UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Medicina TESIS DOCTORAL Influencia del consumo de esteroles vegetales y su relación con la enfermedad cardiovascular MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Ismael San Mauro Martín Directores Luis Collado Yurrita Mª Ángeles Cuadrado Cenzual Mª José Ciudad Cabañas Madrid, 2017 © Ismael San Mauro Martín, 2016 1 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA Programa de Doctorado en Investigación Biomédica Departamento de Medicina INFLUENCIA DEL CONSUMO DE ESTEROLES VEGETALES Y SU RELACIÓN CON LA ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR AUTOR Ismael San Mauro Martín Madrid, 2016 2 3 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA Programa de Doctorado en Investigación Biomédica Departamento de Medicina INFLUENCIA DEL CONSUMO DE ESTEROLES VEGETALES Y SU RELACIÓN CON LA ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR AUTOR Ismael San Mauro Martín Bajo la dirección de los doctores Luis Collado Yurrita Mª Ángeles Cuadrado Cenzual Dña. Mª José Ciudad Cabañas Madrid, 2016 4 5 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Medicina INFLUENCIA DEL CONSUMO DE ESTEROLES VEGETALES Y SU RELACIÓN CON LA ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA AUTOR Ismael San Mauro Martín Vº Bueno del Director: Vº Bueno del Director: D. Luis Collado Yurrita Dña. Mª Ángeles Cuadrado Cenzual Vº Bueno del Director: Vº Bueno del Doctorando: Dña. Mª José Ciudad Cabañas D. Ismael San Mauro Martín 6 7 Luis Collado Yurrita, Director del Departamento de Medicina de la Universidad Complutense de Madrid, y profesor de Medicina, Odontología, Nutrición Humana y Dietética, Dña. Mª José Ciudad Cabañas profesor del Departamento de Medicina de la Universidad Complutense de Madrid, y María Ángeles Cuadrado Cenzual, del Departamento de análisis clínico del Hospital Universitario Clínica San Carlos de Madrid, profesora de Medicina en la Universidad Complutense de Madrid. INFORMAN QUE: el alumno de nutrición humana y dietética, Máster en Nutrigenómica y Nutrición personalizada y Máster Oficial en Condicionantes Genéticos, ambientales y nutricionales en el crecimiento y el desarrollo ISMAEL SAN MAURO MARTÍN ha realizado, bajo su dirección y en el Departamento de Medicina y los Hospitales Clínico San Carlos y San Lorenzo del Escorial de la Comunidad de Madrid, un trabajo que lleva por título “Influencia del consumo de esteroles vegetales y su relación con la enfermedad cardiovascular” y autorizan su presentación para optar al Grado de Doctor en Ciencias Biomédicas. Y para que así conste, expiden y firman el presente informe, en Madrid, Junio de 2016. D. Luis Collado Yurrita Dña. Mª Ángeles Cuadrado Cenzual Dña. Mª José Ciudad Cabañas 8 9 A mi familia 10 11 AGRADECIMIENTOS No puedo empezar sin unas palabras para aquellas personas que han hecho, de una forma u otra, que este proyecto haya culminado. A las que estuvieron y a las que están, a todas ellas, ¡gracias! Agradecer al Departamento de Medicina por acogerme. A mi directora, la Dra. Mª Ángeles Cuadrado, por “abrirme su casa”, y permitirme desde su Unidad del hospital poder dar los primeros pasos. A mi directora Dña. Mª José Ciudad Cabañas, por su apoyo en este proyecto. Y a mi Director, Luis Collado por estar siempre ahí, por sus consejos en todos los ámbitos. Por su confianza y apoyo. Ha sido un placer y un honor, contar contigo Gracias a las dos unidades de los hospitales que acogieron los ensayos, a todo el equipo de Análisis clínicos del Hospital Clínico San Carlos, y endocrinología pediátrica del Centro de Espacialidades de San Lorenzo del Escorial. A Eva y Esperanza y especialmente a Javier Blumenfield, Beni. Gracias por enseñarme y compartir tus conocimientos. Me llevo un buen amigo del Escorial! A Central Lechera Asturiana, por su apoyo y soporte, tanto económico, como institucional y logístico, especialmente a Marta y a Javier. Agradecer a mis compañeros de carrera con los que comencé mi andadura en este mundo de la nutrición que tanto me apasiona, que compartieron esas clases y prácticas interminables. A los investigadores colaboradores que participaron en el transcurso de las publicaciones. Gracias Elena por estar etapa, por tu inestimable ayuda, ¡que haría sin ti! A mis amigos, por la comprensión y apoyo, por estar siempre ahí, por entender mis “no puedo quedar, no me da la vida”. Tengo la suerte de que seais muchos, como para rellenar una hoja llena de nombres. Por el apoyo incondicional en esto y en todo. Por alegrarme cada momento desde hace años, mi segunda familia, os quiero. A mis hermanos a los que admiro, de los que aprendí el modelo a seguir y el afán por la investigación. De los que siempre tuve un “si necesitas algo, solo dímelo”. Gracias por todo. Y por hacer crecer a la familia! A mis padres por dármelo todo. Por aguantar lo inaguantable, por apoyarme hasta el infinito y más allá. Nunca os lo podré agradecer lo suficiente. Os quiero muchísimo. 12 13 “Whether you think you can or you think you can't you're righ” Henry Fordt 14 15 ABREVIATURAS - ACAT: Acilcoenzima colesterol aciltransferasa - ApoA: Apolipoproteina A - ApoAI: Apolipoproteina A-1 - ApoAII: Apolipoproteina A-2 - ApoB: Apolipoproteina B - ApoC-I: Apolipoproteina C-1 - ApoC-II: Apolipoproteina C-2 - ApoE: Apolipoproteina E - BIA: “Bioimpendancia eléctrica” (Bioelectrical Impedance Analysis) - CETP: Transferencia para esteres de colesterol - CI: Consentimiento Informado - Ct: Colesterol total - Dl: Decilitro - DM: Diabetes Mellitus - ECV: Enfermedad cardiovascular - EV: Esteroles vegetales - G: Gramos - HC: Hipercolesterolemia - HDLc: “Lipoproteínas de alta densidad” (High-density lipoprotein Cholesterol). - HIP: Hoja de Información al Paciente - HMG-CoA: Hidroxi-metil-glutaril Coenzima A - HUCSCM: Hospital Universitario Clínico San Carlos de Madrid - HTA: Hipertensión arterial. - IDL: Lipoproteínas de densidad intermedia - IMC: Índice de masa corporal - LCAT: Lecitina colesterol aciltransferasa - LDLc: “Lipoproteínas de baja densidad” (low-density lipoprotein Cholesterol). - LPL: Lipoproteina Lipasa - LRP: Proteína relacionada con el receptor de las LDL - LH: Lipoproteina Hepática - MCP-1: Proteína-1 quimioatrayente de monocitos 16 - MCSF: Factor estimulador de colonias de macrófagos - OMS: Organización mundial de la salud. - PCR: Proteína C Reactiva - rLDL: Receptor LDL - SNP: “Polimorfismo de un único nucleótido” (Single-Nucleotide-Polymorphism) - SRA: Receptor de las LDL oxidadas - TG: Triglicéridos - TRC: Transporte reverso del colesterol 17 ÍNDICE 18 19 Contenido Página 1. ABREVIATURAS…………………………………………………………………..................................15 2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………………. 23 2.1. Enfermedad Cardiovascular……………………………………………………………………….. 25 2.1.1. Contexto global y en España……………………………………………………………………. 26 2.1.2. Factores de riesgo y medidas de actuación………………………………………………. 27 2.1.2.1. Genéticos………………………………………………………………………………. 28 2.1.2.2. Dietéticos………………………………………………………………………………. 30 2.1.2.3. Ejercicio…………………………………………………………………………………. 33 2.1.2.4. Hábitos tóxicos………………………………………………………………. ……..34 2.1.2.5. Obesidad, composición y grasa corporal…………………………………………………………………………………………………. 35 2.1.3. Hipercolesterolemia. Metabolismo lipídico. Placa ateroma…………………… 35 2.2. Esteroles vegetales……………………………………………………………………………………. 46 2.2.1. Estructura química………………………………………………………………………………….. 46 2.2.2. Fuente dietética de esteroles vegetales. ………………………………………………... 46 2.2.3. Esteroles vegetales para controlar el riesgo cardiovascular. …………………… 46 2.2.4. Mecanismos moleculares en el manejo del riesgo de ECV con EV ………………………………………………………………………………………………………………….. 47 2.2.4.1. Metabolismo de los esteroles ……………………………………………….. 47 2.2.5. Evidencia científica sobre la ingesta de esteroles vegetales y la ECV…………………………………………………………………………………………………………. 51 2.3. Alimento funcionales y Regulación ………………………………………………………………… 52 2.3.1. Legislación de la industria alimentaria. Marco regulatorio. …………………….. 53 2.3.1.1. EFSA y Claims acepados. ……………………………………………………………………… 53 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ……………………………………………………………………………….. 55 4. MATERIAL Y MÉTODOS ………………………………………………………………………………… 59 4.1. Diseño de los ensayos.………………………………………………………………………………. 62 4.1.1. Diseño……………………………………………………………………………………………… 62 4.1.2. Comité de bioética y autorizaciones. ……………………………………………….. 64 4.1.3. Reclutamiento y Sujetos ………………………………………………………………….. 65 20 4.1.4. Material y equipos ……………………………………………………………………………. 66 4.1.5. Datos y análisis estadístico. ………………………………………………………………. 68 5. RESULTADOS (PUBLICACIONES) ……………………………………………………………………. 71 6. DISCUSIÓN ………………………………………………………………………………………………… 101 7. CONCLUSION……………………………………………………………………………………………… 115 8. LIMITACIONES……………………………………………………………………………………………. 119 9. BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………………………………………. 123 10. ANEXOS ……………………………………………………………………………………………………… 147 21 RESUMEN Introducción: La enfermedad cardiovascular responde a un conjunto de patologías que se deben a trastornos del corazón y los vasos sanguíneos. En España, suponen la primera causa de muerte y de hospitalización en la población, con cerca del 30 % de las muertes anuales. Aproximadamente el 20% de los adultos tiene el colesterol total ≥250 mg/dl. Por encima de 200 mg/dl se encuentran entre el 50% y el 69% de los adultos de edades medias. Dentro de los factores modificables y de riesgo, algunas medidas de actuación son los hábitos dietéticos, y la ingesta de esteroles vegetales. Estos son compuestos naturales de algunos productos vegetales, de estructura similar al colesterol y con mayor afinidad por la absorción del colesterol procedente de la dieta (vía exógena), así como de la vía endógena y de la vía para el transporte del colesterol reverso del colesterol (vía hepática). De esta forma, se protege la formación de la placa de ateroma, disminuyendo el riesgo de enfermedad cardiovascular. Objetivos: Analizar la efectividad de la ingesta de esteroles vegetales en el manejo del riesgo de enfermedad cardiovascular, mediante la reducción de la hipercolesterolemia en sujetos adultos. Objetivos secundarios: Analizar la reducción del colesterol total, del LDLc, HDLc y Tg, tras la ingesta de esteroles vegetales. Estudiar la relación entre el HDLc y la ApoA1. Métodos: Se diseñó y desarrolló un doble ensayo clínico en dos hospitales de la Comunidad de Madrid. Ambos ensayos fueron diseñados bajo el mismo protocolo y desarrollados por el doctorando, incluyendo a un total de 54 sujetos, controlados, aleatorizados, doble ciego y cruzados. Durante 3 semanas, un grupo de sujetos ingirieron una cantidad de 700 ml de leche con una cantidad diaria de 2,24 gr de esteroles vegetale y, otro grupo con leche desnatada sin esteroles (placebo). Después de cada periodo de ingesta, de 3 semanas, tras un periodo de lavado y el análisis de las lipoproteínas sanguíneas, los sujetos cambiaron de grupo. Resultados: Se comprobó la efectividad de la disminución del colesterol total, afectando especialmente al LDLc (p<0,05), sin diferencias significativas en el HDLc (p>0,05). Se encontró una correlación positiva (p<0,05) entre el HDLc y la ApoA1. Conclusión: La introducción de esteroles vegetales en la alimentación, puede suponer una vía efectiva y segura para el control leve de la hipercolesterolemia en adultos. 22 ABSTRACT Introduction: Cardiovascular disease responds to a number of diseases that are due to disorders of the heart and blood vessels. In Spain, they represent the leading cause of death and hospitalization in the population, with about 30% of annual deaths. Approximately 20% of adults have total cholesterol ≥250 mg / dl. Above 200 mg / dl are between 50% and 69% of adults in middle age. Among the modifiable risk factors, some means of action are the dietary habits and intake of plant sterols. These natural compounds of certain plant products, similar to cholesterol and higher affinity for cholesterol absorption from the diet (exogenous pathway) structure and the endogenous pathway and the route for transportation of reverse cholesterol (liver) pathway. Thus, the formation of atheroma is protected, reducing the risk of cardiovascular disease. AIM: Analyze the effectiveness of the intake of plant sterols in managing the risk of cardiovascular disease by reducing cholesterol in adult subjects. Secondary objectives: Analyze reducing total cholesterol, LDLc, HDLc and Tg, after ingestion of plant sterols. To study the relationship between HDLc and ApoA1. Methods: Design and development is a double trial in two hospitals of the Community of Madrid. Both trials were designed under the same protocol and developed by the doctoral student, including a total of 54 subjects, including both clinical trials, controlled, aletorizados, double-blind cross. For 3 weeks, an amount subjects ingested 700 ml of milk with a daily amount of 2.24 g of vegetable or without sterols skimmed milk (placebo) sterols. After each period of intake of 3 weeks, subjects switched groups, after a washout period, and the analysis of blood lipoproteins. Results: The effectiveness of the decrease in total cholesterol was found, especially affecting LDLc (p <0.05), no significant differences in HDLc (p> 0.05). A positive correlation (p <0.05) between HDLc and ApoA1 was found. Conclusion: The introduction of plant sterols in food can be an effective and safe way to control mild hypercholesterolemia in adults. 23 INTRODUCCIÓN 24 25 2. INTRODUCCIÓN En las últimas décadas, las enfermedades crónicas no transmisibles se han incrementado a la vez que aumentaba la población mundial y la esperanza de vida. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) las muertes provenientes de estas enfermedades suponen la primera causa de muerte a nivel global. En concreto, fueron responsables del 68 % de las muertes totales en 2012, siendo el 40 % en personas menores de 70 años. Atendiendo a la enfermedad, las cardiovasculares representaron la primera causa de muerte, siendo responsables de 46,2 % de las defunciones mundiales, seguida de cáncer con un 21,7 %, enfermedades respiratorias, asma y pulmonares con un 10,7% y diabetes, con un 4 %. Estos cuatro grupos suman hasta el 82 % de las muertes globales de enfermedades crónicas no transmisibles, por lo que suponen el mayor foco de interés en salud pública, tanto en países desarrollados como subdesarrollados(1). 2.1 Enfermedad Cardiovascular La enfermedad cardiovascular responde a un conjunto de patologías que se deben a trastornos del corazón y los vasos sanguíneos, periféricos(2): - Fiebre reumática aguda. - Cardiopatías reumáticas crónicas. - Enfermedades hipertensivas incluyendo la eclampsia (hipertensión durante el embarazo). - Cardiopatía isquémica (infarto de miocardio, angina de pecho). - Enfermedad cardiopulmonar. - Otras enfermedades del corazón (arritmias e insuficiencia cardíaca entre otras). - Enfermedades cerebrovasculares (hemorragia, derrame, embolia, trombosis, apoplejía cerebral o ictus). - Enfermedades de las arterias (arteriosclerosis, aneurisma, embolia y trombosis arteriales entre otras). - Enfermedades de las venas (tromboflebitis). - Malformaciones congénitas del sistema circulatorio - muerte súbita. 26 En Occidente, habitualmente encontramos arterioesclerosis, hipertensión, trombosis, insuficiencia cardiaca, cardiopatía isquémica y enfermedades cerebrovasculares. 