UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL Estudio de la autofagia en el sistema nervioso central en modelos experimentales de enfermedades neuropsiquiátricas MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Cristina Ulecia Morón Directores Javier Rubén Caso Fernández Juan Carlos Leza Cerro Madrid © Cristina Ulecia Morón, 2022 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL Estudio de la autofagia en el sistema nervioso central en modelos experimentales de enfermedades neuropsiquiátricas MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA PRESENTADA POR Cristina Ulecia Morón DIRECTORES Dr. Javier Rubén Caso Fernández Dr. Juan Carlos Leza Cerro 2 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA DOCTORADO EN INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA TESIS DOCTORAL Estudio de la autofagia en el sistema nervioso central en modelos experimentales de enfermedades neuropsiquiátricas Cristina Ulecia Morón Directores Dr. Javier Rubén Caso Fernández Dr. Juan Carlos Leza Cerro 4 6 Este trabajo ha sido realizado gracias a las entidades financiadoras: Agencia Estatal de Investigación Ministerio de Universidades (FPU16/02829) Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2017-83053-R y PID2020-113103RB-I00) Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (SAF2016-75500-R) Centro de Investigación Biomédica en Red de Salud Mental (CIBERSAM), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) 8 Índice Resumen / Abstract……………………………………………………………………..…………1 Abreviaturas…………………………………………………………………………………...……11 Introducción…………………………………………………………………………..............…...19 1. El estrés.............................................................................................................. 19 1.1 Estrés, inflamación y sistema inmune ....................................................... 22 1.2. Estrés oxidativo e inflamación ................................................................... 23 2. Las enfermedades neuropsiquiátricas ............................................................. 25 2.1. Trastorno depresivo mayor ....................................................................... 26 2.2. Trastornos del neurodesarrollo ................................................................. 30 2.3. Modelos experimentales de interés en Psiquiatría .................................... 35 3. La autofagia ....................................................................................................... 36 3.1. Aspectos generales ................................................................................... 36 3.2. Descubrimiento de la autofagia ................................................................. 38 3.3. Mecanismo de acción................................................................................ 39 3.4. Tipos de autofagia ..................................................................................... 50 3.5. Modulación de la autofagia: la Espermidina .............................................. 53 3.6. Autofagia e inmunidad innata .................................................................... 55 3.7. Autofagia en el SNC .................................................................................. 57 3.8. Autofagia en la enfermedad psiquiátrica.................................................... 58 4. La autofagia de la mitocondria: la mitofagia.................................................... 59 4.1. Aspectos generales .................................................................................. 59 4.2. Mecanismo de acción ............................................................................... 61 4.3. Dinamismo mitocondrial: fusión y fisión .................................................... 67 4.4. Biogénesis mitocondrial ............................................................................ 70 4.5. Mitofagia e inmunidad ............................................................................... 71 4.6. Mitofagia en el SNC y la enfermedad neuropsiquiátrica ............................ 73 5. Otras vías moleculares relacionadas con la autofagia ................................... 76 Índice 10 5.1. Complejos de clasificación endosómica necesarios para la maquinaria de transporte (ESCRT) ............................................................................................. 76 5.2. Apoptosis ................................................................................................. 79 Hipótesis y Objetivos……………………………………………………………………………83 Materiales y métodos………………………………………………………………………..….87 1. Modelos animales y diseño experimental ........................................................ 87 1.1. Chronic Mild Stress (CMS) ........................................................................ 88 1.2. Poly I:C y Aislamiento social (Poly+Iso) .................................................... 93 1.3. Deprivación materna y LPS ....................................................................... 95 1.4. Deprivación materna y restricción de movimiento ..................................... 97 2. Pruebas comportamentales .............................................................................. 99 2.1. Prueba de natación forzada .................................................................... 100 2.2. Prueba de campo abierto ........................................................................ 100 2.3. Splash test .............................................................................................. 101 2.4. Prueba laberinto en cruz elevado ............................................................ 102 3. Recogida y procesamiento de muestras ........................................................ 103 3.1. Extractos citosólicos y nucleares ............................................................. 106 3.2. Homogenizado total ................................................................................ 107 3.3. Extracción de ARN .................................................................................. 107 3.4. Extracción de mitocondrias ..................................................................... 108 3.5. Extracción de lisosomas .......................................................................... 108 3.6. Técnicas bioquímicas .............................................................................. 108 4. Análisis estadístico ......................................................................................... 126 5. Certificación Experimentación Animal ........................................................... 128 Resultados…………………………………………………………………………………………131 1. Modelo experimental de depresión: Chronic Mild Stress (CMS) .................. 131 1.1. Vía de la autofagia .................................................................................. 131 1.2. Vía de la mitofagia .................................................................................. 146 2. Estudio farmacológico de la autofagia: CMS + espermidina (CMS+SPD) ... 168 Índice 2.1. Pruebas comportamentales .................................................................... 168 2.2. Vía de la autofagia .................................................................................. 171 2.3. Vía de la mitofagia .................................................................................. 178 3. Modelo experimental de trastornos relacionados con el neurodesarrollo: Poly I:C + Aislamiento ............................................................................................ 187 3.1. Pruebas comportamentales .................................................................... 187 3.2. Vía de la autofagia .................................................................................. 190 3.3. Vía de la mitofagia .................................................................................. 195 4. Modelo experimental de trastornos relacionados con el neurodesarrollo: Deprivación materna + LPS.................................................................................... 207 4.1. Pruebas comportamentales..................................................................... 207 4.2. Vía de la autofagia .................................................................................. 210 5. Modelo experimental de trastornos relacionados con el neurodesarrollo: Deprivación materna + RS ..................................................................................... 220 5.1. Pruebas comportamentales..................................................................... 220 5.2. Vía de la autofagia .................................................................................. 221 Discusión…………………………………………………………………………………………...235 1. Estudio bioquímico de la autofagia ................................................................ 235 1.1. Expresión proteica y génica de la autofagia en los modelos estudiados . 235 1.2. Análisis de inmunofluorescencia en el modelo CMS ............................... 244 1.3. Evaluación de la expresión y función lisosomal en el modelo CMS ......... 246 1.4. Evaluación por inmunofluorescencia de lisosomas en el modelo CMS ... 251 1.5. Análisis de la modulación de la autofagia ejercida por la espermidina en el modelo CMS ...................................................................................................... 252 2. Estudio bioquímico de la mitofagia ................................................................ 258 2.1. Análisis proteico y génico de la mitocondria en los modelos CMS y Poly+Iso………………………………………………………………………………...258 2.2. Estudio de la apoptosis y su relación con autofagia y mitofagia en el modelo CMS …………………………………………………………………………………...266 Índice 12 2.3. Estudio de la microglía y su estado mitocondrial por citometría de flujo en los modelos CMS y Poly+Iso ............................................................................. 270 2.4. Efecto de la espermidina en proteínas y genes relacionados con la mitocondria en el modelo CMS .......................................................................... 274 3. Rutas y procesos relacionados con la autofagia .......................................... 279 3.1. Evaluación del flujo autofágico mediante leupeptina ............................... 279 3.2. Alteraciones en la maquinaria ESCRT por el modelo CMS y su modulación por la espermidina ............................................................................................. 280 3.3. Ambiente prooxidativo evaluado en el modelo CMS ............................... 287 4. Pruebas comportamentales ............................................................................ 289 4.1. Modelo CMS+SPD .................................................................................. 289 4.2. Modelo Poly I:C + aislamiento social ....................................................... 292 4.3. Modelos MD+LPS y MD+RS ................................................................... 292 Análisis crítico y perspectivas futuras…………………………………………………297 Conclusiones…………………………………………………………………………………..…305 Referencias bibliográficas……………………………………………………..……………309 Índice RESUMEN ABSTRACT 14 1 RESUMEN Introducción Las enfermedades neuropsiquiátricas son cada vez más prevalentes en la población mundial. Entre ellas, destacan el trastorno de depresión mayor y los trastornos relacionados con alteraciones ocurridas durante la etapa del neurodesarrollo, como son los trastornos de tipo psicótico (esquizofrenia) o el trastorno del espectro autista. El tratamiento actual para estas patologías combina un enfoque farmacológico con terapias de apoyo psicológico. Desafortunadamente, una proporción importante de los pacientes no responden bien al tratamiento convencional, basado en manipulaciones de la transmisión de serotonina, catecolaminas o glutamato, o este les produce unos efectos secundarios tales que terminan abandonándolo. En la búsqueda de rasgos etio- y fisiopatológicos de estos trastornos, además de los factores genéticos, entre las teorías que más interés están recibiendo se encuentra la hipótesis inflamatoria o de desregulación de la inmunidad, que plantea la existencia de un proceso inflamatorio generalizado a nivel central y sistémico, y la hipótesis neuroendocrina, que sitúa al estrés como un crucial desencadenante de estos trastornos. Dada la fisiopatología multifactorial de estas enfermedades, la mejora del tratamiento habitual debería contemplar el estudio de nuevas vías de señalización molecular que pudieran mejorar los tratamientos antidepresivos y antipsicóticos actuales. En este contexto, la caracterización de la autofagia podría ayudar a mejorar el conocimiento sobre la fisiopatología de estos trastornos, quizá aportando alguna diana sobre la cual desarrollar una terapia farmacológica adicional y/o algún biomarcador. La autofagia consiste en una ruta de reciclaje celular que coordina la eliminación de partes específicas del citoplasma con el fin de obtener energía y degradar en el lisosoma orgánulos defectuosos (como las mitocondrias), proteínas aberrantes o productos de desecho. La autofagia se induce a partir de procesos inflamatorios, oxidantes y metabólicos, y se ha observado que algunos antidepresivos inducen la activación del proceso autofágico. Resumen 2 Hipótesis «La autofagia, así como su subtipo mitofagia, podrían estar implicadas en las alteraciones inmunes e inflamatorias observadas en el sistema nervioso central de diferentes trastornos neuropsiquiátricos, como el trastorno de depresión mayor o los trastornos del neurodesarrollo, pudiendo aportar posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de estas patologías relacionadas con el estrés». Objetivo general Investigar en el sistema nervioso central de un modelo experimental inductor de un comportamiento de tipo depresivo y en tres modelos basados en alteraciones del neurodesarrollo, el papel de la autofagia y su relación con otros procesos celulares a través de diferentes técnicas moleculares, y explorar la posibilidad de que su manipulación farmacológica pueda modificar algunos aspectos bioquímicos o comportamentales en estos modelos. Materiales y Métodos El modelo experimental de depresión Chronic Mild Stress (CMS) se llevó a cabo con ratas Wistar, expuestas a una serie de estresores externos cada 12 horas durante un periodo de 21 días para el desarrollo de un fenotipo de tipo depresivo. Los modelos del neurodesarrollo se basaron en la hipótesis del doble estímulo, por lo que se emplearon dos estímulos (hits) a periodos críticos del desarrollo nervioso (etapa peri o posnatal temprana y adolescencia-juventud). Los estímulos utilizados fueron: como primer hit, la inyección del análogo vírico Poly I:C o la deprivación materna, y como segundo hit, el aislamiento social, la inyección de lipopolisacárido de la pared bacteriana de Gram-, LPS, y la restricción de movimiento por inmovilización (RS). A partir de ellos, se evaluó la conducta desarrollada y se recogieron muestras del sistema nervioso central y plasma. El tejido fue procesado de manera específica según la técnica que fuese a realizarse posteriormente, entre las que destacaron Western blot, RT-qPCR, inmunofluorescencia, inmunoprecipitación, ELISA y citometría de flujo. Para el análisis de la mitofagia y el estado mitocondrial, se efectuó la extracción de mitocondrias en fresco, de la misma manera que se hizo la purificación de fracciones lisosomales. Resumen 3 Además, partiendo de los resultados obtenidos en el modelo CMS, se llevó a cabo la modulación farmacológica de la autofagia con el inductor espermidina, que fue inyectada intraperitonealmente durante la última semana del modelo CMS. Resultados La expresión proteica de p-ULK1, ULK1, Beclin1, p-SQSTM1, Atg3 y Atg16L1 se redujo en la corteza frontal (CF) tras la exposición al modelo de CMS, mientras que mTOR y Atg7 aumentaron. Únicamente el gen Atg7 presentó cambios a nivel génico en la CF. En el hipocampo (Hp), disminuyeron las proteínas p-mTOR, Beclin1, p-SQSTM1, Atg3 y Atg12, aumentando Atg16L1. En este caso, Atg3, Atg5, Atg7 y Atg12 potenciaron su transcripción génica a causa del modelo de estrés. La fosforilación de p-SQSTM1 se halló en exclusividad en el astrocito a través de inmunofluorescencia, revelando el importante papel de este en la regulación autofágica nerviosa. El complejo de clasificación endosómica necesario para la maquinaria de transporte (ESCRT) también se encontró alterado en la CF, donde STAM2, Tsg101, Vps28 y CHMP5 presentaron un descenso de su concentración proteica, y Hrs y CHMP6 un ascenso en esta región. En el Hp, el CMS redujo los niveles proteicos de Tsg101 y Vps4B a la vez que aumentó los de Vps37A. Por otro lado, el CMS ascendió la cuantía lisosomal, tanto en extractos crudos lisosomales como en fracciones purificadas de los mismos, en los cuales se observaron alteraciones en componentes clave de la autofagia mediada por chaperonas (LAMP2A y Hsc70, fundamentalmente), así como enzimas esenciales en su función hidrolítica (catepsinas y cistatinas) en ambas regiones cerebrales. La neurona y la microglía fueron los principales tipos celulares en los que se produjeron los cambios acontecidos en LAMP2A. La cuantificación de los extractos mitocondriales reveló el aumento de proteínas implicadas en el mecanismo de mitofagia en la CF, como fueron Pink1, BNIP3, Nix y FUNDC1, si bien el CMS disminuyó Parkin y FUNDC1 en el Hp. Además, se observó que el CMS inducía un aumento de la masa mitocondrial por citometría de flujo, Western blot e inmunofluorescencia, posiblemente debido a una potenciación de la fusión (se observaron incrementos en la mitofusina 2 y OPA1) o a la inducción génica de la mitogénesis (se halló inducida la transcripción de Pgc1α y Nrf1) en la CF. El tratamiento con espermidina (SPD) produjo mejoras a nivel de las proteínas p-mTOR, Atg3, Atg7, p-SQSTM1, Beclin1, Tsg101, Vps28, Vps37A, FUNDC1, Drp1 y Pink1 en la CF, mientras que en el Hp se observaron menores índices de recuperación de los valores proteicos previamente alterados por el CMS. En esta área, la SPD Resumen 4 potenció la inducción génica de aquellos genes anteriormente estimulados por el modelo CMS. El modelo combinado Poly I:C y aislamiento social solo reguló a la baja las proteínas ULK1, SQSTM1, PGC1α, BNIP3 y OPA1 en la CF, observándose la misma tendencia en p-SQSTM1. También elevó la proteína Pink1 y se detectó la misma tendencia en Nrf1. A nivel génico, el modelo solo causó la disminución de la cantidad de ARNm del gen Lc3α en la CF. La citometría de flujo reveló que el modelo incrementaba la población de microglía en las dos regiones cerebrales bajo estudio, aunque disminuyó la masa mitocondrial en la CF. El modelo de deprivación materna y LPS produjo el descenso de las concentraciones proteicas de p-mTOR, mTOR y Atg3, de la misma manera que elevó las de LC3 y SQSTM1. A nivel de ARNm, el modelo provocó el descenso de la transcripción génica de Sqstm1, Atg12 y Lc3α en la CF. El modelo de deprivación materna y RS dio lugar a alteraciones de la autofagia en los estratos proteico y génico. Por una parte, incrementó los valores de las proteínas p- mTOR, mTOR, Beclin1, ULK1, Atg16L1, Atg3 y p-SQSTM1, reduciendo los de Atg12. Por otra parte, posibilitó la inducción génica de Mtor, Ulk1 y Atg12 en la CF. Conclusiones Los resultados de la presente Tesis Doctoral apuntan hacia una modulación distinta y específica de la vía de la autofagia en función de la naturaleza, la duración y la intensidad del estresor empleado para el desarrollo de cada modelo. Asimismo, dicha modulación es dependiente de la región cerebral y varía entre la corteza frontal y el hipocampo. Los modelos en los que más modificaciones se hallaron fueron el CMS y el modelo de deprivación materna y RS en la corteza frontal, de los que se observó el impedimento de la vía en el primero y la inducción de la misma en el segundo. Además, el modelo CMS mostró más alteraciones en el estado mitocondrial y lisosomal. Este trabajo pone de manifiesto el impacto de los estresores externos de tipo físico y psicológico en la regulación de la autofagia y mitofagia en el sistema nervioso central, aportando su granito de arena a todo el conocimiento previo sobre el potencial uso del mecanismo de autofagia como herramienta terapéutica futura. Resumen 5 ABSTRACT Introduction Nowadays, the prevalence of neuropsychiatric diseases is widely increasing worldwide. Among them, major depressive disorder (MDD) and neurodevelopmental disorders (ND), such as psychosis (schizophrenia) and autism spectrum disorder (ASD) are some of the most frequent ones. The current treatment for these disorders usually combines pharmacological approaches and psychological therapies. Unfortunately, a considerable number of patients either do not properly respond to the average treatment, based on serotonin, catecholamines, or glutamate synaptic manipulation, or quit their prescriptions due to the overwhelming side effects. Among the different theories that try to explain the etiology and pathophysiology of these disorders, apart from the genetic factors, the inflammatory and neuroendocrine hypotheses are receiving great attention lately. The first one states that general inflammatory processes are widespread in neuropsychiatric disorders, both in the periphery and the central nervous system. The neuroendocrine hypothesis highlights the paramount role of stress as one of the main triggers for these diseases. Considering the multiple aspects involved in their pathophysiology, the improvement of their treatment should consider the study of new molecular signaling pathways that could ameliorate the effect of the current antidepressants and antipsychotics. In this way, the characterization of the autophagy pathway might help improve the current knowledge about the pathophysiology of these disorders, possibly providing some new target and/or biomarker on which develop additional pharmacological strategies. Autophagy is a lysosome-based degradative route where parts of the cellular cytoplasm are eliminated with the aim of generating energy and disposing of damaged organelles (such as mitochondria), aberrant proteins or waste products. Autophagy can be induced by inflammatory, oxidant and metabolic mechanisms, and it has been observed that antidepressants induce the activation of the autophagy process. Abstract 6 Hypothesis “Autophagy and its subtype mitophagy might be involved in the immune and inflammatory dysregulations observed in the central nervous system of many neuropsychiatric diseases, such as MDD and ND, being able to become therapeutical targets for the treatment of these stress-related pathologies”. General objective Evaluate the autophagy role and its interplay with other cellular processes in the central nervous system of an animal model that generates a depressive-like behavior and in three neurodevelopmental models in rats, through a variety of molecular biology techniques. Additionally, to explore the pharmacological manipulation of autophagy as a tool to reverse any biochemical or behavioral parameters altered by the stress-based models. Materials y Methods Chronic Mild Stress (CMS), the experimental model of depression, was performed in Wistar rats. They were exposed to many changing stressors during a 21 day-period, each one changing every 12 hours. Neurodevelopmental models were based on the doble hit hypothesis, so that two hits were used in two critical stages of the nervous system development (peri or postnatal and adolescence-early youth, respectively). The stressors employed were the following ones: as fist hit, the viral analog Poly I:C or maternal deprivation, and as second hit, social isolation, LPS administration (the lipopolysaccharide of Gram- bacteria) or movement restraint (RS). From these, behavior tests were performed and central nervous system together with plasma samples were collected until assayed. Brain tissue was specifically processed according to each prospective molecular technique that would be performed, being Western blot, RT-qPCR, immunofluorescence, immunoprecipitation, ELISA, and flow cytometry the most relevant ones. To assess mitophagy and the mitochondrial status, mitochondria were concentrated and extracted from fresh tissue. Lysosomal purified fractions were also extracted from the same kind of sample. Abstract 7 Additionally, considering the results obtained from the autophagy pathway in the CMS model, the pharmacological modulation of the route was performed by using the inductor spermidine (SPD) during the last week of the model. Results Protein expression of p-ULK1, ULK1, Beclin1, p-SQSTM1, Atg3, and Atg16L1 was diminished in the frontal cortex (FC) after the exposure to CMS, while mTOR and Atg7 increased. Atg7 gene was the only one to show changes in the FC. In the hippocampus (Hp), protein levels of p-mTOR, Beclin1, p-SQSTM1, Atg3, and Atg12 were reduced, whereas Atg16L1 was augmented. In this area, the CMS model caused the induction of Atg3, Atg5, Atg7, and Atg12 genes. SQSTM1 phosphorylation was found exclusively located within astrocytes, suggesting the crucial role of the autophagic regulation in the central nervous system. The Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT) was also found altered in the FC, were there was a lower protein concentration of STAM2, Tsg101, Vps28, and CHMP5 factors, and a higher concentration in Hrs and CHMP6 proteins. In the Hp, Tsg101 and Vps4B were downregulated, and the contrary for the Vps37A protein due to the CMS. On the other hand, CMS caused the increase of the number of lysosomes, both in crude lysosomal fractions and in purified lysosomal fractions, from which it was observed many alterations in key components of the chaperone-mediated autophagy (essentially LAMP2A and Hsc70) and in some hydrolytic enzymes (cathepsins and cistatins) from the FC and Hp. Neurons and microglia were the main cells responsible for these changes in LAMP2A. Mitochondrial extracts were analyzed and mitophagy-related proteins were found increased in the FC, such as Pink1, BNIP3, Nix, and FUNDC1, although CMS reduced Parkin and FUNDC1 in the Hp. Moreover, flow cytometry, Western blot, and immunofluorescence determined that CMS led to the increased of the mitochondrial mass, possibly due to the fusion process potentiation (mitofusin 2 and OPA1 protein concentrations were higher) or mitogenesis induction in the FC (Pgc1α and Nrf1 mRNA transcription was also induced). SPD treatment exerted beneficial effects in the protein concentrations of p-mTOR, Atg3, Atg7, p-SQSTM1, Beclin1, Tsg101, Vps28, Vps37A, FUNDC1, Drp1, and Pink1 in the FC, whereas less subtle changes occurred in the Hp at this level. SPD showed a great gene induction stimulation of the previously CMS-induced markers in the Hp. The combined model of Poly I:C and social isolation solely downregulated the proteins ULK1, SQSTM1, PGC1α, BNIP3, and OPA1, showing a similar tendency in p-SQSTM1. Abstract 8 Pink1 was found elevated and Nrf1 also exhibited the same tendency to increase. At the transcriptional level, this model decreased Lc3α mRNA concentration in the FC. Flow cytometry revealed an augmentation of microglia in FC and Hp, although there was a reduction in the mitochondrial mass in the FC. The model of maternal deprivation and LPS caused the decrease of p-mTOR, mTOR, and Atg3 protein values, while showed higher concentrations in LC3 and SQSTM1. Sqstm1, Atg12 y Lc3α transcriptional levels were downregulated in the FC. The model of maternal deprivation and RS gave rise to autophagy alterations both in the proteins and genes considered. On the one hand, it upregulated protein values of p- mTOR, mTOR, Beclin1, ULK1, Atg16L1, Atg3, and p-SQSTM1, downregulating those of Atg12. On the other hand, the model led to the gene induction of Mtor, Ulk1 y Atg12. Conclusions The results obtained from this PhD dissertation point out the distinct and specific modulation of the autophagy pathway according to the nature, duration, and intensity of the stressor applied in the development of each animal model. Additionally, this modulation is dependent on each cerebral region and it varies between the frontal cortex and the hippocampus. The models subjected to a higher degree of alterations were the CMS and the one of maternal deprivation and RS in the FC. From the first one, it was observed an impediment of the autophagy route, whereas the second showed the induction of the pathway. The CMS model also presented further modifications in the mitochondrial and lysosomal statuses. This work evinces the impact of external stressors on the autophagy and mitophagy regulation in the central nervous system, making its contribution to the previous knowledge on the potential use of the autophagic mechanisms as a future therapeutical tool. Abstract 9 ABREVIATURAS 10 11 ∆Ψm: alteración del potencial de membrana mitocondrial 5-HT: serotonina 8-OHdG: 8-hidroxi-2’- deoxiguanosina ACTH: hormona adrenocorticótropa ADN: ácido desoxirribonucleico ADNc: ADN de copia ADNmt: ADN mitocondrial ADP: adenosina difosfato AIM: activación inmune materna AIM2: absent in melanoma 2 AMD1: adenosil metionina descarboxilasa AMPA: α-amino-3-hydroxy-5- methyl-4-isoxazole propionic AMPK: AMP-activated protein kinase ANOVA: one-way analysis of variance ARN: ácido ribonucleico ARNm/mRNA: ácido ribonucleico mensajero/messenger ribonucleic acid ASC: apoptosis-associated speck- like protein containing a CARD ASD: autism spectrum disorder Atg16L1: autophagy-related 16-like 1 Atg: autophagy-related ATP: adenosina trifosfato AU: arbitrary units Bak: Bcl2 homologue antagonist/killer Bax: Bcl2-associated X protein BHE: barrera hematoencefálica Bcl2: B-cell lymphoma 2 Bcl-XL: B-cell lymphoma-extra large BDNF: brain derived neurotrophic factor BNIP3: Bcl2 interacting protein 3 BSA: bovine serum albumin Ca2+: calcio CA: campo abierto CA1,2, 3: cornu ammonis 1, 2, 3 CAI: Centro de Apoyo a la Investigación CF/FC: corteza frontal/frontal cortex CHMP2, 4, 5, 6: charged multivesicular body protein 2, 4, 5, 6 //chromatin-modifying protein Abreviaturas 12 CLF: fracción cruda lisosomal CLR: C-type lectin receptors CMA: chaperone-mediated autophagy CMS: chronic mild stress CRH: factor liberador de la hormona liberadora de adrenocorticótropa CRP: proteína C reactiva CT: control Cyt C: citocromo C DA: dopamina DAMP: damage-associated molecular pattern DAPI: 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride DEPC: diethyl pyrocarbonate Deptor: DEP domain-containing mTOR-interacting protein DG/GD: dentate gyrus/giro dentado DISC1: disrupted in schizophrenia 1 DM/MD: deprivación maternal Drp1: dynamin-related protein 1 DSM5: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 5ª edición ELDR: endo-lysosomal damage response ELISA: enzyme-linked immunosorbant assay EM: extracto mitocondrial EP300: histona acetiltransferasa p300 EPM: elevated plus maze ESCRT: endosomal sorting complex required for transport FBS: fetal bovine serum FIP200: focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kDa FUNDC1: FUN14 domain-containing protein 1 GABA: ácido gamma-aminobutírico Gal3, 9: galectina 3, 9 GFAP: glial fibrillary acidic protein GR: receptores de glucocorticoides GSK3: Glycogen Synthase Kinase 3 Hp: hipocampo HHA: eje hipotálamo-hipofisiario- adrenal Hrs: hepatocyte growth factor- regulated tyrosine kinase substrate Abreviaturas 13 Hsc70: heat shock cognate 70 Hsp70: heat shock protein 70 Iba1: ionized calcium-binding adapter molecule 1 IF: immunofluorescence IFNα, β, γ: interferón alpha, beta, gamma IL1β, 6, 10, 18: interleuquina 1β, 6, 10, 18 ILV: intraluminal vesicles iNOS: inducible nitric oxide synthase IP: immunoprecipitation Ip: intraperitonealmente Iso/Ais: aislamiento social JNK: c-jun N-terminal kinase Keap1: kelch-like ECH-associated protein 1 LAMP1, 2A: lysosomal-associated membrane protein 1, 2A LC3: microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 Leu: leupeptin LIR: LC3-interacting region LPS: lipopolisacárido bacteriano LPSa: LPS inyectado de forma aguda LPSc: LPS inyectado de forma crónica Lyso: fracción purificada lisosomal MAP2: microtubule-associated protein 2 MDA: malonil dialdehído MDD: major depressive disorder Mfn1, 2: mitofusina 1, 2 MHC: complejo mayor de histocompatibilidad MitoGreen: MitoTracker® Green MitoDeepRed: MitoTracker® Deep Red MME: membrana mitocondrial externa MMI: membrana mitocondrial interna MR: receptores de mineralocorticoides Mtfa: mitochondrial transcription factor a mTOR: mammalian target of rapamycin mTORC1: complejo 1 de mTOR Abreviaturas 14 MVB: cuerpos multivesiculares MVB12: multivesicular body sorting factor 12 MyD88: myeloid differentiation primary response 88 NA: noradrenalina NCBI: National Center for Biotechnology Information NAPDH: nicotinamide adenosine dinucleotide phosphate NBR1: neighbor of BRCA1 gene 1 protein ND: neurodevelopmental disorders NDP52/CALCOCO2: calcium binding and coiled-coil domain 2 NeuN: neuronal nuclear protein NF: natación forzada NF-κB: nuclear factor-kappa B NGF: nerve growth factor Nix: NIP3-like protein X NLR: nucleotide oligomerization domain-like receptors NLRP3: NLR family pyrin domain containing 3 NMDA: N-methyl-D-aspartate NO: óxido nítrico Nrf1: nuclear respiratory factor 1 Nrf2: nuclear factor erythroid 2- related factor 2 O2: oxígeno OMS: Organización Mundial de la Salud OPA1: optic atrophy protein 1 P19S: subunidad 19S del proteasoma P20S: subunidad 20S (α+β) del proteasoma p53: tumor supressor protein 53 PAMP: pathogen-associated molecular pattern PBMC: peripheral blood mononuclear cells PE: fosfatidiletanolamina PFA: paraformaldehído PGC1α: peroxisome proliferator- activated receptor-γ coactivator 1α PI3K: fosfatidilinositol-3 quinasas PI3P: fosfatidilinositol-3-fosfato Pink1: PTEN-induced putative kinase 1 PN: posnatal Abreviaturas 15 Poly: Poly I:C Rab5, 7: ras-related protein in brain 5, 7 RE/ER: retículo endoplásmico/endoplasmic reticulum Rheb: RAS-homolog enriched in brain RNS: especies reactivas de nitrógeno ROS: especies reactivas de oxígeno RS: restricción de movimiento RSa: restricción de movimiento aguda RSc: restricción de movimiento crónica RT-qPCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real Rubicon: RUN domain protein as Beclin1 interacting and cysteine-rich containing Sal: salino SDHA: succinato deshidrogenasa SEM: error estándar de la media Ser: serina SGA: síndrome general de adaptación SLR: sequestosome 1-like receptors SNAP25: synaptosome associated protein 25 SNARE: N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor SNC: sistema nervioso central SOD1: superóxido dismutasa 1 SPD: espermidina SQSTM1/p62: ubiquitin-binding protein sequestosome 1/secuestroma SSAT: espermidina N1- acetiltransferasa STAM1, 2: signal transducing adaptor molecule 1, 2 TaxBP1: tax1-binding protein 1 TBA: ácido tiobarbitúrico TDAH: trastorno por déficit de atención e hiperactividad TDM: trastorno depresivo mayor TEA: trastorno del espectro austista TFEB: transcription factor EB TLR2, 3, 4, 7, 9: toll-like receptor 2, 3, 4, 7, 9 Abreviaturas 16 TNFα: tumor necrosis factor alpha TOMM20: translocase of outer mitochondrial membrane 20 TRIF: toll-like receptor adaptor molecule 1 Tsg101: tumor susceptibility gene 101 Ub: ubiquitina UCM: Universidad Complutense de Madrid UCP2: uncoupling protein 2 ULK1, 2: unc-51-like kinase 1, 2 UPR: respuesta ante proteínas mal plegadas UVRAG: UV radiation resistance- associated gene V: voltios VEGF: vascular endothelial growth factor Veh: vehículo VMP1: vacuole membrane protein 1 VPS4, 22, 28, 25, 34, 36, 37A, 4B: vacuolar protein sorting-associated protein 4, 22, 28, 25, 34, 36, 37A, 4B WB: western blot WIPI: WD-repeat protein interacting with phosphoinositides WT: wild type XBP1: X-box binding protein 1 Abreviaturas 17 INTRODUCCIÓN 18 19 1. El estrés Existe un gran número de patologías cuyo principal desencadenante es el estrés [1]. Aunque la exposición al mismo puede ocurrir de forma muy diversa, y cada individuo lo percibe y responde de manera concreta, este desencadena una serie de respuestas fisiológicas e incluso, patológicas que conducen al desarrollo de la enfermedad [2]. Entre ellas, destacan las enfermedades neuropsiquiátricas, algunas enfermedades metabólicas (como la obesidad y la diabetes tipo II) y enfermedades neurodegenerativas como la demencia [1, 3]. El padre del concepto del estrés fue el Dr. Hans Seyle (1907-1982), cuyos experimentos con roedores le llevaron a la conclusión de que independientemente del estímulo dañino que afectase al organismo, este responde siempre de forma estereotipada. Con ello, el organismo debe adaptarse a la nueva condición que se le impone desde fuera y, por tanto, definió este mecanismo como el Síndrome General de Adaptación (SGA), que contiene tres etapas: • Reacción de alarma: en ella se observa la hipertrofia de la corteza suprarrenal y la secreción excesiva de corticotropina y tirotropina. • Adaptación: si el organismo sobrevive a la etapa anterior, alcanza un estado estable en el que normaliza su función, exhibiendo resistencia. • Extenuación o agotamiento: si el estímulo se prolonga sobremanera en el tiempo, las dificultades del organismo para defenderse van creciendo hasta llegar al punto de ocasionar la muerte. Tras su teoría del SGA, Seyle formuló el término stress (del inglés, tensión o presión) para denominar el estado en el que el organismo combate y se defiende frente a un estímulo nocivo, entendido como stressor (estresor) [4]. Esta idea se globalizó en diferentes ámbitos científicos rápidamente y dio lugar a un nuevo campo de investigación. En la actualidad, el vocablo estrés también implica connotaciones positivas, como es la adaptación a un ambiente cambiante y la anticipación a situaciones similares en el futuro. Asimismo, se considera estrés a cualquier elemento que desafía la homeostasis (definida originalmente por Walter Cannon como el estado interno estable y constante que asegura las condiciones vitales óptimas y hacia el cual los procesos fisiológicos retornan para el mantenimiento de su estado basal [5]), de manera que la respuesta al estrés es un mecanismo compensatorio cuyo fin primordial es la restauración de la homeostasis. De no alcanzarse dicha rehabilitación, el organismo podría desarrollar Introducción 20 diferentes patologías. En la Figura 1 se detalla esquemáticamente el sistema de respuesta a estrés [6]. El estrés permite proteger al organismo: la exposición a estímulos dañinos de manera continua sí tiene efectos perjudiciales para la salud, pero su exposición puntual es favorable y ejerce una repercusión biológica beneficiosa. Esta dualidad se entiende como hormesis. Así, lo importante es el mantenimiento del balance entre el estrés y la respuesta del sistema [6]. La respuesta al estrés implica varios sistemas: el endocrino, el nervioso y el inmune. Su regulador principal es el eje hipotálamo-hipofisiario-adrenal (HHA) que modula y adapta la respuesta del organismo al estrés. Su activación lleva a la inducción de las neuronas paraventriculares del hipotálamo para que secreten el factor liberador de la hormona liberadora de adrenocorticotropa (CRH), que va a estimular la hipófisis anterior para que esta sintetice y libere ACTH (hormona adrenocorticotropa). Figura 1. Resumen de la respuesta al estrés de acuerdo con el tipo de estímulo encontrado. Se entiende como eustrés a la situación en la que el organismo es retado por un estímulo nocivo, pero consigue recuperar la homeostasis induciendo una respuesta moderada y le aporta beneficios. El distrés implica un estímulo dañino en el que el organismo es sometido a un estrés de gran calibre, lo que conduce a una respuesta al estrés severa y que puede condicionar la salud. El sustrés se refiere a la menor exposición a cualquier estrés de la debida, dando lugar a una respuesta debilitada del organismo y el fallo en la capacitación de restauración de la homeostasis. Introducción 21 La ACTH impulsa la síntesis y secreción de glucocorticoides (principalmente cortisol en humanos y corticosterona en roedores) y mineralocorticoides (por ejemplo, aldosterona) por parte de las cortezas de las glándulas suprarrenales hacia el torrente sanguíneo. El incremento de cortisol plasmático supone la inhibición por retroalimentación negativa de la secreción de CRH y ACTH, apagando así el eje HHA y devolviéndolo a sus condiciones fisiológicas [7]. Los glucocorticoides son los moduladores estrella de la homeostasis, del sistema cardiovascular e inmune, la cognición y memoria. Asimismo, tienen una función antiinflamatoria e inmunosupresora muy potente [7]. La actuación de los glucocorticoides asegura la defensa y adaptación del organismo ante una situación estresante y, en condiciones basales, tiene un ritmo circadiano. Al hilo de lo ya mencionado, la exposición reiterada al estrés contribuye a la alteración de la retroalimentación negativa del eje HHA, potenciando los efectos del cortisol y haciendo que el organismo no sea ya capaz de responder correctamente en el caso de que un nuevo estresor aparezca [8]. Los efectos del estrés en el sistema nervioso se han investigado durante más de 50 años. Gracias a ellos, se conoce la influencia de este sobre gran cantidad de parámetros, como son el volumen y peso del cerebro, la cognición y la memoria. En función de la naturaleza y la duración del estrés, las alteraciones y su alcance a largo plazo serán diferentes [9]. Una de las consecuencias más notables sobre el sistema nervioso es la reducción del grosor de la barrera hematoencefálica (BHE). La BHE constituye un paso fronterizo entre la periferia y el sistema nervioso central (SNC) que asegura el control de entrada de sustancias tóxicas o perjudiciales periféricas desde la sangre hacia el cerebro. Es tan restrictivo que, incluso, evita el paso de células inmunes [10]. La disminución y debilitación de la BHE tras la exposición reiterada al estrés aumenta la vulnerabilidad del cerebro y causa neuroinflamación. Se ha evidenciado en los últimos años el papel Figura 2. El Dr. Hans Seyle exponiendo su teoría de respuesta al estrés. Introducción 22 de la microbiota intestinal en el mantenimiento fisiológico de la BHE; el estrés no solo alcanzaría a dañar la barrera gastrointestinal sino también la BHE como resultado de la alteración intestinal [11]. 1.1 Estrés, inflamación y sistema inmune El eje HHA ejerce un papel central en la regulación de la inflamación a través del cortisol. En condiciones de estrés permanente, el aumento indiscriminado de cortisol contribuye a la aparición de la resistencia a glucocorticoides, entendida como la menor sensibilidad a estos por parte de las células. Esto conlleva al aumento de parámetros inflamatorios de forma exacerbada y extiende la duración de dicha inflamación [8]. El eje HHA también puede activarse por la estimulación de mediadores inflamatorios como citoquinas: la interleuquina (IL)-1, TNFα (Tumor Necrosis Factor alpha) e IL6 sobre el hipotálamo, induciendo la secreción de glucocorticoides. Precisamente, esta sería una segunda ruta de retroalimentación negativa: los glucocorticoides disminuyen consecuentemente la síntesis de citoquinas proinflamatorias, regulando la inflamación. El agonismo de receptores Toll-like TLR2 y TLR4 en células adrenocorticales estimula la producción de glucocorticoides, constituyendo otra vía inflamatoria con actuación directa sobre el eje HHA [12]. Los receptores TLR tienen un papel fundamental en el reconocimiento de sustancias exógenas y en el desencadenamiento de respuestas inmunes y neuroinflamatorias [13]. La respuesta inflamatoria comprende una secuencia de tres fases: una etapa inicial de alarma, tras la cual se liberan mediadores inflamatorios que señalizan la presencia de algún daño o peligro; otra etapa intermedia que permite la movilización de células inmunes hacia el lugar que inició la vía, como leucocitos y macrófagos; y una fase final en la que se produce la resolución de la inflamación, en donde se elimina el tejido dañado y se consigue la reparación [12]. El sistema inmune reconoce distintas señales endógenas y exógenas mediante receptores propios, como son los TLR, los NLR (Nucleotide oligomerization domain-like receptors) o los CLR (C-type lectin receptors). Sus ligandos más comunes son moléculas PAMP (Pathogen-Associated Molecular Pattern), que derivan de bacterias y otros patógenos, y DAMP (Damage-Associated Molecular Pattern) que son liberadas por células propias en respuesta a daño. Al reconocer este tipo de elementos, los receptores del sistema inmune desencadenan vías inflamatorias [14]. Introducción 23 Los receptores de glucocorticoides (GR) regulan las cascadas de señalización de los TLR por diversas vías; por ejemplo, la activación de los GR lleva al incremento de la expresión genética de inhibidores de TLR y al bloqueo de factores de transcripción proinflamatorios, como NF-κB (Nuclear Factor-kappa B) [12]. La vía de este factor proinflamatorio es la encargada de reunir gran parte de la señalización proveniente de los receptores inmunes y desarrollar la respuesta inflamatoria mediante citoquinas y quimioquinas. Los receptores de mineralocorticoides (MR) presentan una distribución muy heterogénea, y su activación normalmente desencadena en respuestas proinflamatorias. De hecho, presentan una mayor afinidad por el cortisol que los GR, de manera que en la respuesta al estrés, se produce una cascada inicial proinflamatoria mediada por los MR ante la exposición a glucocorticoides, y tras esta, tiene lugar la modulación de su actividad para favorecer la mayor activación de los GR, que mediarán entonces una respuesta antiinflamatoria [15]. No obstante, la función antiinflamatoria clásica de los glucocorticoides puede tornar hacia proinflamatoria ante la exposición crónica a un estresor de intensidad media-alta, contribuyendo y empeorando la situación inflamatoria tanto en la periferia como en el SNC. Este efecto ha sido descrito ampliamente tanto en modelos animales como en humanos, y se conoce como paradoja glucocorticoidea [16, 17]. 1.2. Estrés oxidativo e inflamación Se entiende como estrés oxidativo al estado celular desregulado entre factores prooxidantes y antioxidantes en favor de los primeros, conduciendo a la perturbación de la señal redox y a diverso daño molecular. Las células, en esta situación, quedan expuestas a diferentes moléculas endógenas o exógenas altamente oxidantes. Estas pueden ser radicales o no (como el peróxido de hidrógeno, H2O2) pero todas comparten su capacidad de oxidar (tomar electrones de un elemento) biomoléculas con las que permanecen en contacto, generando finalmente daños en la fisiología celular. Los radicales libres más destacados son los que derivan del oxígeno (ROS) y del nitrógeno (RNS) y en conjunto dan lugar al estrés nitroxidativo [18]. La fuente primigenia de ROS es la mitocondria, de la que se hablará en secciones posteriores. Sus principales componentes son O2, H2O2 y -OH, mientras que los derivados del nitrógeno son NO-, NO2 y ONOO-. Todos ellos tienen la facultad de dañar Introducción 24 biomoléculas como el ADN, proteínas y lípidos. Esto repercute en todos los procesos biológicos en los que están implicados, concluyendo en la ruptura de membranas plasmáticas e intracelulares, peroxidación del ADN, pérdida de energía metabólica y múltiples infecciones [19]. Volviendo al concepto de hormesis, un claro ejemplo es la respuesta al estrés nitroxidativo. Un aumento excesivo de ROS y RNS ha sido implicado en la fisiopatología de muchas enfermedades, como el Parkinson, Alzhéimer, la esquizofrenia y el cáncer. No obstante, cada vez resulta más evidente que un mantenimiento estable de estos radicales libres son cruciales para muchos procesos biológicos [6], ya que son esenciales en la señalización intracelular y la retirada de microorganismos patógenos, protegiendo a las células frente a la infección [19]. Generalmente, la inducción del receptor TLR4 da lugar al aumento de ROS y RNS mediante diferentes rutas: la secreción de citoquinas proinflamatorias, como el interferón (IFN) de tipo I, estimula directamente la creación de ROS y RNS; la interacción directa de TLR4 con la NAPDH (Nicotinamide Adenosine Dinucleotide Phosphate) oxidasa, condiciona la producción de ROS; TNFα e IL6 derivados de la respuesta de TLR4 también potencian su síntesis; TLR4 favorece la expresión genética de la enzima iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase) mediante NF-κB, aumentando la síntesis de NO, que a su vez suprime a la enzima SOD (superóxido dismutasa) y ocasiona malonil dialdehído (MDA). El MDA causa la peroxidación lipídica de diferentes membranas celulares, empeorando el estrés nitroxidativo [19]. El SNC es altamente vulnerable a los efectos del estrés oxidativo: el elevado índice de consumo de O2 conlleva a que la producción de ROS sea mayor que en otros órganos. De hecho, el gran contenido en ácidos poliinsaturados de las membranas neuronales hace que estos sean diana predilecta de ROS, potenciando el daño por MDA. El propio neurotransmisor glutamato provoca estrés oxidativo en concentraciones elevadas, lo que es conocido como neurotoxicidad por glutamato. Por si fuera poco, las defensas antioxidantes del SNC no son tan potentes como en otros tejidos, ya que existen bajos niveles de glutatión peroxidasa, catalasa y vitamina E [20]. El incremento del estrés oxidativo en el SNC resulta en neuroinflamación, por ejemplo, a través de la liberación de TNFα e IL6, así como por la activación de la vía proinflamatoria de NF-κB. Paralelamente, una de las rutas necesarias para la síntesis de enzimas antioxidantes es la regulada por Nrf2 (Nuclear Factor erythroid 2-related factor 2), y cuyos productos tienen una función dual antioxidante y antiinflamatoria. Existe interacción entre la vía proinflamatoria de NF-κB y la antioxidante de Nrf2 [20], y Introducción 25 entre la primera y su mediación en la activación de iNOS, cuya síntesis de NO- y mediación de ONOO- termina ocasionando daño oxidativo/nitrosativo [21]. Todo ello sugiere que inflamación y estrés oxidativo son las dos caras de una misma moneda. 2. Las enfermedades neuropsiquiátricas Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), las enfermedades neuropsiquiátricas o enfermedades mentales comprenden aquellas que afectan al comportamiento y las relaciones con los demás, la capacidad de razonamiento, la interpretación de la realidad y las emociones. Su tratamiento ha ido modificándose en los últimos años, siendo ahora clave la combinación de la psicoterapia y los psicofármacos. La prevalencia de los trastornos mentales ha ido incrementándose a lo largo de los años, bien por el ritmo de vida actual o por una mejora en las herramientas diagnósticas. Actualmente, los más prevalentes son la ansiedad, la depresión, el trastorno bipolar, la psicosis y esquizofrenia, los trastornos de la conducta alimentaria y los trastornos del neurodesarrollo, como los trastornos del espectro autista [22]. Las patologías neuropsiquiátricas pueden diferir mucho entre sí, pero comparten elementos clave en su fisiopatología: la combinación entre la predisposición genética y un estímulo ambiental estresante durante el desarrollo embrionario o en etapas clave de la vida. Figura 3. Litografía por Armand Gautier de 1857 donde se representan las principales enfermedades mentales de la época: alucinación, demencia, erotomanía, idiocia, manía aguda, megalomanía y parálisis. Introducción 26 En algunos trastornos, como en la esquizofrenia, el factor genético tiene mayor peso que en otros, tal es el caso de la depresión. Sin embargo, para el estudio de la esquizofrenia, se han necesitado grandes cohortes de pacientes para la identificación de genes responsables de la fisiopatología debido a fenómenos de pleiotropía: un mismo gen puede dar lugar a varios fenotipos distintos, lo que dificulta sobremanera la caracterización de un único gen como responsable de la enfermedad. Aun así, cada vez hay más evidencia de un posible papel de la heredabilidad en las enfermedades neuropsiquiátricas, en mayor o menor medida según el trastorno [23]. Por otra parte, las consecuencias de la exposición a estresores ambientales son dependientes de la naturaleza del estresor y su duración. Por ejemplo, el estrés psicológico en la edad adulta derivado de situaciones como la pérdida de un ser querido, un despido laboral o el padecimiento de una enfermedad, si se cronifica y mantiene en el tiempo puede ocasionar el desarrollo de depresión [9]. Si, por el contrario, el estresor ambiental ocurre durante el periodo gestacional, donde tienen lugar los procesos centrales del neurodesarrollo, las alteraciones en la conectómica neuronal pueden afectar al normal funcionamiento del cerebro. Este supuesto se cumple en el caso del autismo [24]. Por tanto, las múltiples formas en las que se puede manifestar o presentar el estrés, de acuerdo con las circunstancias personales de cada uno, la etapa de la vida y su bagaje genético, pueden acarrear el desencadenamiento de una enfermedad mental. 2.1. Trastorno depresivo mayor El trastorno depresivo mayor (TDM) se caracteriza por la presencia de tristeza o melancolía, un menor interés, baja autoestima y anhedonia (incapacidad para sentir placer). A esta sintomatología la acompañan además alteraciones somáticas y cognitivas. Se trata de una patología multifactorial cuya afección combina parámetros psicológicos, sociales y biológicos. De ahí deriva su dificultad de estudio [25]. La depresión es la principal causa de discapacidad a nivel mundial, contando con más de 270 millones de personas que la padecen diariamente. Está más extendida en mujeres, donde la prevalencia asciende a 170 millones, en comparación con los 109 millones en el caso de los hombres [22]. Presenta una gran heterogeneidad clínica, pero su diagnóstico se ve fundamentado en los criterios recogidos por el DSM5 (Diagnostic Introducción 27 and Statistical Manual of Mental Disorders, 5ª edición). Entre ellos, destacan tres categorías de síntomas [26]: • Síntomas psicológicos: se incluyen los sentimientos de tristeza y desolación, anhedonia, culpa o pensamientos suicidas. • Síntomas cognitivos: dificultades de pensamiento o razonamiento, problemas para concentrarse y para recordar. • Síntomas neurovegetativos: fatiga y pérdida de energía, así como alteración del apetito y del sueño. También se observa retraso psicomotor. Estudios de neuroimagen han concluido que el TDM genera cambios en la corteza prefrontal, el lóbulo temporal y el hipocampo. Con ello, también se observan alteraciones en la conectómica: especialmente en los circuitos prefrontales-subcorticales, cíngulo anterior-corteza prefrontal y esta última con el hipocampo [25]. Además, existe la posibilidad de la predisposición genética: se han estudiado genes cuyas mutaciones o polimorfismos afectan a la forma en la que el SNC responde al estrés, modificando la función de neurotransmisores. Sin embargo, no parece que el componente genético sea mayor que el ambiental: la exposición crónica a eventos traumáticos o estresores psicosociales aumentan considerablemente la vulnerabilidad al desarrollo del TDM. La comunidad científica ha estado y sigue enfrentándose a múltiples obstáculos en cuanto a la etiología concreta de la enfermedad, sin éxito. Tampoco se ha esclarecido al completo la fisiopatología de la depresión, aunque hay varias teorías al respecto. A pesar de que cada una aporta nociones que explicarían la sintomatología de la enfermedad, es cierto que ninguna cubre y da respuesta de forma completa. Por tanto, estas hipótesis de la depresión no son autoexcluyentes, sino que se consideran complementarias, puesto que es la mejor forma de explicar la clínica del TDM [25, 27]: • Hipótesis monoaminérgica: la sintomatología depresiva es debida a una alteración de la neurotransmisión monoaminérgica en la brecha sináptica. Entre ellas, de serotonina (5-HT), noradrenalina (NA) y dopamina (DA). Como los antidepresivos provocan un aumento de estas, la depresión tiene que estar intrínsecamente relacionada con la concentración monoaminérgica. Desgraciadamente, esta hipótesis no explicaría toda la sintomatología ni tampoco cuestiones como la latencia de respuesta del tratamiento convencional con antidepresivos (generalmente de unas tres o cuatro semanas) ni por qué se Introducción 28 consigue en la mayoría de los casos la remisión pero no la recuperación completa [27, 28]. • Hipótesis glutamatérgica-GABAérgica: el glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio del SNC cuya función es realizada a través de su unión postsináptica a receptores ionotrópicos y metabotrópicos [29]. La rápida acción de la ketamina como antagonista de los receptores NMDA (N-methyl-D- aspartate) es una de las principales evidencias de la implicación del glutamato en los trastornos afectivos. Se postula que la ketamina actúa antagonizando los receptores NMDA de interneuronas GABAérgicas, lo que disminuye la inhibición de la secreción de glutamato en las neuronas glutamatérgicas. Esto conlleva a una explosión de glutamato que se une entonces a receptores AMPA (α-amino- 3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic), contribuyendo a la inhibición de factores como GSK3 (Glycogen Synthase Kinase 3) y la activación de otros como mTOR (mammalian Target of Rapamycin) [30]. • Hipótesis mitocondrial: plantea la posibilidad de que la sintomatología depresiva sea debida a una afección mitocondrial. El SNC precisa de gran cantidad de energía y, por ello, es muy dependiente de la función mitocondrial. Alteraciones en las mitocondrias podrían así contribuir a la aparición de diferentes patologías cerebrales [25]. • Hipótesis neuroinflamatoria: basada inicialmente en el aumento de citoquinas proinflamatorias (IL1β, IL6, TNFα) y CRP (proteína C reactiva) plasmáticas observadas en pacientes con TDM, lo que se ha ido relacionando con mala respuesta al tratamiento antidepresivo [25, 26]. En los últimos años, se han evidenciado diferentes mecanismos por los cuales las señalización inflamatoria periférica acaba repercutiendo en el cerebro. Un ejemplo de ello es la infiltración de citoquinas al SNC por partes concretas de la BHE, cuya interacción con neurotransmisores y la actividad sináptica da lugar a los síntomas clásicos del TDM. Aparte de la BHE, también podría existir comunicación centro-periferia mediante el nervio vago [26]. Asimismo, la propia patología puede inducir de forma sistémica la síntesis de citoquinas proinflamatorias, cerrando el ciclo. Otro ejemplo que respaldaría esta hipótesis es el efecto antidepresivo observado en el tratamiento antiinflamatorio de enfermedades inflamatorias periféricas, aunque no se ha llegado a ningún consenso en cuanto a la repercusión en el tratamiento de la depresión [25]. El impacto de la neuroinflamación sobre el Introducción 29 desarrollo del TDM y su desregulación inmune ha conducido a un profundo estudio comparativo con el fenómeno denominado sickness behavior (comportamiento enfermizo): el conjunto de síntomas no específicos desencadenados por infecciones e inflamación caracterizados por fiebre, malestar, cansancio y pérdida de energía, alteraciones en el humor, anhedonia, sueño, ausencia de apetito, entre otros [31]. El solapamiento entre esta sintomatología y la observada en el TDM apoya esta hipótesis neuroinflamatoria, y ha contribuido al desarrollo de modelos animales que muestran un fenotipo conductual similar para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes al TDM. Un ejemplo clásico consiste en la inyección del lipopolisacárido bacteriano LPS, componente de la pared en bacterias Gram negativas, que induce la activación del sistema inmune y, con ello, múltiples cambios comportamentales y fisiológicos, como es el comportamiento enfermizo [32]. • Hipótesis neuroendocrina: postula que la cronicidad del estrés conduce a la hiperactivación del eje HHA, lo que contribuye a un estado de hipercortisolemia. La duración y el tipo de estresor es condicionante, así como la posible predisposición genética. Aparentemente, un estresor moderado y continuo resulta más perjudicial que uno agudo y severo, ya que es el mantenimiento del estresor el que merma los sistemas de defensa. La hipercortisolemia y demás factores proinflamatorios bloquean eventos de neurogénesis y neuroplasticidad en la corteza prefrontal y el hipocampo, disminuyendo la concentración de glutamato y GABA (Gamma-aminobutyric acid), junto con un menor apetito y anhedonia. La hiperactividad del eje también puede traducirse en resistencia al receptor de glucocorticoides, por una disminución tanto de su expresión como de su funcionalidad. Esto hace que no haya una retroalimentación negativa correcta que suprima al eje, y la situación se perpetúe. Los antidepresivos son capaces de normalizar los niveles de cortisol y reestablecer dicha retroalimentación negativa [27]. • Hipótesis neurotrófica: la reducción de BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) estaría perjudicando la transmisión sináptica en regiones esenciales en la modulación de los estados de ánimo, como son la corteza prefrontal y el hipocampo, además de alterar procesos de neurogénesis, contribuyendo así a la fisiopatología del TDM. El BDNF es una neurotrofina esencial en el desarrollo del SNC que asegura la supervivencia y proliferación neuronal. Sus concentraciones elevadas tras el tratamiento antidepresivo, tanto en pacientes Introducción 30 como en modelos animales, compensa las modificaciones morfológicas y funcionales de conexiones neuronales, así como aumenta la neurogénesis en el giro dentado hipocampal. Partiendo de las funciones del BDNF en el crecimiento axonal y dendrítico, transmisión sináptica y plasticidad, su modulación farmacológica podría mejorar la sintomatología característica del TDM. Curiosamente, durante el periodo de latencia de los efectos del tratamiento antidepresivo, se observa una subida paralela de las concentraciones de neurotrofinas, indicando el papel esencial de estas en la acción central de estos fármacos [33]. De esta manera, aun disponiendo de numerosas hipótesis que explican en diferente medida la posible etiología y características propias del TDM, se desconoce propiamente la fisiopatología de la enfermedad. Considerando el creciente número de casos en todo el mundo, resulta imprescindible la continuación de su investigación, ahondando entre las distintas hipótesis para la identificación de nuevas rutas y dianas terapéuticas. 2.2. Trastornos del neurodesarrollo Los trastornos del neurodesarrollo incluyen patologías que suelen debutar en la infancia, como los trastornos del espectro autista y el trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH). Su prevalencia se ha visto visiblemente aumentada durante los últimos años y es más común en hombres. En términos generales, se caracterizan por conductas repetitivas, problemas sociocognitivos y del control sensorimotor, además de por dificultades en las funciones ejecutivas [24]. Aunque se desconoce la etiología de estas enfermedades, cada vez recibe más atención la interacción entre inflamación y epigenética sobre la dualidad genética- ambiente: la dieta, el sueño, el ejercicio, la contaminación, el microbioma intestinal y el estatus socioeconómico (entre otros) podrían, en su conjunto, modificar la transcripción de genes susceptibles y contribuir al desarrollo de estas patologías [34, 35]. A todos estos factores ambientales que podrían ayudar en el desencadenamiento del trastorno se les denomina exposoma. El exposoma es capaz de modular la arquitectura epigenética y que sus consecuencias se mantengan de por vida. Por ejemplo, la exposición durante el embarazo a algún patógeno u otro tipo de estímulo que obligue a la activación del sistema inmunitario materno provoca la modificación del patrón epigenético del recién nacido, lo que podría Introducción 31 hacerlo más vulnerable al desarrollo de estos tipos de trastorno en etapas futuras de su vida. Dicha activación también conduce a un estado inflamatorio que, de no controlarse correctamente, podría empeorar el pronóstico [24, 36]. De hecho, adultos que sufrieron algún tipo de estrés en una fase temprana de su vida presentaron cambios de metilación en su ADN, correlacionados con variaciones en la respuesta inflamatoria de células sanguíneas periféricas mononucleares (PBMC, de sus siglas en inglés Peripheral Blood Mononuclear Cells). Dicha exposición temprana también se correlaciona con mayores marcadores inflamatorios en la adultez [37]. La hipótesis de la activación inmune materna (AIM) postula que la desregulación inmune materna afecta al neurodesarrollo fetal: el código genético que controla todo el proceso embrionario interacciona continuamente con el sistema inmune, el eje HHA del estrés y las características sexuales del feto, de manera que alteraciones en esta etapa crítica podrían modificar irreversiblemente la formación del sistema nervioso fetal [24, 36]. La observación clínica evidenció que la gestación en épocas estacionales con mayor tasa de infección (gripe, varicela y rubeola) coincidían con un mayor número de diagnósticos posteriores de autismo y esquizofrenia [38]. Lo que todas las infecciones tienen en común es un estado de inflamación crónico, donde otros factores biológicos o psicosociales podrían evitar o retardar su resolución final. Las madres con enfermedades autoinmunes, con obesidad, o con un estatus socioeconómico inferior han mostrado tener una mayor probabilidad para el desarrollo de enfermedades del neurodesarrollo en su descendencia. Sin embargo, aunque estos tres factores contribuyan a dicha aparición, las rutas moleculares participantes pueden ser muy distintas: en las enfermedades autoinmunes, resulta evidente que actúa principalmente la desregulación inmunitaria, pero en el caso de la obesidad, los parámetros mayormente afectados fueron el estrés oxidativo y metabólico, así como factores neuroendocrinos [24]. El desarrollo del cerebro comienza durante la gestación, pero continúa hasta la adolescencia. A partir del periodo postnatal, aumenta la sustancia gris cerebral con un incremento explosivo de sinapsis (sinaptogénesis), seguido de un control y refinamiento de estas conocido como poda (pruning) sináptica en la etapa adolescente, otro periodo crítico. El desarrollo de la sustancia blanca se relaciona con la mielinización axonal, que puede extenderse incluso hasta la edad adulta. Así, la exposición a situaciones adversas durante las etapas críticas del desarrollo cerebral tiene dos posibles consecuencias: afectar negativamente y predisponer al desarrollo de una enfermedad neuropsiquiátrica, Introducción 32 o bien, enriquecer el ambiente al que se expone el cerebro y que maneje correctamente el estrés, desarrollando resistencia para estresores similares en el futuro [20]. 2.2.1. Trastorno del espectro autista El trastorno del espectro autista (TEA) es el trastorno del neurodesarrollo más diagnosticado, con una prevalencia 28 millones de personas, donde 22 millones se corresponden con hombres [22]. Presentan dificultades comunicativas, junto con intereses y comportamientos repetitivos y restrictivos. Estos se suelen observar en torno a los 4 o 5 años. De forma adicional, los pacientes pueden exhibir síntomas comórbidos de otras enfermedades mentales, como depresión y trastorno bipolar [39]. La heterogeneidad observada en cuanto a habilidades sociales, comunicativas y comportamientos estereotipados es la responsable del empleo de la terminología espectro. En lo relativo a lo social, evitan el contacto, no responden cuando les llaman y no les interesa participar en grupos; parecen no inmutarse por la presencia de otras personas, mostrando indiferencia a gestos afectivos o una afección inadecuada. Conforme entran en la vida adulta, las habilidades sociales mejoran, con una menor tendencia al aislamiento social, pero igualmente tienen dificultades de entablar y mantener amistades. A todo ello se suma una percepción e interpretación de la realidad en ocasiones errónea, lo que profundiza aún más su aislamiento. Los problemas de comunicación pueden ser muy diversos: algunos no desarrollan habilidades de comunicación verbal, que puede mantenerse toda la vida; otros, muestran problemas conversacionales, como en el intercambio de turnos al hablar o el reconocimiento de bromas o sarcasmo, unido a dificultades en la interpretación de la entonación, el lenguaje corporal y las expresiones faciales. Otros persisten en una comunicación melódica extraña, tonalidad monótona y ecolalia (repetición continua de una palabra o frase que se acaba de oír) [40]. Entre los trastornos considerados dentro del espectro, se incluyen el trastorno autista clásico, el síndrome de Asperger, el trastorno desintegrativo de la infancia y el síndrome de Rett [40]. Introducción 33 2.2.2. Trastorno psicótico y esquizofrenia Los trastornos del neurodesarrollo también engloban una serie de patologías conocidas como trastornos del espectro esquizofrénico: esquizofrenia, otros trastornos psicóticos y trastorno de la personalidad esquizotípica. El más común, la esquizofrenia, tiene una prevalencia 23 millones de casos en todo el mundo, siendo de 12 millones en hombres y 11 en mujeres en el año 2019 [22]. La enfermedad suele debutar entre los 16 y 30 años. La esquizofrenia se caracteriza por una interpretación errónea de la realidad, incluyendo brotes psicóticos, apatía y aislamiento social, en conjunto con problemas cognitivos. Es uno de los trastornos mentales más discapacitantes, ya que se acompaña con delirios, alucinaciones auditivas y/o visuales y alteraciones del pensamiento. Existen tres grandes categorías de síntomas [41, 42]: • Síntomas positivos: pérdida del contacto con la realidad, falsas creencias (delirios), percepciones de la realidad inexistentes (alucinaciones) y comportamientos erráticos y extraños. Los delirios más frecuentes son los de tipo persecutorios, entre los que destacan la creencia de que los demás leen su pensamiento, los delirios de grandeza y los delirios somáticos. Aunque las alucinaciones auditivas son las más comunes, también pueden darse de forma visual, gustativa, táctil u olfatoria. • Síntomas negativos: comportamientos ausentes, como emociones o conductas poco habituales. Presentan anhedonia, una expresión facial neutra y una tonalidad de voz monótona. Muestran apatía y alogia (disminución o ausencia de lenguaje espontáneo, con bloqueo y mayor latencia de respuesta). A pesar de que los síntomas positivos pueden controlarse y suavizarse parcialmente con el tiempo, no es el caso para la sintomatología negativa. • Síntomas cognitivos: principalmente de atención y memoria, fallos en la concentración y el aprendizaje, así como lentitud psicomotora y dificultades en la función ejecutiva (resolución de problemas o pensamientos abstractos, por ejemplo). • Síntomas afectivos: relacionados con una mala interpretación de los procesos emocionales. Muchos pacientes presentan desregulaciones afectivas derivadas de los síntomas positivos y negativos, entre ellas, destacan episodios depresivos y cuadros de ansiedad. Aunque existen numerosos factores de riesgo, tanto ambientales como genéticos, que comparte con el TEA, la hipótesis actual más extendida que intenta explicar la etiología Introducción 34 de esta enfermedad es la del doble hit: a un primer estímulo durante el periodo gestacional o posnatal temprana (como ocurría en el caso del TEA), se le sumaría otro segundo en la adolescencia o juventud que desencadenaría el desarrollo de la enfermedad. Así, el primer estresor o hit precondicionaría o aumentaría la vulnerabilidad al desarrollo de la enfermedad de presentarse un segundo estímulo estresante en una segunda etapa crítica del neurodesarrollo [43, 44]. Entre los estresores a los que pueden hacer frente en una etapa posterior de la vida, se entremezclan los de tipo biológico con los psicosociales. De los primeros, el abuso de drogas, como el cannabis, son clave. De los segundos, el estrés, las habilidades para sobrellevar los cambios y las situaciones difíciles, así como el apoyo social también juegan un papel muy importante en la capacidad del individuo de afrontar la circunstancia problemática que se les presente. En pacientes con esquizofrenia se observa un aumento volumétrico característico del sistema ventricular cerebral, especialmente en los ventrículos tercero y lateral. Además, se observan disminuciones en el volumen total del cerebro, haciéndose más evidente en los lóbulos frontales, el hipocampo, la amígdala y el tálamo. Estudios de neuroimagen también han mostrado fallos en circuitos sinápticos deslocalizados, no específicos a una región concreta del cerebro [41]. Existen tres teorías clásicas que intentan explicar la fisiopatología de la esquizofrenia [45]: • Teoría dopaminérgica: la sintomatología positiva es consecuencia de la hiperactividad dopaminérgica sobre los receptores D2 de DA en la ruta mesolímbica. Esto se confirma con el uso de antipsicóticos bloqueadores de estos receptores. La hiperactividad dopaminérgica sería la causante de las alucinaciones y los estados maníacos. • Teoría glutamatérgica: la hiperactividad dopaminérgica es un efecto colateral de la desregulación glutamatérgica en la corteza prefrontal. La actividad de los receptores NMDA en defecto en las interneuronas GABAérgicas en esta región cerebral conduce a una sobreestimulación de la señalización por glutamato. Esta sobreexcitación glutamatérgica podría estar a su vez sobreactivando la ruta mesolímbica de la DA, causando las alucinaciones y los delirios. • Teoría serotoninérgica: la clave está en el antagonismo de receptores serotoninérgicos 5-HT2A sin producirse el de los receptores D2. Esto podría Introducción 35 deberse a una liberación excesiva de 5-HT que actúa sobre los 5-HT2A, o a un aumento en la expresión de estos receptores por la enfermad. Todo ello provocaría un efecto en cascada con la liberación de glutamato que, igualmente, podría activar la ruta mesolímbica de la DA. Asimismo, otra hipótesis a destacar es la inflamatoria: estudios de metaanálisis han puesto de manifiesto que, tras el primer episodio psicótico, los pacientes con esquizofrenia presentaron un aumento de las citoquinas proinflamatorias IL1β, IL6 y TNFα tanto en PBMC como en líquido cefalorraquídeo. Además de esta elevación, otros estudios mostraron reducción de la expresión génica de BDNF. En la esquizofrenia crónica, también se observan aumentos considerables de TNFα, IL1β y CRP. Así, las conclusiones fundamentales de estos estudios llevaron a establecer una posible relación entre un peor funcionamiento cognitivo con eventos inflamatorios prolongados [46]. De igual manera, el estrés oxidativo parece ejercer otro papel importante en la enfermedad. Se encontraron valores disminuidos de elementos antioxidantes como el glutatión y de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa y la catalasa. De hecho, se ha propuesto incluso que es el estrés oxidativo el que provoca la sobreestimulación de los receptores NMDA y la alteración de la regulación dopaminérgica [46]. 