UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Ivett Bárány DIRECTORES: Ma. del Carmen Risueño Almeida Pilar Sánchez Testillano Madrid, 2015 © Ivett Bárány, 2008 Reprogramación del polen y obtención de plantas doble- haploides en "Capsicum Annuum L" : marcadores celulares y expresión de moléculas señalizadoras y de estrés Departamento de Genética UNIVERSIDAD COMPLUTENSE 5 3 2 4 9 9 5 0 4 2 U N IV ER SID A D CO M PLUTENSE D E M ADRID FACULTAD D E CIENCIAS BIOLÔGICAS DEPA R TA M EN TO D E G EN ÉTIC A REPROGRAMACIÔN d e l POLEN y OBTENCIÔN DE PLANTAS DOBLE-HAPLOIDES EN Ca p s i c u m ANNUUM l^r. MARCADORES CELULARES y EXPRESIÔN DE MOLECULAS DE SENALIZADORAS Y DE ESTRES TESIS DOCTORAL DE IVETT BAr ANY V° B° DIRECTORES DE TESIS Hi f V° B° TUTORA DE TESIS f̂ UjC 1/U Ù Fdo.; Dra. Maria Carmen R isueflo A lm eida Fdo.: Dra. Pilar Sânchez Testillano Fdo.; Dra. M aria Jesus Puertas G allego Fdo.: Ivett Bârâny C oN S E jo Su p e r i o r d e In v e s t ig a c io n e s C ie n t i f i c a s C e n t r o d e I n v e s t ig a c io n e s B io l o g ic a s M a d r id , 2007 “D is c o v e r y is t o s e e w h a t e v e r y o n e e l s e h a s s e e n AND TO THINK WHAT NO ONE ELSE HAS THOUGHT” Albert von Sf^nt-Gyorgfi 1937 NobelNaureate in Medicine A g r a d e c im ie n t o s Quisiera aprovechar estas primeras tineas para expresar mi gratitud a todas aquellas personas que, de una u otra forma, I)an tyecho posible la realis(aciôn de esta Tests Doctoral, y especialmente: A la profesora Dra. Maria del Carmen Risueno par haberme dado la oportunidad de Jormarparte de su grupo de investigaciôn, y par la ayuda y el apoyo recibidos a lo largo de estos anos. M i mâs sincero agradecimiento. A la Dra. Pilar Sdnche! ̂Testillano por su ayuda, dedicaciôny profesionalidad durante de estos anos. A todos mis companeros de laboratorio, quienes en algrin momenta compartieron conmigo companerismo y amistad: Adriana, Alicia, Ascen, Carmen, Cecilia, Hduardo, Gyanesh, Hong, Yania, Je;(abel, JoseJina, Marta, Margarida, Maria Berdasco, Maria Bernal, Nandini, Ofeliay P^beca. De manera especial quiero dar las gracias a José Maria por los inolvidables protocolos dibujados durante mis primeras pasos en el laboratorio, por su inagotable paciencia para lidiar con la barrera del idioma, por su apoyo en todo momenta y par su generosa amistad a pesar de la distancia. A Maria José por su ayuda, companerismo y amistad, ademds del apoyo en el trabajo diario compartiendo laboratorio conmigo. A Pablo por sus valiosos consejos e ideas, y por tener siempre tiempo para analivyir los re suit ados conmigo. A todos ellos por todo el dnimo que me ban dado durante estos anos. A Carlos por su ayuda en todas aquellas pequenas tareas que tan poco se pen y que, sin embargo, tan importantes son;y por su inestimable amistad. A la EM BO por la concesion de una becapara trabajar en el laboratorio delprofesor Eàsifô Bogre. A é ly a todo su grupo de la Royal Holloway University de Eondres, Reino Unido, por haberme dado la posibilidad de Jormar parte de su laboratorio durante mis meses de estancia en Egham, por su amabilidad, la enorme conftam^a en mi y el apoyo recibido desde el primer momento. En especial al Dr. Ldsifô Magyar por ensenarme nuevas técnicas y a la Dra. Rossana Henriques y al Dr. Tamds Mést^dros por su disposiciôn y amabilidad durante mi estancia. A l Dr. Ivdn Raiska, y a todo su grupo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Praga, Republica Checa, por su apoyo durante mi estancia en su laboratorio y la colaboraciôn y facilidades que puso a mi disposiciôn para poder realii^r mi investigaciôn sobre el nücleo. A Dra. Maria Jesus Puertas Gallego, por su apoyo durante estos anos y por aceptar ser la tutora de esta Te sis Doctoral A mis profesores de la Universidad de Ciencias Agrarias y al Centro de Investigaciones Biotecnolôgicas en Ciencias Agrarias de Gôdôllô, Hungria; especialmente al Dr. Miklos Tadosy a la Dra. Judit Mityko que desde el tercer ano de carrera me dieron la oportunidad de colaborar con ellos, y asi iniciarme en el mundo de investigaciôn. A l Dr. Bamadâs Jenes y al Dr. Las;(lô ¥ies\ky por su disponibilidad, colaboraciôn y apoyo prestado durante estos anos. A mi amiga y ex companera Merche, quien siempre ha estado a mi lado durante estos anos apoyândomey animândome. A Juan Antonio del Instituto Cajalpor las plaças reveladasy fijadas al microscopio electrônico. A Paco de la Universidad de Medicina de Autônoma por encontrarme siempre un hueco en la apretada agenda del microscopio. A Agustin del Servicio de Microscopio Electrônico de Universidad de la Complutense por facilitarme el uso del microscopio electrônico. A Marigel, Silvia y May te por su compafiia y ayuda durante las largas horas trabajando con el confocaly CCD. A Maria Rodrigue\y May te por su valiosa ayuda con los ültimos recortes. A Javier por su incondicional apoyo, comprensiôn y sobre todo, por estar siempre a mi lado. Por ultimo, mi mâximo agradecimiento a mi familia; a mis padres y a mi hermano Roland por su amory su apoyo incondicional,y por haberme animado siempre a perseguir mis ilusiones. A todo ellos. Gracias A b r e v ia t u r a s Abreviaturas ADN âcido desoxirribonucleico AFS automatic freeze-substitucion System (sistema de criosustituciôn automatico) ARN âcido ribonucleico ARNhn ARN heterogéneo nuclear BSA Bovine Serum Albumin (Albùmina de suero bovino) DAPI 4,6-diamidino-2-fenilindol dHzO agua destilada ddHiO agua bidestilada ERK Extracellular signal-Regulated Kinase (quinasa regulada por senales extracelulares) EtOH etanol FCS Fetal Calf Serum (Suero bovino fetal) Hsp heat shock proteins (proteinas de choque térmico) Hsp 70 heat shock protein 70 kD (protefna de choque térmico de 70 kD) Hsp 90 heat shock protein 90 kD (protefna de choque térmico de 90 kD) I2KI Tinciôn de yodo/yoduro potâsico para almidôn MAPKs Mitogen Activated Protein Kinases (proteinas quinasas activadas por mitogenos) M. E. T. Microscopio electrônico de transmisiôn M. O. Microscopio optico PBS Phosphate buffered saline (tampon fosfato salino) PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen (antigeno nuclear de proliferacion celular) RNP partfcula ribonucleoprotefca snRNP small nuclear RNP (partfcula ribonucleoprotefca nuclear con pequefios ARNs) snoRNP small nucleolar RNP (partfcula ribonucleoprotefca nucleolar con pequefios ARNs) snRNA small nuclear RNA (pequeho ARN nuclear) snoRNA small nucleolar RNA (pequeho ARN nucleolar) SDS-PAGE Sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sodico) UV ultravioleta In d ic e Indice Resumen 1 Introduccion 5 1. Importancia de las plantas doble-haploides en mejora genética 5 2. Métodos para la obtenciôn de plantas haploïdes 6 3. La embriogénesis del polen y la duplicaciôn de cromosomas 8 en plantas haploïdes como camino râpido hacia la homocigosis 4. Biologia del cultivo de anteras de Capsicum annuum L. 10 4.1 Capsicum annuum L, el pimiento 10 4.2 Desarrollo gametofïtico del polen 11 4.3 Desarrollo del cultivo de anteras; reprogramaciôn a embriogénesis 14 de microsporas de Capsicum annuum L. 5. Factores que influyen en la inducciôn de embriogénesis de la microspora 16 mediante cultivo de anteras 6. Factores implicados en la inducciôn de embriogénesis haploïde 18 6.1 Proteinas de choque térmico HSP70 y HSP90 18 6.2 Proteinas implicadas en la transducciôn de senales 20 6.2.1 MAPKs 20 6.2.2 Lipoxigenasas (LOX) 23 6.3 El nücleo como centro regulador de la actividad celular 26 7. Los componentes de la pared celular 29 Objetivos 35 I. Optimizacion del sistema de embriogénesis de polen a partir del cultivo in vitro de anteras de Capsicum annuum L, y observaciôn de las primeras etapas del proceso 1. Introducciôn 37 2. Material y Métodos 39 2.1 Material 39 Indice 2.2 Cultivo in vitro de anteras 39 2.3 Citometria de flujo 39 2.4 Crioprocesado de muestras para microscopia optica 40 2.5 Caracterizaciôn celular 40 3. Resultados y Discusiôn 41 3.1 Selecciôn de las yemas florales 41 3.2 Evaluaciôn de las condiciones del cultivo de anteras 46 3.3 Evoluciôn del cultivo de anteras, formaciôn de embriones y 47 regeneraciôn de plantas 3.4 Anâlisis celular de la embriogénesis de microsporas en el cultivo 49 de anteras de Capsicum annuum L. 3.5 Anâlisis del nivel de ploidfa de las plantas regeneradas 51 4. Conclusiones 53 5. Bibliografîa 54 II. Embriogénesis derivada de microsporas en pimiento {Capsicum annuum L.): 59 reorganizaciones subcelulares en comparaciôn con el desarrollo gametofitico Publicado en el Biology o f the Cell 97. 709-722 (2005) 1. Introduccion 60 2. Material y Métodos 63 2.1 Material 63 2.2 Cultivo in vitro de anteras 63 2.3 Citometria de flujo 63 2.4 Crioprocesado de muestras y microscopia electronica 64 2.5 Tinciones citoquimicas 64 3. Resultados 65 3.1 Proceso de embriogénesis mediante cultivos de anteras 65 3.2 Desarrollo gametofitico normal 68 3.3 Cambios morfologicos y caracterizaciôn de las etapas secuenciales 70 de desarrollo durante la embriogénesis de microsporas Indice 3.4 Caracteristicas ultraestructurales de la embriogénesis temprana 74 derivada de microsporas 4. Discusiôn 78 4.1 Los cultivos de anteras sometidas a choque térmico regeneran plantas 78 haploïdes y constituyen un sistema adecuado para los estudios celulares sobre el proceso de embriogénesis 4.2 Marcadores celulares de la ruta esporofïtica 79 4.3 Distribuciôn de almidôn 79 4.4 Depôsitos en vacuolas 79 4.5 Divisiôn simétrica en células inducidas 80 4.6 Citocinesis y diferenciaciôn de la pared celular 80 4.7 Subcompartimentos nucleares 81 4.8 El desarrollo posterior de los embriones derivados de microsporas 82 es semejante al de la embriogénesis cigôtica 5. Bibliografîa 83 III. El cambio del programa de desarrollo de la microspora de Capsicum implica expresiôn de HSP70 y conduce a la producciôn de plantas haploïdes Publicado en el International Journal o f Developmental Biology 45 (SI): S29-S40 (2001) 1. Introducciôn 89 2. Resultados y Discusiôn 89 3. Bibliografîa 92 IV. Büsqueda de factores implieados en la inducciôn a embriogénesis haploïde: proteinas de choque térmico HSP70 y HSP90 1. Introducciôn 93 2. Material y Métodos 96 2.1 Material 96 2.2 Cultivo in vitro de anteras 96 2.3 Anticuerpos 96 Indice 2.4 Electroforesis, Western Blot e inmunodetecciôn de proteinas 97 2.5 Crioprocesado de muestras y obtenciôn de criocortes 97 2.6 Inmunofluorescencia 98 2.7 Crioprocesado de muestras para microscopia electrônica 98 2.8 Inmunomarcado con oro coloidal para microscopia electrônica 99 2.9 Anâlisis cuantitativo del inmunomarcado con oro 99 3. Resultados 100 3.1 “Immunoblotting” 100 3.2 Inmunofluorescencia con anticuerpos anti-HSP70 y con anti-HSP90 101 3.3 Distribuciôn ultraestructural de HSP70: Inmunomarcado con oro y 104 anâlisis cuantitativo 3.4 Distribuciôn ultraestructural de HSP90: Inmunomarcado con oro y 108 anâlisis cuantitativo del marc ado 4. Discusiôn 112 4.1 Las proteinas HSP70 y HSP90 incrementan su expresiôn en respuesta al 112 tratamiento de inducciôn embriogénica 4.2 El aumento en la localizaciôn nuclear y nucleolar de HSP70 sugiere posibles 114 papeles tanto en la respuesta al estrés como en la iniciaciôn de la ruta embriogénica 5. Bibliografîa 117 V. Caracterizaciôn celular de componentes (JIM5, JIM7, XG, RGII) de la pared celular como marcadores celulares de proliferaciôn y diferenciaciôn durante las ru tas gametofitica y embriogénica del polen 1. Introducciôn 123 2. Material y Métodos 125 2.1 Material 125 2.2 Cultivo m v/Yro de anteras 125 2.3 Anticuerpos 125 2.4 Inmuno dot blot 126 Indice 2.5 Inmunofluorescencia y anâlisis en microscopia confocal 127 2.6 Crioprocesado de muestras y crioinclusiôn en résina 128 2.7 Inmunomarcado con oro y amplificaciôn con plata 128 2.8 Inmunomarcado con oro coloidal para microscopia electrônica 128 2.9 Anâlisis cuantitativo del marcado con oro 129 3. Resultados 130 3.1 Inmunolocalizaciôn de los componentes de la pared celular en un sistema 130 modelo de células en proliferaciôn y diferenciaciôn: raiz de Allium cepa L. 3.2 Cambios en los componentes de la pared analizados mediante dot blot 136 3.3 Inmunolocalizaciôn de componentes de la pared celular durante el 137 desarrollo gametofïtico del polen como sistema en diferenciaciôn 3.4 Inmunolocalizaciôn de componentes de la pared celular en la embriogénesis 142 de polen como sistema de reprogramaciôn 3.5 Cuantificaciôn del inmunomarcado de componentes de la pared celular 147 durante el desarrollo y embriogénesis del polen 3.6 Inmunolocalizaciôn de componentes de la pared celular 149 en etapas tempranas de la embriogénesis cigôtica 4. Discusiôn 152 4.1 Los componentes de la pared celular varian en procesos de proliferaciôn 152 y diferenciaciôn 4.2 Los componentes de la pared como marcadores de la reprogramaciôn 153 del polen a embriogénesis 4.3 Los cambios en la pared celular durante la embriogénesis del polen 155 también tienen lugar en la embriogénesis cigôtica 5. Bibliografîa 157 VI. Expresiôn y localizaciôn celular de MAPKs durante la embriogénesis derivada de microsporas de Capsicum annuum L. 1. Introducciôn 163 2. Material y Métodos 165 2.1 Material 165 Indice 2.2 Cultivo/« v/Yro de anteras 165 2.3 Anticuerpos 165 2.4 Electroforesis, Western Blot e inmunodetecciôn de proteinas 166 2.5 Crioprocesado de muestras para criocortes 166 2.6 Inmunofluorescencia 167 2.7 Crioprocesado de muestras para microscopia electrônica 167 2.8 Inmunomarcado con oro coloidal para microscopia electrônica 168 2.9 Anâlisis cuantitativo del marcado con oro 168 3. Resultados 169 3.1 Inmunoblotting con anticuerpos de MAPKs: anti-ERK 1 /ERK2 169 y anti-P-MAPK. 3.2 Inmunolocalizaciôn de ERK 1 /2 en la ruta gametofitica 171 3.3 Inmunomarcado con ERK 1/2 en la ruta embriogénica 173 anâlisis cuantitativo 3.4 Anâlisis cuantitativo del inmunomarcado con ERK 1/2 durante la ruta 175 gametofitica y la embriogénica 3.5 Inmunolocalizaciôn de las MAPKs fosforiladas activas durante la ruta 178 gametofitica 3.6 Inmunolocalizaciôn de las MAPKs fosforiladas activas durante la ruta 180 embriogénica 3.7 Anâlisis cuantitativo del inmunomarcado de P-MAPK durante las dos rutas 182 4. Discusiôn 186 5. Bibliografîa 188 VII. Cambios el dominio de cuerpos nucleares con la reprogramaciôn de la microspora hacia la embriogénesis Publicado en el European Journal o f Histochemistry 50. I. 35-44 (2006) 1. Introducciôn 191 2. Material y Métodos 194 2.1 Material 194 Indice 2.2 Anticuerpos 194 2.3 Inmunofluorescencia 195 2.4 Crioprocesado de muestras para microscopia electrônica 195 2.5 Inmunomarcado con oro coloidal 195 3. Resultados 196 3.1 Reorganizaciones celulares después de la reprogramaciôn de la microspora 196 a embriogénesis 3.2 Los cuerpos nucleares en la ruta de desarrollo del polen 197 3.3 Cambios en los cuerpos nucleares después de la reprogramaciôn a embriogénesis 202 4. Discusiôn 204 5. Bibliografia 207 VIII. El cambio de programa de desarrollo del polen a la ruta embriogénica va acompanado de cambios en la arquitectura y actividad nuclear 1. Introducciôn 213 2. Material y Métodos 216 2.1 Material 216 2.2 Cultivo in vitro de anteras 216 2.3 Anticuerpos 216 2.4 Electroforesis, Western Blot e inmunodetecciôn de proteinas 217 2.5 Crioprocesado de muestras para criocortes 217 2.6 Inmunofluorescencia 218 2.7 Crioprocesado de muestras para microscopia electrônica 218 2.8 Inmunomarcado con oro coloidal para microscopia electrônica 219 2.9 Anâlisis cuantitativo del inmunomarcado con anti-PCNA 219 3. Resultados 220 3.1 Inmunoblotting e inmunolocalizaciôn de PCNA durante el desarrollo 220 gametofïtico y embriogénico del polen Indice 3.2 Inmunolocalizaciôn de PCNA en la ruta embriogénica 223 3.3 Anâlisis cuantitativo del inmunomarcado con anticuerpos anti-PCNA 225 durante la ruta gametofitica y la embriogénica 3.4 Localizaciôn de cuerpos nucleares mediante inmunolocalizaciôn de 227 2,2,7-TMG en la ruta gametofitica 3.5 Inmunolocalizaciôn de 2,2,7-TMG en embriones derivados de polen 229 en comparaciôn con embriones cigôticos 3.6 Anâlisis cuantitativo de los cuerpos de Cajal identificados por anticuerpos 231 anti-2,2,7-TMG durante la ruta embriogénica y en los embriones cigôticos 4. Discusiôn 233 4.1 El cambio de programa de desarrollo del polen a la ruta embriogénica 233 va acompanado de cambios en la organizaciôn y en la actividad nuclear 4.2 Cambios en la actividad replicativa durante la reprogramaciôn 233 a embriogénesis 4.3 El dominio de cuerpos de Cajal cambia durante la reprogramaciôn a 235 embriogénesis 5. Bibliografîa 237 IX. Expresiôn y localizaciôn subcclular de Lipoxigenasas (LOX) durante la embriogénesis del polen y cigôtica 1. Introducciôn 243 2. Material y Métodos 246 2.1 Material 246 2.2 Cultivo in vitro de anteras 246 2.3 Electroforesis, Western Blot e inmunodetecciôn de proteinas 246 2.4 Crioprocesado de muestras para criocortes 246 2.5 Inmunofluorescencia 247 2.6 Crioprocesado de muestras para microscopia electrônica 247 2.7 Inmunomarcado con oro coloidal para microscopia electrônica 248 2.8 Tinciones citoquimicas 248 Indice 3. Resultados 249 3.1 “Immunoblotting” 249 3.2 Inmunofluorescencia con anticuerpos anti-LOX en embriones derivados de 250 microsporas y embriones cigôticos 3.3 Inmunolocalizaciôn a nivel ultraestructural 254 4. Discusiôn 256 5. Bibliografîa 259 Discusiôn general 263 1. Optimizaciôn del sistema de embriogénesis de polen a partir del cultivo 263 in vitro de anteras de Capsicum annuum L, y observaciôn de las primeras etapas del proceso 2. Las proteinas de choque térmico estân implicadas en la reprogramaciôn 263 de la microspora 3. Cambios en la organizaciôn celular determinan marcadores 264 de la reprogramaciôn hacia la ruta de desarrollo esporofïtica 4. La pared celular modifica sus componentes con la reprogramaciôn 265 de la microspora: esterifîcaciôn de pectinas, xiloglucanos y RGII como marcadores 5. La expresiôn, localizaciôn y actividad de MAPKs esta regulada durante la 266 reprogramaciôn de la microspora a embriogénesis 6. La reprogramaciôn de la microspora afecta a la arquitectura y funciôn 268 nuclear: reactivaciôn de la replicaciôn y aumento de cuerpos de Cajal 7. Las lipoxigenasas, LOX, aumentan su expresiôn en etapas avanzadas de la 269 embriogénesis de microsporas 8. Los marcadores identificados durante la reprogramaciôn de la microspora 269 tienen relaciôn con procesos de proliferaciôn y diferenciaciôn Conclusiones 271 Bibliografia 273 Anexo 289 R e s u m e n _______________________________________________________________________Resumen El polen es capaz de cambiar su proceso de desarrollo, reprogramarse y entrar en una nueva ruta denominada embriogénica, tras un tratamiento de estrés. Tras su reprogramaciôn, la microspora comienza a dividirse simétricamente dando lugar a proembriones y embriones que posteriormente continùan su desarrollo regenerando plantas haploïdes o doble-haploides. El desarrollo de la biotecnologia vegetal ha permitido la incorporaciôn de estrategias innovadoras a los métodos tradicionales de mejora, con el fin de generar una mayor variabilidad genética. En este contexto, el cultivo de anteras es, hoy en dia, uno de los métodos mâs eficientes para la obtenciôn de plantas doble-haploides, de gran utilidad para generar nuevas Hneas isogénicas y variedades, asi como para estudios genéticos y de mutagénesis. El pimiento {Capsicum annuum L.) es uno de los cultivos horticolas mâs importantes desde el punto de vista econômico en Espana, siendo éste el pais con mayor producciôn de la Uniôn Europea. La importancia de este cultivo horticola en Espana ha crecido espectacularmente durante las ultimas dos décadas al aumentar su producciôn en invemadero, debido a la demanda en los mercados europeos de pimiento fresco durante todo el ano. Para hacer trente a un mercado cada vez mâs competitivo, es necesario ofrecer productos de alta calidad (tamano, sabor, etc.), junto con la obtenciôn de la mayor variabilidad posible y un buen rendimiento industrial. En esta Tesis doctoral, un primer objetivo ha sido la obtenciôn plantas doble- haploides a partir de cultivos de anteras de Capsicum annuum Yolo Wonder var. B. Hemos optimizado los protocolos existentes (Mitykô et al., 1995), estudiando diversos factores taies como la correlaciôn entre la morfologia de los botones florales, el tamano y la coloraciôn de las anteras con antocianina y el estadio de desarrollo de las microsporas, asi como diversos aspectos del cultivo in vitro y el tratamiento de estrés inductor de la embriogénesis. Por otro lado, se ha llevado a cabo la caracterizaciôn celular de las primeras etapas de desarrollo hasta el estado de torpedo en la embriogénesis de microsporas de Capsicum annuum L. Se ha determinado el nivel de ploidia de las plantas procedentes del cultivo de microsporas, mediante citometria de flujo. Un segundo objetivo ha sido el anâlisis de distintos aspectos del proceso de reprogramaciôn del polen a embriogénesis, concretamente la identificaciôn de marcadores en etapas clave y la expresiôn de proteinas de estrés y senalizadoras. Resumen Existe una estrecha relacion entre las proteinas de choque térmico (HSPs) y el abandono de la ruta gametofitica hacia la embriogénesis. Hemos estudiado los cambios en la expresion y en la localizaciôn subcelular de dos proteinas de choque térmico, HSP70 y HSP90, en la ruta gametofitica y en varias etapas de la ruta embriogénica. Tras el tratamiento inductor se observé un gran aumento de la expresion de HSP70, y una traslocacién al nucleolo de la misma; sugiriendo una funcién especifîcamente protectora de la maquinaria nuclear y reguladora de la expresion génica. Se ha realizado una caracterizacion celular y ultraestructural (gametofitico y embriogénico) secuencial de todas las etapas de los procesos de desarrollo, mediante el empleo de técnicas histoquimicas e inmunocitoquimicas especiflcas, para elegir las fases fundamentals de estudio donde aparecen las caracteristicas celulares y funcionales diferenciales. Ha sido objeto de especial atenciôn la définie ion de marcadores celulares que caracterizan y diferencian los dos programas de desarrollo del polen, el gametofitico y el embriogénico, y que indican los principales cambios de actividad metabolica que estân asociados a la reprogramaciôn del polen. Entre estos marcadores se han identificado los cambios en el tamano y forma celular y nuclear, el patron de condensacion cromatinica, la organizacion funcional de la region intercromatinica y la arquitectura nucleolar, la poblaciôn ribosômica y la densidad citoplâsmica, la presencia y tamano de grânulos de almidôn y por ultimo, la estructura y composiciôn de las paredes celulares. Como método fundamental hemos empleado diferentes anticuerpos en distintas etapas de la ruta gametofitica, y en dos etapas clave de la ruta embriogénica: los proembriones tempranos y los embriones multicelulares tardios. Se ha analizado la expresion in situ de moléculas senalizadoras como las ERKs, P-MAPKs y LOX, encontrândose diferencias en su expresion y localizacion subcelular entre las microsporas que se reprograman hacia proliferaciôn (ruta embriogénica) frente a las que siguen su proceso normal de diferenciaciôn (ruta gametofitica). Asimismo se han detectado cambios en la composiciôn de las paredes celulares en relacion a los procesos de proliferaciôn y diferenciaciôn. Muchos de los anticuerpos empleados han resultaron ser buenos marcadores que nos permiten identificar de forma temprana en el cultivo las microsporas que se reprograman e inician la proliferaciôn (ruta embriogénica): mayor proporciôn de ERK y MAPK en nùcleo, aumento de cuerpos de Cajal nucleares, expresiôn de PCNA asociado a replicacinn y mayor proporciôn de pectinas esterificadas (marcadas por JIM7) en las paredes celulares; frente a las que siguen su proceso normal de diferenciaciôn (ruta gametofitica): acumulaciôn de almidôn, mayor proporciôn de ERK y PMAPK en Resumen citoplasma, y de pectinas no esterificadas (marcadas por JIM5), xiloglucanos (XG) y ramnogalacturonano II (RGII) en las paredes celulares. Los resultados obtenidos aportan nueva informaciôn muy valiosa sobre los mecanismos que controlan el proceso de reprogramaciôn del polen a embriogénesis en Capsicum annuum L, una especie de gran interés econômico; informaciôn que puede ayudar a su explotaciôn de forma mas eficiente y a dirigir futuras estrategias en la mejora de este cultivo. INTRODUCCIÔN Introducciôn 1. Importancia de las plantas doble-haploides en la mejora genética Los métodos tradicionales para la mejora de plantas han sido practicados durante cientos de anos. Actualmente se ha llegado a una etapa en la que estos métodos son insuficientes para hacer frente a las demandas mundiales de producciôn., que no se puede satisfacer a pesar de que cada ano se introducen en el mercado numerosas variedades nue vas. Los objetivos de mejora a largo plazo no podrân ser alcanzados a menos que se genere mucha variabilidad genética que pueda ser utilizada para tal fin, y que existan métodos que acorten el tiempo necesario para la obtenciôn de nuevas variedades. La introducciôn de las técnicas biotecnolôgicas y los avances en biologia molecular han permitido el desarrollo de nuevas herramientas de gran utilidad en la mejora vegetal. Entre éstas, la producciôn de haploides (plantas que poseen un solo juego de cromosomas “n”) y doble-haploides (plantas que poseen dos juegos iguales de cromosomas “n’* producidos por duplicaciôn espontânea o artificial de las haploides) es una herramienta importante ya que permite acortar el plazo requerido para la obtenciôn de nuevas variedades, siendo un buen complemento de los programas de mejora tradicionales. Las poblaciones haploides o doble-haploides (DH) carecen de genotipos heterocigotos, y son de gran utilidad para encontrar genotipos recesivos, taies como las propiedades organolépticas el color, el sabor, la forma y la posiciôn de los frutos como caracteristicas agronômicas y comerciales mas importantes, ya que dichos genotipos no quedan ocultos por los alelos dominantes. Este hecho tiene gran repercusiôn tanto en el campo de la mejora vegetal, como en el de la biotecnologia (Foster et al., 2007). Estas poblaciones présentai! mayor variaciôn genética aditiva y una ausencia de varianza genética debida a la dominancia, si se las compara con poblaciones segregantes, es decir, que se eliminan las complejidades del estado heterocigôtico, simplificândose enormemente dicho estado. De esta manera con el anâlisis genético pueden distinguirse las mutaciones recesivas de forma inmediata, haciendo que el proceso de selecciôn sobre una poblaciôn de haploides resuite mas eficiente. Introducciôn 2. Métodos para la obtenciôn de plantas haploides Exister! diversos métodos para la obtenciôn de plantas haploides (Jensen et al., 1996), los cuales se describen en la figura 1, que también muestra los diferentes tipos celulares que puede experimentar el desarrollo embriogénico en plantas superiores. Producciôn inducida de haploïdes E m b r io n e s e s ta d io to rp e d o P la n ta s h a p lo id e s Androgenesis ill vitro Ginogenesis ill vitra Cruce interespeciTico Técnica de polen irradiado P o le n d e o rra s j|i e s p e c ie s 4 P o le n ir ra d ia d o C u lt iv o d e a n te r a s C u lt iv e d e m ic ro s p o ra s .‘ î Ü M ic ro e s p o ro g é n e s is y M a c ro g a m e to g é n e s is '-------- T u b o p o lin ic o - r - m C é lu la s e s p e r m â t ic a s —e t Androgénesis Semigamia D e g e n e ra d a - â J ^ (O W M ito s is M a c ro e s p o ro g é n e s is y M a c ro g a m e to g é n e s is Poliembrional ■i Eliminacién de cromosomas f t V i Ginogénesis Producciôn de haploides espontânea S e m illa s P la n ta s h a p lo id e s — n N iic le o s g a m e to s fe m e n in o s # — n N ù c le o s g a m e to s m a s c ü l in o s 4> — 2n N iic le o s F ig u ra 1. Métodos de producciôn de plantas haploides (Poster et al., 2007). Las plantas haploides aparecen con muy baja frecuencia en la naturaleza de forma espontânea (Rammana et al., 1974; Rammana y Hermsen 1974; Koul y Karihaloo, 1977), dicha frecuencia es en la mayoria de los casos demasiado baja para ser utilizada en programas de mejora. Introducciôn Uno de los primeros métodos utilizados en la obtenciôn de plantas haploides para su aplicaciôn en programas de mejora fue la partenogénesis. Consiste en la formaciôn de un embriôn sin la intervenciôn del gameto masculino (a partir de un ôvulo no fecundado). La partenogénesis puede ser inducida in vivo o in vitro mediante la polinizaciôn con granos de polen triploides, o mediante la polinizaciôn con granos de polen irradiados o inactivos por tratamientos fïsicos o qmmicos (Sestili y Ficcadeni 1996; Ollitraul et al., 1996; Oiyama y Kobayashi 1993; Germanâ y Chiancone 2001). La partenogénesis in vitro ha proporcionado un método prâctico para la obtenciôn de plantas haploides de Solanum tuberosum, Beta vulgaris, Cucumis sativos y Allium cepa con frecuencias relativamente altas (Metwally et al., 1998). La ventaja de esta técnica es la buena estabilidad genética de las plantas doble-haploides obtenidas, junto con la ausencia de plantas albinas. En la Beta vulgaris hay una gran influencia del genotipo sobre la partenogénesis haploide, en la mayoria de las especies los rendimientos son muy bajos. Ademâs, la diploidizaciôn de los haploides inducidos es todavia ineficiente. Por ultimo, esta técnica esta restringida solamente a la producciôn de doble-haploides no pudiéndose aplicar en la transformaciôn de plantas. Otro sistema para la obtenciôn de plantas haploides es la semigamia, que ha sido empleada en Gossypium hirsutum (Turcotte y Feaster 1974). La semigamia représenta un proceso de fertilizaciôn anormal, donde el nùcleo masculino pénétra en el ôvulo, pero no se fusiona con el nùcleo del mismo. Los nùcleos del gameto masculino y femenino se dividen independientemente, dando lugar a un embriôn quimérico. El camino para conseguir plantas haploides via eliminaciôn cromosômica esta basado en el cruzamiento de dos especies distintas (Jensen et al., 1977; Mujeeb-Kazi y Riera-Lizarazu 1996). Tras la fertilizaciôn y durante la embriogénesis temprana, uno de los cromosomas patemos es eliminado. Esta técnica, conocida como de “bulbusum”, esta muy désarroilada en especies como Holdeum vulgare, Zea mays, Triticosecale, Secale cereale, Avena sativa, y Solanum tuberosum (Kasha et al., 1970; Devaux et al., 2003; Mujeeb-Kazi y Riviera-Lizarazu 1996; Laure et al., 1986; Inagaki et al., 2003; Wedzony et al., 2003; Immonen et al., 2004; Rines et al., 2003; De Maine et al., 2003). En el caso de la cebada, las plantas haploides se obtuvieron mediante la polinizaciôn de plantas de Hordeum vulgare con Hordeum bulbusum, un pariente silvestre que puede propagarse vegetativamente. En las primeras divisiones del cigoto hibrido tras la fecundaciôn, los cromosomas de Hordeum bulbusum son eliminado s obteniéndose un embriôn haploide con cromosomas de Hordeum vulgare ùnicamente. Las semillas obtenidas a partir de estos Introducciôn embriones no tienen endospermo normal, por lo que los embriones haploides son puestos en cultivo suplementado con hormonas, para regenerar plantas haploides. Las planas haploides regeneradas con este método son finalmente con colchicina para la obtenciôn le plantas doble-haploides. La ginogénesis consiste en la formaciôn de embriones que contienen solamente bs cromosomas matemos, debido a que no bay una fusiôn de los nùcleos de los gamebs masculino y femenino. La ginogénesis in vitro se puede llevar a cabo mediante el culti/o de sacos embrionarios, ovarios y ôvulos no polinizados; o bien mediante el cultivo le ôvulo s aislados (Keller y Korzun, 1996). Este método ha sido utilizado para la induccbn de haploides en especies como en Allium cepa, Beta vulgaris y en algunas especes arbôreas (Michalik et al., 2000; Wremerth-Weich et al., 2003; Zakhariev et al., 19^7; Winton et al., 1974). En la actualidad la ginogénesis es la técnica menos empleada debilo a su baja eficiencia, aunque al poder obtenerse plantas doble-haploides con especies que lo responden a tratamientos mas eflcientes, hace que este método tenga todavia algma aplicaciôn. En plantas superiores se pueden obtener plantas haploides y doble-haploices mediante el cultivo de anteras o de microsporas aisladas en medios nutritivos, en los que se estimula la divisiôn celular de las microsporas y posteriormente, la regeneraciôn de ma planta aprovechando la totipotencia de las células végétales (Maluszynski et al., 20(3; Pechan y Smÿkal 2001; Wang et al., 2000; Smÿkal et al., 2000; Reynolds et al., 1997). Hoy en dia, la embriogénesis a partir de microsporas mediante el método de cultvo de anteras o microsporas aisladas es de entre los métodos descritos, el mas râpido y el de aplicaciôn en mayor nùmero de especies para la regeneraciôn de plantas haploides y dobe- haploides. 3. La embriogénesis del polen y la duplicaciôn de cromosomas en plantas haploices como camino râpido hacia la homocigosis. La obtenciôn de plantas haploides o doble-haploides, completamente homocigoas en una sola generaciôn, a través de cultivo de anteras es el método mas empleado an nuestros dias (Zheng et al., 2003). El fenômeno de la embriogénesis de microsporas lie descubierto por Guha y Maheshwari en 1964, quienes obtuvieron embriones a partir de anteras de Datura innoxia Mill. Desde los primeros estudios sobre la embriogénesis, la aplicaciôn del cultivo de anteras y microsporas ha sido documentada en mas de 2)0 8 Introducciôn especies de angiospermas (Ahmadian et al., 1998; Ferrie et al., 1995; Flause y Hause 1996; Heberle-Bors et al., 1989; Pretova et al., 1993; Reynolds et al., 1997; Sangwan y Sangwan- Norreel et al., 1990; Testillano et al., 2001). Si la duplicaciôn cromosômica ocurre en alguna etapa durante la embriogénesis, las plantas regeneradas a partir de microsporas son completamente homocigotas (doble-haploides), siendo individuos homocigotos fertiles. El conseguir la homocigosis en una sola generaciôn ayuda a reducir el nùmero de ciclos de autopolinizaciôn o retrocruzamiento que séria necesario en los sistemas convencionales de mejora para obtener lineas puras o isogénicas (Wang et al., 2000). AAbb Cultivo de anteras Duplicaciôn de cromosomas Genotipos en la poblaciôn DH AAbbAABB aaBB \ Frecuencia de fenotipos en la poblaciôn DH AABB AAbb Generaciôn parental Gametos (^) Gametos Fj Autofecundaciôn AB aB Ab ab AB AABB AaBB AaBb AaBb aB aABB aaBB aABb aaBb Ab AAbB AaBb AAbb Aabb ab aAbB aabB aabb aabb AAbbAABB aaBB 3 Frecuencia de fenotipos en la poblaciôn F2 aabb Figura 2. Ventaja del uso de haploides en la mejora: Esquema comparativo de la obtenciôn de homocigosis en dos alelos mediante embriogenesis de polen y autofecundaciôn (Lentini et al., 2001). Introducciôn Comparândolas con el mejoramiento tradicional, estas técnicas permiten tanto acortar el tiempo de desarrollo de los programas de mejora mediante la utilizaciôn de plantas doble-haploides (DH), como introducir nuevas variedades mediante técnicas de transformaciôn génica y mutagénesis. La embriogenesis de polen in vitro permite la producciôn de plantas homocigotas y ademâs es un excelente sistema para estudios genéticos y de mutagénesis. En las plantas autôgamas y aplicando los métodos convencionales de mejora, la homocigosis se logra ùnicamente a partir de seis a ocho generaciones de autofecundaciôn, mientras que con una técnica de producciôn de haploides seguida de duplicaciôn cromosômica, es posible llegar a homocigosis compléta en una generaciôn solamente. En las plantas alôgamas, la producciôn de homocigotas résulta de gran importancia. Al trabajar con especies de polinizaciôn cruzada se favorece de forma natural la heterocigosidad y, de ser posible la autofecundaciôn, la obtenciôn de homocigotas se ve diflcultada por la endogamia. 4. Biologia del cultivo de anteras de Capsicum annuum L. 4.1 Capsicum annuum L, el pimiento El género Capsicum annuum, perteneciente a la familia de las Solanâceas, procédé de la forma silvestre originaria de la cuenca del amazonas y que se cultivô posteriormente en México tal como lo demuestran datos arqueolôgicos de 7.000 anos antes de Cristo (Eshbaugh et al., 1983). A partir de ahf, se produce la especializaciôn, apareciendo especies adaptadas capaces de vivir en diferentes hâbitats. Se difundiô por el norte de EE.UU., y en 1494 en el segundo viaje de Cristôbal Colôn fue introducido en Europa, desde donde se ha ido extendiendo posteriormente por amplias zonas del Mundo. Se distinguen dos grupos de Capsicum annuum en base a sus caracteristicas morfolôgicas: con flor morada o flor blanca. El grupo Capsicum annuum L. que tiene flores blancas es el de mayor importancia socio-econômica ya que es fuente de varios elementos nutritivos como las vitaminas C y A. Este grupo incluye desde las especies con frutos pequenos que se utilizan para fabricar pimentôn picante, hasta las que dan frutos grandes que se utilizan como hortaliza; estas ùltimas especies son las que adquieren cada dia mâs importancia por sus mùltiples usos a nivel industrial y en el mercado de los productos frescos. 10 Introducciôn 4.2 Desarrollo gametofitico del polen Las angiospermas constituyen el grupo de plantas que se caracterizan por tener estructuras reproductoras especiflcas, las flores, en las cuales se produce la reproducciôn sexual. Las plantas de Capsicum annuum L. son herbâceas anuales, con hojas pinnadas que parten de un eje central; las flores estân formadas por un câliz corto y grueso, y una corola de 6 pétalos. El periantio envuelve el pistilo rodeado de 6 estambres (Figura 3). Estambre Estigma Estilo Ovario Antera Estigma Pétalo Ovulo Sépalo Pistilo Saco embrionario Granos del polen Saco polinico Saco polinico / \ Tejido Teca Filamento Figura 3. Ôrganos sexuales y aparato masculino en angiospermas (Stanley y Linskens 1974). 11 Introducciôn En un corte transversal de una antera joven se aprecia un tejido conectivo por donie se conecta al filamento, y cuatro cavidades denominadas sacos polinicos; dos anteriores y dos posteriores. Cuando ya se han formado los granos de polen, el saco anterior forma ma sola cavidad con el respectivo saco posterior, de manera que la antera queda compuesta por solo dos cavidades, denominadas tecas. La zona mâs importante de la estructura de la antera en una etapa temprana cel desarrollo es el arquesporio, que es la parte interna y que contiene las células madrés cel polen, las cuales estân rodeadas por una pared celular compuesta fundamentalmente por celulosa y calosa. El arquesporio esta rodeado con un tejido granular, conocido como el tapete, que produce enzimas, nutrientes y materiales estructurales criticos para la microsporogénesis. Cuando los microsporocitos de los sacos polinicos alcanzan cierto desarrollo, time lugar la meiosis que origina las 4 microsporas haploides (figura 4). Tétrada N. vegetative N . generative Polen bicelular joven Polen bicelular medio 1 Microspora imicelular © Polen bicelular maduro N ùcleo 1° M itosis del polen Microspora vacuolada 2 “ M itosis de polen • • Desarrollo del tubo polinico Figura 4. Esquema de la microesporogénesis. Cada una de las microsporas estâ rodeada de una capa de calosa y, a su vez, esân unidas entre ellas por otra capa de calosa, conociéndose esta union con el nombre de tétrada. Durante la etapa de tétrada tienen lugar distintos procesos, siendo uno de ellosla formaciôn de la exina, que es la pared especial del polen. Posteriormente se separan as 12 Introducciôn microsporas de la tétrada, y cada microspora individual comienza a aumentar de tamano. Durante esta larga interfase de la microspora tienen lugar grandes cambios metabôlicos y estructurales que afectan al citoplasma y al nùcleo de la misma (Testillano et al., 1991; 1993a; Gonzâlez-Melendi et al., 1996; Testillano y Risueno, 1988; Risueno et al., 1988). Al final de este periodo, comienza la formaciôn de una gran vacuola en la microspora que ocupa casi toda la célula, y que obliga al nùcleo a desplazarse a un polo de la célula, provocando una reorganizaciôn del citoplasma (S hi vanna y Johri, 1985). El nùcleo adquiere una organizaciôn estructural con una cromatina descondensada, pequenas masas de cromatina condensada y un nucleolo con abundante componente granular; esta organizaciôn es tipica de células activas en transcripciôn (Gonzâlez-Melendi et al., 1995). Tras esta fase de transcripciôn, la célula sigue su programa de desarrollo y sufre una primera mitosis, dividiéndose asimétricamente, y dando lugar a dos células con caracteristicas y funciones diferentes: la vegetativa y la generativa, am bas confinadas dentro del grano del polen. La célula vegetativa ocupa la mayor parte del volumen del grano de polen, mientras que la generativa es de menor tamano y estâ incluida en el citoplasma de la anterior, situândose prôxima a la pared del grano de polen. El citoplasma vegetativo es rico en orgânulos que van aumentando en nùmero durante la maduraciôn del grano de polen, al tiempo que se reabsorbe la vacuola que ocupaba gran parte de ese citoplasma (Giménez-Martin et al., 1970; Sanger y Jackson 1971). Aparecen entonces numerosas cistemas de reticulo endoplasmâtico y un gran nùmero de plastidios que se van llenando de almidôn (Rodriguez-Garcia y Garcia 1978), asi como otras estructuras de réserva taies como gotas de lipidos. La célula generativa, en cambio, présenta un citoplasma reducido, con escasas mitocondrias, ribosomas, dictiosomas (Sanger y Jackson 1971; Burgess et al., 1970) y un reticulo endoplâsmico disperso. Los plastidios estân ausentes en algunas especies, posiblemente debido a la distribuciôn polar de los orgânulos previa a la mitosis (Reynolds et al., 1990; Albestsen y Palmer 1979; Raghavan et al., 2000). En etapas sucesivas del proceso de maduraciôn del polen, la célula generativa adquiere una morfologia fusiforme, migrando desde su posiciôn inicial periférica cercana a la pared del polen, hacia el interior del grano de polen pasando a ocupar una posiciôn mâs central y prôxima al nùcleo vegetativo. Esta maduraciôn va acompanada de un aumento progresivo del tamano del grano de polen y de un cambio de forma, que empieza a ser ligeramente ovalada. Se observan diferencias entre la célula vegetativa y la generativa, que se refieren a la sintesis de los âcidos nucleicos. La célula vegetativa, que présenta cromatina de poco 13 Introducciôn condensada, tiene un metabolismo muy activo y sintetiza gran cantidad de RNA y proteinas (Mascarenhas et al., 1975) y (Reynolds y Raghavan, 1982); por el contrario, en la célula generativa el nùcleo présenta una cromatina muy condensada. Es una célula inactiva con escaso metabolismo. Las células vegetativa y generativa presentan también una organizaciôn nuclear diferente, hecho que esta relacionado con las diferentes funciones que tienen en la reproducciôn sexual de las angiospermas. La célula vegetativa tiene una actividad transcripcional muy alta dirigida a producir la maquinaria necesaria para la germinaciôn del tubo polinico, mientras que la principal funciôn de la célula generativa es la replicaciôn de ADN y la formaciôn de gametos en la etapa de polen maduro o en la de germinaciôn del tubo polinico segùn las especies. La exina, la pared celular del grano de polen, se encuentra en toda la superficie excepto en las zonas de apertura, que es donde se producirâ la germinaciôn del tubo polinico. Los primeros estudios demostraron que los elementos primarios de la exina, denominados como primexina, pueden ser detectados ya en la microspora durante de la fase de tétrada (Heslop-Harrison, 1971; 1963). La exina madura contiene esporopolenina, que es un polimero importante por su resistencia a la biodegradaciôn y que parece estar originado por la polimerizaciôn oxidativa de ésteres dicarotenos y carotenoides (Brooks y Shaw, 1971). Esta acumulaciôn de esporopolenina tiene lugar después de la separaciôn de la microspora de la tétrada, y en la mayoria de los casos parece que el tapétum esta relacionado con la transferencia de precursores de esporopolenina a la pared del polen (Risueno et al., 1969; Heslop-Harrison y Dickinson, 1969). La pared celular actùa como diana para ciertas clases de proteinas como enzimas, alérgenos y sustancias de reconocimiento de polen-estigma (Raghavan et al., 2000). La estructura de la exina con cavidades abiertas permite la acumulaciôn de gran cantidad de proteinas, principalmente de alérgenos. A diferencia de la exina, la intina esta formada en su parte interior por microfîbrillas de celulosa embebidas en una matriz de pectina y hemicelulosa, y en su parte exterior présenta una gran cantidad de polisacâridos (Sitte et al., 1989). 4.3 Desarrollo del cultivo de anteras: reprogramaciôn a embriogénesis de microsporas de Capsicum annuum L. Las microsporas normalmente se desarrollan y dan lugar a los granos de polen en un proceso denominado microgametogénesis. Sin embargo, el polen cultivado in vitro 14 Introducciôn mediante tratamientos inductores (hormonas, vitaminas, sacarosa, rayos y y P, frio, choque térmico y ayuno) es capaz de abandonar su programa natural gametofitico hacia una nueva ruta embriogénica, dando lugar a embriones haploides y, en ultimo término, a plantas haploides y doble-haploides (Chupeau et al., 1998; Hause y Hause 1996) (figura 5.) La duplicaciôn cromosômica puede producirse espontâneamente, o puede ser inducida con varios agentes antimitôticos (colchicina, orizalina, amiprofos metil, trifluralina, pronamida, etc...). Célula madré del polen Planta 1 © Tétrada Q I Microspora unicelular \ Embriôn corazôn Embriôn globular Estrés Microspora vacuolada (3°) Pro embriôn de dos células > > Polen bicelular joven Polen bicelular medio Polen bicelular maduro Desarrollo del tubo polinico Figura 5. Representaciôn esquemâtica de la reprogramaciôn embriogénica de la microspora. El cultivo de anteras requiere técnicas relativamente sencillas, por lo que este método ha constituido la principal via de obtenciôn de plantas derivadas de microsporas en multitud de especies (Reynolds et al., 1997). Capsicum annuum L. résulta ser una de las 15 Introducciôn hortalizas mâs importantes en el aspecto econômico, ademâs de una de las de mayor respuesta a la inducciôn de embriogénesis del polen. Las primeras investigaciones sobre la obtenciôn de plantas haploides de Capsicum annuum se iniciaron hace mâs de 50 anos. En 1945, Christiansen y Bamford fueron fos primeros en investigar el desarrollo de las plantas haploides de Capsicum annuum, encontrando plantas haploides espontâneas entre las germinaciones gemelas. Toole y Bamford (1943) obtuvieron la primera planta doble-haploide (DH) fértil de pimierto empleando un tratamiento con colchicina. En 1958, Campos y Morgan indujeron una planta haploide embriogénica in situ mediante cruzado intraespecie. En 1969 en Francia, Pochard y colaboradores extendieron el estudio a grandes cantidades de semillas haploides poliembriônicas; sin embargo, se comprobô que la productividad de las lineas dob e- haploides era sorprendentemente baja. Pochard y Dumas de Vaulx (1979) observaron que la inducciôn de plantas haploides partenogenéticas depende del genotipo y de las condiciones geogrâfîcas, y que por ello, este método no podria ser empleado de forma generalizada. La producciôn de plantas haploides a través del cultivo de anteras de pimiento {Capsicum annuum L.) fue investigada por primera vez por Wang et al (1973; y George y Narayanaswamy (1973). Desde entonces tan sôlo un reducido nùmero de plântulas haploides ha sido regenerado a partir de anteras. El método de cultivo de anteras in vitro en pimiento ha ido mejorândose (Dumas de Vaulx et al., 1981; Mitykô et al., 1995); sin embargo, la eficiencia en la inducciôn de embriones todavia es muy baja. A pesar de los logros obtenidos, el bajo nùmero de microsporas que se dividen indica la necesidad, por un lado de seguir optimizando los protocolos de embriogénesis. y por otro de conocer de forma mâs profunda su mecanismo para reducir el coste de la producciôn de plantas doble-haploides, de forma que esta técnica pueda ser empleada de forma rutinaria a partir de cualquier cruzamiento de interés agronômico o cientifico. 5. Factures que influyen en la inducciôn de embriogénesis de la microspora mediante cultivo de anteras La capacidad de respuesta del cultivo de anteras al tratamiento del estrés inductor, denominada capacidad embriogénica, es altamente dependiente de varios factores. En todos los sistemas estudiados, el genotipo de la planta donante es considerado un factor muy importante para la respuesta embriogénica de las microsporas, como ocurre por ejemplo en muchas plantas herbâceas (Maheshwari et al., 1982) y lenosas 16 Introducciôn (Redenbaugh et al., 1981; Tsay y Su 1985; Chen et al., 1986; Uddin et al., 1988; Milewska-Pawliczuk et al., 1990; Baldursson et al., 1993), y la influencia de genotipos en general en todas las especies (Smÿkal et al., 2000; Wan et al., 1992; Beaumont et al., 1995). Varios estudios realizados en diferentes sistemas vegetales han demostrado que las condiciones de crecimiento de las plantas donantes, taies como el fotopen'odo, la intensidad de la luz, la temperatura, la nutriciôn minerai, las variaciones estacionales, los pretratamientos fîsicos y la aplicaciôn de hormonas influyen en la respuesta de las microsporas al cultivo in vitro (Chen et al., 1991, 1990; Ekberg y Eriksson 1967). Por ejemplo, en algunos cultivo s de Hevea brasiliensis se observô que durante los veranos muy câlidos las anteras daban lugar a microsporas estériles, por lo que no se obtenian embriones a partir de estas microsporas (Chen et al., 1990). La edad del material vegetal también tiene una gran influencia en la eficiencia del proceso de embriogénesis de la microspora. En cebada, las cinco primeras espigas tienen de un 15 % a un 20 % mâs de capacidad de regeneraciôn que las espigas mâs tardias. El estado de desarrollo de las microsporas es el otro factor importante a tener en cuenta para que se lleve a cabo con éxito la embriogénesis del polen, aunque dicho estado de desarrollo varia de una especie a otra. En la mayoria de las especies estudiadas se encuentra entre el estado microspora vacuolada y el bicelular joven (Raghavan et al., 1986; Smÿkal et al., 2000; Pechan et al., 2001). En Capsicum annuum se ha demostrado que la etapa mâs favorable para la inducciôn a embriogénesis es la etapa de microspora vacuolada, observândose una transcripciôn activa (Gonzâlez-Melendi et al., 1995). Se pueden aplicar distintos tipos de estrés en condiciones adecuadas de estudio para desactivar el programa gametofitico e inducir la expresiôn de genes especificos del desarrollo embriogénico (Touraev et al., 1996; 2001; Reynolds et al., 1997; Zheng et al., 2001). Se pueden aplicar tanto in vivo como in vitro, y tanto a los botones florales enteros, como a las anteras o a las microsporas aisladas; y pueden ser en forma de choque térmico, como ya se han aplicado en avena, algunos tipos de trigo, en Brassica napus y en Capsicum annuum L. (Custers et al., 1994; Dumas De Vaulx et al., 1981), o de frio (Gaillard et al., 1991; Kasha et al., 2001), o tratamientos quimicos e irradiaciôn con rayos y (Pechan y Keller, 1988; Zheng et al., 2001). Todos estos factores pueden actuar solos o en combinaciôn, para alcanzar una ôptima conversiôn de las microsporas en células embriogénicas. 17 Introducciôn La composiciôn del medio de cultivo es otro de los factores importantes para el éxito en el cultivo de anteras. No existe una combinaciôn aplicable de forma general, y las distintas composiciones dependen de la especie a cultivar. Otros factores que influyen en la respuesta de la antera son la densidad de las anteras en el cultivo (Sunderland et al., 1981). En cebada se evaluô el efecto de la densidad de las anteras llegando a la conclusiôn de que 50 anteras/ml era la densidad ôptima. 6. Factores implicados en la inducciôn de embriogénesis haploide 6.1 Proteinas de choque térmico HSP70 y HSP90 El tratamiento mâs adecuado para la inducciôn embriogénica en Capsicum annuum L es el choque térmico. El choque térmico provoca en las microsporas el disparo de toda una serie de mecanismos de respuesta y protecciôn ante sus efectos, que han sido profusamente descritos en numerosas especies tanto animales (Lindquist et al., 1986) como vegetales (Vierling et al., 1991). Tras el tratamiento de estrés, una de las primeras reacciones de la célula es la activaciôn de los genes de choque térmico y la sintesis de proteinas de choque térmico (HSP). Las HSP o chaperonas moleculares son proteinas que unen y estabilizan una conformaciôn inestable de otra proteina y que, a través de uniones y liberaciones controladas, facilitan su funciôn correcta in vivo; unen y ensamblan oligômeros, y los transportan a un compartimiento subcelular. Por ultimo, colaboran en la degradaciôn de proteinas (Harti et al., 1996). Las HSPs fueron descubiertas por vez primera en la década de los anos 60 en los cromosomas politénicos de las glândulas salivares de Drosophila (Ritossa et al., 1962). Las HSPs se engloban dentro de un grupo mâs amplio de proteinas denominadas genéricamente proteinas de estrés, que tiene esta denominaciôn ya que se ha demostrado que dichas proteinas actùan en respuesta a diversas situaciones de estrés, no sôlo a incrementos de la temperatura. Las proteinas de choque térmico son un grupo de polipéptidos intracelulares que se clasifica de acuerdo a su tamano molecular en seis familias: (a) las HSP de alto peso molecular de 100-110 kDa; (b) las HSP90 de 83-90 kDa; (c) las HSP70 de 66-78 kDa; 18 Introducciôn (d) las HSP60; (e) las HSP40; y (f) las HSP pequenas de 15 a 30 kDa. Los miembros de la familia de la proteina HSP 70 fueron las primeras proteinas observadas como inducibles al estrés. Es una proteina altamente conservada a lo largo de la evoluciôn, que se encuentra en todos los organismos estudiados; desde bacterias y levaduras, hasta especies vegetales y seres humanos (Boorstein et al., 1994). Los miembros de la familia HSP70 son polipéptidos simples con dominios terminales en los cuales se agrupan, por un lado el ATP y por el otro las proteinas lesionadas por el estrés. Para el correcto funcionamiento de las HSP70 es necesaria la participaciôn de otras familias de proteinas de choque térmico. Estas proteinas estân localizadas en una gran variedad de compartimentos celulares, que incluyen el citosol, las mitocondrias (Dahlseid y col. 1994; Mooney y Harmey 1996), los glioxisomas (Cooper y Ho 1987) y el reticulo endoplasmâtico (Cooper y Ho 1987; Vierling 1991; Brurmer et al., 1994), ademâs de los cloroplastos (Vierling et al., 1986), los fîlamentos de actina del citoesqueleto (Tsang et al., 1993), el nùcleo (Hendrick y Harti; 1993; Cooper y Ho 1987; Vierling 1991) y el nucleolo (Morcillo et al., 1997). En células de mamiferos, el citoplasma contiene la HSP70 inducible, y formas constitutivas de Hsc70 que tienen una correlaciôn estrecha con la primera y que son las que mâs se expresan en su constituciôn (Leppa y Sistonen 1997). En plantas, muchos de los trabajos estân enfocados en los efectos del choque térmico en condiciones normales y, principalmente, desde un punto de vista fîsiolôgico. Respecto al HSP70, también ha sido estudiada su funciôn y localizaciôn. (Cooper y Ho 1987; Lin et al., 1984; Lindquist et al., 1986; Vierling et al., 1991). En células meristemâticas de la rafz de Allium cepa se ha observado al M.E.T. la apariciôn de grânulos densos de proteinas citoplâsmicas tras la exposiciôn a temperaturas de 38 - 40 °C (Risueno et al., 1973). Estos mismos grânulos se han descrito posteriormente en tomate, dândoseles la denominaciôn de heat shock granules (HSG) (Neumann et al., 1989). Se les ha atribuido una funciôn protectora, y en ellos se ha detectado la presencia de HSP70 (Nover et al., 1989). En cultivos embriogénicos de microsporas de Brassica napus se han observado cambios en la localizaciôn de la proteina de HSP70 que se encuentra en el citoplasma antes de la inducciôn, y que pasa a localizarse principalmente en el nùcleo tras la inducciôn (Cordewener et al., 1995; Segui et al., 2003). Todavia no hay datos sobre Capsicum annuum excepto los de nuestro trabajo preliminar (Bârâny et al., 2001). 19 Introducciôn La proteina HSP90 es la segunda proteina de choque térmico mâs conservada, después de HSP70 (Lindquist et al., 1986). En eucariotas se ha documentado su localizaciôn en forma constitutiva en el citoplasma (Lindquist et al., 1986; Hendrick y Harti 1993; Hemoto y Sato 1998), y su fuerte inducciôn tras la exposiciôn a elevadas temperaturas (Vâzquez-Nin et al., 1992). La HSP90 es una proteina hidrofôbica y su hidrofobicidad se incrementa tras el choque térmico. La HSP90 présenta al igual que la HSP70 dos dominios terminales (el campo amino y el carboxi) muy cargados, de manera que esta proteina présenta un gran potencial para unir proteina desplegada, sobre todo en el dominio carboxilo terminal hasta que se repliega. Estudios recientes han demostrado que la HSP90 posee un lugar de uniôn de ATP y una capacidad de autofosforilizaciôn, experimentando un cambio conformacional después de la adiciôn de ATP (Csermely et al., 1998). Aunque la estructura primaria de HSP90 fue descrita hace muchos anos, poco se conoce acerca del papel funcional de varios de los segmentos de la proteina. Es una proteina que évita el agrupamiento de proteina danada por el estrés térmico, para que pueda ser replegada y activada de nuevo. En plantas de Arabidopsis thaliana, han sido detectados homôlogos en plastidios (Ludwig-Muller et al., 2000). Es sabido que el gen HSP90 se expresa en embriones de ciertas especies vegetales como el maiz (Marrs et al., 1993), en Dacus carrota (Milioni et al., 2001) y en Brassica napus (Segui et al., 2003). Otros genes HSP se expresan durante el desarrollo del embriôn (Almoguera y Jordano 1992; Coca et al., 1994; Carranco et al., 1997; Almoguera et al., 1998). Por lo tanto, parece que existe una relaciôn entre la expresiôn de los genes HSPs y la embriogénesis. Se ha estudiado la localizaciôn de la proteina de HSP90 en microsporas inducidas y no inducidas de Brassica napus (Segui et al., 2003). Sin embargo, todavia no se dispone de informaciôn sobre el papel de HSP90 en el sistema de embriogénesis de polen de Capsicum annuum. 6.2. Proteinas implicadas en la transducciôn de senales 6.2.1. MAPKs Los organismos han desarrollado mecanismos de comunicaciôn complejos para coordinar las funciones de las células de un tejido con las de otro, las de las células del mismo tejido y de manera fundamental, para ajustar el funcionamiento del organismo con respecto a las condiciones ambientales extemas. Estos sistemas celulares de producciôn. 20 Introducciôn reconocimiento, transmisiôn y procesamiento de una senal extracelular son los llamados sistemas de transducciôn de senales. Las MAPKs intervienen en la transducciôn de senales en respuesta a una multitud de estimulos extracelulares y dan lugar a una gran variedad de respuestas. Las MAP quinasas en mamiferos fueron identificadas en rutas de transducciôn de sefiales en proliferaciôn, pero mâs tarde se observô que también estân involucradas en sefiales de transmisiôn hormonal, de neurotransmisores y sefiales para diferenciaciôn (Elion et al., 1991; Sturgill y Wu, 1991; Blenis y Resh, 1993; Nishida y Gotoh, 1993; Marshall et al., 1994; Lewis et al., 1998; Robinson y Cobb, 1997; Huang et a l, 2002; Mishra et a l, 2006; Zhang et a l, 2006). Las cascadas de MAP quinasas estân integradas por très elementos consecutivos: MAPKKK, MAPKK y MAPK; su secuencia indica el orden en el que los componentes se van activando consecutivamente mediante reacciones de fosforilaciôn. Las MAPKKKs no se encuentran asociadas directamente con el receptor membranal, y necesitan ser activadas por componentes intermediarios cuya actividad si puede depender de él (Meskiene et al., 2000). Los intermediarios que activan a las MAPKKKs fosforilan residuos localizados en los puntos cataliticos de la MAP quinasa sustrato. Las MAPKKKs asi activadas fosforilan los residuos de Ser/Thr cataliticos de las MAPKKs, que se encuentran conservados entre los subdominios VII y VIII de su estructura primaria (Posada y Cooper, 1992; Payne et al., 1991). Las MAPKKs finalmente activan al ultimo miembro de la cascada fosforilando los residuos de Tyr y Thr localizados en la secuencia caracteristica TxY, donde x représenta cualquier residuo (Meskiene et al., 2000). Una vez activada, la MAPK puede fosforilar directamente a proteinas que contengan al motivo fosfo-receptor Ser/Thr-Pro en regiones denominadas “sitios de acoplamiento”. La fosforilaciôn del sustrato puede efectuarse tanto en el citoplasma como en el nùcleo, pues muchos de sus blancos son factores o correguladores transcripcionales (Treisman et al., 1996; Mizoguchi et al., 1997; Hirt et al., 2000; Nakagami et al., 2005) (Figura 6). 21 Introdtcciôn Senal extracelular i i Membrana plasmâtica MAPKKK Inaztivo MAPKK MAPKK Activo w 1 Inactive MAPK MAPK Activo i Inactive Sustrato Sustrato Activo i Respuesta celular Figura 6. Esquema de la cascada de MAPKs (Hirt et al., 2000) Se han identificado un total de 23 de MAPKKs en varias especies vegetales como er. Arabidopsis thaliana, Nicotina tabacum, Medicago sativa, Petroselium crispum, Avena sctiva, Lycopersicum spp, Glucine max, Holdeum vulgare, Oryza sativa (Wilson et al., 1993; 1995; Duerr et al., 1993; Jonak et al., 1993; 1994; 1995; Mizoguchi et al., 1993; 1994; Hirt et al., 2000). Las MAPKKs identificadas en plantas poseen estructuras piimarias que difieren de las de los mamiferos en la secuencia en el sitio de fosforilaciôn, mientras que respecto a las regiones N-terminales son muy similares (Duerr et al., 1993; Mizoguchi et al., 1993; 1994; Wilson et al., 1993; Decroocq-Ferrant et al., 1995). Las MAPK de plantas se denominan comùnmente PERK (Plant ERK) por su similitud a las MAPKs de la subfamilia ERK de mamiferos. Las PERKs se clasifican en des Nubtipos: las que contienen un dominio TE Y en el sitio de fosforilaciôn, y las que ccntienen un dominio TDY. En las MAPKs de plantas no se han identificado homôlogos dd dominio TGY, que se encuentra en las estructuras primarias de algunas MAPKs de 22 Introd'^cciôn levaduras y mamiferos, ni del dominio TPY présente en las de éstas ùltimas (Ichimora et al., 2002). En la actualidad no existe una nomenclatura definida para la clasificac:ôn de MAPKs vegetales; sin embargo, una propuesta ampliamente aceptada considéra cuatro grupos denominados: A, B, C y D (Ichimora et al., 2002). Las MAPKs de los grupcs A, B y C contienen una secuencia TEY en el sitio catalitico, mientras que el D comprende la secuencia TDY (Ichimora et al., 2002). El anâlisis filogenético de las MAPKs propone un cambio evolutivo entre los grupos A, B y C, ya que los ortôlogos de los grupos A. y B contienen dominios CD muy conservado en su region C-terminal, a diferencia del dominio CD del grupo C que tiene una longitud mayor y su secuencia posiblemente determiia una localizaciôn subcelular de este tipo de proteinas diferente a las MAPKs de los grupos A y B. Las MAPKs del grupo D no contienen el dominio CD (Ichimora et al., 2002). Debido a las condiciones ambientales a las que se enfrentan las plantas, éstas se encuentran sometidas a una gran variedad de tipos de estrés medioambiental por lo que han adquirido y desarrollado diversas defensas constitutivas e inducidas que previenen o evitan la propagaciôn de bacterias, bongos, virus, ataques de invertebrados y de otras especies de plantas (Dangl et al., 1996). Asimismo, varias MAPKs han sido relacionadas con la diferenciaciôn y proliferaciôn de la célula (Bôgre et al., 1999; Coronado et al., 2002; Huang et al,, 2002; Jonak et al., 1993; Mizoguchi et al., 1994; Préstamo et al., 1999; Wilson et al., 1997), asi como con el desarrollo del polen y de la embriogénesis en otras especies vegetales como Brassica napus o Nicotina tabacum (Testillano et al., 2000a; 2005 Coronado et al., 2002, 2007; Segui et al., 2005). 6.2.2 Lipoxigenasas (LOX) La peroxidaciôn de lipidos es comùn a todos los sistemas biolôgicos, teniendo lugar en procesos regulados por el desarrollo. Estas réservas de lipidos sirven como suministros de energia, proporcionando asimismo équivalentes de carbono para los procesos de sintesis durante el crecimiento de la plântula. Productos como los âcidos grasos poliinsaturados, hidroperôxidos y metabolitos derivan de las oxilipinas. Pueden ser originados por la oxidaciôn quimica o ser sintetizados por la acciôn de varios enzimas, como las lipoxigenasas (LOXs). Las lipoxigenasas (linoleate: oxigeno ôxidoreductasa, EC 1.13.11.12) constituyen una gran familia de âcidos grasos dioxigenasas con contenido en hierro, que se encuentran 23 Introducciôn présentés tanto en células vegetales como animales (Brash et al., 1999; Feussner y Wastemack 2002). Las lipoxigenasas catalizan la dioxigenaciôn especifica de la region de los âcidos grasos polienoicos (PUFAs), que contienen un sistema pentadieno (IZ, 4Z) présente en especies vegetales como el âcido linoleico insaturado Cig (LA) y el âcido a- linoleico (a-LeA). En las células vegetales las LOXs se clasifican de acuerdo a su especifîcidad posicional en la oxigenaciôn de LA. El LA es oxigenado a 9 (9-LOX) o 13 (13-LOX) âtomos de carbono, en la estructura molecular de carbono del âcido graso dando lugar a dos grupos de compuestos; los derivados de PUFAs (9S)-hidroperôxidos y los (13S)- hidroperôxidos (figura 7). COGH 13-LOX 9-LOX ---- 3 COOH HOO 13-HPOTE HOO 9-HPOTE Figura 7. Reacciôn de LOX y especifîcidad posicional (Feussner y Wasternack, 2002). Otra clasificaciôn de las LOXs vegetales estâ basada en la comparaciôn de su estructura primaria y propone 2 familias de genes: LOX tipo 1 y tipo 2 (Shibata et al., 1994). Las LOX tipo 1 no transportan péptidos y tienen una alta similitud en la secuencia (mayor del 75 %), mientras que las LOX tipo2 transportan secuencias de péptidos en trânsito en el cloroplasto y muestran en general una baja similitud (aproximadamente del 35 %). Se ha propuesto que las LOX 13 estân involucradas en el catabolismo de los triglicéridos. Se han clonado y secuenciado intensivamente LOXs de diferentes especies 24 Introducciôn végétales, lo que ha permitido crear diagramas en ârbol filogenéticos de familias multigenes (figura 8). Tipo 1 Tipo 2 lOX7P*:1 I I— L LOXZt* tLOXKM4 UBQWa 10X 2 312 1 0 X 2 1 » ? (—— lO X l 1— I r— " t ------ 10X1:0#-'* 10X1 10X1 Om 7 L0XÎ 4), respecto de un residuo adyacente; en esti disposiciôn, un par de residuos, la celobiosa, constituye una subunidad. Las microfîbrilla; miden 5-15 nm de diâmetro y pueden alcanzar varios micrometros de longitud. Lo; abundantes puentes de hidrôgeno en cadenas de glucanos y entre cadenas adyacente; convierten a la microfîbrilla en un agregado casi cristalino. Las capas de microfîbrilla; impiden el estiramiento lateral de la pared celular (O'Neill y Cork, 2003). La hemicelulosa y las pectinas son otros dos componentes importantes de la pairei celular. El xiloglucano (XG) représenta la mayor hemicelulosa, y consiste en unidaide: 30 Introducciôn heptasacâridas repetidas, de cuatro unidades fi-D-glucosa enlazadas (1—>4), con très residuos consecutivos constitutivos de a-D-xilosa enlazadas (1—►b) al esqueleto de glucano. Cerca de la mitad de estas unidades heptaméricas contiene extensiones de 13-D- galactosa (1—>2) sobre la xilosa del glucano, sobre la xilosa media o entre ambos residuos. La rigidez estructural y la fuerza de la pared celular dependen de la integridad de la pared formada por la celulosa y los glucanos entrelazados. La modificaciôn de XG catalizada por las enzimas es un proceso clave para la expansion durante el crecimiento celular (Talbott y Ray, 1992). El metabolismo de XG aumenta durante el alargamiento de la célula vegetal y constituye un factor clave para la extension de la pared celular. La cooperaciôn entre las expansinas y las xiloglucano endotransglucosilasas esta implicada en el alargamiento de polimeros durante el ensamblaje de la pared (Thompson y Fry, 2001), en el estiramiento de la pared durante el crecimiento y la orientaciôn de las microfibrillas (Nishitani et al., 1998). Los polisacâridos pécticos constituyen cerca de un tercio de las paredes celulares de las plantas dicotiledôneas (Carpita y Gilbeaut, 1993). La matriz péctica de la célula vegetal es una mezcla compleja de homogalacturonano (HG), y polimeros de ramnogalacturonano I (RGI) y ramnogalacturonano II (RGII). Los homogalacturonanos son cadenas no ramificadas de residuos de (1—̂ 4) a-D-âcido galacturônico (GaiA) que pueden ser metilesterificadas o acetiladas diferencialmente, mientras que RGIs son heteropolimeros ramificados de (1—̂ 2) a-D-ramnosa altemados con residuos de (1—>4) a-D-GalA que contienen cadenas latérales neutras de residuos (1—̂4) p-D-galactosa y/o (1—»5) a-L- arabinosa, predominantemente unidos a los residuos del esqueleto de ramnosa en 0-4 (Cosgrove et al., 2005). Las cadenas latérales de (1—>-4) P-D-galactano con residuos terminales de arabinosa en posiciôn 0-3 dar lugar al arabinogalactano I (figura 11). Las sustancias pécticas vegetales varian en gran medida en la composiciôn de las cadenas latérales neutrales de sacâridos. Las pectinas se polimerizan en el cis-Golgi, se metilesterifican en el Golgi medio y son modificadas por cadenas latérales en las cistemas del trans-Golgi. A continuaciôn, son segregadas a la pared celular altamente metilesterificadas. Finalmente, pueden ser modificadas por enzimas como las pectinas- metilesterasas, las cuales catalizan la dimetilesterifîcaciôn de homogalacturonas liberando pectinas acidicas y metanol (Fry et al., 2004). 31 Introducciôn 5-Arabinano H4 «W WO ‘Oil MOHO H OIM> HO (Ml 4-GaIactano OH H O MO tm OH [Ml IRI- HO OMHO i>ll Arabsnognlftctano T?po I Figura 11. Estructura bâsica del ramnogalacturonano I (RGI) mostrando el esqueleto de residuos altemados de (1 —̂ 2) a-D- ramuosa y ( 1 —̂ 4) a-D- Gai A cou cadenas latérales neutrales de ( 1 ̂ 4)p-D-galactosa (4-galactano), (1—>5)a-L- arabinosa (5-arabinano) en el 0-4, y/o arabinogalactanos Tipo I (Carpita y McCann, 2000). Aunque la composiciôn quimica de estas moléculas esta bien caracterizada, su ensamblaje dentro de estructuras de alto orden no esta claro (McCartney et al., 2000; Soreuseu et al., 2000). Se hau propuesto diversos roles para los polimeros pécticos incluyendo la regulaciôn de la adhesiôn célula-célula, la expansiôn celular, las propiedades mecânicas de la pared celular, la mediaciôn de la porosidad celular como fuente de moléculas de senalizaciôn y, finalmente, la participaciôn en eventos de la diferenciaciôn celular v oreanoeénesis IReiter et al.. 1997: Rvden et al.. 2003: Baluska et al 20064 Sin embargo, las funciones précisas de estos polimeros dentro del gnjpo de RGI afin se desconocen. En la tigura 12 se muestra un esquema del modelo de estructura propuesto para la pared celular primaria, donde se pueden observar los dominios principales que la 32 Introducciôn constituyen: el entramado celulosa-xiloglucano que confîere resistencia a la elongaciôn, y los polisacâridos pécticos (galacturonanos y ramnogalacturonanos) relacionados con la resistencia a la compresiôn. El tercer dominio esta formado por proteinas estructurales, como la extensina rica en prolina, y otros componentes vitales, como las enzimas, involucrados en el metabolismo de los polisacâridos, y la lignina, que se incorpora una vez finalizadas la elongaciôn y posterior diferenciaciôn, que no se muestran en el modelo. C elulosa sintasa \ M embrana plasm âtica Fibrillas de celulosa HG con Ca uni6n 50 nm Figura 12. Representaciôn esquemâtica de la pared celular. (Somerville et al., 2004). El xiloglucano représenta a la hemicelulosa. La sintesis y ensamblado de estos dominios se realizan independientemente una de la otra, y los componentes que los forman pueden variar en respuesta a las necesidades fîsiolôgicas del tejido; es decir, que las proporciones relativas de los distintos componentes varian de tejido a tejido. Las pectinas también estân involucradas en la creaciôn de la pared celular del grano de polen, especialmente la primexina (Hess y Frosch 1994; Mejewska-Sawka et al., 2006) 33 Introducciôn y la intina (Heslop-Harrison et al., 1980; Cresti et al., 1983; Bedinger et al., 1992; van Aelst y van Went 1992; Geitmann et al., 1995; Li et al., 1995), con acumulaciones masivas en la zona de la apertura (Taylor y Hepler 1997). La distribuciôn de las pectinas ha sido estudiada y descrita en embriones derivados de microsporas de Quercus suber (Ramirez et al., 2004); sin embargo, no se conoce aùn su papel ni en la ruta gametofïtica ni en la embriogénesis de Capsicum annuum. En esta Tesis Doctoral pretendemos estudiar la apariciôn e importancia de los cambios en varios componentes de la pared celular durante el desarrollo gametofïtico de la célula, asi como en varias etapas en la ruta embriogénica, empleando un sistema modelo como es la raiz de Allium cepa T., por ser bien conocido. Concretamente, la zona meristemâtica y la zona de elongaciôn de la raiz, como ejemplo de sistemas en proliferaciôn y diferenciaciôn. 34 Ob j e t iv o s Objetivos En condiciones de estrés, las microsporas vacuoladas pueden ser desviadas de su desarrollo normal hacia una ruta embriogénica, siendo este un proceso conocido como embriogénesis del polen. La embriogénesis del polen es una herramienta muy util para la investigaciôn genética en cultivos de plantas, puesto que permite la obtenciôn de plantas doble-haploides homocigôticas. La producciôn de plantas doble-haploides es extremadamente util en los Programas de Mejora Genética y permite acortar el periodo de selecciôn y producciôn de nuevas variedades, mediante la obtenciôn de lineas completamente homocigôticas al cabo de tan solo una generaciôn. En la présente Tesis se analizan diferentes aspectos de la fisiologia del proceso de embriogénesis del polen en una planta de interés econômico, el pimiento {Capsicum annuum L. var. Yolo Wonder B). Establecimos los siguientes objetivos especificos: 1. Optimizaciôn del sistema de embriogénesis de polen a partir del cultivo in vitro de anteras de Capsicum annuum L, y la observaciôn de las primeras etapas del proceso. 2. Caracterizaciôn de las reorganizaciones subcelulares a lo largo del desarrollo tras la induce ion de embriogénesis de microsporas en pimiento {Capsicum annuum L). 3. Identifîcaciôn de los cambios de expresiôn y localizaciôn de las proteinas de choque térmico HSP70 y HSP90 durante la inducciôn a embriogénesis haploide. 4. Caracterizaciôn celular de los cambios en los componentes (pectinas esterifïcadas y no esterifïcadas, XG, RGII) y su localizaciôn en la pared celular como marcadores celulares de proliferaciôn y diferenciaciôn durante las rutas gametofïtica, embriogénica del polen, asi como en la embriogénesis cigôtica. 5. Expresiôn y localizaciôn celular de MAPKs durante la embriogénesis derivada de microsporas. 35 Objetivos 6. Estudio de los cambios en la actividad replicativa y en los cuerpos nucleares durante los dos programas de desarrollo que incluyen estos procesos de diferenciaciôn y proliferaciôn: la maduraciôn del polen y la embriogénesis del polen. 7. Anâlisis de la expresiôn in situ de la LOX durante la embriogénesis de microspcras y embriones cigôticos. 36 Ca p it u l o L _____________________________________________________________________ Capitulo I. 1. Optimizaciôn del sistema de embriogénesis de polen a partir del cultivo in vitro de anteras de Capsicum annuum L, y observaciôn de las primeras etapas del proceso 1.1 Introducciôn La embriogénesis es un proceso que puede ser iniciado no solo a partir de una célula huevo fertilizada (cigoto), sino también a partir de células totipotentes, como son las microsporas, con capacidad de ser inducidas en diferentes condiciones. Asi, en condiciones especificas in vitro las microsporas pueden ser inducidas para cambiar su ruta de desarrollo gametofïtica a la ruta embriogénica, dando lugar a embriones a partir de los cuales obtenemos plantas adultas. Durante este proceso, la duplicacion espontanea o inducida del nùmero de cromosomas puede dar lugar a la producciôn de lineas doble-haploides. Este proceso hace posible la obtenciôn de lineas completamente homocigôticas en un periodo de tiempo mâs corto en comparaciôn con métodos tradicionales. Podria ser empleado en la selecciôn de caractères recesivos como por ejemplo las propiedades organolépticas, color del fruto, sabor, forma. Ademâs es util en la investigaciôn de mutaciones, anâlisis genético, transformaciôn genética, y resistencia a patôgenos etc. Este proceso tiene por tanto una gran repercusiôn en el campo de la mejora vegetal y en la biotecnologla (Foster et al., 2007). El cultivo de anteras y de microsporas aisladas es el método mâs efectivo y comùnmente empleado para la producciôn de plantas haploïdes y doble-haploides (Heberle-Bors et al., 1985). La embriogénesis de polen depende en gran medida de las especies empleadas, del genotipo y estado fisiolôgico de las plantas donantes (Mitykô y Fâri et al., 1997; Dunwell et al., 1985; Heberle-Bors et al., 1982, 1984; Kristiansen y Andersen 1993), del pretratamiento aplicado a las anteras o a los botones florales, del estado de desarrollo del polen (Gonzâlez-Melendi et al., 1996), de las condiciones de inducciôn y, finalmente, de la composiciôn del medio de cultivo (Guha y Maheshwari, 1964; Heberle-Bors et al., 1985; Raghavan et al., 1986; Vicente et al., 1991; Custers et al., 1994; Reynolds et al., 1997; Touraev et al., 1997; Guha-Mukherjee et al., 1999; Kumlehn y Lorz, 1999). El método mâs extendido para inducir la embriogénesis de la microspora en especies particularmente difïciles para la generaciôn de plantas es el cultivo de anteras. Este método ha sido empleado en numerosas especies, incluidas plantas para consumo, de interés agronômico, y ârboles como citricos (Germanâ et al., 1991) y el alcomoque (Bueno 37 Capitulo L_____________________________________________ ________________________ et al., 1997). Dentro de la familia Solanaceae, este proceso ha sido utilizado en la patata (Rokka et al., 1996; Teparkum y Veilleux, 1998; Chani et al., 2000; Boluarte-Medina y Veilleux, 2002), tomate (Zamir et al., 1980; Ziv et al., 1984; Shtereva et al., 1998; Zagorska et al., 1998, 2004; Segui-Simarro y Nuez 2007) y pimiento (Sibi et al., 1979; Mitykô et al., 1995, 1999; Dolcet-Sanjuan et al., 1997; Gyulai et al., 2000; Bârâny et al., 2001, 2005), entre otras, con diferente éxito. Capsicum annuum L. es una planta econômicamente importante en horticultura, y se han desarrollado varios protocolos para inducir la embriogénesis de la microspora y la regeneracion de diferentes variedades (Dumas de Vaulx et al., 1981; Mitykô et al., 1995, 1999; Dolcet-Sanjuan et al., 1997; Bârâny et al., 2001; 2005). El conocimiento de los mecanismos capaces de inducir la ruta embriogénica séria de gran ayuda en la optimizaciôn de dichos protocolos de cultivo. En el présente estudio se han evaluado varios factores que influyen en este proceso, con objeto de optimizar el sistema de inducciôn a embriogénesis de polen en Capsicum annuum L. var. Yolo Wonder B. Asi, se ha analizado la correlaciôn entre la secuencia de desarrollo floral y el desarrollo gametofïtico del polen para définir un criterio sencillo de selecciôn de las yemas florales con polen en la etapa de mayor respuesta en esta especie; se han observado asimismo las primeras etapas mediante un estudio microscôpico, caracterizândose las primeras divisiones de las microsporas, la formaciôn de embriones y la obtenciôn de plantas haploïdes o doble-haploides a partir del cultivo in vitro de anteras. 38 _____________________________________________________________________ Capitulo I. 2. Material y Métodos 2.1 Material Se cultivaron semillas de Capsicum annuum L., var. Yolo Wonder B (Ramiro Amedo, S. A., Calahorra, La Rioja) en substrato y las plantas obtenidas se mantuvieron en un incubador (MLR 350H, SANYO) a 25 °C, 80 % de humedad y un periodo de luz de 16 boras. Se seleccionaron botones florales de diferentes tamanos, se extra)eron sus anteras y se utilizaron tanto para el anâlisis del desarrollo gametofïtico normal, como para el cultivo in vitro. 2.2 Cultivo in vitro de anteras Solo se emplearon para los cultivos los botones florales de la primera floraciôn. El estado de desarrollo del polen fue determinado mediante marcado con DAPI en anteras aisladas (Vergne et al., 1987, Gonzâlez-Melendi et al., 1995). Para los cultivos, se seleccionaron anteras provenientes de botones florales con pétalos y sépalos de longitud similar, correspondientes al estado de microspora vacuolada. Se esterilizô la superficie de los botones con un 5 % de hipoclorito sôdico. Se emplearon plaças Pétri de 5 cm de diâmetro, colocândose en cada una 15 anteras en un medio de inducciôn con medio CP (Dumas de Vaulx et al., 1981) suplementado con 0,01 mg/1 de âcido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) y kinetina. Después de 8 dias a 35 °C en oscuridad, los cultivos se sometieron a periodos de 12 horas de luz a 500 pmol fotones/m^s a 25 °C. Después de 12 dias de inducciôn en medio CP, las anteras se colocaron en medio Ri (Dumas de Vaulx et al., 1981) suplementado con 0,1 mg/1 de kinetina. 2.3 Citometria de flujo Para determinar el nivel haploide de las plântulas regeneradas empleamos citometria de flujo (Dolezel et al., 1989). Los nùcleos fueron extraidos de hojas trituradas e introducidas en tampôn de lisis (15 mM Tris, 2 mM NaiEDTA, 80 mM KCl, 20 mM NaCl y 0.1 % Triton X-100, pH 7.5), que fue filtrado mediante una malla de nylon de 30 pm de tamano de poro. El material filtrado fue transferido a tubos Eppendorf de 2 ml y centrifugado a 600 g durante 20 min a 4 °C, y el pelet fue resuspendido en 0.5 ml de buffer Capitulo I. de lisis. La suspension con los nùcleos fue transferida tubos de citometria con 55 pl de soluciôn de yoduro de propidio (1 mg/ml) en PBS con 15 mg/ml de RNasa. Los nùcleos («=10000) de cada muestra fueron medidos en un citômetro de flujo Epics-xl (Coulter). Como control utilizamos una suspension de nùcleos de plantas diploides. 2.4 Crioprocesado de muestras para microscopia ôptico Se fijaron anteras de diferentes etapas del desarrollo gametofïtico y diferentes momentos del desarrollo del cultivo in vitro en formaldehfdo al 4 % (w/v) en PBS, pH 7,3, durante una noche a 4 °C. A continuaciôn fueron lavadas en PBS y deshidratadas empleando una serie de concentraciôn creciente de metanol (30 %, 50 %, 70 % y 100 %), con una bajada progresiva de temperatura de 4 °C a -30 °C. Posteriormente fueron impregnadas con mezclas de metanol/Lowicryl K4M (en una serie 2:1, 1:1 y 1:2) a -30 °C, encapsuladas en résina pura a la misma temperatura y polimerizadas bajo luz UV a -30 °C usando un equipo Leica APS, como se ha descrito en trabajos previos (Testillano et al., 1995). Finalmente se realizaron cortes semifïnos (1 pm) y ultrafinos (100 nm) para el estudio con los microscopios ôptico y electrônico. Los cortes semifïnos fueron asi mismo tehidos con azul de toluidina al 2 % para el anâlisis estructural. Las preparaciones fueron observadas en un microscopio Leitz con objetivos de contraste de fase y campo claro y fotografïadas con una câmara digital Olympus DC 10. 2.5 Determinacion de la etapa de desarrollo del polen Las anteras procedentes de botones florales de diferentes tamafio y distintos tiempo s en cultivo en medio solidô. Se tineron con DAPI (4,6 diamino-2-fenilindol) (Vergne et al 1987) para la identifîcaciôn de los nùcleos. Las muestras se observaron bajo luz ultravioleta en un microscopio ôptico de epifluorescencia equipado con una câmara CCD Leica DF300FX. 40 Capitulo I. 3. Resultados y Discusion 3.1 Selecciôn de las yemas florales Se recogieron diferentes tamanos de yemas florales de Capsicum annuum var. Yolo Wonder B, y establecimos una escala morfologica en relaciôn a la longitud de las mismas, estableciendo cinco grupos. Observamos distintos estados de desarrollo de las anteras y de cantidad de antocianina en las mismas (pigmento de color azul que aparece en las anteras con el desarrollo) (Ver tabla 1). Grupos Longitud de botones florales (mm) Antocianina 1. 3,0-3,9 mm - 2. 4,0-4,9 mm - 3. 5,0-5,5 mm + 4. 5,6-6,0 mm + 4 - 5. 6,1-6,5 mm +++ Tabla 1. Correlaciôn entre la longitud de los botones florales y la cantidad de antocianina observada en la superficie de las anteras El primer grupo incluia yemas florales de 3,0 - 3,9 mm de longitud, que presentaban un tamano de pétalos muy inferior al de los sépalos; en las anteras aisladas no se observé ninguna cantidad de antocianina. El segundo grupo contenia yemas de 4,0 - 4,9 mm de longitud, que presentaban un tamafio de pétalos muy inferior al de los sépalos; en las anteras aisladas tampoco se observé antocianina. El tercer grupo contenia yemas de 5,0 - 5,5 mm de longitud, con el tamafio de los pétalos y sépalos iguales; en las anteras extrafdas observamos ya una pequefia cantidad de antocianina. En el cuarto grupo de yemas de 5,6 - 6,0 mm de longitud, las yemas obtenidas presentaban ya sépalos de menor tamafio que los pétalos; en las anteras observamos mâs cantidad de antocianina que en la etapa anterior. En el quinto grupo de yemas de 6,1 - 6,5 mm de longitud los botones mostraban sépalos de un tamafio muy inferior a los pétalos. En la mayor parte de la superficie de las anteras aisladas observamos la presencia de la antocianina. 41 Capitula I._____________________________________________________________________ A continuaciôn, se extra)eron las microsporas contenidas en el interior de las anteras de los botones florales seleccionados, para identificar y establecer una correlaciôn entre las caracteristicas de las anteras y las diferentes etapas de desarrollo de las microsporas del polen, determinândose sus estadios de desarrollo en relaciôn al nùcleo mediante tinciôn con DAPI, que es método de marcado especifico de ADN (Vergne et al., 1987). Con los resultados obtenidos establecimos una correlaciôn entre la longitud de las yemas florales, el tamano y coloraciôn de la antera, y el estado de desarrollo de la microspora (figura 1). 42 Capitulo L E stado del polenB otones 11 oral es Anteras Figura 1. Correlaciôn establecida entre los cinco grupos de botones florales, con las anteras y el estado de desarrollo mayoritario de las microsporas contenidas en las anteras de Capsicum annuum L. var. Yolo Wonder. Desarrollo gametofïtico: tétrada (a”), microspora joven (b"), microspora vacuolada (c"), bicelular joven (d"), bicelular medio (e"). Fléchas, nùcleo generativo. Barras: a, b, c, d, e: 5 mm; a', b', c', d', e’: 2.5 mm a", b", c", d", e": 20 pm. 43 Capitula I. Se realizô una cuantifîcaciôn del porcentaje de en cada etapa de desarrollo contenidas en cada uno de los grupos seleccionados. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 2. Tetrada B Bicelu lar joven 100 0 M icrospora joven I B icelular m edio BS M icrospora vacuolada a B icelu lar maduro (%) 3 ,0 - 3 ,9 m m 4 , 0 - 4 , 9 m m 5 , 0 - 5 , 5 m m 5 , 6 - 6 , 0 m m 6 , 1 - 6 , 5 m m Longitud de los botones florales Figura 2. Estados de desarrollo (en %), contenidos en cada uno de los grupos de botones florales. En el primer grupo de yemas de 3,0 - 3,9 mm de longitud encontramos un 87 % de tétradas y un 13 % de microspora joven. En la fase de tétrada, las cuatro microsporas jôvenes permanecen juntas envueltas por una cubierta de calosa (figura la") y el nùcleo ocupa una posiciôn central. En el segundo grupo seleccionado, con botones florales de 4,0 - 4,9 mm de longitud, nos encontramos un 84 % de microspora joven y sôlo un 16 % de microspora vacuolada. La microspora joven se observa ya liberada de calosa y con un nùcleo central (figura Ib"). En el tercer grupo, de yemas florales de 5,0 - 5,5 mm de longitud, sépalos y pétalos iguales, nos encontramos que las anteras presentan un 91 % de microspora vacuolada y un 9 % de bicelular joven. La fase de microspora vacuolada (figura le") se caracteriza por la presencia de una gran vacuola ocupando la mayor parte del volumen citoplâsmico, que desplaza al nùcleo a una posiciôn lateral. 44 Capitulo I. En el cuarto grupo, de yemas florales de 5,6 - 6,0 mm de longitud, con un tamano de sépalos inferior al de los pétalos, observamos un 88 % de bicelular joven y un 12 % de bicelular medio. La fase bicelular joven (figura Id") esta formada por dos células: la célula vegetativa de mayor tamano y la célula generativa mâs pequena, e incluida en el citoplasma de la anterior. La observaciôn con DAPI révéla la diferencia en el patron de cromatina de las dos células. En el quinto grupo, de yemas florales de 6,1 - 6,5 mm de longitud, con un tamano de sépalos muy inferior al de pétalos, observamos un 89 % de bicelular medio y un 12 % de bicelular maduro. En la fase de polen bicelular medio (figura le") los pôlenes son completamente redondos, el nùcleo vegetativo permanece en el centro y la célula generativa se empieza a desplazar hacia el centro; en esta fase el nùcleo vegetativo comienza a lobularse. Finalmente, en la fase de polen bicelular maduro, el nùcleo vegetativo se lobula completamente y la célula generativa adquiere una forma fusiforme. Estos resultados permitieron establecer un criterio de selecciôn râpido del estadio de desarrollo del polen en las yemas florales (Gonzâlez-Melendi et al., 2005; Germana y Chiancone et al., 2003; Peixe et al., 2004). Uno de los factores claves para que se lleve a cabo con éxito la embriogénesis es el estadio de desarrollo en el que se encuentran las microsporas en el momento de la inducciôn. Establecimos una correlaciôn entre la longitud del botôn floral, la cantidad de antocianina y el estadio de desarrollo del polen. En la mayoria de las especies estudiadas los estadios ôptimos para inducir embriogénesis son el de microspora vacuolada y el bicelular joven (Raghavan et al., 1986; Smÿkal et al., 2000; Pechan et al., 2001; Germana y Chiancone et al., 2003; Peixe et al., 2004). Estas microsporas son potencialmente embriogénicas y al ser sometidas a estrés, pueden cambiar desarrollo gametofïtico normal hacia una nueva ruta, la embriogénica. 3.2 Evaluacion de las condiciones del cultivo de anteras Para poner a punto el sistema de cultivo de anteras de Capsicum annuum L. var. Yolo Wonder, hemos optimizado protocolos previos existentes (Mitykô et al., 1995) para dicha especie. Los resultados del cultivo de anteras son altamente dependientes de las condiciones de crecimiento, calidad y variedad de la planta donante. 45 Capitula I. Se comprobado que las anteras obtenidas en primavera y en otono son mas embriogénicas que las anteras aisladas en un verano câlido, donde observamos microsporas con un bajo porcentaje de respuesta embriogénica. Varios estudios realizados en comferas demostraron que factures ambientales como temperaturas bajas (Ekberg y Ericsson 1967), altas o una situaciôn de sequia, podrian causar graves irregularidades meiôticas in vivo. En cultivos de Hevea brasiliensis se observé que durante los veranos muy calidos, las anteras tenian microsporas no inducibles, de las que no se podian obtener embriones (Chen et al., 1990). Hemos empleado anteras extrafdas 4 semanas después de la primera floraciôn de las plantas donantes, observando que la utilizaciôn de dichas anteras favorecia la respuesta embriogénica, mientras que las recolectadas fuera de este intervalo producian una menor cantidad de embriones. Se observaron similitudes con otras especies como por ejemplo la cebada, en la que las primeras cinco espigas tienen de un 15 % a un 20 % mas de regeneracion que las espigas mas tardias. Las inflorescencias mas jôvenes ban mostrado una mayor respuesta que las mas maduras. (Powell et al., 1990; Chupeau et al., 1998). Asimismo observamos que las anteras extrafdas entre las 10 y las 11 de la manana tenian una capacidad de respuesta mayor que las extrafdas fuera de este intervalo. Resultados similares ban sido descritos por Cben et al (1991) en arroz. Las anteras de las primeras inflorescencias, recolectadas en dfas soleados y entre las 8 y las 10 de la manana, tienen una capacidad de respuesta mayor que las que provienen de la etapa final de la floraciôn, que las extrafdas en dfas Iluviosos o después de las 10 de la mafiana. Estas diferencias relacionan la viabilidad de las microsporas con el momento de recolectar las anteras (Cben et al., 1991). Comprobamos la importancia para la inducciôn de la densidad de las anteras en las plaças Pétri, encontrando que la densidad de 3 anteras/ml résulté ser la mas éptima esta especie. En cebada, la densidad éptima es 25 anteras/ml de medio (Sunderland et al., 1981). Algunos investigadores consideran que una densidad no muy elevada résulta la mas efectiva para que se produzca la embriogénesis con éxito (Sunderland et al., 1981; Cben et al., 1991; Tsay y Cben 1985) Las anteras fiieron sometidas a un cboque térmico de 35 °C durante 8 dfas en oscuridad como tratamiento de estrés. Después, fueron introducidas en una câmara de cultive a una temperatura de 25 °C, con una intensidad de luz 14.000 lux. Transcurridos 12 dfas desde la puesta en cultive en medio de inducciôn (CP) las plaças fueron transferidas a un medio de crecimiento (RI) suplementado con 0.1 mg/1 de kinetina. Al cabo de un mes 46 Capitula I. fueron transferidas a un nuevo medio de crecimiento (Ri). Los resultados obtenidos, en cuanto a los porcentajes de inducciôn fueron significativamente superiores cuando las anteras se sometieron a un tratamiento de calor de 35 °C durante 8 dias, ya que en périodes de tiempo superiores a echo dias se observa una drâstica disminuciôn de la respuesta embriogénica. Resultados similares a los obtenidos en Capsicum annuum en relaciôn al incremento de respuesta embriogénica después de someter el material vegetal a un tratamiento de calor, ban sido observado en otras especies como Brassica napus (Custer et al., 1994), tabaco (Touraev et al., 1996a), trigo (Touraev et al., 1996b) y Quercus suber (Bueno et al., 1997). 3.3 Ëvoluciôn del cultivo de anteras, formaciôn de embriones y regeneracion de plantas A los 6 dias del inicio del cultivo, las anteras que respondieron a la inducciôn se bincbaron e incrementaron su tamano (figura 3b). Mucbas otras, sin embargo, se oscurecieron y perdieron turgencia. Al cabo de 20 ô 30 dias del inicio del cultivo, surgieron de las anteras que respondieron a la inducciôn unas estructuras blancas alargadas (figura 3c-d). Estas estructuras fueron identificadas como embriones, presentando rai ces y tallos en los ùltimos estadios (figura 3e-f). Estos embriones continuaron desarrollândose en el estado cotiledonar y, finalmente, dieron lugar a pequenas plantas con bojas (figuras 3g). 47 Capitula I. k 0 Figura 3. Cultivo de anteras y regeneracion de plantas haploïdes. La germinaciôn de la antera con el estado adecuado de microspora (a), anteras tras 6 dias de cultivo (b), después de 30 dias se observan los embriones desarrollândose a partir de la anteras (c), embriones mas desarrollados (d) con raices y tallos (e) con hoja (f) enraizamiento. Barras: a-d: 2.5 mm; e-h: 5mm. 48 Capitula I. A continuaciôn, las plântulas obtenidas fueron transferidas a tubos de vidrio (figuras 3h) con medio de regeneracion (V 3) sin hormonas. Segùn iban alcanzando sufïciente desarrollo foliar y radicular, las plantas fueron transplantadas a un ffasco de vidrio de 500 ml que contenla una mezcla de suelo/perlita estéril; este ffasco fue tapado con papel transparente (TPFC) (Fâri et al., 1987) y, con el tiempo, fue retirado. Después de 2 6 3 semanas de proceso de aclimataciôn, las plantas fueron transplantadas a macetas (figuras 5a-b) e introducidas en un invemadero. Al cabo de 2 6 3 semanas mas, se transplantaron a un terreno para recibir el cuidado propio de un cultivo de pimiento. 3.4 Anàlisis celular de la embriogénesis de microsporas en el cultivo de anteras de Capsicum annuum L. Se llevô a cabo un estudio del desarrollo del nùcleo mediante marcado con DAPI, que es una técnica especifica para el marcado de ADN (Vergne et al., 1987), que permitiô observar la progresiôn de los cultivos. En los dos primeros dias de cultivo después del estrés con choque térmico de 35 °C durante 8 dias, las microsporas que estaban en el estadio microspora vacuolada (figura 4a) iniciaron el proceso de division, dando lugar a proembriones de dos células, con dos nùcleos, y con el mismo estado de condensaciôn de cromatina (figura 4b). A partir de 4 dias, se observaron proembriones que contenian 5 o mas nùcleos (figura 4c). Después de dos semanas del cultivo, todavia se observaron proembriones en los que persistia la exina. Con el paso de tiempo, el numéro de divisiones provoca la ruptura de la exina en las zonas de la apertura, dando lugar a embriones multicelulares de mayor tamano y hasta 1 4 - 2 0 nùcleos (figura 4d-e), en los que observan dos tipos celulares en las zonas extema e interna. A partir del momento en que se rompe la exina, los pro-embriones empiezan a proliferar ràpidamente dando lugar a embriones globulares (figura 4f). Alrededor de los 20 - 25 dias, los embriones muestran mayoritariamente una organizaciôn estructural de tipo torpedo (figura 4g), haciéndose mas évidente en esta etapa la distinciôn entre la zona interior y exterior. Los embriones torpedo maduran hasta el estadio denominado cotiledonar (figura 4h), mostrando una anatomia y organizaciôn estructural similar a las de los embriones cigôticos, observada en estudios previos (Yeung et al., 1996, Raghavan et al., 2000). 49 Capitula L CW S • m e - - y . ' • ; - I V . . . . ■ ::l: • • • > . . . , • > , < . • Figura 4. Seguimiento del cultivo de embriogénesis de microsporas de Capsicum annuum L. con tinciôn con DAPI. Microspora vacuolada (a), embriôn bicelular tras la inducciôn (b), proembriôn tricelular (c) rodeado con exina (Ex), proembriôn multicelular sin exina (d-e), embriôn estadio globular (f). Barras: a, b, c, d, e: 10 pm; f: 20 pm; g, h: 50 pm. 50 _____________________________________________________________________Capüulo L Después de 80 dias las plantas regeneradas desarrollaron una anatomia normal, aunque en algunos casos resultaron ser mas pequenas y con menos hojas (figura 5b), y crecieron con menos vigor que las plantas diploides de control (figura 5a). Los procesos de embriogénesis y desarrollo posterior de las plantas han sido estudiados a nivel celular con anterioridad en especies vegetales consideradas tradicionalmente como especies modelo de embriogénesis, taies como trigo (Reynolds et al., 1993; Indiantro et al., 2001), Brassica (Fan y col., 1988, Kott et al., 1988), cebada (Wilson et al., 1978; Sunderland y col 1979, Kasha et al., 2001), maiz (Pesticelli y Petolino 1988), tabaco (Sunderland y Wicks 1971) y otras especies como arroz (Chen y Wu, 1983). Nuestros estudios celulares han permitido caracterizar de igual manera los primeros eventos celulares que se producen después de la inducciôn de la embriogénesis en las microsporas contenidas en las anteras de Capsicum annuum L. var. Yolo Wonder, asi como la progresiôn de este proceso hasta la obtenciôn plantas haploides y doble-haploides. 3.5 Anàlisis de! nivel de ploidia de las plantas regeneradas Se llevô a cabo un estudio para determinar el nivel de ploidia de las plantas regeneradas a partir de cultivos in vitro de anteras de Capsicum annuum L. var. Yolo Wonder B. Para ello, se aislaron nùcleos a partir hojas de las plantas regeneradas, que se tineron con yoduro de propidio y se midieron en un citômetro de fiujo para estimar la cantidad relativa de ADN de cada muestra. La cantidad obtenida de ADN de las plantas regeneradas, analizada mediante citometria de fiujo, determinô que se obtuvieron tanto plantas haploides como doble-haploides, al comparar los valores résultantes con el control diploide obtenido de una planta control (figura 5c). En la figura 5 se pueden observar histogramas con diferentes niveles de ploidia correspondientes a las plantas analizadas. En la figura 5a contiene el histograma correspondiente a una plàntula haploide, y se observa un pico mas alto (2c) en el canal 50 que corresponde a la fase G1 de ciclo celular, y un pico mas pequeno (4c) en el canal 100 correspondiente a las células en la fase G2. El histograma de las plantas doble-haploides (figura 5b) esta formado por un pico mas alto (2c), en el canal 100 que corresponde a la fase G1 de ciclo celular, y un pico mas pequeno (4c) en el canal 200 correspondiente a las células en la fase G2. 51 Capitula L N 1023o C antidad relativa de ADN a N 1023 o C antidad relativa de ADN m PJ 1Ô23 C antidad relativa de ADN Figura 5. Anàlisis de las plantas regeneradas con citometria de fiujo. La grâfica con citometria de fiujo que muestra la cantidad relativa de DNA después de la tinciôn con yoduro de propidio de una poblaciôn de nùcleos de hojas. (a) Plântulas haploides regeneradas a partir de cultivo in vitro de anteras (G1 el pico fue establecido en el canal 100). (b) Plântula doble-haploide regenerada a partir del cultivo in vitro de anteras (G1 el pico fue establecido en el canal 200). (c) Control diploide. El eje x représenta el registro de la absorciôn de yoduro de propidio mientras que el eje y représenta el numéro de nùcleos. 52 Capüulo I. 4. Conclusiones Mediante la observaciôn de las caracteristicas morfolôgicas (tamano, cantidad de antocianina etc) y la longitud de la yema floral, pudimos determinar un criterio de selecciôn del material ôptimo. Establecimos una correlaciôn entre el estado morfolôgico de las anteras y las diferentes etapas de desarrollo del polen en Capsicum annuum L. definidas del nùcleo mediante tinciôn con DAPI. La fase de microspora vacuolada, fue el mas adecuado para la inducciôn de embriogénesis. Se han determinado diversas condiciones del cultivo: el momento, estaciôn y floraciôn para la extracciôn de anteras, la densidad de las anteras, la temperatura y duraciôn del tratamiento de estrés. Se han observado las primeras etapas mediante un estudio micro y microscôpico, que ha permitido la visualizaciôn de las primeras divisiones de las microsporas, la formaciôn de embriones y la obtenciôn de plantas a partir del cultivo in vitro de anteras de Capsicum annuum L. var. Yolo Wonder. Se han aclimatado con éxito las plantas regeneradas a partir de los embriones obtenidos, y se han analizado mediante citometria de fiujo, con el resultado de plantas haploides y doble-haploides, originadas a partir de microsporas/polen. 53 CapUulo /■_____________________________________________________________________ 5. Bibliografia Bârâny L, Gonzâlez-Melendi P., Fadôn B., Mitykô J., Risueno M.C. Testillano P. (2005), Microspore-derived embryogenesis in pepper {Capsicum annuum L.): subcellular rearrangements through development. Biol. Cell. 709-22. Bârâny I., Testillano P., Mitykô J., Risueno M.C. (2001). 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Los estudios în situ son muy convenientes para una comprensiôn profunda de la embriogénesis de microsporas; un proceso en el cual coexiste una variedad de poblaciones de células (inducidas y no inducidas) que se desarrollan de forma asincrônica e independiente. Resultados: En este trabajo se han investigado las reorganizaciones subcelulares definidas en la embriogénesis de microsporas del pimiento, que es un cultivo hortfcola de especial interés econômico, en relaciôn a los eventos de proliferaciôn y diferenciaciôn. Las plantas haploides de Capsicum annuum L. var. Yolo Wonder B han sido regeneradas a partir de cultivos in vitro de anteras mediante un tratamiento de choque térmico a 35 °C durante 8 dfas. La morfogénesis de los embriones derivados de microsporas ha sido analizada a mediante el microscopio ôptico y electrônico, usando muestras bien conservadas y procesadas a bajas temperaturas. La comparaciôn con la ruta normal gametofïtica revelô cambios en la organizaciôn de la célula después de la inducciôn a la embriogénesis y permitiô la caracterizaciôn de la secuencia temporal de una serie de eventos estructurales no identificados previamente en el pimiento, relacionados con la actividad proliferativa y la diferenciaciôn. Estos cambios afectan principalmente a los plastidios, el compartimento vacuolar, la pared celular y el nùcleo. Los procesos de diferenciaciôn posteriores fueron idénticos a los que tendrfan lugar en el desarrollo cigôtico. Conclusiones: Los cambios observados pueden ser considerados marcadores celulares de la embriogénesis de microsporas. Esto ha permitido aumentar el conocimiento de los mecanismos que controlan el cambio de ruta de desarrollo y la progresiôn de la 59 CapUulo II. Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005) embriogénesis, lo que podria ayudar a mejorar la eficiencia del método, asi como orientar estrategias de cultivo, especialmente de aquellas plantas de interés econômico. 1. Introducciôn Las microsporas pueden cambiar su ruta de desarrollo normal gametofitico in vitro hacia a la ruta embriogénica. Este proceso, conocido como embriogénesis de microsporas, représenta una herramienta importante en la producciôn de plantas, puesto que permite la generaciôn de lineas isogénicas asi como nuevas variedades mediante plantas doble- haploides (Chupeau et al., 1998). La embriogénesis derivada de microsporas depende en gran medida de la especie empleada, el genotipo, el estado fisiolôgico de las plantas donantes, las condiciones de inducciôn, la composiciôn del medio de cultivo y el estado de desarrollo de las anteras (Guha y Maheshwari 1964; Guha-Mukherjee et al., 1999; Heberle-Bors et al., 1985; Raghavan et al., 1986; Reynolds et al., 1997; Vicente et al., 1991; Custer et al., 1994, Kuhmlen y Lorz, 1999, Touraev et al., 1997). El método mas comùnmente empleado es el cultivo de anteras, sobretodo en aquellas especies que son especialmente récalcitrantes. Este método ha sido aplicado en muchas especies, incluidos cultivos y especies arbôreas (Bueno et al., 1997; Germanà et al., 1991). En la familia Solanaceae, este proceso ha sido aplicado en patata (Teparkum y Veilleux 1998, Rokka et al., 1996, Chani et al., 2000, Boluarte-Medina y Veilleux 2002), en tomate (Zagorska et al., 1998, 2004, Shtereva et al., 1998, Ziv et al., 1984, Zamir et al., 1980) y pimiento (Gyulai et al., 2000, Dolcet-Sanjuan et al., 1997, Sibi et al., 1979, Mitykô et al., 1995, Bârâny et al., 2001), entre otras especies, con diferente éxito. Capsicum annuum L., es un cultivo econômicamente interesante y se han descrito varios protocolos para la inducciôn a la embriogénesis de microsporas y las regeneraciôn de plantas, para diferentes variedades del mismo (Dumas de Vaulx et al., 1981, Mitykô et al., 1995, Dolcet-Sanjuan et al., 1997, Bârâny et al., 2001). Se han llevado a cabo estudios bâsicos, principalmente en sistemas modelo como colza, tabaco y cebada (Chupeau et al., 1998); sin embargo, los estudios sobre otros cultivos econômicamente interesantes son muy limitados y la secuencia de eventos no se conoce en profundidad. Comparàndolos con los anàlisis moleculares, los estudios in situ proporcionan datos sobre la organizaciôn estructural y la expresiôn y localizaciôn subcelular de objetivos moleculares en células individuales, con caracteristicas 60 Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005) CapUulo II. estructurales definidas que proporcionan informacion sobre su estado de desarrollo. Los estudios celulares son muy adecuados para una compresion profunda de la embriogénesis de microsporas, un proceso en el cual coexiste una variedad de poblaciones de células (inducidas y no inducidas) que se desarrollan de forma asincrônica e independiente. Los eventos celulares que tienen lugar en las primeras etapas inmediatamente posteriores a la inducciôn a la embriogénesis proporcionan informaciôn fundamental para ampliar el conocimiento de los mecanismos que controlan el cambio a la ruta embriogénica y la progresiôn de la misma, que podria ayudar a mejorar la eficiencia del método, asi como orientar la estrategia de cultivo, especialmente de aquellas plantas de interés econômico. La investigaciôn de los marcadores celulares y moleculares durante las primeras etapas de la embriogénesis ha sido enfocada a la observaciôn de los procesos fisiolôgico s involucrados en la inducciôn, la identificaciôn de las células que siguen el nuevo programa de desarrollo y el correcto desarrollo de embriones y plantas. No obstante, los estudios celulares sobre la secuencia de eventos estructurales en la embriogénesis de microsporas no son muy numerosos y, en cualquier caso, centrados ffecuentemente en sistemas modelo (Binarova et al., 1993, Hause y Hause 1996, Reynolds et al., 1997). En estudios recientes se han descrito cambios celulares asociados a las primeras etapas del proceso y su relaciôn con el desarrollo posterior de la célula (Coronado et al., 2002, Ramirez et al., 2004, Testillano et al., 2005). El desarrollo de los plastidios y la acumulaciôn de almidôn constituye una caracteristica diferencial en muchas especies durante la formaciôn del polen (Franchi et al., 1996), asi como en etapas determinadas de la embriogénesis cigôtica (Raghavan et al., 2000). Se ha observado en dichos estudios una acumulaciôn no uniforme de almidôn que puede estar asociada a una organizaciôn polar, la diferenciaciôn de la célula y su destino final (Indrianto et al., 2001, Testillano et al., 2000, Raghavan et al., 2000). Los escasos estudios previos realizados, han descrito algunas de las caracteristicas celulares de la embriogénesis de microsporas en Capsicum annuum (Gonzâlez-Melendi et al., 1995, 1996, Testillano et al., 1995, Bârâny et al., 2001, Kim et al., 2004), pero todavia no se ha llevado a cabo una caracterizaciôn ultraestructural detallada de la secuencia de eventos de las estructuras derivadas de microsporas, hasta el présenté estudio. En este trabajo, se han analizado las reorganizaciones celulares en el desarrollo temprano de la embriogénesis de microsporas de Capsicum annuum en comparaciôn con el desarrollo gametofitico normal, con especial atenciôn sobre los cambios que afectan al nùcleo, la 61 Capîtulo II. Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005) pared celular, los plastidios (almidôn) y las vacuolas. En este estudio, se han aplicado los protocolos previos para cultivos in vitro de Capsicum (Dumas de Vaulx et al., 1981), modificados con posterioridad por Mitykô et al., (1995) para inducir el proceso. La caracterizaciôn celular de la progresiôn de la embriogénesis haploide ha sido observada con el microscopio ôptico y el electrônico, usando muestras bien conservadas y procesadas a bajas temperaturas. Los resultados revelaron la apariciôn de reorganizaciones subcelulares determinadas y permitieron la caracterizaciôn de la secuencia de etapas de desarrollo. Los cambios observados pueden ser considerados como marcadores del proceso de embriogénesis, y estân relacionados con los eventos de proliferaciôn y diferenciaciôn. 62 Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005) Capitulo II. 2. Material y Métodos 2.1 Material Se cultivaron, en substrate, semillas de Capsicum annuum L., var. Yolo Wonder B (Ramiro Amedo, S. A., Calahorra, La Rioja), y las plantas se crecieron en un incubador (MLR 35OH, SANYO) a 25 °C, 80 % de humedad y un periodo de luz de 16 boras. Se seleccionaron botones florales de diferentes tamanos y sus anteras fueron extrajeron y utilizaron para el anàlisis del desarrollo gametofitico normal y para el cultivo in vitro. También se separaron algunos ovulos de las flores abiertas para el estudio al microscopio de los embriones cigôticos. 2.2 Cultivo in vitro de anteras Para los cultivos solamente se emplearon los botones florales de la primera floraciôn. El estado de desarrollo del polen se determinô mediante marcado con DAPI en anteras aisladas (Vergne et al., 1987, Gonzâlez-Melendi et al., 1995). Para los cultivos, se seleccionaron anteras con puntas coloreadas de azul provenientes de botones con pétalos y sépalos de longitud similar, correspondientes al estado de microspora vacuolada. Se esterilizô la superficie de los botones con un 5 % de hipoclorito sôdico. Se emplearon plaças Pétri de 5 cm de diâmetro, se colocaron en cada una 15 anteras en un medio de inducciôn con medio CP (Dumas de Vaulx et al., 1981) suplementado con 0,01 mg/1 de âcido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y kinetina. Después de 8 dias a 35 °C en oscuridad, los cultivos se sometieron a periodos de 12 de luz a 500 pmol fotones/m^s a 25 °C. Después de 12 dias de inducciôn en medio CP, las anteras se colocaron en medio RI (Dumas de Vaulx et al., 1981) suplementado con 0,1 mg/1 de kinetina. 2.3 Citometria de fiujo Para determinar el nivel haploide de las plântulas regeneradas se empleô la citometria de fiujo (Dolezel et al., 1989). Los nùcleos se extrajeron de hojas machacadas e introducidas en tampôn de lisis (15 mM Tris, 2 mM Na2EDTA, 80 mM KCl, 20 mM NaCl y 0.1 % Triton X-100, pH 7.5), que se filtrô mediante una malla de nylon de 30 pm de tamano de poro. El material filtrado se transfiriô a tubos Eppendorf de 2 ml y centrifugô a 63 Capitulo II. Biology o f the Cell 97. 709-722 (2005) 600 g durante 20 min a 4 °C, y el pelet se resuspendio en 0.5 ml de tampon de lisis. La suspension con los nùcleos se transfiriô a tubos de citometria con 55 pi de soluciôn de yoduro de propidio (1 mg/ml) en PBS con 15 mg/ml de RNasa. Los nùcleos («=10000) de cada muestra se midieron en un citômetro de fiujo Epics-xl (Coulter). Como control se utilizô una suspensiôn de nùcleos de plantas diploides. 2.4 Crioprocesado de muestras y microscopia electronica Las anteras obtenidas en diferentes etapas de su desarrollo a lo largo de la gametogénesis, en diferentes momentos del cultivo y de los embriones macroscôpicos que fueron sumergidos durante una noche a 4 °C, se fîjaron en una soluciôn de 4 % de formaldehido en tampôn fosfato salino (PBS), pH 7,3. A continuaciôn fueron se lavaron en PBS y deshidrataron empleando una serie metanol a concentraciones crecientes (30 %, 50 %, 70 % y 100 %), con una bajada progresiva de temperatura de 40 °C a -30 °C. Posteriormente se impregnaron con mezclas de metanol/Lowicryl K4M (en una serie 2:1, 1:1 y 1:2) a -30 °C, se encapsularon en résina pura a la misma temperatura, y se polimerizaron bajo luz de UV a -30 °C en un equipo Leica APS, como se ha descrito en trabajos previos (Testillano et al., 1995). Finalmente se realizaron cortes semifmos (1 pm) y ultrafinos (100 nm) para el estudio con microscopio ôptico y electrônico. Los cortes semifmos se tineron con azul de toluidina al 1% para el anàlisis estructural. Los cortes ultrafinos se tifieron con 5 % acetato de uranilo y 1 % de citrato de plomo, y a continuaciôn, se observaron en el microscopio JEOL 1010 a 80 kV. 2.5 Tinciones citoquimicas El almidôn se detectô mediante marcado con yodo/yoduro potâsico (I2KI) (O'Brien y McCully 1981) en cortes semifînos observados al M O. en campo claro. Se empleô el marcado DAPI en cortes semifînos para DNA (Testillano et al., 1995) y se observaron con luz UV en el microscopio epifluorescente. 64 ___________________ Biology o f the Cell 97. 709-722 (2005)_________________Capitulo II. 3. Resultados 3.1 Proceso de embriogénesis mediante cultivos de anteras Para poder identificar y seleccionar el material para iniciar el cultivo, se efectuaron anàlisis iniciales mediante tinciôn con DAPI sobre aplastados de anteras. Las anteras de los botones florales con pétalos y sépalos de longitud similar (Figura la) resultaron ser las de mayor respuesta a la inducciôn. Estas anteras contenian fimdamentalmente microsporas vacuoladas (Figure 3a-3d). Después de 6 dias en cultivo, las anteras que respondieron a la inducciôn se bincbaron y aumentaron su tamano hasta 1.5 ± 0.2 veces (figura Ib). El resto de las anteras se oscurecieron y perdieron turgencia. 20 ô 30 dias mas tarde, surgieron de algunas anteras mas estructuras blancas y alargadas (flgura le), que fueron identificadas como embriones y que mostraron raices y brotes en etapas posteriores (figura Id). Estos embriones pasaron a la etapa cotiledonal (figura le) y finalmente dieron lugar a plântulas verdes con hojas (figuras If, g). Después de 80 dias, las plantas regeneradas desarrollaron una anatomia normal, aunque en algunos casos fueron mas pequenas, con menos hojas y crecieron con menos vigor que las diploides de control (figura Ih). 65 Capitulo IL Bfo/ogy Ce//. 97. 709-722 (200.^ LiJ Vf & Figura 1. Cultivo de anteras y regeneracion de plantas haploides. a: antera al inicio del cultivo; b: antera después de 6 dias de cultivo; c, d: Embriones surgiendo de las anteras después de 30 dias de cultivo, con raices (c) y tallos (d); e, f, g: Plântulas con cotiledones (e) y hojas (f, g) mantenidas en medio de cultivo; (h) planta haploide regenerada de una antera con 80 dias (izquierda) y planta diploide de control de la misma edad (derecha). Barras en a - d: 2. 5 mm; en e - h: 5 mm. 66 Biology o f the Cell 97. 709-722 (2005) Capitulo II. Se realize un ensayo para determinar que las plantas obtenidas proceden de las microsporas y no de la pared de la antera. El anàlisis con citometria de flujo se realize a partir de nùcleos tenidos con yoduro de propidio, obtenidos a partir de hojas de las plantas regeneradas. Se obtuvieron tanto plantas haploides como doble-haploides (figura 2a), como se observa al comparar con un perfil diploide de control (figura 2c). El perfil diploide muestra dos picos (DNA ratio 1:2), y, en todos los casos, el pico mas grande corresponde a G1 y el mas pequefio a G2. Cuando el material de las plantas haploide y diploide se mezclo y se midiô (figura 2d), aparecieron dos picos G l, que correspondian a los valores 1C y 2C. Las pequenas plantas regeneradas (figura Ih, izquierda) mostraron siempre un perfil haploide (figura 2a). tn I I ■s 2 I Z Cantidad relativa de ADNC 0 I •§ o Cantidad relativa de ADN 2 I Z Cantidad relativa de ADN v> I •§ i I Z 3 Cantidad relativa de ADN Figura 2. Anàlisis con citometria de fiujo. La grâfica con citometria de flujo que muestra la cantidad relativa de DNA después de la tinciôn con yoduro de propidio de una poblaciôn de nùcleos de hojas. (a) Plântulas haploides regeneradas a partir de cultivo in vitro de anteras (Gl el pico fue establecido en el canal 100). (b) Plântula doble-haploide regenerada a partir del cultivo in vitro de anteras (Gl el pico fue establecido en el canal 200). (c) Control diploide. Cuando el material de las plantas haploide y diploide se mezclô y se midiô (d), aparecieron dos picos Gl, que correspondian a los valores 1C y 2C. El eje x représenta el registro de la absorciôn de yoduro de propidio mientras que el eje y représenta el numéro de nùcleos. 67 Capîtulo IL____________Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005)_________________________ 3.2 Desarrollo gametofitico normal Se analizo la organizaciôn celular durante el desarrollo normal gametofitico para compararlo con el de la embriogénesis in vitro. Se extrajeron anteras de tamafios crecientes y se analizaron al microscopio ôptico y al electrônico. Las microsporas vacuoladas mostraron una gran vacuola que empujaba al nùcleo hacia la periferia de la célula (figuras 3a, 3b). En esta etapa no se detectô almidôn mediante marcado del yodo/yoduro potâsico (LKl) (figura 3c). A nivel ultraestructural (figura 3d) los nùcleos mostraron un patrôn de cromatina descondensada, abundantes estructuras fibrilo-granulares intercromatfnicas y grandes nucleolos con abundante componente granular, la tipica organizaciôn de un nùcleo con alta actividad transcripcional. El citoplasma formaba una capa fma por debajo de la intina (figure 3d). Después de la primera mitosis, se formô el grano de polen bicelular (figuras 3e-3h), constituido por dos células: la generativa y la vegetativa. La célula generativa de menor tamaflo prôxima a la exina y al nùcleo vegetativo, el cual estaba rodeado de grandes vacuolas todavia présentés (figuras 3e, 3h). El marcado con DAPI revelô diferentes intensidades de fluorescencia en los nùcleos regenerativo y generativo (figura 3f) correspondientes a diferentes grados de condensaciôn de cromatina en los mismos. El nùcleo generativo mostrô cromatina condensada y nucleolos compactos, mientras que el vegetativo mostrô una cromatina descondensada (figuras 3f, 3h). Durante la maduraciôn del polen, las vacuolas grandes se reabsorbieron en la fase de polen bicelular medio (figuras 3i-31), y el citoplasma mostrô numerosos plastidios con almidôn (figuras 3i, 3k), abundantes orgânulos, reticulo endoplâsmico rugoso y una gran poblaciôn ribosômica (figura 31). Se observô que la célula generativa estaba separada de la intina y localizada en el centro del grano de polen (figuras 3j, 31). Los granos de polen maduro mostraron un citoplasma muy denso y una gran acumulaciôn de almidôn (figuras 3m-3p); la célula generativa y su nùcleo mostraron una forma largada con cromatina altamente condensada (figuras 3n, 3p). En esta etapa del desarrollo gametofitico, no se observaron diferencias significativas ni el la estructura ni en el espesor de la pared celular, excepto la formaciôn de estructuras especificas debajo de las aperturas. 68 Biology o f the Cell 97. 709-722 (2005) Capltulo II. \ $ Ex'** Figura 3. Désarroilo normal gametofitico como control de la ruta embriogénica. a-d: microspora vacuolada, e-h: polen bicelular joven, i-1: polen bicelular medio, m-p: polen maduro. Cortes semifinos observados con contraste de fase (a, e, i, m), fluorescencia despues del marcado con DAPI para AON (b, f, j, n, fléchas: nucleos generativos) y en campo claro despues del marcado con IIK para almidon (c, g, k, o). d, h, 1, p: Imagen de microscopio electronico mostrando las principales caracterfsticas ultraestructurales de las diferentes etapas de desarrollo. Ex: exina, V: vacuola, N: nucleo, Nu: nucleolo, Chr: cromatina condensada, Ct: citoplasma, GN: nucleo generativo, VN: nucleo vegetativo, S: almidon. Barras: imagen microscopio optico: 10 pm, y en electronico: 1 pm. 69 Capltulo IL Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005) 3.3 Cambios morfologicos y caracterizacion de las etapas secuenciales de desarrollo durante la embriogénesis de microsporas Los cortes semifinos de anteras al inicio del cultivo mostraron microsporas con ima gran vacuola citoplasmica y un nucleo desplazado hacia la exina: es el estado de microspora vacuolada (figura 4a). Despues del tratamiento de induccion, algunas de las microsporas se dividieron dando lugar a dos células iguales en tamafio y caracterfsticas estructurales, con una pared celular separandolas y un citoplasma poco denso con vacuolas (figura 4b); no se observaron estructuras bicelulares con células asimétricas en las condiciones de cultivo empleadas. En etapas posteriores del cultivo in vitro^ las estructuras bicelulares proliferaron y dieron lugar a estructuras multicelulares con pequenas células que tenian un citoplasma denso, confinadas dentro de la pared del polen (figura 4c). Tras la rotura de la exina (Figure 4d) se liberaron masas embriogénicas redondeadas o proembriones. En etapas posteriores, los proembriones mostraron células con forma poligonal y altamente vacuoladas, con el nucleo en una posicion central (figura 4e). La ausencia de almidon se comprobo por la falta de senal con tincion de yodo/yoduro potasico (LKI) (Figura 4h). Mas tarde se observaron cambios morfologicos en los embriones, relacionados probablemente con el inicio de la diferenciacion. Se pudo observar, en estos proembriones tardfos sin exina, una incipiente organizacion en capas con dos zonas de tipos celulares morfologicamente diferentes. El area mas interna contenia pequenas células densas con pequenas vacuolas (figura 4f), mientras que en la zona exterior se observaron células mas grandes con grandes vacuolas (figura 4f). Se observé una acumulaciôn de almidon de baja intensidad en las células del area exterior (figura 4i). A medida que avanzô la embriogénesis, se observaron estructuras mayores y mas redondeadas, similares a embriones globulares (figura 4g). Los diferentes tipos de células se volvieron mas évidentes y se encontre un patron de capas interiores y exteriores, bien definidas. Se observé una mayor acumulacién de almidén en las capas exteriores de los embriones globulares que en las células extemas de los proembriones (comparar figuras 4j y 4i, respectivamente). En etapas de desarrollo posteriores, los embriones perdieron su forma redondeada y se alargaron en determinadas areas (figura 4k), dando lugar a embriones con forma de corazén. 70 Biology o f the Cell 97. 709-722 (2005) Capltulo II. \ SIS Figura 4. Primeras etapas de embriogénesis derivada de microsporas. Contraste de fase (a-g, k- I) y citoqufmica del almidon en campo claro (h-j). Costes semifinos observados al microscopio optico. a: Microsporas vacuolas en las anteras en el momento de iniciar el cultivo; b: embriones bicelulares, mostrando células idénticas separadas por una pared; c: Proembriones multicelulares rodeados por exina (Ex); d: Proembriones multicelulares liberados cuando la exina (Ex) se rompe (fléchas); e - j: Progrès ion de proembriones multicelulares a embriones globulares observada con contraste de fase (e - g) y campo claro después de tincion con LKI para revelar el almidon (h - j). k: Embriones derivados de microsporas con forma de corazôn mostrando una protodermis perimetral. 1-m: Imâgenes de gran aumento mostrando la protodermis de embriones derivados de microsporas (1) y cigôticos (m). Barras: 10 pm. 7Ï Capitule II.____________Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005)________________________ En la etapa globular y etapas posteriores, se observaron en el area exterior pequenas células isodiamétricas alineadas y organizadas en capas. La capa mas perimetral de células mostrô una morfologia similar a ima protodermis (figura 41), semejante a la de los embriones cigôticos (figura 4m). En la etapa torpedo (figura 5) se pudieron reconocer diferentes tejidos: una epidermis (fléchas en la figura 5a), el primordium del cotiledôn (recuadro b) y parénquima (recuadros c y d). Se encontrô una distribuciôn diferente del almidon en estos tejidos. Las células del parénquima muestran acumulaciôn de almidôn (figuras 5b, 5c y 5d), mientras que no hay senal de LKI en la epidermis (figuras 5b y 5c) ni en el primordium cotiledonal (figura 5b). La presencia de almidôn en la células de la punta de la rafz (figura 5d) fue revelada asimismo mediante ensayo citoquimico. 72 Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005) Capitula II. fr » »3# % ' f \ * / ' X ' , ?.» , . T . "... # # . ' ; 4 $ Figura 5. Embrion derivado de microspora en etapa torpedo. Cortes semifinos observados al microscopio optico bajo contraste de fase (a) y campo claro con marcado LKI para reveler almidon (b - d). a: Se pueden reconocer en esta etapa diferentes tejidos: la epidermis (flecha), el primordium del cotiledôn (cuadrado b) y el parénquima (recuadros c y d). El marcado LKI revelô acumulaciôn de almidôn principalmente en las células de parénquima (b y c) y no en el primordium del cotiledôn (ârea central en b). Se puede observar también una acumulaciôn de almidôn en las células del âpice de los meristemos de la raiz (d). Barras: 10 pm. 73 Capltulo II. Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005) 3.4 Caracterfsticas ultraestructurales de la embriogénesis temprana derivada de microsporas Para poder identificar las caracterfsticas ultraestructurales especfficas de la ruta embriogénica derivada de microsporas respecto al programa gametofitico, se llevo a cabo el analisis con microscopio electronico en determinadas etapas de desarrollo: estructuras bicelulares, estructuras multicelulares con exina, proembriones y embriones globulares. La microspora vacuolada mostrô al inicio del cultivo la ultraestructura tfpica de la ruta gametofitica (figura 6a). En respuesta al tratamiento de inducciôn, se dividiô en dos nùcleos similares (figura 6b) que se dispusieron en una localizaciôn periférica prôxima a la exina y entre sf. Al compararla con la de la ruta gametofitica, la célula generativa résultante después de la mitosis de la microspora, es pequeûa y esta adherida a la exina; mientras que la vegetativa es grande, y con el nùcleo mas centrado y localizado entre la pared de la célula generativa y la vacuola (figura 3e). Estas diferencias sugieren un cambio en el piano de la divisiôn esporofïtica, ambos nùcleos embriogénicos mostraron una organizaciôn nuclear similar (figura 6b); en el desarrollo normal gametofitico ocurre al contrario, y los nùcleos vegetativo y generativo muestraron un patrôn diferente (figuras 3f, 3h) que refleja sus actividades, el destino final de la célula y la progresiôn del ciclo celular son diferentes. Los nùcleos de las estructuras bicelulares mostraron un patrôn similar de condensaciôn de cromatina (figura 6b), con pequenas manchas de cromatina condensada en la periferia del nùcleo, similares al de la microspora. La gran vacuola citoplasmica que ocupa casi todo el volumen de la microspora, empieza a ser reabsorbida después de la divisiôn, y todavfa son visibles algunas vacuolas pequefias (figura 6b). Una vez que la microspora ha sido inducida a la embriogénesis y la primera divisiôn ha tenido lugar, produciendo dos células iguales, comienza la proliferaciôn celular dando lugar a estructuras multicelulares. Estas estructuras multicelulares, confinadas todavfa dentro de la pared del polen (figura 6c), mostraron paredes celulares reflejando series secuenciales de divisiôn Todas las células mostraron una organizaciôn ultraestructural similar, con un nùcleo :on cromatina descondensada, nucleolos activos y citoplasma denso, ricas en orgânulos y vacuolas de diferentes tamafios. En esta etapa embriogénica, se observé una pared celular debajo de la intina gruesa y diferenciada, en comparaciôn con la correspondiente a granos madurados siguiendo una ruta normal. 74 Biology o f the Cell 97. 709-722 (2005) Capltulo II. *É# F ig u ra 6. Ultraestructura de una embriogénesis de microspora. a) Microspora vacuolada con el nùcleo (N) en la periferia y una gran vacuola (V). b) Proembrion bicelular, résultante de una division simétrica de la microspora, con 2 nùcleos (N) mostrando un patron similar, c) proembrion multicelular dentro de la exina y una pared celular gruesa (*) desarrollandose debajo del mismo. Nu: nucleolo, Chr: cromatina condensada, flecha: cuerpo nuclear, Ct: citoplasma, V: vacuola, Pc: pared celular. Ex: exina. Barras: 1 pm. 75 Capltulo IL Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005) En los proembriones tardfos sin exina (figura 7a) se distinguieron, dos tipos diferentes de células (figuras 7a-7c). Las células de la parte interior son pequenas, con paredes finas recién formadas, numerosas vacuolas pequefias, nùcleos con masas de cromatina condensada y nucleolos relativamente activos, a menudo mas de uno por célula (figura 7b). En las capas exteriores, las células son de mayor tamafio, con paredes celulares gruesas y bien diferenciadas, grandes vacuolas, plastidios con almidôn, un patrôn de cromatina descondensada y nucleolos muy activos (figura 7c). En los embriones globulares (figura 7d), se observaron diferencias similares entre los tipos de células junto con algunas caracterfsticas especfficas de esta etapa. Las células interiores mostraron un citoplasma denso, con pocas y pequefias vacuolas y un nùcleo grande (figura 7e), organizaciôn semejante a la de una célula activa en proliferaciôn. Una caracterfstica especffica encontrada en esta etapa fue la gran cantidad de amiloplastos de gran tamafio que contenfan las células de las capas perimetrales, con numerosos granos de almidôn dentro de los plastidios, grandes vacuolas y pequenos nùcleos (figura 7f). 76 Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005) Capltulo II. Proembriôn Célula/îtt teriores N V Células exteriores Pc N Nu * Ct Nu Çélulas interiores f N u >' N Pc Ct Embri<^#^bular # ; d V ... Nu Células exteriores Pc Ct s% Figura 7. Ultraestructura de proembriones derivados de microsporas (a-c) y embriones globulares (d-f). a, d: Estructura general de los proembriones (a) y los embriones globulares (d) al microscopio optico. b, c, e, f: Caracterfsticas ultraestructurales reveladas al microscopio electronico de las células interiores (b) y exteriores (c) del proembrion, y de las células interiores (e) y exteriores (f) del embrion globular. Se observaron grandes vacuolas (V) y grânulos de almidon (S) en grandes amiloplastos en las células exteriores de los embriones globulares. Ct: citoplasma, N: nùcleo. Nu: nucleolo, Cw: pared celular. Barras en a, d: 20 pm; b, c, e, f: 1 pm. 77 Capltulo II.____________Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005)________________________ 4. Discusion 4.1 Los cultives de anteras sometidas a cheque térmice regeneran plantas haploïdes y censtituyen un sistema adecuade para los estudios celulares sobre el proceso de embriogénesis Los primeros estudios sobre la producciôn de plantas haploïdes de pimiento mediante el cultivo in vitro de anteras datan de 1979 (Sibi et al., 1979). En este trabajo, hemos regenerado plantas haploïdes de Capsicum annuum a partir de cultives in vitro de anteras de una nueva variedad, Yolo Wonder B. Se ha demostrado que el choque térmico a 35 °C durante 8 dias es muy adecuado como tratamiento inductive en diverses genotipos de pimiento, con ranges de respuesta de las anteras similares a los obtenidos con otros tipos de pimiento poco eficientes (Mitykô et al., 1995). Este tratamiento inductive en pimiento es mas largo que el choque térmico empleado para inducir la embriogénesis derivada de microsporas en otras especies (Custers et al., 1994). Se consiguiô el enraizamiento y la aclimataciôn, aunque las plantas haploïdes crecieron menos vigorosamente que las plantas diploides de control. El estudio de los cambios celulares relacionados con la embriogénesis del polen en cultives de anteras de Capsicum constituye una tarea difïcil debido a la baja eflciencia de la induccion. Los embriones que surgieron de las anteras se consideraron como una senal de una respuesta positiva al tratamiento de inducciôn, alrededor de 20 6 30 dias después del inicio del cultivo. La asincronia de la embriogénesis en los cultives de anteras (Bueno et al., 2000, Ramirez et al., 2004) représenté una ventaja para los estudios celulares puesto que permitiô la identificaciôn de las etapas secuenciales de desarrollo en secciones consecutivas a lo largo de anteras individuales, haciendo posible la caracterizacion de los eventos tempranos y de los eventos posteriores en el desarrollo. El estudio de los marcadores celulares de la embriogénesis del polen y el posterior desarrollo se realizô mediante la fijaciôn y el procesado a baja temperatura de anteras con embriones emergentes, en diferentes momentos del cultivo, lo que permitiô una buena preservaciôn ultraestructural de las anteras y de las estructuras embriogénicas. 78 _Biology o f the Cell 97. 709-722 (2005)____________________________________ Capltulo II. 4.2 Marcadores celulares de la ruta esporofitica La identificaciôn de marcadores diferenciales tempranos entre las rutas gametofitica y embriogénica pueden ser usados para définir los procesos que son activados o reprimidos cuando la microspora cambia su programa de desarrollo en respuesta a un tratamiento de estrés (Testillano et al., 2000, Ramirez et al., 2004, Segui et al., 2003, 2005). La apariciôn de determinados cambios celulares en etapas de desarrollo concretas esta relacionado con la activaciôn de la proliferaciôn y el comienzo de la diferenciaciôn (Coronado et al., 2002, Ramirez et al., 2004, Segui et al., 2005). El anâlisis descrito en este trabajo permitiô observar reorganizaciones en compartimentes subcelulares, como los amiloplastos, vacuolas, pared celular y nùcleo. 4.3 Distribuciôn de almidôn No se observé acumulaciôn de almidôn en los proembriones jôvenes durante los eventos tempranos de la embriogénesis derivada de microsporas de C. annuum. No se encontrô ninguna acumulaciôn de almidôn ni durante la inducciôn mediante ayuno, como se observé en tabaco (Vicente et al., 1991), ni mediante choque térmico, como ocurriô en la colza (Testillano et al., 2001, Segui et al., 2003), o el pimiento (este trabajo). De esta manera, la falta de almidôn no es una consecuencia de la falta de sacarosa. La acumulaciôn de almidôn temprana en proembriones de microsporas todavfa rodeados por la exina se ha descrito ùnicamente en algunos trabajos sobre cereales (Indrianto et al., 2001, Testillano et al., 2002) y se ha sugerido que es una caracterfstica especffica de la especies monocotiledonales. La acumulaciôn de almidôn podrfa estar asociada a la diferenciaciôn, mientras en las etapas tempranas de la embriogénesis derivada de microsporas, podrfa estar relacionada con la entrada en diferenciaciôn. 4.4 Depôsitos en vacuolas Los depôsitos electrôn densos en vacuolas se consideran marcadores de la embriogénesis del polen en algunas especies (Sangwan y Camefort 1983). No obstante, en Capsicum annuum, no se encontrô ninguna evidencia que apoye esta hipôtesis. En estas especies no se han encontrado depôsitos densos después de la fijaciôn con glutaraldehfdo. 79 Capltulo II.____________Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005)________________________ ni en los proembriones jôvenes ni durante la formaciôn y maduraciôn del polen (Fadôn et al., 1993; Gonzâlez-Melendi et al., 1995). 4.5 Divisiôn simétrica en células inducidas Esta comùnmente aceptado que la primera evidencia morfolôgica de la ruta embriogénica es la divisiôn simétrica de la microspora, en contraste con la divisiôn asimétrica que tiene lugar durante el desarrollo normal gametofitico (Zaki y Dickinson 1991, Hause y Hause 1996). En el pimiento, se han observado diferentes patrones de divisiôn al inicio del la embriogénesis derivada de microspora, incluyendo divisiones asimétricas (Kim et al., 2004). Estas rutas embriogénicas se observaron después de diferentes tratamientos de inducciôn y condiciones de cultivo y fueron el resultado de la respuesta del nùcleo vegetativo o el generativo del polen bicelular (Kim et al., 2004). Se han observado diferentes patrones de divisiôn también en cultivos de microsporas aisladas en pimiento (Gonzâlez-Melendi et al., 1995, 1996). Por otro lado, la microspora vacuolada ha sido la etapa de mayor respuesta, no sôlo en pimiento (Gonzâlez-Melendi et al., 1995), sino también en muchas otras especies (Bueno et al., 2000, Testillano et al., 2002, Pechan et al., 1991). El anâlisis ultraestructural y celular realizado en este trabajo mostrô que en los cultivos de anteras iniciados con microspora vacuolada, tiene lugar una divisiôn simétrica. Se observaron otros patrones de divisiôn pero no se demostrado con éxito el progreso embriogénico posterior. 4.6 Citocinesis y la diferenciaciôn de la pared celular Los embriones multicelulares, todavfa rodeados de exina, mostraron células sin pared y con paredes celulares de diferentes espesores reflejando diferentes series de divisiones. El desarrollo de una pared celular gruesa debajo de la exina en los proembriones multicelulares constituye una caracterfstica especffica y diferencial de esta etapa temprana de desarrollo, que ha sido observada también en otros sistemas (Gonzâlez- Melendi et al., 1995, 1996, Ramfrez et al., 2001, 2004). Son necesarias nuevas investigaciones para determinar los componentes de esta pared gruesa. Durante los procesos de desarrollo, la estructura y componentes de las paredes celulares cambian (Catoire et al., 1998); se han encontrado en las paredes celulares muchos marcadores de embriogénesis somâticas y de organogénesis (Fortes et al., 2002, Fry et al., 1993). El 80 Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005) Capltulo II. desarrollo de esta pared gruesa en esta etapa determinada de la embriogénesis derivada de microsporas podria estar relacionada con el inicio de los subsecuentes eventos de diferenciacion, los cuales solo tienen lugar después de la rotura de esta pared. 4.7 Subcompartimentos nucleares El nùcleo es muy dinâmico y la arquitectura de sus dominios funcionales (cromatina condensada, region intercromatinica y nucleolo) cambia en respuesta a la actividad nuclear (Raska et al., 1995, Dundr y Mistelli 2001, Risueno y Medina 1986). En el polen bicelular, los nùcleos vegetativo y generativo son diferentes, dimorfismo que refleja diferentes actividades celulares, destino final de la célula y progresiôn del ciclo celular en ambas células (Gonzâlez-Melendi et al., 2000, McCormick et al., 1993). El estudio ultraestructural llevado a cabo en este trabajo muestra que en pimiento, como en otras especies, en el metabolismo activo de la célula vegetativa se refleja una cromatina dispersa y un nucleolo activo; mientras, el nùcleo generativo muestra caracterfsticas de una actividad transcripcional baja como masa de cromatina condensada y un nucleolo compacto. En contraste, los dos nùcleos résultantes de la divisiôn simétrica mostraron un patrôn de cromatina similar, con pequenas masas de cromatina condensada en la periferia del nùcleo (Testillano et al., 2000, 2005). La arquitectura del nucleolo puede ser usada también como marcador de su actividad (Risueùo et al., 1988). Inmediatamente después de la divisiôn simétrica los nucleolos se compactan indicando la actividad transcripcional que tiene lugar en la fase G1 (Risuefio et al., 1982; Risueflo y Medina 1986). La remodelaciôn de la organizaciôn fùncional de los dominios nucleares ha sido observada como un evento importante que ocurre en el cambio de las células en diferenciaciôn hacia la proliferaciôn (Testillano et al., 2005). Los proembriones multicelulares jôvenes mostraron nùcleos con patrones de cromatina dispersa, nucleolos activos y un citoplasma denso con pequenas vacuolas. Se han observado caracterfsticas ultraestructurales similares en células en proliferaciôn (Risueflo y Moreno Dfaz de la Espina 1979; Risuefio et al., 1982). La expresiôn diferencial de MAP kinasas con un papel en la proliferaciôn y diferenciaciôn ha sido observada en etapas consecutivas durante la embriogénesis derivada de microsporas de colza (Seguf et al., 2005) y tabaco (Coronado et al., 2002). Una vez que los embriones han sido liberados 81 Capltulo IL____________Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005)_________________________ de la exina, los dos tipos diferentes de células en las capas exteriores e interiores indican el inicio de la diferenciacion de la célula. 4.8 El desarrollo posterior de los embriones derivados de microsporas es semejante al de la embriogénesis cigotica El patron de desarrollo estructural de los embriones derivados de microsporas no se conoce con profundidad. Aparte de la colza, la comparaciôn con la formaciôn del embriôn cigôtico se ha descrito en muy pocos trabajos (Yeung et al., 1996). Los resultados observados en pimiento mostraron que la proliferaciôn inicial y la formaciôn de estructuras multicelulares y proembriones no parece seguir un patrôn regular y defînido de divisiones, como ocurre en la embriogénesis cigôtica (Raghavan et al., 2000). En etapas posteriores de desarrollo, la diferenciaciôn de una protodermis en los embriones globulares y el posterior desarrollo como embriones con forma corazôn y torpedo es semejante a los principales eventos en la formaciôn del embriôn cigôtico. Asi mismo la organizaciôn de los meristemos de la raiz y la presencia de almidôn en las células de la punta de la raiz son similares en los embriones cigôticos y embriogénicos. Trabajos posteriores, todavfa en curso, ayudarân a définir de forma mas précisa los patrones de diferenciaciôn seguidos por embriones derivados de microsporas y su comparaciôn con la ruta cigôtica. Esto sugiere que las estructuras proliferativas résultantes de la inducciôn son caracterfsticas del proceso de embriogénesis. En resumen, la caracterizaciôn celular del la embriogénesis del polen en Capsicum annuum L., mostraron reorganizaciones subcelulares que afectan en etapas especfficas del desarrollo al nùcleo, al depôsito de almidôn, a las vacuolas y a la pared celular. Acompaùan a los eventos de proliferaciôn y diferenciaciôn y pueden ser considerados como posibles marcadores para la observaciôn de las etapas tempranas de la embriogénesis derivada de microsporas. Este conocimiento puede ayudar a futuras estrategias para la mejora de la eficiencia de este proceso y su uso en la transformaciôn y germinaciôn mediante plantas doble-haploides aplicado en cultivos hortfcolas de interés econômico. 82 Biology o f the Cell. 97. 709-722 (2005) Capltulo II. 5. Bibliografia Bârâny I., Testillano P.S., Mitykô J., Risueno M.C. (2001) The switch of the microspore developmental programme in Capsicum involves HSP70 expression and leads to the production of haploid plants. Int. J. Dev. Biol. 45, S39-S40. 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Introducciôn El cambio del programa de desarrollo gametofitico hacia la embriogénesis para dar lugar a una planta haploïde représenta una herramienta importante en el cultivo de plantas para obtener lineas isogénicas y nuevas varicdades mediante plantas doble- haploides. Este proceso puede ser inducido en cultivos in vitro de microsporas mediante tratamientos de estrés, como ayuno o choque térmico. La embriogénesis derivada de microsporas constituye también un sistema in vitro interesante para estudios bâsicos sobre los mecanismos celulares y molcculares que controlan el desarrollo de la planta, el destino final de la célula, la respuesta a estés y en la transducciôn de senales. Este proceso ha sido inducido en muchas especies de plantas pero se conoce poco sobre los mecanismos y factores involucrados en este cambio de programa de desarrollo. En este trabajo se han llevado a cabo varios métodos ultraestructurales in situ para caraeterizar los cambios en la organizaciôn subcelular y en la localizaciôn de las proteinas de estrés, especificamente la HSP70, durante la inducciôn y la embriogénesis temprana derivada de microsporas. 2. Resultados y Discusiôn La embriogénesis derivada de microsporas ha sido inducida en Capsicum annuum L. (Gonzâlez-Melendi et al., 1996) usando un tratamiento de choque térmico a 35 °C (Bârâny et al., 2001) y un medio de cultivo rico con citoquininas (Mitykô et al., 1995). La seleeeiôn de la etapa de desarrollo de la microspora idônea para iniciar el cultivo es un elemento clave puesto que sôlo unas pocas etapas responden a la embriogénesis, siendo la etapa de microspora vacuolada (figura la) una de las mâs eficientes (Gonzâlez-Melendi et al., 1996). Después del tratamiento de inducciôn algunas microsporas fueron inducidas e iniciaron una ruta embriogénica con una sucesiôn de numerosas mitosis que dieron lugar a estructuras molcculares (figuras Ib, le). 20-30 dias después de la inducciôn se pudieron observar pequenos embriones globulares y torpedo blancos, que posteriormente desarrollaron raices, brotes y dos cotiledones verdes y, finalmente, regeneraron pequenas plântulas haploïdes (figura Id). 89 Capltulo III.______ InternationalJournal o f Developmental Biology 45 (SI): S39-S40 (2001)_____ Para el estudio al microscopio, se crioincluyeron en Lowicryl K4M mue stras de diferentes etapas del cultivo in vitro. Este crioprocesado permitiô una buena preservaciôn ultraestructural y mantuvo la reactividad antigénica de las muestras para los ensayos inmunocitoquimicos (figuras If-li) (Testillano et al., 1995). Después de la inducciôn a la embriogénesis, la microspora experimentô numerosas mitosis sugiriendo estructuras multicelulares, todavfa rodeadas por la pared celular, la exina (figura Ib, le). En estos proembriones se observaron algimas caracterfsticas especfficas; la capa interior de la microspora experimentô un importante incremento de espesor, el citoplasma de las pequenas contenfa grandes vacuolas y numerosos vesfculos y orgânulos, y las paredes que separaban las células mostraron un espesor homogéneo y una forma ondulada (Figura le). Después de la ruptura de la exina, el proembriôn aumentô su actividad proliferativa formando masas redondeadas multicelulares (figuras le, Id). La organizaciôn ultraestructural fue bastante diferente en esta etapa de la embriogénesis derivada de microspora, apareciendo pequenas células poligonales separadas por paredes rectas y delgadas, con grandes nùcleos y citoplasmas densos con abundantes ribosomas, mitoeondrias, numerosos plastidios y pequenas vacuolas (figura le). Los nùcleos mostraron pequefias masas de cromatina condesada (figura le) y nucleolos con abundante componente granular; es decir, la tfpica organizaciôn nuclear de células en proliferaciôn activa. Se comprobô que las protefnas de heat-shock estân involucradas en la embriogénesis derivada de microsporas de Brassica, en la cual el tratamiento inductivo es un tratamiento térmico râpido (Cordewener et al., 1995). Se estudio la inmunolocalizaciôn de estas protefnas en la embriogénesis de microsporas de Brassica (Testillano et al., 2000, 2001). Para evaluar el papel del HSP70 en Capsicum, en el cual es necesario aplicar un tratamiento choque térmico mucho mâs largo, se llevô a cabo un estudio con el marcado con oro coloidal de la protefna. Se observaron diferencias en la presencia y distribuciôn subcelular de la protefna al comienzo del cultivo (figura Ig) y un dfa después de la aplicaciôn del tratamiento inductivo (figura Ih). El marcado con oro fue muy escaso en las microsporas al comienzo, con unas pocas partfeulas de oro observadas en el nùcleo y en el citoplasma (figura 1 g), probablemente localizando la forma constitutiva de la protefna. Un dfa después del tratamiento de estrés, la intensidad de marcado de HSP70 aumentô, numerosas partfeulas de oro localizadas en regiones diversas del citoplasma y del nùcleo, especialmente en la regiôn intercromatinica (figura Ih). Estos resultados sugieren que la 90 International Journal o f Developmental Biology 45 (SI): S39-S40 (2001) Capltulo III. reprogramacion de la microspora hacia la embriogénesis implica la induccion de expresiôn de HSP70 un dfa después del inicio del cultivo; la respuesta de la célula al tratamiento térmico probablemente en combinaciôn con otros factores es necesaria para el cambio a la embriogénesis en Capsicum. / : % % J . V t ' m y- CT IR CT y % . "% ' ' ^ !? '■ . - f ÿ %•' g t-" : h . I ' ». « IR a A . . ; ^ Figura 1. Embriogénesis de microspora en Capsicum, (a-d) Diferentes etapas del cultivo de la embriogénesis desde el inicio (a) hasta la regeneraciôn de la planta haploide (d). a: microspora vacuolada b: estructura multicelular rodeada de exina c, proembriôn multicelular, d. Plântula haploide. e, f: ultraestructura de los proembriones multicelulares antes (e) y después (f) de la ruptura de exina. g, h: inmunomarcado con oro con HSP70 en microsporas antes (g) y un dfa después (h) de la aplicaciôn del tratamiento inductivo. N, nùcleo; CT, citoplasma; V, vacuola; W, pared celular; EX, exina. IR, regiôn intercromatinica; CHR, cromatina condensada. Barras en a, b: 10 pm; c: 20 pm; d: 10 mm; e, f: 2 pm; g, h: 0.2 pm. 91 Capitula III.______ InternationalJournal of Developmental Biology 45 (SI): S39-S40 (2001) 3. Bibliografia Bârâny L, Testillano P. S., Mityko J., Risuefio. M.C. (2001). Haploid plant production from stress-induced microspore embryogenesis in Capsicum annuum L: Submitted. Cordewener JHG., Hause G., Gorgen E., Busink R., Hause B., Dons HJM., Van Lammeren AAM., Van Lookeren-Campagne MM., and Pechan P. (1995). Changes in synthesis and localization of the 70 kDa class of heat shock proteins accompany the induction of embryogenesis in Brassica napus L. 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El tratamiento inductor, cuando se aplica en la etapa de microspora vacuolada (Gonzâlez- Melendi et a l, 1995) provoca que la célula abandone su desarrollo normal gametofïtico hacia una nueva ruta esporofïtica. Este método ya se ha aplicado en muchas otras especies como Brassica napus (Chuong y Beversdorf 1985, Lichter et a l, 1982), tabaco (Touraev et a l, 1996 a,b) y cebada (Hoekstra el a l, 1992) entre otras, en las que es necesario un tratamiento térmico, para la inhibiciôn del desarrollo gametofïtico y la inducciôn hacia la ruta esporofïtica altemativa. S in embargo, en otros sistemas se ha observado que las microsporas cultivadas in vitro a una temperatura de 18 °C no experimentaron el cambio en la ruta de desarrollo gametofïtico a la embriogénesis (Custers et a l, 1994). Se estudiaron los efectos del tratamiento térmico en microsporas de Capsicum annuum puesto que el conocimiento de dichos efectos résulta muy util para entender los mecanismos celulares que provocan el abandono de la ruta de desarrollo gametofltica. Existen estudios previos sobre en el anâlisis de las respuestas moleculares a la situaciôn de estrés provocada por este tratamiento, en especies como en Brassica napus (Cordewener et a l, 1995, 2000; Custers et a l, 1994; Pechan et a l, 1991; Segul et a l, 2003), o tabaco (Coronado et a l, 2002; Testillano et a l, 2001). S in embargo, hay pocos estudios celulares que hayan tratado de localizar in situ las moléculas relacionadas con el choque térmico durante la inducciôn a la embriogénesis de microsporas de Capsicum annuum; tan sôlo un estudio preliminar realizado previamente en nuestro grupo de investigaciôn (Bârâny et a l, 2001). HSP70 es una protelna muy conservada a evolutivamente (Boorstein et a l, 1994), que estâ présente en las células procariotas y eucariotas. La exposiciôn de la planta a condiciones medioambientales de estrés provoca una respuesta celular tlpica, caracterizada 93 CapUulo IV._______________________________________________________________________ por una rapida y efïmera sintesis de las protemas de choque térmico: HSPs (Lindquist et al., 1986; Morimoto et al., 1997; Vierling et al., 1991). Las HSPs de alto peso molecular, pertenecientes a las familias HSPllO, HSP90 y HSP70, altamente conservadas, a nivel de secuencia, dentro del reino vegetal. Sin embargo, se caracterizan por presentar una elevada diversidad molecular, incluyendo miembros con diferentes localizaciones intracelulares y funciones celulares aparentemente diversas o solapadas (Lingquist et al., 1986; Vierling et al., 1991). Las HSP70s son un grupo multifunctional de proteinas que actùan como chaperonas moleculares (Sung et al., 2001). La expresiôn de los genes de HSP70 esta directamente relacionada con la adquisiciôn de tolerancia térmica, mientras que su sobreexpresiôn estâ asociada a la mejora de la misma (Nollen et al., 1999; Sung y Guy 2003). Junto a la regulaciôn del desarrollo, la mayoria de los miembros de esta familia se inducen fuertemente en respuesta a un aumento râpido de la temperatura (Sung et al., 2001a). En algunas especies, se ha descrito su presencia en cultivos embriogénicos de microsporas, y que su expresiôn aumenta tras la inducciôn (Cordewener et al., 1995; Testillano et al., 2000); pero todavia no hay datos sobre Capsicum annuum, excepto en trabajos preliminares realizados en nuestro grupo (Bârâny et al., 2001). La familia HSP90 incluye un grupo de chaperonas moleculares abundantes altamente conservadas y con e structuras semej antes, que son esenciales para la viabilidad de la célula eucariôtica (Lindquist et al., 1986; Jakob y Buchner, 1994). Los genes de HSP90 se han aislado a partir de diferentes especies vegetales como Arabidopsis thaliana (Krishna y Gloor 2001), Brassica napus (Krishna et al., 1995), maiz (Marrs et al., 1993) y tomate (Koning et al., 1992). En Arabidopsis se describieron 7 isoformas de HSP90, 4 de las cuales fueron localizadas en el citoplasma, mientras que las otras residian en los cloroplastos, en la mitocondria o en el reticulo endoplasmâtico (Krishna y Gloor 2001). Tanto en las células vegetales como en las animales, la mayoria de las isoformas de HSP90 se expresan constitutivamente, pero su expresiôn aumenta en respuesta al estrés, iniciando las HSP90s su actividad como chaperonas con la ayuda de otros chaperonas como la HSP70, las co-chaperonas y las inmunofilinas. Los compuestos chaperonas basados en el HSP90 desempenan un papel importante en el incremento de nuevas proteinas sintetizadas y en la estabilizaciôn de sus conformaciones originales (Jakob et al., 1995). Numerosos estudios, realizados fundamentalmente en células animales, han demostrado que la HSP90 es diferente de otras chaperonas moleculares en el aspecto de que la mayoria de sus 94 Capüulo IV. protemas “cliente” son componentes de las rutas de transducciôn de senales como las protemas Kinasas, ademâs de factores de trascripciôn como proteinas reguladoras de los ciclos de vida y de muerte de la célula (Aligue et al., 1994). A pesar de que su papel en la respuesta de muchas eucariotas al choque térmico ha sido estudiado con profundidad, hasta la fecha no hay datos de la expresiôn y la localizaciôn de HSP90 en Capsicum annuum; ùnicamente se conocen algunos datos en especies como Brassica napus en diferentes tipos celulares (Krishna et al., 1997; Park et al., 1998), y en microsporas y su posible papel en la embriogénesis haploide inducida con choque térmico (Segui et al., 2003). En este trabajo se ha estudiado la expresiôn y localizaciôn in situ de las dos proteinas HSP70 y HSP90 mediante Western Blot, inmunofluorescencia e inmunomarcado con oro, analizando los cambios en relaciôn con el proceso de embriogénesis durante las primeras etapas de la inducciôn a la misma, y en el inicio del desarrollo embriogénico haploide. 95 Capüulo IV._______________________________________________________________________ 2. Material y Métodos 2.1 Material Se cultivaron semillas de Capsicum annuum L., var. Yolo Wonder B (Ramiro Amedo, S. A., Calahorra, La Rioja) en substrato, y las plantas obtenidas se mantuvieron en incubador (MLR 350H, SANYO) a 25 °C, 80 % de humedad y con un periodo de luz de 16 horas. Se seleccionaron botones florales de diferentes tamanos, y sus anteras fueron extraldas y utilizadas tanto para el anâlisis del desarrollo gametofïtico normal, como para el cultivo in vitro. 2.2 Cultivo in vitro de anteras Para los cultivos se emplearon los botones florales de la primera floraciôn. El estado de desarrollo del polen se déterminé mediante marcado con DAPI en anteras aisladas (Vergne et al., 1987, Gonzâlez-Melendi et al., 1995). Para los cultivos, se seleccionaron anteras con puntas coloreadas de azul provenientes de botones florales con pétalos y sépalos de longitud similar, correspondientes al estado de microspora vacuolada. Se esterilizô la superficie de los botones con un 5 % de hipoclorito sôdico. Se emplearon plaças Pétri de 5 cm de diâmetro y en cada una se colocaron 15 anteras en un medio de inducciôn con medio CP (Dumas de Vaulx et al., 1981), suplementado con 0,01 mg/1 de âcido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y kinetina. Después de 8 dias a 35 °C en oscuridad, los cultivos fueron sometidos a periodo s de 12 horas de luz a 500 pmol fotones/m^s a 25 °C. Después de 12 dias de inducciôn en medio CP, las anteras se colocaron en medio Ri (Dumas de Vaulx et al., 1981) suplementado con 0,1 mg/1 de kinetina. 2.3 Anticuerpos En este estudio se emplearon el anticuerpo monoclonal de ratôn anti-HSP70 (StressGen, Victoria, Canada) y el anticuerpo monoclonal de rata anti-HSP90 (StressGen, Victoria, Canada). 96 Capitula IV. 2.4 Electroforesis, Western Blot e inmunodetecciôn de protemas Los cultivos de anteras se sumergieron en nitrôgeno liquido y se homogenizaron en un mortero enfriado con “cracking buffer” (20 mM Tris HCl, pH 8 , 2 % SDS, 1 % B- mercaptoethanol, 1 mM PMSF), se hirvieron durante 3 minutos y centrifugaron durante 15 minutos; los sobrenadantes se centrifugaron très veces. Las proteinas totales fueron medidas mediante la proteina método de Bradford (Merck's Bioquant). Para cada experimento se tomaron las mismas cantidades de proteinas y se separaron en SDS-PAGE a 12 % a 80 V, usando el miniprotean III de BioRad (Hércules, CA, EE. UU). A continuaciôn, las proteinas se transfîrieron a una membrana nitrocelulosa (PVDF; Millipore, Bedford, MA, EE. UU) durante 1 hora y se bloquearon durante una noche en tampon de bloqueo (2 % leche desnatada + 0.05 % Tween 20 en TBS) a 4 °C. Como control de la transferencia, se tinô una tira de la membrana con amido black para visualizar la cantidad de proteina total. Las membranas se incubaron durante 2 horas, bien con el anticuerpo anti- HSP70, o bien con anti-HSP90 en una diluciôn de 1:1000 en tampon de bloqueo en temperatura ambiente. Después se lavaron cada una très veces durante 10 minutos en soluciôn de lavado (0.2 % leche desnatada + 0.5 % Tween 20 en TBS). A continuaciôn, la membrana se incubô durante 2 horas también al temperatura ambiente con anti-ratôn (para anti-HSP70) o con anti-rata (para anti-HSP90) conjugada con fosfatasa alcalina, en una diluciôn de 1 : 1 0 0 0 de soluciôn de bloqueo, posteriormente se lavaron très veces con soluciôn de lavado y las proteinas se visualizaron mediante incubaciôn con una mezcla de azul de nitrotetrazolio (NTB, Sigma) y bromocloroindolil fosfato, (BCIP, Sigma) en un tampôn apropiado (NaHCOs 100 mM, NaCOg 50 mM, MgCb 6 H2O 4 mM). Por ultimo, se dejô secar la membrana y se digitalizô para su posterior procesado. Los contrôles se realizaron con el anticuerpo primario o con el secundario. 2.5 Crioprocesado de muestras y obtenciôn de criocortes Se fijaron anteras de diferentes etapas del desarrollo gametofïtico y en diferentes momentos del cultivo in vitro en formaldehido al 4 % (w/v) en PBS, pH 7,3, y se mantuvieron durante toda una noche a 4 °C. A continuaciôn, se lavaron en PBS durante 10 minutos, 3 veces. Por ultimo, fueron lavadas en PBS y crioprotegidas en progresivas concentraciones crecientes de sacarosa: 0.1 M (1 h), 1 M (3 h), y 2.3 M toda la noche. Las muestras crioprotegidas se colocaron en una barrita de aluminio y se criofïjaron en propano 97 CapUulo IV._______________________________________________________________________ liquido utilizando una unidad KF80 (Reichert, Viena) a -170 °C. Los criocortes semifinos (l|im ) se obtuvieron con el ultratomo de Ultracut E (Reichert) acoplado con la unidad FC4 para estabilizar a -75 °C. Los cortes obtenidos se colocaron sobre portaobjetos multipocillo (ICN, Costa Mesa, CA, USA). 2.6 Inmunofluorescencia La inmunofluorescencia se realizo sobre criocortes semifinos (1 pm). Los portaobjetos que contenian las muestras se lavaron en PBS para eliminar la sacarosa. Las muestras se bloquearon con PCS al 10 % (suero bovino fetal) en PBS durante 10 minutos. Los anticuerpos primarios se depositaron como gotas sobre cada una de las muestras, diluidos (1:10 para anti-HSP70; 1:25 para anti-HSP90) en FCS 5 % en PBS, e incubados durante 1 hora, a temperatura ambiente. A continuaciôn, se lavaron très veces durante 5 minutos en PBS. Los anticuerpos secundarios (el anti-ratôn conjugado con Alexa 546 para anti-HSP70, y el anti-rata conjugado con Alexa 488 para anti-HSP90, Eugene, OR, EE. UU) se diluyeron a 1:25 en FCS 5 % en PBS y se incubaron durante 45 minutos en oscuridad, a temperatura ambiente. Después se lavaron très veces en PBS y dH2 0 . A continuaciôn, las muestras se tineron con DAPI (4,6-diamidine-2-phenylindol; Serva, Heidelberg, Alemania) durante 5 minutos. Después se lavaron très veces en PBS y très en dH2 0 , luego se contrastaron con DAPI, se montaron con Mowiol (Polysciences, Eppelheim, Germany) y se observaron al scanner confocal Bio-Rad MRC-1000 montado en un microscopic Zeiss Axiovert 135. Los contrôles se realizaron sustituyendo el primer anticuerpo por PBS. 2.7 Crioprocesado de muestras para microscopia electrônica Las anteras obtenidas en diferentes etapas del desarrollo gametofïtico y en diferentes momentos del cultivo in vitro, se fijaron en formaldehido al 4 % (w/v) en PBS pH 7,3 durante una noche a 4 °C. A continuaciôn se lavaron en PBS y se deshidrataron empleando concentraciôn creciente en metanol (30 %, 50 %, 70 % y 100 %), con una bajada progresiva de temperatura de 40 °C a -30 °C. Posteriormente se impregnaron con mezclas de metanol/Lowicryl K4M (en una serie 2:1, 1:1 y 1:2) a -30 °C y se encapsularon en résina pura a la misma temperatura y polimerizaron bajo la luz UV a -30 °C usando un equipo Leica AFS, como se ha descrito en trabajos previos (Testillano et al., 1995). 98 CapUulo IV. Finalmente se realizaron cortes semifinos (1 pm) y ultrafinos (100 nm) para el estudio con microscopio ôptico y electrônico. Los cortes semifinos se tifieron con azul de toluidina al 1 % para el anâlisis estructural. Las preparaciones fueron observadas en un microscopio Leitz con objetivos de contraste de fase y campo claro y fotografiadas con una câmara digital Olympus DC 10. 2.8 Inmunomarcado con oro coloidal para microscopia electrônica La inmunolocalizaciôn se llevô a cabo sobre cortes ultrafinos de Lowicryl K4M como se ha descrito en estudios previos (Risueno y Testillano, 1994; Testillano et al., 1993). Las rejillas de niquel cubiertas por Formvar y carbon portando los cortes ultrafinos de Lowicryl se pusieron a flotar en gotas de ddH2 0 , PBS y BSA al 5 % (suero de albùmina bovina) en PBS durante 5 minutos para bloquearlas. Después, se incubaron con los anticuerpos diluidos en 1 % BSA (1:10 para anti-HSP70; 1:25 para anti-HSP90) durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuaciôn, se lavaron en PBS. Para revelar los anticuerpos primarios las rej illas se incubaron con los anticuerpos secundarios (anti-ratôn para anti-HSP70 y anti-rata para anti-HSP90) conjugados con oro coloidal de 10 nm (Biocell, Cardiff, el Reino Unido) diluido a 1:25 en 1 % de BSA, y a continuaciôn se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente y lavaron en PBS y ddH2 0 . Finalmente se secaron y se tineron con acetato de uranilo al 5 % durante 20 minutos y con citrato de plomo durante 5 segundos. Las muestras se observaron en un microscopio electrônico de transmisiôn JEOL 1010 a 80 kV. 2.9 Anâlisis cuantitativo del inmunomarcado con oro La densidad del marcado con oro, expresada como el numéro de particulas de oro por pm^, se determinô en el nùcleo y en el citoplasma contando el numéro de particulas de oro en cada compartimente de la célula. Las âreas se estimaron usando una rej ilia cuadrada de 15 X 15 mm. El tamano minimo de la muestra (MSS) se determinô empleando una técnica de media progresiva. Todos los anâlisis cuantitativos se llevaron a cabo usando el program a BASIC desarrollado por el Dr. J. Renau-Piqueras, y los resultados se representaron en histogramas. La importancia estadistica de las diferencias entre los valores medios se determinô mediante el test de Student, considerando que eran significativas a partir de P > 0.001. 99 CapUulo IV. 3. Resultados 3.1 ‘̂Immunoblotting” Con los estudios de “immunoblotting” pretendimos revelar la especifîcidad del anticuerpo en nuestro material y ademâs, detectar posibles cambios en la presencia de la proteina antes y después del tratamiento inductor de embriogénesis. Se utilizaron extractos de proteinas totales obtenidas de microsporas recién aisladas que se encontraban en la fase de microspora vacuolada, puesto que ésta es la fase mâs adecuada para la inducciôn embriogénica. Se utilizaron microsporas recién aisladas no inducidas y cultivos inducidos a 35 °C. Mediante inmunoblotting no se detectô presencia de la proteina HSP70 en microsporas no inducidas (figura 1), lo cual sugiere que hay un nivel muy bajo de HSP70 constitutive, probablemente por debajo del umbral de sensibilidad del método. S in embargo, en las mismas condiciones se observô la presencia de una banda de 90 kD correspondiente a la proteina HSP90. En la microspora inducida, se detectô la presencia de las proteinas HSP70 y HSP90 con fuertes senales, de aproximadamente 70 y 90 kDa respectivamente (figura 1); mayores por tanto, que la observada en microsporas no inducidas. Dichas senales representan un importante incremento en ambas expresiones de HSPs después del tratamiento de inducciôn. No se encontraron senales en los ensayos control en los que no se usaron los anticuerpos primario o secundario. 100 CapUulo IV. 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 107 kD c;> 76kO O HSP70 107 kD 70kD c;> HSP90 C 3 52kD c;> 36.8 kD c;> 27 kD 19 kD 52 kD 36.8 kD cp. 27 kD 19kD ^ Figura 1. Inmunoblot anti-HSP70 y anti-HSP90. 1. Marcadores de peso molecular. 2. Microsporas vacuoladas no tratadas. Protemas totales; tinciôn con amido black. 3. Microsporas vacuoladas no tratadas: no se observô ninguna banda detecciôn de anti-HSP70; detecciôn de anti-HSP90 se observô una banda 4. Microsporas vacuoladas 1 dia después del choque térmico, protemas totales; tinciôn con amido black. 5. Microsporas vacuoladas 1 dia después del choque térmico: detecciôn de anti-HSP70 y anti-HSP90. Se observô una ùnica banda de gran intensidad de peso molecular 70 kD y una 90 kD. 3.2 Inmunofluorecencia con anticuerpos anti-HSP70 y con anti-HSP90 Para el estudio de localizaciôn de HSPs, se observô previamente la organizaciôn celular de las etapas principales del cultivo embriogénico. En el momento de la puesta en cultivo, las microsporas vacuoladas mostraban una gran vacuola que desplazaba al nùcleo hacia la periferia de la célula (figura 2a). Durante el desarrollo gametofïtico normal, la microspora vacuolada se divide asimétricamente, y da lugar al polen bicelular, que contiene la célula generativa englobada en el citoplasma de la célula vegetativa. Tras la inducciôn a 35 °C, la microspora abandona la via de desarrollo gametofïtico para seguir la nueva via embriogénica, dividiéndose simétricamente en dos células iguales (figura 2 b), las cuales son diferentes de las observadas en el polen bicelular en etapas posteriores. Por otra parte, se observô una serie de microsporas que no han respondido a la inducciôn y que 101 CapUulo IV. présentai! diversas morfologfas, muchas de las en cuales aparecen vacias, con su e structura degradada, o muertas. Las microsporas inducidas, que si iniciaron el programa embriogénico se diferencian notablemente. Unos de los cambios mâs évidentes es la e structura de las células résultantes tras la division comentada anteriormente, siendo células simétricas y de igual tamano; con los nùcleos con idéntica estructura: redondeados y ocupando una posiciôn central en las células, presentando citoplasma denso con numerosas vesiculas y sin presencia de depôsitos de almidôn. A partir de este punto, cada célula comenzarâ a dividirse mâs o menos simétricamente, con ciclos celulares cortos dando lugar a la apariciôn de e structuras multicelulares (figuras 2c). En etapas posteriores, los embriones aumentan de tamano originado embriones globulares, y posteriormente embriones corazôn, los cuales progresan hasta regenerar pequenas plântulas con raiz y tallo (Bârâny et al., 2001; 2005). a Figura 2. Desarrollo embriogénico a partir de cultivo m vitro de anteras de Capsicum annuum L. a: microspora vacuolada la fase que mejor responde para la inducciôn. b: para la respuesta del estrés se abandona su reprogramaciôn natural dando lugar a proembriones de très células, todavia rodeado con la exina la pared celular del polen. c: con el tiempo la exina se rompe dando lugar un proembriôn multicelular mas desarrollado. Barras: a, b, c: 10 pm. Una vez caracterizados los cambios durante la inducciôn a embriogénesis en microsporas, procedimos a detectar cambios en la acumulaciôn y la distribuciôn de las proteinas de HSP70 y HSP90 a nivel subcelular, mediante inmunofluorecencia en criocortes semifinos. Para ello, se tomaron muestras durante del cultivo in vitro, antes de la inducciôn y en diferentes etapas después de la misma. Antes de la inducciôn, las microsporas mostraron una seftal débil fluorescente con anti-HSP70 y con anti-HSP90, principalmente en el citoplasma (figura 3a' y 3e'). 102 CapUulo IV. I SP70 )AP IISP90P C ' ' W F ig u ra 3. Inmunofluorescencia con los anticuerpos anti-HSP70 y anti-HSP90 durante diferentes etapas del cultivo embriogénico en criocortes de Ipm. a, e: microspora vacuolada del inicio de la embriogénesis, no tratada. b, f: microsporas inducidas: 1 dia después del tratamiento de estrés. c, g: proembriones tras la inducciôn. d, f: control sin el anticuerpo primario. a, b, c, d, e, f, g, f : tinciôn con DAPI. a*, b', c’, d': anti-HSP70. e', f , g’, h': anti-HSP90 Barras: a, b, c, d, e, fi g, h: 10 pm. Sin embargo tras la inducciôn, aquellas microsporas que habian cambiado a la ruta embriogénica, comenzaron a dividirse simétricamente de forma asincrônica, dando lugar a estructuras de dos y très células junto a otras microsporas inducidas aparentemente pero sin divisiones celulares. En esas estructuras se detectô un importante incremento de seftal fluorescente tanto por detecciôn de anti-HSP70 (figura 3b') como de anti-HSP90 (figura 103 Capüulo IV._______________________________________________________________________ 3f). El marcado de anti-HSP70 experimento un fuerte incremento tanto en el nùcleo, como en el nucleolo y el citoplasma (figura 3b’). El marcado por anti-HSP90 en el nùcleo no fùe tan intenso como en el citoplasma (figura 3 f ), no apareciendo senal alguna en el nucleolo. Se observa, que el patron de marcado de anti-HSP70 cambio desde una distribuciôn uniforme antes de la inducciôn a estar concentrado en unos focos brillantes después, tanto en el nùcleo, como en el nucleolo y el citoplasma (comparar figuras 3a' y 3b'); mientras que en el marcado por anti-HSP90 no se observaron dichos cambios (figuras 3e' y 3 f ). La reversibilidad de la alta expresiôn de estas proteinas después del tratamiento con estrés se analizô en proembriones, mostrando casi exclusivamente una senal homogénea y de poca intensidad en todas las células, similar a la expresiôn présente en las microsporas antes de la inducciôn (figuras 3c' y 3g'). Los contrôles realizados, omitiendo el primer anticuerpo, revelaron una ausencia de marcado (figura 3d' y 3f). 3.3 Distribuciôn ultraestructural de HSP70: Inmunomarcado con oro y anâlisis cuantitativo Los estudios de inmunomarcado con oro mostraron la distribuciôn ultraestructural de este antigeno de una forma mâs précisa, permitiendo la cuantificaciôn de las variaciones observadas durante los estadios de desarrollo. En las microsporas no inducidas, se observô una cantidad escasa de particulas de oro de anti-HSP70, mayoritariamente en el citoplasma y de forma dispersa (figura 4a). No se encontrô un marcado con oro significativo en orgânulos, estando totalmente ausentes en los sistemas de endomembranas taies como el reticulo endoplasmâtico, el aparato Golgi o la membrana plasmâtica. Tras el tratamiento de inducciôn, la densidad del marcado de HSP70 aumentô notablemente en las microsporas. El nucleolo especialmente, muestra un abundante marcado, asi como el nùcleo, principalmente en la regiôn intercromatinica (figura 4b). El marcado citoplâsmico apareciô distribuido principalmente en regiones ricas en ribosomas. La membrana plasmâtica y la exina no presentaron marcado significativo. 104 Capüulo IV. r i Microsporu Vacuolada N e t En ' Embriones de dos células tras el choque térmico e t N En /f N N Proembriones multicelulares tras el choque térmico y e t En Nu C Figura 4. Inmunomarcado con oro con el anticuerpo anti-HSP70 durante el cultivo embriogénico; secciôn ultrafina de Lowicryl. a: microspora vacuolada del inicio de la embriogénesis, no tratadas. b: proembriones de dos células después de 1 dia del tratamiento, c: proembriones multicelulares de 15 células tras la inducciôn, Los insertos en a, b, y c ilustran mediante tinciôn con DAPI el estadio seleccionado para los estudios en M.E.T. N: nùcleo, Ct: citoplasma. Barras: a, b, c: 200 nm; en cuadros insertados: 10 pm. ÏÔ5 CapUulo IV._______________________________________________________________________ Asimismo, se detectô un cambio en el patrôn de distribuciôn de las particulas de oro, apareciendo la mayoria formando grupos de hasta 15 particulas, tanto en el citoplasma como en el nùcleo y en el nucleolo. En los proembriones se observô un descenso en el marcado y una distribuciôn principalmente citoplâsmica (figura 4c), apareciendo las particulas de oro de forma dispersa. Para caracterizar las diferencias de la densidad de marcado en microsporas no inducidas y las primeras etapas de la inducciôn a embriogénesis, se realizô un anâlisis cuantitativo del nùmero de particulas por unidad de ârea en los distintos compartimentos celulares: citoplasma, nùcleo y nucleolo. El escaso marcado en las vacuolas citoplâsmicas fue considerado como un control intemo del ruido de fondo, el cual obtuvo en un valor medio por debajo de las 3 particulas por pm^ en todos los casos. La significaciôn estadistica de las diferencias en la densidad media del marcado con oro se calculô mediante el método de la “t” de Student. Los resultados se reflejaron en el histograma de la figura 5. H Citoplasm a N ù cleo N ucleo lo 24 21 s 18 M icrosporas no tratadas M icrosporas 1 dia tras el choque Proem briones tras el choque térm ico térm ico Figura 5. Cuantificaciôn del inmunomarcado de anticuerpo anti-HSP70 en gametofïtico (no inducidas) y embriogénico (inducidas). Diferentes etapas estudiadas: en microsporas no tratadas, al inicio de la embriogénesis, microsporas inducidas, 1 dia tras el choque térmico y etapa mâs désarroilada tras el choque térmico, con proembriones multicelulares de 15 células. 106 Capitula IV. En las microsporas no tratadas se encontrô una densidad de marcado baja, tanto en el nùcleo (valor medio: 6,97 particulas/pm^), como en el nucleolo (valor medio: 6,24 particulas/pm^) y en el citoplasma (valor medio: 10,78 particulas/pm^), no existiendo por tanto diferencias significativas en la densidad de marcado entre nùcleo y nucleolo. Tras el tratamiento térmico, la densidad de marcado en las microsporas fue significativamente mayor en el nucleolo (valor medio: 19,30 particulas/pm^) que en el citoplasma (valor medio: 17,42 particulas/pm^) y en el nùcleo (valor medio: 14,09 particulas/pm^). En la etapa posterior, proembriones, se observô una densidad de marcado con valores cercanos o similares a los de las microsporas no inducidas, siendo superior el valor en el citoplasma (valor medio: 13,66 particulas/pm^), que en el nùcleo (valor medio: 8,51 particulas/pm^) y en el nucleolo (valor medio: 7,95 partfculas/pm^). Para comprobar y mostrar con mayor claridad los cambios en la localizaciôn subcelular de HSP70 durante el proceso de inducciôn a embriogénesis, se comparô la densidad media de marcado del nucleolo frente a la del citoplasma en todas las etapas, mediante la relaciôn entre la densidad de marcado nucleolar y la citoplâsmica (figura 6 ). 0,5 0,575 0,58 M icrosporas no tratadas M icrosporas 1 di'a tras el choque térm ico Proem briones tras el choque térm ico Figura 6. Relaciôn entre la densidad de marcado nuclear y citoplâsmico de anti-HSP70 en gametofïtico (no inducidas) y embriogénico (inducidas). Se observô una traslocalizaciôn nuclear después de la inducciôn de choque térmico. 107 CapUulo IV.______________________________________________________________________ _ En esta relaciôn se aprecia el progresivo cambio en la localizaciôn de la proteina respecto a la localizaciôn en las microsporas no tratadas. El valor de la relaciôn entre la densidad de marcado en el nucleolo y en el citoplasma aumenta 2 veces tras un dia de tratamiento, al compararlo con el de las microsporas no tratadas, y desciende de nuevo en los proembriones. Estos datos indican que la proteina aumenta su presencia en el nùcleo y especialmente en el nucleolo tras la inducciôn. Estos resultados indican una presencia constitutiva de la proteina HSP70 en todas las etapas, localizada en citoplasma, el nùcleo y el nucleolo. Sin embargo, después del choque térmico, se dispara la sintesis de HSP70 y aumenta su localizaciôn nuclear especificamente en el nucleolo. 3.4 Distribuciôn ultraestructural de HSP90: Inmunomarcado con oro y anâlisis cuantitativo del marcado Se estudiaron los posibles cambios en cantidad y distribuciôn de la proteina de HSP90 en las mismas etapas seleccionadas en las que se analizô la presencia de anti- HSP70. Asi mismo, el estudio de la localizaciôn in situ de HSP90 a nivel ultraestructural se llevô a cabo mediante inmunomarcado con oro en cortes ultrafinos de Lowicryl. En las microsporas no inducidas se observô una distribuciôn homogénea de particulas de oro de anti-HSP90 en el nùcleo y en el citoplasma (figura 7a), con un patrôn de marcado bâsicamente disperso. No se detectô marcado alguno en los sistemas de membrana taies como reticulo endoplâsmico, aparatos de Golgi, ni en los diferentes orgânulos citoplâsmicos (figuras 7a). El marcado en el nùcleo se concentrô principalmente en la regiôn intercromatinica, con una senal débil en el nucleolo, siempre menor que la observada en la regiôn intercromatinica antes de la inducciôn; mientras que la envoltura nuclear apareciô libre de marca. En las microsporas inducidas, sin embargo, se observô un importante incremento en la intensidad del marcado con oro coloidal, tanto en el citoplasma como en el nùcleo (figura 7b), mientras que en los proembriones encontramos que la densidad del marcado disminuyô notablemente (figuras 7c). El patrôn de distribuciôn subcelular de las particulas de oro no mostrô cambios notables en las etapas estudiadas. 108 CapUulo IV. r i Microspora vacuolada N j / Ct En a Embriones de dos células tras el choque térmico N Ct En Ex . . . N' Proembriones multicelulares tras el choque térmico Ct Pc En f ‘N' '' ■ C . 1 . Figura 7. Inmunomarcado con oro con el anticuerpo anti-HSP90 durante el cultivo embriogénico; secciôn ultrafina de Lowicryl. a: microspora vacuolada no tratada, del inicio de la embriogénesis b; proembriones de dos células después de 1 dia del tratamiento, c; proembriones tras la inducciôn, Los insertos en a, b, y c ilustran mediante tinciôn con DAPI el estadio seleccionado para los estudios en M.E.T. N; nùcleo, Ct: citoplasma, Pc: pared celular. Barras: a, b, c: 200 nm; en cuadros insertados: 10 pm. ÏÔ9 Capüulo IV._______________________________________________________________________ Para determinar las diferencias cuantitativas de la densidad de marcado de anti- HSP90 durante la embriogénesis se realizô un anâlisis cuantitativo de la densidad de marcado, calculando el nùmero de particulas de oro por pm^ en los dos compartimentos celulares en los que se observaron las diferencias: citoplasma y nùcleo; en este caso no se considerô el nucleolo ya que no apareciô con marcado significativo en ningùn caso. El escaso marcado en las vacuolas del citoplasma fue considerado como un control intemo del ruido de fondo, el cual obtuvo en un valor medio por debajo de las 3 particulas por pm^ en todos los casos. La significaciôn estadistica de las diferencias en la densidad media del marcado con oro fue calculada mediante el método de la “f ’ de Student. El histograma de la figura 8 refleja los resultados obtenidos con las microsporas no tratadas y los obtenidos en las etapas estudiadas del desarrollo embriogénico. C ito p la s m a □ N ù c le o 40 35 E 30 ?5 20 E ■o 15 Q 10 M icrosporas no tratadas Microsporas 1 dia tras el choque térmico Em briones tras el choque térm ico Figura 8. Cuantificaciôn del inmunomarcado de anticuerpo anti-HSP90 en gametofïtico (microsporas no inducidas) y embriogénico (inducidas). Diferentes etapas estudiadas: en microsporas no tratadas, en microsporas inducidas al inicio de la embriogénesis (1 dia tras el choque térmico) y en etapa mâs désarroi lada tras el choque térmico: proembriones multicelulares de 15 células. Se encontrô una densidad de marcado baja en las microsporas no tratadas, tanto en el citoplasma (valor medio: 10,88 particulas/pm^) como en el nùcleo (valor medio: 4,52 particulas/pm^), siendo por tanto mucho mayor la densidad de marcado en el citoplasma. 110 CapUulo IV. Sin embargo, después del tratamiento se observô que la densidad de marcado en las microsporas inducidas fue significativamente mayor que antes de la inducciôn, siendo mayor todavia en el citoplasma (valor medio: 25,95 particulas/pm^) que en el nùcleo (valor medio: 17,54 particulas/pm^). Al estudiar etapas posteriores, se observa en los embriones una densidad de marcado ligeramente superior en el citoplasma (valor medio: 10,61 particulas/pm^) que en el nùcleo (valor medio: 7,43 particulas/pm^), valores comparables a los obtenidos con microsporas no tratadas. Estos datos indican que la expresiôn de HSP90 aumenta tras la inducciôn y es mayor en el citoplasma que en el nùcleo, manteniéndose la proporciôn en todas las etapas; por lo que no hay cambios en la localizaciôn tras la inducciôn como los observados con el HSP70. 111 CapUulo IV. 4. Discusiôn Existen muy pocos datos disponibles en relaciôn a los aspectos bioquimicos y moleculares de la embriogénesis de microsporas de Capsicum annuum (Bârâny et al., 2001; 2005), al contrario que en otras especies donde se ha venido haciendo un importante esfuerzo para conocer la influencia del tratamiento de estrés sobre los mecanismos que controlan la reprogramaciôn (Cordewener et al., 1995; 2000; Chupeau et al., 1998; Custers et al., 1994; Garrido et al., 1993; Pechan et al., 1991; Touraev et al., 1997; Zarsky et al., 1995). Todavia hoy, los puntos mâs importantes del proceso de inducciôn siguen siendo poco conocidos. Una de las claves que queremos entender es por que, sometidas exactamente a las mismas condiciones expérimentales, unas células se reprograman hacia la embriogénesis cambiando su expresiôn génica, y otras no. Por tanto, parece esencial llevar a cabo un estudio subcelular como el que se ha realizado en este trabajo, que combine citoquimica y inmunolocalizaciôn en dos niveles complementarios de observaciôn, y que ofrezca la posibilidad de distinguir microsporas inducidas de las no inducidas. La puesta a punto de diverses criométodos en granos de polen ha resultado indispensable como paso previo a los estudios celulares. Con estas técnicas de procesamiento en frlo, se conservan la reactividad quimica y antigénica de la muestra, manteniéndose la ultraestructura y los componentes celulares mâs cerca de su estado in vivo, y facilitândose el acceso de sondas y anticuerpos a sus dianas moleculares en la célula (Gonzâlez-Melendi et al., 1996, 1998; Risueno et al., 1998; Testillano et al., 1995, 1998). Estas técnicas han permitido la localizaciôn subcelular précisa de las proteinas de HSP70 y HSP90, determinando su apariciôn y las diferencias a lo largo de dos procesos de desarrollo completamente diferentes, como son el embriogénico y el gametofïtico. 4.1 Las protemas HSP70 y HSP90 incrementan su expresiôn en respuesta al tratamiento de inducciôn embriogénica. La sintesis de la proteina HSP70 ha sido relacionada con diferentes tratamientos de estrés, ademâs del choque térmico (Lindquist et al., 1986; Morimoto et al., 1997; Vierling et al., 1991). La proteina tiene funciones protectoras y estâ implicada en el metabolismo normal, en el desarrollo y en el crecimiento de la célula (Al Babili et al., 1986; Bakau y Horwich et al., 1998; Hartl et al., 1996). 112 CapUulo IV. En las microsporas no tratadas, no se detectô la presencia de la proteina de HSP70 mediante immunoblotting; por lo tanto, el nivel de la isoforma constitutiva, estaria por debajo de la sensibilidad de detecciôn del método. El estudio de distribuciôn subcelular con la técnica de inmunofluorecencia revelô una serial débil en las microsporas no tratadas, localizada principalmente en el citoplasma (Alastalo et al., 2003; Welch y Feramisco et al., 1984; Welch y Suhan et al., 1986; Hattori et al., 1993). A nivel ultraestructural, el inmunomarcado con oro detectô la presencia de la proteina HSP70 de forma dispersa en el citoplasma. Sin embargo si se detectô la presencia de la proteina HSP70 en las microsporas inducidas mediante immunoblotting, en las que se observô un incremento del marcado de HSP70 y una translocalizaciôn del citoplasma al nucleolo tras el choque térmico. La translocalizaciôn nucleolar ya se habia descrito en otras células, detectândose la presencia de HSP70 en el nucleolo (Morcillo et al., 1997; Alastalo et al., 2003; Welch y Feramisco et al., 1984; Welch y Suhan et al., 1986; Hattori et al., 1993), aunque el mecanismo molecular de la relaciôn nùcleo y nucleolo después del choque térmico se desconoce todavia. Con el estudio de la distribuciôn del inmunomarcado de HSP70 a nivel subcelular y ultraestructural, se observô que la distribuciôn de las particulas de oro cambia de dispersa a agrupada; un cambio similar al que se ha descrito en Brassica napus (Segui et al., 2003). Estos grupos de particulas de oro se sitùan sobre estructuras que asemejan a grânulos densos citoplâsmicos o grânulos de choque térmico (HSG), que contienen HSPs y mRNA; estructuras descritas en estudios previos en células vegetales sometidas a choque térmico (Neumann et al., 1989; Risueno et al., 1973). En la embriogénesis de Brassica napus se demostrô que el HSP70 concentrado en grupos estaba asociado al RNA como resultado directo de la exposiciôn a choque térmico (Segui et al., 2003), interpretândose dicho patrôn como una recolocaciôn del HSP70 en lugares especificos para asistir como chaperona molecular de ciertas estructuras sensibles al calor (Nover y col et al., 1989). Los resultados apoyarian el modelo propuesto por Telmer, segùn el cual la asociaciôn de mRNA de los genes gametofïticos con HSPs evitaria su expresiôn, produciendo por ello la desviaciôn del desarrollo de las microsporas hacia la ruta embriogénica (Telmer et al., 1995). La HSP90 es la otra forma mâs conservada dentro de la familia de las proteinas de estrés. Es sabido que el gen HSP90 se expresa en embriones inducidos de células animales 113 Capüulo IV._______________________________________________________________________ (Coumailleau et al., 1997), y en embriones de ciertas especies vegetales como el maiz (Marrs et al., 1993), Daucus carota (Milione et al., 2001) y Brassica napus (Segui et al., 2003). Otros genes HSP se expresan durante el desarrollo del embriôn (Almoguera y Jordano 1992; Coca et al., 1994; Carranco et al., 1997; Almoguera et al., 1998), datos que indican una relaciôn entre la expresiôn de los genes de HSP y las diferentes etapas de embriogénesis. Dado que un gran nùmero de genes HSP se expresan durante las embriogénesis cigôtica y somâtica, es importante analizar la localizaciôn de HSP90 en células embriogénicas inducidas y no inducidas que han sido sometidas a choque térmico, puesto que se trata de procesos poco conocidos todavia. Tras el tratamiento inductor sometiendo a las microsporas a 35 °C, se observaron cambios significativos en la densidad de marcado del HSP90, siendo este incremento mayor que el observado con HSP70. En muestras in vitro se observô que la actividad chaperona se activa a temperaturas altas (Yonehara et al., 1996). Esta densidad del HSP90 aumentô después del tratamiento de inducciôn en la misma medida en el nùcleo y en el citoplasma, sin un cambio nuclear de importancia. La localizaciôn citoplâsmica del HSP90 ha sido descrita en embriogénesis de células animales (Gasc et al., 1984; 1990), asociada a la funciôn de prévenir la agregaciôn de péptidos replegados por consecuencia del choque térmico; aglutinândolos hasta que alcanzan un correcto ensamblaje, y produciendo el plegamiento de proteinas nuevamente sintetizadas (Pockley et al., 2003). Ademâs origina la activaciôn de una serie de mecanismos metabôlicos y proliferativos de la célula, como respuesta a la actuaciôn de diferentes estimulos (Broche Valles et al., 1999). 4.2 El aumento en la localizaciôn nuclear y nucleolar de HSP70 sugiere posibles papeles tanto en la respuesta al estrés como en la iniciaciôn de la ruta embriogénica El estudio cuantitativo de la expresiôn de HSP70, detectada inmunocitoquimicamente, y concretamente las diferencias en la proporciôn de marcado entre nucleolo y citoplasma después del tratamiento de estrés, sugiere la traslocalizaciôn nucleolar de HSP70 desde el citoplasma. Asi, el incremento general de HSP70 estaria enfocado a dicha traslocalizaciôn nucleolar. La localizaciôn nucleolar de estas moléculas de HSP70 sobre las estructuras fibrilares de RNP podria indicar una funciôn protectora del 114 Capitula IV. HSP70 sobre componentes RNP sensibles al calor. Ademâs, la maxima concentraciôn en condiciones de estrés de HSP70 en nuestro sistema fiie encontrada en el nucléole, tal y como ya se ha observado en otras células en estudios previos (Alastalo et al., 2003; Welch y Feramisco et al., 1984; Welch y Suhan et al., 1986; Hattori et al., 1993). Varios datos autoradiogrâficos (Nover et al., 1986) e inmunocitoqufmicos (Neumann et al., 1987) han identificado a la HSP70 como un constituyente de las ribonucleoprotelnas (RNPs) pre- ribosômicas del componente granular del nucleolo, las cuales se unen de forma reversible y dependiente del choque térmico, para catalizar el reensamblado de los pre-ribosomas y las proteinas RNPs, danadas por el calor (Pelham et al., 1984). Tampoco deberia descartarse un papel de HSP70 en la maquinaria de transcripciôn y procesado del ARN ribosômico. La aplicaciôn de un choque térmico de 35 °C es el ùnico factor extemo que induce el cambio de ruta de desarrollo hacia la via embriogénica en Capsicum annuum, y en nuestro estudio preliminar se describe una abundante presencia de las proteinas de estrés (Bârâny et al., 2001), que ya habia sido descrita en otros sistemas por efecto del tratamiento de inducciôn a embriogénesis (Cordewener et al., 1995; Segui et al., 2003; Testillano et al., 2000). Con los estudios inmunocitoquimicos y moleculares, se observé una gran diferencia en la expresiôn de HSP70 antes y después de la inducciôn. En las microsporas tratadas, se observé una densidad del marcado nucleolar dos veces superior a la que se observé en las microsporas no inducidas (Segui et al., 2003). Estos datos apuntarian un papel especifico del HSP70 en la inducciôn de embriogénesis. Los resultados que indican diferencias en la presencia de HSP70 entre las microsporas inducidas y no inducidas mediante choque térmico, junto con los resultados de estudios previos (Cordewener et al., 2000; Segui et al., 2003) que describen grupos fosforilados de HSP70, claramente apuntan a un papel importante de esta proteina. La HSP70 como otras HSPs esta involucrada en eventos de proliferacién celular independientes del choque térmico en un amplio rango de organismos, desde bacterias hasta animales (Pechan et al., 1991), asi como en embriogénesis somâtica de plantas (Gyôrgyey et al., 1991). Otros estudios han demostrado que el polen maduro, incapaz de experimentar una embriogénesis haploide, es asi mismo incapaz de dar una respuesta a un choque térmico en términos de sintesis de HSP70 (Duck et al., 1989; Frova et al., 1989). Al inicio de la embriogénesis haploide, los genes de embriogénesis inactivos durante el 115 CapUulo IV._______________________________________________________________________ desarrollo gametofitico parecen volverse activos en condiciones de estrés, especialmente aquellos involucrados en la entrada en proliferacién; esto podria requérir una cantidad adicional de HSP70 en estas células embriogénicas en proliferacién. Los datos aportados aqui podrian sugerir un posible papel del HSP70 especfflcamente en la embriogénesis de microsporas inducida mediante estrés. 116 Capitula IV. 5. Bibliografia Alastalo T.P., Hellesuo M, Sandqvist A, Hietakangas V, Kallio M, Sistonen L. (2003) Formation of nuclear stress granules involves HSF2 and coincides with the nucleolar localization of Hsp70. Journal of cell Science. 116:3557-3570. Aligne R., Akhavan-Niak H., Russell P. (1994). A role for HSP90 in cell cycle control: Weel tyrosine kinase activity requires interaction with HSP90. 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Introduccion La pared celular es un compartimento dinâmico, con una e structura compleja que influye en la determinaciôn del tamano y la forma de la célula, en su crecimiento y desarrollo, en la comunicaciôn intercelular y en la interacciôn de la célula con el entomo. La pared celular primaria esta compuesta fundamentalmente por polisacâridos (celulosa, hemicelulosa y pectinas), enzimas y proteinas estructurales, las cuales cambian su composiciôn y distribuciôn durante el crecimiento y diferenciaciôn celular. La rigidez estructural y la resistencia de la pared celular dependen de la integridad de la red formada por la celulosa y los glucanos entrelazados. El Xiloglucano (XG) es una hemicelulosa que llega a constituir hasta el 30 % en peso de la pared celular primaria. La modificaciôn de XG catalizada por las enzimas, es un proceso clave para la expansion durante el crecimiento celular (Talbott y Ray, 1992). El metabolismo de XG aumenta durante el alargamiento de la célula vegetal y es un factor que contribuye a la extension de la pared celular. Las pectinas son el principal componente matriz de los tejidos que constituyen cerca de un tercio de las paredes celulares de las plantas dicotiledôneas (Carpita y Gibeaut, 1993). El término pectina engloba una familia compleja y heterogénea de polisacâridos que tienen en comùn la presencia de los âcidos galacturonico (GalA) y rhamnosa (Rha) (Willats et al., 2001a). El GalA aparece en los dos elementos estructurales principales que forman la columna vertebral de los très grupos de polisacâridos que se creen présentés en todas las especies de pectinas: homogalacturonanos (HGA) contiguos (l^)-a-ligado GalA, rhamnogalacturonan-1 (RG-I) (1—4)-a-ligado GalA interrumpido por la inserciôn de (1-2) ligado a-L-Rha, y rhamnogalacturonan-II (RG-II), un galacturonano substituido (O'Neil et al., 1990; Albertsheim et al., 1996, Mohnen et al., 1999). Las pectinas se polimerizan en el cis-Golgi, se metilesterifican en el Golgi medio y son modificadas por cadenas latérales en las cistemas del trans-Golgi. Son segregadas a la pared altamente metilesterificadas. Posteriormente, pueden ser modificadas por enzimas como las pectin-metilesterasas, las cuales catalizan la dimetilesteriflcaciôn de homogalacturonas liberando pectinas acfdicas y metanol. 123 Capîtulo V. Las pectinas también estân involucradas en la creaciôn de la pared del grano de polen, especialmente la primexina (Hess y Frosch 1994; Majewska-Sawka A et al., 2006), la intina (Heslop-Harrison y Heslop-Harrison 1980; Cresti et al., 1983; Bedinger 1992; Van Aelst y Van Went 1992; Geitmann et al., 1995; Li et al., 1995) y las zonas de apertura con acumulaciones masivas (Taylor y Hepler 1997). La proporciôn de las pectinas esterificadas y no esterificadas, y su distribuciôn en la pared de las células végétales esta relacionada con distintos procesos (Goldberg et al., 1986; Dolan et al., 1997; Hasegawa et al., 2000; Ermel et al., 2000; Guillemin et al., 2005; Domozych et al., 2006). Parece que contribuyen a la adhesiôn celular y que juegan un papel importante en las propiedades mecânicas y en la textura de las células végétales (Ryden et al., 2003; Baluska et al., 2005). El objeto de este trabajo es el estudio de la presencia de varios componentes de la pared celular e importancia de los cambios en los mismos durante el desarrollo gametofitico de la célula, asi como los que tienen lugar durante su reprogramaciôn celular inducida por estrés, empleando como especie de estudio el polen de Capsicum annuum L., por ser una planta de gran interés econômico. La microspora vacuolada cuando es sometida a condiciones de estrés en un cultivo in vitro, se desvia de su ruta de desarrollo gametofitica hacia la embriogénesis (proceso de proliferacién seguido de diferenciaciôn) para dar lugar a plantas haploïdes y doble-haploides con gran interés agronômico (Chupeau et al., 1998). Se desarrollaron cultivos de anteras para inducir la embriogénesis en las microsporas y obtener plantas doble-haploides, utilizando este sistema para estudiar el mecanismo de reprogramaciôn celular. Los cambios en la distribuciôn de las pectinas ya han sido descritos en estudios previos sobre embriones derivados de microsporas de Quercus suber L. (Ramirez et al., 2004). Asi mismo se han utilizado como sistema modelo la zona meristemâtica y la zona de elongaciôn de la raiz de Allium cepdL L., por ser sistemas de proliferacién y diferenciaciôn bien conocidos. Estos sistemas modelos nos permitieron analizar los cambios asociados a estos procesos de proliferacién y diferenciaciôn, que estân relacionados con el de reprogramaciôn, con el objeto de estudiar los mecanismos que ocurren durante la embriogénesis de la microspora y compararlos con la embriogénesis cigôtica, y asi poder identificar las semejanzas y diferencias entre los dos procesos embriogénicos, asi como establecer posibles marcadores celulares de reprogramaciôn y de las primeras etapas de la embriogénesis. 124 CapUulo V. 2. Material y Métodos 2.1 Material Se cultivaron semillas de Capsicum annuum L., var. Yolo Wonder B (Ramiro Amedo, S. A., Calahorra, La Rioja, Spain) en substrato, y las plantas obtenidas se mantuvieron en un incubador (MLR 350H, SANYO) a 25 °C, en 80 % de humedad y con un periodo de luz de 16 horas. Se seleccionaron botones florales de diferentes tamanos, y sus anteras fueron extraidas y utilizadas tanto para el anâlisis del desarrollo gametofitico normal, como para el cultivo in vitro. Se extrajeron también algunos ovarios de flores abiertas para el estudio al microscopio de embriones cigôticos. Por ultimo, se emplearon meristemos de raiz de bulbos en germinaciôn de Allium cepa L. para su estudio al microscopio. 2.2 Cultivos in vitro de anteras Solo se emplearon para los cultivos los botones florales de la primera floraciôn. El estado de desarrollo del polen fue determinado con DAPI en anteras aisladas (Vergne et al., 1987, Gonzâlez-Melendi et al., 1995). Para los cultivos, se seleccionaron anteras con puntas coloreadas de azul provenientes de botones florales con pétalos y sépalos de longitud similar, correspondientes al estado de microspora vacuolada. Se esterilizô la superficie de los botones con un 5 % de hipoclorito sôdico. Se emplearon plaças Pétri de 5 cm de diâmetro, colocândose en cada una 15 anteras en un medio de inducciôn con medio CP (Dumas de Vaulx et al., 1981), suplementado con 0,01 mg/1 de âcido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) y kinetina. Después de 8 dias a 35 °C y en oscuridad, los cultivos se sometieron a periodos de 12 horas de luz (500 pmol fotones/m^s) a 25 °C. Después de 12 dias de inducciôn en medio CP, las anteras se mantuvieron en medio Ri (Dumas de Vaulx et al., 1981) suplementado con 0,1 mg/1 de kinetina. 2.3 Anticuerpos En este estudio se emplearon los anticuerpos JIM7, JIM5, anti-XG y anti-RGII. La tabla 1 muestra las referencias para la generaciôn de estos anticuerpos y correspondientes epitopos reconocidos. 125 CapUulo V. Anticuerpo Antigeno/epitopo Referencias JIM5 Pectinas no esterificadas (50 % de metilesterificadas) (Knox et al., 1990) JIM7 Pectinas esterificadas (entre 35 % y 90 %) Anti-RG II Dominio de las pectinas del RhamnoGalacturonan II cruzadas con bore Anti-XG Xiloglucano (Knox et al., 1990) (Matoh et al., 1998) (Lynch y Staehelin 1992) Tabla 1. Anticuerpos monoclonales empleados para determinar la distribuciôn de los epitopos pécticos y hemicelulosas en las paredes celulares. 2.4 Inmuno dot blet Se extrajeron las anteras del botôn floral y se homogeneizaron mediante un émbolo accionado eléctricamente, en un tubo Eppendorf con 50 pl de soluciôn salina (TES, 0,14 M NaCl, 2,7 mM KCL, 24,8 mM Tris base, pH 7,2). A continuaciôn se fîltrô toda la muestra con una malla de nylon de 30 pm de tamafio de poro, capaz de retener la fracciôn de pared de antera, permitiendo a la vez la extracciôn del polen; el cual fue transferido a un nuevo tubo Eppendorf. Este fîltrado fue centrifugado a una velocidad de 1.000 revoluciones por minuto en una centrifuga Beckman GPR durante 5 min. El sobrenadante se recogiô cuidadosamente con una pipeta, y se colocô en un tubo Eppendorf. A continuaciôn, la fracciôn de polen se homogenizô sobre hielo con un émbolo eléctrico, en 25 pl de soluciôn inerte a partir de 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 50 mM de âcido trans-1,2-diaminocyclohexano- N,N,N'N’-tetraacético (CDTA) y 25 mM ditiotreitol, y se centrifugô a 7000 revoluciones durante 10 min en 4 °C. Se determinô la concentraciôn de proteina de los sobrenadantes résultantes, y todas las muestras fueron ajustadas a una concentraciôn de proteina de 1 mg/ml. Para los ensayos inmuno dot blot, se aplicaron a la membrana de nitrocelulosa (Millipore Corporation) 5 alicuotas de sobrenadantes ajustados y se dejô secar durante 1 hora. Se incubô la membrana a temperatura ambiente durante toda la noche en una soluciôn de bloqueo con anticuerpos JIM5, JIM7 anti-XG y anti-RGII en relaciôn 1:100 (2 % de leche en polvo desnatada con 0,05 % de Tween-20 en PBS). Para revelar los anticuerpos primarios, las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios anti- rata (para los anticuerpos JIM5 o JIM7) y anti-conejo (para anti-XG o anti-RGII) 126 ________________________________________________________________________Capîtulo V. preparados con fosfatasa alcalina diluida 1:1000 en la soluciôn de bloqueo. Las pectinas reconocidas por el anticuerpo se revelaron mediante incubaciôn con una mezcla de azul de nitrotetrazolio (NTB, Sigma) y bromocloroindolil fosfato (BCIP, Sigma) en un tampôn apropiado (NaHCOa 100 mM, NaCOa 50 mM, MgCli 6 H2O 4 mM). Por ultimo, se secaron y se digitalizaron en un escâner Hewlett Packard 6100C. 2.5 Inmunofluorescencia y anâlisis en microscopio confocal Los bulbos de Allium cepa L var. francesa, se colocaron sobre tubos de vidrio que contenfan agua, en la que se mantuvo sumergida la corona radicular, y se dejaron germinar a temperatura ambiente. Al cabo de dos dias, las puntas de las raices fueron extraidas cuidadosamente y fijadas toda la noche a 4 °C en formaldehido al 4 % (w/v) en PBS pH 7,3; a continuaciôn, se lavaron en PBS durante 10 minutos, 3 veces. Se realizaron coites de 30 pm en vibratomo (Lancer), se colocaron sobre el portaobjetos con una capa de 3- aminopropiltrietoxisilano para asegurar su fijaciôn (Gonzâlez-Melendi y Shaw, 2002) y se mantuvieron a -20 °C hasta el momento de uso. Llegado ese momento, se lavaron en PBS y deshidrataron durante 5 minutos empleando metanol en concentraciones progresivamente crecientes (30%, 50%, 70% y 100%) y decrecientes (100 %, 70 %, 50 % y 30 %). Después de 3 lavados en PBS, los coites se incubaron durante 5 minutos en una soluciôn de PBS con 5 % de BSA (albùmina de suero bovino) y después, durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos JIM5 o JIM7 sin diluir, y anti-XG diluidos 1:100 en 0,1 % Tween-20 y anti-RGII diluidos 1:50 en 1 % de BSA. A continuaciôn, se lavaron très veces durante 5 minutos en PBS. Se diluyeron los anticuerpos secundarios, el anti-rata conjugado con Alexa 488 (para detectar JIM5 o JIM7) y el anti-conejo conjugado con Alexa 488 (para detectar anti-XG o anti-RGII) a 1:25 en PBS y se incubaron durante 45 minutos en oscuridad también a temperatura ambiente. Después se lavaron très veces en PBS y très en dHiO, posteriormente se contrastaron con DAPI y se montaron con Mowiol (Polysciences, Eppelheim, Germany). Por ultimo, se observaron en el scanner confocal Bio-Rad MRC- 1000 montado en un microscopio Zeiss Axiovert 135. Los contrôles se realizaron sustituyendo el primer anticuerpo por PBS. 127 Capitula V. 2.6 Crioprocesado de muestras y criomclusiôn en résina Se fijaron diferentes tamanos de anteras en diferentes etapas de la ruta gametofitica y en diferentes etapas del cultivo in vitro. Las muestras se fijaron en formaldehido al 4 % de PBS, pH 7,3, y se mantuvieron toda la noche a 4 °C. A continuaciôn, se lavaron en PBS y se deshidrataron con series de metanol en concentraciôn creciente (30 %, 50 %, 70 % y 100 %), con un progresivo descenso de la temperatura, de 4 °C a -30 °C. Posteriormente se impregnaron con mezclas de metanol/Lowicryl K4M (en series de 2:1, 1:1 y 1:2) a -30 °C, y se encapsularon en résina pura a la misma temperatura. La polimerizaciôn se realizô a - 30 °C usando un equipo Leica AFS bajo luz UV segùn el protocolo descrito por Testillano et al., 1995. Finalmente, se realizaron cortes semifmos (1 pm) y ultrafinos (100 nm) para el estudio con microscopio ôptico y electrônico. 2.7 Inmunomarcado con oro y amplifîcacion con plata Los cortes semifmos (1 pm) se incubaron durante 5 minutos en PBS con 5 % de BSA y después, durante 1 hora, a temperatura ambiente con anticuerpos JIM5 o JIM7 sin diluir, y anti-XG diluidos 1:100 en 0,1 % Tween-20 y anti-RGII diluidos 1:50 en 1 % de BSA. Después de un lavado con PBS, los cortes se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente, con los anticuerpos secundarios anti-conejo (para detectar el marcado JIM5 y JIM7) y anti-ratôn (para detectar el marcado anti-XG y anti-RGII), conjugados con particulas de oro de 10 nm (BioCell, Cardiff, U.K.) diluidas en PBS al 1:25. A continuaciôn los cortes se lavaron en PBS y agua destilada durante 5 minutos y se revelaron finalmente con el kit de amplificaciôn con plata (British Bicell, Cardiff UK). Por ultimo, se montaron las muestras en Mowiol para ser observadas con el microscopio Leitz con objetivos de contraste de fase y campo claro y fotografiadas con una câmara digital Olympus DC 10. 2.8 Inmunomarcado con oro coloidal para microscopia electrônica La inmunolocalizaciôn se llevô a cabo sobre cortes ultrafinos de Lowicryl K4M como se ha descrito en trabajos previos (Risueno y Testillano, 1994; Testillano et al., 1993). Las rej illas de niquel cubiertas por Form var y carbôn portando los cortes ultrafinos de Lowicryl se pusieron a flotar en gotas de ddH20, PBS y BSA al 5 % en PBS durante 5 128 ________________________________________________________________________CapUulo V. minutos para bloquearlas. A continuaciôn, se incubaron con los anticuerpos JIM5 o JIM7 sin diluir, anti-XG diluidos 1/100 en 0,1 % Tween-20 y anti-RGII diluidos al 1:50 en BSA al 1 % de durante 1 hora, y posteriormente, se lavaron en PBS. Para revelar los anticuerpos primarios las rej illas se incubaron con los anticuerpos secundarios (anti-rata IgG para JIM5 o JIM7, y anti-conejo IgG para anti-XG o anti-RGII) conjugados con oro coloidal de 10 nm (Biocell, Cardiff, el Reino Unido) diluido al 1:25 en PBS, y se incubaron durante 45 minutos. Tras el revelado en PBS y ddH20 se secaron y se tineron con acetato de uranilo al 5 % durante 20 minutos y con citrato de plomo durante 5 segundos. Por ultimo, las muestras se observaron en un microscopio electrônico de transmisiôn JEOL 1010 a 80 kV. 2.9 Anâlisis cuantitativo del marcado con oro La densidad del marcado con oro expresada como el numéro de particulas de oro por pm^, se determinô en las paredes, contando el numéro de particulas de oro contenidas en el compartimento de la célula. Las areas fueron estimadas usando una rej ilia cuadrada de 15 X 15 mm. El tamano minimo de la muestra (MSS en inglés) fue determinado empleando la técnica de media progresiva. Todos los anâlisis cuantitativo s se llevaron a cabo usando el programa BASIC desarrollado por el Dr. J. Renau-Piqueras y los resultados se representaron en histogramas. La importancia estadistica de las diferencias entre los valores medios se determinô el test de Student, considerando que eran significativas a partir de P > 0,001. 129 CapUulo V. 3. Resultados 3.1 Inmunolocalizaciôn de los componentes de la pared celular en un sistema modelo de células en proliferacién y diferenciaciôn: raiz Ae Allium cepa L. Para llevar a cabo estos estudios se utilizô un modelo de proliferacién conocido como es la raiz de cebolla, que es un material de fâcil y râpida disponibilidad, y cuyo ciclo celular esta bien caracterizado (De la Torre y Gonzalez, 1979; De la Torre y col., 1985). En primer lugar nos planteamos caracterizar a nivel subcelular y ultraestructural las zonas de interés, y para ello se realizô un estudio con microscopio ôptico y electrônico. En los cortes semifmos de Lowicryl, se identified la zona meristemâtica y la zona de elongaciôn; en esta ultima zona es donde el crecimiento celular es mucho menor y las células comienzan a especializarse. En la figura 1, se muestran las dos zonas de la raiz estudiadas a nivel subcelular y ultraestructural observadas al microscopio ôptico y electrônico respectivamente. En ellas se aprecian las claras diferencias entre las células proliférantes (figura 1 a cuadrado b) y las células diferenciadas (figura la cuadrado c). En las células en proliferacién (figuras Ib, Ib' y b") se observaron en la zona meristemâtica células pequenas, isodiamétricas, con paredes finas, grandes nùcleos y vacuolas pequenas. En las células diferenciadas (figuras le, le' y c") se observaron en la zona de elongaciôn células mâs grandes y alargadas, con paredes gruesas, nùcleos mâs pequenos y alargados, y vacuolas grandes. 130 CapUulo V. # * * » 1 Figura 1. Identificaciôn de las dos zonas estudiadas en la raiz de Allium cepa. Cortes semifinos tenidos con azul de toluidina (a, b', c'). Foto panorâmica de la raiz de cebolla (a), los cuadros indican las zonas estudiadas; estructura de las células meristemâticas al M. O. (b') y al M.E.T. (b"); estructura de las células de elongaciôn al M. O. (c’) y al M E T. (c"). Ct: citoplasma, N: nùcleo, Nu: nucleolo, Pc: pared celular, V: vacuola. Barras: a: 40 pm, b', c': 10 pm; b", c": 2 pm. Con el objeto de determinar la localizaciôn de componentes de la pared celular en las dos zonas de desarrollo de las raices, taies como las pectinas no esterificadas, las esterificadas, el Xiloglucano y el RGII, se realizaron inmunofluorescencias con los anticuerpos JIM5, JIM7, anti-Xiloglucano y anti-RGII (figuras 2a, d, g, j) en cortes de vibratomo, los cuales se analizaron con microscopia confocal. En todos los casos, las senales de inmunofluorescencia se localizaron en las paredes celulares aunque con diferentes intensidades, mostrândose negatives el resto de componentes celulares. 131 Capîtulo V. J1M5JIM5 I1M7 JIM7IIM7 î Anti-XG RGII Figura 2. Detecciôn diferencial de pectinas no esterificadas (JIM5), y esterificadas (JIM7), anti- XG y anti-RGII en las paredes de células proliférantes y diferenciadas. Los cuadros indican las zonas estudiadas con diferentes anticuerpos (a, d, g, j). En los meristemos radiculares de Allium cep2i no se observé senal de los anticuerpos JIM5 (b), anti-XG (h) ni de anti-RGII (k) en las paredes de las células proliférantes; si se detectô una senal importante de anti-JIM7 (e). En la zona de las paredes de las células mâs diferenciadas, se observé una senal muy intensa de anti-JIM5 (c), anti-XG (i) y anti-RGII (1); sin embargo, no se detectô senal alguna de anti-JIM7 (f). Barras: a, d, g, j: 80 pm; b', c', e', f , h', i', f, k’: 10; 132 CapUulo V. En la zona meristemâtica se observé en las paredes de las células proliférantes una sefial débil de fluorescencia con JIM5 (figura 2b), anti-xiloglucano (figura 2h) y anti-RGII (figura 2k); sin embargo, se detectô en estas mismas células una intensa senal con JIM7 (Figura 2e). En la zona de las paredes de las células de elongaciôn (zona mâs diferenciada) se observé una senal fluorescente muy intensa con JIM5 (figura 2c), anti-XG (figura 2i) y anti-RGII (figura 21); mientras que la seftal con JIM7 fue muy débil (figura 2f). Los contrôles mediante supresiôn del primer anticuerpo no mostraron sefial significativa en ningùn caso. A continuaciôn, se realizô un estudio en los dos tipos celulares de la raiz de cebolla para la localizaciôn y distribuciôn de los polisacâridos a nivel ultraestructural sobre cortes ultrafinos de Lowicryl, mediante inmunomarcados con anticuerpos, que reconocieran pectinas esterificadas, pectinas no esterificadas, XG y RGII. El estudio de la distribuciôn a nivel ultraestructural revelô que en las paredes celulares recién formadas, las particulas de oro con JIM5 se encuentran fundamentalmente en el ârea central de la pared celular denominada lâmina media (figura 3a), mientras que el JIM7 se observé en el ârea mâs densa de la pared celular (figura 3b). Las particulas de oro con XG y con RGII se observaron en la lâmina media de la pared celular (figuras 3c y d). En las paredes mâs desarrolladas, las particulas de oro con JIM5 se observaron en la lâmina media en la pared celular (figura 4a). Las particulas con JIM7, sin embargo, se localizaron en el ârea densa de la pared celular (figura 4b). Por ultimo, las particulas con oro de XG se localizaron en la lâmina media (figura 4c), mientras que el RGII se observé en el ârea densa de la pared celular (figura 4d). 133 f Capîtulo V. JIM5 rjIM7 a f ' \ r A »r e t aÙ < "p g ?* Anti-RGIIA n ti-X t» .,. . A # -' f f w* # » »t * .-i*» ' ' Figura 3. Localizaciôn y distribuciôn a nivel ultraestructural con los anticuerpos JIM5, JIM7, anti-XG y anti-RGII en las paredes recién formadas en la zona proliférante de Allium cepa. Se observé un marcado de oro intenso con el anticuerpo JIM7 en las paredes recién formadas. Ct: citoplasma. Pc: pared celular. Barras: a, b, c, d: 200 nm; en cuadros insertados: 5 pm. 134 CapUulo V. M Anti-RGIIAnti-XG □^ t . * F ig u ra 4. Localizaciôn y distribuciôn a nivel ultraestructural con los anticuerpos JIM5, JIM7, anti-XG y anti-RGII en las paredes mâs desarrolladas de la zona diferenciada de Allium cepa. Se observé un marcado de oro intenso con los anticuerpos JIM5, anti-XG y anti-RGII en las paredes mas desarrolladas. Ct: citoplasma. Pc: pared celular. Barras: a, b, c, d: 200 nm; en cuadros insertados: 5 pm. 135 CapUulo V.________________________________________________________________________ 3.2 Cambios en los componentes de la pared analizados mediante dot blot Se realizô un inmuno dot blot con los anticuerpos JIM5, JIM7 anti-XG y anti-RGII, como marcadores de células en proliferacién y diferenciaciôn, para detectar diferencias en la presencia de estos componentes de la pared en los dos tipos celulares de la raiz (figura 5). En los extrados de las células meristemâticas se observé una senal muy débil, casi inapreciable con los anticuerpos JIM5, anti-XG y anti-RGII, mientras que se observé una senal muy fiierte con el anticuerpo de JIM7. Sin embargo, en los extractos de las células mâs diferenciadas se detectô una intensa senal con los anticuerpos JIM5, anti-XG y anti- RGII, y una sefial inapreciable con el anticuerpo JIM7. A continuaciôn, se analizaron dos etapas de la ruta gametofitica, la microspora vacuolada (etapa clave para la inducciôn a embriogénesis) y el polen bicelular maduro, que es una etapa mâs diferenciada (figura 5). Anticuerpos empleados Anti-XG Anti-RGIIJIM7JIM5 Material de estudio Zona meristemâtica Zona de elongaciôn Microspora vacuolada Polen bicelular maduro Figura 5. Dot blot con anticuerpos J1M5, JIM7, anti-XG y anti-RGII en diferentes tipos celulares de raiz del Allium cepa y en dos estadios de desarrollo del polen. Con los anticuerpos JIM5, anti-XG y anti-RGII se observé senal en la raiz de cebolla en la zona diferenciada y en la etapa de polen bicelular maduro; con el anticuerpo JIM7 se observé senal en la raiz de cebolla en la zona diferenciada y en la etapa de microspora vacuolada. 136 ________________________________________________________________________ Capîtulo V. En los extractos de la microspora vacuolada se detectô una senal casi inapreciable con los anticuerpos de JIM5, anti-XG y anti-RGII, por el contrario, si se detectô una senal muy intensa con el anticuerpo JIM7. En la etapa de bicelular maduro se encontrô una expresiôn intensa de JIM5, anti-XG y anti-RGII, y una senal inapreciable con el anticuerpo J1M7. En los contrôles realizados sin el anticuerpo primario, apenas se observé senal alguna. Los resultados obtenidos indican que los anticuerpos JIM5, anti-XG y anti-RG II estân relacionados con la diferenciaciôn, mientras que el anticuerpo JIM7 puede ser considerado como un marcador de proliferacién. 3.3 Inmunolocalizaciôn de componentes de la pared celular durante el desarrollo gametofitico del polen como sistema en diferenciaciôn Para caracterizar la composiciôn de la pared celular durante la ruta gametofitica se realizaron inmunomarcados en las dos etapas del desarrollo de polen mencionadas anteriormente (microspora vacuolada y polen maduro). Debido a la autofiuorescencia inespecifica de la pared extema del polen, la exina, no se pudo realizar la inmunolocalizaciôn por fluorescencia, empleândose en su lugar la técnica de inmunomarcado con oro y amplificaciôn con plata. Para ello, se extrajeron anteras de diferentes tamanos de plantas, que fueron procesadas e incluidas en Lowicryl, y se obtuvieron cortes semifinos y ultrafinos para los ensayos de inmunolocalizaciôn, que fueron analizados posteriormente con el microscopio ôptico y electrônico. El inmunomarcado con oro y amplificaciôn con plata para microscopio ôptico revelô en la fase de microspora vacuolada una sefial abundante de anticuerpo JIM7 en las aperturas de la microspora (figura 6b'), mientras que no se observé sefial alguna con los anticuerpos JIM5 (figura 6a'), anti-XG (figura 6c') y anti-RGII (figura 6d'). En la etapa de polen bicelular maduro, se observaron diferencias en la intensidad de sefial obtenida con los anticuerpos JIM5, anti-XG y anti-RGII. En los contrôles realizados eliminando el anticuerpo primario no se encontrô sefial significativa en ninguno de los casos. 137 Caphulo V. Microspora vacuolada Folen bicelular inaduro JIM5 y a b a JIM7 Anti-XG Anti-RGII JIM7 g Figura 6. Inmunomarcado con ore y amplificacion con plata con anticuerpos JIM5, JIM7, anti- XG y anti- RGII en dos estadios de la ruta gametofitica del polen. a, b, c, d, microspora vacuolada bajo contraste de fase. Con los anticuerpos JIM5 (a'), anti-XG (c’) y anti-RGII (d') en la fase microspora vacuolada no se observé serial; con el anticuerpo JIM7 (b') se observé una intensa senal. e, f, g, h: polen bicelular maduro bajo contraste de fase. En la misma fase con los anticuerpos JIM5 (e'), anti-XG (g') y anti-RGII (h') se observé una senal intensa. Con el anticuerpo JIM7 (f) no se observé senal en la misma etapa. Barras: a, b, c, d, e, f, g, h: 10pm. 138 _______________________________________________________________________ Capitulo V. A continuacion, para estudiar la densidad y la localizacion del marcado a nivel ultraestructural, se realizo un inmunomarcado con oro con los anticuerpos JIM5, JIM7, anti-XG y anti-RGII en las dos etapas de la ruta gametofitica seleccionadas. En cuanto a la evolucion de la densidad del marcado en la etapa microspora vacuolada, se observé una cantidad muy escasa de particulas de oro con JIM5 (figura 7a), XG (figura 7c) y RGII, mientras que en la fase de bicelular maduro aumento la senal con mayor intensidad del marcado del JIM5 (Figura 7b), XG (figura 8b) y RGII (figura 8d). Sin embargo, con el anticuerpo JIM7, se détecté una intensidad de marcado alta en la etapa de microspora vacuolada, descendiendo dicho marcado en la etapa de bicelular maduro (figura 7d). Desde el punto de vista de la distribucién subcelular, no se observaron diferencias entre la etapa de microspora vacuolada y la de polen bicelular maduro en relacién a la senal de JIM5, detectandose en la zona préxima a la intina en ambos casos (figuras 7a y b). Sin embargo, los anticuerpos JIM7, anti-XG y anti-RGII, se detectaron en la zona préxima a la intina en la etapa de microspora vacuolada (figuras 7c, 8a y 8c), mientras que en el bicelular maduro, se localizaron en la zona distante de la intina (figura 7d, 8b y 8d). 139 Capitulo V. Jim 5 en microspora vacuolada Ct b Jim 5 pol$n hiçelùlar V nüadprd * ’ ct Ex a K Jim 7 #n rqicrospora vacuolada Ct Jim 7 polen bicelular maduro Ct Figura 7. Localizacion y distribucién a nivel ultraestructural con los anticuerpos JIM? y JIM5 durante dos etapas de la ruta gametofitica. En la etapa de microspora vacuolada la densidad de marcado con el anticuerpo JIM5 (a) mayor en la etapa de bicelular maduro (b); en la etapa de microspora vacuolada, la densidad del marcado de JIM? (c) mas baja que en la etapa de bicelular maduro (d). En cuadro insertado: estructura al M. O. Ct: citoplasma. Ex: exina. V: vacuola. Barras: a, b, c, d: 200 nm; en cuadros insertados: 10 pm. 140 Capitulo V. Anti-XG en microspora vacuolada - % -r.; f # Anti-XG en polen bicelular maduro Ct a -üft Anti- icelular Figura 8. Localizacion y distribucién a nivel ultraestructural con los anticuerpos JIM7 y JIM5 durante dos etapas de la ruta gametofitica. En la etapa de microspora vacuolada la densidad de marcado con los anticuerpos anti-XG (a) y anti-RGII (c) mayor en la etapa de bicelular maduro (b, d). En cuadro insertado: estructura al M. O. Ct: citoplasma. Ex: exina. V: vacuola. Barras: a, b, c, d: 200 nm, en cuadros insertados: 10 pm. 141 Capitulo V.________________________________________________________________________ 3.4 Inmunolocalizacion de componentes de la pared celular en la embriogénesis de polen como sistema de reprogramaciôn La embriogénesis del polen es el otro proceso de desarrollo del polen que se ha analizado como sistema de células en diferenciaciôn que se reprograman hacia proliferaciôn. El polen cultivado in vitro, tras ser sometido a estrés por choque térmico, es capaz de desviarse de su ruta normal de desarrollo gametofitico hacia una nueva ruta esporofîtica, multiplicândose para finalmente regenerar plantas haploïdes y doble-haploides. Tras la inducciôn, las microsporas empiezan a dividirse dando lugar a proembriones tempranos homogéneos (figura 9a-d) de entre 10 y 15 células, con células poligonales con citoplasma denso y grandes nùcleos. En esta etapa se observé una elevada sehal con el anticuerpo J1M7 en las paredes de los proembriones tempranos (figura 9b'); sin embargo, no se observé sehal alguna con los anticuerpos J1M5 (figura 9a'), anti-XG (figura 9c') ni anti-RGll (figura 9d'). Très semanas después del inicio de la embriogénesis, los proembriones tempranos evolucionaron hasta dar lugar a embriones multicelulares tardios con dos tipos celulares (figura 9e-h): una zona interior con células mas densas con vaciiolas pequehas (figura 9a, cuadrado a), y una capa exterior con grandes células con vacuolas grandes (figura 9a, cuadrado b). Se observé sehal mas intensa de los anticuerpos J1M5, anti-XG y anti-RGll en las paredes de las células de la zona exterior de los proembriones (figura 9e', g', h'), mientras que en las paredes de las células de la zona interior no se observé sehal o ésta fue muy débil (figura 9e', g' y h'). Sin embargo, la sehal del anticuerpo J1M7 se observé solamente en las paredes de las células de la zona interior (figura 9f ). En los contrôles realizados eliminando la presencia del anticuerpo primario, la ausencia de sehal fue prâcticamente total. 142 Proem briones tempranos Capitulo V. JIM 5 JIM5 w s k Anti-XG V / s/ & ' * f ' . - . A . ' , , Anti-RGII œ s JIM 7 Anti-?^0 Anti-RGII - d ’ / Figura 9. Inmunomarcado con oro y amplificacion con plata con anticuerpos JIM5, JIM7, anti- XG y anti-RGII durante la ruta embriogénica. a, b, c, d, proembriones multicelulares homogéneos en contraste de fase. Con los anticuerpos JIM5 (a'), anti-XG (c') y anti-RGII (d') en proembriones homogéneos no se observé senal; con el anticuerpo JIM7 (b') se observé una senal intensa. e, f, g, h: proembriones mas désarroilados con dos tipos celulares en contraste de fase. En los proembriones con dos zonas se observé una intensa senal en la zona exterior (cuadrado b) con los anticuerpos JIM5 (e'), anti-XG (g') y anti-RGII (h'). Con el anticuerpo JIM7 se observé una senal intensa en la zona interior (cuadrado a) en la misma etapa (f). Barras: a, b, c, d: 10 pm; e, f, g, h: 50 pm._______________________________________________ 143 Capitulo V. Para identiflcar la presencia de los componentes a nivel ultraestructural se llevo a cabo un inmunomarcado con oro con los anticuerpos de JIM5, JIM7, anti-XG y anti-RGII en los proembriones tempranos y en los embriones multicelulares tardios. En las paredes recién formadas la intensidad del marcado observada con los anticuerpos JIM5, anti-XG y anti-RGll fue menor (figura 10 a, c y d), mientras que se observé una densidad alta en las paredes mas desarrolladas. La densidad del anticuerpo J1M7 en las paredes recién formadas fue alta al compararla con la de las paredes mas desarrolladas, donde se observé una densidad baja del anticuerpo estudiado (figura 10b). En las paredes mas desarrolladas se détecté una intensidad baja con el anticuerpo con J1M7 (figura lib), y una intensidad alta de marcado con los anticuerpos JIM5 (figura 11 a), anti-XG (figura 11c) y anti-RGII (figura 11 d). El estudio de distribucién subcelular révélé que las particulas con oro con JIM5, J1M7, anti-XG y anti-RGII se detectaron en la lamina media de la pared celular. En las paredes celulares recién formadas, la lamina media se limité a una banda fina en el centro de la pared (figura 10 a, b, c, d); mientras que la lamina media encontrada en células mas maduras résulté ser un area densa y mas ancha (figura 11 a, b, c, d). 144 Capitulo V. <> •' ' i f (im 7 , 'Jim5^^ ï-T N iaT --W, Hk- » ; K ' : '►'à'*.- l^ ^ r'A h tî-X » i-RGII o 4 ^ ' W f V ' Figura 10. Inmunomarcado con oro para la localizacion de los anticuerpos de JIM5, JIM7, anti-XG y anti-RGII en las paredes interiores recién formadas, de los proembriones multicelulares de dos zonas. Se observé un marcado con oro intenso con el anticuerpo JIM7 en las paredes de los proembriones de dos zonas. Ct: citoplasma. Pc: pared celular. Barras: a, b, c, d: 200 nm; en cuadros insertados: 1 pm. 145 Capitulo V. XL*- » * Ct Jim? • y ' '4 Anti-XG Figura 11. Inmunomarcado con oro para la densidad y la localizacion de los anticuerpos de JIM5, JIM7, anti-XG y anti-RGII en las paredes mas desarrolladas, en la zona exterior de los embriones tardios de dos zonas. Se observé una densidad de marcado alto con los anticuerpos JIM5, anti-XG y anti-GII en las paredes celulares, mientras que se observé una densidad de marcado bajo con el anticuerpo JIM7. Ct: citoplasma. Pc: pared celular. Barras: a, b, c, d: 200 nm; en cuadros insertados: 1 pm. 146 ________________________________________________________________________Capitulo V. 3.5 Cuantiflcaciôn del inmunomarcado de componentes de la pared celular durante el desarrollo y embriogénesis del polen Para determinar la signifîcaciôn estadistica de las diferencias observadas en el inmunomarcado con oro, se realizo un analisis cuantitativo de la densidad de marcado, estimada como el numéro de particulas de oro por imidad de area (pm^) en la pared celular, en etapas claves durante la maduracion del polen, y en dos etapas de la ruta embriogénica. La signifîcaciôn estadistica de las diferencias en la densidad media del marcado con oro se calculé mediante el test método Student. Los resultados obtenidos se reflejaron en los histogramas de las figuras 12 y 13. En la fase inicial de la maduracién del polen (diferenciaciôn), que es la etapa de microspora vacuolada, se encontraron densidades bajas de marcado de componentes celulares con pectinas no esterificadas JIM5 (valor medio: 57,206 particulas/pm^), anti-XG (valor medio: 53,232 particulas/pm^) y anti-RGII (valor medio: 60,582 particulas/pm^). Sin embargo, se encontré una densidad alta de pectinas esterificadas JIM7 (valor medio: 152,511 particulas/pm^). En la etapa de bicelular maduro por el contrario, se détecté una alta densidad de JIM5 (valor medio: 205,131 particulas/pm^), anti-XG (valor medio: 129,011 particulas/pm^) y anti-RGII (valor medio: 268,070 particulas/pm^) y, sin embargo, una densidad baja de marcado con JIM7 (valor medio: 65,664 particulas/pm^). 147 Capitulo V. I M icrospora vacuolada I Bicekjlar m aduro □ Em briones p a red es reclen form adas 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 268,07 205,131 152,511 111.252 57.206 192.033 129 ,0 11 Jim 5 Jim 7 94,937 137.7 RGII Figura 12. Cuantificacion del inmunomarcado con los anticuerpos de JIM5, JIM7, anti- XG y anti-RGII en dos etapas del desarrollo del polen y las primeras etapas de la ruta embriogénica. En la etapa de microspora vacuolada y las paredes de los embriones jovenes se observé un alto numéro de JIM7 comparado con los otros anticuerpos analizados; en la fase de bicelular maduro se observé un alto numéro de JIM5, anti-XG y anti-RGII comparando con el JIM7, que disminuye notablemente. Cuando el polen se reprograma hacia proliferacién y se forman los embriones tempranos, la distribucién de componentes de la pared cambia. En las paredes recién formadas, se observé una densidad alta de pectinas esterificadas JIM7 (valor medio: 192,033 particulas/pm^), detectandose por el contrario densidades de marcado bajas de componentes celulares con pectinas no esterificadas JIM5 (valor medio: 111,252 particulas/pm^), anti-XG (valor medio: 94,937 partfculas/pm^) y anti-RGII (valor medio: 137,700 particulas/pm^). En las paredes mas desarrolladas de los proembriones tardios, con dos zonas, se encontraron densidades de marcado altas de componentes celulares con pectinas no esterificadas JIM5 (valor medio: 324,843 particulas/pm^), anti-XG (valor medio: 190,565 particulas/pm^) y anti-RGII (valor medio: 479,935 particulas/pm^); sin embargo, la densidad del anticuerpo de JIM7 (valor medio: 156,024 particulas/ pm^), disminuyé notablemente. 148 Capitulo V. I Paredes recien formadas ■ Paredes màs desarrolladas 550 500 450 Ç 400 » 350 “479,935 324,843 2 200 192.033 190 565 156,024 Jim 5 Jim7 XG RGII F ig u ra 13. Cuantificacion del inmunomarcado con los anticuerpos de JIM5 JIM7, anti- XG y anti-RGII en la ruta embriogénica en dos tipos de embriones, en las paredes recién formadas, y en las màs desarrolladas. En las paredes recién formadas se observé un alto numéro de JIM7 comparado con los otros anticuerpos analizados; en las paredes màs desarrolladas se observé un alto numéro de JIM5, anti-XG y anti-RGII comparando con el anticuerpo JIM7 que disminuye notablemente. 3.6 Inmunolocalizacion de componentes de la pared celular en etapas tempranas de la embriogénesis cigotica La similitud de la organizacién celular y estructural del embrién derivado de microsporas con la del cigético, sugiere un paralelismo entre los patrones de desarrollo del embrién en ambos procesos de embriogénesis; la haploide y la cigética (Yeung et al., 1996). Se identificaron en embriones derivados de microsporas los proembriones tempranos y los embriones cigéticos con dos zonas, mediante el criterio de cantidad de almidén detectado (Bâràny et al., 2005). Los proembriones tempranos cigéticos se distinguen por sus células poligonales, con una gran vacuola central (figura 14a) y sin presencia del almidén (figura 14a'); mientras que los embriones multicelulares tardios tienen dos zonas (figura 14b): la zona interior con células poco densas y con pequenas vacuolas (figura 14b, cuadrado a), y la capa exterior con grandes células con vacuolas grandes (figura 14b, cuadrado b) y una intensa acumulacién del almidén (figura 14b'). 149 Capitulo V. Proembriones tem pranos cigéticos Embriones tardios cigéticos con dos tipos celulares Î 1 - m # AlmidénAlmidén X , m Figura 14. Revelaciôn diferencial del almidôn en embriones cigéticos. Organizacién celular de los proembriones tempranos cigéticos (a), y embriones tardios cigéticos con dos zonas, zona interior (b, cuadrado a) y zona exterior (b, cuadrado b). Citoquimica de almidén (a', b'). Cortes semifinos observados al microscopio éptico y campo claro después de tincién con IIK para revelar el almidén (a', b'). Hay una acumulacién diferencial de almidén: se observé una mayor intensidad de senal de almidén en el embrién tardio cigético, localizândose solamente en la zona exterior. Barras: a: 10 pm; b: 50 pm. Se realizo un estudio para buscar similitudes o diferencias en los componentes de la pared celular de los embriones cigéticos. En los proembriones tempranos cigéticos, se observé senal del anticuerpo JIM7 (figura 15b') y, sin embargo, no se observé senal alguna de los anticuerpos JIM5 (figura 14a'), anti-XG (figura 14c') y anti-RGII (figura 15d'). En los embriones tardios donde podemos observar los dos tipos celulares descritos en el pârrafo anterior, los anticuerpos JIM5 (figura 15e'), anti-XG (figura 15g') y anti-RGII (figura 15h') dieron senal en las paredes de las células de la capa exterior, no observândose senal en la zona interior (figura 15e', g', h'). Por el contrario, la senal del anticuerpo JIM7 se observé solamente en las células de la zona interior (figura 15f). 150 Capitulo V. Proem briones tempranos cigoticos Em briones tardios cigéticos con dos tipos celulares a -:>.r a JIM5 JIM5 JIM7 # — b ’ — f JIM7 Anti-XG — C * iist Td&f: CSuSB 'f g Anti-XG w Anti-RGII — d* Anti-RGII . % Figura 15. Inmunomarcado con oro y amplificacion con plata con anticuerpos JIM5, JIM7, anti- XG y anti-RGII en dos tipos de proembriones cigoticos. a, b, c, d, en proembriones cigoticos homogéneos, con muestras en contraste de fase. Con los anticuerpos JIM5 (a'), anti-XG (c') y anti-RGII (d') en proembriones cigoticos homogéneos no se observé senal; con el anticuerpo JIM7 (b') se observé una senal intensa. e, f, g, h: proembriones cigéticos mas désarroi lados que tienen dos tipos celulares en contraste de fase. En los proembriones cigéticos con dos zonas se observé una intensa serial en la zona exterior (cuadrado b) con los anticuerpos JIM5 (e'), anti- XG (g') y anti-RGII (h'). Con el anticuerpo JIM7 se observé una senal intensa en la zona interior (cuadrado a) en la misma etapa (f). Barras: a, b, c, d: 10 pm; e, f, g, h: 50 pm. 151 Capitulo V. 4. Discusiôn 4.1 Los componentes de la pared celular vanan en procesos de proliferaciôn y de diferenciaciôn Los polisacâridos pécticos constituyen cerca de un tercio en peso de las paredes celulares de las plantas dicotiledôneas (Carpita y Gibeaut, 1993). El contenido en polisacâridos, proteinas y glicoproteinas en las paredes celulares es regulado durante el desarrollo de la planta y de sus ôrganos, e influye en su programa de desarrollo (Knox et al., 1990; Smallwood et al., 1994; Freshour et al., 2002). La eliminaciôn de los grupos metilester (desesterifïcaciôn) dentro de la matriz de la pared celular da lugar a uniones cruzadas de residues de homogalacturonano con calcio. Este proceso contribuye al reforzamiento de la pared celular aportando rigidez adicional a la misma (Catoire et al., 1998). Por otro lado, los componentes de la pared celular experimentan cambios durante el proceso de desarrollo; al inicio del proceso de formaciôn de la pared celular se detectan niveles altos de calosa (Bhandari, 1982; Verma y Hong, 2001). Esta presencia de calosa en la pared celular es transitoria, siendo substituida por celulosa que es otro de los componentes de la pared celular que se depositan en esta fase (Knox, 1997; Willats et al., 2001; Knox et al., 1990). Nuestros resultados ban revelado que en sistemas en proliferaciôn como los meristemos del âpice radical, existe un nivel alto de pectinas esterificadas en las paredes celulares, hecho que parece ser una caracteristica especifica asociada con la actividad de proliferaciôn. En contraste con este resultado, en las células en diferenciaciôn la proporciôn observada de pectinas no esterificadas en las paredes celulares fue mayor. Estudiando las especies arbôreas y, en concreto, el Quercus suber L. como ejemplo de otros sistemas, también se ban encontrado diferencias en la proporciôn de estas pectinas al comparar los procesos del proliferaciôn y diferenciaciôn (Ramirez et al., 2002, 2003). Se ba utilizado un sistema modelo de proliferaciôn y de diferenciaciôn como son los meristemos de la rafz de Allium cepa L., que es un material muy utilizado para estudios de ciclo celular (De la Torre y Gonzalez, 1979; De la Torre et al., 1985). Existen algunos estudios sobre la distribucién de los anticuerpos JIM5 y JIM7 como marcadores en células proliférantes y diferenciadas de la rafz de Arabidopsis (Dolan et al., 1997). Los resultados obtenidos indican que las pectinas altamente esterificadas detectadas por el anticuerpo JIM7 pueden ser usadas como marcadores celulares de proliferaciôn, y las no esterificadas 152 ________________________________________________________________________ Capitulo V. detectadas por el anticuerpo JIM5 como marcadores de diferenciaciôn (Goldberg et al., 1986; Dolan et al., 1997; Hasegawa et al., 2000). La proporciôn de pectinas esterificadas y no esterificadas, y su distribucién en la pared de la célula esta relacionada por tanto con la proliferaciôn y diferenciaciôn (Guglielmino et al., 1997; Goldberg et al., 1986; Hasegawa et al., 2000; Willats et al., 2001 a,b). Otros dominios de las pectinas como el RGII y la hemicelulosa XG han sido estudiados en menor medida. El RGII observado en las pectinas de la pared celular de células meristemâticas de la raiz del maiz expérimenta una râpida endocitosis dependiente de la F-actin (Baluska et al 2002). El anti-Xiloglucano ha sido observado en la pared celular durante de la formaciôn de la plaça celular en endospermos de Arabidosis thaliana (Otegui et al., 2000). Los resultados obtenidos con compuestos de RGII y XG demuestran que éstos aumentan en las paredes màs diferenciadas; sugiriendo por tanto, que existe una relacién de los mismos con el desarrollo progresivo de la pared celular. 4.2 Los componentes de la pared como marcadores de la reprogramaciôn del polen a embriogénesis El polen cultivado in vitro, tras ser sometido a un tratamiento de estrés, es capaz de desviarse de su ruta normal gametofitica hacia una nueva ruta embriogénica, dando lugar a proembriones multicelulares, a partir de los cuales se regeneran finalmente plantas haploïdes y doble-haploides (Chupeau et al., 1998). En trabajos realizados en nuestro laboratorio en Quercus suber L. (Ramirez et al., 2004) se estudiaron las diferentes composiciones de las pectinas en los proembriones de microspora de alcomoque, revelando que las paredes celulares sufren unas modificaciones concretas y definidas durante la embriogénesis temprana de la microspora. Los cambios en el patrôn de localizacion y en el nivel de esterificaciôn de las pectinas observados en los proembriones de alcomoque presentan similitudes y diferencias con aquellos observados en otros sistemas vegetales (Ramirez et al., 2002, 2003, 2004). En embriones muy tempranos derivados de microsporas de especies herbâceas como pimiento, maiz, cebada y tabaco se ha observado un nivel alto de pectinas esterificadas en las paredes celulares, hecho que parece ser una caracteristica especifica asociada con la actividad de proliferaciôn (Ramirez et al., 2002, 2003, 2004; Bâràny et al., 2006). 153 Capitulo V Los estudios realizados en polen bicelular maduro y en polen germinado donde la densidad de marcado de pectinas no esterificadas es significativamente superior a la de pectinas esterificadas, indican un grado bajo de esterificaciôn de pectinas, (Stepka et al 2000; Suârez-Cervera et al., 2002), que también apoya esa hipôtesis. Una vez que se ha determinado que las pectinas pueden ser utilizadas como marcadores de proliferaciôn y diferenciaciôn, se emplearon en diferentes etapas de la ruta gametofitica. En la fase de microspora vacuolada se observé un alto contenido de pectinas esterificadas en las aperturas, zonas en la que se produce en esta fase la sintesis de una nueva pared (Taylor y Hepler, 1997); por el contrario, otros componentes de la pared celular como las pectinas no esterificadas, el XG y el RGII, se detectaron en niveles bajos en esa misma etapa. En la etapa màs madura del polen, en el polen bicelular maduro, se detectô un alto contenido de pectinas no esterificadas, de XG y de RGII; por el contrario, no se detectô la presencia de pectinas esterificadas. Las pectinas no esterificadas se localizaron en la zona interna de la intina, mientras que las esterificadas, el XG y el RGII se depositaron en la zona extema de la intina (Aouali et al., 2001). Los resultados obtenidos durante la maduracién del polen y en las paredes recién formadas de los proembriones tempranos indican que los componentes de la pared celular: pectinas no esterificadas, el XG y el RGII pueden ser buenos marcadores de la ruta gametofitica, mientras que las pectinas esterificadas pueden ser empleadas como un buen marcador de proliferaciôn, en la ruta embriogénica. Los marcadores celulares tempranos identificados para las rutas gametofitica y embriogénica pueden ser usados para diferenciar las microsporas que responden y que no responden a un tratamiento de estrés; es decir si abandonan o no su programa de desarrollo en respuesta a dicho tratamiento (Testillano et al., 2000; Segui et al., 2003, 2005; Ramirez et al., 2004). En los proembriones tempranos se observé un nivel alto de pectinas esterificadas en la pared celular, y ninguna senal de pectinas no esterificadas, ni presencia de XG o RGII. En los embriones màs desarrollados, donde ya se observan dos tipos celulares, se apreciô un alto nivel de pectinas no esterificadas, asl como la presencia de XG y RGII, en la zona exterior, observândose un alto contenido en pectinas esterificadas en la zona interior. Estos datos sugieren que los componentes de la pared celular con pectinas esterificadas estàn relacionados con la proliferaciôn, mientras que las pectinas no esterificadas, el XG y el RGII estàn relacionadas con la diferenciaciôn. Todos estos 154 _____________________________________________________________ Capitulo V. resultados apoyan la tesis de que estos componentes de la pared celular son marcadores del proceso de embriogénesis. Los resultados obtenidos sugieren la aplicacion del anticuerpo JIM7 como marcador celular de la reprogramaciôn de la microspora, y los anticuerpos JIM5, anti-XG y anti-RGII como marcadores de la ruta de diferenciaciôn del polen; marcadores por lo tanto, aplicables en el proceso de inducciôn embriogénica en polen, asi como en embriones cigôticos. 4.3 Los cambios en la pared celular observados durante la embriogénesis del polen i también tienen lugar en la embriogénesis cigotica El patrôn estructural de desarrollo de embriones derivados de microsporas no se conoce en profundidad. Existen muy pocos estudios sobre la comparaciôn de la formaciôn de embriones derivados de polen con la embriogénesis cigôtica (Yeung et al., 1996; Bârâny et al., 2005). Los resultados obtenidos con pimiento muestran que en la etapa inicial de proliferaciôn, la formaciôn de estructuras multicelulares y de proembriones no parece seguir un patrôn de divisiones constante y defmido, como ocurre en la embriogénesis cigôtica (Raghavan et al., 2000). Sin embargo, en etapas de desarrollo posteriores como son la diferenciaciôn de la protodermis en los embriones globulares y el desarrollo posterior de los embriones corazôn y torpedo es muy similar a la secuencia de eventos que tiene lugar en la formaciôn de un embriôn cigôtico (Bârâny et al., 2005). Se identificaron proembriones tempranos y embriones tardios derivados de microsporas a través de diferentes patrones de la localizaciôn de almidôn. En los proembriones tempranos no se observé la presencia de almidôn, mientras en los embriones màs desarrollados se identificaron dos zonas; detectàndose una intensa acumulacién de almidôn en la zona interior (Bâràny et al., 2005). En los embriones cigôticos se observé el mismo patrôn y la misma localizaciôn del almidôn tanto en los proembriones tempranos como en los embriones tardios. Aùn no existen estudios sobre los componentes de la pared celular en los dos tipos de embriogénesis. Para buscar similitudes y diferencias se realizô un estudio de los componentes de la pared celular en las mismas etapas de la ruta embriogénica de microsporas derivadas a embriogénesis. En los proembriones tempranos cigôticos se observé un alto contenido de pectinas esterificadas en los componentes de la pared celular, mientras que no se observé presencia 155 Capitulo V. alguna de las pectinas no esterificadas, ni de XG o RGII. En embriones mas desarrollados como los embriones tardios cigoticos con dos tipos celulares, si se observé senal de pectinas no esterificadas, asi como de XG y de RGII en la zona exterior, y de pectinas esterificadas en la zona interior. Los resultados obtenidos son similares a los obtenidos con embriones derivados de microsporas y evidencian un patron comùn màs entre los embriones que se desarrollan a partir de los dos tipos embriogénesis: la derivada de microsporas y la embriogénesis cigotica. 156 _________ Capitulo V. 5. Bibliografia Albertsheim P., Darvill A.G., O'Neill M.A., Schols H.A., Voragen A .G J. (1996). An hypotesis; the same six polysaccarides are components of the primary cell walls of all higher plants. In Pectins and Pectinases (Viser, J. and Voragen, A.G.J., eds). Amsterdam: Elsevier Science BV, pp: 47-55. Aouali N., Laporte P., Clement C. (2001). Pectin secretion and distribution in the anther during pollen development in Lilium. Planta. 213: 71-79. Baluska P., Hlavacka A., Samaj J., Palme K., Robinson D.G., Matoh T., McCurdy D.W., Menzel D., Volkmann D. (2002). F-actin-dependent endocytosis of cell wall pectins in meristematic root cells. Insights from Brefeldin A-induced compartments. 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Cada familia de MAPK quinasas esta compuesta de un modulo de 3 quinasas: una MAP quinasa quinasa (MAPKKK) que fosforila y activa una MAP quinasa quinasa (MAPKK), la cual a su vez fosforila y activa una MAPK quinasa (MAPK). La fosforilaciôn reversible de MAPKs desempena un papel clave en la activaciôn de dianas especifîcas en el citoplasma o en el nùcleo, las cuales son los receptores ùltimos de las diferentes respuestas celulares (Posada y Cooper 1992). Varias MAPKs estân relacionadas con la diferenciaciôn y la proliferaciôn en células végétales (Bôgre et al., 1999; Coronado et al., 2002, 2007; Huang et al., 2002; Jonak et al., 1993; Mizoguchi et al., 1994; Préstamo et al., 1999; Wilson et al., 1997), pero solo algunas se han identifîcado recientemente por su expresiôn in situ, localizândose en el nùcleo de células en proliferaciôn (Préstamo et al., 1999) y en procesos de desarrollo, como el desarrollo del polen y la embriogénesis (Testillano et al., 2000a, 2005; Segui et al., 2005; Coronado et al., 2002, 2007). Las quinasas reguladas por senal extracelular (ERKs) pertenecen a la familia de las MAPK. Las ERK1/ERK2 son dos miembros de la familia de MAPKs que estân involucradas en la senalizaciôn de procesos de proliferaciôn y diferenciaciôn en células de mamiferos, a través de rutas de fosforilaciôn (Marshall et al., 1995; Meskiene et al., 2000). La microspora o grano inmaduro de polen normalmente sigue la ruta de desarrollo gametofïtica y se diferencia para dar lugar al polen maduro, un proceso que puede ser reproducido in vitro (Vicente et al., 1991). Con la aplicaciôn de un tratamiento de estrés, este desarrollo puede ser desviado hacia un proceso de proliferaciôn que conduce a la embriogénesis y la regeneraciôn de la planta; proceso conocido como embriogénesis de la microspora (Bueno et al., 1997; Gonzâlez-Melendi et al., 1995; Touraev et al., 1997; Bârâny et al., 2001, 2005). Este proceso constituye una herramienta muy importante en el cultivo de plantas para obtener plantas doble-haploides (Chupeau et al., 1998). El uso mâs amplio de esta tecnologfa estâ obstaculizado fundamentalmente por el escaso conocimiento de los mecanismos que dan lugar a microsporas embriogénicas. Los sistemas de 163 Capitulo VI._______________________________________________________________________ embriogénesis in vitro son unos modelos excelentes para estudiar los aspectos del desarrollo de la induccion a embriogénesis y la formaciôn del embriôn a partir de microsporas haploides aisladas. En este trabajo se han estudiado por primera vez los cambios dinâmicos en la expresiôn y localizaciôn subcelular de los homôlogos de ERK y de las formas activas de MAPK en dos programas diferentes de desarrollo del polen de Capsicum annuum L: la ruta gametofïtica (maduraciôn del polen, diferenciaciôn) y la ruta embriogénica, en concreto las etapas de inicio de la embriogénesis: proembriones tempranos (proliferaciôn) y embriones multicelulares tardios (diferenciaciôn). 164 _______________________________________________________________________ Capitulo VI. 2. Material y Métodos 2.1 Material Se cultivaron semillas de Capsicum annuum L., var. Yolo Wonder B (Ramiro Amedo, S. A., Calahorra, La Rioja) en substrato, y las plantas obtenidas se mantuvieron en incubador (MLR 350H, SANYO) a 25 °C, 80 % de humedad y un periodo de luz de 16 horas. Se seleccionaron botones florales de diferentes tamanos, se extrajeron sus anteras y se utilizaron tanto para el analisis del desarrollo gametofitico normal, como para el cultivo in vitro. 2.2 Cultivo in vitro de anteras Solo se emplearon botones florales de la primera floraciôn para los cultivos. El estado de desarrollo del polen se déterminé mediante tinciôn con DAPI de anteras aisladas (Vergne et al,, 1987, Gonzâlez-Melendi et al., 1995). Para los cultivos, se seleccionaron anteras con puntas coloreadas de azul procedentes de botones con pétalos y sépalos de longitud similar, correspondientes al estado de microspora vacuolada. Se esterilizô la superficie de los botones con una soluciôn al 5 % de hipoclorito sôdico. Se colocaron 15 anteras en un medio de induccion en cada una de las plaças Pétri de 5 cm de diâmetro con medio CP empleadas en el estudio (Dumas de Vaulx et al., 1981), complementado con 0,01 mg/1 de âcido 2,4—diclorofenoxiacético (2,4-D) y kinetina. Después de 8 dias a 35 °C y en oscuridad, se sometieron los cultivos a perfodos de 12 horas de luz a 500 pmol fotones/m^s a 25 °C. Después de 12 dias de induccion en medio CP, las anteras se colocaron en medio Ri (Dumas de Vaulx et al., 1981) complementado con 0,1 mg/1 de kinetina. 2.3 Anticuerpos En este estudio se emplearon dos anticuerpos, el anticuerpo policlonal anti-ERKl/2, que reconoce las p44/42 MAPKs (ERK1/ERK2), y el anticuerpo policlonal anti-fosfo- ERKl/2 especifico para la forma activada (fosforilada) de las p44/42 MAPKs, y cuando es activada cataliticamente por fosforilaciôn con Thr y Tyr en Thr-x-Tyr (TXY) especifîca 165 Capitulo VI._______________________________________________________________________ para MAPKs. Ambos anticuerpos proceden de Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA. 2.4 Electroforesis, Western Blot e inmunodeteccion de protemas Los cultivos de anteras se sumergieron en nitrogeno liquido y se homogenizaron en un mortero enfriado con “cracking buffer” (20 mM Tris HCl, pH 8 , 2 % SDS, 1 % B- mercaptoetanol, 1 mM PMSF). Se hirvieron durante 3 minutos y se centrifugaron durante 15 minutos. A continuacion, los sobrenadantes se centrifugaron tres veces mas. Las proteinas totales se cuantificaron mediante el método de Bradford empleando la protelna Merck's Bioquant. Para cada experimento, se midieron las mismas cantidades de proteinas y se separaron sobre 12 porciones de gel % SDS-polyacrylamide en 80 V, usando el kit BioRad (Hercules, CA, EE. UU) para llevar a cabo el Western blotting. Las proteinas se transfirieron a una membrana nitrocelulosa (PVDF; Millipore, Bedford, MA, EE. UU) durante 1 hora y, a continuacion, se bloquearon durante una noche en tampon de bloqueo (2 % de leche desnatada + 0,05 % Tween 20 en TBS) a 4 °C. Como control de la transferencia se tino una tira de la membrana con amido black para visualizar la cantidad de proteina total. La membrana se incubo durante toda la noche en temperatura ambiente, o bien con el anticuerpo anti-ERKl/2 o bien con el anti-phosphoERKl/2 en una dilucion 1: 200 en tampon de bloqueo. Después se lavaron cada una tres veces durante 10 minutos con soluciôn de lavado (0,2 % leche desnatada + 0,5 % Tween 20 en TBS). A continuaciôn, se incubaron durante 2 horas, con anti-rata (Sigma) conjugada con fosfatasa alcalina, en una diluciôn 1 : 1 0 0 0 de soluciôn de bloqueo, para posteriormente ser lavadas tres veces con soluciôn de lavado. El revelado del anticuerpo segundario se realizô mediante incubaciôn con una mezcla de azul de nitrotetrazolio (NTB, Sigma) y bromocloroindolil fosfato, (BCIP, Sigma) en un tampôn apropiado (NaHCOs 100 mM, NaCOg 50 mM, MgCb 6 H2O 4 mM). Por ultimo, se dejô secar cada membrana y se digitalizô con un escâner Hewlett Packard 6100C. Los contrôles se realizaron o bien con el anticuerpo primario, o con el segundario. 2.5 Crioprocesado de muestras para criocortes Se fljaron anteras de diferentes etapas del desarrollo gametofitico y en diferentes momentos del desarrollo del cultivo in vitro en formaldehido al 4 % (w/v) en PB S y pH 166 Capitulo VI. 7,3, durante toda una noche a 4 °C. A continuacion, se realizaron tres lavados con PBS de 10 minutos cada uno. Por ultimo, se lavaron con PBS y se crioprotegieron con soluciones de sacarosa de concentraciones crecientes: 0,1 M (1 h), 1 M (3 h), y 2,3 M toda la noche. Las muestras crioprotegidas se colocaron en una barrita de aluminio y se criofijaron en propano liquido utilizando una unidad KF80 (Reichert, Viena) a -170 °C. Los criocortes semifinos (1pm) se obtuvieron con el ultratomo de Ultracut E (Reichert) acoplado con la unidad FC4 para estabilizar a -75 °C. Los cortes obtenidos se colocaron sobre portaobjetos multipocillo (ICN, Costa Mesa, CA, USA). 2.6 Inmunofluorescencia La inmunofluorescencia se realizô sobre criocortes semifinos (1 pm). Los portaobjetos que contenian las muestras se lavaron con PBS para eliminar la sacarosa. Las muestras se bloquearon con 10 % de FCS (suero bovino fetal) en PBS durante 10 minutos. Las muestras se incubaron con el anticuerpo sin diluir durante 3 horas a 37 °C. Después, se realizaron 3 lavados con PBS de 5 minutos cada uno y a continuaciôn, se incubaron en oscuridad durante 45 minutos a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario anti- rata conjugado con Alexa 488, diluido al 1:25 en 5 % de FCS en PBS. A continuaciôn, se realizaron tres lavados con PBS y ddH2 0 y posteriormente, se tineron con DAPI (4,6- diamidine-2-phenylindol; Serva, Heidelberg, Alemania) durante 5 minutos. Por ultimo, se lavaron tres veces con dH2 0 y se montaron con Mowiol (Polysciences, Eppelheim, Germany). Los resultados se observaron empleando el scanner confocal Bio-Rad MRC- 1000 montado en un microscopio Zeiss Axiovert 135. Los contrôles se realizaron sustituyendo el primer anticuerpo por PBS. 2.7 Crioprocesado de muestras para microscopia electronica Se fîjaron anteras de diferentes etapas del desarrollo gametofitico y en diferentes momentos del desarrollo del cultivo in vitro en formaldehido al 4 % (w/v) en PBS pH 7,3, durante una noche a 4 °C. A continuaciôn, se lavaron en PBS y se deshidrataron empleando una serie de concentraciôn creciente de metanol (30 %, 50 %, 70 % y 100 %), con una bajada progresiva de temperatura de 40 °C a -30 °C. Las muestras se impregnaron con mezclas de metanol/Lowicryl K4M (en una serie 2:1, 1:1 y 1:2) a -30 °C, se encapsularon en résina pura a la misma temperatura, y se polimerizaron bajo la luz de UV a -30 °C 167 Capitulo VI._______________________________________ ______ ________________________ utilizando un equipo Leica AFS, como se ha descrito en trabajos previos (Testillano et al., 1995). Por ultimo se realizaron cortes ultrafinos (100 nm) para el estudio microscopio electronico. 2.8 Inmunomarcado con ore coloidal para microscopia electronica La inmunolocalizacion se llevo a cabo sobre cortes ultrafinos de Lowicryl K4M como se ha descrito en trabajos previos (Risueno y Testillano, 1994; Testillano et al., 1993). Las rejillas de niquel cubiertas por Formvar y carbon portando los cortes ultrafinos de Lowicryl se pusieron a flotar en gotas de ddH20, PBS y BSA (suero bovino albumin) al 5 % en PBS durante 5 minutos para bloquearlas. Después se incubaron con los anticuerpos sin diluir durante 3 horas a 37 °C y a continuacion, se lavaron con PBS. Para revelar los anticuerpos primarios, las rejillas se incubaron durante 45 minutos con el anticuerpo secundario anti-rata diluido al 1:25 en 1 % de BSA y conjugado con oro coloidal de 10 nm (Biocell, Cardiff, el Reino Unido) y se lavaron con PBS y ddH20. Finalmente, se secaron y se tineron con acetato de uranilo al 5 % durante 20 minutos, y con citrato de plomo durante 5 segundos. Por ultimo, las muestras se observaron en un microscopio electronico de transmisiôn JEOL 1010 a 80 kV. 2.9 Anàlisis cuantitativo del marcado con oro La densidad del marcado con oro, expresada como el numéro de particulas de oro por pm^, se déterminé en el nùcleo y en el citoplasma contando el nùmero de particulas de oro en cada compartimiento de la célula. Las areas se estimaron usando una rejilla cuadrada de 15 x 15 mm. El tamano minimo de la muestra (MSS) se determine empleando una técnica de media progresiva. Todos los anàlisis cuantitativo s se llevaron a cabo usando el programa BASIC desarrollado por el Dr. J. Renau-Piqueras, y los resultados se representaron en histogramas. La importancia estadistica de las diferencias entre los valores medios se determine mediante el ensayo Student, considerando diferencias significativas aquellas con P > 0,001. 168 Capitulo VI. 3. Resultados 3.1 Inmunoblotting con anticuerpos de MAPKs: anti-ERKl/ERK2 y anti-P-MAPK Se realize un inmunoblot para analizar la especificidad de los anticuerpos anti- ERK1/ERK2, anticuerpos que reconocen las quinasas homologas de las ERKs en plantas (Lebrun- Garcia et al., 1998), y los anticuerpos anti-fosfo-MAPK dirigidos al epitopo fosforilado del dominio TEY de la forma activa de las MAPKs (Lebrun-Garcia et al., 1998) en Capsicum annuum . Se ensayo el inmunoblotting en un extracto de protemas totales de microsporas. Tras el revelado, se observaron dos intensas bandas correspondientes a las protemas de ERKl y ERK2 de aproximadamente 42 y 44 kD (figura 1). 1 2 3 107 kO 76 kO 52 kû ERK1/ERK2 36.8 kO “ 27 kû 19 kû Figura 1. Inmunoblot anti-Erkl/Erk2. 1. Marcadores de peso molecular. 2. Protemas totales; tinciôn con amido black. 3. Se detectaron dos bandas intensas de aproximadamente 42-44 kD peso molecular en extracto total de protemas de grano de polen de Capsicum annuum L. 169 Capitulo VI._______________________________________________________________________ Con el anticuerpo anti-P-MAPK en el inmunoblot se detectaron varias bandas de menor intensidad alrededor de los 40 - 45 kD y una banda mas intensa en tomo a los 42 kD (figura 2). En ambos ensayos se realizaron contrôles sin el primer anticuerpo, no obteniéndose senal en ningun caso. 1 2 3 107 kD c;> 70 kD 52 kD 30.8 kD 27 kD 19 kD PMAPK Figura 2. Inmunoblot anti-P-MAPK. 1. Marcadores de peso molecular. 2. Protemas totales; tinciôn con amido black. 3. Se detecta una banda intensa de aproximadamente 42 kD peso molecular en extracto total de proteinas de grano de polen de Capsicum annuum L. Los resultados de los Western blots revelaron la presencia de ambos antigenos MAPK, de homôlogos ERK 1/2 y de formas activadas de MAPK en extractos de polen de Capsicum annuum, demostrando la especificidad de estos anticuerpos al material empleado. 170 _______________________________________________________________________Capitula VI. 3.2 Inmunolocalizacion de ËRKl/2 en la ruta gametofïtica Se estudio la localizaciôn in situ de ERK1/ERK2 y el posible cambio en la expresiôn y distribuciôn de la proteina durante varias etapas de la ruta gametofïtica y en diferentes etapas de la ruta embriogénica, taies como la etapa de proembriones tempranos y la etapa de los embriones multicelulares tardios, mâs desarrollados. Las microsporas en fase de microspora vacuolada (figura 3a-c) se caracterizan por tener una gran vacuola que desplaza al nùcleo hacia la periferia de la célula. A nivel ultraestructural los nùcleos muestran un patrôn de cromatina poco condensado con pequenas masas, abundantes estructuras fibrilares y granulares en la intercromatina y un gran nucleolo con abundante componente granular; todo ello caracteristico de la organizaciôn de un nùcleo con gran actividad trascripcional. El citoplasma forma una capa debajo de la pared o intina. En la etapa mencionada se observô una senal de fluorescencia tanto en el nùcleo como en el citoplasma (figura 3a-a'). Después de la primera mitosis se forma el polen bicelular joven, cuya maduraciôn da lugar a la etapa de bicelular maduro (figura 3b, d) en la que se observa un citoplasma muy denso con abundantes orgânulos, un reticulo endoplasmic o y numerosos ribosomas y plastidios con gran acumulaciôn de almidôn; por ùltimo, la célula generativa y su nùcleo mostraron una forma alargada con cromatina muy condensada. En la etapa mencionada se observô una senal de fluorescencia mas intensa en el citoplasma (figura 3b-b'). El inmunomarcado con oro anti-ERKl/2 revelô diferentes patrones en localizaciôn de esta proteina a nivel ultraestructural durante la ruta gametofitica, en fùnciôn de la etapa de desarrollo. Asi, en la fase de microspora vacuolada revelô la localizaciôn de ERK 1/2 tanto en el citoplasma como en el nùcleo (figura 3e). En la etapa de bicelular maduro el inmunomarcado fue mâs intenso en el citoplasma que en el nùcleo; en este ùltimo, las particulas de oro aparecen decorando algunas âreas de la regiôn intercromatinica y, ocasionalmente, la periferia de las masas de cromatina (figura 3f). En ambas etapas, el marcado citoplâsmico se localizô en zonas ricas en ribosomas, apareciendo los orgânulos libres de particulas de oro. 171 Capitulo VI. A n t , - E R K A n l i - E R K — I b Ex t 'a A * ' En En N Chr e t e t y . j / Figura 3. Inmunolocalization con anti-Erkl/Erk2 en la ruta gametofïtica (a-b). Tinciôn con DAPI para visualizar los nùcleos (a-b) y inmunofluorecencia (a'-b') sobre criocortes semifinos de 1 pm. En la etapa de microspora vacuolada (a) se observô una senal intensa tanto en el citoplasma como en el nùcleo (a'), en la etapa de bicelular maduro (b) se observô una intensa senal en el citoplasma (b'). La exina (Ex) o pared especial del polen mostrô autofluorecencia inespecifica. La microspora vacuolada al microscopio electrônico (c) y polen bicelular maduro (d) cortes ultrafinos de Lowicryl. El citoplasma de bicelular maduro es muy rico en orgânulos, el nùcleo vegetativo (NV) es de mayor tamano y la cromatina (Chr) aparece con un patrôn mâs descondensado que el nùcleo vegetativo (hW). Inmunomarcado con oro con Erkl/Erk2 en el citoplasma (Ct); aparecen algunas particulas de oro (fléchas) en la microspora vacuolada (e), mientras que en la etapa bicelular maduro (f) aumenta la apariciôn de particulas de oro (fléchas) en el citoplasma. V; vacuola, En; envoltura nuclear. Barras: a, b: 10 pm; c, d: 2 pm, e, f: 200 nm. 172 _______________________________________________________________________Capitulo VI. 3.3 Inmunomarcado con ERKl/2 en la ruta embriogénica Tras la induccion a la ruta embriogénica, algunas microsporas se dividieron dando lugar a dos células iguales en tamano y organizaciôn estructural, separadas por una pared celular y con un citoplasma poco denso con algunas vacuolas. En estados posteriores del cultivo in vitro las estructuras bicelulares proliferaron dando lugar a estructuras multicelulares (figura 4a-c). Los proembriones tempranos mostraron células con forma poligonal, citoplasma denso y con el nùcleo en una posiciôn central. La inmunofluorecencia con ERK1/ERK2 en proembriones tempranos dio lugar a una intensa senal en el nùcleo (figura 4a-a'). A las tres semanas del inicio del cultivo, se observaron cambios morfolôgicos en los embriones multicelulares tardios, relacionados probablemente con el comienzo de la diferenciaciôn. En estos embriones multicelulares tardios (figura 4b-d) se observô una incipiente organizaciôn en dos zonas con capas de diferentes tipos celulares. En la inmunofluorescencia con ERK1/ERK2 en embriones multicelulares tardios se observô una intensa senal fluorescente principalmente en el citoplasma (figura 4b-b'), mientras que las vacuolas y las paredes no presentaron sefial (figura 4b-b'). A nivel de microscopia electrônica, en los proembriones tempranos se encontraron particulas de oro en el nùcleo y en el citoplasma (figura 4e), mientras que los orgânulos, las vacuolas y la pared celular aparecieron completamente libres de marcado. El marcado nuclear fue mâs abundante, apareciendo numerosas particulas de oro decorando algunas âreas de la regiôn intercromatinica y, ocasionalmente, la periferia de las masas de cromatina. En el proembriôn multicelular tardio, el marcado fue mâs intenso en el citoplasma (figura 4f) que en el nùcleo. No se encontrô prâcticamente ninguna particula de oro en los contrôles empleados sin afiadir el primer anticuerpo. 173 Capitulo VL A n t i - i : R K Aiili -RRK b b ’ ___ N Nu□ N Ct Pc Ct □ Pc Nu N N En Ct j / En Ct Pc Figura 4. Inmunolocalization con anti-Erkl/Erk2 en la ruta embriogénica (a-b). Tinciôn con DAPI (a-b) para observer los nùcleos y la inmunofluorecencia (a'-b') sobre criocortes semifinos de 1 pm. En la etapa de proembriôn temprano (a) se observô una senal intensa en el nùcleo (a'), y un cambio de localizaciôn del nùcleo al citoplasma (b') en la etapa de embriones multicelular tardios (b). Los proembriones tempranos (c) a nivel ultraestructural mostraron células altamente vacuoladas con forma poligonal, citoplasma denso y con el nùcleo en una posiciôn central. En los embriones multicelulares tardios (d) se observô una incipiente organizaciôn en dos tipos morfolôgicos de células. En la etapa de proembriones tempranos se observô un aumento intenso de particulas de oro (fléchas) de Erkl/Erk2 en el nùcleo (N), sin embargo en los embriones multicelulares tardios aparecieron en el citoplasma (Ct) y en ligero a disminuciôn en cantidad (fléchas). Ex: exina, V: vacuola. En: envoltura nuclear. Nu: nucleolo. Barras: a, b: 50 pm; c, d: 1 pm; e, f: 200 nm. Î74 Capitulo VI. 3.4 Analisis cuantitativo del inmunomarcado con ERKl/2 durante la ruta gametofitica y la embriogénica Para determinar la diferencia en el inmunomarcado con anti-ERKl/2 se realizô el estudio estadistico de la densidad media de particulas de oro (particulas de oro/pm^) durante los dos programas de desarrollo del polen (gametofitico y embriogénico), en los dos compartimentos celulares en los que previamente se habian observado diferencias: el citoplasma y el nùcleo. El escaso marcado en las vacuolas del citoplasma se considerô como un control intemo del nivel de fondo, del cual se obtuvo un valor medio por debajo de las 3 particulas por pm^ en todos los casos. La significaciôn estadistica de las diferencias en la densidad media del marcado con oro se calculô mediante el método de la “t” de Student. Los resultados obtenidos se muestran en los histogramas de la Figura 5. Durante la maduraciôn del polen, se encontrô una densidad de marcado baja en la microspora vacuolada tanto en el citoplasma (valor medio: 7,28 particulas/pm^) como en el nùcleo (6,99 particulas/pm^), no existiendo diferencias significativas entre ambas regiones en la densidad de marcado. En la etapa de bicelular maduro por el contrario, se detectô una densidad mayor de marcado en el citoplasma (valor medio: 9,33 particulas/pm^) que en el nùcleo (5,43 partlculas/pm^) (Figura 5a). 20 I" 10 ERK ■ Citoplasma □ Nùcleo M ic ro s p o ra v a c u o la d a B ic e lu la r m a d u ro 5a. El histograma représenta la densidad media con inmunomarcado con oro con los anticuerpos con Erkl/Erk2 durante la ruta gametofïtica. Se eligieron dos etapas de la maduraciôn: la microspora vacuolada al comienzo de la embriogénesis, y una etapa mas desarrollada como es el polen bicelular maduro. Las particulas de oro se observaron el citoplasma y en el nùcleo. En la etapa de polen bicelular maduro se observô un aumento de la densidad de marcado en el citoplasma al compararla con la de la microspora vacuolada. 175 Capitulo VI. Sin embargo, durante la embriogénesis del polen en las células de los proembriones tempranos, la densidad de marcado fue significativamente mayor en el nùcleo (valor medio: 8,68 particulas/pm^) que en el citoplasma (5,02 particulas/pm^). En la etapa posterior correspondiente a los embriones multicelulares tardios, se observô una densidad de marcado ligeramente superior en el citoplasma (valor medio: 8,98 particulas/pm^) que en el nùcleo (7,19 particulas/pm^) (figura 5b). ERK ■ Citoplasma □ Niideo 20 E 15 10 S 5 M icrospora vacuolada Proembriôn temprano Embriôn m ulticelular tardio 5b. El histograma représenta la densidad media con inmunomarcado con oro con los anticuerpos con Erkl/Erk2 durante de la ruta embriogénica. Se eligieron dos las primeras etapas del comienzo de la embriogénesis: los proembriones tempranos y una etapa mas desarrollada como son los embriones multicelulares tardios. Se determine en las etapas estudiadas la densidad de marcado en el citoplasma y el nùcleo. En los proembriones tempranos se observa un cambio de localizaciôn del marcado en el nùcleo al compararla con la de la etapa de embriones multicelulares tardios. Para comprobar y mostrar con mayor claridad la evoluciôn en la localizaciôn subcelular de ERKl/2 durante la ruta gametofitica y la ruta embriogénica, se compararon la densidad de marcado del nùcleo con la del citoplasma en todas las etapas estudiadas, mediante la relaciôn entre la densidad media de marcado nuclear y el citoplâsmico (figura 6a-b). 176 Capitulo VI. 1.5 0,5 0,96 0,581 M icrospora vacuolada B icelu lar maduro Figura 6a. Relaciôn marcado nuclear/citoplasmico de los anticuerpos anti-Erkl/Erk2 durante de la ruta gametofitica y en las etapas estudiadas. Los resultados muestran que en las microsporas que siguieron el programa de desarrollo gametofitico, la relaciôn marcado nuclear/citoplasmico desciende en la etapa bicelular maduro, siendo una localizaciôn principalmente citoplasmica. 1,72 M icrospora vacuolada Proembriôn temprano Embriôn m ulticelular tardio 6b. Relaciôn marcado nuclear/citoplasmico con los anticuerpos anti-Erkl/Erk2 durante de la ruta embriogénica, en las etapas estudiadas. La relaciôn marcado nuclear/citoplasmico desciende en los embriones multicelulares tardios quedando por debajo de la unidad, siendo una localizaciôn principalmente citoplasmica. Los resultados obtenidos sugieren que los embriones multicelulares tardios ya se encuentran en diferenciaciôn activa. 177 Capitulo VI._____________________________________________________________________ __ Los resultados obtenidos muestran que en las microsporas que continuaron con el programa de desarrollo gametofitico, la relaciôn marcado nuclear/citoplasmico desciende en la etapa bicelular maduro, siendo una localizaciôn principalmente citoplasmica. Sin embargo, en las microsporas que cambiaron su programa de desarrollo hacia la ruta embriogénica, las ERK1/ERK2 se acumulan en el nùcleo en los proembriones tempranos. El histograma muestra un aumento de aproximadamente 2 veces en la relaciôn de marcado nuclear/citoplasmico en la fase de microspora vacuolada, indicando una importante acumulaciôn de ERKl/2 en el nùcleo, precisamente en aquellos tipos celulares que estân proliferando mâs activamente en esta etapa. La relaciôn de marcado nuclear/citoplâsmico desciende en los embriones multicelulares tardios, quedando por debajo de la unidad e indicando por tanto una mayor localizaciôn en el citoplasma. 3.5 Inmunolocalizacion de las MAPKs fosforiladas activas durante la ruta gametofitica En la etapa de microspora vacuolada se observô una senal de P-MAPK tanto en el citoplasma como en el nùcleo siendo superior en el citoplasma (figura 7a-a'). En la fase de polen bicelular maduro se detectô también una sefial de P-MAPK mâs intensa en el citoplasma que en el nùcleo (figura 7b-b'), siendo mâs acusadas en esta fase las diferencias entre ambos compartimentos. Se realizô un estudio de la localizaciôn a nivel ultraestructural de MAP quinasas fosforiladas durante los dos programas de desarrollo del polen (el gametofitico y el embriogénico). En la fase de microspora vacuolada (figura 7c), se observaron particulas de oro en el nùcleo y en las âreas ricas en ribosomas del citoplasma: los orgânulos, mitocondrias y plastidios; mientras que la envoltura nuclear y pared celular apareciô libre de marca. En la fase de polen bicelular maduro se observô una mayor presencia de particulas de oro en el citoplasma que en el nùcleo (figura 7d). En el nùcleo se observô marcado en la regiôn intercromatinica, siendo muy escaso en las masas de cromatina condensada, nucleolo y demâs estructuras nucleares. La envoltura nuclear apareciô también libre de marca. En los contrôles realizados sin el anticuerpo primario, no se observaron particulas de oro en ninguna regiôn. 178 Capitulo VI. N En A n l i - P - M A P K N Ct A i i t i - P - M A P K En Figura 7. Inmunolocalization con anti-P-MAPK en la ruta gametofitica (a-b) Tinciôn con DAPI para visualizar los nùcleos (a-b) y inmunofluorecencia (a'-b') sobre criocortes semifinos de I pm. En la etapa de microspora vacuolada (a) se observô una senal intensa tanto en el citoplasma como en el nùcleo (a') en la etapa de bicelular maduro (b) se observô una intensa senal en el citoplasma (b'). La exina (Ex), que es la pared especial del polen, muestra autofluorescencia inespecifica. Inmunomarcado con oro con anti-P-MAPK en el citoplasma (Ct) aparecen algunas particulas de oro (fléchas) en la microspora vacuolada (e) en la etapa bicelular maduro (f) aumenta la apariciôn de la particulas de oro (fléchas) en la citoplasma. V: vacuola. En: envoltura nuclear. Barras: a, b: 10 pm; c, d: 200 nm. 179 Capitulo VI._______________________________________________________________________ 3.6. Inmunolocalizacion de las MAPKs fosforiladas activas durante la ruta embriogénica Las microsporas inducidas cambian su programa de desarrollo hacia a la ruta embriogénica que comienza con un periodo de proliferaciôn celular. En los proembriones tempranos se observô una intensa senal de P-MAPK en el nùcleo (figura 8a-a'); sin embargo, en los proembriones multicelulares tardios se observô una intensa senal fluorescente en el citoplasma (figura 8b-b'). A nivel ultraestructural, se observaron particulas de oro en la regiôn intercromatinica del nùcleo del proembriôn temprano y en las areas ribosômicas del citoplasma (figura 8c). El resto de los orgânulos citoplâsmicos y la envoltura nuclear no presentaron un marcado significativo, siendo la densidad del marcado inferior en el nùcleo que en el citoplasma. En el embriôn multicelular tardio se observô una distribuciôn similar a la etapa anterior, aunque la intensidad del marcado fue inferior en el citoplasma (figura 8d) que en el nùcleo. En los contrôles realizados omitiendo la presencia del anticuerpo primario, la ausencia de particulas de oro fue prâcticamente total. 180 D A P I N. A n l i - l^ -M A P K An ; , • • ' A n l i - P - M A P K ► . t n , - K En Vt # Ct ct *f‘'; Pc ■ fi’ Figura 8. Inmunolocalization con anti-P-MAPK en la ruta embriogénica (a-b) Tinciôn con DAPI (a-b) para observar los nùcleos y inmunofluorecencia (a'-b') sobre criocortes semifinos de 1 pm. En la etapa de proembriôn temprano (a) se observô una senal intensa en el nùcleo (a'), se observô un cambio de localizaciôn del nùcleo al citoplasma (b') en la etapa de embriones multicelulares tardios (b). En la etapa de proembriones tempranos se observô un intenso aumento de particulas de oro (fléchas) de anti-P-MAPK en el nùcleo (N), sin embargo en los embriones multicelulares tardios aparecen en el citoplasma (Ct) en menor cantidad (fléchas). Ex; exina, V: vacuola, En: envoltura nuclear. Nu: nucleolo. Barras: a, b: 50 pm; c, d: 200 nm. 181 Capitulo VI. 3.7. Anàlisis cuantitativo de! inmunomarcado de P-MAPK durante las dos rutas. Para conocer la significaciôn estadistica de las diferencias observadas en el inmunomarcado con oro, se realizô un anàlisis cuantitativo de la densidad de marcado, calculada como el nùmero de particulas de oro por pm^, en los distintos compartimentos celulares en los que se habian observado diferencias previamente: el citoplasma y el nùcleo. Se escogieron las mismas etapas de desarrollo que las elegidas para el anàlisis cuantitativo del inmunomarcado con oro con anti-ERKl/2. El escaso marcado en las vacuolas del citoplasma se considerô como un control intemo del nivel de fondo, del cual se obtuvo un valor medio por debajo de las 3 particulas por pm^ en todos los casos. La significaciôn estadistica de las diferencias en la densidad media del marcado con oro fue calculada mediante el método de la “t” de Student. Los histogramas de la figura 9 ilustran los resultados obtenidos para los dos programas de desarrollo del polen. Durante la maduraciôn del polen, se encontrô una densidad de marcado baja en la microspora vacuolada, siendo un poco mayor en el citoplasma (valor medio: 9,68 particulas/pm^) que en el nùcleo (7,56 particulas/pm^). Sin embargo, en la etapa de bicelular maduro fue justamente al contrario, detectândose una alta densidad del anticuerpo en el citoplasma (valor medio: 12,84 particulas/pm^) comparada con la del nùcleo (6,92 particulas/pm^) (figura 9a). P-MAPK ■ C ito p la s m a □ N ù c le o M cro»pora vacuolada Figura 9a. El histograma représenta la densidad media con inmunomarcado con oro con el anticuerpo con P-MAPK durante la ruta gametofïtica. Se eligieron dos etapas de la maduraciôn: la microspora vacuolada al comienzo de la embriogénesis, y una etapa mâs desarrollada como es el polen bicelular maduro. Las particulas de oro en el citoplasma y en el nùcleo. En la etapa de polen bicelular maduro se observa un aumento de la densidad de marcado en el citoplasma comparândolo con la de la microspora vacuolada. 182 Capitulo VI. Durante la primera etapa de la ruta embriogénica, la etapa de proembriones tempranos, se observe un cambio en la localizaciôn de la densidad de marcado de P- MAPK, el cual se alojô en el nùcleo. En las células de los proembriones tempranos se observô una densidad de marcado ligeramente mayor en el nùcleo (valor medio: 13,31 particulas/pm^) que en el citoplasma (10,01 particulas/pm^). En los embriones multicelulares tardios se observô una densidad de marcado superior en el citoplasma (valor medio: 8,58 particulas /pm^) que en el nùcleo (4,90 particulas/pm^) (figura 9b). P-MAPK ■ Citoplasma □ Nùcleo 20 15 10 g 5 Microspora vacuolada Proembriôn temprano Embriôn multicelular tardio 9b. El histograma représenta la densidad media con inmunomarcado con oro con el anticuerpo con anti-P-MAPK durante de la ruta embriogénica. Se eligieron dos etapas de la embriogénesis, la primera etapa del comienzo de embriogénesis, proembriones tempranos, y una etapa mâs désarroiladas como es la de embriôn multicelular tardio; en las etapas estudiadas la densidad de marcado se determinô en el citoplasma y el nùcleo. En el proembriones tempranos se observô un cambio de localizaciôn de marcado en el nùcleo comparândolo con la etapa de embriones multicelulares tardios. Para comprobar y mostrar con mayor claridad la evoluciôn en la localizaciôn subcelular de P-MAPK durante las rutas gametofïtica y embriogénica, se comparô la densidad de marcado del nùcleo con la del citoplasma en todas las etapas, expresândola mediante la relaciôn entre la densidad media del marcado nuclear y el citoplâsmico (figura lOa-b). 183 Capitulo VI. 1,5 0,78 M icrospora vacuolada B icelular maduro Figura 10a. Relaciôn marcado nuclear/citoplasmico de el anticuerpo anti-P- MAPK durante de la ruta gametofitica, en las etapas estudiadas. Los resultados muestran que en las microsporas que siguieron el programa de desarrollo gametofitico, la relaciôn marcado nuclear/citoplasmico desciende en la etapa bicelular maduro, siendo una localizaciôn principalmente citoplasmica. Los resultados muestran que en las microsporas que siguieron el programa de desarrollo gametofitico, la relaciôn marcado nuclear/citoplasmico desciende en la etapa bicelular maduro, siendo una localizaciôn principalmente citoplasmica (figura 10a). Sin embargo, las microsporas que cambiaron su programa hacia la ruta embriogénica, las P- MAPK se acumulan en el nùcleo de los proembriones tempranos. El histograma (figura 1 Ob) permite apreciar un aumento hasta un valor 1,8 veces mayor en la fase de microspora vacuolada, indicando una acumulaciôn de P-MAPK activa en el nùcleo celular, precisamente en aquellos tipos celulares que estân proliferando mâs activamente en este etapa. La relaciôn de marcado nuclear/citoplâsmico desciende en el embriôn multicelular tardio, etapa en la que comienza la diferenciaciôn, siendo una localizaciôn principalmente citoplâsmica. 184 Capitulo VI. M icrospora vacuolada Proembriôn temprano Embriôn m ulticelular tardio 10b. Relaciôn marcado nuclear/citoplasmico del anticuerpo anti-P-MAPK durante la ruta embriogénica, en las etapas estudiadas. La relaciôn marcado nuclear/citoplasmico desciende en los embriones multicelulares tardios, quedando por debajo de la unidad, y siendo una localizaciôn principalmente citoplasmica. Los resultados obtenidos sugieren que los embriones multicelulares tardios ya se encuentran en diferenciaciôn activa. Los resultados muestran un patrôn de distribuciôn y de cambios de localizaciôn subcelular, anâlogos entre las ERKl/2 y las formas activas de MAPK en las dos rutas de desarrollo del polen (comparar figuras 5 y 9). 185 Capitula VI. 4. Discusiôn Los modules de MAPKs estân implicados en la transducciôn de senales en respuesta a multitud de estimulos. Se han identificado homôlogos de MAPK diferentes especies de células vegetales (Hirt et al., 2000) incluidos granos de polen (Heberle-Bors et al., 2001; Coronado et al., 2002). En algunos estudios en células de mamiferos, se ha observado presencia de MAPKs en el nùcleo (Chen et al., 1992; Marshall et al., 1995; Shangera et al., 1992), pero pocos trabajos han confirmado la presencia de MAPKs en nùcleos de células vegetales (Coronado et al., 2002, 2007; Silva et al., 2004; Préstamo et al., 1999; Testillano et al., 2000 a,b, 2001; Segul et al., 2005). Los môdulos de MAPKs se relacionan con fenômenos de proliferaciôn (Jouannic et al., 2001) y diferenciaciôn (Tichtinsky et al., 1998). En este trabajo se han estudiado los cambios dinâmicos en la expresiôn y localizaciôn subcelular de los homôlogos de ERK y de formas activas de MAPK en los dos programas del desarrollo del polen de Capsicum annuum L: la ruta gametofitica (maduraciôn del polen y diferenciaciôn) y las dos primeras etapas de inicio de embriogénesis dentro de la ruta embriogénica: proembriones tempranos (proliferaciôn) y embriones multicelulares tardios (diferenciaciôn). Los resultados obtenidos muestran que la progresiôn de los procesos de diferenciaciôn y proliferaciôn se acompana de un incremento de la expresiôn de ERKs, junto con un cambio en la localizaciôn de estas proteinas. En aproximadamente 17 tipos celulares, el anticuerpo anti-ERKl/2 reconoce las dos ERKs en forma de dos bandas ERKl y ERK2, mientras que en Capsicum annuum el anticuerpo anti-MAPK se détecta como una ùnica banda intensa alrededor del homôlogo 42 kDa ERKl/2. La proporciôn relativa de ERKs en el nùcleo comparada con la cantidad en el citoplasma, calculada como el grado de densidad de marcado, fue mayor en células en proliferaciôn en las primeras etapas de embriogénesis que en la microspora vacuolada, sugiriendo que el desplazamiento de ERKs al nùcleo podria estar asociado con el inicio de la proliferaciôn, como se ha de s cri to en otras especies (Coronado et al., 2002; Segui et al., 2005). Por otro lado, la proporciôn de homôlogos de ERK en el citoplasma en la fase de polen bicelular y en los embriones multicelulares tardios, indica un posible papel de estas proteinas en la senalizaciôn en procesos de diferenciaciôn. Por lo tanto, las ERKs se 186 Capitula VI. relacionan con fenômenos de proliferaciôn y diferenciaciôn en animales (Marshall et al., 1995) y en plantas (Coronado et al., 2002; Segui et al., 2005). La inmunolocalizaciôn del epitopo fosforilado de la forma activa de las MAPKs se empleô para relacionar la activaciôn de las MAPK con su localizaciôn subcelular. Durante la diferenciaciôn (maduraciôn del polen) en la fase de polen bicelular se observô mayor proporciôn de las MAPKs activas en el citoplasma, siendo similar a la de las ERKs. Se ha descrito que algunas MAPKs se expresan durante la embriogénesis temprana del polen (Jouannic et al., 2001; Testillano et al., 2000b; Coronado et al., 2002). S in embargo, en las primeras etapas de inicio de la embriogénesis se observa una mayor presencia de MAPKs activas en el nùcleo comparada con la del citoplasma. Los datos obtenidos sugieren una actividad alta de las MAPKs en las células de los proembriones tempranos. Esta alta actividad de MAPKs también tiene lugar en otros sistemas vegetales en proliferaciôn como los meristemos de la raiz y células en suspensiones (Calderini et al., 1998; Préstamo et al., 1999), asi como en embriones tempranos de varias especies (Coronado et al., 2002; Jouannic et al., 2001; Testillano et al., 2000b; Ramirez et al., 2004; Segui et al., 2005). Hay pocos estudios sobre la localizaciôn celular de ERK1/ERK2 y P-MAPK en etapas mas avanzadas de la embriogénesis de microsporas, como son los embriones multicelulares tardios (Segui et al., 2005). En esta etapa se observô una presencia alta de ERKs en el citoplasma comparada con la del nùcleo. Los datos obtenidos sugieren una actividad de las MAPKs en los embriones multicelulares tardios, aunque sus dianas tienen una localizaciôn citoplâsmica. En otros sistemas vegetales en diferenciaciôn (Préstamo et al., 1999) se observô una actividad de MAPKs alta, al igual que en el polen en embriogénesis (Coronado et al., 2002, Segui et al., 2005). Los resultados sugieren que la localizaciôn de MAPKs en el nùcleo o en el citoplasma, y su translocalizaciôn entre estos compartimentos puede jugar un papel en la regulaciôn de la actividad, asi como la implicaciôn de estas moléculas senalizadoras en los procesos de proliferaciôn y diferenciaciôn que tienen lugar en las dos rutas de desarrollo del polen. 187 Capitula VI. 5. Bibliografia Bârâny, I, Gonzâlez-Melendi, P., Fadôn, B., Mitykô, J, Risueno, M. C., Testillano, P. Microspore-derived embryogenesis in pepper {Capsicum annuum L.): subcellular rearrangements through development. Biol.Cell, 709-722. 2005. Bôgre L., Calderini O., Binarova P., Mattauch M., Till S., Kiegerl S., Jonak C., Pollaschek C., Barker P., Huskisson N. S., Hirt H., Heberle-Bors E. (1999). 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Cambios en el dominio de cuerpos nucleares con la reprogramacion de la microsporas hacia la embriogénesis Se analizô la presencia de los cuerpos nucleares y en particular de los cuerpos de Cajal durante las etapas representativas del desarrollo gametofïtico y de la embriogénesis haploide en microsporas aisladas y en cultivos de anteras de un sistema modelo {Brassica napus cv. Topas) y de una especie récalcitrante {Capsicum annuum L. var. Yolo Wonder B). El dominio de los cuerpos nucleares esta involucrado en diversos roles importantes en el metabolismo nuclear, estando los cuerpos de Cajal involucrados especificamente en el almacenamiento y la maduraciôn de las snRNPs y las snoRNPs; asi como en otros eventos necesarios para el procesado de ARNm y pre-ARNr, aunque no directamente para la transcripciôn. En este trabajo se han llevado a cabo inmunofluorescencias y marcados con oro coloidal con anticuerpo anti-trimetilguanosina especifico para snARNs, asi como anâlisis ultraestructurales y citoquimicos sobre muestras crioprocesadas observadas con el microscopio ôptico y electrônico respectivamente. Los resultados mostraron un incremento de los cuerpos de Cajal durante las etapas tempranas del desarrollo embriogénico de la microspora (proembriones jôvenes), al compararlos con los correspondientes al desarrollo de la microspora y el polen. Estos resultados sugieren que los cuerpos de Cajal pueden jugar un papel en las etapas transcripcionalmente activas que caracterizan al desarrollo temprano de la embriogénesis derivada de microspora. 1. Introducciôn La embriogénesis derivada de microspora se define como la desviaciôn de la ruta gametofitica hacia un desarrollo embriogénico con regeneraciôn de plantas haploïdes o doble-haploides. Este cambio en el programa de desarrollo esta inducido generalmente mediante un leve tratamiento previo por estrés quimico o fïsico (calor, frio, ayuno, etc; Chupeau et al., 1998; Maluszynski et al., 2003). No todas las células présentés en el cultivo reaccionan de la misma manera al tratamiento inductivo, ya que algunas de ellas son microsporas que se inducen de forma efectiva (desviadas/reprogramadas), mientras que otras no, y continùan con el desarrollo gametofïtico (Custers et al., 1994; Segui-Simarro et al., 2001). Por eso, es importante identificar los marcadores celulares del programa de desarrollo embriogénico. La sintesis de proteinas de heat shock (HSPs) y de las proteinas kinasas “mitogen - activated" (MAPKs), asi como las reorganizaciones en el citoesqueleto 191 Capitula VIL European Journal o f Histochemistry 50. I. 35-44 (2006) de la célula han sido propuestas ya en trabajos previo s como marcadores celulares de este cambio (Zarsky et al., 1995; Binarova et al., 1997; Simmonds y Keller, 1999; Bârâny et al., 2001; Pechan y Smykal, 2001; Coronado et al., 2002; Segui-Simarro et al., 2003, 2005). Ademâs, determinados dominios nucleares parecen ser los objetivos de la traslocalizaciôn nuclear de HSPs y MAPKs. Dominios especificos de la region intercromatinica, previamente definidos como lugares de transcripciôn (Testillano et al., 1993) son ricos en MAPKs y HSP70 (Bârâny et al., 2001; 2005; Coronado et al., 2002; Segui-Simarro et al., 2003, 2005). Existen diversas evidencias estructurales que indican que el nùcleo es un compartimente celular que cambia su organizaciôn funcional como consecuencia de la inducciôn de la embriogénesis derivada de microspora (Testillano et al., 2000; 2005). En muchos tipos diferentes de células animales y vegetales se ha establecido una relaciôn directa entre la organizaciôn funcional del nùcleo y el estado metabôlico de la célula (Fakan y Puvion, 1980; Risueno y Medina, 1986; Raska et al., 1991; Andrade et al., 1993; Spector et al., 1993; Gonzâlez-Melendi et al., 1998; Segui-Simarro et al., 2001, Fakan et al., 2004). Dentro del nùcleo, el nucleolo y la regiôn intercromatinica son dominios nucleares que remodelan su arquitectura después de la inducciôn (Risueno y Testillano, 1994; Testillano et al., 2005). Recientemente se han propuesto a los cuerpos nucleares como e structuras potencialmente sensibles a los cambios en la actividad proliferativa de las células vegetales (Testillano et al., 2005). Los cuerpos de Cajal (CBs) fueron descritas por primera vez en neuronas por Ramôn y Cajal (1903) como “cuerpos accesorios”, por su localizaciôn prôxima al nucleolo y su marcado con plata. Debido a su particular arquitectura se han denominado también “cuerpos enrollados” por Monneron y Bemhard (1969) en células de mamiferos, y después en células vegetales por Moreno-Diaz de la Espina y colaboradores (1982b). Los CBs estân présentes como elementos constitutivos del nùcleo en las células diferenciadas y en proliferaciôn, tanto animales (Gall et al., 2000) como vegetales (Risueno y Medina, 1986; Beven et al., 1995; Straatman y Schel, 2001). Estructuralmente los CBs son dominios redondeados de hasta 2.0 pm, que aparecen en las imâgenes del microscopio electrônico como lazos enrollados y compactos embebidos en la regiôn intercromatinica (Beven et al., 1995; Lafarga et al., 1998; Fakan et al., 2004; Raska et al., 2005). Frecuentemente, se han encontrado asociados con el nucleolo o conectados con los grânulos intercromatinicos (Risueno y Medina 1986). Los CBs se caracterizan por la presencia de la proteina p80 coilin, que es el antigeno de Sm y de pequenos ARNs (snARNs), asi como de las proteinas 192 European Journal o f Histochemistry 50. 1. 35-44 (2006) CapUulo VII. nucleolares fibrillarin, Noppl40 y de la proteina ribosomal S6 (revision de Gall, 2000). Aunque no se conoce con profundidad la funciôn de los CBs, parece claro que no estân directamente relacionados con el procesado del ARNm (Huang et al., 1994), aunque si con la maduraciôn de las snRNPs y las snoRNPs, con el procesado de histona ARNm 3’ (Dominski y Marzluff, 1999) y con la biogenesis y el almacenamiento de la transcriptosoma y de los factores de procesado (Spector et al., 1993; Gall et al., 2000; Proudfoot et al., 2000), snRNPs (Carvalho et al., 1999) y snoRNPs (Narayanan et al., 1999; Platani et al., 2000). Brassica napus se considéra una especie modelo para el estudio de la embriogénesis derivada de microspora (Chupeau et al., 1998), aunque todavia no se conocen con profundidad los mecanismos celulares que controlan este proc eso. En contraste. Capsicum annuum, de importante interés econômico, se considéra especie récalcitrante debido a la extrema difîcultad para lograr la desviaciôn del desarrollo de la microspora a la embriogénesis. S in embargo, en los ùltimos anos, varios grupos de investigaciôn han realizado de forma exitosa la regeneraciôn de plantas haploïdes de pimiento (Mitykô et al., 1995; Bârâny et al., 2001, 2005). El objetivo de este trabajo, es el estudio de los cambios en los cuerpos nucleares, centrândose especialmente en los CBs, durante el cambio a la embriogénesis derivada de microspora en una especie modelo {Brassica napus) y otra récalcitrante {Capsicum annuum), para evaluar su uso potencial como marcadores de un cambio en el programa de desarrollo. Los resultados de la comparaciôn de células proembriones en proliferaciôn y las células en la etapa de diferenciaciôn de las microsporas que siguen el programa gametofïtico muestran que los cuerpos nucleares y, especificamente, los CBs aumentan en numéro después de la inducciôn a la embriogénesis derivada de microspora. 193 CapUulo VIL______ European Journal o f Histochemistry 50. I. 35-44 (2006)_____________ 2. Material y Métodos 2.1 Material Se cultivaron plantas donantes de Brassica napus L. Cv. Topas y Capsicum annuum var. Yolo Wonder B tal y como se ha descrito en trabajos previos (Segui-Simarro et al., 2003; Bârâny et al., 2005). El cultivo de microsporas de Brassica y la inducciôn a la embriogénesis (16 h. a 32.5 °C) se realizô segùn el método descrito por Jouannic et al., 2001 y en el caso de la anteras de Capsicum, segùn Bârâny et al., 2005. 2.2 Anticuerpos Para la identificaciôn de los cuerpos de Cajal mediante inmunofluorescencia y inmunomarcado con oro coloidal para M.E.T., se utilizô anti-2,2,7 trimetil guanosina (TMG) de Calbiochem (Clone K l21). Este anticuerpo reacciona de forma cruzada con la tapa especifica para los pequenos ARNs nucleares (snARN) présentes en las pequenas ribonucleoproteinas nucleares (snRNPs) de la maquinaria de procesado de ARNm. 2.3 Inmunofluorescencia Se prepararon las microsporas y los cultivos de embriones haploides para la criomicrotomia y los criocortados como se ha descrito en trabajos previos (Segui-Simarro et al., 2003). Los cortes semifmos (1 pm) obtenidos se colocaron en portaobjetos multipocillo ICN Multiwell. Después se realizô la inmunofluorescencia segùn se describe en Segui-Simarro et al., 2003; el anticuerpo primario anti-TMG se diluyô al 1:100 y se incubô durante 1 hora a temperatura ambiente. Para revelar el anticuerpo primario, se utilizô el anticuerpo secundario anti-ratôn IgG-Cy3, diluido al 1:25 en 1 % BSA en PBS, y se incubô durante 45 minutos en oscuridad. Para revelar los nùcleos, se tineron los cortes con DAPI. Los resultados se observaron mediante scanner confocal Bio-Rad MRC-1000 acoplado en un microscopio Zeiss Axioveit 135. Los contrôles se realizaron sustituyendo el primer anticuerpo por PBS. 194 European Journal o f Histochemistry 50. 1. 35-44 (2006) CapUulo VII. 2.4 Crioprocesado de muestras para microscopia electronica Se fijaron las muestras en medio fijador Kamovsky (4 % formaldehido + 5 % glutaraldehido en tampon 0,025 M cacodilato, pH 6,7), tratadas posteriormente con 2 % 0 s0 4 , y deshidratadas en series de metanol durante 3 dias y embebidas lentamente en résina Epon durante 2 dias, para la observacion con el microscopio electrônico. Los bloques de Epon se polimerizaron a 60 °C durante 2 dias. Se realizaron cortes de unos 80 nm de espesor y se colocaron en rej illas de cobre de 75 mesh, se contrastaron con acetato de uranilo y citrato de plomo y, finalmente, se observaron en un microscopio electrônico JEOL 1010 operado a 80 kV. Se fijaron varias muestras en 4 % de formaldehido en PBS y se deshidrataron con el PET (siglas en ingles para el método de Bajada Progresiva de Temperatura) en un sistema Leica APS. Posteriormente se infîltraron las muestras y se polimerizaron a -30 °C en résina Lowicryl K4M con luz UV. A algunos cortes ultrafmos se aplicô el método descrito por Bemhard et al., 1969., citoquimico especifico para RNPs, con tinciôn regresiva de EDTA. 2.5. Inmunomarcado con oro coloidal Se prefijaron microsporas y embriones haploides en diferentes etapas en formaldehido, crioprotegidas en sucrosa 2,3 M, criofijadas en nitrôgeno liquido y crioprocesadas segùn el método descrito por Segui-Simarro et al., 2003. Las muestras se trataron con metanol + 0.5 % acetato uranilo a -80 °C durante 3 dias, se infîltraron en Lowicryl K4M, y se polimerizaron a -30 °C de bajo luz UV usando un equipo Leica APS. Los cortes semifinos (80 nm) se colocaron en rej illas de niquel. A continuaciôn, las rej illas se pusieron a flotar en gotas de PBS, 5 % BSA en PBS, y anti-TMG diluida al 1:100, durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de varios lavados en 1 % de BSA en PBS, las rej illas se incubaron con el anticuerpo segundario anti-ratôn IgG-gold, de 10 nm; (Biocell, Cardiff, UK) diluido al 1:25 en 1 % de BSA, durante 45 minutos a temperatura ambiente, se lavaron, se secaron, se contrastaron, y se observaron con un microscopio electrônico JEOL 1010 a 80 kV. Los contrôles se realizaron eliminando el anticuerpo primario. 195 Capîtulo VU. European Journal o f Histochemistry 50. 1. 35-44 (2006) 3. Resultados 3.1. Reorganizaciones celulares después de la reprogramacion de la microspora a embriogénesis Los cultivos de microsporas de Brassica napus y Capsicum annuum se han empleado para estudiar los cambios en el dominio de los cuerpos nucleares. Primero, se compararon los progresos de ambos sistemas in vitro con el desarrollo in vivo. Durante las etapas estudiadas del desarrollo gametofïtico y las primeras etapas del desarrollo embriogénico, ambos sistemas tuvieron patrones y etapas de desarrollo similares. Se seleccionaron las anteras donantes de Brassica napus y de Capsicum annuum que contenian fundamentalmente microsporas de la etapa microspora vacuolada (figuras lA, A’, B, B’), que se caracterizan por la presencia de una gran vacuola central que desplaza al nùcleo a una posiciôn periférica. En Brassica, el marcado con DAPI revelô un patron de cromatina descondensada, con una senal débil de fluorescencia, con pequenos puntos brillantes indicando masas de cromatina condensada generalmente en la periferia del nùcleo (figuras lA ’, C’). Por el contrario, en Capsicum, la fluorescencia de cromatina apareciô, tras el marcado con DAPI, como una senal fuerte y homogénea, indicando un patron de cromatina compacto (figuras IB ’, D ’). Después de la primera mitosis se formé el grano del polen con dos células diferentes, la generativa y la vegetativa. A medida que madurô el grano de polen, la célula generativa émigré hacia el centro de la célula, como evidencia su posiciôn central bastante prôxima al nùcleo vegetativo (figuras 1C, C’, D, D’). La cromatina del nùcleo generativo se revelô con un patrôn de alta condensaciôn, como evidencia el brillo del marcado con DAPI al compararlo con la débil fluorescencia del nùcleo vegetativo. En Brassica, la segunda mitosis del polen tiene lugar en el grano de polen dando lugar a un polen tricelular maduro, a diferencia de la etapa bicelular del polen maduro de Capsicum. En aquellas microsporas que fueron inducidas con éxito a la embriogénesis, las sucesivas divisiones celulares dieron lugar a células estructuralmente similares, en lugar de las células vegetativa y generativa del grano de polen, que son morfolôgicamente diferentes. Los proembriones jôvenes estân compuestos de células indiferenciadas que proliferan activamente dentro de la pared de exina hasta que ésta se rompe (figuras lE, E% 196 European Journal o f Histochemistry 50. 1. 35-44 (2006) CapUulo VII. F, F’). Tanto en Brassica napus como en Capsicum annuum los nùcleos de las células de los proembriones mostraron una fluorescencia DAPI débil extendida por el nucleoplasma. 3.2. Los cuerpos nucleares en la ruta de desarrollo del polen En los nùcleos de las microsporas y proembriones de Brassica (figuras 1 A% E ’) se observô una gran region intercromatinica, un nucleolo generalmente centrado y pequenas masas de cromatina condensada, que aparecieron en el envoltorio nuclear. fi Figura 1. Etapas de desarrollo gametofitico y de embriogénesis derivada de microspora en Brassica napus (pares A, C y E) y Capsicum annuum (pares B, D y F). A-F: Imâgenes de contraste de fase. A’-F’: marcado con DAPI. A-B’: microsporas vacuoladas. C-D’: polen bicelular. E-F’: proembriones jôvenes después de la ruptura de la exina. Barras en A-D’; 10 pm. Barras E-F’: 50 pm. 197 CapUulo VIL_______ European Journal o f Histochemistry 50. 1. 35-44 (2006)____________ En Capsicum, los patrones de cromatina se mostraron mas condensados, con pequenas y numerosas masas conectadas con lazos de cromatina de diferentes espesores (figuras 2A-C, 3A, 5A). Se observô también un nucleolo muy visible. Los cuerpos nucleares (CNs) estân localizados en la regiôn intercromatinica como elementos constitutivos de la arquitectura nuclear (figuras 2A, B, 3, 4, 5A-B); frecuentemente se observaron en el mismo piano de secciôn que el nucleolo y asociados con él (figuras 2B, 3C, 4C, 5B). Junto con los CNs, uno de los cuerpos mâs notorios son los cuerpos de Cajal (CBs), que se describieron como anti-TMG positivos (Testillano et al., 2005). En este trabajo se utilizô este anticuerpo para identificar especificamente los CBs de entre el resto de CNs (figuras 2D, 5D-E), para poder analizar el dominio de los cuerpos de Cajal durante el desarrollo del polen y los cambios que acompanan a la embriogénesis derivada de microspora reprogramada. Durante el desarrollo de la microspora de Capsicum y Brassica, los CNs estân présentés en la regiôn intercromatinica (figuras 2A, 3A, 4A), también en el mismo piano de secciôn que el nucleolo y frecuentemente asociado a los componentes nucleares (figuras 3C, 4C), pero sin relaciôn con las masas de cromatina. Después de la primera divisiôn del polen, el polen bicelular joven mostrô una presencia similar de CNs, siempre présentes en el nùcleo vegetativo altamente activo (figura 2B). Sin embargo, estos CNs fueron muy escasos en los granos de polen maduros, estando ausentes en la mayoria de los nùcleos observados (figura 2C). El patrôn de inmunofluorescencia anti-TMG consistiô en una senal débil y difusa extendida por el nucleoplasma (figuras 2D, F). En algunas microsporas (figura 2D) y en el polen bicelular joven se observô la senal como un punto brillante. El marcado con DAPI de algunos cortes (figura 2E) revelô que los puntos brillantes no se solapaban con el ADN marcado con DAPI, confirmando la ausencia de ADN en estos cuerpos. No pudimos detectar nunca mâs de uno por corte de nùcleo de microspora o polen en desarrollo (figuras 2A, B, 3A, 4A). Ni los granos de polen maduro, ni el nùcleo vegetativo ni el generativo mostraron puntos brillantes después de la inmunofluorescencia con anti-trimetil guanosina (figuras 2F, G). 198 European Journal o f Histochemistry 50. 1. 35-44 (2006) CapUulo VII. Figura 2; Los cuerpos nucleares y el patron de organizaciôn de cromatina durante el desarrollo gametofitico. A-C: imâgenes al electrônico. A: microspora vacuolada. B: nucleolo de grano de polen bicelular joven. La fecha negra marca los cuerpos nucleares que aparecen en el mismo piano que el nucleolo, y frecuentemente asociados con él. Diferentes grados de condensaciôn de cromatina: A, patrôn descondensado; B, C: descondensadas en el nùcleo vegetativo, y condensada en el generativo. D-G: inmunofluorescencia anti-TMG (D, F) y marcado con DAPI (E, G) de una microspora vacuolada (D, E) y un grano de polen bicelular maduro (F, G), las fléchas blancas marcan los CB (D) y la ausencia de fluorescencia en las correspondientes regiones de la imagen del marcado con DAPI (E). ct: citoplasma; ex: exina; gc: célula generativa; gn: nùcleo generativo; n: nùcleo; nu: nucleolo; v: vacuola; vc: célula vegetativa; vn: nùcleo vegetativo. Barras A-C: 2 pm. Barras D-G: 5 pm. 199 CapUulo VIL European Journal o f Histochemistry 50. 1. 35-44 (2006) El anâlisis con microscopio electrônico de los CBs présentes en la microspora revelô que son cuerpos redondos con una estructura fina que contiene lazos enrollados densos inmersos en material de baja densidad (figuras 3 y 4). mr * Figura 3: Organizaciôn ultraestructural de cuerpos de Cajal en los nùcleos de microsporas. A: nùcleo de microspora de Capsicum con 1 cuerpo de (cb) en la regiôn intercromatinica. B, C: Gran ampliaciôn de la imagen de CBs en la regiôn intercromatinica (B) y asociados con el nucleolo (C), mostrando una estructura en espiral con conexiones con las estructuras intercromatinicas (fléchas blancas). n: nùcleo, nu: nucleolo, chr: cromatina, ct: citoplasma, ex: exina. Barras: 250 nm. 200 European Journal o f Histochemistry 50. 1. 35-44 (2006) CapUulo VII. Ï 1 Figura 4: Estructura fina de cuerpos de Cajal revelada con citoquimica EDTA para RNPs. A: Nùcleo de microspora de Capsicum con cromatina condensada (chr) revelada con EDTA; las estructuras intercromatinicas, el nucleolo (nu) y el cuerpo de Cajal (cb) aparecen generalmente contrastados. B, C: Imâgenes muy ampliadas de CBs en la region intercromatinica (B) y asociados con el nucleolo (C); se observan estructuras fibrilares EDTA-positivas (flecha) conectando los CB con las estructuras intercromatinicas. n: nùcleo, ct: citoplasma, ex: exina. Barras: 250 nm. 201 Capîtulo VIL European Journal o f Histochemistry 50. I. 35-44 (2006) El marcado regresivo EDTA para RNPs contrasta preferentemente en la microspora, el nucleolo y las estructuras intercromatinicas, CBs incluidos (figura 4); revelando también que estân en conexiôn con las estructuras fibrilo-granulares de la region intercromatinica (figuras 4B, C). Se puede observar también que los grânulos intercromatinicos estân conectados a los CBs (figuras 3C, 4C). 3.3. Cambios en los cuerpos nucleares después de la reprogramacion a embriogénesis A diferencia del programa de desarrollo del polen, durante la inducciôn a la embriogénesis derivada de microspora, los CNs fueron encontrados en las microsporas embriogénicas divididas simétricamente y en los proembriones en desarrollo (figura 5). Los CNs aparecen en imâgenes M.E.T. (figura 5A) como masas densas con forma redondeada y de tamano variable, con una textura fibrilar enrollada y gruesa, similar a la de los meristemos en células de la raiz en proliferaciôn (Moreno-Diaz de la Espina et al., 1982a, 1982b). En algunos cortes se observaron hasta 2 CNs en el mismo corte (flecha en figura 5B), y frecuentemente sobre la superficie nucleolar. Los CBs aparecieron también conectados con los grânulos intercromatinicos (figura 5B), como ya se ha observado en trabajos previos sobre los meristemos de la raiz (Moreno-Diaz de la Espina et al. 1982a, b). La inmunofluorescencia del marcado con anti-TMG (figura 5D) y con DAPI (Figura 5C) en proembriones jôvenes revelô la presencia de al menos un CB en la mayoria de las células présentés en el mismo corte del proembriôn, a menudo prôximo al nucleolo. Los puntos brillantes de la fluorescencia con anti-TMG (fléchas en figura 5D) coinciden con un punto oscuro cuando obtenemos imâgenes con marcado con DAPI de las mismas células (fléchas en figura 5C), indicando que los puntos brillantes, posiblemente CBs, se localizan en la regiôn intercromatinica. A nivel de microscopio electrônico, el marcado con oro anti- TMG de las células de los proembriones revelô la presencia de algunas particulas de oro dispersas en la regiôn intercromatinica (figura 5E) correspondientes a los snRNPs, y densamente acumulados especialmente sobre algunos CNs, con un tamano, forma, ultraestructura y localizaciôn nuclear similar a los CBs descritos en varios sistemas vegetales bajo diferentes condiciones de desarrollo. Este patrôn de marcado fue muy especifico, como demostraron los ensayos de control que se realizaron excluyendo el primer anticuerpo (datos no mostrados). En los proembriones jôvenes, se observaron dos o très CNs en un ùnico corte celular en algunas ocasiones (figura 5B). Los CBs anti-TMG- 202 European Journal o f Histochemistry 50. 1. 35-44 (2006) CapUulo VII. positivos parecen aumentar en los proembriones jôvenes derivados de microsporas (figuras 5C-E). " Fif nu 7 '■ ■ . % " - ' I • :• n nu n Figura 5: Cuerpos nucleares durante el desarrollo embriogénico inducido en la microspora. A-B; Imâgenes M.E.T. de células de proembriones de Capsicum (A) y Brassica (B), mostrando CNs de diferentes tamanos (fléchas negras). C-D: marcado con DAPI (C) e inmunofluorescencia anti- TMG (D) de un proembriôn joven de Brassica, mostrando los CBs intensamente marcados (fléchas blancas en D), y la ausencia de fluorescencia en las regiones correspondientes de la imagen de marcado con DAPI (fléchas blancas en C). E: Imagen al electrônico de marcado con oro anti-TMG de una célula de un proembriôn joven de Brassica, mostrando acumulaciôn de particulas de oro sobre un CB. cb: cuerpo de Cajal; chr: cromatina condensada; ct: citoplasma; n: nùcleo; nu: nucleolo. Barras A, B, E: 500 run. Barras C-D: 10 pm. 2Ô3 Capîtulo VIL European Journal o f Histochemistry 50. 1. 35-44 (2006) 4. Discusiôn Brassica napus y Capsicum annuum son ejemplos representativos de una especie modelo fâcilmente inducible y récalcitrante respectivamente, en relaciôn a la respuesta a tratamientos de estrés para cambiar la ruta de desarrollo de la microspora a la embriogénesis. Ambos sistemas tienen varias caracteristicas comunes, como la identificaciôn del estado de microspora vacuolada como el mâs apropiado para la inducciôn a la embriogénesis y la necesidad de un tratamiento de choque térmico como tratamiento inductivo (Segui-Simarro et al., 2003; Bârâny et al., 2005), aunque la eficiencia en la respuesta a tal tratamiento difiere enormemente de una a otra (Custers et al., 1994; Mitykô et al., 1995). Como se esperaba, la comparaciôn en ambos sistemas de los desarrollos gametofïtico y embriogénico inducidos en la microspora mostraron una similitud notable (figura 1). El anâlisis paralelo en ambos sistemas, de los cambios en el patrôn de cromatina, y del dominio de los NB no mostrô diferencias entre las dos especies durante el desarrollo del polen y de la microspora, ni durante el cambio a la embriogénesis. La interfase de cromatina se organiza en masas irregulares que ocupan territorios especificos en el nùcleo. Se ha observado que el interior del nùcleo aloja cromosomas ricos en genes, mientras que los cromosomas pobres en genes permanecen en la periferia. Por eso, las secuencias no transcritas estân localizadas en la periferia del nùcleo mientras que los genes activos y las regiones ricas en genes tienden a localizarse en las regiones expuestas al interior o en lazos extendiéndose desde esos territorios (Dietzel et al., 2004; Gorisch et al., 2005). De esta manera la reorganizaciôn del patrôn de cromatina y la localizaciôn observada durante las diferentes etapas de la embriogénesis derivada de microspora reflejaria los requerimientos especificos de la ruta de desarrollo. Estos requisitos son: un incremento en la actividad durante las etapas de proliferaciôn y un descenso de las actividades durante la diferenciaciôn, como ocurre durante el desarrollo gametofïtico de la microspora. Las actividades biolôgicas de los cuerpos nucleares, y su localizaciôn y dinâmica parecen estar estrechamente relacionadas con la expresiôn de los genes. Los cuerpos de Cajal y los cuerpos PML se localizan regiones especifïcas dentro del nùcleo, aparentemente relacionadas con la organizaciôn dinâmica y la accesibilidad de la cromatina, puesto que las propiedades del entomo de la cromatina determinan la movilidad de los cuerpos de Cajal (y los PML) (Gorish et al., 2005). En células vegetales en 204 European Journal o f Histochemistry 50. 1. 35-44 (2006) CapUulo VII. proliferaciôn, se ha observado que los CBs pueden translocalizarse incluso desde el nùcleo al citoplasma (Moreno-Diaz de la Espina et al., 1982a, Risueno y Medina 1986). Los CBs no estân involucrados en el procesado de ARNm, puesto que no se han observado nunca transcripciones entre el poli (A) RNA y el ARNm recién creado (Moreno-Diaz de la Espina et al., 1982a, b; Huang et al., 1994; Straatman y Schel, 2001). Se ha propuesto que, en las plantas, los CBs estân involucrados en el procesado de ARNr, en su transporte y en su almacenamiento, pero no en su transcripciôn (Moreno Diaz de la Espina et al., 1982a, b, Risueno et al., 1978). Parece que los CBs son lugares de almacenamiento en el nùcleo donde maduran los factores de transcripciôn y procesamiento antes del desplazamiento a los lugares defmitivos de transcripciôn y procesamiento (Spector et al., 1993; Gall et al., 2000; Proudfoot et al., 2000). A pesar de ello, se les relaciona con la activaciôn de la actividad transcripcional, con la progresiôn del ciclo celular y con la actividad metabôlica en células de mamiferos (Spector et al., 1993; Pena et al., 2001; Fernandez et al., 2002; Fakan et al., 2004; Testillano et al., 2005). En Brassica y Capsicum, los CBs estuvieron présentes en las microsporas vacuoladas y en la célula vegetativa de los granos de polen jôvenes, justo después de la primera mitosis del polen, aunque en un nùmero limitado. Estas etapas se caracterizaron por la actividad transcripcional (Mascarenhas et al., 1989) y por ser biosintéticamente activas (Risueno et al., 1988; Testillano y Risueno, 1988). Sin embargo, en los granos de polen maduros, con una célula vegetativa poco activa anclada en la fase GO, raramente se observô la presencia de CNs, sugiriéndose una correlaciôn entre la actividad transcripcional y la presencia de CBs. Durante el desarrollo embriogénico de la microspora, los proembriones jôvenes estân muy involucrados en la proliferaciôn (Segui-Simarro et al., 2005). En las células de proembriones, aumentô la frecuencia de las células con CB y el nùmero de CBs por célula. Por lo tanto, nuestros resultados apoyan la hipôtesis de que el nùmero de CBs aumenta en respuesta a un incremento de la actividad de proliferaciôn de la célula (Andrade et al., 1993; Femândez et al., 2002); la cual, lôgicamente debe estar reflejada en una transcripciôn mâs elevada y en un procesado de nuevas transcripciones. La relaciôn entre los CBs y el nucleolo podria estar relacionada también con la entrada en proliferaciôn. Numerosos estudios en células animales y vegetales, incluido el présente trabajo, evidencian una asociaciôn frecuente entre estas dos estructuras (Moreno Diaz de la Espina et al., 1982a, b; Risueno y Medina, 1986; Narayanan et al., 1999; Platani et al., 2000; Gall et al., 2000; Segui-Simarro et al., 2001; Testillano et al., 2005). Los 205 Capîtulo VIL European Journal o f Histochemistry 50. L 35-44 (2006) estudios en células vivas de mamiferos muestran que los CBs se mueven desde y hacia los nucleolos (Platani et al., 2000). La asociaciôn de CBs con el nucleolo se relacionô con un posible papel de los CBs en la ruta de biogénesis y con el transporte de snoRNPs involucrados en el procesado de pre-ARNr (Narayanan et al., 1999; Platani et al., 2000). La asociaciôn observada frecuentemente entre los CBs y el nucleolo en las microsporas en desarrollo y en los proembriones en proliferaciôn implicaria un incremento en la presencia de componentes necesarios para el procesado de ARNr en los nucleolos, como reflejo del incremento en la actividad nucleolar durante la proliferaciôn, durante la que es necesaria una sintesis masiva de ribosomas. Puesto que la activaciôn de la proliferaciôn esta asociada a la inducciôn de la embriogénesis mediante estrés, los CBs podrian estar relacionados también con la entrada en proliferaciôn como respuesta al tratamiento de inducciôn, y podrian también estar involucrados indirectamente en el progreso de la embriogénesis derivada de microsporas. En resumen, los cuerpos nucleares y, en particular, los cuerpos de Cajal aumentan su presencia en células en proliferaciôn transcripcionalmente activas, durante el desarrollo embriogénico en Brassica y Capsicum, identificândolos por tanto como marcadores potenciales de la entrada en proliferaciôn, debido a la reprogramaciôn de la ruta de desarrollo a la embriogénesis. 206 European Journal o f Histochemistry 50. 1. 35-44 (2006) CapUulo VII. 5. Bibliografia Andrade L.E., Tan E.M., Chan E.K.L. (1993). immunocytochemical analysis of the coiled body in the cell cycle and during proliferation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1951. Bârâny 1., Testillano P.S., Mitykô J., Risueno M.D. (2001). The switch of the microspore developmental program in Capsicum involves HSP70 expression and leads to the production of haploid plants. Int. J. Dev. Biol. 45: S39-S40. Bârâny L, Gonzâlez-Melendi P., Fadôn B., Mitykô J., Risueno M.C., Testillano P.S. (2005). 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En condiciones de estrés, las microsporas jôvenes pueden ser desviadas de su desarrollo normal a una ruta embriogénica, proceso conocido como embriogénesis del polen (Gonzalez-Melendi et al., 1995; Touraev et al., 1997). La embriogénesis représenta una herramienta muy util para la investigaciôn genética en cultivos de plantas, puesto que los embriones derivados de microsporas pueden dar lugar a plantas doble-haploides homocigôticas (Chupeau et al., 1998). No todas las células présentes en el cultivo tienen la misma sensibilidad a los tratamientos de inducciôn; algunas de ellas son microsporas que pueden ser inducidas (desviadas/reprogramadas) de forma efectiva. Otras son microsporas que no son inducidas y que continùan su desarrollo normal gametofïtico (Custers et al., 1994; Segui-Simarro et al., 2001). Por ultimo, otras microsporas no resisten el tratamiento y mueren. El nùcleo es el centro regulador que gobiema los procesos celulares y su organizaciôn funcional refleja el estado de actividad de la célula (Gonzalez-Melendi et al., 1998; Fakan y Puvion, 1980; Risueno y Medina, 1986; Risueno y Testillano, 1994; Testillano et al., 2000; 2005; Spector et al., 1991; 2001). Los estudios ultraestructurales del nùcleo celular ban definido distintos compartimentos nucleares, incluyendo los territorios de cromosomas y el compartimento intercromatinico (Cremer y Cremer, 2001). Los dominios nucleares son estructuras dinâmicas en si mismas (Raska et al., 1992) cuya morfologia y e structura dependen del estado de actividad de nùcleo (Oison et al., 1995; Puvion-Dutilleul et al., 1992; 1997; Puvion-Dutilleul y Puvion 1996; Puvion et al., 1994; Spector et al., 1991; 2001). La cromatina puede presentarse como cromatina condensada o dispersa (Berhnard et al., 1971; Raska et al., 1990), y adopta diferentes patrones de organizaciôn segùn sea la cantidad total de ADN (Jordan et al., 1980). En la region intercromatinica se lleva a cabo la replicaciôn del ADN y la trascripciôn y procesamiento temprano de los ARNs heterogéneos celulares (Fakan y Puvion et al., 1980). Los cuerpos nucleares que estân présentes en la region intercromatinica tienen una funciôn aùn 213 CapUulo VIII. desconocida aunque se les ha asociado a los cambios en la actividad de proliferaciôn de las células végétales (Testillano et al., 2005). El nucleolo es el dominio nuclear donde tiene lugar la trascripciôn de los ARN, asi como su procesamiento, ensamblaje y transporte en forma de particulas preribosômicas (Goessens et al., 1984; Hadjiolov et al., 1985; Risueno y Medina, 1986; Risueno y Testillano et al., 1994). Es una estructura altamente dinâmica cuya morfologia varia drâsticamente con los cambios en su actividad y la expresiôn de los genes (Hemândez- Verdun et al., 1991; Risueno y Testillano, 1994; S cheer y Benavente 1990; Raska et al., 1995; Dundr y Mistela, 2001; Testillano et al., 1991; 2000; 2005). El PCNA (“Proliferative Cell Nuclear Antigen”) es una proteina asociada al ADN pol delta durante la replicaciôn. El inmunomarcado con anti-PCNA se ha descrito como un marcador eficiente de la fase S y de lugares de replicaciôn de plantas (Gonzalez-Melendi et al., 2000; Raska et al., 1989). Durante el desarrollo gametofïtico del polen, se han descrito dos tipos de patrôn del marcado con el anticuerpo anti-PCNA: las particulas de oro agrupadas sobre la regiôn pericromatinica indicando lugares de replicaciôn, y las particulas de oro aisladas en la regiôn intercromatinica (Gonzalez-Melendi et al., 1996) que corresponden a moléculas de PCNA no asociadas a lugares de replicaciôn; sin embargo, no se conoce su distribuciôn durante la progresiôn de la embriogénesis de microsporas. Los cuerpos de Cajal (CBs en inglés) fueron descritos como cuerpos accesorios del nucleolo por Ramôn y Cajal (1903), por su situaciôn cercana a los nucleolos y por su similar marcado con plata. En las células de mamiferos fueron observados por Monneron y Bernhard (1969) y, posteriormente, en las células végétales por Moreno-Diaz de la Espina y sus colaboradores (1982). En animales y plantas fueron bautizados como cuerpos enrollados o “coiled bodies” debido a la arquitectura observada al microscopio electrônico. Los cuerpos de Cajal estân présentes como elementos constitutivos del nùcleo en células animales (Gall et al., 2000) y vegetales (Risueno y Medina, 1986; Beven et al., 1995; Straatman y Schel, 2001; Segui et al., 2006) tanto en diferenciaciôn como en proliferaciôn. Estructuralmente, los cuerpos de Cajal son areas con forma redondeada de hasta 2.0 pm, que aparecen al microscopio electrônico como fîlamentos gruesos, agrupados y enrollados, embebidos en la regiôn intercromatinica (Beven et al., 1995; Lafarga et al., 1998; Fakan, 2004; Raska et al., 2005). Han sido encontrados frecuentemente asociados con el nucleolo, y relacionados o conectados con grânulos intercromatinicos (Risueno y Medina 1986). Los cuerpos de Cajal estân caracterizados por la presencia de la proteina p80 coilin, el antigeno 214 ________ __ __________________________________________________________ CapUulo VIIL Sm y varios pequenos RNAs (snRNAs) nucleares; as! como por las protemas nucleolares fibrillarin, NoppHO y la proteina ribosomal S6 (Gall et al., 2000). Aùn se desconoce con exactitud la funciôn de los cuerpos de Cajal, aunque parece claro que no estân directamente relacionados con el ensamblaje del mRNA (Huang et al., 1994), sino con la maduraciôn de las snRNPs y snoRNPs, con el procesamiento del mRNA de la histona H3 (Dominski y Marzluff, 1999) y con la biogenesis y almacenaje de los factores de ensamblaje y transcripciôn (Spector et al., 1993; Gall et al., 2000; Proudfoot et al., 2000), de snRNPs (Carvalho et al., 1999) y de snoRNPs (Narayanan et al., 1999; Platani et al., 2000; Ciose y Lamond, 2005; Stanek y Neugebauer, 2006). Los cuerpos nucleares han sido identificados recientemente como potencialmente sensibles a cambios durante la actividad de proliferaciôn de las células de plantas (Testillano et al., 2005), aumentando su presencia en células en proliferaciôn transcripcionalmente activas durante el desarrollo embriogénico, en microsporas de Brassica y Capsicum e identiflcândolos por tanto, como potenciales marcadores celulares del comienzo de la proliferaciôn debido al cambio del programa de desarrollo a la ruta embriogénica (Segui-Simarro et al., 2006). La entrada en proliferaciôn de células en diferenciaciôn es un hecho clave tanto en el desarrollo vegetal como en los procesos de organogénesis y morfogénesis. Puesto que el nùcleo de la célula gobiema la actividad celular, el conocimiento de las dinâmicas de los dominios del nùcleo durante la activaciôn de dichos procesos aportarâ nuevas perspectivas sobre los mecanismos que los regulan. Los programas de desarrollo del polen representan sistemas modelo para analizar los cambios celulares que acompanan a la activaciôn de la proliferaciôn en células en diferenciaciôn. En este trabajo, se estudiaron los cambios en el nùcleo, concretamente en actividad replieativa por la localizaciôn de PCNA, y en los cuerpos nucleares durante los dos programas de desarrollo (la maduraciôn del polen y la embriogénesis del polen) que incluyen estos procesos de diferenciaciôn y proliferaciôn. 215 CapUulo VIII. 2. Material y Métodos 2.1 Material Se cultivaron semillas de Capsicum annuum L., var. Yolo Wonder B (Ramiro Amedo, S. A., Calahorra, La Rioja) en substrato, y las plantas obtenidas se mantuvieron en un incubador (MLR 350H, SANYO) a 25 °C, 80 % de humedad y un periodo de luz de 16 horas. Se seleccionaron botones florales de diferentes tamanos y se extrajeron sus anteras para utilizadas tanto para el anâlisis del desarrollo gametofïtico normal, como para el cultivo in vitro. 2.2 Cultivo in vitro de anteras Para la obtenciôn de los cultivos, se emplearon solo los botones florales de la primera floraciôn. El estado de desarrollo del polen se determine mediante marcado con DAPI en anteras aisladas (Vergue et al., 1987, Gonzalez-Melendi et al., 1995). Para los cultivos se seleccionaron anteras provenientes de botones con pétalos y sépalos de longitud similar, correspondientes al estado de microspora vacuolada, y se esterilizaron superficialmente con un 5 % de hipoclorito sôdico. Se emplearon plaças Pétri de 5 cm de diâmetro, colocândose en cada una 15 anteras en un medio de inducciôn con medio CP (Dumas de Vaulx et al., 1981) complementado con 0,01 mg/1 de âcido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) y kinetina. Después de 8 dias a 35 °C en oscuridad, los cultivos se sometieron a un periodo de 12 horas de luz (500 pmol de fotones/m^s) a 25 °C. Después de 12 dïas de inducciôn en medio CP, las anteras se colocaron en medio Ri (Dumas de Vaulx et al., 1981) complementado con 0,1 mg/1 de kinetina. 2.3 Anticuerpos En este estudiô se utilizaron los siguientes anticuerpos; el anticuerpo monoclonal anti-PCNA (Gonzalez-Melendi et al 1996a; 2000) y el anti-2,2,7 trimetil guanosina (TMG) de Calbiochem (Clone K121) (Segui et al., 2005). 216 CapUulo VIII. 2.4 Ëlectroforesis, Western Blot e immunodeteeciôn de protemas Los cultivos de anteras se sumergieron en nitrôgeno liquido, y se homogenizaron en un mortero enfriado con “cracking buffer” (20 mM Tris HCl, pH 8 , 2 % SDS, 1 % B- mercaptoetanol, 1 mM PMSF), se hirvieron durante 3 minutos y se centrifugaron durante 15 minutos; los sobrenadantes obtenidos se centrifugaron de nuevo très veces. Las protemas totales se midieron mediante el método de Bradford (Merck's Bloquant). Para cada experimento, se utilizô la misma cantidad de proteinas que se separaron mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 12 %. El desarrollo electroforético se realizô a 80 V, en el sistema Miniprotean III de BioRad (Hércules, CA, EE. UU). Una vez fînalizada la electroforesis, se transfîrieron las proteinas durante 1 hora a una membrana de nitrocelulosa (PVDF; Millipore, Bedford, MA, EE. UU) mediante la técnica del Western blotting. A continuaciôn, se bloquearon durante una noche en tampon de bloqueo (2 % leche desnatada + 0.05 % Tween 20 en TBS) a 4 °C, Como control de la transferencia, se tinô una tira de la membrana con amido black para visualizar la cantidad de proteina total. Se incubô la membrana con el anticuerpo anti-PCNA en una diluciôn de 1 : 2 0 0 en tampon de bloqueo durante toda la noche a temperatura ambiente. Después se lavé durante 10 minutos, très veces, en soluciôn de lavado (0.2 % leche desnatada + 0.5 % Tween 20 en TBS). A continuaciôn, se incubô la membrana durante 2 horas con anti-human conjugado con fosfatasa alcalina en una diluciôn de 1 : 1 0 0 0 en soluciôn de bloqueo, para posteriormente ser lavada très veces con la soluciôn de lavado. El revelado del anticuerpo segundario se realizô mediante incubaciôn con una mezcla de azul de nitrotetrazolio (NTB, Sigma) y bromocloroindolil fosfato, (BCIP, Sigma) en un tampôn apropiado (NaHCO] 100 mM, NaCO] 50 mM, MgCE 6 H2O 4 mM). Por ultimo, se secô y digitalizô en un escâner Hewlett Packard 6100C. Los contrôles se realizaron con el anticuerpo primario y/o con el segundario. 2.5 Crioprocesado de muestras para criocortes Las anteras obtenidas en diferentes etapas del desarrollo gametofïtico y en diferentes momentos del desarrollo del cultivo in vitro, se fijaron en formaldehido al 4 % (w/v) en PBS, pH 7,3 durante toda una noche a 4 °C. A continuaciôn, se lavaron en PBS durante 10 minutos, 3 veces. Por ultimo, se lavaron de nuevo en PBS y se crioprotegieron mediante incubaciôn en concentraciones crecientes de sacarosa: 0.1 M (1 h), 1 M (3 h), y 217 Capitula VIII. 2.3 M toda la noche. Las muestras crioprotegidas se colocaron en una barrita de aluminio y se criofijaron en propano liquido a -170 °C, utilizando una unidad KF80 (Reichert, Viena). Se obtuvieron coites semifmos (Ipm) con un ultratomo de Ultracut E (Reichert) acoplado con la unidad FC4 para estabilizar a -75 °C. Los coites obtenidos fueron colocados sobre portaobjetos multipocillo (ICN, Costa Mesa, CA, USA). 2.6 Inmunofluorescencia La inmunofluorescencia fue realizada sobre criocortes semifinos (1 pm). Los portaobjetos que contenian las muestras fueron lavados en PBS para eliminar la sacarosa. Las muestras se bloquearon con 10 % de FCS (suero bovino fetal) en PBS durante 10 minutos. El anticuerpo primario se depositô en gotas sobre cada una de las muestras, diluido a 1:100 para anti-TMG al 5 % de FCS en PBS; después de lo cual se incubaron las muestras durante 1 hora, a temperatura ambiente A continuaciôn, se lavaron très veces durante 5 minutos en PBS, siendo el anticuerpo secundario utilizado el anti-ratôn conjugado con Alexa 488 y diluido al 1:25 en 5 % de FCS en PBS, e incubadas durante 45 minutos en oscuridad, también a temperatura ambiente. Después se lavaron très veces en PBS y dH20. A continuaciôn, las muestras se tifieron con DAPI (4,6-diamidine-2- phenylindol; Serva, Heidelberg, Alemania) durante 5 minutos. Después se lavaron très veces en PBS y très en dH20, luego fueron contrastadas con DAPI, montadas con Mowiol (Polysciences, Eppelheim, Germany) y observadas usando el scanner confocal Bio-Rad MRC-1000 montado en un microscopio Zeiss Axiovert 135. Los contrôles fueron realizados sustituyendo el primer anticuerpo por PBS. 2.7 Crioprocesado de muestras para microscopia electronica Se fijaron anteras de diferentes etapas del desarrollo gametofïtico y de diferentes momentos del desarrollo del cultivo in vitro en formaldehido al 4 % (w/v) en PBS, pH 7,3, durante una noche a 4 °C. A continuaciôn, se lavaron en PBS y se deshidrataron empleando una serie de concentraciôn creciente de metanol (30 %, 50 %, 70 % y 100 %) con una bajada progresiva de temperatura de 40 °C a -30 °C. Se impregnaron las muestras con mezclas de metanol/Lowicryl K4M (en una serie 2:1, 1:1 y 1:2) a -30 °C, se encapsularon en résina pura a la misma temperatura, y se polimerizaron bajo luz UV a -30 °C usando un 218 CapUulo VIII. equipo Leica AFS, como se ha descrito en trabajos previos (Testillano et al., 1995). Por ultimo se realizaron cortes ultrafmos (100 nm) para el estudio microscopio electrônico. 2.8 Inmunomarcado con oro coloidal para microscopio electrônico La inmunolocalizaciôn se llevô a cabo sobre cortes ultrafinos de Lowicryl K4M como se ha descrito en trabajos previos (Risueno y Testillano, 1994; Testillano et al 1993a). Se pusieron a flotar las rejillas de niquel cubiertas por Formvar y carbôn portando los cortes ultrafinos de Lowicryl en gotas de ddHiO, PBS y BSA (albùmina de suero bovino) al 5 % en PBS durante 5 minutos para bloquearlas. A continuaciôn se incubaron las muestras con los anticuerpos diluidos al 1:10 para anti-PCNA y al 1:100 para anti-2,2,7 TMG ambos en 5 % de BSA en PBS, e incubadas durante 1 hora. A continuaciôn, fueron lavadas en PBS. Para revelar los anticuerpos primarios se incubaron con el anticuerpo secundario anti-human para anti-PCNA y anti-ratôn para anti-TMG, conjugados con oro coloidal de 10 nm (Biocell, Cardiff, el Reino Unido) diluido a 1:25 en 1 % de BSA durante 45 minutos y se lavaron a continuaciôn en PBS y ddHiO. Finalmente se secaron y se tineron con acetato de uranilo al 5 % durante 20 minutos, y con el citrato de plomo durante 5 segundos. Se observaron las muestras en un microscopio electrônico de transmisiôn JEOL 1010 a 80 kV. Los contrôles fueron realizados incubando las rej illas sôlo en el 1 % BSA en PBS. 2.9 Anâlisis cuantitativo del inmunomarcado con anti-PCNA Para evaluar el patrôn de distribuciôn de las particulas de oro se utilizô el método descrito por J Renau-Piqueras et al., 1989, que consiste superponer una lamina cuadriculada (con tamano de cuadrfcula de 5x5 mm) sobre 20 imâgenes del microscopio electrônico (amplificaciôn de 55.500 veces) por estado de desarrollo. Se calculô el numéro de particulas de oro por cuadricula y su distribuciôn en las cuadriculas se expresô como un porcentaje del area total. La distribuciôn fue considerada “agrupada” si el numéro de particulas por cuadricula era 3 o mayor que 3, mientras que si era menor que 3 fue considerada “aislada”. Finalmente, se representaron mediante histogramas los resultados obtenidos. 219 Capîtulo VIII._____________________________________________________________________ 3. Resultados 3.1 Inmunoblotting e inmunolocalization de PCNA durante el desarrollo gametofïtico y embriogénico del polen. Se realizô un estudio comparativo de la actividad proliferativa mediante marcado con PCNA en diversas etapas de la ruta embriogénica del polen, comparândola con la de la ruta gametofïtica. Inicialmente, se realizô un inmunoblot para analizar la especificidad del anticuerpo en nuestro material. Se ensayô el inmunoblotting en un extracto de proteinas totales de microsporas. Tras el revelado, se observô una banda intensa correspondiente a la proteina de anti-PCNA de aproximadamente 36 kD (figura 1). Se realizaron ensayos de control sin el primer anticuerpo, no obteniéndose senal en ningùn caso. Los resultados de los Western blots revelaron la presencia del antigeno anti-PCNA en extractos de Capsicum annuum, demostrando la especificidad de estos anticuerpos en el material empleado. 1 2 3 107 kD O 76 kD 52 kD C3 PCNA 36.8 kD 27 kD c ) 19 kD Figura 1. Inmunoblot anti-PCNA. L Marcadores de peso molecular. 2. Protemas totales; tinciôn con amido black. 3. Se détecta una intensa banda aproximadamente de 36 kD peso molecular en extracto total de proteinas de Capsicum annuum L. 220 Capîtulo VIIL Se estudiô la localizaciôn in situ de anti-PCNA y el posible cambio en cantidad y distribuciôn de la proteina durante dos etapas de la ruta gametofïtica; las fases de microspora vacuolada como inicio de la embriogénesis y de polen bicelular joven como una etapa mas desarrollada. En la fase de microspora vacuolada (figura 2a), a nivel ultraestructural el gran nùcleo que se encuentra en la periferia de la célula muestra un patrôn de cromatina poco condensado con pequenas masas, abundantes estructuras granulofibrilares de intercromatina y un gran nucleolo con abundante componente granular; esto recuerda a la tipica organizaciôn de un nucleolo con gran actividad trascripcional. El citoplasma forma una capa fina debajo de la intina. El marcado con anti-PCNA aparece en el nùcleo, estando el resto de compartimentos celulares libres de marcado. Se observan dos distribuciones de particulas de oro con anti-PCNA en la regiôn intercromatinica: en pequenos “grupos” (figura 2b', flécha) y aisladas (figura 2 b', puntas de flécha). Las particulas de oro en “grupos” se observaron sobre la regiôn pericromatinica, identificando lugares de replicaciôn y demostrando que la microspora vacuolada es una fase muy activa en replicaciôn (Gonzalez-Melendi et al., 1996). En etapas posteriores del desarrollo gametofïtico después de la primera mitosis, se forma el polen bicelular joven (figura 2c) que esta formado por dos células, la célula vegetativa y la célula generativa. El nùcleo generativo mostrô nucleolos compactos y con cromatina condensada, mientras que el vegetativo mostraba un patrôn de cromatina poco condensada. En el polen bicelular joven, el inmunomarcado con oro con anti-PCNA fue de tipo aislado, tanto en el nùcleo generativo (figura 2d', puntas de flécha) como en el vegetativo (figura 2e', puntas de flécha). 221 CapUulo VIIL Ex # * . . . . - ' # ;T 9 » • N e t m *•̂ Y RI e t a — b* m/m Ciw N et N Figura 2. Inmunomarcado con oro con anti-PCNA en nùcleos de diferentes fases durante de ruta gametofïtica de Capsicum annuum (a-c). En la etapa de microspora vacuolada (a) se observaron grupos de particulas de oro sobre algunas fibras de la region intercromatinica (RI) y en la periferia de las pequenas masas de cromatina condensada (b'). Se observaron algunas particulas de oro dispersas (puntas de fléchas) por la region intercromatinica (b'). En el polen bicelular (c) se observaron los nùcleos vegetativo (NV) y nùcleo generativo (NG). Se observô un marcado muy escaso constituido por algunas particulas de oro dispersas (puntas de fléchas) en la regiôn intercromatinica del nùcleo generativo (d') y del vegetativo (e'). Ex: exina, Ct: citoplasma, N: nùcleo, Nu: nucleolo. Barras: a, c: 2 pm; b', d', e': 200 nm. 222 CapUulo VIIL 3.2 Inmunolocalizaciôn de PCNA en la ruta embriogénica En la ruta embriogénica del polen tras la inducciôn, algunas microsporas se dividieron dando lugar a dos células iguales en tamano y en organizaciôn estructural, separadas por una pared celular y con un citoplasma poco denso con vacuolas. En estadios posteriores del cultivo in vitro las estructuras bicelulares proliferaron dando lugar a estructuras multicelulares. Dos semanas después de la puesta del cultivo, se observaron proembriones tempranos (figura 3a) con 10-15 nùcleos que mostraron células vacuoladas con forma poligonal, citoplasma denso y con el nùcleo en una posiciôn central. Después de très semanas, se observaron cambios morfolôgicos en los embriones multicelulares tardios (figura 3b-c) relacionados probablemente con el comienzo de la diferenciaciôn. En estos embriones multicelulares tardios se observô una incipiente organizaciôn en dos zonas de diferentes tipos morfolôgicos de células. En la zona interior (figura 3c) observamos una gran densidad de pequefias células con vacuolas pequefias, mientras que en la zona exterior observamos células grandes en menor cantidad y con vacuolas grandes (figura 3b). Tras el inmunomarcado con anti-PCNA tanto en los proembriones tempranos (figura 3a', flécha) como en las células de la zona interna de los embriones multicelulares tardios (figura 3c', flécha), se observô la presencia de particulas de oro “agrupadas” en los nùcleos. Estos grupos aparecen en la periferia de las masas de cromatina (Cr) en la regiôn pericromatinica, identificando lugares de replicaciôn. Por otro lado, en las células de la zona exterior de los embriones multicelulares tardios se encuentraron particulas de oro “aisladas” (figura 3b', puntas de flécha), correspondientes a poblaciones de anti-PCNA no asociadas con replicaciôn. 223 Capitula VIIL ' ' " m ËmBriones multicelulares t if- ver. K Embriones Figura 3. Inmunomarcado con oro con anti-PCNA en nùcleos de diferentes etapas de la ruta embriogénica (a-b). En la etapa de proembriôn temprano (a) se observaron grupos de particulas de oro sobre algunas fibras de la region intercromatinica (RI) y en la periferia de las pequenas masas de cromatina condensada. En los embriones multicelulares tardios (b-c) se observô una incipiente organizaciôn en dos tipos morfolôgicos de células. En la zona exterior (b) se observaron algunas particulas de oro dispersas (puntas de fléchas) por la regiôn intercromatinica. Sin embargo, en la zona interior (c) se observaron particulas de oro en grupos sobre algunas fibras de la regiôn intercromatinica (fléchas). Ct: citoplasma, N; nùcleo. Barras: a, b, c: 2 pm; a', b', c': 200 nm. 224 _____________________________________________________________________ CapUulo VIIL 3.3 Anâlisis cuantitativo del inmunomarcado con anticuerpos anti-PCNA durante las rutas gametofïtica y embriogénica Para determinar la diferencia en el inmunomarcado con anti-PCNA se realizô el estudio estadistico de la distribuciôn del marcado obtenido durante los dos programas de desarrollo del polen (gametofïtico y embriogénico). Para evaluar si esta distribuciôn del marcado era “agrupada” o “aislada” se realizô un test de agrupamiento “clustering” tal y como se describiô en el apartado 2.9 de Material y Método. Se calculô el numéro de particulas de oro por cuadricula y su distribuciôn en las cuadriculas se expresô como un porcentaje del area total. La distribuciôn se considerô “agrupada” si el numéro de particulas por cuadricula era 3 o mayor que 3, y “aislada” si era menor que 3. Los histogramas de la figura 4 ilustran los resultados obtenidos considerando los dos programas de desarrollo del polen: gametofïtico y embriogénico El histograma 4.a refleja los siguientes resultados durante la maduraciôn del polen: en la etapa de microspora vacuolada, el marcado “aislado” (1 ô 2 particulas de oro) représenta el 8,43 % del area total medida. ■ Marcado aislado ■Marcado agrupado 10 8 A r 6 e a 4 % Microspora vacuolada Bicelular joven, nùcleo generativo Bicelular joven, nùcleo vegetativo F ig u ra 4. Representaciôn grafica de la distribuciôn del marcado obtenido con el anticuerpo anti- PCNA durante de la maduraciôn del polen (a), y durante de la embriogenesis del polen (b). En ordenadas se indica el porcentaje del area de la regiôn intercromatinica marcado y en abcisas el tipo del marcado “aislado” (1 o 2 particulas de oro) o “agrupado” (3 o mas particulas de oro). 4a: En la ruta gametofïtica: en la fase de microspora vacuolada, la mayor parte del marcado se encuentra en forma aislada, si bien existe un marcado agrupado importante. En el polen bicelular joven, en el nùcleo generativo y vegetativo las particulas de oro se encuentran aisladas, mientras en el nùcleo vegetativo aislado es inexiste o muy escaso. 225 Capîtulo VIII.______________________________________________________________________ En la fase bicelular joven este valor fue 5,8 % tanto en el nùcleo generativo como en el vegetativo. Respecto al marcado “agrupado” (3 o mas particulas de oro), en la microspora vacuolada obtenemos un valor de 2,67 %, mientras que en bicelular joven es de 0,97 % en el nùcleo generativo y 0 % en el vegetativo respectivamente. El histograma 4.b muestra los resultados obtenidos durante la ruta embriogénica, observândose un marcado “aislado” en proembriones tempranos con un valor de 9,8 % y en embriones multicelulares tardios de 9,4 % en la zona interior y de 7,0 % en la zona exterior. Por otro lado, el marcado “agrupado” en proembriones tempranos résulté tener un valor de 5,1 %, mientras que en los embriones multicelulares tardios, fue de 5,0 % en la zona interior y de 0 % en la zona exterior. I Marcado aislado ■ Marcado agrupado A r e a % Proembriones tempranos Embriones multicelulares tardios zona interior Embriones multicelulares tardios zona exterior 4b: En la ruta embriogénica y en las fases de proembriones tempranos y embriones multicelulares tardios en la zona interior la mayor parte del marcado se observô en forma aislada, aunque también un marcado agrupado importante. En los embriones multicelulares tardios en la zona exterior las particulas de oro se encuentraron aisladas, y el marcado agrupado fue inexiste o muy escaso. Los resultados obtenidos indicarian que en la ruta gametofïtica, la fase de microspora vacuolada se encuentra en fase activa de proliferaciôn. Sin embargo el polen bicelular joven no présenta actividad alguna de replicaciôn. En la ruta embriogénica, los proembriones tempranos y los embriones multicelulares tardios de la zona interior se encuentran en fases muy activas de 226 _____________________________________________________________________ CapUulo VIIL proliferaciôn comparândolos con la etapa de microspora vacuolada de la ruta gametofïtica. Sin embargo, los embriones multicelulares tardios no presentan actividad de replicaciôn. 3.4 Localizaciôn de cuerpos nucleares mediante inm unolocalizaciôn de 2,2,7-TM G en la ruta gam etofïtica Se llevô a cabo un estudio para la caracterizaciôn de los cuerpos nucleares durante la maduraciôn del polen. Se eligieron varias etapas de la ruta gametofïtica taies como la microspora vacuolada, el polen bicelular joven y el polen bicelular maduro. En la fase de la microspora vacuolada (figura 5d) se observaron intensos focos de senal fluorescente de anti-2,2,7-TMG en la regiôn intercromatinica (figura 5a'). El nùcleo mostrô un marcado uniforme y débil en intensidad, mientras que el nucleolo apareciô libre de marca. Posteriormente, en la etapa del polen bicelular joven (figura 5e), el nùcleo generativo présenté masas de cromatina algo mas condensadas que en el vegetativo. En el polen bicelular joven se observaron intensos focos de serial fluorescente con anti-2,2,7- TMG en la regiôn intercromatinica (figura 5b'). El nùcleo mostrô un marcado uniforme y de intensidad débil, mientras que el nucleolo apareciô libre de marca. Durante la maduraciôn del polen bicelular, la célula generativa migra al centro del citoplasma vegetativo y posteriormente se alarga, (figura 5f). El nùcleo generativo présenté la cromatina muy condensada, que contrasté con el patrôn mas descondensado de la cromatina del nùcleo vegetativo. En la fase de bicelular maduro no se observaron cuerpos nucleares con la inmunofluorecencia con anti-2,2,7-TMG (figura 5c'). Se estudiô la localizaciôn a nivel ultraestructural de 2,2,7-TMG durante la maduraciôn del polen. Se observô marcado en distintas areas de la regiôn intercromatinica en forma dispersa o en algunos grupos. En las masas de cromatina condensada sôlo se apreciô marcado en su periferia. El nucleolo présenté un escaso marcado, principalmente en el componente fibrilar denso. Se observô una acumulaciôn de particulas de oro sobre los cuerpos de Cajal (figura 5d'). Estos cuerpos presentaron una secciôn casi circular, con una estructura fibrilar gruesa y un tamano de hasta 1,1 pm de diâmetro medio. Tras la primera divisiôn mitôtica en el polen bicelular joven, los cuerpos de Cajal se encontraron en el nùcleo vegetativo en el que se observô una actividad alta. 227 Capîtulo Vm. A n t i - 2 . 2 . 7 - T M G tr: A n l i - 2 . 2 . 7 - T M G # Nu ■ d ’ e t NV % . ■t’-., _ A n t i - 2 . 2 . 7 - T M G \ r Figura 5. Caracterizaciôn de los cuerpos nucleares en très etapas de la ruta gametofitica. Inmunofluorecencia con anti-2,2,7 trimetiîguanosina en la fase de microspora vacuolada (a'), bicelular joven (b'), bicelular maduro (c'); las fléchas senalan puntos brillantes correspondientes a la detecciôn de cuerpos nucleares 2,2,7 TMG positives; tinciôn con DAPI (a), (b), (c); estructuras al M. E. (d), (e), (f); inmunomarcado con anti-2,2,7 trimetiîguanosina (d'); Ex: Exina. Ct: citoplasma. V: vacuola. N: Nùcleo. Nu: nucleolo. Cb. Cueipos nucleares. Nv: nùcleo vegetativo. Ng: nùcleo generativo. Barras: a, a', b, b', c, c': 10 pm; d, e, f: 2 pm; d': 200 nm. 228 _____________________________________________________________________ CapUulo VIIL 3.5 Inmunolocalizaciôn de 2,2,7-TMG en embriones derivados de polen en comparaciôn con embriones cigôticos Para el estudio de la ruta embriogénica se analizaron embriones derivados de polen y embriones cigôticos en las mismas etapas. Se seleccionaron proembriones tempranos con células poligonales con una gran vacuola central (figura 6c), y embriones multicelulares tardios (figura 6d) con dos tipos celulares; observândose en la zona interior una gran densidad de pequenas células con vacuolas pequenas, y en la zona exterior células grandes en menor cantidad y con vacuolas grandes. Asimismo, se utilizaron proembriones cigôticos tempranos con la misma organizaciôn celular y embriones multicelulares tardios. Mediante inmunofluorecencia con anti-2,2,7-TMG en la etapa de proembriones tempranos derivados de microsporas y en los cigôticos se observaron uno o dos cuerpos nucleares en cada nùcleo (figura 6a'-7a'). En los embriones multicelulares tardios se identificaron algunos cuerpos nucleares (figura 6b'- 7b'). Se estudiô la localizaciôn a nivel ultraestructural de 2,2,7-TMG durante la embriogénesis. Se pudo comprobar que el patrôn del marcado de anti-2,27-TMG fue similar al que se observô durante la maduraciôn del polen. Sin embargo, se observaron diferencias en la densidad, en la textura de la fibrilla, y en el tamano de los cuerpos de Cajal. En varias de las células de los embriones, se encontraron uno o mâs cuerpos de Cajal cerca de la envoltura nuclear. Los cuerpos estaban conectados con los grânulos intercromatinicos y aparecieron en mayor nùmero, pero presentaron menor tamano (0,78 y 0,52 pm). 229 CapUulo VIIL Cb Ex N Nu 2.2 7- r M G Ct D A P I .7-1 M G Cb Ct N Nu Pc Nu Cb — d Figura 6. Caracterizaciôn de los cuerpos nucleares en dos etapas de la ruta embriogénica. Inmunofluorecencia con anti-2,2,7 trimetiîguanosina en la fase de proembriones tempranos (a'), y embriones multicelulares tardios (b'); las fléchas senalan puntos brillantes correspondientes a la detecciôn de cuerpos nucleares 2,2,7 TMG positives; tinciôn con DAPI (a), (b); estructuras al M. E. (d), (e); inmunomarcado con anti-2,2,7 trimetiîguanosina (d'). Ex; Exina. Ct: citoplasma. V: vacuola. N: Nùcleo. Nu: nucleolo. Cb. Cuerpos nucleares. Nv: nùcleo vegetativo. Ng: nùcleo generativo. Barras: a, a', b, b’: 50 pm; c’, d': 2 pm; d': 200 nm. 230 Capitula VIIL D A P 2.2 .7 -T N G DAP 2.2.7-TMG Figura 7. Caracterizaciôn de los cuerpos nucleares en embriones cigôticos en las mismas etapas que se han analizado para los embriones derivados de polen. Inmunofluorecencia con anti-2,2,7 trimetiîguanosina en la fase de proembriones tempranos (a'), y de embriones multicelulares tardios (b'); las fléchas senalan puntos brillantes correspondientes a la detecciôn de cuerpos nucleares 2,2,7 TMG positives; tinciôn con DAPI (a), (b); Barras: a, a’, b, b': 50 pm. 3.6 Anâlisis cuantitativo de los cuerpos de Cajal identificados por anticuerpos anti- 2,2,7-TMG durante la ruta embriogénica y en los embriones cigôticos Para determinar la variaciôn en el nùmero de cuerpos de Cajal durante las etapas estudiadas, se realizô el estudio estadistico de nùcleos en proembriones tempranos y embriones multicelulares tardios, comparando las mismas caracteristicas celulares en embriones cigôticos. Los resultados fueron reflejados en el histograma de la figura 8. En los proembriones tempranos se observô un porcentaje superior de cuerpos de Cajal (18,83 % del area total medida) que en los proembriones multicelulares tardios (2,53 % del area total medida). 231 Capîtulo VIII._____________________________________________________________________ Estos resultados indicarîan una mayor presencia de cuerpos de Cajal en les proembriones jôvenes respecto a los embriones multicelulares tardios. % 30 -1 d e n ù c 1 e o s 0 20 10 ■ Nùcleos de proembriones tempranos □ Nùcleos de embriones multicelulares tardios Nùcleos con 1 6 2 CB n= 866 nùcleos analizados Figura 8. Cuantificaciôn del numéro de cuerpos de Cajal durante las dos etapas estudiadas. En los proembriones tempranos se observé un porcentaje superior (18,83 % del area total medida) que en los proembriones multicelulares tardios (2,53 % del area total medida). 232 _____________________________________________________________________ Capîtulo VIII. 4. Discusiôn 4.1 El cambio de programa de desarrollo del polen a la ru ta embriogénica va acompanado de cambios en la organizaciôn y la actividad nucleares En la ruta gametofïtica del desarrollo del polen, los dos nùcleos résultantes presentan distinta actividad metabôlica. Mientras que el nùcleo generative es inactive metabôlicamente, el nùcleo vegetative présenta una elevada actividad transcripcional (Mena et al., 1994; Zarsky et al., 1992; McCormick et al., 1993b). En este trabajo se estudiaron dos de los aspectos de la arquitectura y funciôn nuclear menos conocidos hasta la fecha; la actividad replicativa y los cuerpos de Cajal en las microsporas que siguen su ruta normal gametofïtica, y en las que se reprograman a la nueva ruta embriogénica. Se analizaron dos etapas de la ruta embriogénica como son los proembriones tempranos y los embriones multicelulares tardios. 4.2 Cambios en la actividad replicativa durante la reprogramaciôn a embriogénesis En este trabajo se utilizaron anticuerpos anti-PCNA como marcadores eficientes de lugares de replicaciôn, descritos por Gonzâlez-Melendi et al., (1996). Se comprobô que el marcado con PCNA en grupos de particulas en la region pericromatinica marca nùcleos en replicaciôn, mientras que las particulas dispersas no estân asociadas a actividad replicativa alguna (Gonzâlez-Melendi et al., 1996; 2000). En especies diferentes como Nicotina tabacum, se ha observado que la microspora se mantiene en G1 durante casi todo el periodo de la interfase, y el ADN solo se replica al final de la interfase antes de la mitosis (Zarsky et al., 1992; Binarova et al., 1993). S in embargo los datos obtenidos de nuestro laboratorio en diversas especies como Scilla peruviana, y Allium cepa (Arquiaga et al., 1985; Sânchez-Pina et al., 1983; Risueno et al., 1985; Testillano et al., 1991a), usando citofotometrîa después de tinciôn con Feulgen, y autoradiografïa después de incorporaciôn con Timidina tritiada, indicaron que la dinâmica de la fase S durante la interfase de la microspora presentaba dos picos de aumento de sintesis de ADN, SI y S2 que se solapan con el final de la tétrada G l/S l y el final de la fase de microspora vacuolada S3/G2 respectivamente (Testillano et al., 1991b; Testillano y Risueno, 1988). 233 Capîtulo VIII. El PCNA (“Proliferative Cell Nuclear Antigen”) ha sido descrito como un factor auxiliar para la ADN polimerasa (Tan et al., 1986; Burgers et al., 1998), lo que permite utilizarlo como marcador de proliferacion, ya que juega un papel importante en la replicaciôn en eucariotas (Suzuka et al., 1989). Los resultados obtenidos en pimiento demuestran la existencia de replicaciôn al final de la interfase de la microspora en la fase de microspora vacuolada, como ya se ha observado en otras especies (Gonzâlez-Melendi et al., 1996; Gonzâlez-Melendi et al., 2000). Las microsporas que siguen su ruta normal se dividen asimétricamente, dando lugar al polen bicelular (Rodriguez y Risueno, 1978). El marcado con anti-PCNA en las primeras fases de la maduraciôn del polen revelô la presencia de algunas particulas de oro aisladas en ambos nùcleos, vegetativo y generativo, que no estân asociadas con la replicaciôn (Bravo y Macdonald-Bravo 1987; Gonzâlez-Melendi et al., 1996; Gonzâlez- Melendi et al., 2000). En estadios posteriores de maduraciôn (polen medio) tiene lugar la replicaciôn ùnicamente en la célula generativa (Gonzâlez-Melendi et al., 2000); sin embargo, en las microsporas que cambiaron su programa de desarrollo y se dividieron simétricamente dando lugar a proembriones tempranos de 10-15 células, se observô un inmunomarcado de anti-PCNA en forma de grupos de particulas de oro en la regiôn pericromatinica de los nùcleos, lo que indicô sitios de replicaciôn numerosos. A las très semanas se observaron embriones multicelulares tardios donde ya se diferenciaban dos tipos celulares. En las células de la zona exterior se observaron particulas de oro aisladas, mientras que en las células de la zona interior se observaron particulas de oro formando grupos en la regiôn pericromatinica. Estos resultados sugieren que el nivel de actividad replicativa del DNA de los nùcleos embriogénicos en las primeras fases (proembriones tempranos) es comparable al de células proliférantes en el ciclo de divisiôn celular (Testillano et al., 1993b; Testillano et al., 1994) y sin embargo, el polen bicelular recién dividido no présenta este patrôn de anti- PCNA, como ocurre en otros materiales con células diferenciadas (Egelkrout et al., 2001). En etapas posteriores de la embriogénesis del polen, como son los embriones tardios, los resultados establecen diferencias de marcado entre los dos tipos celulares y confirman que estos embriones tienen una zona interna mâs proliférante y otra extema en la que ha comenzado la diferenciaciôn. 234 _____________________________________________________________________ Capîtulo VIII. 4.3 El dominio de cuerpos de Cajal cambia durante la reprogramacion a embriogénesis Durante la ruta normal gametofïtica los cuerpos de Cajal estân présentes en la etapa de microspora vacuolada, y en el nùcleo vegetativo de polen bicelular joven después de la primera mitosis del polen, aunque en un nùmero limitado. Estas etapas han sido caracterizadas como biosintéticamente activas (Risueno et al., 1988; Testillano y Risueno, 1988) y con una actividad trascripcional elevada (Mascarenhas et al., 1989). Sin embargo, en los granos de polen maduros con células con baja actividad en GO, no se observô la presencia de CBs, sugiriendo una correlaciôn entre la actividad trascripcional y la presencia de cuerpos de Cajal (Lafarga et al., 1998). Durante el desarrollo embriogénico, los proembriones tempranos tienen una gran actividad proliferativa (Segui-Simarro et al., 2005). En las células de los proembriones tempranos aumentô la frecuencia de células con cuerpos de Cajal; los resultados obtenidos indican que el nùmero de cuerpos de Cajal aumenta en respuesta a un desarrollo embriogénico y que podrian estân relacionados con una trascripciôn alta. Sin embargo, en los embriones multicelulares tardios se observô una disminuciôn del nùmero de cuerpos de Cajal por célula. Se ha observado que en las células végétales los cuerpos de Cajal estân involucrados en el procesamiento, transporte y almacenamiento de ARNr; pero no en su trascripciôn (Moreno Diaz de la Espina et al., 1982a, b, Risueno et al., 1978). Pudiera ser por lo tanto, que los cuerpos de Cajal sean el centro de almacenamiento en el nùcleo, donde los factores de trascripciôn y divisiôn maduran antes de la migraciôn a las zonas donde finalmente tienen lugar la transcripciôn y divisiôn (Spector et al., 1993; Gall et al., 2000; Proudfoot et al., 2000; Ciose y Lamond, 2005; Stanek y Neugebauer, 2006). En células de mamiferos sin embargo, los cuerpos de Cajal han sido relacionados con la activaciôn de la trascripciôn, la progresiôn del ciclo celular y la actividad metabôlica (Spector et al., 1993; Pena et al., 2001; Femândez et al., 2002; Fakan et al., 2004; Testillano et al., 2005; Lafarga et al., 1998). Nuestros resultados indican por primera vez una relaciôn entre los cuerpos de Cajal y los nucleolos en embriones de polen, que podria estar relacionada también con el inicio de la proliferaciôn. Numerosos estudios en células animales y vegetales han evidenciado una asociaciôn frecuente entre estas dos estructuras (Moreno Diaz de la Espina et al., 1982a, b, Risueno y Medina, 1986; Narayanan et al., 1999; Platani et al., 2000; Gall et al.. 235 Capîtulo VIII. 2000; Segui-Simarro 2001; Testillano et al., 2005; Segui et al., 2005), pero nuestros datos son la primera evidencia de esta asociaciôn en etapas tempranas de la embriogénesis. En diferentes estudios con células vivas de mamiferos se ha observado que los cuerpos de Cajal se mueven hacia y desde los nucleolos (Platani et al., 2000). La asociaciôn de los cuerpos de Cajal con los nucleolos ha sido relacionada con el papel de los cuerpos de Cajal en la ruta biosintética y el transporte de snoRNPs involucrados en el procesado de pre-ARNr (Narayanan et al., 1999; Platani et al., 2000). La frecuente asociaciôn que se observô entre los cuerpos de Cajal y los nucleolos en microsporas en desarrollo y en proembriones tempranos en proliferaciôn podria ser el reflejo de la necesidad de un aumento de componentes de la maquinaria de procesado de ARNr en el nùcleo, por el incremento de la actividad nuclear durante la proliferaciôn; durante la que se necesita una sintesis masiva de ribosomas. Sin embargo, en los embriones multicelulares tardios este efecto es menor, ya que se encuentran en un estadio de diferenciaciôn. Puesto que la activaciôn de la proliferaciôn esta asociada con la inducciôn a la embriogénesis mediante estrés, los cuerpos de Cajal podrian estar relacionados con el inicio de la proliferaciôn como respuesta al tratamiento de inducciôn y, quizâs, estarian involucrados indirectamente con el progreso de la embriogénesis de la microspora. 236 Capîtulo VIII. 5. Bibliografia Arquiaga T. (1985). Anâlisis citofotométrico y ultraestructural de la interphase de la microspora de Hyacinthoides non scripta. Tesina de Licenciatura Univ Compl Madrid. Bemhard W. (1971). Advances in cytopharmacology. Vol 1. New York: Raven Press. Beven A.F., Simpson G.G., Brown J.W., Shaw P.J. (1995). The organization of spliceosomal components in the nuclei of higher plants. J Cell Sci. 108: 509-518. Binarova P., Straatman K.R., Hause B., Hause G., van Lammeren A.A.M. (1993). Nuclear DNA synthesis during the induction of embryogenesis in cultured microspores and pollen of Brassica napus 1. 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La expresiôn y localizaciôn subcelular de Lipoxigenasas (LOX) durante la embriogénesis del polen y cigôtica. l.Introducciôn La lipoxigenasa LOX (EC 1.13.11.12) es una enzima con alto contenido en hierro que cataliza la peroxidaciôn de los âcidos grasos poliinsaturados con grupos funcionales cis, cis-1,4-pentadieno (Rosal et al., 1996), y que se encuentra présente tanto en plantas como en animales (Brash et al., 1999; Feussner y Wastemack et al., 2002). Las LOXs présentes en plantas estân clasificadas en funciôn de su especifîcidad segùn la posiciôn en la que producen la oxigenaciôn del âcido linoleico, que es un importante âcido graso constituyente de membranas en la mayoria de las especies vegetales. Existen dos grupos de compuestos derivados del âcido linoleico, el (9S)-hidroperôxido- y el ( 13)-hidroperôxido. Segùn la similitud en la secuencia compléta, las LOXs vegetales se pueden clasifîcar en dos subfamilias de genes: LOX tipo 1 y tipo 2. Las LOXs realizan diferentes funciones en las plantas taies como la respuesta a situaciones de estrés, respuesta a danos y a ataques de elementos patôgenos (Farmer y Ryan 1992; Rosahl et al., 1996), la movilizaciôn de lipidos para permitir la germinaciôn de la semilla (Holtman et al., 1997; Feussner y Wastemack 2002), la sintesis de los monômeros de cutina y de las moléculas marcadoras (Blée y Schuber 1993; Brash et al., 1999) y, por ùltimo, también participan en procesos de crecimiento y desarrollo (Hildebrand et al., 1989). No obstante, existen estudios sobre determinadas especies como la soja, en las que no se ha observado ninguna relaciôn entre las LOXs y los cuerpos lipidicos, lo que podria sugerir que en estas especies las LOXs no estân involucradas en la movilizaciôn de lipidos durante la germinaciôn. Adicionalmente, estos estudios han demostrado que en la germinaciôn de plântulas de soja, no hay una oxidaciôn substancial de los âcidos grasos poliinsaturados. Por tanto, el papel concreto de las LOXs en estos procesos no estâ totalmente defmido, en parte debido a la presencia de muchas isoenzimas LOX en plantas (Siedow et al., 1991). Se han encontrado isoenzimas LOX en el citosol, en las vacuolas (Graybum et al., 1991; Stephanson et al., 1998), en las membranas microsomales (Feussner y Kindl 1994), en la membrana plasmâtica (Nellen et al., 1995), en los cloroplastos (Heitz et al., 1997; Feussner et al., 1995; Royo et al., 1996; Blée y Joyard 1996), en los cuerpos lipidicos (Feussner y Kindl 1992), y en los nùcleos y mitocondrias (Rosahl et al., 1996; Hause et al., 2000). 243 Capîtulo IX. En estudios previos se ha propuesto que en ciertas plantas las LOXs son capaces de oxidar no solo âcidos grasos poliinsaturados libres, sino también grupos éster de lipidos, como los fosfolipidos, e incluso las biomembranas (Brash et al., 1987; Maccarrone et al., 1994). Durante las etapas tempranas de la embriogénesis cigôtica del pepino (Cucumis sativus) se ha visto que las LOX en los cuerpos lipidicos son inducidas y oxidan, in vivo, los residuos de âcidos grasos en los depôsitos de lipidos (Feussner et al., 1997a; 1998). Estos residuos de âcidos grasos son fijados normalmente por una lipasa (Balkenhohl et al., 1998), y podrian servir como substratos endôgenos para la oxidaciôn en los glioxisomas (Feussner et al., 1997b; Kindl et al., 1997). Durante la embriogénesis del polen, las microsporas haploides destinadas inicialmente a formar gametos, son reprogramadas para dividirse y formar embriones que parecen seguir un patrôn de desarrollo similar en embriogénesis somâticas y cigôticas (Mordhorst et al., 1997). Como resultado de una duplicaciôn de cromosomas, los embriones derivados de microsporas se desarrollan como plantas doble-haploides, aportando ventajas tanto para la investigaciôn fundamental como para la aplicada (Wang et al., 2000). A pesar de su gran importancia, poco se sabe sobre las moléculas involucradas en su inducciôn y desarrollo. En este trabajo se ha estudiado por primera vez la expresiôn y localizaciôn subcelular a nivel de microscopio electrônico de la LOX; la cual, se ha demostrado que incrementa su presencia en procesos de morfogénesis y organogénesis somâtica (Fortes et al., 2000; 2004); en concreto, durante los procesos morfogénicos de embriogénesis derivada de microsporas de Capsicum annuum L., y embriogénesis cigôtica. 