UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE FARMACIA
TESIS DOCTORAL
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
Paloma Abad Ortega
DIRECTOR:
Pilar González González
Madrid, 2015
© Paloma Abad Ortega, 1981
Estudio del comportamiento de la Glutamato
Deshidrogenasa en diferentes poblaciones mitocondriales del
cerebro de rata
Departamento de Bioquímica
P a lo m a A bad O r t e g a
5 3 0 9 8 6 3 1 5 9
UNIVERSIDAD COM PLUTENSE
X C D , Ï13
ESTUDIO DEL COMPORT AMTFNTO DE LA G LUT AMATO DESHIDROGENASA
EN DIFE RENTES POB LAC TONES MITOCONDRIALES DE CEREBRO DE RATA
D e p a r ta m e n to d e B io q u im lc a
F a c u l t a d d e F a r m a c ia
U n i v e r s i d a d C o m p lu te n s e d e M a d r id
1984 M i l
D i B L I O T E C A
Colecciôn Tesla Doctorales. Ne 32/84
(g) P a lo m a A bad O r t e g a
Edita e imprime la Editorial de la Universidad
Complutense de Madrid. Servicio de Reprografia
Noviciado, 3 Madrid-8
Madrid, 1984
Xerox 9200 XB 480
Depôsito Legal: M-42387-I984
FACULTAD DE FARMACIA DE MADRID
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA
ESTUDIO DEL COMPORTAMIENTO DE LA GLUTAMATO DESHIDROGENASA
EN DIFERENTES POBLACIONES MITOCONDRIALES
DE CEREBRO DE RATA.
Memoria presen tada por la Lda.
Paloma Abad Ortega, para
aspirar al grade de doctor.
Madrid, 1981.
Este trabajo ha sido rcalizado, en su totalidad, en el laboratorio de enzimologi'a
del Departamento de Bioqufmica de la Facultad de Farmacia de Madrid, bajo la direcciôn
de la Dra. Pilar Gonzalez Gonzalez.
Mi sincere agradecimiento al Profesor Santos Ruiz que me acogio en
el Departamento de Bioqufmica que dirige, orientando y supervisando es
te trabajo.
A la Dra. Pilar Gonzalez Gonzalez que no se ha limitado a dirigirme
cientificamente durante estos anos. Su constante ayuda y comprensiôn en
el aspecto humano, junto a su valioso criterio, han hecho posible este tra
bajo.
Al Dr. Angel Jiménez Solves que, ademâs de acercarme a la Dra. Gon
zalez, depositô su confianza en mis intenciones cienti'ficas que él mismo
alimentô.
Al Profesor Trigo y a M® Teresa Esteban que enriquecieron mi espiri-
tu y depositaron en mi la necesidad de superaciôn profesional.
Al Dr. Alberto Martinez, Jefe del Servicio de Btoquimica de la C.S.
de Octubre, cuyo contacto y ejemplo diarios me hacen ser mâs exigen-
te conmigo misma.
A Miguel Femândez Ramil por su colaboracion.
Por ultimo a todo el personal del Departamento de Bioqufmica por
su apoyo.
Ill
A mi madre con todo mi amor y gratitud.
IV
ABREVIATURAS
ACH—as«
ADP
AMP
ATP
EDTA
G
GABA
GDH
GTP
qKG
LDH
MDH
NAD
NADH
NADP
NADPH
n h ;
TRIS
Acetil-colinesterasa.
Adenosin-difosfato
Adenosin-monofosfato
Denosin-trifosfato
Etflen-diamino-ettiaacético
Ghitamato
Acido gamma aminobutirico
Glutamato deshidrogenasa
Guanosin-trifosfato
Alfa-ceto-^utarato
Lactato deshidrogenasa
Malato deshidrogenasa
Nicotinamida-adenosin-dinucleôtido
Nicotinam ia adenosin dinucleotido reducido
Nicotinamida-adenosin-dinucleôtido-fosforilado
Nicotinamida-adenosin dinucleotido fosforilado reducido
Amonio
Tri-hidroxi metil amino-metano
I N D I C E
1. W TRODUCaON ................................................................................................................... 1
1.1.— Antécédentes historicos ........................................................................ 2
1.2.— Objetivos del présente tra b a jo ............................ 4
2. PARTE TEORICA ................................................................................................................... 6
2 1 — Breve exposicion de los datos publicados acerca del conocimiento actual sobre
los distintos aspectos de la G D H ............................. 8
2.2.— Modelo del metabolismo del glutamato en cercbro ....................................... 26
3. MATERIAL Y METODOS ........................................................................................................ 40
5.1.— Obtenciôn de tejido cerebral ..................................................................................... 41
5.2 — Fraccionamiento subcelular ................................................................................. 41
Obtenciôn de M L. y M.S............................................................................................... 41
Obtenciôn de M.S. de subfracciones sinaptosomales ............................................ 44
3.3.— Preparaciôn de extractos enzimâticos ................................................................ 45
Solubilizaciôn de GDH ............. 45
3.4— Valoraciôn de actividades cnzimâticas .................................................................. 47
Fumarasa ......................................... 47
MDH ...................... 48
LDH .............................................................................................................................. 48
ACH-asa ......................................................................................................................... 49
GDH ........................................... 49
3.5.— Valoraciôn de protemas ................................... 51
3.6— Ciilculo de la Km para los distintos sustratos ......................................................... 51
Km para el g lu ta m a to ................................................................................................... 52
Km para cl N A D ............................................................................... 53
Km para el NADII ...................................................................................... 54
VI
Km para cl acetato amônico ............................... 55
Km para el a-cetoglutarato... .............................. 56
3.7.— Electmfôresis en gel de poliacrilamida ............................................................... 57
Preparaciôn de gcles ......................... 57
Migraciôn clcctroforctica...... ...................................................................................... 57
Tenido de los gelcs ............................................................................... • 58
PARTE EXPERIMENTAL..................................................................................................... 59
4.1.— Localizaciôn y solubilizaciôn de la GDH de cerebro de rata ........................... 60
Introducciôn .............................................................................................................. 61
Rcsultados y discusiôn ............................... 61
Conclusiuncs ................................................................................................... • 63
B ibliografia.................................................................................................................. 73
4.2 — Comportamicnto de la GDH proccdcntc de distintas fraccioncs mitocondriales 74
Introducciôn . 75
Rcsultados y discusiôn ............. 76
Conclusiones - 8*0
B ibliografia.................................................................................................................. 8 7
4.3 — Efccto de nucleôtidos sobre la GDH de cerebro de rata y mecanismo de acciôn
del ADP sobre las M.L................................................................. 89
Introducciôn ........................................................................................ 90
Rcsultados y discusiôn .............................................................................................. 91
Conclusiones ............................................... 95
Bibliografia....................... 106
4.4 — Parâmctros cinélicos de la GDII proccdcntc de mitocondrias libres y sinaptoso
males .............................................................................................................................. 107
Introducciôn ................................................................................................................ 108
Rcsultados y discusiôn ............................................. 109
Conclusiones .................. 109
Bibliografia.................................................................................................... 115
VII
4.5.— Conclusiones gcncrales.................................................................................................... 116
5. DIBUOGRAITA GENERAL ............................................................................................ 120
I. INTRODUCCION
1 .- INTRODUCCION
1.1 ANTECEDENTES IIISTORICOS
Los diferentes tejidos animales dificrcn considcrabicmente en su capacidad para formar amo
nio. El cercbro pertcnecc a un grupo de organos que en adecuadas condiciones lo form an a gran
velocidad.
Numerosos invcstigadores (1-5), han encontrado una intima relaciôn entre la actividad nereiosa
y la formaciôn de amonio y es bien conocida su liberaciôn por excitaciôn de ncr\ios periféricos, asi
como por estimulaciôn eléctrica, micntras que existe una depresiôn del mismo por escisiôn del
nervio y durante el sueno (6,7).
El contenido de amonio en el cercbro vivo es también signifïcativamente elevado, antes y
durante las convulsiones producidas, por la administracion de diferentes farmacos talcs como, la
picroloxina (2), el fluoroacetato (3), el pentamelilcnotctrazol (8) o el telodrin (9); por estimulaciôn
eléctrica del cercbro; por prolongado cstimulo androgcnico (10) o por anoxia (2, 11).
De estas observaciones se deduce que el nivel de amonio en cerebro esta estrechamente rclacio-
nado con la actividad nerviosa; es decir, que se incrementa en cerebro en cstado de excitaciôn de las
cclulas neuronales y decrece en estados inhibitorios.
En cl aspecto clinico, cl interés de la conccntraciôn de amonio en sangre y su relaciôn con
disturbios neuropsiquiâtricos, ha sido ampliamcntc estudiado en casos de enfermedades hepâticas
(12, 13). Las hiperamonemias, frecuentementc demostradas, dan lugar a ciertos defectos especificos
en comportamicntos motores, asi como a numerosos casos de enccfalopatias (14, 16).
Se ha descrito (17) una alta correlaciôn entre los niveles de amonio en sangre y las perturbacio-
nes de los estados mentales. Por otra parte son caracteristicas de niovimientos involuntarios en
pacientes con hiperamonemia.
Cuando los niveles de amoniaco en sangre son elevados a causa de enfermedades hepâticas. Su
captaciôn por el cerebro es proporcional a su conccntraciôn arterial. El uso de sustancias taies como
o-cetoglutarato o glutamato, en la terapia del coma liepâtico, parece reducir la tasa de amonio libre
en sangre, aunque las experiencias clinicas no son demasido favorables (18).
Como ya hemos mencionado, la importancia de los ioncs amonio en las actividades del sistema
ncrvioso, se conocc desde h ace varios anos, pero el origcn de su formaciôn en cerebro “in \ivo” no
ha sido esclarecido hasta cl momento. Se considéra que el amonio es metabolizado activamente en el
tejido ncrvioso y contribuyc asi a una funciôn fisiolôgica especifica en el mismo.
La naturaleza del origcn del amonio en el tejido ncrvioso es de gran interés, pero el problema
esta aûn por resolver. Se ha demostrado que el tejido cerebral contiene varios sistemas de enzimas
desaminantes, talcs como la glutaminasa (19), la glutamato deshidrogenasa (20), la aminooxidasa
(21), la adenflico deaminasa (22, 23), la adenosina deaminasa (22, 24), la NAD-deaminasa (25), la
glucosamina 6 fosfato-dcaminasa (26), etc.
Es bien conocido que cl contenido de acido glutâmico en cerebro es alto, encontrândose
fundamentalmcntc en forma libre. Cuando se adiciona acido glutâmico a cortcs de cerebro respiran
tes, se transforma en glutamina, c toes , no hay liberaciôn de amonio. Por otra parte el equilibrio de
la reacciôn de la GDH esta en favor de la aminaciôn rcductora del oKG (27). Segûn ésto, parece que
cl glutamato no es un candidate como precursor de amonio, si bien es posible que su metabolismo
intn'nseco en el tejido cerebral, sea diferente del adicionado “ in vitro” .
De acuerdo con cl concepto clâsico (28), el nitrôgeno de los aminoâcidos pasa al glutamato
median te aminotransfercncias y cl amonio libre se formarfa por la acciôn de la GDH. Esta teoria, no
obstante, ha sido ampliamcntc disentida en cl caso del cerebro (29) y se ha visto que la adiciôn de
âcido glutâmico a homogenados cérébrales da lugar a la formaciôn de aspartato (30). Por tanto, se
acepta como un hecho bas tante probable que cl primer paso en cl metabolismo del glutamato en
tejido cerebral sea una transaminaciôn que no invulucrc la liberaciôn de amonio. La racionalidad de
este mecanismo se explica por el hecho de ser la GDH una enzima reversible cuyo equilibrio se
desplaza en favor de la aminaciôn rcductora (27, 31, 32).
Segûn ésto, quizâ el aumento de amonio podria detencr la reacciôn en el sentido de una
dcsaminaciôn oxidativa. Numerosos experimentos han sido realizados con cl fin de lograr dilucidar
el papel de la GDH en la formaciôn de amonio (30) llegândose, con todos cilos, a la idea de que el
glutamato endôgeno parece ser que se desamina mayoritariamente por la citada enzima.
Hasta el momento, la hipôtesis de que la GDH es la enzima terminal en el proccso de forma
ciôn de amonio en el cerebro, esta apoyada por estudios de inhibiciôn. Los inhibidores de la
formaciôn de amonio se dividen en très grupos:
— aquellos que actûan sobre el transporte de electro nés entre la deshidrogenasa y cl oxigeno.
— los inhibidores de la transaminaciôn.
— los inhibidores cspecfficos de la GDH.
A todos éstos se pueden anadir aquellos sustratos taies como la glucosa, manosa y piruvato, los
cuales afectan al “Stcade state” de los niveles de a KG y oxalacetato y, por tanto, regulan la
direcciôn y velocidad de las aminotransfercncias, desaminaciones y aminaciones. Finalmente, hay
algunos inhibidores taies como la D glutamina y el D aspârtico (33) cuyo mecanismo de acciôn es
totalmente dcsconocido.
Inhibidores del primer grupo (a), han sido estudiados por varios au tores (34, 36). Por otra
parte, los estudios sobre los del scgundo grupo (b) han demostrado que sus efectos inhibidores son
variables (37). Resultaron de interés especial los inhibidores especificos de la GDH (c): El âcido
D glutâmico, âcido glutârico, triyodotironina (T j), etc., que presentan inhibiciôn sobre la GDH
purificada a partir de tejido hepâtico (38, 39) y que también interfieren la formaciôn de amonio en
cortes de cerebro (37, 40).
A pesar de todos los estudios realizados, sobre la formaciôn de amonio con intervenciôn de la
GDH, hasta cl momento, no se ha llegado a una conclusion cl ara, posiblcmentc debido a la gran
heterogeneidad cerebral y a la compartimentaciôn del glutamato. Por elto y en el présente trabajo,
nos hemos marcado unos objetivos concretos con la intenciôn de podcr aportar algunos datos mâs al
esclarecimiento del problema.
1.2 OBJETIVOS DEL PRESENTE TRABAJO
Dado que durante el iinpulso ncnioso, y por excitaciôn nersiosa, se incrementa la producciôii
de amonio en cercbro, y puesto que la GDH es una de las enzimas que parccen estar implicadas en
su formaciôn, nos proponcmos conoccr las caractcr/sticas de dicha enzima en las mitocondias
procedentes de las terminaciones nerviosas (sinaptosomas) y en las libres (procedentes de pericarion
neural y de células gliales). Puesto que el metabolismo del glutamato en cerebro esta compartimen
tado, el estudio de la glutamato deshidrogenasa en los diferentes tipos de mitocondrias ofrece un
particular interés. De esta forma se intenta cubrir très objetivos:
1) Si la GDH de mitocondrias sinaptosomales y libres, difieren en la actividad enzimâtica en
uno y otro sentido. Ello podrfa dar idea de si sus respectivas funcionalidades, en lo que a la GDH se
refiere, van dirigidas hacia la sintesis o hacia la dcgradacicn del glutamato.
2) Si existe una heterogeneidad de comportamicnto, respecto a la GDH, no sôlo entre m ito
condrias libres y sinaptosomales, sino entre diferentes subpoblaciones de las ultimas.
3) Si las difcrencias de comportamicnto de la GDH en las distintas subpoblaciones subcelulares
pueden, de alguna m ancra, esclarcccr los problem as de la compartimentaciôn del glutamato en el
cerebro.
Para ello se pone a punto una técnica de separaciôn de mitocondrias libres (M.L.) y sinaptoso
males (M.S.); se investiga cl grado de "binding” de la enzima con la mitocondria (solubilizaciôn de la
enzima). Asimismo se analiza la actividad enzimâtica de la GDH en ambos scntidos de la reacciôn y
en los dos tipos de mitocondrias con referencia a la relaciôn de la actividad en ambos sentidos y al
efecto del ADP en dichas actividades, asi como la Km para los diferentes sustratos.
Por ultimo, se procura scparar distintas subpoblaciones de sinaptosomas y se intenta conocer
en cada una de ellas las caractcrfsticas de la GDH.
2 . - PARTE TEORICA
2.1 BREVE EXPOSICION DE LOS DATOS PUBLICADOS ACERCA DEL CONOCIMIENTO
ACTUAL SOBRE LOS DISTINTOS ASPECTOS DE LA GDH.
