UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II Estudio de la expresión del daño residual radioinducido en la funcionalidad de las células del sistema hematopoyético de ratón (Mus musculus Z.). Mecanismos compensatorios del estroma en la regulación de la hematopoyesis MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Elvira Cuenllas Díaz Directora Concepción Tejero Ortega Madrid ISBN: 978-84-8466-832-9 © Elvira Cuenllas Díaz, 1992 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA ESTUDIO DE LA ESPRESION DEL DARO RESIDUAL RADIOINDUCIDO EN LA PUNCIONALIDAD DE LAS CELULAS DEL SISTEMA HEMATOPOYETICO DE RATON (Mus musculus L.). MECANISMOS COMPENSATORIOS DEL ESTROMA EN LA REGULACION DE LA IIEMATOPOYESIS. ELVIRA CUENLLAS DíAS 1992 Dedicado muy especialmente a la memoria de mi padre, su recuerdo es un continuo estímulo para mí. Y a mi madre en quién tengo un gran apoyo. Este trabajo de investigación ha sido realizado en el Departamentode Bioquímica y Biología Molecular IV de la Facultad de Veterinaria, bajo la dirección de la Dra. Concepción Tejero ortego y la codirección Dr. Juan Antonio Bueren Roncero Este trabajo forma parte de un proyecto de investigación subvencionado por la CEE en el programa de Protección Radiológica. AGRADECIMIENTOS Deseo expresar mi agradecimiento, a todas aquellas personas que de alguna u otra forma han contribuido a la realización de este trabajo. Y de una manera especial, mi más sincero agradecimiento: Al Dr. Manuel Ruiz—Ajuil, puesto que ha aceptado ser ponente de este trabajo. Al Dr. Amando Garrido Pertierra, por introducirme en este departamento y así brindarme la posibilidad de formarme en el mundo de la Bioquímica. A la Dra. Concepción Tejero Ortego, mi maestra y amiga. La directora de Tesis que todos quisiéramos tener y yo tuve la suerte de encontrar. Gracias a su esfuerzo, ejemplo de trabajo y entusiasmo diario, este trabajo ha llegado a buen fin y, sobretodo mi gratitud es máxima por la comprensión y apoyo que me ofreció en los amargos momentos que acompañaron la realización de este trabajo. Al Dr. Juan Antonio Bueren Roncero, por su ayuda humana y material a lo largo de todos estos años y por la revisión cuidadosa y crítica que ha realizado en este trabajo. A la Dra. Soledad Gaitán Pacheco, la buena amiga y compañera de trabajo y principalmente agradezco su inestimable aportación por la cual este trabajo llegó al final. A la Dra. Pilar Sancho, a quién agradezco no sólo su colaboración en este trabajo, sino la amistad que surgió a partir de la misma. A la Dra. M~ José Herranz Santos, por la amistad que me ha demostrado a lo largo de estos años y por la alegría y tranquilidad que imprime el estar a su lado. A Severiano Escribano Lucas, por su aportación y ayuda en este trabajo que, aunque su incorporación llegó al final del mismo no por ello fué menos importante. A mis compañeros del Laboratorio del CIEMAT por la buena acogida que me han demostrado en todo momento. Al Dr. Juan F. Santarén, por el apoyo técnico en la realización de una parte de este trabajo. Al Dr. Eliseo Vañó por las facilidades prestadas para utilizar la instalaci6n radioactiva de la Facultad de Medicina. Al personal del Animalario del CIEMAT por el buen mantenimiento del protagonista de esta Tesis, el ratón. Agradezco a la Tesis, el que me haya permitido conocer a personas como MB Carmen Serradilla, Alicia Gibello y Mónica Suarez y “aprovecharme” de la amistad que me han ofrecido. INDICE ¡MDI CE Pagína 1.- INTRODUCCION 1 1.1.- HEMATO?OYESZS EN EL RATON 1 1.1.1. Aspectos generales 1 1.1.2. Organización jerárquica del sistema hematopoyético 2 1.1.3. Bioquímica y biología de los factores de crecimiento mieliode 13 1.2.- CARACTERíSTICAS BIOQUíMICAS Y FUNCIONALES DE LAS CELULAS DEL SISTEMA HEMATOPOYETICO . 18 1.2.1. Biología celular y función de las células de médula ósea 19 1.2.2. Características morfológicas y función de las células de la serie eritroide 22 ¡.2.3. Características morfológicas y función de granulocitos 26 1.2.4. Características diferenciales de las enzimas glicoliticas en las células del sistema hematopoyético 35 1.3.- ESTROMA HENATOPOYETICO 41 1.3.1. Aspectos generales 41 1.3.2. Cultivo de larga duración de médula ósea .. 45 ¡.4.— EFECTO DE LAS RADIACIONES IONIZANTES SOBRE SISTEMAS DIOLOGICOS 47 ¡.4.1. Aspectos generales 47 1.4.2. Radiosensibilidad de las poblaciones celulares hematopoyéticas 50 1.5.- OBJETO DEL TRABAJO 53 II.- MATERIAL y METODOS 55 11.1.— MATERIAL 55 11.1.1. Animales de experimentación 55 11.1.2. Productos utilizados 55 11.1.3. Material de laboratorio 56 11.2.- METODOS 58 11.2.1. Irradiación y Dosimetria 58 11.2.2. Preparación y cuantificación de suspensión celular de médula ósea 59 11.2.3. Obtención de poblaciones celulares maduras de sangre priférica: eritrocitos y granulocitos 60 11.2.4. Estimación de la viabilidad celular 61 ¡¡.2.5. Cultivo de larga duración de médula ósea 62 11.2.6. Cultivo de precursores gránulo- macrofágicosCFc—GM 63 11.2.7. Obtención de los extractos enzimáticos .... 66 II.2.7.1.Extracto enzimático de médula ósea 66 II.2.7.2.Extracto enzimático de eritrocitos 66 II.2.7.3.Obtención del extracto enziinático de granulocitos 66 11.2.8. Determinación de la actividad enzimática de las enzimas glicoliticas 67 II.2.8.l.Determinación de la actividad hexoquinasa . 67 II.2.8.2.Determinación de la actividad fosfofructoquinasa 68 II.2.8.3.Determinación de la actividad piruvatoquinasa 68 ¡¡.2.9. Estudio de la unión de transferrina en células de médula ósea 70 II.2.9.1.Marcaje de transferrina humana 70 II.2.9.2.Incubación de las células con 1125—transferrina 71 11.2.10. Determinación de los niveles de 2,3 BPG ... 72 11.2.11. Determinación de los niveles de 74 11.2.12. Determinación de hemoglobina 75 11.2.13. valoración de proteinas 75 11.2.14. Análisis electroforético de proteinas 76 11.2.15. valoración de datos 79 III. — RESULTADOS 80 111.1.- ESTUDIO DEL DM40 RESIDUAL EN POBLACIONES CELULARES REMATOPOYETICAS 80 ¡¡¡.2.— ESTUDIO PREVIO DE LAS CONDICIONES OPTIMAS DE ENSAYO DE ACTIVIDAD EX, PFK y 2K EN CELULAS DE MEDULA OSEA, ERITROCITOS Y GRANULOCITOS 83 111.3.- ESTUDIO DE LA JUICIOS Y METABOLISMO DE CELULAS DE MEDULA OSBA 88 111.3.1. Unión de transterrina a células de médula ósea 88 111.3.2. Actividades de HK, PFI< y PK en células de médula ósea 92 111.4.- ESTUDIO DE LA FUNCION Y METABOLISMO DE ERITROCITOS 97 111.4.1. 111.4.2. Determinación de niveles de 2,3 BPG, hemoglobina (Hb) y proteína total Actividad de HK, PFK y NC 111.5.- ESTUDIO DE LA JUNCION Y METABOLISMO DE ORANULOCITOS 104 111.5.1. 111.5.2. III • 5 • 3. 111.5.4. Determinación de la producción de 02, concentración de proteína en granulocitos obtenidos de sangre periférica Niveles de producción de 02 en granulocitos de LTBMC Actividad de HK, PFK y PK en granulocitos de LTBMC Análisis cuantitativo y cualitativo de proteínas de granulocitos de LTBMC Electroforesis bidiinensional 111.6.- ANALISIS COMPARATIVO DE LAS ACTIVIDADES ENZIMATICAS ESTUDIADAS EN MEDULA OSEA, ERITROCITOS Y GRANULOCITOS 119 111.7.- IMPLICACIONES DEL ESTROMA EN LA NEMATOPOYESIS DEL RATON 125 111.7.1. 111.7.2. IV. - Cuantificación de células en el sobrenadante del LTBMC. Aspectos morfológico del estroma Detección de CSFs en el sobrenadante del LTBMC DISCUSION IV.1.— ESTUDIO DEL DM40 RESIDUAL EN POBLACIONES CELULARES HEMATOPOYETICAS IV.2.- ESTUDIO DE LA FUIICION Y METABOLISMO DE CELULAB DE MEDULA OBRA IV.2.1. Unión de transferrina en células de médula ósea ... IV.2.2. Actividad de HK, de médula ósea PFK y PK en células 134 137 137 140 IV.3.