2.1.1 Contexto global y en España Como ya se ha indicado, en el contexto global se debe atender al gran problema de una enfermedad evitable en gran parte, imponiendo unas medidas de control que permitan alejarse de las cifras actuales(1): La ECV es la causa número uno de muerte en el mundo (más personas mueren anualmente por ECV que por cualquier otra causa). Se estima que 17,5 millones de personas murieron a causa de enfermedad cardiovascular en 2012, lo que representa 31% de todas las muertes a nivel mundial. De estas muertes, se estima que 7,4 millones se debieron a la cardiopatía coronaria y 6,7 millones se debieron a un accidente cerebrovascular. Pero no hay que obviar que más de tres cuartas partes de las muertes por ECV se producen en países de bajos y medianos ingresos, posiblemente porque las medidas sanitarias y farmacológicas de dichos países no son tan eficaces como los de países desarrollados y bajo economías fuertes. En estos últimos, se contrapone un mejor sistema sanitario y económico, pero, con unos peores hábitos de vida (alimentación, ejercicio, tóxicos, obesidad, etc), lo que contribuye a la alta tasa de estas enfermedades. La prevención podría ser origen de la solución, abordando factores de riesgo de comportamiento, tales como el consumo de tabaco, dieta poco saludable, la obesidad, la inactividad física y el uso nocivo del alcohol. Un estudio reciente en Europa(3), mostró cifras de la enfermedad cardiovascular alarmantes, donde sigue causando más del doble de muertes que la siguiente enfermedad que engrosa las cifras, el cáncer. Cabe mencionar un descenso en los últimos 5-10 años de la tasa de mortalidad y letalidad de las enfermedades del corazón y derrame cerebral, pero a un ritmo diferente según el país. En España, la ECV supone la primera causa de muerte y hospitalización en la población española, con cerca del 30 % de las muertes anuales(4). 27 Aproximadamente el 20% de los adultos presenta el colesterol total por encima de 250 mg/dl. Por encima de 200 mg/dl se encuentran entre el 50% y el 69% de los adultos de edades medias. Donde se observa que uno de cada cuatro pacientes en las consultas de atención primaria está diagnosticado de dislipemia. Además, un 35% de la población mayor de 18 años es hipertensa. Estas cifras se incrementan al 40-50% en edades medias y al 68% en los mayores de 60 años. El 65% de los hipertensos saben que lo son; de ellos, el 85% están en tratamiento, pero sólo el 25% logra controlar la presión arterial. En 2004, las enfermedades cardiovasculares causaron en España 123.867 muertes [339 muertes cada día] (56.359 en varones y 67.508 en mujeres), lo que supone el 33% de todas las defunciones (29% en varones y 38% en mujeres)(5), y en 2013 117.484, es decir, prácticamente las mismas. Son cifras realmente alarmantes para España, ya que equivalen a una muerte cada poco más de 4 minutos atribuidas a esta patología(6). 2.1.2 Factores de riesgo y medidas de actuación Debido al incremento de las enfermedades cardiovasculares como causa de mortalidad, poco a poco se han ido sucediendo reacciones de la comunidad científica y médica para prevenir y evitar dicha tendencia. En los años 80 se publicaron varios estudios sobre cientos de factores de riesgo relacionados con la enfermedad cardiovascular. Algunos autores, por su amplio análisis y factores sugeridos merecen especial mención, como Hopkins PN et Al., 1988(7). Otros autores(8) agrupaban cohortes con varios cientos de miles de pacientes y biomarcadores más concretos, como el colesterol sérico y la presión arterial, los cuales cogieron rápidamente relevancia en el sector. Se empezó a reconocer que existían factores de riesgo modificables y, otros que en cambio, eran no modificables (género y edad, por ejemplo) y por lo tanto perdían interés en la prevención. Algunos de los factores modificables más relevantes fueron: hipercolesterolemia (HC), la hipertensión arterial (HTA), el tabaquismo, la diabetes mellitus (DM), el sobrepeso, el sedentarismo y el consumo excesivo de alcohol y la composición de la dieta. 28 Grandes estudios como el Framinghan Heart Study(9), han sido claves en el conocimiento de la ECV, y después de 75 años aportando conocimiento al respecto, sigue contribuyendo con artículos recientes en revistas de máximo impacto(10). Posteriormente aparecieron otras cohortes importantes(11) como el Lyon Diet Heart Study(12), donde también se observa una disminución de la morbimortalidad con modificaciones del perfil lipídico. Gracias a todo ello, aunque sin gran éxito, empezaron los grandes consorcios e informes sobre el tema. Uno de los más interesantes de la última década fue la guía clínica publicada en 2004 “European guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice. Third Joint Task Force of European and other Societies on Cardiovascular Disease Prevention in Clinical Practice (constituted by representatives of eight societies and by invited experts)”(13) 2.1.2.1 Genéticos Desde la publicación del proyecto Genoma Humano a principios de siglo, el estudio de la genética y la genómica se ha desarrollado y ampliado su importancia en las enfermedades. Tradicionalmente se ha considerado el factor genético a través de la herencia, como un factor de riesgo, por ello se incluía en los algoritmos de uso clínico. Gracias a los grandes estudios de asociación de genoma completo (GWAS) se empezaron a conocer variaciones en genes específicas, relacionadas con un incremento de ECV. Posteriormente comenzó a ser más eficiente secuenciar genomas gracias al avance de la tecnología y la llegada de la secuenciación masiva (NSG, por sus siglas en inglés “Next Generation Sequencing”). Algunos consorcios con resultados ya publicados son Women's Genome Health Study (con 25.000 sujetos)(14), CARDIoGRAM (con más de 190.000 sujetos)(15). Así pues, empezó a conocerse algunas regiones genéticas y enfermedad coronaria(16,17), ictus(18), hipertensión(19), grosor de la íntima y formación de la placa de ateroma(20). Sin embargo, se sigue avanzando en como estas mutaciones se relacionan con la patogenia, y como otros componentes diferentes a mutaciones de un único núcleo (SNP, por sus siglas en ingles single nuleotide polimorfism), pueden ser relevantes en la enfermedad, como microARNs, splicing, elementos de regulación, etc(21). 29 Figura 1. Tendencias futuras en la predicción del riesgo de ECV. La necesidad de predecir el riesgo de ECV es innegable. El Framingham Heart Study define un conjunto de factores de riesgo (representada por la línea azul), que ha sido el estándar de oro desde 1960. Adaptado de Lara-Pezzi E, et al. 2012(21) Algunos estudios sobre los locis o conjunto de genes o grandes estudios del genoma, se centran en grandes poblaciones con el fin de fortalecer la evidencia de asociación y la replicación(22). Un estudio(23) de asociación genómica de más de 100.000 participantes en la investigación identificó 95 locis asociados con al menos uno de los tres lípidos sanguineos: LDLc, HDLc y TG. Aunque cada variante individuo tenía sólo un efecto modesto, el efecto combinado de los 95 locis explicaban aproximadamente el 25% de la varianza genética en los niveles de LDL y de colesterol HDL. Del mismo modo, otros grandes meta-análisis de variantes genéticas (SNPs) que están asociados con la diabetes tipo 2(24) o con infarto de miocardio(17) sugieren que estas variantes, en conjunto, representan el 25% y 10%, respectivamente, de la variación hereditaria en la evolución de la enfermedad. Dentro del locus 9p21(25) el loci asociado con genes de enfermedad arterial alberga genes que se consideran importantes en la variación de los lípidos sanguineos, 30 incluyendo SORT1, PCSK9, HNF1A, MRAS, y LPA. La posición de otro SNP implica procesos inflamatorios, aumentando el riesgo de la aterosclerosis coronaria(26). 2.1.2.2 Dietéticos En el caso de los factores ambientales, destaca la dieta, relacionada con ingesta de grasas, y más particularmente con su contenido en ácidos grasos saturados e insaturados. Hasta un 20% del colesterol plasmático está determinado por la dieta. Por ello esta adquiere especial relevancia en salud pública, tanto en forma de prevención primaria como secundaria. Así pues, desde el Estudio Framingham(9) al INTERHEART study(27), un inter-estudio en el que participaron 52 países para determinar los factores de riesgo asociados a la ECV y factores de vida modificables, han puesto en el punto de mira a la alimentación desde hace más de una década. Algunos patrones completos de dieta saludable se han estudiado en relación con la enfermedad cardiovascular. Uno de los más relevantes, es el del consorcio de ONTARGET y TRANSCEND con más de 35.000 personas y 40 países colaborando, y avalando en 2012 (28) que los buenos hábitos alimentarios podían ser un gran recurso para mejorar la salud de la población, disminuyendo el riesgo de la enfermedad cardiovascular y la diabetes tipo 2 en mayores de 55 años. La alimentación tradicional española, basada en la Dieta Mediterránea (DM), está siendo un foco de atención a nivel internacional, gracias a los sucesivos estudios publicados en las revistas de máximo impacto del Estudio PREDIMED (por sus siglas: Prevención-con-Dieta-Mediterránea) (29), Atendiendo a los nutrientes, son varios los estudios que han relacionado distintos componentes específicos de los alimentos con la ECV. MACRONUTRIENTES: Los hidratos de carbono, recomendados por las Sociedades Científicas y entidades más relevantes como el macronutriente de ingesta mayoritario en una dieta equilibrada, que han supuesto un beneficio en la ECV. Esto se ha observado principalmente, 31 cuando el cómputo en la dieta de los hidratos de carbono, provenía principalmente de frutas, verduras, cereales integrales, grano entero, semillas y legumbres(30). Los lípidos han sido a su vez ampliamente estudiados, pero de forma muy dinámica en cuanto al foco de preocupación de ingesta de este nutriente. Tradicionalmente se apostaba por la relación entre “más grasa  más Kcal  peor ECV  restricción en las recomendaciones de su ingesta”. Posteriormente, el aumento del conocimiento en el perfil y la elongación de los ácidos grasos, y su relación con la ECV (apareciendo trabajos en la literatura sobre grasas saturadas (PSA, por sus siglas en inglés), grasas trans y colesterol dietario como perjudiciales y poli-insaturadas (PUFAS, por sus siglas en ingles) o mono-insaturadas (MUFAS, por sus siglas en ingles) como beneficiosas para la ECV). Poco a poco, algunos estudios sugerían que la ingesta de ácidos grasos, podía llegar a suponer la predicción de enfermedad coronaria en América(31). Sin embargo, a la ya asentada evidencia y aceptación por la comunidad científica de que los PUFAS mejoran la ECV (tanto en la prevención como en el tratamiento primario)(32), recientemente han aparecido grandes estudios, meta-análisis, que ponían en duda dicha evidencia(33). Este estudio de 2014, tiene gran relevancia por la amplitud de 600.000 casos de más 72 estudios donde, concluyen los autores, que no existe evidencia clara ni con la ingesta de omega3- o PUFAS ni con la de grasas saturadas como perjudiciales. Una revisión de Cochrane de 2015(34), estudió la relación de la ingesta de PUFAS como medida de prevención de la ECV en atención primaria, tampoco encontró evidencia en los hallazgos. Si bien es cierto, otros autores han ido más allá, con una visión más global, incluyendo el análisis combinado de grasas PUFAS y SFA, o el reemplazo de unas grasas por las otras, cambiando así la recomendación de ingesta en porcentaje con respecto a la ingesta calórica total(35); O la combinación de SFA y carbohidratos, especialmente refinados. Donde abogan por una especial atención al posible riesgo de ECV al disminuir los SFA inversamente proporcional al aumento de carbohidratos(36,37). En cuanto a nutrientes minoritarios y “no nutrientes”, merece la atención el estudio de la fibra dietética, que cuenta con un importante reconocimiento científico, dosis- respuesta, tanto en su forma soluble como insoluble. Especialmente se ha relacionado la ingesta de fibra procedente de frutas, verduras y cereales con la función 32 cardiovascular(38). Esto ha sido recientemente publicado en el meta-análisis de 80 ensayos con casi 700.000 personas(39). Los fitoquímicos, compuestos bioactivos de los alimentos de tamaño minúsculo, han supuesto un nuevo horizonte en el entendimiento de la ingesta de algunos alimentos y su prevención o mejora de la ECV. Por ello, algunos autores recomiendan la ingesta diaria de estos, como herramienta en el manejo de la ECV(40). MICRONUTRIENTES: Algunos micronutrientes, minerales y vitaminas, también han sido estudiados de forma independiente en su relación con la ECV o algunos de sus factores de riesgo. Uno de los más clásicos desde los estudios como Framinghan(9),es el sodio (la sal común, como condimento alimentario para potenciar el sabor), relacionada con la presión arterial y que supone una posible reducción del riesgo de HTA en la medida en que se reduzca, donde está considerada como una prioridad de salud pública en la actualidad(41). A favor de su ingesta en la reducción de la ECV tendríamos el selenio(42) y magnesio(43,44), aunque este ha sido cuestionado recientemente(45). El calcio se ha estudiado, pero aun parece no existir evidencia suficiente(46) Por otro lado, el colesterol de la dieta ingerido de forma natural por la composición de algunos alimentos, estuvo tradicionalmente ligado a mayor ECV, en lo que parecía obvio-más ingesta de colesterol en la dieta mayor concentración de colesterol total y LDLc. Sin embargo, debido a la regulación del colesterol ingerido y el producido por el cuerpo, pronto se empezó a estudiar de forma aislada, y actualmente contamos con importantes revisiones sistemáticas sobre el tema. Una de las de mayor impacto y relevancia, es la publicada en la prestigiosa revista American Journal of Clinical Nutrition en 2015(47), con más de 300.000 sujetos, y concluye que no hay evidencia de relación entre la ingesta dietética de colesterol y la enfermedad cardiovascular. Atendiendo a la ingesta de alimentos, en lugar de a los nutrientes, podemos agrupar los numerosos estudios que apuntan a estos componentes de la dieta, como una medida clínica en el manejo de la ECV. Así pues, el consumo de frutas y verduras(48,49,50); cereales integrales y la fibra procedente de estos (51,52); cereales 33 legumbres(53); y los lácteos(54), son algunos de los alimentos descritos en la literatura con efecto beneficioso para la ECV. Aunque en el caso de los lacteos, los autores concluían que eran necesarios nuevos estudios que evaluasen de una forma más específica los distintos tipos de lácteos en función de su contenido en grasas y especialmente grasas saturadas, como un posible sesgo y diferencias en los resultados. Para ello, otra publicación de 2013, ya contrastaba dicha hipótesis, concluyendo que no existía dicha relación(55). Otros alimentos también se han reportado como beneficiosos: pescado azul(56); frutos secos(57); aceite de oliva(58), como está evidenciado en el proyecto PREDIMED. Desde hace décadas, el consumo de alcohol, cerveza y vino, ha estado ligado a su inversa relación con la ECV(27,59), aunque no aclaraban específicamente cual era el “consumo moderado” propio, ni el rango de seguridad, ni mención a otras enfermedades o problemas asociados al consumo (hígado, neuronal, etc) ni los mecanismos. Otros autores(60), en estudios más específicos, una única enfermedad (HTA) y solo en mujeres, concluyen a favor de la ingesta moderada. Recientemente, autores españoles(61) han introducido en el estudio asociativo del posible beneficio de la ingesta moderada de alcohol en forma de vino y cerveza, a los polifenoles (fitoquímicos) como elementos determinantes de este beneficio. Incluso las especias culinarias han sido estudiadas en la relación con la ECV. Tanto las especias indias(62), como el ajo(63) o la cúrcuma(64), son algunas de las más estudiadas, aunque por ahora las investigaciones solo mencionan una modesta mejora en la ECV. Entre los hábitos dietéticos, destinados a prevenir la hipercolesterolemia, el uso de esteroles vegetales se ha evidenciado científicamente como componentes capaces de modular el colesterol de los humanos. Es por ello, que se le ha dedicado un apartado específico (ver apartado 2.2) 2.1.2.3 Ejercicio Dentro del Estudio Framingham, la actividad física fue uno de los factores estudiados de gran interés, por su relación con la ECV(65). La actividad física reduce 34 considerablemente el riesgo de padecer infartos de miocardio y accidentes cerebrovasculares porque: • Ayuda al cuerpo a quemar grasas y azúcares, y a mantener el peso adecuado. • Reduce la tensión arterial. • Aumenta la concentración de oxígeno en el cuerpo. • Disminuye el estrés. • Fortalece el músculo cardiaco y los huesos. • Mejora la circulación sanguínea y el tono muscular. Todo ello ha contribuido a que con los años apareciesen cientos de publicaciones, que han sucumbido ante la evidencia en forma de meta-análisis sobre el tema. Como es el publicado en 2014(66), que no encontró relación entre el ejercicio físico y la fibrilación articular, por lo que los autores concluyen con el potencial beneficio, sin perjuicio, de la práctica del ejercicio para la salud. Otro grupo el mismo año, estudió el beneficio del ejercicio aeróbico para la rigidez arterial(67). Aunque esto no se vio en sujetos pre- hipertensos en relación a la presión arterial sistólica(68). También en la prevención de la diabetes(69) o la inactividad física (sedentarismo) como un incremento del 14,3 % de la incidencia de ECV y un incremento del 17,9 % aproximadamente en la mortalidad por ECV ha sido reportado(70). 