UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 
 

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 
Departamento de Biología Vegetal 

 

  
 

TESIS DOCTORAL  

 
 
Localización subcelular e interacciones moleculares de la proteína 2b 

del virus del mosaico del pepino: su relevancia en la función supresora 
de silenciamiento génico  

 
 

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR 
 
 

PRESENTADA POR 

 
Inmaculada González Martín 

 
 

Director 
 

Tomás Raimundo Canto Ceballos 
 
 

Madrid, 2016 
 
 
 

© Inmaculada González Martín,  2016 



UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA VEGETAL I 

 

 

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS  

CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS 

GRUPO DE INTERACCIONES MOLECULARES PLANTA/VIRUS/VECTOR  

 

 

 

Localización subcelular e interacciones moleculares de la 

proteína 2b del Virus del mosaico del pepino: su relevancia en 

la función supresora de silenciamiento génico  

 

 

TESIS DOCTORAL 

Inmaculada Elizabeth González Martín 

 

Madrid, 2015 

Director: Dr. Tomás Raimundo Canto Ceballos 



 

  



 

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA VEGETAL I 

 

 

Localización subcelular e interacciones moleculares de la 

proteína 2b del Virus del mosaico del pepino: su relevancia en 

la función supresora de silenciamiento génico 

 

 

Memoria de Tesis Doctoral presentada por la Licenciada 

Inmaculada Elizabeth González Martín para optar al Grado de Doctor 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Vº Bº DIRECTOR DE TESIS 

 Tomás Raimundo Canto Ceballos 
CIB-CSIC 

 
 

 
LA DOCTORANDA 

Inmaculada E. González Martín 

 

 

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGCIONES CIENTÍFICAS (CSIC) 

CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS (CIB) 

 

MADRID, 2015  



 

  



 

Este trabajo ha sido realizado en el grupo Interacciones Moleculares 

Planta/Virus/Vector del Departamento de Biología Medioambiental del Centro de 

Investigaciones Biológicas (CIB) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas 

(CSIC), con financiación de los proyectos AGL2008-0342 del entonces Ministerio de 

Ciencia e Innovación (MCINN) del Gobierno de España, del proyecto bilateral 

2008RU0089 entre el CSIC y la Russian Foundation for Basic Research, y del proyecto 

bilateral ACI2009-0855 entre el MCINN y el Department of Science and Technology del 

Gobierno de la India.  Inmaculada González ha disfrutado de una beca predoctoral JAE-

Predoc 051 del CSIC resuelta el 18 de Junio de 2008. 

 

 



 

  



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dedicado a mi Familia,  

aguas arriba y aguas abajo de mí. 

  



 

  



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

El entusiasta andador de trochas y veredas  

persigue algo que no siempre resulta fácil de comprender.  

Vadea los arroyos,  

sufre las asperezas del piornal, 

trepa por las llambrías casi verticales,  

con fatiga,  

pero seguro de sí mismo 

 y con voluntad de superación,  

que no de competitividad.  

Y así se culmina la meta,  

con la recompensa apetecida. 

 

Manuel Rincón 

 

 

 

 

 



 

  



 

AGRADECIMIENTOS 

Gracias a la familia, por entender que una vocación hay que intentar seguirla y a Juan por su 

apoyo incondicional. Gracias a Zoe por sonreír cada día. 

Gracias a mis mentores en la investigación en la UCM, E. Pangua y S. Pajarón, con vosotros 

comencé en este mundo tan lleno de interrogantes y me picó el gusanillo de la investigación. Y 

a Mery, Elena, Ares, Sara, y Ana, mis primeros compañeros de laboratorio en la Complu. 

Gracias a los compañeros de los cursos de doctorado por compartir esos momentos, 

especialmente a Mery, Elena y Carol, mis amigas en esta y otras aventuras.  

Gracias a todos los que han ayudado en el desarrollo de esta tesis. En primer lugar a Tomás 

Canto, director de esta tesis, sin él no sería posible este trabajo. A las rusas, Natalia Kalinina, 

Daria Rakitina y María Semashko por acogerme tan cálidamente en su laboratorio en el 

Instituto Belozersky de Moscú y sus enseñanzas en la expresión de proteínas y unión in vitro a 

RNA, especialmente a Daria, que realizó la unión al RNA de TMV y me enseñó a calcular las 

cinéticas de unión a 2b. A John Carr y todo su laboratorio, especialmente a Jack Westwood, 

que me acogieron cariñosamente en su laboratorio de la Universidad de Cambrigde. Allí 

aprendí nuevas técnicas que, aunque no han quedado reflejadas en esta tesis, enriquecieron el 

know how. Gracias a ambos grupos la estancia en un país extraño fue muy acogedora. Gracias 

a Shelly Praveen, por la paz que transmite como filosofía de vida. Gracias a todos los firmantes 

de los artículos científicos que hemos publicado juntos, por vuestra dedicación siempre 

enriquecedora a mejorar el trabajo y el conocimiento. Gracias a Mónica Fontenla por las 

fotografías y a Maite Seisdedos por su ayuda en el microscopio confocal. 

Gracias a todos los que han formado parte del grupo en el CIB durante mi estancia, José 

Ramón Díaz-Ruiz, responsable del grupo, y Dionisio López, doctor vinculado en el grupo, 

ambos hasta la jubilación; Paco Tenllado y César Llave, científicos titulares del grupo junto a 

Tomás Canto; y los compañeros predoc y postdoc Llucia, Lourdes, Livia, Nacho, Fran, Meme, 

Löic, Gema, Irene. A mis compañeros de laboratorio, Virginia, Paula, Fátima, Bea, Patxi y Óscar. 

Muchos compartimos el fresquete en la cámara fría haciendo competentes. Y al resto de 

compañeros, Tamara, Mar, Aurora, Teresa, Carlos y Rafa; Sara e Iván; Héctor y Maite, gracias a 

todos por compartir alegrías. 

Gracias al CSIC, por dotarme de una beca para llevar a cabo la tesis doctoral. Deseo que los que 

vienen por detrás tengan esa suerte. 



 



ÍNDICE 

1 ABREVIATURAS 

ACRÓNIMOS DE VIRUS 5 

SUMMARY 7 

RESUMEN 11 

1. INTRODUCCIÓN 15 

17 1.1. CMV 

1.2. Silenciamiento y defensa antiviral en plantas 22 

1.2.1. Detección y procesamiento de RNAs virales 26 

1.2.2. Ensamblaje de RISC 27 

1.2.3. Generación de siRNAs virales secundarios 30 

1.3. Supresores virales de silenciamiento de RNA: mecanismos 

virales de interferencia con el silenciamiento génico 32 

1.3.1. Unión de supresores virales a ácidos nucleicos 34 

1.3.2. Interacción de supresores virales con proteínas de las 

rutas del silenciamiento 38 

1.3.3. Interferencia de supresores virales con la amplificación de 

siRNAs 39 

 1.4. La proteína 2b 41 

1.4.1. Actividad funcional de la proteína 2b 41 

1.4.2. Dominios de la proteína 2b 46 

1.4.3. Localización subcelular de la proteína 2b 50 

1.4.4. Estructura de la forma funcional de la proteína 2b 54 

2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 57 



3. MATERIAL Y MÉTODOS 63 

3.1. Material biológico 65 

3.1.1. Plantas 65 

3.1.2. Cepa Fny de CMV 65 

3.1.3. Cultivos bacterianos 65 

3.2. Clonaje de las construcciones plasmídicas 68 

3.2.1. Mutantes de la proteína 2b de la cepa Fny de CMV 68 

3.2.2. Amplificación de DNA mediante la reacción en cadena de 

la polimerasa (PCR) 69 

3.2.3. Electroforesis en geles de agarosa 70 

3.2.4. Clonaje en plásmidos binarios pROK2 70 

3.2.5. Clonaje en plásmidos pQE30 74 

3.2.6. Transformación de bacterias 75 

3.2.7. Purificación De DNA plasmídico 76 

3.2.8. Selección de clones y secuenciación 76 

3.3. Expresión transitoria de genes en tejidos vegetales mediante 

agroinfiltración 77 

3.3.1. Crecimiento e inducción de cultivos de Agrobacterium 77 

78 3.3.2. Agroinfiltración de tejidos vegetales 

3.4. Ensayo de actividad supresora de silenciamiento 79 

3.4.1. Visualización de fluorescencia en tejidos vegetales 79 

3.4.2. Inmunodetección de proteínas o western blot 80 

3.4.2.1. Preparación de la muestra para análisis por 

western blot 80 

3.4.2.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 81 

3.4.2.3. Transferencia húmeda a membranas 81 

3.4.2.4. Inmunodetección de proteínas por western blot 81 

3.5. Visualización in vivo de proteínas con marcajes fluorescentes 83 

3.5.1. Agroinfiltración y expresión transitoria 83 

3.5.2. Infiltración de tinción DAPI 83 



3.5.3. Visualización de fluorescencia in vivo con microscopio 

84 

85 

Confocal 

3.6. Complementación bimolecular fluorescente 

3.7. Unión in vitro de la proteína 2b a RNAs 86 

3.7.1. RNAs 86 

3.7.2. Expresión de proteínas en bacterias 87 

3.7.3. Purificación de proteínas en condiciones 

desnaturalizantes 88 

3.7.4. Renaturalización de proteínas 89 

3.7.5. Cuantificación de proteínas 89 

3.7.6. Unión in vitro de proteína a sRNAs 90 

3.7.7. Cuantificación de pequeños RNAs unidos a proteínas 91 

3.7.8. Cálculo de la constante de disociación y del coeficiente de 

Hill 92 

4. RESULTADOS 93 

4.1. Localización subcelular y actividad supresora de silenciamiento de 

la proteína 2b de CMV 95 

4.1.1. Proteína 2b nativa fusionada a marcadores fluorescentes 95 

4.1.2. Mutantes de la proteína 2b fusionados a marcadores 

fluorescentes 99 

4.1.3. La proteína 2b marcada con una señal de exportación 

nuclear 105 

4.2. Visualización in vivo de interacciones de la proteína 2b 112 

4.2.1. Visualización de homodímeros de proteína 2b 112 

4.2.2. Visualización de interacciones de la proteína 2b con 

proteínas argonauta 117 

4.3. Unión in vitro de la proteína 2b a RNAs 121 

4.3.1. Caracterización de las propiedades de la unión in vitro de 

proteína 2b nativa o mutante a sRNAs 123 



4.3.2. Caracterización de la unión in vitro de las proteínas 2b o 

131 mutantes a un RNA genómico viral 

4.4. Visualización de potenciales interacciones de la proteína 2b con 

otras proteínas nucleolares de la planta 134 

5. DISCUSIÓN 141 

145 

155 

5.1. Localización, patogenicidad y actividad supresora 

del silenciamiento de la proteína 2b de CMV, nativa o modificada 

5.2. Interacciones de la proteína 2b con proteínas: Formación de 

homodímeros e interacción con proteínas AGO y con otras proteínas 

5.3. Interacciones in vitro de la proteína 2b con RNAs 166 

6. CONCLUSIONES 183 

7. BIBLIOGRAFÍA 187 

ANEXOS 211 

I. Secuencias peptídicas de proteínas 2b de diferentes cepas de CMV 213 

II. Oligonucleótidos utilizados en la clonación y la secuenciación de los

plásmidos 214 

III. Esquema de las construcciones plasmídicas 216 

IV. Efectos de diversas mutaciones en las propiedades de la proteína 2b

de CMV 218 



1 
 

ABREVIATURAS 

A Alanine, aminoácido alanina 

aa, aas Aminoácido, aminoácidos 

Ab Antibody, anticuerpo 

AGO Argonaute protein, proteína Argonauta 

ARR Arginine-rich regions, regiones ricas en argininas  

AtFib2 Arabidopsis thaliana Fibrilarin 2, fibrilarina 2 de A. thaliana  

BiFC Bimolecular fluorescence complementation, complementación 
bimolecular fluorescente   

BrEt Bromuro de etidio  

BSA Bovine serum albumin, albúmina de suero bovino 

BY2 Bright Yellow 2, células Bright Yellow 2 de tabaco 

C Cysteine, aminoácido cisteína 

Cap Caperuza, nucleótido de guanidina modificado del extremo 5’ del mRNA  

CAT3 Catalase 3, proteína catalasa 3 

CB Cajal body, cuerpo de cajal  

CDK2 Cyclin-dependent kinase 2, quinasa dependiente de ciclina 2  

CKII Casein kinase II, caseína quinasa II  

CP Coat protein, proteína de cubierta o de la cápside  

D Aspartic acid, aminoácido ácido aspártico 

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole, 4',6-diamino-2-fenilindol 

DCL Dicer-like, RNasa III semejante a Dicer  

DNA Deoxyribonucleic acid, ácido desoxirribonucleico 

dpi Días post agroinfiltración 

dsRNA Double-stranded RNA, RNA de doble hebra  

ds siRNA Double-stranded small interfering RNA, pequeño RNA interferente de 
doble hebra  

E Glutamic acid, aminoácido ácido glutámico 

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid, ácido etilendiaminotetraacético  

F Phenilalanine, aminoácido fenilalanina 

G Glycine, aminoácido glicina 

GAR Glycine- and arginine-rich domain, dominio rico en glicinas y argininas  

GFP Green fluorescent protein, proteína fluorescente verde  



2 
 

H Histidine, aminoácido histidina 

H2O2 Peróxido de hidrógeno 

HA Hemaglutinin, hemaglutinina (péptido) 

HC-Pro Helper component-protease, proteasa componente “helper” de Potyvirus 

HEN-1 Hua Enhancer 1. RNA metil transferasa. 

His Histidines, Histidinas 

HR Hipersensitive response, respuesta hipersensible  

I Isoleucine, aminoácido isoleucina 

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, Isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranósido 

JA Jasmonic acid, ácido jasmónico 

K Lysine, aminoácido lisina 

Kbs Kilobases 

Kd Constante de disociación 

kDa KiloDalton 

L Leucine, aminoácido leucina 

LB Luria Bertani   

M Methionine, aminoácido metionina 

MCS Multiple cloning site, sitio múltiple de clonaje 

MES Morpholinethanesulfonic acid, ácido 2-N-morfolino-etanosulfónico 

miRNA Micro RNA, micro RNA 

mock Mock, simulacro de infiltración, control negativo 

MP Movement protein, proteína de movimiento del virus  

mRFP Monomeric red fluorescent protein, proteína fluorescente roja 
monomérica  

mRNA Messenger RNA. RNA mensajero 

N Asparagine, aminoácido asparagina 

NES Nuclear export signal, señal de exportación nuclear  

Ni-NTA Nicke- Nitrilotriacetic acid, níquel- ácido nitrilotriacético 

NLS Nuclear localisation signal, señal de localización nuclear 

nm Nanómetros 

NoLS Nucleolar localisation signal, señal de localización nucleolar 

NOS Nopaline synthase, nopalina sintasa 



3 
 

NOS TERM Nopaline synthase terminator, fragmento terminador de la nopalina, 
sintasa 

NPC Nuclear pore complex, complejo de poro nuclear  

nt, nts Nucleótido, nucleótidos 

OD Optical density (Absorbance), densidad óptica (Absorbancia) 

ORF Open reading frame, marco abierto de lectura  

P Proline, aminoácido prolina 

PAGE-SDS Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis, electroforesis en 
gel de poliacrilamida, en presencia de dodecil sulfato sódico  

PAZ Piwi/Argonaute/Zwille 

pb Pares de bases 

PBS Phophate buffered saline, tampón fosfato salino  

PCR Polymerase chain reaction, reacción en cadena de la polimerasa  

PKI Protein kinase inhibitor, proteína inhibidora de kinasa 

PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride, fluoruro de fenilmetilsulfonilo  

PTGS Post-transcriptional gene silencig, silenciamiento génico 
postranscripcional   

Q Glutamine, aminoácido glutamina 

R Arginine, aminoácido arginina 

rasiRNA Repeat-associated small interfering RNAs, pequeños RNAs interferentes 
asociados a repeticiones 

RdDM RNA-directed DNA methylation, metilación de DNA dirigida por RNA  

RDR RNA-dependent RNA polymerases, polimerasa de RNA dependiente de 
RNA 

RdRp Ver RDR 

Rgs-CaM Calmodulin-like protein, proteína calmodulina 

RISC RNA-induced silencing complex, complejo de silenciamiento inducido por 
RNA  

rpm Revoluciones por minuto 

RNA Ribonucleic acid, ácido ribonucleico  

RNP Ribonucleoprotein, ribonucleoproteína 

S Serine, aminoácido serina 

SA Salicilic acid, ácido salicílico 

SDS Sodium dodecyl sulfate, dodecil sulfato sódico  

SGS3 Suppressor of gene silencing 3, supresor de silenciamiento génico 3  



4 
 

siRNA Small interfering RNA, pequeño RNA interferente  

sRNA Small RNA, RNA pequeño 

ss siRNA Single stranded small interference RNA, pequeño RNA interferente de 
hebra sencilla   

T Threonine, aminoácido treonina 

TA Tris acetate, tampón tris-acetato  

TAE Tris acetate-EDTA, tampón tris-acetato EDTA  

T-DNA Transfer DNA, DNA de transferencia  

TGS Transcriptional gene silencing, silenciamiento génico transcripcional 

tRNA Transfer RNA,  RNA de transferencia  

UV Ultravioleta 

V Valine, aminoácido valina 

VIGS Viral-induced gene silencing, silenciamiento génico inducido por virus 

Y Tirosine, aminoácido tirosina 

Y2H Yeast two-hybrid system, sistema doble híbrido de levaduras   

YFP Yellow fluorescent protein, proteína fluorescente amarilla  

sYFPC Split yellow fluorescent protein C-fragment, mitad carboxilo de la 
proteína fluorescente amarilla 

sYFPN Split yellow fluorescent protein N-fragment, mitad amino de la proteína 
fluorescente amarilla 

W Tryptophan, aminoácido triptófano 

  



5 
 

ACRÓNIMOS DE VIRUS 

BCTV Beet curly top virus, Virus del enrollamiento de la punta de la 
remolacha  

BSCTV Beet severe curly top virus, Virus del enrollamiento severo de la 
punta de la remolacha 

BWYV Beet western yellows virus, Virus del amarilleo occidental de la 
remolacha 

BYV Beet yelow virus, Virus del amarilleo de la remolacha 

CaMV Cauliflower mosaic virus, Virus del mosaico de la coliflor  

ClYVV Clover yellow vein virus, Virus del amarilleo del trébol 

CIRV Carnation italian ring-spot virus, Virus de las manchas en anillo del 
clavel italiano 

CMV Cucumber mosaic virus, Virus del mosaico del pepino 

CymRSV Cymbidium ringspot virus, Virus de las manchas en anillo del 
cimbidium 

FHV Flock house virus, Virus del escarabajo neozelandés 

GRV Groundnut rosette virus, Virus de la roseta del cacahuete 

HCV Hepatitis C virus, Virus de la hepatitis C 

HSV-1 Herpes simplex virus type 1, Virus del herpes simple tipo 1 

IBV Infectious bronchitis virus, Virus de la bronquitis infecciosa 

PCV Peanut clump virus, Virus del macizo del cacahuete 

PoLV Pothos latent virus, Virus latente del Pothos 

PRRSV Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Virus del 
síndrome respiratorio y reproductivo porcino 

PSLV Poa semilatent virus, Virus semilatente de la Poa 

PSV Peanut stunt virus, Virus de la atrofia del cacahuete 

PVA Potato virus A, Virus A de la patata 

PVX Potato virus X, Virus X de la patata 

PVY Potato virus Y, Virus Y de la patata 

RHBV Rice hoja blanca virus, Virus de la hoja blanca del arroz 

SCMV Sugarcane mosaic virus, Virus del mosaico de la caña de azúcar 

SPMMV Sweet potato mild mottle virus, Virus del moteado suave de la batata 

SV40 Simian virus 40, Virus simio 40 

TAV Tomato aspermy virus, Virus de la aspermia del tomate 



6 
 

TBSV Tomaco Bushy Stunt Virus, Virus del enanismo arbustivo del tomate 

TCV Turnip crinkle virus, Virus del arrugamiento del nabo 

TEV Tobacco etch virus, Virus del grabado del tabaco 

TGMV Tomato golden mosaic virus, Virus del mosaico dorado del tomate 

TMV Tobacco mosaic virus, Virus del mosaico del tabaco 

TRV Tobacco rattle virus, Virus del cascabeleo del tabaco 

TuMV Turnip mosaic virus, Virus del mosaico del nabo 

TYLCV Tomato yellow leaf curl virus, Virus del rizado amarillo del tomate 

ZYMV Zucchini yellow mosaic virus, Virus del mosaico amarillo del calabacín 

   



7 
 

SUMMARY 

 

Gene silencing is an important resistance of plants against viruses that limits their 

accumulation and dispersión at the celular, local and systemic levels. Plant viruses 

have co-evolved proteins with suppression of RNA silencing functions that can interfer 

this defense at different points; some viral suppressors directly bind and sequester the 

small RNAs (sRNAs) that direct silencing to specific sequence targets, thus preventing 

their incorporation into the RNA-Induced Silencing Complexes (RISCs) and their 

degrading action on viral RNA targets of complementary sequence. Others interact 

with protein components of the silencing machinery inhibiting their functions or 

degrading them. In some other cases, the same suppressor can acts in both manners.   

Cucumber mosaic virus (CMV) is an RNA virus of cosmopolite distribution that causes 

important losses to agricultural and ornamental crops. Different phylogenetic clades 

have been established based on the sequence of the 2b gene that encodes the 2b 

protein: subgroups IA and IB cause severe symptoms in plants while those of subgroup 

II are less severe. The 2b protein has silencing suppressor activity and it is a known 

pathogenicity determinant in this virus. Prior to this work, several research groups had 

postulated that its suppression of silencing activity required nuclear localization (Lucy 

et al. 2000. EMBO 19, 1672), interaction with some argonaute proteins (AGO1: Zhang 

et al. 2006b.  Genes & Dev. 20, 3255) or binding to sRNAs (Goto et al. 2007. Plant Cell 

Physiol. 48, 1050). The work presented in this PhD Thesis was aimed at contributing to 

determine the relative importance that for silencing suppression the nuclear 

subcellular localization and its interaction with host factors from the silencing 

machinery (AGO proteins or small RNAs of viral sequence  RNAs) had in a 2b protein 

from a subgroup IA Fny-CMV strain.  

To pursue this objective we used different experimental approaches. One of them was 

to transiently express the 2b protein, either in its native or in modified forms in 

Nicotiana benthamiana plants through the agroinfiltration technique in order to 

visualize the subcellular localization in epidermal cells of protein fused to fluorescent 

tags in vivo, to perform co-localization studies with other plant proteins also tagged in 



8 
 

order to fluoresce, or to visualize protein-protein interactions using the bimolecular 

fluorescence complementation (BiFC) technique, all in vivo. Crucially, a variant 

application of the agroinfiltration technique allows us also to evaluate the suppressor 

activities of each of our modified 2b protein constructs and thus compare them with 

that of the native protein. This allowed us to determine the effect of the different 

taggings or mutations we used in this work on the suppressor activities of the modified 

proteins, and to correlate our observations in vivo and in vitro with their biological 

activities.  

We started characterizing the effects of fusions to fluorescent markers on the 

suppressor activities of the native 2b protein and of nine mutants affecting regions of 

the protein that previous works by others had described as relevant for diverse 

reasons. We visualized with these tagged constructs their subcellular localizations and 

using BiFC their interactions with proteins. On the other hand, the same nine mutants 

as well as the native protein were expressed in bacteria and purified to determine 

their abilities to bind to RNAs in vitro.     

By performing suppression assays on the silencing of the transient expression of a co-

expressed GFP reporter we characterized the suppressor activities of each of our 

constructs. All mutant constructs that had no suppressor activities accumulated also 

poorly in agroinfiltrated tissue. However, when expressed in the presence of a 

heterologous P19 suppressor from tombusvirus they accumulated to normal levels, 

demonstrating that those mutations did not affect the stability of the protein and that 

their lack of suppressor activities were not caused by their deficient accumulation for 

that latter reason.  

These same silencing suppressor assays showed that native 2b protein fused at either 

termini to fluorescent or to other types of tags retained suppressor activity. This 

allowed us to study the subcellular distribution in vivo of biologically functional native 

protein and of the different mutants by tagging them to fluorescent markers (green 

fluorescent protein, GFP; monomeric red fluorescent protein, mRFP1), or to visualize 

interactions among proteins by BiFC also in vivo.   



9 
 

GFP- and mRFP-tagged 2b protein localized throughout the cytoplasm and nucleus and 

within the latter in the nucleolus and cajal bodies (CBs). This is something that had not 

been described previously. With regard to the mutants, three mutants with deletions 

affecting the nuclear localization signals (NLSs) were found mainly in the cell cytoplasm 

whereas deletion of a putative phosphorylation domain confined the protein to the 

nucleolus. The remaining mutants presented a subcellular distribution similar to that 

of the native 2b protein. Addition of a nuclear export signal (NES) to the protein 

traslocated it to the cell cytoplasm, however, this did not affect its suppressor activity. 

This fact demonstrated that for displaying suppressor activity in the cell the 2b protein 

does not require its accumulation within the nucleus.   

In BiFC assays the 2b proteins fused to the amino- and carboxyl- splits of the yellow 

fluorescent protein interacted forming homodimers in the cytoplasm and the nucleus.  

All the mutants retained this property and also the ability to interact with proteins 

AGO1 in the cytoplasm and also AGO4 in the nucleus, excluding the nucleolus; and 

potentially to interact to the nuclear proteins coilin, fibrillarin and nucleolin in nuclear 

bodies which interaction could explain the nucleolar presence of the protein. 

In in vitro assays the abilities of the native and mutant 2b proteins to bind to synthetic 

sRNAs of 21 nucleotides in length were characterized: to double-stranded siRNAs (ds 

siRNAs), to single-stranded siRNAs (ss siRNAs), or to a micro RNA (miRNA).  The native 

protein was able to bind to the three RNAs at protein:RNA molar ratios of 2:1 with 

different affinities. The nine mutations analyzed affected these bindings differently, 

but overall it was found that those mutants without suppressor activities had their 

ability to bind those sRNAs altered, in most cases very reduced or altogether 

abolished.  In particular no mutant without suppressor activity could bind to ds siRNAs 

at molar ratios that approached 2:1. Proteins with suppressor activities also binded to 

a long RNA (6,4 kb) but the molar ratios had no biological significance. 

Therefore, although the 2b protein of Fny CMV accumulates in the nucleus and within 

it in the nucleolus and CBs, its suppressor of RNA silencing activity does not require 

this nuclear accumulation, and appears to be done by cytoplasmic protein. From the 

study of the interactions of a battery of nine mutants with themselves and with AGO 



10 
 

proteins in vivo or with sRNAs in vitro a correlation between suppressor activity and 

the abiility to bind to sRNAs at suppressor:RNA molar ratios of 2:1 appears, in 

particular with regard to the binding of ds siRNAs. This suggests that homodimers of 

the 2b protein interfere with antiviral silencing through the sequestering of ds siRNAs 

of viral sequence in the cytoplasm, without excluding other possible means of action. 

  



11 
 

RESUMEN 

 

El silenciamiento génico es una importante resistencia de las plantas frente a los virus 

que limita su acumulación y su dispersión a nivel celular, local y sistémico. Los virus 

vegetales han desarrollado proteínas con actividad supresora del silenciamiento de 

RNA que pueden interferir con esta defensa en diferentes puntos; algunos supresores 

virales unen y secuestran directamente los RNAs pequeños (small RNAS, sRNAs) que 

dirigen el silenciamiento hacia dianas específicas previniendo su incorporación a los 

complejos de silenciamiento inducido por RNA (RNA-induced silencing complex, RISCs) 

y su acción degradadora de RNAs virales de secuencia complementaria, mientras que 

otros interaccionan con componentes proteicos de la maquinaria de silenciamiento 

inhibiendo su función o degradándolos. En algunos casos un mismo supresor puede 

actuar de ambas maneras. 

El Virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV) es un virus de RNA 

ampliamente distribuido que causa importantes pérdidas en especies agrícolas y 

ornamentales. Se han diferenciado diferentes clados filogenéticos según la secuencia 

del gen 2b que codifica la proteína 2b: los subgrupos IA y IB causan síntomas severos 

en plantas mientras que en el subgrupo II son más leves. La proteína 2b tiene función 

supresora de silenciamiento y es un conocido determinante de patogenicidad de este 

virus. Con anterioridad a este trabajo varios grupos de investigación habían postulado 

que la actividad supresora de silenciamiento de esta proteína requería de su 

localización nuclear (Lucy et al. 2000. EMBO 19, 1672), de su interacción con 

determinadas proteínas argonauta (AGO1: Zhang et al. 2006b.  Genes & Dev. 20, 3255) 

o de su unión a sRNAs (Goto et al. 2007. Plant Cell Physiol. 48, 1050). 

El trabajo que se presenta en esta tesis doctoral ha pretendido contribuir a determinar 

la importancia relativa que tienen en la supresión del silenciamiento antiviral la 

localización subcelular nuclear, y sus interacciones con factores de la maquinaria del 

silenciamiento antiviral (proteínas AGO o RNAs pequeños de secuencia viral) de la 

proteína 2b de la cepa Fny del subgrupo IA de CMV.  



12 
 

Para perseguir los objetivos de esta tesis utilizamos diversas aproximaciones 

experimentales. Una de ellas fue expresar transitoriamente en plantas de Nicotiana 

benthamiana la proteína 2b, nativa o modificada, mediante la técnica de 

agroinfiltración para visualizar in vivo la localización subcelular en células epidérmicas 

de construcciones de proteína 2b fusionadas a marcadores fluorescentes, realizar 

estudios de colocalización con otras proteínas de la planta también marcadas para 

fluorescer, o visualizar in vivo interacciones proteína-proteína mediante la técnica de 

complementación bimolecular fluorescente (bimolecular fluorescence 

complementation, BiFC). Crucialmente, una variante de la técnica de agroinfiltración 

permite también evaluar la actividad supresora de cada una de nuestras 

construcciones modificadas y comparar así su actividad frente a la de la proteína 

nativa. Esto nos permitió determinar el efecto de los diferentes marcajes o mutaciones 

en la actividad supresora de las proteínas modificadas, y correlacionar nuestras 

observaciones in vivo e in vitro con sus actividades biológicas.   

Caracterizamos primero el efecto de la fusión de marcadores fluorescentes en la 

actividad supresora de la proteína 2b nativa y en nueve mutantes afectando a regiones 

de la proteína que trabajos anteriores de otros grupos habían descrito como 

relevantes por diversas razones. Con estas construcciones visualizamos sus 

localizaciones subcelulares, y mediante BiFC interacciones con proteínas.  Por otro lado 

los nueve mutantes y la proteína nativa se expresaron y purificaron en bacteria para 

determinar sus capacidades de unión in vitro a siRNAs.   

Mediante ensayos de supresión local del silenciamiento de un gen indicador GFP, por 

proteína 2b nativa o por varios mutantes, caracterizamos las actividades supresoras de 

cada uno ellos. Todos los mutantes sin actividad supresora se acumularon pobremente 

en el tejido infiltrado. Sin embargo, cuando se expresaron en presencia de un supresor 

heterólogo, P19 de tombusvirus, se acumularon a niveles normales, lo que demuestra 

que dichas mutaciones no afectaban a la estabilidad de la proteína y que su falta de 

actividad supresora no era debida a su deficiente acumulación por esa razón.   

Mediante los mismos ensayos de supresión de silenciamiento se observó que la 

proteína 2b nativa fusionada a diferentes marcadores fluorescentes y de otros tipos en 



13 
 

cualquiera de sus extremos amino o carboxilo retenía su actividad supresora de 

silenciamiento. Esto nos permitió estudiar la distribución subcelular in vivo de la 

proteína nativa y la de los diversos mutantes mediante su fusión a marcadores 

fluorescentes (proteína verde fluorescente, green fluorescent protein, GFP; o proteína 

monomérica roja fluorescente, monomeric red fluorescent protein, mRFP1), o visualizar 

interacciones entre proteínas mediante BiFC, también  in vivo.  

La proteína 2b marcada con GFP se localizó en el citoplasma y núcleo, y dentro de éste 

en el nucléolo y cuerpos de cajal (cajal bodies, CBs), que hasta este trabajo no se había 

descrito. Los mutantes con delecciones en las señales de localización nuclear (nuclear 

localization signals, NLSs) sólo se encontraron en el citoplasma, mientras que la 

delección de un supuesto motivo de fosforilación confinó la proteína en el nucléolo. El 

resto de mutantes no presentaron alteración de la localización celular respecto a la de 

la proteína 2b. La adición de una señal de exportación nuclear (nuclear export signal, 

NES) a la proteína 2b la traslocó al citoplasma celular aunque esto no afectó a su 

actividad supresora, lo que demostró que para la actividad supresora la proteína 2b no 

necesita acumularse en el núcleo.  

En ensayos de BiFC, las proteínas 2b fusionadas a las mitades amino y carboxilo de la 

proteína fluorescente amarilla interaccionaron formando homodímeros en citoplasma 

y nucléolo. Todos los mutantes retuvieron esta propiedad así como la de interaccionar 

con las proteínas AGO1 en el citoplasma y AGO4 en el núcleo, excluyendo el nucléolo, 

y potencialmente con las proteínas nucleares coilina, fibrilarina y nucleolina en 

cuerpos nucleares, cuyas interacciones tal vez podrían explicar su presencia en el 

núcleo. 

En ensayos in vitro se caracterizaron las propiedades de unión de la proteína 2b a RNAs 

pequeños sintéticos de 21 nucleótidos: de doble hebra (double stranded siRNA, ds 

siRNA), de hebra sencilla (single stranded siRNA, ss siRNA), o un micro RNA (miRNA).  

La proteína 2b nativa unió los tres RNAs a ratios molares de proteína:RNA de 2:1 con 

diferentes afinidades. Las nueve mutaciones analizadas afectaron a estas uniones de 

manera diversa, pero se observó que aquellos mutantes sin actividad supresora tenían 

su capacidad de unión a estos RNAs pequeños alterada, en la mayor parte de los casos 



14 
 

muy reducida o nula. En particular, ningún mutante sin actividad supresora unió ds 

siRNAs a ratios molares cercanos a 2:1. Las proteínas con actividad supresora unieron 

también un RNA largo (6,4 kb) aunque con una relación proteína:RNA sin significación 

biológica. 

Por lo tanto, aunque la proteína 2b de Fny CMV se acumula en el núcleo, y dentro de 

éste en el nucléolo y los CBs, su actividad supresora de silenciamiento de RNA no 

requiere de dicha acumulación nuclear, y parece realizarse por proteína citoplásmica.  

Del estudio de las interacciones de una batería de mutantes consigo mismas y con 

proteínas AGO in vivo o con RNAs pequeños in vitro se observa una correlación entre la 

actividad supresora y la capacidad de unir estos últimos ratios molares supresor:RNA 

de 2:1, en particular ds siRNAs. Esto sugiere que homodímeros de la proteína 2b 

interfieren con el silenciamiento antiviral mediante el secuestro de ds siRNAs de 

secuencia viral en el citoplasma, sin excluir otras posibles formas de actuación. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



15 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. INTRODUCCIÓN  



16 
 

  



17 
 

1.1. CMV  

El virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV) está ampliamente 

distribuido en todo el mundo, especialmente en regiones templadas. Infecta un amplio 

rango de huéspedes, tanto de especies hortícolas (pepino, melón, espinaca, apio, 

tomate, patata, zanahoria, etc.) en las que produce grandes pérdidas económicas, 

como ornamentales (crisantemo, salvia, geranio, gladiolo, margarita, tulipán, petunia, 

etc.) (Ferreira y Boley 1992; Palukaitis y García-Arenal 2003). Este virus se encontró por 

primera vez en pepinos (Cucumis sativus), causando síntomas de mosaico en las hojas, 

de ahí su nombre (Price 1934). Es transmitido por áfidos mediante transmisión no 

persistente (Palukaitis et al. 1992), y las plantas infectadas presentan síntomas de 

mosaico o moteado en las hojas, amarilleo, atrofia del crecimiento y deformación en 

hojas, flores y frutos (Fig. 1). En condiciones de laboratorio, la infección de CMV se 

establece fácilmente por inoculación mecánica de virus o ácido ribonucleico 

(ribonucleic acid, RNA) viral (Mochizuki y Ohki 2012). 

 

 

Fig. 1: Síntomas de CMV en planta. A, síntomas desarrollados por plantas de pepino infectadas con CMV 
(izda., Junta de Andalucía. Consejería de Agricultura 2014) y frutos (dcha., www.fitodiagnostico.com). B, 
planta sana de Nicotiana benthamiana y planta infectada con CMV. Los síntomas manifestados por las 
plantas infectadas pueden ser mosaico o moteado en las hojas, amarilleo, atrofia del crecimiento y 
deformación en hojas, flores y frutos. 

 

CMV pertenece al género Cucumovirus de la familia Bromoviridae (Van Regenmortel et 

al. 2000) junto con el virus de la aspermia del tomate (Tomato aspermy virus, TAV) y el 

virus de la atrofia del cacahuete (Peanut stunt virus, PSV) entre otros. Los Cucumovirus 



18 
 

presentan una cápsida icosahédrica de 29 nanómetros (nm) de diámetro formada por 

180 subunidades proteicas, con un contenido de RNA del 18%, y tienen un genoma de 

RNA tripartito de hebra sencilla y sentido positivo (Palukaitis et al. 1992; Palukaitis y 

García-Arenal 2003). El RNA1 tiene un solo marco de lectura abierto (open reading 

frame, ORF) cuyos nucleótidos (nts) codifican la proteína 1a, relacionada con la 

replicación viral (Nitta et al. 1988; Hayes y Buck 1990) que tiene lugar en la membrana 

vacuolar o tonoplasto (Cillo et al. 2002). Esta proteína consta de un dominio metil-

transferasa, relacionado con el capping de RNAs genómicos y subgenómicos y con la 

inducción de la respuesta hipersensible en tabaco (Lakshman y Gonsalves 1985), y un 

dominio con función helicasa (Gorbalenya et al. 1988; Hodgman 1988; Habili y Symons 

1989; Rozanov et al. 1992), con actividad ATPasa y probablemente con actividad de 

unión a RNAs (Kadaré y Haenni 1997). El RNA2 tiene dos ORFs que solapan 

parcialmente y codifican las proteínas 2a, relacionada con la replicación viral (Nitta et 

al. 1988; Hayes y Buck 1990); y 2b, relacionada con el movimiento viral y la supresión 

del silenciamiento viral (Ding et al. 1994; Ding et al. 1995a; Jones et al. 1999; Li et al. 

1999; Shi et al. 2003). La proteína 2a es una polimerasa de RNA dependiente de RNA 

(RNA-dependent RNA polymerase, RDR) (Habili y Symons 1989; Poch et al. 1989; 

Bruenn 1991) que se expresa a partir del RNA2, mientras que la proteína 2b se expresa 

a partir del RNA subgenómico 4A (Fig. 2) (Ding et al. 1994; Shi et al. 1997) y se localiza 

en el núcleo y citoplasma (Lucy et al. 2000; Mayers et al. 2000). La proteína 2b 

presenta función supresora de silenciamiento génico postranscripcional (Li et al. 1999), 

actúa como determinante de patogenicidad, y aunque no es necesaria en la replicación 

de CMV o de su RNA satélite (Ding et al. 1995b), participa en la promoción del 

movimiento del virus célula-célula (Shi et al. 2003) y a larga distancia (Ding et al. 

1995a; Ji y Ding 2001; Soards et al. 2002). Además, la proteína 2b inhibe la dispersión 

de la señal de silenciamiento génico e interfiere con la metilación de ácido 

desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid, DNA) en tejidos infectados (Guo y Ding 

2002). Por lo tanto es una proteína funcionalmente diversa, que influye en el 

movimiento viral, en la supresión del silenciamiento de RNA y en la patogenicidad. Esta 

supresión de silenciamiento parece darse de forma dual, secuestrando pequeños RNAs 

interferentes (small interfering RNAs, siRNAs) (Goto et al. 2007) e interaccionando con 

proteínas argonauta (Argonaute, AGO) de las rutas de silenciamiento (Zhang et al. 



19 
 

2006b). El RNA3 de CMV también tiene dos ORFs separados por una pequeña región 

no codificante, que codifican las proteínas 3a de movimiento (movement protein, MP) 

y de la cápsida (coat protein, CP), ambas requeridas para el movimiento viral (Suzuki et 

al. 1991; Boccard y Baulcombe 1993; Kaplan et al. 1995). La proteína 3a es esencial 

para el movimiento del virus a larga distancia en la planta y entre células (Mossop y 

Francki 1977; Suzuki et al. 1991; Boccard y Baulcombe 1993; Canto et al. 1997) que se 

ha encontrado tanto en plasmodesmos (Vaquero et al. 1996; Blackman et al. 1998) 

como en tejidos conductores de plantas infectadas (Blackman et al. 1998), y en ella se 

ha identificado un dominio de unión a RNAs (Vaquero et al. 1996; You et al. 1999).  

 

 

Fig. 2: Organización genómica de CMV. CMV está formado por los RNAs genómicos 1, 2 y 3; y por los 
subgenómicos 4A y 4 procedentes del RNA 2 y 3, respectivamente. Todos los RNAs constan de una 
estructura cap en el extremo 5’ y una estructura de pseudolazo en el 3’. El RNA 1 tiene un ORF y codifica 
la proteína 1a, una subunidad de la enzima replicasa viral. Los RNAs 2 y 3 tienen dos ORFs cada uno, y 
codifican las proteínas 2a, y 2b, y 3a y 3b, respectivamente. La proteína 2a es la segunda subunidad de la 
replicasa viral y es la polimerasa de RNA viral. La proteína 2b tiene principalmente función supresora de 
silenciamiento de RNA. La proteína 3a es la proteína de movimiento viral (MP) y la proteína 3b es la 
proteína de cubierta o de la cápside (CP). Las proteínas 2b y 3b se expresan a  partir de los RNAs 
subgenómicos 4A y 4. Figura modificada a partir de Palukaitis y García-Arenal 2003. 

 

Los RNAs de CMV actúan como RNAs mensajeros y son traducidos directamente por la 

maquinaria celular a las proteínas que codifican, cada uno tiene una estructura de 

caperuza (cap) en el extremo 5’ (Symons 1975) y una estructura en pseudolazo en el 



20 
 

extremo 3’, similar a un RNA de transferencia (transfer RNA, tRNA; Rietveld et al. 

1983). Las proteínas 1a, 2a y 3a se expresan a partir de los RNAs 1, 2 y 3; y las 

proteínas 2b y CP se expresan a partir de los RNAs subgenómicos 4a y 4 (Ding et al. 

1994; Schwinghamer y Symons 1975, respectivamente), que se corresponden con la 

zona 3’ de los RNAs 2 y 3 respectivamente (Palukaitis et al. 1992; Ding et al. 1994). Los 

RNAs 1, 2 y 3 del virus son encapsidados por separado (Finch et al. 1967; Habili y 

Francki 1974; Kaper y Re 1974; Francki y Hatta 1980) en cápsidas indistinguibles entre 

sí (Fig. 3), mientras que el RNA 4 subgenómico se encapsida con el RNA 3 (Habili y 

Francki 1974; Lot y Kaper 1976).  

 

 

Fig. 3: Partículas de CMV. Micrografía electrónica de CMV preparada por el Dr. R.G. Milne, Consiglio 
Nazionale delle Ricerche. Istituto di Fitovirologia Applicata. Italia. http://ictvdb.bio-
mirror.cn/Images/Milne/cucumsv.htm 

 

Se han caracterizado numerosas cepas de CMV, que varían en características 

serológicas, rango de huésped, virulencia, inducción de resistencia y transmisibilidad 

por áfidos (Mochizuki y Ohki 2012). En función de las secuencias de RNA, las cepas se 

han dividido en tres subgrupos: IA, IB y II (Roossinck et al. 1999; Roossinck 2002). La 

similitud de secuencias nucleotídicas entre los subgrupos IA y IB es del 92-94%, entre 

los subgrupos IA y II del 74%–78%, y entre los subgrupos IB y II del 73-78% (Roossinck 

2001). En general, las cepas de los subgrupos IA y IB son más virulentas que las cepas 

del subgrupo II (Wahyuni et al. 1992; Zhang et al. 1994; Cillo et al. 2009) y la 

clasificación se ha correlacionado con la actividad de la proteína 2b en las rutas de 

silenciamiento de RNA (Shi et al. 2002; Lewsey et al. 2007). Los subgrupos IA y II tienen 

http://ictvdb.bio-mirror.cn/Images/Milne/cucumsv.htm
http://ictvdb.bio-mirror.cn/Images/Milne/cucumsv.htm


21 
 

una distribución mundial mientras que el subgrupo IB está restringido a Asia 

(Roossinck 2001). Nuestro trabajo se ha llevado a cabo con la proteína 2b de la cepa 

Fny, perteneciente al subgrupo IA de CMV. Es una cepa de alta patogenicidad que 

desarrolla síntomas severos en los huéspedes infectados y cuya proteína 2b está 

compuesta por 110 aminoácidos (aas) (Fig. 4). El subgrupo IB presenta síntomas un 

poco menos severos, y la proteína 2b consta de 111 aas, mientras que el subgrupo II lo 

forman cepas de CMV cuyas proteínas 2b constan de 100 aas, careciendo de la tercera 

α-hélice o dominio 3 definido por Ye y colaboradores (2009). En el Anexo I se puede 

consultar la alineación de secuencias peptídicas de proteínas 2b de diversas cepas de 

CMV. Entre las proteínas 2b de cucumovirus es habitual encontrar una discordancia 

entre el peso molecular calculado y el detectado en SDS-PAGE, siendo mayor este 

último en las cepas del subgrupo II, en las cepas Fny y Q de CMV (Ding et al. 1994; 

Mayers et al. 2000) y en TAV (Shi et al. 1997), y Ding y colaboradores (1994) sugirieron 

que esta discordancia se debe a modificaciones postranslacionales. Mayers y 

colaboradores (2000) mostraron que aunque las proteínas 2b de las cepas de TAV y de 

los subgrupo IA y II de CMV tienen diferentes propiedades antigénicas, sus 

características bioquímicas y funciones son semejantes. 

 

Fig. 4: Grupos formados por las cepas de CMV. Análisis filogenético basado en el ORF de la proteína 2b 
de CMV, modificado de Roossinck (2002). En rojo, cepas del subgrupo IA; en azul, cepas del subgrupo IB; 
en verde, cepas del subgrupo II. Se muestran los valores bootstrap bajo cada rama y las distancias, 
medidas en cambios en nts sobre cada rama. En el Anexo I se puede consultar la alineación peptídica de 
proteínas 2b de diferentes cepas de CMV.  



22 
 

1.2. Silenciamiento y defensa antiviral en plantas  

Los virus de plantas son patógenos o simbiontes biótrofos que necesitan tejido vivo 

para multiplicarse, y normalmente alcanzan un equilibrio infección/defensa sin causar 

la muerte de la planta. En algunos casos la infección viral cursa sin síntomas aparentes, 

mientras que en otros causa fenotipos patológicos resultado de la interferencia y/o 

competición por los recursos del huésped, afectando a su fisiología (Pallás y García, 

2011). El efecto de la infección viral en la expresión génica es generalmente inhibitorio 

(Carthew y Sontheimer 2009), y la alteración de la expresión génica afecta a 

numerosos genes, tendiendo a ser mayor cuanto más severos son los síntomas que 

presenta la planta, ya que los genes inducidos o reprimidos participan en diferentes 

procesos celulares como la regulación hormonal, el ciclo celular y el transporte de 

macromoléculas entre otros (Pallás y García, 2011).  

Uno de los mecanismos de defensa ante una infección de la planta se basa en el 

silenciamiento génico, que es un mecanismo de regulación de la expresión génica 

específico de secuencia que se observó por primera vez en plantas de petunia (van der 

Krol et al. 1990), y que posteriormente se ha descrito en protozoos, plantas, hongos y 

animales, con RNAs intermediarios comunes y maquinaria molecular semejante, 

conservada filogenéticamente (Mlotshwa et al. 2002; Tijsterman et al. 2002). En 

plantas el silenciamiento génico de transcritos o de RNAs virales se llamó 

silenciamiento génico postranscripcional, y como resultado de su acción se degrada 

específicamente RNAs que tienen secuencias complementarias a las de un RNA 

inductor (Angell y Baulcombe, 1997).  

Inicialmente se creyó que el silenciamiento inducido por RNA era un mecanismo 

exclusivamente de defensa frente a virus y trasposones (Waterhouse et al. 2001), ya 

que se activa en la defensa frente a ácidos nucleicos extraños y funciona como 

mecanismo antiviral en plantas superiores (Matzke y Matzke 2004; Mello y Conte 

2004; Ding y Voinnet 2007). Sin embargo, se ha visto que también participa en la 

regulación génica a nivel transcripcional y a nivel traduccional (Brodersen y Voinnet 

2006), y forma una serie de rutas interrelacionadas que suprimen la acumulación viral 

y de otros patógenos, y regulan la expresión génica en el desarrollo y en respuestas a 



23 
 

condiciones ambientales tanto a nivel de RNA como modificando el DNA y la cromatina 

(Baulcombe 2004; Jones et al. 2006).  

Las rutas de silenciamiento y regulación mediadas por RNAs pequeños interferentes 

(small interfering RNAs, siRNAs) dependen de una serie de procesos comunes iniciados 

por un RNA de doble hebra (double-stranded RNA, dsRNA) inductor o precursor, que es 

procesado a siRNAs de doble hebra de complementariedad total (double-stranded 

small interfering RNAs, ds siRNAs) de 21 a 24 pares de bases (pbs) o parcial [micro 

RNAs (miRNAs)] por enzimas RNasas III semejantes a Dicer (Dicer-like, DCLs) (Voinnet 

2001). Estas rutas no son completamente independientes unas de otras y en ellas 

intervienen diferentes siRNAs y miRNAs productos del procesamiento por diferentes 

DCLs (Fig. 5) (Baulcombe 2004). El silenciamiento es un mecanismo muy eficiente en 

defensa, y una vez activado por RNAs bicatenarios que la célula reconoce como 

aberrantes o extraños actúa contra cualquier RNA citoplásmico que presente 

complementariedad de secuencia con la del RNA inductor, como un sistema inmune 

que opera a nivel de ácido nucleico (Voinnet 2001).  

En silenciamiento podemos encontrar dos procesos diferenciados: silenciamiento 

génico transcripcional (transcriptional gene silencing, TGS) y silenciamiento génico 

postranscripcional (post-transcriptional gene silencig, PTGS). En términos generales, el 

TGS inhibe o silencia la expresión del DNA, mientras que el PTGS degrada el RNA 

citosólico inhibiendo la traducción a proteínas. Ambos procesos median la regulación 

de genes endógenos en el desarrollo de la planta (Moussian et al. 1998). En TGS se 

metilan las histonas formando heterocromatina alrededor de un gen, resultando 

inaccesible a la maquinaria transcripcional. Es una metilación de DNA dependiente de 

RNAs (RNA-directed DNA methilation, RdDM) que permite a la célula silenciar 

trasposones y otros elementos repetitivos a nivel transcripcional, y regular genes 

importantes para el desarrollo de la planta en la respuesta a infecciones, crecimiento y 

desarrollo, o estrés (Mahfouz 2010). Esta RdDM tiene lugar en el núcleo (Chinnusamy y 

Zhu 2009; Zhang y Zhu 2011) y se descubrió inicialmente en plantas infectadas con 

viroides (Wassenegger et al. 1994). Jones y colaboradores (1998) observaron que la 

RdDM puede ser inducida por un virus de RNA aunque éste se replique exclusivamente 

en el citoplasma, y Mlotshwa y colaboradores (2002) sugirieron que citoplasma y 



24 
 

núcleo se comunican para ello de alguna forma. Por otro lado, PTGS se refiere al 

silenciamiento de RNAs mensajeros (messenger RNAs, mRNAs) o de otros tipos, que 

son destruidos o cuya traducción es bloqueada, previniendo así la expresión de las 

proteínas que codifican. Este proceso media la protección frente a ácidos nucleicos 

exógenos. 

