UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA DEPARTAMENTO DE SANIDAD ANIMAL © Diego Flórez Cuadrado, 2017 TESIS DOCTORAL Caracterización genómica y resistencia a antimicrobianos de Campylobacter MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Diego Flórez Cuadrado DIRECTORES Lucas Domínguez Rodríguez María Concepción Porrero Calonge Alberto Quesada Molina Madrid, 2018 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Sanidad Animal CENTRO DE VIGILANCIA SANITARIA VETERINARIA (VISAVET) Servicio de Zoonosis de Transmisión Alimentaria y Resistencia a Antimicrobianos TESIS DOCTORAL Caracterización genómica y resistencia a antimicrobianos de Campylobacter Memoria para optar al grado de Doctor con Mención Internacional presentada por Diego Flórez Cuadrado Bajo la dirección de los doctores: Lucas Domínguez Rodríguez, Mª Concepción Porrero Calonge y Alberto Quesada Molina Madrid, 2017 Universidad Complutense de Madrid Facultad de Veterinaria Departamento de Sanidad Animal Centro de Vigilancia Sanitaria Veterinaria (VISAVET) Servicio de Zoonosis de Transmisión Alimentaria y Resistencia a Antimicrobianos Tesis Doctoral Caracterización genómica y resistencia a antimicrobianos de Campylobacter Memoria para optar al grado de Doctor presentada por Diego Flórez Cuadrado Directores de la Tesis Doctoral: Lucas Domínguez Rodríguez, Mª Concepción Porrero Calonge y Alberto Quesada Molina Madrid, 2017 Universidad Complutense de Madrid Facultad de Veterinaria Departamento de Sanidad Animal D. Lucas Domínguez Rodríguez, Catedrático del Departamento de Sanidad Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid; Dª. Mª Concepción Porrero Calonge, Doctora en Ciencias Veterinarias por la Universidad Complutense de Madrid; y D. Alberto Quesada Molina, Profesor Titular del Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Genética de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Extremadura, CERTIFICAN Que la tesis doctoral que lleva por título “Caracterización genómica y resistencia a antimicrobianos de Campylobacter” ha sido realizada por el licenciado en Biología D. Diego Flórez Cuadrado en el Centro de Vigilancia Sanitaria Veterinaria (VISAVET) de la Universidad Complutense de Madrid, bajo la dirección conjunta de los que suscriben, y estimamos que reúne los requisitos exigidos para optar al título de Doctor con Mención Internacional por la Universidad Complutense de Madrid. Madrid, 2017 Fdo. Lucas Domínguez Rodriguez Fdo. Mª Concepción Fdo. Alberto Quesada Porrero Calonge Molina Planos transversales y longitudinales de Campylobacter jejuni. Microscopio electrónico de transmisión (MET). Imagen cortesía de Dª. Mary Parker. Instituto de Investigación Alimentaria, Norwich, Reino Unido Image courtesy of Ms Mary Parker. Institute of Food Research, Norwick, UK Proyectos, contratos y becas de investigación El trabajo de tesis doctoral que se presenta a continuación se ha realizado en el marco de los siguientes proyectos, contratos y becas de investigación:  Beca de Formación del Personal Investigador (FPI) del Ministerio de Economía y Competitividad. Referencia de la ayuda BES-2013-064701.  Beca de movilidad predoctoral para la realización de estancias breves en centros de I+D. Ministerio de Economía y Competitividad. Referencias de las ayudas: EEBB-I-15-10321, EEBB-I-16-11366 y EEBB-I-17-12173.  Proyectos del Ministerio de Economía y Competitividad: ‐ MALDI TOF Campylobacter: genotipado y caracterización molecular Referencia del proyecto AGL2012-39028. ‐ Campylobacter: detección y caracterización molecular. Análisis genotípico de virulencia y posibles estrategias para su control. Referencia del proyecto AGL2009-07550.  Contrato del Ministerio de Agricultura y Pesca, Alimentación y Medio Ambiente. Referencia de la ayuda 2014/000223.  Programa de actividades de I+D entre grupos de investigación de la Comunidad de Madrid: Tecnologías Avanzadas en Vigilancia Sanitaria. Referencia del programa S2013/ABI-2747 Al profesor Benjamín Manzanal A mi padre, a mi madre y a mi madrina AGRADECIMIENTOS Un día te sorprendes escribiendo los agradecimientos de la tesis. En este punto pienso en cómo era yo el primer día que entré en este laboratorio, lleno de ilusiones pero muy pobre en experiencia. Comparo quien era entonces con la persona que soy ahora y podría decir que el doctorado ha sido una escultura de mí mismo. Me he encontrado con varios artistas durante este tiempo; unos esculpieron, otros limaron, otros lijaron y otros pulieron. El resultado es lo que soy ahora. Me gustaría basarme en los objetivos generales que se siguen en la formación de escultores de la Facultad de Bellas Artes de esta universidad, para dar las gracias a todas esas personas que formaron parte de este proyecto. Gracias a mis directores Lucas, Concha y Alberto, artistas del martillo y el cincel. Gracias por haberme ayudado a desarrollar mi capacidad de percepción y autocrítica, por darme la capacidad de suprimir las barreras entre la conceptualización de un estudio y su materialización, en definitiva por darme la capacidad de materializar la obra. Gracias por vuestro tiempo y generosidad, habéis dado forma a la piedra y ese trabajo requiere paciencia, planificación y una constante verificación. Gracias a las personas que hicieron posibles mis estancias en Reino Unido: Samuel K. Sheppard, Guillaume Meric, Ben Pascoe, Daniel Falush y Ana Vidal. Gracias por potenciar mi capacidad reflexiva y analítica. Gracias a todas las personas que me hicieron sentir como si estuviera en casa: Víctor, Ángela, Ferrán, Waldo, Francesca, Guillermito, Gift, Amandine, Leo, Jesús, Marcelo, Jess, Diana y Evangelos. Habéis limado la piedra, alisado las marcas dejadas por el cincel y perfeccionado la forma final de la obra. Gracias a todo el personal de VISAVET, especialmente al servicio de ZTA: María Ugarte, María García, Fany, Nis, Irene, Celia, Estefanía, Esther, Silvia y Pedro. Gracias por darme conocimientos técnicos y herramientas propias de la configuración de cada estudio, por fomentar el trabajo colaborativo y por vuestro respeto. Habéis lijado el producto final, eliminado las marcas de cincel y rayones haciendo que la piedra luzca más profesional. Gracias a Emmanouil, Adriana, Paola, Carmiña, Felipe, Celia, Bolu, Otilia, Teresa, Iván, Montse y Aitor. Gracias por familiarizarme con aspectos de la obra artística que intervienen decisivamente en la escultura. Vosotros sois quienes me habéis hecho sentir una auténtica obra de arte. Gracias por vuestro cariño, comprensión y lealtad. Gracias al profesor Benjamín Manzanal. Gracias por haberme enseñado a analizar e interpretar las formas extraídas de la naturaleza y así aprender a sintetizar. Gracias por haber visto en una piedra una futura escultura. Nos deslumbraste con tu amor por la microbiología y algunos hemos hecho de tus clases un estilo de vida. Gracias a Covadonga, Federico, Jaime, Rencor, Julia, Diego y Salvador. Gracias por permitirme adquirir un mayor conocimiento de obras y artistas que permitan desarrollar mi trabajo en el espacio tridimensional y conceptual. Artistas y referentes fuera del laboratorio. Gracias a mi familia, especialmente a mis padres. Gracias por enseñarme hábitos de trabajo y actitudes para el desarrollo personal, por potenciar mi estilo propio, y por permitirme expresarme con libertad. Gracias por quererme tanto y tan bien. MUCHAS GRACIAS A TODOS ÍNDICE 3.1 Campylobacter ......................................................................................... 30 3.1.1 Antecedentes históricos .................................................................... 30 3.1.2 Características generales.................................................................. 31 3.1.3 Genoma............................................................................................. 32 3.1.4 Metabolismo ...................................................................................... 34 3.2 Epidemiología ........................................................................................... 35 3.2.1 Caracterización ................................................................................. 36 3.2.2 Estructura poblacional ....................................................................... 37 3.2.3 Principales hospedadores ................................................................. 40 3.3 Aspectos clínicos de la infección en personas ......................................... 41 3.4 Resistencia a antimicrobianos .................................................................. 42 3.4.1 Quinolonas ........................................................................................ 44 3.4.2 Tetraciclinas ...................................................................................... 45 3.4.3 Macrólidos ......................................................................................... 45 3.4.4 Aminoglucósidos ............................................................................... 47 3.4.5 Islas genómicas de multirresistencia ................................................. 49 4.1 Objetivo I: Estudio de la diversidad genética de C. jejuni. ........................54 4.2 Objetivo II: Detección del gen de resistencia a eritromicina erm(B) en Campylobacter aislados de animales de abasto y aguas residuales................... 54 4.3 Objetivo III: Caracterización genómica y genes de resistencia a antimicrobianos en Campylobacter aislados de personas, animales de abasto y aguas residuales. ................................................................................................ 55 5.1 Objective I: Study of the genetic diversity of C. jejuni. ..............................58 5.2 Objective II: Detection of the erythromycin resistance gene erm(B) in Campylobacter isolates from food animals and wastewater. .............................. 58 5.3 Objective III: Genomic characterization and antimicrobial resistance genes in Campylobacter isolates from humans, food animals and wastewater. ............ 59 6.1 Polimorfismo genómico, genes de virulencia y perfiles metabólicos de Campylobacter jejuni ST-45 aislados de pollos. .................................................. 62 6.2 Primera descripción del gen erm(B) en un Campylobacter coli de Europa. 75 6.3 Resistencia a eritromicina en Campylobacter aislados de pavos: presencia del gen erm(B) e identificación de posibles especies bacterianas involucradas en la transmisión horizontal de este mecanismo de resistencia. .............................. 83 6.4 Caracterización genómica y resistoma de C. jejuni y C. coli aislados de personas, animales y aguas residuales. ............................................................ 105 7.1 Diversidad genética de C. jejuni y C. coli................................................140 7.2 Resistencia a macrólidos de C. jejuni y C. coli .......................................143 7.3 Genes de resistencia a antimicrobianos en C. jejuni y C. coli ................148 11.1 Abreviaturas......................................................................................... 194 11.2 Lista de genes...................................................................................... 195 11.3 Estancias internacionales .................................................................... 198 11.4 Artículos científicos y de divulgación.................................................... 199   RESUMEN Página 20 de 200   Página 21 de 200     Resumen Las bacterias del género Campylobacter son las principales causantes de gastroenteritis de origen alimentario en todo el mundo, principalmente las especies Campylobacter jejuni y Campylobacter coli. Estos microorganismos colonizan el tracto digestivo de aves y mamíferos, siendo la principal vía de infección para las personas el consumo de carne de pollo contaminada. La infección producida por Campylobacter suele ser auto-limitante, pero ocasionalmente se producen complicaciones que requieren de tratamiento antimicrobiano, frecuentemente con eritromicina. La resistencia a eritromicina en Campylobacter se relaciona con mutaciones en genes o proteínas ribosomales, bombas de eflujo y con la presencia del gen erm(B). Este gen había sido identificado exclusivamente en aislados de Campylobacter procedentes de China y en todos los casos estaba localizado en islas genómicas de multirresistencia. La presencia de islas genómicas que portan genes de resistencia a diferentes antimicrobianos limita las opciones terapéuticas. En el presente trabajo de tesis doctoral se ha caracterizado una colección de aislados de C. jejuni y C. coli procedentes de animales, personas y aguas residuales. La finalidad del estudio fue la caracterización de la población por MLST y la identificación de genes de resistencia a antimicrobianos y su asociación en islas genómicas de multirresistencia. Además, se ha evaluado la presencia de perfiles de genes metabólicos en aislados pertenecientes a secuencias tipo (ST) vinculadas con campilobacteriosis en personas. En el estudio de perfiles metabólicos se ha visto que el gen -glutamil transpeptidasa (ggt), implicado en la expresión del enzima que metaboliza la glutamina, se ha asociado significativamente con C. jejuni ST-45. Además se han identificado en aislados de C. jejuni ST-45 otros genes implicados en el metabolismo de aminoácidos tales como ansB(s), fucP y dmsA, llegándose a identificar cinco perfiles de potencial metabólico diferente. El análisis de polimorfismo genético pone de manifiesto la asociación entre determinados factores de colonización y el ST, además de evidenciar las diferentes combinaciones (en cuanto a genes metabólicos se refiere) existentes en la colección. El estudio de los mecanismos de resistencia a macrólidos en Campylobacter dio lugar a la primera descripción en Europa del gen erm(B), asociado a una isla genómica de multirresistencia. Se ha detectado este mecanismo de resistencia en aislados de pollo y pavo, indicando el análisis genómico una destacada diversidad de estos elementos. Página 22 de 200     Resumen Los resultados sugieren que la presencia del gen erm(B) en Campylobacter tiene su origen en bacterias grampositivas y los alelos identificados en este estudio han sido previamente identificados en bacterias patógenas procedentes principalmente de personas y ganado porcino de Asia y Europa. La disposición de los diferentes genes de resistencia y las secuencias detectadas apuntan a una gran movidlidad de estos elementos genéticos. Por último, se caracterizaron por MLST, un total de 252 Campylobacter aislados de animales de abasto (portadores), personas (casos clínicos) y aguas residuales (pretratamiento), todos ellos obtenidos en España. Se identificaron otros genes de resistencia a antimicrobianos y su posible asociación con islas genómicas de multirresistencia en aislados de C. jejuni y C. coli. Se identificaron aislados multirresistentes (resistentes a tres o más clases de antimicrobianos) en muestras de animales, personas y aguas residuales. En 18 aislados de Campylobacter se identificaron diferentes islas genómicas de multirresistencia, lo que muestra una agrupación de los genes de resistencia a antimicrobianos en una misma secuencia de ADN. Las islas genómicas de multirresistencia se han identificado en aislados procedentes de animales, personas y aguas residuales, sugiriéndose que estas secuencias genéticas son potenciales vehículos de dispersión de genes de resistencia a antimicrobianos. Página 23 de 200     SUMMARY Página 24 de 200   Página 25 de 200     Summary Bacteria of the genus Campylobacter, mainly C. jejuni and C. coli, represent the most frequent cause of gastroenteritis of alimentary origin worldwide. These microorganisms colonize the digestive tract of birds and mammals. The main route of infection for humans is through the consumption of contaminated poultry meat. The infection produced by Campylobacter is usually self-limiting but can occasionally produce complications that require antimicrobial treatment. Erythromycin is the main treatment of choice. Resistance to erythromycin in Campylobacter has been related to mutations in genes or ribosomal proteins, efflux pumps and more recently the presence of the erm(B) gene. This gene was originally identified in Campylobacter isolates from China and in all cases was located in genomic islands of multiresistance. The genomic islands identified in Campylobacter carry genes of resistance to different antimicrobials, which limits the therapeutic options. In the present doctoral thesis, we characterized a collection of C. jejuni and C. coli isolates from food animals, humans and wastewater, with the aim to characterize them by MLST and identify antibiotic resistance genes and their association with multiresistance genomic islands. In addition, the metabolic profiles of isolates belonging to sequences types (STs) related with human campylobacteriosis were evaluated. Regarding the polymorphism detected at genomic level, including virulence genes and metabolic profiles, the characterization of isolates showed that the gamma- glutamyltranspeptidase (ggt) gene, responsible for the expression of the enzyme that metabolizes glutamine, was significantly associated with ST-45 of C. jejuni. In addition, other genes involved in the metabolism of amino acids such as ansB(s), fucP and dmsA were differentially detected in isolates of C. jejuni ST-45, revealing the presence of five different metabolic profiles. The analysis of gene polymorphism showed an association between certain factors of colonization and certain STs, besides evidencing the different combinations of metabolic genes. The study of macrolide resistance mechanisms in Campylobacter resulted in the first description in Europe of the erm(B) gene, associated with a genomic island of multiresistance in Campylobacter isolates. This mechanism of resistance was detected in C. coli isolates from broiler and turkey, with the genomic analysis indicating the diversity of these elements. The results suggest that the presence of the erm(B) gene in Campylobacter has its origin in grampositive bacteria and that the Página 26 de 200   Summary alleles identified in this study have been previously detected in pathogenic bacteria mainly from pigs and people in Asia and Europe. The arrangement of the different resistance genes and the sequences detected, point out to a wide mobility of these genetic elements. Finally, other antibiotic resistance genes and their possible association with genomic multirresistance islands in C. jejuni and C. coli isolates were identified. Multiresistant isolates (resistant to three or more classes of antibiotics) were detected in animal, human and wastewater samples. In 18 Campylobacter isolates different genomic islands of multiresistance were identified, indicating the clustering of antibiotic resistance genes in the same DNA sequence. This study reveals that these genetic elements from Campylobacter are potential dispersion vehicles of antibiotic resistance genes. Página 27 de 200   INTRODUCCIÓN Página 28 de 200         Página 29 de 200   Introducción 3.1 Campylobacter Una zoonosis, del griego -zoo (animal) y -nosos (enfermedad), se define como cualquier enfermedad que puede transmitirse comúnmente entre animales y personas (1). El género Campylobacter es el agente zoonósico que mayor número de gastroenteritis de transmisión alimentaria produce en personas anualmente en la Unión Europea (UE) (2). La infección producida por bacterias del género Campylobacter se denomina campilobacteriosis y se debe principalmente a las especies C. jejuni (aproximadamente un 90%) y C. coli (alrededor del 10%) (3). El último informe de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (European Food Safety Agency, EFSA) sobre agentes zoonósicos indica que se han producido 229.213 casos de campilobacteriosis en personas en Europa en el año 2015 (Figura 1) (4). Campylobacteriosis Salmonellosis Yersiniosis E. coli productor de verotoxinas Listeriosis Tularemia Equinococosis Fiebre Q Brucelosis Tuberculosis causada por M. bovis 229.213 94.625 7.202 5.901 2.206 1.079 872 833 437 170 0 50000 100000 150000 200000 250000 Figura 1. Número de casos notificados de zoonosis en personas confirmados en la UE en 2015. Gráfico adaptado de (4). 3.1.1 Antecedentes históricos La historia del género Campylobacter se remonta a finales del siglo XIX. Theodor Escherich observó por primera vez bacterias de Campylobacter en 1886 (5), aunque no fue hasta 1913 cuando McFadyean y Stockman lo aislaron de tejido fetal de abortos ovinos (6). La identificación de esta bacteria en abortos de animales continuó siendo descrita y años más tarde se le dio el nombre de Vibrio fetus (7). Página 30 de 200 Introducción En la década de los 50 se describen dos nuevas especies de este microorganismo, Vibrio jejuni y Vibrio coli, aisladas a partir de muestras diarreicas de bovino y porcino respectivamente (5). A pesar de su semejanza morfológica, en 1963 los científicos Sebald y Beron del Instituto Pasteur encontraron que presentaban diferencias bioquímicas con el agente del cólera y separaron el género Campylobacter del género Vibrio (8). El primer brote de campilobacteriosis descrito en personas se produce en 1942 en presos del centro penitenciario de Illinois por consumo de leche contaminada (9). En la década de los 70, Campylobacter fue reconocido oficialmente como patógeno entérico para el hombre describiéndose casos por todo el mundo (5). 3.1.2 Características generales El género Campylobacter junto con los géneros Arcobacter, Sulfurospirillum y Thioturbo forman la familia Campylobacteraceae, perteneciente al orden Campylobacterales, clase Epsilonproteobacteria (10). Dentro de Campylobacter, del griego -kampylos (curva) y -baktron (bastón), se incluyen microorganismos gramnegativos, no formadores de esporas y de pequeño tamaño (0,2-0,8 m de grosor y 0,5-5 m de longitud). Son bacterias móviles debido a la presencia de uno (monotrico) o dos flagelos polares (anfítricos) (Figura 2) y la motilidad de la bacteria se produce a modo de sacacorchos o tirabuzón. Generalmente son oxidasa positivos, con excepción de Campylobacter gracilis (11). Cuando interaccionan dos o más bacterias adquieren la forma de “S” o “V” y a altas concentraciones de oxígeno puede adquirir forma cocoide o entrar en estado de células viables no cultivables (12). La temperatura óptima de crecimiento de las especies de Campylobacter oscila entre 37 y 42ºC. Existen actualmente 36 especies (www.bacterio.net), de las cuáles C. jejuni, C. coli, Campylobacter lari y Campylobacter upsaliensis son las conocidas como especies termófilas debido a que su temperatura de crecimiento óptima son 42ºC. Además, las especies termófilas son las que más se asocian con casos de infecciones en personas (C. jejuni y en menor medida C. coli) (11). Las bacterias del género Campylobacter requieren una atmósfera microaerófila (85% N2, 3-5% CO2 y 5-10% O2), aunque la tolerancia al oxígeno puede variar de unas especies a otras (11). A pesar de las características de crecimiento y su reducida habilidad de multiplicarse fuera de su hospedador y en alimentos durante el Página 31 de 200 http:www.bacterio.net   Introducción procesado y conservación, es considerada una de las bacterias más ubicuas de la cadena alimentaria (13). Figura 2. Fisión binaria de Campylobacter. Imagen de microscopía electrónica de transmisión (MET) cedida para esta tesis doctoral por Dª Mary Parker, del Instituto de Investigación Alimentaria de Norwich, Reino Unido. Con el objetivo de reducir el daño que produce el oxígeno sobre estas bacterias, los medios selectivos empleados en el laboratorio para el cultivo de Campylobacter contienen uno o más neutralizadores tales como sangre, hierro ferroso, etc. y agentes selectivos, particularmente antimicrobianos (14). Según cual sea la naturaleza de la muestra, las células de Campylobacter potencialmente dañadas pueden verse afectadas por el efecto inhibitorio de los agentes selectivos. En algunos protocolos es necesario utilizar un paso de enriquecimiento de la muestra con el objetivo de mantener un equilibrio entre la inhibición de microorganismos competidores y la recuperación específica de Campylobacter (15). 3.1.3 Genoma Una colaboración entre la Escuela de Higiene y Medicina Tropical de Londres y el Instituto Sanger permitió, en el año 2.000, secuenciar por primera vez el genoma de Campylobacter. La definición de genoma engloba toda la información genética de un organismo, por lo que se refiere tanto al cromosoma como a los plásmidos, si los hubiera. La cepa secuenciada, C. jejuni NCTC11168, presentó un cromosoma circular de 1.461.481 pares de bases, un porcentaje de guanina-citosina del 30,6% y 1.654 posibles proteínas. Además se identificaron regiones hipervariables asociadas Página 32 de 200 Introducción con proteínas de membrana que podrían tener un papel crucial en la supervivencia de la bacteria (16). Actualmente, el Centro Nacional para la Información Biotecnológica de los Estados Unidos (The National Center for Biotechnology Information, NCBI) posee 1.085 genomas de C. jejuni y 817 de C. coli. Basándonos en el total de genomas completos presentes en el NCBI (último acceso 19/06/2017), se muestran las características genómicas de C. jejuni y C. coli (Tabla 1). Tabla 1. Valores promedio de características genómicas de C. jejuni y C. coli. Datos analizados según los genomas completos presentes en el NCBI (último acceso 19/06/2017). C. jejuni C. coli Tamaño del genoma (Mb) 160 181,6 Guanina-Citosina (%) 30,3 31,2 Número de genes 1.762 1.902 Número de proteínas 1.633 1.781 En relación a los plásmidos, en Campylobacter se conocen tres tipos: pVIR, pTET y plásmidos crípticos. El plásmido pVIR contiene genes del sistema de secreción tipo IV, el cual está involucrado en la exportación de ADN, conjugación bacteriana y secreción de proteínas (17, 18). El plásmido pTET contiene genes de resistencia a antimicrobianos (tetraciclina principalmente) y genes del sistema de secreción tipo IV, aunque en éste caso sólo se relaciona con procesos de conjugación bacteriana (19). Por último, los plásmidos crípticos son aquellos que no contribuyen al fenotipo de la bacteria ya que sólo poseen genes de replicación (20). Desde la secuenciación del primer genoma bacteriano, el número de genomas disponibles ha aumentado considerablemente (21). Con el objetivo de almacenar y analizar datos de genomas bacterianos se ha creado la base de datos BIGSdb (Bacterial Isolate Genome Sequence Database) (22). Página 33 de 200   Introducción 3.1.4 Metabolismo El proceso de adquisición de nutrientes por parte de Campylobacter es lo suficientemente flexible como para permitir la supervivencia en el medio ambiente (heces, agua o alimentos) (23). Sin embargo, las bacterias del género Campylobacter no tienen la capacidad de utilizar los azúcares como fuente de carbono debido a que carecen del enzima clave de la glicólisis, la fosfofructoquinasa (16). Como sustrato nutricional utilizan aminoácidos y son capaces de metabolizar serina, prolina, aspartato y ácido glutámico (24-29). Sin embargo, no todas las cepas de Campylobacter pueden metabolizar glutamina o asparagina, por lo que los aislados que porten genes que les permitan metabolizar estos aminoácidos presentan cierta ventaja de colonización (27). En cuanto a la capacidad de metabolizar aminoácidos, no hay grandes diferencias entre C. jejuni y C. coli excepto en el uso del ácido aspártico, ya que un estudio ha puesto de manifiesto que el 20% de los aislados de C. coli no tienen la capacidad de metabolizar este aminoácido (30). El metabolismo del amioácido glutamina está limitado a los aislados de Campylobacter que porten el gen gamma glutamil transpeptidasa (ggt). La proteína que expresa el gen ggt es un enzima transmembrana, presente tanto en procariotas como eucariotas, e involucrada en el ciclo del gamma glutamilo (31). Este ciclo bioquímico da lugar a la síntesis y degradación de glutatión resultando en un sistema de transporte de aminoácidos a través de la membrana celular (32). El enzima GGT al reaccionar sobre la glutamina produce una molecula, el glutamato, capaz de entrar a la bacteria a través del transportador Peb1 (33). GGT es un enzima clave en la colonización de bacterias como Helicobacter pylori o Neisseria meningitidis, por participar en la síntesis de novo de aminoácidos esenciales permitiendo la supervivencia del microorganismo (34-36). En el caso de Campylobacter, aunque parece que la presencia del gen ggt no afecta a la colonización inicial en pollos, si se ha visto que favorece la persistencia de la bacteria en el intestino (25). Respecto a la asparagina, la mayoría de los aislados de Campylobacter poseen un gen (ansB) encargado de expresar el enzima que metaboliza este aminoácido (33). Por tanto Campylobacter podría metabolizar la asparagina pero carece de transportador de este aminoácido transmembrana, ya que el enzima ansB se localiza en el citoplasma (27). Sin embargo, ciertos aislados de Campylobacter poseen una secuencia adicional (40 pares de bases ó pb) en el gen ansB que codifica un péptido señal que le permite situarse en la zona periplásmica. Así, los aislados que posean Página 34 de 200 Introducción proteínas ansB localizadas en el periplasma (ansBs) pueden utilizar asparagina ya que el producto de esta reacción (aspartato) puede pasar al interior de la bacteria a través del complejo Peb1 (27, 37). Estudios en ratones infectados experimentalmente con Campylobacter mostraron como aislados de C. jejuni carentes de ansB periplásmico muestran un defecto significativo de la colonización hepática (27). Otro gen presente sólo en algunos aislados de Campylobacter y que interviene en su metabolismo es fucP. Como ya se ha mencionado, Campylobacter no puede metabolizar pentosas o hexosas como la glucosa, fructosa o la galactosa ni disacáridos como la lactosa o la maltosa entre otros (38, 39). Sin embargo los aislados que porten el gen fucP tienen la capacidad de obtener energía a partir de L- fucosa (40, 41). La vía catabólica de la fucosa en aislados de Campylobacter no está del todo clara pero se cree que genera piruvato y lactato (27). Al final, el metabolismo de los aminoácidos glutamina y asparagina o del monosacárido fucosa, hace que se vean favorecidas las reacciones bioquímicas que den lugar a piruvato, oxalacetato y a partir de éstos fosfoenolpiruvato (42). A partir del fosfoenolpiruvato, Campylobacter puede sintetizar glucosa a través de la ruta gluconeogénica ya que posee todos los enzimas necesarios (16). En cuanto a la cadena respiratoria, Campylobacter utiliza una gran variedad de aceptores y donadores de electrones tales como fumarato, nitrato, trimetilamina-N- óxido reductasa, DMSO y sulfito (43, 44). Determinados aislados de Campylobacter poseen genes relacionados con funciones respiratorias, como el gen dmsA, que pueden mejorar su capacidad de colonización del tracto digestivo de animales o personas (45). El gen dmsA codifica una subunidad de la trimetilamina-N-óxido reductasa y, junto con el gen de colonización ggt, está presente con mayor frecuencia en aislados de personas y pollos (46, 47). En esta tesis doctoral se ha evaluado la presencia de genes metabólicos en aislados ampliamente distribuídos en el medio ambiente y relacionados con campilobacteriosis humanas. 3.2 Epidemiología La principal fuente de infección por Campylobacter en personas es la carne de pollo, pero estas bacterias pueden encontrarse en gran variedad de aves y mamíferos ya que colonizan de forma asintomática el tracto digestivo de estos hospedadores (48). Página 35 de 200   Introducción Además, y a pesar de las restricciones metabólicas que presentan, se han identificado aislados de Campylobacter en ambientes acuáticos, los cuales pueden actuar como reservorios y focos de infección (49). Así, Campylobacter pone de manifiesto la necesidad de dar un enfoque de “una sola salud” a nuestro estudio, comparando los aislados procedentes del hombre, animales y el medio ambiente (concepto “one health”) (50). La campilobacteriosis suele presentarse en forma de casos aislados aunque en ocasiones pueden producirse brotes epidémicos (51). El Centro Europeo de Control y Prevención de Enfermedades (European Center for Disease Control and Prevention, ECDC) define brote como dos o más casos en que el inicio de la enfermedad está estrechamente vinculado en el tiempo y en el espacio, donde se sospecha o evidencia de una fuente común de infección, con o sin apoyo microbiológico (52). Casi el 10% de los brotes de origen bacteriano que tuvieron lugar en Europa en el 2015 se produjeron por Campylobacter, siendo el segundo agente bacteriano mayoritario después de Salmonella (4). 3.2.1 Caracterización En lo que respecta a la caracterización genética de Campylobacter, uno de los métodos de tipificación más usados en la actualidad es el MLST (Multilocus Sequence Typing) (3, 53, 54). Otras técnicas de tipificación usadas en esta bacteria son el PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) basada en el uso de enzimas de restricción y flaA (flaA-SVR, short variable región) técnica fundamentada en la secuenciación del gen de la flagelina (55). Otro método de comparación genómica es la identificación de polimorfismos de nucleótido único (Single Nucleotide Plymorphism, SNP) (56). La técnica de MLST es la que se ha utilizado como método de tipificación en esta tesis doctoral. Está basada en la secuenciación de una región interna de siete genes conservados (asp, glnA, gltA, glyA, pgm, uncA y tkt) que permite la obtención de un perfil alélico o secuencia tipo (Sequence Type, ST) (57). Cada alelo corresponde con un número asignado en base a la comparación con secuencias de estos siete genes presentes en una base de datos pública denominada PubMLST (http://pubmlst.org/campylobacter/). Página 36 de 200 http://pubmlst.org/campylobacter Introducción Se han descrito entre 300 y 600 variantes alélicas de cada uno de los siete genes, formando más de 5.500 combinaciones o STs (3). Los aislados de Campylobacter que compartan cuatro o más alelos de los siete, están comprendidos dentro del mismo complejo clonal (Clonal Complex, CC); los aislados que pertenecen al mismo CC comparten un ancestro común y a menudo presentan propiedades fenotípicas iguales (58). Los diferentes CCs que forman la estructura poblacional de C. jejuni y C. coli se muestran en el apartado 3.2.2: Estructura poblacional. Un análisis alternativo para investigar la base genética de diversas bacterias como Campylobacter ha sido el estudio denominado gen-por-gen (3). Esta aproximación sigue el mismo procedimiento que el MLST pero en lugar de utilizar sólo siete genes, compara todo el genoma. Se compara cada gen de un aislado con toda la diversidad conocida de ese locus y se le asigna un valor según el alelo que representa. Este método puede usarse para analizar filogenias entre aislados altamente divergentes, por ejemplo los de diferentes especies dentro del mismo género (59, 60). El análisis de MLST basado en la secuencia completa del genoma (whole genome MLST) permite analizar simultáneamente cientos de genomas y se ha implementado en varios géneros bacterianos, entre los que se incluye Campylobacter (54). Estos estudios permiten conocer las características genéticas de aislados de Campylobacter pertenecientes a una población concreta. Comparaciones entre los diferentes aislados establecen las bases para analizar posibles transferencias genéticas y mecanismos de adaptación al hospedador. 3.2.2 Estructura poblacional Las especies C. jejuni y C. coli comparten alrededor del 85% de su genoma y aparentemente habitan el mismo nicho ecológico, el tracto gastrointestinal de mamíferos y aves. Sin embargo, su estructura poblacional es muy diferente. ya que C. jejuni presenta una gran número de CCs mientras que C. coli es menos diverso y está organizado en tres clados (Figura 3) (3). Un clado, del griego -clados (rama), es como se denomina en biología al conjunto de unidades de un árbol filogenético que poseen un antepasado común (61). Ciertos genotipos de Campylobacter se asocian con animales de granja e infecciones en personas, mientras que otros están asociados con el medio ambiente y animales salvajes (62, 63). Se ha estimado que un 80% de los CCs asociados con infecciones en personas han sido también identificados en muestras de pollo (64, 65). En el caso Página 37 de 200   Introducción de C. jejuni, el CC-21 es uno de los más representados y se asocia frecuentemente con casos de enfermedad humana así como con una amplia gama de animales (66, 67). Por otro lado, determinados CCs de C. jejuni están asociados con el hospedador, como son CC-61 y CC-257 en bovino y pollos respectivamente (68). En el caso de C. coli, el CC-828 representa el genotipo mayoritario de esta especie y se identifica en muestras de personas, animales y medio ambiente (3). Los principales CCs de Campylobacter identificados en personas y animales de abasto en cada continente se muestran en la Tabla 2. C. coli C. jejuni Figura 3. Árbol filogenético de 192 genomas de Campylobacter. Se muestran los tres clados de C. coli (clado 1: rojo, clado 2: amarillo y clado 3: verde). La barra de escala indica el número estimado de sustituciones. Figura tomada del artículo (60). Página 38 de 200 In tr od uc ci ón T ab la 2 . R ep re se nt ac ió n d e lo s ci nc o C C s m a yo rit ar io s de C . j ej u ni y C . c ol i e n pe rs o na s, p ol lo s, g a na d o po rc in o y bo vi no d e ca d a co nt in e nt e. Lo s da to s de A m ér ic a co rr es p on d en a A m ér ic a de l N or te . F ue nt e: B ac te ri a l I so la te G en o m e S eq u en ce D at ab as e ( B IG S db ). C o n ti n e n te O ri g e n C C s (% ) P er so na s (n = 98 ) C C -8 28 ( 27 ) C C -3 62 ( 14 ) C C -3 53 ( 11 ) C C -4 60 ( 7) C C -2 2 (7 ) Á fr ic a P ol lo s (n = 70 ) C C -8 28 ( 30 ) C C -3 53 ( 20 ) C C -4 60 ( 14 ) C C -3 54 ( 10 ) C C -5 74 ( 6) B ov in o (n = 11 ) C C -8 28 ( 55 ) C C -4 60 ( 27 ) C C -2 52 ( 9) C C -6 58 ( 9) P er so na s (n = 93 0 ) C C -2 1 (2 6) C C -4 5 (1 1) C C -3 53 ( 10 ) C C -4 8 (7 ) C C -8 28 ( 7) P ol lo s (n = 72 9) C C -8 28 ( 34 ) C C -4 5 (1 3) C C -6 07 ( 13 ) C C -3 53 ( 12 ) C C -2 1 (1 0) A m ér ic a P or ci no ( n= 35 9) C C -8 28 ( 98 ) C C -2 1 (2 ) B ov in o (n = 60 5) C C -2 1 (2 6) C C -8 28 ( 25 ) C C -4 2 (2 0) C C -6 1 (1 1) C C -4 03 ( 5) P er so na s (n = 74 1 ) C C -2 1 (1 3) C C -5 2 (1 1) C C -3 54 ( 10 ) C C -3 53 ( 9) C C -8 28 ( 9) P ol lo s (n = 59 1) C C -2 1 (1 8) C C -3 53 ( 15 ) C C -8 28 ( 12 ) C C -4 5 (1 0) C C -3 54 ( 8) A si a P or ci no ( n= 88 ) C C -8 28 ( 85 ) C C -2 1 (8 ) C C -4 8 (2 ) C C -4 03 ( 2) B ov in o (n = 11 4) C C -8 28 ( 23 ) C C -2 1 (1 8) C C -4 2 (1 1) C C -6 07 ( 8) C C -3 53 ( 5) P er so na s (n = 13 .7 00 ) C C -2 1 (2 7) C C -2 57 ( 9) C C -8 28 ( 9) C C -4 8 (8 ) C C - 45 ( 7) P ol lo s (n = 4. 47 6) C C -8 28 ( 26 ) C C -2 1 (1 6) C C -4 5 (1 2) C C -2 57 ( 7) C C -6 61 ( 4) E ur op a P or ci no ( n= 58 8) C C -8 28 ( 93 ) C C -4 03 ( 6) B ov in o (n = 1. 12 8) C C -2 1 (3 0) C C -6 1 (2 2) C C -4 2 (1 2) C C -4 8 (1 0) C C -4 5 (5 ) P er so na s (n = 1. 6 89 ) C C -2 1 (2 6) C C -4 8 (2 2) C C -4 5 (1 6) C C -6 1 (7 ) C C -4 2 (5 ) P ol lo s (n = 1. 71 6) C C -4 5 (3 0) C C -2 1 (2 3) C C -4 8 (1 7) C C -3 54 ( 10 ) C C -8 28 ( 6) O ce an ía P or ci no ( n= 10 ) C C -8 28 ( 40 ) C C -4 8 (4 0) C C -2 1 (1 0) C C -2 57 ( 10 ) B ov in o (n = 31 8) C C -2 1 (3 9) C C -6 1 (1 7) C C -4 2 (1 5) C C -4 03 ( 7) C C -4 8 (6 ) C C s: C om pl ej os c lo na le s; n : n úm er o de a is la do s de C am py lo ba ct er C C s co rr es po nd ie nt es a C . c ol i s e m ue st ra n en fo rm at o n eg rit a. P ág in a 39 d e 20 0   Introducción 3.2.3 Principales hospedadores Las especies C. jejuni y C. coli están ampliamente distribuidas en la naturaleza, colonizando el tracto digestivo de aves y mamíferos, tanto salvajes como domésticos (50). Las aves de corral, como pollos o pavos, son el portador más común de Campylobacter spp., aunque Campylobacter también coloniza otros animales domésticos como el ganado bovino o porcino (48, 69, 70). En términos generales, los animales no desarrollan la enfermedad pero estos microorganismos contaminan alimentos de origen animal tales como carne o leche (71). La principal fuente de campilobacteriosis humana es el consumo de carne de pollo cruda o poco cocinada y según datos de la EFSA, el 46,7% de las muestras de carne fresca de broiler analizadas en la UE fueron positivas a Campylobacter en 2015 (4, 72). La frecuencia de detección de Campylobacter en ganado bovino varía significativamente pero se le atribuyen alrededor del 19% de los casos de campilobacteriosis en personas (73). La frecuencia de detección de estos microorganismos en porcino es más alta que en bovino aunque el impacto sobre la infección en humanos es mucho menor, alrededor del 2% de los casos de campilobacteriosis son atribuidas al consumo de carne de cerdo (57). También se han aislado especies de Campylobacter en ovejas, cabras y animales de compañía como perros y gatos (74, 75). Aves acuáticas, buitres y jabalís son ejemplos de animales salvajes en los que se ha aislado Campylobacter, aunque la importancia de estos animales como reservorio de infección es aparentemente limitada (76-79). En cuanto a C. jejuni y C. coli, la proporción de cada especie difiere según el hospedador. En muestras cecales de pollos o pavos, aunque no hay grandes diferencias entre el porcentaje de aislamiento de ambas especies, C. jejuni es mayoritario (80, 81). Lo mismo ocurre en muestras de bovino, aunque en este caso la diferencia entre ambas especies es mayor ya que el porcentaje de aislados de C. jejuni supera el 75% respecto a C. coli (82-84). La gran diferencia se encuentra en ganado porcino ya que se encuentran aislados de C. coli en casi el 100% de las muestras positivas (85, 86). Diferentes factores como el método de aislamiento, la edad de los animales o el tamaño del rebaño pueden ser responsables de las diferencias en las tasas de aislamiento de especies termófilas de Campylobacter (80, 87). La diferente proporción de aislados de Campylobacter termófilos se ve reflejada en la carne de pollo, donde C. jejuni prevalece sobre C. coli (88-90). Sin Página 40 de 200 Introducción embargo, datos sobre carne de pavo contaminada muestran un mayor porcentaje de aislados de C. coli respecto a C. jejuni (89). Además de carne contaminada, hay otros alimentos identificados como fuente de campilobacteriosis en humanos como la leche, frutas y verduras, principalmente debido a su contaminación ocasional por contacto con animales, agua no tratada o por contaminación cruzada con otros alimentos (91-95). El agua contaminada es otra fuente de infección de Campylobacter en personas o animales domésticos (96). La contaminación del agua por Campylobacter se debe normalmente a residuos fecales de aves salvajes o domésticos, al vertido de derivados de la producción animal y al vertido de aguas de depuradora (49, 97). El agua junto con la carne de pollo contaminada, es uno de los principales causantes de brotes producidos por Campylobacter (51). En los últimos treinta años se identificaron en Inglaterra y Gales 25 brotes de campilobacteriosis asociados con sistemas públicos de agua potable, poniendo de manifiesto la importancia de un tratamiento apropiado de las aguas (98). 3.3 Aspectos clínicos de la infección en personas La Organización Mundial de la Salud (OMS) considera a Campylobacter como la bacteria más común causante de gastroenteritis de transmisión alimentaria en todo el mundo (2). La campilobacteriosis tiene una marcada estacionalidad, las infecciones aumentan en los meses más cálidos del año y los grupos de personas en los que la incidencia suele ser superior son jóvenes y adultos de entre 15-44 años y niños menores de 4 años (23, 50, 99). En países en vías de desarrollo la enfermedad es considerada esencialmente pediátrica, afectando principalmente a niños menores de 2 años; es común el aislamiento de la bacteria en niños asintomáticos (100). La dosis infectiva es relativamente baja; un estudio ha mostrado como dosis de 800 UFC (Unidades Formadoras de Colonias) de C. jejuni dieron lugar a diarrea en un grupo de voluntarios (101). El cuadro clínico en las personas infectadas con C. jejuni o C. coli tiene como síntomas principales diarrea, fiebre, dolor abdominal y pérdida de peso (102). Se trata de una enfermedad auto-limitante y la sintomatología suele prolongarse durante 5-6 días (103). Aunque la gastroenteritis es el principal síntoma de la infección ocasionada por Campylobacter, estos organismos han sido asociados con otras patologías del tracto digestivo como enfermedad inflamatoria del Página 41 de 200   Introducción intestino, celiaquía y colecistitis (104-106). Como manifestaciones clínicas no asociadas con el sistema digestivo, el síndrome de Guillain-Barré es una de las manifestaciones clínicas más relacionadas con la infección por Campylobacter además del síndrome de Miller Fisher, bacteriemia y septicemia, pericarditis, meningitis, artritis reactiva y abortos (102, 107-112). El tratamiento frente a una campilobacteriosis suele basarse en la reposición de líquidos y electrolitos. Ocasionalmente la infección evoluciona negativamente y puede ser necesario un tratamiento antimicrobiano (51). La ciprofloxacina suele utilizarse como tratamiento empírico frente a gastroenteritis, aunque en el caso de campilobacteriosis los macrólidos y especialmente la eritromicina se consideran el tratamiento de elección (113). 3.4 Resistencia a antimicrobianos La resistencia a los antimicrobianos es la capacidad que tienen los microrganismos de evitar el efecto de los antimicrobianos. Hay microorganismos que producen antimicrobianos (antibióticos), lo que les permite limitar el crecimiento de sus competidores sin que ellos se vean afectados por poseer un mecanismo de resistencia (114). Hasta el descubrimiento de los antimicrobianos, se produjeron infecciones de origen bacteriano devastadoras para el hombre en Egipto, Grecia y China (115). Con el descubrimiento de la penicilina por Alexander Fleming en 1928, nace la era antibiótica en la que surge la medicina moderna y los antimicrobianos salvan millones de vidas (116). Pocos años más tarde, en la década de los 50, surgen los primeros aislados de Staphylococcus resistentes a penicilina por lo que los avances de la década anterior se vieron amenazados (117). La comunidad científica, consciente del problema que suponían las bacterias resistentes a antimicrobianos, pone en marcha líneas de investigación destinadas a la identificación de nuevos antimicrobianos. El periodo entre los años 1940 y 1980 es conocido como la era dorada de los antibióticos debido al descubrimiento de la mayoría de los antimicrobianos que hoy conocemos (118). Desde el descubrimiento del primer microorganismo resistente a penicilina, no ha cesado la identificación de nuevos mecanismos de resistencia, incluso bacterias resistentes a varias familias de antimicrobianos (119). Recientemente la OMS ha publicado una lista con las doce familias bacterianas que más amenazan la salud humana debido a sus resistencias a antimicrobianos Página 42 de 200 Introducción (120). La lista de la OMS tiene como objetivo orientar y fomentar la investigación y el desarrollo de nuevos fármacos y en base a esta necesidad ha dividido la lista en tres niveles según la prioridad: crítico, elevado y medio. De acuerdo con esta clasificación, el género Campylobacter es considerado como un patógeno de prioridad elevada debido a sus resistencias a antimicrobianos. En los siguientes apartados se presenta una revisión de las familias de antimicrobianos utilizadas en la caracterización de los aislados de Campylobacter de esta tesis doctoral. Se han seleccionado quinolonas, tetraciclinas, macrólidos y aminoglucósidos por ser las familias que forman parte del panel de antimicrobianos utilizado por la EFSA en la vigilancia de las resistencias a antimicrobianos en agentes zoonósicos (121). Se resume en cada caso los mecanismos que dan lugar a resistencia a cada familia de antimicrobianos. Todos los mecanismos de resistencia a antimicrobianos se pueden agrupar en tres categorías: (I) reducción del antimicrobiano en el interior de la bacteria, (II) inactivación del antimicrobiano y (III) modificación de la diana sobre la que actúa el antimicrobiano (122). En el primero de los casos, la bacteria controla la cantidad de antimicrobiano que hay en su interior impidiendo su entrada (porinas) o expulsándolo al exterior (bombas de eflujo) (123). La segunda categoría de mecanismos de resistencia se basa en la presencia de genes capaces de expresar enzimas que degradan o modifican el antimicrobiano (124). Por último está la estrategia de modificar la diana molecular de actuación del antimicrobiano, por mutaciones o metilaciones, impidiendo así que éste actúe sobre la bacteria (125). Una bacteria que posea resistencia a antimicrobianos mediada por mutaciones específicas, transmitirá ese mecanismo de resistencia a sus células hijas por transferencia vertical. En cambio, los mecanismos de resistencia ubicados en elementos genéticos móviles tipo plásmidos, transposones e integrones se pueden transferir además de forma horizontal de una bacteria a las células que comparten el mismo nicho ecológico (126). En el caso de Campylobacter, se han identificado islas genómicas, capaces de transferirse de una bacteria a otra, que portan genes de resistencia a diferentes antimicrobianos (127). Según cómo se realice la transferencia del mecanismo de resistencia, el poder de diseminación es diferente. Por transferencia vertical el mecanismo de resistencia está limitado a una línea genética pero por transferencia horizontal el alcance de la resistencia puede llegar a ser mucho mayor (128). Por todo esto, parte de los Página 43 de 200   Introducción trabajos de esta tesis doctoral se han enfocado en el estudio de genes de resistencia a antimicrobianos, con el objetivo de conocer su presencia en Campylobacter aislados de animales, personas y aguas residuales. 3.4.1 Quinolonas Las quinolonas son un grupo de agentes quimioterapéuticos sintéticos, es decir, no son producidos por microorganismos, a diferencia de los antibióticos. Estos antimicrobianos son sustancias bactericidas utilizadas en todo el mundo pero el incremento de resistencias en diferentes especies bacterianas hace que su uso se vea amenazado (129). Se dice que son bactericidas porque producen la lisis y muerte de la bacteria mientras que los antimicrobianos bacteriostáticos, son aquellos que inhiben el crecimiento bacteriano (130). Actúan sobre los enzimas ADN girasa y topoisomerasa IV inhibiendo la síntesis de ADN y produciendo la muerte de la bacteria (131). El primer miembro descrito de este grupo fue el ácido nalidíxico y su uso en clínica se centró en infecciones del tracto urinario causadas por bacterias entéricas (132). En la década de los 80 se desarrolló la segunda generación de estos fármacos y se les denominó fluoroquinolonas por la introducción de un flúor en su estructura molecular. De las fluoroquinolonas cabe destacar la ciprofloxacina por ser la primera de su clase en mostrar actividad significativa fuera del tracto urinario (133). En Campylobacter, el principal mecanismo de resistencia a estos antimicrobianos es la mutación C257T en el gen gyrA, la cual produce un cambio de treonina por isoleucina en la posición 86 del enzima girasa (134). Otro mecanismo de resistencia a quinolonas, tetraciclina y macrólidos, son las bombas de eflujo cmeABC, como veremos más adelante. Este sistema de bombas cmeABC constituyen un sistema de proteínas transmembrana capaz de expulsar el antibiótico al exterior de la bacteria y se produce un efecto sinérgico sobre la resistencia a quinolonas con la mutación del gen gyrA (135). El porcentaje de aislados de Campylobacter resistentes a ciprofloxacina es elevado, y España es el segundo país con mayores niveles de resistencia en C. jejuni aislados de personas, seguido de Portugal (121). Según los último datos de la EFSA sobre resistencia a antimicrobianos en agentes zoonósicos, el porcentaje de C. jejuni resistentes a ciprofloxacina aislados de personas es del 90,4% y en pollo de engorde 69,8% (121, 136). En el caso de C. coli, el porcentaje de aislados Página 44 de 200 Introducción resistentes a este antibiótico en personas es del 70,6%, en pollos es del 74,3% y en ganado porcino (cerdo de engorde) del 62,1% (121, 136). 3.4.2 Tetraciclinas Las tetraciclinas son antimicrobianos bacteriostáticos de amplio espectro pero su utilidad se está viendo reducida debido a que los genes de resistencia a este fármaco son los más frecuentemente encontrados en la naturaleza (137, 138). Las tetraciclinas se unen a los ribosomas impidiendo la correcta síntesis de proteínas y afectando a la viabilidad de la bacteria (139). La resistencia a tetraciclina en C. jejuni y C. coli está codificada por el gen tet(O) y este suele localizarse en plásmidos aunque también puede encontrarse insertado en el cromosoma (140, 141). El gen tet(O) codifica una proteína que protege el ribosoma e impide la unión con el antibiótico. La presencia de este gen en plásmidos conjugativos explicaría su alta distribución en todo el mundo (142). Como se ha mencionado en el apartado anterior, la bomba de eflujo CmeABC también se considera un mecanismo de resistencia a tetraciclina en Campylobacter (143). Según datos de la EFSA el porcentaje de C. jejuni resistentes a tetraciclina aislados de personas es del 44,6% en Europa y del 78,5% en España, mientras que en aislados de pollos de engorde el porcentaje de resistencia es 54,4% (121, 136). En el caso de C. coli aislados de personas el porcentaje de resistencia a tetraciclina es del 68,8% según los datos europeos y 92,7% en España (121). Los datos europeos sobre resistencia en C. coli aislados de ganado porcino (cerdo de engorde) son del 66,6% y de 59,6% en pollos (121, 136). 3.4.3 Macrólidos Los macrólidos son antimicrobianos bacteriostáticos que actúan contra bacterias grampositivas, cocos gramnegativos y bacterias intracelulares. Los macrólidos se unen al ARN ribosomal 23S, componente principal de la subunidad 50S, e inhiben la síntesis de proteínas bacterianas (144). A continuación nos referiremos al primer macrólido identificado, la eritromicina, por ser el tratamiento de elección frente a campilobacteriosis en personas. Los bacilos gramnegativos son generalmente resistentes debido a la impermeabilidad de su membrana celular, excepto Bordetella pertussis, Campylobacter, Chlamydia, Helicobacter y Legionella (145). Página 45 de 200   Introducción La resistencia a eritromicina en Campylobacter se produce como resultado de modificar la unión del antibiótico al ribosoma, bien por mutaciones o metilaciones específicas, o por la expulsión del antibiótico al exterior de la bacteria. El principal mecanismo de resistencia a eritromicina en Campylobacter es la mutación A2075G del gen 23S (146). También las mutaciones A2074C, A2074G y A2074T producen altos niveles de resistencia a eritromicina pero su frecuencia de detección es mucho menor debido a que afectan a la viabilidad de la bacteria (147). Campylobacter posee tres copias del gen 23S y generalmente los aislados resistentes presentan la mutación en los tres genes, aunque la coexistencia con alelos no mutados no produce diferentes grados de sensibilidad (141, 148). El segundo mecanismo de resistencia es el producido por el gen erm(B), que codifica una metilasa, que hace a la bacteria que lo porta resistente a macrólidos, lincosamidas y estreptograminas de tipo B (fenotipo MLSb) (149). El gen erm(B) fue identificado por primera vez en Campylobacter en el año 2014 en China y se ha detectado en cepas aisladas de pollos, cerdos, patos y personas (127, 150). En Europa este gen se ha identificado en C. coli aislados de pollos y de pavos de engorde de España y ambos estudios forman parte de esta tesis doctoral (151). El gen erm(B) puede transferirse horizontalmente entre C. coli y C. jejuni y se asocia en todos los casos con islas genómicas que portan además otros genes de resistencia a antimicrobianos (127, 150, 151). Más adelante, en el apartado 3.4.5., se describen en detalle las islas genómicas de multirresistencia identificadas en Campylobacter. Tanto las mutaciones del gen 23S como el gen erm(B) son capaces de producir altos niveles de resistencia a macrólidos, con valores de Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) superiores a 512 mg/L (151). El tercer mecanismo de resistencia a eritromicina en Campylobacter se debe a cambios (mutaciones, inserciones y deleciones) en las proteínas ribosomales L4 y L22 pero la relación entre este mecanismo y el fenotipo es dudosa (152). Hay aislados con bajo nivel de resistencia a eritromicina (8-16 mg/L) con modificaciones en L4 y/o L22 y bomba de eflujo CmeABC como únicos mecanismos de resistencia a eritromicina. En estos aislados la inactivación de las bombas de eflujo produce susceptibilidad a la eritromicina, lo que sugiere la participación de cmeABC en la resistencia intrínseca de Campylobacter (153, 154). El porcentaje medio de aislados de C. jejuni resistentes a eritromicina en Europa durante el año 2015 fue mucho menor que los aislados de C. coli (1,5% y 14,4% Página 46 de 200 Introducción respectivamente). La distribución de C. coli resistentes a eritromicina en Europa se muestra en la Figura 4. El porcentaje de aislados multirresistentes, aquellos que muestran resistencia a tres o más clases de antimicrobianos, son superiores en C. coli que en C. jejuni (121). La multirresistencia (generalmente a ciprofloxacina, eritromicina y tetraciclina) se ha observado principalmente en aislados de C. coli procedentes de España y de Portugal. En aislados de Campylobacter de pollos de engorde de la UE, el porcentaje de resistencia a eritromicina también es superior en C. coli (14,5%) que en C. jejuni (5,9%). Esta tendencia se mantiene en cepas aisladas de pavos de engorde (43,3% C. coli y 2,5% en C. jejuni) mientras que en aislados de cerdos de engorde solo se dispone de datos de C. coli donde el porcentaje es 21,6%, debido a que prácticamente no se aísla C. jejuni de este hospedador (85, 86). Figura 4. Distribución espacial de C. coli resistentes a eritromicina aislados de personas en 2015 (121). 3.4.4 Aminoglucósidos Tras su descubrimiento, los aminoglucósidos constituyeron el tratamiento de elección frente a tuberculosis, como fue el caso de la estreptomicina, además de infecciones producidas por bacterias aerobias gramnegativas y algunas Página 47 de 200   Introducción grampositivas (155). Cuando se usan frente a grampositivos suelen combinarse con otros antimicrobianos, como los -lactámicos, ya que tienen un efecto sinérgico (156). Los aminoglucósidos son sustancias bactericidas que se unen a los ribosomas bacterianos alterando la correcta síntesis de proteínas (157). La resistencia a aminoglucósidos está mediada por enzimas que modifican el antibiótico, mediante fosforilación, adenilación o acetilación, reduciendo su afinidad por el ribosoma (158). El primer gen de resistencia a aminoglucósidos identificado en aislados de Campylobacter spp. fue el gen de resistencia a kanamicina aph(3´)- III, en el año 1985 (159). En la Tabla 3 se muestran los genes de resistencia a aminoglucósidos identificados en C. jejuni y C. coli cronológicamente. Estos genes pueden codificar tres tipos de enzimas: fosfotransferasas (APH), acetiltransferasas (AAC) y nucleotidil/adenililtransferasas (ANT) (160). Debido a que Campylobacter es considerado un patógeno de nivel crítico debido a las resistencias a antimicrobianos que presenta (161), se están desarrollando estudios in vitro para buscar nuevos tratamientos frente a la campilobacteriosis y la gentamicina podría ser una alternativa viable. Desafortunadamente y como muestra la Tabla 3, ya se han identificado genes de resistencia a gentamicina en aislados de Campylobacter, como es el gen aph-2. Tabla 3. Genes de resistencia a aminoglucósidos identificados en C. jejuni o C. coli cronológicamente. Gen Resistencia Año Referencia aphA-3 Kanamicina 1988 (162) aphA-7 Kanamicina 1989 (163) ant(6) ó aadE ant(3) ó aadA Estreptomicina Estreptomicina y Espectinomicina 1990 (164) sat-4 Estreptotricina 1994 (165) aadE-sat4-aphA3 Estreptotricina y Kanamicina 2004 (166) ant(9) ó aad9 Espectinomicina aph-2 aac Gentamicina Kanamicina 2005 (167) aacA-aphD Kanamicina y Gentamicina ant-like Estreptomicina 2016 (160) Página 48 de 200 Introducción Existen diferentes variantes del gen aph-2 y cada una de ellas parece estar asociada a un hospedador específico excepto el gen aph-2 Ig. La variante aph-2 Ig fue identificada por primera vez en el año 2008, en carne de pollo y en el 2009 se identificó en personas; dos años más tarde la presencia de este gen en C. coli aislados tanto de personas como de animales había aumentado considerablemente (127, 168, 169). Por otro lado las variantes aph-2 If y aph-2 Ih sólo han sido identificadas en C. jejuni aislados de personas (170). De los antimicrobianos testados por la EFSA en la evaluación de antibiorresistencias en Campylobacter, la gentamicina es el que ofrece menor porcentaje de resistencia, con un 0,8% de resistencia en C. jejuni y 1,7% en C. coli (en España 2,2% y 9,1% respectivamente) aislados de personas en la UE. Los datos de resistencia a este antibiótico en Campylobacter aislados de animales también se mantienen muy bajos (0,9%) y bajos (2,6%) en C. jejuni y C. coli aislados de pollos de engorde, respectivamente. Los datos de resistencia en C. coli aislados de cerdos muestran un 3,6% de resistencia a gentamicina (10,6% en España) (121, 136). 3.4.5 Islas genómicas de multirresistencia En Campylobacter, los genes de resistencia de transferencia horizontal se habían identificado en plásmidos, integrones y transposones. Estos genes, principalmente genes de resistencia a aminoglucósidos, parecen estar asociados en un mismo segmento de ADN (166, 167). En el año 1999 se aisló de un caso de diarrea de un soldado estadunidense trasladado de Tailandia, una cepa de C. jejuni multirresistente. El aislado de C. jejuni portaba un plásmido con nueve genes de resistencia a aminoglucósidos y pudo ser movilizado a una cepa de E. coli donde expresó resistencia a múltiples antimicrobianos del grupo de los aminoglucósidos (167). En el año 2012 se identificaron en 26 C. coli aislados de pollos en China, múltiples genes de resistencia a aminoglucósidos. Estos genes se encontraban asociados a una secuencia de ADN o isla genómica insertada en el cromosoma y con capacidad de movilizarse a C. jejuni por transformación natural (171). También en China en el año 2014 se identificó en un C. coli aislado de pollos una isla genómica con genes de resistencia a aminoglucósidos y a macrólidos, concretamente el gen de resistencia a eritromicina erm(B) (127). A la resistencia que ofrecía la isla genómica Página 49 de 200   Introducción frente a los aminoglucósidos había que sumarle la resistencia a macrólidos, lincosamidas y estreptograminas del grupo B, fenotipo que produce el gen erm(B) (145). El gen de resistencia a eritromicina erm(B) se ha identificado en C. coli aislados de animales y personas y en un C. jejuni aislado de pollos, todos ellos procedentes de China (150, 172). Casi desde el descubrimiento de los primeros mecanismos de resistencia a antimicrobianos en Campylobacter se empezaron a proponer hipótesis sobre el flujo de genes desde bacterias grampositivas a gramnegativas (159, 173). Las islas genómicas, son un potencial vehículo de transferencia de genes de resistencia a antimicrobianos desde microorganismos grampositivos a gramnegativos (174). Para Campylobacter, las islas genómicas suponen una vía de captación y dispersión de genes de resistencia a diferentes antimicrobianos, incluso la eritromicina. En parte de los trabajos de esta tesis doctoral se han analizado aislados de Campylobacter con sensibilidad reducida a eritromicina, identificando la presencia del gen erm(B) y las islas genómicas que lo contienen. Estudiar las líneas genéticas y los perfiles de colonización presentes en Campylobacter, así como los mecanismos de resistencia a antimicrobianos, permite estudiar la diseminación de estos microorganismos en la naturaleza y el riesgo que suponen para la salud pública. Página 50 de 200 Página 51 de 200   OBJETIVOS Página 52 de 200 Página 53 de 200   Objetivos En el presente trabajo de investigación se han caracterizado aislados de Campylobacter termófilos, según su genoma y sus genes de resistencia a antimicrobianos, procedentes de i) animales de abasto (pollos, pavos, ganado porcino y ganado bovino), ii) pacientes con campilobacteriosis y iii) aguas residuales. 4.1 Objetivo I: Estudio de la diversidad genética de C. jejuni. La tipificación de aislados de C. jejuni por MLST ha permitido caracterizar la estructura genética de su población y ratificar que presenta más diversidad genética que C. coli. En diferentes países de la UE se ha observado una distribución similar de STs en personas y animales, siendo el CC-21 y el CC-45 los más frecuentemente aislados. A pesar de esto, los mecanismos de colonización de Campylobacter siguen siendo poco conocidos. La diversidad de perfiles metabólicos podría aportar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de colonización y la estructura poblacional de Campylobacter. Así, como parte del objetivo I se ha desarrollado el siguiente estudio:  Primer estudio de investigación: Polimorfismo genómico, genes de virulencia y perfiles metabólicos en Campylobacter jejuni aislados de pollos. 4.2 Objetivo II: Detección del gen de resistencia a eritromicina erm(B) en Campylobacter aislados de animales de abasto y aguas residuales. La descripción del gen erm(B), nuevo mecanismo de resistencia identificado en aislados de Campylobacter procedentes de China, y su asociación con islas genómicas de multirresistencia dio lugar a su búsqueda en aislados de una colección con baja sensibilidad a eritromicina procedente de España. Como parte del objetivo 2 se han desarrollado los siguientes estudios:  Segundo estudio de investigación: Primera descripción del gen erm(B) en Campylobacter coli aislado en Europa.  Tercer estudio de investigación: Identificación del gen de resistencia a eritromicina erm(B) en Campylobacter coli aislados de pavos y estudio de las posibles especies bacterianas involucradas en su transferencia horizontal. Página 54 de 200 Objetivos 4.3 Objetivo III: Caracterización genómica y genes de resistencia a antimicrobianos en Campylobacter aislados de personas, animales de abasto y aguas residuales. Este estudio surge del interés de comparar la diversidad genética existente en islas genómicas de multirresistencia de aislados de personas, animales de abasto y aguas residuales, para ver posibles relaciones entre los aislados, sus mecanismos de transferencia de resistencia (islas genómicas) y los propios determinantes de resistencia. Así, dentro del presente objetivo se ha desarrollado el siguiente estudio:  Cuarto estudio de investigación: Caracterización genómica y resistoma de C. jejuni y C. coli aislados de personas, animales y aguas residuales. Página 55 de 200 OBJECTIVES Página 56 de 200                 Página 57 de 200   Objectives The main aim of this thesis was the characterization of thermophilic Campylobacter isolates from i) food animals (poultry, turkey, swine and cattle), ii) humans and iii) wastewater, according to their genomes and antimicrobial resistance genes. This thesis is structured according to the objectives described below: 5.1 Objective I: Study of the genetic diversity of C. jejuni. The comparison of C. jejuni isolates by MLST has allowed the characterization of the genetic structure of its population and has evidenced the presence of a higher genetic diversity respect to C. coli. A similar distribution of STs in humans and animals has been observed in different EU countries, with CC-21 and CC-45 being the most frequently isolated. In spite of this, the mechanisms of colonization remain little known. The diversity of metabolic gene profiles could provide new insights into the mechanisms of colonization and the population structure of Campylobacter. Thus, as part of objective I, the following study was carried out:  First research study: Genomic polymorphism, virulence genes and metabolic profiles of Campylobacter jejuni ST-45 isolated from poultry. 5.2 Objective II: Detection of the erythromycin resistance gene erm(B) in Campylobacter isolates from food animals and wastewater. The erm(B) gene was recently described as a new mechanism of erythromycin resistance in Campylobacter isolates from China and it was associated with multirresistance genomic islands. The possible impact of this discovery on the treatment of the campylobacteriosis, led us to evaluate its presence in isolates with low sensitivity to erythromycin from Spain. As part of objective II the following studies were performed:  Second research study: Description of an erm(B)-carrying Campylobacter coli isolate in Europe.  Third research study: Erythromycin resistance gene erm(B) in Campylobacter isolates from turkeys and identification of possible bacterial species involved in its horizontal transmission. Página 58 de 200 Objectives 5.3 Objective III: Genomic characterization and antimicrobial resistance genes in Campylobacter isolates from humans, food animals and wastewater. This study arises from the interest of comparing the genetic diversity in multiresistance genomic islands present in Campylobacter isolates from humans, food animals and wastewater, in order to identify possible relations between the isolates, their transfer mechanisms of resistance (genomic islands) and the determinants of resistance. Thus, within this objective the following study was carried out:  Fourth research study: Genomic characterization and resistance of C. jejuni and C. coli isolated from humans, animals and wastewater. Página 59 de 200 TRABAJOS DE INVESTIGACIÓN Página 60 de 200 Página 61 de 200     Trabajos de investigación 6.1 Polimorfismo genómico, genes de virulencia y perfiles metabólicos de Campylobacter jejuni ST-45 aislados de pollos. Campylobacter utiliza aminoácidos como sustrato nutricional debido a su incapacidad para metabolizar azúcares (24, 175). Estos microorganismos pueden metabolizar aminoácidos como serina, prolina, aspartato y glutamato pero sólo algunos aislados tienen la capacidad de metabolizar glutamina, asparagina y/o monosacáridos como L-fucosa (27, 28, 41, 176, 177). Los aislados de C. jejuni que porten los genes que les permitan metabolizar estas moléculas tendrán ventajas frente al resto por lo que son consideradas factores potenciales de colonización (27, 47). En diferentes países de la UE se ha observado una distribución de STs C. jejuni en personas y animales similar a la de nuestro estudio, siendo el ST-21, el ST-45 y el ST-257 los más frecuentemente aislados (178, 179). La presencia de estos factores de colonización podría explicar por qué algunos STs están más distribuidos que otros y ayudaría por tanto a comprender la estructura poblacional de Campylobacter. El enzima -glutamil transpeptidasa (GGT) es considerado uno de los principales factores de virulencia en otros patógenos intestinales como Helicobacter pylori (180, 181). Para identificar aislados capaces de metabolizar el aminoácido glutamina, se identificó el gen -glutamil transpeptidasa (ggt) por PCR (reacción en cadena de la polimerasa o Polymerase Chain Reaction) en una colección de C. jejuni (n=176) aislados de pollos. Los aislados de C. jejuni incluidos en este estudio se obtuvieron a partir de muestras de pollos recogidas entre 2007-2012 en diferentes mataderos del Reino Unido. Los aislados seleccionados pertenecen a los CCs ampliamente diseminados (64, 68), ST-21 (n=23), ST-45 (n=68) y ST-257 (n=85). Tras la identificación del gen ggt, se seleccionaron los aislados de C. jejuni positivos al gen y se confirmó su expresión por técnicas bioquímicas. El gen ggt se identificó en 37 aislados de C. jejuni de los cuáles 36 pertenecieron al ST-45 (97%) y 1 al ST-257 (3%). Las pruebas bioquímicas confirmaron que todos los C. jejuni ggt+ expresaron el enzima GGT (37/37; 100%). Con el objetivo de conocer la diversidad de perfiles metabólicos presentes y hacer estudios filogenéticos, se secuenció el genoma completo de un grupo de aislados de C. jejuni ST-45, positivos y negativos al gen ggt, seleccionados aleatoriamente en Página 62 de 200     Trabajos de investigación los dos grupos (8 ggt+ y 6 ggt-). Se identificaron los genes de colonización ansB(s) (12/14; 86%), fucP (1/14; 7%) y dmsA (11/14; 79%). De acuerdo con el estudio filogenético, basado en los genomas completos, y los genes de colonización, los 14 aislados de C. jejuni ST-45 se clasificaron en siete grupos pertenecientes a cinco perfiles de genes metabólicos diferentes. Este estudio pone de manifiesto la mayor frecuencia de detección de ggt en C. jejuni ST-45 (p<0,05), en comparación con la presencia de ggt en otros STs de nuestro estudio. Los resultados indican también que existe una gran diversidad de C. jejuni (7 grupos en 14 aislados). La asociación entre ciertos factores de colonización y el complejo clonal podría explicar la capacidad que tienen ciertos aislados para colonizar nuevos nichos. Página 63 de 200   Trabajos de investigación Genomic polymorphism, virulence genes and metabolic profiles in Campylobacter jejuni ST-45 isolated from poultry. Summary Campylobacter spp. is the major cause of foodborne diarrhea for humans. Campylobacteriosis is mainly caused by strains of C. jejuni species, followed by C. coli. The main reservoir of Campylobacter isolates is the intestinal mucosa of mammals and birds, among which poultry is a main food stock. Since Campylobacter spp. cannot metabolize sugars, C is assimilated from amino acids like glutamine, although it can only be used by strains carrying the γ­ glutamyltranspepetidase (ggt) gene that is therefore considered a colonization factor. This study was carried out in a collection of C. jejuni strains (n=176) isolated from poultry that belonged to three different sequence types (ST-45, n=68; ST-21, n=23 and ST-257, n=85). Among them, the ggt gene was identified in 37 isolates of C. jejuni ST-45 more one ST-257. With the aim of analyse metabolic differences between ggt+ and ggt- isolates, fourteen ST-45 C. jejuni isolates, eight carrying the ggt gene and six lacking it, were selected for genome- scale analysis including SNP typing and detection of colonization factorsansB(s), fucP and dmsA. Thus, ST-45 C. jejuni strains were classified in seven groups, including five metabolic profiles, with the potential to predict their impact on public health. Introduction Campylobacteriosis is known as the most common gastro-enteric infection in humans, with 229,213 confirmed cases in the EU in 2015 (1). The UK is the second country with the highest number of confirmed cases of campylobacteriosis in 2015, being the first Germany, with an annual cost of more than £550 million to the economy (1, 2). The intestinal microbiota of poultry is the primary reservoir for Campylobacter spp. (1), although it is also present in pigs, sheep and cattle, including food products of animal origin such as milk (3-5) and, due to the presence of faecal matter in the environment, it has also been found in untreated surface water (6). Campylobacter jejuni is the main species associated with human infections in industrialized countries (7). The enteritis caused by C. jejuni is usually a self-limiting illness, but in some cases the infection can lead to a neurological complication known as Guillain-Barre Syndrome (7). Página 64 de 200 Trabajos de investigación Multi-locus sequence typing (MLST) is currently the reference method to characterize the Campylobacter population structure (26). The MLST data from different European countries have shown that strains from clonal complexes (CC) CC-45 and CC-21 are commonly isolated from animal, human and environmental samples (8, 9). On the other hand, it is known that other CCs in C.jejuni are host- associated as CC-61 and CC-257 from cattle and poultry, respectively (10), although C. jejuni CC-257 is also present in humans and swine (www.pubmlst.org/campylobacter). C. jejuni cannot metabolize most sugars because of the absence of the glycolytic enzyme phosphofructokinase, therefore amino acids are used as preferred substrates for bacterial nutrition (11, 12). C. jejuni is able to metabolize amino acids as serine, proline, aspartate and glutamic acid but the ability to metabolize glutamine or asparagineonly occurs in some strains (13-16). Glutamine is the main amino acid in the human blood serum, playing important roles for C and N transport and metabolism among tissues (17), although it only can be used by C. jejuni strains carrying the γ-glutamyltranspepetidase (ggt) gene (13). Presence of the ggt gene has been associated to bloody diarrhea and, therefore, it is considered as a marker of virulence for Campylobacter strains (18). The enzyme γ-glutamyl transpeptidase (GGT) is considered one of the main virulence factors in other intestinal pathogens such as Helicobacter pylori. The metabolic potential of Campylobacter isolates could be also expanded by the expression of other colonization genes as ansB, encoding a secreted L- asparaginase; fucP, a fucose permease; cj1585c and cjj81176-1367/1371, with coding sequences for an oxidoreductase and a serine protease, respectively (13, 19). Prevalence of the ggt gene varies between 8 and 30% according to the clonal complex (CC) composition of the analyzed C. jejuni collections (20, 21). In this study, presence and expression of the GGT enzyme in C. jejuni isolates from poultry was evaluated, including its association to STs linked to infection in humans (ST-45, ST-21 and ST-257). Finally, whole genome sequencing in a selection of ggt+ and ggt- C. jejuni isolates allowed the typing of strains into seven gropus, including five different metabolic profiles. Página 65 de 200 www.pubmlst.org/campylobacter   Trabajos de investigación Material and methods Bacterial strains, culture and DNA extractions. The Campylobacter isolates included in this study (n=176) were obtained from poultry samples collected in a dispersed range of slaughterhouses across the United Kingdom between 2007 and 2012. The isolates were selected according to the ST: ST-45 (n=68), ST-21 (n=23) and ST-257 (n=85). C. jejuni isolates were stored at -80°C in 1% protease peptone and 10% glycerol broth. Strains were recovered by subculturing on SBAA (7% sheep blood agar; 0.01% Actidione) and isolated on selective solid medium, modified charcoal cefoperazone deoxycholate agar (mCCDA). Incubation was performed at 41.5 ± 1 °C under microaerobic conditions. The DNA extraction was made by taking growth (10 µl loopful) into 700 µl distilled water and vortexing to give a suspension. Following, it was placed in a boiling water bath for 10 min, centrifuged for 3 min at 13000 rpm and the supernatant was stored at 4°C. Detection of ggt gene and activity of the enzyme GGT. The detection of the ggt gene was performed by PCR with the following primers ggtFW (5’-GAGTGCTATGCTTGATCGCT-3’) and ggtRV (5’- TAGGTGGCGACATGGAAATG-3’) as previously described (22). Cycling conditions were one cycle of 94 °C for 5 min, followed by 30 cycles of 94 °C for 30 s, 58 °C for 30 s and 72 °C for 30 s and finally one cycle of 72 °C for 5 min. All ggt + C. jejuni isolates were further analysed for the expression of ggt gene. The first step was mixing fresh growth (one 10 µl loopful) from a non-selective agar plate into 100 µL of reagent containing 50 mM Tris (pH 8.25), 1.5 mM L- glutamyl-carboxyl-3 nitro-4 anilide and 50 mM glycylglycine. After 1h at 37ºC, samples from strains expressing GGT activity turned out yellow (18). Whole genome sequencing, phylogeny and gene factor analysis. In order to evaluate de presence of other colonization factors associated or not with ggt gene, 14 DNA extractions from ST-45 C. jejuni isolates (8 ggt+ and 6 ggt-) were sequenced (Table 1). The presence of the following colonization genes has been studied: ansB(s) (L-asparaginase with secretion signal sequence), fucP (fucose permease), dmsA (subunit of the putative tripartite anaerobic dimethyl sulfoxide oxidoreductase), cjj81176-1367/1371 (serine protease) and cj1585c (oxidoreductase) (19). The DNA extraction was carried out by GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Life Technologies, USA). Genomic Página 66 de 200 Trabajos de investigación DNA was fragmented and tagged for multiplexing with Nextera XT DNA Sample Preparations Kits (Illumina) and sequenced using the Illumina GAII platform with 150 bp paired-end reads. Raw data were aligned to the C. jejuni strain 4031 which belongs to ST-45. The quality of the paired-end samples were asserted using FASTQC software (Babraham Institute). Replicated paired-end reads were filtered out leaving a single copy. The remaining reads were trimmed (Trimmomatic, The USADEL Lab) on the right end using a sliding window of length 10bp and a quality threshold of 20. The minimum allowed length after trimming was 35bp. The paired-end reads were mapped onto the C. jejuni strain 4031 (ST-45) using SMALT (Sanger Institute). The resulting SAM files were transformed into BAM format and sorted. Then, variant calling format (VCF) files were generated (SAMtools). The SNPs against the reference strain were extracted from the VCF files applying 3 quality control criteria; firstly, the quality of the variant call has to be greater than 150 (from a range of 0-222), secondly the number of forward and reverse reads in agreement with the variant call has to be greater than 2 in both cases and lastly, the proportions of forward and reverse reads in agreement with the variant call has to be more than 80% of the total forward and reverse reads covering the site. The SNPs for all the strains were combined in a matrix were the rows and columns correspond to the informative sites and strains respectively. Rows containing a non-call for any of the strains were filtered out. Additionally, informative sites within a repeated region in the genome were also filtered out. The phylogeny was generated using the maximum parsimony algorithm implemented using MEGA software. A total of 500 bootstrap iterations were carried out. All the nodes showed more than 95% bootstrap agreement. To detect the presence or absence of the gene factors a FASTA file with the sequence of genes ggt, fucP, dmsA, ansB, Cj1585c and cjj81176-1367/1371 as used as reference. Following the same procedure as described above, the raw data sets were mapped against the reference. A gene was considered present if the percentage of the gene covered was greater than 99% with a mean coverage value greater 20. Página 67 de 200   Trabajos de investigación Results Prevalence of ggt gene. The presence of the ggt gene was investigated in a collection of 176 C. jejuni isolates from poultry belonging to three differente STs. Thirty-seven C. jejuni isolates were positive to ggt gene of which thirty-six belonged to the ST-45 and only one to ST-257. The presence of ggt gene in the ST-45 C. jejuni was 52.94% (36/68). In the ST-257 strains, only one was ggt positive (1/85; 1.17%) and the gene was not detected in any of the ST-21 strains. All the C. jejuni isolates carrying the ggt gene showed a positive reaction in the GGT activity test, with exception of three negative controls randomly selected. Distribution of colonization genes and phylogenetic analysis. In order to make a phylogenetic analysis and to know the distribution of other colonization factors, 14 C. jejuni ST-45 isolates were selected (8 C. jejuni ggt+ and 6 C. jejuni ggt-) to sequence their entire genome (Table 1). The colonization genes identified in the C. jejuni isolates were ansB(s), fucP and dmsA. The genetic markers cjj81176-1367/1371 (serine protease) and cj1585c (oxidoreductase) have not been identified in any of the C. jejuni ST-45 isolates of this study. The presence of the ansB(s) gene was 86% (12/14), fucP 7% (1/14) and dmsA 79% (11/14). The isolates W07_001 and S08_014 lacking the gene ansB(s) were also negative to the rest of the genetic markers except for dmsA gene. The fucP gene was only present in the isolate S08_012 (11). Página 68 de 200 Trabajos de investigación Table 1. Epidemiological data from the C. jejuni strains used Strain Season Year Slaughterhouse ggt W08_015 Winter 2008 F + S08_012 Summer 2008 I + S09_020 Summer 2009 M + S08_009 Summer 2008 C + W09_016 Winter 2009 D + S09_018 Summer 2009 G + S08_010 Summer 2008 C + S07_004 Summer 2007 L + S09_019 Summer 2009 B - S08_011 Summer 2009 E - S07_002 Summer 2007 E - P08_008 Spring 2008 F - W07_001 Winter 2008 F - S08_014 Summer 2008 C - According to the SNPs and colonization factors identified C. jejuni isolates ST-45 could be divided in seven groups belonging to five metabolic profiles. The phylogeny for the 14 strains sequenced and the associated colonization factors are shown in Figure 1. C. jejuni strains associated to factors ggt (III-VII), ansB (I and III-VII), fucP (VI) and dmsA (I-V) form lineages well differentiated from the rest by a considerable number of SNPs (Figure 1). Página 69 de 200   Trabajos de investigación Figure 1. Phylogenetic tree of C. jejuni ST-45 ggt+/ggt- and metabolic profiles. White boxes represent the different metabolic profiles identified (I-VII) according to the genetic markers identified. A black circle represents the genetic markers present in each C. jejuni isolate. NC: Strain used as reference. Scale bar represent the number of nucleotide substitutions per site. The genetic markers cjj81176-1367/1371 (serine protease) and cj1585c (oxidoreductase) have not been included because they have been absent in all isolates analysed. Discussion Research on the colonization factors of Campylobacter, as those analysed in this study, is relevant to understand the ecology of this organism. Indeed, some colonization factors as ggt are related with the sequence type (21, 23). In order to better understand the role of ggt gene in Campylobacter, we evaluated the presence of this genetic marker in a collection of C. jejuni from three STs: ST-21, ST-45 and ST-257. Through genetic characterization by MLST, the animal origin of bacteria producing campylobacteriosis in several countries has been estimated Página 70 de 200 Trabajos de investigación (24-26). The human related C. jejuni ST-21 and ST-45 have been isolated also from raw chicken, several hosts (poultry, ducks and dogs) and water (6, 27-29). Instead, the ST-257 is mainly associated with C. jejuni isolated from poultry (30). There are several factors that can make a lineage able to grow successfully in different hosts as: (i) modify gene expression in different environments, (ii) DNA mutations or (iii) import genes from already adapted strains (31). At the third case, some genetic markers could improve the colonization at different environments or hosts (32). The ggt gene was present in thirty-seven out of one hundred seventy-six C. jejuni isolated from poultry between 2007 and 2009. More than 98% of the isolates were C. jejuni ST-45 while 2.7% (one single isolate) belonged to the ST-257 and any to ST-21. Our results are in line with others where the ggt gene are present in C. jejuni CC-45 but it is lacking in C. jejuni CC-21 or CC-257 (23), confirming the association of ggt gene with the founder of the CC-45. As it has been published, the genetic markers associated with ST-21 are cjj1367, cj1585 and dtlp7. C. jejuni ST-257 is associated with dmsA, ansB(s) and cjj1367 (23). A collection of ST-45 C. jejuni strains, 8 ggt positives and 6 ggt negatives, were selected for WGS in order to evaluate the phylogenetic relationships between ggt and other factors of colonization. Besides gene ggt, three other genetic markers have been identified as colonization factors: ansB(s), fucP and dmsA. Previous studies described the presence of marker genes in different clonal complex, being ggt, ansB(s) and dmsA genes related to CC-45, whereas fucP was found mainly associated to C. jejuni CC-21 isolated from bovine, C. jejuni CC-21 from humans and C. jejuni CC-45 from environmental samples and, to a lesser extent, in isolates from humans (21, 23). Therefore, the finding in our study of fucP in a C. jejuni ST-45 from poultry is a novelty that must be considered in order to better understanding the epidemiology of colonization factors in Campylobacter. The C. jejuni isolates of this study, according to the SNPs and colonization factors identified, have been divided in seven groups (Figure 1). According the ggt gene, three separate phylogenetic groups were detected. One group is composed of C. jejuni ST-45 CC negatives to ggt (I-II) and contains ansB(s) and dmsA as colonization factors. Phylogeny and gene-marker profiling reveals that S09_020 belongs to a second group (III characterized by carrying ansB(s), dmsA and ggt Página 71 de 200   Trabajos de investigación genes. All C. jejuni isolates from the third group carried the ggt gene and different combinations of gene markers: ggt, asnB(s) and dmsA (IV-V), ggt, ansB(s) and fucP (VI) and ggt more ansB(s) (VII). The gene ansB(s) is present in all of the isolates except in the clade II. On the other hand the dmsA gene was present in all C. jejuni apart from the clade VI and VII. Although the sample size of this study might not be large enough to be considered fully representative, the clustering observed suggests that acquisition or loss of gene factors occurred at a unique time during the C. jejuni evolution producing the different metabolic profiles that are currently observed. The findings of this work suggest that ggt gene is common in ST-45 isolates from United Kingdom poultry but not so in ST-21 or ST-257, which highlight the usefulness of the MLST to characterize populations of C. jejuni. In connclusion, the results of this study suggest a great diversity of C. jejuni colonization factors in the sequence type ST-45. Since colonization factors could contribute the ability to colonize biological niches, this study might contribute to a better understand of the ecology of Campylobacter and therefore represents a further step towards controlling its impact on public health. References 1. EFSA, The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2015. EFSA Journal, 2016. 14(12): p. 231. 2. Strachan, N.J. and K.J. Forbes, The growing UK epidemic of human campylobacteriosis. Lancet, 2010. 376(9742): p. 665-7. 3. 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El gen erm(B) es el primer mecanismo de resistencia a macrólidos identificado en Campylobacter con capacidad de transferirse a otras bacterias horizontalmente mediante islas genómicas de multirresistencia (127, 150). Se ha publicado la presencia de este gen en C. coli aislados de personas y animales de abasto así como en C. jejuni de pollos, pero todos los casos procedentes de China (150, 172). Este trabajo se desarrolló con el objetivo de caracterizar la resistencia a macrólidos en aislados de Campylobacter procedentes de España y de identificar la presencia del gen erm(B) en Europa. Para el desarrollo de este estudio se partió de una colección de 88 aislados de Campylobacter procedentes de animales de abasto (pollos: n=29; cerdos: n=34; vacas: n=11) y de aguas residuales (n=14) siendo todos ellos altamente resistentes a eritromicina (MIC > 16 mg/L). Siguiendo la técnica de dilución en agar se aumentó el rango de concentración de eritromicina (0,25 – 1024 mg/L) con el objetivo de medir el nivel de resistencia real de cada aislado. Los aislados con mayor nivel de resistencia (MIC > 512 mg/L) se seleccionaron para detectar la presencia del gen erm(B) así como otros mecanismos de resistencia a eritromicina (mutaciones en el gen 23S, modificaciones en las proteínas ribosomales L4 y L22) y evaluar el efecto inhibitorio de las bombas de eflujo. Para identificar la localización y el entorno genético del gen erm(B), se utilizó la técnica de secuenciación masiva. De los 88 aislados de Campylobacter, 5 revelaron un nivel de resistencia a eritromicina mayor (MIC > 512 mg/L) y todos ellos fueron C. coli procedentes de pollos. Un aislado, concretamente la cepa ZTA09/02204, resultó ser positivo al gen erm(B) y no presentó otros mecanismos de resistencia a eritromicina conocidos. Página 75 de 200       Trabajos de investigación El gen erm(B) identificado en C. coli ZTA09/02204 mostró un 100% de similitud con su ortólogo en otras especies bacterianas como Enterococcus faecium, Clostridium difficile y Streptococcus suis. El gen erm(B) se localizó en el cromosoma, concretamente en una isla genómica de 11.769 pares de bases en la que se encontraban otros genes de resistencia a aminoglucósidos y tetraciclina. Según la organización de los genes y su localización en el cromosoma, parece ser un tipo de isla genómica diferente a las identificadas en Campylobacter de China. El presente trabajo de investigación se muestra tal y como se ha publicado en la revista Journal of Antimicrobial Chemotherapy (151). Página 76 de 200 Trabajos de investigación Description of an erm(B)-carrying Campylobacter coli isolate in Europe C. jejuni and C. coli are the principal cause of foodborne zoonoses in humans. Campylobacteriosis is caused by C. jejuni and C. coli, and the infection is produced by ingesting contaminated food. The main reservoir is the intestinal microbiota of birds, especially poultry. Alhough the treatment for campylobacteriosis is generally oral rehydration therapy; the drugs of choice are macrolides, such as erythromycin (1). Thus, macrolide resistance poses a serious public health threat. Bacteria carrying the erm(B) gene are resistant to macrolides, lincosamides and streptogramin B (MLSB phenotype) via methylation of the 23S rRNA gene (2, 3). The erm(B) gene has been described in highly erythromycin-resistant Campylobacter isolates in China, located in an MDR genomic island (MDRGI). Transference to erythromycin-susceptible C. jejuni by transformation has been observed (2, 3). The aims of our study were to detect erm(B) in erythromycin- resistant isolates of our collection and to compare these findings with the presence of other known mechanisms of erythromycin resistance (target mutations of the 23S rRNA gene and ribosomal proteins L4 and L22, and antibiotic efflux pumps). Of 555 isolates obtained from food animals in Spain during 2008-11, 74 isolates with an erythromycin MIC ≥32 mg/L (broth microdilution by UNE-EN ISO20776- 1) were randomly selected (broiler: n=29; fattening pigs: n=34; young cattle: n=11) (4). Additionally, 14 Campylobacter isolates from urban effluents (MIC ≥32 mg/L) were also selected (5). Isolates were not epidemiologically related. Agar dilution susceptibility testing (CLSI methodology) was performed to increase the antimicrobial range (0.25-1024 mg/L). The assay was carried out using Mueller-Hinton w agar supplemented with erythromycin and 5% lysed horse blood. Isolates with the highest level of resistance (MIC ≥1024 mg/L) were tested to detect the erm(B) gene as well as target mutations in the 23S gene, target modifications in ribosomal proteins L4 and L22 and the effect of PAbN as an efflux pump inhibitor (6-9). WGS (Ion Torrent PGM) was performed to determine the location of the methylase gene erm(B) and its genetic environment. Raw data Página 77 de 200   Trabajos de investigación were aligned to C. coli RM 4661 (NZ_CP007181) using CLC Genomics Workbench 7.5.1. The BLAST application was used to study similarities. Five isolates of 88 revealed a high level of resistance to erythromycin (MIC ≥1024 mg/L), all them C. coli isolated from broilers. Only the C. coli ZTA09/02204 isolate was positive for the erm(B) gene; additional erythromycin-resistance mechanisms were not detected. The C. coli ZTA09/02204 isolate presented resistance to nalidixic acid, ciprofloxacin, tetracycline and streptomycin, and was susceptible to gentamicin (data not shown). The MLSB phenotype could not be confirmed, as lincosamide and streptogramin B were not included in our panel. No effect of PAbN was observed on the MIC for isolate ZTA09/02204, which suggests that the active efflux mediated by CmeABC makes no contribution to the phenotype. Although overexpression of cmeABC could have led to the results, previous studies describe no synergy between methylase erm(B) gene and efflux pumps (10). The erm(B) gene is 738 bp and shows 100% nucleotide identity to erm(B) of Enterococcus faecium e389 (JN899587), Clostridium difficile 200785596 (FN665654) and Streptococcus suis 2-22 (EU047808). When the erm(B) gene from this study is compared with the erm(B) gene described in Campylobacter, the nucleotide identify is 99% (G299A). The erm(B) gene is located in the chromosome of C. coli ZTA09/02204 within a gene cluster with other antimicrobial resistance genes constituting an MDRGI (Figure 1) (2). The MDRGI (GenBank accession no. KT953380) is 11769 bp, and it was inserted in one hypothetical protein (YSS_00750 gene). The average guanine and cytosine content is 38.5%, higher than the guanine and cytosine content in the genome (31.1%). The MDRGI contains 12 ORFs, five of them antibiotic resistance genes (Table S1). The MDRGI of C. coli ZTA09/02204 seems to be a new type, as the organization of genes and its location in the chromosome differ from those in other types (2, 3). Therefore, the MDRGI of this study might be designated type VIII. When the MDRGI C. coli ZTA09/02204 is compared with those already described, its similarity is higher to types V, VI and VII, as they present a complete tet(O) coding regions (2, 3). However, our isolate contains a Página 78 de 200 Trabajos de investigación full-length pnp gene, in contrast to the truncated forms carried by types V to VII (Figure 1). The different structures of the ZTA09/02204 MDRGI and the MDRGI previously published likely reflect a different origin. According to the guanine and cytosine percent content, the MDRGI have been divided into three different regions (Figure 1 and Table S1). Region B had 99% identity with Eggerthella sp. YY918 (AP012211) and Bacteroides uniformis WH207 (AY345595). Regions A and C presented 99% identity with plasmid pN29710-1 from C. coli CVM N29710 (CP004067) (Figure 1), which would suggest a plasmid as the insertion vehicle of the erm(B) gene in the chromosome. Moreover, Eggerthella and B. uniformis belong to the intestinal microbiota (11), so they could coexist with Campylobacter, favouring the DNA exchange. To our knowledge, this is the first description of the methylase gene erm(B) in Campylobacter in Europe. The presence of the erm(B) gene associated with an MDRGI would highlight the potential horizontal transfer of this resistance mechanism. Página 79 de 200   T ra ba jo s de in ve st ig ac ió n F ig u re 1. C om pa ra tiv e g en et ic or ga ni za tio n of th e C . co li Z T A 09 /0 2 20 4 an d pr ev io us ly id e nt ifi ed E g ge rt he lla s p. Y Y 91 8, B . un ifo rm is W H 2 07 , C . c ol i S H -C C D 1 1C 36 5 a nd C . co li C V M N 29 71 0 as p os si bl e or ig in s of th e M D R G I o f t hi s st ud y. T he e rm (B ) g en e is s ho w n in r ed , am in o gl yc os id e re si st a nc e ge ne s ar e sh o w n in y e llo w , th e te tr ac yc lin e re si st an ce g en e te t( O ) is s ho w n in p ur pl e, g en es w ith p re di ct e d fu nc tio ns a re s ho w n in g re en a nd g e ne s en co di ng h yp ot h et ic al p ro te in s ar e sh o w n in w h ite . T he b or de r g en e is s h o w n in b la ck . T he g re y sh ad in g in di ca te s re gi o ns s ha rin g > 98 % D N A i de nt ity . G C , gu an in e a nd c yt os in e co nt e nt . T he s tr uc tu re s ch em e of M D R G I of C . co li S H - C C D 1 1C 36 5 is b as e d on F ig u re 1 in W a ng e t a l ( 2) . T hi s fig u re a p pe ar s in c ol o ur in th e o nl in e ve rs io n of J A C a nd in b la ck a nd w h ite in th e pr in t ve rs io n of J A C . P ág in a 80 d e 20 0 T ra ba jo s de in ve st ig ac ió n T ab le S 1. M ul tid ru g re si st an t ge no m ic is la n d of Z T A 09 /0 22 04 P ág in a 81 d e 20 0   Trabajos de investigación References 1. Ruiz-Palacios GM. The health burden of Campylobacter infection and the impact of antimicrobial resistance: playing chicken. Clin Infect Dis. 2007;44(5):701-3. 2. Wang Y, Zhang M, Deng F, Shen Z, Wu C, Zhang J, et al. Emergence of multidrug-resistant Campylobacter species isolates with a horizontally acquired rRNA methylase. Antimicrob Agents Chemother. 2014;58(9):5405-12. 3. Deng F, Wang Y, Zhang Y, Shen Z. 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Según ha informado la EFSA, el porcentaje de C. coli aislados de pavos y resistentes a eritromicina a alcanzado el 43%, superando considerablemente el porcentaje observado en aislados de pollos, porcino o bovino (121, 183, 184). Este trabajo surge de la necesidad de evaluar la presencia del gen de resistencia a eritromicina erm(B) en Campylobacter aislados de pavos de engorde. Para la realización de este estudio, se partió de una colección de 177 aislados de Campylobacter (133 C. coli y 37 C. jejuni) de pavos procedentes del programa nacional de vigilancia de resistencia (2014-2015). Una vez evaluada la sensibilidad a los seis antimicrobianos del panel definido por la UE se seleccionaron los aislados resistentes a eritromicina (n=85; 81 C. coli y 4 C. jejuni). Mediante PCR se identificaron dos aislados de C. coli portadores del gen erm(B) y se secuenciaron sus genomas completos para analizar el entorno genético del gen erm(B). En ambos casos, el gen erm(B) se localizó en islas genómicas junto con otros genes de resistencia a tetraciclina, espectinomicina, estreptomicina, gentamicina y kanamicina. La comparación entre secuencias de erm(B) identificadas en Europa y las procedentes de China muestra variaciones alélicas. Con el objetivo de analizar las variaciones alélicas y conocer mejor las posibles rutas de transmisión y transferencia horizontal de erm(B), se compararon 12 secuencias de este gen presentes en Campylobacter: tres procedentes de España (pertenecientes a los estudios 2 y 3 de esta tesis doctoral) y nueve procedentes de China. Se identificaron cuatro alelos de erm(B) presentes en Campylobacter y se comparó cada alelo con secuencias idénticas de erm(B) presentes en la base de datos del NCBI. Los resultados sugieren que la presencia del gen erm(B) en Campylobacter tiene su origen en bacterias grampositivas y los alelos identificados Página 83 de 200   Trabajos de investigación en este estudio han sido previamente identificados en bacterias patógenas procedentes principalmente de personas y cerdos de Asia y Europa. La presencia de erm(B) en Campylobacter aislados de pavos añade este hospedador a los animales de abasto implicados en la dispersión de este gen de resistencia a eritromicina. A continuación se muestra el tercer trabajo de esta tesis doctoral siguiendo el mismo formato que se ha enviado para su publicación a la revista Frontiers in Microbiology (enviado el 23 de agosto, 2017). Página 84 de 200 Trabajos de investigación Erythromycin resistance in Campylobacter from turkey: erm(B) gene and possible bacterial species involved in the horizontal transmission of this resistance mechanism. Summary Pathogens in the genus Campylobacter are the most common cause of food-borne bacterial gastro-enteritis. Campylobacteriosis, caused principally by Campylobacter jejuni and C. coli, is transmitted to humans by food of animal origin, especially poultry. As for many pathogens, the trend of susceptibility to antibiotics undergoes an alarming decline in Campylobacter. The mobilization of the erythromycin resistance gene erm(B) compromises erythromycin prescription, the treatment of choice for clinical cases requiring antimicrobial therapy. In this study, resistance to six antimicrobials is evaluated in a collection of 170 Campylobacter isolates (133 C. coli and 37 C. jejuni) from turkeys, a relevant poultry sector where erm(B) had not been previously detected. Erythromycin resistant isolates (n=85; 81 C. coli and 4 C. jejuni) were screened for the presence of the erm(B) gene, and 2 positive C. coli isolates were found and their genomes sequenced. In both isolates the erm(B) gene was clustered with resistance determinants against aminoglycosides plus tetracycline, including aad9, aadE, aph(2")-IIIa, aph(3´)-IIIa and tet(O) genes. Comparative genomic analysis identified identical erm(B) sequences among Campylobacter from turkeys, Streptococcus suis from pigs and Enterococcus faecium and Clostridium difficile from humans, a distribution that is consistent with multiple events of horizontal transfer occurring in distant geographical locations among different bacterial species that colonize distinct hosts and that might be closely surveyed to preserve the effectiveness of erythromycin in antimicrobial therapy. Introduction The World Health Organization (WHO) has recently published a list of bacteria for which new antibiotic therapies are urgently needed, with Campylobacter classified as high priority (1). This is of concern as campylobacteriosis is the most commonly notified bacterial foodborne infection in the European Union (2). The disease is principally caused by Campylobacter jejuni and C. coli following the ingestion of contaminated food and drink, with consumption of poultry meat recognized as a major risk factor (3, 4). Infection can cause extra intestinal pathologies, such as Página 85 de 200   Trabajos de investigación reactive arthritis or Guillain-Barré syndrome (5), but it is usually self-limiting. Treatment of severe infection occasionally requires antimicrobial therapy, often with erythromycin (2) and to a lesser extent with gentamicin, the later used occasionally when infection becomes systemic (6). Although fluoroquinolones were commonly used in the past, the rising of resistance among Campylobacter isolates makes these antibiotics ineffective. Erythromycin inhibits protein synthesis by binding to the ribosome and blocking the exit of the nascent peptide chain (7). Erythromycin resistance in bacterial isolates from animals and humans is associated with the presence of erm genes (8). The most widely distributed erm gene class is erm(B), which encodes an rRNA methylase which produces cross-resistance to macrolides, lincosamides and streptogramins B (MLSB phenotype) (9). The erm(B) encoded enzyme acts on the 23S rRNA gene by methylating an adenine residue that hinders antibiotic binding to the ribosome (8). The erm(B) gene is present in a variety of Gram-positive bacteria, including enterococci, streptococci and staphylococci (10). The potential for interspecies horizontal gene transfer (11) has facilitated the emergence of resistance in multiple species including Gram-negative bacteria of the genera Bacteroides, Shigella, Escherichia, Klebsiella and recently Campylobacter (12-15). Resistance in Campylobacter has been associated with ribosomal mutations, efflux pumps and the erm(B) gene has been identified in isolates from China and Spain (7,15,16). Recent work has reported high-level erythromycin resistance (MIC≥1024 mg/L) in a C. coli isolate carrying erm(B) in a genomic island along with other determinants conferring resistance to aminoglycosides, tetracycline and streptothricin (16). Thus, eight types of erm(B)-carrying genomic islands have been differentiated (15-17), all of which share aminoglycoside resistance genes in addition to other determinants, likely leading to co-selection after genetic mobilization (18). Improve understanding of the distribution of resistance genes within bacterial species in different host niches, and the mobility of these genes between populations, could be crucial for identifying source and sink populations. In the case of Campylobacter, the erm(B) gene has been identified in C. coli isolates from chicken, ducks, swine and humans and from C. jejuni isolated from chicken (15, 17, 19) but other host species may be relevant. Turkeys are among the top ten farmed animals in Europe and the USA with an estimated figure of 323 million birds reared anually (20). While studies have shown that turkeys are an important host species Página 86 de 200 Trabajos de investigación harbouring large numbers of C. jejuni and C. coli, the resistance status of these strains remains unknown. This has lead to the inclusion of this animal species in international surveillance programs to evaluate the levels of antibiotic resistance. In this study we carried out combined molecular microbiology and whole genome sequencing approaches to evaluate the presence of erm(B) and it’s genetic background in Campylobacter isolates obtained from Turkeys sampled in Spain. The comparison with erm(B) sequences from other host species might allow further describe the microevolutionary events associated with the acquisition of this antibiotic resistance gene in Campylobacter. Material and methods Strains and growth conditions Campylobacter isolates were recovered in 2014 (n=170; 133 C. coli and 37 C. jejuni) from turkey samples obtained in the framework of the European Antimicrobial Resistance Surveillance program (DC 652/2013) in Spain (21). Samples were collected at the largest turkey slaughterhouses from Spain located in different regions within the country. Each Campylobacter isolate represented a single farm and they were obtained by culturing pooled faeces from turkeys (10 animals per pool, 1170 individual fecal samples analysed). Each pooled sample was cultured on Campylobacter blood-free selective medium (CCDA) (Oxoid). Inoculated media were incubated at 42ºC for 48 h under microaerobic conditions with a commercial gas-generating system (atmosphere generator system, Oxoid). Suspected colonies were subcultured onto blood agar (BioMérieux) at 37ºC for 48 h. All strains were identified by conventional multiplex PCR of the genus Campylobacter that allows the differentiation between C. coli and C. jejuni with specific primers, as described previously (22). Antimicrobial susceptibility testing Broth microdilution methods were performed to determine the antimicrobial susceptibility of the Campylobacter isolates (Minimum Inhibitory Concentrations or MICs). The following antimicrobials were tested: tetracycline, ciprofloxacin, nalidixic acid, erythromycin, streptomycin and gentamicin. Isolates were grown on blood agar plates (bioMérieux) and incubated for 48 h at 37°C under microaerophilic conditions. From growth cultures (standardized to 0.5 McFarland turbidity) were added 50 μL to 11 mL of cation-adjusted Mueller-Hinton broth (TREK Diagnostics Systems), and supplemented with 600 μL of lysed horse blood prepared in house Página 87 de 200   Trabajos de investigación from defibrinated horse blood (Oxoid). EUCAMP2 microdilution plates (TREK Diagnostics Systems) were inoculated and incubated under microaerophilic conditions for 48 h at 37 °C. C. jejuni strain ATCC 33560 was used as a control for antimicrobial susceptibility test. Following the commission decision 2013/652/UE, the epidemiological cut-offs values considered were those described by EUCAST (23). Campylobacter isolates resistant to erythromycin (MICs: >8 mg/L to C. coli and >4 mg/L to C. jejuni) were selected to evaluate the presence of erm(B) gene. Identification of erm(B) gene and whole-genome sequencing. The RNA methylase gene erm(B) was identified by PCR as described previously (24). Amplicons were detected by gel electrophoresis using 2% agarose gels containing 10 mg/ml SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen) for 40 min at 100 mA. DNA fractions were sequenced and compared using Sanger sequencing and MEGA software (version 5.05) respectively (25, 26). Erm(B)-positive Campylobacter isolates were selected for whole genome sequencing. For DNA extraction, Campylobacter isolates were grown in blood agar plates (48 h at 42 °C under microaerophilic conditions) and DNA was extracted using a QiAmp DNA mini kit (Qiagen). DNA was quantified using a Nanodrop spectrophotometer before sequencing. High-throughput genome sequencing was performed using a benchtop MiSeq sequencer (Illumina), and the short read paired-end data was assembled using the de novo assembly algorithm, SPAdes (27). Genome sequences were archived in the web-accessible Bacterial Isolate Genome Sequence Database: BIGSdb (28), which included functionality for identifying MLST profiles based on the pubMLST database (https://pubmlst.org/campylobacter; accessed May 9, 2017). Allelic diversity has been evaluated using a gene-by-gene approach for genome alignment and its comparison has been developed according to the BLAST algorithm (29). Results Antimicrobial susceptibility testing A total of 170 Campylobacter isolates (133 C. coli and 37 C. jejuni) were tested for susceptibility to six antimicrobials. Antimicrobial resistance profiles (Table 1) and the MIC distribution were recorded (Table S1). The highest proportion of antimicrobial resistance was to tetracycline (168/170; 98.8%) followed by nalidixic acid/ciprofloxacin (164/170; 96.4%), erythromycin (85/170; 50%), streptomycin (82/170; 48.2%) and finally gentamicin (13/170; 7.6%). Considering separately both Página 88 de 200 https://pubmlst.org/campylobacter Trabajos de investigación species, C. coli and C. jejuni, higher prevalence of resistance was observed in C. coli for erythromycin, streptomycin and gentamicin (Fisher´s exact test: p<0.001). Based upon The European Food Safety Authority (EFSA) criteria for quantifying multi-drug resistance (MDR; resistance to at least three classes of antimicrobials tested), seven MDR profiles were recorded for Campylobacter isolates (Table 1) (30). Seventy-nine C. coli isolates (59.4%) and three C. jejuni isolates (8.5%) showed resistance to ciprofloxacin (treatment used against campylobacteriosis before onset of resistance) plus erythromycin (current treatment against this bacteria). Campylobacter isolates resistant to erythromycin (Table 1) were analysed for the presence of RNA methylase gene erm(B). Table 1. Drug resistance profiles found among 170 Campylobacter isolates from turkeys. Resistance C. coli C. jejuni Profile1 No. of Isolates (%) No. of Isolates (%) CTESG 9 (6.76) 0 (0) CTES 46 (34.58) 1 (2.70) CTSG 3 (2.25) 0 (0) CTEG 1 (0.75) 0 (0) CTE 23 (17.29) 2 (5.40) CTS 20 (15.03) 1 (2.70) TES 2 (1.5) 0 (0) CT 29 (21.80) 28 (75.67) TE 0 (0) 1 (2.70) C 0 (0) 1 (2.70) T 0 (0) 2 (5.40) Susceptible 0 (0) 1 (2.70) Total 133 (100.00) 37 (100.00) 1C, ciprofloxacin; T, tetracycline; E, erythromycin; S, streptomycin; G, gentamicin. Página 89 de 200   T ra ba jo s de in ve st ig ac ió n T ab le S 1. M IC d is tr ib ut io n fo r C a m py lo ba ct er is ol te s A n ti m ic ro b ia l S p ec ie s M IC R an g e E C O F F Is o la te s p er M IC ( m g /L ) R es is ta n t A g e n ts (m g /L ) (m g /L )1 0. 12 0. 25 0. 5 1 2 4 8 16 32 64 12 8 > 12 8 Is o la te s (% ) C . c ol i 0. 5- 64 2 1 4 19 10 9 13 3 (1 00 ) T et ra cy cl in e C . j ej un i 1 2 1 3 1 8 13 9 35 ( 95 ) C . c ol i 0. 12 -1 6 0. 5 1 21 42 50 19 13 2 (9 9 ) C ip ro flo xa ci n C . j ej un i 0. 5 4 1 1 3 17 11 32 ( 88 ) C . c ol i 1- 64 16 1 17 72 43 13 2 (9 9 ) N a lid ix ic A ci d C . j ej un i 16 3 1 15 16 2 33 ( 89 ) C . c ol i 1- 12 8 8 49 2 1 2 5 5 17 52 81 ( 61 ) E ry th ro m yc in C . j ej un i 4 33 1 1 2 4 (1 1) C . c ol i 0. 25 -1 6 4 2 12 30 9 1 5 74 80 ( 60 ) S tr ep to m yc in C . j ej un i 4 16 16 3 2 2 (5 ) C . c ol i 0. 12 -1 6 2 11 79 29 1 6 7 13 ( 10 ) G en ta m ic in C . j ej un i 2 23 11 3 0 (0 ) 1 E U C A S T : C .c ol i a nd C . j ej un i d at a fr om th e E U C A S T M IC d is tr ib ut io n w eb si te la st a cc es se d 18 D ec em be r 20 16 P ág in a 90 d e 20 0 Trabajos de investigación Erm(B)-carrying Campylobacter isolates from turkeys Among the 85 erythromycin-resistant isolates, two (2.4%) carried the erm(B) gene: C. coli ZTA14/01086 and C. coli ZTA14/01426. The C. coli ZTA14/01086 is resistant to ciprofloxacin/nalidixic acid, tetracycline, erythromycin and streptomycin, whereas C. coli ZTA14/01426 shares the same MDR pattern plus gentamicin resistance. The erythromycin-resistance MICs were 256 mg/L for C. coli ZTA14/01086 and >1024 mg/L for C. coli ZTA14/01426. Whole genome sequencing revealed that the erm(B) gene in C. coli ZTA14/01086 was located in a cluster along with other resistance genes, including tet(O) and aad9 which confer resistance to tetracycline and spectinomycin respectively (Figure 1; GeneBank accession number: MF134831). The genome of C. coli ZTA14/01426 isolate contained the erm(B) gene in a cluster with aminoglycoside resistance genes aph(2")-IIIa, aph(3´)-IIIa and aadE (Figure 1; GeneBank accession number: MF134832). Both genomic islands were compared with the erm(B)-carrying genomic island from C. coli ZTA09/02204, the unique being identified in Spain (GeneBank accession number: KT953380) (Figure 1, Table S2). Beside these resistance determinants, analysis of 23S rRNA and ribosomal protein (L4 and L22) genes from genomes of the erm(B) positive strains from turkey, excluded the presence of ribosomal mutations previously related with erythromycin resistance (31). Página 91 de 200   Trabajos de investigación Figure 1. Comparative genetic organization of erm(B)-carrying genomic islands from C. coli ZTA14/01086 (this study), C. coli ZTA14/01426 (this study) and previously identified C. coli ZTA09/02204 (Study 2 of this doctoral thesis) (17). Antimicrobial resistance genes are coloured: erythromycin resistance: blue, aminoglycoside resistance: yellow, tetracyclin resistance: purple, genes with predicted functions or encoding hypothetical proteins: white. The grey shading indicates regions sharing 98% DNA identity. Página 92 de 200 T ra ba jo s de in ve st ig ac ió n T ab le S 2. G en et ic a nn ot at io n of th e ge no m ic is la nd s id en tif ie d in C a m py lo b ac te r is ol at es fr om th is s tu dy . G e n e H o m o lo g o u s A m in o A c id S tr a in P ro te in A n n o ta ti o n /B la s t h it o r O R F P ro te in a Id e n ti ty ( % ) C. coli ZTA14/01426 C. coli ZTA14/01086 te t ( O ) p n p a a d 9 e rm ( B ) o rf 1 o rf 2 o rf 3 te t ( O ) 6 3 9 2 5 6 2 5 9 2 4 5 8 5 1 0 8 8 1 6 3 9 6 3 9 2 5 6 1 6 0 6 8 2 4 5 2 8 8 1 0 8 8 1 2 9 5 6 3 9 /6 3 9 (1 0 0 ) 2 5 5 /2 5 6 (9 9 ) 1 6 0 /1 6 0 (1 0 0 ) 5 7 /6 8 (8 4 % ) 2 4 3 /2 4 5 (9 9 ) 4 2 /4 2 (1 0 0 ) 1 0 5 /1 0 8 (9 7 ) 8 1 /8 1 (1 0 0 ) 2 9 4 /2 9 5 (9 9 ) T e tM /T e tW /T e tO /T e tS f a m ily t e tr a c y c lin e r e s is ta n c e [ C a m p yl o b a c te r ] / W P _ 0 2 1 1 3 7 8 3 1 p h o s p h o ry la s e [ C a m p yl o b a c te r c o l i ] / W P _ 0 5 7 0 3 3 2 1 4 A N T 9 [ C a m p y lo b a c te r] / W P _ 0 5 7 0 3 1 3 3 7 m e th y ltr a n s fe ra s e E rm (B ) [C a m p yl o b a c te r c o li ] / W P _ 0 6 0 7 9 4 0 4 9 A m in o g ly c o s id e n u c le o tid y ltr a n s fe ra s e A N T 6 [ F ir m ic u te s ] / W P _ 0 0 6 4 2 6 5 0 9 H y p o th e tic a l p ro te in [ C a m p yl o b a c te r c o li ] / W P _ 0 7 2 2 3 8 4 9 4 H y p o th e tic a l p ro te in [ B a c te ro id a le s ] / W P _ 0 3 2 5 8 5 1 2 9 T e tM /T e tW /T e tO /T e tS f a m ily t e tr a c y c lin e r e s is ta n c e [C a m p y lo b a c te r] / W P _ 0 2 1 1 3 7 8 3 1 a p h ( 2 ") -I IIa 3 0 3 a p h ( 3 ") -I IIa 2 6 4 p n p 2 5 6 a a d 9 2 1 8 o rf 4 1 3 9 e rm ( B ) 2 4 5 a n t6 2 8 8 3 0 6 3 0 1 /3 0 3 (9 9 ) 2 6 4 2 6 4 /2 6 4 (1 0 0 ) 2 5 6 2 5 4 /2 5 6 (9 9 ) 2 1 8 2 1 8 /2 1 8 (1 0 0 ) 1 3 9 1 3 8 /1 3 9 (9 9 ) 2 4 5 2 4 4 /2 4 5 (9 9 ) 2 8 8 2 8 7 /2 8 8 (9 9 ) A m in o g ly c o s id e A P H (2 '') -I IIa [ C a m p yl o b a c te r c o li ] / W P _ 0 5 7 0 3 7 3 5 6 A m in o g ly c o s id e A P H (3 ') -I IIa [ B a c te ri a ] / W P _ 0 0 1 0 9 6 8 8 7 p h o s p h o ry la s e [ C a m p yl o b a c te r c o li ] / W P _ 0 5 7 0 3 3 2 1 4 s tr e p to m y c in 3 ''- a d e n y ly ltr a n s fe ra s e [ C a m p yl o b a c te r c o li C V M N 2 9 7 1 6 ] / E R F 9 9 0 0 3 A T P a s e [C lo s tr id io id e s d if fi c il e ] / W P _ 0 2 1 3 9 7 7 5 3 2 3 S r R N A E rm (B ) [C a m p yl o b a c te r c o li ] / W P _ 0 6 0 7 9 4 0 4 9 A m in o g ly c o s id e A N T 6 [ F ir m ic u te s ] / W P _ 0 0 6 4 2 6 5 0 9 a H o m o lo g o u s p ro te in f ro m th e o rg a n is m lis te d in th e a n n o ta tio n /B la s t h it c o lu m n P ág in a 93 d e 20 0   Trabajos de investigación Erm(B) allelic variation among bacterial genera, hosts and countries. Comparative sequence homology can provide information about the horizontal transfer of resistance genes, including erm(B), among bacterial species. The nucleotide sequences of ten erm(B) genes present in Campylobacter were compared, two from this work and eight of Chinese and Spanish origin. Using the first erm(B) sequence described in Campylobacter as reference (C. coli ZC113; GeneBank accession number: KC575115), four alleles have been identified in the erm(B) sequences from Campylobacter (Table S3). Allele 1 was the most common (7/10) and was using as reference. Alleles 2 and 3 were present in only one C. coli isolate each from Spain with single nucleotide polimorphisms (SNPs) A299G (Asn- 100-Ser) and A353G (His-118-Arg), respectively. Allele 4 was found in a C. jejuni isolate from China and is characterized by the synonymous SNP C726T. Bacterial genera, hosts and origins where erm(B) sequences identical to the four alleles present in Campylobacter are available in NCBI databases were compiled (S3 File) and their interconnections determined (Figure 2). The erm(B) alleles detected in Campylobacter had been previously identified mainly in Enterococcus and Staphylococcus isolated from humans and pigs in Asia and Europe. Thus, allele 1 of erm(B) is represented by 31 sequences from eight bacterial species, including Streptococcus suis (11/31; 35.5%), Enterococcus faecium (7/31; 22.5%) and C. coli (7/31; 22,5%). S. suis isolates were mainly isolated in China (7/11; 63.6%) and all were from swine hosts. Sequences of E. faecium were mainly from Japan (4/7; 57.1%) and all of them are from humans. The majority of erm(B) sequences of allele 1 from Campylobacter were of Chinese origin (6/7; 85.7%) and sampled from humans, swine and chickens. Beside these, allele 2 of erm(B) was detected in sixteen bacterial species mainly Clostridium difficile (10/39; 25.6%) and Enterococcus faecium (7/39; 17.9%), from European and US people, and pigs of Chinese origin respectively. Allele 2 of erm(B) is slightly more common in NCBI database than allele 1, being the only one identified in six bacterial genomes, mainly E. faecium (10/22; 45.4%) sampled from humans in the US, Australia, Japan and South Korea, whereas the allele 4 of erm(B) was not identified in any other sequence available in public databases. Página 94 de 200 Trabajos de investigación Table S3. Host and geographical distribution of the erm(B) alleles identified in Campylobacter. Allele Specie Country Host GeneBank ID 1 Campylobacter coli (reference) China Swine KC575115 Campylobacter coli1 Spain Turkey This study Campylobacter coli China Swine KJ610808 Campylobacter coli China Human KC876752 Campylobacter coli China Human KC876751 Campylobacter coli China Human KC876750 Campylobacter coli China Chicken KC876748 Enterococcus faecium Japan Human NG_047804 Enterococcus faecium China Wild boar KJ645709 Enterococcus faecium Japan Human JN899585 Enterococcus faecium Japan Human JN899583 Enterococcus faecium Japan Human JN899582 Enterococcus faecium Human HM565169 Enterococcus hirae China Food CP015517 Lactobacillus plantarum France Food FJ374272 Staphylococcus aureus Taiwan Human LC102479 Staphylococcus aureus Taiwan Human LC125352 Streptococcus pyogenes Italy Human FN677480 Streptococcus suis China Wild boar CP017142 Streptococcus suis China Swine KT336321 Streptococcus suis China Swine CP015557 Streptococcus suis Canada Swine CP011419 Streptococcus suis China Swine CP003922 Streptococcus suis China Swine CP002644 Streptococcus suis China Swine CP002640 Streptococcus suis China Swine CP002465 Streptococcus suis Itali Human FN997652 Streptococcus suis Italy Human FN677479 Streptococcus suis Vietnam Human FM252032 2 Anaerostipes hadrus China Human CP012098 Arcanobacterium pyogenes USA AY334073 Campylobacter coli2 Spain Chicken KT953380 Peptoclostridium difficile Germany Human HG475346 Página 95 de 200   Trabajos de investigación Table S3. Host and geographical distribution of the erm(B) alleles identified in Campylobacter. Allele Specie Country Host GeneBank ID 2 Peptoclostridium difficile Germany Human HF678446 Peptoclostridium difficile Italy Human HF678445 Peptoclostridium difficile USA Human FN668944 Peptoclostridium difficile Ireland Human FN668375 Peptoclostridium difficile USA Cattle FN665654 Peptoclostridium difficile Italy Human AM072511 Peptoclostridium difficile Italy Human AJ968665 Clostridium perfringens Canada Chicken JQ655732 Eggerthella spp. Japan Human AP012211 Enterococcus faecalis Taiwan Human AB563188 Enterococcus faecium Australia Human LT598667 Enterococcus faecium China Swine KX156279 Enterococcus faecium China Swine KX156278 Enterococcus faecium Germany Human CP011830 Enterococcus faecium China Wild boar KJ645709 Enterococcus faecium China Swine KF421157 Enterococcus faecium Japan Human JN899587 Lactococcus garvieae Japan Fish AB290882 Macrococcus caseolyticus Human Japan AP009486 Peptoclostridium difficile Spain Environment LK933416 Peptoclostridium difficile Spain Environment LK932404 Staphylococcus aureus Germany Cattle FN806789 Staphylococcus aureus China Swine JX560992 Staphylococcus intermedius Switzerland Dog AF239773 3 Campylobacter coli3 Spain Turkey This study Enterococcus faecium South Korea Human CP019210 Enterococcus faecium USA Human CP018072 Enterococcus faecium USA Human CP012468 Enterococcus faecium Australia Human LT603681 Enterococcus faecium USA Human CP013996 Enterococcus faecium Australia Human KR066794 Enterococcus faecium Australia Human CP006623 Enterococcus faecium Japan Human JN899586 Página 96 de 200 Trabajos de investigación Table S3. Host and geographical distribution of the erm(B) alleles identified in Campylobacter. Allele Specie Country Host GeneBank ID 3 Enterococcus faecium Japan Human JN899584 Selenomonas spp. USA Human CP014240 Staphylococcus intermedius USA Dog CP015626 Staphylococcus intermedius USA Dog CP016073 Staphylococcus intermedius Spain Dog JF909978 Streptococcus pneumoniae France Human HG799498 Streptococcus pneumoniae Germany Human HG799489 Streptococcus pneumoniae Canada Human CP002925 Streptococcus pneumoniae Italy Human FN667862 Streptococcus pneumoniae Taiwan Human CP001033 Streptococcus suis Canada Swine CP012731 Streptococcus suis China Swine CP002644 4 Campylobacter jejuni China Chicken KF864551 1C. coli ZTA14/01426, 2C. coli ZTA09/02204, 3C. coli ZTA14/01086. Página 97 de 200   T ra ba jo s de in ve st ig ac ió n F ig u re 2 . H os t a nd g e og ra ph ic al d is tr ib ut io n of th e er m (B ) al le le s id e nt ifi e d in C a m py lo b ac te r in th is s tu d y am on g ot he r b ac te ria l g en er a . E xa ct id en tit y of e rm (B ) al le le s be tw ee n sp ec ie s, h os t/ en vi ro nm e nt a nd o rig in o f is ol at io n is r ep re se nt e d b y a co nn ec tio n. P ág in a 98 d e 20 0 Trabajos de investigación Discussion Definitive characterization of erythromycin resistance in bacterial pathogens is an important objective defined by the EFSA and the European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) (30). To date, the erm(B) gene has been identified in Campylobacter isolates from swine, chickens, ducks and humans from China and in one broiler sample from Spain (16, 17). Monitoring antimicrobial resistance among Campylobacter isolated from turkeys has been mandatory since 2014 in European countries where the production of turkey meat exceeds 10,000 tonnes per year (32). The occurrence of erythromycin resistant C. coli isolates from turkeys in Germany, Romania and Spain had risen to 43.3% in 2014 (32), compared to previous surveys where lower frequencies were detected for poultry (14.5%) and swine (20.7%) (32, 33). Since Campylobacter infections are related to consumption of food from animal origin, these levels of resistance could potentially produce therapeutic failure of antibiotic treatment for campylobacteriosis in humans. Increased antimicrobial resistance among Campylobacter populations is a consequence of the widespread acquisition of antimicrobial resistance and clonal expansion of resistant lineages (34). Campylobacter can acquire DNA, including antimicrobial resistance genes, from relatively distantly related lineages through horizontal gene transfer (HGT), involving the replacement of homologous sequences, or the acquisition of mobile genetic elements (MGEs). There is evidence that plasmid acquisition mediates Campylobacter resistance to tetracycline, chloramphenicol and aminoglycosides (35-37) but, in some cases, these resistances might be conferred by polymorphism of chromosomal sequences. This is also the case in Campylobacter for resistance to fluoroquinolones and macrolides mediated by mutations in gyrA or 23S rDNA sequences, respectively (38). Mutations that confer antimicrobial resistance can occur independently in multiple lineages but can also spread by natural transformation followed by homologous recombination leading to the dissemination of antimicrobial resistance among bacteria that share an ecological niche (39). The increasing number of studies identifying erm(B) gene in Campylobacter provide evidence that horizontal transfer is related with macrolide resistance in Campylobacter (15-17, 19, 30). High levels of resistance among C. coli isolates have been previously reported among isolates from livestock (40), potentially reflecting a selective advantage in these niches and clonal expansion of resistance lineages. However, few studies have characterized the genomic changes Página 99 de 200   Trabajos de investigación associated with the acquisition of resistance. This study shows the location of erm(B) gene in a genomic island along with other antimicrobial resistance genes including: tet(O), encoding resistance to tetracycline and aph(3´)-IIIa, aacA-aphD, aad9 and aadE conferring resistance to different aminoglycosides (15-17), a clustering that implies the possibility of co-selection as its evolutionary mechanism (18). In addition, linked Erm(B) and aph(2")-IIIa genes detected in the genome of C. coli ZTA14/01426 isolate, could be transferred to virulent strains limiting seriously the effectiveness of the two main choices for treatment of severe campylobacteriosis, erythromycin and gentamicin (6). Identical nucleotide sequences of antibiotic resistance genes have been detected in both, Gram-positive and Gram-negative bacteria. This is consistent with horizontal gene transfer facilitating the spread of resistance genes between distantly related species (41, 42). Gram-positive bacteria including Enterococcus, Streptococcus and Staphylococcus are widely known to harbour various resistance genes (43, 44) and recently, tetracycline and aminoglycoside resistance genes from Gram-positive bacteria have been identified in Gram-negative bacteria including E. coli or K. pneumoniae (45, 46) and Campylobacter (43, 44, 47). Four erm(B) alleles were identified in Campylobacter in this study (Table S3) and comparison of these alleles with those from other bacteria provides useful information about possible routes of transmission (Fig 2). First, 100% nucleotide identity with erm(B) genes from Enterococcus, Streptococcus, Peptoclostridium, Anaerostipes, Arcanobacterium, Eggerthella, Lactobacillus, Lactococcus, Macrococcus and Selenomonas suggests horizontal acquisition from Gram-positive bacteria, as previously described (15-17). Second, the erm(B) alleles identified in this study have been previously identified mainly in human and porcine bacterial pathogens of Asian and European origin (Fig 2). The pig and human pathogen S. suis is considered a reservoir of antibiotic resistance genes (48) and genetic transferable element carrying the erm(B), tet(O) and aminoglycoside resistance genes have been reported in isolates of S. suis previously (49). The use of combined antibiotic therapies on swine farms potentially selects for bacterial isolates carrying resistance to different antibiotics (50). Allele 2 of the erm(B) gene has been identified in more bacterial genera than the other alleles in this study (Fig 2). All bacterial genera where erm(B) allele 2 has been identified belong to the Firmicutes, except two which belong to Actinobacteria. These bacterial genera are present in the gastrointestinal tract and species like Página 100 de 200 Trabajos de investigación Enterococcus, Streptococcus and Staphylococcus share the niche with Campylobacter (43). The transfer of antibiotic resistance genes in the human colon between bacteria of different genera has been reported (51) and it is possible that the antibiotics supplied in both animals and humans could facilitate the selection of strains carrying these multiresistant genomic islands and favour their dispersion. Identifying erm(B) genes and multi-drug resistance genomic islands in Campylobacter isolates from turkeys, adds new elements to the already extensive network of bacterial genera and hosts involved in the possible dispersion of critical antibiotic resistance genes and mobile genetic elements. References 1. Lawe-Davies O and Bennett S. WHO publishes list of bacteria for which new antibiotics are urgantly needed. World Health Organization. 2017. Available from: http://www.who.int/mediacentre/new s/releases/2017/bacteria-antibiotics- needed/en/ 2. EFSA (European Food Safety Authority) ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control). The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2015. EFSA Journal. 2016;14(12):4634-865. 3. Whiley H, van den Akker B, Giglio S, Bentham R. The role of environmental reservoirs in human campylobacteriosis. Int J Environ Res Public Health. 2013;10(11):5886-907. 4. 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Página 104 de 200   Trabajos de investigación 6.4 Caracterización genómica y resistoma de C. jejuni y C. coli aislados de personas, animales y aguas residuales. En el año 2012 se describieron en aislados de Campylobacter procedentes de China, unas islas genómicas portadoras de varios genes de resistencia a aminoglucósidos (171). Dos años más tarde se identificaron en Campylobacter aislados de animales y personas de China, islas genómicas portadoras de genes de resistencia a aminoglucósidos y macrólidos, poniendo en riesgo por tanto el tratamiento contra la campilobacteriosis (150). En los anteriores trabajos de esta tesis doctoral se identificaron por primera vez en Europa islas genómicas portadoras de genes de resistencia a aminoglucósidos y macrólidos en C. coli aislados de pollos y pavos (151). Dado que los aminoglucósidos, principalmente gentamicina, se utilizan para el tratamiento de infecciones sistémicas causadas por Campylobacter, la aparición y propagación de esta isla genómica de resistencia a antimicrobianos supone un riesgo potencial para la salud pública (185). Este trabajo surge de la necesidad de analizar las islas genómicas en Campylobacter en España sobre la dispersión de genes de resistencia a antimicrobianos en animales, personas y aguas residuales. Este estudio se desarrolló a partir de una colección de 252 aislados de Campylobacter (163 C. jejuni y 89 C. coli) procedentes de animales de abasto (pollos de engorde, ganado porcino y bovino de engorde), personas infectadas por campilobacteriosis y efluentes urbanos. Se evaluó la sensibilidad a seis antimicrobianos (tetraciclina, ácido nalidíxico, ciprofloxacina, eritromicina, gentamicina y estreptomicina) y se secuenció el genoma de todos los aislados de Campylobacter con el objetivo de caracterizar la colección según su genoma, evaluar los genes de resistencia a antimicrobianos que presentaban y comparar los datos de resistencia fenotípicos y genéticos. Siguiendo el criterio de la EFSA, se agruparon los aislados en multirresistentes, si eran resistentes a tres o más clases de antimicrobianos, y no multirresistentes. Nuestros resultados muestran como hay mayor porcentaje de aislados multirresistentes en C. coli (56.25%) que en C. jejuni (9.24%), con una diferencia estadísticamente significativa (p<0,001). Página 105 de 200       Trabajos de investigación Aislados multiresistentes de C. jejuni se encuentran en diferentes CCs, siendo los mayoritarios CC-45 (3/10; 30%) y CC-21 (5/29; 17%). En el caso de los aislados de C. coli, se han identificado 28 STs diferentes y todos pertenecen al CC-828. Los STs mayoritarios de C. coli fueron ST-825 (19/92; 20,65%) y ST- 827 (16/92; 17,39%). La presencia de los genes ant(6)-Ib, sat-4, ant-like, ant(6)-Ia, aad9, sat-1, aph(2)- IIIa, aph(3)-IIIa, lnuC e hyg se asocia con aislados multirresistentes (p <0,001). El gen blaOXA-61 es más prevalente en C. jejuni que en C. coli (108/168; 64.3% y 47/92; 51.09% respectivamente) (p <0.05). El gen blaOXA-61 es más frecuente en Campylobacter aislados de animales (25/28, 89.23%) que en los aislados de personas (15/25, 60%) o de aguas residuales (9/27, 33.33%). Todos los genes de resistencia a antimicrobianos, excepto blaOXA-61 y ant-like, identificados en este estudio se localizaron en 30 islas genómicas de Campylobacter aislados de animales, personas y aguas residuales. Comparando todas las islas genómicas identificadas, vemos que hay dos tipos de asociaciones genéticas y ambas se repiten en aislados de animales, personas y agua residual. Por un lado la asociación entre los genes ant(6)-Ia, sat-4 y aph(3)­ III, identificada en 16 islas genómicas: 4 en C. jejuni aislados de pollos (4/4; 100%) y 12 en C. coli aislados de pollos (1/12; 8%), vacas (2/12; 17%), personas (5/12; 42%) y aguas residuales (2/12; 17%). Por otro lado, la asociación entre los genes tetO, ant(9) y ant(6)-Ib identificada en 14 islas genómicas: 3 en C. jejuni aislados de pollos y personas (2/3; 67% y 1/3; 34%, respectivamente) y 11 en C. coli aislados de animales (3/11; 27%), personas (3/11; 27%) y aguas residuales (5/11; 45%). Con el objetivo de identificar la posible transferencia horizontal entre C. jejuni y C. coli, se ha analizado la diversidad alélica de los genes de resistencia a antimicrobianos identificados. Se identificaron alelos idénticos en ambas especies de los genes blaOXA-61, tetO, ant(6)-Ia, ant(6)-Ib y sat-4. Página 106 de 200 Trabajos de investigación Multidrug resistance genomic islands in C. jejuni and C. coli isolates from humans, animals and wastewater. Abstract Bacteria of the genus Campylobacter are the main cause of human infections with zoonotic origin in the European Community, with C. jejuni and C. coli as major species associated to the consumption of food products from livestock. In addition to its impact on human health, this bacterium is able to spread antibiotic resistance mobilizing genomic islands that confer resistance to aminoglycosides and macrolides, among others. The aim of this study was to evaluate the potential for horizontal transfer of antibiotic resistance genes in Campylobacter by comparing the multi-drug resistance genomic islands of a vast collection of strains isolated from animals, humans and wastewater. Thus, the susceptibility to six antibiotics was analysed in a collection of 252 Campylobacter isolates from Spain, followed by their whole genome sequencing in order to identify antimicrobial-resistance genes. Regarding the EFSA criteria, there were significant differences between the prevalence of multiresistant isolates within species, being much lower for C. jejuni (9.24%) than C. coli (56.25%). Genes ant(6)-Ib, sat-4, ant-like, ant(6)-Ia, aad9, sat-1, aph(2)-IIIa, aph(3)-IIIa, lnuC and hyg were found frequently in multiresistant isolates, most of them being located in some of the thirty genomic island identified in Campylobacter from animals, humans and sewage. This work reveals how sewage is a potential vehicle for transmission of Campylobacter isolates carrying antibiotic resistance genes to the environment. Introduction Campylobacter is the zoonotic agent that produces the largest number of bacterial infections in humans in the European Union, considerably exceeding cases of salmonellosis [1]. Species of this genus that cause human infections are mainly C. jejuni and C. coli [2]. Both species asymptomatically colonize the digestive tract of birds and mammals and through the food chain, mainly poultry meat, infect humans and cause campylobacteriosis [3-6]. This disease is usually self-limiting, although occasionally it may require treatment based on hydration, replacement of electrolytes and even antibiotics, as erythromycin [7]. Página 107 de 200   Trabajos de investigación The genus Campylobacter is characterized by a high horizontal gene transfer rate even between strains of C. jejuni and C. coli species [8]. This genetic flow has a great impact both on the population structure and the dispersion of antibiotic resistance genes of Campylobacter. Transferable multiresistance genomic islands have been identified in the genome of Campylobacter [9]. In the year 2014, isolates of Campylobacter from animals and humans in China were identified whose genomic islands also carried the erythromycin resistance gene erm(B) [10, 11]. More recently the erythromycin resistance gene erm(B) was detected in C. coli isolates from Spain in both turkeys and chickens [12]. After the raise of resistance to quinolones in Campylobacter, erythromycin is considered the antibiotic of choice for treatment of campilobacteriosis, although the spread of erm(B) genes is compromising antimicrobial chemotherapy. Resistance to antibiotics is causing a crisis in public health, which means that new solutions are needed. One of the alternatives proposed by the World Health Organization (WHO) has been to prioritize research on new antimicrobials. WHO has published a list of the main pathogens in terms of antibiotic-resistance, and Campylobacter was included [13]. Health organizations and the scientific community have recommended that antibiotic resistance should be considered from a global perspective encompassing animals, humans and the environment, the One Health approach [14]. In this context, the objective of present work was to analyse the resistome of Campylobacter isolates from animals, humans and wastewater to evaluate the potential impact of gene mobilization from a global health perspective. Material and methods Bacterial isolates This study was developed on a collection of 252 Campylobacter isolates (163 C. jejuni and 89 C. coli) from food animals, humans and urban effluents, all sampled in Spain. Campylobacter isolates of animal origin (n=55; 44 C. jejuni and 11 C. coli) are from broiler (n=25; 18 C. jejuni and 7 C. coli), cattle (n=27; 26 C. jejuni and 1 C. coli) and pig (n=3 C. coli) samples collected in a dispersed range of slaughterhouses across the Spain (2008-2011). The isolates of animal origin belong to the Spanish Veterinary Antimicrobial Resistance Surveillance (VAV) Network and were selected with the aim of having a wide range of resistance to antibiotics (from susceptible isolates to resistant to 1-5 antibiotics) as shown in Table 1 [15]. The human isolates (n=148; 115 C. jejuni and 33 C. coli) come from Página 108 de 200 Trabajos de investigación campylobacteriosis cases occurring in hospitals in the regions of Castilla y Leon, Extremadura and Andalucía (2013-2016). C. jejuni isolated from humans have been previously characterized [16, 17]. Finally, the Campylobacter isolates from urban effluents (n=50; 4 C. jejuni and 45 C. coli) come from a wastewater treatment plant from a city in the centre of Spain (2011-2013) [18]. Isolates were not epidemiologically related. All isolates were identified by conventional multiplex PCR of the genus and specie of Campylobacter using specific primers to identify C. jejuni and C. coli, as described previously [19]. Antimicrobial susceptibility testing The antibiotic resistance profile of Campylobacter isolates from urban effluents was previously described [18]. The analysis of Campylobacter isolates of human origin was made following the same technique and against the same antibiotics that had been used in isolates from animals and urban effluents: ciprofloxacin, erythromycin, gentamicin, tetracycline, streptomycin and nalidixic acid. The susceptibility of C. jejuni isolates from humans has been previously measured against ciprofloxacin, erythromycin and gentamicin [16]. Campylobacter isolates were grown on blood agar plates (bioMérieux) and incubated for 48 h at 37°C at microaerophilic conditions (Oxoid). Collected cultures (standardized to 0.5 McFarland turbidity) were added 50 μL to 11 mL of Mueller-Hinton broth (TREK Diagnostics Systems, Waltham, MA, USA), and supplemented to 5.5% with lysed horse blood freshly prepared in house from horse blood (Oxoid). This mix was distributed onto EUCAMP2 microdilution plates (TREK Diagnostics Systems) and incubated under microaerophilic conditions for 48 h at 37 °C. The interpretation of the quantitative data was performed as described by the European Committee of Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST [20]. DNA extraction and sequencing Campylobacter collection was stored at -80ºC in 1% protease peptone and 10% glycerol broth. Isolates were subcultured onto blood agar plates (bioMérieux) in microerophilic conditions using the atmosphere generation systema Campygen (Oxoid) at 42ºC for 48 h. The genomic DNA was extracted from 1-day single- colony cultures incubated at 42ºC using the QiaAMP DNA minikit (Qiagen) following the manufacturer´s instructions. DNA was quantified using a Nanodrop spectrophotometer before sequencing. High-throughput genome sequencing was performed using a HiSeq 2500 machine (Illumina) and the 100bp short read paired-end data was assembled using the de novo assembly algorithm within Página 109 de 200   Trabajos de investigación SPAdes 3.1.1 [21]. The 252 Campylobacter sequenced genomes have showed an average of 200 contigs with a median value of 144 contigs. Genotype analysis Genomes sequenced in this study were archived in the Bacterial Isolate Genome Sequence database (BIGSdb) [22]. The complete list of Campylobacter isolates used in this study as well as their BIGS ID are shown in Table S1. A gene-by- gene approach for genome alignment, identification of gene alleles and whole- genome MLST was done by BLAST algorithm [23, 24]. In order to identify the antimicrobial resistance genes, all Campylobacter genomes were confronted with The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) [25]. Table S1. List of Campylobacter isolates used in this study. ZTA ID BIGS ID Specie Source ZTA11/03517-3CPF ZTA12/02041CASA ZTA13/02371 CASA ZTA13/02382 CPF ZTA13/00788 CP ZTA13/00790 CP ZTA13/00791 CP ZTA13/00793 CP ZTA13/00794 CP ZTA13/00795 CP ZTA13/00796 CP ZTA13/00797 CP ZTA13/00798 CP ZTA13/00799 CP ZTA13/00802 CP ZTA13/00803 CP ZTA13/00804 CP ZTA13/00805 CP ZTA13/00806 CP ZTA13/00807 CP ZTA13/00808 CP 5049 5055 5077 5090 5136 5138 5139 5140 5141 5142 5143 5144 5145 5146 5147 5148 5149 5150 5151 5152 5153 SewageC. jejuni C. jejuni Sewage C. jejuni Sewage C. jejuni Sewage C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human Página 110 de 200 Trabajos de investigación Table S1. List of Campylobacter isolates used in this study. ZTA ID BIGS ID Specie Source ZTA13/00809 CP ZTA13/00810 CP ZTA13/00811 CP ZTA13/00812 CP ZTA13/00813 CP ZTA13/00815 CP ZTA13/00816 CP ZTA13/00817 CP ZTA13/00818 CP ZTA13/00819 CP ZTA13/00820 CP ZTA13/00821 CP ZTA13/00822 CP ZTA13/00823 CP ZTA13/00824 CP ZTA13/00825 CP ZTA13/00828 CP ZTA13/00829 CP ZTA13/00830 CP ZTA13/00831 CP ZTA13/00832 CP ZTA13/00833 CP ZTA13/00834 CP ZTA13/00836 CP ZTA13/00837 CP ZTA13/00838 CP ZTA13/00840 CP ZTA13/00841 CP ZTA13/00842 CP ZTA13/00843 CP ZTA13/00844 CP 5154 5155 5156 5157 5158 5159 5160 5161 5162 5163 5164 5165 5166 5167 5168 5169 5172 5173 5174 5175 5176 5177 5178 5180 5181 5182 5183 5184 5185 5186 5187 C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human Página 111 de 200   Trabajos de investigación Table S1. List of Campylobacter isolates used in this study. ZTA ID BIGS ID Specie Source ZTA13/00845 CP ZTA13/00846 CP ZTA13/00847 CP ZTA13/00848 CP ZTA13/00849 CP ZTA13/00850 CP ZTA13/00851 CP ZTA13/00852 CP ZTA13/00853 CP ZTA13/00854 CP ZTA13/00855 CP ZTA13/00856 CP ZTA13/00857 CP ZTA13/00858 CP ZTA13/00859 CP ZTA13/00860 CP ZTA13/00861 CP ZTA13/00864 CP ZTA13/00865 CP ZTA13/00867 CP ZTA13/00868 CP ZTA13/00869 CP ZTA13/00870 CP ZTA13/00871 CP ZTA13/00872 CP HU94 ZTA13/00873 CP ZTA13/00874 CP ZTA13/00875 CP ZTA13/00876 CP ZTA13/00877 CP 5188 5189 5190 5191 5192 5193 5194 5195 5196 5197 5198 5199 5200 5201 5202 5203 5204 5205 5206 5208 5209 5210 5211 5212 5213 5215 5216 5217 5218 5219 5220 C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human Página 112 de 200 Trabajos de investigación Table S1. List of Campylobacter isolates used in this study. ZTA ID BIGS ID Specie Source ZTA13/00878 CP ZTA13/00879 CP ZTA13/00880 CP ZTA13/00881 CP ZTA13/00882 CP ZTA13/00883 CP ZTA13/00884 CP ZTA13/00885 CP ZTA13/00886 CP ZTA13/00887 CP ZTA13/00890 CP ZTA13/00891 CP ZTA13/00892 CP ZTA13/00894 CP ZTA13/00895 CP ZTA13/00896 CP ZTA13/00897 CP ZTA13/00899 CP ZTA13/00900 CP ZTA13/00902 CP ZTA13/00903 CP ZTA13/00904 CP ZTA13/00905 CP ZTA13/00906 CP ZTA13/00907 CP ZTA13/00908 CP ZTA13/00909 CP ZTA13/00910 CP ZTA13/00911 CP ZTA13/00912 CP ZTA13/00913 CP 5221 5222 5223 5224 5225 5226 5227 5228 5229 5230 5233 5234 5235 5237 5238 5239 5240 5242 5243 5245 5246 5247 5248 5249 5250 5251 5252 5253 5254 5255 5256 C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human Página 113 de 200   Trabajos de investigación Table S1. List of Campylobacter isolates used in this study. ZTA ID BIGS ID Specie Source ZTA13/00914 CP ZTA13/00915 CP ZTA13/00916 CP ZTA13/00917 CP ZTA13/00919 CP ZTA13/00920 CP ZTA10/00684 CPD ZTA10/01723 CPD ZTA10/00766 CPD ZTA10/01430 CPD ZTA10/00909 CPD ZTA10/02105 CPD ZTA10/02531 CPF ZTA10/02577 CPD ZTA10/01722 CPD ZTA10/02640 CPF ZTA10/01246 CPD ZTA10/02641 CPD ZTA11/01072 CP ZTA11/01302 CP ZTA11/01874 CP ZTA11/02059 CP ZTA11/02314 CP ZTA11/03523 CP ZTA10/01617 CPD ZTA10/02583 CPF ZTA10/00655 CPD ZTA10/00681 CPD ZTA10/00761 CPD ZTA10/01043 CPD ZTA10/01185 CPD 5257 5258 5259 5260 5262 5263 5264 5267 5270 5271 5272 5274 5275 5276 5279 5281 5282 5284 5285 5286 5287 5288 5289 5291 5293 5295 5296 5297 5298 5299 5300 C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Human C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Broiler C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle Página 114 de 200 Trabajos de investigación Table S1. List of Campylobacter isolates used in this study. ZTA ID BIGS ID Specie Source ZTA10/01678 CPD ZTA10/00700 CPD ZTA10/00900 CPF ZTA10/00951 CPD ZTA10/01185 CPD ZTA10/01333 CPD ZTA10/01411 CPD ZTA10/02289 CPD ZTA10/02492 CPD ZTA10/00575 CPD ZTA11/00934 CP ZTA11/03537 CP ZTA11/03821 CP ZTA11/02705 CP ZTA11/01052 CP ZTA11/03823 CP ZTA11/02069 CP ZTA11/01530 CP ZTA11/01842 CP ZTA09/01326 CP VE08/01737 CP VE08/01742 CP ZTA11/01873 CP ZTA10/02488 CP ZTA11/01966 CP ZTA09/02553 CP ZTA10/00749 CPD ZTA16/00457 CP ZTA16/00460 CP ZTA16/00461 CP ZTA16/00462 CP 5301 5302 5303 5304 5305 5306 5307 5308 5309 5311 5313 5316 5317 5318 5321 5322 5324 5325 5327 5124 5125 5126 5127 5128 5130 5133 5310 5094 5096 5097 5098 C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. jejuni Cattle C. coli Broiler C. coli Broiler C. coli Broiler C. coli Broiler C. coli Broiler C. coli Broiler C. coli Broiler C. coli Cattle C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human Página 115 de 200   Trabajos de investigación Table S1. List of Campylobacter isolates used in this study. ZTA ID BIGS ID Specie Source ZTA16/00463 CP ZTA16/00465 CP ZTA16/00466 CP ZTA16/00467 CP ZTA16/00468 CP ZTA16/00469 CP ZTA16/00470 CP ZTA16/00471 CP ZTA16/00472 CP ZTA16/00474 CP ZTA16/00475 CP ZTA16/00477 CP ZTA16/00478 CP ZTA16/00480 CP ZTA16/00481 CP ZTA16/00482 CP ZTA16/00485 CP ZTA16/00486 CP ZTA16/00487 CP ZTA16/00488 CP ZTA16/00490 CP ZTA16/00491 CP ZTA13/00789 CP ZTA13/00826 CP ZTA13/00827 CP ZTA13/00866 CP ZTA13/00889 CP ZTA13/00893 CP ZTA13/00918 CP ZTA09/02173 CP VE08/03191 CP 5099 5101 5102 5103 5104 5105 5106 5107 5108 5109 5110 5112 5113 5114 5115 5116 5117 5118 5119 5120 5122 5123 5137 5170 5171 5207 5231 5236 5261 5129 5131 C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Human C. coli Pig C. coli Pig Página 116 de 200 Trabajos de investigación Table S1. List of Campylobacter isolates used in this study. ZTA ID BIGS ID Specie Source ZTA09/02282 CP ZTA10/02396 CPFA Preston ZTA11/00429 CPD Preston ZTA11/01227 CPF Preston ZTA11/01965 CPD Preston ZTA11/01965 CPF Preston ZTA11/02394 CPD Preston ZTA11/02394 CPF Preston ZTA11/03024-2 CPF Preston ZTA11/03517-3 CPD Preston ZTA11/03517-4 CPF Preston ZTA12/00985 CPF Preston F ZTA12/01820 CPDA Preston ZTA12/01820 CPFA Preston ZTA12/01820 CPFB Preston ZTA12/02041 CASA A Preston ZTA12/02041 CASA A Preston F ZTA12/02041 CASA B Preston ZTA12/02041 CASA B Preston F ZTA12/02041 CASA C Preston F ZTA12/02041 CPFA Preston F ZTA12/02041 CPFB Preston F ZTA12/02464 CASA Bolton ZTA12/02464 CASA A Preston ZTA12/02464 CPD Preston ZTA12/02464 CPFA Preston ZTA12/02579 CASA F ZTA12/02579 CPD Preston ZTA12/02579 CPD Preston F ZTA12/02785 CASA F ZTA12/02785 CASA Preston 5132 5040 5041 5042 5043 5044 5045 5046 5047 5048 5050 5051 5052 5053 5054 5056 5057 5058 5059 5061 5062 5063 5064 5065 5066 5067 5068 5069 5070 5072 5073 C. coli Pig C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage C. coli Sewage Página 117 de 200   Trabajos de investigación Table S1. List of Campylobacter isolates used in this study. ZTA ID BIGS ID Specie Source ZTA12/02785 CPD Preston 5075 C. coli Sewage ZTA12/02785 CPF Preston 5076 C. coli Sewage ZTA13/02371 CASA Preston 5078 C. coli Sewage ZTA13/02372 CASA F 5079 C. coli Sewage ZTA13/02375 CASA 5080 C. coli Sewage ZTA13/02376 CASA Bolton 5081 C. coli Sewage ZTA13/02377 CASA Preston 5082 C. coli Sewage ZTA13/02378 CASA Preston 5083 C. coli Sewage ZTA13/02380 CASA Preston F 5084 C. coli Sewage ZTA13/02381 CASA Preston F 5085 C. coli Sewage ZTA13/02382 CASA 5086 C. coli Sewage ZTA13/02382 CASA F B 5088 C. coli Sewage ZTA13/02382 CASA Preston F 5089 C. coli Sewage ZTA13/02383 CASA Preston 5091 C. coli Sewage ZTA13/02387 CA+B61:B255SA F 5092 C. coli Sewage Results Antibiotic resistance profile of Campylobacter isolates. The collection of this study consists of Campylobacter isolates of animal, human and sewage origin. Isolates of animal origin have been selected according to their antibiotics resistances (Table 1) to compare the mechanisms of antimicrobial resistance detected in them with those present in isolates from humans and sewage. Campylobacter isolates of animal origin belong to the VAV Network and were selected according to their antibiotic resistance profile since their susceptibility to ciprofloxacin, erythromycin, gentamicin, tetracycline, streptomycin and nalidixic acid is known. Antibiotic resistance profiles from Campylobacter isolates are shown in Table 1. Combined resistance to nalidixic acid and ciprofloxacin were observed in both Campylobacter species, therefore we will refer to them as resistance to ciprofloxacin only. The resistance percentages of C. jejuni and C. coli isolates for each antibiotic tested were, respectively, as follows: ciprofloxacin, 91.6 and 92.5; tetracycline, Página 118 de 200 Trabajos de investigación 94.1 and 93.8; erythromycin, 0.8 and 17.5; streptomycin, 6.7 and 60; gentamicin, 1.7 and 6.3. Higher prevalence of resistance was observed in C. coli for erythromycin, streptomycin and gentamicin. Moreover, 4 of the 116 C. jejuni isolates (3.4%) were susceptible to all antibiotics tested, whereas any C. coli susceptible to less than 2 antibiotics was found. The main resistance profile detected in C. jejuni isolated from both humans and sewage is CT whereas in C. coli are CT and CTS, without significant differences for both origins (Table 1). According to the EFSA criteria, an isolate resistant to at least three classes of antibiotics can be classified as multidrug resistant [26]. Following this, multiresistant isolates were less frequent in C. jejuni (9.24%) than in C. coli (56.25%). Table 1. Drug resistance profiles found among 253 Campylobacter isolates from animals, humans and sewage. C. jejuni2 C. coli2 Profile1 Animals Humans Sewage Animals Humans Sewage CTESG 4 (36.4) 1 (3) CTES 1 (25) 5 (45.5) 4 (12.1) 5 (10.6) CTSG 2 (1.7) 1 (3) 3 (6.4) CTS 15 (34.1) 7 (6.9) 1 (9.1) 11 (33.3) 17 (36.2) CTE 3 (6.8) 1 (0.9) 1 (9.1) 1 (3) 2 (4.3) CT 16 (36.4) 95 (82.6) 2 (50) 12 (36.4) 13 (27.7) TS 1 (3) 4 (8.5) C 3 (6.8) 1 (0.9) 1 (25) 2 (6.1) 1 (2.1) T 5 (11.4) 5 (4.4) Sensitive 2 (4.5) 4 (3.5) TOTAL 44 115 4 11 33 45 1Antibiotic resistance: C, chloramphenicol; T, tetracycline; E, erythromycin; S, streptomycin; G, gentamicin. 2Total number of isolates (% upon species and origin). Population structure of Campylobacter isolates. A core genome tree was implemented to compare the population structure of C. jejuni and C. coli isolates of this study (Figure 1). In addition, the multiresistant or non-multiresistant condition for each isolate is shown. Isolates of C. jejuni from food animals belong to clonal complexes CC-61 (n=8), CC-21 (n=7), CC-42 (n=7), CC-45 (n=6), CC-206 (n=4), CC-464 (n=2), CC-354 (n=2), CC-52 (n=2), Página 119 de 200   Trabajos de investigación CC-658 (n=1) and CC-607 (n=1). Isolates of C. jejuni from human infections belong to CC-21 (n=22), CC-206 (n=15), CC-443 (n=12), CC-353 (n=8), CC-464 (n=7), CC-22 (n=6), CC-354 (n=6), CC-658 (n=5), CC-257 (n=5), CC-45 (n=4), CC-607 (n=2), CC-362 (n=2), CC-48 (n=2), CC-42 (n=1), CC-52 (n=1), CC-574 (n=1), CC-446 (n=1), CC-49 (n=1) and CC-460 (n=1). C. jejuni isolated from urban effluents belong to CC-22 (n=2), CC-45 (n=1), ST-607 (n=1) and CC-362 (n=1). Multiresistant isolates of C. jejuni are located in different clonal complexes throughout the tree (Figure 1). In the case of C. coli isolates, 28 different sequence types (ST) have been identified and all belong to CC-828. The majority sequence types (ST) in C. coli were ST-825 (19/92; 20.65%) and ST-827 (16/92; 17.39%). Most of the C. coli isolates from ST-825 are from sewage (12/19; 63.16%) and those from ST-827 are mostly from humans (8/16; 50%). The 65.71% of C. coli isolates from both ST-825 and ST-827 were considered as multiresistance (23/35) (Figure 1). The distribution of multiresistant isolates following the population structure of C. jejuni and C. coli is shown in Figure 1. The diversity of sequence types from the Campylobacter collection used in this study is available (Table 2). Página 120 de 200 Trabajos de investigación Figure 1. Genetic structure of C. jejuni (A) and C. coli (B) isolates. NJ Tree on core genome (595 genes). The bar-scale represents the number of substitutions per site. Numeric labels correspond to clonal complexes (CC). Campylobacter isolates resistant to at least three classes of antibiotics are considered as multirresistant. Página 121 de 200   Trabajos de investigación Table 2. Clonal complexes (CC) and sequence types (ST) of the Campylobacter isolates analysed in this study. C. jejuni (N=163) CC ST No. of isolates (%) CC-21 ST-19 1 Human (0.6), 1 Cattle (0.6) ST-21 9 Human (5.5), 4 Cattle (2.5), 1 Broiler (0.6) ST-47 1 Human (0.6) ST-50 4 Human (2.4), 1 Cattle (0.6) ST-53 4 Human (2.4) ST-883 1 Human (0.6) ST-3769 2 Human (1.2) CC-206 ST-46 1 Human (0.6) ST-122 5 Human (3.1), 2 Cattle (1.2) ST-227 1 Human (0.6), 1 Cattle (0.6) ST-572 7 Human (4.3), 1 Broiler (0.6) ST-2112 1 Human (0.6) CC-443 ST-51 4 Human (2.4) ST-440 1 Human (0.6) ST-443 3 Human (1.8) ST-772 1 Human (0.6) ST-859 1 Human (0.6) ST-2928 1 Human (0.6) Unknown 2 Human (1.2) CC-45 CC-464 CC-353 ST-45 ST-137 ST-233 ST-538 ST-583 ST-2109 ST-464 ST-5 ST-356 2 Broiler (1.2) 3 Broiler (1.8) 2 Human (1.2) 1 Human (0.6) 1 Human (0.6) 1 Sewage (0.6) 7 Human (4.3), 1 Broiler (0.6), 1 Cattle (0.6) 2 Human (1.2) 6 Human (3.7) CC-354 ST-354 6 Human (3.7), 1 Broler (0.6), 1 Cattle (0.6) CC-42 ST-42 ST-469 ST-575 ST-4016 3 Cattle (1.8) 1 Human (0.6), 1 Broiler (0.6) 1 Cattle (0.6) 1 Broiler (0.6), 1 Cattle (0.6) Página 122 de 200 Trabajos de investigación Table 2. Clonal complexes (CC) and sequence types (ST) of the Campylobacter isolates analysed in this study. C. jejuni (N=163) CC ST No. of isolates (%) CC-61 ST-61 8 Cattle (4.9) CC-22 ST-22 6 Human (3.7), 2 Sewage (1.2) CC-658 ST-523 2 Human (1.2) ST-1044 2 Human (1.2), 1 Broiler (0.6) ST-2180 1 Human (0.6) CC-257 ST-257 1 Human (0.6) ST-990 4 Human (2.4) CC-607 ST-607 1 Human (0.6) ST-1707 1 Human (0.6), 1 Sewage (0.6) ST-7110 1 Broiler (0.6) CC-362 ST-2123 2 Human (1.2), 1 Sewage (0.6) CC-52 ST-52 1 Human (0.6), 1 Broiler (0.6), 1 Cattle (0.6) CC-48 ST-48 2 Human (1.2) CC-460 ST-2844 1 Human (0.6) CC-49 ST-49 1 Human (0.6) CC-446 ST-450 1 Human (0.6) CC-574 ST-305 1 Human (0.6) Unknown ST-441 4 Human (2.4), 1 Cattle (0.6), 1 Broiler (0.6) ST-531 2 Human (1.2) ST-2133 3 Human (1.8) ST-457 1 Human (0.6) ST-586 1 Cattle (0.6) ST-1710 1 Broiler (0.6) ST-2274 1 Human (0.6) ST-2324 1 Human (0.6) ST-3030 1 Broiler (0.6) C. coli (N=89) CC ST No. of isolates (%) CC-828 ST-825 19 Sewage (11.7) ST-826 1 Sewage (1.1) ST-827 16 Sewage (18) ST-829 5 Sewage (5.6) ST-830 2 Sewage (2.2) Página 123 de 200   Trabajos de investigación Table 2. Clonal complexes (CC) and sequence types (ST) of the Campylobacter isolates analysed in this study. C. jejuni (N=163) CC ST No. of isolates (%) ST-832 1 Sewage (1.1) ST-854 2 Sewage (2.2) ST-860 1 Sewage (1.1), 2 Human (2.2) ST-872 2 Human (2.2) ST-887 2 Human (2.2) ST-894 2 Human (2.2) ST-899 3 Human (3.4) ST-901 1 Human (1.1) ST-902 2 Human (2.2) ST-962 1 Human (1.1) ST-1055 6 Human (6.7) ST-1107 1 Human (1.1) ST-1112 1 Human (1.1) ST-1556 1 Human (1.1) ST-1666 2 Human (2.2) ST-2077 1 Human (1.1), 1 Broiler (1.1) ST-2097 4 Broiler (4.5), 1 Pig (1.1) ST-2741 1 Broiler (1.1) ST-3017 2 Pig (2.2) ST-3020 1 Human (1.1), 1 Pig (1.1) ST-3246 1 Human (1.1) ST-5659 3 Human (3.4) ST-7622 1 Human (1.1) Antibiotic resistance genes present in multiresistant Campylobacter isolates. In order to identify the antibiotic resistance genes present in Campylobacter, the genomes sequenced in this study were compared with The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARDdb) [25]. Table 3 shows the antibiotic resistance genes identified in Campylobacter pooled into multirresistant and non- multirresistant isolates from animals, humans and sewage. Página 124 de 200 Trabajos de investigación The presence of the genes ant(6)-Ib, sat-4, ant-like, ant(6)-Ia, aad9, sat-1, aph(2)- IIIa, aph(3)-IIIa, lnuC and hyg is associated with multirresistant isolates (p<0.001). In the case of apr and erm(B) genes there is no significance because of the low number of positive isolates. Multirresistant and non-multirresistant Campylobacter isolates show significant differences in the antimicrobial resistance genetic profile according to the origin, except for the blaOXA-61 and ant-like gene. The blaOXA-61 gene is more prevalent in C. jejuni than in C. coli (108/168; 64.3% and 47/92; 51.09% respectively) (p<0.05). Multiresistant Campylobacter isolates shown different presence of the blaOXA-61 gene according to the origin (p<0.05). This gene is more prevalent in animal isolates (25/28; 89.23%) than in those from humans (15/25; 60%) or from sewage (9/27; 33.33%). The ant-like gene is more prevalent in C. coli than in C. jejuni (38/92; 41% and 2/168; 1.2% respectively) (p<0.001). The presence of the ant-like gene is different depending on the animal, human or residual water source in both resistant (p<0.05) and non-resistant Campylobacter isolates (p<0.01). In the case of non-multirresistant isolates, the frequency difference of the ant-like is probably because most of the human isolates are C. jejuni and those from sewage are C. coli. Página 125 de 200   Trabajos de investigación Table 3. Percentage of Campylobacter isolates carrying each antibiotic resistance gene. No. Isolates multirresistant1 (%) No. Isolates non-multirresistant2 (%) Genes Animals (n=28) Humans (n=25) Sewage (n=27) Animals (n=27) Humans (n=121) Sewage (n=28) blaOXA-61 25 (89.28) 13 (50) 9 (33.33) 17 (62.96) 76 (62.81) 14 (50) tetO 21 (75) 19 (76) 23 (85.19) 21 (77.78) 91 (75.21) 17 (60.71) ant-like 5 (17.86) 12 (48) 11 (40.74) 1 (3.7) 1 (0.83) 8 (28.57) ant(6)-Ia 5 (17.85) 3 (12) 6 (22.22) 1 (3.7) 1 (0.83) sat-4 6 (21.43) 3 (12) 5 (18.51) 1 (3.7) 1 (0.83) lnuC 1 (3.57) 3 (11.11) 1 (0.83) 4 (14.29) ant(6)-Ib 10 (35.71) 5 (20) 8 (29.63) aad9 4 (14.29) 6 (24) 8 (29.63) aph(3)-IIIa 1 (3.57) 2 (8) 3 (11.11) aph(2)-IIIa 2 (7.14) 1 (4) 4 (14.81) hyg 1 (3.57) 2 (8) 6 (22.22) apr 1 (3.57) 1 (4) sat-1 3 (10.71) erm(B) 1 (3.57) 1Isolates resistant to at least three classes of antibiotics. 2Isolates susceptible to less than three classes of antibiotics. With the aim of identifying possible multirresistance genomic islands, the antibiotic resistance genes identified in each isolate are shown in Figure 2. In section B of Figure 2, it is shown that there are associations of some antibiotic resistance genes with others, which could suppose the insertion of these genes in genomic islands of multi-resistance. The genomic islands identified in this study are shown in Figure 3. Página 126 de 200 Trabajos de investigación Figure 2. Antimicrobial resistance genes identified in Campylobacter isolates. The output has been grouped in non-multirresistant (A) and multirresistant Campylobacter isolates (B). The presence of the antimicrobial resistance gene is represented by a pink label. Isolates from animals are represented by green (A: n=27 and B: n=28), humans by red (A: n=121 and B: n=25) and sewage by blue (A: n=28 and B: n=27). The bar represents the number of substitutions per site. Two types of genetic associations in the genomic islands were identified and both are repeated in isolated from animals, humans and residual water. First, the association between genes ant(6)-Ia, sat-4 and aph(3)-III, which is further increased by aph(2) and ant9 in the sewage isolates. Second, an association of genes tetO, ant(9) and ant(6)-Ib was also evidenced (Figure 3). Página 127 de 200   2 Trabajos de investigación A. Animals B. Humans C. jejuni Cattle C. jejuni (2) Broiler C. coli Pig C. coli Broiler C. coli Broiler C. coli Broiler C. jejuni (4) Broiler and cattle C. coli Broiler tetO ant(6)-Ia sat-4 aph(3´)-III ΔtetOlnuC aph(2) sat-1 apmA erm(B) ant(6)-Ib ant(9) hpt C. jejuni Broiler hpt ant(9) tetO ΔtetO apmA ant(6)-Ib C. coli (3) C. coli C. coli C. coli (3) C. jejuni ant(6)-Ia sat-4 aph(3´)-III C. Sewage C. coli aph(2) C. coli C. coli C. coli C. coli (3) C. coli ant(6)-Ib ant(9) tetO hpt ΔtetO ant(6)-Ia sat-4 aph(3´)-III Figure 3. Schematic view of multidrug-resistant genomic islands identified in Campylobacter isolates from animals (A), humans (B) and sewage (C). The grey shading indicates regions sharing > 95% DNA identity. Each gene is identified with a different color. Identical alleles of antibiotic resistance genes present in C. jejuni and C. coli. In order to identify the possible horizontal transfer of antibiotic resistance genes between C. jejuni and C. coli, the allelic diversity of the resistance genes have been analysed. Identical alleles were identified in both species of the antimicrobial resistance genes blaOXA-61, tetO, ant(6)-Ia, ant(6)-Ib and sat-4. The blaOXA-61 gene presents a diversity of 35 different alleles and two of them are detected in both species, one of these in 16 C. coli and 49 C. jejuni isolates Página 128 de 200 Trabajos de investigación and the other in 5 C. coli and 4 C. jejuni. The tetO gene presents the highest allelic diversity, with 48 identified different alleles, with only two identified in both Campylobacter species. The major tetO allele was present in 34 C. coli and 25 C. jejuni, whereasthe minor one exists in 2 C. coli and 26 C. jejuni isolates. Two of the ten alleles identified in the ant(6)-Ia gene are present in both species, with 6 C. coli and 3 C. jejuni isolates in one case and 3 C. coli and 3 C. jejuni in the other. Only one out of the 3 alleles identified for the ant(6)-Ib gene was located in 14 C. coli and 5 C. jejuni. Finally the sat-4 gene shares five different alleles among which two were identified in both species of Campylobacter, including4 C. coli and 3 C. jejuni isolates in one case and 2 C. coli and 1 C. jejuni in the other. Beside this, any association could be found between particular alleles and the origin (animals, humans or wastewater) of isolates. Discussion There are currently 700,000 annual deaths from antibiotic-resistant bacterial infections and if no action is taken, this number can increase to 10 million by 2050 [27]. We are currently experiencing a crisis because of resistance to antibiotics since human infections caused by bacteria resistant to all available antibiotics have been reported. The World Health Organization (WHO) has published this year a list of antibiotic-resistant "priority pathogens", which includes the 12 families of bacteria most dangerous to human health and Campylobacter is one of them [13]. Being the main cause of gastroenteritis in humans and possessing multiresistance genomic islands makes the genus Campylobacter a priority in terms of public health [26]. It has been identified in isolates from China and recently in Europe that the genomic islands of multiresistance present in Campylobacter also carry the gene of resistance to erythromycin, drug of choice against infections probed by this bacterium [11, 12]. The aim of this work was to identify which antibiotic resistance genes are present in Campylobacter and to know their potential genetic mechanisms of transmission in isolates from animals, humans and wastewater. Antibiotics in human and veterinary medicine act as a selective agent for bacteria resistant to these drugs and may cause mechanisms of resistance to be transmitted to other commensal bacteria [28]. Farm residues such as manure or human wastewater can cause antibiotic-resistant bacterial isolates to be transferred into the environment [29]. For all this, the first objective of this study was to compare the resistance phenotypes between animal, human and sewage Página 129 de 200   Trabajos de investigación isolates. To simplify the analysis and following the EFSA criteria, we have considered each Campylobacter isolate to be multiresistant if it shows resistant to three or more classes of antibiotics, or not multiresistant. Most isolates of C. coli are multiresistant (62%) whereas in the case of C. jejuni they are a minority (18%). These results are in line with those published in the last EFSA report, where the presence of isolates resistant to four classes of antibiotics was higher in C. coli (1 isolate in Portugal, 3 in France and 5 in Spain) than in C. jejuni (1 isolate in France and 2 in Spain) isolates from humans [26]. According with our results, the great difference between the multiresistant isolates of C. coli and C. jejuni is the presence of resistance to aminoglycosides (streptomycin and gentamicin). Resistance to aminoglycosides is mainly due to enzymes that modify the antibiotic and in the case of Campylobacter the genes encoding these enzymes are usually associated in genomic islands [9-12]. These genomic islands carry several genes of resistance to antibiotics, mainly aminoglycosides, and they have the capacity to be transferred from one cell to another [9, 10]. As the results of the present work show, the number of multiresistance genomic islands identified in C. coli (n=21) has been much higher than those identified in C. jejuni (n=9). This may be due to lower horizontal gene transfer in C. jejuni isolates than in C. coli by barriers such as C. jejuni CRISPR-Cas system [30]. The entire Campylobacter isolate collection of this study has been characterized by the MLST technique and the four major CCs were CC-21, CC-206, CC-443, CC-45 and CC-464. It is well known that the clonal complexes CC-21 mainly and CC-45 are the most distributed in humans, animals and even food of animal origin or water [6, 31, 32]. The CC-443 is is also considered to be one of the most prevalent in C. jejuni isolated from humans, standing out in Mediterranean countries like Italy, Croatia and now Spain [33-35]. The clonal complex CC-464 was first identified in a human isolate from Japan in 2001 and since then its prevalence in Campylobacter isolated from animals and humans have been growing [4, 36, 37]. The population structure of C. coli is very different from that of C. jejuni since it only has two clonal complexes [38]. All C. coli isolates identified in the present study belonged to the major clonal complex of this species, CC-828. Lineages CC-828 and CC-1150 form the two CCs identified in Campylobacter coli and both are part of one of the three clades within this species [38]. Página 130 de 200 Trabajos de investigación The next objective of this study was to identify which antibiotic resistance genes were present in Campylobacter and to evaluate if there was association between these genes and the level of multiresistance, as well as the origin of isolation. In this study the following antibiotic resistance genes have been identified: blaOXA- 61, tetO, ant-like, ant(6)-Ia, sat-4, lnuC, ant(6)-Ib, aad9, aph(3)-IIIa, aph(2)-IIIa, hyg, apr, sat-1 and erm(B). There were no significant differences between the percentage of multiresistant and non multiresistant isolates carrying the blaOXA- 61 and tetO genes. The gene blaOXA-61 is associated with ampicillin, amoxicillin, penicillin and ticarcillin resistance and its prevalence in Campylobacter is as high as to consider most of the isolates of this genus resistant to beta-lactams, except carbapenems [39, 40]. In this work the susceptibility of Campylobacter isolates to beta lactam antibiotics has not been evaluated. The presence of the tetO gene in the two groups of Campylobacter isolates (multiresistant or not) is due to its widespread distribution in this genus, which produces very high levels of resistance [26, 41, 42]. The high prevalence of tetO gene in Campylobacter is explained because its transfer does not require selective pressure [43]. Genes that offer resistance to aminoglycosides (apramycin, streptomycin, lincomycin, spectinomycin, streptothricin, kanamycin, neomycin, amikacin and gentamycin) and macrolides have been identified in this study. Recently, the World Health Organization (WHO) has reported the urgent need to identify new antibiotics against several pathogens, including Campylobacter [13]. In vitro tests have shown gentamicin as a possible treatment against campylobacteriosis produced by macrolide resistant bacteria [44]. In the present study, the gene for resistance to gentamicin aph(2)-III in C. coli isolated from animals and sewage has been identified. Since the first identification of the aph(2) gene in Campylobacter isolates the report of resistance to gentamicin in this bacterium has increased considerably and different variants of this gene have been identified in isolates from humans, animals and foods of animal origin [9, 45-47]. In Europe, the aph(2) gene has been identified in Campylobacter isolated from turkeys and chickens of Spanish origin, both works belonging to this doctoral thesis. All genes identified in this study, except blaOXA-61 and ant-like, have been identified in genomic islands of multiresistance. The association of antibiotic resistance genes in a cluster in Campylobacter is known, being first identified in Campylobacter isolated from chickens in China [9]. Aminoglycoside resistance Página 131 de 200   Trabajos de investigación genes were identified together, but a few years later, also in isolates of Chinese origin, genomic islands were identified with aminoglycoside and macrolide resistance genes [10]. In addition it has been proven that there is horizontal transfer of these genomic islands between different species of Campylobacter, which could imply a potential route of antibiotic-resistance transmission [11]. In the present work multiresistance genomic islands have been identified in Campylobacter isolates from animals, humans and sewage, which implies an active transfer of antimicrobial-resistance genes in Campylobacter. Comparing all these sequences, we can see two clusters of genes that could be transferred together, on the one hand the cluster and on the other hand. Cluster ant(6)-Ia, sat-4 and aph(3)-IIIa have been previously identified in Gram-positive bacteria such as Staphylococcus [48] and, following the genetic structure of these sequences in Campylobacter, it could have been inserted in cluster tetO, aad9 and ant(6)-Ib. One way to analyse the horizontal transfer between bacterial species is to compare the allelic sequences of certain genes [49]. The gene-flow between C. jejuni and C. coli is known, it is even said that we are facing a process of convergence between both species [8]. In order to evaluate the possible gene transfer of antibiotic resistance we have sought identical alleles of these genes. Identical alleles of blaOXA-61, tetO, ant(6)-Ia, ant(6)-Ib and sat-4 genes have been identified in C. jejuni and C. coli isolates, which could indicate a recent genetic exchange event. The exchange of these genes between both species of Campylobacter could help maintain antibiotic resistance genes in animals, humans and sewage. Wastewater contains traces of antibiotics, which could favour the selection of resistant bacteria [50]. Although there is controversy on this issue, part of the scientific community consider wastewater treatment plants as a possible route of transmission of antibiotic resistance to the environment [29, 51]. This work evidences the presence of Campylobacter isolated from wastewater carriers of genomic islands of multiresistance. This finding shows how the dispersion of antibiotic resistance develops from a one-health perspective in the bacterium that produces the largest number of food infections in the European Union. References 1. (EFSA), E.F.S.A., The trends and sources of zoonoses, European Union summary report on zoonotic agents and food-borne Página 132 de 200 Trabajos de investigación outbreaks in 2015. EFSA Journal, 2016. 14(12): p. 231. 2. Kaakoush, N.O., et al., Global Epidemiology of Campylobacter Infection. Clin Microbiol Rev, 2015. 28(3): p. 687- 720. 3. 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La infección se atribuye principalmente al consumo de alimentos de origen animal, principalmente carne de pollo, y en menor medida al consumo de agua contaminada o al contacto con animales de granja (186, 187). La infección, conocida como campilobacteriosis, produce diarrea principalmente, por lo que su tratamiento se basa en la reposición de líquidos y electrolitos. Aunque esta infección suele ser auto-limitante, ocasionalmente puede requerir tratamiento antibiótico en pacientes inmunodeprimidos o ante infecciones extra intestinales, siendo el antibiótico de elección la eritromicina (48). En la presente tesis doctoral se ha caracterizado una colección de aislados de C. jejuni y C. coli procedentes de personas, animales y aguas residuales, con el objetivo de analizar sus mecanismos de resistencia a antimicrobianos, las estructuras genéticas que los contienen y los grupos filogenéticos a los que pertenecen. 7.1 Diversidad genética de C. jejuni y C. coli La técnica de caracterización MLST ha permitido analizar la estructura poblacional de C. jejuni y C. coli y por tanto conocer en mayor profundidad la ecología de las especies bacterianas causantes de campilobacteriosis en personas. Desde el primer estudio de MLST en C. jejuni en el año 2001 en aislados del Reino Unido (66), muchos países han hecho estudios usando esta técnica. En la actualidad disponemos de bases de datos con información de los principales CCs y STs de Campylobacter identificadas en personas y animales principalmente, de diferentes continentes (http://pubmlst.org/campylobacter/) (Tabla 2 de la Introducción). Durante el presente trabajo de investigación (capítulo 6.4) se han caracterizado por MLST un total de 252 Campylobacter aislados de animales de abasto (portadores), personas (casos clínicos) y aguas residuales (pretratamiento), todos ellos obtenidos en España. En los aislados de C. jejuni (n=163), los CCs mayoritarios han sido CC-21 (29/163; 18%), CC-206 (19/163; 12%), CC-443 (13/163; 8%), CC- 45 (10/163; 6%) y CC-464 (9/163; 6%). Se ha aislado C. jejuni CC-21 de personas (22/29; 76%) y animales (7/29; 24%), siendo una proporción considerable de los aislados de ganado bovino (6/7; 86%) y un único aislado de pollos (1/7; 14%). Aunque también se ha identificado en otros animales como el pollo (188), el CC-21 de C. jejuni es el más frecuentemente aislado de personas y ganado bovino, tanto en nuestro país (189), como a nivel internacional. Como vemos en la Tabla 2 de la Introducción (Capítulo 3.2.2.), este Página 140 de 200 http://pubmlst.org/campylobacter Discusión CC es el más representado en personas y vacas procedentes de América, Europa y Oceanía. Pese a que el CC-21 de C. jejuni es el principal CC identificado en personas y ganado bovino, sólo el 10% de las infecciones humanas se atribuyen al consumo de productos derivados de vacuno (190). Parece evidente que C. jejuni CC-21 presenta ventajas de adaptación al ganado bovino, incluso ha sido un CC muy utilizado para estudiar la asociación a hospedador en Campylobacter. Se ha descrito como aislados de C. jejuni CC-21 se han especializado en la adaptación de ganado bovino exclusivamente, surgiendo así el CC-61 (62, 191). La caracterización genómica llevada a cabo en el estudio 4 de esta tesis doctoral (Capítulo 6.4) permite ver la asociación entre ambos CCs. Respecto a muestras de agua, no se han identificado C. jejuni CC-21 en efluentes urbanos, probablemente debido al reducido número de aislados de C. jejuni del que disponíamos. Un estudio llevado a cabo en diferentes tipos de muestras de agua procedentes del área Mediterránea de nuestro país, ha identificado C. jejuni CC-21 en efluentes urbanos y aguas residuales de granjas de pollos (192). Respecto al CC-206 nuestros resultados coinciden con la bibliografía, que lo relaciona con personas (15/19; 79%) y animales (4/19; 21%), principalmente bovino (189). El CC-443, según nuestros resultados (13/13; 100%) y estudios previos, se asocia con C. jejuni aislados de personas (193-195) aunque también se ha descrito su presencia en muestras de carne de pollo procedentes de China (196) o Vietnam (197). El CC-443 de C. jejuni no es uno de los principales CCs causantes de infección en humanos a nivel global (Tabla 2 de la Introducción; pág. 39), quizás debido a que su presencia en Europa está asociada con países del mediterráneo como Italia (198), Croacia (199) y ahora España. Aislados de C. jejuni CC-45, al igual que los del CC-21, también están distribuidos entre personas, animales y muestras ambientales (66, 190, 200). La mitad de los aislados de C. jejuni CC-45 de nuestro estudio proceden de animales (5/10; 50%), concretamente de pollos, mientras que el resto de aislados provienen de personas (4/10; 40%) o aguas residuales (1/10; 10%). Según nuestros resultados (Capítulo 6.4) y otros estudios basados en C. jejuni CC-45, parecería que éste CC está predominantemente asociado con animales, o al menos su relación con casos clínicos es menos frecuente que en el caso de C. jejuni CC-21 (189). El último CC mayoritario de nuestro estudio ha sido CC-464 y se ha identificado principalmente en personas (7/9; 78%) seguido de dos aislados de animales (2/9; 12%), uno de pollo y otro de ganado bovino. Aislados de C. jejuni CC-464 se Página 141 de 200   Discusión identificaron por primera vez en un paciente afectado de campilobacteriosis de Japón en el año 2001 y desde entonces su presencia animales y personas se ha mantenido e incluso se ha informado de un aumento en su frecuencia de detección (194, 201, 202). La estructura de la población de C. coli es muy diferente de la de C. jejuni, se agrupan en tres clados o grupos filogenéticos distintos debido a que presenta una diversidad genética mucho menor entre sus aislados. Esta menor diversidad se ve reflejada en un reducido número de CCs, siendo dos los mayoritarios C. coli CC- 828 y C. coli CC-1150 (203). Los aislados de C. coli CC-828 y CC-1150 se encuentran formando parte del clado 1, por lo que están relacionados genéticamente (204). Sin embargo, los clados 2 y 3 están formados por aislados de C. coli cuyas STs no están asignadas a ningún CC (204). Todos los aislados de C. coli identificados en esta tesis doctoral pertenecieron al CC-828 (89/89; 100%), lo que refleja una población homogénea, y no mostraron diferencias según la matriz u origen de la muestra. Como vemos, determinados CCs tienen mayor frecuencia de detección que otros, lo que podría estar relacionado con que se trate de líneas genéticas que presenten ventajas de colonización respecto a los demás aislados. Es sabido que algunos aislados de Campylobacter presentan unos factores de colonización que otros aislados no poseen, lo que supondría una ventaja a la hora de sobrevivir en determinados ambientes (33, 205). Además se ha visto que ciertos factores de colonización, como el gen gamma glutamiltranspeptidasa (ggt), pueden estar asociados a un CC o ST determinado, lo que apoyaría la teoría de una mayor dispersión de ciertas líneas genéticas de Campylobacter (46, 206). Con el objetivo de identificar la diversidad genética presente en ciertos CCs de Campylobacter, en el presente trabajo de investigación (Capítulo 6.1) se analizó la presencia de este marcador genético (ggt) en una colección de aislados de C. jejuni pertenecientes a tres CCs asociados con casos clínicos: dos CCs ampliamente distribuidos en animales domésticos (CC-21 y CC-45) y un CC asociado a pollos, principal fuente de campilobacteriosis (CC-257). Nuestros resultados coinciden con otros en los que el gen ggt estuvo asociado significativamente con el CC-45 y prácticamente fue ausente en aislados de C. jejuni CC-21 y CC-257 (46). Además del gen ggt, se identificaron otros factores de colonización, presentes sólo en determinadas cepas, en los aislados de C. jejuni ST-45: ansBs, fucP y dmsA. La diversidad de factores de colonización encontrada Página 142 de 200 Discusión en C. jejuni ST-45, podría explicar la ventaja que presenta este CC para colonizar diferentes nichos. Si recordamos los CCs mayoritarios de C. jejuni aislados de personas, veremos que CC-45 y CC-21 presentaban ciertas diferencias en cuanto a la frecuencia de detección según hospedador. Aislados de C. jejuni CC-45 están ampliamente distribuidos en animales domésticos y a este CC se le asocian los genes de colonización ggt y ansBs (206). En cambio, aislados de C. jejuni CC-21 se asocian principalmente con ganado bovino y en este caso el factor de colonización es el gen fucP (206). Según nuestro estudio, parece que la capacidad de colonización de cada cepa de C. jejuni no se limita a la presencia de dos genes, sino que se han identificado cuatro genes que dan lugar a cinco perfiles metabólicos diferentes: (1) ansBs y dmsA, (2) dmsA, (3) ggt, ansBs y dmsA, (4) ggt, ansBs y fucP y (5) ggt y ansBs. En un estudio anterior (206), se identificaron tres perfiles diferentes en C. jejuni ST-45, ya que no se había evaluado la presencia de los genes fucP y dmsA. Nuestros resultados indicarían que la presencia de los genes ggt, ansBs, dmsA y fucP en aislados de C. jejuni CC-45 supondría una ventaja de colonización y explicaría la mayor dispersión de este CC. 7.2 Resistencia a macrólidos de C. jejuni y C. coli Las campilobacteriosis, infecciones producidas principalmente por C. jejuni y C. coli, suelen ser auto-limitantes aunque en ocasiones precisan de antimicrobianos (23). El tratamiento está basado en fluoroquinolonas ó macrólidos, aunque el incremento de resistencias que presenta Campylobacter hacia la primera clase de antimicrobianos hace que los macrólidos sean el tratamiento de elección, concretamente eritromicina (207). Además, la infección tiene una alta frecuencia en niños de entre 1 y 4 años de edad y el uso de fluoroquinolonas en pacientes pediátricos puede estar limitado (51, 208). Los estudios 2 y 3 de esta tesis doctoral (Capítulos 6.2 y 6.3) han estado enfocados en la caracterización de los mecanismos de resistencia a eritromicina, principalmente vinculados con genes de transferencia horizontal. A partir de una colección de aislados de C. jejuni y C. coli (procedentes de animales de abasto y aguas residuales), altamente resistentes a eritromicina (CMI > 32 mg/L), se evaluó de nuevo el nivel de resistencia a este antibiótico ampliando el rango de concentración empleada (0,5 – 1024 mg/L). La caracterización molecular de la resistencia a eritromicina se llevó a cabo analizando la presencia del gen erm(B) así como de mutaciones específicas en el gen 23S y en las proteínas ribosomales Página 143 de 200   Discusión L4 y L22. También se evaluó el efecto de las bombas de eflujo sobre la resistencia a macrólidos mediante el uso de un inhibidor de estas proteínas. No todos los datos de la caracterización de la resistencia a eritromicina han sido incluidos en los capítulos 8.2 y 8.3 (datos no publicados). Los aislados procedentes de ganado bovino (n=11) y aguas residuales (n=14) mostraron niveles de resistencia a eritromicina más bajos (32-256 mg/L) que los aislados procedentes de pollos (n=29) o ganado porcino (n=34) (256-1024 mg/L). Esta diferencia podría deberse a que el número de aislados de C. jejuni en ganado bovino y aguas residuales era mayor que en ganado porcino o pollos de engordeaunque en general, los porcentajes de resistencias en bovino son menores que en porcino y pollos (209). Aparte de las diferencias entre hospedador, debido probablemente a la mayor presión selectiva por mayor uso de antimicrobianos (210), hay un efecto de especie ya que C. jejuni presenta fenotipos más sensibles que C. coli (121, 136, 183). En cuanto a la caracterización molecular, el 65% de los aislados (58/88) mostraron como mecanismo de resistencia a eritromicina la mutación A2075G del gen 23S, conocido como el factor de resistencia a macrólidos más extendido en Campylobacter (134, 211-213). También se identificaron, en dos aislados de C. coli, otras mutaciones en el gen 23S capaces de generar altos niveles de resistencia a eritromicina (CMI > 1024 mg/L), concretamente A2074C y A2074G. La frecuencia de mutaciones en la posición 2074 es mucho menor que la de las mutaciones encontradas en la posición 2075 (211, 214). Polimorfismos en el nucleótido 2074 del gen 23S, podrían tener un efecto negativo sobre la tasa de crecimiento de la bacteria que lo porta, lo que explicaría la rara aparición de esta mutación en aislados de Campylobacter (211). Además, los dos aislados de C. coli que portan la mutación en la base 2074 no mostraron un aumento de susceptibilidad frente a eritromicina al inhibir las bombas de eflujo, lo que indicaría que la resistencia en este caso no se produce por un efecto sinérgico entre dos mecanismos. Nuestros resultados son coincidentes con otro estudio en el que un aislado de C. jejuni con una mutación en la base 2074 del gen 23S no modificó su resistencia a eritromicina al inhibir el efecto de las bombas de eflujo (143). Por el contrario, aislados de Campylobacter con mutaciones en la base 2075 del gen 23S, si mostraron un efecto sinérgico con las bombas de eflujo y por tanto un aumento de la sensibilidad al inhibir el efecto de éstas (215). Otros autores han llevado a cabo estudios de coste biológico con el objetivo de conocer el efecto que Página 144 de 200 Discusión tienen estas mutaciones en las bacterias que las portan (113, 216). Aislados de Campylobacter con mutaciones en la posición 2074 o 2075 del gen 23S, mostraron tasas de crecimiento inferiores que aislados de tipo salvaje (113). Estos datos sugieren que en ausencia de antimicrobianos, las mutaciones que confieren resistencia a macrólidos hacen que Campylobacter se adapte peor a su hospedador natural (216). El 33% (29/88) de los aislados resistentes a eritromicina no mostraron mutaciones en el gen 23S ni en las proteínas ribosomales L4 y L22, por lo que la resistencia en estos casos se asoció con otros mecanismos, como las bombas de eflujo (28/88). Este hecho fue probado ya que el uso del inhibidor de bombas de eflujo revertió la resistencia a eritromicina de todos los aislados (28/29). El aislado restante (1/29) presentó el gen erm(B) como mecanismos de resistencia a eritromicina. Las bombas de eflujo pueden generar resistencia a macrólidos en Campylobacter sin la ayuda o sinergia de otros mecanismos de resistencia como mutaciones del gen 23S (135). Respecto a las proteínas ribosomales L4 (gen rplD) y L22 (gen rplV), no se identificaron en ningún caso mutaciones o inserciones específicas a las que pudiera atribuirse el fenotipo de resistencia a eritromicina. Existen tres mutaciones descritas en Campylobacter, asociadas con la resistencia a macrólidos, para la proteína L4: G57A, G57V y G74A; en el caso del gen rplV (proteína L22), la resistencia parece estar relacionada con una inserción en la posición 86 o 98 (154, 217). Según la bibliografía y nuestros resultados, la resistencia a macrólidos es generalmente más prevalente en aislados de C. coli que en C. jejuni, lo que inicialmente sugeriría una mayor tasa de mutación. Sin embargo, hay datos que (aunque con un número limitado de aislados) no muestran diferencias significativas entre la frecuencia de mutación de ambas especies, lo que sugiere que C. coli no es más mutable que C. jejuni (218). En esta tesis doctoral se ha identificado, por primera vez en Europa, el gen de resistencia a eritromicina erm(B) en Campylobacter. Concretamente se ha identificado en dos aislados de C. coli procedentes de pollos de engorde (capítulos 6.2 y 6.4) y en dos C. coli procedentes de pavos (capítulo 6.3). Al igual que en los Campylobacter aislados en China, el gen erm(B) se ha localizado en islas genómicas junto con otros genes de resistencia a antimicrobianos, concretamente aminoglucósidos (150, 151). La diversidad de islas genómicas de multirresistencia en Campylobacter se puso de manifiesto en un trabajo posterior donde, según el Página 145 de 200   Discusión contenido genético y los sitios de inserción en el cromosoma, se agruparon en seis tipos de secuencias (219). En China se ha identificado el gen erm(B) en 57 C. coli y 1 C. jejuni aislados de personas y animales (patos, cerdos y pollos) y en todos los casos se localizaron en islas genómicas de multirresistencia. Nuestro estudio por tanto (capítulo 6.3) pone de manifiesto la presencia del gen erm(B) en Campylobacter aislados de pavos por vez primera. En China se identificaron seis tipos de islas genómicas en C. coli (I- VI): los tipos I y II se identificaron aislados de cerdos, el tipo III fue el más común y se identificó en personas y animales (pollo y pato) y los tipos IV, V y VI sólo se identificaron en Campylobacter aislados de personas (150). La isla genómica portadora del gen erm(B) identificada en C. jejuni en pollos de engorde (capítulo 6.2) se denominó como de tipo VII por presentar diferencias con las anteriormente identificadas (172). En total, en España se han identificado cuatro aislados de Campylobacter portadores del gen erm(B) en una isla genómica de multirresistencia. Los cuatro aislados de C. coli positivos al gen erm(B) se aislaron de aves, dos de pollos y dos de pavos. En la producción de aves es común el uso de antimicrobianos y éstos pueden actuar como agentes de selección de microorganismos resistentes (220), favoreciendo así la selección de aislados portadores de genes de resistencia. Las islas genómicas portadoras del gen erm(B) identificadas en esta tesis doctoral presentan una organización de los genes diferente a las descritas previamente. Los genes de resistencia a antimicrobianos presentes en las islas genómicas identificadas en Campylobacter son idénticos o casi idénticos (similitud >90%) a sus homólogos en bacterias grampositivas, lo que supondría un origen común (150). Es de sobra conocido que bacterias grampositivas como Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus portan varios genes de resistencia a antimicrobianos (164, 221). Se considera que los genes de resistencia a antimicrobianos identificados en bacterias gramnegativas, como E. coli, K. pneumoniae o Campylobacter (164, 173, 221-223), provienen de bacterias grampositivas (219). Con el objetivo de analizar el posible origen del gen de resistencia a eritromicina en Campylobacter, se estudiaron las regiones de la primera isla genómica identificada en España y la diversidad alélica del gen erm(B). La isla genómica identificada en el aislado C. coli ZTA09/02204 (capítulo 6.2) se dividió en tres regiones (regiones A, B y C) de acuerdo con el porcentaje de guanina Página 146 de 200 Discusión y citosina, y se estudió la homología de cada una de ellas. Así se vio que la región que porta el gen erm(B) (región B), presenta una identidad del 99% con Eggerthella sp. YY918 (AP012211), bacteria grampositiva. También muestra una similitud igual con la bacteria gramnegativa Bacteroides uniformis WH207 (AY345595). Ambas especies bacterianas, Eggerthella sp y B. Uniformis, forman parte de la microbiota intestinal, pudiendo así compartir nicho con Campylobacter y favorecerse el intercambio de ADN (224). Los C. coli aislados de pavos muestran diferencias respecto a C. coli ZTA09/02204 ya que no presentan región B. Uno de los aislados de pavos (C. coli ZTA14/01086), presenta las regiones A y C, mientras que el otro aislado (C. coli ZTA14/01426) en lugar de la región A posee los genes de resistencia a aminoglucósidos aph(2)-IIIa y aph(3)-IIIa (Figura 1; Capítulo 6.3). En cuanto al estudio de comparación alélica de erm(B), se identificaron varias posibles rutas de transmisión. Por un lado, se identificaron alelos de erm(B) idénticos a los de Campylobacter en Enterococcus, Streptococcus, Peptoclostridium, Anaerostipes, Arcanobacterium, Eggerthella, Lactobacillus, Lactococcus, Macrococcus y Selenomonas, lo que sugiere su adquisición horizontal desde bacterias grampositivas, como se describió anteriormente (127, 150, 151). Los alelos del gen erm(B) identificados en esta tesis doctoral han sido previamente identificados principalmente en personas y patógenos bacterianos de ganado porcino (Streptococcus suis) procedentes de Asia y Europa. La bacteria S. suis, patógena oportunista para personas y ganado porcino, es considerada un reservorio de genes de resistencia a antimicrobianos (225, 226). En este microoganismo se han identificado elementos genéticos móviles portadores de genes de resistencia como erm(B), tet(O) y genes de resistencia a aminoglucósidos (227). Algunos autores advierten de que el uso de antimicrobianos combinados en granjas de cerdos podría seleccionar bacterias portadoras de mecanismos de resistencia frente a diferentes antimicrobianos (228). Uno de los alelos de erm(B) identificados en el estudio 3 (alelo 2; capítulo 6.3) ha sido identificado en nueve géneros bacterianos, muy por encima de los alelos 1, 3 y 4 (5, 5 y 1 géneros bacterianos respectivamente). Todos los géneros bacterianos que se identificaron con el alelo 2 de erm(B) pertenecen al filo Firmicutes, excepto dos que son Actinobacterias. Estos géneros bacterianos están presentes en el tracto gastrointestinal por lo que comparten su nicho ecológico con Campylobacter (221). Se sabe que, la transferencia de genes de resistencia a antimicrobianos Página 147 de 200   Discusión entre bacterias de diferentes géneros, es una realidad en el tracto digestivo del hombre (229). El hecho de haber detectado el gen de resistencia a eritromicina erm(B) en diferentes islas genómicas y con secuencias similares a las descritas en otros microorganismos, sugiere transferencia horizontal y da una idea de la gran diversidad genética y las posibilidades de diseminación de resistencias a varias clases de antimicrobianos debido a la asociación de los genes de resistencias en islas genómicas. El uso conjunto de eritromicina y lincosamida, tratamiento autorizado por la UE frente a micoplasmosis, salmonelosis y colibacilosis en pollos, podría ayudar a seleccionar aislados de Campylobacter portadores del gen erm(B) (230). 7.3 Genes de resistencia a antimicrobianos en C. jejuni y C. coli En nuestro estudio, los porcentajes de resistencia de los aislados de C. jejuni (n=163) y C. coli (n=89) fueron los siguientes: ciprofloxacina (91,6 y 92,5), tetraciclina (94,1 y 93,8), eritromicina (0,8 y 17,5), estreptomicina (6,7 y 60) y gentamicina (1,7 y 6,3). Se observó una mayor frecuencia de resistencia en C. coli para eritromicina, estreptomicina y gentamicina. Además, 4 de los 163 aislamientos de C. jejuni (2,4%) fueron susceptibles a todos los antibióticos probados, mientras que ningún aislado de C. coli fue susceptible a menos de 2 antibióticos. El fenotipo de resistencia mayoritaria en C. jejuni ha sido CT (113/163; 69%) y principalmente se ha asociado con aislados procedentes de personas (95/115; 82%). En cambio, el fenotipo mayoritario en C. coli ha sido CTS (29/89; 33%), principalmente asociado con aislados de aguas residuales (17/29; 59%) y de personas (11/29; 38%). Respecto a la evolución de los fenotipos de resistencia, el reducido número de aislados de cada año (2008-2014) del que disponemos no permite hacer una evaluación en el tiempo. La mayoría de aislados de C. coli fueron resistentes a tres o más clases de antimicrobianos (multirresistencia) mientras que en los aislados de C. jejuni fueron una minoría. Nuestros resultados coinciden con los publicados en el último informe de la EFSA, donde la presencia de aislados multiresistentes fue mayor en C. coli que en C. jejuni procedentes de personas (121). Datos de la UE del año 2015 muestran como el 15% de los aislados de C. coli procedentes de personas fueron susceptibles a todas las clases de antimicrobianos testados, mientras que en el caso de C. jejuni fue del 31,9%. El mismo estudio muestra como el 11,5% de los aislados de C. coli y el 8,7% de los aislados de C. jejuni procedentes de personas, Página 148 de 200 Discusión fueron multirresistentes. En cuanto al porcentaje de aislados multirresistentes hay gran variabilidad entre países ya que, en el caso de C. coli oscila entre el 5,1% en Austria y el 53,5% en Portugal (121). Respecto a Campylobacter procedentes de animales, por ejemplo en pollos, se aprecia de nuevo la gran diferencia de porcentaje de aislados multirresistentes entre C. coli (18,3%) y C. jejuni (4,6%) (136). Para otros animales, como el ganado porcino y bovino, es difícil hacer la comparativa entre especies debido al reducido número de aislados de C. jejuni procedentes de cerdo o de C. coli procedentes de ganado bovino, como hemos citado anteriormente (Capítulo 3.2.3). En el caso del ganado porcino, el 19,5% de aislados de C. coli son multirresistentes (121), mientras que el porcentaje de aislados de C. jejuni procedentes de ganado bovino oscila entre el 2-7% (183). Los datos relativos a pavos muestran como entre el 1- 8% de los aislados de C. jejuni son multirresistentes, en cambio el reducido número de países de la UE que han analizado aislados de C. coli (Alemania, España y Rumanía) no permite tener datos de esta especie (136). Como vemos, el porcentaje de C. jejuni aislados de personas y multirresistentes, es ligeramente superior a los datos encontrados en aislados de origen animal (pollos, ganado bovino y pavos). En cambio, para C. coli, el porcentaje de aislados multirresistentes procedentes de animales (pollos y cerdos) es superior a los aislados de personas. Esto podría estar asociado a la mayor frecuencia de infecciones de C. jejuni (90%) de personas respecto a C. coli, (alrededor del 10%) lo que haría que las cepas de C. jejuni estuvieran expuestas a una mayor fuerza selectiva por el uso de antimicrobianos en personas. Los ambientes acuáticos están involucrados en la dispersión de bacterias multirresistentes y las aguas residuales pueden jugar un papel particularmente importante en estos procesos (231). Los valores de resistencia a antimicrobianos de aislados de Campylobacter procedentes de efluentes urbanos podrían considerarse como una aproximación del nivel de resistencia presentes en los habitantes de una determinada población (232). En cuanto a la dispersión de aislados multirresistentes de Campylobacter, se ha visto que hay grandes diferencias entre aguas residuales urbanas que contienen y no contienen subproductos de origen animal. Un estudio llevado a cabo en Países Bajos mostró como el 23% (10/44) de los aislados de Campylobacter procedentes de aguas residuales urbanas fueron multirresistentes, mientras que en aguas residuales Página 149 de 200   Discusión urbanas donde además se vertían subproductos de un matadero de pollos, el porcentaje fue del 35% (23/66). Los aislados estudiados en esta tesis doctoral portaron los siguientes genes de resistencia a antimicrobianos: blaOXA-61, tetO, ant-like, ant(6)-Ia, sat-4, lnuC, ant(6)-Ib, aad9, aph(3)-IIIa, aph(2)-IIIa, hyg, apr, sat-1 y erm(B). Se han identificado genes que ofrecen resistencia a beta-lactámicos, tetraciclinas, aminoglucósidos (apramicina, estreptimicina, lincomicina, espectinomicina, estreotricina, kanamicina, neomicina, amicacina y gentamicina) y macrólidos. No hubo diferencias significativas entre el porcentaje de aislados multirresistenes y no multirresistentes portadores de los genes blaOXA-61 y tetO. El gen blaOXA-61 está asociado con resistencia a ampicilina, amoxicilina, penicilina y ticarcilina y la frecuencia de este gen es tan alta en Campylobacter que la mayoría de aislados de este género son considerados resistentes a betalactámicos, excepto carbapenems (233, 234). En cuanto al gen de resistencia a tetraciclina tet(O), su presencia en los dos grupos de aislados de Campylobacter (multirresistentes y no multirresistentes) se debe a que está ampliamente distribuido en Campylobacter, dando lugar a un alto porcentaje de aislados resistentes (121, 235, 236). La alta frecuencia del gen tet(O) en Campylobacter se atribuye a que su mantenimiento y su transferencia no requiere de presión selectiva, como ha demostrado L. Avrain y colaboradores en estudios en pollos (237). En este estudio se inocularon pollos con un par de aislados de C. jejuni, una cepa resistente a tetraciclina y susceptible a ampicilina y otra con el fenotipo contrario. A continuación seleccionaron aislados resistentes a ambos antibióticos, los caracterizaron por RFLP y, mediante PCR, se identificó el gen tet(O) (237). Un estudio ha evaluado la actividad de varios antimicrobianos contra Campylobacter y muestra a la gentamicina como posible tratamiento frente a campilobacteriosis provocadas por bacterias resistentes a macrólidos (238). En los estudios de esta tesis doctoral se ha identificado el gen de resistencia a gentamicina aph(2) en aislados de C. coli procedentes de animales de abasto y aguas residuales. Desde la primera identificación del gen aph(2) en aislados de Campylobacter, se han identificado diferentes variantes en aislados de este género procedentes de personas, animales y alimentos de China y Estados Unidos (169, 171, 239, 240). Los estudios de esta tesis doctoral ponen de manifiesto la presencia del gen aph(2) en aislados de Campylobacter procedentes en Europa. Página 150 de 200 Discusión Según nuestros resultados, la diferencia entre aislados multirresistentes y no multirresistentes, se debe a la resistencia a aminoglucósidos (gentamicina y estreptomicina). La resistencia a aminoglucósidos se produce principalmente por la presencia de enzimas que modifican el antibiótico y los genes que codifican estas proteínas están asociados con islas genómicas (127, 150, 151, 171). Nuestro resultados muestran como el número de islas genómicas de multirresistencia identificadas en C. coli ha sido mucho mayor que las identificadas en C. jejuni, al igual que ocurre en trabajos de China (150). La presencia de barreras, como el sistema CRISPR-Cas de C. jejuni, pueden dificultar la transferencia horizontal de genes en C. jejuni con respecto a C. coli (241). El sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) es un sistema inmune procariótico que limita la captación de secuencias de ADN externas y por tanto confiere resistencia a agentes como plásmidos y fagos (242). Se encuentra en aproximadamente el 40% de los genomas bacterianos (243) y su presencia en C. jejuni y C. coli es muy diferente, siendo positivos prácticamente el 100% y menos del 10% de los aislados, respectivamente (244). En el estudio cuatro (capítulo 6.4) se han identificado islas genómicas de multirresistencia en Campylobacter aislados de animales, personas y aguas residuales, lo que implica una posible dispersión de estos genes por transferencia horizontal. Comparando las asociaciones de unos genes de resistencia con otros, vemos que algunos se localizan en el mismo elemento genético y por tanto darían lugar a co-selección (245). La co-selección se produce cuando los genes que especifican fenotipos resistentes se encuentran juntos en un elemento genético móvil tal como un plásmido, un transposón o un integrón. El resultado final es el mismo: el desarrollo de resistencia a un agente antibacteriano se acompaña de la aparición de resistencia a otro agente (245). Es común encontrar en las islas genómicas de Campylobacter la secuencia correspondiente a los genes ant(6)-Ia, sat-4 y aph(3)-IIIa, identificada previamente en bacterias grampositivas como Staphylococcus (246). Por otro lado, los genes tet(O), aad9 y ant(6)-Ib parece que también se localizan juntos en las islas genómicas de Campylobacter. La asociación entre los genes tet y ant(6)-Ib se ha descrito anteriormente en aislados de Campylobacter fetus y también se asociaron con islas genómicas (247). Según las secuencias identificadas en el estudio 4 (capítulo 6.4), parece que el triplete ant(6)-Ia, sat-4 y aph(3)-IIIa se ha insertado en las islas genómicas junto a los genes tet(O), aad9 y ant(6)-Ib. Este hecho coincide con la teoría que dice que las islas genómicas tienen orígenes evolutivos paralelos y que se forman mediante una Página 151 de 200                       Discusión asociación de módulos funcionales, en nuestro caso diferentes paquetes de genes de resistencia a antimicrobianos (248, 249). Comparando las secuencias alélicas de ciertos genes podemos estudiar si han podido tener una evolución conjunta (250). El flujo de genes entre C. jejuni y C. coli es conocido y se cree que está dando lugar a un acercamiento genómico entre ambas especies (251). Se han identificado alelos idénticos en C. jejuni y C. coli de los siguientes genes: blaOXA-61, tet(O), ant(6)-Ib y sat-4, lo que podría indicar un reciente intercambio genético (3, 59, 251). Las aguas residuales contienen trazas de antimicrobianos, lo que podría favorecer la selección de bacterias resistentes (252). Además, un nuevo estudio buscó genes de resistencia a los antibióticos en una cuenca de un río en España, revelando que las descargas de aguas residuales pueden promover la propagación de la resistencia a los antibióticos en arroyos y pequeños ríos (253). Aunque hay controversia y algunos autores dicen que la dispersión de resistencias a antimicrobianos por parte de las plantas de tratamiento de aguas residuales es muy limitado (254), varios autores consideran los efluentes de las plantas de tratamiento de aguas residuales como fuentes de antimicrobianos, genes de resistencia y bacterias resistencias al medio ambiente (252, 255, 256). Página 152 de 200       Discusión Página 153 de 200     CONCLUSIONES Página 154 de 200     Página 155 de 200   Conclusiones 1) La presencia del gen gamma-glutamil transpeptidasa (ggt), está significativamente asociada a C. jejuni ST-45, lo que podría explicar la mayor diseminación de este ST. 2) En base al polimorfismo genético según los genes ggt, ansB(s), fucP y dmsA, los aislados de C. jejuni ST-45 analizados presentan cinco perfiles metabólicos diferentes, lo que refleja la diversidad genética de C. jejuni. 3) El fenotipo de resistencia mayoritario en C. jejuni es ciprofloxacina y tetraciclina, mientras que en C. coli es ciprofloxacina, tetraciclina y estreptomicina. Además, se han identificado aislados de C. coli resistentes a todos los antimicrobianos analizados (ciprofloxacina, tetraciclina, eritromicina, estreptomicina y gentamicina) en pollos, cerdo y personas. Así, nuestros resultados muestran la mayor resistencia de C. coli respecto a C. jejuni. 4) El gen de resistencia a eritromicina erm(B) se ha identificado por primera vez en Europa en aislados de C. coli procedentes de pollos y pavos de España. La presencia del gen erm(B) en Europa y su localización en islas genómicas refleja la dispersión de este mecanismo de resistencia y su posible transferencia horizontal. 5) El gen de resistencia a gentamicina aph(2) se ha detectado en aislados de C. coli procedentes de pollos, pavos y aguas residuales, también asociado con islas genómicas de multirresistencia, lo que limitaría las posibles opciones terapéuticas frente a la campylobacteriosis. 6) Los C. jejuni aislados de personas en España pertenecen principalmente a los CC-21, CC-206 y CC-443, mientras que en el caso de C. coli todos pertenecieron al CC-828, habiéndose encontrado estos CCs en muestras de origen humano y animal (CC-21 y CC-206) o únicamente de personas (CC- 443). 7) C. jejuni CC-21 se encuentra principalmente en personas y ganado bovino mientras que C. jejuni CC-61 se asocia exclusivamente con ganado bovino, lo que indicaría preferencia de hospedador de estos CCs. Página 156 de 200 Página 157 de 200       CONCLUSIONS Página 158 de 200     Página 159 de 200 Conclusions 1) The presence of γ-glutamil transpeptidase (ggt) was significantly associated to C. jejuni ST-45, which could explain the wider spread of this ST. 2) The analysis of genetic polymorphisms of the genes ggt, ansB(s), fucP y dmsA in isolates of C. jejuni ST-45 revealed the presence of five different metabolic profiles which reflect the broad genetic diversity of C. jejuni. 3) The most prevalent resistance phenotype identified among C. jejuni isolates was ciprofloxacin and tetracycline while the most prevalent one among C. coliisolates was ciprofloxacin, tetracycline and streptomycin. Various C. coli isolates originating from poultry, swine and humans were resistant to all the antimicrobials tested (ciprofloxacin, tetracycline, erythromycin, streptomycin and gentamicin). These evidence higher rates of resistance for C. coli isolates respect to C. jejuni isolates. 4) Gene erm(B), that confers resistance to erythromycin, was identified for the first time in Europe in isolates of C. coli originating from broilers and turkeys from Spain. The presence of the erm(B) gene in Europe and its localization in genomic islands reflect the dissemination of this mechanism of resistance and its ability to be transferred horizontally. 5) The gentamycin resistance gene aph(2) was detected in isolates of C. coli originating from broilers, turkeys and sewage water. This gene was also located in multidrug resistance genomic islands. This fact could limit the therapeutic options in the treatment of campylobacteriosis. 6) The majority of human isolates of C. jejuni belonged to the clonal complexes CC- 21, CC-206 and CC443. The first two (CC-21 and CC-206) were also found in animals while CC-443 was found exclusively in humans. On the other hand, all C. coli isolates belonged to CC-828. 7) C. jejuni CC-21 was mainly found in humans and bovines while C. jejuni CC-61 was associated exclusively with cattle which may indicate a possible host preference for these CCs. Página 160 de 200     Página 161 de 200                                         BIBLIOGRAFIA Página 162 de 200     Página 163 de 200   Bibliografía 1. Cantas L, Suer K. Review: the important bacterial zoonoses in "one health" concept. Frontiers in public health. 2014;2:144. 2. Meng X, Wang Y, Wang Y, Chen B, Jing Z, Chen G, et al. OMS-2- Supported Cu Hydroxide-Catalyzed Benzoxazoles Synthesis from Catechols and Amines via Domino Oxidation Process at Room Temperature. J Org Chem. 2017. 3. Sheppard SK, Jolley KA, Maiden MC. A Gene-By-Gene Approach to Bacterial Population Genomics: Whole Genome MLST of Campylobacter. Genes (Basel). 2012;3(2):261-77. 4. 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APH: Aminoglucósido fosfotransferasa. BIGSdb: Base de datos de Secuencias Genómicas de Aislados Bacterianos (Bacterial Isolate Genome Sequence Database). CC: Complejo clonal. CMI: Concentración mínima inhibitoria. ECDC: Centro Europeo para la Prevención y Control de Enfermedades (European Centre for Diseases Prevention and Control). EFSA: Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (European Food Safety Authority). MET: Microscopio electrónico de transmisión. MLSB: Macrólidos, lincosamidas y estreptograminas de tipo B. MLST: Tipificación multilocus de secuencias (Multilocus Sequence Typing). NCBI: Centro Nacional para la Información Biotecnológica (National Centre for Biotechnology Information). OMS: Organización Mundial de la Salud. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction). PFGE: Electroforesis de campo pulsado (Pulsed-field Gel Electrophoresis). SNP: Polimorfismo de nucleótido único (Single Nucleotide Polimorfism). ST: Secuencia tipo. SVR: Región corta variable (Short Variable Region) del gen flaA. UE: Unión Europea. UFC: Unidad formadora de colonia. Página 194 de 200 Anexos 11.2 Lista de genes aacA/aphD: Genes que codifican un enzima bifuncional que participa en la resistencia a gentamicina, tobramicina y kanamicina. La resistencia a la tobramicina y la kanamicina se debe a la actividad de aminoglucósido acetiltransferasa (ACC), especificada por la región N-terminal. La región C-terminal es una quinasa que fosforila varios aminoglucósidos. ansB: Gen que codifica el enzima L-Asparaginasa que cataliza la conversión de asparagina en aspartato. Algunos aislados de Campylobacter poseen este enzima con una secuencia señal que le hace insertarse en el periplasma (ansBs). ant-like: Gen que codifica un enzima capaz de producir resistencia a estreptomicina en C. coli y comparte alrededor del 30% de aminoácidos con los enzimas nucleotidil transferasas de resistencia a aminoglucósidos (ANT) descritas previamente en este género bacteriano. ant(3) o aadA: Gen que codifica los enzimas de tipo ANT más comúnmente encontradas, y que ofrecen resistencia a la espectinomicina y estreptomicina. La nomenclatura alternativa para la proteína codificada por este gen es ANT(3 ")-Ia ó AAD(3"). ant(6) ó aadE: Gen que codifica un enzima de resistencia a la estreptomicina. Es un gen muy extendido entre bacterias grampositivas y suele encontrarse asociado al triplete ant(6)-sat4-aph(3) que ofrece resistencia a aminoglucósidos y estreptomicina. ant(9) ó aad9: Gen que codifica un enzima de resistencia a la espectinomicina. aph(2): Gen que codifica un enzima de resistencia a gentamicina y está ampliamente distribuido en bacterias grampositivas. Corresponde al tipo de enzimas modificadoras de aminoglucósidos, las cuales son del tipo fosfotransferasas (APH). aph(3)-III: Gen que codifica un enzima de tipo APH que produce resistencia a kanamicina, neomicina, lividomicina, paromomicina, livostamicina, butirosina, amicacina e isepamicina. aphA-3: Gen que codifica un enzima de tipo APH que produce resistencia a kanamicina. Página 195 de 200   Anexos aphA-7: Gen que codifica un enzima de tipo APH que produce resistencia a kanamicina. aspA: Gen que codifica el enzima Aspartasa A. Es uno de los siete genes a considerar en el tipado por MLST en Campylobacter. dmsA: Gen que codifica el enzima dimetil sulfoxido reductasa. Cataliza la reducción de dimetilsulfóxido (DMSO) a sulfuro de dimetilo (DMS). La DMSO reductasa sirve como reductasa terminal en condiciones anaeróbicas, siendo DMSO el aceptor terminal de electrones. erm(B): Gen que codifica un enzima de resistencia a macrólidos. Este enzima actúa metilando la base 2075 del gen 23S impidiendo que los macrólidos se unan al ribosoma. flaA: Gen que codifica la flagelina. La técnica de tipado de aislados de Campylobacter flaA-SVR, está basada en la secuenciación de la región variable de este gen. fucP: Gen que codifica un enzima de tipo permeasa de L-fucosa localizado en la región periplásmica. Permite a la bacteria metabolizar L-fucosa hasta la formación de piruvato. ggt: Gen que codifica el enzima gamma glutamiltranspeptidasa. Es un enzima de tipo transferasa que cataliza la transferencia de grupos funcionales de moléculas tales como glutatión a un aceptor que puede ser un aminoácido, un péptido o agua. glnA: Gen que codifica el enzima glutamina sintasa. Es uno de los siete genes a considerar en el tipado por MLST en Campylobacter. gltA: Gen que codifica el enzima citrato sintasa. Es uno de los siete genes a considerar en el tipado por MLST en Campylobacter. glyA: Gen que codifica el enzima serina hidroximetil transferasa. Es uno de los siete genes a considerar en el tipado por MLST en Campylobacter. gyrA: Gen que codifica el enzima ADN girasa. Mutaciones específicas en este gen producen resistencia a fluoroquinolonas. pgm: Gen que codifica el enzima fosfoglucomutasa. Es uno de los siete genes a considerar en el tipado por MLST en Campylobacter. Página 196 de 200 Anexos sat-4: Gen que codifica un enzima acetiltransferasa que produce resistencia a estreptotricina. tet(O): Gen que codifica un enzima de resistencia a tetraciclina en Campylobacter. tkt: Gen que codifica el enzima transcetolasa implicado en la ruta de las pentosas fosfato. Es uno de los siete genes a considerar en el tipado por MLST en Campylobacter. uncA: Gen que codifica la subunidad alfa del enzima ATP sintasa. Es uno de los siete genes a considerar en el tipado por MLST en Campylobacter. Página 197 de 200   Anexos 11.3 Estancias internacionales  Milner Centre for Evolution. Universidad de Bath, Bath, Reino Unido. 2017. Supervisor: Profesor Samuel K. Sheppard. Duración: 3 meses.  Medical School Swansea University, Swansea, Gales, Reino Unido, 2016. Supervisor: Profesor Samuel K. Sheppard. Duración: 4 meses.  Animal and Plant Health Agency (APHA), Weybridge, Reino Unido. 2015. Supervisor: Dª Ana Vidal. Duración: 6 meses. Página 198 de 200 Anexos 11.4 Artículos científicos y de divulgación.  Florez-Cuadrado D, Ugarte-Ruiz M, Quesada A, Palomo G, Dominguez L, Porrero MC. Description of an erm(B)-carrying Campylobacter coli isolate in Europe. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 2016;71(3):841-3. Publicado.  Florez-Cuadrado D, Ugarte-Ruiz M, Meric G, Quesada A, Porrero MC, Pascoe B, Sáez-Llorente JL, Lopez Orozco G, Domínguez L, Sheppard SK. Erythromycin resistance in Campylobacter from turkey: hosts and paths for horizontal spread of erm(B) genes. Artículo enviado para su publicación a la revista Frontiers in Microbiology en agosto de 2017.  Florez-Cuadrado D, Ugarte-Ruiz M, Moreno M.A, Dominguez L. Bacterias que no temen a los antibióticos. Profesión Veterinaria. 22(88):6-13, Colegio Oficial de Veterinarios de Madrid. 2017. Publicado. Página 199 de 200     Página 200 de 200 PORTADA AGRADECIMIENTOS ÍNDICE 1. Resumen 2. Summary 3. Introducción 4. Objetivos 5. Objectives 6. Trabajos de investigación 7. Discusión 8. Conclusiones 9. Conclusions 10. Bibliografía 11. Anexos 11.1 Abreviaturas 11.2 Lista de genes 11.3 Estancias internacionales 11.4 Artículos científicos y de divulgación.