UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA EFECTOS ANTIISQUEMICOS DEL BLOQUEANTE DE LA Ca2~-ATPasaDEL RETICUILO SARCOPLASMICO, ACIDO CICLOPIAZONICO, SOBRE LA ISQUTEMIA EX~RJN4EN1AL DEL CORAZON DE CONEJO TESIS DOCTORAL Martín del Avellanal caladilk Madrid 1996 9 ‘giL INFORME DEL DIRECTOR DE LA TESIS INFORME DEL CONSEJO DE DEPARTAMENTO El Consejo del Departamento de Farmacologia, Facultad de Medicina, INFORMA FAVORABLEMENTE la presentación y defensa del trabajo presentado por O. MARTIN DEL AVELLANAL CALZADILLA dirigido por el Prof. Santos Barrigón Vázquez, Profesor Titular de este Departamento. Madrid, 15 de Noviembre 1996 Fecha reunión Consejo Departamento 14—11—1 996 ¡ Director del Departamento Fdo.: Prof. P. LORENZO SANTOS BARRIGON VAZQUEZ, PROFESOR TITULAR DEL OPTO. DE FARMACOLOGíA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID INFORMA: Que el trabajo de investigación realizado bajo mi dirección por O. MARTIN DEL AVELLANAL CALZADILLA reune los requisitos y condiciones necesarias para ser defendido como Tesis Doctoral. Madrid, 14 de Noviembre de 1996 V~ B~ EL TUTOR (2) El Director de la Tesis Fdo.:_____________________ do.: 5. BARRIGON VA O (Fecha y firma> (Fecha y firma) DNI ONI 12.202.353 (Fecha y firma) AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido realizadoen el Dpto de Farmacologíade la Facultadde Medicinade la UniversidadComplutensede Madrid, bajo la direccióndel Dr. SantosBarrigónVázquez,aquienexpresomi mássincera gratitud por su amistad, dedicación y apoyo llevados al extremo. Igualmentequiero agradecerla infinita pacienciade su familia (Pilar, María, Laura y Enrique), a quien he robado no pocos momentos de intimidad y descanso. Expreso mi gratitud a todo el Departamentode Farmacologíala colaboracióny ayudaqueme han prestadoen estetiempo. El estudiode microscopiaha sido realizadoen el Dpto de Anatomía Patológicadel HospitalGeneralUniversitario GregorioMarañón,bajo la dirección del Dr. Emilio Alvarez Fernández,Jefe del Departamentoy Profesor Titular de esta Universidad. Quiero dejar constanciade mi agradecimientopor su disponibilidady porlas facilidadesquehaprestado parallevar a caboel estudioultraestructural. Los análisisde solucionesy la determinaciónde enzimasde necrosis en el efluente se realizaron en el Servicio de Bioquímica del mismo Hospital,expresandoen conjuntomi gratitudatodoscuantoscolaboraron. Por último, agradecer el ánimo prestado en el Servicio de Anestesiologíay Reanimacióndel HospitalGeneralUniversitarioGregorio Marañón. EFECTOS ANTISQUEMICOS DEL BLOQUEANTE DE LA Ca2~-ATPasaDEL RETICIJLO SARCOPLASMICO, ACIDO CICLOPIAZONICO, SOBRE LA ISQUEMIA EXPERIMENTAL DEL CORAZON DE CONFiO Martín del Aveflanal Calzadilla Madrid 1996 - INDICE. 1.- ~ODUCCION . 1 1.1.- BASES ESTRUCTURALES DE LA CONTRACTILIDAD MIOCARDICA 6 1.1.1.-MIOSINA 9 1.1.2.-ACTINA 10 1.1.3.-TROPOMIOSINA 11 1.1.4.-TROPONINA 11 1.1.5.-TEORIA DEL DESLIZAMIENTO 13 1.2.- ACOPLAMIENTO EXCITACION-CONTRACCION.. 15 1.2.1.-MECANISMOS DE ENTRADA DE Ca1~ A TRAVES DEL SARCOLEMA 19 1.2.2.-MECANISMOS DE SALIDA DE Ca2~ ATRA VES DEL SARCOLEMA 21 1.2.2.1.-BOMBA DE Ca2~-ATP-DEPENDIENTE 22 1.2.2.2.-INTERCAMBIÁDOR Na~ICa2~ 23 1.2.3.-FUNCION DEL RETíCULO SARCOPLASMICO 24 1.2.3.1.-SALIDA DE Ca2~ RETíCULO SARCOPLASMICO. CANALES DE Ca2~ 25 1.2.3.2.-ENTRADA DE Ca2~ AL RETICLJLO SARCOPLASMICO. BOMBA DE Ca2~ ATP-DEPENDIENTE 29 1.2.3.3.-ALMACENAMIENTO DE CALCIO EN EL RETíCULO SARCOPLASMICO. PROTEINAS LIGADORAS DE CALCIO 31 1.2.3.4..-IMPORTANCIA RELATIVA DEL RS SEGUN ESPECIES 31 1.2.4.- FUNCION DE LA MITOCONDRIA 34 1.2.5.-FUNCION DEL SARCOLEMA 34 1.3.- ISQUEMIA MIOCARDICA 37 1.3.1.-FISIOPATOLOGL4DE LA ISQUEMIA 37 1.3.1.1.- DIFERENCIAS IHPOXIA ISQUEMIA.... 39 1.3.1.2.-ALTERACIONES METABOLICAS E IONICAS 40 1.3.1.3.-ALTERACIONES ELECTROFISIOLOG.49 1.3.1.4.-ALTERACIONES DE LA EXPRESION GENICA 50 1.3.1.5.-ALTERACIONES FUNCIONALES 51 1.3.1.6.-ALTERACIONES ESTRUCTURALES.... 53 1.3.2.-MIOCARDIO “HIBERNADO” Y “CONTUNDIDO” 55 1.3.3.-PRECONDICIONAMIENTO ISQUEMICO 59 1.3.4.- FISIOPATOLOGIA DE LA REPERFUSION MIOCARDICA 61 1.3.4.1.-FENOMENOSRESPONSABLESDEL DANO INDUCIDO PORREPERIFUSION 61 1.3.4.2.-REPERFUSIONDE MIOCITOS CON DANO REVERSIBLE 65 1.3.4.3.-REPERFUSIONDE MIOCITOS CON DANO IRREVERSIBLE 66 1.3.4.4.-PAPELDEL CALCIO EN EL DANO INDUCIDO POR REPERFUSION 68 1.4.- INHIBIDORES DE LA Ca2~-ATPasaDEL RS 72 1.4.1.-ACIDO CICLOPIAZONICO 72 1.4.2.-THAPSIGARGINA 74 II.- PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS 76 Hl.- MATERIAL Y METODOS 81 111.1.- PROCEDIMIENTOEXPERIMENTAL. SISTEMA DE DIGITALLZACION 82 111.1.1.- MEDIDA AUTOMATIZADA DE LAS CONTRACCIONES 86 111.2.-EFECTOSDEL CPA SOBREPARÁMETROS CONTRÁCTILES 98 111.2.1.-CURVAS DOSIS-EFECTOY EXPERIMENTOS CONTROL 98 111.3.-ESTUDIOSSOBREPARAMETROS DE CONTRACTILIDAD EN ISQUEMIA 99 [11.3.1.- ISQUEMIA GLOBAL. TECNICA GENERAL. EXPERIMENTOSCONTROL 99 m.3.2.- EXPERIEMNTOSCON CPA EN ISQUEMIA.. 100 111.4.-ESTUDIOSSOBREPARAMETROSBIOQUIMICOS.... 101 111.5.-ESTUDIOSSOBREPARÁMETROSMORFOLOGICOS.102 111.6.-ANALISIS ESTADíSTICO 104 111.7.-FARMACOS Y OTROSPRODUCTOS 104 IV.- RESULTADOS 105 IV.l.- ANALISIS INThRGRUPODE LA HOMOGENEIDAD DE LOS GRUPOSDE ANIMALES Y CONDICIONES DE EXIPERIMiENTACION 106 IV.- EFECTOSDEL CPA SOBRECONTRACTILIDAD MIOCARDICA 108 IV.2.1.- CURVAS DOSIS-EFECTOACUMULATIVAS 108 IV.2.2.- EFECTOSUNITARIOS DEL CPA 10.6 Y io-~ M....ll1 IV.3.- EFECTOSDE ISQUEMIA-REPERFUSIONSOBRE PARAMiETROS CONTRÁCTILES 122 IV.3.1.- EFECTOSDE LA ISQUEMLAL DE 30 MINUTOS SEGUIDA DE 30 MiN DE REPERFUSION 122 IN.3.2.- CARACTERíSTICASCINETICAS DE LA MODIFICACION DE LOS PARAMETROS CONTRÁCTILES POR LA ISQUEMIA 132 IV.4.- EFECTOSDE LA ISQUEMIA-REPERFUSIONSOBRE PARÁMETROSBIOQUIMICOS 143 IV.5.- EFECTOSDE LA ISQUEMIA-REPERFUSIONSOBRE PARAMETROSMORFOLOGICOS 148 y.- DISCUSION 156 VI.-CONCLUSIONES 191 Vil.- ANEXOS 195 VIII.- BIBLIOGRAFL4 229 1. 1.- INTRODUCCION 2 En lasúltimas cuatrodécadasla cardiopatíaisquémicaha sido la causa de modalidad más importante en los paises industrializados, ocasionandoentreel 12 y el 45 % detodaslasdefunciones(Thom, 1989). El númerode infartos agudosde miocardio queocurrenanualmenteen Españaen sujetosentre 25 y 74 añospodría estimarsealrededorde los 27.000 (Pérezet al, 1993). El corazónes un órganoquesehalla en constantefuncionamiento desarrollandoun trabajo considerabley tiene, por tanto, un gran consumode energía.Ejemplode esteimportanteconsumoesel ventrículo izquierdo, quesi bienconstituyetansolo un 0,3% del pesocorporaltotal en el ser humano, utiliza el 7% del consumode oxigeno del cuerpoen reposo(Katz, 1992). Existen importantesdiferenciasentre el metabolismodel músculo esqueléticoy el del cardiaco.Esteseencuentraen constanteactividad y presentamásmitocondrias(un 36% del volumencelulartotalen miocitos ventricularesderata lo constituyenlasmitocondrias(Page,1978)),puede utilizar más sustratos que el músculo esquelético (que dependecasi exclusivamentede la glucosa)y, en condicionesnormales,la producción de energíaen el músculo cardíacotiene lugar por medios totalmente aeróbicos.De hecho,el músculocardiacono desarrollauna deudade oxígenoapreciabledurantecadacontracción,a diferenciadel músculo esqueléticoque debepagaresadeudadurantelos períodosde reposo. 3 Esteconsumode energíarápidoy mantenidoatravésde las víasde fosforilación oxidativa tiene un precio: la dependenciaabsoluta del corazónde un suministro de sustratos Entrada de Ca2~ a través de los canales de calcio de membrana; la mayor parte se emplea en disparar la liberación de Ca1~ por parte del RS a nivel de la hendidura diádica, pero una pequeña proporción (A 1) puede activar directamente las proteínas contráctiles. B1) Intercambiador Na~-Ca 2~, con posibilidad de funcionar en sentido reverso. B 2) Bomba de calcio del sarcolema. C) Salida de Ca 2~ del RS a través de los canales de salida de Ca2~del RS. D) Entrada de Ca2~ al RS a través de la Ca2~-ATPasa del RS. E) La troponina C liga Ca2~ activándose el proceso contráctil. F) La troponina C disocia el Ca2~ previamente ligado iniciándose la fase de relajación. G) El calcio que entra al RS se almacena a nivel de las cisternas subsarcolémicas ligándose a la calsecuestrina y a otras proteínas ligadoras de Ca2~. H) Movimientos de entrada y salida de Ca2~ a nivel mitocondrial. (Modificado de Katz, 1992) 43— TROPONINA C “7 secuenciade contracción-relajaciónnos dan idea del extraordinario grado de ajuste y control que debe existir entre los diversos compartimentosmencionados.Se estima,de hecho,que el consumode energíaempleadoen la regulaciónde los movimientosdel calcioalcanza un 25% del gastototal de energíacelular (Langer, 1992). Desde la superficie de la célula se proyectan hacia su interior estrechasprolongacionesdel sarcolemaque penetran en el espacio intracelular.Son los denominadostúbulostransversaleso túbulosT, que desembocanen las bandasZ de los sarcómerosconduciendohacia el interior la despolarizacióneléctrica(Figura4). Porotro lado, el retículo sarcoplásmicoconstituye un sistema tubular aparte que rodea los sarcómerosy contienecalcio en alta concentración.Este retículo no se conecta directamente con el sarcolemao los túbulos T, pero sus estructurassacularesaplanadas(cisternas)seaponencontrael sarcolema o los túbulos T. En el músculocardíacodonde uno o dos sarcotúbulos lateralesenvuelvenun túbulo transversal,el aspectoencortetransversal es el de una “díada” o “triada”. Estadíadao tríadaesuno de los puntos clavesenla interpretaciónactualdelacoplamientoexcitación-contracción (Langer y Peskoff, 1996). El procesode acoplamientoexcitación-contracciónseinicia cuando un potencial de acción despolarizala membranacelular. Esta señal eléctricasegenerapor el pasode ionesatravésde canalesde membrana invirtiendo el potencialeléctricotransmembrana.Primeroentrael sodio 18 TUIBULO TSARCOLEMA RETíCULO SARCOPLASMICO CISTERNAS RED SARCOTUBIJLAR Figura4..-Estructuradela célulamiocárdica.Importanciarelativaen su composiciónrespectoal volumencelular total de lasmiofibrillas (47%), initocondrias (36%) y retículo sarcoplásmico(3,5%) (Page, 1978). Se observala distribución de los túbulos 1? a nivel de las lineas Z de los sarcómerosy su estrecharelación con las cisternassubsarcolémicasdel RS. ‘9 (corrienterápidahaciadentro); la neutralizacióndela electronegatividad del interior celular por la entradadel sodio causala aperturade los canalesde calciovoltaje-dependientesy el cierredelos canalesde potasio generandounasegundacorriente,estavez lenta,de calcio.Haciael final del potencial de acción el influjo de calcio cesay la repolarizaciónva acompañadapor la entradade potasio,encargándosela Na~-K~-ATPasa de membranade mantenerel potencial eléctrico durante la diástole transportandosodiohaciael exterioren intercambiocon potasioconuna estequiometría3 Nat 2 K~. 1.2.1.- MECANISMOSDE ENTRADA DE Ca2~A TRAVES DEL SARCOLEMA. En las célulascardíacasexistendostipos fundamentalesde canales de calcio voltaje-dependientescuya activación varíasegúnel rango de potencialde membrana:candeslentoso tipo L (“long-lasting”) y candes T (“transient”) (McCleskey et d, 1986). Los candes T tienden a localizarseen células con actividad marcapasos(nodo sinusaly nodo auriculo-ventricularfundamentalmente),perotambiénestánpresentesen miocitos ventriculares(Mitra y Morad, 1986). Más recientementeseha sugeridola existenciade candesdegoteo de calcio o tipo B (“hackground’9en el sarcolemade célulasmiocárdicas de rata (Rosenberget al, 1988; Coulombeet al, 1989). Estoscanalesno 20 requierendespolarizaciónde membranaparaactivarsey no sebloquean con los antagonistasclásicos de los canales tipo L. Su significado fisiológico no estáaúnbien definido, aunquepodríanjugar un papelen la conductanciaal calciodurantela fasede reposo.Algunos postulanun posible papelcomo contribuyentesa la sobrecargade calcio en ciertas condicionespatológicas(Wang et «1,1995). El canal de Ca tipo L es un complejo oligoméricoconstituido por cinco subunidades.Una característicafarmacológicaimportantede estos canaleses la presenciade un receptorde alta afinidad para ligandosde dihidropiridinas.Estos ligandospuedenfuncionartanto comoagonistas como antagonistas.Antagonistascomo la nifedipina, cuandoseunenal receptorbloqueanla actividaddel canal.Porsu parte, el Hay K8644 es un agonistadel receptorde dihidropiridinasy aumentala corrientede Ca> a travésde estoscanales(Sanguinettiet al, 1986). Existen tambiénbloqueantesinorgánicosde estoscanaleslentosde Ca>,comoel Mg>, el Mii> y el Cd>. Aunqueel magnesioformaparte del fluido extracelularnormal, puedebloquearcanalesde Ca> cuando se empleaa altas concentraciones(Lansmanet al, 1986). El manganeso es también un potente bloqueador de canales de calcio, aunque a concentracionesmuchomenores(Kassy Tsien, 1975). 21 La entradade Ca> durantela fase2 del potencialde accióndesempeña, al menos,cinco papelesclave: 1.- Proporciona carga positiva al interior celular contribuyendoasía la despolarizacióncelular. 2.- Activa la aperturade los canalesde potasio,con lo cual se inicia la repolarización. 3.- Suministracalcio activadorpara unirsea la troponinaC e iniciar la contracción.Sin embargo,en la mayoríade los mamíferos estacontribuciónresultainsuficiente por sí solaparainiciar tal proceso, suponiendoapenas1/5 del calcio total necesarioparaactivar el proceso contráctil (Fabiato,1983). El restolo aportaráel retículosarcoplásmico. 4.- Proporcionacalcio para ser almacenadoen el retículo sarcoplásmico. 5.- Activa la liberación de calcio del retículo sarcoplásmico (Fabiato, 1983), (Beuckelmanny Weir, 1988). 1.2.2.-MECANISMOSDESALIDA DECALCIO A TRAVESDEL SARCOLEMA. La entradade calcio duranteel potencialde acciónes un proceso realizado a favor de gradiente, por el contrario, la salida del calcio durantela diástoleserealizacontragradientequímicoy eléctrico,por lo que requiere consumode energía. 22 La célulamiocárdicaextruyeel calcioa travésde dos mecanismos diferentes:la bombade Ca2~-ATP-dependientey el intercambiadorNa~- Ca>. 1.2.2.1.-BOMBA DE Ca2~-ATP-DEPENDIENTE. Fue identificada por vez primera en el sarcolemade miocitos cardiacosde perro por Caroniy Carafoli (1980). Es similar a la bomba de Ca> del RS, si bien éstaes mayor y se regulade forma diferente (Caronietal, 1983). Tieneun pm de 134.000kd. Se encuentrapresente enla mayoríade las célulasdel organismo,y empleala energíaresultante de la hidrólisis de una moléculade ATP para transportaruna molécula deCa>contragradientedeconcentración(Carafoli, 1992).Mientrasque la bomba de Ca> del RS se regula por la protein kinasa A, estimulándosea través de una reacciónde fosforilación, la bomba de Ca> del sarcolema se activa por la unión del complejo calcio- calmodulina. Esto hace que la entrada de calcio estimule, por retroalimentaciónnegativa,la salidadel mismoa travésde la bombade Ca> del sarcolema. En cualquier caso,se trata de una bombade alta afinidad por el calcio perode bajacapacidadde transporte.De hecho,en la mayoríade lascélulasno excitablesconsituyeel único mecanismoparaextruir calcio. 23 Peroen célulasexcitablescomo lascardíacasexisteun segundosistema paraextraercalcio: el intercambiadorNa~-Ca2~. En miocitoscardíacoscultivados, seha calculadoque el índicede extrusiónde calcio por parte de la Ca2~-ATPasade membranaes la décimaparteen relacióncon la del intercanibiadorNa+~Ca> paraun rango de concentracionesde calcio citosólico fisiológico (Barry et al, 1985). Por todo ello, aunque la Ca2~-ATPasade membranapueda contribuir a mantenerla concentraciónde calcio intracelularen miocitos en reposo,su importanciaen relacióncon el intercambiadorpareceser menor. 1.2.2.2.- INTERCAMBIADOR Na~-Ca2~. Utiliza la energíadel gradienteelectroquímicode Na~ (mantenido por la Na~-K~-ATPasa)a travésde la membranaparamovilizar el calcio contragradiente.Es electrogénico,ya quemantieneuna estequiometría de 3Na~: 1Ca2~.Tienemayorcapacidady menorafinidadque la bomba de Ca>, siendo responsablede un 80% del flujo de calcio hacia el exterior celular (Ledereret «1, 1990; Cannelí, 1991). El intercambiadorNa~-Ca> es voltaje-sensible.Si el potencialde membranaes másnegativoque el potencialde equilibrio (alrededorde -40 mv), como ocurre normalmente en el miocito en reposo, el 24 intercambiadorfuncionaen sentido“anterógrado”introduciendoNa~ y sacando Ca> de la célula (Kimura et al, 1986). Durante la sístole cardíaca, con la célula despolarizada (interior con carga positiva), funcionaen sentidoreverso,favoreciendola entradade calcio. Algunos autoreshan sugerido que el calcio que hace su entrada por esta vía podríaser el que estimulasela liberacióndel calcio del RS (Le Blanc y Hume, 1990), sin embargo, los últimos estudiosindican que el calcio transportadopor los canalesde calcio es variasvecesmás efectivo en estimularla liberaciónde calciodel RS queel intercambiadorNa~-Ca’~ (Shamet al, 1995). Laactividaddel intercambiadorpuedeserregulada,ademásdepor el voltajey la tNa~t, porotra seriede mecanismos.De hecho,la acidosis inhibe el intercambiador(Philipson et al, 1982), y el déficit severode ATP produce el mismo efecto, disminuyendo la afinidad del intercambiadorpor el Ca> (Haworth etal, 1987). ¡.2.3.- FUNCION DEL RETICULO SARCOPLASMICO. La funciónprincipal del RS es la regulaciónde la concentracióndel calcio intracitosólico.No sólo aportael mayorporcentajede calciopara ligarsea la troponina C durantela contracción, sino que también lo recapta y almacena,jugando así un papel esencialen el procesode relajación. 25 La membranadel RS es unabicapalipídica quecontieneunaserie de proteínasintrínsecas.Desdeel punto de vista estructuraly funcional sedistinguendos zonas:lascisternassubsarcolémicas,quecontienenlos canalesde salidade Ca> y se sitúanalrededorde los túbulos T y junto al sarcolema; y la red sarcotubular, con la Ca’~-ATPasa del RS, distribuida alrededor de las proteínas contráctiles en el centro del sarcómero(Langer, 1992). La “díada’, verdaderaunión funcional entre el sistemaT y las cisternassubsarcolémicas,esunode los puntosbásicosenla comprensión de la regulaciónde la dinámicadel calcio intramiocárdico(Figura5). Ahí quedan enfrentadosel canal lento de calcio del sarcolema(también denominadoreceptorde dihidropiridinaspor ser el punto de actuación de estosantagonistasdel calcio), y la proteína“pie” (“foot protein”) o receptorde ryanodina,que no esotro queel canalde salidade Ca> del RS (Langery Peskoff, 1996). 1.2.3.1.--SALIDA DE Ca> DEL RETíCULO SARCOPLASMICO. CANALES DE Ca2>. Los canalesde salidade Cadel RS (“foot-protein”) sonestructuras tetraméricas que se proyectan a modo de “pies” en el espacio comprendidoentre la cisternasubsarcolémicay el túbulo-T (hendidura diádica).Estoscanaleshansidodonados,y presentan4.969aminoácidos 26 TUBULO T Figura5.- Representaciónesquemáticadel modelodehendiduradiádica, en corte transversal al túbulo T y RS, tal y como proponenLanger y Peskoff (1996). Canal Canal Canal de Na~ de Ca de Na# RETXC ULO SARCOPLASMICO 27 con un pm de 564.711d(Otsuetal, 1990). Lascuatrosubunidadesrodean un canalcentralqueparececonectarconcuatrocanalesradiales(Block aal, 1988; Saltoet el, 1988). Se ha comprobadoqueexistenvariostipos de canalesde salidade Cadel RS, de formaqueconstituyenunafamilia de isoformas(Borgattaet al, 1991). Se han formulado diversasteorías paraexplicar la liberación de calcio del RS: acoplamientoeléctrico con el potencial de membrana, acoplamientomecánicoentre proteínasdel sistemaT y del RS, y la liberación de calcio calcio-inducida. La última es sin duda la más aceptada;Fabiato postuló que la entradade una pequeñacantidadde calcio a través de la membranaplasmática(canaleslentos de Ca>) induciría una liberación mucho mayor de calcio activador del RS, probablementepor la unión del calcio a un receptor situado en la superciecitosólicadel RS (Fabiato, 1983;Fabiato y Fabiato, 1975). Este canal puedeabrirse tambiénpor la acciónde metilxantinas, como la cafeína(Meissnery Henderson,1987) y tiene altaafinidad por el alcaloide ryanodina. A bajas concentraciones0< 10 ¡xmol/L), la ryanodinainduce la aperturadel canal(Rousseauet al, 1987); mientras queamayoresconcentracioneslo bloqueaporcompleto(Meissner,1986). El rojo rutenio es otro potente inhibidor de la salida de Ca> del RS (Benzi y Lerch, 1992). En miocitos en reposo expuestosa bajas concentracionesde 28 ryanodinaseprovocaunadepleccióncompletadel RS (Bersetal, 1987). En estascondiciones, la entrada de Ca> a través de los canalesde membranatipo L (y quizás también a travésdel intercambiadorNa~- Ca>) no consigue desencadenaruna contracción. Esta observación sugiereque,enmiocitoscardiacosdemamífero,la mayorpartedel calcio activadornecesarioparael acoplamientoexcitación-contracciónproviene del RS. Por otraparte,no todo el calciocontenidoen el RS se libera en cadacontracción,sino queel gradode liberaciónde estedepósitoparece estar en íntima relación con la cantidad de calcio que entra por los canalesde membrana(I?abiato, 1989). El canalde salidade Ca> del RS puedepresentarcuatroestadios funcionales:a) Abierto, como consecuenciadel aumentodel calcio libre citosólicoy de su unión al sitio activador;b) Cerrado,comoconsecuencia de un gran incrementoen el calcio citosólico resultantede la salidade Ca> del RS y de su unión al sitio inactivador; c) Refractarioy d) Activable (Langer, 1992). Estecanal presenta,además,sitios para fosforilación, unión de ATP y unión de calmodulina.La importanciade estosmecanismosen la regulacióndel canal no está clara, si bien pareceque la calmodulina reducela duración del tiempo de apertura del canal (Rousseauet al, 1987). 29 1.2.3.2.-ENTRADA DE Ca> AL RETICULOSARCOPLASMICO. BOMBA DE Ca> ATP-DEPENDIENTE. El procesode relajación miocárdicaimplica la disminución de la concentraciónde calcio intracitosólico.Ya se señalóque el procesode extrusiónde calcio haciael espacioextracelularresultainsuficientepara explicarla dinámicade la relajación.Dehecho, la relajaciónrequierela recaptacióndecalcioporel RS. La Ca2~-ATPasadel RS(SERCA) realiza estetransportecontragradientede concentración,y tiene una afinidad por el calciolo bastantealtacomoparareducirla concentraciónde calcio intracitosólico a niveles suficientementebajos como para permitir la disociación del calciounido a la troponinaC. La bombade Ca> del RS es unaproteínacon un pesomolecular de 100.000-110.000d, menor que la bombade Ca> del sarcolema,y representael 40% de las proteínaspresentesen el RS cardiaco(Tadaet al, 1978).Presentadiversasisoformascodificadasal menosportresgenes (Zerain-Herzberget al, 1990), y pareceactuar como un dímero. Esta Ca2>-ATPasacicla atravésdeun procesodefosforilación-defosforilación, transportando en cada ciclo dos átomos de Ca> por cada ATP hidrolizado a ADP + P~. El flujo de cationes Ca> a través de la membranadebieragenerarun gradienteeléctrico,sin embargo, el RS es permeablea unagran variedadde anionesy el flujo concurrentede anionescloruro y fosfatoevitan quesecreeun potencialtransmembrana (Katz, 1992). 