UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL Anticuerpos anti-fosfatidilserina/protrombina en fracaso reproductivo recurrente MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Daniel Enrique Pleguezuelo Garrote Directores Antonio Serrano Hernández Jesús Hernández Gallego Madrid © Daniel Enrique Pleguezuelo Garrote, 2022 DOCTORADO EN INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS MÉDICO-QUIRÚRGICAS AGRADECIMIENTOS: Esta tesis doctoral no sólo es fruto del trabajo del autor sino que de forma explícita e implícita, han participado en ella muchas otras personas a las que quisiera escribir estas líneas de agradecimiento. A mis padres Lourdes Carmen y José Antonio, por haberme inculcado desde la infancia el valor del trabajo, la dedicación y motivarme para llegar hasta el final de los estudios como una vía no para el desarrollo propio sino para la construcción de nuestra Sociedad. A mi hermana Paula, por su ayuda y preocupación incluso hasta cuando nuestros caminos formativos y profesionales comenzaron a distanciarse. A mi esposa Adriana y a mis hijos, Lucía y Alejandro, por su soporte, esfuerzo y comprensión para permitirme el tiempo y el apoyo necesario para elaborar esta tesis doctoral. A mi tutor y director Antonio, por guiarme en la senda de la investigación científica desde mis primeros pasos y enseñarme a advertir los errores y buscar la excelencia, desde la metódica y la rigurosidad. A mi jefe de Servicio Estela, por su confianza en mí desde el primer día para tomar las riendas de una parte del laboratorio que representa y la apertura de la actividad clínica. A mis compañeros del Servicio de Inmunología del Hospital Universitario 12 de Octubre, por sus consejos, sus recomendaciones, enseñanzas y la ayuda prestada para la elaboración de esta tesis. A mis compañeras del Servicio de Ginecología y Obstetricia del Hospital Universitario 12 de Octubre, por su implicación, generosidad y apoyo para la elaboración de esta tesis. A mis pacientes, de quienes conservo el honor de ser depositario de su confianza para el tratamiento de sus dolencias, de los que aprendo cada día y son fuente de motivación para seguir explorando nuevos caminos para el avance de la Medicina. DEDICATORIA: A mis hijos, por el tiempo que no pasé con ellos para elaborar esta tesis doctoral ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN Página 1 1.1. Descripción y generalidades del síndrome anti-fosfolipídico (SAF) Página 1 1.2. Criterios clasificatorios del SAF Página 8 1.3. Prevalencia del síndrome Página 11 1.4. SAF seronegativo Página 13 1.5. Los anticuerpos anti-fosfatidilserina/protrombina Página 15 1.6. Manifestaciones obstétricas: abortos recurrentes. Página 18 1.6.1. Definición y prevalencia. Página 18 1.6.2. Manifestaciones obstétricas en SAF: abortos recurrentes. Estudio de factores inmunológicos Página 21 1.6.3. Manifestaciones obstétricas en SAF: abortos recurrentes. Limitaciones de los criterios de clasificación de SAF vigentes Página 22 1.6.4. Manifestaciones obstétricas en SAF: abortos recurrentes. La utilización empírica de tratamientos utilizados en el síndrome anti-fosfolipídico Página 24 1.6.5. Manifestaciones obstétricas en SAF: abortos recurrentes. Fisiopatología de los anticuerpos anti-fosfolipídicos Página 25 1.7. Manifestaciones obstétricas en SAF: fracaso de implantación recurrente Página 27 1.7.1. Definición, causas y prevalencia: Página 27 1.7.2. Prevalencia de los anticuerpos anti-fosfolipídicos en esta entidad Página 28 1.7.3. Mecanismos de acción propuestos de los anticuerpos anti- fosfolipídicos en fracaso de implantación recurrente Página 29 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Página 33 2.1. Razonamiento y bases que propician el estudio Página 33 2.2. Hipótesis Página 33 2.3. Objetivos Página 34 3. MATERIAL Y MÉTODOS Página 39 3.1. Controles sanos: Página 39 3.2. Pacientes Página 40 3.2.1. Derivación para estudio Página 40 3.2.2. Duración del seguimiento y puntos de estudio analítico Página 41 3.2.3. Abortos de repetición: Página 41 3.2.4. Fracaso de implantación recurrente: Página 42 3.3. Estudio de anticuerpos anti-fosfolipídicos incluídos en los criterios de clasificación Página 42 3.3.1. Anti-Cardiolipina igg e igm y anti-Beta-2-Glicoproteína-I igg, igm e iga Página 42 3.3.2. Anticoagulante lúpico Página 43 3.4. Estudio de anticuerpos anti-fosfatidilserina/protrombina Página 43 3.5. Estudio de otros autoanticuerpos no órgano-específicos Página 44 3.6. Estudio de otros autoanticuerpos órgano-específicos Página 44 4. RESULTADOS Página 45 4.1.1. Análisis 1A. Definición de un punto de corte para dar como positivos valores de aPS/PT IgG e IgM en las pacientes y las controles de este estudio. Página 45 4.1.2. Análisis 1B. Comparación del rendimiento del punto de corte encontrado con otros posibles, como los sugeridos por el fabricante del test diagnóstico o los calculados a partir de las muestras de las embarazadas que formaban la cohorte de controles sanos. Página 48 4.1.3. Análisis 2A. Descripción demográfica del grupo control. Página 51 4.1.4. Análisis 2B. Descripción demográfica del grupo de pacientes con abortos recurrentes ocurridos antes de la semana 10 de gestación. Página 54 4.1.5. Análisis 2C. Descripción demográfica del grupo de pacientes con abortos desde la semana 10 de gestación en adelante. Página 58 4.1.6. Análisis 2D. Descripción demográfica del grupo de pacientes con fracaso de implantación recurrente. Página 61 4.1.7. Análisis 2E. Estudio de los niveles de aPS/PT en controles sanos y pacientes en la primera determinación. Página 66 4.1.8. Análisis 2F. Estudio de la prevalencia de aPS/PT en controles sanos y los grupos de pacientes. Página 70 4.1.9. Análisis 2G. Estudio de la prevalencia de aFL incluidos en los criterios de Sídney en los grupos de pacientes y en controles sanos. Análisis del solapamiento con respecto a aPS/PT. Página 78 4.1.10. Análisis 2H. Estudio de la evolución de los niveles de aPS/PT en los diferentes grupos de pacientes. Página 83 4.1.11. Análisis 4A. Análisis univariante de los aFL incluidos en los criterios de clasificación para fracaso de implantación recurrente. Página 94 4.1.12. Análisis 3A. Análisis univariante de los aPS/PT en fracaso de implantación recurrente. Página 95 4.1.13. Análisis 4B. Análisis Multivariante de aFL incluidos en los criterios de clasificación y los aPS/PT en fracaso de implantación recurrente. Página 96 4.1.14. Análisis 4C. Análisis univariante de los aFL incluidos en los criterios de clasificación para pacientes con tres o más abortos consecutivos anteriores a la semana 10 de gestación. Página 98 4.1.15. Análisis 3B. Análisis univariante de los aPS/PT en mujeres con tres o más abortos consecutivos antes de la semana 10 de gestación. Página 99 4.1.16. Análisis 4D. Análisis Multivariante de aFL incluidos en los criterios de clasificación y los aPS/PT en el grupo de pacientes con tres o más abortos consecutivos ocurridos antes de la semana 10 de gestación. Página 99 4.1.17. Análisis 4E. Análisis univariante de los aFL incluidos en los criterios de clasificación para pérdidas fetales, con uno o más abortos ocurridos en la semana 10 de gestación o en adelante. Página 101 4.1.18. Análisis 3C. Análisis univariante de los aPS/PT para pérdidas fetales, con uno o más abortos ocurridos en la semana 10 de gestación o en adelante. Página 101 4.1.19. Análisis 4F. Análisis Multivariante de aFL incluidos en los criterios de clasificación y los aPS/PT en pérdidas fetales, con uno o más abortos desde la semana 10 de gestación en adelante. Página 102 4.1.20. Análisis 4G. Análisis univariante de los aFL incluidos en los criterios de clasificación para dos abortos consecutivos ocurridos con anterioridad a la semana 10 de gestación. Página 103 4.1.21. Análisis 3D. Análisis univariante de los aPS/PT para dos abortos consecutivos ocurridos con anterioridad a la semana 10 de gestación. Página 104 4.1.22. Análisis 4H. Análisis Multivariante de aFL incluidos en los criterios de clasificación y los aPS/PT en dos abortos consecutivos ocurridos con anterioridad a la semana 10 de gestación. Página 104 4.1.23. Análisis 4I. Prevalencia y análisis univariante de las alteraciones tiroideas y multivariante en conjunto con los aFL estudiados. Página 105 4.1.24. Análisis 5A. Resultado de las intervenciones terapéuticas realizadas en virtud de los resultados analíticos obtenidos. Página 112 5. DISCUSIÓN Página 121 6. CONCLUSIONES Página 139 7. BIBLIOGRAFÍA Página 141 8. ANEXOS Página 151 8.1. Artículo original publicado en Journal of Clinical Medicine Página 151 8.2. Artículo original publicado en RMD Open Página 165 9. RESUMEN Página 173 9.1. Resumen en castellano Página 173 9.2. Abstract in English Página 174 1 TESIS DOCTORAL 1. INTRODUCCIÓN 1.1. DESCRIPCIÓN Y GENERALIDADES DEL SÍNDROME ANTI-FOSFOLIPÍDICO El síndrome antifosfolipídico (SAF) caracteriza a una enfermedad de base autoinmune descrita en 1983 por Hughes y Harris(1). Este Síndrome se define por la detección en sangre de autoanticuerpos con capacidad de unión a fosfolípidos cargados negativamente o a proteínas plasmáticas(2) asociadas a ellos sobre los endotelios vasculares y la observación clínica de trombosis venosa, arterial o morbilidad obstétrica(3) principalmente. Aunque el término que da nombre a este Síndrome hace mención a los fosfolípidos endoteliales como diana principal de los autoanticuerpos encontrados en estos pacientes, el antígeno que se ha considerado tradicionalmente más relevante(4) pertenece al segundo grupo de los enumerados, la Beta-2-Glicoproteína-I (B2GPI) o apolipoproteína H (apoH), una proteína de unión a lípidos(5) que suele encontrarse en sangre con una concentración de 100–200µg/mL(6). No obstante, a día de hoy, además de la B2GPI, se considera que la protrombina también formaría parte de los antígenos a los que los anticuerpos que ocasionan el SAF se dirigirían mayoritariamente(4). Además de la clínica de trombosis venosa o arterial y la mencionada morbilidad obstétrica, desde la descripción del Síndrome se han notificado un conjunto de manifestaciones clínicas que suelen presentarse acompañando a la sintomatología clásica y son: trombocitopenia, microangiopatía renal, valvulopatía cardiaca, livedo reticularis, migrañas, corea, convulsiones y mielitis longitudinal(7). 2 En enfermedades con presentación clínica heterogénea y en cierta medida aún desconocidas en cuanto a los mecanismos que las originan, las reuniones científicas de profesionales dedicados a la asistencia de pacientes afectos y de investigadores básicos y clínicos, suelen promover la definición de unos criterios de consenso para que las cohortes de pacientes de los diferentes estudios sean lo más homogéneas posibles y así conseguir avanzar en su conocimiento. En SAF, el consenso vigente fue acordado en una reunión celebrada en Sídney(3) en 2004. Cuando Hughes y Harris describieron este Síndrome, lo hicieron en pacientes afectos de otras enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico. No obstante, con posterioridad se demostró la existencia de SAF en pacientes no afectos de otras patologías autoinmunes. En estos casos, a pesar de la recomendación adversa del consenso de Sídney, suele añadírsele a la denominación SAF el adjetivo de primario(8). Con este complemento se intenta enfatizar que su origen no parece radicado en un trastorno mayor de la regulación de las respuestas inmunes, sino que pudiera deberse a una disrupción puntual de la tolerancia frente proteínas propias. Por el contrario, cuando la enfermedad se manifiesta junto a características clínicas y hallazgos complementarios sugerentes de otra enfermedad autoinmune, el SAF suele denominarse como secundario, aunque también se reserva este término en investigación básica para enfatizar los hallazgos en modelos animales. Entre las enfermedades autoinmunes encontradas en la población a las que puede asociarse el SAF, una de todas emerge por su mayor prevalencia sobre las demás. Es el caso del lupus eritematoso sistémico, una enfermedad en la que 3 sucede una desregulación profunda y persistente en el tiempo de la respuesta inmune, con rotura continuada de la tolerancia frente a antígenos propios, y que conlleva la activación y supervivencia de un repertorio de células autorreactivas, entre los que se encuentran linfocitos B y células plasmáticas, siendo éstas las fuentes de producción mayoritarias de los autoanticuerpos(9). Dichos autoanticuerpos pueden encontrarse en títulos detectables en estos pacientes y, dependiendo de su capacidad de fijación al epítopo que reconocen y sus características fisicoquímicas, pueden participar de forma relevante en el proceso patogénico de la enfermedad. Ya sea en la denominada forma primaria o asociada a otras enfermedades autoinmunes, por definición, en el SAF se produce una activación de la cascada de la coagulación, siendo la trombosis, venosa profunda o arterial, una de sus manifestaciones más frecuentes y reconocidas(10). No obstante, la trombosis en pacientes con SAF sin tratamiento es inconstante. Esta observación ha tenido una especial relevancia para dirigir los estudios que intentan aproximarse a la patogenia de este Síndrome, obligando a buscar rutas y mecanismos más complejos de los esperados en una enfermedad autoinmune en la que antígenos, autoanticuerpos y los factores que intervienen en la coagulación se suponen en contacto permanente(11) en sangre. A pesar de la controversia, en modelos animales se ha demostrado la patogenicidad de los aFL al observarse la generación de trombosis tras la infusión de estos(12). En humanos se ha descrito una forma de la enfermedad denominada SAF catastrófico, en la que ocurre una concatenación de eventos trombóticos en un periodo corto de 4 tiempo y que cursa con una grave tasa de morbimortalidad(13). Como resultado de estas observaciones dispares, se ha hipotetizado que debieran existir otros factores que resultan esenciales para la activación persistente de la coagulación en los pacientes con SAF catastrófico y que aparecen y desaparecen intermitentemente o se activan y se inhiben en los pacientes con formas de SAF no catastrófico. Este factor o conjunto de factores desconocidos subyacentes y que podrían suponer la aparición de un “brote” de trombosis en pacientes con SAF ha sido recogido en la llamada teoría del segundo golpe o second hit(14). En esta teoría, la activación de la inmunidad innata de forma intensa por un proceso inflamatorio o una cirugía, podría servir de desencadenante para la activación de la cascada de la coagulación en personas portadoras de aFL circulantes que habrían comprometido la integridad de los endotelios y generado un ambiente procoagulante (“primer golpe”) que a efectos de la cascada de la coagulación resultaba silente(15). Uno de los mecanismos propuestos para este “segundo golpe” consiste en la exposición y el camuflaje de epítopos en la principal proteína de unión a fosfolípidos asociada con este Síndrome, la B2GPI. Esta proteína está compuesta por 5 dominios con repeticiones consenso conocidos en el campo del SAF como dominios “sushi”, debido a la forma tridimensional que adquieren. Se ha descrito que el microambiente de oxidación y reducción predominante(16) podría inducir cambios en la exposición y ocultación de estos epítopos. Se conoce que la B2GPI se encuentra mayoritariamente en una conformación cerrada, mediada por la interacción entre el dominio I y el dominio V(17). Esta interacción parece estar 5 controlada por la relación entre los residuos de cisteína en las posiciones 288 y 326 en forma de tioles libres en el dominio V. □ Figura 1: Ilustración de las conformaciones abierta (izquierda, derecha) y cerrada (centro) de la proteína B2GPI. Modificado con autorización del trabajo de L Pelkmans y colaboradores (18) En un ambiente predominantemente oxidativo, estos residuos forman un enlace disulfuro y la B2GPI torna en una configuración abierta en forma de “J” o “garfio”, exponiendo epítopos habitualmente ocultos(18, 19). Cuando estos epítopos inicialmente crípticos son expuestos a las condiciones previamente reseñadas, pueden inducir la activación de clones de células B con receptores BCR específicos con resultado final de la producción de autoanticuerpos. Estos autoanticuerpos frente a los epítopos ahora expuestos podrían unirse a sus dianas y conseguirían estabilizar la conformación en “J” de la B2GPI. Mediante esta unión, se ha hipotetizado que la B2GPI podría acumularse en sangre en esta conformación abierta, resultando en una mayor activación de la cascada de la coagulación(20). Aunque el principal dominio reconocido por los anti-B2GPI es el dominio I, no todos los anticuerpos anti-B2GPI IgG e IgM presentan 6 especificidad frente a él, habiéndose identificado diferentes dianas en los dominios de la molécula reconocidas por los anticuerpos de los pacientes estudiados. Además, los patrones de reconocimiento de los anticuerpos de pacientes con SAF primario o asociado a otras enfermedades autoinmunes parecen ser diferentes, por lo que la distinción entre una variante y otra de la enfermedad parece incluso radicarse en procesos mecanicísticos diferentes(21). Otros isotipos de anticuerpos frente a la B2GPI, en concreto el IgA, parecen dirigir los anticuerpos frente a los dominios IV y V, y no frente al dominio I(22). Estas descripciones dan idea de la diversidad de idiotipos y epítopos reconocidos para un anticuerpo con una misma denominación genérica, anti- B2GPI, pudiendo ayudar a explicar la amplia variabilidad clínica observada en pacientes que los portan. La explicación detallada por la que los anticuerpos aFL motivan la activación de la cascada de la coagulación es aún objeto de investigación(23). Los procesos, rutas y mecanismos que se han postulado son muy cuantiosos y variados pero entre todos ellos, existe cierto consenso en definir que la trombosis mediada por los aFL precisa el concurso de tres procesos principales que se entrelazan en un circuito de consecuencias desfavorables. El primero de ellos consiste en la unión de los aFL a las células endoteliales, acarreando su activación e infringiendo un estado procoagulante. El segundo consiste en la activación plaquetaria. Por último, el tercero, se basa en la activación de la cascada del complemento, que potencia la activación de células endoteliales y plaquetas. 7 Los aFL pueden unirse a las células endoteliales mediante la fijación de sus idiotipos a la proteína B2GPI. La unión induce la expresión de moléculas de adhesión como selectina-E, ICAM-1 VCAM-1(24), la activación de NF-kB(25), la fosforilación de MAPK p38(26), la expresión de factor tisular(27), la secreción de citoquinas proinflamatorias como IL-6 e IL-8(26, 28) y la expresión de moléculas HLA de clase II. El incremento en la expresión de moléculas de adhesión atraerá a monocitos, que serán activados en el microambiente inflamatorio y aumentarán también la expresión en su superficie de factor tisular. La activación de estos dos grupos de células se basa en la estimulación de varias rutas intracelulares como TLR4(28, 29), Anexina II y ApoE2-R. Sobre las plaquetas, los aFL inducen su activación y agregación, detectándose de forma frecuente en pacientes una reducción en su cuantificación en sangre o trombocitopenia. La activación plaquetaria ocurre en un contexto de preestimulación con la presencia de trombina o colágeno. Este estado conduce al desplazamiento de la molécula Anexina V y la consecuente expresión de fosfatidilserina en la membrana externa plaquetaria, de la glicoproteína IIb- IIIa(17), la secreción de factor plaquetario 4(19) y del incremento en sangre de tromboxano A2(18) de origen plaquetario, con propiedades favorecedoras de la agregación plaquetaria y la vasoconstricción. Otros mecanismos descritos para la activación de la coagulación por parte de los aFL consisten en la inhibición de la proteína C activada, la generación de trampas neutrofílicas extracelulares (NETs)(29), la activación de, de la ruta de 8 señalización NF-kB(30), el consumo de complemento, en especial de C3(31), la inducción de especies reactivas de oxígeno (ROS)(32) y la activación de NADPH oxidasa 2(33). De forma independiente a los mecanismos de trombosis, los aFL se han relacionado con una alteración de los endotelios vasculares consistente en la afectación del estrato íntimo. Se ha detectado en pacientes con nefropatía y presencia de aFL y se ha visto mediada por la activación de la ruta de señalización de mTORC(34). 1.2. CRITERIOS CLASIFICATORIOS DEL SAF En el momento actual no existen criterios diagnósticos consensuados para el SAF sino criterios clasificatorios diseñados para homogeneizar y comparar los estudios de investigación clínica. Estos criterios fueron elaborados por primera vez en 1998 en Sapporo(35) y recibieron su última actualización en el congreso mundial de Sídney en 2004, siendo publicados en 2006(3). Aunque este consenso fue diseñado para investigación, la práctica clínica suele apoyarse en él para diagnóstico y justificación de las medidas de tratamiento. Dicho consenso establece la necesidad de haber padecido un episodio clínico de los contemplados, como una trombosis venosa, una trombosis arterial, de pequeños vasos o en cualquier órgano en el que pueda ser demostrada. Además de los cuadros trombóticos, desde el consenso de Sapporo de 1998(35), en los 9 criterios de clasificación se incluyeron manifestaciones obstétricas que pueden afectar a cualquiera de los trimestres de gestación: 1. Concatenación de abortos continuados (tres o más) sin otra causa anatómica, hormonal o alteraciones cromosómicas de los progenitores que lo justifiquen antes de la semana 10 de gestación. 2. Pérdida fetal de un bebé sin detección de cromosomopatías después de la semana 10 de gestación. 3. Prematuridad antes de la semana 34 debida a preeclampsia, eclampsia o insuficiencia placentaria. La revisión de los criterios de clasificación no supuso la introducción de nuevos criterios clínicos, pero algunas manifestaciones como la livedo reticularis, la enfermedad valvular cardiaca, trombocitopenia, algunas nefropatías y el deterioro cognitivo fueron reconocidas como entidades asociadas o atribuibles al SAF(3, 36, 37). Además del criterio clínico, para que un paciente sea clasificado como afecto de SAF, debe presentar uno de los criterios de laboratorio. En el consenso de Sapporo se estableció la necesidad de encontrar positivos de forma persistente anticuerpos anti-Cardiolipina (aCL) de isotipo IgG o IgM y anticoagulante lúpico. La revisión de Sídney(3) añadió la positividad de los autoanticuerpos anti-B2GPI IgG e IgM a los ya reconocidos previamente. Los aFL deben ser positivos en un título alto o superior al calculado para el percentil 99 de la población general en la que el paciente se testa, pudiendo presentar uno o más aFL. La persistencia de los autoanticuerpos detectados en al menos dos determinaciones 10 distanciadas temporalmente por 12 semanas, estos es, 6 semanas más que en el consenso de Sapporo, fue instaurada en tales términos debido a la necesidad de descartar elevaciones transitorias de los aFL debidas a infecciones o a crorreactividad de las primeras técnicas de detección con anticuerpos despertados por infecciones. Se entendía, ahora y entonces, que si los autoanticuerpos persistían en ausencia de una clínica infecciosa pasados tres meses, que la producción de los anticuerpos detectados era estable y suficiente como para relacionarse con la clínica trombótica u obstétrica observada. Aunque las técnicas de detección modernas tienen excelentes niveles de sensibilidad y especificidad y no presentan apenas correactividad con otras situaciones clínicas, la necesidad de asegurar la persistencia de los autoanticuerpos ha conseguido llegar hasta nuestros días y mantenerse en la última revisión de los criterios de clasificación dado que se ha observado que un 25% de los pacientes presentan oscilaciones relevantes en el título de anticuerpos(3). Por otro lado, el consenso de Sídney recomienda que entre el evento clínico que suscita el estudio y las indagaciones de laboratorio no exista una distancia mayor a 12 semanas, aunque permite la clasificación de pacientes con una diferencia entre el evento clínico y la positividad de laboratorio hasta de cinco años(3). 11 1.3. PREVALENCIA DEL SÍNDROME La prevalencia e incidencia de SAF real es difícil de estimar debido a que las manifestaciones clínicas que llevarían a interrogar la presencia de aFL no son exclusivas de este Síndrome y comparten diagnóstico diferencial con otras entidades(38). Entre las alteraciones que podrían justificar un evento trombótico adicional o no a la presencia de aFL se reconoce la importancia los siguientes factores: edad mayor a 55 años para hombres y 65 para mujeres, hipertensión arterial, diabetes mellitus, dislipemia, hábito tabáquico, índice de masa corporal mayor a 30kg/m2, microalbuminuria, estado portador de trombofilia hereditaria, utilización de anticonceptivos orales, síndrome nefrótico, malignidad, inmovilización o cirugía previa(3). Además, la diferente metodología de detección con sensibilidad y especificidades distintas podría impactar aún más en el reconocimiento de pacientes afectos de esta enfermedad. Aun considerando condiciones óptimas para la indicación de los estudios y el empleo de una metodología consistente, las características poblacionales con distribución étnica, sexo y edad, pueden hacer variar aún más la epidemiología del SAF. La prevalencia estimada por algunos autores es de 40- 50 por cada 100000 habitantes y una incidencia anual de 5 por cada 100000 habitantes(36, 39). Se ha comunicado la presencia de aFL en el 13% de los pacientes con ictus en cualquier edad, en uno de cada tres en menores de 50 años(40), el 11% de los que han sufrido un infarto de miocardio, en el 9,5%- 20%(40, 41) de las trombosis venosas profundas y en el 6% de las mujeres con morbilidad obstétrica(41). Respecto a este último grupo de patologías, cabe mencionar que la prevalencia indicada incluye estudios que informan acerca de 12 mujeres con abortos, retraso de crecimiento intrauterino, preeclampsia, eclampsia y Síndrome HELLP. Al profundizar aún más en este campo, se reconoce que aproximadamente un 9% de mujeres con abortos recurrentes presenta aFL positivos. Este estudio extrapola la prevalencia encontrada de aFL en las diferentes patologías a la prevalencia general de éstas, realizando un cálculo aproximado que podría ayudar a entender la magnitud de morbilidad que supone el SAF en la población a la que hace referencia, en este caso, estadounidense. Los autores concluyen que cada año sólo en EEUU sería esperable encontrar 50000 casos de abortos relacionados con aFL, 110000 ictus, 100000 infartos de miocardio y 30000 trombosis venosas profundas(41). La prevalencia de las complicaciones mencionadas anteriormente en pacientes diagnosticados de SAF se ha comunicado en un artículo reciente fruto del esfuerzo colaborativo internacional y que ha reclutado 804 pacientes con aFL positivos persistentes. En ellos la prevalencia de trombosis arterial o venosa fue del 71%, siendo las venosas más frecuentes (43%) que las arteriales (37%), y con un 11% de pacientes presentando ambas(42). El mayor conocimiento y concienciación sobre el SAF en la comunidad médica ha llevado a una reducción en la demora diagnóstica desde que un paciente sufre la primera manifestación clínica compatible. Recientemente se ha publicado un artículo que estudia este aspecto, con un tiempo medio de retraso de 1990 a 2000 de 4,7 años y una demora actual desde 2015 de 0,8 años(43). En este estudio resultó llamativo que en pacientes con una demora diagnóstica, 13 presentaron antes del evento trombótico otra manifestación clínica diferente pero asociable a otras enfermedades autoinmunes como artralgias, lesiones cutáneas, trombocitopenia y en menor frecuencia, necrosis ósea de cadera, migrañas y livedo reticularis(43). Por el contrario, los pacientes sin demora diagnóstica no reconocieron otra sintomatología previa al evento trombótico(43). 1.4. SAF SERONEGATIVO Desde la descripción del Síndrome se han reconocido y publicado numerosos casos de pacientes que habiendo padecido las situaciones clínicas contempladas en los criterios clasificatorios y careciendo otra causa que las justifique, presentan negatividad para los cinco aFL incluidos en el último consenso de Sídney(44, 45). Esta situación se ha denominado “SAF seronegativo” y en ella se han tomado dos aproximaciones diferentes y a la vez complementarias: • Una de ellas consiste en el examen de los aFL incluidos en el criterio de clasificación de laboratorio mediante técnicas de detección diferentes(46), al conocerse que la correlación entre diferentes métodos es adecuada no es perfecta(47, 48), pudiendo incurrirse en falsos negativos para un número limitado de pacientes. En un taller de calidad realizado en nuestro laboratorio con participación de otros centros de diagnóstico a nivel nacional con la colaboración de GECLID-SEI, demostramos que esta correlación es baja, con un 63% de muestras identificadas correctamente entre 40 laboratorios(49). 14 • La segunda consiste en demostrar la presencia de aFL extracriterio o extraconsenso. Éstos conforman un grupo cuantioso de autoanticuerpos entre los que destacan los anti-beta-2-glicoproteína-I de isotipo IgA(50), los inmunocomplejos circulantes de anticuerpos anti-beta-2- glicoproteína-I(51), los anti-anexina V(52), los anti-anexina II(53), anti- proteína C(54), los anti-proteína S(55), los anti-protrombina(56), los anti- fosfatidilserina(57), los anti-fosfatidil-etanolamina(58), los anti- fosfatidil-inositol(59), los anti-ácido lisobisfosfatídico(60), los anti- complejo vimentina-cardiolipina(61) y los anti-complejo fosfatidilserina/protrombina (aPS/PT)(62). Desde el congreso mundial de SAF de 2010 celebrado en Galveston, Texas, se recomienda la determinación de los aFL de isotipo IgA en pacientes negativos para los aFL incluidos en los criterios de clasificación(63). La medida de estos anticuerpos ha sido objeto de debate dado que no se ha observado el valor añadido de su determinación en el numeroso grupo de pacientes con lupus eritematoso sistémico(64). No obstante, los aFL de este isotipo, especialmente los que reconocen la B2GPI, se han descrito en relación con todas las formas clínicas conocidas de SAF primario, como trombosis arterial, venosa, ictus y morbilidad obstétrica(50). 15 1.5. LOS ANTICUERPOS ANTI-FOSFATIDILSERINA/PROTROMBINA A finales de la década de 1950 el factor II o protrombina fue objeto de asociación con el factor anticoagulante en pacientes con lupus(65). Desde entonces se han realizado estudios sobre los anticuerpos anti-protrombina en cohortes similares de pacientes pero con una asociación muy débil con las manifestaciones de SAF(66). Los aPS/PT fueron delineados en una comunicación rápida publicada en el año 1991 por Galli y colaboradores(67) en un estudio que demostró que el anticoagulante lúpico no se dirigía únicamente a fosfolípidos sino a un complejo formado por protrombina y lípidos compuesto por un 20% fosfatidilserina y un 80% fosfatidilcolina(67). El anticoagulante lúpico fue así relacionado con anticuerpos que en presencia de calcio, reconocerían un epítopo inicialmente oculto en la protrombina que se expondría tras la unión con este complejo de lípidos(67). La detección de anticuerpos anti-fosfatidilserina/protrombina diferenciada de los anti-protrombina fue publicada por el mismo grupo en 1997(68) y su presencia fue confirmada con las manifestaciones clínicas del SAF por Atsumi, Bertolaccini y Koike en 2000(62). Los anticuerpos aPS/PT se asocian fuertemente con la clínica de SAF y se encuentran habitualmente en pacientes que han presentado trombosis (69, 70), tanto de forma aislada como en asociación con diferentes perfiles de otros aFL. Se han descrito en pacientes positivos para anticoagulante lúpico(62, 71) únicamente (el 49% de los pacientes positivos para AL testado mediante dRVVT resultó positivo para aPS/PT y sólo un 3% de los AL negativos) y por otro, en pacientes también positivos para anticuerpos anti-B2GPI y anti-Cardiolipina(69, 16 72), conformando la denominada “triple corona” y suponiendo un alto riesgo protrombótico. De hecho, en la reunión de Sídney donde se establecieron los últimos criterios de clasificación para SAF, los aPS/PT se mencionan de forma destacada como autoanticuerpos asociados a SAF en los que sería necesario realizar un mayor esfuerzo de investigación, considerando prematura su inclusión en el momento de elaboración del consenso en 2004(3). En concreto el consenso de Sídney estimó que la determinación de los aPS/PT sería conveniente para confirmar la presencia de AL. □ Figura 2: Ilustración de las conformaciones abierta (izquierda) y cerrada (derecha) de la protrombina. Modificado del trabajo de M Chinnaraj y colaboradores(73) En un estudio reciente por el grupo de Vittorio Pengo, se describió cómo a escala molecular los aPS/PT pueden reconocer diferentes configuraciones tridimensionales de la protrombina(73). De forma análoga a lo que ocurre con 17 la B2GPI, la protrombina puede encontrarse en una forma abierta o cerrada. Es una proteína formada por varios dominios: Gla, en el extremo N-terminal, dos dominios con forma anular o “kringle” y un dominio serin-proteasa. La forma cerrada depende de la interacción entre dos residuos de diferentes dominios, el Y93 perteneciente al Kringle-1 y el W547 del dominio proteasa, siendo la predominante en circulación. Fruto de las mutaciones inducidas para estabilizar las conformaciones abierta y cerrada, pudieron identificar dos grupos de aPS/PT en el suero de 24 pacientes positivos también para anti-Cardiolipina y anti- B2GPI. El primer grupo de anticuerpos reconoce un epítopo situado en una región críptica, sólo expuesto cuando la molécula de protrombina se presenta en configuración abierta. El segundo grupo reconoce un epítopo expuesto tanto en la conformación abierta como en la conformación cerrada localizado en el dominio Gla. Los pacientes estudiados se pudieron dividir entre los que presentaban ambos tipos de anticuerpos (grupo B), y los que presentaban sólo anticuerpos frente a los epítopos expuestos únicamente en la configuración abierta (grupo A). En este estudio, los autores analizaron los niveles séricos de protrombina, encontrando niveles normales y concluyendo que los aPS/PT detectados no presentaban capacidad neutralizante. Como debaten en su artículo, la ausencia de capacidad de neutralización es esperable para los anticuerpos que se fijan a la región críptica, sólo expuesta en conformación abierta, dado que la protrombina suele encontrarse en configuración cerrada habitualmente. De forma adicional, valoran el posible efecto biológico que estos dos tipos de anticuerpos pudieran tener. Por un lado, los anticuerpos dirigidos frente a regiones crípticas podrían inducir la acumulación de protrombina en las 18 membranas endoteliales y acelerar así la generación de trombina que junto al aumento de la expresión de factor tisular y selectina-E, induciría un fenotipo protrombótico(74, 75). Por otro lado, los anticuerpos dirigidos frente a epítopos naturalmente expuestos reducirían la cantidad de protrombina sobre las membranas endoteliales, limitando la capacidad de conversión de protrombina en trombina. Aunque han estudiado la asociación de los diferentes grupos de anticuerpos con las características clínicas de los 24 pacientes estudiados, detallaron que no han podido encontrar ninguna estadísticamente significativa. 1.6. MANIFESTACIONES OBSTÉTRICAS EN SAF: ABORTOS RECURRENTES. 1.6.1. DEFINICIÓN Y PREVALENCIA. Los aFL son una de las determinaciones recomendadas en el estudio de pacientes con antecedentes obstétricos adversos como en abortos recurrentes o complicaciones como preeclampsia, fallo de crecimiento intrauterino o muerte neonatal sin una causa atribuible. De hecho, como fue reseñado anteriormente, estas manifestaciones están recogidas en los criterios de clasificación del SAF desde su primera formulación en el congreso de Sapporo(35). La pérdida gestacional se define como la situación en la que el embarazo desaparece antes de que el feto alcance su viabilidad(76). El periodo en el que podrían ocurrir dichas pérdidas abarca desde la concepción hasta la semana 24 de gestación(76). La definición de la recurrencia de los abortos es objeto de debate tanto en el campo de la Obstetricia como en el del SAF 19 para los casos con pérdidas gestacionales inferiores a la semana 10 de amenorrea. La Organización Mundial de la Salud definió los abortos recurrentes como entidad patológica en 1976 cuando se concatenan tres o más pérdidas gestacionales consecutivas hasta la semana 20 de gestación(77). Más recientemente, la Sociedad Europea de Reproducción Asistida y Embriología (ESHRE) actualizó la definición para incluir dos o más pérdidas sin explicación aparente(76), e incluye tanto abortos ocurridos en gestaciones naturales como fruto de la aplicación de técnicas de reproducción asistida. En el campo del SAF el debate también está abierto y los artículos que estiman la prevalencia de los aFL encontrados en mujeres gestantes y su asociación con manifestaciones obstétricas suelen incluir también a pacientes con dos abortos anteriores a la semana 10(78). Para mayor precisión, el último documento de consenso sobre pérdida gestacional recurrente reserva la definición de aborto recurrente para los casos en los que se ha constatado la existencia de una gestación intrauterina(76), por lo que los embarazos bioquímicos y los ectópicos quedarían excluidos. Se estima que el 10% de las parejas en edad reproductiva podrían sufrir alguna forma de infertilidad(79) y entre un 1% y un 5% abortos recurrentes(80). El estudio de posibles causas responsables para esta concatenación de pérdidas gestacionales es de interés dado que el riesgo de padecer un nuevo aborto se incrementa con la edad y con una pérdida previa, desde el 25% para mujeres tras dos abortos, hasta el 40% para 20 mujeres tras tres abortos(81). Esta probabilidad es mayor a la esperada debido al azar, lo que obliga a un estudio de posibles factores que pudieran intervenir en la pérdida gestacional. En alrededor del 50% de los casos se ha llegado a identificar una causa concreta para la recurrencia de los abortos(82). Entre los casos con explicación, un 60% se relaciona con aneuploidías embrionarias(83), que suelen aparecer con más frecuencia en los productos de la concepción de progenitores más añosos(84). □ Figura 3: Diagrama circular con la descripción de las principales etiologías no-inmunomediadas para los abortos recurrentes. No obstante, otras causas pueden tener un papel en la recurrencia de los abortos, como son anomalías anatómicas uterinas como sinequias, pólipos, miomas; de los anejos, como hidrosálpinx, alteraciones tiroideas, trombofilia y factor masculino con alteraciones en el seminograma(85). ANEUPLOIDÍAS Sinequias Uterinas Pólipos y Miomas Uterinos Hidrosálpinx Alteraciones Tiroideas Trombofilia Hereditaria Factor Masculino 21 1.6.2. MANIFESTACIONES OBSTÉTRICAS EN SAF: ABORTOS RECURRENTES. ESTUDIO DE FACTORES INMUNOLÓGICOS Entre los factores inmunitarios, la guía sobre abortos recurrentes de la ESHRE recomienda realizar tipaje HLA de clase II sólo en mujeres escandinavas con infertilidad secundaria tras el nacimiento de un varón(86) y el estudio de anticuerpos anti-nucleares (ANA) para cribado de enfermedades autoinmunes que podrían manifestarse con abortos recurrentes(87). La guía considera que las determinaciones de células NK en sangre o biopsia endometrial no han aportado evidencias suficientes sobre su utilidad en este ámbito(88), así como el estudio de los anticuerpos anti-HLA(89). La guía de abortos recurrentes de la ESHRE incluye la determinación de aFL dentro del epígrafe de estudios de trombofilia. En cuanto a los estudios de trombofilia hereditaria, no recomienda su cribado universal, sino sólo en mujeres que tengan otros factores de riesgo para trombofilia, o en el marco de proyectos de investigación(90). En cambio, sí recomienda el estudio de aFL incluidos en los criterios de Sídney para mujeres que hayan padecido al menos dos abortos, sin necesidad de que tengan un diagnóstico de una enfermedad autoinmune(91). Por último, la guía hace mención a que la positividad en títulos altos de anticuerpos aFL es el único biomarcador inmunológico contemplable para guiar tratamientos inmunomediados, recomendando en mujeres que cumplen los criterios de Sídney(92) iniciar tratamiento con aspirina de 75 a 100mg al día desde antes de la concepción 22 y dosis profilácticas de heparina (no fraccionada o de bajo peso molecular) desde el conocimiento del estado de gestación, como opción más beneficiosa que la abstención terapéutica(76). La guía sólo concede la posibilidad de utilización de tratamiento anticoagulante en mujeres con dos abortos, en el marco de estudios de investigación clínica. Además de la ESHRE, otras sociedades en el campo de la Obstetricia recomiendan el estudio de los aFL en mujeres con recurrencia de abortos, como la American Society of Reproductive Medicine (ASRM), la Royal College of Obstetricians and Gynecologists (RCOG) y la Deutsche Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe e. V. (DGGG). Esta última recomendó en 2018 el estudio adicional de aFL no recogidos en los criterios de clasificación de Sídney en mujeres con abortos recurrentes y otras manifestaciones clínicas(93) como microangiopatía renal, alteraciones neurológicas, manifestaciones cardiacas o úlceras cutáneas. 1.6.3. MANIFESTACIONES OBSTÉTRICAS EN SAF: ABORTOS RECURRENTES. LIMITACIONES DE LOS CRITERIOS DE CLASIFICACIÓN DE SAF VIGENTES Dado que muchas mujeres con abortos recurrentes no reúnen los criterios clasificatorios para SAF descritos en Sídney(92), se han comenzado a realizar esfuerzos para clasificar pacientes en una agrupación clínica denominada como Síndrome anti-Fosfolipídico Obstétrico Extra-Criterio. Esta entidad estaría conformada por mujeres que cumplen los criterios de laboratorio del consenso de Sídney(3) pero que no reúnen los requisitos del 23 criterio clínico como tres abortos consecutivos sin una causa identificada antes de la semana 10 de gestación o preeclampsia tardía(94). También incluye a pacientes con manifestaciones clínicas recogidas en los criterios clínicos marcados en Sídney(92), pero con detección positiva de aFL extracriterio(94). No obstante, existen diferencias clínicas entre mujeres con diagnóstico “canónico” de SAF Obstétrico y estos criterios extendidos recientemente investigados. Gracias al esfuerzo colaborativo internacional plasmado en el registro EUROAPS, se ha descrito que mientras las mujeres con pérdida gestacional y diagnóstico de SAF con manifestaciones obstétricas acorde a los criterios de clasificación de Sídney suelen presentar un aborto posterior a la semana 10 de gestación, una muerte fetal o neonatal más frecuentemente, las mujeres con criterios extendidos presentarían más frecuentemente una mayor concatenación de abortos antes de la semana 10 de gestación(95). De forma adicional, las conclusiones del grupo de trabajo EUROAPS apuntan a que estas diferencias clínicas existentes entre ambos grupos no se traducen en resultados distintos cuando las mujeres reciben tratamiento. Un metaanálisis reciente de Van Dijk y colaboradores(96) estudió la prevalencia de causas conocidas para abortos recurrentes en mujeres con dos pérdidas consecutivas por un lado y tres o más por otro. Recoge datos de tres estudios que datan de 2010 a 2013 y muestra cómo la prevalencia de aFL incluidos en los criterios de clasificación de Sídney no muestra 24 diferencias entre ambos grupos de pacientes, con una horquilla de resultados entre el 13,1%(97) y el 17,4%(98) de las mujeres estudiadas. 1.6.4. MANIFESTACIONES OBSTÉTRICAS EN SAF: ABORTOS RECURRENTES. LA UTILIZACIÓN EMPÍRICA DE TRATAMIENTOS UTILIZADOS EN EL SÍNDROME ANTI-FOSFOLIPÍDICO La utilización de heparina y aspirina para la prevención de abortos recurrentes se comenzó a estudiar para mujeres portadoras de anticuerpos aFL en la década de 1990(99, 100) debido a las trombosis detectadas en los vasos uteroplacentarios y a la observación de infarto en zonas de la placenta(101). Desde entonces ha sido un esquema de tratamiento controvertido debido a las dudas sobre el beneficio de agregar HBPM a un tratamiento basado en aspirina en monoterapia(102). Además, se ha utilizado también de forma empírica en mujeres sin trombofilia detectada. En el momento actual las guías de práctica clínica de las principales sociedades de Obstetricia y Reproducción recomiendan la utilización de HBPM y aspirina desde al menos la prueba positiva de gestación en mujeres con SAF(76, 93), tras observar su seguridad, con un menor riesgo de sangrado que las heparinas no fraccionadas al presentar una menor actividad anti-factor II activado(103) y no cruzar la barrera placentaria(104). Un metaanálisis reciente que engloba resultados de ocho ensayos clínicos con 963 pacientes en las que se utilizó Heparina de Bajo Peso Molecular (HBPM) y 891 en las que no fueron comparadas observándose una reducción significativa del número de abortos y un aumento de nacidos 25 vivos(105). No obstante, los autores no comentaron en profundidad los posibles mecanismos responsables del tratamiento con HBPM sobre el beneficio clínico observado, delineando que estos fármacos podrían inhibir la circulación de aFL, la activación de rutas inflamatorias y la inhibición de trombosis venosa en SAF, citando a otro estudio de Liu y colaboradores(106). 1.6.5. MANIFESTACIONES OBSTÉTRICAS EN SAF: ABORTOS RECURRENTES. FISIOPATOLOGÍA DE LOS ANTICUERPOS ANTI-FOSFOLIPÍDICOS La relación causal entre aFL y abortos y otras morbilidades obstétricas como el retraso del crecimiento intrauterino se comenzaron a reconocer desde que en 1982 De Wolf y colaboradores observaran la presencia de trombosis en placentas de mujeres que habían tenido abortos(101). Posteriormente se realizaron estudios en animales demostrando la patogenicidad de estos anticuerpos. Entre los efectos que explicarían la formación de trombos en este territorio se encuentra la disrupción que los aFL generan sobre la capa anticoagulante de anexina V sobre las células del trofoblasto y endoteliales(15, 107, 108). El efecto neto de la intervención resultaría en un estado procoagulante(107). No obstante, la constatación de que mujeres portadoras de aFL y a habían estado embarazadas no presentaban rastro alguno de trombosis en el estudio anatomopatológico de las placentas, abrió la posibilidad a pensar en otros mecanismos independientes de trombosis para la morbilidad obstétrica asociada a estos anticuerpos. Además del estado protrombótico que pueden generar, se ha 26 investigado cómo los aFL podrían causar un daño tisular directo dependiente de las uniones con las moléculas que reconocen. Entre todos los aFL, los aB2GPI de isotipo IgG ha sido el más utilizado para describir los mecanismos por los cuales los aFL podrían causar las alteraciones obstétricas asociadas al SAF. En el año 2000, Di Simone y colaboradores, describieron por primera vez que el trofoblasto expresa epítopos que pueden ser reconocidos directamente or anticuerpos aB2GPI y algunas de las consecuencias negativas de esa interacción(109). Entre los mecanismos observados, los aFL causarían una disrupción de la capacidad invasiva del trofoblasto sobre tejido materno debido a una expresión y/o actividad reducida de metaloproteasas y de la expresión de integrinas y cadherinas, afectando al proceso de placentación. Además, se ha descrito cómo podrían interferir con la diferenciación del trofoblasto a sincitiotrofoblasto(110), debido a la disminución de la expresión de gonadotropina coriónica(109) y causar una alteración en los mecanismos de angiogénesis. Otros mecanismos descritos se basan en la interacción con los receptores tipo Toll-4 (TLR-4) de la placenta, induciendo un estado proinflamatorio al activar a monocitos y células endoteliales, lo que supondría una infiltración de neutrófilos y el incremento de la síntesis local de TNF-alfa, IL-1Beta e IL- 8. Además, los aFL pueden activar la vía clásica del complemento con depósito de C4d. 27 1.7. MANIFESTACIONES OBSTÉTRICAS EN SAF: FRACASO DE IMPLANTACIÓN RECURRENTE 1.7.1. DEFINICIÓN, CAUSAS Y PREVALENCIA: Entre las patologías del espectro de la infertilidad se encuentra una derivada del fracaso de la aplicación de técnicas de reproducción asistida. La definición de fallo de implantación recurrente aún no está consolidada pero se tiende a aceptar el fracaso en la obtención de embarazo clínico a pesar de cuatro o más embriones transferidos en tres o más transferencias embrionarias para mujeres menores a 40 años(111). Esta definición se basa en la probabilidad observada de implantación de los embriones transferidos, siendo de uno de cada tres. Con estos resultados la probabilidad de ausencia de gestación tras una primera transferencia es de entre el 65 y el 70%. Tras la transferencia de dos embriones, la probabilidad de fracaso de implantación disminuye al 49% y tras cuatro embriones al 24%(111). Las causas para el fallo de implantación recurrente se categorizan en tres grupos, una baja receptividad endometrial, un desarrollo embrionario anormal y un cúmulo de causas multifactoriales. Entre el primer grupo se encuentran anomalías anatómicas uterinas(112), afectación de la cavidad endometrial(113), la presencia de miomas intramurales(114), miomas submucososo, pólipos, septo uterino(115), proliferación de la mucosa endometrial alterada coincidente con la transferencia embrionaria, endometritis, trombofilia hereditaria(116), aFL(117) y otros factores 28 inmunitarios(117, 118). El segundo grupo de causas se refieren a alteraciones en la formación y calidad embrionarias, que se relacionan directamente con la edad de los progenitores(119) e incluyen aneuploidías de los gametos(120) o cultivo embrionario subóptimo(121). La última categoría de factores incluye endometriosis, hidrosálpinx(122), estimulación folicular subóptima, niveles altos de estradiol(123) y transferencias anormales o complicadas(124). 1.7.2. PREVALENCIA DE LOS ANTICUERPOS ANTI-FOSFOLIPÍDICOS EN ESTA ENTIDAD Se ha descrito que los aFL podrían influir negativamente en la fertilidad humana, afectando tanto a procesos preconcepcionales como post- concepcionales como el desarrollo ovocitario, a la migración y desarrollo embrionario en situación preimplantacional(125), en la arquitectura y la receptividad endometrial(126) y la decidualización(127). No obstante, la baja prevalencia de los aFL incluidos en los criterios de clasificación de Sídney en pacientes con fallo de implantación recurrente ha llevado a desaconsejar su determinación rutinaria en esta situación clínica(85). La prevalencia descrita de aFL en fallo de implantación recurrente oscila entre el 5% y el 8% pero la mayor parte de los estudios prospectivos no han relacionado la presencia de los anticuerpos con una menor tasa de embarazo clínico o nacido vivo(128). No obstante, las limitaciones de los estudios que analizan esta asociación son importantes: las poblaciones estudiadas resultan heterogéneas, los estudios son retrospectivos, los 29 puntos de corte no son conformes a los últimos criterios de clasificación o no se confirma la persistencia de los aFL(129). Un estudio reciente identifica sólo los aCL IgG como los aFL que resultan de interés en una cohorte de fracaso de implantación recurrente comparado con una cohorte de mujeres fértiles(130). Este estudio sitúa la prevalencia de los aCL IgG en el 3% de las pacientes(130). Otros grupos han estudiado la presencia de aFL en mujeres infértiles o asociándola al resultado de las transferencias embrionarias, pero no específicamente en pacientes que cumplen la definición de fracaso de implantación recurrente. Otros sí tienen en cuenta la definición pero no comparan este grupo con controles fértiles sino con mujeres con abortos de repetición. En este último caso, la prevalencia de aFL en mujeres con fracaso de implantación recurrente no difirió significativamente con respecto a las mujeres con abortos, presentando una prevalencia de aCL del 4,32%, de aB2GPI del 3,70% y de AL del 0,72%. 1.7.3. MECANISMOS DE ACCIÓN PROPUESTOS DE LOS ANTICUERPOS ANTI- FOSFOLIPÍDICOS EN FRACASO DE IMPLANTACIÓN RECURRENTE Los mecanismos por los cuales los aFL podrían interferir con la implantación y el desarrollo de una gestación clínicamente evidente apuntan más hacia consecuencias deletéreas de la unión de los aFL a los epítopos que reconocen que a la aparición de trombosis. Una de las formas en las que los aFL pudieran relacionarse con el fallo de implantación es gracias a la alteración en el proceso de angiogénesis que resulta clave en la decidualización de la mucosa endometrial(108) y en la diferenciación del 30 trofoblasto. En estudios animales se ha observado que la interacción entre los aFL y las células de la decidua llevaría a necrosis, depósito de IgG, de fibrina(131) y de factores del complemento(132). Más recientemente se ha observado cómo anticuerpos anti-B2GPI sintéticos podrían inducir cambios en el perfil de expresión génica hacia un estado más proinflamatorio que en ausencia de aFL(133). Un estudio reciente agrega un nuevo mecanismo por el que los aFL podrían interferir con el resultado de las técnicas de reproducción asistida y consiste en la alteración de la receptividad endometrial y la llamada ventana de implantación(134). La ventana de implantación se refiere a una situación en la que el embrión tiene la oportunidad de adherirse e invadir la mucosa endometrial e inducir una serie de cambios en las células epiteliales y estromales(135). Este grupo ha estudiado la expresión tisular de varios factores relacionados con la receptividad endometrial y ha encontrado un descenso significativo en la expresión de HOXA10 y el factor inhibidor de leucemia (LIF) en las mujeres con fracaso de implantación positivas para aFL con respecto a las que resultaron negativas en la determinación de aFL(134). LIF es una citoquina reguladora del proceso de implantación y desarrollo embrionario que permite la migración e invasión del trofoblasto en la mucosa endometrial(136) y suele determinarse su expresión tisular para calcular la receptividad endometrial(137). HOXA10 es un factor de transcripción de genes HOX que se expresa preferentemente en el tracto urogenital y de forma muy significativa en la ventana de implantación(134). Este estudio postula que los aFL desplazarían la ventana de implantación impidiendo 31 una correcta interacción entre el endometrio y el embrión, ocasionando el fallo de implantación(134). 32 33 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 2.1. RAZONAMIENTO Y BASES QUE PROPICIAN EL ESTUDIO La baja prevalencia de aFL incluidos en los criterios de clasificación en mujeres sanas sin antecedentes de enfermedades autoinmunes sistémicas diagnosticadas o episodios de trombosis previas y que han presentado alguna forma de fracaso reproductivo, bien como abortos recurrentes o como fracaso de implantación recurrente nos ha llevado a estudiar la posibilidad de que los aPS/PT sean más prevalentes que los aFL incluidos en los últimos criterios de clasificación del SAF en este grupo de pacientes. Así mismo, hemos estudiado la relación de los aPS/PT con los aFL incluidos en los criterios de clasificación y su asociación con las formas de fracaso reproductivo estudiadas. Todo ello sirvió de fundamento para plantear los siguientes: 2.2. HIPÓTESIS 1. La presencia de los aPS/PT, bien isotipo IgG o IgM se asocia con la concatenación de abortos consecutivos tanto antes como después de la semana 10 de gestación. 2. La presencia de aPS/PT, bien de isotipo IgG o IgM se asocia con la entidad definida como fracaso de implantación recurrente. 34 3. Los aPS/PT de isotipo IgG o IgM no se asocian con la presencia de otros aFL en cohortes de mujeres sanas en las que ocurren abortos consecutivos o fracaso de implantación recurrente. 4. Cuando las pacientes identificadas como portadoras de aPS/PT reciben tratamiento dirigido en similar esquema al empleado con otros aFL se observa un beneficio clínico en el número de gestaciones clínicas y recién nacidos vivos. 2.3. OBJETIVOS 1. Definición de un punto de corte para aPS/PT IgG e IgM en la población de mujeres gestantes sanas en nuestro entorno. Incluye los siguientes análisis: A. Definición del punto corte. B. Comparación del rendimiento del punto de corte encontrado con otros posibles, como los sugeridos por el fabricante del test diagnóstico o los calculados a partir de las muestras de las embarazadas que formaban la cohorte de controles sanos. 2. Determinación de la prevalencia de aPS/PT en mujeres gestantes y en pacientes afectas de fracaso reproductivo recurrente en las que se han excluido previamente otras causas. Incluye los siguientes análisis: A. Descripción demográfica del grupo control. 35 B. Descripción demográfica del grupo de pacientes con abortos recurrentes ocurridos antes de la semana 10 de gestación. C. Descripción demográfica del grupo de pacientes con abortos desde la semana 10 de gestación en adelante. D. Descripción demográfica del grupo de pacientes con fracaso de implantación recurrente. E. Estudio de los niveles de aPS/PT en controles sanos y pacientes en la primera determinación. F. Estudio de la prevalencia de aPS/PT en controles sanos y los grupos de pacientes. G. Estudio de la prevalencia de aFL incluidos en los criterios de Sídney en los grupos de pacientes y en controles sanos. Análisis del solapamiento con respecto a aPS/PT. H. Estudio de la evolución de los niveles de aPS/PT en los diferentes grupos de pacientes. 3. Evaluar la asociación de los aPS/PT con las categorías de fracaso reproductivo recurrente estudiadas. Incluye los siguientes análisis: A. Análisis univariante de los aPS/PT en fracaso de implantación recurrente. B. Análisis univariante de los aPS/PT en mujeres con tres o más abortos consecutivos antes de la semana 10 de gestación. 36 C. Análisis univariante de los aPS/PT para pérdidas fetales, con uno o más abortos ocurridos en la semana 10 de gestación o en adelante. D. Análisis univariante de los aPS/PT para dos abortos consecutivos ocurridos con anterioridad a la semana 10 de gestación. 4. Determinar si los aPS/PT se comportan como un factor de riesgo independiente para las categorías de fracaso reproductivo recurrente estudiadas. Incluye los siguientes análisis: A. Análisis univariante de los aFL incluidos en los criterios de clasificación para fracaso de implantación recurrente. B. Análisis Multivariante de aFL incluidos en los criterios de clasificación y los aPS/PT en fracaso de implantación recurrente. C. Análisis univariante de los aFL incluidos en los criterios de clasificación para pacientes con tres o más abortos consecutivos anteriores a la semana 10 de gestación. D. Análisis Multivariante de aFL incluidos en los criterios de clasificación y los aPS/PT en el grupo de pacientes con tres o más abortos consecutivos ocurridos antes de la semana 10 de gestación. E. Análisis univariante de los aFL incluidos en los criterios de clasificación para pérdidas fetales, con uno o más abortos ocurridos en la semana 10 de gestación o en adelante. 37 F. Análisis Multivariante de aFL incluidos en los criterios de clasificación y los aPS/PT en pérdidas fetales, con uno o más abortos desde la semana 10 de gestación en adelante. G. Análisis univariante de los aFL incluidos en los criterios de clasificación para dos abortos consecutivos ocurridos con anterioridad a la semana 10 de gestación. H. Análisis Multivariante de aFL incluidos en los criterios de clasificación y los aPS/PT en dos abortos consecutivos ocurridos con anterioridad a la semana 10 de gestación. I. Prevalencia y análisis univariante de las alteraciones tiroideas y multivariante en conjunto con los aFL estudiados. 5. Observar si las modificaciones realizadas en el tratamiento motivadas por el hallazgo de aPS/PT se traduce en una mejoría clínica. Resultado de las intervenciones terapéuticas realizadas en virtud de los resultados analíticos obtenidos. 38 39 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. CONTROLES SANOS: Los controles sanos fueron mujeres gestantes con muestras de suero extraídas junto al cribado del final del primer trimestre para la determinación de anticuerpos frente a Toxoplasma. Las muestras para el estudio se obtuvieron a partir de sueros conservados a -80ºC en la seroteca de Microbiología. Entre las muestras disponibles se eligieron 410 correspondientes a mujeres que habían dado a luz en el Hospital a bebés que sobrevivieron al menos durante el primer año de vida. Las historias clínicas de estas mujeres fueron consultadas para recoger la prevalencia de gestaciones, abortos, partos, vivos anteriores y posteriores a la fecha de la muestra de suero conservada, si existían diagnósticos de enfermedades autoinmunes o tratamientos inmunomoduladores, las semanas de gestación en la que ocurrió el parto del embarazo con la muestra estudiada, la forma del parto o la presencia de complicaciones obstétricas asociadas. El algoritmo de decisiones y el número de controles incluidas y excluidas se ilustra en la Figura 4. 40 □ Figura 4: Algoritmo de decisiones para la inclusión y exclusión de controles sanos para este estudio. 3.2. PACIENTES: 3.2.1. DERIVACIÓN PARA ESTUDIO Se realizó un protocolo específico para estudio de factores inmunitarios en mujeres con abortos recurrentes y fracaso de implantación recurrente en seguimiento en la Unidad de Reproducción del Hospital Universitario 12 de Octubre y que incluía aquellas pacientes con dos o más abortos consecutivos en primer trimestre y para el grupo de fracaso de implantación, aquellas mujeres que no hubieran quedado embarazadas tras dos o más transferencias de embriones grado 1 o 2. A las pacientes que cumplían estos criterios de inclusión se las derivaba para estudios avanzados consistentes en histerosalpingografía, estudios genéticos 41 (cariotipo) de la paciente y la pareja, estudio de trombofilias hereditarias en Hematología y estudio de factores inmunitarios en Inmunología. 3.2.2. DURACIÓN DEL SEGUIMIENTO Y PUNTOS DE ESTUDIO ANALÍTICO Los controles tuvieron un seguimiento clínico ciego con una extensión igual al tiempo en el que se estuvieron incluyendo y estudiando pacientes. Este seguimiento resultó finalmente ser de tres años. Se anotó la presencia de nuevos eventos obstétricos tales como embarazos, abortos, preeclampsia, prematuridad y muertes perinatales. Sólo se estudió, salvo en casos concretos tras solicitud fundamentada por alguno de los especialistas que les asistieron durante este periodo, una única muestra de suero, que fue extraída junto con el cribado serológico realizado para la consulta de revisión alrededor de la semana 10-12 de gestación. Las pacientes tuvieron un seguimiento clínico durante todo el tiempo en el que fueron asistidas en la Unidad de Reproducción o en Inmunología Clínica, que osciló entre 5 meses y 4 años. 3.2.3. ABORTOS DE REPETICIÓN: Se definió como criterio de inclusión a dos grupos de pacientes con abortos. Por un lado, a mujeres con dos o más abortos consecutivos anteriores a la semana 10 de amenorrea y por otro a mujeres con una o más pérdidas fetales ocurridas desde la semana 10 en adelante en ausencia de alteraciones morfológicas o cromosomopatías. 42 3.2.4. FRACASO DE IMPLANTACIÓN RECURRENTE: Se incluyeron pacientes con ausencia de gestación clínica evidenciada mediante ausencia de saco gestacional en ecografía o ausencia elevación de betaHCG en sangre tras tres transferencias embrionarias de al menos cuatro embriones de adecuada calidad. Las pacientes afectas de fracaso de implantación se subdividieron para la descripción demográfica del grupo y para algunos resultados en: 1. Fracaso de implantación primario, cuando nunca habían quedado embarazadas. 2. Fracaso de implantación secundario, cuando la situación de fracaso de implantación es posterior a al menos una gestación con el desenlace que fuere. 3. Fracaso reproductivo mixto, cuando las pacientes cumplieron criterios de fracaso de implantación pero que fueron derivadas para estudio tras un aborto. 3.3. ESTUDIO DE ANTICUERPOS ANTI-FOSFOLIPÍDICOS INCLUÍDOS EN LOS CRITERIOS DE CLASIFICACIÓN 3.3.1. Anti-Cardiolipina IgG e IgM y anti-Beta-2-Glicoproteína-I IgG, IgM e IgA Los anticuerpos aCL y aB2GPI de isotipos IgG, IgM e IgA fueron estudiados en suero de la analítica extraída tras la primera valoración en consulta mediante los aparatos Bio-Plex 2200 (Bio-Rad, Hercules, California, EEUU). Los puntos de corte se establecieron según cálculo realizado con una 43 cohorte de donantes de sangre de nuestra población de referencia y se fijaron en 18UI/mL. 3.3.2. El anticoagulante lúpico se determinó en sangre mediante dos técnicas en paralelo, HemosIL dRVVT, con punto de corte en ratio 1,20 y HemosIL Silica Clotting Time, con punto de corte en ratio 1,30 (Instrumentation Laboratory SpA, Milán, Italia) en momentos en los que las pacientes no estaban recibiendo tratamiento anticoagulante ni antiagregante. 3.4. ESTUDIO DE ANTICUERPOS ANTI-FOSFATIDILSERINA/PROTROMBINA Los aPS/PT IgG e IgM fueron estudiados en suero mediante la prueba comercial QUANTA Lite ELISA (INOVA DIAGNOSTICS, San Diego, California, EEUU) con aplicación de los puntos de corte calculados previamente en una cohorte de 219 donantes de sangre sin patologías conocidas, resultando en 30UI/mL para el isotipo IgG y 40UI/mL para el isotipo IgM(6). Estos puntos de corte fueron obtenidos tras la exclusión de valores extremos (“outliers”) tras la aplicación del método de bloqueo y el cálculo del percentil 99. De forma adicional, estos puntos de corte, de aplicación general para aPS/PT IgG e IgM en nuestro laboratorio, fueron comparados utilizando los datos de controles y pacientes en este estudio con los recomendados por el fabricante y por los personalizados, calculados siguiendo el mismo procedimiento que el empleado para definir el punto de corte para los donantes de sangre (exclusión de valores extremos (“outliers”) y cálculo de percentil 99) pero sobre los resultados obtenidos en las controles sanas embarazadas. 44 3.5. ESTUDIO DE OTROS AUTOANTICUERPOS NO ÓRGANO-ESPECÍFICOS Se estudió en todas las pacientes al menos en una ocasión la presencia en suero de los siguientes anticuerpos frente a antígenos extraíbles del núcleo (ENAs): anti-Ro, anti-La, anti-dsDNA, anti-Sm, anti-RNP, anti-Jo1, anti-Cromatina, anti- Scl70, anti-Ribosomal y anti-centrómero-B mediante la plataforma Bio-Plex 2200 (Bio-Rad, Hercules, California, EEUU). 3.6. ESTUDIO DE OTROS AUTOANTICUERPOS ÓRGANO-ESPECÍFICOS Se recogieron datos sobre la presencia de anticuerpos anti-tiroideos anti- tiroglobulina y anti-microsomales (TPO) en suero a partir del software de Historia Clínica Electrónica del Hospital. 45 4. RESULTADOS 4.1.1. Análisis 1A. Definición de un punto de corte para dar como positivos valores de aPS/PT IgG e IgM en las pacientes y las controles de este estudio. Los puntos de corte utilizados para la determinación de aPS/PT IgG (30UI/mL) e IgM (40UI/mL) fueron los calculados en un estudio interno en el que se incluyeron 219 donantes de sangre con muestras extraídas en 2017 y compuesto por hombres y mujeres mayores de edad, sin patologías protrombóticas previas conocidas. Los resultados de dicho estudio fueron ampliados posteriormente siguiendo la misma metodología para el cálculo de los putos de corte en un estudio con una cohorte mayor de controles (n=718) con similares resultados(6). Estos puntos de corte fueron validados comparando la mediana de los títulos de los donantes de sangre del estudio previo con los resultados obtenidos en los controles sanos del estudio actual. Para conocer si las poblaciones de donantes de sangre con las que se calcularon los puntos de corte para aPS/PT IgG e IgM son comparables para la determinación de estos autoanticuerpos con nuestra población de controles sanas constituida por mujeres embarazadas, se utilizó el test de la U de Mann-Whitney. 46 Controles Sanas Embarazadas Controles Sanos Donantes de Sangre Controles Sanas Embarazadas Controles Sanos Donantes de Sangre aPS/PT IgG aPS/PT IgM Muestra 410 219 410 219 Valor Mínimo 3 4,18 4,64 0 Valor Máximo 50,5 46,6 47,7 60 Mediana 7,4 8,03 11,95 13,8 IC 95% para la mediana 7,22-7,68 7,70-8,37 11,50-12,70 12,70-15,19 Rango intercuartílico 5,60-9,92 6,39-10,90 9,28-17 9,88-20,82 Valor P 0,002 0,001 □ Tabla 1: diferencias para valores de aPS/PT IgG e IgM entre controles sanas embarazadas y controles sanos donantes de sangre. □ Figura 5: Gráfico de cajas y bigotes para valores de aPS/PT IgG entre controles sanas embarazadas y controles sanos donantes de sangre. Como puede apreciarse en las figuras 5 y 6, la mediana de los títulos de aPS/PT IgG para las controles sanas fue de 7,40 (IC 95%: 7,22-7,68UI/mL) y para IgM de 11,95 (IC 95%: 11,50-12,70UI/mL), resultando en diferencias 47 estadísticamente significativas entre embarazadas sanas y donantes de sangre pero clínicamente poco relevantes. Tras aplicación del test estadístico de Kolmogorov-Smirnov se observó que tanto los títulos de aPS/PT IgG como los de aPS/PT IgM de las controles sanas embarazadas no presentaban una distribución acorde con la normalidad, con una D=0,192 para IgG y una D=142 para IgM. □ Figura 6: Gráfico de cajas y bigotes para valores de aPS/PT IgM entre controles sanas embarazadas y controles sanos donantes de sangre Tomando en consideración los resultados de aPS/PT IgG de nuestras 410 controles sanas, se calculó el percentil 99 bruto de los resultados de esta población, hallando un valor de 42,4UI/mL (IC 95%: 28,3-49UI/mL). Para IgM el percentil 99 bruto fue de 42,5UI/mL (IC 95%: 37,8-47,5UI/mL). 48 De forma similar al cálculo utilizado para el establecimiento de los puntos de corte para aPS/PT IgG e IgM en el estudio previo con 219 donantes de sangre, los percentiles 99 brutos fueron recalculados tras la aplicación del método de bloqueo(138, 139), que toma en consideración las diferentes agrupaciones de resultados extremos para refinar el cálculo del punto de corte. Como resultado de este procedimiento, el grupo de resultados superior o igual a 41,9UI/mL para aPS/PT IgG fue excluido del análisis para el cálculo del punto de corte. Una vez aplicada esta exclusión, los cinco mayores registros fueron omitidos y el percentil 99 personalizado fue recalculado en 27,25UI/mL (IC 95%: 23,23-33,27UI/mL). Dado que el resultado fue próximo al definido de 30UI/mL para aPS/PT IgG elegido en nuestro laboratorio para donantes de sangre, decidimos proseguir con este último para este estudio. En cuanto al isotipo IgM, se siguió el mismo procedimiento y se excluyeron los 4 registros iguales o superiores a 45,4UI/mL, con un percentil 99 personalizado recalculado en 37,8UI/mL (IC 95%: 32,2-40,4UI/mL). Dado que el resultado fue próximo al definido de 40UI/mL para aPS/PT IgM elegido en nuestro laboratorio para donantes de sangre, decidimos proseguir con este último para este estudio. 4.1.2. Análisis 1B. Comparación del rendimiento del punto de corte encontrado con otros posibles, como los sugeridos por el fabricante del test diagnóstico 49 o los calculados a partir de las muestras de las embarazadas que formaban la cohorte de controles sanos. □ Figura 7: Curva ROC para aPS/PT IgG (izquierda) y aPS/PT IgM (derecha) para definir punto de corte Utilizando los datos obtenidos con las determinaciones de aPS/PT IgG y aPS/PT IgM para pacientes y controles sanas embarazadas, se construyeron diversas curvas ROC (Receiver Operating Characteristic o Característica Operativa del Receptor) para aPS/PT IgG e IgM y se comparó el rendimiento en cuanto sensibilidad, especificidad e índice de verosimilitud para los puntos de corte estudiados para cada isotipo: el personalizado, fruto del cálculo del percentil 99 tras la aplicación del método de bloqueo para la exclusión de valores extremos (“outliers”), el elegido en nuestro laboratorio a partir de donantes de sangre y el definido por el fabricante. 50 Para aPS/PT IgG el resultado del cálculo del área bajo la curva (Area under the curve, AUC) fue de 0,61, con una sensibilidad para el percentil 99 personalizado de 8,50% (IC 95%: 4,16-14,1), una especificidad de 97,8% (IC 95%: 95,9-99) y un índice de verosimilitud de 3,87 (IC 95%: 1,7-8,9), En cambio, el punto de corte de 30UI/mL elegido en el estudio con los donantes de sangre obtuvo una sensibilidad del 6,54% (IC 95%: 3,2-11,7), una especificidad del 98,3% (IC 95%: 96,5-99,3) y un índice de verosimilitud de 3,83 (IC 95%: 1,5-9,9). □ Tabla 2: Rendimiento de los diferentes puntos de corte estudiados. IVP significa índice de verosimilitud positiva e IVN índice de verosimilitud negativa. Los valores correspondientes al punto de corte elegido para este estudio se muestran en negrita. De forma análoga se realizó el mismo procedimiento para aPS/PT IgM, con resultado de AUC de 0,624 y una sensibilidad para el percentil 99 personalizado de 13,1% (IC 95%: 8,2-19,5%), una especificidad de 98,1% (IC 95%: 96,2-99,2%) y un índice de verosimilitud de 6,7 (IC 95%: 3-14,9). El punto de corte de 40UI/mL elegido en el estudio realizado con los donantes Punto de Corte Personalizado Coincidente con Donantes de Sangre Fabricante p99 sin exclusión de outliers aPS/PT IgG Criterio ≥27,25 ≥30 ≥30 ≥42,4 Sensibilidad (IC 95%) 8,5 (4,6 - 14,1) 6,54 (3,2 - 11,7) 6,54 (3,2 - 11,7) 3,27 (1,1 - 7,5) Especificidad (IC 95%) 97,8 (95,9 - 99,0) 98,29 (96,5 - 99,3) 98,29 (96,5 - 99,3) 99,02 (97,5 - 99,7) IVP (IC 95%) 3,87 (1,7 - 8,9) 3,83 (1,5 - 9,9) 3,83 (1,5 - 9,9) 3,35 (0,9 - 12,3) IVN (IC 95%) 0,94 (0,9 - 1,0) 0,95 (0,9 - 1,0) 0,95 (0,9 - 1,0) 0,98 (0,9 - 1,0) aPS/PT IgM Criterio ≥37,8 ≥40 ≥30 ≥42,5 Sensibilidad (IC 95%) 13,07 (8,2 - 19,5) 9,8 (5,6 - 15,7) 20,26 9,15 (5,1 - 14,9) Especificidad (IC 95%) 98,05 (96,2 - 99,2) 98,78 (97,2 - 99,6) 96,1 (93,7 - 97,8) 99,02 (97,5 - 99,7) IVP (IC 95%) 6,7 (3,0 - 14,9) 8,04 (3,0 - 21,7) 5,19 (2,9 - 9,2) 9,38 (3,1 - 28,1) IVN (IC 95%) 0,89 (0,8 - 0,9) 0,91 (0,9 - 1,0) 0,83 (0,8 - 0,9) 0,92 (0,9 - 1,0) 51 de sangre obtuvo una sensibilidad del 9,8% (IC 95%: 5,6-15,7), una especificidad del 98,78% (IC 95%: 97,2-99,6) y un índice de verosimilitud de 8,94 (IC 95%: 3-21,7), por lo que se estableció el punto de corte en nuestro estudio para aPS/PT IgM en 40UI/mL. 4.1.3. Análisis 2A. Descripción demográfica del grupo control. Como puede observarse en la Tabla 3, el grupo de controles de este estudio constituido por 410 embarazadas sanas, presentó una mediana de edad de 31 años (IC 95%: 30-32), con un resultado para el test de Kolmogorov- Smirnov de D=0,685, resultante en una distribución que no siguió la normalidad. La población se constituyó con un 48,4% de embarazadas de raza caucásica, un 27,7% hispanoamericana, un 8,7% china Han, un 7,1% árabe/bereber, un 3,9% romaní, un 2,3% guineana y un 1,5% india. La mediana para el índice de masa corporal (IMC) calculada en la población control fue de 27,1 (IC 95%: 24,6-31,5) con un peso normal en el 39,7% del grupo, sobrepeso en otro 39,7% y obesidad en el 20,6% de las participantes. La prevalencia de alcoholismo fue del 10,3% y de hábito tabáquico del 3,1%. 52 □ Tabla 3: descripción demográfica del grupo de controles sanos La mediana de semanas de gestación en la que ocurrió el parto o alumbramiento durante el embarazo en el que fue extraída la sangre objeto ESTUDIADO EN MEDIANA IC 95% FACTOR PRESENTE EN OBSERVACIONES D EM O G R Á FI C O S EDAD 410 31 30,0-32,0 - ETNIA/PROCEDENCIA 126 CAUCÁSICA: 61 (48,4%), HISPANOAMERICANA: 35 (27,7%), ÁRABE/BEREBER: 9 (7,1%), CHINA: 11 (8,7%), ROMANÍ: 5 (3,9%), INDIA: 2 (1,5%), GUINEANA: 3 (2,3%) GESTACIONES 410 2 2,0-2,0 410 (100%) ABORTOS (AB) PREVIOS O POSTERIORES 410 0 0,0-0,0 127 (30,9%) 1 AB: 100 (24,3%), 2 AB: 17 (4,1%), 3 AB: 6 (1,4%), 4 AB: 1 (0,2%), 5 AB: 3 (0,7%) VIVOS TOTALES 410 2 2,0-2,0 410 (100%) IVE 410 0 0,0-0,0 79 (19,2%) ALTURA 126 161 160,0-163,0 PESO 126 71,5 68,5-75,0 IMC 126 27,066 26,3-28,1 FA C TO R ES D E R IE SG O OBESIDAD 126 0 0,0-0,0 40 (31,7%) SOBREPESO 126 1 1,0-1,0 90 (71,4%) GRADO 1: 50 (55,5%), GRADO 2: 26 (28,8%), GRADO 3: 14 (15,5%) TABAQUISMO 126 0 0,0-0,0 13 (11,5%) ALCOHOLISMO 126 0 0,0-0,0 4 (3,2%) AUTOINMUNIDAD TIROIDEA 196 0 0,0-0,0 36 (18,5%) HIPOTIROIDISMO 194 1 0,0-1,0 108 (55,6%) HIPOTIROIDISMO AUTOINMUNE 34 19 (55,8%) D A TO S G ES TA C IÓ N E ST U D IA D A OBTENCIÓN GESTACIÓN NATURAL OBTENCIÓN GESTACIÓN FIV 408 0 0,0-0,0 14 (3,4%) PARTO ESPONTÁNEO 410 322 (78,5%) PARTO INDUCIDO 410 32 (7,8%) PARTO POR CESÁREA 410 56 (13,6%) 53 de estudio fue de 39 semanas (IC 95%: 39-39), con 322 partos espontáneos (78,5%), 56 mediante cesárea (13,6%) y 32 inducidos (7,8%). Se observó la historia obstétrica anterior y posterior a la gestación con muestra analítica estudiada, con una mediana de gestaciones resultante en 2 y oscilando entre un embarazo como mínimo hasta 9 embarazos como valor máximo. El número acumulado de gestaciones para este grupo de mujeres fue de 1047. La mediana de abortos fue de 0 (IC 95%: 0-0), aunque fueron observados en 127 mujeres (30,9%). De las 127 con abortos informados, 92 (22,4%) los padecieron en primer trimestre, 4 (0,9%) en el segundo trimestre, 3 (0,7%) en el tercer trimestre y 2 (0,4%) informaron muertes neonatales. De las 92 controles con abortos en primer trimestre, sólo 13 (14,1% de las mujeres con abortos en primer trimestre o 3,1% del total) informaron haber padecido dos o más abortos consecutivos antes de la semana 12 de gestación. En la gestación estudiada, 9 (2,1%) informaron haber padecido preeclampsia y 4 (0,9%) crecimiento intrauterino retardado. El número acumulado de partos con recién nacido vivo en este grupo poblacional fue de 734, con una mediana de 2 por cada mujer (IC 95%: 2-2) y oscilando entre 1 como el valor mínimo y 6 como el valor máximo. 216 (52,6%) de las mujeres que integraron este grupo control ya habían tenido una gestación con alumbramiento de un bebé de forma previa a la 54 gestación en la que la analítica fue extraída. 49 (11,9%) tuvieron otra gestación con posterioridad a la estudiada. 4.1.4. Análisis 2B. Descripción demográfica del grupo de pacientes con abortos recurrentes ocurridos antes de la semana 10 de gestación. DOS ABORTOS S10 PACIENTES INCLUIDAS 32 55 29 MEDIANA (IC 95%) MEDIANA (IC 95%) MEDIANA (IC 95%) EDAD 36 (34-37) 37 (35-38) 36 (31-39) ALTURA 160 (156,1-163) 163 (160,8-165) 163 (158-164) PESO 63,2 (59,1-69,8) 63,5 (61,2-70) 65,1 (62,2-70,7) IMC 24,9 (22,4-27,2) 24,2 (22,6-24,8) 24,9 (23,7-27,1) GESTACIONES 3 (2-3) 4 (3-4) 3 (2-4) SEMANA ABORTOS 7,5 (6,9-8) 8 (7,2-8) 17,5 (14,8-24,2) ABORTOS 2 (2-2) 3 (3-3,2) 1 (1-2,2) VIVOS 0 (0-1) 0 (0-0) 1 (0-1) PREVALENCIA (%) PREVALENCIA (%) PREVALENCIA (%) ALCOHOLISMO 0 (0%) 1 (1,8%) 0 (0%) TABAQUISMO 1 (3,1%) 3 (5,4%) 2 (6,8%) OBESIDAD 4 (12,5%) 10 (18,1%) 5 (17,2%) SOBREPESO 10 (31,2%) 9 (16,3%) 9 (31%) S: semana de gestación en la que ocurrieron los abortos □ Tabla 4: descripción demográfica grupos de pacientes El grupo de pacientes con abortos consecutivos antes de la semana 10 de gestación se compone de 87 mujeres. Se subdivide en dos grandes grupos: Un primer grupo que reúne a aquellas pacientes que cumplirían el criterio clínico para clasificación de SAF consistente en tres o más abortos consecutivos(3) (55 pacientes). 55 □ Figura 8: Gráfico de cajas y bigotes mostrando la mediana y distribución de abortos de las 55 pacientes pertenecientes al grupo de tres o más abortos consecutivos anteriores a la semana 10 de gestación. Otro segundo en el que agrupamos a pacientes que han tenido dos abortos consecutivos sin otra causa que lo explicara (32 pacientes). En el primer grupo de pacientes con al menos tres abortos consecutivos anteriores a la semana 10 de gestación, encontramos mujeres que han tenido abortos ocurridos tanto antes de la semana 10 como después, aunque predominantemente anteriores a ese dintel marcado por el último criterio de clasificación(3). De esta forma, 45 (81,8%) pacientes tuvieron tres o más abortos consecutivos todos anteriores a la semana 10 y 10 (18,2%) tuvieron tres o más abortos consecutivos, predominantemente anteriores a la semana 10 pero también 56 alguno sobrepasado este tiempo de amenorrea. La mediana de las edades de las 45 pacientes con tres o más abortos consecutivos y todos anteriores a la semana 10 de embarazo fue de 37 años (IC 95%: 34-38,5) y la mediana de las que tuvieron tres abortos consecutivos pero alguno también posterior a la semana 10 fue de 36 años (IC 95%: 35-38,5), sin resultar en diferencia significativas al comparar las medianas mediante el test estadístico de U de Mann- Whitney (p=0,878). La mayor parte de las pacientes con tres o más abortos consecutivos, tanto exclusivamente antes de la semana 10 como preferentemente antes de esa semana tuvieron gestaciones obtenidas de forma natural con una mediana de transferencias FIV de 0 (IC 95%: 0-0). La mediana de las semanas en las que ocurrieron los abortos en el primer subgrupo constituido por mujeres con tres o más abortos consecutivos todos anteriores a la semana 10 fue de 8 semanas (IC 95%: 6,8-8). La mediana semanas en las que ocurrieron los abortos en las pacientes que tuvieron tres o más abortos mayoritariamente antes de la semana 10 pero alguno posterior aislado fue de 8,25 (IC 95%: 6,8-9,1). Como la distribución de ambos resultados no seguía la normalidad, fueron comparados con el test estadístico de U-Mann-Whitney con resultado de p=0,138, no señalando diferencias significativas. 57 Entre las 32 pacientes que conforman el segundo gran grupo de pacientes dentro de esta categoría y que padecieron dos abortos consecutivos, y que por tanto, no cumplirían el criterio clínico de clasificación de Sídney(3), 30 (93,7%) tuvieron dos abortos consecutivos anteriores a la semana 10 y 2 (6,3%) tuvieron un aborto anterior y otro a partir de la semana 10 en adelante. La mediana de edades a la fecha de inclusión en este estudio para las pacientes con dos abortos todos anteriores a la semana 10 de gestación fue de 36 años (IC 95%: 34-37) y la de las dos pacientes que tuvieron dos abortos, uno anterior y otro posterior a la semana 10 fue de 36,5 (extremos: 35-38), sin resultar en diferencias significativas al compararlas con el test estadístico de U de Mann-Whitney (p=0,696). Las pacientes con dos abortos consecutivos todos anteriores a la semana 10 contaban una mediana de 3 embarazos (IC 95%: 2-3) y de 2 abortos (IC 95%: 2-2); resultando similar a las pacientes con dos abortos consecutivos, uno anterior y otro posterior a la semana 10, con una mediana de 3 embarazos (extremos: 3-3) y una mediana de 2 abortos (extremos: 2-2), sin resultar en diferencias significativas al compararlos con el test estadístico de U de Mann-Whitney, p=0,458 para las gestaciones y p=0,852 para el número total de abortos. 58 □ Figura 9: Gráfico de cajas y bigotes mostrando la mediana y distribución de abortos de las 32 pacientes pertenecientes al grupo de dos abortos consecutivos anteriores a la semana 10 de gestación. La mediana de las semanas en las que ocurrieron los abortos en el primer subgrupo con dos abortos consecutivos anteriores a la semana 10 fue de 7,5 (IC 95%: 6,5-8) y la de las pacientes con dos abortos, uno ocurrido antes y otro igual o posterior a la semana 10 fue de 9, sin diferencias significativas (p=0,061) al compararlas con el test de U de Mann-Withney. 4.1.5. Análisis 2C. Descripción demográfica del grupo de pacientes con abortos desde la semana 10 de gestación en adelante. 59 □ Figura 10: Gráfico de cajas y bigotes mostrando la mediana y distribución de abortos de las 29 pacientes pertenecientes al grupo de uno o más abortos desde la la semana 10 de gestación. En la categoría de pacientes con abortos a partir de la semana 10 incluimos un total de 29 mujeres, 20 de ellas (68,9%) habiendo padecido uno o más abortos únicamente a partir de la semana 10 de amenorrea y 9 (31,1%) que habían padecido al menos dos abortos, uno de ellos anterior a la semana 10, pero predominantemente posteriores a dicha semana de gestación. Las pacientes del primer subgrupo con pérdidas fetales exclusivamente a partir de la semana 10 tenían una mediana de edad al momento de su inclusión en el estudio de 34 años (IC 95%: 25,5-39) y las que tuvieron abortos preferentemente más allá de la semana 10 pero alguno aislado previo, fue de 38 años (IC 95%: 31,2-39,7), sin resultar en diferencias 60 significativas cuando fueron comparados utilizando el test estadístico de U de Mann-Whitney (p=0,395). Las mujeres con abortos exclusivamente a partir de la semana 10 contaban una mediana de gestaciones de 3 (IC 95%: 2-4) y de 1 aborto (IC 95%: 1-2). Las pacientes que tuvieron algún aborto anterior a la semana 10 aislado contaban una mediana de embarazos de 4 (IC 95%: 2-4,8) y de abortos de 2 (IC 95%: 1,1-4), sin resultar en diferencias significativas al compararlas mediante la U de Mann-Whitney para el número de embarazos (p=0,316) y ligeramente por encima del valor de significación para el número de abortos (p=0,051). En estos dos subgrupos dentro de la categoría de abortos a partir de la semana 10 de gestación, prácticamente todas las gestaciones fueron obtenidas de forma natural, con una mediana de transferencias de 0 (IC 95%: 0-0) y de embriones transferidos de 0 (IC 95%: 0-0). Los extremos para el número de transferencias y embriones transferidos en el subgrupo de pérdidas fetales a partir de la semana 10 exclusivamente fueron 0-2. Los extremos para el número de transferencias FIV realizadas para el subgrupo de abortos anteriores o posteriores a la semana 10, pero mayoritariamente posteriores fueron 0-1 y de 0-2 para el número de embriones transferidos. La mediana del tiempo de amenorrea en la que ocurrieron los abortos en el primer subgrupo de pacientes con únicamente abortos posteriores a la semana 10 fue de 19,5 semanas (IC 95%: 15,1-26) y la de las mujeres con 61 abortos predominantemente a partir de la semana 10 en adelante pero alguno aislado previo fue de 15 semanas (IC 95%: 11,2-23,4). La comparación de las medianas de ambos subgrupos se realizó mediante el test estadístico de U de Mann-Whitney con resultado de ausencia de diferencias significativas (p=0,131). 4.1.6. Análisis 2D. Descripción demográfica del grupo de pacientes con fracaso de implantación recurrente. En esta categoría de pacientes con fracaso de implantación recurrente incluimos 37 pacientes, que estratificamos en tres subgrupos para describir mejor esta cohorte en función de su historia clínica. El primer subgrupo se compone de 23 (62,1%) pacientes que tras al menos tres transferencias y cuatro embriones transferidos, no han obtenido gestación ni la han tenido con anterioridad (fracaso de implantación primario). El segundo subgrupo incluye 8 (21,6%) pacientes que cumplieron criterios para ser consideradas como afectadas de fracaso de implantación recurrente, pero tras haber tenido al menos una gestación previa, con desenlace exitoso o no (fracaso de implantación secundario). 62 FRACASO DE IMPLANTACIÓN PRIMARIO FRACASO DE IMPLANTACIÓN SECUNDARIO FRACASO REPRODUCTIVO MIXTO TODAS PACIENTES INCLUIDAS 23 8 6 37 MEDIANA EDAD (IC 95%) 36 (34,3-38,6) 34 (32,6-37,1) 35,5 (31-39,6) 36 (34-37) EDAD MÍNIMA 32 31 31 31 EDAD MÁXIMA 43 38 40 43 MEDIANA GESTACIONES (IC 95%) 0 (0-0) 1 (1-2,1) 1 (1-1) 0 (0-1) MEDIANA VIVOS (IC 95%) 0 (0-0) 0 (0-0,2) 0 (0-0) 0 (0-0) MEDIANA ABORTOS (IC 95%) 0 (0-0) 1 (0,8-1) 1 (1-1) 0 (0-0,9) MEDIANA SEMANAS ABORTOS (IC 95%) 0 (0-0) 6 (4,8-13,5) 9 (5,5-9) 0 (0-4,6) CICLOS FIV (IC 95%) 3 (2-3) 3 (2-4) 2,5 (2-3) 3 (2-3) TRANSFERENCIAS TOTALES (IC 95%) 4 (4-5) 5 (3,8-7,3) 4 (3-9) 4 (4-5) TRANSFERENCIAS EN FRESCO (IC 95%) 1 (0-3) 1 (0-2) 0 (0-0) 1 (0-2) TRANSFERENCIAS CRIOPRESERVADOS (IC 95%) 3,5 (1-4,5) 4 (1-7,5) 1 (1-1) 3,5 (1-4) EMBRIONES TRANSFERIDOS (IC 95%) 7 (5-8) 8 (5,8-11,9) 4,5 (4-9) 7 (5-8) EMBRIONES TRANSFERIDOS EN FRESCO (IC 95%) 1,5 (0-4,1) 2 (0-4) 2 (2-2) 2 (0-3,6) EMBRIONES CRIOPRESERVADOS TRANSFERIDOS (IC 95%) 5 (1-8,1) 7 (1,4-12,5) 2 (2-2) 5,5 (2-8) MEDIA GRADOS EMBRIONES TRANSFERIDOS EN FRESCO (IC 95%) 2 (1-2,7) 2 (2-2) 1,3 (1,3-1,3) 1,8 (1-2,1) MEDIANA DÍAS DE CULTIVO (IC 95%) 3 (2,3-3) 2 (1,8-3) 3 (ND) 2,8 (2,1-3) □ Tabla 5: descripción del grupo de pacientes con fracaso de implantación recurrente El tercer subgrupo considera 6 (16,2%) pacientes que cumplieron criterios de fracaso de implantación pero que fueron derivadas para estudio tras un aborto (fracaso reproductivo mixto), habiendo sido estudiadas por fracaso de implantación recurrente o abortos en la Unidad de Reproducción de nuestro centro. La edad de las pacientes con fracaso de implantación primario tuvo una mediana de 36 años (IC 95%: 34-38). La mediana de edad de pacientes con fracaso de implantación secundario fue de 34 años (IC 95%: 32,6-37,1) y la 63 de mujeres con fracaso reproductivo mixto fue de 35 años (IC 95%: 31-39). Las edades de las pacientes de los tres grupos comparados entre sí no arrojaron diferencias significativas utilizando la prueba estadística de U de Mann-Withney. El valor de significación de la comparación de la edad entre pacientes con fracaso de implantación primario y fracaso de implantación secundario fue de p=0,165. El resultante de comparar fracaso de implantación primario y fracaso reproductivo mixto fue de p=0,443 y el calculado con la comparación entre fracaso de implantación secundario y fracaso reproductivo mixto fue de p=0,771. El grupo de fracaso de implantación primario no tuvo embarazos (mediana 0, IC 95%: 0-0) ni abortos (mediana 0, IC 95%: 0-0). La mediana de transferencias realizadas en este subgrupo fue de 4 (IC 95%: 4-5) y de embriones transferidos de 7 (IC 95%: 5-8). La calidad definida para los embriones transferidos fue de 2 (IC 95%: 1-2,7). El grupo de fracaso de implantación secundario tuvo una mediana de embarazos previos de 1 (IC 95%: 1-2,18) antes de la instauración del fracaso de implantación. Estas gestaciones previas fueron naturales en 7/8 casos (87,5%) y tuvieron un desenlace en también 7/8 (87,5%) casos en aborto (IC 95%: 0,8-1) ocurrido en un tiempo de gestación mediana de 6 semanas (IC 95%: 6-16) con extremos (6-20). Una única paciente tuvo un embarazo a término con alumbramiento de un recién nacido vivo antes de la instauración del fracaso de implantación recurrente. En la única paciente 64 en la que estos embarazos previos no se obtuvieron de forma natural, partía de un diagnóstico de esterilidad primaria y los embarazos (2) se produjeron tras transferencia FIV. En esta paciente los abortos no fueron espontáneos sino que tuvo dos IVE por cardiopatías no relacionadas con aneuploidías. Los embarazos previos fueron ectópicos para 3/8 pacientes. En la paciente con aborto espontáneo con tiempo de gestación más elevado éste no ocurrió de forma espontánea o por causas fetales sino que fue atribuido a un accidente que tuvo la paciente mientras estaba embarazada en semana 20. La mediana de transferencias realizadas en este subgrupo fue de 5 (IC 95%: 3,8-7,3) y de embriones transferidos de 8 (IC 95%: 5,8- 11,9). La calidad de los embriones transferidos tuvo una mediana de 2. El subgrupo de fracaso reproductivo mixto contó con una mediana de 1 embarazo (IC 95%: 1-1) posterior al fracaso de implantación recurrente y obtenido en todos los casos tras transferencia de embriones fecundados mediante FIV. La mediana de las semanas en las que ocurrieron los abortos fue de 9 (IC 95%: 6,4-9). Este grupo contó con una mediana de transferencias realizadas de 4 (IC 95%: 3-9) y de 4,5 (IC 95%: 4-9,2) embriones transferidos en total. La mediana de la calidad de los embriones transferidos fue de 1,3. 65 □ Figura 11: diagrama de cajas y bigotes que muestra las medianas e intervalos de confianza al 95% para las variables Ciclos FIV, número de transferencias realizadas, número de embriones transferidos y días de cultivo de los embriones transferidos para cada uno de los subgrupos: Fracaso de Implantación Primario (FIR1), Fracaso de Implantación Secundario (FIR2), Fracaso Reproductivo Mixto (FRM) y para el total del grupo. Entre el subgrupo de fracaso de implantación primario y el secundario no hubo diferencias significativas ni en el número de transferencias realizadas (p=0,522) ni en el de embriones transferidos (p=0,204). Entre el subgrupo de fracaso de implantación primario y el fracaso reproductivo mixto tampoco hubo diferencias en el número de transferencias realizadas (p=0,589) ni en el de embriones transferidos (p=0,176). Por último, al comparar los subgrupos de fracaso de implantación secundario y fracaso reproductivo mixto, tampoco encontramos diferencias en el número de transferencias realizadas (p=0,363) pero sí en el número de embriones transferidos (p=0,038), con rango intercuartílico para el fracaso de 66 implantación secundario de 6,5-10 y para fracaso reproductivo mixto de 4- 6. 4.1.7. Análisis 2E. Estudio de los niveles de aPS/PT en controles sanos y pacientes en la primera determinación. □ Figura 12: Niveles de aPS/PT IgG en los diferentes grupos estudiados. La barra horizontal coincidente con el valor de 30UI/mL para aPS/PT IgG marca el punto de corte establecido. Las flechas indican las diferencias significativas entre los diferentes grupos estudiados y muestran sobre ellas el valor p de significación. Los anticuerpos aPS/PT se determinaron en una única ocasión en el grupo control. Como se reseñó en el apartado correspondiente a la definición de los puntos de corte, las determinaciones para aPS/PT IgG en el grupo 67 control resultó en una mediana de 7,40UI/mL (IC 95%: 7,22-7,68UI/mL) con un rango intercuartílico de 5,60-9,92UI/mL. Los niveles de aPS/PT IgM tuvieron una mediana de 11,95UI/mL (IC 95%: 11,50-12,70UI/mL) y un rango intercuartílico de 9,28-17UI/mL. □ Figura 13: Niveles de aPS/PT IgM en los diferentes grupos estudiados. La barra horizontal coincidente con el valor de 40UI/mL para aPS/PT IgM marca el punto de corte establecido. La mediana para aPS/PT IgG de las pacientes de todos los grupos estudiados fue de 8,10UI/mL (IC 95%: 7,57-8,96UI/mL) en la primera extracción, resultando en diferencias significativas con respecto a los controles sanos (p<0,001). La mediana para aPS/PT IgM de todas las pacientes en el primer estudio fue de 16,45UI/mL (IC 95%: 14,67-18,40UI/mL), observándose así mismo diferencias con respecto a los controles sanos (p<0,001). 68 □ Tabla 6: las celdas sombreadas informan de los valores de las medianas para aPS/PT IgG expresados en UI/mL. Los paréntesis a continuación detallan el IC 95% para los valores de esas medianas. Las celdas no sombreadas informan sobre la significación estadística de las diferencias encontradas entre cada uno de los grupos de pacientes y las controles. En negrita están remarcados los valores estadísticamente significativos (p<0,05). El grupo de fracaso de implantación recurrente mostró una mediana de aPS/PT IgG en la primera extracción de 9,03UI/mL (IC 95%: 7,74- 13,06UI/mL). Comparado con los niveles de aPS/PT IgG de los controles sanos, se observaron diferencias significativas (p=0,004), pero no con respecto a otros grupos de pacientes. En cuanto al isotipo IgM, la mediana en la primera extracción fue de 15,20UI/mL (IC 95%: 11,70-21,07UI/mL), con diferencias también con respecto a los controles sanos (p=0,041). El grupo de pacientes con tres o más abortos consecutivos anteriores a la semana 10 mostró una mediana de aPS/PT IgG de 7,99UI/mL (IC 95%: 7,31- 10,36UI/mL), sin resultar en diferencias significativas (p=0,695) con respecto a las pacientes del grupo de dos abortos anteriores a la semana 10, que mostraron una mediana para aPS/PT IgG de 9,90UI/mL (IC 95%: 7,13-12,90UI/mL). Comparados con los resultados de los controles sanos, los valores de aPS/PT IgG tanto en el grupo de pacientes con tres o más CONTROLES FIR ≥3 ABORTOS