Universidad  Complutense  de  Madrid     Master  en  Ciencias  Odontológicas       Desarrollo del modelo de boca artificial en flujo continuo en el biorreactor Lambda Minifor® Iñaki  Suárez  Soto   Tutor:  Mariano  Sanz  Alonso   Septiembre  2013 Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   2                                   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   3   Índice   1.   Introducción  ................................................................................................................  4   2.   Justificación  ..............................................................................................................  14   3.   Hipótesis  ....................................................................................................................  15   4.   Objetivos  ....................................................................................................................  15   5.   Material  y  Método  ...................................................................................................  16   5.1.   Selección  de  cepas  de  referencia  y  curvas  de  crecimiento  .............................  16   5.1.1.   Cepas  utilizadas  y  condiciones  de  cultivo  ..................................................................  16   5.1.2.   Curvas  de  crecimiento  de  las  cepas  seleccionadas  .................................................  17   5.2.   Biorreactor  de  Flujo  Continuo.  .................................................................................  20   5.2.1.   Medio  de  Cultivo  ....................................................................................................................  20   5.2.2.   El  Biorreactor  .........................................................................................................................  20   5.3.   Formación  del  biofilm  oral  ........................................................................................  23   5.3.1.   Preparación  del  preinóculo  de  las  6  bacterias  seleccionadas  ...........................  24   5.3.2.   Montaje,  esterilización  y  preparación  del  sistema  .................................................  25   5.3.3.   Inserción  del  preinóculo  ....................................................................................................  27   5.4.   Toma  de  Muestras  ........................................................................................................  29   5.5.   Estudio  de  la  formación  del  biofilm  en  la  superficie  seleccionada  ..............  30   5.5.1.   Microscopía  Laser  Confocal  (CLSM)  .............................................................................  30   5.5.2.   Cultivo  Bacteriano  ................................................................................................................  31   5.6.   Análisis  Estadístico  .......................................................................................................  32   6.   Resultados  .................................................................................................................  34   6.1.   Selección  de  cepas  bacterianas  y  viabilidad  de  las  mismas  en  el  sistema  de   flujo  contínuo  Lambda  Minifor®  ........................................................................................  34   6.2.   Análisis  estructural  y  evaluación  de  la  viabilidad  de  los  biofilms  por   microscopía  Laser  Confocal  (CLSM)  ...................................................................................  35   6.3.   Análisis  cuantitativo  de  los  biofilms  mediante  la  técnica  de  cultivo  ...........  42   7.   Discusión  ...................................................................................................................  45   8.   Conclusiones  ............................................................................................................  53   9.   Bibliografía  ...............................................................................................................  54     Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   4   1. Introducción     Las  bacterias  están  ampliamente  distribuidas  en   la  naturaleza,  pudiendo   presentar   dos   fenotipos   de   crecimiento:   células   individuales   de   libre   flotación   (planctónicas)  o  células  agregadas  en  colonias  de  microorganismos  sésiles.  Este   último   se   conoce   comúnmente   como   el   modo   de   crecimiento   en   biopelícula   ó   biofilm  (Donlan,  2002).    La  capacidad  de  formar  biofilm  no  parece  restringirse  a   ningún  grupo  específico  de  bacterias  y,  en   la  actualidad,   se  considera  que,  bajo   condiciones  ambientales  adecuadas  la  inmensa  mayoría  de  estas,  independiente   de  la  especie,  puede  habitar  en  biofilms;  se  estima  que  aproximadamente  el  99%   de  las  células  bacterianas  están  en  la  naturaleza  en  forma  de  biofilm,  y  tan  sólo   1%  vive  en  estado  planctónico   (Costerton   JW  y   col.,   1995;  Donlan  y  Costerton,   2002).   Todas  las  superficies  del  cuerpo  que  están  expuestas  al  medio  ambiente,   ya  sea  mucosas  o  piel,  están  colonizadas  por  bacterias  y  otros  microorganismos   (Costerton  et  al.  1999)(Hall-­‐Stoodley  et  al.  2004);  la  superficie  dental,  por  tanto,   también   se   verá   expuesta   a   ellos.   Estos   seres   vivos   pueden   actuar   de  manera   comensal  o  patógena,   y  ambos   tipos   conviven   (Donlan  &  Costerton  2002).  Hay   un  equilibrio  muy  delicado  entre  las  distintas  bacterias,  por  ello,  cambios  incluso   leves,   pueden   propiciar   el   paso   de   salud   a   enfermedad   (Jenkinson   &   Lamont   2005;   C.   J.   Taylor   &   Mahenthiralingam   2006).   La   superficie   dental   no   es   indiferente  a  esto;  sobre  su  superficie,  el  equilibrio  entre  bacterias,  comensales  y   patógenas,  se  puede  ver  afectado  por  cambios  debidos  a  una  pobre  higiene  oral,   condiciones   sistémicas   como   la   diabetes,   condiciones   ambientales   como   el   tabaco,   etc.  Esto  da   lugar  al   cambio  en  el   volumen  y   composición  del  biofilm  y   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   5   puede   dar   lugar   a   la   iniciación   y   posterior   progresión   de   la   enfermedad   periodontal  (Filoche  et  al.  2009)(Beighton  2009).     Como   en   la  mayoría   de   las   superficies   corporales,   sobre   los   dientes   las   bacterias   se   organizan   en   forma   de   biofilms   (Marsh   2004).   Para   comprender   mejor  que  es  un  biofilm,  la  definición  más  aceptada  es  la  propuesta  por  Donlan  y   Costerton   (Donlan  &   Costerton   2002):   «una   comunidad   bacteriana   inmersa   en   un  medio  líquido,  caracterizada  por  bacterias  que  se  hallan  unidas  a  un  substrato   o   superficie,   o   unas   a   otras,   que   se   encuentran   embebidas   en   una   matriz   extracelular  producida  por  ellas  mismas,  y  que  muestran  un  fenotipo  alterado  en   cuanto   al   grado   de   multiplicación   celular   o   la   expresión   de   sus   genes».   Este   biofilm  oral  está  conformado  por  una  gran  diversidad  de  especies  de  bacterias,   que   están   en   constante   competición   por   la   colonización   de   las   superficies,   haciendo  que  haya  un   constante   cambio  de   los   tipos   y   cantidades  de  bacterias   (Sedlacek   &   Walker   2007).   Esto   hace   que   sea   un   biofilm   “dinámico”,   dependiendo   de   varios   factores   físicos,   químicos…   Se   han   identificado  más   de   800   especies   bacterianas   en   la   cavidad   oral,   de   las   cuales,   en   los   depósitos   de   placa   dental   de   un   individuo   sano   se   han   aislado   y   caracterizado  más   de   300   diferentes.  Se  ha  visto  que  en  1mm  cúbico  de  placa  dental  que  pesa  alrededor  de   1mg  hay  presentes  más  de  108  bacterias  (Filoche  et  al.  2009)  .   La  estructura  del  biofilm  oral  presenta  los  tres  elementos  característicos  de  estas   comunidades   altamente   organizadas:   grandes   colonias   de   bacterias   sésiles   embebidas   en   una   matriz   polimérica   extracelular   y   separadas   unas   de   otras   espacios   intersticiales   huecos.   El   crecimiento   y   maduración   de   la   placa   bacteriana   se   ha   estudiado   en   profundidad,   al   igual   que   su   crecimiento   sobre   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   6   superficies   duras,   como   el   esmalte,   la   dentina,   acrílico,   metal,   etc.   utilizando   diferentes   técnicas   tales   como   microscopía   electrónica,   microscopía   de   laser   confocal,   cultivos   bacterianos,   técnicas   basadas   en   biología   molecular,   etc.,   siendo   uno   de   los   pioneros   Theilade   y   Theilade   (E.   THEILADE  &   J.   THEILADE   1985).  Entre  los  diferentes  ambientes  que  podemos  encontrar  en  la  cavidad  oral,   además   de   las   superficies   como   reconstrucciones,   prótesis   e   implantes,   es   posible   reconocer   una   estructura  muy   similar   de   la   placa   bacteriana   en   sitios   específicos.  Según  un  estudio  de  Siegrist  en  el  año  1991  (Siegrist  et  al.  1991)  se   vio  que  a  pesar  de  las  diferencias  en  rugosidad  superficial,  energía  libre  y  carga,   las  características  más  importantes  en  el  desarrollo  inicial  de  la  placa  bacteriana   en  todos  los  materiales  son  similares.     La  biopelícula  bacteriana  se  desarrollo  de  una   forma  secuencial  y   reproducible   (Aas  et  al.  2005)(Diaz  et  al.  2006)(Kolenbrander  et  al.  1990).     Al   poco   tiempo   de   introducir   un   material  solido  o  tras  finalizar  la  higiene   dental  se  empieza  a  formar  una  capa  de   macromoléculas,   que   se   adhieren   a   la   superficie   del   material   o   dientes   (esmalte,   dentina).   A   ésta   se   le   denomina   “película   adquirida”   (figura   1).   Está   compuesta   principalmente   por   glicoproteínas  (mucinas)  y  anticuerpos.   Algunas   de   estas   moléculas   tienen   estructuras   específicas   que   permiten   que   se   adhieran   sobre   ellas   estructuras     Figura   1.   Representación   de   la   “película   adquirida”.   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   7   bacterianas,   como   polímeros   extracelulares   y   fimbrias   (prolongaciones   bacterianas   de   carácter   lipídico   que   tienen   en   su   extremidad   una   terminación   lectínica  (figura  2).     