30 Su regulaciónen el músculocardíacodependedel fosfolamban, unaproteínade unos5500-6000d y 52 aminoácidosqueparecefuncionar comoun pentámero(Fujii etal, 1987).La defosforilacióndelfosfolamban inhibe la bomba de calcio, mientras que su fosforilación suprime tal inhibición (Wegenery Jones,1984). En el corazónla fosforilación del fosfolambantienelugarvía AMPc, segundomensajerointracelular,o por unaproteinkinasaCa2>/calmodulinadependiente,si bien ambossistemas podríanactuarsecuencialmenteactivándosela proteinkinasaal alcanzarse altos niveles de AMPc (Wegeneret al, 1989). Su defosforilación, y por tanto inhibición de la bomba de Ca, se realiza por medio de las fosfoprotein-fosfatasas,un grupo complejo de enzimas altamente reguladas(Kranias et al, 1988). Se ha sugerido que algunasde las alteracionesen contractilidad miocárdica observadasdurante el desarrollo y en ciertos estados patológicos podrían estar relacionadascon modificaciones en las propiedadesdel RS. La cantidadde RNAmn codificanteparala SERCA 2 en rataspresentasu maximoen el momentodel nacimientoy desciende en la última etapa de la vida (Lompré et al, 1994). La hipertrofia miocárdicaseverainducidaen modelosanimalesseacompañaigualmente de un descensorelativo en los niveles de RNAm codificante para la SERCA, asociadoa su vez a un descensoen la captaciónde Ca2~ por partedel RS (Levitsky et al, 1991). Másrecientemente,seha propuesto que el descensoen los niveles de RNAm codificante para la SERCA podría ser un marcadorde la transiciónde la hipertrofia compensada 3’ haciael fracasocardíacoterminal (Feldmanet al, 1993). 1.2.3.3.-ALMACENAMIENTO DE CALCIO EN EL RETíCULO SARCOPLASMICO.PROTEíNASLIGADORAS DE CALCIO. Dentrodel RS el calciopuedealmacenarseenformalibre, ionizada, peroun porcentajede éstequedaunido a diversasproteínasligadoras de calcio. La másimportanteesla calsecuestrina,capazde ligar uno 50 moles de calcio por mol de proteína,y que podríajugar un importante papelen el acoplamientoexcitación-contracción(Barry y Bridge, 1993>. Tambiénmerecencitarsela caireticulinay la “proteína ligadorade calcio rica en histidina”(Mitchell et al, 1988). 1.2.3.4.- IMPORTANCIA RELATIVA DEL RETíCULO SARCOPLASMICO SEGUNESPECIES. La contribucióndel RS paraproporcionarel Ca> involucradoen la actividad contráctil varíaentreespeciesy en función de la etapadel desarrolloen que se encuentren.El orden de dependenciarelativa del calcio liberadopor el RS sería:ventrículode rataadulta > aurículade conejo > ventrículode conejo > ventriculo de rana(Bers, 1985).Las diferenciasentreel ventrículoderatay el deconejoquedande manifiesto por el hechode que la ryanodinadisminuye la fuerzacontráctil en un 32 90% en la rata(por depleccióndel RS), mientrasqueen el ventrículode conejoapenasalcanzael 10% (Rich etal, 1988). En ventrículode cobayo (similar al de conejo) la ryanodinano alterabala fuerzacontráctil pero prolongabala contracciónun 50% (Lewartowskietal, 1990); estoindica queuna función importantedel RS a travésde la liberaciónde calcio- calcio inducidaes aumentarla velocidadde contracción. En definitiva, parececlaro queel corazónde rata es totalmente dependientedel Ca2> del RS parasu contracción.El ventrículode conejo y el de cobayo (similares al humano) pueden desarrollar actividad contráctilplena en ausenciadel Ca> del RS (aunquea una frecuencia muchomenor)graciasa la activaciónde lasproteínascontráctilescon el flujo de calcio a través del sarcolema.El corazón de rana, sin prácticamenteRS, dependecompletamentede la entrada de Ca> exterior. Todo músculo cardíaco,a diferencia de lo que ocurre en el músculo esquelético,requiere al menos un pequeñoflujo de calcio transmembrana,aunqueseatan solo paradispararla salidade Ca> del RS (Langer, 1992). Porotraparte,tambiénexistendiferenciasentreespeciesa la hora de valorar el papel del RS en la relajación miocárdica.Bassaniet al (1994) han comparadola contribución proporcional de los diversos mecanismosde extrusióndeCa2>intracitosólicoenmiocitosventriculares aisladosde ratay conejo. Estimaronque el calcio transportadopor la Ca2>-ATPasadel RS, intercambiadorNa±~Ca>y sistemasde transporte 33 lento (captaciónmitocondrial y Ca2~-ATPasasarcolémica)era 70, 28 y 2% en miocitos de conejo y 92, 7 y 1% en miocitos de rata, respectivamente.De estaforma, demuestranque la dominanciade la Ca>~ATPasadel RS respectoal intercambiadorNa+~Ca>es muchomás marcadaen la rata (13 vecesvs 2,5 vecesen el conejo). 1.2.4.- FUNCION DE LA MITOCONDRIA. Se estimaqueel contenidode calcio intramitocondrialsuponeun 20% del total celular (Langeret al, 1990). Sin embargo,el transportede Ca> a estenivel pareceir dirigido tan solo a la regulaciónde enzimas mitocondrialesresponsablesdel metabolismooxidativo (Gunter et al, 1994). La entrada de Ca> se realiza contra un importante gradiente electroquímico. La afinidad por el calcio de la bomba de calcio mitocondrial es baja y su índice de transporte de calcio a concentracionesfisiológicas de calcio citosólicotambiénes bajo, por ello es improbableque puedajugar un papel importanteen los flujos de calcio responsablesdel acoplamientoexcitación-contracción. La salidade Ca2> tiene lugar por un intercambiadorNa~-Ca2~, que, a diferencia del intercambiadordel sarcolema,actúa como un sistemaelectroneutro.Encualquiercaso,seacualfuerela estequiometría 34 de la entradao salidade Ca> a nivel mitocondrial éstasiempreseda compensadapor la extrusiónde hidrogenionesa travésde la bombade H> de la cadenarespiratoria(Crompton,1990). La mitocondria podría jugar un papel “tamponando” un cierto porcentajedel calcio citosólico en situacionesde sobrecargade calcio, como la provocadapor la reperfusión tras la isquemia miocárdica (Willianson et al, 1983). Segúnel modelo teórico de Crompton,niveles citosólicosde Ca> > 2 pM provocaríana su vezunaseverasobrecarga de Ca> intramitocondrialalcanzandoconcentracionessuperioresa 10 veces la basal (Crompton, 1990). Esta sobrecarga de calcio intramitocondrialinduceunapermeabiizaciónde la membranainterna de la mitocondriaparamoléculasde pesomolecularmenorde 1000 d e inhibe la fosforilación oxidativa (Haworth y Hunter, 1980). 1.2.5.-FUNCION DEL SARCOLEMA. El calcio presenteenlascélulasmiocárdicasseencuentraaltamente compartimentalizado.Mediante análisis de cinética de calcio se ha descritoun compartimentorápido, otro intermedioy un tercerolento y no intercambiable(Langer,1994).El compartimentorápido(desplazable por el Lantano) representaun 38% del calcio celular total en miocitos ventricularesde rata, y seintercambiacon una t112 < is (Langeret al, 1990), constituyendo, por tanto, el compartimento de calcio más 35 importantey más rápidamenteintercambiable. A pesar de su tamaño, este compartimentoha sido difícil de localizar. Estudios con sarcolemaaislado, proveniente de miocitos neonatalescultivadosy separadomediantela técnicade diseccióncongas (Posty Langer, 1992) han permitido asociarestecompartimentocon la hoja interna del sarcolema(rica en fosfolipidos aniónicos con alta capacidadpara ligar calcio) y con la hendiduradiádicasubsarcolémica. Trabajosen miocitos ventricularesde rataexpuestosa cafeína10 mM (paradepleccionarde Ca> el RS) y altasdosisde ryanodina(1 mM, paracerrarlos canalesde salidade Ca> del RS o “pies” de la hendidura diádica) muestranunadisminución de un 25% en el contenidode Ca> del compartimentorápido (Langery Rich, 1993).Estehechosugiereque el Ca> de lascisternaslateralesdel RS contribuyey podríaencontrarse en equilibrio con el calcio ligado a los fosfolípidos de la hojainternadel sarcolema. Por otra parte, estudiosrealizadoscon cadmio y con dibucaina, agentesque desplazanel calcio de su unión al sarcolemapero que, a diferenciadel lantano,no inhibenprácticamenteel intercambiadorNa~- Ca>, sugierenunaestrecharelación entrelos niveles de Ca> en este compartimentoy el funcionamientodel intercambiadorNa~-Ca2~.Los sitios de unión de Ca en la hoja internadel sarcolemaserviríanpara retrasarla difusión del Ca> de la hendiduradiádica una vez liberado 36 desdeel RS. Estomantienela [Ca] en la hendiduradentrode nivelesque permitenun óptimo funcionamientode los intercambiadoresNa>-Ca2~ localizadosen la mismahendidura(Wanget al, 1996). 37 1.3.- ISQUEMIIA MIOCARDICA. La isquemia miocárdicaes consecuenciade la patología de las arteriascoronarias,queno soncapacesde mantenerel clásicoequilibrio entreaportey demanda(Ardehail y Ports, 1990).Por tanto, conviene recordarque el tejido miocárdico es la víctima, y no el responsableo perpetuadoren la patogénesisde la cardiopatíaisquémica. Como se puedeobservaren la Figura 6, los tres determinantes principalesdel consumode oxígenomiocárdicoson: frecuenciacardíaca, tensióndesarrolladay contractilidado estadoinotrópico. Factores Control neural humorales Compresión extravascular Figura6.- Esquemade los principalesfactoresdeterminantesdel aporte y del consumode oxígeno miocárdicos. (Modificado de Ardehaliy Pons,1990) ontrol metabólico diastólica 38 La patologíacoronariaresponsablede la apariciónde cuadrosde oclusióncoronariaque den lugar a episodiosde anginao a infartos, es fundamentalmentearterioesclerótica.Laoclusióncoronariaesproducida habitualmentepor un trombo formadosobreuna placaateroesclerótica complicada.Estetrombo es el resultadofinal de un procesocomplejoy dinámicodondeinteractúancomofactoresetiopatogénicosfundamentales la ateroesclerosiscoronaria,la roturade placa,la agregaciónplaquetaria y el vasoespasmo(Fusteretal, 1992a;1992b). En ocasionesseobservan anginas e incluso infartos en pacientes con arterias coronarias angiográficamentenormales,en estoscasosel espasmocoronariojuega el papel más importante (Nakamura et al, 1987). Aún más excepcionalmentese produceninfartos de origen no ateroescleróticoni vasospástico:arteritis, enfermedadesde depósito,embolismocoronario, anomalíascongénitas,contusiónmiocárdica,etc. Otras circunstanciasespeciales,como la cirugía cardiovascular realizadacon circulaciónextracorpóreao con paradacardiocirculatoria total con hipotermiaprofunda,suponensituacionesprovocadasde daño miocárdicopor isquemia.Porello serequiereun mejorconocimientode la fisiopatología de la isquemia/reperfusiónmiocárdicascon el fin de mejorar en lo posible las condicionesde conservacióndel corazón. 39 1.3.1.- FISIOPATOLOGIA DE LA ISQUEMIA MIOCARDICA. I.3.l.1.-DIFERENCIAS ENTRE HIPOXIA E ISQIJEMIA. La hipoxia o hipoxemiaesun estadode suministro insuficientede oxígenoa los tejidos, a pesarde una correctaperfusión. La isquemia suponeunareduccióndel aportede oxígenoacompañadaenestecasode unainadecuadaperfusióntisularconel consiguientedéficit en la retirada de metabolitosde desecho. Si bien la mayoríade los efectosde la isquemiase debenal déficit de oxígeno, la isquemiay la hipoxia tienen efectosdiferentessobreel miocardio. La oclusióncoronaria,ademásde disminuir el aportede oxígenoy sustratosmetabólicosa las célulasmiocárdicas,provocaun déficit en el drenajevenosoy linfático de los metabolitostóxicos queseacumulanen el espacioextracelular del área isquémica.La reducción de oxígeno detienela producciónaeróbicade fosfatosde altaenergía,utilizándoseen su defecto las vías anaerobias.En el corazón isquémico aumenta progresivamentela concentraciónde hidrogenionesy ácido láctico y cae el pH intracelularconformeseacumulanéstosy otrosmetabolitosácidos de la glicolisis; estacaídadel pH tiene efectoinotrópiconegativodirecto. El lactato, además,inhibe la glicolisis en un momentoen el que las células miocárdicas todavía contienen cantidades significativas de 40 glucógeno.El potasioacumuladoen el espaciointercelular,por su parte, contribuiráa la generaciónde arritmias. Por el contrario, en el corazónhipóxico, el lavadode todos estos metabolitosretrasael desarrollode acidosisintracelulary la generación de arritmias, y ademáscontinúa metabolizandotanto las reservasde glucógenocomola glucosaquepudierallegar atravésdel flujo coronario. Por todo ello es comprensibleque los efectosde la hipoxia seanmenos lesivos que los producidospor la isquemia. 1.3.1.2.-ALTERACIONES METABOLICAS E IONICAS. a) Fosfatosde alta energía . Durante los primeros minutos de una isquemia severala tensión tisular de oxigeno cae rápidamentede forma que impide que continúela fosforilación oxidativa, iniciandoel metabolismoanaerobio, con lo que la producciónde fosfatos de alta energía-ATP y fosfato de creatina(FC)- disminuyemarcadamente. Considerandotan solo el rendimiento energéticoobtenido de la glucosaquedanclaras las diferencias:de los 36 moles de ATP/mol de glucosaque se obtiene de la glicólisis aeróbicaseguidade fosforilación oxidativa, la glicólisis anaerobiatan solo consigueobtener2 moles de 4’ ATP/mol de glucosa.Ademáshay querecordarqueel principal aporte energético durante el metabolismo aeróbico normal en el miocito cardiacolo constituyenlos lípidos. Porello, el mecanismocompensador de la glicólisis anaerobiaresultaclaramenteinsuficiente para mantener las reservasde fosfatos de alta energíanecesariaspara mantener la contracción miocárdica. La producción de lactato e hidrogeniones asociadaal metabolismoanaerobiodeterminarála apariciónde acidosis intracelular,lo cual terminarápor inhibir pasosenzimáticosclavesen la glicólisis anaerobia,con lo que este fenómeno compensadorno sólo resultaráinsuficiente,sino que tendráun carácter transitorio. Los nivelesde FC disminuyenantesy másrápidamentequelos de ATP, ya que se encuentraen equilibrio con éste,y en presenciade ADP se hidroliza a creatina + ATP. En ausenciade fosforilación oxidativa, el ADP pasaa AMP, y a continuación se transformaen adenosina, inosina, hipoxantina y, finalmente en xantina (Jenningset al, 1981). Cuandoel contenidode ATP desciendepor debajodel 20% de su valor normal, los miocitos son incapacesde mantenerlos gradientesiónicos fisiológicosy de controlarsu volumen.En lesionesisquémicasreversibles (susceptiblesde mantenersu viabilidad si se reperfunden) se suelen encontrarniveles de ATP por encima del 60%, mientras que niveles inferiores al 30% se suelenasociara dañocelular irreversible. El metabolismoanerobiodurantela isquemiaseve estimuladopor mecanismoshumoralesy bioquímicos.La descargasimpáticaasociadaal 42 dolor isquémicoy al fallo de bombaen casode infarto masivo,aumenta los niveles de AMPc, el cual estimula a su vez la glicolisis y la glucogenolisis.Porotraparte,la caídaen los nivelesde ATP y glucosa-6- fosfato, hace desaparecersus efectos inhibitorios sobre la glico- y glucógenolisis. b) Hidrogeniones . La mayorfuente de protonesen el corazónisquémicoderiva de la hidrólisis de fosfatosde alta energía,quedanlugaragrandescantidades de fosfato inorgánico,ácido débil quelibera hidrogeniones.Otra fuente importante es la glicolisis, con el ácido láctico como resultadofinal (Cobbe y Poole-Wilson,1980). La acidosis tiene dos efectos fundamentalessobre el corazón isquémico: inhibe la glicolisis actuando sobre diversas reacciones enzimáticassensiblesa la acidosis, e interfiere en el acoplamiento excitación-contraccióndesplazandoal calcio de sus lugares en las proteínascontráctilesy uniéndosea la troponina1. De estaactuaciónse deduce el conocido efecto inotrópico negativo que causa la acidosis (Jacobuset al, 1982). 43 c) Fosfatoinorgainico . La hidrólisis de Al? y FC generagrandescantidadesde fosfato inorgánico,queactúareduciendola sensibilidadal calciopor partedelas proteínascontráctiles,como sedescribeen el apartadoanterior. d) Potasio . A los pocos segundosde una oclusión coronariaempiezaa salir potasiode lascélulasmiocárdicas.Estapérdidaes tan rápida y precoz que no puede achacarse a inhibición de la Na~-K~ ATPasa. Probablementesedebaa queacompañela salidade moléculasaniónicas como el lactatoo el fosfato inorgánico. El acúmulode potasioen el espacioextracelulardepolarizala célula y deprime la velocidaddeconduccióndel potencialde acciónatravésde las membranas,facilitando la aparición de arritmias. Además, esta depresión excitatoria se asocia a un grado variable de disfunción mecánica. e) Ácidos grasosy derivados . En condiciones aeróbicasnormales, del 60 al 90 % de los requerimientosde energíamiocárdicaprovienende la oxidación de los 44 ácidos grasoslibres, presentesen las célulasmiocárdicasen forma de ésteresgrasos conteniendocoenzimaA (Camici etal, 1991). Durante la isquemia, el bajo aportede oxígeno inhibe la beta- oxidación.Si la isquemiaseprolongaseinhibe ademásla actividad de la acil-carnitinatransferasade cadenalarga, responsabledel transportedel Acil-CoA citosólicoa la mitocondriaantesde la oxidación.Deestaforma aumentanlos nivelesde Acil-CoA mientrasdisminuyenlos deacetil-CoA. El Acil-CoA acompañadode la excesivaproducciónde glicerol durante la isquemia,darálugar a la síntesisde triglicéridos, queseacumularán en el miocardioisquémico.Existendatoscontradictoriossobreel posible efecto deletéreo sobre las membranascelulares de estas moléculas anfipáticas(van der Vusseet al, 1985; Vyska et al, 1988). 1) Radicaleslibres . Son moléculasextremadamentereactivas,puesto que poseenun electrón no apareado.Incluyen el anión superóxido (02~), el radical hidroxilo (-OH-) y el peróxido de hidrógeno, que aunqueno es en si mismoun radical libre, da lugara compuestosaltamentereactivos. Los radicaleslibres se originan en la cadenarespiratoria,en el metabolismofinal del ATP, en el del ácido araquidónico,catecolaminas y fosfolípidos de membrana.La isquemiaseverapuedeaumentarlos 45 nivelesde radicaleslibres por diversosmecanismos:(a) disociaciónde la lanzaderaelectrónica a nivel mitocondrial, (b) la entrada de calcio inducida por la isquemia activa fosfolipasas que degradanácido araquidónicoy fosfolipidos de membrana,liberandoa su vez radicales libres; (c)la isquemiatransformaen algunasespeciesla actividadde la enzimaxantino dehidrogenasaenxantinooxidasa,la cualenpresenciade xantina libera radicaleslibres; (d) en el tejido isquémicose activa el complemento,que generaacumulaciónde neutrófilos y liberación de radicaleslibres. Parecedemostradala toxicidad directa sobre las membranas celularesde estosradicaleslibres,queactuaríandandolugarareacciones de peroxidación.En algunosmodelosexperimentalesen animalesseha comprobado que atrapadores (“scavengers”) tales como la superóxidodismutasa(Engler y Gilpin, 1989; Naslundet al, 1990) o la catalasay otros inhibidores de su producción, como la deferoxamina (Willians et al, 1991), puedendisminuir el dañocelular generadopor la isquemia.Sin embargo,el papel de estosradicalesen la patogeniadel dañocelulargeneradopor la isquemiasiguesiendocontrovertido. g) Proteínas . Se producencambiostanto en la síntesiscomoen su degradación. La síntesisestádisminuidapor inhibición de la iniciación y elongaciónde 46 la cadenapeptidica. La elevaciónde los niveles del aminoácidoalanina refleja tanto la disminuciónde la síntesisproteicacomo el aumentode la producciónde piruvato por transaminación. La degradaciónproteicarequiereenergíaderivadadel metabolismo oxidativo, y parecedisminuir hastaun 80% en modelosexperimentales de corazónaisladosometidosa isquemiasevera.La proteolisisrealizada por hidrolasaslisosomalesseha relacionadocon los mecanismosde daño celular durante la isquemia, pero esta actividad enzinática no se encuentraelevadahastavariashoras despuésde iiciarse la isquemia (Schwalbet al, 1989). h) Calcio . Un aspectocrucial en la patogénesisdel daño isquémicoes el aumentode la concentraciónde calciocitosólicoquetienelugar desdelos primerosminutos de la isquemia(Steenbergenet al, 1987; Lee y Míen, 1992). Existen diversos métodos para determinar la concentraciónde calcio intracitosólicodurantela isquemia:resonancianuclearmagnética (Steenbergenet al, 1990), radioisótopos, microelectrodos selectivos, marcadoresfluorescentes como el indo 1 (Lee et al, 1988) y el fura-2 (Backx et al, 1995), o el método de la aequorina,unafotoproteinaque 4.7 emite luz en presenciade Ca> (Allen etal, 1989), entreotros. Leey Míen (1991)analizaroncríticamentelos resultadosobtenidos empleandolos diversosmétodosen distintos modelosexperimentalesde isquemia y proponenla siguientecronologíade modificacionesen la 1Ca>1~: incrementolento de la [Ca2~I 1sistólicay diastólica, alcanzando la primerael máximotras 10 minutos de isquemia.Trasesteperíodo,el progresivoacortamientodel potencialde acción causauna caída en la [Ca 2~] 1y una eventualabolición del tránsito de Ca>, mientrasque la [Ca>]1en diástoleseguiríaaumentando. Estos datos estarían en concordancia con los hallazgos electrofisiológicos, que indican la aparición de un desacoplamiento eléctrico a nivel celularcon unacronologíasemejantey probablemente debidoal aumentode la [Ca 21] 1(Cascioet al, 1990). Por su parte, el tardíoy gradualaumentoen la [Ca 2i~durantela diástoleparecemásen relación con el fallo de los mecanismosde secuestroy salida del Ca> asociadoa la severacaída en los niveles de Al?, que tarda varios minutos en ocurrir (Marbanet al, 1990). Diversosmecanismoscontribuyena producir estasobrecargade calcio intracitosólico: la disminución de los niveles de ATP puede bloquear el transporte de calcio a través de las Ca>~ATPasasde membranay del RS. Porotraparte,la disminuciónde los nivelesde ATP durantela isquemiamiocárdicaafectadirectamenteal funcionamientode 48 la Na~-K~-ATPasade membrana,aumentandode estaformalos niveles intracelulares de Na~. Este sodio será extruido a través del intercambiador Na±.Ca>actuando en forma reversa, con lo que resultaráun aumentodel calcio intracitosólico.Además,esteaumento inicial de los nivelesde calciocitosólicopuededispararla aperturade los canalesde salidade Ca> del RS (Meissner,1994), elevandoaúnmásla concentraciónde calcio intracitosólico. El contenido global de calcio celular no parece variar significativamentehastael momentomismode la reperfusión(Bourdillon y Poole-Wilson,1981;Poole-Wilsonetal, 1984).Porello, puedeafirmarse que la inversión del intercambiadorNa+~Ca> es un fenómenotardío, asumiendoque, al menos durante la fase precoz de la isquemia, la sobrecargade calcio intracitosólico es expresiónde la redistribucióndel calcio intracelular,en especial,dela salidadecalciodel RS (Zucchi etal, 1995). Esteexcesode calcio seráamortiguadoen partepor un acúmulo de calcio intramitocondrial, lo cual traeconsigouna mayordisminución en la producciónde ATP a estenivel. La activaciónde las Ca’~-Al?asas ante la sobrecargade calcio terminarápor agotarlos nivelesde Al?. Además el aumento de Ca> también activa fosfolipasas con las consecuenciasdescritasen apañadosanteriores. La isquemiamiocárdicatambiénse relacionacon una pérdidaen 49 la capacidadde ligar calcio por partedel sarcolema.En miocardiode conejo y perro sometidosa diferentes períodosde isquemia (15 a 75 minutos) se ha determinadopor métodoscitoquimicosuna pérdidadel calcio sarcolémico(Vandeplasschey Borgers, 1990). El calcio parece unirse a fosfolipidos de membranacon cabezascon cargasnegativas (fosfatidilserina,fosfatidilinositol o fosfatidiletanolamina).Estafamilia de fosfolípidosseencuentraexclusiva,opredominantementeal menos,en la hoja internade la bicapalipídica. Estaasimetríaenla distribuciónde los fosfolípidossepierdetrasla isquemia(Mustersetal, 1993)y la inhibición metabólica(Postet al, 1993). 