2.1.2.4 Hábitos tóxicos El tabaco, la ingesta de fármacos y drogas, está relacionado con la ECV, como se puso de manifiesto en los años 60 con el Estudio Framingham: El humo del tabaco contiene numerosas sustancias que dañan los pulmones, los vasos sanguíneos y el corazón. Esas sustancias ocupan en la sangre el lugar del oxígeno que el corazón y el cerebro necesitan para funcionar con normalidad. El consumo de tabaco aumenta de forma considerable la probabilidad de padecer un infarto de miocardio o un accidente cerebrovascular(71). El uso de ciertos medicamentos: algunos anticonceptivos y terapias hormonales incrementan el riesgo de cardiopatías(72,73,74). 35 2.1.2.5 Obesidad, composición y grasa corporal El exceso de peso, medido con el índice de masa corporal, relación entre el peso y la altura al cuadrado, y el exceso de grasa, especialmente la grasa abdominal, se ha relacionado desde la década de los 60(75), hasta la actualidad, como un factor de riesgo relevante. Así lo recoge uno de los últimos estudios de mayor impacto, con más de 1 millón de sujetos(76). 2.1.3Hipercolesterolemia. Metabolismo lipídico. Placa ateroma. La hipercolesterolemia (HC), es uno de los principales factores de riesgo con mayor trascendencia en el desarrollo de las ECV(77), no sólo por su elevada prevalencia, sino también por su deficiente control, además de ser uno de los mejores predictores(78). El aumento de las concentraciones séricas de LDLc, se ha reportado como el principal factor de riesgo en la enfermedad cardiovascular. Algunos estudios sugieren que por cada 1% de reducción de las concentraciones del colesterol total, se consigue un 2% de reducción de riesgo cardiovascular(79). Sin embargo, gracias a los mecanismos de regulación y homeostasis, el colesterol se mantiene ampliamente constante, equilibrando la síntesis endógena del esteroide con la absorción intestinal y con la secreción biliar de ácidos biliares y colesterol. Además, los ácidos biliares son eficientemente captados y una parte del colesterol biliar también es reabsorbido en el intestino. Así, el balance global del colesterol depende de las ingesta (dieta y síntesis) y pérdida (eliminación fecal)(80). Dentro de las hipercolesterolemias, se encontran distintos fenotipos, afectados por distintos mecanismos(81,82,83). Según los datos del Estudio ENRICA(80), el 50% de la población presentarían hipercolesterolemia en nuestro país. El metabolismo lipídico y de las lipoproteínas circulantes se regula a través de varios mecanismos en los humanos expuestos a continuación:(84): Las grasas o lípidos son diferentes componentes químicos que se pueden extraer mediante solventes orgánicos de las plantas, los animales y distintos organismos microbianos. Son compuestos insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos como el éter, cloroformo, hexano, benceno o metanol. Tienen funciones metabólicas 36 esenciales y son importantes como elementos estructurales. Se pueden clasificar desde distintos puntos de vista, teniendo en cuenta su presencia en los alimentos gra- sos, así como su función nutritiva. 1) Según la composición química: • Triacilgliceroles o triglicéridos. • Fosfolípidos y lípidos compuestos. • Colesterol y otros esteroles. 2) Según sus propiedades físicas: • Grasas neutras: ésteres de ácidos grasos con glicerol (monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos) y colesterol. • Grasas anfifílicas: fosfolípidos y glicolípidos, por su capacidad para orientarse en la interfase de dos capas no miscibles, como las membranas celulares y la capa externa de las lipoproteínas. 3) Según su función: • Grasas de almacenamiento (triglicéridos, fundamentalmente). • Grasas estructurales (fosfolípidos, glicolípidos y colesterol) que forman parte de la estructura de las membranas celulares y abundan en ciertos órganos, como el cerebro. Figura 2. Estructura de los fosfolípidos. (Ros E, 2015) 37 Los acilgliceroles son ésteres de ácidos grasos, que en número de uno, dos o tres se adhieren al esqueleto del glicerol para producir mono, di y tri-acilglicerol o triglicérido, respectivamente. Los triacilgliceroles son los más abundantes en los alimentos. La naturaleza y la localización de los ácidos grasos sobre la molécula de glicerol determinan su respuesta biológica. Desde el punto de vista de la alimentación, los triglicéridos constituyen el principal componente de la grasa ingerida, equivalente al 98 %; el 2 % restante está constituido por fosfolípidos, colesterol y lípidos complejos. Los triglicéridos están formados por la unión del glicerol con tres ácidos grasos. Los esteroles y ésteres de esteroles pertenecen a un largo subgrupo de esteroides, que están representados básicamente por el colesterol en los animales y los esteroles vegetales o fitoesteroles en las plantas (sitosterol, campesterol, estigmasterol, etc.). El colesterol es un lípido de estructura distinta a los demás. Químicamente es un derivado del ciclopentano-perhidro-fenantreno. El grupo OH del carbono 3 le permite formar ésteres con los ácidos grasos. El colesterol no es un nutriente esencial porque se puede sintetizar en las células de animales a partir del acetato. La síntesis aporta al organismo unas tres veces más colesterol que el procedente de la dieta. Cada uno de los lípidos tiene diferentes funciones como el mantenimiento de la estructura de la membrana celular (colesterol, fosfolipidos), la sintesis de hormonas esteroideas (colesterol), y el metabolismo energético (trigliceridos y ácidos grasos). Debido a la insolubilidad de los lípidos en un medio acuoso, y para facilitar su transporte en el plasma sanguíneo, se asocian con proteínas y forman unas estructuras que se conocen con el nombre de lipoproteinas. Lipoproteínas(85,86): Las lipoproteínas constan de un núcleo hidrofóbico formado por triacilgliceroles y esteres de colesterol, rodeado de una envoltura organizada en una monocapa y formada por lípidos polares (fosfolipidos y colesterol libre) y por proteínas. Las proteínas que constituyen las lipoproteínas reciben el nombre de apoproteinas y cumplen una función estructural, solubilizando los lípidos, y además regulan la ruta metabólica de las diferentes lipoproteínas al servir de cofactores enzimáticos y por 38 interaccionar y ser reconocidas por receptores específicos localizados en las membranas celulares. Figura 3. Estructura de las lipoproteínas. (Palou A, 2005) Las lipoproteínas plasmáticas se clasifican normalmente en cinco subclases principales en base a sus densidades: los quilomicrones (QM), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL). Algunas subclases de lipoproteínas pueden ser divididas por la densidad de las partículas, o el tamaño, la carga eléctrica, o el contenido de apolipoproteína. Tabla 1. Características de las lipoproteínas (Palou A, 2005) Metabolismo de las lipoproteínas(87,85) Existen tres vías para el transporte de las lipoproteínas en el organismo: a) Vía exógena: transporta los lípidos de la dieta desde el intestino a sus diferentes destinos metabólicos en diversos tejidos. Los ácidos grasos, colesterol y 39 fosfolípidos que provienen del intestino son ensamblados en los QM que contienen la apolipoproteína (apo) B-48 sintetizada en el intestino; esta es una apoproteína B más corta que la B-100 de origen hepático. Los QM además contienen apo A-I, A-II y A-IV y son vertidos desde el intestino a la linfa para alcanzar luego el torrente sanguíneo. En la circulación son hidrolizados por el sistema de la lipoproteína lipasa (LPL) del endotelio vascular. Los QM a medida que circulan van perdiendo triglicéridos y van haciéndose más pequeños y densos, enriqueciéndose más en colesterol, transformándose en QM remanentes. Adquieren a su vez desde las HDL, apo C-II que es el activador de la LPL y apo E, que es imprescindible para la unión a receptores hepáticos que no reconocen a la apo B48 al no contener la región de señalización del receptor. Estas partículas son retiradas de la circulación por el hígado utilizando los receptores para LDL y, en menor proporción, por un sistema de receptores distinto denominados LRP-1 (LDL receptor-related protein) el que actúa en conjunto con el protoglicano de superficie celular. Casi todos los triglicéridos que son transportados por los QM son utilizados en los tejidos extrahepáticos, mientras que casi todo el colesterol es entregado al hígado. Una pequeña proporción de los remanentes de QM son extraídos por tejidos periféricos. Es decir, de esta manera, los quilomicrones se transforman en otros remanentes. Una vez en los hepatocitos, y por la acción de las enzimas hidrolíticas lisosómicas, se libera el colesterol que transportan. Parte del colesterol que la célula no utiliza es excretado por la vía hepatobiliar, bien sea como ácidos biliares o como colesterol per se, que puede a su vez ser reabsorbido por el intestino, reiniciándose el ciclo. b) Vía endógena: es un sistema mediado por apo B-100 de síntesis hepática que forma parte de la estructura de las VLDL, IDL y LDL. Esta vía se inicia en el hígado donde primero se ensamblan y luego se secretan las VLDL. La síntesis hepática de estas lipoproteínas aumenta con la ingestión de grasa e hidratos de carbono. Las VLDL transportan triglicéridos hacia los tejidos periféricos (tejido adiposo y músculo), y colesterol hacia las glándulas suprarrenales y membranas plasmáticas. El colesterol es transportado en las VLDL como colesterol esterificado y colesterol libre. Las VLDL provenientes del hígado al entrar en la circulación intercambian con 40 las HDL apo C-I, apo C-II activador de la LPL, apo C-III inhibidor de la LPL y apo E que modula la unión de las VLDL con receptores en la superficie celular. En la circulación, las VLDL son hidrolizadas por la LPL en la superficie endotelial de diversos tejidos, perdiendo triglicéridos y se convierten en partículas más pequeñas denominadas remanentes. Una proporción de ellas es captada por el hígado, otros tejidos y el resto entra en la llamada cascada impolítica de las lipoproteínas VLDL- IDL-LDL en el compartimento plasmático, todas estas lipoproteínas comparten la presencia de apo B-100 en su estructura, ligando para el receptor de apo B/E hepático. La LPL y la lipasa hepática (LH) dan cuenta del núcleo cargado de triglicéridos de estas partículas remanentes, que se transforman en IDL, al quedar cargadas con apo B-100 y apo E. El receptor hepático que reconoce a las IDL es el receptor para LDL, llamado también receptor apo B/apo E. La apo E cumple un papel modulador para la unión de las lipoproteínas que la transportan con el receptor apo B/apoE. La presencia de apo E es muy importante para el reconocimiento de la partícula IDL por el receptor hepático para apo B/apo E que permite incorporarla en el hígado y proseguir el metabolismo. Una proporción de IDL en el plasma sigue perdiendo triglicéridos y toman el curso hacia LDL las que a su vez, son aclaradas por el sistema de receptores hepáticos para LDL en su mayor parte y las otras son procesadas por otros pasos en los cuales incluso no median receptores. Las LDL constituyen los principales transportadores del colesterol plasmático hacia los tejidos. Sin embargo, el 75% de la captación de las LDL ocurre en el hígado, el resto en las suprarrenales y tejido adiposo. Para que el proceso se realice, es esencial la presencia de apo B-100 y de receptores para su reconocimiento. Una vez en el interior de la célula la partícula es desarmada en sus componentes proteicos y lipídicos, el colesterol libre en exceso, es esterificado de nuevo por la acil-CoA-colesterol aciltransferasa (ACAT) para el almacenamiento intracelular. c) Vía para el transporte del colesterol desde la periferia al hígado (vía reversa): es un sistema mediado por apo A-I, contenido en las HDL, utilizado en el transporte del colesterol desde la periferia hacia el hígado. Este sistema esta interconectado con la vía exógena y endógena del transporte de lípidos. Sirve de reservorio 41 circulante para apoproteinas: apo C-I, apo C-II y apo E. Las partículas HDL derivan de precursores complejos aportados por el hígado e intestino. La vía se inicia cuando las HDL nacientes, provenientes del hígado o intestino delgado incorporan colesterol libre desde las membranas celulares. En este proceso la lecitin- colesterol-acil–transferasa esterifica el colesterol libre con ácidos grasos provenientes de la posición C-2 de la lecitina que son transferidos al C-3-OH del colesterol libre. Al incorporar colesterol la partícula HDL se transforma de discoidal, en esférica, dando lugar a las HDL2, que luego se transforman en HDL3 y vuelve nuevamente al hígado donde es incorporada mediando receptores específicos para apo A-I. Los macrófagos también, vía receptores, incorporan a las HDL y estas captan colesterol y apo E en el interior de ellos. La presencia de apo E en las HDL facilita posteriormente la captación por los receptores hepáticos y su catabolismo. La función principal de las HDL es el intercambio de colesterol libre y su esterificación. Al captar las HDL el colesterol de las membranas celulares, reducen el colesterol almacenado dentro de las células al momento que este se desplaza para reemplazar el colesterol retirado de las membranas. El colesterol esterificado de las HDL a su vez puede ser transferido a las LDL y VLDL mediante la acción de la enzima asociada, denominada Proteína de Transferencia para Esteres de Colesterol (CETP). La ventaja de este paso es permitir mediante un doble mecanismo de receptores para LDL y HDL devolver colesterol al hígado. Esta vía de transporte reverso de colesterol es un mecanismo importante en la prevención de la aterogenesis. Figura 4. Transporte de lipoproteínas. (Palou A, 2005). 