UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Miguel Ángel Vidal Caballero DIRECTOR: F. P. Conde Madrid, 2015 © Miguel Ángel Vidal Caballero, 1984 Interacción de la IgM humana con la proteína A de Staphylococcus Aureus : bases estructurales de la reactividad alternativa de inmunoglobulinas con proteína A UNIVERSIDAD COMPLUTENSE FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS PLUSSIDAD 945877 EN SE INTERACCION DE LA IcM HUMANA CON LA PROTEINA A DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS, BASES ESTRUCTURALES DE LA REACTIVIDAD ALTERNATIVA DE INMÜNOGLOBULINAS CON PROTEINA A. V B 5 el Director Vb p.p. V-R- Tesis que para optar al Grade de Doctor en Biologia por la Univer- sidad Complutense présenta Miguel Angel Vidal Caballero. Departamento de Investigaciôn, Centro Ramon y Cajal, Madrid. Marzo de 1984. el Ponente Dr. A.M. Municio 1 x 1 M.A. Vidal Este trabajo se ha efectuado en los laboratories del Departamento de Investigaciôn del Centro Ramon y Cajal del INSALUD en Madrid. Al Jefe de Secciôn del mismo, Dr. F.P.Conde, di­ rector de esta tesis, agradezco esa labor, asi como la dis- posiciôn de los medios que han hecho posible su realizaciôn. Agradezco tambiên al Prof. Dr. J.M.R. Delgado, Jefe del Departamento, el haberme permitido desarrollar es­ te trabajo en el mismo. Al Dr. E. Mêndez, del Servicio de Endocrinologie del Centro Ramon y Cajal debo su ayuda en algunas têcnicas, y al Dr. F. Sânchez-Madrid, de la Division de Investigaciôn de Alergia e Inmunologia Abellô. S.A., la cesiôn de réacti­ ves y la discusiôn de algunos resultados. Hay que sehalar la colaboraciôn de otros Servicios de 1 Centro Ramôn y Cajal (Medicina Interna, Endocrinologie, Hématologie, etc.) en la provisiôn de materiales y la utili- zaciôn de instrumental de sus instalaciones. Agradezco al Prof. Dr. A. Martin Municio, Director del Departamento de Bioquimica de la Facultad de Ciencias Quimicas de la Universidad Complutense, sus comentarios y la amabilidad de encargarse de la ponencia de esta tesis. El apoyo de Carmela Cales trasciende su asistencia en la redacciôn de esta tesis por la que aqui figura. INDICE Abreviaturas VIII I. INTRODUCCION. Pagina 1.1. Presentacion del trabajo............................... 1 1.2. Bacterias con receptores para proteinas de suero.................................................. 3 1.2.1. Receptores de inmunoglobulinas. 4 1.3. Proteina A ............................................... 5 1.3.1. Presencia de la proteina A en cepas de StaphyloQoaaus. 5 1.3.2. Proteina A de S. aureus, ....................... 7 1.3.2.1. Produccion de proteina A ..................... 7 1.3.2.2. Propiedades fisico-quimicas. 9 I. 3. 2. 3. Estructura de la proteina A. ............ 12 1.3.3. Reactividad de la proteina A con inmunoglobulinas de distintos animales......... 15 1.4. Inmunoglobulinas. .................................... 18 1.4.1. Estructura de inmunoglobulinas................... 19 1.4.2. Genes de inmunoglobulinas......................... 21 I. 4. 2.1. Genes de regiones variables.................. 2 2 I. 4. 2. 2. Genes de regiones constantes................. 26 1.4.2. 3. Genes de inmunoglobulinas activos........... 28 1.4.3. Variantes de inmunoglobulinas..................... 30 1.4.4. Estructura tridimensional de inmunoglobulinas.................................... 32 1.4.5. Fragmentos de inmunoglobulinas................... 37 1.4.6. Produccion de inmunoglobulinas en la diferenciacion del linfocito. .................. 40 1.4.7. Relaciones evolutivas de inmunoglobulinas. ••• 44 1.4.8. Las clases de inmunoglobulinas humanas......... 48 1.4.8.1. Inmunoglobulinas M ............................ 48 1.4.8.2. Inmunoglobulinas A ............................ 51 1.4.8 .3. Inmunoglobulinas G ............................ 53 I.4. 8 .4. Inmunoglobulinas E ............................. 54 I.4.8 .5. Inmunoglobulinas D ............................ 55 -II- 1.5. Interacciôn proteina A-inmunoglobulinas........... 56 1.5.1. Independencia de la funcion anticorpal. .................................... 5 6 1.5.2. Interacciôn con IgG a travês de la region Fc y ........................................ 58 1.5.3. Reactividad de las subclases de IgG.......... 60 1.5.4. Reactividad de otras clases de inmunoglobulinas con proteina A ................ 64 1.5.4.1. Inmunoglobulinas A. .................... 6 4 1.5.4.2. Inmunoglobulinas M .......................... 66 1.5.4.31 Inmunoglobulinas E. ..................... 69 I.5.4.4. Inmunoglobulinas D. ..................... 70 1.5.5. El mécanisme alternative de interacciôn de inmunoglobulinas con proteina A a través de sus regiones F(ab')2................ 70 1.6. Actividad biolôgica de la proteina A .............. 7 3 1.6.1. Proteina A como mitôgeno de linfocitos....... 7 5 1.7. Objetivos y planteamiento experimental............ 78 II. MATERIALES Y METODOS. II. 1. Purificacion de inmunoglobulinas.................... 80 11.1.1. Concentraciôn de soluciones de proteina. ... 80 II.1.1.1. Ultrafiltraciôn............................ 80 11.1.1.2. Diâlisis..................................... 81 11.1.1.3. Calcule de concentraciôn de las soluciones de proteina. ............... 82 11.1.2. Purificaciôn de IgG policlonal humana y de otros mamiferos. ....................... 8 2 11.1.2.1. Cromatografia de afinidad en PA-Sepharose................................ 82 11.1.2.2. Purificaciôn de una IgG3 monoclonal humana. ................................. 8 4 II.1.2.2.1. Preparaciôn del intercambiador iônico de celulosa. .............. 86 II.1.2.2.2. Aislamiento de la IgG3 Fra. ....... 87 11.1.2.3. Purificacion de IgA policlonal humana. .................................... 8 9 11.1.2.4. Purificacion de IgM policlonal humana. .................................... 80 11.1.2.4.1. Purificacion de la IgM sin afinidad por PA-Sepharose. 86 11.1.2.5. Purificacion de una IgM monoclonal humana. .................................... 86 11.1.2.6 . Aislamiento de proteinas Bence-Jones. ••• 88 11.2. Preparaciôn de fragmentos de inmunoglobulinas. ••• ^80 II. 2.1. De IgG humana. ................................. i80 11.2.1.1. Preparaciôn de los fragmentos Faby y Fcy, 100 II. 2.1.2. Obtenciôn del fragmente FCab'jgY.......... 101 II. 2.1.3. Obtenciôn del fragmente F a b 'y.............. 104 11.2.1.4. Obtenciôn de cadenas ligeras............... 107 II. 2. 2. Fragmentos de IgM....... 107 11.2.2.1. Obtenciôn de los fragmentos Fabp y (Fc)gp, 109 II. 2. 2. 2. Obtenciôn del fragmente F(ab’)2U .......... 110 II. 2. 2. 3. Obtenciôn del fragmente Fab’y .............. 110 11.2.2.4. Obtenciôn del fragmente Fcy................. 111 11.2.2.5. Obtenciôn del fragmente Fv .................. 112 II. 2. 2. 6 . Obtenciôn de los dominios y .......... 112 11.2.2.7. Obtenciôn de subunidades de IgM........... 113 11.2.2.8 . Obtenciôn de cadenas ligeras Iz ............ 114 11.3. Obtenciôn de antisueros y anticuerpos. ........... 114 II. 3.1. Inmunizaciôn de los animales............... 115 II. 3. 2. Absorciôn de los antisueros. ........... 118 11.3.2.1. Cromatografia de inmunoafinidad. 118 11.3.2.1.1. Insolubilizaciôn de antigenos en agarosa. .............. 119 11.3.2.1.2. Inmunoabsorciôn y purificaciôn de de anticuerpos. 121 11.3.3. Insolubilizaciôn de anticuerpos en agarosa. .. 12 3 11.3.4. Obtenciôn de fragmentos Fab de anticuerpos IgG.................................................. 124 11.3.4.1, Obtenciôn de fragmentos Fab anti-proteina A. ................... 127 II.4. Têcnicas de inmunoprecipitaciôn en gel.............. 12 7 11.4.1. Inmunodifusiôn doble en dos dimensiones....... 130 II. 4. 2. Inmunodif usiôn radial simple................... 132 II. 5. Têcnicas electroforêticas............................. 134 II. 5.1. Electroforesis en agarosa....................... 135 II. 5.1.1. Inmunoelectroforesis....................... 137 II. 5.1.2. Inmunoelectroforesis cruzada............. 137 11.5.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida....... 139 11.5.2.1, Electroforesis en un sistema de tamponamiento discontinue.................. 140 11.5.2.2, Electroforesis en presencia de SDS....... 142 11.5.3. Isoelectroenfoque, 144 11,5.3,1, Isoelectroenfoque en agarosa, ........... 144 11.6 . Marcaje radiactivo de proteinas, ................... 146 II. 6.1. Yodaciôn con lodoGen............................. 146 II.6 .2. Yodaciôn enzimêtica, .......................... 148 II. 6 . 3. Yodaciôn de anticuerpos........................... 149 >. 12 511.6.4. Calidad de las proteinas marcadas con I. .. 150 11.6.5. Calcule de la actividad especifica............. 152 11.7. Mapas bidimensionales de pêptidos yodados, ....... 154 11.7.1, Preparaciôn de Iq s pêptidos radiactivos....... 154 11.7.2, Electroforesis y cromatografia en capa fina, . 155 11.8. Radioinmunoensayps, 156 11.8.1, De doble anticuerpo, ..... 157 11.8.2, De fase sôlida, ................................. 158 II. 9. Interacciôn con proteina A. ...................... 160 11.9.1. Fijaciôn a celulas de S, aureus. .......... 161 11.9.2. Fijaciôn a proteina A en plaças de plâstico. 163 II. 9.3. Anâlisis de los datos de fijaciôn. ........ 163 II.9.4. Reacciones de precipitaciôn y coprecipitaciôn. 164 II.10. Materiales. ....................................... 167 III. RESULTADOS Y DISCUSION. III.1. Interacciôn de IgM policlonal humana con proteina A. 170 III. 1.1. IgM reactiva con proteina A. ............. 170 111.1.1.1. Aislamiento de IgM por cromatografia de afinidad con PA-Sepharose. ..... 170 111.1.1.2. Utilizaciôn de tampones disociantes en la eluciôn: de IgM de PA-Sepharose. 17 3 111.1.1.3. Interacciôn con PA-Sepharose en funciôn del pH. ..................... 176 111.1.1.4. Rendimiento de la purificaciôn de IgM. 180 111.1.2. Fijaciôn de IgM policlonal a cêlulas de S. aureus, ................................... 184 111.1.2.1. Ensayos de fijaciôn directa. ....... 184 111.1.2.2. Determinaciôn de la Ka del proceso de de fijaciôn y comparaciôn con la correspondiente de IgG policlonal. • 186 111.1.2.3. Capacidades de uniôn de IgM e IgG por S, aureus, ..... 190 111.1.2.4. Efecto del fragmente FCab’)^! sobre la fijaciôn de IgM. .................. 193 111.1.3. Reacciones de coprecipitaciôn y precipitaciôn de IgM e IgG con proteina A. ............. 195 111.1.3.1. Coprecipitaciôn de IgM humana con proteina A y Fcy. .................. 195 111.1.3.2. Precipitaciôn directa de IgM con proteina A. .................. 199 III.1.3.3. Precipitaciôn directa de IgG con proteina A. .................... 201 111.2. Sitios de proteina A para las reactividades clasica y alternativa. ........................... 203 111.2.1. Receptores de proteina A para FCab'jgY y Fc y .203 111.2.2. Actividad del fragmente FabY en los ensayos de fijaciôn a 5. aureus, ................... 210 111.2.3. Inhibiciôn de la reacciôn de coprecipitaciôn de IgM, Fcy Y proteina A...... ................ 212 111.2.4. Efecto de la proteolisis de S. aureus sobre su interacciôn con inmunoglobulinas. ..... 214 111.2.5. Efecto de anticuerpos anti-proteina A sobre la capacidad de fijaciôn de inmunoglobulinas a S , aureus, ................................ 216 « 111.3. Receptor de proteina A de una IgM monoclonal humana.219 111.3.1. IgM I z ........................................... 220 111.3.1.1. Cromatografia de IgM Iz en PA-Sepharose.222 111.3.2. Fragmentos Faby y (Fc)^y. 224 111.3.2.1. Cromatografia de (Fc)^y y Faby en PA-Sepharose. ..... 226 111.3.3. Precursores de (Fc)gy en la proteolisis de IgM. ................................. 229 111.3.3.1. Cromatografia de los precursores de (Fc)^y en PA-Sepharose................. 234 111.3.4. Fragmentos F(ab')2y. ....................... 2 37 111.3.4.1. Cromatografia de F(ab')24 Gn PA-Sepharose.240 III. 3.5. Subunidades de IgM. ...................... 240 111.3.5.1. Cromatografia de IgM monomérica y Fab'y en PA-Sepharose. ....... 243 111.3.6. Inhibiciôn competitive de lafijaciôn de I g M {125%} ^ proteina A. ................... 249 111.3.7. Subfragmentos de la regiôn Fab ............. 253 III. 3.7.1. Obtenciôn del fragmente F v........... 255 III.3.7.2. Obtenciôn de los dominios y V^. ... 261 111.3.8 . Inhibiciôn competitive de la uniôn de I gM {1^51 } a proteina por subfragmentos de Faby.266 111.3.9. Inhibiciôn de la coprecipitaciôn de la IgM Iz con proteina A y Fcy por subfragmentos de Faby.269 111.3.10. Inhibiciôn de la fijaciôn de IgM Iz a proteina A por anticuerpos anti-V^. ..... 269 111.4. Receptor de proteina A en estructuras de dominios variables de cadenas pesadas. .................... 274 111.4.1. Inhibiciôn de la interacciôn proteina A- IgM policlonal por anticuerpos anti-Faby. . 275 111.4.2. Inhibiciôn de la fijaciôn de IgM policlonal a proteina A por anticuerpos anti-V^........ 277 111.4.3. Reactividad anti-"framework" de los anticuerpos que inhiben la interacciôn IgM-proteina A ................................... 28 2 111.4.4. Relaciôn de los sitips antigênicos en regiones "framework” de Vy y reactividad con proteina A.287 111.4.5. Sitios antigênicos recpnocidos por anticuerpos antir-" framework” human os en inmunoglobulinas de otros mamiferos con reactividad tipo Fab con proteina A. ......................... 293 111.5. Discusiôn general, ................................ 296 111.5.1. IgM policlonal reactiva con proteina A. ............ 297 111.5.2. Sitios de proteina A para las reactividades clasica y ^temativa. .................................... 300 111.5.3. Receptor de proteina A de la IgM monoclonal Iz........ 30 3 111.5.4. Receptor de proteina A en los dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulinas. ................ 305 IV. CONCLUSIONES. 317 V. BIBLIOGRAFIA. 321 BSA: C: CH: Cl ’’ CBB: CDR: CM: DEAE: DNP: DPCC: DTT: EDTA: fmol : Fw: GO: H: Hv : Ig: lodoGen: Kpb : L: LPO: mCi : «R mS PA PESA: PBSA-BSA PEG: pl: PMSF: ABREVIATURAS seroalbümina bovina dominio constante de inmunoglobulinas segmentos génicos que los codifican dominio constante de cadena pesada dominio constante de cadena ligera azul brillante de Coomassie regiones déterminantes de complementaridad carboximetil dietilaminoetil dinitrofenil cloruro de difenilcarbamato ditiotreitol âcido etilendiaminotetraacético femtomol (10”^^ mol) regiones "framework” glucosa oxidasa cadena pesada de inmunoglobulinas regiones hipervariables inmunoglobulinas 1,3,4,6-tetracloruro-3a,6adifenilglicoluril kilopares de bases cadenas ligeras de inmunoglobulinas lactoperoxidasa oxidasa milicurio peso molecular milisiemen proteina A de S, aureus tampon fosfato descrito en la tabla II.2. tampon PESA con BSA Img/ml. polietilenglicol punto isoeléctrico fluoruro de fenilmetilsulfonilo PVC p/v rpm SDS SDS-PAGE TA: TCA: TEMED: Tris : V: ''h = v/v : w: cloruro de polivinilo peso/volumen revoluciones por minuto dodecil sulfato sodico electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS tampon Tris-HCl descrito en la tabla II.2. âcido tricloroacêtico N-N-N’- N '-tetrametilendiamina tris-(hidroximetil)aminometano dominio variable de inmunoglobulinas segmentos génicos que los codifican dominio variable de cadena pesada dominio variable de cadena ligera volumen/volumen watio INTRODUCCION 1.1. Presentacion del trabajo. 1.2. Bacterias con receptores para proteinas de suero 1.3. Proteina A. 1.4. Inmunoglobulinas. 1.5. Interacciôn proteina A-inmunoglobulinas. 1.6. Actividad biolôgica de la proteina A. 1.7. Objetivos y planteamiento experimental. I.l. PRESENTACION DEL TRABAJO Con la denominacion de proteina A se désigné mas precisamente, en 1964 (Grov y col., 1964; Ceding y col., 1964), un componente altamente antigenico de Staphylocooous aureus, aislado en un intento de clasifi- cacion serologica de cepas de estafilococos y que mostra- ba la peculiaridad de reaccionar con sueros de conejos o humanos sin inmunizaciôn previa (Jensen, 1958). Asi, se hacia referencia a su naturaleza mas acertadamente que con la ambigua denominaciôn anterior de antigeno A (Jensen, 1958). Si bien la reactividad observada fue inicialmen- te atribuida a anticuerpos de entre los présentes en condi- ciones normales en sueros humanos, contra distintos elemen- tos bacterianos (Jensen, 1958), se trata, en realidad, de un fenômeno no relacionado con la actividad anticorpal de las inmunoglobulinas (Forsgren y Sjoquist, 1966). La reactividad de la proteina A de S. aureus con inmunoglobulinas de numerosos mamiferos (Kronvall y col,, 1970a), le abriô un amplio campo de aplicaciones metodolô- gicas inmunoquimicas (Coding, 19 78 ), pero, ademas, y quiza tambiên asociada a su interacciôn con inmunoglobulinas, la proteina A posee un conjunto de actividades biolôgicas liga- das al sistema inmune, de las que su propiedad de agente anti' tumoral es de las mas espectaculares (Ray y Bandyopadhyay, 1983), El presente estudio, que aborda aspectos de esta reactividad referidos a las estructuras de la protei- na A y de las inmunoglobulinas en ella implicadas, se in­ troduce por medio de très grandes bloques descriptives de los elementos interesados, proteina A e inmunoglobulinas, y de la informaciôn disponible sobre su interacciôn. El relative a proteina A incide en la estructura de su molê- cula y su producciôn por cêlulas de S. aureus. Las inmu­ noglobulinas, a su vez, se contemplan desde la perspectiva de la estructura de sus genes y su expresiôn, fundamental para la comprensiôn de la heterogeneidad de sus molêculas, asi como de sus relaciones evolutivas. Finalmente, la reactividad proteina A-inmunoglobulinas se expone en base a los dos mécanismes de interacciôn descritos y a la acti­ vidad biolôgica mostrada por la proteina A en alguna de las funciones del sistema inmune. 1.2. BACTERIAS CON RECEPTORES PARA PROTEINAS DE SUERO Se ha descrito en los ultimes ahos la existencia en la superficie de algunos grupos de bacterias de estructu­ ras capaces de unir proteinas del suero de mamiferos (Wideback y col., 1982; Richman y col., 1982). Suele tratarse de micro- organismos Gram positives potencialmente patogenos, como estafilococos y estreptococos, sobre todo, y algunos Gram negatives. Esta interacciôn con estructuras de la superficie bacteriana comprende un amplio conjunto de proteinas de suero. Asi, cepas de estreptococos de los grupos G y C (grupos sero- lôgicamente caracterizados por las especificidades antigëni- cas de los carbohidratos de sus paredes celulares (McCarty, 1980)) reconocen albûminas (Myhre y Kronvall, 1980a; Wideback y col., 1982). Estas y las del grupo A unen fibrinôgeno (Kronvall y col., 1979) aunque a través de sitios diferentes de los que unen 62-microglobulina (Kronvall y col., 1978). Algunos estreptococos tambiên unen haptoglobina (Kohler y Prokop, 1978). y el Clq, primer componente del sistema del complemento, interacciona con algunos neumococos (Loos y col., 1978). Estructuras que unen inmunoglobulinas se encuentran en estafilococos y estreptococos (apartado 1 .2 .1 .) y la fibronec- tina tambiên se une a cepas de estafilococos (Doran y Reynor, 1981) . El significado de estas interacciones asi como su efecto sobre las relaciones con el huêsped animal no estân aclaradas, si bien se sabe que la union de estas proteinas a los microorganismos induce cambios en las propiedades fi- sico-quimicas de su superficie (Miorner y col., 1980) y que de ello pueden derivarse alteraciones en su interacciôn con cêlulas fagociticas (Smith, 1977) que, en ultimo têrmino, podrian incidir sobre su patogenicidad. 1.2.1. Receptores de inmunoglobulinas. De todas las interacciones entre componentes de la superficie bacteriana y proteinas de suero de mamiferos, las correspondientes a inmunoglobulinas y receptores de estafilo­ cocos y estreptococos son las major estudiadas (Langone, 1982) En la superficie de estes microorganismos se encuen­ tran diversas estructuras receptoras de inmunoglobulinas, de acuerdo con los distintos patrones de reactividad observados entre las distintas cepas y los distintos tipos de inmunoglo­ bulinas. Esto permite su sistematizaciôn en cinco tipos de receptores (Myhre, 1981): los de tipo I se encuentran en esta- filococos^y los restantes en estreptococos. Asi, los de tipo II se hallan en los del grupo A, cepas de los grupos C y G humanos y C bovino tienen receptores tipo III, en tanto que los de tipo IV y V estân restringidos al grupo G bovino y a cepas del grupo C equino, respectivamente. Aunque recientemente se ha purificado un receptor tipo II (Grubb y col., 1982), la interacciôn extensivamente estudiada es la que ocurre con el receptor tipo I o proteina A de StaphyloQOQQUs aureus (Forsgren y Sjoquist, 1966), de lo que puede dar una idea el hecho de que se trata de un producto comercializado jcuyas caracteristicas le han conver- tido en un reactivo_ inmunoquîmico generalizado, como anti- inmunoglobulina, utilizado en procedimientos cromatogrâficos, enzimo o radioinmunoensayos y têcnicas microscôpicas, entre otras (Goding, 1978). 1.3. PROTEINA A 1.3.1. Presencia de la proteina A en cepas de Staphylocooous. Los organismos del gênero Staphylococcus, el mas importante de la familia de cocos Gram positivos Micrococcaceae, son anaerobios facultativos no môviles, que por su divisiôn ce- lular en très pianos sucesivamente perpendiculares forman, so­ bre todo en medios sôlidos, agrupamientos irregulares de los que dériva su denominaciôn de estafilococos (Morse, 1980). El estudio de la distribuciôn de la proteina A entre los distintos estafilococos, generalmente por procedimientos cualitativos, asocia su producciôn a organismos de S. aureus (tabla I.I.), de manera que su presencia constituye, con la actividad coagulasa y nucleasa termoestable, el principal cri-r terio de identificaciôn de S, aureus de origen humano (biotipo Tabla I.l. PRODUCCION DE PROTEINA A POR DISTINTOS GRUPOS DE ESTAFILOCOCOS Estafilococo Origen % con PA ̂ Referencia S. aureua humano (biotipo A) 70-100 1 ,2 ,3,6 S. aureus humano 0-2b 1 S. aureus bovino (biotipo C) 34-64 3,6 S, aureus otros 2-99 3,4 S. epidermïdis humano 0 5 S. epidermïdis bovino 1-9 6 S. intermedius perro, paloma 3 3 S. hyious humano 97 7 S. hyious otros 0 3 a) la presencia de proteina A se ha detectado. en ensayos de aglutinacion de eritrocitos cubiertos de IgG, de fijaciôn a las bacterias de IgG iiarcada radiactiva o fluôrescentemente, y por difusiôn en gel. bl se trata de cepas coagulasa y DNAasa negativas. c). 1, Forsgren, 1970; 2, Kronvall y col., 1971; 3, lachica y col., 1979; 4, Bomstein y col., 1980; 5, Flandrois y col., 1975; 6, Kronvall y col,, 1972; Muller y col., 1981, A), ya que la PA puede detectarse en el 95% de las cepas (Kronvall y col., 1971). Aunque hay cierta disparidad en los resultados sobre la extension de la producciôn de PA por cepas de S, aureua de origen animal, entre las de biotipo C o bovino se encuentra persistentemente una fracciôn de cepas producto.ras (Kronvall y col., 1972). La presencia de PA en otros estafilococos distintos de 5. aureus es bastante rara (tabla I.l.). Hay que sehalar, no obstante, que el caracter PA positive mayoritario de las cepas de S. hyious de origen humano, se halla relacionado con la producciôn de un polipêptido antigênicamente relacionado con la PA y que muestra la reactividad con inmunoglobulinas caracterîstica de la PA, pero con propiedades estructurales diferentes (Muller y col., 1981). 1.3.2. Proteina A de S. aureus. 1.3.2.1. Producciôn de proteina A. S. aureus^ asi denominado por la pigmentaciôn de sus colonias crecidas aerôbicamente en medios sôlidos, es colonizador habituai de humanos y animales y de los mas im­ portantes por su patogenicidad, siendo responsable de gran variedad de enfermedades supurativas (Morse, 19 80). La mayoria de la PA producida por S. aureus se halla asociada a su pared celular, aunque una pequeha canti- dad tambiên puede encontrarse extracelularmente en el medio de cultivo. Asi, en los organismos Cowan I, una cepa de S. aureua de alto contenido en PA, solo el 10% de la PA celular esta en su citoplasma y un 30% del total es liberado al medio du­ rante la fase logaritmica de crecimiento y principle de la fa­ se estacionaria (Forsgren, 1969). Excepcionalmente, las cepas résistantes a meticilina, o no producen PA o lo hacen solamente en forma extracelular (Winblad y Ericsson, 1973). La PA de la pared celular, donde se encuentra uni- da covalentemente a su porciôn peptidoglicano (Sjoquist y col., 1972b), puede contemplarse en la superficie celular por la observaciôn microscopica de organismos cubiertos con anticuer­ pos contra antigenos visibles al microscopio electrônico (Umeda y col., 1980). La PA, tras su sintesis ribosomal, se incorpora râ- pidamente a la pared celular, aunque su producciôn es indepen- diente de la de peptidoglicano (Movitz, 1974). Asimismo, pro- toplastos de Cowan I o 3695, tienen una velocidad de producciôn de PA similar a la de las bacterias intactas, en las que la mayoria de la PA se encuentra en la pared celular (Movitz, 1976) . Las propiedades de mutantes déficientes en PA obte- nidos por tratamiento de cepas Cowan I con nitrosoguanidina o etilmetano sulfonato, sugiere la existencia en S, aureus de un mécanisme comûn regulador de la sintesis y liberaciôn de productos extracelulares, incluida la PA (Forsgren y col., 1971). El medio y condiciones de cultivo tienen una gran incidencia en el grado de producciôn de PA (Lind, 197 4; Flandrois y col., 1978), siendo caracteristica la reducciôn observada al aumentar la concentraciôn de cloruro sôdico (Lind, 1974). I.3.2.2. Propiedades fisico-quimicas. El aislamiento y caracterizaciôn de la PA ha depen^ dido del procedimiento de su extracciôn de la pared celular, pues de la mayoria de ellos resultaban productos heterogéneos de actividad disminuida (Grov y col., 1954; Forsgren y Sjoquist, 1969), Sin embargo, el tratamiento de cêlulas Cowan I con lisostafina, una mezcla de proteinas producidas por Staphylo'^ ooQous staphylolythious, con actividades glicilglicocola endopep- tidasa, hesoxaminidasa y N-acetilmuramil-L-alanina amidasa (Sloan y col., 1977) que lisa las cêlulas de S, aureus al hi- drolizar los puentes de pentaglicina que conectan los tetra- pêptidos anclados en el esqueleto polisacârido del peptidoglir cano de la pared celular (Leive y Davis, 1980), produce una PA que tras su purificaciôn por procedimientos cromatogrâfi­ cos convencionales aparece homogênea (Sjoquist y col,, 1972a), La PA asi liberada de la pared celular, o la del medio de cultivo de Cowan I o de cepas productoras sôlo de PA extracelular, se aisla en la actualidad por cromatografia de afinidad con IgG-Sepharose (Hjelm y col., 1972). La PA de la cepa Cowan I, que constituye el 6,7% en peso del material de su pared celular (Sjoquist y col. , 1972b), la mejor estudiada, es una molêcula alargada, como puede deducirse de sus paramétrés hidrodinâmicos, viscosidad intrinseca y relaciôn friccional, que se muestran en la tabla 1 .2 ., junto con otras caracteristicas fisico-quimicas. En general, la PA de Cowan I se parece bastante a las producidas por otras cepas (Movitz, 1976), incluyendo las formas extracelulares de cepas meticilina-resistentes, como la A676 (Lindmark y col., 1977). En todos los casos, los pe­ sos moleculares estimados por SDS-PAGE dan valores de 55000- 56000, superiores a los observados por ultracentrifugaciôn o cromatografia, en torno a 41000-42000, mâs acordes con los calculados de su composiciôn de aminoâcidos (tabla 1.2.). No obstante, aunque los extremes amino y carboxilo terminales son comunes, Ala y Lys, respectivamente, en las formas celu­ lar y extracelular de PA (Sjoquist y col., 197 2a; Lindmark y col., 1977; Mpvitz y col., 1979) la Ala de la PA aislada de Tabla 1.2. ALGUNAS PROPIEDADES FISICOQUIMICAS DE LA PROTEINA A Cowan K l ) A676C3) Peso molecular equilibrio de sedimentaciôn y filtracion en 6M GuHCl. anâlisis de aminoâcidos SDS-PAGE a1%, 1 cm 275 Punto isoeléctrico ^20,w ’ S Coeficiente de fricciôn relative Viscosidad intrinseca, ml/g Coeficiente de difusiôn, ° 20,w’ 42000 41942 (2) ,43491( 3) 54000(4) 1.65(2) 5.1(3) 2.1 2.1 4.3 X 10 29 -7 41000 40736 55000 1.46 5.09 La proteina A de la cepa Cowan I es la aislada despuês del tratamiento de las bacterias con lisostafina (2). La referencia de los datos es la que acompana el nombre de las cepas, si no se indica otra. Referencias: 1, Bjork y col., 1972; 2, Sjoquist y col., 1972; 3, Lindmark y col., 1977; 4, Duggleby y Jones, 1983 la pared celular con lisostafina tiene su extreme amino blo- queado (Sjoquist y col., 1972a). Es una proteîna sin Trp, por ello su bajo coefi- ciente de extincion , tabla 1.2. , y sin Cys, con una estabi- lidad conformacional sorprendente, como muestran estudios so­ bre el efecto del pH, en un intervalo de 0.99-11.8, en su espectro de dicroismo circular en la region del ultraviole- ta lejano (Sjoholm, 1975), que, asimismo, muestran una mayo- ritaria recuperaciôn de la conformaciôn nativa después del tratamiento de la PA con clorhidrato de guanidina 6M o cale- facciôn a 80 “C. La estructura secundaria de la PA, estimada de su espectro de dicroismo circular, consta de un 31% de a-hêlice, un 13% de estructura g y un 50% de estructura ape- riodica, tanto si se trata de la forma unida a la pared ce­ lular de Cowan I como de la extracelular de la cepa A67 6 (Lindmark, 1982). 1.3.2.3. Estructura de la proteîna A. La molécula de PA esta constituida por dos regiones bien diferenciadas, una de unos 150 aminoâcidos, que compren- de su extremo C-terminal, denominada region X, y otra que contiene 4 subregiones homôlogas, denominadas D, A, B y C, de aproximadamente 6 0 aminoâcidos cada una, dispuestas lineal- mente por ese orden desde el extremo N-terminal, figura I .1. (Sjodhal, 1977a). -Id- •v.v.v.wKîMrM.v.v.v.v.wX*! %%••• Figura I.l. Representaciones esquemticas de la proteîna A en la superficie de S. aureus^ segun la estructura definida a partir de la secuencia de aminoâcidos de la de la cepa Cowan I (a) y de la deducida de la secuencia de nu­ cleotides del gen de la proteîna A de la cepa 8325 (b). Las fléchas muestran los puntos de hidrolisis por trip- sina, T, y lisostafina, L. Las otras letras corresponden a la denominaciôn de cada une de los dominios de la proteîna A (Sjodahl, 1977a; Lofdahl y col., 1983). Como el dominio C y la region X no se producen en la digestion de los organismos con tripsina, sino solo des­ pues de su tratamiento con lisostafina, se ha sugerido que son adyacentes y que la region X se encuentra incluida en la pared celular (Sjodahl, 1977a). Los dominios D, A, B, y C muestran reactividad con IgG, a diferencia de la region X (Sjodahl, 1977a)^aunque con caracter monovalente, explicando la capacidad de la PA Intacta para unir mas de una molécula de IgG (Sjoquist y c ol.,197 2a). La identidad antigenica de estos dominios se halla de acuerdo con la alta homologia existante entre sus secuen- cias, superior al 80%, y que détermina estados conformacio- nales similares entre si y al de la estructura secundaria de la PA (Sjodahl, 1977b; Lindmark, 1982), en tanto que el co- rrespondiente de la region X es bastante diferente, de acuer­ do con su distinta composiciôn de aminoâcidos (Sjodahl, 1977a) La homologia entre los dominios con reactividad con IgG es mayor cuanto mas préximos se hallan en la molécula, motivo por el que se ha interpretado el origen genêtico de la PA como el resultado de la duplicaciôn de un gen primordial correspondiente al de su extremo N-terminal (Sjodahl, 1977b). Esta disposiciôn estructural de la PA de Cowan I se halla corroborada por la secuencia parcial de nucleôtidos del gen de PA de S. aureus 8325 que, sin embargo, muestra una region adicional, homologa de las otras cuatro repetidas, y en posiciôn N-terminal respecto de ellas (Lofdahl y col., 1983), sospechada por la presencia de un aminoâcido N-termi­ nal bloqueado en la PA aislada por tratamiento de los orga­ nismos con lisostafina (Sjoquist y col., 1972a; Movitz, 1979). La estructura de este gen contiene un peptido hidrofobo o secuencia de sehal que precede a la del polipeptido maduro, asi como un codon de iniciacion y una secuencia de reconoci- miento del ribosoma, similares a las correspondientes de otros genes de bacterias Gram positivas (Lofdahl y col., 1983). La estructura tridimensional de las regiones de ho­ mologia reactivas con IgG, détermina un dominio globular cilin- drico de 26 x 16 ^ , constituido principalmente por dos heli­ ces alfa antiparalelas y el resto del polipeptido plegado irregularmente, como se deduce del analisis cristalografico del patron de difraccion de rayos X del cristal formado por el fragmento Fc de IgG humana (apartado 1.4.5.) y el dominio B de la PA (Deisenhofer y col., 1978; Deisenhofer, 1981). La forma extendida de la PA y la gran semejanza de las propieda- des espectrales de los distintos dominios, permite suponer que se hallen dispuestos secuencialmente, sin interaccionar entre si, de acuerdo con la flexibilidad apreciada en las estructuras de los extremos N y C-terminal del fragmento B (Deisenhofer y col., 1978), 1.3.3. Reactividad de la proteîna A con inmunoglobulinas de distintos animales. Aunque inicialmente observada con inmunoglobulinas humanas y de animales de laboratorio, conejos, cobayos, etc. (Jensen, 1959; Forsgren y Sjoquist, 1967; Forsgren, 1967), el anâlisis de la reactividad de PA con las inmunoglobulinas de otros animales muestra una de las caracterîsticas de esta interacciôn, que es su amplia distribuciôn en los distintos grupos de vertebrados. La relaciôn de reactividades que se muestra en la tabla 1.3. révéla a los mamiferos como grupo con representaciôn principal de especies con inmunoglobulinas reactivas con PA, a pesar de que también pueden encontrarse en las de algunos vertebrados inferiores, como anfibios y aves (Kronvall y col., 1970a; Zikan y col., 1980). La totalidad de los ôrdenes de mamiferos ensayados tienen inmunoglobulinas con alguna forma de reactividad con PA, aunque con grandes diferencias entre ellas, observadas en los estudios cualitativos iniciales (Kronvall y col., 1970a) y que en los ensayos cuantitativos mas sensibles, reflejan rangos de afinidad por la PA de très ôrdenes de magnitud (Langone, 1978; Inganas y col., 1980; Richman y col., 1982; Lindmark y col., 1983), encontrândose entre las de primates, carnivoros y roedores algunas de las inmunoglobulinas que in- teraccionan mas fuertemente con la PA, frente a las de artio- dâctilos y otros ôrdenes con reactividades mas débiles. Tabla 1.3. REACTIVIDAD DE INMUNOGLOBULINAS DE DISTINTOS GRUPOS ANIMALES CON PROTEINA A Positives Mamiferos (1,2) -Euterios Insectivora Dermoptera Quiroptera Primates Edentata Pholidota Lagomorpha Rodentia Cetaoea Carnivora Pinnipedia Tubulidentata Probosoidea Hyracoidea Péris sodactyla Artiodaotyla -Metaterios Marsupalia -Prototerios Monotremata Negatives Aves (1,3,4) -Paleognatos (Rheiformes) -Neognatos (Gallus) Reptiles (1 ) -Anapsides -Lepido-aurides -Arcosaurios Anfibios (1,4) Rana^ no XenopuSj si Peces (1,4) -Agnates -Condrictios -Osteictios iCyprinus) Se muestran solo aquellos ôrdenes que incluyen especies con reactividad ensayada, la cual, entre las positivas, puede ser muy variable dentro de un mismo orden (1,2). Los ôrdenes entre paréntesis en la columna de reactivi­ dad negativa son excepciones, e incluyen especies con reactividad positiva. Referencias: 1, Kronvall y col., 1970a; 2, Richman y col., 1982; 3, Kronvall y col., 1974; 4, Zikan y col., 1980 La cromatografîa de afinidad con PA-Sepharose es el procedimiento que ha permitido extender la reactividad con PA a las inmunoglobulinas de vertebrados inferiores, como peces y anfibios (Zikan y col., 1980). 1.4. INMUNOGLOBULINAS Son glicoproteinas de origen animal con actividad anticuerpo como propiedad efectora caracteristica, aunque participan, ademâs, en otros aspectos de la inmunidad humoral o funciones del sistema inmune de los animales vertebrados no mediadas exclusivamente por células. Se encuentran de dos modos diferentes: en la mem- brana de los linfocitos, como receptor de antigeno, y en circulaciôn, sangre u otros fluidos corporales, como anti­ cuerpo secretado por células derivadas de los linfocitos, desempehando su funcién anticorpal, asi como otras secunda^' rias a la union de antigeno, como la. activaciôn del sistema del complemento (Eisen, 1980a). Las inmunoglobulinas de vertebrados forman una familia bastante heterogénea de proteinas, No obstante, siguen un patrôn estructural comun, que puede ilustrarse con la in- formaciôn obtenida de las mejor estudiadas que son las inmuno^ globulinas humanas y de ratén. 