1.3.1.3.-ALTERACIONES ELECTROFISIOLOGICAS. Las alteraciones metabólicas comentadasy, en especial, los desequilibriosiónicosgeneradospor la isquemia:aumentodel Na~ y Ca> intracelular,aumentodel K> extracelular,acidosisintracelular,provocan unadisminucióndel potencialde reposoy de la velocidad de la fasede ascensorápido del potencialde acción, así como una disminución de la amplitudy duracióndelmismo, conacortamientodel períodorefractario. A todo éstohay queañadirla liberacióniii vivo de catecolaminas,con su conocidoefectoproarrítmico. Si estasalteracionesprogresan,se produceunadisminuciónde la excitabilidad celular y una depresiónde la propagacióndel estímulo 50 dentrodel áreaisquémica,con el consiguientebloqueo. Al progresarla isquemia,las célulasevolucionanhaciala inexcitabiidad. En este contexto se comprendela frecuencia de aparición de arritmias, sobre todo ventriculares,en la fase agudade la isquemia severa.Puedenaparecerpor un aumentodel automatismopropio o por actividad repetitiva (pospotenciales),por corrientes de lesión y por reentrada,si bien los dosprimerosmecanismosno hansido confirmados en modelosexperimentalescon corazónentero(Cinca, 1988). 1.3.1.4.- ALTERACIONES DE LA EXPRESION GENICA. En las células miocárdicas la isquemia produce alteraciones especificas en las concentracionesbasales de RNAm que codifica proteínas con funciones dispares en las células miocárdicas. Estas observacionesindican que lasconsecuenciasalargoplazode la isquemia, puedenser reflejo de una expresióngenéticaalteradaquedeterminala existencia de concentracionesanormalesde proteínas intracelulares específicas(Currie et al, 1988). El impactopotencialde la expresióngenéticaalteradade la síntesis de proteínasespecíficasa la horade generardisfunción cardíacaqueda expresadoen la relaciónexistente,por ejemplo, entreel enlentecimiento de la relajacióny la disminuciónde la expresiónde los genesde la Ca>- 5’ Al?asa,con la consiguientedisminuciónde la concentraciónde bombas decalciointracelularesenlos corazonesderatahipertróficos(dela Bastie et al, 1990). 1.3.1.5.-ALTERACIONES FUNCIONALES. La interrupción del flujo coronarioen una partedel corazónde mamífero se sigue, casi inmediatamente,de una disminución de la contractilidad. En realidad, la alteraciónmás precozse produceen la función diastólicao lusitrópica, con unadisminución de la relajacióny distensibilidadmuscular. Se consideranal menostres causascomo responsablesdel rápido desarrollode las anormalidadeslusitrópicase inotrópicasen el corazón isquémico: - Pérdidadel efecto “Manguera dejardín“: La distensiónque generala presióndeperfusióncoronariasobrelos sarcómerosadyacentes mejora la función contráctil de los mismos en función de la ley de Starling (Vogel etal, 1982). Esteefectosepierdeal producirsela oclusión coronaria.De estaforma, la caídade la presiónde perfusióncoronaria produceun inmediato efectoinotrópiconegativo. - Deprivaciónde sustratos,fundamentalmenteoxígeno: En el primer minuto de oclusión coronariala tensióntisular de oxígenocaea 52 valoresextremadamentebajos.El corazónno almacenaoxígeno,mientras que otros sustratoscomo el glucógenopuedendurar bastantetiempo despuésde iniciarse la isquemia graciasa las considerablesreservas miocárdicas. - Acumulaciónde metabolitos : Como se describióantes,el acúmulo intracelular de fosfato e hidrogeniones,principalmente,y el aumentode los niveles extracelularesde potasio, acabanproduciendo depresiónde la contractilidad. En modelosexperimentalesse compruebaque la fase másprecoz de la respuestainotrópicanegativacorrespondeal efectomecánicode la pérdida de perfusión coronaria (efecto “manguera de jardín”). A continuación, la caída de los niveles de ATP, acidosis y aumentode fosfato inorgánicodesensibilizanla troponinaC frente al calcio, con lo queserequierenmayoresnivelesde calcio intracitosólicoparaconseguir el mismogrado de activación. El efecto lusitrópico negativo es el primer cambio funcional observadotras la oclusióncoronaria.No existetodavíauna explicación paraestehecho,ya que la caídade los nivelesde ATP, queretrasaríala recaptacióndelCa> citosólico por el RS, no ocurrede formatan precoz como paraafectardesdeun primer instantea la diástole. La disfunciónventricularisquémica,tantosistólicacomodiastólica, 53 pone en marcha una serie de mecanismos hemodinániicos y neurohormonales,que intentanrestablecerla normalidad,evitandoasí la apariciónde insuficienciacardiaca(Packer,1992). En primer lugar apareceun aumentode la diastólicos. Este aumentode la precargaprovoca contracción por el mecanismode Frank-Starling. disminución del volumen sistólico activa el determinandoun aumentotantode la fuerzacomo contracción. Sin embargo, tanto la dilatación activaciónsimpáticaacabanprovocandoaumento y, por tanto, del consumode oxígenomiocárdico, suponeen el contextode la isquemia. presión y volumen un aumentode la Por otro lado, la sistema simpático, de la frecuenciadela ventricular como la de la tensión parietal con el riesgoqueello 1.3.1.6.-ALTERACIONES ESTRUCTURALES. Las lesionesqueconducena muertecelular(necrosis)seinician en modelosexperimentalestras 15-40 minutos de isquemia total. Tras 6 horas,quedanmuy pocascélulasviables. La necrosisse inicia en el endocardio,dondelos requerimientos energéticossonmayores,y avanzahaciael epicardio(infarto transmural). La descripciónde lesionesen fasesprecocesde isquemia0< 15 minutos), y duranteel períodode transición (entre los 15 y 40 minutos) resulta 54 especialmentecompleja,sobretodosi sepretendeextraerinformaciónde criterios de dañocelular reversibleo irreversible(punto sin retorno). En este apartadosólo se mencionaránlos mecanismosde daño celularqueaparecencomoconsecuenciade la fasede isquemia,dejando parael apartadode reperfusiónlos asociadosa la misma. Las regiones isquémicastoman un aspectopálido, de infarto acelular, al que en ocasionesseha denominado“momificación”. Puesto que los leucocitosno puedenaccederal tejido necrótico en un áreano perfundida, las célulasmiocárdicassufrenautolisis quedandocon este aspectomacroscópico. Uno de los puntosmásoscuroses el relativo a los mecanismosde lesión y muerte celular. La mayoría de los estudiosse centranen el posible daño producidosobremembranaspor diversosmetabolitos. Existe acuerdogeneralizadoen quedurantela isquemiaseveray prolongadala membranaplasmáticapierde su función de barreraque mantiene un medio intracelular adecuado.Los posibles mecanismos propuestosya hansido comentadose incluyen: - Ataque de fosfolipasasy proteasas. - Radicaleslibres. - Efecto detergentede ácidosgrasoslibres. 55 - Sobrecargaosmótica intracitosólica, consecuenciadel acúmulode metabolitos. - Lesióndel citoesqueleto. - Sobrecargade calcio. En los primeros15 minutos de isquemiamiocérdicase producen unaseriede cambiosestructurales,en generalreversibles.Consistenen un edema moderadoque afecta al sarcolemay todas las organelas. Ademásexisteunadisminuciónde los depósitosde glucógeno,relajación de las miofibrillas y un leve desplazamientode la cromatinacelular (Fukuhara,1985). Cuandoexisten períodosde isquemia prolongadoslos fenómenos inicialesdescritosseexageran.El desarrollode densidadesamorfasen la matriz mitocondrial (depósitosde fosfato cálcico) y la apreciaciónde hendidurasen el plasmalema(Jenningsy Hawkins, 1980) se consideran signosde dañomiocárdicoirreversible. 1.3.2.- MIOCARDIO “HIBERNADO” Y “CONTUNDIDO”. El términomiocardioaturdidoo contundido(“stunning”) describe la disfunción contráctil provocadapor unaoclusión coronariade unos minutosde duración,y quepersistedurantehoras,e inclusodíasdespués de la reperfusión(Braunwaldy Kloner, 1982). Incluye, por tanto, dos 56 aspectosfundamentales:disfunción contráctilreversibley prolongadacon un flujo coronarionormalo casi normal.Por el contrario, el miocardio hibernadoexpresaunainsuficienciacontráctil tambiénreversible,pero en el contextode unahipoperfusiónseveracrónica(Rahimtoola,1989). Los mecanismosresponsablesde estosestadosno seconocenbien. Se ha postuladoquela deplecciónde nucleótidosde adeninatras la fase isquémicapodríajustificar estoscuadros,ya que su síntesisde novo es lenta y puedellevar variosdías.Por otra parte, los posiblescambiosen la expresióngénicade ciertasproteínastrasla isquemiapodríaexplicar, al menosen parte,estosperíodosde disfunción máso menosprolongados tras la reperfusión. Se ha relacionadoel “stunning” con el retrasoenla síntesisdenovo de ATP, consecuenciaa su vez de la pérdidadel sustratoadenosina duranteel periodo isquémico,sin embargo,también hay trabajosque demuestranunaadecuadarecuperaciónfuncionala pesarde presentar bajosniveles de ATP (Taegtmeyeret al, 1985). El papeldel calcio en la patogeniadel “stunning” tambiénresulta contradictorio.Este podría ser consecuenciade una disminución de la disponibilidad de calcio intracelular, de un déficit en la captaciónde calcio por partedel RS o de unaalteraciónde las proteínascontráctiles incapacesderesponderanteunaconcentraciónnormaldecalciocitosólico (Opie, 1989). Este último efecto, posiblementecomo resultadode la 57 fosforilación o modificación covalente de las proteínas contráctiles provocada por proteasasy protein-kinasasactivadas por el calcio intracelular.Kusuokaetal (1987),por su parte,achacaestefenómenoa una sobrecargaprecozde calcio, durante la fase de reperfusión,que podríagenerardañosen lasmembranasintracelulares,alterandoasí, al menostransitoriamente,la homeostasiadel calcio. Se ha demostradouna elevaciónen los nivelesde inositol 1,4,5- trifosfato durantela fase inicial de la reperfusiónen corazónde rata aislado.Esteesun segundomensajeroqueestimulala salidade Ca> del RS miocárdico,con lo quepodríacontribuir a la sobrecargade Ca> en estafasey con ello a la disfunción miocérdicapostisquémica(Mouton et al, 1991). Opie y du Toit (1992) proponenun mecanismopatogénicobifásico en el que el calcio es el protagonista.La primera fase ocurriríamuy rápidamente,de forma inmediatatras la reperfusión,asociadaa una sobrecargade calcio intracitosólico y coincidiendo con una función mecánicanormal. Si en estepunto seadministranfármacosinhibidores de la entradade calcio, disminuirán posteriormentela extensióndel “stunning”. En la segunda fase (stunning establecido) ya hay hipocontractilidad y los antagonistasdel calcio administradosen este momentopodríanempeoraraún másla función miocárdica. El papeldelos radicaleslibres en estefenómenoparecedemostrado 58 por multitud detrabajosquedemuestranmejoríasañadiendoinhibidores de la formaciónde radicaleslibres y/o atrapadores(“scavengers”)como desferrioxamina,N-acetilcisteina, allopurinol, superóxidodismutasao mercaptopropionil glicina antes de la isquemia o en el instante del comienzo de la reperfusión.Uno de los efectosde los radicaleslibres consisteen contribuir ala sobrecargade calcioalterandola captacióndel mismo por el RS (Rowe etal, 1983). Existen canalesde potasiosensiblesa Al? que se activan como resultadode unadisminución en los niveles intracelularesde ATP y un acortamientode la duracióndel potencialde acción;elevacionesdel ADP y de la concentraciónintracelularde protonesproducenel mismoefecto (Noma, 1983; Shigematsuet al, 1995). Estasalteracionesen el medio intracelular tienen lugar durantela isquemia,y de hechoestoscanales permanecenactivadosdurantela misma,y una fracción de ellos sigue activadadurantela fase inicial de la reperfusión.Cole et al (1991) han demostradoquela activaciónde estoscanalesjuegaun papelimportante en la preservaciónde la función celulardurantela isquemia:el bloqueo de los canales con glibenclamida empeorabala recuperaciónde la contractilidadmientrasque su aperturacon pinacidil la mejoraba.Hoy día existenevidenciasfarmacológicasde diversotipo a favor de que la activaciónpersistentede estoscanalesde K sensiblesa ATP durantela faseprecozde la reperfusiónpuedeprotegerde maneraeficazfrenteal “stunning” miocárdico(Shigematsuet al, 1995). 59 1.3.3.- PRECONDICIONAMIENTO ISQUEMICO. El tejido miocárdicoexpuestoaun estrésligero, subletal,escapaz de desarrollaruna serie de cambiosadaptativosque le permitenuna mejor toleranciaante una nueva exposicióna un estrés (de la misma naturalezao no) másintensoe incluso potencialmenteletal (Reimeretal, 1994). En el contextode la isquemia,Murry etal (1986)demostraronque el corazónde perro, “precondicionado”con brevesperíodosde isquemia de 5 minutos de duración,seguidosde períodosde reperfusiónde otros 5 minutoscadauno, tolerabaa continuaciónunaisquemiaprolongadade 40 minutosde duraciónresultandoun áreade necrosisdetan solo el 25% respectoal grupo control. El precondicionamiento isquémico es un potente factor de protección frente a la isquemia prolongada, y su eficacia ha sido demostradaen repetidasocasiones,reproduciéndosetambiénen cerdos (Schott et al, 1990), conejos(Thorntonet al, 1990) y ratas(Yellon et al, 1992). El mecanismoo mecanismosinvolucradosen este fenómenono estánclaros. Un hechoclave es la reducciónde la demandaenergética por parte del miocardio isquémico, puesta de manifiesto por una reducción en los índices de utilización de fosfatos de alta energía 60 (Jenningset al, 1991a). Esteenlenteciniientoen la deplecciónde Al? durantela isquemiaen miocardiosprecondicionadosno se debea una inhibición precozde la ATPasamitocondrial(Jenningsetal, 1991b),sino quepareceserunacaracterísticaqueacompañaala disfuncióncontráctil postisquémica(“stunning”) quetienelugar trasperiódosde isquemiade corta duración, si bien estepunto resultacontrovertido (Miura et al, 1991; Matsudaet al, 1993). Otros mecanismos propuestos incluyen efectos mediados por catecolaminas(Schomig, 1990), activación de receptoresde adenosina (Liu et al, 1991), aperturaprecozde canalesde potasioATP-sensibles (Grossy Auchampach,1992) y proteínasG (Thorntony Downey, 1991). Recientementese han puesto de manifiesto evidencias que relacionanla fisiopatología del precondicionamientoisquémicocon el control de la homeostasiadel calcio. Steenbergenet al (1993) descubrieronque la sobrecargade calciocitosólico estáretrasadaen el miocardio precondicionado. Por otra parte, Zucchi et al (1994), observaronen corazonesde rataquela densidadde canalesde salidade calciodel RS descendíatrasbrevesperíodosde isquemia.Estoshallazgos son interpretados de la siguiente manera: el precondicionamiento determinala deplecciónde glucógeno,lo cual retrasael desarrollode acidosisintracelular,de sobrecargade Na~ (a travésdel intercambiador Na>-H~) y de entradadecalcioatravésdelintercambiadorNa~-Ca2~.La sobrecargade calcio citosólico es expresiónde una redistribución del 6J calcio intracelular. Zucchi et al (1995) postulanque la sobrecargase iniciaría por inhibición de la Ca2’-ATPasadel RS al disminuir los niveles de ATP, por otra parte, la liberación de calcio del RS una vez que empieza a elevarse el Ca> intracitosólico, se vería enlentecidaal disminuir el número de canales de salida de Ca> del RS con el precondicionamiento.Este retrasoen la sobrecargade Ca> durantela isquemiaal disminuir, por un mecanismotodavíaignorado,el númerode canalesde salidade Ca> del RS duranteel precondicionamiento,podría constituir la basemoleculardel precondicionamientoisquémico. 1.3.4.- FISIOPATOLOGíA DE LA REPERFUSION MIOCARDICA. 1.3.4.1.- FENOMENOS RESPONSABLES DEL DAÑO INDUCIDO POR LA REPERFUSION. Si bien la duraciónde un episodiodeisquemiaesfundamentalpara predecir la evolución del tejido miocárdico afectado, de forma que cuantoantesse produzcala reperfusión másmiocardiopodrásalvarse, estefenómenode reperfusiónlleva asociadouna seriedeefectosadversos (“daño inducido por reperfusión”) que limitan en parte sus efectos beneficiosos(Braunwaldy Kloner, 1985): - Aceleraciónde la necrosiscelular: tras la reperfusiónlascélulas 62 isquémicassufren en ocasionesuna serie de cambiosestructuralesque acabanconduciendoala muertecelular.Estoscambiosseobservanmuy rápidamente,e incluyen hinchazóny alteracionesde la arquitectura celular.Estaen dudasi estefenómenotiene lugartan solo sobreaquellas células que presentanya un daño irreversible, de manera que no afectaría significativamente a la evolución del tejido miocérdico implicado. - Apariciónde edemaintracelular: ya hemosmencionadoquees uno delos fenómenosmáscomúnmenteobservados.Esteedemapuedecausar compresión de capilares miocárdicos produciendo nuevas zonas de isquemia o no reperfusiónde territorios ya afectados(Jenningset al, 1985). - Fenómenode “no-reperfusión“: la isquemiatambiénproducedaño al endoteliocapilar.La alteraciónde la microvasculaturatrasperíodos deisquemiaprolongadospuedeimpedir queciertaszonassereperfundan de hecho.Sin embargo,estefenómenosuelequedarenglobadoen zonas con dañoisquémicoirreversible,por lo cual no sueleaumentarel daño celular ni afectara la evolución de esemiocardio(Kloner et al, 1974). - Hemorragiainducidaporla reperfusión:la afectaciónde capilares ya descritapuedeexplicar igualmentela apariciónde zonasde infarto hemorrágicotras la reperfusión. 63 - Sobrecarga de calcio: acabaproduciendocontracturay muerte celular. Al igual que ocurre con la sobrecargade calcio durante la isquemia, no se sabesi la entradade calcio es la causade la muerte celular, o si tan solo esexpresiónde lesión irreversiblede la membrana plasmática. Los fármacos inhibidores de los canales lentos del calcio son incapacesde inhibir por accióndirectael pasode estecatión al interior celulary, por tanto, no parecequepuedanjugar ningúnpapelprotector actuando exclusivamente sobre las células miocárdicas “in vitro” (Bourdillon y Poole-Wison, 1982). En modelos “in vivo” su efecto protector parecemás relacionadocon la disminución del consumode oxígenomiocárdico. - Paradoja del oxígeno: el mecanismode explicación de este fenómenoessemejanteal de la paradojadel calcio (Hearseet al, 1978). Su efecto nocivo podría estar mediado por la entrada, formación o liberaciónde radicaleslibres. Este fenómenose estudióen corazonesalsíadosperfundidoscon soluciones tamponadas anóxicas, y después reoxigenados. La reoxigenaciónprovocabaedemacelularexplosivo, necrosisen bandasde contraccióny liberaciónmasivade enzimas(Hearse,1973). Un hallazgocomúnen lascélulasmiocárdicasreoxigenadastrasun 64 período prolongadode deplecciónde energíaes la apariciónde una rápida hipercontracturajunto a la citolisis. Se ha postuladoque esta hipercontracturaestá provocadapor el nuevo suministro de energía (provenientede lafosforilaciónoxidativa)hacialasmiofibrillas, lascuales podríanpresentarun estadopotencialde altaactivaciónal encontrarse en un medio conunaaltaconcentraciónde calcio (comoconsecuenciade la deplección de energía durante la fase hipóxica) al inicio de la reoxigenación(Siegmundetal, 1993).Deestemodo,la severasobrecarga de calcio citosólico y la reactivaciónde la producciónde energíaserían los factoresclaveparainterpretarestahipercontracturadeletérea. Paracomprobarsi la hipercontracturaes efectivamenteun evento primordial en la patogénesisde la paradoja del oxígeno se han desarrolladoexperimentosqueintentanprevenirlabloqueandoel aparato contráctil en las fasesiniciales de la reperfusión.La 2,3-butanodiona monoxima provoca parálisis contráctil actuando a nivel de las miofibrillas, posiblementeimitando el efectoinhibitorio de la troponina 1 (Gwathmeyet al, 1991). Pesea presentarefectosadversossobreotras funcionescelulares,se la consideraunaherramientaútil paraprovocar un bloqueocontráctil reversibleen célulasmusculares,ya queel inicio de acciónes muy rápidoy la reversiónde la mismatienelugar en menosde 1 minuto. Experimentosrealizadosin vitro (Gwathmeyet al, 1991) e in vivo (García-Doradoet al, 1992)en cerdoshandemostradounaevidente cardioproteccióncon la inhibición del aparatocontráctilen la faseinicial de la reoxigenación, con lo que el efecto patogénico de la 65 hipercontracturaen la paradojadel oxígenoy en el dañoasociadoa la reperfusiónparecendemostrados. En cualquiercaso, las consecuenciasde la reperfusiónsobre el miocardioisquémicodependenfundamentalmentedelgradodeafectación de los miocitos y de la microvasculaturaadyacente. 1.3.4.2.- REPERFUSION DE MIOCITOS CON DAÑO REVERSIBLE. Períodos de isquemia severa inferiores a 15 minutos suelen producir lesionescelularesreversibles:tras reperfusiónno derivan en necrosis(Jenningsetal, 1960).Sin embargo,unarecuperacióncompleta funcional y metabólicapuederequerirvariosdías, incluso trasperíodos de isquemiade tan solo 5 minutos (Kloner et al, 1983). Las alteracionesultrastructuralesya descritasanteriormentese recuperan rápidamente tras la reperfusión. Tras 20 minutos de reperfusiónno seaprecianingunodelos signosde lesión precoz:pérdida de glucógeno,relajaciónde miofibrillas, ligero desplazamientomarginal de la cromatina celular, ligero edema celular y alteraciones mitocondriales.Tan solo un cierto grado de edemamitocondrial puede 66 persistir ocasionalmentedurantevarios días (Jenningset al, 1985). Si bien la fosforilación oxidativa se recuperarápidamentetras la reperfusión,los nivelesde ATP puedentardarhasta4 díasen regresar a valoresnormales(Kloner etal, 1983). Porotro lado, la recuperaciónfuncional sueleser lenta,y requerir varios días: es el conocido “miocardio aturdido”o “contundido” (Braunwaldy Kloner, 1982). Tras la reperfusiónaumentasúbitamente la contracturamiocárdica,haciéndosemáximaen los primerosminutos y disminuyendo posteriormentehastaalcanzarun nivel de tensión de repososimilar al previo a la reperfusión, generalmentehacia los 30 minutos (Bourdillon y Poole-Wilson,1981,1982).La contracturaguarda relacióncon la unión permanentedel calcio a la troponinaC. Ello se produce tanto por falta de recaptación por parte del retículo sarcoplásmicocomo por aumento del calcio intracitosólico (Nayler, 1981). 1.3.4.3.