 



25 
 

Fig. 5: Diagrama esquemático de las rutas de silenciamiento en plantas. A, Rutas de silenciamiento. El 
silenciamiento se puede dividir en cuatro fases. I, detección y procesamiento por DCLs de RNAs virales a 
siRNAs. II, Amplificación de siRNAs virales primarios y secundarios por RDRs (RdRps en la figura) de la 
planta. III, Ensamblaje de siRNAs y RISC, y actuación de RISC activado. IV, silenciamiento sistémico y 
defensa sistémica antiviral. El silenciamiento se inicia con un dsRNA exógeno, como un RNA viral, un 
intermediario de replicación viral o un trasposón; o endógeno, como un mRNA defectuoso al que le falta 
cap o la cola poli-A; o pequeños RNAs propios en el funcionamiento celular. Diferentes DCLs procesan 
los dsRNAs en siRNAs de 20-24 nts. Estos siRNAs nuclean el ensamblaje de RISC, cuyo efector es AGO. 
DCL1 participa en la biogénesis de miRNAs. DCL3 participa en la formación de siRNAs endógenos de 24 
nts que inducen metilación de DNA e histonas. DCL2 y DCL4 generan siRNAs de 22 y 21 nts relacionados 
con la defensa frente a ácidos nucleicos extraños, como los virales. Los siRNAs sirven como molde de 
secuencia específico para silenciar o regular genes, trasposones y virus, y para modificar la estructura de 
la cromatina. AGO utiliza una sola hebra del siRNA como molde para el silenciamiento específico de 
secuencia. Una vez RISC encuentra la diana complementaria a este siRNA, y en función del siRNA y la 
proteína AGO efectora, se inhibe la transcripción, se degrada el RNA o mRNA complementario, o se 
metila el DNA. Figura creada a partir de Baulcombe (2004); Hutvagner y Simard (2008); Meister y Tuschl 
(2004); Brodersen y Voinnet (2006); Carthew y Somtheimer (2009); Zhang y Zhu (2011). B, DCLs. Las 
proteínas DCLs compiten por la unión a dsRNAs generando siRNAs de diversa longitud que se unirán a 
distintas proteínas AGO. Reproducido de (Bologna y Voinnet 2014). C, Actuación de los siRNAs. Las 
hebras de siRNA unidas a AGO guían el RISC en: 1, la degradación endolítica de RNA; 2, la represión de la 
translación; y 3, marcar la cromatina para la metilación. Reproducido de Ruiz-Ferrer y Voinnet (2009). 
RdDM: RNA-directed DNA methylation, metilación de DNA dependiente de RNA. Met: grupo Metilo en la 
metilación de DNA. dsRNA: double-stranded RNA, RNA de doble hebra. RdRp: RNA-dependent RNA 
polymerase, polimerasa de RNA dependiente de RNA. siRNA: small-interference RNA, pequeño RNA de 
interferencia. RISC: RNA-induced silencing complex, complejo de silenciamiento de RNA. AGO: 
Argonaute, argonauta. DCL: dicer-like, RNAsa III semejante a dicer. 

 

Brodersen y Voinnet (2006) diferenciaron tres etapas en el silenciamiento: formación 

de dsRNAs, procesamiento de éstos en siRNAs de 20-24 nts, e inhibición de RNAs o 

DNAs de secuencia complementaria o parcialmente complementaria. Cerutti y Casas-

Mollano (2006) identificaron en estudios bioquímicos y genéticos tres componentes 

proteicos principales en el silenciamiento de RNA en plantas: enzimas DCLs, proteínas 

AGO y RDRs. Y Baulcombe (2004) indicó que hay al menos tres rutas de silenciamiento 

de RNA en plantas, que no son completamente independientes unas de otras. Estas 

rutas se relacionan con las diferentes DCLs, siRNAs y AGOs que intervienen en el 

ensamblaje del complejo de silenciamiento inducido por RNA (RNA-induced silencing 

complex, RISC). La primera ruta es citoplásmica, y el dsRNA inductor puede ser un 

intermediario de replicación de un RNA viral; la segunda es el silenciamiento de 

mRNAs mediado por miRNAs, y destruye del mRNA diana o inhibe su traducción a 

proteínas; y la tercera está asociada a la RdDM y la supresión de la transcripción 

(Baulcombe 2004).  



26 
 

Por lo tanto, una vez que un virus invade una célula, el silenciamiento antiviral se 

puede dividir en cuatro pasos principales (Fig. 5). En primer lugar se detectan los 

dsRNAs virales, generados como intermediarios durante la replicación viral, o de la 

conformación secundaria de los RNAs virales, y las DCLs los procesan en siRNAs 

primarios. En segundo lugar, las RDRs, junto con otras proteínas, amplifican los RNAs 

virales generando nuevos dsRNAs virales que son procesados por DCLs en siRNAs 

secundarios. En tercer lugar, los siRNAs primarios y secundarios se unen a AGO, donde 

permanece una sola hebra monocatenaria, y se ensambla RISC que dirige la 

degradación de los RNAs virales con secuencias complementarias a las de estos siRNAs 

guía o media la metilación de ácidos nucleicos en RdDM, en función del RISC que se 

ensamble. Por último, la señal o señales de silenciamiento sistémico se transportan 

célula-célula por los plasmodesmos (Mlotshwa et al. 2002) y por el floema hacia el 

resto de la planta (Yoo et al. 2004), estableciendo el silenciamiento y defensa sistémica 

antiviral (Dunoyer et al. 2005; Molnar et al. 2010, 2011).  

1.2.1. Detección y procesamiento de RNAs virales 

El silenciamiento se inicia a partir de precursores de dsRNA (Fig. 5), que varían en 

función de su longitud y origen, y que son procesados por las DCLs a siRNAs (Meister y 

Tuschl 2004). Estas DCLs de plantas son enzimas semejantes a las enzimas Dicer de 

vertebrados y levaduras. Las DCLs contienen un dominio Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ), 

que une un extremo del dsRNA precursor de siRNAs, con dos nts desapareados en el 

extremo 3’. La hebra de RNA se extiende hasta el centro procesador en que el dominio 

RNAsa III corta el RNA, dejando dos nts desapareados en el extremo 3’.  

En A. thaliana hay 4 DCLs que generan siRNAs de diferente tamaño (Blevins et al. 2006; 

Bouché et al. 2006; Deleris et al. 2006; Fusaro et al. 2006; Diaz-Pendon et al. 2007) en 

función de la distancia entre los dominios PAZ y RNAsa (MacRae et al. 2006). Aunque 

el dsRNA viral es accesible a todas las DCLs, DCL2 y DCL4 son las que presentan más 

afinidad por los RNAs virales. DCL1 participa en la biogénesis de miRNAs de 21 nts 

(Finnegan et al. 2003; Papp et al. 2003; Xie et al. 2004) que se incorporan a AGO1 y su 

diana son mRNAs (Xie et al. 2004; Baumberger y Baulcombe 2005), aunque también 

puede actuar sobre dsRNAs (Blevins et al. 2006; Bouché et al. 2006). DCL3 genera 



27 
 

siRNAs de 24 nts a partir de siRNAs asociados a repeticiones (repeat-associated small 

interfering RNAs, rasiRNAs), que se incorporan a AGO4 y guían la metilación de DNA y 

modificación de histonas en TGS (Xie et al. 2004; Matzke y Birchler 2005). Esta DCL3 

puede producir siRNAs virales primarios en ciertas condiciones (Wang et al. 2011b) y 

tiene un papel antiviral contra CMV (Bouché et al. 2006; Fusaro et al. 2006; Diaz-

Pendon et al. 2007), y puede amplificar la producción de siRNAs de 21 nts de DCL4 

(Diaz-Pendon et al. 2007). En A. thaliana, DCL2 y DCL4 producen siRNAs virales contra 

distintos virus de RNA de polaridad positiva como CMV, de forma jerárquica o 

redundante (Bouché et al. 2006; Deleris et al. 2006; Fusaro et al. 2006; Diaz-Pendon et 

al. 2007) y en función del virus inductor (Blevins et al. 2006). Bouché y colaboradores 

(2006) mostraron que en infecciones con CMV, la mayoría de siRNAs virales eran 

producidos por DCL4, y Deleris y colaboradores (2006) constataron que DCL2 podía 

suplir su actividad. Diversos autores han informado de que en plantas infectadas se 

encuentran principalmente siRNAs virales de 21 nts, producto de DCL4, seguidos por 

siRNAs de 22 nts (por debajo del 20% de siRNAs virales), producto de DCL2 (Ding 2010; 

Llave 2010), por lo que DCL4 actúa como sensor primario en la producción de siRNAs 

primarios de actividad antiviral (Xie et al. 2004; Bouché et al. 2006; Deleris et al. 2006; 

Fusaro et al. 2006; Bologna y Voinnet 2014). La enzima DCL4 también está implicada 

en la propagación del silenciamiento célula-célula (Dunoyer et al. 2005; Blevins et al. 

2006)  que aísla al virus en las hojas inoculadas (Deleris et al. 2006).  

1.2.2. Ensamblaje de RISC 

Las moléculas de dsRNAs procesadas por las DCLs generan siRNAs que se adhieren a 

las proteínas AGO. Estas proteínas también tienen un dominio PAZ que une RNAs de 

hebra sencilla, siRNAs o miRNAs (Lingel et al. 2003; Song et al. 2003; Yan et al. 2003), 

un dominio Mid, y un dominio PIWI con acción RNAsa que cataliza el corte de la hebra 

complementaria al siRNA, degradándola (Song et al. 2004; Parker et al. 2005). Son las 

efectoras del complejo RISC y por tanto un componente clave en las rutas de 

regulación génica en que participan los siRNAs.   

En A. thaliana hay 10 AGOs que actúan junto con las DCLs en el procesamiento de 

diferentes especies de siRNAs (Dunoyer et al. 2007), participan en la maduración del 



28 
 

siRNAs eliminando su hebra no activa (Matranga et al. 2005; Miyoshi et al. 2005; 

Leuschner et al. 2006) por la norma de la asimetría (Khvorova et al. 2003; Schwarz et 

al. 2003), e inician la adhesión al RNA específico complementario a la hebra de siRNA 

que portan (Hutvágner y Zamore 2002). La proteína AGO activada con el siRNA dirige el 

ensamblaje de RISC y este complejo funciona como una multiproteína que reconoce y 

se adhiere a RNAs complementarios al siRNA que porta, catalizando su degradación o 

represión (Hammond et al. 2000; Zamore et al. 2000; Meister y Tuschl 2004). Meister y 

Tuschl (2004) comprobaron que las proteínas AGO usan unas proteínas adaptadoras 

que seleccionan los siRNAs y miRNAs procedentes de diferentes dsRNAs, que se 

ensamblan en diferentes RISCs en función de los cofactores que participan, por lo que 

algunos autores han diferenciado entre RISC o siRISC, que contienen siRNA, y miRISC, 

que contienen miRNA (Mourelatos et al. 2002; Carthew y Sontheimer 2009). De este 

modo, la diana de RISC puede ser un mRNA, un RNA viral o DNA en el caso de RdDM 

(Wassenegger 2000; Bender 2001; Lippman y Martienssen 2004) y el corte 

endonucleotídico se da en la región complementaria, unos 10 nts por delante del nt 

emparejado con el extremo 5’ del siRNA acoplado a AGO (Elbashir et al. 2001).  

Bologna y Voinnet (2014) definieron tres clados que contienen las diez proteínas AGO 

identificadas en Arabidopsis: AGO1, 5 y 10; AGO2, 3 y 7; y AGO4, 6, 8 y 9. La mayor 

parte de éstas (AGO1, 2, 3, 4, 5, 7 y 10) se han implicado en la defensa antiviral de 

plantas (Hamera et al. 2012; García-Ruiz et al. 2015; Wang et al. 2011b; Schuck et al. 

2013; Qu et al. 2008; Jones et al. 2006; Feng et al. 2013; Jaubert et al. 2011). Bologna y 

Voinnet (2014) han asociado principalmente AGO4, 6 y 9 con siRNAs de 24 nts; AGO1, 

2, 5 y 7 con siRNAs de 21-22 nts; y AGO7 y 10 casi exclusivamente con los miR390 y 

miR165/166, respectivamente; mientras que AGO8 presenta bajos niveles de 

expresión en Arabidopsis y se ha considerado un pseudogén al que aún no se ha 

atribuido un papel (Bologna y Voinet, 2014).  

Diversos autores han relacionado AGO1, 2 y 4 con la infección y resistencia frente a 

CMV (Wang et al. 2011b; Ye et al. 2009; Hamera et al. 2012; Diaz-Pendon et al. 2007; 

Zhang et al. 2006b), y unen diferentes conjuntos de siRNAs virales primarios y 

secundarios. AGO1 se ha asociado con miRNAs y siRNAs de transgenes, siRNAs virales y 

trans-acting siRNAs (ta-siRNAs) (Baumberger y Baulcombe 2005; Qi et al. 2005; Zhang 



29 
 

et al. 2006b; Montgomery et al. 2008b) de 21 nts y con uridina en el extremo 5’ (Mi et 

al. 2008; Takeda et al. 2008; Wang et al. 2011b), aunque recientemente también se ha 

observado un alto porcentaje de siRNAs de 24 nts unidos a AGO1. AGO2 toma 

principalmente siRNAs con adenosina en el extremo 5’. El sesgo de AGO1 y 2 por 

siRNAs con uracilo o adenina en 5’ se ha observado también en la selección de siRNAs 

endógenos (Mi et al. 2008; Montgomery et al. 2008a; Takeda et al. 2008). Wang y 

colaboradores (2011b) observaron que durante la infección viral AGO1 era necesaria 

en el silenciamiento de siRNAs secundarios, y que las plantas defectivas en esta 

proteína eran hipersusceptibles a las infecciones (Morel et al. 2002; Qu et al. 2005; 

Zhang et al. 2006b).  

Como respuesta general de la planta frente a virus, se ha notificado un aumento en la 

inducción de la transcripción de AGO1 en las infecciones con CMV, con el virus de la 

mancha en anillo del cimbidium (cymbidium ringspot virus, CymRSV) y con la cepa cr 

del virus del mosaico del tabaco (tobacco mosaic virus, TMV) (Zhang et al. 2006b; 

Csorba et al. 2007; Havelda et al. 2008). Sin embargo este incremento no conllevaba 

un aumento en la actividad de la proteína, ya que los supresores de silenciamiento 

virales pueden condicionar la producción de AGO, la estabilidad de los siRNAs, la carga 

de siRNAs en AGO1, o la traducción, estabilidad, actividad o degradación de AGO1 

(Chapman et al. 2004; Lakatos et al. 2006; Zhang et al. 2006b; Baumberger et al. 2007; 

Bortolamiol et al. 2007; Csorba et al. 2007; Azevedo et al. 2010; Chiu et al. 2010; Giner 

et al. 2010; Várallyay et al. 2010).  

Las proteínas AGO4 y AGO6 se han asociado con la metilación de DNA e histonas (en  

RdDM). Li y colaboradores (2008) localizaron AGO4 en el núcleo y en los cuerpos de 

Cajal (Cajal bodies, CBs), y unos cuerpos asociados al nucléolo llamados cuerpos A-B, 

donde su actividad se ha relacionado con RdDM junto con otras proteínas con la 

misma localización (RDR2, DCL3 y la subunidad NRPD1 de la polimerasa IV con 

actividad polimerasa de RNA dependiente de DNA) lo que ha sugerido que en los CBs 

se da el silenciamiento transcripcional dependiente de siRNAs de 24 nts (Li et al. 2006; 

Li et al. 2008). Tras la activación con el siRNA, AGO4 recluta RISC y las metiltranferasas 

de DNA que metilan el DNA y forman heterocromatina (Fig. 5) (Wassenegger et al. 

1994; Matzke et al. 2007; Chinnusamy y Zhu 2009; Law y Jacobsen 2010). En 



30 
 

Arabidopsis se ha identificado parte de los componentes involucrados en RdDM: DCL3, 

otras proteínas que reclutan la RdDM, proteínas que metilan el DNA y proteínas que 

remodelan la cromatina (Mahfouz 2010; Zhang y Zhu 2011). Cao y Jacobsen (2002) 

observaron que AGO4 y AGO6 participan en RdDM uniendo siRNAs y en el ensamblaje 

de enzimas metiltransferasas que catalizan la metilación de novo de DNA. La enzima 

citosina demetilasa revierte esta metilación, con lo que la expresión génica tiene un 

control dinámico en respuesta a señales de crecimiento y desarrollo, estrés, o 

infecciones. Diversos estudios han mostrado que la ruta de RdDM puede reconocer 

ácidos nucleicos virales, transgenes y trasposones (Kumpatla et al. 1998; Matzke y 

Matzke 1998; Voinnet et al. 1998), y se pueden utilizar virus para silenciar genes 

específicos en la planta a nivel de DNA (Kanazawa et al. 2011).  

Wang y colaboradores (2011a) han mostrado que AGO1 puede suplir la función de 

AGO4 en plantas de Arabidopsis defectivas en ago4, por lo que AGO1 puede actuar de 

forma redundante en la regulación de RdDM (Wang et al. 2011a). La diversificación, 

especialización, solapamiento y redundancia en las rutas de silenciamiento por RNA, 

con sus distintas DCLs y AGOs podría por lo tanto resultar ventajosa para la planta a 

pesar de su coste, permitiendo regular diferencialmente unas rutas y otras, y potenciar 

por ejemplo la ruta de silenciamiento involucrada en la defensa antiviral sin necesidad 

de alterar otras rutas de silenciamiento implicadas en otros procesos endógenos, o 

compensar el bloqueo de una de ellas mediado por patógenos.  

1.2.3. Generación de siRNAs virales secundarios 

Se han descrito tanto RDRs de plantas como RDRs de origen viral. Las RDRs de planta 

amplifican secuencias de RNA a partir de RNAs de hebra sencilla o transcritos de RNA, 

produciendo de novo intermediarios de doble cadena que sintetizan la cadena 

complementaria usando iniciadores o cebadores de la reacción, como los siRNAs 

(Ahlquist 2002). Schiebel y colaboradores (1998) caracterizaron la primera RDR vegetal 

en tomate, y poco después se observó que también participaban en los mecanismos 

de defensa antiviral frente a virus de RNA, donde juegan un papel importante en el 

silenciamiento. En Arabidopsis hay seis RDRs que intervienen en la amplificación y la 

diseminación del silenciamiento. Wang y colaboradores (2010) sugirieron que se 



31 
 

desarrollaron para participar en la biogénesis de siRNAs endógenos y en la 

amplificación de siRNAs virales, como mecanismo de defensa antiviral. Las RDRs 

vegetales no actúan sobre mRNAs, que presentan las estructuras cap y la cola Poli-A 

(secuencia larga de poliadenilato, formada por múltiples adeninas), sino sobre RNAs o 

mRNAs carentes de estas estructuras, mientras que las RDRs virales sí pueden actuar 

en aquellos mRNAs. Los dsRNAs generados por las RDRs son sustrato de las DCLs que 

generan siRNAs virales secundarios (Baulcombe 2004), y tanto DCL2 como DCL4 

pueden reconocer y procesar los dsRNAs producto del sistema RDR6/supresor de 

silenciamiento génico 3 (Suppressor of gene silencing 3, SGS3) para producir siRNAs 

virales secundarios, a diferencia de  DCL1 y DCL3, que no los pueden producir (Wang et 

al. 2011b).  

La infección viral estimula la expresión de genes rdr en muchas plantas (Ahlquist 2002), 

y diversos estudios han mostrado que en Arabidopsis se producen siRNAs virales 

secundarios a consecuencia de la actividad de las RDRs del huésped frente a 

infecciones de virus de RNA de polaridad positiva (Diaz-Pendon et al. 2007; Donaire et 

al. 2008; Garcia-Ruiz et al. 2010; Wang et al. 2010). Las RDRs también son inducibles 

por el ácido salicílico (salicilic acid, SA), fitohormona que dispara respuestas de defensa 

genéricas (Xie et al. 2001).  

De las seis RDRs de A. thaliana, se ha confirmado la intervención de RDR1, 2 y 6 en la 

respuesta antiviral. Las restantes (RDR3, 4 y 5) no participan en la respuesta antiviral 

de silenciamiento o su actividad es secundaria a las de RDR1 y RDR6 (Lowery 2012). 

Éstas dos participan en el silenciamiento antiviral frente a virus de RNA (Yang et al. 

2004; Schwach et al. 2005; Diaz-Pendon et al. 2007; Donaire et al. 2008), y RDR6, junto 

con DCL2 y DCL4, es la responsable de la biogénesis de siRNAs endógenos de la planta 

para silenciar miRNAs (Poethig et al. 2006; Chapman y Carrington 2007; Voinnet 2008). 

Wang y colaboradores (2010) han mostrado que RDR1 amplifica preferentemente la 

región terminal 5’ de los tres RNAs de la cepa Fny de CMV, mientras que RDR6 

amplifica preferentemente la región terminal 5’ y el RNA 4.  

Diversos estudios han mostrado que la proteína 2b de CMV suprime in vivo el 

silenciamiento de RNA dependiente de RDR6 (Diaz-Pendon et al. 2007; Zhang et al. 



32 
 

2008; Wang et al. 2011b), y en plantas defectivas en rdr6 la infección viral se ve 

facilitada (Jiang et al. 2012). La dispersión de silenciamiento antiviral célula-célula 

depende de RDR2 y RDR6, aunque en su propagación a larga distancia no se da esta 

dependencia (Dunoyer et al. 2005; Schwach et al. 2005; Brosnan et al. 2007; Dunoyer 

et al. 2007; Smith et al. 2007; Díaz-Pendón y Ding 2008; Voinnet 2008). Se ha 

observado que el silenciamiento se extiende en ambos sentidos del siRNA inductor 

(3’5’ y 5’3’) en plantas, mientras que en otros organismos, como nematodos, se 

extiende sólo en un sentido (3’5’) (Sijen et al. 2001; Vaistij et al. 2002; Petersen y 

Albrechtsen 2005).  

 

1.3. Supresores virales de silenciamiento de RNA: mecanismos 

virales de interferencia con el silenciamiento génico  

La invasión de un virus induce respuestas de defensa en la planta, como el 

silenciamiento de RNA viral. Los virus han desarrollado supresores de silenciamiento 

de RNA (Li y Ding 2006; Ding y Voinnet 2007; Valli et al. 2009) que bloquean las rutas 

de silenciamiento en diferentes puntos y permiten la invasión del huésped 

(Anandalakshmi et al. 1998; Kasschau y Carrington 1998; Vance y Vaucheret 2001; 

Chapman et al. 2004; Mlotshwa et al. 2005; Díaz-Pendón y Ding 2008). Actualmente se 

han identificado más de 35 familias de supresores virales de silenciamiento de RNA en 

virus de plantas (Díaz Pendón y Ding, 2008; Li y Ding 2006; Pumplin y Voinnet 2013).   

Jones y colaboradores (1999) mostraron que CMV prevenía el silenciamiento en 

plantas en nuevos tejidos no silenciados. Y Li y colaboradores (1999) demostraron que 

la proteína 2b de TAV tiene función supresora de silenciamiento, como corroboraron 

Lucy y colaboradores (2000) en la cepa Q de CMV. Los ensayos de Béclin y 

colaboradores (1998) con la cepa R de CMV (subgrupo II), mostraron que la proteína 

2b inhibía la dispersión de la señal sistémica de silenciamiento en Arabidopsis y tabaco, 

como han observado también Mlotshwa y colaboradores (2002). 



33 
 

Aunque los supresores de silenciamiento tienen secuencias y funciones específicas 

diversas, comparten algunos mecanismos de acción y propiedades bioquímicas (Diaz-

Pendón y Ding, 2008; Li y Ding, 2006; Ding y Voinnet, 2007). Unos parecen actuar 

uniendo y secuestrando siRNAs para inhibir el ensamblaje de RISC y la dispersión 

célula-célula del silenciamiento (Chapman et al. 2004; Lakatos et al. 2006; Dunoyer et 

al. 2010), lo que podría ser un mecanismo general de supresión de silenciamiento de 

RNA (Mérai et al. 2005; Lakatos et al. 2006; Li y Ding 2006); mientras que otros inhiben 

el silenciamiento interaccionando con los componentes proteicos de su maquinaria 

(Wu et al. 2010; Burgyán y Havelda 2011); y algunos supresores tienen mecanismos de 

actuación múltiples en varios puntos de las rutas de silenciamiento. La interrupción o 

supresión del silenciamiento de un modo u otro lleva eventualmente a la reducción o 

eliminación completa de siRNAs (Zhang et al. 2006b). La proteína 2b de CMV, nuestro 

objeto de estudio, se podría encontrar entre estos supresores de actuación múltiple, 

uniendo siRNAs e interaccionando con las proteínas AGO, como se discutirá más 

adelante.  

Los supresores de silenciamiento no sólo afectan a la defensa antiviral de la planta, 

sino que interfieren y alteran procesos fisiológicos básicos dependientes de la 

regulación de la expresión génica endógena, favoreciendo las condiciones para la 

infección sistémica. De este modo, el virus utiliza la maquinaria de silenciamiento de la 

planta reprogramando la expresión génica del huésped y proporcionando un entorno 

celular favorable a la proliferación viral (Dunoyer y Voinnet 2005; Zhang et al. 2006b; 

Ding y Voinnet 2007; Donaire et al. 2008; Donaire et al. 2009). Esta reprogramación 

contribuye a la patogénesis y al desarrollo de síntomas característicos de diferentes 

virus (Whitham y Wang 2004; Pallás y García 2011), y se ha visto en distintos estudios 

que parte de los síntomas manifestados por las plantas infectadas con CMV se deben a 

la interferencia de los supresores con las rutas de regulación génica (Carrington y 

Ambros 2003; Peragine et al. 2004; Borsani et al. 2005; Du et al. 2014b). A 

continuación veremos más detenidamente diferentes mecanismos mediante los cuales 

los supresores virales interrumpen el silenciamiento de RNA.  



34 
 

1.3.1. Unión de supresores virales a ácidos nucleicos 

Una propiedad observada en varios supresores de silenciamiento de distintas familias 

de virus no relacionadas es su capacidad de unión a siRNAs y dsRNAs (Fig. 6) (Bucher et 

al. 2004; Chapman et al. 2004; Chellappan et al. 2005; Lu et al. 2005; Mérai et al. 

2005). La captura de siRNAs podría bloquear la señal de silenciamiento local y 

sistémico al impedir que el siRNA se una a AGO (Schott et al. 2012) bloqueando el 

silenciamiento.  

Algunos supresores que unen RNAs son las proteínas 2b de Cucumovirus, P14 de 

Aureusvirus, P15 del virus del macizo del cacahuete (Peanut clump virus, PCV), P19 de 

Tombusvirus, P21 de Closterovirus, AC4 de Geminivirus, B2 de Nodavirus y la proteasa 

componente “helper” de Potyvirus (helper component-protease, HC-Pro) del virus del 

mosaico del nabo (Turnip mosaic virus, TuMV) (Goto et al. 2007; Rashid et al. 2008; 

Chen et al. 2008; Silhavyi et al. 2002; Vargason et al. 2003; Chapman et al. 2004; 

Lakatos et al. 2004; Chellapman et al. 2005; Lu et al. 2005; Mérai et al. 2005; García-

Ruíz et al. 2015).  

Los supresores de silenciamiento unen diferentes tipos de RNAs, la proteína P19 del 

virus de las manchas en anillo del clavel italiano (Carnation italian ring-spot virus, CIRV) 

y del virus del enanismo arbustivo del tomate (Tomato bushy stunt virus, TBSV), unen 

siRNAs de 21 nts con extremos romos o con dos nts desapareados en los extremos 3’ 

(Silhavy et al. 2002; Vargason et al. 2003; Ye et al. 2003), otros supresores como HC-

Pro del virus del grabado del tabaco (Tobacco etch virus, TEV), P21 del virus del 

amarilleo de la remolacha (Beet yellows virus, BYV) y p122 de TMV, unen in vitro 

siRNAs con dos nts desapareados en los extremos 3’ (Lakatos et al. 2006; Csorba et al. 

2007). HCPro de TuMV une in vivo siRNAs de 21 y 22 nts (García-Ruíz et al. 2015); y 

otros supresores, como B2 del virus del escarabajo neozelandés (Flok house virus, FHV) 

y P14 del virus latente del Pothos (Pothos latent virus, PoLV) unen dsRNAs 

independientemente de su tamaño. En virus animales se ha visto que los supresores 

de silenciamiento pueden impedir el acceso de las DCLs a los dsRNAs, inhibiendo la 

generación de siRNAs (Chao et al. 2005; Lu et al. 2005; Aliyari et al. 2008) aunque no se 

ha observado tal hecho en virus vegetales. 



35 
 

Chen y colaboradores (2008) observaron que la proteína 2b de TAV unía siRNAs 

independientemente de su secuencia por medio de residuos con carga positiva 

situados en la primera α-hélice, algunos de ellos formando parte de las señales de 

localización nuclear (Nuclear localisation signal, NLS) y el motivo de fosforilación, que 

también participa en el reconocimiento de la hélice de RNA. Duan y colaboradores 

(2012) mostraron que en la cepa SD (subgrupo IB) de CMV las dos primeras α-hélices 

de la proteína 2b, en que se encuentran las NLSs y el motivo de fosforilación, son 

necesarias en la unión a siRNAs de 21 nts, aunque sólo la primera es necesaria en la 

unión a siRNAs de 24 nts y RNAs largos. Estos mismos autores confirmaron que las 

NLSs y la señal de localización nucleolar (Nucleolar localisation signal, NoLS) forman 

parte de la estructura de unión a RNAs de la proteína. Rashid y colaboradores (2008) 

por otro lado observaron que la mitad amino de la proteína 2b de TAV (aas 1-71) une 

in vitro siRNAs, miRNAs y RNAs de hebra sencilla en ensayos de espectroscopía; y Chen 

y colaboradores (2008) observaron la unión preferente a siRNAs de 21 nt, siRNAs de 

hebra sencilla de 21 y 30 nts y miRNAs in vitro con diferente afinidad. Goto y 

colaboradores (2007) mostraron que la proteína 2b de la cepa CM95R (subgrupo IA) de 

CMV unía in vitro siRNAs y miRNAs, como las proteínas P19 de tombusvirus y P21 de 

BYV. En este estudio, la proteína 2b mostró más afinidad por el siRNA que por el 

miRNA, mientras que P19 tuvo semejante afinidad por ambos; y en un estudio 

posterior, Hamera y colaboradores (2012) observaron que la proteína 2b de la cepa SD 

(subgrupo IB) de CMV unía in vivo siRNAs y miRNAs. 

En algunos casos en que se ha observado unión in vitro a siRNAs, ésta no se ha 

demostrado in vivo (Schott et al. 2012). Y en ocasiones distintos grupos de 

investigación han obtenido resultados diferentes que se podrían deber a diferencias en 

las técnicas o en las cepas de virus utilizadas. En el caso de la proteína 2b de CMV, 

algunos autores han propuesto que su mecanismo de supresión de silenciamiento es la 

unión y secuestro de siRNAs (Wang et al. 2004; Goto et al. 2007; Rashid et al. 2008; 

Kanazawa et al. 2011; Duan et al. 2012; Hamera et al. 2012), mientras que otros han 

propuesto que su modo de acción se basa en la interacción e inhibición de proteínas 

AGO (Mérai et al. 2006; Zhang et al. 2006b).  



36 
 

La utilización de plantas de Arabidopsis defectivas en dcls ha permitido discriminar el 

efecto de la actividad de algunos supresores en diferentes rutas de silenciamiento. Así, 

se va visto que la proteína p38 del virus del arrugamiento del nabo (Turnip crinkle 

virus, TCV) inhibe la acumulación de siRNAs de 21 nts dependientes de DCL4 (Deleris et 

al. 2006) y que la proteína 2b de CMV suprime el silenciamiento inhibiendo la 

acumulación de siRNAs virales de 21, 22 y 24 nts (productos de DCL4, DCL2 y DCL3, 

respectivamente) (Bouché et al. 2006; Fusaro et al. 2006; Díaz-Pendón et al. 2007), lo 

que es compatible con la actividad bloqueadora de RdDM e inhibición de la dispersión 

de la señal de silenciamiento célula-célula que se ha visto en esta proteína (Guo y Ding 

2002).  

La unión de las proteínas supresoras a RNAs de diferentes tipos interrumpe el 

silenciamiento tanto al unir dsRNA, impidiendo la actuación de las DCLs que generan 

siRNAs, como al unir siRNAs, impidiendo que éstos se unan a AGO. También interfieren 

con la dispersión de la señal de silenciamiento, ya que los siRNAs de 21 y 22 nts están 

implicados en la dispersión local y sistémica del silenciamiento en plantas infectadas 

(Diaz-Pendon et al. 2007). 

 

 



37 
 

 

Fig. 6: Actividades de supresores de silenciamiento virales en las rutas de silenciamiento. El esquema 
muestra la supresión del silenciamiento de RNA por diferentes supresores de silenciamiento virales. En 
las rutas de silenciamiento los dsRNAs virales son detectados y degradados a siRNAs por enzimas DCLs 
(DCL2/3/4), con actividad RNAsa III. El siRNA viral resultante se une a proteínas AGO, y se ensambla el 
RISC. Este RISC, utilizando una de las hebras del siRNA como molde, degrada RNAs virales diana. Las 
RDRs del huésped y otros cofactores como SGS3 amplifican la señal de silenciamiento generando siRNAs 
secundarios y dispersando el silenciamiento a tejidos sistémicos de la planta. Los supresores virales de 
silenciamiento podrían actuar uniendo siRNAs, previniendo el ensamblaje de diferentes efectores o 
inhibiendo su función, o uniéndose al dsRNA inductor, como la proteína B2 de FHV. Las proteínas P38 de 
TCV y P6 de CaMV actúan a nivel de las DCLs. Otras proteínas supresoras inhiben el silenciamiento 
secuestrando siRNAs, como P19 de CymRSV, de CIRV y de TBSV, HC-Pro de TEV, P122 de TMV y 2b de 
CMV. Mientras que otras proteínas actúan a nivel del RISC, actuando sobre la proteína AGO e inhibiendo 
la formación del complejo, como las proteínas P0 de BWYV, P38 de TCV y P1 de SPMMV, o actuando 
sobre el complejo ya formado. Algunas proteínas interfieren la amplificación de siRNAs secundarios, 
inhibiendo la actividad de las RDR, como la proteína 2b de CMV, o inhibiendo el cofactor de RDR, SGS3, 
como la proteína V2 de TYLCV. Algunas proteínas supresoras actúan a varios niveles de la ruta de 
silenciamiento, como la proteína 2b de CMV que une siRNAs (Goto et al. 2007), interacciona con AGO 
(Zhang et al. 2006b) y actúa a nivel de las RDRs, ya que el virus defectivo en la proteína 2b, CMVΔ2b 
recobra la infectividad en plantas rdr6 y la acumulación de siRNAs virales se reduce (Wang et al. 2011b), 
lo que sugiere que la proteína 2b inhibe específicamente la amplificación de siRNAs virales secundarios 
dependientes de RDR6, que son esenciales en la defensa antiviral. Figura modificada a partir de Jiang y 
colaboradores 2012.  



38 
 

1.3.2. Interacción de supresores virales con proteínas de las rutas del 

silenciamiento 

Los supresores de silenciamiento también interaccionan con elementos proteicos de 

las rutas de silenciamiento (Fig. 6). Algunos ejemplos son las proteínas 2b de las cepas 

Fny y SD (subgrupos IA y IB, respectivamente) de CMV que se unen a AGO1 inhibiendo 

su actividad (Zhang et al. 2006b; Feng et al. 2013); las proteínas P38 de TCV y P1 del 

virus del moteado suave de la batata (Sweet potato mild mottle virus, SPMMV) que 

mimetizan los motivos GW/WG de proteínas endógenas de la planta que interaccionan 

con AGO1, uniendo competitivamente AGO1 para inhibir su actividad (Azevedo et al. 

2010; Giner et al. 2010); las proteínas P0 del virus del amarilleo occidental de la 

remolacha, (Beet western yellows virus, BWYV) y P25 del virus X de la patata (Potato 

virus X, PVX) que promueven la degradación de AGO1 (Chiu et al. 2010; Baumberger et 

al. 2007; Bortolamiol et al. 2007); y otras proteínas supresoras, como P19 de CIRV, P21 

de BYV y HC-Pro de TEV, que unen siRNAs potencialmente previniendo que éstos se 

unan a AGO (Chapman et al. 2004; Lakatos et al. 2006). Jamous y colaboradores (2011) 

comprobaron que el supresor de silenciamiento HC-Pro del virus del mosaico amarillo 

del calabacín (Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV) inhibía in vitro la actividad metilasa 

de la enzima HUA ENHANCER1 (HEN1), lo que conlleva una reducción general de la 

acumulación de sRNAs en la planta (Boulet et al. 2003; Li et al. 2005). 

Algunas proteínas supresoras pueden interaccionar con o afectar a varias proteínas 

AGO, como la proteína P25 de PVX, que interacciona con AGO1, AGO2, AGO3 y AGO4 

(Chiu et al. 2010) y la proteína 2b de CMV, que interacciona con al menos AGO1 y 

AGO4 (Zhang et al. 2006b; Ye et al. 2009; Hamera et al. 2012; Feng et al. 2013). Zhang 

y colaboradores (2006b) demostraron la interacción de la proteína 2b de CMV con 

AGO1, inhibiendo su actividad degradadora y posteriormente, Hamera y colaboradores 

(2012) confirmaron la interacción in vivo con AGO4 mediante co-inmunoprecipitación, 

que nosotros habíamos visualizado anteriormente también in vivo, como veremos más 

adelante. Posteriormente a la publicacion de nuestros resultados, estos autores 

propusieron que la proteína 2b de la cepa SD (subgrupo IB) de CMV compite con AGO4 



39 
 

por la unión a siRNAs además de interaccionar con AGO4, suprimiendo así la 

metilación mediada por esta proteína (Hamera et al. 2012).  

Bisaro (2006) observó que algunos supresores de silenciamiento de virus de DNA 

interfieren la ruta de metilación de DNA. En diversos estudios se ha observado que las 

proteínas AL2 del virus del mosaico dorado del tomate (Tomato golden mosaic virus, 

TGMV) y L2 del virus del enrollamiento de la punta de la remolacha (Beet curly top 

virus, BCTV) inhiben TGS interaccionando e inactivando la adenosina kinasa del 

huésped (Wang et al. 2003; Wang et al. 2005); mientras que la proteína C2 del virus 

del enrollamiento severo de la punta de la remolacha (Beet severe curly top virus, 

BSCTV) interacciona con la proteína S-adenosil-metionina decarboxilasa del huésped, 

previniendo así modificaciones epigenéticas en el genoma viral (Zhang et al. 2011). 

1.3.3. Interferencia de supresores virales con la amplificación de siRNAs  

Durante la replicación, los virus de RNA de polaridad positiva producen intermediarios 

de doble cadena a partir de los que se generan siRNAs virales primarios y secundarios. 

Las proteínas RDR1, RDR2 y RDR6 de la planta reconocen los RNAs virales y producen 

dsRNAs y siRNAs virales secundarios, esenciales en la defensa antiviral (Garcia-Ruiz et 

al. 2010; Wang et al. 2010; Wang et al. 2011b). He aquí otro punto sensible que 

pueden bloquear los virus, ya que las plantas en las que la función de RDR1 o RDR6 

está comprometida presentan mayor susceptibilidad a algunos virus de RNA (Mourrain 

et al. 2000; Xie et al. 2001; Yang et al. 2004; Qu et al. 2005; Schwach et al. 2005; 

Donaire et al. 2008). Distintas lineas de investigación han mostrado que la proteína 2b 

de CMV inhibe la actividad de las RDRs (Diaz-Pendon et al. 2007; Zhang et al. 2008; 

Wang et al. 2011b) y Zhang y colaboradores (2008) han mostrado que las proteínas 2b 

de TAV y HC-Pro del virus del mosaico de la caña de azúcar (Sugarcane mosaic virus, 

SCMV) inhiben la acumulación del mRNA de la RDR6 del huésped. La dispersión 

intercelular de la señal de silenciamiento depende de RDR6 (Schwach et al. 2005), por 

lo que si la proteína 2b inhibe la función de RDR6, se facilita la infección.  

Wang y colaboradores (2011b) han observado que el virus CMVΔ2b (cepa Fny), 

deficiente en la proteína supresora 2b, requiere la actividad de RDR6 para ser 



40 
 

silenciado y otras proteínas de Arabidopsis como SGS3 para la formación de siRNAs 

virales secundarios. Estos autores y Voinnet (2008) han relacionado SGS3 con RDR6 y 

con DCL4 en la ruta de silenciamiento. En plantas de Arabidopsis que presentan 

comprometido sgs3, CMVΔ2b causa síntomas severos (Wang et al. 2011b). En el 

mismo sentido, la proteína supresora de silenciamiento V2 de la cepa Israel del virus 

del rizado amarillo del tomate (Tomato yellow curl leaf geminivirus, TYLCV), interfiere 

la amplificación de siRNAs virales secundarios al interaccionar con la proteína SGS3 

(Mourrain et al. 2000; Peragine et al. 2004; Zrachya et al. 2007; Glick et al. 2008; 

Kumakura et al. 2009).  

Diaz-Pendón y colaboradores (2007) propusieron que la proteína 2b inhibía la 

producción de siRNAs secundarios dependientes de RDRs inducibles por SA, como 

RDR1, ya que en presencia de 2b no se detectan siRNAs virales producto de esta RDR. 

Se han propuesto dos mecanismos que podrían explicarlo: por interacción de la 

proteína 2b con AGO1, que inhibiría la actividad de AGO1 (Zhang et al. 2006b), esencial 

en la amplificación de silenciamiento dependiente de RDR; o uniendo siRNAs y su 

precursor de dsRNA, inhibiendo la producción de siRNAs secundarios, como se ha visto 

en la proteína B2 del FHV (Chao et al. 2005; Lu et al. 2005). Otras proteínas como P6 

del virus del mosaico de la coliflor (Cauliflower mosaic virus, CaMV) inhiben el 

silenciamiento interaccionando con la proteína DBR4, necesaria para la producción de 

siRNAs de 21 nts dependientes de DCL4 (Haas et al. 2008); o el supresor de 

silenciamiento HC-Pro de SCMV, que podría inhibir la función de DCL3, afectando así a 

la acumulación de siRNAs de 24 nts (Zhang et al. 2008).  

Las infecciones de plantas de Arabidopsis deficientes en rdrs con virus deficientes en la 

supresión de silenciamiento, han mostrado que la resistencia a distintos virus de RNA 

de sentido positivo depende de la producción de siRNAs virales secundarios producto 

de RDR1, RDR2 y RDR6 (Mourrain et al. 2000; Xie et al. 2001; Diaz-Pendon et al. 2007; 

Donaire et al. 2008; Garcia-Ruiz et al. 2010; Wang et al. 2010; Wang et al. 2011b), y 

distintas lineas de investigación han mostrado que la proteína 2b de CMV suprime la 

formación de siRNAs virales secundarios producto de las RDRs (Diaz-Pendon et al. 

2007; Zhang et al. 2008; Wang et al. 2011b). Wang y colaboradores (2010) han 

demostrado que RDR1 y RDR6 tienen un papel esencial en la amplificación de siRNAs 



41 
 

virales y el silenciamiento viral en la infección con la cepa Fny de CMV deficiente en la 

proteína 2b en plantas de Arabidopsis (CMVΔ2b). En esos ensayos, observaron que la 

pérdida de rdr1 incrementaba la acumulación viral de forma significativa, mientras que 

la pérdida de rdr2 o rdr6 era apenas perceptible, por lo que RDR1 y RDR6 pueden 

cumplir funciones distintas (Wang et al. 2010). Además, RDR1, es inducible por SA, 

mientras que RDR6 no lo es (Xie et al. 2001; Yu et al. 2003). Ambas sintetizan dsRNA 

que DCL2 y DCL4 procesan en siRNAs virales secundarios, amplificando la señal de 

silenciamiento antiviral, aunque RDR1 amplifica preferentemente siRNAs de la región 

5’ de los tres RNAs virales de CMV, mientras RDR6 amplifica el siRNAs del resto (Wang 

et al. 2010).  

 

1.4. La proteína 2b 

1.4.1. Actividad funcional de la proteína 2b 

Los primeros estudios de la proteína 2b de Cucumovirus se centraron en la función de 

la proteína. Ding y colaboradores (1995b) mostraron que ésta no era necesaria para la 

replicación del genoma viral. Este grupo introdujo, en la cepa Q (subgrupo II), un codón 

de terminación al inicio de la secuencia de 2b que previno la traducción de la proteína, 

originando el virus CMVΔ2b. La ausencia de expresión de 2b atenuó la infección en 

Nicotiana glutinosa e inhibió la infección sistémica en pepino, aunque continuó 

infectando Nicotiana (Ding et al. 1995a) y observaron que CMVΔ2b no inducía 

síntomas en N. tabacum , N. benthamiana o Arabidopsis thaliana ecotipo Col-0.  Sin 

embargo, Lewsey y colaboradores (2009) observaron más tarde que sí podía inducir 

síntomas severos similares a CMV en el ecotipo C24. 

Inicialmente se identificaron las proteínas 2b de CMV y TAV como supresores de PTGS 

(Li et al. 1999) y como determinantes de movimiento viral a larga distancia (Ding et al. 

1995a; Ji y Ding 2001), y se observó que aumentaba la patogenicidad viral en N. 

benthamiana al expresarla desde un vector viral heterólogo (Lucy et al. 2000). Ding y 

colaboradores (2006) observaron, en un estudio en que reemplazaron el gen 2b de la 



42 
 

cepa Q (subgrupo II) de CMV con el de la cepa V de TAV, que el híbrido resultante 

presentaba mayor virulencia que las cepas parentales, y determinaron que 2b era un 

determinante de virulencia (Ding et al. 1996). Y Shi y colaboradores (2002) observaron 

que esto mismo sucedía al reemplazar el gen 2b de la cepa Q (subgrupo II) con el de la 

cepa WAII (subgrupo IA) de CMV, por lo que sugirieron que la proteína 2b también 

determinaba la especificidad de huésped (Shi et al. 2002). Diversos autores han 

relacionado la severidad de los síntomas de las plantas infectadas con CMV con la 

acumulación viral (Gal-On et al. 1994; Ding et al. 1996; Du et al. 2007), pero estudios 

posteriores han mostrado que 2b no es el único determinante de patogenicidad de 

CMV y que las diferencias en la expresión de síntomas no se deben a diferencias en la 

acumulación viral, ya que en cepas con síntomas atenuados o con variaciones que 

afectan a la expresión de síntomas pero no a la acumulación viral, la sustitución 

puntual de un solo aa de la proteína 2b puede afectar a la virulencia (Shi et al. 2002; 

Lewsey et al. 2009 y consultar Anexo IV). Varios ejemplos son la mutación puntual del 

aa41 en el motivo de fosforilación de la cepa Pepo (subgrupo IA) que genera el aislado 

36R37 con virulencia atenuada respecto a la de la cepa Pepo (Kobori et al. 2005); la 

mutación puntual del aa46 de la cepa CM95R (subgrupo IA) que genera la cepa CM95, 

que inhibe la unión a siRNAs y la actividad supresora de silenciamiento (Goto et al. 

2007); las mutaciones puntuales en los aa40 y aa42 de la cepa Fny, que suavizan los 

síntomas en la planta sin afectar a la acumulación viral (Lewsey et al. 2009); y la 

sustitución puntual del aa18 de la cepa M1 (subgrupo IA), que atenúa sus síntomas 

(Maneechoat et al. 2015).  

Entre las funciones que se han sugerido para la proteína, encontramos que Mayers y 

colaboradores (2000) sugirieron que la mitad amino de la proteína, que contiene las 

NLSs y una región de la proteína enriquecida en argininas (arginine rich region, ARR), 

podría unir DNAs y RNAs, y que ésta podría ser la principal actividad de la proteína 

(Mayers et al. 2000). Esta línea ha sido estudiada en diferentes grupos de investigación 

(Duan et al. 2012; Hamera et al. 2012) y, junto con nuestros resultados, sugiere que la 

unión a siRNAs a determinadas relaciones molares correlaciona con la actividad 

supresora de silenciamiento. Lucy y colaboradores (2000) sugirieron que la proteína 2b 

era un competidor en el transporte nuclear o en la regulación transcripcional, y Guo y 



43 
 

Ding (2002) sugirieron que interfería con la metilación de DNA. Diversos grupos han 

comprobado que la proteína 2b inhibe el silenciamiento local y sistémico en plantas 

transgénicas (Jones et al. 1999; Guo y Ding 2002), y Qi y colaboradores (2004) también 

observaron que podía suprimir el silenciamiento a nivel unicelular en protoplastos. 

Diversos estudios han demostrado que la proteína 2b de cucumovirus interrumpe las 

defensas de la planta mediadas por SA (Ji y Ding 2001; Mayers et al. 2005; Shang et al. 

2011) y ácido jasmónico (jasmonic acid, JA) (Westwood et al. 2014) e induce tolerancia 

a la sequía en A. thaliana y N. benthamiana infectadas con la cepa Fny (subgrupo IA) 

(Westwood et al. 2013).  

Otras líneas de investigación han sugerido que la proteína 2b actúa interaccionando 

con proteínas pertenecientes a la maquinaria del silenciamiento como las proteínas 

AGO1 (Zhang et al. 2006b) y AGO4 (Hamera et al. 2012; Feng et al. 2013), y un grupo 

ha observado que inhibe la expresión de AGO4 (Ye et al. 2009). En los últimos años se 

ha observado la interacción de diferentes proteínas supresoras de silenciamiento con 

AGO, como la proteína P0 de Poliovirus, que interacciona con AGO1 libre (no formando 

parte de RISC) mediando su degradación (Pazhouhandeh et al. 2006; Baumberger et al. 

2007; Csorba et al. 2009), y la proteína P38 de TCV que interacciona con AGO 

directamente, lo que puede impedir que se unan siRNAs (Schott et al. 2012). Nuestros 

datos y otros estudios recientes han mostrado la interacción de la proteína 2b de la 

cepa Fny (subgrupo IA) con las proteínas AGO1 y AGO4 de A. thaliana (Zhang et al. 

2006b; Hamera et al. 2012; Feng et al. 2013).  

Las diferencias entre los síntomas causados por diferentes cepas de virus se han 

atribuido a diferencias en la interacción entre sus supresores virales de silenciamiento 

y la ruta de miRNAs (Zhang et al. 2006b; Shimura y Pantaleo 2011). La ruta de los 

miRNAs, además de actuar como mecanismo de defensa, participa en procesos 

celulares básicos de la planta. Lewsey y colaboradores (2007) compararon el efecto en 

la expresión de síntomas de la proteína 2b de las cepas Fny (subgrupo IA, expresión de 

síntomas severos) y LS (subgrupo II, síntomas leves) en Arabidopsis, y como se ha visto, 

esta proteína perturba las rutas de miRNAs, e inhibe la actividad de proteínas del 

huésped por interacción directa (Inaba et al. 2011; Lewsey et al. 2007; Lewsey et al. 

2009; Zhang et al. 2006b). Un estudio reciente ha mostrado que la proteína 2b de la 



44 
 

cepa Fny (subgrupo IA) afecta a las rutas de miRNA mientras que las de las cepas LS y Q 

(subgrupo II) no lo hacen, explicando así las diferencias sintomáticas entre diversas 

cepas de los subgrupos I y II de CMV (Du et al. 2014b). Las plantas transgénicas que 

expresan la proteína 2b de la cepa Fny muestran un fenotipo semejante a las plantas 

mutantes miR159ab (Allen et al. 2007), y Du y colaboradores (2014b) han observado 

que la expresión de la proteína 2b de la cepa Fny en plantas transgénicas de 

Arabidopsis aumenta la acumulación del miR159 y miR159* maduro, como 

consecuencia de la estabilización del dúplex miR159/miR159* unido a los complejos de 

2b de la cepa Fny (Goto et al. 2007; Duan et al. 2012; Hamera 2012). Esta estabilización 

previene que miR159 active RISC y, al no activarse el complejo aumentan los 

transcritos de genes Gibberellin-regulated myb domain protein-like MYB33 y MYB65 

(diana de miR159), al no ser degradados. Por tanto, la expresión de síntomas en 

plantas infectadas con la cepa Fny, reside en la perturbación de los niveles del miR159, 

y según los autores esto puede ser extensible a otras cepas del subgrupo I de CMV (Du 

et al. 2014b). Tanto la cepa Fny como la cepa LS suprimen el silenciamiento, por lo que 

el estudio de este grupo indica que las cepas severas de CMV desarrollan síntomas por 

la inhibición de la ruta de miRNAs, una función que es independiente de la supresión 

de silenciamiento mediada por siRNAs (Mochizuki y Ohki 2012).    

