-IRA y pUC57-IRB con AflII (20 U/µL) durante 2 h a 37 ºC. A continuación tratamos con Klenow (5 U/µL) y dNTPs a 33 µM cada uno durante 15 min a 25 ºC. La reacción se para en hielo y la inactivación com­ pleta de la enzima se realizó calentando la muestra a 65 ºC durante 20 min. Como el resto de enzimas de restricción que vamos a utilizar necesitan tampones dife­ rentes al de Klenow, que requiere NEB2, limpiamos la mezcla de reacción con una mezcla 1:10 de NaAc 3 M pH 5.2 y etanol absoluto. La digestión con PspOMI (20 U) y AfeI (10 U) se llevó a cabo a 37 ºC durante toda la noche y en tampón CutS­ mart. 2 µL de cada producto de digestión se resolvieron mediante electroforesis en un gel de agarosa (Figura 34). Las bandas obtenidas coincidían con los tamaños de banda esperados: IRA 4378 pb + 3137 pb +1667 pb, IRB: 4414 pb + 3137 pb + 1667 pb. Cortamos las bandas de interés 4378 bp IRA y 4414 bp IRB y extrajimos el ADN del gel de agarosa para purificarlo con el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). A continuación, resolvimos el produc­ to purificado en un gel de electroforesis para cerciorarnos de que el corte se había producido correctamente y no había con­ taminaciones de otras bandas (Figura 37). Como se obtuvo una sola banda en cada carril, pudimos concluir que el aislamiento del inserto se había producido de forma correcta y procedimos a su purificación precipitándolo con una mezcla 1:10 de NaAc 3 M pH 5.2 y etanol absoluto. En cuanto al vector, se utilizó el AAV-AAT­ ATP7B (Murillo et al., 2016) cedido por el laboratorio de la Dra. González-Asegui­ nolaza, CIMA, Pamplona. Para eliminar el inserto previo, 10 µg del plásmido se cor­ taron con las enzimas de restricción AfeI y PspOMI durante 2 h a 37 ºC. El produc­ to de la digestión se resolvió en un gel de agarosa en el cual el tamaño de las ban­ das obtenidas coincidió con el tamaño teórico: 4173 pb + 3318 pb + 214 pb. Las dos primeras bandas se resuelven sólo en uno de los pocillos debido a la cantidad excesiva de ADN (con menos ADN no se resolvía la banda de 214 pb, con lo cual no sabíamos si la digestión había funciona­ do o no) (Figura 35). Por tanto, purificamos la banda que contenía a las dos primeras con el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) y la digerimos de nuevo con AfeI durante 2 h a 37 ºC. Cortamos la banda de interés, 3318 bp, y la purificamos (Figura 36). Para defosforilar los extremos del vector y evi­ tar que recircularizase, el vector se trató con fosfatasa alcalina (CIP), durante 1 h a 37 ºC. Corrimos un gel de comprobación con 2 µL de ADN para asegurarnos que la habíamos purificado la banda correcta y no había restos de otras (Figura 37). Por último, el ADN del vector se purifica para la ligación precipitándolo con una mezcla 1:10 de NaAc 3 M pH 5.2 y etanol absolu­ to. Se obtuvo una concentración final de 200 ng/µL. Figura 36. Digestión de la banda purificada del plásmido AAV-AAT-ATP7B con AfeI. El ADN purificado de la banda no resuelta del gel de la Figura 35 se digirió de nuevo con AfeI. Los fragmentos generados se separaron en base a su tamaño en un gel de agarosa. Se comprobó que los tamaños obtenidos (4137 pb + 3318 pb) eran los esperados. La digestión se realizó por triplicado. Figura 37. Comprobación del tamaño de las bandas purificadas para vector e insertos. 1 mL de cada banda purificada se corrió, por duplicado, en un gel de agarosa para comprobar su tamaño. Figura 38. Comprobación de la presencia de los ITRs. El ADN procedente de los plásmidos AAV-AAT-IRA se digirió con XmaI para comprobar la presencia de los ITRs. Se observa una colonia positiva, señalada con una flecha roja. Se indican los tamaños de los fragmentos correspondientes a una digestión con XmaI del DNA de una colonia que conserva ambos ITRs: 4146 pb + 2681 pb + 887 pb. Los tamaños correspondientes a aquellas colonias que no conservan el ITR del extremo 5’ presentan un tamaño de 4146 pb + 3579 pb; los que no conservan el 3’ 6832pb + 887 pb. El plásmido se convierte en lineal cuando no conservan ninguno de los ITRs. Aunque para realizar una ligación la y 3:1. La ligación se llevó a cabo con la cantidad de vector suele ser superior a la ligasa T4 (400 U/µL) a 16 ºC durante toda la del inserto y, teniendo en cuenta que en noche. La transformación de los productos nuestro caso inserto y vector tenían un de la ligación se realizó en bacterias tamaño muy similar, los porcentajes de TOP10 quimiocompetentes. Se realizaron ligación que realizamos fueron 1:4, 1:6 minipreps para las 30 colonias obtenidas y 121 el ADN amplificado se digirió con XmaI (10 U/µL) durante 1 h a 37 ºC para comprobar la presencia de los ITR. De las 30 colonias evaluadas con XmaI, sólo una colonia IRA conservaba los ITRs en 5’ y 3’, dando lugar a fragmentos de 4146 bp + 2681 bp + 887 bp (Figura 38). Para comprobar que inserto y vector habían ligado y descartar una posible autoligación, la posible colonia positiva se digirió con HinCII (10 U/µL) durante 1 h a 37 ºC. Puesto que sólo una de las secuencias de corte para HinCII se encuentra en el vector y el producto obtenido no fue una única banda sino tres: 3819 bp + 3233 bp + 684 bp, podíamos concluir que inserto y vector habían ligado y lo habían hecho en el sentido correcto (Figura 39). Por tanto, habíamos generado el vector para producir los AAV-AAT-IRA. Figura 39. Verificación de la colonia AAV-AAT-IRA. El ADN procedente de los plásmidos AAV-AAT-IRA se digirió de nuevo con XmaI para comprobar la presencia de los ITRs. Una vez más, los tamaños de los fragmentos generados se corresponden con el de los esperados 4146 pb + 2681 pb + 887 pb. Los fragmentos de la digestión con HincII, 3819 pb + 3233 pb + 684 pb, demuestran que el sentido en el que se ha colocado el inserto en el vector es el correcto. Debido a que con esta estrategia sólo habíamos conseguido generar AAV-AAT­ IRA, decidimos eliminar la isoforma A del IR del vector que acabábamos de pro­ ducir y sustituirlo por la isoforma B que obtendríamos de uno de los vectores sin ITRs que habíamos generado siguiendo la estrategia anterior. Para ello amplifica­ mos el ADN de AAV-AAT-IRA y cortamos 4 µg de éste con EcoRI (20 U/µL) y PmlI (20 U/µL) durante 2 h a 37 ºC. Las enzi­ mas fueron inactivadas a 65 ºC durante 20 min. Las bandas obtenidas en el gel de agarosa fueron las esperadas: 5444 pb + 2256 pb (Figura 40). Purificamos la banda de 5444 pb y, a continuación, tratamos el vector con CIP durante 1 h a 37 ºC y puri­ ficamos de nuevo. En cuanto al IRB, cortamos con EcoRI y PmlI durante 2 h a 37 ºC. Las enzimas fueron inactivadas a 65 ºC durante 20 min. Las bandas obtenidas en el gel de agarosa fueron las esperadas: 4390 pb + 2410 pb + 2292 pb + 120 pb (Figura 41). Purificamos la banda de 2292 pb, que contenía la isoforma B del IR (Figura 42). La ligación se llevó a cabo con la ligasa T4 a 16 ºC durante toda la noche en proporción 1:5. La transformación de los productos de la ligación se realizó en bacterias TOP10 quimiocompetentes. Se realizaron minipreps para las 4 colonias obtenidas y el ADN amplificado se digirió con XmaI durante 1 h a 37 ºC para comprobar la presencia de los ITR. De las 4 colonias evaluadas con XmaI, sólo una colonia IRB conservaba los ITRs en 5’ y 3’, dando lugar a fragmentos de 4182 bp + 2681 bp + 887 bp (Figura 44). Para comprobar que inserto y vector habían ligado y descartar una posible autoligación, la posible colonia positiva se digirió con HinCII (10 U/µL) durante 1 h a 37 ºC. Puesto que sólo una de las secuencias de corte para HinCII se encuentra en el vector y el producto obtenido no fue una única banda sino tres: 3819 bp + 3233 bp + 684 bp, podíamos concluir que inserto y vector habían ligado y lo habían hecho en el sentido correcto (Figura 23). Por tanto, habíamos generado el vector viral para producir los AAV-AAT­ IRB. Figura 40. Digestión del plásmido AAV-AAT-IRA para retirar el inserto IRA. Los fragmentos generados al cortar 4 µg del plásmido AAV-AAT-IRA con las enzimas de restricción EcoRI y PmlI se separaron en base a su tamaño en un gel de agarosa. Se comprobó que los tamaños obtenidos al digerir con EcoRI y PmlI (5444 pb + 2256 pb) eran los esperados. Se continuó la agarosa hasta que las bandas del plásmido sin digerir y la correspondiente a 5444 pb se resolvieron lo suficiente para poder purificar ésta última. Figura 41. Digestión del plásmido AAV-AAT-IRB para rescatar el inserto IRB. Los fragmentos generados al cortar 4 µg del plásmido AAV- AAT-IRB sin ITRs con las enzimas de restricción EcoRI y PmlI se separaron en base a su tamaño en un gel de agarosa. Se comprobó que los tamaños obtenidos al digerir con EcoRI y PmlI (5444 pb + 2256 pb) eran los esperados. Se purificó la banda correspondiente al tamaño de 2292 pb. Figura 42. Comprobación del tamaño de las bandas purificadas para vector e insertos. 1 μL de cada banda purificada de vector, AAV-AAT-IRA, e inserto, IRB, se corrió en un gel de agarosa para comprobar su tamaño. Figura 43. Comprobación de la presencia de los ITRs. El ADN procedente de los plásmidos AAV-AAT-IRB se digirió con XmaI para comprobar la presencia de los ITRs. Se observa una colonia positiva, señalada con una flecha roja. Se indican los tamaños de los fragmentos correspondientes a una digestión con XmaI del ADN de una colonia que conserva ambos ITRs: 4146 pb + 2681 pb + 887 pb. Los tamaños correspondientes a aquellas colonias que no conservan el ITR del extremo 5’ presentan un tamaño de 4146 pb + 3579 pb; los que no conservan el 3’ 6832pb + 887 pb. El plásmido se convierte en lineal cuando no conservan ninguno de los ITRs. 123 Figura 44. Verificación de la colonia AAV-AAT-IRB. El ADN procedente de los plásmidos AAV-AAT-IRB se digirió de nuevo con XmaI para comprobar la presencia de los ITRs. Una vez más, los tamaños de los fragmentos generados se corresponden con el de los esperados 4146 pb + 2681 pb + 887 pb. Los fragmentos de la digestión con HincII, 3819 pb + 3233 pb + 684 pb, demuestran que el sentido en el que se ha colocado el inserto en el vector es el correcto. Figura 45. Imágenes in vivo de la actividad luciferasa después de la inyección del AAV-AAT-luc. Para el serotipo 8 el rango de expresión fue de entre 1 y 2 x 1012 γ/s. No se observa expresión en el ratón inyectado con salino. Se muestran imágenes 15 días después de la inyección. Figura 46. Eficiencia de transducción (GFP) en el hígado y páncreas de los ratones iLIRKO. Los ratones iLIRKO se inyectaron con 3x1010 pv/ratón de AAV-AAT-GFP. El hígado se procesó 15 días después de la inyección para el análisis de la expresión de GFP. a: Se muestran las inmunoflorescencias de secciones hepáticas (aumento 10X) y b: pancreáticas (aumento 20X) representativas teñidas con DAPI, GFP o la superposición de ambas, en ratones inyectados con AAV-AAT-GFP (paneles superiores) o con salino (paneles inferiores). c: Análisis morfométrico de la eficiencia de transducción del virus basado en el porcentaje de transducción de hepatocitos. Se representa el porcentaje de células GFP positivas por área. La significación estadística se representa como ratones inyectados con salino vs ratones inyectados con AAV-AAT-GFP *** (p< 0.001). c: Una vez generados los plásmidos se llevó a cabo la producción viral de los AAV-AAT­ IRA y AAV-AAT-IRB que se realizó según se especifica en el apartado 7 correspon­ diente de materiales y métodos. El tropismo hepático se demostró median­ te un ensayo luciferasa in vivo. El transgén de la luciferasa se utilizó para visualizar la distribución relativa del vector en los ani­ males a tiempo real. El ensayo consistía en la cuantificación de la expresión de la enzima luciferasa en ratones inyectados con suero salino o con AAV-luc. Se exa­ minaron imágenes dorsales de los anima­ les (n=4 por grupo) 14 días después de la inyección (Figura 45). Se considera ini­ cio de la expresión cuando la luz liberada por la actividad de la luciferasa se puede distinguir del fondo. Así, los resultados muestran que los animales inyectados con AAV-luc a una dosis 3x1010 partículas virales (pv) desarrollan actividad luciferasa 14 días después de la inyección, mientras que en los animales inyectados con suero salino no se observa expresión. Para evaluar la eficacia de transducción in vivo se llevaron a cabo estudios de microscopía de fluorescencia en hígados de ratones inyectados con AAV-AAT-GFP. Los estudios de expresión se limitaron, por tanto, a tiempos de necropsia. Así, para determinar la dosis que íbamos a utilizar en los experimentos venideros, se llevaron a cabo estudios iniciales en ratones inyec­ tados por la vena de la cola a diferentes dosis. Los hígados de los ratones tras 15 días de la inyección de AAV-AAT-GFP a una dosis de 3x1010 pv/ratón mostraron un alto porcentaje de hepatocitos transduci­ dos, en torno al 90 %. Además, la trans­ ducción no afecta a otros tipos celulares ya que el páncreas de los ratones infecta­ dos con GFP, uno de los órganos propues­ tos como diana para el serotipo 8 de los AAVs, no muestra células GFP positivas (Figura 46). LA EXPRESIÓN SELECTIVA DE LA ISOFORMA A DEL RECEPTOR DE INSULINA MEJORA LA HOMEOSTASIA GLUCÍDICA Para estudiar si las isoformas del IR tienen un papel diferencial en la reversión del fenotipo diabético del ratón iLIRKO, diseñamos el esquema experimental mostrado en la Figura 47. Los AAVs se administraron 20 semanas después del nacimiento de los animales, cuando éstos ya habían desarrollado el fenotipo diabético según muestran los resultados de las curvas de intolerancia a glucosa y resistencia a insulina (Figura 30). La evolución de los ratones se examinó a los 2 y 4 meses tras la inyección de los AAVs. Los animales se sacrificaron 4 meses después de la inyección, es decir, a los 9 meses de edad. Los niveles de ADN genómico del Insr valorado por PCR cuantitativa se midieron en homogenados hepáticos de ratones Control, iLIRKO, iLIRKO IRA e iLIRKO IRB (Figura 48). Los resultados muestran niveles de deleción similares en ratones iLIRKO, iLIRKO IRA e iLIRKO IRB, lo cual indica que la expresión de IR que se observa tras la administración de los AAV es debida a los vectores que éstos transportan y que contienen los transgenes de las isoformas humanas del receptor de insulina. Además, los animales mantienen la expresión de la isoforma que les ha sido administrada cuatro meses después de la correspondiente inyección (Figura 48). De no ser así, los ratones inyectados con la IRA expresarían IRB, puesto que ésta última es la isoforma prevalente en el hígado adulto. A continuación determinamos los niveles de receptor de insulina que se expresaban en el hígado tras la inyección de los AAVs, para descartar una posible sobreexpresión del receptor. La Figura 47. Esquema de administración de los AAVs. Los ratones iLIRKO se inyectaron con 3x1010 pv/ratón del AAV correspondiente a las 20 semanas de edad, una vez alcanzado el fenotipo diabético. Los animales se sacrificaron 28 semanas después de la administración viral. Figura 48. Los AAVs median la recuperación de la expresión de IRA o IRB en el hígado hasta niveles del Control. a: El ADN genómico de ratones de 9 meses de edad Control o iLIRKO inyectados o no con AAV-AAT-IRA o AAV-AAT-IRB se aisló de los hígados y se analizó mediante qPCR para evaluar el grado de deleción del IR a nivel genómico. b: Evaluación de la expresión de las isoformas del