- REPERFUSION DE MIOCITOS CON DANO IRREVERSIBLE. Períodosde isquemiaseverasuperioresa 30-40 minutos suelen producirun dañocelular irreversible.La reperfusiónen estoscasossuele acelerarel procesodedestruccióncelular.Pormicroscopiaelectrónicase 67 demuestrala aparicición de edemacelular intenso y explosivo, con formaciónde ampliasvesículasbajo el sarcolema,todo ello relacionado con aumentode la osmolaridadintracelular(Jenningsy Reimer,1983). Las alteracionesa nivel de sarcómerossonevidentes,con fenómenosde disrupción y contractura. La alteración iónica más evidente es el masivo incrementoen la concentraciónde calciointracitosólico,condepósitosdefosfatocálcicoen la matriz mitocondrial (Jenningset al, 1965). Este influjo masivo de calcio pareceestarmás relacionadocon la alteraciónestructuralde la membranaque con posiblesalteracionesdel transportede calcio, sobre todo a nivel del intercambiadorNa~-Ca2’. La necrosisen bandasde contracción,puedeobservarseya en los dos primeros minutos de la reperfusión. Esta forma de necrosis miocárdica, siguo evidentede dañocelular irreversible (Ganote, 1983), puedeencontrarsetambiénen procesosno isquémicos:cardiotoxicidad por catecolaininas, shock eléctrico, accidentes cerebrovasculares, miocarditis, hipopotasemia,hipomaguesemiay en el contexto de la paradojadel oxígenoy dela paradojadel calcio. Tambiénsela denomina “degeneraciónmiofibrilar”. 68 1.3.4.4.-PAPEL DEL CALCIO EN EL DANO INDUCIDO POR LA REPERFUSION. Se han propuestomúltiples mecanismosparaexplicarel fenomeno de lesión celular asociadoa la reperfusiónmiocárdica: sobrecargade calcio, radicaleslibres, desacoplamientode la respiraciónmitocondrialy lesión mecánicadel sarcolema. Hoy día se acepta que la sobrecargade calcio durante la reperfusión constituye uno de los aspectos claves en el daño postreperfusión(Marbanet al, 1989; Opie, 1989). La sobrecargadecalciodurantela reperfusiónes tantomásintensa cuantomásprolongaday severaseala isquemia.Además,tras períodos de isquemia prolongados no se recupera la homeostasisdel calcio intracitosólico,a diferenciade lo queocurreen el miocardiocontundido (Marbanet al, 1994). Los mecanismosexactos responsablesde esta alteración de la homeostasiadel calcio no estan claros. Se postulan cuatro factores interrelacionados: depleción de Al?, disbalaneeosmótico, trauma mecánicoy actividaddel intercambiadorNa’-Ca2’. Tras la reperfusión, el restablecimientoparcial del metabolismo energético y el lavado de sustanciasinhibitorias como el fosfato 69 inorgánico y los hidrogeniones, en el contexto de un citosol ya sobrecargado de calcio durante la isquemia, hacen que pueda restablecersela actividadAl?asaa nivel de las proteínascontractiles.El resultadoes unacontracturamasivaque puedetraumatizarlas células irreversiblemente(Nayler, 1983). El lavadode metabolitosacumuladosen el intersticio provocauna súbitaalteracióndel equilibrio osmótico,quea su vez puedeprovocar másdañocelular irreversible(Jenningset al,1986). Incluso en célulasquemantienena pesarde todo la integridadde membranas,el influjo de calcio puede darse por la reactivacióndel intercambiadorNa>-Ca>en sentidoreverso(Grinwald, 1984) y por la producciónde radicaleslibres (Opie, 1989). Otros autoresapuntanel posiblepapelde los canalesde goteode calcio o canalestipo B, descritos en miocitos ventriculares de rata (Coulombe et al, 1989), con la sobrecargade calcio (Wang et al, 1995). En otros muchoscasos,la entradamasivadecalciopareceserconsecuenciadeldañode membrana. De estaforma se acabaestableciendoun círculovicioso, en el que la sobrecargade calcio puedeejercerpor sí mismauna seriede efectos catastróficosque incluyen mayoralteraciónde la regulacióndel calcio y afectaciónde la síntesisde ATP. La sobrecargade calcio alterael procesode producciónde energía ‘70 en la mitocondria. De hecho, el acúmulo de gránulos densosen la mitocondria constituye un criterio fundamental de daño celular irreversible inducido por la isquemiay la reperfusión.Estos gránulos densossondepósitosde calcio y su gradode acumulaciónsecorrelaciona de formanegativacon la preservaciónde la función (Henry etal, 1977). Miller y Tormey (1995), trabajandocon músculospapilaresde hurón sometidosa una hora de isquemia seguida de 5 minutos de reperfusión, midieron a continuación la concentraciónde calcio en distintoscompartimentossubcelularesmediantemicroanálisiscon sonda electrónicade los miocitos supervivientes.No encontraroncambiosen la concentraciónde calcio total en estos miocitos, pero si una llamativa redistribución del mismo entrelos compartimentossubcelulares,con un aumentodel calcio intramitocondrial durantela isquemiaque volvía a valoresbasalesdurantela reperfusióny una caídadel 90% en el calcio del “tercer compartimento”(RS+ sarcolema+ sarcoplasmalibre) tras la reperfusión, a costade un aumentodel calcio en el compartimento miofibrilar, fundamentalmente. Igualmente,medidasrealizadasen músculoventricularde conejo sometidoa 60 minutosde isquemiay 5 minutosdereperfusiónmostraron una pérdidadel 50% del calciocontenidoen el “tercer compartimento” que se redistribuíahacia mitocondriay miofibrillas (Walsh y Tormey, 1988 a y b). En amboscasos,la caídade Ca2~ enel tercercompartimento de estosmiocitosviables, seachacabaa pérdidadel Ca> almacenadoen ‘7’ el RS. Estosautoresproponenel dañoen el sarcolemay mitocondrias como factorescríticos en el dañoasociadoa la reperfusión. 72 1.4.- INHIBIDORES DE LA Ca2~-ÁTPasa DEL RETICULO SARCOPLASMICO. 1.4.1.- ÁCIDO CICLOPIAZOMCO. El ácido ciclopiazónico(CPA) es una micotoxina producida por diversasespeciesde hongosPeniciliumy Aspergillus.Desdeel punto de vista químico esun ácidoindol tetrámico(Figura 7). Desdehace menos de unadécadaseconocesu capacidadde inhibir especfficamentela Ca>- Ál?asadel RS de músculoesquelético de conejo(Seidier et al, 1989)y de rata (Goegery Riley, 1989). Tambiénproduceel mismoefectosobre la bomba de Ca> del RS de músculoliso (Uyaina et al, 1992). No tiene ningúnefectosobre Al?asastipo F, comola H~-Ál?asamitocondrial, ni sobreotrasATPasastipo P, como la H’-K~-Al?asa gástrica,lasNa>. K~-ATPasasrenalesy cerebralesy la Ca2’-ATPasaeritrocitaria (Seidler eta), 1989). o ----H a O H FIgura7.- Estructuramoleculardel ácido ciclopiazónico. ‘73 A nivel de miocardio, el CPA ha demostrado bloquear completamentela Ca2’-ATPasadel RS en vesículasde RS (Lahouratate et al, 1992) y en miocitos aislados,disminuyendo en éstos la fuerza contráctil (Miller et al, 1990; Pery-Manet al 1993). Sobremúsculo papilar de rata adulta, en rango de dosis de 0,3 a 30 pM, produceun efecto inotrópico negativo de instauración lenta (pudiendo tardar en equilibrarsehasta60 minutos)acompañadodeunaprolongaciónextrema de la fasede relajacióndel ciclo contráctil (Takahashiet al, 1994). Sin embargo,en miocitos neonatalesno se observótal efecto (Agata et al, 1993), ya que en ellos la contracción miocárdica depende fundamentalmentedel influjo trans-sarcolémicode Ca2’ más que del liberadopor el RS (Bers et al 1981). Baudet et al (1993), trabajandocon trabéculasventricularesde conejo bañadascon CPA 10”’ M encontraronuna disminución de la contractilidaddel 45% y un incrementodel tiempoparael picode tensión desarrolladaasí como una prolongaciónde la fase de relajación.Este mismo grupo encuentra, utilizando la técnica de contractura por enfriamientorápido próximo a 00C, que ni siquieraa altas dosisexiste un bloqueocompletode la bombade Ca> del RS,por lo queno se puede afirmar que, en preparacionesmulticelulares, llegue a producir un bloqueo completo de la misma. Otras experienciascon cafeína y ryanodina apoyanestaafirmación. El CPA no tiene ningúnefectosobreel intercambiadorNa~-Ca2’ ‘74 (Yard et al, 1994),aumentala sensibilidadmiofibrilar al Ca> en fibras cardíacas,y en corazón de rana no sólo no disminuye la amplitud contractil, sino queaumentael pico de tensión (Badaouietal, 1995). 1.4.2.-THAFSIGARGINA. El segundo inhibidor de la bomba de Ca> del RS es la Thapsigargina,un promotor tumoral de naturalezaquímica (lactona sesquiterpénicade origenvegetal)diferenteal CPA y que pareceactuar por otrosmecanismos(Sagarae Inesi, 1991).Su comportamientoesmuy semejanteal del CPA: (a) bloqueapor completola bombade Ca> en vesículasde RSy en miocitosaisladossin afectaraotrasbombasde Ca> (Kirby et al, 1992); (b) en preparacionesmulticelulares disminuye la contractilidaden un rangosemejanteal CPÁ, (c) alargael tiempopara pico y (d) no llega a alcanzarun bloqueo completo. Sin embargo,no alargael períododerelajación,quizásporefectoscolateralesestimulando la salidade Ca> via intercambiadoro disminuyendola sensibilidadde los miofilamentosal Ca’¼y podríaproducirun gradode bloqueoalgo menor que el CPA y menos especifico (Baudet et al, 1993). La thapsigarginapodría bloquearel canallento de entradade calcio, pero este efecto sólo se apreciaa concentracionesde thapsigarginavarios órdenesde magnitudpor encimade los quebloqueanla Ca”-ATPasadel RS (Buryi et al, 1995). ‘75 Du Toit y Opie (1994) demostraroncierto grado de protección frente al daño de reperfusiónen corazonesde ratas sometidosa 20 minutos deisquemiay 20 minutosde reperfusióny pretratadoscon CPA ío~M o Thapsigargina2,5 x 10.8M. Sin embargo,con altas dosis de Thapsigargina(10.6 M), seempeorabael gradoderecuperaciónrespecto al control, lo cual sugieretambiénun menorgradode especificidad.El CPA resultabaefectivo incluso cuando se aplicabasólo durante la reperfusión. En definitiva, la mayoríade los autorescoincidenen señalarestos fármacos,y muy especialmenteel CPApor sumayorespecificidad,como agentesde elecciónparaestudiarla participacióndel RS en los procesos de acoplamientoexcitación-contraccióny en el daño asociadocon la reperfusiónmiocárdica. ‘76 fi.- PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS ‘7.7 La sobrecargade Ca> durante la isquemia miocárdicay, más especialmentedurantela reperfusión,constituyeunosde los mecanismos más aceptadosde daño celular (Marban et al, 1989). Los últimos estudiosparecenestablecerque el calcio acumuladoen el RS podríaser el contribuidor principal a la sobrecargade Ca2’ citosólico durantela isquemia-reperfusión(Miller y Tormey, 1995). Recientementeha sido publicadopor primeravez quela inhibición de la Ca2>-ATPasadel RS (SERCÁ) del corazón de rata in vitro disminuyeel dañofuncionalinducido por la reperfusiónen el miocardio contundido(“stunning”) (du Toit y Opie, 1994). La contribución de la SERCAal procesoexcitación-contracciónvariaen función de la especie animal (Wolska y Levartowski, 1993; Chiesi et al, 1994; Bassaniet al, 1994) y del gradode desarrolloy situacionespatológicasintercurrentes (Lompre et al, 1994). En la actualidadno existenestudiosque demuestrenla utilidad de estos fármacossobre períodosde isquemia de larga duración (= 30 minutos),con evaluaciónno sólodetipo funcional (incrementodetensión de reposo,porcentajede recuperaciónde contractilidadsobrevalores preisquémicos),sinotambién sobreintegridadde membrana(liberación de enzimas intracelulares) y análisis objetivo (microscópico) sobre mantenimientode estructurasmorfológicas(intensidaddeedemacelular, bandasde contracción, ruptura de membranas...).Tampoco existen estudios que evalúen las posibles acciones antiisquémicas de los ‘78 inhibidoresdela SERCAenotra especieanimaldiferenteala rata,y ésto sólo bajo condicionesde contusiónmiocárdicaexperimental.Porello, es precisoconfirmar que los efectosantiisquémicos tambiénse mantienen en isquemiaprolongaday en otras especiesanimales. El objetivo global de estatesiseravalorarsi el bloqueode la Ca>- ATPasa del retículo sarcoplásmico(SERCA) del corazón de conejo produce cardioprotecciónsobre la isquemia miocárdicaexperimental. Paraello nos propusimos 1.- Seleccionarel rango de dosisútil de un inhibidor de la SERCA, el ácido ciclopiazónico (CPA), en baseal rango que produce efectos lusitrópicosnegativos. 2.- Valorar el efecto del CPA sobreparámetrosfuncionales en condiciones basales, durante isquemia de 30 minutos seguida de reperfusiónde 30 minutosy al finalizar la misma.Ello supuso 2.1.- Diseñar y optimizar un sistema de digitalización y medidade señalesbiológicasajustadoa nuestromodelo experimental. 2.2.- Analizar los efectosdel CPA sobrelos parámetrosde contractilidadcontrol del septuminterventricularaisladoy perfundido arterialmentedel corazónde conejo(tiempospara inicio de contracción, + dT/dt máximo, 50% de contracción,pico, -dT/dt máximo y 90% de relajación; tensión de reposo,amplitud contráctil y valor del +dT/dt ‘79 maximoy del -dT/dt máximo). 2.3.- Analizar el efectoen el tiempoqueproduce la isquemia global de 30 minutossobrelos parámetrosanteriores,asícomodurante la reperfusión de 30 minutos tras la isquemia. Elaborar un modelo cinético aplicable a los mismos y calcular parámetroscaracterísticos (constantesde tiempo). 2.4.- Analizarlasmodificacionesqueinduceel CPÁ sobrelos parámetrosanteriores. 2.5.-Evaluarfuncionalmenteel efectoantiisquémico(máximo incremento de tensión de reposo, porcentaje de recuperación de contractilidad sobre valores preisquémicos)que pudiera presentarel CPA. 3.- Valorar el efecto antiisquémico del CPA sobre parámetros bioquímicos,como marcadoresde daño irreversibledel sarcolema,tras isquemiaglobal de 30 minutos.Paraello secuantificó la liberaciónen el líquido de perfusión de creatinfosfokinasa (CPK), la aspartato- aminotransferasa(ASAT/GOT) y la lactato-deshidrogenasa(LDH) antes de la isquemia(valor control) y en los intervalosde reperfusión0-2, 5-7, 15-17 y 28-30 minutos en experimentoscontrol y bajo tratamientocon CPÁ. 4.- Valorar el efecto antiisquémico del CPA sobre parámetros morfológicos (microscopia óptica y electrónica) de las alteraciones inducidastras 30 minutos de isquemiay reperfusión. 80 El modeloexperimentaldel tabiqueinterventriculardel corazónde conejo,aisladoy perfundidoarterialmentesegúnla técnicadescritapor Langery Brady (1968), fue validadoparaestudiosde isquemiaglobal y reperfusiónporBourdillon y Poole-Wilson(1982).Constituyeunatécnica óptima para nuestrospropósitos de análisis funcional, enzimático y estructuralde la isquemiade largaduraciónbajo condicionescontrol o deintervenciónfarmacológica(Reimery Jennings,1986).La isquemiade 30 minutos de duración, si bien se consideraisquemia prolongada, presentaunascaracterísticasintermediasentrela situaciónreversibleque implica la isquemiade cortaduración(15-20 minutos) y la isquemiade 1 hora de duracióncon intenso dañocelular global, por lo que puede suponerun punto de inflexión en el que la eficaciade las intervenciones farmacológicaspuedesermásfácilmenteobservable,tantodesdeel punto de vista funcional como morfológico o enzimático(Reimer y Jennings, 1986). Como bloqueantede la SERCA elegimos el CPÁ, frente a la thapsigargina, por su carácter más selectivo y mayor potencia bloqueadora en preparacionesmulticelulares, así como por haber mostradorelación dosis-efectoen los estudiosde contusiónmiocárdica experimental(du Toit y Opie, 1994). 8’ III.- MATERIAL Y METODOS 82 HI.i.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL : TECNICÁ DEL TABIQUE INTER VENTRICULAR DE CORAZON DE CONEJO, AISLADO Y PERFUNDIDO ARTERIALMENTE. SISTEMA DE DIGITALIZÁC ION. Los experimentos se realizaron sobre el tabique (septum) interventricularde corazóndeconejoNZW (2,3-3,2Kg) segúnla técnica descritapor Langery Brady (1968) y validadaparaestudiosde isquemia global por Bourdillon y Poole-Wilson(1982). Tras heparinizar (2.000 U.I. iv) y sacrificar a los conejoscon sobredosisde pentobarbital(120 mg iv) a travésde la venadorsalde la oreja, se procede inmediatamente a la apertura del tórax por esternotomíay extracción del corazón. Se coloca éste sobre la cara ventricular izquierda en un soporte para disección, procediéndose entoncesa la exéresisde lasaurículasy de la porciónexternade la pared ventricular derecha. Tras abrir la arteria coronaria izquierda, se identifica y canulala arteriadel tabique interventricularmedianteuna cánuladepolietileno (Clay Adams,PE50, diámetroexternode 1,09mm, diámetrointernode 0,38mm) en la que previamenteseha moldeadouna oliva terminal que impide su deslizamientotras su insercióny sutura. Los tabiquesson perfundidoscon solución nutricia medianteuna bombaperistálticaGilson, mod. Miipuls HLP4, de 4 vías, lo quepermite 83 cambiarel tipo de solución perfundidagraciasa un juego de llaves de tres pasos conectadoal sistema de perfusión, sin que ello origine gradientesde flujo, presióno temperatura. Se desechanaquellos tabiques interventricularesen los que el tiempo transcurridodesdela inyección del barbitúrico y el inicio de la perfusiónes superiora 4 minutos. Trassepararlos músculospapilaressituadosenla caraderechadel tabique, la pared ventricular izquierda y el resto del tejido no perfundido, la preparacióntriangular resultantesemonta fijándola por su basemedianteunos forceps en amboslados con el vértice superior unidoa un transductorfuerza/desplazamiento(Grass,Ff03), mediante un hilo de sedade sutura. El transductorseconectaa un polígrafo Grass,mod. 79D, con un módulopreamplificadorD.C. Grass,mod. 7P1F,cuya señalamplificada se registrasobrepapel y simultáneamentese obtienesu derivadaen el tiempo mediante la introducción de la señal (obtenida a través de la salida J6 del preampliticador) en un módulo diferenciadoranalógico Grass7P20. Ello permite, tras la adecuadacalibración del equipo, el registrográficocontinuo tanto de la tensióndesarrollada(g) comode la velocidadde desarrollode la tensión(dT/dt; g/seg).Simultáneamentese obtieneregistrodigitalizado mediantela introducciónde la señalen una tarjetadiferenciadoraPC-Lab mod. PCL-812PG,lo que permitemedir 84 automatizadamentetodoslos parámetroscontráctilesdecadacontracción con gran precisión. Los tabiques interventricularesse estimulan electricamentecon pulsos rectangularesde 15 V y 5 msg de duración, a una frecuencia básicade estimulaciónde 1,2 a 2 Hz, medianteun estimuladorGrass 5D9. Sóloseutilizan los tabiquesinterventricularesqueen los momentos iniciales presentan8 g o más de tensión desarrolladay tienen 10 g o menosde tensiónbasal,a 280C y 0,5 Hz. La perfusión de los tabiques se realiza con Tyrode a flujo constante,procurandoobtenerun flujo mediode2,15ml/min/g detejido. La composicióndel Tyrode es la siguiente, (mM): NaCí, 114; KCI, 5; MgCI 2, 1; CaCI2, 1,8; NaH2PO4,0,43; glucosa,5,5 y NaHCO3hastaun pH de 7,4 (aproximadamente28 mM). Esta solución de Tyrode se oxigenacon carbógeno(95 % de 02 y 5 % de CO2). Los tabiques interventriculares se colocan en una cámara termostatizada,al objeto de realizarlosexperimentosaunatemperatura constantede 32 + 0,25 0C. Las temperaturasde trabajo se controlal continuamentemedianteun teletermómetro(Panlab,mod. pb 0331)y una aguja Thermistor (1W, 524) introducida en la masa muscular. La temperatura de la cámara se controla mediante una sonda de 85 temperatura(VSI, 401) y un teletermómetrodigital Cibertec,mod.TT1. El líquido de perfusión se calienta a su paso por el sistema medianteuna resistenciade calentamientoacopladaa una fuente de corriente continua de voltaje regulable. El interior de la cámarase mantieneala temperaturadeseadamedianteun radiadorrellenodeagua calentadaa la temperaturaque se precise mediante una resistencia eléctrica,y a travésdel cual se burbujeagasnitrógeno. Todas las preparacionesse estabilizan durante, al menos, 45 minutospreviamenteaintroducir cualquiervariacióncorrespondienteal protocoloexperimental. Al final de cadaexperimento,el tabique interventricularse seca ligeramentecon papelde filtro, pesándosey desecándoseen estufahasta pesoconstante. 86 111.1.1.-MEDIDÁ AUTOMÁTIZÁDÁ DE LAS CONTRACCIONES. Las medidasautamatizadasde las contraccionesse han realizado en 4 pasossucesivos: 1~. Registroen discoduro. La señalobtenidaatravésdela salidaJ6Ádel móduloamplificador del oscilógrafo fue introducidaen una tarjetaconvertidoraanalógico1 digital PCL-812PGsituadaen un ordenadorpersonal(InvestrónicaPC 286/16). La adquisiciónde la señalfue sincronizadacon la salidadel pulsoeléctricodesincronismo(pausade 5mseg)del estimuladoreléctrico usado para estimular la preparación. La tarjeta digitalizadora fue manejadamedianteel programaSantosUno(Anexo 1, pag 196), en lenguajePascal,desarrolladoespecíficamenteparaestaaplicación. Se utilizaron las subrutinas de programaciónen Pascal (inicialización, fijación de ganancia, selección de canal, adquisición en forma sincronizada,...)proporcionadaspor el fabricante de la tarjeta. El programaSantosUnogeneraen el disco duro dos ficherosde salidacon el nombreasignadoal experimento,unocon extensión.DAT y otro .BIIN (Tabla 2). El primero contienelos datos de calibracióndel sistemay parámetrosde digitalización (número de puntos fijados para cada contracción y frecuencia de muestreo; habitualmente6 mseg y 120 puntos) (Tabla3). El fichero .BIN contienelos datosde las contracciones 8’7 digitalizadas, en formato binario. El primer número de cada serie correspondientea cada contracción es un número identificador de correspondenciaal tiempo de experimento(basal, efecto del fármaco, isquemia, reperfusión), número clave que se introduce a través del teclado. En cadaexperimentode isquemiasehandigitalizadoalrededorde 100 contracionessucesivasen condicionesbasales,otras100 al final del tratamientofarmacologico,continuamentedesdeel inicio de la isquemia hastala aparenteanulaciónde la actividad contráctil (alrededorde 7 mm), desdeel inicio de la reperfusiónduranteotros 5 - 10 mm y las últimas 100 contraccionesal final del tiempode reperfusión. 20. Conversiónde datosa formato ASCII. Este segundopaso se realiza medianteel programaSantosDos (Anexo II, pag204). Esteprogramaconviertelos ficherosde datosdesde formato binario a formato ASCII. Generaun fichero con el mismo nombredel experimentoya asignadoperocon la extensión.PRN (Tabla 4). Además,cuentael númerode contraccionesregistradasy permite visualizaren pantallabien todo o bien la partedel experimentoquese desee. Ello se realiza indicando a través del teclado el número de contraccióninicial y final del trozoquesedeseevisualizar,observándose en cualquiercasoen idénticaforma al registroanalógicoen papel. 