UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Departamento de Microbiología III TESIS DOCTORAL Identificación de reductasas de ácidos hidroxicinámicos y sus derivados en Lactobacillus plantarum WCFS1 MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Laura Santamaría Rubio Directores Rosario Muñoz Moreno Blanca de las Rivas González del Rey Félix López de Felipe Toledano Madrid, 2017 © Laura Santamaría Rubio, 2017 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CC. BIOLÓGICAS Departamento de Microbiología III Identificación de reductasas de ácidos hidroxicinámicos y sus derivados en Lactobacillus plantarum WCFS1 Memoria presentada por: LAURA SANTAMARÍA RUBIO para optar al grado de doctor DIRECTORES: Rosario Muñoz Moreno Blanca de las Rivas González del Rey Félix López de Felipe Toledano Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Madrid, 2017 Dña. ROSARIO MUÑOZ MORENO, PROFESORA DE INVESTIGACIÓN DEL CSIC, Dña. BLANCA DE LAS RIVAS GONZÁLEZ DEL REY, CIENTÍFICO TITULAR DEL CSIC, Y D. FÉLIX LÓPEZ DE FELIPE TOLEDANO, CIENTÍFICO TITULAR DEL CSIC, CERTIFICAN: Que la memoria del trabajo de investigación titulada: “Identificación de reductasas de ácidos hidroxicinámicos y sus derivados en Lactobacillus plantarum WCFS1” que presenta Dña. Laura Santamaría Rubio, en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Complutense de Madrid para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Departamento de Procesos del Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición del CSIC, bajo nuestra dirección. Y para que conste a los efectos oportunos, firmamos el presente certificado en Madrid a 7 de Abril de 2017. Directores de la Tesis Dra. Rosario Muñoz Moreno Dra. Blanca de las Rivas González del Rey Dr. Félix López de Felipe Toledano AGRADECIMIENTOS Esta tesis ha sido posible gracias a la beca BES-2012-053470, perteneciente al subprograma de Formación de Personal Investigador (FPI), concedida por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. Y también por la dirección del Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos y Nutrición que me permitió utilizar sus instalaciones para su realización. Bueno, y ahora a los que no pusieron pelas (sino algo más valioso). Una hoja en blanco para poner lo que yo quiera, qué peligro. En fin, habrá que hacerlo con un poco de método porque si no esto puede acabar igual que aquel anuncio de la Coca-cola para todos (Coca-cola et al., 2007). Lo primero es lo primero. Muchas, pero que muchas gracias Rosario y Blanca por admitirme en vuestro proyecto porque esta oportunidad me ha cambiado la vida. Gracias por toda vuestra paciencia (por no tirarme por la ventana), los buenos consejos, por estar siempre pendientes y por todo lo que he aprendido (que no es poco). Pondría más pero no es cuestión que esto ocupe más que los Resultados ;). Muchas gracias Félix por hacerte cargo de la tesis y tu supervisión, a pesar de lo complejo de la distancia (de metro a metro, pero ya tiene su aquel). A Josemi, muchísimas gracias por tu ayuda, por estar siempre disponible y poner algo de química al asunto. A mis compañeros de laboratorio empezando por Lauryn (también conocida como Laura P), este año sin ti no hubiera sido posible. Tanto en lo profesional como en lo personal has estado increíble y te lo agradeceré toda la vida. A Mary, tu ayuda en el laboratorio fue crucial y fuera, más inclusive. Gracias por hacer de mi estancia una experiencia fantástica. A Inés, por recordarme que soy una persona ordenada. A mi Pequeño Saltamontes, por hacerme ver que sé más de lo que aparento. A Silvia, por todos sus ánimos en una mala época. A Sandra, por “reducir” un poco conmigo. A María (la de “Güerva”) y a Aida, por las sonrisas mañaneras y el buen humor en el labo. A Natalia, por todo lo que me enseñaste y tu cariñosa paciencia. A Iván y Rocío, por vuestras animadas visitas. Supongo que se me pasa un montón de gente, así que a todos aquellos que habéis pasado por el labo, aunque sea sólo por un instante, os lleváis un saludo. Y a Pepe, dejo lo mejor para el final, aunque seas del Madrid. Gracias por compartir tus conocimientos (que sí, que son muchos), por echar siempre una mano y por los buenos momentos. Ahora la segunda parte. Todos aquellos que han aguantado la tesis desde fuera. A mis padres, que supisteis desde el principio que lo mío era cosa de Biología y probetas, culpa vuestra por grabarme “Erase una vez el cuerpo humano” (Barillé et al., 1987). Vuestro apoyo y la fe en mí que habéis demostrado no me la ha dado nadie, deberíais estar nombrados incluso antes que la beca del Ministerio. De mil amores, gracias. A mi peque (mi hermana) que siempre tratas de hacer el esfuerzo para recordar de qué narices va mi tesis. Has sido una gran cómplice, con besos cuando hacían falta y las collejas cuando se requerían. No te lo digo mucho pero tú y yo lo sabemos (guiño, guiño). A Edu, tal vez los genes digan lo contrario, pero no he podido tener mejor hermano mayor que tú. Todos estos años me has regalado tu apoyo en momentos malos, me has aguantado lo que no está escrito y además me has dado muy buenos consejos tanto en lo profesional como en lo personal, tú y Lauryn sois impagables. A mi yayi, y yo que pensaba que estarías en la defensa de la tesis. Con lo que iba a presumir yo de abuela. Ya te imaginaba sentada, lo más cerca que pudieses de la tarima, afinando al máximo la vista y el sonotone, para poder enterarte de las cosas “tan increíbles” que hace tu antigua compañerita de piso. Aunque para esto no tengo referencia bibliográfica ni experimentos que lo prueben, sé que vas a estar allí. Te pondrás tus más coquetas galas celestiales y vendrás bien cogida del brazo del “Poeta”, presumiendo de lo inteligente y guapa que es tu nieta. A Freya, por tu minina compañía mientras escribía y tus ronroneos mañareros. Y al “Hombre del sofá”, que si no se pica. Ahora toca un poco de popurrí, que si no esto no se acaba. Un recuerdo especial a mis compis de idas de pinza: Dita, Rosa, Raquel, Esther y Elena “líquenes”. A Erica, por tus ánimos constantes desde León. A Raúl por su ayuda y a Daniele, Jenny e Irene, por hacerme sentir como en casa. A mi cuñao, por tener siempre una sonrisa para mí. A Rober, por aparecer en el momento oportuno. A Sergio, por hacerme estrujar el cerebro y recordar Biología básica. A mi compañero de las once, por compartir tanta charla científica. A Berti, por tu granito de arena. Un saludo especial para mis antiguos compis: Ginés, Susana y Gliselle; y a Lolo por abrirme las puertas. Una mención con mucho cariño tanto a los Santamaría (Marisa incluida, obviamente) como a los Rubio (no os nombro a todos que sois muchos), por las veces que me dijisteis « ¡ánimo!» Y a mis tíos Pepa y Alberto, por demostrarme que el cariño va más allá de la sangre. “Puck”, “Loki” y “Long Bob”, ha sido arduo, ha sido duro, pero creo que por fin vamos llegando a acuerdos. Gracias por compartir algunos de vuestros secretos. A todos aquellos que os alegrasteis de mis comienzos, pero que no habéis podido ver el final. Os llevo conmigo. Perdón por adelantado si me dejo a alguien, no tengo últimamente neuronas para tanto nombre. Sólo un par de cositas más. He de hablar de cierto caballero, Don Alberto Santamaría del Río, amante de la radio y fiel colchonero. Tu presencia me ha acompañado a lo largo de toda la tesis y varias veces he imaginado que dirías al ver a tu «nieta, la mayor» con la bata blanca. Todavía quedan trazos de tu espíritu en todo el edificio y no puedo evitar sonreír cada vez que bajo las escaleras y veo por la ventana tu albaricoquero. Estés donde estés, el día de la presentación te espero. En cualquier publicación científica, ya se sabe, los más importantes van al principio y al final. Está claro a quien tengo que nombrar. Si no fuera por ti, Mª Victoria, esto no sería posible. Me gustaría decir mucho, tanto en lo personal como en lo profesional, pero sería inútil, serían páginas y páginas que realmente no reflejarían ni la mitad del valor de todo lo que has hecho por mí. Yo ahora estoy aquí a punto de obtener mi doctorado por ti y sólo por ti. Necesitaré de varias vidas para poder agradecértelo. De todo corazón, gracias. Por dar un gracias Se gana en méritos Más que por glorias (Haiku) Laura S. R. 2017 “Para los que siempre han caminado a mi lado” «How you turn my world, you precious thing You starve and near exhaust me Everything I’ve done, I’ve done for you I move the stars for no one (…) Though, I do believe in you. Yes, I do» “Within you”. David Bowie (1986) «El científico no tiene por objeto un resultado inmediato. Él no espera que sus ideas avanzadas sean fácilmente aceptadas. Su deber es sentar las bases para aquellos que están por venir y señalar el camino» Nikola Tesla ÍNDICE Resumen ................................................................................................................................ I Summary ............................................................................................................................... III Lista de abreviaturas ............................................................................................................ V I. INTRODUCCIÓN 1. Compuestos fenólicos ....................................................................................................... 1 1.1. Clasificación ............................................................................................................... 2 1.2. Ácidos hidroxicinámicos ............................................................................................ 4 1.2.1. Propiedades sensoriales y saludables de los alimentos asociadas a los ácidos.hidroxicinámicos ............................................................................ 5 2. Bacterias lácticas en alimentos .......................................................................................... 6 2.1 Metabolismo de compuestos fenólicos en bacterias lácticas ....................................... 6 2.1.1. Metabolismo de ácidos hidroxicinámicos en bacterias lácticas .......................... 8 2.2 Metabolismo de compuestos fenólicos en Lactobacillus plantarum .......................... 10 3. Reductasas de ácidos hidroxicinámicos ............................................................................ 13 II. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 19 III. MATERIAL Y MÉTODOS 1. Estirpes bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos .......................................................... 23 2. Medios y condiciones de cultivo ....................................................................................... 26 3. Técnicas de ADN .............................................................................................................. 27 3.1. Extracción de ADN cromosómico .............................................................................. 27 3.2. Extracción de ADN plasmídico ................................................................................. 27 3.2.1 Extracción rápida ................................................................................................... 27 3.2.2 Extracción de alta pureza ....................................................................................... 28 3.3. Amplificación de secuencias de ADN mediante PCR ................................................ 28 3.4. Electroforesis de ADN en geles de agarosa ................................................................ 29 3.5. Purificación de ADN a partir de geles de agarosa ..................................................... 30 3.6. Método de clonación ................................................................................................... 30 3.6.1. Método de clonación independiente de ligación (LIC) ......................................... 30 3.6.2. Método de clonación con enzimas de restricción ................................................. 31 3.7. Secuenciación de ADN y análisis de la información ................................................. 32 4. Transformación genética de cepas bacterianas ................................................................. 33 4.1. Transformación genética en Escherichia coli ............................................................. 33 4.2. Transformación genética en Lactobacillus plantarum ............................................... 34 4.2.1 Interrupción genética en Lactobacillus plantarum ................................................ 35 5. Técnicas de ARN .............................................................................................................. 36 5.1. Extracción de ARN .................................................................................................... 36 5.2. Validación de las muestras de ARN ........................................................................... 37 5.3. Tratamiento del ARN con DNAsa .............................................................................. 37 5.4. Análisis de la expresión génica mediante PCR cuantitativa en tiempo real ............... 38 5.4.1. Síntesis del ADNc mediante la enzima transcriptasa inversa ............................... 38 5.4.2. Diseño de oligonucleótidos para el análisis mediante RT-qPCR ........................ 38 5.4.3. Ensayo de RT-qPCR ............................................................................................ 38 6. Técnicas de proteínas ....................................................................................................... 40 6.1. Preparación de extractos proteicos .............................................................................. 40 6.2. Hiperproducción y purificación de enzimas recombinantes ....................................... 41 6.3. Electroforesis en geles de poliacrilamida ................................................................... 42 6.4. Identificación de proteínas mediante huella peptídica y fragmentación MALDI TOF/TOF .............................................................................. 43 6.5. Ensayos de actividad enzimática ................................................................................ 44 6.5.1. Ensayos con extractos de Escherichia coli ........................................................... 44 6.5.2. Ensayos con proteínas puras ................................................................................ 44 6.5.3. Ensayos en cultivos de bacterias lácticas .............................................................. 45 6.6. Análisis de actividad enzimática mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ............................................................................... 45 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. Metabolismo de ácidos hidroxicinámicos ......................................................................... 49 1. 1. Identificación de la proteína reductasa de ácidos hidroxicinámicos en Lactobacillus plantarum WCFS1 .......................................................................... 52 1.1.1. Organización genética de la región adyacente a los genes lp_1424 y lp_1425 en Lactobacillus plantarum WCFS1 ...................................... 57 1.1.2. Análisis transcripcional de la región adyacente a los genes lp_1424 y lp_1425 en Lactobacillus plantarum WCFS1 .................................................. 58 1.1.3. Implicación de los genes adyacentes a lp_1424 y lp_1425 en la reducción de ácidos hidroxicinámicos .......................................................... 61 1.1.4. Estudio de la expresión de los genes lp_1424 y lp_1425 en presencia de ácido m-cumárico ........................................................................ 65 1.1.5. Clonación del gen y producción de la proteína Lp_1425 ...................................... 68 1.1.6. Actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos en la proteína Lp_1425 ............. 72 1.1.7. Producción de la proteína Lp_1424 y estudio de su actividad reductasa ............... 81 1.2. Identificación de sustratos de la reductasa Lp_1425 ................................................... 90 1.3. Inducción de la actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos ................................ 93 1.4. Actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos en otras bacterias lácticas .............. 95 2. Metabolismo de vinil fenoles ........................................................................................... 108 2.1. Identificación de la proteína reductasa de vinil fenoles en Lactobacillus plantarum WCFS1 ........................................................................... 108 2.1.1. Organización genética de la región adyacente al gen lp_3125 en Lactobacillus plantarum WCFS1 ..................................................................... 109 2.1.2. Análisis transcripcional de la región adyacente al gen lp_3125 en Lactobacillus plantarum WCFS1 ..................................................................... 110 2.1.3. Implicación de los genes adyacentes a lp_3125 en la reducción de vinil fenoles ....................................................................................................... 113 2.1.4. Clonación del gen y producción de la proteína Lp_3125 ...................................... 117 2.1.5. Actividad reductasa de 4-vinilfenol en la proteína Lp_3125 ................................. 123 2.2. Identificación de sustratos de la reductasa Lp_3125 ...................................................... 125 2.3. Inducción de la actividad reductasa de vinil fenoles ................................................... 128 2.4. Actividad reductasa de vinil fenoles en otras bacterias lácticas ................................. 130 V. CONCLUSIONS .............................................................................................................. 141 VI. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 145 I Resumen Los ácidos fenólicos constituyen aproximadamente un tercio de los compuestos fenólicos de la dieta y están asociados con propiedades organolépticas, nutricionales y antioxidantes de los alimentos. El término “ácido fenólico” incluye compuestos que poseen al menos un grupo hidroxilo y un ácido carboxílico como grupo funcional. Los ácidos fenólicos presentes en la naturaleza se pueden dividir en dos grupos en función de su estructura: los ácidos hidroxicinámicos y los ácidos hidroxibenzoicos, siendo más comunes los primeros. Los ácidos hidroxicinámicos incluyen fundamentalmente a los ácidos p-cumarico, cafeico, ferúlico y sinápico. Lactobacillus plantarum es la especie de bacteria láctica que más frecuentemente se aísla de fermentaciones de alimentos de origen vegetal en los que los ácidos hidroxicinámicos son abundantes. En L. plantarum, el metabolismo de estos ácidos puede seguir dos rutas diferentes. Por un lado, los ácidos hidroxicinámicos pueden reducirse directamente a sus correspondientes ácidos fenilpropiónicos sustituidos mediante la acción de una reductasa; la otra ruta implica la acción secuencial de dos enzimas, en primer lugar una descarboxilasa que descarboxila el ácido a su vinil derivado y posteriormente una reductasa que lo reduce a su correspondiente etil derivado. De todas las enzimas implicadas en la transformación de ácidos hidroxicinámicos en L. plantarum, hasta el momento actual, tan solo se ha descrito a nivel genético y molecular la descarboxilasa Lp_3665, mientras que las reductasas implicadas en ambas rutas se desconocen tanto a nivel enzimático como genético. El estudio transcriptómico global de la respuesta de L. plantarum WCFS1 a la presencia de un ácido hidroxicinámico (ácido p-cumárico) reveló que tres genes que codificaban posibles reductasas mostraban una inducción de su expresión (lp_1424, lp_1425 y lp_3125). La interrupción de estos genes en L. plantarum WCFS1, mediante un proceso de inserción duplicación por recombinación homóloga, demostró que los mutantes en los que se habían interrumpido los genes lp_1424 y lp_1425 no fueron capaces de reducir los ácidos hidroxicinámicos mientras que el mutante del gen lp_3125 no redujo los vinil a etil fenoles. II Mediante transcripción reversa se demostró que los genes lp_1424 y lp_1425 se transcriben juntos. El análisis de expresión génica confirma que en la reducción de los ácidos hidroxicinámicos es necesaria la presencia de una proteína Lp_1425 funcional. Extractos de Escherichia coli en los que se hiperexpresó el gen lp_1425 redujeron los ácidos hidroxicinámicos ensayados. Sin embargo, las reacciones in vitro usando la proteína recombinante Lp_1425 hiperproducida y purificada no fueron capaces de reducirlos. Un análisis electroforético de la proteína Lp_1425 reveló que ésta se proteoliza y sólo el dominio carboxilo-terminal de unión a FAD está presente después de purificar y dializar la proteína. Teniendo en cuenta que los genes lp_1424 y lp_1425 se expresan juntos en L. plantarum, ambos genes se expresaron simultáneamente en E. coli. Los resultados obtenidos indicaron que ambas proteínas se purificaban juntas y que la presencia de Lp_1424 evita parcialmente la proteólisis de Lp_1425. En relación a la especificidad de sustrato, se observó que todos los ácidos hidroxicinámicos analizados fueron reducidos por la proteína Lp_1425. Los análisis por HPLC y la detección del gen mediante PCR confirmaron que, de todas las bacterias lácticas ensayadas, solamente aquellas que pertenecían al grupo de L. plantarum así como Enterococcus casseliflavus y Enterococcus gallinarum poseían la capacidad de reducir ácidos hidroxicinámicos. Debido a que la inactivación del gen lp_3125 impide la reducción de los vinil fenoles a sus correspondientes etil fenoles en L. plantarum, este gen se hiperexpresó en E. coli. De forma similar a lo que ocurrió con los extractos de E. coli cuando se hiperexpresó lp_1425, los extractos de E. coli con el gen lp_3125 hiperexpresado fueron capaces de reducir los vinil fenoles ensayados. Por el contrario, en las reacciones in vitro utilizando la proteína recombinante Lp_3125 hiperproducida y purificada no se observó dicha reducción. El análisis por HPLC así como la detección del gen mediante PCR revelaron que la capacidad para reducir los vinil fenoles es poco frecuente entre las bacterias lácticas, estando sólo presente en las bacterias del grupo de L. plantarum . III Summary Phenolic acids account for almost one third of the dietary phenols and are associated with organoleptic, nutritional and antioxidant properties of foods. Phenolic acids include phenols that possess one carboxylic acid functional group. The naturally occurring phenolic acids contain two distinguishing constitutive carbon frameworks, the hydroxycinnamic and hydroxybenzoic structures. The hydroxycinnamic acids are more common than are hydroxybenzoic acids and mainly included coumaric, caffeic, ferulic and sinapic acids. Lactobacillus plantarum is a lactic acid bacterial species that is most frequently encountered in the fermentation of plant materials where hydroxycinammic acids are abundant. The metabolism of hydroxycinnamic acids on L. plantarum has been recently described and could follow two simultaneous pathways. Hydroxycinnamic acids could be directly reduced to their corresponding substituted phenyl propionic acids by a still unknown reductase enzyme. Alternatively, the second pathway implies that hydroxycinnamic acids are decarboxylated into their vinyl phenol derivatives, and then, by an unknown reductase, are subsequently reduced to their corresponding ethyl derivatives. The decarboxylation step is catalyzed by the phenolic acid decarboxylase Lp_3665 enzyme. However, the reductase enzymes involved in the metabolism of hydroxyxcinnamic acids have not been genetically or biochemically characterized so far. Whole genome transcriptional analysis of L. plantarum WCFS1 in the presence of a hydroxycinammic acid (p-coumaric acid) revealed that three genes encoding putative reductases were differentially expressed (lp_1424, lp_1425, and lp_3125). Disruption of these genes in L. plantarum WCFS1 by a insertion-duplication mutagenesis, demonstrated that lp_1424 and lp_1425 gene mutants were unable to reduce hydroxycinnamic acids whereas the mutant on the lp_3125 gene was unable to reduce vinyl to ethyl phenols. Reverse transcription analysis revealed that lp_1424 and lp_1425 genes were cotranscribed. Expression analysis confirms that hydroxycinnamic acid reduction implies the presence of a functional Lp_1425 protein. Extracts of Escherichia coli IV overexpressing the lp_1425 gene were able to reduce hydroxycinnamic acids. However, reactions in vitro using the hiperproduced and purified recombinant Lp_1425 protein were unable to reduce the hydroxycinnamic acid present. Electrophoretic analysis of Lp_1425 protein revealed that it was proteolized and only the C-terminal FAD-binding domain was present on the purified and dialyzed protein. As lp_1424 and lp_1425 genes were coexpressed in L. plantarum, both genes were simultaneous coexpressed in E. coli. The obtained results indicated that both proteins are purified together and the presence of Lp_1424 partially avoids Lp_1425 proteolisis. In relation to substrate specificity, all the hydroxycinnamic acids analyzed were reduced by Lp_1425 protein. HPLC analysis and PCR detection confirmed that, from the lactic acid bacteria assayed, only those belonging to the L. plantarum group as well as Enterococcus casseliflavus and Enterococcus gallinarum possessed the ability to reduce hydroxycinnamic acids. As the inactivation of the lp_3125 gene avoids the reduction of vinyl to ethyl phenols, this gene was overexpressed in E. coli. Similarly to lp_1425, extracts of E.coli overexpressing the lp_3125 gene were able to reduce vinyl phenols. Surprisingly, reactions in vitro using the hiperproduced and purified recombinant Lp_3125 protein were unable to reduce them. E.coli extracts containing recombinant Lp_3125 reduced all the vinyl phenols assayed. HPLC analysis and PCR detection revealed that the capacity to reduce vinyl phenols is scarce on lactic acid bacteria, as it is only present on bacteria from the L. plantarum group. V Lista de abreviaturas Además de las unidades y abreviaturas aceptadas por el Sistema Internacional de Medidas (SI) (http://physics.nist.gov/cuu/Units/index.html) y la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC) (http://old.iupac.org/publications/epub/index.html), en esta tesis se han utilizado las siguientes abreviaturas: λ Longitud de onda 2-HPPA Ácido 3-(2-hidroxifenil) propiónico 3-HPPA Ácido 3-(3-hidroxifenil) propiónico A Absorbancia AC Ácido cafeico ACi Ácido cinámico AF Ácido ferúlico AFlo Ácido florético AHC Ácido hidrocafeico AHF Ácido hidroferúlico AHS Ácido hidrosinápico AmC Ácido m-cumárico Amp Ampicilina AoC Ácido o-cumárico ApC Ácido p-cumárico AS Ácido sinápico ATCC Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection) ADNc Ácido desoxirribonucleico copia CECT Colección Española de Cultivos Tipo CSIC Consejo Superior de Investigaciones Científicas DEPC Dietilpirocarbonato ADN Ácido desoxirribonucleico DMSO Sulfóxido de dimetilo dNTPs Desoxinucleótidos-5´-trifosfato DO Densidad óptica DSMZ Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) EC 4-Etilcatecol EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EF 4-Etilfenol EG 4-Etilguayacol Em Eritromicina FAD Flavín adenín dinucleótido FMN Flavín mononucleótido GRAS Reconocido como seguro para la salud (Generally Recognized As Safe) VI HPLC Cromatografía de líquidos de alta resolución (High-performance liquid chromatography) IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido kb Kilobase kDa Kilodalton LIC Clonación independiente de ligación (Ligation independent cloning) LB Medio de cultivo de Luria y Bertani Mb Megabases MCS Sitio de clonaje múltiple (Multiple Cloning Site) MRS Medio de cultivo de Man, Rogosa y Sharpe mUA Miliunidad de absorbancia NADH/NAD + Nicotín adenín dinucleótido reducido/oxidado NADPH/NAPD + Nicotín adenín dinucleótido fosfato reducido/oxidado NCIMB Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marinas (National Collection of Industrial and Marine Bacteria) ORF Marco de lectura abierto (Open Reading Frame) p p-valor PAD Descarboxilasa de ácidos fenólicos (Phenolic acid decarboxylase) PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida pI Punto isoeléctrico pb Par de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase chain reaction) PEG Polietilenglicol PVDF Polifluoruro de polivinilideno (Polyvinylidene difluoride) RT-qPCR PCR cuantitativa en tiempo real (Real Time quantitative polymerase chain reaction) R Resistente ARN Ácido ribonucleico ARNr Ácido ribonucleico ribosómico SDS Dodecilsulfato sódico T Cepa tipo TAE Tris-ácido acético-EDTA TE Tris-EDTA TES Tris-EDTA-NaCl Tris Tris (hidroximetil) aminometano U Unidad UV Ultravioleta VC 4-Vinilcatecol VF 4-Vinilfenol VG 4-Vinilguayacol X-gal 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido Introducción 1 Introducción 1. Compuestos fenólicos El término “compuesto fenólico” describe a un conjunto heterogéneo de moléculas que se encuentran de forma natural en las plantas. Su estructura consiste en uno o varios anillos bencénicos sustituidos por al menos un grupo hidroxilo (Croteau et al., 2000). Constituyen el principal grupo de metabolitos secundarios presentes en el reino vegetal, siendo esenciales para su crecimiento. Entre sus diversas funciones destacan la defensa contra predadores y patógenos, actuar como agentes alelopáticos (que son liberados para ejercer efectos sobre otras plantas), atraer a los polinizadores o a los dispersores de las semillas, protección frente a la radiación UV, aportar estabilidad estructural en los tejidos y actuar como aislantes que impermeabilizan las paredes celulares. Por tanto, la mayoría de éstas moléculas son bioactivas, interactúan con el medio ambiente y desempeñan un importante papel de protección contra el estrés abiótico y biótico en las plantas (Croteau et al., 2000). La estructura química de los compuestos fenólicos es muy diversa, incluyendo desde ácidos fenólicos simples de bajo peso molecular hasta moléculas poliméricas de elevada masa molecular como los taninos condensados y los hidrolizables. La mayoría de estas sustancias y de sus precursores se sintetizan a través de la ruta del ácido siquímico intermediario en la producción de los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptófano) y de un grupo de metabolitos secundarios conocidos como fenilpropanoides. También pueden obtenerse en menor medida a través de la ruta de síntesis de la malonil-coenzima A (también denominada ruta del ácido malónico); o por ambas rutas como en el caso de los flavonoides (Robbins, 2003; Tohge et al., 2013). Los compuestos fenólicos se localizan principalmente en los frutos, semillas, corteza y órganos aéreos jóvenes de las plantas, por lo que se consumen diariamente en la dieta en cantidades importantes (Harborne y Williams, 2000). Muchos de ellos influyen en las propiedades organolépticas de los alimentos y bebidas que contienen materias primas de origen vegetal determinando en parte la calidad final de los mismos. En la dieta humana las fuentes principales de compuestos fenólicos son las 2 Introducción frutas, verduras y bebidas tales como el té y café. Se ha descrito que estas sustancias participan en la formación del color, modulan el aroma a través de fenoles volátiles que se metabolizan por la microbiota presente de forma natural y confieren amargor, astringencia o acidez. Adicionalmente, sus propiedades antioxidantes son esenciales para la estabilidad de los alimentos y bebidas, así como también en sus efectos en la prevención de ciertas enfermedades asociadas al estrés oxidativo (Kapur y Kapoor, 2001; Dimitrios, 2006). 1.1. Clasificación Los compuestos fenólicos se pueden clasificar en función del número de grupos fenoles que contienen, del número y tipo de grupo funcional que se une al anillo aromático y de los elementos estructurales que unen unos anillos a otros. De esta forma se puede distinguir entre los ácidos fenólicos, flavonoides, estilbenos y lignanos. Los flavonoides a su vez se dividen en flavonas, flavonoles, isoflavonas, flavanonas, antocianinas y flavanoles (catequinas y proantocianidinas) (Manach et al., 2004) (Figura 1). Figura 1. Representación esquemática de la clasificación de compuestos fenólicos basado en Manach et al. (2004). Cada grupo muestra su fórmula química general. 3 Introducción Adicionalmente, la diversidad de este grupo se incrementa por la asociación de los compuestos fenólicos con diversos carbohidratos y ácidos orgánicos (Manach et al., 2004) La presencia de ácidos fenólicos se asocia a propiedades sensoriales y nutricionales de los alimentos y constituyen un tercio de los compuestos fenólicos de la dieta (Maga, 1978; Vanbeneden et al., 2008). Los ácidos fenólicos poseen un anillo aromático con al menos un grupo hidroxilo y un ácido carboxílico como grupo funcional y agrupan a más de 8.000 compuestos sintetizados por plantas que forman parte de la estructura de las paredes celulares vegetales (Lynd et al., 2002; Robbins, 2003). Se pueden dividir en dos grupos principales, los derivados del ácido benzoico y los derivados del ácido cinámico (Figura 2). Los derivados del ácido benzoíco comparten la estructura C6-C1 del ácido benzoico sobre la que se producen reacciones de hidroxilación y metilación dando lugar a los ácidos gálico, protocatéquico, p-hidroxibenzoico, vainillinico, elágico y siríngico, entre otros. Los derivados del ácido hidroxicinámico son los ácidos fenólicos más frecuentes, poseen la estructura C6-C3, e incluyen los ácidos p- cumárico, cafeico, ferúlico, sinápico y clorogénico. Ácido benzoico Ácido cinámico Figura 2. Estructura química de los ácidos benzoico y cinámico 4 Introducción 1.2. Ácidos hidroxicinámicos Los ácidos hidroxicinámicos pertenecen al grupo de los compuestos fenólicos no flavonoides. Su estructura consiste en un anillo bencénico asociado a una cadena de tres carbonos (estructura C6-C3) (Andersen y Markham, 2006) La síntesis de estos compuestos tiene como origen habitual al aminoácido fenilalanina a través de la ruta del siquimato (El-Seedi et al., 2012). Este aminoácido se metaboliza por la enzima fenilalanina amonio liasa para originar el ácido trans-cinámico. A partir de él, a través de una serie de reacciones concatenadas llevadas a cabo por diferentes enzimas con actividad hidrolasa y metiltransferasa se forman los diferentes ácidos hidroxicinámicos. Los ácidos hidroxicinámicos y sus derivados normalmente se encuentran asociados a otras moléculas formando derivados glicosilados o ésteres del ácido tartárico o de los ácidos quínico y siquímico (Zhao y Moghadasian, 2010). Estos ácidos son difíciles de encontrar en su forma libre en los alimentos vegetales, sin embargo el procesamiento por congelación, altas temperaturas y fermentación, libera los ácidos p-cumárico, cafeico y ferúlico, entre otros (Manach et al., 2004). El ácido cafeico, libre o esterificado, es el ácido fenólico que se encuentra con mayor frecuencia en las frutas, propóleo (propolis de abejas) y granos de café. Sin embargo, el ácido ferúlico, que se encuentra en hojas y semillas en forma libre o asociado a la lignina, es el compuesto fenólico mayoritario en cereales, describiéndose también en naranjas, tomate y maíz (Maistro et al., 2011). El ácido p-cumárico se encuentra en plantas y hongos en su forma libre o conjugada a monosacáridos y polisacáridos, aminas y alcoholes. Este ácido está presente en frutas (uvas, tomates, etc.), vegetales (judías, patatas, etc.) y en cereales (maíz, trigo, etc.). Es más frecuente encontrar el ácido p-cumárico en su forma conjugada. 5 Introducción 1.2.1. Propiedades sensoriales y saludables de los alimentos asociadas a los ácidos hidroxicinámicos La presencia de diferentes ácidos hidroxicinámicos en alimentos de origen vegetal influye notablemente en sus propiedades organolépticas. La presencia de sustancias fenólicas volátiles derivadas de estos ácidos influye en el aroma de los alimentos. Algunos ácidos cinámicos, como los ácidos p-cumárico y ferúlico, se descarboxilan por la actividad de ciertos microorganismos y originan derivados vinil fenoles (4- vinilfenol y 4-vinilguayacol) los cuales son compuestos muy aromáticos. Sin embargo, la reducción microbiana de estos vinil fenoles a sus correspondientes etil fenoles derivados (4-etilfenol y 4-etilguayacol) da lugar a aromas que dependiendo del alimento se pueden considerar “off-flavours” (desagradables o indeseados) como en el caso de los vinos (Chattonnet, et al., 1995), o aromas característicos como en el caso de las cervezas “weissenbier” (cerveza blanca de trigo alemana) y “Belgian ales” (cerveza destilada) (Piškur et al., 2012) y de ciertas salsas de origen oriental como la salsa de soja (Yokotsuka, 1986; Shahidi y Naczk, 2004). Con respecto al sabor, a la presencia de ácidos hidroxicinámicos se le atribuye un aumento en la acidez de los alimentos, sin embargo, se ha descrito que el ácido p-cumárico en cantidades superiores de 45 mg/Kg puede conferir sensación de amargor y astringencia (Manach et al., 2004). En relación a sus propiedades nutricionales y saludables, se ha propuesto que el efecto beneficioso o antinutricional de los compuestos fenólicos depende de la cantidad consumida y de su biodisponibilidad, así como también del grado de transformación que experimenten a su paso por el tracto gastrointestinal o durante su interacción con la microbiota presente en este último. Se ha descrito que los ácidos hidroxicinámicos presentan efectos beneficiosos frente a enfermedades como el cáncer y la aterosclerosis (El-Seedi et al., 2012; Manach et al., 2004; Olsen et al., 2012). Por ejemplo, se ha descrito que el ácido p-cumárico, especialmente en su forma conjugada, posee propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, antimicrobianas y antimutagénicas (Pragasam et al., 2013). 6 Introducción 2. Bacterias lácticas en alimentos Las bacterias lácticas representan un grupo heterogéneo de bacterias que responden a la definición de “bacterias en forma de cocos o bacilos, Gram positivas, catalasa negativas, inmóviles, no esporuladas, anaerobias aerotolerantes y que producen ácido láctico como metabolito mayoritario de la fermentación de azúcares” (Stiles y Holzapfel, 1997). Este grupo incluye especies de los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Enterococcus y Oenococcus, entre otros (Makarova et al., 2006). Las bacterias lácticas se aíslan de hábitats ricos en nutrientes, entre los que se incluyen plantas y animales, por lo que se adaptan a diversos ambientes y presentan una gran versatilidad metabólica. La mayoría de las bacterias lácticas se consideran inocuas y poseen el estatus GRAS para el consumidor (Makarova et al, 2006) siendo responsables de las características organolépticas de algunos alimentos fermentados, por lo que constituyen un grupo bacteriano beneficioso y muy importante para el hombre. Las bacterias lácticas al encontrarse presentes en una gran variedad de sustratos vegetales y productos agroalimentarios, predominan en las fermentaciones de dichos alimentos. La actividad biológica de las bacterias lácticas permite obtener mejoras en las propiedades nutricionales y sensoriales de los alimentos e incrementa su nivel de seguridad y calidad por la inhibición de la microbiota alterante o patógena (Caplice y Fitzgerald, 1999; Rodríguez et al., 2009; Smid y Lacroix, 2012). 2.1 Metabolismo de compuestos fenólicos en bacterias lácticas Aunque los compuestos fenólicos presentes en las plantas son tóxicos y bacteriostáticos para un gran número de microorganismos, algunas especies de bacterias lácticas se han adaptado a la presencia de estas sustancias y poseen rutas metabólicas para su transformación. 7 Introducción La presencia de bacterias lácticas en sustratos vegetales con un alto contenido de compuestos fenólicos refleja la capacidad que poseen estos microorganismos para transformar estas sustancias. Esta capacidad está relacionada con una respuesta adaptativa al medio ambiente que les confiere ventajas competitivas frente a otros grupos bacterianos. Así, por ejemplo, algunas especies de Lactobacillus son intrínsecamente más tolerantes a los ácidos fenólicos cuando se comparan con Escherichia coli o Bacillus subtilis (Wells et al., 2005; Cueva et al., 2010; Sánchez- Maldonado et al., 2011). Los estudios relacionados con el metabolismo de los compuestos fenólicos llevado a cabo por las bacterias lácticas son escasos y se han realizado en Oenococcus oeni, Pediococcus pentosaceus y algunas especies de Lactobacillus. Whiting y Carr (1957) describieron que durante el proceso de fermentación de la sidra se observaba la desaparición del ácido clorogénico. Empleando extractos celulares de Lactobacillus paracollinoides se observó la transformación del ácido clorogénico a ácido cafeico y quínico (Whiting y Carr, 1957). Posteriormente se describió que el ácido caféico formado se transformaba en ácido hidrocaféico (ácido 3-(3,4-dihidroxifenil) propiónico) y etilcatecol (Whiting y Carr, 1959). Por otro lado, L. paracollinoides también fue capaz de reducir la cadena lateral de los ácidos 4-hidroxicinámico y 3,4-dihidroxicinámico y posteriormente descarboxilarlos a etilfenol y etilcatecol. Whiting y Coggins (1971) describieron que en esta especie una reacción de reducción transforma el ácido quínico en ácido siquímico y ácido dihidrosiquímico. Estudios realizados en Lactobacillus hilgardii describieron que era capaz de degradar el ácido gálico y la catequina presentes en medios de cultivo complejos (Alberto et al. 2004) dando lugar, en el caso del ácido gálico a pirogalol, catecol, los ácidos protocatéquico y p-hidroxibenzoico, alcohol p-hidroxibenzoico, y p- hidroxibenzaldehído; mientras que en los cultivos con catequina se detectó ácido gálico, pirogalol, catecol, ácido p-hidroxibenzoico, acetovainillona, y ácido homovainílico. Por otro lado, se ha observado que O. oeni puede metabolizar antocianinas y otros compuestos fenólicos para producir compuestos aromáticos con 8 Introducción importancia en las características sensoriales del vino. También se ha descrito que algunos aromas del vino se producen mediante la hidrólisis de sustancias precursoras glicoconjugadas, por la acción de glicosidasas de O. oeni (Vivas et al., 1997; Boido et al., 2002; Ugliano et al, 2003; de Revel et al., 2005). Bloem et al. (2007) observaron que O. oeni y Lactobacillus sp. transformaban el ácido ferúlico a vainillina aunque con bajo rendimiento, mientras que cepas de Lactobacillus y Pediococcus lo transformaron en 4-vinilguayacol. En general todas las cepas de bacterias lácticas utilizadas en su estudio redujeron la vainillina a su correspondiente alcohol vainillinico 2.1.1. Metabolismo de ácidos hidroxicinámicos en bacterias lácticas Los estudios realizados en bacterias lácticas indican la existencia de dos posibles rutas metabólicas para la transformación de los ácidos hidroxicinámicos. Las bacterias lácticas pueden tener una de estas rutas o ambas simultáneamente (Figura 3). R1 R2 OHO A R1 R2 CH2 B R1 R2 CH3 C R1 R2 OHO D PAD (Lp_3665) Figura 3. Representación esquemática de la transformación de ácidos hidroxicinámicos por L. plantarum. Cuando R1 (OH) y R2 (H), los compuestos representados son ácido p- cumárico (A), 4-vinilfenol (B), 4-etilfenol (C) y ácido florético (D). Cuando R1 (OH) y R2 (OH), ácido cafeico (A), 4-vinilcatecol (B), 4-etilcatecol (C) y ácido hidrocafeico (D). Cuando R1 (OH) y R2 (OCH3), los compuestos representados son ácido ferúlico (A), 4- vinilguayacol (B), 4-etilguayacol (C) y ácido hidroferúlico (D). Los compuestos representados en A se descarboxilan para originar los compuestos representados en B por acción de la descarboxilasa PAD (Lp_3665). 9 Introducción La primera ruta implica que algunos ácidos hidroxicinámicos (p-cumárico, cafeico y ferúlico) se pueden descarboxilar para producir los correspondientes vinil derivados (4-vinilfenol, 4-vinilcatecol, y 4-vinilguayacol, respectivamente) los cuales a continuación son reducidos a etil derivados (4-etilfenol, 4-etilcatecol, y 4- etilguayacol) (Cavin et al. 1993; Chatonnet et al. 1992, 1997; Stead, 1993). Esta ruta implica la actividad secuencial de dos actividades enzimáticas. La primera es la decarboxilasa de ácidos fenólicos (PAD) que cataliza la descarboxilación del ácido hidroxicinámico para producir el correspondiente vinil fenol. La segunda es una actividad reductasa de vinil fenoles que reduce el vinil fenol producido por la PAD a su correspondiente etil fenol. La segunda ruta para la reducción de ácidos hidroxicinámicos se describió por primera vez en Lactobacillus pastorianus (Whiting y Carr, 1959). Esta ruta implica una actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos que reduce directamente los ácidos hidroxicinámicos (p-cumárico, cafeico o ferúlico) a ácidos fenilpropiónicos sustituidos (ácidos florético, hidrocaféico o hidroferúlico, respectivamente) (Barthelmebs et al., 2000; Rodríguez et al., 2008a). Un estudio realizado en L. plantarum mostró que una cepa en la que se inactivó la enzima descarboxilasa PAD (Barthelmebs et al., 2000) era capaz de producir, aunque débilmente, ácidos fenilpropiónicos sustituidos. Este resultado demuestra que las dos rutas implicadas en la reducción de ácidos hidroxicinámicos pueden coexistir y competir por la degradación de estos ácidos en este microorganismo. Sin embargo, la utilización de las dos rutas descritas para la reducción de ácidos hidroxicinámicos no es universal y es variable dentro de las bacterias lácticas. La utilización de la primera ruta que implica la descarboxilación inicial del ácido, se ha estudiado por Couto et al. (2006) en 20 especies de bacterias lácticas (35 cepas en total). Los resultados indicaron que el 37% de las cepas estudiadas fueron capaces de producir vinil derivados a partir de ácidos hidroxicinámicos. Sin embargo, sólo un 9% de los productores de vinil derivados fueron capaces de reducir éstos a etil derivados. Las bacterias lácticas productoras de etil fenoles 10 Introducción pertenecían únicamente al género Lactobacillus y a las especies L. plantarum, Lactobacillus brevis y L. collinoides. En estudios posteriores algunos de estos resultados se han ratificado y se han añadido nuevas especies capaces de reducir los vinil derivados como P. pentosaceus (Silva et al., 2011). Otras bacterias lácticas, entre las que se encuentran O. oeni y L. hilgardii, no poseen la enzima descarboxilasa PAD y tampoco son capaces de reducir los ácidos hidroxicinámicos (de la Rivas et al., 2009). Mediante experimentos de PCR realizados en O. oeni, L. hilgardii y L. mesenteroides no se detectó la presencia del gen pad que codifica la enzima descarboxilasa PAD y tampoco se observó la descarboxilación de ácidos hidroxicinámicos en estas bacterias. Por el contrario se corroboró la presencia del gen pad en L. brevis y se observó la producción de 4-vinilfenol, 4-vinilguayacol y 4-vinilcatecol en cultivos suplementados con los respectivos ácidos hidroxicinámicos (de las Rivas et al., 2009). Curiel et al. (2010) estudiaron la degradación de ácidos hidroxicinámicos en tres cepas de L. brevis que provenían de hábitats diferentes (vino, saliva humana y heces humanas). Contrariamente a lo descrito para otras cepas de esta especie (Cavin et al., 1993 y Couto et al., 2006), los tres aislados fueron incapaces de producir los etil derivados producto de la reducción de los vinil derivados obtenidos mediante la descarboxilación de los ácidos p-cumárico, ferúlico y cafeico. 2.2 Metabolismo de compuestos fenólicos en Lactobacillus plantarum Dentro de las bacterias lácticas, la especie L. plantarum se caracteriza, entre otras cosas, por ser la que presenta más variabilidad de supervivencia en diferentes ambientes con una diversidad fenotípica muy elevada (Rodríguez et al., 2009). Actualmente, según la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome) existen 183 cepas de L. plantarum cuyo genoma se está secuenciando. De ellos, actualmente, sólo hay 25 genomas de los que se tiene la secuencia completa. El primer genoma secuenciado completamente de una cepa de L. plantarum fue el de la cepa WCFS1, aislada de 11 Introducción saliva humana, número de acceso NC_004567.2 (Kleerebezem et al., 2003). Los tamaños del genoma de todas estas cepas superan los 3,1 millones de bases (Mb) siendo el de la cepa L. plantarum WCFS1 el de mayor tamaño con un cromosoma de 3,3 Mb, más tres plásmidos de 1,9, 2,3 y 36,1 kilobases (kb), este hecho le proporciona a L. plantarum un mayor potencial metabólico. Se ha relacionado la capacidad de adaptación a diferentes ambientes con el gran tamaño de su genoma y la presencia de genes que codifican numerosas proteínas involucradas en el metabolismo de azúcares y proteínas reguladoras (Kleerebezem et al., 2003 y Siezen y van Hylckama Vlieg, 2011). Dadas estas características L. plantarum es la especie utilizada más frecuentemente como cultivo iniciador en la fermentación de vegetales donde los compuestos fenólicos son muy abundantes. Los primeros estudios realizados sobre el metabolismo de compuestos fenólicos en L. plantarum los llevó a cabo Whiting (1975). En ellos se describió que L. plantarum reducía el ácido quínico a los ácidos carboxílicos dihidroxiciclohexanoico y acético a través de una ruta metabólica que incluye 11 reacciones mediadas por enzimas inducibles. Por otra parte, también se describió que en condiciones anaerobias de crecimiento, esta bacteria reducía el ácido quínico y al mismo tiempo oxidaba una porción del sustrato a catecol, en una ruta que incluye la participación de una reductasa NAD-dependiente y de una descarboxilasa del ácido protocatéquico. Posteriormente, Ciafardini et al. (1994) y Marsilio et al. (1996) describieron la degradación del compuesto fenólico más abundante en aceitunas, la oleuropeína, por varias cepas de L. plantarum. Inicialmente la actividad de una β-glucosidasa origina la aglicona de oleuropeína que posteriormente, por la actividad de una esterasa, se transforma en hidroxitirosol y ácido elenólico. Se ha observado que ciertas cepas de L. plantarum aisladas de vinos y otros alimentos fermentados, así como también de muestras colorrectales de algunos mamíferos, presentan la capacidad de degradar taninos mediante una enzima con actividad tanasa (Osawa et al., 2000; Nishitani y Osawa, 2003; Nishitani et al., 12 Introducción 2004). Ayed y Hamdi (2002) determinaron las condiciones óptimas de concentración de glucosa y pH en las cuales la enzima tanasa de L. plantarum es activa. Posteriormente, Iwamoto et al. (2008) identificaron el gen tanLpI (o tanBLp) que codifica una enzima con actividad tanasa o tanin acil hidrolasa (TanLpI o TanBLp). Rodríguez et al. (2008c) estudiaron la capacidad de L. plantarum CECT 748 T para degradar taninos hidrolizables utilizando para ello tres ácidos tánicos comerciales y concluyeron que la biotransformación ocurre vía una despolimerización de los taninos de alto peso molecular y una reducción de los de bajo peso. Como resultado de la degradación de los taninos, se producía la formación de ácido gálico y pirogalol. Rodríguez et al. (2008c) describieron que la transformación del ácido gálico en L. plantarum se lleva a cabo a través de una reacción de descarboxilación no oxidativa que da origen a pirogalol. Posteriormente se describió la caracterización de la enzima responsable de la descarboxilación del ácido gálico en L. plantarum (Jiménez et al., 2013). Cavin et al. (1993) realizaron los primeros estudios sobre la transformación de ácidos hidroxicinámicos en L. plantarum. Demostraron que los ácidos p-cumárico, ferúlico y cafeico se transforman por la acción de la enzima descarboxilasa de ácidos fenólicos (PAD) en sus vinil derivados y luego éstos por la actividad de una reductasa no identificada, se metabolizan a 4-etilfenol, 4-etilguayacol y 4- etilcatecol, respectivamente (Cavin et al., 1997a; Barthelmebs et al., 2000; Landete et al., 2007; Rodríguez et al., 2008b). Cavin et al. (1997b) purificaron y caracterizaron la enzima PAD de L. plantarum estableciendo que se trataba de una enzima inducible. Posteriormente, Barthelmebs et al. (2000), en estudios realizados con una cepa mutante que tenía interrumpido el gen que codifica la descarboxilasa PAD (pad), describieron que L. plantarum posee una reductasa de ácidos fenólicos inducible no identificada. Esta enzima reduce los ácidos fenólicos a ácidos fenil propiónicos sustituidos convirtiendo los ácidos p-cumárico, ferúlico y caféico en los ácidos florético, hidroferúlico e hidrocaféico (Barthelmebs et al., 2000a; Rodríguez et al., 2008a). 13 Introducción Estos resultados demuestran que L. plantarum es un claro ejemplo de la coexistencia de las dos rutas implicadas en la reducción de ácidos hidroxicinámicos, y cuyas enzimas implicadas (reductasa de ácidos hidroxicinámicos y reductasa de vinil fenoles) permanecen sin identificar tanto en L. plantarum como en otras bacterias lácticas que poseen estas rutas. 3. Reductasas de ácidos hidroxicinámicos Una oxidorreductasa es una enzima que cataliza la transferencia de electrones desde una molécula donante (el agente reductor) a una molécula aceptora (el agente oxidante) (Figura 4). No obstante, el metabolismo de estas reacciones puede ser menos patente y consistir en la reducción u oxidación de grupos funcionales, lo que suele implicar a coenzimas que también cambian su estado redox, como pueden ser los compuestos NADH/NAD + , NADPH/NADP + , FAD/FADH2 o FMN/FMNH2. Cuando en la reacción se utiliza, por ejemplo NAD + , éste actúa como oxidante o aceptor de electrones y el compuesto que resulta oxidado es el reductor o donante de electrones. Hasta 2010, el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB) había clasificado casi 1200 tipos distintos de oxidorreductasas (Monti et al., 2011). En el código clásico de 4 dígitos Figura 4. Representación de la reacción catalizada por oxidorreductasas 14 Introducción propuesto en 1961 para las enzimas (EC a.b.c.d), a las oxidorreductasas se les ha asignado el número “1” en la posición “a”. En la posición “b” se indica el grupo funcional que resulta oxidado o reducido (Tabla 1) A pesar de que el grupo de enzimas con actividad oxidorreductasa es muy amplio, tal como muestra la Tabla 1, las reductasas implicadas en la reducción de los ácidos hidroxicinámicos estarían incluidas en la clase “EC 1.3” que incluye a las oxidorreductasas que actúan sobre un grupo CH-CH. En la tercera posición de esta nomenclatura generalmente se indica el tipo de donante o aceptor implicado. Aunque en principio no se conoce el donante o aceptor implicados en las reductasas Clase EC 1.1 Grupos CH-OH EC 1.2 Grupos aldehído o cetona EC 1.3 Grupos CH-CH EC 1.3.1 NAD + / NADP + EC 1.3.2 Citocromo EC.1.3.3 Oxígeno EC 1.3.5 Quinona EC 1.3.7 Proteína Fe/S EC 1.3.99 Otros EC 1.4 Grupos CH-NH2 EC 1.5 Grupos CH-NH EC 1.6 NADH / NADPH EC 1.7 Compuestos nitrogenados EC 1.8 Grupos sulfurados EC 1.9 Grupo hemo EC 1.10 Grupo difenoles EC 1.11 Peróxido EC 1.12 Hidrógeno EC 1.13 Un donante, oxígeno molecular EC 1.14 Dos donantes, oxígeno molecular EC 1.15 Superóxido EC 1.16 Iones metálicos EC 1.17 Grupos CH o CH2 EC 1.18 Proteínas Fe/S EC 1.19 Flavodoxina EC 1.20 Fósforo / Arsénico EC 1.21 Enlaces x-H/y-H formando x-y EC 1.97 Otros Tabla 1. Clasificación de enzimas oxidorreductasas según la base de datos de enzimas BRENDA (www.brenda-enzymes.org) 15 Introducción de ácidos hidroxicinámicos de L. plantarum, los estudios realizados por Whiting (1975) parecen indicar la existencia de una reductasa NAD-dependiente en la reducción del ácido quínico. Las enzimas que actúan con NAD + o NADP + como donante o aceptor se incluyen en la clase “EC. 1.3.1”. De hecho, dentro de las 80 clases distintas de enzimas que utilizan NAD + o NADP + se encuentra la clase o- cumarato reductasa (EC. 1.3.1.11) que pudiera ser similar a la reductasa de ácidos hidroxicinámicos presente en L. plantarum y otras bacterias lácticas que cataliza la reducción del ácido p-cumárico en ácido florético. Sin embargo, no se ha encontrado una clase de oxidorreductasa que pudiera catalizar una reacción similar a la actividad reductasa de vinil fenoles presentes en L. plantarum y en otras bacterias lácticas. La actividad o-cumarato reductasa (EC. 1.3.1.11) se ha definido tomando como base a una única actividad descrita en 1964 en extractos de la bacteria Arthrobacter sp. Extractos celulares de esta bacteria fueron capaces de catalizar la reducción del ácido o-cumárico a ácido 3-(2-hidroxifenil) propiónico o ácido melilótico en presencia de NADH (Levy, 1964; Levy y Weinstein, 1964). La actividad reductasa de Arthrobacter sp. fue muy específica para ácido o-cumárico puesto que los ácidos p-cumárico, cafeico y ferúlico se redujeron con sólo un 1,4, 0,4 y 0,6% de la actividad mostrada en ácido o-cumárico. La falta total de información sobre las enzimas reductasas implicadas en la reducción tanto de los ácidos hidroxicinámicos como en la reducción de vinil fenoles hace muy interesantes y novedosos los estudios encaminados a la identificación genética y bioquímica de este tipo de enzimas bacterianas. Objetivos 19 Objetivos Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios de las plantas que influyen notablemente en las características organolépticas de los alimentos de origen vegetal. Los ácidos fenólicos representan cerca de un tercio del total de los compuestos fenólicos presentes en la plantas. Entre los ácidos fenólicos, los ácidos hidroxicinámicos son los más frecuentes e incluyen a los ácidos cumárico, cafeico y ferúlico. La presencia de bacterias lácticas en sustratos vegetales con alto contenido en compuestos fenólicos refleja la capacidad que presentan estos microorganismos para transformar estas sustancias. Lactobacillus plantarum es la especie de bacteria láctica utilizada con mayor frecuencia como cultivo iniciador en la fermentación de alimentos de origen vegetal ricos en ácidos hidroxicinámicos. Sin embargo, en la actualidad se dispone de información incompleta de la transformación de estos compuestos en L. plantarum y aunque se han descrito las rutas metabólicas implicadas, no se han caracterizado genética ni bioquímicamente algunas de las enzimas involucradas. L. plantarum transforma los ácidos hidroxicinámicos mediante dos rutas. La primera ruta implica la reducción directa de los ácidos a los correspondientes ácidos fenilpropiónicos substituidos. La segunda implica la descarboxilación de estos ácidos a vinil derivados y la posterior reducción de los mismos a sus etil derivados correspondientes. Teniendo en cuenta estos antecedentes y la escasa información sobre las enzimas reductasas implicadas en el metabolismo de ácidos hidroxicinámicos, en esta memoria se han propuesto los siguientes objetivos: 1. Identificación y caracterización de la enzima reductasa de ácidos hidroxicinámicos en L. plantarum 2. Identificación y caracterización de la enzima reductasa de vinil fenoles en L. plantarum Material y Métodos Material y Métodos 23 1. Estirpes bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos Para el desarrollo de este trabajo se han empleado los plásmidos y las estirpes bacterianas indicados en las Tablas 2 y 3 respectivamente, así como los oligonucleótidos sintéticos descritos en la Tabla 4. Tabla 2. Plásmidos utilizados en este trabajo Plásmido Genotipo/Fenotipo relevante Referencia/Origen pURI3-Cter Derivado de pT7-7, Amp R Curiel et al., 2011 pURI3 Derivado de pT7-7, Amp R Curiel et al., 2011 pURI3-Cter-1424 Amp R Este estudio pURI3-Cter-1425 Amp R Este estudio pURI3-1425 Amp R Este estudio pURI3-Cter -1424+1425 Amp R Este estudio pURI3-Cter-3125 Amp R Este estudio pUCE191 pUCE191-1422* Derivado de pUC19, Amp R , Em R Amp R , Em R Arrecubieta et al., 1995 Este estudio pUCE191-1424* Amp R , Em R Este estudio pUCE191-1425* Amp R , Em R Este estudio pUCE191-1426* Amp R , Em R Este estudio pUCE191-3124* Amp R , Em R Este estudio pUCE191-3125* Amp R , Em R Este estudio Amp R , resistente a ampicilina; Em R , resistente a eritromicina Material y Métodos 24 Estirpe a Genotipo/Fenotipo relevante Referencia/Origen b Escherichia coli DH10B F– mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 deoR araD139 Δ(ara leu)7697 galU galK rpsL nupG λ– Durfee et al., 2008 BL21 (DE3) fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [dcm] ΔhsdS λ DE3 = λ sBamHIo ΔEcoRI-B int::(lacI::PlacUV5::T7 gene 1) i21 Δnin5 T1 Studier et al., 1990/Novagen BL21 (DE3) pURI3-Cter-PAD Derivada de E.coli BL21 (DE3); pURI3- Cter-PAD Rodríguez et al., 2008b Enterococcus casseliflavus DSM 20680 Cepa silvestre DSMZ Enterococcus durans DSM 20633 Cepa silvestre DSMZ Enterococcus faecalis DSM 20478 Cepa silvestre DSMZ Enterococcus faecium CECT 4102, DSM 20477 Cepas silvestres CECT, DSMZ Enterococcus gallinarum DSM 24841 Cepa silvestre DSMZ Enterococcus hirae DSM 20160 Cepa silvestre DSMZ Lactobacillus brevis CECT 216, CECT 4121, ATCC 367 (CECT 5354) Cepas silvestres CECT Lactobacillus fermentum CECT 4007 Cepa silvestre CECT Lactobacillus fructivorans CECT 4785 Cepa silvestre CECT Lactobacillus hilgardii CECT 4786 Cepa silvestre CECT Lactobacillus paraplantarum DSM 10641 (ATCC 10776), DSM 10667T (ATCC 10667T) Cepas silvestre y cepa tipo DSMZ Lactobacillus pentosus DSM 16366, DSM 20199, DSM 20314T Cepas silvestres y cepa tipo DSMZ Lactobacillus plantarum WCFS1 (NCIMB 8826) Cepa silvestre Kleerebezem et al., 2003/NCIMB WCFS1Δlp_1422 Derivada de WCFS1; Δlp_1422 Este estudio WCFS1Δlp _1424 Derivada de WCFS1; Δlp_1424 Este estudio WCFS1Δlp _1425 Derivada de WCFS1; Δlp_1425 Este estudio WCFS1Δlp _1426 Derivada de WCFS1; Δlp_1426 Este estudio WCFS1Δlp _3124 Derivada de WCFS1; Δlp_3124 Este estudio WCFS1Δlp _3125 Derivada de WCFS1; Δlp_3125 Este estudio CECT 220 (ATCC 8014), CECT 221 . (ATCC 14431), CECT 223, CECT 224, .. CECT 749 (ATCC 10241), CECT4645 Cepas silvestres CECT DSM 1055, DSM 2648, DSM 10492, ... DSM 13273, DSM 20246, NC8 Cepas silvestres DSMZ RM28, RM31, RM35, RM38, RM39, ... RM40, RM41, RM71, RM72, RM73 Cepas silvestres De las Rivas et al., 2009/IFI subsp.argentorantensis DSM 16365 T Cepa tipo DSMZ subsp. plantarum CECT 748T (ATCC 14917T), DSM 20174 Cepa tipo y cepa silvestre CECT, DSMZ Lactobacillus sakei subsp. carnosus DSM 15831 Cepa silvestre DSMZ Leuconostoc citreum CECT 4025, CECT 4700 Cepas silvestres CECT Streptococcus gallolyticus UCN 34 (CIP110142) Cepa silvestre Dr. Philippe Glaser (Instituto Pasteur, Francia) aT, cepa tipo. b NCIMB, National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria, Scotland, UK; CECT, Colección Española de Cultivos Tipo; DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures; ; IFI, Instituto de Fermentaciones Industriales Tabla 3. Estirpes bacterianas empleadas en este trabajo Material y Métodos 25 Tabla 4. Oligonucleótidos empleados en este trabajo Nombre Secuencia (5´→ 3´) 597 GGGTAATCGGCCACATTGG 598 CTGCTGCCTCCCGTAGGA 697 CAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAACGAGAAAAATATAAAACACA 698 ATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACTTATTAAATAATTTATAGCTATT 877 GGGGTACCTGCTGTCAAAGAAGTGACG 878 GCTCTAGAAGCTAAAATCACCGCATCAGC 890 GCTATTAATGATGATGATGATGATGGGCCGTCACCGGATCAACGTGCTC 891 GGGGTACCGGTGTAATGATTCAAAGTG 892 GCTCTAGATCCCGTCCTGAGCCATTTTG 918 AACCGCGACAATGTTTTGATT 919 TTGTGAACGGCAGTTTCAGTGT 965 ATGACGTTAGCAAAACATGA 976 ATGAAATTTGTTGGGATT 1051 GGGGTACCAACCAGCTTATATGA 1052 GCTCTAGATGAAAGTCGGTGATCCAA 1222 CACTGGTGATGCCAAATATTGAA 1223 GCCCTGATCATCAAAAGCTTGT 1224 CGGCAGCCCTGACCAA 1225 GCCGGCATCAACGTAACG 1226 TGACATCGACTGGCCCAAT 1227 TGCCCTTTGTCAATGCTTCA 1228 GGGGTACCGAACAGCACCAGTAGC 1229 GCTCTAGAATCTGGCGTAAGTGC 1233 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 1242 ATGAAATTTGTTGGAATTGTTG 1243 ATGCAAAAACTAATGCCAGTC 1327 CTTTTTCAACATTGCGGATGC 1328 CATTAACGCTTGGGGCAAAGG 1329 GACTTATTATCAATATTTGACG 1330 CGTCAGCCGTCGCAATTTTAGTGG 1331 GACTTGCCCATCATCGCCTTGC 1332 CGATAAAGTCGCCTTTAGGTAATTG 1333 CAGTCCCGAACAAGTGACGCG 1385 TGCCGTGGCACCATTTTAC 1470 CATGCCTGGAACCTGTGTTG 1471 TGCCGACCGGAATTGC 1516 TAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACGTTAGCAAAACATGAT 1517 GCTATTAATGATGATGATGATGATGATGACTAACGATTGACTGCT 1627 TCGGCTGGTACCTATTGCCCCTA 1628 AACTTGGCGTCGTCTAGATGAC 1630 ATGCCAAAATCAGATTCCAGCGA 1631 TAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATTTGTTGGGATTGTTGGGA 1632 GCTATTAATGATGATGATGATGATGTTCCTCCCCAGTCACTTGCCGCCA 1633 CAGGGTACCTATTACCGGCCTTA 1634 GTTGAGCTTTCTAGACTGTAATAT 1635 ATGGATCTTGACCGGCTACAGA 1655 CARATHYTNGAYGCNCCNGGNGT 1656 CATCATYTGNGWRAANCCCATNCC 1657 GAYVTNGTNGTNGTNGG 1658 CCNGCNGCRTANAGNCC 1684 CAACGGTATAGTTATCATTCGC 1685 TGTTAGTTGCGTTGAACCAAGC Material y Métodos 26 1686 TGCTCATAGTCTTGAATAAACG 1687 GAATATCGTTCACAGCGGACAG 1688 CAGTAGGAACATTAAATTGACG 1689 TCGCCGGCACCCATTGCTTGTACG 1690 ACTGGTTGTAGTACTGCCAGTTGC 1717 CCTTTGCCCCAAGCGTTA 1718 GTGAATGCTCGGCTGGAAA 1719 GCTGCGCAACAAGGCTATG 1720 CCGGGACCGGTTTGATTT 1791 CATCATGGTGACGATGACGATAAGATGAAA 1792 AAGCTTAGTTAGCTATTATGCGTATTAGGC 1810 GCCACGTTCTCATTAAGGTCCG 1811 CTTAATTGGTCGTCAACAACAGG 1812 CATTGATGTCAGCAATGGCTAG 1813 CACTAGCTGCCAATCTTAGCACCAC Los sitios de corte para las enzimas de restricción KpnI y XbaI están subrayados 2. Medios y condiciones de cultivo Las especies de bacterias lácticas, de manera general, se cultivaron en medio MRS (Pronadisa, España) a 30 ºC sin agitación. Las cepas de Enterococcus se cultivaron en medio BHI (Pronadisa, España) a 37 ºC sin agitación. Para los cultivos en medio sólido se añadió agar al 1,5%. La concentración final de antibiótico utilizada para el cultivo de cepas resistentes fue 10 μg/mL para eritromicina y 100 μg/mL para lincomicina. Las cepas de Escherichia coli se cultivaron rutinariamente en el medio de Luria- Bertani (LB) (Sambrook et al., 1989) a 37 ºC en agitación. Para los cultivos en medio sólido se añadió agar al 1,5%. Para aumentar la solubilidad de las proteínas en los casos que fue necesario se utilizó medio LB suplementado con D-sorbitol 1M y betaína 2,5 mM (Ackerley et al., 2004). Cuando se requirió, se añadió ampicilina al medio a una concentración final de 100 μg/mL. Todas las cepas se conservaron congeladas a -80 ºC en el medio de cultivo al que se añadió glicerol estéril al 10% (concentración final). Material y Métodos 27 3. Técnicas de ADN 3.1. Extracción de ADN cromosómico El ADN cromosómico de las bacterias lácticas se aisló utilizando el protocolo descrito por Sambrook et al. (1989). Las bacterias se cultivaron en 10 mL de medio MRS a 30 ºC durante 16 h. Posteriormente, los cultivos se centrifugaron a 12500 x g durante 5 min. Las células sedimentadas se lavaron una vez en 500 μL de TES (Tris HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1mM; NaCl 100 mM). El sedimento se resuspendió en 600 μL de solución TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM) conteniendo 10 mg/mL de lisozima (Sigma) y se incubó durante 30 min a 37 ºC. Para producir la lisis celular, se adicionaron 70 μL de SDS (Sigma) al 10% y 10 μL de proteinasa K (20 μg/mL) (Sigma) y se incubó a 37 ºC durante 30 min. Una vez lisado el cultivo, el ADN se desproteinizó mediante dos extracciones con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y una extracción con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). Con el fin de precipitar el ADN cromosómico, se añadieron dos volúmenes de etanol absoluto frío (-20 ºC) y el tubo se agitó lentamente hasta que apareció el ADN como un precipitado. El ADN precipitado se lavó con etanol al 70% y se dejó secar al aire. Finalmente, el ADN se disolvió en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; 1 mM EDTA) (Sambrook et al., 1989). El ADN se almacenó a -20 ºC. 3.2 Extracción de ADN plasmídico 3.2.1 Extracción rápida Con el fin de seleccionar las cepas de E. coli transformadas con los plásmidos recombinantes portadores del gen de interés, se utilizó un método rápido de extracción de plásmidos a partir de colonias crecidas en medio sólido. Para llevar a cabo la extracción del ADN plasmídico, la colonia se cogió con una punta estéril y se resuspendió en 20 μL de una solución compuesta por lisozima 0,5 mg/mL, EDTA 25 Material y Métodos 28 mM pH 8,0, Tris HCl 25 mM pH 7,5, RNasa 0,1 mg/mL, azul de bromofenol al 0,02% y glicerol al 0,015%. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 min, posteriormente se añadieron 5 μL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y se agitó vigorosamente. La mezcla se centrifugó a 12500 x g durante 2 min. A continuación se recogieron 10 μL de la fase superior acuosa y se realizó una electroforesis convencional en geles de agarosa. Las células transformadas con los plásmidos recombinantes se seleccionaron mediante la diferencia de tamaño con respecto al ADN plasmídico original debido a la presencia de los genes clonados. 3.2.2 Extracción de alta pureza Para obtener un ADN plasmídico de mayor pureza, se realizó la extracción con los sistemas comerciales High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) y FavorPrep Plasmid Extraction Mini Kit (FAVORGEN Biotech Corp) siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez extraídos se conservaron a -20 ºC hasta su uso. 3.3. Amplificación de secuencias de ADN mediante PCR La amplificación de ADN se llevó a cabo utilizando reactivos adquiridos a las casas comerciales Applied Biosystems y Takara Biotechnology. Durante los procesos de amplificación de ADN se llevaron a cabo reacciones en un volumen final de 25 o 50 μL, conteniendo una ADN polimerasa termoestable, tampones de reacción, desoxinucleótidos (dNTPs), ADN molde y los oligonucleótidos utilizados como cebadores. Se han utilizado las siguientes ADN polimerasas: AmpliTaq Gold TM (Applied Biosystems) a una concentración final de 0,025 U/µL y PrimeSTAR TM HS (Takara Biotechnology) a una concentración final de 1,25 U/ µL siguiendo las instrucciones de los proveedores. Los oligonucleótidos utilizados como cebadores fueron sintetizados por MWG Operon Technologies. Las mezclas de reacción fueron las siguientes: para la polimerasa AmpliTaq Gold TM se empleó MgCl2 a una concentración 2 mM en la mezcla final, el tampón de reacción (Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM), los dNTPs a una concentración final de 0,25 mM, una Material y Métodos 29 concentración de oligonucleótidos de 1 μM y una concentración de enzima de 0,025 U/μL; para la polimerasa PrimeSTAR TM HS se utilizó un tampón de reacción con MgCl2 5 mM en la mezcla final, una concentración final de dNTPs de 0,2 mM, la concentración de oligonucleótidos fue 0,3 μM y una concentración de enzima de 1,25 U/μL. En ambos casos el ADN molde se añadió al final. Las reacciones de PCR consistieron en 30 ciclos de tres fases cada uno: fase de desnaturalización de ADN (95 ºC durante 30 s para AmpliTaq Gold TM y 98 ºC durante 10 s para PrimeSTAR TM HS), una fase de hibridación de los oligonucleótidos con el ADN molde a 55 ºC de 30 s para AmpliTaq Gold TM y 5 s para PrimeSTAR TM HS y una fase de elongación de DNA realizada a 72 ºC durante un tiempo proporcional al tamaño del fragmento a amplificar. La reacción de amplificación con la enzima AmpliTaq Gold TM tiene una etapa inicial de 10 min a 95 ºC para activar la enzima. 3.4. Electroforesis de ADN en geles de agarosa Para resolver las muestras de ADN se utilizaron geles de agarosa al 0,7% ó 2% en tampón TAE (Tris-HCl 40 mM pH 8,0, ácido acético 20 mM, EDTA 2 mM). El mismo tampón se utilizó como electrolito. A las muestras se les añadió un 20% de su volumen de una solución compuesta por azul de bromofenol al 0,25%, xilencianol FF al 0,25% y glicerol al 30% en agua. La electroforesis se realizó a 90 V y, una vez finalizada, los geles se tiñeron con GelRed TM Nucleic acid Gel Stain (Biotium) siguiendo las indicaciones suministradas por el proveedor. Los fragmentos de ADN se visualizaron mediante radiación ultravioleta (λ=302 nm) en un sistema de captura y análisis de imágenes ChemiDoc XRS + (Bio-Rad). Como marcadores de tamaño se utilizaron ADN del fago Lambda cortado con EcoT14I (Takara) y el marcador 100 bp ladder (Biotools). Material y Métodos 30 3.5. Purificación de ADN a partir de geles de agarosa Este proceso se llevó a cabo mediante el kit QIAquick Gel extraction (QIAGEN) siguiendo las indicaciones suministradas por el proveedor. 3.6. Métodos de clonación 3.6.1. Método de clonación independiente de ligación (LIC) Para este estudio se utilizaron los vectores de expresión pURI3 (de las Rivas et al., 2007) y pURI3-Cter (Curiel et al., 2011), pertenecientes a la familia pURI, para realizar la clonación de los genes de interés mediante el método de clonación independiente de ligación (LIC) descrito por de las Rivas et al. (2007). Los vectores pURI3 y pURI3-Cter se construyeron a partir del plásmido comercial pT7-7 (de las Rivas et al., 2007). El vector pURI3 presenta una secuencia líder para la expresión de proteínas tras la región RBS constituida por un residuo de metionina seguida de una cola de afinidad que codifica seis residuos de histidina y la secuencia de reconocimiento para la proteasa enteroquinasa (DDDDK). Esta secuencia líder continua con la metionina inicial de la proteína de interés, una región intergénica no codificante de 230 pb que contiene la diana de restricción NotI y finalmente cuatro codones de terminación en tándem. El vector pURI3-Cter presenta la secuencia líder para la expresión de proteínas tras la región RBS, constituida por un residuo de metionina en el extremo amino terminal y la cola de afinidad que codifica seis residuos de histidina se localiza 280 pb tras ese residuo de metionina, seguida de cuatro codones de terminación en tándem. De esta forma la cola de histidinas se inserta en el extremo C-terminal del gen clonado. Con respecto al proceso de clonación se amplificaron los genes con la ADN polimerasa PrimeSTAR TM HS (Takara) utilizando los oligonucleótidos mencionados en la Tabla 4. Estos oligonucleótidos se diseñaron con extremos 5’ complementarios Material y Métodos 31 a regiones presentes en los vectores de expresión. De esta manera, en una segunda amplificación utilizando el vector como molde y el gen amplificado como cebador, los extremos 5’ hibridan en el plásmido, permitiendo a la enzima ADN polimerasa copiar el resto del plásmido y la consiguiente inserción del gen de interés en el mismo. Para seleccionar los plásmidos que contienen el gen de interés, se realizó una digestión de la mezcla anterior con la enzima DpnI (Roche) durante 10 horas a 37 ºC, ya que estos no presentan secuencias metiladas y por lo tanto no van a ser digeridos por dicha enzima. En algunos clonajes se llevó a cabo una segunda digestión con NotI (Takara) durante 4 horas a 37 ºC en tampón H (Takara), ya que esta diana de restricción se encuentra en la región intergénica no codificante presente sólo en el plásmido original y no en los plásmidos que han incorporado el inserto. Cuando el inserto presentó la diana de restricción NotI no se realizó dicha digestión. Posteriormente, ambas enzimas se inactivaron mediante una incubación a 65 ºC durante 25 min y una vez inactivadas, las células competentes de E. coli DH10B se transformaron con el producto de la digestión (ver apartado 4 de Material y Métodos). Como medio de selección se utilizaron placas de LB suplementadas con ampicilina a 100 μg/mL. 3.6.2. Método de clonación con enzimas de restricción Este método se empleó para clonar fragmentos de los genes de interés en el vector pUCE191 (Amp R y Em R ) (Arrecubieta et al., 1995) con el fin de interrumpirlos posteriormente en L. plantarum mediante un proceso de inserción-duplicación por recombinación homóloga ya que el plásmido pUCE191 no replica en L. plantarum. Los plásmidos derivados de pUC presentan un fragmento del gen lacZ que codifica los primeros 146 aminoácidos de la β-galactosidasa LacZ, dentro de este fragmento se encuentra el lugar de clonaje múltiple (MCS) del plásmido sin interrumpir el marco de lectura. Cuando se utilizan estos plásmidos para transformar cepas que producen el fragmento perteneciente a la zona C-terminal de esta enzima, como es el caso de E.coli DH10B, tiene lugar un proceso de α-complementación que Material y Métodos 32 dará lugar a la proteína completa. Por el contrario, si se clonara un gen, o fragmento de gen, en el MCS no se produciría esta α-complementación ya que no se sintetizaría el fragmento N-terminal de LacZ. Esto servirá posteriormente para seleccionar colonias en placas. Los fragmentos se amplificaron mediante PCR usando el ADN cromosómico de L. plantarum como molde. Los cebadores se diseñaron incorporando las dianas de restricción de KpnI y XbaI de tal forma que los fragmentos amplificados presentaban estas dianas en sus extremos 5’ y 3’ respectivamente. Tanto los fragmentos amplificados como el vector se digirieron con ambas enzimas, se purificaron siguiendo el método de purificación en geles de agarosa mencionado en el apartado 3.5 y posteriormente se ligaron usando la enzima T4 DNA ligase (USB) durante 16 horas a 4 ºC. Finalmente con el producto de la ligación se transformó E.coli DH10B (ver apartado 4.1 de Material y Métodos). 3.7. Secuenciación de ADN y análisis de la información La secuenciación de ADN se realizó en la empresa Secugen (http://www.secugen.es). Para ello se utilizó un secuenciador automático modelo ABI Prism 377 (Applied Biosystems) con el kit de secuenciación BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems) con terminadores fluorescentes y la ADN polimerasa AmpliTaq FS (Applied Biosystems). El programa BLAST, herramienta perteneciente al NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi) se utilizó para la búsqueda de secuencias similares depositadas en las bases de datos de EMBL y GenBank (http://www.ebi.ac.uk/embl/). Los alineamientos múltiples de las secuencias se llevaron a cabo la herramienta Clustal Omega proporcionada por el EMBL-EBI: (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). La predicción de secuencias promotoras y la predicción de terminadores de la transcripción se llevaron a cabo en el portal de internet (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) y (http://rna.igmors.u- psud.fr/toolbox/arnold/index.php) respectivamente. El cálculo del punto isoeléctrico y el peso molecular se analizaron en EXPASY (http://web.expasy.org/compute_pi/). Material y Métodos 33 4. Transformación genética de cepas bacterianas 4.1. Transformación genética en Escherichia coli Para la transformación genética de E. coli, se prepararon células competentes obtenidas mediante el método de cloruro de rubidio (Hanahan, 1983). Las células competentes se obtuvieron cultivando células de E. coli DH10B o BL21 (DE3) en 100 mL de LB hasta una DO600 de 0,48, posteriormente se mantuvieron en hielo durante 30 min y el cultivo se centrifugó a 3800 x g durante 7 min a 4 ºC. El sedimento celular se resuspendió en 30 mL de la solución TFBI (RbCl 100 mM, MnCl2 50 mM, KOAc 30 mM, CaCl2 10 mM y glicerol 15%) durante 90 min a 4 ºC. Pasado ese tiempo, la suspensión celular se centrifugó a 3800 x g durante 7 min a 4 ºC y el sedimento se resuspendió suavemente en 4 mL de la solución TFBII (MOPS 10 mM, RbCl 10 mM, CaCl2 75 mM y glicerol 15%) hasta obtener una suspensión homogénea de células competentes. La suspensión se repartió en alícuotas de 200 μL y éstas se conservaron a -80 ºC. La transformación de las células obtenidas se realizó incubándolas con el plásmido (100 ng) durante 15 min en hielo, seguido de 3 min a 37 ºC y de 5 min en hielo. Posteriormente, se añadió 1 mL de LB a las células y se incubaron a 37 ºC durante una hora. Terminada la incubación las células transformadas se seleccionaron en placas de LB conteniendo el antibiótico correspondiente y se incubaron a 37 ºC hasta la aparición de colonias. Las colonias de E. coli DH10B transformadas con las construcciones realizadas en pUCE191 se crecieron en placas de LB suplementadas con ampicilina (100 μg/mL), isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) (Sigma, Alemania) (0,2 mM), utilizado como inductor del gen lacZ, y el sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D- galactopiranósido (X-gal) (0,04 mg/mL). Este último se hidrolizará por acción de la enzima β-galactosidasa y tras oxidarse originará un compuesto azul (5,5'-dibromo- 4,4'-dicloro-índigo) en aquellas colonias en las que se produzca la α- complementación, mientras que las colonias en las que no haya complementación al tener un fragmento clonado en el plásmido serán blancas. Material y Métodos 34 4.2. Transformación genética en Lactobacillus plantarum La obtención de células electrocompetentes de L. plantarum y la transformación de las mismas se llevó a cabo mediante el método descrito por Aukrust y Blom (Aukrust y Blom, 1992). Con objeto de obtener células de L. plantarum electrocompetentes con una pared celular permeable, éstas se cultivaron un medio MRS modificado (MRS*). Este medio MRS* se diferencia del medio MRS convencional (de Man et al., 1960) en que se ha sustituido la glucosa, principal fuente de carbono, por el aminoácido glicina (1%). En las células Gram+ esta modificación del medio provoca una alteración en la organización del peptidoglicano, debilitando la pared celular y aumentando su permeabilidad (Hammes et al., 1973). Las células se incubaron con este medio a 30 ºC durante 18 h. Posteriormente, con objeto de restaurarlas, se añadió glucosa (1% concentración final) al cultivo y éste se incubó hasta una DO600 de 0,6, momento en el que se centrifugó el cultivo a 3000 x g durante 5 min a 4 ºC. El sedimento celular se lavó con MgCl2 (1 mM) y después con polietilenglicol (PEG-1500) al 30%. Finalmente el sedimento celular volvió a resuspenderse suavemente en PEG-1500 al 30% en frío, en una centésima parte del volumen del cultivo inicial. La transformación se llevó a cabo mediante electroporación, añadiendo 200 μg de plásmido (apartado 3.6.2 de Material y Métodos) a 40 μL de células electrocompetentes de L. plantarum. La mezcla se pasó a cubetas de electroporación y se aplicaron los siguientes parámetros: 400 Ω, 25 μF y 1,50 kV en un equipo Gene Pulser XcellTM (Bio-Rad). Las células transformadas se cultivaron en medio MRS suplementado con 0,5 M de sacarosa y 0,1 M de MgCl2 a 30 ºC sin agitación durante 2 h permitiendo así la reconstitución de la pared celular. Las células transformadas se seleccionaron en placas de MRS suplementadas con lincomicina (10 μg/mL) y eritromicina (100 μg/mL). Material y Métodos 35 4.2.1 Interrupción genética en Lactobacillus plantarum Con objeto de confirmar la participación de las reductasas identificadas en esta tesis en el metabolismo de ácidos hidroxicinámicos, se llevó a cabo la interrupción de los genes de L. plantarum que las codifican mediante un proceso de inserción-duplicación utilizando un plásmido no replicativo a través de un proceso de recombinación homóloga. Para ello, se amplificaron fragmentos internos de los genes mediante PCR y se clonaron en el plásmido pUCE191 según el método del apartado 3.6.2. (Material y Métodos) ya que pUCE191 replica en E. coli pero es incapaz de replicar en L. plantarum. A partir de las células de E. coli DH10B transformadas se extrajeron los plásmidos recombinantes conteniendo los fragmentos internos de los genes de interés. Posteriormente, las células competentes de L. plantarum se transformaron con los plásmidos obtenidos (ver apartado 4.2 de Material y Métodos). Las células transformadas de L. plantarum presentan en su cromosoma el resultado de la recombinación homóloga entre el gen nativo cromosómico y el correspondiente fragmento interno clonado en el plásmido pUCE191, produciéndose la consiguiente interrupción génica por inserción-duplicación. Dichos transformantes se seleccionaron en placas de MRS suplementadas con eritromicina (10 μg/mL) y lincomicina (100 μg/mL). Para evitar la selección de mutantes espontáneos resistentes a dichos antibióticos, se comprobó la presencia del plásmido pUCE191 en el interior de las células transformadas mediante amplificación por PCR del gen que confiere resistencia a eritromicina, utilizando los oligonucleótidos 697 y 698 (Tabla 4). Además, se comprobó la correcta integración de los plásmidos en el interior de los genes seleccionados de L. plantarum mediante amplificación por PCR utilizando un oligonucleótido complementario al plásmido pUCE191 (oligonucleótido 1233) (Tabla 4) y uno complementario a una región externa al fragmento del gen interrumpido. Material y Métodos 36 5. Técnicas de ARN 5.1. Extracción de ARN Las células de L. plantarum se cultivaron en medio MRS sin agitación a 30 ºC durante 16-18 h. Los ensayos se llevaron a cabo en cultivos líquidos de 50 mL. Cuando el cultivo alcanzó una DO600 entre 0,8-0,9 se añadió el compuesto en estudio y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Los cultivos se realizaron por triplicado para cada condición ensayada. Como control, se utilizaron cultivos de L. plantarum sin compuesto. Posteriormente, los cultivos se colocaron en un baño de agua/hielo durante 7 min y se centrifugaron a 4.600 x g a 4 ºC durante 5 min en una centrífuga Sorvall RC 6 Plus (Thermo Scientific). Para la extracción del ARN se siguió un protocolo previamente descrito (Saulnier et al., 2007). Después de la centrifugación del cultivo, el sedimento celular se homogeneizó en 4 volúmenes (1 mL) de tampón Quenching (HEPES 66,7 mM en metanol 60%, pH 6,5) en frío (-20 ºC). Posteriormente, la biomasa celular se separó mediante centrifugación a 11.200 x g durante 10 min a -10 ºC y se le añadió la mezcla de extracción conteniendo 400 μL de fenol ácido, pH 4,5, 100 μL de cloroformo, 30 μL de SDS 10%, 30 μL de acetato sódico 3M, pH 5,2, 400 μL de tampón TE y 500 mg de esferas de vidrio (425-600 micrones, Sigma-Aldrich) previamente tratadas con ácido nítrico al 66% durante 48 h a temperatura ambiente y lavadas con agua libre de nucleasas (agua DEPC) (Sambrook et al., 1989). La suspensión celular resultante se agitó 3 veces en un equipo FastPrep TM Fp120 (Savant) a 5.000 rpm durante 40 s. Entre cada ciclo de agitación los viales se enfriaron durante 2 min en nieve carbónica. El lisado obtenido se centrifugó a 18.900 x g durante 2 min a 4 ºC y se eliminaron los restos de proteínas del sobrenadante mediante dos extracciones sucesivas con 500 μL y 400 μL de cloroformo a 4 ºC. Finalmente, se recogió la fase superior acuosa, que contiene el ARN, y se congeló inmediatamente a -80 ºC. Material y Métodos 37 5.2. Validación de las muestras de ARN La concentración y pureza del ARN se valoró en un espectrofotómetro NanoDrop 2000TM (Thermo Electron Corporation). La concentración se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm y la pureza del ARN se evaluó observando las relaciones A260/A280 y A260/A230. La integridad del ARN se comprobó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% en tampón TAE (libre de nucleasas). En el ARN, se observaron las bandas correspondientes al ARN de las subunidades 23S y 16S ribosómicas con igual intensidad. La banda correspondiente al ARN de la subunidad 5S no se observó en la mayoría de las muestras. La presencia de un mayor número de bandas o pérdida de intensidad de la banda 23S se consideró indicativo de degradación del ARN. 5.3. Tratamiento del ARN con DNAsa La presencia de trazas de ADN en el ARN purificado es habitual, siendo imprescindible eliminarlo para evitar datos erróneos en los estudios de expresión génica. El ADN se eliminó utilizando la enzima DNAsa I (Ambion), siguiendo las indicaciones de la casa comercial. Brevemente, el ARN se incubó con 2 μL de la enzima DNAsa I a 37 ºC durante 1 h, repitiendo el tratamiento hasta conseguir la eliminación del ADN. Por último, a la mezcla se añadieron 20 μL del reactivo de inactivación comercial, se incubó 2-3 min a temperatura ambiente y se centrifugó a 18.890 x g durante 1 min para recuperar en el sobrenadante el ARN limpio. La eliminación del ADN se comprobó mediante PCR. Material y Métodos 38 5.4. Análisis de la expresión génica mediante PCR cuantitativa en tiempo real 5.4.1. Síntesis del ADNc mediante la enzima transcriptasa inversa Para los ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) se sintetizó el ADNc a partir del ARN puro, empleando el kit comercial High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems) siguiendo las indicaciones suministradas por el proveedor. Para ello, 1 μg de ARN se mezcló con 1 μL de la enzima transcriptasa inversa en un volumen final de 20 μL conteniendo 2 μL de oligonucleótidos universales, 0,8 μL de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), 1 μL de inhibidor de nucleasas y 2 μL de tampón. La reacción se llevó a cabo indistintamente en un termociclador Mastercycler personal 5332 o en un Mastercycler gradient 5331 (Eppendorf) a 25 ºC durante 10 min seguido de 2 h a 37 ºC y de un periodo de inactivación a 85 ºC durante 5 s. En todos los casos se incluyó un control negativo sin ARN molde. 5.4.2. Diseño de oligonucleótidos para el análisis mediante RT-qPCR Los oligonucleótidos específicos utilizados para amplificar los fragmentos internos de los genes de interés mediante PCR cuantitativa se diseñaron utilizando el programa Primer Express 3.0 (Applied Biosystems). Las secuencias de los genes se tomaron de la base de datos GenBank ® (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Las secuencias y oligonucleótidos utilizados se muestran en la Tabla 4. 5.4.3. Ensayo de RT-qPCR Los análisis de PCR cuantitativa en tiempo real se realizaron en el sistema 7500 Fast (Applied Biosystems). Se utilizó el método que emplea como fluorocromo SYBR Green, que se intercala en las moléculas de ADN y permite la detección directa de los productos de PCR. Este fluorocromo presenta una longitud de onda de excitación máxima a 494 nm y una emisión máxima a 521 nm. Cada ensayo se realizó por triplicado empleando 12,5 μL de SYBR Green real-time PCR Master Mix 2X (Applied Material y Métodos 39 Biosystems) que contiene la enzima Taq polimerasa, MgCl2, los dNTPs y el fluorocromo, 5 μL de cada uno de los oligonucleótidos específicos a una concentración de 200 μM y el ADNc en un volumen final de 25 μL en agua libre de nucleasas. La amplificación se inició con una activación inicial a 95 ºC durante 10 min, seguida de 40 ciclos donde cada ciclo incluyó dos etapas: una a 95 ºC durante 15 s (desnaturalización) y otra a 60 ºC durante 1 min (hibridación/elongación). El análisis por RT-qPCR en la modalidad de cuantificación absoluta se utilizó para validar la calidad del ADNc con el fin de verificar la ausencia de ADN contaminante en las muestras de ARN empleadas. Para ello se compararon los valores de los ciclos umbrales (Ct) (cycle threshold) resultantes tras realizar una RT-qPCR empleando los oligonucleótidos 597-598, que amplifican un fragmento del gen ARNr 16S de L. plantarum, y utilizando como molde para la reacción el ARN y el ADNc correspondientes a cada uno de los cultivos (tanto del grupo control sin adición del compuesto, como los que lo contienen). Un ADNc se consideró óptimo y se utilizó en los análisis de expresión génica mediante RT-qPCR cuando la variación Ct ADNc – Ct ARN fue igual o superior a 10 (ΔCt ≥10). Paralelamente, todas las parejas de oligonucleótidos se validaron elaborando una curva patrón que utiliza los valores Ct resultantes de amplificar mediante RT-qPCR cantidades decrecientes conocidas del ADN. Mediante el análisis de la curva “disociación-temperatura de fusión” (Tm) y realizando un análisis electroforético en geles de agarosa al 2% se verificó que en todos los ensayos tuvo lugar la amplificación de un único producto con lo cual se descarta la formación de dímeros de los oligonucleótidos. Seguidamente se obtuvieron las gráficas del valor Ct vs el log10 de la concentración de ADN y se aplicó un ajuste de regresión lineal con el cálculo de los coeficientes de correlación (R 2 ). La ecuación de cada recta se utilizó para obtener el valor de la pendiente (que debe ser negativo e inferior a −3,15), y éste se empleó para calcular la eficiencia de la reacción (E) para cada pareja de oligonucleótidos mediante la ecuación E = 10 -1/pendiente (Pfaffl, 2001). Material y Métodos 40 Se seleccionó como gen endógeno el gen ldhD previamente utilizado en estudios llevados a cabo frente a los compuestos utilizados en esta tesis (Reveron et al. 2012). Los oligonucleótidos empleados para su amplificación fueron el 918 y 919. La expresión de cada gen se normalizó frente al gen seleccionado como “control endógeno”. El análisis de la expresión génica se realizó mediante un estudio transcriptómico por RT-qPCR que evaluó la expresión relativa de los genes. Dicha cuantificación relativa permitió conocer cambios en la expresión de los genes de reductasas estudiados en presencia de los ácidos hidroxicinámicos y derivados analizados con respecto a las muestras control sin tratar. El valor de la expresión relativa de los genes (RQ) se determinó mediante el método comparativo 2 -ΔΔCt (Livak y Schmittgen, 2001). El ADNc del grupo control (sin adición del compuesto fenólico) se definió como calibrador (donde el nivel RQ se corrige a 1). Aquellos genes cuyas RQ mostraron valores iguales o superiores a 2 veces (fold change (FC) ≥ ± 2 veces) con respecto al control se consideró que presentaron una expresión diferencial. Para comprobar si existían diferencias estadísticamente significativas, se realizó la comparación de medias mediante una prueba t de Student de dos colas utilizando GraphPad InStat 3.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). 6. Técnicas de proteínas 6.1. Preparación de extractos proteicos Los extractos proteicos libres de células se obtuvieron a partir de cultivos de bacterias E. coli BL21 (DE3) Para ello, los cultivos se centrifugaron a 7.000 x g durante 15 min a 4 ºC. El sedimento se sometió a tres lavados en solución salina para eliminar restos del medio y, posteriormente, se resuspendió en tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,0. Esta suspensión celular se rompió mediante tres pases por una prensa de French (Amicon French pressure cell, SLM Instruments) a una presión de 1.100 psi y posteriormente el lisado se centrifugó a 17.400 x g durante 40 min para eliminar las células completas y los restos celulares. Todo el proceso se realizó a 4 ºC. El Material y Métodos 41 sobrenadante obtenido se filtró con filtros de 0,45 μm de tamaño de poro (Millipore) y los extractos proteicos libres de células así obtenidos se utilizaron para los ensayos enzimáticos en el momento de su preparación. Los extractos proteicos se cuantificaron mediante el método de Bradford (Bradford, 1976). Para ello se añadieron 5 μL de la muestra a analizar a 1 mL del reactivo Bradford Protein Assay (Bio-Rad) diluido en agua destilada (1:4). A continuación se agitó la mezcla y se midió en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm. La curva patrón se realizó utilizando diferentes concentraciones de la proteína seroalbúmina bovina en las mismas condiciones. 6.2. Hiperproducción y purificación de enzimas recombinantes Para llevar a cabo la caracterización bioquímica de las proteínas con actividad reductasa estudiadas en esta tesis, los genes que las codifican se clonaron en los vectores de expresión pURI3 y pURI3-Cter de la familia pURI (Curiel et al., 2011) mediante el sistema de clonación LIC (de las Rivas et al., 2007). Estos vectores de expresión presentan promotores inducibles por IPTG y una secuencia que codifica una cola de afinidad de seis histidinas (His6), con objeto de hiperproducir y purificar las proteínas recombinantes en un único paso. Inicialmente se transformaron células de E. coli DH10B con el plásmido para su propagación pero para la expresión se utilizó la cepa E. coli BL21 (DE3) puesto que es necesario la presencia de la ARN polimerasa T7 del fago defectivo DE3. Los cultivos se incubaron a 37 ºC en medio LB con ampicilina (100 μg/mL) en agitación. Cuando los cultivos alcanzaron una DO600 de 0,4-0,6, se indujeron añadiendo IPTG a una concentración final de 0,4 mM. Se ensayaron diferentes condiciones de temperatura y tiempo de incubación valorando así las condiciones óptimas para la producción de las proteínas recombinantes. La inducción se ensayó a 22 ºC, 30 ºC y 37 ºC durante 4 y 16 h con agitación y, en la mayoría de los casos, se observó que las condiciones óptimas de inducción fueron a 22 ºC y 16 h. Algunas proteínas presentaron problemas de solubilización por lo que se cultivaron durante 5 días a 22 Material y Métodos 42 ºC en medio LB suplementado con betaina y D-sorbitol (Ackerley et al., 2004) induciéndose con IPTG (0,25 mM) desde el principio. Finalizado el periodo de inducción, las células se recogieron mediante centrifugación a 7.000 x g durante 15 min a 4 ºC. Las células se resuspendieron en tampón Tris 20mM pH 8 con NaCl 100 mM y se rompieron mediante prensa de French para obtener el extracto celular conteniendo la enzima recombinante soluble. Finalmente, el extracto se filtró a través de un filtro de 0,45 μm de tamaño de poro (Millipore). Una vez obtenido el extracto filtrado éste se puso en contacto con 1 mL de resina TALON® (Clontech) de cobalto durante 20 min a temperatura ambiente. La resina con cobalto se equilibró previamente con tampón fosfato sódico 50 mM, 300 mM de NaCl, pH 7. Una vez unida la proteína a la resina, se realizó un lavado con fosfato sódico 50 mM, 300 mM de NaCl, pH 7, un segundo lavado con este mismo tampón pero conteniendo 10 mM de imidazol y posteriormente, la proteína recombinante se eluyó con 150 mM de imidazol en el mismo tampón. La pureza de la enzima se determino en geles de SDS-PAGE del 10% o del 12,5%, lo cual permitió conocer las fracciones que contenían la proteína. Dichas fracciones se dializaron frente a tampón fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7 a 4 ºC utilizando membranas de diálisis (CelluSep) de 3,5 kDa de diámetro de poro. Se realizaron cuatro cambios de tampón para eliminar el imidazol presente en la muestra. La concentración de proteínas se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm y utilizando el coeficiente de extinción molar teórico de cada proteína (http://web.expasy.org/protparam/). 6.3. Electroforesis en geles de poliacrilamida La electroforesis de proteínas se realizó en condiciones desnaturalizantes en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS). La técnica utiliza geles de poliacrilamida a una concentración de acrilamida dependiente del tamaño molecular de las proteínas a Material y Métodos 43 analizar (Laemmli, 1970). Las muestras que contenían la proteína a resolver se hirvieron durante 5 min en presencia de un tampón Tris-HCl 6,5 mM pH 6,8, SDS 2%, β-mercaptoetanol 5%, glicerol 10% y azul de bromofenol 0,005%. La electroforesis se realizó a temperatura ambiente, utilizando como electrolito el tampón Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM y SDS 0,1%. Las proteínas presentes en los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250 (Sigma). Como marcador de masa molecular se empleó SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range (BioRad). 6.4. Identificación de proteínas mediante huella peptídica y fragmentación MALDI TOF/TOF Con objeto de identificar el fragmento obtenido a partir de la hidrólisis de la proteína pura, la banda correspondiente del gel SDS-PAGE se cortó y analizó mediante MALDI TOF/TOF. Dicha identificación se llevó a cabo en el Servicio de Proteómica del Centro de Investigaciones Biológicas (CIB), CSIC, Madrid. Brevemente, se realizó una digestión de la muestra con la proteasa tripsina y, posteriormente, ésta se analizó en el espectrómetro de masas MALDI TOF/TOF Autoflex III (Bruker). El espectro de masas resultante presentó una serie de masas (m/z) que correspondían a los péptidos trípticos característicos de la proteína presente en la muestra. Esas masas y sus fragmentaciones se combinaron y enfrentaron a una base de datos de proteínas (NCBInr). Empleando el motor de búsqueda Mascot se compararon todas las masas trípticas teóricas de las proteínas contenidas en la base de datos frente a las masas experimentales obtenidas a partir de la muestra. El resultado fue una lista de candidatos estadísticamente validados con una determinada puntuación (score) para un p <0,05. Material y Métodos 44 6.5. Ensayos de actividad enzimática 6.5.1. Ensayos con extractos de Escherichia coli Los primeros ensayos de actividad se realizaron con extractos de E.coli BL21(DE3) obtenidos tal y como se describe en el apartado 6.1 de Material y Métodos e incubándolos durante 5 días con los diferentes sustratos. Todos se añadieron a una concentración final de 1,5 mM. Las reacciones se llevaron a cabo a una temperatura de 37 ºC durante dieciséis horas. Posteriormente los compuestos fenólicos se extrajeron usando un tercio del volumen de la reacción de acetato de etilo y se filtraron en filtros de polifluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,45 μm (Teknokroma) para luego analizarlos mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (apartado 6.6 de Material y Métodos). 6.5.2. Ensayos con proteínas puras La actividad enzimática de proteínas puras sobre el ácido m-cumárico (en el caso de Lp_1424 y Lp_1425) o 4-vinilfenol (en el caso de Lp_3125) se realizó con una concentración de proteína 10 o 100 μg/mL en tampón fosfato 50 mM a pH 7,0. En las reacciones a las que se añadió el cofactor, la enzima se incubó previamente durante 10 min a 4 ºC o bien con FMN o FAD, o ambos, a una concentración 250 µM. Como donadores de electrones se usaron el NADH o NADPH 500µM que se añadieron posteriormente (Hertzberger et al., 2014) y, por último, el compuesto fenólico a ensayar a una concentración de 1,5 mM (volumen final de la reacción 1 mL). La reacción se incubo a 37 ºC durante 16 h. Como controles se utilizaron los sustratos incubados en el tampón en las mismas condiciones pero sin enzima. Posteriormente los compuestos fenólicos presentes se obtuvieron mediante dos extracciones con un tercio del volumen de acetato de etilo y se filtraron en filtros de PVDF de 0,45 μm (Teknokroma) para luego analizarlos mediante HPLC (apartado 6.6. de Material y Métodos). Material y Métodos 45 6.5.3. Ensayos en cultivos de bacterias lácticas Para estudiar la capacidad que tienen diferentes cepas de bacterias lácticas para reducir algunos ácidos hidroxicinámicos o compuestos derivados (ácidos p-cumárico, m-cumárico, o-cumárico, ferúlico, cafeico y sinápico; 4-vinilfenol, 4-vinilguayacol, 4- vinilcatecol), éstas se cultivaron durante 5 días a 37 ºC sin agitación utilizando su medio de cultivo correspondiente (apartado 2 de Material y Métodos) conteniendo una concentración 1.5 mM del compuesto fenólico a ensayar. Después de la incubación, los cultivos se centrifugaron a 7.000 x g durante 2 min. Los compuestos fenólicos se obtuvieron mediante dos extracciones con un tercio del volumen de acetato de etilo y se filtraron en filtros de PVDF de 0,45 μm (Teknokroma) para luego analizarlos mediante HPLC (apartado 6.6. de Material y Métodos). 6.6. Análisis de actividad enzimática mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Para el análisis mediante HPLC se utilizó un equipo cromatográfico Thermo (Thermo Electron Corporation) equipado con una bomba P4000 Spectra System, un inyector automático AS3000 y un detector de fotodiodos alineados UV6000LP. La muestra se inyectó en un cartucho Nova-pack C18 (25 cm x 4,0 mm d.i. x 4,6 μm de tamaño de partícula) en fase inversa con un gradiente de fase A (agua:ácido acético, 98:2) y B (agua:acetonitrilo:ácido acético, 78:20:2) a temperatura ambiente. El programa de elución utilizado fue el siguiente: 0-55 min, 80% B lineal, 1,1 mL/min; 55-57 min, 90% B isocrático, 1,2 mL/min; 70-80 min, 95% B lineal, 1,2 mL/min; 80-90 min, 100% lineal, 1,2 mL/min; 100-120 min, lavado a 1 mL/min. La detección de los sustratos y los productos de degradación se realizó mediante un barrido de 220 a 380 nm (Bartolomé et al., 2000). Las muestras se filtraron en filtros de PVDF de 0,45 μm (Teknokroma) y se inyectaron por duplicado para su análisis. La identificación de los productos de la degradación se llevó a cabo mediante comparación de los tiempos de retención y los espectros de absorción de cada pico con estándares comerciales. Resultados y Discusión 49 Resultados y Discusión 1. Metabolismo de ácidos hidroxicinámicos Las plantas superiores sintetizan un numeroso grupo de moléculas orgánicas, designadas como metabolitos secundarios. Dentro de este grupo, los ácidos fenólicos son muy abundantes en el reino vegetal. La presencia de estos ácidos fenólicos se asocia a propiedades organolépticas de alimentos de origen vegetal como el color y otras propiedades sensoriales, así como propiedades nutricionales y antioxidantes (Shahidi y Naczk, 2004; Vanbeneden et al., 2008). Los ácidos fenólicos representan un tercio de los compuestos fenólicos consumidos en la dieta, por lo que existe un creciente interés por el estudio de sus propiedades antioxidantes y de sus posibles efectos beneficiosos en la salud del consumidor (Dimitrios, 2006; Kapur y Kapoor, 2001; Lodovici et al., 2001). El término “ácido fenólico”, en general incluye compuestos que poseen, al menos, un grupo hidroxilo y un ácido carboxílico como grupo funcional (Lynd et al., 2002; Robbins, 2003). Los ácidos fenólicos presentes en la naturaleza se pueden agrupar en dos grupos en función de su estructura: los ácidos hidroxicinámicos y los ácidos hidroxibenzoicos. Los ácidos hidroxibenzoicos son los componentes de estructuras complejas como los taninos hidrolizables (galotaninos y elagitaninos). Los ácidos hidroxicinámicos son más abundantes que los ácidos hidroxibenzoicos y fundamentalmente son los ácidos p-cumárico, cafeico, ferúlico y sinápico. Estos ácidos raramente aparecen en su forma libre, excepto en alimentos procesados que se han congelado, esterilizado o fermentado. Los ácidos hidroxicinámicos suelen encontrarse como derivados glicosilados o ésteres con los ácidos quínico, sikímico y tartárico (Manach et al., 2004). El ácido cafeico se combina con el ácido quínico para originar el ácido clorogénico. El ácido cafeico, tanto en su forma libre como esterificada, es el ácido fenólico más abundante y representa entre el 75% y el 100% de los ácidos hidroxicinámicos de la mayoría de frutas. Por su parte el ácido ferúlico es el ácido fenólico más abundante en los cereales (Shahidi y Naczk, 2004). Existen tres tipos de isómeros del ácido cumárico: orto (o), meta (m) y para (p) 50 Resultados y Discusión -cumárico. El ácido p-cumárico es el isómero más abundante del ácido cumárico, puede encontrarse de forma libre en las plantas pero lo más frecuente es que se conjugue con otros componentes como alcoholes, mono y polisacáridos y aminas (Pei et al., 2016). Dependiendo de su estructura los ácidos hidroxicinámicos pueden ejercer diversos efectos en el crecimiento y viabilidad de las bacterias, por lo que constituyen un sistema de defensa antibiótica para las plantas (Pragasam et al., 2013). Algunas especies bacterianas han desarrollado diferentes vías para metabolizar los ácidos fenólicos. Estos procesos ganan importancia a la hora de procesar y conservar alimentos de origen vegetal puesto que la concentración de estos metabolitos va a influir en las diferentes características organolépticas y nutricionales. Lactobacillus plantarum es la especie de bacteria láctica que se aísla más frecuentemente en la fermentación de alimentos de origen vegetal ricos en compuestos fenólicos (Klaenhammer et al., 2007; Rodríguez et al., 2009; Siezen y van Hylckama Vlieg, 2011). Con objeto de conocer si las cepas de L. plantarum eran capaces de degradar los ácidos hidroxicinámicos se llevó a cabo un doble abordaje experimental. Por un lado se realizaron cultivos de L. plantarum en presencia de diversos ácidos hidroxicinámicos puesto que si L. plantarum era capaz de metabolizar estos ácidos, en los sobrenadantes de los cultivos se podrían detectar los productos finales de degradación. Por otro lado, las proteínas solubles presentes en los extractos celulares de cultivos de L. plantarum se incubaron en presencia de los mismos ácidos con objeto de conocer las enzimas inducibles implicadas en la degradación de los mismos (Rodríguez et al., 2008b). Se comprobó que los sobrenadantes de cultivos de L. plantarum crecidos en ácido p-cumárico mostraban la presencia de vinil y etilfenol, originados por la descarboxilación y posterior reducción del ácido p-cumárico. Se observó una situación similar en el caso del ácido cafeico en donde en el sobrenadante del 51 Resultados y Discusión cultivo se identificaron el producto de la descarboxilación (4-vinilcatecol) así como el producto de la descarboxilación y posterior reducción (4-etilcatecol). Al igual que en el caso de los ácidos p-cumárico y cafeico, el ácido ferúlico se metabolizó de una manera similar (Rodríguez et al., 2008b). En las reacciones utilizando los extractos celulares de L. plantarum, se comprobó que sólo se descarboxiló una proporción de ácido p-cumárico, obteniéndose 4-vinilfenol. Una situación similar se obtuvo en la reacción con ácido cafeico, en las que el extracto celular descarboxiló parte del ácido presente en la reacción detectándose 4-vinilcatecol. Sin embargo, los extractos celulares de L. plantarum no fueron capaces de descarboxilar el ácido ferúlico presente. Con ninguno de los ácidos se observó la reducción de los vinil derivados producidos. Además se ensayaron otros ácidos hidroxicinámicos (ácido o-cumárico, m-cumárico, cinámico y sinápico), de los que sólo el ácido m-cumárico se redujo en los cultivos de L. plantarum a ácido 3-(3-hidroxifenil) propiónico (3-HPPA). Estos resultados indican que las enzimas implicadas en la reducción de los vinil derivados de los ácidos hidroxicinámicos al igual que la reductasa de ácido m-cumárico necesitan sintetizarse después de su inducción por la presencia de estos ácidos fenólicos y por ello estas actividades enzimáticas no están presentes en los extractos celulares y si en los cultivos en los que se han inducido dichas enzimas. Todos los resultados expuestos anteriormente indican que el metabolismo de ácidos hidroxicinámicos implica la acción secuencial de dos enzimas, en primer lugar los ácidos se descarboxilan a sus vinil derivados, los cuales por acción de una reductasa inducible se pueden reducir a los correspondientes etil derivados. La descarboxilasa implicada en la descarboxilación de ácidos hidroxicinámicos (phenolic acid decarboxylase o PAD) se ha caracterizado 52 Resultados y Discusión molecular y bioquímicamente (Cavin et al., 1997a; Rodríguez et al., 2008b). Esta descarboxilasa tranforma sólo los ácidos p-cumárico, cafeico y ferúlico en los correspondientes vinil derivados (Cavin et al., 1997b; Rodríguez et al., 2008b). Mediante la inactivación del gen que codifica la descarboxilasa PAD se ha comprobado que L. plantarum posee una ácido fenólico reductasa inducible, no caracterizada, la cual reduce los ácido fenólicos a ácidos fenil propiónicos sustituidos, y convierte los ácidos p-cumárico, ferúlico y cafeico en los ácidos florético, hidroferúlico e hidrocafeico. Se ha sugerido que estas actividades inducibles puedan estar implicadas en la respuesta a estrés inducida por los ácidos fenólicos, convirtiéndolos en compuestos menos tóxicos (Gury et al., 2004). De todo lo expuesto, se puede concluir que de todas las enzimas implicadas en la transformación de ácidos hidroxicinámicos en L. plantarum tan sólo se ha descrito a nivel genético y molecular la descarboxilasa PAD (Lp_3665) (Cavin et al., 1997b; Rodríguez et al., 2008b). Estando completamente desconocidas, tanto a nivel enzimático como genético, las reductasas inducibles implicadas en esta transformación. Por un lado la enzima responsable de la reducción de los ácidos hidroxicinámicos para originar ácidos fenilpropiónicos, y por otro la enzima implicada en la reducción de los vinil fenoles a sus correspondientes etil fenoles (Figura 3). 1.1. Identificación de la proteína reductasa de ácidos hidroxicinámicos en Lactobacillus plantarum WCFS1 El estudio del metabolismo de los ácidos hidroxicinámicos en L. plantarum indica que la proteína implicada en la reducción de estos ácidos a ácidos fenilpropiónicos es una proteína inducible por la presencia del sustrato, como el ácido p-cumárico. Para la identificación de proteínas inducibles se pueden utilizar diversas aproximaciones experimentales, entre los que se encuentran los estudios de cambios globales en el proteoma de la bacteria o bien en la expresión génica de las mismas en respuesta al compuesto en estudio. 53 Resultados y Discusión Reverón et al. (2012) realizaron un estudio transcriptómico global de la respuesta de L. plantarum WCFS1 a la presencia de 1,5 mM de ácido p- cumárico. Este estudio reveló la inducción masiva de genes implicados en la resistencia al estrés así como una parada general de los procesos asociados con el crecimiento. También se observó la inducción de genes relacionados con la destoxificación de ácido p-cumárico. Dentro de este grupo, el que experimentó una mayor inducción, 112 veces, fue el gen lp_3665 que codifica la descarboxilasa PAD implicada en la descarboxilación de algunos ácidos hidroxicinámicos (ácido p-cumárico, ácido cafeico y ácido ferúlico) (Rodríguez et al., 2008b). Junto a este gen, en presencia de 1,5 mM de ácido p-cumárico, también se indujeron los genes lp_3664 y lp_3663 con los que forma un operón. Aparte de pad, en este estudio transcriptómico también se indujeron otra serie de genes, varios de ellos posiblemente implicados en las rutas de transporte de electrones. En esta categoría se encuentra el tercer gen más inducido del estudio, lp_1425, con una inducción de 19,7 veces, el cual está anotado como “fumarato reductasa/ succinato dehidrogenasa, flavoproteína de unión a FAD, FMN reductasa dependiente de NADPH”. También aparece inducido (4 veces) el gen lp_3125 que codifica otra posible copia de una fumarato reductasa, (“fumarato reductasa, subunidad flavoproteína”). Además, genes asociados a lp_1425, como son los genes lp_1424 (“proteína de la familia de FMN reductasas dependientes de NADPH”) y lp_1426 (“proteína de función desconocida”) aparecieron muy inducidos, 15,3 y 7,2 veces, respectivamente. Los resultados publicados por Reverón et al. (2012) muestran que algunos de los genes más inducidos en presencia de ácido p-cumárico codifican enzimas con actividad reductasa (como lp_1425, lp_1424 y lp_3125). Sin embargo, la anotación de su función específica no coincide con la actividad buscada sobre los ácidos hidroxicinámicos. Hay que tener en cuenta que muchos de los genes identificados mediante la secuenciación de genomas y metagenomas se han anotado en función de su similitud con otras proteínas. Aunque esta 54 Resultados y Discusión aproximación es rápida y barata, sin embargo, a más del 40% de las secuencias no se les ha asignado ninguna función y muchas de ellas están anotadas incorrectamente (Green y Karp, 2005). La aproximación genómica genera anotaciones referidas a la función bioquímica que debe verificarse experimentalmente. La aproximación experimental definitiva para asignar una función a una proteína es interrumpir esa actividad en el genoma así como producir y caracterizar bioquímicamente la proteína correspondiente (Kuznetsova et al., 2005). Por ello, con objeto de estudiar la posible implicación de las reductasas codificadas por estos genes en la reducción de los ácidos hidroxicinámicos se decidió interrumpir dichos genes en L. plantarum y comprobar la actividad bioquímica presentada por las cepas mutantes. La interrupción se realizó mediante la inserción de un plásmido no replicativo en el cromosoma de L. plantarum WCFS1. Con ese propósito se clonaron fragmentos internos de los genes que codifican las posibles reductasas en el plásmido no replicativo pUCE191 (Arrecubieta et al., 1995). Los fragmentos internos fueron 242 pb de lp_1424 (amplificados con los oligonucleótidos 1228-1229), 271 pb de lp_1425 (amplificados con 877-878) y 472 pb de lp_3125 (amplificados con 891-892). Una vez construídos los plásmidos pUCE191-1424*, pUCE191-1425* y pUCE191-3125* cada uno de ellos se utilizó para transformar L. plantarum WCFS1 mediante el protocolo descrito por Aukrust y Blom (1992). La recombinación homóloga que se produce entre el fragmento interno clonado en el plásmido pUCE191 y la copia del gen presente en el cromosoma de L. plantarum WCFS1, ocasiona la interrupción del gen de interés (lp_1424, lp_1425 o lp_3125) mediante la integración del plásmido en su copia cromosómica. Se ha descrito que no todas las cepas de L. plantarum pueden transformarse con este tipo de método puesto que la eficiencia de transformación de células con plásmidos integrativos en el cromosoma disminuye varios órdenes de magnitud con respecto a la transformación con plásmidos replicativos (Leer et 55 Resultados y Discusión al., 1993). Sin embargo, la cepa L. plantarum WCFS1 utilizada en este estudio presenta una adecuada frecuencia de transformación con plásmidos integrativos (Jiménez et al., 2013; Reverón et al., 2017). Por ello, células electrocompetentes de L. plantarum WCFS1 se transformaron con los plásmidos pUCE191-1424*, pUCE191-1425* y pUCE191-3125*, obteniendo cepas mutantes de L. plantarum WCFS1 que poseen los genes lp_1424, lp_1425 y lp_3125 no funcionales. La correcta integración de los plásmidos, interrumpiendo el gen de interés, se comprobó mediante PCR utilizando un oligonucleótido que hibrida en el plásmido (oligonucleótido 1233) y otro oligonucleótido que hibrida en el gen de interés, pero en una región externa al fragmento insertado. Para comprobar la correcta integración de los plásmidos, como oligonucleótidos que hibridan en el gen de interés se utilizaron los oligonucleótidos 976 (lp_1424), 1242 (lp_1425) y 965 (lp_3125). Una vez comprobada la correcta inserción de los plásmidos pUCE191- 1424*, pUCE191-1425* y pUCE191-3125* y la consiguiente interrupción de los genes lp_1424, lp_1425 y lp_3125 en el cromosoma de L. plantarum WCFS1, las células mutantes obtenidas (L. plantarum WCFS1Δ1424, L. plantarum WCFS1Δ1425 y L. plantarum WCFS1Δ3125) se cultivaron en MRS en presencia de ácido m-cumárico y de 4-vinilfenol, a una concentración 1,5 mM durante cinco días a 30 ºC. Se decidió utilizar ácido m-cumárico como sustrato modelo para la reducción de ácidos hidroxicinámicos puesto que se ha descrito que es el único isómero de este ácido que no es sustrato de la enzima descarboxilasa PAD (Lp_3665) (Rodríguez et al., 2008b) y por lo tanto, todo el ácido presente en el medio permanece como sustrato para la reducción, siendo más fácil la detección del producto reducido, ácido 3-(3-hidroxifenil) propiónico (3-HPPA). Terminada la incubación, los compuestos fenólicos se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron mediante HPLC. Los resultados demuestran (Figura 5) que las cepas de L. plantarum WCFS1 mutadas en los genes lp_1424 y lp_1425 pierden la capacidad para transformar el ácido m-cumárico 56 Resultados y Discusión presente en el cultivo en 3-HPPA, demostrándose así la implicación de estos genes en la reducción de los ácidos hidroxicinámicos. Por otro lado, la figura también muestra que sólo la cepa de L. plantarum WCFS1 mutada en el gen lp_3125 pierde la capacidad para reducir el 4-vinilfenol presente en el medio de cultivo. Esto indica la necesidad de una proteína Lp_3125 funcional para reducir los vinil derivados a sus etil derivados. Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 A B C D AmC AmC AmC 3-HPPA E 3-HPPA Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 250 500 m A U 0 250 500 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 250 500 m A U 0 250 500 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 A B C D E VF EF EF EF VF Ácido m-cumárico 4 - Vinilfenol Tiempo (min) Tiempo (min) m A U Figura 5. Reducción del ácido m-cumárico o 4-vinilfenol en cultivos de L. plantarum WCFS1 (B), y de las cepas con genes interrumpidos, L. plantarum WCFS1Δ1424 (C), L. plantarum WCFS1Δ1425 (D) y L. plantarum WCFS1Δ3125 (E), y control del medio (A). Los cultivos se incubaron durante 5 días a 30ºC en medio MRS conteniendo ácido m-cumárico o 4-vinilfenol a una concentración de 1,5 mM. UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. AmC, ácido m- cumárico; 3-HPPA, ácido 3-(3-hidroxifenil) propiónico; VF, 4-vinilfenol; EF, 4- etilfenol. Ácido m-cumárico 4-vinilfenol 57 Resultados y Discusión 1.1.1. Organización genética de la región adyacente a los genes lp_1424 y lp_1425 en Lactobacillus plantarum WCFS1 El estudio de los cultivos de las cepas mutantes de L. plantarum WCFS1 demuestra que los genes lp_1424 y lp_1425 están implicados en la reducción del ácido m-cumárico y posiblemente de otros ácidos hidroxicinámicos. Puesto que se trata de genes que aparecen contiguos en el cromosoma, se decidió conocer la organización genética de la región adyacente. En el análisis de la secuencia de esta región se incluyó la región lp_1420- lp_1427 que comprende seis marcos de lectura abierta (ORF), dos de ellas corriente arriba (“upstream”) y otras dos corriente abajo (“downstream”) de los genes implicados en la actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos (Figura 6A). Las dos ORFs situadas upstream se transcriben divergentemente respecto a lp_1424 y lp_1425, al igual que la última ORF analizada. La primera, lp_1420, codifica una proteína 33% idéntica a la peptidasa S41 de Enterococcus faecalis (código de acceso S4GJS1). Lp_1420 codifica una proteína de 323 aminoácidos y 35,5 kDa, anotada como peptidasa S41, pero también como proteinasa que procesa en el extremo carboxilo terminal o como proteína de resistencia a la bacteriocina nisina. La siguiente ORF, lp_1422, codifica una proteína de 315 aminoácidos y 35,5 kDa que es 53 % idéntica a un regulador transcripcional de Lactobacillus dextrinicus DSM 20335 (acceso A0A0R2BT54). Lp_1422 está anotada como posible regulador transcripcional o como regulador transcripcional de la familia LysR. Posteriormente se encuentra la primera proteína identificada como implicada en la reducción del ácido m-cumárico, Lp_1424 es una proteína de 204 aminoácidos y 22,9 kDa, que es 70% idéntica a una oxidorreductasa de Lactobacillus dextrinicus DSM 20335 (acceso A0A0R2BLE3). Lp_1424 aparece anotada como posible oxidorreductasa, flavin reductasa, FMN reductasa NADPH-dependiente, precursor de la subunidad flavoproteina de la fumarato reductasa, o como flavoproteina de unión a FAD, fumarato reductasa/succinato deshidrogenasa. La otra proteína 58 Resultados y Discusión implicada en la reducción del ácido m-cumárico es la codificada por el gen lp_1425, el cual se encuentra separado por sólo dos nucleótidos del gen lp_1424. Lp_1425 es una proteína de 812 aminoácidos y 87,2 kDa, 71% idéntica a una proteína de Lactobacillus dextrinicus DSM 20335 (acceso A0A0R1KPL6) anotada como subunidad flavoproteina de la fumarato reductasa. Asimismo, está citada como flavocitocromo c, subunidad flavoproteína de la fumarato reductasa, FMN reductasa NADPH-dependiente o como flavoproteina de unión a FAD, fumarato reductasa/succinato deshidrogenasa. La primera de las ORFs downstream es lp_1426, que codifica una proteína de 186 aminoácidos y 20,7 kDa, la cual presenta una identidad del 35% con una proteína no caracterizada de Lactobacillus dextrinicus DSM 20335 (acceso A0A0R2NGW1). La proteína Lp_1426 de L. plantarum está anotada como proteína hipotética. Finalmente, la última ORF analizada es lp_1427, que codifica una proteína de 146 aminoácidos y 16,6 kDa. Presenta un 85% de identidad con una proteína anotada como nucleósido 2- deoxirribosiltransferasa de Lactobacillus brevis ATCC 367 (acceso Q03T94). La proteína Lp_1427 de L. plantarum está anotada como nucleósido 2- deoxirribosiltransferasa o como purina trans-desoxiribosilasa. 1.1.2. Análisis transcripcional de la región adyacente a los genes lp_1424 y lp_1425 en Lactobacillus plantarum WCFS1 El análisis de la región en la que se encuentran los genes lp_1424 y lp_1425 sugiere que ambos genes pueden estar organizados como un operón y transcribirse juntos. Se realizó un estudio in silico con objeto de identificar posibles promotores y terminadores de la transcripción. La búsqueda de promotores se realizó utilizando el Berkeley Drosophila Genome Project (http:fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl) para organismos procariotas. La búsqueda de terminadores de la transcripción Rho-independientes se realizó utilizando el programa ARNold Finding Terminators (http://rna.igmors.u- psud.fr/toolbox/arnold/index.php). In silico se identificaron posibles promotores 59 Resultados y Discusión situados upstream de los genes lp_1420, lp_1422, lp_1424, lp_1425 y lp_1427, identificando también los posibles sitios de inicio de la transcripción. Respecto a los terminadores de la transcripción éstos se situaron downstream de lp_1420, lp_1422, lp_1426 y lp_1427 (Figura 6A). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10pb 200- 500- 800- A B lp_1425lp_1422 lp_1424lp_1420 lp_1427lp_1426 Figura 6. (A).Organización genética de la región adyacente a los genes lp_1424 y lp_1425 implicados en la reducción del ácido m-cumárico. Se representa la región de L. plantarum WCFS1 (número de acceso NC_004567.2, posiciones 1.299.251 a 1.309.330). Las flechas indican genes. Se indica la localización de posibles promotores y terminadores de la transcripción. También se señala el tamaño y dirección de los transcritos obtenidos mediante transcripción reversa. (B) Análisis transcripcional mediante RT-PCR de la región adyacente a los genes lp_1424 y lp_1425 implicados en la reducción del ácido m-cumárico. Las reacciones de RT-PCR se realizaron con parejas de oligonucleótidos diseñados para amplificar los genes o las regiones intergénicas a partir del ADNc de L. plantarum WCFS1. Las regiones amplificadas son control sin ADNc (1), región interna de lp_1422 de 628 pb amplificada con los oligonucleótidos 1328+1329 (2), región intergénica lp_1422-lp-1424 de 861 pb amplificada con 1327+1229 (3), fragmento interno de lp_1424 de 241 pb amplificado con 1228+1229 (4), región intergénica lp_1424-lp_1425 de 432 pb amplificada con 1222+1330 (5), fragmento interno de lp_1425 de 758 pb amplificado con 877+878 (6), región intergénica lp_1425-lp_1426 de 778 pb amplificada con 1385+1052 (7), fragmento interno de lp_1426 de 384 pb amplificado con 1051+1052 (8), región intergénica lp_1426- lp_1427 de 323 pb amplificada con 1226+1331 (9), y fragmento interno de lp_1427 de 395 pb amplificado con 1332+1333 (10). En el lado izquierdo se muestra el marcador de peso molecular (100 pb Ladder, Biotools) señalándose algunos de los tamaños. 60 Resultados y Discusión Con objeto de comprobar estos resultados, se realizaron simultáneamente experimentos de transcripción reversa utilizando ARNm obtenido a partir de L. plantarum WCFS1 cultivado en presencia de ácido p-cumárico (1,5 mM). El ADNc se sintetizó como se describe en el apartado 5.4.1 de Material y Métodos y el ADNc obtenido se utilizó para amplificar mediante PCR fragmentos internos de los genes lp_1422 (oligonucleótidos 1328 y 1329, amplifican 628 pb), lp_1424 (oligonucleótidos 1228 y 1229, amplifican 241 pb), lp_1425 (oligonucleótidos 877 y 878, amplifican 758 pb), lp_1426 (oligonucleótidos 1051 y 1052, amplifican 384 pb) y lp_1427 (oligonucleótidos 1332 y 1333, amplifican 395 pb). De manera similar, se amplificaron las uniones entre las ORFs implicadas: Las regiónes intergénicas lp_1422-lp_1424 (oligonucleótidos 1327 y 1229, amplifican 861 pb), lp_1424-lp_1425 (oligonucleótidos 1222 y 1330, amplifican 432 pb), lp_1425-lp_1426 (oligonucleótidos 1385 y 1052, amplifican 778 pb), y por último la unión entre lp_1426-lp_1427 (oligonucleótidos 1226 y 1331, amplifican 323 pb). Tal como muestra la Figura 6B, las regiones intergénicas lp_1422-lp_1424 y lp_1426-lp_1427 así como el gen lp_1422 no produjeron amplificación mediante PCR, lo que indica que estas regiones no se transcribieron en las condiciones utilizadas. De hecho, se identificaron in silico posibles terminadores de la transcripción en las regiones lp_1422-lp_1424 y lp_1426-lp_1427 con ΔG= -10,2 y -12,7 kcal/mol, respectivamente. En contraste, se obtuvo amplificación del tamaño esperado en los genes lp_1424 (241 pb), lp_1425 (758 pb), lp_1426 (384 pb) y lp_1427 (395 pb) así como en las regiones intergénicas lp_1424-lp_1425 (432 pb) y lp_1426- lp_1426 (323 pb). Estos resultados demuestran que los genes lp_1424, lp_1425 y lp_1426 se transcriben juntos, como un ARNm policistrónico. Los tres genes se transcriben formado un operón (Figura 6A). 61 Resultados y Discusión 1.1.3. Implicación de los genes adyacentes a lp_1424 y lp_1425 en la reducción de ácidos hidroxicinámicos Se ha descrito en apartados anteriores que la interrupción de los genes lp_1424 y lp_1425 en L. plantarum origina la pérdida de la capacidad para reducir el ácido m-cumárico. Por otro lado, el análisis transcripcional de la región adyacente a estos genes revela que los genes lp_1424, lp_1425 y lp_1426 se transcriben juntos, y que el gen lp_1422, que codifica un posible regulador transcripcional, se transcribe divergentemente a ellos. Con objeto de conocer la implicación de los genes lp_1422 y lp_1426 en la reducción del ácido m- cumárico, se interrumpieron dichos genes en L. plantarum WCFS1 y se comprobó la actividad bioquímica presentada por las cepas mutantes. La interrupción se realizó utilizando la misma estrategia descrita en apartados anteriores mediante la inserción de un plásmido no replicativo en el cromosoma. Para ello se clonaron fragmentos internos de los genes lp_1422 y lp_1426 en el plásmido pUCE191 (Arrecubieta et al., 1995), un fragmento de 335 pb de lp_1422 (amplificado con los oligonucleótidos 1627-1628), y otro de 366 pb de lp_1426 (amplificado con 1051-1052). Una vez construidos los plásmidos pUCE191-1422* y pUCE191-1426* cada uno de ellos se utilizó para transformar L. plantarum y las colonias recombinantes se seleccionaron por su resistencia a eritromicina. La correcta integración de los plásmidos, se comprobó mediante PCR utilizando el oligonucleótido 1233, que hibrida en el plásmido pUCE191, junto con otro oligonucleótido que hibrida en el gen de interés, pero en una región externa al fragmento insertado. Para el gen lp_1422 se utilizó el oligonucleótido 1630 y para el gen lp_1426 el oligonucleótido 1243. Una vez comprobada la correcta inserción de los plásmidos y la correspondiente interrupción de los genes lp_1422 y lp_1426 en el cromosoma de L. plantarum WCFS1, se realizaron cultivos de estas cepas junto con L. plantarum WCFS1Δ1424 y L. plantarum WCFS1Δ1425 obtenidas previamente. Todas se cultivaron en MRS en presencia de ácido m-cumárico a una 62 Resultados y Discusión concentración 1,5 mM durante cinco días a 30 ºC. Una vez transcurrido el tiempo de incubación los compuestos fenólicos se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron mediante HPLC. De los cuatro genes analizados, tan sólo la interrupción del gen lp_1426 no ocasionaba la pérdida de la capacidad para reducir el ácido m-cumárico presente en el cultivo (Figura 7). Este resultado demuestra que aunque el gen lp_1426 se transcribe conjuntamente con los genes lp_1424 y lp_1425, no codifica una proteína que ejerza un papel catalítico en la reducción del ácido m-cumárico. De hecho, el gen lp_1426 codifica una proteína de 186 aminoácidos a la que no se le ha asignado ninguna función específica. Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 A B C D AmC AmC AmC AmC 3-HPPA 3-HPPA E F Tiempo (min) m A U C AmC Figura 7. Reducción del ácido m-cumárico en cultivos de L. plantarum WCFS1 (B), y de las cepas con genes interrumpidos, L. plantarum WCFS1Δ1422 (C) L. plantarum WCFS1Δ1424 (D), L. plantarum WCFS1Δ1425 (E) y L. plantarum WCFS1Δ1426 (F) y control del medio (A). Los cultivos se incubaron durante 5 días a 30 ºC en medio MRS conteniendo ácido m-cumárico a una concentración de 1,5 mM. UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. AmC, ácido m-cumárico; 3-HPPA, ácido 3-(3-hidroxifenil) propiónico. 63 Resultados y Discusión La Figura 7 muestra además, que la interrupción del gen lp_1422 afecta a la reducción del ácido m-cumárico. La proteína Lp_1422 es una proteína de 315 aminoácidos anotada como posible regulador transcripcional de la familia LysR. Los reguladores transcripcionales pertenecientes a esta familia son los más abundantes en procariotas. Éstos pueden actuar como activadores o represores de un único gen o de operones, y a menudo se suelen transcribir divergentemente de los genes que regulan (Maddocks y Oyston, 2008). Este es el caso del regulador Lp_1422, el cual se transcribe divergentemente a los genes lp_1424, lp_1425 y lp_1426, cuya transcripción posiblemente regula. Los reguladores transcripcionales de la familia LysR generalmente poseen una estructura conservada la cual presenta un dominio N-terminal en donde se localiza un motivo hélice-giro-hélice de unión a ADN y un dominio C-terminal de unión a un co-inductor. Se ha descrito que la unión del co-inductor ocasiona un cambio conformacional en la estructura terciaria del regulador. Existen múltiples sitios de unión en la región intergénica entre el regulador y el gen u operón asociado. Generalmente, estos reguladores se unen desde la posición -35 a +20 pb del sitio de unión regulador (RBS, regulatory binding site) y desde la posición -40 a -20 pb del sitio de unión del activador (ABS, activation binding site). Los reguladores de la familia LysR se unen a una secuencia de ADN palindrómica. La afinidad por cada sitio de unión está determinada por el co- inductor, de manera que la forma “apo” de la proteína suele unirse únicamente al sitio RBS mientras que el sitio ABS sólo se ocupa una vez que el co-ínductor se ha unido a la proteína. La curvatura del ADN es un factor importante en la interacción de estas proteínas, de manera que dos proteínas diméricas del regulador localizadas en los sitios RBS y ABS entran en contacto y como consecuencia directa de la curvatura del ADN, éstas forman una estructura tetramérica activa (Maddocks y Oyston, 2008). Esta estructura permite la formación de un complejo de orden superior que implica la ARN polimerasa, iniciándose así la transcripción. La presencia o ausencia de un co-inductor influye en el estado multimérico del regulador, de manera que éste experimenta un cambio conformacional cuando el co-inductor se inserta en el sitio de unión. 64 Resultados y Discusión La posición de la región de unión con el regulador y la extensión de la curvatura parecen estar relacionados con el hecho de que el regulador actúe como activador o represor de la transcripción. El modelo clásico de un activador transcripcional de la familia LysR implica que el gen que codifica el regulador, en nuestro caso el gen lp_1422, se transcribe cuando la proteína Lp_1422 se disocia de su promotor. La proteína Lp_1422 se une upstream del promotor de los genes transcritos divergentemente (lp_1424 a lp_1426). Cuando el co-inductor (ácido m-cumárico) interacciona con el regulador Lp_1422, se activa la transcripción de estos genes. El hecho de que la interrupción del regulador Lp_1422 inhiba la posible actividad catalítica de las proteínas Lp_1424 y Lp_1425 indica que Lp_1422 es un activador transcripcional. De manera que se puede proponer un modelo para la regulación del operón (Figura 8). De manera similar a la mayoría de reguladores transcripcionales LysR, Lp_1422 regula el operón contiguo. Lp_1422 se expresa en una determinada cantidad bajo condiciones fisiológicas. De manera que se puede asumir que una mínima cantidad de Lp_1422 producida en condiciones fisiológicas normales es suficiente para reprimir su propia expresión posiblemente mediante su unión a una región downstream a su sitio de inicio de la transcripción. La presencia de ácido m-cumárico y su posterior unión a Lp_1422 hace que ésta se separe del ADN. Por consiguiente, la proteína Lp_1422 queda libre para su unión al ADN en una zona upstream al promotor de los genes lp_1424-lp_1426 posiblemente debido a un cambio conformacional, lo que da lugar a la transcripción del operón lp_1424-lp-1426. 65 Resultados y Discusión 1.1.4. Estudio de la expresión de los genes lp_1424 y lp_1425 en presencia de ácido m-cumárico. El estudio de los mutantes con genes interrumpidos revela que tanto la interrupción del gen lp_1422, posible activador transcripcional, como los genes lp_1424 y lp_1425 que codifican posibles reductasas, originan la pérdida de la capacidad de reducir ácidos hidroxicinámicos en L. plantarum WCFS1. Por otro CONDICIONES FISIOLÓGICAS lp_1425lp_1422 lp_1424lp_1420 lp_1427lp_1426 PRESENCIA DE ÁCIDO m-CUMÁRICO AC lp_1425lp_1422 lp_1424lp_1420 lp_1427lp_1426 AC AC AC Ácido m-cumárico 3-HPPA Lp_1424 Lp_1425 Lp_1426 Figura 8. Modelo propuesto para el operón implicado en la reducción de ácido m- cumárico en L. plantarum WCFS1. Los genes (lp_1420 a lp_1427) están representados por flechas. Las elipses alineadas o no alineadas (en azul obscuro) representan el regulador transcripcional Lp_1422 unido o no unido al co-inductor (ácido m- cumárico), respectivamente. La flecha el color verde o rojo representa el avance de la transcripción o el bloqueo del operón lp_1424-lp_1426, respectivamente. AC, ácido m- cumárico. 66 Resultados y Discusión lado, el análisis transcripcional de esta región muestra que los genes lp_1424 y lp_1425 se transcriben juntos, formando un operón con lp_1426. Por ello, la interrupción del primer gen del operón (lp_1424) mediante la inserción de un plásmido podría generar efectos polares en la transcripción de los genes posteriores del operón, es decir, la interrupción podría afectar a la transcripción de los genes lp_1425 y lp_1426. Con objeto de verificar si la interrupción del gen lp_1424 ocasionaba también un efecto polar en la expresión del gen lp_1425 se estudió la transcripción de estos genes en presencia de ácido m- cumárico. A partir de cultivos de L. plantarum WCFS1, L. plantarum WCFS1Δ1424 y L. plantarum WCFS1Δ1425 crecidos en MRS e inducidos con ácido m- cumárico (1,5 mM) durante 10 min, se extrajo el ARN celular. Una vez extraído se trató con la enzima DNAsa y posteriormente se sintetizó el ADNc mediante la enzima retrotranscriptasa. Se diseñaron los oligonucleótidos 1222+1223 y 1224+1225 que amplifican regiones internas de los genes lp_1424 y lp_1425 de 65 y 198 pb, respectivamente. Una vez validados los oligonucleótidos (ver el apartado 5.4.3 de Material y Métodos) se analizó mediante RT-qPCR el cambio en la expresión relativa de estos genes respecto al nivel de transcripción de los mismos utilizando ADNc obtenido a partir de cultivos en ausencia del ácido m- cumárico. Se utilizó como control endógeno el gen ldhD utilizado en estudios anteriores con compuestos fenólicos (Reverón et al., 2012). Como se observa en la Figura 9, los niveles de transcripción obtenidos en presencia de ácido m-cumárico en la cepa silvestre, L. plantarum WCFS1, son similares a los encontrados en el estudio de expresión global utilizando micromatrices de ADN. Durante el estudio transcriptómico los genes lp_1424 y lp_1425 mostraron incrementos en la expresión de 15,3 y 19,7 veces respectivamente (Reverón et al., 2012). Los resultados obtenidos en el mutante L. plantarum WCFS1Δ1424 claramente demuestran que la interrupción del gen lp_1424 ocasiona efectos polares en el transcripción del gen lp_1425, en el que se observa una pequeña expresión posiblemente debida a la presencia de un 67 Resultados y Discusión promotor secundario. Este promotor puede ser el identificado upstream lp_1425 mediante el programa utilizado para la búsqueda de posibles regiones promotoras. En este caso, se trataría de un promotor débil, cuya actividad se incrementa 2,3 veces en presencia de ácido m-cumárico. Por otro lado, la Figura 9 también muestra que en el mutante L. plantarum WCFS1Δ1425 ha desaparecido la inducción del gen lp_1425 provocada por la presencia del ácido m-cumarico en la cepa silvestre. Estos resultados indican que la ausencia de la proteína Lp_1425 parece ser el único factor determinante de la falta de actividad reductasa que se observa en el mutante L. plantarum WCFS1Δ1425, debido a que este mutante posee un gen lp_1424 funcional y por lo tanto la correspondiente proteína Lp_1424. Estos resultados indican que la proteína Lp_1425 es una proteína necesaria para la actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos en L. plantarum. WCFS1 WCFS1Δ1424 WCFS1Δ1425 N iv el d e tr an sc ri p ci ó n r el at iv a Figura 9. Análisis de la expresión relativa de los genes lp_1424 y lp_1425 en L. plantarum WCFS1 en las cepas mutantes L. plantarum WCFS1Δ1424 y L. plantarum WCFS1Δ1425 mediante RT-qPCR en presencia de 1,5 mM de ácido p- cumárico. Los resultados muestran la media de tres experimentos independientes. Las barras representan la transcripción relativa del gen lp_1424 (verde) y lp_1425 (rosa). Las barras de error representan la desviación estándar. 68 Resultados y Discusión 1.1.5. Clonación del gen y producción de la proteína Lp_1425 Los resultados obtenidos con los cultivos de las cepas mutantes de L. plantarum WCFS1 en presencia de ácido m-cumárico, respecto a la ausencia de actividad reductasa y ausencia/presencia de expresión génica, revelaron que la proteína Lp_1425 es una proteína necesaria para la reducción del ácido m-cumárico. Por ello se decidió clonar el gen que la codifica, lp_1425, y comprobar la actividad bioquímica de la proteína tanto en extractos de E. coli como con la proteína pura. Debido a que los plásmidos de la familia pURI se ha utilizado con éxito para la producción y purificación de proteínas recombinantes en L. plantarum (Esteban-Torres et al., 2013, 2014a, 2014b, 2015, 2016; Guillén et al., 2009; Jiménez et al., 2014a, 2014b, 2014c) se diseñaron los oligonucleótidos 889 y 890 para amplificar el gen lp_1425 (2.439 pb) añadiendo en sus extremos 5´nucleótidos capaces de hibridar con el vector de expresión pURI3-Cter utilizando una estrategia de clonación independiente de ligación (de las Rivas et al., 2007). Con el plásmido recombinante pURI3-Cter-1425 se transformó la cepa E. coli DH10B y una vez verificada su secuencia, se transfirió a la cepa E. coli BL21(DE3) para la hiperproducción de la proteína Lp_1425 recombinante. Inicialmente, se cultivó la cepa de E.coli BL21 (DE3) con el plásmido recombinante pURI3-Cter-1425 en medio LB. Cuando el cultivo alcanzó una DO600nm de 0,6 se indujo con 0,4 mM de IPTG. Después de probar distintas condiciones de inducción variando la temperatura y el tiempo se observó que en ninguna de ellas se hiperproducía la proteína Lp_1425. Por ello, se decidió producir la proteína en el vector pURI3, siendo la única diferencia respecto al vector pURI3-Cter que produce la proteína recombinante con una cola de 6 residuos de histidina en el extremo amino-terminal de la proteína en lugar de en el extremo carboxilo-terminal. Para clonar lp_1425 en el vector pURI3 se utilizaron los oligonucleótidos 1791 y 1792. Con el plásmido recombinante pURI3-1425 se transformó la cepa E. coli DH10B y posteriormente E. coli 69 Resultados y Discusión BL21(DE3) para la hiperproducción de la proteína. De nuevo, al ensayar distintas condiciones de inducción se comprobó que aunque se producía la proteína Lp_1425, ésta aparecía como cuerpos de inclusión, no obteniéndose proteína en estado soluble. Para aumentar la solubilidad de la proteína producida y evitar la formación de cuerpos de inclusión se utilizó una variante del protocolo descrito por Ackerley et al. (2004). Las células se cultivaron a en medio LB conteniendo 1M de sorbitol, 2,5mM de betaína y 0,25 mM de IPTG durante cinco días a 22 ºC. Utilizando estas condiciones de cultivo e inducción se comprobó que el extracto soluble de E. coli BL21 (DE3) transformado con el plásmido pURI3-Cter-1425 presentaba una proteína de aproximadamente 87 kDa ausente en el extracto procedente de E. coli BL21 (DE3). Con objeto de comprobar, de manera preliminar, la actividad reductasa de la proteína Lp_1425 recombinante, los extractos solubles obtenidos a partir de los cultivos de E. coli BL21(DE3) (pURI3) y E. coli BL21 (DE3) (pURI3-1425) se incubaron directamente en presencia de ácido m-cumárico (1,5 mM) durante 16 horas a 37 ºC. Pasado el tiempo de incubación los productos de la reacción se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron mediante HPLC. La Figura 10 muestra que, al contrario de lo que ocurre con los extractos de E. coli (pURI3), los extractos que contienen la proteína Lp_1425 hiperproducida son capaces de reducir todo el ácido m-cumárico presente. Como resultado de la actividad de Lp_1425 sobre el ácido m-cumárico se observa la producción de 3-HPPA. 70 Resultados y Discusión A partir de los extractos celulares de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-1425) que presentaban actividad reductasa, se purificó la proteína Lp_1425 recombinante en una única etapa. Se utilizó una cromatografía de afinidad a cobalto debido a la presencia de una cola de seis histidinas en el extremo C-terminal de la proteína recombinante producida. La cromatografía de afinidad mediante metales inmovilizados permite una adsorción muy selectiva de la enzima recombinante (Armisen et al., 1999). La proteína se eluyó de la resina mediante un gradiente de imidazol y posteriormente se dializó en 20 mM tampón fosfato sódico, pH 7 conteniendo 300 mM de NaCl para eliminar los restos de imidazol. Mediante el protocolo de hiperproducción y purificación descrito se obtuvieron 20 mg de proteína por litro de cultivo. Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 A B AmC 3-HPPA Tiempo (min) m A U Figura 10. Reducción de ácido m-cumárico (1,5 mM) mediante extractos celulares de E. coli BL21 (DE3) (pURI3) (A) y E. coli BL21 (DE3) (pURI3-1425) (B). La reacción se realizó en tampón fosfato 50 mM pH 7 a 37 ºC durante 16 horas. UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. AmC, ácido m-cumárico; 3HPPA, 3 ácido 3-(3-hidroxifenil) propiónico. 71 Resultados y Discusión Una vez purificada la proteína Lp_1425, se realizó una electroforesis en un gel SDS-PAGE al 10% de acrilamida para comprobar la hiperproducción de la enzima recombinante en los transformantes de E. coli. En la Figura 11 se puede comprobar que, tanto en el extracto soluble procedente de las células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con el plásmido pURI3-1425 como en las diferentes fracciones eluídas de la resina de afinidad con imidazol, aparece la proteína Lp_1425 recombinante con un tamaño aproximado de 87 kDa. 97- 66- 45- kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 Figura 11. Hiperproducción y purificación de la proteína Lp_1425 recombinante de L. plantarum WCFS1. 1, extracto proteico soluble procedente de células de E. coli BL21 (DE3) (pURI3) inducidas con IPTG; 2, extracto proteico soluble procedente de células de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-1425) inducidas con IPTG; 3, fracción eluida no retenida en la resina de afinidad; 4-8, fracciones eluídas de la columna de afinidad con imidazol (150 mM). Gel SDS-PAGE 10% de acrilamida. El marcador de peso molecular Broad- Range (Bio-Rad) aparece a la izquierda. 72 Resultados y Discusión 1.1.6. Actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos en la proteína Lp_1425 Una vez purificada y dializada la proteína Lp_1425 recombinante de L. plantarum WCFS1 se comprobó si ésta presentaba actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos. Esta proteína está anotada como “fumarato reductasa/ succinato dehidrogenasa, flavoproteína de unión a FAD, FMN reductasa dependiente de NADPH”, debido a que presenta varios dominios, entre ellos un dominio de unión a FAD y otro de unión a FMN. La presencia de varios dominios diferentes con la existencia de cofactores asociados a ellos hace necesario que haya que añadirlos exógenamente para analizar la actividad enzimática de Lp_1425. Por ello se realizaron múltiples reacciones utilizando 10 o 100 µg de la proteína Lp_1425 pura. Se llevaron a cabo reacciones añadiendo 500 µM NADH sólo o añadiéndole 250 µM FAD, 250 µM FMN o ambos. De manera similar se realizaron reacciones equivalentes pero conteniendo 500 µM NADHP, en lugar de NADH, sólo o en combinación con 250 µM FAD y/o 250 µM FMN (Hertzberger et al., 2014). Las reacciones se realizaron en tampón fosfato 50 mM pH 7, en presencia de ácido m-cumárico (1,5 mM) durante 16 horas a 37 ºC. Pasado el tiempo de incubación los productos de la reacción se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron mediante HPLC. Sorprendentemente, la proteína Lp_1425 pura no presentó actividad en ninguna de las condiciones ensayadas. La Figura 12 muestra la reacción conteniendo 500 µM NADH, 250 µM FMN y 250 µM FAD. Los resultados indicaban que durante el proceso de purificación y posterior diálisis de la proteína ésta se había inactivado o bien que la proteína pura necesita un cofactor adicional para su actividad in vitro. 73 Resultados y Discusión Con objeto de comprobar posibles cambios producidos en la proteína durante su purificación y posterior diálisis, se realizó un análisis mediante SDS- PAGE de una alícuota de la proteína recién eluída y que había estado congelada durante una semana a -20 ºC y de la proteína tras la diálisis, que fue la utilizada para el estudio de actividad reductasa in vitro (Figura 13). El gel SDS-PAGE muestra que la proteína congelada tras su elución presenta un incipiente patrón de degradación, con la aparición de una banda minoritaria de aproximadamente 55 kDa. Curiosamente, esta es la única banda que aparece tras la diálisis. Este resultado indica que la proteína Lp_1425 se hidroliza durante la diálisis y almacenamiento. Con objeto de evitar la hidrólisis de la proteína, se repitió la purificación y posterior diálisis en presencia de benzaminida 3mM como inhibidor de proteasas y añadiendo un 10% de glicerol, pero en un gel SDS- PAGE se observó de nuevo la proteolisis de Lp_1425. Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000m A U Tiempo (min) AmC AmC A B Figura 12. Reducción de ácido m-cumárico (1,5 mM) mediante la proteína Lp_1425 recombinante pura. La reacción se realizó en tampón fosfato 50 mM pH 7 conteniendo 500 µM NADH, 250 µM FMN y 250 µM FAD, a 37ºC durante 16 horas sin proteína Lp_1425 (A) o conteniendo 100 µg de proteína Lp_1425 pura (B). UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. AmC, ácido m-cumárico; 3-HPPA, 3 ácido 3-(3-hidroxifenil) propiónico. 74 Resultados y Discusión La Figura 13 sugiere que la degradación de la proteína Lp_1425 ocurre en un punto concreto originando una proteína de aproximadamente 55 kDa. Con objeto de identificar el péptido formado, la proteína pura tras la diálisis se sometió a espectrofotometría de masas y a un estudio de identificación por huella péptídica y fragmentación en el Servicio de Proteómica y Genómica del Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC. El análisis de espectrometría de masas del fragmento de Lp_1425 revela que el péptido originado tiene un tamaño de 56.065 kDa. Por su lado, el análisis de huella péptida identifica con una probabilidad p < 0,05 una única proteína de L. plantarum WCFS1. La proteína identificada es gi/28378151 (Lp_1425) anotada como fumararo reductasa, precursor de la subunidad flavoproteína. Se identificaron 17 péptidos que englobaban el 23,5% de la proteína Lp_1425 (Figura 14A). Todos se localizan en el extremo C-terminal de la proteína. De hecho, se identificó el péptido IAAAHAVAEHVDPVTA que constituye en extremo C-terminal de la proteína Lp_1425 completa. Considerando el tamaño del péptido (56 kDa) y la localización de los fragmentos, se puede identificar el extremo N-terminal del fragmento hidrolizado en el aminoácido 289 de la proteína Lp_1425 completa, siendo su extremo N-terminal la secuencia “QVAQPAV” (Figura 14B). kDa 97 - 66 - 45 - 1 2 56 kDa Figura 13. Análisis electroforético de la proteína Lp_1425 recombinante de L. plantarum WCFS1. 1, proteína congelada 7 días a -20ºC tras su elución; 2, proteína dializada durante 16 h a 4 ºC tras su elución. Gel SDS-PAGE 10% de acrilamida. El marcador de peso molecular Broad-Range (Bio-Rad) aparece a la izquierda. 75 Resultados y Discusión A >YP_004889276.1 fumarate reductase/succinate dehydrogenase,FAD-binding flavoprotein; NADPH-dependent FMN reductase [Lactobacillus plantarum WCFS1] MKFVGIVGTNAQHSYNRMLLEFMQRHFATQAEIEILELTDVPMFDESNDQTDSTIIQNFATKIATADGVI IASPEHNHSVPSALKSIIEWLSFKIHPLDGQAVMIVGASYSVQGSSRAQLHLRQILDAPGVNASVMPGSE FLLGRAQTAFDDQGNLKVQGTVDFLDSCFAKFQKFATIVAEMRAPEALSFAPGTYQVTATGHNGELPMRV TLSADRIENIEIDTSSETQGIADVAFERIPKEIIAGQTLAVDAISGASITSHGVIDGVARAVKEAGANPD DLKKRRATKQVAQPAVKEVTTDVVVVGAGGAGMTAAAKVLQAGHQAVVLEKFPAVGGNTVRAGGPMNAAD PDWQRQFAALPGEKQTLKDLSERDESTIAPEYRADFRKLKQQIDAYLTANTNQKGTLFDSTLLHRIQTYL GGQRTDLNGQEIHGQYDLVKELTDNALDSVKWLQSIGVKFDESQVTMPVGAIWRRGHKPMGDLGFAYIKT LRAFVEQQGGTIMTETPVKELLVTDGQVRGVIATNAAHEKVIVHADAVILASGGFAANTKMLQKYNTYWT AIDDDVKTTNSPAMTGDGIRLGTSVGAALVGMGFSQMMPVSDPETGELFSGLQVPPANFVMVNQQGKRFV NEYGSRDELTQAAIDNGSLFYLIADDEIKKTAYNTTQAKIDQQVANGTLFRADTLTDLAQQIGMDPAALT KTIADYNRYVDAGEDPEFHKTAFDLKVAVAPFYATPRKPATHHTMGGLKIDSDAHVLNTDGQVIDGLYAA GEVAGGIHAGNRLGGNSLSDIFTFGRIAAAHAVAEHVDPVTA B Figura 14. Resultados de la búsqueda en Mascot del péptido originado en la hidrólisis de la proteína Lp_1425. (A) La búsqueda identifica con mayor probabilidad a la proteína giǀ28378151, anotada como fumarato reductasa, precursor de la subunidad flavoproteína de L. plantarum WCFS1 o Lp_1425. El resultado de la búsqueda está expresado en -10*Log(P) donde P es la probabilidad de que el resultado observado sea al azar. Los resultados mayores que 83 son significativos (p <0,05). (B) Secuencia de aminoácidos de la proteína Lp_1425. Los péptidos identificados por MALDI TOF/TOF se muestran con fondo azul. La línea roja señala el sitio de proteolisis de la proteína Lp_1425. 76 Resultados y Discusión Cuando se realiza un estudio de los dominios presentes en la proteína Lp_1425 se observa que desde su inicio hasta el aminoácido 175 se identifica el dominio conservado COG0431 (conserved protein domain family SsuE) de FMN reductasas dependientes de NAD(P)H (Figura 15). Posteriormente, desde el aminoácido 179 al 275 se identifica el dominio conservado COG3976 anotado como proteína no caracterizada que contiene un dominio de unión a FMN. Esta función asignada a este fragmento es sólo una predicción, no se ha demostrado ni funcional ni estructuralmente. De hecho, la mayoría de las proteínas anotadas como FMN reductasas carecen de este dominio que sólo se ha identificado en muy pocas proteínas hipotéticas de Mesorhizobium loti, Treponema palidum y Clostridium acetobutylicum. Continuando con el estudio de los dominios presentes en Lp_1425, por último, desde el aminoácido 321 al 797, se identifica el dominio COG1053 (conserved protein domain family SdhA) como la subunidad flavoproteina de las succinato deshidrogenasas/ fumarato reductasas. El punto de proteolisis de la proteína Lp_1425 se localizaría en el punto de unión de los dominios implicados en la actividad FMN reductasa y el dominio de unión al FAD de flavoproteínas. La Figura 16 muestra un modelo propuesto para la estructura tridimensional modular de Lp_1425. A B Figura 15. Identificación de dominios conservados en las proteínas Lp_1425 (A) y Lp_1424 (B). La búsqueda se realizó en la dirección https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. La línea negra superior representa la proteína desde su extremo N-terminal al C-terminal. La posición de los aminoácidos en las proteínas se señala cada 25 aminoácidos. 77 Resultados y Discusión Resultados publicados con una flavoreductasa dependiente de NADH de Lactobacillus johnsonii apoyan el papel prescindible del fragmento situado entre los aminoácidos 179 y 275 de la proteína Lp_1425. Hertzberger et al. (2014) purificaron una flavoreductasa dependiente de NADH implicada en la producción de H2O2 en L. johnsonii la cual está codificada por dos genes contiguos y muy similares (lj_0548 y lj_0549), que codifican proteínas de 20 kDa contendiendo dominios conservados de flavinreductasas. Las proteínas codificadas por los genes lj_0548 y lj_0549 poseen 178 y 184 aminoácidos que presentan un 42% de identidad entre ellas. De manera similar a lo que ocurre con los genes lp_1424 y lp_1425, en la reducción de ácidos hidroxicinámicos, la interrupción de cada uno de los genes lj_0548 y lj_0549 en L. johnsonii ocasiona la pérdida de actividad reductasa lo que identifica a estos genes como responsables de la pérdida de actividad. La hiperexpresión de cada uno de estos genes de manera individual no ocasiona la producción de la correspondiente enzima recombinante. Sin embargo, cuando se hiperexpresan los dos genes simultáneamente, tal como se encuentran en el genoma de L. johnsonii, si se obtiene la hiperproducción de una proteína del tamaño esperado, sin poder determinar si se trata de Lj_0548 o de Lj_0549. Este resultado puede indicar que sólo se necesitaría esa proteína para obtener actividad. Sin embargo los resultados obtenidos en los estudios de complementación en la cepa con los dos genes delecionados (lj_0548 y lj_0549) indican la necesidad de los dos genes para la actividad reductasa. Los autores concluyen que se necesitan los dos genes para obtener una enzima reductasa funcional, aunque se desconoce su composición exacta (Hertzberger et al., 2014). Posteriormente, Valladares et al. (2015) confirmaron que la hiperexpresión de Lj_0548 (FredB) aumentaba la solubilidad de Lj_0549 (FredA). Mediante cromatografía de exclusión molecular determinaron que Lj_0548 en solución se comportaba como un monómero, mientras que Lj_0549 se agregaba durante la cromatografía. Sin embargo, el perfil de elución cuando se hiperproducían las dos proteínas juntas correspondía con un heterodímero, lo que indica que se 78 Resultados y Discusión requieren ambos monómeros para la obtención de una proteína soluble activa. Además, demostraron que se necesita la formación del heterodímero para la unión del cofactor FMN. Figura 16. Modelo propuesto para la estructura tridimensional modular de Lp_1425. Se señala el módulo N-terminal de unión a FMN (color rosa) y el fragmento C-terminal de unión a FAD (color amarillo). Se muestran moléculas de FMN y FAD unidas. El asterisco señala el sitio donde tiene lugar la proteólisis de Lp_1425 (aminoácido 289). La figura se ha preparado con el programa PyMOL (DeLano, 2008) (http://www.pymol.org) 79 Resultados y Discusión En ambos trabajos se analizó la presencia de genes consecutivos similares a lj_0548 y lj_0549 en otras especies. Aparte de las pertenecientes al grupo de Lactobacillus acidophilus (como L. johnsonii, L. gasseri, L. acidophilus y L. delbrueckii) se encontraron genes similares en las especies L. plantarum WCFS1, P. pentosaceus, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae y Atopobium parvulum. En todas estas especies, el primero de los dos genes es similar en secuencia y tamaño a lj_0548 o lj_0549, y están seguidos por un gen más largo, en el que los 200 aminoácidos del extremo N-terminal son similares a lj_0548. En todos estos casos, estos genes están anotados como fumarato reductasas, NADH deshidrogenasas o flavin reductasas (FMN reductasa dependiente de NAD(P)H aunque no hay ningún dato experimental que apoye estas anotaciones (Hertzberger et al., 2014). En el caso de L. plantarum WCFS1 hay tres parejas de genes que presentan el esquema descrito por Hertzberger et al. (2014), los genes lp_1424 y lp_1425, lp_2733 y lp_2732, y lp_3492 y lp_3491. El alineamiento de la proteína Lp_1424 con los 204 aminoácidos del extremo N-terminal de Lp_1425 revela que existe un alto grado de identidad entre ellos (50%) (Figura 17A). Cuando en el alineamiento se incluyen las proteínas Lj_0548 y Lj_0549 se comprueba que presentan un alto grado de similitud hasta el aminoácido 175 de Lp_1425 que coincide con el dominio conservado COG0431 (conserved protein domain family SsuE) de FMN reductasas dependientes de NAD(P)H identificado en la búsqueda de dominios conservados en la proteína (Figura 15 y 17B). 80 Resultados y Discusión Lp_1424 MKFVGIVGTNATKSTNRQLLQYMQRHFQQQATIEICEIKDLPAFNEPEDRTAPVAIQQLS Lp_1425 MKFVGIVGTNAQHSYNRMLLEFMQRHFATQAEIEILELTDVPMFDESNDQTDSTIIQNFA *********** :* ** **::***** ** *** *:.*:* *:* :*:* . **::: Lp_1424 DKITAADGVIFATPEYDHSIPAVLKSAIEWLSYTTRPLINKPVMIVGASNGSLGTSRAQA Lp_1425 TKIATADGVIIASPEHNHSVPSALKSIIEWLSFKIHPLDGQAVMIVGASYSVQGSSRAQL **::*****:*:**::**:*:.*** *****:. :** .: ******* . *:**** Lp_1424 HLRQILEAPELKALVMPNIEYLLGRSLQAFDDQGDLTYPDKVQELDNAFGEFIDFVDLTN Lp_1425 HLRQILDAPGVNASVMPGSEFLLGRAQTAFDDQGNLKVQGTVDFLDSCFAKFQKFATIVA ******:** ::* ***. *:****: ******:*. ..*: **..*.:* .*. :. Lp_1424 KIMPSSQFFEKSKQFSWRQVTGEE Lp_1425 EMRAPEALSFAPGTYQV-TATGHN :: . : :. .**.: Lj_0549 MKLLAIVGTNADFSYNRFLDQFMAKRYKDQAEIEVYEIADLPRFKKEAQ--PDSKVEEFK Lj_0548 MKLFAIVGSNADHSYNRDLLNFIKKHFTDRYDIELGEVKDLPMFKEGVK--EPAAVASFA Lp_1424 MKFVGIVGTNATKSTNRQLLQYMQRHFQQQATIEICEIKDLPAFNEPEDRTAPVAIQQLS Lp_1425 MKFVGIVGTNAQHSYNRMLLEFMQRHFATQAEIEILELTDVPMFDESNDQTDSTIIQNFA **:..***:** * ** * ::: ::: : **: *: *:* *.: . : .: Lj_0549 NKIREADGVIFATPEYDHGIPSALKSAMEWTGSHAQGNADVMKMKPAMVLGTSYGIQGAS Lj_0548 KKVADADAVLISTPEQQHSVPSSLKSALEWLSSAEH----PFKDKPVVIVGTSVLPQGSA Lp_1424 DKITAADGVIFATPEYDHSIPAVLKSAIEWLSYTTR----PLINKPVMIVGASNGSLGTS Lp_1425 TKIATADGVIIASPEHNHSVPSALKSIIEWLSFKIH----PLDGQAVMIVGASYSVQGSS *: **.*::::** :*.:*: *** :** . : : : .:::*:* *:: Lj_0549 RAQEEMREILLSPDQSANVLPGNEVLIGHAADKFDKNTGDLLDQETIHAIDLAFNNFVKF Lj_0548 RGQSHLKLVLSSPGFGAKVFNGDEFMMGTAPEQFDEN-GNLP-AGTVKFLDHFFDEFDSF Lp_1424 RAQAHLRQILEAPELKALVMPNIEYLLGRSLQAFDDQ-GDLTYPDKVQELDNAFGEFIDF Lp_1425 RAQLHLRQILDAPGVNASVMPGSEFLLGRAQTAFDDQ-GNLKVQGTVDFLDSCFAKFQKF *.* .:: :* :* * *: . * ::* : **.: *:* .:. :* * :* .* Lj_0549 VEQAQK----------------------- Lj_0548 YAEVSK----------------------- Lp_1424 VDLTNKIMPSSQFFEKSKQFSWRQVTGEE Lp_1425 ATIVAEMRAPEALSFAPGTYQV-TATGHN . : A B Figura 17. Alineamientos de las secuencias de aminoácidos de la proteína Lp_1424 y el extremo N-terminal de la proteína Lp_1425 de L. plantarum WCFS1 (A), y su comparación con las proteínas Lj_0548 (FRedB) y Lj_0549 (FRedA) de L. johnsonii (B). Se realizó un alineamiento múltiple de secuencias utilizando el programa Clustal Omega. Se indica (*) identidad entre aminoácidos; (:) cambio semiconservativo y (.) cambio conservativo. 81 Resultados y Discusión 1.1.7. Producción de la proteína Lp_1424 y estudio de su actividad reductasa Debido a las características comunes observadas entre Lp_1424/Lp-1425 y Lj_0548/Lj_0549 y la hidrólisis que experimenta la proteína Lp_1425 pura se decidió realizar un estudio similar al realizado en L. johnsonii por si la proteína Lp_1424 tuviese un papel determinante en la estabilidad de la proteína Lp_1425. En primer lugar se clonó el gen lp_1424 para comprobar si la proteína Lp_1424 presentaba actividad reductora sobre ácidos hidroxicinámicos. Para ello se diseñaron los oligonucleótidos 1631 y 1632 para amplificar el gen (615 pb) añadiendo en sus extremos 5´nucleótidos que hibridan con el vector de expresión pURI3-Cter (de las Rivas et al., 2007). Con el plásmido recombinante pURI3-Cter-1424 se transformó inicialmente la cepa E. coli DH10B y posteriormente se transfirió a la cepa E. coli BL21(DE3) para la hiperproducción de la proteína Lp_1424 recombinante. Los cultivos de E.coli BL21 (DE3) conteniendo el plásmido recombinante pURI3-Cter-1424 en medio LB cuando alcanzaron una DO600nm de 0,6 se indujeron con 0,4 mM de IPTG y se incubaron 18 h a 22 ºC. Utilizando estas condiciones de cultivo e inducción se comprobó que el extracto soluble de E. coli BL21 (DE3) transformado con el plásmido pURI3-Cter-1424 presentaba una proteína hiperproducida de aproximadamente 22 kDa ausente en el extracto procedente de E. coli BL21 (DE3). Con objeto de comprobar, de manera preliminar, la actividad reductasa de la proteína Lp_1424 recombinante, extractos proteicos solubles obtenidos a partir de los cultivos de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter) y E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-1424) se incubaron directamente en presencia de ácido m- cumárico (1,5 mM) durante 16 horas a 37 ºC. Pasado el tiempo de incubación los productos de la reacción se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron mediante HPLC. La Figura 18 muestra que los extractos que contienen la proteína Lp_1424 hiperproducida son incapaces de reducir el ácido m-cumárico 82 Resultados y Discusión presente. Estos resultados confirman que la proteína Lp_1424 por si sola no posee actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos. La ausencia de actividad reductasa se confirmó con la proteína Lp_1424 pura. Para ello, la proteína recombinante se purificó a partir de extractos celulares de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-1424) en una única etapa. Para ello se utilizó una cromatografía de afinidad a cobalto debido a la presencia de una cola de seis histidinas en el extremo C-terminal de la proteína recombinante producida. La proteína se eluyó mediante imidazol y se dializó. Mediante el protocolo de hiperproducción y purificación descrito se obtuvieron 30 mg de proteína Lp_1424 por litro de cultivo. Mediante un gel de SDS-PAGE al 12,5 % de acrilamida se comprobó la hiperproducción y pureza de la enzima Lp_1424 recombinante en los transformantes de E. coli. En la Figura 19 se puede comprobar que, tanto en el Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 AmC AmC A B m U A Tiempo (min) Figura 18. Reducción de ácido m-cumárico (1,5 mM) mediante extractos celulares de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter) (A) y E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-1424) (B). La reacción se realizó en tampón fosfato 50 mM pH 7 a 37 ºC durante 16 horas. UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. AmC, ácido m- cumárico. 83 Resultados y Discusión extracto soluble procedente de las células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con el plásmido pURI3-Cter-1424 como en las fracciones eluídas de la resina aparece la proteína Lp_1424 con un tamaño aproximado de 22 kDa. La proteína Lp_1424 está anotada como “FMN reductasa dependiente de NADPH”, debido a que presenta un dominio de unión a FMN. Se realizaron múltiples reacciones utilizando 10 o 100 µg de la proteína Lp_1424 pura y añadiendo 250 µM FMN sólo o con 500 µM NADH. Se realizaron reacciones equivalentes pero conteniendo 500 µM NADHP, en lugar de NADH (Hertzberger et al., 2014). Las reacciones se realizaron en tampón fosfato 50 mM pH 7, en presencia de ácido m-cumárico (1,5 mM) durante 16 horas a 37 ºC. Pasado el tiempo de incubación los productos de la reacción se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron mediante HPLC. Como era de esperar la 1 2 3 4 5 6 7 kDa 31- 66- 45- 21- 8 Figura 19. Hiperproducción y purificación de la proteína Lp_1424 recombinante de L. plantarum WCFS1. 1, extracto proteico soluble procedente de células de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter) inducidas con IPTG; 2, extracto proteico soluble procedente de células de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-1424) inducidas con IPTG; 3, fracción eluida no retenida en la resina de afinidad; 4-8, fracciones eluídas de la columna de afinidad con imidazol (150 mM). Gel SDS-PAGE 12,5% de acrilamida. El marcador de peso molecular Broad-Range (Bio-Rad) aparece a la izquierda. 84 Resultados y Discusión proteína Lp_1424 pura tampoco presentó actividad en ninguna de las condiciones ensayadas. La Figura 20 muestra la reacción conteniendo 500 µM NADH, 250 µM FAD y 250 µM FAD. Con objeto de conocer si para la reducción de ácido m-cumárico en L. plantarum WCFS1 era necesaria la actividad de las dos proteínas para obtener una enzima reductasa soluble, estable y funcional (como ocurre en la reductasa descrita previamente en L. johnsonii (Hertzberger et al., 2014; Valladares et al., 2015) se clonaron los genes lp_1424 y lp_1425 en el mismo vector. En L. johnsonii cuando se hiperproducen las dos proteínas juntas se forma un heterodímero que es el que constituye la proteína soluble activa. En L. plantarum WCFS1 para clonar ambos genes contiguos en el vector pURI3-Cter se utilizaron los oligonucleótidos 1631 y 890 que amplifican el gen lp_1424, las Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 AmC AmC A B m U A Tiempo (min) Figura 20. Reducción de ácido m-cumárico (1,5 mM) mediante la proteína Lp_1424 recombinante pura. La reacción se realizó en tampón fosfato 50 mM pH 7 conteniendo 500 µM NADH y 250 µM FMN, a 37 ºC durante 16 horas sin proteína Lp_1424 (A) o conteniendo 100 µg de proteína Lp_1424 pura (B). UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. AmC, ácido m-cumárico. 85 Resultados y Discusión dos bases que separan ambos genes y el gen lp_1425. A su vez, el oligonucleótido 890 confiere a la proteína Lp_1425 una cola de 6 residuos de histidina en su extremo C-terminal. No se utilizó el vector pURI3 para que la introducción de la cola de histidinas en el extremo N-terminal de Lp_1425 no afectase a la expresión conjunta de ambos genes. En el vector pURI3-Cter el extremo C-terminal de Lp_1424 y el extremo N-terminal de Lp_1425 aparecen de forma idéntica a cómo se encuentran en la cepa original L. plantarum WCFS1. Siguiendo el protocolo habitual, con el plásmido recombinante pURI3-Cter- 1424+1425 se transformó la cepa E. coli DH10B y para la hiperproducción de las proteínas Lp_1424 y Lp_1425 recombinantes se transfirió a la cepa E. coli BL21 (DE3). Cuando el cultivo de E.coli BL21 (DE3) conteniendo el plásmido recombinante crecido en LB se indujo con 0,4 mM de IPTG y se incubó 18 h a 22 ºC no producía proteínas solubles, por ello las células se cultivaron a 22 ºC en medio LB conteniendo 1M de sorbitol y 2,5 mM de betaína e inducidas desde el principio de la incubación con 0,25 mM de IPTG durante cinco días (Ackerley et al., 2004). Utilizando estas condiciones de cultivo e inducción se comprobó que el extracto soluble de E. coli BL21 (DE3) transformada con el plásmido pURI3-Cter-1424+1425 presentaba dos proteínas hiperproducidas de aproximadamente 87 y 22 kDa ausentes en el extracto procedente de E. coli BL21 (DE3) y correspondientes con las proteínas Lp_1425 y Lp_1424, respectivamente (Figura 21). Este resultado indicaba que la producción simultánea de las proteínas Lp_1424 y Lp_1425 hace que ésta última se hiperproduzca mejor en este vector. 86 Resultados y Discusión Se comprobó la actividad reductasa de extractos solubles proteicos incubados en presencia de ácido m-cumárico (1,5 mM) durante 16 horas a 37 ºC. Pasado el tiempo de incubación los productos de la reacción se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron mediante HPLC. Tal como era de esperar, la Figura 22A muestra que los extractos que contenían las proteínas Lp_1424 y Lp_1425 hiperproducidas reducían el ácido m-cumárico presente, al igual que ocurría cuando sólo estaba presente la proteína Lp_1425. Con objeto de asignar un posible papel a la proteína Lp_1424 en la estabilidad de la proteína Lp_1425 durante su purificación, ambas proteínas se purificaron mediante cromatografía de afinidad a partir de extractos proteicos solubles E. coli conteniendo el plásmido pURI3-Cter-1424+1425. Mediante esta cromatografía de afinidad las proteínas que poseen una cola de residuos de histidinas quedan retenidas en la resina y posteriormente se eluyen mediante 1 2 3 4 5 6 7 8 kDa 66 - 45 - 31 - 21 - Figura 21. Hiperproducción y purificación de la proteínas Lp_1424 y Lp_1425 recombinante de L. plantarum WCFS1. 1, extracto proteico soluble procedente de células de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter) inducidas con IPTG; 2, extracto proteico soluble procedente de células de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-1424+1425) inducidas con IPTG; 3, fracción eluida no retenida en la resina de afinidad; 4-8, fracciones eluídas de la columna de afinidad con imidazol (150 mM). Gel SDS-PAGE 10% de acrilamida. El marcador de peso molecular Broad-Range (Bio-Rad) aparece a la izquierda. 87 Resultados y Discusión imidazol. El plásmido pURI3-Cter-1425+1425 produce la proteína Lp_1425 con una cola de histidinas en su extremo C-terminal, sin embargo produce la proteína Lp_1424 en estado nativo, sin cola de histidinas. Por ello, era de esperar que, aunque la proteína Lp_1424 también resultaba hiperproducida mediante este plásmido, sólo la proteína Lp_1425 se quedase retenida en la resina, para ser posteriormente eluida mediante imidazol. Sin embargo, tal como muestra la Figura 21, cuando la proteína Lp_1425 se eluye con imidazol también se eluye la proteína Lp_1424. Esto sólo es posible si ambas proteínas interaccionan entre ellas. Por ello, se podría pensar en un escenario similar al descrito en la reductasa de L. johnsonii por Valladares et al. (2015) en el que cuando se hiperproducen las dos proteínas juntas se forma un heterodímero, indicando que se requieren ambas proteínas para la obtención de una proteína soluble activa. Con las proteínas Lp_1424 y Lp_1425 producidas a partir del plásmido pURI3-Cter-1424+1425, purificadas mediante cromatografía de afinidad y eluidas en tampón fosfato 50 mM pH 7, se realizaron ensayos de actividad reductasa. Al igual que con la proteína Lp_1425 pura se realizaron múltiples reacciones añadiendo 500 µM NADH sólo o añadiéndole 250 µM FAD, 250 µM FMN o ambos, y reacciones equivalentes pero conteniendo 500 µM NADHP, en lugar de NADH, sólo o en combinación con 250 µM FAD y/o 250 µM FMN. Las reacciones se realizaron en tampón fosfato 50 mM pH 7, en presencia de ácido m-cumárico (1,5 mM) durante 16 horas a 37 ºC. Pasado el tiempo de incubación los productos de la reacción se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron mediante HPLC. Al igual que ocurría con la proteína Lp_1425 pura producida sola, cuando ésta se hiperproducía junto con Lp_1425 no presentaba actividad en ninguna de las condiciones ensayadas. La Figura 22B muestra la reacción conteniendo 500 µM NADH, 250 µM FAD y 250 µM FAD. 88 Resultados y Discusión Puesto que en apartados anteriores se ha demostrado la proteólisis que ocurre en la proteína Lp_1425 durante su purificación y almacenamiento, se decidió observar el patrón mostrado por esta proteína cuando se produce sola o de manera simultánea a Lp_1425. Al comparar los extractos proteicos solubles, se observa que la producción de Lp_1424 aumenta la producción de Lp_1425 (Figura 23A). Además, la presencia de Lp_1424 reduce de manera importante la proteólisis experimentada por Lp_1425 durante su purificación (Figura 23B). Sin embargo, a pesar de la evidente reducción en la proteólisis de Lp_1425, los resultados indican que durante el proceso de purificación y posterior diálisis de Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 50 100 m A U 0 50 100 Tiempo (min) 3-HPPA A m U A AmC 1 2 B Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Tiempo (min) AmC AmC 2 1 Figura 22. Reducción de ácido m-cumárico (1,5 mM) mediante las proteínas Lp_1424 y Lp_1425. A, mediante extractos celulares de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter) (1) y E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-1424+1425) (2). La reacción se realizó en tampón fosfato 50 mM pH 7 a 37 ºC durante 16 horas. B, mediante proteínas recombinantes puras; la reacción se realizó en tampón fosfato 50 mM pH 7 conteniendo 500 µM NADH y 250 µM FMN, a 37 ºC durante 16 horas sin proteínas (1) o conteniendo 100 µg de las proteínas Lp_1424 y Lp_1425 puras (2). UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. AmC, ácido m-cumárico; 3-HPPA, 3 ácido 3-(3-hidroxifenil) propiónico. 89 Resultados y Discusión la proteína ésta se inactiva. Es posible que la proteína pura necesite además un cofactor desconocido para su actividad in vitro. 1 2 3 4 5 6 kDa 66- 31- 21- 45- 87 kDa 56 kDa 22 kDa B 1 2 3 4 kDa 66- 31- 45- A 87 kDa 22 kDa Figura 23. Hiperproducción de las proteínas recombinantes Lp_1424, Lp_1425, y Lp_1424 junto con Lp_1425. A, extractos proteicos solubles procedentes de células de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter) inducidas con IPTG (1), E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-1424) inducidas con IPTG (2), E. coli BL21 (DE3) (pURI3-1425) inducidas con IPTG (3) y E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-1424+1425) (4). B, extracto proteico soluble procedente de células de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter- 1424) inducidas con IPTG (1) y la correspondiente proteína Lp_1424 purificada y dializada (2); extracto proteico soluble procedente de células de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-1425) inducidas con IPTG (3) y la correspondiente proteína Lp_1425 purificada y dializada (4); extracto proteico soluble procedente de células de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-1424+1425) (5) y las correspondientes proteínas Lp_1424 y Lp_1425 purificadas y dializadas (6). Las proteínas Lp_1424 (22 kDa) y Lp_4125, completa (87 kDa) y proteolizada (56 kDa), se señalan con flechas. Gel SDS-PAGE 10 % de acrilamida. El marcador de peso molecular Broad-Range (Bio-Rad) aparece a la izquierda. 90 Resultados y Discusión 1.2. Identificación de sustratos de la reductasa Lp_1425 Los resultados anteriores demuestran que la proteína Lp_1425 es la reductasa responsable de la reducción del ácido m-cumárico a ácido 3-(3-hidroxifenil) propiónico (3-HPPA). También se ha demostrado que la proteína Lp_1424 no desempeña una función directa en la catálisis aunque parece que contribuye a la estabilidad de la proteína reductasa Lp_1425. Esta proteína se proteoliza fácilmente durante la purificación por lo tanto, para presentar actividad reductasa in vitro, podría requerir de condiciones especiales durante el proceso, o bien, la presencia de algún cofactor desconocido. Sin embargo, la proteína hiperproducida en extractos de E. coli mantiene su actividad y no necesita la presencia de ningún cofactor adicional. Por ello, se estudió la actividad reductasa de la proteína Lp_1425 en extractos de E. coli que hiperproducían la proteína y se analizaron diversos ácidos hidroxicinámicos para conocer sus posibles sustratos. Cavin et al. (1997b) mediante la inactivación del gen que codifica la descarboxilasa PAD (Lp_3665) describieron que L. plantarum reducía los ácido fenólicos a ácidos fenil propiónicos sustituidos convirtiendo los ácidos p-cumárico, ferúlico y cafeico en los ácidos florético, hidroferúlico e hidrocafeico. Con objeto de comprobar si la proteína responsable de la reducción de ácido m-cumárico, Lp_1425, era también la responsable de la reducción de otros ácidos hidroxicinámicos, extractos de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-1425) que hiperproducen la proteína Lp_1425 se incubaron en presencia de otros ácidos fenólicos. Los ácidos ensayados fueron ácido m-cumárico (ácido 3- hidroxicinámico), ácido o-cumárico (ácido 2-hidroxicinámico), ácido p- cumárico (ácido 4-hidroxicinámico), ácido cafeico (ácido 3,4- dihidroxicinámico), ácido ferúlico (ácido 3-metoxi-,4-hidroxicinámico), ácido sinápico (ácido 3, 5-dimetoxi-,4-hidroxicinámico) y ácido cinámico (Figura 24). 91 Resultados y Discusión Los resultados obtenidos demuestran que la proteína Lp_1425 es la responsable de la reducción de todos los ácidos hidroxicinámicos ensayados (m- cumárico, o-cumárico, p-cumárico, cafeico, ferúlico y sinápico) para originar ácido 3-(3-hidroxifenil) propiónico (3-HPPA), 3-(2-hidroxifenil) propiónico (2- HPPA), o ácido melilótico, 3-(4-hidroxifenil) propiónico o ácido florético, 3- (3,4-dihidroxifenil) propiónico o ácido hidrocafeico, 3-3-metoxi-(4- hidroxifenil) propiónico o ácido hidroferúlico o 3,5-dimetoxi-(4-hidroxifenil) propiónico o ácido hidrosinápico, respectivamente (Figura 25). Los compuestos obtenidos se identificaron mediante la comparación de su tiempo de retención y espectro de absorción, determinado mediante un detector de diodos, con el tiempo de retención y espectro del compuesto comercial (datos no mostrados). OH O R2 R1 R 3 OH O R2 R1 R4 Ácido cinámico R1 R2 R3 R4 Cafeíco OH OH H H Cinámico H H H H m-Cumárico OH H H H o-Cumárico H H H OH p-Cumárico H OH H H Ferúlico OCH3 OH H H Sinápico OCH3 OH OCH3 H Figura 24. Representación esquemática de la estructura de los ácidos cinámicos utilizados en esta tesis. 92 Resultados y Discusión Lp_1425 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 300 m A U 0 100 200 300 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 50 100 m A U 0 50 100 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Tiempo (min) AFlo 3-HPPA 2-HPPA AHF AHC ACi AHS A B C D E F G Control Tiempo (min) Minutes 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 50 100 m A U 0 50 100 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 250 500 m A U 0 250 500 m U A ApC AmC AoC AF AS AC ACi A B F C D E G Control Lp_1425 Figura 25. Reducción de ácidos cinámicos (1,5 mM) mediante extractos celulares de E. coli BL21 (DE3) (pURI3) (Control) y E. coli BL21 (DE3) (pURI3-1425) (Lp_1425). Las reacciones se realizaron en tampón fosfato 50 mM pH 7 a 37 ºC durante 16 horas. Los ácidos analizados fueron ácido p-cumárico (A), ácido m-cumárico (B), ácido o-cumárico (C), ácido ferúlico (D), ácido cafeíco (E), ácido cinámico (F) y ácido sinápico (G). UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. ApC, ácido p- cumárico; AFlo, ácido florético; AmC, ácido m-cumárico; 3-HPPA, 3 ácido 3-(3- hidroxifenil) propiónico; AoC, ácido o-cumárico; 2-HPPA, 3 ácido 3-(2-hidroxifenil) propiónico; AF, ácido ferúlico; AHF, ácido hidroferúlico; AC, ácido cafeíco; AHC, ácido hidrocafeíco; ACi, ácido cinámico; AS, ácido sinápico; AHS, ácido hidrosinápico. 93 Resultados y Discusión Hasta la realización de esta tesis no existía información genética sobre ninguna proteína con capacidad reductora de ácidos hidroxicinámicos. En 1964 se describió una actividad o-cumarato reductasa en extractos celulares de Arthobacter sp. Estos extractos fueron capaces de catalizar la reducción del ácido o-cumárico a ácido 3-(2-hidroxifenil) propiónico, también llamado ácido melilótico, en presencia de NADH (Levy, 1964; Levy y Weinstein, 1964). La actividad reductasa de Arthrobacter sp. fue muy específica con respecto a este ácido. Aparte de este trabajo no se ha purificado ninguna proteína bacteriana que presente actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos, ni tampoco se ha identificado el gen que la codifica. De la misma manera tampoco existía ninguna información, ni genética ni bioquímica, de la proteína de L. plantarum responsable de la reducción de estos ácidos. Se había descrito la presencia de esta actividad bioquímica en L. plantarum (Cavin et al., 1997b) y en otras bacterias lácticas como Lactobacillus curvatus y Weissella cibaria aunque no se realizó ningún estudio sobre la enzima responsable (Filannino et al., 2014). Por lo tanto, en esta tesis no sólo se ha identificado la enzima reductasa implicada en la reducción de ácidos hidroxicinámicos, sino que es la primera vez que se identifica una enzima con dicha actividad bioquímica. 1.3. Inducción de la actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos Puesto que en apartados anteriores se ha descrito que el análisis transcripcional de la región donde se localiza el gen que codifica Lp_1425 revela que los genes lp_1424, lp_1425 y lp_1426 se transcriben juntos, y que el gen lp_1422, que codifica un posible regulador transcripcional, se transcribe divergentemente a ellos, se decidió estudiar la respuesta de estos cuatro genes a la presencia de los diferentes ácidos hidroxicinámicos estudiados. Para ello, se extrajo ARN de cultivos de L. plantarum WCFS1 incubados durante 10 min en presencia de 1,5 mM de cada uno de los ácidos hidroxicinámicos (p-cumárico, m-cumárico, o- cumárico, ferúlico y sinápico), con el ácido cinámico, y con un ácido hidroxibenzoico (ácido gálico). El ARN extraído se trató con la enzima DNasa I 94 Resultados y Discusión y posteriormente se sintetizó el correspondiente ADNc, mediante la enzima retrotranscriptasa. Se amplificaron regiones internas de los cuatro genes mediante los oligonucleótidos 1717+1718 (amplifican 61 pb de lp_1422), 1222+1223 (amplifican 65 pb de lp_1424), 1224+1225 (amplifican 198 pb de lp_1425) y 1226+1227 (amplifican 56 pb de lp_1426). Una vez validados los oligonucleótidos se analizó mediante RT-qPCR el cambio en la expresión relativa de los genes respecto al nivel de transcripción de los mismos utilizando el ADNc obtenido a partir de cultivos de L. plantarum incubados en ausencia de ácidos fenólicos. Los resultados obtenidos muestran que los niveles de transcripción en los cultivos de L. plantarum incubados en presencia de ácidos hidroxicinámicos de los genes lp_1424, lp_1425 y lp_1426 son superiores a los obtenidos en ausencia de ácido (Figura 23). Estos cambios fueron estadísticamente significativos (p <0,05). Curiosamente, estos genes también incrementaron su expresión de manera significativa en presencia del ácido cinámico, a pesar de no ser éste sustrato de la reductasa Lp_1425, posiblemente debido a la similitud en su estructura. Sin embargo, en presencia de un ácido hidroxibenzoico (ácido gálico) no se observa un aumento en la expresión de estos genes. Excepto, en presencia del ácido sinápico, la expresión del gen lp_1422, que codifica un activador transcripcional, no se vio alterada en presencia de ninguno de estos ácidos. 95 Resultados y Discusión 1.4. Actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos en otras bacterias lácticas En apartados anteriores se ha demostrado que la proteína Lp_1425 de L. plantarum WCFS1 confiere actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos a E. coli. Estudios previos realizados en bacterias lácticas han demostrado que esta actividad enzimática es una actividad poco frecuente entre estas bacterias (Filannino et al., 2014). Con objeto de conocer la presencia de proteínas similares a Lp_1425 en otras bacterias lácticas se realizó una búsqueda en las bases de datos. Dicha búsqueda reveló que sólo existían proteínas similares a Lp_1425 en un reducido número de especies de los géneros Lactobacillus (L. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Ácido p-cumárico Ácido m-cumárico Ácido o-cumárico Ácido ferúlico Ácido cinámico Ácido sinápico Ácido cafeíco Ácido gálico N iv el d e tr an sc ri p ci ó n r el at iv a Figura 26. Análisis de la expresión relativa de los genes lp_1422 a lp_1426 en L. plantarum WCFS1 mediante RT-qPCR en presencia de 1,5 mM de distintos ácidos hidroxicinámicos. Los resultados muestran la media de tres experimentos independientes. Las barras representan la transcripción relativa de los genes lp_1422 (azul obscuro), lp_1424 (verde), lp_1425 (rosa) y lp_1426 (azul claro). Las barras de error representan la desviación estándar y los asteriscos marcan las diferencias estadísticamente significativas en comparación con la muestra control sin tratar (test t de Student de dos colas, *, p <0,05). 96 Resultados y Discusión plantarum, L. paraplantarum, L. pentosus, L. fabifermentans, L. alimentarius, L. paralimentarius y L. dextrinicus), Enterococcus (E. phoeniculicola, E. columbae, E. flavescens, E. casseliflavus y E. gilvus), Streptococcus (S. parasanguinis, S. uberis, S. equinus, S. gallolyticus y S. mutans), y Clostridium (C. beijerinckii y C. saccharobutylicum). Todas estas especies poseían proteínas de 803 a 813 aminoácidos que presentaban alta identidad (62 a 97%) con la proteína Lp_1425 de L. plantarum WCFS1. El alto grado de similitud se situaba a lo largo de toda la proteína. Curiosamente, en la búsqueda también aparecían proteínas de otras especies de Lactobacillus como L.gasseri, L. fermentum, y L. johnsonii, pero que sólo presentaban alta identidad a partir del aminoácidos 189 de Lp_1425. Es decir, estas proteínas carecían del dominio conservado COG0431 (conserved protein domain family SsuE) de FMN reductasas dependientes de NAD(P)H. Con objeto de identificar posible motivos conservados entre todas las proteínas de aprox. 800 aminoácidos identificadas en la búsqueda como similares a Lp_1425 se realizó un alineamiento de las mismas (Figura 27). El alineamiento permitió corroborar el alto grado de identidad entre ellas a lo largo de toda la proteína. Se identificaron numerosos motivos conservados de aminoácidos, y se seleccionaron dos dominios a partir de los cuales se diseñaron los oligonucleótidos degenerados 1655 (codifica QILDAPGV, posición 124 de Lp_1425) y 1656 (codifica GMGF(S/T)QMM, posición 598 de Lp_1425). Estos oligonucleótidos amplifican un fragmento de 1422 pb del gen que codifica Lp_1425. 97 Resultados y Discusión CBE ---------MKFIAIVGTSAKRSYNRKLLQFMKKYFESKAEIEILEITDVPMFNQSDNQS CSA ---------MKFIAIVGTSAKRSYNRKLLQFMKKYFDLKAEIEILEITDVPMFNQSDNQS SMU ---------MKLIAIVGTNAKQSYNRILLQFMKRHFVQKADIDIMEIANVPMFNETEDQT SPA ---------MKLVAIVGTNAKQSYNRSLLQFMQRHFATKADIEILEITDVPMFNETDDQT SUB ---------MKFIGIIGTNAKKSYNRQLLSFMREHFASKAEIEVLEIDQVPMFNETNDQT SEQ MGSQLGGAFMKLVAIVGTNAKKSYNRLLLQYMARHFAKQADIELLEITDVPMFNETDDQT SGA ---------MKLVAIVGTNAKKSYNRLLLQYMARHFAKKADIEILEITDVPMFNETDDQT LPA ---------MKFIGIVGTNAKKSYNRMLLQFMQKHFANKAEIEILELKDVPMFNESKDQS LAL ---------MKFIGIVGTNAKKSYNRMLLQFMQKHFMDKAEIEILELKDVPMFNESQDQS LFA ---------MKLVGIVGTNAKKSYNRELLEFIQRHFSDQAELEILELTDVPLFNENDDQS LPE ---------MKFVGIVGTNARHSYNRMLLEFMQRHFADQAEIEILELTDVPMFDESNDQT LPL ---------MKFVGIVGTNAQHSYNRMLLEFMQRHFATQAEIEILELTDVPMFDESNDQT LPP ---------MKFVGIVGTNARHSYNRMLLEFMQHHFATQAEIEILELADVPMFDESNDQT ECO ---------MKFVAIVGTNAKKSYNRQLLLFMQEHFRPQVSIELLELNQVPLFNESEDQT LDE ---------MKFIGIVGTNAEFSYNRLLLNYMQKHFAAEADLEILEVTDVPMFNESDDQT EFL ---------MKFVGLIGTNAKKSTNRQLVAFMQREFAALAEIELLEIKDVPMFNETQDQT ECA ---------MKFVGLIGTNAKKSTNRQLVAFMQREFAALAEIELLEIKDVPMFNETQDQT EPH ---------MKFVGIVGTNAKKSYNRMLLTFMQTHFSEQAEIELLELTDVPMFNESDDQS EGI ---------MKFVGIVGTNAKESYNRKLLKFMKKHFSDKAEIDILELDKVPLFNESKDQS **::.::**.*. * ** *: :: * ..::::*: .**:*::..:*: CBE SSEVIQMFNNKITESDGVIIATPEYNHSIPSSLKSLIEWLSFDLHPLAGKPVMILGASLD CSA SSEVIQMFNDKITASDGVIIATPEYNHSIPSSLKSLIEWLSFDLHPLAGKPVMILGASLD SMU DLPAIQNFNTKISQADGVIIATPEHNHTIPSSLNSLLEWLSFKVHPLDGKPLMIVGASYD SPA DTPVIQKFNQAISEADGVIISTPEHNHTIPSSLNSLIEWLSFNIHPLDGKPTMIVGASYD SUB ESEIIQTFNRKISEADGVIIATPEHNHTIPSALNSLIEWLSFKVHPLTGKPVMIVGASYS SEQ ESAVIQNFNTKITEADGVIIATPEHNHTIPSSLNSLIEWLSFNIHPLTGKPVMIVGASYG SGA ESAIIQEFNSKITEADGVIIATPEHNHTIPSSLNSLLEWLSFNIHPLAGKPTMIVGASYD LPA DSPIIQEFNQKIAASDGVIIATPEHNHSIPAALKSIIEWLSFNLHPLDGKAVMIVGASYN LAL KSEIIQEFNQKIEASDGVIIATPEHNHSIPAALKSIIEWLSFNLHPLDGKPVMIVGASYS LFA QSPVIQAFNEKITAADGVIIATPEHNHSVPSALKSIIEWLSFKLHPLDGKPVMIVGASYS LPE DSDVIQQFATKIEAADGVIIASPEHNHSIPSALKSIIEWLSFKIHPFDGQAVMIVGASYS LPL DSTIIQNFATKIATADGVIIASPEHNHSVPSALKSIIEWLSFKIHPLDGQAVMIVGASYS LPP DSTVIQKFATKIAAADGVIIASPEHNHSVPSALKSIIEWLSFKIHPLDGQAVMIVGASYS ECO NSPIIQYFNTAITQADGVIIATPEHNHSIPSALKSILEWLSFKIHPLDGKPVMIVGASYD LDE NSPIIQTFNDKITAADGVIIATPEHNHSIPSALKSVLEWLSFNVHPFDGKPTMLVGASLS EFL NSEVIQRLNSKILAADGVIIATPEHNHSIPSALKSVLEWLSFNLHPFDGKPVMIVGASYD ECA NSEVIQRLNSKILAADGVIIATPEHNHSIPSALKSVLEWLSFNLHPFDGKPVMIVGASYD EPH DTPIIQSFNQKIMEADGVIIATPEHNHSIPSALKSILEWLSFNLHPFDGKPVMIVGASYD EGI ESPIIQLFNTKILEADGVIIATPEHNHSIPSSLKSILEWLSFNLHPFDGKPVMIVGASYD . ** : * :*****::**:**::*::*:*::*****.:**: *: *::*** . CBE VQGSSRAQLHLRQILDAPGVDANVMPGYEFLLGSAHKAFDEEGNLNNERTIDFLEICFLR CSA SQGSSRAQLHLRQILDAPGVDANVMPGYEFLLGSANKAFDEEGNLNNERTIDFLEICFLR SMU VQGSSRAQLHLRQILDAPGVNAAVMPGSEFLLGRAHQAFDEAGNLKSEATVDFLESCFFK SPA VQGSSRAQLHLRQILDAPGVNATVMPGSEFLLGRAHRAFDENGDLIDERTVDFLDSCFYR SUB EQGSSRAQLHLRQILDAPGVNAMVMPGSEFLLGNVHKAFDEAGHLKDLRTIDFLDSCFFR SEQ IQGSSRAQLHLRQILDAPGVNAVVMPGSEFLLGLAHQAFDENGDLKGQGTIDFLESCFFR SGA IQGSSRAQLHLRQILDAPGVNATVMPGSEFLLGRVQTAFDENGDLKDQGTIDFLESCFFR LPA IQGSSRAQLHLRQILDAPGVNASVMPGSEFLLGKAQDAFDDKGNLKAQRTIDFLDSCFAK LAL IQGSSRAQLHLRQILDAPGVNASVMPGSEFLLGRAQEAFDENGNLNSERTISFLDSCFAK LFA VQGSSRAQLHLRQILDAPGVNASVMPGSEFLLGRAQTAFDDQGNLKESGTVAFLESCFAK LPE VQGSSRAQLHLRQVLDAPGVNASVMPGSEFLLGRAQTAFDDQGNLKVQGTIDFLDSCFAK LPL VQGSSRAQLHLRQILDAPGVNASVMPGSEFLLGRAQTAFDDQGNLKVQGTVDFLDSCFAK LPP VQGSSRAQLHLRQILDAPGVNASVMPGSEFLLGRAQTAFDDQGNLKVQGTVDFLDSCFAK ECO VQGSSRAQLHLRQILDAPGVNATVMPGNEFLLGRAHEAFDENGHLKDERTIDFLESCFRK LDE DQGSSRAQLHLRQILDAPGVNAAVMPGNEFLLGNVQLAFDDEGNLKDQGTIDFLETCFSR EFL 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Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína Lp_1425 con proteínas similares presentes en las bases de datos. Se realizó un alineamiento múltiple utilizando el programa Clustal Omega a partir de las secuencias depositadas en la base de datos GenBank. Las secuencias de aminoácidos pertenecen a Lactobacillus plantarum WCFS1 (LPL) (F9UNH3), L. paraplantarum DSM 10667 (LPP) (A0A0R1QJE0), L. pentosus DSM 20314 (LPE) (A0A0R1FXD4), L. fabifermentans DSM 21115 (LFA) (A0A0R2NPE4), L. alimentarius DSM 20249 (LAL) (A0A0R1K448), L. paraalimentarius DSM 13961 (A0A0R1I2J3), L. dextrinicus DSM 20335 (LDE) (A0A0R2BIK6), Enterococcus phoeniculicola ATCC BAA-412 (EPH) (R3TK57), E. columbae DSM 7374 (ECO) (S0KK72), E. flavescens ATCC 49996 (EFL) (R2PHW6), E. casseliflavus ATCC 12755 (ECA) (F0EFK5), E. gilvus ATCC BAA-350 (EGI) (R2V727), Streptococcus parasanguinis ATCC 15912 (SPA) (F8DIF2), S. uberis ATCC BAA-854 (SUB) (B9DVC8), S. equinus ATCC 9812 (SEQ) (E8JQB5), S. gallolyticus ATCC 43143 (SGA) (F5WWW2), S. mutans ATCC 700610 (SMU) (Q8DW88), Clostridium beijerinckii ATCC 51743 (CBE) (A6LV44) y C. saccharobutylicum DSM 13864 (CSA) (U5MMB3). Identidad entre aminoácidos (*), cambio no conservativo (:) y cambio conservativo (.). La secuencia codificada por los oligonucleótidos 1655 y 1656 se indica marcada en amarillo y con flechas. 102 Resultados y Discusión Utilizando ADN extraído de 47 bacterias lácticas tanto de la especie L. plantarum (26 cepas) como de otras 14 especies de bacterias lácticas (21 cepas) (Tabla 3) y mediante PCR con los oligonucleótidos degenerados 1655 y 1656 se comprobó la presencia de genes similares en estas bacterias lácticas. De las cepas analizadas no se obtuvo amplificación del gen lp_1425 en las pertenecientes a las especies Lactobacillus brevis, L. sakei, L. fructivorans, Leuconostoc citreum, Enterococcus durans, E. faecalis, E. faecium y E. hirae. Por el contario, se obtuvo una amplificación positiva con todas las cepas de las especies del grupo de L. plantarum (L. plantarum, L. paraplantarum y L. pentosus) así como en las cepas analizadas de E. casseliflavus y E. gallinarum (Figura 28). Los resultados obtenidos indican que todas las cepas analizadas del grupo de L. plantarum poseen el gen que codifica la proteína Lp_1425. Estos datos se han confirmado mediante una búsqueda en las bases de datos que ha revelado que todas las cepas del grupo L. plantarum cuyo genoma se ha secuenciado completamente (como por ejemplo, L. plantarum ECFS1, UCMA3037, Lp90, WHE92, NC8, 4_3, IPLA88, ZJ316, 16, AY01. ST-III, B21, DOMLA, CMPG5300, JDM1, 2165 y EGD-AQY, L. pentosus IG1, MP- 10 y KCA1, L. paraplantarum L-Z59, y L. fabifermentans T30PCMOL) poseen un gen similar a lp_1425 (datos no mostrados). 103 Resultados y Discusión Para estudiar la relación entre la presencia del gen lp_1425 y la actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos se cultivaron las 47 cepas de bacterias lácticas, en las que se había realizado el estudio mediante PCR, en medio MRS o BHI conteniendo 1,5 mM de ácido m-cumárico a 30 ºC durante cinco días. Después de la incubación, los compuestos fenólicos presentes en los sobrenadantes se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron mediante HPLC. La Figura 29 muestra los resultados obtenidos. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 kb 7,7- 4,2- 1,5- 0,9- 2,7- Figura 28. Amplificación mediante PCR de genes que codifican proteínas similares a Lp_1425 en bacterias lácticas. La amplificación se realizó utilizando los oligonucleótidos 1655 y 1656 y el ADN cromosómico de las cepas Enterococcus casseliflavus DSM 20680 (1), E. durans DSM 20633 (2), E. faecalis DSM 20478 (3), E. faecium CECT 4102 (4), E. gallinarum DSM 24841 (5), E. hirae DSM 20160 (6), Lactobacillus brevis CECT 5354 (7), L. fermentum CECT 4007 (8), L. fructivorans CECT 4785 (9), L. paraplantarum DSM 10641 (10), L. plantarum subsp. argentoratensis DSM 16365 (11), L. plantarum subsp. plantarum ATCC 14917 (CECT 748) (12), L. plantarum DSM 10492 (13), L. pentosus DSM 16366 (14), L. sakei subsp. carnosus DSM 15831 (15), Leuconostoc citreum CECT 4025 (16), y Streptococcus gallolyticus UCN34 (17). Algunos fragmentos del marcador de peso molecular λ/EcoT14I (Takara) están representados en la izquierda. 104 Resultados y Discusión Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 250 500 m A U 0 250 500 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 1500 m A U 0 500 1000 1500 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 300 m A U 0 100 200 300 Minutes 20 40 60 80 m A U 0 100 200 300 m A U 0 100 200 300 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 m U A Tiempo (min) Tiempo (min)Tiempo (min) control 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 AmC 3-HPPA AmC AmC AmC AmC AmC AmC 3-HPPA 3-HPPA 3-HPPA AmC AmC AmC AmC 3-HPPA 3-HPPA3-HPPA 3-HPPA Figura 29. Reducción del ácido m-cumárico en cultivos de Enterococcus casseliflavus DSM 20680 (1), E. durans DSM 20633 (2), E. faecalis DSM 20478 (3), E. faecium CECT 4102 (4), E. gallinarum DSM 24841 (5), E. hirae DSM 20160 (6), Lactobacillus brevis CECT 5354 (7), L. fermentum CECT 4007 (8), L. fructivorans CECT 4785 (9), L. paraplantarum DSM 10641 (10), L. plantarum subsp. argentoratensis DSM 16365 (11), L. plantarum subsp. plantarum ATCC 14917 (CECT 748) (12), L. plantarum DSM 10492 (13), L. pentosus DSM 16366 (14), L. sakei subsp. carnosus DSM 15831 (15), Leuconostoc citreum CECT 4025 (16), y Streptococcus gallolyticus UCN34 (17). Los cultivos se incubaron durante 5 días a 30 ºC en medio MRS conteniendo ácido m-cumárico a una concentración de 1,5 mM. UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. AmC, ácido m-cumárico; 3-HPPA, ácido 3-(3-hidroxifenil) propiónico. 105 Resultados y Discusión En todas las cepas analizadas los resultados obtenidos mediante HPLC coinciden con los resultados obtenidos en el ensayo de PCR, de manera que todas las cepas de las especies del grupo L. plantarum (31 cepas) fueron capaces de reducir el ácido m-cumárico presente en el medio de cultivo, y amplificaron mediante PCR el fragmento de 1422 pb correspondiente al gen lp_1425. Además, las cepas analizadas de las especies E. casseliflavus (E. casseliflavus DSM 20680) y E. gallinarum (E. gallinarum DSM 24841) también redujeron el ácido m-cumárico y amplificaron el fragmento esperado del gen lp_1425 (Figura 28 y 29). Por el contrario, las cepas que no produjeron amplificación del gen mediante PCR, tampoco fueron capaces de reducir el ácido m-cumárico (Figura 28 y 29). Coincidiendo con los resultados obtenidos en esta tesis, estudios llevados a cabo por Filannino et al. (2014) muestran que cepas de las especies L. brevis (L. brevis POM2 y POM4), y L. fermentum (L. fermentum F1) no redujeron los ácidos hidroxicinámicos presentes en el medio de cultivo (Tabla 5). Aunque en esta tesis no se han estudiado cepas de las especies Lactobacillus rossiae y Leuconosctoc mesenteroides, se ha descrito que son capaces de reducir el ácido p-cumárico, cafeico o ferúlico (Filannino et al., 2014). Por el contrario, la cepa L. curvatus PE5 y cepas de Weissella cibaria (P9, P10, 3XMR5, POM12) redujeron los ácidos p-cumárico, cafeico o ferúlico a ácido florético, ácido hidrocafeico o ácido hidroferúlico, respectivamente (Filannino et al., 2014). Los resultados obtenidos con las cepas de L. brevis estudiadas en esta tesis CECT 5354 y CECT 4121 coinciden con los publicados previamente respecto a su incapacidad para reducir los ácidos hidroxicinámicos presentes en el medio de cultivo (Curiel et al., 2010). 106 Resultados y Discusión AmC Especie Cepa HPLC PCR Enterococcus casseliflavus DSM 20680 + + Enterococcus durans DSM 20633 - - Enterococcus faecalis DSM 20478 - - Enterococcus faecium CECT 4102 - - DSM 20477 - - Enterococcus gallinarum DSM 24841 + + Enterococcus hirae DSM 20160 - - Lactobacillus brevis ATCC 367 (CECT 5354) - - CECT 216 - - CECT 4121 - - Lactobacillus fermentum CECT 4007 - - Lactobacillus fructivorans CECT 4785 - - Lactobacillus paraplantarum DSM 10641 (ATCC 10776) + + DSM 10667 T (ATCC 10667 T ) + + Lactobacillus plantarum WCFS1 + + subsp. argentoratensis DSM 16365 + + subsp. plantarum DSM 20174 + + subsp. plantarum ATCC 14917 T (CECT 748 T ) + + NC8 + + CECT 220 + + CECT 221 + + CECT 223 + + CECT 224 + + CECT 749 (ATCC 10241) + + CECT 4645 + + DSM 1055 + + DSM 2648 + + DSM 10492 + + DSM 13273 + + DSM 20246 + + RM28 + + RM31 + + RM35 + + RM38 + + RM39 + + RM40 + + RM41 + + RM71 + + RM72 + + RM73 + + Lactobacillus pentosus DSM 16366 + + DSM 20314 + + DSM 20199 + + Lactobacillus sakei subsp. carnosus DSM 15831 - - Leuconostoc citreum CECT 4025 - - CECT 4700 - - Streptococcus gallolyticus UCN34 + + Tabla 5. Reducción de ácido m-cumárico en bacterias lácticas 107 Resultados y Discusión Las actividades reductasa descritas pueden tener un significado fisiológico específico para estas especies. Las bacterias lácticas se pueden beneficiar energéticamente de la utilización de aceptores externos de electrones para una regeneración más eficiente del el cofactor NAD(P)H, lo que permitiría un consumo más eficiente de la fuente de carbono y un consiguiente aumento de la síntesis de ácido acético a partir de acetil fosfato, con la ganancia asociada de ATP. Filannino et al. (2014) demostraron que en la mayoría de las condiciones de cultivo, la actividad reductasa de ácidos hidroxicinámicos se correlacionó con los mayores niveles de ATP (intracelular y relación ATP teórico/glucosa) y la más alta relación NAD + /NADH. Los alimentos fermentados son ecosistemas en los que estas rutas metabólicas se pueden llevar a cabo mediante aceptores alternativos de electrones (aldehídos durante la fermentación de zumos de frutas y vegetales) o mediante la adición de los mismos (por ejemplo, fructosa durante la fermentación) (Filannino et al., 2014). Es indispensable una alta tolerancia a altas concentraciones de estos ácidos fenólicos para obtener tasas óptimas de crecimiento en estos sustratos alimentarios. Por ello, las bacterias lácticas capaces de reducir los ácidos hidroxicinámicos pueden proporcionar la necesaria regeneración de NAD + y un consumo más eficiente de la fuente de carbono al utilizar estos ácidos fenólicos como aceptores de electrones externos y así obtener energía metabólica adicional para contrarrestar las condiciones estresantes generadas por los compuestos fenólicos. 108 Resultados y Discusión 2. Metabolismo de vinil fenoles Los resultados publicados antes del inicio de esta tesis indican que una de las rutas en el metabolismo de ácidos hidroxicinámicos implica la acción secuencial de dos enzimas, en primer lugar estos ácidos se descarboxilan a sus vinil derivados, los cuales por acción de una reductasa se convierten en sus correspondientes etil derivados (Chatonnet et al., 1992, 1995, 1997; Snowdon et al., 2006). Tal como se ha descrito en apartados anteriores, los sobrenadantes de cultivos de L. plantarum crecidos en presencia de algunos ácidos hidroxicinámicos, como los ácidos p-cumárico, cafeico y ferúlico, mostraban la presencia de los correspondientes vinil y etil fenoles, originados por la descarboxilación y posterior reducción de los mismos, respectivamente (Rodríguez et al. 2008a). Sin embargo, extractos celulares no inducidos de L. plantarum no fueron capaces de reducir los vinil fenoles originados por la descarboxilación de estos ácidos. Con ninguno de los ácidos ensayados se observó la reducción de los vinil derivados producidos. Por todo ello estos resultados indican que las proteínas implicadas en la reducción de los vinil derivados de los ácidos hidroxicinámicos son enzimas inducibles. Por este motivo, la actividad reductasa de vinil fenoles no está presente en los extractos celulares y si en los cultivos en los que se ha inducido dicha enzima. 2.1. Identificación de la proteína reductasa de vinil fenoles en Lactobacillus plantarum WCFS1 Las técnicas que permiten conocer los cambios que ocurren en la expresión génica global en respuesta a la presencia de un determinado compuesto son aproximaciones experimentales adecuadas para identificar los genes que se inducen en esa situación. Como ya se ha comentado anteriormente, el estudio transcriptómico global de la respuesta de L. plantarum WCFS1 a la presencia de 1,5 mM de ácido p-cumárico reveló la inducción de genes que codificaban proteínas anotadas como “reductasas” (Reverón et al., 2012). Estos genes eran 109 Resultados y Discusión lp_1424, lp_1425 y lp_3125. La interrupción de dichos genes en L. plantarum permitió conocer la implicación de los genes lp_1424 y lp_1425 en la reducción del ácido m-cumárico, y que sólo la interrupción del gen lp_3125 ocasionaba la pérdida de la capacidad para reducir el 4-vinilfenol presente en el medio de cultivo (Figura 5). Esto indica la necesidad, al menos, de la proteína Lp_3125 funcional para obtener etil fenoles a partir de la reducción de los vinil derivados de los ácidos hidroxicinámicos. 2.1.1. Organización genética de la región adyacente al gen lp_3125 en Lactobacillus plantarum WCFS1 Como se ha descrito anteriormente, el cultivo de la cepa L. plantarum WCFS1 con el gen lp_3125 delecionado demuestra claramente su implicación en la reducción de 4-vinilfenol y posiblemente de otros vinil fenoles. Al igual que se hizo con los genes lp_1424 y lp_1425 en un apartado anterior de esta tesis, se decidió conocer la organización genética de la región que rodea al gen lp_3125 en L. plantarum WCFS1. Se realizó el análisis de la región comprendida entre los genes lp_3123 y lp_3127, que contiene cuatro marcos de lectura abierta (ORF), dos de ellos corriente arriba (“upstream”) y otro corriente abajo (“downstream”) del gen implicado en la actividad reductasa de 4-vinilfenol (Figura 30A). Las dos ORFs situadas upstream se transcriben divergentemente respecto a lp_3125. La primera de las ORFs (lp_3123) codifica una proteína 48% idéntica a una pirofosfatasa de Lactobacillus malefermentans DSM 5705 (código de acceso A0A0R1ZZD0). Lp_3123 codifica una proteína de 274 aminoácidos y 31,2 kDa, anotada como posible pirofosfatasa, NADH-pirofosfatasa o NAD + difosfatasa. La siguiente ORF, lp_3124, codifica una proteína de 302 aminoácidos y 34,1 kDa que es 54 % idéntica a un regulador transcripcional de L. malefermentans DSM 5705 (acceso A0A0R2A2P9). Lp_3124 está anotada como posible regulador transcripcional, regulador transcripcional del tipo HTH 110 Resultados y Discusión o como regulador transcripcional de la familia LysR. Posteriormente se encuentra la proteína implicada en la reducción de 4-vinilfenol, Lp_3125, una proteína de 493 aminoácidos y 53,2 kDa, que es 75% idéntica a una proteína anotada como fumarato reductasa de L. malefermentans DSM 5705 (acceso A0A0R2A9X2). Lp_3125 aparece anotada como posible fumarato reductasa, subunidad flavoproteina de la fumarato reductasa, o como proteína con dominio de unión a FAD. Por último, la ORF que se encuentra downstream de lp_3125, lp_3127, codifica una proteína de 1189 aminoácidos de 123,5 kDa. Esta proteína está anotada como proteína de unión a mucosas con un motivo LPXTG de anclaje a la pared celular, o como proteína de anclaje celular, proteína de superficie celular de la familia GY, o como serin proteasa. La proteína Lp_3127 es 35% idéntica a una proteína no caracterizada de Lactobacillus zymae DSM 19395 (A0A0R1MFK5). 2.1.2. Análisis transcripcional de la región adyacente al gen lp_3125 en Lactobacillus plantarum WCFS1 Con objeto de conocer la organización transcripcional del gen lp_3125 y los genes adyacentes a él, se realizó un estudio in silico para identificar posibles promotores y terminadores de la transcripción. La búsqueda de promotores para organismos procariotas y la búsqueda de terminadores de la transcripción Rho- independientes se realizó utilizando los programas descritos en el apartado 1.1.2. de Resultados y Discusión de esta tesis. Mediante esta búsqueda in silico se identificaron posibles promotores situados upstream los genes lp_3124, lp_3125 y lp_3127, identificando también los posibles sitios de inicio de la transcripción. Respecto a los terminadores de la transcripción éstos se situaron downstream lp_1420, lp_1422, lp_1426 y lp_1427 (Figura 30A). Con objeto de comprobar estas predicciones in silico, se realizaron experimentos de transcripción reversa utilizando ARNm obtenido a partir de L. plantarum WCFS1 cultivado en presencia de 4-vinilfenol (1.5 mM). El ADNc 111 Resultados y Discusión se obtuvo como se describe en el apartado 5.4.1. de Material y Métodos. El ADNc obtenido se utilizó para amplificar mediante PCR fragmentos internos de los genes lp_3123 (oligonucleótidos 1810 y 1811, amplifican 617 pb), lp_3124 (oligonucleótidos 1686 y 1687, amplifican 596 pb), lp_3125 (oligonucleótidos 891 y 892, amplifican 472 pb), y lp_3127 (oligonucleótidos 1812 y 1813, amplifican 573 pb). De manera similar, también se amplificaron las uniones entre las ORFs implicadas, la región intergénica lp_3123-lp_3124 (oligonucleótidos 1684 y 1685, amplifican 613 pb), lp_3124-lp_3125 (oligonucleótidos 1688 y 1689, amplifican 800 pb) y finalmente, lp_3125- lp_3127 (oligonucleótidos 1470 y 1690, amplifican 804 pb). La Figura 30B muestra que el único fragmento que se amplificó fue el correspondiente al fragmento interno de 772 pb del gen lp_3125. El resto de genes analizados (lp_3123, lp_3124 y lp_3127) no presentaron amplificación así como ninguna de las regiones intergénicas analizadas; los datos indican que estos genes y regiones no se transcriben en las condiciones ensayadas. Los resultados sugieren que el gen lp_3125 se transcribe solo, y de hecho in silico se identificó un posible terminador de la transcripción en la región lp_3125- lp_3127 con ΔG= -10,5 kcal/mol. Los datos experimentales de transcripción reversa coinciden con los obtenidos in silico respecto a la transcripción de lp_3125 puesto que ambos determinan que lp_3125 se transcribe como un único ARN monocistrónico. 112 Resultados y Discusión A lp_3124 lp_3125lp_3123 lp_3127 B 1 2 3 4 5 6 7pb 200- 500- 800- Figura 30. (A). Organización genética de la región adyacente al gen lp_3125 implicado en la reducción de 4-vinilfenol. Se representa la región de L. plantarum WCFS1 (número de acceso NC_004567.2, posiciones 2.788.661 a 2.798.829). Las flechas indican genes. Se indica la localización de posibles promotores y terminadores de la transcripción. También se señala el tamaño y dirección de los transcritos obtenidos mediante transcripción reversa. (B) Análisis transcripcional mediante RT-PCR de la región adyacente al gen lp_3125 implicado en la reducción de 4-vinilfenol. Las reacciones de RT-PCR se realizaron con parejas de oligonucleótidos diseñados para amplificar los genes o las regiones intergénicas a partir del ADNc de L. plantarum WCFS1. Las regiones amplificadas son un fragmento interno de lp_3123 de 617 pb amplificada con los oligos 1810 + 1811 (1), región intergénica lp_3123-lp_3124 de 613 pb amplificada con 1684+1685 (2), fragmento interno de lp_3124 de 596 pb amplificado con 1686+1687 (3), región intergénica lp_3124-lp_3125 de 800 pb amplificada con 1688+1689 (4), fragmento interno de lp_3125 de 472 pb amplificado con 891+892 (5), región intergénica lp_3125-lp_3127 de 804 pb amplificada con 1470+1690 (6), y fragmento interno de lp_3127 de 573 pb amplificado con 1812 +1813. En el lado izquierdo se muestra el marcador de peso molecular (100 pb Ladder, Biotools) señalándose algunos de los tamaños. 113 Resultados y Discusión 2.1.3. Implicación de los genes adyacentes a lp_3125 en la reducción de vinil fenoles En el apartado 1.1. de Resultados y Discusión de esta tesis se identificaron los genes implicados en la reducción de ácidos hidroxicinámicos (lp_1424 y lp_1425) así como un gen implicado en la reducción de 4-vinilfenol (lp_3125). Se comprobó que la cepa mutante de L. plantarum WCFS1 que posee el gen lp_3125 interrumpido era incapaz de transformar 4-vinilfenol (Figura 5). Esto indica la necesidad, al menos, de la proteína Lp_3125 funcional para obtener 4- etilfenol a partir de la reducción del 4-vinilfenol. Aunque el estudio de transcripción reversa revela que el gen lp_3125 se transcribe solo, los datos de comparación de secuencias indican que la proteína Lp_3124 podría ser el regulador transcripcional implicado en la regulación de la biosíntesis de la proteína Lp_3125. Para determinar la implicación del gen lp_3124 en la reducción de 4-vinilfenol, el gen se interrumpió en L. plantarum y se comprobó la actividad bioquímica presentada por la cepa mutante. El mutante se construyó mediante la estrategia utilizada para la obtención de los otros mutantes utilizados anteriormente en esta tesis. Esta estrategia consistió en la inserción de un plásmido no replicativo en el cromosoma de L. plantarum WCFS1. Un fragmento interno de 308 pb del gen lp_3124 amplificado con los oligonucleótidos 1633+1634 se clonó en el plásmido pUCE191 (Arrecubieta et al., 1995). Una vez construido el plásmido pUCE191- 3124*, éste se utilizó para transformar L. plantarum y las colonias recombinantes se seleccionaron por su resistencia a eritromicina. Mediante PCR se comprobó la correcta integración del plásmido utilizando el oligonucleótido 1233, que hibrida en el plásmido pUCE191, y el oligonucleótido 1635 que hibrida con el gen lp_3124 en una región externa al fragmento insertado. Después de comprobar la correcta inserción del plásmido pUCE191-3124* en el genoma de L. plantarum WCFS1 y la correspondiente interrupción de la copia del gen lp_3124 en el cromosoma, se realizó un cultivo de la cepa junto con la cepa L. plantarum WCFS1Δ3125 obtenida previamente. Ambas cepas, 114 Resultados y Discusión con los genes lp_3124 y lp_3125 interrumpidos se cultivaron en MRS en presencia de 4-vinilfenol a una concentración 1,5 mM durante cinco días a 30 ºC. Después de esta incubación los compuestos fenólicos se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron mediante HPLC. Se observó que la interrupción de los dos genes estudiados, lp_3124 y lp_3125, ocasiona la pérdida de la capacidad para reducir 4-vinilfenol a 4-etilfenol (Figura 31). Es decir, la ausencia de un posible regulador transcripcional (Lp_3124) y de una proteína reductasa (Lp_3125) funcionales dá lugar a cepas de L. plantarum incapaces de reducir 4-vinilfenol. Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 300 m A U 0 100 200 300 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 B C D A Tiempo (min) m A U VF EF VF VF Figura 31. Reducción de 4-vinilfenol en cultivos de L. plantarum WCFS1 (B), y de las cepas con genes interrumpidos, L. plantarum WCFS1Δ3124 (C) y L. plantarum WCFS1Δ3125 (D), y control del medio (A). Los cultivos se incubaron durante 5 días a 30 ºC en medio MRS conteniendo 4-vinilfenol a una concentración de 1,5 mM. UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. VF, 4-vinilfenol; EF, 4-etilfenol. 115 Resultados y Discusión Al igual que lo que ocurre en la reducción de ácidos hidroxicinámicos, la presencia de un posible regulador transcripcional de la familia LysR es necesaria para la actividad vinilfenol reductasa. La proteína Lp_3124 es una proteína de 302 aminoácidos anotada como posible regulador transcripcional, regulador transcripcional del tipo HTH o como regulador transcripcional de la familia LysR. Estos reguladores suelen poseer un dominio de unión al cofactor en el extremo C-terminal y un dominio HTH (hélice-giro-hélice, “helix-turn- helix”) de unión a ADN en el extremo N-terminal. Este último está presente en casi todas las proteínas de unión a ADN en procariotas y originariamente estaba formado por tres hélices en una conformación abierta. La segunda y tercera de estas hélices interaccionaban directamente con el ADN en tanto que la tercera se insertaba en el surco mayor de la doble hélice de ADN (Brennan y Matthews, 1989) (Figura 32). Este motivo HTH ha evolucionado y se ha diversificado, dando lugar a diferentes variantes, como los miembros de la familia LysR, que poseen una horquilla β entre la segunda y tercera hélice (Maddocks y Oyston, 2008) (Figura 32). Figura 32. Representaciones tridimensionales de los dominios HTH de unión a ADN (adaptado de las estructuras de las proteína 1k78 y 1smt de las bases de datos mediante el programa Rasmol). (A) Motivo HTH original que es un haz de tres hélices en una configuración abierta; (B) Motivo HTH-alas de hélice que tiene una región de lámina β antiparalela. Los reguladores transcripcionales de la familia LysR pertenecen al tipo HTH-alas de hélice (adaptado de Maddocks y Oyston, 2008). 116 Resultados y Discusión Al igual que la proteína Lp_1422, la proteína Lp_3124 parece ser un activador transcripcional puesto que su interrupción inhibe la actividad catalítica de la proteína Lp_3125. Por lo que, para la regulación que ejerce Lp_3124 en la reducción de 4-vinilfenol, se puede proponer un modelo similar al reflejado en la Figura 8 para el activador Lp_1422 implicado en la reducción de ácidos hidroxicinámicos. Asumiendo que una mínima cantidad de Lp_3124 producida en condiciones fisiológicas normales es suficiente para reprimir su propia expresión, la presencia de 4-vinilfenol y su posterior unión a Lp_3125 ocasiona un cambio de conformación que hace que Lp_3124 se separe del ADN y queda libre. Posteriormente, la proteína Lp_3124 en su nueva conformación puede unirse a otra región de ADN y activar así la transcripción de lp_3125. A pesar de que las proteínas Lp_1422 y Lp_3124 están anotadas como reguladores transcripcionales de la familia LysR, y que ambas parecen actuar como activadores, sin embargo, sólo presentan un 21% de identidad en su secuencia de aminoácidos (Figura 33). Lp_1422 MPKSDSSEMRRFLDVLLKHGNFTRAAKDLYISQPYLTQSIRNVEKELGVTIINREVTPLR Lp_3124 ---MDLDRLQTFLK-VVQYGSFQQVAAREYRSQRTVSKQMTQLENELKVTLFDRGQNRIQ * ..:: **. ::::*.* :.* * ** :::.: ::*:** **:::* . :: Lp_1422 LTTAGRTYYQYLTALENEKDYFNKQIRQYTHANQQVIRLGVLSSLGYYLLPLFLPAFLKA Lp_3124 LTPQGRLFWASAQDIVNNYTTALTELRQFNVPTDQILRVGYFSAFEQRLLLPALYDLKQQ ** ** :: : *: .::**:. .:*::*:* :*:: ** * : : Lp_1422 HPATKIELTEDIASRNEQRVLHGELDFLIGQNPETIAPGLESYDRGRDGYYAIIPNTVNW Lp_3124 HSELQLVVRQGSNEHLAQQVADGSLDLALSINYGRPAVTPESQLTAVPIYHNQMVIGVSR * :: : :. .: *:* .*.**: :. * * ** . *: : *. Lp_1422 YQPHQAFINPGALPLNDLLQAPLVL-SPHGSSIRRQVDYLLQKHNVTPNIVI-----ES- Lp_3124 LNPLS---RLSQLPPSALATLPILYYSPESST------FLLESFLASAPFIQDYEQIRRV :* . . . ** . * *:: **..*: :**:.. .: :: . Lp_1422 TNTATITKLATAGLGITFLPDSVHTQPDPERYNILPLPQALMSLNYFIAFPAEHSLNQVE Lp_3124 SSAEQMHLLVALNQALAFYPAGLVPTKHDEQVAYLPITDAAQQGYDIVALLKSN----RS :.: : *.: . .::* * .: . *: **: :* . ::*: .: . Lp_1422 KDLVTIFLTQLEADLAQSSTIS Lp_3124 RPLIAKLVQRLKANAKSDE--- : *:: :: :*:*: ... Figura 33. Alineamientos de las secuencias de aminoácidos de la proteína Lp_1422 y Lp_3124 de L. plantarum WCFS1 anotadas como reguladores transcripcionales de la familia LysR. Se realizó un alineamiento múltiple de secuencias utilizando el programa Clustal Omega. Se indica (*) identidad entre aminoácidos; (:) cambio semiconservativo y (.) cambio conservativo. 117 Resultados y Discusión 2.1.4. Clonación del gen y producción de la proteína Lp_3125 La interrupción del gen lp_3125 en L. plantarum WCFS1 ocasiona la pérdida de la capacidad para reducir 4-vinilfenol. Este resultado indica que la proteína Lp_3125 es una proteína necesaria para la reducción de 4-vinilfenol. La proteína Lp_3125 está anotada como posible fumarato reductasa, subunidad flavoproteina de la fumarato reductasa, o como proteína con dominio de unión a FAD. Tal como muestra la Figura 34, desde aproximadamente el aminoácido 30 hasta el final de la proteína se identifica el dominio conservado COG3573 de posibles oxidorreductasas. Además, a lo largo de toda la proteína se observa similitud con proteínas de unión a NAD(P)H/NAD(P) + que poseen el plegamiento de Rossmann. Este plegamiento es un motivo estructural de proteínas de unión a nucleótidos, particularmente el cofactor NAD (Caetano- Anollés et al., 2007; Ma et al., 2008; Wierenga et al., 1986). La estructura está compuesta por tres o más láminas β paralelas unidas por dos hélices α en el orden topológico de β-α-β-α-β formando una superestructura de hoja β (Lesk, 1995; Rao y Rossmann, 1973). A B Figura 34. Identificación de dominios conservados en las proteínas Lp_1425 (A), y Lp_3125 (B). La búsqueda se realizó en la dirección https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. La línea negra superior representa la proteína desde su extremo N-terminal al C-terminal. La posición de los aminoácidos en la proteína Lp_1425 se señala cada 25 aminoácidos y en la proteína Lp_3125 cada 15 aminoácidos. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 118 Resultados y Discusión La unión del NAD(P) implica numerosos enlaces por puente de hidrógeno y contactos de tipo Van der Waals y en particular el establecimiento de un puente de hidrógeno entre residuos situados en un giro presente entre la primera lámina β del plegamiento de tipo Rossmann y la siguiente hélice α. De forma característica, en este giro aparece un motivo de unión cuya secuencia consenso es GXGXXG (Hanukoglu y Gutfinger, 1989; Kleiger y Eisenberg, 2002; White et al., 2000) en el que las dos primeras glicinas participan en la unión de NAD(P) mientras que la tercera facilita el empaquetamiento entre la lámina β y la hélice α. Típicamente, algunas proteínas de esta familia, además del dominio de unión de NAD, presentan un segundo dominio que es el responsable de la unión específica del sustrato y de la subsiguiente catálisis enzimática. La Figura 34 que muestra los dominios conservados en Lp_3125 (Figura 34B) también muestra que la proteína Lp_1425 presenta también el dominio de unión a NAD(P)H/NAD(P) + con plegamiento de Rossmann (Figura 34A). Un alineamiento de ambas proteínas refleja la alta similitud existente entre el dominio C-terminal de la proteína Lp_1425 y la proteína Lp_3125, también se señala la situación del patrón de unión GXGXXG en ambas proteínas (Figura 35). La Figura 36 muestra una representación esquemática de la organización modular de la proteína Lp_3125 y su comparación con las proteínas Lp_1424 y Lp_1425. En la proteína Lp_3125 se muestra el dominio de unión a FAD así como el posible dominio de unión a sustrato. 119 Resultados y Discusión Lp_3125 ------------------------------------------------------------ Lp_1425 MKFVGIVGTNAQHSYNRMLLEFMQRHFATQAEIEILELTDVPMFDESNDQTDSTIIQNFA Lp_3125 ------------------------------------------------------------ Lp_1425 TKIATADGVIIASPEHNHSVPSALKSIIEWLSFKIHPLDGQAVMIVGASYSVQGSSRAQL Lp_3125 ------------------------------------------------------------ Lp_1425 HLRQILDAPGVNASVMPGSEFLLGRAQTAFDDQGNLKVQGTVDFLDSCFAKFQKFATIVA Lp_3125 ------------------------------------------------------------ Lp_1425 EMRAPEALSFAPGTYQVTATGHNGELPMRVTLSADRIENIEIDTSSETQGIADVAFERIP Lp_3125 ----------------------------------------------------MTLAKHDS Lp_1425 KEIIAGQTLAVDAISGASITSHGVIDGVARAVKEAGANPDDLKKRRATKQVAQPAVKEVT .*. : Lp_3125 YDIVVVGTGAAGTAAALEAAQHGASVLLLEKGRHTGGSSNYTEGLFA------------- Lp_1425 TDVVVVGAGGAGMTAAAKVLQAGHQAVVLEKFPAVGGNTVRAGGPMNAADPDWQRQFAAL *:****:*.** :** :. * * ..::*** .**.: : * : Lp_3125 --------------------------------VDSYLQKAQNINVS--ATDVLK------ Lp_1425 PGEKQTLKDLSERDESTIAPEYRADFRKLKQQIDAYLTANTNQKGTLFDSTLLHRIQTYL :*:** * : : : :*: Lp_3125 ----EEVDYSKYRADSRIWRRYLDDSANTVQWLKDQGVEYEGVQAMGAGEATWHIYK-GM Lp_1425 GGQRTDLNGQEIHGQYDLVKELTDNALDSVKWLQSIGVKFDESQVTMPVGAIWRRGHKPM ::: .: :.: : :. *:: ::*:**:. **::: *. * *: : * Lp_3125 GQAVL--HDALQPQAQKLGVELLTSTTAITLHQATDGAITGVMIQSAATNETQVINTAAV Lp_1425 GDLGFAYIKTLRAFVEQQGGTIMTE-TPVKELLVTDGQVRGVIATN-AAHEKVIVHADAV *: : .:*: .:: * ::*. * :. .*** : **: . *::*. :::: ** Lp_3125 ILATGGYLNNPDMMQKLTHYDTRR---LIPVSSGKGTGDGLRLAWQAGAQQYGTGMAMLF Lp_1425 ILASGGFAANTKMLQKYNTYWTAIDDDVKTTNSPAMTGDGIRLGTSVGAALVGMGFSQMM ***:**: * .*:** . * * : ..* ****:**. ..** * *:: :: Lp_3125 GGYLKDPSEPSFKYMASQMETAAGQQPLLWLNEHGERFVDEAVVYNFSYAGNALYTQNQV Lp_1425 PV-----SDPETGELFSGLQ--VPPANFVMVNQQGKRFVNEYGSRDEL--TQAAIDNGSL *:*. : * :: . :: :*::*:***:* : :* :..: Lp_3125 FSILDQGVINKMAQDGNFMGLGVYVRRGEKMTKLQAEIDAAVAANKPFIFKANTIEALAT Lp_1425 FYLIADDEIKKT-----------------AYNTTQAKIDQQVA--NGTLFRADTLTDLAQ * :: :. *:* .. **:** ** : :*:*:*: ** Lp_3125 KMHLPVDQVTHSIQTYNQYCDNGQDDDFGKNPEYLVKVSQGPFYGFELNVGAFCTMGGLK Lp_1425 QIGMDPAALTKTIADYNRYVDAGEDPEFHKT-AFDLKVAVAPFYATPRKPATHHTMGGLK :: : :*::* **:* * *:* :* *. : :**: .***. : .:. ****** Lp_3125 VTTNNEVLDTTGQPITGLYAAGNDAAGLTGDTYGPNMPGTCVGYAFYSGRNSGRHAAQYT Lp_1425 IDSDAHVLNTDGQVIDGLYAAGEVAGGIHAG---NRLGGNSLSDIFTFGRIAAAHAVAEH : :: .**:* ** * ******: *.*: .. .: *..:. * ** :. **. Lp_3125 HQQSIVSH Lp_1425 -VDPVTA- : :.: Figura 35. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la proteína Lp_3125 y Lp_1425 de L. plantarum WCFS1 anotadas como subunidad flavoproteína de fumarato reductasas. Se realizó un alineamiento múltiple de secuencias utilizando el programa Clustal Omega. Se indica (*) identidad entre aminoácidos; (:) cambio semiconservativo y (.) cambio conservativo. Se resalta en amarillo el patrón consenso de unión a NAD(P). 120 Resultados y Discusión Puesto que la proteína Lp_3125 está anotada como reductasa, y que la interrupción del gen que la codifica provoca que L. plantarum pierda su capacidad para reducir 4-vinilfenol, se decidió clonar el gen para producir y caracterizar bioquímicamente la proteína. Al igual que para la clonación de los genes lp_1425 y lp_1424, el plásmido de clonaje inicial fue pURI3-Cter, que permite la producción de la proteína recombinante con una cola de seis residuos de histidina en su extremo carboxilo terminal. Se diseñaron los oligonucleótidos 1516 y 1517 para amplificar el gen lp_3125 añadiendo en sus extremos 5´nucleótidos capaces de hibridar con el vector pURI3-Cter. Para clonar el gen se utilizó la misma estrategia de clonación independiente de ligación utilizada en apartados anteriores (de las Rivas et al., 2007). El plásmido recombinante pURI3-Cter-3125 se transformó en la cepa E. coli DH10B y una vez verificada su secuencia, se transfirió a la cepa E. coli BL21(DE3) para la hiperproducción de la proteína Lp_3125 recombinante. Inicialmente, los cultivos de E.coli BL21 (DE3) conteniendo el plásmido recombinante pURI3-Cter-3125 se cultivaron en medio LB y cuando alcanzaron una DO600nm de 0.6 se indujeron con 0,4 mM de IPTG. Al ensayar diversas condiciones de inducción se comprobó que la proteína Lp_3125 se producía insoluble, como cuerpos de inclusión. Para evitar la formación de cuerpos de inclusión se utilizó nuevamente la estrategia descrita por Ackerley et al.(2004) en la que las células de E. coli se cultivan a 22 ºC Figura 36. Representación esquemática de la estructura modular de las proteínas Lp_1424, Lp_1425 y Lp_3125. Se señala el módulo N-terminal de unión a FMN (color rosa) y el fragmento C-terminal de unión a FAD (color verde) así como el módulo de unión a substrato (color azul). 121 Resultados y Discusión durante 5 días en medio LB conteniendo 1 M de sorbitol, 2,5 mM de betaína y se indujeron con 2,5 mM IPTG desde el inicio de la incubación. En estas condiciones de cultivo e inducción se comprobó que el extracto soluble de E. coli BL21 (DE3) transformado con el plásmido pURI3-Cter-3125 presentaba una proteína de aproximadamente 53 kDa ausente en el extracto procedente de E. coli BL21 (DE3). Al igual que en apartados anteriores de esta tesis, con objeto de comprobar, de manera preliminar, la actividad reductasa de 4- vinilfenol de la proteína Lp_3125 recombinante, los extractos solubles obtenidos a partir de los cultivos de E. coli BL21(DE3) (pURI3-Cter) y E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-3125) se incubaron directamente en presencia de 4- vinilfenol (1,5 mM) durante 16 horas a 37 ºC. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se extrajeron con acetato de etilo los compuestos fenólicos presentes en la reacción y se analizaron mediante HPLC. Los extractos de E. coli que contenían la proteína Lp_3125 eran capaces de reducir todo el 4- vinilfenol presente en la reacción y convertirlo en 4-etilfenol (Figura 37). Por el contrario, los extractos de E.coli no fueron capaces de reducir el 4-vinilfenol presente (Figura 37). Minutes 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 A B m A U VF EF Tiempo (min) Figura 37. Reducción de 4-vinilfenol (1,5 mM) mediante extractos celulares de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter) (A) y E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-3125) (B). La reacción se realizó en tampón fosfato 50 mM pH 7 a 37 ºC durante 16 horas. UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. VF, 4- vinilfenol; 3-HPPA; EF, 4-etilfenol. 122 Resultados y Discusión Los extractos celulares de de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-3125) con actividad reductasa de 4-vinilfenol se sometieron a una cromatografía de afinidad a cobalto para purificar la proteína Lp_3125 presente. Una vez unida la proteína a la resina, ésta se eluyó de la misma mediante un gradiente de imidazol. Las fracciones que contenían la proteína pura se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-PAGE para comprobar la hiperproducción de la proteína Lp_3125 recombinante. En la Figura 38 se observa la presencia de una proteína con un tamaño aproximado de 53 kDa tanto en el extracto soluble procedente de las células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con el plásmido pURI3-Cter-3125 como en las fracciones eluídas de la resina de afinidad. Con objeto de eliminar el imidazol presente, la proteína eluída se dializó frente a 50 mM tampón fosfato sódico, pH 7,0 conteniendo 300 mM de NaCl y 10% de glicerol. Mediante este protocolo se obtuvo 16 mg de proteína por litro de cultivo. 1 2 3 4 5 6 7 8 kDa 97 - 45 - 31 - 66 - Figura 38. Hiperproducción y purificación de la proteína Lp_3125 recombinante de L. plantarum WCFS1. 1, extracto proteico soluble procedente de células de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter) inducidas con IPTG; 2, extracto proteico soluble procedente de células de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-3125) inducidas con IPTG; 3, fracción eluida no retenida en la resina de afinidad; 4-8, fracciones eluídas de la columna de afinidad con imidazol (150 mM). Gel SDS-PAGE 10% de acrilamida. El marcador de peso molecular Broad-Range (Bio-Rad) aparece a la izquierda. 123 Resultados y Discusión 2.1.5. Actividad reductasa de 4-vinilfenol en la proteína Lp_3125 En el apartado anterior se ha comprobado que extractos de E. coli conteniendo la proteína Lp_3125 recombinante son capaces de reducir el 4-vinilfenol presente en el medio de cultivo. Con objeto de conocer si la proteína Lp_3125 pura y dializada en presencia de cofactores presenta la misma actividad se llevaron a cabo diferentes reacciones enzimáticas en función de los cofactores añadidos. La proteína Lp_3125 está anotada como proteína con dominio de unión a FAD y de unión a NAD(P)H/NAD(P) + que posee el plegamiento de Rossmann. La presencia de dominios de unión a diferentes cofactores o compuestos hace necesario añadirlos exógenamente para que transcurra la reacción. Por ello se realizó una batería de reacciones utilizando 10 o 100 µg de la proteína Lp_3125 pura y diferentes combinaciones de cofactores. Se llevaron a cabo reacciones añadiendo 500 µM NADH sólo o añadiéndole 250 µM FAD, y reacciones equivalentes pero sustituyendo NADH por NADPH. Las reacciones se realizaron en tampón fosfato 50 mM pH 7 con 10% glicerol, y en presencia 4- vinilfenol (1,5 mM) durante 16 horas a 37 ºC. Pasado el tiempo de incubación los productos de la reacción se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron mediante HPLC. Sorprendentemente, la proteína Lp_3125 pura no presentó actividad en ninguna de las condiciones ensayadas. La Figura 39 muestra la reacción conteniendo 500 µM NADH y 250 µM FAD. 124 Resultados y Discusión Al igual que ocurría con la proteína Lp_1425 pura, los resultados obtenidos sugieren que el proceso de purificación y posterior diálisis de la proteína ha ocasionado la inactivación de la enzima o bien que la proteína Lp_3125 pura necesita un cofactor adicional para su actividad in vitro. Aunque no se puede descartar que la falta de actividad sea debida a que ambas proteína son poco estables en solución, el hecho de que la actividad in vitro de estas proteínas puras sea nula parece sugerir que la falta de actividad es debida a las condiciones de la reacción. Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 250 500 750 m A U 0 250 500 750 A B m A U Tiempo (min) VF VF Figura 39. Reducción de 4-vinilfenol (1,5 mM) mediante la proteína Lp_3125 recombinante pura. La reacción se realizó en tampón fosfato 50 mM pH 7 con 10% glicerol conteniendo 500 µM NADH y 250 µM FAD, a 37 ºC durante 16 horas sin proteína Lp_3125 (A) o conteniendo 100 µg de proteína Lp_3125 pura (B). UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. VF, 4-vinilfenol. 125 Resultados y Discusión 2.2. Identificación de sustratos de la reductasa Lp_3125 Aunque no se ha podido demostrar actividad in vitro con la proteína pura, los resultados obtenidos mediante la interrupción del gen lp_3125 en L. plantarum y la actividad reductasa que presentan las cepas de E. coli que expresan dicho gen, claramente demuestran que la proteína Lp_3125 es la reductasa responsable de la reducción de 4-vinilfenol a 4-etilfenol. Por ello, se estudió la actividad reductasa de la proteína Lp_3125 en extractos de E. coli sobre otros vinil fenoles. Se ha descrito que cultivos de L. plantarum producen etil y vinil derivados de los ácidos p-cumárico, cafeico y ferúlico (Rodríguez et al., 2008b). Por ello se estudió la capacidad de la proteína Lp_3125 para reducir los vinil fenoles derivados del ácido p-cumárico (4-vinilfenol), ácido cafeico (4- vinilcatecol) y ácido ferúlico (4-vinilguayacol) a sus correspondientes etil derivados (4-etilfenol, 4-etilcatecol y 4-etilguayacol) (Figura 40). Puesto que el compuesto 4-vinilcatecol no se encontró disponible comercialmente se decidió sintetizarlo mediante la enzima PAD (descarboxilasa de ácidos fenólicos o Lp_3665). 4-Vinilfenol 4-Vinilguayacol 4-Vinilcatecol 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-Etilcatecol Figura 40. Representación esquemática de las estructuras de algunos vinil fenoles (4-vinilfenol, 4-vinilcatecol y 4-vinilguayacol) y sus correspondientes etil derivados (4-etilfenol, 4-etilcatecol y 4-etilguayacol). 126 Resultados y Discusión La enzima PAD de L. plantarum es capaz de descarboxilar los ácidos hidroxicinámicos p-cumárico, cafeico y ferúlico en sus correspondientes vinil derivados (4-vinilfenol, 4-vinilcatecol y 4-vinilguayacol) (Rodríguez et al., 2008b). Cultivos de E. coli que hiperproducen esta enzima se han utilizado con éxito para la producción de vinil derivados a partir de hidrolizados alcalinos de mazorcas de maíz (Salgado et al., 2012, 2014). Por ello, se realizaron cultivos de E. coli BL21 (DE3) conteniendo el plásmido pURI3-Cter-PAD los cuales se incubaron a 22 ºC durante 48 horas en presencia de ácido cafeico 3 mM . En estas condiciones E. coli produce la proteína PAD recombinante de L. plantarum y el ácido cafeico presente en el medio de cultivo lo transforma en 4- vinilcatecol. El 4-vinilcatecol producido se recuperó del medio de cultivo mediante dos extracciones con acetato de etilo y se analizó mediante HPLC. La Figura 41A muestra el 4-vinilcatecol producido por la cepa de E. coli recombinante. Este último se identificó mediante su espectro de absorción que se comparó con el obtenido previamente el cual fue identificado mediante su ion molecular [M-H] m/z 135 (Rodríguez et al, 2008b) (Figura 41B). Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Tiempo (min) m A U VC A nm 200 250 300 350 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 2 5 6 v iny l-catechol 2.spc - 25,33 Min VINIL CATECOL DIL CUARTO B VC Figura 41. Producción de 4-vinilcatecol mediante el cultivo de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-PAD) crecido a 22 ºC durante 48 horas en medio LB conteniendo ampicilina (100 µg/ml) y 3 mM de ácido cafeico (A). El cromatograma se registró a 280 nm. (B) Comparación entre el espectro de absorción del compuesto producido (rojo) y el estándar identificado previamente mediante espectrometría de masas (negro). 127 Resultados y Discusión Una vez se dispuso del vinil derivado del ácido cafeico (4-vinilcatecol) se llevó a cabo el estudio para conocer algunos de los sustratos que la proteína Lp_3125 es capaz de reducir. Para ello, extractos de E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-3125) que hiperproducen la proteína Lp_3125 se incubaron en presencia de 4-vinilcatecol, 4-vinilfenol y 4-vinilguayacol (Figura 42). Los resultados obtenidos demuestran que la proteína Lp_3125 es la responsable de la reducción de los tres vinil derivados ensayados puesto que a partir de ellos se obtuvo 4-etilcatecol, 4-etilfenol y 4-etilguayacol, respectivamente (Figura 42). Los compuestos obtenidos se identificaron mediante la comparación de su tiempo de retención y espectro de absorción, determinado mediante un detector de diodos, con el tiempo de retención y espectro de los correspondientes compuestos comerciales, 4-etilfenol, 4-etilcatecol o 4-etilguayacol. Minutes 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 1000 2000 m A U 0 1000 2000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 500 1000 m A U 0 500 1000 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 250 500 m A U 0 250 500 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Control Tiempo (min) m U A VC A Lp_3125 A B B C C Tiempo (min) EC VF EF VG EG VC Figura 42. Reducción de vinil fenoles mediante extractos celulares de E. coli BL21 (DE3) (pURI3) (Control) y E. coli BL21 (DE3) (pURI3-Cter-3125) (Lp_3125). Las reacciones se realizaron en tampón fosfato 50 mM pH 7 a 37 ºC durante 16 horas. Los vinil fenoles analizados fueron 4-vinilcatecol (A), 4-vinilfenol (B) y 4-vinilguayacol (C). UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. VC, 4- vinilcatecol; VF, 4-vinilfenol; VG, 4-vinilguayacol; EC, 4-etilcatecol; EF, 4-etilfenol; EG, 4-etilguayacol. 128 Resultados y Discusión Al igual que en el caso de la proteína Lp_1425, reductasa de ácidos hidroxicinámicos, hasta la realización de esta tesis no existía información genética sobre la proteína de L. plantarum responsable de la reducción de vinil fenoles. Estudios realizados en bacterias lácticas sólo han descrito que algunas cepas de las especies L. plantarum, Lactobacillus collinoides y L. rossiae presentan esta actividad bioquímica (Cavin et al., 1993; Rodríguez et al., 2008a; Filannino et al., 2014) pero no se han realizado estudios para conocer la proteína responsable de dicha actividad. Los resultados obtenidos en esta tesis han permitido identificar por primera vez una enzima bacteriana con actividad reductasa de vinil fenoles. 2.3. Inducción de la actividad reductasa de vinil fenoles Del estudio transcripcional de la región en donde se localiza el gen lp_3125 se deduce que este gen se transcribe solo, mediante un ARN monocistrónico, y que divergente a él se transcribe un posible activador transcripcional (Lp_3124) cuya ausencia ocasiona la pérdida de actividad vinilfenol reductasa. Estos resultados indican que ambos genes están implicados en la reducción de vinil fenoles por lo que se decidió conocer su respuesta de los genes lp_3124 y lp_3125 frente a la presencia de posibles sustratos como son 4-vinilfenol, 4- vinilcatecol y 4-vinilguayacol, además de su respuesta frente a ácido p- cumárico, como compuesto de estructura relacionada. Sin embargo, se decidió no realizar los cultivos en presencia de 4-vinilcatecol y 4-vinilguayacol. Como se ha comentado anteriormente, no se ha conseguido disponer de 4-vinilcatecol comercial por lo que para el estudio de su reducción por Lp_3125 se ha sintetizado mediante cultivos de E. coli recombinantes. Puesto que no se ha podido determinar el grado de pureza ni la concentración del 4-vinilcatecol así obtenido se optó no utilizarlo para el estudio de la expresión por las dudas que podían surgir en la interpretación de los resultados obtenidos. Tampoco se realizó el estudio de la expresión génica en presencia de 4-vinilguayacol, 129 Resultados y Discusión porque, a pesar de estar disponible comercialmente, no se conseguía una adecuada disolución en el medio de cultivo durante los 10 minutos de inducción utilizados en el experimento. Por todo ello, sólo se analizó la expresión en presencia de dos compuestos, 4-vinilfenol y ácido p-cumárico. Para el estudio de la actividad reductasa se realizaron cultivos de L. plantarum WCFS1 que se expusieron durante 10 min a la presencia de 1,5 mM de 4-vinilfenol o de ácido p-cumárico. A partir de estos cultivos se extrajo el ARN, se trató con DNasa y mediante la enzima retrotranscriptasa se sintetizó el correspondiente ADNc. Se amplificaron regiones internas de los genes lp_3124 y lp_3125 mediante los oligonucleótidos 1719+1720 (amplifican 54 pb de lp_3124) y 1470+1471 (amplifican 62 pb del gen lp_3125). Después de validar los oligonucleótidos, se analizó el cambio en la expresión relativa de los genes lp_3124 y lp_3125 respecto al nivel de transcripción de los mismos en el ADNc obtenido de cultivos en ausencia de compuesto fenólico. Los datos obtenidos mostraron la inducción del gen lp_3125 tanto en presencia de su sustrato (4-vinilfenol), como en presencia de su correspondiente ácido hidroxicinámico (ácido p-cumárico) (Figura 40). La inducción de este gen mediante ácido p-cumárico ya se describió anteriormente por Reverón et al. (2012) en un estudio transcriptómico global de respuesta a la presencia de este ácido a una concentración de 1,5 mM, la misma que la utilizada en este estudio. Reverón et al. (2012) describieron una inducción de 4 veces y, aunque en este estudio se ha observado una inducción de sólo 2,3 veces, hay que tener en cuenta que los abordajes experimentales son distintos por lo tanto el valor absoluto de la inducción observada puede variar en ambos estudios. La presencia de 4-vinilfenol induce un aumento mayor (3,3 veces) en la expresión del gen lp_3125. Tanto los resultados obtenidos previamente como los obtenidos en este estudio indican que el gen lp_3125 es un gen inducible. 130 Resultados y Discusión Al igual que lo que ocurría en el regulador transcripcional implicado en la reducción de ácidos hidroxicinámicos (Lp_1422), en las condiciones analizadas no se observa inducción del gen lp_3124, que codifica un regulador transcripcional. El ARN se extrajo después de 10 minutos de exposición al compuesto fenólico, por lo que una posible explicación puede ser que se trate de genes de expresión temprana, cuya inducción se produciría a tiempos más cortos y una vez producida la correspondiente proteína, no sería necesario continuar su expresión. Se trata de reguladores de tipo LysR que se ha descrito que son autorregulables por lo que la presencia de la proteína reguladora puede provocar una regulación negativa de su expresión (Lochowska et al., 2001; Lönneborg y Brzezinski, 2011). 2.4. Actividad reductasa de vinil fenoles en otras bacterias lácticas La capacidad para reducir vinil fenoles es una actividad poco frecuente entre bacterias lácticas (Filannino et al., 2014). Puesto que en esta tesis se ha demostrado que la presencia de la proteína Lp_3125 confiere la capacidad para reducir vinil fenoles a L. plantarum WCFS1, se decidió conocer la presencia de 0 2 4 Ácido p-cumárico4-Vinilfenol N iv el d e tr an sc ri p ci ó n r el at iv a * * Figura 43. Análisis de la expresión relativa de los genes lp_3124 y lp_3125 en L. plantarum WCFS1 mediante RT-qPCR en presencia de 1,5 mM 4-vinilfenol o ácido p- cumárico. Los resultados muestran la media de tres experimentos independientes. Las barras representan la transcripción relativa de los genes lp_3124 (morado) y lp_3125 (naranja). Las barras de error representan la desviación estándar y los asteriscos marcan las diferencias estadísticamente significativas en comparación con la muestra control sin tratar (test t de Student de dos colas, *, p < 0,05) 131 Resultados y Discusión proteína similares en otras bacterias lácticas. Para ello se realizó una búsqueda de proteínas similares entre las proteínas incluidas en las bases de datos. Al igual que lo que ocurría con Lp_1425, la búsqueda reveló que sólo existen proteínas con una identidad superior al 35% en especies del género Lactobacillus. Por ello, parece que la presencia de proteínas similares a Lp_3125 es exclusiva de Lactobacillus. Esto no implica que las todas las proteínas similares presentes en este género posean actividad de vinilfenol reductasa, de la misma manera no se puede excluir que haya proteínas no semejantes que compartan su actividad bioquímica. Proteínas similares a Lp_3125 no sólo están restringidas al género Lactobacillus, si no que dentro de este género sólo están presentes en un reducido número de especies, la mayoría pertenecientes al grupo L. plantarum. Se han encontrado proteínas de 476 a 492 residuos de aminoácidos que presentan una identidad del 43 al 89% con la proteína Lp_3125 de L. plantarum WCFS1. Las proteínas pertenecen a las especies L. pentosus, L. paraplantarum, L. bifermentans, L. collinoides, L. paracollinoides, L. similis y L. rossiae. Con las proteínas similares a Lp_3125 identificadas en las especies de Lactobacillus se realizó un alineamiento utilizando el programa Clustal Omega. Comparando las secuencias se puede comprobar que las proteínas analizadas presentan similitud a lo largo de toda la proteína pudiéndose identificar motivos de aminoácidos conservados en todas ellas, incluyendo las tres glicinas del motivo de Rossmann (Figura 44). Se seleccionaron dos de estos motivos para diseñar oligonucleótidos degenerados y utilizarlos para la detección de los genes que codifican estas proteínas. Los oligonucléotidos 1657 (codifica D(I/V/L)VVG, posición 10 de Lp_1425) y 1658 (codifica GLYAAG, posición 447 de Lp_3125) amplifican un tamaño de 1311 pb del gen Lp_3125. Los oligonucleótidos 1657+1658 se utilizaron con el ADN extraído de las 47 cepas de bacterias lácticas analizadas en apartados anteriores para amplificar, mediante PCR, los genes que codifican proteínas similares a Lp_3125. 132 Resultados y Discusión 1657 LCO --MFPKKTDYDLVIVGGGLSGLAAAVAAGEKKLATLVLEKGRTLGGDGNYVEGAMGVDST LRO MPNITRKDAYDVVVVGTGAAGTSAALTAAQNGASVLLLEKGRHTGGSSNYTEGLFAVDSY LBI -MTISQKERYDIVVVGTGAAGTSAALEATQQGATVLLLEKGRHTGGSSNYTEGLFAVDSY LSI -MSFTKQERYDVVVVGTGAAGTSAALEAAQHGASVLLLEKGRHTGGSSNYTEGLFAVDSY lPC -MSISQKTQYDVVVVGTGAAGTSAALEAAQHGASVLLLENGRHTGGSSNYTEGLFAVDSY LPL -MTLAKHDSYDIVVVGTGAAGTAAALEAAQHGASVLLLEKGRHTGGSSNYTEGLFAVDSY LPE -MTLTKRTSYDIVVVGTGAAGTAAALEAAQHGATVLLLEKGRHTGGSSNYTEGLFAVDSY LPA -MTLTEHTSYDIVVVGTGAAGTAAALEAAQHGATVLLLEKGRHTGGSSNYTEGLFAVDSY : .: **:*:** * :* :**: * :: :.*:**:** **..**.** :.*** LCO MQKDAGISIDKTELLQDELTYSHYEASAPHLKKLIDASGATIDWLQSLGVTFTKVGPQGK LRO LQKQQGITVSGTDVLKEEVAYSKYRADSRIWRNYVDDSADTVKWLNEQGVEYEGVQAMGD LBI LQKQQGIQVSGTDVLKEEVEYSKFKADSRIWRRYVDDSANTVQWLRDQGVTYEGVQAMGA LSI LQKEQGIKVSGTDVLKEEVEYSKYKADSRIWRNYVDDSANTVQWLKDQGVKYEGVQAMGA lPC LQKAQGIKVSATDVLREEVDYSKYRADSRIWRNYLDDSTGTVQWLKDQGVKYEGVQAMGA LPL LQKAQNINVSATDVLKEEVDYSKYRADSRIWRRYLDDSANTVQWLKDQGVEYEGVQAMGA LPE LQQAQHIHVSATEVLKEEVDYSKYRADSRIWRQYLDDSADTVQWLKDQGVEYEGVQAMGA LPA LQQAQNIHVSATDVLKEEVDYSKYRADSRIWRQYLDDSANTVQWLKDQGVEYEGVQAMGA :*: * :. *::*::*: **::.*.: :. :* * *:.**.. ** : * * LCO SWPTIHTFEGGGHAAIE-KLKAKADEYGVEFATSVSAQKLLQ-ANGHISGLAVKNEATGQ LRO GEATWHIYKGMGNAVINDALIPQAKKLGVEVLTSTAATNIDQ-ENGKISRVTIKNLANNL LBI GEATWHIYDGMGQSVLHDHLLPQAEKLGVELLTSTTAVELLQDQTGAITGVKIQDEITRD LSI GEATWHIYEGMGQSVLHDALLPQAEKLGVEVRTLTTAIALHQDADGAINGVTIRDEASQE lPC GEATWHIYEGMGQSVLHDALQPQAEKLGVELLSSTTVTALHQNTDGAINGLTIQDEATGT LPL GEATWHIYKGMGQAVLHDALQPQAQKLGVELLTSTTAITLHQATDGAITGVMIQSAATNE LPE GEATWHIYKGMGQAVLHDALQPKALALGVELLTSTTAIDLHQADNGTITGVTIQNAATKE LPA GEATWHIYKGMGQAVLHDALQPKAQSLGVEMLTSTTVTALHQADDGTITGVTIQDAGTKE . * * :.* *::.:. * :* ***. : .:. : * * *. : ::. . LCO YRDLRAQNVLLATGGYVDNPELIKERTPFV-GRLLTVSDGKSTGDGMQLAWAAGAQHYSM LRO SESVKTSSVILATGGYLNNAEMMSKMTHYDTSRLVTVSSGKGTGDGLQMAWNLGARKYGT LBI LQNVQTSAVILATGGYLNNPEMMAQLTAYDTSRLVPVSSGKGTGDGLRLAWNAGAKQYGT LSI TQDVATGAVVLAAGGYLNNPDMMAKLTQYDTSRLIPVSSGKGTGDGLQLGWKAGAKQYGT lPC TEDIKAGAVVLATGGYLNNPEMMKELTHYDTSRLIQVSSGKGTGDGLRLAWKIGAKKYGT LPL TQVINTAAVILATGGYLNNPDMMQKLTHYDTRRLIPVSSGKGTGDGLRLAWQAGAQQYGT LPE TQLVNTHAVILATGGYLNNPEMMQNLTHYDTSRLIPVSSGKGTGDGLRLAWQAGAQQYGT LPA TQAIATSAVILATGGYLNNPEMMASLTHYDTRRLIPVSSGKGTGDGLQLAWDAGAQKYGT . : : *:**:***::* ::: . * : **: **.**.****:::.* **::*. LCO GAIQYGGGAIYDRQTPPFVHMMSQLGVVATQEAILWVNERGERFVNEDVNDNMCHAGGAI LRO GTAMLFGGYLKDPSVPAFKFMSSEMNTAAGQQPLLWVNENGERFVDEAVVYNFSFAGNAL LBI GMAMLFGGYLKDPDEPSFKLMASQMNTAAGQQPLLWVNEHGERFVDESVVYNFSYAGNAL LSI GMAMLFGGYLKDPDEPSFKFMASQMNTAAGQQPLLWVNEHGERFVDESVVYNFSYAGNAL lPC GMAMLFGGYLKDPDEPSFKYMASQMETAAGQQPLLWLNEHGERFVDEAVVYNFSYAGNAL LPL GMAMLFGGYLKDPSEPSFKYMASQMETAAGQQPLLWLNEHGERFVDEAVVYNFSYAGNAL LPE GMAMLFGGYLKDPSEPSFKYMASQMETAAGQQPLLWLNEHGERFVDEAVVYNFSYAGNAL LPA GMAMLFGGYLKDPAEPSFKYMASQMETAAGQQPLLWLNEHGERFVDEAVVYNFSYAGNAL * ** : * * * * *:: ..* *: :**:**.*****:* * *:..**.*: LCO LTQSRVFSIFDQAAVDHLANVGLFKEVGNSPVSPDKLDKLPGEIETDLGKHASYLTKADS LRO YTQNKVFSILDTAVIDEMAKSGNFMGLGVYVKRGQKMTKLKDEIDEAVAEERPFIFKADT LBI YTQNQVFSILDQGVIDKMATDGHFMGLGVYVKRGEKMATLQAELDETVAAHKPFIFKADT LSI YTQNQVYSILDQGVIDKMAKDGNFMGLGVYVKRGEKMDKLQAEIDGAVAADKPFIFKADT lPC YTQNKVFSVLDQGVIDKMAKDGNFMGLGVYVRRGEKMVKLQAELDAAVSANKPFIFKADT LPL YTQNQVFSILDQGVINKMAQDGNFMGLGVYVRRGEKMTKLQAEIDAAVAANKPFIFKANT LPE YTQNQVFSILDQGVIDRMARDGNFMGLGVYVRRGEKMTKLQAEIDAAVAANKPFIFKAKT LPA YTQNQVFSILDQGVIDRMAQDGNFMGLGVYVRRGEKMTKLQSEIDAAVTAKKPFIFKADT **.:*:*::* ..::.:* * * :* :*: .* *:: : . :: **.: 133 Resultados y Discusión 1658 LCO LEELATKLGLA--KLPDTVTRYNALVDTGADTDFGKDKTYLTAVSDGPFYAVELGVGMAC LRO IEELAQKMGVPSEQLMQTMTKYNQDCELGQDSLFGKDPKYMRPINEGPFYGFSLNVGAFC LBI IEALAQAMGMSETALTQTVLTYNQFCAAGVDQDFGKAQQYLVPVTKGPFYGFKLNVGAFC LSI IEALAEKMNVPVDQLTKTITDYNDYCEAGDDKAFGKDTEYLVKVAEGPFYGFKLNVGAFC lPC IDALAEKMGLPVEKVVETIKTYNGYCDAKEDGDFGKNPEYLVKVAKGPFYGFELNVGAFC LPL IEALATKMHLPVDQVTHSIQTYNQYCDNGQDDDFGKNPEYLVKVSQGPFYGFELNVGAFC LPE IEELAAKMHLPVDQVTRSIQTYNQYCDNGQDNEFGKDPAYLVKVDQGPFYGFELNVGAFC LPA IDELAAKMHLPVDQVTKSVQTYNQYCDNGQDADFGKNPDYLVKVATGPYYGFELNVGAFC :: ** : : : :: ** * *** *: : **:*...*.** * LCO ALGGIRVSDDNEVLNDYGYPVPGLYAAGNDAAGMLVGDTYAVTLPGSTAGYAAFSGRNAV LRO TMGGLQVNPNNEVLNNNGQAIAGLYAIGNDATG-LVGDTYGPNMPGTCVGYAFYSGRNAG LBI TMGGLQVTTDNAVLTNAGTPIPGLYAAGNDASG-LTGDTYGPNMPGTCVGYAFYSGRNAG LSI TMGGLQVTTSNEVLAENGLPVAGLYAAGNDAAG-LTGDTYGPNMPGTCVGYAFYSGRNSG lPC TMGGLQVTTENEVLDDNGDKIGGLYAAGNDAAG-LAGDTYGPNMPGTCVGYAYYSGRNSG LPL TMGGLKVTTNNEVLDTTGQPITGLYAAGNDAAG-LTGDTYGPNMPGTCVGYAFYSGRNSG LPE TMGGLKVTTANEVLDTEGTPIPGLYAAGNDAAG-LTGDTYGPNMPGTCVGYAFYSGRNSG LPA TMGGLKVTTANEVLDTTGNTIQGLYAAGNDAAG-LTGDTYGPNMPGTCVGYAFYSGRNSG ::**::*. * ** * : **** ****:* *.****. .:**: .*** :****: LCO ANM------------ LRO LHAAMTVSDELEDN- LBI HHAAQA--------- LSI KHAAAYAKAGVTA-- lPC KHAASYTKGLKITE- LPL RHAAQYTHQQSIVSH LPE RNAVTYLNNDVAVTD LPA RHAASYANH------ : De las cepas analizadas sólo amplificaron un fragmento del tamaño esperado (1,3 kb) las cepas de las especies pertenecientes al grupo L. plantarum, es decir, las cepas de las especies L. plantarum, L. paraplantarum y L. pentosus (Figura 45). Por el contario, con ninguna cepa de las otras especies de bacterias lácticas se obtuvo una amplificación positiva. Al igual que lo que Figura 44. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína Lp_3125 con proteínas similares presentes en las bases de datos. Se realizó un alineamiento múltiple utilizando el programa Clustal Omega a partir de las secuencias depositadas en la base de datos GenBank. Las secuencias de aminoácidos pertenecen a Lactobacillus plantarum WCFS1 (LPL) (F9USN6), L. paraplantarum DSM 10667 (LPA) (A0A0R1RBK3), L. pentosus DSM 10667 (LPE) (A0A0R1FK87), L. collinoides DSM 20515 (LCO) (A0A0R2BBL2), L. paracollinoides DSM 15502 (LPC) (A0A0R1T9H1), L. bifermentans DSM 20003 (LBI) (A0A0R16M13), L. similis DSM 23365 (LSI) /A0A0R2F9E3) y L. rossiae DSM 15814 (LRO) (A0A0R1RHT0). Identidad entre aminoácidos (*), cambio no conservativo (:) y cambio conservativo (.). La secuencia codificada por los oligonucleótidos 1657 y 1658 se indica marcada en amarillo y con flechas. El motivo GXGXXG del plegamiento de Rossmann está señalado en verde. 134 Resultados y Discusión ocurría con la presencia del gen lp_1425, los resultados obtenidos en esta tesis indican que todas las cepas analizadas del grupo L. plantarum poseen el gen que codifica la enzima responsable de la reducción de 4-vinilfenol. Sin embargo, al realizar una búsqueda en las bases de datos entre 25 cepas del grupo L. plantarum cuyo genoma se ha secuenciado completamente, no se consiguió localizar una proteína similar a Lp_3125 en las cepas DOMLA, CMPG5300, 2165 y EGD-AQY (datos no mostrados). Este resultado negativo no implica que definitivamente estas cepas no tengan la proteína puesto que puede existir algún error o cambio de fase en la lectura del genoma y no haberse identificado el gen correctamente. Aunque la ausencia del gen o la interrupción del mismo en estas cepas tampoco se puede descartar. Puesto que no se dispone de las cepas de L. plantarum DOMLA, CMPG5300, 2165 y EGD-AQY no se pudo comprobar mediante PCR la presencia del gen equivalente a lp_3125 o bien demostrar su capacidad para reducir 4-vinilfenol. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 kb 7,7- 4,2- 1,5- 0,9- 2,7- Figura 45. Amplificación mediante PCR de genes que codifican proteínas similares a Lp_3125 en bacterias lácticas. La amplificación se realizó utilizando los oligonucleótidos 1657 y 1658 y el ADN cromosómico de las cepas Enterococcus casseliflavus DSM 20680 (1), E. durans DSM 20633 (2), E. faecalis DSM 20478 (3), E. faecium CECT 4102 (4), E. gallinarum DSM 24841 (5), E. hirae DSM 20160 (6), L. brevis CECT 5354 (7), L. fermentum CECT 4007 (8), L. fructivorans CECT 4785 (9), L. paraplantarum DSM 10641 (10), L. plantarum subsp. argentoratensis DSM 16365 (11), L. plantarum subsp. plantarum ATCC 14917 (CECT 748) (12), L. plantarum DSM 10492 (13), L. pentosus DSM 16366 (14), L. sakei subsp. carnosus DSM 15831 (15), Leuconostoc citreum CECT 4025 (16), y Streptococcus gallolyticus UCN34 (17). Algunos fragmentos del marcador de peso molecular λ/EcoT14I (Takara) están representados en la izquierda. 135 Resultados y Discusión En las 47 cepas de bacterias lácticas en las que se estudió la presencia o ausencia del gen lp_3125, se analizó también su capacidad para transformar 4- vinilfenol. Para ello las cepas de bacterias lácticas se cultivaron en el medio MRS o BHI conteniendo 1,5 mM de 4-vinilfenol a 30 ºC durante cinco días. Después de la incubación, los compuestos fenólicos presentes en los sobrenadantes se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron mediante HPLC. Tal como refleja la Figura 46, todas las cepas que amplificaron el fragmento de 1,3 kb del gen lp_3125, fueron capaces, en mayor o menor medida, de reducir el 4-vinilfenol presente en el medio de cultivo. Sin embargo, las cepas que no amplificaron el gen no fueron capaces de reducir el 4- vinilfenol presente (Tabla 6). Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 250 500 750 m A U 0 250 500 750 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 250 500 m A U 0 250 500 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 250 500 m A U 0 250 500 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 250 500 m A U 0 250 500 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 250 500 750 m A U 0 250 500 750 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 250 500 m A U 0 250 500 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Minutes 20 40 60 80 m A U 0 250 500 m A U 0 250 500 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 200 400 m A U 0 200 400 Minutes 0 20 40 60 80 m A U 0 100 200 m A U 0 100 200 Tiempo (min) Tiempo (min)Tiempo (min) m U A control 3 6 9 12 15 1 4 7 10 13 16 2 5 8 11 14 17 EF VF VF VF VF VFVF VFVF VFVFVF VF VF VF VF EF EF EF EF Figura 46. Reducción de 4-vinilfenol en cultivos de Enterococcus casseliflavus DSM 20680 (1), E. durans DSM 20633 (2), E. faecalis DSM 20478 (3), E. faecium CECT 4102 (4), E. gallinarum DSM 24841 (5), E. hirae DSM 20160 (6), Lactobacillus brevis CECT 5354 (7), L. fermentum CECT 4007 (8), L. fructivorans CECT 4785 (9), L. paraplantarum DSM 10641 (10), L. plantarum subsp. argentoratensis DSM 16365 (11), L. plantarum subsp. plantarum ATCC 14917 (CECT 748) (12), L. plantarum DSM 10492 (13), L. pentosus DSM 16366 (14), L. sakei subsp. carnosus DSM 15831 (15), Leuconostoc citreum CECT 4025 (16), y Streptococcus gallolyticus UCN34 (17). Los cultivos se incubaron durante 5 días a 30 ºC en medio MRS conteniendo 4-vinilfenol a una concentración de 1,5 mM. UA, Unidades de absorbancia. Los cromatogramas se registraron a 280 nm. VF, 4-vinilfenol; EF, 4-etilfenol. 136 Resultados y Discusión Vinilfenol Especie Cepa HPLC PCR Enterococcus casseliflavus DSM 20680 - - Enterococcus durans DSM 20633 - - Enterococcus faecalis DSM 20478 - - Enterococcus faecium CECT 4102 - - DSM 20477 - - Enterococcus gallinarum DSM 24841 - - Enterococcus hirae DSM 20160 - - Lactobacillus brevis ATCC 367 (CECT 5354) - - CECT 216 - - CECT 4121 - - Lactobacillus fermentum CECT 4007 - - Lactobacillus fructivorans CECT 4785 - - Lactobacillus paraplantarum DSM 10641 (ATCC 10776) + + DSM 10667 T (ATCC 10667 T ) + + Lactobacillus plantarum WCFS1 + + subsp. argentoratensis DSM 16365 + + subsp. plantarum DSM 20174 + + subsp. plantarum ATCC 14917 T (CECT 748 T ) + + NC8 + + CECT 220 + + CECT 221 + + CECT 223 + + CECT 224 + + CECT 749 (ATCC 10241) + + CECT 4645 + + DSM 1055 + + DSM 2648 + + DSM 10492 + + DSM 13273 + + DSM 20246 + + RM28 + + RM31 + + RM35 + + RM38 + + RM39 + + RM40 + + RM41 + + RM71 + + RM72 + + RM73 + + Lactobacillus pentosus DSM 16366 + + DSM 20314 + + DSM 20199 + + Lactobacillus sakei subsp. carnosus DSM 15831 - - Leuconostoc citreum CECT 4025 - - CECT 4700 - - Streptococcus gallolyticus UCN34 - - Tabla 6. Reducción de 4-vinilfenol en bacterias lácticas 137 Resultados y Discusión Los fenoles volátiles, entre los que se encuentran los etil y vinil fenoles, son compuestos aromáticos, los cuales, por encima de ciertos niveles afectan negativamente al aroma de algunos alimentos fermentados. Por ello se han realizado numerosos estudios para conocer la capacidad que tienen las bacterias lácticas para producir estos compuestos. Los estudios realizados sugieren que aunque algunas especies de bacterias lácticas son capaces de descarboxilar los ácidos fenólicos a vinil fenoles, la capacidad para producir etil fenoles es mucho menos frecuente entre estas bacterias (Couto et al., 2006). En los primeros estudios realizados se demostró mediante cromatografía de gases que algunas cepas de L. plantarum, L brevis y P. pentosaceus después de una incubación de dos días en presencia de 500 mg/l de ácido p-cumárico o ácido ferúlico, producían 4-etilfenol o 4-etilguayacol (Cavin et al., 1993). Sin embargo, en un estudio posterior, en el que además de las especies anteriores también se incluyeron cepas de las especies Lactobacillus hilgardii, Pediococcus damnosus y O. oeni, se concluyó que aunque algunas de las bacterias lácticas analizadas en el estudio eran capaces de producir cantidades significativas de vinil fenoles en un vino modelo, L. plantarum fue la única bacteria capaz de producir cantidades significativas de etil fenoles (Chatonnet et al., 1995). También se estudió la capacidad para producir etil fenoles en cepas de varias especies del género Lactobacillus (L. buchneri, L. paracasei, L. casei, L. collinoides, L. confusus, L. curvatus, L. fructivorans, L. kéfir, L. mali, L. sakei, y L. viridescens), Pediococcus (P. acidilactici, P. damnosus, y P. parvulus) y Lc. mesenteroides (Couto et al., 2006). Los resultados indicaron que aunque el 37% de las bacterias estudiadas fueron capaces de producir 4- vinilfenol a partir de ácido p-cumárico, la etapa posterior de reducción para producir 4-etilfenol sólo se encontró en cepas de las especies L. plantarum, L. brevis y L. collinoides. La producción de vinil fenoles por L. collinoides a partir de ácido cafeico y ácido p-cumárico se confirmó posteriormente, no detectándose la producción de estos etil fenoles en cepas de las especies L. brevis, L. mali y Lc. mesenteroides (Buron et al., 2011). Estudios realizados en tres cepas de L. brevis confirmaron la incapacidad de las mismas para reducir 138 Resultados y Discusión los vinil fenoles que producen a partir de ácidos hidroxicinámicos (Curiel et al., 2010). Finalmente, el estudio realizado por Filannino et al. (2014) también confirma que las cepas de L. brevis no producen etil fenoles, al igual que cepas de las especies L. fermentum y Lc. mesenteroides, y, en cambio, si detecta producción de etil fenoles en una cepa de L. rossiae. Por tanto, todos los estudios realizados parecen indicar que sólo un reducido número de especies de bacterias lácticas son capaces de reducir vinil fenoles a etil fenoles, entre las especies que poseen la enzima reductasa sólo estarían L. plantarum, L. collinoides y L. rossiae. Estos datos coinciden con los obtenidos en esta tesis puesto que sólo se ha detectado la capacidad para reducir vinil fenoles en cepas del grupo de L. plantarum (L. plantarum, L. paraplantarum y L. pentosus) y, aunque no se han ensayado cepas de las especies L. collinoides y L. rossiae, si se ha descrito en esta tesis que son de las pocas especies que poseen proteínas similares a Lp_3125 (Figura 44). Estudios realizados en L. plantarum y L. collinoides han descrito que la transformación de 4-vinilfenol en 4-etilfenol puede suponer una ventaja para las bacterias que poseen esta actividad reductasa. Se ha demostrado que estas bacterias en altas concentraciones de glucosa producen casi exclusivamente 4- vinilfenol, mientras que en bajas concentraciones, sólo producen 4-etilfenol. Se ha descrito que parte de la glucosa se puede desviar para la producción de manitol, como ruta alternativa para regenerar NAD(P) + . Estos resultados se confirman con los resultados obtenidos con fructosa, compuesto que algunas bacterias utilizan como aceptor de electrones, y que se reduce a manitol. La reducción de 4-vinilfenol a 4-etilfenol se favorece claramente en anaerobiosis, lo que apoya la necesidad de aumentar la disponibilidad de NAD(P) + . Los datos disponibles sugieren que el metabolismo de estos compuestos en bacterias lácticas viene determinado por el balance NAD(P) + /NADH(P) (Silva et al., 2011). Conclusions 141 Conclusions Conclusions 1. The disruption of reductase-encoding genes, which were induced in the presence of p-coumaric acid, confirmed their involvement on the reduction of hydroxycinnamic acids and vinyl phenols. 2. The presence of a functional Lp_1425 protein is required for the reduction of hydroxycinnamic acids. 3. In spite that a functional Lp_1424 protein is not needed for catalytic activity, this protein helps to Lp_1425 stabilization and avoids its proteolysis. 4. All the hydroxycinnamic acids assayed were reduced to their corresponding substituted phenyl propionic acids by the Lp_3125 protein. 5. In lactic acid bacteria, the presence of proteins similar to Lp_1425 is associated to the ability to reduce hydroxycinnamic acids. 6. In L. plantarum WCFS1, the capacity to reduce vinyl to ethyl phenols is due to the presence of a functional Lp_3125 protein. 7. The protein Lp_3125 is able to reduce different vinyl phenols to their corresponding ethyl phenols. 8. In lactic acid bacteria, the ability to reduce vinyl phenols is less frequent than the ability to reduce hydroxycinnamic acids. 9. The identification of Lp_1425 and Lp_3125 enzymes constitutes the first description of bacterial reductases showing activity on hydroxycinnamic acids and vinyl phenols, respectively. 10. The description of these reductases completes the identification of the enzymes involved on the metabolism of hydroxycinnamic acids in lactic acid bacteria. Bibliografía 145 Bibliografía Bibliografía Ackerley, D. F., Gonzalez, C. F., Park, C. H., Blake, R., Keyhan, M. y Matin, A. (2004). Chromate-reducing properties of soluble flavoproteins from Pseudomonas putida and Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 70, 873-882. 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