UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRUGÍA TESIS DOCTORAL Terapia con células madre mesenquimales de la colestasis microquirúrgica experimental MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Carlos Gilsanz Martín Directores María Ángeles Aller Reyero María Paz de Miguel González Alfredo Alonso Poza Madrid, 2015 © Carlos Gilsanz Martín, 2015 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRUGÍA TERAPIA CON CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DE LA COLESTASIS MICROQUIRÚRGICA EXPERIMENTAL TESIS DOCTORAL CARLOS GILSANZ MARTÍN DIRECTORES Maria Ángeles Aller Reyero Maria Paz de Miguel González Alfredo Alonso Poza MADRID, 2015 Informe del Director de la Tesis Doctoral DATOS DE LA TESIS DOCTORAL Nombre del Doctorando Carlos Gilsanz Martín Título de la Tesis TERAPIA CON CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DE LA COLESTASIS MICROQUIRÚRGICA EXPERIMENTAL Facultad o Centro Medicina, UCM DATOS DEL DIRECTOR DE LA TESIS DOCTORAL Nombre Completo Maria Angeles Aller Reyero Centro al que pertenece y dirección Departamento de Cirugía. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid. Plaza de Ramón y Cajal s.n., 28040 MADRID D.N.I/Pasaporte 02519481S e-mail maaller@med.ucm.es VALORACIÓN DE LA TESIS Muy Buena Buena Suficiente Deficiente Originalidad X Definición Objetivos X Metodología X Relevancia Resultados X Discusión / Conclusiones X INFORME (en caso necesario se podrán añadir más hojas): El tema que se estudia en el presente trabajo de Investigación es de gran trascendencia actualmente por la elevada morbi-mortalidad que comporta la cirrosis hepática. En particular, la cirrosis por colestasis extrahepática en adultos, por litiasis o patología tumoral, y en niños por atresia biliar, es una de las causas de patología inflamatoria hepática que progresa a fibrosis- cirrosis cuya única alternativa terapeútica es el trasplante de hígado. La escasez de hígados donantes implica que un elevado número de pacientes fallezcan en lista de espera. Por éste motivo, el planteamiento de nuevas y más eficaces terapias en ésta patología, como es la administración de células madre mesénquimales y, su ensayo previo en animales de experimentación, aporta un futuro esperanzador para ésta devastadora enfermedad. En la Introducción se expone y actualiza la patología hepática colestásica y la insuficiencia hepática, sus modelos experimentales, así como las terapias anti-fibrogénicas, en particular con células madre mesenquimales. La Hipótesis y los Objetivos se exponen con claridad y son concisos y específicos. El Material y Métodos se caracteriza por su rigor metodológico, especialmente por el modelo experimental microquirúrgico utilizado, por los cuidados y tratamiento post-operatorio a largo plazo que precisan los animales, así como el aislamiento y diferenciación de las células madre mesénquimales, obtenidas de tejido adiposo humano durante la realización de liposucciones quirúrgicas. El diseño experimental está correctamente explicado, a pesar de realizar múltiples grupos de estudio con diferentes tratamientos y tiempos de evolución postoperatoria, lo cual permite reproducir las técnicas empleadas por otros grupos de investigadores. Los Resultados de éste estudio permiten verificar la Hipótesis de Investigación y se exponen claramente, tanto en el texto, como en las numerosas Figuras y Tablas incluidas, permitiéndose así una clara comprensión por los lectores de éste estudio. En la Discusión se estudian e integran todos los resultados obtenidos tras el estudio de las alteraciones hepáticas (insuficiencia hepática crónica e insuficiencia hepática aguda-sobre-crónica, cuando las ratas se descompensan después de la 6ª semana de evolución post-operatoria y desarrollan ascitis) y extra-hepáticas resultantes de la colestasis obstructiva en la rata y se demuestra que la administración de células madre mesénquimales de origen adipocítico, tanto humanas como de rata, quizá por sus efectos anti-inflamatorios, inmunosupresores y potenciadores de la reparación tisular, mejoran la insuficiencia hepática y reducen la fibrosis, la proliferación biliar y la necrosis hepatocitaria. En particular, es de gran interés la demostración de que éstos efectos son mejores cuando se realiza realiza un Isotrasplante de células madre de ratas singénicas prediferenciadas a hepatocitos, respecto al Xenotrasplante de células madre humanas Respecto de la Bibliografía, destaca la exhaustiva y actualizada revisión, tanto de la patología fibrogénica hepática, como de las propiedades y utilización, experimental y clínica, de la terapia con células madre, un tema de vanguardia en la actualidad . En Conclusión, la relevancia del presente trabajo de Investigación se fundamenta en la posible extrapolación de los resultados obtenidos a la clínica humana, en la cual la cirrosis de diferentes etiologías comporta una elevada morbi-mortalidad a nivel mundial. En particular, el tratamiento con células madre de origen mesenquimal adipocítico y prediferenciadas in vitro a hepatocitos podría ser de utilidad para reducir las complicaciones secundarias a las hepatopatías crónicas de origen biliar en el ser humano. Madrid, a 12 de Marzo de 2015 Fdo.:MA Aller Este impreso deberá entregarse al Departamento/Órgano responsable del Posgrado/ Comisión responsable del Programa de Doctorado, para su estudio y aprobación en la admisión a trámite de la tesis doctoral. Asimismo, deberá incluirse entre la documentación enviada a la Comisión de Doctorado para la designación del Tribunal y aprobación de la defensa de la Tesis Doctoral. . A mis padres, a mi mujer, y a mis hijas Agradecimientos - A mis directores de tesis, la Prof. Dra. María Ángeles Aller, la Dra. María Paz De Miguel y el Dr. Alfredo Alonso Poza, por su apoyo constante, su entusiasmo, sus consejos y su dedicación plena a la consecución de este trabajo experimental, sin cuya colaboración no hubiera sido posible lograr este objetivo. - Mi agradecimiento especial a la profesora doctora María Ángeles Aller Reyero, por toda la confianza que depositó en mí, aceptándome bajo su dirección, guiándome en mis primeros pasos en la investigación e inculcándome el compromiso con el rigor científico, lo que me trajo un sinnúmero de enseñanzas, tanto personales como académicas. Por poner a mi disposición su gran sabiduría e inagotable fuente de conocimientos, lo que enriqueció sobremanera el resultado final de este proyecto. Gracias por su constante apoyo, su entrega absoluta y todo el tiempo invertido en lo personal, su paciencia, comprensión y generosidad. Gracias profesora Aller por ser una persona acogedora, amable y sobre todo dispuesta y siempre preocupada. - Al profesor doctor Jaime Arias Catedrático de Cirugía de la Facultad de Medicina de la U.C.Mpor haberme acogido en este departamento y por haberme brindado la posibilidad de desarrollar este trabajo de investigación. Durante el desarrollo de mi tesis he podido disfrutar de su integridad, humildad, sabiduría y sentido común con lo que me siento eternamente agradecido. Gracias, por ser un verdadero maestro, un verdadero gigante como científico y de una altura aún mayor como persona. - Al equipo dirigido por la Dra.María Paz De Miguel, de Ingeniería Celular del Hospital Universitario de La Paz, en especial a Sherezade Fuentes y Alejandro Blázquez, siempre dispuestos a colaborar, haciendo un gran esfuerzo al adaptar sus horarios de trabajo a las exigencias del exhaustivo tiempo empleado en el periodo experimental del desarrollo de esta tesis, llevando a cabo un enorme trabajo con el aislamiento y cultivo de las células madre, así como en el procesamiento de las muestras histológicas. - A la Dra. Isabel Prieto, por su generosa disposición y colaboración en la realización de la parte experimental, al haberme brindado su tiempo y desinteresada ayuda en esta parte tan importante de la tesis. Gracias por haberme acompañado y por compartir esta experiencia de vida. - A Ana Arias ,Carlos Nieto y Zoe de Julián por hacer más agradable el día a día, por su constancia y su capacidad de trabajo y haber compartido las tardes de colestasis formando un gran equipo coordinado, y hacer de nuestro lugar de trabajo un espacio más entretenido y distendido para investigar. Sin estas personas no habría sido posible cumplir esta meta con tanta eficacia y tanta rapidez. - A Santiago Cano, experto en el tratamiento estadístico de los resultados por su disponibilidad y estar siempre dispuesto a resolver cualquier duda. - A la Dra. Beatriz Diéguez Fernández, agradecerla todo el apoyo brindado en los momentos difíciles, por escucharme cuando lo necesité sin necesidad de explicaciones, por tu preocupación incesante así como también la ayuda que me presto para continuar cuando parecía que la cosa no avanzaba. Gracias por tu amistad. - Al Dr. Manuel Losada Ruíz, agradecerle su ayuda, consejos y acertadas opiniones que hicieron que este arduo trabajo fuera más ameno y cuyo aporte influenciara significativamente en el desarrollo de esta tesis. Gracias por tu amistad. -Al Dr. Salvador Argudo, agradecerle su ayuda y orientación, tanto en la parte experimental como en la elaboración de la parte escrita, lo que aporto gran fluidez en el desarrollo de esta tesis. Gracias por tu amistad. - Al Servicio de Cirugía Experimental del Hospital Universitario de La Paz, a la Dra. Carlota Largo (Dra. Veterinaria), así como a los técnicos y al personal auxiliar de su equipo quienes me permitieron el uso de sus instalaciones, que me instruyeron y ayudaron en el manejo y cuidado de los animales de experimentación. - Al personal del laboratorio de bioquímica de la Facultad de veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona quienes realizaron las determinaciones bioquímicas para la obtención de nuestros resultados. -A mis padres, por todo el apoyo que me han dado durante todo este tiempo. Han sido un pilar importante para mí en este nuevo desafío, con su incondicional cariño y con las constantes palabras de apoyo para mi desarrollo personal y profesional. -A mi mujer porque gracias a su paciencia e incondicional apoyo y comprensión, he tenido las fuerzas necesarias para sacar adelante esta tesis, y ha sido su constante motivación la que me ha permitido luchar día a día para alcanzar este objetivo. -A mis hijas Alejandra y Virginia, porque me has dado la fuerza para seguir adelante en este camino y un motivo más para lograr este objetivo, que espero con todo deseo que lleguen a entender algún día el motivo por el que durante tantas horas no he podido dedicarlas la atención que se merecen. -A la Fundación Mutua Madrileña, por su aportación económica a través de la concesión de una beca destinada a la financiación del trabajo de Investigación que constituye ésta Tesis Doctoral (ref.nº. AP69772009) Índice de abreviaturas y acrónimos A A: glándula adrenal ABCB: “ATP-binding cassette bile canaliculus” (transportador ATP- dependiente del canalículo biliar) Ac bil: ácidos biliares Ach: Acetilcolina ACTH: hormona adrenocorticotropa AH: arteria hepática Alb: albumina ALT: alanin aminotransferasa Ang II: angiotensina II ANOVA: análisis de la varianza AST: aspartato aminotransferasa Act Prot: actividad de Protrombina ADN: ácido desoxirribonucleico B B: bazo Bb: bilirrubina Bb T: bilirrubina total Bb D: bilirrubina directa BD/BTx100: % de bilirrubina directa en relación a bilirrubina total. bFGF: “fibroblastic growth factor” (factor básico de crecimiento fibroblastico) C CA: cayado aórtico CCHP: ratas con colestasis micro quirúrgica y xenotrasplante de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRND: ratas con colestasis microquirúrgica e isotrasplante de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCRP: ratas con colestasis micro quirúrgica e isotrasplante de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. CER: circulación colateral espleno- rrenal CMS: ratas con colestasis extrahepática microquirúrgica e inyección intrahepática de solución salina. COL: colágeno CPE: circulación colateral para- esofágica CPF: catéter de perfusión de formaldehído CPR: circulación colateral pararrectal Cr: Creatinina CTGF: “connective tissue growth factor” (factor de crecimiento del tejido conectivo) CXC: Quimioquinas CCL4: tetracloruro de carbono CD4+: células T ayudantes o helper CMQ: Colestasis microquirúrgica. D DMSO: dimetilsulfóxido D: duodeno E E: esófago ECM: “extracellular matrix” (matriz extra celular) EDTA: ácido etilendiaminotetraacético EP: espacio porta ERi: circulación colateral esplenorrenal inferior ERs: circulación colateral espleno- rrenal superior Es: estómago EGF: epitelial growth factor (factor de crecimiento de epitelio) ERO: especies reactivas de oxígeno F F: Ligamento falciforme FA: fosfatasa alcalina FBS: “fetal bovine serum” (suero bovino fetal) FSH: hormona folículo estimulante F: fibrinógeno FGF: “Fibroblastic growth fator” (factor de crecimiento fibroblástico) FXR: receptor nuclear Farnoside X G GAGs: glicosaminoglicanos GGT: γ-glutamiltransferasa H HDL: “high density lipoprotein” (lipoproteínas de alta densidad) HIF-1α: “hipoxia-inducible factor-1 alpha” (factor inductor de hipoxia 1-alfa) HBSS: “Hanks balanced salt solution” (solución salina equilibrada de Hanks) HSCS: “hepatic stellate cells” (células estrelladas hepáticas) HBV: virus de la hepatitis B HCV: virus de la hepatitis C HGF: “Hepatocyte growth factor” (factor de crecimiento hepatocitario) HNFs: factor nuclear hepatocitario I IFN γ: interferón-gamma IGF-1: “Insulin-like growth factor” (factor de crecimiento similar a Insulina) IL: Interleuquina iNOS: “Inducible nitric oxide synthasa” (Óxido Nítrico síntasa inducible) INR: “International Normalized Ratio” IFN-γ: Interferon γ L LA: líquido ascítico LBP:“Lypopolysacharide-binding proteína” (proteína de unión a lipopolisacárido) LC: lóbulo caudado hepático LDH: Lactato deshidrogenasa LDL: “low density lipoprotein” (lipoproteínas de baja densidad) LH: hormona luteinizante LLD: lóbulo lateral derecho hepático LLI: lóbulo lateral izquierdo hepático LM: lóbulo medio hepático LMD: lóbulo medio derecho hepático LMI: lóbulo medio izquierdo hepático LPA: lipoaspirado LXR: “liver X receptor” (receptor hepático X) M MCP: “Monocyte chemoatractant protein” (proteína quimioatrayente de monocitos) MDR3: “multi-drug- resistant 3 protein” (proteína multirresistente a fármacos-3) MELD: “Model for End-stage Liver Disease” ml: mlilitros MMPs: “Matrix metalloproteinases” (Metaloproteinasas de la matriz) MMP-2: “Matrix metalloproteinases–2 (Metaloproteinasa de la matriz-2) MRP: “multidrug resistance proteins” (proteínas relacionadas con resistencia a mútliples fármacos) MC: complejo mayor de histocompatibilidad MEC: matriz extracelular MF: miofibroblastos MSC-TA: “Adipose Tissue Derived Multipotent Mesenchymal Stromal Cells” células madre estromales mesenquimales adherentes derivadas de tejido adiposo. N NASH: “Non-alcoholic steatohepatitis” (esteatohepatitis no alcohólica) NK: células natural killer NKT: “Naturall killer Tcells” (células T natural killer) NO: óxido nítrico NFG: Factor de crecimiento nervioso NTCP: Polipeptido cotransportador de taurocolato sódico O OATP: “organic anion transporting proteins” (proteínas transportadoras de aniones orgánicos) P P: páncreas PAF: “platelet activation factor” (factor activador de plaquetas) PBS: “Phosphate-buffered saline” (tampón fosfato salino) PC: peso corporal PCF: peso corporal final PCG-1α: “peroxisome proliferator- activated receptor gamma coactivator 1-alpha” (coactivador 1-alfa de receptor gamma proliferador activado de peroxisomas) PCI: peso corporal inicial PDGF: “platelet-derived growth factor” (factor de crecimiento derivado de plaquetas) PE: peso esplénico PE/PC: relación peso esplénico / peso corporal ∆ peso: incremento de peso corporal PH: peso hepático PH/PC: relación peso hepático-peso corporal PLC: peso del lóbulo caudado hepático PLLD: peso del lóbulo lateral derecho hepático PLLI: peso del lóbulo lateral izquierdo hepático PLM: peso del lóbulo medio hepático PK: pinza de Kocher PO: post-operatorio PPAR-γ: “peroxisome proliferator- activated receptors gamma” (coactivador gamma del receptor gamma proliferador activado de peroxisomas) PT: peso testicular PrT: proteínas totales PT/PC: relación peso testicular / peso corporal PGE2: prostaglandina E2 PR: Circulación pararrectal R R: recto RANTES: “Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted” (regulador de la activación, expresión y secreción de células T) Ri: riñón ROS: “reactive oxygen species” (especies reactivas del oxígeno) Rat T Cefal: ratio de tiempo de Cefalina S SAMe: S- adenosíl- metionina SO: ratas seudo-operadas SVF: “stromal vascular fraction” (fracción vascular estromal) SC-hp: células madre mesenquimales adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatócitos. SC-rnd: células madre mesenquimales adipocíticas de rata no diferenciadas. SC-rp: células madre mesenquimales adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatócitos. SDF-1-alfa: “stromal derived factor” (factor derivado del estroma alfa 1) SS: suero salino. SMA-α: “Alpha-Smooth Muscle Actin“ (actina alfa de músculo liso) T TD: ligamento triangular derecho TGF: “transforming growth factor” (factor transformador de crecimiento) TIMP: “Tissue inhibitor of metalloproteinases” (inhibidor tissular de metaloproteasas) TL: ligamento triangular izquierdo TBI: traslocación bacteriana intestinal T.Prot: tiempo de protrombina T Cefal: tiempo de Cefalina TLR: “Toll-like receptor” (receptores tipo Toll) TNF: “tumoral necrosis factor” (factor de necrosis tumoral) V VBP: vía biliar principal VEGF: “vascular endhotelial growth factor” (factor de crecimiento de endotelio vascular) VI: ventrículo izquierdo cardíaco VIP: “Vasoactive intestinal peptide” (Polipéptido intestinal vasoactivo) VP: vena porta VVM: vasculopatía venosa mesentérica ÍNDICE ÍNDICE Pag. I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………..…….. 2 1. COLESTASIS EXTRAHEPÁTICA: UNA PATOLOGIA LOCAL Y SISTEMICA………………………………..…………... 2 2. MODELOS EXPERIMENTALES PARA EL ESTUDIO DE LA COLESTASIS EXTRAHEPÁTICA……………. 9 3. FISIOPATOLOGIA DE LA COLESTASIS: RESPUESTA INFLAMATORIA HEPATICA……………..………………………. 18 4. FIBROSIS BILIAR: EL RESULTADO DE LA COLESTASIS EXTRAHEPATICA EN LA RATA…………………………………. 28 5. CELULAS MADRE MESENQUIMALES E INSUFICIENCIA HEPÁTICA………………………………………. 46 II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS…………………………………………….. 57 III. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………….. … 60 1. MATERIAL……………………………………………………………. 61 1.A. ANIMALES……………………………………………………… 61 1.B. INSTALACIONES……………………………………………… 61 1.B.1. Animalario. ……………………………………………. 61 1.B.2. Sala de operaciones………………………………….. 61 1.B.3. Sala de evolución postoperatoria……………………. 62 1.B.4. Sala de sacrificio y procesado de muestras………… 63 1.B.5 Área de conservación de muestras………………..… 63 1.B.6 Eliminación de residuos biológicos………………….. 63 1.C. FARMACOS……………………………………………………. 63 1.C.1 Anestésicos……………………………………………. 63 1.C.2 Otros fármacos………………………………………… 63 1.D. MATERIAL…………………………………………………….... 64 1.D.1 Instrumental quirúrgico……………………………….. 64 1.D.2 Material de sutura y ligadura…………………………. 64 1.D.3 Material quirúrgico complementario…………………. 64 1.D.4 Otros materiales para procedimiento operatorio y de extracción de muestras……………………………………….. 65 1.D.5 Material de laboratorio………………………………… 65 1.E. EQUIPOS DE LABORATORIO……………………………….. 66 1.E.1 Procesado de muestras sanguíneas…………………. 66 1.E.2. Estudios bioquímicos en suero………………………. 66 1.E.3 Laboratorio de Anatomía Patológica…………………. 66 1.E.3.a. Laboratorio general…………………………. 66 1.E.3.b Laboratorio de análisis de imagen………… 66 1.F. REACTIVOS DE LABORATORIO……………………………. 67 1.F.1 Estudios bioquímicos en suero…………………….... 67 1.F.2. Laboratorio de Ingeniería Celular……………………. 68 1.F.3. Estudio histopatológico……………………………….. 68 2. MÉTODOS……………………………………………………………….. 69 2.A. CONDICIONES DE UTILIZACIÓN Y ESTABULACIÓN DE LOS ANIMALES………………………………………………… 69 2.B DISEÑO EXPERIMENTAL……………………………………. 70 2.C. TÉCNICA ANESTÉSICA………………………………………. 72 2.D. TÉCNICA QUIRÚRGICA………………………………………. 73 2.D.1. Pseudo-operación …………………………………….. 73 2.D.2. Colestasis extrahepática microquirúrgica …………… 74 2.E. MANTENIMIENTO Y TRATAMIENTO POSTOPERATORIO………………………………………….. 79 2.F. OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DE ORIGEN ADIPOCITICO………………………………….. 80 2.G. CARACTERIZACIÓN CELULAR FUNCIONAL MEDIANTE DIFERENCIACIÓN……………………………………………. 82 2.H. DIFERENCIACIÓN IN VITRO DE LAS CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DERIVADAS DE ADIPOCITOS EN CELULAS PROGENITORAS HEPATOCITARIAS…............ 83 2.I. ADMINISTRACIÓN INTRAHEPÁTICA DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DE ORIGEN ADIPOCÍTICO… 83 2.J. SACRIFICIO DE LOS ANIMALES…………………………….. 85 2.J.1 Cuantificación del líquido ascítico……………………... 86 2.J.2 Circulación colateral porto-sistémica…………………. 86 2.J.3 Vasculopatía venosa mesentérica…………………….. 86 2.J.4 Extracción sanguínea, perfusión intracardíaca y necropsia………………………………………………. 87 2.J.5 Recogida de muestras histológicas……………………. 88 2.J.6 Eliminación de restos los biológicos………………….. 89 2.K. DETERMINACIONES SÉRICAS DE FUNCIÓN HEPÁTO-BILIAR…………………………………………………….. 89 2.K.1 Bilirrubina total y directa………………………………. 90 2.K.2 Alanin-aminotransferasa (ALT) y Aspartato- aminotransferasa (AST)……………………………...... 90 2.K.3 Lactato-deshidrogenasa (LDH).................................... 90 2.K.4 Fosfatasa alcalina (FA)................................................ 91 2.K.5 γ-glutamiltransferasa (GGT)…………………………... 91 2.K.6 Proteínas totales……………………………………….. 91 2.K.7 Albúmina……………………………………………….... 91 2.K.8 Creatinina………………………………………………... 92 2.K.9 Urea………………………………………………............ 92 2.L. ESTUDIO MICROSCÓPICO E HISTOPATOLÓGICO HEPÁTICO …...... …………………………………………………… 92 2.L.1 Fijación…………………………………………………… 92 2.L.2 Inclusión………………………………………………….. 92 2.L.3 Procesado de los cortes………………………………… 93 2.L.4 Estudio con microscopía de fluorescencia……………. 93 2.L.5 Tinciones histológicas…………………………………… 94 2.L.5.a Hematoxilina & Eosina…………………...... 94 2.L.5.b Tricrómico de Masson…………………….... 94 2.L.5.c Rojo Picrosirio……………………………...... 95 2.L.6. Evaluación histológica por microscopía óptica…….... 96 2.M. CALCULO DEL “Model for end-stage Liver Disease” (MELD) 97 2.N. ANALISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS……….... 99 IV. RESULTADOS……………………………………………………………… 102 1. SUPERVIVENCIA……………………………………………………… 103 1.A. Resultados de la serie I……………………………………….. 105 1.B. Resultados de la serie II……………………………………….. 105 1.C. Resultados de la serie III………………………………………. 106 1.D. Resultados de la serie IV……………………………………… 106 2. COMPLICACIONES POSTOPERATORIAS……………………….. 108 3. ASCITIS……………………………………………………………….. 110 4. CIRCULACION COLATERAL VENOSA PORTO-SISTÉMICA………….............................................................. 111 5. VASCULOPATIA VENOSA MESENTÉRICA……………………… 112 6. EVOLUCIÓN DEL PESO CORPORAL…………………………….. 113 7. PESO HEPATICO……………………………………………………. 114 8. PESO ESPLÉNICO......................................................................... 118 9. PESO TESTICULAR....................................................................... 121 10.DETERMINACIONES SÉRICAS DE FUNCIÓN HEPÁTO-BILIAR 123 11. DETERMINACION DEL “Model for end-stage Liver Disease” (MELD).129 12. ESTUDIO HISTOPATOLÓGICO HEPÁTICO…………………….. 130 12.A. Estudio con microscopía de Inmunofluorescencia……..…… 130 12.B. Estudio con microscopía óptica………………………………. 131 12.C. Estudio de la fibrosis hepática………………………………… 140 12.D. Estructura hepática, proliferación biliar y estudio hepatocitario 146 V. DISCUSIÓN…………………………………………………………………. 151 VI. CONCLUSIONES………………………………………………………….. 171 VII. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………... 173 ANEXO: Tablas…………………………………………………………………….. 226 RESUMEN RESUMEN I. RESUMEN Introducción. El desarrollo de fibrosis hepática e hipertensión portal en múltiples hepatopatías crónicas de etiología diversa es un proceso multifuncional, mediado por células inflamatorias que liberan mediadores fibrogénicos, que tiene además como consecuencia una angiogénesis excesiva. La administración de células madre de origen mesenquimal adipocítico, bien de procedencia humana o de rata, en un modelo experimental microquirúrgico de colestasis extrahepática podría revertir la fibrosis biliar hepática. En ese caso, también mejorarían la insuficiencia hepática crónica, así como la hiperactividad angiogénica esplácnica, que está implicada en la aparición de hepatoesplenomegalia, circulación colateral porto-sistémica, enteropatía hipertensiva portal y vasculopatía venosa mesentérica Material y Métodos. Para verificar ésta hipótesis se ha realizado un estudio experimental en ratas Wistar. Para ello, se utilizaron 4 grupos de ratas: Un primer grupo Control, constituido a su vez por dos subgrupos: un subgrupo de ratas seudo-operadas (n=20) y otro formado por ratas con colestasis microquirúrgica al que se administraba suero salino intrahepatico (n=20) a las 2 semanas de evolución de la colestasis. Los otros 3 grupos estaban constituidos por animales con colestasis microquirúrgica que se diferenciaban entre sí en función del tipo de células madre administradas, también a las 2 semanas de la colestasis: un grupo en el que se realizó un Isotrasplante de células madre mesenquimales de rata indiferenciadas (n=47) ; otro grupo de Xenotrasplante de células madre mesenquimales humanas de origen adipocítico (n=38) , que fueron prediferenciadas a hepatocitos y un tercer grupo de Isotrasplante de células madre mesenquimales de rata prediferenciadas a hepatocitos (n=30). Como terapia analgésica se administró el opioide Buprenorfina (0.05mg/kg/12h) por vía subcutánea durante las primeras 24 horas del postoperatorio. Durante toda la evolución post-operatoria se administró por vía i.m. profunda (Ceftazidima; 50 mg/kg; dos veces a la semana) y Vitamina K1 (Fitomenadiona; 8mg/kg; una vez a la semana) como profilaxis anti-infecciosa y anti- hemorrágica, respectivamente. Además, en el grupo de ratas con Xenotrasplante de células madre adipocíticas se administró el inmunosupresor Tacrolimus (0.05 mg/Kg i.m., 3 veces a la semana) desde las 24 horas previas a RESUMEN la inyección de las células madre hasta el momento del sacrificio como profilaxis de rechazo. Los animales fueron sacrificados en todos los grupos a las 8 semanas de la realización de la colestasis. Así mismo, en todos los grupos, se estudiaron la presencia de ascitis, de vasculopatía venosa mesentérica, hipertensión portal y el desarrollo de circulación colateral porto-sistémica. Además, se cuantificaron las concentraciones séricas de parámetros de función hepato-biliar por fotocolorimetría. Por último, se realizó un estudio histopatológico hepático con microscopía óptica y tinción de Hematoxilina-Eosina, Rojo Sirio y Tricrómico de Masson para comprobar el desarrollo de fibrosis biliar con necrosis hepatocitaria, proliferación biliar y cuantificar el área de fibrosis hepática. Además, con microscopio de fluorescencia se demostró la persistencia intrahepática de las células madre mesenquimales con las que fueron tratadas las ratas con colestasis. Resultados: Respecto a los grupos estudiados con colestasis microquirúrgica, se obtuvieron datos histológicos y bioquímicos más favorables en el grupo de ratas con colestasis microquirúrgica a las que se administraron a las dos semanas del postoperatorio, por vía intrahepática células madre, tanto humanas prediferenciadas a hepatocitos, como de rata no diferenciadas o prediferenciadas a hepatocitos. Dentro de estos tres grupos, los datos obtenidos fueron mejores en el grupo al que se administró células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos. La supervivencia en los distintos grupos fue la siguiente: Las ratas seudo-operadas sobrevivieron el 100% (20/20) y las ratas con colestasis a las que se administró solución salina intrahepática tan solo sobrevivieron el 70% (20/14) (p<0.05). Respecto a las ratas con colestasis a las que se administraron células madre adipocíticas de rata no diferenciadas (Isotrasplante) sobrevivieron el 53,2% (47/25), en tanto que a las que se les administraron células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos (Xenotrasplante) sobrevivieron el 39,5% (38/15) (p<0.05) y, por último, las ratas colestásicas que recibieron células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos (Isotrasplante) sobrevivieron el 66,7% (30/20). En conclusión, en el grupo de ratas colestásicas con Xenotrasplante se apreció una tendencia al incremento de la mortalidad, tanto precoz, probablemente derivada del rechazo agudo; como tardía, posiblemente por el tratamiento inmunosupresor, respecto al resto de los RESUMEN grupos con colestasis, tanto aquellos que solo recibieron suero, como aquellos en los que se realizó un Isotrasplante de células madre de rata. Las ratas colestásicas a las que se les administró solución salina isotónica presentaron un incremento no significativo de ascitis respecto al grupo con Xenotrasplante de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos, y a los dos grupos con Isotrasplante de células madre de rata, tanto no diferenciadas, como prediferenciadas a hepatocitos, siendo este último grupo el que presento valores inferiores de líquido ascítico. Además, todas las ratas colestásicas (100%), tanto si recibieron solución salina, como células madre, desarrollaron circulación colateral porto-sistémica y presentaron vasculopatía venosa mesentérica, todo lo cual confirma el desarrollo de hipertensión portal en éste modelo experimental de colestasis extrahepática microquirúrgica. El incremento del peso corporal fue significativamente menor en las ratas colestásicas con administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos respecto al grupo de ratas seudo-operadas (p<0,001) y al resto de los grupos colestaásicos (p<0,01), siendo éste aumento casi del doble en los grupos con Isotrasplante de células madre de rata, tanto no diferenciadas como prediferenciadas a hepatocitos en relación al grupo de ratas con colestasis que sólo recibieron suero. En el grupo de ratas tratadas con suero se produjo un aumento significativo del peso hepático respecto a las ratas seudo-operadas (p<0,001) y a todos los grupos con colestasis, ya con Isotrasplante cmo con Xenotrasplante (p<0,05). Igualmente ocurre con la relación Peso Hepático/Peso Corporal, que es también, estadísticamente superior en los animales con colestasis e inyección de suero respecto a las ratas seudo-operadas (p<0,001), y a las colestásicas a las que se les inyectaron células madre siendo estas diferencias más marcadas en relación a los grupos que recibieron células madre de rata (p<0,05), tanto no diferenciadas, como las prediferenciadas a hepatocitos. En conclusión, hay que destacar que en el grupo con Isotrasplante de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos se produce menor hepatomegalia que en el resto de los grupos con colestasis. En las ratas colestásica con suero salino también se produjo un aumento significativo tanto de la esplenomegalia respecto a las ratas seudo-operadas (p<0,001) y al resto de los animales colestásicos, existiendo diferencias significativas con el grupo de Xenotrasplante de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (p<0,5), como de la relación peso RESUMEN esplenico/peso corporal, siendo sin embargo, esta diferencia significativa (p<0,5) respecto al grupo de Isotrasplante de células madre de rata prediferenciadas. Se comprobó también, una disminución significativa del peso testicular en las ratas colestasicas que recibieron suero cuando se comparan con las ratas seudo-operadas y con el resto de los grupos colestásicos que recibieron células madre, siendo esta diferencia significativa (p<0,001) con aquellas ratas con Isotrasplante de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos. Así mismo, se comprobó un descenso significativo de la relación peso testicular/peso corporal en las ratas colestásicas tratadas con suero respecto al grupo de ratas seudo-operadas y al resto de los grupos colestásicos que recibieron células madre, existiendo diferencias significativas respecto al grupo con Isotrasplante de células madre de rata prediferenciadas (p<0,05). En conclusión, en el grupo con Isotrasplante de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos se produce menor atrofia testicular que en el resto de los grupos con colestasis. En relación a los parámetros bioquímicos séricos de función hepato- biliar, se apreció una mejoría no significativa en las concentraciones de bilirrubina total, pero sí un aumento significativo (p<0,01) del índice bilirrubina directa/bilirrubina total, de aspartato-aminotransferasa, alanin-aminotransferasa y gamma-glutamiltranspeptidasa. En todos los grupos de ratas tratados con células madre, yá Iso- o Xenotrasplante, se produce un aumento (p<0,05) de las proteínas totales y de la albúmina (p<0,05), respecto a las ratas con colestasis que sólo recibieron suero. También se observó una mejoría en los parámetros bioquímicos de la coagulación, como son el tiempo de Protrombina y la actividad de Protrombina, llegando a ser significativo en el “International Normalized Ratio” (p<0,01), el tiempo de Cefalina (p<0,05) y el Ratio de Tiempo de Cefalina (p<0,05), en los grupos de ratas con colestasis e Iso- y Xenotrasplante de células madre al grupo que sólo recibió suero. En cuanto al estudio histopatológico, se ha demostrado mediante la utilización del microscopio de inmunofluorescencia la persistencia a largo plazo de las células madre que fueron administradas a las ratas colestásicas Así mismo se observó que el área de fibrosis es significativamente inferior (p<0,001) en las ratas seudo-operadas que en las ratas colestásicas y, entre los grupos colestásicos, el porcentaje de fibrosis es significativamente inferior (p<0,001) en las ratas que recibieron células madre, tanto Iso- como Xenotrasplante, respecto a aquellas a las que se inyectó sólo suero. Además, RESUMEN dentro de los grupos que recibieron células madre, el porcentaje de fibrosis es significativamente inferior (p<0,001) en los que se realizó un Isotrasplante de células madre de rata, tanto no diferenciadas como prediferenciadas a hepatocitos siendo entre estos dos últimos grupos inferior en el grupo que con Isotrasplante de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos, si bien ésta diferencia no fue significativa.También, se observó que en el grupo de ratas con colestasis y terapia con células madre hay zonas en las que existe una estructura hepática conservada, proliferación de hepatocitos con mitosis y mínima proliferación biliar en relación a las ratas colestásicas que sólo recibieron suero. Además se comprobó la existencia dentro del parénquima hepático de heterogeneidad respecto de las áreas lesionadas, tanto en cada lóbulo hepático, como en los cuatro lóbulos que constituyen el hígado de la rata , es decir, que hay zonas en las que los hepatocitos están preservados e, incluso existe mitosis hepatocitaria, y otras en las que predomina la proliferación biliar. Conclusión. En un modelo experimental de colestasis microquirúrgica extrahepática crónica en el cual se pretende revertir o reducir la fibrosis biliar mediante xenotrasplante (células humanas) o isotrasplante (células de ratas singénicas) con células madre mesenquimales de origen adipocítico, tanto las alteraciones histopatológicas, esto es, la fibrosis y la proliferación biliar, como la mejoría de la función hepatocelular, han sido más eficaces cuando se realiza un Isotrasplante de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos. La relevancia del presente trabajo de Investigación se fundamenta en la posible extrapolación de los resultados obtenidos a la clínica humana, en la cual la cirrosis de diferentes etiologías comporta una elevada morbi-mortalidad en la actualidad. En particular, el tratamiento con células madre de origen mesenquimal adipocítico y prediferenciadas in vitro a hepatocitos podría ser de utilidad para reducir las complicaciones secundarias a las hepatopatías crónicas de origen biliar en el ser humano. Palabras clave: colestasis, microcirugía, hipertensión portal, ascitis, inflamación, células madre mesenquimales adipocíticas, Isotrasplante, Xenotrasplante ABSTRACT ABSTRACT I. Abstract Introduction. The development of liver fibrosis and portal hypertension in several chronic liver diseases of diferent causes, is a multifunctional process, mediated by inflamatory cells that release fibrogenic mediators and also promotes an excessive angiogenesis as a consequence. The administration of stem cells of an adipocitic mesenquimatous source either from human or rat donors, regarding a microsurgical experimental model of extrahepatic cholestasis could reverse the hepatic biliary fibrosis. And it would also improve the chronic hepatic insuficiency, as well as the splanchnic angiogenic hyperactivity, that is associated with the development of hepatosplenomegaly, colateral porto- systemic circulation, hypertensive portal enteropaty and mesenteric venous vasculopathy. Material and Methods. In order to check this hypothesis, an experimental study with Wistar rats was conducted. There were 4 groups of rats: a first control group divided in two subgroups: a subgroup of pseudo-operated rats (n=20) and another subgroup with rats with microsurgical cholestasis to which was administrated an intrahepatic saline solution (n=20) two weeks after the procedure. The other 3 groups were composed by animals with microsurgical cholestasis, but diferent according to the type of stem cells administrated also after 2 weeks of cholestasis: a group with a Isotrasplant of indiferenciated mesenquimatous rat stem cells (n=47); a group of Xenotransplant of mesenquimatous human stem cells of adipocitic origin (n=38) which were prediferenciated into hepatocytes and a third group of isotransplant of mesenquimatous rat stem cells, prediferenciated into hepatocytes (n=30). As postoperative analgesia it was administrated an opioid – Buprenorfina (0.05mg/kg/12h) - subcutaneously infused for the first 24 hours after the procedure. As an anti-infeccious and anti-hemorragic prophylaxis it was also administrated, through an mintramuscular acess, Ceftazidima (50 mg/kg; twice a week) and Vitamina K1 - Fitomenadiona; (8mg/kg; once a week), respectively, throughout all the postoperative evolution. The group of rats with the xenotransplant of adipocitic stem cells was also given an immunossupresor - Tacrolimus (0.05 mg/Kg i.m., three times a week), from the first 24 hours prior to the injection of the stem cells until the sacrifice, as prophylaxis of rejection. ABSTRACT The animals were sacrificed, in all groups, 8 weeks after the cholestasis. But in all groups were also studied the presence of ascitis, mesenteric venous vasculopathy, portal hypertension and the development of colateral porto- systemic circulation. There were also mesured the blood levels of hepatobiliary metabolism with a photocolorimeter. And for last an histopathological liver study was performed with optic microscopy and staining with Hematoxylin-eosin , Sirium red and Masson Trichromic to show and proove the development of biliary fibrosis with hepatocyte necrosis, biliary proliferation and mesure he area of hepatic fibrosis. With fluorecence microscopy it was also demonstrated the intrahepatic persistence of the mesenquimatous stem cells, with which were treated the rats with cholestasis. Results: Regarding the studied groups with microsurgical cholestasis, there were more favorable histological an biochemical data in the group of rats with microsurgical cholestasis injected with stem cells (by liver acess) 2 weeks after procedure, either human prediferenciated into hepatocytes or rat prediferenciated into hepatocytes or non-diferenciated. In all three groups best data were collected from the group given prediferenciated into hepatocytes rat stem cells. The survival rate of the diferent groups was as follows: the pseudo- operated rats survived by 100% (20/20) and the rats with cholestasis with the intrahepatic saline solution only 70% (20/14) (p<0.05). The rats with cholestasis and with the adipocitic rat non-diferenciated stem cells (Isotransplant) had a survival rate of 53,2% (47/25) and the ones given the human prediferenciated into hepatocytes stem cells (Xenotransplant) a 39,5% (38/15) (p<0.05). The rats with cholestasis given adipocitic prediferenciated into hepatocytes rat stem cells (Isotransplant) survived by 66,7% (30/20).In conclusion, the group of cholestatic rats with Xenotransplant had a tendency to higher mortality rates, either quickly probably due to an acute rejection, or later, possibly because of the immunossurpresor treatment, regarding all rest of the groups with cholestasis, including those recieving saline solution and the ones that undergone a isotransplant with rat stem cells. The cholestatic rats which were given the isotonic saline solution presented a non-significant increase of ascitis regarding the group with Xenotransplant of prediferenciated into hepatocytes human stem cells and the other two groups with Isotransplant of rat stem cells, either non-diferenciated or ABSTRACT prediferenciated into hepatocytes, this last group being the one with lower rates of ascitic fluid. All the cholestatic rats (100%), given sailine solution or stem cells, developed colateral porto-systemic circulation and presented mesenteric venous vasculopathy, which confirms the development of portal hypertension in this experimental model of microsurgical extrahepatic cholestasis. The increase of body weight was significantly lower on the cholestatic rats with the prediferenciated into hepatocytes human stem cells comparing to the pseudo operated rats (p<0,001) and the other cholestatic groups (p<0,01), and the increase was almost the double on the groups with Isotransplant of rat stem cells (non-diferenciated or diferenciated into hepatocytes) regarding the group of rats given only saline solution.The group of rats given the saline solution got a significant increase of liver weight, when compared with the pseudo operated rats (p<0,001) and all the groups with cholestasis (with Isotransplant or Xenotransplant (p<0,05).The same ocurs with the ratio liver weight/body weight, also statisticaly higher in animals with cholestasis and administration of saline solution than in those pseudo operated (p<0,001) and the cholestatic group injected with stem cells, and these diferences are more evident regarding the groups that were given rat stem cells (p<0,05), either non-diferenciated or diferenciated into hepatocytes. In conclusion, we must stand out that in the Isotransplant group of prediferenciated into hepatocytes rat stem cells, there is less hepatomegaly than in all the cholestatic groups. In the group rats with cholestasis and the saline solution, there was also a significant increase of the splenomegaly - regarding the pseudo operated rats (p<0,001) and the rest of the animals with cholestasis, and there are significant diferences with the Xenotransplant group of prediferenciated into hepatocytes human stem cells (p<0,5). The same happens with the ratio splenic weight/ body weight although in this case the significant diferences (p<0,5) regards the Isotransplant group of prediferenciated rat stem cells. It was also demonstrated a significant reduction of the testicular weight on the group of cholestatic rats given saline solution when compared with the pseudo operated rats and with the other cholestatic groups that were given stem cells, and this is significantly diference (p<0,001) with the group of rats with Isotransplant of prediferenciated into hepatocytes rat stem cells. The same way there was a significant decrease of the ratio testicular weight / body weight on the cholestatic rats treated with saline solution regarding the the group of pseudo operated rats and the rest of the groups with cholestasis that were given stem cells, with significant diferences ABSTRACT with the Isotransplant group of prediferenciated rat stem cells (p<0,5). In conclusion, in the group of Isotransplant of prediferenciated into hepatocytes rat stem cells there was less testicular atrophy than in the other groups with cholestasis. The biochemical blood levels of the hepatobiliary function showed a non-significant improvement of the total bilirubin levels but a significant raise (p<0,01) of the ratio conjugated bilirubin/total bilirubin, the aspartate- aminotransferase, alanine-aminotransferase and gamaglutamyl transpeptidase. In all groups treated with stem cells, by Iso or Xenotransplant, there is an increase (p<0,05) of the total protein levels and albumine (p<0,05) when compared with the group treated with saline solution. There was also an improvement of the coagulation biochemical levels such as prothrombin time, prothrombin activity, being significant with the “International Normalized Ratio” (p<0,01), the Cephalin time (p<0,05) and the ratio of cephalin time (p<0,05) in the groups of rats with cholestasis and Iso or Xenotransplant of stem cells when compared with the group that got only saline solution. The histopathological findings, with an immunofluorecence microscopy, demonstrated the persistence (at a long run) of the stem cells administrated to the rats with cholestasis. It was also observed that the area of fibrosis was significantly smaller (p<0,001) in the pseudo operated rats than in the cholestatic ones and, between the groups with cholestasis, the percentage of fibrosis was significantly smaller (p<0,001) in the rats with the stem cells, either Iso or Xenotransplant, when compared to the ones injected with saline solution. Further more, within the groups that were given stem cells, the rate of fibrosis was significantly lower (p<0,001) on those with an Isotransplant of rat stem cells, either non-diferenciated or prediferenciated into hepatocytes, and between these two groups, the last one had a lower percentage although without a significant diference. It was also noticed that the group of cholestatic rats with stem cells therapy presented areas of maintained liver structure, hepatocytes with mitosis proliferation and minimum biliary proliferation when compared to the cholestatic rats with saline solution therapy. In the liver parenchyma it was also found heterogeneity within the areas of lesion, either in each lobule as in all the four lobules that make the liver of the rat, which means that there are areas where the hepatocytes are preserved and further more, there is hepatocytic mistosis and other areas in which the biliary proliferation dominates. ABSTRACT Conclusión. In an experimental microsurgical extrahepatic cronic cholestasis model, in which the goal is to revert or to reduce the biliary fibrosis through a Xenotransplant (human cells) or Isotransplant (syngeneic rat cells) with stem cells of adipocitic origin, either the histopathological changes – fibrosis and biliary proliferation – and the improvement of the hepatocelular function, have been more eficient when a isotransplant of prediferenciated into hepatocytes rat stem cells is performed. The relevance of the present investigation study is based on the posible extrapolation of this study results on human diseases, in which the cirrhosis of diferent etilogies is associated with a high morbidity and morbility rates. Particularly the treatment with mesenquimal stem cells and prediferenciated into hepatocytes in vitro, could be usefull to reduce the secondary complications of the chronic liver diseases of biliary origin in the humans. Key-words: cholestasis, microsurgery, portal hypertension, ascitis, inflamation, mesenquimous adipocitic stem cells, Isotransplant, Xenotransplant. I. INTRODUCCIÓN INTRODUCCION 2 I. INTRODUCCIÓN 1. COLESTASIS EXTRAHEPÁTICA: UNA PATOLOGIA LOCAL Y SISTEMICA La colestasis se define como una alteración en la formación de bilis por el hígado (Pollheimer y cols., 2014) o bien, en el drenaje biliar en el intestino (Gossard 2013) y se clasifica en extrahepática e intrahepática (EASL, 2009; Jüngst y Lammert, 2013). La causa de la colestasis intrahepática reside en el hígado en tanto que el término extrahepatico implica la obstrucción de la vía biliar fuera del parénquima hepático (Li y Crawford 2004; Hirschfield y cols., 2010) (Tabla 1) Los principales síntomas y signos de la colestasis, tanto intra- como extrahepática, son similares. En particular, la ictericia y el prurito son características clínicas de ambos tipos de colestasis, siendo frecuente que las alteraciones bioquímicas plasmáticas precedan su instauración (Ramapa y Aithal, 2011; Gossard 2013). Para realizar el diagnóstico diferencial entre la colestasis intra- y extra-hepática es precisa una cuidadosa evaluación de sus características clínicas, serológicas e histopatológicas, así como de diversas pruebas de imagen (Li y Crawford 2004; Briggs y Peterson, 2007; Gossard 2013). El impacto clínico de la insuficiencia hepática es relevante porque la prevalencia mundial de cirrosis está aumentando y porque, a su vez, es la principal causa de carcinoma hepatocelular (Russo y Parola, 2012). En particular, los datos epidemiológicos demuestran un preocupante incremento de cirrosis hepática secundaria a infección crónica por el virus de la hepatitis B o C, por el consumo de alcohol y por la enfermedad hepática por depósito de grasa (Poynard y cols., 1997, Parola y cols., 2008). La progresión fibrogénica de la insuficiencia hepática crónica se comprueba por los aspectos siguientes: 1. Se estima que aproximadamente 180 millones de pacientes sufren insuficiencia hepática crónica en el mundo, siendo las causas fundamentales en los países occidentales la hepatitis crónica por virus C, seguida y/o asociada al abuso del consumo de alcohol. La hepatitis crónica por virus B y C son también predominantes en África y Asia. Un 25-30% de éstos pacientes desarrollarán fibrosis significativa y, eventualmente cirrosis. Además la obesidad y la diabetes epidémicas aceleran la progresión de las INTRODUCCION 3 patologías hepáticas crónicas y constituyen por sí mismas una causa de cirrosis en el contexto de la evolución de la esteatohepatitis no-alcohólica Novo y cols., 2014). 