1.4,1. Estructura de inmunoglobulinas. Se hallan constituidas por dos polipéptidos de distinto tamaho: uno de 50000-70000 de peso molecular o cadena pesada (H) y el otro de 23000-25000 o cadena ligera (L), siendo el tetrâmero de dos cadenas H idênticas unidas entre si y a dos cadenas L, también idênticas, por puentes disulfuro, figura 1 .2 . , la unidad estructural bâsica. (Putnam, 19 7 7a). Ambos polipéptidos, H y L, se disponen plegados en varias unidades globulares con secuencias homôlogas o dominios de homologia (Edelman, 1970), de unos 110 aminoâci­ dos cada una y con un caracteristico puente disulfuro intra- cadena. De la mayor variabilidad de la secuencia de los do­ minios correspondientes a los extremos N-terminal de cada cadena viene su denominaciôn de regiones variables, Vy Y , y de regiones constantes a los otros dominios, uno en la ca­ dena ligera, C^, y 3 o 4 para las cadenas pesadas, (Putnam, 1977a). En los dominios V se encuentran très segmentes de maxima variabilidad en cortas secuencias de 5-10 aminoâcidos, zonas hipervariables, también conocidas como regiones détermi­ nantes de complementaridad (CDR), ya que son las que definen los sitios de union de los antîgenos, en la asociaciôn V^-V^ (Ray y Cebra, 1972; Padlan y col., 1973). Fv Gozne F (Ob'), Figura 1.2. Representaciôn esquematizada de una molécula de IgG. Los rectângulos corresponden a los distintos dominios de homologia de las cadenas pesadas, en blanco, y ligeras, en negro, identificândose por su abreviatura los de las regiones constantes. Los puentes disulfuro entre cadenas son los de la IgGl humana. El apareamiento de dominios y su disposiciôn trata de adaptarse a la conformciôn espa- cial de la IgG. Los dominios variables tienen franjas que sehalan las regiones déterminantes de complementaridad. Sobre los dominios Cy2 se indican las cadenas de oligosa- caridos. Se muestran, asimismo, las regiones y fragmentes mas caracterî sticas de la molécula. Adaptado de Marquart y Deisenhofer , 1982. Las regiones constantes, en cambio, presentan una variacion restringida a unas pocas secuencias, cadenas y, a, Y 5 6 y 6 , que determinan las distintas clases de inmunoglo­ bulinas, IgM, IgA, IgG, IgD é IgE, respectivamente, con pro- piedades biologicas diferentes. Algunos de estos tipos de cadenas constan de varias relacionadas que definen las sub- clases de inmunoglobulinas, por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas (Putnam, 1977a). El tipo de cadena ligera, X o K, también vienen definidos por la estructura del dominio C^, asociândose indistanmente con cualquiera de las cadenas pesadas (Putnam, 1977a). Aunque la forma H 2L 2 es la habituai en inmunoglo­ bulinas circulantes, las cadenas pesadas de algunas clases tienen una pequeha prolongaciôn en su extremo C-terminal que permite la polimerizaciôn de esas unidades monomêricas bâsicas, apareciendo entonces en forma de dimeros o trimeros, IgA, y pentâmeros, IgM (Koshland, 1975). Sin embargo, en la superficie del linfocito, todas las clases de inmunoglobuli­ nas se encuentran como monômeros y su cadena pesada tiene en su extremo C-terminal un corto segmento adicional, no présen­ te en las formas circulantes, por donde se insertan en la membrana plasmâtica del linfocito (Tyler y col., 1982). 1.4.2. Genes de inmunoglobulinas. El clonaje molecular y la caracterizaciôn estructu- — z z ̂ ral de los genes de inmunoglobulinas, ha contribuido deci- sivamente a la comprension de la diversidad de esta familia de proteinas, expresada fundamentalmente en su capacidad para unir un enorme numéro de antîgenos distintos, asi como en la variedad de reacciones inmunolôgicas que pueden iniciar. Asimismo, estos estudios han aportado pautas signi- ficativas sobre la hiscoria evolutiva de las inmunoglobulinas El sistema de genes de inmunoglobulinas de raton y humano son los mejor conocidos y comprenden très grupos de ligamiento distintos, uno para las cadenas pesadas y otro para cada tipo de cadena ligera, X y k , situados, respecti­ vamente, en los cromosomas 12, 16 y 6 de raton y en los 14, 22 y 2 de humano (Honjo, 1983). 1.4.2.1. Genes de regiones variables. Las regiones variables de las cadenas ligeras son codificadas por dos segmentos separados de. DNA, denominados V y J (Tonegawa y col., 1978; Max y col., 1979) y las de las cadenas pesadas, ademâs de por segmentos V y J similares, por un segmento D adicional (Early y col., 1980). Cada segmento V comprende dos exones o secuencias codificantes, de los que el situado en su extremo 5 ’, déter­ mina los aminoâcidos -19 a -5 de la secuencia de sehal que precede al aminoâcido N-terminal de la cadena ligera o pe- sada y que es escindido durante la traducciôn, en tanto que el otro codifica el resto de la secuencia de sehal y la mayoria del dominio variable, residues -4 a 9 5-100 (Tonegawa y col., 1978). Estos exones del gen V se denomi- nan L y V, respectivamente. Los segmentos J, asi denominados porque definen la secuencia de union entre regiones variables y constantes, codifican 13-21 aminoâcidos en las cadenas pesadas y 12 en las cadenas ligeras (Honjo, 1983). Los segmentos D, de diversidad, definen primaria- mente los fragmentos de distinta longitud correspondientes a la ultima region hipervariable, entre las secuencias codi­ ficadas por los segmentos Vy y (Early y col., 1980 ). Los segmentos V se encuentran presumiblemente en el extremo 5 ’ de cada uno de los grupos de ligamiento con los genes de cadenas H y L, a una distancia indeterminada de los segmentos J, figura 1.3. , y aunque su numéro exacto no es conocido pueden ser varios centenares (solo 2 V^, sin embargo, en ratôn) (Honjo, 1983). Los segmentos se dispo­ nen en tandem, separados entre si por secuencias intermedias no codificantes, intrones, de unos 15 K p b , agrupados en fa- milias multigênicas de genes del mismo subgrupo Vy (Rechavi y col., 1982) que parecen guardar relaciôn con los subgrupos de regiones Vy definidos por el anâlisis comparado de las L V DJ E Sjf, ^Cyl H Cy2 Cy3 Ml M2 Precursor del mRNA IgGl de membrane I Precursor del mRNA IgGl secretorio Vr CrI H Cr2 Cr3 Mi I _u_ , I zru mRNA de IgGl secretorio Fi gura 1,3. Esquema de la produccion de genes activos de cadenas pesadas de inmunoglobulinas y de su transcripcion. En A, B, y C, se muestran las estructuras de los DNA correspondien-r tes a la linea germinal, a células B productoras de cadena,s y y a células en las que se ha producido el cambio de clase de inmunoglobulina expresada, respectivamente, El gen de regién variable résulta de la, recombinacion de segmentos V, con su promotor, (•), D y J, tras la que se activa la transcripcion del gen y activo, bajo control de la secuencia "enhancer", E (o), La secuencia E se conserva en el intrén del gen yi creado a partir de la recombinaciôn entre regio­ nes S, Sy y Sy . Los exones de los genes de cadena pesada se han esquematizado sobre el caso del yi, siendo V y C los correspondientes a los dominios variables y constantes. Figura 1.3. (continuacion), L a la secuencia de sehal, y H a la region gozne. Como unidades transcripcionales complejas que son pueden dar lugar a dos mRNA. uno para IgGl secretoria y otro para la de la superficie del linfocito, que incluye los exones de membrana. Ml y M2. las secuencias no codifi­ cantes de estos RNA son escindidas para dar lugar al mRNA definitivo. (★) représenta los "caps" del extremo 5' de los RNA. Todo el esquema basado en uno de Gillies y col., 1983, ampliado con informaciôn de Sakano y col., 1983, de Tyler y col., 1982 y Kemp y col., 1983. secuencias de aminoâcidos (apartado 1.4.3. ; Capra y Kehoe, 1975). Hay muchos menos segmentos J, 4-7 funcionales junto a algunos seudogenes J (genes inactivos de secuencia relacionada con la del gen funcional) agrupados densamente en un conjunto muy proximo, a unos 3 Kpb, del extremo 5 ’ del de los genes de regiones constantes (figura 1.3. ; Sakano y col., 1980; Hieter y col., 1982), si bien el sistema de genes de cadenas X de raton se aparta excepcionalmente de esta configuraciôn (Elliott y col., 1982). El numéro preciso de segmentos D es desconocido, asi como su localizaciôn respecto de los otros elementos del sistema de genes de cadenas pesadas, aunque 11 de ellos, per- tenecientes a très families de segmentos D, agrupados en una corta region del genoma de raton, adyacente al extremo 5' del conjunto de segmentos Jy (Wood y Tonegawa, 1983). Los segmentos D humanos descritos, también parecen organizados en families de genes (Siebelinst y col., 1981). 1.4.2.2. Genes de regiones constantes. Las regiones constantes k de humano y raton son codificadas por un ûnico gen situado a 2.1-2.3 Kpb del bor­ de 3' de los segmentos (Max y col., 1979, Hieter y col., 1982), mientras que se encuentran multiples genes, 4-6, para las regiones constantes X, asociados a sus propios segmentos (Hieter y col., 1981). El sistema de genes que codifican las regiones constantes de las cadenas pesadas contiene varios genes que comparten un ûnico conjunto de segmentos (Shimizu y col., 1981). El de raton tiene 8 genes, tantos como tipos de ca­ denas pesadas, correspondientes a 5 clases de inmunoglobulinas, una de ellas, la G, con 4 subclases, agrupados en un segment to de 200 Kpb en el orden 5 ’ - y - 6 - y 3 “ Y i - Y2]̂ ^ Yẑ ̂ - - e - a - 3' (Shimizu y col., 1981), En humano, ademâs de los 9 genes de cada cadena pesada, 5 clases de inmunoglobu­ linas, 1 con 2 subclases, IgA, y otra con 4, IgG, se encuen­ tran, al menos, 3 seudogenes, uno ipy y dos i|̂e (Flanagan y Rabbits, 1982). Su disposiciôn en el genoma, a pesar de no estar completamente establecida, difiere de la observada para los genes Cy de raton, encontrândose mezclados genes y, e y a, en el orden 5'- y - 6 - — Ya “ Yi ~ - Qj - - “ “ Y2 - Y4 - E - «2 -3', indicando con trazo discontinuo los segmentos de DNA de estructura desconocida (Flanagan y Rabbits, 1982). El seudogen y no se ha, localizado y el seudegen G2 es un gen procesado (seudogen generado a partir de la se-r cuencia de un gen funcional via un RNA intermedio) présente en otro cromosoma (Batley y col,, 1982). Mientras el dominio constante de las cadenas ligeras es codificado por un ûnico exôn (Max y col,, 1981), los genes -28- de regiones constantes de cadenas pesadas constan de 3 (a y 6) o 4 (y, e y y ) , correspondientes a cada uno de los dominios de homologia, asi como a la region iozne (zona caracteristica entre los dominios y Cy2 de algunas clases de inmunoglobulinas, figuras 1.2. y I.3.). Excep­ cionalmente el gozne de esté incluidoien el exôn del dominio C^2 (Honjo, 1983). Ademâs, a 2-3 Kpb del extremo 3 ’ de los exones que codifican el dominio con el grupo car- boxilo terminal de las inmunoglobulinas circulantes, se encuentran dos exones Ml y M2 que codifican, respectivamente, los segmentos hidrofôbico e intracitoplasmâtico de las in­ munoglobulinas de membrana (Yamawaki-rKataoka y col., 1982 ). 1.4.2.3. Genes de inmunoglobulinas activos. La expresiôn de los genes de inmunoglobulinas es­ ta asociada al proceso de diferenciaciôn de linfocitos y précisa de la recombinaciôn somâtica de algunos segmentos de genes de la que résulta, en la célula productora de in­ munoglobulinas, de configuraciones gênicas distintas de la descrita en el apartado anterior, correspondiente a la con­ figuraciôn germinal. Ademâs, ocurren otros fenômenos como la exclusiôn alêlica e isotipica, el cambio de clase de inmuno­ globulina sintetizada y la mutaciôn somâtica, que se descri- ben en el apartado 1.4.6. Un gen de cadenas ligeras activo se forma al unirse uno de los segmentos con cualquiera de los segmentos con la deleccion del PNA intermedio (Max y col., 1979). Para las cadenas pesadas, un segmento D se une a uno de los segmentos y a ellos se une uno de los segmentos , con la deleccion de las secuencias intermedias, figura 1.3. (Early y col., 1980). En estos procesos de recombinacion somâtica parecen intervenir cortas secuencias de los bordes de los distintos segmentos V, D y J, que por su estructura pueden constituir senates de recombinacion en la molécula de DNA (Early y col. 1980). Buena parte de la diversidad expresada por los dominios V estâ relacionada con estos eventos recombinacio- nales, en primer lugar por la asociaciôn aleatoria de seg­ mentos, y en segundo, por la flexibilidad del proceso en cuanto al sitio preciso de recombinaciôn (Tonegawa, 1983). Aûn se produce otra recombinaciôn en la formaciôn de genes activos de cadenas pesadas, cuando en la diferencia- ciôn del linfocito se produce un cambio en el tipo de cadena pesada sintetizada y que ocurre, al menos una vez, cuando el linfocito se convierte en plasmocito secretor de inmuno­ globulinas (apartado 1.4.6.; figura 1.5.). Este nuevo tipo de recombinaciôn tiene lugar entre regiones situadas a 1-4 Kpb del extremo 5 ’ de los genes (excepte del C^) que -ou- contienen secuencias de nucleotides relacionadas repetidas en tandem, de estructura generalmente conservada, conocidas como regiones S, figura 1.3. (Ravetch y col., 1980). En este proceso, recombinaciôn S-S, el gen V, producido en la re­ combinaciôn V-D-J, es llevado al extremo 5' del gen que va a expresarse, con la delecciôn del DNA intermedio (Kataoka y col., 1980). Esta deleccion, como las que ocurren en la generacion de genes V activos se explican segun dos modelos: uno postula que esa region de DNA forma un bucle expuesto que es escindido y el otro esta basado en un sobre- cruzamiento desigual entre cromatidas hermanas (Honjo, 198 3) 1.4.3. Variantes de inmunoglobulinas. La heterogeneidad de las inmunoglobulinas puede sistematizarse, de manera que las distintas moleculas queden comprendidas en alguna de las categorias o variantes aso- ciadas a caracteristicas estructurales definidas, si bien la discriminaciôn entre ellas se ha venido haciendo serolô- gicamente, por las diferencias antigenicas determinadas por esas estructuras. Cada una de estas variantes suele estar incluida en otra mas general, y asi, mientras ciertas varian­ tes incluyen una sola inmunoglobulina de un individuo, otras comprenden la mayoria de ellas. Las categorias mas amplias o présentes en todos los individuos de una especie se conocen como variantes — <31— isotipicas, y son las clases y subclases de inmunoglobu­ linas, o los tipos y subtipos de cadenas L que se han ci- tado (apartado 1.4.1.), de acuerdo con la existencia de otros tantos genes estructurales para los dominios y C^. Otras variantes isotipicas son las relativas a las re­ giones variables. Hay très grupos de regiones variables, V y , y V^, definidos por genes V de très grupos de liga­ miento distintos, y dentro de cada uno, subgrupos, estable- cidos a partir de las secuencias de regiones variables, que en humanos corresponden a V I-V V, V,I-V,VI y V^I-V^IV^ k k ’ a a - ^ H H . (Wang, 1978), asociados, probablemente a las distintas fa- milias de genes V relacionados (Cory y col., 1981). Las formas alélicas de los distintos genes de inmunoglobulinas determinan las variantes alotîpicas que se presentan en las inmunoglobulinas de algunos individuos de la especie, pero no en las de todos. En humanos se encuen­ tran très grandes grupos de alotipos, Gm, Am y Km, asocia­ dos a alelos de genes C^, y C^, respectivamente, pudiendo ocurrir que cualquiera de estos alelos lleve mas de un alotipo (Natvig y Turner, 1971). Las variantes alotîpicas estân incluidas en la isotipica mâs general: cualquiera de los alotipos Gm es ademâs un isotipo y , por ejemplo. Finalmente, se hallan las formas de inmunoglobulinas présentes en uno o pocos in­ dividuos, correspondientes a las variantes idiotîpicas. Cada uno de los idiotipos es producido por escasos clones celulares, uno solo incluso, aunque no siempre se encuentran asociados a la expresiôn de un sitio combinatorio particular (Hiernaux y Bona, 1982; Kohno y col., 1982). El idiotipo manifestado depende del gen variable expresado, de modo que individuos genéticamente relacionados pueden compartirlo, por ejemplo en la rcspuesta a un mismo antigeno, caso de los idiotipos publicos (Siekewitz y col., 1982) o, por el contrario, como los idiotipos privados, encontrarse en in­ munoglobulinas individualizadas. En algun caso se han podido asociar estructuras de las regiones V con los déterminantes idiotipicos, como en los anticuerpos de ratôn anti-dextra- n o s , en los que los idiotipos privados parecen localizarse en sitios definidos por el segmento D y los publicos en secuencias determinadas por el segmento V (Clevinger y col., 1980). 1.4.4. Estructura tridimensional de inmunoglobulinas. La aplicaciôn de la metodologia empleada en la cristalografia de rayos X al estudio de la estructura de las moleculas de inmunoglobulina permitio obtener mapas de dis­ tribuciôn de densidad electrônica en el cristal de la pro- teina considerada, a partir de su patrôn de difracciôn de rayos X, los cuales, en condiciones favorables, alcanzan resoluciones de hasta 2 K, casos en los que si se conoce la R e g i o n e s H i p e r v a r i a b l e s C O O H C O O H Figura 1.4 Pliegue de la cadena polipeptidica de los doininios variable (I) y constante (II). El esquema muestra los segmentos antiparalelos de las dos laminas 3, con el puente disulfuro que las une (barra negra), que constir- tuyen cada uno de los dominios. El orden de los segmen­ tos en la secuencia de aminoâcidos se corresponde con el alfabetico de las letras con que se designan, indicando con C ’ y C" los segmentos adicionales del dominio varia­ ble. Reproducido de Jensenius y Williams, 1982. secuencia de aminoâcidos de la proteîna, puede deducirse su estructura atomica (Poljak y col., 1976). Los resultados obtenidos con fragmentos o molecu­ las enteras de inmunoglobulinas, sobre todo IgG, muestran que sus cadenas polipeptîdicas aparecen plegadas espacial- mente en estructuras compactas independientes, correspon­ dientes a los distintos dominios de homologia, unidas por tramos lineales. Asimismo, la conformaciôn de cada una de ellas comparte un patrôn caracteristico, denominado pliegue de inmunoglobulinas (Schiffer y col., 1973 ; Poljak y col., 1973), constituido por dos laminas beta antiparalelas, una de 4 segmentos y la otra de 3, que delimitan un volumen den­ samente ocupado por cadenas latérales de aminoâcidos hidrôfo- bos, unidas por un puente disulfuro en direcciôn perpendicu­ lar a los pianos definidos por ambas lâminas, figura 1.4. Aproximadamente, la mitad de los aminoâcidos del dominio constituyen los segmentos de las lâminas antiparalelas, en tanto que el resto, en configuraciones variables, forma los codos y lazos de conexiôn de esos segmentos. Aunque todos los dominios presentan un aspecto conformacional extraordinariamente similar, los de regiones variables tienen dos bucles mâs, correspondientes a la mayor longitud de su cadena polipeptidica, dispuestos en la lâmina équivalente de 3 segmentos de los dominios constantes (Poljak y col.,1973). -35- Las interacciones no covalentes contribuyen de- cisivamente a la estabilidad conformacional de las inmuno­ globulinas, como demuestra el que las cadenas H y L de una inmunoglobulina reducida no se disocien si no es en presencia de agentes desnaturalizantes (Fleischmann y col., 1961). Es­ tas interacciones no covalentes pueden tener lugar entre dominios adyacentes del mismo o de distinto polipeptido, denominândose interacciones cis y transj respectivamente. Los distintos dominios de homologia, excepto el C^2 , aparecen asociados en parejas, a travês de interacciones transj formando môdulos C^l-C^ y Cy3-C^3, figura 1 .2 . , con extensas âreas de contacte entre ellos. Esta asociaciôn de pares de dominios es de dos tipos. En uno de ellos, obser- vado en dominios variables, se produce a traves de la lâmina de 5 segmentos de ambos dominios, incluyendo aminoâcidos de las regiones mâs invariantes y de las regiones hipervariables (Poljak y col,, 1973), En el otro tipo de asociaciôn, el contacte ocurre por las caras de 4 segmentos de ambas lâminas antiparalelas, y se observa en los pares C^-C^l y Cy3-C^3 (Poljak y col., 1973; Rubber y col., 1976). Los aminoâcidos de las âreas de contacte implicados en estas asociaciones de dominios, son invariantes o estân conservados en las inmuno­ globulinas de distintos animales (Poljak y col., 1973; Saul y col. , 1978 ), Los dominios C^2 de cada cadena no interaccionan —36— entre si, sin embargo, muchos de los aminoâcidos situados en posiciones équivalentes a aquellas a traves de las que se produce la asociaciôn de dominios, interaccionan con las cadenas ramificadas de oligoscârido anclado en esos dominios, las cuales cubren un ârea hidrôfoba que de otro modo estaria expuesta al solvente (Marquant y Deisenhofer, 1982). En las interacciones longitudinales entre dominios consecutivos, interacciones cis, intervienen un numéro redu- cido de contactes, generalmente a traves de los segmentos de cadena polipeptidica no incluidos en las lâminas beta, y por su debilidad permiten cambios conformacionales de la molécula que determinan la forma de flexibilidad molecular conocida como flexibilidad intrasegmental (Amzel y Polajk, 1979; Wrigley y col., 1983). En los modelos tridimensionales de complejos antigeno-anticuerpo, se observa el contacte por enlaces de hidrôgeno, electrostâticos y de Van der Waals, de los grupos quimicos del déterminante antigênico o epitopo, con los de aminoâcidos de las regiones déterminantes de complementari­ dad (Amzel y col., 1974; Segal y col., 1974), dispuestas en codos o bucles espacialmente prôximos de los que conectan los segmentos de las lâminas beta, definiendo cavidades o grie- tas en un extremo del par V^-V^ o sitios activos anticor- pales. De este modo, cambios en el tamaho de las regiones déterminantes de complementaridad, o sustituciones en los -37- aminoâcidos que las constituyen, definen las distintas especificidades de un anticuerpo, manteniêndose la estruc- tura tridimensional del dominie gracias a la configuraciôn de los segmentes de secuencia mâs invariante, conocidos como regiones "framework” (Wu y Kabat, 1970), que constituyen el armaz6n sobre el que se disponen gran numéro de sitios com- binatorios diferentes, 1.4.5. Fragmentes de inmunoglobulinas. La obtenciôn de fragmentes de inmunoglobulinas ha contribuido al establecimiento de la estructura general de su molécula (Porter, 1959), asi como a facilitar la de- terminaciôn de su secuencia de aminoâcidos. Estes fragmentes, preparados comûnmente per proteo- lisis controlada, contienen grupos de dominies adyacentes, con actividad biologica propia y que deffnen regiones carac- teristicas en la molêcula de inmunoglobulina, cuya nomencla­ ture, ademâs, se utilize cada yez que hay que designer un ârea topogrâfica dada de su molécule. El patron de proteplisis esta determinado fundamen- talmente per la organizaciôn estructu%&l de la inmunoglobulina en dominies, pues los puntos susceptibles de hidrolisis suelen encontrarse en los segmentes interdominios. Los fragmentes capitales, denominados Fab y F c , -38- son fragmentes excluyentes que contienen, respectivamente, la region de la molecule de inmunoglobulina con los sitios combinatorios y les dominies constantes del extreme C-ter- minal de las cadenas pesadas. La casi totalidad de les otros fragmentes descritos son polimeros o subfragmentos de estes (tabla I.4.). Fab, de fragmente que une antîgeno, y Fc, de fragmente cristalizable (Porter, 1959), resultan de la proteolisis de la inmunoglobulina en su region gozne,. o zona de estructura relativamente rîgida per su contenido en prolina, con los puentes disulfuro entre cadenas pesa­ das y que puede contemplarse como la interseccion de los brazes de una letra T, como figura asimilable a la forma de una immunoglobulina, cuyo trame horizontal constituye dos fragmentes Fab, y el vertical el fragmente Fc (figura 1.2. ). En terne a esta region se articula la flexibilidad segmentai caracteristica del movimiento independiente de les Fab entre si y del Fc (Marquart y Deisenhofer, 1982). En las inmunoglobulinas sin region gozne estes fragmentes se producen per hidrolisis tambiên en posiciones équivalen­ tes de los dominies C^2 . En la tabla 1.4. se muestran los fragmentes habitualmente utilizados, con su composiciôn y notaciôn terminolôgica. Tabla 1.4. FRAGMENTOS DE INMUNOGLOBULINAS Fragmente Dominios Enzimas Fab y ^ papaina(l), tripsina (2,3) F(ab')2 (Vr -Ch ^" gozne y Ljg pepsina (4,5,6) Fv y VR pepsina (7) Fc C h 2 - C h 3 papaina (IgG)(l),_ proteasa de S. sa7iguis (IgAl) (8) (Fc)sw (Cp3-Cp4)g tripsina (2) Facby (Y sin Cy 3 y L)g plasmina (9) pFc ’ Y CY3 pepsina (4) Fd reducciôn de Fab Fab' VR-CRl-"hinge" y L reducciôn de F(ab')2 Fragmentes de inmunoglobulinas que resultan en su digestion controlada con enzimas proteoliticos. Se muestra la estructura de dominios de los mas usua- les, indicândose su referenda y el enzima que los produce. Referencias: 1, Porter, 1959; 2, Plaut y Tomssi, 1970; 3, Waller y col., 1969; 4, Nisonoff y col., 1960; 5, Kishimoto y col., 1968; 6, Wilson y Williams, 1969; 7, Lin y Putnam, 1978; 8, Plaut y col., 1974; 9, Connell y Porter, 1971. 1.4.6. ProduGcion de inmunoglobulinas en la diferenciacion del linfocito. Antes de su diferenciacion a cêlulas plasmâticas secretoras de anticuerpos, los linfocitos B atraviesan estadios celulares en los que la organizaciôn de los genes de cadenas H y L, el tipo de cadenas expresadas y los nive­ lés de expresiôn de esos genes son distintos (figura 1.5. ). Asi, las cêlulas pluripotenciales hematopoyêticas generan un tipo celular de lînea linfoide que dériva en un linfocito pre-B, paso en el que se produce un gen y active, asi como la expresiôn de cadenas y en el citoplasma, sin expresiôn de cadenas L (Siden y col., 1979). Cêlulas pre-B tardias, con sus genes L actives pero no transcrites, se convierten en cêlulas B inmaduras que expresan cadenas L y exponen IgM en su superficie. En el siguiente estadio hay expresiôn de IgM e IgD, con idênticos sitios combinâtes ries, como receptores de antîgeno, en la superficie del linfocito B (Coffman y Cohn, 1977). La ulterior diferenciaciôn del linfocito B requi­ re su activaciôn por mitôgenos o antîgeno, asl como otros grupos celulares del sistema inmune, linfocitos T y macrô- fagos y sus productos (Melchers y col., 1980). El linfocito B activado sécréta IgM y madura a una cêlula plasmatica productora de anticuerpos IgM o IgA o IgG o IgE, sin inmuno- -41- célulo ^«rminal I union V^OJ^ celulo p rt-B I union V^ÜL inmoduro l > IgM celulo B ^ IgD O recombinocio'n .S-S recombinocio'n S-S no IgM 0 IgD celulo plosmotico secretoro de IgM cC" celulo B de memorio celulo plotma'tico secretoro de Ig no IgM Figura 1.5. Esquema simplificado de la dif erenciacion de linfocitos B, mostrando las translocaciones de genes asociadas a la ex­ presiôn de inmunoglobulinas en superficie (Y) o su secrec- ciôn en los tipos celulares indicados. Modificado de Wall y Kuehl, 1983. -42- globulinas en su superficie, o da lugar a una cêlula B de memoria, con inmunoglobulinas en membrana de otro tipo que IgM o IgD, y que por estimulacion antigênica da lugar tambiên a una cêlula plasmatica, figura 1.5. (McKenzie y Potter, 1979). En esta expansion clonal conducida por antîgeno^ se fijan las mutaciones somaticas que pueden producirse solo despuês de la recombinaciôn de segmentes de los genes V (Gearhart y Bogenhagen, 198 3) y que da lugar a los anti­ cuerpos sin la restriccion de afinidad por el antîgeno que muestran aquellos con sitios combinatorios definidos por genes V primaries de la linea germinal (Rodwell y col., 1983) A le largo de este proceso se expresa une solo de los alelos, materne o paterne, de los genes actives para H y L, fenômeno conocido como exclusion alêlica, que junte con la expresiôn de une solo de los genes C^, À o <, fenô­ meno de exclusiôn isotîpica, détermina que cada cêlula B produzca inmunoglobulinas con un sitio combinatorio ünico (Wall y Khuel, 1983). La activa expresiôn de genes H y L, tras la re­ combinaciôn de los segmentes correspondientes a sus regiones variables, esta controlada por secuencias "enhancer" loca- lizadas en el intrôn que sépara los genes Jr y la regiôn S del gen , figura 1.3. (Barneji y col., 1983), y en po- siciones équivalentes de genes (Queen y Baltimore, 1983), que tienen la propiedad de estimular singularmen- te la tasa transcripcional de genes en su ârea de influen- cia (Banerji y col, 1981). La activaciôn de estas secuen­ cias "enhancer" en el proceso recombinacional que produce los genes actives puede explicar la regulaciôn de su ex­ presiôn si se tiene en cuenta que la secuencia 5' del seg­ mente V, con todos los elementos de los promotores de transcripciôn, se mantiene inalterada en el mismo (Clark y col. , 1982 ). Los genes de cadenas ligeras codifican un ünico fiiRNA y contienen un solo sitio de adiciôn de poli (A) (Perry, 1981), pero los de cadenas pesadas contienen al menos dos, constituyendo unidades transcripcionales comple- jas, capaces de producir dos mRNA, figura 1.3.. Estes sitios se encuentran al final del ultimo exon Cr o al final del ultimo exôn de membrana, de modo que la poliadenilaciôn de une u otro en el RNA transcrite (en un proceso acompahado de la escisiôn del RNA que sigue), da lugar a mensajeros de cadenas pesadas secretadas o de membrana, respectiva­ mente (Rogers y col., 1980). Tras el procesamiento de estes mensajeros en el nücleo celular, reuniendo todos los exones en una secuencia continua, tras la escisiôn de los distintos intrones, figu­ ra I.3., los RNA de cadenas H y L résultantes son traducidos. -44- Su localizaciôn en el retîculo endoplasmâtico rugoso, asî como la translocaciôn de las cadenas H y L a las cisternas, parece determinada por las secuencias de sé­ riai situadas en su extremo N-terminal y que son removi- das antes de la conclusion de la cadena polipeptidica y su liberacion del ribosoma (Blowell y gobberstein, 1975). Las cadenas H y L van adoptando su pliegue intramolecular conforme se sintetizan y una vez completadas se ensamblan (tambiên con las cadenas J si son inmunoglo­ bulinas polimêricas, apartado 1.4.8.1.) y en el aparato de Golgi son glicosiladas antes de su exposiciôn en membrana o secrecciôn al exterior celular (Wall y Kuehl, 1983). 1.4.7. Relaciones evolutivas de inmunoglobulinas. La informaciôn estructural disponible sobre in­ munoglobulinas de vertebrados inferiores se ajusta esencial- mente a los criterios deducidos de las mejor estudiadas de mamiferos, siendo muy probable que compartan un mismo ori- gen evolutivo (Putnam, 1977b). La construccion de cadenas H y L sobre un patrôn estructural récurrente de similar disposiciôn tridimensio­ nal, apunta a un gen primordial codificante para el équiva­ lente de un dominio de 110-120 aminoâcidos como el precur­ sor de los sistemas de genes de inmunoglobulinas (Hill y col., 1966). -45- A1 parecer, ese origen evolutivo es comun, ademas, a otras proteinas con estructuras relacionadas con las de inmunoglobulinas, como los antigenos de clase I y II del complejo principal de histocompatibilidad, la 62-micro- globulina asociada a la cadena pesada de los antigenos de clase I , o antigenos de diferenciacion como el Thy-1 (Jensenius y Williams, 1982), De este modo, la duplicaciôn y ulterior diversifi­ cation de ese gen ancestral, habrîa dado lugar a los siste­ mas codificantes para este conjunto de proteinas relacio­ nadas, despues de seguir evoluciones diferenciadas, como en el caso de los genes de regiones V y regiones C. No obstante, la historia evolutiva de las inmuno­ globulinas, como corresponde a una familia multigênica, no puede interpreterse solo a partir de sucesivas duplicacio- nes y la acumulacion de mutaciones en una evolucion indepen­ diente para cada miembro: de esa familia, que no explicaria la mayor divergencia de la region gozne (Ellison y Hood, 1982),o las diferentes homologias de los distintos dominios constantes de cada cadena pesada (Low y col., 1976; Miyata y col., 1980). Asimismo, el que families de genes muy expandidas, como son las de las regiones variables, acumulen variacio- nes de modo que el dominio codificado no modifique su estruc- tura, sugiere la existencia de mecanismos que prevengan la libre diversificacion de los distintos genes durante su evolucion. Se conocen dos mecanismos de correccion genica que actuan sobre families de genes dispuestos en tandem: la conversion genica y el doble sobrecruzamiento desigual (Baltimore, 1981), y de ambos hay evidencia experimental de su probable participacion en la historia evolutiva de los genes de inmunoglobulinas (Bentley y Rabbits, 198 3; Miyata y col., 1980). Mientras que en la conversion genica un pequeno segmente de un gen es reemplazado por otro de un gen homô- logo, sin variaciôn en el tamaho de las correspondientes families de genes, en el doble sobrecruzamiento desigual, résulta reciprocamente alterado el tamaho de las families afectadas (Baltimore, 1981). De hecho se ha sugerido que las regiones de homo- logia de las inmunoglobulinas, se deben no tanto a la pre- siôn evolutiva sobre la secuencia de nucleôtidos de los distintos genes, sino al mecanismo de correccion que opera sobre ellos (Miyata y col., 1980), de modo que las regiones de homologua consistirian en los correspondientes exones y las secuencias intermedias adyacentes, tal como se deduce —H/ — de la probable transferencia de dominios entre distintos genes, a nivel de secuencias intermedias en los dominios CrI y de regiones gozne en genes y humanos (Takahashi y col., 1982b) y de raton (Miyata y col., 1980) o de exones de membrana de genes y de raton (Yamawaki-Kataoka y col., 1982). Los genes Vr muestran, asimismo, homologuas seg- mentales de diversa longitud (Ollo y col., 1983), sugirien- do el intercambio de bloques de secuencias entre genes, con la actuaciôn de mecanismos de correccion gênica. Para- do jicamente, estos mecanismos, al tiempo que contribuyen al polimorfismo de la familia multigênica interesada, cons- truyendo distintas combinaciones entre elementos de su ré­ pertorie, mantienen su homogeneidad, asu como la funcionali- dad de sus secuencias, de las que las correspondientes a las regiones "framework" se hallan sometidas a mayor presiôn evolutiva a nivel de proteîna, de acuerdo con la mayor tasa de sustituciones observada en las propias de CDRl y CDR2 (Givol y col., 1981; Loh y col., 1983). Los genes Vr tienen en sus bordes 5' y 3' secuen­ cias que pueden determiner estructuras que los hacen elemen­ tos potencialmente transponibles (Rechavi y col., 1983) lo que podrua facilitar la amplificacion de las families de genes, algunos de cuyos miembros ancestrales divergieron incluse -40- antes de la diversificacion de los mamiferos (Kataoka y col., 1982), lo que permute comprender el alto grado de homologua entre genes Vr de grupos de vertebrados evo- lutivamente alejados, como aves, reptiles y mamiferos (Litman y col., 1982). Esta preservacion de homologua, que comprende no solo exones sino regiones no codificantes, es tal que la relacion entre genes del mismo subgrupo Vr de diferentes especies es mayor que la observada entre genes de distinto subgrupo en una misma especie (Rechavi y col., 1983). 1.4.8. Las clases de inmunoglobulinas humanas. 1.4.8.1. Inmunoglobulinas M. Constituyen el 5-10% de las inmunoglobulinas del suero. Son macroglobulinas de alto peso molecular, 900000, debido a su estructura pentamêrica de subunidades de dos cadenas ligeras y dos cadenas y (Miller y Metzger, 1965). Su cadena pesada carece de region gozne y su regiôn constante tiene 4 dominios de homologua, sobre los que se disponen 5 oligosacâridos (tabla 1.5.), que compren- den el 12% en peso de la molécula. Posee, ademâs, un corto segmento en su extremo C-terminal, al que se encuentra unida una pequeha glicoproteuna de 15000 de peso molecular, de- nominada cadena J, cuya suntesis es activada en la diferen- -49- Tabla 1.5. CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES DE INMUNOGLOBULINAS HUMANAS Cadena Clase Mr C Puentes inter H gozne Oligosacârido y IgM 9000Û0(y2L2)g 4 2 - 5Glc a IgA (IgAl,IgA2) 150G0G(a2L2) 3 2 + IgA2 corto IgAl:2Glc,5Gal IgA2;4Glc(A2m(l)) 5Glc(A2m(2)) Y IgG (IgGl,IgG2, IgG3, IgG4) 15GGGG(y2L2) 3 2(yi) 11(Y3) ^(72,74) + IgG3 largo IGlc e IgE 19GGGG(E L2) 4 2 - 6Glc 6 IgD 175000(62!^) 3 1 + largo 4Glc,4Gal Junto al peso molecular (M^) se muestra la composiciôn polipep­ tidica de cada clase de inmunoglobulina. C, es el numéro de do­ minios constantes. Puentes inter H indica el numéro de puentes disulfuro que unen cadenas pesadas en un monômero. La presencia o ausencia de "gozne se sehala por + y -, respectivamente. En el contenido de oligosacâridos de la IgA2 se ha diferenciado el de sus dos forms alotipicas, entre parentesis. Glc y Gai, repre- sentan oligosacâridos de glucosamina y galactosamina. Referencias: Eisen y col., 1980a; Putnam, 1977a; Toraho y col., 1977; Toraho y Putnam, 1978; Takahashi y col., 1983. -50- ciaciôn del linfocito a cêlula plasmatica, donde puede constituir un nücleo de polimerizacion sobre el que se organize la forma pentamêrica de la IgM secretada (Raschke y col., 1979). Las subunidades de la IgM se disponen radial- mente, con sus regiones Fab en la periferia de un disco piano, el fragmente (Fc)^y, constituido por los dominios Cy3 y Cy4 de cada una de ellas, unidos por puentes disul­ furo, y una molêcula de cadena J, caracteristica de las inmunoglobulinas polimêricas, tambiên unida por puentes disulfuro a una de las subunidades. A diferencia de lo que ocurre en inmunoglobuli­ nas de otras clases, los dominios de la region Fc de cada subunidad presentan interacciones no covalentes dé­ biles (Hester y col., 1975). Aunque carece de region gozne, la IgM muestra flexibilidad segmentai, que résul­ ta afectada por cambios conformacionales en sus dominios Cy2 (Holowka y Cathou, 1976; Segel y Cathou, 1981), y que hace posible la extraordinaria libertad de movimientos de sus regiones Faby observada en micrografias electrônicas (Feinstein y col., 1971). Quizâ su naturaleza polimêrica sea la propiedad funcionalmente mâs destacable, ya que con sitios anticorpa- les de baja afinidad por el antîgeno, en general (Karush, 1978), -51- muestra una eficaz interaccion con el, siendo, por ejemplo, el anticuerpo tipicamente aglutinante de microorganismos. No obstante, las moleculas de IgM presentan cierta hetero- geneidad en cuanto al nûmero de sitios de uniôn de antîge­ no activos, de modo que los calculados experimentalmente a veces no coincide con los 10 teôricos, mâximos (Giles y col,, 1983). La activaciôn delsistema del complemento por la uniôn de su elemento Clq es, asimismo, mâs eficaz que la producida por inmunoglobulinas monomêricas, a no ser que se hallen agregadas en inmunocomplejos (Jaton, 1976). De acuerdo con esto, los dominios interesados en la polimerizaciôn de las inmunoglobulinas polimêricas, Cy4 y Ca3, son los que muestran una mayor homologîa, un 50%, de entre los dominios Cr humanos (Low y col., 1976). Ademâs, tambiên son idênticas el 78% de las posiciones de las regiones équivalentes de IgM e IgA de raton (Cann y col., 1982). Por su parte, la homologîa de los dominios de las cadenas J humena y de ratôn a travês del que se unen a las cadenas a y y, es del 75% (Cann y col., 1982), todo lo cual sugiere que las estructuras implicadas en la polimerizaciôn son de los elementos mâs conservados en las molêculas de inmunoglobulina. 