Mourrain y colaboradores (2000) han observado que CMV se acumula más en plantas 

de Arabidopsis mutantes deficientes de rdr6. Díaz-Pendón y colaboradores (2007) han 

observado que durante la infección de CMVΔ2b en Arabidopsis, la mayoría de los 

siRNAs virales son generados por RDR1 y han asociado la expresión de 2b con la 

reducción de la acumulación de siRNAs virales. Otros genes que participan en la 

amplificación del silenciamiento dependiente de RDR son sgs3 (Mourrain et al. 2000), 

ago1 (Morel et al. 2002), o sde3 (Dalmay et al. 2001), que contribuyen a la biogénesis 

de siRNAs secundarios de CMV (Díaz-Pendón et al. 2007). Las mutaciones en rdr1, rdr2 

o rdr6 en Arabidopsis no varían la acumulación de siRNAs virales en las infecciones 

cursadas por otros virus de RNA de polaridad positiva como TCV, el virus del 

cascabeleo del tabaco (Tobacco rattle virus, TRV) o tobamovirus (Blevins et al. 2006; 

Deleris et al. 2006), y Zhang y colaboradores (2008) han observado que las proteínas 

2b de TAV y HC-Pro de SCMV inhiben la acumulación del mRNA de RDR6. Como la 



45 
 

dispersión de la señal de silenciamiento intercelular depende de RDR6 (Schwach et al. 

2005), la proteína 2b podría inhibir la función de RDR6 para favorecer la infección 

sistémica del virus.  

En un estudio posterior, Wang y colaboradores (2011b) han demostrado que CMVΔ2b, 

requiere de la actividad de RDR6 para ser silenciado. En la generación de siRNAs virales 

secundarios de CMVΔ2b participan las proteínas SGS3, relacionada con RDR6 en la ruta 

de silenciamiento (Voinnet 2008), y DCL4 (Wang et al. 2011b), y en plantas que tienen 

comprometido sgs3, CMVΔ2b causa síntomas severos (Wang et al. 2011b). Se ha visto 

que la proteína supresora V2 de TYLCV también interfiere la amplificación de siRNAs 

virales secundarios al interaccionar con SGS3 (Mourrain et al. 2000; Peragine et al. 

2004; Zrachya et al. 2007; Glick et al. 2008; Kumakura et al. 2009).  

Diaz-Pendón y colaboradores (2007) propusieron que el supresor 2b inhibe la 

producción de siRNAs secundarios dependientes de RDRs inducibles por SA, como 

RDR1 (Yu et al. 2003), ya que en presencia de 2b no se detectan siRNAs virales 

producto de esta RDR. Propusieron dos mecanismos que podrían explicarlo: por 

interacción de la proteína 2b con AGO1, que inhibiría la actividad de AGO1 (Zhang et 

al. 2006b), siendo AGO1 esencial en la amplificación de silenciamiento dependiente de 

RDR; o uniendo siRNAs y su precursor de dsRNA, inhibiendo así la producción de 

siRNAs secundarios, como se ha visto en la proteína B2 de FHV (Chao et al. 2005; Lu et 

al. 2005). Otras proteínas como P6 de CaMV inhiben el silenciamiento interaccionando 

con la proteína DBR4, necesaria para la producción de siRNAs de 21 nts dependiente 

de DCL4 (Haas et al. 2008). Y el supresor de silenciamiento HC-Pro de SCMV parece 

inhibir la función de DCL3, afectando así a la acumulación de siRNAs de 24 nts (Zhang 

et al. 2008).  

Además de interaccionar con elementos de la maquinaria de silenciamiento, se ha 

encontrado que las proteínas 2b de TAV y CMV y otros supresores interaccionan con 

otras proteínas celulares. De este modo, Nakahara y colaboradores (2012) han 

observado que los supresores de silenciamiento HC-Pro de TuMV y del virus del 

amarilleo del trébol (Clover yellow vein virus, ClYVV), así como 2b de TAV y de CMV de 

las cepas HL (subgrupo IB), Y (IA), CM95 (IA) y CM95R (IA) interaccionan con la 



46 
 

calmodulina rgs-CaM de tabaco. Takabatake y colaboradores (2007) observaron que 

esta proteína de tabaco se expresaba en la respuesta hipersensible (hipersensitive 

response, HR) frente a TMV (Takabatake et al. 2007), y en diferentes estudios se ha 

observado la interacción in vitro específica de rgs-CaM con los supresores de 

silenciamiento virales HC-Pro de TEV, de TuMV y de ClYVV, y con el supresor 2b de 

CMV y de TAV (Anandalakshmi et al. 2000; Nakahara et al. 2012), reconociendo sus 

dominios de unión de dsRNA. En todos los casos los supresores actuaron como un 

inhibidor competitivo de la unión de siRNA, e interfirieron la actividad de las proteínas 

supresoras; al interaccionar con 2b, ésta última no puede unir siRNAs, y el complejo 

formado (calmodulina/2b) es degradado por la célula vía autofagia (Nakahara et al. 

2012). Estos autores han demostrado que las mutaciones que afectan a la afinidad de 

la proteína 2b por los siRNAs también afectan a la interacción con rgs-CaM. 

Inaba y colaboradores (2011) y Masuta y colaboradores (2012) encontraron que las 

proteínas 2b de las cepas Y, HL (subgrupos IA y IB, respectivamente), y Q y M 

(subgrupo II) de CMV interaccionaban con la proteína catalasa 3 (CAT3) de A. thaliana. 

Esta interacción se localiza en los 40 aas de la mitad carboxilo de 2b (Inaba et al. 2011), 

en que predominan las cargas negativas.CAT3 cataliza la descomposición de la especie 

reactiva peróxido de hidrógeno (H2O2), que participa en respuestas de resistencia a 

patógenos induciendo la muerte celular como HR, en agua y oxígeno (Noctor y Foyer 

1998; Foreman y Tang 2003; Peng et al. 2005). La interacción 2b/CAT3 trasloca CAT3 

del citoplasma al núcleo induciendo la muerte celular. Las proteínas 2b de las cepas del 

subgrupo II de CMV reducen la actividad de CAT3 tan eficientemente como la cepa Y 

(IA) (Masuta et al. 2012), y se cree que la necrosis en hojas infectadas con CMV se 

debe a un descenso de la actividad de CAT3 resultado de la interacción 2b/CAT3, por lo 

que Masuta y colaboradores opinan que la interacción podría favorecer a CMV, ya que 

no previene la dispersión de CMV.  

1.4.2. Dominios de la proteína 2b 

El gen 2b se encuentra en todos los cucumovirus secuenciados (Ding et al. 1994) 

solapando con la porción 3´ terminal del ORF 2a, en distinto marco de lectura (siempre 

ORF+1 respecto a 2a) (Ding et al. 1995b), aunque no se encuentra en otros virus 



47 
 

próximos filogenéticamente como bromovirus o alfamovirus. El gen 2b tiene un origen 

híbrido: la parte que solapa con 2a se ha podido generar por sobre-escritura 

(overprinting), mientras que la región no solapante, que corresponde al dominio 

terminal carboxilo de la proteína (16 aa, conservado en todos los cucumovirus) es tan 

antigua como 2a y similar a la secuencia terminal de proteínas 2a bromovirales, 

probablemente originada por la inserción de un nucleótido en la secuencia de 2a que 

cambió su marco de lectura al de 2b (Ding et al. 1995a). La proteína 2b está compuesta 

por entre 95 y 111 aas, presentando en el subgrupo I diez u once aas más que en el 

subgrupo II (Ding et al. 1994; Ye et al. 2009; ver Anexo I). Shi y colaboradores (2002) 

consideran que la diferencia en la virulencia entre ambos subgrupos es resultado de las 

diferencias entre sus respectivos genes 2b (Shi et al. 2002). 

Aunque CMV se replica y acumula en el citoplasma, la proteína 2b de cucumovirus se 

localiza predominantemente en el núcleo (Lucy et al. 2000; Mayers et al. 2000; Wang 

et al. 2004). Esta proteína presenta en la mitad amino dos NLSs en el subgrupo I de 

CMV, y una sola NLS en el subgrupo II de CMV (Lucy et al. 2000). Las NLSs del subgrupo 

I, 22KKQRRR27 y 33RRER36, son ricas en argininas (R) y están contenidas en la ARR que 

proporciona lugares de unión a ácidos nucleicos (Mayers et al. 2000). La proteína 2b 

también presenta una NoLS que Duan y colaboradores (2012) han localizado entre los 

aas 13-37 de la proteína en la cepa SD (subgrupo IB) de CMV. La secuencia NoSL 

consenso se ha encontrado en otras proteínas virales y celulares que se localizan en el 

nucléolo (Boyne y Whitehouse 2006; Rajamaki y Valkonen 2009), y su presencia en la 

proteína sugiere que ésta presenta alguna función nucleolar (Taliansky et al. 2010). 

Wang y colaboradores (2004) observaron que en la cepa Fny (subgrupo IA) de CMV, 

una sola de las NLSs podía traslocar la proteína al núcleo aunque la delección de una 

de las mismas afectaba a su actividad (Wang et al. 2004).  

Lucy y colaboradores (2000) informaron de que la proteína 2b de la cepa Q (subgrupo 

II) presenta unos motivos conservados en todos los Cucumovirus y que potencialmente 

son lugares de fosforilación, sustrato de las enzimas caseína quinasa II (CKII) (S/TxxD/E) 

(en 9TNVE12 y 40SPSE43 en la cepa Fny, y 9STAD12 y 40SPSE43 en la cepa Q) y quinasa 

dependiente de ciclina 2 (CDK2) (en 40SP41 en las cepas Fny y Q) (Lucy et al. 2000). Ding 

y colaboradores (1994) mostraron que el motivo de fosforilación es importante en el 



48 
 

movimiento a larga distancia en plantas de pepino y tabaco. La combinación de NLSs y 

motivos de fosforilación constituyen un motivo llamado CcN, que se ha relacionado en 

otras proteínas con la regulación de la localización nuclear mediada por fosforilación 

(Jans 1995; Jans y Hubner 1996). La existencia de un CcN potencial en la proteína 2b de 

Cucumovirus sugiere que ésta podría moverse entre el citoplasma y el núcleo de forma 

controlada por su estado de fosforilación, como se ha visto en el virus 40 del simio 

(simian virus 40, SV40) (Xiao et al. 1996).  

La mitad carboxilo de la proteína contiene un dominio que Ye y colaboradores (2009) 

han denominado dominio tres o tercera alfa-hélice en la cepa SD (subgrupo IB), 

63SELIEMYHH71 (que en la cepa Fny corresponde a 63SELTGSCRH71, ver Anexo I) y que 

los autores han relacionado con la actividad supresora y la inhibición de la 

transcripción de AGO4. Las cepas del subgrupo II de CMV, que muestran menor 

patogenicidad sobre el huésped, carecen de este dominio; y  la delección del mismo en 

la cepa SD disminuye la actividad supresora de la proteína (Ye et al. 2009).  

La proteína 2b también presenta un dominio terminal amino y un dominio terminal 

carboxilo, que en la cepa Fny corresponden a los aas 1-17 y 95-110, respectivamente. 

Ambos se han implicado en la inducción de síntomas (Lewsey et al. 2009) y son 

necesarios para sobrepasar la resistencia inducida por SA en la planta (Zhou et al. 

2014). El dominio terminal amino está muy conservado dentro de los subgrupos I y II 

de CMV, aunque varía entre ambos. En este extremo, Chen y colaboradores (2008) han 

localizado en la proteína ortóloga de TAV un motivo de cremallera de leucinas, que 

participa en la formación de dímeros de dímeros. Nemes y colaboradores (2014) han 

determinado que los primeros aminoácidos de la proteína (aas 1-3), aunque no 

participan en la conexión entre dímeros, se localizan en el centro de unión a siRNAs del 

tetrámero de 2b y, aunque no son esenciales en la actividad supresora, son necesarios 

en el movimiento célula-célula. Y Ye y colaboradores (2009) observaron en la cepa SD 

(subgrupo IB) de CMV que los aas 1-8, que sólo varían en un aa respecto a la cepa Fny, 

son muy importantes en la inducción de síntomas, y que la sustitución de estos aas en 

la cepa Q (asintomática, subgrupo II) por los de la cepa SD formando una proteína 

quimera, aumenta la actividad supresora respecto a la cepa Q. Por lo que este dominio 

de la proteína parece que participa en diversas actividades. Por otro lado, el dominio 



49 
 

terminal carboxilo está ausente en algunos cucumovirus como TAV. Ding y 

colaboradores (1994) observaron que en CMV éste era necesario en la expresión de 

síntomas en plantas de tabaco e importante en el movimiento a larga distancia. 

Diferentes estudios han asociado este dominio terminal carboxilo con la toxicidad en la 

expresión de la proteína en bacterias (Mayers et al. 2000; Goto et al. 2007; Dong et al. 

2015; Sueda et al. 2010); y recientemente, dentro de esta región de la proteína, Gellért 

y colaboradores (2012) han relacionado el motivo 95DDTD98, conservado en CMV, con 

la estabilidad de la proteína 2b en la formación de tetrámeros en estudios de 

dinamismo molecular, por la unión divalente a iones de magnesio. Sin embargo, las 

delecciones en este dominio terminal no afectaron a la actividad supresora de 

silenciamiento, dependiente de la unión a siRNAs como muestran nuestros datos y los 

de Chen y colaboradores (2008). Estos autores utilizaron la fracción con los aas 1-69 de 

la proteína 2b de TAV en estudios de cristalografía y  revelaron la formación de 

dímeros y tetrámeros unidos a siRNAs, y el estudio más reciente de Dong y 

colaboradores (2015) utiliza la fracción de proteína 2b con los aa 1-61 de la cepa Fny 

de CMV y observan la formación de dímeros, tetrámeros y oligómeros de 2b, por lo 

que esa fracción de la proteína parece más relacionada con la inducción de síntomas 

que con la actividad supresora de silenciamiento. 

Nemes y colaboradores (2014) en un estudio reciente en la cepa Fny han confirmado 

que los aas contenidos en las NLSs y el dominio de fosforilación de la proteína 2b son 

necesarios en la actividad supresora de la proteína, junto con los aa contenidos entre 

las posiciones 10NVE12 y 55LPF57. De estos nuevos dominios implicados en la actividad 

supresora, el primero contiene V11, que en la proteína 2b de TAV es I11 y se había 

relacionado anteriormente con la cremallera de leucinas (Chen et al. 2008); y la 

segunda región contiene una L55 que Xu y colaboradores (2013) han sugerido 

indispensable en la formación de dímeros de 2b. Además de estas regiones implicadas 

en la actividad supresora, Nemes y colaboradores (2014) han identificado dos nuevos 

motivos en 2b relacionados con el movimiento célula-célula, 1MEL3 y 70RHV72, en el 

dominio terminal amino y en la mitad carboxilo de la proteína, respectivamente, 

esenciales en su actividad supresora.  



50 
 

1.4.3. Localización subcelular de la proteína 2b 

Inicialmente Shi y colaboradores (1997) mostraron, en estudios de fraccionamiento 

celular de tejidos infectados con TAV, que la proteína 2b se acumulaba en una fracción 

insoluble que sólo podía ser solubilizada en condiciones desnaturalizantes de dodecil 

sulfato sídico (Sodium dodecyl sulfate, SDS) y urea. Pero su estudio no pudo 

determinar la localización de la proteína más allá de la observación de que, junto con 

la proteína, aparecían paredes celulares, núcleo, citoesqueleto y membranas. Mayers y 

colaboradores (2000), en un estudio de fraccionamiento posterior, mostraron que la 

proteína 2b de la cepa Fny de CMV se localizaba principalmente en el núcleo, aunque 

no pudieron determinar si se encontraba en su interior o en su superficie. Aun así 

propusieron dos posibles modelos de actuación de la proteína 2b en la supresión de 

silenciamiento, no mutuamente excluyentes. En el primero la proteína 2b unía DNA o 

proteínas reguladoras en el núcleo, previniendo la expresión de las proteínas 

involucradas en la iniciación de PTGS, o inhibiendo la expresión de genes relacionados 

con la defensa. En el segundo modelo sugirieron que las ARR de la región amino de la 

proteína 2b podrían unir dsRNAs, como la proteína N de los virus bacteriófagos 

lambda, 21 y P22 (Lazinski et al. 1989). En este caso, la unión 2b/dsRNAs los protegería 

de la acción de enzimas DCLs (Mayers et al. 2000). Por lo tanto ya Mayers y 

colaboradores sugirieron una doble funcionalidad para las NLSs, más allá de marcar la 

localización subcelular de la proteína; y Wang y colaboradores (2004) sugirieron que la 

región ARR unía RNAs. Nuestros resultados, junto con otros autores, como 

discutiremos más adelante, refuerzan esta teoría.  

Ya en estudios de microscopía, Lucy y colaboradores (2000), en un estudio 

contemporáneo a Mayers y colaboradores, mostraron la localización celular de 2b de 

la cepa Q (subgrupo II) de CMV. En este estudio expresaron la proteína 2b marcada 

con GFP en sistemas libres de virus, en suspensiones celulares de células de tabaco 

Bright Yellow 2 (BY2); y también expresaron 2b de forma persistente en plantas, 

utilizando PVX como vector. En ambos casos localizaron la proteína en el núcleo. Sus 

resultados correlacionaron la acumulación nuclear de la proteína 2b con su actividad 

supresora de silenciamiento, y la supresión de silenciamiento con la determinación de 



51 
 

virulencia. También observaron que una mutación puntual en la NLS no afectaba a la 

localización ni la actividad supresora de la proteína, mientras que sustituciones o 

delecciones de mayor extensión sí lo hacían (Lucy et al. 2000). 

Diversos estudios han sugerido que en el subgrupo II de CMV la proteína 2b presenta 

una acumulación nuclear más marcada que en el subgrupo I (Duan et al. 2012; Wang 

et al. 2004; Lucy et al. 2000; Du et al. 2014a). Du y colaboradores (2014a) han 

observado que en la cepa LS (subgrupo II) de CMV la proteína 2b tiene una distribución 

predominantemente nuclear, pero no nucleolar. La acumulación nuclear de la proteína 

2b, como nosotros y otros autores han comprobado, no es suficiente para que la 

proteína presente actividad supresora de silenciamiento, y recientemente Du y 

colaboradores (2014a) han propuesto una relación entre la localización de la proteína, 

la patogenicidad del virus y la actividad supresora de silenciamiento, presentando 

mayor virulencia las cepas con mayor presencia nuclear, y menor virulencia las cepas 

con menor presencia nuclear aunque en éstas se encuentra mayor actividad supresora 

de silenciamiento 

En plantas transgénicas que expresan supresores de silenciamiento virales se han 

asociado las alteraciones fenotípicas con la perturbación de la regulación de dianas de 

mRNAs del huésped (Zhang et al. 2006b; Jay et al. 2011), y Du y colaboradores (2014a) 

han comprobado en  plantas de Arabidopsis que la traslocación forzada de la proteína 

2b de la cepa Fny (subgrupo IA) al núcleo disminuye la perturbación de las funciones 

del miRNA. Este último estudio es el más reciente que ha tratado la localización 

subcelular de la proteína 2b de CMV y, utilizando las cepas Fny y LS de CMV, ha 

mostrado que tanto la presencia citoplásmica como nuclear de la proteína son  

necesarias para el virus, regulando el equilibrio entre la acumulación viral y el daño a la 

planta y maximizando el beneficio para el virus,. También han asociado la localización 

nuclear con la virulencia de la cepa, y la actividad supresora de silenciamiento con la 

unión a siRNAs en el citoplasma (Du et al. 2014a). 

La localización de 2b en el núcleo hace pensar que la proteína desempeñe alguna 

actividad en el mismo. En el núcleo se encuentra el nucléolo y también los CBs (Ramón 

y Cajal 1903), estos últimos son estructuras dinámicas que se mueven, se fusionan y se 



52 
 

separan en el núcleo y nucléolo (Boudonck et al. 1999; Platani et al. 2000). Ambas 

subestructuras tienen un papel en el silenciamiento de RNA en plantas (Li et al. 2006; 

Pontes et al. 2006) y contienen diversas proteínas y pequeños RNAs (Cioce y Lamond 

2005) que se  han relacionado con la maduración de RNA y el ensamblaje de complejos 

relacionados con la transcripción (Collier et al. 2006), con la regulación del ciclo celular 

y con las respuestas a estreses de origen variado (Cioce y Lamond 2005; Boulon et al. 

2010). Los CBs están enriquecidos en la proteína coilina, de función desconocida, y 

fibrilarina, mientras que como componente principal del nucléolo encontramos 

fibrilarina y nucleolina (Chen et al. 2002). Recientemente se ha empezado a estudiar la 

relación entre proteínas nucleares y proteínas virales (Semashko et al. 2012a y 2012b) 

y Greco (2009) y Taliansky y colaboradores (2010) han mostrado que el núcleo y el 

nucléolo juegan un papel importante en algunas infecciones virales en humanos, 

animales y plantas, mientras que Kim y colaboradores (2007) han observado que el 

nucléolo y algunas proteínas nucleolares participan en los ciclos de algunos virus 

animales y vegetales, aunque la función de estas proteínas y el tráfico nucleolar en las 

infecciones virales es poco conocido. Se sabe que las proteínas que se localizan en el 

nucléolo están implicadas en el crecimiento y  ciclo celular (Pederson 1998; Carmo-

Fonseca et al. 2000; Olson et al. 2000), y la interacción de proteínas virales con estas 

proteínas nucleolares podría explicar su presencia en el nucléolo y el uso de funciones 

nucleolares que dirigen alteraciones en la transcripción celular y la alteración del ciclo 

celular, que facilitan la replicación viral. Debido a nuestras observaciones sobre la 

localización nucleolar y en CBs de la proteína 2b hemos analizado de modo preliminar 

una potencial interacción de la misma con las proteínas nucleares coilina, fibrilarina y 

nucleolina, que también se encuentran en el nucléolo y los CBs, mediante BiFC. 

Aún no se conoce la función de la coilina, que se ha relacionado con la formación de 

los CBs (Isaac et al. 1998; Hebert y Matera 2000; Semashko et al. 2012b) y une ácidos 

nucleicos (Bellini y Gall 1998). Los niveles de coilina determinan el tamaño (Collier et 

al. 2006) y número de los CBs (Shpargel et al. 2003), y su presencia es necesaria en su 

formación en A. thaliana, aunque no es esencial en la supervivencia de la planta 

(Collier et al. 2006). Boudonck y colaboradores (1999) han especulado que esta 

proteína tenga función de transporte, y también Bellini y Gall (1999) propusieron que, 



53 
 

en asociación con la fibrilarina, podrían formar parte de un sistema de transporte 

entre citoplasma y núcleo que involucre el citoplasma, nucléolo y CBs.  

La fibrilarina es una proteína muy conservada evolutivamente (Reichow et al. 2007) 

que se ha relacionado con el procesamiento de RNA ribosómico. Contiene un dominio 

terminal amino rico en glicina y arginina (glycine- and arginine-rich domain, GAR), con 

cargas positivas, con el que interacciona con otras proteínas celulares (Nicol et al. 

2000; Jones et al. 2001) y virales (Yoo et al. 2003; Kim et al. 2007); y otras regiones de 

unión a RNAs (Rakitina et al. 2011). La interacción con fibrilarina podría ser una 

propiedad común a varias proteínas virales en diferentes grupos taxonómicos: se ha 

observado su interacción con algunas proteínas de virus animales como la 

nucleocápsida del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (Porcine 

reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) (Chen et al. 2000; Hiscox 2002; 

Yoo et al. 2003; Hiscox 2007), aunque se desconoce su papel en las infecciones. 

También se ha observado su interacción con factores de virus de plantas que podrían 

utilizar la fibrilarina en el movimiento viral, el ensamblaje de ribonucleoproteínas 

(ribonucleoproteins, RNPs), y probablemente para combatir las defensas del huésped 

(Taliansky et al. 2010). Varios ejemplos son la interacción con la proteína 

multifuncional VPg del virus A de la patata (Potato virus A, PVA) (Rajamaki y Valkonen 

2009) o con la proteína ORF3 del virus de la roseta del cacahuete (Groundnut rosette 

virus, GRV), cuyo ciclo incluye una fase en el nucléolo en que participan los CBs. En 

este último caso la interacción participa en la formación de RNPs y es indispensable 

para la propagación viral a larga distancia en la planta (Kim et al. 2007).  

La nucleolina también  contiene un dominio GAR y un motivo de unión a RNA (Lapeyre 

et al. 1987). Se cree que los Adenovirus podrían afectar al nucléolo porque es allí 

donde se da la biogénesis de rRNA, y su interrupción podría liberar recursos para la 

biogénesis de mRNA de Adenovirus (Matthews 2001). Chen y colaboradores (2002) 

han documentado la interacción de la proteína N del virus de la bronquitis infecciosa 

(Infectious bronchitis virus, IBV), con la fibrilarina y la nucleolina; y Shimakami y 

colaboradores (2006) han informado de su interacción de la proteína no estructural 

NS5B del virus animal de la hepatitis C (Hepatitis C virus, HCV), indispensable en la 

replicación viral. Se ha documentado la redistribución de la fibrilarina hacia el 



54 
 

citoplasma consecuencia de la infección viral de Coronavirus (Chen et al. 2002) y 

Adenovirus (Puvium-Dutilleul y Christensen 1993), aunque aún no se conoce la razón 

de esta redistribución, también documentada en la nucleolina en infecciones con virus 

animales (Waggoner y Sarnow 1998; Matthews 2001). Yang y colaboradores (1994) 

piensan que esta redistribución podría evitar la interferencia de la proteína con la 

replicación viral, ya que actúa como represor de la transcripción. 

1.4.4. Estructura de la forma funcional de la proteína 2b  

Se ha caracterizado la estructura de varias proteínas supresoras de silenciamiento y se 

ha visto que muchas de ellas actúan formando parte de complejos o agregados, 

estables o transitorios, necesarios para su acción funcional. Estos agregados pueden 

estar formados por dos o más proteínas iguales, formando homodímeros como la 

proteína P19 de Tombusvirus, que secuestra siRNAs de 21 nts de doble cadena 

evitando que se unan al complejo RISC (Vargason et al. 2003; Ye et al. 2003) o la 

proteína NS3 del virus hoja blanca del arroz (Rice hoja blanca virus, RHBV) que también 

forma dímeros que unen siRNAs (Yang et al. 2011). Algunos supresores de 

silenciamiento pueden unir dsRNAs o RNAs largos (Mérai et al. 2006) como la proteína 

B2 de FHV, que forma un dímero que une dsRNA, evitando tanto la formación de 

siRNAs como su unión a RISC (Chao et al. 2005; Lingel et al. 2005). Incluso se pueden 

formar estructuras más complejas, como los dímeros de dímeros (tetrámeros) 

observados por cristalografía en la proteína 2b de TAV, que unen in vitro RNAs de 

doble cadena (Chen et al. 2008). En este caso primero se forman dímeros que unen 

siRNA y éstos se asocian en tetrámeros por uniones de hidrógeno y una cremallera de 

leucinas en el dominio terminal amino de la proteína (Rashid et al. 2008, Chen et al. 

2008). Recientemente Dong y colaboradores (2015) han informado de la formación no 

sólo de tetrámeros sino de oligómeros de mayor tamaño en la cepa Fny de CMV. Otras 

estructuras complejas observadas son las de la proteína P21 de BYV, que forma un 

anillo de ocho proteínas cuyo interior alberga cargas positivas que interaccionan con el 

RNA (Ye y Patel 2005).  

No se había visualizado in vivo la formación de ninguno de estos estos complejos 

previamente al desarrollo de esta tesis. Hamera y colaboradores (2012) observaron 



55 
 

que tanto los dímeros como los tetrámeros de 2b unen sRNAs con semejante afinidad, 

aunque encontraron que los tetrámeros unían preferentemente los sRNAs, 

comparados con los dímeros. Aunque también se podría interpretar sus resultados de 

otro modo, y es que en presencia de sRNAs las proteínas 2b tienen a tetramerizar, 

como observaron Chen y colaboradores (2008) en TAV, por lo que se encuentra más 

sRNAs unidos a tetrámeros que a dímeros. Xu y colaboradores (2013) mostraron, en la 

cepa Fny (subgrupo IA) de CMV, que la formación de dímeros de 2b era necesaria en la 

actividad supresora de silenciamiento de la proteína y la inducción de síntomas en 

Nicotiana, y que la mutación puntual del aa55 en esta cepa inhibía la formación de 

dímeros de 2b. Dong y colaboradores (2015) informaron recientemente de que las 

mutaciones puntuales de los aa15 y aa18 de 2b en esta cepa, que forman parte de la 

correspondiente cremallera de leucinas  en TAV (Chen et al. 2008), inhiben la 

formación de tetrámeros de 2b y la unión a siRNAs, y mostraron que la formación de 

dímeros de 2b es necesaria, pero no suficiente, para la actividad supresora de 

silenciamiento de la proteína 2b, en concordancia con nuestros resultados. Como se ha 

observado en varios estudios, la cepa Q (subgrupo II) de CMV tiene poco efecto en las 

funciones del miRNA en plantas transgénicas, probablemente por la inestabilidad o 

deficiencia de los dominios involucrados en esta actividad (Lewsey et al. 2007; Zhang 

et al. 2006b); mientras que la cepa Fny (subgrupo IA) es muy estable e interrumpe las 

funciones del miRNA (Lewsey et al. 2007; Zhang et al. 2006b), y los resultados de Dong 

y colaboradores (2015) indican que la cepa Q, cuyo aa18 contiene un residuo diferente 

al de cepa Fny y tiene poca eficiencia en la unión a siRNAs, no forma tetrámeros, y han 

sugerido una relación entre ambos hechos, aunque sin poder establecer una relación 

causal.  



56 
 

  



57 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS    



58 
 

  



59 
 

A pesar de su pequeño tamaño, la proteína 2b de Cucumovirus presenta propiedades 

tales como a) su interacción con proteínas celulares de la ruta de silenciamiento como 

AGO1, suprimiendo su actividad catalítica (Zhang et al. 2006b, Duan et al. 2012) y  

AGO4 (Hamera et al. 2012), y b) su unión a siRNAs, que puede incluso traslocar al 

núcleo y nucléolo (Kanazawa et al. 2011) y a través de cuyo secuestro podría inhibir el 

PTGS antiviral, como se ha visto en otros supresores de silenciamiento. A través de 

estas interacciones realiza sus funciones como supresor del silenciamiento de RNA 

inducido por siRNAs y de la metilación de DNA dependiente de RNA (Duan et al. 2012), 

siendo un determinante de virulencia viral (Shi et al. 2002); y suprime la dispersión de 

silenciamiento célula-célula (Guo y Ding 2002; Nemes et al. 2014) y a larga distancia 

(Ham et al. 1999).  

Los estudios iniciales habían asociado la localización nuclear de la proteína con su 

actividad como determinante de patogenicidad. Sin embargo, estudios posteriores, 

entre ellos los nuestros, han demostrado que la acumulación de la proteína 2b en el 

núcleo no es suficiente para que ésta presente actividad supresora de silenciamiento 

de RNA, y se ha propuesto que las regiones de la proteína que contienen las NLSs 

tienen otro papel además de intervenir en  el transporte de la proteína al núcleo, como 

es la unión a RNAs (Wang et al. 2004). Otras líneas de investigación han sugerido que 

el mecanismo de actuación de la proteína 2b de CMV es mediado por su interacción 

con proteínas AGO (Zhang et al. 2006b; Hamera et al. 2012; Duan et al. 2012; Feng et 

al. 2013), bloqueando su actividad o inhibiendo su expresión (Ye et al. 2009). Las 

interacciones de algunas proteínas virales con proteínas vegetales son importantes en 

el curso de una infección viral, aunque aún se sabe poco de las interacciones de 

proteínas supresoras con proteínas del huésped. Al inicio de este trabajo no se había 

visualizado in vivo la interacción de la proteína 2b con las proteínas AGO, ni estaba 

claro qué dominios de la proteína determinaban estas actividades o cómo contribuían 

a la supresión de silenciamiento. En cuanto a la estructura del supresor de 

silenciamiento 2b, Chen y colaboradores (2008) habían mostrado por cristalografía que 

la proteína ortóloga de TAV formaba dímeros y tetrámeros y que estos complejos 

unían in vitro RNAs de doble cadena, pero no se había visualizado in vivo la formación 

de dímeros o estructuras más complejas en CMV. Otras líneas de investigación se 



60 
 

habían centrado más en la unión de la proteína 2b a siRNAs y miRNAs, y los síntomas 

desarrollados en plantas infectadas con CMV hicieron pensar que algunos de los 

efectos observados se debían a la inhibición de las rutas de miRNAs (Zhang et al. 

2006a; Du et al. 2014b), pero al inicio de este trabajo tampoco se habían estudiado 

comparativamente las cinéticas de dichas uniones a diferentes tipos de RNAs o 

utilizado diferentes proteínas mutantes de función en dichos estudios.  

Por todo ello al comienzo de nuestro estudio nos encontramos con preguntas acerca 

del modo de acción in vivo de la proteína 2b de CMV en su función supresora, tales 

como si era necesaria o no su presencia nuclear para la actividad supresora de 

silenciamiento; si su actividad en la supresión de silenciamiento estaba relacionada 

con la unión y secuestro de RNAs de las rutas del silenciamiento; o si su actividad 

estaba más relacionada con la interacción con proteínas de la ruta de silenciamiento, 

sin olvidarnos de que nos encontrábamos con una proteína con un mecanismo de 

acción potencialmente múltiple. Junto con estas preguntas surgieron otras durante el 

desarrollo de la tesis, como intentar esclarecer el papel que cumple la proteína 2b en 

el nucléolo y si potencialmente podría interaccionar con proteínas nucleares. 

Teniendo en cuenta estas premisas y el estado de conocimiento del tema en el 

momento de iniciar esta tesis doctoral, nuestros objetivos principales fueron: 

1. Estudiar el efecto que generan diversas mutaciones y la fusión a distintos genes, 

reporteros o de otro tipo, en la actividad supresora de silenciamiento de la proteína, 

visualizar la localización subcelular de la proteína 2b y la de una batería de mutantes in 

vivo en un sistema libre de virus, y establecer si existe relación entre una localización 

subcelular determinada y la actividad supresora de silenciamiento de la proteína.  

2. Visualizar in vivo la formación y localización de homodímeros de la proteína 2b y de 

heterodímeros con los efectores de RISC AGO1 y AGO4, y determinar si las alteraciones 

que afectan a la actividad supresora de la proteína guardan alguna relación con estas 

interacciones.  

3. Caracterizar la unión in vitro de la proteína 2b a diversos tipos de RNAs y las 

características de sus cinéticas de unión y determinar, mediante el uso de una batería 



61 
 

de mutantes, si la unión a determinados tipos de RNAs correlaciona con la actividad 

supresora de silenciamiento de la proteína 2b de CMV, y qué dominios o motivos de 2b 

determinan esta capacidad.   

4. Visualizar potenciales interacciones in vivo entre la proteína 2b y proteínas 

nucleares que pudieran ser funcionalmente relevantes.  

5. Relacionar los resultados de las diversas aproximaciones seguidas para el estudio de 

la proteína 2b: de biología celular in vivo con construcciones fluorescentes; de los 

estudios in vitro con diversos tipos de RNAs; de actividades funcionales en ensayos 

biológicos de supresión del silenciamiento in planta, y establecer las conclusiones 

pertinentes.  

 

Nuestro trabajo ha intentado contribuir a clarificar la relación entre la actividad 

supresora de silenciamiento de RNA, la localización subcelular de la proteína, la 

interacción con proteínas Argonauta, la unión a siRNAs y una potencial interacción de 

la proteína con ciertas proteínas nucleares. La mayor parte de los resultados 

presentados en esta tesis se han publicado en los artículos en revistas de alto impacto 

González et al. 2010. Molecular Plant-Microbe Interaction. 23, 294; y González et al. 

2012. RNA. 18, 771. 

 

 

 

 



62 
 

  



63 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. MATERIAL Y MÉTODOS    



64 
 

  



65 
 

3.1. Material biológico 

3.1.1. Plantas 

Se utilizaron plantas de la especie Nicotiana benthamiana. Las plantas se cultivaron en 

cámara de ambiente controlado en condiciones óptimas de crecimiento, a 22-24ºC, 

con humedad relativa de 60-75% y fotoperiodo de 16:8 horas de luz:oscuridad. Como 

sustrato  se empleó una mezcla de tierra vegetal y vermiculita en proporción 2:1.  

3.1.2. Cepa Fny de CMV 

Se utilizó la cepa Fny de CMV perteneciente al subgrupo IA (Roossinck et al. 1999). El 

gen correspondiente a la proteína 2b de CMV Fny con número de acceso de GenBank 

D00355 se clonó a partir del vector pFny209 (Rizzo y Palukaitis 1990). Su secuencia 

nucleotídica y peptídica se puede consultar en la Fig. 7. 

3.1.3. Cultivos bacterianos 

Según el fin del cultivo bacteriano, se utilizaron bacterias de la especie Escherichia coli 

de las estirpes DH5α, XL1-Blue y JM109. Estas tres estirpes pueden acumular DNA 

plasmídico con alta calidad para su aislamiento y análisis posteriores (Taylor et al. 

1993). Además, se utilizó la especie Agrobacterium tumefaciens desarmada, estirpe 

C58C1. Las células electrocompetentes de estas bacterias fueron preparadas en el 

propio laboratorio a partir de un inóculo conservado en glicerol. Se transformaron las 

mismas por electroporación. 

E. coli DH5α (Hanahan 1985) permite amplificar DNA plasmídico. E. coli XL-1 Blue 

(Bullock et al. 1987) se utilizó para amplificar el DNA plasmídico derivado de plásmidos 

pQE30, ya que éste plásmido resulta tóxico para bacterias E. coli DH5α. Finalmente E. 

coli JM109 (Yanisch-Perron et al. 1985) se utilizó para la expresión de proteínas 2b y 

mutantes en bacteria. Los cultivos se crecieron en fase exponencial a 37ºC, con 

agitación de 200 revoluciones por minuto (rpm). 



66 
 

A. tumefaciens C58C1 se utilizó para agroinfiltrar plantas. La agroinfiltración es un 

método para conseguir la expresión transitoria de genes en tejidos de planta. El 

método se basa en inyectar en las hojas una suspensión de Agrobacterium 

conteniendo plásmidos binarios con los genes a expresar en la región del DNA de 

transferencia (transfer DNA, T-DNA). Los cultivos se crecieron en fase exponencial a 

28ºC, con agitación a 220 rpm durante dos días. 

  



67 
 

 

 

Fig. 7: Secuencia del gen 2b y secuencia peptídica de la proteína 2b de la cepa Fny de CMV. Sombreado 
en azul, alfa-hélices (α1, α2 y α3) de la proteína 2b. Sombreado en rojo, delecciones de las proteínas 
mutantes. Las letras rojas representan aminoácidos con carga positiva, y las letras verdes representan 
aminoácidos con carga negativa en la proteína. Los números indican los nucleótidos en la secuencia del 
gen. 

  



68 
 

3.2. Clonaje de las construcciones plasmídicas 

3.2.1. Mutantes de la proteína 2b de la cepa Fny de CMV 

Se utilizó la proteína 2b de la cepa Fny de CMV y nueve mutantes que presentaron, 

como se muestra en la Tabla 1 y Fig. 8, delecciones en los dominios amino y carboxilo 

(CMV2bΔ5T y CMV2bΔ3T, respectivamente), en una o ambas NLSs (CMV2bΔNLS1, 

CMV2bΔNLS2 y CMV2bΔNLS1+2), en el supuesto motivo de fosforilación 

(CMV2bΔKSPSE) y en un dominio relacionado con la inhibición de la transcripción de 

AGO4 (CMV2bΔGSEL) por Ye y colaboradores (2009). Además, se utilizaron dos 

mutantes por sustitución puntual de Serina por Alanina en los aa S40 y S42 (CMV2bS40A 

y CMV2bS42A), dentro del supuesto motivo de fosforilación.    

 

Tabla 1: Resumen de los aminoácidos (aas) afectados por las mutaciones en la proteína 2b de la cepa 
Fny de CMV con número de acceso de GenBank D00355. El gen 2b se clonó a partir del vector infectivo 
pFny209 correspondiente al RNA 2 del virus (Rizzo y Palukaitis 1990). Se generaron una serie de 
mutantes en diferentes puntos de la proteína de estudio, por delección de los nucleótidos (nts) del 
RNA2 de CMV indicados en la tabla. ML: Mutantes procedentes del grupo del Prof. John Carr 
(Department of Plant Sciences, University of Cambridge, Downing Street, Cambridge CB2 3EA, UK) en 
forma de plásmido F209 con las mutaciones correspondientes. IG: mutantes clonados en el laboratorio 
del Dr. Tomás Canto (Grupo “Interacciones moleculares planta/virus/vector” del CIB-CSIC, Ramiro de 
Maeztu 9, 28040 Madrid). ML/IG: mutantes utilizados por ML en estudios previos y clonados de nuevo 
en el laboratorio del Dr. Tomás Canto.  

CMV Proteína Nativa RNA 2 de la cepa Fny de 
CMV 

CMV2bΔ5T (ML/IG) Delección de aas 1 a 17 nts 2419 a 2469 

CMV2bΔNLS1 (ML) Delección de aas 22 a 27 nts 2482 a 2499 

CMV2bΔNLS2 (ML) Delección de aas 33 a 36 nts 2515 a 2526 

CMV2bΔNLS1+2 (ML) Delección de aas 22 a 27 y 33 a 36 nts 2482 a 2499 y 2515 a 
2526 

CMV2bΔKSPSE (ML) Delección de aas 39 a 43 nts 2533 a 2547 

CMV2bS40A (ML) Sustitución de aa
40

: Serina por Alanina nts 2535 a 2537  
sustitución de AG por GC 

CMV2bS42A (ML) Sustitución de aa
42

: Serina por Alanina nts 2542 a 2543  
sustitución de AG por GC 

CMV2bΔGSEL (IG) Delección de aas 62 a 65 nts 2602 a 2613 

CMV2bΔ3T (ML/IG) Delección de aas 95 a 110 nts 2701 a 2748 

 

 



69 
 

 

Fig. 8. Representación esquemática de la proteína 2b de CMV y de los mutantes utilizados. A, se muestra 
la secuencia proteica de la proteína 2b de la cepa Fny de CMV comparada con la secuencia de otras 
proteínas 2b (adaptado de Chen et al. 2008). B, esquema de la proteína 2b de CMV ilustrando la 
presencia de regiones con estructura de alfa hélices, sombreado en naranja; con la distribución de las 
delecciones, rayado; y mutaciones puntuales, marcadas en negro, de los mutantes utilizados en este 
estudio. 

 

3.2.2. Amplificación de DNA mediante la reacción en cadena de la 

polimerasa (PCR) 

La amplificación de fragmentos de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa 

(polymerase chain reaction, PCR) se realizó empleando como molde preparaciones de 

DNA plasmídico  (0,1-0.5 µg). La mezcla de reacción se ajustó a 50 µl, en tampón HF 

(Finnzymes) con una concentración final de 1.5 mM MgCl2, en presencia de 

oligonucleótidos específicos para el fragmento que se deseaba amplificar (ver Anexo II) 

a concentración final 1,3 µM cada uno, mezcla de desoxinucleótidos (dATP, dCTP, 

dGTP, dTTP) (Promega. Cat. U120A a U123A) a concentración final 0.2 mM cada uno y 

2 unidades de enzima termoestable Phusion® High Fidelity DNA Polymerase 

(Finnzymes. Cat. F-530L). El número y condiciones de los ciclos de amplificación 



70 
 

variaron en función de los oligonucleótidos utilizados y el tamaño del fragmento a 

amplificar. La reacción se realizó en termociclador (Thermal Cycler 2720. Applied 

Biosystems). 

3.2.3. Electroforesis en geles de agarosa 

La separación de fragmentos de DNA se realizó mediante electroforesis en geles de 

agarosa (Agarose D2. Pronadisa. Cat. 8034) al 1% en tampón Tris-Acetato EDTA (Tris 

acetate-EDTA, TAE) pH 8, conteniendo bromuro de etidio (BrEt; Sigma Aldrich. Cat. E-

8751). La electroforesis se llevó a cabo a 100-120 V hasta la correcta separación y 

diferenciación de la bandas de ácidos nucleicos. Los geles se visualizaron por 

transiluminación con luz ultravioleta (UV) en Transiluminador Molecular Imager® Gel 

DocTM XR (BIO-RAD). Como marcador de peso molecular se utilizó 1 kb DNA Ladder 

(Promega. Cat. G5711) y marcador de carga Blue/Orange 6X Loadding Dye (Promega. 

Cat. G190A). 

En experimentos de unión de RNA a proteína la electroforesis se realizó en geles de 

agarosa al 2% en tampón Tris-Acetato (Tris acetate, TA) pH 8, conteniendo BrEt. La 

electroforesis se llevó a cabo a 110 V durante 11 minutos, lo que permite que el RNA 

libre se introduzca en el gel aproximadamente un centímetro, suficiente para su 

visualización y cuantificación. Como marcador de peso molecular y control negativo se 

utilizó el sRNA conveniente en cada gel. Los geles  se visualizaron con el 

transiluminador Molecular Imager® Gel DocTM XR (BIO-RAD). Se tomaron imágenes 

digitales para su posterior cuantificación.  

3.2.4. Clonaje en plásmidos binarios pROK2 

Para la expresión transitoria en plantas, clonamos la proteína 2b de la cepa Fny de 

CMV en el vector binario Ti, pROK2 (Baulcombe et al. 1986). El plásmido pROK2 es un 

derivado del vector binario pBin19 (Bevan 1984). pROK2 es un vector grande (12.8 Kb) 

que consta de un cassete de expresión con el promotor 35S de CaMV, un sitio múltiple 

de clonaje (multiple cloning site, MCS) y el fragmento terminador del gen de la 

nopalina sintasa del T-DNA de Agrobacterium (Nopaline synthase terminator, NOS 

TERM).  



71 
 

Se digirió el plásmido y el fragmento a clonar, proveniente de PCR o por digestión 

previa de otro clon, en un volumen de reacción de 50 µl, en presencia de albúmina de 

suero bovino (bovine serum albumin, BSA). Se adecuaron las condiciones de digestión 

a las enzimas utilizadas, realizándose digestiones secuenciales en aquellos casos en 

que las condiciones requeridas para el correcto funcionamiento de las enzimas eran 

incompatibles. Tras la digestión se trataron los plásmidos con Fosfatasa Alcalina FastAP 

(Fermentas. Cat. EF0651), según las instrucciones del fabricante, para evitar su 

recircularización y se precipitaron  y lavaron los ácidos nucleicos, resuspendiéndolos en 

15 µl. Este volumen se cargó en un gel de agarosa 1% en tampón TAE y se separaron 

las bandas por electroforesis. Se tomaron del gel aquellas bandas que correspondían al 

plásmido y a los fragmentos digeridos y se extrajeron del mismo con Qiaex II Gel 

Extraction Kit (QIAGEN. Cat. 20021). En este procedimiento, al añadir la solución QX1 y 

disolver la banda del gel de agarosa, se puso en contacto el plásmido y fragmento 

requeridos para cada construcción, anterior a la adición de la resina (QIAEX II 

suspension) del kit. Se continuó según las instrucciones del fabricante, seguido de 

precipitación y lavado de los ácidos nucleicos. Finalmente se resuspendieron los ácidos 

nucleicos en 15 µl de mezcla de reacción de ligación. La ligación de llevó a cabo a 16ºC 

durante toda la noche con T4 DNA Ligasa (PROMEGA. Cat. M180A). El producto de la 

ligación de utilizó para transformar E. coli. 

Anteriormente se había clonado la proteína 2b de CMV Fny en pROK2, construcción 

pROK-2b (Canto et al. 2002). Contábamos además, con las construcciones pROK-mRFP 

y pROK-GFP que expresaban la proteína fluorescente roja (monomeric red fluorescent 

protein 1, mRFP1) (Shaner et al. 2004) y  verde (green fluorescent protein, GFP) (Canto 

et al. 2002), respectivamente. La proteína 2b se amplificó por PCR (oligonucleótidos 79 

y 97, ver Anexo II) y se clonó usando las enzimas de restricción Bam HI y Sac I, en los 

extremos 5’ y 3’ respectivamente, generando las construcciones pROK-2b-mRFP y 

pROK-GFP-2b. Todas las construcciones marcadas con GFP contienen una variante de 

GFP con fluorescencia desplazada al rojo (Tu65; Clontech) que no es visible bajo la 

lámpara UV (Black Ray, UVP). Además, se clonó 2b en un plásmido pROK que contenía 

el péptido hemaglutinina (Hemaglutinin, HA) de la hemaglutinina del virus de la gripe, 

para generar la construcción pROK-2b-HA.  



72 
 

Para generar los vectores para complementación bimolecular fluorescente 

(bimolecular fluorescence complementation, BiFC) basados en pROK2, se utilizaron las 

mitades amino y carboxilo de la proteína fluorescente amarilla (splits yellow 

fluorescent protein, sYFP; sYFPN y sYFPC, respectivamente): sYFPN, aas 1 a 154 y 

sYFPC, aas 155 a 238 (Bracha-Drori et al. 2004). Se generaron así las construcciones 

pROK-sYFPN y pROK-sYFPC. La proteína 2b y los mutantes utilizados (todas las 

construcciones sin el péptido HA) se clonaron en estos vectores con las enzimas de 

restricción Bam HI y Sac I en extremos 5’ y 3’, respectivamente (ver Anexo III). Con esto 

generamos las construcciones pROK-sYFPN-2b y pROK-sYFPC-2b. 

Del mismo modo que con la proteína nativa, los mutantes de la proteína 2b utilizados 

se amplificaron mediante PCR a partir de clones infectivos que contenían los cDNAs 

mutantes del RNA 2 de Fny de CMV (Fny-CMVΔNLS1, Fny-CMVΔNLS2, Fny-

CMVΔNLS1+2, Fny-CMVS40A, Fny-CMVS42A), amablemente donados por Mathew 

Lewsey (Lewsey et al. 2009) del grupo del Prof. John Carr. Generamos así las 

construcciones en pROK2: pROK-2bΔNLS1, pROK-2bΔNLS2, pROK-2bΔNLS1+2, pROK-

2bΔKSPSE, pROK-2bS40A, pROK-2bS42A; en pROK-GFP: pROK-GFP-2bΔNLS1, pROK-

GFP-2bΔNLS2, pROK-GFP-2bΔNLS1+2, pROK-GFP-2bΔKSPSE, pROK-GFP-2bS40A, pROK-

GFP-2bS42A; en pROK con el péptido HA en el extremo 3’ de la secuencia del gen de 

2b: pROK-2bΔNLS1-HA, pROK-2bΔNLS2-HA, pROK-2bΔNLS1+2-HA, pROK-2bΔKSPSE-HA, 

pROK-2bS40A-HA, pROK-2bS42A-HA; y en pROK a continuación de las mitades amino y 

carboxilo de la proteína YFP: pROK-sYFPN-2bΔNLS1, pROK-sYFPN-2bΔNLS2, pROK-

sYFPN-2bΔNLS1+2, pROK-sYFPN-2bΔKSPSE, pROK-sYFPN-2bS40A, pROK-sYFPN-2bS42A; 

y pROK-sYFPC-2bΔNLS1, pROK-sYFPC-2bΔNLS2, pROK-sYFPC-2bΔNLS1+2, pROK-sYFPC-

2bΔKSPSE, pROK-sYFPC-2bS40A, pROK-sYFPC-2bS42A). 

Para generar el mutante 2bΔGSEL, se amplificaron por PCR las secuencias que 

flanquean el fragmento GSEL a deleccionar de la proteína 2b con los oligonucleótidos 

245 y 325 (ver Anexo II), y se purificaron, seguido de acción con kinasa y ligación con 

T4 DNA ligasa (PROMEGA. Cat. M180A). El resultado de la ligación se utilizó como 

molde de PCR con los oligonucleótidos 79 y 97 (ver Anexo II), correspondientes a los 

extremos de la secuencia de 2b, con las dianas de restricción Bam HI y Sac I.  El 

fragmento resultante de esta PCR se digirió con las enzimas apropiadas para clonarlo 



73 
 

en los plásmidos pROK2, pROK-GFP, pROK-sYFPN y pROK-sYFPC,  pROK-HA y pQE30. 

Obtuvimos así las construcciones pROK-2bΔGSEL, pROK-GFP-2bΔGSEL, pROK-sYFPN-

2bΔGSEL y pROK-sYFPC-2bΔGSEL, pROK-2bΔGSEL-HA y pQE-2bΔGSEL-HA. Para sustituir 

la proteína nativa en pF209 por 2bΔGSEL, se utilizó una aproximación semejante. 

Las proteínas mutantes 2bΔ5T y 2bΔ3T, con delecciones en los extremos 5’ y 3’ del 

gen, se generaron por PCR con los pares de oligonucleótidos 285 y 357, y 79 y 358, 

respectivamente. Los fragmentos resultantes se digirieron con las enzimas apropiadas 

para clonarlos en pROK2, pROK-GFP, pROK-sYFPN y pROK-sYFPC,  pROK-HA y pQE30. 

Así obtuvimos las construcciones pROK-2bΔ5T y pROK-2bΔ3T, pROK-GFP-2bΔ5T y 

pROK-GFP-2bΔ3T, pROK-sYFPN-2bΔ5T y pROK-sYFPC-2bΔ5T, pROK-sYFPN-2bΔ3T y 

pROK-sYFPC-2bΔ3T, y pQE-2bΔ5T y pQE-2bΔ3T. 

También utilizamos una construcción de pROK2 que expresa la proteína fibrilarina 

fusionada a mRFP (pROK-Fib-mRFP) (Kim et al. 2007), donada amablemente por M. 

Taliansky y S.-H. Kim (The James Hutton Institute, Dundee, Reino Unido). Y se clonaron 

las proteínas coilina y nucleolina de A. thaliana y fibrilarina de N. benthamiana en los 

plásmidos pROK-GFP y pROK-sYFPN y pROK-sYFPC. Inicialmente se clonaron en un 

plásmido psk, de alto número de copias, y de éste se traspasaron a los plásmidos 

pROK. A partir de cDNA de Arabidopsis se amplificó la coilina con los oligonucleótidos 

312 y 314, y la nucleolina con los oligonucleótidos 322 y 323. La fibrilarina de N. 

benthamiana se amplificó a partir del plásmido pROK-Fib-mRFP con los 

oligonucleótidos 309 y 311. El fragmento resultante de coilina se clonó en el plásmido 

psk con las enzimas de restricción Kpn I y Sac I en extremos 5’ y 3’, y el resultante de la 

nucleolina con las enzimas de restricción Bam HI y Kpn I en los extremos 5’ y 3’, 

respectivamente (ver Anexo III). El fragmento resultante de la fibrilarina se clonó en el 

plásmido psk con las enzimas de restricción Bam HI y Sac I en los extremos 5’ y 3’, 

respectivamente. Con esto generamos las construcciones psk-coilina, psk-nucleolina y 

psk-fibrilarina. Posteriormente se digirieron los fragmentos de coilina, fibrilarina y 

nucleolina a partir de estos plásmidos y se clonaron en los plásmidos pROK-GFP, pROK-

sYFPN y pROK-sYFPC con las enzimas de restricción Kpn I y Sac I para la construcción 

pROK-GFP-coilina, pROK-sYFPN-coilina y pROK-sYFPC-coilina; las enzimas de restricción 

Bam HI y Kpn I para las construcciones pROK-GFP-nucleolina, pROK-sYFPN-nucleolina y 



74 
 

pROK-sYFPC-nucleolina; y las enzimas de restricción Bam HI y Sac I para las 

construcciones pROK-GFP-fibrilarina, pROK-sYFPN-fibrilarina y pROK-sYFPC-fibrilarina.  

Para aportar una señal de exportación Nuclear (nuclear export signal, NES) a la 

proteína 2b, se tomó la NES de la proteína inhibidora de kinasa (protein kinase 

inhibitor, PKI), con secuencia peptídica Asn-Glu-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Leu-Asp-

Ile-Asn-Lys-Thr-Ala (Wen et al. 1995). Se amplificó con los oligonucleótidos 333 y 334 

(Ver Anexo II) que añadieron, en extremo 5’ un ATG (codón metionina) con diana de 

restricción Nhe I, y en el extremo 3’ la diana de Xba I. Tras digerir el producto de PCR 

con ambas enzimas, se clonó el fragmento de PCR conteniendo NES en las 

construcciones pROK-GFP-2b y pROK-GFP-2bΔKSPSE linearizadas con Xba I, generando 

respectivamente los plásmidos pROK-NES-GFP-2b y pROK-NES-GFP-2bΔKSPSE. 

Posteriormente en este plásmido, se eliminó el segundo ATG correspondiente a la 

primera metionina de la GFP, para evitar la iniciación interna de la traducción por 

ribosomas en el RNA mensajero, ya que se observó que  a partir de pROK-NES-GFP-2b 

se expresaban las proteínas NES-GFP-2b y GFP2b (datos no mostrados).  

Para ello, se realizó una PCR de GFP-2b eliminando el ATG inicial a partir de NES-GFP-

2b con los oligonucleótidos 289 y 410 (ver Anexo II). A continuación se clonó pROK-

NES-GFP2b y el resultado de la PCR digeridos con las enzimas Xba I y Bam HI, con lo 

que se sustituye el GFP con ATG inicial por GFP sin ATG inicial.   

3.2.5. Clonaje en plásmidos pQE30 

El plásmido pQE30 (Qiagen)  es un vector de expresión de proteínas pequeño, de 3.4 

kilobases (kbs) que consta de un promotor T5, el operón lac inducible por Isopropil-β-

D-1-tiogalactopiranósido (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG), un fragmento 

correspondiente a 6 Histidinas (6xHis), MCS, región terminadora y resistencia a 

ampicilina (Fig. 9). Las histidinas quedan fusionadas al extremo amino de la proteína 

una vez expresada en bacteria y permiten la purificación de la misma por 

cromatografía de afinidad.  



75 
 

 

Fig. 9: Esquema del plásmido pQE30 utilizado para la expresión de la proteína 2b y mutantes en 
bacteria, una vez clonadas la proteína nativa y mutantes en el MCS. 

 

Para la expresión de la proteína 2b de CMV y sus mutantes en E. coli, se realizó una 

PCR a partir de pF209 y pF209 conteniendo las mutaciones (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 

2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL, 2bΔ5T y 2bΔ3T) con los 

oligonucleótidos 79 y 285 (ver Anexo II). El primero añade la diana de restricción Bam 

HI y el segundo añade el péptido HA y la diana de restricción Sac I. Se digirieron el 

plásmido y fragmentos correspondientes a 2b-HA nativo y 2b-HA mutantes, con Bam 

HI y Sac I y se ligaron  con pQE30. Generamos así las construcciones pQE-6xHis-2b-HA y 

los diferentes  pQE-6xHis-2b-HA mutantes 

3.2.6. Transformación de bacterias 

Para introducir las construcciones plasmídicas en las bacterias, se partió de células 

competentes. La técnica empleada fue electroporación. En este caso se somete a las 

bacterias a un campo eléctrico que desestabiliza las estructuras de membrana. 

Durante este proceso se inducen poros temporales por los que el DNA puede entrar en 

las bacterias. 

Se utilizaron cubetas Bio-Rad de paso óptico de 0.2 cm (Gene Pulser/MicroPulser 

Cuvettes BIO-RAD. Cat. 165-2086). Para introducir las construcciones generadas en E. 

coli y A. tumefaciens se utilizó el electroporador MicroPulser TM (BIO-RAD). 



76 
 

Tras la electroporación se dejó las células una hora en medio de recuperación (medio 

de cultivo Luria Bertani, LB; 15mM MgCl2) y posteriormente se sembró en césped en 

placas de Petri con medio LB  (bactotriptona 10g/l, extracto de levadura 5g/l y NaCl 

10g/l)/Agar en presencia de los antibióticos pertinentes en cada caso. Se dejó crecer E. 

coli 24h a 37ºC; A. tumefaciens se dejó 48h a 28ºC. Una vez crecidas las colonias, 

seleccionamos algunas de ellas y las crecimos en medio LB con antibióticos, E. coli a 

37ºC y A. tumefaciens a 28ºC,  con agitación 200 y 220 rpm, respectivamente. 

3.2.7. Purificación de DNA plasmídico 

La purificación de DNA plasmídico se realizó a partir de cultivos de E. coli, estirpes 

DH5α y XL-1 Blue, crecidos en medio de cultivo en presencia del antibiótico adecuado 

a la cepa bacteriana y construcción que se quiere seleccionar. Para ello se cultivaron 

las bacterias conteniendo el plásmido de interés en 5 ml de medio LB con el antibiótico 

a 37ºC y 200 rpm durante 24h. Se centrifugó los cultivos y, se purificó los plásmidos a 

partir del precipitado (pellet) haciendo miniprep con High Pure Plasmid Isolation Kit 

(Roche. Cat. 11754777001). 

3.2.8. Selección de clones y secuenciación 

Tras la digestión con las enzimas apropiadas, seleccionadas para cada construcción, se 

seleccionaron aquellos clones de la construcción cuyo patrón de digestión se 

correspondía con el esperado para la construcción de interés.Se secuenciaron estos 

resultados de miniprep en el servicio de secuenciación Secugen S.L.  

Siguiendo las instrucciones de Secugen S.L., se mandó para la secuenciación un 

volumen de 15 µl de la muestra con concentración adecuada y 1,5 µl de 

oligonucleótidos a concentración 5 µM. 

En el caso de plásmidos con bajo número de copia, como ocurre con el plásmido 

pROK2, es habitual una pobre secuenciación de la construcción. En estos casos se 

realizó una PCR previa a la secuenciación, con los mismos oligonucleótidos que se 

emplearían en la secuenciación, para amplificar el fragmento y poder secuenciarlo. Los 

clones en plásmidos psk se mandaron secuenciar con los oligos F17 y R19 



77 
 

proporcionados por el servicio de secuenciación Secugen S.L. (Anexo II); los clones en 

plásmidos pROK se mandaron secuenciar con los oligonucleótidos 327 y 328 (Anexo II); 

los clones en el plásmido pQE30 se mandaron secuenciar con los oligonucleótidos 329 

y 330 (Anexo II); y el clon Fny2bΔGSEL se mandó secuenciar con los oligonucleótidos 

79 y 97 (Anexo II). 

 

3.3. Expresión transitoria de genes en tejidos vegetales 

mediante agroinfiltración 

La técnica de agroinfiltración permite expresar transitoriamente en planta proteínas 

nativas o modificadas, previamente clonadas en un vector de expresión. Este vector se 

introduce en una cepa desarmada de Agrobacterium que, en contacto con tejidos 

vegetales por infiltración sobre la propia hoja, introduce el segmento de interés en las 

células vegetales infectadas, donde se expresa transitoriamente la proteína de interés. 

Esto nos permite, por ejemplo, estudiar los efectos de una proteína aislada del entorno 

viral.  La técnica de agroinfiltración y sus aplicaciones en expresión transitoria de genes 

y en ensayos de supresión del silenciamiento de un gen reportero por proteínas virales 

con actividades supresoras ha sido descrita y puesta a punto previamente (English et 

al. 1997; Voinnet et al. 1998; Johnasen y Carrington 2001; Canto et al. 2002).  

3.3.1. Crecimiento e inducción de cultivos de Agrobacterium 

Para transferir las construcciones obtenidas en E. coli a A. tumefaciens se utilizó la 

técnica de electroporación con BIO-RAD MicroPulser TM de plásmidos purificados, 

como se ha descrito anteriormente en el punto 3.2.6. Tras el crecimiento de colonias 

en placa, se seleccionó una, redonda y aislada, y se dejó crecer en medio LB en 

presencia de los antibióticos pertinentes en un volumen de 2 ml durante 24 horas, tras 

lo cual se aumentó el cultivo a 5 ml y se dejó crecer 24 horas más. Las condiciones del 

cultivo fueron de 28ºC, 220 rpm, como se ha descrito previamente.  



78 
 

3.3.2. Agroinfiltración de tejidos vegetales 

Para expresar las construcciones de la proteína 2b y sus mutantes en N. benthamiana, 

transformamos una cepa desarmada de A. tumefaciens, C58C1 (van Larebeke et al. 

1974), con los plásmidos binarios que contenían la construcción a expresar. Crecimos 

los cultivos de bacterias en medio LB con antibióticos a 28ºC, hasta fase de crecimiento 

exponencial. Centrifugamos a baja velocidad para eliminar el medio de cultivo y 

resuspendimos los cultivos bacterianos en medio de inducción (10mM ácido 2-N-

morfolino-etanosulfónico [morpholineethanesulfonic acid, MES]; 10 mM MgCl2; 200 

µM Acetosyringona) con una densidad óptica (optical density, OD) a 600 nm (OD600) de 

0,2.  

Tras una inducción de 2-3 horas a temperatura ambiente y sin agitación, infiltramos 

hojas de N. benthamiana completamente expandidas. Sobre la hoja, en el punto de 

infiltración, practicamos un pequeño orificio con una punta de pipeta pequeña y sobre 

ésta, presionamos con cuidado e infiltramos desde la superficie del envés de la hoja 

una porción de cultivo bacteriano inducido con acetosyringona, utilizando para ello 

jeringuillas de 1 ml, sin aguja (Fig. 10). El tejido infiltrado resultante tiene forma 

circular y un diámetro aproximado de 2 cm. En aquellos casos en que era necesario 

infiltrar más de una construcción en la misma en la misma infiltración, preparamos las 

mezclas de los cultivos que contenían las construcciones a infiltrar en medio de 

inducción (cada cultivo bacteriano a mezclar a una OD600 final de 0,2) para su 

infiltración en las hojas.  

De forma habitual infiltramos dos focos por hoja (izda. y dcha. de la hoja) y dos hojas 

por planta. Cada experimento se repitió al menos dos veces. Tras la infiltración, se 

esperó de 3 a 6 días para visualizar el resultado con lámpara UV o en microscopio 

confocal. 

 



79 
 

 

Fig. 10: Agroinfiltración de hojas completamente expandidas de N. benthamiana, A. Infiltración de hojas 
con suspensiones bacterianas inducidas de Agrobacterium, que contienen las construcciones de interés, 
con OD600 =0,2. B. Observación de hojas agroinfiltradas con un vector que expresa la proteína 
fluorescente verde (GFP libre, eGFP), visible bajo luz UV, en presencia o ausencia del supresor de 
silenciamiento 2b de CMV. Lado derecho de las hojas, control, infiltrado con Agrobacterium que expresa 
eGFP  junto con Agrobacterium que expresa el vector vacío pROK. Lado izquierdo de las hojas, infiltrado 
con Agrobacterium que expresa eGFP junto con la construcción que expresa la proteína 2b de CMV 
(hoja izquierda), y que expresa la proteína mutante 2bΔNLS1, que carece de actividad supresora de 
silenciamiento, (hoja derecha). En presencia de un supresor de silenciamiento funcional, el disco 
infiltrado muestra mayor fluorescencia bajo iluminación UV.  

 

3.4. Ensayos de actividad supresora de silenciamiento 

La técnica de supresión de silenciamiento local o agropatch assays, nos permite 

chequear de una forma visual o mediante cuantificación de proteínas o transcritos en 

el disco infiltrado la actividad supresora de silenciamiento de una proteína o, carencia 

de actividad de la misma en dicho ensayo.  

3.4.1. Visualización de fluorescencia en tejidos vegetales 

La técnica consiste en agroinfiltrar dos focos por hoja, a derecha e izquierda de la hoja, 

respectivamente, siguiendo el procedimiento expuesto anteriormente en el punto 

3.2.2. En el foco izquierdo (cara abaxial de la hoja) pondremos un control negativo, que 

consiste en una mezcla de bacterias (A. tumefaciens C58C1) que contienen un 

plásmido vector que expresa una proteína fluorescente verde, eGFP libre, visible bajo 

luz UV; y bacterias que contienen el vector vacío que se ha utilizado en las 

construcciones a chequear (pROK2). El otro foco consiste en una mezcla de bacterias 

que expresan eGFP libre y bacterias que expresan la construcción que tenemos interés 

en comprobar su actividad (Fig. 10). El vector que expresa eGFP libre, visible bajo luz 



80 
 

UV ha sido donado amablemente por J. Cubero (INIA, Crta. de la Coruña, km 7,5 

Madrid). 

La expresión de GFP libre a partir de un vector binario es parcialmente silenciada por la 

planta, y bajo luz UV se ve de un tono verde apagado, que se hace más débil según 

pasan los días (Fig. 10 y Canto et al. 2002). Lo mismo ocurre al coinfiltrar dicha 

construcción junto con una construcción que no tiene actividad supresora de 

silenciamiento, como el vector vacío pROK2. Sin embargo, si se expresa junto con un 

vector que exprese un proteína con actividad supresora de silenciamiento, se suprime 

el silenciamiento del RNA mensajero expresado transitoriamente desde el T-DNA 

agroinfiltrado y se observa un incremento de la fluorescencia derivada de GFP bajo luz 

UV, de un verde brillante (Fig. 10B, hoja izda. lado izdo.). De 3 a 6 días 

postagroinfiltración (dpi), observamos las hojas y fotografiamos la fluorescencia 

derivada de la expresión transitoria de GFP libre en las hojas, iluminando con lámpara 

UV. Las imágenes tomadas se procesaron digitalmente con Adobe Photoshop CS5 

Extended (Adobe Systems Software Ltd.).   

3.4.2. Inmunodetección de proteínas o western blot 

Una vez tomadas las imágenes de las hojas, guardamos los círculos de tejido 

infiltrados, para hacer una inmunodetección de proteínas y detectar la presencia de las 

proteínas en los tejidos infiltrados. 

3.4.2.1. Preparación de la muestra para análisis por western blot 

Se extrajo de las hojas de N. benthamiana el contenido de proteínas totales de 

aproximadamente 0,1 g de tejido infiltrado (correspondiente a un círculo de 

agroinfiltración). Para ello, la muestra congelada en nitrógeno líquido se hizo polvo con 

un émbolo en 300 µl de tampón fosfato salino (Phophate buffered saline, PBS) 1X, 1% 

Mercaptoetanol. Tomando 50 µl de este extracto y 50 µl de Laemli 2X (4% SDS; 2% 2-

Mercaptoetanol; 0,1 M Tris HCl pH 6,8; BPB; 20% Glicerol), se homogeneizó y se hirvió 

a 95ºC la muestra con agitación durante 3 minutos, para extraer las proteínas totales; 

y se centrifugó para clarificar la muestra.  



81 
 

3.4.2.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 

Cargamos 15 µl de la muestra por pocillo en los geles de poliacrilamida con SDS. Como 

marcador de peso molecular utilizamos Precision Plus ProteinTM Standards Dual Color 

(BIO-RAD. Cat. 161-0374). En los casos en que ha sido necesario cuantificar cantidad de 

proteína, se incluyó en el gel de interés una serie de concentraciones conocidas de BSA 

para construir una recta patrón que permitiera inferir la concentración de proteína. 

Las muestras se fraccionaron por SDS-PAGE en geles con 15% de acrilamida (BIO-RAD. 

Cat. 161-0158) en sistemas Mini Protean II (BIO-RAD) y fuente de electroforesis 

BIORAD, hasta que el marcador de frente azul (presente en el Laemli 2X) escapa por la 

base del gel. 

Una vez acabada la electroforesis, aquellos geles control de carga o que se utilizaron 

para estimar una cantidad de proteína, se tiñeron con azul de coomassie (Sigma-

Aldrich Brilliant Blue R. Cat. B0149) y se eliminó el exceso de azul con solución de 

desteñido (metanol 15%, ácido acético glaciar 10%). 

3.4.2.3. Transferencia húmeda a membranas 

Los geles de proteínas se transfirieron, por electro transferencia húmeda en buffer tris-

glicina (tris-glicina [25 mM Tris; 192 mM Glicina]; 20% Metanol), a membranas de 

transferencia de proteínas (Hybond-P PVDF membranes, Amersham, GE Healthcare. 

Cat. RPN303F) durante una hora a 100 V, en frío. Una vez transferidas las proteínas a la 

membrana, se tiñeron con rojo Ponceau (Ponceau S solution SIGMA. Cat. P7767) 

durante unos minutos y se tomó la imagen de las bandas como control de carga. A 

continuación se destiñó la membrana con agua y se bloqueó con solución de bloqueo 

(PBS 1X; 5% peso/volumen leche en polvo desnatada) durante al menos una hora, para 

evitar la adherencia de anticuerpos a zonas no específicas de la membrana. 

3.4.2.4. Inmunodetección de proteínas por western blot 

Una vez bloqueada la membrana se puede detectar la presencia de proteínas 

específicas en la membrana. Nosotros teníamos interés en detectar las proteínas 2b y 



82 
 

proteínas 2b mutantes (en los diferentes vectores construidos), GFP (eGFP libre o en 

construcciones tipo GFP-2b) e YFP (en construcciones de BiFC). 

Para la detección inmunológica de GFP, se utilizó un anticuerpo policlonal contra GFP 

de ratón, donado por G. Cowan (James Hutton Institute, Dundee, Reino Unido). Para la 

detección de proteína 2b de la cepa Fny de CMV se utilizó un anticuerpo policlonal de 

ratón contra los dominios amino y carboxilo de la proteína (aas 2-58 y 51-107, 

respectivamente), desarrollado por el Dr. Félix A. Atencio en el CIB-CSIC. Para la 

detección de proteínas marcadas con sYFPN, se utilizó el anticuerpo policlonal de ratón 

contra la terminación amino de GFP (Anti-GFP, N-terminal antibody produced in rabbit. 

SIGMA. Cat. G1544).   

Se incubó la membrana en solución de bloqueo en presencia de los anticuerpos 

primarios durante toda la noche en agitación suave a temperatura ambiente. Se lavó 

bien la membrana en solución de lavado [PBS 1%; 0.05% Tween 20 (Sigma Aldrich. Cat. 

P1379)] antes de poner el anticuerpo secundario. 

Como anticuerpos secundarios se utilizaron un anticuerpo antiratón conjugado con 

fosfatasa alcalina [Anti-Mouse IgG (whole molecule)-Alkaline Phosphatase antibody 

produced in goat. SIGMA. Cat. A3688] o uno anticonejo [Anti-Rabbit IgG (whole 

molecule)–Alkaline Phosphatase antibody produced in goat. SIGMA. Cat. A3687], para 

detectar los anticuerpos primarios contra las proteínas 2b y GFP, respectivamente. Se 

incubó la membrana en solución de bloqueo en presencia de los anticuerpos 

secundarios con la dilución adecuada durante una hora en agitación a temperatura 

ambiente, y se lavó de nuevo la membrana en solución de lavado.  

La presencia de las proteínas se reveló con sigmaFAST TM BCIP/NBT (SIGMA Aldrich. 

Cat. B5655), siguiendo las instrucciones del fabricante. 

El control de carga de los geles se llevó a cabo por geles PAGE-SDS del 15% teñidos con 

azul de coomassie-R (Sigma-Aldrich Brilliant Blue R. Cat. B0149) o por tinción de la 

membrana de transferencia con Rojo Ponceau (Ponceau S solution. SIGMA. Cat. 

P7767). 



83 
 

3.5. Visualización in vivo de proteínas con marcajes 

fluorescentes 

Para observar la localización subcelular de las proteína 2b y mutantes de CMV en 

células vegetales epidérmicas se clonaron las mismas en el vector pROK2-GFP a 

continuación del marcador fluorescente, formando las construcciones pROK-GFP-2b y 

las variantes con la proteína mutada de 2b. Además, la proteína nativa se clonó 

también en posición anterior al fluoróforo GFP y mRFP formando las construcciones 

pROK-2b-GFP y pROK-2b-mRFP. Todo ello se ha descrito anteriormente en el apartado 

3.2.4.  

Para la observación del efecto que produce la presencia de una señal NES en la 

localización subcelular de la proteína 2b  se utilizó la construcción pROK-NES-GFP-2b 

descrita en el apartado 3.2.4. La visualización de las proteínas fusionadas a tags 

fluorescentes se llevó a cabo en microscopio confocal tras su expresión transitoria en 

hojas de N. benthamiana 

 3.5.1. Agroinfiltración y expresión transitoria  

Infiltramos hojas de N. benthamiana con las construcciones a visualizar in vivo, 

marcadas con los fluoróforos GFP y mRFP. Este método nos ofrece una forma sencilla 

de expresar una proteína en planta, ya que se infiltra la suspensión bacteriana 

directamente en las hojas, difunde en el tejido y permite la observación de campos de 

células epidérmicas que expresan la construcción de interés. Las construcciones que 

contenían GFP se infiltraron junto con un plásmido que contenía la proteína fibrilarina 

con el fluoróforo mRFP (pROK-Fib-mRFP). La proteína fibrilarina se localiza en los 

nucléolos y cuerpos de cajal, por lo que se utilizó como marcador de estos corpúsculos 

subnucleares.   

3.5.2. Infiltración de tinción DAPI 

En algunos casos se utilizó la tinción DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). Esta tinción 

fluorescente atraviesa las membranas celulares y se une al DNA por lo que se usa 



84 
 

como marcador de los núcleos, pero no tiñe los nucléolos. Se puede utilizar tanto en 

células fijadas como vivas.  

Se infiltraron las zonas agroinfiltradas de las  hojas con tinción DAPI (4µg/ml en agua) 2 

horas antes de su visualización en el microscopio confocal.  

3.5.3. Visualización de fluorescencia in vivo con microscopio confocal 

El Miscroscopio Confocal emplea una técnica óptica para reconstruir imágenes 

tridimensionales, seleccionando cada vez un solo plano (eje z) del campo, descartando 

la información de otros planos con el pinhole. Esto nos permite observar campos 

epidérmicos en la muestra in toto. Ya que la superficie de la hoja es irregular, se hizo 

un barrido tomando imágenes en el eje z para reconstruir el campo de células 

epidérmicas. Estas imágenes se procesan con el programa Leica para superponerlas en 

una sola proyección que suma la fluorescencia derivada de todas ellas, permitiendo ver 

una imagen plana a partir de una muestra tridimensional. Las imágenes se formaron 

con dos Microscopios Laser Confocales espectrales (CLSM) Leica TCS SP2 y SP5 (Leica 

Microsystems). 

Las preparaciones se montaron unos minutos antes de ir al Microscopio Confocal, a 

partir de tejido fresco colocado sobre portaobjetos. Se evitó en la medida de lo posible 

tomar tejidos con nervaturas, para facilitar la visualización y evitar una superficie 

irregular. Se colocó el tejido sobre el portaobjetos con la cara adaxial hacia el mismo, 

para observar campos de células epidérmicas en la superficie abaxial, desde la que se 

había infiltrado con la jeringuilla. Se inmovilizó el tejido sobre el portaobjetos con 

ayuda de cinta adhesiva de doble cara. 

Se observó el tejido con objetivos de inmersión en agua a tiempos variables tras la 

infiltración (entre 2 y 5 dpi, dependiendo del tipo de experimento) y se tomaron 

imágenes con objetivos 20x, 40x y 63x, en función de si interesaba tomar imágenes de 

campos de células epidérmicas o centrarnos en compartimentos subcelulares, como se 

ha descrito anteriormente (Canto et al. 2006).   



85 
 

Las imágenes se obtuvieron por barrido secuencial (SP2 y SP5) y escáner resonante 

(SP5), con los siguientes ajustes de excitación (longitud de onda en la que un 

fluoróforo absorbe luz) y emisión (rango de longitudes de onda en las que un 

fluoróforo emite luz): para GFP, excitación de 488 nm y emisión de 500 a 530 nm; para 

YFP, excitación a 514 nm y emisión de 530-550 nm, para mRFP, excitación de 561 nm y 

emisión de 590 a 630 nm; para DAPI, excitación de 405 nm y emisión de 440 a 475 nm.  

 

3.6. Complementación bimolecular fluorescente 

Para visualizar interacciones en células vivas utilizamos la técnica de la 

complementación bimolecular fluorescente (BiFC). Es un método muy sensible (Morell 

et al. 2008) basado en la interacción entre dos mitades de una proteína fluorescente 

fusionadas a las proteínas que se pretenden estudiar, que permite visualizar in vivo 

interacciones potenciales proteína-proteína (Citovski et al.  2006) entre proteínas 

iguales o diferentes y establecer su ocurrencia subcelular in vivo y en el contexto 

celular por observación directa sobre tejido fresco, eliminando posibles artefactos 

causados por rotura celular o fijación del tejido previa a su visualización (Kerppola 

2006). La asociación de proteínas produce un complejo fluorescente a partir de 

constituyentes no fluorescentes y se ha utilizado en  distintos tipos celulares y 

organismos (revisado en Kerpola 2006).  

Se examinó por co-expresión transitoria potenciales interacciones entre pares de 

proteínas coexpresadas en células epidérmicas por agroinfiltración, observando en 

microscopio confocal la fluorescencia, de 3 a 6 dpi. Comprobamos diferentes 

combinaciones de plásmidos, en los dos sentidos de la interacción en aquellos casos en 

que se observa la interacción entre proteínas diferentes, no así en homodímeros. La 

visualización se hizo a veces en presencia de fibrilarina marcada con mRFP (Fib-mRFP) 

como marcador nucleolar. Las agroinfiltraciones de vectores binarios expresando 

proteínas marcadas para BiFC se hicieron en las mismas condiciones que para 

proteínas fluorescentes monoméricas, y se visualizaron con los ajustes de excitación y 

emisión de la YFP intacta (excitación 514 nm; emisión 530-550 nm).  



86 
 

3.7. Unión in vitro de la proteína 2b a RNAs 

Para los estudios de unión in vitro de la proteína 2b a RNAs se expresó la proteína 2b y 

mutantes en bacterias, previa comprobación de la funcionalidad de la construcción en 

estudios de agroinfiltración. En estudios anteriores, diversos grupos han expresado y 

purificado sólo proteína 2b truncada, ya que encontraron dificultades en la expresión 

de la proteína completa, pero nosotros no encontramos ningún problema por lo que 

nuestros resultados muestran las propiedades de la unión a RNAs de la proteína 2b  

completa. 

Para expresar y purificar las proteínas 2b y mutantes utilizamos el sistema 

QIAexpressionist TM (QIAGEN) con el vector pQE30. Este sistema se basa en el marcado 

con seis histidinas (6xHis tag), que se unen selectivamente a matrices cromatográficas 

por afinidad al metal níquel- ácido nitrilotriacético (nickel- nitrilotriacetic acid, Ni-NTA), 

sin interferir en su estructura y función.  

3.7.1. RNAs 

Para visualizar la unión in vitro de sRNAs a la proteína 2b y sus mutantes, y 

posteriormente calcular sus cinéticas de unión, sintetizamos tres RNAs sintéticos, 

basados en la secuencia del miRNA 171 de A. thaliana (Fig. 11): de hebra sencilla y 

polaridad positiva (ss siRNA); de doble hebra, con 2 nts desapareados en los extremos 

terminales 3' (ds siRNA); y el micro RNA correspondiente (miRNA).  

Para preparar  los sRNAs de doble hebra, se tomaron cantidades equimoleculares de 

los sRNAs de hebra sencilla de polaridad complementaria, se hirvieron durante 5 

minutos en agua y se enfriaron lentamente hasta temperatura ambiente. Para los 

experimentos de unión in vitro a proteína, se utilizó 5 pmol de sRNAs de doble hebra 

(ds siRNA, miRNA) y 15 pmol de ss siRNA, ya que en este caso 5 pmol de RNA de 

cadena sencilla no se visualizaron bien en el gel.     



87 
 

 

Fig. 11: Representación de los sRNAs sintéticos utilizados en el estudio, correspondientes al RNA 171 de 
Arabidopsis thaliana: sRNA de doble hebra (ds siRNA), micro RNA (miRNA) y sRNA de hebra sencilla (ss 
siRNA). 

 

3.7.2. Expresión de proteínas en bacterias 

Para expresar la proteína 2b nativa y las proteínas mutadas en bacteria, se clonaron en 

el plásmido de expresión pQE30 sus secuencias génicas generando pQE30-2b, como se 

ha explicado en el apartado 3.2.5. Estas proteínas presentan, una vez en el plásmido 

pQE30, 6 histidinas (6xHis) en el extremo amino de la proteína, procedentes del 

plásmido pQE30, y el péptido HA que clonamos nosotros anteriormente en el extremo 

carboxilo de la proteína 2b. No sabemos si las histidinas y el péptido HA a ambos 

extremos de la proteína 2b la estabilizan, ya que nosotros no observamos toxicidad 

alguna durante la expresión de proteínas. Las proteínas se expresaron en la cepa 

JM109 de E. coli. Se utilizó un cultivo recién transformado con el plásmido pQE30-2b, 

ya que en nuestra experiencia, los stocks bacterianos ultracongelados presentan 

alguna dificultad en el crecimiento y expresión de proteínas. Partimos de varias 

colonias de células transformadas, que crecimos a 37ºC durante la noche con agitación 

en 50 ml de medio líquido 2xYT (bactotriptona 16 g/l, extracto de levadura 10 g/l y 

NaCl 5 g/l) en presencia de ampicilina. A la mañana siguiente se llevó el cultivo a 300 



88 
 

ml y se dejó crecer durante una hora más. A continuación inducimos la expresión de la 

proteína durante 3 horas añadiendo al cultivo IPTG (isopropil-β-D-1-

tiogalactopiranósido) (CALBIOCHEM. Cat. 420322) a una concentración final 1 mM. 

Tras la inducción, se eliminó el sobrenadante por centrifugación a 4ºC y se guardaron 

los precipitados de cultivo a -20ºC durante al menos 1 hora.  

3.7.3. Purificación de proteínas en condiciones desnaturalizantes 

Resuspendimos los precipitados de bacterias en 3 ml de tampón B (100mM NaH2PO4; 

10mM Tris-HCl; 8M Urea, pH 8) en presencia de PMSF (isopropil-β-D-1-

tiogalactopiranósido) a una concentración final de 1 mM para romper las células. Las 

muestras se mantuvieron  en agitación a 50 rpm y temperatura ambiente durante una 

hora. Luego las clarificamos por centrifugación a 6000 rpm, 10 minutos a temperatura 

ambiente. Tomamos el sobrenadante, que tiene un aspecto bastante transparente si la 

lisis celular es completa, y descartamos el precipitado con restos celulares. A 

continuación se purificó la proteína por incubación con la resina de Ni-NTA (QIAGEN. 

Cat. D-40724). Previamente a la incubación es necesario lavar tres veces y equilibrar la 

resina con el tampón B, en que también se encuentra la proteína que estamos 

purificando. Incubamos, en pequeñas columnas de plástico de cromatografía (de un 

diámetro de 1,5 cm) cerradas en ambos extremos e inclinadas, el sobrenadante con 

300 µl de resina Ni-NTA en agitación a 50 rpm, a temperatura ambiente durante una 

hora, para que se una la proteína por afinidad entre el Níquel de la resina y las 

histidinas en las proteínas expresadas. Posteriormente colocamos la columna en 

vertical, cuidando de que la resina quedase depositada en la base. A continuación se 

lavó la resina con tampones que eliminaron el resto de componentes del sobrenadante 

y que poco a poco bajaron el pH hasta el pH de elución. Conviene poner el volumen ml 

a ml, para el correcto lavado de la muestra, y el lavado se realizó con la siguiente 

secuencia: 10 ml con tampón B y 5 ml de tampón C (100mM NaH2PO4; 10mM Tris-HCl; 

8M Urea, pH 6.3). Por último eluímos con tampón E (100mM NaH2PO4; 10mM Tris-HCl; 

8M Urea, pH 4.5) de la siguiente manera: Pusimos 1 ml y se eluyó rápidamente en un 

eppendorff de 1.5 ml, muestra E1, en principio la proteína no la encontramos en esta 

fase de elución. Luego se incubó con 1 ml de tampón E durante 10 minutos y se eluyó 



89 
 

en otro ependorff, E2, que en principio contenía la proteína purificada. Por último se 

añadió 1 ml más y se eluyó en otro tubo, E3, que en principio tiene proteína muy 

diluida.   

Una vez purificadas las proteínas se realizó una electroforesis de 10 µl de muestra en 

PAGE-SDS al 15% para comprobar que se han purificado y que el tamaño de las mismas 

es el esperado, y para determinar su concentración de cara a los ensayos. En aquellos 

casos en que la cantidad de proteína obtenida  resultaba insuficiente para los ensayos 

de unión a sRNAs, se concentró la misma 2x-4x, utilizando las columnas Amicon ultra 

0.5 de 10 kilodalton (kDa) (SIGMA-ALDRICH. Cat. Z677108-96).  

3.7.4. Renaturalización de proteínas 

Las proteínas purificadas en estas condiciones presentaban una alta concentración de 

urea en el tampón de elución y se encuentraban desnaturalizadas. Para renaturalizar 

las proteínas purificadas se utilizó la técnica de diálisis, que permite eliminar poco o 

poco la urea y demás productos presentes en el tampón de elución de forma que la 

proteína lentamente va recuperando su conformación nativa. La tripa de diálisis es 

necesario hervirla 5 min y dejarla enfriar lentamente en agua ultrapura (Milli-Q) 

previamente para que tome sus propiedades. 

La diálisis se llevó a cabo frente a agua Milli-Q en una relación 1:103. Así, para 

renaturalizar 100 µl de proteína purificada se puso en tripa de diálisis frente a 100 ml 

de agua Milli-Q en agitación 70 rpm durante 60 minutos. Durante este tiempo se 

cambió el agua a los 20, 40 y 50 minutos. La proteína renaturalizada presenta actividad 

durante un corto espacio de tiempo, por lo que una vez renaturalizada, es necesario 

hacer los experimentos de unión in vitro a RNAs en un breve periodo de tiempo. 

3.7.5. Cuantificación de proteínas 

Para cuantificar la proteína 2b renaturalizada se realizó una electroforesis con 10 µl de 

la proteína dializada en PAGE-SDS al 15%, y se tiñó el gel con azul de coomassie. Se 

eliminó el exceso de azul químicamente con solución de desteñido. Se escaneó el gel y 

obtuvimos la imagen en tonos grises. La cuantificación se llevó a cabo por 



90 
 

densitometría con el  programa Gel-Pro Analyzer (version 3.1.00.00. Media 

Cybernetics) frente a una recta patrón a partir de concentraciones conocidas de BSA 

presentes en el mismo gel. Se infirió la concentración de proteína utilizando el 

programa de cálculo Excel (Microsoft Corp.). Con esto obtuvimos los µg de proteína 

renaturalizada presentes en 10 µl de muestra dializada. Para pasar esta concentración 

a pmol/µl necesitamos saber los KDa de nuestra proteína, que se calcularon por 

traducción de secuencia en el portal www.sciencegateway.or/tools/proteinmw.htm. 

En el portal www.genscript.com/conversion.html relacionamos los KDa con los µg y 

pmol, con lo que finalmente pudimos convertir la concentración de proteína dializada 

presente en el gel que medimos como µg/µl,  en las medidas pmol/µl que utilizamos 

en los cálculos para unión a sRNAs. 

Para nuestros ensayos, dado el volumen de muestra que manejábamos, se requirió 

una concentración de proteína renaturalizada de al menos 3 pmol/µl. 

3.7.6. Unión in vitro de proteína a sRNAs 

Para los experimentos de unión in vitro de proteínas a sRNAs, se utilizó sRNAs 

sintéticos (ds siRNA, miRNA y ss siRNA) a concentración fija (ver apartado 3.7.1), y 

concentraciones crecientes de proteína 2b renaturalizada. La unión in vitro se llevó a 

cabo en volúmenes de 15 µl en  tampón de unión a RNAs (20 mM Tris-HCl pH 7.5; 50 

mM NaCl; 5% Glicerol) en presencia de 1mM MgCl2, incubados durante 15 minutos en 

hielo. El resultado de la incubación se cargó en geles de Tris Acetato (TA) y agarosa al 

2% teñidos con BrEt. El fundamento de esta técnica es que el sRNA libre (no unido a 

proteína) entra en el gel durante la electroforesis, mientras que el sRNA unido a 

proteína queda retenido en el pocillo del gel, donde habitualmente se puede visualizar. 

Este sRNA que entra en el gel se puede cuantificar, y es el inverso al RNA que ha 

quedado retenido por la proteína.  

Los geles resultantes se fotografiaron en transiluminador Molecular Imager® Gel DocTM 

XR (BIO-RAD) y las imágenes se analizaron con el programa Gel-Pro Analyzer.  

http://www.sciencegateway.or/tools/proteinmw.htm
http://www.genscript.com/conversion.html


91 
 

3.7.7. Cuantificación de pequeños RNAs unidos a proteínas 

Para cuantificar los RNAs unidos a proteína, se obtuvo una imagen en tonos grises del 

gel de agarosa con los tonos invertidos, apareciendo las bandas que corresponden al 

RNA en tonos oscuros. La cuantificación del RNA libre (no unido a proteína) presente 

en el gel se llevó a cabo por densitometría con el  programa Gel-Pro Analizer 

(MediaCybernetics). Estos datos se trataron posteriormente con el programa Excel 

(Microsoft Office). La cuantificación de las bandas (de más intensa, RNA libre, a menos 

intensa; el RNA retenido por la proteína no penetra en el gel ya que queda retenido 

por la proteína en el pocillo del gel en que se depositó la muestra) permite relativizar 

la densidad de cada banda respecto a la de la calle control en el gel con RNA libre. Los 

valores resultado de relativizar la densidad de cada calle (muestras con concentración 

creciente de proteína) frente a la calle control, con RNA libre, oscilan de 0 a 1. Valores 

próximos a 1 indican mayor intensidad de banda en el gel, que significa más RNA libre, 

no unido a proteína; valores más próximos a 0 indican menor intensidad de banda y 

por lo tanto más RNA retenido por la proteína en el pocillo del gel. Al expresar estos 

datos en porcentaje (0-1 expresado como 0%-100%), un 100% corresponde a la 

totalidad del RNA libre, no unido a proteína, calle control) y un 0% corresponde con la 

situación en que todo el RNA queda retenido por la proteína. Para calcular el dato 

inverso, el porcentaje de RNA unido a proteína, que es lo que nos interesa (y no el RNA 

libre que es el que ha penetrado en el gel y podemos cuantificar por intensidad de 

banda), restamos estos valores, que ya hemos representado como porcentaje, a 100 

(porcentaje). De este modo pasamos de hablar de porcentaje de RNA libre en el gel, a 

porcentaje de RNA retenido por la proteína (en el pocillo). 

Habiendo estimado anteriormente en un gel de PAGE-SDS la concentración de 

proteína renaturalizada, relacionamos el porcentaje de retención de RNA calculado 

con la concentración conocida de proteína en cada uno de los pocillos del gel, con lo 

que expresamos en una gráfica la relación molar de proteína:RNA frente al valor de 

retención de RNA. Obtuvimos así las cinéticas de retención de RNA de cada una de las 

proteínas, 2b y mutantes, con los tres sRNAs, que representamos en curvas con el 

programa Excel (Microsoft Office). 



92 
 

3.7.8. Cálculo de la constante de disociación y del coeficiente de Hill 

El coeficiente de Hill es un indicador de cooperatividad en la unión a RNA, como se ha 

descrito anteriormente (Marcos et al. 1999). La unión cooperativa significa que la 

afinidad de una molécula por el ligando cambia con la cantidad de ligando unido. 

Describe la fracción de macromoléculas saturadas por ligando en función de la 

concentración de ligando. El coeficiente de Hill de las proteínas 2b y las proteínas 

mutantes se calculó usando la transformación de Hill de los datos de unión a RNA 

obtenidos en experimentos repetidos. Valores del Coeficiente de Hill <1 indican unión 

cooperativa negativa. Esto significa que, una vez que el ligando (sRNA) se ha unido a la 

proteína, la afinidad por el mismo disminuye. El Coeficiente de Hill con valor =1  

significa unión no cooperativa. En este caso la afinidad de la proteína por el ligando no 

depende de si otras moléculas de ligando se han unido a proteína. Y coeficiente de Hill 

con valor >1 significa unión cooperativa positiva. Aquí la afinidad por el ligando 

aumenta según se van uniendo proteína y ligando. 

También se determinó la constante de disociación aparente (Kd) en base a los datos 

obtenidos. Kd es la concentración de proteína a la que el 50% del sRNA aparece unido 

en la interacción proteína/RNA. Representa la concentración de ligando en la que un 

lugar de unión de una proteína está ocupado a medias. Cuanto menor es una 

constante de disociación, más afinidad hay entre proteína y ligando. 

Para determinar los valores del Coeficiente de Hill y Kd se utilizó la ecuación de Hill en 

Sigmaplot 11 [Systat Software Inc. (SSI) San Jose, CA. USA], en que n representa el 

Coeficiente de Hill: 

Fracción unida = 1/(1+(Kdn/[Protein concentration]n)) 

 

 



93 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. RESULTADOS  



94 
 

  



95 
 

4.1. Localización subcelular y actividad supresora de 

silenciamiento de la proteína 2b de CMV 

4.1.1. Proteína 2b nativa fusionada a marcadores fluorescentes 

Para analizar en detalle la distribución subcelular in vivo de la proteína 2b de la cepa 

Fny de CMV la hemos fusionado a proteínas fluorescentes. Sin embargo, un aspecto 

importante a tener en cuenta al trabajar con proteínas fusionadas a una secuencia 

peptídica es el posible efecto que el marcaje pueda tener en su funcionalidad 

biológica. Los ensayos de supresión de silenciamiento local de la expresión transitoria 

de genes en T-DNAs introducidos en N. benthamiana mediante agroinfiltración 

(ensayos de supresión local de silenciamiento, agropatch assays), nos permiten 

evaluar la actividad supresora de las proteínas virales en un sistema libre de virus. En 

este sistema, en ausencia de un supresor de silenciamiento, la expresión transitoria de 

un gen indicador como GFP sufre un silenciamiento parcial que deprime su 

acumulación en el tejido infiltrado, lo que hace que bajo una lámpara de luz UV la 

fluorescencia derivada de esta proteína sea débil en comparación con una situación de 

ausencia de silenciamiento (ver Fig. 10, en Material y Métodos).    

La presencia de la proteína 2b de la cepa Fny de CMV, expresada por agroinfiltración a 

partir del plásmido binario pROK2, causó una supresión del silenciamiento parcial del 

gen indicador GFP, como muestran las intensidades relativas de fluorescencia bajo 

iluminación UV derivadas de GFP, en presencia o ausencia del supresor viral (Fig. 12A, 

primera hoja por la izquierda), o las acumulaciones correspondientes de GFP en los 

tejidos agroinfiltrados, detectadas serológicamente (Fig. 12B, western blot). Cuando la 

proteína 2b se expresó fusionada a la proteína GFP en su extremo amino (GFP-2b), o a 

la proteína mRFP en su extremo carboxilo (2b-mRFP), las proteínas de fusión 

retuvieron la actividad supresora de silenciamiento de GFP libre comparable a la de la 

proteína nativa sin marcar (Fig. 12A, fluorescencia en hojas; y Fig. 12B, acumulación de 

la proteína en el tejido, western blots correspondientes). Las proteínas de fusión 

sYFPN-2b y sYFPC-2b también presentaron actividad supresora de silenciamiento, 

tanto infiltradas por separado como juntas (Fig. 12A). En todos los casos, la mayor 



96 
 

acumulación de GFP se correspondió también con una mayor acumulación de su 

mRNA en tejido infiltrado en el análisis por northern blot (Fig. 12C).  

 

Fig. 12: Actividad supresora de la proteína 2b de CMV. La proteína 2b fusionada a marcadores 
fluorescentes retiene la actividad supresora de silenciamiento de RNA. Se co-agroinfiltró y expresó en 
hojas de N. benthamiana la proteína GFP libre a partir de un vector binario (un clon que emite luz visible 
bajo lámpara de luz UV), junto con el vector vacío pROK2, (círculo de infiltración en lado dcho. de las 
hojas, control interno de cada hoja), o junto con vectores binarios derivados de pROK2 que expresaban 
las proteínas 2b nativa y 2b marcadas con diferentes fluoróforos o el péptido HA (círculo de infiltración 
en lado izdo. de las hojas), insertadas en el MCS del vector. A, Fotografías de las hojas agroinfiltradas. La 
proteína 2b y todas las proteínas de fusión retienen la actividad supresora de silenciamiento en ensayos 
de supresión local de silenciamiento, e inducen un aumento de la fluorescencia derivada de GFP libre 
bajo iluminación UV. La contribución a la fluorescencia de GFP-2b se considera residual al acumularse en 
cantidades mucho menores que la GFP libre, como se observa en el sexto carril del panel de western 
blot con anticuerpo contra GFP. B, El aumento en la fluorescencia (en panel A) derivada de GFP en 
presencia de la proteína 2b nativa o fusionada, se correlaciona con una mayor acumulación de proteína 
GFP [western blot, con anticuerpo (antibody Ab) contra GFP, panel superior]. La presencia de la proteína 
2b nativa y fusionada se confirmó con un Ab contra 2b (western blot, panel central). El panel inferior 
muestra el control de carga, gel de PAGE-SDS teñido con azul de coomassie. En el western blot y el 
control de carga, la línea M (mock) constituye tejido sano que ha seguido el mismo tratamiento de 
infiltración, sin GFP y con el vector vacío pROK2. C, Northern blot, análisis de la acumulación transitoria 
de mRNA de GFP (panel superior) y de los pequeños RNAs interferentes (siRNAs) de la proteína GFP 
expresada transitoriamente en las mismas muestras (panel central). El aumento de la fluorescencia y 
acumulación de GFP se correlaciona con la presencia de mayores niveles de mRNAs de GFP. Los paneles 
inferiores correspondientes, muestran los controles de carga, teñidos con bromuro de etidio (BrEt).  



97 
 

En conclusión, la presencia de marcadores fluorescentes fusionados a los extremos 

amino o carboxilo de la proteína 2b no parecen causar un detrimento en su actividad 

supresora de silenciamiento en ensayos de supresión local de silenciamiento, a pesar 

de su considerable tamaño en relación al de la proteína viral nativa.  

Para analizar en detalle la distribución subcelular in vivo de la proteína 2b de CMV, 

utilizamos la proteína marcada con GFP (GFP-2b) o con mRFP (2b-mRFP). Como hemos 

visto, ambas proteínas de fusión tienen una actividad supresora de silenciamiento 

comparable a la de la proteína 2b en ensayos de supresión local de silenciamiento (Fig. 

12). Expresamos transitoriamente estas proteínas, individualmente, a partir del 

plásmido binario pROK2, por agroinfiltración en hojas de N. benthamiana. La 

visualización de campos de células epidérmicas infiltradas con las proteínas GFP-2b y 

2b-mRFP en microscopio fluorescente confocal mostró que la proteína 2b-mRFP se 

localiza en células epidérmicas, principalmente en unos puntos únicos que podrían 

corresponder a los núcleos celulares (Fig. 13A, izda.), aunque también se encontró una 

parte en el citoplasma celular, que en este tipo de células se localiza en el contorno 

celular (el resto está ocupado por la vacuola). La tinción DAPI (Fig. 13A, central), 

conocido marcador nuclear, permitió confirmar que estos puntos en los campos de 

células epidérmicas correspondían efectivamente a núcleos celulares (Fig. 13A, dcha.). 

Una observación ampliada de estos mismos mostró que la proteína 2b-mRFP se 

localiza en el nucléolo, ya que esta misma región aparece en negro, sin teñir, en la 

imagen con tinción DAPI (Fig. 13B), que no tiñe la cromatina altamente condensada 

contenida en el nucléolo.  

Del mismo modo, la fluorescencia derivada de la proteína GFP-2b se localizó  en los 

núcleos de las células epidérmicas (Fig. 13C) y dentro de éstos en los nucléolos (Fig. 

13D). Descartamos que esta fluorescencia derivase de GFP libre, ya ésta no ocurría en 

el nucléolo (Fig. 13E). La expresión transitoria en el mismo tejido de las proteínas GFP-

2b y de fibrilarina fusionada a mRFP (Fib-mRFP),  conocido marcador del nucléolo y de 

los CBs (Kim et al. 2007), confirmó que la fluorescencia derivada de GFP-2b se 

localizaba en el citoplasma y núcleo y en su interior en el nucléolo y CBs (Fig. 13F, 

imagen izda. vs. imagen central), coincidiendo ambas como se muestra en la 

superposición de imágenes (Fig. 13F, dcha.). 



98 
 

En conclusión, la proteína 2b de la cepa Fny de CMV no sólo se localiza en el núcleo 

celular, como estaba publicado (Lucy et al. 2000; Mayers et al. 2000), sino que dentro 

de éste lo hace en el nucléolo y en los CBs, además de estar presente en el citoplasma, 

donde presenta una distribución uniforme.   