receptor de insulina mediante RT-PCR del exón 11 en homogeneizados totales hepáticos de ratones de 9 meses de edad. Se analiza el Insr en los ratones Control y las INSR en iLIRKO IRA y iLIRKO IRB. c: Evaluación de los niveles de IRβ en homogeneizados totales hepáticos por Western blot en ratones de 9 meses de edad Control, iLIRKO IRA, iLIRKO IRB y iLIRKO luc. Se utiliza la β-actina como control de carga. El histograma muestra la cuantificación de la intensidad de las bandas. (a,c) Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo y la significación estadística como vs Control *** (p< 0.001); vs iLIRKO IRA ### (p< 0.001); vs iLIRKO IRB $$$ (p< 0.001). determinación se llevó a cabo por Western blot en homogeneizados hepáticos totales en ratones de 9 meses de edad. Así, 4 meses después de la administración de los AAV-AAT-IRA o AAV-AAT-IRB, la expresión de IRA o IRB respectivamente es similar a la observada en los animales Control. Sin embargo, no se observan cambios en los ratones iLIRKO inyectados con AAV­ AAT-luc, los cuales mantienen una mínima expresión del IR (Figura 48). Aunque la sobreexpresión del IRA se asocia con situaciones patológicas, no se observaron alteraciones en la morfología o estructura hepática tras 4 meses de la inyección viral ni en iLIRKO IRA, ni en iLIRKO IRB, ni en iLIRKO luc. Además, la tinción para Ki-67 no muestra diferencias signifi cativas 125 Figura 49. La expresión de la isoforma A del receptor de insulina en el hígado de los ratones iLIRKO no provoca daño hepático ni un incremento de la proliferación celular. a: Tinción con hematoxilina/eosina representativa de secciones hepáticas de ratones Control, iLIRKO, iLIRKO luc (paneles superiores); iLIRKO IRA e iLIRKO IRB (paneles inferiores) de 9 meses de edad. Aumento 20X. b: Tinción representativa para Ki-67 en secciones hepáticas de ratones Control, iLIRKO, iLIRKO luc (paneles superiores); iLIRKO IRA e iLIRKO IRB (paneles inferiores) de 9 meses de edad. Se muestra también un Control positivo para Ki-67 tras 48 h de la hepatectomía parcial (panel inferior recuadrado). Aumento 40X. c: Cuantificación de la tinción para Ki-67 en secciones hepáticas. Los datos se representan como medias ± SEM del nº de células positivas por campo. Figura 50. La expresión in vivo de la isoforma A del receptor de insulina en hepatocitos revierte la resistencia a insulina y la tolerancia a glucosa a largo plazo. a: Test de tolerancia a glucosa intraperitoneal (panel superior) y de tolerancia a insulina (panel inferior) en ratones Control e iLIRKO de 5 meses de edad (n=10 animales por grupo). (b,c) A esos mismos 10 ratones iLIRKO se les administran AAV- AAT-IRA o AAV-AAT-IRB (n=5 por isoforma) a los 5 meses de edad. Test de tolerancia a glucosa (panel superior) e insulina intraperitoneal (panel inferior) 2 y 4 meses tras la inyección. Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo y la significación estadística se representa como Control vs iLIRKO * (p< 0.05), ** (p< 0.01), *** (p< 0.001); iLIRKO vs iLIRKO IRA #(p< 0.05), ##(p< 0.01), ### (p< 0.001); iLIRKO vs iLIRKO IRB $ (p< 0.05), $$ (p< 0.01), $$$ (p< 0.001). entre los distintos grupos, lo que indica que no hay una proliferación anómala de las células. El rango de proliferación se mantiene bajo en todos los casos (Figura 49). Así, nuestros datos indican que la expresión a largo plazo mediada por AAVs de IRA o IRB parece una estrategia no dañina y segura para el hígado. Teniendo en cuenta que la expresión selectiva de la isoforma A del receptor de insulina aumenta la captación de glucosa en hepatocitos neonatales, quisimos com­ probar si la expresión selectiva de una u otra isoforma en ratones iLIRKO modifica la homeostasia glucídica. En primer lugar, realizamos test de tolerancia a glucosa e insulina a los ratones iLIRKO de 5 meses que iban a ser inyectados con AAV-AAT­ IRA o AAV-AAT-IRB (4 ratones con cada vector) (Figura 50a). De este modo se puede observar específicamente la evolución de los ratones inyectados. Así, los test de tolerancia a glucosa e insulina que se muestran son a 2 y 4 meses tras la admi­ nistración viral, es decir, 7 y 9 meses de edad respectivamente (Figura 50b,c). Tanto la intolerancia a glucosa como la resisten­ cia a insulina mejora con la expresión de una u otra isoforma del IR. Sin embargo, 2 meses después de la inyección, IRA es capaz de restablecer los niveles de gluco­ sa en sangre similares a los observados en animales Control. Además, estas dife­ rencias entre iLIRKO IRA e iLIRKO IRB se mantienen 4 meses después de la admi­ nistración de los AAVs. Los resultados confirman que IRA parece ser más efec­ tiva que la isoforma B a la hora de res­ tablecer la homeostasia glucídica en los ratones iLIRKO. Quisimos comprobar si el mismo mecanis­ mo que rige en los hepatocitos neonatales para aumentar la captación de glucosa, asociación del GLUT2 con el IR, se confir­ maba en nuestro modelo in vivo. Para ello realizamos ensayos de inmunoprecipita­ ción con anticuerpos anti-GLUT2 con pos­ terior Western blot frente a la subunidad β del IR en homogeneizados hepáticos tota­ les de ratones de 9 meses de edad. Los resultados obtenidos muestran una mayor asociación estadísticamente significati­ va entre IRA y GLUT2 que la observada entre IRB y GLUT2 en los correspondien­ tes ratones iLIRKO IRA o iLIRKO IRB. Se muestra el histograma en el que se repre­ senta la cuantificación de la intensidad de las bandas correspondientes (Figura 51). Figura 51. La isoforma A del receptor de insulina se asocia con el GLUT2 in vivo. Western blot (WB) representativo de IRβ y GLUT2 en homogeneizados totales hepáticos en ratones de 9 meses de edad iLIRKO IRA e iLIRKO IRB sometidos, previamente, a inmunoprecipitación (IP) con GLUT2. El histograma muestra la cuantificación de la intesidad de las bandas. Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo (n=4 por isoforma) y la significación estadística como iLIRKO IRA vs iLIRKO IRB δ (p< 0.05). 127 LA EXPRESIÓN DE IRA EN EL HÍGADO INDUCE UNA DISMINUCIÓN EN LA MASA DE CÉLULA β La mejora de la homeostasia glucídica debida a la expresión de IRA en los ratones iLIRKO trae como consecuencia directa la disminución de los niveles de insulina en plasma y la regresión de la masa de célula β pancreática. En concreto, los niveles de insulina en plasma en iLIRKO IRA dismi­ nuyen de forma significativa 2 meses des­ pués de la administración viral (7 meses de edad) en comparación con los ratones iLIRKO a la misma edad. Sin embargo, los ratones iLIRKO IRB mantienen elevados niveles de insulina en plasma, similares a los de los ratones iLIRKO sin inyectar. Ambos resultados se mantienen a los 4 meses (Figura 52). La hiperinsulinemia observada en los ratones iLIRKO se correlaciona con un Figura 52. La expresión de la isoforma A del receptor de insulina en el hígado de los ratones iLIRKO disminuye la hiperinsulinemia. Niveles de insulina en plasma en animales de 9 meses de edad ayunados durante 16 horas. Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo (n=5) y la significación estadística como iLIRKO vs iLIRKO IRA # (p< 0.05), ## (p< 0.01). aumento significativo de la masa de célula β. Este incremento significativo es debido exclusivamente a un aumento en el núme­ ro de islotes en comparación con los rato­ nes Control, ya que no se observa ningún cambio en la distribución de los islotes por tamaño. En el caso de los ratones iLIRKO IRA, los resultados muestran una regre­ sión de la hiperplasia de la masa de célula hasta valores similares a los de los ratones Control. En este caso, la disminución en la masa de célula β se debe a un menor número de islotes, similares a los del Con­ trol. iLIRKO IRA no muestra cambios sig­ nificativos en la distribución de islotes por tamaños en comparación con los ratones Control o iLIRKO. Los ratones inyectados con la isoforma B mantienen el incremento de la masa de célula β en niveles similares a los de iLIRKO. Sin embargo, el número de islotes está significativamente dismi­ nuido en comparación con iLIRKO. Por tanto, el mantenimiento de la hiperplasia sólo puede explicarse por el cambio en el tamaño de los islotes, favorable a los de tamaño mediano (1000-10000 μm2), en los ratones iLIRKO IRB. Los resultados mos­ trados anteriormente aportan claras evi­ dencias de que la expresión de IRA o IRB en el hígado es un hecho crucial para el control de la homeostasia glucídica y, por tanto, de la masa de célula β (Figura 53). Para caracterizar más a fondo los meca­ nismos mediante los cuales se produce la regresión de la hiperplasia de la célu­ la β pancreática en los ratones iLIRKO IRA, estudiamos el marcador de prolifera­ ción celular PCNA en cortes de páncreas mediante cotinciones con insulina (para marcar los islotes), DAPI (ya que el PCNA sólo es indicativo de proliferación cuan­ do se encuentra en el núcleo celular) y PCNA. Hay un aumento significativo en la expresión de PCNA en núcleo en los rato­ nes iLIRKO en comparación con ratones Control e iLIRKO IRA. Sin embargo, en los Figura 53. La expresión in vivo de la isoforma A del receptor de insulina en el hígado de los ratones iLIRKO revierte la hiperplasia de célula β. a: Tinción representativa con insulina en secciones pancreáticas de ratones Control, iLIRKO (paneles superiores); iLIRKO IRA e iLIRKO IRB (paneles inferiores) de 9 meses de edad. Aumento 10X. b: Masa de célula β c: Densidad de islotes. d: Distribución de islotes por tamaño. Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo (n=5) y la significación estadística como Control vs iLIRKO * (p< 0.05), *** (p<0.001); iLIRKO vs iLIRKO IRA # (p< 0.05); iLIRKO IRA vs iLIRKO IRB $ (p< 0.05), $$ (p< 0.01), $$$ (p< 0.001). ratones iLIRKO IRB observamos ausencia total de células β positivas para PCNA con localización nuclear, lo que sugiere que el incremento de masa de célula β observado en estos ratones puede estar relacionado con la presencia de células β hipertrófi cas (Figura 54). Una de las moléculas que ha sido pro­ puesta en trabajos previos del grupo como mediadora en el eje hígado-páncreas es el IGF-I. Por tanto, analizamos por Western blot el IGF-I presente en los homogeneiza­ dos hepáticos de ratones Control, iLIRKO, iLIRKO IRA e iLIRKO IRB de 9 meses de edad. Los resultados muestran un incre­ mento significativo en los ratones iLIRKO en comparación con el Control. La expre­ sión hepática de la isoforma A consigue revertir ese aumento, disminuyendo los niveles hasta los del Control. Sin embar­ go la isoforma B no es capaz de revertir- los (Figura 55). Estos resultados sugieren una correlación entre la intolerancia a la glucosa, aumento de masa de célula β y sobreexpresión de IGF-I. Por otro lado, teniendo en cuenta que el IGF-I es uno de los principales factores implicados en la proliferación celular, que se sintetiza fun­ damentalmente en el hígado y que, ade­ más, se une con alta afinidad al IRA, una disminución de éste en el hígado es favo­ rable para evitar cualquier tipo de disfun­ ción hepática generada por la formación de un bucle autocrino. 129 Figura 54. La expresión in vivo de la isoforma A del receptor de insulina en el hígado de los ratones iLIRKO revierte la hiperplasia de célula β porque disminuye la proliferación. a: Tinción representativa con insulina (rojo), PCNA (verde) y DAPI (azul) en secciones pancreáticas de ratones iLIRKO IRA (panel superior) e iLIRKO IRB (panel inferior) de 9 meses de edad. Aumento 40X. b: Cuantificación de las células β positivas que presentan localización nuclear para PCNA. Los datos se presentan como % respecto al total ± SEM para cada grupo (n=5) y la significación estadística como Control vs iLIRKO * (p< 0.05) *** (p< 0.001); iLIRKO vs iLIRKO IRA ### (p< 0.001); iLIRKO IRA vs iLIRKO IRB $$$ (p< 0.001). Figura 55. La expresión de la isoforma A del receptor de insulina disminuye la expresión hepática de IGF-I. a: Western blot representativo de IGF-I en homogeneizados totales hepáticos en ratones de 9 meses de edad Control, iLIRKO, iLIRKO IRA e iLIRKO IRB. Se utiliza la β-actina como control de carga. El histograma muestra la cuantificación de la intensidad de las bandas. (a,c) Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo (n=5) y la significación estadística como vs Control *** (p< 0.001). EFECTOS DE LA EXPRESIÓN DE IRA EN EL HÍGADO EN EL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO Puesto que una de las principales contri­ buciones a la fisiopatología de la diabetes tipo 2 es la disminución de las reservas de glucosa, es de gran relevancia cono­ cer el efecto fisiológico de las isoformas en la regulación del metabolismo del glu­ cógeno en un contexto in vivo, concreta­ mente en los animales iLIRKO, iLIRKO IRA e iLIRKO IRB. Tras 24 h de ayuno segui­ das de 1 h de realimentación, los rato­ nes iLIRKO muestran un ligero, aunque no significativo, descenso en el conteni­ do en glucógeno en comparación con los ratones Control. Sin embargo, los ratones iLIRKO IRA muestran aumentado el con­ tenido en glucógeno de forma significativa en comparación con los ratones Control o iLIRKO, mientras que los ratones iLIRKO IRB mostraron valores similares al Control. A continuación se llevó a cabo el estudio de las principales proteínas implicadas en la ruta de la síntesis de glucógeno en rato­ nes Control, iLIRKO, iLIRKO IRA e iLIRKO IRB en las condiciones anteriores de ayuno y realimentación. Así, los niveles totales de GYS2 están significativamente dismi­ nuidos en iLIRKO IRA en comparación con iLIRKO IRB. Sin embargo, la relación pGYS2/GYS2 fue similar en los dos gru­ pos, lo que sugiere una fuerte regulación Figura 56. Regulación diferencial del metabolismo del glucógeno por las isoformas del receptor de insulina en los ratones iLIRKO. La regulación del metabolismo del glucógeno se estudió en ratones Control, iLIRKO, iLIRKO IRA e iLIRKO IRB tras 24 h de ayuno seguidas de 1 h de realimentación. a: Contenido en glucógeno. b: Western blot representativo con los anticuerpos indicados en la figura. GYS2 y GSK3 α/β se muestran como control de carga. Los histogramas muestran la cuantificación de la intensidad de las bandas. (a,b) Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo (n=5 por grupo) y la significación estadística como * (p< 0.05), ** (p< 0.01) vs Control; † (p< 0.05) vs iLIRKO; §§ (p< 0.01), §§§ (p< 0.001) vs iLIRKO IRA. covalente de esta enzima en los anima­ les iLIRKO IRA. Además, estos animales presentan unos niveles de fosforilación de GSK3α/β significativamente aumentados en comparación con los ratones Control, iLIRKO e iLIRKO IRB (Figura 56). Para comprobar que la falta de efecto o el efecto disminuido de la isoforma B en comparación con la A no se debía en nin­ gún caso a la ausencia de señalización por parte de éste, se comprobó la activa­ ción del IRB y su cascada de señalización con insulina en los ratones iLIRKO IRB (Figura 57). ESTUDIO DEL PAPEL DIFERENCIAL DE LAS ISOFORMAS DEL RECEPTOR DE INSULINA in vitro EN RELACIÓN AL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO El siguiente paso fue estudiar en profundi­ dad qué efectos se producen en el meta­ bolismo del glucógeno la variación del patrón de expresión de las isoformas del receptor de insulina. Para ello trabajamos con cuatro líneas celulares de hepatocitos neonatales: IRloxP, IRKO, IRA e IRB. En primer lugar, se comprobó la deleción del exón 4 del Insr por