88 3. Medida automatizadade diversosparámetrosde contracción. Estetercerpasoserealizamedianteel programaSantosTres(Anexo III, pag208). Realizamedidassobrelascontraccionesalmacenadasenun fichero .PRN. Esteprogramageneraun ficherocon los resultadosde las medidasal que asignael mismo nombredel experimentoseleccionadoy la extensión.RES (Tablas2 y 5). Apartede ello, graticaen pantallacada contraccióny su derivada,asícomola contraccióny derivadamediasde todas las contraccionesbasales(control). La forma gráfica puedeser manualo automática.En el primer casopermiteseleccionarel número de contracciónque se deseavisualizary contieneademásen pantallalos valoresde los parámetrosmedidos.En estecasoel avancea travésdel fichero .prn se realizade forma unitaria (contraccióna contracción),a travésde unaordenpor teclado.En el segundocasoexisteademásde la grafica ya descrita una representaciónacumulada, con un avance automáticode unacontraccióncada0,1 segundo.En amboscasosindica el total de contraccionesregistradas,el númerode contracciónactualy, en el casode la isquemia. el tiempotranscurridode la misma. Se mejoró la exactitud de las medidasdisminuyendo el ruido mecánicoregistradoprocediendoa un suavizadode los datos, de la forma: X~= (X,~1 + 2X11 + X~+1)I4 siendoX el valor contenidoen el canalde registron. Experimentalmente 89 se determinó que 1 suavizadooptimizaba globalmenteel procesode medidaen condicionescontrol. Cuandoel valorde la amplitud es menor del 51% del inicial, se suavizaprogresivamentehastaun máximo de 6 suavizadosy 5 de la derivadaen valorespróximos a cero. El programadetectacontraccionesextrasistólicasy no almacenaen el fichero .RES las medidasrealizadassobreéstas.Los criterios para considerar que una contracción es extrasistólica se basan en la comparaciónde lasmedidasde la contracciónactualcon la mediade las 8 precedentesno extrasistólicas.Se consideraextrasístole (salvo en reperfusión)cuandoseda algunade estascircunstancias: # Tensión basalsuperioren un 10%. # Inicio de la contracción > 3 canales. # Amplitud mayor de un 4%. # Tensiónde reposofinal > 20%. Los parámetros que analiza y registra en fichero para cada contracciónson(Figura 8): #tensióndereposo,calculadacomolamediadetensión(expresada en mV) de los n canalesiniciales, hastaqueel valor del siguientedifiere en másde 1 desviacióntípica de los precedentes. # t de inicio de contracción,expresadocomo el númerode canal en que se encuentra el inicio de contracción, calculado según el procedimientoanterior. # t para el pico de confracción, expresadocomo el númerode 90 canal en que se encuentrael máximovalor de mV tras 1 suavizado,en los n canalesutilizados. #amplitud contráctilexpresadacomola diferenciaen mV entreel valor del máximoy de la tensiónde reposo. # t parael 50% de la contracciónexpresadocomo el númerode canal en quese encuentradicho valor. # 50 % de la contracción,valor (expresadoen mV) del canal que más se aproxima al valor de la tensión de reposomás el 50% de la amplitud, empezandoa seleccionardesdeel inicio de la contracción. #t parael 90% delarelajaciónexpresadocomoel númerode canal en quese encuentradicho valor. # 90 % de la relajación,valor (expresadoen mV) del canal que más se aproxima al valor de la tensión de reposo más el 10% de la amplitud, empezandoa seleccionardesdeel máximode la contracción. # t parael máximodela velocidadde contracciónexpresadocomo el númerode canal en quese encuentradicho valor. # máximode la velocidadde confracción(+dT/dt max), máximo positivo obtenido tras la diferenciaciónmatemáticadel valor de los n canales,expresadaen mV. # t parael máximode la velocidadde relajaciónexpresadocomo el númerode canalen que se encuentradicho valor. # máximo de la velocidad de relajación (-dTfdt max), máximo negativoobtenido tras la diferenciaciónmatemáticadel valor de los n canales,expresadaen mV. 9’ Paraverificar el buenfuncionamientodel programase obtuvoen una hoja de cálculo (Lotus 123) la contracción media de 106 contraccionescontrolessucesivasde un fichero *.prn (sobrelas que no sehizo suavizadode la función) pararealizarla medidamanualde estos parámetros.Tambiénsecalcularonlasmediasde estosparámetrossobre las medidasautomatizadasque se realizaronsobrecadauna de las 106 contraccionesmedianteel programadescrito,obteniendoselos siguientes resultados: MANUAL AUTOMATIZADA (%) # Tensiónde reposo # t inicio contracción # t pico de contracción A’ amplitud contráctil A’ t 50% de la contracción A’ 50 % de la contracción A’ t 90% de la relajación A’ 90 % de la relajación #tparael+dT/dtnmx A’ +dT/dt max A’ t parael -dT/dt unix A’ -dT/dt unu 102,75 101,97±2,79 6 39 566,58 19 374,77 74 155,07 16 27,44 59 -23,60 6,08±1,41 39,04±0,44 566,07±2,78 19,06±0,23 375,46±6,02 73,71±0,45 157,42±3,98 15,73±1,39 27,51±0,50 58,71±1,29 -23,69±0,50 (n=106) -0,76 1,33 0,10 -0,09 0,32 0,18 -0,39 1,52 -1,69 0,26 -0,49 0,38 92 40• Calculos y representacionesgráficas. La transformaciónde unidades(mV a g,...), el análisisde medias,ajustesa funciones,análisis estadístico y representacionesgráficas ha sido realizado mediante la utilización de las hojas de cálculo Lotus 123, Excel 5.0 y PowerPoint. Segúnlascondicionesexperimentalesgeneralesarribadescritas,se procedióa realizar las diferentes series de experimentosdetalladosa continuación. o O‘o ~ ~ o La LaLa ~ ii0 0 V V z0-ae0 Ez0 e «ezo 0oIz oca> eQOoe0y zoE cg1~o‘a3-orl, rl, cgca> Aozy 2 < rSz o•Oa0 — o c g c ~ ca> rt rt c tQ — — — E IiI 0 0 0 V V V QQ o•< e0 n i A A M i 0 0 V V ensj0 unAoy-a0 cg PILaoca>orl,cgrl,cgcgaLari~oLaoooca>ocg•Nca>Larl, ou,cgrl,oca>cgcgoLaao‘aca>3-ca>ca> r42 nioozze-a2-a-a ca>ca> ‘cg1~OooLa ‘cgLacgou , Laaca>cgcg4 - cgoocg Tabla 3.- Aspecto del contenido de un fichero .DAT. El período de muestreose expresaen mseg.Númerode muestrasindica el númerode puntos quese registranparacadacontracción.El productoperíodode muestreox númerode muestrasindica el tiempototal deregistrotrasel pulso de sincronismodel estimulador eléctrico (720 msegen nuestro caso).Media inferior y superiorrepresentanla calibración del equipo. Sonel valormedioen mV de 200 medidasrealizadasconunatensiónde O y 10 g sobreel transductor,respectivamente. Periodode muestreo:6 Númerode muestraspor ciclo: 120 Media inferior: -286.04 Media superior:404.69 -67 106 102 109 104 106 105 119 123 142 163 185 210 240 264 290 320 342 374 398 426 450 470 496 519 540 559 572 591 604 619 628 635 646 652 659 663 662 667 667 665 662 659 655 646 644 638 626 609 600 581 565 550 526 510 485 461 442 415 397 370 347 330 304 286 266 246 235 215 205 191 176 172 155 151 142 133 134 123 125 285 268 252 231 223 202 192 179 168 164 150 144 139 131 132 123 122 120 115 118 111 113 113 108 113 108 109 110 105 110 104 109 110 107 111 106 107 109 102 108 104 108 108 100 109 103 105 107 102 108 103 106 106 100 106 103 104 -67 103 109 103 106 106 108 118 124 146 165 186 217 236 268 294 321 350 372 402 426 453 476 497 522 539 560 577 591 607 617 630 640 645 656 660 664 667 665 669 665 664 661 654 652 639 632 621 607 594 577 560 544 522 504 479 461 439 412 392 366 346 327 301 284 261 245 231 210 203 186 174 169 154 152 140 134 133 123 125 118 114 117 109 115 111 107 110 106 110 107 105 109 101 109 105 104 107 103 107 105 103 107 101 108 104 103 108 100 105 103 103 107 101 105 103 103 107 102 104 -67 106 102 107 101 104 110 113 131 140 164 187 209 240 264 292 321 344 377 398 425 451 472 497 517 541 558 573 591 604 620 627 636 647 653 660 660 664 666 664 668 662 657 655 647 641 629 619 609 590 582 561 542 525 503 484 461 436 417 390 371 347 324 306 281 264 248 227 218 198 191 180 167 162 147 145 140 130 134 122 124 121 114 118 111 115 114 107 115 108 111 111 106 111 107 110 111 106 113 108 108 109 105 111 108 107 108 106 110 106 107 108 104 111 106 107 107 105 111 104 TABLA 4.- Aspecto del contenido de un fichero .PRN. Estos datos correspondena3 contraccionescontroles(-67 = contracciónbasal).Los 119 númerossiguientes a cada -67 correspondenal valor de tensión obtenidacada6 mseg. 105 102 104 103 104 104 104 103 105 104 106 105 104 106 104 103 7 40 3 39 4 40 3 39 7 40 5 39 6 38 5 39 6 39 5 39 5 39 4 39 4 38 5 39 6 39 5 39 560 563 sós 563 561 567 562 566 563 563 565 563 564 563 564 569 20 398 19 371 20 401 19 374 19 373 19 375 19 373 19 374 19 374 19 374 19 378 19 374 19 375 19 378 19 375 19 377 134 6 46 499 23 375 133 7 47 499 24 392 134 6 46 502 23 376 134 8 46 501 23 375 131 3 46 507 23 376 130 3 46 516 23 388 130 3 46 502 23 373 132 5 45 497 23 372 132 6 45 501 24 391 134 7 46 494 24 390 131 3 46 500 24 391 136 7 46 495 24 391 74 74 74 74 74 74 74 74 74 74 74 74 74 74 74 74 158 157 160 157 159 158 157 161 158 158 160 157 161 158 158 160 1527 1527 1427 1728 1427 1627 1627 1627 1527 1627 1427 1627 1828 1627 1427 1527 92 184 18 20 93 183 19 20 92 185 22 21 92 185 21 21 93 182 21 21 93 181 18 21 93 180 24 21 93 180 19 20 93 183 23 21 93 182 19 20 94 181 24 21 92 185 19 20 TABLA 5.- Aspectodel contenidode un fichero .RES.Las columnas de izquierda a derechasignifican:númerode la contracción,tipo decontracción(-67 = contracción basal; -3 tras la accióndel flirmaco, CPA), Tensióndereposo,tiempo (t) de inicio de la contracción,t para el pico de contracción,amplitud contráctil, t para el 50% de la contracción,50 % de la contracción,t para el 90% de la relajación,90 % de la relajación, t para el + dT/dt max, + dT/dt max, t parael -dT/dt max, -dT/dt max. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 -67 -67 -67 -67 -67 -67 -67 -67 -67 -67 -67 -67 -67 -67 -67 -67 58 59 58 58 58 58 59 59 59 56 59 57 59 58 57 60 -23 -23 -23 -23 -23 -23 -24 -24 -24 -23 -23 -23 -23 -23 -23 -24 577 -3 578 -3 579 -3 580 -3 581 -3 585 -3 587 -3 589 -3 590 -3 591 -3 592 -3 593 -3 68 -17 71 -17 68 -17 69 -17 69 -17 67 -17 68 -17 68 -17 72 -17 69 -17 70 -17 68 -17 Los saltosen la numeración de la 12 columnaindican contraccionesextrasistólicas. oo ca>ca> O ) .~ — ‘ oCo ‘o ’o .— ~ a>.— ca> cg L a ~ c g ou ca> ca> c g tt PC o cg~& OLO c a > U ~ 3 -c g t 3- O c g c g cg OO.I~ . u,= _ oO ca> (Y ) OO c ~ tI CNt u,ca> ca> OO ‘O ca> a— O ~ cg ¡ ~ a>‘o PC u cg cg 3 -0 3 - o O ca o CNt o c a co o CNt ~ - ~ - ~ - — — O , 98 111.2.- EFECTOS DEL ÁCIDO CICLOPIAZONICO (CPA) SOBRE PARAMETROS CONTRACTILES. 111.2.1.- CURVAS DOSIS-EFECTO Y EXPERIMENTOS CONTROL. Siguiendoel procedimientoexperimentaldescritoanteriormente, realizamos,en primer lugar, curvas dosis-efectoacumulativas(n= 3) utilizando solucionesde Tyrode conteniendoi0~, 1O~ 10-y, 10.6 M, durante30 minutos, obteniendoregistrocontinuoanalógicoy digital, en condiciones control y al final de cada una de las sucesivas concentracionesa En segundolugar, analizamoslos efectosde una concentración únicade CPA ío~M (n= 9), administradadurante30 minutosvalorando los efectossobrela contracciónde forma continuay midiendoparaello los mismosparámetroscontráctilesdescritosen el apartadoanterior. En tercer lugar, realizamos el mismo estudio utilizando una concentraciónúnica de (EPA 106 M (n=8). Analizamosigualmenteel efecto de una dosis de (EPA 3 1V M (n=2) sobrela contractilidaden condicionesbasales. Con el fin de descartarque los efectosencontradosal administrar CPA pudieranser debidosal efecto del disolvente empleado,dimetil- 99 sulfóxido (DMSO), realizamos dos experimentos añadiendo exclusivamenteel disolventea la mismaconcentraciónqueapareceríaal administrarel CPA i0~ M, 100 x1 en 100 ml de Tyrode. Los registrosy medidasa realizarsobreparámetroscontráctilesfueron los mismosque en los experimentosanteriores. 111.3.- ESTUDIOS SOBRE PARÁMETROS DE CONTRÁCTUJIDAD EN ISQUEMIA MIOCAMBICÁ. 111.3.1.- ISQUEMIÁ GLOBAL. TECNICÁ GENERAL Y DESCRIPCION DEL MODELO. EXPERIMENTOS CONTROL. Tras estabilizarlas preparaciones(n=11) durante45 minutoscon Tyrodecomo soluciónnutricia, seprocediósegúnla técnicade isquemia global descrita para esta preparaciónpor Bourdillon y Poole-Wilson (1982). En condiciones control, y tras 30 minutos de perfusión, se procedióapararel flujo durante30 minutos,tiempoa partir del cualse reperfundióla preparaciónduranteotros 30 minutos. Se controló la temperaturade los tabiquesduranteel tiempo de isquemia mediante el sistematermostatizadode calentamientode la cámara,manteniéndoseestablea 32 ±0,25 0C. Los parámetrosmecánicosanalizadospara cuantificar el daño 1~00 isquémico fueron el máximo cambio en la tensión de reposo y el porcentajederecuperacióntras30 minutosdereperfusión,medidofrente a los valores inmediatamenteanterioresa la isquemia (Salinasa al, 1995). Se caracterizaronotros parámetroscontráctiles en condiciones basalesy durantela isquemia-reperfusiónparaanalizarel efecto de la isquemiasobrelos mismosy la cronologíade estasmodificaciones.Estos parámetrosincluyen:duraciónde la contracción,amplitudmáximade la contracción,tiempo necesarioparaalcanzarel pico de la contracción (tPC), tiempoparainicio decontracción,tiempoparaalcanzarel 50% de la contracción,tiempoparael 90% dela relajación,máximavelocidadde contracción(+ dT/dt máx) y su tiempo, máximavelocidadde relajación (-dT/dt max> y su tiempo. m.3.2.- EXPERIMENTOS CON ACIDO CICLOPIAZONICO (CPA) EN ISQUEMIA MIOCARDICA. De acuerdocon la metodologíaexpuesta,seutilizaronsolucionesde Tyrode conteniendoiO~ M (n=9), i0~ M (n=8), 3 x iO~ M (n=2), asícomoDM50, 100 ji1 en 100ml de Tyrode(n=2), perfundidasdurante 30 minutosinmediatamenteantesde inducir isquemiaglobal durante30 minutos. Tras esteperíodose reperfundiócon soluciónTyrode libre de fármaco. 2~01 En tresexperimentosse realizó perfusióndurante30 minutos en preisquemiacon CPA 10’ M y reperfusión tras los 30 minutos de isquemiacon la mismasolución de CPA 106 M durantemediahora. En otroscuatroexperimentosserealizóisquemiade 30 minutossin administración previa del fármaco, tras lo cual se reperfundió con Tyrode conteniendoCPA 10~M durante30 minutos. Se registraron y midieron de forma continua en isquemia y reperfusiónlos mismosparámetroscontráctilesdescritosen el apartado de isquemiacontrol. 111.4.-ESTUDIOSSOBREPARÁMETROSBIOQUIMICOS DEDANO CELULAR EN MIOCARDIO ISQUEMICO. DETERMINACION ANALmCA. Se procedió a la recogidadel líquido de perfusión etluentedel tabiquey a la determinaciónanalfticaen el mismode la actividadde las enzimascreatin-fosfokinasa(CPK), aspartato-aminotransferasa(ASAT ó GOT) y lactato-deshidrogenasa(LDH), como marcadoresde daño irreversibledel sarcolema. El líquido efluente procedentedel tabique interventricular fue recogido en diversos tiempos: 2 minutos antes de la isquemia par~ 102 obtenerun control basal,y durantela reperfusiónen los instantes0-2 minutos, 5-7 minutos, 13-15 minutosy 28-30minutos. Serealizarondeterminacionesen experimentosdeisquemiacontrol de 30 minutos (n=8), CPA 106 (n=7), CPA 10’ M administradoen preisquemia y reperfusión (n= 3) y CPA 1O~ M administrado exclusivamentedurantela reperfusión(n= 4). Lasdeterminacionessellevaronacaboenun analizadormulticanal discretoBM/Hitachi 747 empleandoel “Método standardoptimizado” de la DeutscheGesellschaftfúr Klinische Chemie(Gruber, 1978). 111.5.- ESTUDIOS SOBRE PARÁMETROS MORFOLOGICOS DE DANO CELULAR EN EL MIOCARDIO ISQUEMICO.MICROSCOPIA ELECTRONICA. Paralos estudiosde microscopiaelectrónicasetomaronmuestras de miocardiode aproximadamente1 mm de ladoquefueronfijadas por técnicasde inmersión.La toma de muestraserealizóen la porciónde la base,tomandocomo referenciasu proximidad a la arteriadel tabique interventricular. El tiempotranscurridoentrela tomade la muestray su fijación no superó en ningún caso los 30 segundos,utilizándose con este fin glutaraldehidoal 3%. 103 Las muestrasse mantuvieronen el fijador duranteal menosdos horas y, a continuación, se eliminó el excesode fijador medianteun lavadode 15 minutos en buifer Sorensen(0,1 M de KH2PO4 y 0,1 M de Na2RPO4;pH 7,4). Se realizóunapostfijaciónen tetróxido de osmio al 2% en buffer durante2 h. Porúltimo, laspiezassecontrastarondurante 30 minutosen acetatode uraniloal 2% enbuifer Michaelis(0,025M, pH 7, 440 mOsm/l, con2 nmolesde calcio). Todaslas piezasfueron deshidratadasen acetonasde gradaciones crecientesy finalmente en óxido de propileno, siendo a continuación incluidas en Araldita. A fin de seleccionar las zonas que iban a ser estudiadas ultramicroscópicamente, todos los bloques fueron previamente seccionadosen cortessemifinosde 1 pm de espesor,medianteun ultra microtomoUltratomeLKB-IV, y teñidosconazulde toluidina al 0,5%en boratosódicoal 3%. De las áreasseleccionadasseobtuvieroncortesultrafinosde 20-40 nm de espesorcon el liltratomeLKB-IV, recogiéndoseen rejillas de 400 mesh. Estos cortes se contrastaron para la observación electromicroscópicacon acetatode uranilo y citrato de plomo. Las preparacionesasí obtenidas se estudiaron y fotografiaron en un microscopioJEOL 100-C con un potencialde aceleracióndc 75-100KV. 104 m.6.- ANALISIS ESTADISTICO. La comparaciónde mediasfue analizadamedianteel métododela t de Studentparadatosapareadoso no apareadosdependiendodel tipo de experimento.Los datos se expresancomo la media + desviación típica, salvoque se señalelo contrario. Las diferenciasse consideraron estadísticamentesignificativasparavaloresde p < 0,05. 111.7.-FARMACOS Y OTROSPRODUCTOS. El ácido ciclopiazónico (CPA) se obtuvo de Sigma. El resto de productoso reactivosfueron al menosde purezaanalítica. Las solucionesdel CPA se realizaron en dinietil-sulfóxido. Las diluciones posterioresfueron realizadasdirectamenteen la solución Tyrode. 105 IV.- RESULTADOS 106 111.1.-ANÁLISIS INTERGRUPO DE LA HOMOGENEIDAD DE LOS GRUPOS DE ANIMALES Y CONDICIONES DE EXPERIMENTAC ION. Lascaracterísticasgeneralesquepodríanafectarala homogeneidad delos gruposde experimentaciónincluyen:pesodel conejo,pesofinal del tabiqueinterventricularo septumy frecuenciade estimulación,asícomo la amplitud contráctil desarrolladapor la preparacióny la tensión de reposomedidastras45 minutosde estabilizaciónen condicionesbasales. En la tabla 6 se recogenlos datos relativos a los cinco grupos experimentalessobre los que se realizó isquemiay reperfusión:grupo control (n=11), experimentoscon CPA 1O~ M administradodurante30 minutos antes de la isquemia (preisquemia) (n= 8), CPA 1V M administradodurante30 minutosen la preisquemia(n= 9), CPA 106 M administradodurantela preisquemiay la reperfusión(postisquemia) (n= 3), y CPA 106 M perfundidosólodurantela reperfusión(n = 4). Los resultadosno presentandiferenciasestadísticamentesignificativasentre los diversosgruposconsiderados. Lascaracterísticasdelos experimentosrealizadoscon DMSO (u= 2) y CPA 3 x 1V M (n= 2) tampoco presentandiferenciasaparentes respectoa los gruposanteriores. ISQIJEMIA CONTROL CPA 104M (pre) CPA 1 O S O d fl¡ ~ O N O IS N E J. «3 (0 ~ N O — — ,- — — «3 (0 t (Ni O (O> ~ LLD V 3LN O Dclfl.L Ild flV 4 ¡u * 111 IV.2.2.- EFECTOS UNITARIOS DEL CPA 10-’ M Y lrM. Se midió y registróel efectoaisladode dosisúnicasde CPA (10 y 1V M), perfundidasdurante30 minutos,sobrelossiguientesparámetros contráctiles: tensiónde reposo,amplitudcontráctil, + dT/dt max,-dT/dt max y sobrelos tiempos de inicio, + dT/dt max, 50% de contracción, pico, -dT/dt max y 90% de relajación. El CPA 106 M (n= 8) a nivel de tensión de reposo, amplitud contráctil y velocidadesmáximas de contraccióny relajación produjo pequeñasdisminucionesno significativas en ningún caso(Figuras 11 y 12). Sobre la cronología de la contracción provocó un progresivo alargamientode la misma con especialrepercusiónsobre la fase de relajación,dondelas diferenciasen los tiempospara-dT/dt max (10,84 + 4,20 %) y 90% de relajación (9,30 ± 3,95 %) empezarona ser estadísticamentesignificativasrespectoa los valoresbasales(p < 0,05, en amboscasos)(Figura 13). Si seconsideranlos tiemposde la fasede relajación medidos desde el tiempo para el pico, el alargamientodel tiempoparael -dT¡dt maxfue de un 12,11%y el del tiempoparael 90% de relajación de un 5,09%, respectoa los valoresbasales.Los valores absolutospara cada variable se encuentrantambién recogidosen las tablas7 y 8. ;~c•~ ~ P C —o6 .4 -u PC — oPC — ~ ‘0 6~ u 6 • u ~ ‘c~ O 6 ‘.4 - u ‘o a ‘o o u, o <4 — — o, o o o o o 3 ej — — o 8CV .~ u : 02 — ~ E ~ E .~ 0 2 •~02 6 u o c i’— 0 2 c u ~ ’~ II ‘ci O 02 6 E u ~ ci Z ~ u ‘‘a• .— . r~ ~ — u x ci ci — ‘‘¡u e~ t ~ u 02ciuL E s ¡O ‘o o t~ ~02 ocII 6 c i 4 - Ls c ~ c i < P C ~ ~ to O c i~ : P C c i6 en¡1v ~ * CI> QN5PCPCOOuotn5PCPC+oCI> 8 ~t t CO <‘3 CV — — O estu 115 Las diferencias obtenidas con CPA 1V M (n=9) fueron más notables.La tensiónde reposono semodificó de formasignificativa, sin embargo, la amplitud contráctil sí que experimentó un descenso significativo (15,67±0,37%; p <0,05)tras30 minutosde administración del fármaco(Figura 14). Los efectossobrelas máximasvelocidadesde contraccióny relajaciónresultaronmásnotables,con un descensodel + dT/dt max de un 39,31±3,01 % de media(p <0,001)y del -dT/dt max de un 20 + 2,60 % (p < 0,01) (Figura 15). El alargamientode la contracciónafectaa todos los tiemposregistrados,siendomásevidente durantela fase inicial de contracción.El tiempo de inicio se alargó un 56,22 + 20,26% (p < 0,05), el tiempoparael +dT/dt maxun 81,42± 16,12 % (p < 0,001), el tiempoparael 50% un 49,57 Ii 4,69 % (p < 0,001), el tiempoparael pico de contracciónun 30,30±1,64 % (p < 0,001), el tiempo parael -dT/dt maxun 24,88±1,74 % (p < 0,001), y el tiempo parael 90% de relajaciónun 21,64±1,80 % (p < 0,001) (Figura 16). Si seconsideranlos tiemposde la fasede relajaciónmedidos desdeel pico de contracción,el alargamientodel tiempoparael -dT/dt maxalcanzasólo un 20,32%,y la prolongacióndel tiempo parael 90% de relajaciónun 14,82%.Los valoresabsolutosaparecenrecogidosenlas tablas7 y 8. Los resultadosobtenidosen los dos experimentosrealizadoscon CPA 3 x 1V M siguen la línea de los obtenidoscon CPA 1V M: la tensión de reposo no se modificó significativamente,la amplitud de contracción cayó un 16,14 + 1,01 % (p < 0,05), el +dT/dt max 116 descendióun 50,49±4,97% (p < 0,001) y el -dT/dt max un 37,59± 2,52 % (p < 0,001).Los tiempossealargarondeforma estadísticamente significativa en todos los casosy en un porcentajealgo mayor que el obtenidocon CPA 1V M. En los dos experimentosrealizadoscon DMSO no se apreciaron diferenciasestadísticanientesignificativasen ninguno de los parámetros contractilesregistradostrasla administracióndel solventerespectoa los valoresbasales. o ci CI> 0 2 ~ 0 2 ci PCci —c 0 2 6 6~ 0 2 c i y 0 2 CI> PC ~ II 6 ~ 0 2 ‘~ — o c i 02 ~“2« u uZ P C PC P C a ~ + o 0 2 o :c i 02 0 —.: ‘~ 6 o 0 0 2 0 ~ ci~ I> —~ > •~ u ‘o ” P C * tEc i~ ‘c i’—‘oci ~L s c i 02 P C “2 ci C P C —tEP C ~ 0 2 ’c i s E ~ ci - —E v 0 P C * ~ o a o o o a u, a u , o. — — Bs 6 CI> oQ NEP CPC Ls V ~ I> t P C ~ * c c i .— — c a ~ ~ — CI> CI> P C ~ 0 2 ~ « = c ic CI> 0 0 2 .~ u u, 02 o — ‘a EP C ~ ca CI> P C P C U ~ + ca aca — — ~ ci o O sw T. REPOSO (g) AMPLITUD (g) + dT 1 dt max (g/seg) - dT /dt max (glseg) CONTROL BASAL 6,94±1,91 13,26±4,39 122,62±38,66 -101,14±36,82 FIN REPER 8,33 ±1,86 6,13±2,13 67,78±21,15 -49,73±16,28 CPA RPM (pre) BASAL 6,10±1,10 16,85±4,43 137,94±41,08 -117,746±33,10 CPA 106M 5,70±0,83 16,55±4,25 130,57±33,11 -113,97±25,26 FIN REPER 6,40±1,62 11,56±3,88 105 37+38,39 -86,01±32,SC CPA ¡«3M (pre) BASAL 5,98±1,25 12,72±5,01 115,01±39,72 -91,69±30,02 CPA 105M 6,25±0,87 11,01 ±4,6QV 69,87±26,67 -75,02 ±31,98 FIN REPER 6,18±1,57 6,97±3,15 70,15±27,75 -55,92±25,72 CPA ¡.VM <‘pre + post) BASAL 6,66±1,24 14,34±5,22 133,33±30,90-105,64±35,79 CPA 106M 6,45±0,23 13,57±4,86 124,13±28,30 -101,60±26,42 FIN REPER 6,71±0,15 9,22±3,52 92,70±23,89 -68,64±24,13 CPA ¡(PM (post) BASAL 6,34±0,96 13,33±4,28 126,25 ±33,20 -105,62 ±31,52 FIN REPER 8,80 ±0,75* 6,27±2,57 70,07 ±23,15~ -55,71±20,02 TABLA 7.