2.3. Modelos experimentales de interés en Psiquiatría Los modelos animales nos permiten evaluar comportamiento, rutas moleculares y genética tras la aplicación de un protocolo que desarrolla un fenotipo similar al observado en la enfermedad de estudio. A veces, solo replican la alteración de una vía (mediante animales knock-out, por ejemplo), mientras que, en otras ocasiones, los modelos replican factores tanto comportamentales como moleculares. En el campo de la psiquiatría, la experimentación animal se complica sobremanera. En primer lugar, la nosología empleada en clínica es difícilmente aplicable a los modelos animales [47]; un mismo modelo puede utilizarse para estudiar varias patologías, cuando reproduce simultáneamente diversos parámetros clínicos. Dos modelos distintos también pueden desarrollar los mismos cambios moleculares o conductuales, aunque la metodología para realizarlos sea muy diferente. Así, la clasificación de estos modelos puede llegar a ser algo problemática, ya que es imposible cuantificar la dimensionalidad de los pensamientos suicidas, las dificultades Introducción 36 del lenguaje o la empatía. Sin embargo, los modelos animales aportan la base biológica que permite abrir insólitas fronteras para la identificación de nuevos circuitos sinápticos, de posibles dianas terapéuticas y mecanismos subyacentes que podrían explicar la sintomatología clínica y ayudar en su tratamiento [47, 48]. Los modelos animales son muy útiles para la validación de terapias para enfermedades cuya fisiopatología es clara: modelos genéticos para el estudio del Huntington o placas amiloides y ovillos neurofibrilares para el Alzheimer, por ejemplo. Sin embargo, el desconocimiento de los mecanismos principales alterados en las enfermedades mentales, si bien son muchas las hipótesis que los explican, hacen que su representación experimental en animales de laboratorio no muestre de manera total o fidedigna lo observado en la clínica [48]. En función del fenotipo que se quiera evaluar, la metodología empleada es específica. Los modelos basados en el estrés aportan una perspectiva naturalística, donde estresores externos influyen en el desarrollo del sistema nervioso, en el comportamiento social o en el bienestar de los animales. Con todo ello en mente, en la presente Tesis Doctoral se emplearon cuatro modelos animales de interés basados en el estrés que, según el periodo en el que los estresores se aplicaron, su naturaleza y duración, dieron lugar a diversos fenotipos de estudio. 3. La autofagia 3.1. Aspectos generales La autofagia, que toma su nombre del griego auto que significa «uno mismo» y phagein «comer», hace referencia al proceso metabólico de digestión de componentes intracelulares englobados en una doble membrana lipídica. Su objetivo principal es la obtención de energía y recursos bajo condiciones de ausencia de nutrientes, hipoxia, estrés oxidativo y bacterias, entre otros muchos estímulos [49]. El orgánulo fundamental sobre el que todos los procesos de autofagia convergen es el lisosoma. Gracias a él, la célula es capaz de obtener energía mediante la degradación de orgánulos disfuncionales, proteínas aberrantes o productos de desecho que de mantenerse en el citoplasma serían perjudiciales para su homeostasis. La autofagia, por tanto, también ocurre de forma constitutiva en todas las células, favoreciendo el recambio de su infraestructura por energía útil que la célula invierte en otros procesos [50]. Introducción 37 De acuerdo con esto, la autofagia cumple una serie de características funcionales [51]: • Permite la retirada y reciclaje de aminoácidos, nucleótidos, ácidos grasos y proteínas para obtener energía. • Contribuye a la renovación de orgánulos y maquinaria intracelular, favoreciendo un sistema de control citoplasmático que asegura el correcto funcionamiento celular. • Supone un mecanismo de defensa tanto interno (orgánulos dañados, radicales libres o agregados proteicos) como externo (patógenos tales como virus y bacterias). • Se coordina y retroalimenta con otras vías moleculares, como la apoptosis y los inflamasomas. En ella participan unas proteínas propias específicas de este proceso, conocidas como Atg (de sus siglas en inglés Autophagy related) cuya mediación posibilita la organización de todos los componentes de la vía en el espacio y en el tiempo. En los últimos años se han ido descubriendo nuevos roles para los genes y proteínas Atg, lo que señala la importancia del papel de la autofagia y su comunicación intracelular [52]. De forma breve, la autofagia comienza con la acumulación y señalización de los compuestos a degradar, que activa la maquinaria necesaria para el proceso. La asociación e interacción de diferentes proteínas es clave para el desarrollo de una membrana de aislamiento, que conforme se lleva a cabo el mecanismo, va madurando hasta formar un fagóforo (Figura 4). Una vez cerrado e incluidos en él la carga a degradar, se forma la vesícula con doble membrana lipídica conocida como el autofagosoma. Este se fusiona entonces con el lisosoma, cuyas enzimas van a degradar el contenido englobado en él. La unión entre el autofagosoma y el lisosoma recibe el nombre de autolisosoma. Producida la digestión de los productos, se obtienen elementos esenciales a partir de los cuales se consigue energía para otras funciones vitales, o la materia prima para nuevos orgánulos y componentes subcelulares. Introducción 38 3.2. Descubrimiento de la autofagia El descubrimiento de la autofagia fue una de las muchas consecuencias que siguieron a la identificación del lisosoma. En la década de los 50, el citólogo y bioquímico belga Christian de Duve (1917-2013), halló y describió el lisosoma (del griego, lysis «disolución, disgregación» y soma «cuerpo»), un orgánulo hasta entonces desconocido que parecía degradar nutrientes y sustancias de desecho. Algunos años más tarde, también caracterizó y sugirió el término peroxisoma (definido así por su contenido en oxidasas y catalasas) [53, 54]. En 1963, Christian de Duve acuñó por vez primera el término autofagia, al advertir que mitocondrias y otros contenidos citoplasmáticos eran degradados en los lisosomas [55]. Su grupo observó una serie de vesículas o estructuras de pequeño calibre por microscopía electrónica, aunque la autofagia permaneció prácticamente desconocida hasta su investigación posterior en levaduras [49]. Figura 4. Esquema representativo de la vía de la autofagia. Introducción 39 Y es que el vocablo autofagia ya se usaba por 1860, aunque entendido de forma distinta: en este periodo, hacía referencia a un sistema de nuestro organismo de alimentarse a partir de sí mismo que en condiciones de ausencia de alimentos, conseguía mantener al individuo con vida a partir de sus reservas. Es a partir de las investigaciones de Christian de Duve cuando se comienza a emplear el término como lo entendemos hoy en día [56]. Gracias a sus muchas contribuciones a la bioquímica y biología molecular de la célula, Christian de Duve fue galardonado con el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1974 [54]. Asimismo, las siguientes investigaciones sobre la autofagia también concluyeron en otro Premio Nobel de Medicina, esta vez para Yoshinori Ohsumi en 2016, por el descubrimiento y caracterización de la maquinaria autofágica en levaduras [56]. El Dr. Ohsumi y su equipo describieron los genes esenciales implicados en la vía en levaduras. Actualmente, se han identificado 42 genes Atg, donde 16 de ellos forman parte del mecanismo principal y son imprescindibles para su funcionamiento [49, 56]. Dada la aparente conservación de este proceso y sus componentes a lo largo de la cadena evolutiva, multitud de grupos de investigación centran sus esfuerzos en desentrañar los misterios de la vía de la autofagia. Es en este contexto en el que surgen nuestros estudios sobre el papel de la autofagia en modelos experimentales de enfermedades neuropsiquiátricas. 3.3. Mecanismo de acción El curso de la autofagia puede dividirse en varios pasos: inducción, nucleación, elongación, cierre/maduración, fusión y degradación [57]. 3.3.1. Inducción: Atg13-ULK-FIP200-Atg101 El inicio de la vía comienza con la formación del autofagosoma a raíz de la creación de una membrana de aislamiento, denominada fagóforo [49]. La inducción está mediada por el complejo Unc-51-like kinase con sus isoformas 1 y 2 (ULK1 y ULK2), la proteína Figura 5. El descubridor del lisosoma y la autofagia, Christian de Duve. Introducción 40 FIP200 (Focal adhesion kinase family Interacting Protein of 200 kDa), Atg13 y Atg101 [50, 57]. En condiciones basales, el complejo 1 de mTOR (mTORC1) compuesto por mTOR, Raptor (Regulatory-associated Protein of mTOR), Deptor (DEP domain-containing mTOR-interacting protein) y otras proteínas, se mantiene unido a ULK1, forzando su inactividad vía fosforilación de la serina (Ser) Ser757. Eso se traduce en un bloqueo de la vía. Sin embargo, bajo escasez de nutrientes, mTORC1 se separa de ULK1, lo que repercute en la defosforilación de este último y, por tanto, en su activación. Además de mTORC1, AMPK (AMP-activated Protein Kinase) es un modulador positivo de este y por ello, de la autofagia. AMPK es capaz de inducir el comienzo del mecanismo con la fosforilación de la Ser555 de ULK1 [51]. En situaciones de estrés, la inhibición de mTORC1 posibilita su disociación del complejo ULK, lo que beneficia la actividad quinasa de este. Esta activación ocasiona la fosforilación de Atg13 y FIP200, además de la propia autofosforilación de las proteínas ULK1 y ULK2. La formación del complejo Atg13-ULK-FIP200-Atg101 y su subsecuente fosforilación conlleva al reclutamiento del complejo de proteínas autofágicas específicas de clase III PI3K (fosfatidilinositol-3 quinasas), permitiendo así la formación del autofagosoma [49, 58]. Atg13 presenta alta afinidad a los lípidos, de manera que es responsable del reconocimiento de membranas curvadas, uniéndose a vesículas de membrana con contenido rico en Atg9. Por su parte, Atg101 actúa como el estabilizador de Atg13, y es muy probable que sea la que promueva la unión entre el complejo ULK y el siguiente en actuar, PI3K [51]. Cuando hay abundancia de nutrientes tras el proceso autofágico, los propios productos de la vía o la fosforilación de ULK1, ULK2 y Atg13 mediada por el complejo PI3K causan la asociación del complejo mTORC1 al de ULK, inhibiendo la continuación del mecanismo [50, 57]. Así, el complejo Atg13-ULK-FIP200-Atg101 actúa como un sensor, respondiendo de acuerdo con la necesidad de nutrientes por parte de la célula. 3.3.2. Nucleación: Atg14L-Beclin1-Vps34-Vps15 El grupo conocido como PI3K son quinasas lipídicas que fosforilan el fosfatidilinositol en el grupo hidroxilo de la posición 3, dando lugar al fosfatidilinositol-3-fosfato (PI3P). Así, Introducción 41 el complejo específico de autofagia PI3K está formado por Atg14L, Vps34 (Vacuolar sorting 34 protein), Beclin1 y Vps15. Vps34 es una PI3K implicada en la formación del autofagosoma, membranas endosomales y procesos relacionados con el transporte de materiales. Junto con Beclin1, forman la unidad catalítica del complejo. Beclin1 es el principal efector, puesto que coordina la formación de la membrana del autofagosoma y de la carga a incluir. De hecho, es el nexo de unión con otros procesos celulares clave, como son la inflamación y la apoptosis [51]. El sistema Atg14L-Beclin1-Vps34-Vps15 se coloca en los sitios de interacción del retículo endoplasmático (RE) y las mitocondrias, para que este complejo PI3K proporcione el PI3P necesario para la formación de la membrana de aislamiento. De hecho, el PI3P actuaría como sitio de unión de la familia de proteínas WIPI (WD-repeat protein interacting with phosphoinositides), las cuales forman a su vez un complejo con Atg12 [49]. La membrana de aislamiento, por tanto, puede provenir del RE, de la membrana mitocondrial externa e incluso, de la membrana plasmática [50]. Atg9 parece ser la responsable de proporcionar los lípidos estructurales de la membrana de aislamiento, para lo cual necesita a ULK1 y la actividad quinasa de Vps34 [50]. Eso es posible gracias a su disposición integral en la membrana, que la hace esencial para la formación de los autofagosomas [51]. El propio ULK1 fosforila a Beclin1 y Vps34. Asimismo, VMP1 (Vacuole Membrane Protein 1) induciría la llegada de Beclin1 y otros de sus compañeros al fagóforo [50]. El complejo Beclin1-Vps34-Vps15 puede asociarse además a otros productos, lo que finalmente provoca dos tipos de modulaciones distintas adicionales: un efecto fagocítico al unirse con UVRAG (UV radiation resistance-associated gene), que además promueve la maduración de los autofagosomas, y un efecto inhibidor de esta maduración, al asociarse con UVRAG y Rubicon (RUN domain protein as Beclin1 interacting and cysteine-rich containing) [51]. Es por ello que Rubicon es un inhibidor de la autofagia a través de su interacción con el complejo PI3K. 3.3.3. Elongación: LC3-PE El engranaje que permite el transcurso de la autofagia está compuesto por multitud de enzimas similares a las del sistema de ubiquitinación, y que modulan la ubiquitinación específica de los productos de la autofagia. Por medio de estas, la ubiquitina se une Introducción 42 covalentemente a residuos de lisina de las proteínas de interés mediante un enlace amida en el extremo C-terminal [51]. En la elongación participan dos sistemas de conjugación que van a permitir la distensión del fagóforo. En primera instancia tiene lugar la conjugación covalente de Atg12 con Atg5 gracias a la participación de Atg7 y Atg10. Estas últimas son enzimas similares a las del sistema de ubiquitinación, cuya funcionalidad es semejante a las de tipo E1 en el caso de Atg7 y de tipo E2 para Atg10 [50]. Por tanto, Atg7 actúa como una enzima activadora (activando Atg12) y Atg10 como una enzima que permite la transferencia de residuos (que traslada Atg12 y la une a Atg5) [58]. La unión Atg12-Atg5 se ve seguidamente complementada por la enzima Atg16 que, en este caso, aporta la función de tipo E3 que es de tipo ligasa. Así, la primera forma de conjugación se produce a través de una cascada de reacción de tres enzimas (E1-E2-E3) [50], cuya finalización concluye en su disposición en la membrana del fagóforo [58]. En el compendio Atg12-Atg5-Atg16, Atg12 aporta el andamiaje auxiliar sobre el que dos moléculas de Atg5 se sustentan. Por tanto, cada uno de estos complejos presenta un par de Atg5, cuya estructura contiene regiones específicas de unión a membranas que facultan al complejo en su unión al fagóforo. Complementariamente, Atg12-Atg5 es regulado por el ligando 1 de Atg16 (Atg16L1), el cual se une a través de Atg5 para proteger a ambas proteínas frente a la degradación por ubiquitinación. De hecho, Atg16L1 permanece unido a ellos estabilizando el complejo [51], hasta la formación completa del autofagosoma, en cuyo caso dicho complejo se disocia y se separan de su membrana externa [49, 57]. Inicialmente, Atg16L1 es reclutado por WIPI2 al sitio donde se está extendiendo el fagóforo [49]. Por otro lado, se produce la conjugación de fosfatidiletanolamina (PE) a residuos de glicina en la proteína LC3 (microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3) mediante la acción coordinada de Atg7, Atg3 y Atg4. LC3 es una proteína que se sintetiza inicialmente en forma de pro-LC3 y es recortada por Atg4 en el citosol y convertida a LC3-I [57]. Atg3 actúa como Atg10, ya que es una enzima de tipo transferasa (E2) mientras que Atg4 tiene función proteasa y endonucleasa [50]. En realidad, Atg3 sufre modificaciones alostéricas que inician la lipidación de LC3, donde Atg4A ayuda a su ubiquitinación para la conversión de LC3-I a LC3-II y el consecuente anclaje de PE. De forma inversa, Atg4B contrarresta estas modificaciones postraduccionales y tiene la competencia de desubiquitinar Atg3 [51]. El primer conjugado Atg12-Atg5-Atg16 favorece entonces la correcta transferencia de los residuos PE hacia LC3-I desde Atg3 [51], aportando así su función ligasa E3 [49]. Esta adición lipídica permite la asociación Introducción 43 estable de LC3, finalmente convertida en su segunda isoforma LC3-II, al autofagosoma, por lo que es rutinariamente empleada para estudiar y medir la presencia de autofagia [50]. Todo este proceso de lipidación de LC3 ocurre en la membrana del fagóforo [49]. La evaluación de LC3-II precisa del uso de ciertos inhibidores que bloqueen la degradación llevada a cabo en los lisosomas. Esto es debido a que los autofagosomas tienen un ciclo de vida útil, en el que se forman, se fusionan y se degradan. A dicho ciclo de vida se le denomina flujo autofágico [51]. Como LC3-II es, además, un producto de degradación de la autofagia en sí mismo, estos inhibidores posibilitan la acumulación de autofagosomas no fusionados que sí proporcionan una medida real del proceso autofágico [59]. Una vez adquirida la configuración madura de LC3-II y adherida a la membrana del autofagosoma, este se cierra por completo. Tras esto, es transportado a través del sistema celular de microtúbulos hacia el lisosoma, con el que fundirá su membrana externa para dar lugar al autolisosoma [57, 58]. De hecho, ULK1 fomenta esta fusión [51], en la que LC3-II continúa unida a la membrana del autolisosoma [57]. La carga incluida dentro del autolisosoma es entonces degradada por las enzimas lisosomales, Figura 6. Resumen de las etapas y complejos involucrados en la autofagia. Introducción 44 aunque compuestos como aminoácidos y lípidos son devueltos al citoplasma con la acción de permeasas [57]. Proteína Atg Proceso Función Atg3 Elongación Enzima de tipo E2 transferasa que proporciona las moléculas de LC3-I Atg4 Elongación Proteasa que corta y activa el precursor de LC3 para la obtención de LC3-I Atg5 Elongación Parte del complejo responsable de mediar la maduración de LC3-I a LC3-II Atg7 Elongación Enzima de tipo E1 activadora de Atg12 y mediadora de la lipidación de LC3 Atg9 Inducción Proporciona lípidos de membrana para la creación del fagóforo Atg10 Elongación Enzima tipo E2 transferasa que permite la conjugación de Atg5 a Atg12 Atg12 Elongación Base estructural del complejo que permite la acumulación de PE y su transferencia a LC3 Atg16 Elongación Enzima de tipo E3 ligasa que favorece la cohesión del complejo Atg12-Atg5-Atg16 Atg16L1 Elongación Ligando de la enzima Atg16 y que media todo el proceso de transferencia 3.3.4. El secuestroma SQSTM1/p62 Existe un grupo de proteínas de gran importancia para la vía de la autofagia que tienen el dominio LIR (LC3-interacting region), cuya función se basa en colocarse como adaptadores para compuestos u orgánulos que tienen que ser incluidos dentro del autofagosoma y, por ello, eliminados a través de la autofagia. Su participación se sustenta en la selección de los productos a eliminar y, por tanto, se incluyen en la autofagia selectiva (que será explicada en mayor detalle en líneas posteriores). Una de las proteínas adaptadoras más relevantes es el secuestroma SQSTM1/p62 (Sequestosome 1), que es capaz de reconocer diferentes cargas, como son las proteínas ubiquitinadas [50]. Se encarga de mediar el procesamiento de orgánulos dañados, proteínas mal plegadas, bacteria y virus [60]. Cuando la célula no puede corregir una proteína mal plegada, dicha proteína se acumula en el citoplasma formando agregados con otras proteínas en su misma situación. Una vez son ubiquitinadas, esos agregados son reconocidos específicamente para ser incluidos en el autofagosoma. El secuestroma ejerce en este punto una función clave, concretamente, a la hora de reconocer los agregados etiquetados y dirigirlos al autofagosoma responsable de eliminarlos mediante su unión directa con LC3-II en la Tabla 1. Resumen de las funciones de las proteínas Atg. Introducción 45 membrana interna del autofagosoma [51, 57]. Esta asociación LC3-II-SQSTM1/p62 se mantiene intacta en todo el proceso restante, hasta que SQSTM1/p62 es también eliminado por autofagia. Así, la medida de los valores de SQSTM1/p62 son igualmente claves para la determinación del flujo autofágico [57]. Así, SQSTM1/p62 es un buen adaptador porque se une directamente a la carga y a LC3-II, de manera que junto con su propia polimerización se refuerza la unión entre ambas estructuras. A pesar de ello, en ausencia de carga a eliminar, este adaptador se retira basalmente por autofagia, de la misma manera que la agregación y ubiquitinación de productos lo activa y recluta [60]. De hecho, la regulación de SQSTM1/p62 puede darse a varios niveles: a nivel transcripcional para aumentar su concentración proteica y a nivel postraduccional para contribuir al mejor ensamblaje con otros compuestos y receptores [60]. Este sería el caso de la fosforilación en la Ser403, que contribuye a la mayor afinidad de SQSTM1/p62 por sus sustratos poliubiquitinados y su procesamiento por autofagia [61]. Además de su actividad estrella en la autofagia, SQSTM1/p62 ejerce un papel clave en la respuesta a estrés oxidativo. Cuando la concentración de ROS y RNS aumenta, la maquinaria celular potencia la expresión de Nrf2, una proteína que media la transcripción de gran variedad de enzimas antioxidantes. Es SQSTM1/p62 la que contribuye a la traslocación de Nrf2 al núcleo en caso de necesidad, ya que en condiciones basales este se encuentra secuestrado por la proteína Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1) en el citoplasma. SQSTM1/p62 se une a Keap1 y dirige la Figura 7. SQSTM1/p62 es una molécula adaptadora entre la carga ubiquitinada y LC3-II. Introducción 46 eliminación de ambas por autofagia, para así permitir que Nrf2 quede libre y se transloque al núcleo, donde podrá ejercer su función antioxidante [62]. En este colectivo de adaptadores con motivo LIR también se incluyen NDP52/CALCOCO2 (Calcium Binding And Coiled-Coil Domain 2), TaxBP1 (Tax1- binding protein 1) y la Optineurina. En conjunto, todos reciben la denominación de SLRs (sequestosome 1-like receptors), puesto que interaccionan con LC3-II y sustratos ubiquitinados, forman agregados y se eliminan a través del mismo proceso de autofagia [60]. 3.3.5. El lisosoma, donde todo converge Los lisosomas articulan la deposición de material innecesario para mantener constantes las condiciones fisiológicas intracelulares. Participan en procesos de degradación y reciclaje de compuestos exógenos (endocitosis), que posteriormente son procesados por el apartado de Golgi y exteriorizados por exocitosis. Igualmente, permiten el reciclaje de contenido citoplasmático a través de la autofagia [63, 64]. Paralelamente, están inmersos en la regulación de la respuesta inmune innata y adaptativa, participando y regulando procesos como el reconocimiento de compuestos bacterianos o virales, activación de receptores TLR y NLR, presentación de antígenos y respuesta a señales inmunes como producción de anticuerpos y secreción de citoquinas [63]. Las proteínas de membrana lisosomales regulan la función lisosomal, a la vez que las proteínas luminales (las que residen en su interior) son hidrolasas que se encuentran estabilizadas gracias a la acidez característica de estos orgánulos. Precisamente, las proteínas de membrana son las encargadas de mantener la integridad de esta, así como de asegurar las condiciones acídicas de su interior. El mantenimiento de esta integridad asegura la funcionalidad del lisosoma y evita el estrés celular y muerte. Además, modulan la traslocación proteica a su interior y el tráfico de membranas [64, 65]. Entre las proteínas fundamentales del lisosoma, destacan la proteína estructural LAMP1 (Lysosome-associated Membrane Protein 1), las proteínas responsables del tráfico y fusión subcelular como son las proteínas SNARE (N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors) y las GTPasas Rab, además de transportadores como LAMP2A (Lysosome-associated Membrane Protein 2A) [63]. La familia de proteasas luminales en la que se engloban la catepsina aspártica D y las catepsinas cisteínicas B, C, F, H, entre muchas otras, presenta un variado número de funciones que favorecen el recambio proteolítico y el metabolismo basal celular [66]. Paralelamente, estas Introducción 47 proteasas regulan la autofagia y son claves en el mantenimiento de la integridad lisosomal [65]. Según los requerimientos metabólicos de la célula, los lisosomas pueden ser transportados entre el soma y la periferia celular. De hecho, cambios de pH en el lumen, la acumulación de agregados proteicos y la demanda metabólica afectan a su movilidad y posicionamiento [67]. El traslado desde la periferia hacia la región perinuclear se conoce como movimiento retrógrado, mientras que el caso opuesto recibe la denominación de movimiento anterógrado. Esta movilidad bidireccional se realiza a través de estructuras microtubulares y, por tanto, se lleva a cabo por medio de las proteínas motoras de los microtúbulos. La GTPasa Rab7 modula la atracción y acumulación de dineína-dinactina para el transporte de los lisosomas hacia el soma celular, por ejemplo [65]. Y más específicamente, los lisosomas que se distribuyen por la periferia tienen disminuidos sus valores [67]. Hoy en día, se distinguen dos tipos de lisosomas en base a sus características funcionales, bioquímicas y estructurales [63]: • Lisosomas convencionales: su función primordial es el catabolismo, la degradación de nutrientes para la generación de energía. • Lisosomas secretores: contienen las enzimas de los convencionales junto con un grupo más diverso implicado en la reparación de membranas, regeneración de tejidos, defensa ante patógenos y señalización celular. Resulta fascinante que la propia autofagia sea origen de nuevos lisosomas [68]. El último paso de todo el mecanismo se denomina reforma lisosomal autofágica, ya que a partir de autolisosomas se crean proto-lisosomas que contienen partes integrales de membrana lisosomal, y que posteriormente maduran a su conformación final [63, 68]. Así, es tanto un proceso de biogénesis lisosomal como de regulación de la autofagia [63]. Concretamente, la señalización al inicio de la vía llevada a cabo por mTORC1 directamente alerta al lisosoma para que reduzca su grado de digestión celular; esto conlleva a que el lisosoma no solo sea un orgánulo dedicado a la degradación sino también un sensor ante la escasez de nutrientes en el ambiente [63, 68]. Introducción 48 3.3.5.1. La autofagia del lisosoma: lisofagia Dada la constante y polifacética funcionalidad de los lisosomas, pueden ocurrir rupturas o daños estructurales en su fisiología. Cualquier alteración en su anatomía que implique la salida al citoplasma de su contenido tiene consecuencias fatales para el resto de los componentes de la célula [69]. Un ejemplo de daño lisosomal es el incremento excesivo de permeabilidad en su membrana, lo que conduce a la perturbación de su homeostasis interna [65]. La fuga de protones y ROS contribuyen al daño celular por estrés oxidativo, mientras que la liberación de catepsinas provoca una respuesta inflamatoria que puede terminar en muerte celular [69]. Es más, se ha visto que el daño lisosomal en células microgliales conduce a neuroinflamación [70]. Por ello, los lisosomas desencadenan un mecanismo conocido como ELDR (Endo-lysosomal damage response) [69]. Esta respuesta puede poner en marcha tres tipos de protocolo: por una parte, mTORC1, dispuesto de forma basal en la membrana lisosomal, se disocia de esta y promueve la desfosforilación del factor de transcripción EB (TFEB), con su consecuente traslocación al núcleo para inducir la transcripción de genes lisosomales y de la vía de la autofagia [69]. Por otro lado, la rotura o el incremento de la permeabilidad de su membrana conduce a la liberación de Ca2+ hacia el citoplasma, lo que induce la actividad del Figura 8. Formación del autolisosoma tras la selección específica del producto a degradar, favorecido por la fosforilación de SQSTM1/p62 en el autofagosoma y fusionándose con el lisosoma. Introducción 49 complejo ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport). Aunque se hablará de este complejo en mayor detalle en próximos apartados, resulta imprescindible mencionar que este complejo proteico posibilita la reparación de los lisosomas estructuralmente, permitiendo así el reacondicionamiento interno y la estabilización acídica que favorece la funcionalidad de sus enzimas luminales [65]. Cuando la maquinaria celular es incapaz de reparar el daño lisosomal, la tercera y última opción disponible es la de eliminar estos lisosomas. El mecanismo por el cual los lisosomas son específicamente degradados a través de la autofagia se conoce como lisofagia [65, 69]. Esta vía se erige como un proceso clave en el mantenimiento de la homeostasis celular, evitando así la propagación del daño a otras partes de la célula. Las galectinas son proteínas de unión a carbohidratos que colaboran en eventos de señalización, migración celular, respuesta inmunitaria, inflamación y autofagia [71]. Entre varios cometidos, tienen la labor de vigilancia, reparación y mediación de la eliminación de vesículas dañadas, entre las que se encuentran los lisosomas [65]. Para llevar a término la lisofagia, galectinas citosólicas como la galectina 3, la galectina 8 y la galectina 9 actúan rápidamente tras localizar señales de daño en las membranas lisosomales. Así, cuando un lisosoma presenta daño fisiológico, este expone glicanos luminales propios hacia el citosol, lo que es detectado por la galectina 3. Es esta proteína la que consecuentemente promueve la ubiquitinación del lisosoma dañado [65]. Figura 9. Alternativas ante el daño lisosomal: síntesis de nuevos integrantes lisosomales, reparación de la membrana lisosomal por el complejo ESCRT y la degradación del lisosoma mediante lisofagia. Introducción 50 La ubiquitinación juega un papel clave en la lisofagia, tanto para la señalización de la maquinaria autofágica, como para los adaptadores que permiten incorporar los productos a degradar en los nuevos fagóforos. De esta forma, una vez ubiquitinados los orgánulos dañados, el complejo Atg16L1 favorece la conversión a LC3-II, y junto con el complejo ULK1, se comienza a configurar el fagóforo. Paralelamente, SQSTM1/p62 aparece en la zona para ayudar con la selección y transporte de la carga a eliminar [69]. De hecho, se ha comprobado que la galectina 3 coopera con Atg16L1 para dirigir el proceso de autofagia [72]. Por lo tanto, la galectina 3 ejecuta un papel clave en la detección del daño lisosomal y en el reclutamiento de toda la maquinaria necesaria para eliminarlos. Por su parte, la galectina 8 puede unirse al receptor NDP52 y reunir membranas para formar los fagóforos tras el daño producido por bacterias. En realidad, es la galectina 8 la que impulsa la disgregación de mTORC1 de la membrana lisosomal para inducir la traslocación nuclear de TFEB [69]. Asimismo, la galectina 9 se une a LAMP2A en condiciones basales para estabilizar a los lisosomas, manteniendo su acidez luminal y ayudando en la autofagia. Más concretamente, parece que esta proteína regula el flujo autofágico para prevenir el estrés del RE y la permeabilización de la membrana lisosomal [72]. 3.4. Tipos de autofagia Se distinguen diferentes tipos de autofagia, según la especificidad de los productos para degradar, el tipo de carga y la maquinaria implicada en el mecanismo: • Macroautofagia: es la denominada comúnmente como autofagia, justamente la que ha sido descrita en el apartado anterior. La macroautofagia puede efectuarse de forma selectiva o no selectiva [49]. La autofagia selectiva incluye las distintas variedades específicas de autofagia, como son la mitofagia, la lisofagia, la ERfagia (autofagia del retículo endoplasmático), etc. En cualquier caso, implica la selección particular de los productos que se engloban en el autofagosoma [51]. Para que la autofagia sea selectiva, debe de reunir las siguientes características [60]: - Ser dependiente de moléculas adaptadoras que conectan la carga a degradar con LC3-II en la superficie interna del fagóforo. - Los adaptadores deben incluir el motivo LIR. Introducción 51 - La carga tiene que ser previamente señalizada para ser eliminada, por ejemplo, mediante ubiquitina. - Los adaptadores y la carga tienen que interactuar para permitir el transporte e inclusión a la misma vez que la elongación del fagóforo en formación. - Es necesaria la unión de LC3 con los adaptadores para la inclusión estable de los productos dentro del fagóforo. Este tipo de autofagia se induce localmente, en torno a las zonas en las que se acumulan los productos que hay que deponer. Por el contrario, la autofagia no selectiva, aunque también inducida localmente, recoge partes arbitrarias del citoplasma para obtener energía en caso de necesidad, sin ningún dispositivo previo de selección de compuestos [57]. A pesar de que la ruta clásica es la más común y la que ocurre con mayor frecuencia, existe además una ruta de autofagia alternativa en la que el engranaje en funcionamiento es distinto. La vía autofágica alternativa tiene lugar de forma independiente a la presencia de Atg5 y Atg7, no precisa de las modificaciones postraduccionales sobre la proteína LC3 y, además, el compartimento encargado de deglutir los componentes celulares es una vacuola formada en el aparto de Golgi. Todo este proceso se lleva a término gracias a la actuación de la proteína Rab9. Igualmente los complejos ULK1 y PI3K se sitúan en la parte inicial del proceso y participan en la autofagia convencional y alternativa [73]. • Microautofagia: supone la incorporación directa de contenidos de pequeño calibre al interior del lisosoma a través de invaginaciones directas. Se han identificado recientemente nuevas dianas eliminadas por esta vía, que consisten en peroxisomas (micropexofagia) y mitocondrias (micromitofagia) [65]. La microautofagia es posible gracias a ciertos lípidos y proteínas modificadoras de lípidos que provocan leves surcos en la membrana de los lisosomas, para posteriormente transformarse en invaginaciones. Estas se extienden de forma longitudinal y forman el tubo autofágico que, tras el correcto moldeado de este, se cierra mediante pliegues de la propia membrana. Durante todo el procedimiento, proteínas Atg (como Atg3, Atg5, Atg7 y Atg12) coordinan la sucesión de eventos [74]. Puede efectuarse de forma dependiente o independiente de la maquinaria ESCRT [75]. Introducción 52 • Autofagia mediada por chaperonas (CMA, de sus siglas en inglés Chaperone- Mediated Autophagy): es la única forma de autofagia en la que proteínas concretas son seleccionadas y dirigidas hacia el lisosoma, siendo supervisada y coordinada por chaperonas. Esto se lleva a cabo mediante el reconocimiento del motivo KFERQ (cuyas siglas hacen referencia a su contenido en residuos de lisina -K-, fenilalanina -F-, ácido glutámico -E-, arginina -R- y glutamina -Q-) en diferentes proteínas citosólicas [57]. Dicho motivo se une a la chaperona citoplasmática Hsc70 (Heat shock cognate 70), que es la que dirige la proteína concreta hacia el lisosoma [76]. Esta chaperona es de hecho regulada (entre otras muchas) por ULK1, potenciando la vía de la CMA [51]. Allí, la proteína es despojada de su estructura tridimensional y es dispuesta sobre la superficie lisosomal, donde LAMP2A se multimeriza y controla su traslocación al lumen del lisosoma [57]. El homotrímero que termina constituyendo LAMP2A garantiza la afinidad de este por la proteína que se le aporta, a la vez que evita su agregación y plegamiento [76]. La incorporación de la proteína hacia el interior es seguida de una rápida degradación por parte de las enzimas lisosomales. Dada la función clave de LAMP2A, cualquier alteración que esta sufra tiene consecuencias directas en la degradación proteica mediada por la CMA, y por tanto, en el metabolismo celular y homeostasis lisosomal [65]. Es por ello que LAMP2A regula la dinámica de la CMA y es entendida actualmente como un mecanismo de control esencial de la calidad proteica [76]. Introducción 53 3.5. Modulación de la autofagia: la Espermidina Existen varios compuestos que consiguen estimular o bloquear la autofagia a través de sus múltiples intermediarios. Entre estos compuestos, se encuentran el resveratrol, la rapamicina, la trehalosa, la vitamina D, los ginsenósidos y la espermidina [77]. La espermidina (N-(3-aminopropyl)-1,4-diaminobutano) es una poliamina endógena que modula la homeostasis neuronal. Como compuestos nitrogenados que son las poliaminas, completan su protonación a pH fisiológico, por lo que tienden a unirse a compuestos cargados negativamente como son proteínas y ácidos nucleicos (ARN y ADN). Este hecho le confiere la capacidad de interaccionar y regular la participación de estos en los diferentes procesos celulares [78, 79]. De forma exógena, también se encuentra en alimentos como en la coliflor, brócoli, espinacas, kiwi, naranjas, fresas, almendras y avellanas, leche y huevos. También en carnes como la ternera, el cerdo y el pollo [78]. Existe una gran cantidad de poliaminas en el cerebro, especialmente en las vesículas sinápticas. Cuando ocurre la sinapsis, las poliaminas quedan liberadas en la brecha sináptica, lo que resulta idóneo para que las células gliales las capten con Figura 10. Los tres tipos de autofagia que convergen en el lisosoma: microautofagia, (macro)autofagia y la autofagia mediada por chaperonas (CMA). Introducción 54 transportadores específicos. Las poliaminas en el exterior celular pueden regular la acción de los receptores NMDA [78]. La espermidina ejerce efectos pleiotrópicos entre los que destacan funciones antiinflamatorias (inhibe NF-κB y disminuye los valores de citoquinas proinflamatorias), antioxidantes, mejora de la función respiratoria y metabólica mitocondrial y el refuerzo de la proteostasis (entendida como la homeostasis de las proteínas). Además, es un inductor de la autofagia [80], induciendo el flujo autofágico a través de Beclin1 [81] y bloqueando la actividad acetiltransferasa de la enzima EP300 (histona acetiltransferasa p300), que es justo una de las que activan a AMPK [82]. Con la edad, las concentraciones intracelulares de espermidina se van recortando, lo que posiblemente puede acarrear una reducción en la activación de la vía de la autofagia, contribuyendo a la agregación proteica, el mantenimiento de orgánulos defectuosos y demás sustancias de desecho que, en último término, podrían colaborar en la aparición de enfermedades neurodegenerativas [78]. Es por ello por lo que su principal foco de investigación ha sido la senescencia y el envejecimiento, dado que la espermidina aumenta la esperanza de vida celular a través de la inducción de la autofagia. Paralelamente, parece que desempeña una función antioxidante directa, así como estimula la producción de NO aumentando la biodisponibilidad de la arginina [80]. A decir verdad, se desconoce si estos efectos también son consecuencia de la vía de la autofagia o son completamente independientes. Se ha comprobado que las poliaminas disminuyen con la edad en el cerebro humano y en modelos animales. El tratamiento con espermidina mejora los problemas de memoria y aumenta la esperanza de vida en moscas, nematodos y ratones [83, 84]. Estas observaciones son dependientes de los genes Atg. Además, la espermidina induce la mitofagia mediante la inhibición de mTOR y la activación de AMPK [85], de la misma manera que la vía Pink1-Parkin también se ve impulsada [86]. A pesar de estos indicios, se desconoce las vías moleculares puestas en marcha por la espermidina. El estudio de las poliaminas en el TDM comenzó hace más de 30 años [87]. Su implicación en la respuesta al estrés era debida a la modulación de la neurotransmisión, por lo que constituían una diana terapéutica muy prometedora. En muestras post mortem de pacientes que acabaron con su vida, se observó una reducción considerable de la expresión de la enzima SSAT (Espermidina N1-acetiltransferasa), que es la que se encarga del metabolismo de la espermidina [88]. Introducción 55 Además, se observó que, en la corteza temporal de pacientes con trastorno depresivo mayor, había alteraciones en la expresión génica de AMD1 (Adenosil Metionina Descarboxilasa), encargada de sintetizar la espermidina desde sus precursores [89]. 3.6. Autofagia e inmunidad innata Las proteínas Atg participan en procesos de inmunidad innata a través de la degradación de patógenos externos, presentación de antígenos en moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y control de la inflamación. El engranaje de autofagia detecta y transporta el ARN y ADN de distintos virus hacia las vesículas endosomales en las que se encuentran los receptores TLR7 y TLR9 en células dendríticas, aprovechando la maquinaria Atg. Además, pueden transportar complejos inmunes encapsulados en autofagosomas marcados con LC3 hacia los receptores TLR9 de este mismo tipo celular. Así, la autofagia media la actividad del sistema inmune innato [90]. Las moléculas adaptadoras y segundos mensajeros de TLRs, MyD88 (Myeloid Differentiation primary response 88) y TRIF (Toll-like Receptor adaptor molecule 1) podrían estar actuando con Beclin1, reduciendo la unión de esta con moléculas apoptóticas y, por tanto, favoreciendo la autofagia [50]. La interrelación entre autofagia e inflamasomas ha sido muy estudiada. La autofagia retira materiales perjudiciales (PAMP y DAMP, reconocidos por células inmunes) para evitar o limitar la actuación de los inflamasomas. Adicionalmente, elementos individuales de los inflamasomas son degradados por autofagia, siendo esta otra forma de frenar la inflamación. Por ejemplo, AIM2 (Absent in melanoma 2) y ASC (Apoptosis-associated Speck-like protein containing a CARD) son localizados por SQSTM1/p62 y eliminados por autofagia. Esta sustenta también una vía alternativa que estimula la secreción de IL1β desde el citosol al espacio extracelular [91] en condiciones de escasez de nutrientes, aunque también puede de transportarlo hacia los lisosomas para su degradación [49]. Por tanto, la autofagia es nuevamente un proceso que busca el equilibrio celular. La autofagia constitutiva ayuda a la funcionalidad de los linfocitos, entre ellas, las células de memoria T y B y las células plasmáticas. Sin la correcta y continua renovación de orgánulos como el RE y la mitocondria, las respuestas inmunes ante infecciones virales Introducción 56 previas no serían totalmente efectivas. En concreto, la autofagia del RE en las células plasmáticas contribuye a la producción regular de anticuerpos [49, 90]. De igual manera, las proteínas Atg contribuyen a la presentación de antígenos del MHC de tipo II, pero inhiben los de tipo I de antígenos intracelulares. Esto último es debido a que LC3 dirige la internalización del complejo MHC I desde la membrana plasmática, disminuyendo la acción de las células T. Curiosamente, la adición de antígenos a LC3- II potencia su presentación MHC de tipo II atrayendo a los autofagosomas [91]. Los interferones son inmunomoduladores que actúan respondiendo a patógenos o tumores. El IFN de tipo I (IFNα/β) se asocia con la actividad antiviral, y parece que la autofagia podría directamente inactivar los factores que contribuyen a su inducción con la asistencia de Beclin1 y ULK1. Este IFN puede activarse por señales de los receptores TLR que impulsan la vía de NF-κB [90, 91]. La pérdida de Atg5 bloquea la producción de IFN de tipo I dependiente de TLR7 y TLR9 en las células dendríticas [49]. El IFN de tipo II (IFNγ), una citoquina que protege frente a bacterias intracelulares, también se relaciona con la autofagia. Este interferón modula elementos que acaban en la fosforilación de Beclin1 [91]. Figura 11. Funciones inmunes de la autofagia. Introducción 57 Actualmente, se ha vinculado genes de la vía de la autofagia con la fisiopatología de varias enfermedades: polimorfismos en Atg16L1 condicionan al desarrollo de la enfermedad de Crohn, así como en Atg5 en el asma y la artritis reumatoide. Defectos en la autofagia o en genes de la vía pueden acarrear a eventos de inflamación masiva. Otros factores que cooperan en la balanza autofagia-inflamación son las galectinas. La galectina 8 contribuye a la secreción de IL1β en respuesta al daño lisosomal, mientras que la galectina 3 controla la respuesta autofágica ante daños endosomales cuando ha habido infección por bacterias como la Legionella [91]. 3.7. Autofagia en el SNC La autofagia ocurre de forma constitutiva a bajos niveles, pero puede ser inducida o potenciada tras la exposición a diferentes estresores, tales como ausencia de nutrientes y factores de crecimiento, daño en el ADN, acumulación de agregados proteicos y daño en diferentes orgánulos. La autofagia en neuronas suele mantenerse constitutivamente, puesto que cualquier alteración en esta puede tener consecuencias fatales para ellas. Ejerciendo un rol clave en la homeostasis neuronal, la autofagia regula el neurodesarrollo y la neuroplasticidad, además de proteger contra la neurodegeneración [92]. Concretamente, la autofagia basal mantiene la homeostasis en neuritas y axones, evitando así dicha neurodegeneración [93]. En cuanto al neurodesarrollo, la autofagia está presente en el cierre del tubo neuronal, el desarrollo de axones y la poda sináptica, así como en la formación de nuevas sinapsis. Al hilo de esto último, la autofagia coordina la agregación de las vesículas sinápticas en el espacio presináptico y su maduración previa antes de su liberación en la sinapsis. Además, ayuda en el mantenimiento de las células madre neurales en el periodo posnatal de las zonas subventricular y subgranular del giro dentado del hipocampo, por lo que su papel en la neurogénesis también es clave [92]. En lo referente a las células gliales, el estudio de la autofagia está siendo foco de interés en la actualidad y no se tienen tantas evidencias como en el caso de las neuronas. La microglía parece estar disponiendo de la autofagia para bloquear la activación de los inflamasomas y su producción consecuente de citoquinas, evitando entonces la neuroinflamación. Igualmente, se piensa que los genes Atg están implicados activamente en la poda sináptica efectuada por la microglía, actuando así sobre la Introducción 58 función sináptica y la circuitería neuronal [94]. Esto podría ser clave en patologías como los trastornos del espectro autista [95]. Menos aún se conoce la función autofágica en el astrocito. Parece que la disminución de Atg7 y SQSTM1/p62 condiciona la diferenciación de los astrocitos desde sus progenitores en el neurodesarrollo. De hecho, Atg5 regula la diferenciación astrocitaria durante el neurodesarrollo de la corteza cerebral en el ratón [96]. Aunque la autofagia es esencial para el mantenimiento y equilibrio homeostático, su contribución a la neuroinflamación, metabolismo o inmunidad podría ser dependiente del tipo celular, lo que implicaría una distintiva funcionalidad de acuerdo con la categoría celular. 3.8. Autofagia en la enfermedad psiquiátrica Teniendo en consideración los cambios desencadenados por la neuroinflamación, el estrés oxidativo y la plasticidad neuronal y la posición que la autofagia sustenta con respecto a estos, el estudio de su implicación en la fisiopatología de los trastornos psiquiátricos podría revelar herramientas terapéuticas clave para mejorar el tratamiento farmacológico actual de estas enfermedades. El estudio de la autofagia en la práctica clínica ha sido bastante escaso, dada la dificultad de su estudio en humanos. Es por ello que la mayor parte de las aproximaciones se han llevado a cabo sobre diferentes modelos animales que intentan mimetizar los cambios observados en las distintas enfermedades neuropsiquiátricas. Entre las observaciones clínicas, existen varios estudios que apuntan a la alteración de la autofagia en ciertos trastornos psiquiátricos. Por ejemplo, en PBMC se observó un aumento de los niveles de ARNm de las proteínas LC3, Atg12 y Beclin1 en pacientes con TDM al compararlo con individuos control [97]. En contraposición, pacientes con trastorno bipolar presentaron una reducción en los niveles de ARNm y proteico de LC3 y SQSTM1/p62 [98]. Asimismo, muchos de los fármacos regularmente empleados en el tratamiento de este tipo de patologías han mostrado ejercer su efecto a través de la vía de la autofagia. La potenciación de la autofagia se ha correlacionado positivamente con la mejora del tratamiento farmacológico y pronóstico en varios estudios [57]. Concretamente, la elevación de la presencia de Beclin1 y LC3 era común entre los pacientes cuyo Introducción 59 tratamiento antidepresivo resultaba eficaz, en comparación con aquellos a los que no le funcionaba [99, 100]. Antidepresivos como la fluoxetina y la amitriptilina han mostrado acciones reguladoras de la autofagia a través de los astrocitos: parece que la fluoxetina induce la autofagia en estas células gliales para eliminar las mitocondrias dañadas, lo que apunta a la acción concreta de los antidepresivos sobre esta vía [101]. Paralelamente, la inducción de la formación del autofagosoma y la maduración de LC3 aparentan ser efecto del tratamiento con amitriptilina en cultivos de astrocitos primarios [102]. A pesar de todo ello, la heterogeneidad idiosincrática de las enfermedades psiquiátricas, las cohortes de pacientes consideradas, las técnicas empleadas, el tratamiento individualizado y la comorbilidad con otras patologías dificultan aún más el estudio de la autofagia en estos pacientes. Es más, resulta muy complicado trasladar los datos en la periferia a la posible situación de alteración en el SNC, si es que existe una relación entre la autofagia en las PBMC y entre aquella que se da en las neuronas y las células gliales. Estas vicisitudes contribuyeron a investigaciones en cerebros post mortem de pacientes con TDM, en donde se observaron niveles disminuidos de la expresión genética de Mtor y de los elementos posteriores de su vía de señalización en la corteza prefrontal [103]. 4. La autofagia de la mitocondria: la mitofagia 4.1. Aspectos generales La mitocondria es una pieza fundamental del entramado celular. No solo es la central energética de la célula, sino que también participa en procesos metabólicos, en la homeostasis del Ca2+, la apoptosis, la señalización celular y, por supuesto, la autofagia [104]. La anatomía de la mitocondria presenta dos membranas distintas en naturaleza y función: la membrana mitocondrial externa (MME) y la membrana mitocondrial interna (MMI), que se estructura en plegamientos y dobleces formando crestas. Entre la MME y la MMI se dispone el espacio intermembrana, mientras que el área delimitada por las crestas de la MMI da lugar a la matriz mitocondrial. Es precisamente en esta localización Introducción 60 en donde se encuentran el ADN mitocondrial, que contiene 37 genes, y ribosomas mitocondriales que no son los iguales a los hallados en el citoplasma [93, 105]. La cadena transportadora de electrones produce la adenosina trifosfato (ATP) en la MMI de la mitocondria. Es esta la molécula empleada por las células para obtener energía. Para fabricarla, los electrones son transferidos entre cuatro complejos mitocondriales (I- IV) para finalmente sintetizarse a partir de adenosina difosfato (ADP) y O2, lo que comúnmente se conoce como fosforilación oxidativa. Adicionalmente, la mitocondria elabora más metabolitos intermedios a través del ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de Krebs en su matriz. Esto posiciona a la mitocondria como piedra angular en la fabricación de la materia prima estructural de las células, ya que sus metabolitos participan en la síntesis de muchas biomoléculas, como son los nucleótidos, los lípidos y aminoácidos, e incluso, la β-oxidación de los ácidos grasos [93, 104]. Sin embargo, su contribución energética paga su propio peaje: la mitocondria es la principal fuente de ROS como consecuencia de la fosforilación oxidativa. La presencia en exceso de estos radicales libres daña sobremanera a gran cantidad de biomoléculas (como las mencionadas previamente), lo que pone en marcha al programa antioxidante celular. El correcto manejo de estas especies oxidantes determinará si la célula puede Figura 12. Estructura de la mitocondria con detalle en dos de sus múltiples funciones: la fosforilación oxidativa para la respiración mitocondrial y el ciclo metabólico de Krebs. Introducción 61 continuar con normalidad, si sus mitocondrias dañadas deben retirarse o más bien, que la célula por completo tenga que someterse a la apoptosis [106]. Los radicales libres, además, modulan la autofagia a través de la mitocondria. La inactivación de Atg4 dependiente del ciclo redox inhibe la deslipidación de LC3-II y, por tanto, potencia la autofagia al prolongar la formación de autofagosomas. Por otra parte, Pink1 (PTEN-induced putative kinase 1), responsable de uno de los tipos más comunes de mitofagia, ve activada su transcripción en presencia de concentraciones medias de estrés oxidativo. Por tanto, ROS activa el programa de autofagia para regular sus propias concentraciones y evitar el daño celular [93, 107]. La masa mitocondrial se ve regulada a través de la mitogénesis y la mitofagia, en un proceso de mutua interacción. Dado el origen bacteriano de la mitocondria, estas conservan su propio genoma y son capaces de autoreplicarse sin la intercepción nuclear. La síntesis de mitocondrias de novo se denomina biogénesis mitocondrial o mitogénesis [108]. Paralelamente, la retirada de mitocondrias defectuosas específicamente a través de la vía de la autofagia se denomina mitofagia [109]. La eliminación de mitocondrias dañadas resulta fundamental para impedir la acumulación excesiva de ROS y RNS. La mitofagia se erige como un mecanismo de control de calidad, ya que evita destinos celulares como la apoptosis o la necrosis, contribuyendo a la viabilidad celular y al mantenimiento de una red mitocondrial sana. Además, posibilita el control del volumen o la concentración mitocondrial [93, 109]. 4.2. Mecanismo de acción La célula presenta multitud de mecanismos que inducen la vía de la mitofagia, siendo varios los estímulos que pueden conducir a esta. Además, las cascadas de señalización puestas en marcha pueden, incluso, ser totalmente distintas [110]. La señal más común que indica la necesidad de iniciar el programa de mitofagia es la despolarización de la membrana mitocondrial, que consecutivamente se permeabiliza. Diferentes estresores pueden provocar esta despolarización [50]. La mitofagia puede ser dependiente o independiente de ubiquitina. Estos dos tipos se diferencian por las proteínas participantes y la necesidad de ubiquitinación para el reclutamiento de los mediadores que permiten el avance de la vía. Introducción 62 4.2.1. Mitofagia independiente de ubiquitina Este tipo de mitofagia involucra a varias proteínas mitocondriales que actúan como receptores de mitofagia, de manera que pueden seleccionar las mitocondrias defectuosas e incluirlas directamente en los autofagosomas para su posterior eliminación. Esta acción directa es posible gracias a la presencia en los receptores mitocondriales del dominio LIR de unión a LC3 [110]. Ante diferentes tipos de estresores, tiene lugar la despolarización de la membrana mitocondrial, lo que conduce a un aumento de la permeabilidad. Esto supone la agregación de los receptores mitocondriales en la MME. Por tanto, estos receptores en particular no precisan de la ubiquitinación previa para su activación y reclutamiento (como sí ocurría con SQSTM1/p62, por ejemplo) [60, 109]. Se han distinguido dos tipos fundamentales de receptores dentro de esta categoría: el primero incluye a BNIP3 (Bcl2 interacting protein 3) y su ligando Nix (NIP3-like protein X, también conocido como BNIP3L), mientras que en el segundo se encuentra el receptor FUNDC1 (FUN14 domain-containing protein 1). BNIP3 actúa en la mitofagia inducida por hipoxia. En condiciones basales, BNIP3 se encuentra en el citosol de forma inactiva. Sin embargo, ante la baja presencia de O2 aumenta su concentración, se homodimeriza y se ancla a la MME. BNIP3 es capaz de regular la vía a través de la inhibición de mTORC1, facilitando la inducción del proceso o amplificando la señal de iniciación de la mitofagia [109]. Igualmente, BNIP3 regula la dinámica mitocondrial (detallada específicamente en apartados posteriores), puesto que incita la fisión de las mitocondrias dañadas por medio de la disociación de OPA1 (Optic Atrophy protein 1), al mismo tiempo que atrae moléculas de Drp1 (Dynamin-related protein 1) a la superficie mitocondrial [110]. La mitofagia mediada por Nix se ve activada en presencia del ROS proveniente de la fosforilación oxidativa, atrayendo a las moléculas de LC3, y también precisando de homodimerización para el reclutamiento de la maquinaria mitofagia [109]. En cambio, aún se desconoce la cascada de señalización que activa Nix para llevar a puerto la mitofagia, aunque se postula que en ella se ven inmersas las GTPasas Rheb (RAS- Homolog enriched in brain). Además, tiene una función clave en la mitofagia acontecida durante la diferenciación celular [110]. FUNDC1 es una proteína integral de la MME que también actúa como receptor en la mitofagia inducida por hipoxia. En condiciones basales su actividad se encuentra silenciada mediante la fosforilación de sus regiones LIR. Su expresión se mantiene baja Introducción 63 en situación de hipoxia gracias a una vía dependiente del sistema ubiquitín-proteasoma [109]. FUNDC1 también participa en la dinámica mitocondrial, nuevamente cooperando en la fisión y la fusión. Concretamente, FUNDC1 es parcialmente responsable del control morfológico de la mitocondria y la mitofagia en condiciones de estrés: su desfosforilación conlleva a su disociación de OPA1 y la consecuente inhibición de la fusión; en este punto, FUNDC1 se transloca a las zonas de interacción con el RE y ayuda al reclutamiento de Drp1 y, por lo tanto, a la potenciación de la fisión [110]. Tanto la despolarización de la membrana mitocondrial como la hipoxia favorecen la acción de ULK1 sobre FUNDC1, cuya fosforilación estabiliza la interacción FUNDC1- LC3 [109]. Precisamente, se cree que FUNDC1 es otro receptor de ULK1 y que actúa como su adaptador: la unión FUNDC1-ULK1 permite el cambio posicional de ULK1 sobre la mitocondria, permitiendo así la creación de un nuevo mitofagóforo [110]. Desgraciadamente, todavía no se han elucidado las vías moleculares por las que BNIP3, Nix y FUNDC1 cooperan entre ellas para inducir la mitofagia mediada por receptores mitocondriales. Sin embargo, su trabajo conjunto supone un sistema de control de calidad seguro y garantiza la homeostasis energética celular [110]. Figura 13. Principales mecanismos involucrados en la mitofagia mediada por receptores mitocondriales. Introducción 64 4.2.2. Mitofagia dependiente de ubiquitina La mitofagia que precisa del uso de ubiquitina es coordinada por Pink1 y Parkin. Esta supone una vía central para muchos procesos mitocondriales, ya que intervienen en la dinámica y la morfología mitocondrial, la señalización para el ensamblaje de la maquinaria de autofagia y la biogénesis de nuevas mitocondrias. La vía Pink1-Parkin es activada por diversos estímulos, siendo ROS y RNS de los más destacados [65]. Pink1 es una molécula sensor de voltaje que se incorpora a la mitocondria a través de los complejos transportadores TOMM (en la MME) y TIMM (en la MMI). Resulta imprescindible que los valores de Pink1 se mantengan bajos, para que así la puesta en marcha de su cascada de señalización sea efectiva. De esta forma, Pink1 trabaja como una proteína sensor de daño [107]. En estado fisiológico, Pink1 permanece en la MMI gracias a su procesamiento y anclaje por varias proteasas. Esta forma de Pink1 se degrada mediante el sistema ubiquitín- proteasoma. Cuando el potencial de membrana se ve alterado (∆Ψm), Pink1 se estabiliza y acumula entonces en la MME, y es en este momento en el que su activación por autofosforilación consigue la traslocación de Parkin desde el citosol a la superficie mitocondrial con su consiguiente fosforilación. Esto va a suponer un cambio conformacional en Parkin que ayuda a su mantenimiento en la MME y a la activación de su actividad E3 ubiquitín ligasa [106, 110]. La autofosforilación previa de Pink1 es necesaria para que adquiera su función quinasa, ya que sin ella no puede organizar la mitofagia [107]. Además, Pink1 media la fosforilación de la ubiquitina y de las cadenas poliubiquitinadas de las mitocondrias deterioradas [111]. Es entonces cuando Parkin, que tiene afinidad concreta a la ubiquitina fosforilada, ubiquitina a multitud de proteínas en esta membrana que, precisamente, serán substrato para Pink1 [60, 107]. El estado de fosforilación sobre las cadenas de ubiquitina reduce a su vez la acción hidrolítica de las enzimas deubiquitinasas, lo que potencia aún más este tipo de mitofagia. Así, para que la mitofagia ocurra se necesita un balance concreto de ubiquitinación-desubiquitinación, siendo la ubiquitina la señal para la deposición de mitocondrias dañadas [110]. Partiendo de que Pink1 tiende a acumularse originalmente sobre los complejos TOMM, los primeros sustratos de ubiquitinación son las propias subunidades de este transportador. De igual manera, el aumento de la ubiquitinación en las demás proteínas de la MME supone una retroalimentación positiva para Pink1, que continúa fosforilando Introducción 65 y potenciando la actividad E3 ligasa de Parkin [107]. Esto indudablemente fortalece la mitofagia y el reclutamiento de los elementos de autofagia. La ubiquitinación de proteínas de la MME dirigida por Parkin contribuye a la aparición de proteínas adaptadoras, como son NDP52, la Optineurina y SQSTM1/p62, permitiendo así la puesta en marcha de la maquinaria autofágica [60]. De hecho, NDP52 y la Optineurina se unen fundamentalmente a ubiquitina fosforilada, y son estos los únicos receptores cuya sola presencia desencadena la mitofagia. Otros, como SQSTM1/p62 y NBR1 (Neighbor of BRCA1 Gene 1 protein) son prescindibles para que la mitofagia ocurra [107]. NDP52 y la Optineurina colaboran en la formación de nuevas membranas alrededor de las mitocondrias por medio de la disposición de proteínas involucradas en la biogénesis del fagóforo, como ULK1. Es por esta cuestión que se considera que ambos adaptadores actúan antes que LC3 y en conjunto con esta [107]. De esta forma, Pink1 se une a LC3-II, promoviendo que las mitocondrias dañadas se eliminen de forma dependiente de la actividad autofágica [50, 112]. Paralelamente, se ha comprobado que Pink1 puede inducir la mitofagia independientemente de la acción de Parkin; adquirida su función quinasa, puede fosforilar las cadenas de ubiquitina en las proteínas de la MME con indiferencia de que sea otra ligasa la que ubiquitine. Por tanto, Parkin parece ser una proteína amplificadora de todo el proceso [107]. Figura 14. Secuencia de activación general de la mitofagia mediada por Pink1 y Parkin. Introducción 66 Curiosamente, se desconoce el procesamiento posterior de los sustratos ubiquitinados en la MME por la Parkin, más allá de conseguir la puesta en marcha del equipo de autofagia. Es posible que la degradación de estas proteínas sea dependiente del tipo celular o tejido, o que la ubiquitinización sea de algún modo específica de sustrato que repercuta en una forma de degradación concreta [110]. Actualmente se piensa que BNIP3 y Nix participan en la mitofagia mediada por Pink1- Parkin. BNIP3, por ejemplo, ayuda a estabilizar a Pink1 porque evita su rotura proteolítica. Es más, tanto BNIP3 como Nix contribuyen a la regulación de la homeostasis mitocondrial con la modulación de Parkin. Esto significa que los receptores mitofágicos actúan de cierta manera en el este tipo de mitofagia [110]. Paralelamente, Parkin media la ubiquitinación de Nix, lo que involucra el reclutamiento de NBR1 (otro adaptador selectivo de autofagia), quien reunirá ubiquitina y moléculas de LC3 para promover la formación del autofagosoma en torno a la mitocondria. Asimismo, BNIP3 mejora la acumulación de Pink1 en la MME gracias a su interacción directa, permitiendo así la traslocación de Parkin a la mitocondria [109]. 4.2.3. Clasificación funcional de la mitofagia De acuerdo con el estado fisiológico del tejido, la mitofagia puede ocurrir de forma constitutiva, inducida por estrés o de manera programada [110]: • La mitofagia basal es aquella que ocurre regularmente en las células con el fin de mantener la homeostasis y eliminar mitocondrias viejas o dañadas y reponerlas con otras nuevas. Se produce constitutivamente para asegurar el correcto mantenimiento mitocondrial. Parece que es dependiente de tejido, e incluso, del tipo celular incluido en cada tejido. El sistema nervioso, por ejemplo, presenta un mayor índice de mitofagia basal que el timo o el bazo. • La mitofagia inducida por estrés permite ajustar la capacidad mitocondrial a la demanda metabólica impuesta por un estresor exógeno. En condiciones de ausencia de nutrientes u O2, la mitofagia mediada por receptores es la predominante. Estos y otros estímulos pueden activar también la vía de Pink1- Parkin. La mitofagia se constituye en este contexto como una oportunidad de remodelar el entramado mitocondrial, eliminando mitocondrias que no son necesarias si hay deprivación de nutrientes e induciendo la mitogénesis de otras Introducción 67 nuevas que se ajusten a la nueva situación provocada por el estrés. La hipoxia, sin embargo, reduce la masa mitocondrial. • La mitofagia programada es aquella que forma parte de los procesos de diferenciación particulares de cada tipo celular o tejido. Por ejemplo, en la maduración de los eritrocitos es necesaria la retirada de las mitocondrias, y es un mecanismo dirigido por Nix e independiente de Atg5 [107]. Igualmente ocurre con la eliminación mitocondrial del espermatozoide tras la fecundación del óvulo, cuya degradación por mitofagia supone el paso a la descendencia de solamente las mitocondrias maternas. También se observa en la maduración de los cardiomiocitos, donde la mitofagia mediada por Pink1-Parkin y la mitofusina 2 (Mfn2) permite la adquisición de su fenotipo final de contractibilidad [110]. 4.3. Dinamismo mitocondrial: fusión y fisión La mitofagia no es la única alternativa que la célula reserva para deshacerse de sus mitocondrias dañadas. Dada la importancia de todos los procesos celulares críticos en los que están envueltas, las mitocondrias están continuamente sometidas a cambios en morfología y número a través de los procesos de fusión y fisión mitocondrial. Esto es lo que se conoce como dinamismo mitocondrial. Dicho proceso asegura una agrupación continua y sana de mitocondrias para la fosforilación oxidativa, del mismo modo que contribuye a otros mecanismos tales como el ciclo celular, el manejo de ROS, la apoptosis y la mitofagia [104]. Su contribución a la mitofagia se fundamenta en la capacidad de reparación del daño mitocondrial a través de la fusión con otra mitocondria sana, o incluso, la posibilidad de fragmentación de componentes en mal estado para asegurar la viabilidad mitocondrial [93]. La fusión une dos mitocondrias por ambas membranas gracias a la intervención de tres GTPasas de membrana: la mitofusina 1 (Mfn1), Mfn2 y la ya referida OPA1. Si se produce un incremento excesivo de ROS, este puede provocar mutaciones en ADN mitocondrial, perjudicando el proceso de respiración. Gracias a la fusión, las mitocondrias pueden unirse para intercambiar genes y metabolitos para así responder eficazmente a las necesidades metabólicas de la célula. Introducción 68 Las Mfn1 y Mfn2 están presentes en la MME, aunque esta última también puede hallarse en la membrana del RE. Precisamente, esto resulta ventajoso para la transferencia de Ca2+ desde el RE hacia la mitocondria [104]. Es más, la mitofagia mediada por Pink1-Parkin juega con la actividad de la Mfn2: en primer lugar, Mfn2 actúa como andamiaje para la translocación de Parkin hacia la MME y puede ser fosforilada por Pink1 para su posterior ubiquitinación por Parkin. Seguidamente, Pink1-Parkin promueven la degradación de la Mfn2 para romper la interacción entre el RE y las mitocondrias, contribuyendo a la mitofagia. De esto se deduce que los lugares de interacción RE-mitocondrias regulan la mitofagia negativamente, evitando que Pink1-Parkin degraden proteínas concretas de la MME [110]. La formación del autofagosoma también es dependiente del anclaje de la Mfn2 en situación de escasez de nutrientes [93]. Como la ubiquitinación de ambas mitofusinas no supone una señal de mitofagia, Parkin induce su degradación por el proteasoma para balancear el dinamismo mitocondrial hacia la fisión, facilitando así el proceso de mitofagia. Igualmente, la ausencia de las mitofusinas evita que mitocondrias dañadas se fusionen con las sanas, perjudicando a las demás cadenas mitocondriales [106]. En la MMI se encuentra OPA1, aunque su mecanismo de actuación para promover la fusión de la MMI no ha sido completamente dilucidado aún [106]. Participa en el mantenimiento del potencial de membrana y del ADN mitocondrial, la organización de las crestas mitocondriales y la apoptosis. Para la fusión de la MMI, OPA1 requiere un procesamiento proteolítico para activarse, pero la presencia de las crestas mitocondriales hace que la fusión de la MMI sea más compleja que la de la MME [113]. Además, Parkin puede inducir su transcripción [107]. La fisión implica la división de una mitocondria en otras dos. Es crucial durante la división celular, la distribución de las mitocondrias y la apoptosis. Drp1 es la proteína principal encargada de llevarla a término. El primer paso para ello tiene lugar en las zonas de interacción entre el RE y las mitocondrias, donde se produce una constricción previa a la llegada de Drp1. Esta constricción es necesaria para reducir el diámetro de las mitocondrias y que Drp1, una vez acumulada en la MME, pueda formar un anillo (gracias a su oligomerización) sobre la misma. Sin embargo, su fosforilación en la Ser637 la retiene en el citoplasma y con ello, la fisión se ve inhibida y la degradación por mitofagia también [104]. Introducción 69 Actualmente se desconoce por qué la fisión ocurre previa a la mitofagia, pero se postula que facilita la formación de pequeños subdominios mitocondriales que facilitan su encapsulamiento en los autofagosomas [106]. Pink1 facilita la fisión mitocondrial para ayudar en la inducción de la mitofagia con la estimulación indirecta de Drp1 [60]. Sin embargo, nuevos datos sugieren la existencia de una vía independiente de Drp1 para la retirada de mitocondrias dañadas. En este caso, Drp1 provocaría la restricción de la vía Pink1-Parkin a subdominios mitocondriales, permitiendo así que esa vía ocurra alejada de la red mitocondrial sana y/o retirando proteínas mal plegadas de la cercanía de las mitocondrias. De esta forma, se evitaría el desencadenamiento de cambios de potenciales de membrana en cascada y, por tanto, la mitofagia de toda la red mitocondrial [114]. Además, la fisión mitocondrial ocurre paralelamente a la activación del factor proapoptótico Bax y la permeabilización de la MME. Drp1 colocaliza con Bax en la MME al inicio de la apoptosis. A pesar de que Drp1 no es necesaria para la ejecución de la apoptosis, su acción favorece la liberación del citocromo c de la mitocondria y, por tanto, que finalmente pueda ocurrir. Con ello, la mitofagia y la apoptosis serían dos destinos Figura 15. La dinámica mitocondrial consiste en un ciclo constante de fusión y fisión de mitocondrias según las necesidades energéticas celulares. Introducción 70 celulares posibles de acuerdo con la capacidad celular de restaurar la homeostasis intracelular [106]. Las funciones de Drp1 van incluso más allá de la propia mitocondria: es un modulador fundamental del complejo Beclin1-Vps34-Atg14L para inducir la autofagia. Concretamente, actúa de forma directa con Beclin1 y Atg14L, potencia la actividad de Vps34 y la interacción de esta con Beclin1 [51]. 4.4. Biogénesis mitocondrial La síntesis de nuevas mitocondrias se lleva a cabo mediante la coordinación de los genomas mitocondriales y nucleares. PGC1α (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ coactivator 1α) es el principal regulador de la mitogénesis. Una vez fosforilado y activado por la enzima AMPK, estimula la transcripción de Nrf1 (Nuclear Respiratory Factor 1) y Nrf2, que a su vez inducen la expresión de Mtfa (Mitochondrial Transcription Factor A). Nrf1 y Nrf2 permiten la transcripción de genes mitocondriales Figura 16. Relación entre mitofagia y el dinamismo mitocondrial. Introducción 71 esenciales que van a actuar en conjunción con Mtfa, cuyo trabajo es el de mediar la transcripción y replicación del ADN mitocondrial [108]. Seguidamente, la traducción de los genes del ADN mitocondrial a proteínas se apoya en factores de traducción específicos del citosol y durante este proceso, se les añade una señal de anclaje mitocondrial a su extremo N-terminal. Aquí, los ribosomas se disponen integrados en la membrana mitocondrial, en un procedimiento conocido como ensamblaje oxidativo [105]. El translocador TIMM23 introduce estas proteínas en la parte más interna, la MMI y la matriz, y allí se dispondrán en localizaciones precisas [115]. El aumento de la concentración mitocondrial por esta vía supone un incremento en la potencia de la fosforilación oxidativa, un refuerzo en la lucha contra el estrés oxidativo y la reparación de las mitocondrias que se encontraban en mal estado. Como marcadores empleados para su estudio, se suele evaluar la elevación de la ratio entre el ADN mitocondrial (ADNmt) y el genómico, el número de copias de ADNmt y el rango de expresión de genes mitocondriales [115]. 4.5. Mitofagia e inmunidad Los inflamasomas son receptores del sistema inmune innato. Son complejos multiméricos con receptores de tipo NLR que actúan frente a patógenos externos y otras señales intracelulares. Cuando el metabolismo de la mitocondria es disfuncional, aumenta la liberación de ROS al citoplasma y con ello, la del ADNmt. Ambos provocan la activación del sistema inmune a través de la actividad de los inflamasomas. NLRP3 se induce en respuesta al daño mitocondrial y media la activación de la caspasa 1. Esta, a su vez, genera IL1β e IL18, que conducen a inflamación. En realidad, este fenómeno de respuesta inflamatoria implica la amplificación de las mitocondrias deterioradas, puesto que la propagación de la inflamación conlleva al incremento de la permeabilidad de la membrana mitocondrial y a su fragmentación. Igualmente, la mitofagia puede inhibirse por el inflamasoma, si la caspasa 1 trunca la proteína Parkin para evitar la degradación mitocondrial [14, 109]. Pink1 es considerado como un modulador central de la inmunidad innata, puesto que su pérdida acentúa la inflamación existente elevando los niveles de citoquinas proinflamatorias en las células gliales [14]. Esto sugiere un papel protector de la Introducción 72 mitofagia frente a la neuroinflamación. Es más, la interleuquina antiinflamatoria IL10 activa la mitofagia y controla la actividad mitocondrial [116]. La ausencia de Pink1-Parkin aumenta la presentación mitocondrial de antígenos en las moléculas del complejo MHC de clase I en las células inmunes. Las neuronas dopaminérgicas tienen este complejo, y su vulnerabilidad podría explicarse por el daño mitocondrial [110], puesto que son justo las más damnificadas en la enfermedad de Parkinson. SQSTM1/p62, la Optineurina y NBR1, adaptadores de autofagia y mitofagia, reconocen y unen bacterias ubiquitinadas para ser incluidas durante la formación del autofagosoma [14]. Así, la ubiquitinación juega un papel muy importante en la eliminación de patógenos externos. La presencia de mitocondrias disfuncionales se asocia asimismo con uno de los principales ejes de la inflamación. La vía de NF-κB pone en marcha rutas inflamatorias, entre muchos factores, activando inflamasomas. TLR9 reconoce específicamente el ADNmt, lo que supone la entrada de NF-κB al núcleo y la promoción de la transcripción de TNFα e IL6 [14]. Figura 17. La liberación del ADNmt constituye un indicador de inflamación y de autofagia. Introducción 73 Paradójicamente, NF-κB puede limitar la actividad de NLRP3 mediante la mitofagia mediada por SQSTM1/p62. NF-κB puede inducir la transcripción de Pink1 y SQSTM1/p62 para eliminar las mitocondrias defectuosas. Por tanto, la mitofagia estaría evitando la expansión de daño tisular y el mantenimiento del metabolismo mitocondrial donde NF-κB autorregula su propia acción proinflamatoria [14, 107] 4.6. Mitofagia en el SNC y la enfermedad neuropsiquiátrica Las neuronas presentan un contenido mayor en mitocondrias por su elevada demanda de ATP. Dada su extremada especialización, las mitocondrias se distribuyen de acuerdo con las necesidades energéticas de las neuronas, tanto funcionales como morfológicas [93]. En un estudio con ratones, se comprobó que el flujo mitofágico difiere en las distintas células de un mismo tejido: las neuronas en el giro dentado del hipocampo y las de Purkinje en el cerebelo tienen mayor índice de mitofagia que las neuronas de la corteza, substantia nigra y estriado [107]. Las mitocondrias disfuncionales sintetizan menos ATP y presentan desregulaciones en su contenido de Ca2+. Sin embargo, su eliminación supone un reto al que no se enfrentan los demás tipos celulares, y es que la mayor parte de ellas se encuentran en las zonas distales al soma, donde se producen los mecanismos esenciales para la neurona. Las mitocondrias dañadas son, por tanto, englobadas localmente en los autofagosomas y estos se transportan al soma para su degradación, donde principalmente se distribuyen los lisosomas [93]. Las neuronas y las células gliales pueden llevar a cabo un mecanismo conocido como mitofagia transcelular. Se trata de la exocitosis de mitocondrias por parte de las neuronas en las sinapsis, seguido de la endocitosis o fagocitosis de estas por la microglía o los astrocitos. Este mecanismo evita el gasto energético que supone para las neuronas el traer las mitocondrias desde las zonas más distales hasta el soma para su degradación, por lo que estas son expulsadas y eliminadas por células gliales del entorno. Lo más sorprendente es que las células gliales también pueden transferir sus mitocondrias a las neuronas para ayudarlas en condiciones de insuficiencia energética e hipoxia. Aunque se desconocen los mecanismos moleculares que hacen la mitofagia transcelular posible, se piensa que la proteína GFAP (Glial Acidic Fibrillary Protein) y la UCP2 (Uncoupling Protein 2) estarían involucradas en los astrocitos y neuronas, respectivamente [117]. Introducción 74 La presencia de radicales libres lleva a estrés oxidativo y con ello, a neurodegeneración. Por ello, la mitofagia supone una protección contra las enfermedades neurodegenerativas. De hecho, la mayor parte de la información de la que se dispone sobre la mitofagia en el SNC proviene de los estudios en enfermedades neurodegenerativas: fundamentalmente en Parkinson (la denominación de la proteína Parkin se le atribuyó por su depleción genética en el Parkinson hereditario), Alzheimer, Huntington y esclerosis lateral amiotrófica [116, 117]. Dada la gran cantidad de aspectos en los que se manifiesta la neurodegeneración, la mitocondria supone una de las más prometedoras dianas terapéuticas en la actualidad. Atajando el excesivo estrés oxidativo, las mitocondrias aberrantes y el metabolismo alterado que estas presentan, junto con todas las vías en las que participan y que pueden modificar si su homeostasis no es la correcta, nuevos tratamientos farmacológicos basados en la mitofagia podrían suponer la eliminación de los agregados proteicos o los ovillos neurofibrilares característicos de estas patologías [117]. De la misma forma, en ciertas enfermedades neuropsiquiátricas también se observan índices de deterioro neuronal causados por la acumulación de mitocondrias aberrantes. Figura 18. Flujo de mitocondrias entre neuronas y glías, donde astrocitos y microglías pueden realizar la mitofagia para evitar el gasto energético que supone el transporte anterógrado. Introducción 75 En el TEA, es característico el malfuncionamiento mitocondrial, donde además las mitocondrias se hallan fragmentadas en el soma neuronal. Se han detectado niveles reducidos de Mfn1, Mfn2 y OPA1, mientras que la proteína de fisión Drp1 estaba aumentaba. Aunque la fisión promueve la mitofagia posterior, la acumulación de mitocondrias fragmentadas lleva a considerar que hay también un defecto en la mitofagia. Además, Pink1 se encuentra sobreexpresada mientras que Parkin tiene unos valores de transcripción muy bajos. Es por todos estos parámetros que se está empezando a considerar a la mitofagia como un elemento central en la patogénesis de los desórdenes del espectro autista [95, 116]. En lo concerniente a la esquizofrenia, uno de los genes más caracterizados que parece otorgar susceptibilidad al desarrollo de la enfermedad es el que codifica para la proteína DISC1 (Disrupted in Schizophrenia 1). Se trata de una proteína abundante de las espinas dendríticas y es esencial en el neurodesarrollo, señalización y organización neurítica. Precisamente, DISC1 también juega un papel importante en la dinámica mitocondrial, donde cualquier alteración en ella se relaciona con problemas de transporte y de actividad mitocondrial, junto con una autofagia defectuosa. La regulación al alza de DISC1 en la esquizofrenia conduce a alteraciones en la mitofagia, además de problemas en el funcionamiento del complejo I, que dificulta la respiración mitocondrial. Todo ello contribuye al aumento del estrés oxidativo a consecuencia de una mala gestión energética, conduciendo a inflamación y muerte neuronal [118, 119]. Por su parte, la actividad mitocondrial también se encuentra comúnmente alterada en pacientes con depresión. Se han detectado problemas en la transducción de señales desencadenados por disminuciones en la síntesis de ATP, además de desequilibrios entre la fusión y fisión mitocondrial. Asimismo, la mitofagia se ve disminuida. Mutaciones en DISC1 y en SQSTM1/p62 también se han descrito en la depresión, donde las mutaciones en esta última contribuyen al aumento de la ansiedad y al empeoramiento de la capacidad cognitiva, y a la inducción de NF-κB que promueve la neuroinflamación [120, 121]. La mutación de Parkin se está barajando como predictora de los síntomas depresivos [122], mientras que se ha descrito el incremento del ADN mitocondrial circulante en el plasma de pacientes con depresión [123]. Introducción 76 5. Otras vías moleculares relacionadas con la autofagia 5.1. Complejos de clasificación endosómica necesarios para la maquinaria de transporte (ESCRT) La maquinaria ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) se conforma de un conjunto de proteínas agrupadas en complejos cuya acción es muy diversa: participan en la biogénesis de cuerpos multivesiculares (MVB, de sus siglas en inglés), en la producción de exosomas, el control y remodelado de la membrana nuclear, la reparación de membranas plasmáticas e intracelulares, el cierre de autofagosomas y la reparación de lisosomas. En líneas generales, actúan remodelando membranas [124]. Este complejo puede separar una bicapa lipídica en otras dos bicapas mediante dos vías: provocando el acercamiento de dos partes de la misma bicapa con el fin de crear una vesícula que englobe citoplasma, o bien, hacerlo de la forma opuesta imponiendo que el citoplasma rodee por fuera la nueva vesícula. Este último caso, por ejemplo, comprendería la forma en la que se crean los endosomas [125]. El complejo ESCRT está constituido por cuatro subcomplejos citosólicos: • ESCRT-0: se limita a concentrar la carga ubiquitinada y participa activamente en la síntesis de MVB y en la autofagia. Forman parte de este complejo Hrs (hepatocyte growth factor tyrosine kinase substrate), STAM1 y STAM2 (Signal-transducing adaptor molecule 1 y 2) [126]. • ESCRT-I: es un complejo heterotetramérico cuyos componentes principales son Tsg101 (Tumor susceptibility gene 101), Vps28 (Vacuolar protein sorting 28), Vps37 (Vacuolar protein sorting 37) (con isoformas A-D) y MVB12 (Multivesicular Body sorting factor 12). Interactúa físicamente con el subcomplejo de tipo II [127]. Tsg101 une la ubiquitina y ESCRT-0 a la ruta de los MVB, Vps28 favorece la unión con el siguiente subcomplejo, mientras que Vps37 une membranas y MVB12 estabiliza todas las proteínas oligomerizadas presentes [126]. • ESCRT-II: es otro complejo heterotetramérico formado por Vps22 (Vacuolar protein sorting 22), Vps25 (Vacuolar protein sorting 25) y Vps36 (Vacuolar protein sorting 36), encontrándose este último en duplicado. La interacción con el subcomplejo anterior es mediada por Vps28 y Vps36 [127]. Vps22 une membranas y Vps25 capacita la unión de CHMP6 (Changed Multivesicular body protein 6) para el Introducción 77 reclutamiento de ESCRT-III al cuello de la vesícula y activar el mecanismo de escisión. Vps36 une membranas con contenido rico en fosfoinositol y ubiquitina con el subcomplejo ESCRT-I [126]. • ESCRT-III: está constituido por diferentes polímeros dinámicos de proteínas CHMP (Changed Multivesicular body protein) en forma de α-hélice y que es reclutado por ESCRT-II con mediación de CHMP6. CHMP6 es el maestro de ceremonias de todo el complejo ESCRT: permite la constricción de las membranas que posibilita la deformación y estrechamiento de estas para dar lugar a nuevas membranas o reparar las dañadas [127]. Los subcomplejos ESCRT-I y II colaboran en la formación de la vesícula incipiente, mientras que ESCRT-III se encarga de iniciar y procesar la escisión. CHMP6 inicia el reclutamiento de todo el subcomplejo III para la biogénesis de los MVB. Existen varias proteínas CHMP (CHMP2, CHMP4, CHMP5, entre otras) cuya función está menos caracterizada. CHMP2, por ejemplo, se encarga de señalizar a Vps4 para desensamblar todos los subcomplejos una vez su cometido está finalizado [126]. • Proteínas accesorias ESCRT: en este grupo se incluyen proteínas cuya participación ha sido descrita, pero se desconoce su funcionalidad. Entre ellas, Vps4B (Vacuolar protein sorting 4B) es una ATPasa que ayuda a desarmar el complejo ESCRT dispuesto sobre las membranas una vez estas han sido reparadas o sintetizadas de novo [126]. Las proteínas ESCRT intervienen en el tráfico intracelular y secreción de proteínas (el mecanismo molecular por el que las proteínas son transportadas hacia sus destinos donde llevarán a cabo su función), y en la génesis de las vesículas intraluminales (ILV) en los MVB, que constituyen la principal vía de transporte de cargas dirigidas hacia los lisosomas. Para llevar a cabo esta función, dichos complejos son reclutados desde el citoplasma secuencialmente, siendo la ubiquitina la principal señal atrayente del subcomplejo ESCRT-0. Las subunidades Hrs, STAM, Tsg101 y Vsp36 presentan dominios de unión a ubiquitina que los facultan a unirse a cargas ubiquitinadas [128]. ESCRT-0 concentra los productos ubiquitinados sobre la membrana de los endosomas y recluta a ESCRT-I, que retiene la carga uniéndose mediante la ubiquitina y la dispone para la llegada de ESCRT-II. Este va a organizarse con una conformación concreta que va a actuar como un andamio para el subcomplejo ESCRT-III. Por tanto, cargas Introducción 78 seleccionadas son atrapadas e introducidas en ILV de los MVB, que formarán parte del lumen del endosoma. La ubiquitina es entonces retirada y Vps4B desenvuelve la organización de ESCRT-III permitiendo la biogénesis de un MVB [128]. De forma similar, los elementos ESCRT son reclutados secuencialmente para reparar membranas lipídicas dañadas. Cuando este hecho ocurre, bien por la entrada de algún patógeno o por estrés metabólico, la entrada masiva de Ca2+ constituye un factor de señalización para el acercamiento de lisosomas a la zona que requiere la reparación. Allí, la maquinaria ESCRT ejerce un papel protector ante la muerte celular e incluso puede frenar vías inflamatorias, o al menos, limitarlas [127]. El complejo ESCRT también colabora activamente en la autofagia: los mecanismos de generación y cierre de endosomas son muy similares a la dinámica de formación de los autofagosomas, por lo que actúan en el cierre del fagóforo. A pesar de ello, aún no se ha caracterizado las vías moleculares concretas por las que el subcomplejo ESCRT-III es reclutado. Asimismo, también colaboran en la fusión autofagosoma-lisosoma y en la reparación de lisosomas dañados, donde Tsg101 es uno de los primeros factores reclutados que media la atracción de proteínas del subcomplejo ESCRT-III [127]. La atracción de la maquinaria también se ve favorecida por Beclin1, que colabora en el reclutamiento de la proteína Hrs [51]. Figura 19. Proteínas esenciales del complejo ESCRT que participan en la formación de los MVB; un mecanismo similar se pone en marcha para la formación de los autofagosomas y la reparación de los lisosomas. Introducción 79 Los miembros del complejo ESCRT se distribuyen ampliamente por el SNC y colaboran en eventos de neurodesarrollo y neurogénesis. Al hilo de lo anterior, la maquinaria ESCRT contribuye parcialmente a la poda neuronal. En Drosophila melanogaster, son necesarias para esta actividad proteínas de ESCRT-I y III, junto con Vps4B. Los factores ESCRT también se ven envueltos en la poda de arborizaciones dendríticas [127]. 5.2. Apoptosis La autofagia es un mecanismo que protege a la célula frente a la muerte celular mediante el mantenimiento de la homeostasis intracelular. El inicio de la apoptosis se sitúa en la mitocondria, cuando la permeabilización de su membrana por BAX-BAK (Bcl2 Associated X y Bcl2 homologue antagonist/killer, respectivamente) provoca la liberación hacia el citosol de proteínas proapoptóticas como el citocromo c. La regulación fundamental de la mitocondria (en términos de apoptosis) la realiza la familia Bcl2 (B-cell lymphoma 2), cuyas proteínas efectoras son BAX y BAK. BNIP3 y Nix son miembros de esta familia, pero difieren en que solo actúan como transmisores de estrés desde el citosol a la mitocondria para activar a BAX-BAK. Estas crean poros en la MME por los que pasará el citocromo c desde la matriz al citosol [106]. En contraposición, la proteína Bcl2 en sí misma es antiapoptótica y regula negativamente la autofagia mediante su interacción con Beclin1. También puede inhibir la autofagia uniéndose a Ambra1, que es la molécula que activa el complejo donde participa Beclin1 en el proceso de nucleación. De hecho, para que este evento ocurra, Beclin1 y Ambra1 deben de ser separados de Bcl2 [106]. La permeabilización de la membrana mitocondrial activa la vía intrínseca apoptótica: si esto ocurre en un número concreto de mitocondrias, la mitofagia puede eficazmente atajarlas y degradarlas. Este hecho, junto con la liberación mediada por la autofagia de marcadores antiapoptóticos, entre ellos Bcl2, evita el desarrollo de la apoptosis. Lógicamente, cuando la autofagia resulta inefectiva o tiene problemas de activación, el destino de la célula es la apoptosis. En este caso, la caspasa 3 trunca a Beclin1, perdiendo entonces su funcionalidad autofágica y amplificando así la señal apoptótica [50]. Por otro lado, la proteína p53 (tumor supressor protein 53) regula tanto a la autofagia como a la apoptosis. En condiciones basales, p53 se encuentra a niveles bajos mediante su eliminación por el proteasoma, pero en situaciones de estrés (como daño en el ADN Introducción 80 o hipoxia), sus niveles se ven rápidamente elevados. p53 puede actuar en el núcleo promoviendo la transcripción de genes proapoptóticos (como Bax y Bak) a la vez que reprime la de otros antiapoptóticos como Bcl2 o Bcl-XL (B-cell lymphoma-extra large). Esta proteína asimismo puede activar Bax e inhibir Bcl2 a nivel proteico. Igualmente, también consigue translocarse a la mitocondria, donde contribuye a la permeabilización de su membrana al interactuar con la familia Bcl2 [106]. Numerosos estudios han demostrado la polivalencia de p53, ya que en condiciones normales inhibe la autofagia, pero en respuesta a estrés puede tanto inducirla como inhibirla [106]. De hecho, su porción citoplasmática puede inhibir la ruta mediante la supresión de AMPK, activando por tanto mTOR [93]. Entre otras de sus dianas destaca Parkin, cuya interacción supone el bloqueo de la mitofagia [110]. Introducción 81 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 82 83 Así pues, en base a todos los antecedentes y conocimientos mencionados, y partiendo de los últimos descubrimientos y del estado del entendimiento actual sobre el papel de la autofagia en la enfermedad mental, se planteó la siguiente hipótesis: «La autofagia, así como su subtipo mitofagia, podrían estar implicadas en las alteraciones inmunes e inflamatorias observadas en el sistema nervioso central de diferentes trastornos neuropsiquiátricos, como el TDM o los trastornos del neurodesarrollo, pudiendo aportar posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de estas patologías relacionadas con el estrés». Así, los objetivos generales para la constatación de esta hipótesis fueron los siguientes: • Identificar los niveles de activación de la autofagia en corteza frontal e hipocampo de modelos animales de enfermedad mental, entre ellos, modelos basados en el estrés que desarrollen un fenotipo de tipo depresivo y modelos de enfermedades neuropsiquiátricas basadas en alteraciones del neurodesarrollo. • Determinar la modulación de la autofagia en función de los estresores aplicados para el desarrollo de los modelos de experimentación, así como las posibles diferencias entre la corteza frontal y el hipocampo. • Comprobar la interrelación entre autofagia y el complejo ESCRT en el contexto de los modelos animales de enfermedad neuropsiquiátrica en la corteza y el hipocampo. Figura 20. Hipótesis general de trabajo. Hipótesis y Objetivos 84 • Evaluar el impacto del estrés sobre marcadores lisosomales y su relación con la autofagia en las dos regiones cerebrales. • Estudiar el perfil mitocondrial derivado de la exposición a estrés, así como su relación en la vía de la mitofagia en la corteza frontal y el hipocampo. • Evaluar la relación entre estrés oxidativo y el estado mitocondrial en ambas zonas cerebrales. • Analizar el efecto de un inhibidor o activador de la autofagia sobre los marcadores de esta y de la mitofagia en la corteza frontal. Para la consecución de estos objetivos generales, se plantearon los siguientes objetivos específicos, para llevar a cabo sobre la corteza frontal y el hipocampo: • Analizar la conducta de los distintos grupos experimentales tras la realización de cada modelo animal mediante varias pruebas previamente validadas. • Cuantificar las alteraciones en la vía de la autofagia en los diferentes modelos animales mediante Western blot y RT-qPCR en la corteza frontal y el hipocampo. • Estudiar el papel de las células nerviosas en la autofagia y la mitofagia mediante técnicas de inmunofluorescencia. • Comparar el estado de la autofagia con la apoptosis, y su posible interrelación. • Evaluar proteínas representativas de cada subcomplejo ESCRT por Western blot y su relación con la autofagia. • Analizar marcadores lisosomales por Western blot y su presencia en las distintas células nerviosas por inmunofluorescencia. • Realizar una comparativa entre el dinamismo mitocondrial, la biogénesis mitocondrial y la mitofagia para determinar el estado mitocondrial de los modelos animales de estrés mediante Western blot, RT-qPCR y citometría de flujo. • Comprobar los índices de estrés oxidativo a través de parámetros como la catalasa y la superóxido dismutasa. • Contrastar las posibles alteraciones en la autofagia y mitofagia entre modelos, determinando posibles dianas terapéuticas. • Evaluar la capacidad restauradora de la espermidina como inductor de la autofagia y modulador de la mitofagia, así como sus efectos a nivel comportamental. Hipótesis y Objetivos 85 MATERIALES Y MÉTODOS 86 87 En esta sección, se explican los modelos animales estudiados y el diseño experimental que se siguió en cada uno de ellos. Las pruebas conductuales con las que se examinó el comportamiento animal y la recogida de las muestras necesarias se detallan a continuación. Seguidamente, se especifican las técnicas y aproximaciones bioquímicas que se emplearon sobre las muestras extraídas, además de los análisis estadísticos. Por último, se adjunta una copia del Certificado de Capacitación para el Manejo de Animales de Experimentación, con la categoría B (Eutanasia de los animales) y categoría C (Realización de los procedimientos). En todos los casos, se emplearon ratas Wistar Hannover (HsdRccHan:Wist, ENVIGO, España) jóvenes-adultas con pesos de partida de entre 200 y 225 g. Todos los procedimientos experimentales llevados a cabo en esta Tesis se efectuaron de acuerdo con la normativa dictaminada por el Comité de Experimentación Animal de la Universidad Complutense de Madrid, bajo los PROEX 098/19 y 008/18, y las directrices del Gobierno de la Comunidad de Madrid, según la legislación española (RD 53/2013) y europea (2010/63/EU). El trabajo con animales de experimentación siempre fue enfocado hacia el uso del menor número posible de ellos, así como asegurando unas condiciones óptimas y la reducción de su sufrimiento. Todas las imágenes de rutas moleculares sobre autofagia y relacionadas con la mitocondria mostradas en esta Tesis Doctoral son de elaboración propia, habiendo sido creadas a partir del programa en línea BioRender® y apoyadas en la literatura actual. 1. Modelos animales y diseño experimental Para la cumplimentación de los objetivos planteados en la presente Tesis Doctoral, se produjeron cuatro modelos animales de interés en el estudio de la enfermedad neuropsiquiátrica: • Chronic Mild Stress (estrés crónico de intensidad moderada): permite el desarrollo de un fenotipo de tipo depresivo. En lo sucesivo, citado en su forma acortada como CMS. • Modelos doble hit: se basan en el empleo de dos estímulos estresantes, uno en la etapa perinatal o posnatal temprana, y otro en torno a la adolescencia o juventud temprana. Dan lugar a un fenotipo de tipo psicótico y/o comportamientos derivados de alteraciones del neurodesarrollo. Se desarrollaron tres modelos de diferente naturaleza: Materiales y Métodos 88 1. Poly I:C + Aislamiento social: de aquí en adelante, referido como el modelo Poly+Iso. 2. Deprivación materna + LPS: de aquí en adelante, mencionado como MD+LPS, y detallado como MD+LPSa (si el LPS se inyectó de forma aguda) y MD+LPSc (cuando el LPS se administró de forma crónica). 3. Deprivación materna + Restricción de movimiento: de aquí en adelante, aludido como MD+RS, y especificado como MD+RSa (en su forma aguda) y MD+RSc (cuando se cronificó su exposición). Todos estos modelos fueron estudiados tanto comportamentalmente como bioquímicamente. Según los grupos experimentales y el modelo concreto, el análisis estadístico empleado fue específico, e incluso, complementado desde diferentes tipos de análisis para describir más fielmente los datos obtenidos. Asimismo, es imprescindible recalcar que la enfermedad psiquiátrica es pura y esencialmente humana, derivada de nuestras capacidades cognitivas y fisioanatómicas más evolucionadas. Por tanto, los modelos animales no son más que una herramienta muy útil para el entendimiento del funcionamiento de vías moleculares en el SNC, y que nos ayudan a trasladar a la realidad clínica nuevas dianas y terapias farmacológicas. 1.1. Chronic Mild Stress (CMS) Para el estudio de la vía de la autofagia y mitofagia en un modelo de depresión, se empleó el modelo Chronic Mild Stress (CMS), que permite la aparición de un fenotipo de tipo depresivo en las ratas. Es una adaptación del propuesto por Willner [129]. Es un estrés crónico de tipo moderado que combina factores físicos y psicológicos, siendo incontrolable, impredecible e inescapable. Además, presenta alteraciones fisiológicas y moleculares similares a las que se observan en la práctica clínica. Existen varias modificaciones de este modelo, en las que se combinan diferentes estímulos y la extensión del mismo se alarga dos y hasta cinco semanas más [130]. Sin embargo, trabajos previos en nuestro laboratorio detallaron que una duración de tres semanas era suficiente para el desarrollo del fenotipo de tipo de depresivo, respaldado con pruebas comportamentales y determinaciones bioquímicas [131]. Solo se emplearon ratas macho en este modelo, que fueron estabuladas en grupos de tres o cuatro manteniendo las condiciones estándar de temperatura y humedad, siguiendo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (de 8:00 a 20:00 horas). Una vez recibidas en el Animalario de la Facultad de Medicina de la UCM, se las dejó aclimatar Materiales y Métodos 89 a sus nuevas condiciones durante una o dos semanas. Las ratas siempre tuvieron acceso a comida y bebida ad libitum durante este periodo. Para el protocolo CMS, se emplearon ratas macho divididas de forma aleatoria entre dos grupos experimentales: el grupo control (CT) y el grupo CMS (CMS). El número de animales englobados en cada grupo se estableció acorde con las necesidades de cada determinación, siempre bajo el amparo del Principio de las 3 R (Reducir, Reemplazar y Refinar). Este dato se irá detallando conforme se vayan describiendo los diferentes experimentos. Pasado el periodo de acondicionamiento, donde las ratas se estabularon individualmente, se comenzó con el protocolo de estrés. Durante 21 días, las ratas fueron expuestas a dos estresores diarios que se cambiaban cada 12 horas. La sucesión de estímulos se mantuvo fija durante la primera semana, con únicamente dos días de descanso por las mañanas, de manera que la segunda y tercera semana se repitieron en el mismo orden que la primera. Esta pauta irregular de cambios diferentes durante 7 días, y la repetición posterior de estos durante otras dos semanas, aseguró la impredecibilidad de los estímulos. La siguiente tabla resume la progresión de estresores durante la primera semana: Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes Sábado Domingo 8:00 h Rata A vi- sita a rata B Serrín húmedo Rata B visita a rata A Privación de comida y bebida Jaula inclinada Descanso Descanso 20:00 h Ilumina- ción inter- mitente Privación de comida y bebida Jaula in- clinada Serrín hú- medo Luz estrobos- cópica Iluminación intermitente Privación de comida y bebida De forma más detallada, cada estímulo implica lo siguiente: • Visitas: se emparejan las ratas de manera sucesiva, normalmente las pares con las impares, dos por jaula. Explota el paradigma invasor/huésped y el estrés que supone la invasión del territorio. • Serrín húmedo: la cama de serrín se humedece con agua, alrededor de 250 ml. Tras las 12 horas, se cambió por serrín nuevo y seco. • Privación de comida y bebida: los pellets y las botellas de agua se retiran de las jaulas. • Jaula inclinada: se disponen con un ángulo de unos 45º. Tabla 2. Relación de estímulos aplicados semanalmente para la realización del modelo CMS. Materiales y Métodos 90 • Luz intermitente: se programa un sistema de luces para que se mantengan encendidas durante 2 horas, posteriormente otras 2 horas apagadas, y así sucesivamente durante 12 horas. • Luz estroboscópica: se programa otro sistema de luces que permanece operante durante las 12 horas con luces led funcionando a una frecuencia de 150 flashes por minuto. 1.1.1. Modulación de la autofagia con herramientas farmacológicas experimentales a) Inyección intracerebral con leupeptina La proteína LC3, principal marcador de autofagia, puede constituir una medida indirecta del flujo autofágico mediante la evaluación de sus isoformas por Western blot (técnica explicada en mayor detalle en páginas posteriores). Sin embargo, dado que su eliminación también se efectúa a través del proceso de autofagia, es necesario bloquear el flujo. Esto implica detener temporalmente la actividad del lisosoma para que el mecanismo no llegue a término. Así, la acumulación de autofagosomas, marcados por la isoforma LC3-II (que no se está viendo degradada por el momento) conlleva a su aumento de la expresión proteica observada por Western blot. De esta forma, la medida del flujo autofágico nos aporta información sobre cómo está ocurriendo el proceso de degradación de la carga seleccionada. Hay muchos compuestos que pueden emplearse para obtener la inhibición del flujo autofágico, como la cloroquina o la bafilomicina A1. Algunos actúan impidiendo la unión entre el lisosoma y el autofagosoma, evitando la formación del autolisosoma. Otros, acidifican el interior del lisosoma para dificultar su actividad [132-134]. En base a la literatura disponible [135], y ante la complejidad de bloquear el flujo autofágico en un organismo vivo (es una práctica habitual en los estudios de autofagia realizados in vitro), se optó por inyectar leupeptina hemisulfato (Sigma-Aldrich,108976) directamente en la corteza frontal (CF) y el hipocampo (Hp). Se descartó la inyección sistémica (intraperitoneal, subcutánea o intravenosa) ante la incapacidad del compuesto de traspasar la barrera hematoencefálica. Además, se pretendía inhibir la vía de forma local, únicamente en el tejido bajo estudio. Hay que recordar que la autofagia es un proceso vital e indispensable para la supervivencia celular, por lo que la inyección intraperitoneal o el uso de cualquier otra vía de administración habría irremediablemente Materiales y Métodos 91 repercutido sobre todas las células que entrasen directamente en contacto con el inhibidor. Para este experimento, se establecieron 6 grupos experimentales de ratas Wistar macho: el grupo control (CT, n = 9), el grupo control inyectado con vehículo (CT+veh, n = 6), el grupo control inyectado con leupeptina (CT+leu, n = 9), el grupo CMS (CMS, n =9), el grupo CMS administrado con vehículo (CMS+veh, n = 6) y el grupo CMS inyectado con leupeptina (CMS+leu, n = 9). El vehículo empleado fue solución salina estéril (NaCl al 0.9%; AppliChem, A2942), que también fue empleado para disolver la leupeptina a una dosis de administración de 20 mg/kg. Esta inyección se hizo a partir de las 9 horas del día 22 del protocolo de CMS. Todos los grupos a los que se les iba a realizar la cirugía estereotáxica fueron previamente anestesiados con isofluorano (ELASA, 10162). Tras la comprobación de la ausencia de respuesta ante la estimulación física de patas, cola y vibrisas, se procedió al inicio de la cirugía. Las cabezas fueron entonces colocadas en el equipo estereotáxico (Stoelting, EEUU) para permitir el acceso al cráneo. Con una aguja de 23G se llevó a cabo una perforación de 0.635 mm de diámetro externo. Esta apertura permitió la entrada de una aguja de 22G (Hamilton Company; Small Hub RN NDL, de longitud 1.905 cm de tipo point style 4 cortada con un ángulo de 10-12º) sujeta a una jeringuilla (Hamilton Company; 10 μl, Modelo 701 RN, 26G, 51 mm, de tipo point style 2) y dispuesta sobre el acceso para la inyección de 10 μl a una velocidad de 1 μl/min en la CF bilateralmente (coordenadas desde Bregma: 4.2 mm A/P, 1.5 mm M/L, 1.8 D/V) y en el Hp (coordenadas desde Bregma: -3.6 mm A/P, 2 mm M/L, 3 mm D/V). En ambos casos, la inyección fue bilateral. Las dos inyecciones se efectuaron sobre ambos hemisferios. Cuando la inyección de salino o leupeptina se completó, se retiró la aguja de la apertura tras 2 min de espera. La escisión creada en el cráneo fue sellada con cera ósea (Surgical Specialties Corp, 901) y la piel superior suturada con hilos de seda no absorbibles (B. Braun, G0762121). Una vez realizadas las intervenciones, se mantuvo un tiempo de espera de 3 horas previo a la toma de muestras para asegurar el efecto del inhibidor. Materiales y Métodos 92 Ninguna prueba comportamental sucedió a la inyección de la leupeptina porque el objetivo de su uso no contemplaba ninguna mejora o cambio en la sintomatología y demás alteraciones moleculares derivadas del protocolo CMS. De hecho, impedir la actividad lisosomal en el tejido nervioso no podía ir más que en detrimento para la mayoría de procesos celulares. Su empleo se limitó a inhibir el flujo autofágico de la forma más específica posible, y las muestras obtenidas de este experimento solo se emplearon con este fin. b) Tratamiento con espermidina La espermidina es un inductor de la vía de la autofagia, además de actuar contra el estrés oxidativo y la neuroinflamación. Con el objetivo de dilucidar el posible efecto que el tratamiento con espermidina podría ejercer sobre los desbalances ocasionados en la autofagia y mitofagia a consecuencia del estrés crónico, se administró este inhibidor durante los últimos 7 días del modelo CMS. Para ello, se crearon de nuevo 6 grupos experimentales de ratas Wistar macho: control (CT, n = 9), control inyectado con vehículo (CT+veh, n = 7), control tratado con espermidina (CT+SPD, n = 9), CMS (CMS, n = 9), CMS inyectado con vehículo (CMS+veh, n = 7) y CMS tratado con espermidina (CMS+SPD, n = 9). El vehículo utilizado fue de nuevo solución salina estéril, donde también se diluyó la espermidina trihidroclorhídrica (SPD) (Sigma-Aldrich, S2501) a dosis de 10 mg/kg durante 7 días intraperitoneal (ip) a las 10:00 horas. Se optó por el tratamiento de una semana en base a literatura disponible [136, 137]. Figura 21. Representación procedimental de las inyecciones intracorticales e intrahipocampales de salino y leupeptina en los grupos CT y CMS. Materiales y Métodos 93 La elección de la vía de administración se debió a varios motivos: en primer lugar, resultaba más fácil y menos invasivo administrar durante una semana el tratamiento si era de forma intraperitoneal, ya que este compuesto sí que podía atravesar la barrera hematoencefálica; en segundo lugar, las consecuencias del CMS no solo se limitan al SNC, sino que se observan en muchos aspectos de la periferia y por tanto, su efecto tanto a nivel central como sistémico podrían ser de gran ayuda en cuanto a la pronóstico del fenotipo; y en último lugar, este formato resultaba más traslacional a la clínica que una inyección intracerebral. Tras la administración semanal de SPD, entre los días 21 y 22 se ejecutaron las pruebas comportamentales de natación forzada, campo abierto y Splash test (que serán detalladamente descritas en el siguiente punto), produciéndose la toma de muestras el día 23 desde el inicio del protocolo CMS. 1.2. Poly I:C y Aislamiento social (Poly+Iso) Este modelo se incluye entre los de tipo doble estímulo «hit». El primer hit se correspondió con la inyección intravenosa del análogo vírico de tipo dsRNA Poly I:C (un conocido efector del receptor TLR3) a las ratas madre gestantes, con la intención de inducir una reacción inmunitaria en ellas; el segundo hit empleado fue el aislamiento social sobre su progenie tras el destete. Figura 22. Diseño experimental del CMS con tratamiento de espermidina (SPD). Al comienzo de la tercera semana de CMS (día 14, estableciéndose el día 1 como el del inicio del modelo) se inició el tratamiento con espermidina a una dosis de 10 mg/kg de forma intraperitoneal. Las inyecciones se hicieron a las 10:00 horas, tras las cuales las ratas fueron devueltas a sus jaulas. Tras la administración crónica de 7 días de la SPD, acabando el protocolo de estrés a día 21, se realizaron los estudios comportamentales durante dos días. A día 23 se produjo la toma de muestras. Se detallan los grupos establecidos y el número de ellos empleado sobre cada tipo de rata. Materiales y Métodos 94 Para este modelo, se emplearon 10 ratas Wistar hembra de unos 250 g y 5 ratas Wistar macho con pesos de 200 – 225 g (HsdRccHan:Wist, ENVIGO, España) para poder cruzarlos entre sí. De acuerdo con el ciclo estral de las hembras, siendo la intersección entre el final del proestro y el inicio del estro el periodo de mayor fertilidad, dos hembras y un macho se agruparon por jaula durante su ciclo de actividad nocturno. A la mañana siguiente, antes de las 8:00 horas, se comprobó la posibilidad de fecundación mediante dos técnicas: la visualización de la caída del tapón vaginal, y de no ser esto posible dada su dificultad, la disposición de salino en la cavidad vaginal con pipeta para comprobar la presencia de espermatozoides. De resultar positiva la fecundación de la noche anterior, ese día se establece como el primero del comienzo del modelo (siendo el día 0 aquel de la fecundación). En el día 14, las madres gestantes recibieron una inyección intravenosa en una vena caudal del compuesto Poly I:C (Sigma-Aldrich, P1530) a una dosis final de 4 mg/ml o de salino para establecer posteriormente los grupos control. El vehículo empleado fue nuevamente solución salina estéril. Después del nacimiento de las camadas, estas permanecieron con sus madres hasta el día 21 posnatal (21PN). A partir de este día, cada miembro de la camada fue distribuido de forma aleatoria entre los diferentes grupos establecidos, independientemente del sexo: el grupo control, cuyas madres fueron inyectadas con salino (CT, n = 9), el grupo Poly I:C, cuyas madres recibieron el análogo vírico pero que no recibieron un segundo estímulo (Poly I:C, n = 9), el grupo de aislamiento social, a cuyas madres se les administró salino y que se expusieron al aislamiento como segundo hit (Iso, n = 9), y el grupo doble hit (Poly+Iso, n = 9), cuyas madres recibieron Poly I:C y sus camadas fueron luego sometidas al aislamiento social. Una vez organizados los grupos experimentales, las ratas que se encontraban en los grupos de aislamiento social fueron estabuladas individualmente, desde 21PN hasta 56PN, lo que supondrían 5 semanas de aislamiento. El resto de las ratas permanecieron estabuladas en grupos de 3 por jaula. Transcurrido este periodo de tiempo, las ratas aisladas se volvieron a agrupar, también por grupos de 3, y permanecieron así durante otras dos semanas. En este proceso se produjo su rehabituación. Materiales y Métodos 95 Pasadas las dos semanas, se llevaron a cabo las distintas evaluaciones comportamentales durante los próximos 10 días: laberinto en cruz elevado, campo abierto, reconocimiento de objetos nuevos y laberinto en T. Como la caracterización de este modelo es parte integral de la Tesis Doctoral de otro miembro de nuestro grupo de investigación, estas pruebas se encuentran detalladas en su trabajo. Realizadas las pruebas conductuales de todos los grupos, se procedió a la toma de muestras en el día 81PN. Todos los animales de un mismo grupo fueron sometidos secuencialmente a cada prueba, dejando entre 5-6 h de descanso en caso de realizarse otra posteriormente. 1.3. Deprivación materna y LPS En el segundo y tercer modelos doble hit se empleó como primer estresor la deprivación materna. Se pidieron 6 ratas hembra Wistar (HsdRccHan:Wist, ENVIGO, España) de 1 Figura 23. Diseño experimental del modelo doble hit Poly I:C y aislamiento social. En el día 0 se cruzaron los machos y hembras; el día 1 se tomó como aquel en el que se comprobó que había habido fecundación el día anterior; el día 14 se inyectó intravenosamente el análogo vírico Poly I:C a las madres gestantes; el día 21 gestacional nacieron las crías y se mantuvieron con sus madres hasta el día posnatal 21, donde se realizó el destete; desde el día 21 al 56 se aislaron individualmente las ratas pertenecientes a los grupos de aislamiento; tras cinco semanas de aislamiento, estas ratas volvieron a estabularse conjuntamente con otras durante otras dos semanas; pasadas estas, desde el día 71 hasta el 80 se llevaron a cabo las pruebas comportamentales; el día 81 se tomaron las muestras pertinentes. Se detallan los grupos establecidos y el número de ellos empleado sobre cada tipo de rata. Materiales y Métodos 96 semana de gestación. Después de dos semanas de habituación, en el que fueron individualmente estabuladas, el día del nacimiento se tomó como el día 1 del modelo. El día 9 posnatal (9PN), a las 8:00 horas, las crías fueron separadas de sus madres durante 24 horas. A lo largo de este tiempo, se mantuvieron las condiciones de temperatura, luz y humedad, pero las crías no pudieron alimentarse. El día 10 posnatal a la misma hora, las crías fueron devueltas a sus madres. El día 21, como ocurrió con el modelo anterior, se produjo el destete y la formación de grupos experimentales a partir de las diferentes camadas. Los grupos de estudio en este modelo fueron los siguientes, independientemente del sexo: control (CT, n = 10) de crías que no fueron separadas de sus madres ni recibieron posteriormente el segundo estímulo; deprivación materna (MD, n = 10) de crías que sí fueron separadas de sus madres pero que tampoco se expusieron al segundo estresor; LPS (LPS), que no sufrió la separación de sus madres pero que se les inyectó LPS (0.5 mg/kg, ip) en su adolescencia-juventud temprana y el grupo doble hit (MD+LPS) que fueron tanto aislados de sus madres como inyectados con LPS. En cuanto al segundo hit, la administración de LPS se realizó de forma aguda (LPSa, n = 10) en el día 85PN y de forma crónica (LPSc, n = 11) durante 5 días, desde el 80PN a 85PN, coincidiendo con el agudo. El mismo patrón de inyección se perpetuó en los grupos doble hit, que se dividieron tanto con pinchazo agudo (MD+LPSa, n = 11) como con crónico (MD+LPSc, n = 11). De esta forma, el LPS (Sigma-Aldrich, L2630) se inyectó ip a dosis de 0.5 mg/kg en los grupos previamente mencionados entre las 9:00 y 10:00 horas. Los grupos sin segundo estímulo fueron inyectados con solución salina estéril, que también fue el vehículo del LPS. Las pruebas comportamentales se efectuaron en todos los grupos con la excepción de los LPSa y los doble hit MD+LPSa. Esto fue debido a que el efecto crónico era el realmente importante para nuestro estudio, sirviendo el agudo como control para registrar lo que ocurría con una administración única. Si trasladamos el modelo a la realidad clínica, normalmente son estresores externos a los que nos exponemos crónicamente los que pueden contribuir al desarrollo de una enfermedad mental. Estos estudios se realizaron durante 5 días, dada la cantidad de animales examinados y el entrenamiento que muchas de estas pruebas requieren. Esto permitió que las pruebas finales se llevasen a cabo tras la quinta dosis (día 85) y el día siguiente (día 86). Terminada la evaluación del comportamiento, se procedió a la toma de muestras los días 86 y 87. Materiales y Métodos 97 Todas las pruebas que se realizaron fueron: laberinto en cruz elevado, campo abierto, reconocimiento de objetos nuevos, laberinto en T y splash test. Dado que este modelo se desarrolló de forma conjunta con otro investigador de nuestro laboratorio, en la presente Tesis Doctoral solo se hará referencia en la sección de resultados a los datos procedentes de las pruebas de campo abierto y splash test. 1.4. Deprivación materna y restricción de movimiento Siguiendo el mismo procedimiento que en el modelo anterior, 6 ratas Wistar gestantes (HsdRccHan:Wist, ENVIGO, España) fueron recibidas con una semana de embarazo aproximadamente. Estas permanecieron estabuladas individualmente durante las siguientes semanas restantes de su periodo gestacional. Una vez nacidas las camadas, se fijó ese día como el día 1. El día 9 desde su nacimiento, las crías de los futuros grupos de deprivación materna fueron separadas de sus madres durante 24 horas, desde las 8:00 horas, asegurando las condiciones óptimas de luz, temperatura y humedad. Figura 24. Diseño experimental del modelo doble hit de deprivación materna y LPS. Ratas gestantes fueron estabuladas separadamente para reducir estrés. Conforme iban naciendo las camadas, el día del nacimiento se estableció como el día 1. La deprivación materna (MD) se llevó a cabo a día 9, donde las crías fueron separadas de sus madres durante 24 horas, tras las que se volvieron a juntar. A día 21 se produjo el destete y sexaje, y las crías se distribuyeron en grupos 3 hasta el día 80. Este día, las ratas que se encontraban en el grupo LPS (LPSc o MD+LPSc) comenzaron a recibir sus dosis, que se extendieron durante 5 días. En el día 85, último de inyección, también se inyectaron las ratas LPSa y MD+LPSa. Se detallan los grupos establecidos y el número de ellos empleado sobre cada tipo de rata. Materiales y Métodos 98 Durante estas 24 horas no tuvieron acceso a la alimentación materna. Pasado este tiempo, las crías fueron retornadas a sus madres. Las ratas progenitoras y sus crías permanecieron juntas hasta el día 21, donde se produjo el destete y la distribución de la progenie entre los distintos grupos experimentales, independientemente del sexo: el grupo control (CT, n = 9), que no fueron expuestas a la deprivación materna ni al segundo hit; el grupo de deprivación materna (MD, n = 9) a las que se las separó de sus madres durante 24 horas pero que luego no se sometieron a la restricción; el grupo de restricción de movimiento agudo (RSa, n = 9) y crónico (RSc, n = 10), a las que no se les aisló de su madre pero que sí fueron inmovilizadas de forma puntual y crónica respectivamente, y el grupo doble hit agudo (MD+RSa, n = 9) y el crónico (MD+RSc, n = 9). La diferencia existente entre la restricción de movimiento aguda y crónica fue similar al modelo anterior: la restricción de movimiento crónica implicó la inmovilización de las ratas a lo largo de 7 días mientras que, en la vertiente aguda, solo ocurrió en un día. El protocolo de restricción comenzó el día 72 para los grupos del formato crónico (RSc y MD+RSc), y se repitió durante 6 días más, hasta el día 78. Justo en este día, se inmovilizaron conjuntamente con los grupos agudos (RSa y MD+RSa). La inmovilización de las ratas se realizó mediante conos DecapiCone® (Fisher Scientific, NC9679094), en los que se introdujeron las ratas durante 6 horas/día, desde las 9:00 horas, sin acceso a comida ni agua, pero con una apertura frontal para no obstaculizar la respiración. El cono se cerró por la parte trasera teniendo cuidado con la disposición de la cola. En este caso, las pruebas conductuales empezaron en los 5 días últimos de la restricción de movimiento crónica, puesto que muchos de ellos requerían de ensayos y entrenamiento previo. Por tanto, el estudio conductual se extendió desde el día 75 al 78, en el que se efectuaron los últimos análisis del comportamiento. Fue en este día y el siguiente (día 79) en los que se produjo la toma de muestras. De nuevo, estos análisis solo se llevaron a cabo sobre los grupos CT, MD, RSc y MD+RSc, ya que los grupos agudos se implantaron exclusivamente para conocer el efecto puntual de la inmovilización sobre la deprivación materna. Asimismo, se empelaron los mismos ensayos comportamentales que en el modelo anterior: laberinto en T, laberinto en cruz elevado, reconocimiento de objeto nuevo, campo abierto y Splash test. De igual manera que ocurrió con la aproximación anterior, la investigación de este modelo fue compartida, por lo que nuevamente solo se hará mención explícita de las pruebas de campo abierto y Splash test en posteriores secciones. Materiales y Métodos 99 2. Pruebas comportamentales Todos los estudios conductuales realizados se llevaron a cabo en condiciones controladas de temperatura, humedad y ruido ambiental. Además, se efectuaron haciendo uso de una lámpara con luz roja, para evitar cualquier efecto que la luz blanca pudiera ocasionar sobre los animales. Igualmente, se limitó a lo estrictamente necesario la presencia del investigador en la sala de comportamiento. Todos los ensayos fueron grabados con una videocámara y analizados y respaldados por otro investigador ajeno a las condiciones de experimentación. Figura 25. Diseño experimental del modelo doble hit de deprivación materna y restricción de movimiento. Ratas gestantes fueron estabuladas individualmente. El día de nacimiento se fijó como día 1 para cada camada. La deprivación materna tuvo lugar a día 9 posnatal, donde las crías fueron separadas de sus madres durante un periodo de 24 horas. Transcurrido este, fueron devueltas al cobijo de sus madres. Una vez alcanzado el día 21, se llevó a cabo el sexaje y destete. Las ratas hijas fueron distribuidas entre grupos y permanecieron en grupos de 3 hasta el día 72, donde comenzó el segundo hit para los grupos pertinentes. Aquellas ratas pertenecientes a los grupos RSc y MD+RSc fueron inmovilizadas durante 6 horas diarias en el interior de conos de plástico, sin acceso a comida ni agua, pero sin dificultar su respiración. Este procedimiento fue repetido durante un total de una semana. En el caso de los grupos RSa y MD+RSa, el protocolo de inmovilización solo se realizó a día 78, una única vez. Las pruebas conductuales finales se realizaron el día 78, habiendo empezado los entrenamientos y ensayos hasta 5 días antes. Seguidamente, se efectuó la toma de muestras. Se detallan los grupos establecidos y el número de ellos empleado sobre cada tipo de rata. Materiales y Métodos 100 2.1. Prueba de natación forzada Esta prueba se basa en una adaptación del procedimiento descrito por Porsolt [138]. En ella, se introducen a las ratas de manera individual en un cilindro lleno de agua, de forma que no puedan tocar el fondo ni escalar hacia el borde. Este cilindro de polimetilmetacrilato medía 40 cm de alto y 18 cm de diámetro. El agua empleada para la prueba fue agua corriente mantenida a una temperatura de en torno a 23-25ºC. El agua se fue cambiando cada dos ensayos. El objetivo principal de esta prueba consiste en forzar a las ratas a mantenerse activas, a nadar, dentro de las limitaciones de espacio en las que se disponen. Una respuesta positiva se considera aquella en la que las ratas luchan por salir, nadan, e incluso bucean, en un intento de impulsarse hacia la superficie. Estos detalles apuntan a que la rata no tiene un comportamiento de tipo depresivo, ya que está intentando salir de forma proactiva de la situación en la que se encuentra. Sin embargo, si la rata se deja flotar, y a veces, no lucha ni por mantenerse a flote, quedando totalmente inmóvil y dejando sacar del agua solamente el hocico, se interpreta como comportamiento de tipo depresivo. En cuanto al procedimiento, se llevó a cabo en dos sesiones en días consecutivos: en el primer día, las ratas se introdujeron por vez primera en los cilindros, y se las dejó en ellos durante 10 min como entrenamiento; en el segundo día, se las volvió a sumergir en los cilindros y se les dejó una duración de 5 min [139]. Esta última sesión fue la que se grabó y se consideró para los análisis. Para la evaluación de la prueba, se tuvo en cuenta el tiempo de inmovilidad, el tiempo de natación y el tiempo de escalada. El tiempo de inmovilidad se entiende como aquel en el que la rata no ofrece mayor resistencia y solo se mueve para mantener la cabeza fuera del agua. El tiempo de natación se registra cuando la rata activamente se desplaza en el cilindro y agita las patas para elevarse. Por último, el tiempo de escalada se corresponde con aquel que pasa intentando salir del cilindro, intentando fijarse en las paredes de este para subir al borde. El comportamiento de tipo depresivo se relaciona de forma directa con un incremento del tiempo de inmovilidad. 2.2. Prueba de campo abierto Este procedimiento permite evaluar la actividad locomotora, la exploración y la posible ansiedad del animal al encontrarse en un espacio abierto desconocido y sin posibilidad de refugiarse [140]. Materiales y Métodos 101 Se hizo uso de una caja de 90x90x40 cm totalmente opaca, y en cuyo centro se colocó a la rata a estudiar. En su fondo no se dispuso serrín. Se la dejó durante 5 min en ella, tiempo suficiente para explorar la caja y desplazarse por ella. Todas estas sesiones de 5 min fueron grabadas en vídeo, puesto que no era necesario un proceso previo de habituación. La luz roja se mantuvo en todo momento. Entre animales se limpió la caja con etanol al 25% y se dejó evaporar para evitar posibles interferencias olfatorias. Para el análisis del comportamiento, se empleó el programa ANY-Maze (Stoelting, EEUU), donde previamente se definió las dos partes delimitadas indicando una zona externa y otra interna. De esta forma, se testó el número de veces y el tiempo que pasó cada animal en la zona externa y el número de veces y el tiempo que lo hizo en la zona interna. 2.3. Splash test Este método consigue evaluar los comportamientos y actitudes relacionados con la anhedonia y, por tanto, con un fenotipo de tipo depresivo. Se trata de una adaptación del propuesto por Kalueff [141]. Su objetivo fundamental consiste en detectar los episodios de acicalamiento o higiene ejecutados por las ratas tras ser pulverizadas en el lomo con una solución de sacarosa al 10% (esta sacarosa debe estar disuelta en agua no destilada). El raciocinio tras este procedimiento se sustenta en la continua limpieza que se autoimponen las ratas en condiciones normales, cuando están sanas. Así, una rata que presenta fenómenos de anhedonia no ve la necesidad de acicalarse tras recibir la solución, ni se ve estimulada por el hecho de que un compuesto dulce, que de forma normal sí que las tentaría, esté esparcido por su lomo. Por ello, esta prueba mide el acicalamiento y la apetencia [142]. A nivel procedimental, se pulverizó a la rata delicadamente con la solución previamente mencionada y fue colocada en el interior de una caja cerrada. A partir de ese momento, se contabilizaron 5 min, que fueron grabados en vídeo. Para el análisis, se tuvo en cuenta el tiempo de acicalado, el tiempo que tardaron en empezar a hacerlo (conocido como el tiempo de latencia) y el número de veces que se limpiaron. Una menor cantidad de veces de limpieza/higiene además de una prolongación en el comienzo de la misma son indicativos de un comportamiento característico de anhedonia. Materiales y Métodos 102 2.4. Prueba de laberinto en cruz elevado Mediante este ensayo es posible analizar el comportamiento de tipo ansioso, gracias a la disposición del propio laberinto a la altura de un metro desde suelo [140]. Se trata de una cruz con dos brazos opuestos con paredes altas y opacas y otros dos brazos sin ninguna de ellas. En los brazos abiertos se dispone únicamente una barrera de 2 cm para evitar la caída de los animales. El objetivo principal de esta prueba se fundamenta en contabilizar el número de entradas y de visitas a los brazos abiertos (sin paredes) y a los cerrados, además del tiempo que pasan en cada uno de ellos. Se define entrada cuando solamente introducen las dos patas delanteras, y no continúan desplazándose al interior del brazo. Por su parte, una visita se registra cuando efectivamente el animal coloca su cuerpo en su totalidad en cualquiera de los brazos. De esta forma, se colocó al animal bajo estudio, de forma individual, en el centro de la cruz y se le dejó explorar libremente durante 5 min. Entre animales, los brazos y paredes fueron limpiados con etanol al 25%. Todas las sesiones fueron grabadas. A la hora de analizar los vídeos se tuvo en cuenta los parámetros recién mencionados. Cuanto mayor tiempo pasaran las ratas en alguno de los brazos cerrados, o registraran más entradas en estos que en los abiertos, se considera mayor el grado de comportamiento ansioso presente en el animal. Esto es debido a que buscan estar más protegidos en el interior de los brazos y evitan exponerse a campo abierto donde puedan caerse o estar simplemente más expuestos. Por tanto, se contabilizaron los parámetros tiempo en brazos abiertos y cerrados, y el número de entradas y visitas en brazos abiertos y cerrados. Materiales y Métodos 103 3. Recogida y procesamiento de muestras La recogida de muestras se llevó a cabo de forma organizada y secuencial, repartiendo homogéneamente los grupos experimentales para que las variaciones derivadas del ciclo circadiano fuesen de la menor índole posible. La toma de muestras se realizó de dos formas diferentes: • Dosis letal de pentobarbital sódico (320mg/kg) (Vetoquinol®, España), inyectado ip. No se continuaron con los procedimientos hasta que la respuesta ante la estimulación de patas y cola fuese inexistente. Este método se empleó para los estudios en los modelos doble hit, así como en las fracciones citosólicas y extractos nucleares del modelo CMS. • Dislocación cervical. Este método dificulta la posterior extracción de sangre por punción cardiaca, pero evita posibles interacciones en las cuantificaciones moleculares. Por ello, se aplicó en los estudios de citometría de flujo y en el Figura 26. Resumen gráfico de las principales pruebas comportamentales realizadas. En la primera fila a la izquierda, se muestra la prueba de natación forzada, donde se testa la capacidad de los animales para nadar cuando se disponen en el interior de un cilindro lleno de agua; a la derecha, una representación del Splash test, con el que se pulveriza una solución rica en sacarosa sobre el lomo de las ratas, y se evalúa posteriormente su tendencia a acicalarse. En la segunda fila, de izquierda a derecha, se muestra la caja opaca donde se realiza el estudio del campo abierto, en el que se coloca a la rata en el centro y se deja que explore y se desplace por ella; por último, el laberinto en cruz elevado, visto desde arriba, y donde se coloca al animal en el centro de la cruz, en la que dos brazos opuestos presentan paredes altas y opacas y otros están abiertos. Materiales y Métodos 104 modelo CMS cuando las muestras se usasen para la purificación de mitocondrias y lisosomas. A partir de cualquiera de los dos casos, y tras haber contrastado de manera rigurosa la ausencia de respuesta ante la estimulación física, se procedió a la apertura de la cavidad torácica para la obtención de los tejidos. En primer lugar, se realizó la extracción de sangre por punción cardiaca usando jeringuillas de 5 ml estériles y cargadas con 0.6 ml de EDTA (10% p/v, 1 volumen de EDTA por cada 9 volúmenes de sangre). Este anticoagulante ayudó al mantenimiento de la muestra y a su procesamiento posterior. Para la obtención del plasma, las muestras de sangre extraídas se centrifugaron a 1500 rpm durante 15 min a temperatura ambiente. Se tomó el sobrenadante resultante (plasma) y se almacenó a -80ºC hasta su análisis futuro. En segundo lugar, se llevó a cabo la extracción de tejido nervioso. En función de la naturaleza de los experimentos organizados, se hizo frente a dos tipos de prácticas: • Tejido fresco: se corresponde con las muestras cuyas determinaciones debían de realizarse justo después de la toma de muestras por una cuestión de viabilidad celular, o aquellas que podrían congelarse sin manipulación para su cuantificación posterior. Para ello, el encéfalo se liberó y extrajo tras la exposición y apertura del cráneo. De él se organizaron en el momento las áreas a estudiar: la CF fue dividida en seis fragmentos de igual tamaño (tres por hemisferio) y el Hp en cuatro (dos por hemisferio). En función del destino final de cada parte, el tratamiento de las muestras fue diferente: Destino Solución de almacenado Western blot - RT-qPCR TRIzol® Extracción de mitocondrias PBS 1x + inhibidores de proteasas/fosfatasas Extracción de lisosomas PBS 1x + inhibidores de proteasas/fosfatasas Citometría de flujo DNEM/F-12 + antibióticos Kits ELISA - Las muestras dirigidas a RT-qPCR, ELISA y los Western blot que no requiriesen de extracción en fresco fueron directa e inmediatamente congeladas en hielo seco para ulteriormente ser almacenadas a -80ºC. Tabla 3. Métodos de conservación de las muestras cerebrales en función de su futuro procesado. Materiales y Métodos 105 • Tejido fijado: atañe a la manipulación in situ del tejido mediante fijación, lo que permite preservar en condiciones óptimas el ambiente molecular del tejido. Este procedimiento es esencial para los estudios de inmunofluorescencia en los que se examinan cortes enteros de tejido cerebral. Previo a la fijación del tejido, y mediante la apertura de la cavidad torácica se realizó la canulación del ventrículo izquierdo para permitir la perfusión de suero salino estéril (250 – 300ml) mediante un equipo de perfusión (Cole Parmer Masterflex L/S, EEUU), que posibilitó la limpieza de los tejidos y la salida de sangre de ellos. Una vez completado, se ejecutó la fijación haciendo uso de paraformaldehído (PFA) al 4% (Sigma-Aldrich, 141451) diluido en tampón fosfato salino 0.2M a pH 7.4. Se empleó el mismo volumen de PFA que de salino estéril. Completada la perfusión, se extrajo cada cerebro y se introdujo en tubos con 30 ml de PFA al 4% para continuar con la posfijación durante toda la noche. Al día siguiente, el PFA fue sustituido por una solución de sacarosa al 30% (AppliChem, 141621), y se fue cambiando hasta que la densidad de cada cerebro superase a la de la propia solución. Posteriormente, se hicieron cortes regulares de 30 μm en cada cerebro de forma coronal empleando un microtomo (Leica SM 2000R, Figura 27. Principales técnicas y tipos de estudios realizados sobre el tejido cerebral en fresco. Materiales y Métodos 106 Alemania). Estas secciones fueron almacenadas en una solución crioprotectora (elaborada a partir de glicerol y etilenglicol) a -40ºC. El procesamiento de las muestras también se fundamentó en el tipo de técnica molecular que fuese a completarse luego: 3.1. Extractos citosólicos y nucleares Tratamiento de la muestra que permite la obtención de dos fracciones ricas en contenido citosólico y nuclear respectivamente. Se trata de un protocolo frecuentemente empleado [139, 143] y que se lleva a cabo a una temperatura controlada de 4ºC. Resulta de gran utilidad para el estudio de expresión proteica según la localización subcelular de las proteínas, gracias a la poca o nula contaminación de citosol en los extractos nucleares y viceversa. Los trozos de CF e Hp fueron homogenizados en 600 y 400 μl, respectivamente, de una solución tampón compuesta de 10 mM de HEPES (pH 7.9), 1mM de EDTA, 1mM de EGTA, 10mM de KCl, 1mm de DDT, 5 mM de NaF, 1mM de NaVO4, 10 mM de Na2MoO4, 0.5 M de sacarosa, 0.1 mg/ml de aprotinina y 1 mg/ml de leupeptina y complementado con un cóctel inhibidor de proteasas y fosfatasas (cOmplete y PhosSTOP, Roche, 4693159001 y 4906837001 respectivamente). Para dicha homogenización, se empleó el TissueLyser (Qiagen, Netherlands) con 50 oscilaciones/s. Tras 15 min de incubación en hielo, se añadió Nonidet P-40® (Sigma-Aldrich, 74385) hasta alcanzar una concentración en cada muestra del 0.5%. Los tubos fueron entonces agitados vigorosamente con vórtex durante 15 s en dos tandas, a lo que siguió otra incubación en hielo de 5 min y tras ella, una centrifugación a 3000 rpm durante otros 5 min. El sobrenadante de esta centrifugación fue tomado como la fracción citosólica. Para la fracción nuclear, se añadió al pellet anterior 100 μl del mismo buffer ya mencionado complementado con glicerol al 20% (AppliChem, A2926) y KCl a una concentración final de 0.4 M. Se agitó de nuevo vigorosamente durante 45 min a 4ºC. Posteriormente, se centrifugaron las muestras a 13000 rpm durante 15 min y el sobrenadante resultante se tomó como la fracción nuclear. Ambas fracciones, la citosólica y la nuclear, fueron congeladas a -80ºC para su almacenamiento a largo plazo. Materiales y Métodos 107 3.2. Homogeneizado total Procesamiento de la muestra que permite estudiar su contenido con independencia de compartimentos subcelulares. La homogeneización se llevó a cabo con PBS 1x suplementado con el cóctel de inhibidor de proteasas y fosfatasas mencionado previamente, con unos volúmenes de 600 μl para la CF y de 400 μl para el Hp. Después de homogeneizar la muestra con el TissueLyser o con el sonicador (en este caso, con una amplitud del 30% y dos tandas de 15 s) (Sonifier® S450D, Branson, EEUU), se centrifugó a 12000 rpm durante 10 min a 4ºC. El sobrenadante correspondiente fue transferido y considerado como el homogenizado total. Este tipo de procesamiento se utilizó en estudios de kits ELISA (de sus siglas en ingés, Enzyme-linked immunoassay). 3.3. Extracción de ARN Purificación del contenido en ARN con el fin de realizar estudios genéticos posteriores a través de RT-qPCR. Para ello, bajo condiciones de esterilidad, el tejido es homogenizado con el TissueLyser embebido en TRIzol® (Invitrogen, 15596018), ya que fueron previamente congelados inmersos en este. Así, tras una breve centrifugación, se recogió el sobrenadante y se le añadió cloroformo (Sigma-Aldrich, 288306) en una relación de 200 μl para la CF y 133 μl para el Hp. Una vez agitados manualmente y con vórtex, y reposados en hielo durante unos 2-3 min, se centrifugaron las muestras a 12000 rpm durante 15 min a 4ºC. Finalizada esta, se forman dos fases: una acuosa (transparente) y otra rosa (orgánica), por lo que seleccionamos la acuosa que es donde se encuentra nuestra muestra de interés. Se volvieron a adicionar 200 μl de TRIzol® y 40 μl de cloroformo y tras agitar los tubos en vórtex, se repitió la centrifugación de 12000 rpm durante 15 min a 4ºC. Igualmente, se volvió a seleccionar la fase acuosa, a la que esta vez se le añadió isopropanol (Sigma-Aldrich, I9516) con un volumen de 500 μl para la CF y de 360 μl para el Hp. Las muestras se incubaron durante toda la noche a 4ºC. A la mañana siguiente, se realizó una nueva centrifugación a 12000 rpm durante 10 min a 4ºC, y tras aspirar el sobrenadante, se hicieron 3 lavados consecutivos con etanol al 80% (Sigma-Aldrich, 51976), junto con centrifugaciones intermedias de 3 min para fijar el pellet al fondo del tubo. Terminado el tercer lavado, se retiró el sobrenadante y se dejaron los tubos abiertos para que el pellet se secase. Cuando esto se consiguió, se incorporaron 50-60 μl de agua DEPC (Invitrogen, 46-2224) y, tras diluir bien con el vórtex, se congelaron las muestras a -80ºC hasta su próxima manipulación. Materiales y Métodos 108 3.4. Extracción de mitocondrias La extracción mitocondrial favoreció el análisis de proteínas relacionadas con la mitocondria mediante Western blot, ya que dio lugar a la concentración de este orgánulo en las muestras. Por tanto, esta extracción permitió realizar los estudios comparativos de presencia proteica entre el citosol, la mitocondria y el núcleo. Para obtenerlas, se empleó un kit comercial de aislamiento de mitocondrias (Sigma-Aldrich, MITOISO1) y que se manipuló en fresco tras la toma de muestras. Esto aseguró la extracción de mitocondrias viables y en condiciones favorables. En todo momento se siguieron las directrices indicadas por el fabricante, y tras conseguir los extractos mitocondriales, se llevó a cabo el ensayo de la JC-1 (detallado más adelante) y fueron almacenados a - 80ºC para su futura investigación. 3.5. Extracción de lisosomas Fomenta la purificación de gran variedad de lisosomas en cada muestra, con el fin de poder desarrollar estudios cinéticos, bioquímicos y de otro tipo en lisosomas vivos. Para ello, la extracción tiene también que realizarse en fresco, justo tras la recogida de muestras. En este caso, se utilizó el kit comercial de aislamiento de lisosomas (Sigma- Aldrich, LYSISO1) siguiendo paso a paso las indicaciones del fabricante. Gracias a este kit, se obtuvieron fracciones crudas lisosomales (CLF, Crude Lysosomal Fractions, de sus siglas en inglés) y fracciones lisosomales purificadas, enumeradas de la 1 a la 6 (Lyso1 – Lyso6) y con contenido creciente de lisosomas ligeros a lisosomas pesados. Esas fracciones purificadas se consiguieron gracias a un gradiente de densidad mediante una ultracentrifugación de 2 horas, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para alcanzar el umbral óptimo de concentración lisosomal, se hicieron agrupaciones de 6 animales por grupo. Por lo tanto, se obtuvieron cuatro agrupaciones o muestras finales, dos de CF provenientes de CT y CMS, y otros dos del Hp de los mismos grupos. Sobre estas muestras, se establecieron en fresco los niveles de la fosfatasa ácida y el ensayo Neutral Red en las distintas fracciones, y cuyos excedentes fueron almacenados a -80ºC para comparaciones venideras. 3.6. Técnicas bioquímicas En este apartado se detalla la metodología que se siguió para la obtención de los distintos resultados, una vez que las muestras fueron procesadas. Materiales y Métodos 109 3.6.1. Estudio de proteínas 3.6.1.1. Cuantificación proteica Para el estudio de la expresión proteica, es preciso analizar previamente el contenido proteico de cada muestra. Es una forma de conocer la eficacia del procesamiento anterior, además de permitir el empleo de muestras con concentración homogénea en los ensayos posteriores de Western blot. Con este fin, se utilizó el método Bradford [144] para la cuantificación de proteínas, un procedimiento comúnmente usado que se basa en el cambio de absorbancia del colorante azul de Coomassie® (Dye Reagent Concentrate, Bio-Rad, 5000006) en condiciones ácidas, de forma que cuando este se une a las proteínas adquiere un color azulado. Cuando no está unido a proteínas, tiene sin embargo un color rojizo. Esto ocurre porque el colorante, en presencia de ácido fosfórico, se adhiere a las proteínas y según la concentración de estas, tiñe la muestra en un rango desde marrón oscuro a azul intenso. Cuanto más azul sea el color final, mayor cantidad de proteínas presenta la muestra. Estos cambios son medidos a una absorbancia de 570-590 nm usando un lector de placas (Synergy 2, BioTek, Alemania). Para poder realizar el ensayo, es necesario comparar los datos de absorbancia de las muestras problema con una curva patrón de concentraciones conocidas de proteína. Concretamente, se empleó albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich, P0834) con concentraciones de 0 a 0.8 mg/ml. Las muestras problema deben de ser previamente diluidas antes de añadirles el colorante, de manera que las diluciones para la CF fueron de 1:60 y para el Hp de 1:40 o 1:50 en agua destilada. Finalmente, en una placa se mezclaron 10 μl de curva patrón o muestra problema y luego 200 μl del reactivo de Bradford, para leerse su absorbancia tras 5 min de incubación a temperatura ambiente. A esta determinación se sometieron los extractos citosólicos, nucleares, mitocondriales y lisosomales, además del homogenizado total. 3.6.1.2. Western blot (WB) Una vez medida la concentración proteica de cada muestra, se comparó con la curva patrón y se obtuvieron las diluciones necesarias para preparar diluciones a 1 μg/μl. Esta puesta a punto implicó la mezcla de las muestras con tampón de carga Laemmli® (Bio- Rad, 1610737) y β-mercaptoetanol (AppliChem, A4338) en una relación 20:1. Una vez listas las muestras, se sometieron a una temperatura de 90ºC durante 10 min para inducir la desnaturalización proteica. Materiales y Métodos 110 La técnica WB permite separar las proteínas en función de su peso molecular gracias a la electroforesis, para luego ser transferidas a una membrana que facilita su manipulación y su examinación. Así, se prepararon geles de SDS-poliacrilamida de un porcentaje variable (mayor concentración cuanto menor peso molecular) y 1.5 mm de grosor, en donde se cargaron 15 o 20 μg del preparado proteico según la proteína a estudiar. Cada gel poseía un pocillo con marcador de peso molecular (Bio-Rad, 1610393), para poder así discernir el peso de las muestras problema. La electroforesis se efectuó a 100 V hasta la migración completa de las proteínas en un equipo de Mini- Protean® Tetra Cell (Bio-Rad, España). Finalizada esta, se transfirió el contenido de los geles sobre membranas de nitrocelulosa de 0.2 μm (Bio-Rad, 1704159) y de PVDF para los blots de la proteína LC3 (Bio-Rad, 1704157) en una transferencia semi-seca con el Trans-Blot® Turbo Transfer System (Bio-Rad, España). Tras ella, las membranas fueron bloqueadas con TBS 1x suplementado con un 0.1% de Tween-20 (BioRad, 1706531) y un 5% de BSA (AppliChem, A6588) durante 1 h a temperatura ambiente. Seguidamente, las membranas fueron incubadas con diluciones de anticuerpos primarios de las proteínas de interés durante toda la noche en agitación y a 4ºC. A la mañana siguiente, se retiraron los anticuerpos primarios y, después de 3 lavados con TBS-Tween, se incubó con los anticuerpos secundarios (conjugados a HRP) correspondientes durante 1 h y 30 min a temperatura ambiente. Acabado este periodo, se volvieron a realizar 3 lavados con TBS-Tween y se revelaron las membranas por quimioluminiscencia con el kit Amersham ECL Prime® (Fisher Scientific, 12994780) empleando el equipo Odyssey® Fc System (Li-COR Biosciences, EEUU) o el ChemiDoc MP System (Bio-Rad, España). Las imágenes obtenidas fueron analizadas y cuantificadas por densitometría de las bandas con el programa ImageJ® (NIH, EEUU). Como control de carga en citosol y núcleo, y necesario para la normalización posterior, se empleó la beta-(β)-actina. En la Tabla 4 se resumen las especificaciones de cada anticuerpo primario, con sus condiciones y sus respectivos anticuerpos secundarios. Materiales y Métodos 111 Proteína (peso molecular) Extracto Acrilamida Ac primario (dilución) Ac secundario (dilución) p-MTOR (Ser2448) (289 kDa) Citosólico 10% CS 5536 (1:1000) Anti-Rabbit 1:2000 (CS, 7074) en TBS- Tween MTOR (289 kDa) Citosólico 10% CS, 2983 (1:1000) p-ULK1 (Ser757) (140 kDa) Citosólico 10% CS, 14202 (1:1000) ULK1 (140 kDa) Citosólico 10% CS, 8054 (1:1000) BECLIN1 (60 kDa) Citosólico 10% CS, 3495 (1:1000) p-SQSTM1 (Ser403) (62 kDa) Citosólico 10% CS, 39786 (1:1000) SQSTM1 (62 kDa) Citosólico 10% CS, 5114 (1:1000) ATG3 (40 kDa) Citosólico 10% CS, 3415 (1:1000) ATG5 (55 kDa) Citosólico 10% CS, 12994 (1:1000) ATG7 (78 kDa) Citosólico 10% CS, 8558 (1:1000) ATG12 (55 kDa) Citosólico 10% CS, 4180 (1:1000) ATG16L1 (66-68 kDa) Citosólico 10% CS, 8089 (1:1000) LC3I-II (14-16 kDa) Citosólico 14-16% CS, 12741 (1:1000) ANNEXIN V (37 kDa) Citosólico 10% CS, 8555 (1:1000) CYTOCHROME C (15 kDa) Citosólico, Mitocondrial 14-16% BDP, 556432 (1:1000) Anti-Mouse 1:2000 (sc-2005) BCL2 (26 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% ab196495 (1:1000) Anti-Rabbit 1:2000 BAX (23 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10-12% sc-7480 (1:1000) Anti-Mouse 1:2000 PROTEASOME 19S (56 kDa) Citosólico 10% ab3317 (1:1000) Anti-Rabbit 1:2000, 2% BSA PROTEASOME 20S α + β (23 kDa) Citosólico 10-12% ab22673 (1:750) p-p53 (Ser15) (53 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% CS, 9284 (1:1000) p53 (53 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% sc-126 (1:1000) Anti-Mouse 1:2000 BCL-XL (30 kDa) Citosólico 10% CS, 2764 (1:1000) Anti-Rabbit 1:2000 HRS (115 kDa) Citosólico 10% sc-271455 (1:1000) Anti-Mouse 1:2000 STAM2 (58 kDa) Citosólico 10% sc-365600 (1:1000) TSG101 (45 kDa) Citosólico 10% sc-7964 (1:1000) VPS28 (28 kDa) Citosólico 10% sc-166537 (1:1000) VPS37A (45 kDa) Citosólico 10% ab251760 (1:1000) Anti-Rabbit 1:2000 Materiales y Métodos 112 VPS25 (21 kDa) Citosólico 10-12% sc-271648 (1:1000) Anti-Mouse 1:2000 CHMP6 (23 kDa) Citosólico 10-12% sc-398963 (1:500), 2% BSA Anti-Mouse 1:2000, 2% BSA CHMP5 (32 kDa) Citosólico 10% sc-374338 (1:500), 2% BSA VPS4B (49 kDa) Citosólico 10% sc-377162 (1:1000) Anti-Mouse 1:2000 RAB5 (25 kDa) Citosólico 10-12% sc-46692 (1:1000) RAB7 (22 kDa) Citosólico 10-12% sc-376362 (1:1000) GALECTIN3 (GAL3) (31 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% sc-25279 (1:500), 2% BSA Anti-Mouse 1:2000, 2% BSA GALECTIN9 (GAL9) (40 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% ab69630 (1:1000) Anti-Rabbit 1:2000 LAMP1 (120 kDa) Lisosomal 10% ab25630 (1:750), 2% BSA Anti-Mouse 1:1000, 2% BSA LAMP2A (120 kDa) Lisosomal 10% In, 51-2200 (1:1000) Anti-Rabbit 1:2000 MANNOSE RECEPTOR (190 kDa) Lisosomal 10% ab64693 (1:750), 2% BSA Anti-Rabbit 1:2000, 2% BSA HSC70 (70 kDa) Lisosomal 10% sc-7298 (1:1000) Anti-Mouse 1:2000 HSP70 (70 kDa) Lisosomal 10% sc-32239 (1:1000) CATHEPSIN D (46 y 33 kDa) Lisosomal 10% sc-377124 (1:500), 2% BSA Anti-Mouse 1:1000, 2% BSA CATHEPSIN B (37 y 25 kDa) Lisosomal 10% sc-365558 (1:500), 2% BSA CYSTATIN C (15 kDa) Lisosomal 14-16% SA, ABC20 (1:750), 2% BSA Anti-Mouse 1:2000, 2% BSA PARKIN (55 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% ab77924 (1:1000) Anti-Mouse 1:2000 PINK1 (66 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% ab23707 (1:1000), 2% BSA Anti-Rabbit 1:2000, 2% BSA BNIP3 (22-28 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% CS, 3769 (1:1000) Anti-Rabbit 1:2000 NIX (38 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% CS, 12396 (1:1000) FUNDC1 (17 kDa) Citosólico, Mitocondrial 14-16% SA, ABC506 (1:1000) AMBRA1 (135 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% CS, 24907 (1:500), 2% BSA Anti-Rabbit 1:2000, 2% BSA UBIQUITIN (Ub) (todos) Homogeneizado total 10% CS, 3936 (1:1000) Anti-Rabbit 1:2000, 2% BSA NRF1 (30 kDa) Nuclear, Mitocondrial 10% sc-28379 (1:750), 2% BSA Anti-Mouse 1:2000, 2% BSA Materiales y Métodos 113 MTFA (25 kDa) Nuclear, Mitocondrial 10% sc-166965 (1:750), 2% BSA Anti-Mouse 1:2000, 2% BSA PGC1α (92-105 kDa) Citosólico, Nuclear, Mitocondrial 10% ab54481 (1:1000), 1% BSA Anti-Rabbit 1:2000, 2% BSA MITOFUSINA 1 (Mfn1) (84 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% ab126575 (1:750), 2% BSA Anti-Mouse 1:2000, 2% BSA MITOFUSINA 2 (Mfn2) (80 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% CS, 9482 (1:1000) Anti-Rabbit 1:2000 OPA1 (80-100 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% CS, 80471 (1:1000) p-DRP1 (78 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% CS, 6319 (1:750), 2% BSA Anti-Rabbit 1:2000, 2% BSA DRP1 (78 kDa) Citosólico, Mitocondrial 10% CS, 5391 (1:1000) Anti-Rabbit 1:2000 TOMM20 (16 kDa) Citosólico, Mitocondrial 14-16% CS, 42406 (1:1000) COX IV (17 kDa) Citosólico 14-16% CS, 4850 (1:1000) SDHA (70 kDa) Citosólico 10% sc-166909 (1:750) Anti-Mouse 1:2000, 2% BSA SOD1 (18 kDa) Citosólico 14-16% Sc-11407 (1:1000) Anti-Mouse 1:2000 XBP1 (32 kDa) Citosólico 10% ab198999 (1:500), 1% BSA Anti-Rabbit 1:2000, 2% BSA β-ACTIN (42 kDa) Citosólico, Nuclear, Mitocondrial 10-16% SA, A5441 (1:10000) Anti-Mouse 1:10000 Los resultados de WB (obtenidos en unidades arbitrarias) se expresan todos como porcentaje con referencia a sus respectivos grupos control. Para todos los anticuerpos, se hicieron 5 repeticiones para asegurar la reproducibilidad de los resultados obtenidos. 3.6.1.3. Inmunofluorescencia (IF) La IF permite complementar los datos obtenidos por WB, ya que aporta información como la localización proteica o el tipo celular específico que expresa mayoritariamente una proteína. Esto nos ayuda a perfilar el papel que juega y la función que ejerce el tipo celular que la expresa. Partiendo de las secciones corticales de 30 μm almacenadas (Bregma +3.7 mm para la CF y -3.80 mm para el Hp, aproximadamente), se hicieron 3 lavados con KPBS (buffer Tabla 4. Relación de anticuerpos y sus condiciones para WB. La adición de la letra «p» delante del nombre de algunos anticuerpos indica su versión fosforilada («phospho»), en cuyo caso se especifica posteriormente entre paréntesis qué tipo de fosforilación fue la estudiada. Las siglas de cada casa comercial son las siguientes: CS: Cell Signaling Technology; BDP: BD Pharmingen; SC: Santa Cruz Biotechnology; Ab: Abcam; In: Invitrogen y SA: Sigma-Aldrich. El código de colores establecido hace referencia al tipo de extracto usado para evaluar las dianas de cada anticuerpo. Materiales y Métodos 114 fosfato potasio) para eliminar el exceso de anticongelante, para luego ser incubadas durante 30 min en glicina 100 mM (AppliChem, A1067) y reducir así la autofluorescencia a temperatura ambiente. Todos los protocolos de IF se realizaron en placas de 24 pocillos. Tras la glicina, se repitió el ciclo de lavados con KPBS y se bloqueó con BSA al 10% suplementado con un 0.3% de Tritón X-100 (Sigma-Aldrich, T8787) en KPBS durante 1 h a temperatura ambiente. Pasado el bloqueo, se prepararon las diluciones simples, dobles o triples para las inmunotinciones con los correspondientes anticuerpos primarios, y se los dejó incubado durante 48-72 h en agitación a 4ºC. Una vez finalizada la incubación con los anticuerpos primarios, los cortes se volvieron a lavar con KPBS en 3 ocasiones. Seguidamente, estos fueron incubados con los anticuerpos secundarios, esta vez conjugados a fluoróforos de distinta longitud de onda. De forma general, se han empleado fluoróforos que se excitaban a 488, 555 y 647 nm, además del DAPI (que se excita y emite en el rango de luz ultravioleta). La incubación con los anticuerpos secundarios fue de 1h y 30 min a temperatura ambiente. Completada esta, de nuevo se lavó 3 veces con KPBS y se incubaron todas las secciones con DAPI (Sigma-Aldrich, MBD0015) durante 4 min a temperatura ambiente. Fue entonces cuando se dio la última serie de 3 lavados con KPBS y se pudieron montar los cortes en portaobjetos SuperFrost® Ultra Plus (ThermoFisher 11976299), para ser posteriormente embebidos por la solución de montaje Fluoroshield® (Sigma-Aldrich, F6182) y cubiertos una vez secos. Todas las tinciones se conservaron a 4ºC protegidas de la luz hasta su visualización. Para ello, se hizo uso del microscopio Confocal Leica SP8 Microscope (Leica, Alemania), localizado en el Centro de Citometría y Microscopía de Fluorescencia (CAI- UCM). Para las distintas adquisiciones, siempre se establecieron las condiciones control previas y las preparaciones con las diferentes capas de forma independiente, antes de pasar a las muestras con tinción doble o triple. En todo momento, primero se fijaron las condiciones a 10 X y 20 X de intensidad del láser, ganancia, offset y demás parámetros, para luego pasar a las muestras problema. Para la cuantificación, se empleó nuevamente el programa ImageJ®, donde se midió la media de intensidad de fluorescencia, número de píxeles y número de células (este último con el plugin Cell Counter). Estos análisis se ejecutaron de forma paralela en los 3 canales normalmente usados: el azul (DAPI, que sirve para teñir los núcleos celulares), el verde (Alexa Fluor 488 o FITC) y el rojo (Alexa Fluor 555), en las imágenes adquiridas a 20 X de magnificación. De forma rutinaria, primero se trazó el mapa a 10 X del corte completo (ya fuese CF o Hp) y luego, con el objetivo de 20 X, se escogieron Materiales y Métodos 115 localizaciones concretas para fotografiar en mayor detalle. Estas localizaciones se eligieron por igual en grupos CT y CMS. Para los análisis de colocalización específica de las proteínas p-SQSTM1 y GFAP, se utilizó el plugin JACoP [145] para conseguir los coeficientes de Pearson, Manders y de Solapamiento, también a partir de las imágenes a 20 X. El mismo protocolo de inmunotinción empleado para p-SQSTM1 y GFAP fue aplicado para p-SQSTM1 y NeuN (marcaje con neuronas) y p-SQSTM1 e Iba1 (marcaje con microglía), haciendo uso de estos marcadores celulares en las mismas concentraciones y condiciones detalladas en la Tabla 5. Dada la ausencia de eventos de colocalización con estos dos últimos tipos celulares, se optó por focalizar el estudio íntegro al par p-SQSTM1 y GFAP, por lo que solo se hará mención de este en la próxima sección de Resultados. Para mejorar la visualización y mejor observación de los detalles, se potenció de forma proporcional el contraste de las imágenes en las figuras que muestran el estudio de p-SQSTM1 y GFAP. En cuanto a la inmunotinción triple de LAMP2A, MAP2 e IBA1, su análisis específico se realizó en dos tandas individuales mediante las doble inmunotinciones de LAMP2A y MAP2 por un lado, y LAMP2A e IBA1 por otro. Esto fue debido a que, de esta forma, la fluorescencia se vería menos comprometida ante la presencia de artefactos, mejorando la calidad del análisis. Únicamente un set de muestras fue analizado a 63X: el doble marcaje de LAMP2A e IBA1, donde se midieron la intensidad media, el número de células y el porcentaje de área ocupada. Las imágenes a 20 X de magnificación se exhiben con barras de escala a 100 μm, mientras que las de 63 X se presentan con escalas de 10 μm. También se muestran algunos detalles en zoom sobre las imágenes de 20 X, cuyas escalas son de 80 μm. Las gráficas resultantes de los análisis cuantitativos se corresponden con las medias de la intensidad y se expresan como unidades arbitrarias (Arbitrary Units, por sus siglas en inglés, A.U.). En la Tabla 5 se recogen todas las especificaciones de anticuerpos, diluciones y grupos explorados, además de la cantidad de imágenes analizadas para aquellas a las que se las sometió a un análisis cuantitativo. Materiales y Métodos 116 Proteína Ac primario (dilución) Ac secundario (dilución) N.º de animales* N.º de imágenes* ANNEXIN V CS, 8555 (1:100) Anti-Rabbit AF488, A21206 (1:800) CT (n = 6) y CMS (n = 6) 4-5 imágenes por animal (CF) y 4-5 (Hp) NeuN ab104224 (1:800) Anti-Mouse AF555, A31570 (1:850) - - p- SQSTM1 CS, 39786 (1:100) Anti-Rabbit AF488, A21206 (1:850) CT (n = 6-8) y CMS (n = 6-8) 9 imágenes por animal (CF) y 15 (Hp) GFAP ab4674 (1:850) Anti-Chk AF555, ab150170 (1:850) - - LAMP2A (doble IF) In, 51-2200 (1:50) Anti-Rabbit AF488, A21206 (1:850) CT (n = 6-8) y CMS (n = 6-8) 4-5 imágenes/animal (CF) y 9 (Hp) MAP2 ab5392 (1:1000) Anti-Chk AF555, ab150170 (1:850) - - IBA1 ab5076 (1:850) Anti-Mouse AF555, A31570 (1:850) LAMP2A (triple IF) In, 51-2200 (1:50) Anti-Rabbit AF647, ab150075 (1:800) PARKIN ab77924 (1:100) Anti-Mouse AF555, A31570 (1:850) CT (n = 6) y CMS (n = 6) 9 imágenes por animal (CF) y 15 (Hp) PGC1α ab54481 (1:125) Anti-Rabbit AF488, A21206 (1:850) 4-5 imágenes por animal (CF) y 4-5 (Hp) Mfn2 CS, 9482 (1:70) Anti-Rabbit AF488, A21206 (1:850) TOMM20 ab186735 (1:100) Conjugado AF555 GAL9 ab69630 (1:125) Anti-Rabbit AF488, A21206 (1:850) 3.6.1.4. Inmunoprecipitación (IP) La IP es un recurso muy útil para estudios de interacción proteica. Gracias a esta, es posible intensificar la concentración de una proteína particular mediante su unión a un anticuerpo específico, y con un sistema de columnas de afinidad, extraer el enriquecido proteico como un eludido de dichas columnas. Finalmente, este eludido se carga en un WB, donde puede evaluarse y cuantificarse la formación o presencia de complejos con otras proteínas de interés. Con el objetivo de maximizar el umbral de proteína purificada, se empleó el kit comercial Pierce® Co-Immunoprecipitation kit (ThermoFisher, 26149) siguiendo las instrucciones del fabricante. Beclin1 y Parkin fueron incubadas en columnas con la resina encargada de unirse a estos anticuerpos, en agitación durante 2 h y a 4ºC. Tras esto, se realizaron Tabla 5. Resumen de anticuerpos, diluciones, número de animales por grupo y de imágenes por corte realizados por IF. Entre las abreviaturas destacan: CS: Cell Signaling Technology; Ab: Abcam; In: Invitrogen, AF: Alexa Fluor y Chk: chicken. *El número de animales y sus imágenes respectivas se detallan solamente en la proteína de interés, no en los tipos celulares con las que se marcaron en las inmunotinciones dobles. PARKIN, PGC1α, Mfn2, TOMM20 y Gal9 se marcaron juntamente con NeuN, cuyos detalles se muestran en la segunda fila. PARKIN fue también examinada con IBA1, cuyas especificaciones se muestran en la mita de la tabla. Materiales y Métodos 117 lavados para eliminar el excedente de cada anticuerpo en todas las columnas (se empleó una columna por animal considerado) y se añadió el homogenizado total de cada animal a cada columna, dejándolas incubar durante toda la noche a 4ºC y en agitación. A la mañana siguiente, con lavados mediante diferentes tampones, se consiguió el eluyente final purificado de cada columna. Este eluyente fue posteriormente mezclado con Laemli y β-mercaptoetanol para ser evaluado por WB. Exclusivamente en el caso de los ensayos de IP la concentración final del preparado de muestras fue de 4 μg/μl. Con ello se pretendía la mayor eficacia posible en el revelado de otras proteínas. En lo referente a los WB realizados tras el protocolo de IP, se prepararon geles de acrilamida a los que se les cargó 20 μl por muestra, fijando la electroforesis a 90 V. El resto de los pasos se efectuaron como está detallado en apartados anteriores. Se cargaron todos los controles necesarios, muestras obtenidas tras los diferentes lavados y la comparativa entre el homogenizado total original, el lisado resultante de la interacción con la columna y el eluyente final. El control de carga utilizado fue también la β-actina. Cada experimento de IP fue repetido tres veces independientes, trabajando en cada ronda con CT (n = 3) y CMS (n = 3). 3.6.2. Estudios de ARN/ADN 3.6.2.1. Cuantificación de ARN En condiciones de máxima esterilidad, se procedió a la medición de la concentración de ARN extraído durante el procesamiento de las muestras, así como de su pureza mediante el ratio 260/280 nm. La cuantificación se realizó haciendo uso de una placa Take-3 de 8 pocillos perteneciente al lector de placas Synergy 2 (BioTek, Alemania). Se consideró aceptable un rango de pureza variable entre 1.8 y 2.2. 3.6.2.2. Transcripción inversa (RT) Una vez calculada la presencia de ARN en las muestras, se prepararon diluciones de cada una de ellas para que la concentración final en cada tubo fuese de 1 μg de ARN por 10 μl de volumen final. Esta dilución se hizo en agua DEPC en ambiente estéril. A esta dilución se le adicionó una mezcla de 5X RT Buffer (comercializado junto con la transcriptasa), 25 mM de deoxinucleótidos trifosfatos (dNTP) (Fisher Scientific, Materiales y Métodos 118 10297018), Random Primers (Fisher Scientific, 10646313), la transcriptasa inversa (Fisher Scientific, 10420100), inhibidor de RNAsas (Fisher Scientific, 10154652) y agua DEPC. Tras mezclar bien el contenido en cada tubo, estos se introdujeron en el termociclador My Cycler® (Bio-Rad, España) con un protocolo de 10 min a 25ºC, 30 min a 50ºC y otros 5 min más a 85ºC. Con este calentamiento secuencial se consigue la síntesis de ADN de copia (ADNc) a partir de moldes monocatenarios de ARN. Finalmente, se añadió a cada muestra 80 μl de agua DEPC y se almacenaron a -40ºC hasta su estudio posterior. 3.6.2.3. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) permite amplificar y cuantificar de forma relativa y en el momento el gen que está siendo replicado. Por tanto, es posible determinar el producto de la amplificación en cada ciclo. Esto es ejecutable gracias al uso de un fluoróforo que se intercala de forma inespecífica entre el ADNc, de manera que el propio equipo es capaz de detectar el aumento progresivo de emisión de este fluoróforo y lo cuantifica tras cada ciclo de amplificación. El fluoróforo empleado en todos los casos fue el SYBR Green®, con una longitud de onda de excitación de 488 nm y de emisión de 522 nm. Esa frecuencia de emisión es la que recoge el equipo Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science, Alemania). Para llevar a cabo este protocolo, se dispusieron 2 μl de cada muestra de la retrotranscripción, en el que se obtuvo el ADNc, con 18 μl de una mezcla compuesta por los cebadores específicos del gen a caracterizar (resumidos en la Tabla 6), la sonda SYBR Green® (Biotools, 10606-4153) y agua DEPC. Todos los tubos resultantes, junto con los correspondientes controles internos de carga y controles negativos, se expusieron a la PCR con un número de ciclos establecido para cada gen (entre 28 y 42 ciclos normalmente). La secuencia seguida por el equipo de PCR fue la siguiente: 3 min a 95ºC que permiten la desnaturalización de las hebras de ADNc y, por tanto, la separación de las cadenas bicatenarias; 10 s a 95ºC continuado con 15 s a 60ºC (que posibilitan el anillamiento de los cebadores específicos) y seguidos de 20 s a 72ºC (que consiguen la elongación de las nuevas cadenas bicatenarias). Este último paso, con la sucesión de tres temperaturas distintas, se repite tantas veces (ciclos) como sea necesario para amplificar suficientemente el gen (es dependiente de la expresión concreta de cada uno). Como ya se indicó, esto varió desde 28 ciclos (como es el caso de los genes de Materiales y Métodos 119 carga) hasta 42 ciclos. Normalmente, aquellos genes que precisan de más ciclos son aquellos que se encuentran en menor concentración y, por tanto, requieren de un mayor número de amplificaciones para que el programa detecte los productos. Por último, el equipo fija durante 20 s una temperatura de 72ºC para fusionar las cadenas creadas. Las concentraciones relativas de cada gen se extrajeron gracias al programa incorporado con el equipo de PCR. Todos los productos obtenidos fueron relativizados a los niveles de ARNm de la Tubulina-α y Gapdh, que actuaron como genes de carga para los procedimientos posteriores de normalización. Gen (Localización) Cebador directo (5’-3’) Cebador inverso (3’-5’) Atg3 (NM_134394) AAGTACTACCAGACGCCACG TAAGAGGTGGTGGGAGGTGA Atg5 (NM_001014250) AAGGCGGCAGAAGATTCCAT TTCCCGAGAAGAGAGGCTGC Atg7 (NM_001012097) GAACCCTGCACAACACCAAC AGGAGCATGGGGTTTTCGAG Atg12 (NM_001038495) CGAAGAAATGGGCTGTGGA GGAAGGGGCAAAGGACTGAT Mtor (NM_019906.2) CTGCACTTGTTGTTGCCTCC TGGTCTAGCGTGCGAACAAT Ulk1 (NM_001108341) GGATCCATGGTGTCACTGCA AGGTACACAGCTCTCTCGGT Sqstm1 (NM_175843) CCCATCCACAGGTGAACTCC GCCTTCATCCGAGAAACCCA Beclin1 (NM_053739) AACTCTGGAGGTCTCGCTCT TCGTGTCCAGTTTCAGAGGC Atg16l1 (NM_001108809) CACATCTTTACCCAGCATCAC CAGGACAGAGGGTGCTTTC Lc3α (NM_199500) CTGTAAGGAGGTGCAGCAGA TTATCCAGGACAGGCAGCTG Lc3β (NM_022867) TAGCAGAGGTCTCCAGAGGG AGGTGAAATGGCTGGGGTTC Parkin (NM_020093) CTGGCAGTCATTCTGGACAC CTCTCCACTCATCCGGTTTG Pink1 (NM_001106694) CATGGCTTTGGATGGAGAGT TGGGAGTTTGCTCTTCAAGG Bnip3 (NM_053420) GATTGGATATGGGATTGG CAGATGAGACAGTAACAG Nix (NM_080888) TGGAGCCATGAAGAAAGGGG CAGAAGGTGTGCTCAGTCGT Fundc1 (NM_001025027) TATTTGGCCACAGTTCCGGA AGAAAACCACCACCTACTGCA Nrf1 (NM_001100708) TGCTTCAGAACTGCCAACCA GGTCATTTCACCGCCCTGTA Mtfa (NM_031326) ACACCCAGATGCAAAAGTTTCA TGTACACCTTCCACTCAGCT Pgc1α (NM_031347.1) CAGTCCTTCCTCCATGCCTG CTGTGGGTGTGGTTTGCATG Mfn2 (NM_130894.4) TGCCTGGATGCTGATGTGTT TCCATGTACTCAGGCTCCGA Mfn1 (NM_138976.1) TGGCATCCCTCACGTCTAGA GCTCTCTCTTTCGCACGAGT Opa1 (NM_133585.3) AAGGAGGCTGTGAAGGAGGA TGCGTCCCACTGTTGCTTAT Drp1 (NM_053655.3) TCTCAAGGTTTTCTCGCCCA GTGCCTCTGACGTTGCCATA Ambra1(NM_001134341.3) GAGCAGGATCCAGAGAGCAC TCTGTTGGTAGCGCATGGAG Rnr1 (mt) TGAAGCGGAAAGAAATGGGC AATTTGAGGAGGGTGACGGG Nd1 (mt) GCAGGACCATTCGCCCTATT GGGGTAGGATGCTCGGATTC Nd5 (mt) ATTCCGCAGTCTGGGTTAGC TGGAGAGAGGAGGAAAGGGG Tubulina-α (NM_022298) CCCTCGCCATGGTAAATACAT ACTGGATGGTACGCTTGGTCT Gapdh (NM_017008.4) ATGGTGAAGGTCGGTGTGAA TGACTGTGCCGTTGAACTTG Tabla 6. Secuencias específicas de los cebadores empleados para el estudio de la expresión génica de marcadores de autofagia y mitofagia. La secuencia de colores establece la división entre las dos vías entre sí, y los genes de carga. Materiales y Métodos 120 En lo relativo a los cebadores aplicados, su diseño se perfiló gracias a las bases de datos de nucleótidos disponibles del National Center for Biotechnology Information (NCBI), cuyos datos se usaron para pasarlos por la herramienta en línea Primer3 [146]. Su especificidad se testó posteriormente por medio de una PCR in silico ofrecida en USCS GenomeBrowser. Finalmente, se aseguró y confirmó la elección de cada par de cebadores mediante un BLAST entre el ADNc amplificado y el ADN genónico de las bases de datos, y asegurándose de que solo alineaban con las secuencias de interés. 3.6.3. Determinación de niveles plasmáticos de corticosterona Para la cuantificación de esta hormona del estrés en roedores, se usaron las muestras preparadas de plasma y se diluyeron en una relación 1:40 en agua destilada, tras fijar esta dilución con una prueba de diluciones previa. Los niveles plasmáticos de corticosterona fueron analizados mediante un kit comercial basado en la técnica ELISA (Enzo-LifeSciences, ADI-900-097) siguiendo las indicaciones del fabricante. Se midió la absorbancia a 405 nm nuevamente con el lector de placas Synergy 2. 3.6.4. Cuantificación de los valores de fosfatasa ácida y Neutral Red Para la medición de la calidad de la técnica de purificación de los lisosomas, así como para identificarlos de forma inequívoca, se llevó a cabo el análisis de los niveles de fosfatasa ácida en las fracciones crudas (CLF) y en las fracciones purificadas lisosomales, tanto en la CF como en el Hp. La fosfatasa ácida es un marcador de lisosomas, ya que es una enzima que se encuentra de manera específica incluida en ellos. Finalizado el proceso de extracción de lisosomas, y tras medir por el método Bradford la concentración lisosomal, se ajustaron los valores de todas las muestras y sobre ellas se empleó el kit comercial Acid Phosphatase Assay (Sigma-Aldrich, CS0740). Este kit detecta la presencia de fosfatasa ácida en cualquier tejido, donde el reactivo usado tiñe de un color amarillo intenso aquellas muestras cuyo contenido sea muy alto en esta enzima. Por último, se midió la absorbancia de la reacción colorimétrica a 405 nm con el lector de placas Synergy. Los estudios cinéticos de la actividad lisosomal permiten comprobar su viabilidad funcional y las posibles alteraciones causadas por un modelo experimental previo. El ensayo de Neutral Red (reactivos incluidos en el kit de aislamiento de lisosomas) analiza el patrón de incorporación de un colorante rojo de forma específica en el interior del Materiales y Métodos 121 lisosoma con respecto al tiempo, gracias a la afinidad del colorante por los ambientes ácidos. Además, supone una medida indirecta de la supervivencia lisosomal (su capacidad de seguir en funcionamiento tras la técnica de purificación). A este respecto, calculada la concentración de cada fracción lisosomal a emplear, se añadió el colorante y se dejó incubar durante unos minutos. Posteriormente, la placa fue leída durante 5 min, donde se completaron 5 lecturas (una por minuto) a longitudes de onda de 460 nm y 510 nm en el lector de placas Synergy. Esto fue posible gracias a los reactivos incluidos en el kit de aislamiento de lisosomas (descrito en páginas previas) y cuyos cálculos siguieron las directrices del fabricante. 3.6.5. Estudio de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial El tejido fue procesado en un homogeneizador manual de cristal embebido en el buffer A (compuesto de 320 mM de sacarosa, 1 mM de EDTA y 10 mM de Tris-HCl a pH 7.4). Las mitocondrias cerebrales fueron obtenidas por tandas de centrifugación, siguiendo un protocolo optimizado previamente descrito [147], con las que se consiguió eliminar la debris celular a través de centrifugaciones a 1000 xg durante 5 min a 4ºC. Finalmente, las mitocondrias se tomaron del sobrenadante tras una centrifugación a 11000 xg durante 15 min a 4ºC. Conseguido el aislamiento mitocondrial, las muestras se resuspendieron en un buffer de respiración (producido a partir de 225 mM de sacarosa, 5 mM de MgCl2, 10 mM de PBS, 1 mM de EGTA, 0.05% de BSA y 10 mM de Tris-HCl a un pH controlado de 7.4) para estudiar los complejos mitocondriales del I al V mediante espectrofotometría, siguiendo el protocolo descrito por [148]. El complejo I se midió a una absorbancia de 340 nm usando 250 μg de mitocondrias, por lo que fue necesario hacer inicialmente agrupaciones de todo el tejido, únicamente distinguiendo entre grupos CT y CMS. Las mitocondrias fueron entonces resuspendidas en 1 ml del buffer CI/CII (elaborado con 25 mM de K2HPO4, 5 mM de MgCl2, 3 mM de KCN y 2.5 mg/ml de BSA) al que se le añadió 0.1 mM de UQ1, 0.1 M de NADH y 1 mg/ml de antimicina A. La inhibición se consiguió gracias al uso de 1 μM de rotenona. La actividad del complejo II se midió a 600 nm con 25 μg de mitocondrias, que fueron inhibidas con 100 μM de malonato. Estas mitocondrias fueron resuspendidas en 1 ml del buffer CI/CII, esta vez suplementado con 30 μM de DCPIP, 1 μM de rotenona, 1 μM de antimicina A, 10 mM de succinato y 6 mM de metosulfato de fenazida. Materiales y Métodos 122 Las actividades de los complejos III y IV se midieron siguiendo la aparición y desaparición de la forma reducida del citocromo c a una absorbancia de 550 nm, empleando un kit comercial (Sigma-Aldrich, CYTOCOX1) y con 1 μM de antimicina A o cianida como inhibidores. La actividad hidrolítica del complejo V se midió siguiendo la metodología descrita [147], y se llevó a cabo su inhibición con la presencia de 5 μM de oligomicina. 3.6.6. Determinación de niveles de peroxidación lipídica (MDA) La peroxidación lipídica hace referencia a la oxidación exacerbada y perjudicial de los lípidos de membrana e intracelulares, y es comúnmente empleada como medida indirecta del daño que el estrés oxidativo ejerce sobre los tejidos. La prueba del ácido tiobarbitúrico (TBARS) [149] permite la detección de los niveles de malondialdehido (MDA), que es el compuesto resultante de la peroxidación de estos lípidos. Aplicando el mismo protocolo, el homogenizado total de las muestras de CF fue desproteinizado con ácido tricloroacético (TCA) y HCl, para ser posteriormente mezclado con un 2% de ácido tiobarbitúrico (TBA) en 0.5 N de NaOH. Las muestras fueron entonces incubadas en un baño de agua a una temperatura de 90ºC durante 15min. Con ello se pretendía la formación del complejo cuantificable MDA-TBA. Seguidamente, se centrifugó a 12000 xg durante 15 min a 4ºC, cuyo sobrenadante fue medido a 532 nm en el lector de placas Synergy. Para el cálculo final de los valores de MDA, se normalizaron los datos obtenidos tras la lectura con la concentración total de proteína en cada muestra, previamente conseguida mediante el método de Bradford. 3.6.7. Cuantificación de los niveles de 8-OHdG y catalasa Entre otras de las muchas determinaciones que miden daño por estrés oxidativo, los niveles de 8-hidroxi-2’-deoxiguanosina (8-OHdG) y la función antioxidante de la enzima catalasa ofrecen una buena visión del estado de daño celular en los tejidos. Al igual que la prueba TBARS desvela el daño acontecido sobre los lípidos, los niveles de 8-OHdG hacen alusión al daño oxidativo presente en los nucleótidos. Este tipo de afectación tiene consecuencias extremas sobre las funciones celulares, ya que repercute directamente en el ADN genómico. Así, la formación de 8-OHdG es un Materiales y Métodos 123 marcador no específico de daño en el ADN. Para establecer sus valores periféricos, se emplearon las muestras de plasma (en dilución 1:8) y se examinaron mediante el kit comercial DNA Damage (Arbor Assays, K059-H1) siguiendo las indicaciones del fabricante. El resultado del ensayo fue medido a 450 nm con el lector de placas Synergy. La catalasa es una enzima antioxidante esencial en la respuesta celular al incremento de ROS y RNS. Se encarga de romper el peróxido de hidrógeno (altamente prooxidante) en oxígeno y agua. Con el objetivo de averiguar si la funcionalidad de la catalasa se veía alterada por el estrés, se utilizó el kit comercial Catalase Colorimetric Activity kit (Arbor Assays, K033-H1) en muestras de la CF y el Hp, para ser luego leídas a 560 nm por el equipo Synergy. 3.6.8. Citometría de flujo La citometría de flujo es una técnica que permite analizar célula a célula las características fenotípicas de gran cantidad de poblaciones celulares. A través de la estimación de su tamaño y complejidad, el citómetro es capaz de discernir entre diferentes tipos celulares en función de las sondas usadas para marcarlos. En el caso de esta Tesis Doctoral, fue la población de microglías el principal objeto de interés, por lo que se usaron los anticuerpos específicos para poder aislarlas. Dado que la citometría de flujo es una técnica de célula viva, las muestras fueron recogidas y procesadas en fresco. Se llevó a cabo la perfusión de los animales con suero salino estéril de la misma forma en la que se describió para la fijación de tejidos, pero en este caso particular, justo tras eliminar los restos de sangre del organismo, se extrajeron los cerebros y se dividieron por localización. Así, la CF y el Hp de los dos hemisferios fueron escogidos y colocados en tubos con 3 ml de medio de cultivo DMEM/F-12 GlutaMAX (Fisher Scientific, 31331028) suplementado con los antibióticos penicilina y estreptomicina (Life Technologies, 15070063). Las secciones de la CF de cada hemisferio se introdujeron juntas en un mismo tubo, al igual que los dos Hp por animal también se colocaron en el mismo. Las restantes zonas de la corteza fueron igualmente divididas para fijar las condiciones control de las diferentes tinciones. Precisamente, se emplearon la corteza parietal y la occipital para esos fines. Considerando el pequeño volumen de la CF, y aún más el del Hp, para los experimentos de citometría en el modelo de CMS se hicieron agrupaciones de dos ratas por condición. Materiales y Métodos 124 Esto permitió alcanzar un número de células final más notorio sobre el que realizar los análisis. Esto mismo no pudo aplicarse al modelo Poly I:C + aislamiento, ya que no se dispuso de la cantidad suficiente de animales para duplicar las muestras. Esta es la razón por la que la citometría del modelo CMS se llevó a cabo con 300000 células de partida y el modelo doble hit con 70000. Habiendo recogido todas las muestras, el tejido se homogenizó con cuchillas esterilizadas y se transfirió a un tubo nuevo con medio de disociación. Este medio se elaboró con 1 mg/ml de papaína (Sigma-Aldrich, P4762), 10 mg/ml de dispasa II (Roche, 4942078001), 50 mM de HEPES con 150 mM de NaCl, y 10 U/ml de DNAsa I (ThermoFisher, 90083) en PBS 1x estéril suplementado con un 2% de suero fetal bovino (FBS) (Gibco, 10438026) y un 0.02% de glucosa (Sigma-Aldrich, G8644). A esta solución previa de PBS 1x con FBS y glucosa se la citará en adelante como FACS. Las muestras junto con el medio de disociación añadido fueron incubadas durante 30 min a 37ºC en el baño. Finalizada la incubación, se adicionó medio de neutralización (compuesto por el medio DMEM/F-12 con un 10% de FBS) para parar la reacción enzimática. Tras una centrifugación a 600 xg durante 5 min en frio para eliminar el medio de neutralización, se resuspendió el pellet de células con FACS y se continuó con un proceso de digestión mecánica usando puntas de pipeta de mayor a menor calibre. Seguidamente, las suspensiones celulares se pasaron por filtros de 40 μm. Este filtrado volvió a centrifugarse a 600 xg durante 6-10 min a 4ºC, de manera que al eliminar el sobrenadante se añadió una mezcla equitativa de Percoll® al 37 % (Cytiva, 17089101) y PBS 1x. Esto permitió la separación de la mielina, que normalmente entorpece la lectura del citómetro por su contenido graso. Dicha separación se consiguió mediante la formación de un gradiente, gracias a una centrifugación de 20 min a 350 xg a 4ºC. Eliminada la capa intermedia blanca claramente visible (la mielina), se añadieron 3 ml de FACS y se volvió a centrifugar para eliminar los posibles excedentes que no hubieran sido retirados en el paso previo. Posteriormente, a cada muestra se le agregó de nuevo el mismo volumen de FACS y se distribuyeron entre tubos aptos para la medida del citómetro, donde se realizaron las tinciones con los anticuerpos correspondientes. En primer lugar, se marcaron las mitocondrias con las sondas permeables MitoTracker® incubando durante 20 min a 37ºC en oscuridad. Pasado este tiempo y con un lavado de por medio, a cada tubo se le añadió un bloqueante uniones inespecíficas a receptores FcγII (BD Bioscience, 550270), que fue también incubado durante 10 min en hielo y oscuridad. Consecutivamente, y sin necesidad de más lavados, se fueron agregando Materiales y Métodos 125 los anticuerpos de superficie y se mantuvieron durante 10 – 15 min en hielo y oscuridad. Una vez pasado este tiempo, se lavaron los anticuerpo y se centrifugó a 300 xg durante 6 min a 4ºC. Fue en este momento en el que se añadió el marcador de supervivencia celular Hoechst (Invitrogen, H3569) en dilución 1:1000, justo antes de la lectura del citómetro. Todas las muestras fueron medidas con el citómetro BD FACSAria III® en el Centro de Microscopía y Citometría de Flujo del CAI-UCM. En la Tabla 7 se exhiben los detalles de los anticuerpos empelados. Proteína Anticuerpo (dilución) Fluoróforo Clon CD45 BDB, 559135 PE-Cy5 OX-1 CD11b BDB, 562102 APC WT.5 CD11b BDB, 562105 PE WT.5 MitoTracker® Green FM In, M4675 FITC - MitoTracker® Deep Red FM In, M46753 APC - Para llevar a cabo los análisis, se siguió una estrategia de gating que se mantuvo a lo largo de todos los experimentos y muestras. En primera instancia, se enfrentaron el eje Foward Scatter (volumen celular) y el eje Side Scatter (complejidad) para seleccionar las poblaciones de partida. Posteriormente, gracias a la comparación entre la altura y el área del Foward Scatter, se pudo seleccionar los singletes. Esto es muy importante, puesto que los dobletes son artefactos que nacen a partir de dos células, y todas las cuantificaciones deben realizarse a célula única. Habiendo seleccionado los singletes, se comparó el Side Scatter con la tinción por Hoechst, escogiéndose aquellas que fuesen negativas para este marcador (las células vivas no incorporan el colorante, solo permea por difusión pasiva en las células muertas). En ningún caso se bajó de un 92% de supervivencia celular. La población microglial se seleccionó al contraponer el marcaje con CD11b y el de CD45, ya que la microglía expresa ambos marcadores. Se emplearon tinciones simples y controles FMO (de sus siglas en inglés Fluorescence Minus One, y consistentes en utilizar todos los anticuerpos juntos menos el de interés, para así facilitar el gating cuando este sí esté presente en la muestra problema) para asegurar la correcta elección de las poblaciones microgliales. Teniendo esto en cuenta, se fijaron las condiciones óptimas con los animales control, para aplicar luego los mismos parámetros en las muestras problema. Tabla 7. Anticuerpos de superficie y sondas mitocondriales empeladas en los análisis de citometría de flujo. Las siglas hacen referencia a: BDB: BD Biosciences; In: Invitrogen. Materiales y Métodos 126 Partiendo de la población microglial se seleccionó a continuación aquellas positivas para MitoTracker® Green FM o MitoTracker® Deep Red FM al cotejarlo contra el eje Side Scatter. Las sondas MitoTracker® permean pasivamente al interior de células vivas, puesto que son aquellas en las que la mitocondria es funcional. La mayor diferencia entre los dos tipos de MitoTracker® radica en su capacidad para unirse a las mitocondrias según el potencial de membrana: para MitoTracker® Green, la unión es independiente del potencial, pero no así para el MitoTracker® Deep Red. Por consiguiente, este último aporta información adicional sobre el estado del potencial de la membrana mitocondrial. 4. Análisis estadístico El análisis estadístico implementado varió en función de las muestras consideradas y del modelo en cuestión. En todo momento, los datos se expresan como la media ± SEM (error estándar de la media), con la excepcionalidad de los agrupaciones de lisosomas, en los que se expresan solo las medias. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo con el programa GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc., EEUU). En todas las ocasiones, se realizó en una primera instancia la identificación de outliers con el método de ROUT. A continuación, se evaluó la distribución normal o gaussiana de las muestras mediante la prueba de normalidad de Shapiro Wilk. En el modelo CMS sin leupeptina o espermidina, al tratarse de dos grupos experimentales, se empleó la t de Student de dos colas de tipo paramétrica cuando las muestras siguieron una distribución normal. De no ser así, se aplicó la t de Student no paramétrica con la prueba de Mann-Whitney. Figura 28. Estudio de las poblaciones microgliales y su fenotipo mitocondrial en la CF e Hp de rata por citometría de flujo en el modelo CMS y el modelo Poly I:C + aislamiento. Materiales y Métodos 127 En el modelo de CMS con leupeptina, además de en todos los modelos doble hit, se llevó a cabo el análisis de la varianza (ANOVA) que permite comparar el promedio entre grupos experimentales. Si la distribución de las muestras en todos los grupos era normal, se realizó el ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. Si el análisis de normalidad reveló que algún grupo no seguía una distribución normal, se efectuó la prueba de Kruskal-Wallis junto con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Asimismo, de resultar que las desviaciones estándar entre grupos no fuesen similares, se llevaron a cabo las pruebas ANOVA de Brown-Forsythe y Welch seguidas de la prueba post hoc T3 de Dunnet. Por último, los análisis de los modelos doble hit se complementaron a través del ANOVA de dos vías, que añade información sobre los efectos de cada estresor de forma independiente y conjunta. Los resultados de estos análisis se muestran en tablas, donde se especifica la presencia o ausencia de interacción, así como su p valor. Precisamente, en el modelo CMS tratado con espermidina se realizó únicamente el ANOVA de dos vías, al tratarse de la comparativa entre un modelo de estrés y un tratamiento experimental. En este caso, las gráficas representan directamente este análisis, en las cuales solo se especifican y detallan las comparaciones múltiples en el caso de producirse interacción entre ambas variables. Igualmente, los análisis de este modelo también se exhiben en tablas para el mejor entendimiento y discusión de los datos. Una p < 0.05 fue siempre considerada como estadísticamente significativa. Materiales y Métodos 128 5. Certificación Experimentación Animal Materiales y Métodos 129 RESULTADOS 1. Modelo experimental de depresión: Chronic Mild Stress 2. Estudio farmacológico de la autofagia: CMS + espermidina 3. Modelo experimental de trastornos relacionados con el neurodesarrollo: Poly I:C + Aislamiento social 4. Modelo experimental de trastornos relacionados con el neurodesarrollo: Deprivación materna + LPS 5. Modelo experimental de trastornos relacionados con el neurodesarrollo: Deprivación materna + RS 130 131 1. Modelo experimental de depresión: Chronic Mild Stress (CMS) 1.1. Vía de la autofagia 1) El CMS altera proteínas de autofagia en CF e Hp Para comprobar si el modelo de estrés crónico tenía algún efecto sobre la vía de la autofagia, varias proteínas que actúan en diferentes puntos de esta fueron estudiadas por WB. El CMS provocó la disminución de p-ULK1, ULK1, Beclin1, p-SQSTM1, Atg3 y Atg16L1 en CF, mientras que en Hp disminuyeron p-mTOR, Beclin1, p-SQSTM1, Atg3 y Atg12. CMS produjo un aumento de mTOR y Atg7 en CF, y de Atg16L1 en Hp (Figura 29(Ai) y (Aii)). Estos resultados muestran el impacto diferencial que el estrés ejerce sobre cada región cerebral. Lo mismo ocurre con la proteína LC3, cuyos niveles fueron estudiados a través de la inhibición del flujo autofágico con leupeptina: tanto la CF como el Hp presentaron una susceptibilidad específica a los cambios derivados del CMS. Aunque la inhibición total del flujo autofágico no fue alcanzada, el grupo CMS+leu experimentó un incremento de los niveles de LC3-II en CF con respecto al CT, mientras que el mismo grupo del Hp no sufrió ninguna modificación. De hecho, la ratio LC3-II/LC3- I disminuyó en el grupo CMS en esta área en comparación con los grupos CT y CT+leu, mientras que CMS+leu mostró un aumento con respecto a este grupo CMS (Figura 29(B)). Además, se analizaron los niveles de corticosterona en plasma de los 6 grupos experimentales, donde se observó que los niveles en el grupo CMS+leu se triplicaron con respecto al grupo CT, sugiriendo que la combinación del estrés y la leupeptina activaron el eje HHA de una manera en la que ni solo el CMS o la leupeptina pudieron, aunque igualmente la inhibición del flujo autofágico no se consiguiera (Figura 29(C)). Resultados 132 Figura 29. El CMS modifica la expresión proteica de marcadores de la vía de la autofagia en CF e Hp. Las fosforilaciones de mTOR, ULK1 y SQSTM1, junto con sus valores de proteína total fueron evaluados por WB junto con Beclin1, Atg3, Atg5, Atg7, Atg12 y Atg16L1 en CF e Hp. El CMS modificó selectivamente varias proteínas en cada región cerebral (A). (Ai) muestra los resultados obtenidos en CF y (Aii) los de Hp. (B) Estudio del flujo autofágico y presencia de LC3-II mediante su inhibición con leupeptina, que fue inyectada intracortical e intrahipocampalmente. (C) muestra los resultados del nivel de corticosterona en plasma, donde se aprecia un acusado aumento esta en el grupo CMS+leu. Cada proteína se expresa en porcentaje, mediante la comparación del grupo CMS y su respectivo CT. La t de Student de dos colas fue aplicada en los análisis de cada marcador (A y C), mientras que la ANOVA de una vía se usó para el análisis del experimento con leupeptina (B). Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas CT y 9-14 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 133 2) El CMS induce los genes Atg3, Atg5, Atg7 y Atg12 en Hp y Atg7 en la CF Ya que el CMS moduló la expresión proteica de varios elementos de la vía de la autofagia, se procedió al estudio de la expresión genética de los mismos marcadores por RT-qPCR. En este caso, un único gen sufrió modificaciones derivadas del CMS en CF, Atg7, del que se observó un aumento en sus niveles en el grupo CMS. Sin embargo, el CMS provocó la inducción de cuatro genes Atg, que fueron Atg3, Atg5, Atg7 y Atg12 en Hp (Figura 30(A)). De nuevo, la CF y el Hp parecen responder al protocolo de estrés crónico de manera específica y dependiente de localización. Las Figuras 30(B) y 30(C) muestran los resultados del resto de genes estudiados, en los que el modelo no ocasionó ningún cambio. 3) El CMS disminuye proteínas de apoptosis en Hp y Bcl2 en CF, pero no altera el proteasoma Teniendo en cuenta que tanto autofagia como apoptosis se activan en presencia de estrés, y una puede modular la otra, el estudio de marcadores apoptóticos era esencial Figura 30. Estudio de RT-qPCR de los marcadores de autofagia en CF e Hp. (A) muestra los cambios ocasionados por el CMS a nivel de expresión génica en CF e Hp. (B) presenta los resultados de genes corticales que no sufrieron cambios deri- vados del protocolo de CMS. (C) enseña aque- llos que tampoco se mo- dificaron por el estrés en Hp. Cada gen se ex- presa en porcentaje, me- diante la comparación del grupo CMS y su res- pectivo CT. La t de Student de dos colas fue aplicada en los análisis de cada marcador. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas CT y 9-14 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como esta- dísticamente significa- tiva (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 134 para establecer el papel de la autofagia en CF e Hp. Hp fue el área más afectada, donde la Anexina V, el citocromo C y Bax disminuyeron sus niveles en el CMS. El CMS solo modificó Bcl2 en CF, donde se observó una reducción con relación al CT (Figura 31(A)). Se aprecia una reducción de la fluorescencia de Anexina V en el grupo CMS de Hp (Figura 31(B)), en la misma línea que los resultados de WB (Figura 31(A)). Para seguir estudiando la capacidad celular de combatir el estrés y la consecuente acumulación de proteínas o productos de desecho por una autofagia defectuosa, se llevaron a cabo análisis de WB del proteasoma 26S. Dicho proteasoma está compuesto por dos subunidades, la 20S (con una sección α y otra β) y la 19S. Ninguna subunidad experimentó cambio alguno en CF o Hp, por lo que el CMS no provocó alteraciones en la estabilidad y funcionalidad del proteasoma (Figura 31(E)). 4) El CMS disminuye la fosforilación de p53 en CF e Hp, además de la proteína total en CF Dado el papel modulador que ejerce p53 sobre la autofagia y apoptosis, era importante establecer la relación de ambas a través de esta. La autofagia bloquea p53, pero p53 es también capaz de activarla, a la vez que también activa los mecanismos de apoptosis El daño en el ADN induce la fosforilación de p53 en la serina 15 (Ser15), cuyos valores disminuyeron en el grupo CMS en ambas regiones cerebrales. Sin embargo, la proteína total p53 solo se vio reducida en la CF (Figura 31(C)). 5) El CMS favorece la interacción Beclin1-Bcl2 tanto en CF como en Hp Ya que parte de la comunicación entre autofagia y apoptosis se debe a la interacción entre Beclin1 con Bcl2 y otros miembros de su familia, como Bcl-XL, y dicha interacción reduce la capacidad de Beclin1 para inducir la autofagia, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación de la Beclin1 (Figura 31(D)). El CMS provocó el aumento de la interacción Beclin1-Bcl2 cuando las muestras, tanto de CF como de Hp, fueron enriquecidas en Beclin1 y reveladas mediante WB con Bcl2. Aunque esta interacción se vio favorecida en ambas estructuras, fue aún mayor en Hp que en CF, al compararlo con sus CT. Además, no se observaron cambios en la interacción de la Beclin1 con Bcl- XL en CF, pero el CMS sí aumentó esta interacción en el grupo CMS de Hp, comparado con su CT. Resultados 135 Figura 31. Efectos del CMS sobre la apoptosis, p53, unión Beclin1-Bcl2 y proteasoma. Se realizaron análisis de WB para evaluar la comunicación entre una autofagia alterada con otros procesos que ayudan al mantenimiento de la homeostasis celular, como la apoptosis. La Anexina V, el citocromo C, Bcl2, Bax, p53 y las subunidades 20S y 19S del proteasoma fueron estudiadas por WB en CF e Hp. Aunque no se detectaron cambios en el proteasoma (E), el CMS favoreció la reducción de los marcadores pro-apoptóticos Anexina V, citocromo C y Bax en Hp (A y B). Sin embargo, en la CF solo Bcl2 fue modificado por el CMS comparado con su CT, el cual sufrió una disminución de sus valores (A). La fosforilación de p53 disminuyó en los grupos CMS de ambas regiones cerebrales, pero solo la CF experimentó también una modificación en los niveles de proteína total (C). Además, el CMS aumentó la interacción entre Beclin1 y Bcl2 en CF e Hp (D). Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas CT y 9-14 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 136 6) La fosforilación de SQSTM1 en la serina 403 colocaliza con astrocitos corticales e hipocampales, y el CMS aumentó dicha colocalización en Hp Se llevaron a cabo estudios de colocalización a través de técnicas de inmunofluorescencia para profundizar en el papel de SQSTM1 en la respuesta al estrés crónico. Debido a la drástica disminución que experimentó p-SQSTM1 tanto en ambas áreas por WB, se estudió su expresión junto con la de neuronas, astrocitos y microglía. La Figura 32(A) muestra p-SQSTM1 (verde) y la proteína acídica fibrilar glial (GFAP), marcador de astrocitos (rojo) en muestras de CF: tanto regiones de la periferia de la corteza motora primaria (primera y segunda columnas) como regiones internas (tercera y cuarta columnas). p-SQSTM1 mostró un alto índice de colocalización con GFAP, detallado en la Figura 32(B). De hecho, los niveles de p-SQSTM1 se encontraron aumentados en dos regiones de la CF (Figura 32(C)), pero no se observaron cambios en la corteza motora secundaria (Figura 32(Ci)). En cuanto a GFAP, en esta última estructura y en la corteza orbital medial-ventral, su expresión aumentó (Figura 32(Ci)) pero no en la corteza motora primaria (Figura 32(Cii)). Los resultados de los análisis de colocalización se exhiben en la Figura 32(D) en términos del coeficiente de Pearson (Figura 32(Di)), coeficiente de Solapamiento (Figura 32(Dii)) y el coeficiente de Manders (Figura 32(Diii)): exclusivamente en la corteza motora secundaria, el grupo CMS tuvo un mayor coeficiente de colocalización en comparación al grupo CT (Figura 32(Di)). La Figura 32(D) demuestra que p-SQSMT1 y GFAP tienen un alto grado probabilístico de colocalización, independientemente del protocolo de estrés, lo que puede observarse en la Figura 32(B). La Figura 33(A) presenta los mismos resultados en varias zonas del Hp: en orden de izquierda a derecha, del giro dentado (GD), las células hiliares del GD, de CA1 y CA3. El alto grado de colocalización hallado entre los dos marcadores considerados se representa en la Figura 33(B). GFAP aumentó sus niveles en el grupo CMS de las cuatro regiones expuestas, mientras que p-SQSTM1 solamente vio incrementados sus valores en CA1 (Figura 33(Ci)). Los análisis de colocalización se muestran en la Figura 33(Cii - Civ), donde los tres coeficientes previamente mencionados determinaron que el CMS promovió la colocalización (un aumento causal de la expresión de ambas proteínas) en CA3, GD y las células hiliares del GD. Resultados 137 Figura 32. Análisis de IF de p-SQSTM1/p-p62 y GFAP en CF. Secciones de CF fueron incubadas con p- SQSTM1 y GFAP simultáneamente y fotografiadas a una magnificación de 20 X (A) y 63 X (B). (C) muestra la cuantificación de las medias de intensidad en las cortezas motora secundaria y orbital medial-ventral (Ci) y el contaje de células en la periferia de la corteza motora primaria (Cii). (D) exhibe los análisis de colocalización mediante el coeficiente de Pearson (Di), el coeficiente de Solapamiento (Dii) y el coeficiente de Manders (Diii), donde se observa un alto nivel de colocalización entre ambos marcadores. Solo la corteza motora secundaria mostró una elevación del coeficiente de Pearson en el grupo CMS (Di). Los análisis se llevaron a cabo en imágenes de 20 X de magnificación. Los datos se expresan como la media ± SEM de 6- 8 ratas CT y 6-8 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). CT CMS CT CMS CT CMS Z o o m M e rg e D A P I G F A P p -S Q S T M 1 A C D i ii iii i ii B Resultados 138 Figura 33. Análisis de IF de p-SQSTM1/p-p62 y GFAP en Hp. Se representan imágenes tomadas con magnificación de 20 X (A) y 63 X (B). (C) muestra la cuantificación (Ci) y análisis de colocalización expresados mediante el coeficiente de Pearson (Cii), el coeficiente de Manders (Ciii) y el coeficiente de Solapamiento (Civ). El CMS aumentó el índice de colocalización en GD, CA3 y las células hiliares del GD, comparados con sus CT. Un ejemplo de la mejora de la colocalización en las células CA3 del Hp se muestra en (B). Los análisis se llevaron a cabo con las imágenes al 20 X. Los datos se expresan como la media ± SEM de 6-8 ratas CT y 6-8 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Z o o m M e rg e D A P I G F A P p -S Q S T M 1 CT CMS CT CMS CT CMS CT CMS A M e rg e D A P I G F A P p -S Q S T M 1 B C i ii iii iv Resultados 139 7) El complejo ESCRT se ve afectado por el CMS en CF e Hp Partiendo de la participación del complejo ESCRT en el cierre del fagóforo y la formación del autofagosoma, su estudio permite poner en contexto el papel de la autofagia en la respuesta al estrés crónico. Hrs y STAM2 (ESCRT-0) fueron modulados de forma opuesta en la CF de cada grupo CMS, aumentando la cantidad proteica de Hrs a la vez que disminuyó la de STAM2; Tsg101, Vps28 y Vps37A (ESCRT-I) vieron reducidos sus niveles proteicos a causa del CMS en la CF, mientras que en el Hp, Tsg101 también disminuyó pero Vps37A aumentó, comparado con su CT; Vps25 (ESCRT-II) no presentó ningún cambio en ninguna de las dos zonas; CHMP5 y CHMP6 (ESCRT-III) tampoco vieron modificada su expresión proteica en Hp, pero aumentaron y disminuyeron respectivamente en la CF. En cuanto a la proteína asociada a las ESCRT Vps4B, el CMS redujo sus valores en Hp (Figura 34(A)). Dada la conexión entre el complejo ESCRT y las proteínas Rab y las galectinas, dos de cada tipo fueron también evaluadas mediante WB (Figura 34(B)). Ni en CF ni Hp hubo algún tipo de cambio en las proteínas Rab5 y Rab7 en el grupo CMS, a la vez que la galectina9 sí que disminuyó en ambas regiones cerebrales. Por su parte, la galectina3 aumentó exclusivamente en la CF. 8) El CMS provoca el aumento de la concentración en fosfatasa ácida en las CLF y las fracciones lisosomales purificadas Considerando la función central que desempeñan los lisosomas en la vía de la autofagia, constituyendo la maquinaria clave para la eliminación de la carga seleccionada a eliminar, era imprescindible establecer las consecuencias que el estrés crónico tiene sobre la cantidad y funcionalidad de los lisosomas. Los niveles de fosfatasa ácida fueron examinados en fracciones crudas lisosomales (CLF) y en seis fracciones purificadas, obtenidas gracias a un gradiente de densidad. Estas fracciones se nombran como Lyso 1 a Lyso 6, teniendo en cuenta que la primera fracción contiene los lisosomas de naturaleza más ligera, y la última fracción aquellos más pesados. El CMS elevó los niveles de fosfatasa ácida en CLF y en las fracciones purificadas de la CF y el Hp (Figura 35(A)). Este aumento fue más llamativo en CF que en Hp, tanto entre las distintas CLFs (Figura 35(Ai)), como las fracciones purificadas de cada región (Figura 35(Aii)). Los ensayos de incorporación del colorante Neutral Red por los lisosomas se realizaron sobre las fracciones lisosomales de ambas áreas cerebrales. El CMS mostró una diferente ratio de incorporación del colorante en CF e Hp, pero no suficientemente como para afirmar que el modelo de estrés crónico es capaz de alterar la integridad lisosomal. La fracción Lyso 6 fue la más alterada a causa del CMS (Figura 35(B)). Resultados 140 9) Lisosomas ligeros y pesados están sujetos a cambios diferenciales en su expresión tras la exposición al CMS Proteínas principales de la autofagia mediada por chaperonas (CMA) y de la función lisosomal fueron analizadas mediante WB tanto en CLF como en las fracciones Figura 34. Estudios de WB sobre los componentes principales de la maquinaria ESCRT. Los subcomplejos ESCRT-0, ESCRT-I, ESCRT-II y ESCRT-III fueron examinados a través de sus proteínas principales en los grupos CMS, y comparados con sus respectivos grupos CT en cada una de las zonas cerebrales estudiadas (A). Prácticamente todas las proteínas experimentaron algún tipo de cambio derivado del protocolo de estrés crónico en la CF, donde Vps25 y Vps4B fueron las únicas que se mantuvieron estables. En Hp, el CMS redujo los niveles proteicos de Tsg101 y Vps4B, a la vez que indujo los valores de Vps37A. Otras proteínas que cooperan en la funcionalidad de la maquinaria ESCRT fueron también evaluadas mediante WB (B): la galectina 9 disminuyó en los grupos CMS de ambas localizaciones cerebrales, mientras que el CMS elevó los niveles de la galectina3 únicamente en la CF. Ni la proteína Rab5 ni la Rab7 experimentaron cambio alguno provocado por el CMS. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas CT y 9-14 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 141 purificadas de cada región cerebral. La CF fue la que presentó mayores cambios desencadenados por el CMS. En las CLF, compuestas por el conjunto de todos los lisosomas, las proteínas LAMP1 y LAMP2A aumentaron considerablemente en CF, mientras que, aunque la primera no mostró cambios en Hp, la segunda disminuyó en los grupos CMS (Figura 35(C)). En ambas regiones, LAMP2A descendió en los grupos CMS de todas las fracciones lisosomales (con excepción de la fracción Lyso 2), comparado con los CT. Las bandas correspondientes a LAMP1 no pudieron ser detectadas en las fracciones Lyso 3 y Lyso 6. La chaperona Hsc70, también fundamental junto con LAMP2A en el proceso de CMA, presentó menores cantidades en CF, pero mayores en Hp en sus CLF correspondientes, en contraposición a lo observado con LAMP2A. En las fracciones Lyso 1, 3 y 4, el CMS aumentó la concentración proteica de Hsc70 en Hp, mientras que la redujo en el resto de condiciones y fracciones. Por su parte, la chaperona Hsp70 siguió un perfil de cambio muy similar a Hsc70, con la salvedad de que el CMS elevó sus niveles en la fracción Lyso 3 de CF a la vez que los redujo en Lyso 1 en ambas zonas. Con relación a la funcionalidad lisosomal, la catepsina D en su forma madura aumentó considerablemente en las fracciones Lyso 2 de ambas regiones, mientras que disminuyó en CLF de CF e Hp, en comparación con sus respectivos CT. Esta proteína no fue detectada en las fracciones Lyso 3 y Lyso 6. La proenzima catepsina B se vio reducida en las CLF y fracciones lisosomales de CF, con la excepción de la fracción Lyso 1 (en la que no se observó cambio alguno) y Lyso 3 (donde no pudo observarse ninguna banda). En Hp, el CMS provocó su incremento en CLF y las fracciones Lyso 4 y 6. La catepsina B en su forma activa experimentó unos cambios muy similares desencadenados por el CMS. Sin embargo, la forma activa aumentó en CLF y la fracción Lyso 2 en cada área (pero en mayor grado en el Hp), y su proenzima no cambió en esa misma fracción. A pesar de ello, esta forma sí que pudo ser detectada en la fracción Lyso 3, en la que sus valores fueron menores en el grupo CMS que en los CT del Hp. En último lugar, el CMS elevó los niveles proteicos de la cistatina C en las fracciones Lyso 1 y 2 de las dos regiones cerebrales, y también en la fracción Lyso 3 hipocampal. En las muestras de CLF, sufrió un aumento solamente en Hp. Se observaron menores concentraciones de cistatina C en las fracciones Lyso 4 (CF) y Lyso 5 (Hp), con aumentos correspondientes de la fracción Lyso 5 en CF. Finalmente, no se detectaron bandas en la fracción Lyso 6. Resultados 142 Figura 35. Estudios sobre la cantidad y funcionalidad de los lisosomas a partir de extractos crudos lisosomales (CLF) y fracciones lisosomales purificadas. La enzima fosfatasa ácida fue medida en CLF y en las fracciones purificadas (Lyso 1 – Lyso 6), presentando un incremento general de sus niveles en CF e Hp (A). El ensayo del colorante Neutral Red no mostró diferencias en la integridad lisosomal en los grupos CMS (B). Se llevaron a cabo análisis de WB de proteínas relacionadas con la autofagia mediada por chaperonas (CMA) y proteínas lisosomales (C), en las muestras procedentes de los CLFs y las fracciones lisosomales purificadas de las dos regiones cerebrales bajo estudio. Los datos se expresan como la media de las agrupaciones de 6 ratas CT y 6 ratas CMS. Resultados 143 10) El CMS induce la expresión de LAMP2A en neuronas y microglía de la CF, a la vez que reduce sus niveles en las neuronas hipocampales de CA1 y GD Dada la modulación opuesta que el CMS ejerció sobre el transportador LAMP2A en CF e Hp, y teniendo en cuenta su relevancia en la CMA, se realizaron experimentos de inmunofluorescencia sobre secciones de CF e Hp de los grupos CT y CMS. La Figura 36(Ai) muestra la imnunotinción triple de LAMP2A, MAP2 (marcador neuronal) e Iba1 (marcador microglial) adquirida bajo una magnificación de 20 X, seguidas por más imágenes a 63 X (Figura 36 (Aii)) en la CF. La Figura 36(Aiii) exhibe las gráficas representativas de la cuantificación realizada, en las que se aprecia la subida de las tres proteínas estudiadas en comparación con sus CT correspondientes en las cortezas motoras primaria y secundaria de la CF. Por su parte, la Figura 36(B) muestra imágenes representativas de la corteza orbital medial-ventral, donde, al igual que en la corteza agranular insular, el CMS solo estimuló el aumento de MAP2 e Iba1, pero no de LAMP2A (Figura 36(Bi y Bii)). Seguidamente, la Figura 37(A) enseña la disminución de los niveles de LAMP2A en la zona hipocampal de CA1 y la Figura 37(B) de las células hiliares del GD, también en el Hp. En ambos casos, LAMP2A registró una disminución de su fluorescencia, acompañado de ningún cambio por parte de MAP2 en ambas localizaciones. Aunque fueron muchas las regiones del Hp fotografiadas y analizadas (CA2, CA3, tres capas diferentes del GD) únicamente CA1 y la capa molecular del GD mostraron cambios en el transportador LAMP2A. Además, resultó evidente que LAMP2A seguía una tendencia de expresión clara en el Hp: LAMP2A se localizaba esencialmente en el soma neuronal y en el primer tercio de sus axones. Por otra parte, teniendo en cuenta la expresión de LAMP2A en microglías corticales, se analizó en más detalle el área de ocupación en la que LAMP2A se disponía en el interior de la microglía, y si esta pudiese modificarse por el protocolo de estrés crónico. A pesar de que el CMS incrementó los niveles de LAMP2A e Iba1 en la CF comparado con sus CT (Figura 36(Aiii)), la cantidad de LAMP2A expresada en exclusividad por la microglía cubría menos espacio, a la vez que los somas y las ramificaciones de estas células aumentaron a causa del CMS (Figura 37(C)). En el Hp era tan leve la tinción de LAMP2A en la microglía, que no se pudo proceder a su cuantificación. Resultados 144 Figura 36. Estudios de IF sobre la expresión de LAMP2A por neuronas y microglías en CF. (Ai) Muestra una triple inmunotinción de LAMP2A junto con MAP2 (marcador de neuronas) e Iba1 (marcador de microglía) fotografiada a 20 X de magnificación, mientras que (Aii) presenta un mayor grado de detalle a 63 X. El CMS aumentó la expresión de LAMP2A en las cortezas motoras primaria y secundaria (Aiii), a la vez que favoreció el incremento de MAP2 e Iba1. (B) representa una de las regiones de la CF en las que LAMP2A no sufrió cambios desencadenados por el CMS, y acompañada por (Bi y Bii), se muestra que ni las cortezas orbital medial-ventral ni la agranular insular vieron modificados sus niveles de LAMP2A. En este caso, fueron MAP2 e Iba1 las que aumentaron tras el CMS. Los datos se expresan como la media ± SEM de 6-8 ratas CT y 6-8 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 145 Figura 37. Estudios de IF sobre la expresión de LAMP2A por neuronas en Hp y microglía en CF. (A) muestra la reducción de los niveles proteicos de LAMP2A causada por el CMS en la zona de CA1 del Hp, sin cambios notables en MAP2. (B) presenta la misma tendencia de cambio en LAMP2A derivada del CMS, donde de nuevo, LAMP2A se ve disminuida en la capa molecular del GD. Tampoco se observan modificaciones en MAP2 en esta zona. (C) exhibe en mayor detalle una representación de las poblaciones microgliales que expresan LAMP2A en la corteza motora primaria, donde se evaluó el porcentaje de área ocupada por LAMP2A dentro de la microglía. Se observó que el CMS reducía el área en la que LAMP2A se disponía dentro de la microglía, aunque no se observaron cambios en otras regiones. Los datos se expresan como la media ± SEM de 6-8 ratas CT y 6-8 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 146 1.2. Vía de la mitofagia 11) El CMS modifica las proteínas responsables de mitofagia en los extractos citosólicos y mitocondriales de forma diferente, tanto en CF como en Hp Dada la importancia de la mitocondria como pulmón celular, y su renovación y eliminación dependiente de la vía de la autofagia, pasamos a estudiar proteínas que participaran en la mitofagia. CF e Hp muestran un patrón diferente de cambios derivados del CMS, tanto en extractos citosólicos como en los mitocondriales (Figura 38). En el citosol de la CF, Parkin y BNIP3 aumentaron en los grupos CMS, mientras que FUNDC1 disminuyó (Figura 38(Ai)). Sin embargo, aunque BNIP3 y FUNDC1 experimentaron los mismos cambios que en CF, en Hp se sumaron más alteraciones en Pink1 y Ambra1, cuyos valores se vieron elevados por el CMS, y Parkin que, en este caso, disminuyó su expresión proteica en comparación con el grupo CT (Figura 38(Bi)). En cuanto a la presencia de las mismas proteínas en los extractos mitocondriales, se observó que la CF era la más afectada por el CMS. Pink1, BNIP3, Nix y FUNDC1 aumentaron en los grupos CMS en CF (Figura 38(Aii)). Al compararlo con los resultados de Hp, únicamente se apreciaron disminuciones en la expresión proteica de Parkin y FUNDC1 en los extractos mitocondriales (Figura 38(Bii)). 12) Los cambios modulados por Parkin se llevan a cabo fundamentalmente en neuronas Tinciones de IF muestran que Parkin se expresa mayoritariamente en neuronas (marcadas con NeuN) tanto en CF como en Hp (Figura 39(A)). En los estudios realizados se pudo apreciar un aumento de la fluorescencia en el grupo CMS de CF, a la vez que una leve disminución en el grupo CMS de Hp. En la Figura 39(B) se muestra la misma expresión de Parkin de Hp con microglías (marcadas con Iba1), donde no se observan eventos de colocalización, pero sí la interacción entre microglías y las células (neuronas) que expresan Parkin en Hp. Resultados 147 Figura 38. El CMS modifica la expresión proteica de elementos mitofágicos en extractos citosólicos y mitocondriales de ambas regiones cerebrales. (A) muestra los cambios acontecidos en Parkin, Pink, BNIP3, Nix, FUNDC1 y Ambra1 en extractos citosólicos (Ai) y extractos mitocondriales (Aii), en el que se observaron aumentos en los grupos CMS en las proteínas Pink1, BNIP3, Nix y FUNDC1. En el citosol, Parkin y BNIP3 aumentaron a la vez que FUNDC1 disminuyó. (B) exhibe la modulación que el CMS provocó de los mismos marcadores en Hp, donde se aprecia un aumento de Pink, BNIP3 y Ambra1 junto con la reducción de los niveles proteicos de Parkin y FUNDC1 en (Bi). Por el contrario, (Bii) enseña que solo dos proteínas experimentaron cambios en el extracto mitocondrial, que fueron Parkin y FUNDC1, en las que el CMS forzó una reducción de sus valores. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas CT y 9-14 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001). Resultados 148 Figura 39. Estudios de IF sobre la expresión de Parkin por neuronas en CF e Hp y su relación con microglías. (A) ofrece una representación de la tinción doble de Parkin con NeuN (marcador neuronal) en la CF (corteza motora secundaria) e Hp (neuronas de CA1), donde se observa un aumento de la intensidad de Parkin en CF y una leve disminución en Hp de los grupos CMS, respectivamente. Parkin se expresa fundamentalmente en neuronas. (B) muestra las células positivas hipocampales en Parkin (neuronas) entre las que se distribuyen poblaciones microgliales. No hay eventos de colocalización entre Parkin e Iba1 (marcador microglial). Resultados 149 13) El aumento de la proteína Parkin en CF está ligado a un aumento de la ubiquitinación en el grupo CMS Teniendo en cuenta los cambios observados en la proteína Parkin, y los datos obtenidos acerca de las alteraciones ocasionadas por el CMS en la vía de la autofagia, era interesante estudiar si el CMS modificaba el patrón de ubiquitinación celular. En la Figura 40(A) se muestra un experimento de IP de Parkin en la CF, donde se aprecia un aumento de la presencia proteica en Parkin en los extractos concentrados tras el protocolo de IP. Seguidamente, se puede contemplar cómo el CMS promueve el aumento de los valores de Parkin en estos mismos extractos, siguiendo la misma línea que los datos en la Figura 38(Ai). Por último, se constató que el patrón de ubiquitinación entre grupos CT y CMS sobre los extractos proteicos concentrados en Parkin fue diferente, revelando un incremento de ubiquitina unido a Parkin en los grupos CMS (Figura 40(A)). Por tanto, el protocolo de CMS favorece un aumento de la ubiquitinación mediada por Parkin. 14) El CMS no altera la expresión de los genes de mitofagia, a excepción de Fundc1 en Hp De la misma forma en la que se llevó a cabo el estudio proteico de los mediadores del proceso mitofágico, también era necesaria la caracterización de estos en cuanto a su expresión genética. De esta manera, tras evaluar los mismos marcadores en CF e Hp por RT-qPCR, se corroboró que únicamente Fundc1 era modificado por el CMS a este nivel, concretamente, elevando su expresión genética en Hp (Figura 40(B)). Resultados 150 15) El CMS induce genes involucrados en la génesis mitocondrial en CF e Hp a la vez que reduce su presencia en el extracto nuclear de Hp La Figura 41(A) muestra la evaluación de los tres principales efectores encargados de la síntesis de nuevas mitocondrias Nrf1, Mtfa y PGC1α, en la CF. El CMS indujo los genes Nrf1 y Pgc1α en CF (Figura 41(Ai)), mientras que no alteró la expresión proteica de ninguno de dichos marcadores en el extracto nuclear de la misma área (Figura 41(Aii)). Cuando comparamos con Hp, se comprobó que el CMS inducía únicamente Nrf1 genéticamente (Figura 41(Bi)), mientras que sus niveles proteicos se encontraron reducidos, junto con los de Mtfa, en extractos nucleares de los grupos CMS de Hp (Figura 41(Bii)). Dada la versatilidad de funciones llevada a cabo por PGC1α, también Figura 40. IP de Parkin y su interacción con la ubiquitina, junto con la evaluación de la expresión genética de los marcadores de mitofagia por RT-qPCR. (A) muestra la presencia proteica de Parkin en el homogenizado total (H), en el lisado tras la extracción de Parkin (lis) y en el extracto concentrado en Parkin (E) en grupos CT y CMS, donde se aprecia el aumento de esta proteína en el extracto concentrado tras la IP. El CMS favorece el aumento de Parkin en CF, lo que a su vez repercute en la unión de esta a ubiquitina y demás proteínas ubiquitinadas, aumentadas por el CMS. (B) expone los estudios de expresión genética por RT-qPCR de los mismos marcadores mitofágicos vistos previamente, donde solamente Fundc1 experimentó cambios desencadenados por el CMS en Hp. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7 ratas CT y 10-14 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa. Resultados 151 se evaluó su expresión en extractos mitocondriales de CF e Hp (Figura 41(Ci)) y su ratio de presencialidad entre extractos nuclear y citosólico (Figura 41(Cii)). En la Figura 41(Ci) se observa un aumento en el extracto mitocondrial de la expresión proteica de PGC1α en el grupo CMS de la CF, a la vez que puede apreciarse cómo la concentración de PGC1α se ve disminuida en el extracto nuclear en favor del citosólico en la CF (Figura 41(Cii)). No se observaron cambios en la expresión proteica de este marcador en ninguno de los extractos en Hp. La Figura 42 muestra cómo PGC1α tiende a concentrarse preferiblemente en neuronas (marcadas con NeuN) tanto en CF como en Hp. Además, se aprecia un aumento de la fluorescencia en el grupo CMS de la CF. De nuevo, no se observaron cambios de intensidad en el Hp, en la misma línea que los resultados obtenidos por WB (Figura 41). 16) El CMS provoca alteraciones en la fusión y fisión mitocondrial de acuerdo con la modulación de sus proteínas en extractos citosólico y mitocondrial de CF e Hp Ya que el CMS modificó los valores basales de los mediadores implicados en los procesos de mitofagia, así como los de los reguladores de la mitogénesis, era importante esclarecer si el CMS era igualmente capaz de afectar a los procesos de fusión y fisión de las mitocondrias. El CMS menguó los niveles de la Mfn1, Mfn2 y Drp1 en el extracto citosólico (Figura 43(Ai)), a la vez que aumentó la concentración proteica en Mfn2, Opa1 y p-Drp1 en el extracto mitocondrial de CF (Figura 43(Aii)). En lo concerniente al Hp, el CMS acrecentó la expresión proteica de la Mfn2 y Opa1, recortando paralelamente la de Mfn1 y Drp1 en su extracto citosólico (Figura 43(Bi)). Curiosamente, en el extracto mitocondrial de Hp, el CMS solo causó la bajada de los niveles proteicos de la Mfn1, si bien se observaron algunas tendencias al cambio en el resto de los marcadores examinados (Figura 43(Bii)). Resultados 152 Figura 41. Evaluación de la mitogénesis a partir de sus principales mediadores por RT-qPCR y WB. (A) muestra los datos referentes a CF, donde se exhibe la inducción de los genes Nrf1 y Pgc1α desencadenada por el CMS (Ai), mientras que este no provocó ninguna alteración a nivel proteico (Aii). En (B) se aprecia las alteraciones acontecidas en Hp, donde el CMS indujo la expresión genética de Nrf1 (Bi), a la vez que provocó la reducción de la concentración proteica de Nrf1 y Mtfa (Bii). (Ci) representa el estudio de la presencia de PGC1α en el extracto mitocondrial, y cómo el CMS regula al alza sus niveles proteicos en CF. (Ci) muestra la ratio de proteína PGC1α presente en extractos nuclear y citosólico. No cambios concernientes a PGC1α fueron encontrados en Hp. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas CT y 9- 14 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001). Resultados 153 17) El CMS produce la inducción genética de Mfn1 tanto en CF como en Hp La Figura 44(A) muestra la determinación de la expresión proteica de la Mfn2 por IF, tanto en CF como en Hp, donde puede apreciarse que dicha proteína tiende a congregarse en las neuronas (marcadas con NeuN). La Mfn2 se localiza tanto en el soma como en los axones de las neuronas hipocampales. Además, la Figura 44(B) presenta los resultados del análisis por RT-qPCR de la expresión genética de los marcadores de fusión y fisión mitocondrial, donde se destaca que el gen Mfn1 es el Figura 42. Evaluación de la expresión de PGC1α por neuronas en CF e Hp mediante IF. Se llevó a cabo el estudio por IF de la expresión proteica de PGC1α en CF e Hp (se muestra la corteza motora primaria y las neuronas de CA3, respectivamente), donde se observa que dicha expresión se concentra esencialmente en el soma neuronal (marcados con NeuN). Además, se distingue un aumento de la fluorescencia asociada al aumento de la expresión de PGC1α desencadenada por el CMS en CF. Por su parte, no se vislumbraron cambios de expresión en ninguna región del Hp. Resultados 154 único susceptible a modificación ocasionada por el CMS, viéndose aumentado tanto en la CF como en el Hp. Figura 43. Determinación de la expresión proteica diferencial entre extractos citosólico y mitocondrial de proteínas responsables de la fusión y fisión mitocondrial en CF e Hp por WB. (A) presenta la disminución de los valores proteicos de la Mfn1, Mfn2 y Drp1 en los grupos CMS comparada con sus respectivos CT en el extracto citosólico (Ai) y el aumento correspondiente de la Mfn2, Opa1 y p-Drp1 en el extracto mitocondrial (Aii) de la CF. (B) contiene las gráficas representativas del aumento provocado por el CMS en la Mfn2 y Opa1, junto con la disminución en la Mfn1 y Drp1 en el extracto citosólico de Hp (Bi), además de la reducción de la Mfn1 en el extracto mitocondrial de la misma área cerebral (Bii). Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas CT y 9-14 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001). Resultados 155 Figura 44. IF de la proteína Mfn2 y RT-qPCR de los elementos implicados en la fusión-fisión mitocondrial en la CF e Hp. Se llevó a cabo el estudio de expresión de la proteína Mfn2 en la CF e Hp (se muestra la corteza motora primaria y las neuronas de CA1, respectivamente), donde no se observaron cambios destacables en los grupos CMS en comparación con sus respectivos CT (A). Se comprobó que la Mfn2 se concentra fundamentalmente en el soma neuronal (neuronas marcadas con NeuN), además de en los axones de las neuronas hipocampales. (B) exhibe los resultados de la expresión genética de los mismos marcadores de fusión y fisión mitocondrial, donde se contempla la inducción del gen Mfn1 en ambas regiones cerebrales. Ningún otro gen se vio alterado por el CMS. Los datos de RT-qPCR se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas CT y 9-14 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001). Resultados 156 18) El CMS aumenta la concentración mitocondrial de TOMM20 (reduciéndola en citosol) y Gal9 en CF, mientras que disminuye la de esta última y la del citocromo C en Hp. TOMM29 y Gal9 se expresan principalmente en neuronas Tras comprobar cómo el CMS tenía múltiples efectos sobre la mitocondria a diferentes niveles, se realizó la evaluación de otros productos en el extracto mitocondrial, previamente caracterizados en el extracto citosólico (Figura 31 y Figura 34). En la Figura 45(A), se presenta la variación al alza que provoca el CMS en las proteínas TOMM20 Gal9 en el extracto mitocondrial de CF (Figura 45(Ai)), aunque el mismo extracto en el Hp mostró por su parte disminuciones en el citocromo c y Gal9 (Figura 45(Aii)). De forma complementaria, se analizó el efecto que el CMS podría ejercer sobre la fracción citosólica de TOMM20 y COX IV en la CF e Hp (Figura 45(B)), donde se detectó el decrecimiento de TOMM20 tanto en CF como en Hp de los grupos CMS, si bien el CMS solo provocó la elevación de COX IV en CF. Por último, se estudió el potencial de la membrana mitocondrial a través del análisis de la JC-1 en la CF e Hp (Figura 45(C)), del que no se detectó ningún cambio en ninguna región cerebral. La Figura 46 representa el estudio mediante IF de la proteína TOMM20, la cual se comparó con neuronas (marcadas con NeuN) entre los grupos CT y CMS de la CF e Hp. Si bien TOMM20 se encontró presente en todas las células, las características cadenas mitocondriales se organizaron más ordenadamente en las neuronas, de las que es posible vislumbrar su periferia; se puede concluir que TOMM20 se distribuye tanto por el soma neuronal como por el axón. Asimismo, puede observarse un ligero aumento en la intensidad de fluorescencia en el grupo CMS de la CF, mientras que en el mismo grupo de Hp se aprecia una clara disminución de intensidad de la misma proteína. Curiosamente, al someter la Gal9 al escrutinio mediante IF, también se detectó que su marcaje se correspondía con el soma neuronal (marcado con NeuN) y, por tanto, se expresaba mayormente en neuronas tanto en la CF como en Hp (Figura 47). A través de esta IF, se apreció un aumento en la intensidad de fluorescencia de Gal9 en el grupo CMS de la CF (en concordancia con los resultados de la Figura 45(Ai)), si bien este mismo grupo mostró una leve disminución en Hp, también afín a los resultados de WB (Figura 45(Aii) y Figura 34(Bii)). Resultados 157 Figura 45. Comprobación de la expresión proteica de marcadores previamente estudiados en los extractos mitocondriales de la CF e Hp, además del estudio proteico de TOMM20 por WB y la JC-1. Proteínas relacionadas con fenómenos de apoptosis y reparación de lisosomas (citocromo c, Bcl2, Bax, Gal3 y Gal9) fueron evaluados por WB en extractos mitocondriales, destacándose la elevación de TOMM20 (marcador de masa mitocondrial) y de Gal9 en CF (Ai) y la disminución de la presencia proteica de citocromo c y Gal9 en Hp (Aii). El examen de las proteínas TOMM20 y COX IV en la fracción citosólica concluyó que los grupos CMS presentaban una disminución de TOMM20 en la CF e Hp, seguida del aumento de COX IV en la CF (B). La gráfica que se muestra en (C) representa el estudio del potencial de membrana mitocondrial, realizado a través de la sonda JC-1, y del que no se observaron diferencias entre grupos CT y CMS de ninguna de las áreas cerebrales estudiadas. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas CT y 9-14 ratas CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001). Resultados 158 Figura 46. Caracterización del patrón de expresión de la proteína TOMM20 en la CF e Hp por IF. Cortes del grupo CT y CMS fueron teñidos con el doble marcaje de TOMM20 y NeuN en las dos zonas cerebrales bajo estudio. Se exhiben cortes representativos de la corteza motora secundaria y neuronas hipocampales de CA1 tomados a 63 X. Se comprobó que TOMM20 teñía las cadenas mitocondriales presentes mayoritariamente en neuronas, pero puede visualizarse el marcaje de muchas otras que pertenecerían a otros tipos celulares. Aun así, estas cadenas tienden a localizarse en las neuronas de CF e Hp. Asimismo, los estudios de IF pusieron de manifiesto que TOMM20 aumentó ligeramente su expresión en el grupo CMS de la CF, mientras que, en el Hp, el grupo CMS experimentó una bajada bastante marcada de su intensidad. Se incrementó el contraste de manera proporcional en todos los grupos para facilitar su visualización. Resultados 159 19) El CMS no tiene efecto sobre la actividad de los complejos mitocondriales Teniendo en consideración las diversas variaciones ocasionadas por el CMS en muchas proteínas estructurales de la mitocondria, resultó conveniente profundizar en el alcance que el CMS podría tener sobre la actividad de los cinco complejos mitocondriales y, por consiguiente, en la respiración mitocondrial. La Figura 48(A) muestra la respuesta comparativa de los grupos CT y CMS de cada complejo mitocondrial junto con el ATP. Figura 47. IF de la proteína Gal9 marcada junto con NeuN en cortes de la CF e Hp. Muestras de los grupos CT y CMS de ambas áreas fueron sometidas al estudio por IF, del que se observó un aumento en la intensidad de fluorescencia de la Gal9 en el grupo CMS de la CF. Por su parte, el CMS causó una leve disminución en la intensidad de Gal9 en los cortes de Hp. Igualmente, Gal9 fue expresada fundamentalmente por neuronas, tanto en la CF como en el Hp, estableciéndose prioritariamente en el soma neuronal en ambas regiones. Se muestran de forma representativa la corteza motora primaria y las células hiliares del giro dentado del Hp. Resultados 160 Figura 48. Análisis de la respiración mitocondrial en los grupos CT y CMS en cerebro de rata. (A) muestra las medias de actividad respiratoria de una agrupación de 7-9 ratas de grupos CT y CMS en cada uno de los complejos mitocondriales, además de la disponibilidad total de ATP final. El CMS no provocó ningún cambio a este nivel. (B) ofrece la respuesta de cada complejo mitocondrial con respecto al tiempo según su inhibición específica; el primero con rotenona, el segundo con malonato, el tercero con antimicina A, el cuarto con cianida y el último con oligomicina. No se vislumbraron cambios entre grupos CT y CMS, por lo que se concluyó que el CMS no altera la actividad respiratoria de los complejos mitocondriales. Resultados 161 Aunque los complejos I y II muestran cierta tendencia al cambio en el grupo CMS (al alza en ambos casos), no se advirtió ningún efecto derivado del CMS en ninguno de los complejos mitocondriales, ni en la cantidad total de ATP disponible. La Figura 48(B) ahonda aún más en el estudio de dichos complejos, en los que la inhibición específica de cada uno no evidenció cambios producidos por el CMS a lo largo del tiempo. Por tanto, el CMS no produce complicaciones en la respiración mitocondrial del cerebro de rata. 20) El CMS potencia el ambiente oxidante especialmente en la CF Aunque ya está descrito que el CMS contribuye al aumento de estrés oxidativo y, por tanto, a la concentración de ROS y RNS en el SNC, el conjunto de las alteraciones mitocondriales observadas podría ser causa o consecuencia de dicho ambiente prooxidante. Así, se realizaron diversas determinaciones para esclarecer el daño oxidativo/nitrosativo de la CF e Hp. En términos generales, la CF presentó un aumento de la peroxidación lipídica (medida mediante el análisis de los valores de MDA) (Figura 49(A)), además de la disminución de la enzima antioxidante catalasa (Figura 49(C)). La caracterización de los valores de 8-OHdG en plasma, marcador de estrés oxidativo en los nucleótidos, no mostró diferencias entre los grupos CT y CMS (Figura 49(B)). Seguidamente, el estudio de una de las proteínas estructurales del complejo II de la cadena respiratoria mitocondrial, la SDHA, experimentó una elevación de sus niveles en el grupo CMS de la CF, así como la enzima antioxidante SOD1 (Figura 49(Di)). Curiosamente, de todas las determinaciones realizadas, el CMS solo alteró en Hp la proteína XBP1, una de las principales en la activación del estrés del retículo endoplásmico (Figura 49(Dii)). 21) El CMS aumenta la cantidad total de microglía en la CF, observándose la misma tendencia en el Hp Partiendo de los estudios de IF previos, en los que se detectaron cambios morfológicos en la microglía y un aumento en ramificaciones y número (Figura 36 y 37), se analizó la población microglial a través de citometría de flujo. A partir de estas, se evaluaron también los perfiles mitocondriales de la microglía mediante las sondas MitoTracker® Green (MitoGreen) o MitoTracker® Deep Red (MitoDeepRed) (Figura 50 y 51). La Figura 50 muestra los resultados referentes a la microglía en la CF, donde la Figura 50(A-C) exhibe los datos procedentes de la tinción con MitoGreen, y la Figura 50(D-F) aquellos de la tinción con MitoDeepRed. Resultados 162 La primera columna representa la población microglial, obtenida de la conjunción del marcaje de CD11b alto y CD45 medio, tras haber realizado previamente la exclusión de dobletes y células muertas teñidas con Hoechst. La supervivencia celular de todos los ensayos nunca bajó del 92%. Además, cada gráfica representa los datos procedentes de una agrupación de dos animales, con el fin de aumentar el número de células final. Figura 49. Caracterización del ambiente oxidativo a través de diferentes determinaciones. (A) exhibe el aumento de la concentración de MDA en la CF en el grupo CMS, apuntando a la inducción de la peroxidación lipídica. (B) no muestra cambios en los niveles plasmáticos de la 8-OHdG, por lo que el CMS no causó estrés oxidativo en los nucleótidos. (C) demuestra que la enzima antioxidante catalasa se encuentra reducida en el grupo CMS de la CF, pero no del Hp. (D) presenta el estudio de las proteínas SDHA, SOD1 y XBP1 en la CF (Di) y en el Hp (Dii), donde se aprecia un aumento de la SDHA y SOD1 en la CF, seguido por la también subida de la proteína XBP1 en Hp. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas CT y 9-14 ratas CMS. La catalasa se obtuvo a partir del pool de 6 ratas CT y 6 CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 163 Esta técnica apoya los resultados obtenidos mediante IF, ya que se apreció un aumento de la población de microglías en la CF del grupo CMS (de entorno a un 17-18.3% a un 31.8-32.1%), que se encuentra detallado en las gráficas de la primera columna (Figura 50). De esta población, se escogieron las mitocondrias teñidas con una u otra sonda fluorescente y se compararon los grupos CT y los CMS. A partir de ellas, se obtuvo el histograma representante de la tinción de microglías positivas para la sonda MitoGreen o MitoDeepRed (Figura 50(A-B y D-E)). La Figura 50(C y F) muestra las diferencias entre los grupos CT (en azul) y CMS (en rojo) cuando se solapan las poblaciones obtenidas de forma independiente. Como se puede observar, los histogramas ofrecieron diferencias en la distribución del marcaje con CD11b y CD45, mostrando la población desplazada hacia la izquierda (menor marcaje con CD45) y levemente hacia abajo (menor marcaje con CD11b). Se detectó este patrón similar en las células teñidas tanto con MitoGreen (Figura 50(A-C)) como con MitoDeepRed (Figura 50(D-F)). Aunque de estas poblaciones se observaron ligeras variaciones características en el grupo CMS en las células marcadas con cada sonda (Figura 50(C y F), segunda columna), en ambas tinciones se puso de manifiesto un aumento considerable en el número de células teñidas con MitoGreen (Figura 50(D), tercera columna) y MitoDeepRed (Figura 50(F), tercera columna) en los grupos CMS cuando se comparó con la situación CT. En este punto, es necesario recalcar que siempre se partió del mismo número de células. Algo afín ocurre en el Hp, donde de nuevo se observó una tendencia del CMS a aumentar la población microglial reclutada (Figura 51), de alrededor de un 15.2-15.9% de los CT al 23.7-23.9% en los grupos CMS. En este caso, el desplazamiento de la población de microglías fue en sentido opuesto a la CF en los grupos CMS, ya que se apreció dicho desplazamiento hacia un aumento del marcaje en CD45 (hacia la derecha) y de CD11b (hacia arriba) (Figura 51(C)). Este hecho fue observado en las microglías teñidas con MitoGreen, pero no en aquellas marcadas con MitoDeepRed (Figura 51(F)). Esta diferencia repercutió en el marcaje de cada sonda, puesto que en la segunda columna de la Figura 51(C y F) se muestra un aumento claro de la tinción con MitoGreen, si bien este incremento fue más sutil en el caso del MitoDeepRed. Concretamente, la tercera columna de la Figura 51(C y F) exhibe cómo el CMS eleva de forma cuantiosa el número de microglías marcadas con MitoGreen, mientras que ocurrió de forma más leve con el MitoDeepRed. Resultados 164 Figura 50. Caracterización mediante citometría de flujo del fenotipo microglial y su perfil mitocondrial en la CF. Cada determinación se corresponde con un pool de dos ratas. Se muestran un ejemplo característico de tinción con Mitogreen (A-C) y otro con MitoDeepRed (D-F). Tras evaluar el tamaño y complejidad de las prepa- raciones, se tomaron los singletes y a partir de ellos, las células vivas gracias al empleo del colorante Hoe- chst. El estudio de la pobla- ción resultante de enfrentar CD11b alto y CD45 medio mostró que el grupo CMS experimentó un aumento de la cantidad de microglía reclutada en la CF tras el protocolo de estrés (A y B). A pesar de que el histograma específico de la mitocondria marcada en cada grupo con MitoGreen (A y B) no reveló importantes diferencias, su superposición (el grupo CT en azul y el CMS en rojo) mostró un incremento de estas en el grupo CMS (C). Dicha inducción de la presencia microglial de la CF fue también observada en las preparaciones teñidas con MitoDeepRed (D-F), donde, aunque tampoco se obtuvieron grandes cambios en el patrón de marcaje de la sonda mitocondrial, la su- perposición de los histogramas evidenció la clara potenciación en el grupo CMS del número de mitocondrias marcadas (F). Se analizaron 8 ratas CT y 8 ratas CMS convertidas en agrupacio- nes de 4 CT y 4 CMS. Resultados 165 Figura 51. Investigación mediante citometría de flujo de las poblaciones microgliales y sus mitocondrias en el Hp. Cada determinación se corresponde con un pool de dos ratas. Se muestran un ejemplo característico de tinción con Mitogreen (A-C) y otro más con Mito- DeepRed (D-F). Impo- niendo los mismos criterios de análisis que en la CF, se detectó una elevación de la cantidad total de microglía en el grupo CMS, si bien fue más leve que en la CF (A y B). Sin embargo, una gran diferencia que se observó con respecto a la CF fue el desplazamiento claro en la tinción con MitoGreen de la microglía (en azul el grupo CT y el rojo el grupo CMS). Además, el solapamiento de ambos histogramas manifestó un incremento de la concentración de mitocondrias marcadas con MitoGreen en las microglías del grupo CMS (C). El estudio con MitoDeepRed no reveló el mismo índice de cambios entre los grupos CT y CMS (D y E). En este caso, aunque también se vio ascendida la población microglial en el grupo CMS del Hp, el marcaje con la sonda no fue muy distinto entre los dos grupos (F), y el solapamiento de ambas situaciones también determinó una elevación en el número de mitocondrias positivas para MitoDeepRed en el grupo CMS, pero más sutil que con el MitoGreen. Se analizaron 8 ratas CT y 8 ratas CMS convertidas en agrupaciones de 4 CT y 4 CMS. Resultados 166 La Figura 52 engloba la estadística sobre las agrupaciones estudiadas. De ella destaca el mayúsculo incremento de la cantidad total de microglía en la CF (Figura 52(A)) desencadenada por el CMS, seguida del evidente ascenso en el marcaje de mitocondrias teñidas con MitoGreen o MitoDeepRed en la misma región (Figura 52(G)). Cuando se emplearon las sondas de forma conjunta en las mismas preparaciones, se observó que en la CF los grupos CT y CMS tenían un marcaje combinado similar, con una mayor elevación de células teñidas con MitoGreen en el grupo CMS (Figura 53). Sin embargo, el Hp mostró una disminución del marcaje simultáneo de ambas tinciones en el grupo CMS, lo que puede además observarse en los histogramas con el desplazamiento hacia la izquierda de la población positiva en MitoGreen y hacia debajo Figura 52. Análisis estadístico de los principales resultados de citometría de flujo. Se observó una inducción en el reclutamiento de microglías en la CF promovido por el CMS (A), mientras que en el Hp se detectó una tendencia similar (B). La evaluación independiente de cada caso reveló tendencias al alza en los grupos CMS del marcaje con MitoGreen en la CF (C) y el Hp (D), además de la sonda MitoDeepRed en primera (E) y segunda región (F) previamente citadas. Cuando se tuvieron en consideración la cantidad total de mitocondrias marcadas con cualquiera de las dos sondas, se obtuvo una subida destacable en el número de mitocondrias teñidas en el CMS en comparación con su CT en la CF (G), mientras que el Hp solo exhibió una tendencia similar al alza (H). Los datos se expresan como la media ± SEM de 8 ratas CT y 8 ratas CMS convertidas en agrupaciones de 4 CT y 4 CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 167 de la positiva para MitoDeepRed. Hubo una tendencia al aumento en la expresión coincidente de las sondas en la CF (Figura 54(A)) y un drástico descenso en el grupo CMS en el Hp comparado con su CT (Figura 54(B)). Figura 53. Estudio de la población microglial que expresa simultáneamente las sondas MitoGreen y MitoDeepRed. Estas evaluaciones partieron de la población de microglía seleccionada previamente, tras la exclusión de dobletes y células muertas mediante el uso del colorante Hoechst. La primera imagen que se muestra es una representación de las poblaciones microgliales consideradas, para evitar la repetición de gráficas. Esta gráfica de ejemplo se corresponde con un CT de la CF. A partir de cada grupo, se compararon los marcajes de MitoDeepRed vs MitoGreen en el mismo plot. La CF muestra una intensificación del marcaje con MitoGreen, si bien sus histogramas solapados no ofrecen cambios sustanciales entre los grupos CT y CMS. Al contrastarlo con el Hp, se apreció que el marcaje coexistente de ambas sondas en el grupo CMS era mucho menor, lo que se ve respaldado por un desplazamiento de los histogramas de estas dos sondas. Cada plot representa los datos obtenidos de una agrupación de muestras procedente de la CF o el Hp. Figura 54. Análisis estadístico de las microglías que expresan concurrentemente las sondas MitoGreen y MitoDeepRed en la CF y el Hp. Se tuvieron en consideración el número de células marcadas con la doble tinción en cada región cerebral, y se concluyó que el CMS provocó una tendencia al incremento del marcaje simultáneo en la CF (A), mientras que el Hp sufrió un descenso brusco de la tinción combinada de las sondas (B) con respecto a su CT. Los datos se expresan como la media ± SEM de 8 ratas CT y 8 ratas CMS convertidas en agrupaciones de 4 CT y 4 CMS. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 168 2. Estudio farmacológico de la autofagia: CMS + espermidina (CMS+SPD) 2.1. Pruebas comportamentales 1) La espermidina tiende a reducir el tiempo de inmovilidad en la prueba de natación forzada Dado que la inyección semanal intraperitoneal de SPD supone para los animales un estrés adicional estrictamente solo comparable con aquellos que recibieron el mismo pinchazo, se muestran los resultados en la primera columna con todos los grupos experimentales y solo los grupos inyectados con vehículo y SPD en la segunda columna (Figura 55). Aunque el grupo CMS mostró una tendencia al alza en cuanto al tiempo en el que permanecieron inmóviles (Figura 55(A)), fue el grupo CMS+sal el que mostró mayormente este fenotipo, a partir del cual se observó una tendencia a disminuir el tiempo de inmovilidad en aquellos animales tratados con SPD (Figura 55(B)). En cuanto al tiempo en el que estuvieron nadando y escalando por las paredes del cilindro, no se registraron cambios entre los grupos, si bien se apreció un leve descenso en el grupo CMS+sal (Figura 55(C y D)). Considerando que se detectó cierta propensión de los grupos CT a sumergirse completamente para impulsarse desde el fondo hacia la superficie, se cuantificó el número de veces que repitieron este gesto (Figura 55(E y F)). Ningún animal CMS mostró este comportamiento, por lo que el tratamiento con SPD no consiguió restaurar este tipo de conducta. 2) La espermidina condicionaría a desarrollar un comportamiento menos ansioso en las ratas CT La prueba de campo abierto puso de manifiesto la tendencia del grupo CMS+sal a estar más veces en la parte externa del campo, apuntando a mayores índices de ansiedad, a la vez que se pudo apreciar una tendencia a la baja en este patrón de conducta en el grupo CMS tratado con SPD (Figura 56(A y B)). Sin embargo, no hubo diferencias intergrupales en lo relativo al tiempo empleado en esta sección del campo (Figura 56(C y D)). Asimismo, las ratas CT+SPD visitaron más veces la zona interna (Figura 56(E y F)), donde pasaron más tiempo (Figura 56(G y H)), mostrando la capacidad de la SPD para Resultados 169 inducir un fenotipo con menores índices de ansiedad en las ratas CT y CT+sal. Este comportamiento no se observó tras la exposición al modelo CMS. 3) La espermidina mostró una tendencia a mejorar los índices de anhedonia generados por el modelo CMS El grupo CMS+sal mostró un mayor tiempo de latencia en cuanto al tiempo necesario para el comienzo de la higiene (Figura 57(A y B)), mientras que en el grupo tratado con Figura 55. Prueba de natación forzada en el modelo CMS+SPD. Las ratas fueron sumergidas en cilindros con agua templada durante 5 min y se contabilizaron el tiempo de inmovilidad (A y B), el tiempo nadando y escalando (C y D) y el número de veces que bucearon para impulsarse hacia la superficie (E y F). Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas por grupo considerado. Las gráficas representan los resultados tras el ANOVA de dos vías. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa. Resultados 170 SPD fue inferior. Además, el grupo CMS+sal redujo el tiempo empleado para dicha higiene (Figura 57(C y D)), así como la cantidad de veces de ese acicalado (Figura 57(E y F)). El tratamiento con SPD hizo que la duración y el número de veces de acicalamiento en las ratas expuestas al CMS fuese mayor, a niveles incluso algo superiores a la situación mostrada por el grupo CT+sal (Figura 57(C-F)). Figura 56. Prueba de campo abierto en el modelo CMS+SPD. Los grupos estudiados fueron evaluados según la cantidad de veces y el tiempo que empelaron en la parte externa de la caja (A-D) y los mismos valores, pero en la zona central o interna de la caja (E-H). Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas por grupo considerado. Las gráficas muestran el análisis ANOVA de dos vías. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa. Resultados 171 2.2. Vía de la autofagia 4) El grupo CT presentó elevados niveles de estrés y la espermidina también aumentó dichos valores independientemente del modelo CMS Figura 57. Prueba Splash en el modelo CMS+SPD. Se aplicó una solución azucarada sobre el lomo de los animales y se contabilizó el tiempo que tardaron en empezar a limpiarse (A y B), el tiempo que pasaron acicalándose (C y D) y la cantidad de veces que lo hicieron (E y F). Las gráficas muestran los resultados procedentes del análisis ANOVA de dos vías. Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas por grupo considerado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 172 El análisis de la corticosterona en el modelo CMS+SPD mostró que sus niveles alcanzados en el grupo CT superaron tres veces el umbral de los normalmente registrados (Figura 29), mientras que el grupo CT+sal sí que exhibió valores habituales (Figura 58). Además, se observó la tendencia al alza en los niveles de corticosterona en el grupo CMS+sal. Por último, la administración de SPD incrementó los valores de corticosterona sistémicos tanto en el grupo CT como en el CMS. A la luz de estos resultados, y considerando, como se indicó previamente, que el grupo CT+sal es estrictamente el grupo control que recibió la misma frecuencia de inyecciones y manipulación que los grupos con SPD, los datos obtenidos a nivel bioquímico serán mostrados y cuantificados con respecto a los valores del grupo CT+sal. 5) La espermidina restableció a niveles fisiológicos las proteínas p-mTOR, mTOR, p-SQSTM1 y Beclin1 en la CF La cuantificación de proteínas de la vía de la autofagia tras la exposición al modelo CMS y el tratamiento con SPD fue realizada en parámetros con algún tipo de alteración ya descrita. Estos análisis revelaron que las formas fosforilada y total de mTOR, así como únicamente la forma fosforilada de SQSTM1/p62 y Beclin1 presentaron concentraciones proteicas semejantes a las condiciones control en la CF (Figura 59). Atg7 también manifestó la misma tendencia (Figura 59(F)). Además, se detectó la capacidad de la SPD a subir los niveles de las dos formas de SQSTM1/p62 independientemente del modelo de estrés crónico (Figura 59(G y H)). Figura 58. Niveles de corticosterona plasmática en el modelo CMS+SPD. Se muestran los resultados procedentes del análisis ANOVA de dos vías, expresándose como la media ± SEM de 7-9 ratas por grupo. Resultados 173 Figura 59. Evaluación de la expresión proteica de marcadores autofágicos en el modelo CMS+SPD de la CF. Se muestran los resultados procedentes del análisis ANOVA de dos vías. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas por grupo. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 174 6) Las proteínas hipocampales no mostraron mejora tras el tratamiento con espermidina, a excepción de Atg12 El estudio de la autofagia en el Hp apuntó que, si bien el CMS fue el principal responsable de todas las modificaciones observadas (Tabla 9), la administración de SPD consiguió restaurar únicamente la concentración proteica de Atg12, previamente disminuida por el CMS (Figura 60(F)). Asimismo, la SPD decreció los valores de las dos isoformas de LC3 en el grupo CMS+SPD, pero no en el CT+SPD (Figura 60(J y K)). Figura 60. Análisis de proteínas implicadas en la autofagia en el Hp del modelo CMS+SPD. Se muestran los resultados procedentes del análisis ANOVA de dos vías. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas por grupo. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 175 7) La espermidina no reduce la inducción de la expresión génica de Atg7 en la CF, aunque potencia la de Atg12 en el grupo CMS+SPD Los experimentos de RT-qPCR sobre los distintos grupos experimentales revelaron que Atg7, el único gen hallado elevado anteriormente en la CF tras la exposición al CMS, no redujo sus niveles de transcripción en el grupo CMS+SPD tras la administración del inductor. Sin embargo, se observó una clara tendencia a inducir su expresión al inyectarse en el grupo CT+SPD (Figura 61(A)). Paralelamente, se apreció un efecto de inducción sinérgica del gen Atg12 por el modelo y el tratamiento en el grupo CMS+SPD, cuyos niveles de expresión génica se triplicaron (Figura 61(B)). 8) La espermidina sobreestimula la expresión génica de Atg3, Atg5, Atg7 y Atg12 en ratas expuestas al CMS en el Hp La cuantificación de la expresión génica de los parámetros alterados en el Hp previamente descritos en el modelo CMS (Figura 29) reafirmó que este induce la expresión de los genes hipocampales Atg3, Atg5, Atg7 y Atg12 (Figura 62 y Tabla 9). De los cuatro genes se observó el mismo patrón: el efecto activador sinérgico en estos ocasionado tras la combinación del modelo de estrés y el tratamiento con el inductor autofágico (Figura 62(A-D)). Curiosamente, no se detectó dicha capacidad de inducción en las ratas CT+SPD. Figura 61. Resultados de RT-qPCR del modelo CMS+SPD en la CF. Se muestran los datos del gen Atg7 (A) y Atg12 (B). El resto de los genes de la ruta de autofagia no mostraron cambios en esta región. Las gráficas representan el análisis ANOVA de dos vías. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas por grupo considerado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 176 9) La espermidina regula de forma diferente las proteínas de la maquinaria ESCRT en la CF Los resultados del tratamiento con SPD fueron muy variados en los distintos complejos de la maquinaria ESCRT (Figura 63): la SPD disminuyó los niveles proteicos de Hrs independientemente del modelo de estrés, aunque su efecto fue más notorio en el grupo CMS+SPD (Figura 63(A)); aunque la SPD también redujo los niveles de STAM2 en el grupo CT+SPD comparado con el CT+sal, la combinación CMS+SPD potenció ampliamente su presencia proteica (Figura 63(B)); Tsg101, Vps28 y Vps37A vieron incrementados sus valores proteicos en el grupo CMS+SPD con respecto al CMS, pese a que solo Tsg101 manifestó su propensión a ser inducida por la SPD en el grupo CT+SPD (Figura 63(C, D y E)); por último, los niveles de CHMP6 disminuyeron tanto en relación al grupo CT+sal, como al grupo CMS (Figura 63(G)). Figura 62. Resultados de RT-qPCR del modelo CMS+SPD en el Hp. Se muestran los datos de los genes Atg3 (A), Atg5 (B), Atg7 (C) y Atg12 (D). El resto de los genes de la ruta de autofagia no mostraron cambios en esta región. Las gráficas representan el análisis ANOVA de dos vías. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas por grupo considerado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 177 10) La espermidina reduce los niveles proteicos de Vps37A elevados por el CMS, y consigue mejorar ligeramente los de Gal9 en el Hp La SPD no incrementó los valores reducidos de la proteína Tsg101 en el Hp como sí que lo hizo en la CF (Figura 64(A)). Los factores Vps37A y Vps4B recuperaron su expresión proteica en el grupo CMS+SPD en comparación con el grupo CMS (Figura 64(B y C)). Gal9 también exhibió una regulación distinta por la SPD a la de la CF, ya que esta causó la reducción de su concentración en ratas CT+SPD, acrecentándola en el grupo CMS+SPD en comparación con el grupo CMS, pero sin restablecer los valores normales (Figura 64(D)). Figura 63. Cuantificación de la expresión proteica de la maquinaria ESCRT del modelo CMS+SPD en la CF. Se muestran los cambios en las proteínas que anteriormente se describieron modificaciones a causa del CMS. Las gráficas representan el análisis ANOVA de dos vías. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas por grupo considerado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 178 2.3. Vía de la mitofagia 11) La espermidina tiende a regular proteínas involucradas en la mitofagia, a la vez que modula la fisión mitocondrial pero no la fusión en la CF La evaluación de los extractos citosólicos en el modelo CMS+SPD reveló que las concentraciones proteicas de Parkin y Pink1, previamente incrementadas y disminuidas respectivamente por el modelo de estrés crónico en la CF, se normalizaron tras el tratamiento con SPD, aunque Pink1 presentó valores sobreexpresados con respecto al CT+sal (Figura 65(A y B)). En FUNDC1 no se observaron cambios derivados de la administración de SPD (Figura 65(C)), ni en las proteínas de fusión mitocondrial Mfn1 y Mfn2 (Figura 65(E y F)). La SPD acrecentó los niveles de p-Drp1 en las ratas CT+SPD, aun cuando los redujo en el grupo CMS+SPD, anteriormente elevados a causa del modelo (Figura 65(G)). La forma total de la proteína Drp1 también apuntó a la tendencia de verse inducida por el tratamiento con SPD (Figura 65(I)). Figura 64. Análisis de la expresión proteica de la maquinaria ESCRT del modelo CMS+SPD en el Hp. Se representan las proteínas en las que anteriormente se describieron modificaciones a causa del CMS. Las gráficas representan el análisis ANOVA de dos vías. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas por grupo considerado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 179 Figura 65. Evaluación de la expresión proteica de factores involucrados en la mitofagia, fusión y fisión mitocondrial en extractos citosólicos de la CF en el modelo CMS+SPD. Se representan las proteínas en las que anteriormente se describieron modificaciones a causa del CMS. Las gráficas representan el análisis ANOVA de dos vías. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas por grupo considerado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 180 12) La espermidina tiende a restaurar los niveles proteicos de Nrf1 en la CF y el Hp, y de Mtfa en el Hp Las proteínas implicadas en la mediación de la biogénesis mitocondrial que sufrieron modificaciones a causa del modelo CMS fueron reevaluadas en extractos nucleares, a partir de los cuales se determinó que, si bien Nrf1 no tuvo una bajada de su presencia proteica significativa en la CF (Figura 41(Aii)), la SPD exhibió cierta propensión a elevarla (Figura 66(A)). En el Hp se observó el mismo patrón, aunque en este caso, la SPD también aumentó los niveles de Nrf1 en ratas CT (Figura 66(B)). En cuanto a Mtfa, el grupo CMS+SPD presentó valores más similares a los CT+sal, ligeramente elevados con respecto al grupo CMS+sal, y una reducción de su nivel proteico en las ratas CT+SPD (Figura 66(C)). 13) La espermidina no disminuye los niveles de los genes Parkin, Pgc1α, Nrf1 y Mfn1 previamente inducidos por el CMS en la CF Los genes relacionados con el estatus mitocondrial previamente descritos con modificaciones derivadas del protocolo de CMS fueron de nuevo evaluados. Ninguno de los cuatro marcadores vieron descendida su expresión en el grupo CMS+SPD (Figura Figura 66. Resultados de WB en extractos nucleares sobre proteínas implicadas en la mitogénesis del modelo CMS+SPD. (A) exhibe la proteína Nrf1 en la CF, mientras que (B) la presenta en el Hp. (C) enseña la proteína Mtfa en esta última estructura. El resto de los marcadores no mostraron modificaciones. Las gráficas representan el análisis ANOVA de dos vías. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas por grupo considerado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa. Resultados 181 67), aunque se observó cierta tendencia a la baja en los genes Parkin y Mfn1 (Figura 67(A y D)). Además, los genes involucrados en la biogénesis mitocondrial Pgc1α y Nrf1 mostraron una propensión a su inducción en el grupo CT+SPD (Figura 67(B y C)). 14) La espermidina normaliza la concentración de las proteínas Pink1 y BNIP3, mientras que desregula la fusión mitocondrial en el Hp Para los valores proteicos citosólicos de Parkin, que el modelo CMS disminuyó en el Hp, la SPD no supuso ningún efecto beneficioso y, de hecho, redujo su concentración en las ratas CT+SPD (Figura 68(A)). Sin embargo, esta consiguió restaurar los niveles sobreactivados de las proteínas Pink1 y BNIP3 (Figura 68(B y D)). Las proteínas encargadas de la fusión mitocondrial experimentaron una modulación opuesta en los grupos CMS+SPD que la ejercida únicamente por el modelo CMS, sobrepasando la concentración del grupo CT+sal en el caso de la Mfn1 (Figura 68(E)) y descendiendo con respecto a esta en las proteínas Mfn2 y OPA1 (Figura 68(F y G)). Figura 67. Resultados de RT-qPCR del modelo CMS+SPD en la CF sobre marcadores mitocondriales. Se muestran los datos de los genes Parkin (A), Pgc1α (B), Nrf1 (C) y Mfn1 (D). El resto de los genes implicados en mitofagia, mitogénesis y fusión/fisión mitocondrial no mostraron cambios en esta región. Las gráficas representan el análisis ANOVA de dos vías. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas por grupo considerado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa. Resultados 182 Figura 68. Evaluación de la expresión proteica de factores involucrados en la mitofagia, fusión y fisión mitocondrial en extractos citosólicos del Hp en el modelo CMS+SPD. Se representan las proteínas en las que anteriormente se describieron modificaciones a causa del CMS. Las gráficas representan el análisis ANOVA de dos vías. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas por grupo considerado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 183 15) La espermidina sobreactivó la expresión de genes relacionados con la mitofagia, mitogénesis y fusión/fisión mitocondrial en el Hp Parkin, cuya expresión génica exhibió una tendencia al alza tras la exposición al CMS en el Hp (Figura 40), junto con Fundc1 experimentaron una considerable elevación de su transcripción génica en el grupo CMS+SPD, hasta dos veces superior del efecto mediado únicamente por el CMS (Figura 69). Los niveles de ARNm de los genes Pgc1α y Nrf1, responsables de la mitogénesis, en el grupo CMS+SPD se triplicaron en comparación al grupo CT+sal (Figura 69(C y D)), detectándose también incrementados en el grupo CMS, pero en menor medida. La administración de SPD en las ratas expuestas al CMS también aumentó considerablemente la presencia de los genes Mfn1 (fusión) y Dpr1 (fisión), siendo menos exacerbada en el grupo CMS (Figura 69(E y F)). Por tanto, todos los genes evaluados relacionados con la homeostasis mitocondrial exhibieron el mismo patrón de sobreactivación en el grupo CMS+SPD del Hp. Las Tablas 8 y 9 muestran los resultados de los análisis estadísticos ANOVA de dos vías de todos los elementos evaluados del modelo CMS+SPD en este apartado, distinguiendo entre pruebas comportamentales, y los estudios de expresión proteica y génica. La Tabla 8 ofrece la información concerniente a la CF, mientras que la Tabla 9 lo hace con respecto al Hp. Resultados 184 Figura 69. Resultados de ARNm del modelo CMS+SPD en el Hp sobre marcadores mitocondriales. Se muestran los datos de los genes Parkin (A), Fundc1 (B), Pgc1α (C), Nrf1 (D), Mfn1 (E) y Drp1 (F). El resto de los genes implicados en mitofagia, mitogénesis y fusión mitocondrial no mostraron cambios en esta región. Las gráficas representan el análisis ANOVA de dos vías. Los datos se expresan como la media ± SEM de 7-9 ratas por grupo considerado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 185 Parámetro CMS SPD Interacción p-mTOR (prot) F(1,28)=20.4; p=0.0001*** F(1,28)=8.243; p=0.00077** F(1,28)=38.9; p<0.0001**** mTOR (prot) F(1,28)=6.033; p=0.0205* F(1,28)=4.143; p=0.0514 F(1,28)=26.2; p<0.0001**** p-ULK1 (prot) F(1,28)=57.3; p<0.0001**** F(1,28)=3.358; p=0.0775 F(1,28)=4.954; p=0.0343* ULK1 (prot) F(1,28)=77; p<0.0001**** F(1,28)=2.898; p=0.0998 F(1,28)=1.454; p=0.2379 p-SQSTM1 (prot) F(1,28)=3.074; p=0.0905 F(1,28)=14.92; p=0.0006*** F(1,28)=4.759; p=0.0377* SQSTM1 (prot) F(1,28)=0.07272; p=0.7894 F(1,28)=7.046; p=0.013* F(1,28)=0.7213; p=0.4029 Beclin1 (prot) F(1,28)=1.696; p=0.2034 F(1,28)=3.895; p=0.0584 F(1,28)=5.613; p=0.025* Atg3 (prot) F(1,28)=5.219; p=0.0301* F(1,28)=1.987; p=0.1697 F(1,28)=3.712; p=0.0642 Atg7 (prot) F(1,28)=4.578; p=0.0412* F(1,28)=6.347; p=0.0177* F(1,28)=4.098; p=0.0526 Atg16L1 (prot) F(1,28)=10.57; p=0.003** F(1,28)=0.04292; p=0.8374 F(1,28)=0.4592; p=0.5036 LC3I (prot) F(1,28)=3.629; p=0.0671 F(1,28)=1.144; p=0.2939 F(1,28)=1.682; p=0.2053 LC3II (prot) F(1,28)=0.4960; p=0.4871 F(1,28)=0.2589; p=0.6149 F(1,28)=3.039; p=0.0923 Hrs (prot) F(1,28)=3.586; p=0.0683 F(1,28)=56.72; p<0.0001**** F(1,28)=4.993; p=0.0333* STAM2 (prot) F(1,28)=16.6; p=0.0003*** F(1,28)=27.60; p<0.0001**** F(1,28)=103; p<0.0001**** Tsg101 (prot) F(1,28)=13.38; p=0.001** F(1,28)=26.87; p<0.0001**** F(1,28)=0.01309; p=0.9097 Vps28 (prot) F(1,28)=4.84; p=0.0362* F(1,28)=0.2359; p=0.6310 F(1,28)=8.111; p=0.0082** Vps37A (prot) F(1,28)=2.563; p=0.1206 F(1,28)=11.10; p=0.0024** F(1,28)=5.653; p=0.0245* Gal3 (prot) F(1,28)=6.708; p=0.0151* F(1,28)=0.01126; p=0.9162 F(1,28)=1.152; p=0.2924 Gal9 (prot) F(1,28)=8.338; p=0.0074** F(1,28)=0.000196; p=0.9889 F(1,28)=0.02227; p=0.8824 CHMP5 (prot) F(1,28)=8.295; p=0.0075** F(1,28)=10.10; p=0.0036** F(1,28)=0.01530; p=0.9024 CHMP6 (prot) F(1,28)=0.15121; p=0.7003 F(1,28)=12.06; p=0.0017** F(1,28)=8.333; p=0.0074** Parkin (prot) F(1,28)=1.854; p=0.1841 F(1,28)=9.118; p=0.0054** F(1,28)=3.443; p=0.0741 Pink1 (prot) F(1,28)=1.329; p=0.2587 F(1,28)=10.57; p=0.003** F(1,28)=4.649; p=0.0398* FUNDC1 (prot) F(1,28)=6.837; p=0.0142* F(1,28)=1.547; p=0.2239 F(1,28)=2.490; p=0.1258 Mfn1 (prot) F(1,28)=8.658; p=0.0065** F(1,28)=0.00073; p=0.9787 F(1,28)=0.2845; p=0.5980 Mfn2 (prot) F(1,28)=0.7194; p=0.4035 F(1,28)=0.7771; p=0.3855 F(1,28)=0.1301; p=0.7211 p-DRP1 (prot) F(1,28)=0.02101; p=0.8858 F(1,28)=0.4175; p=0.5235 F(1,28)=16.3; p=0.0004*** DRP1 (prot) F(1,28)=1.858; p=0.1837 F(1,28)=8.342; p=0.0074** F(1,28)=1.141; p=0.2946 Nrf1 (prot) F(1,28)=0.4663; p=0.5005 F(1,28)=1.407; p=0.2459 F(1,28)=1.678; p=0.2061 Atg7 (mRNA) F(1,28)=2.381; p=0.1349 F(1,28)=2.855; p=0.1031 F(1,28)=3.503; p=0.0726 Atg12 (mRNA) F(1,28)=31.8; p<0.0001**** F(1,28)=8.286; p=0.0079** F(1,28)=8.251; p=0.008** Parkin (mRNA) F(1,28)=9.512; p=0.0047** F(1,28)=0.07407; p=0.7876 F(1,28)=2.532; p=0.1232 Mfn1 (mRNA) F(1,28)=5.709; p=0.0244* F(1,28)=2.051; p=0.1640 F(1,28)=2.015; p=0.1676 Pgc1α (mRNA) F(1,28)=5.459; p=0.0274* F(1,28)=1.632; p=0.2127 F(1,28)=1.41; p=0.2459 Nrf1 (mRNA) F(1,28)=21.3; p<0.0001**** F(1,28)=17.42; p=0.0003*** F(1,28)=2.181; p=0.1513 NF inmovilidad F(1,28)=3.543; p=0.0706 F(1,28)=2.151; p=0.1540 F(1,28)=0.8557; p=0.3631 NF nado F(1,28)=2.339; p=0.1374 F(1,28)=1.659; p=0.2083 F(1,28)=1.059; p=0.3122 NF buceo F(1,28)=7.27; p=0.0126* F(1,28)=0.02014; p=0.8883 F(1,28)=0.02014; p=0.8883 CA veces externa F(1,28)=4.917; p=0.0349* F(1,28)=2.7; p=0.1115 F(1,28)=0.333; p=0.5685 CA veces interna F(1,28)=0.2438; p=0.6255 F(1,28)=0.4344; p=0.5154 F(1,28)=3.636; p=0.0672 CA tiempo externa F(1,28)=0.05352; p=0.8188 F(1,28)=0.002004; p=0.9646 F(1,28)=4.947; p=0.0347* CA tiempo interna F(1,28)=1.795; p=0.1911 F(1,28)=1.073; p=0.3091 F(1,28)=4.426; p=0.0445* Splash latencia F(1,28)=1.024; p=0.3205 F(1,28)=0.2265; p=0.6380 F(1,28)=1.222; p=0.2787 Splash acicalamiento F(1,28)=0.1829; p=0.6721 F(1,28)=1.768; p=0.1944 F(1,28)=1.193; p=0.2841 Splash veces acical. F(1,28)=0.1501; p=0.7013 F(1,28)=1.994; p=0.1686 F(1,28)=1.409; p=0.2448 Corticosterona F(1,28)=0.1482; p=0.7033 F(1,28)=4.774; p=0.0377* F(1,28)=0.09945;p=0.7549 Tabla 8. Resumen de los análisis ANOVA de dos vías en la CF del modelo CMS+SPD. Se desglosan los datos obtenidos para cada estímulo (CMS y SPD), junto con su p valor. No se tuvieron en cuenta las comparaciones múltiples de los grupos CT y CMS. Los resultados con cambio significativo se destacan en negrita y color azul. Las siglas «NF» hacen referencia a la prueba de natación forzada y «CA» a la de campo abierto. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 186 Parámetro CMS SPD Interacción p-mTOR (prot) F(1,28)=32.1; p<0.0001**** F(1,28)=8.953; p=0.0057** F(1,28)=1.061; p=0.3119 mTOR (prot) F(1,28)=8.736; p=0.0063** F(1,28)=0.02116; p=0.8854 F(1,28)=0.1116; p=0.7408 p-SQSTM1 (prot) F(1,28)=69.4; p<0.0001**** F(1,28)=12.68; p=0.0013** F(1,28)=3.594; p=0.0683 SQSTM1 (prot) F(1,28)=29.8; p<0.0001**** F(1,28)=1.097; p=0.3038 F(1,28)=0.05249; p=0.8204 Beclin1 (prot) F(1,28)=28.6; p<0.0001**** F(1,28)=2.764; p=0.1076 F(1,28)=0.4041; p=0.5301 Atg3 (prot) F(1,28)=20.32; p=0.0001*** F(1,28)=19.08; p=0.0002*** F(1,28)=0.8229; p=0.3721 Atg12 (prot) F(1,28)=15.20; p=0.0006*** F(1,28)=4.346; p=0.0463* F(1,28)=5.798; p=0.0229* Atg16L1 (prot) F(1,28)=21.6; p<0.0001**** F(1,28)=1.184; p=0.2859 F(1,28)=0.2401; p=0.6279 LC3I (prot) F(1,28)=8.33; p=0.0074** F(1,28)=0.307; p=0.5839 F(1,28)=0.4788; p=0.4946 LC3II (prot) F(1,28)=43.7; p<0.0001**** F(1,28)=18.56; p=0.0002*** F(1,28)=30; p<0.0001**** Tsg101 (prot) F(1,28)=4.277; p=0.048* F(1,28)=0.74; p=0.397 F(1,28)=0.9143; p=0.3472 Vps37A (prot) F(1,28)=0.0041; p=0.9494 F(1,28)=0.9844; p=0.3296 F(1,28)=10.37; p=0.0032** Vps4B (prot) F(1,28)=1.605; p=0.2156 F(1,28)=1.37; p=0.2517 F(1,28)=5.032; p=0.033* Gal9 (prot) F(1,28)=30.7; p<0.0001**** F(1,28)=4.738; p=0.0381* F(1,28)=52; p<0.0001**** Parkin (prot) F(1,28)=21.9; p<0.0001**** F(1,28)=9.807; p=0.004** F(1,28)=9.362; p=0.0048** Pink1 (prot) F(1,28)=2.470; p=0.1273 F(1,28)=15.59; p=0.0005*** F(1,28)=10.35; p=0.0033** FUNDC1 (prot) F(1,28)=15; p=0.0006*** F(1,28)=0.5592; p=0.4608 F(1,28)=0.0118; p=0.9142 BNIP3 (prot) F(1,28)=31; p<0.0001**** F(1,28)=6.634; p=0.0156* F(1,28)=13.8; p=0.0009*** Mfn1 (prot) F(1,28)=0.0326; p=0.858 F(1,28)=16.2; p=0.0004*** F(1,28)=7.201; p=0.0121* Mfn2 (prot) F(1,28)=7.779; p=0.0094** F(1,28)=5.212;p=0.0302* F(1,28)=5.958; p=0.0212* OPA1 (prot) F(1,28)=0.1947; p=0.6624 F(1,28)=4.901; p=0.0352* F(1,28)=31.5 p<0.0001**** DRP1 (prot) F(1,28)=8.503; p=0.0069** F(1,28)=0.5755; p=0.4544 F(1,28)=0.03115; p=0.861 Nrf1 (prot) F(1,28)=9.568; p=0.0047** F(1,28)=15.61; p=0.0005*** F(1,28)=0.0273; p=0.87 Mtfa (prot) F(1,28)=0.7387; p=0.3979 F(1,28)=0.04052; p=0.8420 F(1,28)=4.372; p=0.0465* Atg3 (mRNA) F(1,28)=47.5; p<0.0001**** F(1,28)=8.458; p=0.0072** F(1,28)=6.682; p=0.0155* Atg5 (mRNA) F(1,28)=196; p<0.0001**** F(1,28)=38.53; p<0.0001**** F(1,28)=24.8; p<0.0001**** Atg7 (mRNA) F(1,28)=78.0; p<0.0001**** F(1,28)=7.328; p=0.0116* F(1,28)=3.221; p=0.0839 Atg12 (mRNA) F(1,28)=109; p<0.0001**** F(1,28)=14.24; p=0.0008*** F(1,28)=8.433; p=0.0073** Parkin (mRNA) F(1,28)=114; p<0.0001**** F(1,28)=21.87; p<0.0001**** F(1,28)=15.7; p=0.0005*** Fundc1 (mRNA) F(1,28)=37.4; p<0.0001**** F(1,28)=3.573; p=0.0695 F(1,28)=1.955; p=0.1735 Mfn1 (mRNA) F(1,28)=82.4; p<0.0001**** F(1,28)=18.87; p=0.0002*** F(1,28)=11.08; p=0.0025** Drp1 (mRNA) F(1,28)=94.81;p<0.0001**** F(1,28)=16.01; p=0.0004*** F(1,28)=7.505; p=0.0108* Pgc1α (mRNA) F(1,28)=314; p<0.0001**** F(1,28)=61; p<0.0001**** F(1,28)=43; p<0.0001**** Nrf1 (mRNA) F(1,28)=76.8; p<0.0001**** F(1,28)=10.67; p=0.003** F(1,28)=5.899; p=0.0221* Tabla 9. Resumen de los análisis ANOVA de dos vías en el Hp del modelo CMS+SPD. Se desglosan los datos obtenidos para cada estímulo (CMS y SPD), junto con su p valor. No se tuvieron en cuenta las comparaciones múltiples de los grupos CT y CMS. Los resultados con cambio significativo se destacan en negrita y color azul. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 187 3. Modelo experimental de trastornos relacionados con el neurodesarrollo: Poly I:C + Aislamiento 3.1. Pruebas comportamentales 1) El grupo Poly I:C presentó una mayor locomoción que los CT en la prueba de campo abierto La evaluación del número de veces que pasaron los distintos grupos en la zona externa de la caja reveló una tendencia al alza en el grupo doble hit al compararlo con el grupo CT a través de la t de Student (Figura 70(A)). Sin embargo, el tiempo que pasaron en ella no se vio alterado (Figura 70(B)). Al contar la frecuencia con la que estuvieron en la parte interna de la caja, también se observó una tendencia al aumento (Figura 70(C)), al igual que en el tiempo que estuvieron en ella (Figura 70(D)). Al hacer la comparativa intergrupal mediante el ANOVA de una vía, se comprobó que el grupo Poly I:C pasó más tiempo en la zona externa de la caja que el grupo Iso (Figura 70(E)), pero a la vez pasó menos tiempo en ella con respecto a los grupos CT e Iso (Figura 70(F)). Al contabilizar el tiempo que estuvieron en la parte interna de la caja, se observó una elevación considerable de este en el grupo Poly I:C con relación a los otros tres grupos y, si bien el grupo Iso tuvo unos valores similares al grupo CT, el doble hit pasó más tiempo que el grupo Iso, y en un estadio intermedio entre los CT y los Poly I:C (Figura 70(H)). El incremento de la cantidad de veces pasadas en la zona externa y en la interna del grupo Poly I:C (se observa una tendencia clara en la Figura 70(G)), así como el tiempo invertido en esta última, lleva concluir que el Poly I:C contribuye a la hiperlocomoción de los animales, efecto compensado por el aislamiento en el grupo Poly+Iso. El análisis ANOVA de dos vías demostró que el Poly I:C tuvo efecto en todas las variables estudiadas, aunque el segundo estímulo solo lo tuvo en los tiempos empleados en la zona interna y externa. Además, se registró interacción de ambos estresores en el tiempo pasado en la zona interna (Tabla 10). 2) El grupo Poly+Iso mostró menor comportamiento de tipo ansioso que el grupo Poly I:C La evaluación a través de la t de Student entre los grupos CT y Poly+Iso no mostró diferencias ningún parámetro considerado (Figura 71(A-F)), si bien se observaron Resultados 188 tendencias al alza en el tiempo que pasaron en los brazos abiertos y en la ratio de tiempo (Figuras 71(D y F)) y a la baja en el tiempo empleado en los brazos cerrados (Figura 71(E)). En cuanto al análisis de ANOVA de una vía, nuevamente se apreciaron cambios en los tiempos empleados en cada tipo de brazo y su ratio. Se detectó un aumento del tiempo en los brazos abiertos del grupo Poly+Iso con respecto al Poly I:C (Figura 71(K)), y el patrón inverso en el tiempo pasado en los brazos cerrados (Figura 71(G)). Al considerar la ratio entre ambos tiempos, quedó patente que el grupo Poly I:C había pasado menor tiempo en los brazos abiertos que el grupo Poly+Iso (Figura 71(M)), apuntando a una mayor propensión a conductas de ansiedad del primer grupo en comparación con el segundo. El ANOVA de dos vías demostró seguidamente que el segundo hit ejerció efectos en el tiempo empleado en los brazos abiertos, cerrados y en la ratio entre los dos (Tabla 10). Figura 70. Prueba de campo abierto en el modelo Poly+Iso. La t de Student no reveló cambios significativos entre los grupos CT y Poly+Iso, aunque el ANOVA de una vía mostró alteraciones en el grupo Poly I:C en el número de veces que visitaron la zona externa de la caja (E) y el tiempo en esta (F), así como el tiempo en la zona interna (H). Además, no solo aumentó el tiempo en esta zona los animales Poly I:C con respecto al CT, sino también los Poly+Iso con respecto al grupo Iso, ambos en menor medida que el Poly I:C (H). Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas por grupo considerado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01; ***p<0.001). Resultados 189 Figura 71. Laberinto en cruz elevado en el modelo Poly+Iso. No se apreciaron cambios entre los grupos CT y Poly+Iso en las visitas a los brazos abiertos o cerrados, ni en el tiempo consumido en ellos (A-F). El ANOVA de una vía desveló la diferencia intergrupal entre el grupo Poly I:C y el grupo doble hit, puesto que el primero mostró una disminución en el tiempo empleado en los brazos abiertos (K) y un incremento en los brazos cerrados (L) con respecto al Poly+Iso. La ratio de ambos tiempos apoyó esta diferencia (M). Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas por grupo considerado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 190 3.2. Vía de la autofagia 3) La acción combinada del Poly I:C y el aislamiento disminuye las proteínas ULK1 y SQSTM1 en la CF, aunque también se observan cambios en mTOR, p-SQSTM1 y Atg16L1 El modelo condujo a la disminución de las proteínas ULK1 y SQSTM1, comparado con sus respectivos CT (Figura 72). Sin embargo, el análisis global de los cuatro grupos originalmente evaluados mediante ANOVA de una vía, en la que se comparan todos los grupos indistintamente entre sí, se obtuvieron variaciones en las proteínas mTOR, p- SQSTM1 y Atg16L1 (Figura 73(B, F e I)), además de las dos previamente mencionadas (Figura 73(D y G)). De estas tres últimas, destacó que el grupo Poly I:C presentó una elevación en su expresión proteica en comparación con su CT (en el caso de mTOR) y con respecto al grupo doble hit. Seguidamente, se llevó a cabo el estudio de estos mismos elementos mediante ANOVA de dos vías, para estudiar en mayor profundidad la relación entre los dos estímulos independientes, y comprobar si existían o no fenómenos de potenciación. La Tabla 10 exhibe los resultados de dicho análisis, en el que se destacaron los marcadores que de alguna forma se vieron modificados. Figura 72. WB de los marcadores de autofagia estudiados en el modelo doble hit Poly I:C y aislamiento social. La gráfica muestra la comparativa entre los grupos CT y doble hit, que fueron analizados mediante la t de Student de dos colas. El doble hit únicamente alteró las proteínas ULK1 y SQSTM1 en la CF. Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas CT y 9 ratas Poly+Iso. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 191 Figura 73. Evaluación mediante WB de la expresión proteica de mediadores de la vía de la autofagia en todos los grupos del modelo Poly I:C+aislamiento. El análisis mediante ANOVA de una vía mostró modificaciones en mTOR (B), ULK1 (D), p-SQSTM1 (F), SQSTM1 (G), y Atg16L1 (I). El grupo Poly I:C experimentó un aumento de mTOR en comparación con su CT y el grupo doble hit (B), mientras que ULK1 (D), p-SQSTM1 (F), SQSTM1 (G) y Atg16L1 (I) lo sufrieron en comparación con el grupo Poly+Iso. Además, el grupo Iso vio reducidos sus niveles proteicos de p-SQSTM1 (F) y su proteína total (G) en comparación con el grupo Poly I:C. Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 192 4) El Poly I:C+aislamiento no altera la expresión genética de los efectores de autofagia, aunque la isoforma α de Lc3 disminuyó en el doble hit La equiparación entre los grupos CT y doble hit de los genes estudiados implicados en la vía de la autofagia mediante la t de Student no reveló alteración alguna entre ambos grupos en la CF (Figura 74). En la misma línea se mantuvieron los análisis de ANOVA de una vía de los cuatro grupos considerados en el estudio (Figura 75), donde no se observaron cambios en la expresión genética de los efectores, con la salvedad de Lc3α. Esta mostró una disminución de su expresión mediante RT-qPCR en el grupo Poly+Iso en comparación con los grupos CT y Poly I:C (Figura 75(J)). Aunque no se apreciaron fenómenos de interacción a nivel de expresión genética, el análisis por ANOVA de dos vías dictaminó que el aislamiento social fue causante de las variaciones observadas en los genes Beclin1 y Lc3α, así como en las proteínas ULK1, p-SQSTM1, SQSTM1 y Atg3. De manera específica, se produjo interacción entre ambos estímulos en las modificaciones observadas en las proteínas mTOR, p-ULK1, ULK1, p- SQSTM1 y Atg7. A pesar de que los cambios mediante el ANOVA de una vía en el grupo Poly I:C, este no mostró alteraciones a partir de este tercer análisis (Tabla 10). Figura 74. Evaluación de la expresión genética de los mediadores de autofagia por RT- qPCR. Esta aproximación muestra el análisis llevado a cabo entre el grupo CT y Poly+Iso empleando la t de Student de dos colas. El modelo doble hit no contribuyó a variaciones de la expresión genética de dichos marcadores en la CF. Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas CT y 9 ratas Poly+Iso. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 193 Figura 75. RT-qPCR de los genes principales implicados en la vía de la autofagia en la CF. El análisis de ANOVA de una vía no encontró variaciones en la inducción o represión de los genes Mtor, Ulk1, Sqstm1, Beclin1, Atg3, Atg5, Atg7, Atg12, Atg16l1, y Lc3β, con la excepcionalidad de la isoforma α de Lc3, donde el grupo del doble hit experimentó una atenuación de su expresión en comparación con los grupos CT y Poly I:C. Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 194 En la siguiente tabla se muestran los resultados provenientes del estudio estadístico ANOVA de dos vías de cada estresor independiente y su posible efecto de interacción, referido tanto a las proteínas y genes de autofagia, como a las pruebas comportamentales previamente presentadas. Parámetro Poly I:C Iso Interacción p-mTOR (prot) F(1,32)=0.01835; p=0.8931 F(1,32)=0.2119; p=0.6484 F(1,32)=3.880; p=0.0576 mTOR (prot) F(1,32)=0.1193; p=0.7321 F(1,32)=0.1166; p=0.7349 F(1,32)=12.77; p=0.0011** p-ULK1 (prot) F(1,32)=0.3591; p=0.5532 F(1,32)=1.486; p=0.2317 F(1,32)=4.521; p=0.0413* ULK1 (prot) F(1,32)=0.1814; p=0.6730 F(1,32)=7.173; p=0.0116* F(1,32)=4.912; p=0.0339* p-SQSTM1 (prot) F(1,32)=0.6038; p=0.4428 F(1,32)=11.46; p=0.0019** F(1,32)=4.923; p=0.0337* SQSTM1 (prot) F(1,32)=0.1016; p=0.7519 F(1,32)=20.13; p<0.0001**** F(1,32)=3.131; p=0.0863 Beclin1 (prot) F(1,32)=0.004338; p=0.9479 F(1,32)=0.001291; p=0.9716 F(1,32)=3.716; p=0.0628 Atg3 (prot) F(1,32)=0.1911; p=0.6649 F(1,32)=4.844; p=0.0351* F(1,32)=1.175; p=0.2864 Atg5 (prot) F(1,32)=0.6863; p=0.4135 F(1,32)=0.0004531; p=0.9832 F(1,32)=1.869; p=0.1811 Atg7 (prot) F(1,32)=0.03758; p=0.8475 F(1,32)=0.001803; p=0.9664 F(1,32)=4.293; 0.0464* Atg12 (prot) F(1,32)=0.7509; p=0.3926 F(1,32)=1.992; p=0.1678 F(1,32)=2.833; p=0.1021 Atg16L1 (prot) F(1,32)=0.3182; p=0.5766 F(1,32)=0.1462; p=0.7047 F(1,32)=4.024; p=0.0534 Mtor (mRNA) F(1,32)=0.1095; p=0.7429 F(1,32)=0.7395; p=0.3962 F(1,32)=0.1536; p=0.6977 Ulk1 (mRNA) F(1,32)=0.000066; p=0.9935 F(1,32)=1.718; p=0.1993 F(1,32)=0.06783; p=0.7962 Sqstm1 (mRNA) F(1,32)=0.05600; p=0.8144 F(1,32)=1.328; p=0.2577 F(1,32)=0.5187; p=0.4766 Beclin1 (mRNA) F(1,32)=0.1202; p=0.7310 F(1,32)=4.416; p=0.0436* F(1,32)=0.06627; p=0.7985 Atg3 (mRNA) F(1,32)=0.6527; p=0.4251 F(1,32)=1.071; p=0.3084 F(1,32)=2.349; p=0.1352 Atg5 (mRNA) F(1,32)=1.855; p=0.1827 F(1,32)=1.990; p=0.1680 F(1,32)=1.072; p=0.3082 Atg7 (mRNA) F(1,32)=2.491; p=0.1243 F(1,32)=1.179; p=0.2858 F(1,32)=2.111; p=0.1560 Atg12 (mRNA) F(1,32)=4.101; p=0.0513 F(1,32)=0.003534; p=0.9530 F(1,32)=2.475; p=0.1255 Atg16l1 (mRNA) F(1,32)=1.032; p=0.3179 F(1,32)=0.004597; p=0.9464 F(1,32)=1.021; p=0.3202 Lc3α (mRNA) F(1,32)=0.1901; p=0.6657 F(1,32)=17.32; p=0.0002*** F(1,32)=1.793; p=0.1899 Lc3β (mRNA) F(1,32)=0.6781; p=0.4163 F(1,32)=3.869; p=0.0579 F(1,32)=0.4903; p=0.4888 CA Veces externa F(1,32)=7.340; p=0.0107* F(1,32)=1.773; p=0.1924 F(1,32)=0.00211; p=0.9637 CA tiempo externa F(1,32)=18.1; p=0.0002*** F(1,32)=5.019; p=0.0324* F(1,32)=2.163; p=0.1515 CA Veces interna F(1,32)=8.140; p=0.0075** F(1,32)=0.7540; p=0.3917 F(1,32)=0.4655; p=0.5 CA tiempo interna F(1,32)=36.6; p<0.0001**** F(1,32)=10.90;p=0.0025** F(1,32)=4.434; p=0.0437* EPM E. abierto F(1,32)=0.9369; p=0.3403 F(1,32)=1.464; p=0.2352 F(1,32)=0.01464; p=0.9045 EPM E. cerrado F(1,32)=0.3942; p=0.5346 F(1,32)=2.574; p=0.1184 F(1,32)=0.004866; p=0.945 EPM E. ratio F(1,32)=2.756; p=0.1070 F(1,32)=0.000088; p=0.9926 F(1,32)=0.2858;p=0.5967 EPM t abierto F(1,32)=0.001817; p=0.966 F(1,32)=5.016; p=0.0322* F(1,32)=3.009; p=0.0924 EPM t. cerrado F(1,32)=0.00182; p=0.9663 F(1,32)=5.016; p=0.0322* F(1,32)=3.009; p=0.0924 EPM t. ratio F(1,32)=0.00087; p=0.9767 F(1,32)=4.959; p=0.0331* F(1,32)=3.015; p=0.0921 Tabla 10. Datos del ANOVA de dos vías en el modelo Poly I:C+Iso en proteínas y genes de autofagia, además de las pruebas comportamentales realizadas. Los cambios estadísticamente significativos se detallan en negrita y color azul. Las siglas «CA» hace referencia a la prueba de campo abierto, mientras que «EPM» se corresponde con las siglas en inglés de la prueba de laberinto en cruz elevado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 195 3.3. Vía de la mitofagia 5) El modelo Poly I:C+aislamiento modula proteínas implicadas en la mitofagia, así como disminuye otras implicadas en la mitogénesis y la fusión y fisión mitocondrial Los marcadores más representativos de la homeostasis mitocondrial, así como de procesos relacionados con la mitocondria (evaluados previamente en el modelo CMS), fueron también analizados en el modelo Poly+Iso, dadas las alteraciones observadas en los efectores de la vía de la autofagia. La Figura 76 presenta la evaluación mediante la prueba estadística t de Student de los grupos CT y Poly+Iso en la CF de las proteínas implicadas en la mitofagia (Figura 76(A)), en la mitogénesis (Figura 76(B)) y en la fusión y fisión mitocondrial (Figura 76(C)). En lo referente a la mitofagia, el doble hit causó la bajada en la expresión proteica de BNIP3 y la inducción de Pink1. Paralelamente, se observó una disminución de la concentración proteica de PGC1α en el extracto citosólico, pero no en el nuclear. Por último, OPA1 disminuyó en el grupo doble hit comparado con su CT. Figura 76. Expresión proteica de elementos de la mitofagia, mitogénesis y fusión-fisión mitocondrial, así como algunos representantes de la apoptosis y el proteasoma. Se llevó a cabo la comparativa mediante la t de Student de dos colas de los grupos CT y doble hit. En las proteínas implicadas en la mitofagia (A), se observó un descenso de los niveles de BNIP3 y una elevación de los de Pink en el grupo con ambos estresores. PGC1α, mediador en la mitogénesis, disminuyó en el extracto citosólico del grupo Poly+Iso (B). Únicamente OPA1 experimentó una bajada de su expresión proteica en el grupo doble hit (C). Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas CT y 9 ratas Poly+Iso. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 196 De manera complementaria, se aplicó el análisis ANOVA de una vía a los cuatro grupos representativos, a partir del cual se detectaron otros efectos (Figura 77). Las proteínas Mfn1 y Drp1 (involucradas en la fusión y fisión mitocondrial respectivamente) se vieron disminuidas en sus grupos doble hit en comparación con los grupos Poly I:C (y con su CT también, en el caso de Drp1) (Figura 77(A y E)). De hecho, la Mfn1 experimentó una potenciación de su expresión proteica en el grupo Poly I:C con respecto a su CT. En lo concerniente a la mitofagia, Pink1 y BNIP3 volvieron a experimentar variaciones por el modelo, donde este análisis demostró que la combinación de ambos estresores suponía un aumento en la expresión proteica de Pink1 sobre los otros tres grupos restantes (Figura 77(H)). BNIP3, por su parte, vio mermados sus niveles proteicos en el grupo doble hit con respecto al grupo inyectado con Poly I:C (Figura 77(J)). Referido al proceso de mitogénesis, el modelo atenuó los niveles proteicos de PGC1α en el extracto citosólico, tanto en relación con su CT como con el grupo Poly I:C (Figura 78(C)). Adicionalmente, se observaron alteraciones en la subunidad 20 del proteasoma, en el que este análisis reveló un aumento de su expresión en el grupo Poly I:C y su consecutiva disminución en el grupo doble hit (Figura 78(F)). Resultados 197 Figura 77. Análisis de ANOVA de una vía sobre los WB del modelo Poly I:C+aislamiento en los marcadores de fusión-fisión (A-E) y mitofagia (G-K). El grupo Poly+Iso presentó unos valores disminuidos de la proteína Mfn1 con relación al grupo inyectado con Poly I:C, a la vez que esta experimentó un ascenso en este último grupo comparado con su CT (A). A pesar de que el análisis por la t de Student reveló una disminución en el grupo doble hit en comparación con su grupo CT, este análisis no encontró diferencias significativas en la expresión de esta proteína (C). La presencia proteica de Drp1 fue hallada en descenso en comparación con los grupos CT y Poly I:C (E), al contrario que Pink, cuyos niveles ascendieron en el doble hit al contrastarlo con los grupos CT, Poly I:C e Iso (H). En último lugar, la combinación de Poly I:C y aislamiento provocó una disminución en los niveles proteicos de BNIP3 con respecto al grupo inyectado con Poly I:C (J). Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01; ***p<0.001). Resultados 198 6) No existen modificaciones en los genes relacionados con la mitocondria tras el modelo de Poly+Iso Los mismos marcadores previamente sometidos a estudios de WB fueron examinados mediante la técnica de RT-qPCR para profundizar en el alcance del modelo Poly I:C+aislamiento en relación con la mitocondria. El examen mediante la t de Student no mostró diferencias entre los grupos CT y Poly+Iso ni en los genes implicados en la mitofagia (Figura 79(A)), la mitogénesis (Figura 79(B)), la fusión-fisión (Figura 79(C)) Figura 78. ANOVA de una vía de las proteínas implicadas en la mitogénesis, proteasoma y apoptosis estudiadas por WB. Dicho análisis desveló que este modelo doble hit conllevó a la atenuación de los valores citosólicos de la proteína PGC1α con respecto a los grupos CT y Poly I:C (C). Sorprendentemente, también causó la bajada de la subunidad 20S del proteasoma en comparación al grupo inyectado con Poly I:C. Precisamente, este grupo presentó una escalada de sus valores en relación al grupo CT (F). Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 199 y tampoco en genes mitocondriales (Figura 79(D)). Al ahondar en el análisis de este modelo doble hit, el ANOVA de una vía también dictaminó la ausencia de cambios en la expresión genética de los marcadores mitocondriales bajo estudio (Figuras 80 y 81), aunque se observaron tendencias a la modulación en los grupos Poly I:C de diferentes genes (Figura 80(B, D, I y M)). Curiosamente, aplicando un ANOVA de dos vías, se encontró efecto debido al aislamiento en la expresión genética de Opa1 exclusivamente (Tabla 11). Y de la misma forma, el aislamiento fue el estresor más influyente en cuanto a la inducción de cambios en las proteínas mitocondriales, ya que el ANOVA de dos vías reveló que este había ocasionado alteraciones en OPA1, Drp1, Pink1, BNIP3, PGC1α (citosólico) y el citocromo c (Tabla 11). Por su parte, la inyección de Poly I:C solo varió la expresión proteica de TOMM20. Finalmente, hubo interacción entre ambos estímulos en la presencia proteica de la Mfn1, Pink1, MTFA y la subunidad 20S del proteasoma. Figura 79. Expresión genética de factores mitocondriales y su análisis mediante t de Student. Los mismos elementos previamente considerados fueron examinados mediante RT-qPCR para indagar en la influencia del modelo sobre la mitocondria. De nuevo, no se registró cambio alguno en los genes participantes en la mitofagia (A), la mitogénesis (B), la fusión-fisión (C) y representantes del ADN mitocondrial (D). Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas CT y 9 ratas Poly+Iso. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 200 Figura 80. Representación del estudio de la expresión genética por RT-qPCR de marcadores mitocondriales en el modelo de Poly I:C+aislamiento en la CF. No se detectaron variaciones en ninguno de los grupos de los factores mitocondriales bajo escrutinio tras la aplicación del ANOVA de una vía. Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 201 7) El doble hit aumenta la concentración de células microgliales en la CF y el Hp El mismo estudio que se efectuó sobre el modelo CMS de citometría de flujo fue aplicado a este modelo doble hit. En este caso particular, no hubo agrupaciones de dos animales, sino que los plots que se presentan provienen de una única rata. Esta aproximación reveló que, tanto en la CF como en el Hp, el grupo Poly+Iso recuperó una mayor presencia microglial, similar a la situación CT, con respecto a cada estímulo individual (Figura 82 y 83). La Figura 82 muestra las tinciones de cada grupo de la CF con MitoGreen, mientras que la Figura 83 las muestra del Hp con MitoDeepRed. El análisis se llevó a cabo con ambas sondas en las dos estructuras, pero ante las pocas variaciones observadas entre ellas, se optó por mostrar una representación de cada situación. Hubo un ligero aumento de la población microglial en el grupo Poly I:C, seguido de un desplazamiento en cuanto a su marcaje con MitoGreen (Figura 82). El aislamiento tuvo un gran impacto sobre la microglía, reduciendo considerablemente su número total, lo que evidentemente repercutió en el marcaje de sus mitocondrias. Sin embargo, el perfil del grupo doble hit presentó mayores similitudes con respecto a los grupos CT en cuanto a la presencia microglial. De hecho, al realizar el solapamiento de poblaciones entre estos dos grupos, se detectaron tenues variaciones en el marcaje con CD11b y con MitoGreen, cuyos histogramas mostraron que el número de mitocondria marcada sí que era mucho menor en las microglías del grupo Poly+Iso. Figura 81. Evaluación del posible daño en el ADN mitocondrial causado por el modelo doble hit mediante RT-qPCR. Los genes mitocondriales Rnr, Nd1 y Nd5 fueron comparados con el gen nuclear Gapdh para averiguar si el modelo Poly I:C+Iso provocaba daños en el ADN mitocondrial. Ninguno de los tres representantes registró variación alguna cuando se analizaron mediante el ANOVA de una vía. Los datos se expresan como la media ± SEM de 9 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 202 En el Hp (Figura 83), los grupos Poly I:C e Iso mostraron ambos un descenso en la cantidad de microglía presente, lo que influyó en la cantidad de mitocondrias teñidas por la sonda MitoDeepRed. El grupo Poly+Iso tuvo valores similares a las ratas CT, con un marcaje mitocondrial también muy similar. Si se comparan los grupos CT y doble hit mediante solapamiento de poblaciones, se vio una ligera disminución general en el marcaje de las microglías del grupo Poly+Iso, pero seguido de un discreto aumento en la cantidad de mitocondria marcada con MitoDeepRed. Al analizar la cantidad total de microglía marcada en la CF y el Hp (Figura 84), se apreció un ascenso de esta población en el grupo Poly+Iso con respecto a sus respectivos CT en cada región cerebral (Figura 84(A y B)) a través de la t de Student. Más concretamente, al estudiar mediante ANOVA de una vía las diferencias intergrupales, se detectó una disminución del grupo de aislamiento en la CF con respecto al doble hit (Figura 84(C)). En el Hp, este análisis reveló un incremento de la microglía presente en el grupo Poly+Iso con respecto al grupo Poly I:C y el grupo Iso (Figura 84(D)). Paralelamente, el análisis de ANOVA de dos vías manifestó la existencia de interacción entre los dos estímulos en cuanto a la presencia de microglías tanto en la CF como en el Hp. Además, se observó un efecto del Poly I:C en las microglías de la CF (Tabla 11). Resultados 203 Figura 82. Re- presentación gráfica de los análisis por cito- metría de flujo de la microglía presente en el modelo doble hit en la CF mar- cada con Mito- Green. Estos mismos grupos fueron teñidos con la sonda MitoDeepRed pero no mostra- ron diferencias. Se analizaron 6- 8 ratas por cada grupo conside- rado. Resultados 204 Figura 83. Re- presentación de experimen- tos de citome- tría de flujo so- bre la microglía en el modelo doble hit en el Hp marcada con MitoDeepRed. Estos mismos grupos fueron teñidos con la sonda Mito- Green pero no mostraron dife- rencias. Se analizaron 6-8 ratas por cada grupo conside- rado. Resultados 205 En la Tabla 11 se muestran los resultados estadísticos procedentes del ANOVA de dos vía de proteínas y genes relacionados con la mitocondria y apoptosis en la CF del modelo Poly+Iso, así como los valores de microglías obtenidos por citometría de flujo tanto en la CF como en el Hp. Figura 84. Cuantificación del nú- mero de microglía presente en los grupos del modelo Poly I:C+aisla- miento a través de citometría de flujo. El número de microglía obte- nida en el grupo doble hit fue com- parado mediante la t de Student con su respectivo CT en la CF (A) y en el Hp (B). En ambos casos se observó una potenciación de la pre- sencia microglial en el grupo Poly+Iso. Al analizar todos los gru- pos entre sí a través del ANOVA de una vía, se detectó una disminución del grupo Iso con respecto a su grupo Poly+Iso en la CF (C) y de los dos estresores independientes con respecto al grupo doble hit (D). Los datos se expresan como la media ± SEM de 6-8 ratas por grupo eva- luado. Una *p<0.05 fue conside- rada como estadísticamente signifi- cativa (**p<0.01). Resultados 206 Parámetro Poly I:C Iso Interacción Mfn1 (prot) F(1,32)=2.445; p=0.1278 F(1,32)=0.8348; p=0.3677 F(1,32)=16.77; p=0.0003*** Mfn2 (prot) F(1,32)=0.06896; p=0.795 F(1,32)=0.5451; p=0.4657 F(1,32)=1.275; p=0.2671 OPA1 (prot) F(1,32)=1.223; p=0.2773 F(1,32)=7.298; p=0.0111* F(1,32)=1.326; p=0.2584 p-Drp1 (prot) F(1,32)=0.9906; p=0.3271 F(1,32)=0.8791; p=0.3555 F(1,32)=0.01066; p=0.9184 Drp1 (prot) F(1,32)=2.131; p=0.1541 F(1,32)=19.03; p=0.0001*** F(1,32)=4.098; p=0.0513 TOMM20 (prot) F(1,32)=12.69; p=0.0074** F(1,32)=0.1464; p=0.7120 F(1,32)=0.2223; p=0.6499 Parkin (prot) F(1,32)=3.180; p=0.0840 F(1,32)=1.842; p=0.1843 F(1,32)=0.1512; p=0.7000 Pink1 (prot) F(1,32)=1.606; p=0.2142 F(1,32)=6.984; p=0.0126* F(1,32)=8.945; p=0.0053** FUNDC1 (prot) F(1,32)=2.661; p=0.1129 F(1,32)=0.7126; p=0.4050 F(1,32)=0.04809; p=0.8279 BNIP3 (prot) F(1,32)=0.01944; p=0.890 F(1,32)=10.41; p=0.0029** F(1,32)=3.700; p=0.0633 Nix (prot) F(1,32)=0.3899; p=0.5368 F(1,32)=0.3558; p=0.5551 F(1,32)=1.802; p=0.1889 Nrf1 (prot) F(1,32)=0.06384; p=0.802 F(1,32)=2.300; p=0.1406 F(1,32)=0.3528; p=0.5573 MTFA (prot) F(1,32)=0.7818; p=0.3841 F(1,32)=1.241; p=0.2747 F(1,32)=5.314; p=0.0288* PGC1α cit. (pr) F(1,32)=0.3322; p=0.5685 F(1,32)=18.95; p=0.0001*** F(1,32)=0.6770; p=0.4169 PGC1α n. (pr) F(1,32)=1.018; p=0.3215 F(1,32)=0.2051; p=0.6542 F(1,32)=0.001734; p=0.9671 P19S (prot) F(1,32)=0.00176; p=0.967 F(1,32)=0.1319; p=0.7189 F(1,32)=0.04349; p=0.8361 P20S (prot) F(1,32)=0.03967; p=0.843 F(1,32)=3.734; p=0.0625 F(1,32)=14.96; p=0.0005*** Cit. c (prot) F(1,32)=0.01038; p=0.919 F(1,32)=8.384; p=0.0089** F(1,32)=0.02321; p=0.8804 Bax (prot) F(1,32)=0.4515; p=0.5064 F(1,32)=0.3124; p=0.5801 F(1,32)=0.9375; p=0.3402 Mfn1 (mRNA) F(1,32)=0.1262; p=0.7248 F(1,32)=0.2850; p=0.5972 F(1,32)=2.402; p=0.1310 Mfn2 (mRNA) F(1,32)=0.1228; p=0.7283 F(1,32)=0.03239; p=0.8583 F(1,32)=0.009003; p=0.9250 Opa1 (mRNA) F(1,32)=1.043; p=0.3147 F(1,32)=4.214; p=0.0484* F(1,32)=3.478; p=0.0714 Drp1 (mRNA) F(1,32)=0.8704; p=0.3583 F(1,32)=0.1851; p=0.6701 F(1,32)=0.07475; p=0.7864 Tomm20 (mRNA) F(1,32)=0.9827; p=0.3292 F(1,32)=0.04455; p=0.8342 F(1,32)=0.000875; p=0.9766 Parkin (mRNA) F(1,32)=4.003; p=0.0546 F(1,32)=0.4908; p=0.4890 F(1,32)=0.008724; p=0.9262 Pink1 (mRNA) F(1,32)=1.623; p=0.2121 F(1,32)=0.2898; p=0.5942 F(1,32)=3.224; p=0.0823 Fundc1 (mRNA) F(1,32)=0.4439; p=0.5100 F(1,32)=0.4110; p=0.5260 F(1,32)=0.001724; p=0.9671 Bnip3 (mRNA) F(1,32)=3.643; p=0.0653 F(1,32)=0.005161; p=0.9432 F(1,32)=0.02307; p=0.8802 Nix (mRNA) F(1,32)=0.00483; p=0.945 F(1,32)=0.003254; p=0.9549 F(1,32)=0.09485; p=0.7601 Nrf1 (mRNA) F(1,32)=0.8875; p=0.3532 F(1,32)=1.148; p=0.2920 F(1,32)=0.5444; p=0.4660 Mtfa (mRNA) F(1,32)=0.3149; p=0.5786 F(1,32)=0.000012; p=0.9972 F(1,32)=0.5689; p=0.4562 Pgc1α (mRNA) F(1,32)=1.966; p=0.1705 F(1,32)=0.2961; p=0.5901 F(1,32)=1.752; p=0.1950 Bax (mRNA) F(1,32)=1.135; p=0.2947 F(1,32)=0.01247; p=0.9118 F(1,32)=1.307; p=0.2614 Ambra1 (mRNA) F(1,32)=0.00789; p=0.93 F(1,32)=0.003315; p=0.9544 F(1,32)=0.3296; p=0.5699 Rnr1 (mRNA) F(1,32)=1.659; p=0.2072 F(1,32)=2.647; p=0.1139 F(1,32)=0.2946; p=0.5912 Nd1 (mRNA) F(1,32)=1.810; p=0.1882 F(1,32)=0.3166; p=0.5777 F(1,32)=3.788; p=0.0607 Nd5 (mRNA) F(1,32)=2.030; p=0.1639 F(1,32)=0.6975; p=0.4098 F(1,32)=0.000171; p=0.9896 Microglía CF F(1,22)=4.451; p=0.0465* F(1,22)=0.07809; p=0.7825 F(1,22)=6.026; p=0.0225* Microglía Hp F(1,22)=0.2252; p=0.6398 F(1,22)=3.221; p=0.0864 F(1,22)=15.94; p=0.0006*** Tabla 11. Resumen del estudio por ANOVA de dos vías del modelo Poly I:C+Iso en proteínas y genes relacionados con la mitocondria. Los análisis de WB de la concentración proteica de elementos mitocondriales apuntan a una interacción entre los dos estresores en Mfn1, Pink, MTFA y el P20S, viéndose alterado así un representante de la fusión, mitofagia y mitogénesis, respectivamente. Paralelamente, aunque solo se observó efecto debido al Poly I:C en la proteína TOMM20, el aislamiento ocasionó modificaciones en las proteínas OPA1, Drp1, Pink, BNIP3, PGC1α (en citosol) y citocromo c. Sin embargo, este modelo de doble hit no mostró efecto a nivel de inducción genética, con excepción del efecto desencadenado por el segundo hit en el gen Opa1. Los estudios de citometría de flujo revelaron la presencia de interacción entre ambos estresores tanto en la CF como en el Hp, con un efecto individual del primer hit en la CF. Los cambios estadísticamente significativos se detallan en negrita y color azul. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001). Resultados 207 4. Modelo experimental de trastornos relacionados con el neurodesarrollo: Deprivación materna + LPS 4.1. Pruebas comportamentales 1) El doble hit MD+LPS no llevó al desarrollo de un fenotipo de tipo depresivo Se realizó el Splash test con el fin de comprobar si la combinación de la deprivación materna y la inyección crónica de LPS condujo a la aparición de un fenotipo depresivo en las ratas. La cuantificación del tiempo de latencia, entendido como aquel que transcurre entre la aplicación de la solución rica en sacarosa y el comienzo de la limpieza o higiene (grooming, en inglés), no indicó cambios entre los grupos CT y MD+LPS (Figura 85(A)), de la misma forma que tampoco lo experimentaron el tiempo en el que se estuvieron acicalando (Figura 85(B)) y las veces que lo hicieron (Figura 85(C)). Esta comparativa entre ambos grupos se llevó a cabo mediante el análisis de la t de Student. Seguidamente, al comparar todos los grupos a través del ANOVA de una vía, tampoco se observaron alteraciones en los grupos en ninguna de las tres variables inspeccionadas (Figura 85(D-F)). Sin embargo, resulta interesante destacar la tendencia de la deprivación materna a descender la duración del lavado, a la vez que el LPS crónico lo haría hacia su subida (Figura 85(E)). Llamativamente, la examinación de estos parámetros por la ANOVA de dos vías desveló el efecto de la deprivación materna sobre el número de veces del acicalado, mientras que la inyección crónica jugaría su papel en la duración del mencionado acicalado (Tabla 12). 2) La MD+LPS crónica no contribuyó a la presencia de conductas de ansiedad La Figura 86 exhibe las determinaciones sobre el laberinto en cruz elevada (EPM, por sus siglas en inglés) en los grupos CT y MD+LPS, evaluados utilizando la t de Student, y las correspondientes a todos los grupos, analizados sucesivamente con la ANOVA de una vía. No se apreciaron modificaciones en las veces en las que los animales MD+LPS entraron en los brazos abiertos y cerrados con respecto a sus CT (Figura 86(A y B)), ni en el tiempo que pasaron en cada uno de ellos (Figura 86(D y E)). Cuando se tuvieron en cuenta el conjunto de todos los grupos, el ANOVA de una vía tampoco encontró diferencias significativas en ninguno de los parámetros bajo investigación (Figura 86(G- L)). A pesar de ello, desengranando aún más estos datos, el empleo de la ANOVA de dos vías detectó un efecto del primer hit en la cantidad de entradas a los brazos abiertos del laberinto (Tabla 12). Resultados 208 Figura 85. Splash test del modelo MD+LPS crónico. Esta prueba, que indica la presencia de rasgos de tipo depresivos en el comportamiento de las ratas, probó que los animales no desarrollaron este tipo de conducta tras la administración del modelo. Estas conclusiones se vieron respaldadas mediante la comparativa de los grupos CT y MD+LPS con la t de Student (A-C), y la de todos los grupos entre sí tras el ANOVA de una vía (D-F). Los datos se expresan como la media ± SEM de 10-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 209 Figura 86. Laberinto en cruz elevado sobre el modelo MD+LPS crónico. Se examinó la inclinación del grupo MD+LPS a situarse en los brazos abiertos (A y G) y en los brazos cerrados del laberinto (B y H), así como la ratio entre ambos (C e I). Adicionalmente, se registró el tiempo que pasaban en cada uno de ellos (J y K) y su correspondiente ratio (L). El escrutinio mediante la t de Student no reveló cambios entre los grupos CT y MD+LPS (A-F), de la misma manera que la ANOVA de una vía tampoco encontró alteraciones entre el resto de los grupos (G-L). Los datos se expresan como la media ± SEM de 10-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 210 4.2. Vía de la autofagia 3) El modelo de MD+LPS provoca alteraciones en proteínas de la vía de la autofagia independientemente de si la administración de LPS es aguda o crónica Proteínas implicadas en procesos esenciales de la vía de la autofagia fueron evaluadas mediante WB en los modelos de deprivación materna e inyección aguda y crónica de LPS. Primeramente, se compararon los grupos CT con respecto a los grupos MD+LPSa y MD+LPSc de forma independiente empleando la t de Student. Con este análisis, se comprobó que tanto la inyección aguda como la crónica de LPS repercutían de forma muy similar en las mismas proteínas, siguiendo además un patrón afín (Figura 87). En el modelo de MD+LPSa, se produjeron descensos drásticos en la expresión proteica de las proteínas fosforilada y total de mTOR. También se registraron la disminución de Atg3 y las elevaciones en las dos isoformas de LC3 con respecto al CT (Figura 87(A)). Por su parte, en el modelo MD+LPSc se mantuvo la caída tan característica de la forma fosforilada de mTOR, si bien la proteína total también vio reducidos sus niveles más sutilmente. De manera similar, Atg3 vio mermados sus valores a la vez que los de LC3- I y LC3-II incrementaron. La única proteína que mostró discrepancias entre la administración aguda y crónica de LPS tras la deprivación materna fue SQSTM1, que solo experimentó una tendencia al alza en la administración aguda, que se exacerbó en la crónica (Figura 87(B)). Los efectos en las proteínas de autofagia fueron examinados haciendo uso del ANOVA de una vía de manera independiente sobre la administración crónica y aguda de LPS. Aunque los datos de mayor interés provenían del modelo crónico, la aproximación aguda ayudó a determinar las consecuencias a corto plazo que tenía la inyección de LPS. En la Figura 88 se presenta el análisis estadístico recientemente mencionado del modelo MD+LPSc. Cabe destacar que la fosforilación en la Ser2448 de la proteína mTOR fue la que mayor modulación sufrió ante la combinación de los estresores, pues en el grupo MD+LPSc sus valores descendieron al mínimo en comparación con los tres grupos restantes. Igualmente, la deprivación materna causó la disminución de p-mTOR con respecto al CT (Figura 88(A)). La proteína SQSTM1 también incrementó en el grupo doble hit en comparación con los grupos restantes (Figura 88(G)), mientras que Atg3 se redujo en los grupos MD y LPSc de manera independiente comparado con su CT, pero no el grupo con la doble estimulación (Figura 88(H)). Llamativamente, los niveles de la proteína Atg16L1 menguaron en el grupo MD al contrastarlo con su CT, al mismo tiempo que el grupo MD+LPSc recuperó valores muy similares a ese CT (Figura 88(I)). Resultados 211 La última proteína en verse modificada por el modelo crónico fue LC3-II, cuya presencia aumentó en el grupo doble hit con relación a su CT (Figura 88(K)). Al constatar estos datos con los resultantes de la inyección aguda de LPS, se observó una respuesta muy similar en los marcadores autofágicos. La fosforilación de mTOR sufrió las mismas repercusiones en todos los grupos que con la inyección crónica, con la salvedad de que, en este caso, el grupo LPS también mostró menores niveles de p-mTOR que el CT (Figura 89(A)). Teniendo en cuenta la reducción sustancial de la expresión proteica de p-mTOR en el modelo agudo y crónico, se comprobó que, si bien el modelo crónico no Figura 87. Imagen representativa de los principales efectos de los modelos MD+LPS agudo (MD+LPSa) y MD+LPS crónico (MD+LPSc) en las proteínas de autofagia. Este modelo doble hit moduló las proteínas p-mTOR, mTOR, Atg3, LC3-I y LC3-II de forma semejante en ambas situaciones: en (A) tras la inyección aguda y en (B) tras la crónica de LPS. Únicamente SQSTM1 presentó un incremento en sus valores con la administración crónica que no hizo en la aguda. Destaca principalmente la contundente disminución de la fosforilación en la Ser2448 de la proteína mTOR en las dos condiciones. Los análisis se completaron empleando la t de Student de dos colas. Los datos se expresan como la media ± SEM de 10-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001). Resultados 212 contribuía en cambios en la expresión de la proteína total de mTOR, la inyección aguda sí que promovió el descenso de su concentración en el grupo MD+LPSa con respecto a su CT (Figura 89(B)). Otra diferencia clara se halló en la expresión de SQSTM1, donde la inyección aguda solo provocó su aumento en el grupo doble hit en comparación con el grupo LPSa (Figura 89(G)), mientras que en el modelo crónico observábamos este incremento al equipararlo con todos los grupos (Figura 88(G)). Por su parte, Atg3 y LC3- II experimentaron las mismas variaciones ante las inyecciones aguda y crónica (Figura 89(H)). Adicionalmente, con la inyección aguda no se recuperaron los niveles de Atg16L1 en el grupo MD+LPSa que se perdieron en el grupo MD, como sí que ocurría en la situación crónica (Figura 89(I)). De hecho, la combinación de los dos estímulos moduló al alza la proteína LC3-I cuando el LPS se administró de forma aguda (Figura 89(J)), evento que no ocurrió con el tratamiento de LPS crónico (Figura 88(J)). Conforme a la aplicación del ANOVA de dos vías, los modelos agudo y crónico también registraron diferencias en las proteínas de autofagia (Tablas 12 y 13). Sorprendentemente, las interacciones que se detectaron entre los estresores fueron exactamente en las mismas proteínas de los dos modelos: SQSTM1, Atg3 y Atg16L1. Los efectos surgidos a raíz de la deprivación materna ocurrieron en p-mTOR, mTOR, SQSTM1 y LC3-II en la situación crónica, mientras que en la aguda se sumaron p- SQSTM1 (en lugar de su proteína total) y Atg3. En cuanto al LPS, su distribución crónica tuvo mayor repercusión que la aguda. En el primer caso, se observaron variaciones debidas al LPS en las proteínas p-mTOR, ULK1, SQSTM1, Beclin1, LC3-II y Atg16L1, mientras que el LPS agudo solo tuvo efecto en las modificaciones de las formas de mTOR y LC3-I. 4) El modelo MD+LPSc reprime la expresión genética de Sqstm1 y Lc3α y el MD+LPSa la de Atg12 y Lc3α Una vez comprobados los efectos a nivel proteico en los mediadores de autofagia considerados, se procedió a la evaluación de su expresión genética por RT-qPCR. El análisis comparativo entre los grupos CT y MD+LPS mediante la t de Student desveló que la combinación de la deprivación materna y la inyección aguda de LPS reducía la expresión de los genes Atg12 y Lc3α (Figura 90(A)), mientras que cuando el segundo estímulo se administraba de forma crónica, el descenso de la expresión ocurría en los genes Sqstm1 y Lc3α (Figura 90(B)). Por tanto, se produjo una represión en la expresión del gen Lc3α independientemente de la pauta de inyección del LPS. Aun así, Resultados 213 el análisis ANOVA de una vía no mostró cambios en ninguno de los genes en el modelo crónico, pero sí en el grupo LPS del gen Atg16l1 en el agudo (Figura 51 y 52). Figura 88. ANOVA de una vía de las proteínas implicadas en la vía de la autofagia en el modelo crónico de MD+LPS en la CF. p-mTOR (A), SQSTM1 (G), Atg3 (H), Atg16L1 (I) y LC3-II (K) sufrieron alteraciones en su expresión proteica debidas al modelo doble hit. Destacan los valores mínimos de p- mTOR y el aumento de SQSTM1 y LC3-II en el grupo MD+LPSc. Los datos se expresan como la media ± SEM de 10-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001). Resultados 214 Figura 89. ANOVA de una vía de las proteínas implicadas en la vía de la autofagia en el modelo agudo de MD+LPS en la CF. El grupo MD+LPSa presentó valores mínimos de p-mTOR (A), disminuyendo también su proteína total (B) y aumentando SQSTM1 (G), LC3-I (J) y Lc3-II (K). Sobresalieron además los descensos de las proteínas p-mTOR, Atg3 y Atg16L1 en los grupos MD. Los datos se expresan como la media ± SEM de 10-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001). Resultados 215 El análisis por ANOVA de dos vías concluyó que el gen Sqstm1 era el único en experimentar algún tipo de efecto en el modelo crónico, concretamente debido a la deprivación materna (Tabla 12). Sin embargo, el panorama que ofreció el modelo agudo fue bien diferente: la inyección puntual de LPS moduló la expresión genética de Atg5, Figura 90. RT-qPCR de los grupos CT y MD+LPS en los modelos agudo y crónico. El análisis de ambos grupos de forma independiente dictaminó que el modelo doble hit agudo promovía la bajada de la expresión genética de Atg12 y Lc3α (A), mientras que en el modelo crónico fueron Sqstm1 y la propia Lc3α de nuevo (B). Los análisis se completaron empleando la t de Student de dos colas. Los datos se expresan como la media ± SEM de 10-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 216 Atg12 y Lc3α, entretanto que la deprivación materna lo hizo sobre Atg16l1 (Tabla 13). Figura 91. Estudio de expresión en genes implicados en la vía de la autofagia tras la aplicación del modelo crónico de MD+LPS. La aplicación del ANOVA de una vía no encontró cambio en ninguno de los genes considerados a causa del modelo. Los datos se expresan como la media ± SEM de 10-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 217 Figura 92. Expresión genética de los genes involucrados en la autofagia en el modelo MD+LPS agudo. En este caso, el ANOVA de una vía detectó una disminución debida a la inyección aguda de LPS en la expresión del gen Atg16l1 (H). No se observaron más cambios desencadenados por el doble hit. Los datos se expresan como la media ± SEM de 10-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 218 En las Tablas 12 y 13 se exhibe la estadística ANOVA de dos vías atribuida a los modelos MD+LPSc y MD+LPSa respectivamente, especificando los detalles para proteínas y genes de autofagia, así como las pruebas comportamentales en la Tabla 12. Parámetro MD LPS Crónico Interacción p-mTOR (prot) F(1,35)=44.0; p<0.0001**** F(1,35)=19.13; p<0.0001**** F(1,35)=2.499; p=0.1226 mTOR (prot) F(1,35)=10.61; p=0.0024** F(1,35)=0.1658; p=0.6862 F(1,35)=0.5170; p=0.4766 p-ULK1 (prot) F(1,35)=1.055; p=0.3108 F(1,35)=1.248; p=0.2709 F(1,35)=0.9660; p=0.3319 ULK1 (prot) F(1,35)=0.00281; p=0.9579 F(1,35)=6.252; p=0.0168* F(1,35)=1.159; p=0.2885 p-SQSTM1 (prot) F(1,35)=1.537; p=0.2226 F(1,35)=1.442; p=0.2373 F(1,35)=0.1984; p=0.6586 SQSTM1 (prot) F(1,35)=4.424; p=0.0421* F(1,35)=6.852; p=0.0126* F(1,35)=6.739; p=0.0133* Beclin1 (prot) F(1,35)=0.1300; p=0.7205 F(1,35)=4.163; p=0.0483* F(1,35)=0.5754; p=0.4528 Atg3 (prot) F(1,35)=2.378; p=0.1315 F(1,35)=1.590; p=0.2152 F(1,35)=28.4; p<0.0001**** LC3I (prot) F(1,35)=2.653; p=0.1121 F(1,35)=2.320; p=0.1364 F(1,35)=0.5136; p=0.4782 LC3II (prot) F(1,35)=7.048; p=0.0119* F(1,35)=6.263; p=0.0171* F(1,35)=0.01327; p=0.9089 Atg16L1 (prot) F(1,35)=2.398; p=0.1298 F(1,35)=4.828; p=0.0342* F(1,35)=8.406; p=0.0062** Mtor (mRNA) F(1,35)=0.1288; p=0.7217 F(1,35)=3.500; p=0.0691 F(1,35)=0.6746; p=0.4166 Ulk1 (mRNA) F(1,35)=0.01419; p=0.9058 F(1,35)=0.003325; p=0.9543 F(1,35)=0.01419; 0.9058 Sqstm1 (mRNA) F(1,35)=5.701; p=0.0222* F(1,35)=1.940; p=0.1720 F(1,35)=0.06176; p=0.8051 Beclin1 (mRNA) F(1,35)=0.00692; p=0.9341 F(1,35)=0.3535; p=0.5558 F(1,35)=0.1241; p=0.7267 Atg5 (mRNA) F(1,35)=1.213; p=0.2777 F(1,35)=0.2248; p=0.6381 F(1,35)=0.4712; p=0.4966 Atg7 (mRNA) F(1,35)=0.2034; p=0.6547 F(1,35)=0.1364; p=0.7140 F(1,35)=2.080; p=0.1577 Atg12 (mRNA) F(1,35)=0.7683; p=0.3863 F(1,35)=0.8101; p=0.3738 F(1,35)=0.1442; p=0.7063 Atg16l1 (mRNA) F(1,35)=0.09180; p=0.7636 F(1,35)=0.1238; p=0.7271 F(1,35)=0.00576; p=0.9399 Lc3α (mRNA) F(1,35)=1.065; p=0.3087 F(1,35)=3.707; p=0.0619 F(1,35)=0.01696; p=0.8971 Lc3β (mRNA) F(1,35)=0.3065; p=0.5831 F(1,35)=3.451; p=0.0710 F(1,35)=0.00271; p=0.9587 Splash latency F(1,37)=0.8162; p=0.3721 F(1,37)=3.512; p=0.0688 F(1,37)=0.00761; p=0.9310 Splash g. dur. F(1,37)=1.646; p=0.2072 F(1,37)=5.917; p=0.0198* F(1,37)=0.004686; p=0.945 Splash times F(1,37)=6.970; p=0.0120* F(1,37)=1.616; p=0.2114 F(1,37)=0.4685; p=0.4978 EPM E. abierto F(1,37)=4.513; p=0.0402* F(1,37)=0.0665; p=0.7979 F(1,37)=0.00135; p=0.9708 EPM E. cerrado F(1,37)=2.378; p=0.1318 F(1,37)=0.2057; p=0.6528 F(1,37)=1.307; p=0.2606 EPM E. ratio F(1,37)=0.02379; p=0.8782 F(1,37)=0.6870; p=0.4124 F(1,37)=1.845; p=0.1824 EPM t abierto F(1,37)=1.082; p=0.3049 F(1,37)=0.7017; p=0.4074 F(1,37)=0.9176; p=0.3442 EPM t. cerrado F(1,37)=1.082; p=0.3049 F(1,37)=0.7017; p=0.4074 F(1,37)=0.9176; p=0.3342 EPM t. ratio F(1,37)=1.137; p=0.2930 F(1,37)=0.7296; p=0.3984 F(1,37)=0.915; p=0.3348 Tabla 12. ANOVA de dos vías de los parámetros autofágicos y comportamentales en el modelo MD+LPSc. Solo hubo interacción entre ambos estresores a nivel proteico en SQSTM1, Atg3 y Atg16L1. Gran cantidad de cambios fueron debidos a solo un estímulo de manera independiente: p-mTOR, mTOR, SQSTM1 y LC3II por la deprivación materna y p-mTOR, ULK1, SQSTM1, Beclin1, LC3II y Atg16L1 a la inyección crónica de LPS. La deprivación materna indujo el gen Sqstm1. La MD desembocó en cambios en las veces en las que las ratas se acicalaron, mientras que la inyección de LPS contribuyó a la modificación en el tiempo en el que realizaron esta higiene. Solo se observaron cambios debidos al primer estresor en el número de entradas a los brazos abiertos durante la prueba EPM. Los resultados estadísticamente significativos se marcan en negrita y en color azul. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 219 Parámetro MD LPS Agudo Interacción p-mTOR (prot) F(1,35)=52.5; p<0.0001**** F(1,35)=38.74; p<0.0001**** F(1,35)=1.270; p=0.2675 mTOR (prot) F(1,35)=5.940; p=0.0200* F(1,35)=5.385; p=0.0263* F(1,35)=0.1224; p=0.7286 p-ULK1 (prot) F(1,35)=0.8493; p=0.3629 F(1,35)=1.365; p=0.2503 F(1,35)=2.017; p=0.1641 ULK1 (prot) F(1,35)=0.00327; p=0.9546 F(1,35)=0.4288; p=0.5167 F(1,35)=1.595; p=0.2147 p-SQSTM1 (prot) F(1,35)=5.286; p=0.0274* F(1,35)=0.3476; p=0.5592 F(1,35)=3.121; p=0.0858 SQSTM1 (prot) F(1,35)=3.926; p=0.0552 F(1,35)=1.725; p=0.1974 F(1,35)=5.371; p=0.0263* Beclin1 (prot) F(1,35)=0.3954; p=0.5334 F(1,35)=1.213; p=0.2781 F(1,35)=1.437; p=0.2385 Atg3 (prot) F(1,35)=4.879; p=0.0336* F(1,35)=1.254; p=0.2702 F(1,35)=14.3; p=0.0006*** LC3I (prot) F(1,35)=2.249; p=0.1429 F(1,35)=6.630; p=0.0146* F(1,35)=0.05303; p=0.8193 LC3II (prot) F(1,35)=5.910; p=0.0205* F(1,35)=2.509; p=0.1225 F(1,35)=0.03690; p=0.8488 Atg16L1 (prot) F(1,35)=2.901; p=0.0969 F(1,35)=0.3484; p=0.5587 F(1,35)=7.823; p=0.0081** Mtor (mRNA) F(1,35)=0.1878; p=0.6674 F(1,35)=0.1354; p=0.7151 F(1,35)=1.943; p=0.1722 Ulk1 (mRNA) F(1,35)=0.07966; p=0.7794 F(1,35)=2.059; p=0.1602 F(1,35)=0.5131; p=0.4786 Sqstm1 (mRNA) F(1,35)=2.520; p=0.1217 F(1,35)=0.01305; p=0.9097 F(1,35)=0.1637; p=0.6883 Beclin1 (mRNA) F(1,35)=3.178; p=0.0845 F(1,35)=0.5254; p=0.4740 F(1,35)=1.970; p=0.1703 Atg5 (mRNA) F(1,35)=0.3138; p=0.5789 F(1,35)=5.004; p=0.0318* F(1,35)=1.754; p=0.1939 Atg7 (mRNA) F(1,35)=1.107; p=0.3003 F(1,35)=1.036; p=0.3158 F(1,35)=0.2075; p=0.6516 Atg12 (mRNA) F(1,35)=1.276; p=0.2663 F(1,35)=6.772; p=0.0135* F(1,35)=0.3845; p=0.5392 Atg16l1 (mRNA) F(1,35)=4.241; p=0.0472* F(1,35)=0.000077; p=0.9930 F(1,35)=2.973; p=0.0937 Lc3α (mRNA) F(1,35)=1.071; p=0.3079 F(1,35)=6.564; p=0.0149* F(1,35)=0.01148; p=0.9153 Lc3β (mRNA) F(1,35)=0.9719; p=0.3310 F(1,35)=2.377; p=0.1322 F(1,35)=0.2489; p=0.6210 Tabla 13. Análisis de los elementos de la vía de la autofagia mediante ANOVA de dos vías en el modelo MD+LPSa. SQSTM1, Atg3 y Atg16L1 presentaron interacción entre ambos estresores a nivel proteico, a las que se sumaron p-mTOR, mTOR, p-SQSTM1, LC3II y la propia Atg3 en sufrir alteraciones a raíz del primer estímulo. Además, p-mTOR, mTOR y LC3I también tuvieron modificaciones causadas por el segundo hit. A nivel de ARNm, no se observó interacción alguna, pero sí cambios en el gen Atg16l1 tras el primer hit y en los genes Atg5, Atg12 y Lc3α debido al segundo. Los resultados estadísticamente significativos se marcan en negrita y en color azul. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 220 5. Modelo experimental de trastornos relacionados con el neurodesarrollo: Deprivación materna + RS 5.1. Pruebas comportamentales 1) El modelo MD+RS no desemboca en anhedonia La constatación mediante t de Student de los grupos doble hit con sus respectivos CT no mostró cambios ni en el tiempo de latencia (Figura 93(A)), duración del acicalado (Figura 93(B)) y tampoco en las veces que practicaron ese acicalamiento (Figura 93(C)). Estos resultados fueron posteriormente respaldados mediante el análisis de ANOVA de una vía de todos los grupos (Figura 93(D-F)), tras el que no se observaron cambios desencadenados por el modelo MD+RS. En esta ocasión, también se registró una modulación al alza de la deprivación materna en el tiempo de latencia (Figura 93(D)) y a la baja en la duración del lavado (Figura 93(E)), siguiendo el mismo patrón presente en el modelo doble hit con LPS (Figura 95(D y E)). La evaluación a través del ANOVA de dos vías tampoco reveló efecto alguno en ninguno de los parámetros (Tabla 14). Figura 93. Splash test del modelo MD+RS crónico. El tiempo de latencia (A) para el comienzo de la higiene, la duración de la misma (B) y la cantidad de veces que se efectuó (C) fueron examinadas en los grupos MD+RS comparados a sus CT mediante la t de Student de dos colas, tras la que no se halló modificación ninguna. La ANOVA de una vía aplicada de forma consecutiva tampoco encontró diferencias entre los grupos (D-F). Los datos se expresan como la media ± SEM de 9-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 221 2) No se observaron comportamientos de tipo ansioso tras el modelo MD+RS Los grupos MD+RS no presentaron variaciones con respecto a sus CT en el laberinto en cruz elevado, ni mediante su directa confrontación mediante la t de Student (Figura 94(A-F)), ni a través del ANOVA de una vía (Figura 94(G-L)). En este último caso, sin embargo, se registró una escalada en la cantidad de veces que pasaron los animales MD+RS en los brazos abiertos en comparación con el grupo RS (Figura 94(G)). El mismo grupo doble hit, al compararlo con su CT (Figura 94(A)), experimentó una tendencia al alza en el mismo parámetro. Curiosamente, el ANOVA de dos vías reveló que existía efecto por parte del primer estímulo en el número de entradas a los brazos abiertos, lo que explicaría en parte los datos de la Figura 94(G). Y no solo eso, dicho análisis también encontró efecto de la restricción de movimiento sobre el tiempo que las ratas pasaban en estos brazos abiertos (Tabla 14). 5.2. Vía de la autofagia 3) La modulación de las proteínas de autofagia es diferencial de acuerdo con la duración del segundo hit De manera similar al modelo anterior, se efectuó la evaluación de la expresión proteica de algunos de los marcadores de autofagia en todos los grupos de los modelos MD+RS, tanto en su forma aguda como crónica. En primer lugar, se realizó la comparativa haciendo uso de la t de Student entre los grupos MD+RS agudo y sus respectivos CT (Figura 95(A)), y los grupos MD+RS crónico con los suyos (Figura 95(B)). Esos análisis revelaron la capacidad del modelo MD+RS agudo en potenciar la presencia proteica de p-mTOR, mTOR y Beclin1 (Figura 95(A)). De hecho, esta última fue la única en compartir su mismo destino en el modelo crónico (Figura 95(B)), a la que se le unieron el incremento proteico de ULK1, Atg16L1, Atg3 y p-SQSTM1 y la caída en los valores de Atg12. Por tanto, la imposición reiterada de la restricción de movimiento perfiló un ambiente diferente en términos de autofagia al derivado de la exposición única a dicha restricción. Resultados 222 Figura 94. Laberinto en cruz elevado sobre el modelo MD+RS crónico. Durante esta prueba, se verificaron el número de entradas a los brazos abiertos y cerrados del laberinto y ratio, así como el tiempo empleado en cada uno de los brazos y su correspondiente ratio. Estas variables fueron examinadas mediante la t de Student, donde se compararon los grupos doble hit con sus CT (A- F) y a través del ANOVA de una vía, con la que se hicieron comparaciones entre todos los grupos (G-L). No se observaron alteraciones en los grupos MD+RS con relación a sus CT en ninguno de los parámetros, si bien se produjo un aumento en el número de entradas en los brazos abiertos en este grupo al cotejarlo con respecto al grupo RS (G). Los datos se expresan como la media ± SEM de 9-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 223 4) La deprivación materna y la restricción de movimiento modulan unilateralmente proteínas esenciales de autofagia El mapa dibujado por la t de Student destacó las diferencias claras en cuanto a las consecuencias finales sobre las proteínas de autofagia que tiene la restricción de Figura 95. Resultados de WB de los grupos CT y MD+RS en sus versiones aguda y crónica en la CF. (A) exhibe las variaciones acontecidas en p-mTOR, mTOR y Beclin1 a consecuencia del doble hit, registrando una subida en su expresión proteica. (B) muestra una modulación diferencial de la vertiente crónica: el doble hit potenció la concentración de las proteínas ULK1, Atg16L1, Atg3, Beclin1 y p-SQSTM1, y el descenso de Atg12. Los análisis se completaron empleando la t de Student de dos colas. Los datos se expresan como la media ± SEM de 9-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01; ***p<0.001). Resultados 224 movimiento en su formato agudo o crónico. A pesar de ello, la profundización en el papel de cada estresor de forma independiente sobre cada proteína mediante la ANOVA de una vía desenmascaró una mayor cantidad de efectos y diferencias entre los modelos MD+RS agudo y crónico. En el modelo MD+RSc se observó un aumento de mTOR en el grupo MD comparado con su CT (Figura 96(B)) y de p-ULK1 con respecto al grupo RS (Figura 96(D)). Por su parte, la restricción de movimiento crónica elevó los valores proteicos de p-SQSTM1, Atg3 y Atg16L1 en relación con sus respectivos CT (Figura 96(F, H y I)). Además, el doble hit permitió el incremento de la concentración proteica de Beclin1 (Figura 96(C)) y p-SQSTM1 (Figura 96(F)) al ser comparadas con sus correspondientes grupos CT. No obstante, el ANOVA de una vía en el modelo agudo detectó variaciones distintas al crónico: por ejemplo, las proteínas p-SQSTM1 y Atg3 ascendieron considerablemente en los grupos RS al compararlas con sus CT, si bien en los MD+RS su presencia se vio claramente reducida (Figura 97(F y H)). Algo parecido ocurrió con las formas de mTOR, donde se apreció un aumento de la parte fosforilada en el grupo MD (Figura 97(A)) y en el mismo grupo en la proteína total (Figura 97(B)), en este caso, al igual que en el modelo crónico, pero sumándosele el incremento de la expresión de mTOR por la restricción de movimiento aguda. Igualmente, se registró la potenciación en la expresión proteica de Beclin1 y ULK1 en el grupo RS con respecto a su CT (Figura 97(C y E)), lo que no pasó en su vertiente crónica. Al constatar la influencia de cada estresor a través del ANOVA de dos vías, surgieron nuevas aportaciones esclarecedoras (Tablas 14 y 15): hubo un mayor número de interacciones en el modelo agudo que en el crónico. En el primero, se produjeron sobre la expresión proteica de p-mTOR, mTOR, p-ULK1, ULK1, p-SQSTM1, Atg3 y Atg16L1. En el segundo, en la de mTOR y Atg16L1 exclusivamente. Pese a lo cual, la deprivación materna fue origen de menores efectos en el modelo agudo, concretamente, solo en la concentración de Beclin1 y Atg7, mientras que en el modelo crónico se pudo observar en p-ULK1, ULK1, p-SQSTM1 y también en Beclin1. Curiosamente, la repercusión individual del segundo estímulo afectó en ambos casos a cuatro proteínas, p-SQSTM1 y Atg7 en ambos casos, así como mTOR y Atg5 en la restricción de movimiento aguda y Atg3 y Atg16L1 en la restricción aplicada de forma crónica. 5) El modelo MD+RS crónico induce la expresión génica de mediadores autofágicos Los ensayos de RT-qPCR pusieron de manifiesto que el modelo MD+RS contribuyó a la inducción de genes de autofagia de una forma en la que MD+LPS no tuvo alcance. Resultados 225 Figura 96. ANOVA de una vía de proteínas implicadas en la vía de la autofagia en el modelo crónico de MD+RS en la CF. El grupo MD+RS presentó mayores niveles de Beclin1 (C) y p-SQSTM1 (F) con respecto a sus CT. A su vez, el grupo RS mostró incrementos de expresión proteica en p-SQSTM1 (F), Atg3 (H) y Atg16L1 (I) al contrastarlas con sus respectivos CT. Los datos se expresan como la media ± SEM de 9-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01; ***p<0.001). Resultados 226 Figura 97. Análisis de ANOVA de una vía en el modelo MD+RS agudo de las proteínas efectoras de la vía de la autofagia en la CF. Beclin1 fue modulada al alza por la combinación de ambos estresores (C) con respecto a su CT, aunque p-SQSTM1 (F) y Atg3 (H) lo hicieron a la baja, pero con respecto a la restricción de movimiento, en cuyos grupos se vieron a su vez elevadas, esta vez sí, al compararlas con sus correspondientes CT. mTOR también experimentó una escalada en sus valores proteicos a causa de la restricción de movimiento y a la deprivación materna, pero no tras la combinación de ambos (B). Asimismo, ULK1 (E) y Atg16L1 (I) exhibieron un ascenso en su presencia proteica en los grupos RS en comparación con sus CT. Los datos se expresan como la media ± SEM de 9-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01; ***p<0.001). Resultados 227 La comparación entre los grupos CT y MD+RS por medio de la t de Student manifestó que cuando la restricción de movimiento ocurría de forma puntual, la expresión genética de los marcadores considerados mantenía sus valores basales (Figura 98(A)). No obstante, el modelo crónico indujo los genes Mtor, Ulk1 y Atg12, con tendencias observadas también en Atg7 y Lc3β (Figura 98(B)). Figura 98. Evaluación de la expresión genética de marcadores autofágicos en los modelos MD+RS agudo y crónico en la CF. A pesar de que el modelo agudo no ocasionó variaciones en los genes examinados (A), la cronicidad de la restricción de movimiento desembocó en la inducción genética de Mtor, Ulk1 y Atg12, así como marcadas tendencias en Atg7 y Lc3β (B). Los análisis se completaron empleando la t de Student de dos colas. Los datos se expresan como la media ± SEM de 9-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 228 El análisis resultante del ANOVA de una vía reveló un mayor número de alteraciones a nivel genético, siendo el modelo crónico el de mayor repercusión. Mtor y Ulk1 acrecentaron su expresión genética en los grupos doble hit en comparación con sus CT (Figura 99(A y B)), mientras que Atg3, Atg7 y Atg12 lo hicieron con respecto al grupo MD (Figura 99(E, G y H)). También resultó interesante la elevación en la expresión de los genes Ulk1, Beclin1, Sqstm1, Atg7 y Lc3β en los grupos de restricción crónica cuando eran contrastados con sus respectivos grupos de deprivación materna (Figura 99(B-D, G y K)). De hecho, los genes Ulk1, Sqstm1 y Lc3β potenciaron su expresión con motivo de la restricción de movimiento crónica al ser comparada con sus CT (Figura 99(B, C y K)). Por el contrario, el modelo MD+RS agudo no tuvo tanta repercusión a nivel genético. Solamente se hallaron variaciones en los genes Ulk1 y Atg12. En el primero, los grupos RS y MD+RS presentaron mayores índices de expresión genética que su grupo de MD (Figura 100(B)). En el caso del segundo, también el grupo RS potenció la expresión genética de Atg12 en relación con el grupo MD (Figura 100(H)). En lo relativo al análisis de ANOVA de dos vías consecutivo, la clave fue encontrada en el segundo hit (Tablas 14 y 15). Aunque no hubo efecto debido al primer estímulo en el modelo agudo, el segundo registró influencias sobre la expresión de Mtor, Ulk1, Atg7, Atg12, Lc3α y Lc3β. A pesar de no producirse ningún fenómeno de interacción entre los dos estresores en el modelo agudo, el ANOVA de dos vías reveló que en el crónico sí que se produjo en Atg3 y Atg16l1. En este caso, los efectos de la restricción de movimiento crónica se extendieron por todos los genes considerados, con la salvedad de Atg3, Atg5 y Atg16l1. Por último, la deprivación materna fue responsable de variaciones en el gen Sqstm1, el único en verse modificado por el primer estímulo. Resultados 229 Figura 99. ANOVA de una vía de los genes relacionados con la autofagia en el modelo MD+RS crónico en la CF. En el grupo MD+RS se indujo la expresión genética de Mtor (A) y Ulk1 (B) con respecto a sus CT, y de Atg3 (E), Atg7 (G) y Atg12 (H) con respecto a sus grupos MD. La restricción de movimiento también causó el incremento de la expresión de Ulk1, Beclin1 (C), Sqstm1 (D), Atg7 y Lc3β (K). Los datos se expresan como la media ± SEM de 9- 12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01; ***p<0.001). Resultados 230 Figura 100. Evaluación de la expresión genética de elementos de la vía de la autofagia en el modelo MD+RS por ANOVA de una vía en la CF. Los mismos genes que previamente se cuantificaron fueron sujetos a examen en el modelo agudo, donde se observó una subida de la expresión del gen Ulk1 en los grupos RS y MD+RS en relación con su grupo MD (B), además de la de Atg12 en el grupo RS también con respecto al grupo MD (H). No se hallaron diferencias en el resto de los genes considerados. Los datos se expresan como la media ± SEM de 9-12 ratas por grupo evaluado. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01). Resultados 231 En las tablas que se muestran a continuación se exhiben los resultados del análisis estadístico ANOVA de dos vías de cada estímulo independiente y los efectos de su posible interacción, tanto en el modelo crónico (Tabla 14) como en el agudo (Tabla 15). También se presentan la información relativa a las pruebas comportamentales. Parámetro MD RS Crónico Interacción p-mTOR (prot) F(1,32)=4.015; p=0.0534 F(1,32)=0.2650; p=0.6102 F(1,32)=3.215; p=0.0821 mTOR (prot) F(1,32)=3.870; p=0.0576 F(1,32)=1.458; p=0.2358 F(1,32)=6.379; p=0.0165* p-ULK1 (prot) F(1,32)=15.4; p=0.0004*** F(1,32)=1.199; p=0.2817 F(1,32)=0.2333; p=0.6324 ULK1 (prot) F(1,32)=8.114; p=0.0075** F(1,32)=0.4861; p=0.4905 F(1,32)=0.08526; p=0.7721 p-SQSTM1 (prot) F(1,32)=5.108; p=0.0305* F(1,32)=8.561; p=0.0062** F(1,32)=2.607; p=0.1159 SQSTM1 (prot) F(1,32)=0.2101; p=0.6497 F(1,32)=1.804; p=0.1884 F(1,32)=2.780; p=0.1049 Beclin1 (prot) F(1,32)=12.66;p=0.0012** F(1,32)=1.969; p=0.1699 F(1,32)=3.670; p=0.0641 Atg3 (prot) F(1,32)=0.1562; p=0.6953 F(1,32)=6.232; p=0.0177* F(1,32)=0.8385; p=0.3665 Atg5 (prot) F(1,32)=0.05757; p=0.8119 F(1,32)=1.817; p=0.1868 F(1,32)=0.02523; p=0.8748 Atg7 (prot) F(1,32)=0.3456; p=0.5606 F(1,32)=6.015; p=0.0196* F(1,32)=3.811; p=0.0594 Atg12 (prot) F(1,32)=1.283; p=0.2657 F(1,32)=0.2163; p=0.6450 F(1,32)=0.4919; p=0.4882 Atg16L1 (prot) F(1,32)=0.5334; p=0.4707 F(1,32)=15.48; p=0.0004*** F(1,32)=8.259; p=0.0073** LC3I (prot) F(1,32)=1.099; p=0.3022 F(1,32)=2.962; p=0.0946 F(1,32)=0.2335; p=0.6321 LC3II (prot) F(1,32)=2.972; p=0.0941 F(1,32)=0.1599; p=0.6918 F(1,32)=0.3939; p=0.5346 Mtor (mRNA) F(1,32)=0.2165; p=0.6451 F(1,32)=14.16; p=0.0007*** F(1,32)=2.660; p=0.1133 Ulk1 (mRNA) F(1,32)=0.4103; p=0.5264 F(1,32)=21.27; p<0.0001**** F(1,32)=0.4239;p=0.5197 Sqstm1 (mRNA) F(1,32)=7.451; p=0.0102* F(1,32)=15.53; p=0.0004*** F(1,32)=0.3610; p=0.5522 Beclin1 (mRNA) F(1,32)=3.510; p=0.0702 F(1,32)=5.625; p=0.0239* F(1,32)=0.00246; p=0.9607 Atg3 (mRNA) F(1,32)=0.7503; p=0.3933 F(1,32)=3.671; p=0.0649 F(1,32)=5.096; p=0.0314* Atg5 (mRNA) F(1,32)=0.1416; p=0.7092 F(1,32)=2.738; p=0.1078 F(1,32)=0.8408; p=0.3660 Atg7 (mRNA) F(1,32)=0.004662; p=0.946 F(1,32)=13.82; p=0.0008*** F(1,32)=0.1829; p=0.6717 Atg12 (mRNA) F(1,32)=0.08430; p=0.7734 F(1,32)=15.11; p=0.0005*** F(1,32)=0.4186; p=0.5223 Atg16l1 (mRNA) F(1,32)=0.005189; p=0.943 F(1,32)=0.07210; p=0.7900 F(1,32)=8.366; p=0.0068** Lc3α (mRNA) F(1,32)=0.4910; p=0.4885 F(1,32)=11.51; p=0.0019** F(1,32)=0.0444; p=0.8344 Lc3β (mRNA) F(1,32)=0.9611; p=0.3345 F(1,32)=13.94; p=0.0008*** F(1,32)=0.3518; p=0.5574 Splash latency F(1,33)=2.086; p=0.1581 F(1,33)=0.3149;p=0.5785 F(1,33)=0.003403; p=0.953 Splash g. dur. F(1,33)=0.8325; p=0.3682 F(1,33)=1.816; p=0.1870 F(1,33)=0.5751; p=0.4536 Splash times F(1,33)=0.2061; p=0.6528 F(1,33)=3.507; p=0.007 F(1,33)=0.02898; p=0.8659 EPM E. abierto F(1,33)=10.77; p=0.0024** F(1,33)=0.008866; p=0.9256 F(1,33)=0.6699; p=0.4190 EPM E. cerrado F(1,33)=0.00673; p=0.9352 F(1,33)=0.01664; p=0.8983 F(1,33)=0.08595; p=0.7715 EPM E. ratio F(1,33)=0.07752; p=0.7824 F(1,33)=0.05436; p=0.8171 F(1,33)=0.3384; p=0.5647 EPM t abierto F(1,33)=2.187; p=0.1486 F(1,33)=1765; p<0.0001**** F(1,33)=2.196; p=0.1479 EPM t. cerrado F(1,33)=0.09411; p=0.7609 F(1,33)=0.7748; p=0.3851 F(1,33)=3.803; p=0.0597 EPM t. ratio F(1,33)=0.08322; p=0.7748 F(1,33)=0.6647; p=0.4208 F(1,33)=3.878; p=0.0574 Tabla 14. Evaluación mediante ANOVA de dos vías del efecto de la deprivación materna y la restricción de movimiento crónica sobre la expresión genética y proteica de elementos autofágicos, así como los estudios comportamentales realizados. A nivel proteico, se observó interacción en mTOR y Atg16L1. Paralelamente, el primer estresor fue causante de alteraciones en p-ULK1, ULK1, p-SQSTM1 y Beclin1, mientras que el segundo en p-SQSTM1, Atg3, Atg7 y Atg16L1 a este mismo nivel. La restricción de movimiento crónica sí llevó a la presencia de interacciones en los genes Atg3 y Atg16l1. La deprivación materna fue causante unilateralmente de modificaciones en el gen Sqstm1, así como la restricción de movimiento llevó a variaciones en la expresión de Mtor, Ulk1, Sqstm1, Beclin1, Atg7, Atg12, Lc3α y Lc3β. En cuanto a las pruebas comportamentales, el primer estímulo modificó el número de entradas en los brazos abiertos, a la vez que el segundo alteró la cantidad de tiempo que las ratas pasaron en este. Los resultados estadísticamente significativo se marcan en negrita y color azul. Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 232 Parámetro MD RS Agudo Interacción p-mTOR (prot) F(1,32)=0.5352; p=0.4698 F(1,32)=4.098; p=0.0513 F(1,32)=9.596; p=0.004** mTOR (prot) F(1,32)=1.645; p=0.2088 F(1,32)=5.415; p=0.0264* F(1,32)=11.04; p=0.0022** p-ULK1 (prot) F(1,32)=1.068; p=0.3092 F(1,32)=2.265; p=0.1422 F(1,32)=5.234; p=0.0289* ULK1 (prot) F(1,32)=0.2549; p=0.6171 F(1,32)=3.172; p=0.0844 F(1,32)=10.22; p=0.0031** p-SQSTM1 (prot) F(1,32)=1.872; p=0.1808 F(1,32)=7.353; p=0.0107* F(1,32)=34.9; p<0.0001**** SQSTM1 (prot) F(1,32)=1.283; p=0.2657 F(1,32)=2.486; p=0.1247 F(1,32)=3.119; p=0.0869 Beclin1 (prot) F(1,32)=9.383; p=0.0043** F(1,32)=1.012; p=0.3218 F(1,32)=2.235; p=0.1444 Atg3 (prot) F(1,32)=3.470; p=0.0717 F(1,32)=3.856; p=0.0583 F(1,32)=15.1; p=0.0005*** Atg5 (prot) F(1,32)=1.513; p=0.2276 F(1,32)=5.740; p=0.0226* F(1,32)=1.286; p=0.2652 Atg7 (prot) F(1,32)=6.399; p=0.0165* F(1,32)=7.301; p=0.0109* F(1,32)=0.1531; p=0.6982 Atg12 (prot) F(1,32)=3.870; p=0.0579 F(1,32)=0.1365; p=0.7142 F(1,32)=1.810; p=0.1880 Atg16L1 (prot) F(1,32)=0.7112; p=0.4057 F(1,32)=1.142; p=0.2939 F(1,32)=12.59; p=0.0013** LC3I (prot) F(1,32)=0.6407; p=0.4294 F(1,32)=2.283; p=0.1407 F(1,32)=0.03868; p=0.8453 LC3II (prot) F(1,32)=0.8132; p=0.3741 F(1,32)=0.1706; p=0.6824 F(1,32)=2.710; p=0.1098 Mtor (mRNA) F(1,32)=0.2028; p=0.6558 F(1,32)=4.795; p=0.0367* F(1,32)=0.4348; p=0.5149 Ulk1 (mRNA) F(1,32)=0.4540; p=0.5055 F(1,32)=13.08; p=0.0010** F(1,32)=0.4641; p=0.5008 Sqstm1 (mRNA) F(1,32)=1.140; p=0.2939 F(1,32)=0.09947; p=0.7546 F(1,32)=0.2982; p=0.5889 Beclin1 (mRNA) F(1,32)=3.017; p=0.0923 F(1,32)=1.166; p=0.2886 F(1,32)=0.2618; p=0.6125 Atg3 (mRNA) F(1,32)=1.178; p=0.2861 F(1,32)=0.04965; p=0.8251 F(1,32)=0.01024; p=0.92 Atg5 (mRNA) F(1,32)=0.08051; p=0.7785 F(1,32)=1.999; p=0.1674 F(1,32)=0.09529; p=0.7596 Atg7 (mRNA) F(1,32)=0.5416; p=0.4673 F(1,32)=5.059; p=0.0318* F(1,32)=0.0160; p=0.9002 Atg12 (mRNA) F(1,32)=2.473; p=0.1260 F(1,32)=5.777; p=0.0224* F(1,32)=0.2422; p=0.6261 Atg16l1 (mRNA) F(1,32)=0.4633; p=0.5012 F(1,32)=0.2744; p=0.6041 F(1,32)=3.619; p=0.0664 Lc3α (mRNA) F(1,32)=1.454; p=0.2370 F(1,32)=7.652; p=0.0095** F(1,32)=0.4265; p=0.5185 Lc3β (mRNA) F(1,32)=0.1979; p=0.6597 F(1,32)=6.855; p=0.0137* F(1,32)=0.00055; p=0.9813 Tabla 15. ANOVA de dos vías sobre los parámetros estudiados de la vía de la autofagia en el modelo de deprivación materna y restricción de movimiento agudo. Aunque no se observó interacción entre ambos estímulos a nivel de ARN mensajero, sí se encontraron en las proteínas p-mTOR, mTOR, p-ULK1, ULK1, p-SQSTM1, Atg3 y Atg16L1. La deprivación materna provocó cambios en las proteínas Beclin1 y Atg7, mientras que la restricción de movimiento aguda varió la expresión proteica de mTOR, p-SQSTM1, Atg5 y Atg7. Curiosamente, el segundo hit causó numerosas modificaciones en la expresión genética de varios genes, entre ellos, Mtor, Ulk1, Atg7, Atg12, Lc3α y Lc3β. Los resultados estadísticamente significativo se marcan en negrita y color azul Una *p<0.05 fue considerada como estadísticamente significativa (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Resultados 233 DISCUSIÓN 1. Estudio bioquímico de la autofagia 2. Estudio bioquímico de la mitofagia 3. Rutas y procesos relacionados con la autofagia 4. Pruebas comportamentales 234 235 1. Estudio bioquímico de la autofagia 1.1. Expresión proteica y génica de la autofagia en los modelos estudiados En los últimos años, se ha puesto de manifiesto la implicación de la autofagia en múltiples procesos moleculares [51] y su posible manipulación en diferentes estrategias terapéuticas [150]. En esta Tesis Doctoral se han evaluado marcadores de autofagia desde varias perspectivas y en cuatro modelos animales basados de interés en psiquiatría. De ellos, la principal conclusión que se deduce es la relación intrínseca entre el tipo de estrés y la modulación de la autofagia: según la clase de estímulo empleado, las alteraciones derivadas de los estresores causan una regulación distintiva de la autofagia, dando lugar a modificaciones a diferentes niveles de la vía. A la luz de los resultados obtenidos, no es posible dictaminar si estas modulaciones de la autofagia son consecuencia de las modificaciones en otros sistemas, que acabarían activando y regulando la autofagia, o bien, si el propio estresor activa directamente la autofagia de forma característica de acuerdo con su naturaleza. En el primer caso, la activación de receptores inmunes y rutas inflamatorias podrían secuencialmente inducir la vía de la autofagia, aunque el estresor marque inicialmente qué tipo de rutas entran en acción y a qué nivel se regula la autofagia. En el segundo caso, factores implicados en la autofagia pueden actuar como sensores de estrés y daño celular, por lo que podrían ser puestos en marcha tras la exposición a los estímulos externos. Nuevamente, la naturaleza y duración de estos tejen y entremezclan las vías moleculares participantes en la respuesta al estrés. De hecho, existe la posibilidad de que se produzca cierta interacción entre las dos situaciones. Además, en el caso del CMS, la modulación de la autofagia es específica de la región en el SNC: existe un perfil de alteración concreto en la CF y otro en el Hp, lo que remarca el probable papel característico de la autofagia en cada región, así como la vulnerabilidad propia de cada una ante situaciones de estrés. Se observó que la CF es más susceptible a cambios en los elementos de autofagia que el Hp, donde se registraron cambios de menor intensidad. Algo sobre lo que sería interesante indagar sería la conexión CF-Hp: ¿Habría algún mecanismo que comunique la autofagia entre las dos áreas cerebrales? ¿La modulación de la vía es independiente de zona, o hay repercusión de lo que ocurre en una sobre la otra, en términos de autofagia? Existe una ruta de proyección neuronal desde el Hp hasta la CF muy implicada en fenómenos de cognición y en funciones ejecutivas. Esta ruta es altamente sensible al estrés y se han detectado fallos en su activación en diferentes trastornos psiquiátricos y Discusión 236 modelos animales. Este circuito Hp-CF favorece la sincronía entre ambas estructuras y está implicada en el procesamiento de las emociones relacionadas con el miedo y la ansiedad [151]. La CF y el Hp también pueden interaccionar bidireccionalmente a través de otras rutas indirectas pasando por el tálamo [152]. En modelos animales de estimulación inmune materna, utilizados en estudios de patologías del neurodesarrollo y en especial, en trastornos psicóticos como la esquizofrenia, se observó que la sincronía Hp-CF estaba afectada y se correlacionaba con alteraciones en las pruebas de inhibición prepulso (una respuesta sensorimotora que también presentan los pacientes con esquizofrenia) [152]. Teniendo en cuenta la participación directa de la autofagia en la fisiología neuronal, la neurotransmisión y el desarrollo sináptico, y que la autofagia en la presinapsis se regula por la actividad sináptica [153], no sería muy descabellado pensar en la posibilidad de que las conexiones neuronales Hp-CF transmitan información de los estados de autofagia entre una estructura y la otra. No es factible confirmar si la diferente modulación especifica de zona cerebral es aplicable a los modelos del neurodesarrollo; únicamente se puede extraer esta conclusión del modelo de CMS. En esos casos, podría darse la situación en la que el Hp fuera la zona más afectada en lo relativo a la vía de la autofagia, teniendo como base el papel fundamental del Hp en la neurogénesis y en los distintos eventos del neurodesarrollo. En cuanto a los resultados obtenidos por WB y RT-qPCR, las proteínas mTOR, SQSTM1/p62, Atg3 y Atg16L1 fueron las que experimentaron mayores variaciones a lo largo de los cuatro modelos, si bien su patrón de modulación fue diverso: la deprivación materna, la administración de Poly I:C y el CMS causaron una elevación de los niveles proteicos de mTOR, lo que sugiere que estos tres modelos actuaron en los primeros estadios de la vía, suponiendo un aumento de la inhibición de la autofagia o un apoyo de recursos para todas las funciones ajenas a la autofagia que realiza mTOR. Aunque este incremento es compartido entre modelos, solo en el modelo MD+RSc se produjo una inducción de su expresión génica en el grupo doble hit. La ausencia de este efecto en su vertiente aguda acentúa la cronicidad de la restricción de movimiento como necesaria para la estimulación génica de Mtor (el análisis ANOVA de dos vías indicó que el efecto era debido al RS). Y es que resulta curioso que, en este preciso modelo, el incremento de ARNm y proteína de mTOR en grupos doble hit y MD apunten a la tendencia del estrés a la inhibición de la autofagia. Sin embargo, otros factores analizados muestran un intento de activación de la misma: el incremento de p-SQSTM1 y Beclin1 en el grupo MD+RSc señalan la inducción del proceso de nucleación y selección de la carga a eliminar. Es más, esta subida se ve acompañada del aumento Discusión 237 de la expresión génica de Ulk1, posiblemente como oposición a la elevación de mTOR y como apoyo de p-SQSTM1 y Beclin1. La restricción de movimiento crónica elevó también Atg3 y Atg16L1, aunque parece que la MD previene este efecto en el grupo doble hit. Por su parte, el modelo Poly+Iso también mostró que su primer estresor era capaz de aumentar los valores de mTOR, sin que ocurriese lo mismo en relación con sus niveles de ARNm. Además, el grupo doble hit consiguió restaurar sus niveles comparados con los CT. Este modelo es el más paradójico de todos: el Poly I:C induce la autofagia unilateralmente, observándose en casos como ULK1, p-SQSTM1/SQSTM1, Atg16L1 subidas en niveles proteicos que posteriormente se ven normalizados a los CT en el grupo doble hit. Estos resultados parecen indicar que el segundo estresor, el aislamiento social, condiciona, previene o prepara al animal ante la respuesta consecuente al estrés imperante, de manera que estas proteínas no mostraron modificación alguna en los animales Poly+Iso al compararse con los CT. Todo ello apuntaría a un fenómeno de adaptación, donde el aislamiento suavizaría u homogeneizaría los efectos del Poly I:C en lo relativo a la autofagia. Esto supondría una respuesta adaptativa al estrés donde la autofagia jugaría un papel clave como fenómeno regulador y controlador de la homeostasis celular. Un sistema capaz de responder de forma oportuna a un agente estresor exógeno impediría un daño tisular mayor a largo plazo, así como posibles eventos inflamatorios que perjudicarían aún más si cabe las perspectivas futuras. El único efecto observado en este modelo en lo relativo al ARNm fue el descenso de la isoforma α de Lc3 en el grupo doble hit, con una ligera tendencia al alza en el grupo Poly I:C, hecho compartido con el modelo MD+LPS crónico. La familia de LC3 está compuesta por tres isoformas (LC3A(α), LC3B(β) y LC3C) cuyas funciones específicas no se han dilucidado aún. Normalmente se consideran en su conjunto, ya que los anticuerpos empleados las detectan indistintamente. Aunque desconocidas sus funciones particulares, se ha observado que su distribución celular es específica: LC3A permanece en la zona nuclear y perinuclear, LC3B en el citosol y el nucleolo, y LC3C en el citosol y el núcleo [154]. En los modelos Poly+Iso y MD+LPSc se obtuvieron descensos a nivel génico de la isoforma α en los grupos doble hit, indicando la necesidad de un apoyo adicional a la isoforma localizada en las zonas nuclear y perinuclear. Este hecho abre la puerta a posibles alteraciones del estrés a determinadas isoformas de LC3, señalando una modulación desigual de esta proteína. Que la RSc aumente el ARNm de la isoforma β parece apuntar por tanto a una deficiencia de esta en el citosol y en el nucleolo, evidenciando también que la naturaleza y la duración del estrés afectan de forma concreta y específica a las isoformas de LC3. Discusión 238 Esto, en definitiva, supondría la variación diferencial del proceso de elongación, maduración de LC3-II y formación de los autofagosomas de acuerdo con el estrés y su isoforma diana. Tras la exposición al CMS, mTOR aumentó en la CF, aunque no en el Hp, donde fue su forma fosforilada la que se halló disminuida. En otros estudios realizados en un modelo similar al CMS de 8 semanas de duración se observó la reducción de la fosforilación Ser2448 de mTOR en la amígdala de ratas estresadas, pero solo cierta tendencia a la disminución en el Hp y ninguna variación en la CF [155]. Estos datos apoyarían la hipótesis de una respuesta específica en región y, posiblemente en tiempo, de los elementos implicados en la autofagia. En condiciones basales, mTOR mantiene inactiva a ULK1 mediante la fosforilación de esta última en la Ser757, pero en condiciones de estrés o deprivación de nutrientes, mTOR es inhibida para facilitar la activación de ULK1 [156]. En respuesta al estrés celular, se reduce la fosforilación en la Ser2448 de mTOR para disminuir más aún la fosforilación que esta sustenta sobre la Ser757 de ULK1, permitiendo así la liberación de ULK1 para formar su complejo de iniciación y activar seguidamente a Beclin1 [157]. Es únicamente en este modelo de CMS en el que se registraron cambios proteicos en ULK1 y su fosforilación en la Ser757, apreciándose considerables bajadas en sus niveles en comparación con sus CT. Asimismo, Beclin1 también registró un descenso claro de sus valores proteicos, tanto en la CF como en el Hp. Estos resultados podrían indicar la existencia de anomalías en el proceso de iniciación y nucleación en ambas estructuras. Paralelamente, investigaciones previas en un modelo CMS de 7 semanas de exposición a estrés y en otro modelo de bulbectomía olfatoria bilateral se encontraron niveles reducidos de Beclin1 en el Hp de ratas [158, 159]. En el modelo MD+RSc se observaron concentraciones aumentadas de Beclin1 en el grupo doble hit, señalando nuevamente lo anteriormente comentado: los diferentes tipos de estrés modulan de manera desigual los parámetros esenciales de autofagia. El CMS disminuyó sus valores, dificultando la nucleación, mientras que la MD+RSc los potenció, promoviendo la inducción de la vía. La naturaleza del estrés empleado en ambos casos es de tipo mixta físico-psicológica, pero podría ocurrir que la exposición temporal específica de cada modelo al estrés concluya en esta modulación diferencial observada en los factores de autofagia. En la misma línea, se registró un aumento de la inducción génica de Beclin1 en el grupo RSc, sugiriendo que la cronicidad del segundo estresor es necesaria para el aumento de la transcripción de Beclin1, pero que no es imprescindible para su elevación proteica, ya que el modelo MD+RSa también exhibió un incremento de Beclin1 en el grupo doble hit. Existe asimismo la posibilidad de que Discusión 239 hubiera una inducción rápida de la transcripción tras la exposición aguda a la restricción seguida de la traducción de Beclin1. Aunque en este último modelo no se observaron cambios proteicos en ULK1, tanto el grupo doble hit MD+RSc como el RSc sufrieron un aumento de su correspondiente expresión génica, destacando de nuevo la preferencia del sistema a llevar a cabo la autofagia. Especial mención requiere la drástica disminución de la fosforilación en la Ser2448 de mTOR en los grupos doble hit de los modelos MD+LPS agudo y MD+LPS crónico. El ANOVA de dos vías puso de manifiesto efectos de ambos estresores de forma independiente en los dos modelos, pero en ninguno hubo interacción entre ellos. Esto implica que, aunque en las versiones aguda y crónica cada estímulo redujo los niveles de p-mTOR, su combinación no entraña un efecto sumatorio en el grupo doble hit, como sería deducible en primera instancia. Los valores mínimos de p-mTOR supondrían un aumento brusco de la activación de la autofagia, que precisamente no van en consonancia con la ausencia de modificaciones en elementos posteriores de la vía, como ULK1 y Beclin1. Los que sí se vieron alterados fueron SQSTM1/p62 y LC3-II en el grupo MD+LPSc, evidenciando la potenciación de la autofagia con el aumento de la concentración de los adaptadores y de la cantidad de autofagosomas presentes. Una posible explicación sería que la menor fosforilación de la Ser2448 haya repercutido en otras dianas más allá de las evaluadas y que su contundente reducción haya afectado a otras rutas moleculares. Por ejemplo, la fosforilación de mTOR estimula la síntesis proteica y con ello, la biogénesis y actividad de los ribosomas [160]. La reducción contundente de p-mTOR ante la estimulación conjunta de la MD y el LPSc podría estar impidiendo esta actividad proteica, favoreciendo la autofagia a través de la acumulación de proteínas dañadas y aberrantes: sin un sistema garantizado de renovación de proteínas y ribosomas, las proteínas dañadas tienden a concentrarse y a dificultar otros procesos metabólicos. Esta situación sí explicaría el aumento de SQSTM1/p62 causado por el modelo. Adicionalmente, los valores de p-mTOR también mermaron en el Hp del modelo CMS, lo que deja a su vez como incógnita el patrón de cambios de esta proteína en el Hp del modelo MD+LPSc. Otro de los elementos clave de la autofagia y con mayor susceptibilidad al estrés fue el secuestroma. La fosforilación de SQSTM1/p62 en la Ser403 intensifica la afinidad de este adaptador hacia sus sustratos poliubiquitinados, potenciando así su eliminación por autofagia [61, 161], siendo ULK1 el que lleva a cabo dicha fosforilación y favoreciendo el traslado de SQSTM1/p62 hacia el lugar donde se forma el autofagosoma [161]. Nuevamente se apreció una modulación opuesta de la autofagia entre los modelos CMS y MD+RSc en la CF: la disminución drástica de p-SQSTM1 en el primero en Discusión 240 contraposición con la notable subida en el segundo. De hecho, la aplicación aguda del mismo modelo no produjo dicha elevación en el grupo doble hit, pero sí en el grupo RSa, cuyas concentraciones de p-SQSTM1 fueron tan altas como las detectadas en el grupo RSc. El ANOVA de dos vías puso de manifiesto que los dos estresores fueron los responsables de los efectos observados en la proteína p-SQSTM1 de la versión crónica, pero no en la aguda. Además, p-SQSTM1 junto con Beclin1, fueron dos de las pocas proteínas cuya regulación en respuesta al estrés fue semejante tanto en la CF como en el Hp del modelo CMS. Estos resultados en el CMS tienen coherencia con investigaciones previas de nuestro grupo, donde se observaron niveles elevados de la proteína Keap1 a la vez que la disminución del factor de transcripción antioxidante Nrf2 en la CF [162]. La disminución de la fosforilación en la Ser403 de SQSTM1/p62 conduciría a una menor afinidad de esta por sus dianas moleculares y, por ello, a la acumulación de Keap1 en el citosol. Este hecho conllevaría a la mitigación de la translocación de Nrf2 al núcleo [162]. Por tanto, se produciría la merma de las defensas antioxidantes celulares con el consiguiente aumento de ROS y RNS. La inducción de la autofagia también se produjo a nivel de la proteína p-SQSTM1 en el grupo Poly I:C del modelo Poly+Iso, viéndose considerablemente elevada en comparación en el grupo doble hit. Esta circunstancia apoya la afirmación previa sobre el Poly I:C: esto es, la inyección aguda en el periodo gestacional provoca el aumento de marcadores de autofagia en la etapa juvenil-adulta en ratas, lo que supone que estos animales experimentan mayores niveles de autofagia. La activación inmune materna implica un ritmo autofágico elevado en la descendencia, posiblemente ligado a eventos inflamatorios aberrantes o a dificultades en los procesos de resolución inflamatoria [24]. Es elemental recordar que tanto el defecto como el exceso de autofagia tiene consecuencias perjudiciales para las células. El ANOVA de dos vías reveló que el aislamiento social fue el responsable del efecto observado en p-SQSTM1 del grupo Poly+Iso, respaldando de nuevo la hipótesis de que el aislamiento social ocasiona una respuesta celular adaptativa que repercute en unos niveles autofágicos más similares a los basales (aquellos apreciados en los CT). Sin embargo, los niveles de proteína total de SQSTM1/p62 disminuyeron en el grupo Poly+Iso en comparación con los CT, de los que el ANOVA de dos vías detectó efecto por parte del aislamiento social. La reducción de esta y de su forma fosforilada son indicativo de un menor reclutamiento de los productos para degradar, así como una menor activación del complejo mTORC1, de la ruta de NF-κB y de las defensas antioxidantes de Nrf2 [62]. A pesar de ello, y en términos generales, la autofagia no se Discusión 241 vio afectada por el modelo Poly+Iso, si bien la administración de Poly I:C sí que activó la vía en la progenie. Los niveles de ARNm de Sqstm1 se mantuvieron constantes en el CMS y el Poly+Iso, mientras que decrecieron en el grupo doble hit del modelo MD+LPSc y subieron en el grupo RSc en el caso de la MD+RSc. En el primer caso, esta merma de la expresión génica contrasta con el consiguiente crecimiento de los niveles proteicos en el grupo MD+LPSc: es posible que la reducción de su transcripción sea consecuencia del incremento en la traducción. El propio sistema forzaría la restauración de los niveles basales proteicos a través de la disminución de la expresión génica. Por su parte, la amplificación de las concentraciones de ARNm de Sqstm1 en el grupo RSc no se vieron respaldadas en el grupo agudo RSa, sugiriendo que la exposición prolongada de la restricción de movimiento causa de por sí la inducción génica del gen Sqstm1, que consecuentemente repercute en el aumento de sus niveles proteicos, especialmente en la forma fosforilada. Este tipo de regulación sería la contraria a la que se ejecutaría en el modelo MD+LPSc: en este, por el contexto del resto de marcadores autofágicos, parece que la expresión génica precisa de ser disminuida para normalizar los valores proteicos, mientras que en el MD+RSc, el aumento de la transcripción repercute en la subsiguiente elevación de la presencia proteica, potenciando aún más la degradación de productos mediante la autofagia. Las proteínas Atg más susceptibles al estrés en el conjunto de los modelos fueron Atg3 y Atg16L1. En el CMS, la bajada de la presencia proteica de ambas vuelve a apuntar hacia un defecto en el proceso autofágico en la CF, puesto que esta reducción impediría el funcionamiento correcto de la elongación y la maduración apropiada de LC3-II. Esto repercutiría finalmente en la formación y maduración de autofagosomas. Atg3 también decreció en el Hp, si bien Atg16L1 vio inducidos sus valores. La diferente modulación de Atg16L1 entre las dos áreas cerebrales añade más evidencia sobre la característica regulación de la autofagia en respuesta al estrés según la localización cerebral: en la CF el estrés impidió la formación del complejo Atg16, dificultando la adición de PE a LC3-I, mientras que en el Hp, esta transferencia se vio favorecida. La respuesta al estrés de acuerdo con localización puede entremezclarse con el factor tiempo: sería posible que el Hp respondiese con mayor premura al estrés que la CF (p-ULK1 y ULK1 muestran una leve tendencia a la baja en el grupo CMS, por ejemplo, pudiendo deberse a una recuperación previa de sus niveles proteicos) o que esta última requiera mayor tiempo para recuperar la homeostasis, siendo por ello más vulnerable a los cambios desencadenados por el estrés. Esta hipótesis estaría avalada por la inducción de la Discusión 242 transcripción de varios genes Atg (Atg3, Atg5, Atg7 y Atg12), que estarían fomentando la normalización del proceso en el Hp. Tanto Atg3 como Atg7 facilitan la incorporación de PE a LC3-I para dar lugar a la maduración de los autofagosomas. La bajada proteica de Atg3 con la subida paralela de Atg7 en la CF del grupo CMS podrían ser resultado del ambiente prooxidante generado por el modelo CMS [162]: esta circunstancia alteraría la capacidad de Atg3 y Atg7 de interaccionar con LC3, impidiendo la formación y correcta maduración de los autofagosomas. Paralelamente, la inducción génica y proteica de Atg7 podrían ser consecuencia del descenso de los valores proteicos de ULK1 y Beclin1 en la CF, en un intento del sistema por recuperar la homeostasis. La autofagia dependiente de Atg7 protege a la célula frente a ROS y su deficiencia conduce a la acumulación descontrolada de radicales libres [163]. El ambiente prooxidante derivado del CMS, con un menor índice de translocación de Nrf2 al núcleo, provocarían como respuesta la expresión masiva de Atg7 para mitigar el exceso de estrés oxidativo y fomentar su eliminación a través de la autofagia. Esta circunstancia, unida con la disminución cortical de Atg16L1, agravarían el estado celular y exacerbarían el proceso de maduración de LC3-II. El crecimiento de Atg16L1 en el Hp serviría como respuesta para contrarrestar la reducción de Atg3 y Atg12. En el modelo Poly+Iso solo se aprecia el crecimiento de Atg16L1 en el grupo Poly I:C, con la consiguiente bajada en el grupo doble hit, repitiéndose el patrón de cambios de otras proteínas. Esta recuperación de unos niveles similares a los del CT en el grupo doble hit también ocurrió en Atg16L1 en el modelo MD+LPSc, siendo en este caso la deprivación materna la que baja sus niveles. Es precisamente la administración repetida del LPS la que consigue recuperar los niveles basales, manifestándose un hecho semejante al acontecido en el modelo Poly+Iso: la deprivación materna durante 24 h disminuye en la edad adulta los niveles de Atg16L1, dificultando la maduración de LC3- II, pero asienta las bases de una respuesta adaptativa al exponerse a un estresor crónico como el LPS. Esto ocurre únicamente en dicha proteína en el MD+LPSc, influyendo probablemente en la subida de LC3-II detectada en el grupo MD+LPSc. Curiosamente, en el modelo MD+RSc, es la restricción de movimiento crónica la causante de la elevación de Atg3 y Atg16L1, favoreciendo la degradación por autofagia. A la luz de todos estos datos, pueden extraerse una serie de conclusiones: el modelo de CMS impide el correcto funcionamiento de la autofagia, cuyos principales factores se encuentran en defecto tanto en la CF como en el Hp, aunque es la CF la más susceptible al estrés en términos de autofagia; el modelo Poly+Iso no modifica la vía de la autofagia, aunque el Poly I:C actúa induciendo sus principales factores de Discusión 243 manera independiente; las afectaciones en los modelos basados en la MD son dependientes del segundo estresor empleado, siendo la RS (especialmente en su vertiente crónica) la que induce la autofagia, mientras que la inyección de LPS encontró como su diana principal p-mTOR, sin efectuar grandes alteraciones en el resto de los parámetros evaluados. Lo realmente interesante de estas conclusiones radica en qué rutas moleculares se ponen en marcha en el CMS y cuáles en la MD+RSc para que las consecuencias en la vía de la autofagia sean opuestas. A pesar de que el CMS presentó mayor cantidad de alteraciones a nivel proteico y la MD+RSc a nivel génico, el CMS y la RS se basan en protocolos de estrés de tipo «psicológico» [164, 165], que podrían activar rutas neuroendocrinas y neuroinflamatorias comunes, por lo que cabría pensar inicialmente en una modulación semejante entre ambas. Resultaría muy beneficioso evaluar en experimentos futuros más parámetros que pudieran trazar las similitudes entre ambos modelos que pudiesen explicar la regulación opuesta de los marcadores de autofagia. Figura 101. Resumen de las alteraciones en la expresión proteica obtenidas por WB de los marcadores de autofagia en la CF de cada modelo estudiado. Referido a los modelos doble hit, solo se mostraron aquellos cambios en los grupos con la doble estimulación comparados con sus respectivos CT. Discusión 244 1.2. Análisis de inmunofluorescencia en el modelo CMS Los análisis de IF aportaron información complementaria sobre la localización celular de procesos concretos relacionados con la autofagia. Dado el descenso ocurrido de la fosforilación de la Ser403 de SQSTM1/p62 tanto en la CF como en el Hp, se optó por testarla en cortes corticales e hipocampales en el modelo de CMS. Mediante su colocalización con GFAP, marcador astrocitario, se determinó que esta fosforilación ocurre de forma prácticamente exclusiva en los astrocitos. Revisando la literatura disponible, esta sería la primera vez que se establece dicha conexión. Es más, la inmunotinción no fue homogénea en la población total de astrocitos, potencialmente indicando que hay subpoblaciones concretas de astrocitos que efectúan una modulación específica de p-SQSTM1. Además, la inmunotinción de p-SQSTM1 se distribuyó a lo largo de todo el cuerpo astrocitario, pero la señal fue más brillante (mayor concentración) en las zonas proximales al soma. Aunque no se llevó a cabo la doble tinción de p- SQSTM1 con algún tipo de marcador vascular que permitiese la señalización de vasos Figura 102. Resumen de los cambios de expresión génica obtenidos por RT-qPCR de los marcadores de autofagia en la CF de cada modelo estudiado. Referido a los modelos doble hit, solo se mostraron aquellos cambios en los grupos con la doble estimulación comparados con sus respectivos CT. Discusión 245 sanguíneos en los cortes estudiados, dado el extenso análisis de imágenes y la cantidad de cortes empleados se observó una amplia expresión de p-SQSTM1 en el espacio perivascular, inferido a partir de las formas circulares encontradas en los tejidos y que potencialmente constituirían la luz de vasos cortados de forma cortical. De ser este el caso, p-SQSTM1 ejercería un papel clave en la comunicación astrocitaria con el flujo sanguíneo cerebral. Este descubrimiento resaltaría y apoyaría el papel de la autofagia en astrocitos en la homeostasis cerebral, así como la importancia de estos en la respuesta autofágica al estrés crónico. Es por ello por lo que esta hipótesis debería de ser contrastada en futuros experimentos de inmunofluorescencia. Los astrocitos participan en la formación y conservación de la BHE, que se encuentra dañada en los pacientes con depresión mayor [166]. Modulan activamente la neurotransmisión sináptica mediante el control de la liberación y limpieza de los neurotransmisores en la brecha sináptica, además de sustentar fisiológicamente a las neuronas [167]. Responden rápidamente ante moléculas implicadas en la neuroinflamación y regulan el flujo sanguíneo en concordancia con la actividad neuronal. Figura 103. Mecanismo de acción propuesto sobre la fosforilación específica en la Ser403 de la proteína SQSTM1 en astrocitos. El traspaso de sustancias de desecho neuronales hacia los astrocitos podría implicar la fosforilación y consecuente activación de la autofagia astrocitaria, aumentando así la afinidad de SQSTM1/p62 por los productos enviados por las neuronas. Una vez concluida la autofagia, los residuos resultantes pasarían a las neuronas para que estas los empleen a conveniencia. Paralelamente, la activación de la autofagia en astrocitos podría suponer la inducción de la misma en las neuronas, erigiéndose entonces un proceso regulado por los astrocitos. Discusión 246 Adicionalmente, actúan como la defensa antioxidante del SNC a través de la liberación de moléculas antioxidantes [96, 167]. En términos generales, los astrocitos se activan en situaciones de estrés celular para proteger a las neuronas: la autofagia astrocitaria ha sido descrita como un mecanismo de control de calidad que previene la acumulación de agregados proteicos en los citoplasmas neuronales y astrocitarios. Por tanto, la alteración de la autofagia en estas células conduce de manera directa al desequilibrio de la homeostasis, contribuyendo a daño neuronal, problemas en la neurotransmisión y en la plasticidad neuronal [96]. La discrepancia de resultados entre los análisis de WB, que apuntaban hacia una bajada de su presencia, contrastado con los de IF, que señalan su elevación en la corteza motora primaria, la corteza orbital medial-ventral y las regiones hipocampales CA1 y GD, podría deberse al tipo de muestras de partida: los resultados de WB fueron analizados únicamente teniendo en cuenta las proteínas solubles presentes del citosol, por lo que aquella porción de p-SQSTM1 que estuviera encapsulado en vesículas o unido a orgánulos como el RE o la mitocondria fueron originalmente descartados. En contraposición a esta técnica, la IF permite la consideración de la cantidad total de p- SQSTM1 en todo el tejido. Así, los resultados de ambas técnicas no son excluyentes: el CMS disminuye considerablemente la cantidad total de p-SQSTM1 libre en el citosol, mientras que en zonas específicas de la CF y el Hp el CMS potenció su presencia total. La subida de p-SQSTM1 se relaciona de manera similar con la de GFAP, que muestra hiperactivación astrocitaria a causa del CMS. Paralelamente, el CMS incrementó la expresión de ambas proteínas en la corteza motora secundaria y en CA3, aumentándose la correlación entre ellas en estas zonas. Estos datos indican que el CMS potenció la expresión de p-SQSTM1 y GFAP en la corteza motora secundaria, CA3 y el GD causalmente. Además, la distribución preferente de p-SQSTM1 en el soma podría ser debida al reparto convencional de los lisosomas, que el CMS modificó intensificando su propagación por las ramificaciones astrocitarias. Todo ello pone de manifiesto la necesidad de realizar más estudios que permitan dictaminar la función específica de p-SQSTM1 en los astrocitos según su población y distribución y su posible interrelación con la autofagia neuronal. 1.3. Evaluación de la expresión y función lisosomal en el modelo CMS El lisosoma supone el final de la autofagia. La fosfatasa ácida se ha ido empleando comúnmente como marcador lisosomal; esta actúa cuando los lisosomas se fusionan con endosomas e hidroliza fosfatos a pH ácido, por lo que se usa para comprobar la Discusión 247 pureza lisosomal de las preparaciones [168]. La cantidad superior de fosfatasa ácida en los grupos CMS tanto de la CF como del Hp manifiestan que este modelo de estrés crónico estaría induciendo la biogénesis lisosomal, tanto en las CLF como en las fracciones purificadas. El incremento más marcado en las dos primeras fracciones purificadas de la CF significaría que los lisosomas más ligeros ostentarían una mayor susceptibilidad al protocolo CMS. Qué contenido enzimático presentaban o a qué subcategoría lisosomal pertenecían resulta imposible de saber, por lo que futuros estudios de proteómica de los extractos lisosomales serían una buena estrategia para seguir indagando sobre los efectos del CMS en los lisosomas. Por un lado, el ascenso de la cuantía lisosomal en todas las muestras de las dos áreas cerebrales podría ser el resultado de cargas acumuladas que no hubieran sido apropiadamente eliminadas. Por otro, dicho aumento neto es también evidencia de que la autofagia es defectuosa tras el CMS en las dos regiones: el daño lisosomal induce la autofagia para promover la retirada de estos una vez comprobado que son imposibles de reparar. Por tanto, estarían ocurriendo dos opciones no excluyentes: que el CMS haya generado agregados citosólicos y daño lisosomal, promoviendo la biogénesis lisosomal como respuesta al estrés imperante, pero como la autofagia estaba siendo impedida, no se produjo la correcta retirada y eliminación de lisosomas. Todo ello implicaría que el aumento de mTOR citosólico en la CF podría haber sido causado por la disminución de este en el extracto lisosomal, de manera que el desensamblaje del complejo mTORC1 de las membranas lisosomales tras la exposición a estrés repercutiría sobre la activación de TFEB, estimulando la expresión de genes lisosomales [63, 169]. Adicionalmente, el ensayo cinético Neutral Red no reveló información concluyente sobre la integridad lisosomal. Esta prueba se basa en la capacidad de las células vivas en incorporar el colorante, concentrándose específicamente en los lisosomas dado su pH acídico [170]. La fracción purificada Lyso 6 fue la que mejor índice de incorporación tuvo en las dos regiones, donde los lisosomas hipocampales más pesados no pudieron incluir más cantidad de colorante tras 5 min, lo que podría indicar que los lisosomas pesados son más vulnerables al estrés crónico. Estos resultados no van en desacuerdo con las deducciones anteriores: los lisosomas dañados, por ejemplo, que presenten alteraciones en su membrana, pierden la habilidad de incorporar el colorante bajo un ritmo normal, ya que su contenido acídico queda expuesto progresivamente al exterior. Estas dificultades añadidas provocarían que, o bien se requiriese más tiempo para ingresar el colorante, o bien las fugas y la alteración de la permeabilidad de membrana lisosomal lo hiciesen imposible. Sumado a esto, estos datos también podrían deberse a Discusión 248 una menor viabilidad lisosomal a la hora de la realización de las mediciones: tras un protocolo de varias horas para el aislamiento y purificación lisosomal, junto con las continuas centrifugaciones, se pudo haber dado un mayor índice de muerte celular que eventualmente repercutiese en una menor tasa de integración. Los estudios proteicos de marcadores de la CMA y la función lisosomal en el modelo CMS arrojaron más luz sobre el alcance del estrés crónico en la homeostasis lisosomal y sus consecuencias sobre la autofagia. La chaperona Hsc70 y el transportador LAMP2A fueron regulados de forma inversa en los extractos CLF de la CF y el Hp, mostrando nuevamente la respuesta distintiva al estrés de cada región cerebral. La subida de LAMP2A en la CF y la consiguiente bajada en el Hp son reflejo de la vulnerabilidad de LAMP2A a los cambios desencadenados por el estrés. Teniendo en cuenta que los valores proteicos de LAMP2A regulan el flujo de la CMA y la degradación de las proteínas seleccionadas [76], la modulación diferencial de su expresión proteica implica la desregulación de todo el proceso de CMA en ambas regiones cerebrales. Los niveles de LAMP2A en la membrana lisosomal se correlacionan directamente con la actividad de la CMA, lo que se regula a través de su síntesis, redistribución y degradación [171]. Asimismo, el aumento observado en la CF podría deberse no solo a un aumento de la transcripción de su gen, sino también a la modificación de la tasa de degradación generada por el protocolo de estrés [76]. Así, las principales afecciones derivadas del CMS supondrían la alteración de la proteostasis, que normalmente se encuentra mantenida por la CMA. Figura 104. Principales cambios de la expresión proteica de enzimas maduras y receptores lisosomales tras la exposición al CMS en los extractos CLF de las dos regiones cerebrales estudiadas. Discusión 249 El receptor de manosa asegura que los elementos unidos a residuos de manosa-6-fos- fato sean internalizados en los lisosomas para que adquieran su fenotipo final. Estos residuos son conjugados en el trans-Golgi sobre las futuras enzimas lisosomales para ser entonces transportadas hacia el lisosoma [172]. La inducción acentuada del receptor de manosa en las fracciones Lyso 2 y Lyso 6 en la CF por el CMS, aun cuando cada una contuvo lisosomas de muy distinta naturaleza, hace pensar que una mayor cantidad de receptores permitiría compensar por la carga no retirada y la aparente disfunción lisosomal. De ello se podría inferir el aumento del tráfico de la manosa-6-fosfato con el fin de restaurar la homeostasis lisosomal. Cuanto mayor carga haya que degradar, mayor cantidad de lisosomas se precisan y, por tanto, mayor concentración de proteínas lisosomales. Sin embargo, el Hp mostró nuevamente un patrón diferencial de variación: la reducción homogénea causada por el CMS en todas las fracciones purificadas hipocampales expone la alteración de la vía de la manosa-6-fosfato de manera independiente a la naturaleza y fenotipo de los lisosomas. El seguimiento del tráfico de la manosa-6-fosfato con sondas fluorescentes podría arrojar más luz sobre las alteraciones generadas en la CF y el Hp tras el protocolo de CMS. De las muchas enzimas situadas en el interior de los lisosomas, las catepsinas son la familia de proteasas más prominente. Estas requieren un procesamiento postraduccional para la adquisición de su fenotipo final, ya que se sintetizan en su forma inmadura o inactiva. Presentan sensores moleculares específicos que son reconocidos por los receptores de manosa para incorporarlas en el interior del lisosoma [173, 174]. La catepsina D madura de tipo aspártica y la B de tipo cisteína activada sufrieron una regulación opuesta tras la exposición al CMS en las muestras CLF. La disminución de la catepsina D con el incremento de la catepsina B en las CLF de ambas áreas van en concordancia con un estudio en el que se observó la subida compensatoria de los niveles y actividad de la catepsina B en neuronas de ratones deficientes en catepsina D [175]. Así, es muy probable que la reducción de los niveles de la catepsina D madura en los grupos CMS de la CF e Hp hayan conducido a la elevación de la tipo B activada siendo más notable en el Hp. La principal función de la catepsina D es la digestión de péptidos y productos de desecho incluidos en los lisosomas, encontrándose adicionalmente en los autolisosomas [176]. La reducción de su forma madura resultaría en el crecimiento de productos de desecho en el lisosoma. Recientemente, se ha observado que la maduración de la catepsina D es dependiente de autofagia, y que promueve la apoptosis en Helicoverpa armígera [176]. Si el tráfico de la manosa-6- fosfato es defectuoso, al igual que ocurre a distintos niveles de la autofagia en la CF y el Hp, la maduración de la catepsina D se vería comprometida y con ella, todos los procesos de degradación en los que se ve implicada. La catepsina B, por su parte, Discusión 250 modula la disponibilidad lisosomal y del autofagosoma: su ausencia da lugar a la multiplicación de lisosomas en tamaño y número, así como de los autofagosomas [177]. El ascenso de la catepsina B activada en los CLF de cada región podría explicar el sustancial incremento de la concentración de fosfatasa ácida en ellas, apuntando de nuevo al incremento del número de lisosomas en los grupos CMS. Resulta también evidente que el Hp presentó un perfil de expresión de catepsinas superior a la CF, por lo que una evaluación en mayor profundidad de las distintas categorías de catepsinas en el contexto de la respuesta al estrés podría explicar las regulaciones a las que están expuestas y cómo mantenerlas estables. La cuantiosa elevación de la cistatina C en los grupos CMS de las fracciones purificadas Lyso 1 (en la CF y el Hp), junto con Lyso 2 (CF) y Lyso 3 (Hp) descubrió la tendencia del estrés a modificar los valores de esta enzima en los lisosomas de naturaleza ligera. La cistatina C es un inhibidor reversible de tiol proteasas encargado de evitar que proteasas como las catepsinas sean liberadas de los lisosomas y causen daño celular [178]. La homeostasis celular puede ser interrumpida por cualquier variación en la expresión y actividad de proteasas. Así, el daño lisosomal podría conducir a la ruptura de sus membranas y, con ello, a la liberación de catepsinas al citosol, contribuyendo a un ambiente prooxidante y muerte celular [179]. La perturbación de la proteostasis mostrada por los cambios en LAMP2A y Hsc70, unido al aumento de las catepsinas en Figura 105. Esquema de los marcadores lisosomales con mayor tasa de modificación (al alza o a la baja) en la CF y el Hp en las fracciones lisosomales purificadas. Las enzimas lisosomales, tanto inmaduras como en su forma activada, fueron las más susceptibles a cambios derivados del CMS. Discusión 251 diferentes fracciones de la CF e Hp conllevarían a la consiguiente potenciación de la presencia de la cistatina C, sobrerregulada en un intento por parte del sistema de reducir el acúmulo de proteínas aberrantes y demás sustancias de desecho, además de las posibles catepsinas liberadas al citosol tras la perturbación de la membrana lisosomal. En la misma línea que estos resultados, se hallaron niveles muy elevados de cistatina C en el plasma de pacientes con depresión grave [178]. Además, estos niveles han sido correlacionados positivamente con síntomas depresivos e ideación suicida [180]. De hecho, los antidepresivos pueden unirse a las cistatinas, ocupándolas y no dejando suficientes disponibles para inhibir a las catepsinas, y así, jugando parte importante en los efectos secundarios y la inefectividad asociada al tratamiento antidepresivo [178, 181]. Los lisosomas responden a una gran variedad de estímulos, integrando y coordinando numerosas rutas moleculares. Sienten y reaccionan al estrés para dar lugar a una respuesta unitaria que permite la adaptación celular [179]. En líneas generales, la combinación de todos los resultados destaca el papel imprescindible de la respuesta al estrés por parte del lisosoma, donde sus afectaciones acarrean múltiples consecuencias, ya sean en número, en daño en sus membranas o en su contenido proteolítico que finalmente repercute en el estado fisiológico de las células nerviosas. 1.4. Evaluación por inmunofluorescencia de lisosomas en el modelo CMS El estudio por IF del transportador LAMP2A en el modelo CMS remarcó la labor lisosomal en neuronas y microglías, ilustrando las alteraciones en la CMA en estas células: la subida de la fluorescencia en LAMP2A en las cortezas motoras primaria y secundaria siguieron la misma línea que los resultados de WB en la CF. MAP2 es una proteína asociada a microtúbulos que se une a ellos y regula su estabilidad [182]. Sus niveles incrementados podrían resultar en el aumento de la polimerización de los microtúbulos, dando lugar al desbalance en las arborizaciones dendríticas y estabilidad neuronal. Además, el CMS promovió el reclutamiento de microglías. Estas presentan una respuesta rápida ante numerosos tipos de daño, exhibiendo un diverso espectro de activación según los estímulos recibidos y se dividen en subtipos concretos para la realización de una actividad concreta dependiente del tiempo y el espacio [183]. El CMS ocasionó la activación microglial en la CF, cuyos lisosomas expresaron mayores concentraciones de LAMP2A. Discusión 252 En el Hp, solamente neuronas de CA1 y de la capa molecular mantuvieron unos valores reducidos de LAMP2A, yendo también en consonancia con los resultados de los CLF por WB. Además, se puso de manifiesto que en las neuronas hipocampales los lisosomas tendían a concentrarse en torno al soma neuronal y en el primer tercio de los axones. Generalmente, estos se disponen en dos localizaciones concretas dentro de la célula: en la parte perinuclear y en la periferia. No obstante, pueden moverse a lo largo de la célula sobre los microtúbulos [184]. El modelo CMS no alteró esta distribución perinuclear puesto que no se hallaron modificaciones de MAP2 en esta región: MAP2 controla la entrada al axón y el reparto de la carga a lo largo de las neuronas, selectivamente manteniendo lisosomas alrededor del soma neuronal, mientras que favorece el transporte de vesículas secretoras hacia las zonas más distales [185]. Sin embargo, de las modificaciones observadas en MAP2 en varias zonas de la CF, dada la disposición de los cortes realizados, no pueden deducirse variaciones de la localización de los lisosomas neuronales. El corte longitudinal del tejido en futuras aproximaciones permitiría comprobar si los cambios en su intensidad de fluorescencia se acompañan de cambios en su distribución. Por otro lado, los estudios sobre el nivel de ocupación de los lisosomas en las microglías corticales mostraron que el CMS provocó el alargamiento del soma y la aparición de más ramificaciones en estas células, junto con la concentración local de los lisosomas en la corteza motora primaria. Esto significa que a pesar de encontrarse LAMP2A elevada de forma neta, el área total ocupada por esta en el interior de las microglías fue menor a consecuencia del CMS. Es posible que esta redistribución de los lisosomas microgliales pueda deberse a una respuesta adaptativa frente a la exposición a estrés. Además, resultaría más conveniente para la maquinaria celular la reparación de los lisosomas dañados si estos se encuentran en sus alrededores. 1.5. Análisis de la modulación de la autofagia ejercida por la espermidina en el modelo CMS El primer ensayo bioquímico realizado sobre las muestras plasmáticas del modelo CMS+SPD reveló que el grupo control sin inyección de vehículo o SPD (CT negativo) estuvo sometido a elevados niveles de estrés, medidos a partir de la concentración plasmática de corticosterona. Este descubrimiento condicionó de forma directa los resultados de las pruebas comportamentales (aludidos en secciones posteriores) y los análisis de los ensayos bioquímicos. Discusión 253 Al tratarse de un modelo de estrés crónico, que los CT negativos presentasen tales concentraciones de corticosterona señalaba la imposibilidad de usarlos realmente como controles, ya que impedirían la observación y distinción de los efectos en los grupos a los que se les aplicó el protocolo CMS. Esto, unido a que la administración del fármaco durante 7 días supone un estrés adicional para las ratas, que tanto los animales CT como los CMS inyectados con salino recibieron los mismos que los tratados con SPD, y que los niveles de corticosterona en los grupos salino fueron los que normalmente registramos en este modelo, inclinó la balanza hacia el uso del grupo CT+sal como controles de normalización y comparación en este experimento. A pesar de todo ello, el exceso de corticosterona no se tradujo en una regulación muy distinta en los CT negativos de los CT+salino, al menos, en cuanto a marcadores de autofagia se refiere. Este hecho sería indicativo de dos aspectos: por un lado, que la administración de salino se realizó de forma apropiada y, por otro, que el exceso de corticosterona no derivó directamente en la activación o inhibición de la autofagia, si bien se detectaron algunas variaciones en ciertas proteínas de CF e Hp. En estudios in vitro, se comprobó que el tratamiento con corticosterona inducía la autofagia y que en ratones expuestos a un modelo de estrés crónico ante exposición a frío se inducía la vía en el Hp tras un exceso de corticosterona mediada por dicho modelo [186]. Así, teniendo en consideración todos los datos bioquímicos de la autofagia en las dos regiones cerebrales, se puede deducir que el exceso de corticosterona periférica en ratas CT no tuvo consecuencias en la modulación de la vía al tiempo en el que se recogieron las muestras: el estrés perpetuado en el tiempo podría haber modulado la vía en alguna de las regiones en estadios temporales previos, llegando a una fase de normalización en el momento del estudio o bien, podría haberse producido esta modulación días más tarde, tras este pico de corticosterona. Por otro lado, el considerable incremento de los niveles de corticosterona plasmáticos en los grupos tratados con SPD, independientemente del modelo de estrés, lleva a considerar contraproducente el potencial uso de este inductor como terapia coadyuvante en patologías relacionadas con el estrés, en las que se aprecia, como en el TDM, un comportamiento de tipo enfermizo (sickness behavior) precisamente por la elevación de glucocorticoides. Sin embargo, también debería argumentarse que la vía de administración empleada podría ser causa etiológica de estos aumentos de corticosterona: en un estudio piloto, se detectaron disminuciones significativas de cortisol en el 83% de hombres sanos participantes tras haber ingerido SPD como suplemento alimenticio durante 30 días [187]. Por tanto, sería posible que la propia Discusión 254 inyección intraperitoneal de SPD active la producción de corticosterona en las glándulas suprarrenales de una forma en la que la SPD ingerida no lo hiciese. Igualmente, el diseño experimental contempló el tratamiento de SPD durante solo una semana; podría asimismo darse la circunstancia de que originalmente la SPD produjese un aumento de la corticosterona para posteriormente disminuirla, observándose así su efecto antiinflamatorio más a largo plazo. La elevación, o las tendencias al alza en cada caso, de los niveles proteicos de las formas de ULK1, SQSTM1/p62 y LC3-II/LC3-I en la CF y de Atg3 y Beclin1 en el Hp en el grupo CT+SPD pone de manifiesto el efecto inductor de la SPD en ambas regiones, a la vez que destaca las dianas principales sobre las que actúa y el distintivo papel modulador que ejerce en cada región cerebral. Las formas de mTOR mostraron una regulación opuesta en la CF y el Hp. Mientras que en la CF se incrementaron los valores de p-mTOR en el grupo CT+SPD, indicando la propensión a la inhibición de la autofagia de la SPD en condiciones control, en el Hp se detectó su disminución, apuntando hacia una activación autofágica. No obstante, la combinación CMS+SPD redujo los niveles de p-mTOR y mTOR en la CF, ligeramente elevados por el modelo de estrés, por lo que no se observó dicha propensión a la inhibición en las ratas previamente expuestas al CMS en la CF. En contraposición, la SPD no tuvo efecto alguno en las formas de mTOR en el Hp. Estos datos apoyarían las conclusiones ya señaladas: la modulación de la autofagia es específica de la región cerebral considerada, por lo que el tratamiento con un fármaco también podría deber sus diferentes efectos a esta situación de partida. A esto se le suma que la SPD podría modular las cascadas de señalización previas a la autofagia de forma distinta en cada región cerebral. Por ejemplo, la administración de SPD en ratones expuestos a un modelo de isquemia hepática, desembocó en la inducción de la autofagia mediada por AMPK/mTOR en el hígado [188], mientras que la de espermina (el producto de la SPD) en ratones sometidos a un modelo de diabetes mejoró la patología mediante la inhibición de la vía por AMPK/mTOR en podocitos [189]. Algo más para tener en cuenta sería la capacidad de la SPD de llegar a cada región cerebral: aunque la SPD puede atravesar la BHE, su acceso a cada estructura cerebral podría presentar ligeras diferencias que se tradujesen en distintos efectos en cascadas de señalización. Prácticamente todas las proteínas estudiadas en las dos áreas cerebrales siguieron la misma tendencia al cambio derivado de la exposición al CMS, si bien al llevar a cabo un análisis estadístico diferente la presencia de modificaciones se cuantifica y analiza de otra forma. En otras palabras, el ANOVA de dos vías podría no registrar efecto del Discusión 255 modelo ante la comparativa de dos variables independientes (modelo y tratamiento) entre cuatro grupos, mientras que la t de Student sí podría destacarlo por solo considerar las diferencias entre dos grupos comparables. En la misma línea, los marcadores de autofagia en el Hp registraron los mismos cambios anteriormente descritos, pero la SPD no ejerció ningún efecto beneficioso a la hora de restaurar o mejorar los valores fisiológicos de cada proteína. Lo más destacable fue el aumento de Atg12 mediado por la SPD en el grupo CMS+SPD, superando los niveles proteicos disminuidos en el grupo CMS, observándose una tendencia similar en Atg3. En la CF, además de reducir las formas mTOR, bloqueando la inhibición inicial de la ruta, la SPD incrementó los valores proteicos de Atg3 y redujo a niveles del CT+sal los de Atg7. Asimismo, otro hecho importante a destacar es que las formas de ULK1 no fueron susceptibles a cambios mediados por la SPD, pero sí que lo fueron las de SQSTM1/p62. En un estudio en células madre de la línea germinal de ratonas se describió la mejora en su supervivencia y longevidad celular cuando se trataron con SPD gracias a la inducción de la autofagia mediada por el aumento de SQSTM1/p62 y del flujo autofágico, llevando a cabo un efecto citoprotector en respuesta al estrés oxidativo evaluado [190]. Además, en este estudio se observó la reducción paralela de la fosforilación de mTOR, como ocurre en el grupo CMS+SPD de esta Tesis. En condrocitos humanos, por el contrario, el tratamiento con SPD sí que indujo la expresión proteica de ULK1 [191], lo que parece indicar que según el tipo celular y las condiciones de cada diseño experimental (los efectos in vitro e in vivo podrían diferir bastante), las dianas de la SPD pueden ser variadas, mediando su efecto proautofágico de forma diversa. También se registró la elevación de la concentración proteica de Beclin1 en el grupo CMS+SPD, mejorando los niveles previamente mermados por el CMS. En ratones con una senescencia acelerada, se ha demostrado que la SPD induce la mejora del estrés oxidativo y la apoptosis mediante la inducción de marcadores de autofagia, entre ellos, Beclin1 [192]. Por lo tanto, aunque la SPD no tuvo efectos beneficiosos en la autofagia hipocampal a nivel proteico (tampoco perjudiciales, más allá de lo originado por el propio modelo de estrés), en la CF sí mostró indicios de mejora en los marcadores estudiados, apreciándose interacción entre modelo y tratamiento en varios de ellos. Al efectuar la comparativa entre los niveles proteico y génico, la modulación ejercida por la SPD fue bien distinta. Dado que el CMS solo llevó al aumento de la transcripción de Atg7, se reevaluó en el nuevo modelo y se comprobó que la SPD no producía cambios de expresión al compararlo con el grupo CMS+sal. No obstante, al reanalizar Atg12, que Discusión 256 había mostrado una ligera tendencia al alza tras la exposición al CMS, se determinó que la combinación CMS+SPD suponía un incremento exponencial en la transcripción de este gen. Ya que Atg12 no presentó cambios derivados del CMS, no se cuantificó a nivel proteico, pero sería interesante evaluar si este efecto sinérgico también ocurriese a ese nivel. Es más, el análisis de la expresión génica de los genes Atg3, Atg5, Atg7 y Atg12 constató que la inducción de la transcripción mediada por el CMS en el Hp era modesta en comparación con la resultante de la combinación entre CMS+SPD, evidenciando un aumento exponencial de la misma por el efecto sinérgico del modelo y tratamiento en el proceso de elongación. De hecho, se antoja bastante característica la inducción exponencial en el grupo CMS+SPD aun cuando en el grupo CT+SPD la SPD no causó activación por sí misma. En este caso, parece que la SPD requeriría de un estímulo previo para que su efecto sea mucho más agudo. Que estos mismos efectos no se observasen a nivel proteico podría ser indicativo de varios hechos: primero, que en nuestro diseño experimental la inyección ip de SPD tenga consecuencias características sobre CF e Hp según la exposición a esta específica de cada región; segundo, que en cada estructura las rutas moleculares puestas en funcionamiento sean diferentes, de manera que la CF sea más susceptible Figura 106. Efectos mediados por la SPD a nivel proteico en la CF del modelo CMS+SPD. También se señala la inducción génica de Atg12 por el tratamiento y el modelo. Discusión 257 a cambios a nivel proteico (por ejemplo, mediante la inhibición de la acetiltransferasa EP300, modificando el perfil de acetilación de las proteínas Atg e induciendo la autofagia [82]) y el Hp lo sea a nivel génico; tercero, que la temporalidad en la modulación de la autofagia ejercida por la SPD sea diferente entre CF e Hp, de manera que los cambios observados serían inicialmente similares pero con un espaciado temporal distinto (sería factible que esta sobreactivación de la transcripción se hubiese dado antes en la CF, como se aprecia en Atg12, desembocando en una mejora de sus proteínas y normalizándose a nivel génico posteriormente, de ahí que no se observen más cambios actualmente); y cuarto, que las concentraciones basales de SPD y sus precursores en la CF e Hp fuesen modificadas de manera específica por el modelo de estrés crónico, de manera que su administración exógena conllevaría una regulación diferencial al partir de esos niveles iniciales. Considerando la regulación característica de la SPD en diferentes modelos in vitro, el estudio de células wild type (WT) corticales e hipocampales de manera individual podría poner de manifiesto la regulación llevada a cabo por la SPD, como, por ejemplo, la activación o inhibición de unas rutas y no otras. Y ya no solo enfocar el estudio a todas las células nerviosas conjuntamente, puesto que la SPD podría ejercer sus funciones a través de ciertos tipos celulares especialmente. En particular, los efectos concretos sobre la neurona y su función sináptica serían muy reveladores para la caracterización de la SPD, y más teniendo en cuenta el papel de la autofagia en las sinapsis. Figura 107. Efectos mediados por la SPD en el Hp Del modelo CMS+SPD. La SPD incrementó la induc- ción génica gene- rada por el modelo en la mayoría de los componentes dedi- cados al proceso de elongación autofá- gico. Discusión 258 Una opción sería la evaluación de la regulación monoaminérgica llevada a cabo por la SPD, lo que podría arrojar luz a la interpretación de las modificaciones halladas. En un modelo animal de psicosis inducida por ketamina, se comprobó que las ratas tratadas con SPD (20 mg/kp ip) durante 21 días presentaron un incremento de la concentración de GABA y un descenso en dopamina en la CF, en comparación con las ratas tratadas con ketamina, que las alteró a la inversa [193]. El análisis de la contribución de la SPD a la normalización de la transmisión monoaminérgica a través de la inducción de la autofagia sería clave para futuros estudios enfocados a utilizar la SPD como adyuvante para el tratamiento antidepresivo convencional. Existen análisis controvertidos del papel de las poliaminas y sus concentraciones alteradas en diferentes trastornos neuropsiquiátricos [194], por lo que este estudio contribuye a describir el efecto de una de ellas, la SPD, en el SNC tras la exposición a un estrés crónico de tipo físico y psicológico. De forma paralela, los efectos descritos, además de darse a través de la modulación directa de la autofagia, podrían también provenir de la capacidad de la SPD para inhibir citoquinas proinflamatorias dependientes de NF-κB, lo que promueve la polarización M2 en macrófagos (la SPD regula su fenotipo) y finalmente contribuir a la propia regulación de la autofagia [80]. 2. Estudio bioquímico de la mitofagia 2.1. Análisis proteico y génico de la mitocondria en los modelos CMS y Poly+Iso La evaluación de la mitofagia se centró en los modelos de CMS y Poly+Iso. La gran variedad de cambios registrados en el primero condujo a un análisis en mayor profundidad y su respectiva comparación con extractos mitocondriales (EM) concentrados entre la CF y el Hp. En la CF, los parámetros examinados apuntan a la inducción de la mitofagia, lo que no estaría en desacuerdo con la autofagia defectuosa descrita previamente: un fallo a la hora de deshacerse de las distintas cargas acumuladas provocaría la concentración de marcadores de subtipos específicos de autofagia, puesto que estos son rutinariamente eliminados mediante la misma vía. Además, estos ascenderían en número con la intención de forzar que su ruta (la mitofagia, en este caso) ocurriese. Discusión 259 Así, el aumento de Pink1, BNIP3, Nix y FUNDC1 en los EM indica la estimulación de la mitofagia dependiente de ubiquitina y la dependiente de receptores mitocondriales. Es más, la mayor expresión proteica de Parkin y BNIP3 en el citosol sería necesaria para presionar e incrementar su translocación a la mitocondria y promover sus rutas. Por su parte, el descenso en FUNDC1 estaría indicando su ya traspaso hacia la MME, potencialmente señalando las distintas ratios de respuesta de los receptores mitocondriales. Dado que ULK1 recluta y fosforila a FUNDC1 en la mitocondria para que la mitofagia mediada por él ocurra [109, 110], la disminución ocasionada por el CMS de sus formas fosforilada y total resultaría en un menor índice de reclutamiento y activación de FUNDC1, explicando estos datos. ¿Sería viable que el estrés, en algún estadio anterior, provocase la inducción de un solo tipo de mitofagia, pero la cronicidad de este junto con el ambiente prooxidante generado diesen lugar a la puesta en marcha de ambas? Con los datos actuales, resultaría imposible responder de manera certera a esta cuestión. Sin embargo, resultaría muy interesante la consideración de esta posibilidad que, para estudiarla, habría que efectuar cursos temporales y recoger muestras a distintos tiempos, comprobando así si hubiera alguna activación temporal distintiva en cada marcador. La situación en Hp es bien distinta: hubo un exceso de Pink1 y BNIP3 en el citosol y un descenso paralelo en este y el EM de Parkin y FUNDC1. La mitofagia mediada por Pink1 parece encontrarse impedida, lo que se manifiesta en los altos valores citosólicos de Pink1 y su tendencia a la baja en el EM, seguidos del descenso en ambos de Parkin. Esto sugiere que el efecto de activación en cadena mediado por Parkin estaría disminuido, y con ello, la ubiquitinación de proteínas y la llamada al adaptador SQSTM1/p62. Esto podría explicar el descenso de los valores de p-SQSTM1 en el Hp. De hecho, Ambra1, que activa el complejo Beclin1 y promueve la autofagia, actúa con Parkin e induce la formación de nuevos fagóforos [106]. Por tanto, la disminución de Parkin y los bajos niveles de Pink1 en el EM podrían haber repercutido en una menor activación de SQSTM1/p62, y ante la creciente acumulación de mitocondrias defectuosas, los niveles de proteicos de Ambra1 tuvieron que elevarse para mediar la creación de un nuevo fagóforo con el que eliminarlas. Seguidamente, la menor concentración proteica de FUNDC1 en citosol y EM también apuntarían a una disminución de la mitofagia mediada por este receptor, contribuyendo nuevamente a la acumulación de mitocondrias dañadas y promoviendo el ambiente prooxidante celular [195]. En el empeño de paliar esta situación, su expresión génica hipocampal pudo verse por ello inducida. Discusión 260 La evaluación por IF de la distribución de Parkin apoya su aumento en la CF y descenso en el Hp observados en los extractos citosólicos mediante WB, destacando que sus funciones se ejecutan en mayor medida en el soma neuronal. De hecho, desempeña funciones, junto con Pink1, de protección neuronal frente a la muerte celular, favorece el mantenimiento de la integridad mitocondrial en condiciones de estrés moderado y modula el transporte de cargas mitocondriales hacia el lisosoma [196]. Además, la IP de Parkin y revelada frente a ubiquitina evidenció lo que se iba sospechando a partir de los resultados comentados hasta el momento: el CMS provoca el incremento de productos ubiquitinados, bien porque modifique o altere la morfología o funcionalidad de elementos que en esta circunstancia deben de ser retirados, o bien porque el CMS estimule de forma directa las actividades de ubiquitinación a través de diversos factores. Siendo lo uno o lo otro, la elevada ubiquitinación pone de manifiesto la ya mencionada acumulación de cargas sin degradar y, con ello, su contribución y propagación de eventos proinflamatorios y prooxidantes previamente descritos en este modelo [162, 197, 198]. Esto se deduce del rol intrínseco ejercido por el sistema de ubiquitinación sobre la activación de la inflamación y, en concreto, de los inflamasomas [199]. El modelo Poly+Iso, sin embargo, no exhibió el mismo patrón que el CMS en la CF. En este caso, los dos estresores no supusieron la inducción o inhibición de la mitofagia, si bien se detectó el aumento de Pink1 y la reducción de BNIP3 en el grupo doble hit. Esto parece indicar que BNIP3 ya recibió la señal para desplazarse y anclarse en la MME y promover la mitofagia mediada por receptores, mientras que la subida de Pink1 apuntaría a un comienzo de su acumulación para iniciar su cascada de señalización. La ausencia de cambios en el resto de los marcadores evaluados sugiere que este modelo no provoca grandes alteraciones en la mitofagia. Tampoco se observaron cambios en la biogénesis mitocondrial, lo que iría en consonancia con la ausencia de cambios en la mitofagia: si el modelo no causa variaciones en la morfología o potencial de membrana mitocondrial que requiera su eliminación, el sistema consigue mantener la homeostasis y la ruta de síntesis de mitocondrias de novo no necesitaría activarse. El descenso de los niveles citosólicos de PGC1α no acompañados por su correspondiente subida en el extracto nuclear apunta a la modulación de su porción citosólica a favor de otras de sus funciones metabólicas que no impliquen la excitación de la transcripción nuclear, como es el impulso de la neuroinflamación y el ambiente prooxidante: PGC1α disminuye en condiciones proinflamatorias y regula la respuesta antioxidante cuando se potencian sus niveles [200]. Discusión 261 No obstante, en el modelo CMS sí se vio afectada la razón entre las concentraciones nucleares y citosólicas en la CF, apuntando a la disminución de la estimulación de la transcripción de genes mitocondriales en favor a su presencia citosólica. Observando todos los marcadores en su conjunto, se podría deducir que la inducción de la expresión génica de Nrf1 y del propio Pgc1α (así como la tendencia al alza de Mtfa) son resultado de una activación transcripcional previa de PGC1α, para compensar las bajas tendencias en los niveles proteicos de Nrf1 y Mtfa. El efecto de dicha activación sería por tanto la elevación proteica de PGC1α en citosol y EM. Este incremento provocado por el CMS permitiría el control del exceso de ROS generado por mitocondrias dañadas mediante la expresión de potentes enzimas antioxidantes, así como la adaptación de su producción energética a la situación imperante. Además, los RNS inducen la expresión de PGC1α para promover la síntesis de nuevas mitocondrias [200]. Es por todo ello que se concluye que el modelo CMS sí indujo la mitogénesis en la CF, situación lógica en un contexto en el que la mitofagia habría sido activada para eliminar el contenido mitocondrial defectuoso. A grandes rasgos, los análisis de IF revelaron un aumento de la concentración de PGC1α en la CF, concretamente en neuronas, como en el caso de Parkin, lo cual apoya los resultado obtenidos mediante WB. Figura 108. Resumen comparativo de la modulación en la expresión proteica de los parámetros de mitofagia en la CF entre los modelos CMS y Poly+Iso (grupo doble hit). Discusión 262 Aunque no se detectaron cambios en las IF de PGC1α en el Hp, en conformidad con los datos de WB, la inducción génica de Nrf1 por su evidente decrecimiento en su porción proteica resurge la posibilidad de una regulación temporal distintiva y específica de cada región cerebral: en este caso, parece que los niveles de PGC1α ya se homogenizaron tras efectuar sus correspondientes funciones, y que Nrf1 estaría en vías de estimular Mtfa para restaurar sus valores proteicos. La mitofagia impedida en el Hp podría estar promoviendo la generación de nuevas mitocondrias en compensación por las acumuladas que no se estarían retirando. La modificación de Drp1 en el grupo CMS en citosol y EM de la CF siguió la misma tendencia que la de FUNDC1, ya que esta última es la que actúa como nexo entre la mitofagia independiente de ubiquitina y la dinámica mitocondrial, reclutando Drp1 desde el citosol para promover la fisión previa a la mitofagia [201]. Una bajada de sus valores citosólicos implicaría un menor índice de agregación, que se ve respaldado por el incremento de p-DRP1 en el EM. Si bien esta fosforilación impide la translocación de Drp1 a la mitocondria y que efectúe la fisión, el hecho de que este incremento se haya producido fundamentalmente en el EM podría deberse a una cuestión estructural: Drp1 se polimeriza a gran escala para producir la fisión [104], por lo que es posible que, en el momento de aislar los componentes mitocondriales, monómeros de Drp1 situados en la vecindad mitocondrial hubieran sido también arrastrados y extraídos. Esto explicaría la Figura 109. Efecto de los modelos CMS y Poly+Iso en la síntesis de nuevas mitocondrias de la CF y sus mecanismos moleculares propuestos. Discusión 263 gran variabilidad observada en esta proteína en el grupo CMS, además de la tendencia al alza que exhibe en el citosol. Así, en la CF los datos sugieren un favorecimiento de la fusión a expensas de la fisión: el aumento mitocondrial de la Mfn2 y OPA1 indicarían un mayor índice de fusión, que se vería apoyado por la disminución de Mfn2 en el citosol, bien por una menor ratio de degradación en el proteasoma o por su mayor proporción de translocación a la MME. PGC1α contribuye a la biogénesis mitocondrial aumentando los niveles proteicos de la Mfn2 en condiciones de alta demanda energética [202]. Por tanto, su elevación en el EM podría también explicar la subida de los valores proteicos de la Mfn2. Es más, el considerable incremento mediado por el CMS de la proteína Pink1 en el EM podría ser también el causante de la regulación al alza de la Mfn2, ayudando esta a su vez a la translocación y anclaje de Parkin a la MME [203]. En definitiva, por un lado, la mitofagia dependiente de receptores estaría disminuyendo la fisión mediada por Drp1, mientras que, por otro, la mitofagia mediada por Pink1-Parkin estaría favoreciendo el anclaje de Parkin sobre mitocondrias dañadas, promoviendo su eliminación. El aumento de la cantidad de mitocondrias en el grupo CMS de la CF observado por IF y WB de TOMM20, así como por citometría de flujo, ponen en perspectiva estos datos: el descenso de Drp1 promueve la elongación de las mitocondrias y la acumulación de estas dañadas (que estarían seleccionándose gracias a Parkin), además de dificultar la formación del autofagosoma y la eliminación de las mitocondrias [204]. Estas alteraciones llevarían a incrementar la susceptibilidad al estrés, pudiendo explicar en parte que sea el modelo CMS el que mayores cambios desencadenó en el SNC. ¿Implicaría todo ello que el TDM presente una mayor vulnerabilidad a cambios en el estado mitocondrial y la autofagia que los trastornos derivados de afectaciones en el neurodesarrollo? A la vista de los resultados, se podría decir que no necesariamente. Por ejemplo, se ha comprobado en estudios sobre glioblastomas que el gen DISC1 es capaz de modular e incluso reducir los niveles de Drp1 para controlar la proliferación de estos [205]. La mayor presencia de este gen en pacientes con esquizofrenia podría directamente modificar la homeostasis mitocondrial, teniendo consecuencias más graves en el dinamismo mitocondrial. Paralelamente, en muestras de mucosa oral de niños diagnosticados con TEA, se observó una elevación del ARNm de Drp1, además del ADNmt [206]. En el giro cingulado anterior y la corteza motora en muestras post mortem de pacientes con la misma patología se detectó la reducción de la expresión de Drp1 [207]. Los resultados procedentes del modelo CMS se suman a investigaciones variadas que ponen el foco en la mitocondria, pero que no conducen hacia las mismas conclusiones en este respecto y que en muchas ocasiones están incompletos. Discusión 264 En cuanto a los ensayos de IF, mostraron el papel esencial de las proteínas mitocondrias en las neuronas a través de la inmunotinción de Mfn2, cuya distribución es preferiblemente perinuclear y que se redujo en la CF del grupo CMS. El mismo patrón previamente comentado se aprecia entre el descenso citosólico de FUNDC1 y Drp1 en el Hp, con la regulación al alza de p-DRP1 en el EM. Con la fisión parcialmente obstaculizada, y el descenso proteico de la Mfn1, sería factible que las mayores concentraciones de Mfn2 y OPA1 en el citosol implicasen su mayor incorporación a las MME y MMI, en un intento por parte de la célula de restaurar los valores disminuidos de la Mfn1 en los extractos citosólicos y EM. En el citosol hipocampal fue donde más cambios provocó el CMS, donde la pérdida de la Mfn1 en ambos extractos fue respondida con la inducción génica de la misma. Dicha reducción coincide con el decrecimiento de los valores de Parkin en las dos fracciones: la menor concentración de Parkin perjudica de forma directa la ubiquitinación y reclutamiento de la Mfn1, de manera que la inducción de Pink1 y uno de sus productos, Mfn2, podrían equilibrar la homeostasis mitocondrial [208]. Además, la función de OPA1 en la fusión requiere de la Mfn1, pero no de la Mfn2, por lo que su inducción proteica en el citosol actuaría como un mecanismo compensatorio ante la falta de la Mfn1 [209]. Por otra parte, los análisis de IF no mostraron cambios aparentes en la expresión y distribución de la Mfn2 en las neuronas hipocampales, donde pudo apreciarse su localización perinuclear y en la porción proximal del axón. El modelo Poly+Iso no mostró cambios sustanciales en el dinamismo mitocondrial en el citosol de la CF, a excepción de un considerable descenso en la concentración de OPA1. Dadas las funciones antiapoptóticas de OPA1, y su participación en la modulación de las crestas mitocondriales para la estabilización del citocromo c [210], su disminución citosólica podría señalar un mayor índice de translocación a la mitocondria para regular eventos apoptóticos, explicando la tendencia a la baja en la concentración de citocromo c en el grupo Poly+Iso. De hecho, la reducción de OPA1 se ha correlacionado previamente con la de BNIP3 en neuronas in vitro, lo que resulta lógico considerando su dominio BH3 (clásico en la familia Bcl2) de muerte celular [210]. Así, la disminución citosólica de OPA1 junto con la de Drp1 en el grupo doble hit indicarían el fomento del dinamismo fusión-fisión, necesario para el mantenimiento de las condiciones basales mitocondriales, sin implicar la alteración de todo el proceso por parte del modelo. Discusión 265 De esta manera, la homeostasis mitocondrial precisa del balance entre la biogénesis mitocondrial, la fusión y fisión y, por supuesto, la mitofagia, para sustentar de manera conjunta el metabolismo energético celular [211]. Dicho metabolismo también confía en la apropiada translocación de proteínas, sintetizadas en el citosol, que forman parte del esqueleto mitocondrial y que deben de ser incorporadas diligentemente. Uno de los complejos mitocondriales que permite dicha translocación es TOMM20, que reconoce las proteínas pertinentes y media su integración a través de la MME. Este complejo TOMM20 forma agregados en ella, de forma que su aumento se correlaciona directamente con el incremento del potencial de membrana mitocondrial: la mayor concentración de TOMM20 en la CF (y su tendencia al alza en el Hp) implica una mayor masa mitocondrial en los grupos CMS de los EM, además de un mayor grado de actividad mitocondrial [212]. Estos datos se verían apoyados por la disminución paralela de esta proteína en los grupos CMS de la CF y el Hp en el citosol. Aun no disponiendo de EM en el modelo Poly+Iso, la evaluación de TOMM20 en el citosol reveló su disminución en el grupo doble hit, posiblemente llevando a las mismas deducciones que en el modelo anterior. Figura 110. Estado del dinamismo mitocondrial en la CF de los modelos de estrés CMS y Poly+Iso y los posibles mecanismos implicados. La reducción de intensidades en las proteínas citocromo c y FUNDC1 en el modelo Poly+Iso indican tendencias de su expresión a la baja. Discusión 266 El incremento de la masa mitocondrial puede deberse a varios motivos, y más teniendo en cuenta la naturaleza dinámica de la mitocondria y su alta sensibilidad al estrés. El defecto en la autofagia observado en la CF del modelo CMS, junto con la inducción de su programa de mitofagia podrían haber resultado en esta estimulación de TOMM20: habría un mayor acúmulo de mitocondrias que aún no se degradaron dada las modificaciones en los mediadores autofágicos, a la vez que las mitocondrias sanas estarían intentando compensar por aquellas defectuosas, promoviendo el incremento de su actividad. Además, y en armonía con marcadores previos examinados por IF, las funciones esenciales de TOMM20 tuvieron lugar en las neuronas, distinguiéndose las cadenas mitocondriales distribuidas en soma y axones. No obstante, el refuerzo mitocondrial de TOMM20 no se correlacionó con modificación alguna en los complejos mitocondriales, indicando que el CMS no ejerció ningún efecto funcional sobre la cadena de transporte de electrones. Estos resultados irían en la misma línea que los proporcionados por el ensayo JC-1, cuyo grado de internalización en la mitocondria ofrece una medida de la integridad de la MMI y su potencial de membrana [213]. Conjuntamente, sería factible deducir que el CMS no alteró funcionalmente la cadena de transporte de electrones ni la integridad de la MMI donde se lleva a cabo. Sin embargo, al analizar los niveles de la última enzima participante en dicha cadena, se observó un considerable aumento citosólico de COX IV en ambas regiones cerebrales, apuntando a que, si bien la función neta no se vio comprometida, los componentes estructurales de la cadena respiratoria sí podrían haberse visto modificados. Como solo se consideró COX IV, resulta imposible evaluar si ocurrió lo mismo en otros componentes de la cadena de transporte de electrones o solo en esta enzima. Lo que sí fue evidente es que, partiendo de que la enzima COX IV se usa generalmente como proteína de carga para EM [214], en los estudios de esta Tesis Doctoral tuvo que descartarse en la normalización de los datos desde sus inicios, dada la mostrada modulación de su expresión proteica por el protocolo de estrés. 2.2. Estudio de la apoptosis y su relación con autofagia y mitofagia en el modelo CMS Otra función esencial donde la mitocondria es un elemento clave es la apoptosis. La autofagia y la apoptosis ejecutan mecanismos alternativos, pero pueden ser activados por los mismos estímulos y responder con efectores comunes [215]. Normalmente, la apoptosis sigue a la autofagia cuando el estrés imperante sobrepasa cierto nivel, pero, por ejemplo, la autofagia puede reducir la señalización de la apoptosis mediante la Discusión 267 eliminación de sus mediadores del citoplasma [216]. Algunos de los factores que interconectan apoptosis y autofagia son Beclin1, Bcl2 y p53 [217]. La distintiva regulación de la señalización evaluada entre la CF y el Hp se pudo apreciar también con el estudio de marcadores relacionados con la apoptosis: el Hp mostró una mayor susceptibilidad al estrés en esta vía. La disminución de Annexin V (proapoptótico) y del citocromo c y Bax (mediadores de la ruta extrínseca apoptótica) apuntan a una reducción de la apoptosis en el Hp. En los EM hipocampales, el similar descenso del citocromo c hace pensar en la intervención de Bax: teniendo en cuenta que Bax se transloca a la mitocondria para permeabilizar su membrana y crear poros que fomenten la salida del citocromo c al citosol [218], ejecutando así la inducción de la apoptosis, su menor concentración citoplasmática y su tendencia al alza en el EM, indicarían que favoreció la salida del citocromo c, pero que rápidamente se degradó en el citosol para que no se llevase a término la apoptosis. Esto constituye un mecanismo ampliamente expandido entre neuronas, que promueven la degradación del citocromo c por el proteasoma para promover así su supervivencia [219]. A su vez, el decrecimiento del Bcl2 citosólico en la CF podría correlacionarse con el descenso proteico de las mitofusinas en el mismo extracto, ya que se considera que uno de los mecanismos antiapoptóticos ejercidos por Bcl2 es el efectuado a través del favorecimiento de la expresión de estas proteínas, promoviendo con ella la supervivencia de determinados tipos celulares, como son los macrófagos [220]. La proteína p53 es un sensor molecular de estrés que controla la transcripción de muchos factores relacionados con la muerte celular, como por ejemplo Bax, a la vez que reduce la expresión de Bcl2 [217]. Adicionalmente, es responsable de la inhibición de mTOR para inducir la autofagia, pudiendo mTOR a su vez regular p53 a través de su fosforilación en la Ser15 según el ambiente celular. A pesar de ello, p53 también puede bloquear la autofagia inhibiendo muchos de sus complejos [215]. Teniendo en cuenta que la fosforilación en la Ser15 activa p53 y la ayuda a mediar su regulación de la transcripción, y que el CMS condujo a menores niveles de p-p53 hipocampales, el posible obstáculo en la expresión de Bax podría resultar en sus niveles citosólicos reducidos del Hp. Los datos de p-p53, junto con los de Annexin V, el citocromo c y Bax también podrían interpretarse mediante su interacción con la autofagia: Atg12 puede desempeñar una potente acción proapoptótica en respuesta a estímulos de muerte celular. De hecho, se une a Atg3 para sensibilizar a las células a favor de la ruta intrínseca apoptótica, pero no de la extrínseca. Cuando Atg12 se encuentra ausente, la vía intrínseca se bloquea, pero no la extrínseca. Es más, Atg12 también puede modular la inducción de Bax [215]. La regulación a la baja de Atg3 y Atg12 en el Hp habría Discusión 268 provocado el desbalance de la regulación apoptótica a través de la ruta intrínseca y, por tanto, habría descendido sus efectores. Esto conduciría a la disminución de la tasa de apoptosis, posiblemente de alguna forma que contribuya a la activación de la autofagia alterada, en lugar de al programa de muerte celular. Es más, como p53 activado induce Bax y este promueve la liberación del citocromo c de la mitocondria, los valores reducidos de p53 podrían traducirse directamente en la reducción de la liberación del citocromo c. Así, la evaluación de mediadores de la vía extrínseca podría aportar más luz sobre la regulación apoptosis-autofagia en este modelo de estrés. La menor concentración de las formas de p53 en la CF podría explicarse con la translocación de p53 hacia la membrana mitocondrial o el núcleo, intentando ejecutar el programa apoptótico y reduciendo Bcl2. Otra alternativa plausible sería que, entre la carga selectiva a degradar mediante la autofagia, p53 hubiera sido específicamente señalizado para retirarlo del citoplasma, potenciando la autofagia y reduciendo la muerte celular que, en el SNC, siempre es la última alternativa. Beclin1, que induce la formación del autofagosoma, conecta autofagia, apoptosis e inflamación, siendo actualmente considerada como la coordinadora central de estos tres procesos [51]. Bcl2 es capaz de bloquear la autofagia a través de la Beclin1. La proteína JNK (c-Jun N-terminal kinase) fosforila Bcl2, interrumpiendo su interacción con Beclin1 e induciendo la autofagia. De hecho, se hipotetiza que Bax separa Bcl2 de Beclin1, afectando así las expectativas de autofagia. En ensayo de IP permitió la evaluación de la oscilación entre autofagia y apoptosis a través de Beclin1. Aunque los niveles proteicos de Beclin1 fueron menores en el grupo CMS de la CF y el Hp, y de Bcl2 en la CF, su interacción aumentó debido al CMS, de manera que una mayor cantidad de Bcl2 permaneció acoplada a Beclin1 en las dos áreas cerebrales. Esto demuestra de nuevo la disfunción autofágica que causó el CMS en las dos localizaciones. Bcl-xL también aumentó su interacción con Beclin1 en el Hp. Estos ensamblajes incrementados muestran que, si bien el CMS acabó disminuyendo los valores totales de Beclin1 en la CF y el Hp, dificultando la formación de los autofagosomas y la iniciación de la autofagia, su interacción con miembros de la familia Bcl2 fue mayor gracias al CMS y, por tanto, la autofagia se vio impedida mediante el secuestro de Beclin1 en la CF y el Hp. Volviendo a Bax, sus bajos valores proteicos en el Hp apoyarían esta hipótesis, ya que, en último término, se dispondría de menos Bax que permitiese el desensamblaje de Beclin1 de Bcl2. Ya que Beclin1 se encontró sobreexpresada en astrocitos por acción de fármacos antidepresivos [102] y que sus valores plasmáticos podrían ser indicadores de la eficacia Discusión 269 del tratamiento antidepresivo [100], Beclin1 podría ser señalada como una potencial diana para nuevos tratamientos frente al TDM. El proteasoma, un complejo sistema proteolítico cuyo principal objetivo es la eliminación selectiva de proteínas aberrantes o no funcionales ubiquitinadas, fue evaluado a través de sus dos subunidades estructurales, la 20S (fracción central catalítica) y la 19S (fracción reguladora) que juntas conforman el proteasoma activo [221]. Que el CMS no provocara cambios en sus concentraciones en ninguna región cerebral se traduce en que su estructura se mantuvo intacta para la conservación de su función. Cuando el proteasoma se halla inhibido, los niveles proteicos de SQSTM11/p62 suben rápidamente, favoreciendo la supervivencia celular sobre la inhibición proteasómica a través del secuestro de proteínas ubiquitinadas [222]. Esta noción se corresponde con la ausencia de cambios en los niveles totales de SQSTM1/p62 en las dos zonas cerebrales. Además, la conservación de la función proteasómica a pesar del protocolo de estrés concordaría con su trabajo de eliminación de mitofusinas y citocromo c citosólicos previamente comentado. El modelo Poly+Iso sí que mostró cambios en la subunidad 20S del proteasoma. En concreto, la inyección de Poly I:C indujo considerablemente su expresión proteica, lo que se vio inversamente regulado en el grupo doble hit, alcanzando valores más Figura 111. Propuesta de la relación apoptosis-autofagia derivada del modelo CMS en la CF y el Hp. En líneas discontinuas se muestran aquellas conexiones que se han propuesto pero que no se han analizado. La traslocación hipocampal de Bax a la mitocondria se exhibe con trasparencia para señalar su tendencia al alza hallada en este extracto. Discusión 270 parecidos a los CT. La partícula 20S del proteasoma ha sido descrita como altamente resistente a ambientes prooxidantes y puede mantenerse estable ante muchas situaciones de estrés [223], lo que va en la misma línea que los resultados del modelo CMS. No obstante, la administración prenatal de Poly I:C incrementó la concentración proteica de la subunidad catalítica precisamente, por lo que la actividad del proteasoma se vería también potenciada. Para confirmar esta última hipótesis, sería necesario llevar a cabo un ensayo de actividad del proteasoma, que evidenciaría este posible incremento. De nuevo, la exposición al aislamiento social posterior a la administración de Poly I:C previene o evita que los efectos de este sobre el proteasoma en el grupo doble hit no se produzcan o, lo que es lo mismo: el aislamiento social permite que la inyección del Poly I:C previa no altere el sistema de degradación del proteasoma y, por tanto, la proteostasis [224]. 2.3. Estudio de la microglía y su estado mitocondrial por citometría de flujo en los modelos CMS y Poly+Iso En vistas del fomento de la población microglial y su aparente cambio de fenotipo desencadenado tras la exposición al CMS y detectado mediante IF, resultó interesante evaluar la respuesta de la microglía a los modelos de CMS y Poly+Iso. Además, a sabiendas de que la producción de ROS microglial regula la activación de la microglía y la inducción en ella de la ruta del NF-κB [225], la caracterización del estado mitocondrial en la microglía podría ayudar a esclarecer la contribución del desbalance mitocondrial al ambiente neuroinflamatorio y prooxidante del CMS. Así, se aisló la población microglial de la CF y el Hp en los modelos de CMS y Poly+Iso y, a partir de ella, se examinaron las mitocondrias mediante unas sondas específicas por citometría de flujo. Las sondas MitoTracker® difunden de forma pasiva a través de la membrana plasmática, dirigiéndose directamente hacia las mitocondrias activas. MitoTracker® Green mide masa mitocondrial, ya que permea y se acumula en su interior independientemente del potencial transmembrana. La disminución de su intensidad se correlaciona con la degradación de mitocondrias, por lo que se ha usado en los últimos años para estudiar la mitofagia mediante diferentes técnicas. Sin embargo, la tinción con MitoTracker® Deep Red sí es dependiente del potencial de membrana mitocondrial, por lo que no es recomendable su uso para extraer conclusiones relativas al proceso mitofágico; por el contrario, permite determinar cambios en el potencial de membrana mitocondrial [226]. El CMS provocó el aumento de la población microglial entre un 13-15 % en la CF y entre un 8-8.5 % en el Hp. Estos datos se correlacionarían con las imágenes de Iba1 Discusión 271 observadas por IF, puesto que de estas surgieron mayores cambios microgliales en la CF que en el Hp. En el modelo Poly+Iso también hubo aumento de la población microglial en los grupos doble hit de las dos regiones, aunque el resultado más sorprendente fue la disminución casi a la mitad de dicha población en las ratas sometidas únicamente al aislamiento social, además del cambio en el comportamiento de la población detectada. Nuevamente, y siguiendo el mismo patrón que la expresión proteica evaluada mediante WB, la combinación de los dos estresores mejoró las perspectivas de cada estímulo independiente, recuperando en cierta medida unos valores más semejantes a los CT. De hecho, tanto en la CF como en el Hp, el grupo doble hit presentó una mayor concentración microglial con respecto al grupo Iso. Estos resultados irían en la misma línea que un estudio recién publicado en el que ratones C57BL/6 sometidos a 4 semanas de aislamiento social mostraron un menor número de células microgliales, detectándose también la alteración morfológica y sobreactivación de estas [227]. Se requeriría entonces la caracterización futura de su morfología en el modelo Poly+Iso, de la misma manera que se efectuó en el CMS, para evaluar si esta respuesta también ocurre en el modelo doble hit. Otra característica que destacar es la elevación en la expresión de CD45 en la microglía de la CF, algo que no se determinó en el Hp ni en el modelo Poly+Iso. Estudios de RNASeq y proteómica han confirmado una presencia distintiva de receptores específicos en la microglía en función de su expresión cuantitativa de CD45: CD45alto implica una mayor capacidad fagocítica. Esto implica que las células CD11bbajo CD45alto (ya caracterizadas como células infiltradas de la periferia y señaladas en las gráficas como CD45+CD11b-), fundamentalmente macrófagos y monocitos, tienen una mayor capacidad fagocítica que la propia microglía [228]. Así, se podría hipotetizar que el crecimiento mediado por el CMS de la concentración de CD45 en la microglía podría afectar al ejercicio de su función: una mayor capacidad fagocítica podría ser un indicativo indirecto de su sobreactivación. La hiperactivación microglial sería entonces otra prueba adicional del estado neuroinflamatorio derivado del CMS, puesto que este estado microglial conduce a la liberación de citoquinas proinflamatorias y a la activación de inflamasomas por parte de la microglía [197, 229]. Este ascenso de la microglía en la CF también se corresponde con la notable subida proteica de la galectina 3: proteína expresada fundamentalmente en la microglía (aunque ha sido igualmente hallada en astrocitos y oligodendrocitos en menor concentración) e inductora de la proliferación microglial. Asimismo, la galectina 3 contribuye a la regulación microglial de la neuroinflamación, la reparación neuronal y la mielinización. Es más, p53 bloquea la expresión de la galectina 3 [230]: la disminución Discusión 272 de los valores proteicos de p53 podría haber exacerbado la producción de la galectina 3 en la CF de los grupos CMS y, por tanto, afectado finalmente a la proliferación microglial. Para testar definitivamente esta hipótesis, la evaluación de la galectina 3 mediante citometría de flujo, o el empleo de ARN de silenciamiento sobre la galectina 3 podrían poner de manifiesto el papel de esta lectina en el estado microglial. La sonda MitoTracker® Green reveló que el CMS indujo el aumento de la masa mitocondrial tanto en la CF como en el Hp, siento en esta región donde mayor cantidad de sonda permeó al interior mitocondrial. No obstante, en el modelo Poly+Iso se registró la disminución de la masa mitocondrial en la CF, sin ningún cambio en el Hp (datos no mostrados). Estos datos de los dos modelos concuerdan con las determinaciones de WB de TOMM20, donde se apreció la subida de esta en los EM de la CF y la tendencia al alza en el Hp del modelo CMS y la tendencia a la baja en el grupo doble hit. Como era de esperar, el grupo Iso también presentó una reducción considerable de su masa mitocondrial, lo que sería plausible al partir de una menor población microglial. En lo relativo a las aproximaciones con MitoTracker® Deep Red, el Hp del modelo Poly+Iso no mostró cambios en el estado mitocondrial, en correlación con los resultados obtenidos con la sonda anterior en el mismo modelo. Sin embargo, se observó que la población mitocondrial de los CT podría subdividirse en dos subtipos diferenciados, donde uno, el mayoritario, mostró mayores índices de sonda. Esta diferenciación de subpoblaciones también pudo apreciarse en el grupo Poly+Iso, pero no en el caso de cada estímulo aplicado individualmente. De esta manera, el patrón de recuperación o de mejora que presentó el grupo doble hit a lo largo de toda la experimentación fue consistente: la combinación Poly+Iso consiguió restaurar unos valores similares a los registrados por los CT en diferentes tipos de proteínas de autofagia y mitofagia. El motivo por el cual este comportamiento se repitió insistentemente es algo sobre lo que es necesario seguir investigando. En el modelo CMS pudo observarse la alteración del potencial de membrana mitocondrial, mucho más acusado en la CF que en el Hp, donde los cambios fueron más sutiles. La CF mostró un incremento exacerbado de la incorporación de la sonda al interior mitocondrial, indicando la perturbación del potencial de membrana mitocondrial tras la exposición al CMS. Dicha perturbación fue acorde a todos los datos previamente comentados, los cuales exhibieron una mayor tasa de modificación en diversas proteínas y genes relacionados con la mitocondria procedentes de la CF. Discusión 273 Yendo al detalle, el porcentaje sumatorio de las mitocondrias teñidas con alguna de las dos sondas fue mucho más elevado en el caso de la CF, mientras que en el Hp solo se registró su tendencia al alza. Es más, al evaluar de forma conjunta las mitocondrias teñidas con ambas sondas en las mismas preparaciones, se cuantificó la tendencia del CMS a subirlas en la CF, mientras que en el Hp se halló una reducción a más de la mitad en el grupo CMS. Estos cambios fueron probablemente debidos a la discrepancia entre las sondas: en el grupo CMS del Hp se detectó un porcentaje superior de mitocondrias que incorporaron menos MitoTracker® Deep Red y menos MitoTracker® Green que los CT, a la vez que otra subpoblación negativa para MitoTracker® Green fue positiva para MitoTracker® Deep Red. Esto significaría que ciertamente el CMS disminuyó el número de mitocondrias que conjuntamente incorporaron las sondas, pero que tiende a incrementar la cuantía mitocondrial al evaluarse con una o la otra de forma independiente. Por tanto, el CMS redujo la cantidad de mitocondrias con la capacidad de incorporar ambas sondas en el Hp, poniendo de manifiesto la existencia de dos subpoblaciones cuya investigación beneficiaría al entendimiento, por ejemplo, del distinto comportamiento en el grupo CMS con la sonda MitoTracker® Green comentado Figura 112. Las sondas MitoTracker® revelaron el aumento de concentración mitocondrial en la CF e Hp del modelo CMS, así como la alteración del potencial de membrana mitocondrial en la primera. En el grupo Poly+Iso solo se detectó la disminución de la masa mitocondrial en la CF. Además, ambos modelos provocaron el aumento del reclutamiento de microglía, si bien en el CMS fue más acusado. Discusión 274 en líneas anteriores. Al no haber llevado a cabo esta misma determinación en el modelo Poly+Iso, es imposible averiguar si las dos subpoblaciones observadas en los grupos CT y Poly+Iso serían las que tendrían distinto índice de incorporación de MitoTracker® Green. El cambio indicado en el potencial de membrana por la sonda MitoTracker® Deep Red entraría en discordancia con los resultados de la JC-1 en la CF del modelo CMS, por lo que futuras determinaciones, a través de varias técnicas moleculares, deberían de emplearse para esclarecer dicha disonancia. Precisamente, el ensayo JC-1 se realizó sobre todo el tejido cerebral homogeneizado, por lo que es posible que de forma neta el CMS no modifique el potencial de la MMI en todos los tipos celulares. Sin embargo, los experimentos de citometría de flujo mostraron que, en el caso de la microglía, el potencial de membrana de sus mitocondrias sí que fue alterado a consecuencia del CMS, especialmente en la CF. Aunque las sondas MitoTracker® han sido comúnmente empleadas para el estudio de la mitofagia, en este diseño experimental solo se utilizaron con el fin de evaluar la masa mitocondrial y su potencial de membrana en la microglía tras la exposición a los modelos animales de estrés. Para poder haber realizado el estudio de flujo mitofágico mediante estas sondas y con esta técnica, hubiera sido necesario el tratamiento previo con diferentes inhibidores [226], que hubieran indirectamente modificado el fenotipo de la microglía aislada. Dado que el objetivo inicial de esta determinación por citometría de flujo era analizar el efecto del estrés en cada modelo animal, con la menor cantidad posible de perturbaciones, el empleo de estos inhibidores habría dificultado el estudio del efecto directo del estrés sobre la población de microglía y, por tanto, de su estado mitocondrial. 2.4. Efecto de la espermidina en proteínas y genes relacionados con la mitocondria en el modelo CMS La SPD, además de inducir la autofagia, también actúa activando el mecanismo de mitofagia, lo que resulta en una obstaculización de una generación excesiva de estrés oxidativo [80]. De hecho, la SPD conduce al aumento del número de mitocondrias, así como a una mayor variabilidad de formas y tamaños [231], además de intervenir en la función y respiración mitocondrial [80]. De los parámetros mitofágicos examinados, Parkin y Pink1 sufrieron modificaciones ocasionadas por el tratamiento con SPD en la CF, donde su modulación fue opuesta a Discusión 275 la previamente ejercida por el CMS+sal, aunque FUNDC1 también mostró cierta tendencia a recuperar los valores disminuidos por el CMS. En el Hp, sin embargo, la SPD no logró restaurar las concentraciones reducidas de Parkin, pero sí mermó las de Pink1 y BNIP3, elevadas a causa del estrés. Estos resultados constatan que la SPD es capaz de estimular tanto la mitofagia dependiente de Pink1-Parkin como la mitofagia dependiente de receptores en ambas estructuras cerebrales. Se cree que la SPD actúa provocando la despolarización inicial de la mitocondria, activando la formación de mitofagosomas y finalmente la acumulación de Pink1 y la traslocación de Parkin hacia la mitocondria [86]. Lo que resulta interesante de estos datos es que la SPD mengüe la concentración proteica de Parkin en las ratas CT+SPD del Hp, lo que podría ser indicativo de que la SPD promueva una mayor traslocación desde el citosol hacia la mitocondria, pero que esta situación no se repita en la CF. Otro hecho relevante es que la SPD consiga la modulación diferencial de Pink1 hacia su normalización en el grupo CMS+SPD independientemente de la situación original creada por el modelo en cada área. Esto podría señalar que sea Pink1 la principal diana de la SPD y que, una vez conseguida la restauración de los niveles basales, también inicie la cascada posterior de mitofagia reclutando Parkin y llevándola hasta la MME. Como se aludió en líneas anteriores, sería factible que este efecto se observase antes en la CF, siguiendo el mismo patrón de modulación comentado en la que la CF parece responder antes que el Hp, y por ello los niveles proteicos de Parkin en el grupo CMS+SPD se hallen prácticamente normalizados (la vía ya se habría puesto en marcha para la eliminación de mitocondrias defectuosas). El dinamismo mitocondrial también se vio afectado de manera diferencial en la CF y el Hp. En la CF, se describió que el modelo CMS ocasionaba la disposición del sistema hacia la fusión mitocondrial, lo que entraba en conflicto con la inducción de la mitofagia, puesto que normalmente se promovía la fisión ante la iniciación de la mitofagia. Esto podía ser consecuencia de la desregulación del estado mitocondrial generado por la acumulación de ROS y los defectos en la maquinaria de autofagia. No obstante, la SPD facilitó la fisión mitocondrial en la CF, disminuyendo la inhibición ejercida por p-Drp1 en el citosol y promoviendo la traslocación de Drp1 hacia la mitocondria, de ahí que también la SPD logre incrementar la fracción citosólica de Drp1 en el grupo CMS+SPD. De hecho, este efecto en concreto podría deberse al considerable aumento de Pink1 en el mismo grupo, ya que esta promueve la fisión a través de la estimulación indirecta de Drp1 [60], como ya se aludió en anteriores apartados. Discusión 276 En el Hp, donde mayoritariamente se encontraron variaciones desencadenadas por el modelo CMS en los extractos citosólicos, pero no en los mitocondriales, se registró la elevación de la Mfn2 y OPA1 junto con la reducción de la Mfn1 y Drp1. En este caso, la SPD provocó la regulación inversa a la del modelo CMS, mermando en exceso las concentraciones de la Mfn2 y OPA1 y sobreestimulando las de Mfn1. Así como en la CF la SPD promovió un ambiente regulatorio o más estable del dinamismo mitocondrial, parece que en el Hp su efecto se exacerbó. El descenso de Pink1 en el grupo CMS+SPD en el Hp podría haber desencadenado en la consecuente bajada de la Mfn2 [203] y que esto repercutiese en la de OPA1. Lo que resulta imposible de elucidar es si la Mfn1 elevó sus concentraciones como mecanismo compensatorio a la bajada de la Mfn2 y OPA1, o más bien, que la SPD actuase sobre las tres indistintamente. En el estudio de los efectos de la SPD sobre animales con senescencia acelerada anteriormente mencionado [192], se detectó que la SPD provocaba el aumento de las dos mitofusinas. Para esclarecer por completo el papel que estos cambios podrían desentrañar en el Hp, lo más conveniente sería comparar los mismos factores con sus concentraciones respectivas en los extractos mitocondriales purificados. Por tanto, en el Hp la SPD estaría desembocando en el agravamiento de la descompensación de la fusión mitocondrial, sin ejercer ningún efecto en la fisión. Por otro lado, la caracterización Nrf1 en extractos nucleares de la CF y el Hp, y de Mtfa en el Hp, señaló que la bajada en los niveles de Nrf1 derivada de la exposición al CMS se recuperó a valores muy similares al CT+sal tras el tratamiento con SPD. Mtfa mostró la misma tendencia. Este efecto fue probablemente debido al incremento proteico de PGC1α mediado por la SPD, recientemente caracterizado in vitro [232], y que repercute asimismo en el ascenso de Nrf1 y Mtfa. Efectivamente, se observó que la SPD promovió el aumento de la transcripción de Nrf1, tanto en el grupo CT+SPD como en el CMS+SPD, pero especialmente en el segundo en la CF. Se detectó la misma tendencia en Pgc1α. En su conjunto, todo ello parece indicar que en la CF la SPD conduce a la normalización de los marcadores mitocondriales, estableciendo a valores basales los índices de mitogénesis; este hecho podría ser, en ciertos aspectos, consecuencia de la normalización de los parámetros de mitofagia y de fisión, al promover la escisión de partes mitocondriales dañadas y la consecuente inducción de la autofagia y, con ello, la correcta degradación de las mitocondrias dañadas por el modelo. Discusión 277 Sin embargo, la estimulación de la transcripción ejercida por la SPD en Pgc1α y Nrf1 en el Hp siguió el mismo patrón que la de los genes de autofagia, donde la inducción previa del modelo se acusó aún más con el tratamiento con SPD, potenciándola hasta dos o tres veces más. Exactamente lo mismo se observó en la cuantificación de la expresión génica de Parkin, Fundc1, Mfn1 y Drp1 en el Hp, también previamente sobrerregulados por el modelo de estrés. Resulta bastante inesperado que los genes analizados en el Hp se comporten en la misma línea tras la administración semanal de SPD: en primer lugar, la SPD en los grupos CT+SPD no condujo de por sí una inducción de los genes; en segundo lugar, la transcripción de todos ellos se había visto favorecida por el CMS, en ningún caso disminuida; y en último lugar, la tasa de inducción de la transcripción fue exponencial con un efecto sinérgico entre el modelo y el tratamiento. Figura 113. Cambios en las proteínas relacionadas con la mitocondria en las ratas expuestas a CMS que recibieron el tratamiento de SPD, con respecto al grupo CMS. La flecha naranja muestra tendencia. Todos estos resultados se obtuvieron de extractos citosólicos, aunque se hayan empleado imágenes de mitocondrias para facilitar la explicación. Discusión 278 Un estudio reciente en pacientes diagnosticados con deterioro cognitivo subjetivo describió cómo la ingesta diaria de alimentos con alto contenido en SPD aumentó el volumen del hipocampo y el grosor de la corteza, este último especialmente en los lóbulos temporal y parietal [233]. Es más, esta asociación ocurría independientemente de la presencia o no del deterioro cognitivo. Los autores proponen que altos niveles de SPD hipocampales contribuirían a la potenciación de la neurogénesis, preservando de esta forma un volumen cerebral apropiado. Además, vieron que la ingesta de SPD como suplemento durante 3 meses mejoraba las pruebas de memoria, lo que se asociaba con la mejora de la función hipocampal. De esta manera, aunque se desconocen los efectos neuroprotectores de la SPD, dicho trabajo sugiere que la regulación de la autofagia por la SPD sería crucial para la aparición de estos efectos. Este estudio resulta de vital importancia, ya que aporta un dato clave para la investigación de trastornos neuropsiquiátricos como el TDM: en los pacientes con TDM se aprecia una disminución del volumen del Hp, así como un deterioro cognitivo [118], por lo que el tratamiento con suplementos o la ingesta de SPD podría mejorar o contribuir a los efectos producidos por los antidepresivos convencionales en la neurotransmisión monoaminérgica. Se podría argumentar que la inducción génica exponencial de los elementos relacionados con la autofagia y la mitofagia en el Hp, Figura 114. La combinación del modelo CMS y el tratamiento con SPD potencia la transcripción de genes previamente sobreexpresados por el modelo en el Hp. Este incremento de la expresión puede tener efectos niveles y rutas moleculares. Discusión 279 previamente estimulada por el propio modelo de estrés crónico, resulte de un proceso de retroalimentación positiva en la que factores neurotróficos y de neurogénesis perpetúen el mantenimiento de la autofagia y mitofagia activo con el fin de superar el ambiente celular descontrolado generado por el modelo. Es más, otro estudio en Drosophila melanogaster, ratones y humanos también corroboró la mejora de la función cognitiva tras la ingesta de suplementos de SPD. Se observó que se producía la optimización de la respiración mitocondrial en el hipocampo de Drosophila y en el del ratón, sugiriendo que la SPD ejercía una función en el control de calidad mitocondrial al regular la autofagia y la mitofagia, donde Pink1 y Atg7 serían claros protagonistas [234]. En este diseño experimental, la administración de SPD causó efectos variados en la CF y el Hp, exhibiendo fenómenos de inducción de la autofagia a nivel proteico en la CF, a la vez que mostró su tendencia a normalizar los marcadores mitocondriales alterados y promover la homeostasis de esta región, desequilibrada por el modelo. Por lo tanto, podría afirmarse que la SPD podría también establecer este sistema de control de calidad mitocondrial en la CF en un modelo preclínico de enfermedad neuropsiquiátrica. 3. Rutas y procesos relacionados con la autofagia Entre las aproximaciones realizadas únicamente en el modelo CMS, destacan la evaluación del flujo autofágico, de la maquinaria ESCRT y algunos análisis complementarios sobre el ambiente oxidativo celular, a través de proteínas como SDHA y SOD1. 3.1. Evaluación del flujo autofágico mediante leupeptina Para la evaluación del flujo autofágico, que permite analizar la tasa de maduración de autofagosomas como medida casi directa de la actividad de la autofagia, se hizo uso de la leupeptina. Sin embargo, la total inhibición del proceso no se consiguió (se observan aún bandas en la forma LC3-I, cuando cabría esperar su ausencia), por lo que no es posible extraer de este experimento afirmaciones concluyentes sobre la actividad autofágica. Este problema podría haber sido causado por varios factores: el tiempo de latencia entre la inyección y la recogida de muestras fue insuficiente para generar el bloqueo de todos los autofagosomas; la tasa metabólica en la que las células cerebrales Discusión 280 degradaron la leupeptina pudo ser diferente a los expuestos en la literatura disponible [135], o que la concentración fue inadecuada en nuestras condiciones experimentales. Sin embargo, tanto en la CF como en el Hp la ratio LC3-II:LC3-I aumentó en el grupo CMS+leu en comparación con el grupo CMS, por lo que la leupeptina indujo la acumulación de autofagosomas en mayor medida que el propio CMS, su control negativo. La mejor aproximación del estudio del flujo autofágico es la realizada in vitro. De hecho, la mayor parte de la señalización molecular y de los elementos involucrados en la vía de la autofagia se han descrito a partir de cultivos celulares [59]. Para muchos tipos de modelos animales, como los knock-out [235], el estudio aislado de la autofagia en sus células sí supondría una opción válida, ya que conservan su edición genética original. No obstante, para nuestros modelos animales basados en el estrés, el aislamiento y cultivo de células de rata adulta no solo supone un reto en cuanto a la tasa de supervivencia, sino también en cuanto a que este procedimiento en sí revertiría o modificaría el fenotipo adquirido durante el protocolo de estrés, invalidando, por tanto, los posibles resultados que se extrajesen. 3.2. Alteraciones en la maquinaria ESCRT por el modelo CMS y su modulación por la espermidina El complejo ESCRT, que comprende una maquinaria molecular crucial para el remodelado de membranas y su dinamismo, también mostró diferencias regionales en la CF y el Hp en respuesta al estrés crónico. La maquinaria ESCRT actúa como andamiaje sobre el que numerosas proteínas pueden sintetizar de novo o reparar partes de membranas [236]. La CF mostró desregulaciones en Hrs y STAM2, las cuales son responsables de seleccionar y reclutar al resto de las proteínas ESCRT, además de originar agrupaciones de cargas poliubiquitinadas [127]. Todas las proteínas del subcomplejo ESCRT-I se hallaron reducidas en el CMS, siendo este fenómeno potencialmente causado por la desregulación previa en las concentraciones de Hrs y STAM2. Por tanto, el CMS dificultó el proceso de reclutamiento de la maquinaria ESCRT en la CF. Un experimento futuro interesante sería aquel en el que, mediante inmunotinciones por IF, se pudiesen comparar las zonas concretas del citosol en las que tenderían a agruparse tras el CMS, así como el análisis de su expresión génica. ESCRT-I y ESCRT-II coordinan la interacción y ensamblaje de los múltiples factores necesarios para el proceso de reparación y la formación y estabilización de membranas incipientes, para seguidamente avisar al subcomplejo ESCRT-III. El CMS exacerbó la Discusión 281 concentración proteica de CHMP6 y, por tanto, su respuesta. Esto podría suponer un mecanismo compensatorio por las disfunciones ocasionadas en los primeros estadios de la ruta de señalización, de manera que CHMP6 haya podido ser activada y reclutada mediante otros mecanismos. Reiterando la posibilidad de estudio de la expresión génica, el análisis de la expresión de Chpm6 concluiría si el CMS provoca el aumento directo de su cuantía proteica. Así, las variaciones observadas en los subcomplejos ESCRT-0, ESCRT-I y ESCRT-III ilustrarían el impedimento o perturbación en las muchas funciones de la maquinaria ESCRT. Las consecuencias de estas alteraciones repercutirían en procesos como el tráfico intracelular y secreción de proteínas, la formación y cierre de autofagosomas, la síntesis de mitofagosomas y la reparación de lisosomas. En lo relativo al tráfico y secreción de proteínas, la CF mostró considerables cambios en el grupo CMS que podrían correlacionarse de manera directa con esta función celular. De esta manera, el efecto del estrés sobre el destino de proteínas poliubiquitinadas afectaría a su transporte y distribución, tendiendo así a la acumulación de estas en el citoplasma. El cierre y sellado del autofagosoma sería otra función a tener en cuenta, puesto que está mediado parcialmente por ESCRT-III y Vps4B a través de su unión al complejo ULK1, además de promover la fusión entre este y el lisosoma. De hecho, su ausencia inhibe la formación del autolisosoma y, por tanto, de la autofagia [127]. Para justificar esta teoría, experimentos de IF o microscopía electrónica podrían situar la distribución del complejo ESCRT sobre los autofagosomas y, haciendo uso de inhibidores de autofagia, fomentar su acúmulo para favorecer su visualización. El empleo de este tipo de inhibidores está muy extendido en el campo de la autofagia, a lo que se hará referencia en líneas posteriores. La tercera función que se vería perjudicada por las alteraciones en el complejo ESCRT serían la reparación de lisosomas y la lisofagia, lo que se relacionaría con los cambios producidos por el CMS en el número lisosomas y su funcionalidad. Que la maquinaria ESCRT no se reclute de forma oportuna y lo haga de forma desproporcionada tiene consecuencias directas sobre su papel en la homeostasis lisosomal: los lisosomas no reparados también tenderían a acumularse en el citoplasma. Asimismo, el ascenso proteico de la galectina 3 en la CF indicaría la necesidad del inicio del programa de lisofagia, previsiblemente ante la imposibilidad de reparación de los lisosomas dañados, cuyos agregados dificultan el metabolismo celular regular y, por tanto, deben retirarse. La lisofagia puede efectuarse a pesar de que la maquinaria ESCRT falle al reparar daños menores, por lo que temporalmente la sucede, aunque la naturaleza y la gravedad del daño lisosomal pueden decidir cuál se pone en marcha inicialmente [237]. Discusión 282 Así, la perturbación en el reclutamiento y concentración de las proteínas ESCRT en la CF podría haber contribuido al empeoramiento del estado lisosomal (ya referido en la sección anterior) y con ello, al incremento de la galectina 3 para solucionarlo. En el Hp, el CMS solo causó variaciones en el subcomplejo ESCRT-I y en la proteína asociada Vps4B, que es la que permite la translocación y desensamblaje de las proteínas ESCRT-III una vez finalizada su función [127]. Nuevamente se observó la sensibilidad al estrés región-específica, ya que el perfil de la maquinaria ESCRT fue concreto en cada área cerebral. Tampoco se observaron cambios en la galectina 3. Como las galectinas coordinan las respuestas ante daño en las membranas, regulan la congregación de los subcomplejos ESCRT para favorecer la reparación y, cuando esto no es una opción, activan el mecanismo de autofagia para eliminar el exceso de membranas. Se concentran en el lugar donde se produjo la ruptura, tras el reconocimiento de la exposición de galactósidos (los indicadores de daño en membranas) [238]. Así, la no modificación de la galectina 3 a causa del modelo iría en paralelo con la ausencia de cambios en el subcomplejo inicial, ESCRT-0. La galectina 9, necesaria para la eficiente poliubiquitinación durante daño lisosomal y para conectar las señales de daño de membranas con el sistema de ubiquitinación y la maquinaria ESCRT [239], descendió en los grupos CMS de la CF e Hp, por lo que estas Figura 115. Posibles mecanismos alterados por la desregulación proteica en los subcomplejos de la maquinaria ESCRT tras el modelo CMS en la CF. Discusión 283 dos de sus principales funciones también se verían impedidas por el estrés. Este hecho, en definitiva, podría contribuir a la permeabilización de las membranas y la acumulación de sustratos proteicos y de diversa índole en el citosol de las dos regiones cerebrales analizadas. La galectina 9 es una de las galectinas más expresadas en el SNC, aunque es una de las menos estudiadas [230]. Se ha detectado en un modelo de hemorragia intracerebral en ratas que el aumento de su expresión conduce a la activación de la vía del TLR4, promoviendo la conversión de la microglía hacia el fenotipo M2 [240]. Aunque en este estudio fue la microglía la que expresó mayormente galectina 9, las determinaciones de IF en el modelo CMS mostraron que, en las condiciones experimentales fijadas, tanto en la CF como en el Hp, fueron las neuronas la fuente principal de esta proteína. Además, su localización es bastante concreta, siempre en el soma neuronal y al comienzo del axón. Partiendo de su papel en el proceso inflamatorio, en el que recientemente se ha caracterizado la capacidad de la galectina 9 para inhibir la activación del inflamasoma NLRP3 a través de promover su eliminación mediante autofagia activando SQSTM1/p62 [241], sería interesante establecer su papel y conexiones moleculares con el entramado inflamatorio descrito en este y demás modelos basados en el estrés, ya que podría actuar como un posible nexo de unión entre neuroinflamación y autofagia en el SNC. Recientemente se caracterizó la presencia del subcomplejo ESCRT-III como necesaria para la formación de nuevos mitofagosomas, tanto en los primeros como en los últimos estadios, siendo CHMP4B una de las principales proteínas encontradas. Otra proteína CHMP, como es CHMP2A también participa en el sellado del mitofagosoma [242]. Considerando que la mayoría de las funciones de las proteínas ESCRT están empezando a vislumbrarse, se podría hipotetizar que las alteraciones en el reclutamiento y concentración de ESCRT-III, representadas por CHMP6 y CHMP5 en la CF, podría afectar a la correcta formación e introducción de las mitocondrias dañadas en los mitofagosomas. Consecuentemente, esta situación no ocurriría en el Hp, como puede apreciarse a partir de los resultados de estas proteínas mediante WB. El efecto del tratamiento con SPD fue distinto en cada región cerebral. En primera instancia, el CMS dio lugar a un mayor número de modificaciones en la CF, alterando subcomplejos que permanecieron intactos en el Hp. Este sería el caso de ESCRT-0, cuyos representantes Hrs y STAM2 fueron claras dianas de la modulación ejercida por la SPD. Esta causó la disminución pronunciada de los niveles proteicos de Hrs, previamente elevados por el CMS, así como el acentuado ascenso de STAM2, que por su parte había sido reducido por el modelo de estrés crónico. Por lo tanto, el modelo modificó los valores proteicos de ESCRT-0 de forma opuesta, y la SPD pudo revertir Discusión 284 esos niveles en cada caso, pero finalmente exacerbando esta recuperación al compararlo con los CT+sal. Lo que resulta bastante llamativo es que en el grupo CT+SPD, la SPD redujo los niveles proteicos de Hrs y STAM2. Hasta la fecha, no se ha encontrado ningún estudio sobre el efecto de la SPD en la maquinaria ESCRT, y menos aún en el contexto de las enfermedades neuropsiquiátricas. En este sentido, se podría hipotetizar que la SPD podría ejercer algún tipo de efecto sobre el inicio del reclutamiento de la maquinaria ESCRT, y ya no solo eso: al reducir los niveles de Hrs y STAM en las ratas CT+SPD, las otras funciones paralelas que estas llevan a cabo también podrían estar viéndose moduladas por la SPD. Un ejemplo de ello sería la clatrina y SNAP25 (Synaptosome Associated Protein 25), que son proteínas con las que Hrs interactúa [243]. La primera, permite la formación de vesículas y el transporte intracelular de sustancias englobadas en ellas, por lo que se estaría actuando sobre los mecanismos de endocitosis y exocitosis [244]. La segunda, desempeña funciones pre y postsinápticas, participando en procesos como el tráfico de receptores postsinápticos, morfología de las espinas dendríticas y liberación de neurotransmisores. De hecho, se han descrito alteraciones de su gen en pacientes con TDAH, esquizofrenia y trastorno bipolar [245] y, en experimentos preliminares del modelo CMS, se observó una disminución de su proteína en el Hp. Hrs se expresa en mayor medida en la corteza, el Hp y el hipotálamo. Estudios con ratones KO para Hrs mostraron que su ausencia conducía a la pérdida de neuronas piramidales y a la acumulación de proteínas ubiquitinadas [246]. Esto apuntaría a la posibilidad de que el tratamiento con SPD repercutiese en procesos de tráfico vesicular, conexión sináptica y sistema de ubiquitinación celular. Con ello, y dado que se comprobó que son las neuronas las que expresan en elevadas cantidades STAM2, encontrándose tanto en el núcleo (donde no se halló Hrs) como el citoplasma (fundamentalmente formando parte de endosomas tempranos como integrante del subcomplejo ESCRT-0) [247], la SPD mediaría su efecto esencialmente sobre las neuronas. Para corroborar esta teoría, se podrían realizar estudios de colocalización por IF de Hrs y STAM2 tras el tratamiento con SPD en neuronas marcadas con NeuN y MAP2. Tsg101, con la que también interactúa Hrs, fue igualmente susceptible al tratamiento con SPD en la CF, presentando una mayor variabilidad en el Hp. Mientras que en la CF la SPD sí recuperó los valores disminuidos previamente por el CMS de esta proteína, en el Hp no tuvo efecto a este nivel. En este caso, la SPD indujo la expresión proteica de Tsg101 en el grupo CT+SPD, pudiendo indicar, por una parte, que la SPD actúe de forma directa también sobre ella o bien, sea consecuencia de la regulación a la baja en Discusión 285 Hrs y STAM2 en el mismo grupo. Tsg101 es necesaria para la formación de los MVB, pudiendo ocurrir esto en ausencia de Hrs. Se piensa que Hrs concentra las proteínas ubiquitinadas que deben degradarse por el lisosoma en la cercanía a los endosomas tempranos y que Tsg101 interactúa con ellas [248]. Que la SPD incremente las concentraciones de Tsg101 en la CF del grupo CMS+SPD podría ser prueba de la mejora del ambiente generado por el CMS en cuanto a la acumulación de proteínas aberrantes y aumento de la ubiquitinación, potenciando su eliminación al facilitar su encapsulamiento en autofagosomas, para posteriormente degradarlos por los lisosomas. Los otros miembros del subcomplejo ESCRT-I, Vps28 y Vps37A, que también presentaron concentraciones decrecidas a causa de la exposición al CMS en la CF, experimentaron la modulación al alza de sus proteínas en el grupo CMS+SPD, evidenciando nuevamente la posibilidad de ser dianas directas de la SPD o ello ser consecuencia de los cambios acontecidos en la parte anterior de la vía con el subcomplejo ESCRT-0. Los subcomplejos ESCRT-I y ESCRT-II son necesarios para la estabilidad de la arborización dendrítica en neuronas maduras del Hp de rata in vitro [249], por lo que la reducción de la presencia proteica de Vps37A en esta región cerebral a niveles más próximos a los CT+sal podría ser indicativo de un posible efecto indirecto de la SPD sobre la estabilización dendrítica neuronal. Sin duda, esto mejoraría los procesos neurotróficos hipocampales. Un ejemplo de ello es el estudio en ratones con senescencia acelerada, cuyo tratamiento con SPD elevó en neuronas factores neurotróficos como NGF (Nerve Growth Factor) y BDNF [192]. Y no solo eso, porque Vps28 ha mostrado regular la vasculatura cerebral mediante el control del tráfico de VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) [250]. En este punto, sería conveniente evaluar diferentes factores neurotróficos en este modelo, así como su localización celular para comprobar el alcance de la SPD, teniendo en consideración los niveles alterados de neurotrofinas en pacientes con TDM [251]. El ANOVA de dos vías reveló efecto de la SPD en las proteínas CHMP5 y CHMP6 (ESCRT-III) en la CF, aunque mostraron dos escenarios distintos: CHMP5 disminuyó aún más en el grupo CMS+SPD que en el grupo CMS+sal, mientras que el tratamiento con SPD redujo los valores previamente elevados por el CMS de CHMP6 a niveles inferiores a los presentes en el CT+sal. Por tanto, así como la modulación llevada a cabo por la SPD resultó beneficiosa a nivel proteico en los complejos ESCRT-0, ESCRT-I y ESCRT-II, en el caso de ESCRT-III, la SPD no logró normalizar y mejorar la presencia proteica de CHMP5 y CHMP6. Otros miembros de este subcomplejo, como CHMP4B Discusión 286 podrían presentar otro tipo modulación, por lo que sería interesante abrir la investigación a más posibilidades. El estudio de la expresión de la proteína Vps4B en el Hp reveló que la SPD tiende a mejorar su concentración en el grupo CMS+SPD, situándola a unos valores muy similares a los CT+sal. Dado que se ha corroborado que su localización es exclusivamente neuronal en el Hp de rata, hallándose únicamente en el citoplasma de neuronas [252], se podría deducir que los efectos del tratamiento con SPD sobre esta proteína estarían produciéndose de nuevo sobre este tipo celular en concreto. En cuanto a la modulación de las galectinas por la SPD, los análisis determinaron que el tratamiento con SPD no tuvo efecto alguno sobre Gal3 y Gal9 en la CF, permaneciendo desreguladas en el grupo CMS+SPD al igual que en el CMS+sal. A pesar de ello, en el Hp la SPD mostró reducir los valores proteicos de la Gal9 en el grupo CT+SPD, mientras que fue capaz de potenciar los niveles disminuidos por el modelo de estrés en el grupo CMS+SPD, sin llegar aún a recuperar los valores CT+sal. Partiendo de que una expresión aumentada de Gal9 se correlaciona con un incremento de su interacción con TLR4 y la posterior conversión del fenotipo M1 a M2 de la microglía [240], la mejora mediada por la SPD en el Hp estaría implicando indirectamente la activación o estimulación de rutas neuroinflamatorias, advirtiendo en ese caso que la SPD debería una parte de sus efectos a la regulación de rutas inflamatorias. Para contrastar tal aseveración, podrían llevarse a cabo ensayos de IP, al igual que en la investigación recientemente citada, para ver la interacción Gal9-TLR4 en nuestro modelo, y si la SPD promueve o no una mejor o peor ratio de interacción. Tras ello, se deberían estudiar marcadores neuroinflamatorios y su regulación por la SPD. Por lo tanto, en términos generales, puede concluirse que el tratamiento con SPD supuso un beneficio neto en los miembros de la maquinaria ESCRT en la CF, al menos, en los primeros subcomplejos, mientras que en el Hp el modelo CMS provocó menos alteraciones y, de ellas, la SPD consiguió la recuperación proteica de Vps37A, Vps4B y Gal9. Discusión 287 3.3. Ambiente prooxidativo evaluado en el modelo CMS Añadido a descripciones previas de nuestro grupo en el modelo CMS sobre el estado prooxidante generado por el estrés [162], se detectaron niveles elevados de MDA en el grupo CMS, apuntando a un mayor índice de peroxidación lipídica y, por tanto, de estrés oxidativo. La afectación de este sobre los lípidos no se correspondió en el caso de los ácidos nucleicos, ya que no se hallaron cambios en la 8-OHdG, si bien es verdad que estos resultados se obtuvieron de muestras plasmáticas. Su realización en la CF y el Hp también se efectuó, pero ante resultados contradictorios evidenciados por controles positivos y negativos, no se pudo concluir la veracidad y especificidad del kit empleado en el SNC. Paralelamente, los valores proteicos disminuidos en la CF de catalasa obtenidos mediante ELISA también se correlacionaron con la reducción de su expresión génica anteriormente descrita [162], indicando una menor defensa antioxidante. Por último, la valoración de proteínas adicionales relacionadas con el estrés metabólico, también destacó la mayor perturbación en la CF por el CMS: la SDHA (succinato deshidrogenasa), SOD1 (superóxido dismutasa 1) y XBP1 (X-Box Binding Protein 1) Figura 116. Modificaciones en las proteínas de la maquinaria ESCRT tras la exposición al modelo CMS y su posterior tratamiento con SPD en la CF y el Hp. La SPD tendría un efecto beneficioso en la CF al recuperar los niveles reducidos por el CMS en todos los componentes del complejo ESCRT-I. Discusión 288 mostraron diferentes tipos de modulación. La SDHA cataliza la oxidación del succinato a fumarato en el ciclo de Krebs, así como forma parte del complejo III de la cadena respiratoria mitocondrial para reducir oxígeno y formar agua [253]. Su aumento en la CF implicaría la posible variación de su funcionalidad en esos dos mecanismos, si bien tras el análisis de los complejos mitocondriales no se observaron cambios en el primero. A pesar de ello, el incremento registrado en SDHA siguió la misma línea que COX IV, por lo que este patrón reincidente apuntaría nuevamente a que el CMS podría variar las concentraciones de proteínas esenciales de la cadena respiratoria sin alterar su cometido. Los niveles de SOD1 contrastarían con la reducción de la catalasa en la CF, indicando que el CMS reguló el arsenal de enzimas antioxidantes de forma diferencial, quizá en un intento por parte del organismo de contrarrestar el desequilibrio oxidativo. De hecho, su expresión génica no mostró cambios derivados del CMS [162]. Por su parte, XBP1, una proteína implicada en la señalización del estrés del RE y en la respuesta ante proteínas mal plegadas (UPR), elevó sus valores hipocampales tras la exposición al CMS, mostrando una leve tendencia al alza en la CF. El estrés del RE y la respuesta UPR, entre sus múltiples destinos, activan la maquinaria de autofagia [254]. Este tipo de estrés se define como el desequilibrio de la homeostasis del Ca2+ y el potencial redox, así como acumulación de proteínas mal glicosiladas o mal plegadas en el RE [255]. Sería lógico pensar, considerando los resultados globales previamente mencionados que la CF fuera la que también presentase cambios de mayor índole al nivel del RE, y más dada la interacción RE-mitocondrias y la destacada desregulación de estas. Sin embargo, el Hp podría presentar una mayor vulnerabilidad a la señalización intracelular del estrés del RE y la respuesta UPR ante el protocolo de CMS. Sería interesante continuar indagando la interrelación entre el sistema UPR y la autofagia, porque ejercen mecanismos compensatorios cuyo potencial terapéutico está siendo objeto de gran interés por la comunidad científica actual [256]. Discusión 289 4. Pruebas comportamentales 4.1. Modelo CMS+SPD Las pruebas conductuales realizadas sobre el modelo CMS+SPD mostraron una gran variabilidad intragrupal en todas las determinaciones, lo que dificultó el estudio estadístico. La SPD no modificó los cambios producidos por el CMS. En este aspecto, conviene destacar que los CT no exhibieron los niveles normalmente registrados en estas pruebas comportamentales rutinarias, lo que definitivamente pudo influir en la comparativa posterior con el resto de los grupos experimentales. De esta forma, ya que los grupos CT no presentaron los niveles conductuales generalmente registrados, no se pudieron fijar las condiciones oportunas para normalizar y evaluar posteriormente el fenotipo de tipo depresivo en los grupos CMS. Esto no implica que el modelo no haya sido reproducido como en anteriores ocasiones; el principal problema radicaría en la comparación de los grupos CMS con respecto a los CT. El ensayo de corticosterona mostró que efectivamente los niveles de estrés de los animales CT fueron mayores a lo esperado y, por tanto, que circunstancias ajenas a las Figura 117. Comparación general de los principales factores modificados a causa de la exposición al modelo CMS en la CF y el Hp. Discusión 290 condiciones propias del diseño experimental pudieron ejercer un papel importante en el fenotipo comportamental. Aunque la SPD sí consiguió restaurar las concentraciones proteicas de elementos de autofagia y mitofagia, señalando que la dosis y la pauta de inyecciones fue beneficiosa en ciertos aspectos a nivel bioquímico, la SPD no mostró beneficios a nivel comportamental, aunque se observó la tendencia a desarrollar en ratas CT una conducta menos ansiosa y más atrevida (hiperlocomoción) en la prueba de campo abierto. En base a la literatura existente [136, 193] se eligió la vía intraperitoneal, aunque algunas investigaciones con SPD se han realizado empleándola como suplemento en el agua de bebida [257, 258] o, incluso, mediante la administración intracerebral mediante cánulas [259]. De hecho, existen estudios clínicos recientes que analizan el papel de la espermidina como suplemento alimenticio [80, 260]. Asimismo, a pesar de que el grupo CMS no mostrase sus índices usuales en las distintas pruebas, el grupo CMS+sal registró en varios parámetros unas marcas más similares a las que normalmente registra aquel (mayor tiempo de inmovilidad en la prueba de natación forzada, más tiempo también en la zona externa del campo abierto y una mayor latencia y menor cantidad de periodos de acicalamiento), cuyos animales mostraron una gran variabilidad en todas las pruebas y no siguieron el mismo patrón. Una posible explicación a este hecho sería la tolerancia desarrollada por los animales al manejo y manipulación por parte del experimentador: las ratas administradas con salino fueron diariamente manipuladas durante la última semana, mientras que las ratas CMS podrían haber sufrido por su defecto niveles superiores de estrés que repercutiesen de alguna forma en su respuesta a las pruebas comportamentales. Partiendo de todo ello, y en base a las conductas mostradas por los grupos CT+sal y CMS+sal, se podría exponer que la SPD tiende a disminuir el tiempo de inmovilidad en la prueba de natación forzada, así como incrementar ligeramente el tiempo de nado, lo que apunta a una leve mejora en el comportamiento de tipo depresivo. En ratones administrados intracerebroventricularmente con espermina, el producto metabólico de la SPD, se ha observado que esta producía un efecto contrario a la inmovilización en la prueba de natación forzada, y que posiblemente este efecto era mediado por su unión a receptores de NMDA [261]. La SPD también puede unirse al mismo lugar de interacción de estos receptores, por lo que no sería extraño que pudiese mediar el mismo efecto [136]. Es más, puesto que la SPD y la espermina exógenas pueden unirse a este receptor, la administración de estas incrementa sus propias concentraciones Discusión 291 basales cerebrales de SPD y espermina que, por ejemplo, se vieron disminuidas en el Hp de un modelo similar al CMS, pero de mayor duración [262]. Considerando que nuestro grupo describió hace unos años cómo las subunidades del receptor de NMDA, NMDAR2A y NMDA2B, se redujeron a nivel proteico en la CF tras la exposición de las ratas al modelo CMS [263], es posible que la discreta mejoría en esta prueba comportamental se haya debido a la modulación de la autofagia y de los receptores NMDA. En cuanto a la prueba de campo abierto, la SPD tendió a disminuir el número de visitas en la zona externa en favor del incremento de la zona interna en el grupo CT+SPD, lo que parece indicar que la SPD genere un fenotipo ansiolítico, que pudo también apreciarse en el descenso del número de veces que las ratas CMS+SPD pasaron en la zona externa. A pesar de ello, el grupo CMS+SPD no pasó más tiempo en la zona interna ni la visitó más veces, por lo que no parece que la SPD medie este mismo efecto ante la presencia de un estrés crónico previo. En ratones envejecidos, el tratamiento con SPD diluida en el agua de bebida registró un leve aumento del tiempo empleado en la zona interna del campo, así como un menor tiempo de latencia para dirigirse a ella y una mayor distancia recorrida [234]. De igual manera, en ratones con senescencia acelerada, la SPD potenció el número de veces que visitaron la zona interna y la distancia recorrida dentro de ella [192]. Aunque la especie, el modelo animal y la vía de administración empleados fueron distintos, estas investigaciones destacan la capacidad de la SPD de mejorar el comportamiento exploratorio y la locomoción que apenas se detectó en el modelo CMS. Por último, el grupo CMS+SPD registró un menor tiempo de latencia en el inicio del acicalado tras la aplicación de la solución azucarada, y una mayor propensión en la cantidad y duración de cada acicalado en comparación con el grupo CMS+sal. En todos los casos, los datos siguieron un patrón semejante al mostrado por los CT+sal. Estos resultados apuntarían a la propensión de la SPD a mejorar la anhedonia causada por el CMS. En un modelo que desarrolla un comportamiento de tipo psicótico en ratón inducido por ketamina, se analizaron los comportamientos estereotípicos resultantes (como el acicalado, movimientos de la cabeza, o giros sobre sí mismos) y comprobaron que la SPD disminuía la presencia de estos [193]. La combinación de todas las pruebas en su conjunto, a pesar de las dificultades encontradas, parece apuntar hacia una sutil mejora del comportamiento inducido por el tratamiento con SPD en el modelo CMS. Discusión 292 4.2. Modelo Poly I:C + aislamiento social En este modelo no se registraron alteraciones en conductas de tipo ansioso o fallos de locomoción en comparación con los grupos CT. No obstante, en la prueba de campo abierto se detectó la misma tendencia que en las pruebas bioquímicas: cada estímulo independiente sufrió una modulación característica que de forma conjunta se equilibró. El Poly I:C incrementó notablemente el tiempo empleado en la zona interna, lo que sugiere menores índices de ansiedad que los CT, además de una mayor locomoción, que se contrarresta con el grupo Iso, cuyos valores fueron menores que los CT. A pesar de ello, el laberinto en cruz elevado puso de manifiesto que el grupo doble hit sufrió menos conductas de tipo miedosas o ansiosas al pasar más tiempo en los brazos abiertos que el grupo Poly I:C, empleando menos tiempo en los brazos cerrados. Estos resultados irían en desacuerdo con los procedentes del campo abierto, pero bien es verdad que estos datos de mejora del grupo doble hit se obtuvieron al comparar con el grupo Poly I:C, no con los CT. En este caso, el grupo Iso también mostró un comportamiento similar a los CT. Esta discrepancia podría achacarse a la naturaleza de cada prueba: la zona interna de la caja se rodea de paredes altas alejadas, mientras que los brazos abiertos del laberinto en cruz elevado son estrechos y permiten a la rata visualizar la altura con respecto al suelo. Por ello, se piensa que, aunque miden lo mismo, cada una de estas pruebas puede aportar información sobre un aspecto distinto del comportamiento de tipo ansioso [264]. A esto se le une que los grupos de este modelo se formaron con ratas macho y hembra, y que se han descrito diferencias intersexuales a la hora de la realización de estas dos pruebas concretas [265]. 4.3. Modelos MD+LPS y MD+RS En cuanto al modelo MD+LPS, no se observaron cambios en el grupo doble hit en la prueba del laberinto en cruz elevado, aunque se detectó cierta tendencia al alza por parte del grupo MD a entrar un mayor número de veces en los brazos abiertos, sugiriendo un fenotipo menor de tipo ansioso. Asimismo, se registró la tendencia a un menor número de veces de acicalamiento en la prueba Splash, lo que podría apuntar a que la MD estaría contribuyendo a fenómenos de anhedonia. Sin embargo, el grupo doble hit exhibió valores similares a los CT en todos los parámetros evaluados. Este mismo patrón fue observado en el modelo MD+RS, cuyo grupo MD también mostró una menor tendencia al acicalamiento en la prueba Splash. Dichos datos concuerdan con lo descrito en la literatura, confirmando que la MD induce comportamientos de tipo depresivo al disminuir la tasa de acicalamiento y, por tanto, causando anhedonia [266]. En este último modelo, el único cambio registrado fue el incremento en la cantidad de Discusión 293 veces pasadas en los brazos abiertos por el grupo doble hit en comparación con aquellos animales únicamente expuestos a la RS. Las pruebas mostradas sobre los modelos doble hit tenían como objetivo mostrar que dichos modelos no generaban un comportamiento de tipo depresivo o ansioso, sino que se capacitaban para englobarse dentro de la categoría de modelos del neurodesarrollo o modelos de fenotipo de tipo psicótico. En este sentido, estos modelos sí replicaron el objetivo inicial, al no hallarse índices de comportamientos de tipo ansioso o depresivo en los grupos doble hit. Discusión 294 295 ANÁLISIS CRÍTICO Y PERSPECTIVAS FUTURAS 296 297 Las investigaciones y experimentos realizados en esta Tesis Doctoral dieron fruto a una serie de caracterizaciones y descripciones muy relevantes en el marco del estudio de los trastornos neuropsiquiátricos relacionados con el estrés y sus consecuencias en modelos animales. No obstante, se identificaron una serie de limitaciones: • El primero es consecuencia de una contingencia fatal en todo nuestro Departamento: el fallo en el soporte energético de los ultracongeladores que mantenían en condiciones óptimas las muestras de los modelos MD+LPS y MD+RS y la consiguiente bajada de temperatura durante más de una semana imposibilitó la continuación de la evaluación en ellos de parámetros relacionados con la mitocondria y la autofagia hipocampal. Al no poder asegurar la estabilidad bioquímica del tejido ni poder conocer el índice de degradación durante este periodo, se optó por no continuar estudiando estos modelos. Este es el principal motivo por lo que estos modelos quedaron más incompletos que el resto, no pudiendo realizar la comparativa entre ellos a nivel de la mitocondria. • En los modelos doble hit, solo se evaluaron los parámetros en la CF, por lo que sería necesaria la caracterización de los mismos en el Hp para realmente tener una visión global de la implicación de la autofagia en las dos estructuras de cada modelo animal realizado. Esto permitiría profundizar en la hipótesis propuesta sobre la influencia del estrés en la autofagia de forma dependiente a la localización cerebral, con un patrón de respuesta temporalmente distinto, propuesta en esta Tesis Doctoral. • Para la evaluación del estado lisosomal se eligió el modelo CMS, por ser el que mayor cantidad de alteraciones mostró en la CF. Sin embargo, esta debería también haberse aplicado a los modelos doble hit, fundamentalmente al modelo MD+RS, que fue el que más diferencias registró con respecto al CMS y del que la modulación de la autofagia, de igual manera que el CMS con la SPD, aportaría informaciones más reveladoras. El estudio del lisosoma en el modelo MD+RS podría arrojar luz sobre la respuesta de este orgánulo al estrés, y ayudar a entender mejor si las alteraciones lisosomales asociadas al CMS fueron dependientes directamente del modelo, o bien, consecuencia del impedimento previo de la autofagia. La inducción de la vía en el modelo MD+RS abre la veda para la comparación de estas dos situaciones opuestas. Análisis crítico y perspectivas futuras 298 • Igualmente, la modulación de la autofagia solo se llevó a cabo en el modelo CMS. Dado que cada modelo presentó una modificación distinta de los factores autofágicos, la modulación farmacológica adaptada a cada situación para analizar cómo responden estos factores debe ser estudiada. Además, la combinación de un inductor o inhibidor de la autofagia, en función del contexto, con un antidepresivo o un antipsicótico hubiera permitido más a ciencia cierta comprobar si efectivamente la regulación de la autofagia beneficia de algún modo el ambiente proinflamatorio y oxidante que generan los modelos basados en el estrés. • El análisis del flujo autofágico solo se realizó en el modelo CMS, donde la inyección intracortical e intrahipocampal de leupeptina no logró bloquear el flujo autofágico en su totalidad. Por lo tanto, la puesta a punto de la administración de leupeptina y, una vez conseguida, su ejecución sobre el resto de los modelos doble hit, hubiera sido lo ideal para conocer realmente el índice de formación de autofagosomas maduros tras la exposición a los distintos modelos. • La diferenciación sexual en la evaluación de la autofagia es otro de los puntos débiles de este trabajo, ya que en el modelo CMS se emplearon machos en todo momento (se realizó un modelo CMS con hembras exclusivamente, que también sucumbió al problema de la descongelación de los ultracongeladores, sin tan siquiera haber podido comenzar con las determinaciones bioquímicas); en los modelos doble hit, si bien se hizo uso de todos los integrantes de las camadas resultantes, la división aleatoria entre los grupos experimentales no contempló la distribución totalmente equitativa entre machos y hembras en todos ellos, ya que para ello se hubieran requerido más ratas gestantes de partida, yendo en contra del criterio de reducción recomendado por la legislación actual sobre el uso de animales de experimentación. A partir de aquí, quedaría también reagrupar todos los datos para constatar la posibilidad de que haya efectos que se den en mayor medida o de forma más clara en machos o en hembras, o incluso, que dejen de observarse cambios en un sexo. Este nuevo tratamiento de los datos está planificado para efectuarse en un futuro cercano, y no se consideró para este trabajo por el desequilibrio en la distribución de los grupos, sumado a que en el modelo CMS, el más estudiado, solo se estudiaron machos, por lo que no se podía ofrecer una comparativa en base al sexo con respecto a los modelos doble hit. Análisis crítico y perspectivas futuras 299 • Los análisis de los extractos mitocondriales en el modelo CMS+SPD no pudieron completarse por una disminución del umbral de concentración mitocondrial alcanzado durante el proceso de purificación. Esto desembocó en una menor posibilidad de procesamiento del número de proteínas mitocondriales y la consecuente reducción de las repeticiones técnicas necesarias para asegurar la reproducibilidad del estudio. Este es el motivo por lo que solo se cuantificaron e incluyeron las proteínas extraídas de la fracción citosólica. • Aunque se examinaron múltiples factores relacionados con la mitocondria que permitieron dibujar un perfil consistente del estado mitocondrial, no se realizó una caracterización profunda de la actividad mitocondrial, lo que añadiría información a los cambios fisiológicos y estructurales observados a través de diferentes técnicas. A raíz de estas limitaciones, las perspectivas de futuro que surgen del presente trabajo serían las siguientes: • En primera instancia, el empleo de técnicas adicionales que aporten más información a los resultados obtenidos. En el caso del estudio del lisosoma, ensayos de microscopía electrónica serían muy útiles para corroborar el incremento observado mediante la fosfatasa ácida, así como la realización de ensayos de funcionalidad e IF del tráfico vesicular. De la misma forma, la caracterización de la mitocondria debería de apoyarse en más técnicas, entre ellas, técnicas con células vivas, como puede ser el ensayo seahorse para medir la cantidad de ATP producida por la glicolisis y la mitocondria, permitiendo cuantificar el flujo de oxígeno y su ratio de consumición; asimismo, la microscopía electrónica también serviría para apoyar los resultados de WB, especialmente los de mitofagia y fusión/fisión mitocondrial, con la posibilidad de poder determinar si los modelos de estrés provocan alteraciones a nivel de las crestas mitocondriales y la distribución de las redes mitocondriales por la célula. • Aunque más complicado dada la naturaleza de estos modelos, el análisis de mecanismos in vitro también podría ayudar a determinar la implicación de cada proceso y facilitar el estudio de los tipos celulares exactos que llevan a cabo dichos mecanismos. A pesar de no poder usar células recién extraídas de la rata adulta, ya que sufriría un proceso de desdiferenciación del fenotipo adquirido durante el modelo de estrés, el empleo de células humanas procedentes de Análisis crítico y perspectivas futuras 300 pacientes podría ser una aproximación muy traslacional en la que estudiar autofagia. En este caso, el estudio de macrófagos humanos, quizá sometidos a algún estresor como el LPS, podría arrojar luz a cómo estas células inmunes responden al estímulo y cómo se regula la vía de la autofagia y mitofagia en ellas. • En relación con lo anterior, el análisis de los mismos marcadores de autofagia y mitofagia en muestras de tejido cerebral post mortem de pacientes diagnosticados con depresión y esquizofrenia hubiera sido magnífico de incluir en este trabajo, ya que se contemplaba en el proyecto original. El retraso derivado de la situación sanitaria generado por la COVID-19 en la recepción de las muestras impidió su procesamiento y determinaciones completos, por lo que es un estudio pendiente que sin duda desvelará si los procesos alterados vistos en rata también se replican en el humano. • La evaluación de los parámetros de autofagia y mitofagia en PBMC de pacientes con trastornos neuropsiquiátricos también supondría un gran avance en cuanto a la traslacionalidad y aplicabilidad de lo estudiado en esta Tesis Doctoral, ya que permitiría comprobar si las alteraciones plasmáticas de estas rutas moleculares pudieran usarse como marcadores tempranos de la patología, de la aproximación de un episodio agudo o de la eficacia de los tratamientos convencionales usados. • La modulación farmacológica del modelo MS+RS y la caracterización del estado mitocondrial, así como la extracción de sus mitocondrias y sus lisosomas sería otro proyecto en el que embarcarse. Permitiría evaluar y comparar el alcance de los dos estresores con respecto al CMS, y quizás determinar qué ocurre en cada uno para que el comportamiento de la vía de la autofagia sea tan diferente en ambos. • Completar los estudios de los modelos doble hit con el análisis del Hp, añadiendo también las determinaciones en mitocondria y lisosomas, permitiría corroborar si es en estos modelos el Hp la estructura más afectada en términos de autofagia y mitofagia. • Profundizar en el papel del astrocito y su regulación de la autofagia, investigando qué implicaciones tiene que la fosforilación hallada específica de ellos esté sujeta Análisis crítico y perspectivas futuras 301 a cambios en función de la exposición a estresores externos. Este estudio podría también extenderse a los modelos doble hit, a los que no se sometió a estudios de IF, para ahondar aún más en el papel de cada tipo celular en los mecanismos alterados vistos en este trabajo. • Repetir la modulación farmacológica de la autofagia en el modelo CMS con la SPD empleando otra vía de administración, ya sea diluida en el agua de bebida o suplementada en su comida, para analizar los cambios que conlleva esta administración en el SNC y a nivel comportamental. La consideración de iniciar el tratamiento semanas después del modelo (no en la última semana, como en este estudio) también sería de gran utilidad para conocer la capacidad de la SPD de mejorar los factores alterados previamente por el modelo. • Por último, investigar la combinación de un antidepresivo o antipsicótico, según el modelo, con un inductor o inhibidor de la autofagia o mitofagia (de acuerdo con la situación generada en cada uno), lo que permitiría comprobar si un tratamiento basado en la autofagia o mitofagia empleado como coadyuvante al tratamiento convencional supondría una modulación más temprana en el SNC que se traduzca en una mejor eficacia. Análisis crítico y perspectivas futuras 302 303 CONCLUSIONES 304 305 Los estudios y análisis en esta Tesis Doctoral han llevado a las siguientes conclusiones: 1) La exposición de ratas Wistar macho a un modelo experimental de depresión Chronic Mild Stress (CMS) da lugar a la alteración de la vía de la autofagia en la corteza frontal y el hipocampo, cuyos principales elementos se encuentran regulados a la baja, si bien la corteza frontal es la más susceptible a los cambios derivados del estrés en términos de autofagia. Esto implica que el estrés modula la vía de forma diferencial y específica en cada región cerebral, y/o la presencia de una temporalidad concreta en la respuesta de cada área. 2) El modelo experimental de depresión modifica la mayoría de los componentes del complejo de clasificación endosómica necesario para la maquinaria de transporte (ESCRT) tanto en la corteza frontal como el hipocampo, aunque es nuevamente la corteza frontal la región más vulnerable a los cambios producidos a consecuencia del estrés. 3) El modelo experimental de depresión conduce a la alteración de la homeostasis lisosomal, mostrando indicios de daño estructural y funcional en los lisosomas, así como su incremento en número. El perfil particular de cambios en cada región apunta a una afectación específica de área, poniendo de manifiesto la perturbación de la autofagia mediada por chaperonas en las dos regiones cerebrales analizadas. Neuronas y microglía serían los principales tipos celulares responsables de estos cambios. 4) La exposición al modelo experimental de depresión provoca el aumento de la masa mitocondrial (tanto neta, como en la microglía), induce la ruta de la mitofagia, así como la síntesis de nuevas mitocondrias (mitogénesis), y dirige la tendencia hacia una mayor fusión mitocondrial en la corteza frontal. En el hipocampo, el modelo experimental de depresión también eleva la masa mitocondrial, dificulta el mecanismo de mitofagia y la mitogénesis muestra indicios de haber sido estimulada. Estos resultados evidencian la regulación diferencial del estrés específica de región cerebral en cuanto al estado mitocondrial, afectado por el modelo experimental en las dos localizaciones. 5) La administración intraperitoneal de espermidina reinstaura niveles proteicos de algunos elementos de la vía de la autofagia, mitofagia y el complejo ESCRT previamente modificados a causa del modelo experimental de Conclusiones 306 depresión en la corteza frontal. En el hipocampo, la espermidina actúa fundamentalmente a nivel génico, donde la combinación del modelo de estrés y la espermidina causa una inducción exponencial de la transcripción de parámetros de autofagia y mitofagia. El efecto de la espermidina a nivel comportamental es menor que en el aspecto bioquímico. 6) El modelo doble hit Poly I:C más aislamiento social, que permite evaluar cambios relacionados con trastornos ocurridos durante el neurodesarrollo, no induce modificaciones sustanciales en las rutas de autofagia y mitofagia, mitogénesis, ni fusión/fisión mitocondrial analizados en extractos citosólicos, aunque reduce la masa mitocondrial (tanto neta, como en la microglía) en la corteza frontal. Igualmente, dicho modelo incrementa la población microglial en la corteza frontal y el hipocampo. 7) Los modelos doble hit basados en la deprivación materna presentan cambios en la vía de la autofagia supeditados al segundo estresor empleado, tanto a nivel de proteína como de expresión génica. 8) El modelo doble hit de deprivación materna más inyección intraperitoneal de lipopolisacárido causa variaciones en algunas proteínas y genes de autofagia en la corteza frontal, aunque es la fosforilación de mTOR su principal diana. Este modelo no desarrolla un fenotipo de tipo depresivo ni ansioso. 9) El modelo doble hit de deprivación materna más restricción de movimiento induce la autofagia a nivel proteico, potenciando también la transcripción génica de algunos de sus elementos en la corteza frontal. Este modelo no produce anhedonia ni comportamientos de tipo ansioso. 10) La exposición a estrés modifica la vía de la autofagia y mitofagia de forma dependiente a la naturaleza, la duración y la intensidad del estresor empleado, ejerciendo una modulación distintiva de acuerdo con la región cerebral. Conclusiones 307 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 308 309 1. Richter-Levin, G. and C. Sandi, Title: "Labels Matter: Is it stress or is it Trauma?". Transl Psychiatry, 2021. 11(1): p. 385. 2. McEwen, B.S. and E. Stellar, Stress and the individual. Mechanisms leading to disease. Arch Intern Med, 1993. 153(18): p. 2093-101. 3. Arango, C., et al., Risk and protective factors for mental disorders beyond genetics: an evidence-based atlas. World Psychiatry, 2021. 20(3): p. 417-436. 4. Selye, H., The stress of life. 1956. 5. Klip, A., Homeostasis - the Walter B. Cannon's Legacy - Applied to the Metabolic Syndrome and the Scientific Enterprise. Physiology (Bethesda), 2016. 31(4): p. 246-7. 6. Lu, S., F. 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