 

Fig. 13: Distribución subcelular de la proteína 2b de CMV fusionada a diferentes fluoróforos y expresada 
transitoriamente en hojas de N. benthamiana mediante agroinfiltración. A, Fluorescencia derivada  de 
2b-mRFP en un campo de células epidérmicas. La proteína se localiza en los núcleos (N, flechas en la 
imagen izda.). La naturaleza nuclear de los puntos se confirmó con tinción DAPI, imagen central. La 
imagen dcha. muestra la superposición de las imágenes anteriores. B, Vista ampliada de un núcleo, con 
2b-mRFP, panel izdo.; y tinción DAPI, panel dcho. La proteína 2b-mRFP se localiza, dentro del núcleo 
celular, en el nucléolo (Nu, flechas). C, Fluorescencia derivada de la proteína GFP-2b. Las flechas marcan 
algunos de los núcleos. D, Vista ampliada de la fluorescencia derivada de GFP-2b en el núcleo de una 
célula epidérmica. La proteína se presenta en estructuras que parecen nucléolos (flechas). E, Vista 
ampliada de la fluorescencia derivada de GFP libre en el núcleo, ausente en el nucléolo (punto negro 
dentro del núcleo). F, Distribución subcelular de GFP-2b co-agroinfiltrado con fibrilarina fusionada a 
mRFP (Fib-mRFP). La fluorescencia de GFP-2b en el núcleo (imagen izda.) co-localiza con la fluorescencia 
derivada de Fib-mRFP (imagen central), en los nucléolos, y CBs (pequeño punto a la derecha del Nu) 
como confirma la superposición de imágenes (imagen dcha.). La barra en la esquina superior dcha. 
representa 100 µm. La barra en la esquina inferior dcha. representa 10 µm. 



99 
 

4.1.2. Mutantes de la proteína 2b fusionados a marcadores fluorescentes 

Para estudiar comparativamente la actividad biológica y la localización subcelular del 

supresor 2b, hemos utilizado mutantes que afectan a dominios que se han 

considerado funcionalmente importantes en la bibliografía. En los ensayos de actividad 

biológica expresamos estas proteínas (2b y mutantes) con el péptido HA fusionado en 

el extremo carboxilo, y en los estudios de localización subcelular las expresamos con 

GFP fusionada en el extremo amino. En ambos casos la expresión fue transitoria, 

mediante agroinfiltración. Contamos con la proteína mutante 2bΔ5T con el extremo 

terminal amino deleccionado; con tres proteínas mutantes con delecciones de una o 

ambas NLSs (2bΔNLS1, 2bΔNLS2 y 2bΔNLS1+2, respectivamente); mutantes en un 

supuesto motivo de fosforilación, ya sea por delección (2bΔKSPSE) o por sustituciones 

puntuales por alaninas de los residuos S40 o S42 (2bS40A y 2bS42A); con un mutante 

con una delección que afecta al dominio tres (2bΔGSEL); y con un mutante que 

presenta el dominio terminal carboxilo deleccionado (2bΔ3T). Las nueve proteínas 

mutantes (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bS40A, S42A, 2bΔGSEL, 2bΔ5T 

y 2bΔ3T) y los dominios de la proteína 2b que afectan están representados en la Fig. 7 

de Material y métodos y esquemáticamente en las Figs. 8B y 15A. La proteína 2bΔ5T 

carece de los primeros 17 aas del extremo terminal amino. Algunos de éstos forman 

parte de la primera α-hélice de 2b, y la mayor parte de ellos forman parte del dominio 

de cremallera de leucinas identificado en la formación de dímeros de dímeros en TAV y 

CMV (Chen et al. 2008; Dong et al. 2015). Las proteínas con mutaciones en las NLSs y el 

motivo de fosforilación (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bS40A y S42A) 

afectan a la ARR y algunos de estos aas proporcionan lugares de unión a ácidos 

nucleicos (Mayers et al. 2000). La proteína mutante 2bΔGSEL presenta una delección 

parcial del dominio 3 que Ye y colaboradores (2009) identificaron en la cepa SD 

(subgrupo, IB) de CMV y que han relacionado con la inhibición de la transcripción de 

AGO4. El mutante de delección 2bΔ3T tiene deleccionados los 16 últimos aas, el 

dominio terminal carboxilo, que se ha relacionado con el desarrollo de síntomas en 

plantas infectadas con el virus (Lewsey et al. 2009) y con la toxicidad en la expresión de 

proteínas en bacterias (Mayers et al. 2000; Goto et al. 2007; Dong et al. 2015; Sueda et 

al. 2010). 



100 
 

La patología de los virus que contienen las mutaciones utilizadas en nuestro estudio 

habían sido caracterizadas previamente en planta por Lewsey y colaboradores (2009) 

excepto para la mutación 2bΔGSEL. Nosotros hemos caracterizado la infección de CMV 

conteniendo esta mutación en el RNA2 inoculando mecánicamente hojas de N. 

benthamiana con los transcritos del RNA1, RNA2 conteniendo el gen 2bΔgsel y RNA3 

obtenidos in vitro de los correspondientes clones infectivos. El fenotipo que presentó 

la planta infectada fue más suave que el de la planta infectada con CMV, con menor 

atrofia y deformación de las hojas intermedias, y sin necrosis (Fig. 14). 

 

 

Fig. 14: Patogenicidad del virus Fny-CMV2bΔGSEL en plantas de N. benthamiana. El virus presenta 
síntomas menos severos que el virus nativo (Fny-CMV), con atrofia y distorsión foliar más leve en la 
planta, y sin necrosis. 

 

Con respecto a la actividad supresora en ensayos de supresión local de silenciamiento, 

las proteínas mutantes con un péptido HA fusionado en el extremo carboxilo 2bΔNLS1-

HA, 2bΔNLS2-HA, 2bΔNLS1+2-HA, 2bΔKSPSE-HA, y 2bΔ5T-HA no presentaron actividad 

supresora de silenciamiento, mientras que las proteínas mutantes 2bS40A-HA, 

2bS42A-HA, 2bΔGSEL-HA y 2bΔ3T sí lo hicieron (Fig. 15B). El análisis de la acumulación 

por western blot de dichas proteínas en el tejido agroinfiltrado mostró que las 

proteínas mutantes sin actividad supresora apenas se acumulaban respecto a la 

proteína nativa, mientras que aquellos mutantes que retenían la actividad supresora 

de silenciamiento (2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL y 2bΔ3T) sí se acumularon normalmente 



101 
 

(Fig. 15C). Un ensayo semejante con las proteínas de fusión GFP-2b, GFP-2bΔNLS1, 

GFP-2bΔNLS2, GFP-2bΔNLS1+2, GFP-2bΔKSPSE, GFP-2bS40A, GFP-2bS42A, GFP-

2bΔGSEL, GFP-2bΔ3T y GFP-2bΔ5T, mostró que las proteínas GFP-2bΔNLS1, GFP-

2bΔNLS2, GFP-2bΔNLS1+2, GFP-2bΔKSPSE y GFP-2bΔ5T carecían de actividad 

supresora de silenciamiento, mientras que la proteína GFP-2b, y los mutantes GFP-

S40A, GFP-S42A, GFP-2bΔGSEL y GFP-2bΔ3T sí la presentaban, induciendo en las hojas 

un aumento en la fluorescencia en el área agroinfiltrada bajo lámpara ultravioleta. Por 

lo que la fusión de un gen reportero como GFP no alteró la actividad supresora de 

silenciamiento de cada proteína mutante (Fig. 16). 

La localización subcelular de los mutantes expresados como fusiones a GFP se visualizó 

directamente en los casos de las construcciones GFP-2bS40A, GFP-2bS42A, GFP-

2bΔGSEL y GFP-2bΔ3T mediante su expresión transitoria en células epidérmicas de 

tejido agroinfiltrado (Fig. 17). En todos los casos, tanto en campos de células 

epidérmicas como en núcleos individuales a mayor magnificación, se observó una 

localización citoplásmica y nuclear, y dentro del núcleo en el nucléolo (Fig. 17). En los 

casos de las construcciones GFP-2bΔNLS1, GFP-2bΔNLS2, GFP-2bΔNLS1+2, GFP-

2bΔKSPSE y GFP-2bΔ5T, inicialmente no se observó fluorescencia en el tejido infiltrado, 

o se observó débilmente. Esto podría ser debido a que las mutaciones hicieran a la 

proteína inestable e impidieran su acumulación, a que por la carencia de actividad 

supresora de silenciamiento (Fig. 15) no se acumularan en cantidades suficientes para 

emitir una fluorescencia detectable en el microscopio confocal, o a ambas razones. La 

coexpresión del supresor de silenciamiento P19 de TBSV, que previene el PTGS en el 

tejido infiltrado, permite altos niveles de expresión transitoria de diferentes proteínas 

ectópicas. En nuestro caso la co-agroinfiltración junto con este supresor de 

silenciamiento heterólogo fuerte permitió una acumulación de estos mutantes a 

niveles similares a los de la proteína nativa (Fig. 18A y B), lo que demostró que su falta 

de acumulación en ausencia de P19, o cuando fueron expresadas en CMV (Lewsey et 

al. 2009), no se debía a que las mutaciones hicieran a la proteína inestable, sino a su 

falta de actividad supresora de silenciamiento. Por lo tanto, al carecer de actividad 

supresora, el silenciamiento de la planta dirigido a los transcritos que expresaban las 

proteínas 2b mutadas deprimía su acumulación.  



102 
 

 

Fig. 15: Actividad supresora de silenciamiento de la proteína 2b nativa y las de los nueve mutantes 
2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL, 2bΔ5T y 2bΔ3T, marcados con el 
péptido HA en el extremo carboxilo. A, Representación esquemática de la proteína 2b y de las 
mutaciones utilizadas en el estudio. Tres mutantes presentan delecciones en una o en ambas NLSs 
(2bΔNLS1, 2bΔNLS2 y 2bΔNLS1+2). Un mutante tiene deleccionado un supuesto motivo de fosforilación 
de la proteína (2bΔKSPSE) mientras que dos mutantes presentan sustituciones puntuales en el mismo de 
serina por alanina (2bS40A y 2bS42A). Otro mutante tiene una delección en el dominio 3 (2bΔGSEL). 
Otros dos mutantes tienen sus dominios terminales amino o carboxilo deleccionados (2bΔ5T y 2bΔ3T, 
respectivamente). Las cajas naranjas representan las conformaciones de α-hélices previstas por los 
modelos. Las dos primeras, en CMV son equivalentes a las de la proteína ortóloga 2b de TAV (Chen et al. 
2008). La tercera es el dominio 3 en CMV (Ye et al. 2009). La numeración corresponde a los aas en la 
proteína 2b: dominio terminal amino, aas 1-17; NLS1, aas 22-27; NLS2: aas 33-36; KSPSE aas 39-43; 
GSEL, aas 62-62; dominio terminal carboxilo, aas 95-110. B, Actividad supresora de las proteínas 
mencionadas en A, en ensayos de supresión local de silenciamiento. Se expresó transitoriamente GFP 
libre a partir de un vector binario co-agroinfiltrado con un vector vacío pROK2 (círculo dcho. en cada 
hoja), o junto con vectores binarios derivados de pROK2 que expresan las distintas proteínas 2b (círculo 
izdo. en cada hoja). Las proteínas 2bΔNLS1-HA, 2bΔNLS2-HA, 2bΔNLS1+2-HA, 2bΔKSPSE-HA y 2bΔ5T-HA, 
carecen de actividad supresora de silenciamiento, mientras que la proteína 2b-HA, y los mutantes 
2bS40A-HA, 2bS42A-HA, 2bΔGSEL-HA y 2bΔ3T-HA inducen un aumento en la fluorescencia en el área 
agroinfiltrada bajo lámpara UV. C, Análisis de la acumulación por western blot de GFP libre (panel 
superior) y de las proteínas 2b y mutantes (panel central). Aquellas proteínas que carecían de actividad 
supresora de silenciamiento (2bΔNLS1-HA, 2bΔNLS2-HA, 2bΔNLS1+2-HA, 2bΔKSPSE-HA, 2bΔ5T-HA) no 
se acumularon en el tejido infiltrado, como tampoco lo hizo la proteína GFP. El panel inferior muestra el 
control de carga del experimento (membrana de western blot teñida con rojo ponceau S). La proteína 
2b-HA, los mutantes puntuales 2bS40A-HA y 2bS42A-HA, y los mutantes de delección 2bΔGSEL-HA y 
2bΔ3T-HA se acumularon en el tejido infiltrado e indujeron un aumento en la acumulación de GFP. La 
calle M (mock) representa tejido sano infiltrado con el vector vacío, que ha seguido el mismo proceso 
que el resto del tejido tratado para la expresión transitoria. 



103 
 

 

Fig. 16: Actividad supresora de silenciamiento de la proteína 2b y de los mutantes (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 
2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL, 2bΔ5T y 2bΔ3T) fusionados con GFP en el extremo 
amino, en ensayos de supresión local de silenciamiento. Se expresó transitoriamente GFP libre a partir 
de un vector binario co-agroinfiltrado con un vector vacío pROK2 (círculo dcho. en cada hoja), o junto 
con vectores binarios derivados de pROK2 que expresaban las distintas proteínas 2b fusionadas a GFP 
(círculo izdo. en cada hoja). Las proteínas GFP-2bΔNLS1, GFP-2bΔNLS2, GFP-2bΔNLS1+2, GFP-2bΔKSPSE 
y GFP-2bΔ5T, carecieron de actividad supresora de silenciamiento, mientras que la proteína GFP-2b, y 
los mutantes GFP-2bS40A, GFP-2bS42A, GFP-2bΔGSEL y GFP-2bΔ3T indujeron un aumento en la 
fluorescencia en el área agroinfiltrada bajo lámpara UV. 

 

Aquellas proteínas con delecciones en las NLSs o en el motivo de fosforilación (GFP-

2bΔNLS1, GFP-2bΔNLS2, GFP-2bΔNLS1+2 y GFP-2bΔKSPSE) presentan una localización 

subcelular diferente a la de la proteína 2b. La visualización de campos de células 

epidérmicas (Fig. 18C, imagen izda. de cada construcción) muestra que la delección de 

una o ambas NLSs restringe la fluorescencia principalmente al citoplasma bordeando la 

pared celular y el núcleo y a los filamentos citoplasmáticos (cytoplasmic strands) que 

los conectan atravesando la vacuola. No encontramos estas proteínas en el núcleo, 

como se observa en las imágenes ampliadas de núcleos para cada una de estas 

construcciones (Fig. 18C, resto de imágenes). La delección de la NLS2 no afectó tan 

profundamente a la localización subcelular como la de NLS1, por lo que encontramos 

algo de fluorescencia en el núcleo. Un caso distinto fue el de la proteína GFP-

2bΔKSPSE, en la que la delección del motivo de fosforilación afectó a la localización 

subcelular de la proteína en sentido opuesto, mostrando una localización restringida al 

núcleo y nucléolo. La coexpresión de estos diferentes mutantes con la proteína de 

fusión Fib-mRFP permitió visualizar el núcleo y nucléolo (Fig. 18C, en rojo) y confirmar 

la co-localización nucleolar en este último caso.  



104 
 

En conclusión, el extremo terminal amino, junto con las dos NLSs y el motivo de 

fosforilación parecen ser esenciales para la actividad supresora de silenciamiento de la 

proteína 2b, ya que delecciones en estos tres dominios suprimen su actividad 

supresora, además de alterar su localización subcelular en la mayor parte de los casos. 

La localización nuclear de la proteína no es suficiente para conferirle actividad 

supresora (mutantes GFP-2bΔ5T y GFP-2bΔKSPSE). Las dos sustituciones puntuales por 

alanina en el motivo de fosforilación, GFP-2bS40A y GFP-2bS42A, o las otras dos 

delecciones en motivos de la región carboxilo, GFP-2bΔGSEL y GFP-2bΔ3T, no alteran 

ni la actividad supresora ni la localización subcelular de la proteína. 

 

 

Fig. 17: Distribución subcelular de la proteína 2b de CMV y de las proteínas 2b mutantes con actividad 
supresora de silenciamiento, marcadas con GFP (GFP-2b, GFP-2bS40A, GFP-2bS42A, GFP-2bΔGSEL y 
GFP-2bΔ3T). De cada una de las proteínas de fusión se muestra un campo de células epidérmicas 
(imagen izda.) y una imagen ampliada de un núcleo representativo de la muestra (imagen dcha.). La 
fluorescencia derivada de estas proteínas se encuentra en el citoplasma y los núcleos de células 
epidérmicas (imagen izda.), y dentro de éstos, en nucléolos y CBs. La barra en la esquina inferior izda. 
representa 100 µm. La barra en la esquina inferior derecha representa 10 µm. 



105 
 

 

Fig. 18: Acumulación y distribución subcelular de la proteína 2b de CMV y de mutantes sin actividad 
supresora de silenciamiento, marcadas con GFP (GFP-2b, GFP-2bΔNLS1, GFP-2bΔNLS2, GFP-2bΔNLS1+2, 
GFP-2bΔKSPSE, GFP2bΔ5T). Se co-agroinfiltraron con el marcador nucleolar Fib-mRFP, y en ausencia (A) 
o presencia (B) del supresor de silenciamiento P19 de TBSV. A, B, Análisis la acumulación de la proteína 
2b y mutantes  por western blot del tejido infiltrado. C, imagen izda., fluorescencia derivada de campos 
de células epidérmicas; resto de imágenes, vista ampliada de núcleos representativos: imagen izda., 
fluorescencia derivada de las proteínas GFP-2b, GFP-2bΔNLS1, GFP-2bΔNLS2, GFP-2bΔNLS1+2, GFP-
2bΔKSPSE y GFP-2bΔ5T; imagen central, fluorescencia derivada de Fib-mRFP; imagen dcha., 
solapamiento de ambas imágenes. Las proteínas con una o ambas NLSs deleccionadas tienen alterado 
su patrón de localización, presentando una distribución principalmente citoplásmica. Por el contrario, la 
proteína GFP-2bΔKSPSE presenta un patrón de distribución marcadamente nucleolar y de los CBs. La 
proteína GFP2bΔ5T tiene un patrón de localización subcelular semejante a GFP-2b. La barra en la 
esquina inferior izda. representa 100 µm. La barra en la esquina inferior dcha. representa 10 µm. 

 

4.1.3. La proteína 2b marcada con una señal de exportación nuclear  

Debido a que  las NLSs y el motivo de fosforilación de la proteína 2b de CMV (Lucy et 

al. 2000; Wang et al. 2004) solapan con los dominios de unión a siRNAs en la proteína 

ortóloga de TAV (Chen et al. 2008), es difícil determinar la importancia relativa de la 

presencia nuclear y de la capacidad de unión a siRNAs en su actividad supresora de 

silenciamiento. Ambas propiedades han sido propuestas por separado como 

necesarias para dicha actividad (Lucy et al., 2000; Zhang et al., 2006b, 



106 
 

respectivamente). Nuestros resultados muestran que la sola presencia de la proteína 

2b en el núcleo no confiere actividad supresora de silenciamiento a la proteína, ya que 

aunque aquellas proteínas mutantes de 2b que presentan deleccionada una o ambas 

NLSs (GFP-2bΔNLS1, GFP-2bΔNLS2 y GFP-2bΔNLS1+2) están esencialmente excluidas 

del núcleo y carecen de actividad supresora de silenciamiento, otros mutantes que 

mantienen las NLSs (2bΔKSPSE y 2bΔ5T), aun localizándose en núcleo y nucléolo, 

tampoco presentan actividad supresora (Figs. 15-18). Sin embargo, estas dos 

mutaciones podrían afectar a la actividad supresora por razones distintas a la de su 

localización subcelular. Nos planteamos por tanto diseccionar las propiedades de 

localización nuclear y actividad supresora de silenciamiento en la proteína nativa, 

aprovechando que, como hemos demostrado, la proteína 2b presenta una gran 

tolerancia a los marcajes en sus extremos amino y carboxilo conservando su actividad 

supresora de silenciamiento. Para ello marcamos GFP-2b con una señal de exportación 

nuclear en su extremo terminal amino, generando la proteína de fusión NES-GFP-2b. 

Cuantificamos su grado de presencia nuclear y determinamos su actividad biológica 

como supresor. Esta NES procede de un inhibidor de proteína kinasa (PKI; Wen et al. 

1995; García et al. 2010) y su secuencia está descrita en el apartado de Material y 

Métodos. No teníamos de antemano una idea de cuál sería la distribución subcelular 

que tendría esta construcción, ya que resultaría del equilibrio entre su entrada en el 

núcleo, mediada por las NLSs, y su salida del mismo, mediada por su NES. En paralelo 

expresamos transitoriamente NES-GFP-2b y GFP-2b mediante agroinfiltración en hojas 

de N. benthamiana, y observamos campos de células epidérmicas secuencialmente 

durante un período de tres a seis dpi. Al tercer día de la agroinfiltración, las diferencias 

en la localización subcelular entre ambas proteínas (NES-GFP-2b y GFP-2b) resultaron 

muy evidentes (Fig. 19A), la proteína de fusión NES-GFP-2b presentaba una 

distribución subcelular mucho más citoplásmica que la de GFP-2b, que se acumulaba 

en los núcleos y en particular nucléolos, además de en el citoplasma. Estas diferencias 

se acentuaron a lo largo de los días del experimento, incrementándose el número de 

núcleos vacíos en tejidos que expresaban NES-GFP-2b (Fig. 19A, paneles a 6 dpi). Por lo 

tanto nuestra señal NES promovía activamente la salida de la proteína de fusión del 

núcleo e impedía su acumulación en el mismo. Sin embargo, esto no afectó a su 

actividad supresora de silenciamiento a lo largo de los días del ensayo en ensayos de 



107 
 

agroinfiltración. Tampoco afectó a su acumulación global en el tejido infiltrado, como 

muestra el análisis comparado de la acumulación por western blot de ambas 

construcciones y del marcador GFP (Fig. 19B). Para cuantificar las diferencias en cuanto 

a presencia nuclear entre NES-GFP-2b y GFP-2b, se expresó transitoriamente cada 

proteína por separado y se tomaron imágenes aleatorias de campos epidérmicos bajo 

las mismas condiciones, de modo que estas imágenes son directamente comparables. 

Se realizó en ellos un conteo del número de núcleos que presentaban fluorescencia, de 

3 a 6 dpi. Cada campo de células epidérmicas, de 750x750 µm, contiene alrededor de 

50-80 células epidérmicas. Se contaron en los mismos los núcleos con presencia de 

fluorescencia derivada del supresor (definido como fluorescencia igual o mayor que la 

del citoplasma perinuclear). A 3 dpi, en campos de células epidérmicas infiltradas con 

GFP-2b encontramos que la mayoría de los núcleos presentaba fluorescencia, mientras 

que el número de núcleos fluorescentes en campos epidérmicos que expresaban NES-

GFP-2b era ya un orden de magnitud menor, y esta diferencia se incrementaba a 

medida que el experimento progresaba en el tiempo (Fig. 20A y B).   

Se podría argumentar que la actividad supresora de silenciamiento de NES-GFP-2b (Fig. 

19) fuera debida al efecto de la actividad de la proteína nuclear a tiempos muy 

tempranos (anteriores a 3 dpi), antes de que la NES hubiera sacado completamente a 

la proteína del núcleo. Se sabe que la proteína 2b se acumula en el tejido agroinfiltrado 

a tiempos muy tempranos, siendo detectable a 1 dpi (Del Toro et al. 2014). Para excluir 

esta posibilidad, realizamos un experimento de agroinfiltración secuencial en el que 

expresamos primero NES-GFP-2b o GFP-2b, y tres días más tarde agroinfiltramos el 

mismo tejido con Agrobacterium que portaba un vector binario que expresa GFP libre, 

una vez que NES-GFP-2b está ya ausente del núcleo, como muestra la Fig. 20B. La 

evaluación de la fluorescencia bajo lámpara UV indica que NES-GFP-2b y GFP-2b 

suprimían el silenciamiento de GFP libre de modo comparable en esta infiltración 

secuencial (Fig. 20C).  

Estos experimentos no nos permiten excluir que el tránsito de proteína 2b por el 

núcleo celular sea innecesario para su actividad supresora del silenciamiento, ya que 

NES-GFP-2b entra y sale del núcleo continuamente y la ausencia de fluorescencia en el 

mismo se debe a que el equilibrio entre entradas y salidas bascula su acumulación 



108 
 

hacia el citoplasma. Pero sí podemos concluir que la acumulación de esta proteína en 

el núcleo no es necesaria para su supresión del silenciamiento de transcritos o de RNAs 

virales, y que el núcleo seguramente no es un orgánulo celular donde este tipo de 

supresión esté teniendo lugar. 

En la tabla 2 se puede consultar un sumario de la actividad supresora de silenciamiento 

de la proteína 2b y los mutantes utilizados en nuestro trabajo, su localización 

subcelular, y el fenotipo que presentan en planta el virus CMV y los virus 

correspondientes que portan dichas mutaciones. No se encontró correlación entre las 

citadas propiedades.  



109 
 

 

Fig. 19: Alteraciones en el patrón de localización subcelular de la proteína GFP-2b de CMV marcada con 
una señal NES adicional (NES-GFP-2b), y su efecto en la actividad supresora de silenciamiento. Se 
agroinfiltraron hojas de N. benthamiana para la expresión transitoria de las construcciones. A, 
Visualización de la fluorescencia derivada de campos de células epidérmicas que expresan GFP-2b o 
NES-GFP-2b a 3, 4, 5 y 6 dpi (paneles izdo. y dcho., respectivamente). Todas las imágenes se tomaron 
bajo las mismas condiciones, y son directamente comparables. Los paneles superiores muestran campos 
de células epidérmicas y los centrales núcleos individuales representativos. Las flechas indican nucléolos 
(Nu). A 3 dpi, GFP-2b presentó mayor número de núcleos fluorescente que NES-GFP-2b. Según pasaron 
los días (4-6 dpi), las diferencias entre ambas proteínas aumentaron quedando la mayoría de los núcleos 
sin fluorescencia en el caso de NES-GFP-2b. Los paneles inferiores muestran la actividad supresora de 
silenciamiento de ambas construcciones en ensayos de supresión local del silenciamiento a los mismos 
dpi. En el lado dcho. de la hoja aparece el control (GFP libre co-agroinfiltrado con pROK2) y en el lado 
izdo. GFP libre co-agroinfiltrada con GFP-2b o NES-GFP-2b. La barra en la esquina superior dcha. 
representa 100 µm y la barra en la esquina inferior dcha. 10 µm. B, Análisis de la acumulación de GFP 
libre y de GFP-2b y NES-GFP-2b por western blot a 3, 4, 5 y 6 dpi. Se extrajeron las proteínas totales y se 
analizaron con Ab contra GFP (panel superior) o contra 2b (panel central). El panel inferior muestra el 
control de carga del experimento, la membrana de western blot teñida con rojo ponceau S.  



110 
 

 

Fig. 20: Cuantificación de la alteración en la localización subcelular de la proteínas NES-GFP-2b y GFP-2b. 
A, Se expresó transitoriamente cada proteína mediante agroinfiltración en hojas de N. benthamiana y se 
observaron campos de células epidérmicas de los tejidos infiltrados en microscopio confocal a 3, 4, 5 y 6 
dpi. Las imágenes se tomaron bajo las mismas condiciones. Las diferencias en la distribución subcelular 
de NES-GFP-2b y GFP-2b se hicieron más patentes conforme pasaban los días, presentando NES-GFP-2b 
muchos menos núcleos fluorescentes que GFP-2b. B, Cuantificación del número de núcleos 
fluorescentes. Se analizaron cuatro campos de células epidérmicas aleatorios para cada construcción, de 
750 x 750 µm, y se contó el número de núcleos con fluorescencia en los campos infiltrados con NES-GFP-
2b (barras negras) y GFP-2b (barras grises). C, Supresión de silenciamiento de GFP libre por NES-GFP-2b 
y por GFP-2b en un experimento de agroinfiltración secuencial. Se infiltraron las hojas con las 
construcciones NES-GFP-2b (parte inf. izda. de la hoja), GFP-2b (parte inf. dcha. de la hoja), o el vector 
binario vacío pROK2 (parte sup. dcha. de la hoja). Tres días después se infiltraron estos mismos tejidos y 
una cuarta zona no infiltrada previamente con un vector binario que expresa GFP libre. A los seis días de 
la primera agroinfiltración se observó la fluorescencia derivada de GFP bajo la lámpara UV. Se muestran 
dos réplicas del experimento. La barra en la esquina sup. dcha. representa 100 µm. 



111 
 

Tabla 2: Sinopsis de la actividad supresora de silenciamiento, localización subcelular de la proteína 2b y 
mutantes, y fenotipo de la infección viral. En la tabla se muestra un sumario de los resultados obtenidos 
en los ensayos de actividad supresora de silenciamiento y localización subcelular de las proteínas 2b y 
mutantes fusionadas a GFP en el extremo amino y el fenotipo en planta de los correspondientes virus 
(Fny, Fny2bΔ5T, Fny2bΔNLS1, Fny2bΔNLS2, Fny2bΔNLS1+2, Fny2bΔKSPSE, Fny2bS40A, Fny2bS42A, 
Fny2bΔGSEL y Fny2bΔ3T). N: Nuclear. Nu: Nucleolar. Los símbolos + (y ++) indican una propiedad 
positiva (o marcadamente positiva) mientras que el símbolo - indica negativo a una propiedad. ND, no 
disponible por no haberse analizado. 

Proteína 2b y mutantes de la 
cepa Fny de CMV 

 

Activ. 
Supres. 

de 
Silenc. 

Localización 
subcelular 

 

Síntomas en planta (Lewsey et al. 2009 
excepto *obtenido en el lab. del Dr. Canto 

N Nu 
A. thaliana 

Col0 
N. 

benthamiana 
tabaco 

2b 
MMMMM 

+ + + 

Atrofia, 

deformación 

de las hojas 

Atrofia, 

deformación 

de las hojas, 

necrosis 

Atrofia, 

deformación 

de las hojas, 

mosaico 

sistémico 

2bΔ5T 
 

- + + No No No 

2bΔNLS1  - - - No No No 

2bΔNLS2 
 

- + + No No No 

2bΔNLS1+2  - - - No No No 

2bΔKSPSE 
 

- ++ ++ No No No 

2bS40A 
 

+ + + 
Ligera 

atrofia 

Ligera 

deformación 

de las hojas, 

ligera atrofia 

Ligera atrofia, 

ligera 

deformación 

de las hojas, 

ligero mosaico 

sistémico 

2bS42A 
 

+ + + 
Ligera 

atrofia 

Atrofia 

intermedia, 

deformación 

de las hojas 

intermedia 

Ligera atrofia, 

ligera 

deformación 

de las hojas, 

ligero mosaico 

sistémico 

2bΔGSEL 
 

+ + + ND 

Atrofia 

intermedia, 

deformación 

de las hojas 

intermedia* 

ND 

2bΔ3T 
 

+ + + 

Atrofia, 

deformación 

de las hojas 

Atrofia, 

deformación 

de las hojas, 

necrosis 

Deformación 

de las hojas, 

mosaico 

sistémico, 

clorosis 



112 
 

4.2. Visualización in vivo de interacciones de la proteína 2b  

Muchas proteínas interaccionan consigo mismas para formar homodímeros, o con 

proteínas diferentes para formar heterodímeros, y éstos en ocasiones forman parte de 

agregados más complejos que pueden constituir el estado molecular en que una 

proteína es funcional, o en el que se procesa y madura, almacena, o incluso degrada. 

Chen y colaboradores (2008) han observado que la proteína 2b de TAV, ortóloga a la 

proteína 2b de CMV, puede formar in vitro dímeros y tetrámeros. Por ello era 

interesante para nosotros visualizar in vivo interacciones de la proteína 2b de CMV, y 

de las proteínas mutantes de que disponemos, consigo mismas y con otros factores 

presentes durante la infección viral en la planta, relacionados con la maquinaria del 

silenciamiento. 

4.2.1. Visualización de homodímeros de proteína 2b 

Mediante BiFC estudiamos si la proteína 2b interaccionaba in vivo consigo misma, 

formando dímeros (homodímeros). La técnica permite visualizar las interacciones 

directamente en células epidérmicas de tejido fresco sin fijarlo ni seccionarlo. 

Expresamos transitoriamente las proteínas de fusión sYFPN-2b y sYFPC-2b, con las 

mitades amino y carboxilo de la proteína fluorescente YFP fusionados en el extremo 

amino de la proteína 2b, a partir de plásmidos binarios, mediante agroinfiltración en 

hojas de N. benthamiana. Si dos proteínas marcadas con las mitades complementarias 

de YFP interaccionan entre sí, la proximidad de éstas permite la reconstitución de su 

fluoróforo (Fig. 21A, izda.), emitiendo fluorescencia visible en microscopio confocal 

bajo excitación de luz adecuada (Hu et al. 2002; Kerppola 2006). Sin embargo, la mitad 

de las interacciones potenciales, en que participan mitades iguales del marcador 

fluorescente, continuarían siendo invisibles.  

Observamos fluorescencia derivada de pares de proteínas 2b marcadas con sYFP 

complementarias en tejidos agroinfiltrados en que se habían co-expresado, lo que 

indica que la proteína 2b de CMV puede formar in vivo homodímeros (Fig. 21), como 

sugerían las observaciones in vitro de la proteína ortóloga de TAV (Chen et al. 2008). La 

fluorescencia derivada de la interacción se localizó dentro de la célula vegetal 



113 
 

distribuida por el citoplasma y el núcleo (Fig. 21A, dcha.). La visualización ampliada de 

estos núcleos permitió observar que dentro del núcleo la interacción tenía lugar en el 

nucléolo, coincidiendo con la localización del marcador nuclear fibrilarina (Fib-mRFP; 

Fig. 21B). Este patrón de localización de la fluorescencia derivada de BiFC coincide con 

el patrón de localización subcelular de la proteína 2b fusionada a proteínas 

fluorescentes intactas (2b-mRFP y GFP-2b, Fig. 13). Las proteínas sYFPN-2b y sYFPC-2b 

retienen la actividad supresora de silenciamiento en experimentos de supresión local 

del silenciamiento (Figs. 12, y 21C, izda.). La fluorescencia derivada de YFP 

reconstituida en la interacción YFPN-2b/YFPC-2b no fue visible bajo la lámpara UV (Fig. 

21C, dcha.), y cada una de las construcciones por separado (sYFPN-2b o sYFPC-2b) no 

mostró fluorescencia en microscopio confocal para BiFC cuando se co-agroinfiltraron 

con el binario complementario vacío, que expresa las mitades amino o carboxilo de 

YFP junto con una pequeña cola peptídica en su extremo carboxilo (sYFPN-2b/sYFPC, 

sYFPN/sYFPC-2b), utilizados como controles negativos en los experimentos. Chen y 

colaboradores (2008) propusieron un modelo de formación de los dímeros de la 

proteína 2b de TAV, de su interacción con siRNAs, y de formación de dímeros de 

dímeros mediante una cremallera de leucinas, y la proteína 2b de CMV podría estar 

interaccionando de manera semejante (Fig. 21D).  

 



114 
 

 

Fig. 21: La proteína 2b de CMV interacciona in vivo formando dímeros en experimentos de BiFC. A, La 
BiFC se basa en la expresión de pares de proteínas fusionadas a mitades de una proteína fluorescente. 
En caso de interacción se puede reconstituir el fluoróforo dividido entre las dos mitades de la proteína 
fluorescente produciéndose emisión de fluorescencia cuando es excitado a la longitud de onda 
adecuada (panel izdo.; diagrama esquemático reproducido de Kerppola 2006). La co-agroinfiltración en 
hojas de N. benthamiana de sYFPN-2b y sYFPC-2b y la observación de campos de células epidérmicas 
nos permitió estudiar la posible interacción in vivo entre proteínas 2b (imagen dcha.). El patrón de 
localización subcelular de la fluorescencia fue similar a los observados para 2b-mRFP y GFP-2b, 
principalmente nuclear, con presencia también en el citoplasma. B, En el núcleo, la interacción sYFPN-
2b/sYFPC-2b (imagen izda.) co-localizó con el marcador nucleolar Fib-mRFP (imagen central). Las 
imágenes solapadas se muestran en la imagen dcha. Cada una de las construcciones por separado 
(sYFPN-2b y sYFPC-2b), co-expresadas con el vector vacío (sYFPN o sYFPC), no mostraron fluorescencia 
(imágenes no mostradas). C, Ensayo de supresión local de silenciamiento de sYFPN-2b y sYFPC-2b. 
Ambas construcciones retuvieron la actividad supresora. D, Reproducción de los modelos propuestos 
por Chen y colaboradores (2008) para el dímero y el dímero de dímeros (tetrámero) de la proteína 2b de 
TAV (imágenes izda. y dcha., respectivamente). El color azul representa zonas con cargas positivas y el 
rojo cargas negativas. La interacción con la hélice de RNA se da en zonas con cargas positivas, que 
corresponden con las regiones ricas en arginina. 



115 
 

Las nueve proteínas 2b mutantes utilizadas en este estudio (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 

2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL, 2bΔ5T y 2bΔ3T) fusionadas a las 

mitades amino y carboxilo de YFP retuvieron la propiedad de interaccionar consigo 

mismas (Fig. 22), entre ellas y con proteína 2b no mutada en ensayos de BiFC (datos no 

mostrados). Aquellas proteínas mutantes de 2b que carecían de actividad supresora de 

silenciamiento (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bΔ5T) se agroinfiltraron 

en presencia del supresor de silenciamiento heterólogo P19 de TBSV para asegurar que 

se alcanzaban niveles de acumulación transitoria comparables a los mutantes con 

actividad supresora (Fig. 22A). En aquellos mutantes cuya localización subcelular era 

citoplásmica (GFP-2bΔNLS1, GFP-2bΔNLS2, GFP-2bΔNLS1+2) encontramos que la 

interacción de la proteína consigo misma se localizaba también en el citoplasma (Fig. 

22B). La proteína 2bΔKSPSE, con distribución principalmente nucleolar (GFP-

2bΔKSPSE), mostró fluorescencia derivada de su autointeracción en ensayos de BiFC 

también en el nucléolo. Y las proteínas que presentaban localización subcelular 

semejante a la proteína 2b (GFP-2bS40A, GFP-2bS42A, GFP-2bΔGSEL, GFP-2bΔ5T y 

GFP-2bΔ3T) en ensayos de BiFC también mostraron un fenotipo de fluorescencia 

similar a GFP-2b (Fig. 22B y C). Todo ello sugiere que ninguna de estas mutaciones 

impide la dimerización de la proteína 2b y que, pese a las diferentes localizaciones 

subcelulares observadas in vivo en los mutantes marcados con GFP, en todos los casos 

parecen estar formando homodímeros.  

Dado que los diferentes mutantes de la proteína 2b parecen retener la propiedad de 

interaccionar entre ellos, estudiamos la posibilidad de que las mutaciones que 

suprimen el silenciamiento se pudieran complementar en trans, complementándose 

entre sí y recobrando el dímero la actividad supresora de silenciamiento. Para ello co-

agroinfiltramos y expresamos las construcciones mutantes para BiFC en pares, junto 

con GFP libre. El ensayo se llevó a cabo con las seis proteínas mutantes de 2b que 

teníamos en el momento de llevarlo a cabo (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 

2bΔKSPSE, 2bS40A y 2bS42A). Nuestros resultados mostraron supresión del 

silenciamiento de la GFP libre sólo en aquellos casos en que una o ambas de las 

construcciones de proteína 2b para BiFC retenían la actividad supresora, pero los 



116 
 

mutantes que carecían de actividad supresora no pudieron complementarse en estos 

ensayos de co-expresión (Fig. 23).  

 

Fig. 22: Las proteínas mutantes de 2b retienen su propiedad de formar homodímeros in planta. Las 
proteínas 2b mutantes, marcadas con sYFPN y sYFPC en el extremo amino de la proteína 2b, se co-
agroinfiltraron en N. benthamiana. A, Acumulación por western blot de los pares de proteínas (sYFPN- + 
sYFPC-) de los seis mutantes analizados (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bS40A y 2bS42A). 
Los cuatro primeros mutantes, sin actividad supresora de silenciamiento, se acumularon pobremente 
(western blot superior), pero la co-agroinfiltración con P19 de TBSV igualó su acumulación a la de las 
proteínas con actividad supresora (western blot inferior). Debajo de cada western blot se muestran las 
membranas teñidas con rojo ponceau S como controles de carga. B, la fluorescencia derivada de BiFC en 
campos de células epidérmicas fue predominantemente citoplásmica en el caso de los pares sYFPN+C 
2bΔNLS1, sYFPN+C 2bΔNLS2 y sYFPN+C 2bΔNLS1+2, y principalmente nucleolar en el caso de sYFPN+C 
2bΔKSPSE. La fluorescencia derivada de las interacciones sYFPN+C 2bS40A y  sYFPN+C 2bS42A fue 
semejante a la derivada de la interacción 2b/2b (ver Fig. 21). C, Fluorescencia derivada de la interacción 
de otros tres mutantes: la interacción sYFPN+C 2bΔGSEL fue predominantemente nucleolar, mientras 
que las interacciones sYFPN+C 2bΔ5T  y sYFPN+C 2bΔ3T fueron semejantes a la interacción 2b/2b (ver 
Fig. 21).  



117 
 

 

Fig. 23: Comparación de la actividad supresora del silenciamiento de las combinaciones posibles entre 
seis pares de proteínas 2b mutantes marcadas para BiFC en ensayos de supresión local de 
silenciamiento. En cada hoja de N. benthamiana, como control interno negativo, se expresó 
transitoriamente GFP libre junto con el vector binario vacío (pROK2; lado dcho. de cada hoja). En el lado 
izdo. de las hojas se co-agroinfiltraron pares de proteínas 2b mutantes junto con GFP libre. Hubo 
actividad supresora de silenciamiento en todos aquellos pares de proteínas en los que una o ambas 
tenían actividad supresora de silenciamiento (2b y mutantes 2bS40A y 2bS42A), mientras que los 
mutantes que carecían de actividad supresora por separado (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 
2bΔKSPSE) no se complementaron entre sí en ninguna de las combinaciones posibles.  

 

4.2.2. Visualización de interacciones de la proteína 2b con proteínas 

argonauta  

La interacción de la proteína 2b de CMV con otras proteínas de la planta podría ser 

importante en la actividad supresora de silenciamiento de la proteína 2b. 



118 
 

Anteriormente a nuestro trabajo se había demostrado mediante co-

inmunoprecipitación que la proteína 2b de CMV interaccionaba  in vivo con AGO1 

(Zhang et al. 2006b), y también que inhibía la transcripción de AGO4 (Ye et al. 2009). 

En ensayos de reconstitución in vitro de RISC, Zhang y colaboradores (2006b) 

observaron que la proteína 2b de CMV inhibía el silenciamiento interaccionando con 

AGO1, inhibiendo su actividad degradadora de RNAs. Estas proteínas AGO forman 

parte de complejos RISC de la maquinaria del silenciamiento antiviral de la planta. Las 

proteínas AGO son sus efectores, que degradan los RNAs diana. Mientras que AGO1 

une siRNAs de 21 nts, derivados de DCL4, AGO4 une siRNAs de 24 nts derivados de 

DCL3 (Mi et al. 2008).  

Decidimos visualizar in vivo la ocurrencia subcelular de esas posibles interacciones 

entre la proteína 2b y sus mutantes y las proteínas AGO1 y AGO4 mediante BiFC. La 

proteína 2b se localiza en el citoplasma y nucléolo (Fig. 13) mientras que AGO1 lo hace 

en el citoplasma y en el núcleo celular (Vaucheret 2008) y AGO4 principalmente en los 

cuerpos nucleolares (Li et al. 2006). Mediante BiFC, visualizamos in vivo la interacción 

de 2b/AGO1 y 2b/AGO4 en el citoplasma y de 2b/AGO4 en el núcleo, co-

agroinfiltrando los pares de proteínas sYFPN-AGO1/sYFPC-2b y sYFPN-2b/sYFPC-AGO1, 

y sYFPN-AGO4/sYFPC-2b y sYFPN-2b/sYFPC-AGO4 en hojas de N. benthamiana (Fig. 24, 

A-D). La interacción 2b/AGO4 no se había estudiado anteriormente al desarrollo de 

esta parte experimental de la tesis doctoral, aunque sí se había observado una 

inhibición de la transcripción de AGO4 por la proteína 2b, que Ye y colaboradores 

(2009) relacionaron con el dominio tres o tercera alfa-hélice de esta última. Nuestras 

observaciones nos permitieron visualizar in vivo fluorescencia derivada de BiFC, que 

sugiere una interacción de la proteína 2b con AGO4 dentro del núcleo celular, aunque 

excluyendo el nucléolo del núcleo. Posteriormente a nuestro trabajo se ha demostrado 

la interacción in vitro de la proteína 2b de CMV con AGO1 y AGO4 de Arabidopsis en 

experimentos de inmunoprecipitación y pull down (Hamera et al. 2012).  

Para ver si las mutaciones en nuestra batería de mutantes de la proteína 2b afectaban 

a la interacción del supresor con AGO1 o AGO4, o a la localización subcelular del 

mismo, los co-agroinfiltramos con las proteínas AGO1 y AGO4 en pares compatibles 

para BiFC (por ejemplo, sYFPN-AGO1/sYFPC-2bΔNLS1; sYFPN-AGO4/sYFPC-2bΔNLS1) 



119 
 

en hojas de N. benthamiana. Las proteínas mutantes sin actividad supresora (2bΔNLS1, 

2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bΔ5T) se co-agroinfiltraron junto con P19 de TBSV 

para asegurar su acumulación transitoria y poder visualizar fluorescencia derivada de 

las interacciones, si las hubiere.  

 

Fig. 24: Visualización de la interacción de la proteína 2b de CMV con las proteínas celulares AGO1 y 
AGO4 de A. thaliana y su ocurrencia subcelular. Se co-agroinfiltraron y expresaron transitoriamente en 
hojas de N. benthamiana las construcciones sYFPN-2b, sYFPN-AGO1, sYFPN-AGO4, sYFPC-2b, sYFPC-
AGO1 y sYFPC-AGO4 en pares complementarios. A y B, fluorescencia derivada de las interacciones 
sYFPN-2b/sYFPC-AGO1 y sYFPN-AGO1/sYFPC-2b. La fluorescencia se localizó mayoritariamente en el 
citoplasma y fue mucho más débil que la observada en la interacción 2b/2b (ver Fig. 21). C y D, 
fluorescencia derivada de las interacciones sYFPN-2b/sYFPC-AGO4 y sYFPN-AGO4/sYFPC-2b. La 
fluorescencia se localizó en el núcleo celular, aunque ausente del nucléolo (Nu, en la vista ampliada del 
núcleo en la esquina inferior dcha. de las imágenes), y fue también mucho más débil que la derivada de 
2b/2b. La barra en la esquina superior dcha. representa 100 µm. E, Análisis de la acumulación por 
western blot de sYFPN-2b, sYFPN-AGO1 y sYFPNA-GO4 en tejidos co-agroinfiltrados, en que se utilizó un 
anticuerpo para detectar sYFPN (N-GFP Ab). El panel inferior muestra el control de carga, gel teñido con 
azul de coomassie. La acumulación de sYFPN-AGO1 y sYFPC-AGO4 fue menor a la de sYFPN-2b. Mock 
representa tejido infiltrado con tampón de infiltración en ausencia de agrobacterium, como control 
negativo. 

 

Nuestros resultados mostraron que los nueve mutantes de 2b analizados interaccionan 

con ambas AGOs (Fig. 25): La distribución subcelular de la fluorescencia derivada de su 

BiFC fue semejante a la observada en la interacción con la proteína 2b, todas las 

proteínas 2b mutantes interaccionaron con AGO1 en el citoplasma, y con AGO4 en 

citoplasma y núcleo, excluyendo el nucléolo. A pesar de que algunos mutantes 

carecían de una o ambas NLSs (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2), esto no afectó a la 



120 
 

localización de la interacción, por lo que la interacción con AGO4 sobreexpresada 

transitoriamente parece poder traslocar parte de dichos mutantes (o al complejo 

resultante) al núcleo celular, excluyendo el nucléolo en cualquier caso. Incluso la 

proteína 2bΔKSPSE, de fuerte presencia nucleolar, se re-localizó al nucleoplasma al 

interaccionar con AGO4, aunque no podemos saber en qué proporción. 

 

Fig. 25: Visualización y ocurrencia subcelular de interacciones de nueve mutantes de proteína 2b con las 
proteínas celulares AGO1 y AGO4 de A. thaliana. Se co-agroinfiltraron en hojas de N. benthamiana los 
pares de proteínas 2b mutantes y AGO con las mitades complementarias amino y carboxilo de la 
proteína YFP en el extremo amino de las proteínas. Las proteínas 2b mutantes sin actividad supresora de 
silenciamiento (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bΔ5T) se co-agroinfiltraron junto con P19 
de TBSV para garantizar su acumulación transitoria. Se muestra la fluorescencia derivada de BiFC en 
campos de células epidérmicas. Todas las proteínas 2b mutantes interaccionaron con ambas proteínas 
AGO. En todas las interacciones con AGO1, la fluorescencia fue principalmente citoplásmica, similar a la 
BiFC resultante de 2b/AGO1. En todas las interacciones con AGO4, el patrón de localización subcelular 
fue nuclear, excluyendo al nucléolo, como la BiFC resultante de 2b/AGO4, a pesar de que algunas 
proteínas 2b mutantes no se acumulaban en el núcleo celular por sí mismas (ver Fig. 18). 



121 
 

4.3. Unión in vitro de la proteína 2b a RNAs  

La unión a RNAs se ha encontrado en proteínas supresoras del silenciamiento de virus 

de diferentes familias, y puede constituir una propiedad muy extendida en dichas 

proteínas, y estar relacionada con sus actividades supresoras del silenciamiento. La 

proteína 2b de TAV forma dímeros que unen in vitro sRNAs, con una relación entre 

proteína y RNA de 2:1 (Rashid et al. 2008; Chen et al. 2008). En nuestro estudio 

quisimos investigar si la proteína 2b de CMV unía in vitro diferentes tipos de RNAs, y 

en caso afirmativo determinar las propiedades cinéticas de estas uniones. Los intentos 

de purificación de proteína 2b de planta, marcada con un péptido de seis histidinas 

(6xHis) no fueron exitosos (datos no mostrados) por lo que expresamos en E. coli el 

plásmido pQE30 conteniendo el gen 2b nativo o nuestra batería de nueve mutantes 

que expresaban las proteínas como fusiones a 6xHis en su extremo amino y el péptido 

HA en su extremo carboxilo (construcciones pQE30- 6xHis-2b, 6xHis-2bΔNLS1, 6xHis-

2bΔNLS2, 6xHis-2bΔNLS1+2, 6xHis-2bΔKSPSE, 6xHis-2bS40A, 6xHis-2bS42A, 6xHis-

2bΔGSEL, 6xHis-2bΔ3T y 6xHis-2bΔ5T). Las proteínas expresadas se purificaron 

mediante columnas con resina Ni-NTA en condiciones desnaturalizantes, y 

posteriormente fueron renaturalizadas in vitro. Se evaluó entonces su unión in vitro a 

sRNAs sintéticos en ensayos de retardo en gel (Rakitina et al. 2006). Estos sRNAs están 

basados en la secuencia del miRNA 171 de A. thaliana. Evaluamos tres tipos de RNAs 

pequeños: de doble hebra de 21 nts con complementariedad total y dos nts 

desapareados en los extremos (ds siRNA); el microRNA sintético (miRNA) de 21 nts con 

complementariedad parcial con dos nts desapareados en los extremos y 4 nts 

desapareados en su interior, dos de ellos consecutivos; y de hebra sencilla de 21 nts  y 

polaridad positiva (ss siRNA), descritos en el apartado 3.7. de Material y Métodos (Fig. 

11). Tras incubar las proteínas y el RNA en un tampón de unión, sometimos la muestra 

incubada a electroforesis en condiciones nativas. En este tipo de ensayos el RNA que 

permanece unido a la proteína 2b no penetra en el gel o lo hace con retardo, mientras 

que el RNA libre penetra directamente en el mismo. El ensayo permite cuantificar 

indirectamente la proporción de RNA que se ha unido a la proteína, como medida 

inversa a la cantidad de RNA que ha penetrado en el gel, y éste se puede cuantificar 

midiendo la intensidad de banda visualizada frente al control. 



122 
 

En un primer estudio incubamos la proteína 2b y seis mutantes (6xHis-2bΔNLS1, 6xHis-

2bΔNLS2, 6xHis-2bΔNLS1+2, 6xHis-2bΔKSPSE, 6xHis-2bS40A, 6xHis-2bS42A) con ds 

siRNA con una relación molar proteína:RNA de 15:1. Esta relación molar esperábamos 

que fuera más que suficiente para unir la totalidad del RNA, ya que estudios con la 

proteína 2b de TAV habían mostrado que ésta podía unir sRNAs in vitro con una 

relación molar 2:1 en sus condiciones experimentales (Chen et al. 2008). El resultado 

de este primer ensayo demostró que la proteína 2b de la cepa Fny de CMV une in vitro 

ds siRNA (Fig. 26), como se había observado anteriormente en otros estudios con otros 

cucumovirus (Goto et al. 2007; Rashid et al. 2008). La proteína 2b de CMV y las 

proteínas mutantes 2bS40A y 2bS42A, que retuvieron su actividad supresora de 

silenciamiento intacta (Fig. 15), unieron el ds siRNA, mientras que aquellos mutantes 

en los en que se había deleccionado la NLS1 (2bΔNLS1 y 2bΔNLS1+2) no impidieron la 

entrada del ds siRNA en el gel. Sin embargo, las proteínas mutantes 2bΔNLS2 y 

2bΔKSPSE presentaron cierta unión a ds siRNAs en estos ensayos y retardaron 

parcialmente su entrada en el gel (Fig. 26). En posteriores ensayos utilizamos además 

los otros tres mutantes de la proteína 2b con delecciones fuera de la región de la 

proteína supuestamente involucrada en la unión a sRNAs: 6xHis-2bΔGSEL, con una 

delección parcial de un dominio conservado en el subgrupo I de CMV; 2bΔ5T, con 

delección del dominio terminal amino (aas 1-17); y 2bΔ3T, con delección del dominio 

terminal carboxilo (aas 95-110). Estas delecciones afectan en diferente grado a la 

patogenicidad del virus (Fig. 14, y Lewsey et al. 2009).  

 



123 
 

 

Fig. 26: Unión in vitro de la proteína 2b de CMV a un sRNA sintético de 21 nts de doble cadena (ds 
siRNA). Se expresaron y purificaron las proteínas en E. coli y se incubaron con el RNA sintético a una 
relación molar proteína:RNA de 15:1. Se resolvió el RNA no unido a proteína por electroforesis en gel de 
poliacrilamida (panel superior) o en gel de agarosa al 2% (panel intermedio). La primera calle del gel 
muestra 5 pmol de RNA libre en ausencia de proteína, y las siguientes en presencia de las proteínas 2b y 
seis mutantes (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bS40A y 2bS42A). Las proteínas 2b, 2bS40A 
y 2bS42A previnieron completamente la entrada del ds siRNAs en el gel, por lo que todo el RNA estaba 
unido a la proteína. Las proteínas 2bΔNLS1 y 2bΔNLS1+2 no unieron el ds siRNA, que penetró en el gel. 
Las proteínas 2bΔNLS2 y 2bΔKSPSE retuvieron parcialmente la entrada de ds siRNA de la muestra. El 
panel inferior muestra las proteínas 2b y mutantes utilizadas en el experimento, purificadas, 
renaturalizadas y separadas por electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida del 12%.  

 

4.3.1. Caracterización de las propiedades de la unión in vitro de proteína 

2b nativa o mutante a sRNAs 

Nuestros primeros resultados de unión in vitro de la proteína 2b y seis mutantes al ds 

siRNA (Fig. 26) sugieren que podría haber una correlación entre la unión a sRNAs y la 

actividad supresora de silenciamiento antiviral de esta proteína, ya que mutantes que 

no presentaban actividad supresora (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE) no lo 

unían, o tenían dicha unión debilitada (Fig. 26).  

Investigamos más a fondo esta propiedad de unir sRNAs de la proteína 2b y sus 

posibles implicaciones funcionales. Para ello se ensayaron in vitro la proteína 2b nativa 



124 
 

y los nueve mutantes de que llegamos a disponer (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 

2bΔKSPSE, 2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL, 2bΔ5T y 2bΔ3T) con tres tipos distintos de 

sRNAs (ds siRNA, miRNA y ss siRNA) y con un RNA viral de cadena sencilla, y se 

caracterizaron sus cinéticas de unión, contrastándolas con sus relativas actividades 

supresoras del silenciamiento, y con sus efectos en la infección viral como 

determinantes de patogenicidad cuando los mutantes se expresaban desde el propio 

CMV (Lewsey et al. 2009, y este trabajo).  

Los resultados obtenidos de la unión in vitro a sRNAs mediante geles de retardo (Figs. 

27 y 28), los cuantificamos y los representamos como gráficas de curvas de unión de la 

proteína 2b y mutantes a los tres tipos  de sRNAs analizados (Figs. 27 y 29). Para ello en 

los pocillos de estos geles se aumentó gradualmente la relación molar de proteína 

frente a una concentración fija de RNA. Tras cuantificar el RNA que penetraba en el 

gel, y habiendo cuantificado la proteína, obtuvimos las gráficas que representan el 

porcentaje de RNA que es unido por la proteína para cada ratio molar proteína:RNA, 

en cada una de las calles del gel de retardo, y lo mismo con el RNA viral (Figs. 27 a 30). 

Con estos datos se calculó la constante de disociación (Kd) y el coeficiente de Hill, 

expresados en la Tabla 3. La constante Kd es la concentración de proteína a la que el 

50% del RNA aparece unido a proteína. Cuanto menor es su valor, más afinidad hay 

entre proteína y ligando (RNA). Por otro lado, el Coeficiente de Hill es un indicador de 

cooperatividad en la unión a RNA. Si tiene un valor inferior a uno indica cooperatividad 

negativa, lo que significa que una vez que el ligando (RNA) se ha unido a la proteína, la 

afinidad de otras proteínas por más ligandos disminuye; un valor igual a uno significa 

unión no cooperativa, en que la afinidad de las proteínas por los ligandos no depende 

de si otras moléculas de ligando se han unido a la proteína; y valores superiores a uno 

significan unión cooperativa positiva, en que la afinidad por el ligando aumenta según 

se van uniendo ligandos a las proteínas. En proteínas con un único lugar de unión, uno 

podría esperar encontrar unión no cooperativa (coeficiente de Hill =1), y la observación 

de valores diferentes a uno pueden indicar que la proteína en cuestión no es 

monomérica. Chen y colaboradores (2008) habían mostrado por cristalografía que la 

proteína 2b de TAV forma dímeros y que cada dímero une un siRNA, y que los dímeros 

se asocian por las cremalleras de leucina para formar tetrámeros (un tetrámero une 



125 
 

dos siRNAs). En nuestro caso, los resultados habían mostrado que la proteína 2b 

formaba dímeros (Fig. 21), por lo que la unidad funcional en la  unión in vitro a sRNAs 

podría ser el dímero, como se ha visto en otros casos, en que dos o más proteínas se 

asocian para unir uno o varios ligandos (Monod et al. 1965), y como ya apuntaron los 

resultados de la proteína 2b de TAV, en que un dímero 2b unía un siRNA (Fig. 21D y 

Chen et al. 2008). 

 

 

Fig. 27: Cinéticas de unión in vitro de la proteína 2b nativa a diferentes sRNAs basados en el miRNA 171 
de A. thaliana. Se estudió la unión a un sRNA de 21 nts de doble hebra (ds siRNA), al miRNA sintético 
(miRNA) y a un sRNA de hebra sencilla y polaridad positiva (ss siRNA) (ver Fig. 11). A, Geles de retardo de 
agarosa al 2%. La primera calle del gel muestra RNA libre en ausencia de proteína. Se incubaron 5 pmol 
de ds siRNA o miRNA y 15 pmol de ss siRNA, en concentraciones crecientes de proteína 2b. El RNA unido 
a la proteína es retenido en el pocillo del gel y no penetra o penetra con retardo en el mismo. En 
presencia de concentraciones crecientes de proteína la relación de RNA retenido se incrementó en los 
tres casos. B, Curvas de retención de los RNAs. Se obtuvieron a partir de los geles mostrados en A, y 
representan el porcentaje de RNA retenido por la proteína, respecto a la carrera control (RNA incubado 
en solución sin proteína, primer pocillo), para cada proporción de proteína:RNA. La proteína 2b se unió 
al ss siRNA con una afinidad mayor que al miRNA o el ds siRNA. 

 



126 
 

 

Fig. 28: Unión in vitro de las nueve proteínas mutantes a sRNAs (ds siRNA, a miRNA y a ss siRNA) 
basados en el miRNA 171 de A. thaliana. A, Proteínas purificadas, renaturalizadas y separadas en gel de 
SDS-poliacrilamida al 15%, utilizadas en el experimento. B, Geles de retardo de agarosa al 2%. La 
primera carrera muestra sRNA libre, en ausencia de proteína. Se incubaron 5 pmol de ds siRNA y de 
miRNA y 15 pmol de ss siRNA, con concentraciones crecientes de proteína. En presencia de 
concentraciones crecientes de las proteínas 2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL y 2bΔ3T la proporción de RNA 
libre disminuyó, y el retenido se incrementó, en los tres casos. Otras proteínas mutantes, como 
2bΔKSPSE y 2bS42A retuvieron sRNAs parcialmente, y aquellas proteínas con delecciones en las NLSs 
(2bΔNLS1, 2bΔNLS2 y 2bΔNLS1+2) no retuvieron sRNAs o lo hicieron de forma insignificante. La 
delección en el extremo terminal amino (2bΔ5T) afectó asimétricamente la unión a los sRNAs, 
inhibiendo la unión al ds siRNA pero no al miRNA o al ss siRNA. 



127 
 

 

Fig. 29: Cinéticas de unión in vitro de la proteína 2b nativa y nueve mutantes (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 
2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL, 2bΔ5T y 2bΔ3T) a los sRNAs (ds siRNA, miRNA y ss 
siRNA). Las curvas de retención de los RNAs se obtuvieron a partir de la cuantificación del sRNA que 
penetró en los geles mostrados en la Fig. 27, y representan para cada proporción molar proteína:RNA, 
mostradas en abscisas, el porcentaje de RNA unido a la proteína respecto a la calle control de RNA libre 
(incubado en ausencia de proteína), mostrado en ordenadas.   



128 
 

 

El cálculo de la constante de disociación (Kd) y el coeficiente de Hill mostraron que la 

proteína 2b une ds siRNA de forma cooperativa (Coeficiente de Hill =3.65) con alta 

afinidad (Kd =0.92) (Tabla 3), y que a una relación molar proteína:RNA de 2:1 el 60% 

del ds siRNA quedaba unido a la proteína (Fig. 27). Esta relación molar se corresponde 

bien con los datos estructurales de 2b que Chen y colaboradores (2008) obtuvieron por 

cristalografía en TAV, en que la proteína 2b formaba dímeros que unían sRNAs. La 

proteína 2b unía también miRNA y ss siRNA (Fig. 27) de forma cooperativa 

(Coefficientes de Hill =2.11 y 2.03, respectivamente; Tabla 3) aunque su afinidad por 

estos sustratos era un poco menor que la que tenía por el ds siRNA (Kd =1.23 y 1.61, 

respectivamente frente a 0.92, Tabla 3). Con una relación molar proteína:RNA de 2:1, 

quedaba unido a la proteína 2b más del 80% del ss siRNA, mientras que sólo se unía el 

40% del miRNA (Fig. 27). 

De las nueve proteínas mutantes utilizadas en este estudio, aquellas con delecciones 

en las NLSs y que no tenían actividad supresora de silenciamiento (2bΔNLS1 y 

2bΔNLS1+2) no unieron sRNAs, ya fuera ds siRNA, ss siRNA o miRNA, o la unión 

observada fue insignificante (2bΔNLS2). La proteína 2bΔKSPSE, sin actividad supresora 

de silenciamiento, mostró cierto grado de unión a sRNAs de forma cooperativa, 

aunque con una baja afinidad de unión en comparación con la proteína 2b (2bΔKSPSE: 

Kd ds siRNA =4.63; Kd miRNA =3.96; Kd ss siRNA =5.61; Tabla 3). Esta proteína mutante 

no retuvo ss siRNAs o miRNA (Figs. 28 y 29) a la relación molar proteína:RNA 2:1 de la 

proteína 2b, y su unión al 50% de los ds siRNAs se alcanzó sólo a relaciones molares 

proteína:RNA de 8-10:1 (Figs. 28 y 29). Las proteínas 2bS40A y 2bS42A, con 

sustituciones puntuales en el motivo de fosforilación y que retenían la actividad 

supresora de silenciamiento (Tabla 1), presentaron diferencias en la unión a sRNAs con 

respecto a la proteína 2b nativa. El mutante 2bS40A presentó una afinidad por los tres 

sRNAs un poco mayor que la proteína 2b (Kd ds siRNA =0.55; Kd miRNA =0.62; Kd ss 

siRNA =0.71; Tabla 3), mientras que el mutante 2bS42A presentó una afinidad menor 

que la proteína nativa (Kd ds siRNA =1.59; Kd miRNA =2.8; Kd ss siRNA =2.00). A una 

relación molar proteína:RNA de 2:1, 2bS40A retenía el 80% del ds siRNA, frente al 30% 

de 2bS42A; este porcentaje de RNA unido se mantuvo en 2bS40A en la unión a miRNA, 



129 
 

mientras que fue algo menor para 2bS42A; y en la unión a ss siRNA se alcanzó más 

fácilmente la unión del 100% del RNA de 2bS40A que 2bS42A (Figs. 28 y 29).  

Las proteínas con delecciones en la región carboxilo de la proteína 2b (2bΔGSEL y 

2bΔ3T) presentaron mayor afinidad por los sRNAs que la proteína 2b nativa. Entre 

estas dos proteínas mutantes, 2bΔ3T presentó una mayor afinidad por los sRNAs (Kd 

ds siRNA =0.47; Kd miRNA =0.39; Kd ss siRNA =0.52; Tabla 3) que 2bΔGSEL (Kd ds siRNA 

=0.58; Kd miRNA =0.73; Kd ss siRNA =0.98; Tabla 3). Estas dos proteínas mutantes 

presentaban actividad supresora de silenciamiento (Fig. 15) y conservaban intacta la 

zona de unión a sRNAs y de formación de dímeros equivalente en TAV (Chen et al. 

2008). Nuestros datos indican por tanto que la mitad carboxilo de la proteína puede de 

algún modo entorpecer la unión a sRNAs, ya que las delecciones en esta región de la 

proteína favorecieron la unión in vitro a los sRNAs. 

Un caso distinto y muy interesante lo presentó la proteína 2bΔ5T, que carece del 

dominio terminal amino (aas 1-17). La delección no afecta a las NLSs ni al motivo de 

fosforilación, aunque sí afecta parcialmente a la ARR en la primera α-hélice de la 

proteína 2b, y a la zona equivalente en TAV implicada en la formación de tetrámeros 

(Chen et al. 2008). La proteína 2bΔ5T carecía de actividad supresora de silenciamiento 

(Fig. 15) aunque la localización subcelular y la interacción consigo misma o con las 

proteínas AGO era semejante a la proteína 2b (Figs. 18, 22 y 25). La delección en 2bΔ5T 

afectó a la unión de la proteína a sRNAs diferencialmente según el tipo de sRNA: la 

proteína unió miRNA y ss siRNAs con una afinidad elevada, aunque algo menor que la 

de la proteína nativa (2bΔ5T: Kd miRNA =2,68 y Kd ss siRNA =2,21; vs 2b: Kd miRNA 

=1.23 y Kd ss siRNA =1.61; Tabla 3) y en ambos casos llegó a unir el 100% de estos 

sRNAs con relaciones molares proteína:RNA relativamente bajas (Fig. 29); sin embargo 

no ocurrió lo mismo con el ds siRNA (Figs. 28 y 29) por el que la proteína 2bΔ5T 

presentó una afinidad de unión muy baja (Kd ds siRNA =6,74, Tabla 3), y con una 

relación molar proteína:RNA de 10:1, apenas unió el 20% del ds siRNA (Figs. 28 y 29).  

Por tanto se diferenciaron varios patrones de unión a sRNAs. El primer patrón lo 

conformaron la proteína 2b y los mutantes que retenían la actividad supresora de 

silenciamiento de RNA y la unión a sRNAs (2b, 2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL, 2bΔ3T). El 



130 
 

segundo patrón aquellas proteínas mutantes de 2b sin actividad supresora de 

silenciamiento que no mostraban unión a ningún tipo de sRNAs (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 

2bΔNLS1+2). El tercer patrón, la proteína mutante 2bΔKSPSE, patrón intermedio entre 

los anteriores y con capacidad reducida de unión a sRNAs aunque sin actividad 

supresora de silenciamiento. Y un cuarto patrón lo conformó la proteína 2bΔ5T, sin 

actividad supresora de silenciamiento y con un comportamiento diferencial de unión 

según el tipo de sRNA. No unía ds siRNA, pero sí miRNA y ss siRNA con afinidades 

cercanas a las de la proteína 2b (Figs. 28 y 29).  

En conclusión, el análisis de la unión in vitro a sRNAs de la proteína 2b y de nuestra 

batería de nueve mutantes desveló una correlación entre la actividad supresora de 

silenciamiento de las proteínas y su capacidad de unión in vitro a sRNAs a proporciones 

molares de proteína:RNA cercanos a 2:1, en particular a ds siRNA. También mostró que 

delecciones en la mitad amino de la proteína inhibían la unión a sRNAs mientras que 

delecciones en la mitad carboxilo la favorecían. 

Tabla 3: Parámetros cinéticos de unión a RNAs de la proteína 2b y sus nueve mutantes. La constante de 
disociación aparente (Kd) y el coeficiente de Hill (Coef. Hill) se obtuvieron a partir de la cuantificación de 
las bandas de RNA en los geles de retardo para el ds siRNA,  el miRNA y el ss siRNA. No se calcularon los 
parámetros en aquellas proteínas que no unían RNAs. Los valores son la media de tres experimentos 
individuales y se muestra la desviación estándar de estos datos. En la última columna se indica si la 
proteína presenta actividad supresora de silenciamiento (Act. Sup.). 

 
 

ds siRNA miRNA ss siRNA 
Act. 
Sup. 

Kd Coef. Hill Kd Coef. Hill Kd Coef. Hill 

2b 0.92+0.03 3.65+0.41 1.23+0.05 2.11+0.13 1.61+0.28 2.03+040 + 

2bΔNLS1 No No No No No No - 

2bΔNLS2 No No No No No No - 

2bΔNLS1+2 No No No No No No - 

2bΔKSPSE 4.63+0.39 2.26+0.19 3.96+0.17 4.03+0.56 5.61+1.17 2.7+0.74 - 

2bS40A 0.55+0.07 3.88+0.15 0.62+0.03 3.48+0.47 0.71+0.04 1.85+0.18 + 

2bS42A 1.59+0.36 1.9+0.77 2.80+0.01 2.55+0.33 2.00+0.09 3.23+0.46 + 

2bΔGSEL 0.58+0.09 5.66+2.11 0.73+0.01 3.91+0.15 0.98+0.03 2.38+0.21 + 

2bΔ5T 6,74+0,47 2,52+0,25 2,68+0,3 2,66+0,70 2,21+0,07 3,66+0,31 - 

2bΔ3T 0.47+0.01 2.9+0.01 0.39+0.06 2.69+0.83 0.52+0.02 2.51+0.29 + 



131 
 

4.3.2. Caracterización de la unión in vitro de las proteínas 2b o mutantes 

a un RNA genómico viral    

En nuestro sistema experimental estudiamos también si la proteína 2b podía unir RNAs 

largos, y confirmamos su unión cooperativa a RNA genómico de TMV, de unas 6.4 kb 

(Fig. 30). Estudiamos la unión de proteína 2b y de los ocho mutantes disponibles en el 

momento de realizar el experimento (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 

2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL y 2bΔ3T) a este RNA viral de cadena sencilla. Los resultados 

se muestran en la Fig. 30, con uno de los geles y la representación gráfica de la relación 

molar proteína:RNA frente a 0,2 µg de RNA de TMV, en abscisas; y el porcentaje de 

RNA retenido por la proteína a cada relación molar, en ordenadas. También 

calculamos la Kd y el coeficiente de Hill (Tabla 4).  

 

 

Fig. 30: Cinéticas de unión in vitro de la proteína 2b nativa y de ocho mutantes (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 
2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL y 2bΔ3T) al RNA genómico de TMV. A, Gel resultante 
de la unión de la proteína 2b nativa al RNA de TMV, en las relaciones proteína:RNA indicadas en la parte 
superior del gel. La última carrera muestra 0,2 µg de RNA de TMV. B, En otro experimento, se incubó el 
RNA de TMV en ausencia o presencia de las proteínas 2b o mutantes, en concentraciones crecientes de 
proteína. Las relaciones molares proteína:TMV en este caso fueron 65:1, 125:1, 250:1, 500:1 y 1000:1, 
en un volumen de 20 µl. La muestra se resolvió por electroforesis en un gel no desnaturalizante de 
agarosa al 0.8% (no mostrado). El gráfico resultante de la cuantificación del porcentaje de RNA retenido 
(unido a las proteínas), en ordenadas, frente a la relación de proteína:RNA en abcisas muestra dos 
grupos de cinéticas diferenciadas: Un grupo incluye la proteína 2b y los mutantes 2bS40A, 2bS42A, 
2bΔGSEL y 2bΔ3T y unió el RNA de TMV con una relación molar proteína:RNA de 500:1; mientras que 
otro grupo, formado por las proteínas sin actividad supresora (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2 y 
2bΔKSPSE), no lo unió.  

 



132 
 

La afinidad aparente de unión de la proteína 2b por el RNA de TMV fue 1.78 µM (Tabla 

4), y el retardo total del RNA se alcanzó con una relación molar proteína:RNA de 500:1, 

con unión cooperativa (Coeficiente de Hill =1.72; Tabla 4). Observamos dos patrones 

claramente diferenciados en las cinéticas de unión del RNA de TMV a las proteínas 2b y 

mutantes (Fig. 30). El primer patrón lo conformaron las proteínas 2b y mutantes con 

actividad supresora de silenciamiento (2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL y 2bΔ3T), que 

unieron el RNA de TMV con una relación molar proteína:RNA de 500:1. El segundo 

patrón lo conformaron los mutantes sin actividad supresora de silenciamiento 

(2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE), que mostraron mucha menor unión al 

RNA de TMV, no llegando a alcanzar el 30% de retención del RNA con una relación 

molar proteína:RNA de 1000:1.   

 

Tabla 4: Parámetros cinéticos de unión al RNA de TMV de la proteína 2b y sus nueve mutantes. La 
constante de disociación aparente (Kd) y el coeficiente de Hill (Coef. Hill) se obtuvieron a partir de la 
cuantificación de las bandas de RNA en los geles de retardo  para el RNA genómico de TMV. No se 
calcularon los parámetros en aquellas proteínas que no unían RNAs. Los valores son la media de tres 
experimentos individuales y se muestra la desviación estándar de estos datos. En la última columna se 
indica si la proteína presenta actividad supresora de silenciamiento (Act. Sup.). 

 
 

RNA TMV 
Act. 
Sup. 

Kd  Coef. Hill 

2b 1.78+0.17 1.72+0.13 + 

2bΔNLS1 No No - 

2bΔNLS2 No No - 

2bΔNLS1+2 No No - 

2bΔKSPSE No No - 

2bS40A 2.00+0.11 2.20+0.21 + 

2bS42A 2.01+0.26 2.12+0.43 + 

2bΔGSEL 2.11+0.40 2.02+057 + 

2bΔ5T ND ND - 

2bΔ3T 3.10+0.14 2.01+0.11 + 

 

 



133 
 

En la Tabla 5 se muestra un resumen de los resultados de la proteína 2b y la batería de 

mutantes obtenidos de los ensayos presentados hasta este punto de Resultados, que 

permite correlacionar de forma sencilla los estudios de biología celular y de unión in 

vitro de RNAs con la actividad funcional de las proteínas en ensayos de supresión del 

silenciamiento.  

 

Tabla 5: Sinopsis de las propiedades de la proteína 2b y la batería de nueve mutantes en los ensayos de 
biología celular in vivo, de unión in vitro a RNAs y de actividad funcional de las proteínas en ensayos de 
supresión local del silenciamiento. La actividad supresora de silenciamiento se correlacionó con la 
capacidad de unión a ds siRNA a relaciones molares proteína:RNA de 2:1. Los símbolos + (y ++) indican 
una propiedad positiva (o marcadamente positiva), mientras que el símbolo - indica negativo a una 
propiedad.  +/- indica situaciones intermedias. ND, no disponible por no haberse analizado. 
 

 
Presencia 
nuclear 

Formación 
de 

dímeros 

Interacción 
con AGOs 

Unión a 
sRNAs 

Actividad 
supresora de 

silenciamiento 

2b + + + + + 

2bΔ5T  + + + 
- ds siRNA 
+ miRNA 

+ ss siRNA 
- 

2bΔNLS1 - + + - - 

2bΔNLS2 +/- + + - - 

2bΔNLS1+2 - + + - - 

2bΔKSPSE ++ + + +/- - 

2bS40A + + + + + 

2bS42A + + + + + 

2bΔGSEL + + + + + 

2bΔ3T  + + + ++ + 

NES-GFP-2b - ND ND ND + 

 

 

  



134 
 

4.4. Visualización de potenciales interacciones de la proteína 2b 

con otras proteínas nucleolares de la planta  

La interacción de 2b con otras proteínas nucleares podría contribuir a explicar su 

distribución en el núcleo, nucléolo y CBs. En el núcleo/nucléolo, la proteína viral podría 

beneficiarse de dichas interacciones para alterar la transcripción celular con el fin de 

facilitar la infección viral, poner a disposición del virus diferentes recursos celulares o 

incluso influir en la fase del ciclo celular en que se encuentra ésta.  

Nosotros habíamos observado que al co-infiltrar las proteínas de fusión GFP-2b y Fib-

mRFP en hojas de N. benthamiana, ambas co-localizaban en el nucléolo y CBs (Fig. 13F 

y 31A). Pero además, en esta co-agroinfiltración la sobreexpresión de la proteína 

fibrilarina parecía incrementar la presencia de la proteína 2b en el nucléolo, aunque no 

llegamos a cuantificar este efecto. Es más, co-agroinfiltrando GFP-2b con las proteínas 

sYFPN-fibrilarina (de N. benthamiana) y sYFPN-coilina y sYFPN-nucleolina (de A. 

thaliana), y observando la emisión de GFP en microscopio confocal, o co-

agroinfiltrando 2b-mRFP con GFP-fibrilarina, GFP-coilina y GFP-nucleolina y 

observando la emisión de mRFP, vimos que la sobreexpresión de sendas proteínas 

nucleolares incrementaba la presencia de proteína 2b en el núcleo (Fig. 31B y 

resultados no mostrados). Decidimos pues visualizar mediante BiFC estas potenciales 

interacciones con la proteína 2b.  

Expresamos el par de proteínas de fusión sYFP-2b/sYFP-Fibrilarina por co-

agroinfiltración en hojas de N. benthamiana, y observamos campos de células 

epidérmicas en microscopio confocal. Nuestros resultados mostraron fluorescencia 

derivada de BiFC en los núcleos celulares, y probablemente en el nucléolo, CBs y 

corpúsculos asociados (Fig. 32A).  

 



135 
 

 

Fig. 31: Indicación de una posible interacción de la proteína 2b de CMV con proteínas celulares 
nucleares. A, Co-localización de las proteínas 2b de CMV y la proteína celular fibrilarina. Se muestra la 
ampliación de un núcleo en que se puede observar la localización de GFP-2b (imagen izda.), la de 
fibrilarina-mRFP (imagen central) y la imagen superpuesta de las anteriores (imagen dcha.). B, En 
presencia de sobreexpresión de las proteínas fibrilarina, coilina y nucleolina, parece haber una 
localización más marcadamente nucleolar de la proteína GFP-2b. La barra en la esquina inferior dcha. 
representa 10 µm. 

 

También analizamos la interacción por BiFC de proteínas mutantes de 2b que 

presentaban alterada su localización subcelular (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 

2bΔKSPSE) con la fibrilarina, en presencia del supresor P19 de TBSV para asegurar la 

acumulación transitoria de las proteínas mutantes (Fig. 32A). En los campos de células 

epidérmicas observamos fluorescencia derivada de la interacción en todos los casos y 

que esta fluorescencia se localizaba en el núcleo. La fluorescencia fue más débil en 

aquellos mutantes que presentaban delecciones en las NLSs, mientras que la 

fluorescencia derivada de la interacción 2bΔKSPSE/fibrilarina tuvo una localización 

fuertemente nuclear y una intensidad semejante a la derivada de la interacción 

2b/fibrilarina. El análisis de la acumulación de proteínas (western blot) en el tejido 

agroinfiltrado mostró una acumulación de proteína 2b similar en todos los casos (Fig. 

32B).  



136 
 

 

Fig. 32: Fluorescencia derivada de BiFC de 2b/fibrilarina y 2b mutantes/fibrilarina, y su localización 
subcelular. A, La fluorescencia derivada de BiFC para los pares de proteínas sYFPN-Fibrilarina/sYFPC-2b, 
sYFPN-Fibrilarina/sYFPC-2bΔNLS1, sYFPN-Fibrilarina/sYFPC-2bΔNLS2, sYFPN-Fibrilarina/sYFPC-
2bΔNLS1+2 y sYFPN-Fibrilarina/sYFPC-2bΔKSPSE en presencia del supresor P19 de TBSV se localizó en los 
núcleos celulares. Imagen inf. dcha., control negativo co-agroinfiltrado con sYFPN-Fibrilarina/sYFPC 
(vector vacío). La fluorescencia es más débil con aquellos mutantes con delecciones en las NLSs, no así la 
fluorescencia derivada de la delección del motivo de fosforilación. La localización de la interacción, 
respecto a la proteína 2b, no varía en aquellos mutantes con delecciones en las NLSs, y es fuertemente 
nucleolar en la interacción con 2bΔKSPSE. B, Análisis por western blot de la acumulación transitoria de 
las proteínas 2b nativa y algunas de las mutantes marcadas para BiFC en tejido agroinfiltrado. Todas las 
proteínas 2b se acumularon en cantidades comparables. La barra superior dcha. de las imágenes 
representa 150 µm.  

 



137 
 

La coilina es un componente principal de los CBs y su función se ha relacionado con la 

regulación del ciclo celular y de las respuestas a estreses (Cioce y Lamond 2005; 

Boulon et al. 2010). Un estudio reciente ha relacionado la coilina de A. thaliana con la 

proteína viral 63K del hordeivirus PSLV, encontrándose que interaccionan in vitro en 

ensayos de far-western e in vivo en BiFC (Semashko et al. 2012). 

Expresamos el par de proteínas de fusión sYFP-2b/sYFP-coilina en hojas de N. 

benthamiana por agroinfiltración y visualizamos la fluorescencia derivada de BiFC en 

campos de células epidérmicas en microscopio confocal. Esta fluorescencia se localizó 

en los núcleos y, dentro de éstos, posiblemente en nucléolos y CBs (Fig. 33).  

Estudiamos también la interacción entre aquellas proteínas mutantes de 2b que 

presentan alterada la localización subcelular (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 

2bΔKSPSE), y otros mutantes (2bS40A, 2bS42A y 2bΔGSEL) con la coilina. Expresamos 

los pares de proteínas marcados para BiFC (2bΔNLS1/coilina, 2bΔNLS2/coilina, 

2bΔNLS1+2/coilina, 2bΔKSPSE/coilina, 2bS40A/coilina, 2bS42A/coilina y 

2bΔGSEL/coilina) en hojas de N. benthamiana por agroinfiltración en presencia de P19 

de TBSV. En todos los casos visualizamos la fluorescencia dentro del núcleo, en los 

nucléolos y probablemente CBs (Fig. 33A). El análisis de acumulación de proteínas por 

western blot de la proteína 2b y de sus mutantes mostró que todas ellas se 

acumulaban en cantidades comparables (Fig. 33B). 

 

 



138 
 

 

Fig. 33: Fluorescencia derivada de BiFC de 2b/coilina y 2b mutantes/coilina, y su localización subcelular. 
BiFC para los pares de proteínas sYFPN-Coilina/sYFPC-2b, sYFPN-Coilina/sYFPC-2bΔNLS1, sYFPN-
Coilina/sYFPC-2bΔNLS2, sYFPN-Coilina/sYFPC-2bΔNLS1+2, sYFPN-Coilina/sYFPC-2bΔKSPSE, sYFPN-
Coilina/sYFPC-2bS40A, sYFPN-Coilina/sYFPC-2bS42A y sYFPN-Coilina/sYFPC-2bΔGSEL, y el control 
negativo sYFPN-Coilina/sYFPC (vector vacío). Los mutantes sin actividad supresora de silenciamiento 
(2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE) se co-agroinfiltraron con el supresor P19 de TBSV. A, 
fluorescencia derivada de los campos de células epidérmicas que expresan los pares de proteínas. En 
cada imagen se muestra la ampliación de un núcleo representativo, en que se visualiza nucléolos y 
probablemente cuerpos de cajal. La fluorescencia derivada de BiFC se localiza en los núcleos celulares. 
B, Análisis por western blot de la acumulación de las proteínas 2b y mutantes. Todas las proteínas se 
acumularon en cantidades comparables. La barra superior dcha. de las imágenes representa 75 µm. 



139 
 

La proteína celular nucleolina es, junto con la fibrilarina, uno de los componentes 

mayoritarios del nucléolo (Chen et al. 2002). Expresamos el par de proteínas sYFP-

2b/sYFP-Nucleolina en hojas de N. benthamiana por agroinfiltración y observamos 

campos de células epidérmicas en microscopio confocal. La fluorescencia derivada de 

BiFC se localizó dentro de los núcleos celulares, en el nucléolo y muy probablemente 

en los CBs y corpúsculos asociados, coincidiendo con la distribución subcelular de la 

proteína nucleolina (Fig. 34).  

También estudiamos por BiFC la interacción potencial de aquellos mutantes de 

proteína 2b que tenían alterada su localización subcelular (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 

2bΔNLS1+2 y 2bΔKSPSE) y los mutantes 2bS40A, 2bS42A y 2bΔGSEL con la nucleolina. 

Aquellos mutantes con la actividad supresora comprometida se co-agroinfiltraron en 

presencia de P19 de TBSV. En todos los casos encontramos algo de fluorescencia, 

aunque en el caso de los mutantes con la NLS1 deleccionada ésta era muy débil, lo que 

sugería ausencia o una menor interacción (Fig. 34).   

En conclusión, todas las proteínas 2b interaccionaron con las proteínas celulares 

fibrilarina, coilina y nucleolina, aunque las proteínas con delecciones en las NLS 

interaccionaron débilmente con estas proteínas. La interacción se localizó dentro del 

núcleo formando parte de subestructuras que podían ser nucléolos y probablemente 

CBs, aunque algunos mutantes no tenían por sí mismos una acumulación nuclear (Fig. 

17), lo que sugiere que las NLSs no son las únicas maneras de entrada de la proteína 2b 

al núcleo. 



140 
 

 

Fig. 34: Fluorescencia derivada de BiFC de 2b/nucleolina y 2b mutantes/nucleolina, y su localización 
subcelular. BiFC entre los pares de proteínas sYFPN-Nucleolina/sYFPC-2b, sYFPN-Nucleolina/sYFPC-
2bΔNLS1, sYFPN-Nucleolina/sYFPC-2bΔNLS2, sYFPN-Nucleolina/sYFPC-2bΔNLS1+2, sYFPN-
Nucleolina/sYFPC-2bΔKSPSE, sYFPN-Nucleolina/sYFPC-2bS40A, sYFPN-Nucleolina/sYFPC-2bS42A y 
sYFPN-Nucleolina/sYFPC-2bΔGSEL, junto con el supresor p19 de TBSV. A, En campos de células 
epidérmicas la interacción  se localizó en los núcleos celulares. En cada imagen se muestra la ampliación 
de un núcleo representativo con estructuras subnucleares como nucléolo y probablemente CBs. Las 
proteínas 2b con delecciones en las NLSs presentaron fluorescencia más débil que la observada en la 
interacción 2b/nucleolina, aunque la localización de la interacción fue nuclear. El resto de mutantes 
presentaron igual intensidad de fluorescencia que la interacción Nucleolina/2b y localización 
fuertemente nuclear. B, Análisis por western blot de la acumulación transitoria de las proteínas 2b y 
mutantes. Las proteínas se acumularon en cantidades semejantes. El panel inferior muestra la 
membrana de western teñida con rojo Ponceau, como control de carga. La barra superior dcha. de las 
imágenes representa 75 µm. 



141 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5. DISCUSIÓN 

  



142 
 

  



143 
 

Los supresores virales de silenciamiento interfieren con la defensa antiviral de la planta 

mediada por el silenciamiento de RNAs, lo que los hace determinantes de 

patogenicidad en las infecciones virales. Pueden actuar de diversas maneras, algunos 

de ellos incluso interfiriendo en más de un paso de este mecanismo de defensa (Díaz-

Pendón y Ding 2008). Por un lado, la unión a RNAs es una propiedad común a muchos 

supresores virales, conocida desde hace años (Lakatos et al. 2006; Mérai et al. 2006), 

que podría estar relacionada con la función supresora. Esto se ha confirmado en 

algunos de ellos, como el supresor P19 de tombusvirus (Silhavy et al. 2002). Por otro 

lado, a lo largo de estos últimos años se han ido identificado interacciones de algunos 

supresores de silenciamiento con proteínas del huésped, algunas de ellas 

constituyentes de la maquinaria del silenciamiento, que podrían constituir otros 

mecanismos de bloqueo del silenciamiento de RNA (Baumberger et al. 2007; 

Bortolamiol et al. 2007; Díaz-Pendón y Ding 2008; Zhang et al. 2006b). El carácter 

multifuncional de muchas de las proteínas codificadas en los compactos genomas de 

los virus de plantas hace que no todas estas interacciones con diversos factores tengan 

que estar necesariamente relacionadas con la función supresora. Las dinámicas de 

estas interacciones de supresores con ácidos nucleicos o factores proteicos, y sus 

efectos a nivel funcional en la supresión del silenciamiento antiviral o de otras 

respuestas, en la manifestación fenotípica de la infección, y en general en la 

interacción planta-virus-ambiente, son actualmente motivo de intensa investigación.  

A pesar de su pequeño tamaño, la proteína 2b de cucumovirus es un supresor de 

silenciamiento que tiene las propiedades tanto de unir RNAs como de interaccionar 

con proteínas de las rutas de silenciamiento y estudios previos al nuestro habían 

relacionado la actividad supresora de silenciamiento con su localización celular 

nuclear, con su interacción de proteínas AGO y con la unión a siRNAs in vitro, sin que 

estas propuestas sean excluyentes entre ellas.  

En este trabajo hemos llevado a cabo estudios sobre la distribución intracelular de la 

proteína 2b de CMV, sobre interacciones in vivo proteína-proteína y sobre 

interacciones in vitro con RNAs para contribuir a determinar la importancia relativa de 

estas propiedades de la proteína 2b en su función supresora del silenciamiento 

antiviral. Para ello, nuestra estrategia ha sido la de caracterizar, en proteína nativa o en 



144 
 

mutantes, por un lado sus actividades supresoras del silenciamiento en un sistema de 

expresión transitoria mediante ensayos de agroinfiltración, y por otro lado utilizar 

dichas construcciones para nuestros estudios moleculares y de biología celular, lo que 

nos ha permitido establecer relaciones entre nuestras observaciones y la actividad 

funcional de la proteína estudiada.  

  



145 
 

5.1. Localización, patogenicidad y actividad supresora del 

silenciamiento de la proteína 2b de CMV, nativa o modificada 

La expresión de proteínas o RNAs foráneos en plantas encuentra la limitación de la 

pared celular, y requiere bien de su expresión constitutiva desde un transgén 

integrado en el genoma de la planta, lo que puede ser costoso en tiempo y 

técnicamente complejo (Giddings et al. 2000); o bien el uso de sistemas de expresión 

transitorios por bombardeo de plásmidos que expresen el RNA desde el control de un 

promotor eucariota, ya sea utilizando un vector viral o mediante T-DNAs transferidos a 

la célula vegetal por agroinfiltración (Fisher et al. 1999). En este último caso la 

bacteria, infiltrada en las hojas como un cultivo líquido, media la transferencia del 

fragmento T-DNA de plásmidos binarios a las células de la región infiltrada (Kapila et al. 

1997). A diferencia de los vectores virales, la agroinfiltración no permite una expresión 

sistémica del gen, pero permite expresar localmente en tejidos infiltrados varios 

transgenes de T-DNAs diferentes en una misma célula, procedentes de diferentes 

cultivos que se mezclan previamente a la agroinfiltración (Kapila et al. 1997). Esta 

expresión ectópica puede ser elevada (Voinnet et al. 2003) aunque los transcritos 

expresados por el T-DNA son identificados como foráneos por la planta y sufren 

silenciamiento (Johansen y Carrington, 2001; Canto et al. 2002). Esto, lejos de ser un 

defecto, hace a la técnica adecuada para nuestros estudios porque por un lado nos 

permite expresar proteínas fusionadas a marcadores fluorescentes para estudios de 

co-localización o de interacciones moleculares, y por otro nos permite caracterizar la 

actividad de supresores virales marcados o mutados sobre el silenciamiento de un gen 

indicador también expresado de un T-DNA co-agroinfiltrado. 

Nuestros resultados mostraron que las fusiones de la proteína 2b al péptido HA o a 

diferentes proteínas para la observación de fluorescencia in vivo (fusiones GFP-2b, 

sYFPN-2b, sYFPC-2b 2b-mRFP y 2b-HA, Fig. 12), tanto en su extremo amino como 

carboxilo, no afectaban a su actividad en ensayos de supresión local del silenciamiento 

a pesar de sus tamaños, a veces considerables. Nuestros resultados confirmaron lo que 

diversos autores observaron anteriormente tanto en estudios de microscopía en la 

cepa Q como de fraccionamiento celular en la cepa Fny (Lucy et al. 2000; Mayers et al. 



146 
 

2000): que la proteína 2b se localiza en el citoplasma y, mayoritariamente, en el 

núcleo. Dentro del núcleo, nuestras observaciones revelaron una distribución 

nucleolar y en los CBs asociados, de donde se encuentran ausentes las proteínas GFP y 

mRFP libres (Fig. 13). Esta asociación nucleolar de la proteína 2b no había sido descrita 

anteriormente.  

Por otro lado, analizamos el efecto que tienen delecciones o sustituciones puntuales 

en los diferentes dominios y motivos de la proteína 2b en la actividad supresora y la 

localización subcelular de la proteína. Nuestros resultados de supresión local de 

silenciamiento mostraron, tanto en proteínas con un péptido HA en el extremo 

carboxilo, como en las fusionadas a GFP en el extremo amino del supresor, que los 

mutantes 2bS40A, 2bS40A, 2bΔGSEL y 2bΔ3T tenían actividad supresora como la 

proteína nativa, a pesar de las sustituciones de serina por alanina que presentaban en 

el motivo de fosforilación potencial (2bS40A, 2bS42A) o de las delecciones en una 

fracción del dominio 3 (2bΔGSEL) o del dominio terminal carboxilo (2bΔ3T) (Figs. 15 y 

16). Estas proteínas mutantes se acumularon en el tejido infiltrado a niveles 

comparables con la proteína 2b (Fig. 15C). Sin embargo, aquellas proteínas con 

delecciones en el dominio terminal amino, en las NLSs  o en el motivo de fosforilación 

(2bΔ5T, 2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2 y 2bΔKSPSE, respectivamente), no retuvieron 

la actividad supresora de silenciamiento y se acumularon en el tejido más débilmente 

que la proteína 2b (Figs. 15 y 16).  

En dos de los dominios mutados mencionados hemos observado algunas diferencias 

con resultados publicados por otros grupos: Li y colaboradores (2011) observaron que 

en la cepa Q (grupo II de CMV), sustituciones puntuales en su motivo de fosforilación 

de los residuos K39 (supuesto lugar de ubiquitinización) y S40 inhibían total o 

parcialmente su actividad supresora de silenciamiento por lo que, a diferencia de 

nuestros resultados, en la cepa Q de CMV las sustituciones puntuales en este motivo 

de la proteína 2b sí afectaban a la actividad supresora de la proteína. Por ello se podría 

concluir que el motivo de fosforilación en su conjunto es necesario para la actividad 

supresora de silenciamiento de la proteína aunque las sustituciones puntuales, según 

la cepa, pueden inhibir o no su actividad supresora. Por otro lado, Ye y colaboradores 

(2009) relacionaron el dominio 3 de la proteína 2b con la actividad supresora de 



147 
 

silenciamiento en la cepa SD de CMV. En este dominio, las cepas Fny y SD (subgrupo IA 

y IB, respectivamente) comparten sólo los aas 63SEL65 y H71 (Ver anexo I), y por lo tanto 

nuestra proteína 2bΔGSEL carece de la fracción compartida entre ambas cepas. 

Nuestros resultados mostraron que esta proteína presenta actividad supresora y 

localización subcelular semejante a GFP-2b (Figs. 15 y 17) por lo que a diferencia de lo 

observado por Ye y colaboradores (2009) la delección de una fracción de este dominio 

en la cepa Fny no afecta directamente a su actividad supresora.  

Lewsey y colaboradores (2009) han caracterizado en planta los efectos del virus nativo 

y de los virus que portan la mayoría de las mutaciones que hemos utilizado (todas 

menos ΔGSEL) en el desarrollo de esta tesis. A diferencia del virus nativo Fny de CMV 

(Fny-CMV), que causa atrofia y deformación de las hojas, los virus que portan el gen 2b 

con delecciones en el dominio terminal amino, las NLSs y el motivo de fosforilación 

(Fny-CMV2bΔ5T, Fny-CMV2bΔNLS1, Fny-CMV2bΔNLS2, Fny-CMV2bΔNLS1+2 y Fny-

CMV2bΔKSPSE), eran asintomáticos en tabaco y A. thaliana; aunque en N. 

benthamiana la delección de la NLS1 originaba síntomas leves (Tabla 2 y Lewsey et al. 

2009). Estos autores también observaron que el dominio terminal carboxilo y la 

sustitución puntual de las serinas en el motivo de fosforilación modulaban la severidad 

sintomática en la cepa Fny. Nosotros hemos caracterizado el fenotipo de la infección 

con el virus que porta la proteína 2bΔGSEL. El virus Fny-CMV2bΔGSEL presentó un 

fenotipo con síntomas atenuados frente a Fny (Fig. 14), y en este caso la acumulación 

viral en el tejido infectado fue ligeramente menor a la de aquél, por lo que la ausencia 

de este dominio atenúa los síntomas de infección a pesar de presentar actividad 

supresora de silenciamiento en ensayos de agroinfiltración (Fig. 14). Lewsey y 

colaboradores (2009) mostraron que los virus que portan delecciones en el gen 2b en 

su extremo 5’, en los dominios que codifican las NLSs y el motivo de fosforilación (Fny-

CMV2bΔ5T, Fny-CMV2bΔNLS1, Fny-CMV2bΔNLS2, Fny-CMV2bΔNLS1+2 y Fny-

CMV2bΔKSPSE) se acumulaban en el tejido infectado mucho más débilmente que los 

virus que portaban delecciones en la mitad 3’ de 2b o sustituciones puntuales en el 

motivo de fosforilación de la proteína resultante (Fny-CMV2bS40A, Fny-CMV2bS42A, 

Fny-CMV2bΔ3T). Estos autores sugirieron como posibles explicaciones a esta pobre 

acumulación: que fuera el resultado de la baja acumulación viral general (y la de sus 



148 
 

productos), o que las proteínas alteradas tuvieran una estabilidad reducida. Por tanto 

estas proteínas mutantes podrían no inhibir la actividad supresora de silenciamiento 

bien por no tener actividad supresora, o bien por no tener estabilidad para acumularse 

en el medio de la célula vegetal, lo que también impediría su función supresora. En 

nuestros ensayos, el análisis de la acumulación de las proteínas 2b y mutantes 

expresadas transitoriamente en los tejidos agroinfiltrados demostró que aquellas 

proteínas con delecciones en la mitad amino de la proteína (2bΔ5T, 2bΔNLS1, 

2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2 y 2bΔKSPSE) no se acumulaban en la misma medida que la 

proteína nativa y el resto de mutantes (Figs. 15 y 18), pero la presencia del supresor 

heterólogo P19 de TBSV restauró su acumulación a niveles de la proteína 2b nativa.   

Por lo tanto nuestros resultados, en un sistema libre de virus, demostraron que en 

estas proteínas mutantes las delecciones inhibían su actividad supresora de 

silenciamiento pero no las hacían estructuralmente inestables (Figs. 15 y 18). Esto nos 

permitió estudiar su localización subcelular y otras propiedades, como sus 

interacciones con proteínas y RNAs en ensayos in vivo e in vitro, junto con las 

propiedades de la proteína nativa y las de los otros mutantes con función supresora, y 

relacionar nuestras observaciones con la función biológica. Por lo tanto, podemos 

concluir que las proteínas con delecciones en la mitad amino no se acumulan en el 

tejido infiltrado porque carecen de actividad supresora de silenciamiento y no porque 

sean inestables. Por otro lado, también podemos concluir que las mutaciones 

puntuales del motivo de fosforilación y las delecciones del motivo GSEL y del dominio 

terminal carboxilo, que no afectaban a la supresión local del silenciamiento, deben 

afectar otros aspectos de la interacción planta-virus que afectan a la inducción de 

síntomas y que expliquen las diferencias en el fenotipo de las plantas infectadas. 

En cuanto a la localización subcelular de las proteínas mutantes de 2b, nuestras 

observaciones mostraron que las proteínas con el dominio terminal amino 

deleccionado, con sustituciones puntuales en el motivo de fosforilación y con 

delecciones en la mitad carboxilo de la proteína (GFP-2bΔ5T, GFP-2bS40A, GFP2b-

S42A, GFP-2bΔGSEL y GFP-2bΔ3T) se localizaron en el citoplasma y nucléolo celulares 

como la proteína GFP-2b (Figs. 17 y 18). Sin embargo, las proteínas con delecciones en 

las NLSs (GFP-2bΔNLS1, GFP-2bΔNLS2 y GFP-2bΔNLS1+2) perdieron la localización 



149 
 

nuclear y se localizaron principalmente en el citoplasma (Fig. 18); mientras que la 

proteína con el motivo de fosforilación deleccionado (GFP-2bΔKSPSE) se localizó 

principalmente en el nucléolo, sugiriendo que ésta había perdido su capacidad de 

permanecer o de retornar al citoplasma (Fig. 18). Lucy y colaboradores (2000) habían 

demostrado que la actividad supresora de silenciamiento de la proteína 2b en la cepa 

Q (grupo II de CMV) se correlacionaba con su localización nuclear. A diferencia de la 

cepa Fny, la cepa Q tiene una sola NLS y Lucy y colaboradores (2000) observaron que 

ésta, cuya ubicación en la proteína se corresponde con la NLS1 de la cepa Fny, era 

necesaria en su contexto para la supresión de PTGS y que la sola presencia nuclear de 

la proteína no era suficiente para dotarla de la actividad supresora. Por ello Lucy y 

colaboradores (2000) sugirieron que la proteína 2b podría funcionar como un 

competidor del tráfico nuclear, afectando así a la acumulación nuclear de uno o varios 

factores críticos para el inicio del PTGS, o como un activador de la transcripción en el 

núcleo que aumentase la transcripción de un regulador negativo de PTGS. Más 

adelante, Chen y colaboradores (2008) demostraron, en trabajos in vitro de 

cristalografía, que en la proteína ortóloga de TAV, la región en que se localiza la o las 

NLSs interviene en la interacción in vitro con sRNAs. Nuestras observaciones mostraron 

que en la cepa Fny la delección de una sola de las NLSs de la proteína afectaba a la 

actividad supresora de silenciamiento y a su localización subcelular. La delección de la 

NLS1 o de ambas NLSs (2bΔNLS1+2) inhibió completamente la entrada de la proteína al 

núcleo (Fig. 18), como observaron Lucy y colaboradores (2000) con la NLS de la cepa Q. 

Sin embargo, la delección de la NLS2, ausente en la cepa Q, inhibió sólo parcialmente 

la entrada de la proteína al núcleo (Fig. 18). Como en las observaciones de Lucy y 

colaboradores (2000), nuestros resultados de supresión local de silenciamiento 

(agropatch assays) mostraron que la delección de una o de ambas NLSs de la proteína 

no sólo afectaba a la localización de la proteína en la célula, sino que conllevaba la 

pérdida de la actividad supresora de la proteína (Fig. 15). Por lo que estos datos 

correlacionaban la actividad supresora con la localización nuclear de la proteína, como 

se había propuesto anteriormente. Sin embargo, nuestros resultados también 

mostraron que la delección del motivo de fosforilación (GFP-2bΔKSPSE), que confinaba 

a la proteína en el nucléolo celular (Fig. 18), no implicaba actividad supresora de 

silenciamiento (Figs. 15, 16 y 18). Por otro lado, la delección del dominio terminal 



150 
 

amino de la proteína inhibía la actividad supresora de silenciamiento de la proteína, 

aunque no afectaba a su localización subcelular nuclear. El resto de mutaciones 

(2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL, 2bΔ3T) no afectaron a la actividad supresora de 

silenciamiento ni a la localización subcelular de la proteína (Figs. 15-18). 

En diversas proteínas se ha observado que las NLSs, junto con un motivo de 

fosforilación, conforman un motivo CcN que permite el movimiento controlado de una 

proteína entre el citoplasma y el núcleo (Jans 1995; Jans y Hubner 1996). La presencia 

de un motivo CcN en la proteína 2b de CMV sugiere que este supresor de 

silenciamiento se podría mover entre citoplasma y núcleo de una forma controlada por 

el estado de fosforilación. Como hemos mostrado, la delección de las NLSs inhibía el 

transporte de la proteína al núcleo y, la delección del motivo de fosforilación 39KSPSE43 

inhibía el transporte de 2b al citoplasma, confinando la proteína al nucléolo, lo que 

indica que en este caso la proteína ha perdido su capacidad de permanecer o de 

retornar al citoplasma (Fig. 18), por lo que podemos suponer que para la actividad de 

la proteína parece importante el poder traslocarse entre citoplasma y núcleo para 

llevar a cabo su función, y que este transporte está mediado por el motivo CcN.  

Es difícil separar la actividad supresora de silenciamiento de la localización nuclear de 

la proteína utilizando sólo mutantes de delección, ya que el transporte nuclear 

mediado por las NLSs no es la única propiedad que presenta esta región de la proteína, 

sino que también puede intervenir en la unión a sRNAs. Sin embargo, siguiendo una 

aproximación diferente, clonamos una NES en el extremo amino de la proteína 2b 

fusionada a GFP (NES-GFP-2b) y comparamos su actividad supresora de silenciamiento 

y su localización con GFP-2b. NES-GFP-2b retuvo la actividad supresora de 

silenciamiento y su localización subcelular fue citoplásmica con la sucesión de los días, 

resultado del balance entre la entrada de la proteína en el núcleo inducida por las NLSs 

y su salida, por la señal NES. La acumulación del indicador GFP libre tanto en presencia 

de GFP-2b como de NES-GFP-2b fue semejante (Figs. 19 y 20), por lo que podemos 

concluir que la proteína NES-GFP-2b, sin acumulación nuclear, presenta tanta actividad 

supresora de silenciamiento como la proteína GFP-2b. Por otro lado, la propiedad de 

poder traslocarse entre el núcleo y el citoplasma en ambas direcciones, controlado por 

el CcN, es también importante en la actividad de la proteína viral. Estudios posteriores 



151 
 

a Lucy y colaboradores (2000), utilizando otros mutantes de NLSs, observaron también 

que la localización nuclear de 2b es insuficiente para inducir patogenicidad (Wang et 

al. 2004; Lewsey et al. 2009), y la presencia nuclear de la proteína podría participar en 

alguna otra función. Wang y colaboradores (2004) propusieron que esta función era la 

interacción con miRNAs. 

En un estudio posterior a los nuestros, Nemes y colaboradores (2014) han realizado 

mutaciones a lo largo del gen 2b de la cepa Fny y han confirmado que las NLSs y el 

motivo de fosforilación de la proteína son indispensables en la actividad supresora de 

silenciamiento, corroborando nuestros resultados. Por lo que nosotros desvinculamos 

localización nuclear y actividad supresora utilizando mutantes en las NLSs y en el 

motivo de fosforilación y estos autores en su estudio han demostrado que la inhibición 

de la actividad supresora causada por dichas delecciones está más relacionada con los 

daños que causan las delecciones en la estructura de la proteína (en la primera α-

hélice que une los RNAs, o a la segunda α-hélice que altera la integridad de la proteína, 

respectivamente), que con la deslocalización nuclear de la proteína (Nemes et al. 

2014).  

La mitad amino de la proteína 2b ha sido objeto de diversos estudios en los que se han 

deleccionado o sustituido distintas regiones de la proteína, y observado su fenotipo en 

plantas infectadas con virus que expresan dichas proteínas mutadas. Un ejemplo de 

ello es el trabajo con un virus quimera de TAV y la cepa Q de CMV, en que Shi y 

Palukaitis (2011) observaron que se podía infectar sistémicamente, aunque con un 

fenotipo asintomático, plantas de N. clevelandii y N. glutinosa con tan sólo los 

primeros doce aas de la proteína 2b de TAV. En otro estudio, Ye y colaboradores 

(2009) comprobaron mediante recombinantes entre las cepas Q y SD (subgrupos II y 

IB) de CMV, que los primeros ocho aas de la proteína 2b afectaban a la actividad 

supresora de la proteína. Estos estudios evidenciaron que esta región de la proteína 

era muy importante para la función supresora y para el fenotipo de la infección viral. 

Nuestros datos mostraron que la delección del dominio terminal amino (2bΔ5T), que 

en planta genera un fenotipo asintomático (Fny-CMV2bΔ5T, Lewsey et al. 2009), no 

afectaba a la localización subcelular de la proteína aunque inhibía su actividad 

supresora (Figs. 15, 16 y 18), por lo que esta proteína mutante (GFP-2bΔ5T) es una 



152 
 

evidencia más de que el dominio terminal amino de la proteína y el ARR están 

involucrados en la actividad supresora a través de alguna propiedad diferente a la de 

dirigir la proteína al núcleo, como podría ser la de unir RNAs. 

La mitad carboxilo de la proteína 2b también ha sido objeto de diversos estudios y 

contiene el dominio terminal carboxilo, que es una región altamente especializada que 

no está presente en todos los cucumovirus, como es el caso de TAV. En CMV este 

dominio es necesario para la inducción de síntomas en tabaco (Ding et al. 1994), y 

Lewsey y colaboradores (2009) mostraron que la cepa Fny de CMV que portaba una 

delección del mismo (Fny-CMV2bΔ3T) infectaba diversas especies con síntomas 

semejantes al virus nativo. Shi y Palukaitis (2011) mostraron que los 43 primeros aas 

de la proteína 2b de TAV eran suficientes para promover la infección sistémica de un 

pseudo-recombinante de TAV/CMV, aunque con síntomas muy leves, por lo que estos 

autores relacionaron la mitad carboxilo con la virulencia, y propusieron que ésta 

estaba posiblemente relacionada con la supresión de silenciamiento de RNA o con la 

interacción con la catalasa estudiada por Inaba y colaboradores (2011). En CMV, la 

fracción de los aas 70-110 de la mitad carboxilo de la proteína 2b está parcialmente 

desestructurada, aunque la región está bien conservada entre los aas 95-105 (ver 

Anexo I). Gellért y colaboradores (2012) simularon en ordenador una dinámica 

molecular con la proteína 2b completa de la cepa Rs (subgrupo IA de CMV) y 

propusieron que los residuos con carga negativa 95DDTD98 del dominio terminal 

carboxilo unían Mg2+, el ion más abundante en el contexto celular, y que esta unión 

estabilizaba la estructura 3D del dominio terminal carboxilo y la unión a ácidos 

nucleicos. Estos autores confirmaron experimentalmente sus resultados de 

modelización en un cuádruple mutante de sustitución que suavizó los síntomas de la 

infección en planta y ralentizó el movimiento del virus en N. glutinosa y N. clevalandii 

(Gellért et al. 2012), confirmando que el dominio terminal carboxilo se relacionaba con 

la inducción de síntomas que observada por Lewsey y colaboradores (2009), y 

propusieron que in vivo la sustitución del motivo 95DDTD98 por alaninas debilitaba la 

estabilidad del tetrámero formado por las proteínas 2b unidas a los siRNAs. Por otro 

lado, Inaba y colaboradores (2011) y Masuta y colaboradores (2012) observaron que 

tanto en cepas del grupo I como del grupo II de CMV, los cuarenta aas de la mitad 



153 
 

carboxilo de la proteína estaban involucrados en la interacción con la enzima CAT3. 

Esta interacción traslocaba CAT3 al núcleo, donde inhibía su actividad, y esta inhibición 

generaba H2O2 que inducía necrosis en Arabidopsis, por lo que concluyeron que esta 

región en la mitad carboxilo de la proteína 2b era la responsable de la necrosis. Como 

hemos visto, nuestros resultados mostraron que la delección de este dominio no 

afectaba a la actividad supresora de silenciamiento de la proteína en ensayos de 

agroinfiltración, y que la localización nucleolar en el mutante GFP-2bΔ3T parecía 

incluso más patente que en la proteína GFP-2b (Figs. 15 y 16). Por lo que se puede 

concluir, por nuestros resultados y los de otros estudios, que el dominio terminal 

carboxilo no participa en la actividad supresora de silenciamiento, aunque sí en la 

modulación de los síntomas en planta, y que la modulación de estos síntomas podría 

estar mediada por su interacción con CAT3. 

En el tráfico celular del citoplasma al núcleo, las partículas menores a 9 nm difunden 

pasivamente a través de los complejos de poro nuclear (nuclear pore complex, NPC) 

(Palmeri y Malim 1999), mientras que las NLSs permiten un transporte selectivo de 

proteínas de más de 40-60 kDa y facilitan el de proteínas menores. Las NLSs de las 

proteínas que las portan se unen a la importina α en la parte citoplásmica del NPC, y 

ésta a la importina β para atravesarlo, desensamblándose el complejo en la cara 

nuclear (Görlich y Mattaj, 1996). Esta maquinaria la utilizan proteínas de patógenos de 

plantas para entrar en el núcleo, como Agrobacterium (Ballas y Citovsky 1997; Tzfira et 

al. 2002), algunos virus vegetales de DNA (Kunik et al. 1998; Leclerc et al. 1999) y virus 

de RNA de polaridad negativa (Goodin et al. 2001). Wang y colaboradores (2004) 

mostraron en ensayos de doble híbrido en levaduras (yeast two hibryd, Y2H) que la 

proteína 2b de la cepa Fny de CMV interaccionaba con la karioferina α, la importina de 

A. thaliana. En estos experimentos de Y2H, cada una de las NLSs de 2b se unió 

independientemente a la karioferina α para entrar en el núcleo celular (Wang et al. 

2004). Por otro lado, en células de cebolla y utilizando proteína 2b marcada con β-

glucuronidasa, la delección de una sola de las dos NLSs no previno su presencia en el 

núcleo (Wang et al. 2004). En cambio, nuestros resultados in vivo en N. benthamiana 

mostraron que la delección de la NLS1 de la proteína 2b inhibía completamente el 

paso de la proteína 2b al núcleo mientras que la delección de la NLS2 lo reducía mucho 



154 
 

(Fig. 18), por lo que en este huésped la NLS1 parece tener más importancia para entrar 

al núcleo que la NLS2.  

En un estudio reciente, Du y colaboradores (2014a) han relacionado las cepas del 

subgrupo I de CMV con una mayor presencia nuclear de la proteína 2b respecto a las 

cepas del subgrupo II. Estos autores han establecido una relación entre la localización 

nuclear y nucleolar de la proteína 2b y su patogenicidad en las infecciones virales: las 

cepas con presencia más nuclear presentan mayor virulencia, como la cepa Fny 

(subgrupo I de CMV); y las cepas con menor presencia nuclear presentan menor 

virulencia, como la cepa LS (subgrupo II). Este mismo grupo también ha establecido 

una relación entre la presencia citoplásmica y la actividad supresora de silenciamiento 

en un estudio comparativo entre las cepas Fny y LS. En este estudio observaron que la 

proteína 2b de la cepa Fny, con actividad supresora fuerte, es citoplásmica y 

nuclear/nucleolar mientras que la proteína de la cepa LS, con actividad supresora 

débil, es estrictamente nuclear (no nucleolar y no citoplásmica). Estos autores también 

han mostrado que las diferencias en la distribución y en la localización nucleolar de las 

proteínas 2b observadas entre los grupos IA y II de CMV, anteriormente atribuidas a 

diferencias en las secuencias de las NLSs, se deben también a diferencias en las 

secuencias que las bordean, y que éstas son críticas para el reconocimiento de la NLS1 

por factores como la importina. En la cepa Fny estas secuencias que bordean las NLSs 

determinan una NoLS (aas 13-37), mientras que este mismo fragmento varía en 10 

residuos en otras cepas como LS, lo que explica sus diferencias en la localización 

intranuclear, y confirman que la acumulación nuclear no es suficiente para que la 

proteína se acumule en el nucléolo. Du y colaboradores (2014a) han propuesto que el 

reparto de la proteína 2b entre el citoplasma y el nucléolo permite a CMV regular el 

balance entre la acumulación viral y el daño al huésped, en beneficio del virus. En su 

estudio también han mostrado que la acumulación forzada de la proteína 2b de la cepa 

Fny en el núcleo, por la adición de una NLS extra (Fny2bNLS), disminuye la actividad 

supresora de silenciamiento al tiempo que aumenta la virulencia y acelera el desarrollo 

de síntomas en plantas infectadas de A. thaliana. Por lo tanto, nuestro trabajo ha 

desvinculado la presencia nuclear de la proteína 2b (NES-GFP-2b) de la actividad 

supresora de silenciamiento (Figs. 19 y 20), y Du y colaboradores (2014a) han 



155 
 

confirmado nuestros resultados y han ampliado el conocimiento de la proteína 2b con 

nuevas correlaciones entre localización subcelular, actividad supresora de 

silenciamiento y patogenicidad. Lo que sugiere que la presencia nuclear de la proteína 

2b estaría por tanto relacionada con motivos o con procesos no directamente 

requeridos para la actividad supresora.  

 

 

5.2. Interacciones de la proteína 2b con proteínas: formación de 

homodímeros e interacción con proteínas AGO y con otras 

proteínas  

Se han desarrollado distintos métodos para analizar interacciones entre proteínas.  La 

mayoría de ellos requieren la destrucción de las células para detectar las interacciones, 

o la síntesis y purificación de proteínas expresadas en bacterias o levaduras, con lo que 

no reproducen el contexto ni monitorizan la dinámica y la localización in vivo y en 

tiempo real de la interacción (Revisado en Shoemaker y Panchenco, 2007). Estas 

informaciones son necesarias a veces para entender la función de las proteínas a nivel 

celular y de organismo (Bracha-Drori et al. 2004). Hay diversas técnicas que permiten 

estudiar complejos de interacción de proteínas, como por ejemplo la purificación de 

afinidad y la espectroscopía de masas, los microarrays de proteínas, la cristalografía y 

espectroscopía o la microscopía electrónica (Shoemaker y Panchenco, 2007). Nosotros 

nos hemos aproximado al estudio de las interacciones entre proteínas con la técnica 

de BiFC desarrollada en estudios en células de mamíferos (Hu et al. 2002; Hu y 

Kerppola 2003) y adaptada inicialmente a tejidos vegetales para la detección de 

interacciones transitorias entre proteínas por Bracha-Drori y colaboradores (2004). 

Esta técnica es un método muy sensible (Zamyatnin et al. 2006; Morell et al. 2008 

Kerppola 2009) basado en la interacción entre dos mitades de una proteína 

fluorescente fusionadas a las proteínas cuya potencial interacción se pretende 

estudiar. La aproximación de las mitades del fluoróforo reproduce un complejo y 

permite visualizar in vivo dichas interacciones mediante su excitación con luz de 



156 
 

longitud de onda adecuada. En combinación con la microscopía epifluorescente o 

confocal permite estudiar la ocurrencia subcelular de dichas interacciones en células y 

tejidos vivos no fijados (Hu et al. 2002; Citovsky et al. 2006; Kerppola 2006). Como 

limitaciones a esta metodología encontramos que los dos fragmentos de la proteína 

fluorescente deben poder asociarse a pesar de estar ligados al complejo proteico que 

está interaccionando (Hu et al. 2002) y puede no requerir que las proteínas a las que 

están fusionadas las dos mitades del fluoróforo interaccionen directamente entre sí, 

aunque puede utilizarse en la identificación de nuevas interacciones proteicas sin 

conocimiento previo de la base estructural de la interacción (Hu et al. 2002). La 

sobrexpresión de las mitades amino y carboxilo (solas) de la proteína fluorescente en 

algunos vectores de expresión pueden inducir fluorescencia (Zamyatnin et al. 2006), 

aunque no es el caso de nuestros vectores de expresión; y la sobreexpresión mediante 

promotores fuertes de pares de proteínas para estudios de BiFC puede dar lugar a la 

emisión de fluorescencia en ausencia de interacción real entre proteínas nativas 

(Walter et al. 2004). Es por ello que la BiFC constituye una técnica extraordinariamente 

útil para visualizar la ocurrencia subcelular de una interacción, junto con los 

experimentos de co-localización, pero por sí misma no demuestra la ocurrencia de 

dicha interacción entre proteínas nativas y a niveles fisiológicos. Para ello se necesita el 

apoyo adicional de otros datos, como experimentos de doble híbrido, o su 

confirmación mediante co-inmunoprecipitación. Otras limitaciones de la BiFC son que 

los fluoróforos necesitan un tiempo de maduración, que no se puede detectar cambios 

en tiempo real en las interacciones, o que las disociaciones entre proteínas pueden 

estar muy dificultadas o impedidas (Guo et al. 2005; Demidov et al. 2006).   

Con respecto a la proteína 2b, Chen y colaboradores (2008) habían observado en 

estudios cristalográficos que la proteína 2b de TAV formaba homodímeros y 

estructuras de mayor orden, como dímeros de dímeros, que podían constituir la 

conformación activa de la proteína. Rashid y colaboradores (2008) confirmaron la 

formación de estas estructuras en TAV por espectroscopía de reflexión de 

fluorescencia interna total, aunque no las visualizaron in vivo en un contexto celular. 

En este mismo sentido, Hamera y colaboradores (2012) demostraron que la proteína 

de fusión GST-2b de CMV expresada en bacteria, formaba dímeros y tetrámeros que 



157 
 

unían RNAs. Nosotros hemos visualizado in vivo los dímeros de la proteína 2b de CMV 

mediante BiFC en tejido fresco, y su ocurrencia subcelular. Nuestras observaciones han 

mostrado fluorescencia resultado de interacciones tras la co-expresión transitoria de 

los pares sYFPN-2b/sYFPC-2b a partir de T-DNAs agroinfiltrados en hojas de N. 

benthamiana, y su localización en el citoplasma y en el nucléolo, donde co-localizan 

con fibrilarina-mRFP siguiendo un patrón semejante al de GFP-2b (Fig 21). Por tanto, la 

proteína 2b de CMV está presente en la célula formando dímeros solubles.  

La estructura básica dimérica de la proteína 2b de CMV puede que forme agrupaciones 

más complejas, como los dímeros de dímeros observados en TAV, pero nosotros no 

podemos visualizarlos mediante BiFC. Chen y colaboradores (2008) mostraron en TAV 

que la interacción entre dímeros de 2b tiene lugar mediante un motivo de cremallera 

de leucinas, una estructura secundaria que consiste en el intervalo de múltiples 

leucinas formando una región hidrofóbica en un lado de la primera α-hélice 

(L8/I11/L15/M18). Esta región actúa como dominio de dimerización generando fuerzas de 

adhesión en α-hélices paralelas, y la mutación puntual de estos aas en TAV inhibe la 

oligomerización en tetrámeros (Chen et al. 2008). Comparado con TAV, sólo L15 y M18 

están bien conservados en CMV, y L8 y I11 están sustituidos por M8 y V11 en la cepa Fny 

(ver Anexo I), que también son aas apolares hidrófobos o neutros no polares que 

podrían participar en la formación de dímeros de dímeros del mismo modo que en 

TAV, ya que estos aas tienen ciertas características similares. Por lo que los dímeros de 

2b de CMV, que nosotros visualizamos en BiFC, podrían interaccionar entre sí como en 

TAV, formando tetrámeros. Sin embargo, nosotros proponemos que los dímeros 

constituyen la forma biológicamente activa del supresor 2b, ya que el hecho de que 

nuestra proteína 2b marcada con las mitades de YFP para experimentos de BiFC 

muestre una actividad supresora comparable a la de la proteína nativa (Fig. 12) sugiere 

que la tetramerización no es requerida para esta función, ya que es difícil imaginar que 

fusiones en el extremo amino tan grandes como la propia proteína permitan a ésta 

tetramerizar sin impedimentos estéricos, o al menos no lo dificulten sin afectar a su 

función, en particular cuando se reconstituye un fluoróforo de YFP, que es además un 

proceso difícilmente reversible (Zamyatnin et al. 2006; Kerppola 2009). Aunque la 

tetramerización puede que no sea necesaria para la actividad funcional, ello no es 



158 
 

incompatible con que la proteína nativa pueda formar tetrámeros a partir dímeros en 

las infecciones virales, incluso mayoritariamente, por razones de estabilidad o para 

prevenir su degradación por procesos celulares. 

Nuestros datos de BiFC mostraron también que todas las proteínas mutantes 

analizadas, incluso las que carecían de actividad supresora de silenciamiento (2bΔ5T, 

2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2 y 2bΔKSPSE), mantenían la capacidad de formar 

dímeros (Figs. 15 y 22) con la misma distribución subcelular e intensidad de 

fluorescencia que la de la misma proteína mutante marcada con GFP (Figs. 16-18 y 22). 

Aunque todas nuestras proteínas mutantes formaban dímeros consigo mismas y con la 

proteína 2b (datos no mostrados), los mutantes sin actividad supresora analizados no 

mostraron capacidad de complementarse funcionalmente en trans entre sí 

restituyendo la actividad supresora (Fig. 23). Nuestra proteína mutante 2bΔ5T carece 

de parte de la cremallera de leucinas, por lo que aunque formaba dímeros en BiFC,  

podría no formar tetrámeros, y éste sería un punto interesante a clarificar en futuros 

experimentos. 

Xu y colaboradores (2013) han informado de que en la cepa Rad35 (subgrupo IB) el 

aa55 de la proteína 2b es crucial en la actividad supresora y la formación de dímeros de 

2b. Esta cepa es la única en CMV que contiene P55 en lugar de L55 (ver anexo I), y su 

sustitución puntual por L restableció su actividad supresora de silenciamiento y la 

formación de dímeros de 2b (Xu et al. 2013), por lo que los autores correlacionaron 

estos sucesos. Nosotros tomamos con precaución esta propuesta, ya que la 

restauración de la actividad biológica del mutante no tiene por qué derivarse de su 

capacidad de dimerizar. En cualquier caso la L55 debe ser importante ya que en el resto 

de cepas de CMV está conservada, y puede tener importancia funcional, esté 

relacionada o no con la formación de dímeros. Por otro lado, Dong y colaboradores 

(2015) han publicado recientemente el efecto de los aas L15 y M18 en la presencia de 

tetrámeros de la proteína 2b de la cepa Fny en extractos de planta, en la unión in vitro 

a RNAs, y en la actividad supresora de silenciamiento. Estos aas corresponden a la 

sección de la cremallera de leucinas conservada en CMV, y la sustitución de estos 

residuos inhibió la formación de tetrámeros (Dong et al. 2015), de acuerdo con los 

resultados de Chen y colaboradores (2008) en TAV. Dong y colaboradores (2015) 



159 
 

informaron de que L15 y M18 eran necesarios en la unión a siRNAs y que su sustitución 

la comprometía, y con ello inhibía la actividad supresora de la proteína. Relacionado 

también con la cremallera de leucinas descrita en TAV, Maneechoat y colaboradores 

(2015) observaron que en la cepa asintomática M1 (subgrupo IA), la sustitución 

puntual de T18 por M18 en la proteína 2b generaba síntomas severos que los autores 

relacionaron con la afinidad de unión a siRNAs. Sus resultados, junto con los de Chen y 

colaboradores (2008) y Dong y colaboradores (2015) indican que los residuos que 

forman la cremallera de leucinas tienen importancia funcional tanto en la proteína 2b 

de TAV como de CMV.   

En el curso de una infección viral, la interacción de algunas proteínas virales con 

proteínas del huésped es necesaria. En el caso de la proteína 2b, diversos autores han 

determinado que interacciona con componentes proteicos de la planta, incluyendo 

algunos de las rutas de silenciamiento que intervienen en la defensa antiviral (Zhang et 

al. 2006b; Goto et al. 2007; Hamera et al. 2012). Guo y Ding (2002) sugirieron que la 

proteína 2b de CMV era un inhibidor de RdDM, como han confirmado otros estudios 

posteriores (Zhang et al. 2006; Hamera et al. 2012) y Zhang y colaboradores (2006a) 

propusieron que su re-direccionamiento de la expresión génica del huésped podría 

crear unas condiciones favorables para la proliferación de CMV. Nuestros resultados 

mostraron que este supresor interacciona in  vivo con las proteínas AGO1 y AGO4 en 

BiFC, aunque la fluorescencia derivada de esta interacción es mucho más débil que la 

derivada de la formación de dímeros de proteína 2b (Fig. 24). Esto podría deberse a 

que la acumulación de las proteínas AGO expresadas transitoriamente en el tejido 

infiltrado es mucho menor que la de la proteína 2b. La distribución subcelular de la 

fluorescencia derivada del complejo de BiFC 2b/AGO1 fue citoplásmica y nuclear, 

coincidiendo con la distribución subcelular de AGO1 (Vaucheret 2007; Brodersen et al. 

2012), mientras la del complejo 2b/AGO4 se localizó principalmente en el núcleo, 

aunque ausente del nucléolo. AGO4 es una proteína nuclear que, fusionada a GFP, se 

encuentra en todo el nucleoplasma (Xie et al. 2004), y fusionada al polipéptido Myc, se 

distribuye en el núcleo allí donde hay eucromatina, aunque también se acumula en 

cuerpos nucleolares adyacentes o inmersos en el nucléolo como los CBs (Li et al. 2006). 

Nosotros no hemos observado fluorescencia en corpúsculos nucleares derivada de la 



160 
 

interacción 2b/AGO4, quizá porque la débil intensidad de la señal fluorescente y su 

labilidad nos impidió trabajar a la resolución necesaria, pero en un estudio posterior 

Duan y colaboradores (2012) sí visualizaron co-localización de las proteínas en 

microscopía confocal usando proteínas marcadas con distintos fluoróforos en el 

nucléolo. A diferencia de estos autores, nuestros datos son de BiFC y visualizan las 

estructuras en que ambas proteínas interaccionan. Otra explicación de la ausencia de 

AGO4 de los corpúsculos nucleares puede ser la interferencia de RNA aguas arriba del 

efector AGO4, ya que Li y colaboradores (2006) observaron que en plantas deficitarias 

en algún componente del mecanismo de interferencia de RNA aguas arriba del efector 

AGO4, se producía una deslocalización de esta proteína de los corpúsculos nucleares 

debido a que en ausencia de siRNAs de 24 nts AGO4 se volvía inestable y se 

deslocalizaba de los CBs. Por lo que nuestros datos sugieren que la interacción con 2b 

también provoca la deslocalización de AGO4 de estos corpúsculos nucleares en los que 

normalmente se encuentra, que puede deberse a que la proteína 2b une RNAs aguas 

arriba de la acción de AGO4. Alternativamente, la estabilidad de la interacción por BiFC 

podría impedir dinámicas de desplazamiento del dímero al nucléolo u otras 

subestructuras nucleares, donde no se visualizaría. 

Las proteínas AGO son efectores de los complejos RISCs, especializadas en diversas 

funciones según los tipos de sRNAs que cargan preferentemente cada una de ellas (Mi 

et al. 2008). AGO1 actúa en PTGS (Bohmert et al. 1998; Fagard et al. 2000) y une 

siRNAs de 21 nts derivados de DCL4 como los siRNAs virales (Mi et al. 2008), mientras 

que AGO4 participa en TGS (Zilberman et al.2003; Qi et al. 2006; Mahfouz 2010) y une 

siRNAs de 24 nts derivados de DCL3, preferentemente con adenosina en el extremo 5’ 

(Mi et al. 2008). Estos últimos siRNAs participan en procesos de metilación del DNA 

que regulan la heterocromatinización y la transcripción y Guo y Ding (2002) 

demostraron que la proteína 2b de la cepa Q de CMV inhibía la metilación de DNA. 

AGO4 también promueve la metilación y la modificación de la cromatina (Chan et al. 

2004; Jones et al. 2006) y es uno de los componentes de dispersión del silenciamiento 

sistémico (Jones et al. 2006; Brosnan et al. 2007), por lo que Ye y colaboradores (2009) 

especularon que AGO4 podía ser un punto convergente y de comunicación entre las 

rutas de silenciamiento de TGS y el silenciamiento sistémico. En este sentido, 



161 
 

Kanazawa y colaboradores (2011) demostraron que la proteína 2b de CMV podía 

transportar RNAs pequeños de 24 nts (y de otros tamaños) al núcleo celular, donde 

dirigían la metilación de DNAs de los genes endógenos correspondientes causando su 

silenciamiento heredable. Zhang y colaboradores (2006b) mostraron la interacción de 

AGO1 con la proteína 2b y Diaz-Pendón y colaboradores (2007) relacionaron AGO1 con 

la defensa antiviral contra CMV, ya que plantas deficientes en ago1 eran 

hipersusceptibles a este virus. Algunos supresores de silenciamiento viral bloquean la 

actividad de AGO1 mimetizando el motivo glicina triptófano (GW) de proteínas que 

participan en el ensamblaje de RISC, como la proteína P38 de TCV (Jin y Zhu 2010; 

Schott et al. 2012); o la proteína P0 de poliovirus, que al interaccionar con AGO 

provoca su degradación (Baumberger et al. 2007; Bortolamiol et al. 2007; Csorba et al. 

2009), pero la interacción con la proteína 2b es diferente, ya que ésta no presenta 

ningún motivo GW. Por lo tanto, aunque los mecanismos de acción pueden variar 

entre las distintas proteínas supresoras, la inactivación de AGOs en la ruta de 

silenciamiento puede ser una actividad común en los supresores de silenciamiento 

virales en la interferencia de la actividad de RISC. 

Zhang y colaboradores (2006b) demostraron la interacción de la proteína 2b de la cepa 

Fny de CMV con AGO1 en ensayos in vitro usando proteínas expresadas 

transitoriamente, y en ensayos de co-inmunoprecipitación, pero antes de nuestro 

estudio no se había visualizado in vivo esta interacción. La proteína 2b podría interferir 

la actividad de RISC bien bloqueando el paso en que el siRNA se carga en AGO, o bien 

inhibir la actividad de AGO1 en los complejos RISC activados. Estos autores observaron, 

en ensayos de reconstitución in vitro de RISC, que 2b bloqueaba la actividad de AGO1 

por interacción directa y específica con la misma inhibiendo su actividad degradadora 

de RNAs diana y por tanto bloqueando RISC (Zhang et al. 2006b). Sería interesante 

llevar a cabo un estudio cristalográfico de la estructura que mostrara si la interacción 

2b/AGO provoca un cambio conformacional en AGO o simplemente bloquea el sitio de 

interacción. Por lo pronto nosotros hemos visualizado por BiFC la interacción in vivo 

2b/AGO1, y la interacción con 2b/AGO4, que no se había estudiado anteriormente (Fig. 

24). Posteriormente, como ya mencionamos, Duan y colaboradores (2012) han 



162 
 

observado mediante experimentos de co-localización que la interacción de la proteína 

2b con AGO1 o con AGO4 altera la distribución nuclear de las tres proteínas.   

Anteriormente se había observado que las plantas infectadas con la proteína 2b de la 

cepa Fny de CMV mostraban síntomas que se correspondían con los síntomas de 

plantas deficientes en AGO1 y con una acumulación aberrante de miRNAs, que Zhang y 

colaboradores (2006b) atribuyeron a la inhibición de AGO1. Sin embargo, la planta 

tiene otras proteínas AGO y Harvey y colaboradores (2011) observaron que cuando 

AGO1 es superada, AGO2 muestra un papel antiviral. Usando plantas de Arabidopsis 

con mutaciones en las dcls, Díaz-Pendón y colaboradores (2007) encontraron que los 

siRNAs de 24 nts generados por DCL3 no reprimían la dispersión sistémica de CMVΔ2b, 

carente del supresor 2b, mientras que los siRNAs de 21 y 22 nts sí lo hacían. Esta 

publicación en principio hacía pensar que AGO4 no jugaba un papel en las respuestas 

antivirales mediadas por silenciamiento. Pero en un estudio posterior, Ye y 

colaboradores (2009) publicaron que la proteína 2b de la cepa SD (subgrupo IB) inhibía 

la transcripción de AGO4 en N. benthamiana, mientras que el supresor de la cepa Q 

(subgrupo II) no lo hacía. Este efecto es consistente con el papel de la proteína 2b en la 

inhibición de la señal de silenciamiento sistémico y de RdDM, y los autores lo 

relacionaron con la tercera α-hélice de 2b, ausente en la cepa Q (Ye et al. 2009). Otros 

estudios posteriores han confirmado que la proteína 2b, además de afectar a la 

acumulación de AGO4, también une preferentemente RNAs de 24 nts producto de 

DCL3, sustrato de AGO4 e inductores de RdDM (Chinnusamy y Zhu 2009; Hamera et al. 

2012). Por otro lado, se ha relacionado a AGO4, y no a AGO1, con la inhibición de la 

traducción en casos de resistencia de plantas mediada por genes de resistencia (R), 

que afecta a virus que no portan genes de avirulencia. Este es el caso del gen N de N. 

glutinosa, que confiere resistencia a TMV, y cuya activación causa también la inhibición 

de la traducción de los RNAs de PVX, que no tiene lugar si AGO4 es silenciado por 

silenciamiento génico inducido por virus (viral-induced gene silencing, VIGS; 

Bhattacharjee et al. 2009). De este modo, varias evidencias han asociado a AGO4 con 

las respuestas antivirales, en el silenciamiento génico y en las rutas de resistencia 

mediadas por genes R.  



163 
 

Respecto a las proteínas 2b mutantes utilizadas, nuestros resultados mostraron que 

todas interaccionaban con AGO1 y AGO4, y que sus ocurrencias subcelulares eran las 

mismas que en las interacciones de la proteína 2b nativa con AGO1 (citoplásmica y 

nuclear) o con AGO4 (nuclear) (Fig. 25). Esto ocurrió incluso con aquellos mutantes que 

por sí mismos no se acumulaban en el núcleo celular (Figs. 17, 18). Por lo que podemos 

pensar que la interacción podría traslocar a la proteína 2b al núcleo en un proceso 

independiente de las NLSs del supresor viral, o que la retiene en el núcleo una vez que 

ésta ha entrado en el mismo por medios independientes de las NLSs. Si la interacción 

de 2b con AGO4 suprime la actividad de ésta por interacción directa, como acurre con 

AGO1 (Zhang et al. 2006b) y como apuntan nuestras observaciones (Fig. 24 y 25), la 

proteína 2b podría inhibir de este modo el silenciamiento sistémico, ya que AGO4 es 

un componente necesario para la dispersión del silenciamiento (Jones et al. 2006; 

Brosnan et al.  2007).  

Nuestros resultados mostraron que las proteínas 2b mutantes que carecen de 

actividad supresora también interaccionaban con AGO (Figs. 15 y 25), como han 

confirmado Duan y colaboradores (2012). Estos autores confirmaron que las 

sustituciones de las NLSs de 2b (en la cepa SD, subgrupo IB de CMV) no afectaban a la 

interacción con AGO, y en un ensayo in vitro de reconstitución de RISC, las proteínas 

2b mutantes sin actividad supresora se unieron a AGO e inhibieron la actividad 

degradadora de AGO1, y demostraron que para bloquear la actividad de RISC era 

necesario que la NoLS de 2b fuera funcional. Hamera y colaboradores (2012) acotaron 

el lugar de interacción de las proteínas AGO con la proteína 2b de la cepa SD (subgrupo 

IB) de CMV a los dominios PAZ y PIWI de AGO, que reconocen el extremo 3’ del siRNA 

y cortan las cadenas diana de RNA de hebra sencilla, respectivamente. Y Duan y 

colaboradores (2012) han determinado que el dominio de la proteína 2b que 

interacciona in vivo e in vitro con AGO1 y AGO4, está comprendido entre los aas 38-94. 

Este dominio contiene una región poco conservada y otra altamente variable entre 

distintas cepas de CMV, junto con el dominio tres de la proteína (Ye et al. 2009). Si 

extrapolamos los resultados de Duan y colaboradores (2012) a la cepa Fny, nuestros 

resultados pueden indicar que,dentro de la región de proteína 2b delimitada (aas 38-

94), la delección del motivo de fosforilación (39KSPSE42) no afecta a la interacción con 



164 
 

AGO (Fig. 25), con lo que la región de interacción excluiría dicho motivo quedando 

restringida a los aas 44-94. Nosotros también hemos visualizado la interacción 

2bΔGSEL/AGO, con lo que la delección de este fragmento (62GSEL65) tampoco afecta a 

la interacción, lo que puede sugerir que o bien la región de interacción tiene una 

extensión reducida, o bien la zona de interacción es una región amplia de la proteína 

2b en la que participan aas clave conservados en la secuencia. Por lo tanto, nuestros 

resultados de BiFC han sido confirmados por Hamera y colaboradores (2012) y por 

Duan y colaboradores (2012) en experimentos de pull-down in vitro y de co-

inmunoprecipitación in vivo, y son consistentes con el modelo de Zhang y 

colaboradores (2006b) de supresión in vitro de la actividad degradadora de AGO1. Sin 

embargo, nuestros resultados con mutantes sin actividad supresora de silenciamiento 

indican que, como posteriormente han mostrado Duan y colaboradores (2012), la 

interacción con proteínas AGO no es suficiente para dotar a la proteína 2b de su 

actividad supresora de silenciamiento.  

Como ya hemos tratado, la proteína 2b de la cepa Fny de CMV se localizó en el 

nucléolo de células vegetales, donde interaccionaba con proteínas AGOs afectando a 

su distribución subcelular (Duan et al. 2012), por lo que estudiamos si en esta 

localización la proteína interacciona potencialmente con las proteínas coilina, 

fibrilarina y nucleolina de estos orgánulos. Nuestras observaciones en BiFC mostraron 

una interacción potencial con las tres, no fundamentada aún con otros experimentos 

como co-inmunoprecipitación o Y2H, y son una primera aproximación a la interacción 

de un supresor de silenciamiento viral con estas proteínas nucleares.  

La relación entre la coilina y las proteínas virales ha comenzado a estudiarse hace 

poco, y se ha observado que la infección con los virus animales del herpes simple tipo 

1 (Herpes simplex virus type 1, HSV-1) y adenovirus, redistribuía la coilina de los CBs a 

otras subestructuras nucleares (Morency et al. 2007; James et al. 2010). Por otro lado, 

Semashko y colaboradores (2012b) han observado que la proteína de movimiento viral 

63K del virus semilatente de la Poa (Poa semilatent virus, PSLV) interacciona in vivo e in 

vitro con la coilina y que esta interacción tiene lugar en un dominio con carga positiva 

de la proteína viral que une RNA in vitro, por lo que los autores especularon que la 

interacción podría afectar procesos biológicos importantes del núcleo celular. Nuestras 



165 
 

observaciones en BiFC mostraron una interacción potencial 2b/coilina en los nucléolos 

y probablemente en los CBs, donde se encuentra la coilina. El dominio de la coilina de 

unión a ácidos nucleicos y de interacción con otras proteínas podría ser también el de 

interacción con la proteína 2b.  

La fibrilarina se ha encontrado interaccionando con elementos virales: Kim y 

colaboradores (2007) encontraron que interaccionaba con la proteína ORF3 de un 

umbravirus formando RNPs, esenciales para la diseminación del virus (Kim et al. 2007); 

y Semashko y colaboradores (2012a) observaron la interacción in vivo e in vitro de la 

fibrilarina 2 de A. thaliana (AtFib2) con la proteína 63K de PSLV, entre el dominio GAR 

de la fibrilarina y el dominio terminal amino de 63K, con cargas negativas (Kalinina et 

al. 2001; Semashko et al. 2012a y 2012b). La interacción de proteínas virales con la 

fibrilarina observada en Hordeivirus, Coronavirus, Potyvirus, Umbravirus, y ahora 

potencialmente en Cucumovirus podría constituir un mecanismo general operante en 

virus de diferente origen taxonómico aunque su papel en las infecciones virales es  aún 

desconocido. Yoo y colaboradores (2003) observaron que algunas proteínas virales, 

como la proteína N del coronavirus IBV, y la nucleocápsida de un arterivirus animal 

interaccionaban directamente con la fibrilarina y la nucleolina, y Chen y colaboradores 

(2002) consideraron que esta interacción podía darse con el dominio de unión a RNAs 

de la fibrilarina. Ateniéndonos a los estudios de Semasko y colaboradores (2012a) con 

la proteína 63K de PSLV, cabe pensar que la interacción 2b/fibrilarina también se dé 

entre el dominio GAR de la fibrilarina y las cargas negativas de la mitad carboxilo de la 

proteína 2b (aas 76-110). De nuestras proteínas 2b mutantes, la única que presenta 

afectada esta región es 2bΔ3T, y no disponíamos de dicho mutante en el momento de 

llevar a cabo estos ensayos. 

Por último hemos visualizado también una interacción potencial 2b/nucleolina en el 

nucléolo, y muy probablemente formando parte de los CBs y corpúsculos asociados. Se 

ha observado que algunos virus animales como poliovirus y adenovirus redistribuyen la 

nucleolina hacia el citoplasma (Waggoner y Sarnow 1998; Matthews 2001), aunque 

nosotros no hemos observado este suceso en planta. Nuestras mutaciones en la 

proteína 2b no inhibieron la interacción, ni afectaron a su localización subcelular (Fig. 

34), por lo que puede que la interacción se dé entre el domino GAR de la nucleolina y 



166 
 

las cargas negativas de la proteína 2b, y en un futuro podría tener interés comprobar si 

un mutante con una delección de las cargas negativas de la mitad carboxilo de la 

proteína, como ejemplo 2bΔ76-110, interacciona con la nucleolina y fibrilarina, 

especialmente si esta delección no afectara a la unión a RNAs y la actividad supresora 

de silenciamiento, como cabría pensar. Puede que CMV, como los adenovirus, al 

bloquear la actividad de la nucleolina evite que ésta reprima la transcripción del virus o 

que libere productos necesarios para la transcripción del mismo. O puede que, como 

Chen y colaboradores (2002) observaron en coronavirus, mantengan las células 

infectadas en interfase favoreciendo la transcripción y traducción de proteínas virales y 

el ensamblaje viral, y con ello la propagación viral. De este modo podría CMV causar el 

atrofiamiento que Lewsey y colaboradores (2009) observaron en las plantas 

infectadas. Por otro lado, se ha propuesto que la coilina, en asociación con la 

fibrilarina, tiene  una función de transporte entre citoplasma y nucléolo (Bellini y Gall 

1999; Boudonk et al. 1999), y nuestros resultados no son incompatibles con que este 

fuera el caso con la proteína 2b. En este caso la proteína 2b las utilizaría como 

lanzadera para entrar al nucléolo independientemente de las NLSs de la proteína 2b, lo 

que explicaría la localización de estos complejos en BiFC (Figs. 31-33).  

Podemos concluir que nuestros resultados sugieren interacciones potenciales de la 

proteína 2b de CMV con las proteínas nucleares coilina, fibrilarina y nucleolina. No 

podemos aún confirmar estas interacciones, y en caso positivo interpretar si participan 

en un sistema de transporte nuclear o si están más relacionadas con la creación de un 

entorno favorable para el virus. 

 

 

5.3. Interacciones in vitro de la proteína 2b con RNAs  

Aunque la presencia nuclear de la proteína no es necesaria para su actividad supresora 

del silenciamiento, como ya hemos discutido, es difícil separar ambas propiedades ya 

que el dominio terminal amino, las NLSs y la región que las bordea, y el motivo de 

fosforilación, participan en otra función distinta de la señalización subcelular: la unión 



167 
 

a RNAs. Estudios recientes entre los que se incluye este trabajo, han demostrado el 

papel de la proteína 2b de cucumovirus en la unión a siRNAs y propuesto que 

participan en la interferencia con el silenciamiento de RNA antiviral (Goto et al. 2007; 

Hamera et al. 2012). Cabe destacar que nosotros hemos expresado y purificado la 

proteína 2b completa en bacteria para los ensayos de unión in vitro a RNAs, ya que 

diferentes laboratorios han encontrado dificultades en su expresión y purificación, 

relacionadas con su extremo terminal carboxilo (Mayers et al. 2000, Goto et al. 2007 y 

Dong et al. 2015), y han llevado a cabo sus estudios con proteína 2b incompleta. Sin 

embargo tanto nosotros con la proteína 6xHis-2b-HA, como Ding y colaboradores 

(1994) y Hamera y colaboradores (2012) no encontramos estos problemas, quizás 

porque la fusión de ciertos elementos, especialmente en el extremo terminal carboxilo 

de la proteína, podría eliminar la toxicidad en E. coli encontrada por algunos grupos. En 

nuestro estudio, la unión in vitro a RNAs de proteína 2b nativa o mutada resultó un 

método que permitió establecer, sobre la base de los ensayos paralelos de actividad 

funcional en planta, una relación entre la actividad supresora del silenciamiento de la 

proteína 2b y su capacidad de unión a ds siRNAs.   

Los primeros estudios que relacionaron la presencia nuclear de la proteína con la 

actividad supresora de silenciamiento sugirieron un papel de la proteína como 

competidor del transporte nuclear o en la regulación transcripcional (Lucy et al.  2000), 

o en la interferencia de la metilación  de DNA nuclear (Guo y Ding 2002). 

Posteriormente, Wang y colaboradores (2004) propusieron que las NLSs de la proteína 

2b podían tener otra función más allá de ser una señal de localización para transportar 

la proteína al núcleo, como la unión a miRNAs. Los dominios ARR con cargas positivas, 

como el que encontramos en la mitad amino de nuestra proteína de estudio, se han 

identificado en otras proteínas supresoras, en las que participan en la unión a RNAs 

(Bucher et al. 2004; Chapman et al. 2004; Chellappman et al. 2005; Lu et al. 2005; 

Méray et al. 2005) en lo que podría ser un mecanismo general de supresión de 

silenciamiento (Méray et al. 2005; Lakatos et al. 2006). Guo y Ding (2002) demostraron 

que la proteína 2b de la cepa Q de CMV (subgrupo II) inhibía la actividad de la señal de 

silenciamiento e interfería con la metilación del DNA en el núcleo, y sugirieron que 

esta señal de silenciamiento podrían ser los siRNAs. Posteriormente, Zhang y 



168 
 

colaboradores (2006b) en CMV, y Mérai y colaboradores (2006) en TAV, no obtuvieron 

resultados positivos de la unión de 2b a siRNAs partiendo de proteínas 2b expresadas 

en E. coli y de tejido de planta, respectivamente. Goto y colaboradores (2007) 

consideraron que estos intentos fallidos se debieron a que la proteína 2b aislada en 

estos estudios no era funcional, y demostraron que las proteínas de las cepas CM95 y 

CM95R (subgrupo I de CMV) unían in vitro siRNAs y dsRNAs (algo mayores a los siRNAs) 

generados por una Dicer humana, aunque con distinta afinidad en ambas cepas. Este 

último hecho lo relacionaron con el aa46, que varía entre ambas cepas. En su estudio, 

las proteínas 2b unieron preferentemente siRNAs frente a miRNAs, y la delección de 

las NLSs inhibió esta unión. Tanto las NLSs como el aa46 están contenidos en la ARR, y 

la delección o variación de estos aas afectó a la actividad supresora de silenciamiento, 

por lo que relacionaron ambos sucesos (Goto et al. 2007). Anteriormente, Wang y 

Metzlaff (2005) habían sugerido que los siRNAs, unidos con baja afinidad a los 

supresores de cepas con fenotipo asintomático, podrían liberarse de los supresores y 

jugar un papel importante en la protección cruzada, por lo que Goto y colaboradores 

(2007) relacionaron la unión a RNAs con la protección cruzada que confiere la cepa 

CM95, que une siRNAs con baja afinidad, frente a CM95R, que los une con alta 

afinidad, y sugirieron que los siRNAs unidos a la proteína 2b serían transportados al 

núcleo fuera del citoplasma, donde el complejo (2b/siRNA) forma inclusiones. A día de 

hoy no está aclarada del todo la función de la proteína 2b en el núcleo, donde se ha 

relacionado con la alteración de la expresión génica (Kanazawa et al. 2011; Du et al. 

2014b). 

Posteriormente, en un estudio estructural de la proteína 2b de TAV, Chen y 

colaboradores (2008) confirmaron que la unión a siRNA se daba mediante dos α-

hélices separadas por un codo. En esta estructura, los dominios de las NLSs estaban 

implicados en la unión a siRNAs en la primera hélice y el motivo de fosforilación en la 

segunda hélice (Chen et al. 2008; Rashid et al. 2008). Por ello en nuestros estudios 

cabía esperar que las delecciones en estos motivos afectasen a la unión a siRNAs de la 

proteína 2b de CMV. Nuestros resultados iniciales con la proteína 2b y una selección 

de seis proteínas mutantes (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bS40A, 

2bS42A) y ds siRNA sintético basado en el miRNA171 de A. thaliana, mostraron que las 



169 
 

delecciones de una o ambas NLSs no sólo impidieron la supresión de silenciamiento y 

la localización nuclear de la proteína 2b (Figs. 15 y 18), sino que también inhibieron la 

unión a un ds siRNA (Fig. 26). Esto es similar a lo habían observado en CMV Goto y 

colaboradores (2007) y en TAV Rashid y colaboradores (2008). Asimismo, la delección 

del motivo de fosforilación en la segunda α-hélice, que eliminó la actividad supresora 

de silenciamiento y confinó la proteína en el nucléolo (Figs. 15 y 18) también inhibió la 

unión al ds siRNA (Fig. 26). Por lo tanto, nuestros resultados, los datos estructurales de 

la proteína 2b de TAV, y la unión a ds siRNA de las proteínas 2b de TAV y de CMV (Goto 

et al. 2007; Chen et al. 2008; Rashid et al. 2008) sugirieron que la unión a ds siRNA 

podría estar involucrada en la actividad supresora de silenciamiento de la proteína 2b, 

mientras que en nuestros mutantes, la alteración de la distribución subcelular de la 

proteína sería un efecto diferente, pero no la causa de la pérdida de su actividad 

supresora.  

A la vista de los resultados de esta primera aproximación a la unión in vitro a un ds 

siRNA con proteína nativa y una primera selección de mutantes, diseñamos un estudio 

más detallado de la unión in vitro a sRNAs, utilizando tanto la proteína nativa como las 

nueve proteínas mutantes de las que llegamos a disponer (2bΔ5T, 2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 

2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL y 2bΔ3T) y tres sRNAs sintéticos 

basados en la secuencia del miRNA171 de A. thaliana: ds siRNA, miRNA y ss siRNA (ver 

Fig. 11 en Material y Métodos) y un RNA viral largo, el RNA genómico de 6,4 kb de 

TMV. En este estudio comprobamos si la proteína 2b de CMV purificada de bacteria 

unía in vitro estos cuatro tipos de RNAs, y comparamos las capacidades de la proteína 

2b y de los nueve mutantes de unir in vitro los mismos, determinando sus cinéticas y 

sus afinidades de unión.  

Los análisis con proteína 2b nativa mostraron que unía tanto ds siRNAs como miRNAs y 

ss siRNAs con alta afinidad, los dos primeros a relaciones molares proteína:RNA 

semejantes, por lo que la proteína podría potencialmente alterar los diferentes 

procesos biológicos en que participan estos sRNAs. Por ello, nuestros resultados están 

de acuerdo con los resultados de Hamera y colaboradores (2012), que también 

observaron la unión de la proteína 2b a miRNAs, y creemos que la baja afinidad por 

éstos que Goto y colaboradores (2007) mostraron en la cepa CM95R podría deberse 



170 
 

bien a que las propiedades de la proteína de esta cepa fueran algo diferentes a las de 

la cepa Fny, o bien a diferencias en las condiciones experimentales. Nuestros 

resultados mostraron que en nuestras condiciones se puede encontrar hasta el 60% 

del ds siRNA unido a la proteína 2b nativa a una relación molar proteína:RNA de 2:1 

(Fig. 29, gráfica superior), por lo que estos resultados concuerdan bien con el modelo 

estructural de cristalografía de la proteína 2b de TAV unida a siRNA (Chen et al. 2008), 

y con los datos de unión de RNAs a proteína 2b de TAV inmovilizada en Chip y de 

espectroscopía de reflexión interna total (Rashid et al. 2008). Por tanto, diversos 

estudios entre los que incluimos los nuestros, han establecido un modelo de unión in 

vitro e in vivo de la proteína 2b de cucumovirus a diferentes sRNAs (Goto et al. 2007; 

Rashid et al. 2008; Kanazawa et al. 2011; Duan et al. 2012; Hamera et al. 2012).  

Nuestros resultados mostraron que la proteína 2b tiene mayor afinidad por el ds siRNA 

que por el miRNA o el ss siRNA (Fig. 27 y Tabla 3). Al unir con mayor afinidad ds siRNA 

frente a otros sRNAs, se podría hipotetizar que la proteína 2b afecta en mayor medida 

a los procesos en los que estos siRNAs intervienen, como el silenciamiento antiviral, 

frente a otros procesos mediados por los otros dos sRNAs, como la ruta de metilación 

en RdDM, en que participa AGO4. Hamera y colaboradores (2012) demostraron la 

unión de 2b a ss siRNAs de complejos RISC-AGO4 activados, y nuestros resultados in 

vitro muestran que la proteína 2b puede unir in vitro ss siRNAs sintéticos con alta 

afinidad (Fig. 29 y tabla 3), por lo que este estudio y nuestros resultados se 

complementan.  

Nuestros resultados también mostraron que la unión de la proteína 2b a los sRNAs era 

cooperativa (Tabla 3), lo que indicaba que la proteína no actuaba en forma de 

monómero sino en estructuras más complejas como los dímeros, que habíamos 

visualizado en BiFC (Fig. 21), e incluso en estructuras más complejas. Esto sugiere que, 

como Chen y colaboradores (2008) propusieron para la proteína 2b de TAV, para la 

unión a sRNAs es necesaria una concentración mínima de supresor que permita la 

formación de dímeros, y probablemente de estructuras más complejas. Rashid y 

colaboradores (2008) propusieron que la unión de la proteína 2b de TAV al sRNA 

promovía la formación de tetrámeros; nosotros no podemos descartar que esto no 

ocurra también en CMV, pero como hemos discutido anteriormente, posiblemente el 



171 
 

estado dimérico sea suficiente para conferir la actividad supresora. Por otro lado, 

nuestros resultados sugirieron que la interacción con las proteínas AGO y la unión a 

sRNAs eran sucesos independientes, ya que todas nuestras proteínas mutantes podían 

interaccionar con AGO1 y AGO4 (Fig. 25) aunque estas interacciones no se 

correlacionaron con la unión a sRNAs ni con sus actividades supresoras del 

silenciamiento (Tabla 5). De hecho, Duan y colaboradores (2012) han determinado que 

los lugares de interacción de la proteína 2b con AGO y con los ácidos nucleicos son 

independientes. Estos autores demostraron que en plantas transgénicas que expresan 

la proteína 2b de la cepa SD (subgrupo IB de CMV) hay una menor metilación de DNA, 

por lo que la proteína inhibe el RdDM, y para ello requiere del dominio de unión a RNA 

de la proteína 2b pero no su interacción física con AGO4. Sus resultados están de 

acuerdo con los estudios y el modelo presentado por Hamera y colaboradores (2012), 

en los que la proteína 2b interacciona con los siRNAs de 24 nts que une AGO4.  

Por lo tanto, la proteína 2b de cucumovirus podría bloquear tanto los siRNAs que 

inician la ruta de silenciamiento como las proteínas AGO, y esta actividad dual podría 

conferir una ventaja al virus en lo que comúnmente se ha denominado la “carrera 

armamentística” con el huésped. Históricamente se han propuesto varios modelos de 

posible actuación de la proteína 2b en las rutas de silenciamiento. Uno de ellos es el 

propuesto por Chen y colaboradores (2008) para la proteína 2b de TAV que refleja 

estas dos características de actuación: por un lado previene la incorporación del ds 

siRNA en AGO secuestrando estos sRNAs, y por otro interacciona directamente con 

AGO inhibiendo su actividad (Fig. 35A). Otro modelo es el propuesto por Hamera y 

colaboradores (2012), en que la proteína 2b secuestra preferentemente los siRNAs de 

24 nts que incorpora AGO4, y por otro lado perturba la maquinaria de RdDM de la 

planta formando un complejo AGO4/siRNA/2b que limita el acceso de AGO4 a la diana 

de DNA. En este modelo AGO4 tiene acceso a los siRNAs, y la proteína 2b interacciona 

con estos siRNAs y con AGO4 formando un complejo (Fig. 35B), siguiendo un modelo 

parecido al de la interacción 2b/AGO1 que propuesto por Zhang y colaboradores 

(2006b), en el que la proteína 2b no interfiere el acceso de AGO1 a los miRNAs y 

siRNAs antivirales de 21 nts (Fig. 35C).  



172 
 

 

Fig. 35: Modelos de actuación propuestos para la proteína 2b de Cucumovirus. A, Modelo de Chen y 
colaboradores (2008). Se muestra un diagrama de silenciamiento y la acción de la proteína 2b de TAV. 1, 
El dímero formado por dos proteínas 2b une el siRNA, previniendo la incorporación y activación de RISC. 
2, La proteína 2b interacciona directamente con AGO. 3, Además, la proteína 2b de TAV podría unir 
dsRNAs largos, inhibiendo la formación de más siRNAs. Reproducido de Chen y colaboradores (2008). B, 
Modelo de Hamera y colaboradores (2012): interferencia en dos pasos de la proteína 2b de CMV con la 
ruta de metilación de DNA dependiente de RNA (RdDM). 1, la proteína 2b de CMV tiene alta afinidad de 
unión a los siRNAs de 24 nts que une AGO4. Esta afinidad permite la formación de complejos tripartitos 
AGO4/siRNA/2b, reduciendo el acceso de AGO4 a los loci diana de DNA, causando hipometilación. 2, la 
proteína 2b de CMV, mediante la interacción específica 2b/AGO4, acompaña al complejo AGO4/PolIV, 
reduciendo su acceso al loci diana. Reproducido de Hamera et al. 2012. C, Modelo propuesto por Zhang 
y colaboradores (2006): interacción directa de la proteína 2b de CMV con AGO1 en los dominios PAZ (de 
interacción con siRNA) y PIWI. Se muestra los dominios PIWI, PAZ, Mid, Linker 1 (L1), terminal amino (N) 
y poly-Q. Reproducido de Zhang et al. 2006. 



173 
 

Como hemos visto, diversos grupos además del nuestro han estudiado la unión del 

supresor 2b de cucumovirus a sRNAs. En estos trabajos se ha descrito la unión in vitro 

e in vivo a distintos sRNAs como los siRNAs, miRNAs y siRNAs de cadena sencilla (Goto 

et al. 2007; Rashid et al. 2008; Kanazawa et al. 2011; Hamera et al. 2012) e in vitro a  

RNAs largos como han mostrado nuestros datos (Fig. 30) e in vivo, en TAV a RNAs 

virales (Shi et al. 2008). La afinidad por sendos RNAs varía. En algunos estudios, se ha 

encontrado que la proteína 2b de TAV presentaba mayor afinidad por los siRNAs que 

por los siRNAs de hebra sencilla; y en algunos ensayos se ha observado que la proteína 

2b de CMV, además de unir dsRNAs algo mayores a los siRNAs (Wang et al. 2004; Goto 

et al. 2007), promovía la acumulación de siRNAs en el núcleo, probablemente 

transportándolos ahí, que se ha relacionado con la reducción en la metilación de DNA 

observada en varios estudios de infección viral (Wassenegger 2000; Guo y Ding 2002).  

Por otro lado, las cepas del grupo I de CMV son más virulentas que las del grupo II  

(Wahyuni et al. 1992; Zhang et al. 1994; Cillo et al. 2009), hecho que se ha relacionado 

con la proteína 2b; y diferentes autores han comprobado que la expresión de 2b de la 

cepa Fny (subgrupo IA), a diferencia de las cepas Q o LS (grupo II), inhibía la expresión 

génica regulada por miRNAs, lo que provocaba defectos en el desarrollo (Champman 

et al. 2004; Zhang et al. 2006; Lewsey et al. 2007). Tanto Zhang y colaboradores (2006) 

como Lewsey y colaboradores (2007) propusieron que este efecto causaba las 

diferencias en el desarrollo de síntomas entre los subgrupos IA y II. Recientemente Du 

y colaboradores (2014b) han observado que el fenotipo de las plantas infectadas con la 

cepa Fny coincidía con el de las plantas que presentaban alterado el miR159. Esto no 

es exclusivo de la proteína 2b, ya que diversos estudios han mostrado que las plantas 

transgénicas que expresan constitutivamente supresores virales de silenciamiento 

muestran alteraciones fenotípicas asociadas a efectos en la regulación de mRNAs del 

huésped mediada por miRNAs (Kasschau et al. 2003; Chapman et al. 2004; Zhang et al. 

2006b; Lewsey et al. 2007; Jay et al. 2011). Wang y colaboradores (2004) apuntaron 

que esta podía ser una función de la proteína 2b en el núcleo, y en este sentido Du y 

colaboradores (2014a) publicaron recientemente que la presencia más marcadamente 

nuclear una proteína 2b de la cepa Fny con una NLS extra (2bNLS), perjudicaba su 

actividad supresora de silenciamiento y al tiempo afectaba a la función reguladora de 



174 
 

los miRNAs en plantas transgénicas de Arabidopsis que expresaban la proteína. Este 

mismo grupo también relacionó la patogenicidad de las cepas del grupo I con la mayor 

presencia nuclear de la proteína 2b; y la de las cepas del subgrupo II, con menor 

presencia nuclear de la proteína 2b, con una mayor actividad supresora de 

silenciamiento (Du et al. 2014a). Zhang y colaboradores (2006b) informaron de que las 

proteínas 2b de las cepas Q y LS (grupo II de CMV), con fenotipo más suave en planta, 

no alteraban las funciones de los miRNAs. Y recientemente Du y colaboradores (2014b) 

han interpretado que la presencia en el núcleo de las proteínas 2bNLS y 2b de las 

cepas Q y LS no está relacionada con los efectos de la proteína en las rutas 

dependientes de miRNAs y siRNAs; sino que la presencia nuclear de 2bNLS (cepa Fny) 

está relacionada con la virulencia y un desarrollo más acelerado de los síntomas en 

planta. Por ello concluyeron que la presencia citoplásmica de la proteína 2b de la cepa 

Fny era responsable de la alteración de las rutas de miRNAs que generan los síntomas 

más severos en la cepa Fny respecto a otras cepas, y que los síntomas en planta están 

relacionados con la distribución citoplásmica de la proteína y no con la presencia 

nuclear de la misma. Estos autores mostraron que la acumulación nucleolar estimulaba 

de alguna manera los síntomas severos como la necrosis, y esto podría estar 

relacionado con la traslocación de la catalasa (CAT3) que observaron Inaba y 

colaboradores (2011) resultado de la interacción con la proteína 2b en plantas de 

Arabidopsis.  

En cuanto a la unión de nuestras proteínas mutantes a los sRNAs, hemos caracterizado 

las cinéticas de unión in vitro de 2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE, 2bS40A, 

2bS42A, 2bΔGSEL, 2bΔ3T y 2bΔ5T a los cuatro tipos de RNAs. Nuestros resultados 

mostraron que la delección de las NLSs inhibía la unión a los cuatro RNAs, mientras 

que la delección del dominio de fosforilación, que confinaba la proteína en el nucléolo, 

comprometía sustancialmente la unión a los tres tipos de sRNAs y completamente la 

unión al RNA viral (Figs. 15, 28, 29 y 30). Esta proteína mutante (2bΔKSPSE) presentaba 

más afinidad por el miRNA que por otros sRNAs, aunque la afinidad por aquél era más 

de tres órdenes inferior a la de la proteína nativa por el miRNA (Figs. 28, 29 y Tabla 3). 

Sin embargo, las mutaciones puntuales en S40 y S42 (2bS40A, 2bS42A) en este motivo, 

que no afectaron a la localización subcelular de la proteína ni a la actividad supresora 



175 
 

de silenciamiento, modificaron levemente la afinidad por los sRNAs, resultando ésta 

mayor en el mutante 2bS40A que en 2bS42A (Figs. 15, 28, 29 y Tabla 3). En ambos 

casos estos dos mutantes presentaron, como la proteína nativa, mayor afinidad por el 

ds siRNA que por el miRNA o el ss siRNA. Por lo tanto, en el motivo de fosforilación, 

que estructuralmente se encuentra en la región de unión entre las dos primeras α-

hélices y en la segunda de éstas, la delección completa del mismo tuvo un efecto 

inhibitorio de la unión a sRNAs, que podría ser la causa de la pérdida de la actividad 

supresora de silenciamiento. En ello tendría importancia el aa P41 del motivo KSPSE, 

conservado en CMV, ya que Chen y colaboradores (2008) en TAV demostraron que la 

sustitución de este aa reducía considerablemente la actividad supresora de la proteína 

y la afinidad de la proteína 2b por los siRNAs. En TAV se ha comprobado 

estructuralmente que P41 crea un codo que permite unir una parte del siRNAs en la 

segunda α-hélice de 2b (Chen et al. 2008). Esta razón explicaría que, en contraste con 

2bΔKSPSE, en los mutantes con sustituciones puntuales de S40 y S42 no se observase 

este efecto inhibitorio en la unión a siRNAs. Tomando en conjunto las delecciones en la 

mitad amino de la proteína (2bΔ5T, 2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔKSPSE), éstas 

afectaron seriamente a la unión a sRNAs, inhibiéndola, mientras que las sustituciones 

(2bS40A y 2bS42A) apenas la afectaron, mientras que las delecciones en la mitad 

carboxilo (2bΔGSEL, 2bΔ3T) incluso aumentaron la afinidad de la proteína por los 

sRNAs, respecto a la de la proteína nativa. La proteína mutante 2bΔ5T resultó un caso 

especial, ya que la delección del dominio terminal amino afectó parcialmente a la 

primera alfa hélice de la proteína, implicada en la unión a sRNAs (Chen et al. 2008; 

Duan et al. 2012) y en la formación de tetrámeros por la proteína 2b de TAV (Chen et 

al. 2008). Como comprobamos anteriormente, nuestra proteína mutante 2bΔ5T 

carecía de actividad supresora de silenciamiento (Fig. 15), aunque retenía otras 

propiedades de la proteína. Entre ellas es destacable que unía ss siRNA y miRNA casi 

con tanta afinidad como la proteína nativa y sin embargo apenas unía ds siRNA, lo que 

relacionó la actividad supresora de silenciamiento de la proteína 2b con la unión a ds 

siRNA, respecto a los otros dos sRNAs analizados (miRNAs y ss siRNAs). Duan y 

colaboradores (2012) también observaron que las delecciones en este extremo 

terminal amino afectaban a la unión a RNAs, confirmando nuestros resultados. Al unir 

ss siRNAs y miRNAs con alta finidad, sería esperable que nuestra proteína 2bΔ5T 



176 
 

retuviera la propiedad de inhibir los procesos en que intervienen estos sRNAs, como la 

inhibición de RdDM, o el bloqueo de RISC activados que se nombran en la bibliografía y 

que nosotros no hemos tenido oportunidad de investigar. Tampoco hemos podido 

caracterizar en este trabajo si nuestra proteína 2b nativa o nuestros mutantes 

mostraban afinidades diferenciales por sRNAs de diferente tamaño dirigidos a 

incorporarse a distintas proteínas AGO (Mi et al. 2008; Montgomeri et al. 2008; Takeda 

et al. 2008), o el efecto de la presencia de diferentes nucleótidos en el extremo 5´-

terminal del sRNA en las afinidades de unión, y si nuestras observaciones in vitro 

correlacionarían con los datos obtenidos en planta por otros grupos (Hamera et al. 

2012). Caracterizar estas afinidades podría ayudar a explicar los fenotipos de infección 

que estas mutaciones causan cuando están presentes en el virus (Lewsey et al. 2009; 

nuestro trabajo).   

La región ARR de la proteína 2b tiene un gran interés por sus propiedades. Diferentes 

estudios en TAV han mostrado que la región comprendida entre los aas 20-30, rica en 

cargas positivas, son cruciales para la unión a RNA (Chen et al. 2008; Rashid et al. 

2008). En esta región se encuentran las NLSs, implicadas en la unión a siRNAs y en el 

transporte de la proteína al núcleo. Dos estudios mostraron que mutaciones puntuales 

en las NLSs de proteínas 2b de las cepas CM95 y CM95R de CMV, y también de TAV 

disminuían la unión a RNAs (Goto et al. 2007; Rashid et al. 2008). Aunque los aas de la 

ARR de la proteína 2b de TAV no están completamente conservados en CMV, la 

relación de cargas positivas sí es semejante y las variaciones puntuales o delecciones 

de los aas con carga positiva (como son los de las NLSs) comprometieron la unión a 

RNAs (Goto et al. 2007; Rashid et al. 2008; y nuestros resultados). Del mismo modo 

Chen y colaboradores (2008) observaron que la sustitución de un solo aa en el motivo 

de fosforilación de la proteína 2b de TAV (P41) disminuía la unión a siRNAs. Los aas 

prolina y serina de este motivo (KSPSE) forman interacciones de Van der Vaals y 

puentes de hidrógeno con los sRNAs, y se ha comprobado que la P41 en la proteína 2b 

de TAV forma un codo que permite la unión del siRNA a la segunda α-hélice (Chen et 

al. 2008). Por lo que el motivo de fosforilación cumple una función estructural en la 

proteína y las sustituciones en el mismo afectan a la afinidad por los sRNAs, como han 

mostrado también nuestros resultados (Fig. 29 y Tabla 3). Por ello, la delección del 



177 
 

motivo de fosforilación conllevó un cambio conformacional que inhibió parcialmente la 

unión a RNAs y posiblemente con ello la actividad supresora de silenciamiento. La 

proteína 2bΔKSPSE presentó una constante de disociación cuatro veces superior a la 

de la proteína nativa en su unión in vitro a RNAs, que fue posiblemente insuficiente 

para conferir actividad supresora del silenciamiento. El aa46 de la proteína 2b también 

está contenido en la ARR, y Goto y colaboradores (2007) comprobaron que su 

sustitución puntual en las cepas CM95 y CM95R disminuía la unión a ds siRNAs, por lo 

que tanto los aas con carga positiva de las NLSs como de otras regiones de la ARR son 

importantes en la unión a siRNAs. 

Fuera de la ARR, Ye y colaboradores (2009) definieron un dominio tres (aas 63-69 de la 

proteína 2b) presente sólo en las cepas del grupo I de CMV, y sugirieron que podría 

estar relacionado con la estabilización de la unión de la proteína a RNAs, o con su 

interacción con otros elementos de RISC (Ye et al. 2009). Nuestros resultados 

mostraron que la delección de una fracción de dicho dominio tres (2bΔGSEL) no 

afectaba a la estabilidad de la proteína, ya que ésta se acumulaba normalmente en el 

tejido infiltrado (Fig. 15), y que de algún modo favorecía la interacción con los sRNAs 

(Fig. 29). Podría ser que la función principal de este dominio sea inhibir la transcripción 

de AGO4, como propusieron Ye y colaboradores (2009). Nuestros resultados 

mostraron que el virus que portaba esta delección causaba síntomas atenuados en 

planta respecto al virus nativo (Fig. 14). Esta delección favoreció la unión in vitro de la 

proteína 2b a los sRNAs (Fig. 29 y Tabla 3), y podría también afectar a la estabilidad de 

la tercera α-hélice, cuya función se desconoce. Aunque Ye y colaboradores (2009) 

relacionaron la delección (aas 64-71) en la cepa SD con una reducción de la supresión 

de silenciamiento, en nuestro caso la delección ΔGSEL, (aas 62-65) en la proteína 2b de 

la cepa Fny no afectó a su actividad supresora en ensayos de agroinfiltración (Fig. 15). 

De momento no podemos explicar por qué la delección de estos aas aumentó la 

afinidad de la proteína por los sRNAs in vitro.  

La delección del dominio terminal carboxilo no afectó a la localización de la proteína 

(Fig. 17), como posteriormente confirmaron Kanazawa y colaboradores (2011). 

Nuestros resultados mostraron que la proteína 2bΔ3T unía también sRNAs con mayor 

afinidad que la proteína nativa (Fig. 29). Kanazawa y colaboradores (2011) mostraron 



178 
 

que la delección de una sección del dominio terminal carboxilo permitía la 

acumulación de siRNAs en el núcleo, donde tiene lugar la RdDM. Ham y colaboradores 

(1999) observaron que este extremo presentaba actividad activadora de la 

transcripción en levaduras, y Sueda y colaboradores (2010) observaron, en un estudio 

comparativo de las cepas HL e Y (subgrupos IB y IA, respectivamente), que la delección 

o sustitución del aa104 contenido en este dominio atenuaba la toxicidad de la proteína 

cuando se expresaba en E. coli. También observaron que la proteína 2b unía in vitro 

DNA y que la sustitución del aa104 inhibía esta unión (Sueda et al. 2010). Por otro lado, 

dentro de la región terminal carboxilo, encontramos el motivo 95DDTD98, conservado 

en CMV (ver Anexo I). Gellért y colaboradores (2012) demostraron que este dominio 

(aas 95DDTD98) unía Mg2+ y que su alteración en la cepa Rs (subgrupo IA) debilitaba la 

estabilidad del tetrámero de 2b unido a siRNAs, y consideraron que los residuos W99 y 

W105 conservados en las cepas de CMV (ver Anexo I) estabilizaban la unión al siRNA en 

presencia de Mg2+, apoyándose en que este tipo de residuo (W) en la proteína P19 de 

CIRV estabiliza la unión a RNA (Vargason et al. 2003). En la cepa Fny se ha observado 

que la delección del dominio terminal carboxilo de la proteína 2b aumenta la 

patogenicidad en algunas plantas huésped (Lewsey et al. 2009), lo que podría 

relacionarse con el aumento que nosotros observamos en la afinidad in vitro de 2bΔ3T 

por el siRNAs respecto a la proteína nativa. Una hipótesis que puede explicar esta 

mayor afinidad se basa en que el dominio terminal carboxilo podría haberse originado 

como un añadido que obstruye en cierto grado la unión a los sRNAs, resultante de la 

adición de un aa en el gen 2a, que cambió la fase de lectura del ORF 2a al ORF 2b (Ding 

et al. 1995). Su delección favorecería así la unión a sRNAs in vitro, aunque su 

conservación en el virus indica que su presencia es ventajosa en el contexto de la 

infección viral.  

La comparación de las cinéticas de unión de la proteína 2b y sus mutantes a los tres 

tipos de sRNAs analizados se muestra en la Fig. 29. Basándonos en las cinéticas de 

unión al ds siRNA y tomando la de la proteína 2b nativa como referencia, observamos 

un primer grupo que unía el ds siRNA con una afinidad similar a la de la proteína nativa 

o incluso mayor (2b, 2bΔGSEL, 2bΔ3T, 2bS40A); un segundo grupo que prácticamente 

no unía el ds siRNA (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2, 2bΔ5T); y un grupo que 



179 
 

presentaba una unión al ds siRNA comprometida en cierto grado (2bΔKSPSE, 2bS42A). 

En cuanto a las cinéticas de unión al miRNA, las proteínas mutantes mostraron 

patrones semejantes a los observados en la unión a ds siRNA, salvo en el caso de la 

proteína mutante 2bΔ5T, que por su peculiaridad trataremos separadamente más 

adelante. En cuanto a las cinéticas de unión al ss siRNA, diferenciamos claramente un 

grupo que unía el ss siRNA con mayor afinidad que la proteína nativa (2bΔGSEL, 2bΔ3T 

y 2bS40A) y otras con menor afinidad (2bS42A y 2bΔ5T); un grupo de proteínas que no 

unía ss siRNA, con delecciones en las NLSs, y un caso intermedio (2bΔKSPSE) que unía 

parcialmente el ss siRNA.  

Una vez analizadas por separado las cinéticas consideramos en conjunto la unión a los 

tres sRNAs, y definimos cinco grupos de proteínas: Un primer grupo unía los tres sRNAs 

(ds siRNA, miRNA y ss siRNA) como la proteína 2b o con más afinidad que ésta (2bΔ3T, 

2bΔGSEL, 2bS40A) y presentaban actividad supresora de silenciamiento; un segundo 

grupo de proteínas que no unían sRNAs en ningún caso (2bΔNLS1, 2bΔNLS2 y 

2bΔNLS1+2) y no tenían actividad supresora; el tercer grupo lo formó la proteína 

mutante 2bΔKSPSE con un patrón intermedio en la unión a todos los sRNAs aunque 

carecía de actividad supresora; el cuarto grupo lo constituyó la proteína 2bS42A, cuya 

sustitución puntual afectó relativamente la unión a sRNAs, presentó una afinidad por 

los sRNAs algo menor que la proteína nativa, aunque retuvo la actividad supresora; y 

finalmente el quinto grupo constituido por la proteína 2bΔ5T, muy particular, ya que la 

delección del dominio terminal amino inhibió la unión al ds siRNA, pero no a los otros 

dos sRNAs (miRNA y ss siRNA), a los que se unió de modo comparable al de la proteína 

nativa, y la proteína no retuvo la actividad supresora de silenciamiento.  

Por lo tanto en nuestra batería de mutantes encontramos una correlación entre la 

capacidad de unir ds siRNAs a ratios molares próximos a 2:1 y la actividad supresora de 

silenciamiento de la proteína.  

Por otro lado analizamos también las cinéticas de unión in vitro de nuestras proteínas 

2b al RNA de TMV, y en este caso diferenciamos sólo dos patrones claros, de unión y 

de no unión al RNA (Fig. 30). El primer grupo lo conformaron las proteínas con 

actividad supresora de silenciamiento (2b, 2bS40A, 2bS42A, 2bΔGSEL y 2bΔ3T); y el 



180 
 

segundo grupo las proteínas sin actividad supresora (2bΔNLS1, 2bΔNLS2, 2bΔNLS1+2 y 

2bΔKSPSE). Cuando se realizó este experimento no contábamos con el mutante 2bΔ5T. 

La relación proteína:RNA a la que se produjo el retardo en el gel fue muy elevada 

(500:1), pero los datos indicaron que esta unión era cooperativa (Tabla 5). Por el 

momento no sabemos si la interacción de la proteína 2b con RNAs virales genómicos 

desempeña alguna función biológica. La proteína 2b puede por tanto unir y secuestrar 

ds siRNAs virales.  

La razón de la presencia de la proteína 2b en el núcleo aún no se ha esclarecido, 

aunque en esta localización interacciona con proteínas AGO (Hamera et al. 2012), y la 

interacción puede ser un punto de unión entre la localización nuclear de  la proteína 

2b y la interferencia de la metilación de DNA. En esta localización la proteína 2b 

también podría interaccionar potencialmente con otras proteínas nucleares, por lo que 

su presencia nuclear puede tener también que ver con otras funciones que faciliten el 

ciclo de la infección viral.  

Como sinopsis de nuestro trabajo, mediante estudios de biología celular hemos 

realizado observaciones in vivo de la proteína 2b a nivel subcelular mediante la fusión 

de la proteína a diferentes marcadores fluorescentes o de otro tipo que no afectaron a 

su actividad supresora del silenciamiento en ensayos de agroinfiltración. Hemos 

estudiado su co-localización con otras proteínas y alterado sus dinámicas de 

acumulación entre compartimentos subcelulares. Hemos visualizado in vivo la 

formación de homodímeros de 2b y la interacción con diversas proteínas vegetales. Y 

en estudios in vitro hemos analizado la unión de la proteína 2b y mutantes expresadas 

en bacterias a siRNAs basados en el miRNA171 de A. thaliana. Todos nuestros 

resultados en su conjunto, obtenidos mediante estas aproximaciones de biología 

celular y molecular, y acompañados de ensayos funcionales de actividad supresora del 

silenciamiento, nos han permitido proponer que la supresión de silenciamiento de la 

proteína 2b de CMV reside en su capacidad de unión a ds siRNAs a ratios molares de 

proteína:RNA de 2:1 o cercanos a ellos, mientras que para la función supresora no es 

suficiente la interacción de la proteína 2b con proteínas AGO, o su acumulación 

nuclear-nucleolar. Todo ello sin perjuicio de que sus interacciones con proteínas AGO o 



181 
 

de otro tipo del huésped puedan constituir otros puntos de interferencia con el 

silenciamiento o con otros tipos de resistencia antiviral. 

Hemos finalmente llegado a las conclusiones que se redactan a continuación, en el 

siguiente apartado. 



182 
 

  



183 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6. CONCLUSIONES 

  



184 
 

  



185 
 

 

 

1. La fusión de marcadores fluorescentes a la proteína 2b no afecta a su actividad 

supresora de silenciamiento y permite localizar la proteína en el citoplasma y 

núcleo, donde hemos descrito por primera vez su presencia en el nucléolo y en 

los cuerpos de cajal.  

 

2. La actividad supresora del silenciamiento de la proteína 2b es independiente de 

su acumulación nuclear, aunque requiere de las NLSs y el motivo de 

fosforilación que intervienen en el movimiento y el balance de proteína 2b 

entre el núcleo y el citoplasma. 

 

3. La proteína 2b forma dímeros en el citoplasma y núcleo e interacciona con las 

proteínas AGO1 en el citoplasma y AGO4 en el núcleo, excluyendo al nucléolo. 

Estas interacciones son independientes de la actividad supresora de 

silenciamiento de la proteína. 

 

4. La proteína 2b de CMV une in vitro sRNAs de modo cooperativo con alta 

afinidad. Hemos clasificado las uniones in vitro de la proteína 2b nativa y de 

nueve mutantes a tres sRNAs en cinco categorías y hemos encontrado que la 

unión del supresor de silenciamiento a ds siRNA a proporciones molares 2:1 

correlaciona con la actividad supresora del silenciamiento. En esta unión 

participan el dominio terminal amino, las NLSs y el motivo de fosforilación. 

 

5. Una primera aproximación sugiere que además de con AGO1 y AGO4, la 

proteína 2b podría interaccionar con otras proteínas nucleares no implicadas 

en el silenciamiento. 

  



186 
 

 



187 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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210 
 

  



211 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ANEXOS 

  



212 
 

  



213 
 

ANEXO I: SECUENCIAS PEPTÍDICAS DE PROTEÍNAS 2b DE 

DIFERENTES CEPAS DE CMV 

 

ANEXO II: OLIGONUCLEÓTIDOS UTILIZADOS EN LA CLONACIÓN 

Y LA SECUENCIACIÓN DE LOS PLÁSMIDOS 

 

Clonación: 

Oligo. Secuencia Nombre 

79 ACTGGATCCATGGAATTGAACGTA Fny CMV 2b 5 Bam 

97 GTGAGCTCTGGTCTCCTTTTGG Fny CMV 3end Sac 

285 CATGAGCTCTCAAGCATAATCTGGAACATCG HA3'Sac 

289 CATGGATCCTTTGTATAGTTCATCCATG GFP 3’ –stop BamHI OK 

309 ATGTCTAGAGGATCCATGGTTGCACCAACTAG Fib Nb 5’ Xba-Bam 

311 CATGAGCTCTAGGCAGCAGCCTTCTGC Fib Nb 3’ Sac (+stop) 

312 ATGTCTAGAGGTACCATGGAGGAAGAGAAGG Coilin At 5’ Xba-Kpn 

Secuencias 
peptídicas de 
cepas del 
virus CMV de 
los subgrupos 
IA, IB y II. 
Modificado 
de Ye y 
colaboradore
s (2009). El 
subgrupo IA 
lo forman 
cepas de CMV 
con síntomas 
más severos y 
con proteína 
2b de 110 
aas, incluye la 
cepa Fny; el 
subgrupo IB, 
presenta 
síntomas un 
poco menos 
severos y con 
proteína 2b 
de 111 aas; y 
el grupo II lo 
forman 
aquellas 
cepas de CMV 
con síntomas 
suaves con 
proteína 2b 
de 100 aas, 
careciendo de 
la tercera α-
hélice o 
dominio 3, 
identificado 
por Ye y 
colaboradore
s (2009). 

 



214 
 

314 CATGAGCTCCTCAAATCTCTTTCTGAGATCT Coilin At 3’ Sac (+stop) 

322 ATGGGATCCATGGGAAAGTCTAAATCC Nucleolin At 5’ BamHI 

323 CATGGTACCTACTCGTCACCGAAGGTAGTC Nucleolin At 3’ KpnI 

324 ACAGGGTCATGCCGCCATGTG 2b domain 3 forward 

325 ATCCACTTGATAGAACGGTAG 2b domain 3 reverse 

333 
ACAGCTAGCATGAACGAGCTGGCTCTGAAACTGGCT

GGTCTG 

Nuclear export signal 5' 

NheI 

334 
CATTCTAGAGCTGTTTTGTTAATATCCAGACCAGCCAG

TTT 

nuclear export signal 3´ 

XbaI 

357 ATGGGATCCATGGTGGAGGCGAAGAAGCAG Delta 5T 2b 

358 
CATGAGCTCTAAGCATAATCTGGAACATCGTATGGAT

AAAAATCATGGTCTTCCGCCG 
Delta3T 2b 

410 ATGTCTAGATAGTAAAGGAGAAGAAC GFP minus N ATG 

   

 

 

  



215 
 

     Secuenciación: 

Oligo. Secuencia Nombre 

F17 GTAAAACGACGGCCAGT M13 forward (-20) SECUGEN 

R19 GGAAACAGCTATGACCATG M13 reverse (-24) SECUGEN 

79 ACTGGATCCATGGAATTGAACGTA Fny CMV 2b 5 Bam 

97 GTGAGCTCTGGTCTCCTTTTGG  

327 GATAATCATCGCAAGACCGGCAACAGG New ROK 3´sequencing 

328 GACGCACAATCCCACTATCCTTCGC New 35SP sequencing 

329 CGGATAACAATTTCACACAG PQE 5´seq 

330 GTTCTGAGGTCATTACTGG PQE 3´seq 

 

  



216 
 

ANEXO III: ESQUEMA DE LAS CONSTRUCCIONES PLASMÍDICAS 

 

 

 

 

 



217 
 

 

 

 

 

  



218 
 

ANEXO IV: EFECTOS DE DIVERSAS MUTACIONES EN LA 

PROTEÍNA 2B DE CMV (*En otros Cucumovirus: *TAV) 

 

 

Efectos en la formación de dímeros, tetrámeros y oligómeros en la proteína 2b 

Cepa Formación de 
dímeros, 

tetrámeros y 
oligómeros 

original 

Sustitución o 
delección 

Formación de 
dímeros, 

tetrámeros y 
oligómeros 
resultante 

Técnica Referencia 

Fny (IA) Dímeros Delección aas 1-17 Dímeros BiFC Datos 
propios Delección aas 22-

27 

Delección aas 33-
36 

Delección aas 22-
27 + 33-36 

Delección aas 39-
57 

S40 A40 

S42 A42 

Delección aas 62-
65 

Delección aas 95-
110 

Rs (IA) Tetrámeros 10NVE12 AAA Dímeros Modelado 
molecular 

Nemes et 
al. 2014 

Rs (IA) Tetrámeros 95DDTD98 AAAA Desestabiliza el 
tetrámero 

Simulación 
modelado 
molecular 
dinámico 

Géllert et 
al. 2012 

Rad35 
(IB) 

No forma 
dímeros 

P55 L55 Forma dímeros BiFC Xu et al. 
2013 

Fny (IA) Dímeros, 
Tetrámeros y 
oligómeros 

L15 A15,  M18 
A18 

Sólo Dímeros  Chemical 
cross-linking 
in vitro 

Dong et al. 
2015 

*TAV-
2b 

Tetrámeros y 
más 

L8
A8, I11

A11, 
L15
A15, M18

A18 
(cremallera de 
leucinas) 

Pobre 
oligomerización. 
No tetrámeros 

EGS cross 
linking 

Chen et al. 
2008 

 

  



219 
 

 

Efectos en la localización subcelular de la proteína 2b 

Cepa localización 
original 

Sustitución, delección 
o adición 

Localización 
resultante 

Especie de 
planta 

Referen. 

Fny 
(IA) 

Citoplásmica 
Nucleolar 

Delección aas 1-17 Citoplásmica. 
Nucleolar 

Nicotiana 
benthamiana 

Datos 
propios 

Delección aas 22-27 Citoplásmica 

Delección aas 33-36 Citoplásmica. 
Algo nucleolar  

Delección aas 22-27 + 
33-36 

Citoplásmica 

Delección aas 39-57 ++Nucleolar 

S40 A40 Citoplásmica. 
Nucleolar 

S42 A42 Citoplásmica. 
Nucleolar 

Delección aas 62-65 Citoplásmica. 
Nucleolar 

Delección aas 95-110 Citoplásmica. 
Nucleolar 

Adición NES (NES-GFP-
2b) 

++citoplásmica 

Fny 
(IA) 

Citoplásmica 
Nucleolar 

Adición NLS de cepa LS  Sólo Nucleolar N. 
benthamiana 

Du et al. 
2014 K23 R23 Citoplásmica 

Nucleolar Q24 R24 

E35 A35 

K23, Q24, E35 R23 R24 
A35 (iguala NLS de cepa 
Fny a NLS de cepa LS) 

LS (II) Predominant
emente 
nuclear (no 
nucleolar) 

  N. 
benthamiana 

Du et al. 
2014 

Fny 
(IA) 

Citoplásmica 
Nucleolar 

L15 A15  +  M18 A18 Citoplásmica, 
Nuclear y 
nucleolar 

 Dong et 
al. 2015 

CM95 
(IA) 

Nuclear C46 R46 Nuclear Cebolla Goto et 
al. 2007 

Q (II) Citoplásmica 
y nuclear 

22KRRRRR27 
AAAAAA Punteado 

citoplásmica. 
Perinuclear 

Células 
Bright 
Yellow-2 
(BY2) 

Lucy et al. 
2000 

23RRR25  QAQ perinuclear 

R24 Q24 Nuclear 
22KRRRRR27 AAAAAA 
+ 101KRRRRR106 (prot. 
Original 100 aas) 

Nuclear 

Delección aas 
39KSPSE43 

Nuclear 

Delección aas 85-100 Nuclear 



220 
 

 

Efectos en la virulencia de la proteína 2b en el virus CMV 

Cepa Síntoma 
original 

Sustitución, 
delección o 

adición 

Síntoma resultante Especie de 
planta 

Referencia 

Fny (IA) Mosaico Delección aas 
777-858 de 2a 

Atenuado Nicotiana 
glutinosa 

Du et al. 
2008 Cb7 (IB) 

Rad35 
(IB) 

Mosaico 
atenuado 

P55 L55 Necrosis sistémica N. glutinosa Du et al. 
2008 

Cb7 (IB) Necrosis 
sistémica 

L55 P55 Mosaico atenuado 

Fny (IA) Mosaico S40 A40 Síntoma suavizado Nicotiana 
tabacum 
N. benthamiana 

Lewsey et 
al. 2009 S42 A42 

Fny (IA) Mosaico Delección aas 
1-17 

Atenuado N. tabacum 
N. benthamiana 
Arabidopsis 
thaliana 

Lewsey et 
al. 2009 

Delección aas 
22-27 

Delección aas 
22-36 

Delección aas 
39-57 

Fny (IA) Mosaico Delección aas 
95-110 

Clorosis N. tabacum 
N. benthamiana 
A. thaliana 

Lewsey et 
al. 2009 

CM95 
(IA) 

Atenuado C46 R46 Mosaico N. tabacum Goto et al. 
2007 

HL (IB) Necrosis Delección aas 
71-111  

Atenuado A. thaliana Inaba et al. 
2011 

Rs (IA)  1MEL3 AAA Asintomático Nicotiana 
clevalandii 
Chenopodium 
murale 

Nemes et 
al. 2014 10NVE12 AAA Asintomático 

22KKQ24 AAA Atenuado 
25RRR27 AAA Síntomas como Rs 
31QNR33 

AAA Atenuado 
34RER36 AAA Atenuado 
40SPS42 AAA Asintomático 
55LPF57 AAA Atenuado 
70HRV72 AAA Asintomático 

Rs (IA) Síntomas 
sistémicos 
mosaico, 
atrofia 
severa 

95DDTD98 
AAAA 

Atenuado y retrasado 
respecto a cepa Rs. 
Mosaico. No atrofia 

N. clevelandii 
N. glutinosa 

Géllert et 
al. 2012 

Fny (IA)  Adición NLS de 
cepa LS 

Síntomas más severos 
que Fny. Necrosis 

N. benthamiana Du et al. 
2014 

Pepo (IA) 
36R37 
(IA) 

Severo P41 L41 Síntomas atenuados Nicotiana 
rustica 

Kobori et 
al. 2005. 

      



221 
 

Q (II) Atrofia 
severa, 
deformaci
ón de las 
hojas 
severa 

22KRRRRR27 
AAAAAA 

Atrofia reducida, 
síntomas de la hoja 
reducidos, comparado 
con cepa Q 

N. benthamiana Lucy et al. 
2000 

23RRR25  
QAQ 

Atrofia reducida, más 
mosaico que 
22AAAAAA27 

R24 Q24 Como cepa Q 
22KRRRRR27 
AAAAAA + 
101KRRRRR106 
(prot. Original 
100 aas) 

Atrofia reducida, 
síntomas de la hoja 
reducidos, comparado 
con cepa Q 

Delección aas 
39KSPSE43 

No atrofia 

Delección aas 
85-100 

No atrofia 

Q (II) Lesiones 
cloróticas 
que 
aumentan 
en 
tamaño, 
mosaico 

Delección 2b  
(Q-CMVΔ2b) 

Pequeñas lesiones 
cloríticas. Mosaico 
muy leve 

Cucumis sativus 
Tabaco 

Ding et al. 
1995 

Delección aas 
39KSPSE43 

Más síntomas que Q-
CMVΔ2b. Mosaico 
leve. Retraso síntomas 
sistémicos 

Delección aas 
84-100 (C-
terminal 
conservado) 

Como Q-CMVΔ2b. 
Mosaico leve. 

Fny (IA) Síntomas 
severos 

L15 A15 Síntomas atenuados  Dong et al. 
2015 M18 A18 Síntomas atenuados 

*TAV HR. 
Resistenci
a al virus 
(expresad
o desde 
vector 
TMV), 
activación 
de genes 
de Avr 

K21
V21 + 

R28
S28 

No HR, No resistencia 
al virus 

N. tabacum 
cultivar Samsun 

Li et al. 
1999 

Quimera TAV 
aas 1-69, CMV 
(Q) últimos 34 
aas 

Sin lesiones 
necróticas. 
Multiplicación viral en 
hojas inoculadas 

Quimera TAV 
aas 1-50, 
CMV(Q) 
últimos 50 aas 

Infección sistémica, 
huésped susceptible 

Quimeras con 
50 o más aas 
de extremo 
terminal de 
CMV y resto 
de TAV 

Infección sistémica, 
huésped susceptible 

Rad35 
(IB) 

Asintomát
ico 

P55 L55 Síntomas severos Nicotiana sp Xu et al. 
2013 

M1 (IA) Asintomát
ico 

T18  M18 Síntomas severos N. benthamiana Maneechoa
t et al. 
2015 



222 
 

Efectos en la actividad supresora de la proteína 2b 

Cepa Actividad 
original 

Sustitución, 
delección o 

adición 

Actividad 
resultante 

Especie de planta Referencia 

Fny (IA) 
 

+ 
 

S40 A40 + N. tabacum 
N. benthamiana 
A. thaliana 

Lewsey et al. 
2009 S42 A42 + 

Delección aas 1-
17 

- 

Delección aas 22-
27 

- 

Delección aas 33-
36 

- 

Delección aas 39-
57 

- 

Delección aas 95-
110 

+ 

Rs (IA) + 1MEL3 AAA Atenuado N. clevelandii 
Ch. murale 

Nemes et al. 
2014 10NVE12 AAA - 

22KKQ24 AAA - 
25RRR27 AAA + 
31QNR33 AAA - 
34RER36 AAA - 
40SPS42 AAA - 
55LPF57 

AAA - 
70HRV72 AAA Apenas 

afectado 

Fny (IA) + Adición NLS de 
cepa LS (II) 

Atenuado 
respecto a 

Fny 

N. benthamiana Du et al. 
2014 

Fny (IA) + Adición NES 
(NES-GFP-2b) 

+ N. benthamiana Datos 
propios 

Rad35 
(IB) 

- P55 L55 + N. benthamiana Xu et al. 
2013 

Fny (IA) ++ L15 A15 +, menor 
que Fny 

 Dong et al. 
2015 M18 A18 

L15 A15 + M18 
A18 

SD (IB) + Delección aas 62-
71 

Disminuye 
mucho 

actividad 
respecto a 

SD 

N. benthamiana Ye et al. 
2009 

Q (II) - 1MDVLTVVV8 


1MELNEGAM8 
(aas de cepa SD, 
subgrupo IB) 

Aumenta 
actividad 
supresora 

N. benthamiana Ye et al. 
2009 

M1 (IA) + T18  M18 +  Maneechoat 
et al. 2015 

      

      



223 
 

CM95 
(IA) 

Atenuado C46 R46 (cepa 
CM95 pasa a 
CM95R) 

+, más 
eficiente que 

CM95 

N. benthamiana Goto et al. 
2007 

Q (II) + 22KRRRRR27 
AAAAAA 

- N. benthamiana Lucy et al. 
2000 

23RRR25  QAQ - (Algo de 
actividad) 

R24 Q24 + 
22KRRRRR27 
AAAAAA + 
101KRRRRR106 
(prot. Original 
100 aas) 

- 

Delección aas 
39KSPSE43 

+, como cepa 
Q 

Delección aas 85-
100 

+, como cepa 
Q 

Q (II) + Sustitución K22 
R22 

+ N. benthamiana Li et al. 2011 

Sustitución  
K22 R22 + K39 
R39 

Menor que Q 

Sustitución S40 
A40 

- 

 

Interacción de la proteína 2b con AGO 

Cepa Interacción 
con AGO 

Sustitución o 
delección 

Interacción 
resultante 

Especie de 
planta 

Referencia 

Fny (IA) +  
(AGO1 y 
AGO4) 

Delección aas 1-17 + 
(AGO1 y 
AGO4) 

N. benthamiana Datos propios 

Delección aas 22-
27 

Delección aas 33-
36 

Delección aas 22-
27 + 33-36 

Delección aas 39-
57 

S40 A40 

S42 A42 

Delección aas 62-
65 

Delección aas 95-
110 

Rad35 
(IB) 

No P55 L55 Sí (AGO1) Arabidopsis Xu et al. 2013 

 

 



224 
 

Unión a ácidos nucleicos  

Cepa Unión 
siRNA 

Original 

Sustitución, 
delección o adición 

Unión siRNA 
resultante 

Método Referencia 

Fny (IA) 
 

+ Delección aas 1-17 + In vitro Datos propios 

Delección aas 22-
27 

- 

Delección aas 33-
36 

- 

Delección aas 22-
27 + 33-36 

- 

Delección aas 39-
57 

- 

S40 A40 + 

S42 A42 + 

Delección aas 62-
65 

++ 

Delección aas 95-
110 

++ 

Fny (IA) + Adición NLS de 
cepa LS 

+ In vitro Du et al. 2014 

Fny (IA) + L15 A15,  M18 
A18  
Sólo 61 aas prot. 

Muy 
disminuida 

In vitro Dong et al. 
2015 

L15 A15 

M18 A18 

*TAV-2b Unión a 
siRNA 

L8
A8, I11

A11, 
L15
A15, M18

A18 
(cremallera de 
leucinas) 

Unión a ds 
siRNA 

EMSA Chen et al. 
2008 

P41
A41 Disminución 

unión a RNA 
10 veces 

W50
R50 Disminución 

unión a RNA 
2 veces 

W50
A50 Disminución 

unión a RNA 
5 veces 

28RH29


28AA29 Disminución 
unión a RNA 

10 veces 

CM95 
(IA) 

Poca union 
a siRNAs 

C46 R46 Unión a 
siRNAs 

the wheat 
germ in vitro 
translation 
system  

Goto et al. 
2007 

CM95R 
(IA) 

+ Delección aas 22-
27 + 33-36  

- the wheat 
germ in vitro 
translation 
system  

Goto et al. 
2007 

 



225 
 

Efectos en el movimiento del virus 

Cepa Movimiento 
original 

Sustitución o 
delección 

Movimiento 
resultante 

Especie de 
planta 

Referencia 

Rs (IA) Célula-célula 1MEL3 
AAA  N. clevelandii 

Ch. murale 
Nemes et al. 
2014 70RHV72 AAA  

Rs (IA) Sistémico 95DDTD98 

AAAA 
Retraso en 
movimiento 
sistémico 

N. clevelandii 
N. glutinosa 

Géllert et al. 
2012 

Q (II) Sistémico Delección 2b  
(Q-CMVΔ2b) 

No 
movimiento 
sistémico 

C. sativus 
Tabaco 

Ding et al. 
1995 

Delección aas 
39KSPSE43 

Menor 
movimiento 
que cepa wt 

Delección aas 
84-100 (C-
terminal 
conservado) 

Menor 
movimiento 
que cepa wt 

Q (II) Sistémico Sustitución K22 
R22 

sistémico N. 
benthamiana 

Li et al. 2011 

Sustitución  
K22 R22 + K39 
R39 

reducido 

Sustitución S40 
A40 

no 

 

Interacción de la proteína 2b con AGO 

Cepa Interacción 
con AGO 

Sustitución o 
delección 

Interacción 
resultante 

Especie de 
planta 

Referencia 

Fny (IA) + 
(AGO1 y 
AGO4) 

Delección aas 1-17 + 
(AGO1 y 
AGO4) 

N. benthamiana Datos propios 

Delección aas 22-
27 

Delección aas 33-
36 

Delección aas 22-
27 + 33-36 

Delección aas 39-
57 

S40 A40 

S42 A42 

Delección aas 62-
65 

Delección aas 95-
110 

Rad35 
(IB) 

No P55 L55 Sí (AGO1) Arabidopsis Xu et al. 2013 

 



226 
 

 


	Tesis Inmaculada González Martín
	PORTADA
	AGRADECIMIENTOS
	ÍNDICE
	ABREVIATURAS
	ACRÓNIMOS DE VIRUS
	SUMMARY
	RESUMEN
	1. INTRODUCCIÓN
	1.1. CMV
	1.2. Silenciamiento y defensa antiviral en plantas
	1.3. Supresores virales de silenciamiento de RNA: mecanismosvirales de interferencia con el silenciamiento génico
	1.4. La proteína 2b

	2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
	3. MATERIAL Y MÉTODOS
	3.1. Material biológico
	3.2. Clonaje de las construcciones plasmídicas
	3.3. Expresión transitoria de genes en tejidos vegetales mediante agroinfiltración
	3.4. Ensayos de actividad supresora de silenciamiento
	3.5. Visualización in vivo de proteínas con marcajes fluorescentes
	3.6. Complementación bimolecular fluorescente
	3.7. Unión in vitro de la proteína 2b a RNAs

	4. RESULTADOS
	4.1. Localización subcelular y actividad supresora desilenciamiento de la proteína 2b de CMV
	4.2. Visualización in vivo de interacciones de la proteína 2b
	4.3. Unión in vitro de la proteína 2b a RNAs
	4.4. Visualización de potenciales interacciones de la proteína 2bcon otras proteínas nucleolares de la planta

	5. DISCUSIÓN
	5.1. Localización, patogenicidad y actividad supresora delsilenciamiento de la proteína 2b de CMV, nativa o modificada
	5.2. Interacciones de la proteína 2b con proteínas: formación dehomodímeros e interacción con proteínas AGO y con otrasproteínas
	5.3. Interacciones in vitro de la proteína 2b con RNAs

	6. CONCLUSIONES
	7. BIBLIOGRAFÍA
	ANEXOS
	ANEXO I: SECUENCIAS PEPTÍDICAS DE PROTEÍNAS 2b DEDIFERENTES CEPAS DE CMV
	ANEXO II: OLIGONUCLEÓTIDOS UTILIZADOS EN LA CLONACIÓNY LA SECUENCIACIÓN DE LOS PLÁSMIDOS
	ANEXO III: ESQUEMA DE LAS CONSTRUCCIONES PLASMÍDICAS
	ANEXO IV: EFECTOS DE DIVERSAS MUTACIONES EN LAPROTEÍNA 2B DE CMV