- Efecto de la isquemia-reperfusióny de la administraciónde CPA sobre los parámetroscontráctiles en cada grupo experimental: Control (n=11) y CPA = ácido ciclopiazónico perfundido durante 30 minutosa las dosisindicadasen preisquemia(re; n= 8 para106 M; n= 9 para1V M); en preisquemiay durantela reperfusión(re + post; n= 3) y sólo durantela reperfusión (post; n= 4). Las comparacionesse realizan respectoa las medidasbasalesde cadagrupo(‘<= p< 0,05; ** = p< 0,01; *** —p< 0,001). INICIO (mseg) +dT/dtmax (mseg) 50% CON (mseg) PICO (mseg) -dT/dtmax (mseg) 90%REL (mseg) CONTROL BASAL 29,64+6,95 84,04±8,81 108,84±7,83235,22±14,30326,27±27,65442,41±22,56 FIN REPER 30,94±1,01 77,87±7,55 96,67±8,87 195,61±16,71 283,34+25,0C 369,50+38,52 CPA ¡ .J c i~ ~ 0<-~-’ ~0 2 02 C ) ‘C c i CI> ~~ ~ 02ci •— .-. LsLs o ~ ci e n a c i~ CI> CI> Ls P C P C o 02 ci ~ O CI> PC P C ~ ~ .~ c i± 0 2 ~ c a 0 2 ~ C ~ L . O 02 ~ 02 E ; o — — en ~ L i CI> PC ~ CI> ~ ~ e — P C 0 C I> ~ CI> ~ c~ CI> c i c i~ ~ P C CI> ~ ~ “02 Li .~ ci O ~ tc i PC ~ Li .2 = .E PC— L s O ci ~ Li ~ P C CI> CI> r~ - — ~ ~ •. — ‘ci — .~ O i — Li CI> — ~ b ~ P C i- 2 ‘~1E11H11flli~E~llfflffl¶~ 1 ~ ¡ ¡ •~ .« *,.~ o 4 4 ,3 4 3 ~ ~ -,. r/~ •.~ o ~ cj e~ o e — ~ ~ — II ~ II II ¡ ~ — — oa r ~ je 1~ a — + •e ‘9 ~ ~ — ~a 5 U .... ~Q • ‘e .j. a ¡ 1 Q ~ c iu I~ ~ ~ ’ .~ > ~ o ~ — u — 0 c i’— .- -< ¡ o u ¡1 .~ ~ .E ~ o ~ — II .~ ~ ~ .> a E c ~ ~ o o o o o o o o ~ r— CO L fl t C i CV — N O IO V W B dflO ~U % 7 --l — _ _ _ _ ~ 1 7 — zE Y ¡ ¡¡ rl — L--• ¡ •I ¡ ¡ -— _ _ _ _ _ _ - :3 1 - -- 0 ¡ ¡ ir • ¡ a ¡ ¡ 1— ¡ ~ i~ i~ i --.4 — ¡u,-J 4 -~ - — - F ~ ~ y _ _ _ _ _ _ _ .4o. ¡.4 1 4.4 ¡ ¡ o., 0 2 4 E ~ ~~ :~ ci — — ~ •— ci ~ .~ CI> ~ CI> CI> ~ Li Li ~a Li CI> P C Li c i — ~ ‘o P C t~ 0 2 > ~ 0 2 O CI> ~ 4< P C 02 .2 ‘— c iL iC o CI> ca 0 2 e n ~ oa ~ c i~ c i— • CI> CI> = ~ t z ~ ~ ~ 02 ca -~ 02 02 ~ c a ± —‘~ PC ~ .E ~ E ci.— — c i.~ CI> 0 2 ” PC ~ Li CI> r- ci CI> Li CI> CI> 02 ~ P CCI> 02 P C O ~ c i— ~ 2 ci CI>Li Q N o ~ — ca ~ PC ~ CI> CI>ci L i.-~ ~ ca t * — o ~c i.~ — s ~ Ls -.— .‘4< P C < ~ ~ >~u U ) te 0 2 0 ~ 4 - II ca P C t a E :Q *‘It asc i:~ E c iP C ~ S c i ~ 0 2 ~ S ~ u> P C IÉ : c i t ~ ~ f2~5 - ~ ‘0 0 2 2 to 4 < ¿ u E E 0 2 ~ caCI> O ca .~ ~ o o c i~ E — ~ C I> ~ ~ c ~ P C P C ~ ~ Li O ± P C en .~ E 0 2 P C ~ c i E c i C I> : Li c iii ca 0 ~ ’ 0 2 ~ • Ls .— — “ Q ’o II g ;~ E ~ * o c i ~ = Li o c i II **o***n o o o o o o o o o ~ r— co u en — N O IO V U ~ dflO 3N % 131 En la figura 18 serepresentaun histogramaconlos porcentajesde recuperaciónde la amplitud contráctil respectoa valoresbasalesen los diversos grupos experimentalesdescritos. El máximo porcentaje de recuperacióncorrespondeal grupo tratado con CPA io~ M en la preisquemia(67,45Mi 10,21 %) con unadiferenciamuy significativa (p < 0.001)respectoal grupode isquemiacontrol. La recuperacióncon CPA 1V M en preisquemia(52,53 Mi 9,01 %) también ofrece una diferencia estadísticamentesignificativa respectoa la isquemiacontrol (p < 0,05), y a su vez, respectoal grupode CPA io~ M en preisquemia (p < 0,01). El grupo tratado con CPA 106 M tanto en preisquemiacomo durantela reperfusiónrecuperaun 63,29Mi 2,15 %, con lo que no se distingue estadísticamentede los resultadosobtenidosadministrandoel fármacoa la misma dosis sólo en preisquemia,pero si que presenta diferenciassignificativascon el grupode CPA 1V M

0,99). En el grupopretratadocon CPA i0,99). En los casos bajo tratamiento con CPA 1V M el comportamientoes bien distinto, distinguiéndoseunafaserápidainicial (7=0,45mm; r2=0,95) seguidade otra máslenta(r=2,98;¿=0,98),sin observarsemesetainicial enningúncaso.El comportamientodel + dT/dt max expresadoen g/sg durante los minutos iniciales de la isquemia quedaría definido, en función del tiempo (niin), por la siguientes funciones(Figura 22; tabla 9): El -dT/dt max puede ajustarseen todos los casosa funciones biexponenciales precedidas de un ligero retraso inicial bastante homogéneoentodoslos gruposy significativamentemenordel encontrado en el + dT/dt max.Dicho retrasono esexactamenteunameseta,sino que tiende a reflejar un ligero aumentoinicial (difícilmente caracterizable) antesde iniciar el descensocaracterístico.Así, en el grupo control el retrasoes de 20,4 Mi 14,3 sg, la pendientede la fase rápida es la de Control: y = 115,18 e0,99;p<0,05, respectoal control). Los resultadosobtenidoscon CPA 1V M son intermedios,con un retrasode 15,9 Mi 9,23 sg, fase rápida (r=0,42; ¿=0,97)y fase lenta (r=2,78; = 0,99). El comportamientodel -dT/dt maxexpresadoen g/sgdurante los minutosinicialesde la isquemiapuedecaracterizarse,en función del tiempo(mm), de acuerdocon las siguientesfunciones(Figura 23; tabla 9): El acortamientodel tiempo para el pico durante los primeros momentosde la isquemiasigueun comportamientomonoexponencialen todoslos casos.En el grupocontrol esteacortamientoesligeramentemás rápido (r=0,60 mm; r2=0,97), aunqueno se encuentrandiferencias estadísticamentesignificativasen ningún caso.En el grupode CPA ltV6 M y CPA LV M lasconstantesson muy semejantes:T=O,66 (¿=0,97)y T = 0,69 (r = 0,95), respectivamente.El acortamientodel tiempoparael pico decontracciónexpresadoen msgdurantelosprimerosmomentosde la isquemiase define,en función del tiempo(min), paracadagrupocon Control y = 25,08 e«ÉlO)¡O~37 + 70,24 et¡2~U CPA 1V M y = 38,16 e<~19>’0’~ + 68,85 e413’70 CPA 1V M y = 31,88 e«tl~íO~42 + 43,46etí2~lS 136 las siguientesfunciones(Figura 24; tabla 9): Control: y = 86,59 eÉ/O*~ CPA 106 M y = 100,12 «t/O.~ CPA LV M y = 71,36et/069 El acortamientodel tiempoperael90% derelajaciónsiguetambién un comportamientobastante homogéneoen los diversos grupos de experimentación.La isquemiacontrol presentala menor velocidad de acortamiento(r= 0,48mm; r2=0,97),seguidadel grupotratadocon CPA 1V M (r=O,43; r2=0,93). El grupo al que se adininistró CPA i0~ M exhibe el ritmo de acortamientomás rápido (r=0,36; r2=0,96). Las funcionesquecaracterizanesteprocesoseríanlas siguientes(Figura25; tabla 9): Control: y = 119 e~~0”’8 CPA 106 M y = 97,52 et/ú~36 CPA lOA M y = 87,75 et/ú*43 CONTROL (n=10) CPA 10’ M (n=9) CPA i0~ M (n=8) AMPLITUD Y._Rápida 0,43±0,15 No 0,27±0,08* AMPLITUD F. Lenta 2 74 + 0,81 3,24±0,82 2,64±0,43 + dT/dt max F. Rápida No No 0,45±0,07 +dT/dtmax F. Lenta 2,29±0,78 2,78±0,31 2,98±1,14 -dTfdt max Y. Rápida 0,37±0,13 0,66±0,25* 0,42±0,12 -dT/dt max Y. Lenta 2,44±1,13 3,70±0,55* 2 78 + 1 16 T. PICO 0,60±0,32 0,66±0,14 0,69±0,16 T.90 % RELAJACION 0,48±0,28 0,36±0,15 0,43±0,24 TABLA 9.- Constantesde tiempo de caídade los parámetroscontráctiles ajustablesa funciones mono o biexponencialesdurante los 10 primeros minutos de isquemia.El acortamientodel tiempo parael pico y para el 90% de relajación están ajustadossólo respectoa los 3 y 2 minutos iniciales aproximadamente,momentoen el que el acortamientose hace casi cero. Las constantes de tiempo se expresanen mm. * = p< 0,05, respectoal control. (A) ~ — 14 a’ ~12 1- (A) 160 140 120 a’ t’3 •~> 100 x‘u E 80 4- ~ 60 + 40 20 o 0 600 (B) 5 (A) 120 100 ~80 ci Curvas en valores absolutos. (13) Representaciónsemiogarítmica.Las pendientesde caída del grupo bajo tratamientocon CPA íO~ M son significativamentemenoresquelas del grupocontrol (* = p<0,05). Línea continua: grupo control (n=10); línea de puntos: CPA 10.6 M (n9); línea de puntosy rayas:CPA 1V M (n=8). 100 200 300 400 500 TiEMPO DE ISQUEMIA (sg) 100 200 300 400 500 TIEMPO DE ISQUEMIA (sg> 0 20 40 60 80 100 120 TIEMPO DE ISQUEMIA (sg> 0 20 40 60 80 100 120 TIEMPO DE ISQUEMIA (sg> 140 160 180 200 140 160 160 200 FIGURA 24.- Acortamiento del tiempo para el pico de contracción durantelasfasesinicialesde la isquemia.En menosde3 minutossehace casi cero. (A) Curvas en valores absolutos. (B) Representación semilogarítmicade las Funcionesmonoexponecialesquecaracterizaneste proceso.Línea continua: control (n10); línea de puntos: CPA 106 M (n=9); línea de puntos y rayas:CPA 1V M (n’8). (A) o,u Oca a. -J w 40~ O 1•- z w 4 1- O FIGURA 25.- Acortamientodel tiempoparael 90% de relajacióndesde el inicio de la isquemia.Entornoalos 2 minutossehacecero. (A) Curvas en valoresabsolutos.(B) Representaciónsemilogarítmicadelasfunciones monoexponencialesque definen este proceso.Línea continua: control (n=4O); línea de puntos: CPA 10.6 M (n=9); Línea de puntos y rayas: CPA 1V M (n=8). (A) z o U 4 o a 1~Z o1- 2 tu 4 1- Oca 4 (B) o 120 100 80 a’ 6~ 60 40 20 0 5 4,5 o 4 a> ~ ~g Oz ~O3 WC, ~425 ca ~ 1 0,5 o 20 40 60 80 100 120 TIEMPO DE ISQUEMIA (sg> 140 o 20 40 100 120 140 143 IV.4.- EFECTOS DE LA ISQUEMIA-REPERFUSION SOBRE PARÁMETROS BIOQUIMIC OS. En la figura 26 se recogela evolución de los niveles de creatin- fosfokinasaregistradaen el líquido efluente recogido en condiciones basalesantesde la isquemiay en distintos intervalos de la reperfusión. Los nivelesbasalesen el grupocontrol (n = 8) y en el tratadocon CPA 10.6 M (n = 6) no presentabandiferenciassignificativas.En el intervalo 0-2’ los niveles de CPK obtenidosen el grupobajo tratamientoeranun 67,65 + 34,28 % (p < 0,01) menoresa los registradosen el grupo control, entrelos 5-7’ eraun 71,4 Mi 23,69 % (p < 0,05) menor, en los 13-15’ era del 78,12 + 29,24 % (p<0,01), y en el 28-30’ del 86,74Mi 36,71 % (p ~ 1.~ ~< tC ~ I> ‘~ - L. II ~ ciE E ~ Un—e ~ u f f ~ toe. — :c i ~ II r-u •~ .— lo CI> ~ ‘ ‘ CI> O C I> CI> ~ 02 CI> ~ .0 2 02c i a CI> 6~Iu:n ~ ~ u Li II~ ~ II* E a” O ~ ¡¡ ~ en II e l . S ~ c i — ~ ~ * ‘o o I> a ”. 02 ~ ~ ii :S ~ .@ :s ~ ~ E ~ ~ o E ~ s t t ca í’ ~ o~ 0CI> U P C L ia 0 2 ~ ~ P C .— ~ ci~ 4 t0 2 0 r~ IIIh m t ~ PC u t II ~ S O O O O O O O O O O (O t O ~ CO t N r— — — -- -u n * 8 0 0 0 0 0 0 0 2 ~ oen 0 2 0 • ~ I> en ocr~ •~ P C P C Un— C I> g ” en 02 — C I> .— CI> E-lo ‘— LiCI> C I>C I>Li CI> ~ ~ P C o ~ 02 c i C I> > P C Li 0 2 ~ C I> ~ — .— 02 .~ 0 2 c i a 0 C 0 2 .IIn aca e., * : 02 * £ ~ P C ¡iv II . II —U j + ~ 0 2 0 .fl y $ e n ~ t’9 E .. CI> O~ 02eCI> ci3-0 2 c a ~ oc i~ ~ II ~ _ ~ ci Li — — ~ ~ 02 r~ C I> ~ ~ P C u t o 148 DAS.- EFECTOS DE LA ISQUEMIA-REPERFUSION SOBRE PARÁMETROS MORFOLOGICOS. El estudio morfológico fue realizadopor un histopatólogocon experienciaen el análisismicroscópicode estetipo de muestras.Se le entregaron6 muestras(3 de isquemiacontrol y 3 del grupo pretratado con CPA 10.6 M) identificadaspor un códigonuméricoy se realizó el análisisa doble ciego. Con el estudio inicial de los cortes semifmos se valoró ya la existenciade dosgruposdiferenciadosde muestrasencuantoal gradode lesiones:encontrandoen lasmuestrasdel grupocontrol signosevidentes de la presenciade necrosisen bandasde contracción(Figura 31), no valorablesen el grupopretratado. Los hallazgosultraestructuralesconsistieronen un gradientede lesiones.En el grupobajo tratamientoen preisquemiacon CPA 10.6 M los elementos celulares mostraban alteraciones fundamentalmente mitocondriales,consistentesen unadilataciónmasivade ambascámaras con aclaraniientode la matriz mitocondrialque les conferíaun aspecto ópticamentevacío. De formafocal seobservabanconcrecionesosmiófilas intraniitocondriales y menos frecuentementeestructuras mielínicas (Figura29). Los capilaresmostrabanunaestructurageneralmantenida sin anomalíasparietales(Figura 30). 149 Porcontraste,en el grupode isquemiacontrol seobservó,de una parte,unaacentuaciónde las alteracionesmitocondrialescon dilatación más difusa y extensade las mitocondriasy aumentode los depósitos intraniitocondriales(Figura 32). Por otra parte, aparecióuna neta anomalíaenel aparatocontráctilde la célulaconapariciónde bandasde contracción,estructurasdensasosmiófilas de morfología similar al del materialde la línea Z, visiblesya en los cortessemWmosy confirmadas en los ultrafinos.Estaalteraciónafectabadeformadifusa o focalintensa a todala célula (Figuras31, 33 y 34). 156 y.- DISCUSION 15’? Los resultadosde este estudio han demostradoque, el ácido ciclopiazónico(CPA), un fármacoal queseatribuyenefectosespecíficos de bloqueode la Ca’~-A1’Pasadel retículo sarcoplásmico(SERCA) del miocardio(Seidíeret al, 1989; Miller et al, 1990; Pery-Manet al, 1993), presentaun claro efecto cardioprotector frente a la isquemia en el corazónde conejo. Esteefecto antiisquémicose ha puestode manifiesto tanto sobre parámetrosfuncionalescontráctiles,comobioquímicosy morfológicos,ya quela caracterizacióndelos efectoscardioprotectoresdebeserrealizada, necesariamente,sobreal menosdosdelosparámetrosanteriores(Reimer y Jennings,1986). Conanterioridad,du Toit y Opie (1994) demostraron que el CPA presentabaefectos cardioprotectoressobre parámetros funcionalescontráctilesen corazonesde ratacontundidos.Al contrario de lo encontradopor estosautores,nuestrosresultadosmuestranqueno existe dosis-dependenciadel CPA en la protección frente a isquemia miocárdica,ya quelos septapretratadoscon CPA lEY’ M y sometidosa isquemiade 30 minutosobtenían,trasla reperfusión,unarecuperación de la amplitud contráctil un 54,17% mayor que el grupo control, mientrasque los tratadoscon CPA 1V M mejorabansólo un 20,07% respectoa los controles. 158 - Homogeneidadde los gruposde experimentación. Estosresultadosno puedenseratribuidos a falta dehomogeneidad de los grupos de experimentación,puesno se encontrarondiferencias estadísticamentesignificativasen suscondicionesbasales(Tabla 6). No obstante,aúnpodríaargumentarseque,en el grupode isquemiacontrol, los valoresmedios de la frecuenciade estimulacióny de la tensiónde reposoeranligeramentemáselevadosque los de los gruposrestantes,y que la amplitud contráctil resultabaalgomásbajaquela obtenidaen el grupo pretratadocon CPA 106 M. Ello podría sugerir unas peores condicionesiniciales en el grupo control respectoa los grupos bajo tratamiento.En contra de éstotenemosel hechode que las condiciones basalesdel grupo en que se administró CPA lEY’ M exclusivamente durantela reperfusión,presentabancaracterísticasbiendiferenciadasen sentidocontrarioalas del grupocontrol y, sin embargo,el porcentajede recuperaciónfinal y los niveles de enzimasno presentarondiferencias significativas respectoa estegrupo. Másaún, Bourdillon y Poole-Wilson (1982)handescritoque la intensidaddel dañomiocárdicoinducido por isquemiaesindependientede la estimulacióno no delosseptadel corazón deconejosAdemás,los experimentosdecadaserieserealizaronde forma no consecutiva,alternandolas series,con el fin de evitar la posible variabilidad intergrupo relacionadacon el origen de los animales, alimentacióno condicionesambientales. 159 -Efectosatribuibles al solvente. Tampocopuedenser atribuidos estosefectosal solventede CPA utilizado en nuestroestudio,dimetil-sulfóxido (DMSO). Esbienconocido que el DM50 presentapropiedadescomo atrapadorde radicaleslibres (“free radicalscavenger”; Roweetal, 1983).La generaciónde radicales libres se ha propuesto como uno de los mecanismosfisiopatológicos involucradosen la aparicióndel dañomiocardicodurantela isquemia- reperfusión. De hecho, se ha observadoun enormeincrementoen la formación de éstos justo en los momentosiniciales de la reperfusión (Hearseet al, 1973; Henry et al 1993). Sin embargo,el papel real de los radicales libres en el desencadenamientodel daño miocárdico por isquemiapermanecemotivo de controversia(NohI et al, 1991). Si bien algunosautoreshandescritocardioprotecciónfrente a isquemiacon el uso de inhibidoresde la formación(WilIians etal, 1991) y/o atrapadores de radicaleslibres (Englery Gilpin, 1989;Naslundetal; 1990),otros no lo encuentran(Krinsky, 1988). En cualquiercaso, no pareceque en nuestrosexperimentosla accióncardioprotectorapuedaseratribuibleal DMSO, ya que en los dos experimentosrealizadosúnicamentecon el solvente (DMSO) no se observarondiferenciasaparentescon el efecto medio obtenidoparael grupode los experimentoscontrol. Más aún, si ello fuera cierto,cabríaesperarun efectocardioproctectormásintenso con el grupo de CPA a dosis más elevada,ya que la concentraciónde DMSO fue 10 vecesmayor,mientrasquelos resultadosobtenidosfueron contrarios. 160 -Registroy análisisautomatizadode la contracción. Un análisis exhaustivode la literatura científica nos mostró la inexistenciade publicacionesen lasquese analizaranlas variacionesen el tiempo y, especialmente,las correlacionesentre los parámetros mecánicosmásusuales(tensióndesarrollada,tensiónde reposo, ±dT/dt maxy los tiemposcaracterísticos)duranteel desarrollode la isquemia, sobrela basede medidasrealizadascontraccióna contracción.El único trabajo relativamenterelacionadofue el de Shine et al (1976). Sin embargoestosautoresregistrabantan sólo unacontracciónpor minuto y aparentementerealizaronajustessobrelosvaloresmediosnormalizados de todos los experimentos,lo que les impedíadescribircon precisiónlos fenómenosexistentesy, en especial,aquellosqueocurrenen períodosde tiempomuybreves.Estapobrezadereferenciascontrastaconlosestudios realizadosa nivel celular y subcelular en experimentosde isquemia simulada (Walsh y Tormey, 1988; Miller y Tormey, 1995). El mejor conocimiento de cómo se afectan los diferentes componentesde la contracccióny en qué curso temporal se realiza podría ayudarnosa explicar el mecanismo de la acción antiisquémica de los fármacos conocidosy adiseñardeformaracionalnuevasestrategiasfarmacológicas de prevencióndel dañoisquémico. Por todo ello hemosdesarrolladoun sistemade registroy análisis automatizadode la contracción,específicamentediseñadoparanuestro modelo experimental.El gradodeprecisiónde lasmedidasobtenidasfue 161 de ±3 msgparalasmedidasde tiempo (frecuenciade muestreo6 msg) y de 0,0145 g para las tensiones.La precisión teórica de medida de tensionesfue aproximadamente6 vecesmejorquela real,ya quenuestro equipo de medidano reunía condicionesóptimas para evitar el ruido mecánico.Así, sobre12640 medidasen condicionesbasalesrealizadas paraver la variabilidadde la tensión,obtuvimosunadesviaciónde 0,042 g. Porello, el gradode precisiónrealde las medidassobretensiónpuede estimarseen 0,084 g (2 veces la desviación estandar).Es interesante destacarquela realizaciónde un suavizadosobrelosvaloresde amplitud paracadacontracciónmejoró enormementela exactituden lasmedidas cuando se comparabanéstas con las realizadassobre experimentos medios.Ello es fruto de atenuarel efectode dispersiónoriginadopor el ruido mecánico, por lo que, con este artificio probablemente incrementemosel gradode precisiónde las medidasde tensión. La medidadel 90% - 95 % de relajacióncomoíndice de duración de la contracciónes de usohabitual (Yard et al, 1994; Takahashia al, 1995), dadala dificultad de precisarcon exactitudel momentoen que éstafinaliza. El desarrolloinformático realizadocon estosfines permitiráque, en adelante,éstepuedaseraplicadoconunagraneconomíademediosal estudio de los efectos de otros fármacosque alteren contractilidad miocárdicacualquieraque sealascondicionesde estudio. 162 - CARÁCTERIZACION DE LOS EFECTOS CONTRÁCTILES DEL CPA EN MIOCARDIO NO ISQIJEMICO. - Seleccióndel rango de dosisy tiempode estabilizacióndel CPA. La selecciónde un rango de dosis útil de CPA para nuestra preparaciónde tabiqueinterventricularde corazónde conejo,serealizó estudiandocurvas dosis-efectosobre contractilidad en el entorno de concentracionesya descritosen la literaturaparala mayoríade especies animalesen queéste hasido utilizado: 1O.7~l0.óM en corazónde rata(Du Toit y Opie, 1994; Takahashietal, 1995)y de cobayo(Yard etal, 1994), 1V M en corazónde rana (Badaouiet al, 1995) y en corazónde rata (Pery-Manet al, 1993), y 1V M en corazónde conejo (Baudet et al, 1993). Salvo en el estudio de Dii Toit y Opie, el tejido miocárdico (papilares,trabéculaso aurículas)no eraperfundidoarterialmente,sino bañadoo superfundidopor unasoluciónnutricia con CPA. En tresexperimentos,dosis acumulativasde CPA desdeíO-~ M a 1V M no produjeronmodificacionessignificativas sobrela tensiónde reposo,si bien éstadescendíaligeramente(Figura 9), sin embargoCPA 10.6 M sí que provocabaun ligero descensosignificativo de la amplitud de contracción(Figura LO). No obstante,dicho descensosignificativo no pudoalcanzarseposteriormenteen el grupode isquemia-reperfusióncon dosis unitarias de CPA 106 M (n= 11). Se evidenció también un alargamientoestadísticamentesignificativo de la fasediastólicadel ciclo 163 contráctil (tiempospara-dT/dt maxy 90% de relajación; Tabla8). Setomóla infusión del fármacodurante30 minutosantesdeiniciar la isquemia,puesto que la estabilizaciónde la preparacióncon cada nueva dosis de fármaco en los experimentoscon dosis acumulativas precisabaunos 20 minutos por términomedio. Dado que 1V M era la concentraciónmás baja en la que conseguíamosobservarlos efectoslusitrópicos negativosdescritoscomo característicosde la acciónde estefarmaco,escogimosestadosisde CPA para realizarel resto de experimentos.Seleccionamosigualmenteuna dosis mayor de CPA (1O-~ M), para comprobarel hipotético carácter dosis-dependientede la acción farmacológicadel CPAL (Dii Toit y Opie, 1994; Yard et al, 1994). - Efectosdel CPA sobrecontractilidadmiocárdica. Los efectos sobre contractilidad miocárdica de CPA a la concentración de 10.6 M resultaron sutiles: descensosligeros, no significativos,tantodela tensióndereposo,comodela amplitud, +dT/dt max y -dT/dt max (Figura 35; tabla 7). Junto a ésto, existió un alargamientoprogresivodela cronologíadela contracciónsobretodoslos tiempos estudiadosque sólo empezabaa ser significativo en la fase de relajación (tiempos para -dT/dt max y 90% de relajación), con una prolongaciónmediaen torno al 10% respectoa su basal(Tabla 8). 