42 La placa de ateroma: Los vasos arteriales, con la excepción de los capilares, están compuestos por tres capas bien definidas: íntima, media y adventicia(88). Dichas capas están delimitadas por otras concéntricas de elastina, conocidas como lámina elástica interna (que separa la íntima de la media) y lámina elástica externa (que separa la media de la adventicia). Figura 5. Corte trasversal de una arteria normal (Keaney, JF, 2000) - En la parte luminal, encontramos inmediatamente la capa íntima, constituida por una monocapa de células endoteliales establecida sobre una matriz extracelular y bordeada por la lámina elástica interna. El grosor de la matriz extracelular y elastina es más prominente en las arterias de medio y gran calibre. Las células endoteliales constituyen una barrera dinámica entre la superficie luminar del vaso y el estroma de la pared arterial y regulan un amplio espectro de funciones de la pared arterial, incluyendo la trombosis, el tono vascular y el tráfico de leucocitos dentro de la pared arterial. - En la capa intermedia encontramos la capa media de la pared vascular, que está compuesta por células musculares lisas organizadas en una o varias capas, dependiendo del tamaño de la arteria. Dichas células están embebidas en una matriz extracelular formada principalmente por fibras elásticas y colágeno. - En la capa más externa de la pared vascular, encontramos la adventicia. Su grosor depende del tipo y localización del vaso. Esta capa está formada por una matriz de elastina, células musculares lisas, fibroblastos y colágeno, y está relacionada con la estabilidad y conexión de los vasos sanguíneos a los tejidos. 43 La enfermedad aterosclerótica afecta principalmente a las arterias de calibre mediano, como las coronarias, carótidas, renales, basilares, cerebrales, ilíacas, femorales y también la aorta. Procesos implicados en el desarrollo de la lesión aterosclerótica(89): La enfermedad de la aterosclerosis, tradicionalmente hace referencia al acúmulo de material lipídico, principalmente colesterol y ésteres de colesterol, en la pared arterial, constituyendo las denominadas placas de ateroma. El mecanismo por el cual se forman las placas ateroscleróticas ha sido objeto de muchos estudios, y aun sigue en debate, aunque comienzan a aceptarse por válidas algunas hipótesis. Se han establecido tres etapas en el desarrollo de la aterosclerosis: lesión temprana (estrías grasas), lesión intermedia (placas fibrosas) y lesión madura (necrótica). - Las lesiones tempranas se caracterizan por áreas nodulares de deposición lipídica denominadas morfológicamente “estrías grasas”. Estas áreas representan macrófagos repletos de lípidos y células musculares lisas en zonas de la capa íntima. - Las lesiones intermedias consisten, como su nombre indican, en la formación de lesiones intermedias caracterizadas por placas fibrosas, en forma de cúpula y cubiertas por una capa fibromuscular denominada “caparazón”. Dicha capa está constituida por una matriz extracelular, células musculares lisas y por colágeno. Pueden formarse inicialmente en áreas de las arterias coronarias, aorta abdominal y arterias carótidas, sobre todo durante la tercera hasta la cuarta década de la vida. - Las lesiones maduras se caracterizan por áreas fibrosas calcificadas con ulceración visible. Este tipo de lesiones y su progresión gradual, así como otras alteraciones funcionales de la pared arterial, se han asociado con lesiones en los tejidos distales, como el infarto de miocardio. Parece aceptado que los primeros eventos, conducen a la formación de las estrías grasas. A continuación, se incrementan las concentraciones plasmáticas de LDL que conduce a un aumento de la adherencia de los monocitos circulantes a las células endoteliales de la pared arterial y a una mayor entrada de LDL en la capa íntima. Una vez en el interior, las LDL pueden experimentar un proceso de oxidación(90). Dichas LDL, incluso sólo mínimamente oxidadas, pueden incrementar la adherencia y penetración de los monocitos, en parte estimulando la liberación de la 44 proteína-1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1) por las células endoteliales. Las LDL oxidadas también estimulan la liberación del factor estimulador de colonias de macrófagos (MCSF), que induce la proliferación y diferenciación de los monocitos en un fenotipo celular de macrófago, incluida la mayor expresión de receptores SRA. Las LDL completamente oxidadas tienen por ellas mismas capacidad quimotáctica sobre los monocitos, y son evidentemente uno de los principales ligandos de los SRA y otros receptores en la pared arterial del macrófago que contribuyen a la formación de las células espumosas. Una vez comenzada la iniciación, se produce una fragmentación de la membrana elástica interna y la migración de las células musculares lisas de la capa media a la íntima. Las células musculares lisas de la pared arterial proliferan, producen componentes de la matriz conectiva y también acumulan colesterol. Estas células no suelen expresar el SRA, pero puede inducirse, lo que contribuiría a la formación de células espumosas. Es destacable que la lesión inicial (estría grasa), aun siendo clínicamente silenciosa por ella misma, es la precursora de lesiones más complejas que causan estenosis y limitan el flujo sanguíneo(91). Figura 6. Secuencia de eventos en la aterosclerosis (Palou A, 2005) Las lesiones ateroscleróticas pueden permanecer durante toda la vida sin producir ningún síntoma en el paciente, o pueden activarse y causar las consecuencias fatales 45 de la ECV. La activación de la lesión se inicia por rotura de la placa aterosclerótica, de manera que el contenido de la placa se expone a la superficie luminal de la arteria(92). La exposición de los componentes de la sangre a las actividades procoagulantes del interior de la placa puede conducir a la respuesta trombótica y precipitar el evento vascular(88). Las lesiones son principalmente fibrosas, aunque pueden causar estenosis, no suele coincidir con el sitio de trombosis. Parece que la inflamación y la agregación de citocinas, promueve la necrosis de células espumosas y de células musculares lisas, produciendo un progresivo acúmulo de lípidos en el espacio extracelular, acompañado de una debilitación de la capa fibrosa, que determinan en conjunto que la placa sea más sensible a la rotura. Algunas hipótesis(93,94) se basan en la retención de lipoproteínas por la matriz de tejido conectivo. Las características físicas y químicas de las lipoproteínas plasmáticas pueden explicar por qué el colesterol transportado en las LDL promueve la aterosclerosis, mientras que el colesterol transportado en las HDL no se asocia con ello. 2.2 Esteroles vegetales Los esteroles vegetales (EV) son componentes bioactivos con funciones similares a la del colesterol en mamíferos. Son alcaloides esteroidales que difieren del colesterol en la cadena lateral. Las principales fuentes alimenticias de EV son aceites vegetales, margarinas, pan, cereales, frutas, hortalizas y frutos secos(95). 2.2.1 Estructura química Los EV mayoritarios son los fitoesteroles, que constituyen el 95% del total de estos compuestos, siendo el 80% β-sitosterol y el 15% restante campesterol y estigmasterol, fundamentalmente(96). 46 Figura 7. Estructura del colesterol y esteroles vegetales comunes (Palou A, 2005) 2.2.2. Fuente dietética de esteroles vegetales. Los EV no pueden ser sintetizados por los organismos animales, por lo que son obtenidos a través de la dieta, principalmente por el consumo de aceites, margarinas, cereales y derivados, legumbres, hortalizas, frutas y frutos secos. La dieta habitual occidental solo contiene 150-450 mg diarios de fitoesteroles, los cuales no producen reducciones apreciables de colesterol, aportando la mayor proporción de la fracción insaponificable de grasas(97,98). 2.2.3. Esteroles vegetales para controlar el riesgo cardiovascular. Hace 10 años, quedaba reflejada la posibilidad terapéutica, y utilidad en salud pública, de los esteroles vegetales en una de las guías más relevantes hasta la fecha(83). Con el avance de la literatura científica, los EV se han ido conociendo por reducir el nivel de las LDLc en suero sin modificar el de las lipoproteínas de alta densidad (HDLc) o triglicéridos (TG)(99,100). El consumo diario de alimentos enriquecidos con fitosteroles se utiliza ampliamente como una opción terapéutica para reducir el nivel de LDLc en plasma y, por tanto, el riesgo de la enfermedad aterosclerótica(99). 47 2.2.4. Mecanismos moleculares en el manejo del riesgo de ECV con EV En cuanto al mecanismo de acción, los EV afectan a la absorción intestinal de colesterol, a su síntesis, y a los sistemas de eliminación(101). Al introducir esteroles vegetales a la dieta, la absorción del colesterol en el intestino disminuye entre un 20 y un 80 %. Como respuesta a este descenso el hígado desarrolla mecanismos de compensación destinados a aumentar la síntesis de receptores de LDLc. El resultado final es la disminución del LDLc y del Ct entre un 8 y un 15 %(102). A pesar de que su estructura química es similar, los esteroles vegetales y el colesterol difieren ampliamente en lo que respecta a su absorción intestinal(103). 2.2.4.1. Metabolismo de los esteroles Una de las funciones claves de los esteroles vegetales es su inhibición de la absorción intestinal de colesterol, tanto procedente de la dieta, como del colesterol endógeno recirculante procedente de la bilis, que puede ser parcialmente reabsorbido en el intestino siendo un pilar clave en la recaptación. Los esteroles vegetales, al ser más hidrofóbicos que el colesterol, pueden desplazarlo de las micelas de absorción, produciéndose una disminución de la incorporación del colesterol en las micelas(104). Otro mecanismo propuesto(105), es la reducción de la tasa de esterificación del colesterol en el enterocito, mediando la actividad de la ACAT. De esta forma se reduciría la cantidad de colesterol exportado a la sangre en forma de quilomicrones. Además, se ha propuesto un tercer mecanismo, en el que la absorción del colesterol en el intestino en función a su solubilidad, podría igualmente cambiar en presencia de los EV y con ello, reducir su absorción(106). 48 Figura 8.Mecanismo bioquímico del efecto hipocolesterolemiante de los esteroles (Valenzuela B, 2004). 2.2.4.1.1. Absorción Como ya hemos dicho, la estructura de los EV es similar al colesterol, sin embargo, difieren marcadamente en lo que respecta a su absorción intestinal. La absorción intestinal de los EV es mínima (0,4-3,5%) y los estanoles aún menor (0,02-0,3%). La explicación a esta baja absorción puede ser la baja afinidad de los esteroles vegetales por el proceso de esterificación, incorporándose a los quilomicrones los esteroles y estanoles esterificados(108,109). La tasa de absorción cambia también por la longitud de la cadena lateral y, en los EV, puede ser algo mayor por la presencia del doble enlace en posición 5(110). Finalmente, otro factor que puede afectar a la menor tasa de absorción de los esteroles vegetales, es el funcionamiento de los transportadores de eflujo de esteroles del intestino, los transportadores ABC. Estos transportadores intestinales eliminan colesterol y sistosterol para evitar su absorción y acumulación, aunque su funcionamiento es mucho más eficiente en el caso del sitosterol, devolviendo gran parte de este esterol presente en el enterocito de nuevo al intestino para su eliminación(111). De hecho, las mutaciones o SNPs que codifican para los transportadores ABCG5 o ABCG8 pueden desencadenar la aparición de fitosterolemia, enfermedad poco frecuente caracterizada porque los pacientes presentan una tasa muy elevada de absorción de esteroles vegetales(112). 49 2.2.4.1.2 Transporte Los EV que llegan a la circulación sanguínea se esterifican en el plasma y se transportan al hígado mediante el mecanismo de transporte reverso del colesterol(113), siendo este punto, clave en la bioactividad propuesta por los autores(114): Definición de biodisponibilidad, bioaccesibilidad y bioactividad: - Biodisponibilidad: proceso clave de la eficiencia nutricional. A partir de la ingesta total de alimentos, una cantidad inferior es asimilada y utilizada para el almacenamiento y las funciones metabólicas. - Bioaccesibilidad: conjunto de procesos que tienen lugar durante la digestión gastrointestinal para transformar los nutrientes en componentes potencialmente activos; Absorción/asimilación a través de células intestinales; Metabolismo pre-sistémico. - Bioactividad: transporte y asimilación por el tejido diana; Metabolismo o biotransformación y respuesta fisiológica. 2.2.4.1.3. Función Aunque ya han sido descritos los mecanismos a través de los cuales los EV cumplen la función relacionada con la ECV y la reducción de la hipercolesterolemia, cabe reconocer, que la función individual aun sigue siendo un tema de discusión entre investigadores. Así pues, se han descrito que existen diversos factores que van a condicionar la efectividad y funcionalidad de los EV frente al colesterol. Estos factores fueron publicados en 2006 con el análisis de 45 estudios(115). 50 Figura 9. Impacto de los factores sobre la relación fitoesteroles-colesterol (Chan YM, 2006) También otros autores han descrito la variabilidad de la respuesta a un tratamiento dietético con EV. Desde esta perspectiva se puede clasificar en modelo predictivo de hipo-responderdores, normo-respondedores o hiper-respondedores, en función de si el efecto de los EV frente a la HC es bajo, normal o exagerado con respecto a lo descrito en la bibliografía, respectivamente(116). Figura 10. Ejemplo del efecto de la variabilidad de la respuesta a la dieta en la disminución del % de colesterol plasmático de 100 individuos sometidos a la misma dieta durante el mismo periodo (Corella D, 2007). 51 2.2.4.1.4. Excreción. La eliminación de los EV se realiza mediante las heces, según su baja tasa de absorción intestinal como ya se ha visto anteriormente. Los EV que sí son absorbidos, son rápidamente eliminados debio a la excreción del hígado. Los fitosteroles son capaces de ser metabolizados en el hígado en ácidos biliares, del hígado(117). Además, los transportadores ABC intestinales, son muy eficientes en el caso del sitosterol, devolviendo gran parte de este esterol presente en el enterocito de nuevo al intestino para su eliminación(111). 2.2.5. Evidencia científica sobre la ingesta de esteroles vegetales y la ECV Existen multitud de estudios que han revisado la literatura de forma analítica y basados en la máxima evidencia, meta-análisis de ensayos clínicos. Todos concluyen con el beneficio y eficacia de los efectos de los EV en el manejo de la HC(118,119,120,121,122,123,124,125,126). Figura 11. Reducción de las concentraciones de LDLc en función de la ingesta diaria de EV (Palou A, 2005) 52 2.3 Alimentos funcionales y Regulación En España, el primer Reglamento que regula la comercialización de alimentos enriquecidos en EV, es la legislación europea de “nuevos alimentos” (Reglamento 1997/258/CE del Parlamento Europeo y del Consejo). En este, se regulan alimentos e ingredientes tales como: a) alimentos transgénicos, b) alimentos e ingredientes que poseen una estructura molecular nueva, c) alimentos procedentes de microorganismos, hongos y algas, d) procedentes de animales y plantas en cuya reproducción se empleen métodos no tradicionales, e) los obtenidos con nuevos procesos de producción, que impliquen cambios significativos en la composición o estructura de los alimentos o ingredientes que afecten su valor nutricional, metabolismo o las concentraciones de sustancias no deseables. Atendiendo a ello, todos aquellos alimentos enriquecidos en EV, se encuentran incluidos como “nuevos alimentos”. Se debe añadir, que para poder comercializar un nuevo alimento o ingrediente alimentario se debe cumplir: a) no debe suponer ningún riesgo para el consumidor, b) no debe inducir a error al consumidor y c) no debe diferir de otros alimentos o ingredientes alimentarios a los que vaya a sustituir con el fin de que su consumo normal no implique desventajas para el consumidor desde el punto de vista de la nutrición(127). Los lácteos, consumidos desde hace miles de años(128), y desde la revolución industrial, es uno de los sectores que más ha crecido y que más ha evolucionado adaptándose a las nuevas necesidades del usuario. Estos han innovando con una gama de alimentos funcionales de origen lácteo, especialmente la leche, con gran variedad y posición en el mercado. Así aparecen leches parcial y totalmente desgrasadas (leche desnatada y semidesnatada), y son uno de los alimentos procesados mayormente elegidos para vehiculizar los EV en forma de productos lácteos (margarinas, leche, yogur…)(127). 53 2.3.1 Legislación de la industria alimentaria. Marco regulatorio. A lo largo de los años, se han publicado y legislado distintas Decisiones Europeas en las que se autoriza el enriquecimiento en EV en distintos alimentos, en el contexto de los “nuevos alimentos” (Reglamento 1997/258/CE). En cuanto al marco regulatorio de los esteroles vegetales, se ha ido legislando acorde a las investigaciones y a la innovación de la industria alimentaria. Esta regulación supone la aceptación legal, de un reclamo o alegación nutricional o de salud (claim, en inglés) que la industria alimentaria puede usar comercialmente. Las principales fuentes de EV para el enriquecimiento de alimentos y como suplementos dietéticos son los aceites vegetales y el destilado de “tall oil”, principalmente de soja, maíz, girasol, colza y germen de trigo(129). El Reglamaneto, también recoge que los aceites vegetales crudos deben ser procesados con el fin de eliminar impurezas (130). 2.3.1.1 EFSA y Claims acepados. Recientemente, se ha establecido una lista de declaraciones autorizadas de propiedades saludables de los alimentos, distintas de las relativas a la reducción del riesgo de enfermedad y al desarrollo, y la salud de los niños (Reglamento nº 2009/983/CE, 2012/432/CE) en las que se indica que los fitoesteroles y fitoestanoles contribuyen a mantener niveles normales de colesterol sanguíneo. Los expertos de la European Food Safety Authority (EFSA) confirman que el colesterol en sangre puede reducirse en un promedio de 7 a 10,5% si una persona consume de 1,5 a 2,4 g de EV/día. Este efecto ha sido observado generalmente dentro de las primeras 2-3 semanas desde el inicio de la ingesta. Los estudios a medio y largo plazo, de hasta 85 semanas, muestran que el efecto podría sostenerse durante todo ese período(131). 54 55 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 56 57 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Para el desarrollo de este trabajo se planteó una hipótesis inicial y principal: ¿Es efectivo el uso de esteroles vegetales vehiculizados en leche, para la reducción del colesterol plasmático y como medida de control del principal factor de riesgo para la enfermedad cardiovascular? Con esta premisa se plantearon los objetivos buscados a alcanzar: OBJETIVO PRINCIPAL Analizar la efectividad de la ingesta de esteroles vegetales en el manejo del riesgo de enfermedad cardiovascular, mediante la reducción de la hipercolesterolemia en sujetos adultos. OBJETIVOS SECUNDARIOS  Analizar la posible diferencia del colesterol total, del LDLc y del HDLc, tras la ingesta de esteroles vegetales.  Analizar la la posible diferencia de triglicéridos tras la ingesta de de esteroles vegetales.  Profundizar en el estudio y relación de la ApoA en la eficacia del tratamiento con esteroles vegetales. 58 59 4. MATERIAL Y MÉTODOS 60 61 4. MATERIAL Y MÉTODOS El proyecto estuvo dividido en 2 ensayos clínicos, desarrollados en 2 años consecutivos (2013-2015) en la Comunidad de Madrid. El primero, se desarrolló en el Hospital Universitario San Carlos de Madrid. El segundo se realizó en el Hospital de San Lorenzo del Escorial con una muestra mayor, replicando el protocolo del primero. Los dos proyectos contaron con una estructura y planificación similar, que siguió el siguiente esquema: Figura 1. Esquema de los estudios llevados a cabo: Todo el desarrollo de los ensayos fue realizado íntegramente por el mismo investigador, unificando el criterio y disminuyendo el sesgo de interpretaciones inter- investigadores y ayudantes. 62 4.1. Diseño de los ensayos 4.1.1. Diseño Los ensayos llevados a cabo, tuvieron el siguiente diseño experimental: Ensayo clínico, controlado, aleatorizado, doble ciego y cruzado. Este diseño representa el de mayor validez y evidencia científica, por integrar y considerar los elementos que merman el azar como factor interviniente en los resultados obtenidos. Al ser cruzado, y participar todos los sujetos en ambos grupos, es también el más justo desde el punto de vista ético, puesto que todos los sujetos del estudio se benefician del posible efecto positivo del tratamiento (disminución del LDLc y del riesgo cardiovascular); y su mayor ventaja especialmente, es evitar las posibles diferencias inter-sujetos entre ambos grupos que pueden existir a nivel de metabolismo y genético, ya descritos en la literatura científica en el campo del metabolismo lipídico(132), y que se desconocen al comenzar un ensayo clínico doble ciego no cruzado. El metabolismo de cada individuo es único y dependiente de muchos factores incontrolables, pero al realizarlo de forma cruzada, cada sujeto actúa como su propio control, y las diferencias en el metabolismo inter- individual se reducen hasta casi eliminarse. Previo al comienzo del estudio, se contacto desde el Departamento de Medicina de la Universidad Complutense de Madrid con una empresa láctea como colaboradora del proyecto, promotora económico y y envío del producto del estudio, las leches con esteroles y las leches placebo, sin esteroles. La empresa colaboradora, con la que se inicio una relación contractual y la creación de una Cátedra Universitaria, “Cátedra UCM-CLAS para la investigación y la formación para la salud” fue Corporación Alimentaria Peñasanta S.A. (CAPSA). CAPSA se encargó de la fabricación de los productos a suministrar a los sujetos participantes. Para ello, se envasaron las leches en envases de 1 litro de capacidad totalmente en blanco, en ciego, con la única diferencia en el color del tapón. En cada ensayo se establecieron 2 grupos de estudio: 1) Grupo de estudio: leche desnatada con esteroles. 2) Grupo control (placebo): leche desnatada. 63 La leche de estudio era la fabricada y comercializada por CAPSA bajo la denominación “Naturcol”, y el placebo, la leche desnatada de CAPSA, ambas comercializadas y bajo la legalidad y estándares de calidad durante la totalidad del estudio. CAPSA recomienda la ingesta de Naturcol diariamente para la reducción del colesterol LDL plasmático, en base a la legislación vigente. Es un alimento funcional que contiene una cantidad de 2,24 g en 2 vasos de 350 ml, dosis recomendada por CAPSA de ingesta diaria, es decir 700 ml al día. Debido a la gran cantidad de litros de leche y su consecuente almacenamiento, se realizaron diferentes envíos para cada uno de los estudios. El cegamiento se oculto a los investigadores hasta finalizar cada estudio. CAPSA, además proporcionó los vasos, facilitados a los sujetos, en los cuales se incluía la medida exacta a la que tenían que llegar, la cantidad de ml diarios, para facilitar su comodidad y cumplimiento. Figura 2. Esquema del flujo la investigación y estructura: Como se observa en la figura 2, cada sujeto estuvo en los dos grupos (placebo y esteroles) en 2 periodos diferentes, que cambiaron tras un tiempo de “lavado” de 2 semanas (sin la ingesta de ninguna dieta especial ni suplementos con fitoesteroles). Por lo tanto, desde el inicio hasta el final, cada sujeto permaneció al menos 2 meses en el ensayo, 3 semanas del primer periodo, 2 semanas de lavado y 3 semanas en el segundo periodo. 64 Teniendo en cuenta el ciclo de metabolismo completo de los esteroles en el cuerpo humano-proceso “LADME” (liberación, absorción, digestión, metabolismo y excreción)- no es superior a 2 días(117), la duración del periodo de lavado se consideró de acuerdo a otros trabajos previos. En ellos, la duración de protocolos similares en ingesta de esteroles y manejo del colesterol en ensayos doble ciego-cruzados fue de 0 semanas (133,134), 2 semanas(135,136,137), 3 semanas(138), 4 o más semanas(139,140). Por lo que se estableció un mínimo de 2 semanas para el lavado. La asignación en cada grupo para establecer el orden en el cual empezar, fue completamente aleatoria. Dicha aleatorización se realizó mediante tablas numéricas aleatorias generadas informáticamente, y cumpliendo un riguroso proceso de ocultación de la secuencia de aleatorización. 4.1.2. Comité de bioética y autorizaciones. Todo el estudio, cumplió la normativa vigente española de ensayos clínicos. Por ello, previamente al inicio, se presentaron 2 solicitudes con la memoria del proyecto a los dos hospitales, donde se realizaron los estudios, Hospital Clínico San Carlos y Hospital Puerta de Hierro (como comité de bioética responsable del área de San Lorenzo del Escorial), ver Anexo 1. Además, se partió de la voluntariedad de participación de los sujetos que conformaron la muestra. Para ello se les reclutó en la consulta, mediante diferentes canales de difusión, entre los sanitarios de los hospitales. Mediante la Hoja de Información al Paciente (HIP) (anexo 2) y una entrevista personal, se les informó de las características del estudio (objetivos, métodos, duración, consecuencias positivas y negativas, etc), y tras resolverles cualquier duda, en el caso de que las hubiera, se procedía a firmar la Hoja de Consentimiento Informado (CI) (anexo 3). Además, se les informaba de la posibilidad de renunciar a la participación en cualquier momento sin ningún inconveniente para ellos, con motivo o sin motivo aparente, para tomar esa decisión, para lo cual debían rellenar y firmar una hoja de Revocación de CI. Ambos sub-estudios siguieron los principios éticos reconocidos por la Declaración de Helsinki, las recomendaciones de la buena práctica clínica, la actual legislación española que regula la investigación clínica en humanos, protección de datos 65 personales y bioéticos (Decreto Real 561/1993 sobre ensayos clínicos y 14/2007, 3 Julio para la investigación biomédica). 4.1.3. Reclutamiento y Sujetos Tamaño muestral: Para el estudio 1, que se realizó en el Hospital San Carlos de Madrid, se reclutó a los propios trabajadores del hospital, a través de difusión interna y del Servicio de Salud Laboral del Hospital. Para el estudio 2, que se realizó en el Hospital de San Lorenzo del Escorial, los participantes fueron reclutados en las consultas de medicina interna y endocrinología, y los propios sanitarios del centro. Se realizó el cálculo del tamaño muestral teniendo en cuenta el colesterol total como biomarcador principal, para el cálculo muestral, según las fórmulas estándar para dicha finalidad. Se calculó para una diferencia ± 15 % del Ct, teniendo en cuenta una desviación estándar de 35 mg/dl, para un intervalo de confianza del 95% y una potencia del 90%, y una tasa de pérdida del 10% Criterios de inclusión y exclusión Criterios de inclusión  Hombre y mujer  Edad 18-50 años  Ct > 200 mg/dl y/o TG > 150 mg/dl Criterios de exclusión:  Ct < 200 mg/dl y/o TG < 150 mg/dl  Patología cardiaca (Ictus, infarto miocardio, angina de pecho, etc)  Intolerancia a la lactosa  Alérgicos a la proteína de leche de vaca  Alérgicos a esteroles vegetales  Tratamiento farmacológico para el control del colesterol o triglicéridos: fibratos, estatinas, etc. 66 4.1.4. Material y equipos Variables y factores de estudio: Las variables de estudio se incluyeron en un único cuestionario diseñado a medida, Ad Hoc, en el que se recogían los aspectos más importantes para estudiar y contrastar, una vez obtenidos los resultados clínicos (ver anexo 4). Las variables de estudio de forma global fueron: género, edad, historial clínico y farmacológico, la composición corporal, calidad de sueño (141), hábitos de salud (142), hábitos tóxicos como tabaco y alcohol, hábito intestinal, frecuencia de consumo de alimentos (143) y actividad física (144). Además, se tuvieron en cuenta factores de confusión con una tabla de afinidad al cumplimiento de la ingesta, (>95% para aquellos sujetos que se considerarían como válidos para el ensayo, y no se les excluyera por “cumplimiento del tratamiento dietético”). Así como un registro de frecuencias de consumo de alimentos, para controlar la ingesta que pueden influir en el metabolismo del colesterol a la alza y a la baja (alimentos ricos en fibra dietética, omega 3; o altos en grasas trans o saturadas); y control sobre la no modificación de sus hábitos basales durante el ensayo. Es decir, que no iniciasen una dieta, o un plan de entrenamiento, o los terminasen, sino que fuesen estables a sus hábitos. Todo ello, teniendo en cuenta lo descrito en los apartados anteriores (factores dietéticos, factores de composición corporal, consumo de tóxicos, y teniendo en cuenta los factores influyentes en metabolismo de lipoproteínas, previamente descrito según algunos autores)(145). Antropometria y estudio de la composición corporal: A cada sujeto se le midió: peso, talla, perímetro de la cintura, IMC, % de grasa, % de grasa visceral, masa libre de grasa (kg) y % de agua. El peso, el IMC y la composición corporal se determinaron a través de una bioimpedancia eléctrica, tetrapolar, multifrecuencia (20 y 100 kHz), InBody Modelo 230 para el estudio en el Hospital de el Escorial, y; monofrecuencia (50 KHz) modelo TANITA BP601 para el estudio en el Hospital Clínico San Carlos. 67 Para la medición se siguió el protocolo habitual estándar, las recomendaciones del fabricante y el protocolo estándar(146). Para el perímetro de cintura se usó una cinta métrica flexible, no elástica, metálica y de anchura inferior a 0,1mm-150cm, y la medición según el establecido por la OMS para el perímetro de la cintura. (147) Peso El peso corporal, expresado en kilogramos, se midió mediante una báscula digital de uso clínico (0,1 kg de precisión), con la persona posicionada de espaldas al visor, descalza, con el mínimo de prendas puestas (pantalón y camiseta), talones juntos, mirada hacia delante y postura corporal recta. Talla La medición de la altura, expresada en metros, se realizó mediante un tallímetro de precisión milimétrica (rango 80 cm - 200 cm), con la persona posicionada de espaldas al mismo, descalza, en posición erecta, con los talones, las nalgas, pantorrillas y la parte media superior de la espalda en contacto con el eje vertical del estadiómetro, los brazos extendidos, paralelos al cuerpo, los pies unidos por los talones formando un ángulo de 45º y la cabeza colocada siguiendo el plano horizontal de Frankfurt. En el momento de la lectura, el individuo devió mirar al frente y hacer una inspiración profunda a fin de compensar el acortamiento de los discos intervertebrales. Índice de masa corporal El IMC, se obtuvo mediante la relación entre el peso corporal (kg) y la altura (m) al cuadrado del individuo: peso/(altura)2(148). Análisis clínicos Los marcadores analíticos fueron: perfil lipídico (CT, HDL-c, LDL-c, TG), hematología (recuento de series blanca y roja), glucosa e insulina, proteína C reactiva. En el caso del estudio 1, se realizó además la determinación de apolipoproteínas (ApoA). El método de extracción de la muestra fue el establecido por el protocolo del Hospital Clínico San Carlos y Hospital del Escorial, respectivamente, de donde se han obtenido los resultados de los pacientes. 68 METODO DETERMINACION PARAMETROS ANALTICOS: - HEMATOLOGÍA: Hematología LH750® (Beckman Coulter) Para la determinación de la Hemoglobina, Hematocrito y plaquetas se utiliza El equipo LH® 750. Se trata de un analizador multiparamétrico selectivo discreto que permite realizar el recuento y medición del tamaño de los leucocitos, hematíes y plaquetas BIOQUÍMICA. Olympus® 5400 (IZASA): El equipo Olympus®, (5400), es un analizador multiparamétrico selectivo discreto. Los parámetros se analizaron mediante espectrofotometría. - BIOQUÍMICA ESPECÍFICA. Dimension Vista® 1500 (Siemens Healthcare Diagnostics) Mediante técnica de inmunoensayos homogéneos de gran sensibilidad tanto no competitivos de tipo “sándwich” como competitivos. La extracción de muestras para las pruebas analíticas se llevaron a cabo por personal sanitario, tras 12 horas de ayuno, en la Unidad de Análisis Clínicos del Hospital Clínico Universitario San Carlos de Madrid y del Hospital del Escorial y el Centro de Especialidades San Carlos de San Lorenzo del Escorial, siguiendo el protocolo estándar(149,150, 151). La obtención de muestras sanguíneas se realizó por venopucción utilizando un sistema de extracción con vacio. Se utilizaron tubos secos de 5 ml, no conteniendo ningún anticoagulante para las determinaciones bioquímicas. Los tubos secos destinados a las determinaciones bioquímicas se centrifugaron a 2000 g durante 15 minutos, a 4oC, para separar el suero, procesándose las muestras para bioquímica en el día. 4.1.5. Datos y análisis estadístico Para el análisis de los datos, se utilizó el paquete estadístico SPSS 21.0. En primer lugar, se realizó un análisis descriptivo de los datos socio-demográficos, antropométricos y de los valores lipídicos basales y finales bajo la ingesta de Naturcol y placebo. También se estudió la normalidad de los valores lipídicos mediante la prueba de Shapiro-Wilk. La eficacia de la intervención se comprobó, mediante la comparación de las diferencias (final-basal) de las ingestas de la leche con EV y placebo, aplicándose para ello la prueba T de Student para muestras relacionadas, o la prueba de rangos con signo de 69 Wilcoxon en función del cumplimiento del supuesto de normalidad de los incrementos lipídicos. Se calculó el tamaño del efecto como el cociente de la diferencia de medias con la desviación típica basal, o leche con EV, en su caso. El nivel de significación aplicado fue del 5%. 70 71 5.RESULTADOS 72 73 PUBLICACIÓN 1 “MANEJO DEL RIESGO DE ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR CON LECHE ENRIQUECIDA EN ESTEROLES EN POBLACIÓN JOVEN ADULTA. ENSAYO CLÍNICO CONTROLADO ALETORIZADO Y CRUZADO” “Risk management of cardiovascular disease through milk enriched with sterols in a young-adult population. Crossover, Randomized, Controlled, clinical trial" - Autores: Ismael San Mauro Martín, Luis Collado Yurrita, María José Ciudad Cabañas María Ángeles Cuadrado Cenzual, Marta Hernández Cabria, María Elisa Calle Purón - Afiliación: San Mauro-Martín I1, Collado-Yurrita L1, Ciudad-Cabañas MJ1 Cuadrado-Cenzual MA2 Calle-Purón ME3 Hernández-Cabria M4 1Departmento de Medicina (Universidad Complutense de Madrid) 2Unidad de Análisis clínicos. Hospital Universitario Clínico San Carlos de Madrid. 3Departmento de Medicina Preventiva y Salud Pública (Universidad Complutense de Madrid 4Departamento de Nutrición (Corporación Alimentaria Peñasanta S.A). Año: 2014 Revista: Nutrición Hospitalaria. 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 PUBLICACIÓN 2 "ROLE OF APOA1 ON HIGH-DENSITY LIPOPROTEIN: AN INTERVENTION WITH PLANT STEROLS IN PATIENTS WITH HYPERCHOLESTEROLEMIA" - Authors: Ismael San Mauro Martín, Luis Collado Yurrita, María Ángeles Cuadrado Cenzual, María José Ciudad Cabañas, Paula Mendive Dubourdieu. - Authors and afiliation: San Mauro-Martín I1,3 *, Collado-Yurrita L1, Cuadrado- Cenzual MA2 , Ciudad-Cabañas MJ1, Mendive-Dubourdieu MP3. 1Medicine Department, Complutense´s University of Madrid 2Clinical Analysis Unit, Hospital Universitario Clínico San Carlos de Madrid. 3Research Centers in Nutrition and Health (CINUSA Group) Año: 2015 Revista: Nutrición Hospitalaria. 84 85 86 87 88 89 90 91 PUBLICACIÓN 3 EFECTO DE ESTEROLES VEGETALES EN LA REDUCCIÓN DEL COLESTEROL PLASMÁTICO: ENSAYO CLÍNICO, CONTROLADO, ALEATORIZADO, CRUZADO, DOBLE CIEGO. Effect of plant sterols in reducing plasma cholesterol: crossover double-blind randomized clinical trial. - Autores: Ismael San Mauro-Martín1,6, Luis Collado-Yurrita1, Javier Andrés Blumenfeld-Olivares2, María Ángeles Cuadrado-Cenzual3, María Elisa Calle-Purón4, Marta Hernández-Cabria5, Elena Garicano-Vilar6, Eva Pérez-Arruche2, Esperanza Arce-Delgado2, María José Ciudad-Cabañas1. - Afiliación: 1Departmento de Medicina. Universidad Complutense de Madrid. Madrid, España. 2Hospital Universitario El Escorial. Madrid, España. 3Unidad de Análisis clínicos. Hospital Universitario Clínico San Carlos de Madrid. Madrid, España. 4Departmento de Medicina Preventiva y Salud Pública. Universidad Complutense de Madrid. Madrid, España. 5Departamento de Nutrición. Corporación Alimentaria Peñasanta S.A. Asturias, España. 6Centros de Investigación en Nutrición y Salud S.L. Madrid, España. Año: 2016 (ACEPTADO)  DOI: 10.3305/nutr+hosp.vi.9920 Revista: Nutrición Hospitalaria. 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 6.DISCUSIÓN 102 103 DISCUSIÓN Resulta relevante profundizar en el avance del manejo de la ECV y de los factores de riesgo asociados a ella en nuestro país, debido a las cifras alarmantes que sufrimos y a una población cada vez más envejecida. La alimentación y otros hábitos modificables como el ejercicio, sedentarismo o tabaquismo, se han evidenciado como claves en esta lucha(152). Dentro de los hábitos alimenticios de los que ya se han descrito anteriormente, con efecto en la modulación a la alza o a la baja del colesterol en todas sus formas, algunos autores, no han estudiado el efecto aislado de un nutriente, si no, distintas concentraciones y combinaciones de estas grasas (PUFAS, SFA y MUFAS), frente a la respuesta pospandrial de una comida en las lipoproteínas LDL y TG(153). Sin embargo, últimamente se pone en duda el efecto perjudicial que tradicionalmente se le atribuye a los SFA. Algunos estudios recientes, han señalado una correlación inversa entre el consumo de SFA contenidos en los lácteos y las ECV, posiblemente debida a su contenido en el ácido graso palmitoleico, que permite un aumento de los niveles de colesterol HDL y una disminución de los triglicéridos y menor proteína C reactiva, menor resistencia a la insulina y menor incidencia de Diabetes Mellitus tipo II, con poco efecto neto en la razón colesterol total/colesterol HDL(154). Así pues, en un meta-análisis y revisión sistemática de 2015, no observaron una relación entre los SFA y mayor mortalidad, enfermedades cardiovasculares, enfermedades del corazón, accidente cerebrovascular isquémico, o diabetes tipo 2, aunque aclaran que la evidencia es heterogénea, con limitaciones metodológicas. Por su parte, las grasas trans sí se asociaron a estas enfermedades(154). Los lácteos, utilizados en este proyecto como vehiculizadores de los esteroles, también han sido estudiados en relación a la ECV. En una reciente revisión se ha evidenciado la asociación positiva del consumo de leche y productos lácteos, con la disminución del riesgo de hipertensión y ECV, apuntando al perfil lipídico, a las fracciones de elementos minerales – como magnesio o potasio, pero sobre todo calcio– y de algunas glucoproteínas –a través de péptidos bioactivos(156-157). También otro grupo de investigadores, relacionaron el score de ECV de el Estudio Framinghan con la ingesta 104 de lácteos, observando una protección, especialmente en hombres mayores de 60 años(158). El hígado y el intestino son los principales reguladores del metabolismo del colesterol. La vía de absorción del colesterol, presenta oportunidades clínicas para la suplementación dietética con agentes que atenúen dicha absorción, entre los que destacan los fitoesteroles/fitoestanoles(159). Por tanto, los esteroles vegetales, ampliamente estudiados, son un componente interesante desde el punto de vista de la prevención, y del tratamiento dietético en hipercolesterolemias leves, y complementarias a terapias farmacológicas en hipercolesterolemias moderadas y graves, salvo que existan contraindicaciones por la farmacopea. Aunque también han sido recientemente reportados como un posible riesgo para la salud, de un número reducido, personas con una alteración en la absorción de los esteroles(160), o debido a otros factores e interacciones, como publicó el grupo de Weingärtner O et al, en 2009(161). Esta relación, entre el aumento de las concentraciones de esteroles vegetales con el riesgo cardiovascular, podría estar relacionado con la formación de oxifitosteroles (productos de oxidación de esteroles vegetales). Sin embargo, la pregunta sigue siendo, si el aumento de los oxifitosteroles, es debido a la absorción o la formación endógena(162). La relación entre la síntesis de colesterol y la absorción de colesterol parece ser recíproca; altos sintetizadores son generalmente bajos absorbedores, mientras que los bajos sintetizadores son generalmente altos absorbedores(163). Basándose en resultados anteriores, se podría hipotetizar que la baja síntesis de colesterol y la alta absorción de colesterol, se asocian con un efecto mayor en la reducción del colesterol tras la ingesta de EV(164). Los individuos con alta eficiencia de absorción de colesterol podrían hiperabsorber EV y mostrar grandes elevaciones en las concentraciones de plasma después de la ingesta. Por otro lado, en los individuos con bajos EV en plasma, podría haber mayor margen para aumentarlos después de su ingesta(164). Ras et al. (164), llevaron a cabo un estudio doble ciego, aleatorizado, controlado con placebo, de grupos paralelos en el que se puede observar una hipótesis similar. Hombres y mujeres (n = 240) hipercolesterolémicos, consumieron margarina baja en grasa con o sin EV (3 g/día) durante 12 semanas después de 4 semanas del período de 105 adaptación. En el grupo de EV, las concentraciones de EV en plasma aumentaron en las primeras 4 semanas de intervención en un 69% (IC del 95%: 58; 82) a partir de 7,2 mmol/L y en un 28% (IC del 95%: 19; 39) a partir de 11,4 mol/L, respectivamente, y permaneció estable durante las 8 semanas siguientes. El incremento de EV en plasma en el grupo placebo, no fue significativamente diferente entre altos y bajos sintetizadores de colesterol (p> 0,05). Entre los altos y bajos absorbedores de colesterol, no se observaron diferencias significativas, excepto por la suma de colesterol-estandarizado de cuatro importantes EV en plasma (sitosterol, campesterol, brasicasterol y estigmasterol), que mostraron un mayor incremento en los bajos absorbedores (78,3% (IC del 95%: 51,7; 109.5)) en comparación con los altos absorbedores (40.8% (IC del 95%: 19,9; 65,5)). Se requieren más estudios para evaluar la variabilidad interindividual y sus bases genéticas, para poder identificar a aquellos sujetos que son grandes respondedores y poco respondedores, así como a los hiper-absorbedores de los normo- o hipo- absorbedores de esteroles vegetales(159). EFECTO DE LA INGESTA DE ESTEROLES EN EL Ct y LDLc La comparación entre diferentes tipos de suplementación –isoflavonas, ácidos grasos omega-3 y fitoesteroles- revela que solamente los fitoesteroles (esteroles y estanoles) alcanzan, según algunos autores, una mayor reducción de los niveles de Ct y LDLc(165). Pero la comparabilidad entre los esteroles y estanoles vegetales, en cuanto a su potencial para reducir el colesterol, se encuentra todavía en debate. Un reciente meta- análisis(166) de catorce estudios, comparó la eficacia en la reducción del LDLc de los esteroles vegetales con la de estanoles vegetales en dosis que variaban de 0,6 a 3,3 g PS/día. Siete brazos del estudio, mostraron un efecto no significativamente mayor de la reducción de LDLc de los esteroles vegetales frente a los estanoles vegetales, mientras que ocho brazos del estudio, mostraron un efecto relativamente mayor para los estanoles vegetales que para los esteroles vegetales. En general, se concluyó que los esteroles y estanoles vegetales, no tienen distintos efectos estadística o clínicamente relevantes sobre los lípidos sanguíneos. Para consumos superiores (> 4 g/día de PS), algunos estudios individuales, indican un efecto reductor mayor del LDLc 106 con estanoles vegetales(167-168), que con esteroles de plantas(169). Sin embargo, los estudios de dosis altas son escasos y están dispersos en una amplia gama de dosis (5,8- 9 g/día PS). Los esteroles vegetales, inhiben la absorción intestinal de colesterol(170) a través de varios hipotéticos mecanismos, tales como la competencia con el colesterol para la solubilización en las micelas mixtas de la dieta, la interferencia con los procesos de transporte mediada de la absorción de colesterol y la estimulación de la excreción de colesterol a través del intestino(171). Como los esteroles vegetales actúan principalmente mediante la inhibición de la absorción intestinal, la absorción de otros compuestos solubles en grasa, tales como los carotenoides, los tocoferoles y los retinoides, podría verse posiblemente comprometida(172). La inhibición de la absorción de colesterol con esteres de estanol vegetal, por otra parte, no afectaría a la concentración de proproteina convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), la cual regula el metabolismo del LDLc mediante la captación de receptores de LDL para la degradación(173). La primera descripción de la utilización de alimentos enriquecidos con fitoesteroles es del año 1977. Mediante una preparación comercial derivada del aceite de soja enriquecido con fitoesteroles (3 g/día), observaron una disminución significativa del LDLc(174). En 1986, se comunicó la primera evidencia de la utilización de estanoles vegetales para reducir el colesterol en plasma(175). Demostraron que un aceite de girasol suplementado con ésteres de sitoestanol a una dosis de 1,5 g/día reducía el LDLc en un 15% en adultos hipercolesterolémicos. Actualmente, los productos enriquecidos con esteroles o estanoles utilizan las formas esterificadas debido al aumento de su solubilidad, hecho que permite su incorporación a alimentos tales como leche y yogures, entre otros(159). De hecho, los productos a base de grasa (para untar, mayonesa, aderezos para ensaladas, leche y yogur), tanto los que tiene bajo como alto contenido en grasa, dan como resultado el efecto más beneficioso en la reducción de LDLc(176). Uno de los meta-análisis más relevantes hasta la fecha, publicado en 2014, estudió el efecto de los esteroles y los estanoles de 124 estudios. En el cual, una dosis media de 2,1 g/día redujo un 6-12 % las concentraciones de LDLc en una relación clara de dosis- respuesta(177). 107 Por ejemplo, un estudio similar al realizado por nuestro grupo, (doble ciego, aleatorizado, controlado con placebo) es el de Sun et al. (178), 59 pacientes (19 varones, con edad media de 60,28±6,98 años) con hipercolesterolemia primaria (LDLc en ayunas entre 3,4 y 6,0 mmol/L), fueron divididos aleatoriamente en dos grupos –el grupo de tratamiento (2,5 g de esteres de esterol vegetal al día, n=30) y el grupo placebo (n=29). El LDLc del grupo de tratamiento se redujo significativamente desde el inicio un -17,7% (P<0,05) en la semana 3 y -19,9% (P<0,05) en la semana 6 de estudio; mientras que en el grupo placebo, se redujo -15,57% (P<0,05) y -12,17% (P<0,05) en la semana 3 y en la semana 6, respectivamente. El Ct también se redujo, en el grupo de tratamiento, un -6,03% (P>0,05) en la semana 3 y un -13,8% (P<0,05) en la semana 6. La leche enriquecida en esteroles vegetales no afectó al nivel de HDLc en plasma ni al nivel de TG, en ninguna de las semanas. Después de la normalización con el grupo placebo, el grupo de tratamiento mostró una reducción significativa del LDLc (7,69%) y del Ct (8%) después de 6 semanas. En general, parece aceptado actualmente, que la ingesta de 2-2,5 g/día de esteroles vegetales (muy por encima de la ingesta habitual de 200-400 mg/día(159)) reducen, en un modelo dosis-respuesta, entre 6 y 12 % el colesterol total, especialmente de las lipoproteínas LDLc, y sin afectar a la fracción del HDLc de forma significativa. Asumiendo una media de un 10 %(179), que ya permiten incluir como alegación de salud en Europa y América(131). Si bien es cierto, la eficacia en la disminución del colesterol sanguíneo en la literatura es muy amplia, donde grandes meta-análisis observan una variabilidad del 5 al 25 % de media(180). Sin embargo, el efecto dosis-respuesta se ve limitado por defecto: ingestas de 0,8-1 g/día(181); así como por exceso: donde cantidades superiores a 3 g no han demostrado mayor eficacia, y sí podría existir posibles efectos negativos sobre la absorción de vitaminas liposolubles, el riesgo de cáncer y el posible aumento de la ECV, debido al incremento en las concentraciones de esteroles circulantes(182), por lo que se recomienda no superarlas(183). Así concluyen todos los estudios incluidos en un meta-análisis anteriormente citado(177), que con una dosis creciente de EV, el efecto reductor del LDLc aumenta, pero que este efecto se estrecha en dosis de 2 a 3 g/día. 108 La inhibición de la absorción de colesterol intestinal, producido por la ingesta de esteroles vegetales, se produce rápidamente y el máximo efecto en la reducción de LCLc para la dosis de esteroles vegetales administrada se produce, por lo general, dentro de las 2-3 semanas tras su ingesta y se mantiene estable si el consumo es regular(164). Sin embargo, estudios de investigación a largo plazo (hasta 85 semanas) han demostrado que los esteroles vegetales en plasma, no aumentan más con la ingesta sostenida de esteroles(184). También se ha visto, que el consumo de esteroles vegetales después o durante la comida principal, es significativamente más eficaz que después de un ayuno(185). Otro posible factor en la diferencia, se ha postulado por la frecuencia en la dispensación de los esteroles, aunque por ahora, parece no existir pruebas suficientes(186). Todavía no queda claro cómo explicar, la igualdad de eficacia en la reducción del LDLc tras el consumo de una bebida diaria que contenga 2,5 g de esteroles o estanoles vegetales, en comparación con la misma cantidad de fitoesteroles divididos a lo largo del día(187). Algunos sugieren, que el producto debe consumirse individualmente junto a una comida, con el fin de favorecer la secreción de ácidos biliares y, por tanto, la acción de los fitoesteroles; mientras otros sugieren que las múltiples tomas diarias, tienen un efecto ligeramente mayor, que una única ingesta diaria. Un pequeño número de estudios, sugieren que la ingestión de fitoesteroles debe ser entre comidas; mientras que otro número importante de estudios, no especifica el momento de ingestión(176). Un posible mayor efecto, cuanto mayor sea el colesterol basal circulante, parece otra de las hipótesis que en nuestros resultados pudimos observar, en el momento previo al tratamiento dietético, tal y como se había descrito en la literatura(188,189). Los alimentos con esteroles vegetales añadidos, son útiles en las personas con niveles altos de colesterol, y están especialmente indicados en aquellas con riesgo cardiovascular global intermedio o bajo y cifras de colesterol elevadas, pero que no precisen acciones farmacológicas(159). El ratio latosterol-colesterol, un marcador sustituto de la síntesis de colesterol endógeno, podría servir como un predictor a priori de la reducción de Ct y LDLc circulante en respuesta al consumo de esteroles vegetales; y por tanto tener un uso en 109 la identificación de respondedores y no respondedores a la terapia con esteroles vegetales(190). Las distintas respuestas interindividuales a los esteroles vegetales, indican un determinante potencial genético de capacidad de respuesta. En particular, el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) dentro de los genes que codifican como CYP7A1 y ApoE, así como posiblemente otros genes incluyendo ABCG5 y ABCG8, existen como predictores de si los niveles de LDLc disminuirán o incluso aumentarán tras la administración de esteroles vegetales(191). Existe una asociación dual de la isoforma APOE y CYP7A1-rs3808607 con la respuesta del LDLc tras el consumo de esteroles. La asociación del CYP7A1 rs3808607 con la reducción de LDLc y el consumo de esteroles vegetales demuestra un efecto alelico, con falta de respuesta en los portadores T/T y una respuesta incrementada con cada alelo G(192). También relacionado con aspectos genéticos, en el estudio de Myrie et al.(193), se observó como la eficiencia de absorción de colesterol se redujo (P = 0,01) un 22% y un 17% y la tasa de síntesis aumentó (P = 0,04) un ~20% y un 24% en el grupo de pacientes heterocigotos fitoesterolemicos y en el grupo control, respectivamente, en respuesta al consumo de EV. Pero no sólo existen partículas grandes, boyantes de LDLc. Hay un segundo subtipo reconocido, el LDLc pequeño y denso. En comparación con el LDLc, del que se ha hablado anteriormente, las subclases de LDL pequeñas y densas se han presentado como más aterogénicas como resultado de su prolongada vida media en el plasma, su baja afinidad de unión con los receptores de LDL, su mayor grado de penetración de la pared arterial y su menor resistencia al estrés oxidativo. Los individuos con predominio de LDLc pequeño y denso exhiben un riesgo triple de infarto de miocardio. El consumo diario de 2 g de esteroles vegetales en los pacientes con dislipidemia, tiene también un efecto beneficioso, no solo en los niveles totales de LDLc, sino también en sus partículas más pequeñas, densas y aterogénicas(194). Otro estudio(195), ha optado por identificar con precisión y cuantificar el efecto reductor de los esteroles/estanoles vegetales del LDLc como suplementos, en contraste con los enfoques basados en los alimentos. El análisis, no mostró diferencias significativas entre la acción reductora del LDLc de los EV en suplementos (-12 mg / dL 110 [-0,31 mmol / L]; IC del 95% -0,39 a -0,24; P <0,0001) frente a alimentos enriquecidos con EV (-12 mg / dl [-0,31 mmol / L], IC 95% -0,35 a -0,27; p <0,0001). EFECTO DE LA INGESTA DE ESTEROLES SOBRE LOS TRIGLICÉRIDOS. Una posible ventaja de los alimentos enriquecidos con esteroles vegetales y/o esteres de estanol, frente a los medicamentos dirigidos a un solo blanco, es que dichos compuestos dietéticos, actúan sobre múltiples objetivos, puesto que no solo reducen las concentraciones de LDLc en plasma, sino también las concentraciones de TG en sujetos con concentraciones elevadas de los mismos; especialmente en sujetos con síndrome metabólico. En teoría, varios mecanismos podrían estar implicados sobre dichos efectos, ya sea actuando sobre el mejor aclaramiento de la circulación o sobre la disminución de la aparición de los TG en la circulación. Esto significa que los posibles mecanismos podrían estar relacionados con: 1) el aumento de actividad de la lipoproteína lipasa, 2) el aumento de la captación de lipoproteínas ricas en TG (quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad, o sus restos, 3) el cambio de actividad de la proteína de transferencia de esteres de colesterol (CETP), 4) la reducción de la absorción intestinal de grasas o, 5) la reducción de la producción hepática de VLDL (187). No obstante, existe un debate científico no resuelto, sobre la eficacia de la ingesta de EV para reducir estos ácidos grasos en el plasma. Algunos investigadores, consideran que los EV no tienen un efecto suficiente sobre TG en plasma, destacando otros factores de la dieta como más relevantes en su control(196). Este fue el caso de McKenney et al. (197), quienes en su estudio a doble ciego, cruzado, controlado con placebo y aleatorizado en pacientes con hipercolesterolemia, no observaron reducciones significativas en los niveles de lípidos plasmáticos al analizar los triglicéridos y el HDLc. Otros investigadores, sí que han encontrado una disminución significativa. Los datos disponibles, indican que después de la suplementación con fitoesteroles a dosis de 1,5 a 2 g/día se reducen los niveles de triglicéridos entre un 6 y un 20% sin un efecto significativo sobre el HDLc(198). Algunos meta-análisis así lo corroboran, con reducciones de un 6 % con ingestas de 1,6-2,5 g de EV y del 4% en aquellos individuos con un consumo de 2 g/día de estanoles, además de una relación 111 dosis-dependiente de la concentración basal de TG(199), y un 19 % con la ingesta de 4 g/día(200). Por lo tanto, se puede estimar que una disminución del 10% en los TG podría reducir el riesgo de ECV un 4-5%, independientemente de los cambios en el LDLc(201). Como ya se ha expuesto, en nuestros ensayos, no se obtuvo una reducción significativa de los TG plasmáticos. RELACIÓN DE LA APOA CON EL HDLc Uno de los focos de actuación en el manejo del riesgo cardiovascular, se está centrando en el aumento de las HDLc, por su nivel en la regulación del colesterol plasmático. Recientemente, se ha establecido que las HDLc están constituidas por una población heterogénea de partículas, identificándose al menos dos principales subpoblaciones, una que contiene apoA-I y apoA-II, denominada LpA-I:A-II y otra que contiene apoA-I pero no apoA-II, denominada LpA-I(202). Se ha relacionado un aumento de 1 mg/dl del HDLc, con una disminución de hasta un 3 % de infarto(203). Es por ello, que las apolipoproteinas mayoritarias que lo conforman, adquieren un gran interés. La apolipoproteína A-I (Apo A-I), es la principal proteína estructural de las HDLc y está directamente involucrada en el transporte reverso de colesterol. En contraste, la apolipoproteína B (Apo B), es la proteína estructural de las lipoproteínas aterogénicas (VLDL, IDL y LDL) que transportan colesterol hacia los tejidos periféricos; cada partícula de estas lipoproteínas contiene una molécula de Apo B, por lo que el nivel en sangre de esta apolipoproteína se corresponde con el número total de partículas aterogénicas del plasma(204). La ApoA-I se ha vinculado estrechamente a la cantidad de HDLc(205), como hemos observado en nuestros resultados, con una correlación entre ambos parámetros que también han observado otros autores(206). A pesar de que aun no está claro el mecanismo, parece aceptado que ni el ejercicio ni los esteroles vegetales interfieren directamente en las ApoA-I(207). Es por ello que algunos autores, han sugerido que no todas las HDLc participan en la función del transporte reverso del colesterol, pudiendo 112 conformarse con proporciones diferentes en las ApoA-I, ApoA-II y ApoB(208). En esta línea, se estudia si un aumento de la Apo B y el ratio Apo B/Apo A-I, además de una disminución de la Apo A-I son importantes predictores de ECV, demostrando ser aun más relevante que la concentración de lípidos en sí(209). La ApoB sí parece modificarse con la ingesta de esteroles, reduciendo el ratio ApoB/ApoA-I(210,211). Estas variaciones podrían deberse a SNPs de los genes de las ApoA-I y ApoB(212), pues el estudio de la secuencia genética de la ApoA ha arrojado algo de luz(213). De esta forma, se han agrupado directamente algunas mutaciones con la predisposición a distintas ECV. Obsevándose una respuesta en el metabolismo de los lípidos diferente, según el patrón dietético(214), o estudiando el efecto de los componentes de algunos extractos de alimentos, en la modulación a la alza de la ApoA-I(215). Un aspecto importante a destacar, es el hallazgo de niveles significativamente menores de lipopartículas LpA-I, acompañado de mayores niveles de lipopartículas LpA-I:A-II, en los pacientes coronarios respecto a los sujetos controles, aún cuando la concentración de apoA-I total fuera casi la misma en los dos grupos. Este nivel menor de partículas LpA-I, se correlacionó inversamente con el porcentaje de estenosis; en cambio, las partículas LpA-I:A-II mostraron una correlación positiva con el grado de estenosis(202). Estos resultados, concuerdan en parte con lo reportado por otros autores(216), quienes encontraron menores concentraciones de LpA-I, pero iguales concentraciones de LpA-I:A-II en pacientes con enfermedad coronaria, en relación a un grupo control. En otro estudio, realizado con un grupo de pacientes previo a bypass coronario, se demostró que tanto las concentraciones de LpA-I como de LpA-I:A-II fueron más bajas en los pacientes que en los sujetos controles(217). Trabajos más recientes, comparan las concentraciones de LpA-I en tres regiones distintas con diferentes tasas de mortalidad por infarto al miocardio, demostrando que la concentración de LpA-I fue menor en aquella población con más alta mortalidad por infarto(218). En el estudio de Calvo et al. (202), se demostró que la concentración del HDLc no sería un buen indicador de riesgo de patología cardiovascular, en cambio, las subpoblaciones de HDL, LpA-I y LpAI:A-II demostraron ser útiles para la evaluación del riesgo relativo. Es así como, sujetos con concentraciones de LpA-I por debajo de los niveles de corte presentan un incremento de 2,5 veces en el riesgo relativo de presentar patología coronaria. En sujetos con concentraciones de LpA-I:A-II sobre los 113 niveles de corte, el riesgo es 3 veces superior. Todos estos antecedentes, demuestran la existencia de una alteración en los niveles de partículas LpA-I y LpA-I:A-II asociados a enfermedad coronaria, y sugieren fuertemente que la determinación de estas partículas sería una prueba más eficiente que el HDLc para la detección de individuos con riesgo de desarrollar esta enfermedad. Diferentes investigaciones, han encontrado una gran correlación entre los niveles de los lípidos plasmáticos y las concentraciones de Apo B y Apo A-I(219-220). Tales evidencias coinciden en una disminución significativa a Apo A-I y aumento de la Apo B y rApo B/Apo A-I entre los individuos con hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia o HDLc baja, resultados que se esperaban, dado que la Apo B constituye un resumen de todas las partículas aterogénicas Apo B dependientes mientras que la Apo A-I refleja la vía ateroprotectora del metabolismo lipídico al participar activamente en la depuración del colesterol de los tejidos (204). La reducción de la rHDLc/Apo A-I, se interpreta como un descenso de la eficiencia del transporte reverso del colesterol (TRC) desde los tejidos extrahepáticos, lo cual se refleja en la circulación con partículas de HDL pobres en colesterol esterificado(221). La rHDLc/Apo A-I disminuye significativamente en los individuos mayores de 56 años de edad, dada la disminución de la capacidad de las HDL de los individuos mayores para promover dicho transporte. De igual manera, los participantes con hipertrigliceridemia, muestran una rHDLc/Apo A-I promedio significativamente más baja que aquellos normotrigliceridémicos. El aumento de los triglicéridos se acompaña de una disminución del tamaño de las partículas de HDL, por fallas en la maduración de esta lipoproteína y con ello de la eficacia del TRC(222). Al secuenciar las conocidas mutaciones naturales en el modelo monomérico de longitud completa de la apoA-I, da una idea del desarrollo de la aterosclerosis a través de la alteración del haz de hélices N-terminal o de la supresión del dominio C-terminal de unión a lípidos. El análisis de secuencias de la apoA-I, sugiere que la alpha-hélice anfipática es el diseño estructural de la apolipoproteína intercambiable. La estructura y función del dominio de apoA-I libre de lípidos son los siguientes: el dominio N-terminal [1-184] forma un haz de hélice, mientras que el dominio C-terminal [185-243] carece en su mayoría de estructura definida y es responsable de iniciar la unión, agregación de lípidos y también está implicado en el eflujo de colesterol. Los primeros 43 residuos 114 de apoA-I son esenciales para estabilizar la estructura libre de lípidos. Además, la estructura cristalina del dominio C-terminal truncado de la apoA-I, sugiere un mecanismo monómero-dímero mediado a través de la reorganización y dimerización de la hélice-5 durante la formación de HDLc(223). Algunos autores, han estudiado el efecto dietético en estas apolipoproteinas. En concreto, la ingesta de pan de centeno enriquecido con 2 g/día de esteroles vegetales durante 2 semanas redujo significativamente el Ct y LDLc en suero, la apoB/apoA1 y los ratios de Ct/HDLc un 5,1%, 8,1%, 8,3% y 7,2%, respectivamente, de los sujetos en el estudio de Soderholm et al. (224) Con relación a los niveles de LPA, un único estudio enfocado en valorar los cambios en las concentraciones LPA antes y después de la suplementación con fitoesteroles, sugiere que los fitoesteroles no influyen en las concentraciones de esta partícula(225). 