ES 2 7 85 0 86 B 8 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 21 Número de publicación: 2 785 086 Número de solicitud: 202030312 Folleto corregido: Fecha de publicación de la corrección: 15 72 30.04.2021 A1, B2 48 INID afectado: 51 Int. CI.: G01N 33/84 (2006.01) 12 CORRECCIÓN DE LA PRIMERA PÁGINA DE LA PATENTE DE INVENCIÓN B8 54 Título: MÉTODO FLUORIMÉTRICO PARA LA VALORACIÓN DIRECTA DE NITRITOS/NITRATOS EN SUERO Y EN EXTRACTOS DE TEJIDOS BIOLÓGICOS 73 Titular/es: UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID (100.0%) Avda. de Séneca, 2 28040 MADRID (Madrid) ES 72 Inventor/es: BENEDÍ GONZÁLEZ, Juana; GARCIMARTÍN ÁLVAREZ, Alba; MERINO MARTÍN, Jose Joaquín; LÓPEZ-OLIVA, María Elvira; MACHO GONZÁLEZ, Adrian; GONZÁLEZ GONZÁLEZ, Pilar; RAPOSO GONZALEZ, Rafaela y HERNÁNDEZ MARTÍN, Marina 22 Fecha de presentación: 17.04.2020 43 Fecha de publicación de la solicitud: 05.10.2020 Fecha de concesión: 26.03.2021 45 Fecha de publicación de la concesión: 06.04.2021 57 Resumen: Método fluorimétrico para la valoración directa de nitritos/nitratos en suero y en extractos de tejidos biológicos. La valoración de nitritos y nitratos tiene una demanda creciente en los laboratorios tanto de investigación básica como clínica. Algunos kits fluorimétricos comerciales presentan el gran inconveniente de que las muestran deben procesarse previamente para eliminar interferencias. La presente invención describe un método de valoración de nitritos/nitratos para un intervalo de concentraciones de 0 a 1200 pmoles de muestras biológicas de manera sencilla, directa y evitando el tratamiento previo de preparación de la muestra para eliminar posibles moléculas que interfieren en el resultado en otros métodos. Se puede realizar consulta prevista por el art. 41 LP 24/2015. Dentro de los seis meses siguientes a la publicación de la concesión en el Boletín Oficial de la Propiedad Industrial cualquier persona podrá oponerse a la concesión. La oposición deberá dirigirse a la OEPM en escrito motivado y previo pago de la tasa correspondiente (art. 43 LP 24/2015). Aviso: ES 2 7 85 0 86 B 2 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 21 Número de publicación: 2 785 086 Número de solicitud: 202030312 51 Int. CI.: G01N 33/84 (2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN CON EXAMEN B2 54 Título: MÉTODO FLUORIMÉTRICO PARA LA VALORACIÓN DIRECTA DE NITRITOS/NITRATOS EN SUERO Y EN EXTRACTOS DE TEJIDOS BIOLÓGICOS 73 Titular/es: UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID (100.0%) Avda. de Séneca, 2 28040 MADRID (Madrid) ES 72 Inventor/es: BENEDÍ GONZÁLEZ, Juana; GARCIMARTÍN ÁLVAREZ, Alba; MERINO MARTÍN, Jose Joaquín; LÓPEZ-OLIVA, María Elvira; MACHO GONZÁLEZ, Adrian y GONZÁLEZ GONZÁLEZ, Pilar 22 Fecha de presentación: 17.04.2020 43 Fecha de publicación de la solicitud: 05.10.2020 Fecha de concesión: 26.03.2021 45 Fecha de publicación de la concesión: 06.04.2021 57 Resumen: Método fluorimétrico para la valoración directa de nitritos/nitratos en suero y en extractos de tejidos biológicos. La valoración de nitritos y nitratos tiene una demanda creciente en los laboratorios tanto de investigación básica como clínica. Algunos kits fluorimétricos comerciales presentan el gran inconveniente de que las muestran deben procesarse previamente para eliminar interferencias. La presente invención describe un método de valoración de nitritos/nitratos para un intervalo de concentraciones de 0 a 1200 pmoles de muestras biológicas de manera sencilla, directa y evitando el tratamiento previo de preparación de la muestra para eliminar posibles moléculas que interfieren en el resultado en otros métodos. Se puede realizar consulta prevista por el art. 41 LP 24/2015. Dentro de los seis meses siguientes a la publicación de la concesión en el Boletín Oficial de la Propiedad Industrial cualquier persona podrá oponerse a la concesión. La oposición deberá dirigirse a la OEPM en escrito motivado y previo pago de la tasa correspondiente (art. 43 LP 24/2015). Aviso: 2 MÉTODO FLUORIMÉTRICO PARA LA VALORACIÓN DIRECTA DE NITRITOS/NITRATOS EN SUERO Y EN EXTRACTOS DE TEJIDOS BIOLÓGICOS 5 SECTOR DE LA TÉCNICA La presente invención se encuadra en el sector de medida de parámetros en suero y en tejidos biológicos en laboratorios. De forma más concreta, se refiere a un método de determinación de nitritos y nitratos siguiendo un método 10 fluorimétrico. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En Biomedicina existe un creciente interés en la medida de óxido nítrico (NO) en 15 suero o plasma, ya que puede ser indicativa de varias enfermedades como psoriasis o enfermedades cardiovasculares, entre otras. La medida de NO también presenta interés en casos de isquemia debido a que niveles elevados de NO protegen frente a las secuelas inducidas por el ictus. Investigaciones sobre fisiopatología de enfermedades crónico-degenerativas muy prevalentes 20 actualmente como la enfermedad del Alzheimer o el síndrome metabólico, indican que el NO parece jugar un importante papel en la inflamación de bajo grado presente en todas ellas. Por ello, el análisis de la concentración de NO en muestras biológicas puede ser una herramienta útil para conocer el grado de evolución de dichas patologías 25 La medida de óxido nítrico (NO) en muestras biológicas presenta la dificultad del corto periodo de la vida media de esta molécula (entre 6 y 10 segundos) que se transforma en nitritos y nitratos siendo los nitratos los más estables. Por ello, la valoración de nitritos y nitratos tiene una demanda creciente en los laboratorios 30 tanto de investigación básica como clínica. Existen varios métodos de valoración de nitritos que se basan en técnicas colorimétricas, fluorimétricas, HPLC y quimioluminiscencia. Dentro de ellos, destacan por su elevada sensibilidad, los métodos fluorimétricos que usan 2,3-35 P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 DESCRIPCIÓN 3 diaminonaftaleno (DAN). El método clásico es el desarrollado por Misko (Misko, T.P. et al. A fluorimetric assay for the meassurement of nitrite in biological samples. Analytical Biochemistry (1993)214, 11-16). Existen empresas en el mercado que emplean una metodología similar a la de Misko (por ejemplo el kit de la empresa Abcam). Sin embargo, estos métodos tienen el inconveniente 5 fundamental de la necesidad de realizar un procesamiento previo de la muestra que requiere de aparatos de elevado coste (como ultracentrífugas) o la adquisición de columnas comerciales que también encarecen la técnica. Por todo lo anterior, existe la necesidad de un método sencillo y directo que evite 10 el paso previo de preparación de la muestra. EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención describe un método fluorimétrico de valoración de 15 nitritos/nitratos en muestras biológicas que se basa en el método clásico de Misko modificado. Las modificaciones introducidas permiten eliminar la necesidad de tratamiento previo de la muestra y rebaja el riesgo de toxicidad ocular y respiratoria del reactivo DAN. 20 El método comprende las siguientes etapas: a) Preparar una disolución de 1mg/ml de 2,3-daminonaftaleno (DAN) en HCl 0,6M (a partir de aquí se llamará a esta disolución “DAN concentrado”) y conservar en congelador. 25 b) En el momento de cada valoración, preparar una disolución tomando 10 µl de de la disolución anterior (DAN concentrado) y 190 µl de HCl 0,6M (a partir de aquí se haría referencia a esta disolución como “DAN diluido) c) Obtener una curva de calibración de concentración de nitritos en un rango de 0 a 500 pmoles. (Tabla1). Este rango es suficiente aunque la 30 curva de nitritos podría tener una sensibilidad hasta, al menos, 1200 pmoles. d) Tomar un volumen entre 5 y 30 µl de suero o extracto de muestra biológica e) Añadir agua destilada hasta un volumen total de 150 µl 35 P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 4 f) Adicionar 10 µl de DAN diluido y mantener la mezcla 15 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad para permitir que se produzca la reacción entre los nitritos y el DAN. g) Adicionar 50 µl de NaOH 3M y mantener, de nuevo, la mezcla 15 minutos en la oscuridad. 5 h) Leer la fluorescencia a 340 nm exc. y 460 nm em. en un fluorímetro. i) Determinar la concentración de nitritos a partir de la fluorescencia leída y la curva de calibración de nitritos. j) Para la determinación de los nitratos es necesario un paso anterior a la técnica explicada, en el que los nitratos se pasan a nitritos por la enzima 10 nitrato reductasa. Convertir los nitratos en nitritos y repetir las dos etapas anteriores para obtener la concentración de nitritos más los nitratos. k) Determinar la concentración de nitratos restando el valor de los nitritos. El método permite conocer la concentración de nitritos/nitratos para un intervalo 15 de concentraciones de 0-1200 pmoles (Figura 1) sin necesidad de realizar un pretratamiento a la muestra para eliminar posibles moléculas que interfieren en el resultado en otros métodos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 20 Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña como parte integrante de dicha descripción un juego de dibujos en donde, con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente: 25 La Figura 1 muestra la sensibilidad de la curva patrón de nitritos en unidades arbitrarias de fluorescencia (UAF). La Figura 2 muestra el efecto del volumen de suero sobre el resultado de la 30 valoración fluorimétrica de nitritos La Figura 3 muestra el perfil de elución del suero por paso de Sephadex G-25 Fine. 35 P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 5 La Figura 4 muestra el efecto de la concentración de nitritos correspondiente a la mezcla de las fracciones 21 a 31 del paso de Sephadex G25 Fine que sería la equivalente a los metabolitos del suero. REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN 5 La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance. Ejemplo 1. 10 Este ejemplo se refiere a la preparación de la curva de calibración de nitritos. Se prepara una disolución 5 µM de nitritos en agua destilada. De esta disolución se toman los l indicados en la Tabla 1 (l NaNO2) para obtener un rango de 15 concentraciones de nitrito entre 0 y 500 pmoles. Se añade agua destilada hasta 150 l y después se añade un volumen fijo de DAN diluido de 10 µl. La Tabla 1 muestra las mezclas preparadas. Tabla 1. 20 H2O (µl) NaNO2 (µl) DAN diluido (µl) pmoles (NaNO2) 150 130 110 100 90 80 70 60 55 53 50 0 20 40 50 60 70 80 90 95 97 100 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 0 100 200 250 300 350 400 450 475 485 500 130 Muestra =20 10 ¿? Cada mezcla preparada se mantiene durante 15 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad, con el fin de permitir que se produzca la reacción entre los nitritos y el DAN: 25 P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 6 5 10 Una vez transcurrido este tiempo se adicionan 50 µl de NaOH 3M y se deja otros 15 15 minutos en la oscuridad. Finalmente, se lee la fluorescencia a 340 nm exc y 460 nm em en un fluorímetro. En la Figura 1 se representa el resultado obtenido con una curva patrón realizada con concentraciones de nitritos ente 0 y 1200 pmoles. Se aprecia cómo 20 la concentración de nitritos es lineal hasta, al menos, 1200 pmoles de NaNO2 como lo demuestra el coeficiente de correlación de la curva (R = 0,9969). Ejemplo 2. 25 Este ejemplo se refiere a la influencia del grado de dilución del suero en la mezcla con agua, DAN y NaOH sobre la valoración de nitritos en suero. Se muestra cómo la reacción es lineal hasta los 30 l de suero. Concentraciones superiores empiezan a tener interferencias. 30 Por lo tanto, para la valoración de nitritos en suero o en extracto de muestra biológica se pueden utilizar volúmenes diferentes de suero, entre 5 y 30 µl a los cuales se adiciona agua destilada (H2O) hasta un volumen total de 150 µl. Se añaden 10 µl de DAN diluido y 50 µl de NaOH 3M del mismo modo que en el ejemplo 1. 35 P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 7 En la Figura 2 se muestran los resultados obtenidos con diferentes volúmenes de suero. Se puede observar que la relación entre la concentración de nitritos y el volumen de suero en la mezcla es lineal en el intervalo de 5 a 30 µl de suero según la ecuación Y = 54,6 X + 1,11 (R = 0,997). Cantidades más altas de 5 volumen de suero disminuyen la concentración de nitritos. Esto indica que en el suero hay algún componente (proteína o metabolito) que a concentraciones altas (volumen de suero por encima de 40 µl en la mezcla) disminuye la fluorescencia de la reacción. 10 Ejemplo 3. Con el fin de comprobar si son las proteínas las moléculas responsables de la interferencia observada cuando se emplea un volumen de suero mayor a 30 µL 15 se mide el efecto de las proteínas sobre la fluorescencia. Se determina el efecto de concentraciones de albúmina (alb) en el intervalo de 160 a 640 µg sobre una muestra de 100 pmoles de nitritos. En la tabla 2 se muestra el resultado de la fluorescencia en unidades arbitrarias (UAF) para 20 varias concentraciones en este intervalo. Se indica también el error estándar de la media (SEM) y el valor de probabilidad (p) y se compara con el control (100 pmoles de nitritos). Tabla 2. 25 Muestra UAF Media SEM p< 100 pmol NaNO2 +160 µg Alb + 320 µg Alb + 480 µg Alb + 640 µg Alb 900 830 873 868 862 9 39 13 8 10 (ns) (ns) (ns) (ns) (ns) Estos resultados muestran que la presencia de albúmina, a concentraciones similares a las proteínas encontradas en el suero, no parece ser responsable de la pérdida de fluorescencia de la reacción de nitritos a concentraciones altas de suero. 30 P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 8 Para reforzar este resultado se realiza una valoración de nitritos en suero desproteinizado por la precipitación con sulfato amónico [SO4(NH4)2] y en suero pasado a través de columna de Sephadex G25 fine y se concluye de nuevo, que las proteínas no parecen ser responsables de la pérdida de fluorescencia a concentraciones altas de suero. Se detalla están estos resultados en los 5 siguientes ejemplos. Ejemplo 4. En este ejemplo se muestra la valoración de nitritos en suero desproteinizado 10 con [SO4(NH4)2] Se utiliza sulfato amónico para precipitar la mayoría de las proteínas presentes en el suero debido a su alta solubilidad y a la estabilización de las proteínas en este medio. Para ello se adicionan 100 mg de SO4(NH4)2 a 250 µl de suero. Se 15 agita y, posteriormente, se deja en reposo hasta completar la precipitación. A continuación, se centrifuga a 13000 rpm en Eppendorff durante 15 minutos. Tras la centrifugación, se recoge el sobrenadante (suero sin proteínas) y se valoran los nitritos. 20 En la Tabla 3 se puede observar que en las muestras de suero a las que se ha eliminado la mayor parte de proteínas también disminuye la cantidad de nitritos a volúmenes de muestra más altos (muestras conteniendo suero, agua, DAN diluido y NaOH). Esto apoya la idea de que las proteínas no son responsables de la interferencia en la valoración de nitritos. Al valorar las concentraciones de 25 sulfato de amonio en estas muestras, no se produce ningún efecto sobre la fluorescencia debida a nitritos. Tabla 3. Muestra (µl) pmoles NaNO2 5 10 20 30 38,9 68,9 118,9 88,1 30 P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 9 Ejemplo 5. Este ejemplo se refiere a la determinación de nitritos en suero pasado por una columna de Sephadex G-25 fine. 5 Se utiliza una columna de dimensiones 2 cm de alto 1 cm de diámetro, equilibrada con tampón Tris-HCl 20 mM pH=7,6. Se pasa un volumen de 200 µl de suero a través de la columna eluyendo con el tampón. Se recogen 96 fracciones de 3 gotas/fracción sobre placas Petri especiales para leer a 260- 280nm. Se lee el perfil de elución a 260 nm (detección de nucletótidos) y 280 nm 10 (detección de proteínas) con el fin de detectar la fracción proteica y los metabolitos. Las moléculas de peso molecular (PM) más alto salen las primeras y, a continuación, se eluyen los metabolitos. Este perfil de elución se muestra en la Figura 3. 15 Las fracciones se unen del siguiente modo: - Mezcla 1: fracciones 1 a 6 - Mezcla 2: fracciones 7 a 15 (moléculas de PM más alto, proteínas y ácidos nucleicos) - Mezcla 3: fracciones 16 a 20 20 - Mezcla 4: fracciones 21 a 31 (metabolitos) - Mezcla 5: fracciones 32 a 49 En la mezcla 4 (fracciones 21-31), correspondiente a metabolitos, se valoran los nitritos mostrándose el resultado en la Figura 4, donde se observa que la medida 25 de nitritos de la fracción que contenía solamente los metabolitos (mezcla 4) es lineal hasta la cantidad de 30 µl; fracciones mayores disminuyen la cantidad de nitritos, lo que significa menor fluorescencia de la muestra. Estos resultados indican que la molécula que disminuye la fluorescencia a volúmenes superiores a 30 µL de suero es un metabolito y no una proteína. 30 Por otra parte, todos estos datos indican que el método de valoración de nitritos de la presente invención es válido para muestras de suero comprendidas entres 5 y 30 µl ya que en este intervalo no hay interferencias de proteínas ni metabolitos por lo que no es necesario eliminarlos previamente, lo que supone la 35 P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 10 posibilidad de emplear el método de forma directa, sin el pre-procesamiento de la muestra que realizan el resto de métodos fluorimétricos disponibles en el mercado (ver Figura 2). Ejemplo 6. 5 Este ejemplo muestra valoraciones realizadas en sueros de personas diabéticas. En la Tabla 4 se presentan medidas realizadas con sueros control y muestras de pacientes diabéticos y se observa que los enfermos diabéticos tienen mayor 10 concentración de nitritos en suero. Tabla 4. Muestra Media (mmoles/ml suero) SEM p< Control Diabéticos 6,1 13,2 1,1 1,6 0,038 Ejemplo 7. 15 Este ejemplo muestra valoraciones realizadas en extractos de tejidos y células aisladas. Se preparan extractos con tejidos de hígado, vejiga, células endoteliales y 20 células polimononucleares (PMBC) usando 20mM de tampón Tris-HCl pH=7,6 en una proporción del 1/10 (100 mg de tejido por ml de tampón 20 mM Tris-HCl pH 7,6). Los resultados de la valoración de estos extractos se muestran en la Tabla 5. 25 Tabla 5. Muestra Media Extracto de hígado Extracto de vejiga Células PMBC Medio de cultivo de células endoteliales 53,6 ±3,7 pmol/g tejido 4,15±0,5 nmol/mg proteína 247,6 ±46,7 pmol/ml 3,0 ±0,3 pmol/ml P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 11 Ejemplo 8. Este ejemplo muestra la valoración de nitratos en suero y en extractos de muestras biológicas. 