RT-PCR en mRNA pro­ cedente de las células IRloxP e IRKO, así como la ausencia/presencia del exón 11 mediante RT-PCR en los hepatocitos IRA e IRB respectivamente (Figura 58). Además, 131 Figura 57. La insulina activa al receptor de insulina y su cascada de señalización en ratones iLIRKO IRB. a: Western blot (WB) representativo de la subnidad IRβ en homogeneizados totales hepáticos de ratones de 9 meses de edad iLIRKO IRB. b: WB representativo de la activación de IR por insulina en homogeneizados totales hepáticos de ratones de 9 meses de edad iLIRKO IRB inyectados con salino o con insulina (1U/kg) (n=4 por grupo). Las muestras se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos frente p-Tyr o IRβ y WB frente IRβ o p-Tyr respectivamente. c: WB representativo de la activación de la cascada de señalización de insulina en en homogeneizados totales hepáticos de ratones de 9 meses de edad iLIRKO IRB inyectados con salino o con insulina (1U/kg) (n=4 por grupo). confirmamos la ausencia de expresión del IR en las células IRKO mediante Western blot (Figura 59). A continuación estudiamos las principales proteínas implicadas en el metabolismo del glucógeno de la cascada de señalización de la insulina en condiciones de cultivo, es decir, con medio con 25 mM de glucosa y suero, para observar cualquier cambio en el patrón de expresión dependiente, únicamente, de la presencia o ausencia del IR o de la isoforma del IR expresada. Se observa un aumento significativo en la expresión de IGF-IR en los hepatoci­ tos IRKO o IRB en comparación con los IRloxP o IRA. Además, la expresión de IGF-IR está significativamente disminuida en las células IRKO en comparación con las IRloxP, aunque no se observan cam­ bios significativos en los hepatocitos IRA ni IRB. Más directamente relacionado con Figura 58. Caracterización de las líneas celulares de hepatocitos. Se aisló el ARN total para ser analizado por RT-PCR. a: Se evaluó la deleción del exón 4 de Insr en hepatocitos IRloxP e IRKO. b: Se determinó la presencia/ausencia del exón 11 de INSR en hepatocitos IRA e IRB. el metabolismo de la glucosa, la expresión de la GCK se encuentra significativamente aumentada en los hepatocitos IRA y sig­ nificativamente disminuida en los IRB en comparación con los IRloxP. La expresión de la GYS2 en hepatocitos IRB es signifi­ cativamente mayor que en IRloxP o IRA. Sin embargo, la expresión de p70S6K está significativamente incrementada en IRKO, IRA e IRB en comparación con las célu­ las IRloxP. La expresión de IRS1 en las células IRKO se encuentra significativa­ mente disminuida en comparación con las IRloxP; sin embargo, en IRB se encuentra significativamente aumentado en com­ paración con cualquiera de las otras tres líneas celulares estudiadas. Lo contrario ocurre con el IRS2 en las células IRB. Por último, no se encontraron diferencias sig­ nificativas entre las cuatro líneas celulares estudiadas en los niveles de IGF-II, PKB, p44/42 MAPK, GSK3α/β, GLUT1 o GLUT2 (Figura 59). Para continuar con el estudio del papel diferencial de las isoformas del IR en el Caracterización de las principales proteínas de la cascada de señalización de insulina en las líneas celulares de Figura 59. Caracterización de las principales proteínas de la cascada de señalización de insulina en las líneas celulares de hepatocitos. a: Western blot representativo en hepatocitos IRloxP, IRKO, IRA e IRB. b: Los histogramas muestran la cuantificación de la intensidad de las bandas. Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo (n=4) y la significación estadística como vs IRloxP * (p< 0.05), ** (p< 0.01), *** (p< 0.001); vs IRA † (p< 0.05). metabolismo del glucógeno, estudiamos su respuesta a diferentes dosis de insu­ lina. Las cuatro líneas de hepatocitos se deprivaron de suero durante 5 h y, duran­ te este tiempo, se mantuvieron en medio con 5.5 mM de glucosa. A continuación se estimularon con dosis crecientes de insulina (0,1; 1; 10 nM) durante 5 min. Las dos principales cascadas de señalización activadas por insulina descritas hasta la fecha son la vía de las MAPKs y PKB. En concreto, después de ser estimuladas con insulina 10 nM, en las células IRloxP, PKB se observó un incremento significativo en 133 Figura 60.La cascada de señalización de la insulina está favorecida en hepatocitos IRA vs IRB. a: Respuesta a diferentes dosis de insulina (0-10 nM/L) en la fosforilación de PKB, p70S6K, p44/42 MAPK, GYS2 y GSK3α/β en hepatocitos IRloxP, IRKO, IRA and IRB. Las células se deprivaron de suero durante 5 horas and, a continuación, se estimularon con insulina (0-10 nM/L) durante 5 minutos. Se muestran los Western blot representativos de cinco experimentos independientes (n=6). Como control de carga se utilizaron PKB, p70S6K, p44/42 MAPK, GYS2 and GSK3α/β totales. b: Los histogramas muestran la cuantificación de la intensidad de las bandas. Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo (n=6) y la significación estadística como * (p< 0.05), ** (p< 0.01), *** (p< 0.001) vs IRloxP; † (p< 0.05), †† (p< 0.01), ††† (p< 0.001) vs IRKO; ‡ (p< 0.05), ‡‡ (p< 0.01), ‡‡‡ (p< 0.001) vs IRA; § (p< 0.05), §§ (p< 0.01), §§§ (p< 0.001) vs IRB. Figura 61. Regulación diferencial y acumulación de glucógeno por las isoformas del receptor de insulina. a: Medida de la síntesis de glucógeno en condiciones basales. b: Medida del contenido en glucógeno en condiciones basales. c: Medida de la actividad de GYS2 en hepatocitos estimulados con insulina a 10 nM durante 15 min. d: Medida de la actividad de PYGL en hepatocitos en medio de 5.5 mM de glucosa. e: Efecto de la glucosa 5.5 mM, en células deprivadas de suero, en la fosforilación de PYGL. PYGL es el control de carga. e: Medida de la síntesis y f: Contenido en glucógeno. Los datos se representan como medias ± SEM para cada grupo experimental (n=4). (a-d) Significatividad estadística evaluada mediante el test T-Student * (p< 0.01), ** (p< 0.01), *** (p< 0.001) vs IRloxP; †† (p< 0.01), ††† (p< 0.001) vs IRA. (f,g) Significatividad estadística evaluada mediante el test ANOVA *** (p< 0.001) vs IRA en condiciones basales. su fosforilación si se compara con la situa­ ción basal. Como era de esperar, las célu­ las IRKO no responden a ninguna de las dosis de insulina probadas. En cuanto a las isoformas, la activación de PKB en los hepatocitos IRA es mayor que en los IRB. La activación de p70S6K es mayor en las células IRKO que en IRloxP y, de nuevo, mayor en IRA que IRB. En cuanto a la vía de las MAPKs, p44/42 se encuentran sig­ nificativamente activadas en la dosis más alta de insulina empleada en comparación con la situación basal en los hepatocitos IRloxP e IRA. De nuevo no hay estimula­ ción en las células deficientes de IR. Esta vía se encuentra menos activa en células IRB que IRA. La estimulación por insulina de la inhibición (fosforilación) de GSK3α/β es mayor en las células IRA a dosis de 10 nM que en cualquiera de las otras tres líneas estudiadas. Teniendo en cuenta estos resultados, estudiamos la fosfori­ lación de GYS en los residuos Ser641 y Ser645, susceptibles de fosforilación por GSK3α/β. Sorprendentemente, GYS2 está menos fosforilada en las células IRKO, lo que las predispone a sintetizar glucóge­ no. En cuanto a las isoformas, GYS2 está menos fosforilada en respuesta a insulina en los hepatocitos IRA que IRB (Figura 60). En concordancia con la fosforilación de GYS2, la síntesis de glucógeno en con­ diciones basales está significativamente aumentada en las células IRKO en compa­ ración con las IRloxP, ya que la actividad de 135 Figura 62. Regulación diferencial de la señalización de insulina en el metabolismo del glucógeno por las isoformas del receptor. Efecto de la insulina sobre la fosforilación de GYS2, GSK3α/β y PYGL en hepatocitos IRA e IRB. Las células se deprivaron de suero en medio con 5.5mM de glucosa durante 5 horas y, a continuación, se estimularon con insulina a 100 nM durante 5 min. GYS2, GSK3α/β y PYGL se muestran como control de carga. Los histogramas muestran la cuantificación de la intensidad de las bandas. Los datos se representan como medias ± SEM para cada grupo experimental (n=5) y la significación estadística como ** (p< 0.01), *** (p< 0.001) vs condiciones basales. la GYS2 se encuentra significativamente incrementada. Sin embargo, el contenido en glucógeno no muestra diferencias sig­ nificativas aunque la actividad de la PYGL está también incrementada en las células IRKO en comparación con las IRloxP. Ade­ más, aunque los niveles de PYGL total son similares entre las células IRloxP e IRKO, en estas últimas ésta tiende a estar más fosforilada, lo que sugiere una incrementa­ da degradación de glucógeno. En cuanto a las isoformas, la síntesis de glucógeno en las células IRA está significativamen­ te aumentada en condiciones basales en comparación con las IRloxP. Sin embargo, no hay diferencias significativas entre IRB e IRloxP. De acuerdo con los resultados de la síntesis, el contenido en glucógeno de las células IRA está aumentado signi­ ficativamente en comparación con cual­ quiera de las otras tres líneas estudiadas (Figura 61). En condiciones de estimulación con insu­ lina a 100 nM durante 6 h, se observa un incremento significativo tanto en la sínte­ sis como en el contenido en glucógeno en las células IRA en comparación con IRKO o IRB. De acuerdo con estos resultados de respuesta a insulina, la GYS2 se defos­ forila tanto en hepatocitos IRA como IRB tras la estimulación con insulina a 100 nM durante 5 min. Sin embargo, en las mismas condiciones se observa una menor fosfo­ rilación en GSK3α/β así como en PYGL en los hepatocitos IRB, lo que sugiere que las células IRA e IRB tienen una tasa de reem­ plazo de glucógeno distinta (Figura 62). Además de las modificaciones covalentes, la GYS hepática se regula por G6P, acti­ vador alostérico positivo. Los niveles de glucosa incluso pueden provocar cambios en la expresión de algunas proteínas de la vía de la insulina. Para poder determinar de forma independiente los efectos de la glucosa de los de la insulina en la activa­ ción de la GYS2, analizamos los efectos de la ausencia total de glucosa, normog­ lucemia (5.5 mM) e hiperglucemia (25 mM) en hepatocitos IRA e IRB en ausencia de insulina. En estas condiciones, aunque los niveles totales de GSK3α/β son similares en células IRA e IRB, la fosforilación de la subunidad α en IRB no ocurre a ninguna de las tres concentraciones de glucosa ensayadas. En coherencia con lo anterior, GYS2 se encuentra menos fosforilada en Figura 63. Regulación diferencial de la glucosa en la señalización del metabolismo del glucógeno por las isoformas del receptor de insulina. Efecto de la glucosa en la fosforilación de GYS2 y GSK3α/β en hepatocitos IRA e IRB. Las células se deprivaron de suero en medio con 5.5 mM o 25 mM de glucosa durante 5 horas. GYS2 y GSK3α/β se muestran como control de carga. Los histogramas muestran la cuantificación de la intensidad de las bandas. Los datos se representan como medias ± SEM para cada grupo experimental (n=5) y la significación estadística como ** (p< 0.01), *** (p< 0.001) vs IRA en condiciones basales; †† (p< 0.01), ††† (p< 0.001) vs IRB en condiciones basales; ‡‡ (p< 0.01) vs IRA a 5.5 mM de glucosa; §§§ (p< 0.001) vs IRA a 25 mM de glucosa. hepatocitos IRA en ausencia de glucosa en comparación con IRB en las mismas condiciones; sin embargo, en condiciones de hiperglucemia, muestran niveles de fosforilación similares (Figura 63). IMPORTANCIA DEL IGF-IR EN EL METABOLISMO LIPÍDICO HEPÁTICO En el hígado, la resistencia a insulina no sólo afecta a la incapacidad de la insulina a activar su receptor o a la supresión incompleta de la producción de glucosa hepática, sino también a la lipogénesis. Por tanto, el estudio de la regulación de estas vías metabólicas en un ambiente de resistencia a insulina in vivo, en los ratones iLIRKO, resulta fundamental. Además, puesto que el receptor de IGF-I tiene un papel metabólico clave en la síntesis lipídica (Aguirre et al., 2016), y su receptor podría compensar las acciones del IR en ausencia de éste, estudiamos también la regulación metabólica lipídica en el ratón iLIRIGFIRKO (inducible Liver Insulin Receptor Insulin-like Growth Factor type I Receptor KnockOut) al que me referiré, para simplificar, como DKO (Doble KnockOut). Estos ratones muestran un perfil de intolerancia a glucosa y resistencia a insulina menos acusado que el de los ratones iLIRKO (Figura 64a,b). Además, los niveles de insulina circulantes en estos ratones tienden a ser más altos que los de los ratones Control, pero no alcanzan la hiperinsulinemia de los ratones iLIRKO (Figura 64c). Nuestros resultados muestran una marcada disminución en el contenido en triglicéridos hepáticos, aunque no en suero, en los ratones DKO en comparación con los ratones Control o iLIRKO en condiciones de 24 h de ayuno + 1 h de realimentación (Figura 65). Para entender esta bajada, investigamos la ruta de la lipogenesis de novo (DNL) en las mismas condiciones. Empezamos analizando la expresión de mRNA de dos de los principales genes lipogénicos (Figura 66). No encontramos diferencias significativas entre los tres genotipos estudiados en cuanto a los niveles de mRNA de Srebp-1c. Sin embargo, los niveles de Evol6, elongasa implicada en la 137 Figura 64. Efectos metabólicos de la eliminación del receptor de IGF-I en el hígado. a: Test de tolerancia a glucosa intraperitoneal en ratones Control, iLIRKO y DKO de 3, 5 y 9 meses de edad (n=10 animales por grupo). b: Test de tolerancia a insulina intraperitoneal en ratones Control, iLIRKO y DKO de 3, 5 y 9 meses de edad (n=10 animales por grupo). c: Niveles de insulina en plasma en animales de 5 meses de edad ayunados durante 16 horas. Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo (n=5). La significación estadística se expresa como Control vs iLIRKO *** (p< 0.001). Figura 65. Los ratones DKO presentan un defecto significativo en el contenido en triglicéridos hepático. a: Triglicéridos en suero. b: contenido en triglicéridos hepáticos en ratones Control, iLIRKO y DKO de 5 meses de edad ayunados 24 h seguido de 1 h de realimentación. Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo (n=5 animales por grupo) y la significación estadística como Control vs DKO ## (p< 0.01); iLIRKO vs DKO † † (p< 0.01). Figura 66. Expresión de ARNm de factores lipogénicos. Se midió la expresión relativa del ARNm por qPCR de Gck, Lpk, Srbp-1c y Evol6 en hígados de ratones Control, iLIRKO y DKO de 5 meses de edad ayunados 24 h seguido se 1 h de realimentación. Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo (n=5 animales por grupo) y la significación estadística como Control vs iLIRKO * (p< 0.05), ** (p< 0.01), *** (p< 0.001); Control vs DKO # (p< 0.05), ## (p< 0.01), ### (P< 0.001); iLIRKO vs DKO † (p< 0.05), (p< 0.01), (p< 0.001). † † † † † Figura 67. La expresión de la glucoquinasa está reducida en los ratones DKO. Western Blot representativo de la medida de la expresión de GCK en hígados de ratones Control, iLIRKO y DKO de 5 meses de edad ayunados 24 h seguido de 1 h de realimentación. El histograma muestra la cuantificación de la intensidad de las bandas. Los datos se presentan como media < SEM para cada grupo (n=4 animales por grupo) y la significación estadística como Control vs DKO # (p< 0.05); iLIRKO vs DKO † (p< 0.05) síntesis de ácidos grasos de cadena larga, se encuentran disminuidos en los ratones DKO en comparación con los ratones Control o iLIRKO. Por otro lado, tal y como se espera en un proceso de DNL no alterado, los niveles de Gck de ratones DKO se reducen en comparación con los ratones de otros genotipos. Los resultados obtenidos se confirmaron además a nivel de proteína (Figura 67). Sin embargo, los niveles de Pck, se mantienen elevados con respecto al Control e iLIRKO. Estos resultados parecen indicar que la bajada en triglicéridos hepáticos en los ratones DKO podría deberse a la reducción en Gck y Evol6. Para profundizar en el metabolismo lipí­ dico, evaluamos el contenido en coleste­ rol hepático y en suero. Los ratones DKO muestran un aumento significativo en el contenido en colesterol hepático compa­ rado con los ratones Control e iLIRKO. Sin embargo, los niveles en suero no se ven incrementados en comparación con los ratones Control. Al contrario que los rato­ nes DKO, los ratones iLIRKO presentan igual contenido hepático de colesterol que 139 Figura 68. Efectos metabólicos de la eliminación del receptor de insulina en el hígado. a: Colesterol en suero. b: contenido en colesterol hepático en ratones Control, iLIRKO y DKO de 5 meses de edad ayunados 24 h seguido de 1 h de realimentación. Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo (n=5 animales por grupo) y la significación estadística como vs iLIRKO *** (p< 0.005); vs DKO (p< 0.05). los ratones Control, pero un significativo aumento en suero (Figura 68). Para enten­ der en profundidad qué ocurría en el suero de esos animales, analizamos las partícu­ las HDL, ya que son la forma mayoritaria de colesterol circulante en el ratón. El aná­ lisis por FPLC (Fast protein liquid chroma­ tography) del suero muestra una reducción del, aproximadamente, 50 % de µg de colesterol por fracción en las partículas HDL de los ratones DKO en comparación con los ratones Control o iLIRKO. Ade­ más, el tamaño de estas partículas estaba disminuido ya que el pico de elución ocu­ rría en la fracción 44, mientras que en los ratones Control e iLIRKO ocurre en la 42. En concordancia con los datos de coles­ terol en suero, los ratones iLIRKO presen­ tan mayor contenido en colesterol que los ratones Control y un ligero incremento en el número de partículas HDL más peque­ ñas (Figura 69a). Para saber si la reducción en los niveles de colesterol en suero era debida a un menor contenido de coleste­ rol por partícula o a un menor número de partículas totales, evaluamos el perfil de expresión de ApoA. Como sólo una partí­ cula de ApoA se expresa por molécula de HDL, la cantidad de HDL es directamente proporcional a la de ApoA. Para una prime­ ra evaluación, agrupamos las fracciones pertenecientes al mismo perfil según el patrón obtenido para el FPLC en 5 grupos (A: fracciones 27-30, B: fracciones 31-33, C: fracciones 34-36, D: fracciones 37-41, E: fracciones 42-44). En concordancia con el perfil obtenido por FPLC, los niveles de ApoA disminuyeron en los ratones DKO en comparación con ratones Control e iLIRKO y su pico de expresión se despla­ zó al grupo E (Figura 69b). Analizamos de nuevo el contenido de ApoA, esta vez por fracción (39, 41, 42, 44 y 45) y de nuevo observamos el mismo efecto, menor con­ tenido en los ratones DKO, lo que impli­ caba un menor número de partículas HDL en estos animales. Además, este análisis minucioso nos mostró que la presencia de ApoA era mayor en las fracciones 41, 42, 44 y 45 de los ratones iLIRKO en compa­ ración con los ratones Control, también en consonancia con los resultados de la FPLC. Estos resultados nos indicaban que los ratones iLIRKO tienen mayor número de partículas HDL (Figura 69c). Los análisis por FPLC mostraron también una reducción de contenido en colesterol Figura 69. Los ratones DKO presentan un menor contenido en colesterol en las partículas HDL y un menor número de éstas. a: El suero de los ratones se analizó por FPLC y se midió el contenido en colesterol de cada una de las fracciones. Los datos se presentan como una media de 4 ratones por genotipo ya que, para llevar a cabo la FPLC, se hizo un pool con el suero de los 4. (b,c) Los niveles de las apolipoproteínas del suero sujeto al fraccionamiento mediante FPLC se analizaron por WB. b: se analiza un pool de fracciones por pocillo (indicadas con número) con el mismo volumen de cada fracción por grupo (indicados con letras) (A:28, 29, 30; B: 31, 32, 33; C: 34, 35, 36, 37; D: 38, 39, 40, 41, 42; D: 43, 44, 45, 46). c: se analizan las apolipoproteínas de la fracción que se indica. Figura 70. Expresión de ARNm de factores implicados en el transporte reverso del colesterol. Se midió la expresión relativa del ARNm por qPCR de Abca1, ApoE, Lcat y Scarb1 en hígados de ratones Control, iLIRKO y DKO de 5 meses de edad ayunados 24 h seguido se 1 h de realimentación. Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo (n=5 animales por grupo) y la significación estadística como Control vs iLIRKO * (p< 0.05), ** (p< 0.01), *** (p< 0.001); Control vs DKO # (p< 0.05), ## (p< 0.01), ### (P< 0.001). 141 Figura 71. La expresión de SRB1 en hígado no varía entre los ratones Control, iLIRKO o DKO. Western Blot representativo de la medida de la expresión de SRB1 en hígados de ratones Control, iLIRKO y DKO de 5 meses de edad ayunados 24 h seguido de 1 h de realimentación. El histograma muestra la cuantificación de la intensidad de las bandas. Los datos se presentan como media ± SEM para cada grupo (n=4 animales por grupo). en las partículas LDL y, en concordancia, en los niveles de ApoB100 y ApoB48, prin­ cipales lipoproteínas de las partículas LDL y VLDL. Resulta interesante que los nive­ les de ApoE por grupos se vean reducidos en el DKO, pero estén más aumentados en las fracciones 39, 41, 42 y 44 (Figura 69c). Por tanto, aunque la falta del IR e IGF-IR en el hígado no altere los niveles totales de colesterol en suero, produce una distri­ bución alterada del perfil lipoproteico. Para continuar con la caracterización de las partículas HDL y ahondar en los meca­ nismos de por qué éstas tienen un perfil diferente según el genotipo a estudiar, investigamos el transporte reverso del colesterol, en el cual están directamente implicadas estas partículas. El colesterol se transporta a través de ABCA1 desde diferentes tejidos, entre los que se incluye el hígado, a las partículas HDL nacientes. SRB1 facilita la captación de los ésteres de colesterol por el hígado de las HDL. Este proceso facilita el movimiento del coles­ terol desde los tejidos periféricos hacia el hígado para su excreción. Así, estudiamos los niveles de ARNm por PCR cuantitati­ va de los principales genes implicados en este proceso. No se observan cambios significativos entre los tres genotipos estu­ diados ni en ApoE ni en Lcat. Los niveles de Abca1 en los ratones DKO son signifi­ cativamente más bajos que los del Con­ trol. En cuanto a Scarb1, sus niveles están significativamente aumentados en ratones iLIRKO en comparación con ratones Con­ trol o DKO (Figura 70). Sin embargo, no se observan diferencias significativas a nivel de proteína SRB1 (Figura 71). El defecto en Abca1, junto con otros factores no estu­ diados, podría explicar el defecto en partí­ culas HDL nacientes así como el aumento en el contenido de colesterol hepático en los ratones DKO (Figura 70). En cuanto a los animales iLIRKO, sus niveles normales de SRB1 no explican el acúmulo de partí­ culas HDL con gran contenido en coleste­ rol por lo que este efecto requiere estudios más en profundidad. 08/ discusión 147 iLIRKO, modelo de progresión a la diabetes tipo 2 sin daño hepático La diabetes tipo 2 es una enfermedad poligénica que implica diversos polimor­ fismos en diferentes genes que codifican para proteínas que participan en la cas­ cada de señalización de la insulina, en su secreción y en su metabolismo inter­ medio (Saltiel y Kahn, 2001). Los mode­ los animales han conseguido proporcionar conocimientos moleculares del papel de diferentes vías de señalización implica­ das en la modulación de la homeostasia glucídica. Cómo y cuáles de esos genes contribuyen a la enfermedad en humanos requiere una investigación más en profun­ didad. Estos polimorfismos, en combina­ ción con factores ambientales concretos y un determinado estilo de vida, participan también en el desarrollo de la diabetes tipo 2 y dan lugar a una manifestación comple­ ja de la enfermedad. Sin embargo, aunque estos factores no estén del todo claros, es evidente que tanto la resistencia a insulina como el fallo de la célula β son esenciales para el desarrollo completo de la enferme­ dad (Neubauer y Kulkarni, 2006). En este sentido, el ratón iLIRKO se postu­ la como un buen modelo para el estudio de la diabetes tipo 2. Este modelo mues­ tra resistencia a insulina hepática inicial, debida a la deficiencia en el receptor de insulina hepático, y, como mecanismo de compensación, desarrolla una marca­ da hiperinsulinemia, consecuencia de un incremento en la masa de célula β. Ade­ más, la generación de un modelo animal para el estudio de una enfermedad debe minimizar al máximo los efectos colatera­ les que puedan surgir de su manipulación genética. Un ejemplo claro son los mode­ los knockout globales para el receptor de insulina, que en su gran mayoría han fracasado por una muerte prematura del animal. En consecuencia, los modelos inducibles cobraron una importante rele­ vancia. Sin embargo, algunos autores han puesto en entredicho los métodos de inducción utilizados, concretamente el tamoxifeno. Algunos autores describen al tamoxifeno como un pro-drug ya que se metaboliza a diferentes compuestos, que son antiestrógenos más potentes que él mismo, ya que presenta baja afinidad por los receptores de estrógenos. Uno de sus metabolitos activos, generado por las iso­ formas del citocromo P450 (CYP) CYP2D6 y CYP3A4 en el hígado, es el 4-hidroxita­ moxifeno (4-OHT). La adición del grupo 4-hidroxi al tamoxifeno aumenta notable­ mente su afinidad por los receptores de estrógenos y compite por la unión a éstos con los estrógenos propios del organismo (Desta et al., 2004, Johnson et al., 2004). El 4-OHT es prohibitivamente caro y, en consecuencia, la mayoría de los estudios in vivo utilizan en su lugar tamoxifeno, el cual es más barato y se metaboliza rápi­ damente a 4-OHT (Desta et al., 2004). En contrapartida, el tamoxifeno presenta una vida media corta in vivo, de 16 h aproxi­ madamente, y es poco soluble en prepa­ raciones acuosas. Por tanto, la mayoría de los estudios que presentan resultados consistentes en cuanto a la activación del ERTAM fusionado a diferentes proteínas, se han obtenido mediante inyecciones intra­ peritoneales diarias de tamoxifeno diluído en aceite vegetal. Sin embargo, debido a la acumulación de aceite en la cavidad intraperitoneal de los animales, este méto­ do de administración deriva, en repetidas ocasiones, en el desarrollo de una perito­ nitis aséptica. Por tanto, el desarrollo de la estrategia presentada en esta tesis para la inducción de la deleción del receptor de insulina mediante la administración oral de tamoxifeno en la dieta, evita estos daños derivados de la administración no fisio­ lógica del compuesto. Además, ratones alimentados a largo plazo a base de dieta de tamoxifeno, hasta 18 semanas, no pre­ sentan signos de enfermedad. Trabajos previos describen una pérdida del 16 % de peso en los ratones durante la prime­ ra semana en la que son alimentados con dieta de tamoxifeno, debido a la afagia derivada de la falta de palatabilidad de esta dieta. En nuestro caso, la pérdida de peso no fue tan acusada, sino que el peso de los ratones durante la primera sema­ na se mantuvo, no generando ganancia. Tras esta semana, los ratones recuperan el peso normal y continúan sanos, sin pre­ sentar signos de enfermedad en ningún tejido (Díaz-Castroverde et al., en revisión; Wilson et al., 2014). Otro problema derivado de la deleción de un gen es el momento en el que se induce esa deleción. Los ratones LIRKO, que pierden el receptor de insulina hepá­ tico ya durante el desarrollo embrionario, presentan una marcada displasia celu­ lar hepática que se inicia a los 2 meses de edad (Michael et al., 2000). Cuando el daño celular se agudiza, a los 6 meses de edad, logra revertir la hiperglucemia, pre­ viamente generada por la resistencia a insulina hepática consecuencia directa de la falta del receptor de insulina en el híga­ do (Michael et al., 2000). Sin embargo, en los ratones iLIRKO este efecto no ocurre, mantienen su fenotipo y no desarrollan en ningún momento nódulos hiperplásicos hepáticos. Esto demuestra dos cosas: que el IR desempeña un papel clave durante el desarrollo embrionario hepático que el IGF-IR no es capaz de compensar y que el momento de la retirada del receptor de insulina es clave para generar un buen modelo para el estudio de la diabetes tipo 2, aunque esta última reflexión es, por supuesto, extrapolable a cualquier enfer­ medad. Siguiendo en la línea de la salubridad hepática, no sólo el tamoxifeno o la falta del receptor de insulina se han considera­ do como candidatos para poder alterarla. La expresión de la isoforma A del receptor de insulina se ha asociado con situaciones de malignidad celular. En concreto, IRA presenta alta afinidad por IGF-II en líneas 149 tumorales de fibroblastos y, estudios previos en hepatocarcinomas humanos, cáncer de mama y cáncer de colon, rela­ cionan la sobreexpresión de esta isoforma con el desarrollo de la patogénesis de esta enfermedad (Frasca et al., 1999; Chettouh et al., 2013). Sin embargo, aunque en los ratones iLIRKO IRA en torno al 90 % de la expresión del IR pertenece a la isoforma A, no presentan signos de displasia celu­ lar, incluso a tiempos largos, cuando se ha descrito que se produce el desarrollo de hepatocarcinoma en modelos animales (Chettouh et al., 2013). Además, la expre­ sión de IRA no incrementa la proliferación hepatocelular en estos ratones, por lo que se descarta que puedan desarrollar un proceso de hiperplasia/displasia celular. El hígado posee la capacidad de adap­ tarse rápidamente a los cambios en la concentración de glucosa debido a su papel principal en el mantenimiento de la homeostasia glucídica (El Ouaamari et al., 2013). Sin embargo, su papel en la progresión de la resistencia a insulina e hiperglucemia en ayuno se desconocen. Estudios previos con ratones knockout condicionales y reconstituidos conclu­ yen que la progresión de la resistencia a insulina a la diabetes con hiperglucemia en ayuno requieren defectos en otros teji­ dos además de en el hígado. Sin embargo, nuestros resultados muestran que la elimi­ nación inducida del receptor de insulina en el hígado, induce el desarrollo de into­ lerancia a la glucosa crónica e hiperinsuli­ nemia. Por tanto, el modelo iLIRKO que se presenta en este trabajo, demuestra que la resistencia a insulina primaria es nece­ saria y suficiente para generar la patogé­ nesis progresiva de la diabetes tipo 2. Regulación de la hiperglucemia en ratones iLIRKO IRA: asociación de la isoforma A del receptor de insulina con el GLUT2 A pesar de los periodos de alimentación y ayuno, los niveles de glucosa en plas­ ma se mantienen en un margen estrecho entre 4 y 7 mM en individuos sanos (Saltiel y Kahn, 2001). Como la glucosa es la fuen­ te principal de la energía metabólica en la mayoría de las células, este