UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MEDICINA TESIS DOCTORAL Estudio de la actividad in vitro de compuestos fenólicos presentes en el vino y de seis antimicrobianos en aislados clínicos de Helicobacter pylori PRESENTADA POR Ana María Correa Ruiz Directores Manuel López-Brea Calvo Teresa Alarcón Cavero José Prieto Prieto Madrid, 2014 ©Ana María Correa Ruiz, 2014 Universidad Complutense de Madrid Facultad de Medicina Departamento de Medicina Estudio de la actividad in vitro de compuestos fenólicos presentes en el vino y de seis antimicrobianos en aislados clínicos de Helicobacter pylori Tesis Doctoral Ana María Correa Ruiz Madrid 2014 Manuel López Brea Calvo, Doctor en Medicina, ex jefe de Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de la Princesa y ex Profesor Asociado de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Madrid, Teresa Alarcón Cavero, Doctora en Ciencias Biológicas, Facultativo del Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de la Princesa y Profesora Asociada de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Madrid y José Prieto Prieto, Doctor en Medicina y Catedrático de la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense de Madrid CERTIFICAN: Que la Tesis Doctoral titulada “Estudio de la actividad in vitro de compuestos fenólicos presentes en el vino y de seis antimicrobianos en aislados clínicos de Helicobacter pylori” realizada por Ana María Correa Ruiz para optar al Grado de Doctor en Medicina, ha sido desarrollada bajo mi dirección y reúne los requisitos suficientes para su lectura y defensa. Para que así conste, se expide le presente certificado. Madrid, 1 de Septiembre del 2014 Fdo: Dr. Manuel López-Brea Calvo Fdo: Dra Teresa Alarcón Cavero Fdo: Dr. José Prieto Prieto A mi familia AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS Me gustaría agradecer en primer lugar a los directores de esta tesis, el Doctor Manuel López-Brea, a la Doctora Teresa Alarcón y al Doctor José Prieto, por su colaboración y consejos. Al Dr. López-Brea debo agradecerle el haber hecho que mostrara interés por este microorganismo, después de tantas sesiones en inglés de Helicobacter pylori todos los miércoles por la tarde. Gracias a la Doctora Teresa Alarcón, por la paciencia y apoyo, animándome constantemente para seguir adelante y no abandonar pese a los momentos complicados. En segundo lugar, quiero agradecer al Dr Adolfo J Martínez-Rodríguez y al Dr. Alfonso V. Carrascosa, por proporcionarme los compuestos fenólicos y la realización de una rotación externa en el Instituto de Investigación de Ciencias de la Alimentación del CSIC, quiero destacar su enorme interés por mi trabajo. Mi agradecimiento para el Servicio de Microbiología y Parasitología del Hospital Universitario de La Princesa, donde me estoy formando como especialista: facultativos, técnicos y residentes (especialmente para Laura, mi gran confidente). Quiero dar las gracias a mis “R” mayores Ángela y Marina, por haberse implicado en mi trabajo (gracias por enseñarme a hacer las extracciones y PCR) y como no, a mi co- R Alba, que más de una vez ha tenido que dar pases de placa para que no se muriese el H. pylori. Gracias a mis padres, por enseñarme a ser constante, y por confiar en mí. Sin ellos, no podría haber llegado hasta donde estoy llegando. Quisiera agradecer a mi hermano, mis cuñados y mis suegros por su preocupación en cada etapa de mi vida. A mi hija Ainhoa, gracias por haber sido tan buena en sus primeros meses de vida, y haberme dejado escribir mientras ella dormía. A pesar de haber sido momentos agotadores, verla me llenaba de vitalidad y fuerzas para seguir con este trabajo. Te quiero hija mía. Por último, quiero agradecer a mi marido Jorge, por haberme apoyado, por haberme dejado tu hombro para mis lágrimas, por hacerme reir cada día, por tu comprensión, por animarme cada día, y por infinitas cosas. Muchas gracias cariño. ÍNDICE ÍNDICE ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1 CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS. 2 1.1.1 Historia 2 1.1.2 Epidemiología 4 1.1.3 Caracterización 8 1.2 FACTORES DE VIRULENCIA DE H. pylori. 9 1.2.1 Ureasa 10 1.2.2 Sistemas antioxidantes 12 1.2.3 Adhesinas 13 1.2.4 Citotoxina vacuolizantes VacA 13 1.2.5 CagA 15 1.2.6 Lipopolisacárido 16 1.3 MANIFESTACIONES CLÍNICAS. 17 1.3.1 Manifestaciones digestivas 18 1.3.2 Manifestaciones extradigestivas 21 1.4 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS PARA LA DETECCIÓN 23 DE LA INFECCIÓN POR H. pylori. 1.4.1 Métodos invasivos 23 1.4.2 Métodos no invasivos 26 1.5 TRATAMIENTO. 29 1.5.1 A quién tratar 29 1.5.2 Cómo tratar 30 1.6 RESISTENCIA ANTIBIÓTICA. 33 1.6.1 Amoxicilina 33 ÍNDICE 1.6.2 Claritromicina 34 1.6.3 Metronidazol 34 1.6.4 Tetraciclina 35 1.6.5 Furazolidina 36 1.6.6 Levofloxacino 36 1.6.7 Rifabutina 37 1.7 MÉTODOS DE DETECCIÓN DE RESISTENCIAS. 37 1.7.1 Dilución en agar 37 1.7.2 Difusión con disco 38 1.7.3 Método del epsilómetro (E-test) 38 1.7.4 Puntos de corte 38 1.7.5 Métodos moleculares 39 1.8 VINO Y SALUD. 40 1.9 COMPUESTOS FENÓLICOS. 42 1.9.1 Compuestos puros 44 1.9.1.1 Catequina (C) 44 1.9.1.2 Metil galato (M) 45 1.9.1.3 Ácido gálico (G) 46 1.9.1.4 Quercetina (Q) 46 1.9.1.5 Taninos (Tan) 47 1.9.1.6 Resveratrol puro (RE) 48 1.9.2 Extractos 49 1.9.2.1 Extracto de semilla de uva (GSE) 50 1.9.2.2 Extracto de uva (Pu) 51 ÍNDICE 1.9.2.3 Resveratrol 1 (R1) 52 1.9.2.4 Resveratrol 2 (R2) 52 1.9.2.5 Extracto de semilla de uva (SCOM) 53 1.10 TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE LOS EFECTOS. 54 DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS SOBRE EL H. pylori. 1.10.1 Estudio del daño de membrana mediante yoduro de propidio 54 1.10.2 MALDI-TOF 55 1.10.2.1 Aplicaciones de MALDI-TOF en Microbiología Clínica 57 2. OBJETIVOS 58 3. MATERIALES Y MÉTODOS 60 3.1 Helicobacter pylori. 61 3.1.1 Número de cepas estudiadas 61 3.1.2 Procedencia de los microorganismos 61 3.1.3 Transporte de las muestras 61 3.1.4 Procesamiento de las muestras 61 3.1.5 Identificación de los microorganismos 62 3.1.6 Cepa control 63 3.1 7 Conservación de las cepas 63 3.2 COMPUESTOS FENÓLICOS. 63 3.2.1 Preparación de catequina 64 3.2.2 Preparación de metil galato 65 3.2.3 Preparación de ácido gálico 65 3.2.4 Preparación de quercetina 65 3.2.5 Preparación de resveratrol puro 66 ÍNDICE 3.2.6 Preparación de Taninos 66 3.2 7 Preparación de GSE 66 3.2.8 Preparación de Pu 67 3.2.9 Preparación de SCOM 67 3.2.10 Preparación de Resveratrol 1 67 3.2.11 Preparación de Resveratrol 2 68 3.2.12 Conservación de los compuestos fenólicos 69 3.3 ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO DE H. pylori. 69 3.3.1 Difusión en agar usando E-test 69 3.3.2 Puntos de corte 70 3.4 ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE LOS GENES vacA Y cagA. 70 3.4.1 Extracción del DNA cromosómico de H. pylori 70 3.4.2 Detección del gen vacA 72 3.4.2.1 Primers utilizados 72 3.4.2.2 Mastermix 72 3.4.2.3 Condiciones de la PCR 73 3.4.2.4 Revelado de la PCR por electroforesis en gel de agarosa 73 3.4.3 Detección del gen cagA 73 3.4.3.1 Primers utilizados 73 3.4.3.2 Mastermix 74 3.4.3.3 Condiciones de la PCR 74 3.4.3.4 Revelado de la PCR por electroforesis en gel de agarosa 75 3.5 ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE LOS COMPUESTOS 75 FENÓLICOS MEDIANTE DIFUSIÓN EN AGAR. ÍNDICE 3.6 ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LOS COMPUESTOS 76 FENÓLICOS FRENTE A H. pylori. 3.6.1 Curvas de muerte 76 3.6.2 Concentración mínima inhibitoria 78 3.6.3 Estudio del daño de membrana mediante yoduro de propidio 79 3.6.3.1 Preparación del yoduro de propidio 79 3.6.3.2 Protocolo 79 3.6.4 Estudio sobre el efecto proteínico en H. pylori 81 mediante MALDI-TOF 3.6.4.1 Extracción de la muestra 81 3.6.4.2 Análisis 82 3.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO. 82 4. RESULTADOS 83 4.1 ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO DE H. pylori. 84 4.1.1 Sensibilidad global a antibióticos 84 4.1.2 Sensibilidad a antibioticos según la edad 85 4.1.3 Sensibilidad a antibioticos según el sexo 87 4.1.4 Resistencia a antibióticos por cada año de estudio 88 4.2 ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE LOS GENES vacA Y cagA. 91 4.2.1 Presencia de los alelos s1 y s2 del gen vacA 91 4.2.2 Presencia del gen cagA 92 4.2.3 Relación entre la presencia del gen vacA y el gen cagA 93 4.2.4 Relación entre los alelos del gen vacA y la edad 93 4.2.5 Relación entre la presencia del gen cagA y la edad 94 ÍNDICE 4.3 ESTUDIO DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN 95 DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS. 4.3.1 Halos de inhibición 95 4.3.2 Relación entre los alelos del gen vacA y los halos producidos 97 por los compuestos fenólicos 4.3.3 Relación entre la presencia del gen cagA y los halos producidos 98 por los compuestos fenólicos 4.3.4 Relación entre la resistencia a claritromicina y los halos 99 producidos por los compuestos fenólicos 4.4 ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LOS COMPUESTOS 100 FENÓLICOS FRENTE A H. pylori. 4.4.1 Curvas de muerte 100 4.4.2 Concentración mínima inhibitoria 103 4.4.4 Estudio del daño de membrana mediante yoduro de propidio 105 4.4.5 Estudio sobre el efecto proteínico en H. pylori mediante MALDI-TOF 105 5. DISCUSIÓN 109 5.1 ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO DE H. pylori. 110 5.1.1 Sensibilidad a amoxicilina 110 5.1.2 Sensibilidad a claritromicina 111 5.1.3 Sensibilidad a rifampicina 113 5.1.4 Sensibilidad a levofloxacino 114 5.1.5 Sensibilidad a tetraciclina 115 5.1.6 Sensibilidad a metronidazol 116 5.2 ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE LOS GENES vacA y cagA. 118 ÍNDICE 5.2.1 Presencia de los alelos s1 y s2 del gen vacA 118 5.2.2 Presencia del gen cagA 119 5.2.3 Relación entre la presencia del gen vacA y el gen cagA 119 5.2.4 Relación entre la presencia del gen vacA y cagA y la edad 120 5.3 ESTUDIO DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN DE LOS 120 COMPUESTOS FENÓLICOS FRENTE A H. pylori. 5.3.1 Estudio de los halos de inhibición de los compuestos fenólicos 120 5.3.2 Relación entre los factores de virulencia y los halos 122 producidos por los compuestos fenólicos 5.3.3 Relación entre la resistencia a claritromicina y los halos 123 producidos por los compuestos fenólicoso 5.4 ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LOS COMPUESTOS 123 FENÓLICOS FRENTE A H. pylori. 5.4.1 Curvas de muerte 123 5.4.2 Concentración mínima inhibitoria 124 5.4.3 Estudio del daño de membrana mediante yoduro de propidio 125 5.4.4 Estudio sobre el efecto proteínico en H. pylori mediante MALDI-TOF 125 6. CONCLUSIONES 127 7. BIBLIOGRAFÍA 130 8. SUMMARY 161 ABREVIATURAS Ácido gálico………………………………………………….. G Amoxicilina………………………………………………….. AMX Catequina…………………………………………………….. C Claritromicina………………………………………………... CLA Concentración mínima inhibitoria……………………………. CMI Dimetilsulfóxido……………………………………………... DMSO Extracto de uva………………………………………………. Pu Extracto de semilla de uva-GSE……………………………... GSE Extracto de semilla de uva-SCOM……………………………SCOM Levofloxacino……………………………………………….. LEV Metil galato…………………………………………………... M Metronidazol………………………………………………… MET Quercetina……………………………………………………. Q Resveratrol 1…………………………………………………. R1 Resveratrol 2…………………………………………………. R2 Rifampicina………………………………………………….. RIF Taninos……………………………………………………….. Tan Tetraciclina…………………………………………………… TET 1 INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 2 INTRODUCCIÓN 1.1 CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS 1.1.1 Historia. En octubre del 2005 recorrió el mundo la noticia de la obtención del premio Nobel de Medicina por los australianos Barry Marshall, de 54 años, y Robin Warren, de 68, por el descubrimiento del bacilo Helicobacter pylori, asociado a la etiología de la gastritis y de la úlcera gástrica. Tras esta escueta noticia, había una fábula de tintes clásicos, apta para una película de Hollywood, con una bella moraleja incluida. Todo comenzó en 1979, cuando Robin Warren, patólogo del Royal Perth Hospital, encontró en una biopsia de úlcera gástrica la presencia de una gran cantidad de bacterias, que “no podían estar allí”, pues el dogma científico establecía que la acidez gástrica impedía el desarrollo bacteriano. Interesado vivamente en el tema, descubrió que esta pequeña bacteria colonizaba el antro del estómago en la mitad de los pacientes a los cuales tomara muestra, existiendo signos de inflamación siempre que estaba presente en la mucosa. Convencido de su hallazgo, que convertía la úlcera péptica en una enfermedad infecciosa, debió luchar contra la incomprensión y los chistes malos de sus colegas. En defensa de sus ideas, se atrevió a tratar como infección la úlcera de su propia esposa, Win, con quien compartía un feliz matrimonio y cuatro hijos. Por esa época Barry Marshall estaba terminando sus estudios de medicina, planificando su futuro como un simple médico general, porque, en sus propias palabras, tenía la impresión que todo ya había sido descubierto en medicina, de manera que nunca pensé que la investigación médica pudiera ser interesante, hasta que hice mi internado y comprendí que había un montón de personas haciendo cosas equivocadas, sin que se pudiera hacer nada al respecto. De manera que este futuro galeno, que nunca había destacado en ese terreno, comenzó a buscar un proyecto de investigación 3 INTRODUCCIÓN que completara su formación médica. En ese momento, su jefe le insinuó que le preguntara a Warren, que estaba siempre viendo bacterias en biopsias estomacales. El joven estudiante y Warren estudiaron una serie de cien biopsias, que resultó muy estimulante. Marshall hizo múltiples intentos para cultivar la bacteria, fracasando una y otra vez, hasta que el azar (error o accidente) vino en su ayuda, como le ocurriera a Fleming con su placa de Petri abandonada junto a una ventana abierta. En un fin de semana largo, de Semana Santa, en que no había personal suficiente en el laboratorio, un cultivo quedó más tiempo en incubación y el bacilillo creció. Los autores lo identificaron como perteneciente al género Campylobacter; muy pronto se le agregó el epíteto latinizado equivocadamente de pyloridis; con el tiempo, con ese afán de acortar las palabras, devendría en pylori en 1988. El bacilo había sido atrapado, pero faltaba probar que tenía un papel patógeno en la úlcera. Warren y Marshall creían que la presencia bacteriana contribuía al desarrollo de la lesión, sumada a los factores clásicos claramente establecidos por la ciencia médica, teoría de la cual se burlaba todo el mundo científico. Entonces, a los 32 años de edad, Barry Marshall decidió hacer su experimentum crucis y, un día de julio de 1984, preparó una infusión de unos cuantos miles de millones de Campylobacter pyloridis… y la bebió de un trago. El audaz investigador comenzó en los días siguientes a sentir los síntomas de un flu-like, esto es, síntomas similares a una gripe, pero con algunos vómitos y dolor abdominal. Al día catorce se le practicó una endoscopia gástrica, que reveló una inflamación de la mucosa similar a la que acompaña a la mayoría de las úlceras. Marshall no tomó antibióticos y su fuerte sistema inmune se encargó de erradicar a la bacteria. 4 INTRODUCCIÓN El triunfo llegó y el 10 de diciembre del 2005 Robin Warren y Barry Marshall recibieron de la Fundación Nobel unos 10 millones de coronas, es decir, un millón trescientos mil dólares. El triunfo para ellos, claro, pero en lo personal, porque el bacilillo no está derrotado y su historia continua dejando misterios por desvelar. Por lo pronto, ha sido aislado casi exclusivamente de biopsias u otros especímenes de esófago o duodeno con metaplasma gástrica. Al poco tiempo de ser cultivado por primera vez, se vio que era diferente de los otros representantes del género Campylobacter. Además de tener múltiples flagelos en vez de uno polar, posee una composición de ácidos grasos que es única y propia; por otra parte, al revés de la superficie rugosa de los Campylobacter, su superficie es más bien lisa. Por último, la estructura de su ácido nucleico demostró que se apartaba del género que lo cobijara, de manera que el año 1989 se creó un nuevo género. Se eligió el término Helicobacter por la forma en que mueve sus flagelos, como hélices. Como el cultivo siempre ha sido engorroso, el mismo Marshall desarrolló en 1988 un test no invasor, que aprovechaba la presencia de una potente ureasa en el arsenal metabólico de la bacteria, con la cual desdobla urea y libera anhídrido carbónico; de esta manera, marcando la urea a ingerir con carbono 14, este marcador podía recuperarse en la respiración del enfermo (Ledermann, 2007). 1.1.2 Epidemiología. A pesar de que, al igual que ocurre con otras enfermedades de tan alta prevalencia, es difícil establecer cifras exactas, se estima que la infección por H. pylori afecta a más de la mitad de la población mundial. De todas formas, muchos trabajos publicados han sido realizados con pacientes sometidos a una gastroscopia, por lo que en estos casos las cifras de prevalencia han sido sobrestimadas (Pueyo, 1998). 5 INTRODUCCIÓN Desde el punto de vista epidemiológico la prueba diagnóstica ideal debe de cumplir una serie de requisitos: poseer una alta sensibilidad y especificidad, no ser invasiva, ser fácilmente realizable y no excesivamente costosa. La prueba más utilizada en estudios epidemiológicos es la detección de anticuerpos séricos, tipo IgG, frente al H. pylori mediante técnicas de enzimoinmunoanálisis (Ghasemi, 2013). Otros autores prefieren el test del aliento tras la toma oral de urea marcada con 13C por presentar una mayor especificidad y no precisar venopunción (Vandenplas, 1992). Ambas técnicas poseen una alta sensibilidad (superior al 95%) (Marshall, 1995), pero a favor de la segunda estaría el hecho de que podría detectar infecciones agudas o muy recientes en las que todavía no se hubiera producido la seroconversión (Thomas, 1994). Al revisar la prevalencia publicada en la bibliografía médica se puede observar una amplísima variación entre las diversas zonas estudiadas, existiendo una clara diferenciación entre los países desarrollados y aquéllos en vías de desarrollo. Así pues, podemos apreciar cifras bajas en países desarrollados como es Francia (25%) (Megraud, 1989), hasta otras superiores al 80% en países como Nigeria o India (Holcombe, 1992, Graham, 1991). Estas diferencias parecen deberse fundamentalmente a la incidencia de la infección durante la infancia (Taylor, 1991), edad en la que se infecta la gran mayoría de niños en las regiones en vías de desarrollo (Ghasemi, 2013). En los países avanzados la prevalencia es baja en las primeras decadas de la vida, para ir aumentando progresivamente a partir de la cuarta- quinta década (Pounder, 1995), circunstancia ésta que Banatvala, entre otros autores, achaca al efecto generacional que se produce en relación al progreso acontecido en los últimos años en dichos países (Banatvala, 1993). La prevalencia publicada en España es un tanto dispar, comunicándose cifras que van desde el 36% en una determinada comarca valenciana (Alfonso, 1995) hasta el 6 INTRODUCCIÓN sorprendente 84% referido por Carballo al área de Guadalajara (Carballo, 1995). Tal vez una cifra que represente más la situación global y más acorde al desarrollo de nuestro país sea la referida por Martín de Argila, que halla una prevalencia del 53% en la zona de Madrid (Martín de Argila, 1996). La incidencia actual de la infección en regiones desarrolladas es muy baja en el adulto, siendo coincidentes los trabajos publicados en cuantificarla por debajo del 1% (Sipponen, 1997). Por otra parte, varios estudios realizados con sueros conservados observan cómo la infección va decreciendo en las últimas décadas para individuos de la misma edad (Banatvala, 1993), hecho que podría estar en relación con un progresivo menor riesgo de infección durante la infancia. Todo ello vendría a apoyar el antes mencionado efecto generacional relacionado con el progreso socio-económico. Probablemente el principal factor epidemiológico de riesgo sea el bajo nivel económico-higiénico-sanitario; de ahí que la infección, como ya se ha comentado, sea mucho más frecuente en regiones no desarrolladas. Estudios realizados en paises industrialmente avanzados también confirman este hecho: Graham en U.S.A (Graham, 1991), Murray en el Reino Unido (Murray, 1997) o Haeckel en Alemania (Haeckel, 1996) encuentran una clara relación entre la infección por H. pylori y clase social baja en general y hacinamiento, bajo nivel educacional o malas condiciones sanitarias en particular. Algunos autores consideran posibles factores raciales o genéticos, de forma independiente al nivel social de la población estudiada, como predisponentes a la adquisición de la infección (Azuma, 1994). El sexo no parece ser una variable de riesgo esencial ya que, aunque hay trabajos que encuentran una mayor prevalencia en hombres (Murray, 1997), son mayoría aquéllos que no encuentran diferencias significativas entre ambos sexos (Samie, 2014) 7 INTRODUCCIÓN El consumo de alcohol o de tabaco parecen suponer un factor de riesgo, no implicando una mayor prevalencia en la mayoría de estudios (Martín de Argila, 1996). No obstante, en cuanto al tabaco existe una cierta controversia, ya que autores como Murray (Murray, 1997) o Bateson (Bateson, 1993) lo identifican como un posible factor de riesgo. Otra variable que tampoco tiene bien definido su papel es la actividad laboral. Un trabajo realizado en Italia, entre trabajadores de un matadero, observó que la prevalencia de la infección era mayor en los operarios de la carne que en los trabajadores de oficinas, no correspondiéndose adecuadamente con el estatus social (Vaira, 1988). Por otra parte, diversos estudios han encontrado una mayor prevalencia en profesionales de la salud, sobre todo en gastroenterólogos y especialmente en endoscopistas (Chong, 1994), en los que el riesgo de infección se correlacionaba directamente con el número de endoscopias realizadas (Matysiak-Budnik, 1997). Estos hallazgos son puestos en entredicho por otros investigadores, que o bien no encuentran diferencias significativas entre dichos grupos y controles (Pristautz, 1994), o bien concluyen que la supuesta exposición ocupacional es un riesgo menor en comparación con la condición socio-económica (Matysiak-Budnik, 1994). El hábitat natural fundamental del H. pylori es la mucosa gástrica humana, sobre todo la antral, aunque ha sido cultivado o detectado mediante técnicas de PCR por diversos autores a nivel de la placa dental, saliva y heces (Mujmadar, 1990, Li, 1995, Kelly, 1994). El significado de la presencia de la bacteria en la cavidad oral todavía no está claro, siendo posible que se trate de una localización primaria o que, por el contrario, provenga de su reservorio principal, el estómago, mediante el reflujo gastro- esofágico fisiológico. 8 INTRODUCCIÓN Una de las cuestiones previsiblemente más importantes por dilucidar es el mecansimo de transmisión, ya que su total conocimiento podría conllevar la adopción de medidas sociales o campañas preventivas concretas que atenúen la enorme penetración de la infección. Actualmente se acepta, aún sin poder descartar otras rutas, que el contagio se realiza mediante un mecanismo de persona a persona, bien a través de la vía fecal-oral, bien a través de la vía oral-oral, ambas posiblemente mediadas por diversos vectores como fómites, saliva, alimentos o aguas contaminadas. (Neale, 1995, Logan, 1996). La transmisión via oral-oral sería la más frecuente, sobre todo en el ámbito intrafamiliar (Veres, 2007), es decir, de hermanos a hermanos y de padres a hijos (Ghasemi-Kebri, 2013); siendo el papel de la madre, como transmisora de la infección el más importante duante el primer año de vida (Urruzuno, 2012). 