164 Por el contrario, el efectodel CPA. a la concentraciónde l0~ M sobre la contractilidad miocárdicano signe la línea de los resultados obtenidoscon la concentracióninferior (Figura36; t.abla7).La amplitud contráctil sí que caede forma significativa (15,67%; p<0,05), pero la tensiónde reposono desciende,sino que tiendeaelevarseaunqueseade forma no estadísticamentesignificativa (Figura 14). Porotra parte,los tiemposde contracciónse alarganllamativamente,peroa costade una prolongaciónde la fasede contraccióny, en concreto,de la fase inicial de la misma, con un alargamientodel t para el + dT/dt max de un 81,42% (Tabla8; figura 16). Sorprendentemente,el alargamientode la fasede relajación, medido desdeel tiempo para el pico de contracción, fue únicamentede un 20,32% parael tiempo del -dT/dt max y de un 14,82 % para el tiempo del 90% de relajación.En la mismalínea, la máximavelocidadde contraccióncayó el doble quela máximavelocidad de relajación(39,31 vs 20%, respectivamente). Portanto, esevidentequela concentraciónmenorutilizada(10.6M) afectapreferencialmenteala cronologíadela relalación,mientrasque la concentraciónsuperior (14Y5 M) mantienelos efectosobservadoscon la dosisanterior(prolongacióndel 10-14% enel tiempoparael -dT/dt max), pero su efectofundamentalse observaespecialmentesobrecontracción (disminución significativa de la tensióndesarrollada)y, especialmente, sobrela faseinicial de la misma(prolongacióndel tiempode inicio de la contracción,importantedisminución del + dT/dt maxy muy llamativa prolongaciónde su tiempo). 165 Estos resultadoscontrastanen parte con los obtenidoshastala fechapor otrosautores,y especialmentecon la interpretaciónqueéstos hacen de los mismos. Yard et al (1994>, trabajandosobre aurícula izquierdade cobayobañadacon solución nutricia y CPA 1V y iO~ M, a 300 C y estimuladasa 2,5 Hz de frecuencia, encuentranuna prolongación de la contracción a expensas fundamentalmentedel alargamientode la fase de relajación en todos los casos. Igualmente, describendescensosde la tensión desarrollada,máxima velocidadde contraccióny máximavelocidadde relajación,y unaligera elevaciónde la tensión de reposo.Todos estosefectostendríanun comportamiento concentración-dependiente.Sin embargo, las diferenciassignificativas entreestasdosdosisde fármacosólo semanifiestanen el descensode la tensióndesarrollada,del + dT/dt max y del -dT/dt max. Pery-Manet al (1993) y Takahashiet al (1995) describentambién el preponderanteefectohusitrópico negativodel CPA ion, IV y LV M sobreel músculopapilar de rata. Baudetet al (1993), trabajandocon músculopapilar y trabéculas ventricularesde corazónde conejobañadascon soluciónnutriciay CPA LO”’ M, a300 C, y estimuladasa 0,5 Hz, encuentranunaprolongaciónde la duraciónde la contraccióncon un aumentodel tiempoparapico del 63% y del tiempo para el 50% de relajación de un 43%, junto a un descensode la fuerzade contracciónde un 45%. Estees el único estudio realizado en conejo y que, al igual que el nuestro, encuentrauna 166 prolongación de la fase de contracción más acentuadaque la de relajación. Desafortunadamente,no comparan el efecto de varias concentracionesde fármaco y, más aún, obvia la discusión de esta aparenteparadoja. Estos resultadosde la literatura científica presentangrandes diferenciasmetodológicasquehacendifícil la comparacióncon nuestros resultados.Entodoslos casosdescritossetrabajasobrepreparacionesde distintasespeciesanimalesno perfundidasarteriabnentecomola nuestra, sino bañadaspor unasoluciónnutricia, quea su vez varíade un autor a otro. Las condicionesde estimulacióntambiénsonmuy variadas(0,5 a 2,5 Hz) y el soporte informático paraobtenerlos registros,cuando existe,no permiteun gradode precisióny discriminaciónen lasmedidas comparableal alcanzadopor el nuestro. Es importante destacarla diferente contribución del RS a la contracción (Bers, 1985) y a la relajación (Bassani et al, 1994) miocárdicasen función de la especie animal estudiada,por lo que la extrapolacióndirectade resultadosde una especieanimal diferente debe hacerse,cuando menos,con gran cautela. En definitiva, a la concentraciónmenor, el CPA tendría un comportamientoacordecon lo generalmentedescritoenlaliteratura,esto es:aumentode la duraciónde la contraccióna expensasde prolongarla fasede relajación(Pery-Manetal, 1993; Yard etal, 1994; Takahashiet al, 1995), mientrasquea la mayorconcentración,si bien semantieneel 167 efecto husitrópiconegativo,predominael alargamientode la faseinicial de la contracción(el tiempo parael + dT/dt max suelecorresponderal 30% de la duración del tiempo para el pico) como responsablede la prolongacióndel ciclo contráctil. Llamala atenciónqueel extraordinario alargamientodel tiempo parael + dT/dt max vaya acompañadode un descensosignificativo de la amplitud contráctil y del + dT/dt max,quizás como expresiónde la apariciónde efecto inotrópiconegativoa elevadas concentracionesdel fármaco. Nuestros resultados exigen una discusión acerca del posible mecanismopor el queocurretal aparentedisparidadde efectoscon sólo un incrementode un ordende magnituden el rangode concentraciones estudiado.No existedudadequeel CPA produceunainhibición selectiva de la SERCAen un nivel deconcentracionespor debajode losestudiados por nosotros.En efecto, Seidíeret al (1989) demostraronuna relación estequiométricaentre la unión del CPA y el bloqueode la SERCA, así como su especificidadde inhibición no actuandofrenteaotrasATPasas de membrana.Más aún, Yard et al (1994) han cuantificado que, en vesículasaisladasde RS de miocitos ventricularesde cobayo, el CPA bloqueapor completola captación de Ca2~ por partedel RS con una 1C 50 de 0,2 gM. Es interesanteteneren cuentaque la 1C50 parainhibir la ATPasaesfunción de la concentraciónde ATP en el medio,elevándose desde 0,2 ~M a 1 $M con niveles de ATP en el rango milimolar. Convienedestacartambién que la acción del CPA es selectiva, ya que Takahashi et al (1995) han demostrado que este fármaco, a 168 concentracionesen el rango de las empleadaspor nosotros,no alterala relaciónpCa/tensióndesarrolladaen célulasdenudadasde miocardiode ratasin RS funcional, lo queevidenciala falta de efectodirectodel CPA sobre la maquinaria contráctil. Tampoco encontraron efectodel CPA sobrecorrientesde membranabienen situaciónde estadoestacionarioo bien sobrela corriente de pico. Ello evidenciaque el CPA pareceno afectar las corrientes iónicas correspondientesa la traslocación de electrolitos que ocurren durante el ciclo de contracción-relajación miocárdica. También se ha descritoque en vesículasde sarcolemade miocitos de rata el CPA, 0,3-30 pM, no inhibe el intercambiador Na~/Ca2~de membrana.Utilizando técnicasaúnmáselegantes,Kirby et al (1992) han publicado resultados en rata similares usando la thapsigargina,otro de los inihibidoresespecíficosde la SERCA. Se podría intentar explicar estos efectosapuntandola posible la presenciade efectoscolateralesde estefármaco,actuandoaotrosniveles distintos a la SERCA, y poniéndosede manifiesto sólo a elevadas concentraciones.De forma intuitiva esta hipótesis ya había sido manifestadacon anterioridad(Baudetetal, 1993).No obstante,estápor comprobarsi estosefectosguardanrelaciónconel posiblebloqueoparcial de los canalesde Ca2~ tipo L, responsablesde la liberación del Ca2~ activadordel RS y, por tanto, del inicio de la contracción,tal y comose ha demostradoparamuy altasconcentracionesde thapsigargina(Buryi etal, 1995). Sin embargo,estahipótesisparecepocofactible, ya que los estudiosiniciales no encontraronefectos del CPA sobreotros sistemas 169 distintos de la SERCA (Takabashietal, 1995). En cualquiercaso,si con unaconcentraciónde 1V M existeun bloqueoparcial,con 3 x 1V M se debería haber manifestado más intensamente,y sin embargo los resultadosfueron indistinguiblesde los obtenidoscon la dosisanterior. Cabriaexplicarnuestrosresultadossobrecontractilidaden basea quela dosismenorusada,10.6 M, en condicionesbasales(concentración de ATP — 5 mM/kg; Katz, 1992) produciríaun bloqueoparcial de la SERCA (1C50 = 1 pM con concentracionesaltas de ATP; Yard et al, 1994). Concentracionespor encimade ésta,1V M, podríanproducirun bloqueo total. En nuestro caso éso lo sugiere el hecho de que la concentraciónde 3 x 10~ M no produce efectos adicionales sobre parámetroscontráctilesdistintosdelos obtenidoscon1V M. Si seadmite queCPA estáexhibiendoefectosdebidosa su acción selectiva(bloqueo de la SERCA), un bloqueoparcial de la mismapodríatraducirseen un retraso de la recaptación del calcio citosólico durante la fase de relajación, sin que el total de calcio recaptadofuera menor. Por el contrario, un bloqueototal de la SERCA haríaque los fenómenosde contraccióny relajaciónmiocárdicaocurrierancomo consecuenciade la acción vicariantede otros sistemasinvolucrados,en ausenciafuncional del RS. En condicionesfisiológicas se ha cuantificado la contribución del intercambiadorNa~/Ca 2~ durantela etapade relajación, y en miocitos deconejosehacalculadoqueel Ca2~transportadopor el intercambiador 170 Na~/Ca1~ es del 28 % frente al 70 % del recaptadopor la SERCA y el 2 % extruidodel citosol por los sistemasde transportelento (captación mitocondrialy Ca2#ATPasadel sarcolema;Bassanietal, 1994).Porotra parte, es sabido que tanto el ventrículo de conejo como el de cobayo (similares al humano en su dependenciacontráctil del RS) pueden desarrollaractividadde contracciónplenaen ausenciadel calciodel RS (aunquea una frecuenciabastantemenor) por activacióndirecta de los miofilamentos por parte del flujo de Ca2~ transsarcolémico(Langer, 1992). De hecho,el corazónde rana,queno presentacasi RS, depende por completo de la entradade Ca2~ a través de membranapara su contracción (Badaoui et al, 1995). Igualmente, es sabido que la contracciónmiocárdicaen ratasneonatasdepende,fundamentalmente, del influjo de Ca2~transsarcolémico(Fabiatoy Fabiato,1978; Bersetal, 1981;Tanakay Shigenobu,1989)adiferenciade lo queocurreen la rata adulta. Aún más, en el ventrículo de cobayo (similar al de conejo) el bloqueo de los canales de salida de Ca2~ del RS con ryanodina, no disminuye la tensión desarrollada,pero prolonga la duración de la contracción un 50% por término medio (Lewartowski et al, 1990). Basándoseen estefenómeno,seha interpretadola función del RS como la de un amplificador del aumentode la [Ca2~] 1durantela contracción, de forma que la liberación de calcio calcio-inducida (Fabiato, 1983) tendríacomo finalidad aumentarla velocidadde contracción(Langer, 1992). Junto a todo lo dicho, hay que añadir que el intercambiador Na~/Ca 2~,si bienno parecetenerun papelfundamentalen la entradade Ca2~ durante la contracción (Bassani et al, 1994) en condiciones 171 fisiológicas,y sólo presentaun papelsecundariodurantela relajaciónen presenciade un RS funcionante, podría asumir una capacidadde funcionamiento mayor si sedanlas condicionesde activaciónnecesarias (Langer y Peskoff, 1996), como puedeocurrir durantela diástole en presenciade un bloqueode la SERCA con el consiguienteaumentode la IICa2~1~. Resumiendo, nuestra hipótesis plantea que la diferencia de resultadosobservadacon las dosconcentracionesdel fármacoexpresalos efectosde un bloqueo parcial de la SERCA frente a los de un bloqueo probablementecompletocon la mayorconcentraciónempleada.El ligero alargamientode la fase de relajación, ya observadocon la menor concentraciónde CPA, vendríaoriginadopor unamenordisponibilidad de sistemaspara recaptarcalcio hacia el RS, pesea una hipotética compensaciónparcialpor un mayorfuncionamientodel intercambiador Na~ICa2~ de membrana,si bien a una velocidad mucho menor en comparacióncon la SERCA. Porotra parte, el bloqueocompletode la SERCA,ademásde seguirmanifestandoesteefectosobrela relajaciónde formamásmarcada,traeríaimplícita tambiénunadisminuciónllamativa de la fasede contracción(disminución detensióndesarrolladay + dT/dt max, prolongaciónde los tiemposde inicio decontraccióny pico, y muy especialmente,del tiempo parael + dT/dt mas)comoconsecuenciade la pérdidadel mecanismode aceleraciónde la velocidadde contraccióna travésde la liberaciónde calcio calcio-inducida(Fabiato,1975). TE N S IO N D E S A R R O LL A D A (g > ~ — -. -. M M (> 3 ‘f l 0 2 ~ O (> 1 0 (J i 0 Ci i O o o .. ~ P C e> a ” O . 40% de TD). En condicionesbasalesla máximavelocidaddecontracciónha sido puesta en relación con el correcto funcionamiento del retículo sarcoplásmico,responsablede catalizar, a través del mecanismode liberación de calcio calcio-inducido (Fabiato, 1975), la aceleracióndel procesode contracciónmiocárdico (Langer, 1992). Bajo isquemia,el mantenimientodurante50 sg de la + dT/dt mas(tiempoen el queya ha desaparecidoun 40% de TD) parececlaramenteindicativo de la correcta capacidadfuncional del RS duranteestetiempo inicial. - Relación entre la pérdida de la tensión desarrollada y el acortamientode la duración de la contracción. En los segundosinicialesde isquemiase produceun acortamiento monoexponencialen la duracióndel estadoactivo (t parael picoy el 90% de relajación),evidenteincluso antesde unapérdidaefectivade tensión desarrollada(Figuras24, 25 y 38 A). Esteacortamientoes rápido (más veloz parala relajación),ya quesecompletaantesde los 2,5 min O- 0,60 y 0,48 mm, respectivamente).Aunque la disminuciónmediaen valores absolutoses de 87 msgparael t parael pico y de 119 msgparael 90% 179 de relajación,proporcionalmenteesun acortamientomuchomayorpara la contracción(37 % vs 15,5%). Tras los 2,5 min el tiempoparael pico se mantiene, mientras que el tiempo de relajación se alarga lenta y progresivamente,superandolascondicionesde partida. Ensíntesis,durantelos2-3minutosinicialesdeisquemiaseproduce un acortamiento asimétrico de la duración de la contracción (proporcionalmentemayor en la fase de contracción). Existe un desplazamientohacia la izquierda del pico de contracción, con mantenimientoinicial de la máximavelocidadde contracción(50 msg) y unapendientede la fasederelajaciónprogresivamentemenor(máslenta) (Figura38 A). En conclusión, y a la luz de los conocimientosactualespodríamos interpretardeforma global nuestrosresultadosdel efectode la isquemia sobrecontractilidaden condicionescontrol del siguientemodo: 1.- La rápida disminución de tensión desarrolladadesde los momentosmásinicialesde la isquemiaindicanunamenordisponibilidad o aprovechamientoglobal del Ca2~,ya seaporun menormflujo a través de los canales voltaje-dependientesde membrana,por una menor participacióndel RS, o por unapérdidade sensibilidadde las proteínas contráctilesal calcio (Luciani et al, 1993). 180 2.- Estadisminucióndetensióndesarrolladano esincompatiblecon un mantenimientode la máxima velocidadde contracción.Ello podría explicarse si la velocidad con la que el calcio penetra al citosol (mayoritariamentedesdeel retículosarcoplásmico,procesopasivoafavor de gradiente)se mantuviera,aun a pesarde que la cantidadtotal de calcio quedifunde fueramenor (disminución de la TD). Es interesante destacarque la disminución de TD sufreunafaserápidade caída(s de 0,43 mm). Esta fase podría ser consecuenciade la menor eficacia de recaptación total del calcio citosólico por parte de la SERCA y, consecuentemente,de una menor disponibilidad de calcio para ser liberado. 3.- Lavelocidadderelajaciónseafectamuchomásprematuramente que la de contraccióndebido a que éstaúltima es un procesopasivo, mientrasque la relajaciónrequiereextrusiónactivadel calcioactivador en cada contracción. La disminución de la máxima velocidad de relajaciónen los tiemposinicialespodríaestarrelacionadacon unamás rápida afectaciónde la velocidad de recaptación del calcio que de la cantidadtotal de calcio recaptadopropiamentedicha. Más aún, otros procesos que facilitan la salida del calcio desde el citosol, p.e. el intercambiadorNa~/Ca~‘j podrían realizarvicariamenteestafunción (Langer y Peskoff, 1996). Ello seríaposible sobrela basede una más lenta afectaciónde los mecanismosquemantienenel gradientede sodio transsarcolémico.Es interesante destacar a este respecto que el 181 compartimentode calcio susceptiblede ser intercambiadoa través del intercambiadorNa~/Ca~+ no seve alteradohastatrascurridos50 miii de inhibición metabólicaen miocitos neonatalesde rata, y ello a pesarde quelasconcentracionescelularesdeATP están20 vecespordebajodelas iniciales. Sin embargo,la contractilidaddesapareceal cabo tan sólo de 2-3 mm de inhibición metabólica(Barrigon et al, 1996). 4.- La velocidadde recaptacióndel calcioactivadorcitosólicoestá disminuida(< -dT/dt mas)y la cantidadtotal de calcio recaptadoen RS disminuyeprogresivamente(<11)). Inicialmentenosealterala velocidad de salidadel calcio haciamiofilamentos(manteniminetoduranteaprox. 1 minuto del + dT/dt, condisminución paralelade TD y máximavel. de relajación).Perocuandola disponibilidad de calcio en RS desciendede un nivel critico (isquemia de más de 1 minuto, que comprometela disponibilidadde calcio en RS paraser liberadopor unidadde tiempo), sedesactivala función aceleradorade contraccióndel RS,y la disipación detensióndesarrolladase correlacionaya tambiéncon la disminucióndel + dT/dt. 182 - EFECTOSDEL CPA SOBREPARÁMETROSCONTRÁCTILES DE LA ISQIJEMIA. El efecto másdestacablede la isquemiaen septapretratadoscon CPA 1V M es el retardoen la desapariciónde la tensióndesarrollada, de la máximavelocidaddecontracción(con prolongaciónsignificativa de la meseta)y enlentecimientotambiénde la caldade la máximavelocidad de relajación(las dos fasesde formasignificativa) (Figuras38 y 39). No se apreciauna modificación significativa de la tensión de reposo (no acúmulo de calcio libre en citoplasma).El hecho de que se tardemás tiempo en perder contractilidad durante la isquemia sin alterarsela tensiónde reposoes unaevidenciaindirectade queel estadometabólico se encuentramejorado(Bourdillon y Poole-Wilson, 1982). Por el contrario, la isquemiaen los septapretradoscon CPA 1O~ M, tiene un comportamientomarcadamentedistinto durante la fase inicial de la misma.En efecto,llama la atenciónla desapariciónabsoluta de la mesetainicial característicadel + dT/dt mas,que presentaen su lugarunarápidacaídainicial (Figura22) quecorrelaciona,a su vez, con la del -dT/dt mas (Figura 40). En concordanciacon estefenómeno, el acortamientodel t parael pico esmenor queen la isquemiacontrol (25 vs 37%), como también se acortamenosel t parael 90% de relajación medidodesdeel pico de contracción(7 vs 14 %). Todosestosfenómenos puedenexplicarsede forma racionalsi aceptamos,como ya se describió con anterioridad, que el CPA a la concentraciónUY5 M produceun 183 bloqueo completo de la SERCA. De estemodo, la ausenciade un RS funcionante traería consigo la falta del mecanismo responsablede mantenerla velocidadde contracciónmáximadurantela fase inicial de la isquemia.Estehechoconstituye,portanto,un argumentomása favor de queel CPA empleadoa la concentraciónmayor(1V M) produzcaun bloqueocompletode la SERCA, e igualmentesostienenuestrahipótesis del papel del RS como mantenedorde la velocidad de contracción durantecasi el primer minuto de la isquemia. Del mismo modo, el menor acortamientodel t para el 90% de relajación expresaríala ausenciade funcionalidad de la SERCA, de forma que la extrusión de Ca2~ debería realizarsea expensasdel funcionamiento vicariante del intercambiador Na~/Ca2~ fundamentalmente. A 120 o 4 o o 4u, w o 2 o u> 2 w 1- 100 80 60 40 20 o e 100 ~80 ~70 o 60 ~50 u, uj 40 o z 30 o ~20 2 w 10 1- o 0 10 20 30 40 50 +dTldtmax 80 90 100 FIGURA 37.-Correlacionesnormalizadas(%) entretensióndesarrollada y + dT/dt masobtenidassobre381 contraccionesdesdeel inicio de la isquemiaen un experimentocontrol típico. (A) La pendientedel ajuste lineal escasi1 (k=O,989)y el coeficientedecorrelaciónr2=0,98.(B) La maxima velocidad de contracción presenta meseta inicial y sólo correlacionacon la TD en la fase lenta (pendientek=1,56). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 -dTldt max <%) 60 70 * 0 100 200 300 400 500 6(X 100 200 300 400 600 eLY 100 200 300 TIEMPO uJ o 40 z o z ‘Ja 1•- o 0 120 e 120 ___ 4 o ~80 o 60 u>‘Ja 04Q z o ~ 20z w 1- 120 FIGURA 39.- Correlaciónnormalizada(%) entretensióndesarrolladay + dT/dt mas obtenidasobre 480 contraccionesdesde el inicio de la isquemiaen un septumpretratadocon CPA 10.6 M. La correlaciónes semejanteen amboscasosala isquemiacontrol, con unapendientede 1 parael ajustelineal de (A). 20 40 60 80 100 -dTldt max (%) íoa- - o 0 20 40 60 80 100 +dTldtmax A 120 4 100 o o 60 u> LLI o 40 z o ~ 20z w 1- o 120 e 120 4100 o ~80 o ea u> LLI o 40 2 o u>20z w 1”’- o 0 120 FIGURA 40.- Correlación normalizada entre tensión desarrolladay +dT/dt max obtenida sobre 370 contraccionesdesde el inicio de la isquemia en un septum pretratadocon CPA 1V M. Se mantienela correlación lineal absoluta con el -dTldt mas (A). Sin embargo, el comportamiento de la TD respecto al +dT/dt mas (B) tiene un comportamientoclaramentediferentea los casosanteriores. 80—---- — 0 20 40 60 80 100 -dTldt max (%) 20 40 60 80 100 +dTldt max (%) 188 -EFECTOSCARDIOPROTECTORESDEL CPA. El CPA ha demostradotenerefectoscardioprotectoresfrentea la isquemiade intensidadmoderadatanto desdeel puntode vistafuncional, como bioquímico y morfológico. El único estudio en que se había analizadoel efectocardioprotectorde estefármacocon anterioridadal nuestrovalorabaprotecciónfrentea contusiónmiocárdica(“stunning”) teniendo en cuentatan solo parámetrosfuncionales(Du Toit y Opie, 1994).A esterespecto,convienerecordarquela demostraciónde efectos antiisquémicos debe ponerse en relación con al menos dos de los parámetrosseñalados(Reimery Jennings,1986). Si bien el eje del trabajo experimentalha girado en torno a la demostraciónexhaustivade los efectosantiisquémicosdel bloqueo de la SERCA con CPA respectoa parámetroscontráctiles,los estudiosde análisisde actividadde enzimasintracelularesen el liquido efluentetras la reperfusión,así comola descripciónde la intensidaddel dañocelular valoradopor un histopatólogoexperto, hanconfirmado los resultados anteriores.En estepunto, es lógico suponerqueun menordañocelular con mayor integridad de membranaspresentemenor liberación de enzimas intracelulares. Sin embargo, llama la atención el hallazgo constanteen las observacionesde microscopiaelectrónicade una casi perfecta preservaciónde las paredescapilarestras isquemia de 30 minutos y reperfusión en los tabiquesbajo tratamientocon CPA. La acción protectoradel CPA frenteaisquemia-reperfusiónen el endotelio 189 vascularno ha sido caracterizadahastala fecha,y podríacontribuir ala disminución del daño postreperfusión.En cualquiercaso, se trata de observacionesparcialesquemerecenmásestudio. El trabajo ya mencionadode Du Toit y Opie (1994) presenta diferenciasmetodológicasquehacendifícil la comparaciónderesultados. Así, estosautorestrabajansobremiocardiode rata, cuya dependencia contráctil del RS, es mayor queen el de conejo (más parecidoen este sentido al humano) (Bassani et al, 1994). Estos autoresencuentran relación dosis-dependienteen cuantoa los efectoscardioprotectoresde tresconcentracionesde CPA administradosantesde isquemiade corta duración (1V, íO~ y 1V M). Tambiénencuentranun mismorango de protecciónadministrándoloexclusivamentedurantela reperfusión,por lo queconcluyenquesu principal mecanismode acciónpuederadicaren evitar la sobrecargade calcio, especialmentedurantelas fasesiniciales de la reperfusión.A esterespecto,esinteresantedestacarqueel Ca2~del RS podríaserel principal responsablede la sobrecargade Ca2~durante las fasesinicialesde la reperfusión(Miller y Tormey, 1995). Sin embargo,en estatesissedemuestraqueel efectoantiisquémico del CPA no guardadosis-dependencia,y sumecanismodeacciónno tiene quever exclusivamentecon unaposibleatenuaciónde la sobrecargade Ca2~ intracitosólico durante la reperfusión. En efecto, el mayor porcentajede recuperaciónde contractffidadtras isquemia-reperfusión (67,45%) se obtuvo con la concentración1V M, mientras 1V M 190 recuperabasóloun 52,35%respectoal valorbasalde la preparación.Sin embargo,si se comparael porcentajede recuperaciónrespectoal valor de la tensióndesarrolladainmediatamenteantesde la isquemia(bajo la acción del fármaco, que disminuye de forma significativa la contractilidad;Tabla 7) el porcentajede recuperaciónes del 63%, valor que no presenta diferencias estadísticamentesignificativas con la concentraciónmenor.Además,no sepuedeafirmarquesu mecanismode acción radiqueexclusiva o fundasnentalmenteen evitar la sobrecarga intracitosólica de Ca’~ durante la reperfusión, ya que sus efectos antiisquémicosse ponen de manifiesto desdeel inicio de la isquemia, como demuestranlas constantesde tiempode caída de los parámetros funcionales caracterizadosen las figuras 21-25, y tabla 9. Es más, administradoexclusivamentedurantela reperfusión,no manifiestaen absolutoningún efecto cardioprotector,lo quecontradicetambién los hallazgos de Du Toit y Opie (1994). Por todo ello, parece que la concentraciónmenor de CPA, con un bloqueo parcial de la SERCA actuaríadisminuyendolos transientesde calcio y mejorandoel gasto energéticocelular.A esterespecto,es interesantedestacarque Du Toit y Opie encontraronunosnivelesde fosfocreatinay A1’P algomayoresen el grupo tratado con CPA en preisquemia. Por otra parte, la concentraciónmayor de CPA <1V M), si bien manifestadaefectos cardioprotectoresevidentesdisminuyendola sobrecargade calcio, puede disminuir el resultado de los mismos sobre contractilidad como consecuenciade la significativa repercusión sobre los parámetros contráctilesdel bloqueo completode la SERCA. 