control, para mantener la glucemia en torno a 5 mM, se consigue gracias a un control riguroso en su absorción, producción por el hígado y su consumo y metabolismo por los teji­ dos periféricos. Así, la insulina aumenta la captación de glucosa en el músculo y el tejido adiposo e inhibe la producción de glucosa hepática (Saltiel y Kahn, 2001). La insulina promueve también el crecimiento celular y su diferenciación, y promueve el almacenamiento de sustratos en el tejido adiposo, hígado y músculo por medio de la estimulación de la lipogénesis, glucoge­ nogénesis y síntesis de proteínas (Saltiel y Kahn, 2001). La diabetes tipo 2 se caracte­ riza por una señalización de insulina des­ equilibrada debido a la hiperinsulinemia compensatoria (Malaguarnera y Belfiore, 2011). Se ha demostrado que, en estados de resistencia a insulina, la insulina pierde su capacidad de suprimir la producción de glucosa, aunque mantiene durante más tiempo su capacidad para dirigir la lipogé­ nesis (Cook et al., 2015). Esta selectividad de la resistencia a insulina en diabetes tipo 2 tiene importantes implicaciones en cuan­ to a su terapia. Parece preferible buscar nuevos agentes que mejoren la sensibili­ dad a insulina para así mejorar la cascada de señalización y suprimir la gluconeogé­ nesis, así como agentes que sean capa­ ces de aumentar la captación de glucosa para disminuir la hiperglucemia (Brown y Goldstein, 2008). En este sentido, nuestro grupo ha descrito que la presencia o ausencia de una u otra de las isoformas del receptor de insulina implica cambios en el perfil metabólico. Concretamente, la expresión de la isofor­ ma A, pero no la B, en hepatocitos neo­ natales mejora la captación de glucosa debido a su asociación con GLUT2 (Neva­ do et al., 2006). Teniendo en cuenta que la afinidad por la insulina es la misma en ambas isoformas y que además, la capta­ ción de glucosa en el hígado es indepen­ diente de esta hormona, estos cambios no pueden achacarse a la unión de la insulina a su receptor. Debe tenerse en cuenta que el extremo α carboxi-terminal del IR es una de las zonas críticas para la interacción con el ligando. Esta zona comprende entre los residuos 704-719, pero tolera la inserción de 12 aminoácidos extra (IRB) entre los residuos 717 y 718 (Menting et al., 2013). En el caso del IGF-IR, está región es prác­ ticamente homóloga a la del receptor de insulina, excepto en la Val 712 y Val 715, pero no admite la inclusión de los 12 ami­ noácidos extra (Menting et al., 2013). El hecho de que se conserve igual afinidad, indica que existe una gran plasticidad en las interfaces de unión proteína-proteína y que la insulina emplea un modo diferente para unirse a cada isoforma, lo cual sea, probablemente, consecuencia de una coevolución entre la molécula de insulina y su receptor (Benyoucef et al., 2007; Whi­ ttaker et al., 2002). Sin embargo, estudios de mutagénesis en diferentes residuos de los dominios que conforman el sitio de unión a ligando del receptor de insulina, demuestran que sí existen diferencias en su estructura, aunque no en su afinidad por el ligando (Whittaker et al., 2002). Esta disimilitud está apoyada por el hecho de que las isoformas del IR presentan dife­ rente afinidad por los IGFs. Además, estas variaciones estructurales, según la presen­ cia/ausencia del exón 11, podrían explicar el hecho de que sea una isoforma y no la otra la que se asocie al GLUT2. Estas aso­ ciaciones han sido descritas de nuevo por Root-Bernstein y Vonck en 2009, aunque, en este caso, se postula que además la glucosa podría jugar un papel directo en la interacción (Root-Bernstein y Vonck, 2009). En hepatocitos, GLUT2, junto con otras moléculas, es considerado uno de los “sensores de glucosa”, entendiendo como tal, cualquier mecanismo molecular cuya actividad sea una respuesta directa a cambios en las concentraciones fisiológicas de glucosa. GLUT2 actúa en otros tipos celulares, por ejemplo, en las células β pancreáticas, en las cuales desempeña un papel fundamental, ya que es absolutamente necesario para la secreción de insulina dependiente de glucosa. Volviendo a los hepatocitos, tal y como demuestra el knockout para GLUT2 en hígado (modelo LG2KO), GLUT2 es completamente necesario para equilibrar las concentraciones intra y extracelulares de glucosa que controlan a su vez a los genes hepáticos cuya expresión es susceptible a la concentración de glucosa. Sin embargo, esta regulación tiene matices, ya que GLUT2 es indispensable para la captación de glucosa, pero dispensable para su salida, la cual podría producirse por un mecanismo alternativo en el que estarían involucrados una vía de transporte a través de membrana originada en el RE (Eisenberg et al., 2005). Además, como ya se ha comentado, IRA es un modulador de GLUT2 ya que aumenta la captación de glucosa in vitro (Nevado et al., 2006). Esta asociación entre GLUT2 e IRβ se repite de nuevo en nuestro modelo in vivo, en el que está significativamente aumentada en iLIRKO IRA en comparación con iLIRKO IRB. Así, de acuerdo con los resultados previos in vitro, en los ratones iLIRKO IRA podría producirse un incremento en la captación de glucosa a nivel hepático. 151 Por tanto, teniendo en cuenta que la hiperglucemia fundamentalmente decrece en ratones iLIRKO IRA y el papel primordial de GLUT2 en la captación de glucosa, éste podría proponerse como un mecanismo para la mejora de la intolerancia a glucosa. La disminución de la hiperglucemia mejora la hiperinsulinemia y modifica la masa de célula β en iLIRKO IRA Por todas las razones expuestas a lo largo de esta tesis, es necesario diseccionar el papel de cada isoforma in vivo en el híga­ do y caracterizar más a fondo su posible uso como herramienta para disminuir los niveles de glucosa circulante. Nuestros resultados demuestran que la resistencia a insulina global y, como consecuencia, la homeostasia glucídica, pueden verse modificadas por la expresión de IRA, pero no IRB, en el hígado. La expresión selecti­ va de IRA es capaz de restablecer la tole­ rancia a glucosa y la resistencia a insulina, mientras que IRB sólo mejora parcialmen­ te la sensibilidad a insulina. Además, nuestros resultados demuestran una recuperación mantenida en el tiempo de los niveles de insulina en los ratones iLIRKO IRA acompañada por una disminu­ ción en la masa de célula β hasta valores de los ratones Control. Estos resultados sugieren que, como ocurre en condiciones fisiológicas durante el embarazo (Huang et al., 2009; Rieck y Kaestner, 2010; Sca­ glia et al., 1997; Sorenson y Brelje, 1997) la masa de célula β se adapta, variando su tamaño, para conseguir una mejora en la sensibilidad a insulina. De este modo, teniendo en cuenta que la insulina afecta a todos los tejidos, sería un reto identificar las señales que promueven el crecimien­ to o regresión de los islotes de masa de célula β pancreática, en estados de resis­ tencia a insulina. Considerando que no se ha detectado un aumento de masa de célula β en ningún otro modelo de resis­ tencia a insulina, (Brüning et al., 1998; Brüning et al., 2000; Kulkarni et al., 1999) se podría especular con un papel regula­ dor del hígado en este proceso. Las seña­ les y proteínas que median la respuesta compensatoria de los islotes en respuesta a resistencia a insulina no se conocen en profundidad. La glucosa per se promue­ ve el crecimiento de la masa de célula β (Assmann et al., 2009; Bonner-Weir et al., 1989) y es un posible candidato para la inducción de la hiperplasia de célula β hallada en los ratones iLIRKO, los cuales presentan además una marcada hiperglu­ cemia. Sin embargo, otros factores deben estar implicados y el ejemplo más claro es que el suero de ratones LIRKO aumenta la proliferación en islotes humanos, lo cual indica que, al menos un factor derivado del estado a resistencia a insulina hepáti­ ca es capaz de inducir cambio fisiológicos en la masa de célula β. Concretamente, el IGF-I fue descrito por nuestro grupo como posible molécula comunicadora en el eje hígado-páncreas. En concreto, nuestros resultados muestran que la expresión hepática del IGF-I se ve incrementada en los ratones iLIRKO y disminuye en los ratones iLIRKO IRA, pero no en los rato­ nes iLIRKO IRB. Además, los niveles de IGF-I hepático observados se correlacio­ nan con cambios en la homeostasia glu­ cídica (disminución de la hiperglucemia), lo que sugiere que ambos factores, IGF-I y glucosa, deben verse implicados en la regulación de la masa de célula β en los ratones iLIRKO. Por todo ello, y con la necesidad de un análisis en mayor pro­ fundidad, podría especularse que el IGF-I podría ser un biomarcador de resistencia a insulina hepática. Para investigar más en profundidad la regresión de la masa de célula β observa­ da, se evaluó su nivel de proliferación en los diferentes grupos estudiados median­ te la localización nuclear de PCNA. Las células β adultas proliferan de forma lenta en situaciones fisiológicas, sin embargo, en una situación patológica, como la de resistencia a insulina observada en los ratones iLIRKO, la proliferación está alta­ mente incrementada. Nuestros resultados muestran que la expresión hepática de IRA es capaz de reducir la masa de célula β a través de la disminución de la prolife­ ración de ésta a valores similares a los de los ratones Control. Teniendo en cuenta todo lo descrito, este estudio remarca el papel central y complejo que desempeñan las isoformas del recep­ tor de insulina hepáticas en el control del metabolismo de la glucosa. En base a los hallazgos aquí descritos, la expresión de la isoforma A con AAVs mediante ensayos de terapia génica, podría aumentar la cap­ tación de glucosa y regular de este modo la homeostasia glucídica y el crecimiento de la masa de célula β. Si estos factores no se regulan desencadenarían en el fallo total de las células β y, en consecuencia, en diabetes tipo 2. Papel diferencial de las isoformas del receptor de insulina en la síntesis de glucógeno in vivo Como se ha ido comentando a lo largo de esta tesis, diversas cuestiones que rodean a las isoformas del IR permanecen inconclusas, especialmente aquellas que conciernen a cuestiones referentes a su papel fisiológico. Además, el modo por el cual activan de forma diferencial las distintas cascadas de señalización en respuesta a insulina, necesitaba de un mayor esclarecimiento. Por ello, centramos nuestro estudio en la vía de la síntesis de glucógeno en la que además la glucosa juega un papel fundamental. La glucosa modifica el metabolismo celular mediante regulación alostérica y transcripcional. Inhibe la lisis de glucógeno mediante la activación de la glucógeno fosforilasa quinasa, la cual inactiva a la glucógeno fosforilasa, enzima limitante en este proceso. Por otro lado, la G6P es un activador alostérico de la glucógeno sintasa. Por tanto, incrementar la entrada y fosforilación de la glucosa implica estimular, de forma alostérica, su síntesis e inhibir su degradación. Así, teniendo en cuenta nuestros resultados in vivo, la ausencia del receptor de insulina hepático en los ratones iLIRKO rompe el balance entre la utilización y producción de glucosa por el hígado. Los resultados sugieren que la expresión especifica de IRA, en los ratones iLIRKO IRA, induce un incremento en la captación de glucosa, lo que permite una mayor disponibilidad para la síntesis de glucógeno en estos ratones. En este sentido, los niveles de glucógeno en los ratones iLIRKO IRA están significativamente aumentados en comparación con los ratones Control. Este efecto no se explica por la regulación enzimática covalente de las principales proteínas de la cascada, GYS2 y GSK3α/β, sino que de nuevo la glucosa juega un papel fundamental como regulador alostérico dirigido por las isoformas del receptor de insulina (Gomis et al., 2003; von Wilamowitz-Moellendorf et al., 2013). La síntesis y el contenido en glucógeno se ven favorecidas por la expresión de la isoforma A del receptor de insulina in vitro Para profundizar en la regulación del metabolismo del glucógeno descrita en el apartado anterior, recurrimos a un abordaje in vitro con hepatocitos neonatales. Por tanto, en esta tesis se llevaron a cabo dos aproximaciones experimentales: 153 1) in vitro por medio de estudios con hepatocitos neonatales inmortalizados que expresaban el IR o carecían de él y células que expresaban una u otra isoforma del receptor de insulina, los cuales se discuten a continuación; 2) in vivo mediante el uso de los ratones diabéticos iLIRKO que expresaban específicamente IRA o IRB en hígado, discutidos en el apartado anterior. Como se ha comentado anteriormente, la importancia de la glucosa en el control de la homeostasia glucídica y la síntesis del glucógeno está bien establecida. En situación postprandial, la insulina dirige a la glucosa para restablecer los niveles de glucógeno en el hígado y suprime su salida de éste. Un incremento en la con­ centración de glucosa en sangre es prerre­ quisito fundamental para la estimulación de la síntesis de glucógeno, la cual incluye la secreción de insulina que activa a PKB e inhibe a GSK3α/β, quinasa reguladora negativa de GYS2 (Agius, 2008; Frame y Cohen, 2001; von Wilamowitz-Moellendorf et al., 2013). Las isoformas del receptor de insulina ya se han relacionado con una cascada de señalización diferencial en las células β (Escribano et al., 2015; Leibiger et al., 2001). Nuestros resultados in vitro sugieren una fuerte correlación entre el aumento en la señalización de insulina y el incremento en la síntesis y almacenamien­ to de glucógeno en respuesta a la insulina en hepatocitos que expresan la isoforma A frente a los que expresan la isoforma B. Este efecto se ve reforzado por el aumen­ to en la captación de glucosa descrito en los hepatocitos neonatales que expresan IRA en comparación con los que expresan IRB (Nevado et al., 2006). Por otro lado, la estimulación de la expresión de GLUT2 por glucosa en hepatocitos en cultivo, una de las proteínas descrita como “sensores de glucosa”, se debe a una activación en la transcripción génica y depende de un metabolismo activo de la glucosa, aunque los metabolitos responsables de este efecto no han sido totalmente identificados. Además, el incremento el G6P intracelular da como resultado un cambio conformacional en la GYS2, el cual la convierte en mejor sustrato para su defosforilación (activación) por la fosfatasa PP1 (Agius, 2008; von Wilamowitz-Moellendorf et al., 2013). La activación de GYS2 por PP1 resulta inhibida por la fosforilación de PYGL. Esta inhibición se elimina con elevadas concentraciones de glucosa (Bollen et al., 1998). En coherencia con esto, la G6P regula también la actividad de GYS2 por activación alostérica, incluso cuando está fosforilada (Stalmans et al., 1997; von Wilamowitz-Moellendorf et al., 2013). Además de un aumento en la captación de glucosa, la disponibilidad de glucosa intracelular está favorecida en los hepatocitos IRA ya que poseen una mayor expresión de GCK, en comparación con los hepatocitos IRB. En ausencia de IR, los hepatocitos mues­ tran un incremento en la actividad de la GYS2 y, en consecuencia, en la síntesis de glucógeno que se correlaciona con una mayor inhibición de la GSK3α/β, en comparación con los hepatocitos IRloxP. En cambio, presentan una marcada acti­ vación de PYGL y un incremento de G1P, producto directo de la degradación del glucógeno. Estos efectos explicarían por­ qué, a pesar del marcado incremento de la síntesis de glucógeno, no se observa ningún cambio significativo en el conteni­ do en glucógeno celular sugiriendo la pre­ sencia de un ciclo fútil en la regulación de la síntesis/degradación de glucógeno para compensar la menor entrada de glucosa debido a la ausencia del IR (Nevado et al., 2006). A medida que nuestro conocimiento acer­ ca de las vías de señalización aumenta, es cada vez más importante establecer cuales son los puntos críticos en la vía de regulación. La red de señalización de la insulina ilustra el concepto de puntos crí­ ticos, gracias a las relaciones que se han establecido entre sus componentes, vali­ dadas por medio de aproximaciones gené­ ticas y bioquímicas tanto in vitro como in vivo (Taniguchi et al., 2006). Un punto crí­ tico de señalización se define como aquel en el que numerosas isoformas molecu­ lares convergen y están implicadas en procesos de señalización divergentes, altamente regulados y esenciales para las acciones biológicas derivadas de la unión del ligando y que son, en la mayoría de los casos, un punto de crosstalk con otros sistemas de señalización. Estos puntos permiten una increíble diversificación en la regulación y un cambio muy fino en la transducción de la señal de la insulina en estados fisiológicos normales o de resis­ tencia. Así, uno de los mayores retos es validar los resultados obtenidos en cuanto a la regulación de los sistemas receptor-li­ gando in vitro en sistemas in vivo. En este caso concreto, la translación de resulta­ dos desde los hepatocitos neonatales en cultivo al sistema iLIRKO ha sido un reto importante que nos ha permitido no sólo entender los puntos clave en la regula­ ción del metabolismo del glucógeno, sino diseccionar los efectos biológicos a gran escala derivados de la expresión de las isoformas del receptor de insulina. Papel fundamental del IGF-IR en el metabolismo lipídico hepático El hígado juega un papel fundamental en la regulación de la glucosa sistémica y el flujo lipídico durante los periodos de ali­ mentación y ayuno además de regular esos mismos sustratos para su propia energía. Estos requerimientos paralelos están mediados por un control coordinado del flujo de carbohidratos y lípidos el cual se regula, fundamentalmente, por insuli­ na y glucagón. Durante la progresión a la diabetes tipo 2, los carbohidratos hepá­ ticos y el flujo de biosíntesis lipídica se encuentran elevados, por lo que contribu­ yen a la hiperglucemia e hipertrigliceride­ mia (Jones, 2016). Estos son los motivos por los que la resistencia a insulina en la diabetes tipo 2, obesidad y dislipidemia es una característica común que se con­ sidera además como central en la desre­ gulación del metabolismo de la glucosa y lipídico. Sin embargo, los mecanismos por los que ésta actúa no se conocen en pro­ fundidad (Kahn et al., 2005). Los estudios realizados en los ratones LIRKO mues­ tran que la resistencia a insulina hepática causa un perfil proaterogénico, según la distribución del colesterol en el suero, ya que se produce una disminución del 50 % en el colesterol de las HDL. Además, estos ratones muestran una bajada significativa de los triglicéridos en suero y un aumen­ to en el contenido de colesterol hepático (Biddinger et al., 2008). Estos resultados se pierden cuando el estudio lo realizamos en nuestro modelo iLIRKO. La explicación más clara podría ser que los estudios con los animales LIRKO se realizaron a los 6 meses de edad, cuando la hiperglucemia ya se había revertido como consecuencia del severo daño hepático desarrollado. Por otro lado, aunque el principal papel del IGF-IR se asocia con efectos eminen­ temente mitogénicos y poco se conoce del IGF-IR en el metabolismo lipídico, su presencia en el hígado parece fundamen­ tal para el correcto funcionamiento de éste. Concretamente, la combinación de la falta de IR e IGF-IR en el hígado pro­ voca un decrecimiento significativo en el contenido en triglicéridos hepáticos. Para poder explicar este efecto, estudiamos 155 los principales genes que participan en la lipogénesis de novo. Sin embargo, sólo Evol6 disminuye significativamente. Esta disminución se acompaña con una reduc­ ción en los niveles de la proteína GCK. Así, por un lado, uno de los sensores de la glucosa estaría disminuido en los hepato­ citos de los ratones DKO (carentes de IR e IGF-IR en hígado) y, como consecuen­ cia directa, éstos estarían fosforilando y, por tanto, reteniendo menos glucosa; y por otro lado, la síntesis de ácidos grasos de cadena larga estaría disminuida, lo que afectaría en ambos casos al contenido en triglicéridos. Estudios recientes en ratones muestran que la inhibición de Evol6 trae como consecuencia la supresión de la síntesis de ácidos grasos de cadena larga (Mizutani et al., 2009) y se planea probar estos inhibidores en modelos animales de diabetes tipo 2. El análisis por FPLC del suero de los rato­ nes muestra una marcada disminución en el contenido en colesterol de las partículas HDL en los ratones DKO, en torno al 50 %, en comparación con los Control. Además, estos ratones muestran un menor número de partículas HDL y éstas son más peque­ ñas. Este defecto viene acompañado por una menor expresión del transportador de colesterol ABCA1 en hígado, encargado de transportar el colesterol a las partículas HDL en formación desde diferentes teji­ dos. Así, los ratones DKO acumulan par­ tículas HDL nacientes con bajo contenido en colesterol, que podría explicarse por el defecto en ABCA1 que presenta el hígado de estos ratones. Sin embargo, otros fac­ tores deben estar implicados en este pro­ ceso ya que los ratones iLIRKO presentan también este defecto y sus partículas HDL no se ven modificadas. Nuestros datos sugieren, por tanto, un papel fundamental del receptor de IGF-I en el metabolismo lipídico en un contexto de resistencia a insulina, más allá de su asociación clásica con procesos mitogénicos. En conclusión, la resistencia a insulina juega también un papel fundamental en el desarrollo de la dislipidemia. Este hecho es fundamental ya que demuestra que el síndrome metabólico no es sólo un con­ junto de anomalías que deban interpre­ tarse y tratarse por separado, sino que además, existen una serie de desajus­ tes en el metabolismo de la glucosa y del colesterol, en los que juega un papel fundamental una señalización de insulina defectuosa. 09/ conclusiones 159 La resistencia a la acción de la insulina y la disfunción de la célula β son los rasgos más característicos de la diabetes tipo 2. La naturaleza progresiva de la diabetes tipo 2, junto con la relación entre la función de la célula β, y la aparición de hiperglu­ cemia y complicaciones, ha sido reafir­ mada en diferentes estudios prospectivos (UKPDS, 1998; Weyer et al., 1999; Kahn, 2001). Individuos que presentan resisten­ cia a insulina, son capaces de mantener una tolerancia a glucosa normal, gracias a una hipersecreción adaptativa de insu­ lina que compensa la menor acción de la hormona. En ciertos individuos, estos mecanismos compensatorios fallan con el tiempo, apareciendo hiperglucemia y las manifestaciones clínicas de la diabe­ tes. Comprender la función diferencial de las isoformas del receptor de insulina en el hígado así como su repercusión en la regulación de la homeostasia glucídica y masa de célula β, es clave para discernir el desarrollo de la diabetes tipo 2 y así poder abordarla convenientemente. Esta tesis se ha centrado en el estudio de la función diferencial de las isoformas del receptor de insulina en el hígado. En una primera parte, se generó el modelo animal en el que se llevaron a cabo los estudios, iLIRKO, y las partículas de AAVs con las isoformas del receptor de insulina nece­ sarias para su expresión in vivo. En una segunda parte, se estudió el perfil meta­ bólico hepático in vivo, así como su reper­ cusión en la masa de célula β, y las vías se señalización molecular controladas por insulina y glucosa que inciden sobre el control del metabolismo glucídico. La ter­ cera parte profundiza en los mecanismos moleculares de estos procesos utilizando un modelo in vitro. Y por último, en la cuar­ ta parte, se abordó, de forma preliminar, el papel in vivo del receptor de insulina y de IGF-I en el metabolismo lipídico hepático. Las conclusiones obtenidas en esta tesis son las siguientes: 1. El modelo iLIRKO es un modelo de progresión a la diabetes tipo 2 en el que se observa intolerancia a la glucosa y resistencia a insulina, ambos procesos estables en el tiempo. 2. El abordaje inducible se consiguió mediante la administración de dieta con tamoxifeno y esto permitió el desarrollo del fenotipo diabético sin mostrar nin­ guna patología hepática, mejorando de este modo el modelo constitutivo previa­ mente descrito en la literatura. 3. Los ratones iLIRKO IRA presentan una mejor regulación de la homeostasia glu­ cídica y una disminución de la hiperinsu­ linemia y de la masa de célula β. 4. La disminución en la masa de célula β en los ratones iLIRKO IRA se debe a una bajada en la proliferación de estas células. 5. La expresión de IRA en el hígado no causa procesos proliferativos de carác­ ter maligno. 6. La expresión de IRA induce un alto contenido en glucógeno, fundamental­ mente favorecido por la regulación alos­ térica que ejerce la glucosa sobre la vía de señalización que regula la síntesis de éste. 7. La falta del IR in vitro provoca una sín­ tesis y degradación de glucógeno incre­ mentados, lo que indica la existencia de un ciclo fútil en este punto. 8. El receptor del IGF-I en hígado es clave en la formación de las partículas HDL, ya que su carencia implica que estas sean más pequeñas y con un menor conteni­ do en colesterol. 10/ bibliografía 165 Abu-Farha M, Abubaker J, Al-Khairi I, Cherian P, Noronha F, Hu FB, et al. Higher plasma betatro- phin/ANGPTL8 level in Type 2 Diabetes subjects does not correlate with blood glucose or insulin resistance (2015). Sci Rep 5:10949. Accili D, Drago J, Lee EJ, Johnson MD, Cool MH, Salvatore P, et al. Early neonatal death in mice homozygous for a null allele of the insulin receptor gene (1996). Nat Genet 12:106-109. Agius L. Glucokinase and molecular aspects of liver glycogen metabolism (2008). Biochem J 414:1-18. Agius L. Role of glycogen phosphorylase in liver glycogen metabolism (2015). Mol Aspects Med. 46:34-45. Aguirre GA, De Ita JR, de la Garza RG, Casti- lla-Cortazar I. Insulin-like growth factor-1 deficien- cy and metabolic syndrome. Journal of Translational Medicine (2016). 14:3. Alexander IE, Cunningham SC, Logan GJ, Christo- doulou J. Potential of AAV vectors in the treatment of metabolic disease (2008). Gene Ther 15:831- 839. Alonso-Chamorro M, Nieto-Vazquez I, Monto- ri-Grau M, Gomez-Foix AM, Fernandez-Veledo S, Lorenzo M. New emerging role of protein-tyrosine phosphatase 1B in the regulation of glycogen meta- bolism in basal and TNF-α-induced insulin-resis- tant conditions in an immortalised muscle cell line isolated from mice (2011). Diabetologia 55:1157- 1168. Andersson KB, Winer LH, Mørk HK, Molkentin JD, Jaisser F. Tamoxifen administration routes and dosage for inducible Cre-mediated gene disruption in mouse hearts (2010). Transgenic Res 19:715-25. Araki E, Lipes MA, Patti ME, Brüning JC, Haag B 3rd, Johnson RS, Kahn CR. Alternative pathway of insulin signalling in mice with targeted disruption of the IRS-1 gene (1994). Nature 372:186-190. Arruda VR, Xiao W. It's all about the clothing: cap- sid domination in the adeno-associated viral vector world (2007). J Thromb Haemost 5:12-15. Assmann A, Ueki K, Winnay JN, Kadowaki T, Kulkarni RN. Glucose effects on beta-cell growth and survival require activation of insulin receptors and insulin receptor substrate 2 (2009). Mol Cell Biol 29:3219-3228. Bäck K, Brännmark C, Strålfors P, Arnqvist HJ. Differential effects of IGF-I, IGF-II and insulin in human preadipocytes and adipocytes--role of insu- lin and IGF-I receptors (2011). Mol Cell Endocri- nol 339:130-135. Backer JM, Myers MG Jr, Shoelson SE, Chin DJ, Sun XJ, Miralpeix M, et al. Phosphatidyli- nositol 3'-kinase is activated by association with IRS-1 during insulin stimulation (1992). EMBO J 11:3469-3479. Bartolomé A (2012). Papel del TSC2/m-TORC1 en proliferación, autofagia y estrés de retículo endo- plasmático en célula β pancreática (Tesis doctoral). Baskaran S, Roach PJ, DePaoli-Roach AA, Hurley TD. Structural basis for glucose-6-phosphate acti- vation of glycogen synthase (2010). Proc Natl Acad Sci 107:17563–17568. Belfiore A, Frasca F, Pandini G, Sciacca L, Vigneri R. Insulin receptor isoforms and insulin receptor/ insulin-like growth factor receptor hybrids in phy- siology and disease (2009). Endocr Rev 30:586- 623. Belke DD, Betuing S, Tuttle MJ, Graveleau C, Young ME, Pham M, et al. Insulin signaling coordi- nately regulates cardiac size, metabolism, and con- tractile protein isoform expression (2002). J Clin Invest 109:629-639. Benyoucef S, Surinya KH, Hadaschik D, Siddle K. Characterization of insulin/IGF hybrid recep- tors: contributions of the insulin receptor L2 and Fn1 domains and the alternatively spliced exon 11 sequence to ligand binding and receptor activation (2007). Biochem J 403:603-613. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli (1951). J. Bacteriol 62:293-300. Biddinger SB, Hernandez-Ono A, Rask-Madsen C, Haas JT, Alemán JO, Suzuki R, et al. Hepatic insulin resistance is sufficient to produce dyslipide- mia and susceptibility to aterosclerosis (2008). Cell Metab 7:125-134. Blüher M, Michael MD, Peroni OD, Ueki K, Car- ter N, Kahn BB, Kahn CR. Adipose tissue selective insulin receptor knockout protects against obesity and obesity-related glucose intolerance (2002). Dev Cell 3:25-38. Bollen M, Keppens S, Stalmans W. Specific fea- tures of glycogen metabolism in the liver (1998). Biochem J 336:19-31. Bonner-Weir S, Deery D, Leahy JL, Weir GC. Compensatory growth of pancreatic beta-cells in adult rats after short-term glucose infusion (1989). Diabetes 38:49-53. Boucher J, Kleinridders A, Kahn CR. Insulin recep- tor signaling in normal and insulin-resistant states (2014). Cold Spring Harb Perspect Biol 6:a009191. Boussif O, Lezoualc'h F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B, Behr JP. A versatile vec- tor for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine (1995). Proc Natl Acad Sci U S A 92:7297-7301. Bouzakri K, Roques M, Gual P, Espinosa S, Gue- bre-Egziabher F, Riou JP, et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased seri- ne 636 phosphorylation of insulin receptor subs- trate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes (2003). Diabetes 52:1319-1325. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein uti- lizing the principle of protein-dye binding (1976). Anal Biochem 72:248–254. Brown MS, Goldstein JL. Selective versus total insulin resistance: a pathogenic paradox (2008). Cell Metab 7:95-96. Brüning JC, Michael MD, Winnay JN, Hayashi T, Hörsch, D, Accili D, et al. A muscle-specific insulin receptor knockout exhibits features of the metabo- lic syndrome of NIDDM without altering glucose tolerance (1998). Mol Cell 2:559-569. Brüning JC, Gautam D, Burks DJ, Gillette J, Schu- bert M, Orban PC, et al. Role of brain insulin recep- tor in control of body weight and reproduction (2000). Science 289:2122-2125. Burcelin R, Eddouks M, Kande J, Assan R, Girard J. Evidence that GLUT-2 mRNA and protein con- centrations are decreased by hyperinsulinaemia and increased by hyperglycaemia in liver of diabetic rats (1992). Biochem J 288:675-679. Burkhardt BR, Parker MJ, Zhang YC, Song S, Was- serfall CH, Atkinson MA. Glucose transporter-2 (GLUT2) promoter mediated transgenic insulin production reduces hyperglycemia in diabetic mice (2005). FEBS Lett 579:5759-5764. Butler AE, Janson J, Bonner-Weir S, Ritzel R, Rizza RA, Butler PC. Beta-cell deficit and increa- 167 sed beta-cell apoptosis in humans with type 2 dia- betes (2003). Diabetes 52:102–110. Cai D, Dhe-Paganon S, Melendez PA, Lee J, Shoel- son SE. Two new substrates in insulin signaling, IRS5/DOK4 and IRS6/DOK5 (2003). J Biol Chem 278:25323-25330. Chettouh H, Fartoux L, Aoudjehane L, Wendum D, Clapéron A, Chrétien Y, et al. Mitogenic insulin receptor-A is overexpressed in human hepatoce- llular carcinoma due to EGFR-mediated dysregu- lation of RNA splicing factors (2013). Cancer Res 73:3974-3986. Chick WL, Like AA. Studies in the diabetic mutant mouse. 3. Physiological factors associated with alterations in beta cell proliferation (1970). Diabe- tologia 6:243-251. Cho H, Mu J, Kim JK, Thorvaldsen JL, Chu Q, Crenshaw EB 3rd, et al. Insulin resistance and a diabetes mellitus-like syndrome in mice lacking the protein kinase Akt2 (PKB beta) (2001). Science 292:1728-1731. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyana- te-phenol-chloroform extraction (1987). Anal Bio- chem 162:156–159. Cook JR, Langlet F, Kido Y, Accili D. Pathogenesis of selective insulin resistance in isolated hepato- cytes (2015). J Biol Chem 290:13972-80. Copps KD, White MF. Regulation of insulin sensiti- vity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2 (2012). Diabetologia 55:2565-2582. Cox AR, Lam CJ, Bonnyman CW, Chavez J, Rios JS, Kushner JA. Angiopoietin-like protein 8 (ANGPTL8)/betatrophin overexpression does not increase beta cell proliferation in mice (2015). Dia- betologia 58:1523-31. Denley A, Bonython ER, Booker GW, Cosgrove LJ, Forbes BE, Ward CW, Wallace JC. Structural determinants for high-affinity binding of insulin-li- ke growth factor II to insulin receptor (IR)-A, the exon 11 minus isoform of the IR (2004). Mol Endo- crinol 18:2502-2512. Desta Z, Ward BA, Soukhova NV, Flockhart DA. Comprehensive evaluation of tamoxifen sequential biotransformation by the human cytochrome P450 system in vitro: prominent roles for CYP3A and CYP2D6 (2004). J Pharmacol Exp Ther 310:1062- 1075. Doble BW, Woodgett JR. GSK-3: tricks of the trade for a multi-tasking kinase (2003). J Cell Sci 116:1175-1186. Duffy D, Rader DJ. Update on strategies to increase HDL quantity and function (2009). Nat Rev Cardiol 6:455-463. Edvell A, Lindström P. Development of insulin secretory function in young obese hyperglycemic mice (Umeå ob/ob) (1995). Metabolism 44:906- 913. Eisenberg ML, Maker AV, Slezak LA, Nathan JD, Sritharan KC, Jena BP, et al. Insulin Receptor (IR) and Glucose Transporter 2 (GLUT2) Proteins Form a Complex on the Rat Hepatocyte Membrane (2005). Cell Physiol Biochem 15:51-58. Emanuelli B, Vienberg SG, Smyth G, Cheng C, Stanford KI, Arumugam M, et al. Interplay between FGF21 and insulin action in the liver regulates metabolism (2014). J Clin Invest 124:515-527. Escribano O, Guillén C, Nevado C, Gómez-Her- nández A, Kahn CR, Benito M. Beta-Cell hyper- plasia induced by hepatic insulin resistance: role of a liver-pancreas endocrine axis through insulin receptor A isoform (2009). Diabetes 58:820-828. Escribano O, Gómez-Hernández A, Díaz-Castro- verde S, Nevado C, García G, Otero YF, et al. Insu- lin receptor isoform A confers a higher proliferative capability to pancreatic beta cells enabling glucose availability and IGF-I signaling (2015). Mol Cell Endocrinol 409:82-91. Fantin VR, Wang Q, Lienhard GE, Keller SR. Mice lacking insulin receptor substrate 4 exhibit mild defects in growth, reproduction, and gluco- se homeostasis (2003). Am J Physiol Endocrinol Metab 278:E127-133. Feingold KR, Grunfeld C. (2015) Introduction to Lipids and Lipoproteins. South Dartmouth (MA): MDText.com. Folch J, Lees M, Sloane Stanley GH. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues (1957). J Biol Chem 226:497-509. Folli F, Saad MJ, Backer JM, Kahn CR. Insulin sti- mulation of phosphatidylinositol 3-kinase activity http:MDText.com and association with insulin receptor substrate 1 in liver and muscle of the intact rat (1992). J Biol Chem 267:22171-22177. Folli F, Bonfanti L, Renard E, Kahn CR, Merighi A. Insulin receptor substrate-1 (IRS-1) distribution in the rat central nervous system (1994). J Neurosci 14:6412-6422. Frame S, Cohen P. GSK3 takes centre stage more than 20 years after its discovery (2001). Biochem J 359:1-16. Frasca F, Pandini G, Scalia P, Sciacca L, Mineo R, Costantino A, et al. Insulin receptor isoform A, a newly recognized, high-affinity insulin-like growth factor II receptor in fetal and cancer cells (1999). Mol Cell Biol 19:3278-3288. Gomis RR, Favre C, García-Rocha M, Fernán- dez-Novell JM, Ferrer JC, Guinovart JJ. Gluco- se 6-phosphate produced by gluconeogenesis and by glucokinase is equally effective in activating hepatic glycogen synthase (2003). J Biol Chem 278:9740-9746. Gonçalves MA. Adeno-associated virus: from defective virus to effective vector (2005). Virol J 2:43. Gonzalez-Aseguinolaza G, Prieto J. Gene therapy of liver diseases: a 2011 perspective (2011). Clin Res Hepatol Gastroenterol 35:699-708. Grieger JC, Choi VW, Samulski RJ. Production and characterization of adeno-associated viral vectors (2006). Nat Protoc 1:1412-1428. Grimm D, Kay MA, Kleinschmidt JA. Helper virus- free, optically controllable, and two-plasmid-based production of adeno-associated virus vectors of serotypes 1 to 6 (2003). Mol Ther 7:839-850. Gu H, Marth JD, Orban PC, Mossmann H, Rajews- ky K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene tar- geting (1994). Science 265:103–106. Guerra C, Navarro P, Valverde AM, Arribas M, Brüning J, Kozak LP, et al. Brown adipose tis- sue-specific insulin receptor knockout shows dia- betic phenotype without insulin resistance (2001). J Clin Invest 108:1205-1213. Gusarova V, Alexa CA, Na E, Stevis PE, Xin Y, Bonner-Weir S, et al. ANGPTL8/betatrophin does not control pancreatic beta cell expansión (2014). Cell 159:691-696. Hanahan D. Studies on transformation of Escheri- chia coli with plasmids (1983). Journal of Molecu- lar Biology 166:557–580. Hoeflich KP, Luo J, Rubie EA, Tsao MS, Jin O, Woodgett JR. Requirement for glycogen synthase kinase-3beta in cell survival and NF-kappaB acti- vation (2000). Nature 406:86-90. Holst JJ, Gromada J. Role of incretin hormones in the regulation of insulin secretion in diabetic and nondiabetic humans (2004). Am J Physiol Endocri- nol Metab 287:E199–E206. Hoorens A, van de Casteele M, Klöppel G, Pipe- leers D. Glucose promotes survival of rat pancreatic beta cells by activating synthesis of proteins which suppress a constitutive apoptotic program(1996). J Clin Invest 98:1568–1574. Huang C, Snider F, Cross JC. Prolactin receptor is required for normal glucose homeostasis and modu- lation of beta-cell mass during pregnancy (2009). Endocrinology 150:1618-1626. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7th edn. Brussels, Belgium: International Diabetes Federation, 2015. Islam MS, Wilson RD. Experimentally induced rodent models of type 2 diabetes (2012). Methods Mol Biol 933:161-174. Johnson MD, Zuo H, Lee KH, Trebley JP, Rae JM, Weatherman RV, et al. Pharmacological characte- rization of 4-hydroxy-N-desmethyl tamoxifen, a novel active metabolite of tamoxifen (2004). Breast Cancer Res Treat 85:151-9. Jones JG. Hepatic glucose and lipid metabolism (2016). Diabetologia 59:1098-1103. Kahn R, Buse J, Ferrannini E, Stern M. The meta- bolic síndrome (2005). Lancet 366:1921-1922. Katz EB, Stenbit AE, Hatton K, DePinho R, Cha- rron MJ. Cardiac and adipose tissue abnormalities but not diabetes in mice deficient in GLUT4 (1995). Nature 377:151-155. Kühbandner S, Brummer S, Metzger D, Chambon P, Hofmann F, Feil R. Temporally controlled soma- tic mutagenesis in smooth muscle (2000). Genesis 28:15-22. Kulkarni RN, Brüning JC, Winnay JN, Postic C, 169 Magnuson MA, Kahn CR. Tissue-specific knoc- kout of the insulin receptor in pancreatic beta cells creates an insulin secretory defect similar to that in type 2 diabetes (1999). Cell 96:329-339. Kulkarni RN, Holzenberger M, Shih DQ, Ozcan U, Stoffel M, Magnuson MA, Kahn CR. Beta-cell-spe- cific deletion of the Igf1 receptor leads to hyperin- sulinemia and glucose intolerance but does not alter beta-cell mass (2002). Nat Genet 31:111-115. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 (1970). Nature 227:680–685. Lauro D, Kido Y, Castle AL, Zarnowski MJ, Hayas- hi H, Ebina Y, Accili D. Impaired glucose tolerance in mice with a targeted impairment of insulin action in muscle and adipose tissue (1998). Nat Genet 20:294-298. Laustsen PG, Michael MD, Crute BE, Cohen SE, Ueki K, Kulkarni RN, et al. Lipoatrophic diabetes in Irs1(-/-)/Irs3(-/-) double knockout mice (2002). Genes Dev 16:3213-3222. Leibiger B, Leibiger IB, Moede T, Kemper S, Kulkarni RN, Kahn CR, et al. Selective insulin sig- naling through A and B insulin receptors regulates transcription of insulin and glucokinase genes in pancreatic beta cells (2001). Mol Cell 7:559-570. Leibowitz G, Yuli M, Donath MY, Nesher R, Melloul D, Cerasi E, et al. beta-cell glucotoxicity in the Psammomys obesus model of type 2 diabetes (2001). Diabetes 50:S113–S117. Leone DP, Genoud S, Atanasoski S, Grausenburger R, Berger P, Metzger D, et al. Tamoxifen-inducible glia-specific Cre mice for somatic mutagenesis in oligodendrocytes and Schwann cells (2003). Mol Cell Neurosci 22:430-440. Lingohr MK, Briaud I, Dickson LM, McCuaig JF, Alárcon C, Wicksteed BL, Rhodes CJ. Specific regulation of IRS-2 expression by glucose in rat primary pancreatic islets beta-cells (2006). J Biol Chem 281:15884-15892. Lipson KL, Fonseca SG, Ishigaki S, Nguyen LX, Foss E, Bortell R, et al. Regulation of insulin biosynthesis in pancreatic beta cells by an endo- plasmic reticulum-resident protein kinase IRE1 (2006). Cell Metab 4:245–254. Liu JP, Baker J, Perkins AS, Robertson EJ, Efstra- tiadis A. Mice carrying null mutations of the genes encoding insulin-like growth factor I (Igf-1) and type 1 IGF receptor (Igf1r) (1993). Cell 75:59-72. MacAulay K, Doble BW, Patel S, Hansotia T, Sin- clair EM, Drucker DJ, et al. Glycogen synthase kinase 3alpha-specific regulation of murine hepatic glycogen metabolism (2007). Cell Metab 6:329-37. Madisen L, Zwingman TA, Sunkin SM, Oh SW, Zariwala HA, Gu H, Ng LL, Palmiter RD, Hawrylycz MJ, Jones AR, Lein ES, Zeng H. A robust and high-throughput Cre reporting and cha- racterization system for the whole mouse brain (2010). Nat Neurosci 13:133-40. Maedler K, Spinas GA, Lehmann R, Sergeev P, Weber M, Fontana A, et al. Glucose induces beta-ce- ll apoptosis via upregulation of the Fas receptor in human islets (2001). Diabetes 50:1683–1690. Malaguarnera R, Belfiore A. The insulin receptor: a new target for cancer therapy (2011). Front Endo- crinol (Lausanne) 2:1-16. Marcuello C, Calle-Pascual AL, Fuentes M, Runkle I, Soriguer F, Goday A, Bosch-Comas A, et al. Eva- luation of Health-Related Quality of Life according to Carbohydrate Metabolism Status: A Spanish Population-Based Study (Di@bet.es Study) (2012). Int J Endocrinol 2012:872305-872311. McCarty DM, Young SM Jr, Samulski RJ. Integra- tion of adeno-associated virus (AAV) and recom- binant AAV vectors (2004). Annu Rev Genet 38:819-845. McManus EJ, Sakamoto K, Armit LJ, Ronaldson L, Shpiro N, Marquez R, Alessi DR. Role that phos- phorylation of GSK3 plays in insulin and Wnt sig- nalling defined by knockin analysis (2005). EMBO J 24:1571-83. Medina M, Wandosell F. Deconstructing GSK-3: The Fine Regulation of Its Activity (2011). Int J Alzheimers Dis ID 479249. Meier JJ, Butler AE, Saisho Y, Monchamp T, Galasso R, Bhushan A, et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansión of beta-cell mass in humans (2008). Dia- betes 57:1584-1594. Menting JG, Whittaker J, Margetts MB, Whittaker LJ, Kong GK, Smith BJ, et al. How insulin enga- ges its primary binding site on the insulin receptor mailto:Di@bet.es (2013). Nature 493:241-245. Metzger D, Chambon P. Site- and time-specific gene targeting in the mouse (2001). Methods 24:71-80. Metzger D, Chambon P. Generation of Spatio-Tem- porally Controlled Targeted Somatic Mutations in the Mouse (2011). Curr Protoc Mouse Biol 1:55-70. Michael MD, Kulkarni RN, Postic C, Previs SF, Shulman GI, Magnuson MA, Kahn CR. Loss of insulin signaling in hepatocytes leads to severe insulin resistance and progressive hepatic dysfunc- tion (2000). Mol Cell 6:87-97. Mizutani T, Ishikawa S, Nagase T, Takahashi H, Fujimura T, Sasaki T, et al. Discovery of novel ben- zoxazinones as potent and orally active long chain fatty acid elongase 6 inhibitors (2009). J Med Chem 52:7289-7300. Montanya E, Nacher V, Biarnés M, Soler J. Linear correlation between beta-cell mass and body wei- ght throughout the lifespan in Lewis rats: role of beta-cell hyperplasia and hypertrophy (2000). Dia- betes 49:1341–1346. Muoio DM, Newgard CB. Metabolism: A is for adi- pokine (2005). Nature 436:337–338. Murillo O, Luqui DM, Gazquez C, Martinez-Espar- tosa D, Navarro-Blasco I, Monreal JI, et al. Long- term metabolic correction of Wilson's disease in a murine model by gene therapy (2016). J Hepatol 64:419-426. Murphy R, Ellard S, Hattersley AT. Clinical impli- cations of a molecular genetic classification of monogenic beta-cell diabetes (2008). Nat Clin Pract Endocrinol Metab 4:200-213. Naïmi M, Arous C, Van Obberghen E. Energetic cell sensors: a key to metabolic homeostasis (2010). Trends Endocrinol Metab 21:75-82. Nakai H, Fuess S, Storm TA, Muramatsu S, Nara Y, Kay MA. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice (2005). J Virol 79:214-224. Nandi A, Kitamura Y, Kahn CR, Accili D. Mouse models of insulin resistance (2004). Physiol Rev 84:623-647. Neubauer N, Kulkarni RN. Molecular approaches to study control of glucose homeostasis (2006). ILAR J. 47:199-211. Nevado C, Valverde AM, Benito M. Role of insulin receptor in the regulation of glucose uptake in neo- natal hepatocytes (2006). Endocrinology 147:3709- 3718. Newgard CB, Quaade C, Hughes SD, Milburn JL. Glucokinase and glucose transporter expression in liver and islets: implications for control of glucose homoeostasis (1990). Biochem Soc Trans 18:851– 853. El Ouaamari A, Kawamori D, Dirice E, Liew CW, Shadrach JL, Hu J, et al. Liver-derived systemic factors drive β cell hyperplasia in insulin-resistant states (2013). Cell Rep 3:401-10. El Ouaamari A, Dirice E, Gedeon N, Hu J, Zhou JY, Shirakawa J, et al. SerpinB1 Promotes Pancreatic β Cell Proliferation (2016). Cell Metab 23:194-205. Pagès G, Guérin S, Grall D, Bonino F, Smith A, Anjuere F, et al. Defective thymocyte maturation in p44 MAP kinase (Erk 1) knockout mice (1999). Science 286:1374-1377. Pandini G, Frasca F, Mineo R, Sciacca L, Vigneri R, Belfiore A. Insulin/insulin-like growth factor I hybrid receptors have different biological charac- teristics depending on the insulin receptor isoform involved (2002). J Biol Chem 277:39684-39695. Patel S, Doble BW, MacAulay K, Sinclair EM, Drucker DJ, Woodgett JR. Tissue-specific role of glycogen synthase kinase 3beta in glucose homeos- tasis and insulin action (2008). Mol Cell Biol 28:6314-28. Patel S, Macaulay K, Woodgett JR. Tissue-specific analysis of glycogen synthase kinase-3α (GSK-3α) in glucose metabolism: effect of strain variation (2011). PLoS One 6:e15845. Pechhold K, Koczwara K, Zhu X, Harrison VS, Walker G, et al. Blood glucose levels regulate pan- creatic beta-cell proliferation during experimenta- lly-induced and spontaneous autoimmune diabetes in mice (2009). PLoS ONE 4:e4827. Pick A, Clark J, Kubstrup C, Levisetti M, Pugh W, et al. Role of apoptosis in failure of beta-cell mass compensation for insulin resistance and beta-cell defects in the male Zucker diabetic fatty rat (1998). Diabetes 47:358–364.Zucker diabetic fatty rat (1998). Diabetes 47:358–364. Raupp C, Naumer M, Müller OJ, Gurda BL, Agbandje-McKenna M, Kleinschmidt JA. The 171 threefold protrusions of adeno-associated virus type 8 are involved in cell surface targeting as well as postattachment processing (2012). J Viro 86:9396- 9408. Rieck S, Kaestner KH. Expansion of beta-cell mass in response to pregnancy (2010). Trends Endocri- nol Metab 21:151-158. Roach PJ, Depaoli-Roach AA, Hurley TD, Taglia- bracci VS. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes (2012). Biochem J. 441:763-787. Robertson RP. Chronic oxidative stress as a cen- tral mechanism for glucose toxicity in pancreatic islet beta cells in diabetes (2004). J Biol Chem 279:42351–42354. Root-Bernstein R, Vonck J. Glucose binds to the insulin receptor affecting the mutual affinity of insulin and its receptor (2009). Cell Mol Life Sci 66:2721-2732. Russell ND, Cooper ME. 50 years forward: mecha- nisms of hyperglycaemia-driven diabetic complica- tions (2015). Diabetologia 58:1708-1714. Russell WC, Newman C, Williamson DH. A simple cytochemical technique for demonstration of DNA in cells infected with mycoplasmas and viruses (1975). Nature 253:461–462. Saltiel AR, Kahn CR. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism (2001). Nature 414:799-806. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular clo- ning: a laboratory manual (1989). NY. Cold Spring Harbor. Sands MS. AAV-mediated liver-directed gene the- rapy (2011). Methods Mol Biol 807:141-157. Sauer B, Henderson N. Site-specific DNA recom- bination in mammalian cells by the Cre recombina- se of bacteriophage P1 (1988). Proc Natl Acad Sci USA 85:5166-70. Sauer B, Henderson N. Cre-stimulated recombina- tion at loxP-containing DNA sequences placed into the mammalian genome (1989). Nucleic Acids Res 17:147-161. Scaglia L, Smith FE, Bonner-Weir S. Apoptosis contributes to the involution of beta cell mass in the post partum rat pancreas (1995). Endocrinology 136:5461-5468. Scaglia L, Cahill CJ, Finegood DT, Bonner-Weir S. Apoptosis participates in the remodeling of the endocrine pancreas in the neonatal rat (1997). Endocrinology 138:1736-1741. Schuler M, Dierich A, Chambon P, Metzger D. Efficient temporally controlled targeted somatic mutagenesis in hepatocytes of the mouse (2004). Genesis 39:167-172. Schwarz JM, Linfoot P, Dare D, Aghajanian K. Hepatic de novo lipogenesis in normoinsulinemic and hyperinsulinemic subjects consuming high-fat, low-carbohydrate and low-fat, high-carbohydrate isoenergetic diets (2003). Am J Clin Nutr 77:43-50. Shaw LM. The insulin receptor substrate (IRS) pro- teins: at the intersection of metabolism and cáncer (2011). Cell Cycle 10:1750-1756. Siddle K. Molecular basis of signaling specificity of insulin and IGF receptors: neglected corners and recent advances (2012). Front Endocrinol (Lausan- ne) 3:34. Slaaby R, Schäffer L, Lautrup-Larsen I, Ander- sen AS, Shaw AC, Mathiasen IS, Brandt J. Hybrid receptors formed by insulin receptor (IR) and insu- lin-like growth factor I receptor (IGF-IR) have low insulin and high IGF-1 affinity irrespective of the IR splice variant (2006). J Biol Chem 281:25869- 25874. Sommer JM, Smith PH, Parthasarathy S, Isaacs J, Vijay S, Kieran J, et al. Quantification of ade- no-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement (2003). Mol Ther 7:122-128. Sonawane ND, Szoka FC Jr, Verkman AS. Chloride accumulation and swelling in endosomes enhan- ces DNA transfer by polyamine-DNA polyplexes (2003). J Biol Chem 278:44826-44831. Sorenson RL, Brelje TC. Adaptation of islets of Langerhans to pregnancy: beta-cell growth, enhan- ced insulin secretion and the role of lactogenic hor- mones (1997). Horm Metab Res 29:301–307. Stalmans W, Cadefau J, Wera S, Bollen M. New insight into the regulation of liver glycogen meta- bolism by glucose (1997). Biochem Soc Trans 25:19-25. Stumvoll M, Goldstein BJ, van Haeften TW. Type 2 diabetes: principles of pathogenesis and therapy (2005). Lancet 365:1333–1346. Sun XJ, Rothenberg P, Kahn CR, Backer JM, Araki E, Wilden PA, et al. Structure of the insulin receptor substrate IRS-1 defines a unique signal transduction protein (1991). Nature 352:73-77. Taguchi A, White MF. Insulin-like signaling, nutrient homeostasis, and life span (2008). Annu Rev Physiol 70:191-212. Taniguchi CM, Emanuelli B, Kahn CR. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action (2006). Nat Rev Mol Cell Biol 7:85-96. Tannour-Louet M, Porteu A, Vaulont S, Kahn A, Vasseur-Cognet M. A tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase specifically effective in the fetal and adult mouse liver (2002). Hepatology 35:1072- 1081. Taylor SI. Lilly Lecture: molecular mechanisms of insulin resistance. Lessons from patients with mutations in the insulin-receptor gene (1992). Dia- betes 41:1473-1490. Teta M, Rankin MM, Long SY, Stein GM, Kush- ner JA. Growth and regeneration of adult beta cells does not involve specialized progenitors (2007). Dev Cell 12:817-826. Trigatti B, Rayburn H, Viñals M, Braun A, Mietti- nen H, Penman M, et al. Influence of the high den- sity lipoprotein receptor SR-BI on reproductive and cardiovascular pathophysiology (1999). Proc Natl Acad Sci U S A 96:9322-9327. Van Assche FA, Aerts L, De Prins F. A morphologi- cal study of the endocrine pancreas in human preg- nancy (1978). Br J Obstet Gynaecol 85:818-838. Vance MA, Mitchell A, Samulski RJ. (2015) Gene Therapy - Principles and Challenges (Cap 5 pp. 119-143). InTech. Vanrell L, Di Scala M, Blanco L, Otano I, Gil-Fari- na I, Baldim V, et al. Development of a liver-speci- fic Tet-on inducible system for AAV vectors and its application in the treatment of liver cancer (2011). Mol Ther 19:1245-53. Villar-Palasí C, Guinovart JJ. The role of glucose 6-phosphate in the control of glycogen synthase (1997). FASEB J 11:544-558. Voliovitch H, Schindler DG, Hadari YR, Taylor SI, Accili D, Zick Y. Tyrosine phosphorylation of insu- lin receptor substrate-1 in vivo depends upon the presence of its pleckstrin homology región (1995). J Biol Chem 270:18083-18087. Ward CW, Lawrence MC. Ligand-induced activa- tion of the insulin receptor: a multi-step process involving structural changes in both the ligand and the receptor (2009). Bioessays. 31:422-434. White MF. Regulating insulin signaling and beta-cell function through IRS proteins (2006). Can J Physiol Pharmacol 84:725-737. Whitfield J, Littlewood T, Soucek L. Tamoxifen administration to mice (2015). Cold Spring Harb Protoc 2015:269-271. Whittaker J, Sørensen H, Gadsbøll VL, Hinrichsen J. Comparison of the functional insulin binding epi- topes of the A and B isoforms of the insulin receptor (2002). J Biol Chem 277:47380-47384. von Wilamowitz-Moellendorff A, Hunter RW, Gar- cía-Rocha M, Kang L, López-Soldado I, Lantier L, et al. Glucose-6-phosphate-mediated activation of liver glycogen synthase plays a key role in hepatic glycogen synthesis (2013). Diabetes 62:4070-4082. Wilson CH, Gamper I, Perfetto A, Auw J, Litt- lewood TD, Evan GI. The kinetics of ER fusion protein activation in vivo (2014). Oncogene 33:4877-80. Withers DJ, Gutierrez JS, Towery H, Burks DJ, Ren JM, Previs S, et al. Disruption of IRS-2 causes type 2 diabetes in mice (1998). Nature 391:900-904. Wu Z, Asokan A, Samulski RJ. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene the- rapy (2006). Mol Ther 14:316-327. Wu Z, Yang H, Colosi P. Effect of Genome Size on AAV Vector Packaging (2010). Mol Ther 18:80-86. Xuan S, Kitamura T, Nakae J, Politi K, Kido Y, Fisher PE, et al. Defective insulin secretion in pancreatic beta cells lacking type 1 IGF receptor (2002). J Clin Invest 110:1011-1019. Yakar S, Liu JL, Stannard B, Butler A, Accili D, Sauer B, LeRoith D. Normal growth and develop- ment in the absence of hepatic insulin-like growth factor I (1999). Proc Natl Acad Sci U S A 96:7324- 7329. Yamaguchi Y, Flier JS, Benecke H, Ransil BJ, Moller DE. Ligand-binding properties of the two 173 isoforms of the human insulin receptor (1993). Endocrinology 132:1132-1138. Yi P, Park JS, Melton DA. Betatrophin: a hormone that controls pancreatic β cell proliferation (2013). Cell 153:747-58. Zincarelli C, Soltys S, Rengo G, Rabinowitz JE. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection (2008). Mol Ther 16:1073-1080. Zolotukhin S, Byrne BJ, Mason E, Zolotukhin I, Potter M, Chesnut K, et al. Recombinant adeno-as- sociated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield (1999). Gene Ther 6:973-85. Tesis Sabela Díaz-Castroverde Vicario Agradecimientos ÍNDICE 01/resumen 02/summary 03/ abreviaturas 04/introducción 1. DIABETES TIPO 2 Y PAPEL DEL RECEPTOR DE INSULINA EN LA HOMEOSTASIA GLUCÍDICA 1.1. LA DIABETES EN LA ACTUALIDAD 1.2. FISIOPATOLOGÍA DE LA DIABETES TIPO 2 1.3. MODELOS ANIMALES EN LA INVESTIGACIÓN DE LA DIABETES TIPO 2: VÍA DEL RECEPTOR DE INSULINA Y DEL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO INSULÍNICO TIPO I 1.3.1. Modelos knockout específicos de tejido 1.3.2. La necesidad de los modelos knockout inducibles y específicos de tejido: modelo iLIRKO 1.3.3. Mecanismos de compensación: otros modelos knockout 2. RECEPTOR DE .INSULINA E IGF-I. 2.1. ESTRUCTURA DE LOS RECEPTORES, ISOFORMAS DEL RECEPTOR DE INSULINA Y RECEPTORES HÍBRIDOS 2.2. VÍAS DE SEÑALIZACIÓN DE LA INSULINA Y EL IGF-I 2.2.1. Ruta PI3K/PKB 2.2.2. Ruta Ras/MAPK 2.2.3. Modulación de la captación de glucosa en los hepatocitos 2.3. FUNCIÓN DEL HÍGADO EN EL CONTROL METABÓLICO 2.4. INTRODUCCIÓN AL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO: REGULACIÓN POR GLUCOSA-6-FOSFATO 2.4.1. Glucógeno sintasa hepática 2.4.2 Glucógeno sintasa quinasa 3 2.4.3. Regulación específica por la Glucosa-6-fosfato 2.4.4. Degradación del glucógeno 3. PAPEL DE LA CÉLULA β PANCREÁTICA EN LA HOMEOSTASIA METABÓLICA. PLASTICIDAD DE LA MASA DE CÉLULA β PANCREÁTICA 3.1. APOPTOSIS EN LAS CÉLULAS β PANCREÁTICAS 3.2. EFECTO GLUCOTÓXICO EN LAS CÉLULAS β PANCREÁTICAS 4. EJE DE COMUNICACIÓN HÍGADO-PÁNCREAS 5. DESREGULACIONES EN EL METABOLISMO LIPÍDICO ASOCIADOS A DIABETES TIPO 2 6. TERAPIA GÉNICA CON VIRUS ADENOASOCIADOS 6.1. DESCRIPCIÓN DE LOS VIRUS ADENOASOCIADOS 6.1.1. Vector viral 6.1.2. Serotipos virales: tropismo celular 6.2. RESPUESTA INMUNE FRENTE A LOS VIRUS ADENO­ASOCIADOS 6.3. CARACTERÍSTICAS DEL VIRUS ADENOASOCIADO SEROTIPO 8 6.4 ENSAYOS CLÍNICOS EN MARCHA CON VIRUS ADENOASOCIADOS 6.4.1. T erapia génica con virus adenoasociados en enfermedades metabólicas 05/ objetivos 06/materiales y métodos 1. TRABAJO CON MODELOS ANIMALES 1.1. CRÍA Y GENOTIPAJE DE ANIMALES 1.1.1. Mantenimiento del modelo iLIRKO 1.1.2. Obtención de ADN de cola de ratón 1.1.3. Genotipaje 1.2 GENERACIÓN DEL MODELO INDUCIBLE 1.2.1 Pruebas administración del tamoxifeno: vía enteral o vía parental. 1.2.2. Esquema de dietas o esquema definitivo para la generación del modelo inducible 1.3. TESTS METABÓLICOS in vivo 1.3.1. Test de tolerancia a glucosa 1.3.2. Test de tolerancia a insulina 1.4. OBTENCIÓN DE PLASMA SANGUÍNEO 1.5. SACRIFICIO DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 2. CULTIVOS CELULARES. 2.1. LÍNEAS CELULARES YMEDIOS DE CULTIVO 2.2. CONDICIONES DE CULTIVO, MANTENIMIENTO Y EXPERIMENTACIÓN 2.2.1. Condiciones de cultivo 2.2.2. Congelación, criopreservación y descongelación de líneas celulares 2.2.3. Condiciones de experimentación 2.2.3.1. Micoplasma 3. TÉCNICAS DE ADN RECOMBINANTE 3.1. CULTIVO DE BACTERIAS 3.1.1. Cultivo en placa de agar-LB 3.1.2. Cultivo en LB líquido 3.1.3. Congelación (glycerol-stock) 3.2. PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS Y TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS 3.2.1. Purificación de plásmidos 3.2.2. Transformación de bacterias 3.3. CLONAJE Y TRABAJO CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN 3.3.1 Digestión con enzimas 3.3.2. Precipitación del ADN plasmídico con acetato sódico y etanol 3.3.3. Generación de extremos romos 3.3.4. Defosforilación de los extremos del vector 3.3.5. Purificación de bandas de geles de agarosa 3.3.6. Ligación y cribado de colonias positivas 3.3.7. Secuenciación 4. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA 4.1. AISLAMIENTO DE ARN DE LÍNEAS CELULARES Y TEJIDOS 4.2. RT-PCR 4.2.1. Valoración de ácidos nucleicos 4.2.2. Síntesis de ADNc por retrotranscripción 4.2.3. PCR y electroforesis en geles de agarosa 4.2.4. PCR cuantitativa 5. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS 5.1. EXTRACTOS PROTEICOS 5.1.1. Obtención de extractos proteicos 5.1.2. Valoración de proteínas 5.2. WESTERN BLOT 5.2.1. Preparación de muestras para electroforesis 5.2.2. Electroforesis en geles de SDS-PAGE 5.2.3. Transferencia a membranas de PVDF 5.2.4. Bloqueo e incubación con anticuerpos 5.2.5. Detección de anticuerpos por quimioluminiscencia 5.2.6. Borrado de membranas de PVDF 5.3. INMUNOPRECIPITACIÓN 6. INMUNOHISTOQUÍMICA E INMUNOFLUORESCENCIA DE SECCIONES PANCREÁTICAS Y HEPÁTICAS 6.1. PREPARACIÓN DELOS TEJIDOS PARA LASTINCIONES 6.1.1. Fijación de tejidos y obtención de cortes 6.1.2. Desparafinización e hidratación de cortes 6.2. TINCIÓN CON HEMATOXI­LINA Y EOSINA 6.3. INMUNOFLUORESCENCIA EN SECCIONES PANCREÁTICAS O HEPÁTICAS 6.4 INMUNOHISTOQUÍMICA EN SECCIONES HEPÁTICAS Y PANCREÁTICAS 7. OBTENCIÓN DE PARTÍCULAS VIRALES 7.1. PRODUCCIÓN DE PARTÍCULAS VIRALES 7.1.1. Purificación de las partículas virales 7.2. TITULACIÓN DE LAS PARTÍCULAS VIRALES 7.3. ADMINISTRACIÓN DE LOS AAV A LOS ANIMALES 7.4. ENSAYOS DE BIOLUMINISCENCIA 8. TEST METABÓLICOS. 8.1 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 8.2. METABOLISMO GLUCÍDICO 8.2.1 Determinación de la síntesis de glucógeno en cultivo celular 8.2.2. Determinación del contenido en glucógeno en cultivo celular y hepático 8.2.2.1. Determinación del contenido en glucógeno en cultivo celular 8.2.2.2. Determinación del contenido en glucógeno hepático 8.2.3 Determinación de la actividad de la glucógeno sintasa hepática 8.2.4. Determinación de la actividad de la glucógeno fosforilasa hepática 8.3. METABOLISMO LIPÍDICO 8.3.1. Aislamiento y purificación del total de los lípidos hepáticos 8.3.2. Ensayos colorimétricos para la medida de colesterol y triglicéridos 8.3.3. Cromatografía líquida de separación rápida de proteínas (Fast protein liquid chromatography, FPLC) 9. OTRAS TÉCNICAS 9.1 CUANTIFICACIÓN 9.1.1. Blots 9.1.2. Imágenes deinmunohistoquímica einmunofluorescencia 9.2. ESTADÍSTICA 9.3. TÉCNICASBIOINFORMÁTICAS 9.3.1. Trabajo con secuencias de ADN 9.3.2 Trabajo con imágenes 10. MATERIALES 07/resultados 08/discusión 09/conclusiones 10/ bibliografía