2.2 MODELO DEL METABOLISMO DEL GLUTAMATO EN CEREBRO.
2.1 BREVE EXPOSICION DE LOS DATOS PUBLICADOS ACERCA DEL CONOCIMIENTO
ACTUAL SOBRE LOS DISTINTOS ASPECTOS DE LA GDH
La enzima L-glutamato deshidrogenasa o GDH (E.C. 1.4.1.2.4.) cataliza lasiguiente reacciôn:
a-cetoglutarato + NAD (P) H + NHj + H* " Lglutamato + NAD(P)* + H ,0
es decir, la interconversion de a-cetoglutarato y âcido L glutâmico. Aunque el equilibrio de la
reacciôn esta desplazado a favor de la formaciôn de L-glutamato, la reacciôn inversa (desaminaciôn
oxidativa) es importante en algunos oiganismos, asf como en dcterminadas funciones de tejidos
especializados.
La GDH es una enzima de gran interés, debido a la posiciôn clavc que el a-cetoglutarato y cl
glutamato, ocupan en el metabolismo, ya que participan en numerosos e importantes rutas metabôli-
cas. Esta enzima proporciona pues una via de incorporaciôn de nitrôgeno a compuestas que no
poseen este elemento quimico y enalaza asi cl metabolismo gluci'dico con el proteico. La acciôn
catalftica de la GDH no se limita al âcido glutâmico, sino que intervienc igualmente en la intercon-
vcrsiôn de otros a-aminoâcidos y sus correspondientes a cetoâcidos (41, 42). Concretamcnte la
interconversiôn de a alanina y piruvato ha sido ampliamcntc estudiada (43).
Se conocen, al menos, très tipos de GDH que difieren, tanto en su cspccificidad por el
coenzima (NAD, NADP, o ambos) como por sus caractcrfsticas moleculares y funcionales. La GDH
se halla ampliamcntc distribuida en la naturaleza y solamente unos pocos organismes carecen de
ella. Ha sido extrafda y purificada a partir de muy variadas fuentes: bacterias, hongos, plantas y
numerosos tejidos animales (44). La enzima proccdcntc de tejidos animales puede utilizar como
coenzima tanto NAD (H) como NADP (H), micntras que la obtenida de otras fuentes es especifica
para uno u otro (45, 46, 47). Ademâs, la capacidad de la GDH para utilizar NAD (H) o NADP (H),
varfa segûn la especie animal de que procédé.
Los niveles de GDH en los mam/feros, varia mucho de unos tejidos a otros. Normalinente es el
hfgado cl ôrgano mâs rico en ella (54 U.I/g) scguido del rifiôn (1 1 U.I/g), y sc cncucntran valorcs mâ
bajos en cerebro, mucosa gâtrica, nôdulos linfâticos, puhnôn, placenta, médula y tejido muscular
(48). Las distintas GDH, procedentes de diferentes ôrganos de una misma especie, son similares y en
ocasiones idénticas. A este respecte se producen reacciones cruzadas complétas entre extractos
cnzimâticos obtcnidos a partir de bazo, cerebro y corazôn bovines y anticuerpos inducidos per
GDH de hfgado bovino (49). Per otra parte, las enzimas de higado, cerebro, rinôn, corazôn y
mûsculo esquelétîco, responden de la misma forma a la acciôn de purin nucleôtidos (50).
La localizaciôn subcelular de la GDH de origen animal, reside fundamentalmcnte en mitocon-
drias (51, 52). Algunos autores, sobre todo en lo que respecta a la GDH hepatic a, sugieren su
presencia en la matriz basândose en su fâcil solubilizaciôn, aunque estudios mas recientes parecen
confirmar la hipôtesis de que, al menos una parte del total, se encuentra ligada a las membranas
mitocondriales. Existen también trabajos, aunque contradictories, sobre la presencia de GDH en les
nûcleos de células hepâticas de rata (53, 54, 55) y, mâs recientemente, Di Frisco (56, 57) ha
aportado datos sobre diferencias cincticas y estructurales entre las enzimas mitocondrial y nucelar.
Asimismo se ha encontrado GDH en la fracciôn citosôlica de algunos hongos. Tante la GDH NAD
dependiente como la GDH NADP dependiente de Sacharomyces Carisbergensis y Cerevisiae son
citosôlicas (58, 59) y en Dictiostelium Discoideum existen 2 GDH, una mitocondrial, que es NAD*
o NADP* dependiente y otra extramitocondrial solo NAD* dependiente (60).
Respecte a su composiciôn, el contenido en aininoâcidos de las diferentes GDH es bas tante
aemejante aunque difiere del de otras deshidrogenasas; por ejemplo, su proporciôn en arginina y
Usina es mâs elevada. Apella y Tomkins (61), detectaron cuatro restes de triptôfano por subunidad
en la enzima de higado bovino, mediante anâlisis espectral y titulaciôn con N-bromosuccinmida,
mientras que en la determinaciôn secuencial, solo se localizaron très restes (62, 63). No se ban
encontrado puentes disulfuro en ninguna GDH pero si aparecen seis restes de cisteina en la enzima
bovina y siete en la de higado de polio (62, 63, 64). Succsivos estudios de hidrôlisis de la GDH con
tripsina y pepsina (66, 67, 68), asf como con bromuro de cianôgcno(69, 70) y con hidroxilamina
(62), h an permitido determinar la secuencia de GDH hepâtica (bovina y de polio) (65) asf como de
GDH, NADP dependiente, de Neurosporas (71) y también la secucncia de algunos péptidos en la de
bi'gado de rata (72). De todos estes estudios se desprendc que la cadena polipeptidica de la enzima
c onsta de 500 aminoâcidos, que corrcsponden a un Pm de 55.390. La secuencia de la GDH de polio
e:s significativamente similar a la bovina con solo 27 aminoâcidos diferentes entre les 500 que ambas
piosecn. Ademâs de los très restes adicionales que la primera tienc en su extreme amino. La
secuencia incompleta de la enzima del higado de rata indica, asimismo, una gran similitud con las
10
antenorcs.
El estudio de la secuencia de las enzimas bovina y de polio, ponen de manificsto que el resto
N-terminal de la cadena (alanina y àcido cisteico, respcctivamente) es bastante polar, mientras que et
extremo C terminal es rclativamente hidrofôbico (treonina). Ix)S aminoâcidos que constituyen am
bas enzimas son normales, con la excepciôn del âcido cisteico N-terminal de la GDH de polio (65,
65).
Los estudios sobre la GDH NADP dependiente, de Neurospora, revelan que, aunque posee 48
restos de aminoâcidos menos que la bovina, existe una gran analogi'a entre ambas; particularmente
en los 200 ptimeros aminoâcidos de la cadena, donde estân incluidos dos restos de Usina que se
su ponen implicados en la union con el sustrato (71). Como veremos posteriormente, se ha demostra-
do que los restos de aminoâcidos que intervienen en la union con moduladores alostéricos, se sitûan
en la region —COOH terminal Segûn ésto y como la enzima de Neurospora no présenta propiedades
alostéricas frente a ADP y GTP, a diferencia de la de los vertebrados, podrfa anticiparse que las
diferencias secuenciales dcberân ser mâs pronunciadas en esta zona. Es curioso senalar que los restos
de cistcfna, histidina, metionina y triptôfano de la enzima de Neurospora no coinciden con los de la
de vertebrados. Ello no excluye que dichos restos estén localizados en cl centro activo, ya que al no
posecr las cadenas la misma lonptud, podn'an estabiccerse en la misma disposiciôn en la estructura
tridimensional, a pcsar de sus diferencias en la secuencia. Cabe también des tac ar 21 restos de
glicocola en posiciôn anâloga en la secuencia de la GDH de vertebrados y la de Neurospora; lo que
sugiere cl que puedan estar implicados mâs bien en mantener la conformaciôn tridimensional que en
el mecanismo catah'tico.
Otro dato estructural se refiere a la posibilidad o no de que la GDHsea una Zn-protefna. En un
principio se pensô que efectivamente de ello se trataba pucsto que la espectroscopi'a de emisiôn
detectaba un âtomo de Zn por mol de proteina; no obstante, este dato no ha sido confirmado
posteriormente (73). A esto puede ahadirse que observaciones mâs recientes (74) h an planteado la
duda de que sea o no cl Zn esencial para la actividad enzimâtica. Lo que si parcce ser un hccho es el
que la GDH posée alla afinidad por tal eicmento quimico y se postula que éste podn'a actuar sobre
la actividad enzimâtica como modulador alostérico (75). Por otra parte, la enzima bovina estâ
constituida por cuatro oligômeros (subunidades activas), cada uno de los cuales estâ, a su vez,
formado por seis cadenas polipeptidicas iguales (subunidades inactivas). Estas cadenas conticncn.
11
por su parte, un centro catalitico para el nucleotido, un centro regulador para el mismo y uno o
varios sitios implicados en la asociaciôn-disociacion del oligômero.
El equilibrio reversible de asociaciôn-disociacion (que veremos mâs adelante), de la GDH,
origînô grandes difîcultades en la determinaciôn correcta de su peso molecular, asi como del numéro
de subunidades que forma el oligômero activo. Se han dado pesos moleculares para la enzima bovina
que oscilan entre 280.000 (76) y 400.000 (77). En la actualidad se admite como cierta lacifra de
332.000, como consecuencia del estudio de la secuencia de aminoâcidos de las seis cadenas idénticas
que form an el dfmero (62). La GDH de hfgado de polio posee 4 oligômeros que constan también de
6 cadenas polipeptfdicas, aunque cada una de éstas poseen très restos de aminoâcidos adicionales
(64), mientras que las cadenas de la GDH NADP dependiente, de N euro^ora, poseen 50 restos
menos y la enzima es similar a la de E. coli, levadura y posiblemente a la de higado de rata. Por su
parte la GDH NAD dependiente también de neurospora, es muy diferente a las anteriores ya que
posee un peso molecular de 48 0000 y cuatro subunidades enzimâticamente activas de casi doble
tamano que aquéllas (78). Eisemberg y Reisler (79) han propuesto un modelo para la estructura del
oligômero de la GDH de hfgado bovino y han estuadiado las diferentes formas de asociaciôn, de las
seis subunidades que lo integran, en una configuraciôn simétrica. El modelo présenta simetria
diédrica y la polimerizaciôn se efectùa en la direcciôn del eje temario. Los modelos que se corres-
ponden con los que fueron obtcnidos por micrografi'a (80) con diferentes orientaciones aparecen'an
como indica la figura 2.1 — 1.
Figura 2. 1 — 1
12
Parcce ser que en diferentes condicioncs las subunidades del oligômero pueden interaccionar y
asociarse dando lugar a dimeros o trimeros. Estas formaciones han sido descritas en presencia de
SDS, si bien las condicioncs no han sido indicadas con detalle (81).
El microscopio clectrônico ha revelado la presencia de tr/meros (82, 80, 83) cuyas subunidades
dispuestas en triângulo se pueden aproximar mediante ta adopciôn de formas elipsoides. El oligôme
ro estaria en tal caso constituido por dos trimeros superpuestos. No obstante, no ha sido posible la
scparaciôn de trimeros cataliticamcnte activo.
También se han realizado estudios inmunolôgicos para adquirir mayor informaciôn acerca de la
estructura del oligômero. Lehman observé (84) que la enzima de higado humano y la de higado
bovino probablemente no poseen antigeiios déterminantes en el centro activo, ni en su inmediato
entomo. Asimismo, postula que los sitios de union del anticuerpo no son facilmente accesibles al
complejo enzimâtico polimérico. Smith (63) mediante tripsinizaciôn de la enzima, previo marcado
del centro activo con PLP radioactivo, obtuvo el pcptido Gli-123-Lis-134, observando que no
contcnfa fenil-alanina, triptôfano ni tiroxina. l.a ausencia de aminoâcidos aromâticos en esta parte
de la molécula podria indicar la falta de déterminantes antigénicos. Por otra parte, una prcponderan-
cia de aminoâcidos aromâticos en la rcgiôn que permanece oculta durante la polimerizaciôn, cxplica-
rfa la misiôn que tiencn los hidrocarburos aromâticos en cl incremento de la polimerizaciôn. Ade
mâs los complejos de la GDH con anticuerpos retienen la actividad enzimâtica o interficren con la
acciôn de los moduladores alostéricos ADP y GTP. No existe evidencia de competiciôn alguna entre
unos y otros, pero aquellos pueden dar lugar a cambios conformacionales que interfieren la régula
ciôn (43).
La actividad enzimâtica puede estar estrcchamente relacionada con el estado de agregaciôn de
las subunidades al constituir el oligômero, segûn el siguiente esquema (38):
13
ADP
Leucina
CH, Hg OH
MONOMERO Y
y
Asociaciôn depen
diente de la con-
centraciôn de
enzima
GTPh
NADH + AXP j
MONOMERO X POLIMERO
etc.
Las très formas son catalfticamente activas, aunque la especifîcidad por el sustrato vari'a de
unas a otras. De esta forma, mientras el monômero X es especi'fico para el glutamato y puede
polimerizarse, el monômero Y no lo hace y tiene mayor actividad frente a ciertos aminoâcidos
monocarboxilicos, como la alanina por ejemplo. Las très formas estân en equilibrio y diversos
agentes conocidos afectan al desplazamiento del equilibrio de la enzima en uno u otro sentido,
como Indica cl esquema. También diversas sustancias, que influycn sobre la velocidad catalitica,
afectan a la reacciôn de polimerizaciôn. El GTP (85), la tiroxina (8 6 ) y el dietil estilbestrol (87) que
inhiben a la GDH, favorecen la degradaciôn de la enzima en presencia de NADH. Por otro lado, el
ADP que estimula la actividad enzimâtica, ayuda a la agregaciôn de la enzima en presencia de NADH
( 8 8 ) y a la formaciôn del monômero X a partir del Y.
La concentraciôn de GDH, en numerosos ôrganos, estâ a nivelcs en los cuales pueden darse
formas polimerizadas. Sin embargo, se sabe que la GDH de distintas procedencias cambia notable-
mente su capacidad polimérica. Por ejemplo, la GDH de higado de cerdo (89) y humano (90) se
polimerizan en soluciones concentradas al igual que la enzima de higado bovino, mientras que la de
hfgado de polio y de sapo (91, 92) se agregan en soluciones de menor concentraciôn. La enzima
purificada de higado y rinon de rata, asi como las de proccdcncia no animal, no se polimerizan (55,
94).
Sobre el mecanismo de polimerizaciôn se han emitido teon'as varias. Colin an y Friedcn (77)
proponen la existencia de un equilibrio, sin e tapas intermedins, entre el oligômero y el polimero. La
cxistencia de este tipo de equilibrio, sitpondria la formaciôn de dos picos por ultracentrifugaciôn, y
14
segûn los datos de Oison y Anfinsen (95) solo se forma uno. Sund y Buchard (76) han sugerido una
asociaciôn por pasos y el poli'mcro asi formado estaria limitado a ocho oligômeros. Por su parte
Chun y Kim (96), basândose en trabajos anteriores de Eisemberg y Tomkins (97), se inclinan por la
posibilidad de formaciôn de un polimero de indefïnido nûmero de oligômeros.
Experimentos sobre viscosidad (98), di fracciôn de ray os X (99) y microscopi'a electronic a
(100, 101) han evidenciado que la enzima se agrega form an do polimeros lineales. La polimerizaciôn,
que es reversible y dependiente de la concentraciôn, se ha estudiado por medida del esparcimiento
de la luz {light scattering) y por equilibrio de sedimentaciôn ( 1 0 2 ) y se llega a la conclusion de que
el peso molecular aumenta paralelamente al incremento de concentraciôn. La eneigia libre de
adiciôn de cada unidad sucesiva es independiente de' grado de polimerizaciôn y el proceso puede
describirse como una condensaciôn lineal abierta de oligômeros funcionales. La energia de actîva-
ciôn, a dis tintas conccntraciones de protefna, es la misma. Mayor evidencia la proporciona el que las
e tapas bimolecularcs, que dan lugar a polimeros lineales, poseen la misma constante de equilibrio; si
bien hay que senalar datos contradictorios (103). Las fuerzas implicados en la reacciôn de polimeri
zaciôn no han sido aûn bien caractcrizadas. La influcncia del pH (a pH 7,8 se favorece la forma X y
a pH 9 la forma Y) (104), de la fuerza iônica y de la tcmperatura sobre el grado de agregaciôn
permiten suponer que en la polimerizaciôn estân implicadas interacciones electrostâticas ( 103,
105). El efecto del dioxano, que rompe las formas polimericas, indicarla la partieipaciôn de formas
hidrofôbicas (90), aunque ésto no impiica cambio alguno en cl entorno de los residuos aromâticos
(106).
Los hidrocarburos aromâticos, como el benceno y el tolueno, aunientan la polimerizaciôn,
aunque sin efecto sobre la actividad especiTica de la enzima, lo que parece indicar que esta pueda ser
independiente del grado de agregaciôn.
La secciôn de coenzimas nucleotidicos sobre la GDH tiene un gran efecto sobre cl equilibrio de
polimerizaciôn de la enzima (107). La importancia de estas interacciones, asociadas en algunos casos
a cambios en la actividad enzimâtica, se debe a que los nivelcs metabôliros de ciertos nucleôtidos
controlan estos mecanismos (108).
Tomkins (43) ha investigado acerca de la influcncia de los nucleôtidos sobre los cfcctos
cataliticos, relacionândolos con el equilibrio de polimerizaciôn. Como sc ha indicado en cl esquema
15
de la pâg. 13, el GTP, en presencia de NADH, inactiva a la enzima (109) y présenta mayor afinidad
por la forma desagregada del mismo, que para la polimérica (108). Sin embargo, otros ligandos que
inhiben a la GDH, favorecen su despolimerizaciôn. Por su parte el ADP en presencia de NADH
aumenta la actividad enzimâtica y favorece la polimerizaciôn. Todos estos hechos inducen apensar
que los purin-nucleôtidos actûan sobre la GDH y cambian el equilibrio entre una forma polimérica,
enzimâticamente activa, y o tra oligomcrica de poca actividad.
Estudios posteriores realizados a altas conccntraciones de enzima y en presencia de inhibidores,
no han aportado datos signifîcativos que indiqucn correlaciôn alguna entre especifîcidad y grado de
polimerizaciôn (110). Fisher (111) ha supuesto que el GTP influyc en la polimerizaciôn y que
compite, posiblemente, con el lugar de union del oligômero impidiendo, de esta forma, la agregaciôn
del mismo. El GTP podrfa unirse ala enzima en presencia de NADH o NADPH mientras que el ADP
tal vez interfierc.
Se ha postulado también, la forma de union del NADH a los oligômeros, indicândose que en
cada una de ellas el cocnzima se une en dos lugares diferentes: el “sitio catali'tico” que parcce estar
relacionado con la despolimerizaciôn, y el "sitio regulador’’ que estaria implicado en la protccciôn
de la enzima frente a la disociaciôn. Esta idea parece confîrmarse por el hecho de que si la enzima es
incubada con NADH (en ausencia de NADH) antes de ta adiciôn de GTP, la despolimerizaciôn es
mâs lenta. Por ultimo, se han apuntado notables variacioncs en las velocidades de despolimerizaciôn,
dependientes del purin nucleôtido utilizado en la reacciôn (112). Se admite la posibilidad de un
control por medio de diferentes formas de la enzima, con distinta capacidad de actuaciôn Trente a
los diversos coenzimas.
Respecto a la estabilidad de la GDH, cabe senalar, que la procedente de tejidos animales, es
mâs estable en tampones que contengan aniones polivalentes como el fosfato, que con cationes
monovalentes como el Tris (113). Cuando se utiliza Tris, la pérdida de actividad va acompanada de
un cambio conformacional considerable, que puede estudiarse en relaciôn con cl aumentodc reac-
tividad de los grupos sulfhidrilo, asi como con la pérdida de fluorcscencia intrinseca. La desnatu-
ralizaciôn puede prcvenirse con CINa (114), lo que le permite suponer que las fuerzas electrostâticas
ayudan a mantener la integridad de la molécula de ta enzima.
Los coenzimas reducidos producen sobre la dcsnaturalizaciôn, cfectos dobles. A concenlracio-
16
ncs por debajo dc 10 * M, el NADH y el NADPH incrcmentan la velocidad de inactivaciôn. Por el
contrario, a conccntraciones superiorcs actûan con un efecto desestabilizador sobre la proteina
<113).
En presencia de NADH, el dietilestilbestrol, cl GTP y los cationes Zn**, aumcntan la velocidad
de desnaturalizacion, (114) mientras que el ADP proteje a la enzima en la mayor parte de las
condicioncs suavemente inactivantes (113). En tampon fosfato potâsico 0,2 M pH 7,6 la GDH de
hfgado bovino es estable durante una bora a 41" C, incluso irrcversiblemente (115), sino se anade al
tampon sulfato sôdico 0,5 M (90).
La disociaciôn en subunidades de la GDH de higado bovino va acompanada de pérdida de
actividad. Cuando los valores de pH aumentan de 10 a 12 o disminuyen de 5 a 2, la disociaciôn se
acompana de cambios en el espectro ultravioleta, caracterfsticos de la perturbaciôn de cromôforos
tirosilo (116, 117). También muestran la misma dependencia a los cambios de pH, las variacioncs
del peso molecular y pueden ajustarse a curvas de titulaciôn teôrica para grupos inoziantes con
valores de pK de 3,7 a 10,8.
Una interpretaciôn de estos resultados supondri'a que, algunas de las fuerzas que mantienen
subunidades juntas, podn'an implicar unioncs de tipo puente de hidrôgeno entre grupos hidroxilo
fenôlicus y la cadena dc grupos carboxilo (116, 117). Por el contrario, la dcsagrcgaciôn de las
formas polimericas de la proteina a la forma de hexârncro activo, no va unida a ningt'm cambio
espectral (109). El clorhidrato de guanidina a conccntraciones de, al menos 2 M, disocia a la enzima
hepâtica bovina, aunque a veces estas prcparaciones enzimâticas estân contaminadas por una prolea-
sa que es activa en estas condicioncs (103). También se ha observado que sc produce disociaciôn de
la enzima en subunidades, a conccntraciones 4 M dc urea (90).
En cuanto al centro activo, los primeros ensayos realizados para llcgar a su idcntificaciôn, se
realizaron con GDH de hfgado bovino (93) y establecicron que algunos âcidos dicarboxilicos, como
el glutarato y el isoftalato, asf como un grupo de m-halobenzoatos, son potcntcs inhibidores compc
titivos. La caracterfstica comûn a estos compucstos es la presencia de dos gnipos carboxilo o bien,
de un grupo carboxilo y un componente muy eicctroncgativo. La estructura tridimensional dc los
inhibidores cfclicos mâs efcctivos mucstra que los dos sustituyentes, que scparan los electrones,
estân a una distancia de 7,5 A y parcce ser que la cadena recta dc los dicarboxilatos posée una
17
conformaciôn similar. El isoftalato, inhibidor muy potentc para la enzima bovina (93) tiene sus dos
grupos carboxilo separados por 7,5 À. Por todo ello se postulô que el sitio de union del sustrato
debe contener dos grupos catgados positivamente y separados entre si 7,5 A.
Fisher (42) ha propuesto que la union del glutamato, para que sea de maxima eficacia, requicre
no sôlo los grupos a y y carboxilo, sino también el grupo a-amino y los hidrôgenos a y y. No
obstante, posteriormente, se comprobô que con y-monofluoro-glutamato como sustrato, la enzima
posee la misma Km que el glutamato, de lo que se deduce que los hidrôgenos a y 7 no deben ser
esenciales.
La GDH de hfgado bovino catallza también la desaminaciôn oxidativa de ciertos L aminoâcidos
taies como la L-leucina, L-noivalina y L-gamma aminobutirato (118), lo que indica que el centro
activo présenta mayor apetencia para el grupo a-carboxilo. La sustituciôn de este grupo, en el
glutamato, por tetrazol, disminuye la fuerza de uniôn en grado superior que en el caso de un
reemplazo del grupo 7 carboxilo (119).
En lo referente al sitio del coenzima. Cross y Fisher (120) lo han dividido en dos subsitios: uno
especiTico para la porciôn amidica de la nicotinamida y otro para la adenosina
21
Este esquema fuc modificado por Albis y Pantalon: (132), con la inclusion de una etapa
adicional de desprotonizacion a partir de un complejo intermedio: E.X.NAD (P), donde X podn'a
ser un iminoglutarato:
E X NAD(P)H + i rE + S + NAD(P) E S NAD(P) ^
Pi + Pi + NAD(P)H + H E P, Pi NAD(P)H + H
E + NAD(P)H + H* + P, + P;
Segun estos autores, la etapa de velocidad limitante en la oxidaciôn del glutamato, es la
disociaciôn del complejo enzima coenzima reducido (2® etapa). El GTP favorece la uniôn del NADH
a la enzima, por ello estabiliza el complejo enzima coenzima reducido y provoca la inhibiciôn de la
reacciôn total. El ADP, que activa la reacciôn, dcsestabiliza dicho complejo. Los efectos reci'procos
del GTP y del ADP sobre la reacciôn con alanina como sustrato, se originan en la primera etapa de la
reacciôn antes de la disociaciôn del coenzima reducido. Résulta asf una activaciôn por el GTP y,
similarmente, una inhibiciôn de la uniôn de la enzima al coenzima por el ADP. Esta inhibiciôn en la
primera etapa, résulta mas importante que el efecto del ADP, en la segunda etapa, de incremento de
disociaciôn del coenzima reducido. Iwatsubo y Pantaloni (131) han concluido que la etapa inicial de
activaciôn por el GTP y de inactivaciôn por el ADP, es independiente del sustrato utilizado, lo que
explica el comportamiento cinético de la GDH as: como su regulaciôn por GTP y NADH, ademâs de
por otros efectores. Sin embargo, por medio de experimentos cinéticos, Markan y Steinhübel (133)
piensan que el GTP puede comportarse como activador o inhibidor, en dependencia de la concen
traciôn de sustrato. Cross y Fisher (120) han intentado relacionar los resultados cinéticos con los
ensayos espectroscôpicos de complejos formados por la enzima y varios sustratos, coenzimas y
productos de la reacciôn. Admiten como modelo estructural para la regulaciôn de la actividad
catalitica de la GDH, una regiôn de superficie activa que con tiene seis subsitios capacewle unirse al
22
pu p o funcional. Los efectos reciprocos del GTP y del ADP, se atribuyen entonces a sus uniones
mu tuas, que se excluyen una a otra.
Colen y sus colaboradorcs (134) han demostrado que los complejos binarios enzima glutamato
y enzima-NADP* son importantes cinéticamente y se equilibran de manera râpida mediante un
mecanismo desordenado. La interacciôn cooperativa entre coenzima y sustrato produce un comple
jo temario: ,
E-NADP*
E-GLUTAMATO ^ E-NADP-GLUTAM ATO
Una conclusion parccida la obtuvieron Engel y Dalziel (135) y, de la misma forma, este
esquema podn'a incorporarse a la etapa inicial del propuesto por Iwatsubo (131). También apoyan
esta idea Bates y Frieden (137), pero estudios anteriores de Frieden (136) sugieren un mecanismo
ordenado en cl que se forma un complejo enzima-coenzima.
Los estudios sobre las velocidades de intercambio (138) de los parcs (Glutamato-a-ceto-
glutarato; NAD* NADH y NADP* NADPH) apoyan cl conccpto dc un mecanismo parcialmente
desordenado o alternante. Los sustratos y coenzimas, segun tal mecanismo, sc unirt'an en cualquier
orden, pero se disociarfan mâs libremente a partir de los complejos binarios que de los tcrnarios y,
como las velocidades de cambio para estos complejos no son iguales, el mecanismo no séria comple-
tamente desordenado.
Hochreiter y Schellcmberg (139, 140) en lo que respecta al mecanismo dc la reacciôn, han
propuesto el amino glutarato como intermediario en la reacciôn dc la GDH. La incuhaciôn de la
23
enzima con a-cetoglutarato y amonio, da lugar a la formaciôn dc a -iminoglu tara to, cl cual es atrapar
do por reducciôn con hidruro de boro formândose L-glutamato. La formaciôn de dicho iminoâci-
do es un proceso enzimâtico, ya que los inhibidores compctitivos previcnen su si'ntcsis.
Es interesante tener en cuenta la Usina-126 en la reacciôn que impiica el a-aminoglutarato ya
que, segûn Brown y sus colaboradorcs (141), este aminoâcido interviene en la uniôn del sustrato.
Sin embargo, y puesto que su pK es del orden de 7,6 a 8,0 es poco probable que représenté uno de
los dos grupos catiônicos necesarios para la uniôn de los carboxilatos, puesto que estan'a al 50% de
protones en el pH ôptimo para la reducciôn del a-cetoglutarato y casi completamente dcsprotoniza-
do en la concentraciôn de hidrogeniones mâs Favorable a la oxidaciôn del ^utam ato.
Una hipôtesis mâs atractiva supondrfa la condensaciôn de un grupo a-amino, no cargado,
con a-cetoglutarato para format una base de Schiff con liberaciôn de una molécula de agua. La
acciôn del amonio sobre esta base de Schiff intermediaria daria lugar a la formaciôn de a iminoglu
tarato, que se reducina con NAD(P)H para format glutamato. La reacciôn tendria asi pasos separa
dos de deshidrataciôn y reducciôn. En el sentido contrario de la reacciôn, se form aria un ion
hidruro, en la etapa inicial, a partir de glutamato. Es probable que intervenga una base enzimâtica
que lo transfiera al coenzima para formar iminoglutarato, seguido de la reacciôn de éste con cl grupo
e-amino de Usina-126 para formar la base de Schiff con pérdida de amonio. La hidrôlisis de la base
^ Schiff, que puede ser catalizada por un grupo protonado como el amino, podria originar a-ceto
glutarato: (figura. 2.1-3).
En (B) se forma la base de Schiff, intermediaria de la Usina—126 de la enzima, con cl o-cetoglu-
tarato, lo que impiica la formaciôn de (C) iminoglutarato unido a la enzima y cuya reducciôn da lu
gar a la formaciôn de glutamato (D).
Este hipotético mecanismo se basa en que el a-iminoglutarato sea realmente un intermediario
en la reacciôn. El que los a-iminoâcidos son compucstos intermediarios en reacciones catalizadas por
cicrtas oxidasas, estâ demostrado (142, 143) y, por otra parte, este mecanismo séria cohcrente con
la existencia de distintos p ll ôptimos para las reacciones directa e inversa. El p li ôptim o para la
GDll de la mayor parte dc las fuentes de procedencia, en el sentido de aminaciôn del a-cetoglutara
to es del orden de 7,6 a 8,0, mientras que, en el sentido de la oxidaciôirdel'ghrtamattj; es dc 8^5 a
24
NADHNADH
BH NHBHm b;
NH,
C-H :
= : L h,
NH
t - H ,
Figura 2.1-3
25
9,0 (144, 145, 146). El pH ôptimo para la oxidaciôn c!el glutamato resultarra dc la necesidad de un
grupo 6 -amino de la lisina 126 de la enzima, asi como de la parcial desprotonizaciôn del grupo
amino del glutamato, ya que se producirfa una repulsiôn electrostâtica entre los grupos amino del
sustrato y la enzima si ambos estuviesen cargados positivamente.
Al referimos a la acciôn enzimâtica y a la composiciôn de la GDH, se ha citado la regulaciôn
que ejercen los mecanismos de polimerizaciôn despolimerizaciôn y la presencia de nucleôtidos, no
obstante se resumen conjuntamente todos los mecanismos y sustancias que intervienen en la regula
ciôn de la GDH y se sintetizan en los siguientes puntos:
a) Mecanismos de polimerizaciôn despolimerizaciôn.
b) Efectos de inducciôn represiôn (en hongos, bacterias y algunas plantas existe un control
entre algunos aminoâcidos o precursores de nitrôgeno y metabolitos de glucosa).
c) Efectores alostéricc», que pueden subdividirse en très clases:
C l P u r i n nucleôsidos di y trifosforilados.
C j S u s t r a t o s y coenzimas.
Cj.— Algunos lipidos y hormonas esteroi'dicas.