244 Capîtulo IX. 2. Material y Métodos 2.1 Material Se cultivaron semillas de Capsicum annuum L., var. Yolo Wonder B (Ramiro Amedo, S. A., Calahorra, La Rioja) en substrato y las plantas obtenidas se mantuvieron en un incubador (MLR 35OH, SANYO) a 25 °C, 80 % de humedad y un periodo de luz de 16 horas. Se seleccionaron botones florales de diferentes tamanos, se extrajeron sus anteras y se utilizaron tanto para el anâlisis del desarrollo gametofïtico normal, como para el cultivo in vitro. Por ùltimo, se extrajeron embriones cigoticos de flores abiertas para el estudio ôptico. 2.2 Cultivo in vitro de anteras Solo se emplearon para los cultivos los botones florales de la primera floraciôn. El estado de desarrollo del polen se déterminé mediante tinciôn con DAPI de anteras aisladas (Vergne et al., 1987; Gonzâlez-Melendi et al., 1995). Para los cultivos, se seleccionaron anteras con puntas coloreadas de azul procedentes de botones con pétalos y sépalos de longitud similar, correspondientes al estado de microspora vacuolada. Se esterilizô la superficie de los botones con un 5 % de hipoclorito sôdico. Se emplearon plaças Pétri de 5 cm de diâmetro, colocândose en cada una 15 anteras en un medio de inducciôn con medio CP (Dumas de Vaulx et al., 1981) suplementado con 0,01 mg/1 de âcido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) y kinetina. Después de 8 dias a 35 °C en oscuridad, los cultivos se sometieron a periodos de 12 horas de luz a 500 pmol fotones/m^s a 25 °C. Después de 12 dias de inducciôn en medio CP, las anteras se colocaron en medio Ri (Dumas de Vaulx et al., 1981) suplementado con 0,1 mg/1 de kinetina. 2.3 Electroforesis, Western Blot e immunodetecciôn de proteinas Los cultivos de anteras se sumergieron en nitrôgeno liquido, se homogenizaron en un mortero enfriado con “cracking buffer” (20 mM Tris HCl, pH 8, 2 % SDS, 1 % 13- mercaptoetanol, 1 mM PMSF), se hirvieron durante 3 minutos y se centrifugaron durante 15 minutos; los sobrenadantes obtenidos se centrifugaron de nuevo très veces. Las proteinas totales se midieron mediante el método de Bradford (Merck's Bloquant). Para 245 Capîtulo IX._______________________________________________________________________ cada experimento, se utilize la misma cantidad de proteinas, que se separaron mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 12 %. El desarrollo electroforético se realize a 80 V, en el sistema Miniprotean III de BioRad (Hercules, CA, EE. UU). Una vez finalizada la electroforesis las proteinas se transfîrieron durante 1 hora a una membrana de nitrocelulosa (PVDF; Millipore, Bedford, MA, EE. UU), mediante la técnica del Western blotting. A continuaciôn, se bloquearon durante una noche en tampon de bloquée (2 % leche desnatada + 0.05 % Tween 20 en TBS) a 4 °C. Como control de la transferencia, se tino una tira de la membrana amido black para visualizar la cantidad de proteina total. Las membranas se incubaron con el anticuerpo primario (anti-LOX) en una diluciôn de 1: 1000 en tampon de bloquée a temperatura ambiente y en agitaciôn durante toda la noche. Después se lavaron durante 10 minutos, très veces, en soluciôn de lavado (0.2 % leche desnatada + 0.5 % Tween 20 en TBS). A continuaciôn, la membrana se incubô durante 2 horas con un anticuerpo segundario anti- conejo conjugado con fosfatasa alcalina, diluido al 1:1000 en soluciôn de bloquée, y posteriormente se lavô très veces con la misma soluciôn empleada para lavar los anticuerpos primaries, durante 10 minutos. Finalmente, el revelado del anticuerpo segundario se realizô mediante incubaciôn con una mezcla de azul de nitrotetrazolio (NTB, Sigma) y bromocloroindolil fosfato, (BCIP, Sigma) en un tampôn apropiado (NaHCOg 100 mM, NaCOs 50 mM, MgCL'ôHzO 4 mM). Por ùltimo, se secaron y digitalizaron en un escâner Hewlett Packard 6100C. Los contrôles se realizaron con el anticuerpo primario y/o con el segundario. 2.4 Crioprocesado de muestras para criocortes Se fijaron anteras de diferentes etapas del desarrollo gametofïtico, y en diferentes momentos del desarrollo del cultivo in vitro, en formaldehido al 4 % (w/v) en PB S y pH 7,3, durante toda una noche a 4 °C; a continuaciôn se realizaron 3 lavados en PBS, de 10 minutos, cada uno. Por ùltimo, se lavaron en PBS y se crioprotegieron en concentraciones crecientes de sacarosa: 0.1 M (1 h), 1 M (3 h), y 2.3 M toda la noche. Las muestras crioprotegidas se colocaron en una barrita de aluminio y se criofijaron en propano liquido utilizando una unidad KF80 (Reichert, Viena) a -170 °C. Por ùltimo, se obtuvieron los criocortes semifinos (Ipm ) con el ultratomo de Ultracut E (Reichert) acoplado con la unidad FC4 para estabilizar a -75 °C y se colocaron sobre portaobjetos multipocillo (ICN, Costa Mesa, CA, USA). 246 CapUulo IX. 2.5 Inmunofluorescencia La inmunofluorescencia se realizô sobre criocortes semifinos (1 |xm). Los portaobjetos que contenian las muestras se lavaron en PBS para eliminar la sacarosa. Las muestras se bloquearon con 10 % de FCS (suero bovino fetal) en PBS durante 10 minutos. Las muestras se incubaron con el anticuerpo primario diluido al 1:25 en 5 % de FCS en PBS, durante 1 hora, a temperatura ambiente. Después, se realizaron 3 lavados de 5 minutos con PBS y a continuaciôn, las muestras se incubaron en oscuridad durante 45 minutos con el anticuerpo secundario anti-conejo (Eugene, O, EE. UU) diluido al 1:25 en 5 % de FCS en PBS, también a temperatura ambiente. Después, se lavaron très veces con PBS y dHiO y posteriormente, se tineron con DAPI (4,6-diamidine-2-phenylindol; Serva, Heidelberg, Alemania) durante 5 minutos. Por ùltimo, se lavaron très veces con dH20 y se montaron con Mowiol (Polysciences, Eppelheim, Germany). Los resultados se observaron usando el scanner confocal Bio-Rad MRC-1000 montado en un microscopio Zeiss Axiovert 135. Los contrôles se realizaron sustituyendo el primer anticuerpo por PBS. Adicionalmente, los cortes incubados con anti-LOX se marcaron mâs intensamente con la soluciôn de Rojo Nilo (Sigma) Img/ml en acetona diluida al 5:100 en PBS durante 30 minutos. Se empleô a continuaciôn un lâser azul para la visualizaciôn de la senal de inmunofluorescencia de LOX, y un lâser verde para la detecciôn del Rojo Nilo. 2.6 Crioprocesado de muestras para microscopia electrônica Se fijaron anteras de diferentes etapas del desarrollo gametofïtico y en diferentes momentos del desarrollo del cultivo in vitro con paraformaldehïdo al 4 % (w/v) en PBS y pH 7,3, durante toda una noche a 4 °C. A continuaciôn, se lavaron con PBS y se deshidrataron empleando una serie de concentraciôn creciente de metanol (30 %, 50 %, 70 % y 100 %), y una disminuciôn progresiva de temperatura de 40 °C a -30 °C. Las muestras se impregnaron con mezclas de metanol/Lowicryl K4M (en una serie 2:1, 1:1 y 1:2) a -30 °C, se encapsularon en résina pura a la misma temperatura, y se polimerizaron bajo la luz de UV a -30 °C usando un equipo Leica AFS, como se ha descrito en trabajo s previos (Testillano et al., 1995). Finalmente, se realizaron cortes semifinos (1 pm) y ultrafmos (100 nm) para el estudio con microscopio ôptico y electrônico respectivamente. Los cortes semifinos se tineron con azul de toluidina al 1 % para el anâlisis estructural. Las 247 Capîtulo IX._______________________________________________________________________ preparaciones se observaron en un microscopio Leitz con objetivos de contraste de fase y campo claro y fotografiadas con una câmara digital Olympus DC 10. 2.7 Inmunomarcado con oro coloidal para microscopia electrônica La inmunolocalizaciôn se llevô a cabo sobre cortes ultrafinos de Lowicryl K4M, como se describio en trabajos previos (Risueno y Testillano, 1994; Testillano et al., 1993). Se pusieron a flotar en gotas de ddH20 las rej illas de niquel cubiertas por Formvar y carbon con los cortes ultrafinos de Lowicryl, PBS y BSA (suero bovino albumin) al 5 % en PBS durante 5 minutos para bloquearlas. Posteriormente se incubaron con anticuerpo LOX diluido a 1:75 en 1 % BSA durante 1 hora a temperatura ambiente y, a continuaciôn, se lavaron en PBS. Para revelar el anticuerpo primario, las rej illas se incubaron con anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados con oro coloidal de 10 nm (Biocell, Cardiff, Reino Unido) diluido a 1:25 en PBS durante 45 minutos y se lavaron très veces con PBS y ddH20. Finalmente, se secaron y se tineron con acetato de uranilo al 5 % durante 20 minutos, y con citrato de plomo durante 5 segundos. Las muestras se observaron en un microscopio electrônico de transmisiôn JEOL 1010 a 80 kV. Los contrôles se realizaron incubando las rej illas en sôlo 1% de BSA en PBS. Adicionalmente, se marcaron los cortes ùnicamente con DAB para la detecciôn de catalasa (localizaciôn de peroxisomas). La inmunolocalizaciôn de LOX se llevô a cabo en cortes ultrafinos, los cuales también se tineron con DAB. Estos cortes se pusieron a flotar durante algunos minutos (después de la inmunolocalizaciôn) en un medio estabilizador de catalasa (cacodilato 0.1 M, glucosa 6 %, NaCl 2.5 %). A continuaciôn, se colocaron sobre unas gotas de soluciôn de DAB (soluciôn Teorell Stenghagen con 0.01 M, 0.20 % 3,3 DAB, 0.15 % H2O2) a 37 °C durante 2 horas y se lavaron luego très veces con soluciôn Teorell Stenghagen con 0.01 M (pH 10.5). Finalmente, se secaron, y se tineron con acetato de uranilo al 5 % durante 20 minutos, y con citrato de plomo durante 5 segundos, y se secaron al aire antes de la observaciôn con microscopio electrônico. 2.8 Tinciones citoquimicas Las muestras se tineron con la tinciôn DAPI (Vergne et al., 1987) para ADN y se observaron bajo luz ultravioleta utilizando un microscopio para epifluorescencia. 248 CapUulo IX. 3. Resultados En este estudio se empleô un anticuerpo anti-LOX policlonal, obtenido a partir de la izoenzima 13-LOX de patata (Royo et al., 1999), cedido por el laboratorio J. Sânchez- Serrano (CNB, CSIC, Madrid), y que lue utilizado previamente en estudios de inmunomarcado en Humulus lupulus (Fortes et al., 2004), quedando probada la especifîcidad del mismo para LOX. 3.1 “Immunoblotting” 1 2 3 107 kD 76 kD 52 kD O 36.8 kD 27 kD 19 kD C 3 LOX Figura 1. Inmunoblot anti-LOX. 1. Marcadores de peso molecular. 2. Proteinas totales; tinciôn con amido black. 3. Se détecta una intensa banda de aproximadamente 98 kD peso molecular en extracto total de proteinas de Capsicum annuum L. Para analizar la especifîcidad del anticuerpo en Capsicum annuum L, se realizô un inmunoblot en el que se empleô un extracto de proteinas totales extraldas de plântulas de dicha especie. Tras el revelado con fosfatasa alcalina, se detectô una intensa banda de 249 CapUulo IX. aproximadamente 98 kD (figura 1), que corresponde con el peso molecular que présenta esta izoenzima en otras especies (Fortes et a l, 2004). 3.2 Inmunofluorecencia con anticuerpos anti-LOX en embriones derivados de microsporas y embriones cigoticos La embriogénesis de polen se induce in vitro en la microspora vacuolada, la cual tras un tratamiento inductor abandona su ruta normal gametofïtica, dividiéndose simétricamente y dando lugar a proembriones de 2 a 3 células que se desarrollan para dar lugar a proembriones tempranos. Estos embriones contienen células poligonales poco vacuoladas, con citoplasma denso y nùcleos grandes con cromatina descondensada que ocupan generalmente la zona central de la célula (Bârâny et al., 2005). Con el paso del tiempo, el nùmero de divisiones celulares aumenta y provoca la ruptura de la exina, que es la pared celular de la microspora, en las zonas de apertura. En los embriones multicelulares tardios (figura 2a) se observan dos tipos celulares. 250 Capîtulo IX. I ^•DAPl\ n t i - L O X D A P # 0. . . I 1 \ n t i - 1 . 0 X I iR o i o N i l o T ' * ‘ :• Figura 2. Inmunolocalization con anti-LOX en la ruta embriogénica derivada de microsporas. En la etapa de proembriones multicelulares tardios se observan dos tipos célulares (a), en la etapa mencionada no se observa senal de fluorescencia de LOX (a'), tinciôn con DAPI (a") para observar los nùcleos. En la fase de torpedo (b) se reconocen diferentes tejidos celulares: la epidermis (flécha), un tejido vascular (c) y un parénquima (d). La fluorescencia con anti-LOX présenta una intensa senal en células parenquimâticas (c’) y en la epidermis (flécha). Tinciôn con DAPI (b") para revelar los nùcleos. Tinciôn con Rojo Nilo para revelar los cuerpos lipidicos (c), inmunofluorecencia con LOX (c'), tinciôn con DAPI (c"). Barras: a, a', a", b, b', b”, c, c', c": 50 pm. 251 CapUulo IX.______________________________________________ ________________________ Las células de la zona exterior son grandes, poligonales, con citoplasma denso, grandes vacuolas y presentan gran cantidad de almidôn en inclusiones de gran tamano. En la zona interior las células son mâs pequenas, con morfologia poligonal, y presentan un citoplasma también denso, pero con muchas menos vacuolas y sin almidôn. El estudio de la localizaciôn subcelular de anti-LOX con inmunofluorecencia no mostrô senal ni en los proembriones tempranos (datos no mostrados), ni en los embriones multicelulares tardios (flgura 2c-c"). Los embriones se desarrollaron hasta el estadio torpedo (figura 2b), detectândose en dicha etapa una senal intensa de inmunofluorescencia de LOX punteada en el citoplasma, estando los nùcleos revelados por DAPI negativos (figuras, comparando 2b-b"). En esta etapa, se observa una senal intensa en las células parenquimâticas (figura 2b, cuadro c), y en las epidérmicas (figura 2b, flécha). Se realizô en la etapa de torpedo un marcado especifico para los cuerpos lipidicos mediante tinciôn con Rojo Nilo tras la inmunofluorescencia con LOX, y el anâlisis confocal revelô una doble senal fluorescente: de color rojo indicando la localizaciôn de cuerpos lipidicos con Rojo Nilo (figura 2c) y de color verde indicando la de LOX (figura 2c'). La similitud entre la organizaciôn celular y estructural del embriôn derivado de microsporas y el cigôtico, sugiere un paralelismo en el pimiento entre los patrones de desarrollo del embriôn en ambos procesos de embriogénesis haploide y cigôtica (Yeung et al., 1996). Se identificaron proembriones tempranos cigôticos y embriones multicelulares tardios cigôticos mostrando dos tipos celulares, siguiendo el criterio de presencia o no de almidôn que fùe descrito para los embriones derivados de microsporas (Bârâny et al., 2005). Se realizô un estudio para buscar similitudes o diferencias en la localizaciôn del LOX en los embriones cigôticos en el mismo estadio que fùe estudiado en los embriones derivados de microsporas. Ni en los proembriones tempranos cigôticos (datos no mostrados) ni en los embriones multicelulares tardios cigôticos (figura 3a-a') se observô senal alguna con el anticuerpo LOX. 252 CapUulo IX. A n t i - L O X A n t i - L O X } A Figura 3. Inmunolocalizaciôn con anti-LOX en embriones cigôticos (a-b) Tinciôn con DAPI (a-b) para observar los nùcleos y inmunofluorecencia (a’-b’) sobre cortes semifinos de 1 pm. En la etapa de proembriones tardios (a) no se observa senal de fluorescencia (a'), En fases mas avanzadas, como la fase de torpedo (b) se reconocen diferentes tejidos. En la etapa mencionada, se observa una intensa senal de fluorescencia en células parenquimâticas (b') pero no en el tejido vascular (d') como observamos en los embriones derivados de microsporas en la misma etapa. Barras: a, a\ b. b': 50 um. 253 CapUulo IX.______________________________________________________________________ _ No obstante, en la etapa torpedo cigôtico se detectô una intensa senal de LOX mostrando un patrôn punteado en el citoplasma de las células parenquimâticas (figura 3b) y en las epidérmicas (figura 3b-b'). Se observô un patrôn de localizaciôn semejante al que ya se habia observado en las microsporas derivadas de embriogénesis. Los contrôles realizaron omitiendo el primer anticuerpo y revelaron ausencia del marcado. 3.3 Inmunolocalizaciôn a nivel ultraestructural Para estudiar la localizaciôn a nivel ultraestructural, se realizô un inmunomarcado con oro con el anticuerpo LOX. Para ello, se incluyeron en Lowicryl los embriones derivados de microsporas y los cigôticos, y se realizaron cortes ultrafinos para los ensayos de inmunolocalizaciôn, que posteriormente se analizaron con el microscopio electrônico. El estudio de la distribuciôn ultraestructural revelô presencia de particulas de oro de LOX en las células parenquimâticas (figura 4a), en el citoplasma (figura 4b-4d), en cuerpos lipidicos (figura 4b-d) y en los peroxisomas (figura 4b-f). Para confirmar la identificaciôn de peroxisomas se llevô a cabo un inmunomarcado con oro con anti-LOX combinado con una tinciôn (DAB) especifica para la detecciôn de las peroxisomas. En el citoplasma se observaron varios peroxisomas con un gran nùmero de particulas de oro (figura 4c-f), mientras que en otras estructuras no se observô un marcado significativo. En los contrôles llevados a cabo sin usar los anticuerpos primarios, no se observô senal de particulas de oro. En los embriones cigôticos se observa el mismo patrôn de localizaciôn (datos no mostrados). No se encontrô un nùmero de particulas de oro significativo; ademâs no se observô senal alguna de particulas de oro en los ensayos de control realizados sin el primer anticuerpo. 254 Capitula IX. X.' Pc P e t N Nu e t -pl . , _ a # e t ’-%: ;.- f I s s î .^ Figura 4. Inmunolocalizaciôn a nivel ultraestructural con oro coloidal con anti-LOX en embriones torpedo (a-d). La LOX se localiza a nivel ultraestructural en cuerpos lipidicos (b) en ôrganos (c-d). Ct: citoplasma, N: nùcleo, Nu: nucleolo, Pc: pared celular, V: vacuola, L: cuerpos lipidicos, P: peroxisoma. Barras: a: 1 pm; b, c, d, e, f: 200 nm. 255 Capitula IX._______________________________________________________________________ 4. Discusiôn 4.1 Los cambios de la expresiôn de LOX durante la embriogénesis del polen también suceden en la embriogénesis cigôtica La movilizaciôn de los depôsitos lipidos es un proceso esencial en la germinaciôn de plantas oleaginosas puesto que proporciona la energla y el carbono necesarios para el crecimiento de las plântulas (Hooks et al., 2002). A pesar de que se han realizado muchos estudios sobre el tema, todavia no se comprende por completo el mecanismo que rige este proceso. El patron estructural de desarrollo de embriones derivados de microsporas no se conoce en profundidad, existiendo pocos estudios sobre la comparaciôn de la formacion de embriones derivados de polen con la embriogénesis cigôtica (Yeung et al., 1996; Bârâny et al., 2005). La expresiôn de LOX, por otro lado, se estudiô durante los dos tipos de embriogénesis: la derivada de microsporas y la cigôtica, para buscar similitudes y diferencias durante los procesos de desarrollo y diferenciaciôn. Los estudios de inmunolocalizaciôn se llevaron a cabo en cortes semifînos de mue stras de diferentes e tapas de la embriogénesis, y en las mismas etapas en embriones cigôticos. Ni los proembriones tempranos y tardios derivados de microsporas, ni los embriones cigôticos estudiados en las mismas etapas mostraron expresiôn de LOX, como ya se describiô en embriones tempranos cigôticos de soja (Altschuler et al., 1989; Hildebrand et al., 1991). En etapas posteriores del desarrollo, en concrete en la etapa torpedo, se detectô LOX en la zona de parénquima con una alta actividad meristemâtica, lo que sugiere un papel en la activaciôn de la formaciôn de meristemos. Las LOX parecen estar involucradas en los procesos de crecimiento y desarrollo (Hildebrand et al., 1989). En el guisante, la distribuciôn de LOX se ha asociado a células en las que tienen lugar la expansiôn y el crecimiento celular, siendo esta enzima la responsable del crecimiento y desarrollo de la vaina (Rodriguez-Concepciôn et al., 1996). Asi mismo, la LOX también esta implicada en la hidrataciôn de los tejidos (Hildebrand et al., 1989), en la elongaciôn de la célula (Rodriguez-Concepciôn y Beltrân 1995) y en el almacenamiento de nitrôgeno (Tranbarger et al., 1991; Chateigner et al., 1999); correlacionândose la expresiôn de LOX-g con la reanudaciôn de eje de crecimiento en las semillas del guisante, y sugiriéndose que esta isoforma podria contribuir a la elongaciôn de 256 _______________________________________________________________________ Capitula IX. la célula durante el crecimiento del eje, al remodelar el contenido en fosfolipidos de la membrana celular. En im sistema de inducciôn de morfogénesis in vitra en Humulus lupulus L., se localizô la LOX en prenôdulos y nôdulos organogénicos, lo que sugiere su participaciôn en la formaciôn de nôdulos y en la regeneraciôn de plântulas a partir de dichos nôdulos (Fortes et al., 2004). En Capsicum annuum, la LOX fue particularmente abundante en las células parenquimâticas. Esta senal de alta fluorescencia de LOX puede estar relacionada con la divisiôn celular activa que tiene lugar en estas zonas. Recientemente, se ha demostrado que la LOX esta involucrada en el control del desarrollo del tubérculo de la patata, que es un proceso morfogénico (Kolomiets et al., 2001). El Western blotting revelô una intensa banda indicando la presencia de LOX en pimiento, quedando probada la especificidad de la enzima en Capsicum annuum. En las plantas, los âcidos grasos hidroperôxidos derivados de LOX son metabolizados a través de cuatro rutas principales con la participaciôn de enzimas como la hidroperôxido liasa (HPL), aliéné oxido sintasa (AOS), peroxigenasa (POX) y la divinil éter sintasa (Feussner y Wastemack 2002). En los embriones torpedo la LOX esta localizada en los cuerpos lipidicos, lo que sugiere la participaciôn de LOX en la transformaciôn del depôsito de lipidos en azùcares para ser utilizados como substrato respiratorio en el proceso de formaciôn de la raiz y el tallo, proceso que requiere mucha energia. Estos lipidos pueden ser utilizados para producir azùcares via gluconeogénesis. Estudios previos han demostrado un ciclo de acumulaciôn y la movilizaciôn de almidôn durante la formaciôn de embriogénesis (Bârâny et al., 2005). Segùn Creelman y Mullet (1997) la inducciôn de la sintesis de proteinas del almacenamiento vegetativo (mediada por el âcido jasmônico) en condiciones de gran acumulaciôn de azùcar, créa un depôsito de carbono y nitrôgeno y libera fosfatos de los depôsitos de fosfatos en azùcar para una mayor fijaciôn del carbono. La presencia de LOX en plastidios puede estar relacionada con la sintesis de âcido jasmônico (Leôn y Sânchez-Serrano 1999) o con la degradaciôn de las membranas tilacoidales durante la transiciôn del cloroplasto a amiloplasto. Las células parenquimâticas de la periferia en Capsicum annuum L. mostraron la presencia de puntos fluorescentes de LOX coïncidentes con cuerpos lipidicos. Estos resultados sugieren la participaciôn de LOX en la movilizaciôn de los depôsitos de lipidos, aportando una fuente adicional de energia para la regeneraciôn de la plântula mediante gluconeogénesis. En Humulus lupulus L. la localizaciôn subcelular indica que las LOX estân involucradas en la movilizaciôn de cuerpos lipidicos durante de la formaciôn de 257 Capitula IX._______________________________________________________________________ nôdulos y en la regeneraciôn de plântulas a partir de esos nôdulos (Fortes et al., 2004). En la cebada y el pepino, los compuestos oxigenados de LOX almacenan triacilgliceroles; este proceso de oxigenaciôn parece iniciar la movilizaciôn de depôsitos de lipidos (Feussner et al., 1997 a,b). En el proceso de germinaciôn de la semilla de pepino se ha encontrado una isoforma especial de 13-LOX en los orgânulos en depôsitos de lipidos (cuerpos lipidicos). Esta isoforma oxigena los triacilgliceroles almacenados mâs que los âcidos linoleicos libres liberados por la acciôn de una enzima hidrolizante de lipidos. Las lipasas que parecen actuar principalmente sobre lipidos ester-oxigenados mâs que sobre los lipidos no oxigenados, han sido observadas en membranas microsomales de varias plantas (Stahl et al., 1995). Los cambios en la distribuciôn y cantidad de LOX durante el desarrollo en diferentes tejidos y compartimentos celulares son debidos en parte a la expresiôn de diferentes miembros de la familia del gen LOX (Creelman y Mullet 1997). Del Rio et al. (2002) han propuesto que los perixomas podrian tener en las células végétales la funciôn de fuente de senales moleculares taies como el ôxido nitrico, los radicales superôxidos y los perôxidos de hidrôgeno. En muchos niveles fisiolôgicos, incluyendo el crecimiento y el desarrollo, estân involucrados niveles bajos de ôxido nitrico y ROS (Del Rio et al., 2002, y referencias relacionadas), posiblemente por la actividad de los LOX en los perixomas que estén actuando como una fuente de ROS. La importante réserva de nuevos metabolites disponibles en los perixomas puede tener un efecto en las rutas metabôlicas en otros compartimentos de la célula. Los cambios en la distribuciôn y cantidad de LOX durante el desarrollo en diferentes tejidos y compartimentos celulares son debidos en parte a la expresiôn de diferentes miembros de la familia del gen LOX (Creelman y Mullet 1997). En este trabajo hemos determinado por primera vez la expresiôn y localizaciôn a nivel celular y ultraestructural de LOX durante el proceso morfogénico de embriogénesis derivada de microsporas de Capsicum annuum L., asi como su implicaciôn en la movilizaciôn de lipidos durante la embriogénesis; habiéndose observado también similitudes con dicha movilizaciôn en embriones cigôticos de Capsicum annuum L.; por lo que puede considerarse a las LOX como un componente clave en el proceso de embriogénesis. 258 Capitula IX. 5. Bibliografia Altschuler M., Graybum W.S., Collins G.B., Hildebrand D.F. (1989). 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La embriogénesis era activada mediante un pretratamiento de las anteras a 4 °C durante 48 horas, para posteriormente realizar el cultivo en un medio base con hormonas y vitaminas. En esta Tesis Doctoral, las plantas haploïdes de Capsicum annuum se regeneraron a partir de cultivos in vitro de anteras de una nueva variedad, denominada Yolo Wonder B. Se ha demostrado que un tratamiento inductor a 35 °C durante 8 dias es el mâs adecuado como tratamiento inductor tanto para esta variedad como para otros genotipos del pimiento, con una respuesta de la antera dentro del rango de baja respuesta a la inducciôn (Mitykô et al., 1995). Se han evaluado varios factures que afectan al proceso, con objeto de optimizar el sistema de inducciôn a embriogénesis de polen en Capsicum annuum L. var. Yolo Wonder B. Se ha definido un criterio sencillo como es la correlaciôn entre la secuencia de desarrollo floral y el desarrollo gametofïtico del polen, para poder realizar la selecciôn de las yemas florales con polen en la etapa de mayor respuesta en esta especie; asi mismo, se monitorizaron las primeras etapas mediante un estudio microscôpico, llevândose a cabo la caracterizaciôn de las primeras divisiones de las microsporas, de la formaciôn de embriones y de la obtenciôn de plantas haploïdes o doble-haploides a partir del cultivo in vitro de anteras. 2. Las protemas de choque térmico estân implicadas en la reprogramaciôn de la microspora El estrés es capaz de inducir el cambio en el programa de desarrollo en las microsporas. Tras el tratamiento de inducciôn, una de las primeras reacciones de la célula es la activaciôn de los genes de choque térmico y la sintesis de proteinas de choque térmico (HSP) (Lindquist et al., 1986; Morimoto et al., 1997; Vierling et al., 1991; Segui et al., 2003). Existen muchos datos en otras especies, sobre los aspectos bioquimicos y moleculares de la embriogénesis de microsporas, donde se ha realizado un importante esflierzo para conocer la influencia del tratamiento de estrés sobre los mecanismos que 263 Discusiôn general contrôlai! la reprogramaciôn (Cordewener et al., 1995; 2000; Chupeau et al., 1998; Custers et al., 1994; Garrido et al., 1993; Pechan et al., 1991; Touraev et al., 1997; Zarsky et al., 1995). Sin embargo, todavia hoy los puntos clave del proceso de inducciôn siguen sin conocerse en su totalidad. En Capsicum annuum los ùnicos datos sobre los efecto s del tratamiento térmico en microsporas de Capsicum annuum son los que contiene nuestro trabajo preliminar (Bârâny et al., 2001). Estos datos serân muy utiles para entender los mecanismos celulares que provocan el abandono de la ruta de desarrollo gametofïtica. En esta Tesis Doctoral se ha estudiado la expresiôn y localizaciôn in situ de las proteinas HSP70 y HSP90 mediante Western Blot, inmunofluorescencia e inmunomarcado con oro y se han analizado los cambios durante el proceso de embriogénesis en las primeras etapas de la inducciôn a la misma, y en el inicio del desarrollo embriogénico haploïde. Los resultados obtenidos indican una presencia constitutiva de la proteina HSP70 en todas las etapas, localizada en citoplasma, el nùcleo y el nucleolo. Sin embargo, después del choque térmico, se dispara la sintesis de HSP70 y aumenta su localizaciôn nuclear especificamente en el nucleolo. Estos datos podrian sugerir un posible papel del HSP70 especifîco en la embriogénesis de microsporas inducida mediante estrés. Estos resultados indican asi mismo que la expresiôn de HSP90 aumenta tras la inducciôn y es mayor en el citoplasma que en el nùcleo, manteniéndose la proporciôn en todas las etapas; por lo que no hay cambios en la localizaciôn tras el tratamiento de inducciôn embriogénica como los observados con el HSP70. 3. Cambios en la organizaciôn célular determinan marcadores de la reprogramaciôn hacia la ruta de desarrollo esporofitica En el momento de la inducciôn a la embriogénesis, se dan una serie de cambios a diferentes niveles, con la expresiôn de un conjunto de genes que acompanan a la respuesta celular. Existen muy pocos estudios que hayan tratado de localizar in situ moléculas implicadas en este proceso (Cordewener 1995; Straatman et al., 1999; Testillano et al., 2000; Segui et al., 2003), a pesar de que esto es clave para comprender procesos tan complejos como son el cambio de programa de desarrollo, y la formaciôn y el desarrollo del embriôn. 264 Discusiôn general En cultivos de microsporas de Brassica napus y en Nicotina tabacum se han descrito cambios en el numéro y en las caracteristicas morfolôgicas, estructurales o funcionales de algunos de sus componentes, como el citoesqueleto, la poblaciôn ribosômica, o la cantidad de proteinas totales entre otras (Zaki y Dickinson, 1991; Mascarenas et al., 1990; Mascarenas et al., 1975; Harada et al., 1988; Touraev et al., 1996c; Hause et al., 199); pero todavia no se han definido cambios caracteristicos de cada ruta de desarrollo (Touraev et al., 1996c; Hause et al., 1993; Pechan et al., 1991; Telmer et al., 1992; 1995; Zaki y Dickinson, 1990). Los resultados obtenidos en la inducciôn a embriogénesis en otros sistemas, y en nuestro estudio en Capsicum annuum indican ciertas semejanzas en los procesos. La identificaciôn de los marcadores diferenciales tempranos de las rutas gametofïtica y embriogénica podria ser usada para définir los procesos que son activados y los que son reprimidos cuando las microsporas cambian su programa de desarrollo en respuesta a un tratamiento de estrés (Testillano et al., 2000; Segui et al., 2003, 2005; Ramirez et al., 2004). La apariciôn de determinados cambios celulares en etapas especificas del desarrollo ha sido relacionada con la activaciôn de la proliferaciôn o con el comienzo de la diferenciaciôn (Coronado et al., 2002; Ramirez et al., 2004; Segui et al., 2005). Se ha determinado una serie de caracteristicas morfolôgicas estructurales y funcionales en algunos de los componentes de las células que siguen la ruta embriogénica frente a las que siguen la ruta gametofïtica, taies como forma, tamano y posiciôn nuclear, la escasa presencia de los amiloplastos, y la situaciôn y diferenciaciôn de paredes celulares. Estos cambios se producen en etapas concretas, pudiendo constituir por tanto marcadores del proceso (Bârâny et al., 2005). 4. La pared celular modifîca sus componentes con la reprogramaciôn de la microspora: esterificaciôn de pectinas, xiloglucanos y RGII como marcadores La pared celular es una estructura dinâmica que détermina el tamafio, forma y desarrollo de la célula. Los polisacâridos (celulosa, hemicelulosa y pectinas), enzimas y proteinas estructurales que constituyen la pared celular primaria, cambian su composiciôn y distribuciôn durante el crecimiento y diferenciaciôn celular. Los cambios en el patrôn de localizaciôn y en el nivel de esterificaciôn de las pectinas observados en los proembriones 265 Discusiôn general de alcomoque presentan similitudes con aquellos observados en otros sistemas vegetales, y parecen indicar una caracteristica especifica asociada con la actividad de proliferaciôn (Ramirez et al., 2002, 2003, 2004; Bârâny et al., 2006). Los estudios realizados en polen bicelular maduro y en polen germinado donde la densidad de marc ado de pectinas no esterificadas es significativamente superior a la de pectinas esterificadas, indicando un grado bajo de esterificaciôn de pectinas, (Stepka et al 2000; Suârez-Cervera et al., 2002) también apoyan esa hipôtesis. En la fase de microspora vacuolada se observa un alto contenido de pectinas esterificadas en las aperturas (Taylor y Hepler, 1997); por el contrario, otros componentes de la pared celular como las pectinas no esterificadas, XG y RGII, se han detectado en niveles bajos en esa misma etapa. En la etapa polen bicelular maduro, se detectô un alto contenido de pectinas no esterificadas, de XG y de RGII; por el contrario, no se detectô la presencia de pectinas esterificadas. Las pectinas no esterificadas se localizaron en la zona interna de la intina, mientras que las esterificadas, se depositaron en la zona extema de la intina (Aouali et al., 2001). Los resultados obtenidos en esta tesis Doctoral, en el sistema de Capsicum annuum L., indican que las pectinas no esterificadas, el XG y el RGII, estân relacionadas con la diferenciaciôn y pueden ser buenos marcadores de la ruta gametofïtica; mientras que las pectinas esterificadas pueden ser empleadas como un buen marcador de proliferaciôn, en la ruta embriogénica. Los marcadores celulares tempranos identificados para las rutas gametofïtica y embriogénica podrian ser usados para diferenciar las microsporas que responden y que no responden a un tratamiento de estrés. 5. La expresiôn, localizaciôn y actividad de MAPKs esta regulada durante la reprogramaciôn de la microspora a embriogénesis Como todos los organismos eucariôticos, las células vegetales han desarrollado evolutivamente diverses sistemas de transducciôn de senales que les permiten responder de forma especifica a los estimulos extemos. Las cascadas de MAPKs estân implicadas en la transducciôn de senales en respuesta a multitud de estimulos. Homôlogos de MAPK se han identificado en diferentes especies de células vegetales (Hirt et al., 2000) incluidos granos de polen (Heberle-Bors et al., 2001; Coronado et al., 2002). La presencia de MAPKs en el nùcleo ha sido observada en algunos 266 Discusiôn general estudios en células de mamiferos (Chen et al., 1992; Marshall et al., 1995; Shangera et al., 1992), pero pocos trabajos han confirmado la presencia de MAPKs en nùcleos de células vegetales (Coronado et al., 2002, 2007; Silva et al., 2004; Préstamo et al., 1999; Testillano et al., 2000 a,b, 2001; Segui et al., 2005). Los môdulos de MAPKs han sido relacionados con fenômenos de proliferaciôn (Jouannic et al., 2001) y diferenciaciôn (Tichtinsky et al., 1998). En este trabajo se han estudiado los cambios dinâmicos en la expresiôn y localizaciôn subcelular de los homôlogos de ERK y de formas activas de MAPK en los dos programas del desarrollo del polen de Capsicum annuum L: la ruta gametofïtica (maduraciôn del polen y diferenciaciôn) y las dos primeras etapas de inicio de embriogénesis dentro de la ruta embriogénica: proembriones tempranos (proliferaciôn) y embriones multicelulares tardios (diferenciaciôn). Los resultados mostraron que la progresiôn de los procesos de diferenciaciôn y proliferaciôn estuvo acompanada de un incremento de la expresiôn de ERKs junto con un cambio de localizaciôn de estas protemas. El grado de densidad de marcado de ERKs fue mayor en células en proliferaciôn en las primeras etapas de embriogénesis que en la microspora vacuolada, sugiriendo que la translocaciôn de ERKs al nùcleo podria estar asociada al inicio de la proliferaciôn, como se ha descrito en otras especies (Coronado et al., 2002; Segui et al., 2005). Por otro lado, la proporciôn de homôlogos de ERK en el citoplasma en la fase de polen bicelular y en los embriones multicelulares tardios, indica un posible papel de estas proteinas en la senalizaciôn en procesos de diferenciaciôn. Las ERKs se han relacionado con fenômenos de proliferaciôn y diferenciaciôn en animales (Marshall et al., 1995), y en plantas (Coronado et al., 2002; Segui et al., 2005). La inmunolocalizaciôn del epitopo fosforilado de la forma activa de las MAPKs fue empleada para relacionar la activaciôn de las MAPK con su localizaciôn subcelular. Los resultados obtenidos sugieren que la localizaciôn de MAPKs en el nùcleo o en el citoplasma, y su translocaciôn entre estos compartimentos puede jugar un papel en la regulaciôn de la actividad, asi como la implicaciôn de estas moléculas senalizadoras en los procesos de proliferaciôn y diferenciaciôn que tienen lugar en las dos rutas de desarrollo del polen. 267 Discusiôn general 6. La reprogramaciôn de la microspora afecta a la arquitectura y funciôn nuclear: reactivaciôn de la replicaciôn y aumento de cuerpos de Cajal En la ruta gametofïtica, los dos nùcleos résultantes presentan distinta actividad metabôlica. Mientras que el nùcleo generativo es inactivo metabôlicamente, el nùcleo vegetativo présenta elevada actividad transcripcional (Mena et al., 1994; Zarsky et al., 1992; McCormick et al., 1993b). En este trabajo se han estudiado dos aspectos de la arquitectura y funciôn nuclear que no habian sido estudiados con profundidad hasta ahora; la actividad replicativa y los cuerpos de Cajal en las microsporas que siguen su ruta normal gametofïtica y en las que se reprogram an a su nueva ruta embriogénica. El PCNA (“Proliferative Cell Nuclear Antigen”) ha sido descrito como un factor auxiliar para la ADN polimerasa & (Tan et al., 1986; Burgers et al., 1998), que le permite ser utilizado como marcador de proliferaciôn, ya que juega un papel importante en la replicaciôn en eucariotas (Suzuka et al., 1989). En este trabajo, el anti-PCNA se ha utilizado como un marcador eficiente de lugares de replicaciôn, como ya se propuso en trabajos anteriores (Gonzâlez-Melendi et al., 1996). En la fase de microspora vacuolada nuestros resultados demuestran la existencia de replicaciôn al final de la interfase de la microspora, como se ha descrito para otras especies (Gonzâlez-Melendi et a l , 1996; Gonzâlez-Melendi et al., 2000). Los resultados obtenidos con el marcado anti PCNA sugieren que el nivel de actividad replicativa del DNA de los nùcleos embriogénicos en las primeras fases (proembriones tempranos) es comparable al de células proliférantes en el ciclo de divisiôn celular (Testillano et al., 1993a; Testillano et al., 1994b). Sin embargo, el polen bicelular recién dividido no présenta este patrôn de anti-PCNA, como ocurre en otros materiales con células diferenciadas (Egelkrout et al., 2001). En la etapa de embriones tardios, los resultados establecen diferencias de marcado entre los dos tipos celulares y confirman que estos embriones tienen una zona interna mâs proliférante y otra extema en la que ha comenzado la diferenciaciôn. Los cuerpos de Cajal estân présentes como elementos constitutivos del nùcleo en células animales (Gall et al., 2000) y vegetales (Risuefio y Medina, 1986; Beven et al., 1995; Straatman y Schel, 2001; Segui et al., 2006) tanto en diferenciaciôn como en proliferaciôn. En las células de los proembriones tempranos la frecuencia de células con cuerpos de Cajal aumentô; los resultados obtenidos indican que el nùmero de cuerpos de Cajal aumenta en respuesta a un desarrollo embriogénico, y podrian estân relacionados con 268 Discusiôn general una alta trascripciôn. Por el contrario, en los embriones multicelulares tardios se observa una disminuciôn del nùmero de cuerpos de Cajal por célula. Nuestros resultados indican por primera vez una relaciôn entre los cuerpos de Cajal y los nucleolos en embriones de polen, que podria estar relacionada con el inicio de la proliferaciôn. Nuestros datos son la primera evidencia de la asociaciôn de estas dos estructuras en etapas tempranas de la embriogénesis. 7. La lipoxigenasa, LOX, aumentan su expresiôn en etapas avanzadas de la embriogénesis de microsporas La lipoxigenasa LOX (EC 1.13.11.12) es una enzima con alto contenido en hierro que cataliza la peroxidaciôn de los âcidos grasos poliinsaturados con grupos funcionales cis-1,4-pentadieno (Rosal et al., 1996), y que se encuentra tanto en plantas como en animales (Brash et al., 1999; Feussner y Wastemack et al., 2002). En esta tesis Doctoral se ha estudiado por primera vez la expresiôn y localizaciôn subcelular y a nivel de microscopic electrônico de la LOX, la cual se ha demostrado que incrementa su presencia en procesos de morfogénesis y organogenesis somâtica (Fortes et al., 2000; 2004), durante los procesos morfogénicos concrètes de embriogénesis derivada de microsporas de Capsicum annuum L., y embriogénesis cigôtica. La distribuciôn de la expresiôn LOX en etapas avanzadas de la embriogénesis de polen, similar a la de las embriogénesis cigôticas, sugiere un papel de estas enzimas en los procesos de diferenciaciôn y morfogénesis. 8. Los marcadores identificados durante la reprogramaciôn de la microspora tienen relaciôn con procesos de proliferaciôn y diferenciaciôn Estos resultados han permitido elaborar la tabla 12 que muestra los marcadores celulares identificados durante el desarrollo de esta tesis Doctoral, y que indican las células que se reprograman en procesos proliferativos (mta embriogénica) frente a las que siguen su proceso normal de diferenciaciôn (mta gametofïtica). 269 Discusiôn general Marcadores Localizaciôn subcelular Proliferaciôn Diferenciaciôn Almidôn Citoplasma +++ ERK Nùcleo/Citoplasma 4-H - en Nùcleo +++ en Citoplasma P-MAPK Nùcleo/Citoplasma 4—H- en Nùcleo +++ en Citoplasma Pectinas no esterificadas Pared celular +-H - Pectinas esterificadas Pared celular -H -+ XG Pared celular +4-4- RGII Pared celular +++ Cuerpos nucleares de Cajal Nùcleo +++ PCNA Nùcleo +++ LOX Citoplasma +++ (Etapas avanzadas) Tabla 1. Los marcadores celulares identificados durante nuestro estudio y que indican las células que se reprograman en procesos proliferativos (ruta embriogénica) frente a las que siguen su proceso normal de diferenciaciôn (ruta gametofïtica). Por lo tanto, nos permiten identificar las microsporas inducidas a la embriogénesis frente a las no inducidas, de forma temprana en el cultivo. Es decir, nuestro estudio aporta informaciôn necesaria para la comprensiôn mâs profunda del proceso de reprogramaciôn del polen de Capsicum annuum a la embriogénesis y los mecanismos que lo controlan. El conocimiento mâs profundo de este proceso permitirâ una explotaciôn mâs eficiente y productiva de esta especie de gran interés econômico, a la vez que la mejora en su cultivo. 270 CONCLUSIONES Conclusiones En esta Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el estudio de la embriogénesis de Capsicum annuum L. var. Yolo Wonder. De los resultados obtenidos en el présente trabajo se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. Se han determinado mediante el anâlisis de las caracteristicas morfolôgicas (tamano, color de antocianina, etc.) de la yema floral, y su correlaciôn con el estadio del desarrollo del polen, un criterio de selecciôn del material que se encuentra en la fase de microspora vacuolada, que es la fase mâs adecuada para iniciar el cultivo de anteras por tener una alta capacidad de respuesta embriogénica en Capsicum annuum var. Yolo Wonder B. 2. Se han estudiado diversos factores y su influencia en el cultivo in vitro de anteras: el momento de desarrollo, la estaciôn del ano, el estado de floraciôn, la densidad de anteras por plaça, la temperatura y duraciôn del tratamiento de estrés determinândose las condiciones ôptimas para la inducciôn de embriogénesis. 3. Se han monitorizado las primeras etapas del proceso, caracterizândose las primeras divisiones de las microsporas, la formaciôn de embriones y la obtenciôn de plantas a partir del cultivo in vitro de anteras de Capsicum annuum L. var. Yolo Wonder. 4. Se han regenerado con éxito plantas a partir de los embriones derivados de polen originados en el cultivo de anteras. 5. Se han analizado las plantas regeneradas a partir de cultivo de anteras mediante citometria de flujo obteniéndose plantas haploïdes y doble-haploides. 6. Las protemas de choque térmico HSP70 y HSP90, présentés de forma constitutiva en las microsporas, tienen un papel clave en las primeras fases de la embriogénesis haploïde, al aumentar su expresiôn tras el tratamiento inductor. La traslocalizaciôn de HSP70 al nùcleo sugiere una funciôn especifica protectora de la maquinaria nuclear y reguladora de la expresiôn génica. 271 Conclusiones 7. La reprogramaciôn de la microspora hacia la embriogénesis va acompanada de cambios especfficos en la organizaciôn estructural de nùcleo y citoplasma, como la forma, el tamano, la posiciôn nuclear, la presencia de amiloplastos, la densidad ribosômica, y la situaciôn y diferenciaciôn de paredes celulares. Estos cambios se producen en etapas concretas. 8. Se han identificado marcadores celulares de las microsporas que se reprograman e inician la proliferaciôn (ruta embriogénica): mayor proporciôn de ERK y MAPK en nùcleo, aumento de cuerpos de Cajal nucleares, expresiôn de PCNA asociado a replicaciôn y mayor proporciôn de pectinas esterificadas (marcadas por JIM7) en las paredes celulares. 9. Se han identificado marcadores celulares de las microsporas que siguen su proceso normal de diferenciaciôn (ruta gametofïtica): acumulaciôn de almidôn, mayor proporciôn de ERK y PMAPK en citoplasma, y de pectinas no esterificadas (marcadas por JIM5), xiloglucanos (XG) y ramnogalacturonan II (RGII) en las paredes celulares. 10. Se ha determinado la expresiôn de LOX en etapas avanzadas de la embriogénesis de polen, con una distribuciôn anâloga a la de embriogénesis cigôticos, sugiriendo un papel en relaciôn procesos de diferenciaciôn y morfogénesis. 272 B ib l io g r a f ia ________________________________________________________________________Bibliografia 1. Bibliografia Ahmadian P., Testillano P.S., Gonzâlez-Melendi P., Fadon B. Préstamo G., Jimenez-Durân G., Risueno M.C, (1998). Cell biology of the pollen developmental program and the induction of microspore embryogenesis in Capsicum annuum L. Pages 183-186 Palloix A., Daunay M. C. (eds). EUCARPIA. INRA Publish., Paris. 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This process, known as microspore embryogenesis, is an important tool in plant breeding. Basic studies on this process in economically interesting crops, especially in recalcitrant plants, are very limited and the sequence of events is poorly understood. In situ studies are very convenient for an appropriate dissection of microspore embryogenesis, a process in which a mixture of different cell populations (induced and non-induced) develop asynchronically. Results. In the present study, the occurrence of defined subcellular rearrangements has been investigated during early microspore embryogenesis in pepper, an horticultural crop of agronomic interest, in relation to proliferation and differentiation events. Haploid plants of Capsicum annuum L. (var. Yolo Wonder B) have been regenerated from in vitro anther cultures by a heat treatment at 35°C for 8 days. Morphogenesis of microspore-derived embryos has been analysed, at both light and electron microscopy levels, using low-temperature-processed, well-preserved specimens. The comparison with the normal gametophytic development revealed changes in cell organization after embryogenesis induction, and permitted the characterization of the time sequence of a set of structural events, not previously defined in pepper, related to the activation of proliferative activity and differentiation. These changes mainly affected the plastids, the vacuolar compartment, the cell wall and the nucleus. Further differentiation processes mimicked that of the zygotic development. Conclusions. The reported changes can be considered as markers of the microspore embryogenesis. They have increased the understanding of the mechanisms controlling the switch and progression of the microspore embryo­ genesis, which could help to improve its efficiency and to direct strategies, especially in agronomically interesting crops. In tr o d u c tio n Microspores can switch their normal gam etophytic developm ent in vitro towards an em bryogénie path­ way. The process, known as microspore em bryogen­ esis, represents an important tool in plant breeding. To whom correspondence should be addr^sed (email testillano@clb.csic.es). Key words: anther culture, electron microscopy, haploid plant, pepper (Capsicum annuum L), pollen embryogenesis. Abbreviation used: DAPI, 4,6-diamidino-2-phenylindole. since it allows the generation o f isogenic lines and new varieties through double-haploid plants (Chupeau et al., 1998). Microspore-derived embryogenesis is highly dependent on the species, genotype and physiological state o f the donor plants, induction conditions, culture media com position and state o f developm ent o f the explants (Guha and Maheshwari, 1964; Heberle-Bors, 1985; Raghavan, 1986; Vicente 1 o m .cc tii., i y y i , ^ iistcts ct al., 1994; RcyHoIds, 1997; Touraev et al., 1997; Guha-Mukherjee, 1999; www.biolcell.org j Volume 97 (9) j Pages 709-722 709 mailto:testillano@clb.csic.es http://www.biolcell.org Bioioi of (h(Wu I. Bârâny and others Kuhmlen and Lorz, 1999). The most widely used events on microspore embrj'ogenesis are nor abunlant method to induce microspore embryogenesis in sev­ eral species that are particularly recalcitrant for plant breeding purposes is anther culture. It has been ap­ plied to many species, including crops and trees (Germanà et al., 1991; Bueno et al., 1997). In the Solanaceae family, this process has been triggered in potato (Rokka et al., 1996; Teparkum and Veilleux, 1998; Chani et al., 2000; Boluarte-Medina and Veilleux, 2002), tomato (Zamir et al., 1980; Z iv e ta l., 1984; Shtereva et al., 1998; Zagorska et al., 1998, 2004) and pepper (Sibi et al., 1979; M ityko et al., 1995, 1999; Dolcet-Sanjuan et al., 1997; Gyulai et al., 2000; Barany et al., 2001), among others, w ith variable efficiency. Capsicum annuum L. is an econom i­ cally interesting crop in horticulture, and several protocols have been reported to induce microspore embryogenesis and plant regeneration in different varieties (Dumas de Vaulx et al., 1981; Mityko et al., 1995, 1999; Dolcet-Sanjuan et al., 1997; Barany et al., 2001). Basic studies on the process have been m ainly pur­ sued in model species, such as rape seed, tobacco and barley (Chupeau et al., 1998), but reports on other economically interesting crops are very lim ited and the sequence o f events is poorly understood. In com­ parison with the molecular analysis, in situ studies provide data on the structural organization and the expression and subcellular localization o f molecular targets in individual cells with defined structural fea­ tures that are informative as to their developmental stage. Cellular studies are very convenient for an ap­ propriate dissection o f the microspore embryogen­ esis, a process in which a mixture o f different cell populations (induced and non-induced) develop asynchronically. Understanding the cellular events taking place in the first stages after embryogénie induction is necessary to increase the understanding o f the mechanisms controlling the switch and pro­ gression o f the embryogenesis pathway; this would help to improve the efficiency of the process and to direct strategies, especially in agronomically interest­ ing crops. The search for molecular and cellular mark­ ers during the early stages ot microspore embryogen­ esis has been pursued to monitor the physiological processes involved in the induction, to identify the cells com m itted to the new programme and the cor­ rect developm ent o f embryos and plants. N everthe­ less, cellular studies analysing sequential structural and frequently directed to m odel species (Binaova eta l., 1993; Hause and Hause, 1996; Reynolds, 1S97). Recent studies have reported cellular changes accom­ panying early stages o f the process and their relaion to cell developmental fate (Coronado et al., 2)02; Ramirez ct al., 2004; Testillano et al., 2005). Tht de­ velopm ent o f plastids and starch accumulation :on- stitutes a differential feature during pollen ft>rma:ion in many species (Franchi et al., 1996), as well is in defined stages of zygotic embryogenesis (Raghwan, 2000). An uneven starch accumulation has beer ob­ served and suggested to be associated w ith polarity es­ tablishment, cell differentiation and fate (Raghwan, 2000; Testillano et al., 2000; Indrianto et al., 2(01). A few previous studies have reported some celular features o f microspore embryogenesis in Capicum annuum (CJonzalez-Melendi et al., 1995, 1)96; Testillano et al., 1995 ; Barany et al., 2001; K im e al., 2004), but a detailed ultrastructural characterizaion o f the sequential events o f microspore-derived sruc- tures has still been m issing, until the present won. In this paper, the subcellular rearrangements durin/ the early development o f microspore embryogeness in C. annum have been analysed in comparison vith normal gam etophytic development, with specia at­ tention to the changes affecting nuclei, cell wills, plastids (starch) and vacuoles. In the present w>rk, previous protocols for in vitro anther cultun in Capsicum (Dumas de Vaulx et al., 1981), later nodi- fied slightly by Mityko et al. (1995), have kien applied to induce the process. The cellular chaac- terization o f the progression o f haploid embryogen­ esis has been pursued at both light and elecron microscopy levels using low-temperature-procesed, well-preserved specimens. The results showed thi oc­ currence o f defined subcellular rearrangements and permitted the characterization o f sequential deveop- mental stages. The reported changes can be cmsi- dered as markers for the embryogenesis profess, being modulated in relation to proliferation anddif- ferentiation events. R e s u l ts Process of embryogenesis by anther culture In order to identify and select the starting matrial at the onset o f the culture, an initial analyses olthe flower bud morphology, the size o f the anthers and 710 c Portland Press 2005 | www.biolceil.org http://www.biolceil.org Microspore embryogenesis development in Capsicum Research article F i g u r e 1 i A n i h ê r O u i iu re û n d h â p i ù i d p i â n i s r e g e n e r a t i o n (a) Anther at the onset of the culture, (b) Anther after 6 days in culture, (c, d) Embryos emerging from the anthers after 30 days in culture, showing roots (c) and shoots (d). (e-g) Plantlets with cotyledons (e) and with leaves (f, g) subcul­ tured in growing medium, (h) 80-day-old regenerated haploid plant from anther culture (left-hand side) and a diploid control of the same age (right-hand side). Scale bars In (a -d )» 2.5 mm; in (e-h), 5 mm. the developmental stage o f the microspores were per­ formed by DAPI (4,6-diamidino-2-phenyIindole) staining on squashes o f tissue. Anthers from buds w ith a similar length o f sepals and petals (Figure la) were the most responsive for embryogenesis induc­ tion. These preferentially contained late-vacuolated microspores (see Figures 3a—3d), as determined by DAPI staining. After 6 days in culture, responsive anthers swelled and increased in size up to 1.5 i 0.2-fold (Figure 1 b). Many other anthers became dark and lost turges­ cence. Later, 20 to 30 days, white elongated structures emerged from the responsive anthers (Figure Ic). r ig u rè ^ I n o w c y io m ê iry âriàiystS Charts showing the relative amounts of DNA after prop- idium-iodide staining of a population of leaf nuclei, (a) Hap- loid-regenerated plantlets from in vitro anther culture (Gl peak was set at channel 100). (b) Double-haploid regenerated plant­ let from in vitro culture (G1 peak was set at channel 200). (c) Diploid control. In (d) haploid and diploid samples are pre­ pared and measured together, showing two Gl peaks, at 10 and 20 respectively and a smaller one (G2) at 40. The x-axis represents the log of absorbance of propidium iodide and the y-axis represents the numt)er of nuclei. I 1 J ! 1 i . 11 'z 11 i . 1 L 1 ; il.A ......... R c b liw amttwtb» o f UNA R cb iix c jfnountfc o f UNA JC i '•S I KclHix c jiBouDb o l'D N A KïtMn V «f DNA These were identified as embryos, showing roots and shoots at later stages (Figure Id). These embryos pro­ ceeded through the cotyledonal stage (Figure le), and finally towards green plantlets with leaves (Fig­ ures I f and Ig). After 80 days, the regenerated plants developed a normal anatomy, but, in some cases, they were smaller with less leaves (Figure Ih, left-hand side) and grew less vigorously than control diploid plants (Figure Ih, right-hand side). Flow cytometer analysis o f a propidium-iodide- srained population of nuclei from leaves o f regen­ erated plants determined that both haploids (Fig­ ure 2a) and doubled haploids (Figure 2b) were obtained, as compared with a diploid control pro­ file (Figure 2c). The diploid profile showed two peaks (D N A ratio 1:2), and, in all cases, the highest peak corresponded to G l and the smallest to G2. W hen material from the haploid and the diploid samples was mixed and measured (Figure 2d), two G l peaks were clearly resolved, indicating that they www.biolcell.org | Volume 97 (9) | Pages 709-722 711 http://www.biolcell.org Bioloi of ikemt I. Barany and others correspond to 1C and 2C values. Small regenerated plants (Figure Ih, left-hand side) always showed a haploid profile (Figure 2a). Normal gametophytic development The cellular organization during the normal gameto­ phytic development was analysed in order to compare it with in vitro embryogenesis. Anthers of increasing sizes were excised from plants and analysed at both light and electron microscopy levels. Vacuolated microspores exhibited a large vacuole, which pushed the nucleus to the cell periphery (Fig­ ures 3a and 3b). No starch was detected by the iodide- based staining (l2 KI) at this stage (Figure 3c). At the ultrastructural level (Figure 3d), the nucleus dis­ played a decondensed chromatin pattern with small patches, abundant fibrillo-granular interchromatin structures and a large nucleolus with an abundant granular component; this resembled a typical organ­ ization of a nucleus with high transcriptional activity. The cytoplasm formed a thin layer below the intine (Figure 3d). After the first mitosis, the young bicellular pollen grain was formed (Figures 3e—3h). The generative cell appeared attached to the exine and in close vicinity with the vegetative nucleus, which was surrounded by large vacuoles that were still present (Figures 3e and 3h). DAPI staining revealed different fluor­ escent intensities in the generative and vegetative nu­ clei (Figure 3f), corresponding to different degrees of chromatin condensation in both nuclei. The generat­ ive nucleus exhibited condensed chromatin and com­ pact nucleolus, whereas the vegetative one displayed a more decondensed chromatin (Figures 3f and 3h). As pollen maturation proceeded, in mid bicellular pollen (Figures 3i—31), the large cytoplasmic vacu­ oles disappeared and the cytoplasm showed plastids with starch (Figures 3i and 3k), abundant organelles, endoplasmic reticulum and high ribosome popu­ lation (Figure 31). ihe generative cell was observed detached from the intine and localized in the centre of the pollen grain (Figures 3 j and 31). Mature pollen grains showed very dense cytoplasms and high starch accumulation (Figures 3m—3p); the generative cell and its nucleus exhibited an elongated shape with a highly condensed chromatin (Figures 3n and 3p). At this stage of the gametophyte development, no signi­ ficant differences were observed in the structure and thickness of the cell wall, except for the formation of specific structures below the apertures (results nor shown). Morphological changes and characterization of sequential developmental stages during microspore-derived embryogenesis Semi-thin sections through anthers at the onset of the culture revealed microspores with a large cytoplasmic vacuole and the nucleus pushed towards the exine: the vacuolated microspore stage (Figure 4a). After the inductive treatment, some of the microspores divided producing two cells equivalent in size and structural features, with a dividing cell wall and a low density cytoplasm with vacuoles (Figure 4b); no two-celled structures with un«jual cells were observed in the culture conditions used. Many other microspores ap­ parently died during the treatment or were stopped in their development, exhibiting one nucleus and vacu­ olated morphology, with no other structures observed at this stage. At later stages of the in vitro culture, the two-celled structures proliferated and gave rise to multicellular structures with small cells, having a dense cytoplasm, confined within the pollen wall, the exine (Figure 4c). Then, the exine broke down (Figure 4d) and rounded embryogénie masses or pro- embryos were released. At later developmental stages, pro-embryos dis­ played highly vacuolated, polygonal-shaped cells, with the nucleus in a central position (Figure 4e). There was no starch accumulation, indicated by an ab­ sence of I2 KJ staining (Figure 4h). Later on, morpho­ logical changes were observed in the pro-embryos, probably related to the start of a differentiation. An incipient organization in two layered zones of mor­ phologically different cell types could be observed in these late pro-embryos without exines. The inner­ most area contained small densely packed cells with small vacuoles (Figure 4f). In the outer zone, bigger cells with large vacuoles were observed (Figure 4f). 1 here was only some low intensity of starch accumu­ lation in cells of the outer area (Figure 4i). As embryogenesis proceeded, bigger and more rounded structures, similar to globular embryos, were observed (Figure 4g). The different cell types became more evident and a pattern of well-defined inner and outer layers of cells was found. There was a higher de­ position of starch in the outer layers of the globular embryos than in the external cells of the pro-embryos (compare Figures 4j and 4i respectively). At further 712 c Portland Press 2005 | www.bioicell.org http://www.bioicell.org Microspore embryogenesis development in Capsicum Research article F ig u r e 3 1 N o r tn é i g â m ê i ù p h y i i c d è v e i O p m ê i i i â s à O û n irO i ô f i n ê ê n i b r y O g ê n i c p â i h w ê y (a-d) Vacuolated microspore; (e-h) young bicellular pollen; (M) mid bicellular pollen; (m-p) mature pollen. Semi-thin sections observed under phase-contrast (a, e, i, m), fluorescent microscopy after DAPI staining for DNA (b, f, j, n; arrows, generative nuclei) and bright field after I2KI staining for starch (c, g, k, o). (d, h, I, p) Electron micrographs showing the main ultrastructural features of the different developmental stages. Ex, exine; V, vacuole; N, nucleus; Nu, nucleolus; Chr, condensed chromatin; Ct, cytoplasm; GN, generative nucleus; VN, vegetative nucleus; S, starch. Scale bars in light micrographs are 10 p.m, and in electron micrograph are 1 p.m. 1 ‘ - X -' www.biolcell.org | Volume 97 (9) | Pages 709-722 713 http://www.biolcell.org Biol o f tkrm i I. Barany and others R yure 4 1 R rst s ta g es of m iûrûspùrs-tjarivau erribryûgeiiesis Cellular organization (a-g, k-l) and starch cytochemistry (h-j). Semi-thin sections observed under light microscopy, (a) Vacuoated microspores contained in the anthers at the time of setting the cultures; (b) two-celled pro-embryos, showing similar cells and the formation of a cell wall between them; (c) multicellular pro-embryos surrounded by the exine (Ex); (d) multicelular pro-embryos being released as the exine breaks down (arrows); (e-j) progression from multicellular pro-embryos to glo>ular embryos, observed under phase-contrast (e-g) and bright-field microscopy after IgKI staining to reveal starch (h-j). (k) Hear-like microspore-derived embryo showing a peripheral protodermis, (l-m) High-magnification micrographs showing the protodtrmis of microspore-derived (I) and zygotic (m) embryos. Scale bars, 10 p.m. » . deveiopmentai stages, embryos lost their rounded shape and elongated in some areas (Figure 4k), giving rise to heart-shaped embryos. At the globular and subsequent stages, organized layers of small, lined- up, isodiametric cells were observed in the outer area. The most peripheral layer of cells showed a morpho­ logy resembling a protodermis (Figure 41), similur to that of zygotic embryos (Figure 4m). At torpedo stage (Figure 5), different tissues ciuld be recognized: an epidermis (arrows in Figure )a), the primordium of cotyledon (boxed area b) ind a parenchyma (boxed areas c and d). A diffeent 714 c Portland Press 2005 j www.biclcell.org http://www.biclcell.org Microspore embryogenesis development in Capsicum Research article F ig u r e 5 1 m iû r û s p ù n ê - d û r i v û d è r t l b f y ô û i i û r p ê d o s i â g û Seml-thin sections observed at the light microscope, under phase-contrast (a) and bright-field microscopy after IgKI stain­ ing to reveal starch (b-d). (a) Different tissues can be recog­ nized at this stage: the epidermis (arrow), the primordium of cotyledon (boxed area b) and the parenchyma (boxed areas c and d). IgKI staining showed starch accumulation mainly in parenchymatic cells (b and c), but not in the cotyledon pri­ mordium (b, centre). Also, an accumulation of stench in the cap cells of the root meristems can be observed (d). Scale bars, 10 nm. m y distribution of starch between those tissues was found. The parenchymatic cells showed starch ac­ cumulation (Figures 5b, 5c and 5d), whereas there was no I2 KJ signal in the epidermis (Figures 5b and 5c) and the cotyledonal primordium (Figure 5b). The presence of starch in the root cap cells (Figure 5d) was also revealed by the cytochemistry assay. Ultrastructural features of early microspore embryogenesis In order to identify specific ultrastructural features of the microspore embryogenesis pathway when com­ pared with the gametophytic programme, electron microscopy analysis was performed at defined de­ velopmental stages: two-cell structures, multicellular structures with exine, pro-embr>'os and globular em- F ig u r e 6 I u i i r a s i r u c i u r e Or e a r l y rtr iO rO sp O re embryogenesis (a) Vacuolated microspore with the nucleus (N) at the peri­ phery and a large vacuole (V). (b) Two-celled pro-embryo, re­ sulting from a symmetric division of the microspore, with two nuclei showing a similar organization pattern, (c) Multicellular pro-embryo within the exine and a thick cell wall (*) develop­ ing underneath it. Nu, nucleolus; Chr, condensed chromatin; arrow, nuclear body; Ct, cytoplasm; V, vacuole; Cw, cell wall; Ex, exine. Scale bars, 1 îm. Ex C r bryos. The vacuolated microspore at the beginning of the culture showed the typical ultrastructure of the gametophytic pathway (Figure 6a). In respo*̂ *!#" www.biolcell.org j Volume 97 (9) j Pages 709-722 715 http://www.biolcell.org Biolg I. Bàràny and others the inductive treatment, it divided into two similar nuclei (Figure 6b) which were both at a peripheral lo­ cation close to the exine and next to each other. When compared with the gametophytic pathway, after the mitosis of the microspore, the resulting generative cell was small, attached to the exine and the veget­ ative cell was bigger, with the nucleus more centred and localized in between the generative cell wall and the vacuole (Figure 3e). In comparison with the cell wall in the young bicellular pollen, this suggested that the division plane changed in this sporophytic division. Both embryogénie nuclei showed a similar nuclear organization (Figure 6b). This was opposed to the normal gametophytic development where the vegetative and generative nuclei showed a different pattern (Figures 3f and 3h) that reflects their differ­ ent activities, cell fate and cell cycle progression. The nuclei of the two-celled stmctures showed a similar pattern of chromatin condensation (Figure 6b), with small patches of condensed chromatin at the peri­ phery of the cell nucleus, similar to that of the mi- crospore. The large cytoplasmic vacuole, which filled most of the microspore volume, began to be reab­ sorbed after the induced microspore division with some smaller vacuoles still visible (Figure 6b). Once the microspore was induced towards embryogenesis and the first division occurs, producing the two equi­ valent cells, cell proliferation proceeded and gave rise to multicellular structures. The multicellular structures, still confined within the pollen wall (Fig­ ure 6c), showed newly formed and more developed cell walls of different thicknesses, reflecting sequen­ tial rounds of division. All cells showed similar ultra- structural organization, with chromatin-decondensed nuclei, active nucleoli and a dense cytoplasm, rich in organelles and vacuoles of different sizes. A differen­ tiated, thick cell wall was observed under the exine at this embryogénie stage, as compared with normally matured pollen grains. In late pro-embryos without exine (Figure 7a), two different cell types could be distinguished (Fig­ ures 7a—7c). The cells from the inner core were small, with thin newly formed cell walls, numerous small In globular embryos (Figure 7d), simîla r vacuoles, nuclei with patches ot condensed chromatin and medium-active nucleoli, often more than one per cell (Figure 7b). In the outer layers, the cells were bigger, with thick and differentiated cell walls, large vacuoles, plastids with starch, a decondensed pattern of chromatin and highly active nucleoli (Figure 7c). between cell types were also observed together vith some specific features of this stage. The inner ells showed dense cytoplasm, very few and smallei va­ cuoles and large nucleus (Figure 7e), resembling the organization of a proliferating active cell. A specific feature found at this stage was that the cells fron the peripheral layers contained numerous and large anyl- oplasts, with several starch grains inside the plasids, large vacuoles and small nucleus (Figure 7f). D is c u s s io n Ksat-tr&stscl in vitro sntlisr cuSturss rsgsnGrsb hapioid plants and constitute a suitable systen for cellular studies on the embryogenesis process The earliest studies on the production of hapioid plants in Capsicum by in vitro anther cultures late back to 1979 (Sibi et al., 1979). Embryogenesis was triggered by pre-treatment of the anthers at 4°C for 48 h, then culture in a base medium with hormines and vitamins. In the present work, hapioid plans of Capsicum armuum have been regenerated from in vitro anther cultures in a new variety, Yolo Wonder Î. A heat treatment at 35°C for 8 days has been denon- strated to be appropriate as inductive treatmen, as for other pepper genotypes, for the anther respinse within the range of other low-responsive cultivas of p>epp>er (Mityko et al., 1995). This inductive teat- ment in p>epp>er is longer than the heat shock ised to induce microspore embryogenesis in other species (Custers et al., 1994). Rooting and acclimatizaion was achieved, although the hapioid plants grew less vigorously than the diploid control plants. The study of the cellular changes related to pxllen embryogenesis in anther cultures of Capsicum coisti- tutes a difficult task due to the low yield of inluc- tion. The embryos emerging from the anthers vere considered to be the signal of a positive respone to the inductive treatment, about 20 to 30 days fter setting the culture. The asynchrony of embryo;en- esis in anther cultures (Bueno et al., 2000; Ram'rez et al., 2004) represented an advantage for celklar studies, since it permitted the identification o se­ quential developmental stages on consecutive sec­ tions across single anthers, making the characer- ization of the earliest events, along with forher stages of development, possible. The study of cdlu- lar markers of pollen embryogenesis and subseqient 716 c Portland Press 2005 | www.biotcell.org http://www.biotcell.org Microspore embryogenesis development in Capsicum Research article F ig u r é 7 I U i i r â s i r u C i u r é o f m i c r o s p O r é - d é r i v e d p r o - é m b r y O s ( é - c ) a n d g i ù b u i a r é rn b ry O S { d - f ) (a, d) General structure of the pro-emt>ryos (a) and globular embryos (d) under the light microscope, (b, c, e, f) Ultrastructural features revealed by the electron microscope of the inner (b) and outer (c) cells of the pro-embryo, and the inner (e) and outer (f) cells of the globular embryo. Large vacuoles (V) and starch (S) granules in large amyloplasts are observed in the outer cells of globular embryos. Gt, cytoplasm; N, nucleus; Nu, nucleolus; Cw, cell wall. Scale bars in (a , d) are 20 pm, and in (b, c, e, f} are 1 rim. Inner cells Cw Cl Prwfmbmo staee Outer cells Cw Ct Nu * Nu Inner cells Nu I P Outer cells Cw Cw Ct — f T % Ct development was approached by fixing and low- temperature processing of anthers with emerging em­ bryos at different time points of the culture, which resulted in a good ultrastructural preservation of the anthers and the embryogénie structures. Defined changes in the cell organization determine cellular markers of the switch to the sporophytic pathway The determination of early differential markers between the gametophytic and the embryonic www.biotcetl.org | Volume 97 (9) | Pages 709-722 717 http://www.biotcetl.org Biol, of ihtm t I. Barany and othsrs pathways can be used to define the processes that are activated and/or repressed when the microspores change their developmental programme in response to a stress treatment (Testillano et ah, 2000; Seguf et al., 2003, 2005; Ramirez et ah, 2004). The occur­ rence of defined cell changes at specific developmental stages was related to the activation of proliferation and the beginning of differentiation (Coronado et al., 2002; Ramirez et al., 2004; Segui et al., 2005). The analysis reported in the present paper showed defined rearrangements in specific subcellular compartments, i.e. amyloplasts, vacuoles, cell walls and nuclei. Starch distribution There was no starch accumulation in young pro­ embryos during the early events of microspore em­ bryogenesis in C. annuum. No starch deposition was found, not only after induction under starvation, as in tobacco (Vicente et ah, 1991), but also by a heat treat­ ment, as in rapeseed (Testillano et ah, 2001, Segui et al., 2003), and pepper (present study). Therefore, the lack of starch is not a consequence of sucrose fasting. Early starch accumulation in microspore pro­ embryos still surrounded by the exine has only been found in a few reports on cereals (Indrianto et al., 2001; Testillano et ah, 2002), and it has been sug­ gested as a specific feature of monocot species Since starch depmition could be associated with differenti­ ation, the early events of microspore-derived embryo­ genesis could be related to a previous stage before the entrance to differentiation. Deposits In vacuoles Electron-dense deposits in the vacuoles have been re­ ported as markers of pollen embryogenesis in some species (Sangwan and Ĉ amefort, 1983). Neverthe­ less, no evidence supporting this hypothesis has been found in C. annuum. In these species, after fixation with glutaraldehyde, dense deposits were not found either in young pro-embryos or during pollen forma­ tion and maturation (Fadon, 1993; Gonzalez-Melendi et ah, 1995). Symmetric division of Induced cells It is widely accepted that the first morphological evi­ dence of the embryogénie pathway is the symmetric division of the microspore, as opposed to the asym­ metric division occurring during the normal gam­ etophytic development (Zaki and Dickinson, 1991; Hause and Hause, 1996). In pepper, dififerent division patterns at thf onset of microspore embry^ogensis have been reported, including asymmetric divisions (Kim et ah, 2004). These embryogénie pathways wre observed after different inductive treatments and cul­ ture conditions, and were the result of the response of either the vegetative or the generative nude of the bicellular pollen (Kim et ah, 2004). Diffecnt division patterns were also reported on isolated ni- crospore cultures of pepper (Gonzalez-Melendi etal., 1995, 1996). On the other hand, the late vacuolaed microspore was the most responsive stage, not mly for pepper (Gonzalez-Melendi et ah, 1995) but for many other species (Pechan et ah, 1991; Bueno et ah, 2000; Testillano et ah, 2002). The cellular md ultrastructural analysis performed here showed mat in anther cultures beginning with the vacuokced microspore an equal division tœk place. Diffecnt division patterns have been described, but their sic- cessftil embryogénie progress has not yet been in- equivocally proven. Cytokinesis and cell wail differentiation Multicellular pro-embryos, still surrounded by he exine, showed completely ‘walled-off cells with cell walls of different thicknesses, reflecting different di­ vision rounds. The development of a thick cell vail underneath the exine in multicellular pro-embrms constitutes a specific and differential feature of this early developmental stage, which was also found in other systems (Gonzalez-Melendi et ah, 1995, 19)6; Ramirez et ah, 2001, 2004). Further invescigatims are needed to determine the components and cis- tributton of this thick wall. During developmettal processes, the structure and components of the cell walls change (Catoire et ah, 1998); many molecdar markers of somatic embryogenesis and organogentsis have been found in cell walls (Fry et ah, 19)3; Fortes et ah, 2002). The development of this thck wall at this particular stage of microspore embryo­ genesis could be related to the initiation of the sib- sequent differentiation events, which only occur ater the release from this wall. The nucleus is highly dynamic and the architectire of its fonctional domains (condensed chromatin, n- terchromatin region and nucleolus) changes in re­ sponse to nuclear activity (Risueno and Mediia, 1986; Raska, 1995; Dundr and Mistelli, 2001). In 718 c Portland Press 2005 | www.biolcell.org http://www.biolcell.org Microspore embryogenesis development in Capsicum M H cl! the bicellular pollen, id vegetative (Yeung et al. 1996). The results presented in pepper nuclei are structurally different; this dimorphism between both nuclei is the result of their differen­ tial cell activity, cell fate and cell cycle progression (McCormick, 1995\ Gonzalez-Melendi et al., 2000). The ultrastructural study performed here showed that in pepper, as in other species, the active metabol­ ism of the vegetative cell is mirrored by its nucleus, with dispersed chromatin and an active nucleolus, whereas the generative nucleus shows features of low transcriptional activity, such as condensed chromatin patches and a compact nucleolus. In contrast, the two nuclei resulting from the symmetric division showed a similar pattern of chromatin, with small patches of condensed chromatin at the periphery of the nucleus (Testillano et al., 2000, 2005). The architecture of the nucleolus can also be used as a marker of its activity (Risueno et al., 1988). Immediately after the sym­ metric division, the nucleoli are compacted, indi­ cating the resumption of the transcriptional activity occurring in GI phase (Risueno and Medina, 1986; Risueno et al., 1982). Remodelling of the functional organization of nuclear domains has been reported as a main event occurring in the switch of differentiat­ ing plant cells towards proliferation (Testillano et al., 2005). Young multicellular pro-embryos had nuclei with a dispersed chromatin pattern and active nucleoli, and a dense cytoplasm with small vacuoles. Similar ultra- structural features have been reported in cells during proliferation (Risueno and M̂ oreno Diaz de la Espina, 1979; Risueno etal., 1982). Differential expression of mitogen-activated protein kinases, with roles in pro­ liferation and differentiation, has been observed in consecutive developmental stages during microspore embryogenesis in rapeseed (Segui et al., 2005) and to­ bacco (Coronado et al., 2002). Once the pro-embryos have been released from the exine, the observation of two different cell types between the inner core and the outer layers indicates the starting of a cell differentiation. Further microspore-derived err.br/e development mimics zygotic embryogenesis The structural pattern of development of microspore- derived embryos is poorly understood. Apart from rapeseed, there has been very little study of its com­ parison with the formation of the zygotic embryo showed that the initial proliferation and the forma­ tion of multicellular structures and pro-embryos do not seem to follow a regular and defined pattern of divisions, as the zygotic embryogenesis (Raghavan, 2000). At further developmental stages, the differ­ entiation of a protodermis in globular embryos and the ulterior development of heart-like and torpedo embryos mimic the main events of zygotic embryo formation. Also, the organization of the root meri­ stems and the presence of starch in the root cap cells are similar in zygotic and microspore embryos. Further work, now in progress, will help to define more precisely the pattern of differentiation followed by microspore-derived embryos and its comparison with the zygotic pathway. This suggests that the pro­ liferative structures resulting from induction acquire embryogénie competence. In summary, the cellular characterization of pollen embryogenesis in C annuum L. showed defined sub- cellular rearrangements affecting the nucleus, starch storage, vacuoles and the cell wall at specific devel­ opmental stages. They accompanied proliferation and differentiation events, and could be considered as pos­ sible markers for early monitoring of microspore em­ bryogenesis. This knowledge, in a horticultural crop of agronomic interest, such as pepper, could guide fu­ ture strategies for improving the yield of the process and its use in transformation and breeding through double-haploid plants. M a te r ia ls a n d m e th o d s Materials Seeds o f C. annuum L. (var. Yolo Wonder B) (Ramiro Arnedo, S.A., Calahorra, La Rioja, Spain) were germinated in soil and the plants grown in a growth chamber (MLR 350H , Sanyo) at 25°C, 80% hum idity with a photoperiod o f 16 h o f light. Buds of different sizes were selected, and anthers were excised and used for either microscopical analysis o f normal gametophytic development or in vitro culture. Some ovaries were also excised from open flowers for a microscopical study of zygotic embryos. In vitro anther culture Only buds from the first flowering were used tor the cultures. Pollen development stage was determined by DAPI staining on anther squashes (Vergne et al., 1987; Gonzalez-Melendi et al., 1995). Anthers w ith blue-coloured tips from buds with a similar length o f petals and sepals, corresponding to the late vacuolated mictospore, were selected for the cultures. The buds were sur­ face sterilized w ith 5% calcium hypochlorite. Fifteen anthers were plated on to 5 cm diameter Petri dishes containing Cp 1061 \ ted w ith 0.01 mg/1 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and kinetin. www.biolcell.org | Volume 97 (9) | Pages 709-722 719 http://www.biolcell.org Bioloj m u I. Barany and others ♦'•VI r to 25°C with a photoperiod o f 12 h o f ligh t at 1 4 0 0 0 luxes (186 pnaol/m^ per s). After 12 days o f induction in Cp m edium , anthers were transferred to R1 m edium (Dum as de Vaulx et al., 1981) supplemented w ith 0.1 mg/1 kinetin. Piantlets were grown in a V3 hormone-free m edium for further development (Dumas de Vaulx et al., 1981). Row cytometry To determine the ploidy level o f the regenerated piantlets we used flow cytometry (Dolezel et al., 1989). Nuclei were iso­ lated by laCêîàliüg leaves 111 a l y S iS buuci (15 uiîvî T î i S , 2 iV iM NazEDTA, 80 mM KCl, 20 mM NaCl and 0.1% Triton X -1 0 0 , p H 7.5), which was filtered through a 30 (i.m (pore size) nylon mesh. The filtrate was transferred into 2 m l Eppendotf tubes and centrifuged at 600 g for 20 min at 4°C , and the pellet was resiisnended in 0.5 ml o f lysis buffer. The nuclei suspension was transferred into cytometer tubes w ith 55 pi o f solution o f propidium iodide (1 m g/m l) in PBS containing 15 m g/m l o f RNase. N uclei (» = 1 0 0 0 0 ) o f each sample were measured in an F.pics-xl flow cytometer (Coulter). As a control, we used a nuclei suspension from diploid parental plants. Sample cryoprocessing and electron microscopy Anthers at different developmental stages throughout gam eto- genesis, at different tim e points o f the anther culture and macro­ scopic embryos emerging from the anthers were fixed overnight at 4 “C J Ü 4% foiiVjalucliydc 111 PBS, pH 7 .3 . Tlicil, they wclc washed in PBS and dehydrated through a methanol graduation series (30% , 50%, 70% and 100%), with a progressive lowering o f temperature from 4°C to —30°C. The specimens were per­ meated w ith mixtures o f methanol/Lowicryl K4M (in a series 2:1. 1:1 and 1:2) at —30°C, embedded in pure resin at the same temperature, and polymerized under U V light at —30°C in a Leica AES device, as described previously (Testillano et al., 1995). Sem i-thin (1 pm ) and ultra-thin (100 nm) sections were obtained and used for ligh t and electron microscopy observa­ tions. Toluidine-Blue-stained sem i-thin sections were observed under bright field microscopy for structural analysis. Ultra-thin sections were counterstained w ith 5% uranyl acetate and 1% lead citrate, and observed using a JEOL 1010 microscope at 80 kV for general ultrastructute description. Cytochemicai staining Starch was detected by I2 KI staining (O ’Brien and McCully, 1981) on scm i-thin sections and observed under bright field. DAPI staining for D N A was applied to sem i-thin sections (Testillano et al., 1995) and observed under U V ligh t using A c k n o w le d g e m e n ts We thank the service of Electron Microscopy of Insti­ tute Cajal (CSIC). I.E. is recipient of a p redoctoral fel­ lowship of the I3P Programme of the CSIC. P.G.-M. is a tenure-track scientist of the Ramon y Cajal Pro­ gramme at the CSIC. This work was supported by grants from the Spanish MCyT (BOS2002-03572) and Comunidad de Madrid (CM 07G/0026/2003). R e f e r e n c e s Bàràny, I., Testillano, P.S., MItykô, J. and Risuefio, M.C. (2001) The switch of the microspore developmental programme in Capsicum involves HSP70 expression and leads to the production of hapioid plants. Int. J. Dev. Biol. 45, S39-S40 Binarova, P.. Straatman, K.R., Hause, B., Hause, G. arxf van Lammeren, AAM. 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TESTILLANO^ JUDIT MITYKÔ^ and MARIA DEL CARMEN RISUENO^ ' ^Plant Development and Nuclear Organization, Centro de Investigaciones Biolôgicas, CSIC, Madrid, Spain and ^Agricultural Biotechnological Center, Inst, for Plant Science,Gôdôll6, Hungary A B S T R A C T The switch of the gam etophytic developm ental program of the m icrospore tow ards em bryogenesis to form a hapioid plant rep resen ts an im portant tool in plant breeding for obtaining isogenic lines and new varieties through double-haploid plants. This p rocess can be induced in m icrospore in v/fro cultures by s tre ss treatm ents, like starvation or heat-shock. M icrospore em bryogenesis a lso constitu tes an interesting in v/fro system for basic studies on cellular and m olecular m echan ism s controlling plant developm ent, cell fate, s tre s s re sp o n se and signalling pathw ays. This p rocess h a s been induced in m any plant spec ies but little is known about the m echan ism s and factors involved in this change of developm ental program . In this work, various ultrastructural in s itu approaches have been perform ed to charac­ terize changes in the su bcellular organization and the localization of s tre ss proteins, specifically the H SP70, during the induction and early m icrospore em bryogenesis. M icrospore em bryogenesis has been induced in Capsicum annuum L. (G onzâlez-M elendi e t ai., 1996) using h ea t treatm ent of 35°C for the induction (B arany e ta l., 2001) and a rich culture medium containing cytokinines (Mityko etal., 1995). The appropiate selection of the m icrospore developm ental s tag e to initiate the culture is a key feature since only a few s ta g e s are responsive to em bryogenesis, the late vacuola te m icrospore s tag e (Fig. la ) being one of the m ost efficient (G onzàlez-M elendi e ta l., 1996). After the inductive treatm ent som e m icrospores w ere induced and initiated an em bryogenesis pathw ay with the occurrence of num erous mitosis forming multicellular struc tu res (Fig. 1 b,c). Twenty-thirty days after induction, sm all white globular and tor­ pedo em bryos w ere observed , which futher developed root, shoot and two green cotiledons, regenerating sm all hapioid piantlets (Fig. Id). For microscopical analysis, sam p les a t different s ta g e s of the in vitro culture w ere cryoem bedded in Lowicryl K4M. This cryoprocessing provided a good ultrastructural preservation and kept the antigenic reactivity of the sam ple for im munocytochemi- cal a ssa y s (Fig. 1 e-h) (Testillano eta l., 1995). After em bryogen­ e sis induction, the m icrospore underw ent several mitosis forming multicellular structures, still su rrounded by th e special pollen wall, the exine (Fig. 1 b,e). In th ese proem bryos som e specfic fea tures w ere observed: the inner layer of th e m icrospore wall exhibited an im portant increase in th ickness, cytoplasm of the individual small cells contained large vacuo les and num erous vesicles, organells, and walls separa ting cells show ed h e te ro g en eo u s th ickness and wavy sh ap e (Fig. 1e). After the breakdow n of the exine, the proem bryo increased its proliferative activity forming multicellular rounded m a sse s (Fig. 1 c,f). The ultrastructural organization w as quite different a t this s tag e of m icrospore em bryogenesis, po­ lygonal small cells ap p ea red sep a ra ted by thin and straight walls: with large nuclei and d e n se cy toplasm s containing abundant ribosom es, m itochondria, num erous plastids and small vacuoles (Fig. If). Nuclei show ed small condensed chromatin patches (Fig. If) and nucleoli with ab u n d an t granular com ponent, the typical nuclear organization of active proliferating cells. The heat-shock proteins have been reported to be involved in B rassica m icrospore em b ry o g en esis , in which a short heat- shock co n stitu te s the inductive trea tm en t (C ordew ener e t al., 1995). S om e im m unolocalization data w ere also reported in B rassica m icrospores and em bryogenesis (Testillano etal., 2000, 2001 ).To evalua te the involvem ent of H SP70 in Capsicum sy s­ tem in which a much longer h ea t trea tm en t is applied, immunogold labelling w as perform ed. D ifferences in the p resence and sub- cellular distribution of the protein have been observed in mi­ crospores a t the beginning of the culture (Fig. 1g) and 1 day after the application of the inductive trea tm en t (Fig. 1h). Immunogold labelling w as very sca rce in m icrospores just after plating, a few gold particles w ere observed in the nucleus and cytoplasm (Fig. 1g), probably localizing the constitutive form of the protein. 1 day after the s tre s s treatm ent, H SP70 labelling density increased , many gold particles being localized in som e regions of the cytoplasm and the nucleus, specifically on the interchromatin region (Fig. 1 h). T hese resu lts su g g es ted that the reprogram m ing of the m icrospore to em bryogenesis involved the induction of H SP70 expression one day after the initiation of the culture, the cell resp o n se to the h ea t trea tm en t probably in combination with o ther factors is needed for the switch to the em bryogenesis in C apsicum . Work supported by Projects DGESIC PB98-0678, CAM 07G/0054/ 2000. I.B. is grant recipient ofAECI. * Add re## corre#pondence to: Maria del Carmen Risueno. Plant Development and Nuclear Organization, Centro de Investigaciones Biolôgicas, CSIC, Velézquez 144, 28006 Madrid, Spain. e-mall:rlsueno@clb.csic.es mailto:rlsueno@clb.csic.es S40 I. Barany et al. N W CT Ct %* h Fig. 1. Microspore embryogenesis in Capsicum, (a-d) Different stages of the embryogenesis culture from the beginning (a) to the hapioid plantiet regeneration (d). a, vacuolate microspore; b, multicellular structure surrounded by the exine; c, multicellular proembryo; d, Hapioid green plantiet.(e,f) Ultrastructure of the multicellular proembryos before (e) and after (f) the exine breakdown. (g,h) HSP70 immunogold labelling in microspores before (g)and 1 day after (h) the application of the inductive treatment. N, nucleus; CT, cytoplasm; \/, vacuole; W, cell wall; EX, exine. IR, interchromatin region; CHR, condensed chromatin. Bars in a,b, 10 pm; c, 20 pm; d, 10 mm; e,f, 2 pm; g,h, 0.2 pm. References BARANY, I.. P. S. TESTILLANO, J. MITYKO, and M.C. RISUENO. (2001). 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Risueno Plant Development and Nuclear Organization, Centro de Investigaciones Biolôgicas (CiB), C.S.I.C., Madrid, Spain; ^Centro de Conservacion y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana (COMAV), Univ. Politécnica de Valencia, Spain g © 2006, European Journal of Histochemistry We analysed the presence of nuclear bodies and particu­ larly Cajal bodies during representative stages of gameto- ph^ic and hapioid embryogénie development in isolated microspore and anther cultures of a model system {Brassica napus cv. Topas) and a recalcitrant species {Capsicum annuum L var. Yolo Wonder B).The nuclear bod­ ies domain is involved on several important roles on nuclear metabolism, and Cajal bodies are specifically involved on the storage and maturation of both snRNPs and snoRNPs, as well as other splicing factors, necessary for mRNA and pre-rRNA processing, but not directly on the transcription. In this study, immunofluorescence and immunogold labelling with anti-trimethylguanosine antibodies against the specific cap of snRNAs, ultrastructural and cytochemicai analysis were performed on cryoprocessed sam ples a t confocal and electron microscopy respectively. Results showed that Cajal bodies increase during the early stages of microspore embryogénie development (young pro-embryos), compared to microspore and pollen development. Our results suggest that Cajal bodies may have a role in the transcriptionally active, proliferative stages th a t characterise early microspore embryogénie development. Key words: microspore embryogenesis, nuclear architecture, nuclear bodies, Cajal bodies, Brassica napus, Capsicum annuum, confocal microscopy, transm ission electron microscopy. Correspondence: M.C. Risueno, Plant Development and Nuclear Organization unit Centro de Investigaciones Biolôgicas (CIB), C.S.I.C. C/ Ramiro de Maeztu, 9; 28040 Madrid, Spain E-mail: risueno@cib.csic.es Paper accepted on November 28 ,2005 European Journal of Histochemistry 2006; vol. 50 Issue 1 (Jan-Mar): 35-44 M icrospore embryogenesis is defined as the deviation of the gametophytic pathway tow ards embryogénie development and hapioid or doubled hapioid p lan t regeneration.This change in developmental program is generally induced by a p re - trea tm en t with mild physical and/or chemical s tress (heat, cold, s tarvation, etc; Chupeau et al., 199 8 ; Maluszynski et a i , 2 0 0 3 ) . Not all the cells present in the culture are equally sensitive to the pre - trea tm ent, some of them are effectively induced (d e v ia ted /rep ro g ram m ed ) m ic rospo res b u t o th e rs a re non-induced microspores th a t continue the gametophytic devel­ opment (Custers et a!., 1 9 9 4 ; Segui-Simarro, 200 1 ) . Therefore, it is im portan t to identify cellu­ lar markers of the embryogénie developmental program. Synthesis of hea t shock proteins (hsps) and mitogen-activated protein kinases (MAPKs), as well as rearrangem ents in the cell cytoskeleton have been previously proposed as cellular markers of this change (Zarsky et a!., 1 9 9 5 ; Binarova et a!., 19 9 7 ; Simmonds and Keller, 199 9 ; Barany et a!., 2 0 0 1 ; Pechan and Smykal, 2 0 0 1 ; Coronado et a i , 2 0 0 2 ; Segui-S im arro et al., 2 0 0 3 , 2 0 0 5 ) . In addition, defined nuclear domains seem to be the ta rge ts for the nuclear t ranslocation of hsps and MAPKs. Specific dom ains of the interchromatin region, previously identified as transcription sites (Testillano et a!., 1 9 9 3 ) are enriched in MAPKs and Hsp70 (B àràny et al., 2 0 0 1 ; 20 0 5 ; Coronado et al., 2 0 0 2 ; Segui-S im arro et al., 2 003 , 2 005) . Several s truc tura l evidences indicate th a t the nucleus is one of the cell com partm ents th a t change its functional organization as a conse­ quence of microspore embryogenesis induction (Testillano et al., 2 0 0 0 ; 2 0 0 5 ) . In many different plant and animal cell types, it has been established a direct relationship between the functional organ­ ization of the nucleus and the metabolic s ta tus of 35 mailto:risueno@cib.csic.es J.M. Segui-S im arro e t al. the cell (Fakan and Puvion, 1 9 8 0 ; Risueno and Medina, 1986 ; Raska et al., 1 9 9 1 ; Andrade et al., 1993; Spector, 19 9 3 ; Gonzalez-Melendi et al., 1998; Segui-Simarro, 2 0 0 1 , Fakan, 2 0 0 4 ) . Within the nucleus, the nucleolus and the interchromatin region are nuclear domains th a t remodel their a rch i tec tu re a f te r induction (R isueno and Testillano, 1994 ; Testillano et al., 2 0 0 5 ) . Nuclear bodies have recently been proposed as potentially sensitive to changes in proliferative activity in plant cells (Testillano et al., 2 0 0 5 ) . Cajal bodies (CBs) were firstly described in neu­ rons by Ramon y Cajal ( 1 9 0 3 ) a s accessory bodies because of their frequent location near the nucleo­ lus and their similar silver staining. Due to their convoluted architecture, they were named coiled bodies by Monneron and Bernhard (1 9 6 9 ) in mammalian cells and afte rw ards in plants by M oreno-D iaz de la E sp ina and cow orkers (1982b) . CBs are present as constitutive nuclear elements of both differentiated and proliferating animal (Gall, 2 0 0 0 ) and plant cells (Risueno and Medina, 1986 ; Beven et al., 1 9 9 5 ; S traa tm an and Schel, 2 0 0 1 ) . Structurally, CBs are round-shaped domains of up to 2 .0 pm, appearing in electron m icrographs as packed , coiled th ick th re a d s embedded in the interchromatin region (Beven et al., 1995 ; Lafarga et a i , 1 9 9 8 ; Fakan, 2004 ; Raska et a i , 2 0 0 5 ) . They have been frequently found associated with the nucleolus and related or connected to the interchromatin granules (Risueno and Medina 1 986) . CBs a re charac terized by the presence of the p80 coilin protein, the Sm antigen and several small nuclear RNAs (snRNAs), as well as the nucleolar proteins fibrillarin, N o p p l4 0 and the S6 ribosomal protein (revision by Gall, 2000) . Functionally, CBs are not well understood. It seems clear th a t they are not directly engaged in mRNA splicing, (Huang et a i , 1 9 9 4 ) , bu t in the maturation of both snR N P s and snoR N Ps, in the processing of histone mRNA 3 ' ends (Dominski and Marzluff, 19 9 9 ) and biogenesis and storage of transcrip tosom e and splicing fac to rs (Spector, 1993 ; Gall, 20 0 0 ; Proudfoot, 2 0 0 0 ) , snR N Ps (Carvalho et a i , 19 9 9 ) and snoR N P s (Narayanan et a i , 1999 ; Platani et a i , 2 0 0 0 ) . Brassica napus is considered a model species for the study of microspore embryogenesis (Chupeau et a i , 1998) , but the cellular mechanisms control­ ling the process are still not well known. In con­ tra s t , some economically interesting crops, as Capsicum annuum, have been considered recalci­ t ra n t species, due to the extreme difficulty to devi­ a te the m icrospore to w a rd s embryogenesis . However, in the last years several groups have suc­ cessfully obtained hapioid embryogénie régénér­ ants in pepper (Mityko et a i , 1995 ; Bàràny et a i , 2001 , 2 0 0 5 ) . In this study, we aimed to study the changes in nuclear bodies, specially focusing on CBs, during the switch to microspore embryogene­ sis in both a model (Brassica napus) and a recal­ citrant (Capsicum annuum) species, in order to evaluate the ir potential use as markers of the change in developmental program. Our results show th a t NBs and specifically CBs increase the ir number after microspore embryogenesis induction in reprogram m ed pro-embryo cells, which are in proliferation, com pared to the differentiating cell s tage of the microspores and pollen th a t follow the gametophytic programme. Materials and Methods Plant material Brassica napus L. Cv.Topas and Capsicum annu­ um var Yolo Wonder B donor plants were grown as previously described (Segui-S im arro et a i , 200 3 ; Bàràny et a i , 2 0 0 5 ) . Brassica microspore culture and embryogenesis induction (16 h. a t 32.5°C) was performed according to (Jouannic et a i , 200 1 ) . Capsicum an thers were excised and cul­ tured as described (Bàràny et a i , 2005) . Antibodies Anti-2 ,2 ,7 trimethyl guanosine (TMG) from Calbiochem (Clone K121) was used for Cajal bod­ ies identification by immunofluorescence and TEM immunogold labelling. The antibody cross- reac ts with the specific cap of the small nuclear RNAs (snRNA) present in the small nuclear ribonucleoproteins (snR N Ps) of the mRNA splic­ ing machinery. immunofluorescence Microspore and hapioid embryo cultures were processed for cryomicrotomy and cryosectioned as previously described (Segui-S im arro et a i , 2003) . Semithin (1 ^m ) cryosections were obtained and placed on multiwell glass slides. After thawing the sections, immunofluorescence was performed as described (Segui-S im arro et a i , 2003) , using anti- 36 Original Paper TMG as the primary antibody diluted 1 /100 and incubated for 1 hour a t room tem pera tu re in dark­ ness, and secondary antibody (anti-m ouse IgG- Cy3) diluted 1 :25 in 1 % BSA in PBS, and incu­ bated for 45 minutes in darkness. Sections were stained with DAPI prior to observation in a Bio- Rad MRC-lOO confocal scanning head coupled to a Zeiss Axiovert 135 microscope. Controls were performed excluding the primary antibody from the incubation buffer. Electron microscopy and cytochemistry Samples to be observed for electron microscopy were fixed in Karnovsky fixative (4 % form alde­ hyde + 5 % glutaraldehyde in 0 .0 2 5 M cacodilate buffer, pH 6 .7), post-fixed in 2 % 0 s 0 4 , dehydrat­ ed in an ethanol series for 3 days and slowly embedded in Epon resin for 2 days. Epon blocks were polymerized a t 60°C for 2 days. - 8 0 nm thin sections were collected on 75-m esh copper grids, counterstained with uranyl ace ta te and lead citrate and observed in a JEO L 1 0 1 0 TEM operating a t 80 kV. Several sam ples were fixed in 4 % formaldehyde in PBS and dehydrated by the PLT (Progressive Lowering of Temperature) method in a Leica APS system. Then, sam ples were infiltrat­ ed and polymerized a t -30°C in Lowicryl K4M resin under UV light. Some ultrathin sections were sta ined by the EDTA regressive sta in ing of Bernhard (1 9 6 9 ) , a preferential cytochemicai method for RN Ps. immunogold labeling Microspores and hapioid embryos a t different stages were prefixed in formaldehyde, cryoprotect­ ed in 2 .3 M sucrose, cryofixed in liquid nitrogen and cryo-processed as described (Segui-S im arro et a i , 2 0 0 3 ) . S am ples w ere f reeze -su b s t i tu ted in methanol + 0 .5 % uranyl ace ta te a t -80°C for 3 days, infiltrated in Lowicryl K4M and polymerized a t -3 0 ° C under u.v. irradiation in a Leica AFS sys­ tem. Thin (80 nm) sections were placed on nickel grids. The grids were sequentially floated in PBS, 5 % BSA in PBS, and anti-TMG diluted 1 /100, 1 hour a t room tem perature . After several washes in 1 % BSA in PBS, the grids were incubated with anti-mouse IgG-gold, 10 nm; (Biocell, Cardiff, UK) diluted 1 :25 in 1 % BSA, for 45 minutes a t room temperature, washed, a i r dried, countersta ined and observed in a JEO L 1 0 1 0 TEM a t 80 kV. Controls were performed excluding the primary antibody. Results Cellular rearrangements after microspore reprO’ gramming to embryogenesis Brassica napus m icrospore cu ltures and Capsicum annuum an ther cultures were used to study the changes in the nuclear bodies domain. First we comparatively checked the progress of both in vitro systems in comparison with the in vivo development. During the studied stages of gameto­ phytic deve lopm ent and the f i rs t s tages of microspore embryogénie development, both sys­ tem s behaved similarly in term s of developmental s tages and p a t te rn s . Donor an th e rs of both Brassica napus and Capsicum annuum containing m icrospores a t the s ta g e of late vacuolate microspores were selected (Figure lA , A', B, BO. They mostly con ta ined vacuo la te microspores which are characterised by the presence of a large central vacuole th a t displaces the nucleus to an off- centred position. In Brassica, the chromatin pa t­ tern, as revealed by DAPI staining with faint fluo­ rescence signal, was essentially decondensed, with few, small bright foci indicating condensed chro­ matin masses, generally a t the periphery of the nucleus (Figure lA ', CO. In Capsicum, chromatin fluorescence af te r DAPI staining appeared as a strong and quite homogeneous signal, indicating a compacted chrom atin pattern (Figure IB ' , D'). After the first pollen mitosis, two different cells form the young pollen grain, the vegetative and the generative. As the pollen grain matures, the gener­ ative cell migrates tow ards the centre of the cell, as evidenced by the central disposition of the genera­ tive cell which is quite close of the vegetative nucle­ us (Figure 10, O', D, O'). The cromatin of the gen­ erative nucleus appears in a highly condensed state, as evidenced by the brightness of DAPI staining, compared with the faint fluorescence of the vegeta­ tive nucleus. In Brassica, the second pollen mitosis takes place in the pollen grain, giving rise to the tri- cellular mature pollen, in con tras t to the bicellular stage of the m ature pollen in Capsicum. In those microspores successfully induced to embryogenesis, successive cell divisions lead to structurally similar cells, instead of the morpholog­ ically different generative and vegetative cells of the pollen grain. Young pro-embryos are composed of multicellular, indiferentiated cells th a t actively proliferate within the microspore exine wall until 37 J.M. Segui-S im arro e t al. c . Figure 1. Brassica napus (A, C and E pairs) and Capsicum annuum (B, D and F pairs) stages of gametophytic and induced microspore embryogénie development. A-F. Phase contrast images. A’-F’. DAPI-staining images. A B% Vacuoiate microspores. C-D'. BIcellaiar poiien. E-F’. Young pro-embryos after the burst of the exine. Bars in A-D’: 10 pm. Bars in E-F’: 50 pm. they burst out (Figure IE , E', F, F'). Both Brassica napus and Capsicum annuum proembryo cell nuclei display a faint DAPI fluorescence spread through­ out the nucleoplasm. The nuclear bodies domain during pollen developmental pathways The nuclei of Brassica microspores and pro­ embryos (Figure 1 A', E') had a large interchro­ matin region, a generally centred nucleolus and small masses of condensed chromatin which were frequently abutted to the nuclear envelope. In Capsicum, chromatin pattern was more condensed, with small and numerous patches connected by chromatin threads of different thickness (Figures 2A-C, 3 A, 5A). Also, a conspicuous nucleolus can be observed. In addition, nuclear bodies (NBs) are located in the interchromatin region as constitutive elements of the nuclear architecture (Figures 2 A, B, 3, 4, 5A-B); they were frequently observed in the same section plane of the nucleolus and associated with it (Figures 2B, 3C, 4C, 5B). Among the NBs, one of the most distinct bodies are the Cajal bodies (CBs). They have been described to be anti-TMG positive (Testillano et a/., 2005) . In this study, we used this antibody to specifically identify C3s among the rest of NBs (Figures 2D, 5D-E) in orcer to analyze the Cajal bodies domain during pollen development and the changes tha t accompany the reprogrammed microspore embryogenesis. During Capsicum and Brass/ca microspore devel­ opment, NBs were present in the interchromatin region (Figures 2A, 3A, 4A), also in the sam e sec­ tion plane of the nucleolus and frequently in cicse association with the nucleolar components (Figures 3C, 4 0 , but not in relation to the condensed chro­ matin patches. After the first pollen division, youig bicellular pollen exhibited a similar presence of NBs, always present in the highly active vegetative nucleus (Figure 2B). Conversely, in m ature pollen NBs were very scarce, being most of the obser\^d nuclei devoid of them (Figure 2 0 . Anti-TMG immunofluorescence pattern consisted of a faiit , diffuse signal spread through the nucleoplasm (Figure 2D, F). Additionally, in some microspores (Fig 2D) and young bicellular pollen (da ta rot 38 Original Paper o Figure 2. Nuclear bodies and chromatin organization pattern during gametophytic development. A-C. Electron micrographs. A. Vacuolate microspore. B. Young bicellular pollen grain. The black arrow points to nuclear bodies appearing In the same plane of the nucleolus, and frequently associated with It. Different chromatin condensation degrees are shown: A, decon­ densed pattern; B, C. Decondensed In vegetative nuclei, and condensed In generative nuclei. D-D. Antl-TMG Immunofluores­ cence (D, F) and DAPI-stalnIng (E, G) of a vacuolate microspore (D, E) and a mature bicellular pollen grain (F, G), white arrows point to a CB (D) and to the absence of fluorescence In the cor­ responding regions of the DAPI-stalned image (E). ct. Cytoplasm; ex. Exine; gc. Generative cell; gn. Generative nucle­ us; n. Nucleus; nu. Nucleolus; v: Vacuole; vc. Vegetative cell; vn. Vegetative nucleus. Bars In A-C: 2 pm. Bars In D-G: 5 pm. shown) a bright spot emerged over the diffuse sig­ nal. DAPI staining of the same sections (Figure 2E) revealed tha t the bright spots do not overlap with the D A PI-sta ined DNA, confirming the absence of DNA in these bodies. We could never detect more than one per section of developing microspore/pollen nucleus (Figures 2A, B, 3A, 4A). In mature pollen grains, both the observed genera­ tive and vegetative nucleus showed no bright spots after anti-trimethyl guanosine immunofluorescence (Figure 2F, G). The electron microscopy analysis of the CBs pres­ ent in the microspore revealed th a t they were rounded bodies with a fine structure showing dense coiled threads immersed in a low dense material (Figures 3 and 4 ) .The EDTA regressive staining for RN Ps preferentially contrasted, in the microspore, the nucleolus and interchromatin structures, includ­ ing the CBs (Figure 4), also revealing that they were in connection with fibrillo-granular structures of the interchromatin region (Figure 4B, C). Interchromatin granules could also be seen in con­ nection with the CBs (Figures 3C, 4 0 . Changes in the nuclear bodies domain after the switch to embryogenesis In contrast to the pollen developmental pro­ gramme, during induced microspore embryogene­ sis, NBs were consistently found in embryogénie microspores symmetrically divided and developing pro-embryos (Figure 5). NBs in TEM micrographs (Figure 5 A) appeared as dense, round-shaped masses of variable size, with a thick, coiled fibrillar texture, similar to those in proliferating cells of root meristems (Moreno-Diaz de la Espina et al., 1982a, 1982b). In some sections, up to two NBs were observed in the same section (arrows in Figure 5B), and were frequently found apposed to the nucleolar surface. CBs appeared also connected with the interchromatin granules (Figure 5B), as it has been reported in root meristems (Moreno-Diaz de la Espina et al., 1982a , b). Anti-TMG immuno­ fluorescence labelling (Figure 5D) and DAPI stain­ ing (Figure 5 0 of young pro-embryos revealed the presence of a t least one CB, in most of the cells present in the same pro-embryo section, often close to the nucleolus. The bright spots of anti-TMG flu­ orescence (arrows in Figure 5D) coincided with a dark spot when imaging the DAPI staining of the same cells (arrows in Figure 5 0 , indicating tha t bright spots, likely CBs, locate in the interchromatin region. At the electron microscopy level, anti-TMG immunogold labelling of pro-embryo cells revealed the presence of some gold particles dispersed 39 J.M. Segui-Sim arro e t al. Figure 3. Ultrastructural organization of Cajal bodies In microspore nuclei. A. Capsicum microspore nucleus with a Cajal body (cb) In the interchromatin region. B, C. High magnification micrographs of CBs In the Interchromatin region (B) and asso­ ciated with the nucleolus (C), showing a colled structure and connections with Interchromatin structures (white arrows), n: nucleus, nu: nucleolus, chr: chromatin, ct: cytoplasm, ex: exine. Bars represent 250 nm. Figure 4. Fine structure of Cajal bodies as revealed by EDTA cytochemistry for RNPs. A. Capsicum microspore nucleus with the condensed chromatin (chr) bleached by the EDTA; the Inter- chromatln structures, the nucleolus (nu) and Cajal body (cb) appeared preferentially contrasted. B, C. High magnification micrographs of CBs In the Interchromatin region (B) and asso­ ciated with the nucleolus (C); EDTA-posltlve fibrillar structures (arrow) are observed connecting the CB with Interchromatin structures, n. Nucleus, ct. Cytoplasm, ex. Exine. Bars: 250 nm. through the interchromatin region (Figure 5E) cor­ responding to the snRNPs, but densely accumulat­ ed specifically over some NBs, with a size, shape, ultrastructure and nuclear location similar to the CBs described in several plant systems under dif­ ferent developmental conditions. This pattern of labelling was very specific, as demonstrated by con­ trol assays excluding the first antibody (data not shown). In young pro-embryos, two or three NBs could be also observed in a single cell section in some occasions (Figure 5B). Anti-TMG-positive CBs seem to increase in microspore-derived young pro-embryos (Figures 5C-E). Discussion Brassica napus and Capsicum annuum are repre­ sentative examples of a model, easily inducible and a recalcitrant species, in terms of response to stress treatments switching the microspore to embryogen­ esis. Both systems have several common character­ istics, such as the establishment of the vacuolate microspore as the most responsive stage for microspore embryogenesis induction and the need for a heat stress as inductive treatm ent (Segui- Simarro at ai., 200 3 ; Barany et a!., 2005), although the efficiency in response to such trea t­ ment greatly differs between them (Custers et al., 1994; Mityko eta l., 1995). The comparison of both systems in terms of gametophytic and induced microspore embryogénie development showed a rem arkable similarity (Figure 1), as expected.The parallel analysis in both systems of the changes in the chromatin pattern and in the NB domain showed no differences between the two species during microspore and pollen devel­ opment, and during the switch to embryogenesis. Interphase chromatin is organized in irregular patches which occupy specific territories in the 40 Original Paper T. Figure 5. Nuclear bodies during Induced microspore embryogénie development. A B. TEM micrographs of a Capsicum (A) and Brassica (B) pro-embryo cells, showing NBs of different sizes (black arrows). C-D. DAPI staining (0) and anti-TMG Immunofluorescence (D) of a young Brassica pro-embryo, showing Intensely stained CBs (white arrows In D), and the absence of fluorescence In the correspon­ ding regions of the DAPI-stalned Image (white arrows in C). E. Electron micrograph of anti-TMG Immunogold labeling of a young Brassica pro-embryo cell, showing the accumulation of gold particles over a CB. cb. Cajal body; chr. Condensed chromatin; ct. Cytoplasm; n. Nucleus; nu: Nucleolus. Bars In A, B, E: 500 nm. Bars In C-D: 10 pm. nucleus. It has been reported tha t the interior of the nucleus houses gene-rich chromosomes while gene- poor chromosomes are a t the periphery. Thus, non­ transcribed sequences are located in the nuclear periphery while active genes and gene-rich regions tended to localize on regions exposed inwards or in loops extending from the territories (Dietzel et al., 2 0 0 4 ; Gorisch et al., 2 0 0 5 ) . This way, the rearrangem ent of the chromatin pattern and loca­ tion observed during the d ifferent s tages of microspore embryogenesis would reflect the specif­ ic requirements of the developmental pathway. 41 J.M. Segui'-Simarro e t al. These requisites are: an increase of activity during the proliferative stages and a decrease of activity during differentiation, as occurs during microspore gametophytic development. The biological activities of the nuclear bodies as well as their localization and dynamics seem to be closely related to gene expression. Cajal bodies and PML bodies translocate to specific regions within the nucleus, apparently related to the dynamic organization and accessibility of the chromatin, since properties of the chromatin environment determine the mobility of Cajal (and PML) bodies (Gorish et al., 2 0 0 5 ) . In proliferating plant cells, it has been reported th a t CBs can even translocate from the nucleus to the cytoplasm (Moreno-Diaz de la Espina et al.,. 1 982a , Risueno and Medina 1986). CBs are not involved on mRNA splicing, since poly (A) RNA and nascent mRNA transcrip ts have never been observed within them (Moreno-Diaz de la Espina et al., 1 982a , b; Huang et a!., 1994; S traa tm an and Schel, 2 0 0 1 ) . In plants, it has been suggested th a t CBs are involved on rRNA process­ ing, transport and storage, but not in transcription (Moreno Diaz de la Espina et al., 1982a , b, Risueno et al., 1 978) . It seems th a t CBs are nuciear storage sites where the transcriptosome and splicing factors m ature prior to recruitment to transcription and splicing sites (Spector, 1993; Gall, 2000 ; Proudfoot, 2 0 0 0 ) . Despite this fact, they have been related to transcriptional activation, cell cycle progression and metabolic activity in mammalian cells (Spector, 1993 ; Pena et al., 2001 ; Fernandez et a i, 200 2 ; Fakan, 2004 ; Testillano et ai, 2 0 0 5 ) . In Brassica and Capsicum, CBs were present in vacuolate microspores and the vegetative cell of young pollen grains, just a fter the first pollen mitosis, but in a limited number. These stages have been characterised as biosynthetically active (Risueno et a i, 1 9 8 8 ; Testillano and Risueno, 1988), with high transcriptional activity (Mascarenhas, 1989) . However, in m ature pollen grains, with the lowly active vegetative cell a rres t­ ed in GO, presence of NBs is rarely observed, sug­ gesting a correlation between transcriptional activ­ ity and presence of CBs. During m icrospore embryogénie development, young pro-embryos are highly engaged in proliferation (Segui-Simarro et al., 2 005) . In pro-embryo cells, the frequency of CB-containing cells and the number of CBs per cell increased. Therefore, our results favour the notion th a t the number of CBs increase in response to an increase in cell proliferation activity (Andrade et ai, 1993; Fernandez et a i, 2002) , which conceiv­ ably must be reflected in a higher transcription and processing of the nascent transcripts. The relationship between CBs and the nucleolus could also be related with the entry into prolifera­ tion. Numerous studies in animal and plant cells, including the present one, have evidenced a frequent association between these two structures (Moreno Diaz de la Espina et ai, 1982a , b, Risueno and Medina, 1986 ; Narayanan et a i, 1999 ; Platani et a i, 2 0 0 0 ; Gall 2 0 0 0 ; S egu i-S im arro 2 0 0 1 ; Testillano et a i, 20 0 5 ) . Studies on mammalian live cells have shown th a t CBs move to and from nucle­ oli (P latani et a i, 2 0 0 0 ) . The association of CBs with the nucleolus has been related to a role for CBs in the biogenesis pathway and transport of snoR N P s involved on pre-rR N A processing (Narayanan et a i, 199 9 ; Platani et ai, 2 0 0 0 ) .The frequent association observed between CBs and the nucleolus in developing microspores and prolifera­ tive pro-embryos would imply an increased nucleo­ lar recruitment of rRNA processing machinery components, as a reflection of an increased nucleo­ lar activity during proliferation, where a massive synthesis of ribosomes is needed. Since the activa­ tion of the proliferative activity is associated to the induction of embryogenesis mediated by stress, CBs could also be related to the entry into proliferation by the response to the inductive trea tm ent and, maybe, would also be involved indirectly in the microspore embryogenesis progress. In summary, nuclear bodies and in particular Cajal bodies increase their presence in transcrip­ tionally active, proliferative cells during microspore embryogénie developm ent in Brassica and Capsicum, defining them as potential cell markers of the entry into proliferation due to the repro­ gramming of the developmental pathway to the embryogenesis. Acknowledgements This work was supported by projects granted by Spanish Ministry of Education and Science (MEC) B 0 S 2 0 0 2 -0 3 5 7 2 , A G L 2 0 0 5 -0 5 1 0 4 , B FU 2005- 0 1 0 9 4 , and Com unidad de Madrid, CM 07 G /0026 /2003 .T hanks are due to M.T. Seisdedos (CCD and Confocal Service of CIB) for expert tech­ nical assistance. References 42 Original P aper Andrade LE,Tan EM, Chan EK.L. immunocytochemical analysis of the coiled body in the ceil cycle and during proliferation. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90:1951. Bàràny I, Testillano PS, Mitykô J, Risueno MD. 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