- ESTUDIO DE LA JUNCION Y METABOLISMO DE ERITROCITOS 97 .100 .104 .106 .110 .115 .125 .... 130 .... 134 143 IV.4.- ESTUDIO DE LA FUNCION Y METABOLISMO DE GRANULOCITOS 146 IV.5.— IMPLICACIONES DEL ESTROMA EN LA NEMATOPOYESIS DEL RATON 153 Y.- VI.- CONCLUSIONES 157 BIBLIOGRAFíA 160 ABREVIATURAS APS persulfato amónico Emaz capacidad máxima de unión del ligando a su receptor BTU—E unidad formadora de “burst” eritroides EPA actividad promotora de “burst” CPU—E unidad formadora de colonias eritroides CPU—E0 célula formadora de colonias de eosiófilos CPC—OM célula formadora de colonias de gránulocitos y macrófagos CPC—G célula formadora de colonias de granulocitos CFC—M célula formadora de colonias de macrófagos CFC—Meg célula formadora de colonias de megacariocitos CSPS factores estimulantes de colonias CPU—a unidad formadora de colonias en bazo Epo eritropoyetma EEC célula sensible a eritropoyetina UDC-?2 línea celular dependiente del factor Paterson- 2 EBSS solución salina de Hank’s ¡E? isoelectroenfoque Ka constante de afinidad LTBMC cultivo de larga duración de médula ósea PMA forbol—12—miristato—13—acetato SC? factor estimulante de célula madre SDS dodecilsulfato sódico Sm célula madre mieloide Sí célula madre linfoide BOD superóxido-dismutasa TEMED N,N,N ,N - tetranietiletilendiamina Tf transterrina. INTRODUCCION 1.- INTRODUCCION ¡.1.- HEMATOPOIESIS EN EL RATON 1.1.1.— Aspectos generales Se conoce como hematopoyesis al proceso de formación de las células sanguineas. Dado que la mayoría de las células de la sangre tienen una vida media relativamente corta y que el número de dichas células se mantiene constante a lo largo de la vida del animal, la hematopoyesis se desarrolla como un proceso en continua renovación celular sometido a complejos mecanismos de regulación. La producción de células sanguineas ‘Un vivo” está regulada por la síntesis y liberación de citoquinas especificas producidas en la médula ósea y en otros tejidos (Metcalf,1984) y mediante otros bioreguladores como son, los interferones, el factor de necrosis tumoral, lactoferrina y otros (Lord y Testa,1988). Las lineas de diferenciación que componen el tejido hematopoyético se pueden clasificar en dos: Linea mieloide que incluye a las células eritroides, los monocitos, granulocitos, megacariocitos y células cebadas y la linea linfoide que comprende a las células T y a las células B. Para completar la lista de células que 1 comprende el sistema hematopoyético es necesario incluir a aquellas células que originadas en los órganos hematopoyéticos se asientan en diversos tejidos; este grupo incluye a los distintos macrófagos tisulares, como son las células Kupffer del hígado, los macrófagos alveolares, los osteoclastos de médula y las células Langerhans de la piel; así mismo existe evidencia de que las células endoteliales tienen un origen hematopoyético (Keating y col., 1982) al igual que las células “natural killer” y las células dendriticas del tejido linfoide ¡.1.2.- Organimación jerárquica del siBtema hematopoyético. El tejido hematopoyético es un sistema en organización jerárquica formado por distintos compartimentos celulares. Cada compartimento va repoblando al siguiente completando así los procesos de proliferación y diferenciación celular que dan lugar a las células maduras de la sangre. Tradicionalmente, las poblaciones celulares hematopoyéticas se han clasificado en tres subclases (Lord, 1983) —células madre, son células multipotentes con capacidad de automantenimiento. —células progenitoras derivan de las células madre multipotentes (Lajtha,1982). Se considera pues, que su potencial de diferenciación es multipotente, con capacidad de producir los distintos tipos celulares maduros de la línea mieloide y linfoide. Son células dotadas de capacidad de automantenimiento, lo que le permite mantener constante el tamaño de su compartimento. (Siminovitch y col.,1963; Lajtha, 1982). Un pequeño porcentaje de estas células (<10%) se encuentra en fase de sintesis de ADN. El resto de esta población se encuentra en situación de reposo proliferativo, fuera del ciclo celular (Go); sin embargo poseen la capacidad de entrar en fase de síntesis en situaciones de estrés. 3 El ensayo de colonias “in vivo” que sirvió para poder definir a un precursor próximo a la célula madre hematopoyética fue desarrollado por Tilí y McCulloch en 1961. Estos autores inyectaron células hematopoyéticas de un ratón donador a un ratón receptor isogénico irradiado con una dosis potencialmente letal. Transcurridos 10—14 dias de la inyección sacrificaron los animales, y observaron colonias macroscópicas en el bazo de estos animales. Análisis citogenéticos y bioquímicos confirmaron el carácter clonal de estas colonias e indicaron que a menudo estaban formadas por células de las dos lineas sanguineas y que contenían aproximadamente 106 células . Asi mismo, estos ensayos han servido para caracterizar ciertos factores estimulantes de la supervivencia, proliferación y diferenciación en estas células, a los que se ha llamado factores estimulantes de colonias (CSFs) 6 En este apartado, vamos a hacer una breve descripción de algunos precursores comprometidos referidos a la línea mieloide. — Precursores eritroidea La diferenciación y maduración de la línea eritroide supone una secuencia ordenada de acontecimientos que comienzan en la célula madre multipotente, continuan en las células comprometidas a la linea eritroide y finalizan en la producción de eritrocitos maduros. El uso de los cultivos “in vitro” en matriz semisólida ha permitido identificar a distintos precursores eritroides de ratón (Stephenson y col.,l971); éstos son el precursor eritroide temprano llamado unidad formadora de “burst” eritroide o BFU—E . Para terminar con la descripción de los precursores hematopoyéticos comprometidos, vamos a referirnos a los precursores definidos a eosinófilos y megacariocitos. Los precursores comprometidos a diferenciarse y desarrollar eosinófilos y megacariocitos maduros en el 9 ratón, se han denominado unidades formadoras de eosinófilos o CFC—Eo y de megacariocitos o CFC—Meg respectivamente (Metcalf y col.,1975 y Johson y Metcalf,1980). La diferenciación y proliferación de ambos precursores, está regulada por citoquinas especificas. Así el precursor, CFC—Eo está regulado por la acción sinérgica de la IL-3 e IL-5 . La regulación de la hematopoyesis, se ejerce a través de distintos mecanismos de control en los que intervienen, entre otros, las células del estroma mediante la producción y liberación de los distintos factores de crecimiento hematopoyético (Alíen y Dexter, 1983; Spooncer y col. ,1986). La supervivencia, diferenciación, proliferación y desarrollo de las células madre y progenitores hematopoyéticos así como la actividad funcional de las células maduras está regulada por la acción de diversos factores de crecimiento (Dexter, 1987; Nicola,1989; Whetton y Dexter,1989; Heyworth y col. .1990). Las distintas técnicas de cultivo “in vitro” han permitido detectar,aislar, caracterizar y en ciertos casos investigar el modo de acción de estos factores de crecimiento (Metcalf y Mercharn, 1982). Así, se ha podido conocer que la supervivencia y proliferación de la línea celular FDC—P2 por la IL—3 se mantiene a través de la regulación de los niveles intracelulares de ATP mediante 13 un aumento en el consumo de glucosa, todo ello mediado por este factor (Whetton y Dexter,1983; Whetton y col.,1985)’. Los factores hematopoyéticos constituyen una familia de proteinas de naturaleza glicosilada que regula la producción y la actividad funcional de las células maduras. La respuesta biológica a los factores hematopoyéticos es amplia, algunos de ellos actúan sobre un dilatado espectro celular, otros son más específicos en su rango de acción. Así, la Interleuquina 3 (Williams,1985). Por otro lado, el Fe+3 es necesario para cumplimentar 20 procesos de proliferación y diferenciación celular . Esta es una glicoproteina plasmática cuya función fundamental es la del transporte de Fe+3 al interior de la célula. La unión de la Tf a su receptor, localizado en la membrana plasmática, es un paso esencial en el mecanismo de incorporación del Fe a la célula. El receptor de Tf ha sido encontrado en las células que presentan una gran capacidad proliferativa (Sutherland y col.,1981; Trowbridge y Omary,1981)¡. En este sentido, la expresión del receptor de la Tf está relacionado con la proliferación de las células del sistema hematopoyético 1.2.2.—Algunas características morfológicas y función fisiológica de las células de la serie eritroide Como ha sido indicado en el apartado 1.1.2 de esta memoria, los eritrocitos se generan a partir de los precursores eritroides BFU—E y CFU-E mediante los procesos de diferenciación celular. El eritrocito de los mamíferos es una de las células más especializadas del sistema hematopoyético. Morfológicamente se caracteriza por carecer de núcleo, mitocondrias y ribosomas; su composición es por lo tanto muy simple, está formado por una membrana citoplasmática que rodea una solución de proteína y electrolitos. La proteína mayoritaria que compone el eritrocito es la hemoglobina, que está representando el 95% de la proteína total, el resto lo forman las enzimas necesarias para la producción de energía y para el mantenimiento de la hemoglobina en el estado fisiológico funcional. Los eritrocitos de mamíferos son células anucleadas que circulan por la sangre durante un tiempo determinado que varia según las especies. Así, en el hombre la vida 22 media del eritrocito es de 120 días mientras que en el ratón es de 20—30 días (Magnani y col., 1980). El estudio del eritrocito ha despertado gran interés en virtud de la función fisiológica que desempeña y porque dada su sencillez estructural y metabólica resulta una célula ideal para realizar estudios bioquímicos. Por carecer el eritrocito de orgánulos citoplasmáticos como ribosomas y mitocondrias, su metabolismo queda limitado a la glicolisis, el ciclo de las pentosas fosfato, ciclo del 2,3 bifosfoglicerato (2,3 BPG), algunas reacciones de oxido-reducción y ciertos aspectos del metabolismo de nucleótidos. Los eritrocitos, al igual que toda célula animal, requiere energía para cumplimentar su actividad metabólica y funcional, de tal manera que su metabolismo está encaminado hacia la formación de la molécula que actúa como transportador especial de energía libre ó ATP Distintos sustratos tales como la ribosa, fructosa, manosa, galactosa, etc.., pueden ser metabolizados para obtener energía, siendo la glucosa la principal fuente energética de los eritrocitos de todas las especies animales, excepto el cerdo en el que el sustrato principal es la inosina (Agar y Board,1983; Kim,1983). Así cada molécula de glucosa que entra en la célula es fosforilada 23 por acción de la hexoquinasa y transformada a glucosa—E— fosfato. Este compuesto formado es metabolizado por la vía de Emberf—Meyerhoff o por la ruta de las pentosas fosfato en distinta cuantía. En situaciones fisiológicas, entre un 5% y un 13% de la glucosa se metaboliza por la ruta de las pentosas fosfato . 25 ¡.2.3.— Características morfológicas y función fisiológica de granulocitos. Ha sido indicado en esta memoria, que los granulocitos y macrófagos se pueden originar a partir de un precursor común denominado CFC—GM o a partir de los precursores CFC—G y CFC—M. A través del proceso de diferenciación celular generan primero las células inmaduras y posteriormente la célula madura ó granulocito. En este apartado vamos a hacer una descripción de las características morfológicas de las células que componen la línea de diferenciación de la serie granulocitica. El promielocito es la célula inmadura, perteneciente a la serie granulocitica, en la que aparecen los gránulos azurófilos. Estos contienen enzimas lisosómicas como fosfatasa ácida, mieloperoxidasa, indolesterasa, B— glucuronidasa y proteasas neutras , hidrolasas ácidas y proteinas microbicidas que actúan hidrolizando los enlaces 51—4 glucosídicos de la pared bacteriana y eliminando los “detritus” celulares < Zinkl, 1989; Curnutte y Babior, 1990>. Al promielocito le sigue el estado de mielocito, siendo en esta célula en la que se producen los cambios morfológicos más acusados en el desarrollo del granulocito. En este estadio, se origina la síntesis de gránulos específicos que aparecen rodeando al núcleo y posteriormente se expanden a todo el citoplasma. 26 Los gránulos secundarios o específicos, contienen lisozima y lactoferrina. Esta última es una proteina unida a Fe3~ que actua bloqueando el crecimiento bacteriano así, ambos factores aumentan el número de granulocitos en sangre periférica y activan las funciones fisiológicas de estas células (Yuo y col,1990). Las especies derivadas del oxigeno, pueden ser tóxicas por si mismas o aumentar su toxicidad por sus reacciones con la mieloperoxidasa, por lo que los granulocitos poseen un sistema de detoxificación celular que transforma los derivados tóxicos en H20 (Klebanoff, 1988). Estos mecanismos de detoxificación están compuestos por la enzima superóxido dismutasa dependen fundamentalmente de la glicolisis para cumplimentar sus necesidades metabólicas y funciones fisiológicas (Akkerman,1978; Rogers y col.,1980; Smolen y Boxer,1990>. En las células de médula ósea, la glicolisis es la ruta metabólica que adquiere especial importancia para desarrollar los procesos de diferenciación y proliferación celular. Los eritrocitos necesitan de la glicolisis para obtener la energía necesaria para el mantenimiento de los niveles de 2,3 BPG . En este sentido, se ha descrito que las enzimas glicoliticas presentan modificaciones en la expresión de las distintas formas isoenzimáticas, en los mecanismos de regulación y en los niveles de actividad a lo largo de la diferenciación del sistema hematopoyético de diversas especies < Setchenska y Arnstein,1978; Kidron y col.,1981; Gaitán y col.,1989,1990; Cuenlías y col.,1990). Las diferencias de actividad enzimática durante la maduración y edad celular responden a diversos factores, tales como la distinta compartimentación de las enzimas, la diferente sensibilidad a los sistemas de oxidación, las acciones de proteasas especificas... ( Magnani y col.,1984; Beutler,1990). La HE (ADP:D-hexosa-6-fosfotransferasa. EC 2.7.1.1. 111<>, cataliza la fosforilación de la glucosa a glucosa—E— fosfato en la primera reacción de la glicolisis. En numerosos tejidos de mamíferos, la HIC es reguladora del metabolismo glucldico, como ocurre en eritrocitos, plaquetas, linfocitos y granulocitos . Los tejidos de mamíferos presentan 4 isoenzimas de mc . En el precursor CFU—E, de la línea de diferenciación eritropoyética de ratón, se ha identificado la presencia de la isoenzima 1 (principalmente el subtipo la) y en menor proporción el tipo II. Este desaparece durante la diferenciación en favor de la isoenzima la, siendo ésta la forma predominante en el eritrocito ( Nijhof y col.,1984). En otras células sanguíneas, como linfocitos y plaquetas se ha identificado la forma isoenzimática HK—II La fosfofructoquinasa es una de las enzimas claves de la glicolisis en numerosos organismos (Rapoport,1974; Uyeda,1979). En los tejidos altamente especializados, el flujo glicolitico depende del nivel de actividad de PER, como sucede en los eritrocitos de mamíferos (Rapoport, 1974). Las isoenzimas se han designado como P o C que predomina en cerebro; la isoenzima L o B presente en eritrocitos y la forma isoenzimática M o A que se presenta en músculo . Los neutrófilos contienen principalmente subunidades tipo L y en las plaquetas existe un hibrido PL Los tejidos de mamíferos poseen 3 tipos de subunidades isoenzimáticas, cada una de las cuales se expresa en diferentes tejidos y, entre ellas pueden dar fenómenos de dimerización resultando así homotetrámeros y heterotetrámeros que presentan distintos mecanismos de regulación y propiedades fisico—quimicas, inmunoquimicas y cinéticas diferentes (Oskam y col.,1985; Vora y col.,1985; Bristow y col.,1987; Heesbeen y col.,1987). 38 La mayoría de las isoenzimas de PFK de mamíferos están formadas por subunidades de Pm 85+5 Kd siendo el tetrámero la forma activa (Frieden y col.,1976). La asociación de estas subunidades depende del pH y de la concentración de enzima. La PFK es una de las enzimas que presenta complejos mecanismos de regulación. Así, está sometida a regulación por un elevado número de metabolitos, a la acción de diversas hormonas y al estado nutricional. El número de efectores que puede influir en la actividad PFK depende del tejido donde esté la enzima y de la concentración de efectores (Bosca y Corredor,1984>. La piruvatoquinasa , cataliza la reacción de transformación del fosfoenolpiruvato (PEP) a Piruvato en el último eslabón de la ruta glicolitica. La NC ha sido descrita como una de las enzimas reguladoras del metabolismo glucidico en diversos organismos y tejidos (Ngo y col.,1983; VanBerkel y Kostner,1973). Su papel regulador implica que está sometida a numerosos mecanismos de control. Similar a otras enzimas glicoliticas, la regulación de la actividad PK se puede ejercer a través de la existencia de diferentes formas isoenzimáticas. En tejidos de mamíferos, se han descrito 4 isoenzimas de PK, 39 designadas como ~ (14); ~2 (K); L y R. Estas isoenzimas difieren en su distribución y propiedades cinéticas, inmunoquimicas y reguladoras . Presenta cinética siginoidal respecto a PEP y es inhibida por la L-Ala . La PK de eritrocitos de muchos organismos regula las concentraciones intracelulares de 2,3 BPG , por lo que, la hematopoyesis observada tras la implantación de fibroblastos “in vivo” se debe a la contaminación de elementos del estroma del huesped (Dexter,1982). Estos argumentos indican que los fibroblastos constituyen una matriz que sirve de apoyo para el desarrollo de otras células del estroma pero no se consideran componentes del estroma hematopoyético. Otro componente del estroma lo constituyen los macrófagos, que aunque no tienen su origen en células del estroma, se consideran una parte funcional del mismo . El cultivo de larga duración de médula ósea, produce granulocitos maduros que son morfológica y funcionalmente equivalentes a la célula “in vivo” ; el mecanismo de regulación de la hemoglobina en eritrocitos . Para evaluar la implicación del estroma de médula en el daño hematopoyético residual, utilizaremos el sistema de cultivo ‘Un vitro” de larga duración de médula ósea, que nos permitirá analizar las interacciones entre las células del estroma y las células hematopoyéticas en el proceso de regulación de la hematopoyesis. 54 MATERIAL Y METODOS II.- MATERIAL Y ¡(¡TODOS ¡¡.1.— MATERIAL 11.1.1.— Animales de experimentación Se han utilizado ratones hembras adultas, híbridas (F1) del cruzamiento entre machos de la cepa Balb/C y hembras de la cepa 057 Bí, de 12 semanas de edad. Los animales pertenecen al estabulario de la Unidad de Efectos Biológicos del CIEMAT, fueron mantenidos en condiciones ambientales constantes a 22W de temperatura, 50% de humedad relativa y con periodos de luz—oscuridad de 12 horas. Para su alimentación, se les administró pienso Sandernius (Sanders) y agua ad libitum . 11.1.2.- Productos utilizados Se han utilizado productos químicos de los laboratorios Merck calidad R.A. Los productos bioquímicos pertenecían a los laboratorios Boehringer Mannheim y Sigma Chemical Company (St. Louis Mo USA>. Los medios de cultivo ; los sueros empleados procedían de los laboratorios Flow y Hazíeton, antes de su utilización fueron inactivados en baño de agua a 56W durante 30 mm y testeada su capacidad para estimular el crecimiento “in vitro” de precursores heamtopoyéticos. La transterrina utilizada fué transferrina humana saturada de Fe Sigma Chemical Co (USA). El 125INa (100 ~¿Ci/ml>pertenecía a la casa Amnershan Radiochemical Centre (LIX). Las esferas de poliestireno fueron de Pierce Eurochemie B.V . 58 ¡¡.2.2.- Preparación y cuantificación de la suspensión celular de médula ósea. Para cada experimento se sacrificaron un mínimo de tres ratones de la misma edad para control e irradiado, mediante dislocación cervical. Las suspensiones celulares de médula ósea se obtuvieron de los fémures y tibias de las extremidades posteriores. En condiciones estériles, se procedió a obtener la médula ósea mediante inyección en los huesos de NaCí 0,9% o de medio de cultivo 114DM con ayuda de jeringa. Los agregados celulares presentes en la suspensión, se dispersaron mediante la aspiración repetida de toda la suspensión celular a través de agujas de diferentes grosores. La suspensión celular se mantuvo en baño de hielo <0— 40C> hasta su utilización. La cuantificación de las suspensiones celulares de médula ósea se realizaron al microscopio óptico utilizando cámara de NeUbauer y, en ciertas ocasiones se utilizó el contador electrónico de partículas. 59 ¡¡.2.3.— Obtención de poblaciones celulares maduras de sangre periférica: eritrocitos y granulocitos Una vez anestesiados los animales, se extrajo la sangre y se introdujo en tubos heparinizados. A continuación, 1 ml de sangre se mezció con Dextrano T—500 (0,33 mí) al 6%, quedando una concentración final de 1,5% y se dejaron sedimentar los eritrocitos a temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente, los eritrocitos sedimentados, se lavaron 3 veces sucesivas con Nací 0,9% para eliminar el exceso de Dextrano. El aislamiento de granulocitos de sangre periférica se realizó según una modificación del método de Bbyum (1974) Una vez sedimentados los eritrocitos a temperatura ambiente durante 30 mm, el sobrenadante se introdujo en Ficoll-Paque se observó una muestra al microscopio óptico. Para calcular el porcentaje de viabilidad celular, se cuantificó un mínimo de 50—100 células, entre las viables (sin teñir) y las no viables . La viabilidad celular determinada en cada ensayo alcanzó unos valores del 99%. 61 11.2.5.- Cultivo de larga duración de médula ósea El cultivo de larga duración de médula ósea, se realizó según el método descrito por Dexter (Dexter y col,1977). El método consiste en la formación de una capa adherente de células de médula ósea , medio condicionado de la línea celular Wehi-3b <11-3) (10%) o sobrenadante de los cultivos de LTBMC libres de células como fuente de factor estimulante de colonias, medio de cultivo Iscove y agar 0,3%. Los cultivos se incubaron en estufa a 3700 y con un 63 5% de 002. Transcurrido el periodo de incubación de 7 días, se cuantificaron la colonias obtenidas. En la microfotografía 1, se muestra el aspecto de una colonia granulo—macrofágica después de la incubación. En cada experimento se emplearon al menos, 5 placas de cultivo. 64 ¡¡.2.7.— Obtención de los extractos enuimáticos ¡¡.2.7.1.- Extracto enzimático de médula 6sea Una vez obtenida la suspensión de médula ósea según se indica en el apartado ¡¡.2.2, el extracto enzimático se preparó sometiendo esta suspensión a un proceso de ruptura por congelación y descongelación, y posterior centrifugación a 14.000 xg durante 30 minutos a 400. El sobrenadante obtenido, se recogió por decantación y se distribuyó en pequeños viales que se conservaron congelados (~20ÓC) hasta el momento de su utilización. 11.2.7.2.— Extracto enzimático de eritrocitos Para obtener el extracto de eritrocitos, se sometió a éstos, a un proceso de hemólisis por la adición de saponina al 0.2%. La saponina extrae las fracciones de enzimas (PFK, *11<> asociadas a las membranas plasmaticas de eritrocitos en dilución 1:3. El hemolizado se congelO, descongeló y se centrifugó a 14.000 xg durante 30 minutos a 400. El sobrenadante obtenido se utilizó para las determinaciones enzimáticas. ¡¡.2.7.3.— Extracto enmimático de granulocitos Las determinaciones enziináticas de granulocitos, se realizaron con las células obtenidas en el cultivo “in vitro” de larga duración de médula ósea, a la 3~ semana de 66 cultivo. Las células se obtuvieron según se indica en 11.2.3. La suspensión celular se ajustó a una concentracción celular de 10~ células/mí, a continuación se sometió a congelación y descongelación, y posteriormente se homogenizó a 840 xg durante 2 minutos. Finalmente, el homogenado se centrifugó a 14.000 xg durante 30 minutos a 400. El sobrenadante obtenido se fraccionó en viales y se mantuvo congelado <~20oC) hasta su utilización. ¡¡.2.8.— Determinación de la actividad enzimática de las enzimas glicoliticas ¡¡.2.8.1.— Determinación de la actividad hexoquinasa La actividad hexoquinasa se determinO midiendo espectrofotométricamente a 340 nm, la velocidad de reducción del NADP, según el método de Mc Leod y col <1963) que utiliza un sistema acoplado a glucosa 6— fosfatodehidrogenasa (G6PD>, según el siguiente esquema de reacción: Glucosa + ATP HK > G6P + ADP G6P + NADP G6PD > EP-gluconato + NADPH + La cantidad de NADP reducida por unidad de tiempo es proporcional a la actividad hexoquinasa. 67 Los reactivos y sus concentraciones en cubeta para cada una de las poblaciones celulares estudiadas, se indican en el apartado ¡¡¡.2 ¡¡.2.8.2.- Determinación de la actividad fosfofructoquinasa La actividad fosfofructoquinasa se determinó midiendo espectrofotométricamente a 340 nin la velocidad de oxidación de NADH, según el método de Layzer (1975> que utiliza un sistema acoplado de aldolasa, triosafosfato isomerasa (TIM) y glicerolfosfato dehidrogenasa F 1,6-bP + ADP aldolasa DHP F l,6bP fi GAP 2 DHP + 2 NADH + 2 H~ GDH~ L<-) Glicerol La cantidad de NADPH oxidado por unidad de en relación 2:1 con la F6P que se fosforila. TIM 3-P + NADP tiempo está Los reactivos utilizados en los ensayos, y sus concentraciones en cubeta, se indican en el apartado 111.2 ¡¡.2.8.3.- Determinación de la actividad piruvatoquinasa La determinación de la actividad piruvatoquinasa, se 68 nm es de 6,22 ío3 mol V1 cnCt (Horecker y Kornberg,1948). ¡¡.2.9.- Estudio de la unión de tranaferrina en células de médula ósea 11.2.9.1.— Marcaje de transferrina humana Se utilizó transferrina humana comercial <10 mg/ml en PES, Sigma Chemical>. El marcaje de la transferrina saturada de hierro con Na125I se realizó en presencia de un antioxidante (cloramina T) inmovilizado en bolitas de poliestireno (Iodobeads, Pierce). De ésta forma el procedimiento de marcaje es menos agresivo para la proteína ya que no es necesario usar agentes reductores (Markwell,1982>. Protocolo experimental: se disuelven 100 pg de transferrina en 0,1 ml de PBS 0,05 14 pH 7,4 quedando una concentración final de 1 mg/ml. A continuación, se incuba durante 30 minutos en baño de hielo con 0,5 mCi Na125I en presencia del catalizador de la mezcla y se cuantifica la radioactividad total (la debida a la que se ha unido a Tf y la de el 1251 libre) ésta será el 100% de actividad para determinar posteriormente el rendimiento de incorporación. Para eliminar el exceso de Na25I se separa la 70 proteína mediante filtración en gel con Sephadex G-25, a continuación se recogen las fracciones y se cuantifica la radioactividad. Se utilizan las fracciones en las que aparece la mayor radiactividad. ¡¡.2.9.2.— Incubación de las células con transferrina Los ensayos de unión con células de médula ósea, se realizaron previa obtención de la suspensión de médula tal como se indica en el apartado 11.2.2. Se incubaron 0,7—0,9 ío~ células/ml con cantidades crecientes de 1125—transferrina <0,5—30 pg/ml) en un volumen final de 0,3 ml de HBSS con 1% de BSA. Los tubos se gasearon con un 5% CO 2 y se incubaron durante 90 minutos a 4 0C con agitación permanente. Después del periodo de incubación, se lavaron las células 3 veces con HBSS y se midió la radioactividad en un contador gamma. Para calcular la unión no específica se realizaron incubaciones paralelas con transferrina no marcada en una proporción 200 veces superior a la de 1125—transferrina. Los datos se analizaron con un método de regresión no lineal capaz de utilizar los valores de unión total directamente. Con este fin, se utilizó el programa Ligand 8% en relación 1:3 y se mantuvo en bafio de hielo al menos 5 minutos para asegurar la total precipitación de las proteinas. A continuación, se centrifugó a 2.200 xg durante 10 mm. El sobrenadante obtenido se utilizó para la determinación del 2,3 BPG. En estas condiciones, las muestras son estables durante 2 semanas a 400; no obstante las determinaciones de 2,3 BPG se realizaron siempre el mismo día de la extracción de sangre. Los niveles intracelulares de 2,3 BPG, se determinaron según el método de Lowry y col (1964> modificado por Rose y Liebowitz (1970). El método consiste en la conversión del 3-PGA a gliceraldheido—3—fosfato en un sistema de reacciones acoplado a 3-fosfogliceratofostoquinasa 1,3 BPG + ADP 1,3 BPG + NADH ~‘~-~-> 032 + NAO El descenso de absorbancia a 340 nm, debido a la oxidación de NADH es proporcional a la concentración de 2,3 BPG presente en la célula. La mezcla contenía en un volumen final de 1 mí: Tampón trietanolamina pH 8, 160 mM; NADH 0,1 mg/mí; ATP 3,3 mg/mí; 0,25 ml de muestra se agitó, y a continuación se añadieron las enzimas GAPD 5,3 UI/mí; 201< 3 UI/mí; PGM 15,8 UI/mí. Esta mezcla se agitó, se dejó reposar 5 mm y se leyó la absorbancia a 340 nm frente a agua destilada. A continuación, se añadió 0,66 mM de ácido fosfoglicólico, se incubé durante 15 mm a 370C y se registró la absorbancia a 340 nm una vez completada la reacción. Para la realización de los cálculos, se halla la diferencia entre las absorbancias registradas antes y después de la adición de fosfoglicólico y se corrige según la dilución de este compuesto. Para calcular la concentración de 2,3 BPG, se aplica la siguiente expresión — E NADH x Vmuestra x d 73 en la que: y total es el volumen de la mezcla de reacción en cubeta. E. es el coeficiente de extinción molar de NADH a 340 nm. V muestra es el volumen de la muestra problema en cubeta. d es el paso óptico de la cubeta. Su valor es 1 cm. Los valores de 2,3 BPG se expresan como gmol/ml de sangre. 11.2.11.— Determinación de los niveles de 0% La determinación de la generación de anión superóxido se realizó cuantificando la reducción del ferriciticromo c según una modificación del método descrito por Babior y col <1973). La mezcla de reacción contenía para ambas cubetas (referencia y muestra): 50 nmol de ferricitocromo c, granulocitos <ío6 células del LTBMC y 5x105 células de sangre periférica) y HBSS suplementado con glucosa. A la cubeta de referencia se añadió 50 131/ml de SOD. Ambas cubetas se estimularon simultáneamente con 1 gg de PIlA y se registró el cambio de absorbancia a 550 nm. La concentración de 0% producido, se calculó al dividir el incremento de absorbancia entre el valor del 74 coeficiente de extinoción molar del ferricitocromo c que es de 21,1 mW1 cm’. Los resultados se expresan como nmol 07/mm/lO6 células. El tiempo de activación (lag time) se calculó determinando el punto de interseción entre la porción curva antes de la activación y la parte lineal después de la misma. Los resultados de este parámetro se expresan en segundos. 11.2.12.— Determinación de heoglobina El método utilizado fue el de la cianmetahemoglobina . Esta técnica separa las proteinas en función del punto isoeléctrico en la primera dimension y del peso molecular en condiciones desnaturalizantes en la segunda dimension. Se utilizaron granulocitos de animales 6 meses después de la irradiación y a la 42 semana de cultivo. Paralelamente, se utilizaron células obtenidas de cultivos establecidos con animales control de la misma edad. PreDaración de la muestra Se recogieron las células del sobrenadantedel LTBMC según se indica en ¡¡.2.11 y se resuspendieron en tampón de lisis. Las muestras se distribuyeron en viales que se mantuvieron a -70W hasta el momento de aplicarlos a la primera dimensión. El método seguido para la primera dimensión fue el desarrollado por O’Farell y col <1977). 76 El gel contenía urea 5,5 g; solución de acrilamida 1,3 mí; NP—40 10%; anfolitos para un rango de pH 5—7 y 3—10. Una vez mezclados los reactivos, se degasifica la urea y se añade el catalizador (TEMED> y el iniciador de la reacción (APS> <10%>. Con esta mezcla se cargan los tubos y se deja polimerizar durante 3 horas, tras las cuales, los geles se transfieren a una cámara de electroforesis y se llena el reservorio con P04H3 10 mM. A continuación, se realiza la precorrida de los geles, para eliminar los iones sulfato de APS y así el sistema queda dispuesto para cargar las muestras. La capacidad de carga del gel, depende de la naturaleza de la muestra aplicada. En nuestro caso, se aplicaron 111 gg de proteina tanto para la nuestra de animales control como de irradiados. La concentración de células de la muestra control fue de 358 ío~ células/ml y la de la muestra de irradiado de 186 l0~ células/ml. En la primera dimensión, los geles se dejaron correr durante 18 horas a 1000 V, finalmente se equilibraron durante 10—15 minutos para eliminar los anfolitos y la urea y así, permitir la interacción de las proteinas con el SOS, de éste modo quedan preparados para aplicarlos a la segunda dimensión. La electroforesis de la segunda dimensión, se realizó según la técnica de geles en placa con hendidura , usando el sistema de geles discontinuos con 77 SDS descrito por Laemmli (1970>. Se preparó el gel de resolución y el gel de concentración como indica Laemmli (1970). A continuación, se aplicó el gel de la primera dimensión en la parte superior de la placa de la segunda dimensión. Una vez selladas las placas, se recubren con agarosa y se colocan en la cámara de electroforesis. Finalmente, se añade el tampón de corrida en los tanques de la cámara, se conectan los electrodos y se dejan correr los geles durante toda la noche a corriente constante (12- 15 mA). Al final del proceso, se separaron las placas de las cámaras y se procesaron los geles por el método de tinción con plata. El método de tinción utilizado fué el descrito por Morrissey JH <1981). Este método consiste en prefijar el gel durante 30 minutos en una solución de metanol 50% y ácido acético 10%, a continuación se incuba de nuevo el gel en una solución de metanol 5% y ácido acético 10%. Seguidamente se fija el gel en glutaraldehido 10% durante 30 minutos y se lava con agua destilada durante 2 horas mediante pases sucesivos. A continuación, se incuba el gel en una solución de DTT (5 gg/ml> durante 30 minutos; se retira la solución de DTT y se incuba en una solución de nitrato de plata 0,1% durante 30 minutos. Por último, se lava el gel con agua destilada y con una pequeña cantidad de solución de revelado formada por formaldehido 0,018% y carbonato sódico 3%. Para alcanzar el nivel de tinción adecuado, se introduce el gel en una nueva solución de revelado. 78 11.2.15.— Valoracion de datos El tratamiento estadístico de los valores experimentales obtenidos, se ha realizado mediante el cálculo de media aritmética , desviación típica (DS) y error estandar . Se calculó la significancia estadística por la distribución de Student, que es una correción de la distribución normal de frecuencias para pequeños muestreos (Spiegel,1970>. Con el cálculo de la “t” de Student para distintas probabilidades, evaluamos la mayor o menor probabilidad de que la diferencia de un resultado con otro sea o no estadisticamente significativa. Se calcularon los limites de confianza a partir de los cuales la diferencia es altamente significativa (***, p< 0,001); muy significativa (**, pc 0,01); significativa <*, p< 0,05>. 79 RESULTADOS III. - RESULTADOS 111.1.— ESTUDIO DEL DANO RESIDUAL EN POBLACIONES CELULARES HEMATOPOYET¡CAS Para cuantificar el daño hematopoyético residual inducido por una dosis subletal de 5 Gy, hemos determinado algunos parámetros celulares que reflejan el estado de la médula ósea tras la irradiación. La tabla 1 resume los resultados obtenidos respecto a diversos parámetros de la hematopoyesis de ratón a diferentes tiempos después de la irradiación. Con respecto a las células nucleadas en sangre podemos indicar que no se observan diferencias entre animales control e irradiado en los tiempos postirradiación analizados superiores a un mes. El valor hematocrito a estos tiempos después de la irradiación, tampoco está significativamente afectado Representación de Scatchard de los unión específica para células de médula ósea. Condiciones experimentales: 0,7—0,9 108 células/ml y 0,5—30 gg/ml transferrina. de médula datos de A 4 3,5 3 2,5 2 ‘.5 1 0.5 o 1.5 7 16.25 Total U/L 0~2 0,15 0,1 0,05 a o 1.2 1.36 1.50 1.66 2 Tabla 2.- Capacidad de unión de transferrina (Bmax) y constante de asociación ; mientras que para los otros tiempos postirradiación no se observan diferencias significativas. De los resultados obtenidos, respecto a las alteraciones que la irradiación induce en el metabolismo glicolitico de células de médula ósea, podemos concluir que sólo se produce una disminución significativa en la actividad PK a 1 mes postirradiación, mientras que las actividades de HE y PFK no muestran modificaciones significativas durante el periodo analizado. 93 Medula osea Actividad Hexoquinasa 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 o -6 (UI/lO cels>1O 3 ?ig.2.— Actividad hexoguinasa en células de médula ósea a diferentes tiempos despuésde la irradiación. Los valores expresanx±ES.Número de experimentos 3—4 para cada punto. 1 3 6 12 Meses Medula osea Actividad Fosfofructoquinasa .3 119.3.— Actividad ósea a diferentes valores expresan cada punto. fosfofructoquinasa en células de médula tiempos después de la irradiación. Los x±ES. Número de experimentos 3—4 para -6 (UI/lO cels)1O 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 o 1 3 6 12 Meses Medula osea Actividad Piruvatoquinasa -6 (UI/lO cels)1O -3 Fig.4.— Actividad piruvatoguinasa en células de médula ósea a diferentes tiempos después de la irradiación. Las valores expresan x±ES. Número de experimentos 3—4 para cada punto. (**) p tampoco existen diferencias entre los animales tratados y control. Los niveles de 2,3—BPG encontrados en eritrocitos de animales control e irradiados guardan relación 97 equimolecular con los niveles de Hb presentes en la célula, tanto a los 6 como a los 12 meses después de la irradiación. Así mismo, en cuanto a los niveles de proteina expresados por ml de eritrocitos (Tabla 3>, no se observan tampoco diferencias entre los animales irradiados y los controles a lo largo del periodo estudiado (3, 6 y 12 meses) 98 Tabla 3.— Niveles de 2,3 BPG, hemoglobina y proteína en eritrocitos a diferentes tiempos después de la irradiación. 2, 3-BPG (pmol/ml) hemoglobina (pmol/ml) proteína (mg/mí> 6, 8±0,80 7,0±0,60 6,9±0,95 6,6±1,30 8, 2±0,85 7, 4±1,30 8,3±0,40 7,8±0,22 9,3±0,74 9,7±0,57 Tiempo (meses) 3 C 1 6 12 C 1 o 1 317±27 325±21 3 53±27 297±48 2 68±38 324±49 O: control; 1: irradiado. Valores expresan x±ES. N=3—12. Cada experimento corresponde a un ratón. 111.4.2.- Actividad de HK, PPK y PK en eritrocitos Dado que la glicolisis es la ruta metabólica fundamental del eritrocito, hemos estudiado la posible variación de los niveles de actividad de las 3 enzimas glicoliticas correspondientes a extracto crudo de eritrocitos, a lo largo de 15 meses después de la irradiación. Los niveles de actividad Hexoquinasa se indican en la figura 5. Se destaca una disminución significativa 10 liq.5.— Actividad hexoquinasa en eritrocitos a diferentes tiempos después de la irradiación. Los valores expresan x±ES.Número de experimentos 3 para cada punto. C*)pc0.O5 2,5 2 1,5 1 0,5 o 3 6 12 15 Meses Eritrocitos Actividad Fosfofructoquinasa -6 —~ (UI/lO cels)1O Fiq.6.- Actividad fosfofructoquinasa en eritrocitos a diferentes tiempos después de la irradiación. Los valores expresan x±ES. Número de experimentos 3 para cada punto. (**> pcO.0l. 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 o 3 6 12 15 Meses Eritrocitos Actividad Piruvatoquinasa -8 (UI/lO cels>1O —3 Fig.7.— Actividad piruvatoquinasa en eritrocitos a diferentes tiempos después de la irradiaci6n. Los valores expresan x±ES. Número de experimentos 3 para cada punto. (*) p. A los 12 meses después de la irradiación la diferencia en la producción de 02 entre células de animales tratados y de control se mantiene en 2,1 veces. Esta diferencia es también estadisticamente significativa 6 12 nmol 02/min/10 6 cei. O 0,72±0,04 1 1,36±0,02 1,10±0,04 2,30±0,40 Tiempo activación mg protelna/106 cel O 72,00±15,50 1 85,70±15,60 O 0,24±0,02 1 0,33±0,02 N=3—7. CadaO: control; 1: irradiado. valores expresan x±ES. experimento corresponde a un rat6n. 111.5.2.— Niveles de producción de 02 en granulocitos de LTMDC. Para analizar los parámetros que están implicados en los cambios funcionales observados en sangre periférica, establecimos cultivos de larga duración de médula ósea (LTBMC) que permiten obtener poblaciones homogéneas de granulocitos, a partir de la activa proliferación de precursores hematopoyéticos adheridos al estroma celular. Como ya indicamos en el apartado 1.3.1., el cultivo de larga duración de médula ósea es un sistema de cultivo ‘Un vitro” que mimetiza la hematopoyesis que se produce «in vivo” y permite estudiar el posible daño residual en las células hematopoyéticas y en el estroma hematopoyético. Los granulocitos obtenidos del sobrenadante del cultivo de larga duración de médula ósea, se han utilizado, para determinar los niveles de producción de 02. Los cultivos se establecieron 6 y 12 meses después de la irradiación; paralelamente, se establecieron cultivos de médula ósea de animales control de la misma edad. Las determinaciones de los niveles del se realizaron entre la 31 y 61 semana de cultivo. Los resultados se expresan en la figura 8. Como se puede observar, a los 6 meses de la irradiación los granulocitos de animales irradiados muestran un aumento en 106 la producción de 02 tanto en la 3* como en la 41 y 58 semana de cultivo, respecto al control. Estos incrementos son significativos estadisticamente (p p<0.OOl. 14 12 - 10 - 8- 6- 4- 2- m Control Irradiado ** ~1 o 3 Granulocitos Tiempo de activación (seg) 120 tiempo Iag (seg> 100 - 80-1 60 - 40 - 20 o 3 4 6 5 4 Meses 5 12 6 Fig.9.- Tiempo de activación en granulocitos de LTBMC a los 6 y 12 meses después de la irradiación a diferentes semanas de cultivo. Los valores expresan x±ES.Número de experimentos 3-11 para cada punto. (***> pcO.0O1. m Control Irradiado 1 1rr 111.5.3.— ActivIdad de NR, flR y PR en granulocitos de LTDMC Canto ha sido indicado anteriormente, la glicolisis es la ruta fundamental de obtención de energia que poseen 105 granulocitos, de aid la importancia del estudio de las enzimas claves de esta ruta. El estudio se ha realizado determinando los niveles de actividad enzimática de la Hexoquinasa, Fosfofructoquinasa y Piruvatoquinasa en granulocitos obtenidos a la 31 semana del cultivo de larga duración de médula ósea, a diferentes tiempos postirradiación y a lo largo de un año. Las figuras 10, 11 y 12 muestran los niveles de actividad obtenidos para las tres enzimas glicoliticas estudiadas (HK, PFK y PK) a diferentes tiempos postirradiación (1,5; 3; 6; y 12 meses). Los niveles de actividad obtenidos para la HK . A los 12 meses después de ‘lo la irradiación, no existen diferencias en la actividad enzimnática de animales tratados respecto al control. Los niveles de actividad enzimática para la PK se indican en la figura 12. Podemosobservar un incremento en los niveles de actividad a 1,5; 3 y 12 meses de la irradiación. Estos incrementos son estadisticamente significativos con valores de pcO,05 a los 1,5 y 3 meses de la irradiación y de pc0,01 a los 12 meses. Al contrario de lo observado a otros tiempos, la actividad PK a los 6 meses de la irradiación no muestra diferencias con el control. De los resultados obtenidos respecto a los niveles de actividad enzimática de ¡IX, PFK y PK, podemos indicar que, en los granulocitos obtenidos de animales irradiados existe un incremento neto en los niveles de actividad de las enzimas glicoliticas. Este incremento se mantiene a los 12 meses de la irradiación en el caso de la PR, por el contrario las actividades ¡IX y PFK no muestran diferencias respecto al control para este mismo periodo de tiempo. 111 Granulocitos Actividad Hexoquinasa -8 (UI/lo cels)10 -3 Fig.1O.- Actividad hexoquinasa en granulocitos de LTBHC a diferentes tiempos después de la irradiación a la 31 semana de cultivo. Los valores expresan x±ES. Número de experimentos 3—6 para cada punto. <*) p<0.05; <**) p<0.0l 16 14 12 10 8 6 4 2 o 1,5 3 6 12 Meses Granulocitos Actividad Fosfofructoquinasa -8 (UI/lO cels>10 -3 Fig.fl.— Actividad fosfofructoquinasa en granulocitos de LTBMC a diferentes tiempos despuésde la irradiación a la 30 semanade cultivo. Los valores expresanx±ES.Número de experimentos 3—6 para cada punto. <**) p10 Actividad Piruvatoquinasa -3 Fig.12.— Actividad piruvatoquinasa en a diferentes tiempos después de la semana de cultivo. Los valores expr experimentos 3-6 para cada punto. (*> granulocitos de LTBMC irradiación a la 3’ esan x±ES. Número de p de ¡IR, PFK y PR para los animales control e irradiado de los distintos tipos celulares analizados. Nuestras determinaciones de los niveles de actividad 119 111< indican que, la actividad de esta enzima es superior en eritrocitos que en células de médula ósea total. El resultado encontrado por nosotros, puede ser justificado por la necesidad de incrementar los niveles de G6P para iniciar la ruta de las pentosas fosfato y obtener el poder reductor necesario para la célula. El aumento observado en los niveles de actividad HK al comparar células de médula con granulocitos, podría justificarse por la necesidad de un incremento en los niveles de G6P para seguir la ruta de las pentosas fosfato y obtener NADPH necesario para la actividad del sistema oxidasa, responsable de la producción de 0%. Los valores de actividad PFK y PR disminuyen de médula ósea a eritrocitos para animales control y tratados. Este resultado esta de acuerdo con la disminución descrita para las enzimas glicoliticas durante los procesos de diferenciación celular en el sistema hematopoyético de diversas especies (Rodriguez-Horche y col.,1988; Gaitán y col. ,1989) Los niveles de actividad PER y PK aumentan de médula ósea a granulocitos. Este aumento está asociado a la necesidad energética de los granulocitos para cumplir la fagocitosis, proceso en el que la glicolisis adquiere especial relevancia e irradiados . Los ensayosse realizaron, estableciendo cultivos con distintas concentracciones <10%, 20% y 40%) del sobrenadantede los LTMBC de animales irradiados. Paralelamente, y como control, se establecieron cultivos con el 10% de medio condicionado de la línea celular Wehi— 3b fuente de IL—3 como factor estimulador de colonias. Los resultados, representadosen la figura 18 muestran el número de colonias originadas en función de la fuente de CSFs utilizada. Como se puede observar> los sobrenadantes de LTBMC establecidos con médula ósea de ratónes irradiados 12 mesesantes son muy activos, mientras que los sobrenadantes de los cultivos de ratón control presentan una escasacapacidad de estimular la formación de colonias GM. Las colonias obtenidas fueron pequeñasy compactas, el análisis mediante tinción con May—Grunwald Giemsa, indicó que estaban formadas por granulocitos y macrófagos. 130 Estroma hematopoyético Expresión precursor CFC-GM a colonIas/lO células Fig.l8.— Expresión del precursor CFC—GM utilizando como factor estimulante de colonias,los sobrenadantes y en el estado proliferativo de ambos tipos celulares después de una irradiación y de la capacidad que poseen de reaccionar con el Fe+ y así impedir las reacciones de radicales libres que dependende este elemento . El número de precursores hematopoyéticos se estabiliza en niveles subóptimos comprendidos entre un 40% y un 50%. A partir de este momento los precursores adqueririan una mayor capacidad proliferativa, incrementando su porcentaje en fase de síntesis a lo largo de la vida del animal (Tejero y col.,1988), lo que implicaría, que en estas células haya un incremento en las necesidadesenergéticas (Vora,1983; Oskam y col.,1985). La complejidad de la médula ósea, en la que tan sólo un 3% son precursores hematopoyéticos, justifica que tal incremento energético no se vea reflejado en aumentosglobales de la actividad HK, PFK y PK a largos tiempos postirradiación. Estos resultados, junto a los obtenidos en el apartado anterior, ponen de manifiesto que en la población mayoritaria de este tejido, células de proliferación y tránsito, no se produzcan modificaciones de caracter residual como consecuenciade una irradiación 141 subletal. Los valores absolutos de actividad HK, PFK y PK obtenidos en células de médula ósea, tanto de animal control como irradiado son del mismo orden de magnitud a los descritos en diversas lineas celulares. Así, la actividad mc guarda similitud con la descrita en la línea celular H—EP—2 derivada de un carcinoma de laringe y con la línea MRC5 derivada de fibroblastos normales. Los niveles de actividad PFK son similares a los descritos en la línea supresora ESH—P6 y las lineas celulares normales rcc 1-3 y rcc 1-4. Y la actividad PK guarda relación con la encontrada en la línea celular ESH 2—6 designada como línea supresiva , pueden producirse alteraciones en la función o en el metabolismo de estas células. Así, se han descrito cambios en los niveles de actividad de enzimas de diversas rutas metabólicas en eritrocitos como consecuencia del tratamiento citotóxico (Etiemble, 1979; Janseny col. .1985). En relación a la posible alteración de los niveles de proteína, hemoglobina y 2,3-BPG se ha descrito que el factor GM-CSF induce la transcripción y síntesis de proteínas 1988> En resumen, los resultados presentados en este apartado, en cuanto a los niveles de producción de 0%, tiempo de activación, niveles de actividad enzimática y proteínas a distintos tiempos después de la irradiación, nos permiten plantear que, los aumentos encontrados en estos parámetros son reflejo de un daño residual en el sistema hematopoyético en el cual, el estroma hematopoyético podría ejercer un papel primordial mediante la producción de CSFs. IV.5.— IMPLICACIONES DEL ESTRONA EN LA HEXATOPOXESIS DEL RATON Si bién, los mecanismos responsables del daño residual no son del todo conocidos, ha sido ampliamente indicado en la literatura que el estroma hematopoyético tiene un papel fundamental en el desarrollo de este tipo de daño . La respuesta de las células del estroma a la irradiación es muy variable, dependede la cepa del animal, de la dosis y de la tasa de dosis aplicada. 154 Por otro lado, a causa de la baja capacidad de recambio de estas células, los tiempos en los cuales se expresa y regenera el daño producido trAs la irradiación son en general elevados. La dosis máxima de irradiación que permite la recuperación del estroma depende de la cepa del ratón, de la dosis y de la tasa de dosis aplicada (Bierckens y col,1989). Nuestros resultados señalan que, la irradiación global y aguda del ratón con 5 ay, daña el estroma hematopoyéticoy éste no se recupera a lo largo de un año despuésde la irradiación. Con el fin de comprobar la implicación de los CSFs en el desarrollo del daño hematopoyético residual observado, determinamos la presencia de CSFs, en los sobrenadantesde los cultivos establecidos con animales irradiados, a través de ensayosclonales de CFC—GM. Como se observa en la Figura 18, los sobrenadantesa distintas concentraciones, 12 meses después de la irradiación, son capaces de estimular la proliferación del precursor CFC-GM. El análisis morfológico de las colonias indicó que estaban formadas por granulocitos y macráfagos, lo cual nos permite apuntar la posibilidad de que factores con rango de acción sobre el precursor CFC—GM sean los liberados por las células del estroma trAs la irradiación. Finalmente, y para corroborar que los factores liberados por el estroma hematopoyético son los responsables de la activación de la capacidad fagocitica de los granulocitos, realizamos los experimentos que se 155 representan en la fig.19, en donde se observa que, los sobrenadantesde LTBMC de animales irradiados son capaces de aumentar los niveles de producción de 0% de células control al ser incubados 3 h a 37QC con ellos. Este resultado demuestra la hipótesis descrita en esta memoria según la cual> los responsables del incremento en la producción de 0% son factores hematopoyéticos liberados por el estroma trAs la irradiación. Los resultados expuestos en esta memoria ponen de manifiesto la existencia de una relación entre daño residual en el estroma, activación en la funcionalidad de células maduras y alteraciones en el compartimento de precursores y, nos permiten establecer una sucesión de acontecimientos en la hematopoyesis del ratón trAs la irradiación. Estos consisten en una deplección de precursores hematopoyéticos y posterior caida de células maduras, si bién el síndrome se corrige en un periodo próximo a un mes . Series VI,2. Pergamon Press, London, 2: 1—10 -BAZIL, G.W., HAYNES, M., GARLAND, J. yDEXTER, T.M. <1983). Characterization and partial purification of a haemopoietic celí growth factor in Wehi-3 celí conditioned medium. Siochem. 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