Figura   2.   Formación   del   biofilm.   Fase   1:   Adsorción   molecular,   y   formación   de   la   película   adquirida.   Fase   2:   Adhesión   bacteriana,   primeros   microorganismos.   Fase   3:   Producción   de   la   matriz  extracelular  y  adhesión  de  más  bacterias,  y  su  multiplicación.  Fase  4:  Adsorción  de  mayor   y  distintas  bacterias,  aumentando  la  complejidad  del  biofilm.       Las   primeras   bacterias   en   adherirse,   los   colonizadores   primarios,   son   principalmente  Streptococcus  sanguis,  S.  oralis  y  S.  mitis,  y  algo  posterior  a  ellos,   especies   de   Actinomyces,   Neisseria,   Prevotella     y   Veillonela   (Diaz   et   al.   2006).   Estos   colonizadores   primarios   son   principalmente   cocos   y   bacilos   gram   positivas,   anaerobias   facultativas.   No   obstante,   dentro   del   grupo   de   los   actinomyces   hay   algunas   especies   que   son   anaerobias   estrictas.   Este   es   el   comienzo  de   la   formación  del  nuevo  biofilm,  y  como  está  descrito,  una  vez  que   una  bacteria   cambia  de  un   estado  planctónico   a   un  biofilm   también   cambia   su   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   8   comportamiento.   Comienzan   a   sintetizar   polímeros   extracelulares   y   a   multiplicarse   a  mayor   velocidad.   Así,   la   placa   bacteriana   va   incrementando   en   grosor,   generándose   unos   gradientes   de   oxigeno,   habiendo   poca   difusión   de   oxigeno  en  las  capas  más  profundas  de  la  masa  bacteriana.   Tras  la  unión  de  estos  a  la  película  adquirida  y  entre  sí,  se  empiezan  a  adherir  los   colonizadores   secundarios,   representado   principalmente   por   Fusobacterium   nucleatum,  bacteria  “puente”  puesto  que  es  de  gran   importancia  en   la  adhesión   de   los   colonizadores   tardíos   (figura   2   y   3).   Los   colonizadores   secundarios   y   tardíos   son  microorganismos   gram   negativos,   anaerobios   estrictos,   que   tienen   poca  habilidad  para  unirse  a  la  película  adquirida,  adhiriéndose  a  estructuras  de   los   colonizadores   primarios   o   sus   productos.   Los   colonizadores   tardíos   presentan   un   alto   potencial   periodonto-­‐patógeno   elevado.   Estos   son   principalmente:   Treponema   denticola,   Porphyromonas   gingivalis   y   Tannerella   forsythia   (Kolenbrander  &  London  1993)(Kolenbrander  et   al.   2002),  miembros   del  complejo  “rojo”  según  la  clasificación  de  Sigmund  Socransky  en  el  año  1998   (Socransky   et   al.   1998).   Hay   un   caso   especial,   el   del   Aggregatibacter   actinomycetemcomitans,    considerado  en  ocasiones  como  colonizador  primario  y   en  otras  como  tardío.   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   9     Figura   3.   Representación   esquemática   de   loa   primeras   fases   de   formación   de   un   biofilm   bacteriano  sobre  una  superficie  oral.     Por   consiguiente,   la   asociación   de   las   bacterias   en   los   biofilms   orales   no   es   aleatoria   sino   que   hay   asociaciones   específicas   entre   especies   bacterianas.   Socransky  y  Haffajee  examinaron  más  de  13.000  muestras  de  placa  subgingival,   de  185  adultos  e  identificaron  seis  grupos  de  especies  bacterianas  asociadas,  que   incluían   colonizadores   iniciales,   como   S.   oralis   con   capacidad   para   fijarse   a   diferentes   receptores   de   la   película   dental   y   proveer   de   receptores   a   especies   como  F.  nucleatum,  intermedios  y  tardíos  (Socransky  et  al.  1998)  (figura  4).   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   10     Figura  4:  Complejos  microbianos  subgingivales,  adaptado  de  Socransky  et  al.  1998     En   la   cavidad   bucal   es   posible   reconocer   una   composición   muy   similar   de   la   placa   bacteriana   en   las   diferentes   localizaciones   (supragingival,   subgingival,   además   de   la   localizada   en   superficies   como   reconstrucciones,   prótesis   e   implantes),   solamente   hallando   variaciones   considerables   en   los   microorganismos  predominantes  detectados,  debidos  en  gran  parte  a  la  estrecha   relación  entre   las  propiedades  del  hábitat  y   los  organismos  que  son  capaces  de   predominar   (Ximénez-­‐Fyvie   et   al.   2000)(Aas   et   al.   2005)(Paster   et   al.   2005)(Marsh   2004).   Al   igual   que   la   influencia   del   oxígeno,   la   disponibilidad   y   variedad   de   productos   utilizados   como   alimentos   es   de   gran   importancia   y   condicionamiento  del  biofilm.     En   bolsas   poco  profundas   los   productos   dietéticos   consumidos  por   el   huésped   son   una   fuente   importante   de   nutrientes,   sobre   todo   para   las   bacterias   del   biofilm  más  supragingival.  No  obstante,  a  medida  que  va  creciendo  el  biofilm,  y   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   11   éste   causando   la   inflamación   del   tejido   periodontal,   con   su   consecuente   incremento  de  la  profundidad  de  la  bolsa  periodontal,  estos  nutrientes  no  llegan   a  las  zonas  más  profundas  del  biofilm,  siendo  la  fuente  principal  de  alimento  los   restos  hidrolizados  de  periodonto  y   sangre.  Las  bacterias  periodontopatógenas   encontradas   en   las   bolsas   periodontales   producen   enzimas   hidrolíticas   que   hidrolizan   macromoléculas   del   huésped   en   aminoácidos.   También,   la   acumulación   de   placa   da   lugar   a   una   reacción   inflamatoria,   que   incrementa   la   secreción  de  fluido  crevicular  y  sangre  generándose  un  ambiente  propicio  para   la   multiplicación   y   crecimiento   de   las   especies   gram   negativas   anaerobias   estrictas  con  gran  potencial  periodontopatógeno.     Por  consiguiente,  cuanto  más  tiempo  pasa  y  más  se  incrementa  el  biofilm,  este  va   cambiando   su   composición   (y   la   proporción   de   diferentes   especies),   de   cocos   gram   positivos   anaerobios   facultativos   hacia   un   biofilm   compuesto   mayoritariamente   por   bacilos   gram   negativos   anaerobios   estrictos.   Esto   es   promovido  por  la  inflamación  ocasionada  por  la  placa  bacteriana,  que  a  su  vez  se   convierte  en  un  incremento  de  la  profundidad  de  la  bolsa  periodontal.   Los  biofilms  orales  son  la  causa  del  desarrollo  de  enfermedades  orales,  como  la   caries   y   las   enfermedades   periodontales   (Löe   et   al.   1965)(Löe   et   al.   1978)   (Baelum   et   al.   1988)(Baelum  &   Fejerskov   1986),   algunas   de   las   enfermedades   más   prevalentes   del   ser   humano.   De   aquí   la   gran   importancia   que   tiene   el   estudio  de  su  formación,  composición,  progresión,  etc.   Más  aún,  hay  estudios  que  han  relacionado  la  enfermedad  periodontal  con  otras   enfermedades   sistémicas,   como   el   parto   prematuro   (Offenbacher   et   al.   1996)(Jarjoura  et  al.  2005)(Goepfert  et  al.  2004)(Jeffcoat  et  al.  2001),  la  diabetes   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   12   (Seppälä   et   al.   1993)(Saremi   et   al.   2004)(G.  W.   G.   Taylor   et   al.   1996)(G.  W.   G.   Taylor   et   al.   1998),   enfermedades   respiratorias   (Scannapieco   et   al.   2003)   (Scannapieco  et   al.   1992)(Scannapieco  1999)  y  enfermedades   cardiovasculares   (Beck   et   al.   2001)(BECK   et   al.   2005)(Desvarieux   et   al.   2005)(Pussinen   et   al.   2004)(Engebretson  et  al.  2005).   Esto   último   hace   de   gran   relevancia   a   las   enfermedades   periodontales,   puesto   que  no  es  ya  solo  por  su  importancia  a  nivel  local  (oral),  sino  a  nivel  sistémico.   Combatir  la  formación  del  biofilm  dental  es  una  de  las  medidas  más  efectiva  para   la  prevención  de   las  enfermedades  periodontales.  Las  bacterias   incluidas  en  un   biofilm   presentan   una   organización   estructural   que   las   hace   resistentes   a   los   mecanismos   de   defensa   del   hospedador.   Los   biofilms,   revestidos   por   la  matriz   extracelular  y  conteniendo  múltiples  microcolonias  bacterianas  en  su  interior,  se   convierten   en   estructuras   demasiado   grandes   como   para   ser   fagocitadas,   reduciendo  la  accesibilidad  del  sistema  inmune.  Por  añadidura,  el  biofilm  provee   de  una  barrera  física  que  aumenta  la  resistencia  de  patógenos  a  las  defensas  del   hospedador,  como  la  opsonización,   lisis  por  complemento  ó  fagocitosis  (Post  et   al.  2004).Aún  así,   los  biofilms  provocan  respuestas   inmunes  celular  y  humoral,   demostradas   por   la   identificación   de   citoquinas   liberadas   por   leucocitos   expuestos   a   biofilm.   Sin   embargo,   debido   a   su   aislamiento   del   entorno   por   la   matriz   y   su   reducido   estado   metabólico,   esta   respuesta   sistémica   es   muy   pequeña  (Donlan  &  Costerton  2002).   Otra  ventaja  de  coexistir  en  biofilm,  extremadamente  importante  desde  el  punto   de  vista  clínico,  es  que  las  bacterias  incluidas  en  biofilms  son  muy  resistentes  a   los   antibióticos,   siendo   capaces   de   sobrevivir   frente   a   concentraciones   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   13   antibióticas  miles  de  veces  mayor  respecto  a  las  bacterias  planctónicas  (Huang  et   al.  2011).                                     Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   14   2. Justificación   Es  necesario  estudiar  el  comportamiento  de  las  bacterias  orales  en  biofilm  para   poder  tratar  eficazmente  la  enfermedad  derivada  de  su  acción.  El  estudio  in  vivo   de   estas   comunidades   conlleva   un   problema   ético,   además   de   complicaciones   metodológicamente  hablando,  por  lo  que  los  diferentes  grupos  de  investigación   de   este   campo   están   desarrollando   modelos   in   vitro   que   permitan   un   estudio   adecuado.  En  éste  trabajo  de  investigación,  el  objetivo  es  conseguir  un  modelo  de   placa   subgingival   en   modalidad   dinámico,   que   reproduzca   con   precisión   las   complejas   condiciones   que   ofrece   el   ambiente   oral   y   evaluar   su   fiabilidad   y   precisión.     Previo   a   este   trabajo,   el   grupo   de   investigación   ha   desarrollado   un  modelo   de   biofilm  subgingiaval   in  vitro,   reproducible  y   sencillo  de  manejar,  en  un  sistema   de   flujo  estático   (Sánchez  et  al.  2011).  Este  modelo  estático  cumple  muchas  de   las  características  necesarias  para  poder  desarrollar  un  biofilm  estático,  pero  le   faltaba   el   dinamismo  que   está  presente   en   la   boca.   Las  bacterias   en   la   cavidad   oral  están  sometidas  al  flujo  salivar  y  crevicular  de  una  manera  constante.  Estos   condicionan   las   propiedades   estructurales   (topográficas   y   arquitectónicas)   y   fisiológicas   del   biofilm   bacteriano   formado   sobre   la   superficie   dental.   Por   consiguiente  los  modelos  estáticos,  necesarios  en  un  principio,  no  son  suficientes   para  simular  estas  condiciones  dadas  en    la  cavidad  oral.  De  hecho  hay  estudios   que   demuestran   que   la   estructura   y   propiedades   del   biofilm   son   diferentes   dependiendo   de   si   se   trata   de   un  modelo   estático   o   dinámico   (Vaughan   et   al.   2010)(Drescher  et  al.  2011).   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   15   3. Hipótesis   Basándonos  en  estudios  anteriores,  vamos  a    desarrollar  un  modelo   in  vitro  de   biofilm  oral  reproducible  y  sencillo  de  manejar,  en  un  sistema  de  flujo  continuo,   inoculando   bacterias   representativas   del   biofilm   oral   en   un   medio   ambiente   físico-­‐químico  similar  al  de  la  cavidad  bucal,  que  será  la  base  para  el  estudio  del   efecto   de   sustancias   antisépticas   sobre   dichas   comunidades,   sin   los   problemas   éticos  que  supone  trabajar  con  pacientes  con  enfermedad.     4. Objetivos   Los  objetivos  son:   1. Seleccionar  bacterias  representantes  de  la  microbiota  del  biofilm  subgival   y  conocer  su  curva  de  crecimiento.   2. Comprobar   que   cada   una   de   las   especies   por   separado   son   capaces   de   crecer  adecuadamente  en  el  sistema  propuesto.   3. Desarrollar  un  biofilm   in  vitro  semejante  al   formado  sobre  los  dientes   in   vivo   sobre   discos   de   hidroxiapatita,   que   simulan   el   esmalte   dental.   Estudiaremos:   3.1. La   estructura   tridimensional   de   los   biofilms   generados   en   el   sistema  mediante  microscopia  laser  confocal.   3.2. La  presencia  de  las  bacterias  usadas  en  el  estudio  y  la  ausencia  de   contaminación  por  otras  bacterias,  y  cuantificaremos  el  total  de  las   mismas  incorporadas  en  el  biofilm  hasta  alcanzar  la  madurez  (1h,   12h,  24h,  48h,  72h  y  96h).       Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   16   5. Material  y  Método   5.1. Selección  de  cepas  de  referencia  y  curvas  de  crecimiento   5.1.1.    Cepas  utilizadas  y  condiciones  de  cultivo   La   formación   de   un   biofilm   con   bacterias   orales   sobre   superficie   de   hidroxiapatita   se   ha   realizado   seleccionando   bacterias   que   representan   a   los   colonizadores  primarios,  secundarios  y  tardíos:  S.  oralis,  A.  naeslundii,  V.  parvula,   F.  nucleatum,  A.  actinomycetemcomitans  y  P.  gingivalis.  Las  cepas  utilizadas  y  las   colecciones  de  cultivo   tipo  a   la  que  pertenecen  se  muestran  en   la  Tabla   1.  Las   cepas  se  mantienen  crio-­‐  conservadas  a  -­‐80ºC.     Tabla  1.-­‐  Cepas  seleccionadas  en  el  estudio  y  colección  de  cultivo  tipo   Cepa   Referencia   Fusobacterium  nucleatum   DSMZ1    20482   Aggregatibacter  actinomycetemcomitans   DSMZ          8324   Veillonella  parvula   NCTC2      11810   Actinomyces  naeslundii   ATCC3      19039   Porphyromonas  gingivalis   ATCC            33277   Streptococcus  oralis   CECT4      907T     1DMS,  Deutsche  Sammlung  von  Mikroorganismen  und  ZellKulturen   2NCTC,  National  Collection  of  Type  Cultures   3ATCC,  American  Type  Cultures  Collection     4CECT,  Colección  Española  de  Cultivos  Tipo     Las  bacterias   se   crecieron   en  placas  de  medio  Agar   Sangre   (Oxoid  no  2;  Oxoid   Ltd.,  Basingstoke,  Inglaterra)  (figura  5),  suplementado  con  un  5%  de  sangre  de   caballo,  Hemina  (5  mg/L)  y  Menadiona  (1  mg/L),  en  condiciones  de  anaeróbicas   (10%  H2,  10%  de  CO2  y  N2  en  equilibrio)  a  37ºC  entre  24-­‐  72h.   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   17     5.1.2. Curvas  de  crecimiento  de  las  cepas  seleccionadas   Con   el   fin   de   estandarizar   las   condiciones   del   estudio  e  inocular  una  concentración  constante   de  cada  una  de  las  cepas  en  todos  los  ensayos,   favoreciendo   así   la   reproducibilidad   del   modelo,   se   emplearon   las   curvas   de   crecimiento   de   cada   bacteria,   que   fueron   realizadas  con  anterioridad,  para  el  desarrollo   del  modelo  de  biofilm  estático  (Sánchez  et  al.  2011).  Estas  curvas    permitieron   relacionar  con  facilidad  los  datos  de  densidad  óptica  (D.O),  tiempo  de  generación   y  unidades  formadoras  de  colonia  (ufc)  por  mililitro  (ufc/mL).   Los   ensayos   se   han   realizado   en   100   mL   del   medio   denominado   BHI2,   que   consiste   en   medio   BHI   [medio   Brain   Heart   Infusion   (Becton,   Dickinson   and   Company;  EE.UU.),  suplementado  con:   • Mucina  (2,5  g/L)   • Extracto  de  levadura  (1,0  g/L)   • Cisteína  (0,1  g/L)   • Bicarbonato  sódico  (2,0  g/L)   • Hemina  (5  mg/L)   •  Menadiona  (1  mg/L)     • 0,25%  de  ácido  glutámico  (v/v)]       Figura  5:  Placa  Agar-­‐Sangre   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   18   Se  preparó  un  preinóculo    a  partir  de  una  colonia  de  un  cultivo  fresco  en  placas   de  medio  Agar  Sangre  suplementado,  que  se   inoculó  en  15  mL  de  medio  BHI2,   incubándolo   en   anaerobiosis   a   37ºC,   durante   24-­‐72h   en   función   de   la   especie   bacteriana.   Entre   100-­‐300   µL   del   preinóculo   se   adicionó   a   100   mL   de   medio   BHI2   fresco,   para   comenzar   la   curva   en   la   fase   “lag”   o   de     aclimatación   (aproximadamente  0,05  de  D.O).   A   determinados   intervalos   de   tiempo,   en   función   de   la   especie   bacteriana,   se   fueron  realizando  medidas  de  la  D.O  a  550  nm.  Las  medidas  de  la  densidad  óptica   se  realizaron  en  un  espectofotómetro  (figura  6),  previamente  calibrado  con  dos   cubetas  de  medio  BHI2,  para  posteriormente  introducir  1  mL  de  cada  una  de  las   bacterias   en   sus   respectivas   cubetas   y   medir   su   densidad   óptica,   siempre   dejando  uno  de  los  controles  en  el  equipo.         Igualmente,  se  fueron  tomando  alícuotas  de  100  µL,  que  fueron  diluidas  de  forma   seriada  en  buffer  PBS  estéril  (por  sus  siglas  en  inglés  Phosphate  Buffered  Saline)   y  sembradas  en  placas  de  Agar  Sangre  suplementado,  siempre  por  duplicado,  por   Figura  6.  Espectofotómetro.   Laboratorio   de   Microbiología   de   la   Facultad   de   Odontología   de   Univ.   Laboratorio   de   Microbiología   de   la   Facultad   de   Odontología   de   Univ.   Complutense  de  Madrid   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   19   el   método   de   siembra   en   superficie.   Las   placas   inoculadas   se   incubaron   en   anaerobiosis  a  37ºC.  Después  de  4  a  7  días  de  incubación,  se  realizó  el  recuento   de  las  UFC  por  placa,  para  determinar  el  número  total  de  UFC/mL.   De  esta  manera  se  relacionaron  el  tiempo  de  crecimiento,  la  medida  de  D.O.  y  las   UFC/mL  correspondientes.   Las  curvas  de  crecimiento  obtenidas  en  el  estudio  previo  (Sánchez  et  al.  2011),  y   que  han  sido  confirmadas  en  el  presente  trabajo,  se  muestran    en  la  figura  7.                   Figura  7:  Curvas  de  crecimiento  utilizados  en  el  modelo  Sánchez  et  al.  2011.   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   20   5.2. Biorreactor  de  Flujo  Continuo.   5.2.1. Medio  de  Cultivo   Hemos  formulado  un  medio  de  cultivo,  que  denominamos  BHI2,  que  contiene   una   proporción   elevada   de   proteínas,   similar   tanto   al   fluido   gingival   crevicular,   principal   fuente   de   nutrientes   de   las   bacterias   subgingivales   in   vivo,  como  la  saliva,  puesto  que  incorpora  mucina.  Ésta  es  fundamental  para   la   formación   de   la   película   adquirida   sobre   la   superficie   en   la   que   se   va   a   generar  el  biofilm.     Este  medio,  el  mismo  con  el  que  hemos  realizado  las  curvas  de  crecimiento,   consiste   en  medio  BHI   [medio  Brain  Heart   Infusion   (Becton,  Dickinson   and   Company;  EE.UU.),  suplementado  con:  mucina  (2,5  g/L),  Extracto  de  levadura   (1,0  g/L),  cisteína  (0,1  g/L),  bicarbonato  sódico  (2,0  g/L),  hemina  (5  mg/L)   menadiona  (1  mg/L)  y  0,25%  de  ácido  glutámico  (v/v)].     5.2.2. El  Biorreactor   Entre   los   diferentes   modelos   de   biofilm   utilizados   para   reproducir   la   placa   dental   hemos  seleccionado  un  modelo   con   un   biorreactor   Lambda   Minifor®   asociado   a   un   sistema  de  flujo  continuo.           Figura   8:  Diferentes  elementos  que   incluye  el   sistema  Lambda  Minifor®.     Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   21   El    sistema  está  compuesto  por:   A. Un   recipiente   de   alimentación   (figura   9)   que   contendrá  el  medio  de  cultivo.   B. El  biorreactor:  Se  trata  de  un  sistema  destinado   al  crecimiento  y  mantenimiento  de   las  bacterias   en  estado  planctónico.  El  cual  se  subdivide  en:     • Vessel  o  frasco  fermentador,  en  el  centro,   en  el  que  realizaremos  la  inoculación  bacteriana.     • Unidad  básica,  que  soporta  al  frasco  fermentador,  y  se  compone  de   una   base   calefactora   con   el   panel   de   control   de   funciones   incorporado  (figura  8).     • Bombas  peristálticas   (de  entrada  y   salida  del   vessel):   sobre  unos   soportes   que   salen   de   la   unidad   básica   se   encuentran   las   dos   bombas   (figura   8).   Estas   se   encargan   de   pasar   el   BHI2   con   contenido   bacteriano   dentro   y   fuera   del   vessel,   desde   el   recipiente  de  alimentación  al   vessel,   y   desde   este   último   hacia  el  Robbins  Device.     El   sistema   de   mezclado   o   bombeo  (figura  10)  que  está   monitorizado  desde  la  unidad   básica,   se   introduce   a   través     Figura  9:  Alimentador     Figura  10:  Sistema  de  Mezclado   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   22   de   la  entrada  principal-­‐central  del  vessel,  que  se  haya  en   la  parte   superior.  Este  sistema  es  de  funcionamiento  distinto.  En  lugar  del   tradicional   agitador  en  hélice,   el  Minifor  utiliza  un  nuevo   sistema   vibrador.   Un   potente   electroimán   que   mueve   el   disco   mezclador   (perforado  en  la  punta,  para  la  salida  del  gas  de  anaerobiosis)  hacia   arriba  y  hacia  abajo.  La  principal  ventaja  es  una  mezcla  eficiente  y   una  aireación  del  medio  de  cultivo.  Mantiene  el  interior  del  vessel   totalmente  aislado.  En  cuanto  a  la  entrada  de  aire,  ésta  se  efectúa  a   través  de  varios  capilares  fijados  en  el  disco  inferior,  en  la  punta  de   este.  Esta  vibración  se  encarga  de  mantener  en  estado  planctónico   las  bacterias.  Se  puede  variar  la  velocidad  de  mezclado,  nosotros  la   mantenemos  constante  a  0,2  MHZ.     • Medidor  de  pO2       • pH-­‐metro  y  Termometro  (Mismo  aparato)     • Tubo  de  entrada,  desde  el  recipientede  alimentación   • Tubo  de  salida,  hacia  el  Robbins  Device   • Tubo  de  plástico  sellado,  desde  un  codo,  para  toma  de  muestras  e   inoculación  de  las  cepas  bacterianas  al  vessel   • Entrada  del  sistema  de  refrigeración     Todos  estos  últimos   instrumentos  (referidos  desde  el  medidor  de  pO2)  acceden   al  interior  del  vessel  por  una  de  las  múltiples  entradas  laterales.  Estas  entradas   están  perfectamente   aisladas  del  medio   ambiente  mediante  un   sistema  aislado   compuesto  por  un  tapón  y  gomas  de  silicona,  que  no  permiten  la  entrada  y  salida   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   23   de  materia  orgánica  e  inorgánica  y  que  permite  el  mantenimiento  de  la  presión   generada  dentro  del  vessel.   C. Un   dispositivo   denominado   “Robbins  device”  (figura  11),   que   contiene   los   discos   del   material   hidroxiapatita,   sobre   el   que   estudiaremos   la   formación   del   biofilm.   Los   discos   tienen   unas   dimensiones  de:  7mm  de  diámetro  y  1,8mm  de  grosor.  El  Robbins  Device   está   soportado   por   una   placa   calefactora   que   mantiene   la   temperatura   constante   de   37ºC,   para   que   las   bacterias   se   mantengan   a   la   misma   temperatura  que  en  el  biorreactor.     D. Aparatos  Accesorios:  Botella  de  anaerobiosis.  Sistema  de  refrigeración  y   eliminación  de  presión.  Recipiente  de  recogida  final,  donde  se  desecha  el   BHI2  que   contiene   las   bacterias   que  no   se  han   adherido   a   los  discos  de   hidroxiapatita.   5.3. Formación  del  biofilm  oral   El   proceso   para   la   formación   del   biofilm   en   el   sistema   se   desarrolla   en   varias   fases,  que  incluyen:   -­‐ Preparación   de   los   preinóculos   de   las   6   bacterias   seleccionadas   en   el   estudio   -­‐ Preparación  del  sistema:  medio  de  cultivo,  montaje  y  autoclavado     Figura  11:  Robbins  Device   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   24   -­‐ Mantenimiento   de   las   bacterias   en   un   estado   planctónico   y   en   fase   exponencial   de   crecimiento   en   el   vessel   en   unas   condiciones   físico-­‐ químicas  idóneas.     -­‐ Una   vez   alcanzado   este   nivel,   se   acciona   el   sistema   de   flujo   dinámico,   fluyendo  así  el  medio  de  cultivo  con  las  bacterias  hasta  el  Robbin  device,   donde  se  encuentran  los  discos  de  hidroxiapatita  en  los  que  se  formará  en   biofilm.     5.3.1. Preparación  del  preinóculo  de  las  6  bacterias  seleccionadas   Partiremos  de   las   cepas   seleccionadas,  descritas   en   la  Tabla  1,   conservadas  a   -­‐ 80ºC.  Realizamos  un  cultivo  en  placas  de  agar  sangre  a  partir  de  las  criobolas  de   las  cepas  mencionadas  e   incubaremos  en  jarras  de  anaerobiosis  (10%  H2,  10%   de  CO2  y  N2  en  equilibrio)  (figura  12)  a  37ºC  entre  24-­‐  72h.    Llevamos   las   muestras   a   la   campana   de   flujo   (figura   13),   cerca   de   un   mechero   bunsen,   para   obtener   condiciones   de   esterilidad   optimas.   Preparamos   tubos   de   plástico   estériles   de   50   mL   de   capacidad   (falcons)   con   15ml   de   BHI2.   Inocularemos   cada   una   de   las   bacterias   individualmente   y   siempre   se   acompañaran   de   un   tubo   que   contenga   solo   medio   de   cultivo   como   control.  Para  ello,  extraemos  una  o  dos  colonias  de  las  placas,  ayudados  por  las   asas   de   siembra   e   introduciremos   la   muestra   en   uno   de   los   falcons,   con   movimientos  de  agitación  para  desprender  bien  la  muestra.  Cerramos  el  falcon,   lo   vorteamos,   y   acompañado   del   falcon   control   de   nuevo   lo   incubaremos   en   condiciones   de   anaerobiosis,   a   37ºC,   durante   12   horas.   Pasadas   estas   horas,     Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   25   sacamos  los  falcons,  tomamos  una  muestra  de  cada  falcon,   incluido  el  control  y   realizamos   una   medida   por   espectrofotometría.   Calibraremos   en   0   el   espectrofotómetro   con  el   control   y   a   continuación   tomando   las  medidas  de   las   muestras.   Calculamos   las   ufc/mL   mediante   la   medida   de   espectrofotometría   obtenida   basándonos   en   las   curvas   de   crecimiento,   ya   calculadas   con   anterioridad  (figura  7).       Figura  13:  Campana  de  flujo  y  material  en  esterilidad     5.3.2. Montaje,  esterilización  y  preparación  del  sistema     Se   procede   al  montaje   del   equipo.   En   primer   lugar   se   prepara   el  medio   de   cultivo.  Este  es  el  BHI2  ya  descrito  anteriormente.  A  continuación,  se  conecta   el   recipiente   de   alimentación   al   vessel,   vía   tubos   de   plástico.   A   su   vez   se   conecta   éste   último,   también   vía   tubos   de   plástico   al   Robbins   Device,   que   contiene  los  discos  de  hidroxiapatita  (previamente  limpiados).  Introducido  al   vessel  central  también  se  encuentran  el  medidor  de  pH  y  de  temperatura,  el   medidor  de  pO2  y  la  parte  final  del  sistema  de  refrigeración.  La  medición  de   pH   se   hace   por   medio   de   un   electrodo,   que   se   combina   con   un   sensor   de   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   26   temperatura.   La   calibración  del   electrodo  es   semiautomática.  Pero   se  ha  de   hacer  previo   a   la   esterilización  del  material.  Hay  que  hacer  una   calibración   con  un  medio  básico  y  ácido.  Por  la  parte  superior  se  introduce  el  sistema  de   mezclado.  Una  vez  ensambladas  todas   las  partes  del  equipo,  está  preparado   para   la   esterilización,   exceptuando   la   base   calefactora   con   el   panel   de   funciones  y  mezclado,  el  sistema  de  refrigeración,  la  botella  de  anaerobiosis  y   el  recipiente  de  recogida  final.   Todo   esto   es   traspasado   al   autoclave,   donde   será   sometido,   durante   21   minutos,  120°C  y  1,0  atmosfera  de  presión  a  un  proceso  de  esterilización  por     calor  húmedo.     Una   vez   autoclavado   se   pasa   todo   el   material   a   la   campana   de   flujo   y   se   procede   a   la   adición   del   ácido   glutámico,   hidróxido   sódico   y   hemina   menadiona   en   el   recipiente   de   alimentación.   Se   procede   al   cierre   y   aislamiento  total  del  sistema.     Se   pasa   al  montaje   en   el   “sistema   fijo”.   Se   coloca   el   vessel   sobre   la   unidad   básica,  eje  central  del  sistema.  Se  conecta  el   tubo  de  plástico  que  conecta  el   vessel   con   el   recipiente   de   alimentación   al   sistema   de   bombeo   de   entrada   (bomba  peristáltica)  al  vessel  (también  conocido  como  frasco  fermentador).   Se  activa  y  se  espera  hasta  que  se  llene  el   frasco  fermentador  a  220ml.  Ésta   cantidad   se  va  a  mantener   constante  durante   todo  el   experimento.  Una  vez   esté   con   ésta   cantidad   se   procede   al   ajuste   del   medidor   de   pO2.   Para   ello   simplemente  se  conecta  el  cable   indicado,  que  sale  de   la  Unidad  Básica,  a   la   terminación  externa  del  medidor  y  se  realiza  una  calibración  semiautomática,   ayudado  por  el  panel  de  control.  La  regulación  del  oxígeno  disuelto  se  obtiene   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   27   con  la  variación  del  caudal  del  aire.  Finalizado  esto,  se  procede  a  la  inserción,   vía  tubo  de  plástico,  a  través  del  vástago  del  sistema  del  gas  de  anaerobiosis  y   activación   del   sistema   de   mezclado.   Este   viene   desde   una   botella   de   anaerobiosis  que  contiene  el  gas,  compuesto  por:  10%  H2,  10%  de  CO2  y  N2   en   equilibrio.   El   caudal   de   aire   puede   ser   programado   entre   0   y   5l/min   en   etapas   de   0,01   L.   Se   utiliza   un   preciso   caudalímetro   másico   para   gas.   La   medición   es   independiente   de   la   variación   de   presión   de   oxigeno   y   temperatura  del  aire.  Una  válvula   (figura   14)  proporcional  ajusta  el   caudal   del  aire.  Ésta  válvula  se  haya  en  la  punta  del  sistema  de  mezclado,  justo  por   debajo   del   disco   de   mezclado.   Después   comprobamos   que   la   temperatura   dentro  del  biorreactor  es  de  37ºC  y  el    pH  es  de  7.2  (7.0-­‐7.5)  y  se  mantiene   constante.  Cuando  se  ve  que  los  niveles  de  pO2  son  de  0  o  cercanos  a  este,  se   activa   el   sistema   de   refrigeración   y   regulación  de  presión,  para  evitar   exceso  de   temperatura   y   presión   originado   dentro   del   vaso  fermentador.  Una  vez,  comprobado  que   todas   las  condiciones  son  estables,  se  pasa  a   la  inserción  del  preinóculo.     5.3.3. Inserción  del  preinóculo   Una   vez   que   se   ha   confirmado   que   las   6   cepas   bacterianas   están   en   las   condiciones  de   crecimiento  apropiadas,   y   se  ha   creado  un  ambiente   idóneo   para  el  crecimiento  de  las  mismas,  se  realiza  un  preparado  con  un  mililitro  de   cada   uno   de   los   preinóculos.   Se   adicionarán   al   vessel   en   condiciones   de     Figura  14:  Disco  Mezclado   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   28   esterilidad.   La   cantidad   de   BHI2   de   220  mL   se  mantiene   constante   todo   el   experimento,    gracias  a  las  bombas  peristálticas.   5.3.3.1. Adición  bacteriana  individualmente   Antes   de   realizar   la   inoculación   de   las   seis   bacterias   conjuntamente,   comprobamos   individualmente   que   cada   especie   bacteriana   era   capaz   de   crecer  y  multiplicarse  en  el  medio  (BHI2)  en  el  frasco  fermentador.     Para   ello,   insertamos   individualmente   los   distintos   preinóculos.   Dejamos   la   bacteria   multiplicarse   durante   12   horas.   Para   esto,   el   sistema   de   flujo   (bombas  peristálticas)  se  mantuvo  inactivo.  Esto  se  debe  a  que  las  bacterias   necesitan  un  tiempo  de  adaptación,  o  aclimatación,  al  medio  nuevo  al  que  son   insertadas,   antes   de   empezar   a   multiplicarse   y   encontrarse   en   la   fase   exponencial.     A  las  12  horas  se  tomaron  alícuotas  de  100  µL,  que  fueron  diluidas  de  forma   seriada   en   buffer   PBS   estéril   y   sembradas   en   placas   de   Agar   Sangre   suplementado,   siempre   por   duplicado,   por   el   método   de   siembra   en   superficie.   Las   placas   inoculadas   se   incubaron   en   anaerobiosis   a   37ºC.   Después   de   4   a   7   días   de   incubación,   se   realizó   el   recuento   de   las   ufc   por   placa,  para  determinar  el  número  total  de  ufc/mL.   5.3.3.2. Adición  de  las  6  cepas  bacterianas  al  vessel  central   Una  vez  comprobado  que  cada  bacteria  se  multiplicaba  independientemente   en  el  biorreactor,  se  pasó  a  la  inoculación  de  todas  las  bacterias  en  conjunto.   Se   utilizó   la  misma   cantidad   de   preinóculo   que   el   que   se   utilizó   durante   la   comprobación  de  bacterias   individualmente,  1ml  por  bacteria.  Se  esperó  12   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   29   horas  a  que  se  completara  la  fase  de  adaptación  y  se  inició  el  sistema  de  flujo   de  continuo.  Mediante  la  activación  de  las  bombas  peristálticas  de  entrada  y   de   salida,   a   una   velocidad  que   imita   el   flujo   salival   no   estimulado,   en   boca.   Este  es  30ml/h  {Blanc:2013ui}.    El  BHI2  es  transportado  desde  una  botella  de   5litros,   a   través   del   sistema  de   bombeo,   donde   entra   en   el   biorreactor   a   la   velocidad  de  30ml/h.  Una  vez  aquí  se  mezcla  con   las  bacterias  mediante  un   sistema   de   “mezclado”.   Del   Biorreactor   sale   a   una   velocidad   idéntica   de   entrada   pasando   por   un   tubo   de   silicona   estéril   hasta   llegar   al   “Robbin   Device”,   donde   se   encuentran   los  discos  de  hidroxiapatita.  Una  vez  pasan  a   través  del  Robbin  Device,  las  bacterias  que  no  se  han  adherido  a  los  discos  y   el  BHI2  restante  continúan  por  otro  tubo  de  silicona  estéril  al  otro  extremo   del  Robbin  Device  y  salen  al  exterior,  donde  caen  a  un  vaso  recolector.   Una   vez   que   haya   completado   el   tiempo   de   exposición   de   los   discos   de   hidroxiapatita  al  BHI2  con  las  6  bacterias  se  para  el  sistema.     5.4. Toma  de  Muestras   Una  vez   finalizado  el   tiempo  de  exposición  se  separa  el  Robbins  device,  con   sus  discos  de  hidroxiapatita,  del  resto  del  sistema  (figura  15).  El  tiempo  de   exposición   bacteriana   será   de   1,   12,   24,   48,   72   y   96   horas.   Para   esto   se   procede  al  aislamiento  de  ambos  extremos  del  Robbins  Device,  pinzando  los   tubos  de  plástico  de  entrada  y  salida,  que  se  lleva  a  la  cabina  de  flujo  laminar,   donde,   en   condiciones  de   esterilidad   se   retiran   los   discos   de  hidroxiapatita   con   el   biofilm   formado   para   posterior   análisis,   ya   sea   por   cultivo   o   microscopía.   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   30     Figura  15:  Vista  Interna  y  Externa  del  Robbins  Device     5.5. Estudio  de  la  formación  del  biofilm  en  la  superficie  seleccionada   5.5.1. Microscopía  Laser  Confocal  (CLSM)   Previamente  al  estudio  por  microscopía  los  discos  son  extraídos  y  lavados  en  2   mL  de  PBS  estéril  tres  veces,  durante  10  segundos,  para  retirar  las  bacterias  no   adheridas.   A   continuación,   se   tiñó   con   el   Kit   LIVE/DEAD   BacLight   Bacterial   Viability   Kit   (Molecular   Probes,   Eugene,   OR,   EE.UU.),   que   proporciona   una   combinación  de  dos  fluorocromos:  “SYTO  9  green-­‐fluorescent  nucleic  acid  stain”   y   “Ioduro  de  Propidio  red-­‐fluorescent  nucleic  acid  stain”,  que  se  diferencian  en   sus   características   espectrales   y   en   su   capacidad   de   penetración   en   las   células   bacterianas.  El   fluorocromo  SYTO  9  es  capaz  de  penetrar  en  todas  las  bacterias   presentes   en   una   muestra,   tanto   con   las   membranas   celulares   intactas   como   dañadas.   En   contraste,   el   Ioduro   de   Propidio   penetra   únicamente   en   bacterias   con  membranas  dañadas,  causando  una  reducción  de  la  fluorescencia  del  SYTO  9   cuando   los   dos   fluorocromos   están   presentes   en   la  misma   célula.   Por   tanto,   la   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   31   combinación   adecuada   de   ambos   fluorocromos,   permite   marcar   las   células   bacterianas   de   una   muestra,   de   forma   que   las   bacterias   con   sus   membranas   celulares   intactas   presentarán   fluorescencia   verde,   mientras   que   las   bacterias   con   la   membrana   dañada   emitirán   fluorescencia   roja.   La   máxima   excitación/emisión   para   estos   fluorocromos   es   de   aproximadamente   480/500   nm  para  SYTO  9  y  490/635  nm  para  Ioduro  de  Propidio.   Para   obtener   la   señal   óptima   de   fluorescencia   se   ha   puesto   a   punto   la   técnica   previamente,  utilizando  diferentes  ratios  de  concentración  de  los  fluorocromos  y   diferentes   tiempos   de   tinción.   Se   ha   seleccionado   el   ratio   1:1   y   el   tiempo   de   tinción  de  9±1  min.     5.5.2. Cultivo  Bacteriano   Los  discos  de  hidroxiapatita  son  extraídos  y  lavados  en  2  mL  de  PBS  estéril  tres   veces,   durante   10   segundos,   para   retirar   las   bacterias   no   adheridas.   A   continuación,  se  introducirán  en  un  1  mL  de  PBS,  sometiéndose  3  min  a  agitación   por  vortex  para  disgregar  el  biofilm.     A   continuación,   se   tomaron   alícuotas   de   100   µL,   que   fueron   diluidas   de   forma   seriada   en   buffer   PBS   estéril   y   sembradas   en   placas   de   Agar   Sangre   suplementado,   siempre  por  duplicado,  por  el  método  de  siembra  en  superficie.   Las  placas  inoculadas  se  incubaron  en  anaerobiosis  a  37ºC.  Después  de  4  a  7  días   de   incubación,   se   realizó   el   recuento   de   las   UFC   por   placa,   para   determinar   el   número  total  de  UFC/mL.       Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   32   5.6. Análisis  Estadístico   Para   estudiar   le   evolución   temporal   del   biofilm   se   transforman   las   unidades   ufc/ml   de   cada   ensayo   en   logaritmos.   Posteriormente   es   hallada   la  media   por   especie.   Son   representados   en   gráficas   lineales.   Para   el   análisis   de   ésta   concentración   bacteriana   utilizamos   contrastes   de   hipótesis   para   los   distintos   tiempos  de  incubación.     Previo  a  este  se  realizan   las  pruebas  de  normalidad  por   tiempos  de   incubación   de   cada   una   de   las   bacterias.   Debido   al   escaso   tamaño   de   muestra,   que   imposibilita   el   cálculo   de   la   prueba   de   kolmogorov,   y   a   que   incluso   para   los   tiempos   de   incubación   en   los   que   si   puede   realizarse   se   obtiene   falta   de   normalidad   en   muchos,   se   realizan   los   contrastes   mediante   pruebas   no   paramétricas.  Aunque  se  dan  casos  en  los  que  a  partir  de  los  test  de  normalidad   se   podrían   considerar   muestras   normales,   las   escasas   observaciones   e   imputación  de  valores  hace  que  optemos  por  test  no  paramétricos  en  todos   los   casos.   Por   consiguiente,   el   contraste   de   hipótesis   utilizado   es   el   Contraste   de   Friedman.     Los   datos,   en   el   caso   de   la   altura   de   los   biofilms,   fueron   calculados   como   micrómetros  (μm)  y  como  porcentaje  (%)  en  el  caso  de  la  vitalidad  celular.  Este   ultimo  a  partir  del  área  ocupada  por  las  células  vivas  y  las  muertas  obtenido  por   el  análisis  de  las  micrografías  del  CLSM  mediante  el  software  Metamorph®  7.6.   Se  realizó  un  análisis  a  nivel  de  experimento  para  cada  parámetro  de  estudio  (n  =   9).  Se  aplicó  el  test  de  Shapiro-­‐Wilk  para  cada  variable  y  los  datos  se  expresaron   como  medias   y   desviaciones   estándar   (DS),   además   se   han   utilizado   Box-­‐plots   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   33   para  la  presentación  gráfica  de  los  datos.  Para  el  contraste  de  tanto  la  vitalidad,   como  altura  del  biofilm  utilizamos  cómo  contraste  el  Test  de  Wilcoxon.   Se  realizó  la  media  de  la  proporción  de  bacterias/volumen  de  biofilm  a  las  48h  y   72h  y  se  aplico  un  estadístico  de  contraste,  el  test  de  Wilcoxon,  para  ver  si  había   diferencias  estadísticamente  significativas,  entre  los  biofilms  generados.   Se  empleó  el  software  IBM®  SPSS®  19.0  para  todos  los  análisis  de  datos.                                     Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   34   6. Resultados   6.1. Selección   de   cepas   bacterianas   y   viabilidad   de   las   mismas   en   el   sistema   de   flujo  contínuo  Lambda  Minifor®   En   primer   lugar,   se   procedió   a   la   selección   de   las   cepas   más   idóneas   para   el   desarrollo   de   un   modelo   de   biofilm   subgingival.   Basándonos   en   modelos   anteriormente   desarrollados   por   el   equipo   de   investigación   (Sánchez   et   al.   2011){Blanc:2013ui},  se  seleccionaron  las  cepas  detalladas  en  la  Tabla  1  ya  que   representan  a   colonizadores  primarios   (S.  oralis  y  A.  naeslundii),   tempranos   (V.   parvula),   secundarios   (F.   nucleatum)   y   tardíos   (P.   gingivalis   y   A.   actinomycetemcomitans).   Para   estandarizar   las   condiciones   del   estudio   e   inocular   una   concentración   constante   de   cada   una   de   las   cepas   en   todos   los   ensayos,   y   favorecer   así   la   reproducibilidad   del   modelo,   se   comprobó   el   número   de   bacterias   que   se   obtenían  tras   incubar  cada  una  de   las  especies  seleccionadas  en  15  ml  de  BHI2   durante  12  h,  en  condiciones  de  anaerobiosis  y  37ºC  de  temperatura,  tanto  por   espectrofotometría   (se   emplearon   las   curvas   de   crecimiento   de   cada   bacteria   (figura   7),   que     permitieron   relacionar   con   facilidad   los   datos   de   densidad   óptica,   tiempo  de   generación   y   ufc/mL)   como  por   cultivo.   El   ensayo   se   repitió   por   triplicado,   en   días   distintos   y   con   diferentes   preinóculos   de   partida.   El   resultado  fue  del  orden  de  109    ufc/mL  para  todas  las  especies  bacterianas.     Una  vez  estandarizada  las  condiciones  de  inoculación  (1  mL  de  cada  una  de  las   bacterias   seleccionadas   a   109   ufc/mL),   fueron   realizados   experimentos   individuales   con   cada   bacteria   en   el   sistema   de   flujo   Lambda   Minifor®.   Se   inoculó   1   mL   de   cada   preinóculo   (109   ufc/mL)   de   forma   independiente,   en   condiciones  de  esterilidad  descritas  en  el  apartado  de  materiales  y  métodos,    en   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   35   el  vessel  que  contenía  previamente  220  mL  aproximadamente  de  medio  BHI2,  a   37ºC,  en  condiciones  de  anaerobiosis  y  en  constante  agitación.  Igualmente,  estos   ensayos   se   realizaron   por   triplicado,   en   días   distintos.   Los   inóculos   se   mantuvieron  12  h.   A  las  12  horas,  se  tomó  la  muestra  y  se  hicieron  comprobaciones  densitométricas   y   de   cultivo.   Todas   las   pruebas   densitométricas   y   de   cultivo   corroboraron   el   crecimiento  individual  de  las  bacterias  en  el  frasco  fermentador.  Los  resultados   se  presentan  en  la  Tabla  2.   Tabla   2:  Unidades   fromadoras  de  colonias  por  mililitro  (ufc/mL)  obtenidas  de  cada  una  de   las   cepas  utilizadas  de  forma  individual  en  el  sistema  de  flujo  continuo  Lambda  Minifor®.   Bacteria   UFC/ml   Aggregatibacter  actinomyctemcomitans   8,6x106  ±1x106   Porphyromona  gingivalis   1,8x107±0,26x107   Fusobacterium  nucleatum   1,25x1012±0,5x1012   Veillonella  parvula   1,2x109±0,32x109   Actinomyces  naeslundii   8,24x1010±0,25x1010   Streptococcus  oralis   3,2x1012±1x1012       6.2. Análisis   estructural   y   evaluación   de   la   viabilidad   de   los   biofilms   por   microscopía  Laser  Confocal  (CLSM)     La  morfogénesis  de   los  biofilms  de  cada  disco   fueron  examinados  por  CLSM  en   cada   uno   de   los   tiempos   (1,   12,   24,   48,   72   y   96   h).   El   análisis   se   centró   en   el   estudio  de  la  arquitectura  en  tres  dimensiones  y  la  vitalidad  que  presentaban  las   bacterias  a  cada  tiempo  estudiado.     En   las   primeras   12   h   tras   la   inoculación   se   observa   una   capa   dispersa   de   bacterias   adheridas   a   las   tres   superficies   de   estudio.   Las   células   se   organizan   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   36   como  células   individuales,   como    cadenas  de    estreptococos,  o  como  agregados   multicelulares;   también   pueden   reconocerse   los   bacilos   en   forma   de   huso   correspondientes  a    F.  nucleatum.   A   las   24   horas   de   desarrollo,   la   complejidad   y   el   tamaño   de   las   estructuras   aumentan  considerablemente.  En  la  superficie  de  hidroxiapatita  se  observa  una   capa  de  células  agrupadas  en  microcolonias  o  clusters   formando  prominencias.     Esta  estructura  evoluciona  en  las  siguientes  24  horas  hacia  la  estructura  típica  de   un   biofilm,   con   capas   de   bacterias   organizadas   como   capas   homogéneas   de   células   combinadas   con   grupos   de   bacterias   apiladas   en   forma   de   “setas”   o   “torres”,   mostrando   canales   en   el   interior   de   la   estructura.   Esta   estructura   se   mantendrá  hasta  las  96  horas  de  incubación.  Esto  nos  hace  pensar  que  entre  las   48  y  las  72  horas  de  incubación,  el  biofilm  habría  podido  alcanzar  la  madurez.  La   figura  16  muestra  un  ejemplo  de  biofilm  a  las  48h  y  72  h  de  desarrollo.  En  verde   se  observan  las  bacterias  vivas  y  en  rojo  las  bacterias  muertas.  Visualmente  no  se   observan  grandes  diferencias  en  los  biofilms  a  estos  tiempos  de  incubación.   A)   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   37     B)   Figura  16:  Micrografías  obtenidas  por  microscopía  laser  confocal  (  CLSM:  A)  Biofilm  de  48h  de   incubación  y  B)  Biofilm  de  72h  de  incubación.  Objetivo  60x  en  ambos  casos.     Antes  de  comenzar  nuestro  análisis  realizaremos  un  estudio  en  profundidad  de   los   datos,   observando   el   comportamiento   de   los   mismos,   viendo   si   cumplen   hipótesis   importantes   que   nos   marcarán   el   resto   del   estudio,   así     como   adecuarlos  y  simplificarlos  de  tal  forma  que  podamos  trabajar  de  forma  cómoda   y  rigurosa  sobre  ellos.  Para  ello  utilizaremos  distintas  técnicas  estadísticas  como,   contrastes  de  hipótesis  para  pruebas  de  normalidad  o  pruebas  de  homogeneidad   de   varianzas   si   fuera   necesario.   Mostraremos   también   distintas   medidas   de   interés   para   la   investigación,   como   pueden   ser   medias   o   varianzas   de   las   distintas  muestras;  a  través  de  tablas  que  nos  mostrarán  los  valores  descriptivos   de   las   distintas   variables.   Además   de   visualizar   de   forma   gráfica   el   comportamiento  de  los  datos  para  así  intentar  tratarlos  de  la  forma  más  rigurosa   posible.   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   38   La  Tabla   3   muestra   el   análisis   estadístico   descriptivo   de   los   datos   obtenidos   para   los  biofilms  de  48  y  72  horas  de   incubación  en  cuanto  a  altura  y  vitalidad   alcanzada.     Tabla  3:  Estadística  descriptiva  de  la  altura  y  vitalidad  de  los  biofilms  de  48  y  72  horas  de  incubación   formados  en  el  sistema  Lambda  Minifor®   Tº  de  incubación  (h)   Altura   (μm)   Vitalidad   Tº  de  incubación  (h)   Altura   (μm)   Vitalidad   48     Media   25,33   0,5285   7 2     Media   21,11   0,5218   Interval o   de   confianz a  para   la   media   al   95%   Límite   inferior   21,77   0,3820   Interval o   de   confianz a  para   la   media   al   95%   Límite   inferior   16,98   0,3123   Límite   superior   28,90   0,6749   Límite   superior   25,24   0,7314   Media   recortada   al   5%   25,54   0,5467   Media   recortada   al   5%   21,29   0,5229   Mediana   29,00   0,5682   Mediana   21,00   0,6148   Varianza   21,500   363,121   Varianza   28,861   743,160   Desv.  típ.   4,637   0,19056   Desv.  típ.   5,372   0,27261   Mínimo   18   0,04   Mínimo   11   0,03   Máximo   29   0,69   Máximo   28   0,99   Rango   11   0,64   Rango   17   0,96   Amplitud   intercuartil   8   0,11   Amplitud   intercuartil   8   0,31   Asimetría   -­‐,689   -­‐2,481   Asimetría   -­‐,782   -­‐,175   Curtosis   -­‐1,405   6,793   Curtosis   ,224   ,769     Fijándonos  en  las  alturas  alcanzadas  (μm)  por  los  biofilms  en  el  sistema  de  flujo   continuo   Lambda   Minifor®   el   biofilm   de   48   h   presenta   un   espesor   medio   de   25,33±3,56μm  y  de  21,11±4,13μm  los  biofilms  de  72h  (Tabla  3;  figura  17  y  19). Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   39     Figura   17:  Representación  en  Boxplot  de   la    altura  alcanzada  por   los  Biofilms   de  48h  y  72h   Así   mismo,   la   vitalidad   (ratio   vivas/muertas)   es   de   52,85±14,65%   para   los   biofilms  de  48  h  y  de  52,18±20,95%  para  los  biofilms  de  72  h  (Tabla  3;   figura   18  y  19).       Figura  18:  :  Representación  en  Boxplot  de  la    vitalidad  en  los  Biofilms  de  48h  y  72h   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   40   No   se   encontraron   diferencias   estadísticamente   significativas   al   estudiar   la   altura  alcanzada  y  la  vitalidad  al  comparar  los  biofilms  de  48h  y  72h  (P<0,05).       Figura   19:   Representación   en   Boxplot   de   la   Vitalidad   y   Altura   en   los   biofilms  de  48h  y  72h     La  Tabla  4  refleja  el  número  de  planos  que  ocupa  el  biofilm  (siendo  cada  plano   correspondiente   a   1   µm),   la   vitalidad   total   del   biofilm,   el   plano   de   máxima   vitalidad   y   el   porcentaje   de   vitalidad   en   dicho   plano.   Podemos   ver   que   la   distribución   de   los   planos   de   máxima   vitalidad   es   muy   homogénea   para   los   biofilms   de   48h,   en   cambio   para   los   de   72h   la   distribución   es   bastante   heterogénea.   El   plano   con   mayor   vitalidad   para   los   biofilms   de   48h   se   suele   encontrar   en   las   capas  más   profundas,   y   este   plano,   suele   tener   una   vitalidad   muy  alta.     Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   41   Tabla  4:  Representación  tabulada  de  la  altura  y  vitalidad  de  los  biofilms  de  48  y  72h         La  figura  20  da  información  del  porcentaje  de  volumen  del  biofilm  ocupado  por   bacterias.   Se  observa  que   la   concentración  es  mayor  en  el  biofilm  de  72h,   y   se   puede  añadir  que  estas  diferencias  son  estadísticamente  significativas  (p<0,05)     Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   42     Figura  20:  Boxplot  de  la  proporción  de  bacterias/volumen  en  los  biofilms  de  48h  y  72h     6.3. Análisis  cuantitativo  de  los  biofilms  mediante  la  técnica  de  cultivo   Mediante  la  técnica  de  cultivo,  se  pudo  observar  la  presencia  de  las  seis  bacterias   desde  el  biofilm  de  1  h    de  incubación  (figura  21).   Los   cultivos   realizados   a   1,   12,   24,   48,   72   y   96   h   nos  muestran   la   cinética   de   crecimiento  de  cada  una  de  las  bacterias  en  el  interior  del  biofilm  (figura  22).       Figura  21:  Representación  del  logaritmo  de  las  ufc/ml  de  cada  una  de  las  especies  bacterianas  a   los  diferentes   tiempos  de   incubación  estudiados.   So:  S.  oralis;  Vp:  V.  parvula;  An:  A  naeslundii;   Fn:  F.  nucleatum;  Pg:  P.  gingivalis;  Aa:  A.  Actinomycetemcomitans.   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   43   En   la   primera  hora  de   incubación   se   observa   ya   la   presencia  de   las   6   especies   bacterianas,   con   un   mayor   número   del   colonizador     primario   S.   oralis.   Sorprendentemente,   se   observa   un   número   importante   de   los   colonizadores   tardíos  P.  gingivalis  y  A.  actinomycetemcomitans  (figura  22).     Al  analizar  el  número  de  bacterias  a  las  12  horas  se  observa  que,  mientras  que  S.   oralis   no   aumenta   significativamente   en   número,   si   lo   hacen   los   colonizadores   primarios   V.   parvula   y   A.   naeslundii.   Igualmente   se   observa   un   aumento   considerable  de  la  bacteria  F.  nucleatum.  En  este  caso,  los  colonizadores  tardíos   no  aumentas  significativamente.       Después   de   24   horas,   destaca   el   aumento   de   los   colonizadores   tardíos   P.   gingivalis  y  A.  actinomycetemcomitans,  junto  con  la  bacteria  S.oralis.     A  las  48  horas  de  incubación,  se  observa  un  descenso  en  el  número  de  bacterias   viables  para   la  mayoría  de   las  bacterias   implicadas  en   la   formación  del  biofilm,   que  continúa  a  las  72  h  de  incubación.     A  las  96  h  todas  las  especies,  a  excepción  de  S.  oralis  y  V.  parvula,  presentan  un   crecimiento,  destacando  el  de  P.  gingivalis  y  también,  en  menor  medida  el  de  F.   nucleatum  y  A.  actinomycetemcomitans.  También  destacando  por  el  lado  opuesto,   el  descenso  de  V.  parvula.   Podemos   observar   que,   estudiando   la   evolución   temporal   del   número   de   bacterias,   de   forma   conjunta,   la   tendencia   al   crecimiento   bacteriano   es   más   marcada   hasta   las   24h,   estabilizándose   para   el   resto   de   los   tiempos   de   incubación  (figura  22).       Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   44     Figura  22:  Representación  de  la  evolución  temporal  de  los  logaritmo  de  las  ufc/ml  de  cada  una   de  las  especies  bacterianas  a  los  diferentes  tiempos  de  incubación  estudiados.  So:  S.  oralis;  Vp:  V.   parvula;  An:  A  naeslundii;  Fn:  F.  nucleatum;  Pg:  P.  gingivalis;  Aa:  A.  Actinomycetemcomitans.     En   la   figura   23   podemos  ver  de   forma  más   exhaustiva   el   comportamiento  del   nivel   bacteriano   en   cada   uno   de   los   momentos,   teniendo   en   cuenta   todas   las   mediciones.     Figura  23:  Gráfica  de  la  evolución  en  el  tiempo  de  los  logaritmo  de  las  ufc/ml  de  cada  una  de  las   especies  bacterianas  a  los  diferentes  tiempos  de  incubación  estudiados  por  disco  de  estudio.  So:   S.   oralis;   Vp:   V.   parvula;   An:   A   naeslundii;   Fn:   F.   nucleatum;   Pg:   P.   gingivalis;   Aa:   A.   Actinomycetemcomitans.     Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   45   7. Discusión   Los  resultados  de  este  trabajo  de  investigación  muestran  los  primeros  pasos  en   la   puesta   a   punto  de  un  modelo  de   biofilm   subgingival   in  vitro,   reproducible   y   sencillo  de  manejar,  que  nos  va  a  permitir  obtener  biofilms  maduros  que  simulan   a   los   biofilms   subgingivales   in   vivo,   como   herramienta   útil   de   estudio   de   las   diferentes   variables   que   afectan   a   estas   comunidades,   con   el   que   en   un   futuro   poder   realizar   análisis  muy   diversos,   desde   el   estudio   de   la   susceptibilidad   de   unión   y   posterior   formación   de   un   biofilm   oral   a   una   determinada   superficie   hasta  el  estudio  del  efecto  de  sustancias  antisépticas  sobre  las  bacterias  orales  en   biofilm.   La   naturaleza   del   biofilm   oral   es   compleja   y   variable:   estos   biofilms   pueden   albergar  hasta  200  especies  conviviendo  en  un  individuo  sano  (Kolenbrander  et   al.  2010)(Dewhirst  et  al.  2010)(Filoche  et  al.  2009),  estructuralmente    adquieren   una  gran  complejidad  y  tienen  lugar  un  gran  número  de  interacciones  entre  las   bacterias  que  conviven  en  ellos.  En  la  literatura,  pocos  son  los  modelos  descritos   de  biofilms  subgingivales,  y  es  que  su  desarrollo  no  está  exento  de  dificultades.   Stoodley   y   cols.   (2004)   (Hall-­‐Stoodley   et   al.   2004)   atribuyen   gran   parte   del   retraso   en   el   estudio   de   los   biofilms   a   la   dificultad   de   trabajar   con   estas   poblaciones  heterogéneas  en  comparación  con  el  estudio,  que  desde  hace  unos   años  se  venía  realizando,  de  poblaciones  planctónicas  homogéneas,  sumado  a  las   consideraciones   éticas   asociadas   con   el   estudio   microbiológico   in   vivo   en   pacientes  con  enfermedad  periodontal  o  caries  dental.   En  primer  lugar,  se  han  seleccionado  seis  bacterias  diferentes  para  este  estudio,   basándonos   en   la   participación,   en   la   composición   del   biofilm,   de   una   o   dos   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   46   especies   bacterianas   pertenecientes   a   los   diferentes   clusters   o   complejos   descritos   por   Socransky   y   cols.   (Socransky   et   al.   1998),   basados   en   la   incorporación  temporal  de  estas  al  biofilm  dental.  Las  especies  seleccionadas  son   las  que  frecuentemente  se  localizan  en  la  placa  subgingival  (Ximénez-­‐Fyvie  et  al.   2000)(Paster  et  al.  2005)(Ledder  et  al.  2006))  e  incluye  colonizadores  primarios   (S.  oralis   y  A.  naeslundii),   tempranos   (V.  parvula),   secundarios   (F.  nucleatum)   y   tardíos   (P.   gingivalis   y   A.   actinomycetemcomitans).   Cada   uno   juega   un   papel   fundamental  en  la  formación  del  biofilm,  los  iniciales  para  formar  la  base  sobre   la   que   se   cimentara   el   biofilm,   F.   nucleatum,   porqué   es   una   bacteria   conocida   como   “puente”   de   unión   entre   los   primarios   y   tardíos.   Esto   se   debe   a   unas   prolongaciones   citoplasmáticas   que   tiene,   que   sirven   de   unión   para   estas   últimas.   Los   tardíos,   A.   actinomycetemcomitans   y   P.   gingivalis   tienen   su   importancia  ya  que  son  los  mas  periodontopatógenos.     Con   respecto   al   número   de   bacterias   seleccionadas,   utilizamos   seis   bacterias   diferentes,  a  diferencia  de  otros  estudios,  que  utilizan  como  inóculo  placa  dental   de  pacientes,  lo  que  conlleva  una  alta  variabilidad  inter-­‐experimento  o,  en  otros   casos,  solo  dos  o  tres  especies  bacterianas.  En  la  literatura  se  han  utilizado  desde   dos   a   seis   especias   bacterianas   (Foster   &   Kolenbrander   2004)(Wei   et   al.   2006)(Helmerhorst   et   al.   1999)(Corbin   et   al.   2011).   La   razón   de   incluir   6   bacterias   es   la   de   la   existencia   de   interacciones   bacterianas   que   favorecen   el   crecimiento  simbiótico  entre  estas.  Por  ejemplo,  el  crecimiento  de  las  especies  S.   oralis,   V.   parvula   y   P.   gingivalis   en   conjunto   se   ve   acrecentado   mutuamente   (Guggenheim  &  Meier  2011).  El  cultivo  simultáneo  del  género  Actinomyces  y  de   P.  gingivalis  también    favorece  el  crecimiento  de  ambas.  Algo  similar  ocurre  con   A.  actinomycetemcomitans  y  P.  gingivalis  o  F.  nucleatum  y  P.  gingivalis  (Periasamy   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   47   &   Kolenbrander   2010).   Aún   y   todo   cabe   mencionar   que   estos   son   factores   favorecedores,  puesto  que  el  medio  de  cultivo  es  muy  rico  en  nutrientes.   Una  de  las  claves  para  trabajar  con  éxito  con  biofilms  orales  in  vitro  es  utilizar  un   medio   de   cultivo   específico   para   su   crecimiento   (Guggenheim   et   al.   2001).   En   nuestro   caso,   hemos   formulado   un  medio   de   cultivo,   que   denominamos   BHI2,   que  contiene  una  proporción  elevada  de  proteínas,  similar  tanto  al  fluido  gingival   crevicular,  principal   fuente  de  nutrientes  de   las  bacterias   subgingivales   in  vivo,   como   a   la   saliva,   puesto   que   incorpora   mucina.   Ésta   es   fundamental   para   la   formación  de  la  película  adquirida  sobre  la  superficie  en  la  que  se  va  a  generar  el   biofilm.   Entre   los   diferentes   modelos   de   biofilm   utilizados   para   reproducir   la   placa  dental,  en  nuestra  opinión,  el  más  representativo  de  ellos  es  el  biorreactor   asociado  a  un  sistema  de  flujo  continuo.  El  biorreactor  será  suplementado  con  el   medio  de  cultivo  formulado,  a  una  velocidad  de  flujo  constante  adecuada  para  el   crecimiento  de  las  bacterias  y  lo  más  similar  posible  al  de  la  cavidad  oral.     La   superficie   sobre   la   que   se   desarrolla   un   biofilm   tiene   una   importante   influencia   en  numerosos   aspectos  de   las   bacterias   implicadas,   entre   los   que   se   incluyen   el   ratio   de   unión   de   las   bacterias   a   la   superficie,   la   influencia   en   el   fenotipo   de   las   bacterias,   o   la   modificación   en   la   producción   de   factores   de   virulencia   y   en   la   producción   de   polisacárido   extracelular.   Se   ha   escogido   el   material   de   hidroxiapatita   puesto   que   es   la   que   más   simula   al   diente.   En   un   futuro  próximo   también  probaremos   a   realizar   este  mismo   experimento   cobre   superficies  de  titanio,  zirconio,  etc.   En  cuanto  al  sistema  utilizado,  igualmente  juega  un  papel  fundamental  a  la  hora   de  conseguir  un  modelo  de  biofilm  in  vitro  adecuado  para  estudiar  la  estructura,   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   48   formación   y   evolución   de   la   placa   subgingival.   Con   el   fin   de   imitar   el   biofilm   subgingival   varios   investigadores   han   desarrollado   modelos   de   biofilm   realizando   ensayos   tanto   estáticos   como   dinámicos.   Se   han   intentado   llevar   a   cabo   varios   modelos   diferentes.   Uno   se   basaba   en   la   inserción   de   diferentes   materiales   en   las   bolsas   periodontales   de   pacientes   (Takeuchi   et   al.   2004)(Wecke   et   al.   2000).   Otros,   utilizando   placa   subgingival   dispersa   o   una   selección   de   bacterias   subgingivales   especificas   en   ensayos   con   placas   de   microvaloración   o   en   sistemas   de   fermentación   constante   de   (Periasamy   &   Kolenbrander   2009)(Hope   &   Wilson   2006)(Kuramitsu   et   al.   2005)(Walker   &   Sedlacek  2007)(Tamura  et  al.  2008).  Muy  pocos  de  estos  estudios  han  permitido   obtener   información   de   cómo   madura   la   placa   subgingival   y   la   secuencia   de   eventos  que  ocurren  en  el  desarrollo  del  biofilm  dental.     Como  comentado  con  anterioridad,  el  objetivo  de  este  estudio  ha  sido  la  puesta  a   punto   de   un   sistema   de   flujo   continuo   que   sea   lo  más   semejante   posible   a   las   condiciones  dadas  en  la  cavidad  oral:  tempertaura,  pH,  flujo  de  líquidos,  etc.  Ha   habido  estudios  previos  que  han  utilizado  diferentes  sistemas  estáticos,  como  el   de  Sánchez  et   al.   2011   (Sánchez  et   al.   2011)  o   el   estudio  de  Guggenheim  et   al.   2001   (Guggenheim   et   al.   2001)     el   “Calgary   Biofilm  Device”   (Wei   et   al.   2006).   Estos  estudios,  no  obstante,  no  imitan  las  condiciones  fisiológicas  de  la  boca  con   exactitud,  puesto  que  carecen  del  dinamismo  característico  de  la  misma.    Las  bacterias  en   la  cavidad  oral  están  sometidas  al   flujo  salivar  y  crevicular  de   una   manera   constante.   Estos   flujos   condicionan   las   propiedades   estructurales   (topográficas   y   arquitectónicas)   y   fisiológicas   del   biofilm   bacteriano   formado   sobre  la  superficie  dental.  Por  consiguiente  los  modelos  estáticos,  necesarios  en   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   49   un  principio,   no   serían   suficientes   para   simular   estas   condiciones   dadas   en     la   cavidad   oral.   De   hecho   hay   estudios   que   demuestran   que   la   estructura   y   propiedades  del  biofilm  son  diferentes  dependiendo  de  si  se  trata  de  un  modelo   estático   o   dinámico   (Vaughan   et   al.   2010)(Drescher   et   al.   2011).   Más   específicamente,   Laue   y   cols.   2006   (Laue   et   al.   2006)   observó   diferencias   temporales   en   algunos   patrones   de   expresión   de   algunos   componentes   de   la   matriz   extracelular   de   la   P.   aeruginosa.  Maezono   y   cols.   2011   (Maezono   et   al.   2011)  descubrió  que  la  resistencia  a  la  eritromicina  por  parte  de  P.  gingivalis  era   mayor   cuando   ésta   estaba   cultivada   en   un   sistema   fluido,   frente   al   estático.   También  se  ha  descrito,  en  S.  epidermidis,  que  el  dinamismo  induce  la  expresión   de   la   adhesina  polisacarídica   intercelular   (PIA),   influenciando   la   estructura  del   biofilm.  Se  compararon  tasas  de  flujo  muy  bajas,  de  18  μl/min  y  de  4,5  μl/min,  y   se   vieron   diferencias   en   la   expresión   de   este   polisacárido   y   la   estructura   del   biofilm   (Foka   et   al.   2011)(Weaver   et   al.   2012).   Como   se   puede   ver   en   estos   estudios,  el  dinamismo  y  su  tasa  de  flujo  son  de  gran  influencia  en  la  formación   de   un   biofilm,   ocasionando   cambios   estructurales   y   de   composición.   Por   consiguiente,  es  necesario  un  biofilm  dinámico  a   la  hora  de  generar  un  sistema   que  intente  imitar  el  biofilm  que  se  forma  sobre  la  superficie  dental.  A  día  de  hoy   no   se   ha   estudiado   la   influencia   de   ésta   variable,   de   aquí   la   importancia   del   desarrollo   de   éste   tipo   de   sistemas,   ya   que   ésta   variable   puede   ser   un   factor   significativo   en   la   estructura   del   biofilm   y   en   la   resistencia   bacteriana   a   antimicrobianos.     El  estudio  muestra   los  datos  pioneros  en   la  puesta  a  punto  del  sistema  de  flujo   continuo   para   generar   un   biofilm   oral.   Se   ha   comprobado   que   el   sistema   es   compatible  con  el  crecimiento  de  las  6  bacterias  seleccionadas,  tanto  de  manera   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   50   independiente  como  en  conjunto,  siendo  capaces  de  organizarse  en  biofilm  a  lo   largo  del  período  de  incubación  empleado  (hasta  96  horas  de  incubación).   El   análisis   del   biofilm   generado   por   Microscopía   Laser   Confocal   (CLSM),   y   el   posterior  tratamiento  de  las  imágenes  obtenidas  con  el  programa  Metamorph®,     ha   permitido   obtener   una   proyección   tridimensional   del   mismo   y   observar   la   disposición  espacial  de  las  células  dentro  de  la  matriz  que  lo  compone.  Al  utilizar   los   fluorocromos   “SYTO   9   green-­‐fluorescent   nucleic   acid   stain”   y   “Ioduro   de   Propidio  red-­‐fluorescent  nucleic  acid  stain”,   se  ha  podido  analizar  y  cuantificar   relativamente  el  número  de  bacterias  vivas  y  muertas,  así  como  la  tendencia  de   distribución  de  las  células  viables  y  no  viables  a  lo  largo  de  todo  el  biofilm.   De   acuerdo   con   lo   publicado   por   otros   autores,   nuestro  modelo   presenta   una   disposición   estructural   representativa   de   la   placa   dental   (Netuschil   et   al.   1998)(Auschill  et  al.  2001)(Dige  et  al.  2009)(Pratten  et  al.  2000)Hope  &  Wilson   2006)   a   partir   de   las   48h,   alcanzando   la   madurez   entre   las   48   y   72   h,   observándose  a  partir  de  las  72  h  un  descenso  en  general  en  la  vitalidad  celular.   No   se   han   encontrado   diferencias   estadísticamente   significativas   tanto   en   la   altura   como   en   la   vitalidad   alcanzada   por   los   biofilms   de   48   y   72   horas   de   incubación   (p>0,05   en   ambos   casos),   lo   que   nos   indica   que   el   biofilm   se   encuentra   en   una   fase   de   estabilidad   en   cuanto   a   su   composición.   En   ambos   casos,  la  vitalidad  que  presenta  corrobora  lo  postulado  por  Branda  y  cols.  (2005),   que  afirman  que  los  biofilms  maduros  presentan  tan  solo  alrededor  del  50%  de   sus  células  vivas.   La  mayor  vitalidad  es  observada  en  las  capas  más  profundas  del  biofilm  de  48  h,   en  cambio  a  las  72  h  de  incubación  el  biofilm  presenta  una  mayor  variabilidad  en   Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   51   cuanto   a   ésta   distribución,   presentando   una   vitalidad   menor   en   las   capas   profundas  (figura  18).  Esto  podría  ser  debido  a  que  a  medida  que  el  biofilm  va   madurando   las   capas   más   profundas   del   mismo   se   quedan   sin   acceso   a   nutrientes,  a  pesar  de   los  gradientes  generados  y   los  canales  existentes  para  el   paso  de  estos.     En   lo   referente   a   la   proporción   de   bacterias/volumen   del   biofilm,   se   observa   diferencia  estadísticamente  significativa  cuando  se  comparan  los  biofilms  de  48   y  72  h  de  incubación,  observándose  mayor  número  de  bacterias  por  volumen  de   biofilm  en  el  de  72  h  de  incubación  (figura  20).   A   partir   del   estudio   del   crecimiento   bacteriano  por   cultivo,   se   observó  que   las   bacterias  P.  gingivalis  y  A.  actinomycetemcomitans  están  en  menor  número  en  los   biofilms  más   jóvenes   (exceptuando   el   de  1   h   de   incubación),   en   cambio   en   los   más  maduros,  véase  el  de  96  h,  son  las  dos  especies  bacterianas  más  abundantes   (figura  22).  Esto  puede  ser  debido  a  su  condición  de  colonizadores  tardíos,  que   el  biofilm  al  madurar  e  ir  cambiando  de  bacterias  anaeróbicas  facultativas,  pasa  a   uno  con  mayor  abundancia  de  las  bacterias  anaeróbicas  estrictas,  que  son  estas   últimas.   Lo   contrario   sucede   con   los   colonizadores   primarios   y   tempranos,   S.   oralis,  A.  naeslundii   y  V.  parvula,  al   principio   en  mayor   abundancia,   y   a  medida   que   el   biofilm   va   madurando   y   cambiando   a   uno   con   mayor   abundancia   de   bacterias  anaeróbicas  estrictas,   van  disminuyendo  en  número   (Socransky  et  al.   1998).   Con   respecto   a   F.   nucleatum,   ésta   bacteria,   siempre   se   halla   en   concentraciones   modestas,   como   le   ocurre   a   otros.   Esta   dinámica   de   incorporación   en   el   biofilm   concuerda   por   lo   descrito   por   otros   autores   ((Kolenbrander  et  al.  2010)).     Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   52   Por  tanto,  se  ha  podido  comprobar  que  el  sistema  es  capaz  de  generar  biofilms  a   partir   de   las   especies   bacterianas   seleccionadas,   incluidas   ya   desde   la   primera   hora  de  generación,  que  siguen  la  cinética  de  incorporación  descrita  in  vivo,  y  que   alcanza   la   madurez   adecuada   a   las   72   h.   Serán   necesarios   más   análisis   y   repeticiones   de   los   ensayos   para   corroborar   los   datos   presentados   en   la   memoria.                               Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   53   8. Conclusiones     -­‐ El  biorreactor  Lamba  Minifor®  es  óptimo  para  el  desarrollo  de  biofilms   orales  in  vitro.   -­‐ Las   seis   cepas   bacterianas   seleccionadas   son   válidas   para   el   estudio,   y   constituyen  un  buen  cimiento  para    el  desarrollo  del  biofilm  en  el  sistema   de  flujo  Lambda  Minifor®.     -­‐ Los   resultados   obtenidos   por   CLSM   nos   indican   que   entre   1h   y   96h   de   incubación  se  forman  biofilms  maduros.   -­‐ Por  CLSM  hemos  observado  que  el  biofilm  alcanza   la  madurez  entre   las   48h  y  72h,  sin  presentar  diferencias  estadísticamente  significativas  entre   ambos  biofilms  en  cuanto  a  altura  y  vitalidad.  Sin  embargo,  si  se  observan   diferencias   estadísticamente   significativas   en   la   concentración   de   bacterias  en  volumen  del  biofilm,  siendo  mayor  a  las  72h.     -­‐ Los   resultados   del   cultivo   nos   demuestran   que   los   biofilms   alcanzan   la   estabilidad  entre   las  48h  y  72h,  y  que  a  partir  de  este  último   tiempo  de   incubación   se   ve   un  descenso   general   del   número  de   bacterias   (ufc/μl),   pudiendo  concluir  que  estos  biofilms  se  hallan  en   la   “fase  estacionaria  o   de  madurez”,  fase  idónea  para  posteriores  estudios.     -­‐ La  dinámica  de  incorporación  de  las  bacterias  utilizadas  en  el  modelo  de   biofilm  puesto  a  punto  concuerda  con  lo  descrito  por  otros  autores,  tanto   in  vitro  como  in  vivo.               Desarrollo  del  Modelo  de  Boca  Artificial  en  Flujo  Continuo  en  el  Biorreactor  Lamba  Minifor®   54   9. 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