1.4.8.2. Inmunoglobulinas A. Las inmunoglobulinas de esta clase son los anti- -oz- cuerpos mâs abundantes en las secrecciones de las glân- dulas exocrinas, aunque tambiên se encuentran en el suero, constituyendo alrededor del 15% de las inmunoglobulinas. Gran parte de la IgA de suero es un monômero de dos cadenas ligeras y dos cadenas a, de 150000 de peso mo­ lecular, pero tambiên aparece como dimeros y trimeros de esa subunidad (tabla 1.5. ). Hay dos cadenas a que corresponden a las subcla- ses IgAl e IgA2, con 3 dominios de homologîa en sus regiones constantes y una regiôn gozne, que en las tiene 13 ami­ noâcidos menos (Toraho y Putnam, 19 78) y por ello carece de 5 cortos ;sacâridos caracteristicos, unidos 0-glicosîdicamen- te en esa regiôn, aunque su contenido en oligosacâridos unidos 0-glicosidicamente es mayor (Toraho y col., 1977). La mayoria de las IgA2 son de una forma alotipica, IgA2m(l), en la que las cadenas ligeras y pesadas se encuentran aso­ ciadas de modo no covalente (Toraho y Putnam, 1978). En las secrecciones exocrinas la abundancia de ambas subclases de IgA es similar, a diferencia de lo que ocurre en suero, donde el 85% es IgAl. La IgA exocrina es- tâ constituida por dos subunidades de IgA monomêrica y una molêcula de cadena J, unida por puentes disulfuro al corto segmento del extremo C-terminal, a una de las cadenas a —53— de cada subunidad (Garcia Pardo y col., 1981), como en las formas polimêricas de suero. Contiene ademâs, carac- teristicamente, una glicoproteina de 71000 de peso mole­ cular, unida por dos puentes disulfuro a la cadena pesada de una de las dos subunidades ■. (Garcia Pardo y col., 1979), denominada pieza secretoria, por su papel en el transporte de la IgA hacia la luz de las vias de secreciôn. (Brandtzaeg, 1981). 1.4.8.3. Inmunoglobulinas G. La IgG constituye el 80% de las inmunoglobulinas del suero. Su peso molecular de 150000 se corresponde con la estructura de dos cadenas ligeras y dos cadenas y. El 3% en peso de la molêcula se debe al ünico oligosacârido de sus cadenas pesadas (tabla I.5.). Hay 4 tipos de cadenas y, todas con 3 dominios de homologia en sus regiones constantes, que determinan las subclases IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, con diferencias locali- zadas, fundamentalmente, en sus regiones gozne (tabla 1.5.), de las que resultan, por ejemplo, distintas susceptibili- dades a la proteolisis (Turner y col., 1970; Virella y Parkhouse, 1971). Asi, mientras la longitud de la regiôn gozne de IgGl, IgG2 e IgG4 es similar, la de IgG3 es mayor, por repeticiôn de la correspondiente secuencia (Michaelsen y col., 1977). La uniôn entre las cadenas pesadas se produce a travês de puentes disulfuro en la regiôn gozne , en nûmero variable segûn la subclase de que se trate (tabla 1.5. ). Asimismo, en la IgGl la cadena ligera se une al final del dominio Cr I, en vez de al principle del mismo, como ocurre en las otras subclases (DePreval y col., 1970) Por otro lado la abundancia relativa de cada una de las subclases en suero es tambiên distinta: 60 % IgGl, 30%, IgG2, 7 %, IgG3 y 3 %, IgG4 (Eisen, 1980a), y de acuerdo con las estructuras propias de sus cadenas pesadas muestran actividades biolôgicas diferenciadas, taies como la uniôn a receptores de IgG en la superficie de cêlulas efectoras del sistema inmune (Winkelhake 1978), o en la capacidad de activaciôn del sistema del complemen­ to (Brunhouse y Cebra, 1978). 1.4.8.4. Inmunoglobulinas E. Las inmunoglobulinas de esta clase se encuentran en la superficie de leucocitos basôfilos y mastocitos, uni- das a receptores de estas cêlulas especificos de IgE (Spiegelberg, 19831, y en muy pequehas cantidades en suero, Su cadena pesada, con 4 dominios de homologia en su regiôn constante, y sin regiôn gozne. (Bennich y von Bahr-Lindstrom, 19741, tiene 5 oligosacâridos, lo que — 00 — en conjunto détermina el alto peso molecular de estas inmunoglobulinas5 constituidas. por monômeros de dos cade­ nas ligeras y dos cadenas e (tabla 1.5. ). La IgE media caracteristicamente las reacciones de hipersensibilidad inmediata, producidas por las sustan- cias liberadas desde las cêlulas donde se encuentran uni- das, tras la agregacion de los receptores de IgE que sigue a la union de su antigeno (Segal y col., 1977). 1.4.8.5. Inmunoglobulinas D. La IgD se encuentra en muy bajas concentraciones en suero, un 0.2% de las inmunoglobulinas, y esta consti­ tuida por dos cadenas ligeras y dos cadenas 6, con un pe­ so molecular de 175000 (tabla I;5.). La cadena 6 tiene 3 dominios de homologia en su region constante, y una larga region gozne (Lin y Putnam, 1977), con 4-5 oligosacâridos cortos, unidos 0-glicosidica­ mente, que con los 3 oligosacâridos complejos de otras re­ giones de la cadena pesada, determinan asi un peso molecu­ lar para la IgD intermedio entre los de las formas monomê­ ricas de inmunoglobulinas con 3 o con 4 dominios Cr . Las inmunoglobulinas de esta clase son las ünicas cuyas cadenas pesadas se hallan unidas por un ünico puente disulfuro, en la region gozne (Lin y Putnam, 1979), Asimismo, en tanto las cadenas ligeras humanas se encuen­ tran asociadas con las distintas cadenas pesadas en la proporciôn 70%k, 30%X (Putnam, 197 7a), aproximadamente el 80% de las IgD llevan cadenas \ (Takahashi y col,, 1983). Su actividad biolôgica, aparté la de receptor de antigeno de su forma de membrana (Rowe y col., 1973), es aûn bastante desconocida, 1.5. INTERACCION PROTEINA A-INMUNOGLOBULINAS Aunque las primeras manifestaciones de esta interaccion, observadas en la precipitaciôn en geles de agarosa de sueros de individuos humanos en presencia de extractos de cepas de S\ aureus con proteîna A, fueron atribuidas a la existencia en los sueros de anticuerpos contra componentes bacterianos (Jensen, 1958), las evi- dencias en contra de la participaciôn de las inmunoglobu­ linas como anticuerpos en esta reaccion, atrajeron la atenciôn de numerosos investigadores hacia el estudio de esta particular interacciôn. 1.5.1. Independencia de la funcion anticorpal. Los métodos iniciales de estudio de la reactivi' dad de PA con inmunoglobulinas, se han basado en el anâli' sis de la formaciôn de complejos precipitables, o su inhi- -57- bicion, definiendo reactividades précipitante e inhibi- dora de precipitaciôn, respectivamente (Kronvall y Williams, 1969). Cuando por estos medios se observô que el 45% de la IgG de suero humano normal precipitaba en presencia de preparaciones de PA de la cepa Cowan I, y que esta reacciôn de precipitaciôn ocurre tambiên con proteinas IgG de mieloma distintas, se sospechô que se trataba de una reacciôn diferente de las de tipo antigeno-anticuerpo. Por otra parte, los fragmentos Fab y Fc de IgG humana policlonal, no precipitan en agarosa con PA, pero mientras el Fab no es capaz de inhibir la reacciôn de pre­ cipitaciôn de IgG y PA, el Fc si (Forsgren y Sjoquist, 1966) Asimismo, fragmentos Fab de IgG de mieloma con actividad anti-estreptolisina 0, no son absorbidos, a diferencia de la IgG entera, por organismos aureus con PA (Kronvall, 1967), Todos estos resultados coinciden en sehalar que en la interaccion considerada no se hallan implicados los sitios combinatorios de las inmunoglobulinas, y que el re­ ceptor o receptores de PA han de hallarse en otro punto de sus molêculas, —58— 1.5.2. Interaccion con IgG a travês de la region Fey. Desde los primeros estudios, tambiên, la reac- tividad de la IgG con PA fue asociada a estructuras de sus cadenas pesadas, pues êstas, a diferencia de las cade­ nas ligeras, conservan la capacidad de interaccion con la PA e inhiben la reacciôn de precipitaciôn con la molêcula Intacta (Forsgren y Sjoquist, 1966). Adicionalmente, de las distintas reactividades de varies fragmentos de IgG, apuntan a la localizaciôn del receptor de PA en la regiôn Fcy, ya que en tanto el Faby o el F(ab’)2y no son actives en la reacciôn de precipitaciôn, el Fcy , pero no subfrag­ mentos, como el F c ’ o el p F c , es capaz de dar reacciones de inhibiciôn, aunque, sin embargo, por si solo no forma complejos precipitables con PA (Kronvall y Frommel, 1970). La reducciôn suave y alquilaciôn del fragmente Fcy (Kronvall y Frommel, 1970) o la proteolisis del mismo con tripsina, despuês de su desnaturalizaciôn parcial con pH âcido (Endresen y Grov, 1976), dan lugar a productos que conservan la reactividad con PA, con la comûn caracte­ ristica de tener intacta al menos una de sus cadenas (Endresen y Grov, 1976). Estes resultados, junto con la ausencia de reactividad observada para el fragmente Facby (Lancet y col., 1978), sugieren que la estructura definida por los dominios 0^2 y Cr 3, intactes y adyacentes, es im- prescindible para la interacciôn del fragmente Fcy con -59- la PA (Lancet y col., 1978 ).' Los fragmentos Fc de la IgG de otros mamiferos (cerdo, raton, conejo, cobayo) precisan mantener, analoga- mente, los contactes intracadenas de sus dominios, lo que configura un receptor general de PA, en la region Fc de las moleclas de IgG, evolutivamente conservado, al menos en el grupo de vertebrados mamiferos (Kronvall y col., 1970a). Estas conclusiones se han confirmado en el anâ- lisis de la estructura a nivel atômico de los cristales formados por el fragmente B de la proteina A (apartado I.3.2.3.) y la regiôn Fc de IgG humana (Deisenhofer y col., 1978). De los dos tipos de contactes observados en estos cristales, el mâs probable en la interacciôn que ocurre en soluciones acuosas, parece ser uno de naturaleza hidrôfoba, de 1234%^ de superficie, en el que participan aminoâcidos de los dominios Cr 2 y 0^3 y de las dos hélices a en que se organize buena parte de la cadena del fragmente B (Deisenhofer, 1981). De acuerdo con esto, ademâs de la Ile253 del Fey, que se encuentra completamente cubierta por aminoâcidos del fragmente B, los otros residues del Fcy implicados en la interacciôn son: Met252 y Ser254, Leu3Û9 ,His310,Glu311 y Asn434,His435,Tyr436, que se hallan dispuestos muy prôximos entre si, en el ârea entre los dominios Cr 2 y 0^3 (Deisenhofer y col., 1978). Los estudios cristalogrâficos coinciden asimismo con los resultados obtenidos acerca del efecto de la modi- ficaciôn quimica selectiva de aminoâcidos de la PA sobre su reactividad con IgG, los cuales han mostrado la importancia de las Tyr. Asî, la secuencia Phe-Tyr-Glu, présente tambiên en posiciones équivalente de los otros dominios de homolo­ gîa de la PA (Sjodahl, 1977a), es uno de los puntos de con-. tacto de una hélice a del fragmente B con el Fcy (Deisenhofer, 1981), y de acuerdo con el anâlisis de aminoâcidos de la PA (Sjoquist y col., 1972a), debe ser la que résulta alterada en tratamientos con acetilimidazol (Sjoholm y col., 1972), tetranitrometano (Sjoholm y col., 1973) o yodaciôn (Sjoholm y Sjodin, 1974), en los que se encuentran implicados resi­ dues de Tyr, y que van acompahados de pérdida de reactivi­ dad de la PA. Los estudios de modificaciôn quîmica de IgG, en cambio, solo han podido identificar a la His como aminoâcido esencial en la interacciôn con PA (Haake y col., 1982), pro- bablemente la His435 del contacte observado en el cristal (Deisenhofer, 1978). En otras modificaciones menos selecti- v a s , resultan pérdidas de actividad por acetilaciôn o cambio de reactividad précipitante a inhibidora de precipitaciôn por carbamilaciôn (Kronvall y col., 1970d). 1.5.3. Reactividad de las subclases de IgG. El estudio de la interacciôn con PA de distintas IgG humanas de mieloma, muestra que las subclases 1, 2 y 4 son reactivas, tanto como précipitantes como inhibidoras de precipitaciôn, mientras las IgG3 no presentan ninguna de las dos actividades (Kronvall y Williams, 1970). Esta distinta reactividad de las subclases de IgG humana, es la base de un método de purificaciôn de IgG3, que utiliza la cromatografîa de afinidad con PA-Sepharose (Patrick y Virella, 1978). No obstante, entre el material de suero humano que es retenido en esta columna de afinidad, se ha detectado la presencia de parte de la IgG3 (Skvaril, 1976; Van Kamp, 1979). Esto puede estar relacionado con la existencia de proteinas IgG3 reactivas con PA, y que mues­ tran cambios en la secuencia de su regiôn F c , particularmen- te la sustituciôn en las posiciones 435-436, que en estas proteinas es His-Tyr en lugar de la Arg-Tyr habituai (Recht y col., 1981), y que con otras, se encuentra en las varian­ tes alotipicas G3m(u~) (VanLoghem y col., 1982). Son, pues, alelos 7 3 que codifican una secuencia en esa zona del domi­ nio Cr3, idêntica a la de las subclases 1, 2 y 4 implicada en la interacciôn con PA. Tambiên se ha apreciado reactividad diferencial en las subclases de IgG de otros mamiferos, principalmente referida a su distinto comportamiento en columnas de PA-Sepharose, debido a los esfuerzosdedicados a la busqué- —bZ— da de condiciones cromatograficas que permitan el aisla- miento de subclases de IgG, no logrado per procedimientos convencionales. Asi, cuando el suero de raton es cromatografia- do en una columna de PA-Sepharose a pH 8.0, y el material retenido en el gel es eluido con tampones de acidez crecien- te, se observa la disociaciôn secuencial de IgGl, IgG2a e IgG2b (Ey y col., 1978). La interacciôn de la IgGl con la columna es muy dêbil, pues si la cromatografîa se hace a pH 7.0, apenas es retenida. Estudios con proteinas de mie- loma confirman estos resultados y extienden la reactividad a la IgG3 (Mackenzie y col., 1978b). La interacciôn de la IgG de cabra con FA es dêbil, siendo en todo caso mayor la afinidad de la JgG2 que la de la IgGl, la cual solo se une a columnas alargadas de PA-Se­ pharose de gran capacidad y a pH 9.1 (Delacroix y Vaerman, 1979). Son IgGs que no dan reaccion de precipitaciôn con PA, sino de inhibiciôn (Kronvall y col., 1970a). La IgGl e IgG2 de oveja muestran asimismo, un comportamiento similar al observado para las subclases 1 y 2 de cabra, respectiva- mente (Bennell y Wattson, 1980). La IgG2a de rata no se fija a columnas de PA-Sepha- rose, y la IgG2b solo en condiciones como las citadas para la IgGl de cabra (Rousseaux y col., 1981). La IgGl interac- ciona tambiên débilmente, como la IgGl de raton, y solo la IgG2c es claramente retenida por la columna (Rousseaux y col. , 1981). En cualquier caso, la separaciôn de las distin­ tas subclases por su interacciôn con PA dependiente de pH no es definida, y su utilidad como procedimiento de puri- ficaciôn de subclases de IgG, limitada (Ey y col., 197 8; Delacroix y Vaerman, 197 9; Chalon y col., 1979), ya que es una interacciôn que muestra heterogeneidad intraisotipica, como es el caso de la IgGl e IgG2 de cobayo (Ricardo y col., 1981), ambas précipitantes, a diferencia de las IgG de ratôn (Kronvall y col., 1970a), y que por eluciôn de la columna de PA-Sepharose con tampones de distinto pH se se- paran en dos fracciones que contienen moléculas de ambas subclases (Ricardo y col., 1981). Este fenômeno se aprecia tambiên con las IgG de otros roedores (Coe y col., 1981) y con proteinas de mieloma de rata (Rousseaux y col., 1981) y ratôn (Mackenzie y col., 1978b). La IgG humana, que a pH neutro se une a PA-Sepharose, excepto la IgG3, puede resolverse, en determinadas condiciones, en un eluido que muestra una cierta separaciôn de IgG2, que sale de la co­ lumna a pH algo menos âcido que la IgGl (Duhamel y col., 1979). 1.5.4. Reactividad de otras clases de inmunoglobulinas con proteina A. 1.5.4.1. Inmunoglobulinas A. La primera referencia de inmunoglobulinas no IgG reactivas con PA corresponde a proteinas IgA de calostro humano (McDowell y col., 1971). Sin embargo, esta reacti­ vidad no incluye a la totalidad de la IgA de calostro o de suero, ni la de las proteinas de mieloma (Grov, 197 6; Saltvedt y Harboe, 19 76; Van Kamp, 1979). A diferencia de la de IgG, la interacciôn de IgA con PA no puede apreciarse por medio de reacciones de pre­ cipitaciôn directa en geles de agarosa, pero si en modifi- caciones del mêtodo, que permiten la formaciôn de complejos precipitables constituidos por la PA, la inmunoglobulina no précipitante y un tercer elemento, como fragmentes F(ab')2 de anticuerpos anti-PA, en lo que se denomina reacciôn de coprecipitaciôn (Kronvall y Williams, 1971). Estos complejos, cuando los reactantes difunden en el gel de agarosa desde dos puntos, forman una banda rec­ ta, pero cuando difunden desde très pocillos dispuestos como vertices de un triângulo, el precipitado adopta una forma caracteristica, constituida por très lineas que, partiendo de cada pocillo, converger dibujando una estrella de très puntas, lo que dio a esta precipitaciôn el termine de fenô- meno estrella (Kronvall y Williams, 1971; Grov y Endresen, 1976). Aunque se llego a asignar la reactividad de la IgA a moléculas de la subclase IgA2 (Saltvedt y Harboe, 1976), esta conclusion no se ha confirmado y , en realidad, no pa-r rece existir ninguna relaciôn entre los isotipos de IgA y su capacidad de interacciôn con PA (Brunda y col., 1979; Van Kamp, 197 9; Biewenga y col., 19 82). Sobre la estructura de la molecula de IgA implica- da en la uniôn de PA, los resultados no son claros. Asi, los fragmentos F(ab')2a, preparados a partir de IgA de calostro humano que se une a columnas de PA-Sepharose, no son reteni- dos por la misma columna, ni dan reacciôn de coprecipitaciôn (Grov, 1976). Por otro lado, el fragmente F(ab')2a no con­ serva la capacidad de uniôn de la IgAl de mieloma de la que se obtuvo, para unirse a células de 5. aureus con PA (Brunda y col., 1979). Estos son resultados que se han interpretado en base a la presencia en la regiôn Fca del sitio de interac­ ciôn de la IgA con la PA. Sin embargo, tambiên se han des­ cribe proteinas IgA cuyos fragmentos F(ab')2a son réactivés con PA, aunque no los Fab o Fab*, apuntando la necesidad de la regiôn gozne para esta interacciôn (Biewenga y col., 1982) Con proteinas de mieloma no se ha podido establecer una relaciôn entre grade de polimerizaciôn y reactividad con PA (Brunda y col., 1979) y las fracciones de IgA poli- -66- clonal de calostro o suero que interaccionan con PA son similares, en torno al 30% (Grov, 1976 ; Van Kamp, 1979 ). Junto a la existencia de proteinas no reactivas, se encuen- tran IgA cuya afinidad por la PA parece incluso mayor que la de la IgG (Harboe y Foiling, 1974), aunque ello debe ser excepcional, teniendo en cuenta que para la mayoria de las IgA monoclonales, solo una pequena parte de cada una es retenida en PA-Sepharose (Biewenga y col., 1982). De otros mamiferos, la IgA policlonal de suero de cerdo, perro y gato, contiene fracciones reactivas con PA (Goudswaard y col., 1978), como la de cabra (Delacroix y Vaerman, 1979) y oveja (Bennell y Watson, 1980). Tambiên la IgA de calostro de cerdo y oveja es reactiva con PA (Bennell y Watson, 1980). A diferencia de lo observado con IgA humana, los fragmentos Faba de IgA policlonal de cerdo mantienen su capacidad de union a PA-Sepharose (Zikan, 1980b) I.5.4.2. Inmunoglobulinas M. Al igual que con las IgA, la ausencia de reactivi­ dad de proteinas IgM de mieloma humano en ensayos de preci­ pitaciôn directa con PA en geles de agarosa, estableciô para esta clase de inmunoglobulinas la condiciôn de no reac­ tivas con PA (Kronvall y col., 1970a), idea que se ha cam- biado ante la descripciôn, por otros mêtodos, de IgM de —67— suero humano normal (Field y col., 1980) y macroglobuli- nemico (Harboe y Foiling, 1974, Grov, 1975a). Asi, aunque se conoce una IgM sintetizada por una linea linfoblastoide humana que da reaccion de precipita­ ciôn directa con PA (Howell-Saxton y Weettstein, 1978), to- das las otras IgM monoclonales reactivas con PA no dan esa reacciôn, ni la de inhibiciôn, pero si, en cambio, la de coprecipitaciôn con IgG de conejo (Grov, 1975a) y, asimismo, se unen a PA-Sepharose (Grov, 1975a; Inganas, 1981; Romagnani y col., 1981b), y a células de S, aureus con PA (Harboe y Foiling, 1974; Howell-Saxton y Wettstein, 1978). Como no todas las IgM monoclonales ensayadas mues­ tran reactividad con PA, este fue un criterio de identifi- caciôn de dos subclases de IgM (Harboe y Foiling, 1974) que mas adelante se ha rebatido (Inganas, 1981). En el estudio de la localizaciôn del receptor de PA se ha mostrado que tanto las subunidades de una IgM mono­ clonal reactiva con PA, como sus fragmentos (Fc)5y y Fcy se unen a PA-Sepharose, pero no los fragmentos Faby (Grov, 1975a), aunque ni (Fc)5y ni las subunidades son capaces de dar reac­ ciôn de coprecipitaciôn como la de la IgM Intacta (Grov, 1975a) De acuerdo con la reactividad observada para los monômeros de IgM, diverses estructuras intermedias del pro- ceso de ensamblaje de IgM, desde pentâmeros hasta complejos ]iL, incluyendo cadenas pesadas no glicosiladas, aislados de un lisado de células de una lînea linfoblastoide humana, se unen a células de S, aureus con PA (Howell-Saxton y Wettstein, 1978). No obstante, la afinidad de las formas monoméricas es siempre menor que la de sus correspondien- tes formas pentaméricas (Harboe y Follin, 1974; Howell- Saxton y Wettstein, 1978), La situaciôn del receptor de PA en la molécula de IgM no esta, sin embargo, bien establecida, pues la dife­ rencia antigénica hallada entre dos IgM monoclonales, una reactiva con PA y otra no, no se ha podido asociar a los fragmentos (Fc)5y o Faby, sugiriendo que el déterminante antigénico implicado pudiera ser de tipo conformacional, hallândosele en las subunidades de IgM (Grov, 1975b). Anti­ cuerpos contra ese epitopo, ausente en la IgM no reactiva, son capaces de inhibir su reacciôn de coprecipitaciôn con PA (Grov, 19 7 5b). Como la de IgA, la interacciôn de IgM con PA comprende un amplio rango de afinidades, tal como se mani- fiesta en las distintas fracciones de proteinas monoclona­ les (Grov, 1975a) o de sueros individuales normales (Field y col., 1980) que son retenidas en PA-Sepharose. Entre las IgM de otros mamiferos se observan pa- trones de reactividad con PA similares a los de IgM humana -69- A s i , las IgM de suero de perro y cerdo se distribuyen en fracciones unida y no unida a PA-Sepharose (Goudswaard y col., 19 78), habiendose descrito tambiên la reactividad con PA de IgM de oveja (Bennell y Watson, 1980), de raton (Chalon y col., 1979), cabra (Delacroix y Vaerman, 1979) y rata (Medgyesi y col., 1978), correspondientes a distin­ tas fracciones en cada caso, del conjunto de IgM, desde el 40% de la de cerdo (Zikan, 1980b) al 3% de raton (Ey y col., 1978), aunque se trata de determinaciones variables, segûn los laboratorios. En el caso de la IgM de suero de cerdo, se ha mostrado que sus fragmentos Faby se unen a PA-Sepharose, mucho mejor que los (Fc)5y (Zikan, 1980b) y, asimismo, para una IgM de raton se ha sehalado la posible implicacion de las regiones Cy2 en su interacciôn con PA (Mackenzie y col., 197 8a). Tambiên por el criterio de uniôn a PA-Sepharose se ha descrito la reactividad con PA de algunas IgM de ver- tebrados no mamiferos, como polios, sapos y carpas (Zikan y c o l ., 1980). 1.5.4.3. Inmunoglobulinas E. Aunque no se conoce ninguna IgE monoclonal reac­ tiva con PA, una pequeha fracciôn de la policlonal de suero humano, 6-9%, se une a PA-Sepharose (Inganas y col., 1980). De los fragmentos de IgE obtenidos por digestion con pepsina, el F(ab')2£ conserva la capacidad de union a PA-Sepharose, pero no el Fc”e, constituido por un dimero de dominios Ce2. Como, ademâs, esta interacciôn no résulta afectada en la inactivaciôn del suero por calor, tratamien- to que modifica la region C-terminal de la IgE, se ha suge- rido que los dominios Ce3 y Ce4, no intervienen decisivarnen- te en la union de la IgE a la PA (Inganas y col., 1980). I.5.4.4. Inmunoglobulinas D. Junto a resultados negatives de reactividad de proteinas IgD monoclonales humanas con PA (Kronvall y col., 1970c; Forsgren y Grubb, 1979), se encuentra la evidencia de la interacciôn de la IgD de membrana, en expérimentes de inmunoprecipitaciôn (Kessler, 1976) o estimulaciôn de lin- focitos de sangre perifêrica (Romagnani y col., 1980). 1.5.5. El mécanisme alternative de interacciôn de inmunoglo­ bulinas con proteina A a travês de sus regiones F(ab') .̂ La reactividad descrita para parte de los fragmen­ tos F(ab')2 de IgG de cerdo y cobayo (Endresen, 1979; Zikan, 1980a), o la de fragmentos Fab de IgA e IgM de cerdo (Zikan, 1980b) o de IgE humana (Inganas y col., 1980), en ensayos de uniôn a PA-Sepharose, o las reacciones de coprecipitaciôn -71- en presencia de IgG de conejo, de FCab'jgY de humano y co­ bayo (Grov y Endresen, 1976), plantean la participacion en la interacciôn con PA de un mecanismo no considerado, dis­ tinto del descrito a travês de regiones Fc. Verdaderamente, este otro tipo de reactividad con PA es diferente, tal como se deduce de expérimentes de in­ hibiciôn de la fijaciôn de IgE e IgG humanas a PA-Sepharose, donde se observa que sôlo fragmentos F(ab’)2Y, pero no FcY son capaces de inhibir la fijaciôn de IgE (Inganas y col., 1980). Asimismo, IgA e IgM monoclonales son capaces de in­ hibir la fijaciôn de IgE a PA-Sepharose, aunque el efecto es variable para cada proteina (Inganas, 1981). En estos ensayos se encuentra actividad asociada a la regiôn F(ab’)2ct y que la fijaciôn de Fcy a PA-Sepharose sôlo es afectada por IgG, a travês de su regiôn Fc (Inganas, 1981). La interacciôn de inmunoglobulinas mediada por este mecanismo alternativo résulta especialmente significa- tiva en la reacciôn de precipitaciôn directa con PA. Asi, la inhibiciôn de esta reacciôn de IgG policlonal por IgG de mieloma no précipitantes, esta en relaciôn inversa con la actividad inhibidora de la uniôn de IgE a PA -Sepharose de cada una de allas, mientras que la inhibiciôn de precipita­ ciôn observada con los correspondientes fragmentos FcY es similar (Inganas y Johansson, 1981). Este mecanismo puede explicar tambiên, las reac- -72- ciones de coprecipitaciôn de fragmentos F(ab')2Y de IgG policlonal humana, asi como la de proteinas IgA de mie­ loma con capacidad inhibidora de la fijaciôn a PA-Sepharose de IgE, y la de sus fragmentos F(ab’)2a (Inganas y Johansson 1981), Estas IgA, pero no otras que no dan reacciôn de co­ precipitaciôn, inhiben la reacciôn de precipitaciôn direc­ ta de IgG policlonal (Inganas y Johansson, 1981). Esta asociaciôn entre reactividad alternative y formaciôn de complejos precipitables, puede observarse en la relaciôn existante entre capacidad de inhibiciôn de la uniôn de IgE a PA-Sepharose por distintas IgG de mieloma y la intensidad de sus correspondientes reacciones de pre­ cipitaciôn (Inganas y Johansson, 1981). Anâlogamente para las IgG de otros mamiferos, de modo que las no précipitan­ tes, como las de vaca o conejo (en este caso se conoce in­ cluso la composiciôn del complejo soluble: (IgG2-PA)2 (Mota y col., 1981)) tampoco afectan la interacciôn de IgE y PA-Sepharose, a diferencia de las précipitantes, como las de perro o cobayo (Kronvall y col., 1970a; Inganas y col., 1980). Recientemente se ha detectado en estreptococos de los grupos G y C, un receptor que interacciona tambiên con regiones Fab de inmunoglobulinas, aunque esa reactivi­ dad parece distinta de la équivalente de PA, en el sentido de las correspondientes especificidades, pues a diferencia -73- de la PA, este receptor de estreptococos reconoce mejor estructuras de IgG de conejo que de perro (Erntell y col., 1983). 1.6. ACTIVIDAD BIOLOGICA PE LA PROTEINA A La interacciôn de la PA con las inmunoglobulinas se pone de manifiesto,tambiên, en la actividad observada en algunas de las funciones efectoras de inmunoglobulinas o relacionadas con ellas. Asi, la molêcula de C3 résulta escindida cuando se mezclan PA e IgG humana en presencia de suero, pero no en su ausencia, lo que sugiere el inicio de actividades de la molê­ cula de Cl, por su uniôn, probablemente, a la IgG agregada por la PA (Stalenheim y Castensson, 1971). Esta activaciôn del sistema del complemento se ha observado, asimismo, con IgG de cobayo (Stalenheim y Malmheden-Eriksson, 1971). La PA produce un claro efecto antifagocitico de estafilococos por polimorfonucleares humanos (Forsgren y Quie, 1974; Peterson y col., 1977), actuando en los dos prin­ cipales medios de opsonizaciôn: al unirse al Fc de los anti­ cuerpos impide su reconocimiento por los receptores de Fc de los neutrôfilos, y por la activaciôn extracelular del com­ plemento, évita el recubrimiento de la superficie bacteriana por moléculas de C3 y enfonces no pueden unirse a los recep- -74- tores de C3 de las células fagocîticas, cuya efectividad, ademâs5 debe verse disminuida por el efecto inhibidor de quemotaxis de los complejos IgG-PA (Musher y col., 1981). Por otro lado, da lugar a reacciones de hipersen- sibilidad en cobayos y conejos, similares a las mediadas por immunocomplejos formados en exceso de anticuerpo (Gustaffson y col., 1968; Heczko y col., 1973) y reacciones de hipersen- sibilidad retardada, detectadas por la inhibiciôn especifi- ca de la migraciôn de leucocitos perifêricos de cobayos sen- sensibilizados con PA (Helgoland y col., 1975). Ha sido descrito, asimismo, el aumento de activi­ dad citotôxica natural (NK) de linfocitos humanos, contra distintas lineas tumorales, en presencia de PA (Vesella y col., 1978), aunque este podria ser un efecto secundario a la es- timulacion de la produccion de interferon y por los linfoci­ tos (Catalona y col., 1981), el grupo celular directamente afectado por la PA (siguiente apartado). En todo caso, este efecto sobre varias de las actividades del sistema inmune, podria ser responsable de la actividad antitumoral observa­ da enla regresion de tumores sôlidos en ratas, perros y hu­ manos, tras la inoculacion de PA (Ray y Bandyopadhyay, 1983), o la reinfusiôn de los plasmas absorbidos con PA insolubili- zada (Ray y col., 1982; Terman y col., 1980), casos en los que el efecto se sospecha pueda deberse a la presencia de PA liberada desde el medio de absorciôn (Ray y Bandyopadhyay, 1982). -75- 1.6.1, Proteina A como mltogeno de linfocitos. Desde los primeros resultados de estimulaciôn por PA de la proliferaciôn "in vitro" de linfocitos huma­ nos, estimada como aumento de sintesis de DNA (Rodey y col., 1972), se han efectuado numerosos estudios sobre su meca­ nismo, los tipos celulares implicados y la comparaciôn con otros mitôgenos conocidos. Esta actividad es dependiente de la forma en que se encuentra la PA. Asi, mientras en soluciôn estimula espe- cificamente linfocitos T humanos y de ratôn (Sakane y Green, 1978; Romagnani y col., 1978, Schuurman y col., 1980, Nakao y col., 1980), como PA-Sepharose o células de 5. aureus for- malinizadas, es un activador policlonal de células B, a di­ ferencia de la PA soluble, pero, sin embargo, no muestran efecto sobre las células T (Forsgren y col., 1976; Romagnani y col., 197 8; Schuurman y col., 1980), La estimulaciôn por células de S, aureus de linfo­ citos B es un fenômeno dependiente de células T, si se estima como secreciôn de inmunoglobulinas (Lipsky, 1980; Falkoff y col,, 1982), pero la sola proliferaciôn celular es indepen- diente de la presencia de células T (Falkoff y col., 1982), contribuyendo de este modo a la diferenciaciôn de las etapas de maduraciôn de los linfocitos B (Muraguchi y col., 1983). En lo que respecta a las células T, la capacidad mitogénica de la PA es comparable a la de la fitohemaglutinina, y mucho -76- mayor que la de la concanavalina A (Sakane y Green, 197 8, Ringden y Rynnel-Dagoo, 1978), dos lectinas mitôgenos de linfocitos T. Ademâs de la heterogeneidad de tipos celulares afectados en los distintos estudios "in vitro", dependiendo de la procedencia de las células o su estadio de diferencia- ciôn, y de las actividades observadas segûn la forma de PA utilizada, se encuentra la cuestiôn de cual o cuales son los elementos celulares implicados. En el caso de las células T, y relacionado con su polémico receptor de antigeno y con la ausencia de inmunoglo­ bulinas en su superficie, se ha postulado un mecanismo de activaciôn no mediado por inmunoglobulinas (Nakao y col., 1980), aunque, sin embargo, es inhibido por IgG policlonal humana (Sumiya y col., 1980). Incluso esta estimulaciôn ha sido atribuida a la presencia de pequehas cantidades de en- terotoxina estafilocôcica, un potentisimo mitôgeno de célu­ las T, en las preparaciones comerciales de PA utilizadas (Smith y col., 1983), o a la interacciôn con los antigenos de histocompatibilidad (Paterson y col., 1975; Schuurman y col., 1980). Por lo que respecta a las células B, que mayorita- riamente llevan en membrana inmunoglobulinas no IgG (Winchester y col., 1975), se ha determinado que linfocitos -77- B de sangre perifêrica.o tonsilo,normales,o de pacientes, con leucemia linfocitica crônica, con IgM e IgD en super­ ficie, son activados por células de 5. aureus (Romagnani y col., 1980; Romagnani y col., 1981a; Romagnani y col., 1981b). Esta estimulaciôn de células B, tanto de individuos normales como de pacientes con leucemia, esta relacionada con la interacciôn de la PA con las regiones F(ab’)2 de las inmuno­ globulinas de membrana, como sugiere el que sea inhibida por IgG humana y sus fragmentos F(ab’)2Y> pero no por IgG que no muestran reactividad alternativa, tipo Fab (apartado 1.5.5. ), y por el hecho de que los linfocitos interesados son capaces de formar rosetas con eritrocitos cubiertos de PA, cuando no hay en el medio anticuerpos anti-inmunoglobulina (Romagnani y col., 1981b; Romagnani y col., 1982a). —7 8— 1.7. QBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL Ya que la reactividad alternativa de inmunoglobu­ linas con PA se ha establecido como tal recientemente, e in­ cluso hay reticencias para su consideracion como mecanismo de esta interacciôn, resultaria conveniente ampliar la in- formacion disponible sobre ella, que es el objetivo general de este trabajo. En primer lugar, se ha abordado la caracterizacion de la reactividad de inmunoglobulinas no IgG, que segûn se ha descrito carecen de la reactividad clâsica, tipo Fc. Para ello se ha escogido la IgM de suero humano, debido a la uti- lizacion de un procedimiento de purificaciôn que ha facilita- do su aislamiento, respecte del de la IgA, pues IgE e IgD, por sus bajisimas concentraciones en suero, no se considera- ron. Que, inicialmente, se haya trabajado con IgM policlonal, ha sido para tratar de darle un carâcter general a los resul­ tados obtenidos. Trente a la informacion disponible, que ha­ ce referencia sôlo a IgM monoclonales. La interacciôn de la IgM policlonal humana se ha estudiado en relaciôn con la de IgG policlonal y sus frag­ mentos, tanto en experimentos con PA en fase sôlida, como en soluciôn, para una mejor identificaciôn de las reactividades observadas. Por otro lado, mientras el receptor de PA de las regiones Fey esta perfectamente definido, se sabe mucho me­ nos del que media la reactividad alternativa, excepto su re­ laciôn con las regiones F(ab')2 de inmunoglobulinas, e in­ cluso, en este sentido, con resultados contradictorios. Por ello se ha tratado de determiner cual puede ser la estruc­ tura que media la interacciôn de inmunoglobulinas y PA a travês del mecanismo alternativo. En este caso, se ha uti- lizado una IgM monoclonal, que por su naturaleza homogênea permite considérer mas fâcilmente la reactividad asociada a las distintas regiones de su molêcula, obtenidas por di- gestiôn enzimâtica controlada o por disociaciôn de sus ca­ denas en medios reductores, y su comparaciôn con la de la IgM intacte, para establecer la localizaciôn de la estruc­ tura a travês de la que se une a la PA. Séria asimismo de gran interês, poder extender las conclusiones obtenidas del estudio de una proteina monoclonal, al conjunto de inmunoglobulinas que muestran la reactividad alternativa, de modo que permita explicar sus caracteristi- c a s , como son la heterogeneidad y distribuciôn entre las distintas clases de inmunoglobulinas y especies animales, o su incidencia en la formaciôn de complejos precipitables con PA o en los fenômenos de estimulaciôn de linfocitos. Para desarrollar esta parte del trabajo, se ha buscado una actividad antigénica asociada a la interacciôn alternativa, con la que poder estudiar inmunoquîmicamente su expresiôn en las distintas clases de inmunoglobulinas y en relaciôn con su reactividad con la PA. MATERIALES Y METODOS 11.1. Purificaciôn de inmunoglobulinas. 11.2. Preparaciôn de fragmentos de inmunoglobulinas 11.3. Obtenciôn de antisueros y anticuerpos. 11.4. Têcnicas de inmunoprecipitaciôn en gel. 11.5. Têcnicas electroforéticas. 11.6. Marcaje radiactivo de proteinas. 11.7. Mapas bidimensionales de pêptidos yodados. 11.8. Radioinmunoensayos. 11.9. Interacciôn con proteina A. 11.10. Materiales. 11.1. PURIFICACION DE INMUNOGLOBULINAS En la purificaciôn de inmunoglobulinas y la prepa­ raciôn de sus fragmentos, asi como en el aislamiento de an­ ticuerpos, se han seguido têcnicas de fraccionamiento con­ vencionales, como la cromatografîa de afinidad, de intercam- bio iônico o de filtraciôn en gel, que se detallan para cada caso mas adelante. Aqui se describen procedimientos comunes a todas las purificaciones. 11.1.1. Concentraciôn de soluciones de proteina. 11.1.1.1. Ultrafiltraciôn. Consiste en la reducciôn del volumen de la solu­ ciôn por el paso, bajo presiôn positiva o negativa, del disol- vente a travês de un filtro que no deja pasar las proteinas, debido a su mayor tamaho molecular. Se han empleado como filtros membranas Diaflo PMIO y XM50, que son permeables a compuestos de pesos molecu- lares de hasta 10000 y 50000, respectivamente, en una cêlula de ultrafiltraciôn de Amicon. Las concentraciones se efectuan a 4~C, hasta el volumen deseado, con nitrôgeno comprimido, a una presiôn de 2 ^1 kg/cm . Despuês, las membranas se conservan en tampones con 0.1% azida sôdica, p/v, en la nevera, en 50% etanol, v/v, si es por periodos prolongados. Ocasionalmente se lavan con — o 1 0.1% Triton X-100, v/v, cuando el caudal que proporcionan disminuye a causa de la adsorciôn de proteinas a su superficie, II.1.1.2. Diâlisis. Tiene el mismo fundamento, aunque el movimiento de solutos es pasivo. Se efectua en membranas de celulosa en for­ ma de tubo, que se hidratan en agua destilada en ebulliciôn, durante 20 minutos, para lavar la glicerina y otros compuestos que llevan. Despuês se comprueba que no estân rotas y, tras anudar uno de sus extremes, se introduce la soluciôn que quie- re concentrarse, anudândose el otro tras haber sacado la mayo­ ria del aire. La boisa de diâlisis se introduce en un vaso de precipitados con PEG de peso molecular 40000 semisôlido (el ta- mano de poro de la membrana permite el paso de solutos de pe­ so molecular en torno a 10000), o con Sephadex seco, que ex- traen el solvente. Este procedimiento se utiliza cuando los volümenes a concentrar son pequenos, 2-10 ml. Del mismo modo se hacen los cambios de disolvente, introduciendo la boisa en volümenes del nuevo tampôn en que se quiere poner la proteina, 200-300 veces mayor que el de la so­ luciôn que se dializa. Esto suele hacerse con agitaciôn, a temperatura ambiante, durante 18 horas, o a 4~C si es por mas tiempo, renovando el tampôn si es necesario. -82- II.1.1.3. Câlculo de concentracion de las soluciones de proteina. Se hace a partir de su A^gQ y de los correspon­ dientes coeficientes de absorciôn (tabla II .1.). Las lectu- ras se han efectuado en espectrofotometros Beckman, modèles 2 5 y DU-5, diluyendo convenientemente las soluciones, para que el valor de absorbancia sea < 1.0, utilizando como cero de absorbancia la del disolvente que se trate. II.1.2. Purificaciôn de IgG policlonal humana y de otros mamiferos. II.1.2.1. Cromatografîa de afinidad en PA-Sepharose. Es un procedimiento utilizado habitualmente en el aislamiento de IgG de numerosos mamiferos (Goding, 1978; Lindmark y col., 1983), basado en la afinidad de estas inmu­ noglobulinas por la proteina A de 5, aureus^ empleando como material de partida sueros, preparados como se indica en II.3.1 El medio cromatogrâfico, PA-Sepharose, se hidrata en el tampôn habituai de utilizaciôn, PBSA (tabla II .2.), y con 3g se hace una columna de 2 x 3,3 cm, que se équilibra en el mismo tampôn y en la que se cromatografian alicuotas de no mâs de 10 ml de suero. La columna se lava con PBSA a 100 ml/h, recogiendo el eluido en fracciones de 4,2 ml, hasta Tabla II.1. PESOS MQLECULARES Y COEFICIENTES DE ABSORCION UTILI- ZADOS EN EL CALCULO DE CONCENTRACIONES Immunoglobulinas y fragmentos de IgG Fragmentos de IgM Mp X 10"3 280, 1cm IgM 900 11.8 (Fc )5W 340(a) IgA 150 10.6 Fcy 33(b) IgG 150 14.3 F(ab')24 114(c) F(ab’)2T 104 14.8 Fab’y 57(c) Fab'y 52 14.8 Faby 48(a) Faby 50 15.3 Monômeros 180(d) Fcy 50 12.2 Fv 25(e) L 25 11.8 % Vl 13(e) 13(e) Los coeficientes de absorciôn y los pesos moleculares se han tornado de Hudson y Hay, 1976 y de Eisen, 1980a, excep­ to los sehalados con letras. (§), los coeficientes de absorciôn de los fragmentos de IgM se han tanado iguales al de la IgM Intacta. Otras referencias: a, Zikan y Bennett, 1973; b, Hester y col., 1975; c, Miller y Metzger, 1966; d, Miller y Metzger, 1965; e. Lin y Putnam, 1978. -84- que su A 2gg es < 0,04, figura II.l.. Para recuperar la proteina retenida en la columna se cambia el tampon de eluciôn, utilizando citrato sôdico O.IM o glicocola-HCl Q,1M, de pH 2.5. Los tubos donde se colecta el eluido contienen 0.1 ml de Tris-HCl 2v5M, pH 8.5, para su in- mediata neutralizaciôn. Las fracciones con A 2gg > 0.05, se reunen y concentran por ultrafiltraciôn, conservândose conge- ladas a -20~C despues de dializarlas contra PBSA. Una vez utilizada, la columna de PA-Sepharose se rééquilibra en PBSA y se conserva a 4“C. El rendimiento conseguido depende de cada suero, segûn la afinidad de su IgG por la columna, con extremos en 12 y 6 mg/ml de gel para el de cerdo y vaca, respectivamente. Tras electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS, figura II.l., este material migra con movilidad similar a la de la IgG humana. Habitualmente, la IgG humana asi purificada, se cromatografîa despuês en una columna de Sephacryl S-200 de 2 X 150 cm, equilibrada en PBSA, para conseguir una prepara­ ciôn libre de agregados. II.1.2.2. Purificaciôn de una IgG3 monoclonal humana. Se aislô del suero del paciente Era, con mieloma mûltiple. La inmunoglobulina monoclonal se identificô como — 8 5 ~ 40.0 30.0 - O S 20.0 - < 10.0 - 10 20 30 Fracciones Figura II.l. Aislamiento de IgG de suero por cromatografîa de afinidad con PA-Sepharose. El procedimiento se ilustra con el cro- matogram corre spondiente a la cromatografîa de 10 ml de suero de cerdo en una columna de 2 x 3.3 cm de PA-Sepha­ rose equilibrada en PBSA. Las fracciones recogidas son de 3.2 ml y el flu jo de 100 ml/h. La flecha indica el inicio de la eluciôn con citrato sodico O.IM, pH 2.5. Se muestra tambiên el anâlisis por SDS-PAGE, en un gel de 3.5%C y 7%T, de las IgG obtenidas de modo similar a partir de sue­ ro humano (1), conejo (2), cobayo (3), perro (4), cerdo (5) y vaca (6) , en picos como el sehalado en el cromato- grana. —Ou — IgG3(<), por su reacciôn con antisueros especificos de Fcy, de cadena k y de subclase IgG3. La IgG3 Fra se aislo por cromatografla de inter- cambio iônico, a partir de la fracciôn de suero que no es re- tenida en PA-Sepharose y que as! carece del resto de proteînas IgG, que son fijadas a la columna de afinidad (II.1.2.1.). II.1.2.2.1. Preparacion del intercambiador ionico de celulosa. Aunque aqui se refiere a la carboximetilcelulosa utilizada en la purificaciôn de la IgG Fra, el procedimiento es similar al seguido con las celulosas microfibrilares em- pleadas en otras purificaciones. La celulosa se hidrata en el tampon en el que se iniciarâ la cromatografla, 10 veces mas concentrado, para fa- cilitar un mas râpido equilibramiento del intercambiador. La pasta se sépara en un filtro de Buchner, o por decantaciôn, y se vuelve a resuspender en tampon, otras 3-4 veces, hasta que el pH de la suspension se aproxima al del tampon que se esta utilizando. La suspensiôn se deja reposar ahora, y antes de que sedimente completamente, se quita el tampôn con las partîculas mas finas de celulosa, que podrian obstruir el soporte de la columna y disminuir su flujo. Finalmente, la celulosa se resuspende en el tampon -87- de cromatografla y se vierte en una columna, donde se empaque­ ta hasta conseguir el tamaho deseado. Entonces se lava con 10 volümenes del mismo tampon, o mas, si fuese necesario para igualar el pH y la conductividad del efluente con el del tam­ pon de equilibrado. Las medidas se han efectuado en pHmetro Century SS-1, de Beckman o pHM8 3 autocal, de Radiometer, y en un Qonductivîmetro 525 de Crison. II.1.2.2.2. Aislamiento de la IgG3 Fra. La fracciôn de suero Fra no unida a PA-Sepharose se pone en tampôn de cromatografla por diâlisis contra fosfa- to sôdico O.OIM,pH 7.0. La muestra se carga en la columna, de 2 X 16.5 cm de CM-celulosa, equilibrada y eluida con ese tampôn, manteniendo un flujo de 60 ml/h, hasta que las frac- ciones recogidas, de 4.2 ml, tienen una Aggg < 0.02. La IgG3 sale en un segundo pico que se retrasa respecte del conjunto de proteînas que no interaccionan con la columna, figura II.2. La IgG3 asî obtenida, se conserva a -20“C y su pu- reza se détermina por electroforesis en gel de poliacrilamida, donde a diferencia de la IgG policlonal produce una estrecha banda, y cuando se analiza reducida y en presencia de SDS, su cadena pesada muestra la caracterîstica movilidad, mener que la de las otras subclases (figura 11,2.), de acuerdo con su mayor peso molecular (Patrick y Virella, 1978). 6.0 4.0 - O00 CM< 2.0 - 20 30 40 50 60 Frocciones Figura II. 2. Aislamiento de la IgG3 monoclonal Fra. El cromatograma muestra el fraccionamiento de la fracciôn de suero Fra no retenida en PA-Sepharose en una columna de CM-celulo­ sa, 2 X 16.5 cm, equilibrada en 'fosfato sodico O.OIM, pH 7.0. El flujo es de 60 ml/h y las ffacciones de 4.2 ml. La flécha muestra el inicio de elucion con ese mismo tampon conteniendo NaCl IM. Se sehalan las fracciones recogidas con lgG3. Los electroforetogramas corresponden al anâli- sis en un gel de poliacrilamida de 3.5%C y 7%T del suero Fra (4) y su lgG3 (3), comparando con el de suero normal (6) y la IgG policlonal (5), por un lado, y de otro, en un gel de 3.5%C y 10%T, con SDS, de la lgG3 Fra (2) y de la IgG policlonal (1), reducidas. II.1.2.3. Purificaciôn de IgA policlonal humana. Como material de partida se utilizô la fracciôn de suero humano normal que précipita al anadir sulfato amônico hasta una concentraciôn 50% de la de saturaciôn, procédante de procesos de purificaciôn distintos, pero que sirve para la obtenciôn de IgA, ya que la mayoria de ella se encuentra en esta fracciôn (Heide y Schwick, 1978). Disuelta en PESA, se ahade sulfato de zinc sôlido, para conseguir una concentraciôn 0.0 5M, llevando el pH a 6.8 con carbonato sôdico, y se mantiene a 22~C con agitaciôn, du­ rante 2 horas. La suspensiôn formada se centrifuga a 10000 rpm, en un rotor JA-14 de Beckman, durante 15 minutes, para retirar el precipitado de IgG (Heide y Schwick, 1978). Al sobrenadante se ahade glicocola hasta una concen­ traciôn final de 2%, p/v, para acomplejar los iones Zn**, te- niêndolo 30 minutes a 28~C y centrifugândolo en las mismas condiciones que antes. La IgA présente en este nuevo sobrena­ dante, se concentra por precipitaciôn con sulfato amônico 1.8M y se purifica en un intercambiador aniônico. La DEAE-celulosa se équilibra como se indica en II.1.2.2.1., en Tris-HCl'0.03M, pH 7.9. La muestra, dializada contra ese tampôn, se cromatografia en una columna de 2 x 16 cm, a 90 ml/h. Cuando la AggQ de las fracciones es < 0.02, se eluye con un gradiente lineal de concentraciôn de cloruro sôdico, conseguido al mezclar 100 ml del tampôn Tris-HCl con -90- 100 ml del mismo tampon con cloruro sodico 0.4M. El primer pico del cromatograma de la figura II.3. contiene solo IgG, en tanto que la IgA se halla en las frac­ ciones del pico principal que eluye con el gradiente de sal, donde se detecta por inmunodifusion con sueros anti-IgA. De este material se obtiene la IgA por cromatogra­ fia de afinidad en PA-Sepharose, donde se eluye con tampon acido el 25% de la proteina cromatografiada, que ademas de IgA contiene una pequeha cantidad de IgG. Elio hace necesa­ rio, finalmente, la cromatografia en una columna de afinidad con anticuerpos anti-Fcy (II.3.3.), para retirar cualquier IgG presente en esta preparacion de IgA, cuyo analisis por electroforesis en gel de poliacrilamida se muestra en la figura II.3.. II.1.2.4. Purificaciôn de IgM policlonal humana. El suero empleado en su aislamiento es la mezcla de alicuotas de 1-3 ml del de, aproximadamente, 300 individuos, al que se anade azida sôdica hasta 0.1%, p/v, para conservar- lo a 4~C, despuês de haberlo centrifugado durante 3 0 minutes a 10000 rpm en un rotor GSA de Sorvall. La IgM de este suero se obtiene en la fracciôn de macroglobulinas que se prépara por filtraciôn de 5 0 ml del mismo en una columna de 3.5 x 98 cm de Sephacryl S-300, equi- m 0.9 - «N SM< 0.6 - 1.0 M NoCI 0.3 - 20 40 60 80 100 120 Fracciones Figura II. 3. Aislamiento de IgA de suero hunano normal. Cromatografia de la fracciôn de suero precipitada con sulfato de zinc (II. 1.2.3.) en una columna de DEAE-celulosa, 2 x 16 cm, equilibrada en Iris-HCl 0,03M, pH 7.9. El flujo es de 90 ml/h y las fracciones de 4.2 ml. La primera flécha sehala el inicio de la elucion con un gradiente de concentraciôn s al (100 ml de Tris-HCl 0.Û3M, pH 7.9 y 100 ml del mismo tampôn con NaCl 0=.4M. Finalmente, el tampôn de eluciôn contiene NaCl 1,0M. Se muestra tambiên el analisis por SDS-PAGE de la IgA reducida (1), en un gel de 3.5%C y 10%T, junto al patrôn de IgG reducida (2). La IgA analiza- da es la fracciôn unida a PA-Sepharose no retenida en anti-FcY-Sepharose (II.1.2.3.) de la présente en el pico sehalado en el craratograna. -92- librada y eluida con PBSA a 40 ml/h, cogiendo fracciones de 4.3 ml. Aunque el volumen de muestra excede a 1 adecuado para una resolucion optima, como las fracciones que contienen la IgM estan suficientemente separadas de las que contienen IgG, en el primero de los dos picos principales del cromatograma de la figura II.4., que es la finalidad de este paso croma- togrâfico, se pueden asi procesar mayores cantidades de suero de una sola vez. La fracciôn de macroglobulinas obtenida se croma­ tografia ahora en una columna de 10 ml de PA-Sepharose, figu­ ra II. 5. (de ahi el interês en que las cantidades de IgG en la fracciôn con IgM fuesen minimas) equilibrada y eluida en PBSA, a 100 ml/h, hasta que la A^gg del eluido es < 0.02. La recuperaciôn del material retenido en la columna se hace con un tampôn citrato sodico O.IM, pH 2.7, recogiêndose el elui­ do en tubos con un pequeho volumen de Tris-HCl 2:5M, pH 8.5, para su neutralizaciôn. La figura II.5, muestra también el analisis de este paso cromatografico,por electroforesis en gel de poliacrilamida. En la tabla II.2. se muestra la composiciôn de los tampones utilizados cuando la eluciôn de PA-Sepharose se hace bajando el pH discontinuamente. Para desechar los agregados que se hallan en sue­ ro, y los producidos en el proceso de aislamiento, las prepa- raciones de IgM se cromatografian sistemâticamente en una -93- 20.0 - 15.0- 5.0- - 1.0 -0.5 70 100 190130 160 «o 2 Fracciones Figura II. U. Aislamiento de IgM de suero normal. Cromatografia de 50 ml de suero humano en una columna de Sephacryl 8-300, 3.5 x 98 cm, eluida con PBSA a 40 ml/h. Las fracciones son de 4.3 ml y se sehalan las recogidas conteniendo IgM, de acuerdo con su distribuciôn, trazo discontinuo, detectada por inmunodifusion radial, y representada respecto de los valores maximos de concentraciôn de IgM. —94— F 30 40 Fracciones Figura II . 5. Aislamiento de IgM de suero humano normal por cromatogra­ fia de afinidad con PA-Sepharose. Cromatografia de la frac­ ciôn de macroglobulinas de suero hunano (figura II.4.) con IgM en una columna de PA-Sepharose, 2 x 3.3 cm, equilibra­ da en PBSA. El flujo es de 100 ml/h y las fracciones de 5 ml. La flécha indica el inicio de la eluciôn con citra­ to sôdico O.IM, pH 2.7. Se muestra, asimismo, el analisis por electroforesis en gel de poliacrilamida, 5.25%C y 8%T, de suero humano, tubo 1, y de las fracciones de macroglo­ bulinas no unida (tubo 2) y unida (tubo 3) a la columna de PA-Sepharose. -95- Tabla II.2. TAMPONES UTILIZADOS EN CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD EN PA-SEPHAROSE Equilibrado de columna PBSA: fosfato sodico 25mM (PÔ ^NaH^ 15.7mM, PO^Na^ 9.2mM), pH 7.4, cloruro sodico 0.15M y azida sodica 0.1%, p/v. TA : Tris-HCl 50mM, pH 7.6, cloruro sodico 0.12M y azida sodica, 0.1%, p/v. Elucion acida Citrato sodico O.IM: pH 6.1 citrato trisodico 91.6mM, acido citrico 8.4mM pH 5.1 " 70.3mM, " 29.7mM pH 4.4 ” 51.8mM, ” 48.2mM pH 4.0 ” 41.0mM, " 59.0mM pH 3.4 " 27.8mM, " 73.2mM pH 2.7 ” 9.1mM, " 91.9mM pH 2.5 ” 6.2mM, " 93.4mM Glicocola-HCl O.IM, pH 2.5 columna de Sepharose 6B, recogiendo el pico con las fraccio­ nes siguientes a las del volumen excluido, figura III.3., que luego se concentran por ultrafiltraciôn, con una membrana XM50, y se conservan en alicuotas de 1 m l , a -70“C, descon- gelândolas una sola vez, para prévenir su agregaciôn. II.1.2.4.1. Purificaciôn de la IgM sin afinidad por PA-Sepharose Se aisla de la fracciôn de macroglobulinas que no se une a PA-Sepharose, la cual contiene un 50-60% de la IgM inicial (tabla III.1.), por cromatografia de afinidad en una columna con anticuerpos anti-(Fc)^y (II.3.3.), de donde se eluye con un tampôn glicocola-HC1 O.IM,pH 2.6, en tubos con Ttis-HCl 2.5M, pH 8.5 (II.1.2.4.). La figura II-6. muestra el cromatograma correspon- diente a una de estas purificaciones. La forma del pico elui­ do con tampôn âcido puede deberse a la heterogeneidad de la afinidad de los anticuerpos inmo'vilizados en la agarosa. Esta IgM, cuyo patrôn electroforetico en gel de poliacrilamida con SDS se muestra en la misma figura, se dializa contra PBSA y se conserva congelada a -70“C. II.1.2.5. Purificaciôn de una IgM monoclonal humana. Se hace a partir del fluido obtenido por plasmafê- resis del paciente Iz, con macroglobulinemia de Waldestrom. 0.8 n 0.6 - o00N< mu 0.2- 10 20 30 Fracciones Figura 11,6, Aislamiento de la de suero norml sin afinidad por PA-Sepharose. Cromatografia de la fracciôn de macroglobuli­ nas de suero humano con IgM no unida a PA-Sepharose en 4 pa- sadas en una columna de IgG anti-(Fc)^^-Sepharose, 2.6 x 3.6 cm, equilibrada en PBSA. El flujo es de 60 ml/h y las fracciones de 5 ni. La flécha indica el inicio de la elu­ ciôn con Gly-HCl O.IM, pH 2.6. Se muestra el analisis por SDS-PAGE de la IgM as! aislada, en el pico senalado,(1), junto al de la IgM purificada por cromatografia de afinidad con A-Sepharose (2), reducidas, en un gel de 3.5%C y 10%T. La figura II.7. muestra el aumento de la turbidez del plasma debido a la precipitaciôn de la IgM,causada al reducir su fuerza iônica por diluciôn con agua destilada. De acuerdo con ello, para el aislamiento de esta euglobulina, se mezcla un volumen de plasma y 16 de agua. La precipitaciôn se hace a temperatura ambiante y el sedimento se recoge tras centrifuger la suspensiôn, 20 minu­ tes a 10000 rpm en un rotor JA-14 de Beckman, y despues de disolverlo en PBSA se précipita del mismo modo, una vez mas, para retirar aquellas proteînas que coprecipitan asociadas a la IgM, El sedimento de la centrifugaciôn se conserva a -20~C. 11,1,2.6. Aislamiento de proteînas Bence-Jones. Son dlmeros no covalentes de cadenas ligeras mono- clonales, secretadas en la orina de enfermes de mieloma (Putnam, 1977a), Una de estas proteînas, la Viz, fue cedida por el Dr, E, Mendez, del Servicio de Endocrinologie del Centro Ramôn y Cajal. Otra, fue aislada de la orina de un pa­ ciente, Bla, tras su concentraciôn por ultrafiltraciôn y cro­ matografia en una columna de Sephacryl S-200 de 2 x 150 cm, equilibrada en PBSA, El tipo de cadena ligera de estas proteînas se identificô por doble inmunodifusion contra antisueros especi­ ficos de tipo, resultando X el de la Viz y k el de la Bla. -99- 20.0 - 15.0- Dilucion p lasma Figura II. 7. Euprecipitaciôn del plasma macroglobulinemico Iz. Se représenta la turbidez del plasma Iz, como A650' corres- pondiente a su dilucion con cantidades crecientes de agua destilada. Se muestra asimismo el analisis por inmunoelec- troforesis del material asi euprecipitado (2) y el del plasma de partida (1), con sueros anti-suero humano total, (3) y anti IgM especifico (4). II.2. PREPARACION DE FRAGMENTOS DE INMUNOGLOBULINAS En este apartado se describe la preparacion de di- versos fragmentos de inmunoglobulinas, producidos por proteo- lisis controlada, asi como la de sus subunidades o cadenas pe­ sada y ligera, tras la reduccion parcial de sus puente disul- furo. 11.2.1. De IgG humana. Se obtienen a partir de preparaciones comerciales de IgG policlonal. 11.2.1.1. Preparacion de los fragmentos Faby y Fcy. Son productos de la proteolisis de la IgG con pa- paina (Porter, 1959). La IgG, 20 mg/ml en fosfato sodico Ü.IM, pH 7.0, EDTA 2mM^ se precalienta en un baho a 37“C. Entonces se ahade papaina sôlida, de modo que la relaciôn enzima:IgC es 1:100, en peso. La digestion se detiene 16 horas despuês, inactivando la papaina con yodoacetamida O.OIM. Los productos de la digestion se separan por croma­ tografia de intercambio iônico, en una columna de DEAE-Sepha- cel (particulas esfëricas de celulosa, en vez de fibrillas), de 3 X 20 cm, equilibrada en Tris-HCl Q .04M, pH 8.0, cogiendo fracciones de 6 ml, a 100 ml/h. Cuando la A^gg del eluido es < 0.03 se inicia el paso de un gradiente lineal de concentra- -101- ciôn de sal, formado por la mezcla de 20 0 ml de Tris-HCl 0.04M, pH 8.0 y 200 ml del mismo tampon con cloruro sôdico 0.5M. El pico con la proteina no retenida en la celulo­ sa esta constituido por el fragmento Faby , como indica su analisis por inmunoelectroforesis, figura U . S . . El Fcy se encuentra en las fracciones sehaladas del segundo pico del material eluido de la columna con el aumento de fuerza iônica, y para liberarlo de la IgG no digerida que sale delante, se cromatografia en una columna de 2 x 154 cm de Sephacryl S-200, equilibrada en PBSA, figura II-9A , de don.de se recoge en las fracciones del pico principal. Ya que en inmunoelectroforesis se détecta una dêbil contaminaciôn de esta preparaciôn de Fcy por Faby, probable- mente aquellos mas âcidos, se cromatografia en una columna de PA-Sepharose, desechando todo lo que no se fija a la misma, figura II-9B . El Fcy eluido con glicocola -HCl "0. lM,pH 2.5, ya no da reacciôn de precipitaciôn con antisueros con actividad contra cadenas ligeras, figura II-9B. Ambos fragmentos, Faby y Fcy, dializados contra PBSA, se conservan a -20“C. 1 1 . 2 .1. 2. Obtenciôn del fragmento F(ab') ŷ . Se aisla del digerido de la IgG con pepsina (Bennich y Turner, 1969). La IgG, 25mg/ml en acetato sôdico O.IM, pH 4.4, 9.0- -20 -10 -0 6.0- OflO. 12 5cuentas del fotopico del espectro de émision del I, P, y en otro el total de cuentas, T, la actividad absoluta de la muestra considerada résulta de la relaciôn (2T-P) /4(T-P) (Eldridge, 1964). Normalmente se ha trabajado con eficien- cias de contaje en torno al 75%. Asi, el grado de sustituciôn conseguido en el mar- 12 5caje, como atomes de I por molêcula de proteina, se cal­ cula a partir de la actividad especifica de la preparaciôn, en dpm/molécula (hay que conocer el peso molecular de la > 12 5proteina que se marca) y de la actividad especifica del I, — 6 ^7,6 X 10” dpm/âtomo, suponiendo una abundancia isotôpica 12 5del 95% en el . INa utilizado. Habitualmente se consiguen 12 5incorporaciones de 0.1-1 âtomos de I por molêcula de -154- proteîna, indicândose en la figura 11.15, las actividades especîficas, en yCi/yg correspondientes a las proteinas que alli se muestran. II.7. MAPAS BIDIMENSIONALES DE PEPTIDOS YODADOS Este procedimiento (Elder y col., 1977) permite obtener los mapas peptidicos de proteinas separadas por electroforesis en geles de poliacrilamida, compensândose la escasez de material disponible para el analisis con el aumen­ to de sensibilidad conseguido al marcar radiactivamente los 12 5polipêptidos con I. II.7.1. Preparaciôn de los pêptidos radiactivos. El fragmento de poliacrilamida con la proteina que quiere analizarse se corta con un bisturi del gel, fijado y tehido, poniêndose en un tubo de vidrio siliconizado por im- pregnaciôn con Sigmacote, donde se lava con una solucion de 25% isopropanol, v/v, con varios cambios, para quitar el co­ lorante unido a la proteina. Los ûltimos lavados se hacen con 10% metanol, v/v. Ahora la poliacrilamida se seca, por liofilizaciôn, y se rehidrata durante 30 minutos en 60 yl de fosfato sôdi­ co 0.1M,pH 7.4, conteniendo 0.3 mCi de ^^^INa.. El marcaje comienza al ahadir 10 yl de cloramina T, 1 mg/ml, en agua, y finaliza 30 minutos despuês, al ahadir 100 yl de metabisul- fito sôdico, 3 mg/ml, en tampôn fosfato. Tras 15 minutos, las piezas de poliacrilamida se transfieren a nuevos tubos de vidrio siliconizado, donde se lavan con numéros!simas alicuotas de 5 ml de 10% metanol, v/v, hasta que la radiac­ tividad lavada se estabiliza en un valor bajo. Cuando se considéra que todo el yodo no unido a proteina ha sido lavado, la poliacrilamida se seca por lio- filizaciôn y se rehidrata en 0.3 ml de bicarbonate amôni­ co, 0.05M,pH 8.1, en un baho a 37“C, donde la proteina in- cluida en la poliacrilamida es digerida con 2 5 yg de trip­ sina tratada con DPCC, durante 16-18 horas. Las soluciones de bicarbonate, que contienen los pêptidos producidos en la digestiôn, se pasan a tubos nuevos y se liofilizan. II.7.2. Electroforesis y cromatografia en capa fina. Los pêptidos se separan inicialmente por electro­ foresis en cromatofolios de celulosa de 20 x 20 cm, donde se aplican, con ayuda de un capilar de vidrio, 5 yl (10^ cpm) en una de sus esquinas, a 3 cm de los bordes, disueltos en tampôn de electroforesis: 10 ml de piridina, 100 ml de acido acêtico y agua hasta 1 litro. Los cromatofolios se colocan sobre una plaça de refrigeraciôn por la que circula agua a 14~C, y tras poner sus bordes en contacte con el tampôn de los electrodos, a travês de tiras de papel Whatman 3MM, se inicia la electrofo- -15a- resis, en un campo constante de 600V. A la misma altura de la plaça en que se aplican los pêptidos, pero en otro punto, se ponen 2 yl de una mezcla de 0.5% xylene cyanol, p/v, y G .1%.N - N ’-diDNP-lisina, p/v, como marcadores de electrofo­ resis . Cuando ambos colorantes se han separado 2 cm, aproximadamente 110 minutos despuês de haber comenzado la electroforesis, el cromatofolio se seca con la corriente de aire de un secador de pelo y se efectua la separacion croma­ tograf ica, en direccion perpendicular a la de electroforesis, en un sistema ascendante desarrollado con butanol: piridina: âcido acêtico: agua (32.5: 25: 5: 30), hasta que el frente llega a 1 cm del borde superior del cromatofolio. La distribuciôn de pêptidos se révéla por autorra­ diografia (II.5.2.2.) del cromatofolio seco, otra vez, tras la cromatografla. II.8. RADIOINMUNQENSAYOS En este apartado se describen los mêtodos empleados en el estudio de la reactividad de antigenos y anticuerpos, con cualquiera de ellos marcado radiactivamente. Estes ensa- yos evaluan su asociaciôn en experimentos de fijacion direc- ta, asi como el efecto sobre dicha union de otros antigenos, no radiactivos, observado en experimentos de inhibicion y de competiciôn. Como las concentraciones de reactivos empleadas son muy bajas, los tampones en que se efectuan estos ensayos contienen BSA, para minimizar su adsorciôn inespecifica. Las distintas determinaciones se efectuan, asimismo, por duplicado, II.8.1. De doble anticuerpo. Los inmunocomplejos formados en el ensayo estan demasiado diluidos para precipitar, pero pueden reunirse acomplejandolos con un segundo anticuerpo, que reconociendo al primero, en presencia de inmunoglobulina no inmune del mismo animal del que procédé el primer antisuero, constitu- ye un segundo sistema antigeno-anticuerpo, con cantidades de reactivos que aseguran su precipitaciôn (Hunter, 1978). En tubos de microfuga de polietileno, de 0.4 ml de capacidad, se mezclan 75 yl de la soluciôn de antigeno ra­ diactivo, unas 40000 cpm, y 25 yl de una diluciôn de antisue­ ro que une el 50-60% de la maxima cantidad de antigeno capaz de ser unida, en presencia de tampôn o del antigeno competi- dor. Tras mezclar bien, se deja incubar 16 horas a 4"C. Ahora se ahaden 150 yl de suero de oveja anti-IgG de conejo, absorbido con suero humano, e IgG de conejo no inmune, en 50 yl, suficiente para tener, junto con la del primer anti­ cuerpo, no mâs de 5-6 yg por tubo, cantidad que es precipita­ da totalmente, al hallarse el segundo sistema antigeno-anti­ cuerpo en leve exceso de anticuerpo. -158- Tras 1 hora a temperatura ambiente y otra hora a 4“C, los tubos se centrifugan en una microfuga, a 4~C, du­ rante 5 minutos. El sobrenadante se extrae por aspiracion, con una jeringuilla provista de una aguja que no llega al fondo del tubo, y el sedimento se lava dos veces con 0.35 ml de PBSA-BSA antes de contarse en el espectrometro de ra­ diactividad gamma. En este ensayo, se introduce un control de precipi­ taciôn inespecifica, consistante en la sustituciôn del primer anticuerpo por otro, tambiên de conejo, pero de especificidad no relacionada con los antigenos considerados. Las cuentas de este tubo, C, se restan de todos los otros, como inespeci- ficidad interna del ensayo, que nunca supera el 2-3% de la radiactividad puesta. Del mismo modo, las cuentas especificamente preci­ pitadas en ausencia de inhibidor, T, reflejan el mâximo de ra­ diactividad unida, por lo que el calcule del grado de inhibi- ciôn conseguida por un antigeno dado se expresa como: {(cpm en presencia de inhibidor - C)/T} x 100. II.8.2. De fase sôlida. Con esta denominaciôn se designan aquellos ensayos en los que el antigeno o el anticuerpo se encuentran insolu- bilizados sobre algün soporte, como plastico, agarosa, etc.. La insolubilizaciôn se ha efectuado en plaças de PVC que contienen pocillos de fondo redondo o piano, de 0.2- 0.4 ml de capacidad, en cada uno de los cuales se hace una determinaciôn. El antigeno o el anticuerpo, disueltos en 50 yl de bicarbonate sôdico O.IM, pH 8.5, a la concentraciôn apropiada en cada caso, se ponen en estos pocillos, dejando­ los a temperatura ambiente durante 2 horas. Entonces se vacian y aquellos sitios del plastico que fueran capaces de unir aûn proteina, se bloquean ahadien- do a los pocillos 0.1 ml de PBSA-BSA, incubando la plaça, a temperatura ambiente, durante 1 hora. En los ensayos de fijaciôn directa, el antigeno o el anticuerpo radiactivos, 20-50000 cpm en 50 yl de PBSA-BSA, se incuban en las plaças cubiertas como se ha indicadoantes, durante 1-2 horas, dependiendo del ensayo, a temperatura am­ biente. Los pocillos se vacian, se lavan 5 veces con 0.2 ml de PBSA-BSA y se cuentan, recortândolos, si la plaça es de PVC flexible, o contando 90 de los 100 yl de hidroxido potâ­ sico 2M utilizados para despegar la radiactividad del plâsti- co, si se trata de PVC rigide. La fijaciôn inespecifica se estima a partir de la radiactividad de pocillos que en la etapa de insolubilizaciôn fueron cubiertos sôlo con tampôn bicarbonate. Para los ensayos de inhibicion, el componente ra­ diactivo, 20 yl, se mezcla con las soluciones de inhibidor. 40 yl, de concentraciôn variable por su diluciôn seriada en tampôn PBSA-BSA, en pocillos de plaças de PVC rigide. Tras su incubaciôn a temperatura ambiente durante 16 horas, ali­ cuotas de 50 yl, 20-60000 cpm, se anaden a plaças previamen­ te cubiertas con una cantidad de réactive suficiente para unir el 80% del mâximo de cuentas que se unirian, donde se dejan durante 2 horas, a temperatura ambiente, siguiendo el proceso descrito para los ensayos de fijaciôn directa. En los ensayos de competiciôn, el trazador y el inhibidor, disueltos en 50 yl de PBSA-BSA, se ahaden, una vez mezclados como se ha dicho antes, a las plaças que se han cubierto con una cantidad limitante de réactive, donde se efectua la incubaciôn, durante 1 hora, a temperatura am­ biente, siguiendo despuês los pasos ya indicados. El câlculo de la inhibiciôn de la fijaciôn obser- vada en cada caso, se efectua como en II.8.1. II.9. INTERACCION CON PROTEINA A Aqui se incluyen los experimentos que no son de cromatografia de afinidad con PA-Sepharose, y en los que se han utilizado las inmunoglobulinas, o la PA, marcadas ra­ diactivamente. Comprenden ensayos de fijaciôn a PA insolubi- lizada, como cêlulas de S, aureus o unida a plaças de plâs- tico, asi como reacciones de precipitaciôn directa y de co- precipitaciôn, con la PA en forma soluble. II.9.1. Fijacion a celulas de S. aureus. Se han empleado organismes de la cepa Cowan, pre- viamente muertos por calor y tratados con formaldehldo, con- servados liofilizados o a 4-“C en suspension en PBSA-BSA al 10%, v/v. Inmediatamente antes de su utilizaciôn, las bac- terias se lavan dos veces con el mismo tampon, resuspen- diendolas a una concentracion determinada por su Aggg, asu- miendo que la correspondiente de una suspension de 5 x 10^ celulas/ml es de 0.3 (Movitz, 1976). Los ensayos se han realizado en tubos de microfu- ga de polietileno, de 0.4 ml de capacidad, a temperatura ambiente y con agitacion rotatoria, para mantener las celu­ las en suspension, en un volumen final de 0.15 ml, durante 1-2 horas. Las inmunoglobulinas o sus fragmentes que se han fijado a las bacterias se separan por centrifugaciôn en una microfuga, a 4“C, durante 4 minutes, aspirando el sobrena- dante como se ha indicado en II.8.1.. Los tubos se cuentan en un espectrômetro de radiactividad gamma, despuês de lavar- les dos veces con 0.35 ml de PBSA-BSA. La fijacion inespecifica, estimada a partir de la radiactividad que, en idênticas condiciones expérimentales, se une a cêlulas que han side tratadas con pepsina, 10 mg/ml de suspensiôn de estafilococos al 10%, v/v, en àcetato sodi- co 0.1M,pH 4.0, durante 16 horas a 37“C, para eliminar la PA de su superficie, oscila entre el 3-6% del total de ra- -IbZ- diactividad que se ha anadido, y se resta sistemâticamente de las cuentas unidas a las bacterias con PA, para determi- nar la fijacion especlfica. Los distintos ensayos, por duplicado y en PBSA-BSA, bien de fijacion directa a las cêlulas, de su inhibiciôn por anticuerpos o de competiciôn por inmunoglobulinas y sus frag- mentos, siguen lo expuesto para los radioinmunoensayos anâlo- gos, especificândose en los pies de las figuras las caracte- rîsticas concretas de cada ensayo. En el estudio de la dependencia de la fijacion de IgM a los estafilococos respecto del pH del medio, el tampon utilizado esta constituido por una mezcla de âcido dietilbar- bitûrico, fosfato dipotâsico y âcido bôrico, 0.03M de cada uno, llevando con hidrôxido sôdico o HCl el pH al valor de- seado (Tengblad, 1980). El efecto de la proteolisis parcial de los esta­ filococos sobre su capacidad de fijacion de inmunoglobulinas y sus fragmentos, se estudio con cêlulas incubadas en tubos de microfuga de polipropileno, al 1%, v/v en citrato sôdico • O.IM, pH 4.0, o en PBSA, durante 1 hora a 37“C, con canti- dades variables de pepsina y tripsina, respectivamente, pre- paradas por diluciones sucesivas de sendas soluciones de una concentracion inicial de proteasa de 0.5 mg/ml. La digestion en los tubos con pepsina se detuvo su- -163- biendo el pH del medio, y la de los tubos con tripsina al anadir inhibidor de tripsina de soja, en 10% exceso, en pe­ so, de enzima. Tras 1 hora a temperatura ambiente, las bac­ terias se lavaron 5 veces con PBSA-BSA. 11.9.2. Fijaciôn a protelna A en plaças de plâstico. La insolubilizaciôn de la PA, asi como el resto de las operaciones en los ensayos de inhibiciôn de la fija- ciôn de inmunoglobulinas por anticuerpos, o de competiciôn por inmunoglobulinas y fragmentos no marcados, se efectuan de modo similar a lo descrito en II.8.2. 11.9.3. Anâlisis de los^datos de fijaciôn. Los resultados de los experimentos de inhibiciôn y de competiciôn se expresan del modo que se ha descrito en II.8.1. . El câlculo de las constantes de asociaciôn aparen- tes, Ka, en experimentos de fijaciôn directa a cêlulas, asi como la concentraciôn de receptores de inmunoglobulina, n, se han efectuado por procedimientos analiticos, a partir de la representaciôn de Scatchard (Scatchard, 1949), utilizando un rango de concentraciones de ligando que sature la capacidad de fijaciôn del mismo de las cêlulas empleadas en el experi-g mento, 1.5 x 10 . -164- La concentracion molar de inmunoglobulina unida, B, se estima a partir de su actividad especîfica absoluta, en tanto que la de la fraccion no unida, F, se obtiene de la diferencia entre la de inmunoglobulina total présente y la de la unida. Los datos expérimentales representados de este mo­ do parecen ajustarse a la relaciôn B/F = Ka(n-B), correspon­ diente a un sistema receptor de n sitios idénticos e inde- pendientes. La expresiôn de la recta de regresiôn de esos datos se calcula por el mêtodo de minimos cuadrados, utili­ zando el coeficiente de correlaciôn para evaluar la hipôte- sis de ausencia de correlaciôn entre B/F y B (Cramer, 1972). En algunos casos la Ka se ha calculado del inverso de la concentraciôn de inmunoglobulina no marcada que produ­ ce una inhibiciôn del 50% de la fijaciôn de la inmunoglobu­ lina radiactiva. Esto se ha hecho en experimentos de fija­ ciôn a PA insolubilizada en plâstico, de modo que las concen­ traciones de PA e inmunoglobulina marcada sean suficientemen- te bajas (Cuatrecasas y Hollenberg, 1975). II.9.4. Reacciones de precipitaciôn y coprecipitaciôn. Difieren, esencialmente, en que las de coprecipi­ taciôn llevan, ademâs de la PA y la inmunoglobulina, el frag­ mente Fey. -165- Se hacen en tubos de polietileno de microfuga, de 0.4 ml de capacidad, con todos los reactivos disueltos en PBSA-BSA o en Tris-HCl. 0 , 05M j pH 7.6, dloruro s6dico:'0.12M, azida s6dica 0.1%, p/v, PEG 6000 3%, p/v y Tween 20 0.1%, v/v. La extension de la reaccion se mide como radiactividad sedi­ mentable por centrifugaciôn en microfuga a 4“C, durante 5 minutos, tras 20-24 horas de incubacion a temperatura ambien­ te, y que es lavada dos veces con 0.3 5 ml de tampon antes de contarse en el espectrômetro de radiactividad gamma. En los experimentos de coprecipitaciôn, la IgM.y el Fey se mezclan previamente antes de ahadirlos a tubos con PA. La composiciôn exacta de las mezclas de reacciôn, que se in­ dicé en los pies de las figuras, depende del tipo de ensayo. En unos la inmunoglobulina radiactiva, con o sin Fcy , se in­ cuba con una cantidad variable de PA, en tanto que en otros, por ejemplo, manteniendo constantes las concentraciones de los otros reactivos se varia la de Fcy , etc. Para el estudio de la composiciôn del complejo precipitable, los ensayos se han hecho por triplicado, de modo que el componente radiacti- vo en la mezcla es, en cada uno de ellos, distinto. Otro grupo de experimentos es el constituido por los de inhibiciôn de la reacciôn de precipitaciôn y copreci­ pitaciôn. En ellos, para una relaciôn inmunoglobulina:PA pre- determinada, se incluyen cantidades variables de inhibidor, fragmentos de inmunoglobulina o anticuerpos, que se mezclan —166— previamente con la inmunoglobulina radiactiva, antes de aha­ dirlos, inmediatamente, a los tubos con PA. Los tubos con los precipitados inespecificos difie­ ren de los otros en que carecen de Fey, en los experimentos de coprecipitaciôn, o de PA, en los de precipitaciôn directa, y las cuentas sedimentadas en estes casos se sustraen para el câlculo de la precipitaciôn especîfica. Los resultados de los experimentos de inhibiciôn se expresan como se ha indicado en II.8.1.. -167- 11.10. MATERIALES Medîos cromatogrâficos; Sephacryl S-200, Sephacryl S-300, Sepharose SB, Sephadex G-150 superfino, DEAE-Sephacel, Sepha- rose 4B activada con bromuro de cianogeno, PA-Sepharose CL4B, de Pharmacia Fine Chemicals; CM 5 2 y DE 52, de Whatman; croma- tofolios de celulosa (5577), de Merck; Bio-Gel P - 4 , de Bio- Rad Laboratories. Colorantes : CBB G-250 y xylene cyanol FF, de Serva Feinbioche- mica; CBB R-250 y N-N'-di-DNP-Lys, de Sigma Chemical Co.; azul de bromofenol, de Merck. Materiales de electrcforesis; TEMED, acrilamida y agarosa de baja electroôsmosis, de Sigma Chemical Co.; acrilamida, N-N'r- metilenbisacrilamida, persulfato amônico. Tris, Glicina, Gli-r cerol, de- Merck; Anfolitos, pH 3,5^40, de LKB; Isogel y Gel Bpnd film, de FMC corporation, Materiales de marcaje radiactivo de proteinas; lodo-Gen, de Pierce; Cloramina T, metabisulfito sôdico, glucosa y perô- xido de hidrôgeno, de Merck; L-tiroxina, de Sigma; ^^^I sôdico, de 'The Radiochemical Center" de Amersham. Sueros, antisueros, inmunoglobulinas: suero de cerdo, de GIRESA; otros sueros, del animalario del departamento; IgG humana, de Kabi; proteinas de mieloma, de pacientes del hospital; IgA hu­ mana de calostro, de Sigma Chemical Co.; antisueros anti-IgM, anti-IgA y anti-IgG, de Behring Institute y de Operon; antisue- 468, ros anti-subclases de IgG humana, de Nordic Immunological Laboratories. Disolventes y acidos organicos: Butanol, Piridina, Isopropanol, Dioxano, Cloroformo, Metanol, Etanol, Acido Acetico, Acido formico, Acido Tricloroacetico, Acido Perclorico, Acido Sul- fosalicilico, de Merck; Triton X-100, de Sigma Chemical Co.; Tween 20, de Serva Feinbiochemica. Proteinas y Enzimas: Papaina (tipo IV), Tripsina (tipo XI), Pepsina, BSA, LPO, GO (tipo VII), a-quimotripsinogeno A (tipo II), Conalbumina, Citocromo c, Mioglobina, Inhibidor de trip­ sina de soja, de Sigma Chemical Co.; Lisozima, Anhidrasa Car- bônica y Cadena B de insulina, de Serva Feinbiochemica; Catalasa, de Calbiochem; Proteina A de S. aureus^ de Pharmacia Fine Chemicals. Materiales radioinmunoensayos e interaccion con PA: tubos de microfuga de polietileno de Beckman; cêlulas de S. aureus^ de Sigma Chemical Co.; Plaças de pocillos de PVC, de Nunc y de Linbro. Acidos y sales inorganicos: de Merck y Carlo Erba. Otros materiales: 2-mercaptoetanol, Etanolamina, PMSF, EDTA, DTT, de Sigma Chemical Co.; PEG 6000 y 40000, membranas de diâlisis, Glutaraldehido, de Serva Feinbiochemica; L-cisteina y urea, de Merck; Adyuvantes Complete e Incomplete de Freund, de Difco Laboratories; Clorhidrato de Guanidina, de Carlo Erba; -169- Agarosa de electroosmosis media, de FMC Corporation; Papel de filtro 3MM y tipo 1, papel de fibra de vidrio GF/A y GF/C, de Whatman; Yodoacetamida, de Sigma Chemical Co.; Peliculas de autorradiografîa X-OMAT S y X-OMAT MA, de'Kodak-Pathe. RESULTADOS Y DISCUSION 111.1. Interaccion de IgM policlonal humana con proteina A. 111.2. Sitios de proteina A para las reactividades clâsica y alternativa. 111.3. Receptores de proteina A de una IgM monoclonal humana 111.4. Receptores de proteina A en estructuras de dominios variables de cadenas pesadas. 111.5. Discusiôn general. -170- 111.1. INTERACCION DE IgM POLICLONAL HUMANA CON PROTEINA A 111.1.1. IgM reactiva con proteina A. 111.1.1.1. Aislamiento de IgM por cromatografia de afinidad con PA-Sepharose. La interaccion de la IgM humana con la PA de S, aureus se ha estudiado utilizando una preparaqiôn de in­ munoglobulinas de esta clase aisladas de suero humano normal por cromatografia de afinidad con PA-Sepharose (II.1.2.4.). La electroforesis en gel de poliacrilamida, en pre- sencia de SDS, de la IgM asi obtenida, figura III-IA, produce una banda de escasa movilidad, de acuerdo con su alto peso molecular, y cuando es reducida con DTT, dos bandas de movi- lidades correspondientes a las de las cadenas ligeras y cade­ nas pesadas y. La figura III.IB., muestra asimismo el anâlisis por inmunoelectroforesis de la IgM eluida de PA-Sepharose, y aunque con los sueros anti-suero humano utilizados solo se aprecia la banda de precipitaciôn de la IgM, en esta prepa- raciôn puede apreciarse la presencia de IgG e IgA, en canti­ dades que,estimadas por inmunodifusiôn radial, representan el 2 y 4%, respectivamente, del total de material retenido en PA-Sepharose, como se indica en la tabla III. 1., del que mâs del 90% es IgM, de acuerdo con la fraccion del mismo que que es precipitada por antisueros especificos de cadena y -171- 2 m B Figura III.l. Caracterizaciôn de la IgM policlonal aislada por cromatografia de afinidad con PA-Sepharose. A, anâlisis por SDS-PAGE en un gel de 3.5%C, con 4%T en su region superior y 10%T en la inferior, de IgM reducida (1) y no reducida (2), que queda en el gel superior. Como referencia IgG reducida en (3). B, anâlisis por inmunoelectroforesis de la IgM eluida de PA-Sepharose (2) con sueros anti-suero hunano total (5) y anti-fracciôn de suero hunano de baja concentracion en IgG y albumina ( 6 ). Los otros pocillos contienen: suero hunano (4), mcroglobulinas cromatografiadas en PA-Sepharose (3) y su fraccion no retenida en esa columna (1). -172- Ta.bla 111,1, DISTRIBUCION DE IgM, IgA e IgG EN LAS DISTINTAS ERACCIONES DEL PRQCESO DE PURIFICACION DE IgM, DETERMINADAS POR INMUNODIFUSION RADIAL Proteina en mg b IgM IgA IgG Muestra original^ 50 90 585 Macroglobulinas 46.2 2.38 (de Sephacryl S-300) No unido a PA-Sepharose^ 2 2.6 1.42 Unido a PA-Sepharose° 17.53(93.8)d 0.79(4.2) 0.37(1.98) a, calculadas tomandp como concentraciones de IgM, IgA e IgG en suero, 1, 1,8 y 11.7 mg/ml, respectivamente. b, no detectada. c, corresponde al pico de una primera cronatografia. d, entre parëntesis el porcentaje del total de inmunoglo­ bulina presente en ese pico. -173- (figura 11,151.). El procedimiento de purificaciôn empleado, se de- sarrollô a partir de la observaciôn, figura III.2., de la presencia regular de IgM en la fracciôn de suero humano con afinidad por la columna de PA-Sepharose, formando, junto a la IgA (Van Kamp, 1979), el 8-9% de esa fraccion, constituida principalmente por IgG (tabla III.3,). III.1.1.2. Utilizaciôn de tampones disociantes en la elucion de IgM de PA-Sepharose. La fuerte interaccion de la IgM con la PA-Sepharose détermina el empleo de condiciones disociantes para su complé­ ta elucion de la columna, obteniêndose con soluciones de iso- tiocianato sôdico 3M o clorhidrato de guanidina 4M, recupera- ciones algo mayores que la obtenida con tampones âcidos como el descrito (tabla III.2.). No obstante, todos estos tratamien- tos, y el cambio de pH quizâ mâs que los otros, deben afectar notablemente a su estructura tridimensional, ya que, como se indica en la misma tabla, cuando el material asi eluido es re- cromatografiado en PA-Sepharose, se observa que parte de la IgM ha perdido su capacidad de union a la columna. Afortunadamente, esta probable desnaturalizaciôn pue­ de reducirse si el tratamiento disociante se abrevia al mâximo, como en la neutralizaciôn inmediata del eluido, pues entonces la disminuciôn de la capacidad de interacciôn con la PA-Sepha- -174- C ) II Figura III. 2. Anâlisis por inmunoelectroforesis de la fraccion de suero hunano retenida en PA-Sepharose. El pocillo (a) tiene suero hunano, y su fraccion no unida y unida a PA-Sepharose en los (b) y (c), respectivamente. Los an­ tisueros son: anti-IgM (T), anti-IgA (II), anti-IgG (III) y anti-suero hunano (IV). Tabla III.2. EFECTO DEL TRATAMIENTO DISOCIANTE EN EL AISLA­ MIENTO DE IgM POR CROMATOGRAFIA EN PA-SEPHAROSE Tampon eluciôn primera cromatografia PBS-GUHCl 4M IgM cargada 8.9 mg No unida a PA-Sepharose 3.1 Eluida de PA-Sepharose con tampon âcido. 4.2 PBS-NaSCN 3M 7.7 mg 3.4 4.2 Gly-HCl O.IM ■7.1 mg 3.1 2.9 Volumenes iguales de la fraccion de macroglobulinas recogidas de la columna de Sephacryl S-300, se cargan en la columna de afinidad eluyendo el material en ella retenido con los tampones sehalados. Tras diâli- sis contra 200 volumenes de PBSA, se recromtografia en PA-Sepharose, eluyendo ahora con Gly-HCl O.IM, pH 2.5. La distribuciôn de proteina se ha calculado a partir de su A2qq y el coeficiente de absorcion de la IgM. -1/b- rose résulta minimizada. Por esto, aunque el rendimiento es ligeramente inferior cuando la columna es eluida con tampon âcido, la posibilidad de revertir râpidamente el tratamiento, hace que éste fuera el procedimiento elegido. Ademâs, la IgM asi obtenida mantiene su estructura cuaternaria, como puede deducirse del patron que résulta de su cromatografia en Se­ pharose 6B, figura III.3., que muestra su estado esencial­ mente desagregado. III.1.1.3. Interaccion con PA-Sepharose en funcion del pH. La interaccion de la IgM humana con la columna de PA-Sepharose es dependiente de pH, como sucede con la IgG de varios mamiferos (Ey y col., 1978; Duhamel y col., 1979; Delacroix y Vaerman, 19 79). En la figura III.4., puede ob- servarse que su elucion con tampones de distinto pH produce fundamentalmente cuatro fracciones, en un patron cromatogrâ- fico repetitivo en la distribuciôn de proteina y en su forma, y que, ademâs, muestra la necesidad de utilizer tampones muy âcidos para una compléta recuperaciôn de la IgM retenida en la columna. Las movilidades electroforêticas de cada una de estas fracciones en agarosa, o su actividad antigenica con antisueros especificos de cadena y, figura III.5 ., no desve- la la posible heterogeneidad manifestada en ese patron de élu- ciôn, lo cual, unido a la inexistencia de variantes isotipi- -177- o S< 0.1- 90 120 ISO 180 Fracciones Figura III. 3. Estructura de la IgM policlonal humana purificada por cromatografia de afinidad en PA-Sepharose. El cromato- gram muestra la elucion de la IgM filtrada en una co­ lumna de Sepharose 6B, 2.2 x 102 cm, a 15 ml/h con PBSA. Las fracciones son de 1.5 ml y se sehalan las correspon­ dientes al volumen excluido, Vo, y de elucion de IgG. •rl78̂ LO. .8. 8 O CO 6.1 4.4. 4.0 3.4 2.5 .2 . «0 80 100 120 140 Fracciones 20 40 160 Figura III.4. Elucion de IgM policlonal humana de PA-Sepharose en funcion del pH. Cromatografia de la fraccion de macro­ globulinas del suero en una columna de 1 x 7.5 cm de PA-Sepharose equilibrada en PBSA, La elucion del material retenido se hace con los tampones de acidez creciente de la tabla II.2., a 50 ml/h, en fracciones de 3 ml. Los distintos pH se muestran junto a las fléchas que sehalan los cambios de tampon de elucion. B 100 80 - 60 - Q. Fracciones de IgM .ng Figura III. 5. Anâlisis de las fracciones de IgM obtenidas por elucion de la columna de PA-Sepharose con tampones de acidez creciente. A, inhibiciôn competitive de la union de IgM{ ̂ '̂"1} 35000 cpm, a un suero anti-IgM policlonal (H+L), por cantidades variables de IgM eluida de PA-Sepharose a pH 4.4 (■), a pH 4.0 (A), a pH 3.4 (Y) y a pH 2.5 (•), en 10.0 yl, de los que 25 son del antisuero 1:1000. Tras 16 horas se ahaden 150 yl de un suero de oveja anti-IgG de conejo y 50 yl de una soluciôn de IgG de conejo, 0.12 mg/ml, para precipitar la IgM{^^^I} unida, en un ensayo de doble anticuerpo, segun II.8.1. B, inmunoelectroforesis de la IgM eluida a pH 4.4 (1), pH 4.0 (2), pH 3.4 (3) y pH 2.5 (4), con un antisuero contra suero humano. En (5) suero humano. —180— cas o alotîpicas conocidas en la IgM, hace dificil la inter- pretaciôn de su comportamiento cromatogrâfico en la columna de PA-Sepharose. La figura III.6 . muestra el fraccionamiento que, de modo anâlogo, se produce cuando el material cromatografia- do es suero humano: aqui se obtienen tantas fracciones como eluciones a distintos pH se efectuan y, como en el caso de la IgM, el patron es representative de otros realizados en con­ diciones similares de cantidad de muestra, tamaho de columna, etc. En cada una de ellas se détecta IgA e IgM, tabla III.3., sobre todo en las eluidas con los tampones mâs âcidos, y no se ha podido apreciar una resoluciôn de las distintas subcla- ses de IgG, tal como ha sido descrita (Duhamel y col., 1979; Biewenga y col., 1982), aunque en condiciones cromatogrâficas diferentes de las utilizadas aqui. III.1.1.4. Rendimiento de la purificaciôn de IgM. Si la fraccion de macroglobulinas de suero no rete­ nida en PA-Sepharose vuelve a cargarse en la columna, puede eluirse con tampôn âcido un segundo pico de inmunoglobulina, mucho mâs reducido, y un tercer aûn menor en una nueva recro- matografia, de modo que considerando como no reactiva con PA a la IgM présente en esta fracciôn de macroglobulinas tras su­ cesivas pasadas a travês de la columna de PA-Sepharose, cons- tituye el 50-60% de la IgM del suero, resultado que esta de -101- 2.0- 1.5-oOD N< 1.0 - 0.5- 4.4 40 34 2.5 20 40 60 80 100 120 140 160 Fracciones Figura III. 6 . Elucion de la fraccion de suero humno retenida en PA-Sepharose con tampones de distinto pH, Cromatogra­ fia de 10 ml de suero humano en una columna de 1 x 7.5 cm de PA-Sepharose equilibrada en PBSA. La elucion del material unido se hace a 50 ml/h, con los tampones de acidez creciente de la tabla 11.2.. El pH de cada uno de ellos se indica junto a las fléchas que sehalan el cambio de tampon de elucion. Las fracciones son de 3ml, -liSZ-r- Tabla III.3. ANALISIS DE LAS FRACCIONES OBTENIDAS EN LA ELUCION DEL MATERIAL DE SUERO HUMANO UNIDO A PA-SEPHAROSE CON TAMPONES DE ACIDEZ CRECIENTE pH eluciôn Proteina (mg) IgA IgM IgGl IgG2 IgG3 IgG4 6.1 2.51 + + + + + + - +/- 5.1 25.7 t + + -f - + 4.4 16.5 + + + + - + 4.0 7.85 + + + + - + 3.4 8.4 + + + + + + - V- 2.5 0.94 + + + + + + - +/- 62^ 2.5 b 2.7 b a, la cantidad total de proteina se détermina a partir de su Aggg y el coeficiente de absorcion de IgG, inmunoglobulina mayoritaria. b, cantidades medidas por inmunodifusiôn radial, con suero especificos anti-IgA y anti-IgM. La presencia de inmunoglobulinas se détecta por doble inmunodifusiôn, con sueros anti-IgA, anti-IgM y anti-subclases de IgG humana, indicando con - reacciôn negativa, y con + reacciôn positiva, seha- lando con mas de una la intensidad aparente de las mismas. —183— acuerdo con la existencia de proteinas de mieloma reactivas y no reactivas con PA (Harboe y Foiling, 1974). El mêtodo de purificaciôn utilizado tiene un ren­ dimiento aceptable, en torno al 30-40% (tabla III.l.) y pro­ duce IgM reactiva con PA, motivo de interês adicional para este trabajo. Esto, junto a su simplicidad, le hace prefe- rible a los procedimientos convencionales que suelen emplear la filtraciôn de las euglobulinas del suero y la electrofo­ resis preparativa de las macroglobulinas correspondientes (Chaplin y col., 1965) u otros menos générales, que produ­ cer fracciones enriquecidas en IgM por su acomplejamiento con âcido bôrico (Mauch y col., 1980) o su retenciôn en co- lumnas con sustancias policatiônicas como la protamina (Wichman y Borg, 197 7) y que, ademâs de resultar mâs laborio- sos, a veces no conducen a preparaciones de la pureza deseada El procedimiento descrito para la obtenciôn de IgM policlonal humana puede, ademâs, considerarse de validez ge­ neral com mêtodo de purificaciôn de IgM, y por sus caracteris- ticas puede aplicarse a pequehas cantidades de suero o a muestras de sueros individuates, teniendo en cuenta que el rendimiento va a depender, sobre todo, de la reactividad de las proteinas IgM consideradas. -184- III.1.2. Fijaciôn de IgM policlonal a cêlulas de 5. aureus, III.1.2.1. Ensayos de fijaciôn directa. La reactividad de la IgM policlonal humana con PA se ha estudiado por medio de experimentos de fijaciôn de la inmunoglobulina marcada radiactivamente a cêlulas de 5. aureus con PA, mostrândose en la figura III.7. algunas de las ca- racteristicas de este sistema de ensayo. De la cinêtica de captaciôn de IgM por cêlulas con PA, figura III.7A., puede apreciarse cômo a los 10 minutos el 80% de la IgM ya se halla unida a los estafilococos, por lo que para sucesivos experimentos se escogen 60 minutos como tiempo suficiente para asegurar las condiciones de equilibrio. La velocidad de asociaciôn de la IgM es algo menor que la observada por procedimientos similares para IgG humana (Myhre y Kronvall, 1980b). La fijaciôn a cêlulas sin PA, por otro lado, résulta muy pequeha y casi invariable desde el principio de la incubaciôn, tal como caracterîsticamente sucede con las fijaciones inespecificas (Cuatrecasas y Hollenberg, 1975). En la figura III,7B. se muestra la fijaciôn de IgM a los estafilococos en funciôn del pH del medio, resultando una dependencia similar a la observada para IgG (Myhre y Kronvall, 1980b) y que se halla de acuerdo con su comporta­ miento cromatogrâfico en la columna de PA-Sepharose. 0.6-2.0- b i - VI 0.9- 50 Tiompo, minuto» 90 pH #0- 2 #0 - 20- 2 Nüm«ro de bocteriosxIO 4 -a Figura III. 7. Fijacion directa de policlonal a S. aureus, A, cinetica de la fijacion de 0.3 yg de a 1.5 X 10® celulas de S, aureus no tratadas (•) o dige- ridas con pepsina (A). B, Fijacion de 1 yg de IgM{^^^I} en 10 yl, a 140 yl de suspensiones de S, aureus conteniendo 1.5 x 10® celulas en tampones de los pH indicados (II.9.1.) C, fijacion de 0.1 yg (•) o 3 yg (̂ ) de IgM{^^^I} en fun- cion del nijmero de bacterias, el cual se mantiene constan­ te, sin embargo, anadiendo estafilococos digeridos con pepsina. -Ibb- En este sistema los estafilococos unen un 60% de la IgM, figura 111.7C., y esta fijacion es proporcional al numéro de celulas de S, aureus présentes, como puede apre- ciarse en la misma figura, cuando la concentraciôn de inhiuno- globulina es saturante. 111.1.2.2. Determinacion de la Ka del proceso de fijacion y comparacion con la correspondiente de IgG policlonal La IgM unida a un numéro constante de celulas de S, aureus en funciôn de la concentraciôn de inmunoglobulina, figura 111.8 ., muestra la saturabilidad del proceso de fija­ cion con el aumento de la cantidad de IgM présente, en tanto que la union inespecîfica se mantiene lineal, resultando ocu- opados todos los receptores de 1.5 x 10 células con 3 yg de IgM El anâlisis grâfico de estos datos por el procedi- miento de Scatchard (Scatchard, 1949), produce una represen­ tation lineal, esencialmente recta, figura 111.9., sugiriendo que la fijacion observada de IgM a los estafilocos ocurre a travês de un ûnico tipo de receptor y permite calcular una gconstante de asociaciôn, Ka, para esta fijacion, de 1 x 10 1/mol, valor superior a la mayoria de los estimados para la uniôn de IgG de conejo o de proteinas IgG monoclonales huma^ 7nas, en el rangQ 50-0,5 x 10 1/mol (Kessler, 1975; Kronvall y col,, 1970bl, El anâlisis de los datos de fijacion de IgG humana -187- 0.9 cm Zi o 0.6-•o c3 r—i lON C_i I za»H-l 0 .3 - onadido, Uq Figura III. Saturabilidad del proceso de fijacion de IgM a S. aureus, Soluciones de concentraciôn variable de IgMf^^^I} , 7.7 X 10""̂ - 4.1 X 10“ *̂̂ M, se incuban en 150 yl con 1.5 X 10® células no tratadas (A) o digeridas con pepsina (■), durante 1 hora. La diferencia de la radiactividad fijada a una y otra preparaciôn (•) se représenta como fijacion especifica. •“ISS"!*- 3.2- 2.4- *o 0.8 - IgM unida x 10^ M Figura III. 9. Representacion de Scatchard de los datos de fijacion de cantidades variables de IgM policlonal a S. aureus (figura 111.8.). La expresiôn de la recta de regresiôn es y = -1.07x + 3,12, y el coeficiente de correlaciôn r = -0.98, con una p < 0.001 para 15 puntos (11.9.3.). 1.0 - 0.8 - ^ 0.6 - 0.4- 0.2 - 0.3 0.6 0.9 1.2 IgG unida x IO*M Figura III. 10. Representacion de Scatchard de los datos de fijacion de cantidades variables de IgG a S, aureus, Soluciones de concentraciôn variable de lgG{l^^^} , 8.81 x 10 - 1.02 X 10"^M, se incuban en 150 yl con 1.5 x 10^ celulas de S, aureus^ efectuando la representacion a partir de las fracciones de IgG especificamente unida y libre, calculadas como se indica en 11.9.3.. la expresiôn de la recta de regresiôn de mayor pendiente es y = -0.16x + 1.09, y la de la de menor pendiente y = -0.03x + 0.32. Los coeficientes de correlaciôn respectives son, . r = -0.92, p < 0.001 para n = 12, y r = -0.89, p < 0.005 para n = 9. -lyu- policlonal en este sistema, produce una representacion de Scatchard curvilinea, figura 111,10., similar a las observa- das en otros trabajos (Kronvall y col., 1970b; O ’Keefe y Bennet, 1980), que se ha descompuesto de modo arbitrario en dos ramas rectas, supuestamente correspondientes a sen- dos procesos de fijacion de distinta afinidad, tal como se 8 7indica en la misma figura, con Ka de 1.6 5 x 10 y 2.7 x 10 1/mol, respectivamente, en cualquier caso inferiores al valor calculado para la de la fijacion de IgM. III.1.2.3. Capacidades de union de IgM e IgG por S, aureus. Que el receptor considerado de IgM se encuentra en la molêcula de PA, viene indicado no solo porque la IgG poli­ clonal es capaz de inhibir completamente su union a los esta­ filococos, figura III.IIA., sino que dicha fijacion tambiên résulta interferida en presencia de fragmentes Fab de anti- cuerpos contra la PA, figura III,IIB., frente a lo apuntado por otros autores acerca de que debia ser otro el componen- te de la pared celular de S, aureus que fijaba IgM (Harboe y Foiling, 1974). Por otro lado, la menor actividad inhibidora de IgG respecte de la de IgM, figura III.IIA., esta de acuerdo con las distintas afinidades observadas para la fijacion de una y otra inmunoglobulina a los estafilococos (III.1.2.2.). Sin embargo, aparté la heterogeneidad observada en ^191— ioo< •0- Ôi 40- 20- 0.01 0.1 I K) 100 Inmunoglobulina oAodldo, Ug woo wo Frogmtnto Fob oRodido, Uq Figura III. 11. Proteina A como receptor de S. aureus para IgM. A, inhibicion ccmpetltiva de la fijacion de IgM{^^^I) a 5. aureus, Soluciones de concentraciôn variable de IgM (A) e IgG (•) se mezclan con 1 ug de IgMf^^^I} en 100 yl y se anaden a tubos con 50 yl de una suspension 0.2% de bacterias, v/v, representandose la fracciôn de IgM{i25%} unida tras 1 hora de incubacion, calculada segun II.9.1.. B, Inhibicion de la fijacion de IgM a S. aureus por an- ticuerpos anti-PA. Soluciones de concentraciôn variable de Fab anti-PA (♦) o Fab no inmune (■), se mezclan con 1 yg de IgM{i2Sj} en 100 yl y tras 1 hora se anaden a tubos con 50 yl de una suspensiôn 0.2% de bacterias, v/v. La fracciôn de IgMC^^^I} unida se calcula segun II.9.1. ~ la fijacion de IgG, la capacidad de union de esta inmunoglo­ bulina es superior a la de union de IgM, calculadas a partir de las correspondientes representaciones de Scatchard (figu­ ras III.9. y 111,10.), 6-12 fmoles y 3 fmoles por 10^ célu­ las, respectivamente. En todo caso, el nûmero de receptores por cêlula que resultaria, suponiendo un ûnico sitio de union por molê­ cula de PA, 2-8 X 10^, es mucho menor que el de 8 x 10^ cal­ culado de modo similar para células de la cepa Cowan I (Kronvall y col., 1970b). Esta discrepancia puede reflejar la conocida variabilidad del contenido en PA de los estafi­ lococos , dependiendo del medio y condiciones de cultivo (Lind, 1974), pero, ademâs, este ultimo valor fue estimado con células frescas de una preparaciôn que mostraba una râ- pida pérdida de capacidad de uniôn de IgG con el tiempo de almacenamiento (Kronvall y col., 1970b). Habrîa que conside- rar, asimismo, el posible efecto que los tratamientos de formalinizaciôn, liofilizaciôn, etc., pudieran tener sobre los componentes de la pared celular. Esta menor capacidad de los estafilococos para unir IgM podria derivar de la no ocupaciôn de todos los receptores présentes, por impedimentos estéricos relacionados con el ma­ yor tamaho de su molêcula, si bien hay que considerar alter- nativamente, o al tiempo, que por su estructura polimérica puede contener varios sitios de interacciôn por molêcula de IgM, con lo que la diferencia en el nûmero de receptores, del -193- modo en que se ha calculado, no séria real y, para la IgM, se hallarîa infravalorado. Este fenômeno se maniflesta tam­ biên en las distintas capacidades de fijacion de IgM e IgG a columnas de PA-Sepharose, en torno de 2 y 12 mg/ml de gel, respectivamente (tabla III.1. y III. 3.), una diferencia ma­ yor que la observada con células de 5. aureus. Hay que tener en cuenta, no obstante, que en la columna de afinidad, la PA se encuentra unida covalentemente a la agarosa por uno o va­ rios de sus grupos amino (Pharmacia Fine Chemicals, 1979), en una disposiciôn y densidad probablemente distintas de la correspondiente a la superficie de los estafilococos, en don- de se encuentra en una uniformemente orientada, debido a su anclaje en la pared celular por su extremo C-terminal (Sjodahl, 1977a). III.1.2.4. Efecto del fragmento F(ab')nY sobre la fijacion de IgM. Cuando en los experimentos de inhibiciôn competiti­ ve de la fijacion de IgM a células de S. aureus se utilizan fragmentes de IgG, figura III.12., résulta que la actividad observada para la molêcula entera se conserva en su regiôn F(ab’)2Y, la cual es capaz de inhibir completamente la uniôn de IgM a los estafilococos, mientras que para el fragmente Fcy se aprecia un dêbil efecto sôlo a las mayores concentra- ciones ensayadas. La pequeha diferencia entre las actividades inhibidoras de IgG y F(ab*)2Y puede reflejar el contenido en 90- r-i 60- I— I 10" * M o l e s d e Inhibidor Figura III.12. Inhibicion competitiva de la fijacion de IgM a S. aureus por fragmentos de IgG. 100 yI de solucio­ nes de concentraciôn variable de Fcy (A), F(ab’)2Y (■)t IgG (#) e IgM (•) se mezclan con 25 yl de IgM{l25%} 0.04 mg/ml, y a continuacion se incuban durante 2 horas en tubos con 25 yl de una suspensiôn 0.4% de bacterias, v/v, representandose la fracciôn de { 1 2 5 unida, calculada como se indica en 11.9.1.. -195- en una y otra preparaciôn de especies moleculares con estruc- turas reactivas en su region F(ab’)2Ï) ya que por el modo en que se ban obtenido podrlan ser distintas. Segûn estos resultados, la reactividad de la IgM policlonal humana con PA es similar a la descrita por Inganas para la IgE, y que sirviô para définir el mecanismo de interac­ ciôn por medio de fragmentos F(ab')2 , a partir de que, como la observada aqul para IgM, la fijaciôn de IgE a PA-Sepharo­ se es inhibida por IgG y por F(abf)2Y, pero no por el frag­ mente Fcy (Inganas y col., 1980). 111,1,3. Reacciones de coprecipitaciôn y precipitaciôn de IgM e IgG con proteina-A. III.1.3.1. Coprecipitaciôn de IgM humana con proteina A y Fcy. La IgM policlonal interacciona con la PA formando complejos insolubles en presencia del fragmente Fcy humane, como se muestra en la figura III,13A., en una reacciôn de co­ precipitaciôn similar a las descritas para IgM de mieloma con IgG de conejo en agarosa (Grov, 1975a). o tambiên con Fcy en soluciones con PEG (Inganas y Johansson, 1981). En las condi­ ciones empleadas, la ausencia de cualquiera de las très pro­ teinas détermina la no formaciôn de agregados precipitables (figura III,13A,), Estos complejos contienen, en la regiôn de la curva -196- 40 10- 0 0.9 2 0 2 4 6 10 Proteina A onadida, Mg Figura III. 13. Reacciones de coprecipitaciôn de IgM y de precipitaciôn directa de IgG con proteina A. A, fracciones de IgM precipitadas en la incubaciôn de 50 >*1 de IgM{|2 5]T̂ 0.02 mg/ml y Pcy 0.04 mg/ml con 100 ]il de soluciones de concentraciôn variable de PA (•), calculadas segun 11.9.4.. Se muestra asimismo las corres­ pondientes de FcY{t25%j e IgMC^^^Î} precipitadas en ausencia de IgM (A) y Fcy (t ) , respectivamente. B, fracciones de lgG{^^^I} en 25 yl de soluciones 0.8 mg/ml precipitadas en presencia de 100 yl de soluciones de concentraciôn variable de PA, calculadas segun 11.9.4.. -197- de maxima precipitaciôn, 6-7 moléculas de PA por molêcula de IgM, figura III.14., mostrando, ademâs de la multivalen- cia de la IgM, una composiciôn bien diferente de la de los formados en la precipitaciôn de PA e IgG policlonal humana, en los que la relaciôn molar de ambos componentes es 1:2 (Sjoquist y col., 1972a). La magnitud de la precipitaciôn es dependiente de la concentraciôn relativa de cada una de las proteinas inte- resadas. Asi, para las cantidades fijadas de IgM y Fcy de la figura III.13A., pueden distinguirse condiciones de aparènte exceso de IgM, a la izquierda del mâximo de la curva de preci­ pitaciôn, y de exceso de PA a su derecha, en las que deben tenerse, fundamentalmente, complejos solubles. El efecto estimulante de la precipitaciôn debido al fragmento Fcy se muestra en la figura III.14., en la que se han representado las fracciones de IgM y PA que se encuentran en los complejos formados al variar las concentraciones de Fcy, No obstante, cuando se supera la relaciôn de 11 moles de Fcy por mol de PA, la precipitaciôn empieza a disminuir, en un comportamiento que puede ser comparado con la inhibiciôn que produce en la reacciôn de precipitaciôn directa de IgG y PA (Kronvall y Frommel, 1970; Inganas y Johansson, 1981). Esta actividad podrîa estar asociada a algûn efecto sobre el tama­ ho de los complejos formados en presencia de esas concentra­ ciones de Fcy, ya que en los que aûn precipitan, la relaciôn - l a o - 25-o*oo Cl -6o 2Q. 15- uo o q: -2 242.670.290.03 f 8 5 I 8 #—#6 - z Fcy aAodido, Ug Figura 111.1*4. Coprecipitaciôn de Fcy y proteina A enfmcion de la concentraciôn de Fcy. Se ha representado la fracciôn de radiactividad precipitada, segun II.9.4., en la mezcla de 50 yl de IgM, 20 yg/ml y 50 yl de PA, *4 yg/ml, con 50 yl de soluciones de concentraciôn variable de Fcy, en tubos con IgM{^.^^I} (•) o PA{^^^I} (A), asi como la relaciôn molar PA/IgM(»') en los complejos precipitados. Tubos sin Fcy indican la inespecificidad del ensayo. -199- IgM:PA se mantiene inalterada, figura III.14.. Hay que destacar lo paradojico de la actividad del fragmento Fcy en la interacciôn de inmunoglobulinas y PA en soluciôn, ya que si por un lado inhibe la reacciôn de preci­ pitaciôn directa (Kronvall y Frommel, 1970), la formaciôn de complejos precipitables de la reacciôn de coprecipitaciôn con PA de inmunoglobulinas no précipitantes (Grov y Endresen, 197 6) o de fragmentos F(ab’)2 (Inganas y Johansson, 1981), requieren su presencia. Puesto que los agregados correspondientes a la ma­ xima precipitaciôn, la relaciôn molar PAiFcy calculada es de 1:3, resultado que se halla de acuerdo con la monovalencia funcional de este fragmento en su interacciôn con la PA (Inganas y Johansson, 1981), êsta ha de poseer en su molécu- la mas de un sitio de uniôn de IgM, y asi hacer posible la polimerizaciôn que produce los grandes complejos insolubles. Esto haria posible entonces que la sola asociaciôn de IgM y PA condujera a agregados precipitables en ausencia de Fcy, pe­ ro estos sôlo se han observado en presencia de PEG, en un efec­ to estimulante de precipitaciôn similar a los observados pa­ ra este compuesto con inmunocomplejos (Johanssen y col., 1980). III.1.3.2. Precipitaciôn directa de IgM con proteina A. Asi, en la figura III.15., puede observarse cômo todas las fracciones de IgM eluidas de PA-Sepharose con tam- -2UU- o 40- Q. 30- O l 1— 1 10- OL 10033II1.2 P r o t é i n e I] cftodida, n g Figura III. 15. Precipitaciôn directa de IgM policlonal y proteina A. Se representan las fracciones de PA{^^^1} precipitadas, segun II.9.2.4., en la incubaciôn de 100 yl de solucio­ nes conteniendo 10 yg/ml de IgM eluida de PA-Sepharose a pH 4.4 (•), pH 4.0 (T), pH 3.4 (■) y pH 2.5 (A), con 50 yl de soluciones de concentraciôn variable de PAl^^^I} de actividad especifica constante, en tampôn Tris-HCl 0.05M, ^ 7.6, NaCl 0.12M, 0.1% Tween 20, v/v y 3% PEG,6000, p/v. -ZUl- pones de acidez creciente dan complejos precipitables con PA, en un medio con PEG, si bien la capacidad de formaciôn de agregados para cada una de ellas es bien diferente. Se puede pensar entonces, que en las reacciones de coprecipi­ taciôn cabria cierta heterogeneidad en los complejos, de modo que la estimaciôn de 6-7 moléculas de PA por molêcula de IgM en los mismos, podrîa representar un valor promedio de los correspondientes a agregados de otra estequiometrîa. III.1.3.3. Precipitaciôn directa de IgG con proteina A. Por el contrario, no todas las fracciones de IgG obtenidas de su cromatografîa en PA-Sepharose forman comple­ jos precipitables con PA, ya que, como puede observarse en la figura III.16., sôlo los producer aquellas eluidas con los pH mas âcidos, e incluso su contenido en especies pré­ cipitantes es variable, llegando a comprender el 85% de la IgG en una de ellas, lo cual es un enriquecimiento notable, si se tiene en cuenta que en el conjunto de IgG no pasa del 35%, figura III.13B., o incluso del 45% descrito utilizando concentraciones mucho mayores de PA e IgG (Sjoquist y col., 1972a). Esta diversidad en la formaciôn de complejos con PA se contempla tambiên en proteinas IgG de mieloma, de las que la fracciôn précipitante de alguna de ellas es dos y has- ta très veces mayor que la de IgG policlonal (Kronvall y col., 1970d). 100 80 -oXJo Cl 60 - Q l I— I in CM 20- Proteino A ohodido, M g Figura III.16. Precipitaciôn directa con proteina A de fracciones de IgG policlonal obtenidas de PA-Sepharose. 100 yl de soluciones 0.2 mg/ml de IgG eluida de PA-Sepharose a pH 6.1 (♦), pH 5.1 (*), pH 4.4 (■), pH 4.0 (A), pH 3.4 (•) y pH 2.5 (▼), conteniendo 100-200000 cpm de cada una de esas fracciones marcadas con ̂ ^^I , se mezclan con 50 yl de soluciones de concentraciôn variable de PA, representandose la radiactividad precipitada, segun II.9.4.. -203- Las fracciones no précipitantes eluidas de PA-Se- pharose con los tampones menos acidos, deben corresponder a las proteinas con reactividad tipo inhibidor de la reacciôn de precipitaciôn, pues aunque en mezclas equimolares con IgG de las fracciones précipitantes aparecen mezcladas en los mismos complejos, figura III.17., para las mayores concentra­ ciones de PA puede observarse un efecto inhibidor de preci­ pitaciôn, si se comparan las curvas con las de la figura III.16..El doble marcaje permite, asimismo, apreciar cômo los complejos formados en presencia de las concentraciones mas bajas de PA se hallan particularmente enriquecidos en IgG précipitante. III.2. SITIOS DE PROTEINA A PARA LAS REACTIVIDADES CLASICA Y ALTERNATIVA II1.2.1. Receptores de proteina A para F(ab*)oY y Fcy. De acuerdo con la diferencia de actividades de los fragmentos FCab'jgY y Fcy sobre la fijaciôn de IgM a S. aure (figura III.12.), la uniôn de F(ab')2Y es afectada débilmen- te por Fcy, que produce una inhibiciôn graduai, aunque incom­ plete, a diferencia de la IgG y el propio fragmento P(ab’)2y, figura III.18., cuya actividad en este ensayo es, sin embargo, menor que la de la molêcula de IgG intacte. Recîprocamente, la fijaciôn de Fcy a los estafilo­ cocos es interferida parcialmente por F(ab')2y, en tanto que us -204- O"Oo 60“ Q. oQ) 40-o. I— I #—Im (M I OO» 2 4 6 8 10 Protéine A onadido, jUg Figura III. 17. Coprecipitaciôn de IgG no précipitante con proteina A, en presencia de IgG précipitante y proteina A. 50 yl de soluciones de concentraciôn variable de PA se incuban con 100 yl de una de IgG 0.2 mg/ml que contiene canti­ dades iguales de IgG eluida de PA-Sepharose a pH 5.1 y de IgG eluida a pH 3.4. Se représenta la radiactivi­ dad precipitada asociada a complejos con IgGC^^Sjj je pH 5.1 (•) o con IgG{^^^I} de pH 3.4 (A), calculada segun II.9.4.. r20brr 120 \ IQ-I* |0“" IQ- Moles de Inhibidor 10* Figura 111,18. Inhibicion competitiva de la fijacion de F(ab')2Y a S. aureus por fragmentos de IgG. 100 yl de solucio­ nes de concentraciôn variable de Faby (A), F(ab’)2Y(*)> Fcy (▼) e IgG (■), se mezclan con 25 yl de F(ab')2Y{^^^I} 60yg/ml, y a continuacion se incuban con 25 yl de una suspension de bacterias 0.6%, v/v, durante 2 horas. La fracciôn de F(ab')^Y unida representada se ha cal­ culado segun II.9.1. -206- la IgG Intacta o el mismo Fc y , producen una inhibicion équi­ valente y compléta, como muestra la figura III.19.. Esta ac­ tividad del fragmento F (a b ')2Y es similar a las observadas en la fijacion de Fcy a PA-Sepharose (Inganas y col., 1980; Inganas, 1981) y en la de PA a Fcy insolubilizado en plâsti- co (Biguzzi, 1982), para F (a b ')2Y policlonal y de algunas proteinas de mieloma. La existencia en la molêcula de IgG de dos estruc- turas capaces de interaccionar con PA se manifiesta, de nuevo, cuando se considéra su fijaciôn a los estafilococos en presen­ cia de sus fragmentos F(ab’)2Y y Fc y que, por separado, apa­ recen con actividades inhibidoras menores que las de la IgG, figura III.20.. Asimismo, puede observarse la distinta natura- leza de los efectos inhibidores de cada fragmento, que para el Fcy es apreciable a concentraciones mucho menores que a las que se produce el de F(ab’)2Y. Por otra parte, las pen- dientes de las curvas obtenidas tambiên son diferentes, siendo la inhibiciôn debida al fragmento Fcy graduai y mas incomple- ta que la correspondiente de F(ab')2Y, en relaciôn, quizâ, con la mayor sensibilidad que muestra la uniôn a los estafi­ lococos del fragmento Fcy a la presencia de F(ab’)2Y. Estos resultados permiten entender la complejidad observada en la interacciôn de IgG con los estafilococos, de modo que la fijaciôn a travês de estructuras de Fcy o F(ab’)2Y, sea lo que tal vez de lugar a representaciones de Scatchard 110 #0-o•oc3 I— I a 50- I 20- 10" “ 10" Moles de inhibidor Figura III. 19. Inhibicion competitiva de la fijacion de F c y {125̂ ]. a S, aureus por fragmentos de IgG. 100 yl de soluciones de concentraciôn variable de Faby (A), F(ab' )^y (•), Fcy (▼) e IgG (■), se mezclan con 25 y 1 de Fcy{^^^1} 80 yg/ml, y a continuacion se incuban con 25 yl de una suspension de bacterias 0.6%, v/v, durante 2 horas. la. fracciôn de Fcyf^^^Dunida representada se ha cal­ culado segun II.9.1. —208»" ISO 100- I Io 40- 10- 10“ “ K )“ " Moles de inhibidor Figura III. 20. Inhibicion competitiva de la fijacion de IgG{^^^%} a S, aureus por fragmentos de IgG. 100 yl de soluciones de concentraciôn variable de Faby (A), F(ab')2Ï (*), Fcy (▼) e IgG (■), se mezclan con 25 yl de IgG{ 2^ yg/ml, y a continuacion se incuban con 25 yl de una suspension de bacterias 0.4%, v/v. La fracciôn de IgG{^^^I} unida representada se ha calculado segun II.9.1. - Z U 9 T . curvilineas como la obtenida, figura III.10.. De este modo, si el rango empleado de concentraciones de IgG es suficiente- mente amplio, puede observarse el proceso de fijaciôn de me­ nor afinidad, a travês de estructuras en la regiôn F(ab’)2Y, cuando comienza a completarse el otro proceso de uniôn de mayor afinidad, con cantidades menores de IgG. Quizâ por ello resulten similares las Ka de fijaciôn a S. aureus de IgG de mieloma précipitantes e inhibidoras de precipitaciôn (Kronvall y col., 1970b), a pesar de que las précipitantes muestren tambiên reactividad a travês de sus regiones FCab'jgY (III.4.4.; Inganas y Johansson, 1981). De este modo, la identidad entre los sitios de PA que unen IgM y F(ab')2Y, sôlo o formando parte de la IgG (III.1.2.4.), junto al dêbil efecto del fragmento Fcy sobre la fijaciôn de IgM o IgE a la PA, sugiere que los dos meca- nismos de interacciôn descritos, a travês del Fcy y de la re­ giôn F(ab’)2 (Inganas y col., 1980), deben hallarse mediados por estructuras receptoras de la molêcula de PA distintas, que pudieran ser no totalmente independientes, a la vista de las interferencias reciprocas parciales observadas en los procesos de uniôn de F(ab’)2Y y Fcy, aunque lo suficiente para constituir la causa de las distintas capacidades obser­ vadas para la fijaciôn de IgG e IgM a las células de 5, aureus (III.1.2.3.). -z±u- III.2.2. Actividad del fragmente Faby en los ensayos de fijacion a S, aureus. En todos estos experimentos se estudia tambien el comportamiento del fragmente Faby , que como puede apreciarse en las figuras III.18., III.20. y III.21., actua como muy debil inhibidor de las fijaciones de F(ab’)2Yj IgG e IgM, respectivamente, sin afectar, en cambio, la de Fey (figura III.19.). Aunque la fijacion de F(ab')2y es la mas sensible a la presencia de Faby, la potencia inhibidora de este frag­ mente es mucho mener que la manifestada en cada case per el FCab')^?, lo que conduce a plantearse que implicaciones pu- diera tener la region gozne de la molécula de IgG en su union a la PA por este mécanisme alternativo relacionado con la iiteraccion a travês de sus regiones F(ab')2 . Para examinar esta cuestion se prepararon por re- duccion parcial del F(ab')2y los fragmentes Fab'y, los cuales, como se aprecia en la figura III.21,, muestran una potencia inhibidora de la fijacion de IgM a los estafilococos équiva­ lente a la de los fragmentes Faby , de modo que, respecto de la competiciôn con IgM por sus sitios de union en PA, pare- ce indiferente la presencia del péptido de la region gozne resultando esencial, por el contrario, el mantenimiento de tal region intacta, en la forma que se encuentra en la molé­ cula de IgG o de F (a b ')gY , para preservar sus respectivas -211- 120 90- o■oc3 n_iIzo> 30- 10-" Moles de Inhibidor Figura III. 21. Efecto de la reduccion parcial de F(ab')2Y sobre su actividad inhibidora de la fijacion de I g M ^ S, aureus, 100 yl de soluciones de concentracion varia­ ble de Faby (•), F(ab')2Y (■), Fab’y (t) e IgM (A) se mezclan con 25 yl de lgM{^^^I} 40 yg/ml, y a continuacion se incuban con 25 yl de una suspension de bacterias 0.4%, v/v. La fraccion de IgMf^^^l} unida representada se ha calculado segun 11.9.1. afinidades por la PA, como indica la disminucion de activi­ dad inhibidora observada para el Fab'y. 111.2.3, Inhibicion de la reaccion de coprecipitacion de IgM, Fey y proteina A. La dualidad sehalada de sitios receptores, se apre­ cia, asimismo, en la reaccion de coprecipitacion de IgM con PA y Fcy, la cual résulta inhibida por el fragmente Faby, tal como aparece en la figura 111.22., mientras que la region F(ab')2y solo lo hace levemente, produciendo incluso, una es- timulacion de la misma a las menores concentraciones, mostran- do que el efecto del fragmente Faby no se debe a una posible interferencia con la union de Fcy a PA. Este resultado puede interpretarse suponiendo que la IgM es desplazada de su sitio de union en la molécula de PA al ser ocupado por el fragmente Faby, el cual, en su inte- racciôn se comportaria como monovalente, deshaciendo los agre- gados que pudieran formarse, al contrario que el F(ab')2y, el cual no inhibe esta reacciôn, probablemente, por llevar en su molécula dos sitios de interaccién con PA, une en cada Fab'y, por lo que participaria en los complejos precipitables, hasta que a altas concentraciones sustituyese en los mismos a la IgM, obteniêndose asi una mener cantidad de radiactivi- dad precipitada. Acerca de la localizaciôn en estos fragmentes de la ^213- 100- o.u«» o. 60-TI_iIZ0» I— • 20- 225ISO75 900 Fragmente onodldo, jUg Figura III. 22, Inhibicion de la reaccion de coprecipitacion de IgM con proteina A y Fcy. 25 yl de una solucion de IgM{^^^I}, 0.04 mg/ml y Fcy 0.08 mg/ml, se mezclan con 100 yl de soluciones de inhibidores conteniendo cantidades varia­ bles de F(ab')2y (■) o Faby (♦), y se ahaden a tubos con 25 yl de PA, 0.012 mg/ml, representandose las frac- ciones de IgM precipitada, segun 11.9.4. -214- estructura a travês de la cual se unen a la PA, estos resul- tados sugieren que si en el Faby es ûnica, y doble en el F(ab')2y, la presencia de la region gozne no debe ser dé­ terminante en esta interaccién, tal como tambiên se deducia de la actividad del fragmente F a b ’y (figura III. 21.). Ademas, esta reactividad alte^nativa a, travês de sitios en F(ab’)2 se présenta en inmunçglçbulinas que, como IgE e IgM, carecen de regiôn gozne (Putnam, 1977a), 111.2,4, Efecto de la proteoÜsis de S\ aureus sobre su interaccién con inmunoglobulinas. Abundandp en la existencia de distintos sitios re^ ceptpres de IgG en la molécula de PA> la figura III.23., mues- tra el efectp de la prpteplisis graduai de cêlulas de 5, aureus cpn tripsina y pepsina spbre la fijaciôn de IgM, IgG, F(ab’)2y y Fcy, cpnsistente en una disminucién prpgresiva de su capa- cidad de unipn de Ips distintps ligandps ensayadps. La prpba- ble destruccipn de PA es mês acusada cuando la prpteasa utili- zada es pepsina, figura 111,23B , perp aparté estp, el efectp del tra,tamientp cpn ambps enzimas respectp de la fijaciôn re­ sidual para cada ligandp es similar: la unipn de IgM y la de F(ab’)2yrésulta afectada, perp menps que la de IgG y que, sp­ bre tpdp, la de Fcy, La cantidad de PA présente en cada puntp del trata- mientp puede cpntrplarse siguiendp la variaciôn de la fijacipn —215— 100 70-§ u .2 4 0 -I 10- 40 79 129 900 40 79 900129 Tripsina oAodido, Ug/ml Pepsina aAadida, kg/ml Figura III. 23. Efecto de la proteolisis de 5. aureus sobre su capaci- dad de union de I^, IgG y fragmentes de IgG. 100 yl de suspensiones de bacterias 0.2%, v/v, tratadas con can­ tidades variables de tripsina (A) o pepsina (B) como se indica en 11.9,1., se mezclan con 50 yl de soluciones que contienen 0.5 y g de IgMt^^^I) (■), 0.2 y g de Fcy{125i} (e), 0.7 yg de IgG (A), 1.5 yg de F(ab’)2Y CA) G fragmentes Fab anti-PA marcados con (♦), representândose las fracciones de radiac- tividad unida tras 2 horas de incubaciôn, respecto de las fijadas por un numéro igual de cêlulas no tratadas. -216- a los estafilococos de fragmentes Fab monoespecificos contra PA, admitiendo la suposicion de que la especificidad de la po- blaciôn de anticuerpos inducida en la inmunizaciôn no se halla desequilibrada, con una desigual distribuciôn de los distin­ tos anticuerpos hacia une o pocos déterminantes de la PA, asi como que estes se disponen de modo relativamente uniforme en el conjunte de la molécula. Los resultados muestran, figura III.23., que la pêr- dida moderada de sitios antigênicos, estimada a partir de la cantidad de Fab anti-PA unido, va acompanada de una reduccion importante en la capacidad de fijaciôn del fragmente Fcy e IgG, sobre todo, y tambiên , pero menos pronunciada, de las corres- pondientes de IgM y F(ab')2Y. III.2.5. Efecto de anticuerpos anti-proteina A sobre la capa­ cidad de fijaciôn de inmunoglobulinas a S, aureus. Anâlogamente, cuando se estudia el efecto del blo­ quée de sitios antigênicos de la PA por fragmentes Fab anti-PA sobre la fijaciôn a los estafilococos de los mismos ligandos. puede observarse,figura III.24., que la uniôn de IgM y F(ab’)2Y es mâs sensible a la presencia de estos anticuerpos que la de Fcy, la menos afectada, o la de IgG, que es inhibida en grade intermedio respecto de las otras. La interpretaciôn de estos resutados, sin embargo, ha de ser muy cuidadosa, pues ademas del hecho ya citado de la 110 o •0“•o"c3 ■OO■o z 50-o'•5o OC 12.5 50 F o b onti“proteina A, Uq 200 Figura III.24. Relaciôn entre antigenicidad de la proteina A y sus sitios de union de Fcy y F(ab’)2Y. 25 ul de IgG{^^^I}, 0.024 mg/ml (■), de F c y { 1 2 5 1 } ^ 0.008 mg/ml (♦), de F(ab’ , 0.048 mg/ml (A) o de IgMf^^^I} 0.04 mg/ml (•), se prein- cuban durante 2 horas con 100 yl de soluciones de con­ centracion variable de fragmentes Fab anti-PA, en tubos de microfuga a los que se ahaden despuês 25 yl de una suspension 0.4%, v/v, de estafilococos. La fraccion de radiactividad unida se calcula respecto de la maxima fi- jada, observada en la incubaciôn con fragmentes Fab de IgG de coneje no inmune. -ZIO- posible diferencia de concentraciones de fragmentes Fab con­ tra uno u otro déterminante antigenico, la naturaleza del en- sayo obliga a considerar las distintas afinidades de las in­ munoglobulinas por sus receptores en PA o la del mismo recep­ tor, como sitio antigenico o parte de el, por su Fab especi- fico, asi como el efecto que sobre la afinidad de la PA por cualquiera de las inmunoglobulinas o sus fragmentos pudiera tener el bloqueo de déterminantes antigênicos no relaciona- dos con los verdaderos sitios de union de las mismas. Entre estos resultados y los obtenidos con cêlulas parcialmente digeridas con proteasas, existe, no obstante, una correspondencia determinada por la relacion que parece exis- tir entre la configuraciôn antigénica de la PA y las regiones de su molécula que unen IgM y FCab'jgY, mientras que la capa­ cidad de fijaciôn de Fcy muestra una mayor independencia de los sitios antigênicos de la PA. Asi, a una mayor integridad antigénica se halla aso- ciada una fijaciôn de F(ab’)2y cuantitativamente mayor que la de Fcy, figura III.23., al tiempo, que por lo mismo, es inhi­ bida mucho mâs efectivamente por los fragmentos Fab anti-PA que la de Fcy, la cual résulta afectada sôlo parcialmente. El comportamiento de la IgG en estos experimentos, intermedio entre los de IgM o F(ab’)2Y Y ^1 de Fcy, puede deberse, posi- blemente, a su interacciôn con ambos tipos de receptores de la molécula de PA, -219- Esta interpretaciôn se halla de acuerdo con la des- cripciôn de la reacciôn de coprecipitaciôn de IgG de conejo o de fragmentos Fcy con PA, inicialmente caracterizada utili- zando anticuerpos FCab'jg anti-PA (Kronvall y Williams, 1971), que, al parecer, no deben interferir la interacciôn de Fcy y PA, asi como del hecho de que la modificaciôn quimica selecti- va de aminoâcidos de la PA, como Tyr o H y s , que participan en el contacte con la regiôn Fcy (Deisenhofer y col., 1978), y de la que résulta una sensible disminuciôn en su reactivi- dad cop diversàs IgG, apenas afectan su actividad antigénica (Sjoholm y col., 1972; Sjoholm y col., 1973; Sjoholm y Sjodin, 1974) y, en definitive, esté de acuerdo con la existencia de dos tipos de receptores distintos en la molécula de PA, uno que uniria IgG por su regiôn Fcy y otro que la uniria por su regiôn FCab'jgy, a través del que ademâs une IgM e IgE, No obstante, y como se podia apreciar en los experimentos de in^ hibiciôn competitive, las estructuras que definen estos recep­ tores, o se hallan prôximas en lanplêcula de PA o, en todo caso, no deben ser completamente independientes, como sugiere la afectaciôn generalized^ de la capacidad de uniôn de Fcy y FCab'lgy tras la proteolisis de los estafilococos. 111,3. RECEPTOR DE PROTEINA A DE UNA IgM MONOCLONAL HUMANA Los trabajos dirigidçs al conocimiento de la regiôn de la mplécula de IgM implicada en la interacciôn con la PA se han efectuado con una proteina monoclonal, por la simpli- -220- ficacion que puede suponerse de su naturaleza homogênea. Asimismo, la disponibilidad de grandes cantidades de esta IgM ha facilitado la preparaciôn, por digestion enzimâtica controlada, de fragmentos de su molécula, cuya reactividad se ha estudiado por cromatografia de afinidad y en ensayos de inhibicion competitive de la interacciôn con PA de la IgM intacta. Los resultados obtenidos se extienden, mâs adelante, al conjunto de moléculas IgM policlonales del suero normal (III.4.1. y III.4.2.). III.3.1. IgM Iz. Se aislô del paciente Iz, con macroglobulinemia de Waldestrom, que tiene grandes cantidades de esta IgM en sue­ ro, 30-8 0 mg/ml, dependiendo del momento de su tratamiento, a partir del fluido obtenido del mismo por plasmaféresis. Esta paraproteina es una euglobulina, lo que permi- te su aislamiento por precipitaciôn repetida en soluciones de baja fuerza iônica (II.1.2.5.), La proteina asi obtenida apa­ rece como IgM antigênicamente pura en la inmunoelectrofore- sis de la figura II.7., con la movilidad restringida propia de su naturaleza monoclonal, y tras electroforesis en gel de poliacrilamida, en presencia de SDS y DTT, figura III.25., da dos bandas que migran en posiciones correspondientes a las de cadenas y y cadenas ligeras. Su forma estructural es la pentamérica tipica, como puede deducirse del patrôn cromato- ■ r 2 2 U 5.0 - 150 , * 67 3.0- oCOM< 30 90 120 150 180 Fracciones Figura III. 25. Caracterizacion de la IgM Iz. Cromatografia de la IgM obtenida por euprecipitacion del suero Iz en una columna de Sepharose 6B, 2.2 x 102 cm, eluida con PBSA a 15 ml/h. Las fracciones son de 1.5 ml y se han senalado las que se recogen para tener una preparaciôn de IgM sin agregados de alto peso molecular. Las frac­ ciones del volumen excluido y de eluciôn de IgG como en la figura III.3.. Se muestm tambiên el analisis por SDS-PAGE de esta IgM, reducida (1) y sin reducir, en un gel de 3.5%C, con 4%T en su zona superior y 9%T en la inferior. Se indica el M^CxlO de los narcadores de peso molecular utilizados. grâfico obtenido en una columna de Sepharose 6B, figura III-25, asi como de su reducida movilidad electroforética, cuando no esta reducida, en la misma figura, de acuerdo con el gran tamaho molecular esperado para esta proteina. La cadena ligera fue identificada de tipo A por doble inmunodifusiôn con antisueros anti-cadenas A y k . III.3.1.1. Cromatografia de IgM Iz en PA-Sepharose. La mayoria de la IgM Iz, un 8 5%, es retenida en una columna de PA-Sepharose cuando la cromatografia se efec- tua en condiciones no saturantes, tal como puede observarse en la figura III.29A., que muestra el perfil correspondiente a la cromatografia de 5 mg de IgM Iz en una columna capaz de unir 20 mg de IgM. Este comportamiento se contempla tam- bién con otras proteinas monoclonales reactivas con PA, que al ser cromatografiadas en esa columna de afinidad se repar- ten en sendas fracciones unida y no unida a la columna, cuya magnitud relativa es variable para cada proteina considerada (Grov, 1975a; Biewenga y col., 1982), En la figura 111,26, se muestra el patron croma- togrâfico obtenido en la eluciôn de la IgM Iz de la columna de PA-Sepharose utilizando los mismos tampones de acidez creciente que se emplearon en el fraccionamiento de la IgM policlonal reactiva con PA (figura III.4.). Puede observarse una distribuciôn fundamentalmente homogênea de la proteina 1.0 0.8- 0.6 - O CO CM< 6.1 4.4 3.44.0 2.50.4- 0.2 - 20 40 60 80 100 120 140 Fracciones Figura III.26. Eluciôn de IgM Iz de PA-Sepharose en funciôn del pH. Cromatografia de 18 mg de IgM Iz en una columna de PA-Sepharose, 2 x 3.3 cm, equilibrada en PBSA. La eluciôn de la proteina unida se hace con los tampo­ nes de acidez creciente de la tabla II.2., a 70 ml/h, en fracciones de 1.7 ml. Los distintos pH se mues­ tran junto a las fléchas que sehalan el cambio de tampôn de eluciôn. -224- unida en un pico principal, con cantidades menores en otros d o s . Otra diferencia respecto del cromatograma de las pro­ teinas IgM de suero normal es su compléta eluciôn a pH 4.4, tampôn con el que aûn queda en la columna el 8 0% de la IgM policlonal (III.1.1.3.). El no fraccionamiento y caracteristica eluciôn de la proteina Iz en esta columna, probablemente se deba a la individualidad de la IgM considerada, frente al conjunto heterogénedo de proteinas que son las IgM de suero normal. III.3.2. Fragmentos Faby y (Fc)^y. En un primer intento para establecer a travês de que regiôn de la molécula de IgM se produce su interacciôn con la PA, se prepararon los fragmentos Faby y (Fc)^y, obte­ nidos tratando la IgM con tripsina en las condiciones de ele- vada temperatura necesarias para el mantenimiento de la in­ tegridad de los dominios Cy3 y Cy4, que a temperaturas infe- riores son hidrolizados a pequenos pêptidos (Plaut y Tomassi, 1970; Miller y Metzger, 1966). La mayoria de la IgM résulta asi digerida, separân- dose los productos obtenidos en dos picos tras filtraciôn en una columna de Sephacryl S-300, figura III.27., que contie­ nen los polipéptidos correspondientes a los fragmentos (Fc)^y (una banda de =40000 de Fcy) y Faby (dos bandas, de 30000 y 25000, Fdy y cadena ligera, respectivamente), como se obser- 8.0 - 676.0 - 30 2.0 - 90 120 150 ISO 210 Fracciones Figura III. 27. Obtenciôn de los fragmentos (Fc)^y y Faby. El cromtogram corresponde a la separaciôn de los pro­ ductos de digestion trîptica de la IgM Iz en caliente (11.2.2.1.), en una columna de Sephacryl S-300 eluida a 40 ml/h con TA. Las fracciones son de 3.8 ml y se han sehalado las que se reunen conteniendo (Fc)^y, priiær pico, y Faby, segundo pico, respectivamiente. Se muestra tambiên el analisis por SDS-PAGE en un gel de 3.5%C y 10%T de IgM Iz (1), (Fc)^y (2) y Faby (3), reducidos.Sobre las fléchas los Mp x 10” ̂de los marca- dores de peso molecuJar. -226- va en el gel de poliacrilamida de la misma figura. Por otro lado, la inmunoelectroforesis de la figura 111.28. muestra como el (Fc)^y, con movilidad anodica, carece de déterminan­ tes antigênicos de cadena ligera, que solo se encuentran en el fragmento Faby del siguiente pico del cromatograma, el cual présenta un leve desplazamiento catôdico, de acuerdo con la nula movilidad de la IgM entera. Esta ausencia de dé­ terminantes comunes entre el material de ambos picos se ob­ serva tambiên en la inmunodifusiôn de la figura 111.36, con un antisuero contra la IgM Iz. El tiempo de digestion empleado, résulta de prue- bas previas para la obtenciôn de un fragmento (Fc)^y que no reaccione en inmunodifusiôn con sueros anti-cadenas ligeras, o que en los geles de poliacrilamida aparezca libre de cade­ nas pesadas, causa quizâ del bajo rendimiento de su prepara­ ciôn, un 30% del mâximo teôrico. 1113.2.1. Cromatografia de (Fc)^y y Faby en PA-Sepharose. Cuando los fragmentos (Fc)gy y Faby se cromatogra- fian en PA-Sepharose, eluyen en las fracciones correspondien­ tes al material no retenido en la columna, figura 111.29., mientras que la IgM del control de digestiôn, tratada en to­ do igual, excepto en la presencia del enzima proteolitico, conserva toda su reactividad. Asi, el resultado obtenido con el fragmento (Fc)^y Iz discrepa del descrito para el (Fc)^y -227- a V b 1 2 a Figura III. 28. Analisis de Faby y (Fc)^y por inmunoelectroforesis, El pocillo 1 contiene IgM Iz y el 2 y 3, material de los picos senalados en el cromatograma de la fi­ gura 111.27. correspondientes a Faby y (Fc)^y, res­ pectivamente. Los antisueros son anti-lgM(H+L), a, y anti-cadenas X, b. T228. 0.8- 0.6- 0.4- 0.2- s < 0.8- 06- 0.4- 0.2 - 20 3020 30 1010 Fracciones Figura III. 29. Cromatografia de afinidad en PA-Sepharose de fragmentos tripticos de IgM. 5 mg de IgM (A), de Faby (C), de (Fc)^y (D) y de IgM control de digestion (B), se cro- matografian en una columna de PA-Sepharose, 2 x 3.3 cm, equilibrada en TA. Las fléchas sehalan el inicio de la eluciôn con Gly-HCl O.IM, pH 2.5. Las fracciones son de 2.7 ml y el flujo de 80 ml/h. -229- aislado de modo similar de la proteina monoclonal As, que si es retenido en la columna de PA-Sepharose (Grov, 1975a). III.3.3. Precursores de (Fc)^y en la proteolisis de IgM. Para saber en qué momento del proceso de proteo­ lisis de la IgM Iz se pierde la estructura reactiva con PA, se efectuaron digestiones durante tiempos mâs cortos que el empleado en la preparaciôn del fragmento (Fc)^y. La figura III.30. muestra los perfiles cromatogrâ- ficos de la filtraciôn en una columna de Sephacryl S-300 de los digeridos de IgM correspondientes a 20, 30 y 50 minutos. Puede notarse la presencia de IgM no digerida que, no obstan­ te, con sôlo 20 minutos de proteolisis représenta ya una muy pequena fracciôn de la inicial. Con el aumento del tiempo de digestiôn, el primero de los dos picos principales, corres­ pondiente al fragmento (Fc)^y, disminuye y se desplaza leve­ mente a posiciones de eluciôn de material de menor peso mole­ cular, en tanto que el segundo pico, con el fragmento Faby, crece con la extensiôn de la proteolisis. El contenido de las fracciones del pico correspon­ diente a la regiôn (Fc)^y, analizado por electroforesis en agarosa, aparece como una mezcla heterogénea de componentes cuyas movilidades comprenden desde el punto de aplicaciôn hasta la del propio fragmento (Fc)^y, figura III.31., si bien todos ellos antigênicamente relacionados, como indica la fu- :230^ M< 7.0 5.0 3.0 1.0 50 80 110 Fracciones Fi gura III. 30. Comparacion de los productos de digestion triptica de IgM en caliente durante distintos tiempos, por cromatografia en una columna de Sephacryl S-300. La. columna es de 2 x 141 cm, y se eluye con TA a 20 ml/h. Los perfiles corresponden a la digestion de 20 (----), 30 (...... ) y 50 ( — ■ ) minutos. Las frac­ ciones son de 3.4 ml. -231- 6 5 4 3 2 I r 4 ^ "T ' * Figura III. 31. Analisis de los productos de digestion triptica en caliente de IgM durante distintos tiempos, por elec­ troforesis en agarosa.(11.5.1.). En cada pocillo se han puesto 25 yg de IgM (6), y de los digeridos de 20 (2), 30 (3) y 50 (4) minutos. Adems, Faby (1) y (Fc)^y (5), como referencia. -232- siôn de las lineas de precipitaciôn en la inmunoelectrofore­ sis de la figura III.32A. y con déterminantes de cadenas ligeras. Tras electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS y reducidos con DTT, figura III.32B., dan, ademâs de las correspondientes al fragmento Fcy, bandas con movilida­ des similares a las de cadenas pesada y ligera de la IgM, mâs abundantes cuanto menor es el tiempo de digestion. De estos resultados se puede deducir que el mate­ rial del pico considerado estâ constituido por una mezcla de moléculas de IgM parcialmente digerida conteniendo cantida­ des variables de regiones Faby, a las que deberia su menor movilidad electroforética en geles de agarosa respecto de la del (Fc)^y, asi como la presencia de déterminantes de ca­ denas ligeras y las cadenas pesadas intactas observadas en los geles de poliacrilamida. Se trataria de especies precur- soras del fragmento (Fc)^y, cuyo contenido en Faby se reduce conforme aumenta el tiempo de digestiôn. No obstante, estas especies no parecen representar todos los intermedios de di­ gestiôn posibles, correspondientes a la presencia de 1,2,3,. ..,9 fragmentos Faby de los 10 existentes en la IgM, refle- jando, tal véz, el mecanismo de proteolisis que, como en in­ munoglobulinas monoméricas, raramente produce subunidades digeridas en una de sus cadenas pesadas (Michaelsen y Natvig, 1972), de modo que serian moléculas con un numéro de Faby doble del de subunidades intactas. -233-r B 1 2 3 b: f M f --------— — — ——--- — ..— , M MfM tumuÊit•T** " ; — ■ • H 3 r Figura III. 32. Analisis de los productos de digestion triptica en caliente de la IgM durante distintos tiempos. A, inmunoelectroforesis de IgM (1) y de los digeri­ dos de 20 (2), 30 (3) y 50 (4) minutos,con sueros anti-cadenas L, a, y anti-(Fc)^]i, b. B, SDS-PAGE en un gel de 3.5%C y 10%T de los produc­ tos de digestion de IgM reducidos,correspondientes a 20 (1), 30 (2) y 50 (3) minutos de proteolisis. -234- III.3.3.1. Cromatografia de los precursores de (Fc)c4 en PA-Sepharose. Estos productos de digestion incomplete son, a di­ ferencia del fragmento (Fc)^y, parcialmente retenidos en la columna de PA-Sepharose y, como se indica en la figura III.33., la proporcion relativa de las fracciones unida y no unida disminuye segûn procédé la digestion, hecho que estâ de acuer­ do con la incapacidad mostrada por el (Fc)^y de esta protei­ na de fijarse a esta misma columna. Para estudiar que diferencias pueden presentar los componentes reactivo y no reactivo con PA-Sepharose de estas mezclas de intermedios de digestiôn de la IgM, se escogieron las correspondientes a uno de los tiempos de digestiôn. Los patrones electroforêticos en gel de poliacrila­ mida con SDS de las fracciones unida y no unida del digerido de 30 minutos son similares en composiciôn polipeptîdica, figura III.34A., pero la intensidad de las distintas bandas no es idêntica, ya que a la vez que las correspondientes a cadena pesada y ligera se hallan enriquecidas en la fracciôn retenida en la columna de PA-Sepharose respecto de la no uni­ da, la de Fcy es mucho menos aparente. Esto sugiere que, de la mezcla cromatografiada, aquellas moléculas con mayor numé­ ro de cadenas pesadas intactas son las que resultan retenidas preferentemente en la columna de PA-Sepharose. T235- 2.5- 2.0 - 1.5 - 1.0 - 0 .5 - 20 30 40 20 30 40 20 30 40 Frocciones Figura III. 33. Cromtografia de afinidad en PA-Sepharose de productos de digestion triptica en caliente de IgM durante dis- tintos tiempos. En una columna de PA-Sepharose de 2 X 3.3 cm, equilibrada en TA, se cromatografian 5 mg de las mezclas de digestion de 20 (A), 30 (B) y 50 (C) minutes. Las fléchas senalan el inicio de la elucion con Gly-HCl O.IM, pH 2.5. El flujo es de 80 ml/h, y las fracciones de 2.7 ml. —2 36— B 2 1 + Figura III.34. Anâlisis de las fracciones unida (2) y no unida (1 ) a PA-Sepharose de la mezcla de digestion triptica en caliente de IgM durante 30 minutes (figura III.33.B.). A, SDS-PAGE en un gel de 3.5%C y 10%T, reducidas B, inmunoelectroforesis cruzada (II. 5.1.2.) en agarosa conteniendo 3% suero anti-IgM (H+L), v/v, mostrando el material cromatografiado en 3. -237- Apoyan esta interpretaciôn los resultados del anâ­ lisis de las mismas fracciones por inmunoelectroforesis cru­ zada con un suero anti-IgM. La figura III,34B. révéla, de mo ­ do anâlogo a como aparecia en inmunoelectroforesis, la hete- rogeneidad del producto cromatografiado. De este material, las molêculas mas âcidas no son retenidas en la columna de PA-Se­ pharose, en tanto que la fracciôn unida estâ constituida por las molêculas con menor movilidad, debido a una mayor abundant cia en regiones Fabu, capaces de contrarrestar el desplaza- miento anôdico caracterîstico del fragmente (Fc)^p. III.3.4. Fragmentes F C a b M oP» Estes resultados sugieren que si bien la estructura a travês de la que la IgM Iz interacciona con la PA no parece estar asociada a sus regiones Faby o (Fc)gy separadas, su reactividad se halla favorecida por el mantenimiento de su- bunidades intactas. Para averiguar quê papel pudieran desem- penar las regiones Cy2, que son destruidas en la digestion con pepsina (Plaut y Tomassi, 1970; Shimizu y col., 1974) pero se encuentran en los precursores de (Fc)^y, se estudia el comportamiento cromatogrâfico de fragmentes FCab')^^. Esta region se obtiene despuês de la digestion de la IgM Iz con pepsina (Kishimoto y col., 1968), recogiêndose en las fracciones indicadas en el cromatograma de la figura 111,35, correspondiente a la separacion de los productos de -238- 9.0 150 67 6.0 - 10 —o CO CVJ< 3.0- 70 90 110 130 150 Fracciones Figura III. 35. Obtencion del fragmente P(ab*)2P. El cromatograma mues- tra la separacion de los productos de digestion de IgM con pepsina (11.2,2.2,) en una columna de Sephacryl 8-200, 2.4 X 154 cm, eluida con PESA. El flujo es de 40 ml/h y las fracciones de 2.5 ml. Se senalan las que se reco- gen con el fragmente F(ab')2W. Se muestra tambiên su analisis por SDS-PAGE, en los pocillos 1 y 2, reducido, de un gel de 3.5%G y 8%T, junte con el de Fab'y (5 y reducido, 4) y el de Faby (6 y reducido, 3). Se indican los valores de (x lO” )̂ de los marcadores de peso molecular utilizados. -239- 0 Figura 111,36, Anâlisis antigénico de fragmentes de IgM. Doble inmunodifusion de Faby (1), IgM (2), F(ab')2y (3) y (Fc)^y (4) contra un suero anti-IgM (H+L). — — proteolisis en una columna de Sephacryl S-200. Su analisis por SDS-PAGE, reducido con D T T , mues­ tra la composicion polipeptidica esperada: una banda con la cadena ligera y otra con el segmente de cadena pesada que in- cluye el dominie Cy2, y por consiguiente de mayor tamano que la del Faby, figura III.35.. En la inmunodifusion de la fi­ gura III.36., con un antisuero contra la IgM Iz, puede apre- ciarse su carencia de déterminantes antigénicos comunes al fragmente (Fc)^y, asi como su reaccion de identidad parcial con la IgM. III.3.4.1. Cromatografia de F(ab')^y en PA-Sepharose. La mayoria del F(ab’)2y cromatografiado en PA-Se­ pharose no es retenido en la columna de afinidad, figura III.39A., eluyëndose de la misma con el tampon âcido una pe- queha cantidad del fragmente utilizado. Comparândolo con los cromatogramas anâlogos de los fragmentes Faby y (Fc)^y, fi­ gura 111,2 9., la principal diferencia observable es la forma del pico con el material no unido, que suele presentarse en los cases en que la proteina interacciona con el medio cro­ matogrâfico, aunque sin la afinidad suficiente para quedar retenida en êl. III.3.5. Subunidades de IgM. El estudio de la interaccion con PA-Sepharose de las subunidades de IgM, esto es, de los monomeros WgE?, se efectuo entonces con el fin de conocer si la reactividad de la IgM précisa de areas interdominio en torno al Cw2, como sucede en la IgG con sus regiones Cy2 y CY3 (Lancet y col., 1978). La preparaciôn de estas subunidades requiere la reduccion parcial de la molecula de IgM Iz, la cual muestra una susceptibilidad extrema a este tratamiento, ya que en las condiciones de reduccion empleadas con otras proteinas IgM (Miller y Metzger, 1965), resultan afectados otros puen- tes disulfuro ademas de los intersubunidades. Por ello se probaron distintas cantidades de redactor, para optimizer el proceso de obtencion de sus monomeros. La figura III. 37 , muestra los perfiles cromatogra- ficos de la filtracion en una columna de Sepharcyl S-300 de la proteina Iz reducida con las concentraciones senaladas de DTT, Puede apreciarse como con el aumento de la cantidad de agente empleado se redistribuye la proteina en el eluido de la columna, hacia posiciones correspondientes al peso molecu­ lar de los monômeros de IgM, de modo que con ImM DTT no queda prâcticamente nada de IgM pentamêrica. El anâlisis de los segundos picos de estos cromato­ gramas mediantes SDS-PAGE muestra, ademâs de las correspondien­ tes al monômero, bandas de movilidad mayor, figura III.37 .. Sin embargo, su proporciân guarda relaciôn con la cantidad de o00M< 2 0 - 90 110 130 150 170 Fracciones Figura III. 37. Analisis de los productos de reduccion parcial de IgM Iz con cantidades variables de DTT. Los perfiles cromtograficos corresponden a la elucion de una co­ lumna de Sephacryl S-300, 3.5 x 98 cm, de la IgM redu­ cida con DTT ImM (- — ), DIT 0. 4mM (--- ) y DTT 0. 2mM (--- ) como se describe en II.2.2.7.. El flujo es de 50 ml/h y las fracciones de 3.8 ml, senalândose las recogidas, en la reduccion con DTT 0. 2mM, para la re- purificacion de la IgM monomerica. Se muestra tambiên el analisis por SDS-PAGE, en un gel de 3.5%C y 7%T, de los segundos picos de los perfiles de elucion cuando la IgM se reduce con DTT 0.2mM ( 1 ), DTT 0.4mM. (2) y DTT ImM (3); como referenda IgG policlonal (4). -243- DTT empleada, de modo que el mayor rendimiento en la banda de movilidad équivalente a 180000, se obtiene con 0.2mM DTT, por lo que a pesar de la baja eficiencia de reduccion de la IgM, figura III.37 ., es la concentraciôn de DTT escogida pa­ ra la preparaciôn de sus subunidades. La figura III.38. muestra el perfil correspondiente a la cromatografîa en una columna de Sephacryl S-2 0 0 de las fracciones de III.37 . conteniendo IgM monomerica tras redu­ ccion con 0.2mM DTT, para liberarla de todos los agregados y polipêptidos de tamaho distinto del de las subunidades de IgM El material recogido estâ constituido, ademâs de por subunida­ des con puentes disulfuro entre cadenas pesadas intactes , por dimeros no covalentes uL ̂ como sugiere la electroforesis en gel de poliacrilamida de la figura III.37 Situaciones similares se conocen en la prepara­ ciôn de subunidades de IgM policlonal y monoclonal de raton (Parkhouse, 197 5; Giles y col., 198 3) y es posible que ocurra con carâcter mâs general, debido a que los productos de re- ducciôn parcial no siempre son caracterizados en condiciones disociantes. III.3.5.1.^Cromatografîa de IgM monomerica y F ab’y en PA-Sepharose. Esta preparaciôn de subunidades de IgM muestra, a diferencia de la IgM intacta, una baja afinidad por la colum- 3.0- IgG 2.0 - o00 CM< 1.0 - 70 90 110 130 Fracciones Figura III. 38. Recromtogpafia de las fracciones senaladas en la fi­ gura III.37. de los productos de reduccion de IgM con DTI Q,2mM. la columna es de Sephacryl S-200, 2.4 x 140 cm, eluida con PBSA a 30 ml/h cogiendo fracciones de 2.4 ml. Se han senalado las correspondientes al volumen excluido de la columna y las de elucion de IgG, asi como las recogidas conteniendo monomeros de IgM. -245- na de PA-Sepharose, reteniéndose en ella una pequeha parte del material, cromatografiado, en tanto que lo que no se une eluye lentamente de la columna, figura III.39C., dando un pa­ tron similar al obtenido con el fragmento FCab’)^^* Una relaciôn similar entre la reactividad con PA y el estado de polimerizaciôn ha sido descrito para otras pro­ teinas IgM monoclonales y, por ejemplo, de las diversas es- pecies intracelulares halladas en la linea linfoblastoide humana L17 3, productora de IgM, aquellas mâs organizadas en su proceso de ensamblaje hacie formas maduras pentaméricàs son las que preferentemente se unen a cêlulas de S. aureus (Howell-Saxton y Wettstein, 1978). Asimismo, las subunida­ des de esta proteina, y las de la IgM Se (Harboe y Foiling, 1974), muestran afinidades menores por los estafilococos que sus correspondientes formas pentaméricas, recuperândose esta capacidad de interaccion en las molêculas pentaméricas producidas por reoxidacion de esas subunidades (Harboe y Foiling, 1974). La IgM As, cuyas subunidades si se fijan a PA-Sepharose, aparecen, no obstante, como una excepcion (Grov, 1975a). Por otro lado, incluso la conversion del F(ab')2U a su forma monomerica F a b ’y, por reduccion parcial, figura III.40A. afecta su comportamiento en la columna de PA-Sepha- rose, ya que ademâs de no fijarse, su perfil cromatogrâfico, figura III.39B., es muy parecido al del fragmento Faby, sin el retraso en la eluciôn de la proteina no retenida observa- -246- 0.6 0.4- s CM< 0.2- 3010 20 30 10 20 30 10 20 Fracciones Figura III. 39. Cromtografia en PA-Sepharose de fragmentes de IgM con el dominio Cy2. 5 mg de F(ab')2y (A), de Fab’y (B) e IgM monomerica (C), se cromtograflan en una co­ lumna de PA-Sepharose, 2 x 3.3 cm, equilibrada en PBSA. Las fléchas senalan el inicio de la elucion con Gly- HCl 0.lM,pH 2.5. Las fracciones son de 2.7 ml y el flujo de 80 ml/h. -247-r 3.0 2.0 - o00CM< 1.0 - no90 130 ISO no 130 ISO 170 Frocciones Figura III.40. Preparacion de los fragmentes Fab’y y Fey. Cromatogranas correspondientes a la cromatografia en una columna de Sephacryl S-200, 2 x 150 cm, equilibra­ da en PBSA, de los productos de reduccion parcial de F(ab’)2y (A) y (Fc)^y (B) (II.2.2.3-4,). Las fracciones son de 2.5 ml y el flujo de 25 ml/h. Se indican las fracciones recogidas conteniendo Fab’y y Fey. -248- do en los correspondientes a IgM monomerica y FCab’)^^ (figura III.39.). De este modo, ni la presencia del dominio Cw2 en F(ab’)2 4 o en IgM monomerica, ni el mantenimiento, tambiên en las subunidades de IgM, de estructuras interdominio, par- cialmente ausentes en los cv , fragmentos, determinan una eficar interaccion con la PA a la columna de afinidad, y de las otras preparaciones estudiadas que no sean la IgM intac­ ta, solamente aquellas procédantes de digestiones incompletas de la proteina con tripsina, consistantes en molêculas con algunas de sus regiones Faby, son capaces de ser retenidas en PA-Sepharose, e incluso de allas las menos digeridas. Asi, si la presencia de la region (Fc)^y, comun a todos los intermedios de digestiên triptica, no parece critica para su retenciôn en la columna de PA-Sepharose, sino mâs bien el mayor numéro de cadenas pesadas intactas y, en todo caso, s6lo las subunidades de IgM o los fragmentos F(ab')2 y, asimismo sin la porciên Fcy, son las otras fracciones de _la, molêcula que muestran una cierta reactividad con la columna, puede pensarse que el receptor de PA ha de estar asociado a la regiôn Faby o a estructuras determinadas por varias de ellas, pues aunque el fragmento Faby aislado no se une a la columna, los intermedios de digestion tripti­ ca de menor contenido en Faby, que tampoco son retenidos en ̂ PA-Sepharose, interaccionan débilmente, retrasândose en su elucion, figura III.33., sugiriendo que la estructura busca- da puede estar definida, probablèmente, por un numéro mînimo de regiones Faby y/o su suficiente proximidad en la molêcula reactiva con PA-Sepharose. III.3,6. Inhibiciôn competitive de la fijacion de IgM-(I^^^} a proteina A. Puesto que los experimentos de cromatografia de afi­ nidad con los distintos fragmentos de la IgM Iz se revelan incapaces de resolver el problème planteado, se recurrio al estudio de la inhibiciôn competitive de la fijacion de la IgM Iz radiactiva a PA por los distintos fragmentos de su mo­ lêcula que se han venido considerando. Estos ensayos permiten contempler cuantitativamente interacciones que,como las media- das por mecanismos de baja avidez, en PA-Sepharose aparecen asociadas a formas de reactividad representadas por la no fi­ jacion a la columna o la elucion retrasada de ella. Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 111,41,, observândose, efectivamente, reactividad en las regiones Faby, si bien su actividad inhibidora se mani- fiesta a concentraciones mayores que las de otros fragmentos, p a r a un efecto équivalente en la interferencia de la fijacion de la IgM a la PA, Puede verse,que la IgM monomêrica y el F(ab')2 y inhiben tambiên completamente, con similar eficiencia, esa interacciôn, pero su afinidad, aunque mayor que la de Faby -2bO- 120 90- oSc3 E?U) (M 60 -u_i S0»♦H 30- 10° 10' Inhibidor, pmoles Figura III.41. Inhibiciôn competitiva de la fijacion de IgM Iz a proteina A. 10-20 ng de IgM-Iz {^^^1} , 40000 cpm, se mezclan con soluciones de concentraciôn variable de IgM policlonal (•), IgM Iz (o), subunidades de IgM (♦), FCab')^^ (A), (Fc)giJ (v), Fcy (★), Fab’y (▼) y Faby (ü)̂ en un volumen final de 55 yl, e inmediatamente 50 yl se ponen en plaças de PVC previamente cubiertas con 50 yl de PA, 1 yg/ml. La fracciôn de IgM-lzl^^^I) unida se calcula a partir de la radiactividad fijada despuês de 1.5 horas, como se indica en 11.9.2.. -251- es menor que la de la molêcula de IgM intacta. Asi, como se muestra en la tabla 111.4., la capaci­ dad inhibidora de F C a b M ^ y y de la IgM monomêrica es unas 140 veces menor que la de la IgM pentamêrica, y la de los frag­ mentos F a b ’y o Faby, aproximadamente unas 2200 veces menor. Estos resultados se hallan de acuerdo con la informacion pro- porcionada por los cromatogramas de PA-Sepharose, de modo que a la mayor avidez de la IgM en este ensayo corresponde su re- tenciôn en la columna y a interacciones progresivamente mâs débiles, como son las de IgM monomêrica y F(ab’)2p o Faby, un retraso en su elucion o la no fijacion sin mâs, respecti- vamente. ̂ nSegûn el valor de Ka, 7.5 xlO 1/mol, calculado de los resultados de la figura 111.41. (11.9.2.), la avidez de la IgM Iz por la PA es algo menor que la de la IgM poli­ clonal calculada en un ensayo similar (111.4.4.) o en los experimentos de fijaciôn a S', aureus (111,1.2.2.), lo cual se halla de acuerdo con la mayor actividad inhibidora de la fijaciôn de lgM^lz-r{ ̂ ̂ ̂ 1} observada para la IgM policlonal (tabla 111,4.), Esta diferencia de afinidad, asimismo, tal vez guarde relaciôn con que la proteina monoclonal resuite eluida de la columna de PA-Sepharose a pH 4,4, mientras que en condiciones similares permanece retenida gran parte de la IgM policlonal (figura 111,4,), La dêbil acciôn inhibidora que présenta el fragrnen- Tabla III.4. REACTIVIDAD DE FRAGMENTOS DE IgM CON PROTEINA A Inhibidor Concentraciôn que da 50% inhibiciôn Actividad inhibidora IgM Iz 1.3 X 10-G 1 IgM policlonal 3.0 X 10-9 4.4 F(ab')_y 2.2 X 10-9 6.0 X 10-9 Fab'y 2.4 X 10-9 5. 5 X 10-4 Faby 3.5 X 10-9 3.8 X 10-4 IgM monômero 1.6 X 10-9 8.3 X 10-9 (Fc)^y >>2.5 X 10-9 - Fcy >>1.3 X 10-^ - Fv 5.8 X 10-9 2.3 X 10-4 1.6 X 10-9 8 . 3 X 10-4 V l >>3.7 X 10-4 - L Iz >>9.3 X 10-4 - Se muestra la reactividad de distintos fragmentos de IgM en la inhibiciôn competitiva de la fijaciôn de I g M ( I z ) - a pocillos de PVC con PA (II.9.2., figura III.41.). La actividad inhibidora esta referi- da a la de la 1 ^ Iz. En la columna de concentraciôn de inhibidor que da el 50% de inhibiciôn, para aque- llos que no la producen, indicados con actividad -, se senalan las maxims concentraciones ensayadas. La tabla se ha realizado con los datos de las figuras 111.41. y 111.51.. to (Fc)gy puede atribuirse a la presencia de una muy pequena cantidad de Faby,detectada en su reactividad con anticuerpos especificos contra cadenas A, figura III.42., ya que, por otro lado, el fragmento Fcy aislado de cualquier subunidad intacta residual, por filtracion de los productos de la reduc­ cion parcial de esta preparaciôn de (Fcl^y, figura III.40B., carece completamente de actividad inhibidora, figura III.41. Asi, teniendo en cuenta el efecto de la despolime- rizaciôn de la IgM sobre su capacidad de interacciôn con PA y la baja afinidad intrinseca de los sitios de uniôn de sus regiones Faby, se hace aparente el destacado efecto que, como en otros sistemas de interacciôn multivalentes (Karush, 1978; Sarkart y col., 1979) tiene la presencia repetida de recepto- res de PA en la molêcula intacta de IgM, a la que debe la mayor avidez mostrada en su reactividad con la PA respecto de formas de IgM monomêricas (tabla III.4.). III.3.7. Subfragmentos de la regiôn Faby. Para définir mâs precisamente la situaciôn del re­ ceptor de PA en el fragmento Faby de la IgM Iz se consideran, a continuaciôn, las reactividades de varios polipêptidos cons- tituyentes del mismo, como son su cadena ligera y los dorninios variables, aislados o formando parte del fragmento Fv, para compararlas con la conocida de la regiôn Faby y asi tratar de establecer si puede asociarse a alguno de ellos las estruc- ^254- 120 9 0 - 6 0 - o» so­ lo* Inhibidor, nmoles Figura III. 42. Déterminantes de cadenas ligeras en fragmentos de IgM. 20 ng de IgM{^.^^IJ , 40000 cpm, se mezclan con solucio­ nes de concentraciôn variable de IgM Iz (▼), Faby (A), (Fc)gy (■) y Fcy (•), en un volumen final de 60 yl. In­ mediatamente, 50 pi de estas mezclas se ponen en plaças de PVC. previamente cubiertas con 50 yl de IgG monoclo­ nal de raton anti-cadenas X hunanas (HG3/6.1, regalo del Dr. Sanchez Madrid), 8 yg/ml, y la fracciôn de IgM-Iz{^^^I) unida se calcula a partir de la radiacti­ vidad fijada tras 1 hora, segun II.8.2.. -255- turas que determinan el sitio de interaccion con la PA. %- III.3.7.1. Obtencion del fragmento Fv. Este fragmento se prépara por digestion de la IgM intacta con p e p s i n a , a baja temperatura (Lin y Putnam, 1978). La figura III.43. muestra el anâlisis por SDS-PAGE del frac- cionamiento de la mezcla de digestion en una columna de Sepha­ cryl S-200, del que se recogen las fracciones del pico prin­ cipal del cromatograma de la figura III. 43., constituidas por polipêptidos con movilidades correspondientes a un peso molecular en torno a 15000. A la vista de los productos formados en la diges­ tion con pepsina, tal como se advierte en el cromatograma de la figura III. 43., la IgM Iz parece seguir la via de di­ gestion de la IgM Cam (Lin y PÙtnam, 1978), en la que el frag­ mento Fv se obtiene directamente, con alto rendimiento, a par­ tir de la hidrêlisis en puntos entre los dominios variable y constante de las cadenas y y L. En la inmunodifusiên con un antisuero contra la IgM Iz, este material présenta identidad parcial, con deficiencia de déterminantes antigénicos, con el fragmento Faby, como pue­ de observarse en la figura III.44. y, asimismo, lleva détermi­ nantes de cadena ligera, de acuerdo con lo que habia de espe- rarse para la regiôn Fv de la IgM. -256- 9.0 H 86 67 mm«f 30 6.0 - OCDN< 3 .0 - 80 120 160 200 Fracciones Figura III. 43. Obtencion del fragmento Fv. El cromatograma muestra la separacion de los productos de digestion de IgM Iz con pepsina en frîo (II.2.2.5.) en una columna de Sephacryl S-200, 3 X 146 cm, eluida con PBSA a 40 ml/h. Las frac­ ciones son de 4.2 ml. Se muestra asimismo el analisis por SDS-PAGE, en un gel de 5.3%C y 12%T, de las fraccio- senaladas, en su orden de elucion de izquierda a dere- cha, (*), indicândose las recogidas conteniendo el frag­ mento Fv. En el electroforetograma, D es la mezcla de _q digestion y los numéros el (x 10 ) de los marcadores de peso molecular utilizados. -257- Figura III.44, Analisis antigénico del fragmento Fv. Doble inmunodifusion en agarosa con 3% PEG 6000, p/v, de IgM Iz (1), Faby (2 y 5), Fv (3) y cadena ligera Iz (4), contra un suero anti-IgM Iz (H+L). -258- Sin embargo, cuando se analiza por electroforesis en agarosa, produce varias bandas, figura III.45., y esta aparente falta de homogeneidad determine su repurifiaciôn en un intercambiador iônico. La preparaciôn de Fv obtenida de la columna de Sephacryl S-200 se resuelve en dos picos de muy distinto ta­ maho cuando se cromatografia en CM-celulosa, figura III.45., cuyo anâlisis por SDS-PAGE, figura III.46B., muestra que la banda mayoritaria del material de partida se encuentra en las fracciones eluidas de la columna por aumento de la fuerza iônica del tampon de elucion, mientras que el com- ponente minoritario se halla en las correspondientes a lo no retenido en la columna en las. condiciones de carga. De acuerdo con este patron cromatogrâfico, en electroforesis en agarosa el pico eluido dé la columna con el gradiente de concentraciôn de sal tiene movilidad catôdica y el pico no unido a ella movilidad anôdica, figura III.45. El material de estos dos picos, estudiado por in- munodifusiôn con un antisuero contra la IgM Iz, figura III.46A., muestra su identidad antigénica parcial con el considerado como Fv, del que se han aislado, y entre ellos dan un curib- so dibujo, con lineas de no identidad, pero tambiên con una linea de identidad, aunque invertida, formada probablemente por la asociaciôn de ambos componentes en esa zona del gel de agarosa, en un producto que por la fusiôn que muestran en sus extremes las correspondientes lineas de precipitaciôn, -259- 8.0 - -12 O S< -4 -0 4.0- 20 40 60 80 100 Fracciones 3c/>\o 3 Figura III. 45. Repurificaciôn del fragmento Fv en CM-celulosa. El croiuatograina muestra la elucion de Fv cromatografia­ do en una columna de CM-celulosa, 3 x 16 cm, equilibra­ da en fosfato sodico O.OIM, pH 7.2, y eluida a 150 ml/h en fracciones de 4.2 ml. (----) représenta la conducti- vidad especifica de las fracciones cuando se eluye' con un gradiente de concentraciôn de sal, obtenido al mez- clar 150 ml del tampon inicial y 150 ml del mismo tam­ pon con NaCl 0.411. En el cronatograma se muestran las fracciones recogidas como material inicialmente no uni­ do (3) y unido (1) a la celulosa, mostrândose su anali­ sis por electroforesis en agarosa junto con el del mate­ rial cromtografiado (2) y Faby (4), como referenda. B 2 1 3 30 21 14 Figura III.46. Anâlisis de las fracciones de Fv no unida (1) y unida (2) a CM-celulosa. A, doble inmunodifusiôn en agarosa con 3% PEG 6000, p/v, de 1, 2 y Fv (3) contra un suero anti-IgM Iz(H+L). B, SDS-PAGE, en un gel de 5.3%C y 12%T, de 1, 2 y Fv, indicando los valores de (x 10” ) de los narcadores de peso molecular utlizados. -261- debe ser analogo al Fv de los otros pocillos. III. 3.7.2. Obtencion de los dominios y V^. Si la fraccion mayoritaria de la columna de CM-ce­ lulosa fuese el fragmente Fv, aunque sus dos polipêptidos conS' tituyentes, y Vĵ , no se resolviesen por electroforesis en poliacrilamida, como ocurre con los Fv de otras IgM de mieloma (Lin y Putnam, 1978), cabria esperar que una posible diferencia de carga entre ellos permitiese separarlos (Ben-Neriah y col., 1978). Sin embargo, cuando se recromato- grafia en la misma columna, pero en presencia de urea 6M, que- da igualmente retenido y eluye en su totalidad, en un solo pico, figura III.47., cuando se aumenta la fuerza ionica del tampon de eluciôn. La aparente homogeneidad de esta fraccion se rnani- fiesta tambiên cuando se analiza mediante isoelectroenfoque, figura III.47., al producir una ûnica banda, cuyo pi es de dificil determinaciôn debido a su extrema basicidad, lo que le situa en una zona del gradiente de pH con dériva catôdica, pero que por referencia a las movilidades del citocrorno c y del quimotripsinôgeno, puede estimarse alrededor de 9.5-9.8. Para una definitiva identificaciôn de este material se hicieron los mapas peptidicos de las dos fracciones de CM-celulosa, comparândolos con los de polipêptidos conocidos -262- 10.0 80- 6.0 - o00(Si< 4.0- 2.0 - 10 20 30 40 50 Fracciones Figura III.47. Anâlisis de la fraccion de Fv unida a CM-celulosa. El cromtograna corresponde a la cromtografia en una columna de CM-celulosa, 3 x 16 cm, equilibrada en f09fe.tç'sodico 0,OIM, pH 7.2, urea 6M. El flujo es de 120 ml/h y las fracciones de 3.5 ml, indicando con la flécha el comienzo de la eluciôn con un gradiente de concentraciôn de sal como el de la figura III.45.. Se muestra asimismo su anâlisis por isoelectroenfoque en agarosa (II.5.9.), pH 3.5-10.0, en el pocillo 1. Com3 marcadores de pl, citocromo c (2), quimotripsi­ nôgeno A (3) y mioglobina (4). -263- como son el Fd. y la cadena ligera del fragmente Faby. La figura III.48. muestra los autorradiogramas de los mapas obtenidos con los peptidos formados en la digestion con trip- sina de las bandas correspondientes a los dos picos, despues 125de marcarlos radiactivamente con i* Résulta asi que el componente de movilidad catodica, mayoritario en el material de la columna de Sephacryl S-2 0 0 asimilado al fragmente Fv, no contiene peptidos de la cadena ligera, sine de los présentes en el mapa de F d y y no todos, lo cual permite identificarlo como el dominie de la IgM I z . Por el contrario, la fraccion no retenida en la columna de CM-celulosa da un mapa mas complejo, en el que la mayoria de sus peptidos son comunes a los de la cadena ligera, por lo que puede pensarse que se trate del dominie V^. Este se hallaria de acuerdo, ademâs, con la alteracion de su movili­ dad electroforetica en poliacrilamida tras su reduccion con DTT, figura III.49., cambio que tambiên présenta la cadena ligera intacta y que entonces puede ser atribuido a la reduc- ci6n del puente disulfuro de su dominio V^. A la vista de este, los anteriores resultados cro- matogrâficos y electroforéticos pueden interpretarse suponien- do que en el fragmente Fv de la IgM Iz sus dominios y se hallan asociados a travês de una interaccion dêbil, que determinaria su separaciôn en un intercambiador iônico en condiciones no disociantes, de modo que mientras el componen- 4 & ê » • pQbji 3 1 Fd — I — * *-30 f i — 21 — 14 # 4 f f • I ^ I - E + Figura III.48. Identificaciôn de los dominios variables de la IgM Iz. Se muestran los autorradiogramas de los mapas peptidi­ cos obtenidos tras electroforesis, E, y cromatografia, C, de los peptidos tripticos del material marcado con 125I contenido en las bandas observadas tras SDS-PAGE de Faby reducido (figuras III.27. y III.35.), Fdy (2) y L (4), asi como de las fracciones unida (1) y no uni­ da (3) de FV Iz a CM-celulosa (figura III. 4 9.) tal como se ha esquematizado. Los mapas se han hecho en cranatofolios de celulosa, como se describe en II *. 7. , y para la autorradiografia se han utilizado peliculas X-OMAT MA de Kodak, en chasis s in pantallas intensif i- cadoras. ‘ V —265— 67 ^ 2 3 5 6 30 21 14 Figura III. 49. Anâlisis por SDS-PAGE de los dominios variables de la IgM Iz. Electroforesis de (3 y 6), (2 y 5) y ca­ dena ligera Iz (1 y 4) reducidos (4-6) y sin reducir (1-3), en un gel de 3.5%C y 12.5%T. Se senalan los va- lores de M^ (x 10 ) de los marcadores de peso molecu­ lar utilizados. -zoo- te bâsico, , se fija a la carboximetilcelulosa, el de mo­ vilidad anionica, es arrastrado en el tampon de eluciôn, aun­ que pueden aparecer mezclados en una zona del cromatograma como la cola del primer pico (figura III.45.). Del mismo mo­ do, en un campo eléctrico, y teniendo movilidades opuestas, podria resultar favorecida la disociaciôn de ambos dominios. Si esta no es simultânea para todos los Fv y teniendo en cuen- ta que entonces, el fin de la electroforesis en agarosa, no séria una situaciôn de equilibrio, puede tenerse el patrôn heterogéneo observado, con bandas de movilidades intermedias a las de cada uno de ellos. Por otro lado, el antisuero producido contra esta regiôn no reconoce, como era de esperar, ni a ni a la cadena ligera, dando reacciôn de identidad con el fragmente Fv, figura III. 50.. Curiosamente no es capaz de producir li- neas de precipitaciôn con el Faby, pero si con la IgM intacta, lo cual tiende a indicar que reconoceria un solo déterminante antigénico en Vy de Faby (fijarse en la posible disoluciôn de la linea de precipitaciôn con IgM en el extremo correspondien- te al pocillo con Faby), y e n ’todo caso asegura la identidad de ese material con la regiôn Vy asignada. III,3.8. Inhibiciôn competitiva de la uniôn de IgM-f^^^j^ a proteina A por subfragmentos de Faby. En experimentos de inhibiciôn competitiva de la uniôn de IgM Iz a PA puede apreciarse, figura III.51., que el -267- A 0 0 0 0 ■ Figura III.50. Antigenicidad del doninio Vy Iz. Doble inmunodifusiôn en agarosa con 3% PEG 6000, p/v, de IgM (1), Faby (2), (3), cadena L (4), Fv (5) y Vy (6), todos de la IgM Iz, contra un suero anti-dominio Iz. ■Zbu— 90 - o T3 'E3 30- 10̂ Inhibidor, pmoles Figura III. 51. Inhibiciôn competitiva de la fijaciôn de IgM Iz a proteina A. 10-20 ng de IgM-Izf^^^I}, 50000 cpm, se mezclan con soluciones de concentracion variable de cadenas ligeras Iz (T), (A), (■), Fv (•) y de Faby (o), antes de anadirse a plaças de PVC previa- mente cubiertas con 50 yl de PA, 1 yg/ml. Tras 2 horas de incubaciôn se cuentan los pocillos y se cal­ cula la fraccion de IgM-Iz{^^^IXinida segun II.9.2.. -269- efecto inhibidor propio del fragmento Faby es conservado por su region Fv, asi como por la region de la misma, que in­ cluse présenta una eficiencia inhibidora algo mayor. En el mismo ensayo el dominio muestra, como la cadena ligera intacta, ausencia total de actividad, lo cual permite descar- tar la implicacion de estructuras de este polipéptido en la interaccion de la IgM Iz coa' la PA, por si mismas o estabi- lizando conformacionalmente, por su asociaciôn en Fv o Fab , al sitio receptor en V^. 111.3.9. Inhibiciôn de la coprecipitacion de la IgM Iz con proteina A y Fcy por subfragmentos de Faby. Asimismo, como se muestra en la figura III.52., el fragmento Vy es tan activo como los Faby y Fv en la inhibi­ ciôn de la reacciôn de coprecipitaciôn de la IgM Iz, a dife­ rencia de la cadena ligera o la regiôn V^, 111.3.10, Inhibiciôn de la fijaciôn de IgM.Iz a proteina A por anticuerpos anti-Vy, Cuando, en otro tipo de ensayo, se estudia el efecto del bloqueo de sitios antigénicos de la IgM sobre su interac- ciôn con la PA, puede apreciarse, figura III.53A,, como la ocupaciôn de déterminantes de su regiôn por fragmentes Fab de anticuerpos purificados de un suero anti-V^. por cromato- grafia de afinidad con Vy(Iz)^Sepharose (11,3.2.1.2.), deter- -27Q- 100- oTJo 80- Q.O 2Q. 60-r-1 I N 40- »—I 20- 10' Inhibidor, iUg ■4V Figura III. 52. Inhibiciôn de la coprecipitacion de IgM Iz con proteina A y Fey. En tubes de microfuga de 0.4 ml se mezclan 50 pl de Fey, 20 yg/ml, e I g M - I z -, 1.6 yg/ml, y 50 yl de soluciones de concentracion variable de Faby ; (■), Fv (T), (•), cadena L Iz (A) y Fc y (♦), ahadiendo, finalmente, 25 yI de PA 0.4 yg/ml. La frac­ cion de I g M - I z p r e c i p i t a d a se calcula a partir de la radiactividad precipitada tras 21 horas a tem- peratura ambiente (II.9.4.). 100- o 5 8 0 -ca 0.8 r - i IA AJ 6 0 - I 0.6 - 4 0 - O 0 . 4 - 20- 0.2 - 10" 0 .07 0 .6 S Proteino A, /Ug/ml 4 0 Fragmento Fob oftodido, Ug/ml Figura III. 5 3 .Efecto del bloqueo de , sitios antigénicos en de la IgM Iz sobre su interaccion con proteina A. A, inhibiciôn de la fijaciôn de IgM Iz a PA por frag- mentos Fab de anticuerpos anti-lgM Iz y anti-V^^ Iz. 10-20 ng de IgM-lz , 54000 cpm, se incuban en pla­ ças de PVC con soluciones de concentraciôn variable de Fab anti-Vy (■), Fab anti-lgM Iz (H+L) (A), Fab enti­ l e Iz (H+L) eluido de (Iz)-Sepharose (•) y Fab de conejo no inmune (▼). Tras 2.5 horas, 50 de los 60 ul de estas mezclas se ponen en plaças de PVC previamente cubiertas con 50 pl de PA 1 yg/ml. La fracciôn de IgM Iz unida se calcula como se indica en 11.9.2.. 125B, fijaciôn de Fab anti-V^ Iz nercado con I (♦) o de IgGl^^^l} de conejo (•), 150000 cpn en 50 yl, a pla­ ças de PVC previamente cubiertas con soluciones de con­ centraciôn variable de PA. Se représenta la radiactivi­ dad unida très 1 hore. de incubaciôn. -272- mina la incapacidad de fijaciôn de la IgM a la PA de modo es- pecifico, si se considéra la ausencia de efecto alguno de fragmentes Fab antigênicamente no relacionados con PA o IgM. Puesto que, ademâs, la reactividad con PA de estos Fab anti- V y , estimada a partir de la fracciôn de anticuerpo radiactivo que se fija a plaças con PA, es insignificante, figura III.53B., puede considerarse que el efecto observado se halla asociado, exclusivamente, al bloqueo de déterminantes antigénicos de la IgM Iz. En la figura 111,53 puede apreciarse, asimismo, que la actividad de los anticuerpos anti-V^ purificados de modo anâlogo a partir de un suero contra la IgM Iz, es incluso su- perior a la de los anticuerpos del suero anti-V^. Aunque en los dos casos se han obtenido por su uniôn al dominio aislado, del suero anti^V^, correspondiente a la inmunizaciôn con Iz, es posible que, como se ha descri­ be (Kubagawa y col,, 1982), se tengan anticuerpos contra si- tios inaccesibles del dominio variable tal como se encuentra en la molêcula de IgM: los anticuerpos del mismo antisuero, purificados por cromatografia de afinidad con Faby(Iz)-Sepha­ rose, muestran una capacidad de uniôn de Vy muy inferior, fi-r gura III.54C, Asi, las reactividades observadas para ambos tipos de anticuerpos, figuras III,54A,B, (los del suero anti-V^ re-r. conocen mejor a su antigeno, la regiôn aislada, y unen 60- 40- i— • 20- É à-r—I 40- •— 1 20- 40- 20 - 10° 10' IgG, lUg / m l Figura II 1.54, Antigenicidad de los anticuerpos anti-V^. Se représenta la capacidad de fijaciôn directa de 10-20 ng de IgM-Iz- {̂ ^̂ 1} (e) y 5-10 ng de V^-Iz(^^^I} (A) a plaças de PVC cubiertas con cantidades variables de anticuerpos IgG, purificados por cronatografia de afinidad en Vy(Iz)- Sepharose, a partir de sueros anti-Vy Iz (A), anti-lgM Iz (B) o por cromtografia de afinidad en Fab (Iz)-Sepha­ rose de un suero anti-V^ Iz (C), estimada de la radiac­ tividad fijada tras 2 horas, segiln 11,8.2. -274- IgM en grado similar a los del suero anti-lgM, pero con afi­ nidad algo menor), permiten interpretar sus distintos efectos inhibidores de la uniôn a PA de la IgM Iz en termines de las especificidades de los anticuerpos de cada antisuero implica- das en el reconocimiento de la regiôn en la IgM. 1. Estos resultados, obtenidos con la molêcula Iz ente­ ra, por un procedimiento diferente, se hallan completamente de acuerdo con los anteriores correspondientes a sus fragmentes, y asi apoyan convenientemeente la localizaciôn, apuntada en­ tonces, del sitio reactive con PA de la IgM Iz en sus dominios Vh - III.4. RECEPTOR PE PROTEINA A EN ESTRUCTURAS PE DOMINIOS ' v a r i a b l e s DE CADENAS PESADAS La asociaciôn del sitio a travês del que la IgM Iz se une a la PA con estructuras localizadas en su region V̂ ,̂ ayuda, asimismo, a descartar que esta reactividad se halle re- lacionada con una posible, y no comprobada, actividad anticor- pal de esta inmunoglobulina contra la PA, por medio de los sitios combinatorios definidos por las regiones déterminantes de complementaridad de sus dominios Vy y V ^ , que, por otro la­ do, habria determinado una interacciôn mis eficaz de Faby y Fv que la observada con V y . No obstante, el poder extender esta idea a otras proteinas IgM, contribuirla a establecer la generalidad de la conclusiôn deducida aqui con una proteina -275- monoclonal y, sobre todo, serviria para averiguar si este puede ser el mecanismo de interacciôn de las inmunoglobuli- nas M.'G. de otras clases, reactivas con la PA a travês de sus regiones Fab. III.4.1. Inhibiciôn de la interacciôn proteina A-IgM policlonal por anticuerpos anti-Faby. Del mismo modo que anticuerpos contra la IgM Iz o contra su regiôn Vy interfieren su uniôn a la PA, fragmentes Fab de anticuerpos producidos contra la IgM policlonal réac-- tiva con PA-Sepharose, tambiên son capaces de inhibir la fi­ jaciôn de IgM policlonal a cêlulas de S, aureus^ tal como puede observarse en la figura III.55,. Si esos fragmentes ^Fab anti-lgM se absorben en columnas de Fabp(Iz)-rSepharose o ( Fc ) ̂ y-Sepharose (II.3.2.1.2.), se obtienen fracciones sin reactividad contra déterminantes antigénicos présentes en esas regiones de la IgM, que se com- portan de modo muy distinto en el mismo ensayo, figura III.55., pues en tante que la ausencia de fragmentes Fab que reconocen la regiôn (Fc)^y no afecta a la capacidad inhibidora observada con la mezcla de Fab contra toda la molêcula de IgM, la ab- sorciôn de los Fab réactivés con déterminantes de la regiôn Fabji détermina la pêrdida de dicha actividad. Como la IgM Iz, la IgM policlonal parece tener sus sitios réactivés con la PA en las regiones Faby, e incluso su 100- 80- 60- 20 - Frogmento Fob onadido, Uq Figura III. 55. Inhibiciôn de la fijaciôn de IgM policlonal a S, aureus por fragmentos Fab de anticuerpos anti-lgM policlonal. 1 yg de IgM{^^^I>, 100000 cpm, se mezcla en un voluraen final de 100 yl con soluciones de concentraciôn variable de Fab anti-IgMCH+L) (•), y de las fracciones de estos Fab absorbidas con (Fc)gy-Sepharose (■) o con Faby-Se- phaxose (A), asi como con Fab de conejo no inmune (♦), en tubos de microfuga de 0,4 ml. 2 horas despues se ahaden 50 ^1 de una suspension 0.2% de estafilococos, v/v, deterrainando la radiactividad fijada a las bacte- rias tras 2 horas, cçsno se indica en 11.9,1,. -277- reacciôn de coprecipitaciôn es completamente inhibida por fragmentos Fab del suero anti-lgM policlonal que son reteni- dos en la columna de Faby(Iz)-Sepharose, pero no por los re- tenidos en la columna de (Fc)^y-Sepharose, figura III.56., en un resultado que, como era dé esperar, esta de acuerdo con los de la figura III.55., en el sentido de que êstos Fab anti« Fab^ son los activos en la inhibiciôn de la uniôn de IgM a la PA, y que cuando son retirados por absorciôn de la mezcla total anti-lgM, dejan a esta preparaciôn sin efecto inhibidor. III.4.2. Inhibiciôn de la fijaciôn de IgM policlonal a proteina A por anticuerpos anti-V^. Puesto que la IgM I»z, proteina donante del fragmen­ to Faby utilizado en la absorciôn de los anticuerpos anti-lgM policlonal, tiene en su regiôn el sitio reactivo con PA (III. 3. 8.)', se quiso averiguar si entre los Fab anti-lgM reactivos con Faby Iz hay fragmentos con especificidad contra su regiôn , para evaluar la actividad que les corresponde en el efecto observado con l’os anticuerpos anti-lgM (figura III.56.), aislados por cromatografia de afinidad con Faby(Iz)- Sepharose. De estos anticuerpos anti-Faby, una importante fracciôn es retenida en V^^dz)^Sepharose, alrededor del 35%, y cuando se ensaya su efecto sobre la fijaciôn de IgM poli­ clonal a PA se observa que'^on mâs activos que los anti-Faby, figura III.57., como habîa de esperarse si se produjese un -.278- 100- Q. 6 0 - I— I I—I 4 0 - 0»#-# 20 - F r a g m e n t o F o b afiadido, jUg Figura III. 56. Inhibiciôn de la coprecipitaciôn de IgM policlonal con proteina A y Fcy por fragmentos Fab anti-lgM po­ liclonal . En tubos de microfuga de 0.*4 ml se mezclan 50 yl con IgMi^^^I}, 20 yg/ml, y Fcy, 20 yg/ml, con 50 yl de soluciones de concentraciôn variable de fragmentos Fab anti-IgM(H+L) eluidos de (Fc)^y-Sepha- ; rose (♦) o de Faby-Sepharose (•), o de Fab de conejo no inmme (■),ahadiendo, finalmente, 25 yl de PA 8 yg/ml. La fracciôn de IgMi^^^I} precipitada, se calcula a partir de la radiactividad precipitada tras 20 horas, segun II.9.4.. » -2/y- 100- 80-o•o"c3 n ^ 60- lAW LjI 0» 40- 20- 10"' 10 ‘ F r a g m e n t o F o b aftadido, jUg/ml Figura III. 57. Inhibiciôn de la fijaciôn de IgM policlonal a proteina A por fragmentos Fab anti-Fabu. 10-20 ng de IgM poli- clonal nercada con J, 50000 cpm, se mezclan con so­ luciones de concentraciôn variable de Fab anti-lgM po­ liclonal eluido de Faby(Iz)-Sepharose (A) y de sus fracciones uniÿ^ (•) y no unida (■) a (Iz)-Sepharo­ se. Despuês de 2 horas, 50 de los 60 yl de estas mez­ clas , se ponen^en plaças de PVC previamente cubiertas con 50 yl de PA 1 yg/ml, y la fracciôn de IgM{^^^I) unida se calcula a partir de la radiactividad fijada tras 1.5 horas, segun II.9.2,. -280- enriquecimiento en los anticuerpos relevantes en esa inhibi­ ciôn, al tiempo que la fracciôn sin afinidad por la columna debia poseer una actividad inhibidora mucho menos acusada, que es lo que puede apreciarse en la misma figura. Esto per­ mite buponer que es la ocupâciôn de los sitios antigénicos de la regiôn de la IgM policlonal lo que prioritariamente afecta su uniôn a la PA y que, por tanto, es posible que las estructuras a travês de las que se produce tal interacciôn se • t localicen en los dominios variables de sus cadenas pesada^. ftQue la fracciôn de Fab no unida a la columna de : (Iz)-Sepharose conserve actividad inhibidora puede deberse a que anticuerpos contra déterminantes estructurales, défini-* dos por las areas de contacte interdominios, V^-V^, u otras en esa zona de la molêcula (Miller y Terry, 1968; Jensenius y col., 1982a), no présentes en ( Iz )-Sepharose , al unirse a la IgM puedan afectar su interacciôn con PA por impedimentos estêricos o alteraciones conformacionales del receptor localizado en su proximidad. Asi, en la figura III.58. puede advertirse que en tanto los Fab no retenidos en Vp^(Iz)-Sepharose no inhiben la uniôn de Vpp a anticuerpos contra IgM policlonal, purificados en la misma columna de afinidad, son Fab sin reactividad contra este dominio, si afectan parcialmente la uniôn de la IgM a esos mismos anticuerpos. Mientras, los Fab anti-V^ inhiben com­ pletamente ambas fijaciones. Adicionalmente, la diferencia de actividad antigênica de los anticuerpos anti-Faby, tras su ab- «‘s- «a-. 100- •K>0 \ S so- -•0 40- -40 20- -20 W' 10* »•' Fragmente Fob oAodido, Ug/ml 1 2̂a.o Figura III. 58. Reactividad anti-V^ de los Fab anti-Faby,de un suero anti-lgM policlonal, unido y no unido a V^dz)-Se­ pharose . 10 ng de V„-Iz-{^^^I'}, 25000 cpm, y 20 ng 125de IgM policlonal marcada con I , 45000 cpm, se mez­ clan con soluciones de concentraciôn variable de Fab anti-Faby unido (A) y no unido (■) a Vy(Iz)-Sepharose, en un voluraen .final de 60 yl. Despuês de 2 horas, 50 yl de estas mezclas se ponen en plaças de PVC previa­ mente cubiertas con 50 yl de IgG anti-lgM policlonal elilida de V^Clz)-Sepharose 12 yg/ml (A) y 1.2 yg/ml (&). Las fracciones de y de IgM{^^^I}unidas se cal­ cula a partir de la radiactividad fijada tras 1.5 horas, segun II.8.2.. Las cantidades de anticuerpo insolubili- zado en cada caso, unen =50% de IgM {^^^1} del ensayo. -282- ' absorciôn con Iz)-Sepharose » respecto de la fracciôn rete­ nida, es del mismo orden que la observada para su efecto in­ hibidor de la fijaciôn de IgM a PA, requiriéndose en cada caso una concentraciôn aproximadamente 9 0 veces mayor de los Fab no unidos a Vp^(Iz)-Sepharose para conseguir un efecto équivalente. y î . Una inhibiciôn similar de la interacciôn con PA, en reacciones de coprecipitaciôn de IgM, ha sido descrita para anticuerpos contra una IgM monoclonal reactiva con PA, la proteina As, pero sin determiner la especificidad concre­ te de los mismos, sugiriendo, sin embargo, la implicaciôn de déterminantes conformacionales, en base a su no absorciôn por sus fragmentos (Fc)^y o Faby, pero si por sus subunidades (Grov, 19 7 5b). III.4.3. Reactividad anti-”framework" de los anticuerpos que inhiben la interacciôn IgM-proteina A. Las estructuras recpnocidas por los Fab eluidos de I z )-Sepharose se encuentran,. ademâs de en proteinas IgM, en inmunoglobulihas de otras clases, como puede observarse en la figura III.59A., en la que sus reactividades con estos anticuerpos, estimadas a partir de la competiciôn con la IgM Iz por los Fab anti-V^, résulta superior para la IgA que pa­ ra la IgG. Asimismo, se han detectado tambiên en una proteina IgE monoclonal, que es capaz de fijarse a los mismos anticuer- -283- 100- ao- ■AMT-l 6 0 - I < % 20- KT* 10"' K)® K)' 10» 2.S 22.2 200 Inmunoglobulina#, ng IgG u g /m l Figura III. 59. Reactividad auti-"frainework" de los anticuerpos anti-V^ del suero anti-lgM policlonal. A, 40 yl de solucionfeS de concentracion variable de (•), IgA (A) é IgG (■) policlonales se anaden a 20 yl de Fab anti-Vpj{i2 5jj^ 25000 cpm (III.4.2.), dejandose toda la noche. Despuês, 50 yl de estas mezclas se ponen en plaças de PVC previamente cubiertas con 50 yl de IgM Iz, 6 yg/ml, y la fracciôn de anticuerpo unido se calcu­ la a partir de la radiactividad fijada tras 1 hora, seg(jn II.8.2.. B, fijaciôn directa de IgE-Abe-{^^^I}, 80000 cpm (regalo del Dr. Sanchez Madrid), a plaças de PVC previamente cu­ biertas con anticuerpos IgG purificados de un suero anti- lgM policlonal por cromtografia de afinidad con Faby-Se- pharose (♦) o con Vy-Sepharose (▼). Se représenta la frac­ ciôn de IgE unida tras 2 horas de incubaciôn. -284- pos insolubilizados en plâstico, figura III.59B.. El reconocimiento d e ‘‘déterminantes antigénicos f comunes a inmunoglobulinas policlonales de las distintas cla­ ses por la fracciôn del conjunto de anticuerpos producidos en la inmunizaciôn con IgM humana eluida de PA-Sepharose, obtenidos por cromatografia de afinidad con Iz)-Sepharose, define la especificidad anti-regiones ’’framework" de los dominios variables de cadena pesada de los Fab anti-V^^ consi^ derados. Aunque escasamente estudiada, la producciôn de anti­ cuerpos contra déterminantes especificos de regiones en la inmunizaciôn con inmunoglobulinas intactas, cuenta con algunos précédantes (Stanilawski y Mittard, 1979; Jensenius y c o l ., 1982b). Esta especificidad se ha comprobado para proteinas IgG, figura III.60., observândose que estos anticuerpos no se unen a sus cadenas ligeras, ni al fragmento Foy. Tampoco se fijan a una proteina IgG3 monoclonal que no es retenida en PA-Sepharose, ni inhibe, la uniôn de IgM a PA, figura I III.6 3., por lo que su reactividad debe limitarse a estructu­ ras antigênicas del dominio V^. Anticuerpos de especificidad relacionada se encuen- tran tambiên en los antisuero^'»producidos contra IgG normal o IgA de calostro, ya que, ctoo se observa en la figura III.61., la fracciôn de ellos que es purificada por cromato­ grafia de afinidad con Faby-Sepharose, es capaz de inhibir la X Eo.o •o 0-6 - c3 r—I U)M I— I 0.3-I X> O £ 6 100251.25 Proteinos, jUg/ml Figura III. 60. Especificidad de 16^ anticuerpos anti-IgM policlonal eluidos de V^-Sepharose. A plaças de PVC rigido, pre- viamente cubiertas con 50 yl de soluciones de concen- tracion variable de IgG (•), IgGS Fra (A), cadenas Fi­ geras policlonales (■) y de Fey (T), se anaden 50 yl de Fab anti-IgM eluido de V^-Sepharose (III.4.2.) nar- 125cado con I, 50000 cpm. Tras 1 hora se cuenta la ra- diactividad unida a los pocillos, como se indica en II.8.2.. • i -Züb- 9 0 - m so­ in CM L_J en 3 0 - 10"' 10° 10' F r a g m e n t o F o b o n a d i d o , u g / m l Figura III. 61. Inhibicion de la fijàciôn de IgM policlonal a proteina A por fragmentos Fab.de anticuerpos anti-Fab. 20 ng de Igil 125policlonal narcada con 1, 60000 cpm, se mezclan con soluciones de coHceiitraciôn variable de Fab anti-lgM poli­ clonal eluido de Fabu-Sepharose (A), Fab anti-lgG eluido de Faby-Sepharose (•), Fab anti-lgA eluido de Faby-Sepnazo- se (V)yFab de IgG de conejo no inmune (M), en un voluiMn final de 60 yl. ^Tras 2 horas, 50 yl de estas mezclas se !;■ ponen en plaças'de PVC, previamente cubiertas con 50 jjl de FA 0.4 jag/ml, y la fracciôn de lgM{^^^l} unida se cal­ cula a partir de la radiactividad fijada tras 2 horas, segun 11.9.2. -287- fijacion de IgM policlonal a PA. Su menor efectividad in- hibidora debe estar relacionada con una probable menor avi- dez por la IgM respecto de la de los anticuerpos anti-Faby, pero, en todo case, son una muestra de la antigenicidad de algunas estructuras présentes'en los dominios variables de inmunoglobulinas, capaces de inducir la formacion de anticuer-: pos reactivos con gran numéro de estas regiones variables. 111.4.4. Relacion de los sitios antigenicos en regiones "framework" de y reactividad con proteina A. ■ t La reactividad de êstos anticuerpos anti-V^ del suero anti-lgM con la IgG policlonal se distribuye de modo désignai entre las distintas fracciones que se obtienen elu- yendo la IgG unida a la columna de PA-Sepharose con tampones de acidez creciente, de manera que las obtenidas a pH mas bajos unen mejor los fragmentos Fab anti-V^ que las eluidas , con pH menos âcidos, las cuales fijan, aproximadamente, la mitad de anticuerpo, figura 111.62.. Asi, las IgG reconocidas preferentemente por los anticuerpos anti-"framework",'son aquellas que dan reacciones de precipitaciôn directa con PA, figura 111.16., sugiriendo que la presencia simultânea'de reactividades en sus regiones PcY y Faby détermina su capacidad de formacion de complejos precipitables, a diferencia de las no précipitantes, que de- ben interaccionar con la PA fundamentalmente solo a travës de % -Züü- K Eo.o 0 ■o1 r—I 0.8 - I X ^ 0.4- ü S. 1.25 256 100 F rocciones d e IgG, U g / m l Figura III. 62. Reactividad "framework" de las fracciones de IgG policlonal eluidas de PA-Sepharose. A plaças de PVC rigido, previaiAënte cubiertas con 50 yl de soluciones de concentraciôn variable de IgG eluida de PA-Sepharo­ se a pH 6.1 (%), 5.1 (■), 4.4 (A), 4.0 (•), 3.4 (V) y 2.5 (♦), se ahaden 50 yl de Fab anti-Vy{^2 5^j (111.4.2.), 50000 cpm. Tras 1 hora se cuenta la radiactividad unida a los pocillos, ccrno sè indica en 11.8.2.. -289- su region F c y Desde luego, esta diferente reactividad de V las fracciones de IgG se aprecia en la inhibicion competi- tiva de la fijacion de IgM policlonal a PA, figura 111.63., donde mientras la actividad de la IgG de una de las fraccio- » nes précipitantes, la eluida a pH 3.4, es mayor que la del conjunto de IgG, la de una de las fracciones no précipitan­ tes es casi imperceptible. En la misma figura se incluye el ^ efecto inhibidor de la IgA poCLiclonal, tambien algo mayor 11 que el de la IgG, pero ambos nienores, unas 10 y 30 veces, respectivamente, que el de la IgM, la cual manifiesta la mayor avidez por la PA, con una Ka calciklada en este ensayo 9de 0.2 X 10 1/mol, del orden de la medida en la fijacion a células de S. aureus (111.1.2.2.). Surge asi una relacion entre la presencia de es­ tructuras reactivas con PA en el fragmento Fab de las inmuno- ‘ t globulinas y sus déterminantes antigênicos reconocidos por anticuerpos contra los segmentos "framework" del dominio v#- raible de la cadena pesada, la cual sugiere que la localiza- ciôn del receptor de PA que’media la interacciôn alternative, asociada al Fab, con la région de las inmunoglobulinas. Los anticuerpos anti-"framework" considerados aquî'.l en relaciôn con la uniôn a PA por medio de los dominios , no muestran, sin embargo, una reactividad con las distintas inmunoglobulinas estrictamente ajustada a la correspondiente de êstas con la PA, pues si bien existe una relacion en tér- 1 20 10" ' 10" 10' Inhibidor, pmoles Figura III. 63. Inhibicion de la ’fijacion de IgM policlonal a proteina A por IgA, IgG e IgM. 10-20 ng de IgM policlonal narca- 125da con I, 40000 cpm, se mezclan con soluciones de con­ centraciôn variable de IgA (#), IgG (M), IgG3 Fra (o), IgG eluida de PA-Sepharose a pH 5.1 (♦), IgG eluida de PA-Sepharose a pH 3.4 (y), IgM policlonal unida W y -̂i' no unida (A) a PA-Sepharose. Inmediatamente, 50 de los 60 ]il de estas mezclas se ponen en plaças de PVC previa­ mente cubiertas con 50 yl de PA 0.5 yg/ml, y la fracciôn de IgM {^^^1} unida se calcula a partir de la radiactivi­ dad fijada despues de 1.5 horas, segun II.9.2.. -291- minos cuantitativos, figuras III.62. y III.63,, es ciertb que proteinas poco o nada reactivas a traves de sus regiones Fab, como la IgM monoclonal no retenida en PA-Sepharose, o las fracciones no précipitantes de IgG, manifiestan cierta actividad antigenica, como tambien puede apreciarse en las figuras III.62. y III.63., siendo una excepcion la IgG3 Fra. Como estos anticuerpos deben incluir mas especifi- cidades que las estrictamente asociadas al receptor de PA, es posible que reconozcan, aunque menos efectivamente, domi­ nios sin reactividad o con m,uy baja afinidad por la PA, lo cual no presupone la imposibilidad de la preparacion de anti­ cuerpos de especificidad altamente selectiva que fueran ca­ paces de distinguir mas claramente entre dominios de distinta reactividad. En el caso de las fracciones de IgM obtenidas en la elucion de la columna de PA-Sepharose con tampones de pH va­ riable, por consiguiente con dominios reactivos, la dificul- tad para poder apreciar diferencias antigenicas entre ellas,' figura III.64., puede deberse,ademas, a que cada una de ellas forma parte del conjunto antigenico utilizado en la produccion del antisuero del que se han aislado los anticuerpos anti- "framework" utilizados. -zyz- 100- c 80- I_I 40- U_ 20 - 10" ' Fracciones de I g M , jUg/ml Figura III. 64. Reactividad "framework" de las fracciones de IgM poli­ clonal eluidas de PA-Sepharose. A 40 yl de soluciones de concentraciôn variable de IgM policlonal unida (•) y no unida (*) a PA-Sepharose, asi como de IgM eluida de PA-Sepharose â p̂H 4.4 (A), pH 4.0 (t ) , pH 3.4 (■) y pH 2.5 (♦), se ahaden 20 y 1 de Fab anti-V^ 20000 cpm (III.’4.2.). Se dejan durante toda la noche y entonces 50 yl de estas mezclas se ponen en plaças de PVC previamente cubiertas con 50 yl de IgM Iz, 6 yg/ml, y la fracciôn de anticuerpo unida se calcula a partir de la radiactividad unida tras 1 hora, segun' II.8.2.. -293- III.4.5. Sitios antigênicos reconocidos por anticuerpos anti-"framework" humanos en inmunoglobulinas de otros mamlferos con reactividad tipo Fab con proteina A. Ademâs de las inmunoglobulinas humanas, las de otros mamiferos también manifiestan reactividad con PA de ti­ po alternative, a travës de sus regiones Fab (Inganas y col., 19 80), por lo cual se examinaron las de algunos de ellos, pa­ ra ver si presentasen homologias estructurales capaces de determiner sitios antigênicos que fuesen reconocidos por los Fab anti-V^ y compararlas con las de animales representatives del mecanismo clâsico de interacciôn por medio de su region Fc. En la figura III.65. se puede apreciar que de las inmunoglobulinas purificadas por cromatografla de afinidad con PA-Sepharose, a partir del suero de estos animales,, constituidas fundamentalmente por IgG (II.1.2.1.), llevan si­ tios antigênicos comunes con los de regiones humnas, ias de perro y cerdo, sobre todo, y tambiên las de cobayo, que son inmunoglobulinas précipitantes con PA (Kronvall y col., ''■h''1970a), con reactividad tipo Fab (Inganas y col., 1980), a diferencia de las de conejo y vaca, que no son reconocidas por los anticuerpos anti-"framework", y son ejemplos caracte- rîsticos de inmunoglobulinas no précipitantes (Kronvall y col., 1970a), que interaccionan con la PA ûnicamente a travës de sus regiones Fcy (Inganas y c ^ . , 1980). -294, 100- o 80- 3C rn 60-u_i I ® 40- S. 20 - 10° Inmuncjglobutinos, iUg/ml Figura III. 65. Reactividad ’’framework" V̂ j humano de IgG de distintos mamiferos obtenida por cromatografia de afinidad con . PA-Sepharose. A 40 yl de soluciones de concentraciôn. variable de inmunoglobulinas de conejo (▼), vaca (#), ̂ cobayo (♦), hunano (♦), cerdo (■) y perro (A), se aha­ den 20 yl de Fab anti-Vpj {i2 5i}^ 15000 cpm (111.4.2.), y se dejan durante .toda la noche. Despues, 50 yl de es­ tas mezclas se poi&n en plaças de PVC previamente cubier­ tas con 50 yl de IgM Iz, 6 yg/ml, y la fracciôn de an­ ticuerpo unida se calcula a partir de la radiactividad fijada tras 1 horav segun 11.8.2.. % -295- Asi pues, del mismo modo que las estructuras de la region Fcy que median la union de las inmunoglobulinas a la molecula de PA se encuentran evolutivamente conservadas (Kronvall y col., 1970a), aquellas que median la interacciôn alternative, a traves de la regiôn Fab, tambien parecen ha- llarse representadas en distintos grupos de mamiferos y , aun­ que no esta probado, situarlas sobre los dominios variables de sus cadenas peeadas, constituye una sugerencia consecuente con la actividad antigenica apreciada con anticuerpos reacti­ vos con los dominios homôlogos de inmunoglobulinas humanas. % V -296- III.5. DISCUSION GENERAL La reactividad de la proteina A de S, aureus con inmunoglobulinas humanas y de otros animales, ha venido considerandose hasta hace poco ..tiempo referida, principal- mente, a proteinas IgG, en una interacciôn que fue asociada a su regiôn Fc (Forsgren y Sjoquist, 1966), antes que a cualquier actividad relacionada con la funciôn anticorpal de estas proteinas (Kronvall, 1967). Entre tanto, la descripciôn de la reactividad de algunas proteinas monoclonales humanas de otras clases, IgA e IgM, con PA (Harboe y Foiling, 1974; Grov, 1976), era con- siderada circunstancialmente, en relaciôn con la individua- lidad de esas proteinas, ya que, al tiempo, las de otros mielomas de esas clases no moâtraban dicha reactividad (Harboe y Foiling, 1974; Salvedt y Harboe, 1976). De hecho, y con fines practices, la creciente uti- lizaciôn de la PA en multitud de mêtodos inmunoquimicos (Goding, 1978), fundamentalmente como segundo anticuerpo generalizado o anti-lgG, no precisaba la consideraciôn de la reactividad de inmunoglobulinas no IgG. Sin embargo, su manifestaciôn por inmunoglobulinas de varies mamiferos (Goudswaard y col., 1978), asi como su mecanismo, aparente- mente distinto del comünmente observado con IgG (Inganas y col., 1980), hacen necesario el estudio de esta nueva reacti­ vidad para un conocimiento mas complete de la interacciôn * -297- entre inmunoglobulinas y la PA de S, aureus. En este apartado se inicia una discusiôn general de los resultados presentados anteriormente y que, deriva- dos esencialmente de estudios coïi proteinas IgM, permiten extraer las conclusiones que se muestran en el capitule IV. III.5.1. IgM policlonal reactiva con proteina A. La mayoria de los trabajos acerca de la reactivi- Vdad de la IgM, se han efectuado con proteinas de mieloma (Harboe y Foiling, 1974; GrdV, 1975; Inganas, 1981; Inganas y.Johansson, 1981), planteândose, en primer lugar, para la consideraciôn de la de IgM policlonal, la cuestiôn de su aislamiento. -«:• El método de purificàciôn que se ha utilizado (apartado II.1.5.), se basa en la observaciôn de que cuando se cromatografia una muestra de #guero humano normal en PA- / , Sepharose, la fracciôn del mismo retenida en la columna contiene cantidades pequenas de IgM e IgA. Aunque represen- tan sôlo un 8-10% de la inmunoglobulina total (tabla III.3.), constituyen, sin embargo, el 30-40% de la IgM présente, va­ lor que esta de acuerdo con los resultados obtenidos por otros autores en el estudio de la separaciôn de anticuerpos anti-rubeola IgG e IgM, por cromatografia de los sueros in- dividuales en columnas de PA-Sepharose (Field y col., 1980). ^298^ El método descrito^produce una preparacion de IgM de gran pureza (tabla III.1.) que, a diferencia de otros procedimientos, se obtiene râpidamente y con buen -f' rendimiento. Presumiblemente, el método debe ser étil para sueros de otros animales cuyas IgM muestren reactividad con PA, destacando entre ellos los de perro (Goudswaard y col., 1978) y cerdo (Zikan, 1980b), Todos los estudios de interacciôn de IgM policlo­ nal con PA, se han efectuado con esta preparaciôn, que con­ tiene la fracciôn reactiva con PA del conjunto de IgM del suero normal y que, al parecer, présenta cierta variabilidad entre los sueros individuales (Grov, 1975a; Field y col., 1980), mostrando lo que probablemente sea el factor déter­ minante del rendimiento del método en la purificàciôn de IgM a partir de muestras individuales de suero. Un primer grupo de experimentos con la IgM policlo­ nal lo constituyen los de fijàciôn directa a células de S, aureus de alto contenido en PA, como las de la cepa Cowan (apartado III.1.2.). El anâlisis de los resultados muestra que la asociaciôn ocurre a través de un ûnico tipo de sitios de uniôn en la molécula de PA, con una Ka de 9 >10 1/mol (III.1.2.), que permite explicar su fijàciôn a co­ lumnas de PA-Sepharose en prdsencia de concentraciones de IgG mayores, caso de las muestras de suero, como corresponde a un proceso de mayor afinidad. que el de la fijàciôn de IgG, -299- tal como se deduce de su menar Ka, 1.7 x 10 1/mol (111,1.2.) i o de los valores inferiores cklculados tambien para IgG po­ liclonal y monoclonal en otros trabajos (Kronvall y col., 1970b; Myhre y Kronvall, 1980b; Lindmark y col., 1981). Tanto en los experimentos de union a bacterias, como en los de cromatografia en PA-Sepharose, résulta una mayor capacidad de fijacion d#e IgG que de IgM (III.1.2.3.), a pesar de su aparente menor afinidad por la PA. Elio pue­ de deberse, en parte, a la existencia de varios sitios de union de PA en la molecula de IgM, tal como se deduce de la composicion de los complejos formados en la reaccion de co- precipitacion de IgM, PA y Fc.y humano (III.1.3.1.). La IgM, asimismo, es capaz de dar reacciones de precipitaciôn directa con PA, que a diferencia de la de IgG précisa de PEG para la precipitaciôn de los complejos forma­ dos (III.1.3.2. y III.1.3.3.), lo que sugiere que ambas reacciones suceden en cada caso a traves de mecanismos di- ferentes. La presencia simultânea de IgM y Fcy en un mismo complejo con PA (III.1.3.1) .plantea, por otro lado, la exis- ’ S'tencia en la molecula de PA de estructuras distintas para la uniôn de ambos componentes del complejo. Esto se halla de acuerdo, ademâs, con la inhibiciôn observada de la fijàciôn de IgM a células de S, aureus por el fragmento F(ab’)2Y f pero no por el Fcy (III.1.2.4.), lo que configura un patrôn —300— de reactividad similar al tipo-alternative, a travës de re­ giones Fab de inmunoglobulinas, inicialmente caracterizado con IgE policlonal humana (Inganas y col., 1980). III.5.2. Sitios de proteina A para las reactividades clâsica y alternative. ! Otro resultado que'pone de manifiesto la presencia en la PA de sitios diferentes para ambos tipos de reactivi­ dades, es el relative a la* inhibicion de la reaccion de co- precipitaciôn de IgM policlonal con PA y Fcy por el fragmen­ te Faby, pero no por el F(ab')_y (III.2.3.). Esta dualidad de receptores en PA puede, adicional- mente, ser causa de las distintas capacidades de union de IgM e IgG, aunque por ahora no pasa de ser una especulaciôn. Asi, a la multiplicidad teôrica de sitios de union de Fcy en la PA (Sjodahl, 1977a), observada en la reaccion de preci- pitacion directa: 2 IgG por molécula de PA (Sjoquist y col., 1972a)-y coprecipitaciôn: 3 Fcy por PA (III.1.3.1.), puede oponerse la correspondiente a sitios de union de F(ab’)2 apuntada, por ejemplo, en la^precipitaciôn directa de IgM y PA (III.1.3.2.; Howell-Saxtôn y Wettstein, 1978). Es posible, asimiëmo, que la representaciôn curvi- linea del analisis de Scatchard de los datos de fijacion de; IgG policlonal a células de S, aureus (III.1.2.2.), se co- -301- rrœsponda con la uniôn a distintos sitios de PA, a traves de sus regiones Fc o FCab’ïg, siendo esta ultima la de me- noir afinidad, de àcuerdo con la pequeha fracciôn de FCab'lgï o ZFaby que resultan fijadas a grandes cantidades de S, aureua (Laancet y col., 197 8 ; Myhre y Kronvall, 19 80b). 1 . No obstante, estos sitios de PA que unen Fcy y F ( æ b ')gY , no parecen ser completamente independientes, a la viæta de los resultados de los experimentos de inhibiciôn conmpetitiva de la fijàciôn de F(ab’)2y y Fcy a S. aureus ^ . (IICI.2.1.), pues a altas concentraciones se observan efectos de inhibiciôn reciprocos, débiles e incomplètes, como el de- bicdo a Fcy en la fijàciôn de IgK/(III.1.2.4.). No se ha ob- serrvado en estos ensayos, sin embargo, estimulaciôn de la uniiôn de Fcy a PA en presencia de F(ab’)2y , tal como se ha deæcrito en otro trabajo (Biguzzi, 1982). En el mismo sentido pueden interpretarse los resul- tadios obtenidos en el estudio del efecto de la proteolisis parrcial de células de 5 . aureus sobre su capacidad de uniôn de IgM, F(abf)2y , Fcy e IgG (111,2.4.), los cuales muestran q u æ si bien la de Fcy es mucho més afectada que la de F(ab’)2y las3 estructuras receptoras no deben hallarse claramente sepa- radlas, ya que la diferencia observada no es lo suficientemen- te limpia como para sosta-i)e;j^O contrario. Hay que considerar, s i m embargo, la limitaciôn experimental que puede suponer el heczho de que la ;especificidad de los enzimas utilizados no fuesra la mas adecuada para determiner esta cuestiôn. V‘ —302“ Con todo, no cabe duda de que se trata de sitios localizados en puntos distintos de la molecula de PA, como lo demuestra la mayor relacion,hallada entre los de union de IgM y F(ab’)2l y los epitopos de PA, respecto de los de union de Fcy (III.2.5.), de acuerdo con la descripciôn ini- cial de la reacciôn de coprecipitaciôn entre Fcy , PA y anti­ cuerpos anti-PA (Kronvall y Williams, 1971), o con los traba­ jos de modificaciÔn quimicâ’. de^aminoâcidos de la PA esencia- les en la interacciôn con la regiôn Fcy , como la Tyr (Sjoholm y col., 1972; Sjoholm y col., 1973), que no afectan i su reactividad con regionea F’(ab ’ ) 2y (Romagnani y col., 1982b). La localizaciôn en la-molécula de PA de estos si- - tios implicados en la reactividad alternativa, a través de^^^-C regiones Fab de inmunoglobulinas, es por el momento una cues­ tiôn abierta, al carecerse, par ejemplo, de complejos cris- talizados similares al que permitiô la caracterizaciôn del sitio de uniôn de Fcy, por el analisis de su patrôn de di- fracciôn de rayos X (Deisenhofer y col., 1978). Puede decir- se, no obstante, que probablemente se hallen también sobre los mismos dominios de la PA que tienen sitios de uniôn de Fcy (Sjodahl, 1977a; Deisenhofer y col., 1978), pues de en- contrarse en la otra zona diferenciada de la PA, la regiôn X, no habria resultado afectada la capacidad de uniôn de IgM 0 F(ab’)2y en la digestiôn de 5. aureus con tripsina, ya que esa regiôn de la molécula de PA permanece Intacta sobre la pared celular tras ese tratamiento (Sjodahl, 1977a). - 3 0 3 ^ De hecho, existe evidencia indirecta de que los dominios homolôgos de la PA tienen sitios de interac- . ciôn con estructuras Fab, por la aglutinaciôn observada en presencia del fragmento B de eritrocitos cubiertos de IgG humana, pero no cuando estân cubiertos con IgG de co­ nejo (Barnett-Foster. y col., 1982), que a diferencia de la humana, no muestra reactividad tipo Fab (Inganas y col., 1980). En el mismo sentido, podria ser interesante el estudio de un polipêptido producido por cepas de 5. hyious^ el cual da reacciones de precipitaciôn con IgG humana y con sueros anti-PA (Muller y col,, 1981), pero su estructura, a juzgar por su movilidad electroforêtica y tamano molecu­ lar, puede equivaler a uno de los dominios de homologia de la PA, o unidad de la que podria haber surgido la actual molécula de S, aureus^ poh duplicaciôn del gen primitive correspondiente a tal dominio (Sjodahl, 1977b). III.5.8. Receptor de proteina A de la IgM monoclonal I z . Para determinar la regiôn de la molécula de IgM que tiene el sitio de uniôn de PA,» se han examinado las reacti­ vidades de los fragmentos producidos a partir de una pro­ teina monoclonal, la IgM Iz, por la conveniencia sehalada en el apartado III.3.1.. Algunos estudios 'han asociado el receptor de PA de IgM. a estructuras de su region (Fc)ry, en base a que este fragmento de la molecula, y ho el Faby, es retenido en colum­ nas de PA-Sepharose y da reaccion de coprecipitaciôn (Grov, 1975a). Estos resultados, sin embargo, no se reproducer, con otras proteinas monoclonales, que como la IgM Se pierden su reactividad con PA sôlo con tratamientos parcialmente desna-^ turalizantes (Harboe y Follin, 1974), ni coinciden con los obtenidos aqui con la IgM Iz. Asi, en ensayos de reactividad preliminares, por cromatografia de afinidad en PA-Sepharose, résulta que nin- guno de los fragmentos preparados es retenido en la columna (III.3.2.-III.3.5.), sôlamente algunos de los precursores de (Fc)^y en la digestiôn de IgM, son fijados, precisamente los de mayor contenido en regiones Faby intactas, pudiendo de- ducirse de este conjunto de experimentos, la irrelevancia de la regiôn (Fc)^y en la interacciôn, frente a la aparente re­ laciôn entre la reactividad inicial y el mantenimiento de las regiones Faby de la IgMT(III.3.3.). Estos resultados, no obstante, se comprenden mejor a la vista de los datos de los ensayos de inhibiciôn compe­ titive de la fijàciôn de IgM Iz a PA (III.3.6 .), los cuales muestran claramente cômo la regiôn Faby lleva la estructura receptora de PA. Por otro lado, y como se apuntaba en los experimentos de cromatografia de afinidad, la avidez de la IgM por la PA, viene determinada por la naturaleza multiva- lente de su molécula polimérica, apreciândose una progresi- va disminuciôn en la avidez-de la interacciôn con el grado de despolimerizacion, repre’Sentado en el paso IgM a IgM monô- mero o FCab’jgy a F a b ’y o Faby (tabla III.4.), motivo por el que carecen de capacidad de fijàciôn a la columna de PA-Sepharose. Esta relaciôn entre multivalencia y avidez por la PA se conoce también en otras IgM monoclonales (Harboe y Foiling, 1974; Howell-Saxton y Wettstein, 1978), en la in­ teracciôn de la IgG humana policlonal a través de su regiôn Faby (III.2.2.) y en la de IgG de cabra, capaz de unirse a la PA cuando se encuentra agregada en inmunocomplejos (Langone, 1980). Adicionalmente, varios tipos de radioensayos con subfragmentos de la regiôn Faby, como la inhibiciôn competi­ tive de la fijàciôn de IgM Iz a PA (III.3.8 .) o de su reac­ ciôn de coprecipitaciôn (III.3.9.), en los que la cadena ligera es inactive, o la inhibiciôn de la fijàciôn de IgM Iz a PA por anticuerpos contra el dominio Vy (III.3.10.), asocian a esta regiôn de la IgM las estructuras de su receptor de PA. III.5.4. Receptor de proteina A en los dominios variables de cadena pesada de inmunoglobulinas. Los resultados obtenidos con la IgM Iz pueden ex- — OUD- tenderse, asimismo, a las proteinas IgM policlonales, a par­ tir de la evidencia indirectà obtenida en los ensayos de in- hibicion de fijacion a S, aureus y de coprecipitaciôn con PA y Fcy , en presencia de anticuerpos anti-Faby (III.4.1.) o anti-Vy (III.4.2.). Por otra parte, la generalizaciôn de estas conclusiones, que se hallan de acuerdo con la uniôn de algunos fragmentos F(ab')2y y Fv de IgM policlonal a PA-Se­ pharose (Biguzzi, 1982), ayuda a descartar que en la interac­ ciôn considerada de IgM y PA, estén implicados los mecanis­ mos de reconocimiento de antîgeno de la funciôn anticorpal (III.3.8 .), tal como ha sido descrito con anticuerpos de es­ pecificidad conocida, capaces de unir su antigeno y de unir PA a través de su regiôn F(ab*)^y (Biguzzi, 1982). Mas interesante es que de la probable actividad anti-"framework" de los anticuerpos anti-V^ que interfieren la interacciôn de IgM con PA, claramente apreciada en su reacciôn con IgG e IgA policlonales, asi como con una IgE monoclonal (III.4.3.), surge una relaciôn entre epitopos de las regiones Vy y reactividad alternativa con PA del tipo Fab, que sugiere la localizaciôn del receptor de PA de estas inmunoglobulinas en los dominios variables de sus cadenas pesadas (III.4.4.), de acuerdo con los resultados obtenidos directamente con la IgM Iz. De este modo, la presencia de un receptor de PA en los dominios Vy de inmunoglobulinas, permite contempler -307- los resultados acerca de la interacciôn inmunoglobulinas-PA, desde una perspectiva integradora, pudiendo entenderse la irrelevancia del isotipo de cadena ligera o de cadena pesa­ da en la naturaleza de la reactividad, précipitante o inhi- dora de precipitaciôn, de IgG humana de mieloma (Kronvall y Williams, 1969 ; Myhre y Kronvall, 19.80b; Inganas y Johansson, 1981), o en la sola determinacion de la reactividad o no reactividad con PA de IgA e IgM monoclonales humanas (Harboe y Foiling, 1974; Biewenga y col., 1982). Asi, aunque en algün momento llegaron a asociarse las proteinas IgA2 con las formas de IgA que unen PA (Saltvedt y Harboe, 1976; Virella y col., 1978), posteriormente se describieron protei­ nas IgAl, tanto monoclonales (Brunda y col., 197 7) como po­ liclonales (Van Kamp, 1979), que también reaccionan con PA. Del mismo modo, no ha podido sostenerse la divisiôn de la IgM en dos subclases de acuerdo con la diferente reactivi­ dad de las proteinas consideradas (Harboe y Foiling, 19 74; Inganas, 19 81). Por lo que se refiere a la IgG, la no reactividad iniqialmente atribuida a lâtüfgGS (Kronvall y Williams, 1969 ), parece estar relacionada con la sustituciôn de aminoâcidos en la secuencia del Fc que détermina la uniôn a PA de las IgG reactivas (Recht y col., 1981; tabla III.5.), siendo posible, incluso, que algunas de las IgGS policlonales que se unen a PA-Sepharose (Skvaril, 1976; Van Kamp, 1979), lo » hagan a través de receptores de sus dominios V^. I —308— Verdaderamente, la^. estructuras que median la reactividad con PA del tipo Fc, parecen encontrarse solo en proteinas IgG (Inganas, Ïg81), mientras que la reacti- vidad tipo Fab es comun a todas las clases de inmunoglobu­ linas policlonales: IgG, IgA e IgM (III.4.4.), IgE (Inganas y col., 1980) y monoclonales (Inganas, 1981). Esto podria constituir una mas de las distintas capacidades efectoras . ’ de las clases de inmunoglobulinas relacionada con las di­ ferencias de sus cadenas pesadas. Asi, ademas del efecto que el distinto patron de glicosilacion de las regiones Fc de las otras clases de in­ munoglobulinas respecto del de Fc y (Toraho y col., 1977 ) pudiera tener sobre el acceso de la PA, cuando se comparan las secuencias de aminoâcidos de las regiones Fc correspon- dientes a los tres segmentos del Fcy que establecen contac­ te con la PA (Deisenhofer y col., 1978), puede advertirse como unicamente se hallan representadas identicamente, o casi, en las distintas subclases de IgG (tabla III.5.), en tanto que las de IgAl, IgA2, IgE, IgM e IgD, dispuestas del modo en que puede conseguirse mâxima homologia en la totalidad de la oadena pesada, aparecen completamente diferentes (tabla III. 5.). Sin embargo, proteinas IgG réactivas con PA de otros mamiferos, como cobayo y raton, conservan la mayoria de la secuencia de esas zonas de contacte (Ricardo y col., 1981). -309- Tabla III.5. SECUENCIA DE LAS REGIONES DE CONTACTO Fcy-PA Y LAS DE SEGMENTOS HOMOLOGOS DE OTRAS CLASES DE INMUNOGLOBULINAS. N252 N308 N433 Yl Met Ile Ser Val Leu His Gin Asn His Asn His Tyr Y 2 t Ile Ser Val Val His* Gin Asp His Asn His Tyr Y3 t Ile Ser Val Leu His Gin Asp His Asn Arg Tyr Y4 Met Ile Ser Val Leu His Glx Asx His Asx His Tyr «1 § Leu Gly Gly Cy? Ala Gin Pro Pro Leu Ala Phe • § Leu Gly Gly Cys Ala Glx Pro Pro Leu Ala Phe ' y § Leu Thr Ile Cys Gin Asp Asx Pro Asn Arg Val E § Ile Arg Val Gly Thr Arg Asx Ser Pro Ser Gin 5 § Leu Arg Leu Pro Arg Ser Leu Ser § Arg § Comparacion de las secuencias de aminoâcidos de los très segmentos N252-254, N308-312 y N433-436 de la region Fc que interaccionan con la PA (Deisenhofer y col., 1978), correspondientes a las subclases de IgG humana y a los segmentos équivalentes de las cadenas pesadas de las res­ tantes clases de inmunoglobulinas que resultan de la ali- neaciôn de las sediencias que permite una simetrîa de do­ minios y homologia mâximas. Las secuencias proceden de: Low y col., 1976 (Yl, e y «i), Connell y col., 1979 ■ (Y2)j Wolfenstein-Tqddel y col., 1976 (yg), Pink y col., 1970 (yi+), Toraho y Putnam, 1978 («2) y Takahashi y col., 1982 ( 6 ). El alineamiento base es de Low y col., 1976. El ultimo segmento 5 es de dificil asignaciôn, por la baja homologia de su extremo C-terminal. § y t, indioan hueoos del alineamiento y posiciôn no determinada, respectivamente -310- Por otro lado, ademas de no llevar en su region Fc estructuras équivalentes a las de Fey que unen PA, ré­ sulta dificil imaginar que variacion deben presentar las inmunoglobulinas no IgG en las regiones constantes de sus cadenas pesadas, capaz de expLicar la variabilidad observa- da en su reactividad con la* PA (Harboe y Follin, 1974; Biewenga y col., 1982). Esta caracteristica, junto con que el mecanismo de interacciôn sea comûn a todas las clases de inmunoglobulinas, incluida la IgG (III.4.4.; Inganas, 1981), son propiedades de la reactividad tipo Fab,que pue- den explicarse fiablemente a partir de la existencia en los dominios de un receptor de P A . Hay que tener en cuenta, que todas las clases de inmunoglobulinas utilizan el mismo con junto de genes (Tonegawa, 198 3) y que, si bien dan lugar a gran numéro de secuencias para el dominio , su estructura tridimensional adopta una configuraciôn definida, capaz de albergar esa variabilidad en un modèle de pliegue polipeptidico determi- f nado por la disposiciôn en segmentes de los aminoâcidos mas invariantes, o regiones "framework", del dominio (Davies y Metzger, 1983). Este, como las homologuas del dominio de inmunoglobulinas del mismo subgrupo V y , superiores a las de sus regiones si son de distinta clase (Putnam, 197.7a), es compatible con la manifestaciôn de reactividades tipo Fab por las distintas clases de inmunoglobulinas a través de estructuras de sus dominios . -311- Con todo, la heterogeneidad observada en esta reactividad,: puede estar asociada con la variabilidad estruc- tural inherente a los dominios, , aunque se hallen pendien- tes estudios con proteînas de distintos subgrupos Vy para tratar de averiguar si hubiese^alguna relacion con su reac­ tividad con PA. Que las inmunoglobulinas con reactividad tipo Fab de otros mamiferos lleven, asimismo, epitopos reconocibles por anticuerpos contra regiones de inmunoglobulinas hu- manas (III.4.5.), constituye un apoyo adicional a la presen- cia de receptores de PA en los dominios . De hecho, el analisis de las secuencias de nucleo­ tides de genes , permite establecer la existencia de gran­ des homologuas entre les genqs del mismo subgrupo de distin­ tos animales: las homologuas halladas entre genes de ma- muferos, humane y raton (Rechavi y col., 198 3) o humane y conejo (Bernstein y col., 1982), se extiende incluse a espe- cies evolutivamente distantes, como los primitives insectivo­ res, aves y reptiles (Litm&h y col., 1982 ). Asu, el 70% de los nucleotides de un gen Vy de Caiman son idênticos a los del gen de raton utilizado como prueba en su aislamiento, y la homologia con genes humanos parece aün mayor (Litman y col., 1983), hallândose'el mayor numéro de nucleotides idênticos en las regiones "framework", de acuerdo con la seleccion conservativa a quê Se encuentran sometidas, efn . -312- una mayor presion evolutiva que la que actua sobre otras areas del dominio variable libertad adaptativa, como las regiones CDR (Loh y col., 1983). Ya que el dominio como la region Fv, conser­ va la reactividad con PA de las regiones Fab, como se ha determinado para la IgM Iz (III.10.), es posible que este receptor de PA este definidO soiÿ). por estructuras del do­ minio variable, a diferencia del ^e la region Fc de IgG, definido por segmentos de la zona interdominios Cy2-Cy3 (Deisenhofer y col., 1978). Esto, junto con el hecho cono- cido de que las laminas 3 antiparalelas que constituyen ambos dominios variables, se hallen asociadas a través de su capa de 5 segmentos (figüra 1 .4 . ), permite especular con que el receptor de PA estuviese definido por secuencias de las regiones "framework" 1 ÿ / ^ 3, que forman las hojas ex- ternas de la lamina (figura fll.6'6 ). Por otro lado, esta reactividad a través de los dominios , probablemente esté relacionada con los fenome- nos de activacion de linfocitos por PA (apartado 1.6.1. ). Asi, para las células B se ha demostrado que la prolifera- cion inducida por S, aureus^ se debe a su interacciôn con las inmunoglobulinas de su membrana, a través de estructu­ ras de sus regiones Fab (Romagnani y col., 1981b), lo que permite comprender esta actividad en poblaciones celulares constituidas mayoritariamente por linfocitos con IgM e IgD en superficie, y que incluse en la estimulaciôn de linfoci- 20 40 60 80 100 117 s --------------------------------------------------s 4Bl 432 33 i 334 385 433 4 3 4 332 333 FWI Hvl FW2 Hv2 FW3 Hv3 FW4 Figura III.66. Diagrama esquematizado de un dominio mostrando, en el centro, los segmentos de las hojas externa, negros, e interna, blancos, de la lamina 3 antiparalela en que se dispone su cadena polipeptîdica, identificados segun una nomenclatura que hace referencia a su posiciôn en la hoja de 4 o de*3 Segmentos (5 en regiones V) del pliegue de inmunoglobulinas, y su orden en la secuen- cia de aminoâcidos (Amzel y Poljak, 1979). Esta dispo- sicipn y la de los segmentos "framework", FW, y regio­ nes hipervariables, Hv, corresponden al dominio Vy de la IgG humana New, arriba (Poljak y col,, 1977; Saul y col,, 1978). . -314- tos con IgG, no se hallen implica.dos los sitios de. union de PA del fragmento Fey (Sjodahl y Holier, 1979). Que anticuerpos anti-F(ab')^y o fragmentos F(ab') inhiban completamente la formacion de rosetas entre eritro- citos cubiertos de PA y linfocitos no T, asi como su proli- feracion en presencia de S, aureus^ tanto de individuos nor­ males (Romagnani y col., 1981b), como de pacientes con leu- cemia linfocitica cronica (Romagnani y col., 1982a), se ha- 11a de acuerdo con que se trate de actividades mediadas a traves del receptor de PA en las regiones de las inmuno­ globulinas de membrana. En la estimulaciôn de células T por PA, se halla pendiente la identificaciôn de la estructura reconocida en estas células (Nakao y col., 1980) y la eventual relacion con su receptor de antigeno j El hecho de que se puedan de- tectar en su superficie epitopos de regiones Vy no idiotî- picos, e incluso que puedan perturbarse funciones celulares caracteristicasde células T por anticuerpos contra esos epi­ topos (Forre y col., 1982), ha apuntado a que los sitios de union de antigeno de ese receptor podrian estar definidos, también, por los genes de las regiones de inmunoglobuli­ nas (Marchalonis, 1982), en# estructuras que por ello podrian ser reconocidas por la PA. ■ r ' Sin embargo, no se han hallado mRNA con secuencias -315- homologas de las de genes en células T de muy diversa procedencia: linfomas, linfocitos periféricos, hibridomas, etc., utilizando pruebas de DNA conteniendo genes Vy conoci- dos (Kemp y col., 1982), ni se han detectado translocaciones en los genes de células T productoras de factores especî- ficos de antigeno con un idiotipo comûn al de anticuerpos contra ese mismo antigeno (Nalcà^ishi y col. , 1982 ; Kraig y col., 1983), todo lo cual sugiere que las células T probable­ mente no transcriben ninguno de los segmentos génicos del ré­ pertorie Vy de las células B (Kronenberg y col., 1983). La proliferaciôn de células T humanas en presencia de PA, no obstante, es inhibida por IgG policlonal y sus frag­ mentos F(ab')2Ï (Sumiya y col., 1980), habiéndose descrito in­ cluso la union de receptores de antigeno de membranas de célu­ las T a PA insolubilizada en agarosa a alta densidad (Binz y, col., 1980). Sin embargo, el receptor de antigeno de células T (Ti) se ha identificado recientemente como un heterodimero de 90000 de peso molecular, compuesto por dos subunidades a de - 50000 y 43000 de peso molecular, respectivamente, unidas por un puente disulfuro (Meuer y col., 1983a,b), asociado no covalentemente a una molécula de 20-25000 de peso molecular, el componente T3, que es similar en todas las células T inaduras (Reinherz y col., 1980), a diferencia de las Ti, que pr-cscntan el polimorfismo esperado para la region variable del rcccp- “316- tor de antigeno (Acuto y col., 1983). Esta molécula Ti pa­ rece no interaccionar con la PA, tal como indirectamente pue­ de deducirse de los contrôles de los experimentos de inmuno-^- precipitaciôn con PA-Sepharose o S, aureus con PA (Acuto y col., 1983; Reinherz y col., 1983). Por todo ello, aunque en la estimulaciôn de células T por PA pudieran hallarse implicados los sitios relaciona- dos con su reactividad alternativa, tipo Fab, se trata de un fenômeno mucho menos conocido que el correspondiente de estimulaciôn de células B. V."' CONCLUS IONES -317- El analisis de los resultados obtenidos del con- junto de la labor experimental efectuada acerca de la inte- raccion de inmunoglobulinas humanas con la proteina A de S. aureus^ puede resumirse en las siguientes conclusiones|: 1.- La capacidad de fijaciôn de la IgM policlonal a columnas de PA-Sepharose permite, en combinacion con otras têcni- cas cromatogrâficas, como la filtraciôn en gel, su ais­ lamiento a partir de suerd normal, en un procedimiento râpido y de buen rendimiento, Esto es, ademâs, clara evi- dencia de que otras clases de inmunoglobulinas, y no solo las IgG, interaccionan con la proteina A. 2.- La pequeha cantidad de IgM e IgA présente en la fraccion de suero retenida en PA-Sepharose se debe, en buena par- te, a su menor concentraciôn en suero respecto de la de IgG, inmunpglobulina mayoritaria en aquella fraccion, ya que en estudios de fijaciôn cuantitativa la afinidad de la igM-por la proteina A résulta mayor que la de la IgG (por ejemplo, en la union'a células de S, aureus, las q . q Ka respectivas son 1 x .10 1/mol y 1,65 x 10 1/mol).’ • 3,T La interacciôn con proteina A de la IgM policlonal es ■ -9 del tipo alternativo, pues résulta inhibida por fragmen­ tos F(ab’)q de IgG Déro no por los Fc. k 4, T' Las estructuras de la prateina A que median ambos tipos de reactividades de inmunoglobulinas, alternativa, rela-. cionada con sus fragmentos Fab, y clâsica, con el Fey, -318- determinan sitios de interacciôn distintos, permitiendo do la formacion de complejos en los que la proteina A tiene unidas simultaneamehte moleculas de IgM o Faby y de Fey. No obstante, las débiles inhibiciones recipro- cas observadas en la fijacion de unos y otros fragmentos de IgG a células de S, aureus , sugieren que tales si­ tios no son totalmente independientes. 5.- La reactividad con proteina A del tipo alternativo mues- tra una estrecha relacion con la Valencia de la molécula considerada, de modo que a mayor contenido en regiones Fab mas fuerte es la interacciôn observada. 6.- La reaccion de precipitaciôn directa con proteina A esta restringida a inmunog]jObulinas que manifiestan ambos ti­ pos de reactividades, por lo que las IgG con regiones Fab no reactivas con proteina A no dan reacciones de precipitaciôn, aunque si de coprecipitaciôn. Del mismo modo, las IgM, sôlo con reactividad de tipo alternativo, da reacciones de coprecipitaciôn; sin embargo, y proba­ blemente a causa de ,su .multivalencia, en condiciones par- ticulares da reacciones de precipitaciôn directa. 7.- En la localizaciôn del sitio de interacciôn de la IgM con proteina A, efectuada directamente con una proteina mo­ noclonal, el dominio es la regiôn mas pequena de su molécula que contiene las estructuras a través de las que se une a la proteina A. -319- 8.- Déterminantes antigênieos de la IgM policlonal reacti­ va con proteina A, comunes con otros del dominio de una monoclonal de reactividad conocida a través de esa region de su molécula, se hallan asociados al sitio de interacciôn con proteina A, de modo que, probablemente, todas las moléculas de IgM que interaccionan con protei­ na A llevan también en sus dominios el sitio de unionn 9.- Estos déterminantes antigênieos, que deben localizarse en los segmentos "framework" o menos invariantes del dominio V y , ya que se encuentran en regiones de IgG policlonal, y también en inmunoglobulinas IgA e IgE, es- tân relacionados con la reactividad de tipo alternati­ vo, hallândose fundamentalmente en todas las inmunoglo­ bulinas que la presentan, antes que en las que no o en las que tienen sitios reactivos solo en su region F c . 10.T La reactividad alternativa de inmunoglobulinas esta me- diada por estructuras de sus dominios V y , pudiendo atri- buirse la heterogeneidad de dicha interacciôn a la va­ riabilidad estructural de esa regiôn de las inmunoglo­ bulinas y, por lo mismo, la independencia del isotipo de cadena ligera o pesada caracteristica de la reactividad alternativa, -f- 11.T De igual modo que el sitio de uniôn a proteina A d e l à ; regiôn Fcy, el de interacciôn a través de los dominios Vy aparece evolutivaÉiente^conservado, encontrândose en -320- las inmunoglobulinas de mamiferos con reactividad alter­ nativa, pero no en las de los que no la presentan, es­ tructuras que son reconocidas por los mismos anticuer­ pos contra segmentos "framework" humanos que interfie- ren la interacciôn de inmunoglobulinas humanas con la proteina A. 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