2. Más de un millón de muertes al año, lo cual representa un 2% de todas las muertes, y 31.027.000 incapacidades ajustadas a los años de vida son secundarias a cirrosis hepática. La cirrosis producida únicamente por abuso de alcohol es responsable de 493.000 muertes anuales y 14.544.000 incapacidades ajustadas a los años de vida (Rehm y Shield, 2014) 3. Además, entre las patologías del tracto gastrointestinal, la cirrosis hepática es la causa de muerte más frecuente de origen no tumoral en Europa y USA, constituye la séptima causa de muerte en los países occidentales (Novo y cols., 2014) 4. El carcinoma hepatocelular, un tipo de cáncer muy agresivo, que representa el 5º tipo de tumor más frecuente, que cursa a su vez con un 85-90% de mortalidad (Gupta y cols., 1999), siendo la tercera causa de muerte por cáncer en todo el mundo, casi siempre tiene su origen en un hígado cirrótico, e incluso sobre una fibrosis biliar (El-Serag, 2011). El índice anual de progresión de cirrosis a carcinoma hepatocelular varía dependiendo de su etiología, pero se ha estimado en un 2-3% al 7-8% de los pacientes. 5. Los datos epidemiológicos predicen un pico de incidencia de insuficiencia hepática descompensada y de carcinoma hepatocelular en la próxima década (Rosselli y cols. 2013; Rehm y Shield, 2014), en paralelo con un descenso del número de hígados donantes para trasplante hepático que, actualmente, es el único tratamiento eficaz para los enfermos cirróticos. 6. La progresión de una insuficiencia hepática crónica hacia la cirrosis se produce al menos después de 10 a 15 años de evolución y, a veces requiere incluso hasta 30 años, pero puede ser extremadamente rápida en algunos tipos de patología hepática, en particular, en los niños con atresia biliar, en pacientes con recurrencia del virus de la hepatitis C después del trasplante hepático o en pacientes co-infectados con virus de la hepatitis B y C (Friedman, 2008; Rosselli y cols. 2013; Rehm y Shield, 2014; Novo y cols., 2014). Se consideran factores predictivos del desarrollo de fibrosis y cirrosis avanzadas el sexo masculino, la edad inferior a 50 años, la ingesta diaria de alcohol, el contenido hepático de hierro, la obesidad y la diabetes mellitus, así como factores individuales relacionados con la capacidad de respuesta inmune y el metabolismo de tóxicos (Novo y cols., 2014). INTRODUCCION 4 Respecto de la colestasis extrahepática en el ser humano, su etiología es la obstrucción mecánica de la vía biliar extrahepática, desde los conductos hepáticos, derecho e izquierdo, el conducto hepático común o el colédoco (Gossard y Talwakar, 2014). Dicha obstrucción puede ser causada a su vez por malformaciones biliares (Nakamura y Tanoue 2013), litiasis (Li y Crawford 2004; Hirschfield y cols, 2010), tumores biliares (Hirschfield y cols, 2010) o compresión extrínseca de la vía biliar (Suarez y cols, 2013) (Tabla 1). Con independencia de su etiología, la colestasis extrahepática se manifiesta clínicamente por ictericia, coluria, acolia y prurito (Imam y cols., 2012; Gossard 2013). Las alteraciones bioquímicas séricas se relacionan principalmente con la retención sanguínea de todas las sustancias normalmente excretadas en la bilis (Ramappa y Aithal, 2011). Así, al incremento sérico de bilirrubina y ácidos biliares se asocian elevadas concentraciones séricas de fosfatasa alcalina, γ-glutamil transferasa, 5´-Nucleotidasa y colesterol (Li y Crawford 2004; Ramappa y Aithal, 2011). La inflamación hepática es una consecuencia importante de la colestasis extrahepática. Entre las alteraciones inflamatorias hepáticas de la colestasis obstructiva destacan el edema con infiltración leucocitaria de los tractos portales y la proliferación de las células epiteliales biliares con fibrosis portal (Saito y Maher 2000; Tacke y cols, 2009). En particular, el término fibrosis biliar, define un patrón hepático consistente en la asociación de proliferación ductular biliar y de los miofibroblastos periductulares entre las áreas portal y hepatocitaria o parenquimatosa que causa el desarrollo de septos fibrosos porto-portales (Parola y Pinzani 2009). Finalmente, la inflamación hepática crónica secundaria a la colestasis extrahepática induce la progresión secuencial de fibrosis a cirrosis y culmina en el desarrollo de un carcinoma hepatocelular (Aller y cols, 2010c; Pinzani y cols, 2011). El mecanismo exacto por el cual la inflamación induce cáncer no está aún perfectamente definido, pero factores de transcripción, como el NF-κB, el STAT3 y JNK., y el inflamosoma, un complejo multiproteico que actúa como sensor de lesión celular, se han implicado recientemente en éste mecanismo de transformación celular maligna. Las alteraciones claves de la cirrosis son necroinflamación, depósito de matriz extracelular y acortamiento de de telomeros, todo lo cual comporta procesos inmunomoduladores, como la senescencia y la regeneración celular, que podrían ser la causa de la progresión tumoral de la cirrosis hepática (Ramakrishna y cols., 2013). INTRODUCCION 5 El hígado está compuesto por dos tipos de células epiteliales, los hepatocitos y los colangiocitos. Estos últimos, aunque sólo constituyen del 3 al 5% de todas las células del parénquima hepático, desarrollan un papel fisiológico clave durante el tránsito de la bilis a lo largo de la vía biliar, que implica la la secreción y absorción de agua, electrolitos, como el Cloro y el bicarbonato, y de otros solutos orgánicos, principalmente la bilirrubina (Glaser y cols., 2010; Pollheimer y cols., 2014). La integración de estímulos prosecretorios (Secretina, Glucagon, Polipeptido Intestinal Vasoactivo, VIP, Acetilcolina y Bombesina) con los anti secretorios (Somatostatina y Endotelina-1) implica a Adenilil-ciclasas transmemebrana que regulan la concentración intracelular de Monofosfato cíclico-3´,5´. El transporte de proteínas basolateral (sinusoidal) y acanalicular (apical) conduce los ácidos biliares desde la sangre sinusoidal hacia el canalículo, lo cual se denomina circulación enterohepática (Hirschfield y cols., 2010). Durante las últimas tres décadas los colangiocitos se han considerado como una heterogénea y altamente dinámica población celular implicada en la adaptación del hígado a la agresión (Marzioni y cols., 2010; O´hara y cols., 2013). En respuesta a la agresión, los colangiocitos liberan múltiples mediadores inflamatorios, en particular citoquinas y quimioquinas (Factor de Necrosis Tumoral-alfa;TNF-α, Interleuquina-6, IL-6, e Interleuquina-8, IL-8), factores de crecimiento (Factor de crecimiento derivado de plaquetas, PDGF, Factor de crecimiento de endotelio vascular, VEGF y Factor de crecimiento transformador-beta, TGF-β); morfógenos, como Hedgehog y Notch, y expresan moléculas de adhesión que facilitan el reclutamiento, localización y modulación de la respuesta inmunitaria en el tracto biliar y el hígado (Syal y cols, 2012; O´hara y cols., 2013). Estas moléculas funcionan de forma autocrina/paracrina induciéndo fenómenos celulares, como la proliferación, apoptosis, vasculogénesis y fibrosis, que se asocian con la respuesta de reparación biliar (Syal y cols, 2012). En éste sentido, algunas células mesenquimales derivadas de epitelio sufren una transición mesenquimo-epitelial, revirtiendo a células epiteliales que posteriormente pueden diferenciarse en colangiocitos o en hepatocitos (Hirschfield y cols., 2010). Así, la modulación de la función y supervivencia de los colangiocitos, favorece, tanto su proliferación, como la diferenciación de los fibroblastos portales y células estrelladas hepáticas en miofibroblastos, lo que explicaría la concomitante respuesta proliferativa biliar y fibrosante en la fibrosis/cirrosis biliar (Syal y cols, 2012; Park, 2012). INTRODUCCION 6 Tabla 1: ETIOLOGIA DE LA COLESTASIS EXTRAHEPATICA __________________________________________________________ - Atresia biliar extrahepática - Litiasis biliar - Lesiones inflamatorias. * Colangitis esclerosante primaria y secundaria * Estenosis postoperatorias ^ Colédoco ^ Esfínter de Oddi * Biliopatía hipertensiva portal por obstrucción extrahepática de la vena porta. * Pancreatitis ^ Aguda ^ Crónica * Pseudoquistes pancreáticos - Tumores * Intrínsecos ^ Benignos – Papilomas ^ Malignos – Colangiocarcinomas - Extrínsecos ^ Pancreáticos ^ Gástricos ^ Metástasis ganglionares hiliares hepáticas ^ Lifomas: Enfermedad de Hodgkin - Causas inusuales * Quistes del colédoco * Abscesos amebianos * Divertículos duodenales * Infecciones parasitarias: Ascariasis, fascioliasis * Hemobilia Sherlock S. Cholestasis. En: Diseases of the Liver and Biliary System. Ed. Sherlock S. Blackwell Scientific Publications. London 1989; 8ª Edición. Chapter 13; pp. 248-272. A su vez, las interacciones epitelio-mesenquimales desempeñan una importante influencia en la evolución de las colangiopatías crónicas. Incluso se ha sugerido que los colangiocitos como los hepatocitos, pueden transformarse en células mesenquimales mediante un proceso de transición epitelio- INTRODUCCION 7 mesenquimal, en cuyo caso este proceso podría también contribuir a la generación de miofibroblastos y, por tanto, a la producción de fibrosis biliar (Fabris y Strazzabosco, 2011; Park, 2012). Se podría concluir que la colestasis extrahepática, comparte con otros tipos de colangiopatías la existencia de proliferación biliar, ductopenia por inhibición de la proliferación o por apoptosis, fibrosis biliar y carcinogénesis (Marzioni y cols., 2010; Park, 2012; Syal y cols, 2012; O´hara y cols., 2013). Una complicación frecuente de la colestasis extrahepática es la infección bacteriana con colangitis y posterior formación de abscesos. Charcot yá describió en 1877 la tríada clínica de fiebre, ictericia y dolor en el hipocondrio derecho que se asocia a la colangitis secundaria a litiasis o estenosis del colédoco (Lipsett y Pitt 1990). La obstrucción del flujo biliar induce alteraciones en la respuesta inmune local del huésped, incluyendo defectos de la quimiotaxis y de la fagocitosis, así como de la función de las células de Kupffer y por la existencia de circulación colateral portosistémica, que evita el tránsito del flujo portal por el hígado, unidas a alteraciones sistémicas (Navaneethan y cols., 2011). La ausencia de bilis y de la secreción de IgA en el tracto gastrointestinal, como consecuencia de la colestasis obstructiva, induce cambios en la flora bacteriana intestinal, pérdida de la integridad de la mucosa, disminución de la inactivación de Endotoxina (LPS), con sobre crecimiento bacteriano, bacteriemia portal, endotoxemia y traslocación de LPS al hígado, todo lo cual puede producir colangitis y finalmente sepsis en éstos pacientes (Navaneethan y cols., 2011). Las infecciones bacterianas son frecuentes en los pacientes con insuficiencia hepática crónica con independencia de su etiología. Las infecciones más frecuentes son la peritonitis bacteriana espontánea, las infecciones urinarias y la neumonía, que en el 80% de los casos son causadas por bacilos gram- negativos y, en particular, por Escherichia coli, lo que sugiere que estos episodios infecciosos que sufren éstos pacientes son de origen entérico (Bellot y cols, 2013). El paso de bacterias viables desde la luz intestinal, a través de su pared, hasta los ganglios linfáticos mesentéricos y otros tejidos y órganos de la economía, es un mecanismo patogénico aceptado para explicar el desarrollo de las infecciones bacterianas en el paciente con insuficiencia hepática crónica y, por tanto, en los pacientes con colestasis extrahepática. Este fenómeno fue originalmente descrito por Berg y Garlington en 1979 (Berg y Garlington, 1979). Los mecanismos que favorecen la traslocación bacteriana intestinal asociados a INTRODUCCION 8 la insuficiencia hepática crónica son, al menos, tres: el excesivo crecimiento de las bacterias intestinales, el incremento de la permeabilidad intestinal y el deficitario sistema inmunológico del tejido linfoide intestinal compuesto por las placas de Peyer, los linfocitos y las células dendríticas de la lámina propia, los linfocitos intraepiteliales y los ganglios linfáticos mesentéricos (Bellot y cols, 2013). Otra grave consecuencia de la colestasis extrahepática en particular cuando se cronifica, es la hipertensión portal. Las complicaciones clínicamente significativas de la hipertensión portal, se considera que se producen cuando el gradiente de presión venosa hepática es superior a 10 mmHg (Miñano y García- Tsao 2010). Entre estas complicaciones destacan la encefalopatía hepática, la ascitis, el síndrome hepatorrenal y las varices gastroesofágicas que son causa de hemorragia, así como de una creciente mortalidad con cada episodio hemorrágico (Rahimi y Rockey 2011; Abraldes y cols., 2012). Sin embargo, la alteración más representativa de la afectación hepática crónica, incluyendo la secundaria a colestasis extrahepática, es la existencia de circulación hiperdinámica tanto esplácnica como sistémica. La circulación hiperdinámica se atribuye tanto al incremento de sustancias vasodilatadoras circulantes como a una reducida respuesta a sustancias vasoconstrictoras (Iwakiri y Groszmann 2006; Laleman 2009). En esencia, las alteraciones hemodinámicas asociadas a la insuficiencia hepática crónica, hipertensión portal y traslocación bacteriana, sugieren la existencia de un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica de origen multifactorial (Aller y cols, 2007a; Thabut y cols, 2007a; Tandon y García-Tsao 2008; Cazzaniga y cols, 2009; Abdel-Khalek y cols, 2011). En este caso, las complicaciones propias de la colestasis extrahepática, tanto locales o hepáticas (fibrosis/cirrosis biliar), regionales o esplácnicas (hipertensión portal, circulación colateral portosistémica, traslocación bacteriana intestinal, ascitis) y generales o sistémicas (encefalopatía hepática, síndrome hepatorrenal) por su naturaleza inflamatoria, podrían ser integradas para su estudio etiopatogénico y, por tanto, en la investigación de nuevos y más eficaces tratamientos (Jalan y Williams 2002; Coltart y cols, 2013). INTRODUCCION 9 2. MODELOS EXPERIMENTALES PARA EL ESTUDIO DE LA COLESTASIS EXTRAHEPÁTICA La colestasis extrahepática cursa con una elevada incidencia de morbilidad y mortalidad (Gossard y Talwalkar; 2013) Las graves alteraciones hepáticas, esplácnicas y sistémicas que produce la ictericia obstructiva, justifica la creación de modelos experimentales que permitan el estudio de sus mecanismos patogénicos, con el objetivo de instaurar eficaces medidas profilácticas y terapéuticas (Aller y cols, 2008b). Los dos modelos experimentales más utilizados en la actualidad para el estudio de la cirrosis/fibrosis biliar son la ligadura y sección del colédoco y la administración de CCl4, pero el primero se considera mejor que el segundo porque se evita la toxicidad que comporta éste producto químico para los investigadores y porque, además el tiempo requerido para la obtención de fibrosis biliar es mucho más corto cuando se secciona el colédoco (Guimaraes Marques y cols., 2012). La colestasis obstructiva inducida por la ligadura y sección del colédoco se considera el modelo experimental más grave de colestasis porque induce la interrupción brusca y completa del drenaje biliar (Pollheimer y cols., 2014). En ésta situación acontece la inhibición predominante del receptor nuclear Farnoside X (FXR), un sensor nuclear hepatocelular de las sales biliares implicado en la síntesis de bilis por los hepatocitos, como consecuencia de la elevada concentración intracelular de sales biliares. FXR, a su vez inhibe la expresión de un polipeptido cotransportador de Taurocolato sódico (NTCP), expresado en la membrana basocelular de los hepatocitos que es responsable de la captación de sales biliares por los hepatocitos en contra de un gradiente de concentración. Estos hallazgos se han interpretado como una respuesta adaptativa del hígado para reducir el efecto citotóxico de las sales biliares sobre los hepatocitos sometidos a estrés (Pollheimer y cols., 2014). Por ello, el modelo experimental más frecuentemente utilizado de ictericia obstructiva es el resultante de la ligadura y sección del colédoco en la rata, aunque también se ha desarrollado en conejos y ratones (Katsuta y cols, 2005; Abraldes y cols, 2006; Geerts y cols., 2008; Liedtke y cols. 2013). Además, de la ligadura y sección del colédoco, se han utilizado otros métodos como modelo experimental de colestasis neonatal, como la inyección intrabiliar de esclerosantes y superglue en ratones, hámsteres, ratas y minipigs, que permiten estudiar las consecuencias metabólicas de la colestasis en ésta etapa de la vida. (Petersen y Davenport, 2013). INTRODUCCION 10 La fibrosis hepática crónica es un problema de salud de proporciones significativas. El desarrollo experimental de modelos preclínicos, en particular en el ratón, han proporcionado una plétora de posible alternativas terapéuticas. Sin embargo, el hígado del ratón no es un buen modelo de lesión hepática en el ser humano y los esfuerzos realizados para trasladar sus resultados a la fibrosis hepática humana han sido improductivos hasta la actualidad (Friedman 2010; Bissell 2011; Ellis y Mann 2012). Además, la rata es el animal de elección ya que no posee vesícula biliar, en tanto que en el ratón, la oclusión del colédoco produce una gran dilatación de la vesícula biliar que puede causar su perforación y coleperitoneo (Abraldes y cols, 2006), lo que exige ligadura del conducto cístico o bien colecistectomía previa a la colestasis (Aller y cols,2008a)(Figura 1). Figura 1. A. Disección de la vía biliar extra hepática en el ratón. B.Colecistectomía durante la realización de colestasis extra hepática microquirúrgica en el ratón (Aller y cols. Extrahepatic Cholestasis. En: Microsurgery In Liver Research, Aller MA; Arias J. Eds. Bentham Scientific Publishers, 2009 b, pp 137-156.) En el ratón, la transección del conducto colédoco entre ligaduras, asociado a colecistectomía, también permite conseguir un modelo para el estudio de la fibrosis biliar, aunque coexiste una extensa necrosis hepática INTRODUCCION 11 (Heinrich y cols, 2011). Para evitar ésta grave lesión hepática se ha propuesto la realización de una ligadura parcial del colédoco, que consiste en la ligadura conjunta del colédoco y una aguja quirúrgica de 7-0. Posteriormente, se retira la aguja y así persiste una estenosis graduada del colédoco que produce a los 14 días de evolución, proliferación biliar pero evita la necrosis del parénquima hepático (Heinrich y cols, 2011). Para evitar ésta complicación, otros grupos de investigación utilizan el modelo de ligadura y sección del colédoco, pero en ratones transgénicos (Tiao y cols., 2014; Marzioni y cols., 2014). En el ratón, la ligadura y sección del colédoco induce un incremento brusco de la presión en la vía biliar, y ya a las 8 horas de evolución se produce una intensa infiltración de neutrófilos, que es la respuesta inmune predominante haste el tercer día (Georgiev y cols. 2008). A continuación, entre el 2º-3º y 5º días se produce una respuesta proliferativa de los colangiocitos, como parte de la reacción ductular, y de los hepatocitos (Georgiev y cols. 2008; Pollheimer y cols., 2014). Estas lesiones agudas se acompañan con una aumento delas concentraciones séricas de AST, ALT, TGβ, bilirrubina y fosfatasa alcalina, así como de una continua reparación tisular hepática (Georgiev y cols. 2008). Los colangiocitos en proliferación secretan citoquinas y quimioquinas proinflamatorias, con reclutamiento de neutrófilos que contribuyen a la lesión del hígado colestásico mediante la generación de especies reactivas de oxígeno ya a los tres días del postoperatorio desde los cinco días posteriores a la intervención se forman infartos biliares y un intenso edema periportal, que se acompaña de la infiltración de gran número de neutrófilos CD11-b positivos alrededor y en el interior de los infartos biliares, así como en los tractos portales (Pollheimer y cols., 2014). A las dos semanas de evolución se produce un marcado incremento del depósito hepático de colágeno y de la infiltración por linfocitos y células de Kupffer, que se cree reducen la agresión aguda hepática liberando IL-6, que posee un importante efecto anti-apoptótico, importante para la regeneración hepática (Pollheimer y cols., 2014). Posteriormente, el número de células estrelladas activadas y la expresión de TGF-β, de inhibidor tisular de Metaloproteasa I (TIMP-I) y de Procolageno I disminuyen y la fibrosis biliar se estabiliza hasta la sexta semana del postoperatorio (Georgiev y cols. 2008). Por el contrario, en la rata la técnica quirúrgica de ligadura y sección del colédoco es sencilla ya que, al ser una técnica macroquirúrgica, no requiere medios de magnificación para su realización. En esencia, y tras laparotomía media o subcostal derecha, se diseca el colédoco y se reseca entre dos INTRODUCCION 12 ligaduras. Sin embargo, las ratas con colestasis extrahepática macroquirúrgica desarrollan un pseudoquiste biliar hiliar por dilatación del extremo proximal ligado del colédoco, que se infecta por microorganismos Gram-negativos, y los animales fallecen durante las dos primeras semanas de evolución postoperatoria por sepsis secundaria a la existencia de múltiples abscesos intraperitoneales, hepáticos y pulmonares (Aller y cols, 1993c; Aller y cols, 2004a; Aller y cols, 2009a; Llamas y cols., 2010). En este modelo experimental también se ha descrito el desarrollo de fibrosis biliar por lo que ha sido considerado apropiado para el estudio de la patología humana secundaria a la atresia biliar extrahepática y la colangitis esclerosante primaria (Petersen 2012; Marzioni y cols. 2014). Las especiales características anatómicas del hígado de la rata, multilobulado, y cada lóbulo poseen su propia vascularización portal y arterial, así como un drenaje biliar y venoso individualizado, permite mediante la utilización del microscopio operatorio realizar una nueva técnica de colestasis extrahepática. Figura 2. Disección, ligadura y sección de los conductos biliares de los lóbulos medio y lateral izquierdo en el ratón (Aller y cols. Extrahepatic Cholestasis. En: Microsurgery In Liver Research, Aller MA; Arias J. Eds. Bentham Scientific Publishers, 137-156;2009 b). La técnica microquirúrgica de colestasis extrahepática en la rata permite la resección de la vía biliar extrahepática que incluye el colédoco, hasta el inicio de su porción intrapancreática, en continuidad con los conductos biliares que INTRODUCCION 13 drenan cada uno de los lóbulos hepáticos (Figuras 2 y 3) (Aller y cols, 1993a; Lorente y cols, 1995; Aller y cols, 2009a; Aller y cols, 2009b; Aller y cols, 2010a; Aller y cols., 2012a). Con ésta técnica microquirúrgica, la inexistencia de vía biliar extrahepática residual previene la formación de pseudoquistes biliares hiliares, así como de abscesos abdomino-torácicos y reduce la mortalidad respecto al modelo clásico de ligadura y sección del colédoco (Aller y cols, 1993a; Aller y cols, 2004a; Aller y cols, 2009a; Aller y cols, 2009b; Aller y cols, 2010a). Figura 3. Técnica de la colestasis extrahepática microquirúrgica en la rata. En el dibujo de la izquierda se representa la vía biliar extrahepática del hígado de la rata (a). En el dibujo de la derecha (b), tras la resección microquirúrgica de la vía biliar extrahepática, se observan los conductos lobulares hepáticos ligados a ras del parénquima hepático. Este modelo de colestasis extrahepática microquirúrgica, al conseguir mayor supervivencia, también permite obtener a más largo plazo un nuevo modelo de fibrosis hepática que puede ser de gran utilidad para el estudio de nuevas terapias antifibrogénicas. A este respecto, se debe considerar que durante la evolución de la colestasis extrahepática en la rata existen dos fases. La fase evolutiva precoz que se extiende hasta la cuarta semana del periodo postoperatorio, y la fase evolutiva tardía que comprende las posteriores semanas de supervivencia (Assimakopoulos y Vagianos 2009). Así, cuando la ictericia obstructiva es aguda, la colemia predomina sobre la lesión del parénquima hepático y no existe aún hipertensión portal ni cirrosis, si bien se producen efectos inotrópicos y cronotrópicos negativos cardíacos, hipotensión arterial y vasodilatación periférica (Hajrasouliha y cols, 2004; Moezi y Dehpour; 2013;) y INTRODUCCION 14 se altera la respuesta vasoconstrictora simpática (Jacob y cols, 1993; Moezi y Dehpour; 2013). Parece que la disfunción cardíaca es secundaria fundamentalmente a la acción de los ácidos biliares, unidos al aumento de oxido nítrico (NO), de opioides endógenos y de endocanabinoides (Moezi y Dehpour; 2013) Además, el acúmulo de ácidos biliares causa una intensa diuresis y natriuresis que pueden incluso producir grave hipovolemia (Kramer 1997). Como consecuencia, se producen hipotensión arterial y disfunción renal prerrenal (Kaler y cols; 2004) que es agravada por la endotoxemia que acompaña a éste modelo experimental (Abrahám y cols., 2008). A su vez, durante la fase evolutiva considerada crónica, esto es, superior a las cuatro semanas del postoperatorio, no solo existe colemia, endotoxemia y translocación bacteriana intestinal (Clements y cols, 1998; Ara y cols., 2006) sino también una significativa patología hepática con fibrosis/cirrosis biliar, hipertensión portal y ascitis (Abraldes y cols, 2006; Georgiev y cols., 2008; Aller y cols. 2009b; Han y cols., 2014; Mejias y cols; 2014; Yang y cols, 2014) que se asocia con una lesión renal similar fisiopatológicamente al síndrome hepatorrenal de los enfermos cirróticos. Los modelos de colestasis extrahepática, tanto macroquirúrgicos, por ligadura del colédoco, como microquirúrgicos por resección de la vía biliar extrahepática, cursan a largo plazo (4ª a 6ª semana del postoperatorio) con hepatomegalia, fibrosis biliar, infiltración leucocitaria de los espacios portales hepáticos y muerte de los hepatocitos por necrosis y apoptosis, aunque no se observa la pérdida de la estructura normal hepática con la formación de nódulos de regeneración delimitados por septos fibrosos y remodelación vascular, descrita por algunos autores inicialmente (Kountouras y cols, 1984). Por esta razón, no es apropiado conceptuar estos modelos experimentales como productores de cirrosis en esta fase evolutiva. Por el contrario, en la actualidad se acepta que los cambios histopatológicos constituyen una fibrosis biliar (Aller y cols, 1993a; Aller y cols, 2004b; Liedtke y cols., 2013). Tanto las alteraciones en la fase precoz como en la fase tardía o a largo plazo, de este modelo experimental, validan su empleo para el estudio de los mecanismos fisiopatológicos de la colestasis extrahepática así como para la investigación de nuevos y más eficaces tratamientos de ésta grave patología hepática (Assimakopoulos y Vagianos 2009). INTRODUCCION 15 Para la puesta a punto de la técnica microquirúrgica de la colestasis extrahepática en la rata, se ha estudiado previamente la anatomía de la vía biliar extrahepática, descrito sus variaciones anatómicas (Lorente y cols, 1995), la incidencia de infecciones postoperatorias (Aller y cols, 1993a) así como se ha estandarizado una microtécnica de fácil aprendizaje y mínima mortalidad atribuible a su ejecución. El estudio del modelo experimental se ha fundamentado en la valoración de la patología hepatobiliar, con el grado de fibrosis y proliferación biliar de los hígados colestasis (Aller y cols, 2004a; Aller y cols, 2004b) y de las alteraciones bioquímicas plasmáticas propias de la lesión hepatobiliar (Aller y cols, 2008a), así como de las alteraciones del metabolismo oxidativo hepato-intestinal (López y cols, 1999) y cerebral (García-Moreno y cols, 2002) y, por último, la respuesta inflamatoria esplácnica mediante la determinación de las concentraciones de citoquinas pro y anti-inflamatorias en hígado, bazo, ganglios linfáticos mesentéricos e íleon (García-Domínguez y cols, 2010). La utilización profiláctica de antibióticos de amplio espectro (Ceftazidima 50 mg/kg) y la administración semanal de vitamina K (8 mg/kg i.m.) reduce la mortalidad precoz de las ratas con colestasis extrahepática (Beck y Lee 1995; Akimoto y cols, 2005; Abraldes y cols, 2006). En particular, en las ratas con colestasis obstructiva microquirúrgica la supervivencia es superior a las ocho semanas y, por tanto, los resultados pueden ser más fácilmente extrapolados a la clínica humana, que se suele caracterizar por la evolución crónica de la colestasis extrahepática. Las alteraciones extrahepáticas son múltiples en la colestasis extrahepática experimental en la rata, con independencia de la técnica quirúrgica empleada. Destacan la ictericia, la coluria (Huang y cols, 2003; Aller y cols, 2004b), la hipertensión portal con esplenomegalia y circulación colateral portosistémica (Aller y cols, 1993b; Huang y cols, 2003; Aller y cols, 2004b; Chan y cols, 2004; Katsuta y cols, 2005), la insuficiencia renal (Assimakopoulos y Vagianos 2009), la encefalopatía hepática (García-Moreno y cols, 2002; Assimakopoulos y cols, 2010; Eslimi y cols, 2011; Leke y cols., 2012; Leke y cols., 2013; Jover-Cobos y cols., 2014) y al final de este periodo considerado crónico, 6ª semana del postoperatorio, la ascitis (Aller y cols, 2010a; Aller y cols, 2010c). Por lo tanto, la colestasis extrahepática experimental no solo es un modelo apropiado para el estudio de la patología hepática secundaria a la obstrucción biliar, sino que también reproduce las alteraciones esplácnicas y INTRODUCCION 16 sistémicas que son propias de la ictericia obstructiva crónica en la clínica humana. También se ha descrito un modelo experimental quirúrgico de ictericia obstructiva parcial, que consiste en la sección entre ligaduras de los conductos biliares de los lóbulos hepáticos medio, lateral derecho y caudado, dejando intacto el correspondiente al lóbulo lateral izquierdo, que no sufre por tanto obstrucción biliar (Polimeno y cols, 1995). La colestasis selectiva lobular permite la supervivencia a largo plazo de los animales, aunque no evita que los lóbulos hepáticos colestásicos sufran proliferación biliar, discreta proliferación hepatocitaria e infiltración por células inflamatorias. Sin embargo, un hallazgo inesperado en éste modelo de colestasis selectiva ha sido la existencia de proliferación biliar en el lóbulo lateral izquierdo, que no sufría colestasis obstructiva. Este inopinado resultado también ha sido demostrado por otros autores cuando se ligan selectivamente sólo los conductos biliares de los lóbulos medio y lateral izquierdo (Tannuri y cols., 2012). La conclusión es que la ligadura selectiva biliar induce alteraciones, evidenciadas por el aumento de expresión de α-SMA, una proteína relacionada con la fibrogénesis hepática, tanto en el parénquima hepático colestásico, como en el adyacente no sometido a obstrucción biliar. Estas alteraciones generalizadas hepáticas serían mediadas por vía paracrina y/o endocrina (Polimeno y cols, 1995; Tannuri y cols., 2012). La colestasis experimental, en particular de localización extrahepática, se ha considerado un modelo apropiado para el estudio de los mecanismos implicados en la producción de atresia biliar en la clínica humana (Aller y cols, 2008a). Sin embargo, otros modelos experimentales no quirúrgicos, se han propuesto como alternativas válidas. En particular, los modelos de atresia biliar de etiología vírica en ratones, mediante la inoculación intraperitoneal de varios serotipos de reovirus o rotavirus de monos Rhesus, que causan acumulo de células asesinas naturales (NK cells) y de células presentadoras de antígeno alrededor de los conductos biliares y una respuesta mediada por células T, con inflamación del hígado y de los conductos biliares e ictericia (Leonhardt y cols, 2010). Estas células inflamatorias inducen una respuesta inmune mediada por células T, mediante la expresión de antigensos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad, (MC), tanto de clase I (para células CD8+ citotóxicas), como de clase II (para células T ayudantes o helper CD4+) (Petersen y Davenport, INTRODUCCION 17 2013). Las células CD4+ , activadas por IL-12, producen una respuesta Th1, liberando múltiples citoquinas, como IL-2, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, quimioquinas, como CXCL 9, CXCL 10 y CCL5 y otros mediadores pro-inflamatorios, como Stat 1, Granzyme A y B u Osteopontin. Recientemente, se ha demostrado también el desarrollo de una respuesta Th2, así como de células T-reguladoras (Treg) que causan una lesión epitelial biliar (Petersen y Davenport, 2013). Una cuestión clave es que mecanismos desarrollados en éste modelo experimental en el ratón pueden ser extrapolados a la atresia biliar en el ser humano. Una diferencia fundamental es que estos ratones fallecen antes de desarrollar una fibrosis biliar grave. Por ello, optimizar este modelo experimental infecciosos en el ratón es un objetivo prometedor para comprender los mecanismos etiopatogénicos de ésta grave enfermedad y así, conseguir una investigación translacional efectiva (Petersen y Davenport, 2013). La atresia biliar produce colestasis neonatal y se manifiesta por una inflamación progresiva y fibrosis de la vía biliar intra- y extra-hepática que evoluciona hacia una cirrosis devastadora que amerita la realización de un trasplante hepático en la mayoría de los niños. Estudios en ratones y en el ser humano sugieren una potencial infección vírica colangiotrópica perinatal como el iniciador de la lesión de los conductos biliares en la atresia biliar, en tanto que la respuesta inmune adaptativa y autoinmune serían los responsables de la progresión de la enfermedad (Mack, 2007). La presencia de rotavirus, además de en éstos modelos experimentales, se ha confirmado en niños con atresia biliar (Hertel y Estes, 2012). Todos los modelos experimentales de colestasis previamente citados son realizados durante el periodo postnatal y, por esta razón, se considera que, aunque permiten estudiar las consecuencias metabólicas de la colestasis y la patogenia de la colangitis, no aportan conocimiento al mecanismo productor de la atresia biliar. Por esta razón, se han desarrollado modelos prenatales que se asemejan a la atresia biliar en niños, ya ligando el conducto colédoco en corderos a los 80 días de gestación o por ligadura de la arteria hepática en conejos fetales, que produce isquemia selectiva de la vía biliar intrahepática (Petersen and Davenport, 2013). También se ha ensayado la administración de tóxicos, por ejemplo derivados de setas Amanita phalloides, y fármacos, así antihelmínticos, como el 1,4-fenilendiisotiacianato, a ratas Wistar gestantes que producen ictericia en las ratas recién nacidas. En estos modelos postnatales se consigue la producción de ictericia con inflamación y dilatación de las vías INTRODUCCION 18 biliares intrahepáticas (Petersen and Davenport, 2013). Sin embargo, respecto de esta patología congénita, los modelos experimentales son apropiados para el estudio de las consecuencias hepáticas y extrahepáticas de la colestasis, aunque no para el estudio de los mecanismos productores de atresia biliar (Petersen 2012). 3. FISIOPATOLOGIA DE LA COLESTASIS: RESPUESTA INFLAMATORIA HEPÁTICA Las alteraciones hepáticas secundarias a la colestasis extrahepática han sido comparadas a las que protagonizan la curación de las heridas, esto es, la proliferación epitelial y, en particular, la fibrogénesis (Bissell, 2004; Aller y cols., 2008b; Meran y Steadman, 2011). La patogenia de la fibrosis hepática consiste en un depósito excesivo de colágeno fibrilar y otras proteínas de la matriz extracelular que distorsiona la arquitectura hepática e induce capilarización sinusoidal e hipertensión portal. En esencia, la fibrosis hepática es un proceso dinámico de reparación tisular aberrante en el que los fenómenos claves son la activación y transformación de las células estrelladas hepáticas quiescentes en células similares a miofibroblastos, por un proceso de transición epitelio- mesenquimal de tipo 2, con el subsiguiente incremento en la síntesis de proteínas, como actina de musculo liso-α (α-SMA), colágeno, metaloproteasas de la matriz, inhibidores tisulares de metaloproteasas y proteoglicanos (Mormone y cols., 2011; Ding y cols., 2014). Los mecanismos fisiopatológicos implicados en el desarrollo de ésta hepatopatía son múltiples e interrelacionados y se pueden agrupar en tres fenotipos celulares que se expresan fundamentalmente en el espacio intersticial (Aller y cols., 2008b) (Figura 4). Inmediatamente después de la obstrucción de la vía biliar en la rata se produce un intenso incremento (60%) de la presión biliar intraductal (Slott y cols., 1990; Azmaiparashvili y cols., 2009), seguido por alteraciones patológicas de la matriz extracelular (Desmouliere y cols.,1997). Por el contrario, la descompresión biliar, al suprimir el estrés mecánico, revierte las lesiones hepáticas inducidas por la ligadura del colédoco (Kloek y cols., 2008; Kirkland y cols., 2010), lo cual demuestra la relevancia de la energía mecánica en la etiopatogenia de la patología hepática secundaria a la obstrucción de la vía biliar. INTRODUCCION 19 Figura 4. Representación esquemática en 3D de un acino de acuerdo con la descripción de Rappaport. Tres espacios porta divergen de un eje, formado por el canalículo biliar, la arteria hepática y la vena porta. Así mismo, se representan varias trabéculas hepáticas formadas por láminas de dos células hepáticas orientadas hacia las venas eferentes (venas centrales). En la parte inferior del dibujo, las placas hepáticas cubiertas por el endotelio sinusoidal, y el espacio de Disse situado entre ambas estructuras, contiene líquidointersticial que fluye hacia el exterior por los vasos linfáticos del espacio porta. El espacio de Disse se continúa con el espacio porta, y ambos conforman el espacio intersticial del acino (Aller y cols. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair.1:6;2008b). La respuesta del hígado de los roedores a la lesión obstructiva biliar implica su reprogramación transcripcional, favoreciendo la activación de genes reguladores del metabolismo, de la proliferación celular y de la remodelación de la matriz de forma secuencial y limitada en el tiempo (Campbell y cols., 2004; Wang y cols., 2005) desde una fase inmediata (1 día) hasta una fase tardía (21 días) (Campbell y cols., 2004). Sin embargo, en tanto que genes implicados en la disrupción del metabolismo lipídico y en la fibrosis son activados en el periodo precoz de la colestasis, otros genes, como los implicados en mecanismos de protección celular frente a la agresión por acumulación tóxica de ácidos biliares, son inhibidos (Kojima y cols., 2004). Después de la ligadura del colédoco, el hígado de la rata sufre marcadas alteraciones hemodinámicas, portales y arteriales, que pueden comportar lesiones por isquemia-reperfusión y estrés oxidativo (Huang y cols., 2009; Oguz http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Aller%20MA%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Experimental%20obstructive%20cholestasis%3A%20the%20wound-like%20inflammatory## INTRODUCCION 20 et al., 2012; Lee y cols., 2014). El aumento de la resistencia vascular en el sistema portal hepático secundario a colestasis extrahepática produce hipertensión portal (Van Steenkiste y cols., 2010; Hsu y cols., 2014) e isquemia hepática, asociadas a una síntesis deficitaria del enzima Oxido Nítrico Síntasa- inducible (iNOS) y de oxido nítrico (NO) (Lee y cols., 2010). La vía biliar es vascularizada solo por el plexo peribiliar (Gaudio y cols., 1996; Morell et y cols., 2013), localizado alrededor de los conductos biliares de menor calibre, haciéndose así progresivamente más estrecho y más simple (Gaudio y cols., 1996) (Figura 5). Estas características del plexo peribiliar comportan que el aumento de presión intraductal con dilatación de la vía biliar que ocurre en la colestasis extrahepática comprimiría el plexo peribiliar, con la consiguiente isquemia de la vía biliar. Sin embargo, la disminución del flujo sanguíneo portal induce un aumento del flujo arterial hepático o “hepatic arterial buffer response” (Lautt, 1983). Además, dos semanas después de la ligadura del colédoco en la rata se produce una proliferación significativa del plexo peribiliar, que drena por pequeñas vénulas en ramas de la vena porta y en los sinusoides hepáticos (Gaudio y cols., 1996). Por ello, la lesión por isquemia-reperfusión ha sido implicada en la patogénesis de la colestasis intrahepática (Fu y cols., 2013). Figura 5. A la izquierda se observa una representación esquemática de la vascularización arterial intrahepática, comprobándose que los conductos biliares reciben su vascularización únicamente desde la arteria hepática de la hepatona. A la derecha, igualmente se demuestra que el colédoco tan solo recibe irrigación de la arteria hepática común. (Lorente y cols. Microcirugía Experimental. Nueva Editorial Médica, Madrid, 75- 84; 2000). INTRODUCCION 21 Las ratas con ligadura del colédoco sufren una excesiva acumulación de ácidos biliares hidrofóbicos, que son considerados la causa principal de hepatotoxicidad (Poli, 2000; Chatterjee y cols., 2014), con deterioro de las funciones de la cadena transportadora de electrones mitocondriales, estrés oxidativo y apoptosis (Poli, 2000; Wang, 2014). La retención y el acúmulo de sales biliares hidrofóbicas (tauro- y glicoquenodesoxicolato) inhiben la actividad antioxidante hepática de catalasa, glutation peroxidasa, glutation reducido y superóxido dismutasa, así como inducen necrosis hepatocitaria al activar la permeabilidad de la membrana mitocondrial (Portincasa y cols., 2007; Assimakopoulos y cols., 2007; Arduini y cols., 2011). Existe por tanto una estrecha relación entre la ictericia obstructiva experimental y el estrés oxidativo (Assimakopoulos y cols., 2004; Wang y cols., 2014). Así, se ha demostrado que el tratamiento con antioxidantes mejora el estado redox celular hepático (Assimakopoulos y cols., 2004; Soylu y cols., 2006), y las funciones hepáticas al inhibir la formación de especies reactivas del oxígeno (ROS) (Soylu y cols., 2006; Assimakopoulos y cols., 2007; Portincasa y cols., 2007; Somi y cols., 2013). Por consiguiente, en la fase precoz tras ligadura del colédoco en la rata el insuficiente aporte de oxígeno que sufre el hígado, como consecuencia de las alteraciones hemodinámicas, así como de la incorrecta utilización del oxígeno por la hepatotoxicidad de las sales biliares, constituirían factores etiológicos de la inhibición del metabolismo energético hepático. Por lo tanto, el hígado reduce su capacidad funcional para satisfacer las necesidades metabólicas tisulares. Además, la lesión oxidativa hepática disminuiría el contenido intracelular de proteínas responsables de la síntesis energética y de las funciones de membrana, como son las proteínas reguladoras del transporte de H 2 O e iones (Portincasa y cols., 2007), lo cual induciría edema intersticial y celular. También, el aumento de peroxidación lipídica hepática, un marcador de estrés oxidativo (Portincasa y cols., 2007), puede inducir el aumento de la permeabilidad de membrana, de la degradación de la matriz extracelular y edema (Kennett y Davies, 2007). La acumulación intersticial de fragmentos de glicosaminoglicanos (GAGs) es un importante mecanismo de la formación del edema por sus propiedades hidrofílicas, en particular de hialuronan (Cantor y Nadkarni, 2006; Stern y cols., 2006; Jiang y cols., 2007; Kennett y Davies, 2009; Robert, 2014). GAGs son largas cadenas de polisacáridos no ramificadas compuestas de unidades http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chatterjee%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24211540 INTRODUCCION 22 repetidas de disacáridos que tienden a adoptar conformaciones en espiral, y que ocupan un gran volumen en relación con su masa. Estos polisacáridos atraen y atrapan agua e iones, con lo cual forman geles hidratados, aunque permiten el flujo a su través de nutrientes para las células (Jiang y cols., 2007; Solís-Herruzo y cols., 2011). En situaciones de inflamación, el hialuronan es más polidisperso y tiende a formas de menor peso molecular, favoreciendo así la infiltración edematosa de los tejidos (Jiang y cols., 2007; Robert, 2014), el flujo del líquido intersticial y el gradiente de presión del sistema linfático. Además, la tensión mecánica producida por la ligadura del colédoco puede alterar por mecanotransducción la remodelación de los proteoglicanos y de GAGs en el intersticio (Wight y cols., 2014). Virtualmente todos los órganos y tejidos están organizados en jerarquías estructurales y poseen una capacidad de respuesta mecánica inmediata aumentando su rigidez en proporción directa al estrés mecánico aplicado (Ingber, 2006). Este aumento de la consistencia y/o rigidez hepática parece ser el resultado del aumento de la cantidad de matriz neoformada, de la reticulación de la matriz y, posiblemente de otras variables desconocidas (Georges y cols., 2007; Guvendiren y cols., 2014). En las patologías hepáticas, el aumento precoz en la rigidez hepática podría causar la diferenciación de las células estrelladas hepáticas en miofibroblastos (Georges y cols., 2007; Muddu y cols., 2007; Guvendiren y cols., 2014), que entónces se comportan como células musculares lisas y, por consiguiente, responden a las sustancias vasoactivas contrayéndose (Friedman; 2010; Lee y Friedman, 2011). La contracción de éstas células estrelladas activadas regula el diámetro de la vascularización hepática, alterando el flujo sanguíneo, y la presión hepática (Winau y cols., 2008; Brunt y cols., 2014). La adquisición posterior en la evolución del hígado colestásico de un fenotipo inmune afecta a las células parenquimatosas (hepatocitos y colangiocitos), a las no parenquimatosas (células endoteliales sinusoidales, células de Kupffer y miofibloblastos) y a las células sanguíneas que migran al intersticio hepático (Szabo y cols., 2007; Winau y cols., 2008; Albillos y cols., 2014) (Figura 6). Precisamente parece ser el espacio intersticial el que modula la actividad inflamatoria de las células inmunes tras la ligadura del colédoco en la rata (Aller y cols., 2008b). En particular, los fragmentos de matriz extracelular y sus receptores ejercen importantes efectos sobre las células inflamatorias y, por ello, se considera que están claramente implicados en la evolución de la respuesta inmune intersticial (Morwood y Nicholson, 2006; Korpos y cols., 2009). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Guvendiren%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24361340 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Guvendiren%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24361340 INTRODUCCION 23 Las metaloproteasas de la matriz (MMPs) son una familia de enzimas que degradan componentes de la matriz extracelular expresadas en los tejidos inflamados (Zitka y cols., 2010; McKleroy y cols., 2013) y, en particular, en el hígado colestásico (Bergheim y cols., 2006a; Onozuka y cols., 2011). La destrucción enzimática de la matriz extracelular cursa con la liberación inmediata de los mediadores secuestrados en dicha matriz. Figura 6: Isquemia-revascularización y fenotipos leucocitarios durante la evolución de la colestasis obstructiva. Predominio del estrés oxidativo con edema y estrés enzimático con infiltración de leucocitos y la activación de las células de Kupffer. AC: capilar arterial; B: bacterias; C: colangiocitos; ECM: matriz extracelular; HSC: células estrelladas hepáticas; KC: célula de Kupffer; LPS: lipopolisacárido; MC: mastocitos; N: neutrófilos; PM: miofibroblastos portales; PP: plexo arterial peribiliar; RBC: glóbulos rojos; SC: Células madre; SS: espacio sinusoidal; Th1: Linfocitos T h1; Thi: Linfocitos intraepiteliales. (Aller y cols. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair.1:6; 2008b). Las proteínas de la matriz extracelular y el hialuronan poseen funciones proinflamatorias que pueden activar la respuesta inmune, tanto la innata como la adquirida (Morwood y Nicholson, 2006; Bei y cols., 2008). Estas moléculas se unen a los receptores Toll-like (TLR)-4 y TLR-2 (Szabo y cols., 2007), con activación del complejo regulador transcripcional NFαB/IκBα y la producción de citoquinas proinflamatorias, como TNF-α e IL-1β, y de quimioquinas que inducen la activación y el reclutamiento intersticial de leucocitos (Morwood y Nicholson, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=McKleroy%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23564511 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Aller%20MA%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Experimental%20obstructive%20cholestasis%3A%20the%20wound-like%20inflammatory## INTRODUCCION 24 2006). Los linfocitos T, una vez activados, se polarizan hacia la producción de distintos perfiles de citoquinas (Yagi y cols., 2011; Yamane y Paul, 2013). El tipo 1 (Th 1 ) sintetiza Interferon γ (IFN-γ) e IL-2 y, los de tipo 2 (Th 2 ) producen IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13 (Yamane y Paul, 2013). Los macrófagos residentes en el hígado, o células de Kupffer, se localizan fundamentalmente en el área periportal del lobulillo y por ello podrían desempeñar un papel fundamental en la lesión por isquemia-reperfusión (Kolios y cols., 2006; Abu-Amara y cols., 2010; Jaeschke 2012). Pero las células de Kupffer están también implicadas en la inflamación hepática que produce la colestasis mediante la liberación de sustancias biológicamente activas que inducen un proceso inmunopatogénico (Minter y cols., 2005; Abrahám y cols., 2008; Zandieh y cols., 2011; Cheng y cols., 2011; Ramachandran e Iredale, 2012) (Figura 7). Figura 7. A la izquierda, representación esquemática de una trabécula hepática en la rata, en la que se observa el canalículo biliar existente entre dos hepatocitos (esquema superior izquierdo), el espacio perisinusoidal de Disse, las células endoteliales sinusoidale, una célula de Ito y una célula de Kupffer. En el esquema de la derecha, se ha representado la trabécula hepática con mayor complejidad, lo cual permite apreciar la disposición laminar de los hepatocitos, en contraste con la supuesta disposición tubular del esquema de la parte izquierda de ésta Figura, ya que el canalículo biliar es el centro de la trabécula bicelular. (Arias y cols. Anatomía e histología hepática: Morfología y Función. En: Cirugía Hepática Experimental. Ed. Kronos. Zaragoza, 99-125, 1.993). Las células de Kupffer están claramente afectadas en la obstrucción biliar (Minter y cols., 2005; Abrahám y cols., 2008; Zandieh y cols., 2011; Cheng y cols., 2011; Calmus y Poupon; 2014) con activación de la fagocitosis y una marcada respuesta pro inflamatoria frente a endotoxina y a la proteína de unión INTRODUCCION 25 a lipopolisacárido (lypopolysacharide-binding protein, LBP), ambas aumentadas en la colestasis extrahepática (Minter y cols., 2005; Kolios y cols., 2006; Isayama y cols., 2006; Minter y cols., 2009; Kassel y cols., 2011; Chou y cols., 2012). La hipersensibilidad a endotoxina en colestasis es la causa de la síntesis aumentada de citoquinas proinflamatorias y del aumento de la peroxidación lipídica (Isayama y cols., 2006; Abrahám y cols., 2008), con agravamiento de la apoptosis que, finalmente progresa a necrosis (Moazzam y cols., 2002; Lida y cols., 2010). La respuesta proinflamatoria inducida por LPS en ratas con ligadura de colédoco es inhibida por lipoproteínas de alta densidad (HDL), que, a su vez, inhiben las vías proinflamatorias hepáticas, restauran la actividad de eNOS y reducen la presión portal (Thabut y cols., 2007a; Galbois y cols., 2009). La inflamación se asocia a la infiltración intersticial y de los tractos portales por leucocitos, en particular por neutrófilos, un proceso regulado por quimioquinas CXC (Saito y Maher 2000; Aller y cols., 2006; Jaeschke ,2006; P; Aller y cols., 2010a; Mantovani y cols., 2011; Jailon y cols., 2013) Los neutrófilos son componentes esenciales de la respuesta inflamatoria precoz a la agresión que sufre el hígado por colestasis (Laschke y cols., 2010; Licata y cols., 2013), infiltrando el intersticio ya a los tres días de la ligadura del colédoco (Gujral y cols., 2003; Georgiev y cols., 2008). Las células del epitelio biliar contribuyen a la inflamación produciendo moléculas quimioatrayentes de neutrófilos (Dold y cols., 2010). Además, las células de Kupffer, activadas por la endotoxemia portal secundaria a colestasis, estimulan la liberación de quimioquinas por los hepatocitos, lo cual implica a su vez la infiltración por neutrófilos (Wakabayashi y cols., 2008). En la colestasis extrahepática monocitos/macrófagos infiltran también el hígado, que hiperexpresa a su vez proteína quimioatrayente de monocitos (monocyte chemoatractant protein, MCP- 1), una quimioquina CC y, como resultado éstos monocitos favorecen la respuesta inflamatoria (Tacke, 2012; Zhou y cols., 2013). En esencia, la inflamación crónica hepática y la fibrogénesis constituyen un agregado dinámico de linfocitos, macrófagos y células del estroma relacionadas por interacciones autocrinas y paracrinas (Holt y cols., 2008; Pellicoro y cols., 2014). A largo plazo, en ratas con ligadura de colédoco persiste una importante migración celular alrededor de la triada portal y de la vena central que se asocia con un aumento de citoquinas pro inflamatorias en el hígado (Fernández-Martínez y cols., 2009), que inducen una respuesta http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jaeschke%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16687579 INTRODUCCION 26 hepatocitaria heterogénea al estímulo colestásico, inhibiendo los hepatocitos de la zona periportal (Donner y cols., 2007). Las células estrelladas hepáticas y los miofibroblastos, ambos tipos celulares presentes en el intersticio hepático, tienen la capacidad de expresar un fenotipo inmune. En particular, las células estrelladas sintetizan un amplio espectro de mediadores inflamatorios, como quimioquinas (MCP-1, RANTES), factor de activación plaquetario (platelet activation factor, PAF), IL-8 y moléculas de adhesión leucocitaria (ICAM-1, VCAM), que son necesarias para el reclutamiento y la activación de los leucocitos en el intersticio (Bataller y Brenner, 2005; Rockey, 2006; Iredale, 2007; Gressner y cols., 2007; Friedman, 2008; Wasmuth y cols., 2010; Seki y Schwabe , 2014). El alojamiento de leucocitos en el espacio intersticial hepático es favorecido por las células estrelladas hepáticas, que expresan MMPs, lo cual aumenta la degradación de la matriz extracelular (Rockey, 2006; Gressner y cols., 2007; Aller y cols., 2010a; Day y cols., 2011). Por lo tanto, las células estrelladas hepáticas cambian su fenotipo contráctil a un fenotipo inmune y éstos dos fenotipos están íntimamente relacionados, e incluso son interdependientes (Rockey, 2006) (Figura 6). La infiltración del hígado colestásico por células inflamatorias también sería secundaria a traslocación bacteriana intestinal (TBI), fenómeno por el cual endotoxinas y bacterias de procedencia intestinal alcanzarían el hígado en elevadas concentraciones por aumento de la permeabilidad de la barrera mucosa intestinal (Balzan y cols., 2007; Alaish y cols., 2013). La TBI es una complicación de la hipertensión portal y, por consiguiente, se produce en ratas con ligadura de colédoco (Garcia-Tsao y Wiest, 2004; Sztrymf y cols., 2005; Karatepe y cols., 2010; Seo y Shah, 2012). En ratas con cirrosis y ascitis las bacterias que colonizan la luz intestinal constituyen un gran reservorio de productos microbianos, como LPS, endotoxinas y otros fragmentos de la pared bacteriana capaces de inducir la síntesis de citoquinas proinflamatorias, como TNF-α (Garcia-Tsao y Wiest, 2004; Francés y cols., 2007; Aller y cols., 2010d; Corradi y cols., 2012). Por lo tanto, la TBI es un mecanismo etiopatogénico de infecciones bacterianas en la colestasis experimental (Sztrymf y cols., 2005; Abdeldayem y cols., 2007). Las fases evolutivas tardías del modelo experimental de colestasis extrahepática se caracterizan por el desarrollo de angiogénesis, esto es, el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a expensas de vasos pre-existentes http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Seki%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25066777 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schwabe%20RF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25066777 INTRODUCCION 27 (Gaudio y cols., 2006a; Gaudio y cols., 2006b; Davis 2011; Geudens y Gerhardt, 2011) (Figura 8) La angiogénesis requiere la migración de células endoteliales al espacio intersticial, con la consiguiente proliferación y diferenciación en capilares (Aller y cols., 2007b). Aunque el objetivo final de la proliferación endotelial es formar nuevos vasos sanguíneos para el transporte de oxígeno, sustratos y células sanguíneas, el endotelio posee otras funciones (Aller y cols., 2007a, Aller y cols., 2007b). Así, en las fases iniciales de la respuesta inflamatoria (fenotipos de isquemia-reperfusión y leucocitario), las nuevas células endoteliales podrían adoptar funciones anti-inflamatorias, anti-oxidantes y anti-inmunes, que favorecerían la resolución de la inflamación (Aller y cols., 2007b). Figura 8: Fenotipo angiogénico durante la evolución de colestasis obstructiva. Aumento de la proliferación de colangiocitos con un importante desarrollo del plexo arterial peribiliar y de la arterialización sinusoidal con aplasia hepatocitaria. AC: capilar arterial; C: colangiocitos; ECM: matriz extracelular , H: hepatocitos; M: miofibroblastos; PP: plexo arterial peribiliar ; SS: espacio sinusoidal; Th2: Lifocitos Th2; Treg: Linfocitos T reguladores (Aller y cols. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair. 2008b;1:6). En ratas con ligadura de colédoco la proliferación de los conductillos biliares, como ocurre en la organogénesis hepática, precede a la proliferación de los microvasos que los vascularizan. Solo después de 2 a 4 semanas de evolución se desarrolla una significativa proliferación de la microvascularización que se extiende desde el plexo peribiliar de los tractos biliares (Gaudio y cols., http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Aller%20MA%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Experimental%20obstructive%20cholestasis%3A%20the%20wound-like%20inflammatory## INTRODUCCION 28 1996; Glaser y cols., 2009; Glaser y cols., 2011). Tras la ligadura del coledoco en la rata se ha demostrado el papel fundamental que ejercen los colangiocitos en la angiogénesis asociando la ligadura de la arteria hepática a la colestasis. En ésta situación, aumenta la apoptosis de colangiocitos, se altera la proliferación de los colangiolos con disminución de la secreción de factor de crecimiento de endotelio vascular (vascular endotelial growth factor, VEGF) por los colangiolos y desaparece el plexo peribiliar. Curiosamente, las funciones de los colangiocitos y, por lo tanto, la integridad del plexo peribiliar son preservadas mediante el tratamiento con VEGF-A recombinante (Gaudio y cols., 2006c). 4. FIBROSIS BILIAR: EL RESULTADO DE LA COLESTASIS EXTRAHEPÁTICA EN LA RATA La fibrosis hepática es un proceso dinámico de reparación tisular secundario a la agresión persistente del hígado por múltiples factores, como la infección vírica, la ingesta excesiva de etanol, fármacos o toxinas, reacciones inmunes diversas en enfermedades metabólicas y colestasis. Por lo tanto, una consecuencia patológica común de la insuficiencia hepática crónica es la fibrosis (Mormone y cols., 2011; Cohen-Naftaly y Friedman, 2011). El modelo experimental de colestasis obstructiva en la rata, bien por ligadura y sección del colédoco o por colestasis extrahepática microquirúrgica, (Aller y cols., 1993a; Aller y cols, 2004a; Aller y cols, 2009a; Aller y cols, 2009b; Aller y cols, 2010c) induce una respuesta inflamatoria hepática cuyo resultado final es el desarrollo de fibrosis biliar. Este patrón histopatológico se caracteriza por dos fenómenos: -Fibrogénesis. -Proliferación biliar o reacción ductal. En la clínica humana, las enfermedades hepáticas crónicas se caracterizan por una agresión persistente al parénquima, cuyas causas principales son: -La infección crónica por virus hepatotropos (Virus de la hepatitis B y C). -La exposición crónica a fármacos y diversas sustancias tóxicas, siendo la causa principal en los países occidentales, el consumo excesivo de bebidas etílicas. -Alteraciones metabólicas crónicas. INTRODUCCION 29 -Enfermedades autoinmunes crónicas. -Patologías colestásicas intra o extra hepáticas (Novo y cols., 2014). La patogenia de la fibrosis hepática resulta en esencia de una alteración de la remodelación por la sustitución progresiva del parénquima funcional hepático por haces estrechamente unidos de colágeno I/III y otras proteínas de la matriz extracelular. La fibrosis altera la arquitectura y la función normales del hígado, disminuye el número de fenestras de las células endoteliales (capilarización sinusoidal) y se produce hipertensión portal (Cohen-Naftaly y Friedman, 2011; Ellis y Mann 2012). Este proceso de cicatrización hepática, si progresa, conduce al desarrollo de cirrosis hepática, una patología caracterizada por la desestructuración del parénquima hepático, con formación de septos fibrosos que delimitan nódulos de regeneración, aumento de la resistencia al flujo sanguíneo portal y un grave deterioro de la función hepática que puede comportar finalmente un fallo hepático. Además, la fibrosis se considera un estadio precanceroso que proporciona un medioambiente idóneo para el desarrollo de tumores primarios (Domínguez y cols., 2009; Hirschfield y cols., 2010; Mormone y cols., 2011; Cohen-Naftaly y Friedman, 2011; Solís-Herruzo y cols., 2011; Hytiroglou y cols., 2012; Wynn y Ramalingam, 2012). La agresión crónica del hígado induce la activación persistente de una respuesta inflamatoria y de reparación tisular, que asociada a otros factores patogénicos, como el estrés oxidativo y la alteración de la interacción entre células epiteliales y mesenquimales, comporta una fibrogénesis hepática, cuyo resultado tisular es la fibrosis hepática (Friedman, 2008b; Forbes y Parola, 2011). Por tanto la fibrogénesis hepática se puede definir como un proceso celular, tisular y molecular dinámico y exquisitamente integrado, que induce una acumulación excesiva y progresiva de componentes de la matriz extracelular, en un intento de limitar las consecuencias de la agresión crónica del parénquima hepático (Friedman 2008b; Forbes y Parola, 2011; Novo y cols., 2014). La fibrogénesis hepática, independientemente de su etiología, es fundamental para la progresión de cualquier tipo de patología hepática crónica, siendo la fibrogénesis persistente la causa fundamental de cirrosis e insuficiencia hepática (Friedman 2008b; Rosselli y cols., 2013; Novo y cols., 2014). Los principales mecanismos fisiopatológicos de la fibrogénesis hepática, evolucionan en estadios. El primer estadio, independientemente del agente etiológico, está protagonizado por la secuencia interrelacionada de lesión INTRODUCCION 30 parenquimatosa persistente, que produce necrosis y/o apoptosis crónica y activación crónica de una respuesta inflamatoria y de fibrogénesis, que son los factores inductores del depósito excesivo de componentes de la matriz extracelular, lo que constituye la fibrosis (Figura 9). En síntesis, este estadio consiste en la asociación de varios mecanismos, entre los que se encuentra la perpetuación de la agresión hepática, una característica clave en la progresión de las enfermedades hepáticas crónicas, depende no solo de la exposición persistente a un agente etiológico específico, sino también de la lesión parenquimatosa crónica por sí misma, así como de la respuesta inflamatoria crónica, con la liberación de múltiples mediadores, en particular de especies reactivas de oxígeno (ERO). Figura 9. Progresión de las enfermedades hepáticas crónicas. Principales eventos en la progresión fibrogénica de enfermedad hepática crónica donde se produce una progresión persistente de lesión hepática, independientemente de la etiología, de la inflamación crónica y la activación de la reparación, con principal énfasis en el papel de miofibroblastos hepáticos en el impulso de la enfermedad a fibrosis significativa y eventualmente a cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular.(Novo y cols., Cellular and molecular mechanisms in liver fibrogenesis. Archives of Biochemistry and Biophysic. 20-37, 2014). Así mismo participa la activación crónica de la respuesta inflamatoria y el reclutamiento y activación de células implicadas en la inmunidad innata y adquirida, puede crear un microambiente pro-fibrogénico, en el cual la síntesis y liberación de factores de crecimiento, citoquinas, quimioquinas, ERO y otros mediadores, por una parte altera significativamente la hiperplasia/regeneración INTRODUCCION 31 del parénquima hepático y por otra, favorecen la activación crónica de la reparación tisular y de la fibrogénesis. El microambiente pro-fibrogénico induce, a su vez, la activación persistente de células similares a los miofibroblastos, con la subsiguiente acumulación excesiva de componentes de la matriz extracelular (MEC) y paralelamente, de una remodelación tisular ineficaz. También se ha puesto de manifiesto, el papel fundamental de la hipoxia y la angiogénesis en el mantenimiento y quizá también, en la inducción de la fibrogénesis, así como en las alteraciones vasculares, que son de relevancia grave durante la progresión de las enfermedades hepáticas crónicas. Por último la fibrosis hepática en este primer estadio, es potencialmente reversible, lo cual depende de la eliminación del agente etiológico o bien de una terapéutica efectiva (Novo y cols., 2014). Cuando el depósito de componentes de la matriz extracelular es muy intenso y los septos de fibrosis, asociados a las alteraciones vasculares intrahepáticas, comienzan a modificar significativamente la estructura global del parénquima hepático, la hipertensión portal y las complicaciones fisiopatológicas relacionadas, inducen la progresión de la patología hepática crónica al estadio de cirrosis. A su vez, cuando ya el deterioro hepático adquiere el grado de cirrosis, existen dos estadios, dependiendo de su gravedad: (I): Estadio de cirrosis compensada o cirrosis sin manifestaciones clínicas y con un gradiente de presión venosa hepática en un rango de 5 a 10 mm Hg (II): Estadio de cirrosis descompensada o de cirrosis con sintomatología clínica y un gradiente de presión venosa hepática que supera los 10-12 mm Hg (El-Sevag 2011; Novo y cols., 2014). El patrón histopatológico de la fibrosis depende de la etiología y de las células fibrogénicas. Esta idea, ya propuesta en 2004 (Pinzani y Rombouts, 2004), se ha aceptado en los últimos años (Parola y cols., 2008; Rosselli y cols., 2013). Así, el patrón de fibrosis postnecrótica dispuesta en forma de puentes o septos, que conectan diferentes áreas portales, se desarrolla típicamente en los pacientes con hepatitis vírica crónica por virus B y C o por patologías autoinmunes. El patrón de de fibrosis pericelular y capilarización de los sinusoides, se produce en enfermos con esteatohepatitis alcohólica y no alcohólica. El factor etiopatológico en este caso, es el estrés oxidativo asociado a la hepatotoxicidad. La fibrosis centrolobulillar es características en las INTRODUCCION 32 situaciones de obstrucción del drenaje venoso hepático, como ocurre en los pacientes con fracaso cardiaco y finalmente, la fibrosis biliar se produce en la cirrosis biliar primaria y secundaria, así como en colangitis esclerosante primaria y se caracteriza por la formación de septos fibróticos porto-portales rodeando los nódulos hepáticos. Este patrón de fibrosis se desarrolla preservando las conexiones entre la vena central y el tracto portal y se asocia a una intensa proliferación de los ductos biliares y de los miofibroblastos peri ductales, que se supone derivan, principalmente, de los fibroblastos portales y de las células estrelladas hepáticas. El estrés oxidativo y la alteración del equilibrio epitelio- estroma alrededor de los conductos biliares, se piensa que protagonizan una fibrogénesis persistente (Novo y cols., 2014). *Poblaciones celulares implicadas en la fibrogénesis hepática Independientemente de la etiología específica o del patrón histopatológico de la fibrosis, la fibrogénesis hepática que ocurre durante una patología hepática crónica, es un proceso que resulta de las intensas y persistentes interacciones entre las poblaciones celulares hepáticas, que resultan de la síntesis y liberación de múltiples mediadores (factores de crecimiento, citoquinas, quimioquinas, ROS, agentes vaso activos, etc.). Aunque también, células extra hepáticas, principalmente derivadas de la médula ósea hematopoyética, pueden ser reclutadas e implicadas en el hígado crónicamente, lesionándolo, prácticamente, cualquier célula hepática residente puede desempeñar un papel significativo en la progresión fibrogénica de la insuficiencia hepática crónica (Friedman, 2008; Forbes y Parola 2011; Novo y cols., 2014). Como se resume en la Figura 10, la situación persistente de lesión celular parenquimatosa y la muerte por necrosis o apoptosis, la respuesta inflamatoria crónica y alteraciones cuantitativas y cualitativas de los componentes de la matriz extracelular, inevitablemente implican la activación de células inflamatorias, en particular, las células de Kupffer y los macrófagos reclutados de la sangre periféricas y de la médula ósea. Estos macrófagos, al activarse, constituyen una población celular fundamental en la progresión de las patologías hepáticas crónicas, sintetizando y liberando gran cantidad de mediadores pro inflamatorios y pro fibrogénicos, siendo los más importantes el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (platelet-derived groowth factor; PDGF), factor de crecimiento fibroblástico básico (basic fibroblastic growth factor; bFGF), INTRODUCCION 33 factor de crecimiento transformador beta-1 (TGFB1), factor de necrosis tumoral alfa (tumoral necrosis factor alpha; TNF--alfa), interleuquina 1 (IL--1), proteína 1 quimio atrayente de monocitos (monocyte chemoattractant protein-1; MCP-1 O CCL2) y ROS. (Novo y cols., 2014). Figura 10. El escenario '' crónico '': Historia de la diafonía entre las poblaciones de células hepáticas. Un esquema simplificado del complejo escenario de las interacciones entre las principales poblaciones de células hepáticas implicadas en la fibrogénesis hepática. Para cualquier población de células también aparecen mediadores que una vez son capaces de afectar de manera significativa el comportamiento de las células vecinas. La hipoxia también es capaz de afectar a la respuestas de las poblaciones de células hepáticas (Novo y cols., Cellular and molecular mechanisms in liver fibrogenesis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20-37, 2014). Las células de Kupffer y los macrófagos procedentes de la circulación y de la médula ósea, inician y perpetúan una respuesta inflamatoria y, además, activan a las células estrelladas hepáticas. El reclutamiento de las subpoblación de monocitos inflamatorios Gr1+ (LyGC+) precursores de los macrófagos tisulares, es secundaria al receptor de quimioquina CCR2 y a su ligando MCP- 1/CCL2 (Heymann y cols., 2009). Estos monocitos derivados de la médula ósea que se acumulan en el hígado lesionado, se diferencian de forma predominante en una subpoblación de macrófagos productores de óxido nítrico-síntasa inducible (iNOS), que ejercen acciones pro inflamatorias y pro fibrogénicas, como son la activación de las INTRODUCCION 34 células estrelladas hepáticas, la diferenciación de los linfocitos Th en la subpoblación Th1 y la liberación de TGF-beta 1. La TGF-beta es una citoquina característicamente pro fibrogénica, que actúa aumentando la producción de componentes de la matriz extracelular y del enzima inhibidor de la metaloproteína tisular-1 (TIMP-1). Además, los macrófagos pueden sintetizar PDGF, un potente estimulador de la proliferación de miofibroblastos, IL-1beta y TNF-alfa, ambas citoquinas pro inflamatorias y múltiples quimioquinas que inducen un subsiguiente reclutamiento de células inflamatorias, perpetuando así, el estímulo pro inflamatorio y pro-fibrogénico (Figura 11), (Ramachandran, Iredale, 2012). Figura 11.Los macrófagos como organizadores de la fibrogénesis hepática y resolución de la fibrosis. Durante la fibrogénesis, monocitos inflamatorios son reclutados por la inflamación del hígado a través de quimioquinas formando de la población de macrófagos pro-fibrótico. Macrófagos pro-fibróticos expresan mediadores tales como la IL-1β, TGF-β, PDGF y CCL2, que promueven la activación de miofibroblastos hepáticos. Miofibroblastos activados sintetizan el ECM y TIMP-1, un inhibidor potente de la actividad MMP. Ambos TIMP-1 y ECM promueven la persistencia del fenotipo de miofibroblastos activado. Durante la fase de resolución de la fibrosis, los macrófagos expresan MMP que promueven la degradación de ECM y expresan mediadores que inducen la apoptosis de miofibroblastos, lo que conduce a una reducción en la síntesis de ECM, la pérdida de TIMP-1 y el aumento de la actividad MMP. (Ramachandran y cols., Macrophages: central regulators of hepatic fibrogenesis and fibrosis resolution. J Hepatol. 2012; 56: 1417-9). Los macrófagos se caracterizan por su gran plasticidad y pueden diferenciarse funcionalmente en diferentes subtipos, los clásicamente activados http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ramachandran+y+cols.%2C+%2CMacrophages%3A+central+regulators+of+hepatic+fibrogenesis+and+fibrosis+resolution INTRODUCCION 35 M1 y los alternativamente activados M2. Es muy interesante que modelos experimentales han demostrado que los monocitos/macrófagos no solo son imprescindibles para la progresión de la fibrosis, sino también, para su regresión, ya que pueden degradar proteínas de la matriz extracelular y ejercer una acción anti inflamatoria (Heymann y cols, 2009; Tacke, 2012; Ramachandran e Iredale, 2012) (Figura 11). Pero además de las células de Kupffer y de los macrófagos procedentes de los monocitos hepáticos que infiltran el hígado lesionado, otras células propias del parénquima hepático agredido de forma crónica, intervienen en el proceso de fibrinogénesis. Así los hepatocitos se considera que son una fuente importante de producción de ROS, así como de otros mediadores relacionados con el estrés oxidativo. Además, estos hepatocitos se consideran, en un sentido cuantitativo, la fuente principal de VEGF durante la progresión de la patología hepática crónica. Además, las células endoteliales, lesionadas y activadas, y las plaquetas constituyen el origen adicional de factores de crecimiento, citoquinas y también de otros mediadores. En particular, las células endoteliales contribuyen significativamente a la liberación de agentes vaso activos, como el óxido nítrico (NO) y la endotelina-1. Sin embargo, en cualquier tipo de hepatopatía crónica, la fibrogénesis hepática es protagonizada por lo miofibroblastos (MF) hepáticos, que representa una población heterogénea de células cuyo marcador fundamental es su inmunopositividad para la actina alfa del músculo liso (alfa- smooth-muscle actin, alfa-SMA). Por tanto, los MFs hepáticos son los efectores clave de la fibrogénesis hepática, posiblemente por su capacidad para ser una célula integradora de todas las señales autocrinas y paracrinas, liberadas desde el resto de las células del parénquima hepático (factores de crecimiento, citoquinas pro inflamatorias, quimioquinas, mediadores pro angiogénicos, adipoquinas y ROS, entre otros mediadores.) (Novo y cols., 2014). (Figura 10). Aunque el parénquima hepático posee una gran capacidad regeneradora, la agresión aguda y crónica, puede causar necrosis asociada a una respuesta inflamatoria fibrogénica, que resulta en insuficiencia del órgano, asociada a hipertensión portal (Parola y cols., 2009). La agresión que sufre el parénquima hepático, puede tener diferentes etiologías, esto es, vírica, alcohólica o por drogas y el mecanismo de muerte de los hepatocitos suele ser heterogénea. A los clásicos tipos de muerte celular, que son la necrosis y la apoptosis, se deben añadir los descritos recientemente, INTRODUCCION 36 como son la muerte celular por autofagia, la piroptosis y la necroptosis. (Cookson y cols., 2001; Galluzzi y cols., 2009; Komatsu, 2012). La mayoría de formas de muerte celular se han caracterizado “in vitro” y tan solo algunas de las descritas están bien definidas “in vivo”, utilizando ya modelos experimentales o en pacientes con hepatopatías. Sin embargo, se considera que en la mayoría de las enfermedades hepáticas, son diversos los mecanismos causantes de muerte celular y por esta razón, la muerte de los hepatocitos representa un proceso heterogéneo, en el cual participan varios de los mecanismos descritos. (Eguchi y cols., 2014). A su vez, las células proclives a la muerte o incluso cuando son activadas, puede liberar micropartículas, que son pequeñas vesículas transportadoras de receptores, proteínas citosólicas o nucleares y micro RNAs.) (Morel y cols., 2011; Diehl y cols., 2012). Estas partículas son liberadas por los hepatocitos y transportadas por la circulación sanguínea. Así mismo, en ratas con ligaduras de colédoco, se ha demostrado que estas micropartículas activan las células sinusoidales hepáticas y por tanto, contribuyen a la remodelación tisular durante la evolución de la lesión colestásica hepática. (Witek y cols., 2009). En la colestasis extrahepática, no solo se produce la muerte celular de los hepatocitos, sino que se lesionan también los colangiocitos y ambos tipos celulares liberan mediadores, que estimulan la producción de sustancias proinflamatoria. (Pellicoro y cols., 2014). En general, todos los modelos experimentales de fibrosis hepática secundaria a colestasis, presentan inicialmente lesión de las células epiteliales biliares, que desencadenan una respuesta inflamatoria crónica. (Liedtke y cols., 2013). La fibrosis secundaria a colestasis extrahepática o fibrosis biliar, tiene unas características histológicas propias, ya que cursan con tabiques fibrosos porto-portales, a los cuales se asocia la proliferación de conductos biliares. En particular, esta reacción ductular biliar se relaciona con la existencia de miofibroblastos periductulares. (Parola y cols., 2009). La colestasis extrahepática en la rata, causa fibrosis biliar, así como complicaciones extrahepáticas, tanto cardiovasculares, como renales inmunológicas y neurológicas. (Kountouras y cols., 1984; Aller y cols., 2012a; Hosseini y cols., 2014). La fibrosis biliar en las ratas con ligaduras del colédoco es progresiva durante las primeras tres semanas de evolución, si bien, se ha INTRODUCCION 37 demostrado que en la cuarta semana, la producción de colágeno se reduce, (Tarcin y cols., 2011), lo que no excluye, que en estadios posteriores, progrese la fibrosis, aunque no se consigne la producción de cirrosis. (Kountouras y cols., 1984; Tsuhamoto y cols., 1990). Sin embargo este modelo experimental de colestasis por ligadura y sección del colédoco, ha sido propuesto como útil para el estudio de la atresia biliar, ya que simula esta patología del ser humano. (Chen y cols., 2013). Incluso, mediante la inyección de etanol 95% por vía biliar intrahepática, se trata la fibrosis biliar mediante la cistoyeyunostomía, emulando así, el tratamiento de la atresia biliar humana con la intervención de KASAI. (Wang y cols., 2014). Sin embargo, la atresia biliar humana, es un proceso complejo, de etiopatogenia aún no esclarecida completamente. La anomalía en el desarrollo de la vía biliar se suele asociar a una inflamación esclerosante de los conductos biliares, pero se desconoce la causa que inicia dicha patología. (Sokol y cols., 2001; Mieli-Vergani y cols., 2009). Con independencia de la causa originaria de la inflamación, la extravasación de bilis en los tejidos periductales, también potencia la respuesta inflamatoria y la fibrosis, produciendo colestasis obstructiva. (Mieli-Vergani y cols., 2009). Aunque la portoenterostomía de Kasai consigue en algunos casos la reversibilidad del proceso, se ha descrito también, el incremento postoperatorio de mediadores proinflamatorios, lo que a su vez, implicaría la existencia de un proceso inmunológico progresivo. (Narayanaswami y cols., 2007). En estos casos, el trasplante de hígado es el tratamiento de elección. (Davenpoert y cols., 2004). La respuesta inflamatoria hepática secundaria a la colestasis obstructiva, se inicia en el espacio periductular y se cree que es protagonizada por los fibroblastos portales, que se activan y se transforman en miofibroblastos. (Novo y cols., 2014; Wells 2014). Inicialmente se especuló respecto de las posibilidades patogenéticas de la transición epitelio-mesenquimal de los colangiocitos en la fibrosis biliar. (Kalluri y cols, 2003; Choi y cols, 2009; Kalluri, 2009). Sin embargo, en la actualidad no se considera que este mecanismo represente una significativa importancia en la producción de fibrosis biliar. (Chu y cols., 2011). Se ha demostrado que los hepatocitos ante determinados estímulos, que inducen su regeneración, se transforman en células con características mesenquimales, por el proceso denominado transición epitelio-mesenquimal. Este complejo fenómeno, produce la pérdida de la polaridad de las células INTRODUCCION 38 epiteliales, así como de las uniones intercelulares, en tanto, que son capaces de adquirir motilidad, así como de invadir el espacio intersticial, mediante la destrucción de la matriz extracelular, que son características propias de las células mesenquimales. (Kalluri, 2009). La transición epitelio-mesenquimal de los hepatocitos se correlaciona con la inhibición de factores nucleares hepatocitarios (HNFs) y en particular de HFN 4-alfa. Este factor nuclear, no solo regula la expresión molecular de adhesión, sino que incluso, es capaz, cuando se expresa ectópicamente en fibroblastos, de estimular la expresión de uniones fuertes intercelulares y moleculares de polaridad epitelial. (Ciccini y cols., 2014).Aunque la transición epitelio-mesenquimal se puede inducir “in vitro”, no participa en la producción de fibrosis, en ningún modelo experimental de insuficiencia hepática colestásica. (Scholteri y cols., 2010). Se considera, que los fibroblastos portales son los responsables principales de la producción de miofibroblastos en la fibrosis biliar. En particular, se ha propuesto, que en la fibrosis biliar, los fibroblastos portales originan una población de miofibroblastos procedentes de las células estrelladas hepáticas (Iwaisako y cols., 2014a). Incluso, se ha llegado a proponer que los fibroblastos portales y las células estrelladas hepáticas, poseerían funciones contrapuestas. Así, los miofibroblastos procedentes de los fibroblastos portales, regularían la fibrosis, en tanto que, los miofibroblastos procedentes de las células estrelladas hepáticas, mediarían la reparación hepatocelular. (Lemoinne y cols., 2013). Los fibroblastos portales son una pequeña población de células fibroblásticas, que rodean la vena porta y mantienen la integridad del tracto portal. También se denominan fibroblastos periductulares (Dranoff y cols., 2010) y se han descrito como protagonistas de la patogenia de la insuficiencia hepática colestásica. A su vez, las células estrelladas hepáticas son el principal origen de los miofibroblastos en la insuficiencia hepática experimental, producida por tetracloruro de carbono (CCL4). (Iwaisako y cols., 2014b). Se considera, que tras la ligadura y sección del colédoco en roedores, la obstrucción al flujo biliar produce aumento de la presión biliar y disfunción de las células epiteliales biliares, que secretan citoquinas y causan una respuesta inflamatoria moderada. Con posterioridad, la difusión a través de la pared de los conductos biliares de los ácidos biliares libres, puede estimular la reacción ductular, con respuesta hiperplásica de las células epiteliales biliares, activación de los colangiocitos y por último, estimulación de los fibroblastos portales. (Syal y cols., 2012). Estudios “in vitro” e “in vivo”, han demostrado que los fibroblastos portales INTRODUCCION 39 depositan colágenos de membrana basal y colágeno fibrilar, propios de la fibrosis hepática. Así mismo, tras la ligadura del colédoco en la rata, los fibroblastos periportales producen colágenos de tipos I, III y IV, en tanto que los miofibroblastos procedentes de fibroblastos portales, expresan RNA mensajero, que codifica colágeno de tipo I y de tipo II (Desmouliere y cols., 1997; Perepelyuk y cols., 2013). Además, los miofibroblastos poseen función contráctil mediante la acción de la actina de músculo liso (SMA)-alfa. La integración de alfa-SMA organizada como fibras de estrés, con las fibras propias de la matriz extracelular, permite al miofibroblasto, ejercer una acción contráctil a distancia, causando remodelación y distorsión de la estructura hepática, asociada a la fibrosis. (Ma y cols., 2013; Shi y cols., 2014). Los colangiocitos dañados, liberan mediadores que inducen la respuesta inflamatoria hepática. Uno de los principales mecanismos de daño celular es el estrés oxidativo. (Novo y cols., 2014).Es posible que las alteraciones metabólicas que produce la colestasis en los colangiocitos, genere hipoxia y por tanto, producción de radicales libres de oxígeno y nitrógeno, que a su vez, inducen la activación de factores de transcripción proinflamatorios, como son NFκB y AP-1. (Liedtke y cols., 2013). Entre los mediadores proinflamatorios que se generan, destacan las quimioquinas, que son responsables de la atracción de leucocitos. (Koenderman y cols., 2014). En la actualidad, al considerar que fosfoinositol-3- Kinasas (P13Ks) desempeña una acción importante en la señal inicial de transducción, que conduce a la expresión de quimioquinas y sus receptores y por tanto, regulan la extravasación y migración de células protagonistas de la inmunidad natural, como son neutrófilos y monocitos, al parénquima hepático inflamado. (Hawkins y cols., 2014). El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) desempeña una importante acción reguladora del desarrollo embrionario, mediante la regulación de la transición mesénquimo-epitelial. Sin embargo, HGF por sus efectos pleiotrópicos, también está implicado en la regulación de la inflamación, en numerosos modelos experimentales, ya que ejerce una acción protectora, mediante su acción inmunosupresora. Así, HGF puede prevenir la insuficiencia hepática experimental, entre otros mecanismos, induciendo la producción del antagonista de receptores de IL-1 o limitando la citotoxicidad hepatocitaria causada por interferón (IFN). (Molnarfi y cols., 2014). La inhibición en la síntesis y secreción de esta citoquina por las células de origen mesenquimal hepático, como son los fibroblastos portales, podría constituir un factor inductor de INTRODUCCION 40 inflamación en la fibrosis biliar, así como la degradación enzimática de sus receptores epiteliales. (Stoker y cols., 1987). La producción hepática de quimioquinas, no solo atrae células derivadas de las células madre hematopoyéticas, sino también células madre mesenquimales procedentes de la médula ósea, así como fibrocitos, en particular los fibrocitos migran al hígado colestásico y constituyen el 4 al 6% de las células que expresan colágeno tipo I. (Kisseleva y cols., 2012). Los fibrocitos poseen la capacidad de transformar su fenotipo y diferenciarse en miofibroblastos productores de colágeno en el hígado inflamado y por esta razón, se ha investigado el mecanismo por el que son reclutados. Entre los factores que regulan la movilización de los fibrocitos desde la médula ósea, destaca el TGF-B1. (Hong y cols., 2007) y entre las quimioquinas que facilitan su reclutamiento, se han descrito, principalmente, CCL 2, CCL 7, CCL 12 y CCL 3, que son ligandos para los receptores CCR 2 y CCR 1 en células hepáticas y derivadas de la médula ósea. (Seki y cols., 2009). En ratones con ligadura de colédoco, se ha demostrado que los fibrocitos procedentes de la médula ósea, migran específicamente al hígado con fibrosis biliar y por lo tanto, participarían en la fibrogénesis, ya que colaboran en el incremento de la población hepática de miofibroblastos. (Scholten y cols., 2011). Las células inflamatorias que son atraídas al parénquima hepático, fagocitan células necróticas o apoptóticas y amplifican las respuesta inflamatoria, al liberar citoquinas proinflamatorias, como son TFN-alfa, IL-6 e IL-1beta, así como por la captación de linfocitos T. (Jenne y cols., 2013; Park y cols., 2014; Sipeki y cols., 2014). Así mismo, numerosos mediadores liberados por las células inflamatorias, estimulan la actividad de los miofibroblastos, así como potencian su proliferación y la producción matriz extracelular. Entre estos factores, los que poseen mayor actividad son TGF-B, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) e IL-13. (Iwaisako y cols., 2014). Por lo tanto, el modelo experimental de fibrosis billiar por ligadura del colédoco, cursaría con colestasis, inflamación portal hepática, infiltración leucocitaria de los tractos portales, proliferación de los colangiocitos y fibrosis de los tractos portales. La alteración del metabolismo de los colangiocitos durante la colestasis, no solo estaría causada por el estrés oxidativo inducido por la hiperpresión y los ácidos biliares, sino que también concurriría la activación de INTRODUCCION 41 las células de Kupffer por su capacidad de liberar radicales libres de oxígeno. (Ljubuncic y cols., 2000). Los fibroblastos portales establecen relación paracrina con los colangiocitos e influyen en su proliferación cuando existe colestasis obstructiva. Cuando se transforman en miofibroblastos, no expresan ectonucleotidasa NTPDasa 2 y por lo tanto, no degradan los nucleótidos extracelulares, que interaccionan con los receptores de clase P2Y en los colangiocitos y estimulan su proliferación. (Jhandier y cols., 2005). Este mecanismo por el que los miofibroblastos portales regulan la proliferación de los colangiocitos, se considera que participa en la reacción ductular, que es secundaria a la colestasis extrahepática. (Fausther y cols., 2013). Así mismo, los fibroblastos portales podrían regular la proliferación de colangiocitos mediante la producción de ácido hialurónico, que se ha demostrado en la fibrosis biliar que aumenta en el espacio portal y se une al receptor CD44, cuya expresión está aumentada en los colangiocitos y favorece su hiperplasia (He y cols., 2008). En la colestasis obstructiva, otros mecanismos, que podrían regular la activación y proliferación de los fibroblastos portales, estarían relacionados con su interacción paracrina con endotelios vasculares sanguíneos y linfáticos, así como con la inervación, en particular del plexo vascular arterial peri biliar. Así, durante el desarrollo de fibrosis biliar, los fibroblastos portales pueden favorecer la angiogénesis en los espacios portales. (Figura 12), (Lemoinne y cols., 2013). También las células endoteliales linfáticas, por estimulación mediante factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), favorecen el desarrollo de células parietales con alfa-SMA, que a su vez, causan gran producción de ácido hialurónico. Este último mecanismo de interacción entre los miofibroblastos y las células endoteliales linfáticas, que ha sido demostrado en la fibrosis pulmonar, también podría participar en la patogenia de la fibrosis biliar. (Meinecke y cols., 2012). La relación funcional entre los miofibroblastos y las células nerviosas, es propia del desarrollo embrionario, aunque se sospecha que en la fibrosis biliar, esta interacción podría estar unificada también en su patogenia, máxime si se considera, que el plexo vascular perihiliar está muy inervado y que las células precursoras de los fibroblastos portales expresan receptores de neurotrofina que participa en el desarrollo nervioso embrionario. (Suzuki K y cols., 2008). Recientemente, también se ha demostrado la implicación de receptores cannabinoides en la apoptosis y fibrosis hepática, secundarias a la ligadura del INTRODUCCION 42 colédoco en la rata. Así, la estimulación de receptores CB2 o el bloqueo de receptores CB1, atenúan la fibrosis hepática. (Mahmoud y cols., 2014). Figura 12. La interacción de las células progenitoras hepaticas/ductular con miofibroblastos hepáticos. Células progenitoras hepaticas/ductular interactúan bidireccionalmente con miofibroblastos, a través de múltiples vías, para proliferar y activar acciones profibrogenicas, proangiogénicas y / o proregenerativas, dependiendo de su origen y microambiente. (Lemoinne y cols., Origins and functions of liver myofibroblasts. Biochim Biophys Acta. 948-54, 2013). Las células estrelladas hepáticas, constituye la principal fuente productora de miofibroblastos en la insuficiencia hepática crónica de causa vírica (Infecciones por HBV y HCV). Así como en la esteatosis hepática, lo que no excluye de su participación secundaria a los fibroblastos en la fibrosis biliar. (Xu y cols., 2014). Las células estrelladas hepáticas proceden del mesénquima embrionario y residen en el espacio de Disse, entre los hepatocitos y las células endoteliales sinusoidales. Mediante sus prolongaciones dendríticas, contactan con las células endoteliales de los sinusoides hepáticos y en su citoplasma acumulan vitamina A cuando expresan un fenotipo quiescente. (Asajina, 2012). También son características de su fenotipo quiescente, la expresión de desmina, marcadores neuronales, como la proteína asociada fibrilar glial, sinaptofisina, sinemina y receptor p75 de factor de crecimiento nervioso (NGF). (Bataller y cols., 2003). Por el contrario, cuando se activan liberan los depósitos lipídicos, (Jing y cols., 2013) e inhiben la expresión de marcadores neuronales, en tanto http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lemoinne.+S.+y+cols.%E2%80%9D+Origens+and+funtions+of+liver+myofibroblasts%E2%80%9D+Brochim+Biophys.Acta.+1832%3A948-954%2C+2013 INTRODUCCION 43 que expresan alfa-SMA (Amooth mucle actin alpha) y sintetizan colágeno tipo 1 transformándose en miofibroblastos. (Forbes y cols., 2011; Novo y cols., 2014). Las células estrelladas hepáticas también se han denominado células peri sinusoidales y células de ITO, aunque en estado quiescente, una de sus funciones principales es la propia de los pericitos, rodeando los sinusoides hepáticos y por lo tanto, con capacidad para acoplar el flujo sanguíneo intrahepático. Sin embargo, tras su estimulación por TGFB1 se activan y protagonizan la cicatrización hepática. (Yin y cols., 2013). En esencia, la pérdida de la homeostasis de las células estrelladas hepáticas quiescentes, es la productora principal de su activación. En este sentido, se han propuesto varias alteraciones como inductoras de la expresión miofibroblástica por las células estrelladas hepáticas. Así, la activación de los canales de K+, (Freise y cols., 2014) la expresión del factor inducible por hipoxia (HIF)-1-alfa, (Zhan y cols., 2014) y la autofagia. (Mallat y cols., 2014). En particular, la autofagia de los depósitos lipídicos de las células estrelladas hepáticas contribuye a su activación y diferenciación miofibroblástica. Se ha propuesto, que el estrés oxidativo y el estrés del retículo endoplasmático, serían dos factores estimuladores de la autofagia en las células estrelladas hepáticas. (Hernandez-Gea y cols., 2013). Por el contrario, también se ha propuesto la autofagia como un mecanismo protector anti inflamatorio. En este sentido, la autofagia en los macrófagos evita la liberación de mediadores proinflamatorios en la insuficiencia hepática crónica. Por lo tanto, la autofagia, según el tipo celular en que se produce, puede contribuir a la fibrogénesis hepática; por ejemplo, la autofagia en las células estrelladas hepáticas, o bien puede ejercer un efecto anti inflamatorio y anti fibrogénico, por ejemplo, la autofagia en macrófagos o la autofagia en los hepatocitos, que evita su apoptosis tras la agresión. (Mallat y cols., 2014). Las células estrelladas hepáticas favorecen la proliferación de los hepatocitos y de las células biliares. Así mismo, durante el desarrollo embrionario inducen la diferenciación de ambos tipos celulares hepáticos. (Lemaigre, 2009) También han sido implicadas en la regeneración hepática, mediante la producción de factores angiogénicos, que modulan las células endoteliales y factores que causan la proliferación de los hepatocitos y la remodelación de la matriz extracelular. (Roskams, 2008). Por lo tanto, las células estrelladas hepáticas son capaces de expresar un fenotipo pro-regenerativo hepático, cuya investigación experimental es fundamental, ya que su manipulación puede ofrecer múltiples aplicaciones terapéuticas en la clínica INTRODUCCION 44 humana. (Yin y cols., 2013). Así, las células estrelladas hepáticas, se pueden trasplantar en el hígado lesionado y contribuir a la regeneración tisular, ya que son capaces de expresar un fenotipo similar al propio de las células progenitoras hepáticas durante su diferenciación en hepatocitos y células epiteliales biliares. Por lo tanto, la terapia con células estrelladas hepáticas, puede constituir un excelente método en el futuro, para conseguir la regeneración hepática, ya que pueden diferenciarse, tanto en hepatocitos como en células biliares. (Kordes y cols., 2014). Sin embargo, las condiciones ambientales secundarias a la agresión hepática crónica, inducen la expresión del fenotipo fibrogénico en las células estrelladlas hepáticas. (Pellicoro y cols., 2014; Xu y cols., 2014; Jwaisako y cols., 2014; Novo y cols., 2014). Las células hepáticas activadas y los miofibroblastos que de ellas derivan, tienen características inmunológicas y por esta razón, son capaces de establecer interacciones con células inherentes a la inmunidad natural, así como ejercer acciones inmunoreguladoras. Así, las células estrelladas hepáticas, al ser activadas, producen radicales libres de oxígeno, a través de NADPH oxidasa, citoquinas pro inflamatorias, quimioquinas y receptores de quimioquinas, como CCRZ, CCR 5, CCR 7, CXCR 3 y CXCR 7 (Pellicoro y cols., 2014).Entre las células inmunes que regulan, destacan los macrófagos, incluyendo también las células de Kupffer. Sin embargo, la agresión hepática, causa reducción de las células de Kupffer, en tanto, que aumenta considerablemente el número de macrófagos, que infiltran el tejido fibrosado hepático. (Ramachandran y cols., 2012), ya que el reclutamiento hepático de los macrófagos es fundamental en la producción de fibrosis, se han estudiado las características que poseen estas células, en distintos modelos experimentales de insuficiencia hepática crónica y se ha demostrado que los macrófagos profibrogénicos producen TGFB, PDGF, IL-4, IL-13, que a su vez, estimulan la síntesis de colágeno por los miofibroblastos. A su vez, mediante la producción de citoquinas proinflmatorias, como son TNF-alfa e IL-1B, favorecen la supervivencia de los miofibroblastos derivados de las células estrelladas hepáticas. (Wynn y cols, 2010; Zimmermman y cols., 2010). Las propiedades inmunológicas de las células estrelladas hepáticas activadas, también le permiten modular la inmunidad adquirida, en particular, durante la producción de fibrosis hepática favorecen la aparición de linfocitos INTRODUCCION 45 Th17, que secretan IL-17 e IL-22, que actuando en receptores IL-17 de las células estrelladas hepáticas, activan el factor de transcripción STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) e inducen la producción de colágeno de tipo I. (Meng y cols., 2012). Otras interacciones con potencial actividad profibrogénica, es la que las células estrelladas hepáticas activadas pueden establecer con las células asesinas naturales (Natural Killer T cells=NKT cells), que constituyen el 30% de los linfocitos hepáticos. (Geissmann y cols., 2005) y con las células cebadas, que también aumentan significativamente en el hígado, tanto en modelos experimentales de fibrosis hepática, como en la cirrosis humana. (Franceschini y cols., 2006; Franceschinic y cols., 2007; Aller y cols, 2007c). TGF-ß1 induce la activación de las células estrelladas hepáticas y aumenta la expresión del receptor PDGF, así como favorece la respuesta proliferativa dependiente de AKT, PI3K y p70S6K. Por lo tanto, aunque TGF- ß inhibe la proliferación hepatocitaria, sin embargo, estimula la proliferación de las células estrelladas hepáticas. (Ren y cols., 2013). Por el contrario PPAR-Gamma (peroxime proliferator-activated receptor gamma), favorece la sensibilidad a insulina e inhibe la activación de las células estrelladas hepáticas. (Qian y cols., 2012; Janani y cols., 2015). La vía de señalización Wnt es también fundamental en la inducción de proliferación de las células estrelladas hepáticas, en tanto que Notch favorece la diferenciación biliar. La activación anómala de Wnt causa fibrosis hepática, no solo por proliferación de las células estrelladas hepáticas, sino también, porque estimula su transición miofibroblástica. (Miao y cols., 2013). Por esta razón, la inhibición de Wnt. asociada a la activación de PPAR-gamma, poseería un efecto antifibrogénico hepático. (Kang y cols., 2009). En la fibrosis biliar experimental, se considera que la fibrogénesis es iniciada por la activación de los fibroblastos portales y según progresa la fibrosis, las células estrelladas hepáticas colaboran progresivamente en la remodelación, contribuyendo a incrementar la población de miofibroblastos hepáticos. Por lo tanto, en la colestasis extrahepática experimental, se ha sugerido que los fibroblastos portales podrían regular la activación de las células estrelladas hepáticas. (Twaisako y cols., 2014) Entre los mecanismos de activación de ambos tipos de precursores miofibroblásticos hepáticos, destacan los epigenéticos, que alteran la función de los genes sin modificar la estructura del ADN. Así, tras su activación, las células estrelladas hepáticas inhiben la metilación de los genes que producen quiescencia, esto es, que silencian los INTRODUCCION 46 genes antifibrogénicos, como son IKB-alfa o PPAR-gamma y por lo tanto, se aumenta la expresión de la metil transferasa de histona, que a su vez, permite la transcripción de colágeno, TIMP-1 y TGF-B. (Yang y cols., 2012). A su vez, el aumento de la expresión de PPAR-gamma en los miofibroblastos derivados de células estrelladas hepáticas, produciría la reversión de su activación profibrinogénica. (Jaster y cols., 2005). Estos resultados sugieren, que las alteraciones micro ambientales que inicialmente se producen en la colestasis obstructiva experimental, causan la activación de fibroblastos portales y de células estrelladas hepáticas por mecanismos epigenéticos. En este supuesto, la manipulación y control del metabolismo celular, que regula las características bioquímicas ambientales hepáticas en la fibrosis biliar, representaría un eficaz mecanismo terapéutico. 5. CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES E INSUFICIENCIA HEPÁTICA Las células madre, representan un futuro prometedor en medicina, ya que se ha demostrado experimentalmente su gran capacidad para modular la respuesta inflamatoria, así como para participar en la regeneración de tejidos y órganos. (Sutton y cols., 2014). Las células madre pueden proliferar manteniendo su indiferenciación y por su potencial pluripotencia generan células progenitoras de múltiples tipos celulares. Esta última propiedad, les confiere capacidad para regenerar y reparar tejidos humanos. En los mamíferos existen dos tipos fundamentales de células madre, las células madre somáticas, también denominadas células madre somáticas o progenitoras y las células madre embrionarias. (Niwa y cols., 2000). Las células madre somáticas se encuentran en los tejidos de adultos, principalmente en médula ósea, tejido adiposo y sangre. Estas células, son capaces de proliferar y regenerar el tejido lesionado. Su limitación es que solo se pueden diferenciar en un tipo celular. (Gimble y cols., 2007). Por el contrario, las células madre embrionarias son pluripotentes y se pueden diferenciar en células derivadas de las tres capas germinativas, esto es, del endodermo, mesodermo y ectodermo. Por desdiferenciación, una célula somática diferenciada se puede transformar en una célula madre pluripotente o multipotente, en tanto que por transdiferenciación, una célula somática, cambia su fenotipo y adopta una identidad diferente, sin tener que desdiferenciarse. (Evan y cols. 1981; Graft, 2011). INTRODUCCION 47 La reprogramación celular tiene su origen en la transferencia de núcleos de células somáticas, que demostró, que el núcleo contiene toda la información genética necesaria para transformar cualquier célula del organismo. (Briggs y cols., 1952; Campbell y cols., 1996; Tachibana y cols., 2013). Un gran avance en la reprogramación celular, fue la creación de células equivalentes a las células madre embrionarias sin utilización de embriones, sino mediante su creación “in vitro”. Así, las células somáticas pueden ser reprogramadas genéticamente para inducir una célula madre pluripotente (iPSCs). Para alcanzar este objetivo, se realizó la transformación de los factores de transcripción Oct 4, Sox 2, Klf 4 y c-Myc a fibroblastos de ratón y humanos, utilizando vectores retrovirales. (Takahashi y cols., 2006; Takahashi y cols., 2013). La aplicación clínica más atractiva de estas técnicas de reprogramación genética, es la obtención de iPSCs específicas de los pacientes, para sustituir los tejidos dañados. (Kanherkar y cols., 2014).La posterior manipulación utilizando diferentes factores para la reprogramación genética, ha conseguido resultados más eficaces. Así se puede favorecer la expresión de específicos factores de transcripción, tanto del endodermo, como de los hepatocitos que representan diferentes estadios evolutivos del desarrollo embrionario. (Banas y cols., 2007b). Algunas células madre del adulto tienen la propiedad de diferenciarse en hepatocitos. Inicialmente, la obtención de estas células para diferenciarse a hepatocitos se limitó a la médula ósea. En particular, se llegó a seleccionar una fracción de estas células, localizadas en el estroma de la médula ósea, denominadas células madre mesenquimales. Estas células demostraron su capacidad para diferenciarse en hepatocitos. (Pittenger y cols., 1999). Sin embargo, en la actualidad la fuente más atractiva para la obtención de células madre mesenquimales es el tejido adiposo, ya que gran número de estas células pueden ser obtenidas por liposucción, una técnica quirúrgica mínimamente invasiva (Seo y cols., 2005a; Seo y cols., 2005b). Así, estas células madre pueden ser obtenidas del propio paciente y tras su diferenciación a hepatocitos, pueden ser trasplantadas. (Wu y cols., 2012; Banas y cols., 2007b). Para inducir la diferenciación de las células madre mesenquimales a hepatocitos “in vitro”, es fundamental someterlas a estímulo adecuado para que mantengan las funciones especializadas de las células epiteliales hepáticas. Existen varios métodos para lograr este fin. Por ejemplo, mediante su INTRODUCCION 48 tratamiento con diferentes citoquinas y factores de crecimiento, como Hepatocyte growth factor (HGF), epitelial growth factor (EGF), los factores de crecimiento de los hepatocitos (HGF) y de epitelio (EGF), insulina o factor de crecimiento similar a insulina (IGF). Además, también estimulan la diferenciación a hepatocitos, la dexametasona, el ácido retinoico, la nicotinamida y la noradrenalina. (Wu y cols., 2012; Talen y cols., 2007) En general, las células con características similares a hepatocitos obtenidos a partir de las células madres mesenquimales, derivadas del tejido adiposo, tienen características diferentes según el método utilizado para su diferenciación. (Snykers y cols., 2006). Otro método para diferenciar hepatocitos, consiste en cultivar las células madre mesenquimales con hepatocitos o con células hepáticas no epiteliales adultas o de hígado fetal. (Lange y cols., 2006; Deng y cols., 2008). Por último, la diferenciación hepatogénica “in vitro”. Puede ser conseguida induciendo determinados factores de transcripción. Así, HNF3B es un factor de transcripción fundamental para el desarrollo embrionario del hígado y puede ser regulado con tetraciclina. (Ishii y cols., 2008). Las células madre mesenquimales se pueden diferenciar también en hepatocitos “in vivo”. Estos experimentos se han realizado principalmente en roedores con insuficiencia hepática aguda o crónica y han demostrado que la diferenciación hepatogénica “in vivo” de las células madre mesenquimales, es un eficaz tratamiento de las enfermedades hepáticas. (Dai y cols., 2009). En particular, las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, inyectadas directamente en el parénquima hepático de ratas cirróticas, se diferencia sin fusión, en hepatocitos. Por lo tanto, se puede considerar que las células madre mesenquimales pueden diferenciarse a hepatocitos “in vivo”, así como estimular la regeneración hepática y favorecer la degradación de la matriz extracelular fibrosa. (Dai y cols., 2009). A este respecto, las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea indiferenciadas, son más eficaces en la reversión de la fibrosis causada por tetracloruro de carbono en rata, que las adipogénicas y hepatogénicas, entre otras razones, porque producen más metaloproteínas (MMP)-2 y MMP-9. (Hardjo y cols., 2009). Las células madre mesénquimales están consideradas como principales candidatas para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias crónicas productoras de fibrosis. A sus efectos inmunomoduladores se une su acción para reducir los factores profibróticos, como son el estrés oxidativo, la hipoxia y la INTRODUCCION 49 actividad de TGF-B1. (Figura 13), (Usunier y cols., 2014). Entre las acciones inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales, se han demostrado múltiples, entre ellas, la inhibición de la proliferación de linfocitos T y B, la inhibición de la producción de inmunoglobulinas, el cambio de polaridad de los linfocitos Th1 a Th2 o anti inflamatorios, la disminución en la expresión de TLR (toll leke receptors), la reducción de la infiltración de monocitos/macrófagos, neutrófilos y linfocitos, que se correlaciona con la disminución de la expresión de MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1). Disminución de macrófagos de tipo 1 y aumento de los macrófagos de tipo 2, inhibición liberación de microvesículas a la circulación sanguínea por las células inflamatorias, así como la disminución en la expresión de citoquinas proinflamatrorias, como IFN- gamma, TNF, IL-1-alfa e IL-6 y aumento de la producción de citoquinas anti inflamatorias, como IL-4 e IL-10. (Zheng y cols., 2013; Usunier y cols., 2014; Haidara y cols., 2014; Glenn y cols., 2014). Las propiedades anti inflamatorias e inmunosupresoras que poseen las células madre mesenquimales, las hace igualmente atractivas para reducir la agresión inmunológica en el trasplante de órganos. En particular las células madre mesenquimales inducen tolerancia. La membrana celular de estas células presenta pocos antígenos leucocitarios humanos (HLA) de clase I y no expresa HLA de clase II, ni moléculas co- estimuladoras (Le Blanc y cols., 2003), por lo que se las considera células inmunoprivilegiadas, aunque no se excluye que en determinadas circunstancias, como son, por ejemplo, tras la estimulación con Interferón gamma (IFN-ɣ) puedan expresar moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MMC) y por lo tanto, ser capaces de presentar antígeno. (Krarojera y cols., 2006). Sin embargo, tanto las células madre mesenquimales, como las células presentadoras de antígeno por excelencia, como son las células dendríticas, son capaces de inducir tolerancia en el trasplante de órganos. (Guo y cols., 2014).Además las células madre mesenquimales humanas, se considera que no tienen riesgo de malignización, esto es, de transformarse en células cancerosas. (Casiraghi y cols., 2013). Sin embargo, las células madre mesenquimales pueden interaccionar con la terapia inmunosupresora, ya que ambos comparten similares funciones inmunosupresoras. Así, tacrolimus, un inhibidor calcioneurina y rapamicina, un inhibidor de mTOR, reducen las propiedades inmunosupresoras de las células madre mesenquimales y por el contrario, estas células también reducen la capacidad inmunosupresora de Tacrolimus y Rapamicina. Incluso a elevadas dosis tacrolimus pueden ser tóxicas para las células madre INTRODUCCION 50 mesenquimales. (Hoogduijin y cols., 2008). Por lo tanto, es importante la adecuada selección de la terapia con fármacos inmunosupresores si se utilizan células madre mesenquimales (Vandemeulen y cols., 2014). Figura 13. Las células madre mesenquimales ejercen diversos efectos sobre las células inmunes. Resumen de los efectos mediados por las celulas madre mesenquimales en la respuesta inmune. Varios factores secretados por estas ejercen un efecto inhibidor sobre las células del sistema inmunitario que están implicados en el proceso fibrótico (HGF: factor de crecimiento de hepatocitos, HLA: antígeno humano de leucocitos, IDO: indoleamina 2,3-dioxigenasa, IFN-γ: interferón γ, Ig: inmunoglobulina, IL: interleucina, MSC: células estromales mesenquimales, NO: óxido nítrico, PGE2: prostaglandina E2, Tc: citotóxica de células T, TGF-β: factor de crecimiento transformante-β, TNF-α: factor de necrosis tumoral -α, Th: células T helper, y Treg: de células T reguladoras).(Usunier y cols., Management of fibrosis: the mesenchymal stromal cells breakthrough. Stem Cells Int. 2014). Las funciones inmunosupresoras de las células madre mesenquimales permite que sean utilizadas también para inhibir la respuesta inmunológica del injerto contra el huésped, por ejemplo, en el trasplante de médula ósea (Francois y cols., 2013) y de intestino, así mismo para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes. (Glenn y cols., 2014; Kyurkchiev y cols., 2014) A su vez, por sus propiedades regenerativas, se ha propuesto su utilización en múltiples enfermedades que cursan con insuficiencia o degeneración tisular u orgánica. (Parekkadan y cols., 2010; Lanzoni y cols., 2013; Qin y cols., 2014; Sutton y cols., 2014). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Usunier+B%2C+Bendentter+M+y+cols.+%E2%80%9CManagement+of+fibrosis%3A+The+mesenchymal..%E2%80%9D.+Stem+Cells+International.+340257%2C+2014 INTRODUCCION 51 Las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (MSC- TA), también llamadas células estromales derivadas del tejido adiposo y células estromales adherentes derivadas de tejido adiposo, son multipotentes y muy similares a las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea. (De Ugarte y cols., 2003). Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (MSC-TA), se pueden diferenciar en hepatocitos, tanto “in vitro” como “in vivo” y así expresan marcadores hepáticos, esto es, proteínas y enzimas propias de los hepatocitos, así como sus funciones, ya que sintetizan urea y captan lipoproteínas de baja densidad (LDL). (Seo y cols., 2005a). El mecanismo de transdiferenciación de las células madre mesenquimales en células similares a hepatocitos, es un proceso inverso al de transición epitelio-mesenquimal, esto es, constituye un proceso de especialización celular y por esta razón, se inhiben los reguladores de transición epitelio-mesenquimal como son Twist y Snail, en tanto que se expresan marcadores epiteliales como E-cadherina y alfa-catenina. (Christ y cols., 2010; Yammamoto y cols., 2008). Así mismo, la vía de señalización Wnt, que está implicada en el desarrollo embrionario, se inhibe en el proceso de diferenciación de las células madre mesenquimales a hepatocitos. (Ke y cols., 2008).En esta diferenciación, también participan mecanismos epigenéticos, como la metilación de ácido desoxirribonucleico (ADN) y la acetilación de histonas. (Yamazaki y cols., 2003; Sgodda y cols., 2007). En su condición de células inmunoprivilegiadas se ha propuesto la utilización de MSC-TA, en alo- y xeno-trasplante. Sin embargo, se ha demostrado que estas células aún poseen capacidad para inducir respuesta inmunitaria en el receptor y por lo tanto, su longevidad y capacidad funcional podrían reducirse por la agresión inmunológica. Así, los xenotraplantes de las células madre mesenquimales son rechazados, ya que inducen una respuesta inmune mediada por linfocitos T. (Fibbe y cols., 2007). Esta respuesta mediada por la inmunidad adquirida obliga, por lo tanto, al empleo de terapia inmunosupresora cuando se realiza este tipo de trasplante. La inmunogenicidad de las células madre derivadas de tejidos del adulto, se reduce mediante su encapsulamiento. (Goren y cols., 2010; Meier y cols., 2014). Las células madre mesenquimales diferenciadas a hepatocitos, se considera que realizan las funciones propias de su especialización, esto es, se deposita en ellas glucógeno, se detoxifica el amonio mediante la síntesis de urea, captan lipoproteínas de baja densidad (LDL) y tienen la actividad metabólica de citocromo P450. (Wu y cols., 2012), así como aumentan la INTRODUCCION 52 expresión de múltiples proteínas mitocondriales, con un concomitante incremento de la actividad oxidativa. (Wanet y cols., 2014). Sin embargo, una alternativa al trasplante de MSC-AT diferenciados a hepatocitos, para el tratamiento de enfermedades metabólicas, lo constituye el trasplante de hepatocitos. Así, en ratones con colestasis intrahepática, el trasplante de hepatocitos por vía portal, permite la corrección metabólica que induce esta enfermedad. (Boudechiche y cols., 2014). MSC-TA diferenciadas hepatocitos, se han trasplantado, por vía sistémica a través de la vena de la cola, demostrándose que reduce la inflamación y la apoptosis, así como favorece la proliferación de hepatocitos en la fibrosis hepática por CCl4. (Yin y cols., 2014). En este sentido, incluso el trasplante sistémico de células madre mesenquimales ha demostrado su eficacia en el tratamiento de la insuficiencia hepática aguda y crónica experimental. (Ma y cols., 2014; Pascual-Miguelañez y cols., 2014). Para favorecer la llegada de estas células trasplantadas al parénquima hepático lesionado, se considera que es importante utilizar el factor quimiotáctico propio de la respuesta inflamatoria. (Marra y cols., 2014). Así, en el tejido inflamado se encuentran elevadas concentraciones de SDF-1-alfa (stromal derived factor), una quimioquina fundamental para dirigir la migración de las células que expresan el receptor CXCR4. (Bleul y cols., 1996) y que por lo tanto, es capaz de atraer hacia el foco inflamatorio, tanto células madre hematopoyéticas, como leucocitos o células madre mesenquimales. (Yang y cols., 2015). Así, se ha demostrado que la modificación genética de las células madre mesenquimales, modificando la expresión CXCR4, consigue que su trasplante mejore la colonización hepática tras su administración intravenosa y por lo tanto, consigue mayor eficacia en el tratamiento de la insuficiencia hepática crónica producida por CCl4. (Ma y cols., 2014). Sin embargo, el trasplante sistémico de células madre mesenquimales en la insuficiencia hepática aguda experimental, no solo ejerce efectos beneficiosos en el hígado inflamado, sino también sistémicamente. (Zhu y cols., 2013). Aunque las células madre trasplantadas se alojan en el hígado, se ha sugerido que además del efecto paracrino hepático, las células madre mesenquimales también podrían ejercer una acción inmunosupresora sistémica, mediante la producción y liberación de factores tróficos e inmunomoduladores. (Parekkadan y cols., 2007). Las células mesenquimales madre no suelen diferenciarse en hepatocitos, por lo que su acción beneficiosa se atribuye a los factores INTRODUCCION 53 hepatoprotectores que producen IL-6, que induce la expresión de FGL-1 (Fibroblast-like-protein 1 gene), un estimulante de la regeneración hepática. (Kovalorich y cols., 2001) y que además, protege contra la muerte celular mediada por Fas, ya que incrementa la expresión de proteínas hepáticas antiapoptóticas. (Bansal y cols., 2005). Por lo tanto, en la insuficiencia hepática aguda, el tratamiento con células madre mesenquimales, poseería una acción beneficiosa, tanto hepática, favoreciendo la regeneración, como sistémica, mediante la secreción de mediadores antiinflamatorios. (Van y cols., 2008). Otro factor que se debe considerar en el trasplante de células madre mesenquimales en la insuficiencia hepática aguda, es el estadio evolutivo de dicha patología. Así, en la fase en la que se produce la máxima agresión hepática, es posible que estas células se transformen en miofibroblastos en vez de hepatocitos. Por el contrario, en fases evolutivas más avanzadas existiría una predisposición a su transformación en hepatocitos. (Meier y cols., 2013). En la insuficiencia hepática crónica experimental, ya producida por tetracloruro de carbón, tioacetamida o colestasis extrahepática, el tratamiento con células madre mesenquimales ha demostrado que favorece la regeneración hepática. (Sun y cols., 2013; Ahmed y cols., 2014; Motawi y cols., 2014;).Las células madre mesenquimales isotrasplantadas por vía intravenosa en ratones cirróticos, se alojan en los hígados con fibrosis inducida por CCl4 y reducen la fibrosis, así como favorecen la regeneración hepática. Sin embargo, este efecto beneficioso tan solo se logra, si el trasplante se efectúa inmediatamente tras la exposición a CCl4, pero no, si se retrasa a la primera semana tras la inducción de fibrosis. (Fang y cols., 2004). Así mismo, también influyen las condiciones ambientales en las que se cultivan las células madre mesenquimales. Se ha demostrado, que las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo, son más estables cuando se cultivan en hipoxia, puesto que es un ambiente similar al que proceden. Incluso en condiciones de cultivo hipóxico, estas células poseen mayor capacidad para ejercer efectos terapéuticos (Feng y cols., 2014). Entre los mecanismos antifibrogénicos de las células madre mesenquimales, destaca su acción paracrina en las células estrelladas. (Day y cols., 2009). Las células mesenquimales causan la apoptopsis de las células estrelladas hepáticas, mediante la producción de factor de crecimiento hepatocitario (HGF) y factor de crecimiento nervioso (NFG), así como también reducen su función de síntesis de colágeno I e inhiben su proliferación (Figura INTRODUCCION 54 14) (Parekkadan y cols., 2007). Esta acción antifibrótica hepática de las células madre mesenquimales, se puede potenciar mediante manipulación genética. Así, MSC-AT, con capacidad para incrementar la expresión HGF, reducen la fibrosis post-radiación hepática en la rata. (Zhang y cols., 2014). Figura 14. Un modelo esquemático de los efectos paracrinos de factores activados derivados de las células madre mesenquimales. La liberación de IL-6 por las celulas estrelladas activadas conduce a la secreción de IL-10 por MSCs que induce la secreción de TNF-α por las celulas estrelladas y esta a su vez, inhibe la proliferación SC y la síntesis de colágeno. El efecto marginal de IL-10 en la proliferación de las células estrelladas se denota poco. Las células estrelladas se someten a la apoptosis después del cultivo con celulas madre mesenquimales debido al aumento de los niveles de HGF. (Parekkadan y cols., Immunomodulation of activated hepatic stellate cells by mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2007). En animales con fibrosis hepática, se ha demostrado que las células madre mesenquimales inyectadas por vía portal, aumentan la expresión hepática de VEGF, HGF, IL-10 y MMP-9, se diferencian en hepatocitos y además, favorecen la regeneración hepática. (Li y cols., 2013). En la insuficiencia hepática crónica experimental, el trasplante de hepatocitos, ha demostrado recientemente, que es más eficaz en la producción de regeneración hepática, que las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea y las células de hígado fetal. Este efecto beneficioso, se atribuye a que sus efectos son principalmente metabólicos y no antiinflamatorios. (Sun y cols., 2014). El trasplante de hepatocitos ha tenido la limitación impuesta por la imposibilidad de obtener un número apropiado de células, mediante el cultivo de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17869217 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17869217 INTRODUCCION 55 células madre hepáticas para conseguir un resultado beneficioso. Sin embargo, en la actualidad es posible utilizar células madre hepáticas inducidas (i Hep.SCs). (Yu y cols., 2013), lo que facilita ampliar su número mediante cultivo “in vitro”. También las células fetales hepáticas poseen células progenitoras hepáticas, que favorecen la regeneración hepática (Alison y cols., 2007). El trasplante de células madre mesenquimales ha demostrado ser más eficaz, cuando se realiza por inoculación directa en el parénquima hepático lesionado. Por inyección intrahepática, se han xenotrasplantado MSC-AT humanas en el ratón y se ha demostrado su persistencia, así como su acción antioxidante en la fibrosis hepática. (Francois y cols., 2013; Ayatollahi y cols., 2014) Las células trasplantadas expresan citoqueratina (CK18 y CK19), así como proteínas de fase aguda, NGF, HGF y moléculas antiinflamatorias, como IL-10 y receptor soluble de IL-1 (IL-1 RA) (Francois y cols., 2013), así como incrementan las concentraciones del antioxidante glutatión (Ayatollahi y cols., 2014), por lo que reducen la apoptopsis e incrementan la proliferación de hepatocitos, consiguiendo corregir la disfunción hepática. (Francois y cols., 2013). Aunque la administración de células madre mesenquimales por vía intraesplénica, no se considera tan eficaz como la intrahepática, se ha demostrado en un modelo de esteatosis hepática en el ratón, que el xenotrasplante de células madre mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos por vía esplénica, favorece la regeneración posthepatectomía parcial, localizándose la células trasplantadas en los espacios periportales. (Winkler y cols., 2014). Para facilitar el trasplante de las células madre mesenquimales, ya derivadas, de médula ósea, cordón umbilical, amnios o tejido graso, es aconsejable que no exista barrera inmunológica, que impida o reduzca su implantación en los tejidos lesionados. Ya que estas células tienen capacidad para expresar antígenos de histocompatibilidad, cuando se realiza alotrasplante o xenotrasplante, es conveniente la inmunosupresión asociada, para evitar su rechazo. (Volarevic y cols., 2014). Aunque no se han descrito casos de malignización de las células madre mesenquimales trasplantadas, se debe considerar que existe dicho riesgo, puesto que inciden varios factores predisponentes, como son la inestabilidad genómica, la significativa aneuploidia, la delección telomérica y la inhibición o INTRODUCCION 56 silenciamiento de genes que participan en la reparación de DNA. (Volarevic y cols., 2014). En la actualidad, también se ha desarrollado un amplio campo de investigación en la consecución de órganos y tejidos a expensas de células madre mesenquimatosas indiferenciadas o diferenciadas incluidas en estructuras, ya de material orgánico o inorgánico. La ingeniería tisular persigue la obtención de estructuras que permitan la proliferación y la diferenciación celular, para lo cual se precisará un adecuado suministro de nutrientes y oxígeno para las células trasplantadas. (Cohon, 1995; Gunatillake y cols, 2003; Hosseinkhani y cols., 2014). En modelos experimentales en animales pequeños, se investiga la aplicación de órganos bio-artificiales, utilizando métodos de descelularización y recelularización, en pulmón, corazón, riñón e hígado. (Kadota y cols., 2014). Ya que aún se desconocen los mecanismos moleculares que rigen la función de las células madre mesenquimales, se precisa investigación adicional para trasladar los resultados conseguidos en experimentación animal a la clínica humana. Sin embargo, se considera, que será preciso asociar a los hepatocitos células madre para lograr su supervivencia a largo plazo, cuando estos órganos neoformados sean trasplantados. . II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 58 II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipótesis La técnica microquirúrgica es aplicable a la cirugía experimental. En particular, ha sido utilizada para la obtención de diversos modelos experimentales de insuficiencia hepática en la rata. Por esta razón, ha sido elegida para la puesta a punto de un modelo experimental de insuficiencia hepática colestásica. En esencia, la producción de colestasis extrahepática en la rata, utilizando una técnica microquirúrgica, se fundamenta en la resección de la vía biliar extrahepática y permite el estudio evolutivo a largo plazo de las complicaciones que comporta ésta patología, tanto hepática como extrahepática. Las alteraciones hepáticas secundarias a colestasis extrahepática en la rata consisten fundamentalmente en la instauración de un proceso inflamatorio, que a su vez está implicado en la producción de proliferación biliar y fibrosis. El grado de insuficiencia hepática que causa la colestasis induce la muerte del animal a corto plazo por infección y/o hemorragia, si no se realiza su profilaxis. Por el contrario, evitar estas complicaciones que se producen precozmente permite conseguir un modelo de insuficiencia hepática crónica por fibrosis biliar en la rata. La fibrosis secundaria a colestasis en la rata, aunque tiene su origen en la respuesta inflamatoria hepática, no revierte mediante los multiples tratamientos anti-inflamatorios ensayados hasta la actualidad, que han demostrado ser ineficaces. Así mismo, se debe considerar que la fibrosis es el estadio previo a la cirrosis hepática en la clínica humana, cuyo único tratamiento efectivo es el trasplante de hígado. Por lo tanto, todos los estudios dirigidos a evitar la evolución cirrótica de la patología inflamatoria hepática constituyen un objetivo fundamental en la actualidad para conseguir reducir la elevada morbi-mortalidad que comporta ésta frecuente patología en el ser humano. En particular, en el presente trabajo experimental se ha ensayado el tratamiento de la patología hepática colestásica realizando tanto Xenotrasplantes de células madre mesenquimales adipocíticas humanas como, Isotrasplantes de madre mesenquimales adipocíticas de ratas singénicas, ya que se ha demostrado que estas células pluripotenciales, son capaces de diferenciarse en hepatocitos y, además poseen una gran actividad anti-inflamatoria e inmunosupresora. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 59 Objetivos 1. Estudiar la evolución a largo plazo de la colestasis extrahepática microquirúrgica en la rata, así como demostrar la existencia de fibrosis biliar causante de insuficiencia hepática crónica en este modelo experimental. 2. Obtener células madre mesenquimales de origen adipocítico, tanto del ser humano como de rata, con capacidad para diferenciarse en hepatocitos para ser utilizadas en el tratamiento de la patología hepática colestásica. 3. Demostrar que mediante el tratamiento con células madre mesenquimales adipocíticas prediferenciadas a hepatocitos, tanto humanas como de rata, se reduce la gravedad evolutiva a largo plazo de la patología hepática secundaria a colestasis extrahepática microquirúrgica en la rata. 4. Investigar si es diferente la efectividad del Xenotrasplante respecto del Isotrasplante hepático de células madre mesenquimales adipocíticas en la disminución de la patología hepática producida por la colestasis extrahepática microquirúrgica en la rata. 60 III. MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL Y MÉTODOS 61 III. MATERIAL Y MÉTODOS 1. MATERIAL 1. A. ANIMALES Se han utilizado 155 ratas macho de la cepa Wistar, cuyo peso corporal osciló entre 200 y 400 gramos, procedentes de las instalaciones homologadas para la cría de animales de experimentación de la Unidad de Cirugía Experimental del Hospital Universitario de La Paz, en Madrid. Todos los ejemplares cumplían los requisitos de salud para animales de experimentación recomendados por la Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). 1. B. INSTALACIONES 1. B.1. Animalario El transporte desde el proveedor se realizó en las condiciones establecidas en la normativa vigente sobre comercio, sanidad y bienestar animal, es decir en un medio adecuado y en contenedores homologados. La estabulación se efectuó en una sala acreditada para tal fin en el Animalario de la Unidad de Cirugía Experimental del Hospital Universitario de La Paz. Dicho Animalario es un Centro de Asistencia a la Investigación con registro nº 28079-15 ABC-M en la Dirección General de Agricultura y Alimentación de la Comunidad Autónoma de Madrid que cumple con los requerimientos legislativos relativos a la experimentación animal (R.D. 1201/2005). El Animalario cuenta con instalaciones óptimas homologadas para la cría, mantenimiento y cuarentena de animales de experimentación, así como también con instalaciones propias para la investigación, quirófanos y laboratorios anejos para la manipulación y toma de muestras alojamiento de roedores durante el postoperatorio. Los animales se mantuvieron en grupos de cuatro dentro de cajas de Plexiglas de 42x65x15 cm (Letica, España) móviles con lecho de viruta (Panlab S.L. Barcelona). 1.B.2 Sala de operaciones La técnica quirúrgica en la que se fundamenta el modelo experimental utilizado se realizó en la Unidad de Microcirugía de la Unidad de Cirugía Experimental del Hospital Universitario de La Paz, en una sala que dispone de: MATERIAL Y MÉTODOS 62  Refrigerador para conservación de los fármacos anestésicos.  Mesa de trabajo de 80 x 100 cm.  Sillas ergonómicas ajustables en altura.  Microscopio operatorio Carl Zeiss OPMI 1-DFC nº serie 211069.  Centrífuga refrigerada superspeed Du Pont Instrument (GIRALT Sorval® RC-5B).  Balanza de precisión para pesado de los animales Jadever LPW- 1260 nº certificado PM-245/04 (Jadever Scale Co.LTD, Taiwan).  Contenedor desechable de residuos biológicos cortantes y punzantes.  Vaporizador de flujo continuo para la anestesia inhalatoria, tipo TEC 4 (Ohemeda)  Fuente de O2 (suministro centralizado). También disponible en bombona: 10.6 m3 de O2 a 200 Kg/cm2  Arcón congelador Koxka a -80 ºC. Figura 15. Fotografías del Laboratorio de Cirugía Experimental donde se llevó a cabo la técnica de colestasis microquirúrgica. 1. B.3 Sala de evolución postoperatoria La Unidad de Cirugía Experimental del Hospital Universitario de la Paz posee instalaciones propias acondicionadas para el mantenimiento y el control de la evolución postoperatoria de las ratas. MATERIAL Y MÉTODOS 63 1. B.4 Sala de sacrificio y procesado de muestras Esta sala dispone de los siguientes elementos:  Mesa de trabajo.  Sillas ergonómicas ajustables en altura.  Lámpara halógena de brazo con bombilla de 60 W.  Contenedor hermético con bolsa para residuos biológicos.  Contenedores desechables de residuos biológicos punzantes.  Centrífuga.  Formaldehído al 2%  Máquina de perfusión de formaldehído Dynamax – Rainin Model RP-1.  Elementos de protección individual: guantes y gafas. 1. B.5 Área de conservación de muestras Se realizó en un espacio habilitado para ese fin en la Unidad de Cirugía Experimental del Hospital Universitario de la Paz. La misma dispone de un congelador SANYO MDF-U5186S nº de serie 50709226 (SANYO Electric Biomedical Co., Ltd Japan) que conserva las muestras a –80ºC. 1. B.6 Eliminación de residuos biológicos Los residuos biológicos se almacenaron en espera de su eliminación en un área especial que dispone de un congelador tipo arcón modelo ZCF320L/2 Zanussi (Electrolux Home Products España, S.A. Madrid). 1. C. FÁRMACOS 1. C.1 Anestésicos Isofluorano: concentración de inducción al 3-5%, y de mantenimiento al 1.5-2%. 1. C.2 Otros fármacos  Ceftriaxona sódica (D.C.I), 500 mg. (Ceftriaxona Normon 500 mg FG Lab. Normon S.A. Madrid).  Fitomenadiona, vit. K 1 ampollas 1ml con 10 mg. (Konakion® Roche Farma S.A. Madrid).  Prograf (Tacrolimus) concentrado de solución para perfusión 5mg/ml: 0.10 mg/Kg/día  Buprenorfina (Buprex®). MATERIAL Y MÉTODOS 64  Fibrinógeno humano + Trombina humana (Tachosil), esponja 5,5 mg/2 UI (Lab. NYCOMED PHARMA) 1. D. MATERIAL 1. D.1 Instrumental quirúrgico Caja con instrumental de microcirugía, que incluye: 1. D.1.A Pinzas:  Clamp de paños Backhaus de 13.3 cm (2)  Disección con dientes de 13cm (1)  Disección de Adson con dientes de 12cm (1)  Halsted Mosquito curva sin dientes de 12.7 cm (2)  Halsted Mosquito recta sin dientes de 12.7 cm (2)  Pinza de Heiss recta (1)  Pinza de Heiss curva (1)  Pinza de microcirugía recta de 10.5 cm. (1)  Pinza de microcirugía curva de 10,5 cm.(1) 1. D.1.B Porta-agujas Mayo-Hegar de 12,7 cm. (1) 1. D.1.C Tijeras:  De Metzenbaum curva de 14 cm (1)  De Mayo recta de 14cm (1)  Tijera de microcirugía recta de 15 cm. (1) 1. D.2. Material de sutura y ligadura  Seda trenzada ligadura 3/0 Silkam®. (B. Braun España).  Seda negra trenzada ligadura 6/0 Silkam®.(B. Braun España).  Sutura de Vicryl ® (poliglactina 910) aguja curva 3/0. (Ethicon Inc.)  Sutura de seda negra trenzada aguja curva de 3 /0 Silkam®. (B.Braun España). 1. D.3 Material quirúrgico complementario  Paños quirúrgicos.  Guantes de exploración de látex natural sin polvo. Talla 7 (King TM Amebil S.A. Vizcaya. España) MATERIAL Y MÉTODOS 65  Guantes quirúrgicos de látex natural con polvo (estériles). Talla 7 (Medi- Grip Plus. Ansell Ltd. UK)  Gasas de 10 × 10cm. (Envase de 10 unidades Texpol .Manresa. España)  Torundas de algodón pequeñas montadas (Algodones del Bages, S.A. Barcelona. España) 1. D.4. Otros materiales para el procedimiento operatorio y la extracción de muestras  Guantes de protección frente a mordedura de animales  Bloque de plastilina de 10 × 2 × 3 cm  Jeringas de 10, 5 y 2 ml BD DiscarditTM II (Becton Dickinson S.A. Fraga. Huesca. España )  Agujas de tipo Luer 20G 0,91×25,4 mm (monoject magellan Safety Needle Tyco Healthcare Group LP.USA)  Agujas de tipo Luer 21G 0,82×38,1 mm (monoject magellan Safety Needle Tyco Healthcare Group LP.USA)  Agujas de tipo Luer 25G 0,51×15,8 mm (monoject magellan Safety Needle Tyco Healthcare Group LP.USA)  Hoja de bisturí de acero estériles del nº 11 (Albion Surgical Limited . Sheffield. England)  Solución Salina isotónica: ClNa, 0.9g/100ml. Envase 10 ml B.Braun  Contenedor cilíndrico de polietileno para residuos biológicos marca Consenur de 30 litros fabricado según norma DIN-30739.  Contenedor de polipropileno para residuos biológicos punzantes y cortantes marca Biocompact 1,8 litros ( Sanipick Plastic SA. Madrid)  Bolsas de plástico de 15 litros para residuos biológicos  Recipiente de acero inoxidable para transporte de nitrógeno líquido Airliquide GT 2 (Airliquide España)  Guantes de protección frente frío Midera 10 1. D.5. Material de laboratorio  Pipetas Pasteur no estériles de 1 ml.  Micropipetas Jencons automáticas variables de 0.5-10 μl, 5-50 μl, 200- 1000 μl (Labsystem) y puntas de pipetas desechables (Labcenter)  Tubos de centrifuga 10ml (BD VacutainerTM. BD Vacutainer Systems. Plymouth. UK). MATERIAL Y MÉTODOS 66  Microtubos para muestras de suero (Eppendorf Ibérica, S.L. Madrid).  Tubos de polipropileno de 50 ml para muestras de tejido (BD Falcon™ NY USA). 1. E. EQUIPOS DE LABORATORIO 1. E.1 Procesado de muestras  Centrífuga angular Nahita modelos 2610 ref. 2610000 OF.  Balanza analítica de precisión AB 204 Mettler Toledo nº serie:1113043273 (Mettler-Toledo S.A.E. L'Hospitalet de Llobregat Barcelona). 1. E.2 Estudio bioquímico en suero Autoanalizador Olympus AU400 nº serie 311267. Olympus Optical España S.A. 1. E.3 Laboratorio de Anatomía Patológica El procesado de las muestras histológicas y su posterior estudio microscópico se efectuó en el laboratorio del Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Universitario de la Paz. Este centro cuenta con: 1. E.3.a. Laboratorio general:  Procesador automático de tejidos con vacío.  Estación de trabajo para inclusión.  Microtomos motorizados.  Baños de flotación.  Microscopios ópticos convencionales.  Microscopio de fluorescencia.  Cabina de extracción de gases. 1. E.3.b Laboratorio de análisis de imagen:  Microscopio motorizado Leica CTR-5000 con epifluorescencia. - Cámara digital Leica DC-300. - Cámara digital Leica DC-350F. - Software Leica Qwin V3. - Impresora HP Photosmart 7960.  Microscopio Nikon Labophot 2 con epifluorescencia MATERIAL Y MÉTODOS 67 - Cámara de vídeo b/n Hitachi KP-140. - Cámara de vídeo color Hitachi KP-C50 - Software MIP4 de C.I.D. - Impresora laser Epson EPL-6100.  Equipamiento común: - Cámara fotográfica digital Nikon Coolpix 950. - Videoimpresora Mitsubishi. - Videocopiadora Polaroid. - Sistema macro para fotografía. 1. F. REACTIVOS DE LABORATORIO 1. F.1 Estudios bioquímicos en suero  Bilirrubina total y directa: • Total Bilirrubin Olympus System Reagent y Direct Bilirrubin Olympus System Reagent (Olympus Irlanda ref. OSR 6111 y OSR 6112). • Olympus System Calibrator (Olympus Irlanda ref. 66300).  Aspartato aminotransferasa (AST) • AST Olympus System Reagent (Olympus Irlanda ref. OSR6109). • Pyridoxal phosphate liquid (P5P) (Olympus Irlanda ref. (60106). • Olympus System Calibrator (Olympus Irlanda ref. 66300).  Alanina aminotransferasa (ALT) • ALT Olympus System Reagent (Olympus Irlanda ref. SR6107). • Pyridoxal phosphate liquid (P5P) (Olympus Irlanda ref. 60106). • Olympus System Calibrator (Olympus Irlanda ref. 66300).  γ - glutamiltransferasa (GGT) • GGT Olympus System Reagent (Olympus Irlanda ref. OSR6120). • Olympus System Calibrator (Olympus Irlanda ref. 66300)  Fosfatasa alcalina (FA) • ALP Olympus System Reagent (Olympus Irlanda ref. OSR6104). • Olympus System Calibrator (Olympus Irlanda ref. 66300).  Lactato deshidrogenasa (LDH) • LDH Olympus System Reagent (Olympus Irlanda ref. OSR6126). • Olympus System Calibrator (Olympus Irlanda ref. 66300). MATERIAL Y MÉTODOS 68  Proteínas totales • Total proteins Olympus System Reagent (Olympus Irlanda ref. OSR6103). • Olympus System Calibrator (Olympus Irlanda ref. 66300).  Albúmina • Albumin Olympus System Reagent (Olympus Irlanda ref. OSR6102). • Olympus System Calibrator (Olympus Irlanda ref. 66300).  Creatinina • Creatinin Olympus System Reagent (Olympus Irlanda ref. OSR6178). • Olympus System Calibrator (Olympus Irlanda ref. 66300).  Urea • Urea Olympus System Reagent (Olympus Irlanda ref. OSR6178). • Olympus System Calibrator (Olympus Irlanda ref. 66300). 1. F.2. Laboratorio de Ingeniería Celular:  Medio de expansión DMEM high glucose+ 10% FBS, más 1% P/S, Na- piruvato, glutamina  Medio de expansión: 60% DMEM-LowGlucose (Gibco); 40%MCDB-201 (Sigma); 1% ITS (Gibco); 10-9 M dexametasona (Sigma); 10-4 M ácido ascórbico 2 fosfato (Fluka); 10 ng/ml rhEGF (R&D); 5% FBS (Gibco); 1% Pen/Strep (Gibco); 0.6% Glutamina (Gibco)  Medio de diferenciación celular: Igual que el de expansión pero sin FBS y con 10ng/ml de rhHGF (Gibco) + 10 ng/ml de rhOSM (Sigma)  Suero bovino fetal (FBS)  Solución salina Hanks balanced SALT solution, HBSS, (Invitrogen) 1. F.3. Estudio histopatológico  Fijación • Formol tamponado al 10%  Inclusión • Agua destilada • Alcohol etílico (70º,96º,100º) • Xilol • Parafina MATERIAL Y MÉTODOS 69  Tinción de Hematoxilina-Eosina: • Hematoxilina de Harris.............................0,5g. • Eosina ...................................................... 1g. • Agua destilada .........................................100ml  Tinción con Rojo Picrosirio: Solución rojo sirio-ácido pícrico: • Rojo sirio F3BA al 1%....................................10 ml • Solución acuosa saturada de ácido pícrico…90 ml  Tinción con Tricrómico de Masson: Reactivos • Solución de hematoxilina férrica de Weigert. • Solución de escarlata de Biebrich – fucsina ácida: - 90 cc de escarlata de Biebrich al 1% en agua destilada. - 9 cc de fucsina ácida al 1% en solución acuosa. - 1 cc de ácido acético glacial. • Solución acuosa de ácido fosfomolíbdico (se utiliza ácido fosfotúngstico en la misma proporción, si se va a teñir con verde luz): - 5 g de ácido fosfomolíbdico. - 200 cc de agua destilada. • Solución de azul de anilina: - 2,5 g de azul de anilina. - 2 cc de ácido acético glacial. - 98 cc de agua destilada. • Solución de verde luz al 2% (alternativa al azul): - 2 g de verde luz SF amarillento. - 99 cc de agua destilada. - 1 cc de ácido acético glacial. • Solución diferenciadora: solución acuosa de ácido acético glacial al 1%. 2. MÉTODOS 2.A. CONDICIONES DE UTILIZACIÓN Y ESTABULACIÓN DE LOS ANIMALES La estabulación de las ratas durante el tiempo en el que se ha realizado la parte experimental del presente trabajo se realizó de acuerdo con la http://es.wikipedia.org/wiki/Hematoxilina http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Escarlata_de_Biebrich&action=edit&redlink=1 http://es.wikipedia.org/wiki/Fucsina http://es.wikipedia.org/wiki/Cent%C3%ADmetro_c%C3%BAbico http://es.wikipedia.org/wiki/Agua_destilada http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_ac%C3%A9tico http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=%C3%81cido_fosfomol%C3%ADbdico&action=edit&redlink=1 http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_fosfot%C3%BAngstico http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_fosfot%C3%BAngstico http://es.wikipedia.org/wiki/Gramo http://es.wikipedia.org/wiki/Azul http://es.wikipedia.org/wiki/Anilina http://es.wikipedia.org/wiki/Verde http://es.wikipedia.org/wiki/Luz http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_ac%C3%A9tico_glacial MATERIAL Y MÉTODOS 70 legislación vigente en nuestro país sobre el cuidado y la utilización de animales de laboratorio, por la cual España adopta la normativa de la Unión Europea de 1996 sobre el uso de animales con fines científicos. Se incorporó a nuestro ordenamiento legal con fecha de 4 de Agosto de 1986 en el Real Decreto 1201/2005, de 10 de octubre, sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos. (BOE 252; 21-10-2005). (Aller y cols., 2009a). Los animales se mantuvieron a una temperatura de 20 ± 2 ºC, y con una humedad relativa del 65 ± 10 %. Las condiciones de luz/oscuridad fueron cíclicas, estableciéndose períodos alternos de 12 horas (8:00-20:00h/20:00- 8:00h). Los animales se mantuvieron en grupos de 2, en cajas homologadas (Plexiglas de 42x65x15 cm; Letica, España) móviles con lecho de viruta (Panlab S.L. Barcelona). Dichas cajas fueron etiquetadas, consignándose en éstas últimas los datos de identificación de cada animal, y se colocaron en estanterías. Todos los animales fueron alimentados con una dieta estándar para roedores de laboratorio (rata /ratón dieta de mantenimiento A04. Panlab: España) y agua ad libitum. (Aller y cols., 2009a). 2. B. DISEÑO EXPERIMENTAL El modelo de colestasis extrahepática microquirúrgica en la rata se ha estudiado en 4 grupos: un primer grupo estaba constituido por animales con colestasis, pero sin tratamiento, y otros 3 grupos integrados por ratas que se diferenciaban entre sí en función del tipo de células madre que se les administraron para el tratamiento de la fibrosis biliar y de la insuficiencia hepática secundarias a la colestasis: 1. Células madre mesenquimales de origen adipocítico de rata indiferenciadas 2. Células madre mesenquimales de origen adipocítico humana prediferenciadas en células progenitoras hepatocitarias; 3. Células madre mesenquimales de origen adipocítico de rata prediferenciadas en células progenitoras hepatocitarias. Las células madre del segundo grupo fueron obtenidas de tejido adiposo procedente de lipoaspirado de pacientes intervenidos en el Hospital de La Paz. En estas, la inyección se realizó en los lóbulos hepáticos medio, lateral derecho MATERIAL Y MÉTODOS 71 y lateral izquierdo (LM, LD y LI). Por el contrario, en el último grupo, las células madre mesénquimales fueron obtenidas del tejido adiposo de ratas singénicas, es decir, de la misma cepa que las utilizadas para este estudio (Wistar), procedentes del animalario de la Unidad de Investigación del Hospital de La Paz. En estos animales colestásicos, la inyección de las células madre se realizó en el lóbulo medio hepático (LM). De esta forma, las ratas fueron agrupadas aleatoriamente para su estudio en los siguientes grupos:  Serie I (n=40): ratas control: • Grupo 1 (n=20): ratas seudo-operadas (SO). Grupo 2 (n=20): ratas con colestasis extrahepática microquirúrgica e inyección intrahepática de solución salina isotónica (0.9%) (CM-S) • Grupo 2 (n=20): ratas con colestasis extrahepática microquirúrgica e inyección intrahepática de solución salina isotónica (0.9%) (CM-S)  Serie II (n=47): Colestasis microquirúrgica e inyección de células mesenquimales de origen adipocítico, obtenidas de ratas singénicas y no diferenciadas .(CCRND)-Colestasis Células Rata No Diferenciadas  Serie III (n=38): Colestasis microquirúrgica e inyección de células mesenquimales de origen adipocítico humanas que fueron prediferenciadas a hepatocitos en el Laboratorio de Ingeniería Celular previa a su administración intrahepática. (CCHP)-Colestasis Células Humanas Prediferenciadas  Serie IV (n=30): Colestasis microquirúrgica e inyección de células mesenquimales de origen adipocítico, obtenidas de ratas singénicas que fueron prediferenciadas a hepatocitos previa a su administración intrahepática (CCRP)-Colestasis Células Rata Prediferenciadas Tabla 2: Diseño experimental de los Grupos de ratas utilizadas en éste trabajo MATERIAL Y MÉTODOS 72 SERIE I GRUPO 1 SO n=20 Seudo-operadas GRUPO 2 CM-S n=20 Colestasis microquirúrgica e inyección intrahepática de solución salina isotónica SERIE II CCRND n=47 Colestasis microquirúrgica e inyección intrahepática de células adipocíticas de rata no diferenciadas SERIE III CCHP n=38 Colestasis microquirúrgica e inyección intrahepática de células adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos SERIE IV CCRP n=30 Colestasis microquirúrgica e inyección intrahepática de células adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos 2. C. TÉCNICA ANESTÉSICA El principal objetivo de la anestesia cuando se utilizan animales de laboratorio es de carácter ético y consiste en evitarles el dolor y el sufrimiento innecesarios. Independientemente del método anestésico elegido por cada grupo de Investigación, éste debe conseguir suficiente relajación muscular para que la cirugía pueda ser realizada fácilmente, debe bloquear la actividad refleja para impedir la activación del Sistema Nervioso Autónomo y, por lo tanto alteraciones de la frecuencia y del ritmo cardíaco y, lo más importante, la técnica anestésica debe procurar un grado suficiente de pérdida de conciencia por hipnosis que, unido a la analgesia, impida que el animal sufra dolor. En definitiva, el objetivo fundamental de la anestesia es causar a los animales de experimentación el mínimo distrés físico y psicológico asociado a la cirugía experimental (Aller y cols., 2009a). Entre los múltiples métodos de anestesia descritos en la rata los fundamentales son los que utilizan la vía inhalatoria o la parenteral. En este estudio, la anestesia se administró por vía inhalatoria utilizando Isofluorano, con una concentración de inducción al 3-5%, y de mantenimiento al 1.5-2%, administrada a través de un vaporizador de flujo continuo para la anestesia inhalatoria, tipo TEC 4 (Ohemeda), conectada a una fuente de O2. Esta pauta MATERIAL Y MÉTODOS 73 proporciona un plano anestésico quirúrgico y adecuada relajación muscular durante el tiempo que dura la intervención. Una vez finalizado el tiempo quirúrgico la recuperación espontánea de la conciencia se produce habitualmente entre los 5 y 10 minutos. Por la sensibilidad de los pequeños roedores a la hipotermia (Rodríguez, 1999), durante el postoperatorio inmediato se colocó a las ratas en un ambiente cálido suministrado por una manta eléctrica (Aller y cols., 2009a). 2. D. TÉCNICA QUIRÚRGICA 2. D.1. SEUDO-OPERACIÓN Con la rata en decúbito supino se realiza una laparotomía media xifopubiana, las asas intestinales se cubren con una gasa humedecida en solución salina isotónica (0.9%) a temperatura corporal, y son desplazadas hacia el lado izquierdo del animal. A continuación y, tras colocar un bloque de plastilina en la zona dorso lumbar, se secciona el ligamento falciforme, situado entre los lóbulos hepáticos lateral izquierdo y caudado, y posteriormente los ligamentos triangulares izquierdo y derecho (Figura 16). Figura 16. Laparotomía media y sección del ligamento falciforme Las maniobras anteriores permiten una exposición adecuada del hilio hepático y la tracción ligera del duodeno hacia el lado izquierdo permite visualizar la vía biliar, que es la estructura hiliar más superficial en la rata (Lorente y cols., 2000). Tras disecar el colédoco, se introduce el intestino en la cavidad peritoneal, y la pared abdominal se cierra en dos planos: peritoneo, músculo y aponeurosis mediante sutura continua reabsorbible Vycril ® MATERIAL Y MÉTODOS 74 (polyglactin 910) de 3/0, y piel con sutura continua de seda de 3/0. (Lorente y cols. 2000). 2. D.2. COLESTASIS EXTRAHEPATICA MICROQUIRURGICA El parénquima hepático en la rata está constituido por cuatro lóbulos: lateral derecho (LLD), medio (LM), lateral izquierdo (LLI) y caudado (LC) y cada uno de ellos posee una vascularización portal y arterial y un drenaje venoso y biliar independientes (Figura 17) (Aller y cols., 2008; Lorente y cols., 2009). Esta característica anatómica permite resecar los conductos biliares que drenan cada lóbulo hepático en continuidad con el colédoco mediante la utilización de una técnica microquirúrgica (Aller y cols., 1993a; Aller y cols., 2009b). Figura 17. Representación del hígado de la rata dividido en cuatro lóbulos: medio (LM), lateral izquierdo (LLI), lateral derecho (LLD) y caudado (LC). En el hilio se puede apreciar la relación entre las ramas portales, arteriales y biliares, así como la ausencia de vesícula biliar. VBP, vía biliar principal, AH, arteria hepática, VP, vena porta Tras administrar anestesia inhalatoria con Isofluorano, y con el animal en decúbito supino, se realizó una laparotomía media xifopubiana y se seccionó el ligamento falciforme. A continuación se extrajeron las asas intestinales, desplazándolas hacia el lado izquierdo del animal y se protegieron con una gasa humedecida en solución salina isotónica (0.9%) a temperatura corporal. Después de colocar un bloque de plastilina en la zona dorso-lumbar los lóbulos hepáticos superiores se evirtieron sobre el tórax y también se cubrieron con una gasa LM LLI LLD LC AH VBP VP MATERIAL Y MÉTODOS 75 empapada en suero salino. Estas maniobras permitieron una correcta exposición de la totalidad de la vía biliar extrahepática. A continuación se seccionan el ligamento falciforme (situado entre el LLI y el LC), y posteriormente los ligamentos triangulares izquierdo y derecho (Figura 18). Figura 18. Ligamentos principales del hígado de la rata. F: Ligamento falciforme; TD: Ligamento triangular derecho; TI: Ligamento triangular izquierdo; LM: Lóbulo medio; LLI: Lóbulo lateral izquierdo; LMD: Lóbulo medio derecho; LMI: Lóbulo medio izquierdo; LLD: Lóbulo lateral derecho; LC: Lóbulo caudado Para las siguientes fases de la intervención es necesario utilizar un microscopio operatorio binocular como medio de magnificación (Aller y Arias, 2009), ya que la disección y sección de los conductos biliares de los cuatro lóbulos hepáticos debe ser realizada sin lesionar la vascularización portal o arterial de estos lóbulos (Figura 19). LLI TI LC LLI LM LM LLD TD MATERIAL Y MÉTODOS 76 Figura 19. A la izquierda: fotografía en la que se observa al cirujano realizando la técnica microquirúrgica utilizando como medio e magnificación un microscopio operatorio. A la derecha: imagen percibida con el microscopio de la vía biliar extrahepática, que es anterior respecto de la arteria hepática y sus ramas lobulares, siendo a su vez la vena porta y sus ramas subyacentes a la arteria hepática La tracción del duodeno hacia la izquierda del animal permite visualizar el colédoco, que se liga con Seda negra trenzada 6/0 Silkam®.(B. Braun España) y se secciona proximalmente al inicio de su porción intrapancreática (Figura 20). Esta maniobra, al producir dilatación de la vía biliar extrahepática, facilita la identificación y posterior disección del colédoco y de los conductos biliares procedentes de los cuatro lóbulos hepáticos que constituyen el hígado de la rata. El colédoco, una vez seccionado, se desplaza proximalmente y se diseca hasta el origen de los conductos biliares propios del LLD y del LC. Después de disecar el conducto biliar del LC y de identificar la rama de la arteria hepática de este lóbulo, se liga el conducto biliar lo más próximo posible de su salida del parénquima hepático. La disección, ligadura del conducto biliar del LLD se realiza de igual forma (Figura 21). MATERIAL Y MÉTODOS 77 Figura 20. A la izquierda: Ligadura del colédoco previa al inicio de su porción intrapancreática, lo cual produce dilatación de la vía biliar extrahepática. A la derecha: Ligadura y sección del colédoco proximal al inicio de su porción intrapancreática.. Figura 21. Ligadura del conducto biliar procedente del lóbulo caudado (derecha) e inicio de la ligadura del conducto biliar del lóbulo lateral derecho (izquierda). Se continúa la disección del colédoco en sentido craneal, liberándolo del tejido graso y de las adherencias peritoneales, e individualizándolo de la arteria hepática, y de la vena porta hasta los conductos biliares procedentes del lóbulo medio (LM) (Figura 22) Estos últimos se disecan independientemente. Por último, se diseca, se secciona el conducto biliar del LLI y se secciona la vía biliar (Aller y cols., 1993a; Aller y cols.,2009b) (Figura 23). MATERIAL Y MÉTODOS 78 Figura 22. A la izquierda: Disección del conducto biliar procedente del lóbulo hepático medio (LM) previa a su ligadura. Los conductos biliares de los lóbulos derecho, caudado y lateral izquierdo ya ligados. A la derecha: ligadura de los conductos biliares que drenan los cuatro lóbulos hepáticos de la rata. Figura 23. Imagen de la vía biliar extrahepática y de sus ramas lobulares una vez resecada con una técnica microquirúrgica Previa comprobación de la integridad de la vascularización portal y arterial de los lóbulos hepáticos, así como de la inexistencia de hemorragia procedente de alguna lesión inadvertida del parénquima hepático (Figura 24), se reintegran las asas intestinales al interior de la cavidad abdominal y se administran por vía intraperitoneal 1,5 ml de solución salina isotónica (0.9%)o fisiológico para compensar las pérdidas hídricas producidas por la apertura de la cavidad abdominal durante la intervención quirúrgica. Por último, se procede al cierre del plano peritoneo-músculo-aponeurótico con sutura continua reabsorbible Vycril ® (polyglactin 910) de 3/0, y de la piel con sutura continua de seda de 3/0. MATERIAL Y MÉTODOS 79 Figura 24. A la izquierda: Aspecto del hilio hepático una vez finalizada la exéresis de la vía biliar principal, con las ligaduras correspondientes de los conductos biliares que drenan los cuatro lóbulos que constituyen el hígado de la rata. A la derecha: Sección de las ligaduras a ras del parénquima hepático con el objeto de dejar la menor cantidad posible de vía biliar extrahepática. Se comprueba la indemnidad de la arteria hepática y de la vena porta, así como de sus ramas lobulares 2. E. MANTENIMIENTO Y TRATAMIENTO POSTOPERATORIO Una vez finalizada la intervención las ratas se colocaron en su caja de policarbonato (42 x 65 x 15 cm, Letica. España) sobre un lecho de viruta especial para roedores de laboratorio (Panlab) que permite su estabulación en un medio limpio y seco, con luz poco intensa y en un ambiente tranquilo hasta que se recuperan de la anestesia. Debido a la especial sensibilidad de los pequeños roedores a la hipotermia (Rodríguez, 1999; Aller y cols., 2009a), la prevención de la hipotermia postoperatoria es de fundamental importancia. Por ello, inmediatamente después de la intervención el animal se colocó cerca de una fuente de calor (una lámpara) sobre una manta eléctrica para mantener la temperatura corporal en el rango aconsejado para las ratas adultas (25-30ºC) (Waynforth y Flecknell, 2004). Además en los roedores, es importante controlar la respiración durante el postoperatorio inmediato ya que es común la depresión respiratoria durante este periodo. Esta complicación es especialmente peligrosa ya que suele pasar inadvertida hasta que los animales sufren hipoxia e hipercapnia. Durante una intervención quirúrgica, en particular si como en éste modelo experimental se realiza una laparotomía, se pierden abundantes fluídos por evaporación, lo cual se agrava ya que las ratas generalmente son incapaces de MATERIAL Y MÉTODOS 80 ingerir líquidos durante las primeras 12-24 horas del p.o. Por tanto, se deben aportar aproximadamente 40-80ml/kg/24h preferiblemente por vía oral si el animal ha recuperado la conciencia. En caso de que no se hayan recuperado del íleo paralítico se administra una solución salina-dextrosa (4% dextrosa, 0.18% salino) o salina (0.9%) por vía intraperitoneal o subcutánea (Aller y cols., 2009a). La realización de una laparotomía con manipulación de las asas intestinales y resección de la vía biliar en la rata cursa con un importante dolor p.o. En particular, las ratas Wistar tras sufrir una laparotomía adoptan posturas sugerentes de dolor abdominal arqueando la espalda, aumentan su frecuencia respiratoria y reducen la ingesta de líquidos y sólidos. Por éste motivo, como terapia analgésica se administró el opioide Buprenorfina (0.05mg/kg/12h) por vía subcutánea durante las primeras 24 horas de p.o. (Aller y Nava, 2009). Buprenorfina ha sido muy utilizado en medicina veterinaria durante las últimas tres décadas porque proporciona un nivel de analgesia excelente y produce una mínima depresión cardíaca y/o respiratoria. Los animales fueron sacrificados a las 8 semanas del post-operatorio. Durante este periodo p.o. se les administró por vía i.m. profunda un antibiótico de amplio espectro (Ceftazidima; 50 mg/kg; dos veces a la semana) y Vitamina K1 (Fitomenadiona; 8mg/kg; una vez a la semana) como profilaxis anti-infecciosa y anti-hemorrágica, respectivamente (Aller y cols., 2009b). Además, en el grupo de ratas a las cuales se les inyectaron células madre de origen adipocítico humanas, con el objetivo de evitar el rechazo del xenotrasplante, se les administró el inmunosupresor Tacrolimus (0.05 mg/Kg i.m., 3 veces a la semana) desde las 24 horas previas a la inyección de las células madre hasta el momento del sacrificio. 2. F. OBTENCIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DE ORIGEN ADIPOCÍTICO En el grupo de ratas de la Serie II se han utilizado células madre obtenidas durante la realización de un Proyecto anterior financiado por el Fondo de Investigaciones Sanitarias, que fueron extraídas de tejido adiposo procedente de liposucciones estéticas electivas realizadas en el ser humano. El tejido obtenido de las pacientes donantes y, previo consentimiento informado siguiendo las directivas del BOE 2006/17/CE del 8 de febrero del 2006, fue procesado como más adelante se detalla. Por el contrario, en los grupos de las Series III y IV se administraron células madre mesenquimales de rata que se MATERIAL Y MÉTODOS 81 obtuvieron de lipectomias de la grasa perirrenal y abdominal de ratas de la cepa Wistar (procedimiento aprobado por el Comité Ético de experimentación animal del Hospital Universitario La Paz). La fracción vasculo estromal (SVF), tanto en el ser humano como en la rata, fue aislada del tejido adiposo utilizando un procedimiento basado en el descrito por Zuk y cols en 2001 (Zuk y cols., 2001); brevemente: 1. La muestra de tejido adiposo se digiere con un volumen de 1:1 de solución de colagenasa tipo I en PBS (ambos de Gibco-BRL,Grand Island, NY, USA) al 0,075% ( si es tejido adiposo humano), 0,1% ( si es tejido adiposo de rata) a 37ºC con agitación suave durante 30 minutos. Posteriormente, la actividad enzimática se neutraliza con un volumen 1:1 de DMEM + 10% suero bovino fetal (FBS) al 10% + 1% de solución antibiótica de penicilina y estreptomicina (Medio de cultivo, todos ellos de Gibco-BRL). Tras la incubación, el tejido se centrifuga a 300 x g durante 10 minutos, y el sobrenadante, consistente en gotas lipídicas, adipocitos maduros, y la solución de colagenasa y el medio se retira, dejando un pellet con la SVF. 2. Los eritrocitos que contaminan esta fracción se lisan con un buffer de NH4Cl 160 mM, 10 mM de KHCO3 y 1 mM de EDTA y, posteriormente la solución se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Dicho buffer se inhibe con PBS 5:1. 3. El SVF, yá libre de eritrocitos contaminantes, se aísla por centrifugación en las mismas condiciones anteriores, se resuspende en medio de cultivo y se siembra a una densidad aproximada de 30.000 células por cm2. Por último, se cultiva toda la noche a 37º C y 5% de CO2 en medio de cultivo (DMEM con 10% FBS). 4. Posteriormente, la fracción SVF se lava con PBS con el fin de eliminar las células no adheridas y la población celular adherida, denominada lipoaspirado procesado (LPA), se cultiva en las mismas condiciones hasta su confluencia, cambiando el medio tres veces por semana. 5. Para su almacenamiento hasta su uso, se eliminan del LPA las células no adheridas mediante lavado con PBS, quedando únicamente la población celular adherida, o LPA. Estas células se cultivan y crecen hasta su confluencia, lo que significa que están suficientemente maduras para ser MATERIAL Y MÉTODOS 82 utilizadas. Para extraerlas de los medios de cultivo se utiliza tripsina-EDTA al 0,05% en HBSS (Sigma) y se procede a su congelación en rampa (0,5ºC/min) en un medio de criopreservación (medio de cultivo con 10% DMSO, Sigma, San Louis, MS, USA) hasta los -80ºC, para luego sumergirlas en N2 líquido. 2.G. CARACTERIZACIÓN CELULAR FUNCIONAL MEDIANTE DIFERENCIACIÓN La caracterización funcional de las células madre mesenquimales se realiza mediante inducción de su diferenciación osteogénica, condrogénica y adipogénica:  Inducción osteogénica: (Guilak et al., 2006): El medio de inducción osteogénica contiene DMEM (alta concentración de glucosa), con 10% de suero bovino fetal (FBS), 10 mM de glicerofosfato, 0.15 mM de ácido ascórbico -2-fosfato, 10 nM de 1,25- (OH) vitamina D3, y 10 nM de dexametasona, además de solución antibiótica estándar (P/S). Las células se mantienen en cultivo 28 días, refrescando el medio tres veces por semana, y el último día se mide la actividad fosfatasa alcalina en células control y en las células inducidas para comprobar si se ha producido la diferenciación dirigida hacia osteocitos in vitro.  Inducción condrogénica: (Barry et al., 2001): El medio de inducción condrogénica contiene DMEM-LG (baja concentración de glucosa), con 110 mg/L de piruvato sódico, 0.15 mM de ácido ascórbico-2-fosfato, 100 nM de dexametasona, 1% ITS y 10 ng/ml de TGF-1 y 1% de solución antibiótica. Las células se mantienen en cultivo durante 4 semanas para después comprobar la presencia de proteoglicanos sulfatados mediante tinción con azul Alcián.  Inducción adipogénica (Lin et al, 2006): El medio de diferenciación adipogénica está constituído por: DMEM (Gibco) suplementado con 10% FBS (Gibco), 500μM IBMX (Sigma), 1μM dexametasona (Sigma), 1μM Indometacina (Sigma). A las 72 horas se refresca el medio añadiendo 10μM insulina (Actrapid, Novonordisk) y 24 horas después se retira éste medio y se cambia por un medio de diferenciación adipogénica sin insulina. El medio con insulina se añade, de esta manera, cada 72 horas MATERIAL Y MÉTODOS 83 lavándolo las 24 horas posteriores con medio sin insulina y se mantiene este protocolo durante 2 semanas, tras las cuales se revela la presencia de vacuolas lipídicas intracelulares mediante una tinción liposoluble de aceite rojo-O (Red Oil-O; ORO) 2.H. DIFERENCIACIÓN IN VITRO DE LAS CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES DERIVADAS DE ADIPOCITOS EN CELULAS PROGENITORAS HEPATOCITARIAS Las células aisladas del tejido adiposo humano se someten a condiciones de inducción hepatogénica, siguiendo el protocolo ya establecido por Seo y cols. en 2005, con pequeñas modificaciones: Las células se cultivan durante 7 días sobre un delgado substrato de colágeno (0,1% en PBS; Sigma) en medio de inducción hepatogénica (60% DMEM-LG; 40% MCDB-201 (Sigma); 1% ITS (Gibco); 10-9 M dexametasona (Sigma); 10-4 M ácido ascórbico 2 fosfato (Sigma); 10 ng/ml rhEGF ; 10 ng/ml rh OSM, 10ng/ml rhHGF (todos de R&D Systems); 1% P/S (Gibco); 0.6% Glutamax (Gibco), que se referescará cada 2 días. Después del tiempo aceptado como necesario (entre 2 y 4 semanas), se confirma la pre-diferenciación dirigida hacia hepatocitos, verificándose la expresión por éstas células madre de albúmina mediante inmunocitoquímica frente a albúmina (anticuerpo de Dako). Para la inducción hepatogénica de las células mesenquimales estromales de rata, dichas células se mantuvieron en cultivo de inducción en medio de diferenciación durante 10 días (refrescando cada 2 días), que consistió en : DMEM-LG; 1% FBS; 10-9 M Dexametasona; 20 ng/ml HGF; 10ng/ml FGF-4; 1%ITS; 1% Glutamax; 1% P/S. Previamente a su trasplante, las células mesenquimales prediferenciadas hacia el linaje hepatocitario, tanto del ser humano como de rata, se marcan con Bromodeoxi-Uridina (1:1000) y fluorocromo CMDiI (Molecular Probes 1: 200) con el objeto de identificarlas una vez trasplantadas en el parénquima hepático de la rata. 3. I. ADMINISTRACIÓN INTRAHEPÁTICA DE CÉLULAS MADRE DE ORIGEN ADIPOCÍTICO Una vez desarrollada la ictericia obstructiva, a las dos semanas de realizar la resección microquirúrgica de la vía biliar extrahepática, la MATERIAL Y MÉTODOS 84 administración de células madre se ha realizado mediante inyección directa en el parénquima hepático. Para ello se realiza una re-laparotomia media con la rata en decúbito supino, tras colocar un bloque de plastilina en la zona dorso lumbar lo que permite una exposición adecuada de la superficie hepática (Figura 25). La técnica consiste en la obtención de una suspensión de células madre (número de células madre: 2,5 x 10E6 células/rata en 1 cc de solución salina, Hanks balanced SALT solution, HBSS, Invitrogen) que se inyectó mediante una aguja de calibre 18G. El método de la inyección intrahepática fue diferente en función del Grupo de animales: 1. En el caso de las células mesenquimales de origen adipocítico humanas prediferenciadas a hepatocitos, en los lóbulos hepáticos medio, lateral izquierdo y lateral derecho (0.33 ml/lóbulo). 2. En el caso de las células mesenquimales de origen adipocítico de rata, tanto las no diferenciadas, como las prediferenciadas a hepatocito, sólo en el lóbulo hepático medio (1 ml/lóbulo). Figura 25. A la izquierda: Fotografía en la que se observa la rata anestesiada en decúbito supino con una re-laparotomia media y, el material quirúrgico, las jeringuillas con analgesia, vitamina K y antibiótico (lado derecho del animal) y las jeringuillas con las células madre y el Tachosyl (lado izquierdo). A la derecha: Imagen ampliada de la re- laparotomia media. Una vez inoculadas las células madre de origen adipocítico o bien, la solución salina isotónica en los animales con colestasis microquirúrgica que sirvieron como Grupos Control, se aplica un material hemostático (Tachosyl) sobre el sitio de punción hepática (Figura 26) y se cierra la pared abdominal en 2 planos: peritoneo, músculo y aponeurosis mediante sutura continúa reabsorbible MATERIAL Y MÉTODOS 85 Vycril ® (polyglactin 910) de 3/0, y piel con sutura continua de seda de 3/0. (Lorente y cols., 2000). Figura 26. Inoculación de las células madre de origen adipocítico o de la solución salina isotónica en el parénquima hepático. Inmediatamente después, se aplica un material hemostático (Tachosil) sobre el sitio de punción hepática Los animales que recibieron un xenotrasplante de células madre de origen adipocítico humano prediferenciadas a hepatocito, fueron inmunosuprimidos desde las 24 horas previas y tras la infiltración hepática con Tacrolimus (0.05 mg/Kg), como profilaxis de rechazo. En el caso de los animales a los que se administraron células madre de origen adipocítico de rata, tanto indiferenciadas, como prediferenciadas a hepatocito, al tratarse de células de procedencia de ratas genéticamente idénticas, se considera como un isotrasplante y, por tanto no fue necesaria la inmunosupresión. 2. J. SACRIFICIO DE LOS ANIMALES Los animales supervivientes en cada serie fueron sacrificados por exanguinación a las 8 semanas del post-operatorio. Antes de proceder a la anestesia y sacrificio de los animales se determinó su peso corporal (PC). La anestesia de realizó de nuevo por vía inhalatoria, a las concentraciones descritas con anterioridad. Tras colocar a la rata en decúbito supino se realizó una laparotomía xifopubiana y se realizó un estudio macroscópico de la cavidad abdominal, en el que se valoraba la presencia de líquido ascítico, el aspecto macroscópico de hígado y bazo, así como la presencia de circulación colateral portosistémica y de vasculopatía venosa mesentérica. De esta manera, durante el sacrifico, y de forma seriada, se valoraban los siguientes aspectos: MATERIAL Y MÉTODOS 86 2. J.1 CUANTIFICACIÓN DEL LÍQUIDO ASCÍTICO Tras realizar la laparotomía, se valoraba si había líquido ascítico, y en el caso en el que éste estuviera presente, se procedía a su cuantificación mediante aspiración con jeringa estéril y graduada en cm. 2. J.2. CIRCULACIÓN COLATERAL PORTOSISTÉMICA A continuación, se valoró la presencia de venas colaterales en aquellas áreas donde se desarrolla habitualmente circulación colateral venosa porto- sistémica en la rata, es decir, en las áreas esplenorrenal (ER), gastroesofágica (colaterales paraesofágicas) (PE), y pararrectal(PR). 2. J.3. VASCULOPATÍA VENOSA MESENTÉRICA Se denomina vasculopatía venosa mesentérica a la dilatación y tortuosidad de las ramas de la vena mesentérica superior. Se consideran tres grados de vasculopatía venosa mesentérica (Aller y cols., 2001): • Grado 0: aspecto macroscópico normal de las ramas de la vena mesentérica superior. • Grado I: dilatación y tortuosidad de las ramas mesentéricas, secundarias al clampaje transitorio (1 minuto) de la vena mesentérica superior. • Grado II: dilatación y tortuosidad espontáneas de las ramas de la vena mesentérica superior. Para su estudio, se extrajeron parcialmente las asas intestinales, situando el árbol mesentérico por su región ileocecal, donde se visualizaron con facilidad las ramas de la vena mesentérica superior (Figura 27). Esto es, las ramas de primer y segundo orden o proximales, por su vecindad con la vena mesentérica superior, y las de tercer y cuarto orden o distales, por su vecindad con el intestino (íleon y ciego) (Castañeda y cols., 2000). MATERIAL Y MÉTODOS 87 Figura 27. Vascularización venosa mesentérica en la que se observa la vena mesentérica superior (flecha) y sus ramas venosas de primer (1), segundo (2), tercer (3) y cuarto (4) orden. 3. J.4. EXTRACCIÓN SANGUÍNEA, PERFUSIÓN INTRACARDÍACA Y NECROPSIA Tras realizar un estudio macroscópico de la cavidad abdominal y valorar los signos macroscópicos sugerentes de hipertensión portal, como son el desarrollo de vasculopatía venosa mesentérica y de circulación venosa colateral, se procedió a la extracción de sangre de la vena cava inferior infrahepática, obteniéndose entre 5 y 8 ml de sangre en cada animal (Figura 28). Esta maniobra deja al animal exangüe, falleciendo por shock hipovolémico. Para la extracción de sangre se utilizaron jeringuillas heparinizadas con heparina al 1% (Rovi®). Posteriormente, la sangre se conservó refrigerada en hielo (4ºC), y se centrifugó a 3500 rpm durante 15 minutos para obtener el plasma sanguíneo. Tras separar el plasma, este se dividió en alícuotas, que se congelaron a -80 ºC hasta su utilización para determinar diferentes marcadores bioquímicos. Figura 28. Extracción sanguínea de la vena cava inferior infrahepática Antes de finalizar la extracción sanguínea y en tanto se mantiene el latido cardíaco, se procede a la realización de una toracotomía bilateral a nivel de la línea media clavicular, lo que permite la apertura de la cavidad torácica y el acceso al mediastino. Posteriormente se inserta un catéter en el ventrículo izquierdo y se inicia la perfusión con una máquina de perfusión de solución salina isotonica (0.9%) a través de este catéter. Inmediatamente después del MATERIAL Y MÉTODOS 88 comienzo de la perfusión, se realiza la sección de la aurícula derecha del corazón de la rata lo cual permite la salida del efluente del animal y evita la congestión (Figura 29). Este proceso de “perfusión-lavado” de los tejidos con suero fisiológico dura unos 15 minutos, tras los cuáles se continua la perfusión con formaldehido al 2%, durante unos 30 minutos aproximadamente. Figura 29. Se puede apreciar el catéter de perfusión de formaldehído (CPF) insertado en el ventrículo izquierdo (VI) y con el extremo distal en la luz del cayado aórtico (CA), fijado con una pinza de Kocher (PK) 2. J.5. Recogida de muestras histológicas Tras la perfusión y una vez fijados los tejidos con formol, se procede a la extracción del bazo, del hígado (figura 30) y de los testículos, registrándose su peso. Los lóbulos hepáticos se pesaron por separado (figura 31), y posteriormente se transfirieron a un tubo que contenía Formol al 10% para su posterior estudio histopatológico. Figura 30. Aspecto del hígado colestásico una vez completada la exéresis de los órganos tras el sacrificio de los animales a las 8 semanas de evolución CPF VI CA PK MATERIAL Y MÉTODOS 89 Figura 31. Fotografía de las piezas quirúrgicas extraídas durante el sacrificio de los animales, después de ser pesadas. Cada columna corresponde a una rata, en la cual se puede apreciar desde la parte superior a la inferior, los testículos, el bazo, y los lóbulos hepáticos medio, izquierdo, derecho y caudado. 2. J.6. Eliminación de los restos biológicos Una vez tomadas las muestras los restos de los animales y los tejidos desechados de las vísceras fueron depositados en bolsas plásticas e introducidas en contenedores especiales. La gestión de los restos biológicos (recogida, transporte y tratamiento de los mismos) se realizó a través de la empresa CONSENUR, S. A. C/Rio Ebro, s/n. Polígono Industrial Finanzauto. Arganda del Rey (Madrid) que cumple con la normativa vigente: Decreto 83/1999, de 3 junio, por el que se regulan las actividades de producción y gestión de los residuos biosanitarios y citotóxicos en la Comunidad de Madrid. 2. K. DETERMINACIONES SÉRICAS DE FUNCIÓN HEPÁTO-BILIAR Para la valoración de la reversibilidad de las alteraciones producidas por la colestasis con células madre de rata indiferenciadas y de células madre, tanto de rata como humanas, prediferenciadas a hepatocitos, se han estudiado parámetros bioquímicos séricos de insuficiencia hepática y de colestasis (Aspartato-aminotransferasa (AST), Alanin-aminotransferasa (ALT), Lactacto- dehidrogenasa (LDH), Gamma-Glutamiltransferasa (GGT), Bilirrubina total y directa, Fosfatasa Alcalina (FA), proteínas totales, albúmina, creatinina y urea). MATERIAL Y MÉTODOS 90 2. K.1 Bilirrubina total y directa La bilirrubina total se determina mediante el uso de un reactivo compuesto por ácido Sulfanílico, ácido Clorhídrico y Dimetil sulfóxido (DMSO), que hace que se forme en determinadas condiciones azobilirrubina por una reacción de diazotación, obteniéndose una coloración rojo cereza. La absorbancia de la muestra se valora por espectrofotometría a una longitud de onda de 555 nm (530-580) y a 20-25ºC (Martinek, 1966; Royer y cols., 1973). 2. K.2. Alanin-Aminotransferasa (ALT) Y Aspartato- Aminotransferasa (AST) La valoración de AST se fundamenta en que el α-cetoglutarato y el aspartato sufren una reacción catalizada por la AST, transformándose en L- Glutamato y oxalacetato que, a su vez, reaccionan con NADH e Hidrogeniones, para obtener malato y a NAD+, por acción de la enzima Malato-deshidrogenasa. El método de valoración se basa en la oxidación del NADH a NAD+, y se mide el valor medio de los incrementos de extinción por minuto mediante un test U.V. cinético (normativa IFCC) a una longitud de onda de 334 nm, 340 nm y 365 nm. La técnica de determinación de la ALT sigue estos mismos principios, si bien en este caso los sustratos de la reacción catalizada por la ALT son el α- cetoglutarato y la L-Alanina, que se convierten en L-glutamato y piruvato. Aquí, es el piruvato el que se combina con NADH e hidrogeniones para dar -por una reacción catalizada por la enzima Lactato Deshidrogenasa- Lactato y NAD+ (Bergmeyer y cols., 1976; Bergmeyer y cols., 1978; Bergmeyer y cols., 1980). 2. K.3. Lactato-deshidrogenasa (LDH) Para la cuantificación de los niveles séricos de LDH se utilizó un método cinético espectrofotométrico ultravioleta recomendado por el Comité Escandinavo de Enzimas (SCE). LDH es una enzima que cataliza la reacción de reducción del piruvato a lactato en un medio con pH neutro produciéndose en la misma una oxidación de NADH. La concentración de NADH se monitoriza mediante la absorbancia a una longitud de onda de 340nm. La disminución en la absorbancia por minuto (Ä A /min) es proporcional a los micromoles de substrato transformado en ese periodo de tiempo y por lo tanto proporcional a la actividad de la LDH. (Scandinavian Committee on Enzymes, 1974) MATERIAL Y MÉTODOS 91 2. K.4. Fosfatasa Alcalina (FA) La fosfatasa alcalina se determina basándose en que hidroliza los ésteres del ácido fosfórico en medio alcalino, produciendo fosfato inorgánico y el correspondiente resto orgánico con el que se había esterificado. Para su valoración, se utiliza un test cinético optimizado con el que se mide el valor medio de los incrementos de extinción por minuto a una longitud de onda de 405 nm y a 25 ºC, 30ºC y 37ºC, siguiendo la metódica DGKC (Izquierdo y cols., 1982; Tietz y cols., 1983; Tietz, 1987). 2. L.5. γ - glutamiltransferasa (GGT) Para la valoración sérica de las concentraciones del enzima GGT se utilizó un método cuantitativo fotocolorimétrico. GGT cataliza la transferencia de un grupo γ-glutamil de un substracto donante (γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida) a un receptor (glicilglicina), dando lugar γ-glutamilglicilglicina y 5-amino-2- nitrobenzoato. El aumento de la concentración de éste último produce cambios en la absorbancia a una longitud de onda de 410 nm., siendo por tanto la misma directamente proporcional a la actividad enzimática de GGT. (Schuman y cols., 2002) 2. K.6. Proteínas Totales Las proteínas totales se determinaron mediante el test colorimétrico de “Biuret”, basado en que los grupos -CO-NH- unidos entre sí reaccionan con con las sales cúpricas en medio alcalino, adquiriendo la solución un color violeta, siendo la más representativa y simple la que produce con el reactivo de Biuret. Se valora la absorbancia de la muestra por espectrofotometría a una longitud de onda de 540 nm. En la actualidad, éste constituye el método más exacto y simple para la determinación de las proteínas totales (Henry y cols.1957; Peters 1968). 2. K.7. Albúmina La albúmina se cuantificó mediante el test colorimétrico denominado “verde de bromocresol”, en el que se combina la muestra con esta tinción a determinado pH, produciéndose un cambio de color del indicador, que pasa de ser amarillo verdoso a verde azulado. La absorbancia de la muestra se valora MATERIAL Y MÉTODOS 92 por espectrofotometría a una longitud de onda de 630 nm y a temperatura ambiente (Doumas y cols., 1971; Webster y cols., 1974). 2. K.8. Creatinina Los niveles séricos de Creatinina se cuantificaron utilizando un test químico cinético fotocolorimétrico. Por la reacción de Jaffé, la creatinina en un medio alcalino reacciona con el ácido pícrico formando un producto de color amarillo-naranja que es visible en el espectro de longitud de onda de 520/800 nm. La velocidad de cambio en la absorbancia es proporcional a la concentración de creatinina en la muestra. (Cook, 1971; Lamb y cols., 2006). 2. K.9. Urea Los niveles séricos de Urea se cuantificaron utilizando un test enzimático por espectrofotometría ultravioleta en suero proporcional a la concentración de urea (Sampson y cols 1980; Lamb y cols 2006). El descenso en la concentración de NADH produce una disminución en la absorbancia por unidad de tiempo en la longitud de onda de 340 nm, que es proporcional a la concentración de urea. (Sampson y cols 1980; Lamb y cols 2006) 2. L. ESTUDIO MICROSCÓPICO E HISTOPATOLÓGICO Para su estudio histopatológico, se procesaron las muestras mediante técnicas de rutina para microscopía óptica: 2. L.1. Fijación La fijación de los tejidos es imprescindible para que las estructuras tisulares y celulares se preserven intactas, evitando así que los procesos autolíticos postmortem las modifiquen. Para ello, además de su perfusión i.v. realizada “in vivo” con formol tamponado, los tejidos se introdujeron inmediatamente después de su extracción en formol tamponado al 10%, que tiene una penetración relativamente rápida en los mismos. El tiempo de fijación para este reactivo es de unas 24 horas. 2. L.2. Inclusión Tras el tallado macroscópico de los órganos, las piezas seleccionadas se incluyeron en parafina mediante un sistema automático, con temperatura y vacío controlado por ordenador (Histomatic 166 MP, Fisher). Para ello, las muestras MATERIAL Y MÉTODOS 93 formolizadas se pasan por 3 cubetas que contienen concentraciones crecientes de alcohol etílico: primero al 70%, después al 96% y por último alcohol absoluto (100%). A continuación, se realiza el aclarado, que es un paso necesario para que se pueda incluir el tejido en parafina. El agente utilizado fue el Xilol, debido a su rápida acción. De esta forma, se sustituye el alcohol etílico por Xileno (sustancia miscible con la parafina), para que la parafina se pueda disolver y penetrar en el tejido, formándose así los bloques. Después, se procedió a la elaboración de los bloques de parafina sólidos con la pieza de tejido en su interior. Para ello, se impregna el material en parafina blanda a 46ºC durante 1 hora, tiempo tras el cual se realiza un segundo baño en parafina dura a 58ºC durante 1 hora. Por último, ya en la estación de inclusión, se coloca la muestra en un paramol, se vierte la parafina dura fundida en su interior, y se enfría en hielo. 2. L.3. Procesado de los cortes Tras la inclusión, se procedió a realizar el corte de las piezas con un microtomo de parafina tipo Minot (Microm), obteniéndose secciones de 4 μm de grosor. A continuación, las secciones colocadas en un portaobjetos e identificadas se sometieron a un proceso de desparafinado. Para esto, las preparaciones se dejan a 60ºC durante 20 minutos, y después se someten a tres baños de 3 a 5 minutos en Xilol. Tras esto, las muestras histológicas se han de hidratar para lo cual se incluyen nuevamente en soluciones decrecientes de alcohol de 96º, 80º y 70º y por último en agua como paso previo a realizar las tinciones. 2. L.4 Estudio con microscopía de fluorescencia El microscopio de fluorescencia es un microscopio en el que los objetos son excitados por rayos de una determinada longitud de onda cuyo resultado es la emisión de rayos de otra longitud de onda. Se observan las preparaciones hepáticas al microscopio de fluorescencia para comprobar la persistencia de células fluorescentes (previamente marcadas con CmDiI) que identificamos como células madre de origen adipocítico, Estas células, de procedencia humana, fueron las únicas marcadas con el agente fluorescente antes de su inoculación en el hígado colestásico de la rata, con lo cual se identifican por diferenciarse claramente de los hepatocitos de la rata no fluorescentes. http://es.wikipedia.org/wiki/Longitud_de_onda MATERIAL Y MÉTODOS 94 2. L.5. Tinciones histológicas 2. L.5. a. Hematoxilina & Eosina: Las secciones hepáticas realizadas se han de hidratar para que la hematoxilina-eosina pueda actuar, utilizando alcohol en concentraciones decrecientes (de la forma expuesta anteriormente) y finalmente, agua destilada. Las muestras han de estar sumergidas en cada baño entre 3 y 5 minutos. Finalmente, se llevó a cabo la tinción con Hematoxilina-Eosina para la posterior observación al microscopio óptico de las secciones hepáticas. Hematoxilina- Eosina es una tinción general que proporciona una visión global de las estructuras tisulares. Los portaobjetos con las secciones desparafinadas se sumergieron en hematoxilina de Harris durante 10 minutos, y después se lavaron en agua destilada durante otros 10 minutos. A continuación se sumergieron en Eosina unos segundos y se procedió a su deshidratación en alcoholes de gradación creciente. A continuación, se realiza su aclarado con Xilol y, para finalizar, se procede a su montaje, colocando una gota del medio de montaje (DPX: bálsamo de Canadá, o un medio sintético) sobre el corte, apoyando y presionando sobre éste el cubreobjetos para eliminar las burbujas. Por último, se limpia el medio de montaje excedente y se deja secar. A continuación, se toman fotos de las muestras hepáticas teñidas con Hematoxilina&Eosina para estudiar las áreas ocupadas por hepatocitos y por proliferación epitelial biliar. 2. L.5. b. Tricrómico de Masson: En primer término, se tiñen las secciones con un tinte ácido, como escarlata de Biebrich. Todos los elementos acidófilos del tejido, como el citoplasma celular, el músculo y el colágeno se unirán a los tintes ácidos, por ello ésta tinción permite visualizar my bien las áreas de fibrosis. A continuación, las secciones se tratan con ácido fosfotúngstico y/o fosfomolíbdico. Ya que el citoplasma es mucho menos permeable que el colágeno, los ácidos fosfotúngsticos y fosfomolíbdicos permiten que la escarlata de Biebrich difunda del colágeno pero no del citoplasma. http://es.wikipedia.org/wiki/Tinte http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Escarlata_de_Biebrich&action=edit&redlink=1 http://es.wikipedia.org/wiki/Tejido_(biolog%C3%ADa) http://es.wikipedia.org/wiki/Citoplasma http://es.wikipedia.org/wiki/M%C3%BAsculo http://es.wikipedia.org/wiki/Col%C3%A1geno http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_fosfot%C3%BAngstico http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=%C3%81cido_fosfomol%C3%ADbdico&action=edit&redlink=1 MATERIAL Y MÉTODOS 95 Procedimiento: Se realizan los siguientes pasos sobre la preparación histológica: • Desparafinar e hidratar • Hematoxilina de Weigert, 12 minutos • Agua corriente: 10 -15 minutos (lavar bien hasta eliminar el color del agua) • Tinción con Ponceau - fucsina ácida – arfloxina, 20 minutos: Solución de Masson: 10 ml + 2 ml de solución de arfloxina + 88 ml de ácido acético al 0.2%.  1 parte de solución A: 1 g de fucsina ácida en 100 ml de agua: hervir, añadir 1 ml de ácido acético puro y filtrar.  2 partes de solución B: 1 g de Ponceau de xilidina en 100 ml de agua, hervir, añadir 1 ml de ácido acético puro y filtrar. Solución de azofloxina: 0.5 g de arfloxina + 100 ml de agua + 0.2 ml de ácido acético puro • Agua acidulada (ácido acético 1%): Tirar y seguir lavando con agua del grifo • Ácido fosfomolíbdico – naranja G hasta decoloración del tejido: 4 minutos: 3 g de ácido fosfomolíbdico + 2 g de naranja G en 100 ml de agua • Agua acidulada • Verde luz 45 minutos (tapado): 0.1 g de verde luz SF + 0.2 ml de ácido acético puro + 100 ml de agua • Agua acidulada, muy rápido, para que no se vaya el verde luz • Deshidratar con rapidez hasta alcohol 100º (dejar 2 minutos) 2. L.5 c. Rojo Picrosirio: La tinción con Rojo Sirio se caracteriza por su alta afinidad a las proteínas del colágeno, tiñe el colágeno en rojo y contratiñe en verde el resto de las proteínas. Procedimiento: • Desparafinar e hidratar • Picrosirio: 1 hora a temperatura ambiente • Lavar en agua acidulada 10 minutos • Contrastar con Hematoxilina de Harris (opcional) http://es.wikipedia.org/wiki/Parafina http://es.wikipedia.org/wiki/Hidrataci%C3%B3n MATERIAL Y MÉTODOS 96 • Deshidratar en alcoholes crecientes • Montar con D.P.X. (bálsamo de Canadá) • Soluciones  Picrosirio: - Rojo sirio, 0.2 gramos (sirian red) - Ácido Pícrico a saturación: 100 ml  Agua acidulada: Con ClH 0.1 N A continuación, se realizan fotos de campo claro del Rojo Picrosirio para cuantificar el área de fibrosis, así como fotos con luz polarizada para ver qué tipo de colágeno (maduro o no maduro) hay en los cortes del parénquima hepático. Las fotos se convierten a sistema binario (blanco y negro) y se analizan mediante un programa de análisis de imagen ◊ IMAGEJ. Así, mediante el programa computacional analizador de imágenes IMAGEJ, se llevó a cabo la cuantificación del tejido fibroso y del depósito de fibras colágenas en las tinciones con Rojo Picrosirio. En las fotografías digitales realizadas, se midió el área total en pixeles, de la cual se restaba el área de luz ocupada por vasos, y se cuantificaron las áreas de fibrosis, hepatocitos y proliferación biliar. Una vez medidas las áreas, se calculó el porcentaje de los distintos aspectos histológicos objeto de estudio. El cálculo se realizó en fotos con 400x de magnificación. 2. L.6 Evaluación histopatológica por microscopia óptica Los cortes hepáticos realizados fueron sometidos a las tres tinciones diferentes indicadas anteriormente y observados a doble ciego por microscopía óptica, con el fin de evaluar distintos aspectos histológicos. Para intentar determinar de una manera objetiva si existen diferencias histopatológicas entre los diferentes grupos de estudio, se estableció un baremo por el cual se asignaba una puntuación a distintas variables de cada muestra histológica en función de la magnitud de los cambios observados. Las variables estudiadas son:  Colestasis  Nódulos de regeneración  Proliferación ductular  Binucleación  Infiltrado inflamatorio  Necrosis MATERIAL Y MÉTODOS 97  Trombosis  Fibrosis  Peliosis  Dilatación venular centrolobulillar  Estructura  Función  Congestión Así, se puntuaba cada uno de los aspectos histológicos enumerados anteriormente con 0, 1, 2, o 3 puntos. Finalmente se sumaban todos los puntos y se clasificaba a cada preparación histológica correspondiente a cada individuo en unos de los siguientes grupos en función de la puntuación final obtenida: • Diagnóstico histopatológico bueno: ≤ 5 puntos • Diagnóstico histopatológico intermedio-bueno: 6-12 puntos • Diagnóstico histopatológico intermedio-malo: 13-20 puntos • Diagnóstico histopatológico malo: ≥ 20 puntos Para realizar las tinciones con Rojo Sirio y Tricrómico de Masson se eligieron al azar 9 casos de cada grupo (ratas con inyección de suero salino, con células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos, con celulas madre indiferenciadas de rata y con células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos). Se realizó tinción Tricrómico de Mason y Rojo Picrosirio en los lóbulos LM y LC de cada caso, de tal forma que realizaríamos una comparación histológica entre el lóbulo medio, que es uno en los que se había inyectado células madre, con el lóbulo caudado, en el cuál no se habían inyectado células madre. 