191 VI.- CONCLUSIONES 192 1.- El inhibidor específicode la SERCA, ácido ciclopiazónico (CPA), presenta efectos cardioprotectores frente a la isquemia experimentalrealizadaen tabiqueinterventriculardecorazónde conejo. Esteefectoseha evidenciadosobre: - parámetros funcionales (porcentaje de recuperación de contractilidadtras30 mm de isquemia-reperfusióny máximoincremento de la tensiónde reposo). - parámetrosbioquímicos (liberaciónen el liquido efluentede las enzimasintracelularesCPK, ASAT/GOT y LDH). - observacióndirecta en preparacionesde microscopiaóptica y electrónica. 2.- Este efecto cardioprotectorocurre por mecanismosque se desencadenanpreviamentea la inducciónde la isquemia,puestoque la cardioprotecciónno ha sido evidentecuandoestefármacose perfundió unicamentedurantela reperfusión. 3.- CPA producecardioprotecciónestadísticamentesignificativaen todo el rango de dosis estudiada,10.6, 1V y 3 x 1V M, pero sin que existadosis-dependenciaen la intensidadde su efectoantiisquémico,ya que la concentraciónmenor fue la másefectiva, sin existir diferencias respectoa la cardioprotecciónentrelas dos concentracionesmayores. 193 4.- CPA 10.6 M, produceun bloqueoparcialde la SERCA, ya que en el tabique interventricular no isquémico, tan sólo prolonga significativamentela fasede relajacióndel ciclo contráctil. 5.- Concentracionesmayoresdel CPA producenun bloqueototal de la SERCAya quesusefectossobretabiqueno isquémicoseevidencian más sobre la velocidad de contracción,lo que indica la ausenciade funcionalidaddel retículosarcoplásmico.El bloqueoes total puestoque la máximaconcentraciónutilizada,3 x 1V M, no incrementalos efectos de la concentracióninmediatamentemenor. 6.- Durante la isquemia sin tratamiento farmacológico, los mecanismosresponsablesde la desapariciónde la tensióndesarrolladay de los fenómenosde relajaciónson comunesen ambosprocesos,como pone de manifiestola estrechacorrelaciónlineal y pendientede 1, entre los valoresnormalizadosde tensióndesarrolladay -dT/dt masa lo largo de la isquemia.Por el contrario,ello no ocurrecon la + dT/dt mas,ya que éstasemantieneinalteradadurante50 sg. 7.- La conservaciónde lamáximavelocidaddecontraccióndurante los 50 segundos iniciales de la isquemia está en relación con el mantenimientode la actividaddel retículosarcoplásmico,ya que éstono ocurrecuandose bloqucatotalmentela SERCAcon las concentraciones mayoresdel CPA. 194 8.- Se postulaqueel mecanismode acciónantiisquémicodel CPA 1V M guardarelaciónconunahipotéticamejorade eficienciaen el gasto energético celular, ya que el pretratamiento con este fármaco y concentraciónproduce durante la isquemia un enlentecimientoen la desapariciónde la tensión desarrollada,de la máxima velocidad de contracción (con prolongación significativa de la meseta) y retardo tambiénde la máximavelocidadde relajación. 9.- Se ha desarrolladoy optimizadoun sistemapara el registro, medida y análisis automatizadode la contracción que permite por primera vez la correlación entre múltiples parámetroscontráctiles tomados contracción a contracción. Se aportan los programas de ordenadordesarrolladosy el estudiode precisióny fiabilidad. 195 VII.- ANEXOS 196 ANEXO 1. ProgramSantosUno; usesDos,Crt; {$F+} {$L Sl2pgtpf} type array par= array[O..5] of integer; array_datos= array[O. .555] of integer; var parm:array par; aryl,ary2:array datos; i,er,fun,size:integer; BASE,start,stop:integer; y,number:char; fd Text f file of integer; gr,gm Integer color Integer bl,b2 Barray: Byte; disp Real; st String Function KbdActivo Boalean; 197 var Regs Registers; Begin FiIIChar(Regs,SizeOf(Regs),0); Regs.AH := $01; Intr($16,Regs); IF (Regs.Flagsand $40) = O THIEN KbdActivo = True Else KbdActivo = False; End; ProcedureLeeKbd; var Regs Registers; Begin FiIlChar(Regs,SizeOf(Regs),0); Regs.AH := $00; Intr($16,Regs); Regs.AH; b2 := Regs.AL; End; Procedurepc1812(fun:integer;vara,b,c,d:integer);external; Var fm byte; 198 Nm stt’i Graba Estadolni bi Mi,Ms Frec :Byte; String; :Byte; Array[O..1] of Char; Byte; :Real; Real; Begin CIrScr Write(’Periodo de muestreo(1 - 10 ms) ‘); readln(fm); Write(’Numero de muestraspor ciclo ‘); readln(Nm); Write4(’Fichero(sinextension)xxxxxxx.BIN ‘); readln(stfi); Graba := O; Estadolni[O] = Estadolni[1] = Assign(fd, stt’i+ ‘.dat’); Rewrite(fd); Writeln(fd,’ Periodode muestreo‘Sm); Writeln(fd,’ Numero de muestras ‘,Nm); Assign(f,stt’i+ ‘.bin’); Rewrite(f); 199 BASE:= $220; parm[OJ: = BASE; parm[1]:=5; parmlj2]:= 1; fun:=O; pclSl2 (fun,parm[O],aryl[O],ary2[O],er); IFer <> Othen begin writeln (‘ No se puedeinicializar la tarjeta ‘); exit end; parmiO]:=0; parmll]: =2; fun:=23; pc1812(funparm[0],aryL[0jI ,ary2[0] ,er); IF erC >0 then begin writeln(’No se puedefijar la ganancia‘,er); exit end; 0; b2 := 0; WrkeIn(’Calibracion’); 200 Write(’Nivel inferior, pulseINTRO 9; readln; Mi := 0; Ms := 0; FOR i:= 1 to 200 DO Begin pc1812 (3,aryl[i],parm[0],ary2[0I,er); End; FOR i:= 1 to 200 DO Begin Mi := Mi + aryl[i] End; mi : = mi/200 Writeln(’Media inferior ‘, mi:4:2) Writeln(fd,’Media inferior ‘, mi:4:2) Write(’Nivel superior,pulse INTRO ‘); readin; FOR i:= 1 to 200 DO Begin pc1812 (3,aryl[ijj,parm[0i,ary2[0],er); End; FOR i:= 1 to 200 DO Begin Ms := Ms + aryl[i] End; ms := ms/200 201 Writeln(’Media superior ‘, ms:4:2) Writeln(fd,’Media superior‘, ms:4:2) Close(fd); Writeln(’Procesode medida,pulse INTRO cuandoeste readin; gr:= 0; = 67 then TREN LeeKbd;IF kbdActivo bi:= bU IF bí = 68 then Begin Graba:= O; bí := bi; End Else IF Begin Graba:= 1; bí := bi; End; Write(EstadolniliGraba]); Xvriteln(bl,’ ‘,b2,’ ‘,gr,’.’) parmfjO]:= 200; listo’); 202 parm[1]: = fm*10; fun:= 17; pc1812 (fun,parm[0J,aryl[0I,ary2[0] ,er); IF er< >0 then begin writeln(’Fallo en la fijacion de condiciones‘); exit end; parm[0] := 0; parm[1] := 0; hin := 1; pclSl2 (fun,parn4O],aryl[0],ary2[0],er); W er< >0 then begin writeln(’Fallo en selecciónde canal scan’) exit end; size : = Nm; parm[0]: =size; parmlj2]: = 1; fun:=4; 203 Until (Portlj$226] and $1 = 1) pc1812 (fun,parm[0J,aryl[0] ,ary2[0] ,er); IF erC >0 then begin writeln(’No se puedorealizarla conversion‘); exit end; 1 := bi IF Graba = 1 then Begin inc(gr) Write(f,i); FOR i:=0 to size DO begin write(f,aryl [i]); end; End; until b2 = 27; Close(f); End. 204 ANEXO fi. PrograniSantosDos usesCRT,Graph; type tipoin = Array[1. .122] of integer var st : String gr,gm, fin,pipa, res,k,tecla,punt, ¡ : Integer y : Tipoin fi : File fs : Text sino : Char; sum, mus, cent : Real nom, sal String; Begin ClrScr; Write(’Nombre del fichero a convedir BIN ‘); 205 readln(nom); Write(’Nombre del fichero convedido readin(sal); Write(’Numero de puntospor contraccion: ‘); readln(punt); Assign(fi, nom + ‘.bin’); Reset(fi,1); Assign(fs, sal + ‘.prn’); Rewrite(fs); PRN ‘); BlockRead(fi,v,sizeof(v),res); inc(k); until EOF(fl); Writeln(’N0 de registros= ‘ Write(’Primer valor Convenido ‘) ;readln(i); Write(’Ultimo valor Convenido‘);readln(fin); gr:= VGA; gm : 2; Initgraph(gr,gm,’.\bgi’); SetBkcolor(7); SetColor(1}; str(i,st); OuttextXY(10,50,’Primervalor ‘+st); str(fin,st); OuttextXY(1O,70,’Llltimo valor ‘+st); 206 OuttextXY(450,50,’Fichero‘+ nom+‘.prn’); Rectangle(10,450,600,150); SetColor(15); fin fin 4; Reset(fi,1); k:= 0; IFi > lthen BlockRead(fi,v,sizeof(v),res); inc(k); until (k = BlockRead(fi,v,sizeof(v),res); sum := -100000 mus := 100000; FOR i := 1 to punt DO Begin v[i] := -1 * v[i] write(fs,v[i],’ ‘); IF v[i] > suni TREN sum := v[i] End; FOR i := 2 to punt DO Begin IF v[i] < mus TREN mus : = vil] 207 End; Writeln(fs); inc(k); cent = 500/fin tecla : = v[1] IF tecla = -23 TREN SetColor(12) else1SF tecla = -68 TREN SetColor(10) Line(50+ trunc((cent)*k),400-trunc(mus/5),50+ trunc((cent)*k»400~trun c(suml5)); until (EOF(fi) OR (k = fin)); Close(fs); Close(fi); readín; CloseGraph; End. 208 ANEXO III. PrograinSantosTres Uses CRT,Graph; Var mn,sdv: Array[1. .150] of real; n,d,s,p,z: Array[1. .1501 of integer t : Array[1..7] of Integer bsl,nc,mxcmixc : Array[1. .10] of Real; sz : Array¡jl . .22] of Longlnt txt : Array[1..7] of string ¡,y,j,js,nsuav,nsuavf,gr,gm,gs,numf, numl,numr,numb,numx,numz,numt, maxn,devmaxamp,devminamp,npunt,ncal,pmr,fnl,xp,mindm, minm,tminm,mm ,max,mmd,maxd,maxdm,tmaxdm,tniindm, maxm,tmaxm,basal,h,sx,k,inis,inre,WI,fnal: Integer f,fs : Text v,med,dev,w,emp,empc,fst,fmg,maxp : Real; st,wt : String ch,visu,preca,si,xst Char ProcedureLECTURA; Begin i:= 1 209 read(f,d[1]); FOR i: = 2 to npunt DO read(f,d[i]); readln(O; inc(numl); End; ProcedureSUAVIZADO; Begin FOR i := 3 to (npunt-1) DO s[i] := (d[i-1] + 2*d[i] + d[i+ 1]) DIV 4; s[1] := d[1] sf2] := d[2] s[npunt] : = d[npunt] End; ProcedureINICONT; Begin numf := 0; numr := O; si := ‘s’ read(f,d[1]) readln(f) inc(numr) IF (d[1] = -23) AND (mis = O) THiEN mis : = numr - 1 ELSE IF (df1] = -19) AND (inre = 0) THEN inre = numr-1 210 ELSE IF (inre + 1 < ints) TREN inre: O ELSE lE NOT (dlii = -67) TREN si : = ELSE IlE (dlii = -67) AND (si = ‘s’) 1’TLEN inc(numf) until EOF(f); reset(f) FOR ¡ := 1 to 150 DO mn[i] := 0; y := 0; j := 0; lectura suavizado; FOR i := 1 to npunt DO mn[iI := mnl?ii + su; inc(y) until y = numf; End; ProcedureMÁXIMO; Begin max := O while ¡ < Begin inc(i) IF d[i] > Begin max t[i] := ¡ i := O; (npunt-i) DO maxthen dli] 211 End End; End; ProcedureMEDCONT; Begin reset(f); FOR i := 1 to 150 DO Begin mn[iJ := O; sdv[i] := O; End; y := 0; ncal := O; ¡mml := 0; lectura suavizado; FOR i := 1 to npunt DO d[i] := s[i] maximo; IF (t[1] > tmax¡n - 4) AND (t[1] < tmaxm + 4) then Begin ncal := ncal + 1 FORi:= ltonpuntDO Begin w := d[i] mn[i] = mnlli] 212 sdv[i]: = sdv[i] + SQR(w) End; End; inc(y) until y = numf; ¡ := 1 w := mn[i]; sdv[i] : = SQRT({sdv[i] - SQR(w) ¡ ncal) ¡ (ncal - 1)) * 100 mn[i] := w 1 ncal; inc(i) until ¡ = npunt FORi := ltonpunt DO Begin d[i] : = ROUND(mn[iJ) s[i] : = ROUND(mn(i] + ((2 * sdv[iJ) ¡ 100)) End; End; ProcedureINIMIN; Begin mm := 16000 ; med 0; dey := 0; emp :=0 ; empc O ;numz := 1; 213 w:= d[i] emp :=emp +w; empc = empc + SQR(w) med : = emp ¡ numz, IF (numz > 2) TREN dey : = SQRT«empc- SQR(emp)¡ numz) ¡ (numz-1)); IF pmr > O TREN dec(i) ELSE ¡nc(i) inc(numz) until (((pmr =0) AND (d[i] > med + dey)) OR ((pmr>0) AND (d[i]> med + dey)) AND (dey > 0)) OR ((numz = npunt-1) OR (i = 0)); min : = ROUND(med); IF pmr = O TREN basal:= mm ELSE fnal := mm; IFi=npuntTHiENi:= 00 IFpmr > OTREN FORj := 2tonpunt DO ¡iii] := dUl IF pmr = O TREN pmr := i ELSE fnl := npunt-(numz+1) End; ProcedureDOBLEZ; Begin ¡ := tu] ; inc(i); until (d[i] > med + (4 * dey)) OR (i=npunt) IF (i > fnl) TREN preca := ‘s’ 214 End; ProcedureEXTRASIST; Begin IF NOT (numt = dli]) TREN k := O; numt : = d[1] IF(k<9)TRENk:=k+1; bsl[k] : = basal; nclk] : = pmr; mxc(k] max; mixc[kF= fnal; bsl[10] := O ; nc[10] := O ; mxcflO] := O ; mixc[10] := O FORi:= lto8DO Begin bsl[10] : = bsl[1O] + bsl[i] nc[10] = nc[1O] + nc[i] mxc[1Oi = mxc[10] + mxc[i] mixc[1O]: = mixc[lO] + mixc[i] End; IF (k>8) AND (d[1] = -19) TREN IF «mixc[9]I(mixc[1O] ¡ 8)) > 1.2) OR ((bsl[9] ¡ (bsl[1O] 1 8)) > 1.2) OR ((mxci9] ¡ (mxc[1O] ¡ 8)) > 1.3) TREN Xst IF (k >8) AND NOT (d[1] = -19) TREN IF ((bsl[9] ¡ (bsl[1O] ¡ 8)) > 1.1) OR (nc[9] > nc[1O] ¡ 8 + 3) OR ((mxc[9] ¡ (mxc[1O] ¡ 8)) > 1.04) 215 OR ((mixc[9] ¡ (mixc[10] ¡ 8)) > 1.2) TREN Xst := IF (k>8) AND NOT (Xst = ‘s’) then FORi:= lto8DO Begin bsl[i] : = bsl[i+ 1]; nc[i] := nc[i+1] mxc[i] = mxcfi+ 11; mixc[iI: =mixc[i+1] End; End; ProcedureMEDIDAl; Begin i := 2 inc(i); until (dli] > ((max-basal)div 2) + basal)OR ti = npunt-1) t[2] := ¡ lF ({((niax-basal) div 2) + basal)-dfi-1]) < dliii - (((niax-basal)div 2) + basal)TILEN t[2] : = i-1 := tUl]; inc{i); until (d[i] < ((max-basal)div 10) + basal)OR 216 (i = npunt-1) 113] := i IF d[i-1]- (((max - basal)div 10) + basal) < (((max - basal)div 10) + basal) -di)] ‘FILEN t[3] := i-1; End; 0; 2 to tU] DO ProcedureMEDIDA2; Begin maxd : = FOR i:= Begin IF p[i] > maxd then Begin maxd : = p[i] t[4] := i End; End; mmd : = FOR i:= Begin IF ph] •c Begin mmd := p[i] t[5] := i End; 10000; tíl] to (npunt-1) DO mmd then 217 End; End; ProcedureGRAF1; Begin SetLineStylelO,1,1); h := 1 ; sx : 51 IFgs=OTHiENj:=2ELSEj:=1; IFgs = OTRENxp:= maxmELSExp:= maxdm; IlE (Xst = ‘n’) OR ((Xst = ‘s’) AND (sx = 51)) then Begin WHILE(h<3)DO Begin IlE (h = 2) AND NOT ((GetColor = 7) OR (Xst = ‘s’)) TITEN sx := 346; v: (pIZ] ¡xp) ; y := v*<90*j) IF (sx = 346) AND (d[1] = -19) AND NOT (si = ‘s’) ‘FIJEN SetColor(1); IlE (SX=346) AND (d[1I=-23) AND NOT (si = ‘s’) TREN SE’FCOLOR(3); Move’Fo(sx, (200+ gs)-ROLJ?ND(v» IlE (numí < mis) and (sx=346) ANO NOT (si = ‘s’) and not (dijí] = -67) TREN SetColor(5) FOR i: = 2 to (npunt-1) DO Begin 218 IlE NO’F ((ROtJND(v) > 190) OR (ROUND(v) < -140)) then Line’Fo(sx+i*2, (200+gs)-trunc(v)) End; h:=h+1; End; End; End; ProcedureSuader; Begin FOR i:= 3 to (npunt-1) DO s[i] := (p[i-1] + 2*p[i] + pli+1]) div 4; s[1] s[2] := s[npunt] : = p[npunt]; End; ProcedureGRAU; Begin SetLineStyle(Dottedln,10,1) FOR i := 1 to 7 DO Begin Line(60+t[i]*2,20,60+thi]*2,400) 219 IF(imod2 > 0)OR(i = 2)then Out’FextXY(50+ t[iJ*2,410, ‘t’ + CHiR(i+ $30)) ELSE Out’FextXY(50+t[i]*2,420,~t~ +CHiR(i+ $30)) End; FOR i := 1 to 7 DO Begin SIITR(t[iI,wt) OutTextXY(555,20+ 20*i,wt) IlE (i < 6) TREN STR(nljt[i]],wt) ELSE STR(p[tli]i,wt) OutTextXY(585,20+20*i,wt) End; End; ProcedureFINAL; Begin CloseGraph Close(t) Close(fs) llalt; End; BEGIN CIrScr 220 numb O; numl := O; k := 0; ints := 0; inre := O; numx := 1; pmr := O; numr := 1 ; j := 0; mmm := O; niaxd:=O;nsuav:=0; nsuavf:=1;preca:= ‘n’ ch := gr:=VGA;gm:=2; Write(’Fichero ‘); readln(st); Write(’Frecuenciade estimulacion(Hz) ? ‘); readln(fst) Write(’N0 de puntospor contraccion? ‘); readln(npunt) Write(’Deseayisualizacionmanual (“sin”) ? 9; readln(visu) IF yisu = ‘s’ TREN Begin Write(’N0 de contracciónde partida(0...n) ? 9; readln(numb) End; Assign(f,’c:\tp\’+st+ ‘.prn’); Reset(f); fst := 1 ¡ fst INICONT; MÁXIMO; tmaxm := t[1] d[1] := O ; d[2] := O FOR i := 3 to npunt DO dli] ROUND((mn[i]/numf)-(mn[i-1]¡numf)) MÁXIMO; 221 PORi := 1 to npunt DO zIji] := dlii tmaxdm : = tít] maxdm = d[t[1]] FOR i := 2 to npunt DO d[i] := d[iJ * .4 MÁXIMO; mindm := d[t[1]] tmindm : = t[1I FOR ¡ : = 1 to npunt DO d[iJ := ROUND(mn[iJ/numf) MÁXIMO; mann := d[t[1]] tmaxm := 41] 1 := 2; INIMIN; mmm : = basal; ¡ := npunt; INIMIN; MEDCONT; d[npuntl : = d[npunt-1] SUAVIZADO; FORj := 1 to nsuavfDO Begin FOR Np := 2 to npunt DO Begin d[xpj := s[xp] Suavizado 222 End; FOR i := 1 to npunt DO mnhul := dlii End; numl = numb reset(f) IlE NO’F (numí = 0) then Begin FOR i := 1 to numí -5 DO readln(f) End; numt := -67; Assign(fs,’c:\tp\’+st+tres’); Rewrite(fs); Initgraph(gr,gm,”); ClearDevice SetBkColor(7) ; SetColor(15); Set’FextStyle(1,0,1); OuttextXY(40,425,’Fichero: ‘+st) S’FR(nuni¡f,wt) ; Out’FextXY(40,450’n0 controles= ‘ + wt); Out’FextXY(250,425,‘Contraccion n0 ‘) SetTextStyle(2,O,7); SetUserCharSize(4,5,4,5) Line(50,20,5O,200) ; Line(50,200,300,200) Line(50,220,50,400); Line(50,300,300,300) SetColor(1) Rectangle(2,2,638,478) ; Rectangle(6,6,634,474) IlE (visu = ‘s’) OR (visu = ‘5’) then Begin 223 SetColor(8) Set’Fextjustify(0,1) ; SetLineStyle(0,1,1) FOR i: = 1 to 8 DO Iine(440,10+20*i,620,10+20*i) Rectangle(437,27,623,173) Rectangle(440,30,620,170) FOR i := 1 to 2 DO line(510+20*i,30,510+20*i,170) Line(580,30,580,170) txt[1] := ‘Max Cont.’ ; txt[2] := ‘50% Cont.’ txtl3] := ‘90% Reí’ ; txt[4] ~Max.1aD.’ txt[7] : = ‘% -d’FIdt’ FOR i : = 1 to 7 DO Out’FextXY(445,20+20*i,txt[iI) FOR i := 1 to 5 DO OutTextXY(532,20+ 20*i, ‘t’ + CILR(i + $30)) End; SetColor(15) IlE NOT ((visu = ‘s’) OR (visu =‘S’)) then Begin Line(345,20,345,205) ; Line(340,200,620,200) Line(345,220,345,405); Line(340,300,620,300) EnO; Xst := ‘n’ ; si := ‘s’ ; pmr := 0; SetColor(15); SetLineStyle(0,L,1) Line(45,200,300,200); Line(45,300,300,300) 224 STR(numl+1,wt) ; Out’FextXY(375,425,wt) SetColor(4); IF (numí= ints) TREN Out’FextXY(250,450,’tde isquemia(seg) =‘); FOR i : = 2 to npunt DO ph] : = ROUND(mn[i]) IlE (numí > numb + 1) TREN GRAFí; si := ‘n’ FOR i:= 1 to 150 DO Begin di)] := O ; si)] := O ; ph] := O ; nhui O End; LECTURA; ¡ := 2; INIMIN; 1 := npunt; INIMIN; IlE numx = 1 TREN DOBLEZ; IlE preca = ‘s’ TREN fst := fst * 2 MÁXIMO; maxp = (max-basal)¡ (maxm-minm) IF (numx> mis) AND (maxp < 0.5) then Begin nsuavf : = ROtJND((O.6~maxp)*10) nsuav := nsuavf-1; End; 225 IlE (d[1] = -23) then Begin WI : = ROtJiND((numl~inis)*fst) STR(WI,wt); OutTextXY(425,450,wt) End; gs := O nhuI : = ROUND(mnl2i) EX¶URASIS’F; SUAVIZADO; SetColor(1); FORj:= Oto nsuavfDO Begin FOR i:= 2 to npunt DO dlii := Suavizado; End; SetColor(14) pl1] := d[1] plnpunt] : = p[npunt-1] POR i := 2 to npunt DO ph] := dlii GRAF1; MÁXIMO; pmr := O; ¡ := 2 ; 226 INIMIN; 1= npunt INIMIN; MEDIDAl; FOR i := 1 to npunt DO ni)] := ph] gs := 100; SetColor(4); si : = FOR ¡ := 1 to npunt DO ph] := zhuI GRAFí mnaxd := O; si:=’n’ mmd := 16000; FOR i: 3 to (npunt-2) DO Begin ph] := dlii - dhl-il; IlE ph] > maxd TREN maxd : = ph]; IlE pi)] < mmd TREN mmd : = End; SetColor(1); IlE nsuav > O then Begin FORj:= 1 to nsuavDO Begin Suader; FOR i:= 2 to npunt DO pi)] := si)] 227 End; SetColor(14) pl1] := dli] End; MEDIDA2; GRAFí; IF NO’F (Ó’isu=’S’) OR (visu=’s’)) TREN delay(100) IlE (numí= mis) OR (numl= inre) TREN delay(20000) SETCOLOR(7); IF (numx = numr) TREN ch : = readkey; IF NO’F (numl=inis-1) OR (numl=inre-1) TREN GRAFí; SetColor(8); IlE (visu=’s’) OR (visu=’S’) TREN GRÁF2; SetColor(7) IlE NOT (numí= numr) OR (numí= mis) OR (numí= inre) then Begin SetColor(7) S’FR(numl,wt) ; Out’FextXY(375,425,wt) S’FR(WI,wt) ; Out’FextXY(425,450,wt) IlE (numí = inre) then Out’FextXY(250,450,’t de isquemia(seg) = ‘) FOR i := 1 to npunt DO ph] ni)] gs := O; 228 GRAFí; End; IlE ((visu=’s’) OR (visu=’S’)) TREN GRAF2 n[tll]] : = nitílil - basal IF (nlt[1]]-basal) >0 then Begin devmaxamp: = round(((nltí4]1~basa1)¡(n¡jtl1j]~basaI))*1OO) devminamp: = round(((n[tl5]]~basal)/(nltl1]]~basal))*100) End; IlE NO’F (Xst = ‘s’) TREN Begin Write(fs,numx,’ ‘,d[1],’ ‘,basal,’ ‘,pmr,’ 9; FOR i:= 1 to 3 DO Write(fs,t[i],’ ‘,nlthi]],’ ‘); FOR i:= 4 to 5 DO Write(fs,tlii,’ ‘,plti)]],’ ‘); Write(fs,devmaxamp,’‘,devminamp,’ ‘); Writeln(fs); End; IlE (visu=’s’) OR (v¡su=’S’) TREN ch := readkey; IlE(ch= ‘f’)OR(ch = ‘F’)TIIENFinaI; IlE (preca = ‘s’) TUEN numx:= numx + 2 ELSE numx:= numx + 1. UNTIL EOF(O; FINAL; End. 229 VIII.- BIBLIOGRAFIA 230 - Ágata N, ‘Fanaka H & Shigenobu K. Possible action of cyclopiazonicacidonmyocardialsarcoplasmicreticulum:inotropiceffects on neonataland adult rat heart. Br J Pharmacol1993; 108: 571-572. - Allen DG, LeeJA & Smith GL. ‘Fhe consequencesof simulated ischemiaon intracellularCa1~ andtensionin isolated ferret ventricular muscle.J Physiol (Lond) 1989; 410: 297-323. - Ardehail A & Ports‘FA. Myocardialoxygensupplyanddemand. Chest1990; 98: 699-705. - BackxPH, GaoW-D, Azan-BackxMD & MarbanE. Forceand intracellular lCa2~] in intact rat cardiactrabeculae.JGenPhysiol 1995; 105:1-19. - BadaouiA, Huchet-CadiouC & Léoty C. Effects of cyclopiazonic acid on membranecurrents, contraction and intracellular calcium transientsin frog heart.J Mol Ccli Cardiol 1995; 27: 2495-2505. - Barrigón 5, Wang 5-Y, Ji X & LangerGA. Characterizationof the calcium overload in cultured neonatalrat cardiomyocytesunder metabolicinhibition. 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AGRADECIMIENTOS ÍNDICE I.- INTRODUCCIÓN I.1.- BASES ESTRUCTURALES DE LA CONTRACTILIDAD MIOCÁRDICA I.2.- ACOPLAMIENTO EXCITACIÓN-CONTRACCIÓN I.3.- ISQUEMIA MIOCÁRDICA I.4.- INHIBIDORES DE LA Ca 2-ATPasa DEL RS II.- PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS IIl.- MATERIAL Y MÉTODOS III.1.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. SISTEMA DE DIGITALIZACIÓN III.2.- EFECTOS DEL CPA SOBRE PARÁMETROS CONTRÁCTILES III.3.- ESTUDIOS SOBRE PARÁMETROS DE CONTRACTILIDAD EN ISQUEMIA III.4.- ESTUDIOS SOBRE PARÁMETROS BIOQUÍMICOS III.5.- ESTUDIOS SOBRE PARÁMETROS MORFOLÓGICOS III.6.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO III.7.- FÁRMACOS Y OTROS PRODUCTOS IV.- RESULTADOS IV.1.- ANÁLISIS INTERGRUPO DE LA HOMOGENEIDAD DE LOS GRUPOS DE ANIMALES Y CONDICIONES DE EXPERIMENTACIÓN IV.2.- EFECTOS DEL CPA SOBRE CONTRACTILIDAD MIOCÁRDICA IV.3.- EFECTOS DE ISQUEMIA-REPERFUSIÓN SOBRE PARÁMETROS CONTRÁCTILES IV.4.- EFECTOS DE LA ISQUEMIA-REPERFUSIÓN SOBRE PARÁMETROS BIOQUÍMICOS IV.5.- EFECTOS DE LA ISQUEMIA-REPERFUSIÓN SOBRE PARÁMETROS MORFOLÓGICOS V.- DISCUSIÓN VI.- CONCLUSIONES VIl.- ANEXOS VIII.- BIBLIOGRAFÍA DCFB: L: