UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Montserrat Torres Hortal DIRECTORES: Marta, dir Ortiz Rivera Alfredo, dir García Saiz Madrid, 2015 © Montserrat Torres Hortal, 2011 Epidemiología molecular del virus del papiloma humano de alto riesgo oncogenético en una población de hombres que practica sexo con hombres (HSH), coinfectados o no con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (VIH-1) Departamento de Microbiología III UNIVERSIDAD COMPLUTENSE 14153299 Universidad Complutense de Madrid Facultad de Biologia Departamento de Microbiologia III Î Epidemiologia Molecular del Virus del Papiloma Humano de Alto Riesgo Oncogénico en una Poblacion de Hombres que Practican Sexo con Hombres (HSH), Coinfectados o no con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana Tipo 1 (VIH-1). Tests Doctoral Montserrat Torres Hortal Madrid, 2011 Universidad Complutense de Madrid Facultad de Biologia Departamento de Microbiologia 111 Epidemiologia Molecular del Virus del Papiloma Humano de Alto Riesgo Oncogénico en una Poblacion de Hombres que Practican Sexo con Hombres (HSH), Coinfectados o no con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana Tipo 1 (VIH-1). Memoria presentada por Montserrat Torres Hortal Para optar al grado de Doctor en Biologia Dirigida por los Doctores: Marta Ortiz Rivera Alfredo Garcia Sâiz Agradecimientos Al Centro Nacional de Microbiologia del Instituto de Salud Carlos 111 de Madrid, por ofrecerme la posibilidad de realizar este trabajo. Muy especialmente, a la Dra. Marta Ortiz, directora de esta tesis, por su generosa dedicacion y su esfuerzo continuo que ban hecho de esta etapa un recorrido inolvidable. Gracias por hacer de tu brillante capacidad investigadora un ejemplo a seguir para mi. A1 Dr. Alfredo Garcia Saiz, director de esta tesis, por abrirme las puertas de mi primer laboratorio y permitirme contar con su dilatada experiencia en el mundo de la ciencia. A la Dra. Ascension Bemal Zamora, por brindarme la posibilidad de iniciar mi carrera profesional. A mis companeras del Centro Nacional de Epidemiologia del Instituto de Salud Carlos 111 de Madrid, especialmente a la Dra. Cristina Gonzalez Blazquez, por su ayuda en la realizacion de este trabajo. Gracias por ser una gran companera de proyectos. A la Dra. Beatriz Hernandez Novoa, por su exquisita y cuidadosa revision de este trabajo. Es un lujo contar con tus aportaciones. A la Universidad Complutense de Madrid, especialmente a la Dra. Laura Benitez Rico, por la ayuda prestada estos anos y con la excelente revision de este trabajo; y a la Dra. M® José Valderrama Conde, por facilitarme amablemente la tramitacion de mi tesis doctoral. A1 Centro Sanitario Sandoval de Madrid, por el interés y la importante aportaciôn en la realizacion de este trabajo. A Angeles Pablos Martin, por ensenarme desde el primer dia y no haberse ido nunca, y a Esther, por estar siempre dispuesta a compartir algo mas que un café. A mis companeras de la Unidad de Retrovirus y Papiloma virus, M® Angeles, M® Carmen, Marisa, Sonsoles, Lucia y M ̂José, por su interés en este trabajo. A mis companeras de doctorado, Alejandra, Virginia, Ana y Carolina, que han sufrido conmigo este "periodo de formaciôn". A mis amigos, que han vivido este trabajo con la misma intensidad que yo.. A mi gran familia, que me acompana en todos los momentos y es el pilar de mi vida. A mi madré, por la tenacidad; a mi padre, por la confianza. A mis hermanas, mis companeras inseparables. A mis sobrinos, la alegria de mi vida. A mi companero, por haberme brindado de forma tan generosa parte de nuestro tiempo para realizar este trabajo. Compartir la vida contigo es un regalo. Gracias a vuestro ânimo y aliento este trabajo ha sido mas fâcil. ...Y a todas las personas que, de alguna manera, han colaborado y participado en la realizacion de esta tesis doctoral. La realizacion de este trabajo ha sido posible gracias a los Proyectos de Investigaciôn MPY1117/03 (Programa Intramural) y MPY1357/07, concedidos por el Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) del Instituto de Salud Carlos III (Madrid), y al Proyecto de Investigaciôn MPY1421/06, concedido por la Fundaciôn para la Investigaciôn y Prevenciôn del SIDA (FIPSE). A Esteban, A mi familia "La mayorîa de las ideas fundamentales de la ciencia son esencialmente sencillas y por régla general pueden ser expresadas en un lenguaje comprensible para todos" Albert Einstein (1879-1955) ABREVIATURAS A260, A28o: Absorbancia a 260 y 280 nanometros AA: Asiatico-Americana ADN: Âcido desoxirribonucleico Af: Africana Af-1: Africana tipo 1 Af-2: Africana tipo 2 AIN: Neoplasia anal intraepitelial {Anal Intraepithélial Neoplasia) AP I: Protema activadora 1 {Activator Protein 1) AR: Alto riesgo oncogénico ARN: Âcido ribonucleico ARNm: Acido ribonucleico mensajero As: Asiatica AsAi: Asiatico-Amerindia ATCC: Coleccion Americana de cultivos tipo {American Type Culture Collection) ATP: Adenosintrifosfato BLAST: Basic Local Alignment Search Tool BR: Bajo riesgo oncogénico C/EBP: Protema de union al potenciador CCAAT {CCAAT Enhancer Binding Protein) CIN: Neoplasia cervical intraepitelial {Cervical Intraepithélial Neoplasia) ddNTPs: Dideoxinucleotidos trifosfato DMSO: Dimetilsulfoxido E: Europea E: Temprana {Early) E2BS: Secuencias de union de E2 (E2 Binding Sequences) E6AP: Protema asociada a E6 (£6 Associated Protein) EDTA: Acido etildiaminotetraacético EGRF: Receptor del factor de crecimiento epitelial {Epidermal Growth Factor Receptor) ELISA: Enzimoinmunoanalisis en fase solida {Enzyme Linked Immunosorbent Assay) EMEA: Agenda Europea de los Medicamentos {European Medicines Agency) ETS: Enfermedades de transmision sexual FDA: Food and Drug Administration GRE: Elemento de respuesta a glucocorticoides {Glucocorticoid Response Elements) HSH: Hombres que practican sexo con hombres HSIL: Lesion escamosa intraepitelial de alto grado {High Grade Squamous Intraepithélial Lesion) lARC: Agenda Intemacional de Investigaciôn en Cancer {International Agency for Research on Cancer) IC95%: Intervalo de confianza al 95% ITS: Infecciôn de transmisiôn sexual KDa: Kilodalton Kpb: Kilopares de bases KRF-1: Factor especifico de queratinocitos 1 {Keratinocyte Specific Transcription Factor 1) L: Tardia {Late) LCR: Regiôn larga de control {Long Control Region) LSIL: Lesiôn escamosa intraepitelial de bajo grado {Low Grade Squamous Intraepithélial Lesion) ml: mililitros NF-1: Factor nuclear 1 {Nuclear Factor 1), ng: nanogramos Oct-1: Octamero de uniôn para el factor 1 {Octamer Binding Transcription Factor 1) OR: Razôn de riesgo {Odds Ratio) Ori: Origen de replicaciôn viral Pb: Pares de bases PBS: Tampon fosfato salino (Phosphate Buffer Saline) PCR: Reaccion en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) pg: picogramos PV: Papilomavirus r.p.m.: Revoluciones por minuto Rb: Retinoblastoma s: segundos SIL: Lesion escamosa intraepitelial (Squamous Intraepithélial Lesion) SP-1: Protema estimulante de la transcripcion 1 (Specificity Protein 1) SRY: Region déterminante del sexo del cromosoma Y (Sex Determining Region Y) TEF-1/2: Potenciador de transcripcion del factor 1/2 (Transcriptional Enhancer Factor 1/2) TMB: Tetrametilbencidina U.I: Unidades intemacionales USF: Factor estimulante aguas arriba (Upstream Transcription Factor) VIH-1: Virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 VLP: Particulas semejantes a virus (Virus Like Particles) VPH: Virus del papiloma humano YY-1: Factor ying-yang 1 (Factor Yin Yang 1) pg: microgramos pi: microlitros INDICE DE CONTENIDOS 1. INTRODUCCIÔN................................................................................................................1 1.1. El virus del papiloma humano.......................................................................................... 1 1.2. Estructura y organizaciôn del genoma de VPH............................................................... 1 1.3. Clasificadôn taxonômica de VPH..................................................................................... 3 1.4. Ciclo viral............................................................................................................................ 6 1.4.1. Uniôn al receptor celular y entrada viral..........................................................7 1.4.2. Replicaciôn y transcripcion viral.......................................................................7 1.4.3. Ensamblaje y liberaciôn de las particulas virales.............................................12 1.5. Patologia de la infecciôn por VPH anogenital..................................................................13 1.5.1. Infecciôn subclinica............................................................................................ 13 1.5.2. Infecciôn cllnica.................................................................................................. 13 1.5.2.1. Verrugas anogenitales....................................................................... 13 1.5.2.2. Lesiones precursoras de cancer en cérvix y ano..............................14 1.5.2.3. Cancer de cérvix y cancer de ano......................................................14 1.5.2.4. Otros cânceres anogenitales.............................................................. 16 1.5.3. Progresiôn a cancer de la infecciôn viral.......................................................... 17 1.6. Epidemiologia de la infecciôn anogenital.........................................................................18 1.6.1. Prevalencia de la infecciôn en mujeres...........................................................19 1.6.2. Prevalencia de la infecciôn en hombres..........................................................21 1.6.3. Prevalencia de la infecciôn en mujeres y hombres infectados por VIH 21 1.7. Métodos de detecciôn y caracterizaciôn de VPH...........................................................22 1.7.1. Identificaciôn directa..........................................................................................22 1.7.1.1. Sistemas de hibridadôn..................................................................... 22 1.7.1.2. Ensayos basados en amplificaciôn por PCR.................................... 24 1.7.2. Identificaciôn indirecta. Ensayos serolôgicos...................................................26 1.8. Vacunas profilâcticas..........................................................................................................27 1.9. Variantes de VPH............................................................................................................... 28 1.9.1. Significado funcional de las variantes.............................................................. 31 2. OBJETIVOS...........................................................................................................................37 3. MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................................. 41 3.1. MATERIALES..................................................................................................................... 41 3.1.1. Contrôles de laboratorio.................................................................................... 41 3.1.1.1. Lineas celulares..................................................................................41 3.1.1.2. Muestras clinicas................................................................................41 3.1.2. Muestras clinicas de estudio..............................................................................41 3.1.3. Medios de cultivo...............................................................................................42 3.1.4. Cebadores sintéticos.......................................................................................... 42 3.2. MÉTODOS.......................................................................................................................... 42 3.2.1. Crecimiento y conservaciôn de las lineas celulares.........................................42 3.2.2. Recogida y conservaciôn de las muestras anales.............................................42 3.2.3. Detecciôn de ADN de VPH de alto riesgo en las muestras anales mediante el método High-Risk HPV DNA Tesf®........................................................ 43 3.2.4. Extracdôn de ADN de las muestras anales y de las lineas celulares.............44 3.2.5. Medida de la concentraciôn de âcidos nucleicos de los contrôles de laboratorio mediante espectrofotometrîa..............................................................45 3.2.6. Genotipado de VPH mediante Linear Array HPV Genotyping® Test................46 3.2.7. Amplificaciôn del ADN de VPH mediante la reacciôn en cadena de la polimerasa (PCR) para la caracterizaciôn de variantes................................... 47 3.2.8. Electroforesis en geles de agarosa.....................................................................50 3.2.9. Purificaciôn de los productos amplificados..................................................... 51 3.2.9.1. Purificaciôn mediante geles de agarosa........................................... 51 3.2.9.2. Purificaciôn mediante columnas...................................................... 52 3.2.10. Cuantificaciôn de los productos amplificados...............................................52 3.2.11. Secuenciaciôn.................................................................................................... 52 3.2.12. Ediciôn y anâlisis de secuencias......................................................................53 3.2.13. Anâlisis filogenético......................................................................................... 53 3.2.14. Asignaciôn de variantes...................................................................................54 3.2.15. Predicciôn de los posibles efectos de las mutaciones puntuales en la regiôn reguladora................................................................................................55 3.2.16. Anâlisis estadistico........................................................................................... 55 4. RESULTADOS................................................................................................................... 59 4.1. Caracteristicas de la poblaciôn de estudio....................................................................... 59 4.2. Prevalencia de VPH-AR y distribuciôn de genotipos......................................................59 4.3. Anâlisis de variantes y polimorfismos de genotipos de VPH-AR..................................64 4.3.1. Anâlisis de variantes de VPH16........................................................................64 4.3.1.1. Anâlisis filogenético de muestras infectadas por VPH16...............64 4.3.1.2. Polimorfismos en las regiones codificantes de las protemas E6, E7 y en la regiôn reguladora de VPH16.................................................66 4.3.1.2.1. Polimorfismos en la regiôn codificante de la protema E6.........................................................................................67 4.3.1.2.2. Polimorfismos en la regiôn codificante de la protema E7.........................................................................................69 4.3.1.2.3. Polimorfismos en la regiôn reguladora........................... 70 4.3.1.3. Comparaciôn de los polimorfismos en las regiones codificantes de las protemas E6 y E7 y en la regiôn reguladora.................73 4.3.1.4. Distribuciôn de variantes de VPH16 entre los pacientes................74 4.3.1.5. Distribuciôn de variantes de VPH16 de acuerdo al estatus VIH-1 y el origen geogrâfico de los pacientes.............................77 4.3.2. Anâlisis de variantes de VPH18........................................................................78 4.3.2.1. Anâlisis filogenético de muestras infectadas por VPH18...............78 4.3.2.2. Polimorfismos en las regiones codificantes de las protemas E6, E7 y en la regiôn reguladora de VPH18.................................................80 4.3.2.2.1. Polimorfismos en la regiôn codificante de la protema E6.........................................................................................80 4.3.2.2.2. Polimorfismos en la regiôn codificante de la protema E7.........................................................................................82 4.3.2.2.3. Polimorfismos en la regiôn reguladora........................... 83 4.3.2.3. Comparaciôn de los polimorfismos en las regiones codificantes de las protemas E6 y E7 y en la regiôn reguladora................ 86 4.3.2.4. Distribuciôn de variantes de VPH18 entre los pacientes................86 4.3.2.5. Distribuciôn de variantes de VPH18 de acuerdo al estatus VIH-1 y el origen geogrâfico de los pacientes.............................89 4.3.3. Anâlisis de variantes de VPH31........................................................................91 4.3.3.I. Anâlisis filogenético de muestras infectadas por VPH31............ 91 4.33.2. Polimorfismos en las regiones codificantes de las protemas E6, E7 y en la region reguladora de VPH31................................................. 93 4.3.3.2.1. Polimorfismos en la regiôn codificante de la protema E6.........................................................................................93 4.3.3.2.2. Polimorfismos en la regiôn codificante de la protema E7.........................................................................................94 4.3.3.2.3. Polimorfismos en la regiôn reguladora........................... 95 4.3.3.3. Comparaciôn de los polimorfismos en las regiones codificantes de las protemas E6 y E7 y en la regiôn reguladora.................97 4.3 3.4. Distribuciôn de variantes de VPH31 entre los pacientes................98 4.3.2.5. Distribuciôn de variantes de VPH31 de acuerdo al estatus VIH-1 y el origen geogrâfico de los pacientes............................. 100 4.3.4. Anâlisis de variantes de VPH33........................................................................ 101 4.3.4.1. Anâlisis filogenético de muestras infectadas por VPH33............... 101 4.3.4.2. Polimorfismos en las regiones codificantes de las protemas E6, E7 y en la regiôn reguladora de VPH33..................................................102 4.3.4.2.1. Polimorfismos en la regiôn codificante de la protema E6.........................................................................................102 4.3.4.2.2. Polimorfismos en la regiôn codificante de la protema E7.........................................................................................103 4.3.4.2.3. Polimorfismos en la regiôn reguladora............................104 4.3.4.3. Comparaciôn de los polimorfismos en las regiones codificantes de las protemas E6 y E7 y en la regiôn reguladora.................106 4.3.4.4. Distribuciôn de variantes de VPH33 entre los pacientes................107 4.3.4.5. Distribuciôn de variantes de VPH33 de acuerdo al estatus VIH-1 y el origen geogrâfico de los pacientes............................. 109 4.3.5. Anâlisis de variantes de VPH52........................................................................ 110 4.3.5.1. Anâlisis filogenético de muestras infectadas por VPH52............... 110 4.3.5.2. Polimorfismos en las regiones codificantes de las proteinas E6, E7 y en la regiôn reguladora de VPH52..................................................112 4.3.5.2.1. Polimorfismos en la regiôn codificante de la proteina E6.........................................................................................112 4.3.5.2.2. Polimorfismos en la regiôn codificante de la protema E7......................................................................................... 113 4.3.5.2.3. Polimorfismos en la regiôn reguladora............................114 4.3.5.3. Comparaciôn de los polimorfismos en las regiones codificantes de E6 y E7 y en la regiôn reguladora....................................... 117 4.3.5.4. Distribuciôn de variantes de VPH52 entre los pacientes................ 117 4.3.5.5. Distribuciôn de variantes de VPH52 de acuerdo al estatus VIH-1 y el origen geogrâfico de los pacientes............................. 119 5. DISCUSIÔN.......................................................................................................................... 123 5.1. Prevalencia global y tipo especifica de VPH de alto riesgo.............................................123 5.2. Prevalencia y caracterizaciôn molecular de veiriantes de VPH16, VPH18, VPH31, VPH33 y VPH52.......................................................................................................... 127 5.3. Influencia de la coinfecciôn con VIH-1 en la distribuciôn de variantes de tipos de VPH de alto riesgo................................................................................................. 143 5.4. Influencia del origen geogrâfico de los pacientes en la distribuciôn de variantes de tipos de VPH de alto riesgo.................................................................................145 6. CONCLUSIONES................................................................................................................. 151 7. BIBLIOGRAFIA................................................................................................................. 155 INTRODUCCION Introducciôn 1. INTRODUCCIÔN 1.1. EL VIRUS DEL PAPILOMA La Familia Papïllomaviridae, es un grupo de virus conocido desde la antigüedad pero descrito por primera vez a finales del siglo XX (Orth et al., 1977; Coggin et al, 1979). Los papilomavirus (PV) estân ampliamente distribuidos en la Naturaleza e infectan a la mayoria de especies de mamiferos, asi como a las aves o los reptiles, con un tropismo muy definido por sus hospedadores. La primera secuencia del genoma de un aislado de PV fue clonada con éxito a finales de los anos 70 (Orth et al, 1977; zur Hausen et al, 1989) y en la actualidad hay descritos 189 tipos, 120 de los cuales son capaces de infectar al hombre (Bernard et al., 2010). El virus del papiloma humano (VPH) se transmite por contacto e infecta las células basales del tejido epitelial estratificado cutâneo o mucoso. Los tipos de VPH cutâneos tienen un tropismo muy definido por la epidermis e infectan la piel de manos y pies, mientras que los tipos de VPH mucosos infectan el epitelio de la boca, la garganta, el tracto respiratorio y el tracto anogenital. El ciclo viral del VPH esta mtimamente unido al programa de diferenciaciôn de las células del tejido epitelial, y las distintas fases del mismo son dependientes y acompahan al proceso de maduraciôn y diferenciaciôn del queratinocito. La infecciôn ocurre a través de abrasiones en el tejido epitelial que exponen las células de la capa basai a la entrada de las particulas virales, y una vez en el interior, aprovechando la maquinaria celular el virus se replica y se propaga, restringiendo la producciôn de las protemas y el ensamblaje viral a las capas superiores del epitelio (Middleton et al., 2003; Longworth et al., 2004a). La infecciôn por VPH no produce lisis celular o muerte citopâtica como consecuencia de la replicaciôn, ensamblaje o la liberaciôn viral debido a que el queratinocito es una célula destinada a la descamaciôn. Ademâs, para permitir la replicaciôn viral, las protemas virales retrasan la condensaciôn nuclear en los queratinocitos diferenciados (coilocitos), y los queratinocitos "cargados" con el virus mueren asi por causas naturales, tal y como esta programado en su proceso de diferenciaciôn. De esta forma, la infecciôn por VPH no esta acompanada de inflamaciôn, y al no haber una senal obvia de dano (muerte celular) que alerte al sistema inmune de la presencia viral, permite que éste sea ignorado durante periodos muy largos, pudiendo dar lugar a la persistencia o la cronicidad de la infecciôn (Stanley, 2006). 1.2. ESTRUCTURA Y ORGANIZACIÔN DEL GENOMA DE VPH El VPH es un virus pequeno, sin envuelta y con una câpsida icosaédrica compuesta de 72 capsômeros, constituidos por dos protemas estructurales codificadas por el virus (Figura l.l.A) La protema viral L1 es el elemento estructural primario de la câpsida viral con cinco Introducciôn copias por capsômero, tiene un peso molecular de 55 Kilodalton (KDa) y esta muy conservada entre los diferentes tipos virales. La protema viral L2 se localiza como una ûnica molécula en el centro de los capsômeros, tiene un peso molecular de aproximadamente 70 KDa y esta menos conservada entre los distintos tipos virales (Finnen et al., 2003). Una caracterîstica importante de la protema L1 es su capacidad de autoensamblarse cuando es expresada en sistemas heterôlogos en forma de particulas similares al virus (VLPs, Virus Like Particles), en ausencia o presencia de la proteina L2 (Florin et al, 2002). Estas estructuras son similares a los viriones infectivos, tanto en su morfologia como en sus epitopos, y han sido empleados en el desarrollo de las vacunas profilâcticas frente al VPH (Gardasil® y Cervarix®), por dos razones fundamentales, su alta inmunogenicidad y su inocuidad al carecer de material genético. HPV > lo» Figura 1.1. A) Microscopia electrônica de la câpsida virai. B) Mapa genético de VPH16. (Cedido por Qiagen). El genoma de VPH es ADN de doble cadena, circular, y con una longitud de aproximadamente 8.000 pares de bases (pb). Estâ organizado en ocho marcos abiertos de lectura que codifican para las protemas virales, y una regiôn reguladora no codificante conocida como regiôn larga de control (LCR, Long Control Region), que présenta numerosos sitios de uniôn para represores y activadores de la transcripciôn (Figura I.IB). Durante el ciclo viral, se establece un programa temporal de transcripciôn para la sintesis de las protemas de acuerdo con el estado de diferenciaciôn del queratinocito y se distinguen genes de expresiôn temprana (E, Early) y genes de expresiôn tardia (L, Late). Los genes de expresiôn temprana son expresados en las células no diferenciadas del epitelio y codifican para las protemas virales no estructurales: El, E2, E4, E5, E6 y E7, que estân implicadas en el control de la replicaciôn, la transcripciôn y la expresiôn genética del virus. Su expresiôn estâ estrechamente regulada, tanto por factores celulares especlficos de tejido como por las propias protemas virales. Los Introducciôn genes de expresiôn tardia son expresados en las células diferenciadas del epitelio y codifican para las proteinas estructurales de la câpsida viral: L1 y L2 (Bekkers et ah, 2004). La regiôn reguladora tiene un tamano que oscila entre 650 y 900 pb, dependiendo del tipo de VPH (Figura 1.2). Para su estudio, la regiôn reguladora puede ser dividida en très segmentos funcionales: (i) el extremo 5', que contiene las senales de terminaciôn de la transcripciôn y de poliadenilaciôn de los transcritos tardios y tiene una longitud de aproximadamente 300 pb; (ii) el segmento central, que incluye un potenciador especifico de tejido con sitios de uniôn a numerosos activadores y represores de la transcripciôn y que se extiende en 400 pb aproximadamente; (iii) el extremo 3", que identifica el origen de replicaciôn viral (ori), y que tiene un tamafio aproximado de 140 pb (O Connor et al., 1995). Segmente central Segmente 3'Segmente 5' Potendador #3 #4 Figura 1.2. Esquema de la regiôn larga de control de VPH. AP-1, Proteina Activadora 1; YY-1, Factor ying-yang 1; # l / 2 / 3 / 4 , Sitio de uniôn proteina viral E2; Oct-1, Octâmero de uniôn para el factor 1; N F l, Factor nuclear 1; TEFl/2, Potenciador de transcripciôn del factor 1 y 2; GRE, Elemento de respuesta a glucocorticoides; SPl, Proteina estimulante de la transcripciôn 1. (Modificado de O'Connor et a l , 1995). 1.3. CLASIFICACIÔN TAXONÔMICA DE VPH La infecciôn por VPH generalmente cursa sin smtomas o produce lesiones de carâcter benigno, sin embargo, un pequeno porcentaje de individuos infectados puede llegar a desarrollar lesiones con potencial pre-maligno e incluso cancer (Bosch, 2003). Debido a su importancia médica, los VPH han sido ampliamente estudiados y el anâlisis de su secuencia de ADN ha permitido identificar 120 tipos distintos. En el ano 2004, De Villiers et al. analizaron por primera vez las secuencias de PV disponibles en las bases de datos, y con secuencias representativas de 96 tipos de VPH y 22 tipos de PV animales, realizaron el anâlisis filogenético y establecieron los niveles de la clasificadôn taxonômica incluyendo: género, especie, tipo, subtipo y variantes. Los géneros de PV comparten menos de un 60% de homologia de la secuencia de nucleôtidos que codifica la protema viral Ll; y en el caso de la secuencia del genoma completo, los géneros tienen mâs del 23% pero menos del 43% de homologia. Empleando como referenda la secuencia de nucleôtidos de la proteina viral Ll, las especies comparten entre el 60-70% de homologia de la secuencia; los tipos el 71-89% de homologia; los subtipos entre un 90-98%; y las variantes de Introducciôn PV muestran divergencias de entre 1-2% en la secuencia nucleotidica. La investigaciôn continuada ha permitido actualizar la nomenclatura inicial como resultado de la identificaciôn de 28 tipos nuevos de VPH y 45 de PV animales (Bernard et al., 2010), y hoy se definen 29 géneros de PV, que incluyen 66 especies, y que se distribuyen en: Alfa (14 especies). Beta (seis especies). Gamma (diez especies). Delta (cinco especies). Epsilon (una especie), Zeta (una especie). Eta (una especie). Thêta (una especie). Iota (una especie). Kappa (dos especies). Lambda (dos especies). Mu (dos especies). Nu (una especie). Xi (una especie), Omikron (una especie). Pi (una especie), Rho (una especie). Sigma (una especie). Tau (una especie). Upsilon (dos especies). Phi (una especie), Chi (dos especies). Psi (una especie). Omega (una especie), Dyodelta (una especie), Dyoepsilôn (una especie), Dyozeta (una especie), Dyoeta (una especie), Dyotheta (una especie) y Dyoiota (una especie) (Figura 1.3). Alpha Omega Dyodelta Lambda Kappa Sigma Nu Mu Iota Psi Dyozeta Thêta Etaw Dyoepsilon Delta Dyotheta Epsilon Zeta Dyoiota Chi Rho Phi Omikron Upsilon Tau Beta Gamma Dyoeta Figura 1.3. Ârbol filogenético de los 29 géneros de PV. Basado el alineamiento multiple de las secuencias de nucleôtidos de la regiôn del genoma que codifica para la protema viral Ll de los 189 tipos identificados. Los numéros al final de cada rama identifican tipo; especie y género, respectivamente. (Tomado de Bernard et al., 2010). Introducciôn De este total, solo cinco géneros incluyen tipos que infectan humanos (Alfa, Beta, Gamma, Mu y Nu), y aproximadamente el 90% de los tipos caracterizados estân incluidos en los géneros Alfa y Beta. En el caso de los subtipos, se detectan mâs frecuentemente en el género Beta, donde se han identificado 30 subtipos o posibles subtipos frente a los 10 subtipos o posibles subtipos del género Gamma o siete subtipos de Alfa (Hazard et al., 2007); y en las variantes genômicas pueden aislarse entre 10-100 dependiendo de los tipos. El género Alfa incluye el mayor numéro de tipos e infectan tanto el epitelio cutâneo, causando verrugas comunes, como el epitelio mucoso del tracto anogenital. En este ultimo grupo se conocen mâs de 30 tipos, y solo un numéro reducido de ellos causan lesiones que pueden progresar a câncer (Bosch et al., 1995; Walboomers et al., 1999; Munoz et al., 2006). Los estudios de la asociaciôn de estos tipos de VPH con el câncer cervical, han permitido hacer una clasificaciôn epidemiolôgica basada en la frecuencia con la que son localizados en las lesiones neoplâsicas y que de acuerdo a su potencial oncogénico los divide en cuatro categorîas; riesgo indeterminado, bajo, probablemente alto y alto (Muhoz et al, 2006) (Tabla 1.1). Tabla 1.1. Clasificaciôn filogenética y epidemiolôgica de los tipos de PV que infectan el epitelio cutâneo y anogenital humano incluidos en el género Alfa (Modificado de Munoz et al, 2006). Mucosa oral Indeterminado VPH32 Mucosa genital Bajo VPH42 2 Epitelio cutâneo Indeterminado VPH3, VPHIO, VPH17, VPH28, VPH29, VPH78, VPH94 Mucosa genital Indeterminado VPH62, VPH83, VPH84, VPH86, VPH87, VPH1023 Bajo VPH61, VPH72, VPH81, VPH89 4 Epitelio cutâneo Indeterminado VPH2, VPH27, VPH57 Indeterminado VPH69 5 Mucosa genital Probable alto VPH26, VPH82 Alto VFH51 Indeterminado VPH30 6 Mucosa genital Probable alto VPH53, VPH 66 Alto VPH56 Indeterminado VPH85, VPH97 7 Mucosa genital Bajo Probable alto Alto VPH70 VPH68 VPHIS*, VPH39, VPH45, VPH59 8 Epitelio cutâneo Indeterminado Bajo VPH7, VPH91 VPH40, VPH43 9 Mucosa genital Indeterminado Alto VPH67 VPH16*, VPH31% VPH33*, VPH35, VPH52*, VPH58 10 Mucosa genital Indeterminado Bajo VPH55, VPH74 VPH6, VPH ll, VPH13, VPH44, 11 Mucosa genital Indeterminado VPH34, VPH73 13 Mucosa genital Bajo VPH54 14 Mucosa genital Indeterminado VPH71, VPH90, VPH106 (*) genotipos de VPH cuyas variantes se han analizado en este trabajo. Introducciôn Entre los doce tipos incluidos en la categoria de alto riesgo (AR), VPH16 es el tipo mâs prevalente en la poblaciôn general, responsable de aproxim adam ente el 50% de todos los cânceres anogenitales (Doorbar, 2006). Los tipos de bajo riesgo (BR) se asocian m uj raram ente con câncer cervical, sin embargo son los causantes de las verrugas génitales, con una importancia médica notable por su elevada frecuencia. El género Beta esta sublividido en cinco especies, e incluye tipos que causan lesiones subcllnicas o infecciones latentes en poblaciôn general, pero pueden llegar a tener im portancia clinica en individuos inm unodeprim idos o en pacientes que padecen Epidermodiaplasia verruciformis, lo eue les hace susceptibles a la infecciôn (Harwood et al., 2002; Pfister et al., 2003). Los tipos incluidos en los géneros Gamma, Mu y N u causan papilomas y verrugas cutâneas que no suelen progresar a câncer, aunque hay descritas algunas excepciones (Pfister, 1992; Shamanin et a l, 1994). 1.4. CICLO VIRAL DE VPH En la figura 1.4 se esquem atizan las principales etapas del ciclo vital de VFH, desde la entrada de las particulas virales en zonas de descamaciôn del epitelio hasta la liberaciôn de las nuevas particulas virales. H Antc-jwpc: nauJratear!» IgG VPH ' ^ p LamànaçmlÊat ■ W no «angulnao Uwn6nna basai Granular Suprabasal ^ Basai ■ iberacon Sintesis ensam blaje Amplificaoén genom a viral Persistencia genom a viral Figura 1.4. Esquema de la in fecciôn por VPH en el tejido ep itelial m ucoso. En la figura se indican las capas del tejido y se esquem atizan los acontecimientos mâs significativos que ocurren durante la infecciôn por VPH. Los circulos rojos representan los nùcleos de las células no infectadas; los circulos azules representan los nùcleos de las células infectadas. La replicaciôn del genom a viral se produce en las capas basai y suprabasal, asi com o la expresiôn de las proteinas virales E l, E2, E4, E5, E6 y E7. En la parte superior de la capa suprabasal se produce la sintesis de las proteinas estructurales Ll y L2, favoreciendo la proteina L2 el empaquetam iento del genoma viral y la proteina Ll el ensamblaje de los viriones. La liberaciôn de los m ism os se lleva mediante la descamaciôn de las células que los contienen, en la capa granular del epitelio. (M odificado de Doordbar, 2006). Introducciôn 1.4.1. Union al receptor celular y entrada viral La primera etapa de la infecciôn es la union del virion a las células basales del epitelio. El heparân sulfato, glicosaminoglicano de la matriz extracelular, es considerada una de las moléculas responsables de facilitar la adhesion inicial, al unirse a la region carboxi-terminal de la proteina viral L1 (Joyce et al, 1999; Shafti-Keramat et al, 2003; Patterson et al, 2005). Como en el caso de otros virus, parece que es necesaria la union a receptores celulares secundarios para una infecciôn eficiente, aunque no se dispone de datos suficientes de este proceso. En el caso de VPH6 se ha descrito la integrina-ae como un posible receptor, aunque para otros tipos no parece necesario (Evander et al, 1997; McMillan et al, 1999). La entrada al interior celular es un proceso lento y los mecanismos implicados en las etapas de penetraciôn y pérdida de la câpsida del virion parece que son similares a los que llevan a cabo los poliomavirus. En algunos tipos, se ha descrito que la penetraciôn y el transporte al interior del nùcleo podrîan seguir las vias endociticas mediadas por clatrina (VPH16) o caveolina (VPH31), empleando la red citoesquelética celular (Day et al, 2003; Bousarghin et al, 2003). Lisosomas y endosomas participan en la descapsidaciôn viral y el ADN viral desnudo llega al nùcleo, pero la via de entrada al interior es un proceso que hasta el memento no es demasiado conocido, aunque se sabe que esta mediado por secuencias especificas y por la proteina menor de la câpsida L2 (Howley, 1996; Joyce et al, 1999; Nelson et al, 2002; Burd, 2003; Longworth et al, 2004b; Doorbar, 2006). 1.4.2. Replicaciôn y transcripciôn viral En las células de la capa basai, la entrada del genoma viral al nùcleo celular inicia un periodo de replicaciôn continue pero moderado, que da lugar a la producciôn de 50-100 genomas virales extracromosômicos por célula. Esta concentraciôn de episomas virales se mantiene en las células no diferenciadas, estableciendo una replicaciôn vegetativa. Los genomas se replican a una media de una vez por célula durante la fase S del ciclo celular, en concordancia con el cromosoma celular, de manera que el genoma del virus es fielmente repartido entre las células hijas (Gilbert et al, 1987; Longworth et al, 2004a). El mecanismo que dirige esta replicaciôn vegetativa y los procesos que la regulan son aùn desconocidos, pero aseguran una infecciôn latente y persistente en las células basales del epitelio. En las células diferenciadas de las capas superiores, tiene lugar la etapa final y se produce la replicaciôn productiva de miles de genomas virales por célula para el ensamblaje en particulas virales (Flores et al, 1997). Las proteinas virales implicadas en el proceso de replicaciôn son El y E2. Ambas proteinas se unen y forman un complejo que favorece el reclutamiento de los Introducciôn complejos de replicaciôn celulares (la proteina de replicaciôn A y la subunidad a-primasa de la ADN polimerasa celular) para la replicaciôn viral (Masterson et al., 1998; Conger et al., 1999; Han et al., 1999; Loo et al., 2004). La proteina viral El es una helicasa que abre el ADN a costa de la hidrôlisis de ATP, rompiendo los puentes de hidrôgeno y actuando como un hexâmero (très dimeros) en el origen de replicaciôn viral. Présenta un orificio central por el que se cree que pasa el ADN, lo que permite la separaciôn de la doble banda del ADN viral por delante del complejo de replicaciôn (Hughes et al., 1993; Longworth et al., 2004a). La proteina viral E2 es la responsable del reconocimiento y de la uniôn de la proteina viral El al origen de replicaciôn viral (Cripe et al., 1987; Doorbar, 2006). Funciona como un dimero y se une a secuencias consenso del ADN [AACCg(N4)cGGTT] llamadas secuencias de uniôn de E2 (E2BS, E2 Binding Sequences), très de las cuales flanquean este origen de replicaciôn (Longworth et al, 2004a; Dell et al., 2003). Ademâs de la funciôn descrita, la proteina viral E2 parece que tiene un papel critico en el anclaje de los genomas virales a los cromosomas mitôticos para una correcta segregaciôn; en el caso concreto de los tipos de VPH-AR, la asociaciôn parece que se hace empleando el huso mitôtico y una serie de proteinas celulares adicionales (You et al., 2004; McPhillips et al., 2005). Otra importante funciôn de la proteina viral E2 es actuar como un factor de transcripciôn, al regular el promoter viral temprano para controlar la expresiôn de los oncogenes virales {e6 y e7). Juega un papel central en la regulaciôn genética de los VPH al reprimir o activar la transcripciôn viral dependiendo de la cercania entre sus sitios de interacciôn y la caja TATA (Âlvarez-Salas et al., 1995; Hines et al., 1998). En los VPH que infectan el epitelio mucoso genital, existen dos E2BS a 3-4 pb de la caja TATA, de forma que cuando las concentraciones de la proteina E2 son bajas, esta se une a sus secuencias, pero también lo hacen los factores celulares necesarios para la replicaciôn y se activa el promoter temprano. Cuando las concentraciones de la proteina viral E2 son altas, se reprime la transcripciôn de la proteinas virales tempranas debido, posiblemente, a la exclusiôn fisica de los factores asociados a la caja TATA, y esta configuraciôn da lugar a la represiôn del promoter temprano. (Romanczuk et a l, 1990; Steger et al, 1997; Longworth et al., 2004a). La transcripciôn viral tiene lugar en el nùcleo celular y esta regulada por el estado de diferenciaciôn celular, por factores celulares especificos del propio tejido epitelial y por las proteinas virales. Los promotores de los distintos tipos de PV varian en su nùmero y posiciôn entre las distintas especies; asi, en el virus del papiloma bovine se han determinado hasta siete promotores distintos, mientras que en los papilomas humanos han side identificados seis. Las variaciones de algunos pares de bases observadas en la localizaciôn de los sitios de los promotores entre las distintas especies, no parece que influyan demasiado en la funciôn y la Introducciôn regulaciôn (Velazquez et al., 2002). Los mayorîa de los ARN mensajeros (ARNm) generados a partir de los promotores conocidos en VPH son policistrônicos (très o mas marcos de lectura abiertos), y estân sujetos a una serie de modificaciones post-transcripcionales, entre ellas procesamientos alternatives y poliadenilaciones en lugares concretes, lo que da lugar a la producciôn diferencial de los ARNm que codifican para las distintas proteinas virales individuales. Sin embargo, los mecanismos concretes que dirigen estas modificaciones no son demasiado conocidos (Longworth et al, 2004a). La transcripciôn temprana de VPH produce en primer lugar las proteinas virales E6 y E7, que actùan alterando las vias reguladoras del ciclo celular y modificando el entomo para facilitar la replicaciôn viral en las células que han completado su diferenciaciôn y permanecen en fase GO del ciclo celular (Burd, 2003). La proteina viral E6 se distribuye por el nùcleo y el citoplasma pudiendo unirse hasta a 12 proteinas celulares diferentes (Mantovani et al., 2001; zur Hausen, 2002; An et al., 2008; Tungteakkhun et al., 2008; Howie et al., 2009; Vos et al., 2009). En la mayorîa de los casos se desconoce el signihcado biolôgico, en concreto, no esta claro si estos complejos de proteinas virales/celulares estân ùnicamente implicados en el ciclo viral o si también contribuyen a la transformaciôn maligna de la célula infectada. Sin embargo, una de las dianas de la proteina E6 mâs estudiadas es la proteina celular p53, que actùa regulando los puntos de control del ciclo celular G l/S y G2/M y con ello la expresiôn de ciertas proteinas implicadas en el control del ciclo celular, incluyendo el inhibidor de ciclinas dependientes de quinasas p21 (Ko et al., 1996). Cuando el ADN celular es danado, se activa p53, lo que induce altos niveles de expresiôn del inhibidor p21 y produce una parada en el ciclo celular, deteniendo el crecimiento y la divisiôn de las células que han sufrido el daho en su ADN. Si no se puede reparar el dano, la proteina p53 con el tiempo iniciarâ la muerte celular programada o apoptosis, impidiendo el crecimiento descontrolado de las células genéticamente danadas (Huibregtse et al., 1991; Hubbert et a l, 1992). Para los VPH-AR, la proteina viral E6 se asocia con la proteina celular p53 mediante una ubiquitina ligasa de la célula llamada proteina asociada a E6 (E6 AP, E6 Associated Protein) formando un complejo temario que da lugar a la ubiquitinizaciôn de p53, y a su consecuente degradaciôn por el proteosoma 26S (complejo multiprotéico), reduciendo la vida media de p53 de unas horas a minutos (Huibregtse et al., 1991; Huibregtse et al., 1993; Stewart et al., 2004). La disminuciôn de la actividad de p53 provocada por la uniôn de E6 , da lugar a la pérdida de esta regulaciôn del ciclo celular, provocando la duplicaciôn de los cromosomas y anomalias en el centrosoma, lo que incrementa enormemente la probabilidad de las células de evolucionar a un fenotipo maligno (Figura 1.5) (Kessis et al., 1993; Foster et a l, 1994; Thompson et a l, 1997). Para los Introducciôn VPH-BR la afinidad de uniôn de la proteina E6 con p53 es menor, lo que limita su capacidad para unirse a E6AP, y ademâs no se observa la degradaciôn de p53 (Lechner et al., 1994; Hiller et al., 2006). Ubiquina ligasa celular S e u n e Activa D an o ADN ce lu la r A poptosis p21 S e un e E7PARADA EN G1 F - l I DPI Ciclo Celular Oc Unas Oc Unas dependientes de kinasas Otras proteinas celulares que Interacclonen en rritosis G2 Figura 1.5. Esquema de las funciones asociadas a las proteinas virales E6 y E7. Las proteinas virales E6 y E7 se unen en primer lugar a las proteinas celulares p53 y la proteina del retinoblatoma (pRB), respectivamente. La proteina E6 de los VPH-AR es capaz de interferir en la regulaciôn negativa de la funciôn de p53, uniéndose a ella y ubiquitinizândola, lo que lleva a la disminuciôn en los niveles de p53. La degradaciôn de pRB por parte de la proteina E7 de los VPH-AR, permite la activaciôn de una replicaciôn productiva en las células diferenciadas del epitelio. En ambos casos, la alteraciôn de las vias regulatorias del ciclo celular da lugar a la transformaciôn celular. (Modificado de Burd et al., 2003). De esta forma, la degradaciôn de p53 mediada por VPH es clave en el proceso de carcinogenesis, de la misma manera a como ocurre en otros cânceres humanos en los se observa muy a menudo que el gen de p53 esta mutado. Ademâs de esta se han descrito otras funciones de la proteina E6, como su capacidad de activar la transcripciôn de la subunidad catalitica de la telomerasa (Klingelhutz et al., 1996). La actividad de la telomerasa estâ restringida a las células embrionarias, de manera que en las células somâticas su sintesis estâ reprimida, lo que lleva al acortamiento de los telômeros con la edad, que parece relacionarse con la senescencia de las células y su muerte. Sin embargo, las células infectadas por VPH16 albergan una actividad de la telomerasa muy elevada, lo que da lugar al mantenimiento de la longitud de los telomeros y la proliferaciôn de forma indefinida (Liu, 1999; Ghittoni et al.. 10 Introducciôn 2010). Los estudios al respecto, han descrito diversos mecanismos implicados en esta activaciôn transcripcional de la enzima inducida por VPH y que predisponen a una infecciôn de larga duraciôn y al desarrollo de cancer (Veldman et al., 2003; Gewin et al., 2004; Bedard et al., 2008; Sekaric et al., 2008). La proteina viral E7, localizada principalmente en el nùcleo celular, se une a la proteina celular Rb, miembro de la familia de las proteinas supresoras de tumores del Rb junto con las proteinas pl07 y pl30. Los miembros de esta familia son los principales reguladores de la permanencia de las células en la fase GO del ciclo celular, después de producirse la diferenciaciôn celular (Berezutskaya et al., 1997; Classon et al, 2001). En concreto, la proteina Rb régula negativamente, a través de la asociaciôn directa, la transcripciôn de diversos factores de transcripciôn entre los que se incluyen los miembros de la familia E2F (E2F1-8), que estân asociados con las proteinas celulares DP (Cobrinik et al., 2005; Dimova et al., 2005). La uniôn de la proteina E7 a pRb, produce su bloqueo e impide su uniôn al complejo formado por el factor de transcripciôn celular E2F-1 y la proteina celular DPI, lo que da lugar a la activaciôn constitutiva de ciertos genes cuyos productos son necesarios para la entrada de la célula en la fase S del ciclo celular (Figura 1.5). Todas las proteinas E7 de los tipos de VPH mucosos contienen el dominio de uniôn para pRb, pero la afinidad de uniôn por la misma puede diferir considerablemente, y la proteina E7 de los VPH-BR se une a pRb con menor afinidad que la proteina E7 sintetizada en los tipos de AR (Munger et al., 1989). Ademâs, se ha observado que la degradaciôn de la proteina a través del mecanismo dependiente de la ubiquitinizaciôn por el proteosoma es una propiedad exclusiva de los tipos de VPH-AR, lo que da como resultado la estimulaciôn de la sintesis y la proliferaciôn en las células ya diferenciadas del epitelio (Boyer et al., 1996; Berezutskaya et al., 1997; Helt et al, 2003). De la misma forma que ocurre con la proteina E6 , la proteina E7 interacciona también con otras proteinas celulares citoplasmâticas y nucleares, en muchos casos estos mecanismos estân todavia en estudio (Ghittoni et al., 2010). Ademâs de las descritas, son sintetizadas las proteinas virales E4 y E5. La proteina E4 se describe como una proteina de expresiôn temprana al observarse ciertos niveles de expresiôn en las primeras fases de la infecciôn en las células basales, sin embargo los mayores niveles se encuentran en células epiteliales diferenciadas, durante la fase tardia de la infecciôn. La proteina se sintetiza como una proteina de fusiôn con los cuatro primeros aminoâcidos de la proteina El (E1^E4), y actùa formando complejos hexaméricos que se unen y alteran la red de queratina del citoplasma en la célula infectada, produciendo la desorganizaciôn de la estructura celular. Esto sugiere que podria facilitar la liberaciôn de las particulas virales 11 Introducciôn maduras del interior de la célula. En VPHll y VPH16, se ha observado ademâs que su sobreexpresiôn produce una parada en fase G2 del ciclo celular y aunque no estâ claro que implicaciôn tiene esta parada en el ciclo viral, parece contrarrestar los efectos de la proteina viral E7 que actùa estimulando las células a fase S (Doorbar et al, 1991; Howley, 1996; Dhabi et al., 2002). La proteina viral E5 es una pequena proteina hidrofôbica que se localiza sobre todo en la membrana del reticulo endoplasmâtico, pero también estâ asociada a H+-ATPasas vacuolares, para retrasar el proceso de acidificaciôn de los endosomas. La funciôn de esta proteina no estâ clara, aunque parece favorecer un ambiente para la estimulaciôn de la replicaciôn viral, mediado por su uniôn al receptor del factor de crecimiento epitelial (EGRF, Epidermal Growth Factor Receptor), dando lugar a una proliferaciôn celular continuada y una pérdida de la diferenciaciôn celular (Straight et al, 1995; Rodriguez et al, 2000; Disbrow et al, 2005). En las células totalmente diferenciadas se transcriben, a partir de los promotores tardios, los genes que codifican para las proteinas de la câpsida viral, L1 y L2. Los procesos que unen la amplificaciôn del genoma a la sintesis de las proteinas de la câpsida viral estân todavia en estudio, aunque parece que dependen de cambios en el splicing de los ARNm y en la generaciôn de transcrites que terminan en los sitios de poliadenilaciôn tardios. Durante la diferenciaciôn celular epitelial, la sintesis de la câpsida estâ regulada, tanto a nivel de procesamiento del ARN como a nivel de sintesis de proteinas (Zhou et al., 1999; Schwartz et al., 2000). Por un lado, se contrôla la estabilidad del ARNm con elementos reguladores negatives, présentes tanto en las regiones codificantes como en la regiôn reguladora, y por otro con la presencia de un silenciador de splicing en el gen 11, lo que lleva, al menos en el caso de VPH16, a la sintesis preferencial de los transcrites tempranos en las células que estân proliferando (Zhao et al., 2003). 1.4.3. Ensamblaje y liberaciôn de las particulas virales Las particulas virales ensambladas en el nùcleo son liberadas con la descamaciôn de las células de la ùltima capa de la epidermis. El ensamblaje de las particulas infecciosas en las capas superiores del epitelio requiere la presencia de la proteina viral E2, junto con las proteinas virales L1 y L2, para mejorar la eficacia del proceso de encapsidaciôn (Day et al, 1998). Los procesos que permiten la entrada de las proteinas de la câpsida al interior del nùcleo para el ensamblaje de las mismas, junto con el ADN viral, estân todavia en estudio, aunque parece que el transporte estâ mediado por receptores de la familia Kap (Middleton et al, 2003). 12 Introducciôn 1.5. PATOLOGIA DE LA INFECCIÔN FOR VPH ANOGENITAL El primer PV animal fue descrito por Richard Shope (1930), que identified y caracterizô la naturaleza transmisible de los papilomas en los conejos comunes. La introducciôn de las técnicas de biologia molecular permitiô el conocimiento de las funciones de los diferentes genes virales, fundamentalmente los oncogenes, ademâs de las propiedades biolôgicas y bioquimicas del virus. El establecimiento de la relaciôn causal entre la infecciôn viral y el desarrollo de câncer fue sugerido por primera vez a principios del ano 1976 y en el ano 1981, Zur Hausen et al. detectaron la presencia de ADN de VPH en neoplasias, siendo descrita la capacidad de la proteinas virales E6 y E7 de VPH16 para inmortalizar y transformar queratinocitos humanos en el ano 1989. El VPH infecta el tejido epitelial del tracto anogenital, aunque también puede producir lesiones en el trato superior aerodigestivo (cavidad oral, faringe y laringe) y el tejido epitelial cutâneo. La infecciôn anogenital se localiza fundamentalmente en una delgada regiôn del epitelio conocida como zona de transiciôn, localizada tanto en el cérvix como en el canal anal, y que limita el tejido epitelial columnar y el tejido epitelial escamoso. 1.5.1. Infecciôn subclinica La gran mayorîa de las infecciones por VPH se incluyen en este grupo. Al no presentar una evidencia clinica o morfolôgica, la infecciôn pasa desapercibida y se facilita el contagio. Sôlo es posible detectarla con métodos de determinaciôn del ADN viral. 1.5.2. Infecciôn clinica Una pequena proporciôn de infecciones por VPH se manifiestan clinicamente, son en su mayorîa de tipo benigno y en aproximadamente el 90% de los casos se produce un aclaramiento, ya que el sistema inmune es capaz de controlar la infecciôn. Sin embargo, un pequeno porcentaje de individuos pueden Uegar a desarrollar lesiones con potencial pre- maligno e incluso câncer, generalmente a partir de infecciones crônicas o persistentes. 1.5.21. Verrugas anogenitales Las verrugas anogenitales o su acumulaciôn {condyloma acuminata) son tumores benignos que se localizan en cualquier zona de los génitales extemos e intemos. Son la consecuencia de la proliferaciôn anormal de las células y estân causadas, en la mayor parte de los casos, por la infecciôn con tipos de BR (VPH6,11, 30, 42, 43, 54, 55, 70). En los individuos inmunocompetentes, mâs del 90% de las verrugas génitales estân relacionadas con los tipos de VPH6 y 11, siendo el mâs observado VPH6 (55-90% de los casos). En el caso particular de los 13 Introducciôn individuos inmunodeprimidos, es mayor la prevalencia del tipo 11 con respecto al tipo 6, se observan mâs lesiones que contienen infecciones con tipos de AR, con mâs de un tipo, o incluso verrugas génitales en las que no se observa la presencia de los tipos 6 u 11. 1.5.2.2. Lesiones precursor as de câncer en cérvix v ano Los cambios histopatolôgicos resultado de la infecciôn por VPH en cérvix han sido descritos y la terminologia de las alteraciones del epitelio ha evolucionado paralelamente al avance del conocimiento de la biologia e historia natural del virus. Inicialmente se describiô el carcinoma in situ y fue en la década de los cincuenta cuando se estableciô el término displasia para los cambios epiteliales menos acusados. La demostraciôn de cambios histolôgicos que eran similares en algunas displasias y el carcinoma in situ condujo, a principios de los ahos 70, a la introducciôn del concepto de neoplasia cervical intraepitelial (CIN, Cervical Intraepithélial Neoplasia), que unificaba los conceptos anteriores y clasificaba las lesiones en très grados de menor a mayor severidad (I, II y III). En la actualidad, sigue empleândose esta terminologia en el diagnôstico histolôgico, pero no en el citolôgico. En el ano 1989 se propuso el Sistema Bethesda para describir las alteraciones citolôgicas, incluyendo nuevos conceptos sobre infecciôn cervical por VPH. En el ano 2001 se revisô y modificô ligeramente dicha clasificaciôn, sustituyendo el término neoplasia por lesiôn escamosa intraepitelial (SIL, Squamous Intraepithélial Lesion) con dos categorias: bajo grado (LSIL, Low Grade Squamous Intraepithélial Lesion) y alto grado (HSIL, High Grade Squamous Intraepithélial Lesion). Las lesiones de bajo grado reflejan cambios morfolôgicos debidos a la replicaciôn activa de VPH, y no son considerados precancerosos. Sin embargo, HSIL incluye CIN II y CIN III, respectivamente, y estas lesiones, concretamente CIN III, son consideradas verdaderas lesiones precursoras de câncer cervical. Al igual que en el câncer cervical invasivo, el câncer anal invasivo es precedido de lesiones precursoras claramente establecidas y que se denominan neoplasia anal intraepitelial (AIN, Anal Intraepithélial Neoplasia) (clasificaciôn histolôgica) o LSIL/HSIL (clasificaciôn citolôgica). El AIN I y el LSIL no se consideran precursores directes del câncer anal invasivo, pero pueden predecir el desarrollo posterior de AIN II/III o HSIL. 1.5 2.3. Câncer de cérvix v câncer de ano En las grandes series de casos de câncer cervical invasivo, el ADN de VPH ha sido identificado en el 99,7% de los tumores, por lo que se ha establecido que es la causa necesaria para su desarrollo (Bosch et al., 1995; Walboomers et al., 1999), En un estudio mundial de 3.000 casos publicado por la Agenda Intemadonal de Investigaciôn en Câncer (lARC, International Agency for Research on Cancer) (Muhoz et al., 2004a) y en un meta anâlisis de aproximadamente 10.000 casos (Clifford et al., 2003), se han descrito las distribuciones de tipos de VPH en el 14 Introducciôn câncer cervical, y los ocho tipos mâs comunes en las muestras analizadas en ambas series fueron: VPH16,18,45, 31, 33, 52, 58 y 35. De acuerdo con su clasificaciôn histolôgica, el 85% de los cânceres cervicales pertenecen al tipo escamoso, le siguen adenocarcinomas, y un pequeno nùmero son tumores neuroendocrinos. Los estudios llevados a cabo en base a su clasificaciôn histolôgica, muestran que VPH16 y 18 son los mâs comunes para los tipos escamoso y adenocarcinoma, pero la fracciôn de cânceres escamosos atribuibles a VPH16 y VPH18 es del 70%, mientras que para el adenocarcinoma es del 86%. (Munoz et al, 2004a; Castellsagué et al, 2006). Los datos publicados para câncer de cérvix por Globocan en el afio 2008, lo sitùan como el segundo câncer mâs comùn en el mundo, describiéndose aproximadamente 530.000 casos/ano (Figura 1.6), con una mortalidad anual de cerca de la mitad de los casos (Ferlay et ai, 2010). A pesar de que el câncer cervical se describe en todo el mundo, su frecuencia estâ distribuida de manera désignai, siendo en los paises en vias de desarrollo donde se describen la mayor parte de los casos (80%), lo que se atribuye a las diferencias para accéder a las estrategias de prevenciôn taies como el cribado mediante la citologia o el tratamiento de las lesiones precursoras de câncer (Hoory et al, 2008). C asos por 100.000 m ujeres/ano < 7 .0 ■ < 12.9 ■ < 2 0 .3 ■ < 29 .8 ■ < 56 .3 Figura 1.6. Tasas de incidencia estandarizadas por edad del câncer de cérvix actualizadas en 2008 en el mundo. (Ferlay et al., 2010). En relaciôn a la asociaciôn de la infecciôn por VPH y el câncer anal, en una revisiôn de 35 estudios realizada en pacientes con câncer anal invasivo y publicada por Hoots et al. en el 15 Introducciôn ano 2009, se describiô la presencia de VPH en el 86,5% de las mujeres y 76,7% de los hombres. El tipo de VPH mâs prevalente fue VPH16, que se identified en el 73,7% de los casos en las mujeres y en el 60% de los hombres, seguido de VPH18, aunque este sôlo se identified en, aproximadamente, el 8% de los casos, tanto en mujeres como en hombres. La presencia descrita de otros tipos de VPH fue menor. La mayor parte de los cânceres anales invasivos pertenecian al tipo histolôgico escamoso (74,5%), aunque una pequena proporciôn de los cânceres eran clasificados como basaloides (3,4%), adenocarcinomas (0,7%) o no teman asignada una clasificaciôn histolôgica (21,4%), de manera que para el anâlisis de los datos se emplearon los dos tipos histolôgicos mâs frecuentes. Los datos de câncer anal publicados en el ano 2002, describen aproximadamente 99.000 nuevos casos en el mundo, el 60% en mujeres y el 40% en hombres, pero a pesar de la baja frecuencia de este câncer, en los ùltimos 50 ahos se ha descrito un incremento de la tendencia en su incidencia tanto en mujeres como en hombres (Giuliano et ah, 2008). Durante el perîodo 1973 a 2000, la incidencia de câncer anal en los Estados Unidos se incrementô dos veces mâs entre los hombres que entre las mujeres (Daling et ah, 2004), y esta incidencia es particularmente mayor (10-50 veces) entre los hombres que practican sexo con hombres (HSH) y los adultos (hombres y mujeres) infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), cuando es comparada con la poblaciôn general (Rabkin et ah, 1994; Melbye et ah, 1994a; Koblin et ah, 1996; Goedert et ah, 1998; Grulich et ah, 1999; Frisch et ah, 2000, 2001; Mbulaiteye et ah, 2003; Dal Maso et ah, 2003; Parkin et ah, 2006a; Hessol et ah, 2007). 1.5.2.4. Otros cânceres anogenitales Ademâs del cérvix y el ano, la infecciôn por VPH se détecta en otras localizaciones del tracto anogenital que presentan epitelio estratificado como son la vulva, la vagina o el pene. El câncer de vulva y vagina en los datos publicados por Globocan en el ano 2002 (Ferlay et ah, 2004) representan aproximadamente un 3% y un 2% respectivamente, de los cânceres en el mundo (Sankaranarayanan et ah, 2006), y en ambos casos con mâs frecuencia en mujeres mayores; el 66% de las pacientes con diagnôstico de câncer de vulva tienen 70 ahos o edades superiores y en el câncer de vagina la media de edad en el momento del diagnôstico es de 69 ahos (Giuliano et ah, 2008). La prevalencia de ADN de VPH observada en el câncer de vulva varia desde 27,3% al 100% y VPH16 es el tipo que se détecta con mâs frecuencia, seguido de VPH18 (Giuliano et ah, 2008). En el câncer de vagina, el ADN de VPH se détecta en el 91% de los casos y, de la misma manera que en el câncer de vulva, VPH16 es el tipo mâs prevalente (Hildesheim et ah, 1997; Carter et ah, 2001; Daling et ah, 2002). El câncer de pene représenta menos de un 0,5% de los cânceres en los hombres y la correlaciôn geogrâfica entre las 16 Introducciôn incidencias de los cânceres de pene y cervical en parejas, lleva a pensar en un origen comùn para ambos (Micali et al., 2006). El ADN de VPH es detectado en el 40-50% de todos los cânceres de pene, y los estudios serolôgicos han confirmado el papel de VPH16 y 18 (lARC, 2007). En una revisiôn bibliogrâfica de los principales estudios (1986-2008) publicada por Miralles-Guri en el ano 2009, se confirman estos datos de prevalencia global de infecciôn por VPH (46,9%) e indican que la mitad de los tumores de pene estân asociados a los tipos 16 y 18. 1.5.3. Progresiôn a câncer de la infecciôn viral Debido a que la relaciôn entre VPH y câncer cervical es la mâs estudiada, nos centramos en esta para describir las principales etapas de la carcinogenesis que incluyen: la infecciôn en la zona de transiciôn del epitelio por uno o mâs tipos de VPH-AR, la persistencia del virus, la progresiôn de las lesiones precursoras de câncer y la invasiôn del tejido (Figura 1.7). Las razones por las que la infecciôn por VPH tiende a causar câncer en las âreas que se conocen como zonas de transiciôn son desconocidas, pero el cérvix y el ano son ejemplos de tejidos con zonas de transformaciôn propensos a la carcinogenesis viral (Moscicki et al, 2006). En la mayorîa de los casos la infecciôn por VPH es transitoria porque el sistema inmunolôgico es capaz de resolverla y, como hemos indicado, puede o no estar asociada a la apariciôn de lesiones clinicas. El tiempo de aclaramiento de la infecciôn para los tipos de AR, particularmente VPH16, es de media 8-14 meses, considerablemente mâs alto que para los tipos de bajo riesgo, que suele ser de 5-6 meses (Franco et al, 1999; Giuliano et al, 2002; Brown et al, 2005). Sin embargo, si la respuesta inmune no es eficiente, la infecciôn por VPH se puede establecer como persistente, lo que es probable que lleve a que se produzcan cambios genéticos secundarios, dada la capacidad de las proteinas virales para interferir con los puntos de control del ciclo celular, e inducir la inmortalizaciôn del queratinocito. Activaciôn de oncoproteinas celulares y/o neutraiizaciôn de genes supiBsores de tumores Persistencia de la Infecciôn tr I Inestabilidad cromosômica | Bpitelio Nonnal % <=> I Integraciôn ADN de VPH Figura 1.7. Esquema del proceso de transformaciôn inducido por VPH. (Modificado de Ghittoni et al, 2010). 17 Introducciôn Los factores que estân asociados a esta persistencia viral son dificiles de interpretar, ya que no se conoce en que paso de los multiples que incluye el proceso carcinogénico, estân mâs involucrados o a que nivel. Sin embargo, se han descrito a nivel viral ademâs del tipo de VPH, la elevada carga viral, la presencia de mâs de un tipo en el epitelio y la presencia de ciertas variantes de VPH (Xi et al, 1995; Xi et al, 1997), tema principal de este trabajo. Otros cofactores de persistencia que podrîan modular la historia natural de la infecciôn por VPH son el consumo de tabaco, el uso prolongado de anticonceptivos orales, el empleo de métodos profilâcticos, un elevado nùmero de alumbramientos, la presencia de otras infecciones de transmisiôn sexual (Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis), el consumo de alcohol, o el efecto protector de la ingesta de diferentes nutrientes (vitaminas E-C, fi-caroteno, licopeno) frutas y verduras (Moscicki et al., 2006). De especial interés en este trabajo es la inmunodepresiôn causada como consecuencia de la infecciôn por VIH-1, descrita también como un factor de riesgo para la persistencia viral asi como otros estados de inmunodepresiôn (Sun et al., 1997; Frisch et al., 2000; Palefsky et al., 2003). A pesar de lo descrito, la persistencia no es suficiente para el desarrollo de câncer ya que existen tipos que no estân identificados como carcinogénicos, que también persisten (ej. VPH61). La progresiôn de las lesiones y la invasiôn del tejido se sabe que también son necesarios, sin embargo, tampoco es posible determinar el momento exacto de transiciôn desde que VPH infecta el epitelio hasta el estadio previo a câncer, definido como CIN III, debido a la dificultad que implica la clasificaciôn histolôgica de una lesiôn intraepitelial cervical de grado II. En el câncer de cérvix, en una elevada proporciôn de las células, se détecta el ADN de VPH integrado en el genoma celular del hospedador. Esta integraciôn viral, que se produce mediante recombinaciôn no homôloga, ocurre preferentemente en los sitios frâgiles de los cromosomas. La integraciôn implica la pérdida del gen e2, y como consecuencia se produce una regulaciôn positiva de la expresiôn de las proteinas virales E6 y E7, lo que facilita la transformaciôn celular (Ghittoni et al., 2010). 1.6. EPIDEMIOLOGIA DE LA INFECCIÔN POR VPH ANOGENITAL La infecciôn por VPH es la mâs comùn de las infecciones de transmisiôn sexual (ITS) que se diagnostican actualmente en la poblaciôn mundial. Se han descrito formas altemativas de transmisiôn, que incluyen la transmisiôn vertical o matemo-infantil y horizontal o por fomites, pero el impacto potencial en el nùmero de infecciones o en su patologia asociada es mucho menor. El factor mâs documentado para la adquisiciôn de la infecciôn por VPH es el 18 Introducciôn nùmero de parejas sexuales; a mayor nùmero de parejas sexuales mayor sera el riesgo de adquirir la infecciôn (Munoz et al., 2004b; Moscicki et al., 2006). Otros posibles factores de riesgo son el inicio temprano de las relaciones sexuales (Burchell et al., 2006), el consumo de tabaco (Burchell et al., 2006) y la ausencia del uso del preservative (Winer et al., 2006). El uso de anticonceptivos orales, un alto nùmero de alumbramientos, y la infecciôn previa con otras infecciones de transmisiôn sexual no se han asociado claramente con el riesgo de adquirir la infecciôn (Moscicki et al., 2006). En algunos estudios, se ha apuntado la circuncisiôn masculina como una medida de protecciôn frente a la infecciôn por VPH para reducir el riesgo de cancer cervical, aunque es un factor todavia en estudio (Castellsague et al., 2002). En el caso particular del grupo de HSH, poblaciôn de estudio en este trabajo, los factores de riesgo para la presencia de la infecciôn anal por VPH incluyen, ademâs de los descritos, la infecciôn por VIH, bajos niveles de CD4, la presencia de verrugas génitales y una historia de relaciones sexuales anales receptivas (Critchlow et al., 1998). 1.6.1. Prevalencia de la infecciôn en mujeres Los estudios de la infecciôn por VPH mediante técnicas de detecciôn de ADN en mujeres asintomâticas en poblaciôn general, estiman una prevalencia de la infecciôn con datos variables (Trottier et al., 2006). Esta amplia variaciôn en los datos bibliogrâficos son explicados en gran parte por las diferencias en la edad de la poblaciôn estudiada, y en la sensibilidad de la metodologia molecular empleada para detectar el genoma viral (Bosch et al., 2003). En cualquier caso, la prevalencia de la infecciôn es mayor entre las mujeres jôvenes sexualmente activas (Schiffman et al., 1992; Kjaer et al., 2001). La mayorîa de los estudios epidemiolôgicos describen la prevalencia de la infecciôn con una tendencia a disminuir con la edad, lo que puede explicarse posiblemente por la combinaciôn ciertos factores, entre ellos la disminuciôn de la exposiciôn a VPH, la naturaleza autolimitante de la propia infecciôn y la resistencia a re- infecciones. Sin embargo, en estudios llevados a cabo en poblaciones de América del Sur, se describe una tendencia en U, con un incremento de la prevalencia en la madurez (Herrero et al., 2000; Salmeron et al., 2003). Esto podria reflejar cambios en el comportamiento sexual (efecto cohorte), lo que résulta en nuevas exposiciones en esta etapa vital o reactivaciones de infecciones latentes adquiridas en la etapa juvenil (Ferenczy et al., 1985; Maran et al., 1995; Boxman et al., 1999). Las estimaciones de prevalencia de infecciôn en mujeres de poblaciôn general en el mundo han sido coordinadas por la lARC, comparando estudios realizados con la misma metodologia de diagnôstico molecular y anâlisis epidemiolôgico. En funciôn de los datos 19 Introducciôn obtenidos, las tasas mâs altas de prevalencia se observan en Nigeria (28%) (Thomas et al., 2004) o en paises latinoamericanos como Argentina (17%) (Matos et al., 2003) y Costa Rica (16%) (Herrero et al., 2000). En los paises europeos estudiados se describen prevalencias de infecciôn mâs bajas, como es el caso de Suecia (7%) (Forslund et al., 2002) o en Espana, donde el ûnico estudio de âmbito poblacional fue llevado a cabo en la ciudad de Barcelona y la prevalencia de la infecciôn descrita fue de un 3% (de Sanjose et al., 2003). En Espana existen otros trabajos en los que se describen datos de prevalencia de la infecciôn, aunque empleando muestreo de conveniencia. Es el caso de un estudio de 1.011 mujeres realizado en un centro de planihcaciôn familiar en Alicante, en el que se describe una prevalencia global de infecciôn de VPH-AR del 10%, siendo del 8,2% en mujeres espanolas, 27,5% en mujeres colombianas, de 23,1% en mujeres ecuatorianas y 22,7% en mujeres de otros palses latinoamericanos (Gonzâlez et al., 2006). Puig et al. observan una prevalencia muy similar (10,6%) para 298 mujeres que acuden a una red de centres urbanos de detecciôn precoz de câncer de cérvix en Zaragoza, en el ano 2005. Un grupo de gran interés en el estudio de la prevalencia de la infecciôn por VPH en mujeres son las poblaciones de alto riesgo de infecciôn, que incluyen mujeres que ejercen la prostituciôn y las internas en prisiôn. La elevada prevalencia de infecciôn con respecto a la poblaciôn general, puede estar asociada a multiples factores de riesgo como la coinfecciôn por VIH y otras ITS, y estar sometidas a exclusiôn social. Los datos en Espana en mujeres que ejercen la prostituciôn parten de trabajos publicados por grupos en diferentes ciudades. En el aho 2001, se describe una prevalencia del 61,6% en una muestra de 177 mujeres que acuden a una clinica especializada en enfermades transmisibles sexualmente de la ciudad de Oviedo (Touze et al., 2001); y en el ano 2002, en un centro de enfermedades de transmisiôn sexual en la ciudad de Madrid, la prevalencia obtenida para una muestra de 754 mujeres inmigrantes fue del 39% (Del Amo et al., 2005). Los datos publicados en mujeres en prisiôn en Espafia son escasos. En un trabajo llevado a cabo en Barcelona, se describiô una prevalencia del 46%; y entre los factores de riesgo que se identificaron se encontraban estar infectada por VIH y haber consumido drogas durante mâs de 10 ahos (de Sanjose et al., 2000). En la ciudad de Alicante, se observô una prevalencia de la infecciôn del 29% (Gonzalez et al., 2008). En esta linea, los datos de prevalencia obtenidos en un estudio de 1.889 mujeres (Madrid y Alicante), que incluia mujeres de poblaciôn general y de alto riesgo (mujeres que ejercen la prostituciôn y recluidas en prisiôn), fueron 10,7% y 31,5%, respectivamente (Ortiz et al., 2006). 20 Introducciôn 1.6.2. Prevalencia de la infecciôn en hombres Existen numerosos trabajos publicados sobre la infecciôn por VPH y sus consecuencias en las mujeres, sin embargo los datos en hombres son mâs escasos. A finales de los ahos 90 se empieza a vislumbrar que el VPH produce en la zona de transiciôn del canal anal lesiones similares a las que produce en el cérvix uteiino, y que éstas son mâs frecuentes en HSH que en hombres heterosexuales. La mayorîa de estudios publicados en los ùltimos ahos son principalmente los realizados en HSH y coinfectados por VIH, dada la alta prevalencia de infecciôn y lesiôn anal en esta poblaciôn. Los datos bibliogrâficos sobre la infecciôn por VPH en hombres heterosexuales son escasos. En el aho 2006, Dunne et al., realiza una revisiôn de diversos estudios disponibles en la literatura sobre infecciôn por VPH en hombres asintomâticos. La prevalencia de infecciôn variô en base a la toma de muestra, la localizaciôn anatômica de la misma (prepucio, glande, escroto, uretra o el cuerpo del pene) y la metodologia de diagnôstico molecular empleada. La prevalencia en el glande fue 6,5%-50%; en el cuerpo del pene 5,6%-51,5%; en el prepucio 24%-50%; en el escroto 7,1 %-46,2% y en la uretra los datos de prevalencia oscilaron entre 8,7%-50%. Algunos estudios evaluaron la regiôn perianal, el ano o el recto encontrândose valores de prevalencia de VPH que oscilaron entre el 0% y el 32,8%. Como conclusiôn a dicho trabajo, destacar que las mejores localizaciones para realizar la toma de muestra fueron el glande, el prepucio, el cuerpo del pene y el escroto. Si bien el semen y la orina se han utilizado en diversos estudios publicados en la bibliografîa para el anâlisis de prevalencia de infecciôn por VPH, estas muestras biolôgicas no se consideran las mâs apropiadas (Giuliano et al., 2007; Nielson et al., 2007). 1.6.3. Prevalencia de la infecciôn en mujeres y hombres infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana Histôricamente, los principales estudios de neoplasias asociadas a VPH en estados de inmunodepresiôn se realizaron en pacientes receptores de un transplante (Roka et al., 2004; Patel et al., 2005), pero en los ùltimos ahos la mayorîa de los estudios de prevalencia de infecciôn o de lesiones asociadas se han focalizado en los pacientes infectados por VIH. Tanto VPH como VIH son ITS, de tal forma que las personas que han adquirido el VIH por via sexual, tienen una alta probabilidad de ser infectados por VPH ya que los factores que incrementan la susceptibilidad de los pacientes VIH positives para la infecciôn por VPH, facilitan que ésta sea mâs persistente y /o altera la historia natural de infecciones preexistentes de VPH (Fife et al., 2009). Al igual que ocurre en las mujeres y hombres no infectados por VIH, los estudios de la prevalencia de infecciôn por VPH en mujeres coinfectadas por VIH, 21 Introducciôn presentan diferencias en el diseno y en la metodologia empleadas para la detecciôn del ADNJ de VPH. Las publicaciones mâs recientes en mujeres infectadas por VIH describen altas tasas de prevalencia de infecciôn anogenital, que varian entre 44-84%. (Anderson et al., 2008; Hessol et al., 2009; Dames et al., 2009; Fife et al, 2009). De la misma manera, los hombres heterosexuales infectados por VIH han mostrado valores elevados de infecciôn anal por VPH, que varian entre 23,8% y 64% (Abramowitz et al., 2009; Muller et al, 2009). La mayor parte de los estudios de prevalencia de infecciôn anal en hombres infectados por VIH-1 se han llevado a cabo en HSH, y en todos se describen tasas de infecciôn anal muy elevadas (85-97,9%) (Critchlow et al, 1998; Piketty et al, 2003; Palefsky et al, 2005; De Pokomandy et al, 2009). Ademâs, para los HSH, la probabilidad de presentar infecciones multiples (61%) y con tipos de alto riesgo oncogénico (65%) es también muy elevada (Hessol et al, 2009). En Espana, los datos de la prevalencia de infecciôn por VPH en pacientes infectados por VIH son escasos. Para las mujeres, los datos descritos por un estudio publicado en el ano 2009 en una cohorte de 139 mujeres seguidas durante cuatro anos (1999-2003), establecen una prevalencia de infecciôn cervical por VPH del 63% (Videla et al, 2009). Entre los hombres, un estudio publicado en el ano 2006 describiô un prevalencia global de infecciôn anal por VPH del 78%, siendo 83% en HSH y del 68% en hombres heterosexuales (Sirera et al, 2006). En un estudio realizado en el aho 2010 por Ortiz et al. en una cohorte abierta, multicéntrica y prospectiva de pacientes infectados por VIH-1 y sin tratamiento con antirretrovirales cuando se incluyen en la cohorte, describen una prevalencia de infecciôn anal por VPH del 88% para HSH y del 65% y 55% de infecciôn anal y cervical, respectivamente en mujeres. 1.7. MÉTODOS DE DETECCIÔN Y CARACTERIZACIÔN DE VPH La introducciôn de los métodos moleculares en el diagnôstico del VPH y la caracterizaciôn de tipos y variantes ha sido de gran utilidad en el conocimiento de la infecciôn, dadas las limitaciones derivadas de la ausencia de sistemas de cultivos m vitro del VPH. 1.7.1. Identificaciôn directa La mayor parte de los métodos de identificaciôn directa de infecciôn por VPH estân basados en la detecciôn del ADN del virus, aunque también se han desarroUado sistemas basados en la detecciôn del ARN y de las proteinas virales. 1.7.11. Sistemas de hibridaciôn El Southern blotting es el primer método utilizado en la detecciôn de VPH en muestras clinicas. De manera esquemâtica, el ADN extraido de la muestra se digiere con una o 22 Introducciôn mâs enzimas de restricciôn y posteriormente los productos résultantes se separan por electroforesis en gel de agarosa y son transferidos a un soporte de nitrocelulosa o nylon. Por ultimo, se lleva a cabo una hibridaciôn con sondas especificas de VPH marcadas con fôsforo- 32. Puede ser utilizado desde el punto de vista diagnôstico, aunque con ciertas limitaciones: es dependiente de la cantidad y la calidad del ADN purificado, del tamano de la sonda y de la cantidad de ADN transferido, y requiere grandes cantidades de muestra. Es una técnica laboriosa y ademâs requiere la utilizaciôn de radioactividad, por lo que su utilizaciôn se ha reemplazado por métodos de hibridaciôn mâs prâcticos que permitan el anâlisis de un elevado nùmero de muestras (Southern, 1975; Schiffman et al., 1991; Hubbard, 2003). La hibridaciôn in situ es una técnica aplicada normalmente a muestras citolôgicas e histolôgicas que son permeabilizadas mediante la utilizaciôn de enzimas o detergentes, de manera que se permita la accesibilidad de sondas marcadas que hibridan de forma especifica con el ADN de VPH en el interior del nùcleo celular. Para la identificaciôn de los tipos de VPH se requiere el uso de sondas tipo-especificas y mùltiples ensayos de hibridaciôn, lo que hace que se convierta en una técnica demasiado laboriosa para realizarla sobre un elevado nùmero de muestras. Su especificidad comparada con PCR es mayor, y por ello se considéra mâs como una técnica confirmatoria de la presencia de VPH en biopsias cuyo diagnôstico es dudoso. Es posible la utilizaciôn de sondas marcadas con radioactividad pero, dada la necesidad de instalaciones adecuadas y personal debidamente entrenado para la manipulaciôn de las mismas, no es de elecciôn para su uso de manera rutinaria. Las técnicas no isotôpicas para detecciôn colorimétrica o quimiluminiscente utilizan sondas marcadas con biotina y digoxigenina que permiten una localizaciôn mâs précisa de la reacciôn, ademâs de ser mâs estables y econômicas (Hubbard, 2003). El ensayo de captura de hibridos (hc2 High-Risk HPV DNA Test®, Qiagen, Alemania) para la detecciôn del ADN de VPH estâ basado en la hibridaciôn en soluciôn de un elevado nùmero de sondas de ARN sintéticas, complementarias a la secuencia especifica de 18 tipos de VPH. La prueba se présenta en dos formatos independientes, la detecciôn ùnicamente de 13 tipos de AR (16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) o la detecciôn de los tipos de AR y BR (6, 11, 42, 43, 44). Los resultados se expresan como unidades de luz relativas y son proporcionales a la cantidad del ADN de VPH présente en la muestra biolôgica, lo que aporta una medida semicuantitativa de la carga viral. El valor de corte a partir del cual se establece un resultado como positivo es de 1.0 unidad de luz relativa (équivalente a 1.0 pg de ADN de VPH por 1.0 ml de muestra). El limite de detecciôn de este ensayo es de 1 pg/m l de muestra, lo que équivale a 100.000 copias de VPH por ml de muestra (instrucciones del fabricante). 23 Introducciôn El ensayo de captura de hibridos es de fâcil aplicaciôn y adecuado para la automatizaciôn y el procesamiento de un elevado numéro de muestras, sin embargo aunque es la metodologia recomendada por la EDA (Food and Drug Administration, EE.UU) para la detecciôn de la infecciôn por VPH en muestras cérvico uterinas, se han descrito algunas limitaciones en la técnica, como es la hibridaciôn cruzada con los tipos VPH6 y VPH42 para la sonda de alto riesgo, y en menor medida para los tipos VPH40, VPH53 y VPH66 (Meyer et al., 1998). 1.71.2. Ensavos basados en amplificaciôn por PCR La sensibilidad y especificidad de los métodos basados en técnicas de amplificaciôn por PCR varian dependiendo de los cebadores utilizados, el tamano del producto, la polimerasa empleada, el tipo de VPH amplificado y la capacidad del sistema para detectar multiples tipos. Para la detecciôn y caracterizaciôn de tipos de VPH mediante PCR se pueden utilizar cebadores especificos de tipo, que se han disenado clâsicamente en regiones del genoma con un elevado polimorfismo entre los distintos tipos virales, taies como las regiones que codifican para las proteinas virales E6 y E7 o sistemas de cebadores consenso o genéricos que se disenan en regiones altamente conservadas en los diferentes tipos de VPH, como es la regiôn que codifica para la proteina viral Ll. El primer diseno permite amplificar un solo tipo de VPH en cada reacciôn, de manera que es necesario realizar mùltiples reacciones separadas de una misma muestra para la identificaciôn de tipos, o bien disehar sistemas de amplificaciôn mùltiples utilizando diferentes mezclas de cebadores en una misma reacciôn (PCR multiplex). La utilizaciôn de cebadores consenso o genéricos permite la detecciôn de un amplio nùmero de tipos de VPH. Entre los diferentes sistemas de cebadores genéricos utilizados de forma clâsica podemos hablar de diferentes disenos: sistema de GP5/6 y su versiôn modificada GP5+/6+ (Van der Brûle et al, 1990; De Roda et al., 1995), sistema MY09/11 (Manos et al., 1994), sistema PGMY09/11 (Gravitt et al, 2000) y sistema SFl/2 (Kleter et al, 1998). En la actualidad existen diferentes metodologias en el mercado estandarizadas y validadas para la detecciôn de VPH mediante sistemas de amplificaciôn, como el Amplicor® Human Papillomavirus (HPV) DNA Test (Roche Molecular Diagnostics, EE.UU). La prueba utiliza la amplificaciôn del ADN de VPH de 13 tipos de AR empleando cebadores marcados con biotina en su extremo 5', amplificando un fragmento de 170 pb en la regiôn que codifica para la proteina viral Ll y tras la amplificaciôn, la doble banda del ADN es desnaturalizada en condiciones alcalinas para permitir la posterior hibridaciôn de los productos de PCR a pocillos de microplacas recubiertos de sondas oligonucleotidicas de VPH. Los hibridos son detectados posteriormente mediante una reacciôn colorimétrica. 24 Introducciôn La caracterizaciôn de tipos mediante la utilizaciôn de estos sistemas de cebadores genéricos requiere el anâlisis posterior de los productos amplificados por diferentes sistemas: anâlisis de los patrones de restricciôn, secuenciaciôn genômica e hibridaciôn indirecta. El anâlisis de los productos amplificados mediante anâlisis de patrones de restricciôn es una técnica en desuso debido a la complejidad de interpretaciôn de resultados en muestras infectadas por multiples tipos. La secuenciaciôn genômica es una tipificaciôn directa e inequivoca que permite distinguir las variantes y polimorfismos virales de VPH. Existen diferentes métodos de secuenciaciôn genômica, empleando tanto cebadores como dideoxinucleôtidos trifosfato (ddNTP) marcados con fluorocromos. El ultimo es el método mâs ampliamente utilizado, dado que el marcaje de un elevado nùmero de cebadores aumenta significativamente el coste de la técnica. La asignaciôn del tipo de VPH se lleva a cabo por comparaciôn de la secuencia obtenida con las secuencias de referencia de los diferentes tipos de VPH de bases de datos internacionales, bien en base ùnicamente a la homologia de secuencia o bien mediante el anâlisis filogenético de las mismas. Esta metodologia no es adecuada en muestras infectadas por mùltiples tipos, ya que la secuencia obtenida corresponde solo al tipo de VPH mayoritario. El anâlisis de los productos amplificados mediante hibridaciôn indirecta es la metodologia mâs utilizada actualmente. La amplificaciôn por PCR se lleva a cabo con cebadores marcados con biotina en su extremo 5' y, tras la amplificaciôn, la doble banda del ADN es desnaturalizada en condiciones alcalinas para permitir la posterior hibridaciôn de los productos de PCR a tiras de nitrocelulosa en la que estân fijadas mùltiples sondas para diferentes tipos de VPH. Los hibridos son detectados posteriormente mediante una reacciôn colorimétrica. La estandarizaciôn del método en formate tira estâ disponible bajo la denominaciôn de Lineal Probe Assay® o INNO LiPA HPV Genotyping (Innogenetics, Bélgica) y Linear Array® Human Papillomavirus (HPV) Test (Roche Molecular Diagnostics, EE.UU). Ambas son aplicables, desde el punto de vista metodolôgico, al estudio de un elevado nùmero de muestras cuando se utilizan sistemas automatizados, permitiendo la detecciôn de infecciones mùltiples, aunque con un coste relativamente elevado. La prueba LiPA® amplifica un fragmento de 65 pb en la regiôn que codifica para la proteina Ll y permite la detecciôn de 28 tipos de VPH de AR y BR. En el caso de Linear Array®, el fragmento amplificado es de, aproximadamente, 450 pb en la misma regiôn, y permite la detecciôn de 37 tipos de VPH de AR y BR. Este formato de hibridaciôn en fase sôlida es el fundamento de las nuevas tecnologias de arrays y chips de ADN, en auge en los ùltimos anos. El formato comercial de la tecnologia de array se denomina CLART® Papillomavirus 2 (Genômica S.A.U, Espana) y estâ disenado para 25 Introducciôn la detecciôn de 35 tipos de VPH de AR y BR. La principal ventaja que presentan con respecto a los ensayos clâsicos es que permiten el anâlisis de un elevado nùmero de muestras. Recientemente, se han desarroUado diferentes metodologias para la cuantificaciôn de la carga viral de VPH y para la determinaciôn del estado de integraciôn del genoma, aunque no estâ claramente definida su utilidad en el diagnôstico clinico. De la misma manera, se han desarroUado técnicas de detecciôn de expresiôn de los oncogenes virales e6 y e7 para algunos tipos de alto riesgo basadas en métodos de amplificaciôn isotérmica del ARN viral combinada con detecciôn a tiempo real (NASBA, Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, PreTect HPV Proofer, NorChip, Noruega) y en formato de hibridaciôn in situ empleando sondas marcadas con fluorocromos (FISH, Fluorescent In Situ Hïbridation, HPV Oncotect, Labec Pharma, EE.UU). 1.7.2. Identificaciôn indirecta. Ensayos serolôgicos La infecciôn con VPH genital va seguida de una respuesta inmune tanto de tipo celular como de tipo humoral, esta ùltima dirigida fundamentalmente frente a las proteinas de la câpsida viral. Los anticuerpos anti-VPH, podrîan ser indicadores de infecciones recientes y pasadas. La seroconversiôn ocurre entre los 6 y los 18 meses después de la detecciôn del ADN de VPH, pero en pacientes con detecciôn transitoria de ADN tiene lugar con poca frecuencia. Los anticuerpos frente a proteinas de la câpsida estân por tanto asociados con la detecciôn persistente de ADN y son détectables durante muchos anos (Combita et ai, 2002, Touzé et ai, 2001). Los ensayos serolôgicos de VPH no se utilizan en el diagnôstico habituai y hasta el momento los métodos comerciales estandarizados y validados son escasos. Las limitaciones de los métodos serolôgicos en el estudio de la infecciôn por VPH, desde el punto de vista clinico, estân asociadas con la gran variedad de tipos, con las reacciones cruzadas que existen entre diversos tipos, y la respuesta inmunolôgica variable (la ausencia de anticuerpos no implica, como en otras infecciones viricas, la ausencia de infecciôn) (Nindl et al, 2000; Coursaget, 2003; Iftner et al., 2003). Algunos de estos ensayos se basan en la utilizaciôn de VLP originadas por el autoensamblaje de la proteina de fusiôn Ll o L1/L2, unidas a soportes sôlidos para detectar los anticuerpos présentes en el suero frente a las proteinas estructurales. Las VLP son, de manera global especificas de tipo, excepto en los tipos 6 y 11 que presentan reactividad cruzada y en los tipos 31 y 45 en los que se ha descrito bajos niveles de reactividad cruzada con VPH33 y VPH18. También se ha observado reactividad cruzada entre VPH16 y VPH31 y entre los tipos 58 y 18, 45 y 59 (Giroglou et al., 2001). Otra estrategia establece el uso de péptidos sintéticos y proteinas recombinantes del VPH, producidas en diferentes sistemas de expresiôn 2 6 Introducciôn tanto procariotas como eucariotas (Strickler et ah, 1998; Konya et al., 2001; Palker et al., 2001; Sehr et al., 2002; Karem et al., 2002; Iftner et al., 2003). La técnica de enzimoinmunoanâlisis en fase sôlida (ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) con antigenos VLP es especifica de tipo y la mas frecuentemente utilizada. Sin embargo la sensibilidad de la técnica varia entre el 50-60%, en funciôn del antigeno y protocole utilizado. El desarrollo de ensayos competitivos en formato multiple (Luminex, EE.UU) permite la detecciôn de anticuerpos frente a diferentes tipos del VPH simultâneamente y aunque estos ensayos son complejos a la hora de realizarse, su especificidad es muy elevada. Una limitaciôn importante en la estandarizaciôn y validaciôn de sistemas de detecciôn de anticuerpos frente al VPH, es la carencia de paneles de sueros y antigenos de referencia validados intemacionalmente frente a los distintos tipos del VPH. En los ùltimos anos, se ha planteado la utilizaciôn de la detecciôn de anticuerpos IgA en las secreciones génitales como un marcador directo de la infecciôn, sin embargo, la reproducibilidad y estandarizaciôn de estos métodos de detecciôn esta todavia en fases preliminares (Snowhite et al., 2002; Iftner et al., 2003). 1.8. VACUNAS PROFILÀCTICAS La vacunaciôn es, en este momento, una de las estrategias de prevenciôn de las enfermedades relacionadas con VPH, aunque ésta en ningùn caso es un sustituto de los programas de cribado de cancer cervical, y los individuos vacunados deben observar las mismas actuaciones. En el mercado existen dos vacunas que se diferencian en la forma de obtenciôn del antigeno, en el nùmero y tipo de antigenos incluidos, en la concentraciôn de alguno de ellos, en el adyuvante utilizado en su composiciôn, la metôdica de desarrollo e investigaciôn clinica, los objetivos y sistemas de valoraciôn utilizados para éstos. La vacuna profilâctica tetravalente (VPH6-11-16-18 [Gardasil®; Merck & Co., EE.UU]) contiene VLPs de la proteina Ll de los tipos 6,11,16 y 18 producidas en Saccharomyces cerevisiae (Carter et al., 2001; Garland et al., 2007) y la vacuna profilâctica bivalente (VPH16-18 [Cervarix®; GlaxoSmithKline Biologicals, Bélgica]) contiene VLPs de la proteina Ll de los tipos 16 y 18, obtenida mediante la replicaciôn de baculovirus recombinantes en células de insecto Sf9 y Hi5. Ambas vacunas son administradas por via intramuscular en un calendario de très dosis, presentando sôlo una ligera diferencia para la segunda dosis. La protecciôn conferida por las dos vacunas es muy alta en mujeres de edades entre 15 y 26 anos, tanto en la prevenciôn de la infecciôn como de las enfermedades asociadas a los tipos que incluyen. Los datos de la eficacia de prevenciôn de CIN I, obtenidos en los ensayos clinicos de las vacunas bivalente y tetravalente para VPH16 y VPH18 varian desde 89,2% hasta el 100%, respectivamente (Pavoneen et al., 2007; Garland et 27 Introduccièn ai, 2007); y en el caso de CIN II/CIN III varian desde 90,4% hasta el 98%, respectivamerte (Pavoneen et al., 2007; FUTURE II Study Group 2007). La vacunaciôn tetravalente ha mostrado una eficacia que varia del 91-100% en lesiones precursoras de grado II y III de cancer vulvai y vaginal, cuando los tipos implicados son el 6,11,16 y 18 y del 96-100% en verrugas génitales (Garland et al., 2007). Para la vacuna bivalente los datos también demuestran una eficacia le entre el 21,9% y el 32,8% para infecciones cervicales con cualquier otro tipo de VPH persisterte durante seis meses o un ano. Los datos actuates no indican que las vacunas tengan efecias terapéuticos en las mujeres que estân infectadas en el momento de la vacunaciôn; la vacma tetravalente no impide la progresiôn de la enfermedad o la regresiôn de una lesiôn existerte (FUTURE II Study Group 2007), y en el caso de la vacuna bivalente, tampoco se describin mejoras en la aclaraciôn de la infecciôn (Hildesheim et al., 2007). Por esta razôn, la vacma produce su mâximo beneficio cuando es administrada antes del comienzo de las relaciones sexuales. Debido a que la vacuna no estâ sintetizada a partir de virus atenuados, puede ær administrada en individuos inmunodeprimidos, sin embargo la eficacia puede ser menor qie en los individuos inmunocompetentes. Ambas vacunas han mostrado protecciones cruza&s para otros tipos relacionados filogenéticamente con los incluidos en la vacuna. En el caso ie VPH16 se describe para VPH31, 33, 35, 52 y 58, y en VPH18 se describen para los tipos VPH:9, 45, 59 y 68 (Brown et al., 2007). Ademâs, algunos autores han indicado que la vacunaciôn puede resultar en cambios en el cribado futuro de câncer cervical, posiblemente debidos a cambios en el nicho ecolôgico viral (Dunne et al., 2008). Las dos vacunas fueron aprobadas por la Agenda Europea de los Medicamentos delà Uniôn Europea (EMEA, European Medicines Agency) en septiembre de 2006 (Gardasil®) y septiembre de 2007 (Cervarix®), y en la actualidad ambas son administradas en gran parte le los palses europeos. En Espana, en el ano 2007 el Consejo Interterritorial del Sistema Nacioral de Salud acordô incluir la vacuna frente a VPH en los calendarios vacunales oficiales de hs Comunidades Autônomas. La vacunaciôn se lleva a cabo en ninas con edades que oscilin entre los 11 y 14 anos, segûn la Comunidad Autônoma. 1.9. VARIANTES DE VPH Los virus papiloma tienen un genoma muy conservado y los cambios en la secuenda debidos a mutaciones puntuales, deleciones, inserdones o procesos de recombinaciôn, ün frecuentes en virus ARN, son eventos que ocurren con una probabilidad muy baja (de Villiers et al., 2004). Estas variaciones que se producen en el genoma, y que ocurren de manera fortuia, llegan a establecerse en la poblaciôn si hay algûn mecanismo que los seleccione positivamene. 28 Introducciôn o si esas mutaciones son funcionalmente neutrales, por expansion selectiva de la poblaciôn hospedadora del mutante (dériva genética). En el caso de VPH, existen datos suficientes que muestran la diversidad de variantes para cualquier tipo y el interés en su estudio esta creciendo râpidamente (Stewart et al., 1996; Calleja-Macias et al, 2004, 2005; Prado et al., 2005). Las variantes de VPH presentan diferencias en sus propiedades biolôgicas y bioquimicas, por esta razôn se ha asumido que deben tener diferencias en su patogenicidad, pudiendo tener implicaciones en la evoluciôn de la infecciôn y afectar a su potencial oncogénico (Giannoudis et al., 2001; Bernard et al., 2006). Los estudios de anâlisis comparative de las secuencias han permitido establecer ciertas caracteristicas de sus relaciones filogenéticas, centrândose la mayor parte de ellos en la variabilidad para los tipos que infectan la mucosa genital debido a su relevancia clinica, entre ellos: VPH16 (Ho et al., 1993; Yamada et al., 1997; Pillai et al., 2002, 2009; De Boer et al., 2004; Del Refugio et al., 2004; Kang et al., 2005; Chen et al., 2005; Lee et al., 2008; Tomesello et al., 2008a/b), seguido por VPH18 y 45 (Ong et al., 1993; De la Cruz et al., 2005; De Boer et al., 2005; Cerqueira et al., 2008, Cheng et al., 2009), VPH6 y 11 (Heinzel et al., 1995), VPH5 y 8 (Deau et al., 1991) y mâs recientemente 31, 33, 35, 52 y 58 (Xin et al., 2001; Aho et al., 2003, 2004; Calleja-Macias et al., 2004; Gagnon et al., 2004, 2005, 2007; Raiol et al., 2009). Debido a su prevalencia en el câncer cervical y las lesiones previas, la heterogeneidad intratipo de VPH16 ha sido la mâs estudiada y asi en el ano 1993, Ho et al. analizaron la regiôn reguladora del genoma de VPH16 de una colecciôn de muestras cervicales procedentes de diferentes regiones del mundo, y demostraron que las variaciones en la secuencia formaban cinco ramas filogenéticos diferentes. Aunque existian représentantes de cada rama filogenética en todas las poblaciones del mundo, se describieron patrones concretos que diferian en su localizaciôn geogrâfica y en el origen étnico de los pacientes, de forma que en el ârbol filogenético la nomenclatura reflejaba el origen geogrâfico de los aislados que lo formaban: Africana tipo 1, Africana tipo 2, Asiâtica, Asiatico- Américana, Europea (Figura 1.8). Estudios posteriores, que se realizaron empleando como metodologia la hibridaciôn con sondas biotiniladas e incluyendo ademâs otras regiones genômicas (E6, Ll y L2) y el genoma completo (Yamada et al. 1995; Wheeler et al. 1997, Chen et al. 2005), complementaron esta clasificaciôn y demostraron una fuerte relaciôn entre la covariaciôn de la secuencia de los genes para los aislados de VPH16, confirmando que las variaciones nucleotidicas podian usarse para distinguir linajes de virus diferentes y su asociaciôn con la displasia de alto grado y /o câncer. Se han propuesto ramas menores, como la denominada Norte Americana, que corresponde a variantes detectadas en los indios norteamericanos, aunque el nùmero de 29 Introduccièn aislados es mâs limitado. (Yamada et al., 1997; Wheeler et al., 1997). En el aho 2011, Huertis- Salgado et al., han propuesto un nuevo criterio de clasificaciôn y nomenclatura de las varianies de VPH16 en la regiôn codificante de la proteina E6, mediante el anâlisis descriptive y comparative de las secuencias nucleotidicas publicadas desde el aho 1991 al 2010. En la rana Europea se han descrito très clases (E-350T, E-350G y E-350A), en la rama Asiâtica très (A;a, Asb y Asc), en la rama Asiâtico-Americana très (AAa, AAb y AAc), en la rama Africana tipc 1 seis (Afla, Aflb, Aile, Afld, Afle y Aflu) y en la rama Africana tipo 2 très (Af2a, Af2b y Af2(). HPV-16 E HPV-18 E GîB-2 Af2TSS AA (As + Al) Af1 AA Figura 1.8. Ârboles filogenéticos de las variantes de VPH16 y VPH18. Distribuciôn de las ramæ filogenéticas basadas en el anâlisis de las bases de datas publicadas. Af, Africana; Af-1, Africana tip* 1; Af-2, Africana tipo 2; As, Asiâtica; AA, Asiatico-Americana; As Ai, Asiâtico-Amerindia; E, Europec (Tomado de Bernard et al, 2006). Un estudio similar se llevô a cabo con VPH18, de manera inicial en la regim reguladora (Ong et al, 1993) y mâs adelante en otras regiones del genoma (Arias-pulido et à., 2005). Los resultados obtenidos llevaron a la construcciôn de un ârbol filogenético con ma topologia similar que la obtenida para VPH16, que incluia las variantes denominadis: Africana, Asiâtico-Amerindia y Europea (Figura 1.8). Las relaciones filogenéticas obteniàs son reflejo de la evoluciôn y los patrones migratorios de las poblaciones humanas (Bemardef al, 1994), y sugieren que ciertas variantes pudieron divergir en el mismo tiempo en que se formaron los principales grupos étnicos humanos. Los estudios de diversidad intratipo 30 Introducciôn llevados a cabo para otros tipos de VPH confirman que ésta es mâs limitada, asi como su diversidad geogrâfica, lo que sugiere tasas de evoluciôn molecular mâs bajas que las observadas en los tipos VPH16 y VPH18 (Calleja-Macias et ah, 2005). La secuencia de referencia o prototipo para las variantes de VPH16 pertenece a la rama Europea y fue asilada de un paciente de origen alemân. En VPH18 la secuencia de referencia utilizada pertenece a la rama Asiâtico-Amerindia y fue aislada de un paciente de origen brasileno. En el resto de variantes asociadas a los tipos estudiados en este trabajo, las secuencias de referencia fueron asiladas de un paciente alemân en VPH31, de un paciente francés en VPH33 y de un paciente de Estados Unidos en VPH52. 1.9.1. Significado funcional de las variantes Como ya se ha indicado, los estudios de variantes de VPH se han dirigido fundamentalmente al tipo 16 debido a su prevalencia, al ser el tipo mâs detectado en poblaciôn general, y a su importancia en el desarrollo de câncer cervical, al ser un tipo de alto riesgo oncogénico. Para este tipo, los datos obtenidos de los diferentes estudios comparando variantes de origen Europeo (prototipo) con variantes de origen no Europeo, indican que estas ultimas estân asociadas con un mayor riesgo de desarrollo de lesiones cervicales (Xi et ah, 1997; Villa et al., 2000; Hildesheim et al., 2001; Berumen et al., 2001; Xi et al., 2002); sin embargo los datos son contradictorios ya que algunos estudios apuntan que no existe tal asociaciôn (Schlecht et al., 2005; Rajeevan et al., 2005; Beskow et al., 2005). Las diferencias en estos resultados podrîan reflejar las diferencias genéticas entre las poblaciones, en concreto polimorfismos genéticos del complejo mayor de histocompatibilidad (Zehbe et al., 1998a; Zehbe et al., 2001), o podrîan deberse al predominio de las variantes Europeas en las poblaciones de estudio. Los estudios dirigidos a otras poblaciones (Xi et al., 1997; Villa et al., 2000; Berumen et al., 2001; Xi et al., 2002; Tomesello et al., 2004; Sichero et al., 2007) han senalado un mayor riesgo de câncer cervical y de las lesiones de alto grado en pacientes infectados por variantes no Europeas, especialmente para las Asiâtico-Americanas (Hildesheim et al., 2002; Bernard et al., 2006). En general, los estudios llevados a cabo para VPH16 presentan un diseno transversal y aunque se han llevado a cabo algunos con diseno longitudinal los tamanos muestrales son pequenos, hecho que también dificulta la interpretaciôn de los resultados para distinguir los riesgos asociados a las variantes que pertenecen a linajes no Europeos (Xi et al., 1997; Bontkes et al., 1998; Villa et al., 2000; Xi et al., 2002). 31 Introducciôn La relevancia clinica de las variantes de VPH18 es mas desconocida, aunque es el tipo mas detectado en cancer cervical después de VPH16, y el tipo mas asociado con adenocarcinoma cervical. Los trabajos de variantes para este tipo aunque son mas escasos, indican que ciertas variantes se identifican mas en los adenocarcinomas y otros cânceres del tipo escamoso (Lizano et al., 1997; Burk et al., 2003; De Boer et al., 2005) y, al igual que para VPH16, se describe ademâs un mayor riesgo de anomalias citolôgicas de alto grado asociadas a las variantes no Europeas cuando se comparan con las variantes Europeas (Villa et al., 2000). En un estudio publicado en Estados Unidos, se describen ademâs diferencias en la persistencia de la infecciôn de las variantes de VPH16 y VPH18 asociadas al ârea geogrâfica de procedencia de los pacientes. Los resultados del trabajo, indican que en mujeres americanas de origen africano persisten mas las variantes Africanas y en mujeres con diferente origen son mas persistentes las variantes Europeas (Xi et al., 2006). Las diferencias en la patogeneicidad de las variantes pueden deberse a cambios en las regiones codificantes de las protelnas virales o los elementos reguladores présentes en el genoma del virus. Por ejemplo, las tasas de transcripciôn y replicaciôn pueden verse afectadas por la alteraciôn de elementos de respuesta en cis; cambios de aminoâcidos en la secuencia proteica de las protemas virales E6 y E7 que pueden alterar la funciôn transformadora de estas oncoprotemas; y cambios en la secuencia de la proteina viral L1 pueden afectar a la eficacia de la infecciôn o alterar la antigenicidad viral (Kimbauer et al., 1993). Ademâs, estos cambios de manera simultânea en varias dianas, pueden modular sinergicamente la patogenicidad, lo que puede ocurrir indirectamente a través de cambios que influencien la persistencia viral. Un gran numéro de los estudios se ban centrado en las variaciones en las oncoprotemas E6 y E7 debido a que en los carcinomas en los que se détecta VPH, ambas protemas se expresan de manera conjunta y es conocido que interaccionan con importantes factores celulares implicados en el ciclo celular, en concreto las protemas celulares p53 y Rb, participando de manera directa en el proceso de transformaciôn (Hildesheim et a\., 2001). De esta forma, en un estudio realizado entre mujeres inglesas con lesiones citolôgicas cervicales se identificô una variante de VPH16 asociada con la persistencia viral y con la progresiôn de CIN II a CIN III. Esta variante de la regiôn codificante de la proteina viral E6 tiene una sustituciôn de timina a guanina en la posiciôn nucleotldica 350, y la mutaciôn résulta en un cambio del aminoâcido en posiciôn 83 de Leucina a Valina (L83V) que estâ présente en las variantes incluidas en las Hneas filogenéticas Europeas y Asiâtico-Americanas (Londesborough et al., 1996). Esta variante de VPH16 se identificô mâs frecuentemente en muestras de mujeres diagnôsticadas con carcinoma invasivo que con CIN de grado III en un estudio llevado a cabo en Suecia (Zehbe et 32 Introducciôn al., 1998b), y las variantes multiples de la proteina viral E6 (que tenian mâs de un cambio de aminoâcido) se distribuian de manera homogénea en los dos estadios histolôgicos. Sin embargo, en un estudio realizado por los mismos autores, la secuencia prototipo de la proteina viral E6 se distribuyô de manera homogénea en CIN y carcinoma invasivo, y la variante L83V solo se detectô entre las lesiones precursoras de alto grado, cuando se analizô una poblaciôn de mujeres procedentes de Italia. En esta poblaciôn, el porcentaje de las variantes de la proteina E6 multiples era dos veces mayor en las mujeres con carcinoma invasivo (Zehbe et al., 1998a). Las diferencias en los resultados descritos entre los trabajos publicados pueden reflejar las variaciones asociadas al diseho del çstudio, la poblaciôn y el numéro de pacientes examinados. Ademâs, la oncogenicidad de la variante L83V puede variar geogrâficamente, posiblemente debido a diferencias genéticas con implicaciones en la respuesta inmune celular, por ejemplo los haplotipos en el complejo mayor de histocompatibilidad. En el caso de la proteina viral E7, varios grupos que han investigado distintas poblaciones y las variaciones de la secuencia nucleotidica, fundamentalmente para VPH16, indican que la proteina E7 estâ altamente conservada in vivo (Zehbe et al., 1998b; Veress et al., 1999; Nindl et al., 1999). Sin embargo en un estudio entre mujeres coreanas, se detectô el prototipo de la proteina en el 10% de los carcinomas invasivos y la variante mâs comûn (Asparagina a Serina en el codôn 29; N29S) se localizô en el 70% de los carcimomas invasivos (Song et al., 1997). Los estudios de variaciôn de secuencia de la regiôn reguladora, en el caso concreto de VPH16, han atribuido diferencias funcionales en las tasas de replicaciôn (Hubert, 2005) asi como en las actividades transcripcionales del promoter de E6 cuando se comparan con la prototipo (Park et al., 1999; Kammer et al., 2002). Algunos estudios sugieren que las variaciones de secuencia en esta regiôn, afectan a los sitios de uniôn de los factores de transcripciôn tanto para VPH16 como VPH18 (Londesborough et al., 1996; Rose et al., 1998; Sichero et al., 2005). En esta linea se describen los resultados de un trabajo publicado en el ano 1994, en el que los autores refieren que las variantes Europeas de VPH16 que contenian mutaciones puntuales o deleciones en los sitios de uniôn del factor de transcripciôn ying-yang 1 (YY-1, Factor Yin Yang 1) aisladas de carcinomas cervicales, mostraban actividades transcripcionales mâs elevadas cuando se comparaban con muestras que contenian la secuencia de referencia (Dong et al., 1994); aunque estudios posteriores similares no permitieron concluir que las mutaciones en la secuencia nucleotidica en los sitios de uniôn del factor YY-1 asociadas a ciertas variantes, estuvieran funcionalmente relacionadas con el desarrollo de la neoplasia cervical (Park et al, 1999; Veress et al, 1999). Los distintos estudios han identificado que ademâs de factores virales, hay factores asociados al hospedador, como diferencias en los haplotipos para el complejo mayor de 33 Introducciôn histocompatibilidad (Apple et al., 1994; Ellis et al, 1995; Lenner et al, 1995; Lie et al, 1999) o polimorfismos en las dianas de uniôn celular de las protemas virales, taies como el polimorfismo en el codôn 72 de p53 (Storey et al, 1998; Thomas et al, 1999). Estos cambios estân asociados con variantes especificas en cânceres invasivos (Bontkes et al, 1998; Rosenthal et al, 1998; Brady et al, 1999; Chen et al, 1999; Cuzick et al, 2000; Van Duin et al, 2000); pero estân sin définir otras posibles dianas celulares de las protemas de VPH que puedan ser igualmente importantes. Como hemos indicado, la oncogenicidad de las diferentes variantes de VPH parece variar geogrâficamente y con el origen étnico de la poblaciôn estudiada, pero debido a que el proceso de transformaciôn tiene multiples pasos y a que la relaciôn entre las variantes de VPH y otros factores no virales es compleja, es necesario todavia profundizar en su estudio. Los datos bibliogrâficos indican que las variaciones intratipo de la secuencia representan un importante factor de riesgo para el desarrollo de lesiones precursoras y neoplasia cervical invasiva en las mujeres; sin embargo en los hombres, los estudios de variantes de VPH son escasos y se centran fundamentalmente en la infecciôn por VPH en el pene (Grégoire et al, 1995; Tomesello et al, 2000; Kalantari et al, 2008; Tomesello et al, 2008a), aùn cuando la infecciôn en el canal anal es mâs frecuente (Xi et al, 1993, 1998; Da Costa et al, 2002). De la misma forma, el estudio de las variantes de VPH entre personas infectadas por VIH es también escaso, aunque en los pacientes inmunodeprimidos debido al deterioro del sistema inmune podria esperarse que la historia natural de las variantes fuera particularmente agresiva (Chatuverdi et al, 2004; Schlecht et al, 2005; Tomesello et al., 2008b; Tanzi et al, 2009). En Espana en el ano 2001, se publicô un estudio de caracterizaciôn de variantes de VPH16 en pacientes infectados o no por VIH, con citologias cervicales alteradas (Pérez-Gallego et al, 2001). En el aho 2006, Ortiz M et al. describieron las variantes de VPH16 circulantes en dos grupos de poblaciôn de alto riesgo para la infecciôn por VPH, mujeres que ejercen la prostituciôn y mujeres recluidas en prisiôn. 34 OBTETIVOS _______________________________________________________________________ Objetivos 2. OBJETIVOS La infecciôn por el VPH es la mas frecuente de las infecciones de transmisiôn sexual en el mundo, y juega un papel central en la patogénesis de los cânceres anogenitales y sus lesiones precursoras. En el caso del câncer de ano, y a pesar de las bajas tasas de incidencia del mismo que se han descrito a nivel mundial (0,l-2,8 casos por 100.000 en los hombres; 0,0-2,2 casos por 100.000 en las mujeres), en los ultimos 50 anos se ha descrito un incremento de la tendencia en su incidencia especialmente mayor en HSH y en los adultos infectados por VIH. Los datos publicados en los trabajos llevados a cabo en hombres con câncer de ano, describen la presencia de VPH en el 71,2% de los casos, siendo VPH16 el tipo mâs prevalente (65,6%), seguido de VPH18 (5,1%). En el caso particular de la infecciôn anal por VPH en HSH la mayoria de trabajos se han realizado en hombres que estân coinfectados por VIH, y los valores de preValencia de infecciôn que se describen son especialmente elevados (85-97,9%). El VPH es clasificado en tipos, subtipos o variantes, basândose en el grado de homologia del genoma viral, de forma que cuando estas variaciones son menores del 2% se puede hablar de variantes intratipo. Los estudios de variantes de los tipos de alto riesgo oncogénico 16 y 18, indican que existen diferencias en sus propiedades biolôgicas y bioquimicas, razôn por la que se ha asumido que deben tener diferencias en su patogenicidad, que pueden tener implicaciones en la evoluciôn de la infecciôn y afectar a su potencial oncogénico. La mayoria de estos estudios de variantes se han llevado a cabo en muestras cervicales, debido a la importancia que el câncer de cérvix tiene en Salud Pùblica. Sin embargo, como consecuencia de los elevados valores de prevalencia de infecciôn de VPH y el incremento de la incidencia del câncer de ano descritos en los HSH, especialmente aquellos que estân infectados por VIH, se plantea la posibilidad de identificar y estudiar las variantes intratipo no solo de los tipos de alto riesgo 16 y 18, sino también de otros tipos de VPH que se detectan con prevalencias menores, en este grupo de poblaciôn. 2.1. Objetivo general El objetivo del présente trabajo ha sido el estudio de la prevalencia de infecciôn anal por el virus del papiloma humano (VPH) de alto riesgo oncogénico global y tipo especifica en hombres que practican sexo con hombres (HSH) infectados y no infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), asi como el anâlisis de las variantes de los tipos de papilomavirus humanos 16, 18, 31, 33 y 52 de alto riesgo oncogénico considerados de mayor relevancia en el câncer anal. 37 _______________________________________________________________________ ObietiM)s 2.2. Objetivos especificos 2.2.1. Estudio de la prevalencia de infecciôn anal por VPH de alto riesgo, global y tpo especifica, en muestras procedentes de HSH, infectados y no infectados por el VIH-1. • Determinar la prevalencia de infecciôn por VPH de alto riesgo oncogéniccy evaluar las diferencias en base a la presencia o no de infecciôn por el VIH-1, la edad y el origen geografico de los pacientes. • Establecer la distribuciôn de los diferentes genotipos de VPH de alto ries;o oncogénico, asi como el porcentaje de infecciones multiples, y evaluar las diferencias n pacientes infectados y no infectados por el VIH-1. 2.2.2. Caracterizaciôn molecular de las variantes de los tipos de papilomavirus humanos b, 18, 31, 33 y 52 en muestras anales procedentes de HSH, infectados y no infectados poral VIH-1. • Anâlisis filogenético de las secuencias de nucleôtidos en las regions codificantes de las proteinas virales E6 y E7 y la regiôn reguladora. • Estudio de los polimorfismos de nucleôtidos en las regiones codificantes e las protemas virales E6 y E7 y la regiôn reguladora. • Relevancia de las mutaciones observadas a nivel de traducciôn de Is protemas (polimorfismos en las regiones codificantes de E6 y ET) y en la regulaciôn de a transcripciôn (polimorfismos en la regiôn reguladora). 2.2.3. Anâlisis de la distribuciôn de las variantes intratipo de acuerdo a la presencia o no e infecciôn por el VIH-1 y el origen geografico de los pacientes. 38 MATERIALES Y METODOS Materiales y Métodos 3. MATERIALES Y METODOS 3.1. MATERIALES 3.1.1. Contrôles de laboratorio 3.1.1.1. Lmeas celulares Las lmeas celulares utilizadas para realizar los contrôles intemos de laboratorio se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y fueron: a) células HeLa (ATCC no. CCL2.1), linea celular epitelial hum ana de adenocarcinoma cervical infectada con VPH18 que contiene aproxim adam ente 25 copias por célula (Figura 3.1) y; b) células SiHa (ATCC no. HTB35), linea celular epitelial hum ana de carcinoma escamoso celular de cérvix (grado II) infectada con una copia por célula de VPH16. i Figura 3.1. Células HeLa. (Tornado de Centro Nacional de Microbiologia, Institute de Salud Carlos III, Madrid). 3.1.12. M uestras cllnicas Extracciones de ADN de raspados cervicales y anales anonimizados, obtenidas de pacientes y genéticamente caracterizadas como infectados por VPH31, VPH33 y VPH52, procedentes de la Unidad de Retrovirus y Papilomavirus del Centro Nacional de Microbiologia (Instituto de Salud Carlos III, Madrid). 3.1.2. M uestras cllnicas de estudio Muestras de raspados anales obtenidas de una poblaciôn de HSH infectados o no por VIH-1, que acudieron a una consulta de Enfermedades de Transmisiôn Sexual en M adrid (Centro Sanitario Sandoval), en un periodo com prendido entre el 1 de enero del ano 2005 hasta el 31 de diciembre del ano 2006. Las muestras fueron células epiteliales procedentes de la zona de transiciôn escamo-columnar del canal anal y se recogieron em pleando un dispositivo tipo cepillo (Qiagen, Alemania). 41 Materiales y Métodos 3.1.3. Medios de cultivo El medio de cultivo utilizado para el crecimiento de las lineas celulares infectadas por VPH (células HeLa y SiHa) fue RPMI1640 modificado (lOmM HEPES, ImM piruvato sôdico, 2mM L-glutamina, 4.500mg glucosa/L, 1.500mg bicarbonato sôdico/L) suplementado al 10% con suero bovino fetal (inactivado por calor), 50 U.I/ml de penicilina, 50 pg/m l estreptomicina y al 5% con L-Glutamina lOOmM. 3.1.4. Cebadores sintéticos Los cebadores sintéticos utilizados en la reacciones de PCR fueron sintetizados por la empresa Genosys (Sigma-Aldrich, EE.UU) y facilitados por la Unidad de Genômica del Centro Nacional de Microbiologia (Instituto de Salud Carlos III, Madrid). 3.2. MÉTODOS 3.2.1. Crecimiento y conservaciôn de las lineas celulares Las dos lineas celulares se cultivaron utilizando cabinas de seguridad biolôgica de clase 2, manteniendo los cultivos a una temperatura de 37* C en atmôsfera de 5% de CO2 y 95% de humedad. Los pases celulares se realizaron cada 48 ô 72 horas hasta lograr una confluencia celular compléta, aproximadamente una concentraciôn celular de 10 ̂células por ml de medio de cultivo. Los pases celulares se realizaron mediante la decantaciôn del medio de cultivo y tratamiento con 5 ml tripsina-verseno (0,005%-0,05%) con el fin de disgregar la monocapa celular. Posteriormente las células se centriguraron a 1.200 r.p.m durante 10 minutos con el fin de eliminar los restos de tripsina-verseno de las células, y se resuspendieron en el volumen adecuado de medio de cultivo. La conservaciôn de las células durante periodos de tiempo prolongados, se realizô mediante su almacenamiento en nitrôgeno liquido (-196* C). Para ello se prepararon alicuotas de 10 ̂ células por ml en medio de congelaciôn constituido por 10% de DMSO (dimetilsulfôxido) en suero bovino fetal. Antes de almacenarse en nitrôgeno liquido se mantuvieron durante 24 horas a -70* C. 3.2.2. Recogida y conservaciôn de las muestras anales Para la conservaciôn y transporte de las muestras se empleô el medio recomendado para la prueba de captura de hibridos hc2 High-Risk HPV DNA Test® (Qiagen, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante que incluian un mâximo de dos semanas a una 42 Materiales y Métodos temperatura de entre 2 y 8* C (Figura 3.2). Las muestras fueron recogidas por los clmicos responsables de la clinica de ETS y codificadas con el fin de mantener la confidencialidad de los datos de los pacientes. Se trasladaron al Centro Nacional de Microbiologia (Instituto de Salud Carlos III, Madrid) donde se Uevô a cabo el anâlisis de la infecciôn por VPH. La detecciôn y el genotipado de VPH se realizô a partir de la misma toma de raspado anal. Figura 3.2. D ispositivo de toma de muestra y m edio de conservaciôn y transporte de la prueba hc2. High-Risk H PV D N A Test®. (Cedido por Qiagen). 3.2.3. Detecciôn de ADN de VPH de alto riesgo en las muestras anales mediante el método High-Risk HPV DNA Test® En todas las muestras se llevô a cabo la detecciôn del ADN de VPH de alto riesgo empleando la prueba de captura de hibridos High-Risk HPV DNA Test® con la tecnologia Hybrid Capture® 2 (hc2) (Qiagen, Alemania). La prueba estâ basada en la hibridaciôn en soluciôn de una mezcla de sondas ARN sintéticas complementarias a la secuencia especifica de 13 tipos de VPH-AR: 16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. En un primer paso, las muestras se incubaron durante 45 minutos a 65° C con una soluciôn de desnaturalizaciôn proporcionada por la técnica (soluciôn diluida de hidrôxido de sodio), lo que permitiô la lisis viral y la liberaraciôn del ADN. El volumen de soluciôn de desnaturalizaciôn que se anadiô a cada muestra fue la mitad del volumen de la misma, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Después las muestras se sometieron a la hibridaciôn con sondas ARN especificas para los VPH de alto riesgo dando lugar a la formaciôn de hibridos de ARN-ADN, que fueron capturados por anticuerpos unidos a la fase sôlida, capaces de reconocer los hibridos de manera especifica. A continuaciôn, los hibridos inmovilizados reaccionaron con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina especificos para los hibridos de ADN-ARN, y la reacciôn fue detectada mediante la adiciôn de un sustrato quimioluminiscente y su detecciôn empleando un luminômetro. Los resultados se expresaron como unidades de luz relativas (RLU), siendo proporcionales a la cantidad del ADN de VPH 43 Materiales v Métodos présente en la muestra, lo que aporta una medida semicuantitativa de la carga viral (Figura 3.3). El valor de corte a partir del cual se estableciô un resultado como positivo fue de 1.0 RLU (équivalente a 1.0 pg de ADN de VPH por 1.0 ml de muestra). El limite de detecciôn de este ensayo es de 1 pg/ml de muestra lo que équivale, segûn las instrucciones del fabricante, a 100.000 copias de VPH/ ml de muestra. i s H 1.Desnaturalizaciôn 2. Hibridaciôn con del ADN sonda ARN especifica 3. Los hibridos son 4. Detecciôn con 5. La reacciôn da capturados con anticuerpos marcados lugar a la emisiôn de anticuerpos especificos con fosfatasa alcalina luz * *1 Figura 3.3. Esquema de detecciôn de VPH-AR em pleando el test hc2 H igh -R isk H P V D N A con la tecnologia H ybrid Capture® 2. (Cedido por Qiagen). 3.2.4. Extracciôn de ADN de las muestras anales y de las lineas celulares La obtenciôn del ADN genômico de las muestras anales se llevô a cabo empleando un extractor automâtico: BioRobot M48 (Qiagen, Alemania). El principio que rige el sistema extractor esta fundamentado en la uniôn de los âcidos nucleicos a la superficie de silice de particulas magnéticas en presencia de sales caotrôpicas (Figura 3.4). La extracciôn del ADN para el genotipado y la caracterizaciôn de las variantes de VPH, se hizo empleando un protocolo recomendado por el fabricante a partir de un volumen de muestra de 100 pl. Las muestras se trataron empleando un tampôn de lisis y uniôn que contiene tiocianato de guanidina y dos tampones de lavado, uno de ellos (tampôn de lavado- 1) que contiene hidroclorato de guanidina y etanol. El ADN se eluyô en un tampôn proporcionado por el método en un volumen final de 50 pl y se almacenô a -80° C hasta su utilizaciôn. Todos los componentes de los protocolos de extracciôn son propiedad de Qiagen, de manera que el acceso a las composiciones estâ restringido. 44 Materiales v Métodos La extracciôn del ADN genômico de las lineas celulares se llevô a cabo a partir de sedimentos celulares secos (aproximadamente 1,5 x 10̂ células) conservados a -20° C. Para su procesamiento en el extractor de ADN automâtico, éstos fueron previamente resuspendidos en un volumen de 100 pl de tampôn fosfato salino (PBS, Phosphate Buffer Saline). El protocolo de trabajo utilizado fue el mismo empleado en el procesamiento de las muestras anales. El ADN se eluyô en 50 pl de tampôn de eluciôn de Qiagen. El empleo de un extractor automâtico, minimizô el riesgo de contaminaciôn entre las muestras. 1. Lisis ceiuiar 2. Suspension de particulas magnéticas 3. Separaciôn magnética 4. Obtenciôn de ADN Figura 3.4. Esquema del proceso de extracciôn de A D N y extractor autom âtico BioRobot M48. (Modificado de Qiagen). 3.2.5. Medida de la concentraciôn de âcidos nucleicos de los contrôles de laboratorio mediante espectrofotometria Las concentraciones de ADN de las lineas celulares y las muestras cllnicas empleadas como control de laboratorio, fueron determinadas midiendo la absorbancia a 260 nm y 280 nm en un espectrofotômetro NanoDrop® ND-1000 (NanoDrop Thechnologies, EE.UU). La lectura de absorbancia se estableciô como vâlida si oscilaba entre los rangos de 0.1- 1.0, siendo A260 = 1,0 para una concentraciôn de ADN igual a 50 pg/ml de muestra. La pureza del ADN se determinô calculando la razôn de los valores de absorbancia a 260 nm y 280 nm (A260/A 280). Cuando el valor de dicho cociente estuvo comprendido entre 1,7-1,9 el ADN se considerô vâlido para su estudio. 45 Materiales v Métodos De esta forma la concentraciôn del ADN se estableciô utilizando la fôrmula: [ADN] = A260X D X 50 fi^m l siendo, D = factor de diluciôn La concentraciôn de ADN se ajustô, en el caso de los contrôles realizados a partir de las lineas celulares Hela y SiHa, a 10,5 ng/pl; la concentraciôn de ADN obtenida a partir de las muestras clinicas fue ajustada a 1 ng/pl. 3.2.6. Genotipado de VPH mediante Linear Array HPV Genotyping^ Test En todas las muestras positivas en la prueba hc2 High-Risk HPV DNA Test®, los genotipos présentes en cada una de ellas fueron detectados empleando la metodologia Linear Array® HPV Genotyping test (Roche Molecular Systems, EE.UU), una versiôn comercializada y mejorada del ensayo line blot PGMY (PGMY-LB) (Coutlee et al., 2002, 2006). La prueba emplea los cebadores PGMY biotinilados, disenados para amplificar un fragmente de 450 pb de la regiôn polimôrfica que codifica la proteina L1 en el genoma de VPH. El grupo de cebadores consenso PGMY09/11 (Gravitt et al., 2000) empleados en este ensayo estân disenados para amplificar ADN de VPH de 37 genotipos (VPH6,11,16,18, 26, 31, 33, 35, 39,40, 42, 45, 51, 52, 53, 54,55,56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 y CP6108). La prueba incluye un par de cebadores del gen de la 6-globina humana que proporciona un control para una extracciôn de âcidos nucleicos y una amplificaciôn adecuadas. La prueba estâ basada en cuatro procesos: preparaciôn de las muestras, amplificaciôn mediante PCR, hibridaciôn de los productos amplificados con sondas oligonucleôtidas y detecciôn de los productos amplificados fijados a las sondas mediante determinaciôn colorimétrica. La preparaciôn de la muestra, segûn las instrucciones del fabricante, se realiza liberando el ADN de VPH mediante la lisis de las células bajo condiciones de desnaturalizaciôn a elevadas temperaturas en presencia de la proteinasa K, un agente caotrôpico y un detergente. A continuaciôn se procédé al aislamiento y purificaciôn del ADN en una columna, y a la eluciôn con un reactivo proporcionado por la prueba. El gen de la 6-globina humana se aisla de forma simultânea. Este paso fue sustituido por la extracciôn del ADN en el extractor automâtico descrito en el apartado 3.2.4. La amplificaciôn empleô los cebadores biotinilados incluidos en la mezcla de reacciôn, incluyéndose los cebadores adicionales para el gen de la fi-globina humana. Tras la amplificaciôn, se realizô la hibridaciôn de cada muestra con una tira de genotipado 46 Materiales v Métodos revestida con las sondas de los distintos tipos de VPH y sondas de fi-globina. El producto amplificado y marcado con biotina hibridarô con alguna de las sondas solo si contenta la secuencia correspondiente de la sonda complementaria. Por ultimo, se realizô la detecciôn empleando un conjugado de estreptavidina y peroxidasa, que se uniô al producto amplificado marcado con biotina e hibridado con las sondas especificas de los tipos de VPH. Se revelô con una soluciôn substrato que contenta perôxido de oxigeno y 3, 3',5, 5'- tetrametilbencidina (TMB), que virô a color azul sobre las posiciones correspondientes a cada una de las sondas especificas de los diferentes tipos de VPH inmovilizadas en la tira de nitrocelulosa. La lectura del ensayo se realizô visualizando las reacciones de hibridaciôn empleando una guta de referencia proporcionada por la prueba. Las muestras fueron clasificadas como validas si los resultados de la prueba fueron positivos para VPH, 6-globina o ambos (Figura 3.5). 1. Preparaciôn de la muestra liberando el ADN de VPH y el gen de la D-globina Genoma de VPH Cebadores biotinilados PGMY09/11 3-giobina biotinilados p- globina 4. Detecciôn revelando con una soluciôn substrato que vira a color azul sobre las posiciones de cada VPH de la tira 2. Amplificaciôn empleando cebadores biotinilados 3. Hibridaciôn con una tira de genotipado revestida con las sondas de los distintos tipos de VPH y sondas de 13-globina Figura 3.5. Esquema de detecciôn de los tipos de VPH-AR em pleando el test Linear A rra y H P V Genotyping®. (Autor, Montserrat Torres). 3.2.7. Amplificaciôn del ADN de VPH mediante la reacciôn en cadena de la polimerasa (PCR) para la caracterizaciôn de variantes La amplificaciôn de ADN de VPH se llevô a cabo en las muestras caracterizadas mediante la prueba Linear Array® HPV Genotyping test (Roche Molecular Systems, EE.UU) como VPH16,18, 31, 33 y 52 en très regiones del genoma viral: las regiones codificantes de 47 Materiales v Métodos las protemas virales oncogénicas E6 y E7, y una parte de la region reguladora o region no codificante. Se emplearon cebadores especificos de la region y del tipo de papiloma a estudiar descritos en la bibliografîa o disenados empleando el programa PrimerSelect incluido en el paquete informâtico Lasergene (DNAstar, EE.UU). Los cebadores fueron disenados de modo que en las regiones codificantes de las oncoprotemas se amplificaron la secuencia compléta de los genes, y en la region reguladora una region variable desde 362 pb en VPH18 hasta 541 pb en VPH33. Estas secuencias correspondian al segmento central de la region reguladora, que incluye el potenciador especifico de tejido con sitios de union a numerosos activadores y represores de la transcripciôn (Tablas 3.1, 3.2 y 3.3). Las posiciones de cada cebador en las diferentes regiones del genoma viral se esquematizan en la figura 3.5. Tabla 3.1. Cebadores empleados en la amplificaciôn de VPH16, 18, 31, 33, y 52 para el anâlisis de polimorfismos en la regiôn codificante de la proteina E6. P osic iôn T a m a n o VPH 16 E616F 52-69 523 CGAAACCGGTTAGTATAA VPH 16 E616R 558-575 GTATCTCCATGCATGATT VPH 18 E618F 7819-7840 620 GCAACCGAAATAGGTTGGGCAG VPH 18 E618R 558-581 TTATACTTGTGTT-TCTCTG-CGTCG VPH 31 E631F 40-57 640 CGAAAGTGGTGAACCGAA VPH 31 E631R 659-680 GACTGTCTATGACATCCTCCTC VPH 33 E633F 35-54 561 TGTAACCGAAAGCGGTTCAA VPH 33 E633R 575-596 TAACGTTGGCTrGTGTCCTCTC VPH 52 E652F 76-98 480 GAACACAGTGTAGCTAACGCACG VPH 52 E652R 535-556 GCATGACGTrACACTTGGGTCA Referencia b ib liogràfica Diseno propic Pista et al; 2007 Gagnon et a l,2005 Gagnon et a l,2004: Aho et a l, 2004 48 Materiales v Métodos Tabla 3.2. Cebadores empleados en la amplificaciôn de VPH16, 18, 31, 33, y 52 para el anâlisis de polimorfismos en la regiôn codificante de la proteina E7. VPH 16 E716F 500-522 VPH 16 E716R 967-990 VPH 18 E718F 425-446 VPH 18 E718R 949-932 VPH 31 E731F 510-529 VPH 31 E731R 1032-1051 VPH 33 E733F 529-548 VPH 33 E733R 920-940 VPH 52 E752F 481-500 VPH 52 E752R 901-980 490 507 541 411 499 S ecu en c ia 5 - 3 ACCGCTCGATCTATCTCTTCTTC ACTGTCAmTCGTrCTCGTCATC GTGCCAGAAACCGTTGAATCCA CGTGCCCTCCCCGTCTGT CGTTGCATAGCATGTTGGAG CTGCTTCTGCCTGATrGlTG AGGTCCCGACGTAGAGAAAC TCTACCTCAAACCAACCAGTA ATAlTATGGGTCGTrGGACA TTCAAACCAGCCTGTACATC R eferencia b ib liogrâfica Diseno propio Diseno propio Gagnon et al, 2005 Gagnon et a l, 2004 Aho et a l, 2004 Tabla 3.3. Cebadores empleados en la amplificaciôn de VPH16, 18, 31, 33, y 52 para el anâlisis de polimorfismos en la regiôn reguladora. VPH 16 VPH 16 LCR16F LCR16R 7477-7458 7861-7842 384 GGGGTACCTCGGTTGCATGCTITITGGC GGTCTAGACGGnTGCACACACCCATGT Calleja-Macias et a l, 2004 VPH 18 VPH 18 LCR18F LCR18R 7463-7484 7809-7825 362 nTCGCTTGCCTIT-GGCTTA-TG CGGTTGCATAAACTATGTAT Pista et a l, 2007 VPH 31 VPH 31 LCR31F LCR31R 7381-7403 7795-7814 433 TTAGGTGTCACGCCATAGTAAAA CATGACACAACCITGGCAGT Gagnon et a l, 2005 VPH 33 VPH 33 LCR33F LCR33R 7337-7354 7861-7878 541 TGGGTGTACCTATATGAG GACCTAAAACGGTTAGTC Gagnon et a l, 2004 VPH 52 LCR52F 7393-7412 TTGCACCCACATGAGIAACA Aho et a l. VPH 52 LCR52R 7873-7892 499 AGTGCACACCTGGTGAGTAA 2004 VPH 16 VPH18 VPH31 < VPH33 VPH52 Figura 3.5 Cebadores de VPH16, VPH18, VPH31, VPH33 y VPH52. Esquema de las posiciones de los cebadores empleados en la detecciôn de los polimorfismos de la regiôn reguladora, y las regiones codificantes de las proteinas E6 y E7. (Autor, Montserrat Torres). 49 Materiales v Métodos Para llevar a cabo la puesta a punto y evaluaciôn de las reacciones y condiciones de la amplificaciôn empleadas en cada uno de los tipos de papiloma estudiados, se empleô un pool de ADN de VPH de los tipos: VPH16, VPH18, VPH31, VPH33 y VPH52 obtenido a partir de las lmeas celulares y las muestras clinicas. Las reacciones de amplificaciôn de cada uno de los tipos de VPH estudiados se realizaron por separado empleando un termociclador 9700 (Applied Biosystems^”, EE.UU), en tubos de 0,2 ml en un volumen final de 50 pl conteniendo 49 pl de mezcla de reacciôn y 1 pl del ADN extraido de cada una de las muestras (10-50 ng). La mezcla incluia 25 pl de 2X iQ™ Supermix (Bio-Rad, EE.UU) que contiene la enzima hot-start iTaq™ DNA polimerasa 50U/ml, lOOmM KCl, 40mM Tris-HCl, pH 8.4; 0,4mM de cada dNTP, 6mM MgCL; 15 pmoles de cada uno de los cebadores y agua destilada hasta completar el volumen final. Las condiciones de amplificaciôn que se emplearon variaron dependiendo del tipo de VPH amplificado y de la regiôn analizada: paso inicial de desnaturalizaciôn y activaciôn de la enzima a 96°C durante 4 minutos, seguido de 40 ciclos de 15 segundos (s) a 94 "C, 30 s a temperaturas que variaron desde 55'C en la regiôn reguladora para los tipos 18, 31, 33, 52 y en la regiôn codificante de E7 en VPH16, una temperatura de 60*C en la regiôn codificante de E6 para los tipos 18, 31, 33, 52, una temperatura de 58’C en la regiôn codificante de E7 en VPH18, y una temperatura de 63“C en la regiôn codificante de E7 en los tipos virales 31,33, 52; y un paso final de extensiôn durante un minuto a 72‘C en todos los casos. Estas condiciones fueron usadas para todas las amplificaciones con la excepciôn de VPH16 en la regiôn reguladora que incluyô: 94°C durante 4 minutos, 40 ciclos de 15 s a 94°C, 1 minuto y 30 s a 68°C y un paso final de extensiôn durante 1 minuto a 72°C. En todas las reacciones de PCR, se incorporé un tubo de control de contaminaciôn, al que no se anadia ADN. Los productos de PCR fueron conservados a 4°C hasta su utilizaciôn. 3.2.8. Electroforesis en geles de agarosa La identihcaciôn de los productos de PCR para cada tipo en cada una de las regiones, se realizô en geles de agarosa D-1 (Pronadisa, Espana) al 2%. La suspension se préparé en tampôn TAE IX (Tris-Acetato 40mM, EDTA ImM, pH 8) y tinciôn con bromuro de etidio a una concentraciôn final de 0,5 pg/m l. Como tampôn de carga se utilizô una soluciôn comercial (Fermentas, EE.UU) compuesta por: Tris-HCl lOmM (pH 7,6); azul de bromofenol al 0,03% (v/v); xilencianol FF al 0,03% (v/v); glicerol al 60% (v/v) y EDTA 60mM. El tamano de los fragmentos se estimé por comparaciôn utilizando un marcador de peso molecular conocido de 100 pb (ADN del fago X digerido con varias enzimas de restricciôn; GenRuler'^*^ 50 Materiales v Métodos DNA Ladder Plus, Fermentas, EE.UU) que genera un patron de 14 bandas y que es el recomendado para la cuantificaciôn de fragmentos de ADN de pequeno tamano. El sistema de electroforesis fue una cubeta horizontal Mini-Sub® Cell GT (Bio-Rad, EE.UU) con un voltaje de 90 a 100 V, durante 30 minutos, empleando tampon TAE IX. Los geles se visualizaron en un transiluminador mediante exposiciôn de luz ultravioleta y fueron fotografiados con un video-impresor acoplado a la estaciôn de trabajo Gelprinter Super II, (TDI, Espana). 3.2.9. Purificaciôn de los productos amplificados 3.2.9.I. Purificaciôn mediante geles de agarosa Cuando se observaron bandas minoritarias de amplificaciôn inespecificas, se empleô para la purificaciôn el sistema comercial QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Alemania) disenado para extraer y purificar fragmentos de ADN de entre 70 pb y 10 Kpb en geles de agarosa. Las bandas de interés (identificadas por su tamano cuando los geles se observaban bajo luz ultravioleta) se cortaron mediante la utilizaciôn de bisturî, y a continuaciôn se siguieron las instrucciones recomendadas por el fabricante. Las muestras se eluyeron en un volumen final de 50 pl H2O destilada estéril y se mantuvieron a -20°C hasta su posterior utilizaciôn. Esta purificaciôn se realizô en la regiôn codificante de la proteina E6 en seis muestras infectadas por VPH33 y 11 muestras infectadas por VPH52; en la regiôn codificante de la proteina E7 en siete muestras infectadas por VPH16 y en diez muestras infectadas por VPH52; y en la regiôn reguladora se purificô mediante gel de agarosa en diez muestras infectadas por VPH31 y en siete muestras infectas por VPH52 (Figura 3.6). □Separar con Calentar columnas 500 pb 100 pb Cortar la banda Lavar r i g- Eluir Figura 3.6. Esquema de la purificaciôn del A D N em pleando la m etodologia de geles de agarosa. (Autor, Dra. Marta Ortiz). 51 Materiales v Métodos 3.2.9.2. Purificaciôn mediante columnas El ADN amplificado fue purificado utilizando QIAquick PCR Purification (Qiagen, Alemania) cuando se visualizô una ûnica banda especifica en el gel. Este método esta basado en la adsorciôn de âcidos nucleicos a superficies de silica-gel que ocurre en presencia de altas concentraciones de sales caotrôpicas (Vogelstein et al, 1979). El protocolo se realizô segûn las recomendaciones fabricante y el ADN se eluyô en 50 pl H2O destilada estéril. 3.2.10. Cuantificaciôn de los productos amplificados La cantidad y calidad de los productos obtenidos, se determinô mediante electroforesis en geles de agarosa utilizando un marcador de peso molecular 100 pb (GenRuler'^^ DNA Ladder Plus, Fermentas, EE.UU). Los ADN purificados se mantuvieron a -20”C hasta su posterior utilizaciôn. 3.2.11. Secuenciaciôn El método empleado para la secuenciaciôn fue el de los terminadores de cadena (Sanger, 1981), basado en la utilizaciôn de ddNTPs. Se realizô la reacciôn de secuenciaciôn (ciclica), utilizando el marcaje fluorescente comercial BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems™, EE.UU) empleando el protocolo recomendado por el fabricante, utilizando los productos purificados para cada una de las regiones de cada uno de los tipos virales. Los oligonucleôtidos empleados para la secuenciaciôn fueron los mismos que se emplearon en las reacciones de amplificaciôn a una concentraciôn de 3,2 pmoles/pl. La cantidad de ADN purificado utilizado para secuenciar cada una de las muestras se fijô en 20 ng por cada 100 pb y se realizaron dos reacciones de secuenciaciôn independientes empleando los oligonucleôtidos de la reacciôn de amplificaciôn, de forma que se obtuvo una lectura en ambos sentidos de una parte de la regiôn reguladora o del gen complete en el caso de las protemas oncogénicas. Los ciclos de la reacciôn de secuenciaciôn variaron segûn el tipo viral y la regiôn a secuenciar: 94*C durante 3 minutos, seguido de 25 ciclos de 10 s a una temperatura de 96°C; 5 s a diferentes temperaturas (en la regiôn reguladora 50*C en los tipos 18, 31, 33, 52 y en la regiôn codificante de la proteina E7 en el tipo 16; en la regiôn codificante de la proteina E6 en VPH18, 31, 33, 52 una temperatura de 55'C; y en la regiôn codificante de la proteina E7 en VPH18 53’C y en VPH31, 33, 52 a 58*C) y un paso final de 4 minutos a 60*C. Para la regiôn reguladora y la regiôn codificante de la proteina E6 del tipo 16: 94°C durante 3 minutos, 25 ciclos de 10 segundos 96°C, 5 segundos a 63°C y 4 minutos a 60°C (Tabla 3.4). 52 Materiales v Métodos Las muestras ya amplificadas se remitieron a la Unidad de Genômica del Centro Nacional de Microbiologia (Instituto de Salud Carlos III, Madrid), para su purificaciôn y electroforesis. La lectura de cada secuencia se realizô en un secuenciador ABI PRISM 3100 DNA Analyzer (Applied Biosystems, EE.UU). Tabla 3.4. Esquema de las temperaturas de hibridaciôn em pleadas en las reacciones de secuenciaciôn de V PH 16,1 8 ,31 ,33 , y 52 en cada una de las regiones anaÜzadas. VPH 16 E6 50 VPH 18, VPH 31, VPH 33, VPH 52 E6 55 VPH 16 E7 50 VPH 18 E7 53 VPH 31, VPH 33, VPH 52 E7 58 VPH 16 LCR 63 VPH 18, VPH 31, VPH 33, VPH 52 LCR 50 3.2.12. Ediciôn y anâlisis de secuencias Las secuencias fueron visualizadas y analizadas empleando los paquetes informâticos Chromas versiôn 1.55 (Helensvale, Australia) y Lasergene (DNAstar, EE.UU). Las comparaciones de secuencia se llevaron a cabo con el programa de alineamiento local BLAST (NCBI, EE.UU). 3.2.13. Anâlisis filogenético El anâlisis filogenético de las secuencias correspondientes a cada uno de los genotipos de VPH en las diferentes regiones analizadas, requiriô como paso previo el alineamiento multiple de las secuencias problema con muestras de referencia tomadas de la base de datos del GenBank (NCBI, EE.UU). En el caso de los genotipos de VPH en los que hay definidas ramas filogenéticas en base a los estudios previos que correlacionan el origen geografico de las variantes de VPH y la topografia de la filogenia résultante (Burk, 2003), se utilizaron secuencias de referencia de cada una de las ramas descritas (Tabla 3.5). Asi en VPH16, se utilizaron secuencias de referencia de las ramas: Europea, Asiâtica, Asiatica-Américana, Africana tipo 1 y Africana tipo 2; y en VPH18 de las ramas: Europea, Asiâtico-Amerindia y Africana. En los genotipos de VPH en los que no existen establecidas ramas filogenéticas, el anâlisis filogenético se realizô utilizando como referencia las secuencias prototipo. Los alineamientos multiples se realizaron utilizando el programa MegAling del paquete informâtico Lasergene (DNAstar, EE.UU) y el programa Clustal W1.8 (Thompson et 53 Materiales v Métodos al., 1994), aunque fueron definidas con intervenciôn manual. El anâlisis filogenético se realizô empleando los métodos UPGMA y Mâxima Verosimilitud utilizando el paquete informâtico TreeCon (Van de Peer et al., 1993); se analizaron 1.000 réplicas y los ârboles se editarcn empleando el mismo programa. Tabla 3.5. Numéro de acceso de la base de datos GenBank (NCBI, EE.UU) de las secuencias de referencia de los tipos de VPH empleadas en este trabajo. VPH 16 Europea / E-350T K02718 VPH 16 Europea / E-350G AF536179 VPH 16 Asiâtico-Americana AF402678 VPH 16 Africana tipo 2 AF472509 VPH 18 Asiâtico-Amerindia AY262282 VPH 18 Europea EF202147 VPH 18 Africana EF202152 VPH 31 Referencia o prototipo J04353 VPH 33 Referencia o prototipo M12732 VPH 52 Referencia o prototipo X74481 3.2.14. Asignaciôn de variantes La caracterizaciôn de las variantes moleculares se hizo de forma independiente, ce manera que las divergencias en las secuencias de cada aislado con respecto a las secuenciis de referencia de cada tipo nos permitieron identificarlas. En algunos casos, las variacioms detectadas en las secuencias estudiadas con respecto a la secuencia de referencia pertenecim a variantes moleculares que ya habian sido descritas; en los casos en los que los cambios localizados no pertenecian a patrones conocidos, las secuencias se clasificaron de acuerco con su grado de similitud con los descritos y fueron caracterizadas como variantes nuevæ. En este ultimo caso, las muestras fueron confirmadas por duplicado repitiendo a amplificaciôn y el anâlisis de la secuencia, para evitar variaciones de nucleôtidos derivadis de errores de la enzima Taq polimerasa. En los genotipos de VPH16 y VPH18, en los cuales hay definidas ramas filogenéticas, el anâlisis de polimorfismos genéticos se realizô mediante la descripciôn de los diferentes patrones identificados en cada una de ellas. En la regiôn codificante de E6, en la que se hm descrito clases dentro de cada rama filogenética, las variantes de VPH16 se clasificaron en rama y clase. Sin embargo, en los genotipos de VPH en los que no hay definidas ramis filogenéticas, las variantes detectadas fueron agrupadas en dos categorias mâs amplias. 54 Materiales v Métodos prototipo y no prototipo (aquellas con una secuencia de ADN divergente a la secuencia de referencia). 3.2.15. Predicciôn de los posibles efectos de las mutaciones puntuales en la regiôn reguladora En la regiôn reguladora, se ha descrito que determinadas mutaciones puntuales dan dar lugar a pérdida o ganancia de sitios de uniôn de diferentes protemas celulares o factores de transcripciôn. Para predecir el posible efecto de las mutaciones nuevas descritas en dicha en esta regiôn, se empleô el programa informâtico TFSEARCH (Heinemeyer et al., 1998). 3.2.16. Anâlisis estadistico Las caracteristicas sociodemogrâficas analizadas de los pacientes que participaron en el estudio fueron la edad y el origen geogrâfico, y las caracteristicas clinicas fueron la presencia o no de infecciôn por VIH-1. En ambos casos, los datos fueron amablemente cedidos por el Centro Sanitario Sandoval (Madrid). Se realizô un anâlisis descriptivo de las variables utilizadas para caracterizar la poblaciôn de estudio utilizando una distribuciôn de frecuencias para variables categôricas y médias con desviaciôn estândar para variables continuas. Se modelizaron las variables continuas como categôricas para permitir una mayor flexibilidad en la forma de su relaciôn con el logaritmo de la odds de infecciôn por VPH-AR. Ademâs se recodificaron algunas variables categôricas para aumentar la muestra en los grupos y poder estudiar la relaciôn con las variables respuestas de una manera mâs eficaz. Se calcularon las razones de riesgo (OR, Odds Ratios) e intervalos de confianza al 95% (IC95%) para investigar y cuantificar la asociaciôn entre cada factor de riesgo potencial y la infecciôn por el VPH-AR. Ademâs de la regresiôn logistica para valorar asociaciones con la infecciôn por el VPH-AR, paralelamente se realizaron otras dos regresiones logisticas, donde la variable respuesta por un lado fue la presencia de la variante Europea vs. variante no Europea en las muestras de pacientes infectados por VPH16 y VPH18, y por otro lado la presencia de variante prototipo vs. variante no prototipo en las muestras de pacientes infectados por VPH31, 33 y 52. En ambos casos, se calcularon también OR e IC95% para observar la relaciôn entre las variables del estudio y las variables respuesta. En el anâlisis univariado realizado para estudiar las posibles diferencias entre las variables sociodemogrâficas y clinicas y las diferentes variables respuesta, se uso el test de t- student para datos continuos con distribuciôn normal, el test de Mann-Whitney para datos no paramétricos, el test de Chi-cuadrado (%̂) para frecuencias y para calcular el p valor de 55 Materiales v Métodos tendencia se uso el test y} y el de Fisher. Todos los anâlisis se muestran estratificados por la variable "estatus VIH-1" de acuerdo a los objetivos planteados en esta tesis doctoral. Para todos los anâlisis se utilizaron los paquetes estadisticos Epi Info 3 (version 3.3.2,1995, Centro de Control y Prevenciôn de Enfermedades, EE.UU), SPSS v. 18 (IBM, EE.UU) y Stata 11 (StataCorp LP, EE.UU). 56 RESULTADOS Resultados 4. RESULTADOS 4.1. CARACTERISTICAS DE LA POBLACIÔN DE ESTUDIO Durante el periodo de estudio (2005-2006) se reclutaron 401 HSH, a los cuales se les realizô una toma de cepillado anal para la deteccion de la infeccion por VPH-AR. Las caracteristicas de la poblacion estudiada se muestran en la tabla 4.1. De acuerdo al estatus VIH-1 de los pacientes, 233 hombres no estaban infectados por VIH-1 (58,1%), 143 hombres estaban infectados por VIH-1 (35,7%) y en 25 hombres se desconocia su estatus frente a la infeccion por VIH-1 (6,2%). La poblacion espanola fue mayoritaria (64,8%), seguida por la procedente de paises latinoamericanos (26,2%). La edad de los pacientes estaba comprendida desde los 14 hasta 60 anos (edad media 32 anos ± 8,38). En cuatro casos (1%) no se dispuso de datos de edad, aunque los pacientes no fueron excluidos del estudio. Para el analisis de resultados, la variable edad se estratifico en cuatro grupos, menores de 30 anos (47,4%), entre 30 y 40 (37,9%), entre 41 y 50 (11%) y mayores de 50 anos (2,7%). En la distribuciôn de los pacientes de acuerdo con la edad, se observé que en los hombres no infectados por VIH-1 y en aquellos con estatus VIH-1 desconocido, el mayor porcentaje correspondia a los pacientes menores de 30 anos (54,9% y 52%, respectivamente); mientras que en los pacientes infectados por VIH-1 el grupo mayoritario era el que presentaba una edad entre 30-40 anos (49%). Tabla 4.1 Caracteristicas sociodemogrâficas de los 401 HSH participantes en el estudio estratificadas por el estatus VIH-1. Origen geogràfîco Espana 153 (65,7) 90 (62,9) 17 (68) 260 (64,8) Latinoamérica 62 (26,6) 39 (27,3) 4 (16) 105 (26,2) Otros 18 (7,7) 14 (9,8) 4 (16) 36 (9) Edad <30 128 (54,9) 49 (34,3) 13 (52) 190 (47,4) 30-40 72 (30,9) 70 (49) 10 (40) 152 (37,9) 41-50 23 (9,9) 21 (14,7) - - 44 (11) >50 8 (3,4) 2 (1,4) 1 (4) 11 (2,7) Desconocido 2 (0,9) 1 (0,7) 1 (4) 4 (1) 4.2. PREVALENCIA DE VPH-AR Y DISTRIBUCIÔN DE GENOTIPOS La prevalencia de VPH-AR obtenida mediante la metodologia de captura de hibridos en los 401 hombres analizados fue del 54,9%. Como se muestra en la tabla 4.2, cuando los resultados se estratificaron por estatus VIH-1, se observé una prevalencia significativamente mayor en los hombres infectados por VIH-1 frente a los no infectados (74,8% vs. 43,3%; 59 Resultados p<0,001). En el anâlisis univariado se observé que estar infectado por VIH-1 estaba asociado con una prevalencia de VPH-AR cuatro veces mayor (OR 3,9; IC95%:2,5-6,1). Tabla 4.2. Prevalencia de la infeccién de VPH-AR en los pacientes incluidos en el estudio de acuerdo con el estatus VIH-1. Estatus VIH-1 Negative Positive Desconocido 233 143 25 Prevalencia V P H -A R («o) 101 (43,3) 107 (74,8) 12 (48) p-valor < 0,001 O R (IC95‘> o) u n ivar iado 3,9 (2,5; 6,1) 1,2(0,5;2,8) p-valor < 0,001 En la tabla 4.3 se muestran los resultados del anâlisis univariado de la prevalencia de infeccién de VPH-AR segûn el origen geogrâfico y la edad de los pacientes, estratificado por la variable estatus VIH-1. En los pacientes no infectados por VIH-1 no se observaron diferencias estadisticamente significativas en la prevalencia de infeccién en funcién del origen geogrâfico ni la edad de los pacientes. Sin embargo, en la poblacién infectada por VIH-1 si se observaron diferencias estadisticamente significativas en base al origen geogrâfico (p < 0,001). De esta forma, en los hombres latinoamericanos la prevalencia de infeccién por VPH-AR es del 92,3%, significativamente mayor que la observada en los hombres espaholes (72,2%) y en los hombres procedentes de otros paises (42,9%). En los pacientes infectados por VIH-1, procéder de un pais latinoamericano estaba asociado con una prevalencia de VPH-AR entre cuatro y cinco veces mayor (OR 4,6; IC95%:1,3-16,4). Para la variable edad, no se obtuvieron diferencias estadisticamente significativas de acuerdo con el estatus VIH-1 de los pacientes. Tabla 4.3. Prevalencia de la infeccién de VPH-AR por origen geogrâfico y edad de acuerdo con el estatus VIH-1. Netrati\ o Lstatus VIH-1 Pv Posit ivo Origen geogrâfico Espana 71 (46,4) 0,274 1 0,026 65 (72,2) Latinoamericano 25 (40,3) 0,78 (0,4;1,4) 36 (92,3) Otros 5 (27,8) 0,44 (0,2;1,3) 6 (42,9) Edad <30 60 (46,9) 0,398 1 0,336 36 (73,5) 30-40 29 (40,3) 0,8 (0,4;1,4) 54(77,1) 41-50 10 (43,5) 0,9(0,4;2,1) 16 (76,2) >50 1 (12,5) 0,2(0;1,4) 0(0) Desconocido 1 (50,0) 1,1 (0,1;18,5) 1 (100) 0,001 0,162 1 0,001 4,6 (13;16,4) 0,3 (0,1;0,9) 1 1,2(0,5;2,8) 1,2(0,4;3,8) 0,899 Pv, Prevalencia 60 R esultados En las 220 muestras positivas a VPH-AR mediante la metodologia de captura de hibridos se déterminé el genotipo viral utilizando la tecnologia Linear Array® HPV Genotyping test. La prevalencia tipo especifica en la poblacién estudiada se muestra en la tabla 4.4. Tabla 4.4. Prevalencia de genotipos de VPH en 401 HSH de acuerdo con el status VIH-1 empleando la metodologia Linear Array Genotypin^ Test. Genotipo VPH Alto Riesgo VPH16 37 47 4 88 (21,9) VPH18 22 24 2 48 (12,1) VPH51 18 22 2 42 (10,6) VPH68 9 27 4 40 (10,1) VPH45 21 16 2 39 (9,9) VPH58 15 23 1 39 (9,9) VPH59 14 22 2 38 (9,6) VPH39 17 19 1 37(9,4) VPH56 10 21 3 34 (8,6) VPH31 11 16 2 29 (7,3) VPH52 8 16 1 25 (6,3) VPH35 10 11 3 24 (6,1) ■VPH33 9 13 - 22 (5,6) Probable Alto Riesgo VPH53 14 35 6 55 (13,9) VPH66 9 20 2 31 (7,8) VPH73 5 20 3 28 (7,1) VPH26 2 7 1 10 (2,5) VPH82 2 6 - 8(2) Bajo Riesgo VPH6 33 33 6 72 (18,2) VPH72 4 34 1 39 (9,9) VPHll 15 21 2 38 (9,6) VPH61 10 23 1 34 (8,6) VPH42 12 17 2 31 (7,8) VPH54 9 20 1 30 (7,6) VPH70 12 15 - 27(6,8) VPH40 9 7 1 17(4,3) VPH81 4 11 - 15 (3,8) Indeterminado VPH84 14 33 6 53 (13,4) CP6108 20 26 3 49 (12,4) VPH62 12 25 - 37(9,4) VPH55 9 25 1 35 (8,7) VPH83 4 10 3 17 (4,3) VPH69 5 5 - 10 (2,5) IS39 7 3 - 10 (2,5) VPH71 1 4 - 5 (1,3) VPH67 2 1 - 3 (0,8) Se obtuvo un resultado vâlido en 212 muestras (96,4%). Las ocho muestras restantes fueron consideradas falsos positivos ya que en seis casos el resultado no fue vâlido al 61 ______________________________________________________________________ R esultados obtenerse un resultado negativo para la amplificaciôn del gen de la f-globina humana; y en dos casos porque no se detectô ningûn genotipo de VPH. Estos casos correspondian a dos pacientes infectados por VIH-1, y seis pacientes no infectados por VIH-1. En las muestras analizadas se identificaron 36 tipos y su potencial oncogénico fue establecido de acuerdo con la clasificaciôn epidemiolôgica descrita en el afio 2006 por Munoz et al. La ùnica excepciôn fue el tipo 68, que se clasificô como tipo de AR porque se incluye en la sonda empleada en la técnica de captura de hibridos. De esta forma, en el total de muestras estudiadas se describieron trece tipos de alto riesgo oncogénico, seis de probable alto riesgo, nueve de riesgo indeterminado y nueve genotipos de bajo riesgo. En siete muestras de las 212 (3,3%) en las que se obtuvo un resultado vâlido de genotipado de VPH, no se detectô ningûn genotipo de AR oncogénico de los que es capaz de detectar la tecnologia de captura de hibridos y fueron considerados por tanto como falsos positivos. En el resto se detectô al menos uno de los genotipos de alto riesgo. Entre los genotipos de alto riesgo, el detectado con mâs frecuencia fue VPH16 (21,9%), seguido por VPH18 (12,1%), VPH51 (10,6%), VPH68 (10,1%) y los genotipos VPH45 y 58 (9,9%). Los genotipos de probable alto riesgo mâs prevalentes fueron VPH53 (13,9%) y VPH66 (7,8%) y entre los genotipos de bajo riesgo, el detectado con mayor frecuencia fue VPH6 (18,2%), seguido de VPH72 (9,9%), VPH 11 (9,6%) y VPH 61 (8,6%). Los genotipos VPH84 (13,4%) y CP6108 (12,4%) fueron los mâs frecuentemente detectados entre los tipos con riesgo oncogénico desconocido. En la tabla 4.5 se muestra la prevalencia de genotipos de VPH-AR funciôn del estatus VIH-1, observândose diferencias significativas en su distribuciôn en todos los genotipos excepto en VPH35, VPH39 y VPH45. En el estudio y la caracterizaciôn de las infecciones multiples solo se consideraron los trece tipos de VPH-AR que es capaz de detectar la metodologia de captura de hibridos. Como se muestra en la tabla 4.6, en el 16,2% de las muestras de detectô una infeccion con un ûnico genotipo y en el 34,9% fueron infecciones por multiples genotipos. No se establecieron diferencias estadisticamente significativas en la prevalencia de infecciones simples para los pacientes no infectados e infectados por VIH-1 (14,6% vs. 16,8% p = 0,56); no asi en el caso de las infecciones multiples para las que si se observaron diferencias estadisticamente significativas (24% vs. 55,2% p < 0,001). En los pacientes con estatus VIH-1 desconocido se identificaron siete muestras con infeccion simple (28,0%) y cinco muestras en las que se detectô mâs de un genotipo (20,0%). 62 ______________________________________________________________________ Resultados Tabla 4.5. Prevalencia de genotipos de VPH de alto riesgo de acuerdo con el estatus VIH-1 de los pacientes. Genotipo VPH-AR VPH16 37 15,9 47 32,9 <0,001 VPH18 22 9,4 24 16,8 0,035 VPH31 11 4,7 16 11,2 0,018 VPH33 9 3,9 13 9,1 0,036 VPH35 10 4,3 11 7,7 0,163 VPH39 17 7,3 19 13,3 0,055 VPH45 21 9,0 16 11,2 0,492 VPH51 18 7,7 22 15,4 0,019 VPH52 8 3,4 16 11,2 0,003 VPH56 10 4,3 21 14,7 <0,001 VPH58 15 6,4 23 16,1 0,003 VPH59 14 6,0 22 15,4 0,003 VPH68 9 3,9 27 18,9 <0,001 Tabla 4.6. Frecuencia de infecciones multiples de acuerdo con el estatus VIH-1 de los pacientes. Estatus V'IH-1 Infeccion VPH-AR Simple Multiple__________ IHQ 34 14,6 24 16,8 7 28,0 65 16,2 0,56 56 24,0 79 55,2 5 20,0 140 34,9 <0,001 En la figura 4.1 se muestra la frecuencia de infecciones por dos, très, cuatro o mâs de cinco genotipos de VPH-AR, en funciôn del estatus VIH-1 de los pacientes. Si bien se observô una mayor frecuencia de infecciones por mâs de très genotipos de VPH-AR en los pacientes infectados por VIH-1, las diferencias no fueron estadisticamente significativas en ninguno de los casos. 45% 40% 35% g 30% I 25% S 20% 10% H 3 4 Nûm ero de t ipos OVIH negatives ■ VIH positivos Figura 4.1. Frecuencia de numéro de genotipos de VPH- AR en la poblacion estudiada de acuerdo con el estatus VIH-1. 63 ______________________________________________________________________R esultados 4.3. ANÂLISIS DE VARIANTES Y POLIMORFISMOS DE GENOTIPOS DE VPH-AR En el présente trabajo se ha realizado el anâlisis, caracterizaciôn y distribuciôn de las variantes de los genotipos de VPH16,18, 31, 33, y 52 mediante el anâlisis de secuencia en très regiones del genoma que incluian: la regiôn reguladora y las regiones codificantes de las proteinas virales oncogénicas E6 y E7. La regiôn reguladora es la mâs variable en el genoma de VPH y es el principal sitio de control de la transcripciôn viral y como consecuencia, las mutaciones a este nivel podrîan ser particularmente relevantes a la hora de modificar las propiedades biolôgicas del virus. En el caso de las oncoproteinas virales E6 y E7, aunque la secuencia estâ mâs conservada entre los diferentes genotipos, los cambios detectados pueden afectar a las funciones biolôgicas de las proteinas que codifican, implicadas en el control de la transformaciôn y la inmortalizaciôn celular. En este trabajo se ha llevado a cabo la caracterizaciôn de polimorfismos de la secuencia de nucleôtidos en un total de 212 muestras: 88 muestras infectadas por VPH16, 48 muestras de VPH18, 29 muestras de VPH31, 22 muestras de VPH33 y 25 muestras infectadas por VPH 52. 4.3.1. Anâlisis de variantes de VPH16 Se identificaron 88 muestras anales de HSH infectadas por VPH16, de las cuales en 83 se obtuvo una secuencia vâlida en las très regiones genômicas de estudio para la identificaciôn de variantes y para llevar a cabo el anâlisis filogenético de las mismas. La exclusiôn del resto fue debida, en cuatro muestras a que no se disponia de suficiente ADN y en una muestra, porque la calidad de la secuencia en dos de las très regiones de estudio (E6 y E7), no era la ôptima para el estudio de polimorfismos. 4.3.11. Anâlisis filogenético de muestras infectadas por VPH16 Para realizar el anâlisis filogenético de las muestras infectadas por VPH16 y con el fin de clarificar y simplificar los resultados obtenidos, todas las muestras que presentaban la misma secuencia de nucleôtidos en las très regiones del genoma analizadas, fueron representadas por una ùnica secuencia. En total se identificaron 20 secuencias representativas de las 83 muestras de VPH16 estudiadas. En las variantes de VPH16, dentro de la rama Europea se dispone de secuencias de referencia de las clases E-350T y E-350G, por lo que se incluyeron en el anâlisis filogenético. Este hecho es exclusive en este tipo de VPH. Los fenogramas obtenidos en cada una de las regiones analizadas se muestran en la figura 4.2. 6 4 R esultados E6 91% 94% I SP3013 (3) 'AF472509 89% 95% ■-AF472608 SP6065© SP5152 — AF402678 r— SP4859 'SP4114 ] a£2 D A fl E7 AA J-SP3689 r L SP4193 (2) — AF536179 — SP5027 SP5656 (2) SP4152 (29) [-SP5139 ^ j — SP3946 ' SP3249 — SP3194 (2) SP4162 (4) SP4903 SP3641 SP5931 (10) SP3139 (15) SP6148 — AF534061 (EpG178T) MD2718 E-350G E-350T/AS ■ AF472508 jSP3G13(3) 'AF4725Ü9 SP4903 SP6148 SP3194 (2) ^Afl ^Af2 A SP4193(2) SP3946 SP3641 SP5139 AF536179 SP3689 SP5027 SP3249 SP4152 (29) SP5931 (10) SP4162 (4) SP5656 (2) SP3139 (15) KD2718 AF534061 fEpG178~nJ E(E-350T/E-350G)/As SP4114 SP6085(5) SP4859 SP5152 AF402678 AA LCR AF472508 99% IAF4725Q9 ^ S P 3 0 1 3 ( 3 ) AF402678 SP5152 SP4859 SP4114 — SP6085 (5) ]A fl J a£2 L AA SP5931 (10) SP6148 SP4193 (2) — SP3689 — AF53G179 — SP4162 (4) SP3946 SP3194 (2) SP5027 SP49G3 I— SP3641 SP3249 SP4152 (29) -------------AF534061 (EpG178T) -Lsp I-! SP5139 SP5656 (2) SP3139 (15) M02718 E(E-350T/E-350G)/As Figura 4.2. Analisis filogenético de las 83 muestras caracterizadas como VFH16 en las regiones codificantes de E6, E7 y la region reguladora (LCR). AA, rama Asiatico-Americana; Af-1, rama Africana tipo 1; Af-2, rama Africana tipo 2; As, rama Asiatica; E, rama Europea. K02718, secuencia de referencia de la rama Etuopea clase E-350T (Seedorf et al., 1985); AF536179, secuencia de referencia de la rama Europea clase E-350G; AF402678, secuencia de referencia de la rama Asiatico-Americana; AF472509, secuencia de referencia de la rama Africana tipo 2. Entre paréntesis se indica el numéro de muestras que comparten la misma secuencia y que han sido simbolizadas por la secuencia representativa. Los numéros situados en las ramas indican los valores de bootstrap mayores del 70%. 65 ______________________________________________________________________ Resultados De las 83 muestras de VPH16, 72 (86,7%) fueron caracterizadas como pertenecientes a la rama Europea, de las cuales 34 pertenecian a la clase E-350T y 38 a la clase E-350G. De las once muestras restantes, ocho (9,6%) se clasificaron en la rama Asiatico-Americana y très (3,6%) en la rama Africana tipo 2. Las 34 muestras pertenecientes a la clase E-350T de la rama Europea, estân representadas en el anâlisis filogenético por siete secuencias representativas: SP3139 (15 muestras), SP4162 (cuatro muestras), SP5931 (10 muestras), SP6148 (una muestra), SP4903 (una muestra), SP-3641 (una muestra) y SP3194 (dos muestras). Las 38 muestras clasificadas en la clase E-350C de la rama Europea, estân representadas por ocho secuencias representativas: SP5656 (dos muestras), SP4152 (29 muestras), SP4193 (dos muestras), SP3249 (una muestra), SP3946 (una muestra), SP5027 (una muestra), SP3689 (una muestra) y SP5139 (una muestra). Las ocho muestras clasificadas en la rama Asiâtico-Americana, estân representadas por las secuencias SP4114 (una muestra), SP4859 (una muestra), SP5152 (una muestra) y SP6085 (cinco muestras). Las très secuencias caracterizadas como pertenecientes a la rama Africana tipo 2 estân representadas por la secuencia SP3013. La filogenia en la region codificante de E6 fue la que proporcionô una mayor informaciôn, ya que permitiô la discriminaciôn de las variantes Europeas en las dos clases descritas, hecho que no sucede al analizar las relaciones filogenéticas de las variantes de VPH16 en la region codificante de E7 y en la region reguladora. El anâlisis de los valores de bootstrap en las regiones estudiadas, nos permitiô indicar que en la regiôn codificante de E7, todas las secuencias mostraron una mayor similitud entre ellas, ya que en dicha regiôn los valores de bootstrap fueron menores del 70% en todos los casos. Todas las muestras analizadas se clasificaron en la misma rama filogenética en las diferentes regiones genômicas, lo que implica la ausencia de variantes de VPH16 recombinantes o infecciones multiples. 4.3.12. Polimorfismos en las regiones codificantes de las proteinas E6, E7 v en la regiôn reguladora de VPH16 Con el fin de simplificar el anâlisis de resultados en cada regiôn del genoma, se estableciô utilizar una nomenclatura uniforme para cada patrôn descrito que incluyera: la rama filogenética asignada, el genotipo de VPH, la regiôn estudiada y el numéro de patrôn identificado. Los patrones dentro de cada rama, genotipo y regiôn se denominaron con numéros correlativos en orden descendente de frecuencia de los mismos. 6 6 Resultados 4.3.1.2.1, Polimorfismos en la regiôn codificante de la proteina E6 El anâlisis de la regiôn codificante de E6 mediante la secuenciaciôn compléta del gen, permitiô identificar trece patrones diferentes a la secuencia prototipo, ocho pertenecientes a la rama Europea (E-16-E6-1 hasta E-16-E6-8), cuatro a la rama Asiâtico-Americana (AA-16- E6-1 hasta AA-16-E6-4) y uno a la rama Africana tipo 2 (Af2-16-E6-1). Como se muestra en la tabla 4.7 el patrôn mâs frecuente fue el prototipo, que se identificô en 32 muestras (38,5%), seguido por el patrôn E-16-E6-1, que incluye un ûnico cambio en el nucleôtido en posiciôn 350(T^G) y que fue identificado en 31 secuencias (37,3%). Los patrones E-16-E6-2 y el E-16-E6-3, se identificaron en dos secuencias (2,4%). El primero de ellos presentô dos cambios en las posiciones 350(T-^G) y 176(G—>C) y el patrôn E-16-E6-3 presentô un cambio ûnico en la posiciôn 109(T—>C) descrito previamente en la bibliografia; y ademâs fue el ûnico de los patrones (excluyendo la secuencia prototipo), en el que no se identificô cambio en la posiciôn nucleotidica 350. El resto de patrones descritos en esta rama (E-16-E6-4, E-16-E6-6, E-16-E6-7, E-16-E6-8) identificô a un grupo secuencias que presentaban ademâs del cambio en el nucleôtido 350(T—>G), una serie de cambios adicionales en posiciones nucleotidicas ya descritas en esta regiôn. El patrôn E-16-E6-5 se caracterizô por presentar en la secuencia un cambio en la posiciôn 132. Dicho cambio es mayoritario en las variantes pertenecientes a la rama Africana, pero muy infrecuente en las pertenecientes a la rama Europea. Tabla 4.7. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la regiôn codificante de E6 y frecuencia de los patrones en las 83 muestras de VPH16 analizadas. ■ ■ ■ ■ 0 1 ^ 0 i m 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 4 5 0 3 4 4 7 8 8 7 8 8 9 3 5 0 3 9 2 3 5 6 3 _8_ 1 6 9 3 5 0 3 2 N % E E-350T Prototipo T G C G G T G T T A G C T A A 32 38,5 E-350G E-16-E6-1 - - - - - - - - - - - - G - - 31 37,3 E-350G E-16-E6-2 - - - - C - - - - - - - G - — 2 2,4 E-350T E-16-E6-3 C - - - - - - - - - - - - - — 2 2,4 E-350G E-16-E6-4 - - - - - - C - - - - - G - - 1 1,2 E-350G E-16-E6-5 - C - - - - C - - - - - G - 1 1,2 E-350G E-16-E6-6 - - - - - - - - - - A - G - - 1 1,2 E-350G E-16-E6-7 - - - - A - - - - - - - G - 1 1,2 E-350G E-16-E6-8 - - - - - - _A - - - - - G - - 1 1,2 AA AAa AA-16-E6-1 - - - T - - - - A G - T G - 6 AAc AA-16-E6-2 - - - T - G - - A G - T G - G 1 1,2 AAc AA-16-E6-3 - - - T - G - C A G - T G - G 1 1,2 AAa AA-16-E6^ - - - T - - - - A G - T G - G 1 1,2 A£2 Af2a Af2-16-E6-1 C T G T - - - - A G - T - G - 3 3,6 Los numéros verticales describen la posiciôn nucleotidica; (-) ausencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo; AA, Asiâtico-Americana; Af2, Africana tipo 2; E, Europea. 67 R esultados Once secuencias fueron caracterizadas como variantes no Europeas, de las cuales ocho se asignaron a la rama Asiâtico-Americana (seis a la clase AAa y dos a la clase AAc) y très secuencias a la rama Africana tipo 2. En la rama Asiâtico-Americana se identificaron cuatro patrones diferentes, siendo el patron AA-16-E6-1 el mâs prevalente (6,0%). Todas las secuencias pertenecientes a esta rama filogenética presentaban cinco cambios comunes en las posiciones nucleotidicas: 145(G—>T), 286(T—>A), 289(A—>«G), 335(C^T) y 350(T^G) y las secuencias clasificadas en la clase AAc presentaron dos cambios adicionales, uno en posiciôn 532(A-^G) y uno caracteristico de esta clase en la posiciôn 183(T^G). Estas variantes representadas por los patrones AA-16-E6-2 y AA-16-E6-3, se identificaron en una ùnica secuencia (1,2%). La variante AA-16-E6-3 presentô un cambio adicional en el nucleôtido 271(T-^C). Las très secuencias restantes (3,6%) pertenecientes a la rama Africana tipo 2, clase Af2a presentaban un mismo patrôn que se denominô Af2-16-E6-1 e incluyô ocho cambios en la secuencia que ya habian sido descritos previamente en la bibliografia para esta clase y rama filogenética. En la tabla 4.8 se muestran los cambios nucleotidicos detectados, la frecuencia de los mismos, asi como su relevancia a nivel de traducciôn de la proteina. De las 15 posiciones con mutaciôn descritas en la regiôn codificante de E6, la mutaciôn que se observô con mâs frecuencia (55,4%), tanto en las variantes pertenecientes a la rama Europea como a las ramas no Europeas, fue la transversiôn en la posiciôn nucleotidica 350 que dio lugar al cambio de Leucina a Valina en el aminoâcido en posiciôn 83 (L83V). Del resto de los cambios que se detectaron en la regiôn, seis fueron mutaciones sileciosas y ocho fueron mutaciones que implicaban cambio de aminoâcido, siendo en estas ultimas los cambios mâs frecuentes (detectados en el 13,3% de las 83 secuencias analizadas), aquellos localizados en las posiciones nucleotidicas 145 (G—̂T) y 335(C^T), siendo la primera un cambio de aminoâcido neutro (Glutamina) a bâsico (Histidina) en el codôn 14 (Q14H); y la segunda un cambio de aminoâcido bâsico (Histidina) a aromâtico (Tirosina) en el codôn 78 (H78Y). Ambos cambios se localizaron sôlo en secuencias asignadas a ramas no Europeas. 68 Resultados Tabla 4.8. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH16 en la regiôn codificante de E6, de acuerdo con la posiciôn nucleotidica, nucleôtido, aminoâcido, codôn y tipo de mutaciôn. E6 E/Af2 109 T C F - 2 Ts,S 5 6 E/Af2 132 G C/T R T/I 10 Tv/Tv, Ms/Ms 4 4,8 Af 143 C G Q E 14 Tv, Ms 3 3,6 AA/Af2 145 G T Q H 14 Tv, Ms 11 13,3 E 176 G C /A D H /N 25 Tv/Ts, Ms/Ms 3 3,6 AA 183 T G I R 27 Tv, Ms 2 2,4 E 188 G C /A E Q/K 29 Tv/Ts, Ms/Ms 3 3,6 AA 271 T C D - 56 Tv,S 1 1,2 A A /M 2 286 T A A - 62 Tv,S 11 13,3 A A /M 2 289 A G V - 63 Ts,S 11 13,3 E 293 G A D N 64 Ts, Ms 1 1,2 A A /M 2 335 C T H Y 78 Ts, Ms 11 13,3 E/AA 350 T G L V 83 Tv, Ms 46 55,4 Af2 403 A G L - 100 Ts,S 3 3,6 AA 532 A G S - 143 Ts,S 3 3,6 AA, Asiâtico-Americana; Af2, Africana tipo 2; E, Europea; Ts, transiciôn; Tv, transversion; Ms, cambio con sentido; S, mutaciôn silenciosa. 4.3.1.2.2. Polimorfismos en la regiôn codificante de la proteina E7 El estudio de la secuencia compléta de la regiôn que codifica la proteina viral E7, nos permitiô identificar cinco patrones diferentes, dos en la rama Europea (prototipo y E-16-E- 1), dos en la rama Asiâtico-Americana (AA-16-E7-1 y AA-16-E7-2) y uno en la rama Africana tipo 2 (Af2-16-E7-1). Todos ellos habian sido descritos previamente en la bibliografia. Como se muestra en la tabla 4.9, de las 72 muestras caracterizadas como pertenecientes a la rama Europea, 68 (81,9%) presentaron la secuencia prototipo y las cuatro secuencias restantes (4,8%), identificadas como el patrôn E-16-E7-1, presentaron un ûnico cambio en la posiciôn 822(A^G). Tabla 4.9. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la regiôn codificante de E7 y frecuencia de los patrones en las 83 muestras de VPH16 analizadas. 6 7 7 7 8 4 3 8 9 2 7 2 9 5 2 N % E Prototipo A T T T A 68 81,9 E-16-E7-1 - - - - G 4 4,8 AA AA-16-E7-1 - - C G - 5 6 AA-16-E7-2 - C C G - 3 3,6 A£2 Af2-16-E7-1 G - c A - 3 3,6 Los numéros verticales describen la posiciôn nucleotidica; (-) ausencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo; AA, Asiâtico-Americana; Af2, Africano tipo 2; E, Europea. 69 Resultados De la misma forma que en la region codificante de E6, en la region codificante de E7 las once secuencias restantes se asignaron a ramas no Europeas. En la rama Asiâtico- Americana se identificaron dos patrones, siendo AA-16-E7-1 el mâs frecuente (6,0%) con cambios en dos posiciones: 789(T-^C) y 795(T—>G). El patron AA-16-E7-2, se presentô en très secuencias (3,6%), y se definiô con los cambios descritos en el patrôn AA-16-E7-1 y un cambio adicional en posiciôn 732(T^C). En la rama Africana tipo 2 se detectô un ûnico patrôn, Af2-16-E7-1, con cambios en las posiciones: 647(A^G), 789(T—>C) y 795(T^A). En la tabla 4.10 se indican las posiciones nucleotidicas con mutaciôn descritas en la regiôn codificante de E7, los aminoâcidos alterados y la frecuencia de estos cambios. En la regiôn, sôlo una transiciôn dio lugar a un cambio de aminoâcido, de Asparagina a Serina en el codôn en posiciôn 29, y fue detectado en las très muestras pertenecientes a la rama Africana tipo 2 (3,6%). El resto de los cambios detectados fueron mutaciones silenciosas. En las variantes Europeas la sustituciôn nucleotidica identificada en la posiciôn 822(A-^G), que no produjo ningûn cambio de aminoâcido en el codôn 97; en las variantes no Europeas se detectaron con la misma frecuencia (13,3%) las mutaciones 789(T—>C), 795(T—>G/ A), aunque tampoco dan lugar a ningûn cambio en la secuencia de aminoâcidos. Tabla 4.10. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH16 en la regiôn codificante E7, de acuerdo con la posiciôn nucleotidica, nucleôtido, aminoâcido, codôn y tipo de mutaciôn. E7 Af2 647 A G N S 29 Ts, Ms 3 3,6 AA 732 T C F - 57 Ts,S 3 3,6 AA/Af2 789 T C I - 76 Ts,S 11 13,3 AA/Af2 795 T G /A T - 78 Tv,S 11 13,3 E 822 A G L - 97 Ts,S 4 4,8 AA, Asiâtico-Americana; Af2, Africana tipo 2; E, Europea; Ts, transiciôn; Tv, transversiôn; Ms, cambio con sentido; S, mutaciôn silenciosa. El nûmero de mutaciones con sentido localizadas fue mayor en la regiôn codificante de E6 frente a la regiôn codificante de E7 (60% vs. 20%), sin embargo no se observaron diferencias estadisticamente significativas entre ambas regiones (p = 0,12). 4.3.1.2.3. Polimorfismos en la regiôn reguladora El estudio de 363 pb de la regiôn reguladora nos permitiô identificar ocho patrones de nucleôtidos diferentes que se denominaron: E-16-LCR-1 hasta E-16-LCR-4; AA-16-LCR-1 hasta AA-16-LCR-3 y Af2-16-LCR-1 (Tabla 4.11) En todos los casos a excepciôn de uno (AA-16-LCR-1), los patrones pertenecian a alguna de las variantes de VPH16 ya descritas. 70 Resultados Tabla 4.11. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la region reguladora estudiada y frecuencia de los patrones en las 83 muestras de VPH16 analizadas. ■ ■ ■ ■ ■ ■ 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 4 4 4 5 5 5 6 6 7 7 7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 9 0 2 5 6 8 1 2 4 6 8 8 2 3 3 3 5 9 6 7 1 2 9 9 4 9 _3_ 4 4* 6 6 4 7 9 N % E Prototipo A G T A G G C C T A T C C C G G A A 17 20,5 E-16-LCR-1 - - - - A - - - - - - - - - - - - - 47 56,6 E-16-LCR-2 - - - - A A - - - - - - - - - - - - 4 4,8 E-16-LCR-3 - - C - A - - - - - - - - - - - - - 3 3,6 E-16-LCR-4 - - - - A - - - _G - - - - - - - - - 1 1,2 AA AA-16-LCR-1 C A - - A - “T""“ - “c" - T T T - T - - 5 6 AA-16-LCR-2 C A - G A - T A - C - T - T - - - - 2 2,4 AA-16-LCR-3 C A - - A - T A - C _G T - T - - - - 1 1,2 Af2 Af2-16-LCR-1 c A - - A - T - - - - T - T A T C G 3 3,6 Los numéros verticales describen la posiciôn nucleotidica; (-) ausencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo; (*) posiciôn con cambios descritos por primera vez y en negrita los patrones identificados por primera vez; AA, Asiâtico-Americana; Af2, Africana tipo 2; E, Europea. En la rama Europea se identificaron ademâs de la secuencia prototipo, cuatro patrones diferentes nombrados desde E-16-LCR-1 hasta E-16-LCR-4. La secuencia prototipo se identified en 17 muestras (20,5%), y el patron E-16-LCR-1, con una sustituciôn nucleotidica en la posiciôn 7521(G—>A), fue el mâs frecuentemente detectado al identificarse en 47 muestras (56,6%). Los patrones E-16-LCR-2, E-16-LCR-3 y E-16-LCR-4 se observaron en cuatro (4,8%), très (3,6%) y una (1,2%) muestras respectivamente, y las secuencias que los presentaron, ademâs del cambio mencionado en la posiciôn 7521, presentaron cambios adicionales en las posiciones 7552(G—>A) el patrôn E-16-LCR-2; 7496(T^C) el patrôn E-16- LCR-3; y 7714(T-^G) el patrôn E-16-LCR-4. En la rama Asiâtico-Americana se pudieron identificar très patrones diferentes: AA- 16-LCR-l, AA-16-LCR-2 y AA-16-LCR-3, siendo el primero el detectado mâs frecuentemente (6,0%). Las variantes con este patrôn presentaron los cambios definidos para una variante descrita previamente, mâs un cambio adicional en la posiciôn nucleotidica 7784(C^T) que no habia sido descrito hasta el momento, por lo que las muestras que presentaron este patrôn se consideraron variantes nuevas. Las très muestras que presentaban los patrones AA-16-LCR-2 y AA-16-LCR-3 tenian ocho cambios comunes y sôlo se diferenciaban en un cambio adicional, las dos variantes AA-16-LCR-2 tenian un cambio en posiciôn 7507(A—>G) y la variante AA-16-LCR-3, detectada en una secuencia (1,2%), un cambio en la posiciôn 7743(T^G). El patrôn Af2-16-LCR-1 se identificô en très secuencias pertenecientes a la rama Africana tipo 2, y se definiô con cambios en las posiciones: 7485(A—>C), 7489(G—>A), 71 R esultados 7521(G^A), 7669(C^T), 7764(C-^T), 7786(C->T), 7826(G^A), 7834(G->T), 7837(A^C), 7839(A^G). En la tabla 4.12 se muestran el anâlisis de las mutaciones identificadas en la region reguladora, los factores reguladores de la transcripciôn viral que pueden verse afectados asi como la frecuencia de estos cambios. En los patrones descritos se observaron 18 sustituciones nucleotidicas con respecto a la secuencia de referencia, y en ocho de ellas se afectaron los sitios de uniôn de cinco factores de transcripciôn: el elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE, Glucocorticoid Response Elements), el factor YY-1, el factor nuclear 1 (NF-1, Nuclear Factor 1), el potenciador de transcripciôn del factor 1 (TEF-1, Transcriptional Enhancer Factor 1) y el octâmero de uniôn para el factor 1 (Oct-1, Octamer Binding Transcription Factor 1). La mayoria de los patrones identificados en la regiôn reguladora (79,5%), incluian la mutaciôn en la posiciôn nucleotidica 7521, que supone la transiciôn G—>A, y que afecta a uno de los sitios de uniôn de los factores de transcripciôn YYl y NFl. Este cambio se identificô en muestras que fueron asignadas a todas las ramas identificadas en este trabajo. Se identificaron con la misma frecuencia (13,3%) cambios en las posiciones nucleôtidicas 7485(A-^C), 7489(G-^A), 7669(C-^T), 7764(C—>T) y 7786(C-^T), aunque sôlo la transversiôn y la transiciôn de las posiciones 7485 y 7786 respectivamente, alteraban los sitios de uniôn del factor de transcripciôn YY-1 y GRE. En ambos casos, la mutaciôn sôlo se presentô en muestras clasificadas en las ramas no Europeas. La mutaciôn C-^^A descrita en la posiciôn nucleotidica 7689 que se observô con una frecuencia menor (9,6%), afectô al sitio de uniôn de TEF-1 y sôlo se presentô en las muestras asignadas a la rama Asiâtico- Americana. La nueva posiciôn nucleotidica 7784(C^T) se identificô sôlo en muestras asignadas a la rama Asiâtico-Americana (6 %), y este cambio puede afectar al sitio de uniôn de Oct-1. La transiciôn G ^ A descrita en la posiciôn 7826, se identificô en très muestras (3,6%) que fueron asignadas a la rama Africana tipo 2, y afectô al sitio de uniôn de los factores YY-1 y TEF-1. Los cambios descritos en las posiciones nucleotidicas 7714 y 7743, que afectaron a los sitios de uniôn de los factores NF-1 y TEF-1 respectivamente, sôlo se observaron en dos muestras (1,2%) que pertenecian a las ramas Europea y Asiâtico- Americana. El resto de mutaciones observadas en las secuencias nucleôtidicas no tuvieron implicaciones a nivel de alteraciôn de los factores de transcripciôn. 72 ______________________________________________________________________Resultados Tabla 4.12. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH16 en la region reguladora de acuerdo con la posiciôn nucleotidica, sitio de uniôn, y tipo de mutaciôn. LCR AA/Af2 7485 A C YY-1,GRE Tv 11 13,3 A A /M 2 7489 G A - Ts 11 13,3 E 7496 T C - Ts 3 3,6 AA 7507 A G - Ts 2 2,4 E/AA/Af2 7521 G A YY-1,NF1 Ts 66 79,5 E 7552 G A - Ts 4 4,8 A A /M 2 7669 C T - Ts 11 13,3 A A 7689 C A TEF-1 Tv 8 9,6 E 7714 T G NF-1 Tv 1 1,2 AA 7729 A C - Tv 8 9,6 AA 7743 T G TEF-1 Tv 1 1,2 AA/Af2 7764 C T - Ts 11 13,3 AA 7784 C T Oct-1 Ts 5 6 AA/Af2 7786 C T YY-1 Ts 11 13,3 Af2 7826 G A YY-1,TEF-1 Ts 3 3,6 AA/Af2 7834 G T - Tv 8 9,6 Af2 7837 A C - Tv 3 3,6 Af2 7839 A G - Ts 3 3,6 AA, Asiâtico-Americana; Af2, Africana tipo 2; E, Europea; Ts, transiciôn; Tv, transversiôn; GRE, Elemento de respuesta a glucocorticoides; NF-1, Factor nuclear 1; Oct-1, octâmero de uniôn para el factor 1; TEF-1, potenciador de transcripciôn del factor 1; YY-1, Factor ying-yang 1. 4.3.1.3. Comparaciôn de los polimorfismos en las regiones codificantes de las proteinas E6 , E7 y en la regiôn reguladora En el anâlisis de las secuencias no se localizaron inserciones o deleciones. Las variantes de la regiôn codificante de E6 presentaron desde un cambio de nucleôtido con respecto a la secuencia de referencia (0 ,2 %) hasta un mâximo de ocho cambios de nucleôtidos (1,7%); en la regiôn codificante de E7 las variantes de este trabajo presentaron desde un cambio (0,3%) hasta très cambios de nucleôtidos (1%); y en la regiôn reguladora se identificaron variantes que incluyeron desde un cambio ûnico (0,3%) hasta diez cambios de nucleôtidos (2,6%). La media de variaciones puntuales con respecto a la variante prototipo en la regiôn codificante de E6 fue de cuatro cambios (3,5 ± 3,1; rango 1-8 mutaciones; p = 0,08), de dos cambios en la regiôn codificante de E7 (1,8 ± 1,2; rango 1-3 mutaciones; p = 0,3) y de cinco cambios en la regiôn reguladora (media de 4,7 ± 4,2; rango 1-10 mutaciones; p = 0,04). Para llevar a cabo el anâlisis total de la variabilidad genética en cada una de las regiones del genoma estudiadas, se comparô el nûmero total de nucleôtidos con variaciôn ajustando por la longitud del amplicôn secuenciado. La variabilidad de la regiôn codificante de E6 fue generada por 17 cambios de nucleôtidos puntuales (3,1%); la variabilidad de la regiôn codificante de E7 por cinco mutaciones (1,7%); y la de la regiôn reguladora por 18 73 ______________________________________________________________________ Resultados cambios de nucleôtidos en un total de 363 pb analizadas (4,9%). Los datos de variabilidad genética observada no fueron estadisticamente significativos cuando se compararon las regiones codificantes de E6 y E7 (p = 0,19) y la regiôn reguladora con la regiôn codificante de E6 (p = 0,31); sin embargo la regiôn reguladora si presentô una variabilidad genética significativamente mayor al compararse con la regiôn codificante de E7 (p < 0,05). Las mutaciones en posiciones ûnicas en los nucleôtidos 271, 293 de la regiôn codificante de E6 ; y 7714 y 7743 de la regiôn reguladora se identificaron en muestras individuales. 4.3.14. Distribuciôn de variantes de VPH16 entre los pacientes En la tabla 4.13 se indica de manera global las variantes identificadas en las 83 muestras infectadas por VPH16 y su distribuciôn: 72 muestras se asignaron en la rama Europea (86,7%), ocho muestras en la rama Asiâtico-Americana (9,6%) y très muestras en la rama Africana tipo 2 (3,6%). De las muestras asignadas a la rama Europea, 34 muestras (47,2%) fueron clasificadas en la clase E-350T, y las 38 muestras restantes (52,8%) se asignaron en la clase E-350G. Se identificô una variante no descrita previamente en la bibliografia perteneciente a la rama Asiâtico-Americana (indicada en negrita en la tabla). En las variantes Europeas asignadas a la clase E-350T, la variante representada por la secuencia SP3139 fue la mâs frecuente detectândose en 15 muestras (18,1%) y se caracterizô por presentar la secuencia prototipo en las très regiones analizadas. La variante representada por la secuencia SP5931 e identificada en diez muestras (12%) sôlo presentô un cambio en la regiôn reguladora. En orden decreciente de frecuencia le siguieron las variantes representadas por las secuencias: SP4162 (detectada en cuatro muestras), con la secuencia prototipo en las regiones codificantes y dos cambios en la regiôn reguladora; SP3194 (detectada en dos muestras) con un ûnico cambio en las regiones codificantes de E6 y E7 y dos cambios en la regiôn reguladora; SP6148, SP4903 y SP3641 identificadas en una ûnica muestra clinica cada una de ellas y presentando todas ellas la secuencia prototipo en la regiôn codificante de E6 . 74 Resultados J I Is I I 0 ■S 1 - § Cf ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ •â I ■g < < < < < < 'T îiO p P r H r H O r H Oi.£pLHWu4eL,weL, CL, CL, II . U U U U U U U U ! ! ! ! ! ! < : ! . ' . , , , u u , , < , . ! u , . , < , u u O O O O O O c T ) T - i r - i e s | T l < -s s Æ -S’ -ê* s s ^ s IÇ vo ts . 00 ^ UMUWUWUMW WMWMMMWWM S 3 i S o\ in , . . _ ................... | m i D ' ^ ' O ^ r p c O T j i i n ^ j t ' r t ç r i i n ç p i p ë ë ë ë ë «l ÛÛÛWÛÛÛÙÙÙÙÙÙÙK) H H H H H 1 1 I H H H H , , , U U U U U < < < < H H H H < < < < . U U , < < < < u u u u rH (SI r 4 CD g § § § Vî vO vD vOiiii o u u o u u u u ■ u u u r 4 (N (N (S M M W M ^ VO VO vo î i ü . u u u u u u u H H t- H o u u u < < < < , . u . , u u ■ H H H H rH f S m Tj*\0 \0 \D \Dw w w wvo 'O VO vo i i i i i i i i Ui i YYl/TEFl YYl Oct-1 TEFl NFl TEFl Y Y l/N Fl YYl/GRE j —► > X Q — Z a X c< X Z X w H I—, 3 "Q II w' o 11 1 4 2 2. Il I |î! lii u SP4438 (5) SP4286 SP6270 SP6340# SP5227» SP4844 SP5289 SP6015 (4) SP6268 SP3418 (7) SP5126 SP5876 (13) SP3754 SP4162 SP5627# SP6148 (2) AY262282 H SP3249 SP5813 (3) L EF202152 AsAi A f LCR 99% 100% r - SP3754 SP5876 (13) SP5126 SP6270 SP4286 EF202147 C SP6015 (4) SP5627* SP4438 SP4844 (5) SP3418 (7) SP6268 -SP5289 r SP6148 (2) SP4747 80% 84% 9go/oi SP6340< AY262282 100 ŜP5813 (3) • SP5227* SP3249 EF202152 AsAi A f Figura 4.3. Anâlisis filogenético de las 46 muestras caracterizadas como VPH18 en las regiones de E6, E7 y en la region reguladora (LCR). Af, rama Africana; AsAi, rama Asiâtico-Amerindia; E, rama Europea. AY262282, secuencia de referencia perteneciente a la rama Asiâtico-Amerindia (Narechania ei al, 2005). EF202147, secuencia de referencia de la rama Europea; EF202152, secuencia de referencia de la rama Africana. Entre paréntesis se indica el nûmero de muestras que comparten la misma secuencia y que ha sido simbolizada por la secuencia representativa. Los nùmeros situados en las ramas indican los valores de bootstrap mayores del 70%. Los circulos rojos indican las muestras recombinantes de VPH18. 79 Resultados Las très muestras asignadas a distintas ramas en las très regiones estudiadas fueron clasificadas como infecciones recombinantes de VPH18 y se caracterizaron porque la muestra SP-6340 se asignô en las regiones codificantes de E6 y E7 a la rama Europea, y en la region de LCR a la rama Asiâtico-Amerindia; la muestra SP5627 se asignô en las regiones codificantes a la rama Asiâtico-Amerindia, mientras en la regiôn reguladora se agrupô como una variante Europea; y por ultimo la muestra SP5227 se caracterizô como una variante Africana en la regiôn codificante E6 y en la regiones reguladora y codificante de E7 se agrupô con las variantes de la rama Europea. Tanto en las regiones codificantes de las proteinas E6 y E7, como en la regiôn reguladora, la filogenia obtenida fue vâlida para la clasificaciôn de las 46 muestras analizadas en las très ramas filogenéticas descritas para este tipo de VPH. No se llevo a cabo divisiôn en clases en ninguna rama filogenética porque esta clasificaciôn no se ha descrito de manera homogénea en la bibliografia. 4.3.2.2. Polimorfismos en las regiones codificantes de las proteinas E6 , E7 y en la regiôn reguladora de VPH18 La nomenclatura empleada para indicar los patrones de nucleôtidos descritos en las regiones analizadas ha sido la misma que la empleada en VPH16. 4.3.2.2.I. Polimorfismos en la regiôn codificante de la proteina E6 El anâlisis de polimorfismos en la regiôn codificante de E6 se llevô a cabo en la totalidad del gen y como se indica en la tabla 4.15 se identificaron cuatro patrones ademâs de la secuencia prototipo, très en la rama Europea y uno en la rama Africana. En la rama Asiâtico-Amerindia, las cuatro secuencias identificadas presentaron el patrôn prototipo (8,7%). En la rama Europea, se describieron très patrones. El patrôn E-18-E6-1 que fue el mâs frecuente al identificarse en 34 secuencias (73,9%), y presentô dos cambios en los nucleôtidos 485(T^C) y 549(C—>A), que ya habian sido descritos previamente. Los patrones E-18-E6-2 y E-18-E6-3 identificados en dos (4,8%) y una secuencia (2,7%) respectivamente, presentaron très cambios con respecto a la secuencia de referencia. Ambas se consideraron nuevas; E-18-E6-2 al incluir un cambio en la posiciôn 314(T—»C) y E- 18-E6-3 por la presencia de un cambio en la posiciôn 467(T^C). Las cinco secuencias restantes (10,9%) se clasificaron en la rama Africana, y presentaron un patrôn idéntico entre ellas que incluyô nueve cambios en la secuencia y que se denominô Af-18-E6-1. 80 R esultados Tabla 4.15. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la region codificante de E6 y frecuencia de los patrones en las 46 muestras de VPH18 analizadas. ■ ■ ■ 2 2 3 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 1 1 4 7 6 8 9 4 4 1 6 4* 7 2 4 7* 5 1 8 9 N % AsAi Prototipo T G T T C G_ T T C A C 4 8,7 E E-18-E6-1 - - - - - - C - - A 34 73,9 E~18~E6“2 - - G - - - - C - - A 2 4,3 E-18-E6-3 - - - - - C C - - A 1 2,2 Af Af-18-E6-1 C A - C T A - C A G A 5 10,9 Los numéros verticales describen la posiciôn nucleotidica; (-) ausencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo; (*) posiciôn con cambios descritos por primera vez y en negrita los patrones identificados por primera vez; Af, Africana; AsAi, Asiâtico-Amerindia; E, Europea. Los cambios de nucleôtidos identificados en los 476 pb de la regiôn codificante de E6 , la frecuencia de los mismos y su relevancia en la secuencia proteica se indican en la tabla 4.16. Se describieron un total de once posiciones con cambio que se identificaron en muestras asignadas en las ramas Europea y Africana. Las mutaciones mâs frecuentes fueron la transiciôn T—>-C y la transversiôn C—>A en las posiciones nucleotidicas 485 y 549. Las dos mutaciones se identificaron en 42 muestras (91,3%) pertenecientes a las ramas Europea y Africana, y ambas dieron lugar a una mutaciôn silenciosa. De las mutaciones descritas en la regiôn, très posiciones nucleotidicas dieron lugar a cambios de aminoâcidos. Los cambios incluyeron la posiciôn 314(T-^G), descrita por primera vez en este trabajo y observada en dos muestras (4,3%) asignadas a la rama Europea, que indujo un cambio de Âcido Aspârtico a Âcido Glutâmico en el codôn en posiciôn 70; y los cambios en las posiciones 342(C—»T) y 491(C—>A), descritos en cinco muestras (10,9%) pertenecientes a la rama Africana, que indujeron cambios de aminoâcidos en los codones en posiciones 80 (Histidina a Tirosina) y 129 (Arginina a Lisina). Las mutaciones descritas en las ocho posiciones nucleôtidicas restantes, no produjeron cambios de aminoâcidos en la secuencia proteica. 81 Resultados Tabla 4.16. Cambios localizados y frecuencia de les mismos en las secuencias estudiadas de VPH18 en la region codificante de E6 de acuerdo con la posicion nucleotidica, nucleotido, aminoacido, codon y tipo de mutacion. E6 Af 251 T C F - 49 Ts,S 5 10,9 Af 266 G A V - 54 Ts,S 5 10,9 E 314 T G D E 70 Tv, Ms 2 4,3 Af 317 T C F - 71 Ts,S 5 10,9 Af 342 C T H Y 80 Ts, Ms 5 10,9 Af 374 G A L - 90 Ts,S 5 10,9 E 467 T C L - 121 Ts,S 1 2,2 E/Af 485 T C F - 127 Ts,S 42 91,3 Af 491 C A N K 129 Tv, Ms 5 10,9 Af 548 A G E - 148 Ts,S 5 10,9 E/Af 549 C A R - 149 Tv,S 42 91,3 Af, Africana; E, Europea; Ts, transicion; Tv, transversion; Ms, cambio con sentido; S, mutacion silenciosa. 43.2.2.2. Polimorfismos en la region codificante de la proteina E7 El estudio de los polimorfismos se llevo a cabo en la totalidad de la region que codifica la proteina E7 y nos permitio identificar tres patrones diferentes, cada uno de ellos asignado a ima rama filogenética (Tabla 4.17). En la rama Asiâtico-Amerindia se identificaron cuatro secuencias (8,7%) idénticas a la secuencia prototipo. En la rama Europea se describiô el patron denominado E-18-E7-1 que se observé en la mayoria de las muestras (82,6%), y présenté un ûnico cambio, descrito en la bibliografia, en el nucleétido en posicién 751 (G—>T). En la rama Africana se definié el patrén Af-18-E7-1, que fue compartido por cuatro muestras (8,7%), y que incluyé tres cambios en posiciones previamente descritas: 593(C^T), 640(C^T) y 864(A-^G). Tabla 4.17. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la region codificante de E7 y frecuencia de los patrones en las 46 muestras de VPH18 analizadas. 5 6 7 8 9 4 5 6 4 0 2 _4__ N % AsAi Prototipo C C G A 4 8,7 E E-18-E7-1 - - T - 38 82,6 Af Af-18-E7-1 T - ~G~~ 4 8,7 Los numéros verticales describen la posicién nucleotidica; (-) ausencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo; Af, Africana; AsAi, Asiâtico-Amerindia; E, Europea. En la tabla 4.18 se describen la frecuencia y las implicaciones a nivel proteico de las cuatro mutaciones observadas en la regién codificante de E7. La mutacién mas frecuente (82,6%) correspondié a la transversién G—>T en la posicién nucleotidica 752, descri ta en las 82 ______________________________________________________________________R esultados muestras pertenecientes a la Imea Europea. Esta mutacion dio lugar a una mutacion silenciosa. El resto de cambios identificados en la region fueron transiciones en los nucleôtidos en posiciones 594(C-^T), 640(C^T) y 864(A-^G) y en todos los casos fueron observados en secuencias asignadas a la rama Africana (8,7%). La mutacion en la posicion nucleotidica 594 produjo el cambio de Histidina a Tirosina en al aminoacido en posicion 2; la mutacion en el nucleotido en posicion 640 fue una mutacion silenciosa; y el cambio descrito en la posicion nucleotidica 864 indujo un cambio de Lisina a Serina en el codôn en posicion 92. La presencia de mutaciones con sentido fue mayor en la region codificante de E7 (50%) que en la region codificante de E6 (36,4%), aunque estas diferencias no fueron estadisticamente significativas (p = 0 ,6 ). Tabla 4.18. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH18 en la region codificante de E7 de acuerdo con la posicion nucleotidica, nucleotido, aminoacido, codôn y tipo de mutacion. E7 Af 594 C T H Y 2 Ts, Ms 4 8,7 Af 640 C T P - 17 Ts,S 4 8,7 E 752 G T A - 54 Tv,S 38 82,6 Af 864 A G K S 92 Ts, Ms 4 8,7 Af, Africana; AsAi, Asiâtico-Amerindia; E, Europea; Ts, transicion; Tv, transversion; Ms, cambio con sentido; S, mutacién silenciosa. 4.3.2.2.3. Polimorfismos en la region reguladora El estudio de los polimorfismos de la region reguladora se llevô a cabo en 362 pb y nos permitiô identificar 13 patrones ademâs de la secuencia de referencia (Tabla 4.19). Cuatro de los patrones descritos pertenecian a variantes descritas por primera vez. En la rama Asiâtico-Amerindia se observaron el patron prototipo, y los patrones denominados AsAi-18-LCR-l y AsAi-18-LCR-2. El patron prototipo se observé en una ùnica muestra (2,2%) y los patrones AsAi-18-LCR-l y AsAi-18-LCR-2, se identificaron en dos (4,3%) y una muestra (2,2%), respectivamente. El primero présenté dos cambios en la posiciones 7592(T—>C) y 7717(A^C); el segundo mostré un ûnico cambio en la posicién 7717(A^C). 83 R esultados Tabla 4.19. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la région reguladora estudiada y frecuencia de los patrones en las 46 muestras de VPH18 analizadas ■■■■■■ ■■■■■■■ 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 7 7 7 7 8 9 0 1 2 2 3 6 6 6 9 4 5 5 7 9 0 1 2 3 6 6 7 2 7* _9_ 0 3 7 2 3 1 8 0 4 7 6 0 N % AsAi Prototipo C C A G A C T G A A T T T A A T T A C C 1 2,2 AsAi-18-LCR-l - - - - - - - - - - C - - - - - - C - - 2 4,3 AsAi-18-LCR-2 - - - - - - - - - - - - - - - - - C - - 1 2,2 E E-18-LCR-1 T - - - - A - - “ c"~C~ - - - T - - - - - 14 30,4 E-18-LCR-2 - - - - - A - - - C C - - - T - - - - - 8 17,4 E-18-LCR-3 T - - - - A - - - C c - - - T - - - - - 6 13 E-18-LCR-4 T - - - - - - A - c c - - - T - - - - - 4 8,7 E-18-LCR-5 T - - - - A - A - c c - - - T - - G - - 1 2,2 E-18-LCR-6 - - - - - A - - - c c - - - T - - C - - 1 2,2 E-18-LCR-7 T - - - C A - A - c c - - - T - - - - - 1 2,2 E-18-LCR-8 T - - - - A - A - c c - - - T G - G - - 1 2,2 E-18-LCR-9 - - G - - _A - - _C_ c c - - - T - - - - - 1 2,2 Af Af-18-LCR-l - G - A - - C A - c c G C C T - C - T A 4 8,7 Af-18-LCR-2 - G - A - C A - c c G C C T - C - T A 1 2,2 Los numéros verticales describen la posicién nucleotidica; (-) ausencia de variacién con respecto a la secuencia prototipo; (*) posicién con cambios descritos por primera vez y en negrita patrones descritos por primera vez; Af, Africana; AsAi, Asiâtico-Amerindia; E, Europea. En la rama Europea se describieron nueve patrones; cinco patrones incluian cambios en posiciones nucleotidicas que hablan sido descritas previamente en la bibliografia y cuatro patrones se consideraron nuevos al incluir en la secuencia cambios en posiciones que hasta el momento no habian sido referidas. Todas las variantes pertenecientes a esta rama presentaban tres cambios en las posiciones nucleotidicas: 7567(A^C), 7592(T-^C) y 7670(A->T). El patron mas frecuente en el total de muestras estudiadas fue E-18-LCR-1 (30,4%), que présenté los tres cambios comunes y tres cambios mas en las posiciones nucleotidicas: 7486(C^T), 7529(C^A) y 7563(G—>-A). El segundo patrén mas frecuente fue E-18-LCR-2, que se identificé en ocho secuencias (17,4%) e incluyé un cambio en la posicién nucleotidica 7529(C^A) ademâs de los tres cambios comunes. Los patrones E-18-LCR-3 y E- 18-LCR-4 se observaron en seis (13%) y cuatro secuencias (8,7%) respectivamente, y ambos presentaron cinco cambios en la secuencia, incluyendo los tres cambios comunes, un cambio en la posicién 7486(C^T) y cambios especificos de cada patrén en posiciones: 7529(C—>A) en E-18-LCR-3 y 7563(G—>A) en el patrén E-18-LCR-4. Cada uno de los patrones identificados como nuevos fueron detectados en una muestra clinica (2,2%) y fueron: E-18- LCR-5, E-18-LCR-6, E-18-LCR-7 y E-18-LCR-8. Las posiciones nucleotidicas que al incluir mutaciones definen estas nuevas variantes son: 7527(A^C); 7699(T^G) y 7717(A-+G/C). Esta ultima posicién no se describe por primera vez, pero sélo se habia observado en las variantes pertenecientes a la rama Asiâtico-Amerindia. El patrén denominado E-18-LCR-9 8 4 Resultados se observé en una secuencia (2 ,2 %) y présenté cambios en seis posiciones, las tres posiciones comunes y las posiciones 7507(A^G), 7529(C—>A) y 7564(A—>C). En la rama Africana, se describieron dos patrones: Af-18-LCR-l y Af-18-LCR-2. El patrén 1, se identificé en cuatro muestras (8,7%) y présenté 13 cambios en la secuencia con respecto a la secuencia prototipo en posiciones nucleotidicas ya descritas. El patrén 2 de la rama se identificé en una secuencia (2 ,2 %), y présenté los mismos cambios que el patrén anterior mas un cambio adicional en la posicién nucleétidica 7529(C-^A). Las sustituciones de bases descritas en la regién reguladora, los sitios de unién a factores de transcripcién alterados y la frecuencia de los cambios se muestran en la tabla 4.20. Del total de 20 posiciones nucleotidicas con cambio descritas, seis de ellas afectaron a sitios de unién para factores de transcripcién. Tabla 4.20. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH18 en la regién reguladora estudiada de acuerdo con la posicion nucleotidica, nucleotido, sitio de union, y tipo de mutacion. m m m m LCR E 7486 c T - Ts 27 58,7 Af 7496 c G - Tv 5 10,9 E 7507 A G - Ts 1 2,2 Af 7512 G A - Ts 5 10,9 E 7527 A C C/EBP, Oct-1 Tv 1 2,2 E/Af 7529 C A - Tv 34 73,9 Af 7530 T C - Ts 5 10,9 E/Af 7563 G A - Ts 26 56,5 E 7564 A C - Tv 1 2,2 E/Af 7567 A C - Tv 42 91,3 AsA i/E/A f 7592 T C - Ts 44 95,7 Af 7643 T G - Tv 5 10,9 Af 7651 T C KRF-1 Ts 5 10,9 Af 7658 A C Oct-1 Tv 5 10,9 E/Af 7670 A T - Tv 42 91,3 E 7699 T G YY-1, TEF-1 Tv 1 2,2 Af 7704 T C - Ts 5 10,9 AsAi/E 7717 A C/G - Tv/Ts 6 13,0 Af 7726 C T TEF-1, Oct-1 Ts 5 10,9 Af 7730 C A TEF-1, Oct-1 Tv 5 10,9 Af, Africana; AsAi, Asiâtico-Amerindia; E, Europea; Ts, de unién al potenciador CCAAT; KRF-1, sitio de unién Factor ying-yang 1; TEF-1, potenciador de transcripcién factor 1. transicién; Tv, transversién; C/EBP, proteina del factor especifico de queratinocitos 1; YY-1, del factor 1; Oct-1, octâmero de unién para el La posicién nucleotidica 7527 descrita por primera vez, altéré los sitios de unién de la proteina de unién al potenciador CCAAT (C/EBP, CCAAT Enhancer Binding Protein) y Oct-1, la transicién T ^ C en la posicién nucleotidica 7651, afecté al sitio de unién del factor especifico de queratinocitos 1 (KRF-1, Kératinocyte Specific Transcription Factor); la 85 ______________________________________________________________________Resultados transversién A ^ C en posicién 7658 afecté al factor Oct-1; la transversién T ^G en la posicién nucleotidica 7699 altéré los sitios de unién de los factores YY-1 y TEF-1; y cambios en las posiciones 7726 y 7730 alteran los sitios de unién de los factores de transcripcién TEF- 1 y Oct-1, Todos los cambios anteriormente descritos fueron identificados en secuencias asignadas a la rama Africana, con la excepcién de los nuevos cambios en las posiciones nucleotidicas 7527 y 7699, que sélo se observaron en secuencias asignadas a la rama Europea. La sustitucién descrita con mas frecuencia (95,7%) fue la transicién T ^ C en el nucleétido en posicién 7592 que se identificé en muestras asignadas a las tres ramas filogenéticas; y le siguieron con una frecuencia del 91,3%, las transversiones A—>C y A—*T en los nucleétidos en posiciones 7567 y 7670, respectivamente. 4.3.2.3. Comparacién de los polimorfismos en las regiones codificantes de las proteinas E6 v E7 v en la regién reguladora En el anâlisis de las secuencias de las muestras infectadas por VPH18 no se localizaron inserciones o deleciones. Las variantes de la regién codificante de E6 presentaron un mlnimo de dos (0,4%) y un mâximo de nueve cambios de nucleétidos (1,9%) con respecto a la secuencia de referencia; en la regién codificante de E7 las variantes observadas mostraron un mâximo de tres cambios de nucleétidos (0,9%); y en la regién reguladora se identificaron variantes que incluyeron hasta catorce cambios de nucleétidos (3,4%) en los 362 pb estudiados. El numéro medio de sitios con variacién fue de tres sitios en la regién codificante de E6 (media de 3,4 ± 3,4; rango 0-9 mutaciones; p = 0,2), de un sitio en la regién codificante de E7 (media de 1,3 ± 1,5; rango 0-3 mutaciones; p = 1,0) y de seis para la regién reguladora (media de 5,8 ± 4; rango 0-14 mutaciones; p < 0,001). La variabilidad genética total fue significativamente mayor en el fragmento de la regién reguladora estudiada que en los oncogenes virales, ya que se observaron 2 0 sitios con variacién de nucleétidos (5,5%), frente a once sitios con variacién de la regién codificante de E6 (2,3%; p < 0,05) y cuatro cambios de nucleétidos de la regién codificante de E7 (1,3%; p < 0,05). En las regiones E6 y E7 sin embargo, la variabilidad genética fue équivalente (p = 0,5). Todas las posiciones nucleotidicas con cambio que se observaron en las regiones estudiadas fueron compartidas entre las secuencias con algunas excepciones; en la regién codificante de E6 la posicién nucleotidica 467; y en la regién reguladora las posiciones nucleotidicas: 7507, 7527, 7564, 7699. 4.3.2.4. Distribucién de variantes de VPH18 entre los pacientes La distribucién de los patrones descritos en las tres regiones de genoma en el total de muestras infectadas por VPH18, se muestra en la tabla 4.21. Las 46 muestras analizadas en 86 ______________________________________________________________________R esultados este trabajo se distribuyeron: tres muestras en la rama Asiâtico-Amerindia (6,5%), 36 muestras en la rama Europea (78,3%), cuatro muestras en la rama Africana (8,7%) y tres muestras clasificadas como recombinantes (6,5%). Se identificaron seis variantes nuevas en la rama Europea. De las tres muestras asignadas a la rama Asiâtico-Amerindia, ninguna de ellas présenté la secuencia prototipo en las tres regiones estudiadas, y las dos variantes que se identificaron en la rama, presentaron ùnicamente cambios en la regién reguladora. La mayoria de las muestras infectadas por VPH18 se asignaron a la rama Europea, siendo la variante representada por la secuencia SP5876 la mâs frecuente, al identificarse en 13 muestras (28,3%). Le siguieron las variantes representadas por la secuencia SP3418 (15,2%), la secuencia SP4438 (10,9%) y la secuencia SP6015 (8,7%). El resto de variantes incluidas esta rama se identificaron en una ùnica muestra clinica (2,2%). Todas las variantes se definieron con una serie de cambios caracterlsticos en posiciones concretas de las regiones estudiadas que incluyeron; en la regién codificante de E6 las posiciones nucleotidicas 485 y 549; en la regién codificante de E7 un cambio ûnico en la posicién nucleotidica 751, y en la regién reguladora las posiciones nucleotidicas 7567, 7592 y 7670. Sélo en dos variantes pertenecientes a la rama Europea, representadas como SP5126 y SP6270, se produjeron cambios de aminoâcidos (D—>E) en la secuencia que codifica para la proteina E6 , como consecuencia de la mutacién observada en el nucleétido en posicién 314. En la regién codificante de E7, la mutacién observada en las variantes no indujeron cambios de aminoâcidos; y en la regién reguladora de los cambios observados las mutaciones descritas por primera vez en las posiciones nucleotidicas 7527y 7699 alteran los sitios de unién de los factores de transcripcién C/EBP, Oct-1, YYl y TEF-1. Las seis variantes nuevas de VPH18 se describieron en esta rama, de acuerdo con la presencia de algûn cambio en posiciones nucleotidicas no descritas previamente en la bibliografia. Fueron las representadas por las secuencias: SP4286, SP5289, SP3754, SP5126, SP6270 y SP6268, y en todos los casos se observaron en una muestra (2,2%). Las variantes SP4286, SP5289, SP3754 fueron iguales entre ellas en las regiones codificantes de las proteinas E6 y E7, por lo que sélo se diferenciaron en cambios de la regién reguladora. 87 Resultados 1 m 1 I l s o d r i ' f N f N o i t N r J t ^ ' O r j f M r î f S t ï —) t—< r - t r ^ T —< i “ < r O r H r H u u u u U ' U H H U U U u u u < • ■ < < < u u u u < < < u u u u H H H < < ' < < < H H ' e e e e s s e e e s e aôaôoôoôc6j>c6a0o6oôoci w w w w w w w w w w w Q O a O O O O O O O Q O O O O O Q O O O O Or ™ » r H r H r H r H r H T —* r H r H r H r HÙÙÙÙÙÙÙÛÙt ü Ù < < < < < < < < < < < u u u u u u u u u u u ................................................u u u ryrHrHT-4T-4r4rHr f̂4M( ̂vOvOvOvOvO' '̂OvOvOVÔ MWWWWWWWWWW Qooôoôoôoôoôoôoôo&a&ai» T H r H r H r H r H r H r H r H T H r H f HWWWMWWWWMWW \o 00 00 m 4 g I I ICL, pL, k & & p. < < H H U U H H U U U U U U U U U U < < U u • < < < u u u u H H H H W W 00 00 T T < < H H U U < < U u 00 00 r4 rH il H H Oh PL] u < < ■ < < o o ' > u < < ' ' < u u ' u u li i i l l TEF-l/Oct-l TEF-l/Oct-: YY-1/TEF-1 Oct-1 KRF-1 II u il u s 1 “ * w ■S $ II s g ilOct-l/C/EBP g g CL % g "Q I j lifi J3 M (% III lit 5<-ë 88 Resultados Las variantes SP5126, SP6270 y SP6268 se caracterizaron con un cambio nuevo en la region codificante de E6 en las posiciones nucleotidicas 314 y 467, y en el caso de la variante SP6270 ademâs, el cambio en la posicion nucleotidica 7699 de la region reguladora. De las cuatro muestras asignadas a la rama Africana, la variante representada por la secuencia SP5813 incluyô el mayor numéro de muestras (6,5%). Las variantes de esta rama incluyeron el mayor numéro de posiciones nucleotidicas con cambio descritas entre las variantes de VPH18. Las secuencias de la region codificante de E6 incluyeron nueve cambios de nucleôtidos que dieron lugar a dos cambios de aminoâcidos; las secuencias de la region codificante E7 presentaron tres cambios de nucleôtidos que causaron dos cambios de aminoâcidos; y en la region reguladora las variantes identificadas presentaron 13 y 14 cambios con respecto a la secuencia de referencia, que alteraron los sitios de union de los factores de trasncripciôn: KRF-1, Oct-1 y TEF-1. Las variantes de esta rama fueron idénticas en las tres regiones analizadas con la excepciôn de un cambio en la posicion nucleotidica 7529 en la region reguladora, que se observé sélo en la variante representada por la secuencia SP3249. Las tres muestras representadas por las secuencias SP5627, SP6340 y SP5227 fueron consideradas variantes recombinantes de VPH18 debido a que no se asignaron en la misma rama filogenética en las tres regiones estudiadas. La variante SP5627 no présenté cambios en las secuencias de las regiones codificantes de E6 y E7, y en la regién reguladora su secuencia présenté los cambios descritos en las variantes de la rama Europea. En la variante SP6340 los dos cambios que se observaron en las secuencias de las regiones codificantes correspondieron a variantes de la rama Europea, mientras que la secuencia de la regién reguladora no présenté ninguna variacién con respecto a la secuencia de referencia. La variante SP5227 présenté en la regién codificante de E6 y en la regién reguladora, cambios incluidos en las variantes asignadas a la rama Africana, y en la regién codificante de E7 présenté un ûnico cambio en la posicién 751, caracteristico de las variantes pertenecientes a la rama Europea. 4.3.2.5. Distribucién de variantes de VPH18 de acuerdo al estatus VIH-1 v el origen geogrâfico de los pacientes La distribucién global de las variantes de VPH18 identificadas de acuerdo al estatus VIH-1 y el origen geogrâfico de los pacientes (Tabla 4.22), se llevé a cabo comparando variantes Europeas y no Europeas, al agrupar las variantes asignadas a las ramas Asiâtico- Amerindia y Africana con el fin de aumentar la potencia estadistica. En el anâlisis de las variantes identificadas de acuerdo al estatus VIH-1 de los pacientes, se descartaron dos 89 ______________________________________________________________________Resultados pacientes con estatus VlH-1 desconocido, incluyéndose 18 pacientes no infectados por VIH- 1 y 23 pacientes infectados por VIH-1. De acuerdo al origen geogrâfico, se analizaron 26 hombres espafioles y doce hombres procedentes de paises latinoamericanos. Dada la escasa representaciôn de pacientes procedentes de otros paises europeos (N = 4) y de America del Norte (N = 1), estos hombres fueron excluidos del anâlisis. En ambos anâlisis no se tuvieron en cuenta las tres variantes recombinantes de VPH18. Como se indica en la tabla, cuando se compara la distribucién de variantes de acuerdo al estatus VIH-1, tanto en los pacientes infectados como no infectados por VIH-1, las variantes Europeas fueron las mâs prevalentes, y no se observaron diferencias estadisticamente significativas en la distribucién. La prevalencia de las variantes Europeas fue superior tanto en hombres espafioles como en latinoamericanos. Sin embargo, el anâlisis univariado llevado a cabo, indicé que ser un hombre latinoamericano estâ asociado con una prevalencia entre siete y ocho veces mayor de estar infectado con una variante asignada a una rama no europea (OR 8 ,6 ; IC95%;1,3-54,1). Tabla 4.22. Prevalencia y anâlisis univariado de las variantes asignadas a las ramas Europea y no Europeas de VPH18 de acuerdo al estatus VIH-1 y el origen geogrâfico de los pacientes. Estatus VIH-1 Negative Positivo Origen geogrâfico Espana Latinoamérica 41 18 (100) 23 (100) 38 26 (100) 12 (100) Prevalencia V ariantes Puropeas V ariantes N o J uropeas NC'o) N("o) 14 (77,8) 20 (86,9) 24 (92,3) 7 (58,3) p-valor QR(IC95"o) 4 (22,2) 3(13) 2(7,7) 5 (41,7) 0,4399 0,0151 0,52 (0,10-2,72) 8,57(1,35-54,15) 90 R esultados 4.3.3. Anâlisis de variantes de VPH31 El anâlisis de polimorfismos de las secuencias de nucleôtidos se realizô en las 29 muestras en las que se detectô la presencia de ADN de VPH31. La asignaciôn de variantes se basé en la comparaciôn con la secuencia de referencia descrita en el ano 1989 por Goldsborough et al. En el caso de los tipos 16 y 18, se ha llevado a cabo el anâlisis comparativo del genoma de VPH con colecciones de muestras procedentes de diferentes regiones del mundo, lo que ha permitido, mediante el anâlisis de sus relaciones filogenéticas, la asignaciôn a ramas caracteristicas de ciertas regiones geogrâficas. En el resto de tipos de VPH no se ha llevado a cabo este anâlisis filogenético aùn, por tanto las diferentes variantes que se identificaron en este trabajo para VPH31, VPH33 y VPH52, no se asignaron en ramas y /o clases descritas previamente, y solo se clasificaron como secuencias prototipo o no prototipo. Al igual que en VPH16 y VPH18, las diferentes variantes se han denominado mediante el nombre de una secuencia representativa de todas las muestras que presentaban la misma secuencia. 4.3.3.I. Anâlisis filogenético de muestras infectadas por VPH31 En las 29 muestras analizadas, se identificaron nueve secuencias representativas que incluyeron la secuencia prototipo y ocho variantes. La secuencia SP3096 représenté cinco muestras que fueron idénticas a la secuencia prototipo, la secuencia SP4031 représenté nueve muestras, SP6270 incluyé una muestra, SP4473 représenté dos muestras, SP3021 dos muestras, SP4193 incluyé cuatro muestras idénticas, SP3730 fue la représentante de tres muestras, SP3692 para una muestra y SP3400 incluyé dos muestras. Los fenogramas obtenidos del anâlisis filogenético de cada una de las regiones estudiadas se indican en la figura 4.4. La filogenia de las regiones codificantes de E6 y E7 y la regién reguladora LCR nos permitiô distinguir tres posibles ramas o clusters con valores de bootstrap significatives (mayores del 70%). La asignaciôn de las diferentes secuencias representativas de las muestras clinicas analizadas, a las tres ramas observadas, fue igual en las tres regiones del genoma, con la excepcién de la secuencia SP4473. La rama denominada A incluia las secuencias representativas SP4193 y SP3021, con valores de bootstrap del 94%, 93% y 99% en las regiones codificantes de E6 , E7 y reguladora, respectivamente. La rama nombrada B, incluyé en las regiones codicante de la proteina E7 y reguladora, tres secuencias representativas (SP3730, SP3400, y SP3692) y en la regién codificante de la proteina E6 cuatro secuencias, las tres descritas anteriormente y la secuencia SP4473. La rama llamada C 91 R esultados en las tres regiones del genoma analizadas incluyô el resto de las secuencias del présente estudio y la secuencia de referencia o prototipo. E6 94% 86% 86% SP4193 (4) SP3021 (2) SP373G (3) SP4473 (2) H- SP3692 SP3400 (2) ] E7 93% 71% SP6270 SP4031 (9) SP3096 (5) J04353 95% 80% L SP6270 SP4473 (2) SP4031 (9) SP3096 (5) J04353 SP4193 (4) SP3021 (2) SP3730 (3) SP3400 (2) SP3692 ] LCR 99% 95% 86% 98% SP4193 (4) L- SP3021 (2) SP3692 -SP3400(2) SP3730C3) 1 SP6270 SP4473 (2) SP4031 0) SP3CJ96(5) Æ4353 Figura 4.4. Anâlisis filogenético de las 29 muestras caracterizadas como VPH31 en las regiones codificantes de E6 , E7 y la region reguladora (LCR). J04353, secuencia de referencia de VPH31 (Goldsborough et al, 1989). Entre paréntesis se indica el numéro de muestras que comparten la misma secuencia y que han sido simbolizadas por la secuencia representativa. Los numéros situados en las ramas indican los valores de bootstrap may ores del 70%. 92 ______________________________________________________________________Resultados 4.3.3.2. Polimorfismos en las regiones codificantes de las proteinas E6 , E7 y en la region reguladora de VPH31 La designaciôn de los patrones identificados en cada region se denominô con el genotipo de VPH-la region estudiada-nûmero de patron identificado en orden descendente de frecuencia. 4.3.3.2.I. Polimorfismos en la region codificante de la proteina E6 El anâlisis de polimorfismos en la totalidad de la region codificante se indica en la tabla 4.23. Se identificaron cuatro patrones ademâs del patron de la secuencia prototipo, con cambios en posiciones nucleotidicas descritas con anterioridad en la bibliografia. La mayoria de las muestras se asignaron a la secuencia prototipo (51,7%), y le siguiô en frecuencia el patron denominado 31-E6-1 (20,7%). Este patron présenté cinco cambios en las posiciones nucleotidicas: 285(C-^T), 320(A^T), 404(G-^A), 428(A^G) y 520(C^T). El patron 31-E6-2 fue identificado en cinco secuencias (17,2%) y se definiô igualmente con cinco cambios, aunque en las posiciones nucleotidicas: 248(T^C), 297(A—»̂ G), 320(A-^T), 475(A^G) y 520(C—>T). El patron 31-E6-3 se observé en dos muestras (6,7%) y présenté los mismos cambios que el patron 31-E6-2, con la excepciôn del cambio en la posicién 248(T—>C). El patrén 31-E6-4 se observé en una muestra (3,4%) y présenté cinco cambios iguales a los que definieron el patrén 31-E6-2, con la ùnica diferencia de la posicién 261(A->C). Tabla 4.23. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la regién codificante de E6 y frecuencia de los patrones en las 29 muestras de VPH31 analizadas. 2 2 2 2 3 4 4 4 5 4 6 8 9 2 0 2 7 2 8 J _ 5 7 0 4 8 5 0 N % Prototipo T A C A A G A A C 15 51,7 31-E6-1 - - T - T A G - T 6 20,7 31-E6-2 C - - G T - - G T 5 17,2 31-E6-3 - - - G T - - G T 2 6,7 31-E6^ - C - G T - - G T 1 3,4 Los numéros verticales describen la posicion nucleotidica; (-) ausencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo. En la tabla 4.24 se indican los cambios nucleotidicos y proteicos en la regién codificante de E6 , asi como la frecuencia de los mismos. Las variaciones observadas con mâs frecuencia entre las muestras (48,3%) fueron las correspondientes a la transversién A->T en el nucleétido en la posicién 320, y la transicién C—>T en el nucleétido en posicién 520. La mutacién en posicién 320 es una mutacién silenciosa; y la mutacién en el nucleétido 520, 93 R esultados indujo un cambio de Alanina a Valina, ambos aminoâcidos neutros, en el codôn en posicion 138. Seguidas en frecuencia (27,6%) se describieron las transiciones en las posiciones nucleotidicas 297(A-^G) y 475(A^ G), que en ambos casos implicaron cambio de aminoâcido. La primera en el codôn 64, con un cambio de Treonina a Alanina, y la segunda en el codôn 123, con un cambio de Lisina a Arginina. Los cambios descritos en las posiciones nucleotidicas 248(T-^C), 404(G—>A) y 428(A—+G) son considerados mutaciones silenciosas por no inducir cambio de aminoâcido. La transicién de C a T en la posicién 285, se observé en seis muestras (20,7%) e induce un cambio de Histidina a Tirosina en el codôn 60. La transversién A -^C en la posicién 261, sélo se présenté en una muestra (3,4%) y dio lugar a cambio de Isoleucina a Leucina en el codôn 52. Tabla 4.24. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH31 en la region codificante de E6 de acuerdo con la posicion nucleotidica, nucleotido, aminoâcido, codôn y tipo de mutacion. Re g io n E6 m m m m ■ B 248 T C F - 47 Ts,S 5 17,2 261 A C I L 52 Tv, Ms 1 3,4 285 C T H Y 60 Ts, Ms 6 20,7 297 A G T A 64 Ts, Ms 8 27,6 320 A T S - 71 Tv,S 14 48,3 404 G A L - 99 Ts,S 6 20,7 428 A G Q - 107 Ts,S 6 20,7 475 A G K R 123 Ts, Ms 8 27,6 520 C T A V 138 Ts, Ms 14 48,3 Ts, transicién; Tv, transversién; Ms, cambio con sentido; S, mutacién silenciosa 4.3.3.2.2. Polimorfismos en la regién codificante de la proteina E7 El estudio de la secuencia compléta de la regién codificante de E7, permitiô définir cinco patrones, indicados en la tabla 4.25. De la misma forma que en la regién codificante de E6 , las posiciones nucleotidicas con mutacién ya habian sido descritas en la bibliografia. El patrén mayoritario fue 31-E7-1, que se identificé en once muestras (37,9%) e incluyé un cambio ûnico en la posicién nucleotidica 743(A^G). Con la misma frecuencia (20,7%) se identificaron los patrones 31-E7-2 y 31-E7-3 que contenian tres cambios comunes en las posiciones nucleotidicas 670, 695 y 743, y un cambio especifico en el nucleétido en la posicién 626, en el patrén 31-E7-3. La secuencia prototipo se présenté en cinco muestras (17,2%); y el patrén 31-E7-4 (4,2%) que se definié con dos cambios en las posiciones nucleotidicas 626(C—►T) y 743(A—̂G), se identificé en una secuencia (3,4%). 94 Resultados Tabla 4.25. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la region codificante de E7 y frecuencia de patrones en las 29 muestras de VPH31 analizadas. 6 6 6 7 2 7 9 4 6 0 5 J _____ N % Prototipo C C G A 5 17,2 31-E7-1 - - - G 11 37,9 31-E7-2 - T A G 6 20,7 31-E7-3 T T A G 6 20,7 31-E7-4 T - - G 1 3,4 Los nûmeros verticales describen la posicion nucleotidica; (-) ausencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo. Las mutaciones identificadas en la region codificante de E7 y la frecuencia de las mismas se indican en la tabla 4.26. El cambio mâs importante, al observarse en todos los patrones, correspondié a la transicién A—+G en la posicién 743, e indujo el cambio de un aminoâcido bâsico (Lisina) a un aminoâcido âcido (Âcido Glutâmico) en el codén 62. Le siguieron con una frecuencia del 41,4%, las transiciones C-^T y G—»A en las posiciones nucleotidicas 670 y 695 repectivamente; la primera dio lugar a una mutacién silenciosa y la segunda indujo el cambio de Âcido Glutâmico a Lisina. Por ultimo, la transicién C—►T en el nucleétido 626 que se identificé en siete muestras (24,1%), indujo el cambio de Histidina a Tirosina en el codén 23. Aunque la presencia de mutaciones con cambio de aminoâcido fue mayor en la regién codificante de E7 (75%) que en la regién codificante de E6 (55,5%), estas diferencias no resultaron estadisticamente significativas (p = 0,9). Tabla 4.26. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH31 en la région codificante de E7 de acuerdo con la posicion nucleotidica, nucleétido, aminoâcido, codôn y tipo de mutacién. E7 626 C T H Y 23 Ts, Ms 7 24,1 670 C T V - 37 Ts,S 12 41,4 695 G A E K 46 Ts, Ms 12 41,4 743 A G K E 62 Ts, Ms 24 82,8 Ts, transicion; Tv, transversién; Ms, cambio con sentido; S, mutacién silenciosa. 4.3.3.2.3. Polimorfismos en la regién reguladora El anâlisis de 433 pb en la regién reguladora, nos permitié identificar cuatro patrones ademâs de la secuencia de referencia (Tabla 4.27). 95 Resultados La secuencia prototipo fue la mâs frecuente al localizarse en 17 muestras (58,6%), seguida de los patrones 31-LCR-l y 31-LCR-2 que se presentaron con la misma frecuencia (13,8%). El patron 31-LCR-l se definiô con diez cambios en las posiciones nucleotidicas: 7449(G^A), 7457(G^A), 7474(C-^T), 7515(C—A), 7525(G-^A), 7533(C^T), 7575(T^C), 7642(C—»A), 7707(A^G) y 7749(A^C), y el patron 31-LCR-2 présenté nueve cambios en las posiciones: 7449(G^A), 7450(A^C), 7457(G-+A), 7474(C—T), 7506(C->T), 7525(G^A), 7575(T—>C), 7710(C—>T) y 7754(C—>A). El patrén 31-LCR-3, identificado en dos muestras (6,9%), presento los mismos cambios que el patrén 31-LCR-l y uno mâs en la posicién nucleotidica 7659(T-^G), siendo el patrén mâs divergente con respecto a la secuencia prototipo al presentar once cambios. El patrén 31-LCR-4, observado en dos secuencias (6,9%), présenté los mismos cambios que el patrén 31-LCR-2 y un cambio adicional localizado en el nucleétido 7534(C^T) no descrito anteriormente, de forma que fue considerado nuevo. Tabla 4.27. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la region reguladora estudiada y frecuencia de los patrones en las 29 muestras de VPH31 analizadas. ■ ■ ■ ■ 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 6 6 7 7 7 7 4 5 5 7 0 1 2 3 3 7 4 5 0 1 4 5 9 0 7 4 _6 5 5 3 4* _5_ 2 _9_ 7 0 9 4 N % Prototipo G A G C C C G T C T C T A C A C 17 58,6 31-LCR-l A - A T - A A C - C A - G - C - 4 13,8 31-LCR-2 A C A T T - A - - C - - - T - A 4 13,8 31-LCR-3 A - A T - A A C - C A G G - C - 2 6,9 31-LCR-4 A C A T T - A - T C - - - T - A 2 6,9 Los nûmeros verticales describen la posicion nucleotidica; (-) ausencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo; (*) posicion con cambios descritos por primera vez y en negrita patrones descritos por primera vez. En esta regién se identificaron im total de 16 mutaciones en la secuencia de nucleétidos, que se indican en la tabla 4.28. Las mutaciones que podian afectar a sitios de unién para factores de transcripcién incluyeron las transiciones en las posiciones nucleotidicas: 7449(G^A), 7474(C^T), 7534(C->T) y la transversién en el nucleétido 7659(T->G). Las transiciones en las posicién 7449 y la descrita por primera vez 7534, dan lugar a la alteracién de un sitio de unién de la regién déterminante del sexo, cromosoma Y (SRY, Sex Determining Region Y); la transicién en la posicién 7474 se asocié con un cambio en un sitio de unién de la proteina viral E2; y la mutacién en posicién 7659 afecté a un sitio de unién de C/EBP y la proteina SRY. Estos cambios se identificaron en el 41,4% de las 96 Resultados muestras estudiadas, excepto los detectados en las posiciones 7534 y 7659 que se identificaron en el 6,9% de las muestras estudiadas. El resto de mutaciones observadas en esta region, no se asocian con alteraciones en sitios de union de factores de transcripcién; y las mâs frecuentes (41,4%) fueron las que incluyeron las posiciones nucleotidicas 7457, 7525, 7575 y 7642. Tabla 4.28. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH31 en la région reguladora estudiada de acuerdo con la posicién nucleotidica, nucleétido, sitio de union, y tipo de mutacién. LCR 7449 G A SRY Ts 12 41,4 7450 A C - Tv 6 20,7 7457 G A - Ts 12 41,4 7474 C T E2 Ts 12 41,4 7506 C T - Ts 6 20,7 7515 C A - Tv 6 20,7 7525 G A - Ts 12 41,4 7533 T C - Ts 6 20,7 7534 C T SRY Ts 2 6,9 7575 T C - Ts 12 41,4 7642 C A - Tv 12 41,4 7659 T G SRY, G/EBP Tv 2 6,9 7707 A G - Ts 6 20,7 7710 C T - Ts 6 20,7 7749 A C - Tv 6 20,7 7754 C A - Tv 6 20,7 Ts, transicién; Tv, transversién; SRY, Regién déterminante del sexo del cromosoma Y; E2, proteina viral E2; C/EBP, proteina de unién al potenciador CCAAT. 4.3.S.3. Comparacién de los polimorfismos en las regiones codificantes de las proteinas E6 y E7 y en la regién reguladora En las secuencias analizadas no se localizaron deleciones o inserciones. Las variantes de la regién codificante de E6 observadas en este trabajo presentaron im minimo de cuatro cambios (0,9%) y un mâximo de cinco cambios de nucleétidos (1,1%) con respecto a la secuencia de referencia; en la regién codificante de E7, las variantes se definieron con un minimo de un cambio de nucleétido (0,3%) hasta un mâximo de cuatro cambios de nucleétidos (1,3%), y en la regién reguladora se definieron variantes que presentaron entre nueve (2,1%) y once cambios de nucleétidos (2,5%). En las variantes, la media mâs baja de variaciones puntuales con respecto a la prototipo fue la regién codificante de E7 (media de 2 ± 1,6; rango 0-4 mutaciones; p = 0,4); seguida de la regién codificante de E6 (media de 3,8 ± 97 Resultados 3,2; rango 0-5 mutaciones; p = 0,05) y en ultimo lugar la region reguladora (media de 8 ± 4,5; rango 0-11 mutaciones; p < 0,05). La variabilidad genética total de la region codificante de E6 con respecto a la region de reguladora fue menor, al describirse nueve posiciones con cambio (2 %) frente a 16 posiciones con cambios (3,7%) en el total de pares de bases analizadas para cada region (p = 0,19). En la region codificante de E7 y con respecto a la region reguladora, la variabilidad fue también menor, al presentarse cuatro cambios en 296 pb (p = 0,09). La variabilidad genética en las regiones codificantes de E6 y E7 fue équivalente (p = 0,7). En el anâlisis de los polimorfismos de tres regiones, todas las mutaciones identificadas en las secuencias fueron compartidas por otras secuencias, con la excepciôn de la posicion nucleotidica 261. 4.3.3 4. Distribucién de variantes de VPH31 entre los pacientes En la tabla 4.29 se indican las variantes identificadas en las 29 muestras infectadas por VPH31; cinco muestras representadas por la secuencia SP3096 fueron clasificadas como prototipo en las tres regiones estudiadas (17,2%); y 24 muestras fueron clasificadas como variantes no prototipo (82,8%). La variante representada por la secuencia SP4031 fue la mâs prevalente (31%), e incluia un cambio ûnico en la regién codificante de E7. La variante representada por la secuencia SP4193 se observé en cuatro muestras (13,8%), la variante representada por la secuencia SP3730 en tres muestras (10,3%); las variantes representadas por las secuencias SP4473, SP3400 y SP3021 se identificaron cada una en dos muestras (6,9%) y las variantes representadas por las secuencias SP3692 y SP6270 en una muestra (3,4%). Las variantes SP3021 y SP4193 fueron iguales en las tres regiones analizadas con la excepcién de un cambio adicional descrito en la posicién nucleotidica 7659 de la regién reguladora en la variante SP3021, que afecté al sitio de unién del factor de transcripcién C/EBP y la proteina SRY. De la misma forma, las variantes representadas por las secuencias SP3692 y SP3730 fueron iguales con la excepcién de un cambio en la regién codificante de E6 , en posicién nucleotidica 261 en las muestras con la secuencia SP3692, y en posicién 248 en la variante representada por la secuencia SP3730. En las muestras estudiadas sélo se describié una variante nueva: SP3400; debido a la presencia de una mutacién en el nucleétido 7534 de la regién reguladora, no descrita previamente y que produjo la alteracién en el sitios de unién de la proteina SRY. 98 Resultados ■o I O T3 <8 g R o R s, II s ir r-, - t u ir — -c < < H H U U H ' < < H H H H < < U U < < < ' • ■ U U H ' ' ' U a ■ u ' I < < u u u ' u u < < < ' < < E-H . . H H H < < < U - • < < < o o o es O ent t f ggt ggg o o o o i-i u2££5? £ S en în ■ HB ■ o o u ü U u O ü w H , . , < < • < < < W . , , H t—' ' H H H f M . ■ H H H ■ H ■ ■ X -H. >N §,r-iT| 1 1 Ü U Ü Ü - ■ . 1 . 1 ' ' • U U ■ ' ■ < < 1 1 1 f-H H H H H H 1 1 1 O U Ü U • ■ ■ ■ ' H H u - ' - ■ ■ I I . ■ u u • ■ C l . C l c C L i f ^ ' t f ^ e N r H r H K0 \0 \6 \6 NO- O W W M W W W p rH rH rH r - t rH rH CD fO e n CD CO CD ÇNI CD O rH CD 3 ^ R 8 S 2 S 2 £ 2 SRY/C-EBP SRY E2 SRY I S. 99 Resultados En las variantes no prototipo descritas en este trabajo, se observaron una serie de posiciones nucleotidicas con cambios comunes a todas. En la region codificante de E6 fueron las posiciones nucleotidicas 320 y 520, aunque solo esta ultima produjo un cambio de Alanina a Triptôfano; en la region codificante de E7 fue la posicion 743 que dio lugar al cambio de Lisina a Âcido Glutâmico; y en la region reguladora fueron cinco las posiciones nucleotidicas caracteristicas (7449, 7457, 7474, 7525 y 7575), aunque solo los cambios en 7449, 7474 y 7534 afectaron a los sitios de union del factor de transcripcién SRY y de la proteina viral E2, respectivamente. Las variantes de VPH31 descritas en este trabajo presentaron entre dos y cuatro cambios de aminoâcidos en la regién codificante de E6 ; dos y tres cambios en la regién codificante de E7; y en la regién reguladora se alteraron los sitios de unién de dos y tres factores de transcripcién, como se ha descrito anteriormente. 4.3.3 5. Distribucién de variantes de VPH31 de acuerdo al estatus VIH-1 v el origen geogrâfico de los pacientes En la tabla 4.30 se muestra la distribucién global de las variantes de VPH31, asignadas como prototipo o no prototipo, de acuerdo al estatus VIH-1 y el origen geogrâfico de los pacientes. El anâlisis de las variantes se llevé a cabo en 16 pacientes infectados por VIH-1 y once pacientes no infectados por VIH-1; dos pacientes en los que no se teruan datos de la infeccién fueron excluidos del anâlisis. De acuerdo con el origen geogrâfico de los hombres incluidos en el estudio, 2 2 eran espafioles y seis procedian de paises latinoamericanos. Un paciente de origen europeo distinto al espahol, fue excluido del anâlisis. Tabla 4.30. Prevalencia y anâlisis univariable de las variantes asignadas como prototipo y no prototipo de VPH31 de acuerdo al estatus VIH-1 y el origen geogrâfico de los pacientes. Estatus VIH-1 Negative 27 11 (100) 3 (27,3) 8 (72,7) 0,3356 1 Positivo 16 (100) 2(12,5) 14 (87,5) 2,62 (0,35-19,18) Origen geogrâfico Espana 28 22(100) 4 (18,2) 18 (81,8) 0,9311 1 Latinoamérica 6(100) 1 (16,7) 5 (83,3) 1,11 (0,10-12,30) Las variantes no prototipo fueron mayoritarias tanto en los pacientes infectados como no infectados por VIH-1, y no se observaron diferencias estadisticamente significativas en su distribucién, ni en el anâlisis univariable de la infeccién por variante prototipo vs. no prototipo. Se observé el mismo patrén en cuanto a la variable origen 100 Resultados geogrâfico, siendo las variantes no prototipo mayoritarias entre los hombres espafioles y latinoamericanos y no se observaron diferencias estadisticamente significativas en el anâlisis univariable. 4.3.4. Anâlisis de variantes de VPH33 El estudio de los polimorfismos se realizô en el total de 22 muestras caracterizadas como VPH33. Para la asignaciôn de variantes se empleô como referencia el primer aislado secuenciado de VPH33 (Cole et al., 1989). 4.3 4.1. Anâlisis filogenético de muestras infectadas por VPH33 Los fenogramas obtenidos del anâlisis de cada una de las regiones estudiadas se indican en la figura 4.5 E 6 E7 SP4510 ■*' SP4844 SP3814 (5) SP6333 SP5140(2) SP6171 SP5818 SP4570 SP3139 (8) -----SP4048 M127J2 h ;SP5140 (2) SP3614 (5) SP4844 SP4510 S P3139 (8) SP5818 SP4046 SP6171 SP4570 SP6333 M1273? LCR 98% SP4510 — S P3614 P ) SP4570 — SP5818 S P4046 S P5140 (2) S P6333 - SP6171 - S P4844 SP3139 (8) M12732 Figura 4.5. Anâlisis filogenético de las 22 muestras caracterizadas como VPH33 en las regiones codificantes de E6, E7 y la region reguladora (LCR). M12732, secuencia de referencia de VPH33 (Cole et al., 1989). Entre paréntesis se indica el numéro de muestras que comparten la misma secuencia y que han sido simbolizadas por la secuencia representativa. Los nûmeros situados en las ramas indican los valores de bootstrap may ores del 70%. 101 ______________________________________________________________________ Resultados El anâlisis filogenético se llevô a cabo en diez secuencias representativas de las 22 muestras de VPH33 analizadas. La secuencia denominada SP3139 representô ocho muestras que fueron idénticas en su secuencia con la secuencia prototipo, la secuencia SP3614 representô cinco muestras, SP5140 representô dos muestras y el resto representaban muestras individuates. El anâlisis filogenético en las regiones codificantes de E6 y E7 permitiô la clasificaciôn de las secuencias representativas en dos posibles ramas o clusters, con valores de bootstrap significativos. Este hecho no se observô al analizar la regiôn reguladora LCR. La asignaciôn de las diferentes secuencias a las dos ramas en las regiones codificantes fue idéntica, a excepciôn de la secuencia SP6333. La rama A estaba constituida por las secuencias representativas SP4510, SP4844, SP3614 y SP5140; y la rama B incluia el resto de secuencias. Los valores de bootstrap obtenidos fueron del 86% en la regiôn codificante de E6 y del 85% en la regiôn codificante de E7. 4.3.4.2. Polimorfismos en las regiones codificantes de las proteinas E6, E7 v en la regiôn reguladora de VPH33 La denominaciôn de los diferentes patrones identificados en las 22 muestras infectadas por VPH33 ha sido la misma que la empleada para VPH31. 4.3.4.2.I. Polimorfismos en la regiôn codificante de la proteina E6 El estudio de los 449 pb del gen e6 nos permitiô définir tres patrones ademâs del patrôn prototipo, en los que se identificaron un total de cinco cambios en la secuencia de nucleôtidos en posiciones tanto descritas como no descritas (Tabla 4.31). Tabla 4.31. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la regiôn codificante de E6 y frecuencia de variantes en las 22 muestras de VPH33 analizadas. 2 3 3 3 4 1 3 4 6 8 3 8* 6* 4 0 N % Prototipo A G A A A 11 50 33-E6-1 C - - C T 8 36,4 33-E6-2 C - - - - 2 9,1 33-E6-3 - A T - - 1 4,5 Los nûmeros verticales describen la posicion nucleotidica; (-) ausencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo; (*) posicién con cambios descritos por primera vez; en negrita se indican los patrones descritos como nuevos. La secuencia prototipo fue la mâs frecuente (50%). A continuaciôn se observô el patrôn denominado 33-E6-1 en ocho muestras (36,4%) que incluyô tres cambios en las posiciones nucleotidicas: 213(A^C), 364(A^C), 480(A^T). El patrôn 33-LCR-2 se identificô en dos muestras (9,1%) y presentô un cambio ûnico en la posiciôn nucleotidica 213(A—>C). 102 ______________________________________________________________________ Resultados Se definiô como nuevo el patrôn denominado 33-LCR-3, que se observô en una ùnica secuencia (4,5%), y presentô dos posiciones nucleotidicas con cambios no descritos previamente; la posiciôn 338(G^A) y la posiciôn 346(A-»T). En la tabla 4.32 se indican las posiciones nucleotidicas y proteicas con mutaciôn descritas en la regiôn codificante de E6, asi como la frecuencia de las mismas. Todas las mutaciones observadas dieron lugar a cambio de aminoâcido, con la excepciôn de la transversiôn A-^^T de la posiciôn nucleotidica 480. La transversiôn A-^C en el nucleôtido en posiciôn 213 que dio lugar a un cambio de un aminoâcido con carga positiva (Lisina) a neutro (Asparagina), fue la mutaciôn que se observô con mâs frecuencia (45,5%) en la muestras estudiadas; le siguiô la transversiôn A->C en la posiciôn 364 (36,4%), que indujo un cambio de Asparagina a Tirosina en el codôn 86 y que se detectô en el 36,4% de la muestras. Las mutaciones nuevas de las posiciones nucleotidicas 338 y 346 dieron lugar a cambios en los aminoâcidos en posiciones 77 y 80. Tabla 4.32. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH33 en la regiôn codificante de E6 de acuerdo con la posiciôn nucleotidica, nucleôtido, aminoâcido, codôn y tipo de mutaciôn. E6 213 A C K N 35 Tv, Ms 10 45,5 338 G A R K 77 Ts, Ms 1 4,5 346 A T N Y 80 Tv, Ms 1 4,5 364 A C N H 86 Tv, Ms 8 36,4 480 A T R - 124 Tv,S 8 36,4 Ts, transicion; Tv, transversiôn; Ms, cambio con sentido; S, mutaciôn silenciosa. 4.3.4.2.2. Polimorfismos en la regiôn codificante de la proteina E7 El estudio de los polimorfismos de la secuencia de la regiôn codificante de E7, nos permitiô identificar tres patrones y la secuencia prototipo (Tabla 4.33). El patrôn mayoritario correspondiô a la secuencia prototipo, que se detectô en doce muestras (54,4%). El patrôn denominado 33-E7-1 fue identificado en siete muestras (31,8%) y se definiô por presentar dos cambios en las posiciones nucleotidicas 737(A^G) y 862(A-^T). El patrôn 33-E7-2 fue identificado en dos secuencias (9,1%) que presentaron un cambio ûnico en la posiciôn 862(A^T). El patrôn 33-E7-3, con una ûnica variaciôn en la posiciôn 608(T-^G), fue descrito en una secuencia (4,5%). 103 Resultados Tabla 4.33. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la region codificante de E7 y frecuencia de variantes en las 22 muestras de VPH33 analizadas. 6 7 8 0 3 6 8 __ 7 2 N % Prototipo T A A 12 54,4 33-E7-1 - G T 7 31,8 33-E7-2 - - T 2 9,1 33-E7-3 G - - 1 4,5 Los numéros verticales describen la posiciôn nucleotidica; (-) ausencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo. Las implicaciones a nivel de cambios en la secuencia de proteinas de las mutaciones detectadas en la region codificante de E7, asi como la frecuencia de las mismas se muestran en la tabla 4.34. Solo la transversion A ^ T en el nucleôtido 862, identificada en nueve muestras (40,9%), dio lugar a un cambio de aminoâcido polar a apolar (Glutamina a Leucina) en el codôn 97. Tabla 4.34. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH33 en la regiôn codificante de E7 de acuerdo con la posiciôn nucleotidica, nucleôtido, aminoâcido, codôn y tipo de mutaciôn. E7 608 T G V - 12 Tv,S 1 4,5 737 A G V - 55 Ts,S 7 31,8 862 A T Q L 97 Tv, Ms 9 40,9 Ts, transiciôn; Tv, transversiôn; Ms, cambio con sentido; S, mutaciôn silenciosa. 4.3.4.2.S. Polimorfismos en la regiôn reguladora El anâlisis de polimormismos en la regiôn reguladora nos permitiô identificar siete patrones diferentes, en base a cambios en 13 posiciones de nucleôtidos y una deleciôn de un secuencia en tândem de 79 pares de bases a partir del nucleôtido 7596 (Tabla 4.35). Los patrones descritos presentaron cambios en posiciones nucleotidicas que ya habian sido definidas previamente en la bibliografia, con la excepciôn de dos posiciones que definieron un patrôn nuevo: 33-LCR-3. El patrôn prototipo fue el mâs frecuente al localizarse en ocho aislados (36,4%). Le siguiô el patrôn 33-LCR-l, que se observô en siete secuencias (31,8%) y que presentô cambios en siete posiciones: 7704(T^A), 7422(G—>T), 7443(C—»T), 7454(G—>A), 7535(G-^A), 7537(C-+A), 7732(C—>G) ademâs de la deleciôn. Este patrôn fue el ûnico en el que se identificô la deleciôn descrita anteriormente. El patrôn 33-LCR-2 presentô cuatro cambios en 104 Resultados las posiciones: 7422(G^T), 7424(A^G), 7436(A—►G), 7481(T—>G) y se localizô en dos muestras (9,1%). El patron 33-LCR-3, se caracterizô como nuevo, ya que en los cuatro cambios que lo definian, las posiciones 7541(G—>A) y 7772(C-^T) eran observadas por primera vez. El resto de los patrones descritos en la region (33-LCR-4, 33-LCR-5, 33-LCR-6 y 33-LCR-7), se caracterizaron por presentar cambios en una ûnica posiciôn nucleotidica y fueron identificados en secuencias individuales (4,5%). Tabla 4.35. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la regiôn reguladora estudiada y frecuencia de variantes en las 22 muestras de VPH33 analizadas. ■ ■ ■ ■ 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 D 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 7 7 7 0 2 2 3 4 5 8 3 3 4 8 3 7 9 4 2 4 6 3 4 1 5 7 1* 4 2 2* pb N % Prototipo T G A A C G T G C G G C C 8 36,4 33-LCR-l A T - - T A - A A - - G - + 7 31,8 33-LCR-2 - T G G - - G - - - - - - - 2 9,1 33-LCR-3 - T - - - - - A - A - - T - 1 4,5 33-LCR-4 - - - - - - - A - - - - - - 1 4,5 33-LCR-5 - - - - - C - - - - - - - - 1 4,5 33-LCR-6 - - - - - - - - - - A - - - 1 4,5 33-LCR-7 - T - - - - - - - - - - - - 1 4,5 Los nûmeros verticales describen la posiciôn nucleotidica; (-) ausencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo; (+) presencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo; (*) posiciôn con cambios descritos por primera vez y en negrita los patrones descritos por primera vez; D79pb, deleciôn de 79 pares de bases. Las posiciones nucleotidicas con cambio y la frecuencia de los mismos en la regiôn reguladora se indican en la tabla 4.36. El cambio que se detectô con mâs frecuencia entre las secuencias (50%) fue la transversiôn G—>T del nucleôtido en posiciôn 7422, y le siguiô la transiciôn G—>A del nucleôtido en posiciôn 7535 que se detectô en nueve muestras (40,9%). La mutaciôn en el nucleôtido 7422 afectô al sitio de uniôn del factor de transcripciôn SRY, y la mutaciôn en la posiciôn nucleotidica 7535 no afectô al sitio de uniôn de ningûn factor de transcripciôn. Se describieron siete mutaciones mâs en la secuencia de nucleôtidos que implicaban alteraciones en los sitios de uniôn de factores de transcripciôn. Los cambios en las posiciones nucleotidicas 7443 y 7732 se identificaron en siete muestras (31,8%), y afectaron a los sitios de uniôn de la proteina SRY y el factor estimulante aguas arriba (USE, Upstream Transcription Factor). De la misma manera, los cambios en las posiciones 7424 y 7436, présentes en dos muestras (9,1%), afectaron a la uniôn de los factores de transcripciôn SRY y C/EBP, respectivamente. El cambio descrito en la posiciôn nucleotidica 7481(T—>G), 105 Resultados que se identificô en dos muestras afectô al sitio de uniôn de los factores de transcripciôn C/EBP y YYl. La deleciôn descrita en esta regiôn, supuso la pérdida de un sitio de uniôn de los factores de transcripciôn c-Myb y SRY. Tabla 4.36. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH33 en la regiôn reguladora estudiada de acuerdo con la posiciôn nucleotidica, nucleôtido, sitio de uniôn, y tipo de mutaciôn. LCR 7404 T A - Tv 7 31,8 7422 G T SRY Tv 11 50,0 7424 A G SRY Ts 2 9,1 7436 A G C/EBP Ts 2 9,1 7443 C T SRY Ts 7 31,8 7454 G A,C - Ts, Tv 7,1 31,8; 4,5 7481 T G C/EBP; YY-1 Tv 2 9,1 7535 G A - Ts 9 40,9 7537 C A - Tv 7 31,8 7541 G A - Ts 1 4,5 7584 G A - Ts 1 4,5 7732 C G USF Tv 7 31,8 7772 C T - Ts 1 4,5 D7596 - 79pb c-Myb, SRY 7 31,8 Ts, transiciôn; Tv, Transversiôn; C/EBP, proteina de uniôn al potenciador CCAAT; YY-1, Factor ying-yang 1; SRY, Regiôn Y Déterminante del Sexo; USF, Factor estimulador corriente arriba. 4.3 4.3. Comparaciôn de los polimorfismos en las regiones codificantes de las proteinas E6 v E7 v en la regiôn reguladora Como ya se ha indicado, en las secuencias analizadas no se localizaron inserciones, aunque si una deleciôn en tandem de 79 pb en la regiôn reguladora que en el estudio de la variabilidad de la regiôn fue considerada como un cambio. Las variantes de la regiôn codificante de E6 identificadas presentaron desde un nucleôtido (0,2%) hasta un mâximo de tres nucleôtidos mutados (0,7%) con respecto a la secuencia de referencia; en la regiôn codificante de E7 las variantes se definieron por presentar desde un cambio de nucleôtido (0,3%) hasta un mâximo de dos cambios (0,7%) en los 293 pb de la secuencia analizada; y el estudio de las 541 pb de la regiôn reguladora nos permitiô identificar variantes que incluyeron desde un cambio en la secuencia de nucleôtidos (0,2%) hasta un mâximo de ocho cambios de nucleôtidos en la secuencia (1,5%). El numéro medio de sitios con variaciôn en la regiôn codificante de E6 fue de dos (media de 1,5 ± 1,3; rango 0-3 mutaciones; p = 0,4), un ûnico sitio en el caso de la regiôn 106 ______________________________________________________________________Resultados codificante de E7 (media de 1 ± 0,8; rango 0-2 mutaciones; p = 1,0) y en la region reguladora fue de très sitios (media de 2,5 ± 2,6; rango 0-8 mutaciones; p = 0,2). La variabilidad genética total fue significativamente mayor en la region reguladora que en los oncogenes virales, 92 sitios con variacion en 541 pb estudiadas (17%), comparado con cinco sitios de variacion en la region codificante de E6 (p < 0,05), y très cambios en la region codificante de E7 (p < 0,05). Al comparar la variabilidad genética en las regiones codificantes de E6 y E7, los datos obtenidos nos permitieron describirla como équivalente (p = 0,8). En las region codificantes de E6 y E7 las posiciones nucleotidicas 338, 348 y 608 fueron ûnicas entre las variantes al no ser compartidas entre ellas. En la region reguladora se identificaron las posiciones nucleotidicas 7454, 7541, 7584 y 7772. 4.3.4.4. Distribuciôn de variantes de VPH33 entre los pacientes La distribuciôn global de los patrones identificados en cada region nos permitiô asignar ocho muestras como variante prototipo (36,4%) y 14 muestras como variantes no prototipo (63,6%), como se indica en la tabla 4.37. La variante representada con la secuencia SP3139 fue la mas frecuente (36,4%) e incluyô la secuencia prototipo en las très regiones analizadas. La variante representada con la secuencia SP3614 se identified en cinco muestras (22,7%) y la variante representada con la secuencia SP5140 en dos muestras (9,1%). El resto de variantes descri tas (SP6171, SP5818, SP4570, SP4046, SP4510, SP4844 y SP6333) se identificaron en muestras individuales. Se identificaron dos variantes nuevas representadas por las secuencias: SP4046 y SP5818. La variante SP4046 de acuerdo a los cambios descritos en la region codificante de E6, y la variante SP5818 de acuerdo a dos cambios descritos por primera vez en la region reguladora y que no afectaron a los sitios de union de ningûn factor de trasncripciôn. En las variantes identificadas en este trabajo, la region codificante de E6 présenté cuatro posibles cambios de aminoâcidos. En la nueva variante representada por la secuencia SP4046 los cambios de Arginina a Lisina y Asparagina a Tirosina, y en las variantes representadas por las secuencias SP3614, SP4510, SP4844 y SP6333 los cambios asociados con el patron identificado que incluian: un cambio de Lisina a Asparagina y un cambio de Asparagina a Histidina. En la région codificante de E7 solo se describiô un cambio de aminoâcido (Q—>L) que presentaron las variantes representadas por las secuencias SP5140, SP3614, SP4510 y SP4844. 107 Resultados ï I I T3s s 0 1 I i ■d î lo m m lo r-t m f (Q Ita I ■d & 3 i • I + + + I ■ i < u • > 0 0 I ê I 'd 0 •s 1 a ° I i O i n W r H t N - ' f r H r - l v O t ^ t â Sgâ à â â â â ■ ' • • H ' H H H ■ ■ • • • 0 • U • - ■ ■ • - • • • • ■ • Ü 0 0 0 0 0Cl, CL CL CL Cl y, z (Q (0 108 ______________________________________________________________________R esultados La region reguladora se caracterizô por la presencia o no de la deleciôn de 79 pb. Las variantes representadas por las secuencias SP4570, SP3614 y SP4510 incluyeron el total de siete muestras en las que se identificô la deleciôn (31,8%) que se asociô con un patrôn caracteristico que incluyô la alteraciôn de hasta cuatro sitios de uniôn de factores de transcripciôn en la posiciones nucleotidicas: 7404, 7422, 7443, 7732. Entre las variantes que no presentaron la deleciôn, la secuencia representativa SP5140 incluyô un patrôn con très sitios de uniôn a factores de transcripciôn alterados (SRY, C/EBP y YY-1); y en la variante representada por la secuencia SP6333 sôlo se observô un posible cambio (SRY). 4.3.4.5. Distribuciôn de variantes de VPH33 de acuerdo al estatus VIH-1 y el origen geogrâfico de los pacientes El anâlisis de la distribuciôn de las variantes de VPH33 identificadas de acuerdo al estatus VIH-1 y al origen geogrâfico de los pacientes se muestra en la tabla 4.38. De las 22 muestras analizadas, nueve pertenecian a pacientes no infectados por VIH-1 y 13 pacientes infectados por VIH-1. Con respecto al origen geogrâfico de los pacientes, 16 muestras eran de hombres espanoles, cinco de hombres procedentes de un pais latinoamericano, y una pertenecia a un paciente portugués, aunque esta ultima fue excluida del anâlisis. De acuerdo con el estatus VIH-1 de los pacientes, la distribuciôn de variantes prototipo entre los pacientes no infectados e infectados por VlH-1 fue similar; siendo las variantes no prototipo las mâs prevalentes. Una distribuciôn similar, se observô de acuerdo al origen geogrâfico de los pacientes, y tanto en los pacientes de origen espaûol como latinoamericano fueron las variantes no prototipo las mâs prevalentes. Tal y como se observa en la tabla, no se observaron diferencias estadisticamente significativas en la distribuciôn de las variantes, ni en el anâlisis univariable de la infecciôn de la variante prototipo vs. no prototipo de acuerdo al estatus VIH-1 de los pacientes. El anâlisis de la distribuciôn de acuerdo al origen geogrâfico, todas las variantes prototipo se identificaron en pacientes de origen espanol. Tabla 4.38. Prevalencia de las variantes asignadas como prototipo y no prototipo de VPH33 de acuerdo al estatus VIH-1 y el origen geogrâfico de los pacientes. Estatus VIH-1 22 Negativo 9 (100) 4 (44,4) 5 (55,5) Positivo 13 (100) 4 (30,8) 9 (69,2) Origen 21geogrâfico Espana 16 (100) 7(43,7) 9 (56,3) Latinoamérica 5 (100) - 5(100) p-vdlor O R (IC95^’ ü) 0,5132 11,8 (0,30-10,51) 109 ______________________________________________________________________Resultados 4.3.5. Anâlisis de variantes de VPH52 Del total de 25 muestras de pacientes HSH infectados por VPH52, el anâlisis de polimorfismos se llevô a cabo en 22 muestras. En una muestra no se disporua de suficiente ADN y en dos muestras la calidad de las secuencias de las très regiones, en repetidas ocasiones, no fue optima. El anâlisis de las variantes se realize empleando la secuencia de referenda (X74481) aislada de una paciente de Estados Unidos (Delius et al, 1994). 4.3.51. Anâlisis filogenético de muestras infectadas por VPH52 El anâlisis filogenético de las muestras se realize en catorce secuencias representativas y los fenogramas obtenidos en cada una de las regiones estudiadas se indican en la figura 4.6 La secuencia SP3688 représenté ocho muestras que fueron idénticas a la secuencia prototipo, la secuencia SP6187 représenté dos muestras, y el resto de las secuencias representativas correspondian a una ùnica muestra clmica: SP5790, SP5849, SP5140, SP4028, SP5572, SP5584, SP5027, SP5996, SP3996, SP4357, SP3691 y SP5849. La filogenia de las regiones codificantes de E6 y E7 y la region reguladora nos permitiô distinguir dos posibles ramas o clusters con valores de bootstrap significatives (A y B). La asignaciôn de todas las secuencias representativas de las muestras clinicas analizadas en las dos ramas descritas, fue igual en las très regiones del genoma, con la excepciôn de la secuencia representativa SP3996. La rama A incluia las secuencias representativas SP5140 y SP5849, con valores de bootstrap del 98% y 90% en las regiones codificantes E6 y E7, respectivamente. En la regiôn reguladora esta rama agrupô ademas de las dos secuencias representativas descritas, la secuencia SP3996 con un valor de bootstrap del 99%. La rama B incluyô en las regiones codificantes E6, E7 y la regiôn reguladora el resto de secuencias del estudio. 110 Resultados E6 98% SP5140 L— SP5849 ] E7 90«/o L-SP3996 SP4028 ■SP5572 SP3688 (B) SP3691 H- SP5996 SP5027 I— SP5948 SP6187 (2) H- SP5584 SP5790 SP4357 m m J SP5140 SP5849 L- SP3996 SP5790 SP5572 SP4028 SP6187 (2) SP5996 SP5027 SP5584 SP3691 SP4357 SP5948 SP3688 (8) V 4481 ] LCR 99%r SP3996 100% SP5140 - SP5849 p SP6187 (2) SP5572 SP5584 — SP4028 SP3691 SP5948 SP3688(8) SP5790 h SP4357 SP5996 SP5027 X744R1 Figura 4.6. Anâlisis filogenético de las 22 muestras caracterizadas como VPH52 en las regiones codificantes de E6, E7 y la region reguladora (LCR). X74481, secuencia de referencia de VPH52 (Delius et al., 1993). Entre paréntesis se indica el numéro de muestras que comparten la misma secuencia y que han side simbolizadas por la secuencia representativa. Los numéros situados en las ramas indican los valores de bootstrap may ores del 70%. I l l Resultados 4.3.5.2. Polimorfismos en las regiones codificantes de las protemas E6, E7 y en la region reguladora de VPH52 La designaciôn de los patrones identificados en cada region se Uevo a cabo empleando la misma nomenclatura que en los genotipos de VPH31 y 33, descritos anteriormente. 4.3.5.2.I. Polimorfismos en la region codificante de la protema E6 En el estudio de la region codificante de E6 identificamos ocho patrones de secuencia ademas de la secuencia de referencia o prototipo (Tabla 4.39). La secuencia prototipo fue la mâs frecuente al identificarse en 13 muestras (59,1%). En dos muestras (9,1%) se describiô el patrôn denominado 52-E6-1, con un ùnico cambio en la posiciôn nucleotidica 123(C^A). El resto de los patrones descritos, sôlo se identificaron en un aislado (4,5%) y se definieron con cambios en posiciones nucleotidicas que y a habian sido descritas. La excepciôn fue el patrôn que se denominô 52-E6-8 y que incluyô cinco cambios en las posiciones nucleotidicas: 200(C—>T), 237(C-^T), 332(G^A), 350(G—>T) y 425(G-^T). La mutaciôn G—>>A en la posiciôn nucleôtidica 332 es la primera vez que se describe. Tabla 4.39. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la regiôn codificante de E6 y frecuencia de variantes en las 22 muestras de VPH52 analizadas. ■ 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 4 4 2 4 7 0 3 5 3 5 7 7 0 2 3 3 1 0 7 1 2* 0 5 9 4 5 N % Prototipo C A C C C A G G G A T G 13 59,1 52-E6-1 A - - - - - - - - - - - 2 9,1 52-E6-2 - - G - - - - - - - - - 1 4,5 52-E6-3 - - - - - - - - - - C - 1 4,5 52-E6-4 - C - - - - - - T - - - 1 4,5 52-E6-5 - - - - - G - - - G - - 1 4,5 52-E6-6 - - - - - - - T - G - - 1 4,5 52-E6-7 - - - T T - - T - - - T 1 4,5 52-E6-8 - - - T T - A T - - - T 1 4,5 Los numéros verticales describen la posiciôn nucleotidica; (-) ausencia de variacion con respecto a la secuencia prototipo; (*) posiciôn con cambios descritos por primera vez y en negrita los patrones descritos por primera vez. En la tabla 4.40 se muestran las mutaciones que se observaron en la regiôn codificante de E6, los cambios de aminoâcidos que producen y la frecuencia de los mismos. El cambio mâs frecuente correspondiô a la transversiôn G—>T en el nucleôtido 350, observada en très muestras (13,6%), que no induce cambio en el aminoâcido en el codôn en posiciôn 83. Del resto de cambios observados, siete dieron lugar a mutaciones silenciosas. 112 Resultados incluida el cambio descrito por primera vez en la posiciôn nucleotidica 332, y cuatro mutaciones dieron lugar a cambios de aminoâcidos. La posiciôn nucleotidica 143, indujo un cambio de Acido Glutâmico a Acido Aspârtico en el codôn en posiciôn 14. La mutaciôn en el nucleôtido 171 dio lugar a un cambio de aminoâcidos con polaridad diferente en el codôn en posiciôn 24 (Histidina a Acido Aspârtico). La transiciôn G—>T en el nucleôtido en posiciôn 375 indujo un cambio de Valina a Leucina en el codôn en posiciôn 92, y la transiciôn A—>G en la posiciôn 379, codificô el cambio entre dos aminoâcidos bâsicos (Lisina y Arginina) en el codôn 93 (K93R). Todas las mutaciones con sentido se identificaron en muestras individuales (4,5%), excepto la mutaciôn que se observô en dos muestras (9,1%). Tabla 4.40. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH52 en la regiôn codificante de E6 de acuerdo con la posiciôn nucleotidica, nucleôtido, aminoâcido, codôn y tipo de mutaciôn. E6 123 C A R - 8 Tv,S 2 9,1 143 A C E D 14 Tv, Ms 1 4,5 171 C G H D 24 Tv, Ms 1 4,5 200 C T C - 33 Ts,S 2 9,1 237 C T L - 46 Ts,S 2 9,1 251 A G L - 50 Ts,S 1 4,5 332 G A R - 77 Ts,S 1 4,5 350 G T L - 83 Tv,S 3 13,6 375 G T V L 92 Tv; Ms 1 4,5 379 A G K R 93 Ts, Ms 2 9,1 404 T C I - 101 Ts,S 1 4,5 425 G T T - 108 Tv,S 2 9,1 Ts, transiciôn; Tv, transversiôn; Ms, cambio con sentido; S, mutaciôn silenciosa. 4.3.5.2.2. Polimorfismos en la regiôn codificante de la protema E7 El estudio de los polimorfismos en los 299 pb que codifican la protema E7, nos permitiô identificar très patrones diferentes y cuatro posiciones con cambios en la secuencia; todos descritos previamente (Tabla 4.41). La secuencia prototipo fue la mâs frecuente al detectarse en 19 muestras (86,4%), seguida del patrôn 52-E7-1 (9,1%) que se definiô por presentar très cambios en las posiciones 573(T-^C), 766(C^A) y 801 (A^G). El patrôn 52-E7- 2 se observô en una muestra (4,5%) y se caracterizô por presentar dos variaciones en las posiciones 751(C—>T) y 801 (A^G). 113 Resultados Tabla 4.41 Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la region codificante de E7 y frecuencia de variantes en las 83 muestras de VPH52 analizadas. 5 7 7 8 7 5 6 0 3 1 6 1 N % Prototipo T C C A 19 86,4 52-E7-1 C - A G 2 9,1 52-E7-2 - T - G 1 4,5 Los numéros verticales describen la posiciôn nucleotidica; (-) ausencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo. Las posiciones con mutaciones descritas en la region codificante de E7, asl como la frecuencia de las mismas se indican en la tabla 4.42. El cambio mas frecuente fue la transiciôn A— en la posiciôn 801 que se detectô en très muestras (13,6%) y que dio lugar a una mutaciôn silenciosa en el codôn en posiciôn 83. Las sustituciones en los nucleôtidos 573(T^C) y 766(C^T), codificaron para una mutaciôn silenciosa la primera y un cambio de aminoâcido bâsico (Histidina) a neutro (Asparagina) la segunda, y se observaron en dos secuencias (9,1%). La mutaciôn silenciosa en la posiciôn nucleôtidica 751, se identificô en una muestra (4,5%). Tabla 4.42. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH52 en a regiôn codificante de E7 de acuerdo con la posiciôn nucleotidica, nucleôtido, aminoâcido, codôn y tipo de mutaciôn. E7 573 T C T - 7 Ts,S 2 9,1 751 C T L - 67 Ts,S 1 4,5 766 C A H N 72 Tv, Ms 2 9,1 801 A G Q - 83 Ts,S 3 13,6 Ts, transiciôn; Tv, transversiôn; Ms, cambio con sentido; S, mutaciôn silenciosa. 4.3.5.2.3. Polimorfismos en la regiôn reguladora El anâlisis de la regiôn reguladora se llevô a cabo en 499 pb y nos permitiô identificar 17 posiciones mutadas y dos deleciones ya descritas (Aho et al, 2003). La primera deleciôn incluyô très pares de bases (CTT) a partir del nucleôtido 7695 y la segunda 11 pares de bases (TCTTGCTGACT) a partir del nucleôtido 7696. Los cambios descritos al comparar con la secuencia de referencia, nos permitieron identificar diez patrones (Tabla 4.43). Con la excepciôn de dos mutaciones en las posiciones nucleotidicas 7627 y 7719, que dieron lugar a dos patrones que se caracterizaron como nuevos (52-LCR-4, 52-LCR-6), el resto de las 114 Resultados posiciones con cambios ya estaban descritos. El patron mâs frecuente fue la secuencia prototipo, que se identified en nueve secuencias (40,9%). Los patrones 52-LCR-l y 52-LCR-2 se observaron en dos secuencias (9,1%) y se caracterizaron por presentar un cambio ùnico en la posiciones nucleotidicas 7580(A—>C) y 7624(T -^C), respectivamente. Los patrones 52- LCR-3 y 52-LCR-4 se identificaron en dos secuencias cada uno (9,1%) e incluyeron dos y très cambios en la secuencia, respectivamente. El patron 52-LCR-4 presento un cambio no descrito antes en la posiciôn nucleotidica 7719(C^T), de forma que se caracterizô como variante nueva. El patrôn 52-LCR-5, se identificô en una secuencia y sôlo presentô un cambio en posiciôn 7549 en la secuencia. El patrôn 52-LCR-6, se identificô en una secuencia (4,5%) y se caracterizô como nuevo, porque presentô en las seis sustituciones que lo definieron un cambio no descrito antes en la posiciôn nucleotidica 7627. Este patrôn presentô ademâs la deleciôn de 3 pb descrita en esta regiôn. El patrôn 52-LCR-7 se localizô en una secuencia (4,5%) y presentô siete cambios en las posiciones nucleotidicas: 7622(G-^A), 7624(T-^G), 7657(A->C), 7659(T-^C), 7712(G^C), 7861(G-^A), 7865(A-^G) y la deleciôn de 3 pb. Los patrones 52-LCR-8 y 52-LCR-9 presentaron el mayor el mayor numéro de variaciones, nueve y diez respectivamente y fueron identificados en una muestra clmica (4,5%). En ambos patrones se observô la deleciôn de 11 pb. Tabla 4.43. Sustituciones nucleotidicas comparadas con la secuencia prototipo en la regiôn reguladora estudiada y frecuencia de variantes en las 22 muestras de VPH52 analizadas. ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 4 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 8 8 D D 2 4 7 7 8 0 2 2 2 5 5 1 1 4 4 6 6 3 11 4 9 1 9 0 2 2 4 7* J _ 9 2 9* 3 4 1 5 pb N % Prototipo C A C A A T G T A A T G C C T G A 9 40,9 52-LCR-l - - - - C - - - - - - - - - - - - - - 2 9,1 52-LCR-2 - - - - - - - C - - - - - - - - - - - 2 9,1 52-LCR-3 - - - - - - - C - - - - - T - - - - - 2 9,1 52-LCR-4 - - - - - - - C - - - - T T - - - - - 2 9,1 52-LCR-5 - C - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 4,5 52-LCR-6 - - - - - - A c T - - - - T C - - + - 1 4,5 52-LCR-7 - - - - - - A G - C C C - - - A G + - 1 4,5 52-LCR-8 T - G C - - A G - - - C - - - A G - + 1 4,5 52-LCR-9 T - G C - A A G - - - C - - - A G - + 1 4,5 Los numéros verticales describen la posiciôn nucleotidica; (-) ausencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo; (+) presencia de variaciôn con respecto a la secuencia prototipo; (*) posiciôn con cambios descritos por primera vez; D3pb, deleciôn de très pares de bases; D llpb, deleciôn de 11 pares de bases. Los cambios de nucleôtidos localizados en la regiôn reguladora y la frecuencia de los mismos, asi como los posibles sitios de uniôn de factores de trasncripciôn alterados se 115 ______________________________________________________________________ Resultados muestran en la tabla 4.44. El cambio que se detectô con mâs frecuencia entre las muestras fue la transiciôn T ^ C en el nucleôtido 7624 al identificarse en siete muestras (50%), seguido de la transiciôn C ^ T en el nucleôtido 7743 que se observô en cinco muestras (35,7%). Ambos cambios, afectaron al sitio de uniôn del factor de transcripciôn C/EBP. La transiciôn G-^A en la posiciôn nucleotidica 7622, se describiô en cuatro muestras (28,6%) y la trasversiôn A ^ T en la posiciôn nucleotidica 7627 descrita por primera vez (7,1%), de la misma manera que en los casos anteriores, afectaron al sitio de uniôn del factor G/EBP. Los cambios observados en las posiciones nucleotidicas 7571(C^G), 7861(G—>A) y 7865(A^G) dieron lugar a alteraciones en la secuencia que afectaron a los sitios de uniôn de la proteina viral E2. Las deleciones de 3 y 11 pb descritas en la regiôn y observadas en dos muestras (14,3%) cada una, afectaron al sitio de uniôn de la proteina activadora 1 (AP-1, Activator Protein 1). En las mutaciones descritas en la regiôn reguladora, no se observaron mâs sitios de uniôn de factores de transcripciôn alterados, incluyendo la posiciôn nucleotidica 7719 en la que se describiô una mutaciôn por primera vez. Tabla 4.44. Cambios localizados y frecuencia de los mismos en las secuencias estudiadas de VPH52 en la regiôn reguladora estudiada de acuerdo con la posiciôn nucleotidica, nucleôtido, sitio de uniôn, y tipo de mutaciôn. R e s io n LCR 7424 C T - Ts 2 14,3 7549 A C - Tv 1 7,1 7571 C G E2 Tv 2 14,3 7579 A C - Tv 2 14,3 7580 A C - Tv 2 14,3 7602 T A - Tv 1 7,1 7622 G A C/EBP Ts 4 28,6 7624 T G,C C/EBP Tv,Ts 3;7 21,4; 50 7627 A T C/EBP Tv 1 7,1 7657 A C - Tv 1 7,1 7659 T C - Ts 1 7,1 7712 G C - Tv 3 21,4 7719 C T - Ts 2 14,3 7743 C T C/EBP Ts 5 35,7 7744 T C - Ts 1 7,1 7861 G A E2 Ts 3 21,4 7865 A G E2 Ts 3 21,4 7695 - D3pb AP-1 2 14,3 7696 - D llpb AP-1 2 14,3 Ts, transiciôn; Tv, transversiôn; C/EBP, protema de uniôn al potenciador CCAAT; E2, proteina viral E2; AP-1, proteina activadora 1; D3pb, deleciôn de très pares de bases; D llpb, deleciôn de 11 pares de bases. 116 ______________________________________________________________________Resultados 4.3.5.3. Comparaciôn de los polimorfismos en las regiones codificantes de E6 y E7 y en la region reguladora En el anâlisis de las secuencias se identificaron dos deleciones de très y once pb en los 499 pb estudiados de region reguladora, que como en el genotipo VPH33, fueron consideradas un cambio para el anâlisis de variabilidad. Asi las variantes de la region codificante de E6 presentaron en la secuencia desde un cambio (0,2%) hasta un mâximo de cinco cambios de nucleôtidos (1,1%) con respecto a la secuencia de referencia en los 443 pb estudiados; en la regiôn codificante de E7 las variantes presentaron dos (0,7%) y très cambios de nucleôtido (1%) en 299 pb; y en la regiôn reguladora en las variantes obtenidas se identificaron desde un cambio de nucleôtido (0,2%) hasta diez cambios (2%) en los 499 pb estudiados. En la regiôn codificante de E6 el numéro medio de posiciones con cambio fue de dos (media de 2 ± 1,6; rango 0-5 mutaciones), en la regiôn codificante de E7 fue de dos (media de 1,6 ± 1,5; rango 0-3 mutaciones) y en la regiôn reguladora el numéro medio fue cuatro (media de 4,1 ± 3,8; rango 0-10 mutaciones). La proporciôn total de nucleôtidos polimôrficos fue mayor en la regiôn reguladora que en las regiones codificantes de E6 y E7, 20 sitios (deleciôn de très pares de bases) y 28 sitios (deleciôn de 11 pares de bases) en 499 pares de bases (4-5,6%), comparado con 12 sitios de variaciôn en la regiôn codificante de E6 (p = 0,35; p = 0,04) y cuatro cambios en la regiôn codificante de E7 (p = 0,03; p < 0,05). En el caso de la regiôn codificante de E7, no se observaron diferencias estadisticamente significativas al comparar aquellas variantes que presentaron la deleciôn de 3 pb en la regiôn reguladora pero si cuando se comparô con las variantes que presentaron la deleciôn de 11 pb. En las regiones codificantes de E6 y E7 la variabilidad genética fue équivalente (p = 0,31). 4.3.5.4. Distribuciôn de variantes de VPH52 entre los pacientes En la tabla 4.45 se indican las variantes identificadas en las 22 muestras de pacientes infectados por VPH52; ocho muestras fueron clasificadas como prototipo (36,4%) y 14 muestras como variantes no prototipo (63,6%). La variante representada por la secuencia SP3688 fue la mâs frecuente (36,4%) y presentô la secuencia prototipo en las très regiones analizadas. 117 Resultados vb I I ■§ • • ■ • ' • • • • • ' + + • • ■ • ' - ■ • + + ■ ' . . . . . . . . . O U u • ■ ' • • ' > ' ' < < < • ■ • ■ • ' ■ ' U • • ■ H • • ■ ■ • H H H • ' ■ H ■ ■ ' ■ • - ■ ■ ' ' ' • • • • • ■ ' • ■ U u u • • ■ • • ■ ' ' ' u ' • • • ■ • • • ' ' ' u ' • • • . ■ ■ • ' • H • ' ■ U • • u • u U U U o o u ■ • ■ ' • ■ ' ■ < < < < ■ ■ ■ • • ■ ' ' • • < ■ U ■ ■ u ■ ' ' • ■ ■ • > ■ > ' • ■ > > u u • • • • • ■ ' ■ ■ ü u • > U • < • > ■ > ■ • • ■ ■ • ' ' ■ ' ' H H o t “? 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Las variantes SP5027, SP4357 y SP3691 son muy similares, presentando la secuencia prototipo en las regiones codificantes, y un ùnico cambio de nucleôtido en la regiôn reguladora. La variante nueva representada por la secuencia SP5849 y la variante SP5140 se presentaron con patrones muy similares en las très regiones estudiadas, difiriendo por presentar la variante SP5849 un cambio nuevo en la regiôn codificante de E6, que no induce ningùn cambio de aminoâcido y la posiciôn nucleotidica 7622 en la regiôn reguladora. Esta variante presentô el mayor nùmero de variaciones de secuencia en las très regiones, cuando se comparô con la secuencia de referencia. Las variantes en la regiôn codificante de E6 presentaron ninguno (SP5790, SP5996, SP5584, SP5140, SP5849), uno (SP5948, SP4028, SP3996) o dos (SP5572) cambios de aminoâcidos. En la regiôn codificante de E7 las variantes representadas por las secuencias SP5140 y SP5849 son las ùnicas en las que se presentaron variaciones, aunque sôlo la posiciôn nucleotidica 766 (incluida en las variantes SP5140 y SP5849), induce un cambio de aminoâcido en la secuencia de la proteina. En la regiôn reguladora las variantes SP5140 y SP5849 presentaron el mayor nùmero de sitios de uniôn para factores de transcripciôn alterados e incluyeron ademâs la deleciôn de 11 pb descrita en la regiôn. La variante SP4028 se caracterizô como nueva debido al cambio en la posiciôn nucleotidica 7627 que afectô al sitio de uniôn del factor C/EBP; y junto con la variante SP3996 presentaron en la regiôn la deleciôn de 3 pb. 4.3.6.5. Distribuciôn de variantes de VPH52 de acuerdo al estatus VIH-1 v el origen geogrâfico de los pacientes La distribuciôn de las variantes asignadas como prototipo o no prototipo, se describiô de acuerdo al estatus VIH-1 y el origen geogrâfico de los pacientes (Tabla 4.46). De las 22 muestras analizadas, 15 pertenecian a pacientes infectados por VlH-1 y siete a pacientes no infectados por VIH-1. Con respecto al origen geogrâfico de los pacientes, trece muestras eran de hombres espanoles, ocho muestras de hombres de origen latinoamericano y se excluyô del anâlisis la muestra de un paciente de origen europeo distinto al espanol. De acuerdo con el estatus VIH-1 de los pacientes, en ambos grupos las variantes no prototipo fueron mayoritarias. De acuerdo al origen geogrâfico de los pacientes, en los pacientes de origen espanol las variantes no prototipo fueron las mâs prevalentes, y en los hombres de origen latinoamericano las variantes prototipo y no prototipo se distribuyeron 119 Resultados de forma homogénea. En ninguno de los grupos de estudio se observaron diferencias estadisticamente significativas en la distribuciôn de las variantes, ni en el anâlisis univariable de la infecciôn por variante prototipo vs. no prototipo. Tabla 4.46. Prevalencia y anâlisis univariable de las variantes asignadas como prototipo y no prototipo de VPH52 de acuerdo al estatus VIH-1 y el origen geogrâfico de los pacientes. Estatus VIH-1 22 Negativo 7 2 (28,6) 5 (71,4) Positivo 15 6(40) 9(60) Origen geogrâfico 21 Espana 13 3(23) 10 (76,9) Latinoamérica 8 4(50) 4(50) p-valor O R ( I C 9 5 ‘'ii) 0,5999 0,6 (0,08^,16) 0,2062 0,3 (0,04-1,99) 120 DISCUSION ______________________________________________________________________ Discusiôn 5. DISCUSIÔN 5.1. Prevalencia global y tipo especifica de VFH de alto riesgo En el cancer cervical, los tipos 16 y 18 del VFH se detectan en el 70% de los cânceres escamosos y en el 86% de los casos de adenocarcinomas (Munoz et al., 2006; Castellsagué et al., 2006). Los valores de prevalencia de infecciôn de otros tipos de alto riesgo, no son tan homogéneos y difieren entre los diferentes paises e incluso entre diferentes regiones geogrâficas del mismo pais. En este sentido, los datos publicados por el lARC a nivel mundial, sitûan al VPH31 y VPH33 en la segunda y tercera posiciôn respectivamente, de los tipos que se detectan con mâs frecuencia en las lesiones de alto grado y VPH52 en la sexta posiciôn (Smith et al. 2007; Clifford et al., 2003;). A diferencia de lo que ocurre con la infecciôn por VPH en las mujeres, los datos de prevalencia de la infecciôn por VPH en los hombres son mâs escasos en la literatura (Dunne et al., 2006; Giuliano et al, 2007; Nielson et al., 2007); y en el caso mâs concreto de la infecciôn anal la mayoria de los estudios se han llevado a cabo en HSH infectados por VIH-1. Esto se debe fundamentalmente, a que se ha observado en este grupo de pacientes un incremento de la incidencia de câncer anal en los ùltimos anos. (Frisch et al., 2000, 2001; Mbulaiteye et al., 2003; Dal Maso et al., 2003; Parkin et al., 2006b; Hessol et al., 2007). Hasta la fecha no han sido publicados estudios que indiquen la distribuciôn a nivel mundial de los tipos VPH mâs frecuentes en lesiones preneoplâsicas o en câncer anal. En el aho 2009, Hoots et al. realizaron una revisiôn sistemâtica de la bibliografia publicada sobre la distribuciôn de tipos de VPH en câncer anal y lesiones intraepiteliales precursoras. Los datos obtenidos de esta revisiôn, describieron una prevalencia global de VPH del 71, 91 y 88%, en câncer anal, HSIL y LSIL, respectivamente. La prevalencia de VPH16 y 18 fue del 72% en câncer anal, del 69% en HSIL y del 27% en LSIL, observândose que la prevalencia de VPH16 y /o 18 en câncer anal invasivo es similar a la que se describe para câncer cervical invasivo. Los datos de prevalencia tipo especifica obtenidos analizando muestras de biopsias, establecieron los tipos VPH33, VPH31 en tercera y cuarta posiciôn en el câncer anal, después de VPH16 y VPH18. En el caso concreto de la infecciôn anal por VPH en HSH infectados por VIH-1, se observan unos valores de prevalencia de infecciôn especialmente elevados, hecho que puede estar relacionado con la mayor persistencia de la infecciôn en los pacientes inmunocomprometidos (Palefsky et al., 2009). En la actualidad son poco conocidos los déterminantes de la persistencia viral, pero la respuesta inmunitaria parece esencial, de ahl que el adaramiento de la infecciôn se vea comprometido en las personas VIH-positivas y 123 ______________________________________________________________________ Discusiôn que, en ellas, los valores de CD4 y carga viral sean un importante déterminante de la persistencia viral, aumentando la probabilidad de progresiôn a neoplasias intraepiteliales anales (Ahdieh et al. 2001; Palefsky et al. 2001, 2007; Fife et al. 2009). La mayor parte de los estudios de prevalencia de infecciôn anal por VPH en HSH, publicados hasta el momento, incluyen series muy reducidas de pacientes, siendo ademâs muy limitados en Europa y mâs en concreto en Espana. En el présente trabajo la poblaciôn de estudio fueron 401 HSH que acudieron a una clmica de ETS en Madrid. De ellos, el 58,1% de los hombres no estaban infectados por VIH-1, el 35,7% estaban infectados por VIH-1 y en el resto se desconocia su estatus frente a la infecciôn por VIH-1. La prevalencia global de infecciôn por VPH-AR, mediante la tecnologia de captura de hibridos, fue del 54,9%, y cuando los resultados se analizaron estratificando de acuerdo a la presencia o no de anticuerpos frente a VIH-1, se observô que la prevalencia de infecciôn en aquellos pacientes infectados por VIH-1 era significativamente superior (74,8 vs. 43,3%; p < 0,001). El anâlisis univariado mostrô que estar infectado con VIH-1 estaba asociado con presentar una prevalencia de VPH-AR cuatro veces mayor, resultados que confirman los trabajos realizados por otros grupos, en los que los factores de riesgo para la presencia de la infecciôn anal por VPH incluyen la infecciôn por VIH-1, bajos niveles de CD4, la presencia de verrugas génitales y una historia de relaciones sexuales anales receptivas (Critchlow et al., 1998). En el anâlisis de la variable origen geogrâfico, en el grupo de pacientes infectados por VIH-1, se observô que procéder de un pais latinoamericano estaba asociado con una probabilidad entre cuatro y cinco veces mayor (OR 4,6; IC95%:1,3-16,4) de presentar una infecciôn anal por VPH-AR. Los datos de prevalencia de infecciôn por VPH-AR obtenidos, son muy similares a los publicados en otros trabajos, describiéndose una mayor prevalencia de infecciôn por VPH en HSH infectados por VIH-1 frente a los no infectados. Los primeros trabajos realizados en estudios de cohortes de HSH en Estados Unidos, mostraron una prevalencia de la infecciôn anal por VPH del 60% entre los hombres no infectados por VIH-1 y del 93% en los hombres infectados por VIH-1 en la ciudad de San Francisco (Palefsky et al, 1998a); y valores del 65,9% para los hombres no infectados por VIH-1 y del 91,6% entre los pacientes infectados por VIH-1 (p < 0,0001), en la ciudad de Seattle (Critchlow et al, 1998). Estos primeros datos de infecciôn anal por VPH en cohortes de conveniencia en Estados Unidos, se han confirmado con los datos mâs recientes publicados en el primer estudio poblacional llevado a cabo en HSH infectados o no por VIH-1 en San Francisco, y que describen tasas de prevalencia de la infecciôn anal del 88% (Chin-Hong et al, 2008). Un trabajo llevado a 124 ______________________________________________________________________ Discusiôn cabo en una cohorte de HSH infectados por VIH-1 en Canada, describe tasas de prevalencia de infecciôn del 97,9% (de Pokomandy et al, 2009). En Australia, en un trabajo llevado a cabo empleando la técnica de captura de hibridos, se obtuvo una prevalencia de infecciôn anal en HSH infectados por VIH-1 del 84% (Anderson et al, 2008), En Europa los estudios realizados confirman estos valores, asi en el aho 2003, Piketty et al., Uevaron a cabo un trabajo en Francia con 118 pacientes infectados por VIH-1, de los que 67 eran HSH y 50 hombres heterosexuales usuarios de drogas por via parenteral, obteniéndose en los HSH un valor de prevalencia de infecciôn anal por VPH- AR del 55%. En el aho 2005, en Alemania, Kreuter et al, en 103 HSH infectados por VIH-1 describieron un prevalencia de infecciôn anal del 86%; y mâs recientemente en Italia, Pierangeli et al. en al aho 2008, realizaron un estudio en 36 HSH/ bisexuales infectados o no por VIH-1, y las tasas de prevalencia de infecciôn en los 27 HSH fueron del 89% y del 94%, en los pacientes no infectados e infectados por VIH-1, respectivamente. En Espaha, los datos de la infecciôn anal por VPH se remontan al aho 2006, Sirera et al., publican un trabajo en el que describen las tasas de prevalencia de infecciôn en ano, pene y boca por VPH en 52 HSH y 22 hombres heterosexuales infectados por VIH-1. La prevalencia global de infecciôn anal en la poblaciôn de estudio fue de 78% (IC95%, 67-87%) siendo del 83% en los pacientes HSH (IC95%, 70-92%). En un estudio realizado en el aho 2009 por Ortiz et al. en una cohorte abierta, multicéntrica y prospectiva de pacientes infectados por VIH-1 y sin tratamiento con antirretrovirales cuando se incluyen en la cohorte, describen una prevalencia de infecciôn anal por VPH del 88% para HSH. Los datos de prevalencia de infecciôn anal por VPH descritos en el présente estudio, son ligeramente inferiores que los que se observan en los trabajos anteriormente mencionados. Esta diferencia se debe fundamentalmente a que en la mayor parte de los trabajos, la detecciôn de la infecciôn se realiza mediante la tecnologia de PCR, y en el présente trabajo se han descrito valores de prevalencia de infecciôn anal empleando el método de captura de hibridos, que aunque présenta menor sensibilidad, es mucho mayor su especificidad desde el punto de vista clinico. Ademâs, la utilizaciôn de la metodologia de PCR proporciona datos de infecciôn de VPH tanto de alto como de bajo riesgo, y la técnica de captura de hibridos empleada en este trabajo solo ha permitido la detecciôn de infecciones por tipos de alto riesgo. Los tipos de VPH-AR mâs prevalentes en el présente trabajo fueron VPH16 (21,9%), VPH18 (12,1%), VPH51 (10,6%) y VPH45-58 (9,9%), y se observaron diferencias estadisticamente significativas en la distribuciôn de todos los tipos de VPH en funciôn del 125 ______________________________________________________________________ Discusiôn estatus VIH-1 de los pacientes, con la excepciôn de VPH35, 39 y 45; asi en los pacientes no infectados por VIH-1 los tipos mâs frecuentes fueron VPH16, VPH18, VPH45, VPH51 y en los pacientes infectados VPH16, VPH68, VPH18 y VPH58. Sin embargo, en un estudio realizado por Pierangeli et al., en el aho 2008, los autores no describen estas diferencias en la distribuciôn de tipos entre los pacientes infectados y no infectados por VIH-1, aunque este hecho puede ser atribuible a la diferente sensibilidad tipo especifica de la metodologia utilizada, ya que en este trabajo se empleaba la secuenciaciôn directa de productos de PCR, que détecta el tipo mayoritario y subestima los tipos minoritarios présentes en las coinfecciones. La distribuciôn tipo especifica de VPH-AR obtenida entre los pacientes infectados por VIH-1, es similar a la descrita por otros autores. En un estudio realizado en 103 HSH infectados por VIH-1 en Alemania, se describe una distribuciôn muy similar, siendo los tipos mâs prevalentes el VPH16 seguido de VPH18 y VPH58 (Kreuter et al. 2005) y Pokomandy et al. en un estudio de cohorte de 247 participantes en Canadâ, describen los tipos VPH16, VPH18 y VPH52 como los mâs prevalentes. En Espaha, Sirera et al. en el aho 2006 describen una distribuciôn ligeramente diferente a la obtenida en el présente estudio, siendo después del VPH16 (47%) los tipos mâs prevalentes VPH33-39 (33%) y VPH51-52 (30%). Este hecho puede atribuirse a diferencias en el tamaho muestral (N=52 vs. N=401) y a que en la poblaciôn de estudio se incluian tanto hombres HSH como heterosexuales. En un estudio llevado a cabo en una cohorte de HSH infectados o no por VIH-1 en Estados Unidos, Chin-Hong et al. en el aho 2009 describieron que el riesgo de adquisiciôn de VIH-1 incrementaba significativamente al aumentar el nùmero de tipos de VPH aislados en un paciente, y que este hecho puede estar relacionado con la mayor presencia de lesiones anales en los HSH. En el présente estudio, la prevalencia global de infecciones mùltiples de VPH-AR (34,9%) fue mayor que la de infecciones simples (16,2%), y se establecieron diferencias estadisticamente significativas en la distribuciôn de las infecciones mùltiples entre los pacientes infectados por VIH-1 frente a los no infectados (55,2% vs. 24%; p<0,001). Estos datos son similares a los descritos previamente en la bibliografia, en los que se observan mayores tasas de prevalencia de infecciones mùltiples en los pacientes infectados por VIH-1. En esta linea, uno de los primeros trabajos llevados a cabo en Estados Unidos, describe una tasa de infecciôn mùltiple de tipos de VPH de alto y bajo riesgo oncogénico del 73% en los pacientes infectados por VIH-1, y del 23% en los no infectados (Palefsky et a/.,1998a). Recientemente en Canadâ, de Pokomandy et al., en una cohorte de HSH infectados por VIH-1, observan una prevalencia de infecciones 126 ______________________________________________________________________ Discusiôn multiples de VPH del 90,9%. En Europa, un estudio realizado en Francia en pacientes HSH infectados por VIH-1, describe una prevalencia de infecciôn por mùltiples tipos de VPH- AR muy similar a la descrita en el présente trabajo (35,8%) (Piketty et al., 2003). En Espaha, Sirera et al., 2006 observaron igualmente una elevada prevalencia de infecciones por mùltiples tipos de VPH, tanto de bajo como de alto riesgo oncogénico (81%). Cuando se comparan los valores de la prevalencia de infecciones mùltiples obtenidas en el présente trabajo, son inferiores a los descritos previamente en la bibliografia, hecho que puede deberse a que sôlo se han tenido en cuenta infecciones mùltiples por tipos de alto liego oncogénico, y diferencias asociadas a la metodologia de detecciôn. 5.2. Prevalencia y caracterizaciôn molecular de variantes de VPH16, VPH18, VPH31, VPH33y VPH52 En el estudio del genoma de VPH16, los genes de expresiôn temprana y la regiôn reguladora son claves en la patogénesis del virus y en su asociaciôn al desarrollo de cancer, debido a que regulan varias propiedades, entre las que se incluyen la replicaciôn y la transcripciôn del ADN viral, asi como la inmortalizaciôn y la transformaciôn de las células infectadas (Stewart et al., 1996). Se ha demostrado mediante estudios funcionales, que los cambios en la secuencia de estos genes puede llegar a alterar las funciones biolôgicas de las proteinas que codifican, lo que podria afectar a la historia natural de la infecciôn por VPH16, hecho que podria ser extensivo a otros tipos de VPH. De la misma manera, las variaciones también pueden influir en la persistencia de la infecciôn y la progresiôn a cancer invasivo, lo que podria explicar en parte, el amplio espectro de patologias y la alta prevalencia de cancer cervical en algunos paises (Pista et al., 2007). Por lo tanto, la identificaciôn de las variantes tanto de VPH16 como otros tipos de VPH de alto riesgo, tiene entre sus objetivos establecer bases de datos que nos permitan: (i) desarrollar disehos eficaces en las estrategias del diagnôstico y vacunaciôn de la infecciôn; (ii) aplicar a estudios epidemiolôgicos en los que las variaciones en la secuencia pueden ser utilizadas como marcadores para monitorizar la infecciôn por VPH en diferentes poblaciones; (iii) estudiar las relaciones entre los genotipos y los fenotipos (el hecho de que ciertas variantes se asocien positiva o negativamente con las lesiones, dependiendo de sus propiedades biolôgicas y funcionales) y (iv) hacer estudios evolutivos y taxonômicos (Stewart et al, 1996). La mayoria de los trabajos de variantes de VPH han sido llevados a cabo en muestras cervicales, y se han centrado fundamentalmente en pacientes con cancer. Son mas escasos los trabajos que han estudiado las variantes de VPH en muestras anales tanto 127 ______________________________________________________________________ Discusiôn en mujeres como en hombres, aunque se ha demostrado que la displasia anal varia considerablemente con los diferentes tipos de VPH y que las regiones genômicas de elevada variabilidad intratipo, que incluyen las alteraciones nucleotidicas que definen las diferentes variantes, podrian tener una importante relevancia en las propiedades biolôgicas del virus, estando asociadas a un riesgo variable para carcinoma in situ (Melbye et al, 1994a; Palefsky et al, 1994; Critchlow et al., 1995; Steward et al., 1996). En este trabajo hemos determinado las variantes de los tipos de alto riesgo VPH16, VPH18, VPH31, VPH33 y VPH52 en un grupo de HSH infectados o no por VIH-1, en las regiones genômicas que codifican las dos proteinas virales impHcadas en el proceso de transformaciôn e inmortalizaciôn celular (E6 y ET) y en una parte de la regiôn reguladora que contiene los elementos implicados en la regulaciôn de la expresiôn viral, con el fin de analizar la distribuciôn y las caracteristicas de las variantes de los diferentes tipos de VPH- AR en dicha poblaciôn, asi como valorar el efecto de la coinfecciôn con VIH-1 y el origen geogrâfico en la distribuciôn de las mismas. Este trabajo, es pionero en Espana en el anâlisis de variantes intratipo de VPH-AR asociadas a la infecciôn anal en pacientes HSH infectados y no infectados por VIH-1. En el présente trabajo, el anâlisis de los polimorfismos de VPH16 en las très regiones genômicas estudiadas, ha permitido identificar variantes pertenecientes a très de las cinco ramas filogenéticas descritas para este tipo de VPH (Yamada et al., 1997), clasificândose el 86,7% de las muestras en la rama Europea, siendo el 48,2% variantes Europeas y el 38,5% secuencias prototipo; el 9,6% se asignaron a la rama Asiâtico- Americana y el 3,6% a la rama Africana tipo 2. La elevada prevalencia de secuencias pertenecientes a la rama Europea de VPH16, obtenida en nuestro trabajo, coincide con los escasos datos bibliogrâficos de anâlisis de variantes en la infecciôn anal en HSH. En el ano 1998, Xi et al., publicaron el primer trabajo en el que se demostraba que la infecciôn con diferentes variantes de VPH16 ténia implicaciones en su asociaciôn con el carcinoma anal in situ. En dicho estudio, la identificaciôn de variantes se realizô mediante hibridaciôn molecular, en muestras anales de una cohorte de HSH que estaban infectados o no por VIH-1 en Estados Unidos, observândose que las secuencias pertenecientes a la rama Europea eran las mâs prevalentes (88,9%). En el ano 2002, Da Costa et al., evaluaron las variaciones de la regiôn codificante de E6 de VPH16 en muestras anales de mujeres y hombres infectados o no por VIH-1, procedentes de dos estudios de cohortes realizados en Estados Unidos. En el caso de las muestras anales procedentes de los hombres, el 93% eran variantes de VPH16 pertenecientes a la rama Europea. 128 ______________________________________________________________________ Discusiôn La distribuciôn de variantes no Europeas obtenida en el présente estudio (mayor prevalencia de variantes clasificadas en la rama Asiàtico-Americana que de variantes pertenecientes a la rama Africana tipo 2), difiere de la observada en los dos trabajos anteriormente mencionados. Asi en el trabajo realizado por el grupo de Xi et al, las variantes Africanas fueron mâs prevalentes que las Asiâtico-Americanas (4,4% vs. 3,2%), al igual que en el trabajo realizado por Da Costa et al (8,2% vs. 1,4%). Estas diferencias pueden asociarse al pais de procedencia de los pacientes y /o al origen racial de los mismos. En Europa, la mayoria de los trabajos de epidemiologia molecular de variantes de VPH16 se han llevado a cabo en muestras cervicales y las variantes Europeas se han descrito como las mâs frecuentes. En un trabajo realizado en Italia en 90 muestras cervicales de pacientes infectados por VPH16, la prevalencia de variantes pertenecientes a la rama Europea fue del 78,8%, correspondiendo el 25,5% a la secuencia prototipo. Las variantes Africanas tipo 1 se detectaron en el 12,2% de los casos y las variantes Asiâtico- Americanas en el 8,9% (Tomesello et al., 2004). Un trabajo mâs reciente, también en mujeres italianas, describe una prevalencia extremadamente alta de muestras con secuencias pertenecientes a la rama Europea (98,4%) y sôlo se detectô un caso con una variante Asiâtico-Americana (Cento et al., 2009). En el aho 2007, en un estudio realizado en 187 mujeres portuguesas, se describe una prevalencia de infecciones por VPH16 pertenecientes a la rama Europea del 74,3%, detectândose variantes pertenecientes a las ramas filogenéticas Africana tipo 1, Asiâtico-Americana y Africana tipo 2 en un porcentaje de 11,8%, 9,6% y del 4,3% respectivamente (Pista et al., 2007). Los datos de la epidemiologia molecular de las variantes de VPH en Espaha son escasos. Las primeras aproximaciones resultan de trabajos realizados en los ahos 90, en el marco de estudios intemacionales con colecciones de muestras de pacientes con câncer cervical procedentes de diferentes palses y localizaciones geogrâficas (Stewart et al, 1996; Yamada et al, 1997). En el aho 2001, se publican los resultados del anâlisis de polimorfismos en la regiôn codificante de la proteina E6 de 61 muestras positivas para VPH16, y procedentes de mujeres atendidas en un Centro Hospitalario de Madrid (Perez- Gallego et al., 2001); y en el aho 2006, Ortiz et al., describen el anâlisis de las variantes de VPH16 mediante el estudio de las regiones codificantes de las protemas E6, E2 y L1 en 75 mujeres procedentes de dos provincias de Espaha (Madrid y Alicante). En ambos estudios, las variantes mâs prevalentes fueron las que pertenecian a la rama Europea. Perez-Gallego et al., describieron valores de prevalencia de las variantes Europeas del 90,2%; y Ortiz et al.. 129 ______________________________________________________________________ Discusiôn del 78,7%. Este ultimo estudio, describe ademâs la presencia de variantes no Europeas pertenecientes a las ramas filogenéticas Asiâtico-Americana, Africana tipo 1 y Africana tipo 2, siendo la prevalencia de cada una de ellas del 16%, 4% y 1,3%, respectivamente. La presencia de variantes pertenecientes a las ramas Asiâtico-Americanas y Africanas en las poblaciones europeas, puede deberse a los movimientos migratorios hacia Europa desde los paises latinoamericanos y africanos, ya que los estudios realizados en dichos paises describen una mayor prevalencia de dichas variantes (Berumen et ah, 2001; Hildesheim et al., 2001; Piccono et al. 2003; Calleja-Macias et al., 2004; Sichero et al. 2007; Junes-Gill et al. 2008). La caracterizaciôn de las variantes realizada en el présente trabajo se basô en el anâlisis de los polimorfismos de très regiones del genoma de VPH. Las oncoproteinas virales son importantes en varias funciones virales, entre las que se incluyen la replicaciôn y la transcripciôn del ADN viral, la interacciôn con la red del citoesqueleto, la inmortalizaciôn y la transformaciôn celular (Xi et al., 1997). Las variaciones en las secuencias codificantes de las oncoproteinas virales son menores que en la regiôn reguladora (Giannoudis et al., 2001), sin embargo los polimorfismos de sus secuencias tienen importancia debido a que pueden llegar a alterar las funciones biolôgicas de las mismas y de esta forma afectar al desarrollo clinico de la infecciôn viral (Pillai et al. 2009). La regiôn reguladora no codifica para ninguna proteina y estâ implicada en el control de la replicaciôn y la transcripciôn viral. La expresiôn de los genes virales estâ bajo el control de los promotores y elementos potenciadores de la transcripciôn localizados en esta regiôn, que ademâs contiene los sitios de uniôn de factores de transcripciôn celulares, que pueden modular sus funciones positiva o negativamente (Desaintes et al. 1996). La regiôn reguladora es muy variable, lo que permite llevar a cabo una clasificaciôn mâs exacta de las variantes que se describen en ella (Ho et al. 1991; Chan et al. 1992; Ong et al. 1993; Giannoudis et al. 2001). En el caso concreto del tipo 16, ciertos estudios han demostrado que los polimorfismos de la regiôn reguladora del genoma pueden estar asociados con un riesgo elevado de persistencia de infecciôn o de inducir lesiones (Xi et al. 1997; Veress et al. 1999; Giannoudis et al. 2001; Hildesheim et al. 2001). Las variantes de VPH16 mâs frecuentes, fueron aquellas que presentaron la mutaciôn en la regiôn codificante de la protema E6 en posiciôn 350(T—>G) y la mutaciôn en la regiôn reguladora en posiciôn nucleotidica 7521(G^A). La mutaciôn descrita en la regiôn codificante de E6, que caracteriza la clase E-350G de la rama Europea, da lugar a un cambio de Leucina a Valina en el aminoâcido en posiciôn 83 de la proteina (L83V). Esta 130 ______________________________________________________________________ Discusiôn mutaciôn, se describiô en variantes pertenecientes a la rama Europea y Asiâtico Americana, pero no en las variantes pertenecientes a la rama Africana tipo 2. Estos datos coinciden con los datos bibliogrâficos publicados en estudios llevados a cabo en diferentes localizaciones geogrâficas y tanto en muestras cervicales como anales (Xi et al., 1998; Da Costa et al., 2002; De Boer et al., 2004; Tomesello et al., 2004; Junes-Gill et al., 2008; Pillai et al., 2009; Cento et al., 2009). Con respecto a la asociaciôn de esta mutaciôn con câncer, los datos bibliogrâficos son contradictorios, algunos estudios llevados a cabo en mujeres inglesas, suecas o indias describen una prevalencia elevada de esta mutaciôn en las muestras procedentes de pacientes con câncer cervical, proponiendo los autores que estâ mutaciôn podria estar relacionada con la persistencia viral (Zehbe et al., 1998b; Giannoudis et al., 2001; Kammer et al., 2002; Pillai et al., 2009); sin embargo en otros trabajos realizados en mujeres en Alemania, Holanda, China o Brasil la presencia de variantes con dicha mutaciôn se observa tanto en mujeres con câncer cervical, como en aquellas con lesiones intraepiteliales de alto y bajo grado (Bontkes et al. 1998; Nindl et al. 1999; Chan et al. 2002; Junes-Gill et al. 2008). Ademâs, Zehbe et al. en el ano 2001, en mujeres italianas, describieron un menor riesgo de desarrollo de câncer cervical en pacientes con dicha mutaciôn. Los estudios funcionales llevados a cabo en relaciôn a la mutaciôn L83V, describen que en las variantes que muestran tal mutaciôn en la protema se observan niveles de actividad de degradaciôn de Bax (protema celular proapoptôtica) y de uniôn de la protema mayores cuando son comparados con la protema prototipo. Esta mutaciôn es un ejemplo de que ciertas mutaciones pueden por tanto alterar actividades de la protema importantes en el potencial carcinogénico. Las variaciones de la oncogenicidad que se han descrito, pueden ser debidas a diferencias genéticas entre las poblaciones (diferencias geogrâficas) o la presencia simultânea de otras co-mutaciones (lichtig et al., 2006; Pillai et al, 2009). La mutaciôn en la posiciôn nucleotidica 7521(G-^A) de la regiôn reguladora, se identificô en variantes pertenecientes a las très ramas filogenéticas, Europeas, Asiâtico- Americanas y Africanas tipo 2. Esta posiciôn, localizada en el segmento central de la regiôn reguladora, contiene el potenciador especifico de tejido de la transcripciôn y los diferentes estudios de variaciones de la regiôn, indican que esta posiciôn mutada es el cambio en la secuencia mâs frecuente en el mundo, siendo especialmente ^omûn en Europa (Ho et al, 1993; Yamada et al, 1997; Kurvinen et al, 2000; ViUa et al, 2000b; Tomesello et al, 2004; Alencar et al, 2007; Junes-Gill et al, 2008; Cento et al. 2009; Pillai et al, 2009). Las variantes que incluyen dicha posiciôn mutada alteran los sitios de uniôn de 131 ______________________________________________________________________ Discusiôn los factores de transcripciôn YYl, NFl, aimque los pocos estudios que existen se han centrado en los efectos que taies mutaciones tienen en la actividad de YYl. El factor YYl es un miembro de la fanülia de reguladores de la transcripciôn relacionados con los tumores, conocidos por estar implicados en el desarrollo mamario y en la diferenciaciôn celular pero ademâs, porque pueden jugar un papel en el establecimiento y progresiôn de ciertos tipos de tumores (Austen eï al, 1997; Shi et al., 1997; Thomas et al, 1999; Krippner- Heidenreich et al., 2005). Algunos trabajos han descrito que mutaciones o deleciones de la region que dan lugar a la pérdida de los sitios de union de dicho factor, conllevaban una potenciaciôn de la actividad transcripcional y que dichas variaciones se aislaban muy frecuentemente en las muestras de pacientes con cancer cervical (Dong et al., 1994, 1999; May et al., 1994). Sin embargo, en un estudio realizado en el aho 2005 por Kim et al., y analizando las variaciones en la region reguladora de diferentes variantes de E7 de VPH16 los autores sugieren que las diferencias observadas en la secuencia de la region reguladora que afectaban a la union de ciertos factores de transcripciôn, incluidos YYl, TEF-1 y GRE, se correlacionaban con una actividad transcripcional igual o menor cuando eran comparadas con la secuencia prototipo y que por tanto, taies diferencias no estaban relacionadas con el potencial oncogénico de las variantes. Otros estudios posteriores, han confirmado estos resultados e indican que estas variaciones de la secuencia de la regiôn reguladora de VPH16 que afectan a YYl, no se asocian comùnmente con un riesgo de progresiôn de las lesiones a un estadio mas severo (Kurvinen et al., 2000; Veress et al., 2001). En el présente estudio no se han descrito variantes nuevas de VPH16 pertenecientes a la rama Europea. Sin embargo, se han identificado variantes con cambios poco frecuentes en esta rama filogenética. La variante representada por la secuencia SP4193 presentô una mutaciôn en la posiciôn nucleotidica 176 de guanina a citosina, que implica un cambio de un aminoâcido neutro (Glutamina) a un aminoâcido con polaridad positiva (Histidina). En esta posiciôn nucleotidica, el cambio mas frecuente es una transiciôn de guanina a adenina, que a pesar de ser una mutaciôn con sentido, tanto el aminoâcido de la proteina nativa como el de la proteina mutante tienen la misma polaridad. La variante representada por la secuencia SP3946 se caracterizô por presentar un cambio en la posiciôn nucleotidica 132 de la regiôn codificante de E6 de guanina a citosina, que aûn habiéndose descrito previamente en variantes pertenecientes a la rama Europea, es mas frecuente en las variantes de la rama Africana tipo 1. 132 ______________________________________________________________________ Discusiôn Todas las variantes de VPH16 pertenecientes a la rama Asiâtico-Americana presentaron, ademâs del cambio en la posiciôn nucleotidica 350 ya descrita, mutaciones en las posiciones nucleotidicas 145 y 335 de la regiôn codificante de E6, que estân incluidas en regiones responsables de la uniôn y degradaciôn de la proteina p53 y la transactivaciôn transcripcional de la proteina (Pillai et al. 2009). No son muchos los estudios llevados a cabo para conocer el efecto biolôgico que las variaciones pueden llegar a tener en las funciones de las proteinas y el potencial carcinogénico. Los estudios realizados se han dirigido a ensayar los efectos en funciones como la degradaciôn de p53, la degradaciôn de Bax y la inhibiciôn de la transactivaciôn de p53 de la proteina E6, e indican que en la mayoria de los casos las variantes con cambios en las regiones implicadas en taies funciones no muestran importantes reducciones de la actividad con respecto a la proteina prototipo, indicando la gran importancia que estas actividades tienen en el proceso carcinogénico (Lichtig et al, 2006). Sin embargo, existen algunas excepciones como la descrita por Foster et al, que indican que los mutantes con deleciones de los aminoâcidos nueve a 13 o la presencia simultânea de las mutaciones de los aminoâcidos ocho, nueve y diez de la proteina de VPH16 anulan totalmente su capacidad de inducir la degradaciôn de p53 (Foster et al, 1994). En otro estudio, una variante con la mutaciôn KllE, mostrô una incapacidad absoluta de unirse y degradar la proteina p53 en los estudios in vivo e in vitro llevados a cabo en queratinocitos humanos (Cooper et al, 2003). Un trabajo reciente muestra que las variantes relacionadas con la mutaciôn L83V, como la variante Asiâtico- Americana con los cambios Q14H/H78Y/L83V, que en nuestro trabajo estâ présente en todas las muestras de esta rama, son mâs prevalentes que la proteina prototipo en las lesiones precancerosas y en cancer cervical (Zehbe et al, 2009). Los trabajos llevados a cabo en la regiôn reguladora de VPH16 para estudiar la actividad del promoter temprano en las diferentes variantes, indican que las variantes pertenecientes a la rama Asiâtico-Americana muestran unos valores de actividad hasta très veces mayores que los detectados en las variantes de la ramas Europeas y Africanas, y que este hecho puede ser atribuido principalmente a la presencia de la transiciôn A-+C en la posiciôn nucleotidica 7729 de la regiôn reguladora, caracteristica de la rama (Kàmmer et al, 2000). El efecto que el incremento de la actividad de promotor puede tener es desconocido aûn, pero podria estar implicado en la mayor probabilidad de progresiôn a un fenotipo maligno que se ha descrito en las variantes de esta rama, ya que la expresiôn de las oncoproteinas virales esta mediada por el promotor temprano. Todas las variantes pertenecientes a la rama Asiâtico-Americana en el présente estudio presentaron la 133 ______________________________________________________________________ Discusiôn mutaciôn anteriormente descrita. En esta rama se identified una nueva variante (representada por la secuencia SP6085), que se caracterizô por presentar en la regiôn reguladora una transiciôn que no habia sido descrita previamente en la posiciôn nucleotidica 7784 (C^T) y que fue la mâs frecuentemente detectada. Las variantes de la rama Africana fueron las ùnicas que presentaron cambios en la secuencia de nucleôtidos de la regiôn codificante de E7 que indujeron cambio del aminoâcido correspondiente (N29S). Este cambio se localiza en una zona de la proteina implicada en funciones inmunogénicas. En un estudio llevado a cabo en Korea, esta mutaciôn se localizô en el 70% de los carcinomas cervicales invasivos (Song et al. 1997). El estudio de la regiôn codificante de la proteina E7 en diferentes grupos de poblaciones, ha sugerido que esta regiôn estâ altamente conservada para VPH16 (Eschle et al., 1992; Fujinaga et al., 1994). La escasez de mutaciones en la regiôn codificante de E7 de VPH16 sugiere una selecciôn positiva evolutiva, lo que puede estar relacionado con las propiedades carcinogénicas ùnicas de VPF116 (Safaeian et al., 2010). De acuerdo con estos resultados, en nuestro trabajo también encontramos que la regiôn codificante de la proteina E7 (1,7%) es mâs conservada cuando se comparô con la regiôn codificante de la proteina E6 (3,1%), y ninguna de las variaciones nucleotidicas en esta regiôn se describian por primera vez. Sin embargo, algunos estudios realizados en muestras procédantes de mujeres de Japôn, Indonesia, Korea y China han descrito una alta frecuencia de mutaciones en la regiôn codificante de E7. De la misma manera que el estudio de las variantes de VPH16, la mayor parte de los estudios de las variantes de VPF118 se han centrado en muestras cervicales de pacientes con câncer (Villa et al., 2000; Burk et al., 2003; De la Cruz-Hemândez et al., 2005; De Boer et al., 2005; Lizano et al., 2006; Xi et al., 2006; Lôpez-Saavedra et al., 2009) y hasta la fecha no hay trabajos en los que se hayan descrito las variantes en la infecciôn anal, y mâs concretamente en HSH. Las variantes de VPH18 en nuestro trabajo se clasificaron en las très ramas filogenéticas descritas para este tipo, 78,3% en la rama Europea, 8,7% en la rama Africana y 6,5% en la rama Asiâtico-Amerindia. Los trabajos de la distribuciôn de las variantes de VPH18 describen la rama filogenética Europea como la mâs prevalente en general, pudiendo variar la distribuciôn de las ramas Asiâtico-Amerindia y Africana en funciôn de las diferentes localizaciones geogrâficas de estudio. En el aho 2004, Calleja-Macias et al., llevan a cabo el estudio de los polimorfismos intratipo de VPFI18 en muestras de mujeres procedentes de México, representando las variantes de la rama Europea el 87% de los casos, y el 13,3% restante 134 ______________________________________________________________________ Discusiôn pertenecian a la rama Africana. En el aho 2005, Arias-Pulido et al, en un estudio realizado en muestras procedentes de mujeres de Estados Unidos, describen las variantes Europeas como las mâs prevalentes (48%), seguidas de las variantes Asiâtico-Amerindias (30%) y las variantes africanas (22%). En el aho 2006 en Estados Unidos, se realizô un estudio de caracterizaciôn de variantes de VPH16 y VPH18 en 1.114 mujeres que presentaban lesiones intraepiteliales. Las variantes Europeas de VPH18 fueron las mâs frecuentes (43,1%), seguidas de las variantes Asiâtico-Amerindias y las variantes Africanas que se distribuyeron homogéneamente (28,6%; 28,3%) (Xi et al., 2006). Un trabajo llevado a cabo en una cohorte de mujeres de Brasil, identihco las variantes Europeas como las mâs prevalentes (80%), seguida de las variantes Africanas (13,3%) y por ultimo las variantes Asiâtico-Amerindias (6,7%) (Sichero et al., 2007). En los paises europeos, el estudio de las variantes de VPH18 es mâs escaso, y en un trabajo realizado en Portugal en el aho 2007, la distribuciôn de variantes fue ligeramente diferente a la observada en el présente trabajo, ya que las variantes de las ramas Europea y Africana se identihcaron con la misma frecuencia (39%) y las variantes de la rama Asiâtico-Amerindia se identificaron en el 22% de las muestras estudiadas, debido posiblemente a la mayor heterogenicidad étnica de la poblaciôn portuguesa, descrita por los autores (Pista et al., 2007). En el présente estudio, ninguna de las muestras analizadas fue clasificada como variante prototipo de VPH18, y solo dos variantes se clasificaron en la rama Asiâtico- Amerindia. Ambas variantes, presentaron uno o dos cambios en la regiôn reguladora que ya habian sido pubÜcados en trabajos previos, y que hasta la fecha, no se ha descrito que puedan afectar al sitio de uniôn de algûn factor de transcripciôn (Burk et al., 2003; Callejas- Macias et al, 2004; Arias-Pulido et al., 2005; De Boer et al, 2005; Pista et al., 2007; Cerqueira et al., 2008). En este estudio, se han identificado seis nuevas variantes de VPH18 pertenecientes a la rama Europea, de acuerdo a la presencia de nuevas mutaciones en la regiôn codificante de E6 y en la regiôn reguladora, bien en posiciones que no se habian descrito en esta rama (SP4286, SP5289) o en posiciones nuevas (SP3754, SP5126, SP6270, SP6268). Entre las sustituciones nuevas descritas en la regiôn reguladora las posiciones nucleotidicas 7527 y 7699, afectaron a los lugares de uniôn de los factores de transcripciôn C/EBP, Oct-1, YYl y TEF-1 y la posiciôn nucleotidica 314 de la regiôn codificante de E6, dio lugar al ùnico cambio de aminoâcido descrito en esta proteina en las variantes de la rama Europea y correspondiô al codôn en posiciôn 70 (D70E). La variante mâs frecuente de la rama Europea fue la representada por la secuencia SP5876, y los cambios que la 135 ______________________________________________________________________ Discusiôn caracterizaron en las regiones codificantes y que fueron caracteristicos de todas las variantes Europeas, dieron lugar a mutaciones silenciosas en las oncoproteinas. De la misma manera, en la region reguladora, las mutaciones descritas en las variantes Europeas no alteraron el sitio de uniôn de ningûn factor de transcripciôn, excepto en aquellas variantes que presentaban mutaciones en posiciones descritas por primera vez. Se identificaron dos variantes pertenecientes a la rama Africana que se diferenciaron entre ellas en una posiciôn nucleotidica de la regiôn reguladora. En la regiôn codificante de E6, dichas variantes sôlo presentaron dos mutaciones que dieron lugar cambios en la secuencia proteica (H80Y, N129K); y como se esperaba por ser uno de los genes mâs conservados de los VPH, sôlo las variantes de esta rama presentaron mutaciones asociadas a cambios en la secuencia de la proteina E7. Todos los polimorfismos detectados en las variantes pertenecientes a esta rama ya habian sido descritos previamente, (Callejas-Macias et al, 2004; Arias-Pulido et al., 2005; De Boer et al., 2005; Pista et al., 2007; Cerqueira et al., 2008). Son muy escasos los trabajos que han caracterizado el significado funcional y las implicaciones en el potencial el potencial carcinogénico de los polimorfismos intratipo de VPH18. La mutaciôn en el codôn 129 de la regiôn codificante de E6, incluida en las variantes asignadas a la rama Africana, estâ altamente conservada en los tipos de alto riesgo oncogénico, sin embargo un trabajo publicado en el aho 2005, reahzando experimentos in vitro para clarificar los efectos de dicha mutaciôn, ha demostrado que este cambio en la regiôn codificante de E6, no afecta a su capacidad para degradar la proteina p53. En este trabajo se describe que la mutaciôn de la posiciôn nucleotidica 491 de la regiôn codificante de E6 de las variantes asignadas a la rama Africana, invierte el patrôn de transcripciôn de la proteina E6 y consecuentemente, muestra un incremento en los niveles de p53, lo que podria explicar en parte, el comportamiento menos agresivo propuesto en las variantes de VPH18 de esta rama (De la Cmz et al., 2005). La infecciôn con variantes no Europeas de VPH16 y VPH18 muestra una tendencia general a estar mâs asociada con lesiones intraepiteliales de alto grado y câncer cervical, como muestran los trabajos llevados a cabo en diferentes localizaciones en el mundo (Lizano et al.,1997; Xi et al.,1997; Zehbe et aZ.,1998b; Villa et al., 2000; Hildesheim et al., 2002; Tomesello et al., 2004, 2008b; De Boer et al., 2005 Xi et al, 2006, 2007; Pista et al., 2007; Sichero et al., 2007). En el aho 1996 Xi et al. observaron que las variantes no prototipo de VPH16 estaban mâs frecuentemente asociadas con el desarrollo de lesiones cervicales que las variantes prototipo. El mismo grupo de investigadores en el aho 1998, observaron 136 ______________________________________________________________________ Discusiôn resultados similares en una serie de muestras de carcinomas anales, en las que las variantes no prototipo fueron mâs prevalentes que las variantes prototipo de VPH16 (Xi et al,, 1998). Tras estas observaciones y dado que la variante prototipo de VPH16 pertenece a la rama Europea en base a su relaciôn geogrâfica y filogenética. Villa et al establecieron como hipôtesis en un estudio que realizaron en el ano 2000, que las diferencias en la atribuciôn del riesgo entre variantes no prototipo o prototipo descritas en diferentes trabajos, podrîan ser indicativas de claras diferencias en la capacidad para inducir carcinogénesis para los tipos de alto riesgo oncogénico de las diferentes âreas geogrâficas. Los resultados que se obtuvieron en este trabajo en una cohorte de mujeres en Brasil, corroboraron los datos anteriores al describir que las infecciones con las variantes no Europeas de VPH16 y VPH18 tenian una tendencia general a persistir mâs frecuentemente y a estar mâs asociadas con lesiones pre-invasivas (Villa et al, 2000). Estudios posteriores han confirmado estos resultados en las variantes no Europeas de VPH16, especialmente para las variantes Asiâtico-Americanas, que no sôlo tienen mâs tendencia a persistir sino que estân también mâs asociadas con un riesgo mayor de desarrollo de lesiôn cervical, como indican estudios de cohortes llevados a cabo en Brasil y Estados Unidos (Sichero et al., 2007; Xi et al., 2007). Los resultados para las variantes Asiâtico-Americanas de VPH16 en otros paises latinoamericanos como México (Berumen et al., 2001; Del Refugio et al, 2004) o Costa Rica (Hildesheim et al., 2001) son similares, al detectar frecuencias mâs elevadas y estadisticamente significativas de estas variantes en pacientes con câncer cervical. En el caso concreto de México, los autores describen que las clases a /c de las variantes Asiâtico-Americanas se localizan con mayor frecuencia en pacientes con câncer y en mujeres jôvenes con tumores mâs agresivos, siendo muy baja la frecuencia con la que se localizan las variantes Asiâtico-Americanas en los casos contrôles. En Europa, los datos obtenidos de los trabajos que se han realizado en Italia y en Portugal, confirman también que la frecuencia de las variantes no Europeas aumenta notablemente con la severidad de la lesiôn, sugiriendo este papel mâs relevante en la oncogenicidad (Tomesello et al., 2004, 2008b; Pista et al, 2007). Estos datos pueden corroborar la hipôtesis de que la elevada incidencia de câncer cervical observada en Africa y Latinoamérica, podria estar asociada con la presencia de variantes de VPH16 diferentes a la variante Europea o prototipo (Pista et al. 2007). Aûn con lo anteriormente descrito, los datos son contradictorios, y a que algunos estudios apuntan que no existe tal asociaciôn (Schlecht et al., 2005; Rajeevan et al, 2005; Beskow et al, 2005) y que las diferencias en estos resultados podrîan reflejar las diferencias genéticas entre las poblaciones, en concreto polimorfismos genéticos del 137 ______________________________________________________________________ Discusiôn complejo mayor de histocompatibilidad, o deberse al predominio de las variantes Europeas en las poblaciones de estudio (Zehbe et al., 1998a; Zehbe et al., 2001; Beskow et al, 2005). En el caso de VPH18, los resultados de los trabajos realizados son similares y la infecciôn con ciertas variantes tiene una tendencia general a estar asociada con lesiones pre-invasivas y cancer cervical. Cuando se estudia la distribuciôn de las variantes de VPH18 en diferentes tipos histolôgicos de cancer cervical asi como en lesiones premalignas y epiteho normal, las asociaciones descritas llevan a considerar que las variantes de este tipo viral tienen comportamientos biolôgicos diferentes, como se describe en VPH16. Por ejemplo, la variante Africana de VPH18 se ha localizado, exclusivamente en carcinoma celular escamoso, a diferencia de las variantes Europeas y Asiâtico-Amerindias, que se han localizado en otros tipos histolôgicos de câncer cervical (adenocarcinoma, tumores neuroendocrinos) que presentan un peor pronôstico clinico. Las variantes Europeas, en concreto, muestran una mayor tendencia a persistir, y las variantes Asiâtico-Amerindias tienen mayor capacidad de inducir la formaciôn de tumores in vivo (Burk et al, 2003; De Boer et al, 2005; De la Cruz-Hemândez et al, 2005; Lizano et al, 2006; Xi et al, 2006, 2007; Pista et al, 2007; Sichero et al, 2007). Existen pocos trabajos en los que se describen los polimorfismos genéticos para tipos de alto riesgo diferentes de VPH16 y VPH18, debido a la baja prevalencia con la que se observan en lesiones precursoras de câncer y en câncer, por lo que el anâlisis y discusiôn de los resultados de variabilidad obtenidos en los tipos VPH31, VPH33 y VPH52 incluidos en el présente estudio han sido mâs limitados (Calleja-Macias et al, 2004, 2005; Raiol et al, 2009). La prevalencia global de infecciones por VPH31 en nuestra poblaciôn ha sido del 7,3%, muy similar a la descrita en un trabajo llevado a cabo en una cohorte de mujeres canadienses infectadas o no por VIH-1 (Gagnon et al, 2005). El anâlisis de las variantes de las muestras de pacientes infectados por VPH31, nos permitiô identificar la secuencia prototipo (17,2%) y ocho variantes mâs, siendo la variante mâs frecuente la representada por la secuencia SP4031 que incluyô un cambio ùnico en la posiciôn nucleotidica 743 de la regiôn codificante de E7, y que dio lugar a un cambio de aminoâcido bâsico (Lisina) a âcido (Âcido Glutâmico) en el codôn en posiciôn 62. Este cambio ademâs, fue descrito en el resto de variantes identificadas en este trabajo, asi como en otros trabajos de polimorfismos de este genotipo viral (Calleja-Macias et al, 2004; Safaeian et al, 2010). Todos los cambios identificados, en las variantes analizadas, en las très regiones habian sido descritos previamente, con la ùnica excepciôn de la posiciôn nucleotidica 7534, que 138 ______________________________________________________________________ Discusiôn dio lugar a una nueva variante representada por la secuencia SP3400, y que altera el sitio de uniôn de SRY. La variaciôn identificada en la posiciôn nucleotidica 7659 en la regiôn reguladora, da lugar a la alteraciôn de un sitio de uniôn de C/EBP y SRY que ha sido descrita en VPH52 (Aho et al, 2003), sin embargo no se identifica con frecuencia en VPH31. En los escasos estudios de este tipo llevados a cabo en mujeres, la variante prototipo (21,9%) es la que se détecta con mâs frecuencia (Gagnon et al, 2005), aunque la diferencia podria deberse al tipo de muestras y la poblaciôn de estudio. En el anâlisis de las variantes de VPH33, se obtuvieron ademâs de la secuencia prototipo, nueve variantes mâs. La variante prototipo fue la mâs prevalente (36,4%), de la misma manera que en los escasos trabajos de variantes que se han llevado a cabo para este tipo (Gagnon et al., 2004; Khouadri et al., 2006). Le siguiô en frecuencia la variante representada por la secuencia SP3614, que presentô el mayor numéro de cambios en las très regiones analizadas (13) incluyendo la deleciôn de la secuencia en tandem de 79 pb localizada en la posiciôn 7596 de la regiôn reguladora. Esta deleciôn se ha identificado en otras dos variantes de VPH31 (SP4570 y SP4510). La presencia de esta repeticiôn perfecta en tândem después de un posible origen de replicaciôn en la regiôn reguladora, es una caracteristica ùnica de VPH33. En la secuencia original (Cole et al., 1989) y en trabajos posteriores (Gagnon et al., 2004; Khouadri et al., 2006) se ha descrito la repeticiôn con un tamaho de 78 pb, pero un anâlisis exhaustivo de la misma en secuencias descritas previamente y disponibles en bases de datos de secuencias intemacionales, nos ha permitido establecer que el tamano de la repeticiôn en la secuencia corresponde a 79 pb y no a 78 pb como se definiô inicialmente. En un principio se sugiriô que la repeticiôn localizada corriente arriba del promotor, podria actuar como un potenciador de la transcripciôn (Seif et al., 1979; Benoist et al., 1981; Cole et al., 1989). Sin embargo, otros trabajos llevados a cabo en otros tipos virales (SV40) han mostrado que las repeticiones en tândem similares tienen un efecto opuesto (Nakagoshi et al, 1990), posiblemente por la competiciôn entre la proteina c-myc y los transactivadores. Son necesarios mâs estudios funcionales para describir el posible efecto que esta deleciôn tiene al nivel de la transcripciôn viral; aunque en un trabajo realizado en el aho 2004 en una cohorte de mujeres infectadas y no infectadas por VIH-1, los autores describen una asociaciôn entre la presencia de esta deleciôn y la persistencia de la infecciôn por VPH33 (Gagnon et al. 2004). En el présente trabajo, se han identificado dos nuevas variantes de VPH33 (representadas por las secuencias SP5818 y SP4046), que se caracterizan por presentar cambios en dos posiciones no descritas previamente en la 139 ______________________________________________________________________ Discusiôn regiôn codificante de E6 y en la regiôn reguladora. Los cambios présentes en la regiôn codificante de E6 dieron lugar a dos mutaciones en la secuencia proteica. El anâlisis de las 22 muestras infectadas por VPH52, nos permitiô identificar la secuencia prototipo y 13 variantes mâs. La variante prototipo se describiô como la mâs frecuente (36,4%), al igual que en otros trabajos publicados de polimorfismos en este genotipo viral (Aho et al, 2003, 2004; Calleja-Macias et al., 2005; Gagnon et al., 2007). Con la excepciôn de la variante prototipo y la variante nueva representada por la secuencia SP6187, todas las variantes descritas en el présente estudio se identificaron en muestras individuales. En cuatro de las 14 variantes de VPH52, se observaron deleciones en la regiôn reguladora que estân localizadas en una regiôn asociada a sitios de uniôn para el factor de transcripciôn AP-1. El efecto que estas deleciones podrlan tener en el potencial carcinogénico de VPH es desconocido, aunque los estudios llevados a cabo para el factor de transcripciôn AP-1, indican que tiene un papel central en la regulaciôn de ciertos tipos de VPH taies como VPH16 y VPH18. En el caso concreto de algunos trabajos, se observan niveles alterados en las actividades de uniôn y expresiôn de este factor de transcripciôn y miembros de esta fanülia (c-Jun, JimB, JunD, c-Fos, FosB, Fra-1 y Fra-2) en câncer, indicando que puede tener un papel importante en el proceso carcinogénico (Prusty et al., 2005; De Wilde et al., 2008). La mayoria de las variantes de VPH52 descritas en este trabajo, muestran mutaciones en la regiôn reguladora, siendo uno de los cambios mâs frecuentes, la alteraciôn de los sitios de sitio de uniôn de la proteina C/EBP. Un trabajo realizado en el aho 2004, describe la asociaciôn de este hecho con la persistencia de la infecciôn con VPH52, por extensiôn de los resultados obtenidos en un estudio funcional llevado a cabo en el tipo 18 empleando como modelo células HeLa (Bauknecht et al.,1998). Este trabajo indica que la sobreexpresiôn de G/EBP reprime la regiôn reguladora, y especificamente, interhere con la uniôn de la proteina a la caja TATA de la regiôn reguladora de VPH18 (Aho et al., 2004). Esta mutaciôn también estâ descrita en VPH33, pero como en el caso de VPH52 son necesarios estudios funcionales en estos tipos virales, para conocer el efecto que estas alteraciones pueden tener en la historia natural de la infecciôn y en el proceso carcinogénico. En la regiôn codificante de E6 se ha descrito la variaciôn en la posiciôn nucleotidica 350, identificada en las variantes Europeas de la clase E-350G de VPH16 y asociada en este tipo con la persistencia viral y el desarrollo de la neoplasia intraepitelial cervical. En VPH52, el cambio dio lugar a una mutaciôn sin sentido, por lo que posiblemente no tiene las mismas implicaciones biolôgicas y fue detectada con una 140 ______________________________________________________________________ Discusiôn frecuencia menor que en el caso de VPH16. En el anâlisis de variabilidad intratipo de VPH52, se identificaron très variantes nuevas, de acuerdo a mutaciones en la region reguladora y en la regiôn codificante de E6, aunque en esta ultima el cambio en la posiciôn nucleotidica 332, no dio lugar a un cambio de aminoâcido. Los trabajos llevados a cabo para estudiar el efecto que los polimorfismos detectados en las variantes de los tipos de VPH31, 33 y 52 tienen en las propiedades biolôgicas y bioquimicas del virus y su implicaciôn en el proceso carcinogénico son muy escasos, y los resultados varian segûn el tamano muestral, el origen de la poblaciôn y si las muestras pertenecen a pacientes que estaban o no infectados por VIH-1. En el aho 2004 un grupo de Canadâ, publicô dos trabajos en los que se describia por primera vez la persistencia de infecciôn para VPH52 y los polimorfismos de VPH33 y VPH35 respectivamente, en una cohorte de mujeres reclutadas durante el periodo de 1993-2000. La comparaciôn de los resultados permitiô establecer que las mujeres infectadas por variantes no prototipo de VPH52, tenian mâs probabilidad de tener una infecciôn persistente cuando se comparaban con mujeres que estaban infectadas por la variante prototipo (Aho et al., 2004). Un anâlisis similar se llevô a cabo en las mujeres infectadas por VPH33 y VPH35 y los resultados proporcionaron evidencia epidemiolôgica de que las variantes de estos tipos diferian en su capacidad de inducir una infecciôn persistente, y las mujeres con una infecciôn persistente estaban infectadas mâs frecuentemente por las variantes no prototipo (Gagnon et al., 2004; Aho et al., 2004). Los resultados de estos trabajos indicaron una tendencia de las variantes no prototipo en otros tipos diferentes de VPH16 y VPH18, a inducir persistencia de la infecciôn y, estar potencialmente asociadas a la presencia de lesiones cervicales. En el aho 2001 Xin et al, estudiaron las variaciones en la proteina E6 en los tipos VPH33, 52 y 58 en mujeres japonesas con neoplasia intraepitelial cervical y câncer cervical invasivo. Los resultados del trabajo describieron una distribuciôn de variantes que diferia segûn el tipo estudiado, asi para VPH33 las variantes se observaron mâs frecuentemente en las mujeres que presentaban GIN I/II que en los casos de GIN III/câncer cervical invasivo (71% vs. 15%; p = 0,02). Las variantes de VPH52 se detectaron en el 98% de los casos y en el tipo VPH58 fue la variante prototipo la mayoritaria, detectândose en el 98% de las muestras infectadas por dicho genotipo viral. Esto puede sugerir que la relaciôn entre las variaciones en la regiôn codificante de E6 y el potencial oncogénico puede ser tipo especifico. La mayor variabilidad descrita en este trabajo en la regiôn reguladora fue en VPH33, de acuerdo con la presencia en ciertas variantes de la deleciôn de 79 pb y la menor 141 ______________________________________________________________________ Discusiôn variabilidad correspondiô a VPH31, como se ha observado en otros trabajos realizados en este genotipo viral (Gagnon et al. 2004; Safaeian et al. 2010). Para el resto de tipos descritos en este trabajo, las variabilidades descritas en esta regiôn fueron muy similares entre ellos (VPH16 5,2%; VPH18 5,8%; VPH52 4-5,6%). En las regiones codificantes de E6 y E7, la variabilidad fue muy similar entre los distintos tipos estudiados, y menor que cuando se comparô con la regiôn reguladora, siendo estas diferencias estadisticamente significativas en el caso de la regiôn codificante de E7. En dicha regiôn ademâs, se observaron los valores de variabilidad menores, indicando que la regiôn estâ muy conservada en los diferentes tipos de VPH. Entre los tipos estudiados no se encontraron inserciones, y las deleciones descritas sôlo se observaron en la regiôn reguladora. Los datos de variabiHdad de las regiones analizadas presentados en el présente estudio, estân en la linea con los que describen los trabajos realizados anteriormente en muestras cervicales (Giannoudis et al, 2001; Aho et al., 2003, 2004; Gagnon et al, 2004; Tomesello et al, 2004; Cheng et al, 2005; Pista et al, 2007; Cerqueira et al., 2008). En VPH16 no se describiô la presencia de infecciones multiples por diferentes variantes o variantes recombinantes con diferente asignaciôn filogenética en las diferentes regiones analizadas. Yamada et al, en 1997, en un trabajo exhaustivo de anâlisis de las variantes de VPH16, describen la presencia de infecciones por mâs de una variante como un hecho bastante infrecuente (0,7%). Algunos autores han sugerido que VPH establece una infecciôn persistente en la que una ùnica variante de VPH puede detectarse o predominar, y que la co-infecciôn con variantes adicionales de VPH16, en los pocos casos que se llega a detectar, es en poblaciones minoritarias (Wheeler et al., 1997; Yamada et al. 1997; Mayrand et al. 2000; Arias-Pulido et al., 2005). Los trabajos realizados en otros tipos de VPH, que incluyen VPH31, 33, 35 y 52 han descrito resultados similares en la detecciôn de presencia de infecciones por mâs de una variante, entre los que no se han observado nunca o son poco comunes (Aho et al., 2004; Gagnon et al., 2004, 2005). Un estudio llevado a cabo en variantes de VPH18 (Arias-Pulido et al., 2005), describe datos similares, y las infecciones mixtas de variantes se detectaron en una frecuencia muy baja (1%). En un trabajo llevado a cabo en una cohorte de mujeres infectadas y no infectadas por VIH-1 e infectadas por VPH16 y VPH18, la frecuencia con la que se detectaron infecciones con mâs de una variante fue un poco mayor en mujeres infectadas por VIH-1, en VPH16 se detectaron con una frecuencia del 6% y en VPH18 con una frecuencia del 1,2% (Schlecht et al., 2005). En el présente trabajo, se ha descrito la presencia de infecciones por mâs de una variante en très muestras de VPH18, al asignarse a mâs de una linea filogenética en las 142 ______________________________________________________________________ Discusiôn diferentes regiones analizadas (6,5%). Si este hecho es superior en los individuos inmunodeprimidos por la presencia del VIH-1, puede potencialmente proporcionar un modelo para la protecciôn inmunolôgica. Sin embargo en el présente estudio, el reducido numéro de muestras con infecciones por una mezcla de variantes no permite extraer conclusiones, y son necesarios estudios con un mayor tamano muestral para conocer la posible asociaciôn de este hecho con la coinfecciôn por VIH-1. 5.3. Influencia de la coinfecciôn por VIH-1 en la distribuciôn de variantes de tipos de VPH de alto riesgo Los escasos trabajos de variantes realizados en pacientes infectados por VIH-1 se han realizado en la mayoria de los casos, en muestras cervicales, con la excepciôn de algunos trabajos de muestras anales. En el aho 1992, Icenogle et al., Uevaron a cabo un trabajo en Zaire de los polimorfismos del gen 11 de VPH16 en mujeres infectadas o no por VIH-1. Los resultados del estudio describieron una distribuciôn similar de las variantes entre pacientes infectados y no infectados por VIH-1, aunque en este estudio el tamaho muestral fue muy pequeho (N = 20). En el aho 2004, Chatuverdi et al., realizaron un estudio de las variantes de la regiôn codificante de E6 de VPH16 en mujeres de Estados Unidos infectadas o no por VIH-1. En ambos grupos de estudio se describieron las variantes de la rama Europea como las mâs prevalentes, con una frecuencia del 57,9% y del 54,6%, respectivamente. Los autores del trabajo, describen entre las variantes de la linea Europea, una prevalencia significativamente mayor de la mutaciôn en la posiciôn nucleotidica 350 en las mujeres infectadas por VIH-1, y una tendencia incrementada de la prevalencia de las variantes Asiâtico-Americanas en las mujeres infectadas por VIH-1. En el aho 2005, Schlecht et al., determinaron la distribuciôn de variantes en la regiôn codificante de E6 de los genotipos virales 16 y 18, en una cohorte de mujeres infectadas o no por VIH-1 también norteamericanas. En ambos grupos de estudio, las variantes Europeas fueron las mâs prevalentes, con valores muy similares (63-69%). En VPH18, entre las mujeres no infectadas por VIH-1, las variantes mâs frecuentes pertenecieron a la rama Europea (58%), sin embargo en las mujeres infectadas por VIH-1, las variantes mâs frecuentes correspondieron a linea Africana (49%). En un estudio de los polimorfismos de la regiôn codificante de E6 de VPH16 en muestras anales de una cohorte combinada de mujeres y hombres infectados o no por VIH-1 en San Francisco, no se observô asociaciôn entre la presencia de variantes no Europeas de VPH16 y la infecciôn por VIH-1 (Da Costa é ta l, 2002). 143 ______________________________________________________________________ Discusiôn Los datos de los estudios realizados en paises europeos describen las variantes de la rama Europea como las mâs prevalentes tanto en pacientes infectados como no infectados por VIH-1. En un estudio realizado en Italia, los autores identificaron las variantes de VPH16, en 227 mujeres infectadas o no por VIH-1. Las variantes Europeas de la clase E-350G fueron las mâs prevalentes en las mujeres infectadas y no infectadas por VIH-1, con una frecuencia del 66,7% en las mujeres infectadas por VIH-1 y del 50% en las mujeres no infectadas por VIH-1. Los autores sôlo detectaron variantes de la linea Africana tipo 2 en mujeres infectadas por VIH-1, por lo que sugieren ciertas diferencias en el comportamiento sexual entre las mujeres infectadas y no infectadas por VIH-1 (Tomesello et al., 2008b). En Espaha el ùnico trabajo llevado a cabo, se publicô en el aho 2001 y los autores identificaron las variantes de la regiôn codificante de E6 de VPH16 en mujeres infectadas o no por VIH-1 (Perez-GaUego et al., 2001). Las variantes mâs prevalentes fueron las que pertenecian a la rama Europea, siendo del 89,9% para las mujeres no infectadas por VIH-1 y 92,3% para las mujeres infectadas por VIH-1. En nuestro trabajo, las variantes de VPH16 pertenecientes a la rama Europea han sido también las mâs prevalentes entre los pacientes infectados por VIH-1 (91,2%) y no infectados por VIH-1 (82,2%) y no se han establecido diferencias estadisticamente significativas en la distribuciôn en ambos grupos de estudio en el anâlisis univariable de la infecciôn con variantes Europeas frente a la infecciôn con variantes no Europeas. La variante mâs prevalente de la rama Europea en ambos grupos de estudio, fue la variante representada por la secuencia SP4152 asignada a la clase E- 350G, y no se observaron diferencias estadisticamente significativas en su distribuciôn (38,2% y 28,9%; p = 0,38. Datos no mostrados). Al igual que en el estudio llevado a cabo en Italia (Tomesello et al., 2008b) la mutaciôn mâs frecuente se observô en la posiciôn 350 de la regiôn codificante de E6, y se identified de manera homogénea entre los pacientes infectados por VIH-1 y en los no infectados por VIH-1 (2,8% vs. 37,2%; p = 0,25. Datos no mostrados). En las variantes de las lineas Asiâtico-Americana y Africana, se observô la mayor frecuencia entre los pacientes infectados por VIH-1, aunque no se describieron diferencias entre los gmpos de estudio. La menor prevalencia entre las variantes de VPH16 de este trabajo, se detectô para la linea Africana tipo 2, y no se establecieron como en el caso de Italia, asociaciones entre los dos grupos de estudio para esta rama filogenética. En las variantes de VPH18, los trabajos llevados a cabo en pacientes infectados por VIH-1 son también muy escasos. Un trabajo realizado en Brasil, détermina los polimorfismos de VPH18 en la regiôn reguladora y en las regiones codificantes de E6 y 144 ______________________________________________________________________ Discusiôn LI en mujeres infectadas o no por VIH-1, aunque los autores no asocian la presencia de determinadas variantes pertenecientes a las diferentes ramas filogenéticas con el estatus VIH-1 (Cerqueira et al., 2008). En el présente estudio, las variantes de VPH18 mâs prevalentes fueron las que se asignaron a la rama Europea y se distribuyeron homogéneamente entre los pacientes infectados o no por VIH-1, aunque en esta rama la variante representada por la secuencia SP6015 sôlo se identificô en pacientes infectados por VIH-1. En el resto de tipos analizados en el présente estudio, no existen datos bibliogrâficos sobre la distribuciôn de las variantes entre pacientes infectados o no por VIH-1. En este estudio, no se han detectado diferencias en la distribuciôn de las variantes de VPH31, VPH33 y VPH52 entre los pacientes infectados o no por VIH-1, observândose una distribuciôn homogénea de las variantes de los diferentes tipos estudiados, lo que puede sugerir que en la poblaciôn estudiada no hay diferencias en el comportamiento sexual entre los pacientes infectados o no por VIH-1, aunque son necesarios mâs estudios con un mayor tamano muestral. 5.4. Influencia del origen geogràfico de les pacientes en la distribuciôn de variantes de tipos de VPH de alto riesgo De forma clâsica, la distribuciôn de variantes de VPH se ha asociado con el origen étnico de los pacientes, siendo una de las variables asociada a la posible evoluciôn conjunta del VPH y su hospedador (Villa et al., 2000; Giannoudis et al., 2001; Aho et al., 2003, 2004; Gagnon et al., 2004; Tomesello et al, 2004; Del refugio et al., 2004; Pista et al., 2007; Junes-Gill et al., 2008; Pillai et al, 2009). En el présente estudio, se analizô la distribuciôn de las variantes de acuerdo al origen geogràfico de los pacientes, teniendo en cuenta que la poblaciôn de estudio se dividia fundamentalmente, en pacientes de origen espanol y latinoamericano. En las variantes de VPH16, los trabajos realizados en poblaciones en México (Bemmen et al., 2001; Calleja-Macias et al., 2004; Del Refugio et al, 2004) y Costa Rica (Hildesheim et al., 2001), los datos publicados indican que las variantes Asiâtico-Americanas son las mâs frecuentes. Los resultados de dos estudios llevados en cabo en Brasil, describen valores de prevalencia muy similares en las variantes Asiâtico- Americanas (43-41%) y en las variantes Europeas (42-50%), aunque estas ligeras diferencias en poblaciones de Brasil, pueden ser atribuidas a la elevada mezcla poblacional originada por los cruces interétnicos (Cmz et al, 2004; Junes-Gill et al, 2008). En este trabajo los datos observados en ambos grupos de estudio incluyeron las variantes asignadas a la rama Europea como las mâs prevalentes, de la misma forma que se ha observado en otros paises europeos como Portugal (Pista et al, 2007) o Italia (Tomesello et 145 ______________________________________________________________________ Discusiôn al., 2008b) con muestras poblacionales que incluian pacientes de diferentes origenes geogrâficos. En este estudio ademâs, las variantes Asiâtico-Americanas y Africanas se distribuyeron de forma homogénea entre los pacientes tanto de origen espanol como latinoamericano, y entre los pacientes procedentes de paises latinoamericanos los valores de prevalencia que mostraron las variantes Asiâtico-Americanas fueron bajos en comparaciôn con los descritos en los trabajos llevados a cabo en paises de Latinoamérica. La bibliografia de variantes de VPH18 en paises latinoamericanos incluye dos trabajos llevados a cabo en mujeres de Brasil (Villa et al., 2000; Sichero et al., 2007) y un estudio de mujeres mexicanas infectadas tanto por VPH16 como VPH18 (Lizano et al., 2006). En los très trabajos, las variantes que se detectaron con mâs frecuencia pertenecian a la linea Europea, lo que es similar a los resultados observados en el présente trabajo, en el que la mayor prevalencia descrita fue en las variantes asignadas a la rama Europea tanto en pacientes espanoles como en pacientes latinoamericanos. Sin embargo observamos que ser un hombre latinoamericano, estaba asociado con una prevalencia entre siete y ocho veces mayor de estar infectado con una variante asignada a una rama no Europea, lo que podria deberse a diferencias genéticas caracteristicas propias de la poblaciôn latinoamericana, aunque serân necesarios mâs estudios para evaluar esta posibilidad. En el anâlisis de polimorfismos llevado a cabo en VPH31, los autores refieren diferencias con respecto a la raza, y describen que en las mujeres caucâsicas se observa con mâs frecuencia que estân infectadas por la variante prototipo (Gagnon et al., 2005). En nuestro trabajo, la variante prototipo se localizô en los hombres espanoles (18,2%) y en los hombres latinoamericanos (16,7%), sin embargo fueron las variantes no prototipo las que se identificaron con mâs frecuencia, aunque no observaron diferencias estadisticamente significativas en la distribuciôn. En VPH33, los autores de un estudio de los polimorfismos en las très regiones del genoma estudiadas en nuestro trabajo (regiones codificantes E6 y E7, y regiôn reguladora), no describen diferencias en la distribuciôn de las variantes prototipo y no prototipo, en muestras obtenidas de mujeres procedentes de Canadâ y Brasil (Khouadri et al., 2006). En los pacientes de nuestro estudio tampoco se observaron diferencias estadisticamente significativas en la distribuciôn de las variantes no prototipo ya que se identificaron en ambos grupos de pacientes, pero las variantes prototipo sôlo se observaron en los pacientes espanoles. En un estudio llevado a cabo en Canada de las variantes de VPH52 en las très regiones analizadas en nuestro trabajo, los autores describen la variante prototipo con mâs frecuencia en las mujeres de origen caucâsico y las variantes no prototipo entre las mujeres descendientes de mujeres africana, tal y como se 146 ______________________________________________________________________ Discusiôn ha descrito para el tipo viral 33. En las variantes detectadas en nuestro trabajo, en los hombres latinoamericanos las variantes se distribuyeron homogéneamente, y aunque en los hombres espanoles se detectaron con mas frecuencia las variantes no prototipo (76,9%), estas diferencias no fueron estadisticamente significativas. Estos resultados de distribuciôn homogénea de las variantes de los diferentes tipos virales en pacientes procedentes de distintos palses de origen, podrîan ser consecuencia de que los pacientes llevan mucho tiempo en Espana y se han infectado con las variantes circulantes, que los comportamientos sexuales entre los pacientes son muy similares, o que las poblaciones no estân aisladas. Sin embargo, debido a que los escasos datos bibliogrâficos asocian las diferencias en la distribuciôn de las variantes al diferente origen étnico de los pacientes, no se pueden extraer conclusiones. Una limitaciôn importante del présente estudio para analizar el efecto de la infecciôn por VIH-1 y el origen geogràfico de los pacientes, en la distribuciôn de las variantes de los genotipos de VPH de alto riesgo mâs relevantes en el câncer anal, es el reducido tamano muestral en cada uno de los tipos virales analizados, si bien es, hasta el momento, el primer estudio realizado en Espaha sobre la caracterizaciôn de variantes de VPH en la infecciôn anal de HSH infectados y no infectados por VIH. La ampliaciôn del présente estudio requiere el anâlisis de cohortes multicéntricas de pacientes HSH infectados y no infectados por VIH-1. Asi mismo, no se ha podido establecer correlaciones entre la presencia de determinadas variantes y las lesiones asociadas a la infecciôn por VPH. Este hecho, se debe a que se carecia de los datos de citologia anal de dichos pacientes. El cribado de lesiones preneoplâsicas cervicales mediante citologia y tinciôn de Papanicolaou es la intervenciôn preventiva de câncer que mâs éxito ha tenido en la historia de la Medicina, reduciendo en un 75% el câncer de cérvix en los paises desarrollados en los ûltimos 50 ahos. El cribado de cancer de ano se realiza mediante tacto rectal y se ha de realizar anualmente, aun en ausencia de otras técnicas de diagnôstico y tratamiento de AIN (Palefsky et al, 2008). A pesar de haber demostrado ser coste-efectiva en HSH infectados por VIH-1 (Goldie et al, 1999) al mismo nivel que otras intervenciones ampliamente aceptadas (cribado de câncer de colon en poblaciôn general, profilaxis de neumonia por Pneumocystis), la citologia anal no se ha implementado de forma general y en el momento del estudio existian importantes limitaciones para su realizaciôn en este grupo de pacientes. 147 CONCLUSIONES Conclusiones 6. CONCLUSIONES 6.1. La prevalencia global de infecciôn por VPH de alto riesgo obtenida en muestras anales procedentes de hombres que practican sexo con hombres (HSH) fue del 54,9%, siendo significativamente mayor en aquellos individuos infectados por VIH-1 (74,8 vs. 43,3%; p < 0,001). Ademâs, estar infectado por VIH-1 y procéder de un pais latinoamericano se asocia con una probabilidad entre cuatro y cinco veces mayor (OR 4,6; IC95%:1,3-16,4) de presentar una infecciôn anal por VPH de alto riesgo. 6.2. Los genotipos de VPH de alto riesgo mâs prevalentes fueron VPH16 (21,9%), seguido por VPH18 (12,1%) y VPH51 (10,6%). Se observaron diferencias estadisticamente significativas en la distribuciôn de todos los genotipos de alto riesgo entre los pacientes infectados y no infectados por VIH-1 excepto en VPH35, VPH39 y VPH45. La prevalencia de infecciones por multiples tipos de VPH de alto riesgo oncogénico fue del 34,9%, siendo significativamente mayor en los pacientes infectados por VIH-1 (24% vs. 55,2% p < 0,001). 6.3. El anâlisis filogenético de las variantes en las très regiones del genoma analizadas nos ha permitido establecer la ausencia de variantes recombinantes o infecciones por multiples variantes en los tipos de VPH16, VPH31, VPH33 y VPH52 en las muestras analizadas. En VPH18 se identificaron très variantes recombinantes o infecciones multiples. Dos de ellas fueron variantes recombinantes de las ramas Europea y Asiâtico- Amerindia y la tercera de las ramas Europea y Africana. 6.4. El estudio de las variantes de VPH16 y VPH18 nos permitiô establecer, que en la poblaciôn estudiada, las variantes pertenecientes a la rama Europea son las mayoritarias Las variantes no prototipo fueron las mâs frecuentemente detectadas en los tipos VPH31, VPH33 y VPH52. 6.5. En el présente estudio se han identificado 13 variantes no descritas previamente en la bibliografia, una de VPH16 (1,2%), seis de VPH18 (13%), una de VPH31 (3,4%), dos de VPH33 (9,1%) y très variantes de VPH52 (13,6%). 6.6. Los estudios funcionales sobre las implicaciones de las mutaciones présentes en las diferentes variantes de VPH se han focalizado en VPH16. Algunos estudios han asociado 151 Conclusiones la presencia de la mutaciôn en la posiciôn 350(T^G) de la regiôn codificante de la proteina viral E6, con la persistencia de la infecciôn viral y el incremento del potencial oncogénico de estas variantes. En el présente trabajo, dicha mutaciôn se ha detectado en el 55,4% de los pacientes infectados por VPH16. Los efectos a nivel biolôgico del resto de las mutaciones detectadas, tanto en las regiones codificantes como en la regiôn reguladora, son desconocidos en la actualidad y deben ser objeto de futuras investigaciones. 6.7. La infecciôn por VIH-1 no influye en la distribuciôn de las variantes entre los pacientes. En las variantes de VPH16 y VPH18, las Europeas fueron las mayoritarias tanto en los pacientes infectados por VIH-1 como en los no infectados. De manera similar, en VPH31, VPH33 y VPH52 las variantes no prototipo fueron mayoritarias en los dos grupos de estudio. 6.8. El origen geogràfico de los pacientes no influye en la distribuciôn de las variantes en los genotipos VPH16, VPH31, VPH33 y VPH52. Sin embargo, en VPH18, se observô que los pacientes procedentes de paises latinoamericanos presentaban mâs frecuentemente variantes clasificadas como no Europeas que los pacientes de origen espanol. 152 BIBLIOGRAFIA ____________________________________________________________________ Bibliografia ■ Abramowitz L., Benabderrahmane D., Baron G., Walker F., Yeni P., Duval X. Systematic évaluation and description of anal pathology in HIV-infected patients during the HAART era. Dis. 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