2. M. CALCULO DEL “Model for end-stage Liver Disease” (MELD) La escala MELD (del acrónimo inglés MELD, Model for end-stage Liver Disease) es un modelo matemático de predicción de la sobrevida y de medición de la gravedad de la enfermedad hepática muy utilizado en la clínica humana que se basa en simples valores rutinarios de laboratorio (bilirrubina, INR y creatinina). Fue inicialmente desarrollado para predecir la muerte dentro de los tres meses post-cirugía en pacientes a los que se les había colocado un TIPS (transjugular intrahepatic portosystemic shunt) y fue subsecuentemente MATERIAL Y MÉTODOS 98 demostrada su utilidad para determinar el pronóstico y para priorizar los pacientes en lista de espera para trasplante hepático. La puntuación MELD es calculada en el ser humano con la siguiente fórmula: MELD Score = 9, 57 Ln (Creat) + 3, 78 Ln (Bili) + 11, 2 Ln (INR) + 6, 43 Consideraciones: -El rango de valores va de 6 a 40. -El valor mínimo es 1 para cada una de las variables. -El valor se redondea al entero más cercano. -Si el paciente ha sido sometido a diálisis (al menos 2 veces durante la semana anterior), el valor de creatinina a considerar es 4 mg/dL. “A diferencia de la escala de Child Pugh, la escala MELD sí cumple las características de un buen score, como son el incluir variables objetivas, aplicables a un heterogéneo grupo de pacientes con enfermedad hepática crónica, distinguiendo la gravedad de la enfermedad. Además, ésta escala se ha constatado y validado en múltiples estudios que incluyeron múltiples subgrupos de pacientes con hepatopatía crónica”. La interpretación de la escala MELD en pacientes hospitalizados indica: 40 o más — 71.3% mortalidad a los 3 meses 30–39 — 52.6% 20–29 — 19.6% 10–19 — 6.0% <9 — 1.9% En nuestro trabajo hemos adaptado el cálculo del MELD al estudio de las ratas, ya que el peso y la edad de estas, difiere de la especie humana. Para ello hemos mantenido los valores séricos de bilirrubina, creatinina y el INR, con la salvedad de conservar los valores decimales de dichos valores y no redondear al entero más próximo. Con el resultado de los valores de MELD que hemos obtenido se ha aplicado el análisis estadístico antes descrito. MATERIAL Y MÉTODOS 99 3. N. ANÁLISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó la aplicación informática SPSS versión: 19.0 para Windows® (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). En primer lugar, se realizó un estudio descriptivo de los resultados obtenidos. Los métodos estadísticos utilizados fueron los siguientes (SPSS, 2010): -Estadística descriptiva de las variables cuantitativas (procedimiento DESCRIPTIVE) expresándolas mediante una medida de centralización (media aritmética) y una medida de dispersión (desviación estándar) (x ± DE) (Ferrán, 1996). -Estadística descriptiva de las variables cualitativas (procedimiento FREQUENCIES), con la obtención de frecuencias y porcentajes de las categorías. (Ferrán, 1996) -Tablas de contingencia para la relación entre variables cualitativas (procedimiento CROSSTABS). A estas tablas se les aplica una distribución estadística: Prueba de Chi-cuadrado para contrastar la independencia o influencia entre dos variables cualitativas, con información en cada casilla de la tabla de contingencia del porcentaje en fila y los residuos corregidos no tipificados para ayudar a descubrir las tramas en los datos que contribuyen a una influencia significativa. (Everitt, 1992 y Ferrán, 1996), considerándose un resultado significativo cuando dicho residuo no está incluido en el intervalo (- 2,+2). -Test de Kolmogorov-Smirnov para una muestra (procedimiento NPAR TESTS) para determinar si las variables cuantitativas del estudio se ajustan a una distribución Normal (Ferrán, 1996) y así cumplir los requisitos para utilizar pruebas estadísticas paramétricas (ANOVA en este estudio). Si las variables no siguen una distribución Normal se deben utilizar pruebas no paramétricas (por ejemplo, en nuestro caso, el test de Kruskal-Wallis). -ANOVA para variables cuantitativas (procedimiento ONEWAY), para la comparación de múltiples medias. A la ANOVA se le aplica una distribución estadística F de Snedecor Cuando el valor global de la F de Snedecor es significativo nos indica que las medias en los grupos no son iguales. El p-valor o significación obtenida, que es lo que valora si hay diferencias significativas entre los grupos, si las hay con unos niveles de significación fijados anteriormente, (en nuestro caso 95%, p<0.05, 99%, p<0.01 y 99.9%, p<0.001), como prueba de contrastes “a posteriori” usamos el test de Duncan, que realiza comparaciones múltiples de medias, ordenando las medias de menor a mayor y compara las MATERIAL Y MÉTODOS 100 diferencias entre pares (menor-mayor), conectando los grupos que no difieren significativamente. De esta manera se identifican subconjuntos de medias no significativamente diferentes. Si dos medias se agrupan en un mismo subconjunto no son diferentes significativamente, en otro caso serán diferentes significativamente. (Ferrán, 1996) (Sánchez, 1996). -Para realizar el análisis de supervivencia, las diferencias entre grupos se expresan en función del riesgo relativo de supervivencia (RR), empleando un intervalo de confianza del 95%. El RR se considera significativo cuando el intervalo de confianza no incluye el valor 1. Los resultados de supervivencia se expresan gráficamente mediante curvas de Kaplan Meier. Respecto de los estudios histopatológicos (porcentaje del área de fibrosis), para comparar el efecto del lóbulo en el que se inyectan células y el efecto propio del tratamiento con células madre en los grupos con distinta evolución p.o. se utilizó ANOVA y posteriormente el test de Duncan de contrastes post-hoc o a posteriori. Los valores se consideran estadísticamente significativos si p<0.05. 101 VI. RESULTADOS RESULTADOS 102 VI. RESULTADOS Habiendo demostrado previamente que las células madre humanas más adecuadas para la reversión de la patología colestásica son aquellas prediferenciadas a hepatocitos, y que el periodo evolutivo de colestasis microquirúrgica en la rata en el cual las lesiones hepáticas ya están completamente establecidas es alrededor de 14 días del p.o., se diseñó el presente estudio con la intención de analizar el posible efecto terapéutico, (reversión de la patología colestásica) de las células madre, tanto obtenidas del tejido adiposo del ser humano, como de la rata, a las 8 semanas de la realización de la colestasis extrahepatica. A continuación, se describen los resultados correspondientes a los grupos formados por ratas a las cuales se las realizo una colestasis microquirúrgica, y se les administró bien suero salino, células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos, células madre indiferenciadas de rata, o células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos, en cada grupo correspondiente. En todos los casos la inyección intraparenquimatosa hepática, de solución salina o de células madre mesenquimales de origen adipocítico, se realizó a las 2 semanas del p.o., y los animales se sacrificaron a las 8 semanas de la colestasis (Tabla 3). Tabla 3. Relación de las Series de ratas correspondientes al diseño del estudio experimental. SO: pseudo-operadas. CM-S: Colestasis microquirúrgica con administración de suero salino. CCRND: Colestasis microquirúrgica con administración de células madre de rata adipociticas no diferenciadas CCHP: Colestasis microquirúrgica con administración de células madre humanas adipociticas prediferenciadas a hepatocitos CCRP: Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipociticas de rata prediferenciadas a hepatocitos CMQ: Colestasis microquirúrgica. SS: Suero salino. SC-hp: células madre mesenquimales adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatócitos. SC-rnd: células madre mesenquimales adipocíticas de rata no diferenciadas. SC-rp: células madre mesenquimales adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatócitos. RESULTADOS 103 CIRUGÍA 2 semanas p.o. 8 semanas p.o. CONTROL SO (n=20) SO - Sacrificio (n=20) SERIE I CM-S (n=20) CMQ SS Sacrificio (n=14) SERIE II CCRND (n=47) CMQ SC-rnd Sacrificio (n=25) SERIE III CCHP (n=38) CMQ SC-hp Sacrificio (n=15) SERIE IV CCRP (n=30) CMQ SC-rp Sacrificio (n=20) 1. SUPERVIVENCIA La supervivencia global fue del 56,1 %, produciéndose el fallecimiento de 61 de los 139 animales que formaban el estudio, apreciándose en las comparaciones globales de los grupos, diferencias estadísticamente significativas (p=0,003). La supervivencia por grupos se expone en la tabla 4 y en la figura 32 mediante una curva de Kaplan Meier. Tabla 4. Supervivencia global. SO: pseudo-operadas.CM-S: Colestasis microquirúrgica con administración de suero salino CCRND: Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipociticas humanas prediferenciadas a hepatocitos CCRP: Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. GRUPO SUPERVIVENCIA C SO (n=20) n=20 (100%) I CM-S (n=20) n=14 (70%) II (CCRND) (n=47) n=25 (53,2%) III (CCHP) (n=38) n=15 (39,5%) IV (CCRP) (n=30) n=20 (66,7%) RESULTADOS 104 A las 8 semanas de evolución p.o. el grupo control (C) presenta la mayor supervivencia, con un 100%, mientras que el grupo III, de ratas con colestasis y administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos, presenta la menor supervivencia con el 39,5%. En el grupo I, de ratas con colestasis microquirúrgica y administración de suero salino, la supervivencia fue del 70%, en el grupo II, de ratas con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas, la supervivencia fue del 53,2% y, por último, en el grupo IV, de ratas con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos sobrevivieron el 66,7% de los animales En el análisis de comparaciones globales entre grupos se observa que existen diferencias estadísticamente significativas (p=0,003). En el análisis de comparación por pares se concluye que la supervivencia menor es la conseguida por las ratas del grupo III, de colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipociticas humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP), existiendo diferencias estadísticamente significativas entre éste grupo, y los grupos control, de ratas seudo-operadas (C; p=0,039), de colestasis y administración de suero salino (CMS, p=0,012) y IV, de colestasis e inyección de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP, p=0,002). Figura 32. Curva de supervivencia de Kaplan Meier correspondiente a los cinco grupos de ratas Grupo C: Seudo-operadas. Grupo I: Colestasis microquirúrgica y administración de suero salino Grupo II: Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas Grupo III: Colestasis microquirúrgica y administración de células madre adipocíticas humanas RESULTADOS 105 prediferenciadas a hepatocitos Grupo IV: Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. 1.A. RESULTADOS DE LA SERIE I, DE RATAS CON COLESTASIS Y ADMINISTRACIÓN INTRAHEPÁTICA DE SOLUCIÓN SALINA ISOTÓNICA: La Serie I está compuesta por ratas con colestasis y administración intrahepática de solución salina isotónica (CM-S) a las 2 semanas del p.o. Esta Serie estaba formada inicialmente por 20 animales, de los cuales 14 permanecían vivos en el momento del sacrificio (supervivencia del 70%). La supervivencia de esta serie en función del periodo p.o., después de dos semanas de colestasis y realizar la inyección intrahepática de suero, fue la siguiente: • Supervivencia intraoperatoria (administración de suero intrahepatico) : 95% (19/20) • Supervivencia precoz (primera semana post-administración del suero): 89,5 % (17/19) • Supervivencia intermedia (a partir de la primera semana tras la administración de suero y hasta 2 semanas antes del sacrificio): 94,1% (16/17). • Supervivencia tardía (desde la sexta a la octava semana de colestasis, en la cual se procedió a su sacrificio): 82,4% (14/17). 1. B. RESULTADOS DE LA SERIE II, DE RATAS CON COLESTASIS Y ADMINISTRACIÓN INTRAHEPÁTICA DE CÉLULAS MADRE ADIPOCÍTICAS NO DIFERENCIADAS DE RATA: La Serie II está compuesta por ratas con colestasis y administración intrahepática de células madre adipocíticas no diferenciadas de rata (CCRND) a las 2 semanas del p.o. De los 47 animales que constituían este grupo, 25 permanecían vivos en el momento del sacrificio (supervivencia global del 53,2%). La supervivencia de esta serie en función del periodo p.o., después de dos semanas de colestasis fue la siguiente: • Supervivencia intraoperatoria (administración de las células madre): 91,5% (43/47) RESULTADOS 106 • Supervivencia precoz (primera semana post-administración de las células madre): 97,7 % (42/43) • Supervivencia intermedia (a partir de la primera semana tras la administración de las células madre hasta 2 semanas antes del sacrificio): 92,9% (39/42) • Supervivencia tardía (desde la sexta a la octava semana de colestasis., en la cual se procedió a su sacrificio): 59,5% (25/42). 1. C. RESULTADOS DE LA SERIE III, DE RATAS CON COLESTASIS Y ADMINISTRACIÓN INTRAHEPÁTICA DE CÉLULAS MADRE ADIPOCITICAS HUMANAS PREDIFERENCIADAS A HEPATOCITOS: La Serie III está compuesta por ratas con colestasis y administración intrahepática de células madre adipociticas humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP) a las 2 semanas del p.o. De los 38 animales que constituían este grupo, 15 permanecían vivos en el momento del sacrificio (supervivencia de 39,4%). La supervivencia de esta serie en función del periodo p.o., después de dos semanas de colestasis fue la siguiente: • Supervivencia intraoperatoria (administración de las células madre): 89,4% (34/38) • Supervivencia precoz (primera semana post-administración de las células madre): 88,2 % (30/34) • Supervivencia intermedia (a partir de la primera semana tras la administración de las células madre hasta 2 semanas antes del sacrificio): 66,7% (20/30). • Supervivencia tardía (desde la sexta a la octava semana de colestasis, en la cual se procedió a su sacrificio): 46,7% (14/30). 1. D. RESULTADOS DE LA SERIE IV, DE RATAS CON COLESTASIS Y ADMINISTRACIÓN INTRAHEPÁTICA DE CELULAS MADRE ADIPOCÍTICAS DE RATA PREDIFERENCIADAS A HEPATOCITOS La Serie IV está compuesta por ratas con colestasis y administración intrahepática de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP) a las 2 semanas p.o. De los 30 animales que constituían RESULTADOS 107 este grupo, 20 permanecían vivos en el momento del sacrificio (supervivencia global del 66,7%). La supervivencia de esta serie en función del periodo p.o., después de dos semanas de colestasis fue la siguiente: • Supervivencia intraoperatoria: (administración de las células madre) 93,3% (28/30). • Supervivencia precoz (primera semana post-administración de células madre): 100% (28/28). • Supervivencia intermedia (a partir de la primera semana tras la inyección de células madre hasta 2 semanas antes del sacrificio): 100% (28/28). • Supervivencia tardía (desde la sexta a la octava semana de colestasis., en la cual se procedió a su sacrificio): 71,4% (20/28). Las conclusiones en relación a los resultados de supervivencia son las siguientes: - Hay un descenso no significativo de la supervivencia intraoperatoria en el grupo que recibió células madre humanas (CCHP; 89,4%), respecto a los grupos con solución salina (CMS; 95%), con células madre de rata indiferenciadas (CCRND; 91,5%) y con células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP; 93,3%). - Por el contrario en fases posteriores tras la inyección intrahepatica de suero salino o de células madre, se produce un descenso significativo (p=0,05) de la supervivencia precoz en las ratas que recibieron solución salina (CMS; 89,5%), y en las que se administraron células madre humanas (CCHP; 88,2%), respecto a los grupos, con células madre de rata indiferenciadas (CCRND; 97,7%) y con células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP; 100%). - Hay un descenso significativo (p= 0.05) de la supervivencia intermedia en el grupo que recibió células madre humanas (CCHP; 66,7%), respecto a los grupos con solución salina (CMS; 94,1%), con células madre de rata indiferenciadas (CCRND; 92,9%) y con células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP; 100%). RESULTADOS 108 - Por último, hay también un descenso significativo (p=0,01) de la supervivencia tardía en el grupo que recibió células madre humanas (CCHP; 46,7%), respecto a los grupos con solución salina (CMS; 82,4%), con células madre de rata indiferenciadas (CCRND; 59,5%) y con células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP; 71,4%). Tabla 5. Supervivencia acumulada dividida en periodos en los diferentes grupos de ratas con colestasis: CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos SUPERVIVENCIA CM-S (n=20) CCRND (n=47) CCHP (n=38) CCRP (n=30) Intraoperatoria 95% (19/20) 91,5%(43/47) 89,4% (34/38) 93,3% (28/30) Precoz (1ª semana) 89,5 %(17/19) 97,7%(42/43) 88,2 %(30/34) 100 % (28/28) Intermedia (1º-4ºsemana) 94,1% (16/17) 92,9%(39/42 66,7%(20/30)) 100% (28/28) Tardía (6ª-8ªsemana) 82,4% (14/17) 59,5% (25/42) 46,7% (14/30) 71,4% (20/28) Global 70% (14/20) 53,2% (25/47) 39,4% (15/38) 66,7%(20/30) 2. COMPLICACIONES POST-OPERATORIAS Las complicaciones más frecuentes que presentaron los animales durante el postoperatorio fueron: 1. Peritonitis biliar y fallecimiento secundario (3 casos) Los 3 casos correspondieron: 1 al grupo de ratas con colestasis y administración de solución salina (CM-S), 1 al grupo de colestasis y administración de células madre adipocíticas de rata indiferenciadas (CCRND) y, el último al grupo con colestasis y administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP). 2. Eventración en la cicatriz de laparotomía (2 casos), con formación de lesiones ulcerosas. Los 2 casos correspondieron al grupo de ratas con RESULTADOS 109 colestasis y administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP) (figura 33). 3. Formación de abscesos crónicos calcificados sobre la cicatriz de laparotomía (5 casos) Los 5 casos correspondieron, 2 al grupo de ratas colestásicas con administración de células madre de rata indiferenciadas (CCRND) y 3 casos al grupo de ratas con colestasis y administración de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP). 4. Complicaciones hemorrágicas (1 caso) Hemoperitoneo tras punción del parénquima hepático, que fue controlado en el momento del sangrado con medidas de compresión y sustancias hemostáticas. Esta complicación ocurrió en una rata con colestasis y administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP). 5. Exitus inmediatamente trás la la inyección intrahepática de células madre de rata indiferenciadas (CCRND) en tres ratas. 6. Morbilidad hepática: Se identificó la presencia de mínimos quistes biliares y abscesos hepáticos en 3 casos de ratas con colestasis y administración de células madre de rata indiferenciadas. (CCRND). 7. Síndrome adherencial intenso en una rata del grupo con colestasis y administración de células madre de rata indiferenciadas. (CCRND) (1 caso) que produjo un cuadro de obstrucción intestinal (figura 34). Figura 33. Complicaciones postoperatorias: Úlcera sobre la cicatriz de laparotomía secundaria a infección local en una rata del grupo con colestasis y administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP). RESULTADOS 110 Figura 34. Complicaciones postoperatorias: Obstrucción intestinal por adherencias peritoneales en una rata del grupo con colestasis y administración de células madre de rata indiferenciadas (CCRND). 3. ASCÍTIS La producción de líquido ascítico fue superior en las ratas con colestasis microquirúrgica y administración de suero salino respecto de los grupos a los que se administraron células madre adipocíticas, tanto humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP), como de rata, indiferenciadas (CCRND) y prediferenciadas (CCRP) (Tabla 6, ANEXO 2, y figura 35). VOLUMEN DE LIQUIDO ASCITICO m l 0 2 4 6 8 10 CM-S CCHP CCRND CCRP RESULTADOS 111 Figura 35 Volumen de líquido ascítico en ratas com colestasis. CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos Resulta llamativo que en las ratas colestásicas, el volumen de líquido ascítico acumulado en la cavidad abdominal cuando se sacrifican, es menor en aquellos animales a los que se les administraron células madre respecto de los que tan solo recibieron solución salina, si bien ésta diferencia, aunque es prácticamente del doble, no alcanza significación estadística, posiblemente por la dispersión de los datos. (Figura 35). Por el contrario, entre los grupos de animales a los que se les administraron células madre no se aprecian grandes diferencias, sin embargo, se observa que el volumen de líquido ascítico es menor en los grupos en que se administraron células de rata, en relación a aquellos que recibieron células humanas, sobre todo en el grupo que recibió células de rata prediferenciadas a hepatocitos. 4. CIRCULACION COLATERAL VENOSA PORTOSISTÉMICA Se ha estudiado aquellas áreas donde se desarrolla habitualmente circulación colateral venosa en las ratas con hipertensión portal, es decir, en las áreas esplenorrenal (CER), gastroesofágica (colaterales paraesofágicas: CPE), y pararectal (CPR). • Área Esplenorrenal: Se forman la vena esplenorrenal craneal (anterior o proximal), y la esplenorrenal caudal (posterior o distal), que drenan a distinta altura en la vena suprarrenal izquierda (figura 36). • Área Gastroesofágica: Las colaterales paraesofágicas son dos venas tortuosas y de grueso calibre que ascienden por la cara anterior y posterior del esófago: paraesofágica anterior y posterior. • Área Colorrectal: Se localiza la vena mesentérica inferior, que se continúa con las venas hemorroidales en situación pararrectal izquierda (Figura 36). RESULTADOS 112 Figura 36. Representación de circulación colateral porto-sistémica tras colestasis microquirúrgica en la rata. Ri: Riñón; A: Glándula adrenal; B: Bazo; P: Páncreas; ERs: Circulación esplenorrenal superior; ERi: Circulación esplenorrenal inferior; R: Recto; PR: Circulación pararrectal; En los grupos de ratas con colestasis no se aprecian diferencias significativas en cuanto al desarrollo de circulación colateral venosa, estando presente en todos los grupos y en todas las áreas anatómicas descritas (tabla 7, ANEXO 2, figura 37). Figura 37. Imagen fotográfica en la que se observa la existencia de circulación colateral venosa esplenorrenal (a) y paraesofágica (b), a las 8 semanas de evolución post- operatoria, en una rata con colestasis microquirúrgica a la que se le administró solución salina. 5. VASCULOPATIA VENOSA MESENTERICA En todos los animales con colestasis, es decir con colestasis y administración de suero salino (CM-S), con colestasis y administración de Ri a b RESULTADOS 113 células madre de rata no diferenciadas (CCRND), con colestasis y administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP) y las ratas con colestasis y administración de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP), se comprobó el desarrollo de vasculopatía venosa mesentérica (VVM) de grado I, no apreciándose en ninguno VVM espontánea o de tipo II (tabla 8, ANEXO 2, figura 38). Figura 38. Vasculopatía venosa mesentérica: A la izquierda, rata seudo-operada en la que se observa una vasculoracion fisiológica o normal del mesenterio de la rata. A la derecha, rata del grupo CM-S (Colestasis microquirúrgica con administración de suero salino) en la que se aprecia vasculopatía de grado I, con dilatación y tortuosidad tras el clampaje transitorio (2 minutos) de la vena mesentérica superior. 6. EVOLUCIÓN DEL PESO CORPORAL Los resultados correspondientes al peso corporal tanto al inicio (PCI) como al final del estudio (PCF) de los animales, así como el incremento de PC durante su evolución p.o., se representan en la Tabla 9, ANEXO 2. El PCI es significativamente menor en el grupo CCRND (Colestasis con administración de células madre de rata no diferenciadas) que en los grupos CCRP (p<0,05) (Colestasis con administración de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos) y CCHP (p<0,01) (Colestasis con administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos) El PCF es significativamente mayor en el grupo CCRP (Colestasis con administración de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos) que en los grupos CCHP (p<0,01) (Colestasis con administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos) y CM-S (p<0,05) (Colestasis microquirúrgica con administración de suero). (Tabla 9, ANEXO I, Figura 39). RESULTADOS 114 En lo que al incremento del peso corporal (∆PC) se refiere, se produce una disminución significativa del mismo en las ratas colestásicas con administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP) respecto del resto de los grupos colestaticos (p<0,01), como del grupo de ratas seudo-operadas (p<0,001). Además, en el grupo de ratas seudo-operadas (SO) hay un aumento estadísticamente significativo (p<0,001) del peso corporal, y en los grupos de ratas con colestasis que recibieron células madre de rata, tanto no diferenciadas (CCRND), como prediferenciadas a hepatocitos (CCRP) el aumento del ∆PC es casi del doble en relación al grupo que recibió suero (CM-S). (Figura 39). INCREMENTO PESO CORPORAL g -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 SO CM-S CCHP CCRND CCRP Figura 39. Incremento de peso corporal (∆ peso; g) en las ratas de los grupos de estudio: SO: Seudo-operadas; CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos; Media ± DE **p<0.01: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S; ººp<0.01;ºººp<0.001: Valor estadísticamente significativo respecto de CCHP. 7. PESO HEPÁTICO En relación al peso hepático, este es significativamente superior en las ratas colestásicas a las que sólo se les inyectó solución salina (CM-S) respecto ºº ºº ºº ººº ** RESULTADOS 115 a las ratas seudo-operadas (p<0,001) y a todos los grupos de animales con colestasis a los que se les administraron células madre adipocíticas, tanto de rata no diferenciadas (CCRND) y prediferenciadas a hepatocitos (CCRP), como las humanas prediferenciadas a hepatocitos CCHP (p<0,05). Lo mismo ocurre con la relación PH/PC, que es también, estadísticamente superior en los animales con colestasis e inyección de suero (CM-S) respecto a las ratas seudo-operadas (p<0,001) y a las colestásicas a las que se les inyectaron células madre. Estas diferencias son más marcadas en relación a los grupos que recibieron células madre de rata, tanto no diferenciadas (CCRND; p<0,05), como las prediferenciadas a hepatocitos (CCRP; p<0,05). (Tabla 10, ANEXO 2, figuras 40 y 41). PESO HEPATICO g 0 5 10 15 20 25 30 SO CM-S CCHP CCRND CCRP Figura 40. Peso hepático (PH;g). SO: Seudo-operadas CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata indiferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos; Media ± DE:♦p<0.05;♦♦p<0.01;♦♦♦p<0.001:Valor estadísticamente significativo respecto de SO; *p<0.05; ***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S. ♦ *** ♦♦ ♦♦ *** ♦♦♦ RESULTADOS 116 PH/PC % 0 2 4 6 8 10 SO CM-S CCHP CCRND CCRP Figura 41. Relación peso hepático / peso corporal x 100 (PH/PC; %) en las ratas de los diferentes grupos de estudio: SO: seudo-operadas; CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos; Media ± DE:♦♦p<0.01;♦♦♦p<0.001:Valor estadísticamente significativo respecto de SO; *p<0.05; ***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S. Es de interés destacar que la hepatomegalia, tanto en valor absoluto, como cuando se estudia la relación peso hepático/peso corporal, en comparación a los valores de referencia que se obtienen al pesar los hígados de las ratas seudo-operadas, es inferior en las ratas con colestasis a las que se les administran células madre respecto de aquellas que sólo recibieron suero salino Se observa también que el grupo con menor hepatomegalia, y por tanto con pesos hepáticos más aproximados a los pesos de los hígados de las ratas seudo-operadas, es aquel al que se le administraron células madre humanas, si consideramos los valores absolutos, pero al estudiar la relación peso hepático/peso corporal, los animales con menor incremento del peso hepático, y con pesos hepáticos más aproximados a los pesos de los hígados de las ratas seudo-operadas, son aquellos a los que se les administraron células madre de rata, sobre todo las que recibieron células prediferenciadas a hepatocitos (Figuras 40 y 41). En la figura 42 se puede apreciar el aspecto macroscópico del hígado de una rata con colestasis microquirúrgica y administración de células madre y otra del grupo de ratas colestásicas a la que se le inyectó suero. * * *** ♦♦ ♦♦ ♦♦♦ ♦♦♦ RESULTADOS 117 Figura 42. .Fotografía comparativa del aspecto macroscópico del hígado en una rata con colestasis microquirúrgica y administración de células madre adipocíticas prediferenciadas a hepatocitos (a) y otra del grupo de ratas colestásicas con suero (b). Se aprecia hepatomegalia, ictericia y aumento de la consistencia en mayor grado en el hígado de la rata con colestasis y administración de solución salina, respecto al hígado de la rata colestásica a la que se administraron células madre. Respecto de la evolución de los pesos lobulares hepáticos, se produce un aumento del peso del lóbulo medio hepático (LM) en el grupo de ratas con colestasis y solución salina (CM-S) respecto a las ratas seudo-operadas (p<0,01), y al resto de los grupos de animales colestásicos con células madre, si bien éste, en los animales colestaticos, no alcanza significación estadística. También se puede comprobar un aumento significativo del peso del lóbulo lateral derecho (LLD) en el grupo CM-S respecto a las ratas seudo-operadas (p<0,001) y a los grupos de ratas con colestasis que recibieron células madre, tanto de rata no diferenciadas (CCRND; p<0,05), como humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP; p<0,01). El peso del lóbulo lateral izquierdo (LLI) es significativamente mayor en el grupo CM-S respecto a las ratas seudo-operadas (p<0,001) y al grupo CCHP (p<0,05). Por último, el peso del lóbulo caudado (LC) es superior en las ratas colestásicas con suero (CM-S) y con células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP), respecto al grupo de ratas seudo- operadas (p<0,001) y al grupo que recibieron células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP), si bien éste aumento no alcanza significación estadística (Tabla 11). Tabla 11. Peso de los lóbulos medio (PLM), lateral derecho (PLLD), lateral izquierdo (PLLI) y caudado (PLC) hepáticos en las ratas de los diferentes grupos de estudio: SO: Seudo-operadas; CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas b a RESULTADOS 118 prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. GRUPO PLM (g) PLLD (g) PLLI (g) PLC (g) SO (n=20 ) 4,37** ± 0,09 2,36*** ± 0,12 3,43*** ± 0,18 0,79** ± 0,10 I CM-S (n=20) 7,14♦♦ ± 1,5 6,18♦♦♦ ± 1,84 7,55♦♦♦ ± 1,23 2,13♦♦ ± 0,46 II (CCHP) (n=38 5,84 ± 2,2 3,79** ± 1,8 5,73♦ ± 1,47 1,67 ± 0,78 III (CCRND) (n=47) 5,54 ± 1,76 4,22* ± 1,46 6,34♦ ± 2,15 1,96♦ ± 0,73 IV CCRP (n=30) 5,56 ± 1,35 5,11♦♦ ± 1,85 6,36♦ ± 2,04 2,24♦♦ ± 1,06 Media ± DE:♦♦p<0.01;♦♦♦p<0.001:Valor estadísticamente significativo respecto de SO; *p<0.05; ***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S. 8. PESO ESPLÉNICO Todos los grupos de ratas con colestasis microquirúrgica presentan esplenomegalia cuando se comparan con las ratas seudo-operadas, si bien, en las ratas colestásicas que recibieron tan solo solución salina (CM-S) el incremento del peso esplénico es más marcado en relación al resto de los grupos, existiendo diferencias significativas (p<0,5) con el grupo de ratas colestásicas a las que les administraron células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP). La relación PE/PC es, también, mayor en el grupo CM-S en relación al resto de los grupos, siéndo esta diferencia significativa (p<0,5) respecto al grupo de ratas colestásicas a las que se inyectaron células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP). (Tabla 12, ANEXO 2, figuras 43 y 44). RESULTADOS 119 PESO ESPLENICO g 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 SO CM-S CCHP CCRND CCRP Figura 43. Peso esplénico (PE;g) en las ratas de de los diferentes grupos de estudio: SO: Seudo-operadas CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipociticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos; Media ± DE; ♦♦♦p<0.001: Valor estadísticamente significativo respecto de SO; ***p<0.001;*p<0.05; Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S. PE/PC % 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 SO CM-S CCHP CCRND CCRP *** * * ♦♦♦ ♦♦♦ ♦♦♦ ♦♦♦ ♦♦ ♦♦♦ ♦♦♦ ♦♦♦ *** RESULTADOS 120 Figura 44. Relación peso esplénico / peso corporal x 100 (PE/PC; %) en las ratas de de los diferentes grupos de estudio: SO: Seudo-operadas CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. Media ± DE; ♦♦p<0.01; ♦♦♦p<0.001: Valor estadísticamente significativo respecto de SO.; ***p<0.001;*p<0.05; Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S. Todas las ratas colestásicas presentaron esplenomegalia (p<0.001) respecto a las ratas seudo-operadas. Sin embargo, al igual que ocurría con la hepatomegalia, el incremento del peso esplénico es inferior en las ratas colestásicas que recibieron células madre respecto de aquellas a las que se inyectó sólo suero salino intrahepático (Figura 43). También se puede observar que en los grupos tratados con células madre se produce un aumento significativo de la relación PE/PC respecto a las ratas seudo-operadas: CM-S, CCRND, y CCHP (p<0.001), siendo este aumento menos marcado en el grupo de ratas colestaticas que recibieron células madre de rata prediferenciadas (p<0.01). Entre los grupos colestaticos se observa que en el grupo tratado con suero se produce un aumento más marcado de la relación PE/PC, que en los grupos tratados con células madre (figura 44). En la figura 45 se puede apreciar el aspecto macroscópico del bazo de una rata con colestasis microquirúrgica y administración intrahepática de células madre, y otra del grupo de ratas colestásicas a las que se administró suero. Figura 45. Fotografía comparativa del tamaño del bazo de una rata del grupo con colestasis y administración de suero (CM-S) a la izquierda, y otra, a la derecha, de una rata seudo-operada (SO). a RESULTADOS 121 9. PESO TESTICULAR Las ratas con colestasis a las que se inyecto sólo suero salino intrahepático (CM-S), sufrieron atrofia testicular cuando se comparan con las ratas SO (p<0.05) (Tabla 13; Figura 46) y al resto de los grupos colestaticos que recibieron células madre, siendo esta diferencia significativa (p<0,001) con el grupo de ratas que recibieron células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP) que incluso llegan a tener un tamaño testicular mayor a las ratas seudo-operadas (SO); (Tabla 13, ANEXO 2, Figura 46). PESO TESTICULAR g 0 1 2 3 4 5 SO CM-S CCHP CCRND CCRP Figura 46. Peso testicular bilateral (PT;g) en las ratas de de los diferentes grupos de estudio.SO: Seudo-operadas CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. Media ± DE; ♦p<0.05: Valor estadísticamente significativo respecto de SO;***p<0.001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S. La relación PT/PC es también menor en las ratas con insuficiencia hepática colestásica a las que se inyecto suero salino intrahepático (CM-S) respecto al grupo de ratas seudo-operadas y al resto de los grupos colestaticos que recibieron células madre . Dentro de las ratas colestásicas, el índice PT/PC es inferior en el grupo CM-S que en los grupos con colestasis que recibieron células madre, existiendo diferencias significativas respecto al grupo con células ♦ *** ♦ RESULTADOS 122 madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP;p<0,05). (Tabla 13, ANEXO 2, figuras 47 y 48). Figura 47. Peso testicular bilateral (PT;g) y Relación peso testicular / peso corporal x 100 (PT/PC en las ratas de de los diferentes grupos de estudio: SO: Seudo- operadas CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipociticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. Media ± DE; *p<0.05: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S. En la figura 48 se puede apreciar el aspecto macroscópico de los testículos de una rata con colestasis microquirúrgica y administración de células madre prediferenciadas a hepatocitos (CCRP) y otra del grupo con colestasis y administración de suero (CM-S), comprobándose la atrofia testicular que se produce en las ratas del último grupo. a b * RESULTADOS 123 Figura 48. Imagen comparativa del tamaño testicular en una rata (a) del grupo de colestasis con administración de células madre prediferenciadas a hepatocitos (CCRP) y en otra (b) del grupo de colestasis con administración de suero salino (CM-S). 10. DETERMINACIONES SÉRICAS DE FUNCIÓN HEPÁTO-BILIAR En relación a los valores de bilirrubina se observa que, todos los grupos de ratas con colestasis microquirúrgica presentan valores significativamente mayores (p<0,001), tanto de bilirrubina total como de bilirrubina directa, cuando se comparan con las ratas seudo-operadas. Respecto de las ratas con colestasis que recibieron suero salino (CM-S), presentan valores de bilirrubina total (BT) mayores, en tanto que los de bilirrubina directa (BD) son inferiores, respecto al resto de los grupos de animales colestásicos, tanto aquellos con células madre de rata no diferenciadas (CCRND), con células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP) y con células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP). Respecto del índice BD/BT, se produjo un descenso estadísticamente significativo en el grupo que recibió suero salino (CM-S) en relación al resto de los grupos colestasicos, tanto los que recibieron células madre prediferenciadas a hepatocitos, yá humanas (CCHP; p<0,01) o de rata (CCRP; p<0,01), como aquellas que recibieron células madre no diferenciadas de rata (CCRND) (p<0,001). (Tabla 14, ANEXO 2, Figura 49). BILIRRUBINA TOTAL U /I 0 2 4 6 8 10 12 14 SO CM-S CCHP CCRND CCRP BILIRRUBINA DIRECTA U /I 0 1 2 3 4 5 6 7 SO CM-S CCHP CCRND CCRP ♦♦♦ ♦♦♦ ♦♦♦ ♦♦♦ ♦♦♦ ♦♦♦ ♦♦♦ ♦♦♦ RESULTADOS 124 BILIRRUBINA D/ BILIRRUBINA T *100 % 0 10 20 30 40 50 60 70 CM-S CCHP CCRND CCRP Figura 49. Concentraciones séricas de Bilirrubina Total (BT; mg/dl) y Bilirrubina Directa (BD; mg/dl), % de Bilirrubina Directa en relación a Bilirrubina Total (BD/BTx100), en las ratas de los diferentes grupos de estudio: SO: seudo-operadas; CM-S: Colestasis con administración de suero salino CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. Media±DE; ♦♦♦p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de SO;**p<0.01;***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S. En el grupo de ratas con colestasis que recibieron suero salino (CM-S), los valores de Aspartato-aminotransferasa (AST) son mayores (p<0,01) respecto al grupo de ratas seudo-operadas (SO) y a los grupos en que se administraron células madre, existiendo tan sólo en éstos últimos grupos diferencias estadísticamente significativas (p<0,01) en comparación con los grupos de ratas colestásicas a las que se administraron células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP). Así mismo, en el grupo de ratas seudo operadas (SO), los valores de Alanin-aminotransferasa (ALT) son mayores respecto a los grupos en que se administraron células madre, y al grupo que recibió suero (CM-S) existiendo diferencias estadísticamente significativas en comparación con los grupos de ratas colestasicas a las que se administraron células madre, tanto de rata no diferenciadas y prediferenciadas (CCRND y CCRP; p<0,01), como humanas prediferenciadas (CCHP; p<0,01). Entre los grupos de ratas colestasicas, los valores de Alanin-aminotransferasa (ALT) son mayores en el grupo de recibió suero salino (CM-S) en comparación al resto de los grupos, existiendo diferencias estadísticamente significativas (p<0,01) en comparación al grupo de ratas colestásicas a las que se administraron células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP). (Tabla 15, Figura 50). ** *** ** RESULTADOS 125 En cuanto a las concentraciones séricas de Fosfatasa Alcalina (FA), aumentan en las ratas con colestasis e inyección de células madre no diferenciadas de rata (CCRND) en relación a los grupos de ratas seudooperadas y ratas colestasicas, yá con suero salino (CM-S; p<0,05), con administración de células madre de rata prediferenciadas (CCRP; p<0,05), y de células madre humanas prediferenciadas (CCHP; p<0,01). Por el contrario, no se aprecian diferencias significativas en los valores de Gamma-Glutamiltranspeptidasa (GGT) entre los grupos de ratas colestasicas estudiados, pero si existen diferencias estadísticamente significativas entre el grupo de ratas seudo operadas y los grupos colestasicos, tanto con suero salino (CM-S; p<0,001), como trás la administración de células madre de rata prediferenciadas (CCRP; p<0,01), de células madre humanas prediferenciadas (CCHP; p<0,01), y de células madre de rata no diferenciadas (CCRND; p<0,001). (Tabla 15, ANEXO 1,figura 50). ALT U /I 0 20 40 60 80 100 SO CM-S CCHP CCRND CCRP AST U /I 0 100 200 300 400 SO CM-S CCHP CCRND CCRP FOSFATASA ALCALINA U /I 0 100 200 300 400 SO CM-S CCHP CCRND CCRP GGT U /I 0 10 20 30 40 50 60 70 SO CM-S CCHP CCRND CCRP Figura 50. Concentración sérica de AST (U/l), ALT (U/l), FA(U/l) Y GGT(U/l) en las ratas de los diferentes grupos de estudio: SO: seudo-operadas; CM-S: Colestasis con administración de suero salino CCRND: Colestasis con administración de células madre ♣ ♣♣ ♣ ** ** ♦♦ ♦♦ ♦♦♦ ** ♦♦ ♦♦ ♦♦♦ ♦♦♦ RESULTADOS 126 adipocíticas de rata no diferenciadas CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos; Media±DE;♦♦p<0,01;♦♦♦p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de SO;**p<0.01;***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S; ♣p<0.5, ♣♣p<0.01: Valor estadísticamente significativo respecto de CCRND. En relación a las proteínas totales, todos los grupos de ratas con colestasis microquirúrgica presentan valores menores cuando se comparan con las ratas seudo-operadas, si bien, las ratas colestásicas con suero salino (CM-S) presentan valores significativamente inferiores en relación a las ratas seudo operadas (SO; p<0,001), y al resto de los grupos de ratas con colestasis, tanto con células madre de rata no diferenciadas (CCRND; p<0,05), como con células madre humanas prediferenciadas (CCHP; p<0,01) y, en particular, de rata (CCRP; p<0,001) prediferenciadas a hepatocitos. De igual forma, los valores de albumina son estadísticamente superiores (p<0,001) en las ratas seudo operadas (SO) que en las ratas colestaticas. Entre las ratas con colestasis microquirúrgica, en aquellas que solo recibieron suero (CM-S) se observan también valores inferiores al resto de los grupos, existiendo diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) respecto a los grupos de ratas con células madre humanas (CCHP) y de rata (CCRP) prediferenciadas a hepatocitos (Tabla 16, figura 51). Por el contrario, en relación a la función renal, el grupo de animales con colestasis y células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP) presenta un valor estadísticamente mayor (p<0,05) de las concentraciones de Urea en comparación a los otros tres grupos de colestasis: con solución salina (CM-S), con células madre de rata no diferenciadas (CCRND) y con células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP). Respecto de las concentraciones séricas de Creatinina, son superiores también, en el grupo de animales con colestasis y células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP), respecto a los grupos de ratas seudo-operadas (SO) y colestásicas, existiendo diferencias estadísticamente significativas con los grupos a los que se inyectaron células madre de rata, tanto no diferenciadas (CCRND; p<0,01), como prediferenciadas a hepatocitos (CCRP; p<0,05) (Tabla 16, ANEXO 2, figura 51). RESULTADOS 127 PROTEINAS TOTALES gr /d l 0 1 2 3 4 5 6 7 SO CM-S CCHP CCRND CCRP ALBUMINA gr /d l 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 SO CM-S CCHP CCRND CCRP UREA m g/ dl 0 20 40 60 80 CM-S CCHP CCRND CCRP CREATININA m g/ dl 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 SO CM-S CCHP CCRND CCRP Figura 51. Concentraciones séricas de Urea (mg/dl), Creatinina (Cr; mg/dl), Albúmina (Alb; g/dl) y Proteínas Totales (PT; g/dl) en las ratas de los diferentes grupos de estudio: SO: seudo-operadas;. CM-S: Colestasis con administración de suero salino CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos; Media±DE;*p<0.05;**p<0.01;***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S; ♣p<0.5, ♣♣p<0.01: Valor estadísticamente significativo respecto de CCHP. En relación a los parámetros bioquímicos de la coagulación, se observa que el tiempo de protrombina (T.Prot), en relación a las ratas seudo operadas (SO), es inferior en las ratas colestásicas con suero salino (CM-S), mientras que en los grupos con colestasis y células madre de rata, tanto no diferenciadas (CCRND), como prediferenciadas a hepatocitos (CCRP), es superior. Por el contrario, la actividad de Protrombina (Act Prot) es estadísticamente mayor (p<0,05) en el grupo de ratas colestásicas con suero salino (CM-S) respecto de las ratas seudooperadas (SO) y a los otros dos grupos con colestasis (CCRND y CCRP). En relación a las concentraciones séricas de Fibrinógeno, todos los grupos de ratas con colestasis microquirúrgica presentan valores mayores cuando se comparan con las ratas seudo-operadas, si bien, en las ratas ♣♣ ♣ ♣ ♣ ♣ * * * ** *** *** *** RESULTADOS 128 colestásicas que recibieron tan solo solución salina (CM-S) el incremento es menos marcado en relación a los otros dos grupos con colestasis a las que se administraron tanto células madre de rata no diferenciadas (CCRND), como prediferenciadas a hepatocitos (CCRP). Sólo existieron diferencias significativas (p<0,5) entre las ratas seudoperadas y el grupo de ratas colestásicas a las que les administraron células madre adipocíticas de rata no diferenciadas (CCRND). Por el contrario, en el grupo CM-S hay un incremento significativo (p<0,01) del valor del “International Normalized Ratio” (INR) respecto a las ratas seudooperadas y a los otros dos grupos de ratas colestásicas con células madre de rata, tanto no diferenciadas (CCRND; p<0,01) como en las prediferenciadas a hepatocitos (CCRP; p<0,01). El tiempo de Cefalina (T Cefal) y el Ratio de Tiempo de Cefalina (Rat T Cefal) son menores en el grupo CM-S que en las ratas seudo-operadas (p<0,001), que en los grupos colestásicos con isotrasplante de células madre de rata, tanto no diferenciadas como prediferenciadas de hepatocitos (CCRND y CCRP), existiendo diferencias significativas (p<0,05) solo en el primer grupo (CCRND) (Tabla 17, ANEXO 2, figura 52). T PROTROMBINA se g 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 SO CM-S CCRND CCRP ACT. DE PROTROMBINA % 0 20 40 60 80 100 120 140 SO CM-S CCRND CCRP FIBRINOGENO m g/ dl 0 50 100 150 200 250 300 SO CM-S CCRND CCRP INR 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 SO CM-S CCRND CCRP * * *** *** ♦ * *** RESULTADOS 129 T CEFALINA se g 0 10 20 30 40 50 60 SO CM-S CCRND CCRP RAT T CEFALINA 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 SO CM-S CCRND CCRP Figura 52. Tiempo de Protrombina (TProt; seg), Actividad de Protrombina (ActProt; %), Fibrinógeno (F; mg/dl), International Normalized Ratio (INR), Tiempo de Cefalina (TCefal; seg) y Ratio de Tiempo de Cefalina (RatT), en los diferentes grupos de estudio: SO: seudo-operada:.CM-S: Colestasis con administración de suero salino CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. Media ± DE:♦p<0.05;♦♦p<0.01;♦♦♦p<0.001:Valor estadísticamente significativo respecto de SO;*p<0.05;***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S 11. DETERMINACION DEL “Model for end-stage Liver Disease” (MELD) Al analizar el “Model for end-stage Liver Disease” (MELD) en los grupos de ratas seudo-operadas (SO) y colestásicas, con células madre de rata no diferenciadas (CCRND) y con células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP), se ha demostrado la existencia de diferencias estadísticamente significativas entre las ratas seudo-operadas y los grupos de ratas con colestasis a las cuales se inyectaron células madre de rata, tanto no diferenciadas (CCRND), como prediferenciadas a hepatocitos (CCRP), siendo ésta última diferencia estadísticamente menor (p<0,01) en relación al grupo SO. (Tabla 18, ANEXO 2, figura 53). * *** *** ♦♦♦ ♦ * RESULTADOS 130 MELD 0 2 4 6 8 10 12 14 16 SO CCRND CCRP Figura 53. Determinación del “Model for end-stage Liver Disease” (MELD) en los diferentes grupos de estudio: SO: Seudooperadas CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. Media±DE;**p<0,01: Valor estadísticamente significativo respecto de SO. 12. ESTUDIO HISTOPATOLÓGICO HEPÁTICO 12.A. Estudio con microscopía de Inmunofluorescencia. A las 8 semanas del p.o., mediante el microscopio de inmuno fluorescencia se ha demostrado la persistencia de las células madre inyectadas en los lóbulos hepáticos de las ratas con colestasis, tanto en los grupos a los que se administraron células madre humanas como en los que se administraron células madre de rata (figura 54). ** ** a b RESULTADOS 131 Figura 54. Imágenes obtenidas mediante el microscopio de inmunofluorescencia en las que se aprecia la presencia intrahepática de células madre mesenquimales adipocíticas en ratas con colestasis microquirúrgica. a) CCRND (Colestasis con administración de células madre de rata no diferenciadas). b) CCRP (Colestasis con administración de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos.) c) CCHP (Colestasis con administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos). 12.B. Estudio con microscopía óptica Una vez examinadas todas las preparaciones de las muestras hepáticas con tinción H&E (figura 55) en todos los grupos estudiados, se evaluaron las siguientes variables histopatológicas: colestasis, nódulos de regeneración, proliferación ductal, binucleación, infiltrado inflamatorio, necrosis, trombosis, fibrosis, peliosis, dilatación vena centrolubulillar, estructura, congestión y función, dando una puntuación a cada una de ellas (tablas 19,20,21 y 22, ANEXO 2) (ver Material y Métodos).Tras asignar las puntuaciones correspondientes y proceder a clasificar a cada individuo en función de la puntuación final obtenida, se establecieron 4 grados: bueno (puntuaciones iguales o inferiores a 5), intermedia-buena (puntuaciones entre 6 y 12), intermedia-mala (puntuaciones entre 13 y 19) y mala (puntuaciones iguales o superiores a 20). A continuación se exponen las Tablas que resumen la puntuación total, valorada en los lóbulos hepáticos medio y caudado, en cada rata de todas las Series estudiadas (Tablas 23, 24, 25 y 26). C a b RESULTADOS 132 Figura 55. Imágenes hepáticas obtenidas mediante el microscopio óptico correspondientes a ratas con colestasis microquirúrgica: a) CMS: Colestasis con administración de suero salino b) CCHP: Colestasis con administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos c) CCRND: Colestasis con administración de células madre indiferenciadas de rata d) CCRP: Colestasis con administración de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (Hematoxilina&Eosina; 10 X) Tabla 23. Puntuaciones obtenidas al sumar la puntuación de cada rata tras el estudio de las a las siguientes variables histopatológicas: colestasis, nódulos de regeneración, proliferación ductal, binucleación, infiltrado inflamatorio, necrosis, trombosis, fibrosis, peliosis, dilatación vena centrolubulillar, estructura, congestión y función, evaluadas en los hígados de ratas del grupo CMS (Colestasis microquirúrgica con administración de suero salino). RATA CHRR50 CHRR51 CHRR52 CHRR53 CHRR54 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 17 12 15 14 15 15 11 10 13 10 RATA CHRR55 CHRR64 CHR68 CHR69 CHR70 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 9 14 13 6 11 10 21 18 17 18 RATA CHR72 CHR74 CHR76 CHR78 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 23 23 22 20 20 20 21 20 Mejor puntuación = 2; Buena<5; Intermedia-buena 5-12; Intermedia-mala 13-19; Mala>20; Peor puntuación = 39 Tabla 24. Puntuaciones obtenidas al sumar la puntuación de cada rata tras el estudio de las a las siguientes variables histopatológicas: colestasis, nódulos de regeneración, c d RESULTADOS 133 proliferación ductal, binucleación, infiltrado inflamatorio, necrosis, trombosis, fibrosis, peliosis, dilatación vena centrolubulillar, estructura, congestión y función, evaluadas en los hígados de ratas del grupo CCHP (Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos). RATA CHR125 CHR130 CHR132 CHR134 CHR141 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 17 18 26 18 21 12 20 20 15 12 RATA CHR142 CHR144 CHR145 CHR148 CHR149 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 15 15 21 16 17 12 12 20 20 15 RATA CHR150 CHR152 CHR153 CHR154 CHR155 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 9 14 4 7-8 17 16 12 9-10 11 13 Mejor puntuación = 2; Buena<5; Intermedia-buena 5-12; Intermedia-mala 13-19; Mala>20; Peor puntuación = 39 Tabla 25. Puntuaciones obtenidas al sumar la puntuación de cada rata tras el estudio de las a las siguientes variables histopatológicas: colestasis, nódulos de regeneración, proliferación ductal, binucleación, infiltrado inflamatorio, necrosis, trombosis, fibrosis, peliosis, dilatación vena centrolubulillar, estructura, congestión y función, evaluadas en los hígados de ratas del grupo CRND (Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas). RATA CHRR1 CHRR6 CHRR7 CHRR8 CHRR9 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 15 12 16 12 15 11 17 13 21 13 RATA CHRR13 CHRR14 CHRR15 CHRR16 CHRR18 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 19 20 17 18 19 19 17 18 21 13 RATA CHRR19 CHRR20 CHRR25 CHRR26 CHRR31 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC RESULTADOS 134 TOTAL 13 13 16 13 15 16 15 17 17 6 RATA CHRR32 CHRR56 CHRR57 CHRR58 CHRR60 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 6 13 12 10 9,5 9 12 14,5 15 14 RATA CHRR61 CHRR62 CHRR65 CHRR66 CHRR67 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 16 17 14 13 14 16 16,5 13 11 11,5 Mejor puntuación = 2; Buena<5; Intermedia-buena 5-12; Intermedia-mala 13-19; Mala>20; Peor puntuación = 39 Tabla 26. Puntuaciones obtenidas al sumar la puntuación de cada rata tras el estudio de las a las siguientes variables histopatológicas: colestasis, nódulos de regeneración, proliferación ductal, binucleación, infiltrado inflamatorio, necrosis, trombosis, fibrosis, peliosis, dilatación vena centrolubulillar, estructura, congestión y función, evaluadas en los hígados de ratas del grupo CRPD (Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos). RATA CHRR39 CHRR41 CHRR43 CHRR46 CHRR47 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 18 15 9 13 15 12 17 10 16 6 RATA CHRR48 CHRR49 CHRR68 CHRR69 CHRR70 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 14 13 14 12 18,5 16,5 16 17 17 18 RATA CHRR71 CHRR72 CHRR73 CHRR74 CHRR75 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 16,5 15 10,5 16,5 18 16 16,5 9,5 8,5 RATA CHRR76 CHRR77 CHRR78 CHRR80 CHRR81 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC TOTAL 18 13,5 17 15 13 15 9 8 20 20 Mejor puntuación = 2; Buena<5; Intermedia-buena 5-12; Intermedia-mala 13-19; Mala>20; Peor puntuación = 39 RESULTADOS 135 Una vez sumadas las puntuaciones correspondientes a las alteraciones histopatológicas presentes en cada animal y, tras llevar a cabo una clasificación en función de la puntuación obtenida, se valoró el porcentaje de animales que dentro de cada grupo pertenecían a cada nivel de dicha clasificación (Tablas 27; Figura 56) y a su vez se subdividió cada valor porcentual según el lóbulo hepático estudiado (lóbulo medio y caudado) (Tabla 28; Figuras 57 y 58). Finalmente, en función de los resultados obtenidos y del análisis estadístico aplicado podemos concluir que: 1. Los grupos presentan diferencias estadísticamente significativas (p=0.004), siendo las alteraciones histopatológicas correspondientes a la colestasis, más marcadas en el grupo de ratas a las que tan sólo se les administró solución salina (CM-S) respecto del resto de los grupos de ratas colestásicas a las que se les administraron células madre (Tabla 27 ; Figura 56). 2. El resultado BUENO (prácticamente inexistente en este estadio evolutivo de las ratas con colestasis a largo plazo) se demuestra en algunas ratas del grupo de colestasis con xenotrasplante de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP), no existiendo en los grupos restantes. El resultado BUENO en éstas ratas es superior (p=0.004) al esperado (3.3% respecto a un 0,7% esperado) (Tabla 27; Figura 56). 3. El resultado INTERMEDIO-BUENO no es más frecuente en los grupos de ratas con colestasis en los que se administraron células madre que en el grupo que tan sólo recibió suero (Tabla 27; Figura 56). 4. Donde se aprecian grandes diferencias es en los resultados más frecuentes; esto es, INTERMEDIO-MALO Y MALO, observándose que: -En el grupo de ratas con colestasis y suero salino (CM-S) prácticamente 1/3 de los resultados son INTERMEDIO-MALOS, destacando por tanto su baja presencia (39,3% respecto a un 59,2% esperado; p=0.004). En otro 1/3 de las ratas de éste grupo, con colestasis y solución salina, se ha comprobado una alta presencia del resultado MALO (32.1% respecto a un 13,6% esperado; p=0.004). Este grado más grave de resultados MALOS, además es más frecuente en éstas ratas que en el resto de los grupos de colestasis y trasplante de células madre, sobre todo en el LM hepático (35%). (Tabla 27 y 28; Figura 56,57 y 58). RESULTADOS 136 - Sin embargo, en los grupos de colestasis e isotrasplante de células madre de rata, tanto no diferenciadas (CCRND), como prediferenciadas a hepatocitos (CCRP), destaca la elevada presencia del resultado INTERMEDIO-MALO (72% y 69,2% respectivamente, respecto a un 59,2% esperado; p=0.004), siendo el resultado MALO prácticamente inexistente (4% y 5,1% respectivamente, versus un 13,6% esperado; p=0.004) (Tabla 27; Figura 56). -En el grupo de ratas con colestasis y administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP) el resultado MALO no llega a ¼ de los animales, (23%) siendo en el lóbulo caudado incluso de un 13,3%. El resultado INTERMEDIO-MALO aparece en el doble de los casos que el MALO (43,3%) en estos animales. (Tabla 27 y 28; Figura 56,57 y 58). Tabla 27. Clasificación en función de las puntuaciones asignadas a las diferentes variables histopatológicas evaluadas en los hígados de las ratas con colestasis microquirúrgica: CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. COLESTASIS CM-S CCRND CCHP CCRP RESULTADO BUENO 0 (0%) 0 (0%) 1 (3,3%) 0 (0%) RESULTADO INTERMEDIO-BUENO 8 (28,6%) 12 (24%) 9 (30,1%) 10 (25,6%) RESULTADO INTERMEDIO-MALO 11 (39,3%) 36 (72%) 13 (43,3%) 27 (69,2%) RESULTADO MALO 9 (32,1%) 2 (4%) 7 (23,3%) 2 (5,1%) Test estadístico Chi-cuadrado (p=0.004) Tabla 28. Clasificación en función de las puntuaciones asignadas a las diferentes variables histopatológicas evaluadas en los lóbulos hepáticos medio (LM) y caudado (LC) de ratas con colestasis microquirúrgica: CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. RESULTADOS 137 COLESTASIS CM-S CCRND CCHP CCRP LM LC LM LC LM LC LM LC RESULTADO BUENO 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (6,6%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) RESULTADO INTERMEDIO- BUENO 3 (21,4%) 5 (35,7%) 5 (20%) 7 (28%) 4 (26,8%) 5 (33,3%) 4 (21%) 6 (30%) RESULTADO INTERMEDIO-MALO 6 (42,9%) 5 (35,7%) 18 (72%) 18 (72%) 5 (33,3%) 8 (53,3%) 14 (73,7 %) 13 (65%) RESULTADO MALO 5 (35,7%) 4 (28,6%) 2 (8%) 0 (0%) 5 (33,3%) 2 (13,3%) 1 (5,3%) 1 (5%) Test estadístico Chi-cuadrado (p=0.004) RESULTADOS 138 Figura 56. Comparación de resultados histopatológicos evaluadas en los hígados de las ratas de los diferentes grupos de estudio CM-S: Colestasis con administración de suero salino CCRND: Colestasis con administración de células madre humanas adipocíticas no diferenciadas de rata. CCHP: Colestasis con administración de células madre humanas adipocíticas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre humanas adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos 0% 21% 43% 36% CMS. LOBULO MEDIO BUENO INTERM-BUENO INTERM-MALO MALO 7% 27% 33% 33% CCHP.LOBULO MEDIO BUENO INTERM-BUENO INTERM-MALO MALO RESULTADOS 139 Figura 57. “Comparación de los resultados histopatológicos evaluados en el lóbulo hepático medio (LM) de ratas de los diferentes grupos de estudio: CM-S: Colestasis con administración de suero salino CCRND: Colestasis con administración de células madre humanas adipocíticas no diferenciadas de rata. CCHP: Colestasis con administración de células madre humanas adipocíticas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre humanas adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos RESULTADOS 140 Figura 58. Comparación de los resultados histopatológicos evaluados en el lóbulo hepático caudado (LC) de ratas de los diferentes grupos de estudio: CM-S: Colestasis con administración de suero salino CCRND: Colestasis con administración de células madre humanas adipocíticas no diferenciadas de rata. CCHP: Colestasis con administración de células madre humanas adipocíticas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre humanas adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos 12.C. Estudio de la fibrosis hepática Para estudiar la fibrosis hepática, se realizaron dos tinciones de las muestras del parénquima hepático: Tricrómico de Mason (figura 59) y Rojo Picrosirio (figura 60) en los lóbulos hepáticos medio y caudado de 9 individuos de cada grupo experimental. Con la tinción de Tricromico de Masson, todos los elementos acidófilos del tejido, como el citoplasma celular, el músculo y el colágeno se unen a los tintes ácidos, por ello ésta tinción permite visualizar muy bien las áreas de fibrosis. Con esto observamos en las fotografías de los cortes histológicos las zonas de parénquima en las que se ha depositado un aumento de la matriz extracelular se tiñen de color turquesa, en tanto que el citoplasma y los núcleos celulares de los distintas células hepáticas no captan ésta tinción. a b http://es.wikipedia.org/wiki/Tejido_(biolog%C3%ADa) http://es.wikipedia.org/wiki/Citoplasma http://es.wikipedia.org/wiki/M%C3%BAsculo http://es.wikipedia.org/wiki/Col%C3%A1geno RESULTADOS 141 Figura 59. Imágenes obtenidas mediante microscopía óptica con tinción de Tricrómico de Masson correspondiente a hígados de ratas de los diferentes grupos de estudio a) CMS: Colestasis con administración de suero salino (40X) b) CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos (10X) c) CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas no diferenciadas de rata. (20X) d) CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos (20X). Cuando se utilizó la tinción con Rojo Picrosirio (figura 60), (que tiñe específicamente las fibras de colágeno en rojo, en tanto que los hepatocitos y las células epiteliales biliares neoformadas aparecen de color blanco), las microfotografías obtenidas se convirtieron a sistema binario (B/W; figura 61) y fueron analizadas mediante un programa de análisis de imagen ◊ IMAGEJ, cuantificando posteriormente las áreas de fibrosis. . a b c d RESULTADOS 142 Figura 60. Imágenes obtenidas mediante microscopía óptica con tinción de Rojo Picrosirio correspondiente a higados de las ratas de los diferentes grupos de estudio. El Rojo Picrosirio tiñe específicamente las fibras de colágeno en rojo, en tanto que los hepatocitos y las células epiteliales biliares neoformadas aparecen de color blanco. a) CMS: Colestasis con administración de suero salino b) CCHP: Colestasis con administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos c) CCRND: Colestasis con administración de de células madre no diferenciadas de rata. d) CCRP: Colestasis con administración de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos Figura 61. Tinción hepática con Rojo Picrosirio convertido en sistema binario en una rata con colestasis y administración de células madre indiferenciadas de rata: Negro=hepatocitos; Verde= vasos; blanco= fibrosis + proliferación biliar. Se cuantificaron el área de fibrosis total y del porcentaje del área de fibrosis respecto del área de parénquima hepático en los lóbulos medio y caudado (tabla 29 y 30) (figura 62 y 63) y las conclusiones obtenidas de éste estudio fueron las siguientes: 1. En el grupo de ratas con colestasis que recibieron suero salino (CM-S) se produce un incremento estadísticamente significativo en el porcentaje de fibrosis respecto al resto de los grupos que recibieron células madre; tanto humanas y prediferenciadas a hepatocitos (CCHP; p<0,001), como de rata, d c RESULTADOS 143 no diferenciadas (CCRND; p<0,001) y prediferenciadas a hepatocitos (CCRP; p<0,001) (Tabla 29, Figura 62). 2. En el grupo de ratas a las que se administraron células madre, el porcentaje de fibrosis es mayor (p<0,001) en el grupo en el que se administraron células humanas (CCHP) respecto a los grupos en que se administraron células de rata, tanto no diferenciadas (CCRND), como prediferenciadas a hepatocitos (CCRP) (Tabla 29, Figura 62). 3. Entre los grupos en los que se administraron células de rata el porcentaje de fibrosis es mayor en el grupo que recibió células madre no diferenciadas (CCRND), respecto del grupo al que se administraron células madre prediferenciadas a hepatocitos (CCRP), si bien ésta diferencia no fué significativa (Tabla 29, Figura 62). 4. No se aprecian diferencias en el área de fibrosis entre lóbulos (no hay efecto lóbulo) en ninguno de los grupos de ratas colestásicas estudiadas. Por lo tanto, el área de fibrosis es homogénea en todo el hígado, no apreciándose diferencias en función del lóbulo en el que se realice el estudio (Tabla 30, Figura 63). El porcentaje de fibrosis es significativamente inferior (p<0,001) en las ratas seudooperadas (SO) que en las ratas colestásicas y, entre los grupos colestásicos, el porcentaje de fibrosis es significativamente inferior (p<0,001) en las ratas que recibieron células madre respecto de aquellas a las que se inyectó sólo suero salino. Así mismo, dentro de los grupos que recibieron células madre, el porcentaje de fibrosis es significativamente inferior (p<0,001) en los que se realizó un isotrasplante de células de rata, tanto no diferenciadas (CCRND) como prediferenciadas a hepatocitos (CCRP). Tabla 29. Porcentaje del área de fibrosis hepática trás tinción con Rojo Picrosirio en los diferentes grupos de estudio: SO: seudo-operadas; CMS: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre no diferenciadas de rata. CCHP: Colestasis con administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos CCRP: Colestasis con administración de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos RESULTADOS 144 PORCENTAJE DEL ÁREA DE FIBROSIS HEPÁTICA SO (n= 20) 1,46 ± 0,44 CMS (n= 9) 31,62 ± 9,98♦♦♦ CCRND (n= 9 ) 16,19 ± 8,13♦♦♦*** °°° CCHP (n= 9 ) 22,09 ± 10,65♦♦♦*** CCRP (n= 9 ) 14,59 ± 7,7 ♦♦♦*** °°° Media ± DE; ♦♦♦p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de SO; ***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S; °°°p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CCHP PORCENTAJE AREA DE FIBROSIS HEPATICA Fi br os is (% ) 0 10 20 30 40 50 SO CMS CCHP CCRND CCRP Figura 62. Porcentaje del área de fibrosis hepática trás tinción con Rojo Picrosirio en los diferentes grupos de estudio: SO: seudo-operadas; CMS: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre no diferenciadas de rata. CCHP: Colestasis con administración de células madre humanas prediferenciadas a hepatocitos CCRP: Colestasis con administración de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos. Media ± DE; ♦♦♦p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de SO; ***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S; °°°p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CCHP. ♦♦♦ ●●● *** ♦♦♦ ●●● *** ♦♦♦ *** ♦♦♦ RESULTADOS 145 Si analizamos el porcentaje de fibrosis en los lóbulos hepáticos medio (LM) y caudado (LC) en cada grupo experimental, siempre es menor en el lóbulo caudado (en el cual no se inyectaban células madre), excepto en el grupo de animales con colestasis que recibieron células madre de rata no diferenciadas (CCRND), aunque estas diferencias no son significativas. Por lo tanto, el área de fibrosis es homogénea en todo el hígado, no apreciando diferencias marcadas en función del lóbulo en el que se realice el estudio (Tabla 30, Figura 63). Igualmente, si comparamos el porcentaje de fibrosis hallado en los lóbulos hepáticos medio (LM) y caudado (LC) entre los diferentes grupos, observamos que tampoco se aprecian diferencias en función del lóbulo estudiado (Tabla 30, Figura 63). Tabla 30. Porcentaje del área de fibrosis en los lóbulos hepáticos medio (LM) y caudado (LC) trás tinción con Rojo Picrosirio en ratas de los diferentes grupos de estudio. CMS: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas no diferenciadas de rata. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. PORCENTAJE DEL ÁREA DE FIBROSIS LOBULAR HEPÁTICA LM LC CMS (n= 9) 30,01 ± 10 33,17 ± 9,8 CCHP (n= 9) 20,92 ± 11,43*** 23,22 ± 9,82*** CCRND (n= 9) 16,68 ± 9,51*** 15,72 ± 6,58*** °°° CCRP (n= 9) 13,77 ± 7,75*** °°° 15,38 ± 7,63*** °°° Media ± DE; ***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S; °°°p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CCHP RESULTADOS 146 PORCENTAJE AREA FIBROSIS LOBULAR HEPATICA CM-S CCHP CCRND CCRP Fi br os is (% ) 0 10 20 30 40 50 LC LM Figura 63. Porcentaje del área de fibrosis en los lóbulos hepáticos medio (LM) y caudado (LC) trás tinción con Rojo Picrosirio en ratas de los diferentes grupos con colestasis microquirúrgica CMS: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas no diferenciadas de rata. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. Media ± DE; ***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S; °°°p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CCHP 12.D. Estructura hepática, proliferación biliar y estudio hepatocitario Se estudiaron otras lesiones propias del modelo experimental obtenido tras la resección microquirúrgica de la via biliar extrahepática en la rata, como son la proliferación biliar y el estado de los hepatocitos en los lóbulos hepáticos medio y caudado. En el lóbulo caudado del grupo de ratas con colestasis y administración de solución salina (CM-S; Chrr53 figura 64.a) se observa desestructuración hepática, asociada a intensa proliferación epitelial biliar y necrosis hepatocitaria. Por el contrario, en el lóbulo caudado de las ratas con colestasis e isotrasplante de células adipocíticas de rata no diferenciadas (CCRND; chrr20; figura 64.b), se observa una estructura hepática prácticamente normal, con fibrosis moderada, grandes zonas de hepatocitos preservados y menor proliferación biliar, aunque se observan algunos hepatocitos en fase de necrosis con retracción eosinófila (figura 64.b). ●●● *** ●●● *** ●●● *** *** *** *** RESULTADOS 147 Figura 64. Imágenes obtenidas mediante microscopio óptico correspondientes al lóbulo caudado hepático de los grupos de ratas con colestasis microquirurgica: a)Con suero (CM-S) donde se observa desestructuración hepática, asociada a intensa proliferación epitelial biliar y necrosis hepatocitaria (H&E, 40x).b) Con células madre adipocíticas de rata no diferenciadas (CCRND) donde se observa una estructura hepática prácticamente normal, aunque algunos hepatocitos se encuentran en fase de necrosis con retracción eosinófila (flechas) (H&E, 40x) En las imágenes de la figura 65, obtenidas mediante estudio con microscopio óptico de cortes histológicos hepáticos de ratas correspondientes a los grupos de colestasis microquirúrgica y administración de células madre de rata no diferenciadas (CCRND; chrr26 lm) (Figuras 65.1) y de colestasis y administración de células madre de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP: chrr43 lm), (Figura 65.2 ) se aprecia la heterogeneidad de la proliferación biliar y de las áreas de hepatocitos preservados. Así, se observan zonas donde predominan los hepatocitos (a), como en las áreas 3 del acino, y otras donde hay predominio de los ductos biliares y de la fibrosis (b), como son las áreas periportal (área 1) y área 2 del acino hepático. b a a b a b 1 40x 2 40x RESULTADOS 148 Figura 65. Imágenes del parénquima hepático obtenidas mediante microscopio óptico con tinción de Tricrómico de Masson correspondientes a los grupos con colestasis microquirurgica: a) Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas: Fotografia 1 (40x) b) Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos: Fotografia 2 (40x), en las que se aprecia la heterogeneidad de la proliferación biliar y hepatocitaria En las imágenes de la figura 66, obtenidas mediante la misma técnica y correspondientes a los grupos de ratas con colestasis y administración de células madre de rata, ya no diferenciadas (CCRND; chrr20 lc) (Figura 52.1) o bien, prediferenciadas.a hepatocitos (CCRP; chrr46 lm) (Figura 66.2), se comprueba la presencia de mitosis de células hepáticas. Figura 66. Imágenes obtenidas mediante microscopio óptica con tinción de Tricrómico de Masson correspondientes a los grupos de ratas con colestasis microquirurgica: a) Colestasis microquirúrgica con administración de de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas Fotografia 1 (40x) b) Colestasis microquirúrgica con administración de células madre de rata adipocíticas prediferenciadas a hepatocitos Fotografia 2 (40x). En ambas se demuestra la presencia de multiples mitosis de hepatocitos (flechas). Por ultimo, en el hígado del grupo de ratas con colestasis y administración de suero (CM-S; figura 67.2) se demuestra, tanto en el lóbulo medio, como en el lóbulo caudado, un marcado predominio de la proliferación epitelial biliar respecto del área de hepatocitos, observándose muchos de ellos con retracción eosinófila, lo cual significa que están necrosandose. Por el contrario, en las ratas con colestasis a las que se les administraron células madre adipociticas no diferenciadas de rata (CCRND; figura 67.3), prediferenciadas a hepatocitos humanas (CCHP; figura 67.4), y prediferenciadas de rata (CCRP; figura 67.5), los hallazgos histopatológicos son ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← 1 2 40x 40x RESULTADOS 149 heterogéneos, si bien en algunos animales predomina el área de hepatocitos respecto de la proliferación biliar, tanto en el lóbulo caudado, en el cual no se trasplantan células madre, como en el lóbulo medio, uno de los tres lóbulos hepáticos de la rata en los que se inyectan dichas células madre . Figura 67. Imágenes obtenidas mediante microscopio óptico correspondientes a cortes histológicos del parénquima hepático de ratas del grupo con colestasis microquirúrgica: Seudoperada (SO): Fotografía 1(40X). Con administración de suero (CM-S) en las que se demuestra una marcada proliferación biliar que se acompaña de una reducción del área de hepatocitos, muchos de ellos en fase de necrosis (retracción eosinófila): Fotografía 2 (40X).Estas alteraciones histopatológicas son más intensas en el lóbulo medio que en el lóbulo caudado Con administración células madre adipocíticas no diferenciadas de rata (CCRND): Fotografía 3 (40X). Con administración células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos (CCHP): Fotografía 4 (10X) y con CHRR20 LM 2 CHR50 LC 40x 40x CHRR43 LM 5 40x CHR45 LM 3 10x CHR45 LM 10x 4 1 RESULTADOS 150 células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos (CCRP):Fotografía 5 (40X), en las que predomina el área de hepatocitos respecto de la proliferación biliar, tanto en el área 1 y 2, como 3 del acino hepático. En función de los resultados obtenidos, se puede concluir que: 1. En el grupo de ratas con colestasis y terapia con células madre se aprecian zonas en las que existe una estructura hepática conservada, proliferación de hepatocitos con mitosis y mínima proliferación biliar en relación a las ratas colestásicas que sólo recibieron suero (figura 64). 2. Dentro de cada corte histológico de un mismo lóbulo se observó que existen áreas heterogéneas, ya que hay zonas donde los hepatocitos están preservados, e incluso existe mitosis hepatocitaria, y otras donde predomina la proliferación biliar (figura 65). 3. Se aprecia efecto lóbulo, es decir la cantidad de hepatocitos y la proliferación biliar no es homogénea en todo el hígado, apreciándose diferencias en función del lóbulo en el que se realice el estudio. En resumen, después de analizar histopatológicamente las muestras hepáticas obtenidas de los grupos de ratas con colestasis microquirúrgica y administración de suero (CM-S), con células de rata no diferenciadas (CCRND), con células humanas prediferenciadas (CCHP) y con células de rata prediferenciadas (CCRP), se puede concluir que en el grupo con administración de suero hay más fibrosis que en aquellos grupos en los que se administraron células madre, y dentro de estos, hay menos fibrosis en los grupos en los que se administraron células de rata que en los que se administraron células humanas. . V. DISCUSIÓN DISCUSIÓN 152 La administración intrahepática de células madre mesenquimales de origen adipocítico, tanto obtenidas del tejido adiposo del ser humano, como de la rata, a las dos semanas de evolución post-operatoria, en un modelo experimental microquirúrgico de colestasis extrahepática, donde los animales son sacrificados tras ocho semanas de insuficiencia hepática colestásica, produce efectos beneficiosos, ya que revierte parcialmente las alteraciones secundarias a la hipertensión portal y a la insuficiencia hepática, como son la hepatomegalia, la ascitis, la circulación colateral, el hipogonadismo, y la disminución de las concentraciones plasmáticas de parámetros de insuficiencia hepática así como la fibrosis y la proliferación biliar. De esta manera, se pueden apreciar diferencias significativas en los grupos donde se administraron células prediferenciadas humanas (CCHP), de rata no diferenciadas (CCRND), y de rata prediferenciadas (CCRP) siendo estas diferencias más marcadas en los grupos que recibieron células de rata. De tal forma se observa un enlentecimiento en la progresión de los datos histológicos propios de la colestasis, un descenso en el volumen de ascitis, así como también un descenso en la disminución del peso corporal, en la relación peso hepático/peso corporal, peso esplénico/peso corporal y un aumento en la relación peso testicular/peso corporal. En relación a la circulación colateral, en contra a lo expuesto anteriormente, los cambios propios de la colestasis están plenamente establecidos en todos los grupos colestaticos. La progresión de la vasculopatía mesentérica es similar en los grupos de células y en el control. Además, podemos encontrar en los grupos de células un descenso no significativo tanto en los parámetros de colestasis como en los de función hepática. La supervivencia global es baja, sobre todo en el grupo colestatico con administración de células humanas prediferenciadas (CCHP), posiblemente en relación a la inmunosupresión farmacológica. Si analizamos esta disminución de la supervivencia por etapas, observamos que hay un descenso no significativo en el grupo de células humanas por el aumento de la mortalidad intra operatoria secundaria al rechazo agudo, en relación al grupo que se administró suero (CMS) y a los grupos con administración de células de rata tanto prediferenciadas como no diferenciadas. Al igual, en fases posteriores (a partir de la primera semana post-administración de suero salino o de células madre hasta el sacrificio), se produce un descenso significativo de la supervivencia en las ratas que recibieron células madre humanas (CCHP), respecto a los grupos con administración de solución salina (CMS), o células de rata tanto DISCUSIÓN 153 indiferenciadas (CCRND) como prediferenciadas a hepatocitos (CCRP), posiblemente en relación a la inmunosupresión farmacológica. En el presente trabajo, se ha realizado un estudio comparativo del tratamiento de la fibrosis biliar en la rata, según se efectúe un isotransplante o bien xenotransplante de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo. El modelo experimental utilizado ha sido la colestasis extrahepática microquirúrgica en la rata, que tras una evolución de 8 semanas presenta insuficiencia hepática crónica con ictericia, hipertensión portal, circulación colateral porto sistémica, encefalopatía hepática y ascitis (Sánchez-Patan y cols., 2008; Aller y cols., 2008b; Aller y cols., 2010c; García-Domínguez y cols., 2010). La utilización de una técnica microquirúrgica para realizar la colestasis extra hepática en la rata, mejora los resultados conseguidos en el modelo experimental donde se utiliza la clásica técnica macroquirúrgica, consistente en la sección del colédoco entre las ligaduras. La microcirugía permite la disección de la vía biliar extra hepática sin ocasionar lesión vascular arterial o portal en el hilio hepático, así como su posterior resección sin lesionar el parénquima hepático (Diéguez y cols., 2002; Aller y cols., 2009b). Así mismo, la inexistencia de vía biliar extrahepática impide la formación de pseudoquistes biliares, que son propios de las técnicas macroquirúrgicas y que son causantes de precoces y graves complicaciones infecciosas, en particular abscesos hepatopulmonares y sepsis (Diéguez y cols., 2002; Aller y cols., 2009b; Aller y cols., 2009c). Las ratas con ictericia obstructiva microquirúrgica precisan en su evolución tratamiento con antibióticos de amplio espectro que aminora el riesgo de infección postoperatoria, y la administración de vitamina K, ya que de lo contrario, los animales fallecen con precocidad por hemorragias, por deficiencia de factores de coagulación vitamina K dependientes que produce la insuficiencia hepática progresiva (Aller y cols., 2009c). En este modelo experimental microquirúrgico, se produce una respuesta inflamatoria, tanto esplácnica como sistémica en la que están implicados factores, tanto pro inflamatorios como antiinflamatorios (García-Domínguez y cols., 2010), en particular, dentro de la respuesta inflamatoria esplácnica, destaca la propia del parénquima hepático, que se asemeja a la que acontece en las heridas y que finaliza con producción de fibrosis. En este sentido, se ha propuesto que sucesivamente se instaura, en el hígado un fenómeno de DISCUSIÓN 154 isquemia-reperfusión con estrés oxidativo, edema del espacio de Disse, activación de fibroblastos portales y células estrelladas hepáticas que se transforman en miofibroblastos, estimulación de células de Kupffer e infiltración intersticial leucocitaria y por último, intensa respuesta fibrogénica, si bien, asociada a proliferación canalicular biliar (Aller y cols., 2008b; Aller y cols., 2010c ; Aller y cols., 2010f). La colestasis extrahepática experimental causa alteración de la homeostasis del parénquima hepático y, en consecuencia, se produce apoptosis y necroptosis hepatocitaria, que contribuyen a la instauración de fibrosis (Jiang y cols., 2010). En particular la homeostasis hepática, se ha demostrado que depende, entre otros factores, de la correcta regulación de la autofagia. Este proceso catabólico celular es responsable de la degradación de los distintos componentes de la célula por los lisosomas (Mizushirna y cols., 2008). Mediante la eliminación autofágica de proteínas y mitocondrias anómalas, la célula es capaz de regular el estrés oxidativo y el crecimiento, evitando la apoptosis. En el caso de los hepatocitos, la autofagia también regula importantes fenómenos metabólicos, como son la gluconeogénesis, la Beta-Oxidación de los ácidos grasos y la (Czaja y cols., 2013). A su vez, la alteración de la actividad autofágica en las células estrelladas hepáticas contribuye a su activación, induciendo su diferenciación a miofibroblastos. Se han propuesto dos mecanismos que inducen principalmente la alteración de la autofagia en las células estrelladas hepáticas, como son el estrés oxidativo y el estrés del retículo endoplasmico, ambos vinculados a diferentes tipos de agresión hepática, incluyendo la colestasis (Hernández-Gea y cols., 2013; Deretic y cols., 2013). Por último, también la deficitaria actividad autofágica de los macrófagos y en particular, de las células de Kupffer, favorecería la excesiva respuesta inflamatoria profibrogénica hepática. En este sentido, se reduciría su capacidad antioxidativa y por tanto, antiinflamatoria, con incremento de la producción y liberación de mediadores proinflamatorios, como la IL-1-alfa, IL-1-beta, IL-6 y TGF-Beta, que a su vez, estimularian la diferenciación y la actividad de linfocitos Th 17 (De Castro y cols., 2012). Sin embargo, la autofagia, además de su capacidad hepatoprotectora, también puede ejercer un efecto profibrogénico cuando se activa en células con capacidad fibrogénica, lo que sugiere que existe un sutil equilibrio regulador de los mecanismo autofágicos, para mantener la homeostasis hepática (Mallat y cols., 2014). DISCUSIÓN 155 En las ratas con colestasis extrahepática, diferentes factores producen alteración de la regulación de la autofagia y por lo tanto, inducen apoptosis y fibronogénesis (Ertor y cols., 2013; Mahmoud y cols., 2014). Entre ellos, destaca la disminución de la capacidad antioxidativa, que favorece el estrés oxidativo y por tanto, la lesión hepática (Chen y cols., 2013). En este sentido, el modelo experimental de colestasis extrahepática, se ha propuesto como adecuado para estudiar los mecanismo patogénicos, que en los casos de atresia biliar producen insuficiencia hepática (Chen y cols., 2013; Wang y cols., 2014). Sin embargo, en estos modelos experimentales también debe considerarse necesaria la administración de vitamina K1, para evitar graves hemorragias precoces en los animales, que se ha sugerido que inhibe la activación fibrogénica de las células estrelladas hepáticas (Jiao y cols., 2014). El estrés oxidativo, la activación del sistema inmunológico y la transdiferenciación mesenquimal celular, son los mecanismos más frecuentemente descritos como profibrogénicos (Parola y cols., 2009; Liedtk C., 2013; PU y cols., 2013; Novo y cols., 2014; Park y cols., 2014; Pellicoro y cols., 2014; Cicchini y cols., 2015). La colestasis extrahepática incluye además, como factores etiopatogénicos, la hipertensión intraductal y el estasis de sales biliares. En particular, las sales biliares son potencialmente tóxicas para las células hepáticas y a elevadas concentraciones dañan la integridad mitocondrial, produciendo liberación de citocromo y activación de la apoptosis. Sin embargo, y como ya ha sido mencionado, la apoptosis también puede ser iniciada en el retículo endoplásmico (Mallat y cols., 2014). Así el acúmulo de sales biliares puede causar estrés del retículo endoplásmico y liberación de calcio iónico, con la subsiguiente activación de las cascadas apoptóxicas, tanto en hepatocitos como en colangiocitos (Beuers y cols., 2010). Sin embargo, los mecanismos productores de muerte hepatocitaria podrían ser múltiples en este modelo experimental de fibrosis biliar. En la actualidad, existe la evidencia de una cooperación entre los diversos mecanismos de muerte celular, lo que excluye considerar la implicación de un único mecanismo en su producción (Eguchi y cols., 2014). La eficacia del tratamiento con células madre mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos en las ratas con colestasis extrahepática, sugiere que este tipo de trasplante celular es capaz de revertir parcialmente la respuesta inflamatoria profibrogénica hepática y por tanto, reducir la intensidad de los mecanismos patogénicos inherentes a la muerte celular hepatocitaria. Las DISCUSIÓN 156 células madre mesenquimales retienen el potencial para diferenciarse a hepatocitos y así, son capaces de modular la inflamación hepática, asociando diferentes mecanismos, como son la producción de factores solubles y mediante contacto intercelular. Por lo tanto, el trasplante, por inyección intraparenquimatosa hepática, a las ratas con colestasis extrahepática, podría crear un ambiente propicio para la regeneración (Kadota y cols., 2014). Sin embargo, su prediferenciación a hepatocitos, podría favorecer esta función antiinflmatoria y proregenerativa. Las células mesenquimales derivadas del tejido adiposo, se diferencia a hepatocitos, tras ser tratadas con factor de crecimiento hepatocitario, dimetil sulfóxido y oncostatin M (Seo y cols., 2005). Protocolos posteriores de diferenciación hepatogénica de estas células mesenquimales, han permitido considerarlas como una terapia eficaz de la insuficiencia hepática (Teratani y cols., 2005; Banas y cols., 2007b). Los resultados del presente trabajo, sugieren que a su vez, el Isotrasplante, al evitar la respuesta inmunológica, favorece la recuperación estructural y funcional del hígado, respecto al xenotrasplante y por tanto es de elección. Así mismo, aunque las células madre mesenquimales derivadas del tejido graso, tiene capacidad regenerativa hepática, (Ishikawo y cols., 2012; Francois y cols., 2013; Lanzoni y cols., 2013) su prediferenciación a hepatocitos demuestra que produce una reversión significativa del grado de insuficiencia hepática y por lo tanto, de sus complicaciones respecto de las que no han sido prediferenciadas. La gran capacidad que poseen las células madre mesenquimales para diferenciarse en hepatocitos, ofrece múltiples posibilidades terapéuticas, tanto en la insuficiencia hepática aguda como crónica (Lange y cols., 2005; Volarevic y cols., 2014). En el ser humano, las células madres mesenqimales pueden ser obtenidas, no solo del tejido adiposo por lipoaspiración, sino también, de la médula ósea, del cordón umbilical y del líquido amniótico (Zheng y cols., 2008; Banas y cols., 2009). Con independencia de su origen, estas células pueden ser diferenciadas en células con características similares a hepatocitos (Lee y cols., 2004). La capacidad que tienen estas células prediferenciadas a hepatocitos de expresar funciones hepatocitarias, como son la síntesis de albúmina, el almacenamiento de glucógeno, la producción de urea, la captación de lipoproteínas de baja densidad y la actividad detoxificadora de citocromo P450, (LingL y cols., 2008; Volarenic y cols 2014) explica el significativo resultado terapéutico que hemos obtenido tras su administración a las ratas con insuficiencia hepática crónica colestásica. DISCUSIÓN 157 Aunque la investigación realizada sobre las funciones hepatocitarias de las células mesenquimales, demuestra su capacidad terapéutica en la insuficiencia hepática, (Esmaeli y cols., 2014; Jang y cols., 2014; LU y cols., 2014; Hang y cols., 2014) no se ha excluido la posibilidad de utilizar células madre hepáticas para suplir los hepatocitos perdidos, en casos de lesión hepática aguda o crónica, así como hepatocitos de hígado fetal y células madre embrionarias (Esrfoglu y cols., 2013; Lee y cols., 2014; Kamiga y cols., 2014). A favor de las utilización de las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo, se arguye que pueden ser obtenidas en gran número por lipoaspiración y que su capacidad inmunomoduladora, de diferenciación hepatocitaria y de albergarse en ambientes de lesión celular, así como de inductoras de revascularización y regeneración tisular, las hace enormemente atractivas para el tratamiento de la insuficiencia hepática, tanto aguda como crónica (Ochiya y cols., 2010; Seo y cols., 2005; Esrefoglu y cols., 2013; Fiore y cols., 2014). Recientemente, se ha demostrado que la fibrosis hepática secundaria a colestasis extrahepatica, se produce principalmente, por la activación de los miofibroblastos portales. Estos miofibroblastos fibrogénicos, contribuyen a la formación del 70% de los miofibroblastos que se originan en el 5º día de evolución, tras la ligadura y sección del colédoco en el ratón, (Iwaisako y cols., 2014). Los fibroblastos portales, normalmente rodean a la vena porta y mantienen la integridad de los tractos portales y por esta razón, se han denominado “fibroblastos periportales” (Dranoff y cols., 2010.). Tras colestasis extrahepática, los miofibroblastos portales expresan con mayor intensidad su RNA de colágeno tipo I, Alfa-actina de músculo liso (α-SMA) e Inhibidor de metaloproteinasa tisular-1 (TIMP-1), así como, receptor de IL-25. Por lo tanto la IL-25 podría estimular a los miofibroblastos portales, que secretarían IL-13, causando a su vez, la estimulación posterior de células estrelladas hepáticas (Iwaisako y cols., 2014). La inyección intraparenquimatosa hepática de células madre mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos, es posible que causen inhibición tanto de la respuesta fibrogénica inicial , protagonizada por fibroblastos periportales , como por la respuesta fibrogénica asociada posterior producida por las células estrelladas hepáticas , ya que dicho tratamiento fue realizado a las 2 semanas de evolución tras la realización de la colestasis extrahepática. Ambos tipos de células hepáticas fibrogénicas tienen su origen en el mesotelio. Durante su desarrollo embrionario el mesotelio sufre una transición epitelio-mesenquimal DISCUSIÓN 158 que produce tanto fibroblastos periportales como células estrelladas hepáticas (Enzan y cols., 1997; Hassan y cols., 2004). Sin embargo, mesotelina que se expresa en células mesoteliales normales, tan solo es expresado por fibroblastos portales activados, y por tanto se considera un marcador específico de este tipo de células fibrogenicas (Iwaisako y cols., 2014). Así mismo, el trasplante de células madre mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos, podrían desempeñar, tanto las funciones propias de los hepatocitos en los hígados de rata con fibrosis biliar, (Lee y cols., 2014) como inducir la transición mesénquimo-epitelial de las células estrelladas hepáticas. Las células estrelladas hepáticas quiescentes, están localizadas entre las células endoteliales sinusoidales y los hepatocitos en el espacio de Disse, que tiene unas características similares a los nichos de célula madre. Por estimulación, tras la producción de colestasis, estas células estrelladas, podrían transformarse en células con características hepatocitarias tras el trasplante de células madre mesenquimales. Este efecto paracrino de las células madre mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos, determinaría la diferenciación de las células estrelladas hepáticas en células mesenquimatosas hepáticas. En este sentido, se ha demostrado que las células estrelladas hepáticas en cultivo, pueden diferenciarse en células sintetizadoras de ácidos biliares y adquirir funciones contribuidoras a la regeneración hepática (Kordes y cols., 2014). Se ha demostrado, que las células estrelladas hepáticas ejercen una función primordial en el desarrollo embrionario del hígado, asi como en su homeostasis durante la vida adulta (Asahina, 2012). Durante el desarrollo embrionario, las células estrelladas hepáticas secretan quimioquina SDF-1, en tanto que las células endoteliales sinusoidales producen su receptor CXCR4. A su vez, las células endoteliales producen PDGF-beta, en tanto que las células estrelladas hepáticas producen su receptor. Así mismo, las células estrelladas hepáticas, mediante la producción de SDF-1 son capaces de reclutar células madre hematopoyéticas en el hígado, mediante el eje SDF-1alfa/CXCR4 (Yin y cols., 2013). Las células estrelladas hepáticas también producen factores de crecimiento, como Wnt, Factor de crecimiento fibroblástico (Fibroblastic growth factor; FGF), Factor de crecimiento hepatocitario (Hepatocyte growth factor; HGF) y ácido retinoico, que a su vez, regulan el crecimiento de las células epiteliales hepáticas (Alatas y cols., 2011; Chen y cols., 2012; Yin y cols., 2013). DISCUSIÓN 159 Por lo tanto, estos factores pueden estimular la proliferación de células progenitoras del hígado, así como de hepatocitos o bien, actuar indirectamente a través de las células endoteliales sinusoidales y las células inmunes, para regenerar el hígado (Friedman, 2008). Entre los factores de crecimiento citados, destaca Wnt, ya que es una vía de señalización hepática implicada en la patogénesis de la fibrosis (Thompson y cols., 2007). Esta vía de señalización produce inhibición de GSK 3 beta (Glycogen syntethase Kinase 3 B), que a su vez inhibe la degradación de Beta- catenina y su traslocación al núcleo, donde altera la expresión de genes Wnt. Sin embargo Wnt posee una vía de señalización independiente de Beta-catenina, mediante la liberación de calcio iónico intracelular, que activa la protein-kinasa C y calmodulina kinasa II sensible al calcio, así como la regulación del crecimiento y la diferenciación celular mediante la activación de GTP-asas que estimulan la actuación de quinasas, como rhoquiinasa y DNK (Miao y cols., 2013) . En esencia, Wnt está implicado en la fibrosis hepática, ya que puede causar activación y proliferación de las células estrelladas hepáticas, incluso tras su modificación por factores epigenéticos. Por lo tanto, es posible su modificación para tratar la fibrosis hepática. En este caso, la actividad paracrina de las células madre mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos, podría ejercer un efecto antifibrinogénico en el modelo experimental de colestasis extrahepática, inhibiendo la vía de señalización Wnt en las células estrelladas hepáticas activadas a miofibroblastos. Las células estrelladas hepáticas también expresan receptores Notch y genes que se estimulan por la vía de la señalización Notch, los cuales están implicados en la diferenciación de las células biliares intrahepáticas (Zong y cols., 2009). Se explicaría así su protagonismo en la producción de proliferación biliar en la colestasis extrahepática experimental. Además, las células estrelladas hepáticas pueden ejercer su actividad fibrogénica regulando la síntesis y destrucción de la matriz extracelular hepática. Así, pueden influenciar la diferenciación de los hepatoblastos durante el desarrollo embrionario, regulando los componente de la matriz extracelular, (Suzki y cols., 2003) o bien, degradar la matriz extracelular mediante la producción de metaloproteinasas, liberando moléculas biológicamente activas como, por ejemplo, citoquinas y factores de crecimiento, que se acumulan en su interior (Pi y cols., 2008). Por lo tanto, el isotrasplante de células madres mesenquimales intrahepático en la fibrosis biliar, podría favorecer la regeneración hepática, entre otros DISCUSIÓN 160 mecanismos, inhibiendo las funciones profibrogénicas de la células estrelladas hepáticas activadas a miofibroblastos. El trasplante de células madre mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos en ratas con ictericia obstructiva, no solo reduce la fibrosis, sino que también induce la expansión de la población hepatocitaria, en tanto que podría reducir la proliferación ductular biliar. Este efecto terapéutico, podría ser atribuido a la capacidad que poseen las células madre mesenquimales para revertir la desdiferenciación celular hepática que induce la respuesta inflamatoria secundaria a la colestasis extrahepática (Aller y cols., 2012b). En particular, la reacción ductular que se produce en la colestasis extrahepática, se corresponde con los estadios finales de la metaplasia o desdiferenciación colangiocitaria de los hepatocitos descrita por Desmet, (Desmet, 2011a) que induce la activación de células progenitoras existentes en el hígado y/o de células progenitoras formadas de novo en el hígado (Desmet, 2011b). Estas reacciones ductulares hepáticas, adoptan una configuración en “placa ductal”. Las places ductales son formas primitivas de conductos biliares intrahepáticos, formados durante el desarrollo embrionario del hígado y consisten en una doble pared celular que delimita una hendidura (Van Eyken y cols., 1988; Desmet 2011). En la mayoría de las reacciones ductulares que se producen en el hígado colestásico, se constituyen, a manera de pequeñas placas ductales, formadas por un pequeño vaso sanguíneo central, rodeado de una pequeña cantidad de mesénquima y una doble capa de células epiteliales biliares, que delimitan una hendidura luminal, casi virtual. Esta configuración se asemeja a las placas ductales embrionarias con estructura bicapa epitelial en un estadio precoz de remodelación (Desmet, 2011a). Por esta razón, la denominada “metaplasia colangiocítica” de los hepatocitos, podría representar una desdiferenciación hacia tipos celulares más primitivos (Desmet y cols., 1995). Este concepto de desdiferenciación celular es ratificado por diversos trabajos publicados en la literatura científica y ha sido atribuido, principalmente, a una respuesta a la inflamación (Aller y cols., 2013). Existen diferentes tipos de reacciones ductulares, que a lo largo de la evolución de la colestasis extrahepática experimental, se podrían expresar superponiéndose. Así, la denominada reacción ductular tipo I, es la que predomina tras la obstrucción aguda y total de la vía biliar. Este tipo de reacción, DISCUSIÓN 161 tiene como resultado, la proliferación de los colangiocitos preexistentes, con elongación, ramificación y dilatación de los conductos biliares (Desmet, 2011a). A su vez, la reacción ductular de tipo 2A, ha sido interpretada como una “metaplasia ductular” de los hepatocitos y se asocia a un cambio de su polaridad secretora. Este tipo de reacción ductular, se aprecia en las áreas periportales y es propia de la colestasis crónica, asociándose a fibrosis. Se considera que las reacciones ductulares de tipos 1 y 2 A, son reversibles cuando la causa de la obstrucción biliar es eliminada (Desmet, 2011a). Ya que la reacción ductular de tipo 2 A, se produce en las ratas con colestasis extrahepática microquirúrgica, (Aller y cols., 2008a) y revierte parcialmente tras el isotrasplante de células madre mesenquimales, a pesar de la persistencia de la causa original de la colestasis, cual es la obstrucción biliar, se precisa evaluar los mecanismos que inducen su reversión. La hipotética subdivisión del hígado, dependiendo del protagonismo vascular arterial y portal, implicaría la existencia de un parénquima arterio-biliar, por la dependencia trófica de la vía biliar con el flujo arterial hepático (Aller y cols., 2010c) y un parénquima complementario porto-hepatocitario, por la dependencia trófica de la trabéculas hepáticas con el flujo portal (Starzl y cols., 1973). La colestasis extrahepática, produce proliferación biliar y fibrosis, que a su vez reduce el flujo portal y menoscaba el funcionalismo hepatocitario. Sin embargo, la respuesta inflamatoria secundaria a la colestasis obstructiva, podría ejercer una acción ambivalente, según incida en el hígado arteriobiliar o en el hígado porto-hepatocitario. Así, en el hígado arteriobiliar la inflamación causaría un fenómeno de desdiferenciación, lo que explicaría formación de estructuras semejantes a las placas ductales, propias del desarrollo embrionario hepático (Desmet, 2011a). A su vez, la respuesta inflamatoria porto-hepatocitaria, induciría la desdiferenciación metabólica, con atrofia hepatocitaria. En este supuesto, el trasplante de células madre mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos, facilitaría, por su actividad inmunomoduladora, la reposición parcial hepatocitaria, favorecería el metabolismo hepático, mejorando la supervivencia de los animales, el grado de necrosis y/o apoptosis de los hepatocitos, la proteinemia y albuminemia y MELD, así como, reduciendo la hipertesión portal y la intensidad de la ascitis. La semejanza de las células trasplantadas con los hepatocitos, permite su función metabólica, si bien, deficitaria, (Esrefoglu, 2013) aunque poseen una elevada capacidad proliferativa y por lo tanto, en los días DISCUSIÓN 162 sucesivos a su trasplante proliferan y se especializan, recuperando significativamente la función hepática (Zhang y cols., 2010). Puesto que, el xenotrasplante de células madre mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos, no consigue los beneficiosos resultados del isotrasplante en las ratas colestásicas, debe considerarse, que dicho déficit funcional, podría ser atribuido a la agresión inmunológica de las células trasplantadas, a pesar del tratamiento inmunosupresor que les fue administrado durante el periodo posoperatorio. La agresión inmunológica de las células es un tema (Streckbein y cols., 2013), ya que algunos autores han obtenido buenos resultados sin un significativo rechazo (Arinzeh y cols., 2003; Ben-David y cols., 2011; Lin Ch S, Lin y cols., 2012; Tsuji y cols., 2014) mientras que otros demuestran la existencia de una importante respuesta immune post trasplante. (Grunnerns y cols., 2004; Poncelet y cols., 2007). Por esta razón, cuando hemos realizado xenotrasplante, administramos Tacrolimus, un macrólido inmunosupresor para la profilaxis del rechazo. Su mecanismo de acción es mediado por la inhibición de la calcineurina que impide la producción de IL-2 y por tanto reduce la proliferación de linfocitos T. (Brazelton y cols., 1996). En la actualidad los fármacos inhibidores de la Calcineurina constituyen el tratamiento fundamental en los protocolos inmunosupresores en el trasplante hepático (Ganschow y cols., 2014). El isotrasplante de células madres mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos, no solo recupera la función metabólica hepatocitaria, sino que también reduce significativamente el grado de fibrosis en el hígado con colestasis extrahepática crónica (Figura 48 y 49), ya que estas células madre multipotentes tienen actividad antiinflamatoria (Glenn y cols., 2014). La disminución o reversibilidad de la fibrosis podría atribuirse a la disminución de la producción de factores profibrogénicos por las células estrelladas hepáticas y el epitelio biliar proliferante, como por el incremento de factores antifibrogénicos. En este sentido, la disminución de la intensidad de la respuesta inflamatoria induciría también la diferenciación de los miofibroblastos derivados de fibroblastos portales y de células estrelladas hepáticas, adoptando un fenotipo inerte (Pellicoro y cols., 2014; Jawaisako y cols., 2014). Sin embargo, se debe excluir la posibilidad de que se produzca una transdiferenciación mesénquimo- epitelial , ya que se ha demostrado que las células estrelladas hepáticas son suficientemente multipotentes para producir hepatocitos, colangiocitos o células ovales, por transición mesénquimo-epitelial , (Lua y cols., 2014). Por el contrario DISCUSIÓN 163 no se puede excluir la posibilidad de que uno de los efectos terapéuticos de las células madre mesenquimales sea la producción de hepatocitos a expensas de los conductos biliares proliferantes o células ovales (Tarlow y cols., 2014). Por lo tanto, los efectos beneficiosos del trasplante de células madres mesenquimales en el hígado de rata con fibrosis biliar, podría ser atribuido, principalmente, a sus efectos inmunomoduladores e inmunosupresores, que suprimirían o reducirían la inflamación (Kyurkchiev y cols., 2014, Glenn J D y cols., 2014). A su vez, tras su prediferenciación a hepatocitos, se favorecería su utilización para conseguir la regeneración hepática (Wu y cols., 2012: Qin y cols, 2014). Respecto a las alteraciones esplácnicas y sistémicas que se asocian a la fibrosis biliar en la rata, destacan la hipertensión portal con circulación colateral portosistémica con vasculopatía venosa mesentérica, esplenomegalia, ictericia, disfunción renal, encefalopatía, hipogonadismo y ascitis. Estas alteraciones son propias, tanto del modelo experimental de colestasis extrahepática microquirúrgico, como macroquirúrgico (Aller y cols., 2009b; Aller y cols., 2008b). Los animales evolucionan con circulación hiperdinámica esplácnica y sistémica (Martinez-Prieto y cols., 2000; Atucha y cols., 2000; Li y cols., 2003; D’Aroico y cols., 2012), disfunción inmunológicacon traslocación bactriana intestinal e importante respuesta de fase aguda (Elgek y cols., 2012; Sipeki y cols., 2014; Barut y cols., 2014), encefalopatía hepática (García-Moreno y cols., 2005; Méndez y cols., 2008; Hosseini y cols., 2014), disfunción hepática y renal (Harry y cols., 1999; Adebayo y cols., 2014) y ascitis (Salerno y cols., 2010; Aller y cols.,2010e). Sin embargo, en este modelo experimental se consideran dos periodos evolutivos con distintas características. Durante el primer periodo evolutivo, los animales desarrollan insuficiencia hepática crónica de evolución progresiva hasta las 6 semanas del posoperatorio. A partir de esta fecha, la aparición de ascitis indica la descompensación de la insuficiencia hepática crónica, instaurándose un fallo hepático agudo sobre el crónico, con fallecimiento de los animales hacia la 9-10 semana de evolución (Li y cols., 2003; Aller y cols., 2004a). Se considera, que a partir de la 6ª semana de evolución, las ratas con colestasis obstructiva microquirúrgica, inician una fase de franca descompensación, asociándose una intensa respuesta de fase aguda, con incremento de las concentraciones séricas de glicoproteína ácida alfa-1 y tiostatina, edema mesentérico, principalmente DISCUSIÓN 164 peripancreático e incremento de citoquinas Th1 y Th2 en intestino delgado y el complejo ganglionar mesentérico.(García-Domínguez, 2010). Esta asociación de citoquinas consideradas proinflamatorias y antiinflamatorias en el área esplácnica (Aller y cols., 2008b), sugiere la existencia de una modulación inmune con respuestas antagónicas. Se ha propuesto que en esta fase descompensada de la evolución de la insuficiencia hepática crónica, se produciría un cambio metabólico, con instauración de un metabolismo oxidativo que se fundamentaría en la reducida producción energética por glucolisis (Aller y cols., 2010b). Mediante este mecanismo metabólico defensivo se reducirían las necesidades energéticas del organismo y por lo tanto, también la capacidad para expresar funciones celulares sumamente especializadas, especialmente las funciones celulares creadoras de barreras endoteliales, epiteliales y mesoteliales, que son las que compartimentan eficazmente el organismo (Aller y cols., 2010b). Quizá por esta razón, una vez que se inicia la fase de descompensación en las ratas colestásicas, la progresiva reducción de la actividad metabólica, causaría el aumento progresivo de la permeabilidad de las barreras epiteliales, por ejemplo, gastrointestinal y urinaria y barreras endoteliales, por ejemplo, los sistemas microcirculatorios sanguíneo y linfático esplácnicos y por último, las barreras mesoteliales, por ejemplo, el peritoneo. En suma, se originaría una grave descompartimentalización, principalmente esplácnica, que produciría fracaso funcional multiorgánico. En este hipotético caso, se establecería en el territorio esplácnico, un eje inflamatorio en el que concurrirían patologías epiteliales, endoteliales y mesoteliales, caracterizadas por el aumento de la permeabilidad, por lo que se instauraría una continuidad anómala entre el espacio intersticial gastrointestinal, el sistema vascular linfático mesentérico y la cavidad peritoneal (Aller y cols., 2010e). En particular, el intersticio esplácnico, los linfáticos mesentéricos y el mesotelio peritoneal, podrían crear una vía inflamatoria, que tendría gran relevancia fisiopatológica cuando se produce fallo hepático agudo sobre crónico, como sucede en las ratas con colestasis extrahepática a las 6 semanas de evolución posoperatoria. La instauración de un brusco cambio metabólico esplácnico en las ratas colestásicas, como causa principal de la descompensación de la insuficiencia hepática crónica, podría permitir integrar los diferentes mecanismos etiopatogénicos propuestos para explicar la aparición de ascitis (Cazaniga y DISCUSIÓN 165 cols., 2009; Arroyo y cols., 2014; Zamora y cols., 2004; Kim y cols., 2013; Moreau y cols., 2013; Asrani y cols., 2014). En este sentido, el estado hipometabólico que se produce durante este proceso inflamatorio agudo sobre crónico, podría inducir una desdiferenciación celular. Así, las células endoteliales, epiteliales y mesoteliales esplácnicas, al adoptar propiedades similares a la que poseen las células madre, reducirían la expresión de genes que codifican moléculas de adhesión (Auraamides y cols., 2008), lo que a su vez, facilitaría el aumento de la permeabilidad de las barreras que respectivamente constituyen el individuo adulto. En este supuesto, el isotrasplante de células mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos a las ratas con colestasis obstructiva microquirúrgica, se alojaría en el hígado lesionado y por su capacidad para la diferenciación, mejorarían la función hepatocelular y por tanto el metabolismo (Ochiya y cols., 2010; Kim y cols., 2011). Estas células prediferenciadas a hepatocitos, aunque no tienen las características de los hepatocitos maduros, pueden generar hepatocitos y por consiguiente, favorecerían la recuperación metabólica de los animales. En este caso, impedirían o aminorarían la desdiferenciación celular impuesta por la inflamación aguda sobre crónica y en consecuencia, reducirían sus complicaciones, en particular, el grado de ascitis. Las células madre derivadas de tejido adiposo poseen numerosas funciones que les permiten alojarse en tejidos lesionados, como son, la capacidad para la inmunomodulación y la revascularización, pero, además, ejercen actividad antiapoptótica, de diferenciación y regenerativa (Esrefoglu, 2013). Además, una vez trasplantadas en animales con insuficiencia hepática, residen en el hígado lesionado y se diferencian a hepatocitos (Banas y cols., 2009). En el presente trabajo el isotrasplante en ratas con fibrosis biliar, reduce el grado de insuficiencia hepática, fibrosis biliar y ascitis, aunque su eficacia es menor que la propia de estas células cuando son prediferenciadas a hepatocitos. Las células madre mesenquimales ejercen una función inmunomoduladora, por sus propiedades anti inflamatorias (Glenn y cols., 2014). Se ha demostrado, que su acción inmunosupresora incluye, tanto la inmunidad natural como la adquirida. Así, las células madre mesenquimales antagonizan el fenotipo proinflamatorio de los macrófagos tipo 1 (M1), en tanto, potencian el fenotipo macrofágico tipo 2 (M2), productor de IL-10, (Kim y cols., 2009). Así mismo, producen prostaglandina E2 (PGE2), que suprime al TNF-alfa y a la IL-6 DISCUSIÓN 166 (Maggini y cols., 2010) y reduce el estrés oxidativo al aumentar la producción de glutatión (Ayatollani y cols., 2014). Este conjunto de funciones, explicaría su capacidad para revertir la fibrosis hepática y por tanto, mejorar la función de los hígados, tanto tras la administración de troacetamida como de tetracloruro de carbono (Ayatollani y cols., 2014). Así mismo, las células madre mesenquimales inhiben la capacidad de las células cebadas para degranular (Brown y cols., 2011), mediante la producción de PGE2. En particular, en la insuficiencia hepatica crónica, así como en la hipertensión portal prehepática experimental, se ha sugerido que los mediadores inflamatorios producidos por las células cebadas, podrían tener un destacado protagonista en la producción de la inflamación esplácnica (Prieto y cols., 2005; Aller y cols., 2007c). Las células cebadas participan, tanto en la respuesta inmunitaria natural como en la adquirida y en las ratas con hipertensión portal, la infiltración que producen, tanto en el intestino delgado como en los ganglios linfáticos mesentéricos, sugiere dicha actividad dual en la inflamación esplácnica (Aller y cols., 2007c). En los animales con colestasis extrahepática microquirúrgica, el hígado presenta aumento significativo de la densidad de las células cebadas. Estás células se acumulan en los espacios porta y en los septos fibrosos, asociándose pues, a la fibrosis y a la proliferación ductular biliar (Aller y cols., 2008a). Las células cebadas residen habitualmente, aunque en escaso número, en los tractos portales hepáticos, sin embargo, en las patologías hepáticas crónicas, como son la cirrosis biliar primaria y la cirrosis alcohólica, su número aumenta invadiendo, no solo los espacios portales, sino también los sinusoides (Farrel y cols., 1995). En estas enfermedades hepáticas progresivas, el incremento del número de células cebadas se correlaciona con el grado de fibrosis hepática. Por lo tanto, se ha sugerido que las células cebadas y sus mediadores podrían estar implicadas en la fibrogénesis hepática (Francis y cols.,2010; Francis y cols., 2010). En la colestasis extrahepática experimental, también se ha demostrado, que las células cebadas se acumulan en los espacios portales, alrededor de los conductos biliares proliferantes (Takeshita y cols., 2005). Sin embargo, las células cebadas también pueden migrar a los ganglios linfáticos e inducir tolerancia. Así, se ha demostrado que el trasplante de órganos cursa con migración de células cebadas a los ganglios linfáticos, donde participan en la presentación de antígenos a linfocitos T, así como contribuyen a la inducción de (Jahauyar y cols,, 2008; Bond y cols., 2015). DISCUSIÓN 167 Estos resultados contradictorios, se atribuyen a la gran capacidad que poseen las células cebadas para modificar su fenotipo, en relación con las características ambientales, el tipo de estímulo que reciben y el tejido u órgano de procedencia. Así mismo, es variable su proceso de síntesis, almacenamiento y secreción de mediadores (Moon y cols., 2014). Por lo tanto, no se puede excluir que tras la inyección intrahepática de células madre mesenquimales, se modifique su fenotipo en razón a las nuevas características bioquímicas que impone este trasplante celular. Incluso, las células cebadas pueden ejercer funciones antiinflamatorias, por ejemplo, mediante la degradación enzimática de citoquinas proinflamatorias y quimoquinas (Wernersson y cols., 2014). Ya que el modelo experimental de colestasis extrahepática microquirúrgica cursa, a partir de la 6ª semana de evolución, con fracaso hepático agudo sobre crónico productor de ascitis, se puede considerar que tanto el xenotrasplante de células madre mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos, como el isotrasplante de dicho tipo de células, es un tratamiento eficaz de esta grave complicación. Tanto el xenotrasplante como el isotrasplante, favorecerían la reversión parcial de la insuficiencia hepática aguda, por sus acciones antiinflamatorias (Kyurkchiev y cols., 2014; Glenn y cols., 2014) como promotora de regeneración (Zhov y cols., 2014). Esta capacidad regeneradora hepatica, también ha sido demostrada experimentalmente, utilizando células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (Sato y cols., 2005; Cho y cols., 2009; Sun y cols., 2013). Las células madre mesenquimales humanas procedentes de la médula ósea, han sido trasplantadas, tras su encapsulación para favorecer su protección inmunológica, a ratones cirróticos. Por este método se consigue incrementar su eficacia antiinflamatoria y antifibrótica. Mediante la producción de mediadores antiinflamatorios, las células madre mesenquimales microencapsuladas, reducen la concentración de RNA mensajero, de colágeno tipo 2 y aumentan la producción de metaloproteinasa 9, así como incrementan los niveles plasmáticos de receptor soluble de IL-1 (IL-1Ra) humano (Meier y cols., 2014). La insuficiencia hepatica aguda sobre crónica, se ha propuesto que induce una regresión metabólica, con la adopción de un fenotipo denominado de isquemia-reperfusión, que se caracteriza por la producción de hipoxia o disoxia, hipometabolismo y edema intersticial (Aller y cols., 2007c; Aller y cols., 2010). El organismo que sufre los efectos de este fenotipo, aumentaría el estrés oxidativo y enzimático, que favorecería su hidratación y salinización, con retención de DISCUSIÓN 168 agua y sal, edema celular e intersticial, disminución de la producción de energía al utilizar en exceso la glicolisis y desdiferenciación celular con inhibición de las funciones especializadas, que comporta la disminución en la producción de uniones intercelulares y por tanto, la descompartimentalización del organismo (Aller y cols., 2010e). Este supuesto mecanismo de supervivencia, ante la grave deficiencia metabólica impuesta por el fracaso hepático agudo, causaría, a su vez, un síndrome hepato-renal, con ascitis refractaria al tratamiento (Salerno y cols., 2010; Adebayo y cols., 2014). En esencia, la insuficiencia metabólica asociada a este fenotipo de isquemia-revascularización, causaría un fenómeno de desdiferenciación, que favorecería la supervivencia. En este grave proceso defensivo, se considera que también podrían participar las células cebadas, ya que poseen mediadores inflamatorios capaces de causar las alteraciones hemodinámicas y metabólicas asociadas a la ascitis (Allen y cols., 2007c). Por esta razón, la reversión parcial de la ascitis en las ratas con xenotrasplante e isotrasplante de células madre mesenquimales pre diferenciadas a hepatocitos, reflejaría su efecto antiinflamatorio y favorecedor del metabolismo esplácnico. La descompensación de la insuficiencia hepática colestásica, aumentaría la permeabilidad endotelial en el eje hepato-intestinal con edema intersticial, incremento del drenaje linfático y disfunción linfática esplácnica con linfangiectasia, que se asociaría a la producción de ascitis (Wiig y cols., 2012; Seo y cols., 2012). A su vez, el tratamiento con células madre mesenquimales, al diferenciarse en hepatocitos favorecerían el metabolismo hepático, potenciarían la diferenciación celular, reducirían la permeabilidad endotelial, aminorarían el edema intersticial y el drenaje linfático y en conseciuencia, reducirían la producción de líquido ascítico. Este efecto terapéutico de las células madre mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos es superior en el caso de los isotrasplantes respecto a los xenotrasplantes, lo que sugiere que la agresión inmunológica del injerto reduce su eficacia. Por el contrario, el isotrasplante, incluso utilizando células madre mesenquimales no prediferenciadas a hepatocitos produce una reducción mas significativa del volumen de líquido ascítico que el xenotrasplante y por esta razón, se podría considerar de elección en el tratamiento de la insuficiencia hepática aguda sobre crónica. DISCUSIÓN 169 En conclusión, los resultados del presente trabajo experimental demuestran que el tratamiento con células mesenquimales derivadas de tejido adiposo, tanto prediferenciadas a hepatocitos como no prediferenciadas, revierte significativamente las alteraciones que son propias de la insuficiencia hepática crónica descompensada o aguda sobre crónica en la rata con colestasis extrahepática microquirúrgica. Sin embargo, el mecanismo podría ser diferente según se utilicen células madre mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos o no prediferenciadas. En el primer caso, la intensa función metabólica y regeneradora hepatocitaria, induciría la reversibilidad de la desdiferenciación inflamatoria. En esencia, el retorno de la capacidad para el metabolismo fundamentado en la fosforilación oxidativa y por tanto con elevada producción energética, propio de las células epiteliales especializadas, revertiría a fibrosis hepática y la proliferación biliar. A su vez, el trasplante de células madre mesenquimales no prediferenciadas a hepatocitos ejercerían principalmente, una actividad inmunosupresora, si bien, con posterioridad y mediante trans diferenciación a hepatocitos, poseerían un efecto regenerador hepático y prometabólico. Quizás por esta razón, su efecto terapéutico es menor respecto del logrado por las células madre mesenquimales prediferenciadas a hepatocitos. La respuesta inflamatoria hepática a la colestasis extrahepática es compleja y en ella participan múltiples mecanismos como son el estrés oxidativo (Czaja y cols., 2014), la hipoxia con actividad del factor inducible por hipoxia (HIF)-1-alfa (Zhan y cols., 2015), la activación de células de Kupffer (Marra y cols., 2014), la infiltración leucocitaria (Xu y cols., 2014), la activación inicial de fibroblastos portales (Clozeau-Girard y cols., 2006; Kissileva y cols., 2012; Wells y cols., 2014) y más tarde de células estrelladas hepáticas (Freise y cols., 2004; Iwaisako y cols., 2014; Marra y cols., 2014). El resultado final, es la fibrosis billiar con intensa proliferación ductular biliar (Aller y cols, 2008a). La mayor eficiencia obtenida con el trasplante de células madre mesenquimales cuando se prediferencian a hepatocitos, tanto en la reversibilidad de la patología hepática, como extrahepática, reflejarían la importancia que posee el metabolismo hepatocitario, para mantener la diferenciación celular de endotelios, epitelios y mesotelios, que es fundamental, a su vez, para regular la homeostasis orgánica. Respecto de su capacidad para revertir la patología hepática, se debe destacar la gran influencia que ejerce la recuperación metabólica en los distintos mecanismos que se implican en la respuesta inflamatoria. Entre otros DISCUSIÓN 170 mecanismos, la actividad metabólica hepatocitaria, crearía unas condiciones medioambientales o epigenéticas, que inducirían un fenotipo quiescente (Xu y cols., 2014) En esencia, la regulación epigenética de los miofibroblastos, silenciaría los genes profibrogénicos, facilitando la transcripción de genes antifibrogénicos, como son IKB-alfa y PPAR-gamma (Yang y cols., 2012). Las modificaciones post-translocacionales de las histonas nucleosómicas, pueden ser reguladas por metilación, acetilación y fosforilación, lo que permite el cambio en la expresión genética sin alteración de la estructura cromosómica (Henikoff y cols., 2008). Por este mecanismo, se ha propuesto que las alteraciones ambientales, pueden regular la respuesta proinflamatoria y profibrogénica hepática (Tsukamoto y cols., 2012), y por tanto, este efecto puede ser extrapolable a las alteraciones extrahepáticas propias de la ictericia obstructiva. Por último, estos resultados de la investigación experimental, referentes a la ictericia obstructiva, podrían ser trasladados a la clínica humana. En particular, el modelo experimental de colestasis extrahepática microquirúrgica, podría ser utilizado para el estudio de los mecanismos patogénicos que causan la atresia biliar, así como, para su tratamiento potencial, mediante trasplante de células madre mesenquimales (Deng y cols., 2011). En conclusión, aunque los resultados terapéuticos de las células madre mesenquimales, tanto obtenidas del tejido adiposo del ser humano, como de la rata, en la insuficiencia hepática crónica colestásica en la rata sugieren su efecto beneficioso, tanto esplácnico como sistémico, se desconocen sus mecanismos íntimos de acción, los cuales deben ser dilucidados antes de proceder a utilización en la clínica humana. El modelo experimental de fibrosis colestásica en la rata ha permitido demostrar que su patología multifactorial puede ser tratada mediante trasplante de células madre mesenquimales y, por esta razón, se podría sugerir también su utilización para investigar los complejos mecanismos fisiopatológicos inherentes tanto a la hipertensión portal como a la insuficiencia hepática crónica. VI. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 172 1. La colestasis extrahepática microquirúrgica en la rata permite obtener un modelo experimental de insuficiencia hepática aguda sobre crónica. 2. El trasplante de células madre mesenquimales produce la reversión parcial de la patología hepática y extra hepática propia de la insuficiencia hepática crónica descompensada. 3. El xenotrasplante de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo disminuye las complicaciones propias de la colestasis obstructiva crónica en la rata. 4. El isotrasplante de células madre mesinquimales derivadas de tejido adiposo y prediferenciadas a hepatocitos es más eficaz que el xenotrasplante para reducir las complicaciones hepáticas y extrahepáticas secundarias a la colestasis microquirúrgica extrahepática en la rata VII. BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 174 Abdeldayem H, Ghoneim E, Refaei AA, Abou-Gabal A. Obstructive jaundice promotes intestinal-barrier dysfunction and bacterial translocation: experimental study. Hepatol Int. 2007;1: 444-8. Abdel-khalek EE, El-fakhry A, Helaly M, Hamed M, Elbaz O. Systemic inflammatory response syndrome in patients with liver cirrhosis. Araba J Gastroenterol 2011; 12: 173-7. Abrahám S, Szabó A, Kaszaki J, Varga R, Eder K, Duda E, Lázár G, Tiszlavicz L, Boros M, Lázár G Jr. Kupffer cell blockade improves the endotoxin-induced microcirculatory inflammatory response in obstructive jaundice. Shock 2008; 30:69-74. Abraldes JG, Pasarín M, García-Pagán JC. Animal models of portal hypertension. 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ANEXO 1; COMUNICACIONES A CONGRESOS..……………........... 229 ANEXO 2: TABLAS...…………………...................................................... 231 I. Tabla 6: Volumen de líquido ascítico………………….......................... 231 II. Tabla 7: Circulación colateral portosistémica…………………………... 231 III. Tabla 8: Vasculopatía venosa mesentérica………………………….. 232 IV. Tabla 9: Peso corporal inicial (PCI;g), peso corporal final (PCF;g), e incremento de peso corporal ( peso; g) …………………………. 232 V. Tabla 10: Peso hepático (PH;g), Relación peso hepático / peso corporal x100 (PH/PC; %) ………………………………………. 233 VI. Tabla 12: Peso esplénico (PE;g) y Relación peso esplénico / peso corporal x 100 (PE/PC; %) ………………………..…………….. 233 VII. Tabla 13: Peso testicular bilateral (PT;g) y Relación peso testicular / peso corporal x 100 (PT/PC; %) ……………………………………… 234 VIII. Tabla 14: Concentraciones séricas de Bilirrubina Total (BT; mg/dl) y Bilirrubina Directa (BD; mg/dl), relación Bilirrubina Directa respecto a Bilirrubina Total (BD/BTx100), AST (U/L), ALT (U/L), FA(U/L) yGGT (U/L)…………………………………………………… 235 IX. Tabla 15:Concentraciones séricas de AST (U/L), ALT (U/L), FA(U/L) y GGT(U/L)……………………………………………........... 235 X. Tabla 16: Concentraciones séricas de Urea (mg/dl), Creatinina (Cr; mg/dl), Albúmina (Alb; g/dl) y Proteínas Totales(PT;g/dl)……. 236 XI. Tabla 17: Tiempo de Protrombina (TProt; seg), Actividad de Protrombina (ActProt; %), Fibrinógeno (F; mg/dl),International Normalized Ratio (INR), Tiempo de Cefalina (TCefal; seg) Ratio de Tiempo de Cefalina (RatTCefal)…………...................... 237 XII. Tabla 18:Determinación del“Modelforend-stageLiverDisease” (MELD) 237 ANEXOS 228 XIII. Tabla 19: Puntuaciones asignadas a las diferentes variables histopatológicas evaluadas en los hígados de ratas del grupo CMS (Colestasis microquirúrgica con administración de suero salino)… 238 XIV. Tabla 20: Puntuaciones asignadas a las diferentes variables histopatológicas evaluadas en los hígados de ratas del grupo CCHP (Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos)…... 239 XV. Tabla 21: Puntuaciones asignadas a las diferentes variables histopatológicas evaluadas en los hígados de ratas del grupo CRND (Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas)…………………… 241 XVI. Tabla 22: Puntuaciones asignadas a las diferentes variables histopatológicas evaluadas en los hígados de ratas del grupo CRPD (Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos)........ 244 ANEXOS 229 ANEXO I; COMUNICACIONES A CONGRESOS: 1. AUTORES: ARGUDO S, ALLER MA, DE MIGUEL MP, PRIETO I, FUENTES S, BLÁZQUEZ A, GILSANZ C, ALONSO A. TITULO: “Resultados histopatológicos de la terapia experimental con células madre pre diferenciadas a hepatocito en un modelo de insuficiencia hepática secundario a colestasis extrahepática en ratas” TIPO DE PARTICIPACIÓN: Comunicación Oral. PREMIO a la mejor Comunicación por Investigadores Jóvenes. CONGRESO: XX Congreso de la Sociedad Española de Investigaciones Quirúrgicas LUGAR DE CELEBRACIÓN: Albacete AÑO: Octubre, 23-24, 2014. ANEXOS 230 2. AUTORES: ARGUDO S, ALLER MA, DE MIGUEL MP, PRIETO I, ARIAS J, GILSANZ C, ALONSO A. TITULO: “Terapia con células madre de origen mesenquimal en in modelo experimental de insuficiencia hepática” TIPO DE PARTICIPACIÓN: Comunicación Oral. CONGRESO: XXX Congreso Nacional de Cirugía de la Asociación Española de Cirujanos. LUGAR DE CELEBRACIÓN: Madrid. AÑO: Noviembre, 10-13, 2014. ANEXOS 231 ANEXOS 232 ANEXO II; TABLAS: Tabla 6. Volumen de líquido ascítico.CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos Media± DE Tabla 7. Circulación colateral portosistémica en ratas con colestasis microquirúrgica: Areasparaesofágica (CPE), esplenorrenal (CER), y pararrectal (CPR). SO: Seudo-operadas.CM-S:Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos GRUPO CPE CER CPR n % n % n % I CM-S (n=20) 20 100 20 100 20 100 II (CCRND) (n=47) 47 100 47 100 47 100 III (CCHP) (n=38) 38 100 38 100 38 100 IV (CCRP) (n=30) 30 100 30 100 30 100 GRUPO ASCITIS (ml) I CM-S (n=20) 4,26 ± 3,5 II (CCRND) (n=47) 2,44 ± 1,91 III (CCHP) (n=38) 2,53 ± 1,88 IV CCRP (n=30) 2,2 ± 2,46 ANEXOS 233 Tabla 8. Vasculopatía venosa mesentérica: grado 0 (ausente), grado I (secundaria al clampaje transitorio de la vena mesentérica superior) y grado II (espontánea).CM- S:Colestasiscon administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas.CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. GRUPO GRADO 0 GRADO I GRADO II n % n % n % CM-S (n=20) 0 0 20 100 0 0 CCRND (n=47) 0 0 47 100 0 0 CCHP (n=38) 0 0 38 100 0 0 CCRP (n=30) 0 0 30 100 0 0 Tabla 9. Peso corporal inicial (PCI;g), peso corporal final (PCF;g), e incremento de peso corporal (∆ peso; g) en las ratas de los grupos de estudio.SO: Seudo-operadas. CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos GRUPO PCI (g) PCF (g) ∆PC (g) C SO (n=20) 292,13 ± 33,3 360 ± 10 86ººº; ** ± 23 I CM-S (n=20) 287,9 ± 41,57 315,25● ± 44,39 32,39ºº ± 26,17 II CCRND (n=47) 269,17 ± 50,23 322,08 ± 48,39 53,04ºº ± 22,22 III CCHP (n=38) 326,47♣♣ ± 70,37 281,87●● ± 42 -37,8 ± 22,73 IV CCRP (n=30) 311,87♣ ± 26,58 365,6 ± 35,39 56,05ºº ± 35,98 ANEXOS 234 Media ± DE**p<0.01: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S; ♣p<0.05; ♣♣ p<0,01: Valor estadísticamente significativo respecto de CCRND; ●p<0.05; ●●p<0.01: Valor estadísticamente significativo respecto de CCRP;ººp<0.01;ºººp<0.001: Valor estadísticamente significativo respecto de CCHP. Tabla 10. Peso hepático (PH;g), Relación peso hepático / peso corporal x 100 (PH/PC; %)SO: Seudo-operadas CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. Media ± DE:♦p<0.05;♦♦p<0.01;♦♦♦p<0.001:Valor estadísticamente significativo respecto de SO; *p<0.05; ***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S. Tabla 12. Peso esplénico (PE;g) y Relación peso esplénico / peso corporal x 100 (PE/PC; %) en las ratas de los diferentes grupos de estudio: SO: Seudo-operadas CM-S: Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. GRUPO PH (g) PH/PC x100 SO (n=20 ) 10,58*** ± 0,22 3,02*** ± 0,10 I CM-S (n=20) 23♦♦♦ ± 3,09 7,39♦♦♦ ± 1,18 II (CCRND) (n=47) 18,07♦♦ ± 4,99 5,67♦♦* ± 1,56 III (CCHP) (n=38) 17,03♦* ± 4,1 6,14♦♦♦ ± 1,78 IV CCRP (n=30) 19,28♦♦ ± 4,99 5,27♦♦* ± 1,25 ANEXOS 235 Media ± DE; ♦♦p<0.01; ♦♦♦p<0.001: Valor estadísticamente significativo respecto de SO; *p<0.05; Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S. Tabla 13. Peso testicular bilateral (PT;g) y Relación peso testicular / peso corporal x 100 (PT/PC; %) en las ratas de los diferentes grupos de estudio: SO: Seudo- operadas CM-S:Colestasis con administración de suero salino. CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCHP: Colestasis con administración de células madre humanas adipocíticasprediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos GRUPO PE PE/PC (%) C SO (n=20) 0,58 ± 0,01 0,15 ± 0,005 I CM-S (n=20) 1,70♦♦♦ ± 0,29 0,55♦♦♦ ± 0,11 II (CCRND) (n=47) 1,44♦♦♦ ± 0,23 0,45♦♦♦ ± 0,09 III (CCHP) (n=38) 1,28*♦♦♦ ± 0,58 0,46♦♦♦ ± 0,22 IV CCRP (n=30) 1,35♦♦♦ ± 0,3 0,37*♦♦ ± 0,08 GRUPO PT PT/PC (%) C SO (n=20) 2,83 ± 0,04 0,78 ± 0,02 I CM-S (n=20) 1,6♦ ± 0,74 0,52 ± 0,27 II (CCRND) (n=47) 2,31 ± 0,7 0,72 ± 0,21 III (CCHP) (n=38) 1,65♦ ± 0,2 0,6 ± 0,37 IV CCRP (n=30) 3,24*** ± 0,58 0,89* ± 0,13 ANEXOS 236 Media ± DE; ♦p<0.05: Valor estadísticamente significativo respecto de SO; *p<0.05;***p<0.001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S. Tabla 14. Concentraciones séricas de Bilirrubina Total (BT; mg/dl) y Bilirrubina Directa (BD; mg/dl), relación Bilirrubina Directa respecto a Bilirrubina Total ( BD/BTx100), AST (U/L), ALT (U/L), FA(U/L) y GGT ((U/L) en ratas con colestasis microquirúrgica.SO: seudo-operadas; CM-S:Colestasis con administración de suero salino CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas.CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. GRUPO BT (mg/dl) BD (mg/dl) BD/BT x100 SO (n=20) 0,09 ± 0,05 0,01 ± 0,01 - CM-S (n=20) 8,57♦♦♦ ± 3,15 3,87♦♦♦ ± 1,68 45,84 ± 15,55 CCRND (n=47) 8,25♦♦♦ ± 2,19 4,96♦♦♦ ± 1,24 60,56*** ± 5,45 CCHP (n=38) 8,19♦♦♦ ± 1,44 4,69♦♦♦ ± 1,18 56,95** ± 8,13 CCRP (n=30) 7,93♦♦♦ ± 1,88 4,78♦♦♦ ± 1,03 58,03** ± 4,85 Media±DE; ♦♦♦p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de SO; ;**p<0.01;***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S. Tabla 15. Concentraciones séricas de AST (U/L), ALT (U/L), FA(U/L) y GGT ((U/L) en las ratas de los diferentes grupos de estudio: SO: seudo-operadas; CM-S: Colestasis con administración de suero salino CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas.CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. ANEXOS 237 GRUPO AST (U/L) ALT (U/L) FA (U/L) GGT (U/L) SO (n=20) 146,6** ± 77,31 53,5 ± 29,77 112,34 ± 34,12 1 ± 0 CM-S (n=20) 252,33 ± 96,67 40,25 ± 12,77 37,37♣ ± 31,73 38,91♦♦♦ ± 23,46 CCRND (n=47) 209,82 ± 67,28 34,35♦♦ ± 7,42 182,04 ± 170,67 42,38♦♦♦ ± 21,68 CCHP (n=38) 154,66** ± 45,91 26**♦♦♦ ± 8,22 25,79♣♣ ± 12,84 33,91♦♦ ± 23,37 CCRP (n=30) 196 ± 35,89 32,73♦♦ ± 7,08 54,15♣ ± 31,14 26,66♦♦ ± 14,9 Media±DE;♦♦p<0,01;♦♦♦p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de SO.; **p<0.01;***p<0,001: Valor estadísticamentesignificativo respecto de CM- S;♣p<0.5,♣♣p<0.01: Valor estadísticamente significativo respecto de CCRND. Tabla 16. Concentraciones séricas de Urea (mg/dl), Creatinina (Cr; mg/dl), Albúmina (Alb; g/dl) y Proteínas Totales (PT; g/dl) en las ratas de los diferentes grupos de estudio: SO: seudo-operadas; CM-S: Colestasis con administración de suero salino CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos GRUPO Urea (mg/dl) Cr (mg/dl) Alb (g/dl) PT (g/dl) SO (n=20) - 0,56 ± 0,04 3,02*** ± 0,14 5,97*** ± 0,38 CM-S (n=20) 37,02♣ ± 5,91 0,55 ± 0,07 1,61 ± 0,38 4,33 ± 1,38 CCRND (n=47) 34,47♣ ± 13,21 0,5♣♣ ± 0,05 1,84 ± 0,52 5,08* ± 0,94 CCHP (n=38) 51,59 ± 21,96 0,57 ± 0,06 2,07* ± 0,46 5,41** ± 0,74 CCRP (n=30) 36,62♣ ± 6,33 0,51♣ ± 0,03 2,12* ± 0,44 5,73*** ± 0,46 ANEXOS 238 Media±DE;*p<0.05;**p<0.01;***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S; ♣p<0.5,♣♣p<0.01: Valor estadísticamente significativo respecto de CCHP. Tabla 17. Tiempo de Protrombina (TProt; seg), Actividad de Protrombina (ActProt; %), Fibrinógeno (F; mg/dl),International Normalized Ratio (INR), Tiempo de Cefalina (TCefal; seg) y Ratio de Tiempo de Cefalina (RatT),en los diferentes grupos de estudio: SO: seudo-operada:.CM-S: Colestasis con administración de suero salino CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas CCHP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. GRUPO TProt (seg) ActProt r( % F (mg/dl) INR T Cefal (seg) Rat T C ef SO (n=20) 12,17 ± 0,57 79,75* ± 2,22 11,25 ± 21,73 1,75*** ± 0,09 44,57*** ± 9,19 1,59*** ± 0,46 CM-S (n=20) 9,75 ± 0,49 117 ± 2,82 184,5 ± 3,53 2,05 ± 0,21 15,7 ± 1,41 0,55 ± 0,07 CCRND (n=47) 14,22 ± 2,75 74,9* ± 24,99 200,4♦ ± 70,59 1,25*** ± 0,25 30,13 ± 9,01 1,11*♦ ± 0,34 CCRP (n=30) 13,28 ± 2,89 80,57* ± 26,8 190,07 ± 50,30 1,19*** ± 0,24 22,35 ± 5,49 0,82♦♦♦ ± 0,2 Media ± DE: ♦p<0.05; ♦♦♦p<0.001:Valor estadísticamente significativo respecto de SO;*p<0.05;***p<0,001: Valor estadísticamente significativo respecto de CM-S Tabla 18. Determinación del “Modelforend-stageLiverDisease”(MELD) en los diferentes grupos de estudio: SO: Seudooperadas CCRND: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas. CCRP: Colestasis con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos. GRUPO MELD SO (n=4) 12,71 +/- 0,81 CCRND (n=47) 7,8** +/- 2,64 CCRP (n=30) 7,71** +/- 2,6 ANEXOS 239 Media±DE;**p<0,01: Valor estadísticamente significativo respecto de SO. Tabla 19. Puntuaciones asignadas a las diferentes variables histopatológicas evaluadas en los hígados de ratas del grupo CMS (Colestasis microquirúrgica con administración de suero salino). RATA CHRR50 CHRR51 CHRR52 CHRR53 CHRR54 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis + + + + + + + + + + Nódulos Regeneración ++ - + - - - + + + - Proliferación Ductal ++ +++ ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ Binucleación ++ + + + + + + ++ ++ ++ Infiltrado Inflamatorio ++ + ++ +++ +++ +++ + + ++ + Necrosis - - - + - - - - - - Trombosis ++ - - - - - + - - - Fibrosis ++ - + - - - + + + - Peliosis - - - - + + + - - - Dilatación V. centrolobulillar - - + - + + - - - - Estructura R M M M M M R/B R/B R R Congestión - - - - - - - - - - Función R M M M M M R/B R/B R R TOTAL 17 12 15 14 15 15 11 10 13 10 RATA CHRR55 CHRR64 CHR68 CHR69 CHR70 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis + ++ + + + + + + + + Nódulos Regeneración - - - - - - +++ + ++ + Proliferación Ductal + ++ ++ + ++ ++ +++ +++ ++ +++ Binucleación + ++ ++ + + + +++ ++ ++ +++ Infiltrado Inflamatorio + + + + + ++ ++ ++ + ++ Necrosis + ++ ++ - - - - - - SUP Trombosis - - - - - - - - - - ANEXOS 240 Fibrosis + - + - + + ++ ++ ++ ++ Peliosis - - - - - - - - - - Dilatación V.centrolobulillar - - - - ++ + + ++ ++ + Estructura R/B R/M R B B B M M M M Congestión - - - - - - + - - - Función R/B R/M R B R B R/M R/M R/M R/M TOTAL 9 14 13 6 11 10 21 18 17 18 RATA CHR72 CHR74 CHR76 CHR78 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis + + + + + + + + Nódulos Regeneración +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ +++ Proliferación Ductal +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ Binucleación +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ + Infiltrado Inflamatorio + + ++ + ++ + ++ + Necrosis - - - - - - - - Trombosis - - - - - - - - Fibrosis +++ +++ ++ + ++ ++ +++ +++ Peliosis ++ ++ ++ ++ + + + + Dilatación V. centrolobulillar + + ++ + + ++ + + Estructura M M M M M M M M Congestión - - - - - - - - Función M M M M M M M M TOTAL 23 23 22 20 20 20 21 20 Mejor puntuación = 2; Buena<5; Intermedia-buena 5-12; Intermedia-mala 13-19; Mala>20; Peor puntuación = 39 Tabla 20. Puntuaciones asignadas a las diferentes variables histopatológicas evaluadas en los hígados de ratas del grupo CCHP (Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas humanas prediferenciadas a hepatocitos). ANEXOS 241 RATA CHR125 CHR130 CHR132 CHR134 CHR141 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis - - + + + + ++ + + + Nódulos Regeneración - - + - + ++ + ++ + Proliferación Ductal +++ +++ ++ +++ ++ + +++ +++ ++ ++ Binucleación +++ +++ +++ ++ ++ + ++ +++ + + Infiltrado Inflamatorio + + +++ ++ +++ +++ + ++ ++ ++ Necrosis + - ++ ++ - - - + - Trombosis - - +++ ++ - - - - - - Fibrosis +++ +++ ++ ++ ++ + ++ ++ + + Peliosis - ++ ++ - - - ++ - + - Dilatación V. centrolobulillar - - ++ - + - + + - - Estructura M M R M M R/B M M R/M R/M Congestión - - - - + - - - - - Función M M M M M B M M R/M R/M TOTAL 17 18 26 18 21 12 20 20 15 12 RATA CHR142 CHR144 CHR145 CHR148 CHR149 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis ++ ++ ++ + ++ ++ ++ + ++ + Nódulos Regeneración + - ++ + + + ++ ++ + - Proliferación Ductal ++ +++ +++ +++ ++ ++ +++ ++ +++ +++ Binucleación + + + + + + + + + + Infiltrado Inflamatorio ++ ++ ++ ++ ++ + ++ + ++ ++ Necrosis - - - - + - - - - - Trombosis - - + - - - + - ++ Fibrosis ++ + +++ ++ ++ + ++ - +++ ++ Peliosis + - + - + - + - - - Dilatación V.centrolobulillar - - - - - - - - - - Estructura R M M M R/M R M R/M M M Congestión - - - - - - - - - - Función R M M M R/M R M R/M M M ANEXOS 242 TOTAL 15 15 21 16 17 12 12 20 20 15 RATA CHR150 CHR152 CHR153 CHR154 CHR155 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis + ++ - + + + + + + + Nódulos Regeneración - - - - + ++ ++ + + Proliferación Ductal + ++ - + +++ +++ + + ++ +++ Binucleación + ++ - + + - ++ ++ ++ + Infiltrado Inflamatorio + + + + + + + + + ++ Necrosis + ++ - - - - - - - - Trombosis - - - - ++ + - - - - Fibrosis + - + + + + ++ + + + Peliosis - - - - - + - - - - Dilatación V.centrolobulillar - - - - + - + - - - Estructura R/B R/M B B M M B B R/B R Congestión - - - - - - - - - - Función R/B R/M B R/B M M R/B R/B R/B M TOTAL 9 14 4 7-8 17 16 12 9-10 11 13 Mejor puntuación = 2; Buena<5; Intermedia-buena 5-12; Intermedia-mala 13-19; Mala>20; Peor puntuación = 39 Tabla 21. Puntuaciones asignadas a las diferentes variables histopatológicas evaluadas en los hígados de ratas del grupo CRND (Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas de rata no diferenciadas). RATA CHRR1 CHRR6 CHRR7 CHRR8 CHRR9 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis + + + + + + + + + + Nódulos Regeneración + ++ - - - + - + + Proliferación Ductal ++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ Binucleación ++ + + ++ ++ - + ++ ++ + Infiltrado Inflamatorio + - + + + - + + + + ANEXOS 243 Necrosis - - - - - + ++ - + - Trombosis - - - - - - - - + - Fibrosis + + + ++ + + ++ + ++ + Peliosis + + ++ - + - + - + - Dilatación V.centrolobulillar - - + - - + - - + - Estructura M R M R M R/B M R/M M M Congestión - - - - - - - - + - Función - - - - - - - - - - TOTAL 15 12 16 12 15 11 17 13 21 13 RATA CHRR13 CHRR14 CHRR15 CHRR16 CHRR18 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis + + + + ++ ++ + + + + Nódulos Regeneración +++ +++ - + ++ ++ - + + - Proliferación Ductal ++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ +++ +++ Binucleación ++ ++ + + + + + + ++ + Infiltrado Inflamatorio + ++ + ++ ++ ++ + ++ + + Necrosis - - - - - - - - + - Trombosis + - + ++ - - + ++ + - Fibrosis ++ ++ + +++ ++ ++ + +++ ++ + Peliosis + + ++ - + + ++ - + - Dilatación V.centrolobulillar - + + - + + + - + - Estructura M M M M M M M M M M Congestión - - - - - - - - + - Función - - - - - - - - - - TOTAL 19 20 17 18 19 19 17 18 21 13 RATA CHRR19 CHRR20 CHRR25 CHRR26 CHRR31 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis + + ++ + + + ++ ++ + + Nódulos Regeneración ++ + ++ + - - ++ - + - Proliferación Ductal ++ ++ ++ ++ +++ +++ + +++ +++ + ANEXOS 244 Binucleación + + ++ ++ + + ++ + + + Infiltrado Inflamatorio + + + + + ++ + ++ ++ - Necrosis - - - - - - - - - - Trombosis - - + - - - - - - - Fibrosis ++ ++ + + ++ ++ ++ ++ ++ + Peliosis - + + + + + + + + - Dilatación V.centrolobulillar - - - - - - - - - - Estructura R R R R M M R M M B Congestión - - - - - - - - - - Función - - - - - - - - - - TOTAL 13 13 16 13 15 16 15 17 17 6 RATA CHRR32 CHRR56 CHRR57 CHRR58 CHRR60 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis - + ++ + ++ ++ + + + + Nódulos Regeneración + - + + - - - - - - Proliferación Ductal - +++ + + - - + +++ +++ +++ Binucleación + + + + ½ + + ½ ++ ++ Infiltrado Inflamatorio. + + ++ ++ ++ + +++ ++ ++ ++ Necrosis - - - - - - - - - - Trombosis - - - - - - - - - - Fibrosis + + ++ + ++ + ++ ++ - - Peliosis - - - - - - - - + - Dilatación V.centrolobulillar - - - - - - - - - - Estructura B M R/B R/B B R/B R M M M Congestión - - - - + ? - - - - Función - - R/B R/B B R/B R M M M TOTAL 6 13 12 10 9,5 9 12 14,5 15 14 RATA CHRR61 CHRR62 CHRR65 CHRR66 CHRR67 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis + + + + + + + + + + ANEXOS 245 Nódulos Regeneración - - - - + - + - + - Proliferación Ductal +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ ++ + ++ Binucleación + ++ + ++ + ++ + ++ + ++ Infiltrado Inflamatorio +++ +++ ++ + +++ +++ ++ ++ ++ ++ Necrosis - - - - - - + - - - Trombosis - - - - - - - - - - Fibrosis + ++ + - ++ + + ++ ++ Peliosis - - - - - - + - - - Dilatación V.centrolobulillar + - - - - - - - - - Estructura M M M M R M M/R R R/B R Congestión - - - - - - - - - - Función M M M M R M M R R/B R/M TOTAL 16 17 14 13 14 16 16,5 13 11 11,5 Mejor puntuación = 2; Buena<5; Intermedia-buena 5-12; Intermedia-mala 13-19; Mala>20; Peor puntuación = 39 Tabla 22. Puntuaciones asignadas a las diferentes variables histopatológicas evaluadas en los hígados de ratas del grupo CRPD (Colestasis microquirúrgica con administración de células madre adipocíticas de rata prediferenciadas a hepatocitos). RATA CHRR39 CHRR41 CHRR43 CHRR46 CHRR47 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis + + + + + + + + + + Nódulos Regeneración + - - + + - ++ - ++ - Proliferación Ductal +++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ + - Binucleación + ++ + + + + + + + + Infiltrado Inflamatorio + + + + ++ - ++ + ++ ++ Necrosis + - - - + - + - - - Trombosis + + - + - - + - - - Fibrosis ++ + - - ++ + + - ++ - Peliosis + - - + - - - - - Dilatación V.centrolobulillar - - - - + - + + + - Estructura M M R R/M R M R/M R M B ANEXOS 246 Congestión - - - - - - - - - - Función M M R R/M R M R/M R M B TOTAL 18 15 9 13 15 12 17 10 16 6 RATA CHRR48 CHRR49 CHRR68 CHRR69 CHRR70 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis + + + + + + + + + + Nódulos Regeneración + ++ + - +++ - + + + - Proliferación Ductal +++ ++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ Binucleación - + ++ ++ +++ +++ + + ++ ++ Infiltrado Inflamatorio ++ + ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Necrosis - - - - - - - - - - Trombosis - - + - - - - - - - Fibrosis + + + - + - + ++ +++ +++ Peliosis - - - - - - - - - - Dilatación V.centrolobulillar - + - + - + - - - - Estructura M R R R/B R/M R/M M M R/M M Congestión - - - - - - - - - - Función M R R R/B M M M M R/M M TOTAL 14 13 14 12 18,5 16,5 16 17 17 18 RATA CHRR71 CHRR72 CHRR73 CHRR74 CHRR75 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis + + + + + + - + + + Nódulos Regeneración + - - - + - - - - - Proliferación Ductal ++ +++ ++ +++ +++ +++ - +++ + + Binucleación + ++ + ++ ++ ++ - ++ ++ ++ Infiltrado Inflamatorio +++ ++ ++ +++ ++ ++ - +++ ++ ++ Necrosis - - - - - - - - - Trombosis ++ - - - - - - - - - Fibrosis + + + ++ +++ ++ - ++ + - Peliosis + - - - - - - - - - ANEXOS 247 Dilatación V.centrolobulillar - + - - - - - - - - Estructura R R R/B R/M M M - R/M B/R B/R Congestión - - - - - - - - - - Función R/M M R M M M - M B B TOTAL 16,5 15 10,5 16,5 18 16 - 16,5 9,5 8,5 RATA CHRR76 CHRR77 CHRR78 CHRR80 CHRR81 LOBULO LM LC LM LC LM LC LM LC LM LC Colestasis + + + + + + + + + + Nódulos Regeneración - - + + - - - - +++ +++ Proliferación Ductal +++ +++ +1/2 +1/2 ++ ++ + + ++ ++ Binucleación ++ ++ +++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ Infiltrado Inflamatorio +++ + +++ +++ +++ +++ ++ ++ +++ +++ Necrosis - - - - - - - - - - Trombosis - - - - - - - - - - Fibrosis ++ + ++ ++ + + + - +++ ++ Peliosis + - + - - - - - - - Dilatación V.centrolobulillar - - + + - - - - - + Estructura M R/M R/B R/B R R/M B/R B/R M M Congestión - - - - - - - - - - Función M M R R R R/M B B M M TOTAL 18 13,5 17 15 13 15 9 8 20 20 Mejor puntuación = 2; Buena<5; Intermedia-buena 5-12; Intermedia-mala 13-19; Mala>20; Peor puntuación = 39 Tesis Carlos Gilsanz Martín PORTADA ÍNDICE RESUMEN ABSTRACT I. INTRODUCCIÓN II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS III. MATERIAL Y MÉTODOS IV. RESULTADOS V. DISCUSIÓN VI. CONCLUSIONES VII. BIBLIOGRAFÍA VIII. ANEXOS quitecommands.xml quitecommands.xml quitecommands.xml quitecommands.xml quitecommands.xml quitecommands.xml quitecommands.xml quitecommands.xml quitecommands.xml quitecommands.xml quitecommands.xml quitecommands.xml quitecommands.xml quitecommands.xml quitecommands.xml