1.1.3 Caracterización El género Helicobacter se describe integrado por bacilos gram negativos, de aspecto curvado, con una longitud de 2,5 a 5 mm y un grosor de 0,5 a 1 mm. Sus extremos son redondeados, y puede presentar un mechón polar de flagelos envainados en uno o ambos extremos dependiendo de la especie. En el caso de H. pylori presenta de 4 a 6 flagelos en un solo extremo; generalmente aparece con un engrosamiento a manera de vesícula en el extremo de los flagelos, lo que parece deberse a problemas de fijación. Se trata de bacterias microaerofílicas de crecimiento lento, cuya temperatura óptima es de 37ºC. Es oxidasa, catalasa y ureasa positivo (Goodwin, 1989). 9 INTRODUCCIÓN 1.2 FACTORES DE VIRULENCIA DE H. pylori. La infección por H. pylori origina prácticamente siempre gastritis crónica. Sin embargo, las complicaciones principales (úlcera péptica, adenocarcinoma y linfoma gástrico) se desarrollan sólo en una minoría de personas infectadas, predominantemente en hospedadores adultos (Ernst, 2000). Uno de los retos en la investigación de H. pylori es la identificación de los factores de virulencia predictivos de la progresión de la infección. Se han propuesto numerosos factores de virulencia como CagA, VacA y BabA, entre otros (Ozbey, 2013). Aunque se han asociado con un mayor riesgo de enfermedad ulcerosa péptica, adenocarcinoma gástrico o linfoma tipo MALT, ninguno de ellos implica por sí mismo el desarrollo de una enfermedad en concreto (Kusters, 2006). Esta asociación aumenta cuantos más factores de virulencia acumula una bacteria (Salama, 2013). Los factores de virulencia son productos bacterianos o estrategias que contribuyen a la patogenicidad. Algunas propiedades y productos, como la capacidad para adherirse a las células o la de producir una toxina proteica, se pueden considerar un mecanismo de virulencia de las bacterias patógenas. Pero es conveniente usar “factores de virulencia” para características de la bacteria conectadas con su capacidad para producir enfermedad. Así pues, muchos de los considerados como factores de virulencia de H. pylori han sido detectados en cepas aisladas de pacientes con enfermedades gástricas más graves pero no se ha demostrado una acción patogénica. Puede ser una de las causas de la existencia de estudios que muestra resultados contradictorios (García Campos, 2007). Por otro lado, el valor predictivo de los factores de virulencia se cree limitado debido a que, presumiblemente, la patogenicidad depende de interacciones multifactoriales entre los propios factores de virulencia bacterianos y factores 10 INTRODUCCIÓN inmunológicos del hospedaderos, factores fisiológicos e influencias ambientales que modulan la respuesta inmune del hospedador (Höcker, 2003; Salama, 2013). H. pylori origina una fuerte respuesta inmune, humoral y celular, en la mucosa gástrica que no consigue eliminar la infección y es responsable de muchos de los daños producidos en la mucosa gástrica. Tras la colonización de la mucosa gástrica, H. pylori libera sustancias tóxicas que estimulan la respuesta inmunológica local en la que fundamentalmente participan los neutrófilos. Después se produce una amplificación de la respuesta inflamatoria por la interacción de linfocitos, neutrófilos, macrófagos, células mastoides células no inmunes que liberan gran cantidad de mediadores químicos. La úlcera péptica, el adenocarcinoma y el linfoma gástrico son complicaciones de esta inflamación crónica. 1.2.1 Ureasa. Al contrario de lo que se puede pensar, H. pylori es extremadamente sensible al ácido. Su hábitat natural se encuentra debajo de la capa mucosa, donde el pH se aproxima a la neutralidad. El mecanismo que utiliza para protegerse del pH ácido de la capa mucosa durante la colonización, o de las bajadas de pH que pueden ocurrir por daños mecánicos de la mucosa (Bauerfeind, 1997), se basa en acumular una gran cantidad de ureasa en el citoplasma, en el espacio periplásmico y en la superficie de la bacteria. La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea presente en el estómago y libera amonio y dióxido de carbono (Posselt, 2013). El amonio producido aumenta el pH, con lo que H. pylori mantiene el pH adecuado, interno y periplásmico, incluso aunque el pH externo sea extremadamente bajo. Es esencial para la colonización, como se ha demostrado en experimentos utilizando cepas de H. pylori con ureasa no funcional (Eaton, 1991). 11 INTRODUCCIÓN La producción de ureasa se regula de acuerdo con la condición del entorno, puesto que un aumento excesivo de la alcalinidad debida al NH4 + producido mataría la bacteria. La regulación se produce mediante un transportador dependiente de pH. El transportadore (UreI) permite la entrada de urea pero, una vez que pH alcanza el valor de 6-7, se inactiva (Weeks, 2000). El NH4 + liberado va a producir una serie de daños que afectan a la microcirculación y a las células epiteliales superficiales. Origina una necrotización del tejido profundo (Murakami, 1990); colabora en el desarrollo de gastritis atrófica crónica humana y facilita el incremento de infecciones virales y la carcinogénesis (Megraud, 1992). También origina la formación de cloramina (Suzuki, 1998), elevadamente tóxica, que debido a su lipofilicidad y bajo peso molecular, atraviesa la membrana plasmática celular. Así mismo, la formación de monocloraminas con el ácido hipocloroso que liberan los PMN, que contribuye a la lisis celular y a la úlcera, puede servir de protección frente al sistema inmune (García Campos, 2007). La concentración de NH4 + en el estómago de pacientes infectados es significativamente mayor que la encontrada en sujetos no infectados (Thomsen, 1989), disminuyendo tras la erradicación de H. pylori. El dióxido de carbono resultante de la hidrólisis de la urea por la ureasa se transforma en bicarbonato y tiene un papel protector puesto que suprime el efecto bactericidad del peroxinitrito (Kuwahara, 2000). La ureasa se ha utilizado en la búsqueda de vacunas debido a que está formada por dos subunidades, UreaA y UreB, que son inmunodominantes proteicos (Nomura, 2005, Urruzuno, 2012). 12 INTRODUCCIÓN 1.2.2 Sistemas antioxidantes. H. pylori es una bacteria microaerofílica muy vulnerable a la toxicidad del O2. Durante el proceso de colonización H. pylori promueve una fuerte respuesta inflamatoria mediada por neutrófilos y macrófagos, que generan una gran cantidad de metabolitos reactivos del oxígeno (MRO) (García Campos, 2007). Se ha comprobado que también son producidos por las células epiteliales gástricas en respuesta a la infección (Nardone, 2004), aumentando su concentración en la mucosa gástrica. H. pylori cuenta con mecanismos para detoxificación de los MRO, así como de reparación de los daños sufridos, que favorecen su supervivencia en el tejido inflamado. Estos mecanismos son adaptables y están interconectados entre sí (Wang, 2006). Entre los sistemas enzimáticos de detoxificación de los MRO están la enzima superóxido dismutasa que cataliza la tansformación del superóxido en peróxido de hidrógeno; la catalasa o peroxidasa, que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno; las peroxirredoxinas, que catalizan la reducción de peróxido de hidrógeno, peroxinitrito y otros hidroperóxidos orgánicos a sus correspondientes alcoholes (Wood, 2003) y la flavoproteína MdaB, una NADPH quinona reductasa, que H. pylori expresa cuando debe compensar la pérdida de los principales componentes antioxidantes. Además, el sistema tiorredoxina cataliza los procesos de oxidación- reducción, tiol-dependientes, de un gran número de enzimas detoxificadoras de MRO llevados a cabo por NADPH. La actividad enzimática de la catalasa, superóxido dismutasa y las peroxiredoxinas está incrementada en las cepas cagA positivas (Salama, 2013). A veces los sistemas de detoxificación no son suficientes y puede existir daño oxidativo. Para ello, H. pylori cuenta con mecanismos para reparar el ADN dañado, como las proteínas RecA, UvrABC, endonucleasa III (Nth), MutS y RuvC. Los daños 13 INTRODUCCIÓN oxidativos producidos en las proteínas son reparados por la metonin sulfóxido reductasa (García Campos, 2007). 1.2.3 Adhesinas. H. pylori se une a las células receptoras del huésped, las células epiteliales gástricas, de una forma específica mediante un elevado número de adhesinas utilizando múltiples receptores (Beswick, 2006). Entre ellos hay glicerofosfolípidos, sulfátidos, componentes de la matriz extracelular ( como el colágeno) y secuencias repetidas de N- acetil-lactosamina o de glicoconjugados (Miller-Podraza, 2005). Una sola clase de anticuerpo no inhibe por completo la adhesión de la bacteria a las células, por lo que se considera que la adherencia de H. pylori se realiza a través de múltiples adhesinas y receptores al mismo tiempo. Dado el nicho tan específico que tiene, el hecho de poseer tantas adhesinas debe indicar que son muy importantes para H. pylori (Posselt, 2013). De algunas de ellas se tienen datos que muestran su papel potencial como factores de virulencia. Además se ha observado una contribución elevada del epitelio gástrico a la respuesta de citoquinas, lo que sugiere, que tiene un papel importante en la inmunopatogénesis y resultado de la infección. 1.2.4 Citotoxina vacuolizante VacA. La proteína VacA es una toxina codificada por el gen vacA, que induce vacuolización en las células epiteliales, la muerte celular y la destrucción de la integridad epitelial (Salama, 2013). Posee una estructura hexamérica y se ensambla en la bicapa lipídica celular del hospedador formando un canal selectivo de aniones (Cover, 1997). Produce un gradiente de pH que atrae sustancias alcalinas al interior haciendo que se capte agua por ósmosis, lo que origina la vacuolización alrededor del 14 INTRODUCCIÓN núcleo y más tarde el estallido y muerte celular (Posselt, 2013). En el citosol interfiere con el tráfico vesicular de los lisosomas (Cover, 2005). Es producida por aproximadamente el 50% de las cepas de H. pylori. La infección por cepas que producen la toxina es más frecuente en pacientes con úlcera péptica y cáncer gástrico que en pacientes que solo padecen gastrtis (Boquet, 2003). Otros estudios no encuentran esta relación (Suerbaum, 1999). Una explicación posible es que el gen vacA, que está presente en todas las cepas de H. pylori, tiene una estructura mosaico con varias formas posibles de presentación. Cuatro en la secuencia señal, que son s1a, s1b, s1c y s2, y tres en la región media, m1, m2a y m2b. De la combinación de éstos podrían generarse distintos genotipos que podrían tener comportamientos más o menos agresivos (Van Door, 1998). Así, las cepas s1/m1 son más citotóxicas que las s1/m2. En el caso de las cepas cagA+ occidentales suelen tener un patrón genotípico s2 y s1a/m1a vacA (que está más asociado a úlcera péptica) y las cepas cagA+ del este asiático suelen tener el patrón genotípico s1c/m1b vacA. (Ozbey, 2013). La presencia de VacA puede llevar a la muerte celular programada, de forma independiente a la vacuolización, pues induce la liberación de citocromo C de las mitocondrias a través de la activación de proteínas proapoptóticas Bax y Bak (Yamasaki, 2006). También puede participar en el proceso de la apoptosis a través de la activación del receptor Fas/CD95 (Rudi, 1998), a través de diversas caspasas y de la ruptura de la membrana mitocondrial que, al afectar a la concentración de APT celular, altera el ciclo celular. VacA puede inducir la expresión de factor de crecimiento vacular endotelial (VEGF) y provocar el desarrollo de procesos tumorigénicos (Caputo, 2003). 15 INTRODUCCIÓN VacA amplifica la respuesta inflamatoria de la mucosa gástrica aumentando la expresión de ciclooxigenasa 2 (COX-2), en las células T, neutrófilos y macrófagos (Montecucco, 2003), que a su vez pueden activar la producción de VEGF. Aunque no están perfectamente definidos los mecanismos por los que la respuesta inmune inducida por H. pylori contribuye a la carcinogénenesis gástrica, la sobreexpresión de COX-2 y VEGF, la activación de NF-kß y el aumento de citoquinas proinflamatorias originan alteraciones morfológicas que llevan al desarrollo de gastritis atrófica y metaplasia gastrointestinal. 1.2.5 CagA La presencia del gen cagA se asocia más con síntomas graves, como son la gastritis severa, la atrofia de la mucosa, alto riesgo de úlcera y cáncer gástrico. De hecho, las cepas procedentes de pacientes con úlcera, en un porcentaje superior al 90% son cagA positivas. Pero, al igual que ocurre con el resto de factores de virulencia, en muchas ocasiones no hay asociación entre el genotipo de cagA y el estado clínico. Forma parte de la isla de patogenicidad Cag (cagPAI). Las islas de patogenicidad son segmentos de ADN que contienen más de un gen de virulencia con la peculiaridad de que una simple deleción lleva a la pérdida de al menos dos genes de virulencia con segmentos de ADN de más de 30 kb (Hacker, 1990). Tienen un papel fundamental en la contribución a la virulencia de las bacterias patógenas que los contienen y en el desarrollo de la enfermedad (Schmidt, 2004). cagPAI tiene un tamaño de 37 a 40 kb y está flanqueada por direct repeats de 31 pb. Su contenido G+C es del 35% en contraste con el 39% del cuerpo del genoma. Como muchos genes de virulencia los genes de la cagPAI no se expresan constitutivamente, sino que responden a señales ambientales. Están reguladas por complejos mecanismos 16 INTRODUCCIÓN que pueden activarse o no dependiendo de condiciones microambientales como el nivel de oxígeno, la osmolaridad, la fase de crecimiento bacteriano, el pH, presencia o no de ácidos grasos volátiles de cadena corta, etc (Durant, 2000). 1.2.6 Lipopolisacárido. El lipopolisacárido (LPS) de H. pylori, como el de otras especies bacterianas, presenta una estructura con tres dominios principales: la capa polisacárida externa o cadena específica O, el núcleo oligosacárido y el lípido A. La estructura química del LPS de H. pylori, en concreto la cadena específica O, puede mimetizar los antígenos de grupo sanguíneo de Lewis (Lex, Ley) (Aspinall, 1996). Cuando sucede, se dice que son cepas que expresan antígenos de Lewis. La expresión de estos antígenos se ha asociado a patologías más graves (Zheng, 2006). Algunos estudios muestran que cepas H. pylori cagA+ los expresan más frecuentemente (Wirth, 1996). Se han propuesto varios significados biológicos a su mimetización molecular. Entre ellos la respuesta autoinmune del hospedador, la evasión de la respuesta inmunológica y la adherencia a la mucosa gástrica. La respuesta autoinmune inducida por H. pylori genera autoanticuerpos que contribuyen al desarrollo de gastritis atrófica. Se ha observado que la bomba protón/ potasio tiene epítopos Lewisy y podría ser un objetivo del sistema inmune en casos de gastritis crónica (Appelmelk, 1996). La capacidad que tiene H. pylori para evadir la respuesta inmunológica origina que la infección se cronifique. El LPS de H. pylori es inmunológicamente inerte comparado con el de otras bacterias gramnegativas (Salama, 2013). El antígeno lipopolisacárido O participa en la adherencia de H. pylori a las células epiteliales gástricas. Es reconocido específicamente por una lectina que une ß- 17 INTRODUCCIÓN galactósidos (Fowler, 2006). Los antígenos Lex de H. pylori participan en la colonización de H. pylori (Appelmelk, 2000) por su función como adhesinas. Se ha visto que la adherencia de las cepas, que expresan Lex, a células epiteliales gástricas puede inhibirse mediante un anticuerpo monoclonal anti-Lex. Además, en pacientes con gastritis crónica se ha encontrado una relación entre la expresión Lex y Ley y la densidad de colonización de H. pylori. Aunque es un patógeno extracelular, puede encontrarse en el interior de las células epiteliales gástricas y se cree que el antígeno Lex puede jugar algún papel en esta internalización (Lozniewski, 2003). La expresión Lex se ha asociado a patologías más agresivas. Por tanto, la estructura del polisacárido O parece ser un determinante de la severidad de la gastritis (Eaton, 2004). 1.3 MANIFESTACIONES CLÍNICAS. Cuando H. pylori coloniza la mucosa gástrica humana produce una gastritis superficial que puede permanecer así durante el resto de la vida o bien, al cabo de años o décadas desarrollar una úlcera péptica (duodenal o gástrica) o una gastritis atrófica que podría ser el primer paso para la evolución a cáncer gástrico (Kodaman, 2014). También puede desarrollarse un tipo de linfoma, poco frecuente, que es el linfoma gástrico tipo MALT (mucosa associaated lymphoid tissue) (Salama, 2013). Todavía no se conoce claramente por qué en unos pacientes la enfermedad es casi asintomática mientras que en otros se producen enfermedades digestivas de diferente gravedad. Existen factores genéticos predisponentes en el paciente, como el grupo sanguíneo, el tipo de antígeno Lewis o el tipo de HLA. También existen factores ambientales como las condiciones socioeconómicas, el consumo de tabaco o la dieta (la ingestión de sal actúa como factor agresivo de la mucosa mientras que el consumo de 18 INTRODUCCIÓN alimentos anti-oxidantes actúa como factor protector), que pueden influir en el desarrollo de un tipo u otro de enfermedad. Por otro lado, los factores de patogenicidad de la propia bacteria pueden tener su efecto en el desarrollo de la enfermedad (Alarcón, 2004) 1.3.1 Manifestaciones digestivas. * Gastritis: La colonización permanente de la mucosa gastroduodenal por H. pylori causa una inflamación con un infiltrado mixto en el que predominan los polimorfonucleares, pero también con linfocitos y células plasmáticas, dando lugar a lo que se denomina una gastritis crónica activa. Una de las características de este infiltrado en la edad pediátrica es la mayor presencia de linfocitos y células plasmáticas y una afectación más leve que la que tiene lugar en el adulto, por lo que se le denomina gastritis crónica superficial activa. La bacteria puede ser identificada en biopsias gástricas mediante tinción de Giemsa y en presencia de mucha cantidad de bacterias, incluso con hematoxilina-eosina. Después de la erradicación de la bacteria, la gastritis histológica mejora lentamente pero no desaparece totalmente hasta 6 meses o un año después de haber finalizado el tratamiento (Urruzuno, 2007). Tanto la afectación glandular (gastritis atrófica) como el desarrollo de metaplasia intestinal, se ha descrito en adultos, y menos frecuente en niños. Estas lesiones son factores de riesgo para el posterior desarrollo del cáncer gástrico y que pueden estar presentes durante muchos años antes de la aparición de displasia y malignidad. * Úlcera péptica: Existe una estrecha relación entre la enfermedad ulcerosa duodenal y la infección por H. pylori con una prevalencia que oscila entre el 95% y el 97% (Kuipers, 1995), en la úlcera gástrica su relación es menor, siendo su prevalencia 19 INTRODUCCIÓN de alrededor del 83% (Boixeda, 1996) y achacándose el porcentaje restante a otros factores, tanto externos como genéticos. Ahora bien, de todos los infectados por H. pylori tan sólo desarrollan enfermedad ulcerosa una escasa proporción (10% al 12%) (Martín de Argila, 1996), por lo que es necesaria la presencia de una serie de factores que determinen dicho desarrollo y expliquen por qué en unos casos se produce una úlcera péptica y en otros no llega a presentarse aunque persista la infección por mucho tiempo. En la úlcera duodenal el microorganismo está presente con más frecuencia en el antro que en el duodeno. Los mecanismos que se han sugerido para explicar que un microorganismo antral produzca una lesión duodenal son las alteraciones causadas por productos del microorganismo infectante, la respuesta inflamatoria del huésped, la colonización bacteriana de una metaplasia gástrica en el duodeno, y las alteraciones secundarias de la secreción ácida gástrica o del bicarbonato pancreático. Entre los primeros está la propiedad bacteriana de alguna de las cepas de H. pylori, como la producción de citotoxinas que inducen vacuolización celular y que dependen de su acción citotóxica del gen cagA. Respecto a la úlcera gástrica hay autores que sugieren una asociación significativa entre el polimorfismo genético localizado en el gen C del pepsinógeno y la úlcera gástrica como factor de predisposición a padecerla. Aprecian diferencias etiológicas entre la úlcera gástrica del cuerpo y la úlcera de incisura y/o antral, no estando asociada con la infección por H. pylori (Ohtaki, 1997). Este dato, junto con la administración de AINE y otros factores externos, puede explicar la menor prevalencia de H. pylori en la enfermedad ulcerosa gástrica. 20 INTRODUCCIÓN * Cáncer gástrico: En julio de 1994, la International Agency for Research on Cancer y la Organización Mundial para la Salud reconocieron la existencia de evidencia suficiente en humanos, e insuficiente en animales para clasificar a H. pylori como un carcinógeno categoría 1 (Serrano, 2009). Durante el proceso carcinogénico se han detectado cambios histológicos que se inician con la inflamación, formación de gastritis no atrófica y luego atrófica, metaplasia intestinal, displasia y, finalmente, la presencia del adenocarcinoma gástrico; a esta serie de cambios histológicos se le conoce como secuencia de Correa (Correa, 2006). La secuencia de Correa se observa, frecuentemente, en cáncer gástrico tipo intestinal mientras que en aquellos de tipo difuso no siempre se detecta. H. pylori se relaciona, principalmente, con el desarrollo de cáncer gástrico de tipo intestinal, localizado con mayor frecuencia en el cuerpo y/o antro gástrico (Ando, 2006). * Linfoma gástrico tipo MALT: Los linfomas MALT son un tipo de cáncer de células B clonales originados en el tejido linfoide asociado a las mucosas (mucosa associated lymphoid tissue). Se distinguen dos tipos, los de bajo y los de alto grado, diferenciándose los primeros de los segundos por contar con menos de un 20% de formas blásticas (Hall, 1988). Se han identificado en todo el tracto gastrointestinal y otras localizaciones, como las glándulas salivales, el tiroides, el pulmón, la mama, la conjuntiva, el hígado, la piel, el timo y el tracto genitourinario (Pelstring, 1991). Paradójicamente, se localizan con una elevada frecuencia en el estómago, donde en condiciones fisiológicas no existe tejido linfoide. Numerosas evidencias epidemiológicas, experimentales y clínicas apoyan una fuerte asociación entre los linfomas primarios MALT del estómago y la infección por H. pylori. Datos derivados de estudios epidemiológicos, biológicos y moleculares indican que los linfomas tipo 21 INTRODUCCIÓN MALT serían el último estadio de la gastritis crónica inducida por H. pylori (Eidt, 1994). La evidencia definitiva que apoya esta relación entre infección por H. pylori y linfoma gástrico MALT es que la erradicación de H. pylori se sigue de la remisión mantenida del linfoma en un porcentaje variable de casos (Mégraud, 2007). A día de hoy, según los resultados obtenidos por Kodaman y colaboradores (2014), se podría decir que la manifestación clínica es el resultado de la interacción genotipo patógeno-genotipo hospedador. Así aunque siempre se ha dicho que el genotipo de la cepa estaba involucrado en la gravedad de la sintomatología (Parra-Cid, 2013, Posselt, 2013), el cuadro patológico y la severidad de la clínica de cada paciente dependería de si la cepa de H. pylori que porta en su estómago pertenece a la ascendencia evolutiva correspondiente (Kodaman, 2014). Este reciente descubrimiento podría corroborar las controvertidas afirmaciones respecto a los beneficios que la infección por H. pylori puede aportar a determinados hospedadores. Afirmaciones como que su infección puede llegar a prevenir el reflujo gastroesofágico y sus secuelas, el síndrome de Barrett, adenocarcinoma de esófago (Blaser, 2004) y disminuir síntomas alérgicos como: asma, rinitis y dermatitis atópica (Salama 2013). 1.3.2 Manifestaciones extradigestivas. * Enfermedades dermatológicas: Urticaria crónica idiopática. Diversos estudios han relacionado la infección por H. pylori y la etiopatogenia de la urticaria crónica idiopática (Kolibasova, 1994). Un estudio publicado demuestra que 21 pacientes diagnosticados de urticaria crónica asociada a gastritis crónica por H. pylori quedaron libres de infección, desapareciendo las lesiones de urticaria tras ser sometidos a tratamiento erradicador (Kolibasova, 1994). 22 INTRODUCCIÓN Psoriasis. Hay estudios que sugieren que H. pylori puede ser uno de los microorganismos causantes de psoriasis (Rosenberg, 1994), encontrando algunos autores una incidencia del 47% de infección en este grupo de pacientes. * Anemia ferropénica refractaria: Diversos trabajos han demostrado una asociación entre la infección por H. pylori y la anemia ferropénica refractaria al tratamiento en niños pequeños como en adolescentes, y sobre todo en este último grupo de edad especialmente vulnerable por poseer unos depósitos de hierro relativamente bajos (Urruzunu, 2012). No está claro si se trata de un incremento en las pérdidas de hierro o de una disminución de la absorción, pero lo que si es cierto es que la erradicación de la bacteria permite la normalización de las cifras de la sideremia y de los valores de la ferritina en determinados pacientes con anemia ferropénica refractaria portadores de una gastritis por H. pylori (Choe, 2001). * Púrpura trombocitopénica idiopática (PTI): Se ha observado que algunos pacientes portadores de una púrpura trombocitopénica idiopática crónica han respondido a la erradicación del H. pylori con un incremento en el número de plaquetas (Francini, 2003; Urruzunu, 2012). La explicación biológica de esta posible asociación es la similitud de los anticuerpos antiplaquetarios del suero con la citotoxina asociada al gen cagA del H. pylori (Jaing, 2003). * Otras manifestaciones extradigestivas: También se ha asociado la infección por H. pylori con la alergia alimentaria, al encontrarse títulos elevados de anticuerpos específicos tipo IgG frente a H. pylori en algunos casos de pacientes con alergia a alimentos en mayor proporción que en otras situaciones como el asma o la enfermedad 23 INTRODUCCIÓN inflamatoria intestinal. La atopia estaría relacionada con un incremento de la permeabilidad gástrica como consecuencia de la gastritis, y la asociación de ambas entidades se demostraría si estas alteraciones desaparecieran con la erradicación del H. pylori (Urruzuno, 2007). 1.4 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS PARA LA DETECCIÓN DE LA INFECCIÓN POR H. pylori. La infección por H. pylori puede diagnosticarse mediante métodos invasivos (que requieren realización de endoscopia con toma de biopsia gástrica) o no invasivos (métodos para los que no se requiere realización de endoscopia) (Glupczynski, 1999). Todos ellos presentan ventajas e inconvenientes y ninguno de los que existen hasta este momento puede considerarse gold standard utilizado únicamente. Un método de diagnóstico ideal es no invasivo o mínimamente invasivo, no caro, seguro, disponible en todos los centros y que sea capaz de diferenciar infección activa de infección pasada. El método debe ser capaz de diferenciar entre la infección por H. pylori y la enfermedad asociada a la bacteria. Ninguno de los métodos que existe actualmente cumple todos estos requisitos (Dzieranowska-Fangrat, 2006). 1.4.1 Métodos invasivos. El diagnóstico definitivo de H. pylori y de las consecuencias de la infección sólo puede conseguirse mediante la endoscopia gástrica con toma de biopsias. * Histología y visión microscópica: El estudio histológico de la biopsia permite conocer las lesiones de la mucosa además de detectar la infección por H. pylori. La 24 INTRODUCCIÓN confirmación histológica de la inflamación de la mucosa es fundamental para el diagnóstico de la gastritis y su clasificación. Además permite detectar zonas de metaplasia intestinal (Correa, 1999). La técnica de tinción es fácil, rápida, de bajo coste y de alta utilidad en el estudio de la infección por el microorganismo. Se han utilizado diferentes tinciones como la de Gram, Giemsa, Carbolfuchina, Genta o tinciones inmunohistoquímicas. La visión microscópica tiene una sensibilidad y especificidad menor que la del cultivo (López- Brea, 2007). Se ha utilizado hibridación in situ que permite detectar H. pylori y la resistencia a claritromicina directamente en las biopsias gástricas (Morris, 2005). La mejor muestra para estudio histológico es la biopsia del antro gástrico. Se recomienda también una muestra de cuerpo gástrico o de la zona de transición si el paciente ha tomado recientemente medicación supresora de ácido (Gold, 2000, Saadah, 2010). * Prueba de la ureasa: H. pylori posee una ureasa de estructura hexamérica, que le capacita para la colonización y para la persistencia en la cavidad gástrica. La prueba de la ureasa permite detectar la presencia de la descomposición de la urea en anhídrido carbónico y amoniaco, que se demuestra como un cambio de color en el medio que contiene un indicador de pH. NH2-CO-NH2 + 2H+ + 2H20 CO2 + 2NH4 + H2O La prueba de la ureasa rápida se puede realizar directamente con la muestra de biopsia gástrica y existen diferentes reactivos comerciales que contienen urea a diferentes concentraciones y un indicador de pH (Laine, 1996). 25 INTRODUCCIÓN Los resultados de sensibilidad y especificidad son en general superiores al 80% y 90%. Sin embargo, en niños, esta técnica tiene un bajo valor predictivo positivo (hasta el 50%) aunque sí tiene un alto valor predictivo negativo (97-98%) (Gold, 2000). * Cultivo de H. pylori: El aislamiento mediante cultivo de H. pylori es sin duda el método más específico en el diagnóstico del microorganismo y presenta ventajas, como permitir el estudio de la sensibilidad a los diferentes antimicrobianos, la caracterización de factores de virulencia y la posibilidad de tipado de cepas con fines epidemiológicos (Pellicano, 2005; Martínez Gómez, 2010). No obstante, su sensibilidad varía en relación con la recogida, transporte y almacenamiento de la muestra, los medios de cultivo utilizados y las condiciones de incubación. H. pylori es un microorganismo lábil y el procesamiento de la muestra debe realizarse de una forma rápida una vez que ha sido obtenida (Hua, 1998). La identificación se realiza mediante visión en fresco con un microscopio de contraste de fases para ver la morfología o bien mediante una tinción de Gram. Las pruebas positivas de catalasa, ureasa y oxidasa confirma la identificación como H. pylori (López-Brea, 2007). La muestra más habitual para el cultivo de H. pylori es la biopsia a partir de mucosa gástrica pero también se han utilizado otras como jugo gástrico, la prueba del hilo (“string test”) o vómitos. * Métodos moleculares: En los últimos años se han desarrollado numerosas técnicas que permiten detectar la presencia del ADN de H. pylori directamente en la biopsia gástrica pero también en otro tipo de muestras como heces, saliva o agua (Simala-Grant, 2004). 26 INTRODUCCIÓN La mayoría de las técnicas se basan en la PCR tanto clásica como en tiempo real y presentan diferentes objetivos de diagnóstico, siendo los fundamentales los siguientes: - Detección de genes específicos de la bacteria. - Detección de factores de virulencia. - Detección de mecanismos de resistencia. - Como métodos de tipado para comparar aislamientos de H. pylori cultivados del mismo paciente o de familiares (López-Brea, 2007). 1.4.2 Métodos no invasivos. El método de diagnóstico ideal para diagnosticar la infección sería uno no invasivo, o mínimamente invasivo, capaz de diferenciar infección activa de infección pasada. * Serología: H. pylori provoca una respuesta inmunitaria, tanto local como sistémica, que comienza con un aumento transitorio de IgM, y posteriormente un aumento de IgG e IgA que persisten durante la infección. Los niños pequeños presentan menor respuesta de anticuerpos, por lo que la sensibilidad de las técnicas serológicas es baja en niños menores de 12 años (Sanz, 1999). Existen numerosos métodos serológicos para detectar anticuerpos anti- Helicobacter, principalmente IgG. Los resultados pueden variar de acuerdo con la clase de antígeno y la técnica serológica que se utilice, pero además dependen del método diagnóstico considerado como referencia, así como de la población estudiada (Marchildon, 2003). 27 INTRODUCCIÓN La detección de IgG mediante EIA cuantitativo es útil en el seguimiento de la respuesta al tratamiento, aunque se deben analizar simultáneamente los dos sueros del paciente (pre y postratamiento) y se observará un descenso significativo en el título de anticuerpos después de 3-6 meses de tratamiento, si se ha producido la erradicación (López-Brea, 2007). Los métodos serológicos cualitativos muestran peores resultados. Existen kits rápidos que se aplican en sangre completa que presentan especificidad del 95% pero la sensibilidad varía del 43,3% al 80,2% (Marchildon 2003). En general, los EIA en suero o pruebas en sangre completa para su uso en la consulta del médico en niños sintomáticos en países desarrollados presentan una baja sensibilidad por lo que no son seguros para el diagnóstico de la infección por H. pylori (Gold, 2000). * Prueba del aliento: Es un método indirecto para detectar la ureasa de H. pylori. Si H. pylori se encuentra en el estómago, va a hidrolizar la urea ingerida previamente (marcada con 13C o 14C) y se va a liberar CO2 marcado que se absorbe, difunde a sangre, es transportado a los pulmones y es liberado con el aliento. Se considera uno de los métodos no invasivos más seguros para detectar H. pylori (Mégraud, 2007). La descripción del método se realizó utilizando un isótopo radiactivo (14C) pero actualmente se utiliza un isótopo no radiactivo (13C). Algunas condiciones en la realización de la técnica no están completamente estandarizadas como el tipo de comida, la dosis de urea, el tiempo en el que se recogen las muestras o incluso el punto de corte (Pathak, 2004). La prueba del aliento indica una infección actual por la bacteria, ya que en una infección pasada el resultado sería negativo. Por esto es útil como seguimiento del tratamiento realizado 4 a 6 semanas después de finalizado. El método tiene una 28 INTRODUCCIÓN excelente sensibilidad y especificidad para el diagnóstico (Gold, 2000). Además, es una prueba global que valora la presencia de H. pylori en todo el estómago, no es dependiente de las condiciones de transporte de la muestra, ni de la experiencia del personal técnico. También se puede utilizar un analizador con espectrometría de infrarrojos que permite la realización de la técnica en la consulta del clínico en pocos minutos y los resultados se correlacionan con los obtenidos mediante espectrometría de masas (Kato, 2004). * Antígeno en heces: Es un método directo que permite la detección de antígeno de H. pylori en muestras de heces (Andrews, 2001). El primer kit comercializado (Premier Platinum HpSA) es un ELISA con anticuerpos policlonales. Posteriormente se desarrolló un ELISA basado en anticuerpos monoclonales (Amplified IDEIA HpStAR o Femtolab). Actualmente también existen ensayos rápidos de inmunocromatografía basados en anticuerpos monoclonales (Immuno-Card STAT HpSA), que tienen la ventaja de ser rápidos (en 10 minutos) y fáciles de usar (López- Brea, 2007). En poblaciones con baja prevalencia de H. pylori puede ser recomendable comprobar los resultados positivos con prueba del aliento o serología (Ito, 2005). Por otra parte, se han descrito resultados positivos de forma transitoria que podrían considerarse como falsos positivos (Haggerty, 2005), los autores consideran que un dato positivo aislado, obtenido mediante una prueba no invasiva en poblaciones con baja prevalencia de infección por H. pylori es probablemente un falso positivo y debe realizarse una prueba confirmatoria utilizando un método que detecte un parámetro diferente (Nugalieva, 2006). 29 INTRODUCCIÓN 1.5 TRATAMIENTO. 1.5.1 A quién tratar. En general se recomienda que, una vez diagnostica la infección por H. pylori, el tratamiento debe ser ofrecido a todos aquellos pacientes que presenten síntomas gastroduodenales, aun en ausencia de enfermedad ulcerosa (Martínez 2010). Los pacientes con infección por H. pylori y enfermedad ulcerosa, así como con linfoma tipo MALT tienen indicación absoluta de tratamiento. Dado que no existe evidencia de la asociación entre infección por H. pylori y dolor abdominal recurrente, la presencia de éste no constituye indicación de tratamiento (Bourke, 2005). Es aconsejable la realización previa de endoscopia con toma de biopsia para histología y cultivo microbiológico y con estudio de resistencias antibióticas. La endoscopia no sólo es útil para el diagnóstico de la patología gastroduodenal presente y, por tanto, para establecer la indicación de tratamiento, sino también para realizar cultivo con estudio de resistencias, lo que facilitará la instauración de un tratamiento correcto desde la primera pauta (Martínez, 2007). El hallazgo de gastritis por H. pylori en ausencia de úlcera péptica y de sintomatología específica, durante la realización de una endoscopia por otro motivo, supone un dilema para el gastroenterólogo. Tanto en adultos como en niños, no existe evidencia del beneficio para el paciente de realizar tratamiento antibacteriano en esta situación. Se ha especulado con la relación entre el reflujo gastroesofágico y la infección por H. pylori y sobre la conveniencia de tratar previamente el reflujo antes que la infección. En este momento se aconseja erradicar H. pylori previamente a la instauración de tratamiento prolongado con inhibidores de la bomba de protones (IBP) (Moayyedi, 2006). 30 INTRODUCCIÓN La presencia de anemia ferropénica es indicación de tratamiento erradicador, ya que se ha demostrado que la desaparición de la bacteria supone la mejoría en todos los parámetros sanguíneos (Hacihanefloglu, 2004). 1.5.2 Cómo tratar. El tratamiento ideal es aquel que consigue tasas de erradicación elevadas, superiores al 90%, de corta duración para asegurar el cumplimiento y con mínimos efectos secundarios. En niños, igual que en adultos, se recomienda como primera línea de tratamiento la triple terapia (Collins, 2006; Bihn, 2014). La triple terapia consiste en la administración asociada de dos antibióticos y un antisecretor, ya sea un inhibidor de la bomba de protones, un antagonista de los receptores de H2 y/o un compuesto derivado de bismuto, según las recomendaciones del Consenso de Maastricht (Wu, 2014). Son pocos los antibióticos capaces de ejercer su función en el lumen del estómago (De Francesco, 2011), de ahí que los antibióticos más ampliamente usados se reduzcan a seis: metronidazol, claritromicina, amoxicilina, tetraciclina (Samie, 2014), rifabutina y levofloxacino (Martínez Gómez, 2010). Los inhibidores de bomba de protones (IBP) se encargan de disminuir la secreción de protones al lumen gástrico en las células parietales y los más utilizados en la actualidad son: omeprazol, lansoprazol, rabeprazol, pantoprazol y esomeprazol, siendo el primero, el más utilizado. Los IBPs no sólo disminuyen la hiperacidez del estómago, sino que también aumenta la absorción, el transporte y la concentración de antibióticos en el moco gástrico, y disminuye la concentración mínima inhibitoria (CMI). Los antagonistas de los receptores, son compuestos que, en presencia de 31 INTRODUCCIÓN histidina, desencadenan la secreción de protones por las células parietales al lumen gástrico. Dentro de los antagonistas de los receptores H2 más utilizados se encuentran: la cimetidina, famotidina, nizatidina y la ranitidina, esta última, es la más utilizada (Samie, 2014). Estos antisecretores pueden administrarse en compañía de subcitrato de bismuto, el derivado de bismuto más utilizado (Gisbert, 2013), que se encarga de formar una película protectora sobre la mucosa gátrica que la protege de la acción corrosiva del ácido gástrico. A los pacientes adultos que son diagnosticados a través de pruebas no invasivas, no se les suele realizar cultivos a partir de una biopsia previamente a la administración de un primer tratamiento por lo que los gastroenterólogos han elaborado distintas líneas de tratamiento ordenadas prioritariamente, por si la anterior falla (Tabla 1.1) (Gisbert, 2013; Kanizaj, 2014; Wu, 2014). Tabla 1.1 Pautas para el tratamiento de la infección por H. pylori en adultos. A: amoxicilina. B: compuesto derivado de bismuto. C: claritromicina. M: metronidazol. O: omeprazol. T: tetraciclinas. Tn: tinidazol. L: Levofloxacino. R: rifampicina/rifabutina (según lo revisado en Gisbert, 2013; Kanizaj, 2014; Wu, 2014). Opción Terapia Tratamiento Duración del tratamiento Primera Triple BAM/OAM/OCM 14 días Concomitante OCAM 3 a 7 días Segunda Cuádruple BOMT 14 días Secuencial OA + (OCTn/OCM) 5 + 5 días Tercera Rescate OTM/BTM 10 a 12 días Cuarta Casos refractarios OAR 14 días 32 INTRODUCCIÓN Por el contrario, en pediatría gastroentelógica, auqnue existen unas pautas de tratamiento de la infección en niños (Martínez, 2010) (Tabla 1.2), se realiza en la mayoría de los casos una endoscopia digestiva alta y, a partir de esta, se toma una biopsia (Urruzuno, 2012), por lo que se suele conocer la susceptibilidad antibiótica a través de los antibiogramas del aislado obtenido Esto permite aplicar la triple terapia, utilizando los dos antibióticos para los cuales el aislado en concreto se muestre susceptible in vitro (Mégraud, 2007). Opción Terapia Tratamiento Duración del tratamiento Primera Triple BAM/OAM 14 días Segunda Cuádruple BOMT (<8años) 7 días Secuencial OA + (OCTn/OCM) 5 + 5 días Tercera Terapia de rescate OAR/OAL* 14 días Tabla 1.2 Pautas para el tratamiento de la infección por H. pylori en niños. A: amoxicilina. B: compuesto derivado de bismuto. C: claritromicina. M: metronidazol. O: omeprazol. T: tetracilinas. Tn: tinidazol. L: levofloxacino. R: rifampicina/rifabutina. * Usado sólo en pacientes pediátricos mayores (modificado desde Martínez, 2010 según Gisbert 2013). El fracaso del tratamiento puede estar influido por la resistencia antibiótica y también, a otros factores como: incumplimiento terapéutico (en duración y dosis), propiedades farmacológicas de los antibióticos, ausencia de penetración en la mucosa gástrica, desactivación por el pH estomacal, la no correspondencia entre sensibilidad in vitro e in vivo y las características de las lesiones gástricas (Alarcón, 1999). Actualmente y debido a las crecientes tasas de resistencia a antibióticos, se están investigando nuevas fuentes de compuestos naturales eficaces en la erradicación de la infección por H. pylori. Así se han recopilado evidencias de que ciertas plantas y 33 INTRODUCCIÓN frutos, como los arándanos y el ajo (Samie, 2014); algunos probióticos, como Lactobacillus acidophilus, L. rhamnous, L. busgaricus, L. casei, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium infantis, y B. breve (López-Brea 2008; Samie, 2014) y compuestos naturales como la miel (Manyi-Loh, 2010), podrían inhibir el crecimiento y contribuir en el tratamiento de la infección. 1.6 RESISTENCIA ANTIBIÓTICA. H. pylori es sensible a un gran número de antibióticos in vitro (López-Brea, 1999) pero no todos presentan eficacia in vivo. La resistencia antibiótica tiene múltiple consecuencias, ya que a causa de ella, las infecciones bacterianas son más difíciles de tratar, lo que a su vez puede generar procesos patológicos más largos y más graves, periodos de contagio mayores, efectos secundarios más frecuentes (debido al uso de antibiótico con un rango terapéutico menor, de dosis más altas o de tratamientos más largos) e ingresos hospitalarios más prolongados (Lázaro, 2006). Todo ello conlleva un aumento de costes sanitarios nacional y/o personal para los apcientes. Por todos esos motivos es más que necesario y urgente el estudio de las resistencias a antibióticos. 1.6.1 Amoxicilina. Entre todos los betalactámicos ensayados in vitro sólo amoxicilina ha demostrado ser útil en el tratamiento de la infección por H. pylori y se utiliza en diferentes pautas de tratamiento asociado a metronidazol, tetraciclina o claritromicina. Es el betalactámico más estable en medio ácido y el que alcanza mayores concentraciones en tejidos después de una dosis oral. Los antibióticos betalactámicos 34 INTRODUCCIÓN actúan inhibiendo la formación de la pared bacteriana de los microorganismos (Alarcón, 2007). Se han descrito alteraciones de las PBPs, concretamente mutaciones en el gen pbp-1A que se asocian con resistencia a este antimicrobiano (Megraud, 2004). 1.6.2 Claritromicina. Claritromicina es el macrólido más utilizado, que presenta una excelente actividad in vitro frente a H. pylori y tiene modificaciones químicas con respecto a los macrólidos más antiguos, que le confieren mayor estabilidad en medio ácido (Czinn, 1986). Los macrólidos inhiben la síntesis de proteínas mediante su acción a nivel de los ribosomas bacterianos. La función de los ribosomas consiste en la transducción en proteínas del mensaje genético expresado por el ARN mensajero (ARNm). El grupo formado por macrólidos, lincosamidas y estreptograminas tipo B inhiben la síntesis proteica mediante el bloqueo de la función de la región peptidil transferasa, impidiendo la extensión de las cadenas proteicas causando la liberación de los fragmentos de péptidos incompletos (Alarcón, 2007). El mecanismo de resistencia a macrólidos observado en H. pylori y otras bacterias, como Mycoplasma pneumoniae y micobacterias atípicas, es el debido a una mutación en una secuencia de la región peptidiltransferasa 23S del ARN ribosómico, en la subunidad 50S (Versalovic, 1996). 1.6.3 Metronidazol. Metronidazol es un antimicrobiano ampliamente utilizado en el tratamiento de la infección por H. pylori por conseguirse, junto con amoxicilina y sales de bismuto, tasas muy altas de erradicación. Metronidazol y otros antibióticos nitroimidazólicos son 35 INTRODUCCIÓN activos después de la reducción del grupo nitro unido al anillo imidazólico. Este proceso genera compuestos intermediarios de vida corta y altamente tóxicos que producen daño en el ADN bacteriano y causan la muerte celular (Edwards, 1993). Existen 2 genes que, están involucrados en la resistencia de H. pylori a este antibiótico, ellos son rdxA y frxA. El gen rdxA, codifica para una NADPH nitrorreductasa insensible al oxígeno que dona los electrones reduciendo al metronidazol y activándolo (Kaakoush, 2005). Uno de los mecanismos más importantes en la resistencia de H. pylori a metronidazol son las mutaciones que inactivan al gen rdxA. El gen frxA, codifica para la enzima NADPH flavinoxidorreductasa que tiene un mecanismo similar a rdxA y constituye un importante factor en la activación del metronidazol en el interior celular. La resistencia debida a la disfuncionalidad de este gen se ha observado solo en algunas cepas (Chisholm, 2004). 1.6.4 Tetraciclina. Tetraciclina presenta buena actividad in vitro (López-Brea, 1999) y ha demostrado su utilidad en la práctica clínica aunque tiene el inconveniente de no poderse utilizar en enfermos pediátricos. Las tetraciclinas son antibióticos que actúan inhibiendo la síntesis proteica. El mecanismo de resistencia descrito consiste en mutaciones puntuales en el gen 16S rRNA en la posición 926-928 (cambio de AGA por TTC) (Gerrits, 2006). Cuando se lleva a cabo una única sustitución o sustituciones dobles se produciría resistencia de bajo nivel; sin embargo, si se presentan las 3 mutaciones la resistencia sería de alto nivel. También se ha propuesto como mecanismo de resistencia la reducción de la permeabilidad, ya que algunas cepas resistentes no 36 INTRODUCCIÓN presentan las mutaciones descritas y muestran una disminución de la acumulación de tetraciclina (Gerrits, 2006). 1.6.5 Furazolidona. Los nitrofuranos tienen también buena actividad frente a H. pylori (McNulty, 1988), siendo furazolidona el más eficaz en la curación de úlceras duodenales (Zhi- Tian, 1985) y en erradicar H. pylori de la mucosa gástrica. El mecanismo de acción es similar al del metronidazol: reducción de la prodroga llevando a la formación de radicales nitro aniónicos y se produce el daño del ADN. El mecanismo de resistencia no se conoce pero es diferente del de metronidazol porque no presentan resistencia cruzada (Gerrits, 2006). 1.6.6 Levofloxacino. El rango inhibitorio de quinolonas como ciprofloxacino y ofloxacino frente a H. pylori es similar a betalactámicos y macrólidos (López-Brea, 1999). Sin embargo, las primeras quinolonas utilizadas no mostraron eficacia clínica, por la disminución de la actividad en pH ácido o por el desarrollo de resistencia después del tratamiento. Actualmente levofloxacino se ha utilizado con éxito en la erradicación de la bacteria. Las quinolonas actúan inhibiendo la ADN girasa, un tetrámero con dos subunidades A y dos B, codificadas por los genes gyrA y gyrB. En H. pylori se han descrito al menos, cuatro tipos de mutaciones en el gen gyrA (Miyachi, 2006): cambio de Asn por Lys en el aminoácido 87, cambio de Ala por Val en el aminoácido 88, cambio de Asp por Gly, Tyr o Asn en el aminoácido 91 y mutaciones simultáneamente en 91 (Asp Asn) y en 97 (AlaVal). 37 INTRODUCCIÓN 1.6.7 Rifabutina. Muestra buena actividad in vitro (López-Brea, 1999) y ha demostrado ser eficaz en la erradicación de la bacteria. Las resistencias descritas se producen por mutaciones puntuales en el gen rpoB, que codifica para la RNA polimerasa, y cuando se produce confiere resistencia cruzada a todas las rifamicinas. Las mutaciones descritas corresponden a los aminoácidos 149, 524-545 y 586 (Gerrits, 2006). 1.7 MÉTODOS DE DETECCIÓN DE RESISTENCIAS. La resistencia a antimicrobianos se puede detectar mediante diferentes métodos que se pueden clasificar en fenotípicos (basados en la apariencia macroscópica tras el cultivo de la bacteria) y genotípicos (basados en la detección de los genes y las mutaciones implicadas en la resistencia). 1.7.1 Dilución en agar. Es el método de referencia, pero poco útil para realizar de forma rutinaria, aunque válido para confirmar los resultados obtenidos por otros métodos y para realizar estudios para conocer la tasa global de resistencia en un área determinada. Existen recomendaciones de Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) que aconseja el método de dilución en agar y recomienda punto de corte para claritromicina (CLSI, 2014). 1.7.2 Difusión con disco. Es el método más fácil y barato para determinar la sensibilidad in vitro, pero los resultados que se obtienen no siempre se correlacionan con los obtenidos por el método 38 INTRODUCCIÓN de dilución en agar, aunque algunos autores sí observan buena correlación y lo recomiendan como práctico, seguro y con aplicación para predecir los resultados clínicos (DeCross, 1993; McNulty, 2002). 1.7.3 Método del epsilómetro (E-test) Es un método cuantitativo para realizar las pruebas de sensibilidad in vitro basado en la difusión. El método del epsilómetro está especialmente recomendado en organismos exigentes y cuando se deben probar pocos microorganismos o pocos antibióticos y tiene diferentes ventajas sobre los métodos tradicionales de dilución en agar, dilución en caldo o difusión en agar (King, 2001). La British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) y European Comittee of Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) recomiendan este método para detectar la resistencia en H. pylori (King, 2001; EUCAST, 2014). 1.7.4 Puntos de corte. En la tabla 1.3 se muestra las recomendaciones de la EUCAST usando el método del E-test. El punto de corte de resistencia a claritromicina recomendado por la EUCAST considera que el antibiótico se utiliza en una de las pautas aprobadas por la FDA junto con un inhibidor de la bomba de protones o ranitidina citrato de bismuto (EUCAST, 2014). 39 INTRODUCCIÓN Tabla 1.3 Puntos de corte según EUCAST 1.7.5 Métodos moleculares. La detección de las mutaciones que confieren resistencia a claritromicina en H. pylori se ha realizado mediante técnicas de microbiología molecular como la reacción en cadena de la polimerasa. Versalovic y cols desarrollaron en 1996 (Versalovic, 1996) una PCR que amplificaba un fragmento de 1,4 Kpb de la región 23S del ARNr y posteriormente se detectaba la mutación en A2142G y A2143G tras digestión con las enzimas MboII y BsaI, respectivamente. Este método ha sido utilizado por muchos autores (Gerrits, 2006). Se han desarrollado otros métodos que permiten detectar una o varias de las mutaciones relacionadas con la resistencia como: secuenciación, PCR “mismatched” que permite detectar la mutación A2142C (Alarcón, 2000), PCR y posterior ensayo de unión con oligonucleótido (PCR-OLA) (Stone, 1997), hibridación en fase sólida (LIPA) (Van Doorn, 1998) o en fase líquida (Pina, 1998) e hibridación in situ, FISH (Trebesius, 2000). También se ha utilizado la PCR en tiempo real, que permite detectar cualquier tipo de mutación, según el diseño de la sonda y tiene la ventaja de que se puede realizar en 1 hora (Lascols, 2003). La mayoría de los protocolos realizados mediante PCR en tiempo real se basan en la utilización de 2 sondas entre las que se produce transferencia 40 INTRODUCCIÓN de energía cuando se encuentran hibridadas en el ADN diana (sondas FRET). Cuando se completa el proceso de amplificación se determina la temperatura de fusión (Tm) del ADN amplificado. Si existe una mutación puntual, la Tm del fragmento amplificado será unos grados más baja (al menos 4-5ºC) que cuando no existe. Esta metodología se ha utilizado con éxito en aislamientos clínicos, pero también directamente sobre muestras de biopsia gástrica. En algunos trabajos se ha aplicado sobre muestras de heces directamente, con muy buenos resultados para algunos autores pero no para otros, por la dificultad de realizar una extracción adecuada del ADN en este tipo de muestras (Schabereiter-Gurtner, 2004). También existen kits comerciales diseñados para detectar la presencia de mutaciones relacionadas con resistencia a claritromicina (López-Brea, 2006). La ventaja de las técnicas moleculares es la rapidez en obtener resultados y la excelente correlación con la sensibilidad obtenida por métodos fenotípicos y que se pueden aplicar a diferentes muestras, sin necesidad de que el cultivo sea positivo. Por otra parte, los métodos moleculares permiten detectar infecciones mixtas con cepas sensibles y resistentes simultáneamente o infecciones por cepas heterogéneas (cepas con mutación en una de las dos copias de genes), que pueden pasar desapercibidas por los métodos fenotípicos. 1.8. VINO Y SALUD El vino ha sido parte de la cultura humana desde hace unos 6000 años y los antecedentes históricos relacionan al vino con la salud y la longevidad, sobre todo en la cultura mediterránea. Efectivamente, en varios países del área mediterránea (Francia, España, Portugal, Italia y Grecia) el vino está integrado en el comportamiento habitual 41 INTRODUCCIÓN de los pueblos que lo consumen con las comidas y en las celebraciones (Leighton, 1999). El vino es un producto natural obtenido por fermentación directa de la uva o de su mosto; contiene alcohol y múltiples productos secundarios de su fermentación alcohólica, pero contiene además otras muchas sustancias procedentes de la uva, en las que radica especialmente su valor desde el punto de vista de la salud. Estudios científicos muestran que beber moderadamente es beneficioso para la salud, en especial para la prevención de las enfermedades coronarias (Doll, 1995). En general, se encuentra una disminución del riesgo de mortalidad por enfermedad coronaria de aproximadamente 30-40% y de 10-20% para mortalidad general, en hombres o mujeres que consumen vino de manera moderada (Gaziano, 1999). Este efecto beneficioso sería debido a que en la elaboración del vino tinto se incorporan la semilla y la piel de la uva, ambas con altas concentraciones de flavonoides, principalmente catequina, ácido gálico y epicatequina. Según las investigaciones, se deduce que los beneficios que el vino aporta a la salud humana son (Val, 2003): a. Acción antiespasmódica b. Activación de la secreción biliar c. Acción antibacteriana d. Protección de las paredes arteriales, al fortalecer el colágeno y la elastina que las forman e. El vino aporta minerales y oligoelementos  Magnesio: disminuye el estrés  Zinc: mejora las defensas inmunitarias  Litio: equilibra el sistema nervioso 42 INTRODUCCIÓN  Calcio y potasio: garantizan un adecuado equilibrio iónico y eléctrico  Se recomienda en casos de anemia ya que el vino contiene siempre algunos miligramos por litro de hierro  Acción fungicida  Efectos positivos sobre la enfermedad de Alzheimer La concentración de compuestos polifenólicos del vino varía entre 1,80 y 1,06 g/L, con un promedio de 2,57 g/L para el vino tinto y entre 0,16 y 0,30 g/L para el blanco (Díaz, 2001). Como el contenido total de fenoles de alimentos y bebidas se correlaciona muy fuertemente con su actividad antioxidante, por su composición en polifenoles y en términos del poder antioxidante, un vaso de vino tinto (150mL) equivale a 12 de vino blanco, o a 2 tazas de té, 4 manzanas, 5 porciones de cebolla, 3 vasos y medio de cerveza, 7 jugo de naranja o 20 manzanas (Papaganga, 1999). 1.9 COMPUESTOS FENÓLICOS. Los compuestos polifenólicos agrupan un conjunto de sustancias que durante mucho tiempo fueron denominadas genéricamente “Materias tanoides o Taninos”. Son compuestos que se encuentran muy difundidos en la naturaleza y juegan un papel muy importante en los carácteres organolépticos o sensoriales de los alimentos. Sufren modificaciones con mucha facilidad, como las oxidaciones que contribuyen al envejecimiento y madurez del vino, desarrollándose así su buen sabor a la vez que evitan la oxidación de otros componentes del mismo, que darían compuestos contrarios a la buena calidad (Leandro, 1985). Sufren también complejaciones con metales y cambios debidos a modificaciones del pH, por lo que participan en procesos que dan lugar a cambios organolépticos en muchos alimentos. 43 INTRODUCCIÓN Su importancia en enología es muy significativa, ya que entre estas sustancias se encuentran las responsables en mayor medida del color de las uvas (particularmente de las tintas o negras), jugando un importante papel en la evolución de los vinos con el envejecimiento. En el caso del vino también son los responsables de la sensación de astringencia en la lengua y de la sensación que se nota en la boca (impresión táctil de los vinos). Además contribuyen al sabor, especialmente a los sabores amargos y a la apreciación organoléptica, distinguéndose así un vino blanco de uno tinto no sólo por su sabor sino también por su olor. Otras propiedades que tienen los polifenoles son (Hidalgo, 2003): * Propiedades bactericidas o bacteriostáticas, frente a microorganismos patógeneos que produciendo alteraciones fisiológicas se desarrollan, ocasionalmente, en el aparato digestivo y, de manera particular, en el intestino. * Propiedades antitóxicas, de manera concreta frente a la toxicidad de los alcoholes, demostrada experimentalmente en ensayos con animales de laboratorio. * Valor vitamínico P, frente a la fragilidad de los vasos sanguíneos capilares, que pueden ocasionar hemorragias en estos conductos. Los polifenoles del vino varían desde compuestos relativamente sencillos producidos por las vides, hasta sustancias sumamente complejas formadas durante el envejecimiento, asi como otras extraídas por el vino de la madera de los barriles. Provienen básicamente de las partes sólidas de la uva, y en menor medida de la pulpa, siendo su aportación diferente según procedan de hollejos, pepitas o raspones, ya que la composición polifenólica del vino varía según el tiempo de contacto de cada una de estas partes con el mosto (Rapisarda, 2000) 44 INTRODUCCIÓN 1.9.1 Compuestos puros. Una sustancia pura es aquella que tiene unas propiedades específicas que la caracterizan y que sirven para diferenciarla de otras sustancias. Las sustancias puras pueden ser elementos o compuestos. Los compuestos puros son sustancias puras que se pueden descomponer en otras más simples por métodos químicos (Ej. El agua es un compuesto que se puede descomponer en dos gases (hidrógeno y oxígeno). 1.9.1.1 Catequina (C). La catequina es un antioxidante polifenólico que procede de las plantas en las cuales aparece como un metabolito secundario. El término catequina se emplea comúnmente para referirse a la familia de los flavonoides y al subgrupo de los flavan-3- oles (o simplemente flavonoles). El nombre de catequina proviene de la familia de plantas denominada catechu (Terra Japonica) y concretamente del jugo extraído de la Mimosa catechu. Se ha visto que la catequina entre otros compuestos fenólicos afectan en el crecimiento de bacterias ácido-lácticas, aunque el mecanismo no está completemante estudiado (García-Ruiz, 2009). La molécula de catequina posee dos anillos bencénicos (denominados los anillos A- y B-) y un heterociclo dihidropirano (el anillo C) con un grupo hidroxilo sobre el carbono 3. El anillo A es similar al grupo funcional del resorcinol mientras que el anillo B es similar al grupo funcional del catecol. Existen en la molécula dos centros de quiralidad, uno se encuentra en el carbono 2 y el otro sobre el 3. Por lo tanto, la catequina posee cuatro diastereoisómeros. Dos son isómeros trans y se denominan catequina y los otros dos son de configuración cis y se denominan epicatequina. 45 INTRODUCCIÓN La catequina es el compuesto fenólico más abundante en el vino tinto (120-390 mg/L); en el vino blanco varía entre 16 y 46 mg/L (Frankel, 1995) 1.9.1.2 Metil galato (M) El metil galato es un compuesto fenólico encontrado en Terminalia myriocarpa y Geranium niveum. También se encuentra en el vino. Es un éster del ácido gálico El punto de ebullición de esta molécula se encuentra entre 201-204ºC, es soluble en etanol o en agua caliente. Se ha visto que la catequina entre otros compuestos fenólicos afectan en el crecimiento de bacterias ácido-lácticas, aunque el mecanismos no está completemante estudiado (García-Ruiz, 2009). 46 INTRODUCCIÓN 1.9.1.3 Ácido gálico (G) El ácido gálico es un ácido orgánico también conocido como ácido 3, 4, 5- trihidroxibenzoico, que se encuentra en las agallas, en las hojas de té, en la corteza de roble y otras plantas. El ácido gálico se encuentra tanto en su forma libre como formando taninos. Las sales y los ésteres del ácido gálico se denominan galatos. Tiene usos en la industria farmacéutica como patrón para determinar el contenido de fenoles de diversos analitos mediante el reactivo de Folin-Ciocalteu. También se puede utilizar para sintetizar el alcaloide alucinógeno mescalina o 3,4,5- trimetoxifenetilamina. El ácido gálico tiene propiedades antivíricas y antifúngicas, además actúa como antioxidante y protector de las células contra los oxidantes (Simonetti, 2014). El ácido gálico es uno de los compuestos monoméricos más abundantes en el vino tinto (65-126 mg/L). Sin embargo, en el vino blanco varía entre 4-11 mg/L (Frankel, 1995). 1.9.1.4 Quercetina (Q). La quercetina es un flavonol que se encuentra presente en altas concentraciones tanto en frutas como en verduras. Es el flavonoide más abundante y el más habitual en la dieta humana, destacando por su elevada actividad antioxidante. 47 INTRODUCCIÓN Muchas plantas, ya sean consideradas medicinales o no, deben gran parte de sus beneficios a los altos niveles de quercetina que presentan. Por ejemplo, algunas clases de cebolla (como la roja) contienen tanta quercetina que el compuesto representa el 10% de su peso seco, siendo este hecho de donde derivan sus múltiples propiedades terapéuticas. Otros alimentos con niveles elevados de quercetina son otras clases de cebollas, lechugas, brócolis, arándanos, manzanas, aceite, té y vino tino (Rice-Evans, 1996). Sus aplicaciones terapéuticas son diversas, siendo especialmente efectivo en el tratamiento y prevención de las enfermedades cerebrovasculares, la obesidad o el cáncer. Debido a su actividad antihistamínica hace que sea útil para la prevención de ataques alérgicos y de asma. Un estudio realizado in vitro mostró que la quercetina y el resveratrol combinados inhiben la producción de células adiposas (Yang, 2010). El contenido total de flavonoles, considerado como la suma de miricetina y quercetina, en vinos tintos varía entre 4,6 y 41,6 mg/L (McDonald, 1998). La miricetina y la quercetina se encuntran libres o conjugadas; la proporción de flavonoles libres varía entre un 20% y un 50% del total. 1.9.1.5 Taninos (Tan). El término tanino fue originalmente utilizado para describir ciertas sustancias orgánicas que servían para convertir a las pieles crudas de animales en cuero, proceso 48 INTRODUCCIÓN conocido en inglés como tanning. Se extraen de las plantas con agua o con una mezcla de agua y alcohol, que luego se decanta y se deja evaporar a baja temperatura hasta obtener el producto final. Los taninos tienen un ligero olor característico, sabor amargo y astringente, y su color va desde el amarillo hasta el castaño oscuro. Expuestos al aire se tornan oscuros y pierden su efectividad para el curtido. Los taninos se utilizan en el curtido porque reaccionan con las proteínas de colágeno presente en las pieles de los animales, uniéndolas entre sí, de esta forma aumenta la resistencia de la piel al calor, a la putrefacción por agua, y al ataque por microbios. Químicamente son metabolitos secundarios de las plantas, fenólicos, no nitrogenados, solubles en agua y no en alcohol ni solventes orgánicos. Los taninos poseen propiedades astringentes y antiinflamatorias, por lo tanto, son muy útiles ante diarrea o gastroenteritis. Además, tienen acción antioxidante que protegen a las células ante los radicales libres y permiten reducir el riesgo de enfermedades degenerativas, sin embargo, no se debe abusar de los alimentos ricos en taninos, ya que en cantidades excesivas, pueden reducir la absorción de nutrientes como el hierro o las proteínas, y ser causante de carencias (Corder, 2001). Podemos encontrar taninos en el vino tinto, las uvas, el té, el café, las espinacas, la granada, membrillo o manzana (Rice-Evans, 1996). 1.9.1.6 Resveratrol puro (RE) El resveratrol es una fitoaloxina con varias porpiedades biológicas y farmacológicas y del que depende el color característico del vino (Palmeri, 1999). In vitro el resveratrol ha mostrado ser un fuerte antioxidante, un fitoestrógeno, un inhibidor de la tumorogénesis, un vasorelajador, un inhibidor de la agregación 49 INTRODUCCIÓN plaquetaria, un inhibidor de la cicloxigenasa 2 y de los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (Wang, 2002). In vivo también se ha comprobado el efecto antioxidante del resveratrol con LDL de mujeres posmenopáusicas, el efecto antiinflamatorio y antiaterogénico al inhibir la expresión de moléculas de adhesión al endotelio en un modelo experimental murino (Bertelli, 2001), que tiene un efecto citostático sobre células tumorales colónicas a través de una supuesta inhibición de la ciclooxigenasa 2 y un efecto como antiagregante plaquetario en conejos hipercolesterolémicos y voluntarios humanos sanos (Wang, 2002) La concentración del resveratrol, uno de los polifenoles del vino que más atención ha concitado, puede variar entre 0 y 2,9 mg/L en el vino tinto y entre 0 y 0,06 mg/L en el vino blanco (Frankel, 1995). 1.9.2 Extractos. Un extracto es una sustancia obtenida por extracción de una parte de una materia prima, a menudo usando un solvente como etanol o agua. Los extractos pueden comercializarse en forma de polvo. Los extractos están formados por distintos compuestos puros. http://es.wikipedia.org/wiki/Materia_prima http://es.wikipedia.org/wiki/Materia_prima http://es.wikipedia.org/wiki/Solvente http://es.wikipedia.org/wiki/Etanol http://es.wikipedia.org/wiki/Agua 50 INTRODUCCIÓN 1.9.2.1 Extracto de semilla de uva (GSE). La composición fenólica (mg/L) del extracto de semilla de uva (GSE) se muestra en la siguiente tabla. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar. a Contenido fenólico total (CFT) (mg EAG/L) EAG: equivalentes de ácido gálico. COMPUESTO CONCENTRACIÓN (mg/L) Flavonoles Quercetina-3-glucósido 46,5 ± 0,1 Miricetina-3-glucósido 15,0 ± 0,1 Kaempferon-3-glucósido 10,6 ± 0,1 Ácidos fenólicos Ácido gálico 18,8 ± 0,1 Ácido protocatéquico 23,2 ± 0,1 Ácido caftárico 193,4 ± 0,9 Ácido clorogénico 22,9 ± 0,1 Catequinas y proantocianidinas Dimero B1 (Ec-Cat) 111,6 ± 0,3 Trímero (Ec-Ec-Cat) 319,9 ± 4,0 Catequina (Cat) 182,7 ± 1,1 Dímero B2 (Ec-Ec) 311,5 ± 4,7 Epicatequina (Ec) 251,6 ± 2,6 Antocianinas Delfinidina-3-glucósido 1,9 ± 0,1 Peonidina-3-glucósido 6,1 ± 0,1 Malvidina-3-glucósido 0,1 ± 0,0 Malvidina-3-acetato 0,1 ± 0,0 CFTa 2478,4 ± 6,1 51 INTRODUCCIÓN 1.9.2.2 Extracto de uva (Pu). La composición fenólica (mg/L) del extracto de uva se muestra en la siguiente tabla. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar. COMPUESTO CONCENTRACIÓN (mg/L) Flavonoles Quercetina-3-glucósido 4 ± 0,0 Quercetina 7 ± 0,0 Ácidos fenólicos Ácido gálico 37 ± 0,1 Ácido homogentísico 21 ± 0,0 Ácido protocatéquico 27 ± 7,0 Ácido clorogénico 6 ± 0,1 Ácido homovaníllico 72 ± 4,6 Ácido vaníllico 41 ± 2,0 Ácido p-cumárico 12 ± 0,0 Ácido p-hidroxibenzoico 21 ± 1,6 Ácido Sinápico 31 ± 1,0 Catequinas y proantocianidinas Dímero B1 (Ec-Cat) 66 ± 1,3 Catequina (Cat) 680 ± 4,4 Dímero B2 (Ec-Ec) 130 ± 23,1 Epicatequina (Ec) 806 ± 8,1 TOTAL 3600a ± 0,0 aTotal de contenido fenólico (mg GAE/L) 52 INTRODUCCIÓN 1.9.2.3 Resveratrol 1 (R1). La composición fenólica (mg/L) del Resveratrol 1 se muestra en la siguiente tabla. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar. COMPUESTO CONCENTRACIÓN (mg/L) Gálico 23,53 ± 1,39 Resveratrol 94,58 ± 5,09 Malvidina 8,48 ± 0,20 1.9.2.4 Resveratrol 2 (R2). La composición fenólica (mg/L) del Resveratrol 2 se muestra en la siguiente tabla. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar. COMPUESTOS CONCENTRACIÓN (mg/L) Gálico 12 ± 2,08 Dímero B1 (Ec-Cat) 23,06 ± 0,34 Catequina (Cat) 204,09 ± 11,51 Dímero B2 (Ec-Ec) 26,21 ± 2,32 Epicatequina (Ec) 147,4 ± 11,96 Resveratrol 65,76 ± 2,89 Malvidina 2,22 ± 0,03 53 INTRODUCCIÓN 1.9.2.5 Extracto de semilla de uva (SCOM). La composición fenólica (mg/L) del SCOM se muestra en la siguiente tabla. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar. COMPUESTO CONCENTRACIÓN (mg/L) Flavonoles Quercetina-3-glucósido 71,7 ± 0,5 Miricetin-3-glucósido 22,5 ± 1,4 Kaempferol-3-glucósido 16,4 ± 1,2 Ácidos fenólicos Ácido gálico 29,1 ± 0,7 Ácido protocatéquico 36,1 ± 1,3 Ácido clorogénico 35,5 ± 0,1 Ácido homovaníllico 2,9 ± 0,1 Ácido caftárico 299,8 ± 4,8 Catequinas y proantocianidinas Dímero B1 (Ec-Cat) 167,4 ± 3,6 Catequina (Cat) 274,1 ± 3,1 Dímero B2 (Ec-Ec) 486,2 ± 4,7 Epicatequina (Ec) 381,5 ± 5,6 Galato de epicatequina 6,4 ± 0,6 Antocianinas Delfinidin-3-glucósido 2,8± 0,2 Peonidin-3-glucósido 9,1± 0,1 Malvidin-3-glucósido 0,2± 0,0 TOTAL 3810,67 ± 48,61 54 INTRODUCCIÓN 1.10 TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS. Se han utilizado diferentes técnicas para estudiar la acción de los compuestos fenólicos, la mayoría de ellos similares a los utilizados para es estudio de antibióticos como métodos de dilución y difusión, curvas de muerte, etc. También se han utilizado técnicas que permiten detectar la posible permeabilidad de membrana o los cambios en el patrón de proteínas ribosomales que se producen al actuar el compuesto fenólico. 1.10.1 Estudio del daño de membrana mediante yoduro de propidio. Yoduro de propidio es un agente de intercalación y una molécula fluorescente con una masa molecular de 668,4 Da que se puede utilizar para teñir las células. Cuando está ligada a los ácidos nucleicos, la excitación de la fluorescencia máxima es de 535 nm y la emisión máxima es de 617 nm. La energía de excitación puede ser suministrada con una lámpara de xenón o de arco de mercurio o con la línea de un láser de iones de argón 488. Yoduro de propidio se utiliza como una mancha de ADN, tanto para citometría de flujo, para evaluar la viabilidad celular o contenido de ADN en el análisis del ciclo celular, y la microscopía para visualizar el núcleo y otro ADN que contiene orgánulos. Se puede utilizar para diferenciar las células necróticas, apoptóticas y normal (Ganan, 2009). Yoduro de propidio es el tinte más utilizado para evaluar cuantitativamente el contenido de ADN. Yoduro de propidio se une al ADN por intercalación entre las bases con poca o ninguna secuencia de preferencia y con una estequiometría de un colorante por 4-5 pares de bases de ADN. También se une al ARN, que requiere tratamiento con 55 INTRODUCCIÓN nucleasas para distinguir entre el ARN y la tinción de ADN. Una vez que el colorante se une a los ácidos nucleicos, su fluorescencia se ve reforzada 20 a 30 veces, la excitación de fluorescencia máxima se desplaza ~ 30-40 nm para el rojo y la emisión de fluorescencia máxima se desplaza ~ 15 nm para el azul (Lecoeur, 2002). El yoduro de propidio es impermeable a la membrana y generalmente excluido de las células viables. Se utiliza comúnmente para la identificación de células muertas en una población y como un colorante de contraste en técnicas fluorescentes multicolores. Los protocolos de tinción de contraste a continuación son compatibles con una amplia gama de técnicas de etiquetado citológico-directa o métodos de detección basados en anticuerpos indirectos, ARNm hibridación in situ, o tinción con reactivos fluorescentes específicos para las estructuras celulares. Estos protocolos pueden ser modificados para la tinción de tejidos. 1.10.2 MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of- Flight). El MALDI-TOF es una técnica de ionización suave que consiste en un espectrómetro de masas con un analizador de tiempo de vuelo. Un espectrómetro de masas es un instrumento que separa los iones que se desplazan rápidamente según su relación masa/carga, m/z. La mayoría de los iones que se estudian presentan una sola carga, de modo que la relación es sencillamente la masa del ión. El objetivo del sistema de entrada es introducir una cantidad muy pequeña (microgramos) en la fuente de iones, donde los componentes de la muestra se convierten en iones gaseosos mediante el bombardeo con electrones, fotones, iones o moléculas. Alternativamente, la ionización se puede conseguir con energía térmica o 56 INTRODUCCIÓN eléctrica. La señal de salido de la fuente de iones es un flujo de iones positivos (generalmente) o iones negativos gaseosos que son acelerados en el analizador de masas. La función del analizador de masas es análoga a la de un monocromador en un espectrómetro óptico. En el primer caso, sin embargo, la dispersión se realiza en función de la relación m/q de los iones del analito, en vez de en la longitud de onda de los fotones. En los instrumentos de tiempo de vuelo (TOF), los iones positivos se producen periódicamente mediante el bombardeo de la muestra con impulsos cortos de electrones, iones secundarios o fotones generados por láser. Estos impulsos suelen tener frecuencias de 10 a 50 KHz y un tiempo de vida de 0,25 µs. Los iones producidos de esta manera son acelerados después mediante un impulso de campo eléctrico de 103 a 104 V que tiene la misma frecuencia que el impulso de ionización, pero desfasada. Las partículas aceleradas pasan al tubo analizador de aproximadamente un metro de longitud y que no está sometido a ningún campo (Sauer, 2010). Debido a que todos los iones que entran en el tubo idealmente tienen la misma energía cinética, sus velocidades dentro del tubo deben variar inversamente con sus masas, llegando al detector antes las partículas más ligeras, que las más pesadas. 57 INTRODUCCIÓN El estudio directo bacteriano usando MALDI-TOF es una técnica rápida e innovadora para la identificación bacteriana (Sauer, 2008). Se basa en la comparación del espectro de masas de los componentes celulares, principalmente proteínas y péptidos. 1.10.2.1 Aplicaciones de MALDI-TOF en Microbiología Clínica. La irrupción de MALDI-TOF en los laboratorios de diagnóstico microbiológico clínico, ha sido descrita por algunos autores como verdaderamente revolucionaria (Seng, 2009). A su facilidad de manejo y rapidez en la obtención de resultados, se une su versatilidad para identificar un gran número de microorganismos diferentes, desde bacterias hasta hongos. A todo esto hay que añadir otras aplicaciones que se están empezando a desarrollar que amplían enormemente su utilidad en la práctica clínica; detección directamente en muestras, estudios de sensibilidad y estudios de tipificación (Murray, 2010). 58 OBJETIVOS OBJETIVOS 59 OBJETIVOS El objetivo principal va dirigido al estudio de la capacidad de inhibición que pueden presentar los compuestos fenólicos en aislamientos clínicos de H. pylori. Para ello se plantean los siguientes objetivos: 1. Caracterizar los aislamientos de H. pylori de un periodo de 4 años según el patrón de sensibilidad a amoxicilina, tetraciclina, claritromicina, levofloxacino, metronidazol y rifampicina y sus factores de virulencia. 2. Determinar la actividad de diferentes compuestos fenólicos extraidos del vino (extracto de semilla de uva, extracto de uva, catequina, metil galato, gálico, resveratrol, quercetina) mediante difusión con disco sobre aislamientos clínicos de H. pylori. 3. Estudiar la actividad de los compuestos fenólicos sobre H. pylori con diferentes factores de virulencia como los genes cagA y vacA y estudiar su comportamiento en cepas resistentes y sensibles a claritromicina. 4. Estudiar la actividad inhibitoria (CMI) mediante microdilución en caldo y la actividad bactericida mediante la realización de curvas de muerte de diferentes compuestos fenólicos en aislamientos clínicos de H. pylori. 5. Estudiar el mecanismo de acción que ejercen los compuestos fenólicos en H. pylori, mediante estudios de permeabilidad de membrana y estudios de proteínas ribosomales utilizando MALDI-TOF. 60 MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 61 MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Helicobacter pylori. 3.1.1 Número de cepas estudiadas. Se estudiaron un total de 439 cepas de aislamientos clínicos de H. pylori, tanto de niños como de adultos desde el 1 de enero del 2010 hasta el 31 de diciembre del 2013. De ellas, en 86 aislamientos no se registró la edad de los pacientes. De las 353 cepas restantes, 315 correspondieron a niños (151 hombres y 164 mujeres) y 38 a adultos (19 hombres y 19 mujeres). 3.1.2 Procedencia de los microorganismos. Todos los aislamientos clínicos de H. pylori se obtuvieron de muestras de biopsia gástrica de pacientes sometidos a endoscopia en los hospitales del Niño Jesús, Fuenlabrada, Doce de Octubre, La Mancha-Centro y La Princesa. 3.1.3 Transporte de las muestras. Las biopsias obtenidas por endoscopia se depositaron en las paredes de un tubo estéril con 1 ml de solución salina para impedir su desecación y se enviaron rápidamente al laboratorio de Microbiología para ser procesadas, o bien se congelaron a -80º C y se enviaron por lotes. Las muestras de La Mancha-Centro se enviaron en medio de trasnporte Porta- Germ. 3.1.4 Procesamiento de las muestras. Las biopsias se recogieron del tubo con una torunda estéril y se rodaron repetidas veces sobre la superficie de una placa de agar Columbia con 5% de sangre de cordero (Biomèrieux) y de una placa de medio selectivo de agar PYLORI que se 62 MATERIALES Y MÉTODOS incubaron en atmósfera microaerofílica a 37ºC (Fig 1). La torunda se introdujo en 0,5 mL de caldo de urea de Christensen y se dejó a temperatura ambiente hasta 24 horas. Fig 1. Placa de medio selectivo de agar PYLORI con cremiento de la bacteria. Las placas incubadas en microaerofilia se colocaron en una jarra para cultivo de anaerobios, donde se introdujo un sobre de GENbox microaer (Biomérieux) y se mantuvieron en estufa de 37ºC durante un tiempo que osciló entre 4-14 días con revisión de las placas cada 48 horas. 3.1.5 Identificación de los microorganismos. Las colonias con crecimiento pequeño y brillante con apariencia de H. pylori se subcultivaron en placas de agar Columbia con 5% de sangre de carnero y se identificaron por la metodología habitual: morfología de la colonia, tinción de Gram y la positividad de la ureasa, la catalasa y la oxidasa. 63 MATERIALES Y MÉTODOS 3.1.6 Cepas control. En este estudio se incluyó la cepa patrón H. pylori 146128 (Aznar, 2013). 3.1.7 Conservación de las cepas. Las cepas se conservaron congeladas a -80ºC. Para ello se recogieron el máximo número de colonias de una placa de Petri con una torunda y se depositaron en caldo de tripticasa de soja con 15% de glicerol. Cuando una cepa fue requerida para posteriores estudios, se descongeló y se cultivó en placas de agar sangre, incubándose durante 4-5 días en estufa de CO2 hasta obtener abundante crecimiento. A partir de ahí se subcultivaron cada 48 o 72 horas, dándoles pases a los medios necesarios según el estudio a realizar. 3.2 COMPUESTOS FENÓLICOS. Los compuestos fenólicos fueron suministrados por el Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL). El CIAL es un instituto mixto perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) y la Universidad Autónoma de Madrid (UAM). Su objetivo es el desarrollo de la investigación científica de calidad en el área de Ciencia y Tecnología de Alimentos, así como la participación en la formación de jóvenes investigadores y profesionales, y en la trasmisión de conocimiento a la sociedad. En la siguiente tabla se muestra la composición de los extractos, teniendo en cuenta sólo, los compuestos puros estudiados y sus concentraciones. http://www.csic.es/ http://www.uam.es/ 64 MATERIALES Y MÉTODOS Extracto Compuesto puro Concentración (mg/L) Extracto de semilla de uva (GSE) Ácido gálico 18,8 Catequina 182,7 Extracto de uva (Pu) Ácido gálico 37 Catequina 680 Quercetina 7 Resveratrol 1 (R1) Ácido gálico 25,53 Resveratrol 94,58 Resveratrol 2 (R2) Ácido gálico 12 Catequina 204,09 Resveratrol 65,76 Extracto de semilla de uva (SCOM) Ácido gálico 29,1 Catequina 274,1 3.2.1 Preparación de catequina 400 mg de C (Sigma Aldrich) se disolvió en 10 ml de DMSO al 8% y se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La dilución obtenida se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se cogió con una pipeta y se esterilizó mediante filtración con un filtro de membrana de 0,22 mm (Sarstedt, Nümbrecht, Germany) Posteriormente, se hicieron alícuotas de 1 ml en tubos eppendorf. 65 MATERIALES Y MÉTODOS 3.2.2 Preparación de metil galato 400 mg de M (Sigma Aldrich) se disolvió en 10 ml de DMSO al 8% y se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La dilución obtenida se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se cogió con una pipeta y se esterilizó mediante filtración con un filtro de membrana de 0,22 mm (Sarstedt, Nümbrecht, Germany) Posteriormente, se hicieron alícuotas de 1 ml en tubos eppendorf. 3.2.3 Preparación del ácido gálico 400 mg de G (Sigma Aldrich) se disolvió en 10 ml de DMSO al 8% y se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La dilución obtenida se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se cogió con una pipeta y se esterilizó mediante filtración con un filtro de membrana de 0,22 mm (Sarstedt, Nümbrecht, Germany) Posteriormente, se hicieron alícuotas de 1 ml en tubos tubos eppendorf. 3.2.4 Preparación de quercetina 130 mg de Q (Sigma Aldrich) se disolvió en 10 ml de etanol al 100% y se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La dilución obtenida se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se cogió con una pipeta y se esterilizó mediante filtración con un filtro de membrana de 0,22 mm (Sarstedt, Nümbrecht, Germany) Posteriormente, se hicieron alícuotas de 1 ml en tubos eppendorf. 66 MATERIALES Y MÉTODOS 3.2.5 Preparación de Resveratrol puro 80 mg de Re (Sigma Aldrich) se disolvió en 10 ml de DMSO al 100% y se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La dilución obtenida se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se cogió con una pipeta y se esterilizó mediante filtración con un filtro de membrana de 0,22 mm (Sarstedt, Nümbrecht, Germany) Posteriormente, se hicieron alícuotas de 1 ml en tubos eppendorf. 3.2.6 Preparación de Taninos 400 mg de T obtenidos en el CIAL se disolvió en 10 ml de agua destilada y se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La dilución obtenida se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se cogió con una pipeta y se esterilizó mediante filtración con un filtro de membrana de 0,22 mm (Sarstedt, Nümbrecht, Germany) Posteriormente, se hicieron alícuotas de 1 ml en tubos eppendorf. 3.2.7 Preparación de GSE 50 mg de extracto de semilla de uva (Laboratorios GSN, Madrid) se disolvió en 10 ml de agua destilada y se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La dilución obtenida se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se cogió con una pipeta y se esterilizó mediante filtración con un filtro de membrana de 0,22 mm (Sarstedt, Nümbrecht, Germany) (Silván, 2013) Posteriormente, se hicieron alícuotas de 1 ml en tubos eppendorf. 67 MATERIALES Y MÉTODOS 3.2.8 Preparación de Pu 400 mg de extracto de uva obtenidos en el CIAL se disolvió en 10 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) al 8% y se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La dilución obtenida se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se cogió con una pipeta y se esterilizó mediante filtración con un filtro de membrana de 0,22 mm (Sarstedt, Nümbrecht, Germany) Posteriormente, se hicieron alícuotas de 1 ml en tubos eppendorf. 3.2.9 Preparación de SCOM 400 mg de SCOM (Laboratorios GSN, Madrid) se disolvió en 10 ml de agua destilada y se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La dilución obtenida se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se cogió con una pipeta y se esterilizó mediante filtración con un filtro de membrana de 0,22 mm (Sarstedt, Nümbrecht, Germany). Posteriormente, se hicieron alícuotas de 1 ml en tubos Eppendorf 3.2.10 Preparación del Resveratrol 1 400 mg de R1 obtenidos en el CIAL se disolvió en 10 ml de agua destilada y se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La dilución obtenida se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se cogió con una pipeta y se esterilizó mediante filtración con un filtro de membrana de 0,22 mm (Sarstedt, Nümbrecht, Germany) Posteriormente, se hicieron alícuotas de 1 ml en tubos eppendorf. 68 MATERIALES Y MÉTODOS 3.2.11 Preparación del Resveratrol 2 400 mg de R2 obtenidos en el CIAL se disolvió en 10 ml de agua destilada y se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La dilución obtenida se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se cogió con una pipeta y se esterilizó mediante filtración con un filtro de membrana de 0,22 mm (Sarstedt, Nümbrecht, Germany) Posteriormente, se hicieron alícuotas de 1 ml en tubos eppendorf. En la siguiente tabla se muestra la concentración final en mg/ml de los distintos compuestos puros y extractos: Compuestos puros C 40 mg/ml M 40 mg/ml G 40 mg/ml Q 13 mg/ml RE 8 mg/ml Tan 40 mg/ml Extractos GSE 5 mg/ml Pu 40 mg/ml SCOM 40 mg/ml R1 40 mg/ml R2 40 mg/ml 69 MATERIALES Y MÉTODOS 3.2.12 Conservación de los compuestos fenólicos. Los compuestos fenólicos se conservaron en eppendorf de 1 ml, congelados a - 20ºC, hasta que fueron utilizados. 3.3 ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO DE H. pylori. 3.3.1 Difusión en agar usando E-test. Se probaron los antibióticos amoxicilina, claritromicina, rifampicina, levofloxaciono, tetraciclina y metronidazol por E-test, y para ello se utilizaron tres placas de agar sangre; una para claritromicina y rifampicina, otra para metronidazol y levofloxacino y otra para amoxicilina y tetraciclina. La tira de E-test con 15 diluciones seriadas desde 0,016 µg/ml hasta 256 µg/ml para AMX, CLA, TET Y MET y desde 0,002 µg/ml hasta 32 µg/ml para LEV Y RIF, se colocó sobre la superficie de una placa de agar sangre previamente inoculada con una torunda empapada en un cultivo fresco de H. pylori de 48-72 horas, ajustado a un inóculo de concentración 3 MacFarland. El antibiótico difunde de forma inmediata desde el soporte hasta el agar, creándose de este modo, a lo largo de la tira, un gradiente exponencial de las concentraciones del antibiótico. Tras la incubación de las placas durante 3-5 días a 37ºC con 10% de CO2 y 95% de humedad, la concentración mínima inhibitoria (CMI) se calculó como el valor obtenido en el punto donde intersecciona el extremo de la elipse de inhibición con la tira de E-test. 70 MATERIALES Y MÉTODOS 3.3.2 Puntos de corte. Se siguieron los puntos de corte recomendados por EUCAST en el 2011 usando el método del E-test, que son los que se emplean actualmente (EUCAST, 2014). En nuestro estudio, usamos los puntos de corte actuales en las cepas anteriores al 2011. 3.4 ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE LOS GENES vacA Y cagA. 3.4.1 Extracción del DNA cromosómico de H. pylori. Se seleccionaron 53 cepas de H. pylori, se procedió a la extracción de su DNA y a realizar el estudio de la presencia de los genes vacA y cagA. La extracción del DNA se realizó utilizando un novedoso sistema de tarjeta. Se descongelaron los tubos con glicerina que contenía el microorganismo almacenado en el congelador a – 80 ºC. Antibiótico Punto de corte CMI (mg/L) NOTA S≤ R> 1. Los puntos de cortes están basados en valores epidemiológicos cut-off (ECOFFs), los cuales distingue los aislados salvajes de aquellos con sensibilidad reducida Amoxicilina 0,121 0,121 Claritromicina 0,251 0,51 Rifampicina 11 11 Levofloxacino 11 11 Tetraciclina 11 11 Metronidazol 11 11 71 MATERIALES Y MÉTODOS Se depositaron 20 µl de glicerina con el microorganismo en el círculo de la tarjeta whatman 2B BlackLight® Card (2B BlackBio, Biotools, Madrid, España). Estas tarjetas contienen productos químicos que conservan el DNA de la muestra durante 15 años a temperatura ambiente. Posteriormente, se recoge el DNA del microorganismo mediante un punzón, pinchando en el círculo. Este punzón permite perforar pequeños discos y equivale a 5 µl de extracto de DNA. 72 MATERIALES Y MÉTODOS 3.4.2 Detección del gen vacA. 3.4.2.1 Primers utilizados: vacA s Forward-5´ATG GAA ATA CAA CAA ACA CAC 3´Tm 54ºC vacA s Reverse-5´CCT GAG ACC GTT CCT ACA GC 3´ Tm 63ºC Que amplifica una secuencia de 176/200 pares de bases (pb) para vacA s1/s2. 3.4.2.2 Mastermix Se utilizó el kit comercial illustraTM puReTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare companies). Dicho kit contiene dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ± 2,5 unidades de pureTaq polimerasa y buffer de reacción que deben reconstituirse para conseguir un volumen final de 25 µl. Para ello, además de un disco de la tarjeta con ADN, son necesarios 24 microlitros de una mezcla compuesta por: Volumen para cada muestra Concentración final en la Mastermix Primer vacA s Forward 0,625 µl 0,5 µM Primer vacA s Reverse 0,625 µl 0,5 µM Agua 22,75 µl - La reacción se llevó a cabo en el termociclador PCR Express GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer). 73 MATERIALES Y MÉTODOS 3.4.2.3 Condiciones de la PCR: Condiciones de la PCR vacA s Pasos Temperatura ºC Tiempo Número de ciclos Desnaturalización inicial 94 5 minutos 1 Desnaturalizacion 94 45 segundos 30 Hibridación 52 45 segundos Extensión 72 45 segundos Extensión final 72 7 minutos 1 Temperatura final de mantenimiento 4ºC. 3.4.2.4 Revelado de la PCR por electroforesis en gel de agarosa. Se utilizaron geles de agarosa (Roche Diagnostics) al 2% en TBE-buffer (Merck KGaA) y como marcador de peso molecular se empleó el 50 pb ladder (Novagen). 3.4.3 Detección del gen cagA. 3.4.3.1 Primers utilizados: cagA Forward-5´ATA ATG CTA AAT TAG ACA ACT TGA GCA A 3´ Tm 63ºC cagA Reverse- 5´TTA GAA TAA TCA ACA AAC ATC ACG CCA T 3´ Tm 63ºC Que amplifica una secuencia de 297 pares de bases (pb). 74 MATERIALES Y MÉTODOS 3.4.3.2 Mastermix. Se utilizó el kit comercial illustraTM puReTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare companies). Dicho kit contiene dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ±2,5 unidades de pureTaq polimerasa y buffer de reacción que deben reconstituirse para conseguir un volumen final de 25 µl. Para ello, además de un disco de la tarjeta con ADN, son necesarios 24 microlitros de una mezcla compuesta por: Volumen para cada muestra Concentración final en la Mastermix Primer cagA Forward 0,375 µl 0,3 µM Primer cagA Reverse 0,375 µl 0,3 µM Agua 23,25 µl - La reacción se llevó a cabo en el termociclador PCR Express GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer). 3.4.3.3 Condiciones de la PCR: Condiciones de la PCR cagA Pasos Temperatura ºC Tiempo Número de ciclos Desnaturalización inicial 94 2 minutos 1 Desnaturalizacion 94 1 minuto 38 Hibridación 60 1 minuto Extensión 72 1 minuto Extensión final 72 5 minutos 1 Temperatura final de mantenimiento 4ºC. 75 MATERIALES Y MÉTODOS 3.4.3.4 Revelado de la PCR por electroforesis en gel de agarosa. Se utilizaron geles de agarosa (Roche Diagnostics) al 2% en TBE-buffer (Merck KGaA) y como marcador de peso molecular se empleó el 50 pb ladder (Novagen). 3.5 ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE DIFUSIÓN EN AGAR. Se utilizaron discos blancos que se impregnaron con 10 µl de compuesto fenólico. Se usaron 9 discos para cada uno de los siguientes compuestos: extracto de semilla de uva (GSE), extracto de uva, catequina, metil galato, resveratrol 1, resveratrol 2, quercetina y resveratrol puro. El disco con el compuesto fenólico se colocó sobre la superficie de la placa inoculada con cultivo fresco de H. pylori, de la misma forma que para la sensibilidad a antibiótico. El compuesto difunde a través del agar, originándose concentraciones del mismo cada vez menores a medida que el agar está más alejado del disco. Si el microorganismo es sensible al compuesto del disco, no se produce crecimiento, lo que se traduce en la aparición de un halo de inhibición alrededor del disco. El diámetro de 76 MATERIALES Y MÉTODOS este halo es proporcional a la sensibilidad del microorganismo probado. La lectura se realiza midiendo el diámetro del halo en milímetros. Los discos blancos se conservaron a 2-8ºC protegidos de la humedad. 3.6 ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS FRENTE A H. pylori. 3.6.1 Curvas de muerte. Es un método cinético de determinación del poder bactericida. Se valora la capacidad de matar en relación con el tiempo y con distintas concentraciones fijas de antimicrobiano enfrentando un inóculo normalizado a concentraciones fijas de antimicrobiano en un caldo. El poder bactericida se determina en la caída de 3 logaritmos decimales en un tiempo determinado. En nuestro estudio se eligieron los siguientes compuestos fenólicos: Extracto de semilla de uva (GSE), el extracto de semilla de uva (SCOM), Resveratrol 1 y Resveratrol 2 y como microorganismos usamos 2 aislamientos clínicos de H. pylori y la cepa secuenciada HP 146128 a concentración 3 MacFarland, con las siguientes características de sensibilidad y patogenicidad. La concentración de los distintos compuestos fenólicos se encuentra en el apartado 3.2 de este trabajo. CEPA CLARITROMICINA METRONIDAZOL vacA cagA 3166912 S S s2 neg. 3177553 R S s1 neg. HP 146128 S R s2 neg. 77 MATERIALES Y MÉTODOS Se usaron placas de 24 pocillos con capacidad de 2 ml cada uno, por cada cepa de H. pylori se usaron 5 pocillos. Todos contenían caldo compuesto por BHI suplementado con 10% de suero fetal bovino, extracto de levadura a concentración 5g/l, 20 mg/L de Ca2+ y 12,5 mg/L de Mg2+ y H. pylori a concentración 3 MacFarland, posteriormente se añadió 40 µl de cada uno de los compuestos fenólicos a 4 pocillos distintos y el quinto se dejó como control de crecimiento del H. pylori. La placa se incubó en estufade CO2 a 37ºC y a horas predeterminadas (0, 16h, y 24 h) se depositaron 100 µl en una placa de micropocillos en la que se realizaron diluciones seriadas 1:10 para realizar recuento del número de colonias. En una placa de agar sangre dividida en 8 porciones se depositaron 10 µl procedentes de cada pocillo conteniendo diferentes diluciones. Se incubaron a 37ºC durante 3-5 días, para posteriormente realizar el recuento de colonias viables, y los resultados se representaron en una gráfica con el logaritmo del número de ufc/ml (eje Y) respecto a tiempo (número de horas, eje X). 78 MATERIALES Y MÉTODOS 3.6.2 Concentración mínima inhibitoria (CMI). La CMI es la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de su incubación. La CMI es importante en diagnósticos de laboratorio para confirmar la resistencia de microorganismos a un agente antimicrobiano y además para monitorizar la actividad de los nuevos agentes antimicrobianos. La CMI puede ser determinada mediante métodos de microdilución en caldo, normalmente siguiendo las directrices de centros de referencia tales como el CLSI, BSAC o EUCAST. En nuestro estudio utilizamos los siguientes compuestos fenólicos, que fueron el mayor número de compuestos que nos pudieron proporcionaron el CIAL para obtener una mayor visión de cómo actuaban: GSE, extracto de uva, catequina, metil galato, galico, Resveratrol 1, Resveratrol 2, quercetina, Resveratrol puro, y taninos, y como microorganismos usamos 3 aislamientos clínicos de H. pylori a concentración 3 MacFarland, con las siguientes características de sensibilidad y patogenicidad. CEPA CLARITROMICINA METRONIDAZOL vacA cagA 3180768 R R s2 neg. 3181005 R S s2 neg. 3181006 S R s1 pos. Para la realización de la microdilución, preparamos caldo compuesto por BHI suplementado con 10% de suero fetal bovino, extracto de levadura a concentración 5g/l, 2 µl/ml de Ca2+ y 1 µl/ml de Mg2+. El microorganismo se diluyó en el caldo preparado a una concentración de 3 MacFarland. Se preparó 1 ml de los distintos compuestos 79 MATERIALES Y MÉTODOS fenólicos disueltos en el caldo anterior, hasta conseguir una concentración final de 2048 µg/ml. En el primer pocillo de una placa microtiter, se añadió 200 µl de compuesto fenólico a la concentración de 2048 µg/ml y en el resto de los pocillos se añadió 100 µl de caldo BHI preparado anteriormente. A continuación, se realizó diluciones seriadas 1:2 de cada compuesto y se añadió 100 µl de H. pylori 3 MacFarland a cada pocillo. Se incluyó un pocillo como control de esterilidad (sólo con caldo) y otro como control de crecimiento (caldo y H. pylori). Se incubó de 5 a 7 días, y se leyó según la turbidez observada en los pocillos. 3.6.3 Estudio del daño de membrana mediante yoduro de propidio. 3.6.3.1. Preparación del yoduro de propidio. Se pesó 2 mg de yoduro de propilo y se disolvió en 1 ml de PBS. Esta solución puede mantenerse 1 mes a la temperatura de 4ºC. 3.6.3.2. Protocolo. Para este estudio utilizamos los siguientes compuestos fenólicos: GSE, catequina, metil galato, galico, Resveratrol 1, Resveratrol 2, quercetina, Resveratrol puro y SCOM y como microorganismos usamos 4 aislamientos clínicos de H. pylori y la cepa secuenciada HP 146128 a concentración 3 MacFarland, con las siguientes características de sensiblidad y patogenicidad. CEPA CLARITROMICINA METRONIDAZOL vacA cagA 80 MATERIALES Y MÉTODOS 3167664 S S s1 neg. 3166912 S S s2 neg. 3175144 S R s2 neg. 3177553 R S s2 neg. HP 146128 S R s2 neg. Para la realización de este estudio, se preparó caldo compuesto por BHI suplementado con 10% de suero fetal bovino, extracto de levadura a concentración 5g/l, 2 µl/ml de Ca2+ y 1 µl/ml de Mg2+. El microorganismo se diluyó en el caldo preparado a una concentración de 3 MacFarland. Se prepararon 8 tubos eppendorf de 1 ml para cada uno de los microorganismos, a los que se le añadió 1 ml de microorganismo a la concentración de 3 MacFarland y 40 µl compuesto fenólico (un compuesto para cada eppendorf). Se centrifugaron todos los tubos a 1300 rpm durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y posteriormente se añadió 1 ml de PBS. Esta operación se realizó dos veces más. Posteriormente se resuspendió la solución y se añadió 1 µl de yoduro de propidio a una concentración de 2mg/ml. Se almacenaron durante 10 minutos en la oscuridad. A continuación, se centrifugaron todos los eppendorf a 1300 rpm durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y se añadió 1 ml de PBS. Esta operación se realizó dos veces más. Posteriormente se resuspendió la solución y se depositaron 100 µl de cada uno de los tubos en una placa de microtiter, donde se medió la fluorescencia en un lector de microplacas Biotek Synergy HT Multi-Mode con una longitud de onda de excitación de 495 nm y una longitud de onda de emisión de 615 nm. Los datos de fluorescencia para cada muestra fueron normalizados con la densidad óptica a 600 nm. 3.6.4. Estudio sobre el efecto proteínico en H. pylori mediante MALDI-TOF. 81 MATERIALES Y MÉTODOS Para este estudio utilizamos los siguientes compuestos fenólicos: GSE, Resveratrol 1, Resveratrol 2, y SCOM y como microorganismos usamos 3 aislamientos clínicos de H. pylori a concentración 3 MacFarland, con las siguientes características de sensibilidad y patogenicidad: CEPA CLARITROMICINA METRONIDAZOL vacA cagA 3167664 S S s1 neg. 3166912 S S s2 neg. 3175144 S R s2 neg. 3.6.4.1 Extracción de la muestra. Se prepararon 4 tubos eppendorf para cada uno de los microorganismos, a los que se le añadió 1 ml de microorganismo a la concentración de 3 MacFarland y 40 µl compuesto fenólico (un compuesto para cada eppendorf). El tubo con 1 ml de la solución de H. pylori y 3 MacFarland y compuesto fenólico se centrifugó a 14000 rpm durante 1 minuto, se eliminó el sobrenadante utilizando una pipeta, se le añadió 1 ml de PBS y se agitó en vórtex. Esta operación se realizó 3 veces. Se cogió 300 µl de la solución final y se le añadió 900 µl de etanol y se agitó en vortex. Se centrifugó a 14000 rpm durante 1 minuto, se eliminó el sobrenadante utilizando una pipeta y se añadió un volumen de ácido fórmico al 70% proporcional al tamaño del sedimento. Se agitó intensamente en vórtex y se añadió el mismo volumen de acetonitrilo que de ácido fórmico al 70%. Se centrifugó a 14000 rpm durante 1 minuto y se analizó el sobrenadante. 3.6.4.2 Analisis. 82 MATERIALES Y MÉTODOS Se depositó 1 µl del sobrenadante en una placa metálica MALDI (Bruker Daltonics, Bremen, Germany), que se dejó secar completamente. Posteriormente se añadió 1 µl de Matriz HCCA y se dejó secar completamente. La identificación de la bacteria se realizó mediante la obtención de espectros que fueron comparados con una base de datos (Biotyper). La identificación se dio valida cuando obtuvo un score mayor o igual a 2. Los espectros fueron obtenidos con un Microflex LT espectrómetro de masas, que se analizó con un software Bruker Daltonics Biotyper 3.0, que permitió obtener el índice de correlación (CCI). Este índice permite hacer análisis estádisticos, para el estudio de la relación entre espectros. 3.7 ESTUDIO ESTADÍSTICO. Los datos se analizaron utilizando el programa estadístico IBM SPSS Statics 20.0 para Mac. Para evaluar el grado de asociación entre variables cualitativas entre sí se utilizó el estadístico Chi cuadrado, considerándose una diferencia estadísticamente significativa cuando p≤ 0.05. La comparación de medias cuantitavas se realizó usando el estadístico t-student, previa comprobación de igualdad de varianzas mediante el test de Levene. Se consideró una diferencia estadísticamente significativa cuando p≤ 0.05. 83 RESULTADOS RESULTADOS 84 RESULTADOS 4.1 ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO DE H. pylori. 4.1.1 Sensibilidad global a antibióticos Los datos de sensibilidad global a amoxicilina, claritromicina, rifampicina, levofloxacino, tetraciclina y metronidazol, se muestra en la tabla 4.1 y figura 4.1. ANTIBIÓTICO Nº TOTAL DE AISLAMIENTOS RESISTENTES n (%) SENSIBLES n (%) AMOXICILINA 435 58 (13,3%) 377 (86,7%) CLARITROMICINA 436 230 (52,8%) 206 (47,2%) RIFAMPICINA 420 130 (31%) 290 (69%) LEVOFLOXACINO 397 26 (6,5%) 371 (93,5%) TETRACICLINA 431 3 (0,7%) 428 (99,3%) METRONIDAZOL 435 150 (34,5%) 285 (65,5%) Tabla 4.1. Número y porcentaje de cepas sensibles y resistentes a los 6 antibióticos probados. Fig 4.1. Porcentajes de resistencia y sensiblidad a AMX, CLA, RIF, LEV, TET y MET por difusión en agar con E-test. 47% 53% Claritromicina S R 87% 13% Amoxicilina S R 69% 31% Rifampicina S R 93% 7% Levofloxacino S R 99% 1% Tetraciclina S R 65% 35% Metronidazol S R 85 RESULTADOS 4.1.2 Sensibilidad a antibióticos según la edad. Se agruparon a los pacientes en 3 grupos según la edad: de 0 a 10 años, de 11 a 17 años y mayor de 18 años. Para amoxicilina hubo 28 cepas resistentes (15,7%) y 150 sensibles (84,3%) en niños de 0 a 10 años, entre 11 y 17 años, hubo 17 cepas resistentes (12,7%) y 117 cepas sensibles (87,3%) y para mayores o igual a 18 años hubo 10 resistentes (26,3%) y 28 sensibles (73,7%). Para claritromicina, en niños de 0 a 10 años hubo 99 cepas resistentes (55,3%) y 80 cepas sensibles (44,7%), entre 11 y 17 años hubo 63 resistentes (47%) y 71 sensibles (53%) y en mayores o igual a 18 años hubo 25 resistentes (65,8%) y 13 sensibles (34,2%). Para rifampicina, en niños de 0 a 10 años hubo 59 cepas resistentes (33,3%) y 118 cepas sensibles (66,7%), entre 11 y 17 años hubo 26 resistentes (20,3%) y 102 sensibles (79,7%) y en mayores o igual a 18 años hubo 17 resistentes (47,2%) y 19 sensibles (52,8%). Para levofloxacino, en niños de 0 a 10 años hubo 4 cepas resistentes (2,7%) y 142 cepas sensibles (97,3%), entre 11 y 17 años hubo 5 resistentes (4,9%) y 98 sensibles (95,1%) y en mayores o igual a 18 años hubo 6 resistentes (26,1%) y 17 sensibles (73,9%). Para tetraciclina, en niños de 0 a 10 años hubo 1 cepas resistente (0,6%) y 176 cepas sensibles (99,4%), entre 11 y 17 años no hubo ninguna cepa resistente, hubo 133 cepas sensibles y en mayores o igual a 18 años hubo 1 resistente (2,6%) y 37 sensibles (97,4%). Para metronidazol, en niños de 0 a 10 años hubo 72 cepas resistentes (40%) y 108 cepas sensibles (60%), entre 11 y 17 años hubo 39 resistentes (29,1%) y 95 86 RESULTADOS sensibles (70,9%) y en mayores o igual a 18 años hubo 23 resistentes (60,5%) y 15 sensibles (39,5%). (Fig 4.2). Fig 4.2. Porcentaje de resistencia y sensibilidad a AMX, CLA, RIF, LEV, TET y MET. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0-10 años 11-17 años >= 18 años P o rc e n ta je Amoxicilina R S p=0,125 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0-10 años 11-17 años >= 18 años P o rc e n ta je Claritromicina R S p=0,091 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0-10 años 11-17 años >= 18 años P o rc e n ta je Rifampicina R S p=0,003 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0-10 años 11-17 años >= 18 años P o rc e n ta je Levofloxacino R S p=<0,001 87 RESULTADOS 4.1.3 Sensibilidad a antibióticos según el sexo. De las 439 cepas estudiadas, 227 correspondían a mujeres (51,7%) y 212 a hombres (48,3%). La sensibilidad global a amoxicilina, claritromicina, rifampicina, levofloxacino, tetraciclina y metronidazol según el sexo, se muestra en la tabla 4.2 y en la figura 4.3. ANTIBIOTICO SEXO nº R (%) nº S (%) p AMOXICILINA MUJERES 25 (11,1%) 201 (88,9%) 0,147 HOMBRES 33 (15,8%) 176 (84,2%) CLARITROMICINA MUJERES 123 (54,2%) 104 (45,8%) 0,532 HOMBRES 107 (51,2%) 102 (48,8%) RIFAMPICINA MUJERES 68 (31,3%) 149 (68,7%) 0,860 HOMBRES 62 (30,5%) 141 (69,5%) LEVOFLOXACINO MUJERES 10 (6,4%) 146 (93,6%) 0,795 HOMBRES 10 (6,9%) 135 (93,1%) TETRACICLINA MUJERES 1 (0,4%) 223 (99,6%) 0,517 HOMBRES 2 (1%) 205 (99%) METRONIDAZOL MUJERES 74 (32,7%) 152 (67,3%) 0,427 HOMBRES 76 (36,4%) 133 (63,6%) Tabla 4.2. Número y porcentaje de cepas resistentes y sensibles a cada antibiótico en hombres y mujeres. 88 RESULTADOS Fig 4.3. Porcentaje global de resistencia (R) a AMX, CLA, RIF, LEV, TET y MET según el sexo 4.1.4 Resistencia a antibióticos por cada año del estudio. a) Resistencia global. Si miramos cada año del estudio, desde 2010 hasta 2013, con datos globales, la resistencia a amoxicilina en el año 2010 fue del 20,2%, en 2011 del 14,3%, en 2012 del 5,2 y en 2013 del 10,3%. Para claritromicina, la resistencia en 2010 fue del 53,9%, en 2011 del 58%, en 2012 del 50,6% y en 2013 del 47,9%. Para rifampicina, la resistencia en 2010 fue del 25,8%, en 2011 del 33,9%, en 2012 del 27,6% y en 2013 del 36,1%. Para levofloxacino, la resistencia en 2010 fue del 5%, en 2011 del 9%, en 2012 del 8,3% y en 2013 del 5,9%. Para tetraciclina, la resistencia en 2010 fue del 0,8%, en 2011 del 0%, en 2012 del 1,3% y en 2013 del 0,9%. Para metronidazol, la resistencia en 2010 fue del 38,3%, en 2011 del 33%, en 2012 del 31,6% y en 2013 del 33,6%. (Fig 4.4). 0 10 20 30 40 50 60 AMX CLA RIF LEV TET MET P o rc e n ta je Mujeres Hombres 89 RESULTADOS Fig 4.4. Porcentaje de resistencia global a AMX, CLA, RIF, LEV, TET y MET. Aunque se observa una disminución de la resistencia para amoxicilina, claritromicina y metronidazol, sólo fue estadísticamente significativo con amoxicilina (p<0,01) b) Resistencia según la edad. Separando los datos por años en cuanto a la edad, en los niños la evolución de la resistencia a amoxicilina en el año 2010 fue del 20,7%, en 2011 del 13,2%, en 2012 del 3,6% y en 2013 del 14%. Para claritromicina, la resistencia en 2010 fue del 50,4%, en 2011 del 57,1%, en 2012 del 43,9% y en 2013 del 54%. Para rifampicina, la resistencia en 2010 fue del 24,8%, en 2011 del 34,1%, en 2012 del 23,6% y en 2013 del 28,3%. Para ciprofloxacino, la resistencia en 2010 fue del 0,9%, en 2011 del 4,4%, en 2012 del 8,7% y en 2013 del 4,7%. Para tetraciclina, la resistencia en 2010 fue del 0,9%,y en p=0,007 p=0,232 p=0,232 p=0,607 p=0,707 p=0,433 90 RESULTADOS 2011, 2012 y 2013 del 0%. Para metronidazol, la resistencia en 2010 fue del 34,8%, en 2011 del 33%, en 2012 del 36,8% y en 2013 del 39,2%. (Fig 4.5). Fig 4.5. Porcentaje de resistencia por años a AMX, CLA, RIF, LEV, TET y MET en aislamientos de H. pylori obtenidos de niños. En niños hay una disminución estadísticamente significativa de la resistencia a amoxicilina (p<0,05), sin embargo, se observa un aumento de la resistencia para levofloxacino, aunque no es estadísticamente significativo. En los adultos, la resistencia a amoxicilina en el año 2010 fue del 14,3%, en 2011 del 33,3%, en 2012 del 20% y en 2013 del 26,7%. Para claritromicina, la resistencia en 2010 fue del 85,7%, en 2011 del 66,7%, en 2012 del 80% y en 2013 del 53,3%. Para rifampicina, la resistencia en 2010 fue del 16,7%, en 2011 del 33,3%, en 2012 del 40% y en 2013 del 71,4%. Para levofloxacino, la resistencia en 2010 fue del p=0,043 p=0,939 p=0,856 p=0,071 p=0,3 p=0,555 91 RESULTADOS 28,6%, en 2011 del 33,3%, en 2012 del 25% y en 2013 del 33,3%. Para tetraciclina, la resistencia en 2010 fue del 0%, en 2011 del 0%, en 2012 del 0% y en 2013 del 6,7%. Para metronidazol, la resistencia en 2010 fue del 85,7%, en 2011 del 50%, en 2012 del 60% y en 2013 del 60%. (Fig 4.6). Fig 4.6. Porcentaje de resistencia por años a AMX, CLA, RIF, LEV, TET y MET en aislamientos de H. pylori obtenidos de adultos. Se observa un aumento estadísticamente significativo de la resistencia a rifampicina en adultos. 4.2 ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE LOS GENES vacA y cagA. 4.2.1 Presencia de los alelos s1 y s2 del gen vacA. La secuencia señal del gen vacA se presentó como forma s1 en el 18,9% de las cepas probadas (10 de 53 probadas), mientras que el 81,1% de las cepas (43 de 53 probadas) presentaban el alelo s2 (Fig 4.7). p=0,801 p=0,178 p=0,020 p=0,903 p=0,272 p=0,537 92 RESULTADOS Fig. 4.7. Presencia de los alelos s1 y s2 del gen vacA 4.2.2 Presencia del gen cagA. El 18,9 % de las cepas presentaron el gen cagA (10 de 53 probadas cagA+). El 81,1% no lo presentaron (43 de 53 probadas cagA-). (Fig. 4.8). Fig 4.8. Presencia del gen cagA. 18,9% 81,1% vacA s1 vacA s2 18,9% 81,1% cagA + cagA - 93 RESULTADOS 4.2.3. Relación entre la presencia del gen vacA y el gen cagA. En la tabla 4.3 se muestra el número y el porcentaje de cepas con gen vacA y cagA (Fig 4.9): vacA s1 n (%) vacA s2 n (%) p cagA - 4 (9,3) 39 (90,7%) <0,001 cagA+ 6 (60) 4 (40) Odd: 0,068 IC95%:0,013-0,349 Tabla 4.3. Número y porcentaje de cepas con gen vacA y cag A. Fig 4.9. Relación entre los genes vacA y cagA. 4.2.4 Relación entre los alelos del gen vacA y la edad. De las 53 cepas a las que se le hizo el estudio de la presencia de los alelos del gen vacA, 27 correspondieron a niños entre 0 y 10 años, 23 cepas correspondieron a adolescentes entre 11 y 17 años, 2 a adultos y una se desconocía la edad. 0 20 40 60 80 100 cagA + cagA - 60 9,3 40 90,7 P o rc e n ta je vacA s1 vacA s2 94 RESULTADOS En los niños con edades comprendidas entre 0 y 10 años, de las 27 cepas con presencia del gen vacA, 5 correspondieron al alelo s1 (18,5% de las cepas vacA s1) y 22 al alelo s2 (81,5% de las cepas vacA s2). En los adolescentes con edades comprendidas entre 11 y 17 años, de las 23 cepas con presencia del gen vacA, 5 correspondieron al alelo s1 (21,7% de las cepas vacA s1) y 18 al alelo s2 (78,3% de las cepas vacA s2). En los adultos, las dos cepas correspondieron al alelo s2 (100% de las cepas vacA s2). (Fig 4.10). Fig 4.10. Relación entre los alelos del gen vacA y la edad. 4.2.5 Relación entre la presencia del gen cagA y la edad. En los niños con edades comprendida entre 0 y 10 años, de las 27 cepas estudiadas, 3 presentaron el gen cagA (11,1% de las cepas cagA+) y 24 no (88,9% de las cepas cagA-). 0 20 40 60 80 100 0-10 años 11-17 años >= 18 años 18,5 21,7 0 81,5 78,3 100 P o rc e n ta je vacA s1 vacA s2 p=0,749 95 RESULTADOS En los adolescentes con edades comprendida entre 11 y 17 años, de las 23 cepas estudiadas, 7 presentaron el gen cagA (30,4% de las cepas cagA+) y 16 no (69,6% de las cepas cagA-). En los adultos, las dos cepas no presentaron el gen cagA (100% de las cepas cagA-). (Fig 4.11). Fig 4.11. Relación entre el gen cagA y la edad. 4.3 ESTUDIO DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS. 4.3.1 Halos de inhibición Se estudiaron los halos producidos en 21 cepas de H. pylori . Para el extracto de semilla de uva (GSE), se observó un halo mínimo de 6 mm y un halo máximo de 18 mm, para el extracto de uva, el halo mínimo fue de 13 mm y el máximo de 33, para la catequina el mínimo fue de 11 y el máximo de 48 para metil galato el mínimo fue de 21 0 20 40 60 80 100 0-10 años 11-17 años >= 18 años 11,1 30,4 0 88,9 69,6 100 cagA+ cagA- p=0,175 96 RESULTADOS y el máximo de 56, para el resveratrol 1, el mínimo fue de 6 y el máximo de 30, y para el resveratrol 2 el mínimo fue de 6 y el máximo fue de 31. Con quercetina y resveratrol puro se estudiaron 20 cepas, siendo el halo mínimo de quercetina de 14 y el máximo de 27 y para el resveratrol puro el mínimo fue de 6 y el máximo de 24 (Fig 4.12) (Fig 4.13). Fig 4.12. Diagrama de caja de los halos producidos por GSE, Pu, C, M, R1, R2, Q y RE. Fig 4.13. Placa de agar sangre con discos inoculados con compuesto fenólico. Se observa el crecimiento de H.pylori y el halo de inhibición. 97 RESULTADOS 4.3.2 Relación entre los alelos del gen vacA y los halos producido por los compuestos fenólicos. En la tabla 4.4 se muestra los halos medios producidos en mm por los compuestos: GSE, Pu, C, M, R1, R2, Q y RE, en las cepas vacA s1 y vacA s2 (Fig 4.14). COMPUESTO Cepas vacA s1 media(DS) Cepas vacA s2 media(DS ) p IC (95%) GSE 10 (5,7) 11,7 (3,9) 0,625 -4,73 a 7,27 Pu 19,5(0,7) 22,2(5,7) 0,039 -6,34 a 10,65 C 20,5(6,4) 26,9(12,7) 0,125 -13,01 a 24,85 M 41,5(3,5) 43,2(7,3) 0,379 -9,99 a 11,84 R1 9,5(4,9) 16,2(7,5) 0,442 -4,41 a 17,95 R2 27,5(16,2) 16,71(7,9) 0,142 -23,54 a 1,85 Q 16(1,4) 17,13(5,5) 0,277 -7,23 a 9,23 RE 23,5(12,0) 13,8(6,5) 0,245 -20,02 a 0,71 Tabla 4.4. Valor medio y desviaciones estándar de los halos de inhibición en cepas según el gen vacA en mm. Fig 4.14. Relación entre los alelos del gen vacA y los halos producido por GSE, Pu, C, M, R1, R2, Q y RE. 0 10 20 30 40 50 GSE Pu C M R1 R2 Q RE 10 19,5 20,5 41,5 9,5 27,5 16 23,5 11,71 20,5 26,92 43,21 16,29 16,71 17,13 13,83 m m vacA s1 vacA s2 98 RESULTADOS 4.3.3 Relación entre la presencia del gen cagA y los halos producido por los compuestos fenólicos. En la tabla 4.5 se muestra los halos medios producidos en mm por los compuestos: GSE, Pu, C, M, R1, R2, Q y RE, en las cepas cagA+ y cagA- (Fig 4.15). Tabla 4.5. Valor medio de los halos de inhibición en cepas según el gen cagA. Fig 4.15. Relación entre la presencia del gen cagA y los halos producido por GSE, Pu, C, M, R1, R2, Q y RE. 0 10 20 30 40 50 GSE Pu C M R1 R2 Q RE 10,75 20,5 24 43,25 12,5 22 14,75 14,75 11,73 22,27 26,86 43,05 16,36 16,73 17,45 14,55 m m cagA+ cagA- COMPUESTO Cepas cagA- media(DS) Cepas cagA+ media(DS) p IC(0,95%) GSE 11,3(3,9) 10,8(3,9) 0,906 -4,93 a 3,93 Pu 21,7 (5,8) 20,5(4,7) 0,313 -7,43 a 5,09 C 26,9(12,8) 24(11,6) 0,450 -16,34 a 11,68 M 43(7,6) 43,25(3,775) 0,239 -6,99 a 9,07 R1 16,4(7,6) 12,5(6,9) 0,708 -12,16 a 4,49 R2 16,7(8,1) 22(12,2) 0,426 -4,31 a 14,98 Q 17,5(5,7) 14,78(2,0) 0,180 -8,54 a 3,43 RE 14,5(6,4) 14,7 (12,3) 0,117 -7,95 a 8,41 99 RESULTADOS 4.3.4 Relación entre la resistencia a claritromicina y los halos producidos por los compuestos fenólicos. En la tabla 4.6 se muestra los halos medios en mm producidos por los compuestos: GSE, Pu, C, M, R1, R2, Q y RE en las cepas sensibles y resistentes a claritromicina (Fig 4.16). Tabla 4.6. Valor medio de los halos de inhibición en cepas sensibles y resistentes a claritromicina. Fig 4.16. Relación entre la resistencia a claritromicina y los halos producidos por GSE, Pu, C, M, R1, R2, Q y RE. 0 20 40 60 GSE Pu C M R1 R2 Q RE 11,6 21,7 31,1 43,4 15,8 18,9 17,3 14,75 12 23 27,7 40,2 19,64 19,36 20 13,2 S R COMPUESTO Sensible media(DS) Resistente media(DS) p IC(0,95%) GSE 11,6 (4,3) 12 (3,8) 0,781 -3,28 a 4,10 Pu 21,7(5,0) 23 (6,2) 0,396 -3,87 a 6,47 C 31,1 (13,0) 27,7 (10,5) 0,619 -14,13 a 7,39 M 43,4 (5,4) 40,2 (8,1) 0,513 -13,61 a -0,83 R1 15,8 (7,5) 19,64 (7,3) 0,822 -12,90 a 10,58 R2 18,9 (4,8) 19,36 (7,2) 0,492 -5,22 a 6,15 Q 17,3 (3,1) 20,0 (4,8) 0,126 -1,09 a 6,49 RE 14,75(5,2) 13,2 (3,1) 0,192 -1,23 a 6,82 100 RESULTADOS 4.4 ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS FRENTE A H. pylori. 4.4.1 Curvas de muerte. Se estudió el efecto de 4 compuestos fenólicos (GSE, SCOM, R1 y R2) sobre 3 cepas de H. pylori que poseían diferentes características patogénicas y de sensibilidad antibiótica. Tras el recuento de colonias después de 3-5 días de incubación, se pudo comprobar que el efecto inhibitorio de los compuestos fenólicos se ejerce a las 24 horas de estar en unión con H. pylori y se obtuvieron los siguientes patrones de acción: 1. Los 4 compuestos fenólicos coincidieron con el mismo patrón de acción sobre la cepa 3177553. Al cabo de 24 horas, los compuestos fenólicos ejercieron su acción y disminuyeron el número de colonias de H. pylori hasta niveles por debajo del límite de detección, siendo todos bactericidas a las 24 horas (Fig 4.17). Fig 4.17. Patrón de curva de muerte para la cepa 3177553. Efecto de los compuestos fenólicos: GSE, SCOM, R1 y R2 en los tiempos 0 (t=0), 16 horas (t=16) y 24 horas (t=24). 1 10 100 1000 10000 100000 T=0 T=16 T=24 lo g u fc / m l horas GSE SCOM R1 R2 C+ 101 RESULTADOS En la tabla 4.7 se muestra el número de colonias y porcentajes de inhibición producidos por los compuestos GSE, SCOM, R1 y R2 para T=0, T=16 y T= 24h. COMPUESTO T=0 h T=16h T=24h GSE Nº colonias 6x103 1 x103 1 % de inhibición - 83,4 99,9 SCOM Nº colonias 6 x103 2 x103 1 % de inhibición - 66,6 99,9 R1 Nº colonias 9 x103 2 x103 1 % de inhibición - 77,7 99,9 R2 Nº colonias 8 x103 1 x103 1 % de inhibición - 87,5 99,9 Tabla 4.7. Número de colonias y porcentaje de inhibición a las 0, 16 y 24 horas. 2. En la cepa 3166912 de H. pylori, se observa acción inhibitoria producida por GSE y R2. Sin embargo, el compuesto SCOM y R1 tienen una actividad bactericida a las 24 horas (Fig 4.18). Fig 4.18. Patrón de curva de muerte para la cepa 3166912. Efecto de los compuestos fenólicos: GSE, SCOM, R1 y R2 en los tiempos 0 (t=0), 16 horas (t=16) y 24 horas (t=24). 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1E+09 1E+10 1E+11 T=0 T=16 T=24 lo g u fc / m l horas GSE SCOM R1 R2 C+ 102 RESULTADOS En la tabla 4.8 se muestra el número de colonias y porcentajes de inhibición producidos por los compuestos GSE, SCOM, R1 y R2 para T=0, T=16 y T= 24h. COMPUESTO T=0 h T=16h T=24h GSE Nº colonias 2x109 15x108 109 % de inhibición - 25 50 SCOM Nº colonias 5x1010 109 9x107 % de inhibición - 98 99,8 R1 Nº colonias 24x108 22x107 11x106 % de inhibición - 90,8 99,5 R2 Nº colonias 5x109 109 5x108 % de inhibición - 80 88 Tabla 4.8. Número de colonias y porcentaje de inhibición a las 0, 16 y 24 horas. 3. Con la cepa secuencia 146128, se observa acción inhibitoria con GSE, R1 y R2, sin embargo se observa acción bactericida con SCOM (Fig 4.19). Fig 4.19. Patrón de curva de muerte para la cepa 3166912. Efecto de los compuestos fenólicos: GSE, SCOM, R1 y R2 en los tiempos 0 (t=0), 16 horas (t=16) y 24 horas (t=24). 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1E+09 1E+10 1E+11 T=0 T=16 T=24 lo g u fc / m l horas GSE SCOM R1 R2 C+ 103 RESULTADOS En la tabla 4.9 se muestra el número de colonias y porcentajes de inhibición producidos por los compuestos GSE, SCOM, R1 y R2 para T=0, T=16 y T= 24h. COMPUESTO T=0 h T=16h T=24h GSE Nº colonias 14x109 12x109 12x109 % de inhibición - 14,3 14,3 SCOM Nº colonias 14x109 9x108 8x107 % de inhibición - 93,6 99,4 R1 Nº colonias 16x109 9x109 8x108 % de inhibición - 43,8 50 R2 Nº colonias 14x109 1010 16x108 % de inhibición - 28,6 88,6 Tabla 4.9.Número de colonias y porcentaje de inhibición a las 0, 16 y 24 horas. 4.4.2 Concentración mínima inhibitoria (CMI). a) Cepa 3180768 El compuesto más activo frente a esta cepa fue Pu, que mostró una CMI de 4 (μg/ml), seguido de GSE, RE y SCOM con una CMI de 8 (μg/ml). El compuesto menos activo fue el G, que mostró una CMI de 512 (μg/ml). (Fig 4.19). b) Cepa 3181005 El compuesto más activo frente a esta cepa fue el Pu con una CMI de 4 (μg/ml), seguido de Re con una CMI de 8 (μg/ml) y de GSE con una CMI de 16 (μg/ml). El compuesto menos activo fue la C y el G con una CMI de 256 (μg/ml). (Fig 4.19). c) Cepa 3181006 El compuesto más activo frente a esta cepa fue el Pu con una CMI de 4 (μg/ml), seguido de M con una CMI de 16 (μg/ml). El compuesto menos activo fue GSE con 104 RESULTADOS una CMI de 256 (μg/ml), seguido de R1 con una CMI de 128 (μg/ml). (Tabla 4.10) (Fig 4.20). Tabla 4.10. Concentración mínima inhibitoria de GSE, Pu, C, M, G, R1, R2, Q, Re, Tan y SCOM sobre 3 cepas de H. pylori. Fig 4.20. Representación gráfica de la concentración mínima inhibitoria de GSE, Pu, C, M, G, R1, R2, Q, Re, Tan y SCOM sobre 3 cepas de H. pylori. 1 10 100 1000 lo g C M I 3180768 3181005 3181006 CMI (μg/ml) C. FENÓLICO 3180768 3181005 3181006 GSE 8 16 256 Pu 4 4 4 C 128 256 64 M 64 128 16 G 512 256 64 R1 128 128 128 R2 64 64 64 Q 32 32 64 RE 8 8 32 Tan 64 128 64 SCOM 8 32 32 105 RESULTADOS 4.4.4 Estudio del daño de membrana mediante yoduro de propidio. En la tabla 4.11 se muestra los resultados de fluorescencia probados para las 5 cepas estudiadas. En la cepa 3177553, el R1 mostró una mayor actividad frente al H. pylori junto al SCOM. M mostró una menor actividad. En la cepa 3166912 el SCOM y Re mostraron una mayor actividad. El GSE mostró una menor actividad. En la cepa 3167664 el G y el SCOM mostraron una mayor actividad. El GSE mostró una menor actividad. En la cepa 3175144 el Re y C mostraron una mayor actividad. GSE mostró una menor actividad. En la cepa HP 146128, el SCOM y R1 mostraron una mayor actividad. El GSE mostró una menor actividad. GSE SCOM R1 R2 G Re C M 3177553 1,9x103 16x103 21x103 2,4x103 2,1x103 0,3x103 1,5x103 0,2x103 3166912 0,9x103 13x103 2,5x103 9,9x103 4,6x103 12x103 10x103 4,6x103 3167664 0,6x103 17x103 1,9x103 3,7x103 28x103 138x103 132x103 73x103 3175144 1,8x103 15x103 1,9x103 3,7x103 28x103 138x103 132x103 73x103 146128 0,3x103 20x103 18x103 4x103 0,6x103 15x103 1,8x103 3x103 Tabla 4.11. Fluorescencia resultante de restar la fluorescencia emitida (Femitida) menos la fluorescencia de la cepa sin estar sometido bajo la presencia del compuesto fenólico (Fcontrol) en tres 5 cepas de H. pylori. 4.4.5 Estudio sobre el efecto proteínico en H. pylori mediante MALDI-TOF. Todas las cepas de H. pylori fueron identificadas mediante MALDI-TOF con un score superior a 2. El índice de correlación (composite correlation index, CCI), indica la relación entre las cepas. En nuestro estudio lo utilizamos para ver la correlación entre la misma cepa sometida a distinta condición. Un valor bajo indica que hay menos similaridad 106 RESULTADOS entre las cepas bajo las mismas condiciones, así que el compuesto fenólico produce un mayor efecto sobre las proteínas de H. pylori. Los colores cálidos indican CCI más elevados y los colores fríos indican CCI más bajos. a) Cepa 3166912 Los valores de CCI correspondientes a la cepa 3166912 cuando se pone en contacto con SCOM, GSE, R1 y R2 son 0,6335; 0,4310; 0,5112; y 0,3823 respectivamente (Fig.4.21). Fig 4.21. CCI de la cepa 3166912 con GSE (3), SCOM (4), R1 (5), R2(1) y sin compuesto fenólico. 0,3823 0,4310 0,6335 0,5112 0,9110 107 RESULTADOS b) Cepa 3167664 Los valores de CCI correspondientes a la cepa 3167664 cuando se pone en contacto con SCOM, GSE, R1 y R2 son 0,8047; 0,8748; 0,8582; y 0,8070 respectivamente (Fig 4.22). Fig 4.22. CCI de la cepa 3167664 con GSE (1), SCOM (2), R1(3), R2(4) y sin compuesto fenólico. 0,8047 0,8748 0,8582 0,8070 0,9779 108 RESULTADOS c) Cepa 3175144 Los valores de CCI correspondientes a la cepa 3175144 cuando se pone en contacto con SCOM, GSE, R1 y R2 son 0,5573; 0,5641; 0,6148; y 0,6515 respectivamente (Fig 4.23). Fig 4.23. CCI de la cepa 3175144 con GSE (1), SCOM (2), R1(3), R2(4) y sin compuesto fenólico 0,5641 0,5573 0,6148 0,6515 0,9720 109 DISCUSIÓN DISCUSIÓN 110 DISCUSIÓN 5.1 ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO DE H. pylori. 5.1.1 Sensibilidad a amoxicilina. Amoxicilina es un antibiótico ß-lactámico incluido en la mayoría de los régimenes terapéuticos para erradicar H. pylori (Malfertheriner, 2012). El mecanismo de resistencia es debido a que interfiere en la síntesis de peptidoglucano por alteración en las PBPs (Megraud, 2007). En casi todos los estudios, los porcentajes de resistencia son bastante bajos, y estos datos parecen ser que son homogéneos en la mayoría de los estudios. No se han detectado resistencias en Croacia, Francia, Alemania, Holanda, Portugal o Suecia (Bago, 2002; Megraud, 2003; Wolle, 2002; Debets-Ossenkopp, 1999; Cabrita, 2000; Megraud, 1999). En Italia, se han descrito resistencias del 0% y 0,2% (Toracchio, 2003), y en el Reino Unido oscila entre el 0% y 0,4% (Parsons, 2001). En América y Oceania, también se han publicado resistencias insignificantes. Sin embargo, la tendencia contraria se ha descrito en Irán y Japón, con una resistencia del 28,6% (Milani, 2012) y 8,2%-15,2 % (Horiki, 2009), respectivamente. Sorprendentemente, hay un porcentaje de resistencia extremadamente alto (85,6%) en Cameroon (De francesco, 2010). En un estudio realizado en Cantabria, describen un porcentaje de resistencia en 2010 del 1,4% (Cuadrado-Lavín, 2012). Sin embargo, en nuestro estudio hemos observado un mayor porcentaje de resistencia (13,3%), siendo en el año 2010 del 20,2%. En una publicación anterior de nuestro grupo (Díaz-Regañón, 2006), los porcentajes de resistencia eran mucho más bajos. Sin embargo, este aumento puede deberse a la utilización de los nuevos puntos de corte de EUCAST, pues al utilizar un punto de corte más bajo, los porcentajes de resistencia han aumentado. 111 DISCUSIÓN 5.1.2 Sensibilidad a claritromicina La resistencia global a claritromicina en nuestro estudio fue del 52,8%, siendo en cepas de niños de 0 a 10 años del 55,3%, de adolescentes entre 11 y 17 años del 47% y de adultos del 65,8%. En el año 2010 obtuvimos una resistencia del 53,9%, en 2011 del 58%, en 2012 del 50,6% y en 2013 del 47,9%. Los macrólidos se han considerado antibióticos con una buena sensibilidad in vitro frente a H. pylori. El mecanismo de resistencia a claritromicina mejor conocido es la mutación en la secuencia de la región peptidiltransferasa 23S del ARN ribosómico: las tres mutaciones más frecuentes son A2143G, A2142G y A2142C, siendo responsable del 90% de casos de resistencia primaria en cepas de H. pylori en paises del occidente. En particular, la mutación A2143G confiere mayor nivel de resistencia que las otras dos (De Francesco, 2006). En paises del este de Asia, han publicado altos porcentajes de resistencia a claritromicina. El porcentaje más alto se ha encontrado en Japón (86,4%) en un estudio de la eficacia de este antibiótico en un régimen de tercera linea (Murakami, 2013). Hay que destacar, que en el mismo pais, se detectó un bajo porcentaje (15,2%) en un estudio de terapia de primera linea realizado unos años antes (Horiki, 2009). Con los datos obtenidos de diferentes artículos, DEAs y Tesis Doctorales realizados en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de La Princesa, hemos podido recoger datos de resistencia a claritromicina desde el año 1991 y hasta mediados del año 2005, y hemos comprobado la tendencia al aumento de forma importante. Partimos de sólo un 4,8% de resistencia en el año 1994 y, sin embargo, en el año 2005 esta tasa se situó en el 37%. En nuestro estudio podemos constatar cifras aún más altas que las descritas anteriormente, ya que en el año 2010 hubo un 53,9% de 112 DISCUSIÓN resistencias, en el 2011 hubo un 58%, en el 2012 un 50,6% y en el 2013 un 47,9%. Las diferencias observadas entre lo publicado previamente y lo obtenido en la actualidad puede deberse al hecho de que nosotros hemos incluido principalmente cepas procedentes de hospitales de Madrid, mientras que en los demás estudios se incluyeron cepas procedentes de otras provincias de España (Asturias, Almeria, etc). El hecho de que en Madrid la resistencia sea más alta coincide con los datos obtenidos en dos Tesis Doctorales en donde la resistencia a claritromicina era mucho mayor en la ciudad de Madrid en comparación con el norte, sur o este de España (De la Obra, 2002; Domingo, 1997). Los datos obtenidos desde 1991 nos indican un aumento muy importante de la resistencia a claritromicina tanto en cepas de niños como de adultos, ya que partimos de un 0% de resistencia en adultos en el año 1991 y de un 2,3% en niños en el año 1992, y llegamos a cifras del 30% en adultos y del 64% en niños en el año 2004. En nuestro estudio comprobamos que la resistencia a claritormicina en niños sigue siendo alta con un 55,3% de resistencias en niños de 0 a 10 años y un 47% de resistencias en niños entre 11 y 17 años. Sin embargo, en adultos observamos un aumento más acusado con un 65,8% de resistencias. En los datos obtenidos en una Tesis Doctoral, obtuvieron una resistencia a claritromicina en niños del 100% en el 2005 y en adultos del 40,9% (Díaz- Regañón, 2006). Se puede observar que ocurre lo contrario que en nuestro estudio, es posible que algunos de los niños estudiados en el 2005, estén incluidos en el grupo de adultos en 2010 y por eso se observe un menor porcentaje en niños y un mayor porcentaje en adultos desde el 2010 al 2013. Es posible que la resistencia vaya disminuyendo debido a la menor utilización del antibiótico por la tasa de resistencia tan elevada. 113 DISCUSIÓN Diferentes estudios reflejan tasas de resistencias a claritromicina en niños del 84,9% en China (Liu, 2011), seguido de un 50,9% en Vietnam (Rafeey, 2007). Las resistencias más bajas se observan en Bulgaria con un 13,9% (Boyanova, 2006). Nuestro estudio refleja que nos encontramos ante un pais con una de las resistencias más altas en niños. En un estudio europeo, donde estudiaron la resistencia de H. pylori en el año 2008-2009 (Megraud, 2012), han observado un aumento en la resistencia a claritromicina desde el 1998, hasta la fecha del estudio. Obtuvieron una tasa de resistencia a claritromicina en cepas de adultos del 17,5% y de niños del 31,8%. Los paises con mayor tasas de resistencia fueron Austria, Hungría y Portugal, con un porcentaje del 36,6; 33,3 y 31,5%. Según el consenso de Maastrichit (Wu, 2014), recomiendan no usar claritromicina en el tratamiento empírico, cuando la prevalencia de la resistencia es mayor al 20%. La alternativa a claritromicina, sería el uso de levofloxacino en tratamiento empírico, aunque el éxito de este tratamiento depende del nivel de resistencia a levofloxacino (Megraud, 2012). 5.1.3 Sensibilidad a rifampicina La rifampicina está normalmente indicada en el tratamiento de las infecciones por Mycobacterium, incluyendo la tuberculosis y la lepra; juega un papel en el tratamiento de Staphylococcus aureus meticilina-resitente (MRSA) en combinación con el ácido fucsídico. Se puede usar en la profilaxis para la prevención de meningitis de Neisseria meningitidis. Se puede usar también en el tratamiento de infección por Listeria, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae y Legionella pneumophila. Las indicaciones no estandarizadas deberían ser respaldadas por un antibiograma con sensibilidad http://es.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium http://es.wikipedia.org/wiki/Tuberculosis http://es.wikipedia.org/wiki/Lepra http://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus_resistente_a_la_meticilina http://es.wikipedia.org/wiki/MRSA http://es.wikipedia.org/wiki/Profilaxis http://es.wikipedia.org/wiki/Neisseria_meningitidis http://es.wikipedia.org/wiki/Listeria http://es.wikipedia.org/wiki/Neisseria_gonorrhoeae http://es.wikipedia.org/wiki/Neisseria_gonorrhoeae http://es.wikipedia.org/wiki/Haemophilus_influenzae http://es.wikipedia.org/wiki/Legionella_pneumophila 114 DISCUSIÓN demostrada. Dado el rápido desarrollo de resistencias, la rifampicina no debería ser usada en monoterapia. En el tratamiento de H. pylori se usa rifabutina, pero no existe E-test para probar este tratamiento in vitro, por lo que se prueba otro antibiótico de la misma clase, como la rifampicina. En nuestro estudio hemos observado un porcentaje de resistencias del 31%. Al hacer un estudio en cuanto a la edad, se observa que en niños entre 0-10 años la resistencia es del 33,3%, entre 11 y 17 años del 20,3% y en mayores de 18 años del 47,2%. Este ligero aumento del porcentaje en adultos, puede deberse a que las cepas hayan desarrollado resistencia, debido al uso de rifampicina por diferentes infecciones. En un estudio realizado en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de La Princesa en 2009, no obtuvieron ninguna cepa resistente a rifampicina (Agudo, 2009). El aumento de resistencia en la actualidad se puede deber a una disminución en el punto de corte, antiguamente el punto de corte que se usaba era CMI >32 resistente y < 32 sensible, a partir del 2011 comenzó a emplearse los puntos de corte del EUCAST donde >1 es resistente y < 1 sensible. En un estudio realizado en Alemania mostró una resistencia para rifampicina del 1,4%. La resistencia está asociada con mutaciones producidas en el gen rpoB (Glocker, 2007). 5.1.4 Sensibilidad a levofloxacino Levofloxacino es una quinolona de amplio espectro que es activo tanto para bacterias Gram-positivas como Gram-negativas. Actúa inhibiendo la DNA girasa, (o topoisomerasa tipo II) y la topoisomera IV (Drlica, 1997). La resistencia de H. pylori a 115 DISCUSIÓN fluorquinolonas es debida a una mutación puntual determinante de la región gyrA (Moore, 1995). Levofloxacino ha sido propuesto como tratamiento de segunda línea cuando falla la clásica terapia de primera línea (Malfertheriner, 2012). Sin embargo, en los últimos años, se ha producido un aumento en la resistencia, debido principalmente a mutaciones puntuales en gyrA. En diferentes bacilos Gram negativos se ha descrito un plásmido que se transfieren horizontalmente codificando resistencia a quinolonas (Robicsek, 2006), así que tratamientos con levofloxacino pueden no ser efectivos en el futuro. En países asiáticos la resistencia a levofloxacino en H. pylori se encuentra en el 10% (Ierardi, 2013). En Europa, en un estudio epidemiológico multicéntrico, muestra una resistencia del 14,1% (Megraud, 2013), con valores que varian desde el 11,7% en Irlanda (O´Connor, 2013) al 29,1% en Alemania (Wueppenshorst, 2013). En un estudio realizado en Cantabria en 2010, publicaron una resistencia a levofloxacino del 14,3% (Cuadrado-Lavín, 2012). Sin embargo, en nuestro estudio hemos obtenido una resistencia global a levofloxacino mucho menor que en el norte de España (6,5%). Esta baja resistencia se debe fundamentalmente a la baja resistencia en niños, ya que entre 0 y 10 años la resistencia fue del 2,7%, entre 11 y 17 años fue del 4,9%. En adultos la resistencia a levofloxacino aumenta notablemente, siendo del 26,1%, muy superior a los datos mostrados en estudios europeos. 5.1.5 Sensibilidad a tetraciclina En nuestro estudio obtuvimos una resistencia a tetraciclina del 0,7% (un niño, un adulto, y otra de edad desconocida) en el periodo comprendido entre el 1 de enero del 2010 al 31 de diciembre del 2013. 116 DISCUSIÓN La resistencia a este antibiótico es un hecho excepcional (Peitz, 1999), aunque ya hay estudios que describen tasas del 3,3% (Boyanova, 2006), del 9% (Godoy, 2003) y de hasta el 12,3% (Kim, 2004). La primera cepa resistente se describió en Australia en 1996 (Midolo, 1996) y más tarde aparecieron en Japón y Korea en el año 2000, para posteriormente llegar a Europa y aparecer en Bélgica e Italia (Kwon, 2000). El mecanismo de resistencia es debido a mutaciones de los genes rrnA y rrnB en la subunidad 16S del rRNA, las cuales dan lugar a sustituciones de nucleótidos en las posiciones 926-928 (Glocker, 2005) ó 965-967 (Nonaka, 2005). Estas sustituciones se asocian a un descenso en la unión ribosomal que conlleva al aumento en la CMI a tetraciclina (Wu, 2005). En otros estudios realizados en Madrid la sensibilidad fue del 100% (Toro, 2001), lo que confirma la utilidad de este antibiótico en la terapéutica anti-H. pylori como fármaco de primera elección. Se ha descrito un 85% de erradicación al combinar tetraciclina, metronidazol, un inhibidor de la bomba de protones y un compuesto de bismuto durante 10-14 días (Bytzer, 2005) demostrando que tetraciclina es una buena opción terapéutica como antibiótico de primera línea. 5.1.6 Sensibilidad a metronidazol. La resistencia global a metronidazol en nuestro estudio fue del 34,5%, siendo en cepas de niños entre 0 y 11 años del 40%, de adolescentes entre 11 y 17 años del 29,1% y de adultos del 60,5%. En el año 2010 obtuvimos un 38,3% de resistencia, en 2011 un 33%, en 2012 un 31,6% y en 2013 un 33,6%. Históricamente metronidazol es el antibiótico con mayor tasa de resistencia de los utilizados para el tratamiento de H. pylori variando desde el 27% al 90% según la 117 DISCUSIÓN población estudiada (López-Brea, 1999). Concretamente la resistencia primaria se sitúa entre el 30-40% y la secundaria entre el 70-100% (Glupczynski, 1998). Su uso como terapia frente a otras infecciones en la población general puede influir en el incremento en la resistencia. Actualmente se acepta que la resistencia se produce por la inactivación del gen rdxA debido a una mutación sin sentido que da lugar a una proteína truncada, aunque también se ha descrito mutaciones en los genes frxA y frxB, mutaciones de cambios de fase, delecciones, inserciones, etc (Megraud, 2012). En nuestro estudio la resistencia global a este antibiótico, desde el año 2010 hasta el año 2013, ambos inclusive, fue del 34,5%. Diferentes estudios europeos nos informan de porcentajes similares al nuestro (Ierardi, 2013). Sin embargo en los últimos diez años la situación está cambiando sorprendentemente, con un descenso de la resistencia en paises del norte: 22,5% en Noruega (Larsen, 2013), 1,1% en Lituania (Karczewska, 2012) y 13% en el Reino Unido (Larsen, 2013). En el sur y centro de Europa, los porcentajes de resistencia son algo más altos: 34,9% en Francia (Megraud, 2013), 37,2% en Alemania (Selgrad, 2013) y 23,3% en Bulgaria (Boyanova,2006). Con los datos obtenidos de difetentes artículos, DEAs y Tesis Doctorales realizados en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de La Princesa, hemos podido recoger datos de resistencia a metronidazol desde el año 1991 y hasta mediados del año 2005. En estos trabajos se estudiaron cepas procedentes de diferentes hospitales de Madrid y de otras provincias de España, tanto de niños como de adultos, por lo que los datos pueden reflejar la resistencia existente en el país. La resistencia global a metronidazol fue aumentando de forma progresiva hasta situarse en el 39% en el año 2005 (Díaz-Regañón, 2006). En 1994 la tasa fue del 20,3% y se mantuvo alrededor de esa cifra hasta el año 2003 en que aumentó de forma 118 DISCUSIÓN importante hasta el 36% para, posteriormente aumentar de forma lenta hasta el 39% en el año 2005. En nuestro estudio podemos ver como las tasas de resistencia son ligeramente menores a las obtenidas anteriormente, habiendo un 38,3% de resistencia en 2010, un 33% en 2011, un 31,6% en 2012 y un 33,6% en 2013. Si estudiamos estos porcentajes en función de la edad en niños (0-17 años) la resistencia fue en 2010 del 34,8%, en 2011 del 33%, en 2012 del 36,8% y en 2013 del 39,2%, y en adultos la resistencia en 2010 fue del 85,7%, en 2011 del 50%, en 2012 del 60% y en 2013 del 60%. Podemos observar como en niños, el porcentaje de resistencia ha aumentado en estos 4 años de estudio, sin embargo en adultos ha disminuido ligeramente. 5.2. ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE LOS GENES vacA y cagA. 5.2.1 Presencia de los alelos s1 y s2 del gen vacA. La proteína VacA, que in vitro induce la vacuolización de las células epiteliales, está codificada por el gen vacA, que tiene varios tipos alélicos (Atherton, 1995). Las diferencias genómicas en vacA están localizadas en la secuencia de la región señal (s) o de la región media (m) y nosotros hemos estudiado las variaciones en la región señal s1 o s2. Los estudios publicados muestran grandes discordancias ya que, mientras unos hablan de un 100% de presencia del alelo s1, otros presentan porcentajes del 63% y del 65% (Domingo, 1999a; Domingo, 1999b), esto se puede deber a la relación de este alelo con la patología digestiva. El porcentaje es mayor en pacientes con úlcera. En otro estudio realizado en Madrid mostraron la presencia global del alelo s1 del 32,2% (Agudo, 2010). En nuestro estudio la presencia global del alelo s1 fue del 18,9%, porcentaje más bajo que el descrito anteriormente. Sin embargo no se ha evaluado la 119 DISCUSIÓN patología presente en los pacientes aunque la mayoría son niños que suelen tener patología más leve. En concreto, en niños con edades comprendidas entre 0 y 10 años hubo un 18,5% de cepas vacA s1. Estos datos no concuerdan con estudios publicados en donde las cepas infantiles son las que más se relacionan con el alelo s1 del gen vacA (Jaber, 2005). En un estudio realizado en Turquia, la prevalencia del alelo s1 fue del 91,8% (Ozbey, 2013). 5.2.2 Presencia del gen cagA. La gran mayoría de los estudios realizados sobre la virulencia de H. pylori se han centrado en la isla de patogenicidad en la que el gen cagA codifica la proteína CagA, un marcador de virulencia. La mayoría de estudios describían porcentajes superiores al 85% de cepas cagA+ de H. pylori (Domingo, 1999a; Domingo, 1999b), pero en los últimos años se han publicado porcentajes más bajos como en el estudio realizado en Madrid (Agudo, 2010). Sin embargo, en Turquía la prevalencia es del 61,2%, un porcentaje más elevado que en España (Ozbey, 2013). En nuestro estudio el porcentaje global de cepas cagA+ fue del 18,9%, porcentaje bastante inferior al descrito en otros trabajos, pero comprensible debido a la inclusión de cepas infantiles, las cuales tienen porcentajes de positividad del gen cagA menores (Alarcón, 2000) 5.2.3 Relación entre la presencia del gen vacA y el gen cagA. Dentro de las cepas con presencia del gen cagA el 60% de ellas presentaron el alelo s1 y el 40% el alelo s2. Estos datos coinciden con lo descrito en otros estudios en donde el porcentaje de cepas vacA s1 cagA+ es superior al de las cepas vacA s2 cagA+ 120 DISCUSIÓN (Brito, 2003). En el estudio realizado en Madrid el porcentaje de cepas vacA s1 cagA+ fue del 79,6% y del vacA s2 cagA+ fue del 13,6% (Agudo, 2010). 5.2.4 Relación entre la presencia del gen vacA y cagA y la edad. Se estudió la relación de la presencia del gen vacA y cagA por grupos de edad. En este trabajo, obtuvimos en niños con edades comprendidas entre 0 y 10 años, un porcentaje de vacA s1 del 18,5%, del vacA s2 del 81,5% y del cagA+ del 11,1%. Sin embargo, en un estudio realizado en Turquía en niños con edades comprendidas entre 4 y 18 años, tuvieron un porcentaje de vagA s1 del 91,8% , del vagA s2 del 8,2% y del cagA+ del 61,2% (Ozbey, 2013). Nuestros valores fueron diferentes al de ellos, probablemente porque nuestro grupo de edad estudiado contenía a niños con más corta edad (entre 0 y 10 años y no entre 4 y 18 años) y también por las diferencias que puede haber entre pacientes de diferentes paises. En el grupo de niños con edades comprendidas entre 11 y 17 años, los porcentajes de vacA s1 y cagA+ aumenta ligeramente ( 21,7% de vacA s1, 78,3% de vacA s2 y 30,4% de cagA+). 5.3 ESTUDIO DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS. 5.3.1 Estudio de los halos de inhibición de los compuestos fenólicos. En este trabajo se han probado diferentes compuestos fenólicos que se encuentran en el vino. Tanto compuestos puros como son la catequina, el metil galato, el gálico, la quercetina, el resveratrol puro y los taninos, como distintos extractos, que contienen algunos de los compuestos puros, y otras sustancias, como son dos extractos 121 DISCUSIÓN diferentes de semilla de uva (GSE), y (SCOM), un extracto de uva, el resveratrol 1 y el resveratrol 2. En nuestro estudio, observamos una mayor actividad en un compuesto puro, el metil galato, con un halo de inhibición mínimo de 21 mm y un halo máximo de 56 mm, con una media de 43,62 mm (SD=7,75). El siguiente compuesto más activo fue el extracto de uva con un halo mínimo de 13 mm y un halo máximo de 33 mm con una media de 22,38 mm (SD=5,55). El extracto de uva contiene quercetina (7mg/L), ácido gálico (37 mg/L) y catequina (680 mg/L). Sin embargo el compuesto que menos actividad mostró fue el extracto de semilla GSE que contiene ácido gálico (18,8 mg/L) y catequina (182,7 mg/L). Vemos como en el extracto de semilla GSE la concentración de los distintos compuestos puros es menor que en el extracto de uva, por lo que parece razonable que la actividad sea menor. Se ha descrito la inhibición del crecimiento de Campylobacter jejuni debido a la catequina, los ácidos fenólicos y los flavonoles (Ganan, 2009), y se ha visto que las catequinas tiene un efecto en la inhibición del crecimiento de diferentes bacterias gram- negativas como V. cholera y Shigella spp (Cowan, 1999). Los mecanismos de acción propuestos para la catequina se atribuyen a daños en la membrana citoplasmática, aunque también están involucrados otros mecanismos (Cushnie, 2011). Además, la inhibición del crecimiento de bacterias gram-negativas por distintos ácidos fenólicos ha sido publicado para microorganismos que se transmiten por los alimentos como el Escherichia coli (Cueva, 2010). El mecanismo de acción descrito para los ácidos fenólicos es que producen daño de membrana, haciéndola más permeable. También se ha descrito que puede afectar a la bomba sodio-potasio ATPasa involucrada en la síntesis de ATP (Vattem, 2005). Por otro lado, los flavonoles, especialmente quercetin- 3 glucosido, se ha encontrado una actividad antibactericida frente a algunas bacterias 122 DISCUSIÓN gram-negativas (familia Enterobacteriaceae), como E. coli, Salmonella spp and Shigella spp (Yao, 2011) . 5.3.2 Relación entre los factores de virulencia y los halos producidos por los compuestos fenólicos. En nuestro estudio vemos que para los distintos compuestos fenólicos los halos de inhibición son mayores cuando la cepa es vacA s2, excepto para el resveratrol 2 y el resveratrol puro. El resveratrol 2 está compuesto de catequina, gálico y resveratrol entre otros, sin embargo el resveratrol 1 está compuesto de gálico, resveratrol y malvidina. En cuanto a la presencia del gen cagA, en nuestro estudio vemos que todos los compuestos tienen un mayor halo de inhibición cuando la cepa de H. pylori es cagA-, salvo resveratrol 2, resveratrol puro y metil galato. Es posible que el conjunto de los tres compuestos puros gálico, catequina y resveratrol que se encuentran en el resveratrol 2, tengas un efecto sinérgico en cepas cagA+. En un estudio realizado por Martini et al. en 2009, mostraron la actividad antibacteriana de extractos de uva frente a dos cepas de H. pylori, una cagA- y otra cagA+. En este estudio probaron tres compuestos fenólicos: extracto de uva Colorino, de uva Sangiovese y de uva Cabernet. El extracto Colorino fue el único que mostró una mayor actividad antibacteriana frente a la cepa cagA+ (Martini, 2009). Ellos concluyen que la administración de extractos de uva procedentes del vino, además del uso de antibióticos, podría utilizarse en la infección del H. pylori. 123 DISCUSIÓN 5.3.3 Relación entre la resistencia a claritromicina y los halos producidos por los compuestos fenólicos. Al estudiar los halos medios producidos por los compuestos fenólicos en cepas de H. pylori resistentes y sensibles a claritromicina, no observamos diferencias estadísticamente significativas. Posiblemente sea debido a que el punto de acción de los compuestos fenólicos y la claritromicina sean distintos. La claritromicina actúa en la síntesis de proteínas sobre el ARN ribosomal y el mecanismo de resistencia se produce por mutaciones en la secuencia de la región peptidiltranferasa 23S del ARN ribosómico. El mecanismo de acción de los compuestos fenólicos no se conoce bien pero podrían actuar sobre la permeabilidad de la pared celular. 5.4 ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS FRENTE A H. pylori. 5.4.1 Curvas de muerte. Tras el estudio del efecto de los 4 compuestos fenólicos (GSE, SCOM, R1 y R2) sobre 3 cepas de H. pylori, observamos que en una de las cepas (3177553), los 4 compuestos tienen actividad, llegando a ser bactericida a las 24 horas de incubación. En otra de las cepas (3166912) se observó una acción inhibitoria al poner en contacto la cepa con SCOM, R2 y R1, llegando a ser bactericida a las 24 horas de incubación. En otra cepa (3166912) el SCOM y R2 mostraron actividad bactericida a las 24 horas. Por lo tanto, R2 y el extracto de semilla de uva (SCOM), mostraron actividad bactericida en las tres cepas estudiadas. Tanto R2 como SCOM contienen ácido gálico ( 12 y 29,1 mg/L, respectivamente) y catequina (204,09 y 274,1 mg/L, respectivamente), además el R2 contiene resveratrol puro. El extracto de semilla de uva GSE contiene también ácido 124 DISCUSIÓN gálico (18,8 mg/L) y catequina (182,7 mg/L), pero la concentración de catequina es mucho menor. 5.4.2 Concentración mínima inhibitoria Al estudiar la CMI que producen los distintos compuestos fenólicos: extracto de semilla de uva (GSE), extracto de uva, catequina, metil galato, ácido gálico, resveratrol 1, resveratrol 2, quercetina, resveratrol puro y taninos en las 3 cepas de H. pylori, observamos que en todas ellas, la CMI más baja se encuentra con el extracto de uva (4 µg/ml en las 3 cepas). Por otra parte, dos cepas tienen una CMI alta para el ácido gálico (512 y 256 µg/ml). El extracto de uva contiene quercetina, ácido gálico y catequina, entre otros compuestos. Es posible que la combinación de estos tres compuestos fenólicos, ejerza un efecto sinérgico, haciendo que la CMI disminuya. En un trabajo realizado por Brown en 2013, observaron que quercetina y resveratrol tienen una fuerte actividad in vitro anti-H. pylori, realizando CMI (Brown, 2013). En nuestro estudio RE y Q, también tienen CMI bajas con una media de 8 y 32 µg/ml para RE y Q, respectivamente. En un trabajo realizado por Silván, mostraron que el extracto de semilla de uva (GSE) tiene una actividad antibacteriana frente a Campylobacter spp, mostrando una CMI menor de 20 µg/ml (Silván, 2013). En su estudio, concluyeron que los ácidos fenólicos y las catequinas eran los principales responsables del efecto inhibitorio del GSE. En nuestro trabajo, estudiamos una cepa cagA+ y dos cagA-, y observamos una CMI mayor en la cepa cagA+ para los compuestos GSE, Q y RE, sin embargo para el resto de los compuestos (Pu, C, M, G, R1, R2 y Tan) las CMI fueron iguales o menores 125 DISCUSIÓN que en las cepas cagA-. En un trabajo realizado por Martini, et al en 2011, estudiaron la acción del resveratrol en 26 cepas clínicas de las cuales 9 eran cagA+ de pacientes con carcinoma gástrico, 8 cagA- y 9 cagA+ de pacientes con gastritis (Martini, 2011). Ellos mostraron que la concentración mínima bactericida era menor en las cepas cagA+ de pacientes con carcinoma gástrico y concluyeron que estos pacientes tienen reducida la expresión F-ATPasa, cuya función es la de proteger a la bacteria de los bajos niveles de pH, manteniendo el gradiente de protones en la membrana. 5.4.3 Estudio del daño de membrana mediante yoduro de propidio. En el estudio del daño de membrana, observamos que en las 4 cepas estudiadas, el extracto de semilla de uva (GSE) produjo un mayor efecto que el resto de los compuestos. Sin embargo, el otro extracto de semilla de uva (SCOM) produjo menor efecto en tres de las cuatro cepas estudiadas. Ambos extractos contienen los mismos compuestos fenólicos puros: ácido gálico y catequina. Pero se diferencian en la concentración. Las concentraciones en el extracto de semilla SCOM son 29,1mg/L y 274,1 mg/L respectivamente. Y en el extracto de semilla GSE las concentraciones son 18,8 mg/L y 182,7 mg/L. Vemos que la combinación de ácido gálico y catequina tiene actividad en la membrana de H. pylori, pero cuando se encuentran a una mayor concentración. 5.4.4 Estudio sobre el efecto proteínico en H. pylori mediante MALDI-TOF. El MALDI-TOF en los laboratorios de diagnóstico microbiológico clínico, ha permitido identificar un gran número de microorganismos diferentes, desde bacterias hasta hongos, en cuestión de 15 minutos. Actualmente se están empezando a desarrollar estudios de sensibilidad y estudios de tipificación (Murray, 2010). 126 DISCUSIÓN En este trabajo hemos empleado los índices de correlación CCI, para poder ver la relación entre los distintos espectros obtenidos cuando el H. pylori se ponía en contacto con los distintos compuestos fenólicos. Al estudiar la magnitud en que afecta a las proteínas los distintos compuestos fenólicos: extracto de semilla de uva (SCOM), extracto de semilla de uva (GSE), Resveratrol 1 y Resveratrol 2; observamos que el extracto de semilla de uva (SCOM), produce un mayor efecto. Como en el caso del estudio del daño de membrana, es posible que la combinación de ácido gálico y catequina a altas concentraciones, tenga una mayor actividad sobre las proteinas. Hay pocos trabajos que estudian el perfil de las proteinas de H. pylori, uno de ellos es de Ilina et al., donde estudan 17 muestran clínicas y observan entre 7 a 13 picos principales por muestra y solo 6 señales de proteínas fueron idénticas en más de la mitad de las cepas. Cuatro de los picos se asignaron a proteinas ribosomales RL32, RL33, RL34 y RL36. El pico con una relación m/z de 6948 fue identicado como un polipeptido transportador de metales ricos en histidina (Ilina, 2010) 127 CONCLUSIONES CONCLUSIONES 128 CONCLUSIONES 1. En nuestro trabajo se observó un alto porcentaje de resistencia a claritromicina (52.8%) y metronidazol (34.5%) en los aislamientos clínicos de H. pylori estudiados en un periodo de 4 años. Se observó una disminución gradual del porcentaje de resistencia a amoxicilina del 2010 al 2013 (20,2% a 10,3%). 2. Se observó un porcentaje de resistencia mayor en las cepas de H. pylori aisladas en adultos con respecto a las de niños para todos los antibióticos estudiados, probablemente debido a que han estado sometidos a una mayor presión antibiótica. También se observó un aumento del porcentaje de resistencia a rifampicina en las cepas de adultos desde el 2010 al 2013 (16,7% a 71,4%). 3. Se encontró un alto porcentaje de cepas vacA s2 (81,1%) y alto porcentaje cagA- (81,1%) en las cepas de H. pylori estudiadas, existiendo una correlación entre ambas (p<0,001). 4. Al estudiar la actividad de los compuestos fenólicos extraidos del vino mediante difusión con disco, se observó que metil galato y catequina, son los compuestos que presentaron mayores halos de inhibición frente a los aislados clínicos de H. pylori estudiados. 5. Todos los compuestos fenólicos excepto Resveratrol 2 y Resveratrol puro produjeron halos de inhibición mayores en las cepas de H. pylori sin factores de virulencia (vacA s2 y cagA-). No hubo diferencias significativas al estudiar el efecto de los compuestos extraídos del vino en cepas de H. pylori con diferente patrón de resistancia a claritromicina. 129 CONCLUSIONES 6. El compuesto que presentó una concentración mínima inhibitoria más baja, estudiada mediante microdilución en caldo, fue el extracto de uva (4 µg/ml). Mediante curvas de muerte, observamos que tanto el extracto de semilla de uva (SCOM) como el Resveratrol 2, mostraron actividad bactericida frente a las cepas de H. pylori estudiadas. 7. El compuesto que produjo mayor daño en la membrana bacteriana, estudiando la fluorescencia emitida mediante yoduro de propidio, fue el extracto de semilla de uva (SCOM). 8. El compuesto que produjo un mayor efecto en el patrón de las proteínas ribosomales de H. pylori, estudiado con el empleo del espectrómetro de masas MALDI- TOF, fue el extracto de semilla de uva (SCOM). 9. Con los distintos resultados obtenidos en este estudio se observa que la combinación de metil galato con catequina, ambos presentes a altas concentraciones en el extracto de semilla de uva (SCOM) y en un vaso de vino tinto, presentan un potente efecto inhibitorio frente a las cepas de H. pylori. 130 BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 131 BIBLIOGRAFÍA 1. Agudo, S., Alarcón, T., Cibrelus, L., Urruzuno, P., Martínez, M., & López-Brea, M. (2009). High percentage of clarithromycin and metronidazole resistance in Helicobacter pylori clinical isolates obtained from Spanish children. Rev Esp Quimioter, 22, 88-92. 2. Agudo, S., Pérez-Pérez, G., Alarcón, T., & López-Brea, M. (2010). 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SUMMARY INTRODUCTION Helicobacter pylori is a microaerobic, Gram-negative spiral bacterium that colonizes the human stomach and is found in more than half of the world’s population. Infections with H. pylori are closely associated with chronic gastritis, peptic ulcer disease, and the development of gastric cancer. All consensus guidelines recommend eradication of H. pylori for patients with symptoms. Standard therapy combines a proton pump inhibitor (PPI) or ranitidine bismuth citrate and two antibiotics, chosen from among amoxicillin, clarithromycin, and metronidazole. However, this therapy has been questioned because of the increased eradication failure rates. Many factors have been implicated as causes of treatment failure, including ineffective penetration of antibiotics into the gastric mucosa, antibiotic inactivation by the low stomach pH, a lack of patient compliance, and the emergence of acquired resistance to antibiotics by H. pylori. 163 SUMMARY Although it is clear that H. pylori infection increases the risk of these upper gastrointestinal diseases, it is still not fully understood why infected individuals develop one disease rather than another, emphasizing the importance of the host and other cofactors. It has been suggested that both the possession of the cytotoxin-associated gene A (CagA), and the production of a vacuolating cytotoxin encoded by the vacuolating cytotoxin A (VacA) gene, are linked to increased pathogenicity of H. pylori strains. There is substantial evidence that H. pylori infection, especially with the strains expressing the 128 kDa CagA protein, is associated with enhanced gastric inflammatory response and increased risk of developing atrophic gastritis, peptic ulcer and even GC . However, conflicting results regarding the association between these virulence factors and clinical disease have been reported, and epidemiological papers suggest that not all tumours are H. pylori-positive. Helicobacter pylori is associated with digestive diseases and it is considered a risk factor in the development of gastric cancer. Although several antibiotics and antacids have been used for treatment, there is a failure rate of up to 20%. Some studies have published the in vitro activity of natural substances, as phenolic compounds, against H. pylori. 164 SUMMARY Wine is a natural product obtained by direct fermentation of grapes or their juice; contains alcohol and multiple -products of alcoholic fermentation , but also contains many other substances from the grapes , which is its value especially from the point of view of health . The concentration of polyphenolic compounds in wine varies between 1.80 and 1.06 g / L , with an average of 2.57 g / L for red wine and between 0.16 and 0.30 g / L for white. As the total phenol content of foods and beverages correlates very strongly with their antioxidant activity, polyphenol composition and in terms of antioxidant power , a glass of red wine ( 150mL ) equals 12 white wine or 2 cups area, 4 blocks , 5 servings of onion , 3 ½ cups of beer, orange juice 7 or 20 blocks. The objective of this study were to study the susceptibility of differents antimicrobians against H. pylori, characterize virulence factors of H. pylori and compare the effect of various wine phenolic compounds in H. pylori by differents methods. 165 SUMMARY METHODS A total of 439 strains of H. pylori clinical isolates were studied from both children and adults since January 2010 until December 2013. The susceptibility of 6 antimicrobial agents was made by E-test method and virulence factors (cagA gene and vacA alleles) of H. pylori was characterized by PCR. The study of the effect of phenolic compounds in H. pylori was performed by disc diffusion, killing curves, minimum inhibitory concentration, MALDI-TOF and the emission of fluorescence using propidium iodude. H. pylori was identificated by MALDI-TOF. RESULTS A high percentage of resistance to clarithromycin (52,8%) and metronidazole (34,5%) was observed. 166 SUMMARY The percentage of resistance to amoxicillin decreased from 2010 to 2013. A high percentage of vacA s2 (81.1%) and cagA negative (81.1%) was found in the H. pylori strains studied. A higher percentage of resistance was observed in H. pylori strains isolated in adults with respect to children for all antibiotics studied , probably because they have been subjected to increased antibiotic pressure. An increase in the percentage of rifampicin resistance in strains of adults from 2010 to 2013 (16.7% to 71.4 %) was also observed. In our work , we study a cagA + strain and two cagA- , and observed a higher CMI in cagA + strain for GSE , Q and RE compounds, however for the rest of compounds ( Pu, C , F, G , R1, R2 and Tan) MICs were equal to or lower than in cagA- strains. All phenolic compounds except Resveratrol 2 Resveratrol pure produced greater inhibition halos in strains of H. pylori virulence factors without ( vacA and cagA- s2 ) . No significant to study the effect of the extracted compounds in wine strains of H. pylori with different pattern of resistance to clarithromycin differences. 167 SUMMARY Methyl gallate and catechin showed the greatest inhibition zones against H. pylori clinical isolates by disc diffusion. Grape extract showed a lower minimum inhibitory concentration using broth microdilution. The grape seed extract (SCOM) and Resveratrol 2 showed bactericidal activity against H. pylori strains tested by killing curves. Grape seed extract (SCOM) produced greater damage to the bacterial membrane, by studying the fluorescence of propidium iodide. The compound produced a greater effect on the pattern of ribosomal proteins of H. pylori , studied with the use of the mass spectrometer MALDI - TOF, was the grape seed extract (SCOM ) . CONCLUSION According to the different results obtained in this study, the combination of methyl gallate and catechin, both present at high concentrations in the grape seed 168 SUMMARY extract (SCOM) and in a glass of red wine, had a potent inhibitory effect against H. pylori clinical isolates. In the study of membrane damage , we note that the four strains tested , the grape seed extract (GSE ) resulted in a greater effect than the other compounds . Another grape seed extract (SCOM ) however, there was little effect on three of the four strains tested . In our study we see that for different phenolic compounds the inhibition zone are larger when the strain is vacA s2, except for resveratrol 2 and pure resveratrol. Resveratrol 2 is composed of catechin , gallic and resveratrol , however resveratrol 1 is composed gallic, resveratrol and malvidin . Regarding the presence of cagA gene , in our study , we see that all compounds have a greater inhibition zone when the strain of H. pylori is cagA- except resveratrol 2, pure resveratrol and methyl gallate . It is possible that all three gallic pure compounds , 169 SUMMARY resveratrol and catechin found in resveratrol 2 , have a synergistic effect in cagA + strains . We used the correlation coefficients ICC to see the relationship between the different spectra obtained when H. pylori was contacted with various phenolic compounds. In considering the extent to which proteins affect different phenolic compounds : grape seed extract (SCOM ) , grape seed extract (GSE ) , Resveratrol 1 and Resveratrol 2; note that the grape seed extract (SCOM ) , produces a greater effect . As with the study of membrane damage , it is possible that the combination of catechol and gallic acid at high concentrations, has a higher activity in membrane. Tesis Ana María Correa Ruiz PORTADA ÍNDICE INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA SUMMARY