5 Para realizar la valoración de nitratos en primer lugar se pasan a nitritos, se valora la cantidad total de nitritos calculando después la diferencia. Para convertir los nitratos en nitritos se utiliza la enzima nitrato reductasa que cataliza la siguiente reacción: 10 Para realizar la valoración se mezclan 20 µl de suero con 5 µl de NADPH (2mg/ml), 23 l de tampón Tris-HCl 20 mM pH = 7,6 y 2 µl de nitrato reductasa (20 mU), en un volumen total de 50 µl, y la mezcla se incuba a 37°C durante 15 minutos. Después se añaden 100 µl de agua, con lo que queda un volumen total de 150 µl y se procede a la valoración de los nitritos adicionando 10 µl de DAN 15 diluido y 50 µl de NaOH. Se obtiene una curva patrón de la misma forma que se expone en el ejemplo 1 para el caso de los nitritos, pero adicionando a cada muestra NADPH (2mg/ml) y 23 µl de tampón Tris-HCl 20 mM pH = 7,6 para compensar la posible fluorescencia debida a al NDAPH y/o al tampón Tris-HCl. La Tabla 6 muestra los datos de la curva patrón. 20 Tabla 6. H2O (µl) NaNO2 (µl) NADPH (µl) Tris-HCl (µl) DAN diluido (µl) NaNO2 (pmoles) 122 102 82 72 62 52 42 32 27 25 22 0 20 40 50 60 70 80 90 95 97 100 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 0 100 200 250 300 350 400 450 475 485 500 Con esta curva de calibración se determinan los nitritos más nitratos (transformados en nitritos) de la muestra de suero o extracto biológico (nitritos 25 P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 12 totales). El valor de nitratos, se obtendría restando el resultado de la valoración de los nitritos libres que se hace simultáneamente como se indicó en la sección de valoración de nitritos. P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 13 REIVINDICACIONES 1. Método fluorimétrico para la valoración directa de nitritos/nitratos en suero y en extractos de tejidos biológicos, caracterizado porque no requiere 5 tratamiento previo para eliminar proteínas o metabolitos y que comprende las siguientes etapas: a) Preparar una disolución de 1mg/ml de 2,3-daminonaftaleno (DAN) en HCl 0,6M y conservar en congelador. 10 b) En el momento de cada valoración, preparar una disolución tomando 10 µl de de la disolución anterior (DAN concentrado) y 190 µl de HCl 0,6M. c) Obtener una curva de calibración de concentración de nitritos en un rango de 0 a 500 pmoles. 15 d) Tomar un volumen entre 5 y 30 µl de suero o extracto de muestra biológica e) Añadir agua destilada hasta un volumen total de 150 µl f) Adicionar 10 µl de DAN diluido y mantener la mezcla 15 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad para permitir que se produzca 20 la reacción entre los nitritos y el DAN. g) Adicionar 50 µl de NaOH 3M y mantener, de nuevo, la mezcla 15 minutos en la oscuridad. h) Leer la fluorescencia a 340 nm exc y 460 nm en en un fluorímetro. i) Determinar la concentración de nitritos a partir de la fluorescencia 25 leída y la curva de calibración de nitritos. j) Convertir los nitratos en nitritos y repetir las dos etapas anteriores para obtener la concentración de nitritos más los nitratos. k) Determinar la concentración de nitratos restando el valor de los nitritos. 30 2. Método fluorimétrico para la valoración directa de nitritos/nitratos, según reivindicación 1, donde la concentración de nitritos/nitratos en la muestra de suero o extracto biológico está comprendida en el intervalo de 0 a 1200 pmoles. 35 P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 14 3. Método fluorimétrico para la valoración directa de nitritos/nitratos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, donde el volumen de la muestra de suero o extracto de muestra biológica está comprendido entre 5 y 30 µl. 4. Método fluorimétrico para la valoración directa de nitritos/nitratos, según 5 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el extracto biológico procede de tejidos de hígado, vejiga o células endoteliales y polimorfonucleares. 10 15 20 25 30 35 P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 15 Figura 1 Figura 2 P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 16 Figura 3 Figure 3 Figure 3 Figura 3 Figura 4 P202030312 17-04-2020   ES 2 785 086 B2 Primera Página Primera Página Descripción Reivindicaciones Dibujos