C l P u r i n nucleôtidos: Todas las GDH de los vertebrados estudiados, presentan inhibiciôn
p o r el GTP y también, excepto la GDH de higado dc sapo, son activadas por el ADP. La interacciôn
de nucleôtidos sobre el equilibrio de polimerizaciôn y sus efectos sobre la reacciôn enzimâtica, ya
ham sido expuestos anteriormente (pâg. 14).
Cj.— Sustratos y coenzimas: Altas conccntraciones de L-glutamato inhiben la reacciôn de la
GDH en el sentido de la desaminaciôn del glutamato. La causa se atribuye a la formaciôn de un
coRnpIoJo terciario E NAD(P)H L glutamato (147) en el que los ligandos estân mâs estrcchamente
unidos que en el complejo binario. También la concentraciôn de a-cetoglutarato y de amonio
ejercen un papel regulador de la reacciôn.
26
En cuanto a los coenzimas, ya se ha indicado (109) que Frieden propuso dos sitios de uniôn
por cadena peptfdica, uno activo y uno regulador. El activo es igualmente acccsible para la NADH y
el NADPH, pero el segundo posee unas diez veces mayor apetencia por cl NADH (148). La uniôn de
los coenzimas oxidados NAD* y NADP* a la GDH ha sido poco analizada, pero existe algun trabajo
en el que se seôala que la maxima capacidad corresponde a una molécula por subunidad enzimâtica
(149). También parece ser que la concentraciôn del coenzima afecta a la actividad enzimâtica. A
elevadas conccntraciones de NADH, se inhibe la reacciôn en el sentido de aminaciôn del a-cetogluta
rato.
C ] . — Lipidos y hormonas esteroidicas: Los lipidos mitocondriales, como las fosfatidil colinas,
fosfatidil-etanolaminas, fosfatidil-serinas y cardiolipina son inhibidores (150). Igualmente ciertos
esteroides como el dietil bestrol inactivan la reacciôn, si bien hay que hacer constat que su efecto se
ha ensayado con cantidades superiores a las efectivas “ in vivo” como hormona.
2.2 MODELO DEL METABOLISMO DEL GLUTAMATO EN CEREBRO
Durante mucho tiempo, el métabolisme y el papel del glutamato, en cerebro, ha captado el
interés de numerosos investigadores, habiéndosele atribuido funcioncs realmente beneficiosas en
pacientcs epilépticos. Sin embargo, y a pesar dc su larga historia todavi'a se siguen haciendo prcgun-
tas sobre cuâl serâ la verdadera funciôn de este metabolito en el cerebro.
Al ser, el glutamato, una molécula extraordinariamcnte simple, es de esperar que jueguc un
papel limitado en los procesos metabôlicos. Como se sabe, estâ implicado en varias reacciones dc
aminotransferencia, también su grupo amino puede transformarsc en amonio y éste puede incorpo
rarse al 2 oxoglutarato para transformarlo en glutamato mediante la intervenciôn de la GDI!. Por
otra parte la descarboxilaciôn del mismo orgina âcido gamma-aminobuti'rico (GABA), corn pues to
localizado muy preferentemente en el S.N.C. de los mamifcros. La amidaciôn del grupo y-carboxrti-
co del glutamato da lugar a la formaciôn de glutamina. Finolmcntc el glutamato es utilizado en la
sfntesis de péptidos y pro te mas. Con la excepciôn dc la formaciôn del GABA, todas estas reacciones
se efectûan en, prâcticamente, todas las células vivas, aunque la cuantia y distribuciôn difiere de
unas a otras.
27
El hecho de que, en el cerebro, el glutamato intervenga en la si'ntesis del GABA, es sufîciente
razon para examinar intensamente el metabolismo de este aminoâcido en dicho tejido. Ademâs, el
amonio es tôxico para el cerebro y la conversion del glutamato en glutamina es probablemente, bien
un factor que contribuye a la toxicidad del amonio o un agente importante en el proceso dc su
destoxificacion. Generalmente se acepta que el sisttma glutamato glutamina en el cerebro contrôla
los nivelcs de amonio; el exceso de glutamina abandona el cerebro y asf el amonio tôxico es
transportado a otros ôrganos capaces de eliminarlo.
Ademâs del papel que juega cl glutamato en todas estas transformaciones metabôlicas, existe
una gran evidencia de que, tanto el GABA como él mismo y también el aspartato, son aminoâcidos
neurotranÿmisores, lo cual es otro dato a favor del énorme interés experimental por el estudio del
glutamato.
Desde el ano 1969 y debido a los trabajos de Berl y sus colaboradorcs (151), se sospecha que
existen en el cerebro, al menos, dos compartimentos para el metabolismo del glutamato, uno
denominado “compartimento pcqueno” caracterizado por un intenso metabolismo y otro Ilamado
“compartimento grande” con un ritmo de metabolismo mâs lento (152, 156).
Los experimentos que Uevaron a postular la compartimcntaciôn del glutamato (151) pusieron
de manificsto que, cuando se inyecta glutamato marcado, la mayor radiactividad especiTica se
encuentra en la glutamina y que la velocidad demarcaje de esta, es mucho mâs râpida de lo que
cabrfa esperar si sôlo existiera un lugar para el metabolismo del glutamato. También se observô que
tanto el bicarbonato marcado como el amonio, se incoiporan preferentemente en la glutamina.
Mediante cl uso de precursores del glutamato, taies como acetato y glucosa marcados en distintas
posiciones, se ha intentado establecer la idea de su compartimcntaciôn asf como la probable existen*
cia de dos ciclos tricarboxflicos en el cerebro (157). La hipôtesis propuesta se resume en la figura
2.2-1. En ella los numéros indican pmoles/gramo/minuto de flujo a través dc los dos ciclos cftricos.
Las principales conclusiones que se han obtcnido de estos estudios (157, 158) son las siguien
tes::
1 ) Una gran cantidad del glutamato formado a partir del acetato que entra en el ciclo de ta
dcrecha (compartimento pequeno), se transforma en glutamina.
28
Acetato
Glucosa
0,80,8
Acetil Co AAcetil CoA
0,31,25
GABA
0 , 1 4 /
Glutamato
Glutamato
0,14Membrana celular Glutamina ^
Figura 2. 2 — 1
29
2) Esta glutamina se transporta hacia cl ciclo citrico del compartimento grande, donde se
tnnsform a en-glutamato.
3) En el compartimento grande se sintetiza GABA a partir del glutamato.
4) El GABA sintetizado es transportado al compartimento pequeüo donde se dégrada, via
ciclo tricarboxilico, previa transformaciôn en semialdehido succfnico. Al mismo tiempo, y en este
mismo compartimento, se forma glutamato por aminotransferencia entre el GABA y cl a-cetogluta
rato con el concurso de la GABA T.
5) El flujo de la glutamina desde el compartimente pequeno al grande, es semajante al del
GABA en la direcciôn inversa, lo cual es necesario para mantener la tasa de compucstos carbonados.
6 ) En et compartimento pequeno, una gran parte del a cetoglutarato formado, abandona el
ciclo cftrico transformândose en glutamina vfa glutamato. El déficit de âcido succinico a partir de
a-ceto^utarato se suple por la formaciôn del mismo via GABA.
Esta hipôtesis metabôlica puede comprobarse facilmente manipulando la velocidad y el tamano
de los pools, mediante cl empleo de precursores marcados. Existen sin embargo diversas considéra
ciones que pueden inducir a pensar que este modelo no se verifique “in vivo". La mâs importante
considéra que cl GABA se forma, en su totalidad, en el compartimento grande del glutamato y que
sôlo un 25X de este glutamato forma GABA. Si el GABA sc sintetizase al azar en dichas neuronas a
partir del glutamato dc las mismas, solamente un 25% de este originaria dicho GABA. El glutamato
estâ présenté también en las células gliales, luego, segun esto, el GABA se form aria a partir de un
25% de un “pool" y no de la totalidad. A pesar de las distintas consideraciones que se han hecho a
este respecto, la idea de que la formaciôn del GABA se realiza en el compartimento grande del
glutamato, sigue siendo valida. La que pudiera no serlo tanto es la que suponc que el flujo de la
glutamina desde el compartimento pequeno hacia el grande, sea del mismo orden que el del GABA
en el sentido contrario; esta ultima hipôtesis tendria que demostrarse.
El modelo bicompartimcntal para cl glutamato en cerebro, es muy lôgido debido a la existencia
dc dos tipos de células en el mismo: neuronas y gliales. Balazs y sus colaboradorcs (159) han
propuesto un modelo trici'clico con el fin de acomodar alguna hctcrogenctdad-»» las^imé*ic3a«del
30
GABA. Este modelo considéra très compartimentos: las células gliales, cl pcricarion neural y las
terminacioncs nerviosas.
Se ha intentado también relacionar la compartimcntaciôn del glutamato a nivcl de la hetcroge
neidad mitocondrial en el cerebro. Esta hcterogeneidad ha sido demostrada claramcnte en distintas
células mediante microscopi'a electrônica. Donde las demandas metabôlicas dc una celui a son sim
ples, como puede ser el requerimiento de ATP, solamente se requicre un uniforme y simple tipo de
mitocondrias. Este pudiera ser el caso del cerebro en el que son necesarias grandes demandas de
ATP, cubiertas casi totalmente por la glucosa. Este punto de vista es compatible con el hecho de que
el cerebro es una compleja red de membranas que propagan, generan y distribuyen mensajes eléctri-
cos que requicren gran aporte cnergético.
Quizâs sea mejor considerar en primer lugar, que el cerebro es, en cada nivel, un conjunto de
fenômenos y de moléculas heterogéneas y ordenadas dinâmicamente. Esta hcterogeneidad puede
funcionar dentro de un contexto puramente metabôlico, como ocurre a gran escala en el higado, o
dentro de una dinâmica “organizaciôn molecular" como puede ser el caso del cerebro. Nunca, sin
embargo, deben separarse estos dos aspectos.
Dcspués de estos plan team icntos teôricos, vamos a comentar algunos datos obtcnidos cxperi-
mentalmente.
El que las mitocondrias cérébrales son heterogéneas se deduce de las observaciones dc algunos
investigadores (160, 161) los cuales han observado que la GDH y la GABA T, en un gradicnte de
dcnsidad de glucosa, se encuentran en distinto lugar que la citocromo-oxidasa, glutaminasa y succi
nato-dehidrogenasa. Como todas estas enzimas son mitocondriales, el hallazgo anterior significa que
existen, al menos, dos poblaciones de mitocondrias en el cerebro. Estas observaciones se han
corroborado mâs tarde con los trabajos de Neidie y sus colaboradorcs (162) los cuales han observa
do que la acetil-CoA sintetasa y la GDH tienen la misma distribuciôn. Puesto que cl acetato, el
amonio y el GABA son precursores del compartimento pequeno del glutamato, puede pensarse que
el cerebro contiene dos poblaciones de mitocondrias, cada una de ellas implicada en uno de los dos
compartimentos (162, 157, 158). Debido a que los trabajos de la medida de actividades enzimâticas
en experimentos de scparaciôn mediante gradicnte de dcnsidad de sacarosa no impiica solapamiento
de dichas actividades, hay autores que consideran una mayor heterogcnidad mitocomdrial (163).
31
Con todos estos estudios se ha Ilegado a la conclusion de que cl compartimento pcqucno del
glutamato es también heterogéneo. Otra conclusion que puede también obtenerse de los datos
anteriores es la de que, las mitocondrias del cerebro son muy heterogéneas (164).
Los anâlisis de los perfiles de sedimentaciôn en un campo gravitatorio, son muy dificiles
incluso para moléculas muy homogéneas. Estas dificultades son aûn mayores cuando las parttculas
son grandes y su composiciôn compleja; por lo tanto, un tratamiento cuantitativo de los datos es
imposible si bien estos estudios nos proporcionan alguna evidencia sobre esta hcterogeneidad m ito
condrial.
La hcterogeneidad del compartimento pequeno del glutamato se deduce, no sôlo de los estu
dios sobre hcterogeneidad mitocondrial sino también de estudios realizados con precursores marca
dos tanto “ in vivo" como “ in vitro”. Chcng y sus colaboradorcs (165) fueron los primeros en
apreciar esta hcterogeneidad. Sus evidencias se basan en estudios comparativos de la incorporaciôn
de acetato y de citrato en glutamato, glutamina y GABA, realizados en cortes de cerebro. Tanto el
primero como el segundo se incorporan aproximadamente en la misma proporciôn en glutamina y
glutamato mientras que el marcaje del GABA por citrato es mucho menor que el obtcnido con
acetato. SI, como ya sc ha indicado, la glutamina se transporta del compartimento pcqueno al
grande, donde se sintetiza el GABA, esto serâ cierto para la glutamina marcada por acetato pero no
para la marcada con citrato. Existe pues, un pool de glutamina marcada por citrato que no es
transportada al lugar de sfntesis del GABA, por lo que puede deducirse que el compartimento
pequeno del glutamato estâ al menos bicompartimentado.
Otros datos que confirm an la evidencia de la hcterogeneidad del compartimento pequeno son
los realizados usando amonio marcado. Desde los inicios de la hipôtesis de la compartimcntaciôn del
glutamato, se sabe que cl amonio es un precursor del compartimento pcqueno (166, 167) y se ha
observado que incrementa la velocidad de sfntesis de la glutamina en el cerebro (168, 169) aunque
hay alguna diferencia segûn la fuente de carbono que se administre. De los datos expuestos anterior
mente se deduce que la GDH se encuentra présenté sôlo en una pequena fracciôn de las mitocon
drias cérébrales. Como la primera reacciôn de incorporaciôn de amonio en el cerebro es, probable
m ente la dc la GDH, varios autores han estudiado el efecto del amonio sobre la incorporaciôn de
acetato y propionato a los aminoâcidos. También se ha consider ado interesante utilizar GABA
puesto que la GDH y la GABA T no tienen la misma distribuciôn y por el posible papel de la
32
glutamina en la sfntesis del mismo.
En cl cerebro de raton adulto, el amonio incrementa los nivelcs dc glutamina cuando la fuente
dc carbono es el propionato pero no cuando es el acetato, en cambio en ratas jôvenes ( 1 0 dfas de
vida) el amonio incrementa por igual los nivelcs de glutamina en presencia de propionato o acetato.
Por lo tanto, en cl cerebro adulto del raton, el amonio tiene claramcnte distinto efecto sobre el
metabolismo de los dos precursores del pcqueno compartimento, lo cual indica la presencia de dos
subcompartimentos dentro de él. En este modelo se suponc que la glutamina marcada, a partir del
acetato, es transportada al compartimento grande donde se transforma en glutamato.
La evidencia sobre la hcterogeneidad del compartimento pequeho del glutamato se confirma
también mediante estudios farmacolôgicos. El âcido amino-oxiacético, que es inhibidor de las tran-
saminasas, inhibe aprcciablcmcnte la incorporaciôn del acetato en el glutamato mientras que la
glutamina es mucho menos afectada (170). Esto indica que, bajo las condicioncs de este experimen-
to, la mayorfa del glutamato se forma mediante reacciones de aminotransferencia y que la mayorfa
del glutamato utilizado para la sfntesis de glutamina, se forma mediante la reacciôn de la GDH lo
cual indica que la localizaciôn de esta enzima no es idéntica a la de las transaminasas. Por otra parte,
el fluoroacetato (1 mM) inhibe, aproximadamente en un 50%, la transform aciôn del acetato en
glutamato y sin embargo no afccta a su transformaciôn en aspartato y GABA aunque sf inhibe la
incorporaciôn de acetato, aspartato y GABA en glutamina (171). El efecto sobre la incorporaciôn
del acetato podrfa expticarse en el caso de que el fluoroacetato inhibiera a la aconitasa tras su
conversiôn en fluorocitrato, vfa fluoroacctil-CoA, reacciôn que catalizarfa la acetil-CoA sintetasa. La
ausencia de un efecto del fluoroacetato sobre la conversiôn del aspartato y del GABA en glutamina,
signifîcarfa que estas transformaciones no tienen lugar en un compartimento que contenga acetil-
CoA sintetasa. Si el fluoroacetato actua como tal, sin conversiôn inicial vfa acetil Coa sintetasa,
actuarfa claramcnte de distinta forma sobre los dos pasos metabôlicos implicados en la transfoima-
ciôn del aspartato, del GABA y del acetato en glutamato y glutamina. De todo esto se deduce que
existen dos espacios metabôlicos encaigados de la degradaciôn del GABA, uno que es afectado por
cl fluoroacetato y el otro que es independiente de él. El primero (GABA-1) da lugar a la formaciôn
de glutamina y el segundo (GABA-2) no.
En realidad, se cree que existen al menos très, y probablemente cuatro, espacios metabôlicos
para el acetato:
33
1) En cl que cl acetato se transforma en glutamina, el cual no es inhibido por el âcido
amino-oxiacético y si' por el fluoroacetato (ACET-1).
2) En el que cl acetato se transforma en glutamato y que es inhibido tanto por el fluoroace-
tato como por el âcido amino-oxiacético (ACET-2).
3) En el que no se realiza su conversion en glutamina y en el que el “ turnover" del glutamato
es aumentado por el amonio (ACET-3).
4) Espacio con râpido m arcade de la glutamina y que no obstante sôlo es visible en los
primeros minutos (ACET-4).
Todos los datos expuestos nos conducen a la conclusiôn final de una gran hcterogeneidad en el
metabolismo de los aminoâcidos en el cerebro especialmente del GABA y del glutamato si bien,
hasta el momento, no se puede contestas a la pregunta dc “cuântos espacios metabôlicos existen en
el cerebro” . Si se observa, sc comprueba que todos los datos se han obtcnido partiendo de estudios
de incorporaciôn de precursores marcados y de medidas de actividades enzimâticas localizadas en
distintas subpoblaciones de mitocondrias, pero no se ha realizado ningun estudio, al menos en lo
que a nuestros conocimientos concieme, sobre el comportamiento de las enzimas implicadas en la
sfntesis y degradaciôn de estos aminoâcidos. La falta de estos estudios ha sido una de las razones
que nos ha impulsado al planteamiento experimental del presente trabajo. A la vista de todos los
datos expuestos anteriormente, nos hemos planteado la siguiente pregunta: “ éEstarâ implicada la
regulaciôn de estas enzimas en la compartimentaciôn metabôlica? " Y también “ éPodrfa una misma
enzima presentar distinto comportamiento en cada uno de los distintos compartimentos? " Para
nuestro estudio elegimos la GDH por ser una enzima regulable y por intervenir, no sôlo en la sfntesis
y degradaciôn del glutamato sino también, en la formaciôn y eliminaciôn del amonio. De nuestros
datos se deduce que el comportamiento de esta enzima es distinto en mitocondrias libres (proceden
tes de células gliales y pcricarion neural) que en las sinaptosomales (procedentes de las terminacio-
nes nerviosas), ya que en ausencia de ADP las ML no sintetizan glutamato mientras que las MS sf lo
sintetizan. Por lo tanto si es en la regiôn sinâptica donde se sintetiza fundamentalmcnte cl GABA,
éste o parte de éste GABA podrfa procéder de un pool de glutamato sintetizado por la vfa de la
GDH.
34
De ttuestros datos parece tainbién dcducirsc que, respccto al comportainicnto de la GDH en las
mitocondrias sinaptosomales, existe una gran variabilidad, lo que podria indicar una hcterogeneidad
sinaptosomal. De cualquier forma, les resultados que hemos obtenido, seri'an un date a tencr en
cucnta aunquc nunca podri'an considerarsc définitives debido a la propiedad de la GDH de présentât
un discutido mécanisme de regulacién mediante proceses de pelimerizacién-despotimerizacîôn, ya
que una cenfirmaciôn definitiva sobre la hcterogeneidad sinaptosomal requeriria la realizaciôn de
medidas de la actividad de la GDH a igualdad de concentraciôn proteica. Per otra parte, esta
hcterogeneidad deben'a de ser probada mediante microscopfa electrônica para poder ascgurar que
las cuatro subpoblacioncs que se suponen sinaptosomales, lo son realmente y no se trataen ningûn
caso de mitocondrias libres.
Hasta ahora se ha hablado de la compartimentaciôn del metabolismo del glutamato en cerebro
sin mencionar ningûn dato que indicase dônde estdn localizados los distintos compartimentos. En
principio no hay prioridad para considérât que un cierto espacio metabôlico esté présente en un solo
tipo de cclulas. Un espacio metabôlico cerebral es un lugar en este organo con algunas propiedades
comunes. Se han dado diferentes criterios para dividir cl cerebro en espacios que puedan distinguirse
metabôlicamente. For ejemplo, los diferentes compartimentos definidos anteriormente para el aceta-
to y cl GABA, no tienen p o t que ser espacios muy diferentes ya que podria haber solapamiento
entre elles. Muchos espacios metabôlicos diferentes pucden coexistir dentro de la cclula y puede
decirse que, en general, la estructura de cada cclula esta estrictamente organizada y no es un fluido
homogéneo. Si, como se ha indicado antes, una parte del espacio metabôlico con las propiedades del
compartimento "grande" del ^utam ato, esta implicado en la sfntesis del GABA y esta présenté, por
definiciôn, en las cclulas que lo sintetizan, no quiere decir que este espacio metabôlico se encuentre
en estas cclulas solamentc pues podria existir, por ejemplo, en otras cclulas en las que el glutamato
no se utilice para sintetizar GABA.
La idea mâs fâcil de barajar, en cuanto a la localizaciôn de compartimentos, es partiendo del
GABA y especialmente desde que Robertis y otros autores (172, 174, 161, 162) cstablecieron
distinta localizaciôn para la GAD y la GABA T. Segûn ellos, la primera de estas enzimas es tari a
localizada en las tcrminacioncs nerviosas (sinaptosomas) mientras que la GABA T lo esta en mitoco
ndrias no sinaptosomales. Respecto a la localizaciôn de esta ultima. Van Celder (175, 172) mediante
cxperimentos histoqui'micos ha comprobado que se encuentra en neuronas. Otros estudios realiza-
dos en retina (176) indican su localizaciôn en cclulas gliales. Esto parece conllrmar que cl GABA se
35
metaboliza tanto en células gliales como en las neuronas y, por ello, el espacio metabôlico atribuido
al compartimento "pequeno" del glutamato no esta ccnfînado a un sôlo tipo de células.
No se conoce la localizaciôn de la acetil-CoA-sintetasa mientras que la GDH parece que se
encuentra en todo tipo de mitocondrias (180, 181). Wilson y sus colaboradores (178) asf como
Nicklas (179) han encontrado GAD en células gliales de la cepa Ce y ha comprobado que en dichas
células la GABA T se encuentra en muy pequena cantidad. Por su parte Bardakjian y sus colabora
dores (182) han hallado esta ultima enzima en eritrocitos asi como una pequena proporciôn de
GAD. Desde luego parece claro que cl compartimento "grande” del glutamato se caracteriza por
sintetizar GABA por lo que parece estar confînado en las terminaciones nerviosas y el hecho de
haberse encontrado una pequeAa proporciôn de GAD en células gliales podrfa deberse a que este
tipo de células fuera tumoral. Lo que no esta tan claro es si se sintetiza o no GABA en el pericardion
neural ya que de confirm arse dicha sfntesis, podrian con firm arse igualmente los dos lugares de
sfntesis del GABA (GABA 1 y GABA-2).
O tro dato que puede aportarse, para apoyar la idea de que el compartimento grande del
glutamato se halla localizado en las terminaciones nerviosas, se debc a Ruse (183) que ha encontra
do GS en neuronas y en neuropilis que contenfan células gliales, asf como a Nicklas y sus colabora
dores (179) que la han hallado en gliomas C« y han comprobado que los sinaptosomas no la
con tienen o la poseen en pequena cuantia, mientras que la glutaminasa esta présenté a concentracio-
nes muy elevadas (184).
Todos los datos expuestos pucden ser resumidos en los siguientes puntos:
1 ) Existencia de un compartimente “grande” y otro “pequeno” .
2) El compartimento “grande” se caracteriza por:
a) Ser marcado por la Glucosa.
b) Poseer un metabolismo mâs lento.
c) Transformar la glutamina en glutamato y éste en GABA.
d) La posibilidad de estar bicompartimentdo, ya que sintetiza GABA con dos pool
distintos (G/\BA 1 y GABA-2) uno de los cualcs es inhibido por el fluoracctato y el
36
otro no.
3) El compartimento "pequeno” se caracteriza por:
a) Formar glutamina a partir de glutamato.
b) Formar glutamina a partir de acetato y de citrato.
c) Degradar al GABA.
d) Formar glutamato y glutamina a partir de a-cetoglutarato.
e) La posibilidad de estar bicompartimentado (P, y ).
4) El compartimento "pequeno” P, se caracteriza por:
a) Formar glutamina a partir de acetato pero no de citrato.
b) Formar glutamina con amonio pero con acetato como fucnte de carbono y no con
propionato.
c) La inhibicion de la sintcsis de la glutamina con acido amino oxiacético en presencia
de acetato.
d) Formar la glutamina que va al compartimento “grande” para dar lugar a la forma
cion de glutamato y GABA.
5) El compartimento “pequeno" P% se caracteriza por:
a) Formar glutamina a partir de citrato.
b) Formar glutamina con amonio y propionato como fuente dc carbono.
c) Formar glutamato y glutamina a partir de acetato, en presencia de âcido amino oxia-
cético.
Dc todo ello se puede sacar la conclusion de que en el compartimento Pi cl glutamato se forma
fundamcntalmente por la via dc la GDH mientras que en el P, se hace por la de las aminotransfe-
rasas.
Segûn Balazs y sus colaboradores (185) la compartimentaciôn metabôlica del tejido ncrvioso
podrfa esqucmatizarsc como se indica en la figura 2 .2 -2 .
37
Herzt (184) ha establecido un tipo de interrelaciones entre cclulas neurales y gliales que se
esquematizan en la figura 2.2-3.
Como conclusion de todo lo expuesto, podemos apuntar:
1) Existen muchos pools de glutamato en el cerebro, cada uno de ellos con un ciclo tricarboxi-
lico y otras rutas metabôlicas propias. Alguna de estas rutas son cualitativamente iguales pero
distintas desde el punto de vista cuantitativo y otras son diferentes en ambos aspectos. Respecto a
cuântas de estas vfas existen, es diffcil de determinar partiendo de las evidencias hasta ahora
obtenidas.
2) Para algunos a^ec to s del metabolismo de los aminoâcidos, la hcterogeneidad del mismo se
establece, no solo con cxperimentos basados en estudios con isôtopos radiactivos, sino también con
otros basados en la localizaciôn de diferentes enzimas, lo que nos permite establecer principios
estructurales sobre la hcterogeneidad metabôlica.
3) Se han obtenido datos para iniciar anâlisis preliminares, con la utilizaciôn del amonio y de
agentes farcacolôgicos.
4) Se han descrito algunos aspectos sobre la localizaciôn celular de distintos espacios metabôli
cos del glutamato. Asimismo se ha deducido que no puede atribuirse un espacio metabôlico determi-
nado a un solo tipo dc células.
5) Las mitocondrias del cerebro son extraordinariamente hctcrogéneas y esta hcterogeneidad
parece estar rclacionada con la compartimentaciôn metabôlica.
6 ) El cstudio dc las caracten'sticas de las enzimas en los distintos compartimentos, pucden ser
de gran utilidad en el entendimiento de la compartimentaciôn del glutamato.
38
T3
O.
ft.
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Eo
:
39
TERMINACION NERVIOSA A ST R O crro
bicarbonato ^ bicarbonato
—̂ glucosa
^ piruvato
glucosaglucosa ^
i ,
•piruvato T piruvato
aspartato
as|
oxalac.
[lu-NH;lu-NH; oxalac.
a-KG
GABA - hGABA
GABA
glutamato
a-KGsucc.succ.
piruvatopiruvato ̂ piruvato
glucosaglucosa ^ glucosa
PERICARION OI.IGODENDROCITO
Figura 2. 2-3
40
3 . - MATERIAL Y METODOS
41
S .- MATERIAL Y METODOS
3.1 OBTENCION DE TEJIDO CEREBRAL
En todos nuestros experimcntos utilizamos ratas adultas dc la raza Wistar, cuyo peso oscila
entre los 200 y 300 gramos, procedentes del criadero instalado en la Facultad.
La forma de sacrificio a que fueron sometidas las ratas consistio en la extracciôn del corazon,
bajo anestesia con vapores de éter sulfûrico. La extracciôn del cerebro se realizô siempre, inmediata
mente a la del corazôn, practicando certes en distintas areas del crâneo (Figura 3.1-1) a fin de dejar
a descubierto la mas a encefâlica. Cada cerebro fue lavado a continuaciôn, en soluciôn flsiolôgica a
4“ C y sccado sobre pape! de filtro. Por ôltimo se pesaron todos los cerebros extraidos ( 6 a 8 por
ensayo).
El éter sulfurico utilizado fue de la casa MERCK y la soluciôn
fîsiolôgica se preparô con CINa también Merck.
Figura 3.1—1
3.2 FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
3.2-1 Obtenciôn de ML y MS
Nuestra técnica es una modificaciôn de la descrita por Clark, J . H. Nicklas (188) y se realizô
scgun el siguientc protocole:
(a) Los cerebros se some tic ron a la acciôn mecânica de un Potter de vidrio con pistilo de
Teflôn, a 4.000 r.p,m./ 8 veces/ cada vez; utilizando como véhiculé de homogeneizaciôn 15 ml. de
Medio A (M.A.) por gramo de cerebro. La composiciôn del M.A. fue la siguiente (187):
Sacarosa (0,32 M.)
Cl2 M g ( 3 mM.)
Tampôn Cacodilato-K ( 1 mM ), pH 6,4
(
42
(a) (b)
T. CEREBRAL-------------- ►HOMOGENADO-l--------------- ►HOMOGENADO-2
(c)
SOBRENADANTE
(d)
1
PRECIPITADO
(c)
PPDO 2 4 ------------PPDO-1
(f) (g)
SOBRENADANTE
SOBRENADANTE
MX.
t
SUSPENSION-M.L. ^
SUSPENSIONS. 4 ____
i
PPDO-3
(h)
-► M.C.
mielina
F. MIEUNA
F.M.L. ^ —
F.S.
7,5%
13%
M.S.
SUSPENSIONS’
(m)
SOBRENADANTE
(b) El homogenado-1 se filtré a travcs de una tela de gasa con el fin de separar restes de
tejido.
(c) Se centrifugé el homogcnado-2 a 1.500 r.p.m. durante 10 minutos y a 4® C, en una
centrffuga rcfrigerada SORVALL RC 5, a fin de precipitar la fraccién nuclear.
(d) El sobrenadantc se centrifugé durante 20 minutos a 12.500 r.p.m. y a 4® C en la misma
43
centrffuga, con el fin de separar un precipitado que constaba de mitocondrias libres (M L.) y
sinaptosomas. Este precipitado (PPDO-1), practicamente todas las veces que fue repetida la técnica,
apareciô contaminado de g^ôbulos rojos.
(e) Se eliminaron los glôbulos rojos del PPDO-1 m anualmente------------------^ PPDO 2.
(f) Se suspendio el PPDO 2 en M.A. (3 veces/vol.).
(g) Se centrifugé durante 10 minutos a 17.000 r.p.m. y a 4“ C en SORVALL-RC-5.
(f) y (g) Se lavé el PPDO-2------------------^ PPDO-3.
h) Se suqiendié el PPDO-3 en 10 ml. de M.A. con lo que se obtuvo una suspensién de M.L. y
sinaptosomas: (M.C.).
i) Se prepararon scis tubos con un gradiente discontinue de Ficoll con los siguientes
volumenes en cada uno de ellos: 6 ml. de M. Ficoll al 13%, 6 ml. de M. Ficoll al 7,5% y 2 ml. de
M.C
La composicién de los medios Ficoll fue la siguiente (188):
M. FicoU 13% : Sacarosa (0,32 M.); EDTA-K (ImM.), pH 7,4;Tris-ClH (10 mM ), pH 7,4.
M. Ficoll 7,5%: Sacarosa (0,32 M.); EDTA-K (1 mM.), pH 7,4;Tris-ClH (10 mM ), pH 7,4 y Ficoll
al 7,5%.
(j) Se sometieron a ultracentrifugacién los tubos de gradiente, durante 30 minutos a 23.000
r.p.m. en ultracentrffuga Beckman modelo L 5 50 con rotor SVV-27-1. Se obtuvieron asi très fraccio-
nes: la superior correspondra a la mielina, la intermedia (S) a los sinaptosomas y la inferior a las
M.X
(k) Se scpararon las fracciones correspondientcs a mielina y sinaptosomas con pipe tas Pasteur.
La fraccién M L. quedaba pegada al fondo de los tubos, para separarla se decanté el resto de M.
Ficoll y se obtuvo una suspension de M.L., agitando con M A. (doblc de su volumen). Se suspendié
la fraccién corrcspondiente a los sinaptosomas en M.A. (doble de su volumen). Por ultimo, se
ccntrifugaron ambas suspensiones M L. y S. en SORVALL RC 5 durante 10 tirmutos a 17.000
44
r.p.m. y a 4" G Sc consiguio asi un pellet corrcspondiente a mitocondrias libres % otro a los
sinaptosomas.
(I) El pellet dc la fraccién sinaptosomal (S), sc agité con tampén Tris-CLH (0,02M.), pH 7,4
(aproximadamcnte el dobic dc su volumen) durante 2 0 minutos, a fin dc romper los shaptosomas
por shock osmédco.
(m) La suspensién, producto del shock, sc centrigué en SORVALL-RC-5 a 4° Cdurante 20
minutos y a 20.000 r.p.m. El precipitado corresponds a la fraccién de mitocondrias simptosomales
(M.S.).
3.2-2 Obtencién de M.S. de subbracciones sinaptosomales
La técnica utilizada en este caso, fue la misma que para la obtencién dc M.L. y Vf.S (2.2.1)
hasta (k). A partir de este punto y con el pellet corrcspondiente a los sinaptosomas, sf obtuvieron
distintas subfracciones sinaptosomales, y de ellas las mitocondrias correspondientcs segCn e siguien
te protocolo:
SUSPENSIONS
9%
F.S,
rF.S,
► F.S;
11 %
F.S.
13%
S4
a) Se suspendié el pellet S en 10 ml. de Medio A, utilizado cn 3.2-1 (pag. 43).
b) Se prepararon seis tubos con un gradiente discontinuo de Ficoll con los siguientesvolumc-
nes en cada uno de ellos: 5 ml. dé M. Ficoll al 13% -I- 5 ml. de M Ficoll al 1 1% + 5 ml. de d. Ficoll
al 9% 4- 2 ml. de SUSPENSION S.
45
La composiciôn de los diferentes M. Ficoll fue la siguiente:
M- Ficoll al 13% visto en 3.2-1 (pâg. 43);
M. Ficoll al 11%: Sacarosa (0,32 M.) -k EDTA-K (1 mM.), pH 7,4 + Tris-CIH (10 mM.), pH 7 ,4 -F
Ficollal 11%;
M. FicoU al 9%: Sacarosa (0,32 M.) -F EDTA-K (1 mM.), pH 7,4 F Tris-CIH (10 mM.), pH 7,4 +
FicoU al 9%.
c) Se sometiô el gradiente a ultracentrifugacién durante 30 minutos en una ultracentrffuga
Beckman modelo L5-50 con rotor SW-27-1 y a 23.000 r.p.m. (90.000 X G). Se consiguieron de esta
forma cuatro fracciones de sinaptosomas que denominos S, , S%, S, y S<.
d) Se separaron S , , S%, S, y S4 con pipetas Pasteur.
e) Se lavé con M.A. (doble de su volumen) cada una de las fracciones y se centrigué cn
SORVALL RC-5 a 4* C durante 15 minutos a 20.000 r.p.m. (40.000 X G). Se obtuvieron asf cuatro
peUets correspondientcs a las subfracciones sinaptosomales S , , S , , S, y S4 que los denominamos
M Si, M Sj, MSs y MS4 respectivamente.
3.3 PREPARACION DE EXTRACTOS ENZIMATICOS
3.3-1 Solubilizacién de GDH
Las mitocondrias obtenidas, segùn los anteriores apartados, fueron sometidas a distintos medios
de solubilizacién de la GDH con el fin de establecer cual de ellos era el mâs idénco.
1) Primcramente, las mitocondrias se sometieron a congelacién y descongclacién sucesiva, des
pues a distintos medios de solubilizacién de la siguiente manera:
46
M
(a)
EXTRÀCrO-A (I) PRECIPITADO A
________ |(b)
EXTr Xc TO-B (II) P R E C I^ A D O B
1(c)
EXTRACTO-C (III) PRECIPITADO C
l(
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3.7 ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRIL-AMIDA
Los extractos enzimâticos obtenidos segûn 2.3, fueron sometidos a migraciôn electro foré tica
en gel de poliacril amida, con el fin de separar posibles isoenzimas de GDH.
3.7.1 Frepaiaciôn de geles
Réactivas
Soluciôn A: 48 ml. de CIH (1 M); 36,6 g. de Tris; 0,46 ml. de tetrametil-etileno-diamina, y
agua destilada hasta 1 0 0 ml.
Soluciôn C: 30 g. de acrilamida; 0,8 g. de bis acrilamida; 10 mg. de ferricianuro pots'ico y agua
destilada hasta 1 0 0 ml.
Soluciôn P: 140 mg. de persulfato amônico y agua destilada hasta 100 ml.
Pteparaciôn
Para préparât ocho geles mezclamos: 2 ml. de soluciôn A, 2 ml. de agua destilada, 4 ml. de
soluciôn C y 8 ml. de soluciôn P.
Los geles asf obtenidos presentaba un grado de polimerizaciôn del 7,5% debido a la proporciôn
de 30 a 0,8 entre la acrilamida y la bis acrilamida en la soluciôn C.
3.7.2 Migraciôn electroforétka
En cada tubo fue depositada la misma cantidad de extracto enzimâtico (50^1.) mezclado con
sacarosa, a fin de aumentar su densidad e impedir que difundicra al adicionar el tampôn.
El tampôn utilizado fue Tris-Glicina pH 8,5; 3 g. de Tris hidroximctil amino mctano y 14,4 g.
de glicina, para 5 CD ml. (Antes de usarlo se diluyô al 1/10).
Las condiciones en las que se efectuô la migraciôn fueron las siguientes:
58
Corriente aplicada . . .
Ticmpo • • • • • •
Temper atura ..............
2 mA/tubo
2 h. 30 ’
4" C
3.7.3 Tenido de los geles
Segûn el método de Gorman y sus colaboradores (186) con ligcras modificaciones.
Réactivas
Tampôn fosfato potâsico (0,01 M), pH 7,4 . .
Glutamato sôdico (1 M ) ................................
NAD (30 m g ./m l .) .........................................
Metasulfato de fenacina (5 g./ml.)
Azul de tetrazolio (10 g./ml.) . . . . . .
21,3 ml.
2 . 0 ml.
0 , 6 ml.
0 , 1 2 ml.
1 . 0 ml.
TeHida
Una vez realizada la ecectroféresis, los geles se colocaron (fuera del soporte de vidrio) en un
tubo, cada uno de ellos, y se adicionaron 3 ml. de la mezcla anterior. Se incubaron de 30 a 60
minutos a 37° C. Al cabo de ese tiempo las bandas donde existia actividad dc GDH aparecieron de
ccdor azul.
Una vez tenidos, se fijô el colorante con âcido acético al 4%.
La reacciôn efectuada en los geles fue la siguiente:
G + N A D --------------------------------- ► a KG + NHJ + NADH
El NADH cede su H* al metasulfato de fenacina y éste al azul de tetrazolio el cual pasa de color
amarillo a azul.
59
4 . - PARTE EXPERIMENTAL
60
4 .1 .- LOCAUZACION Y SOLUBILIZACION DE LA GDH DE CEREBRO DE RATA
Esta parte del trabajo ha sido presentada en el VIII congreso de la SEB, celebrado en Murcia
del 26 al 30 de septiembre del ano 1979.
61
INTRODUCCION
Se sabe que la glutamato deshidrogenasa (GDH, EC 1.4.1.3) de las células animales, se encuen-
tra localizada en las mitocondrias ( 1 ) y, dada su fâcil solubilizacion, se pcnsô que se hallaba en la
matriz mitocondrial y no unida a la membrana. Las enzimas procedentes de higado bovine y de rata
ban sido las mas estudiadas y no obstante casi nada se sabe acerca de la enzima de cerebro de rata,
aunque algunos autores (2-4) sugieren que se trata de una enzima mitocondrial. Conocimientos
précisés sobre la localizacion intramitocondrial. Conocimientos precises sobre la localizaciôn intra
mitocondrial de la enzima de cerebro son interesantes, no sôlo en le refcrente a su funcionalidad,
sino también para aportar dates que esclarezcan la compartimentacién del glutamato en este tejido.
En esta parte de nuestro trabiÿo présentâmes, no sôlo informaciôn sobre la distribuciôn subce-
lular y submitocondrial de la GDH de cerebro de rata, sino que aportamos algunas evidencias sobre
el efecto regulador del ADP sobre la actividad de dicha enzima.
MATERIAL Y METODOS
Se indican detalladamente en la parte general de esta tesis.
RESULTADOS Y DISCUSION
Segûn los resultados de la Tabla I, la GDH de cerebro de rata, al igual que la de higado, esta
localizada en las mitocondrias. El que no se h alla encontrado actiridad enzimàtica en cl homogena-
do ni en la fracciôn soluble S, podria atribuirse a la presencia de un inhibidor de la enzima
encontrado por Gonzalez y sus colaboradores (5.7) en la fracciôn soluble de cerebro.
El h echo de que solamcnte una pcquena fracciôn de la enzima (aproximadamcnte 2 por ciento)
sea extraida con tampon iris-ClH, sin fuerza iônica, parece indicar que la enzima no esta en forma
soluble en la matriz mitocondrial, sino que una gran proporciôn de ella, aproximadamcnte el 4 9 %,
se encuentra intcraccionando con las membranas mitocondriales, (porciôn de la enzima
62
extraible con tampon fosfato potâsico de distintas fueizas iônicas) y el rcsto, aproximadamente
otro 49%, se halla unida fuertemente a la membrana mitocondrial (enzima extraible con triton
X 100) (Tabla II). Est os resultados estân de acuerdo con los estudios de Me. Donnel y sus colabora
dores (1) y con los de Duve y sus colaboradores (6 ).
Podemos observar que la relaciôn de velocidades de la GDH, entre el sentido biosintético y
degradativo de la reacciôn, es superior para la enzima extrafble con tampon tris CIH (0,02 M.), pH
7,4 y con tampon fosfato potâsico (0,2 M.) pH 7,4 (Tabla II). Dichos resultados podn'an indicar que
la localizaciôn submitocondrial de la enzima, présenta distinto comportamiento o bien que el medio
de extracciôn ejerce algun tipo de influencia sobre su regulaciôn.
De los resultados de las Tablas III y IV podemos deducir que la enzima, en el sentido biosinté
tico, esta fuertemente regulada por el ADP hasta el punto de que, en la mayoria de los casos no se
encuentra actividad en ausencia del mismo, a excepciôn de la enzima extraida con triton X-100.
Tambicn puede observarse que el tanto por ciento de activaciôn del ADP es dependiente del medio
de extracciôn que se baya utilizado.
La concentxaciôn mâs idônea de triton X 100 para la extracciôn de la GDH de cerebro de rata,
esta comprendida entre el 0,5 y el 0,7%. Concentraciones superiores (1%) parece ser que inhiben
ligeramente la actividad enzimàtica. La concentraciôn de triton X 100 no parece, sin embargo,
influir en la realaciôn de actividades en ambos sentidos de la reacciôn (Tabla V).
Cuando se midiô la actividad de la GDH en el sentido de la degradaciôn del glutamato,
habiéndose efectuado la extracciôn en presencia de tritôn X 100, cl tanto por ciento de activaciôn
por el ADP fue muy similar para todas las concentraciones del detergente, a excepciôn de la del 5%.
Lo mismo ocurriô cuando se midiô la actividad de la enzima en si sentido de biosintesis de
glutamato. En cambio, y en ausencia de ADP, la concentraciôn de tritôn afcctô al sentido de la
reacciôn, lo cual podria indicar alguna modificaciôn de la enzima por acciôn de este detergente
(Tabla VI).
Al some ter cl extracto enzimàtico a elcctrofôresis sobre gel de poliacrilamida, se ban visualiza-
do cinco bandas con actividad de GDH (Figura 4.1-1); esto, junto con el becbo de babcrse encontra
do difercncias en su comportamiento cuando se mide la actividad de los distintos extractos en
63
presencia de ADP, podrfa indicar que se trata de isoenzimas, probablemente localizadas en células
distintas del cerebro. No obstante para confirm ar esta hipôtcsis, serfan necesarios much os mâs
ensayos.
œNCLUSIONES
1.— La mayor actividad de la GDH se extrae de las mitocondrias crudas en presencia de tritôn
X-100, lo que parece indicar que una gran porporciôn de la enzima se encuentra unida a la mem
brana (aproximadamente el 50% ) (Tabla II).
2.— Una pequena proporciôn de la enzima (^roxim adam ente el 2%) parece encontrarse libre
en la matriz mitocondrial (fracciôn extraible con tampôn Tris-CIH) (Tabla II).
3.— Aproximadamcnte el 48% de la actividad enzimàtica es extraible con tampôn fosfato
potâsico de distintas fuerzas iônicas, lo que podria indicar que una parte del contenido total de la
enzima pueda estar unidad a la membrana mitocondrial median te fuerzas electrostâticas (Tabla II).
4.— La relaciôn de actividades entre el sentido biosintético y degradativo de la reacciôn, en
presencia de ADP, dépende del medio de extracciôn utilizado, encontrândose la relaciôn mâs a!ta en
la enzima procedente de la matriz mitocondrial (aproximadamente el 1 0 % ) y de la fracciôn extraida
con la mayor fuerza iônica. La menor actividad se ha encontrado en las fracciones de enzima
extrafdas con fuerza iônica baja y con tritôn X-100 (Tabla II).
5.— El factor de activaciôn del ADP depende del medio de extracciôn que se utilice (Tabla III)
y no es el mismo para uno y otro sentido de la reacciôn.
6 .— La relaciôn de actividades en el sentido biosintético y degradativo es diferente en presen
cia y en ausencia de ADP (1,3 mM) (Tabla IV), siendo mayor (aproximadamcnte cl doble) en el
primer caso (en presencia de ADP), lo que podri'a indicar un efccto modulador de este nucleôtido
para dcsplazar la actividad hacia el sentido biosintético y supondrta su participaciôn en la regulaciôn
del sentido de la actividad.
64
7.— La concentraciôn idônea de tritôn X-100, para la solubilizaciôn de la GDH, es la del 0,7%
(Tabla VI).
8 .— La relaciôn de actividades en sentido biosintético y degradativo, en presencia de distintas
concentraciones de tritôn X-100, prâcticamente no varfa.
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III
IV
Banda
15.5
28.5
20,2
20,2
15.6
72
CONDIOONES EXPERIMENTALES DE LA TABLA II
I Extracciôn con tampon tris Cl H (0,02 M) pH 7,4.
n Extracciôn con tampôn fosfato potâsico (0,005 M) pH 7,4.
m Extracciôn con tampôn fosfato potâsico (0,02 M) pH 7,4.
IV Extracciôn con tampôn fosfato potâsico (0,2 M) pH 7,4.
V Extracciôn con tampôn fosfato potâsico (0,02 M) pH 7,4, que contiene tritôn X—100 al
IX.
Las actividades se midieron en presencia de ADP (1,3 mM)
G ■— >aKG Actividad medida en el sentido de degradaciôn del glutamato.
aKG ' ► G Actividad medida en el sentido de la biosintesis del glutamato.
(Los signos I, II, III, IV y V, tâenen el mismo significado en la Tabla III).
CONDICIONES EXPERIMENTALES DE LA TABLA V
El tritôn X—100 estaba disuelto en iampôn fosfato potâsico (0,02 M) pH 7,4.
Las actividades se midieron en presencia de ADP (1,3 mM).
73
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74
4 .2 .- COMPORTAMIENTO DE LA GDH PROCEDENTE DE DIS1ÎNTAS
FRACCIONES MITOCONDRIALES
Esta parte del trab^o ha sido enviada al 12th FEBS Meeting, celebrado en Dresde del 2 al 8 de
julio del ano 1978.
75
INTRODUCCION
No hace mucho que ha sido pues ta de manifiesto la evidencia sobre la heterogeneidad mitocon
drial en el tejido nervioso y algunos autores como Papay y sus colaboradores ( 1 ) han demostrado
que en el pericarion neural, en las células gliales, en las dendritas y en las terminaciones nerviosas,
existen mitocondrias de distinta forma y tamaôo. Esta heterogeneidad morfolôgica ha sido confir-
mada median te observaciones, al microscopic electrônico, de fracciones mitocondriales aisladas del
cerebro (2,3). Por medio de centrifugaciones diferenciales de homogenados de cerebro en gradiente
de sacarosa y/o FicoD-sacarosa, se han identificado poblaciones de mitocondrias caracterizadas por
la distribuciôn de enzimas marcadoras a lo largo del gradiente, considerandose como mitocondrias
libres (M.L.) aquellas que proceden de pericarion neural y de células gliales, y como sinâpticas
(M.S.) tas procedentes de terminaciones nerviosas (4-10). Blaschko (11) ha sugerido que las m ito
condrias del cerebro, en los diferentes estados de su vida, tienen que realizar diferentes funciones.
El glutamato es un aminoâcido sujeto, en el cerebro, a un metabolismo grande y râpido (12)
estando présente en dicho ôtgano a concentraciones muy altas (13). Se han realizado numerosas
investigaciones sobre la sintcsis y el metabolismo en general del glutamato en cerebro, con el fin de
tratar de esclarecer su funciôn como ncurotransmisor putativo (14, 15); su aportaciôn rcgulando la
eliminaciôn del amonio cerebral (16, 17) asi como la bien establecida compartimentacién del
metabolismo del glutamato y sus derivados (18). La propuesta existencia de, al mènes, dos ciclos
tricarboxilicos separados en el cerebro (18, 19) y su asociaciôn con un compartimente “grande” y
o tro "pequeno” para el glutamato, se ha explicado en parte por las observaciones a la heterogenei
dad mitocondrial y recientemente se ha avanzado un poco mâs en estos conocimientos, con la
pucsta a punto de técnicas que permiten separar mitocondrias libres y sinaptosomales. Los trabqos
mâs completos en este sentido son los abord ados por Dennis y sus colaboradores (20-22) los cuales
(dïservaron que la sfntesis de glutamato se realiza tanto en un tipo como en cl otro de mitocondrias
(MLL. y M.S.) (20), y apoyan la tesis de que la glutamato deshidrogenasa en cerebro esta relativa-
mente limitada y que la principal ru tadcl metabolismo del glutamato es la transaminaciôn (21). En
estos trabajos Dennis y sus colaboradores han estudiado el comportamiento de la GDI! de ambos
tipros de mitocondrias, fundamentalmcntc en cl sentido biosintético y sicmpre en presencia de ADP
que, como es sabido, es un potentc regulador de la enzima hepâtica (23). El estudio del comporta
miento de la GDH en las diferenntes poblaciones mitocondriales del cerebro, ofrece un especial
intterés ya que al encontrarse esta enzima fuertemente implicada, no sôlo en el metabolismo del
76
^utam ato, sino que podria estar ademis involucrada en la regulaciôn de los niveles de amonio en
cerebro, su estudio podrfa dar alguna luz sobre el esclarecimiento de la compartimentacion del
glutamato en cerebro y sobre la regulaciôn del ion amonio en el mismo.
En el présenté trabtyo hemos abordado el problema desde dos vertientes. En primer lugar
hemos puesto a punto técnicas de separaciôn, no sôlo de mitocondrias libres y sinaptosomales sino
que ademâs hemos separado dis tintas subpoblaciones de mitocondrias sinaptosomales. Seguidamen-
te hemos estudiado el comportamiento de la GDH en todos los tipos de mitocondrias, analizando
dicho comportamiento en uno y otro sentido de la reacciôn y, en ambos casos, en ausencia y en
presencia de ADP, asimismo damos datos sobre la hipôtesis de la posible presencia de isoenzimas de
la GDH, lo cual podrfa explicar de alguna manera el extrano comportamiento del glutamato en el
cerebro.
MATERIAL Y METODOS
Expuestos en la parte general de esta tesis.
RESULTADOS Y DISCUSION
Los estudios realizados que hemos expuesto en la parte anterior (4.1) de nuestra tesis, se
llevaron a cabo con la enzima procedente de mitocondrias crudas, pcro nos interesaba conocer si las
difcrencias de comportamiento frente al ADP podn'an deberse al diferente origen de las mitocon
drias: sinaptosomales (como prototipo de mitocondrias procedentes de terminaciones nerviosas) y
mitocondrias libres (aquellas que proceden de pericarion neural y de células gliales). En primer lugar
nos interesaba conocer la separaciôn idônea de ambos tipos de mitocondrias y para cllo estudiamos
enzimas marcadoras de fracciones mitocondriales y citosôlicas.
De los resultados de la Tabla VI podemos deducir que la concentraciôn de lactato deshidroge
nasa (enzima marcadora de la fracciôn citosôlica) en mitocondrias libres (M.L.) es mucho menor que
en sinaptosomales, lo cual es un dato a favor de la pureza de dichas fracciones. La menor actividad
de acetil-colinesteresa (enzima marcadora de membranas cclularcs y por tanto de sinaptosomos) asi
77
como el que la relaciôn acetil-colinesteresa/lactato deshidrogenasa sea pequena en M.L. con respecto
a M.S., son otros datos que apoyan la no contaminaciôn de las M.L. con sinaptosomas. De los
resultados de esta tabla podemos también deducir que la citocromo-oxidasa es mâs activa en mito
condrias libres que en las sinaptosomales, lo cual esta de acuerdo con los trabajos de Gayet y sus
colaboradores (24). Si observamos los resultados obrenidos para estas enzimas en mitocondrias
sinâpticas, podemos observar que tanto la actividad de LDH como de la ACH-asa y las relacioncs
ACH-asa/LDH son muy superiores que las halladas en M.L., lo cual podrfa indicar que esta sea una
fracciôn de sinaptosomas. Podemos observar también que esta fracciôn es mâs activa en fum arasa
que la correspondiente a M.L. lo que esta en desacuerdo con los trabzÿos de Lai y sus colaboradores
(9) que encuentran lo contrario.
Respecto a la glutamato deshidrogenasa, encontramos mayor actividad enzimàtica espectfica
en las mitocondrias libres que en las sinaptosomales, cuando ésta se mide en el sentido degradativo,
es decir, en el de la desaminaciôn oxidativa, tanto si la actividad enzimàtica se mide en presencia de
ADP como si se hace en su ausencia, si bien el grado de actividad en el primer caso es superior
cuando se trata de mitocondrias sinaptosomales lo que podria indicar un distinto comportamiento
de la enzima de ambas procedencias (Tabla VIII). Estos resultados estân de acuerdo con los estudios
de Dennis y sus colaboradores (21) que encuentran distinto tipo de comportamiento cinético
respecto a diferentes concentraciones de ADP en mitocondrias libres y sinaptosomales, aunque
dichos autores no han realizado ningûn estudio comparativo entre los dos sentidos de reacciôn de la
enzima. Cuando la actividad enzimàtica se mide en el sentido biosintético (aminaciôn reductora)
encontramos que la actividad enzimàtica espccflïca es mayor en M.S. que en M.L. cuando cl
coenzima era el NADH, ocurriendo lo contrario si se trataba de N AD PII, lo cual podria indicar la
fuerte regulaciôn por parte del coenzima (Tabla VIII). La regulaciôn del sentido de la reacciôn por
el ADP estâ también apoyada por los resultados encontrados en esta misma tabla, donde podemos
observar que, en presencia de ADP, la enzima procedente de los sinaptosomas desplaza la reacciôn
hacia la sfntcsis de glutamato (relaciôno KG/G = 3,2). Igunlmente ocurrc en M L. en presencia de
ADP, donde se encuentra la misma relaciôn pcro con la diferencia de que en estas, no sc encuentra
actividad en ausencia de ADP para la enzima medida en cl sentido biosintético de glutamato. Por
o tra parte puede obsenarse que en ausencia de ADP la GDH de M.L. estâ fuertemente inclinada
hacia la degradaciôn del glutamato, mientras que en las M.S. esta relaciôn ligeramente fa\orecida
hacia dicha degradaciôn (relaciôn sentido biosintctico/degradativo = 0,9).
78
En las mitocondrias cérébrales existe una gran lieterogeneidad (10) tanto de las M L. como de
las M.S. En nuestro trabajo hemos intentado separar subpoblaciones de mitocondrias procedentes de
distintas fracciones subsinaptosomales (ver material y métodos) identificândolas con enzmas marca
doras de mitocondrias; fumarasa, malato deshidrogenasa y citocromo-oxidasa. Asimsmo hemos
estudiado su posible contaminaciôn por fracciones citosôlicas (lactato deshidrogenasa) tsi como su
contaminaciôn por membranas (acetil-colinesterasa). Los resultados se expresan en Ii Tabla IX.
Obtuvimos cuatro fracciones, probablemente de sinaptosomas a juzgar pos sus altos ccntenidos de
LDH y ACH-asa respecto a los encontrados por M.L. (Tabla VIII). Observamos qie la mayor
actividad total para todas las enzimas marcadoras se encuentra en la fracciôn MS4 ,
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89
4 .3 .- EFECTO DE NUCLEOTIDOS SOBRE LA GDH DE CEREBRO DE RATA Y MECANISMO
DE ACCION DEL ADP SOBRE LAS MITOCONDRIAS LIBRES.
Trabajo presentado en cl I Congreso Hispano-Portugucs de Bioquimica, celebrado en Coimbra
del 23 al 26 de Septiembre del ano 1980.
90
INTRODÜCaON
Olson y Anfinscn (1) han observado la degradaciôn de ta glutamato deshidrogenasa en solucio-
nes satinas y estudios de dispersion de luz han dcmostrado que la GDH se polimeriza a concentracio-
nes de proteina alrededor de 0,1 mg./ml. (2). La actividad enzimâtica de la GDH parece estar
reladonada estrechamcntc con el estado de agregaciôn que presenten las subunidades (3) segûn el
esquema:
Polfmero ̂ Monômero X ̂ Monômcro Y
Las très formas indicadas en el esquema son enzimâticamente activas si bien difîeren en su especiflci-
dad por el sustrato, asi el monômero X puede polimerizarse y es especffico del glutamato, en
cambio el monômero Y no se polimeriza y présenta mayor actividad cuando actûan como sustrato
determinados aminoâcidos monocarboxilicos como la alanina. Las très formas se encuentran en
equilibrio y varias sustancias afectan a la enzima, desplazando dicho equilibriu en un sentido o en
otro. Por ejemplo, la concentraciôn enzimâtica (concentraciôn pro té ica) elevada favorece la polime
rizaciôn y cuando esta concentraciôn es baja, se favorece la formaciôn del monômero X Efectores
como el NADP y el GTP favorecen la formaciôn del monômero Y, mientras que el ADP y la leucina
desplazan el equilibrio hacia la del monômero X Agentes como cl GTP (4), la tiroxina (5) y el
dietil-estilbestrol (6), inhibidores de la GDH hepâtica, favorecen ademâs la degradaciôn de la enzi
ma, en presencia del coenzima rcducido, mientras que el ADP, que es activador de la GDH, favorece
la agregaciôn en presencia de NADH (7) asf como la formaciôn del monômero X.
En muchos ôrganos la concentraciôn de GDH esta a niveles en los que pueden darse formas
polimerizadas, por ello se sugiriô que los efectos de modificadores sobre la polimerizaciôn podrian
tener significado biolôgico. Sin embargo, se sabe que la GDH de distintas proccdencias varia nota-
blemente su c^acidad polimérica; por ejemplo, la proccdente de hi'gado de ccrdo (8) y de hombre
(2) se polimeriza en soluciones concentradas al igual que la enzima bovina, en tanto que la de polio
(9) y sapo (10) se agregan en menor proporciôn y la obtenida de higado y rinôn de rata (11, 12),
hfgado de pez perro (13) y de atûn, no se polimerizan, lo mismo que ocurrc con las enzimas de
procedencia no animal. No existe pues certeza de que el fenômeno de polimerizaciôn despolimc-
rizaciôn Juegue un papel ftsiolôgico destacado ya que la GDI! proccdente de higado de rata y bovino
que son cinéticamente y hasta estructuralmente similares, prcscntan distinto comportamiento frente
91
a la polimerizaciôn.
En los apart ados 4.1 y 4.2 de esta tesis, hemos apuntado la posibilidad del efccto rcgulador del
ADP sobre la GDH de cercbro de rata asf como la posible presencia de isoenzimas. En el présente
apartado hemos crefdo interesante estudiar con mayor detenimiento, el efecto del ADP sobre la
GDH procedente de los dos tipos de mitocondrias cerebrales: sinaptosomales y libres. Hemos
Uevado a cabo el trabajo, estudiando el efecto que ejerce este metabolito sobre la actividad enzimâti
ca, medida en los dos sentidos de la reacciôn con el propôsito de esclarecer nuestra hipôtesis
anterior de que el ADP regulaba el sentido de actuaciôn de la enzima. Asimismo hemos tratado de
estudiar cuâl séria el mécanisme por cl que el ADP ejerce su acciôn reguladora sobre las mitocon
drias libres.
MATERIAL Y METODOS
Expuestos en la parte general de esta tesis.
RESULTADOS Y DISCUSION
Segûn los resultados de la Tabla XII cl ATP, el ADP y el AMP son activadores de la glutamato
deshidrogenasa de cercbro de rata, tanto de las mitocondrias libres como de las sinaptosomales, si
bien el grado de activaciôn de estos nucleôtidcs es mayor en las primeras. Podemos observar que
ninguno de los nucleôtidos mencionados, afectan al sentido de la reacciôn ya que las rclaciones
entre las actividades, en el sentido biosintetico y degradativo, no son afectadas por ellos, liecho que
atribuimos a la concentraciôn de proteinas utilizada: 0,39 mg./ml. y 0,61 mg./ml. para mitocondrias
libres y sinaptosomales respectivamente. Dicha relaciôn de actividades es mayor en M.L. que en M.S.
lo que podrfa indicar que el comportamiento de la GDH en ambas poblaciones, es diferente respecto
al sentido de la reacciôn aunque bien podrfa pensarse que la concentraciôn de enzima juega un
importante papel en la orientaciôn de dicho sentido. El GTP, a las concentraciones utilizadas (0,16
mM), inhibe totalmente a la enzima de ambos tipos de mitocondrias. Por su parte el ADP y el ATP
protegen ligeramente a la GDH frente al efecto inhibidor del GTP si bien, el ATP présenta mayor
efecto protector para la enzima procedente de M.S. que para la obtenida de M.L. siendo ello debido
ta! vcz, a que dicho efecto protector no sea espccffico del ATP, sino que se deba al ADP proccdente
92
del mismo por acciôn de la ATP-asa del medio, o bien a que el comportamiento de la enzima de
ambas procedencias sea distinto.
A la vista de estos resultados y centrando el tema en el efecto del ADP, pensamos que el
mecanismo de activaciôn de este nucleôtido podri'a ser el siguiente:
Consideremos que la GDH procedente del cerebro fuese una enzima semejante en su regulaciôn
a la hepâtica, ya que los resultados que hemos encontrado apuntan esta posibilidad por un gran
numéro de evidencias. Si esto es asi, el ADP podrfa actuar a dos niveles:
a) ejercicndo un efecto alostérico sobre la actividad enzimâtica.
b) favoreciendo la formaciôn del oligômero, es decir, favoreciendo la polimerizaciôn de la
enzima.
Para dilucidar estas posibilidades hemos realizado una serie de experimentos. En prim er lugar
hemos estudiado el efecto de la concentraciôn de ADP sobre la actividad de la GDH en ambos
sentidos de la reacciôn que nos han conducido a las observaciones siguientes (Tabla XIII): se puede
apreciar en esta tabla que, la concentraciôn de ADP activa a la enzima procedente de M.L. en ambos
sentidos pero que esta activaciôn es mucho menor cuando la medida se realiza en el sentido
degradativo, hasta el punto que dicha actividad no varia en concentraciones de ADP que oscilan
entre 0,16 mM y 0,32 mM (0,15 a 0,40 /imoles en los 1,2 ml ), en cuambio cuando se mide en el
sentido biosintetico, la actividad se incrementa extraordinariamente a medida que aumenta la con
centraciôn de ADP. Este efecto parece ser alostérico en el sentido biosintetico, a la vista de los
resultados expresados en la grâfica de la figura 4.3-2, sin embargo, cuando la actividad se midiô en el
sentido de la degradaciôn del glutamato, la forma de la curva es hiperbôlica y no sigmoidal, lo que
descarta en parte el efecto alostérico, al menos de un sistema K de la enzima, en este sentido de la
reacciôn. Esto conduce a una variaciôn en la relaciôn de actividades entre el sentido biosintético y
degradativo cncontrândosc dichas rclaciones comprendidas entre 0,25 y 9,6, lo que podrfa significar
un potente efecto regulador del ADP frente al sentido de la reacciôn puesto que, de estar marcada
mente inclinada hacia la degradaciôn del glutamato en ausencia de ADP, en su presencia la reacciôn
se inclinarfa muy acusadamente hacia la sfntesis del mismo. Hemos ris to que cuando la concentra
ciôn de proteina es al ta (0,4 a 0,7 mg./ml.) (forma polimerizada de la enzima), el ADP no ejerce
efecto alguno sobre el sentido de la reacciôn (Tabla XII) aunque si activa a la GDH, en cambio
93
cuando la concentraciôn de proteinas disminuye (forma probable men te despolimerizada), cl ADP
inlluye en la actividad y en cl sentido de la reacciôn (Tabla XIII). Con el propôsito de comprobar
todo esto, hemos estudiado cômo influye la concentraciôn de la enzima sobre cl efccto del ADP. En
los resultados expuestos en la Tabla XIV, sobre la GDH procedente de mitocondrias libres, podemos
observar que el ADP a concentraciones de 1,3 mM. ejerce un efecto activador mâs acusado cuanto
menor es la concentraciôn de proteinas, tanto si la actividad se mide en el sentido biosintetico como
si se realiza en el degradativo, aunque el efecto es mayor en cl primer caso.
Se sabe que, en el caso de la GDH, la concentraciôn pro te ica favorece la polimerizaciôn (7).
Segûn nuestros resultados, en ausencia de ADP, a medida que aumenta la concentraciôn proteica, lo
h ace tambicn la actividad enzimâtica especifica lo que indica que la forma polimérica favorece la
reacciôn en el sentido biosintetico (Tabla XIV). El ADP, segûn Fricden (7), se une a la enzima en el
lugar del NADH, justamente en el sitio de union reguladora. Cuando el NADH se encuentra unido a
la enzima en ese sitio, esta présenté una forma enzimâtica menos activa por disgregaciôn del
oligômero y cuando dicho sitio es ocupado por el ADP, se favorece la formaciôn de la estructura
oligomérica (Figura 4 .3 .1).
proteinas
+ ADP
+ NADH
Monômero X Poli'mero
Figura 4.3. 1
Cuando la reacciôn se mide en cl sentido biosintetico, existe gran cantidad de NADH en el medio y
dicha cantidad, en relaciôn a la concentraciôn de enzima, résulta mâs elevada cuanto menor es esta,
p o r lo tanto, el efecto del ADP sobre la actividad enzimâtica, tendn'a. que ser mayor a menor
concentraciôn proteica, lo que esta de acuerdo con nuestros resultados (Tabla XIV).
Cuando la reacciôn se mide en sentido degradativo, la concentraciôn proteica no afecta a la
actividad de la enzima. Esto podrfa indicar que la forma mâs polimerizada (polfmcro) ticnc la
94
misma actividad que el monômero X para la degradaciôn del glutamato. El hecho de que cl ADP
influya en la actividad en el sentido degradativo en funciôn inversa a la concentraciôn proteica,
pudiera ser otro dato en favor de la posibilidad de que el ADP favorezca el paso del monômero Y a
monômero X.
Todo lo anteriormente expuesto podri'a resumirse en los siguientes puntos;
a) El ADP podrfa favorecer cl paso del mono nero Y a monômero X, de acuerdo con el
esquema indicado en la introducciôn y aumentar asf la actividad enzimâtica, es decir;
ADP
Monômero Y Monômero X
y que la concentraciôn proteica favorccerfa la polimerizaciôn, es decir:
Gone, proteica
Monômero X<, . __ Protômero
y ademâs: 1) el monômero X présenta mayor actividad que el Y en ambos sentidos de la reacciôn,
si bien dicha actividad es mayor para el sentido biosintetico.
2) El monômero Y es mâs activo que el X en el sentido degradativo que en cl biosintético.
3) El protômero es la forma mâs activa de la enzima cuando la actividad de ésta se mide en el
sentido biosintético.
Concretando, la forma monômero Y actuaria en cl sentido de la degradaciôn del glutamato,
mientras que cl monômero X y el polfmcro serfan las formas mâs activas en los dos sentidos de la
reacciôn aunque con predominio del sentido biosintético.
b) El ADP podrfa ademâs ejercer un efecto alostérico sobre la actividad enzimâtica, cuando
esta se mide en presencia de NADH, es decir en el sentido de la biosfntesis del glutamato, hecho que
estarfa de acuerdo con las teorias de Frieden (7) y que serf a la razôn del desplazamiento de la
actividad hacia el sentido de la biosfntesis.
Los resultados de la Tabla XV parecen indicar que, en ausencia de ADP, la concentraciôn de
proteinas y, por tanto, el mecanismo de polimerizaciôn-dcspolimerizaciôn, regulan el sentido de la
95
reacciôn de manera que el de la sfntesis del glutamato se vc favorecido tanto mâs cuanto mayor es
dicha concentraciôn (forma mâs polimerizada). El ADP favorecerfa cl mismo sentido de la reacciôn
y en igual cuantfa (nôtcsc que los incrementos de actividad con y sin ADP son prâcticamente del
mismo orden). Esto podrfa indicar que rcalmentc el efccto de activaciôn del ADP se ejerce por un
mecanismo alostérico. Esta ultima suposiciôn parece estar apoyada por los resultados de la Tabla
XVI y de la Fig. 4.3.—3 donde puede observarse que, a concentraciones de ADP que oscilan entre
0,08 mM y 0,32 mM, el efecto activador del ADP se incrementa en funciôn de la concentraciôn en
ambos sentidos de la reacciôn y que el tanto por cîento de activaciôn es mayor al aumentar dicha
concentraciôn lo cual no apoya la hipôtesis del efecto sobre la polimerizaciôn-despolimerizaciôn y sf
la del efecto alostérico. Cuando représentâmes los datos de la Tabla XVI (Fig. 4.3.-3), podemos
observar que los per files grâficos nos ofrecen una curva sigmoidal (indica ti va del efecto alostérico)
cuando la actividad de la enzima se mide en el sentido de la sfntesis del glutamato, mientras que la
curva es hiperbôlica cuando es medida en el sentido de la degradaciôn (Fig. 4.3. 3 ). Esto podrfa
indicar que el ADP no ejerce un efecto alostérico, al menos de tipo K, para la enzima, cuando se
mide su actividad en este ultimo sentido.
Siguiendo con los resultados de la Tabla XVI obscrvamos que, a concentraciones de 0,38 niM y
0,64 mM la enzima présenta mayor actividad cuando la medida se realiza en cl sentido biosintético y
cuando la concentraciôn proteica es menor, pero cuando se efectûa en cl sentido degradativo no se
encuentran variaciones respecto a los resultados anteriores. Este dato por ser ûnico, aunque compro-
bado por triplicado, no le comentamos puesto que pensamos, deberfa estudiarse mâs detenidamente
con el fin de comprobar si concentaciones elevadas de ADP pudieran, efectivamente, favorecer la
polimerizaciôn.
Por otra parte, el ADP no afecta al pH ôptimo de la enzima (Fig. 4.3.-4) de loque se deduce
que no actûa a nivel de la ionizaciôn de los aminoâcidos del centro activo.
De todo lo expuesto en esta parte del trabajo, podemos extracr las siguientes conclusioncs:
i 1.— Los nucleôtidos ATP, ADP y AMP activan a la glutamato deshidrogenasa proccdente de
mitoconcrias libres y sinaptosomales y el GTP la inhibe.
2.— Tanto el ADP como el ATP protegen ligeramente a la enzima, frente al efccto inhibidor
96
del GTP.
3.— El ADP parece regular el sentido de la reacciôn, siendo su mecanismo probablemente de
tipo alostérico.
4.— La glutamato deshidrogenasa, procedente de mitocondrias libres, parece ser semejante a la
de origen hepâtico, presentando un tipo de regulaciôn basado en mecanismos de polimerizaciôn
despolimerizaciôn.
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0 .5 0 m ga K G
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0 8 0
Figura 4. 3.— 3
104
1000
oK G
100#
0,08 -------------------------- 0 3 2
Figura 4. 3. — S'
0 6 4
105
• -------- # (-A D P) a K G ------ 1> G
A r-— ;-A (+ A D P ) a k g p> G
( ^ ^ - : ^ ( _ A D P ) G
(+ADP) C
1000
KG
^>o KG
+ ADP
8 0 0
120
6 0 0
+ ADP
4008 0
- 4 0 ADP2 0 0
ADP
Figura 4.3-4
Condiciones expérimentales: Tampon fosfato potâsico (0,2 M) para pH 5,5 a 8 y tampon
pirofosfato sôdico (0,2 M) para pH 8,5.
106
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107
4 .4 .- PARAMETROS CINETICOS DE LA GDH PROCEDENTES DE MITOCONDRIAS LIBRES Y
SINAPTOSOMALES.
108
INTRODUCCION
Los cnsayos cinéticos sobre la GDH de origen bovino han aportado resultados a mcnudo
conflictivos debido al fenômeno de poümerizaciàn-despolimerizaciôn que présenta la enzima y a los
efectos alostéricos y polimerizantes de los coenzimas (1,2). Varies nucleôtidos, incluidos el NAD y
el NADIL ejercen diferentes efectos alostéricos sobre la reacciôn de la GDH, segûn que el sustrato
sea el glutamato o cualquier otro aminoâcido monocarboxilico. Los datos cinéticos senalan que
estos efectos distintos, sobre los dos tipos de sustrato, se deben a diferentes causas que limitan la
velocidad para ambas reacciones (3,4). Segûn estos autores, la etapa de velocidad limitante en la
oxidaciôn del glutamato es la disociaciôn del compicjo enzima coenzima rcducido. El GTP incre
menta la union del NADH a la enzima y por ello estabiliza dicho complejo. Esquemâticamente
podemos expresario asf:
E + NAD (P) • ► E-NAD (P) ^ E - S - NAD (P) H
E + P, + NAD (P) H
De acuerdo con los apartados 4.2 y 4.3 de esta tesis, el ADP ejerce, sobre la g lu t^ a to deshidrogena
sa de cerebro, el mismo efecto activador que en el caso de la enzima de origen hepâtico. Ademâs
parece ser que el ADP interviene en el sentido que tome la reacciôn, en favor de la sfntesis del
glutamato.
En esta parte de nuestro trabajo presentamos algunos datos sobre cl efecto del ADP sobre las
Km de los distintos sustratos de la GDH de mitocondrias libres y sinaptosomales, de cerebro con cl
fin de esclarecer si realmente el ADP influye en el equilibrio de la reacciôn.
MATERIAL Y METODOS
Expuestos en la parte general de esta tesis.
109
RESULTADOS Y DISCUSION
De los rcsultados comparativos presentados cn las Tablas XIX y XX, sobre los paramètres
cinéticos de la GDH procedente de M.L. y M.S., en ausencia y en presencia de ADP, podcmos
deducir que:
1) Si el ADP disminuye la afinidad de la enzima por el glutamate en las mitocondrias libres,
quiere decir que la presencia de este nucleotide y a concentracienes bajas de glutamate, el comparti
mente encargado de degradar este glutamate per la via de la GDH, estarfa identificado con las M.S.
mientras que en ausencia de ADP le estaria con las M.L. Esta idea esta apoyada per los resultades
que se muestran en la Tabla XX en la que se observa que las relaciones de velecidades màximas
entre el sentido biosintctico y degradative, en ausencia de ADP, es mener en el case de las M.L. que
en el de las M.S. mientras que cuande la reaccién se realiza en presencia de ADP, las relaciones son
muy semejantes.
En los resultades mes trades en la Tabla XIX se puede apreciar una diferencia de comporta
miento entre la enzima de mitocondrias libres y sinaptesomales ya que, en ausencia de ADP, las
M.L. presentan mayor velocidad maxima para la reaccién en el sentido dcgradativo que cn el
biesintético y, per cl contrario, en el caso de las M.S. la relacion esta ligeraincnte desplazada hacia cl
sentido biesintético del glutamate.
Otre date, a Favor de la diferencia de comportamicnto de la GDH de ambas subpoblaciones
mitocondriales, consiste en que, en ausencia de ADP, las M L. presentan mayor actividad de GDH en
ambos sentidos en comparaciôn con las M.S., mientras que en presencia de ADP ocurre lo contrario.
Este resultado esta de acuerdo con los encontrados por Dennis y sus colaboradores (5).
Concluyendo, el ADP disminuye la afinidad de la GDH para cl glutamato en las M L. y la
aumenta ligeramente cn las M.S.
2) El ADP aumenta la afinidad (disminuye la Km) para el NAD tanto en las M.L. como cn las
M.S. (Tabla XIX).
3) El ADP disminuye intcnsaniente la afinidad para el NADH en las M L. y la incrcmcnta en
110
las M.S. (Tabla XIX).
4) El ADP disminuye intensamente la afinidad para el a-cetoglutarato(aKG) y ligeramente para
el amonio, en el caso de las M.S. (Tabla XIX).
5) En ausencia de ADP, las M.L. presentan una Km menor (mayor afinidad) para el glutamato
que las M.S. y succde lo contrario cn presencia de ADP (Tabla XIX).
6 ) La Km para el NAD es muy semejante en el caso de las ML. que en el de las M.S. tanto en
ausencia como en presencia de ADP (Tabla XIX).
7) En ausencia de ADP las M.L. presentan mayor afinidad para cl NADH que las M.S. ocu
rriendo lo contrario en presencia del mismo (Tabla XIX).
8 ) En ausencia de ADP la actividad de GDH en ambos sentidos de la reaccién, es mayor en el
caso de las M L. que en el de las M.S. succdiendo lo co. trario en presencia de ADP.
9) El ADP desplaza et equilibrio de la reaccién hacia la sintesis de glutamato en ambos tipos
de mitocondrias (Tabla XX) cjerciendo mayor efecto de desplazamicnto cn el caso de las M.L.
De esta serie de conclusiones podemos extraer ciertas hipétesis cxtrapolables al nivcl fisiolégico
aunque lo que parece realmente évidente, es que el ADP afecta con gran intensidad al equilibrio de
la reaccién.
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115
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116
4 .5 .- CONCLUSIONES GENERALES
117
4 .5 .- CONCLUSIONES GENERALES
l'"’) La mayor actividad de la CDU se extrac de las mitocondrias crudas cn presencia de
triton X 1 0 0 , lo que parece indicar que una gran proporciôn de la enzima se cncucntra unida a la
mcinbrana (aproximadamente cl 50% ). Una pcquena proporciôn de la enzima (aproximadamcnte cl
2%) parccc cncontrarsc libre en la matriz mitocondrial (fracciôn extraible con tampon Tris-CIH).
Aproximadamente el 48% de la actividad enzimâtica es extraible con tampon fosfato potàsico de
distintas fuerzas ionicas, lo que podn'a indicar que una parte del contenido total de la enzima pueda
cstar unida a la membrana mitocondrial mediantc fuerzas elcctrostâticas (Tabla II).
2*) La rclaciôn de àctividades entre el sentido biosintctico y dcgradativo de la reacciôn, en
presencia de ADP, dépende del medio de extracciôn utilizado, cncontrândose la rclaciôn mâs al ta cn
la enzima procedente de la matriz mitocondrial (aproximadamente el 1 0 %) y de la fracciôn extraida
con la mayor fuerza iônica. La menor actividad se ha encontrado en las fracciones de enzima
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i f e ï
: b l i o t e c a