115 7.CONCLUSIONES 116 117 CONCLUSIONES 1) La ingesta de 2,24 g de EV suministrados en leche de forma diaria durante 3 semanas, ayudan en el control y manejo de la hipoercolesterolemia disminuyendo el colesterol sanguíneo LDLc. La diferencia entre los marcadores basales y finales fueron de 23,7±23,04 mg/dl, 21,7±22,84 mg/dl, y 23,9±22,43 para el CT, el LDL-c, y el colesterol no HDL, respectivamente. Esto supuso una reducción en porcentaje del 9,73%, 12,5%, y 13,2% para el CT, LDL-c, y Colesterol no HDL (p<0,001). Sin sufrir cambios considerables en las fracciones de HDL-c, 1,4±10,07 mg/dl para los consumidores en la fase de la leche con esteroles (1,9%,), diferencia entre basal y final. Aunque si se encontraron, entre el tratamiento con esteroles y placebo, ya que en el tratamiento del placebo, se incrementó levemente (3,4mg/dl) el HDLc, suponiendo una diferencia entre placebo y esteroles significativa de p=0,02. 2) En cuanto a los triglicéridos, las diferencias observadas entre la ingesta de leche con esteroles frente al placebo, no fueron significativas (p=0,547), aunque si se observó una modesta reducción de los TG de 6,8±54,07 mg/dl, un 3,15%, entre el basal y el final. 3) Se pudo comprobar una relación importante entre el HDLc y ApoA1. Lo cual sucedió tanto en la medida basal como en la final del tratamiento con esteroels vegetales, correlación de Person = 0,846 y 0,903, respectivamente. Observandose una alta dependencia en la regresión lineal (R2 = 0,715 y 0,816, respectivamente). Surgiriendo a la ApoA1 como un buen indicador para mejorar el HDLc y con él, una posible modulación del riesgo cardiovascular. 4) En base a los resultados, se puede afirmar que una dosis diaria de 2,24 g de esteroles vegetales suministrados en leche, pueden representar una estrategia terapéutica, no farmacológica, de control y manejo de la hipercolesterolemia. 118 119 8.LIMITACIONES 120 121 LIMITACIONES Los ensayos clínicos se diseñaron a medida para evitar la mayor parte de sesgos posibles, pero se deben tener en cuenta las siguientes limitaciones que pudiesen perturbar los resultados, como ocurre en otros estudios: - No hubo un periodo de adaptación a la dieta, ni una dieta homogénea para evitar sesgos, aunque se tuvieron en cuenta los alimentos ingeridos como se describió en la metododología, no se pudo estandarizar a toda la muestra por igual. Además, de existir sujetos con un colesterol basal con un rango amplio. - Las bioimpedancias usadas fueron 2 diferentes, y a pesar de cumplir con las recomendaciones que cada fabricante establece, especialmente al realizar la medición en ayunas, y la primera hora de la mañana para los análisis de sangre, eran las más propias. Estos equipos miden agua corporal, extrapolando después las proporciones de otros compartimentos, por lo que una variación en la hidratación, puede indicar resultados diferentes de grasas y músculo. - El periodo de lavado pudo ser insuficiente en los sujetos que emepzaron el tratamiento por la leche con esteroles de forma aleatoria, a pesar de haber replicado otros protocolos y la bibliografía al respecto, que indicaba que no deberíamos haber tenido ese efecto de arrastre. Además, no todos los sujetos hicieron exactamente 2 semanas, sinó 2 semanas mínimo, pero algunos tiuvieron un periodo de descanso superior, según disponibildiad de las siguientes citas. Aun así, se tomarón muestras al inicio y al final de cada periodo de tratamiento, midiendo la efectividad según la diferencia entre ambos (basal-final). 122 123 10.BIBLIOGRAFÍA 124 125 BIBLIOGRAFÍA 1. World Health Organization. Global Status Report on noncommunicable diseases 2014. Disponible en: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/148114/1/9789241564854_eng.pdf?ua=1 2. World Health Organization. Cardiovascular diseases (CVDs). Disponible en: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs317/en/ 3.Nichols M, Townsend N, Scarborough P, Rayner M. Cardiovascular disease in Europe 2014: epidemiological update. Eur Heart J. 2014,7;35(42):2950-9 4.Villar Álvarez F, Banegas Banegas JR, Donado Campos JM, Rodríguez Artalejo F. Sociedad Española de Arteriosclerosis (SEA). Las enfermedades cardiovasculares y sus factores de riesgo en España: hechos y cifras 2007. Disponible en: http://www.searteriosclerosis.org 5.Instituto Nacional de Estadística. 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La participación, va destinada a todos aquellos voluntarios, hombres o mujeres de edad comprendida entre 18 y 45 años. Los voluntarios se clasificarán en función de sus hábitos de consumo de leche del estudio, en dos posibles grupos. ¿En qué consistirá participar en el estudio? El estudio consiste en hacer una evaluación de la variación en el perfil lipídico y riesgo cardiovascular, tras la ingesta durante un tiempo controlado de leche enriquecida en esteroles vegetales. ¿Cuáles son los riesgos potenciales de su participación en este estudio? La participación en el estudio no entraña riesgo alguno. ¿Cuáles son los beneficios de su participación? El estudio, podrá proporcionar evidencias de los posibles efectos beneficiosos para la salud del consumo de leches enriquecidas con esteroles vegetales. A nivel particular, los voluntarios que lo deseen, obtendrán como beneficio un informe con el resultado de los análisis que se les realicen y de los resultados del estudio. ¿Se mantendrá la confidencialidad de su participación en este estudio? En todo momento se mantendrá la confidencialidad de sus datos y siempre respetando la ley de protección de datos vigente en España (Ley Orgánica 15/1999, de 13 de diciembre). Los 152 resultados del estudio podrán ser publicados, pero no se hará referencia a su nombre ni tampoco se le identificará y los datos referenciados no permitirán remontar hasta Ud. ¿Quién ha revisado el estudio? El estudio ha sido revisado por representantes del Hospital Universitario Clínico San Carlos. Contacto para información adicional Si tiene cualquier problema, dudas o cualquier pregunta acerca de este estudio, debe contactar con: Dr. Luis Collado Yrrutia ó Ismael San Mauro Martín Cátedra UCM-CLAS. Plaza Ramón y Cajal, s/n. 28040. Madrid TF: 913941263 (Luis); 617765976 (Ismael). e-mail: lcollado@med.ucm.es ; ismael.sanmauro@pdi.ucm.es mailto:lcollado@med.ucm.es 153 ANEXO 3. HOJA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO: Consentimiento informado para participar en un estudio de investigación médica Título del estudio: “Uso de Leches enriquecidas con Fitoesteroles como estrategia de reducción de Factores de Riesgo de enfermedad cardiovascular en población joven-adulta” Investigador__________________________________________________________________________ Sede donde se realizará el estudio: Madrid Nombre del paciente: ________________________________________________ A usted se le está invitando a participar en este estudio de investigación científica. Antes de decidir si participa o no, debe conocer y comprender todas las características del mismo. Este proceso se conoce como consentimiento informado. Siéntase con absoluta libertad para preguntar sobre cualquier aspecto que le ayude a aclarar sus dudas al respecto. Una vez que haya comprendido el estudio y si usted desea participar, entonces se le pedirá que firme esta forma de consentimiento, de la cual se le entregará una copia firmada y fechada. ACLARACIONES – Su decisión de participar en el estudio es completamente voluntaria. – No habrá ninguna consecuencia desfavorable para usted, en caso de no aceptar la invitación. – Si decide participar en el estudio puede retirarse en el momento que lo desee, -aun cuando el investigador responsable no se lo solicite, pudiendo informar o no, las razones de su decisión, la cual será respetada en su integridad. – No tendrá que hacer gasto alguno ni recibirá retribución económica por su participación. – En el transcurso del estudio usted podrá solicitar información actualizada sobre el mismo, al investigador responsable. – La información obtenida en este estudio, utilizada para la identificación de cada paciente, será mantenida con estricta confidencialidad por el grupo de investigadores. – Los objetivos del mismo son: la valoración del consumo de una leche comercializada y disponible en el mercado español, enriquecida con fitoesteroles como mecanismo para la reducción de factores de riesgo de enfermedad cardiovascular en población joven adulta. Y tendrá una duración de 6 semanas con un periodo de lavado (interrupción), de un mes. HOJA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO Yo,_______________________________, con DNI_______________ he leído y comprendido la información anterior y mis preguntas han sido respondidas de manera satisfactoria. He sido informado y entiendo que los datos obtenidos en el estudio pueden ser publicados o difundidos con fines científicos. Convengo en participar en este estudio de investigación. Recibiré una copia firmada y fechada de esta forma de consentimiento. _____________________________________ ___________ Firma del participante o Representante legal Fecha A COMPLETAR POR EL INVESTIGADOR RESPONSABLE: 154 He explicado al Sr(a).-__________________________________ la naturaleza y los propósitos de la investigación; le he explicado acerca de los riesgos y beneficios que implica su participación. He contestado a las preguntas en la medida de lo posible y he preguntado si tiene alguna duda. Acepto que he leído y conozco la normatividad correspondiente para realizar investigación con seres humanos y me apego a ella. Una vez concluida la sesión de preguntas y respuestas, se procedió a firmar el presente documento. ___________________ ______________ ________________ Firma del investigador/colaborador Fecha CARTA DE REVOCACIÓN DEL CONSENTIMIENTO INFORMADO Título del protocolo: “Uso de Leches enriquecidas con Fitoesteroles como estrategia de reducción de Factores de Riesgo de enfermedad cardiovascular en población joven adulta” Equipo Investigador___________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ __________________________ Sede donde se realizará el estudio: Madrid Nombre del participante: ________________________________________________ Por este conducto deseo informar mi decisión de retirarme de este protocolo de investigación por las siguientes razones: (Este apartado es opcional y puede dejarse en blanco si así lo desea el paciente) _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ __________________________ Si el paciente así lo desea, podrá solicitar que le sea entregada toda la información que se haya recabado sobre él, con motivo de su participación en el presente estudio. _____________________ _______________________ Firma del participante Fecha 155 ANEXO 4. HOJA DE RECOGIDA DE DATOS Código del participante: ________/2014 Sexo: V M Fecha de nacimiento: ____/____/_____ ENFERMEDADES Y SITUACIÓN DE SALUD ¿Padece o ha padecido alguna enfermedad en el último año? PATOLOGIA ¿La ha padecido en el último año? ¿Está tomando medicación por este problema? ¿Padece alguna otra enfermedad crónica? indique cual:_____________________________________ ¿Consume algún medicamento además de los anteriores? ___________________________________ En el momento actual, ¿sigue usted alguna dieta o régimen especial? __Sí __ No En Caso afirmativo indique cual___________________________________________________ ¿Cuál es su hábito intestinal? _1 vez cada 3-4 días __1 vez cada 2 días __1-2 vez al día __> 2 veces al día ¿Cuál de las siguientes formas describe mejor su consumo de tabaco? _Fumo diariamente _Fumo pero no diariamente _No fumo, pero he fumado _Nunca he fumado El día que fuma, ¿Cuántos cigarrillos consume por término medio ese día? ____Cigarrillos/día de diario ____Cigarrillos/día de fin de semana ¿Durante cuánto tiempo ha fumado? ___ Años ¿A qué edad comenzó a fumar?___ Años ¿Cuánto tiempo (años) hace que no fuma? ______ ANTROPOMETRÍA: Talla:__ m. Peso:___Kg. Grasa total:___, Grasa V.:___; Músculo:__, G metabólico :__ INFORMACIÓN DIETÉTICA: Alimento Ingesta a la semana/día y cantidad que toma Frutas Verduras (ensalada y cocinada) Cereales integrales: pan, pasta, arroz, cereales de desayuno Legumbres Pescado azul Frutos secos Embutidos (Tipo ______________________) Dulces, pastelería y bollería industrial (tipo___________________) Queso Curado Semicurado Postres lácteos no yogur (natillas, pettit suis, flanes, mouses…) Aperitivos (patatas fritas, snacks, etc.) 156 Consumo de alimentos que pueden interferir en los niveles de colesterol por el contenido en fibra, grasas PUFAS o MUFAS, o con alto contenido en grasas saturadas, colesterol y trans. ¿Cuántas comidas realiza a lo largo del día? _____ RECUERDO DE 24 HORAS CODIGO: _____________/2014 FECHA _____/ ______/ ______ ALIMENTOS Y SUPLEMENTOS CONSUMIDOS LUNES MARTES MIERCOLES JUEVES VIERNES SÁBADO DOMINGO DESAYUNO ALIMENTOS (ingredientes del menú) Cantidad (g) o tamaño Hora de inicio: Hora de finalización: Lugar: MEDIA MAÑANA Hora de inicio: Hora de finalización: Lugar: Menú: COMIDA Hora de inicio: Hora de finalización: Lugar MERIENDA ALIMENTOS Y SUPLEMENTOS (ingredientes del menú) Cantidad (g) o tamaño de las porciones Hora de inicio: Hora de finalización: Lugar: Menú: CENA Hora de inicio: Hora de finalización: Lugar Este día ha sido diferente a un día habitual en su vida: Sí 0 No 0 Comida Rápida Suplemento 1: _________________ Suplemento 2: _________________ 157 ANEXO 5. CONTROL DE CONSUMO DE LA LECHE DURANTE EL ESTUDIO. Hoja de recogida de consumo de leche. (Marcar el recuadro con una “X” AL TOMARLO) PRIMER PERIODO SEMANAS 1-3* DIAS VASO LECHE 1 VASO LECHE 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 NOTA: INDICAR LA RAZON POR LA QUE NO LO TOMÓ, EN SU CASO *Se entregaron hojas de control para el periodo 1 y el periodo dos. 158 ANEXO 6. Copyright de las editoriales de las revistas donde fueron publicados los artículos 159 160 Portada AGRADECIMIENTOS ABREVIATURAS Contenido RESUMEN ABSTRACT INTRODUCCIÓN HIPÓTESIS Y OBJETIVOS MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN CONCLUSIONES LIMITACIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS