UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Microbiología II CIPIOS ANTIINFLAMATORIOS DE T PRINCIPIOS ANTIINFLAMORIOS DE Implicación de los genes CDC 15 y NPKI en el fenotipo autolítico Lyti de Saccharomyces cerevisiae y aislamiento de dos genes heterólogos supresores MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR María Yuste Rojas Directores César Nombela Cano Miguel Sánchez Pérez. Madrid 2005 ISBN: 978-84-8466-957-9 © María Yuste Rojas, 1995 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA TESIS DOCTORAL IMPLICACION DE LOS GENES CDCI5Y NPKT EN EL FENOTIPO AUTOLITICO Lytl DE Saccharomyces cerevísie Y AISLAMIENTO DE DOS GENES HETEROLOGOS SUPRESORES. MARIA YUSTE ROJAS Madrid, 1995 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE MICROB¡OLOGIA II IMPLICACION DE LOS GENES CDCISY NPKI EN EL FENOTIPO AUTOLITICO Lyt 1 DE Saccliaromyces core vísie Y AISLAMIENTO DE DOS GENES HETEROLOGOS SUPRESORES. Memoria presentada para optar al grado de Doctor en Farmacia Por, MARiA YUSTE ROJAS Directores, Dr. MIGUEL SANCHEZ PEREZ Dr. CESAR NOMBELA CAtO Madrid, 1995 CERTIFICA: Que Dña. MARIA YUSTE ROJAS ha realizado en el Departamento de Microbiologia II dela Facultad de Farmacia dela Universidad Complutense de Madrid, bajo la dirección del Dr. Miguel Sánchez Pérez y del Dr. César Nombela Cano, el trabajo que presenta para optar al grado de Doctor en Farmacia con el titulo: “Implicación de los genes CDC)5 y NPKI en el fenotipo autolitico Lytl de Saccharomyces corevisie y aislamiento de dos genes heterólogos supresores’. Y para que asi conste, firmo la presente certificación en Madrid, a 3 & Mayo de 1995. 1’ (¡2 161 / CESAR NOMBELA CANO, CATEDRATICO-DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGíA II DE LA FACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID Fdo: Prof. Dr. César Nombela Cano La realización de este trabajo ha sido posible gracias a la concesión de una becadel Ministerio deEducacióny Ciencia para la Formación det Personal tnvestigador. “Knowledege is power” F. Bacon T. Jefferson “Knowledge is power, knowledge is safety, knowledge is happiness” A mas padres y hermanos 1 ~ AGRADECIMIENTOS ¡ Este trabajo no hubiera podido llegar a buen fin sin la ayuda inestimable de una 1. serie de personas a las que me gustaria expresar mi agradecimiento. En primer lugar al Dr. César Nombela, por haberme permitido realizar este proyecto en el Departamento. Al Dr. Miguel Sánchez, por haber dirigido esta tesis doctoral. Por sus consejos orientaciones e ideas. To the Cross’s ab: Fred & Liz, Ben & Martha, Liz Vallen, Arthur, Kristi, Ben, Maarten, Isabel, Ana, Dan L., Steve and Kim. For showing me that research can be something else, for being my friends and treating me as their faniily. Thanks to you alí 3 am happily going to follow this track. Thanks a lot!. To ah the people and friends that have listened, helped and advised me at the Rockefeller University (specially in the early years: Dr. Rubén Henríquez and Dr. Cías’ Reid). To Dan Schwartz, for being there supporting me this past year. To Dr. KoIler, fon his unselfish help and friendship from Swítzerland. Al “club social” departamental: José, Isabel, Alberto, Amalia, Miguel. Alejandra, Antonia, Mada y Alicia. Por haberme “aguantado” y escuchado durante estos ¼ largos cuatro años. ¡ 0 A todas las personas implicadas en el Iytl, especialmente a Ramiro Revuelta y a Javier Jiménez, que trabajaron directamente conmigo “para bien o para mal”, y a los que intenté pasar el testigo cientifico. A los “chicos” de la Unidad 3, por los buenos ratos 41 63 2 2.5.1.- Estudio dele lisis yesporulación del diploide heterozigótico cdc 15(1>4?) ¡Clxi 5 (integrado en un fondolyt 1) 63 2.6.- RESCATE ALELICO DEL GEN NPK 1 DE LA ESTIRPE ~ .4 MUTANTE Iyt 1 63 Estudio de la lisis y esporulación del diploide 2.6.1.-heterozigótico npkl( Iyt 1) /NPKI (integrado en un fondolyt 1) 67 ½ 3.- CARACTERIZACION DE GENES HETEROLOGOSSUPRESORES DEL FENOTIPO Lytl 70 ½ 3.1.- CLONACIONDEL GEN slt 1< ~chizosaccharomyces~yt 1) DE Sch¡zosaccharornyces pcwnte 70 3.1.1.- Caracterización del fenotipo conferido a la 11~cepa mutante ¡ja ¡por TS1 70 >4 3.1.2.- Secuenciación del gen slt 1 70 3.1.3.- Estudio de la expresión de slt 1 70 3.2.- CLONACIONDEL GEN HLTJ (Liumanotytfl DE Horno sap¡ons 75 3.2.1.- Caracterización del transformante ¡>4 l-TH 75 3.2.2.- Secuenciación del gen HLTI 75 ½U4.- INTERACCION DEL Lytl CON OTROSGENES RELACIONADOS 77 4.1.- RELACION CON Dbf2p 77 indice 4.1 .1 .- Estudio fenedpico del diploide MY4O (¡>4 l/dbf2 heterozigótico) 77 4.1.2.- Estudio fenotipicodela estirpe mutantedbf2-1 transformada con los genes relacionados descritos 77 77 81 82 82 83 84 84 85 88 89 89 90 en este trabajo 4.2.- RELACiON CDC ¡SISPOIZ III.- DISCUSION 1 .- ANALISIS DE LAS CARACTERíSTICAS FENOTIPICAS DE LA ESTIRPE Iyt 1, UN MUTANTE atOE Saccharornyces corevisiBe 1.1.- LACEPAIytIESUNMUTANTEat 1.2.- LA INTEGRIDAD CELULAR DEPENDE DE UNA SíNTESIS ACTIVA DE PROTEíNAS 1.3.- EL CICLO MEIOTICO SE DETIENE TRAS LA MEIOSIS 1 1.4.- EXISTE UN DEFECTO, A 37C, EN LA ELECCION DEL PATRON DE GEMACION EN CELULAS HAPLOIDES 2.- AISLAMiENTO Y CARACTERIZACION DE LOS GENES RESPONSABLES DEL FENOTIPO Lytí 2.1.- ESTUDIO DEL Lytl EN RELACIONCONOTROSGENES Y MUTACIONES 3.- ESTUDIO DE DOS GENES HETEROLOGOSCAPACESDE COMPLEMENTAR EL DEFECTO DE ESPORULACION Lyt 1 3. 1 . - slt 1 DE Schizosaccharornycescerevisiae 3.2.- HLTI HUMANO IV.- CONCLUSIONES 92 V.- BIBLIOGRAFíA 94 INTRODUCCION CDC3 CDC70 CDC?) CDC12 CDC15 CDC24 CDC2S CDC28 CDCS1 CDC35 CDC42 CDC43 Genes de ciclo celular GENES QUE AFECTAN AL CICLO CELULAR QUE SE CITAN EN ESTE tRABAJO GENES CDC Forman una familia de genes cuyos productos son necesarios para el ensamblaje de un anillo de filamentos de 1 Onm en la unión entre la célula madre y la hija. Un mutación termosensible en cualquiera de ellos impide la citoquinesis. Codifica una protein-quinasa. Su mutación impide la mitosis. En el momento de la parada, el citoesqueleto está alargada y los núcleos separados. También llamado CLS4. Codifica una proteína de unión a calcio. Interacciona genéticamente con CDC42 y con genes implicados en el patrón de gemación. Su mutación impide la gemación. Codifica una proteina de intercambio de nucícótidos que actua sobre Ras. Su defecto para el ciclo celular antes de START e impide el crecimiento de los mutantes. Codifica una protein-quinasa que se asocia con ciclinas. Esencial para STARTy mitosis. Es requerida para la entrada en Meiosis 1, aunque no para la síntesis de DNA premeiótica. Su defecto detiene el ciclo preferentemente en el punto START. Codifica una proteina de unión a calcio, de pequeño tamaño, cuya actividad se requiere para la duplicación del cuerpo polar del huso. También llamado CYR1. Codifica la adenilato ciclasa. Su defecto detiene el ciclo celular antes deSTARTe impide el crecimiento de los mutantes. tscdc3S prolifera aunque muy despacio. Codifica una proteina 43 de bajo peso molecular. interacciona cai CDC24, CDC43y otros genes implicados en la selección del patrón de gemación. Su mutación impide la gemación, aunque otros aspectos del ciclo son normales. Codifica la subunidad & de la prenil-transferasa que modifica a Cdc42p. Interacciona genéticamente con CDC42 y otros genes implicados en el patrón de gemación. Su mutación impide la gemación aunque otros aspectosdel ciclo son normales. REGULADORES DE Cdc2Sn Codifican dos ciclinas 431, altamente relacionadas. Su mRNA fluctúa durante el ciclo alcanzandoun máximo en el punto START. También llamado DAFI y WHhl. Codifica una ciclina 431 esencial para la regulación del tamaño celular en el punto START. Activa la transcripción de las restantes ciclinas 431. 2 CLI4 1 CLN2 CLN3 & ¼‘ 4< “4>> ~ Genes de ciclo celular I-1CS26 Codifica una posible ciclina 61. Interacciona con SWPI , aunque no con las demás CLNs. CLB) Codifican las ciclinas mitóticas. El defectode los cuatro genes CLB2 causa células capaces de pasar por START, gemar y sintetizar CLB3 DNA aunqueincapacesdeensamblar el citoesqueletos’ tÉ CLB4 proceder a la mitósis. CLB5 Codifican una pareja deciclinas 8 cuya función es la inducción cJe CLBG la síntesis de DNA. SWI4 Codifica la subunidad de unión a DNA del factor de transcripción SBF, que induce la transcripción de CLNI y CLN2. MBP1 Codifica la subunidad de unión a DNA del factor de transcripción MBF, que induce la transcripción de CLB5, CLBG y genes responsables dela replicación del DNA. SWIE3 Codifica un activador transcripcional que se asocia con SWh4 para formar SBF y con MBP 1 para formar MBF. AMPc Y CONTROL DEL CRECIMIENTO TPKI Codifican tres subunidadescataflticas detres protein-quinasas, TPK2 homologas entre si, dependientes deAMPc. La deleción TPK3 simultánea de los tres es letal RASI Codifican dos proteínas Ras altamente relacionadas. La deleción RAS2 de ambas es letal. Su activación previene la meiosis y la fase G~ IRA! Codifican dos6TPasasqueestifllulan la hidrólisis deGTP por Ras. IRA2 Su mutación previene la meiosis, la fase Goy suprime /=.cdc25. CUINASAS Y FOSFATASAS CMDI Codifica la calmodulina. Esencial. Su defecto provoca una gemación ralentizada y la muerte en la mitósis. DBF2 Codifica una protein-quinasa. Su mutación retrasa la síntesis cJe DNAy la parada en mitosis; fenotipo suprimido por Spol 2p. DBF2O Codifica una protein-quiflasa homóloga a Dbf2p. La supresión cJe ambas es letal. GEMACION Y CITOESOUELETO DE ACTiNA También llamado RS!?). Codifica una proteína G de pequeño tamaño requerida para la elección del patrón de gemación. £3UD 1 3 Genes de ciclo celular BUD2 Codifica una proteína activadora de GTPasas que actúa sobre Budí p. Requerida para la elección del patrón de gemación. BUD3 Codifica una proteína localizada en el sitio de gemación de células diploides. Requerida para la elección del patrón de gemación. BUD4 No está donado. Requerido para la elección del patrón cJe gemacion. BUOS Codifica una proteina con homologia a proteínas de intercambio de nucleátidos. Requerida para la elección del patrón de gemación. BENI) Codifica una proteína con dominios SH3 .. SPO13 Sin homologías conocidas. Aspo 13 produce esporas aponiicticas por un defecto en la consecución de la Meloisis 1. Su sobreexpresión para el ciclo mitótico en 432/Nl. ¡ 2< $2., ~5 h 2>’~ Genes de ciclo celular RME1 Codifica un represor dela expresión de IME 1, que se expresa en células haploides pero no en diploides. Su defecto permite esporular diploides a/a ou/u. ¡ME? Codifica un regulador transcripcionaJ producido en células a/u comorespuesta acondiciones nutricionales desfavorables, timol no esporulan. Su sobreexpresión permite esporular diploides a/a ou/u. 6 Introducción <‘Y A ‘Y it. Y Introducción El ciclo celular es la secuencia de procesos par los cuales una célula se divide para dar lugar a dos células idénticas. Sin comprender este “simple” hecho de la Biología, nunca podremos entender cómo a partir de una célula sencilla, como puede ser un espermatozoide y un óvulo, se produce un ser humano adulto compuesto aproximadamente de 1013 células, ni ningún proceso de crecimiento o de diferenciación tisular, ni la multiplicación de seres procariotas o eucariotas unicelulares... Sin conocer los puntos de control que modulan las fases de este proceso, nunca podremos diseñar estrategias efectivas para controlar la multiplicación celular incontrolada que se da en el cancer. Gracias a que los mecanismos bioquímicos que rigen el proceso de división celular estén conservados filogenéticamente, proteínas humanas pueden suplantar la función, a lo largo del ciclo celular, de proteinas de un organismo tan sencillo como una levadura. Así pues, el uso de técnicas de ingenieria genética y biología molecular en eucariotas unicelulares como S. cerov¡s¡ae y S. pombo, nos permite donar genes tanto homólogos como heterólogos para intentar dilucidar los procesos que tienen lugar en otros cucariotas e incluso en células humanas. La importancia de trabajar con una genética interespecífica reside, principalmente, en la obtención de una visión global y generalizada del ciclo celular y no sólo restringida a una especie eucariota. 1.- CICLO BIOLOGICO DE Saccharomyces cerev¡siae La figura 1 muestra el ciclo biológico de 5. cerevisiae. En este se distinguen principalmente dos partes. Una correspondiente al ciclo mitótico o asexual y otra que incluye todos los procesos que dan lugar a un cambio de ploidia en la célula (apareamiento y esporulación). 1.1.- Ciclo mitótico. El ciclo celular de un organismo eucariota se puede dividir principalmente en dos estadios principales: la interfase (dónde el DNA se encuentra, unido a proteínas, distribuido difusamente por el núcleo y los cromosomas son indistingibies como unidades separadas) y la Mitosis (FASE M) (división de los cromosomas). En ambas fases se diferencian dos tipos de procesos: aquellos que tienen lugar de manera continuada (síntesis de ribosomas, membranas, citoesqueleto, etc.), y aquellos que tienen lugar de una manera puntual; es decir, una sola vez en cada ciclo. La replicación del DNA, o FASE 5 del ciclo celular, es uno de estos procesos puntuales y esté restringida a un periodo en mitad de la interfase. El intervalo del ciclo entre la mitosis y la fase 5 se denomina FASE 431. El que va desde la síntesis del material génico hasta la mitosis se llama FASE G2 (Murras’ et a/., 1993). Gracias a que 5. cerevis¡ae se divide asimetricamente por gemación, es fácil seguir la evolución del ciclo celular. En los primeros estadios del ciclo, se forma una pequeña yema (justo tras el punto “START” que explicaremos más adelante), que crece de manera continuada para separarse al final de la célula madre. Este hecho permite seguir facilmente el ciclo, pues el tamaño de la yema es indicativo del punto de división en que se encuentra la célula madre (Murras’ a aL, 1993). S. cerevisiae difiere de otras células eucariotas no sólo en cómo crece, sino también en cómo organiza la mitosis. Lo más destacable en este sentido es que la membrana nuclear no se desorganiza y que los microtúbulos se concentran en una estructura denominada “cuerpo polar del husotm equivalente funcional, pero no estructuralmente, al centrosoma de cucariotas superiores (Murray a aL, 1993). 7 r FIGURA 1: CICLO BIOLOGICO DE S. core visife. fritroducción La busqueda de mutaciones que afectaran el ciclo celular empezó al final de 1960 (Hartwell a aL, 1970). Como la división celular es esencial, las mutaciones que afectan al ciclo tienen que ser condicionales. La primera serie de mutantes de ciclo celular procedió de una gran colección de cepas termosensibles (mutaciones que no se expresan a la temperatura permisiva (24C) pero si a la temperatura restrictiva (370C)). Al incubar estos mutantes en condiciones no permisivas paran su ciclo celular en un punto determinado, dando lugar a un cultivo sincrónico, sin que el aumento del tamaño celular o la síntesis de macromoléculas sean bloqueados. Este hecho sugirió la existencia de algunos genes que sólo se expresan en un punto concreto del ciclo celular. Defectos en la expresión de estos genes dió lugar a los primeros mutantes de ciclo celular o mutantes cdc (Hartwell, 1974, 1978; Pringle, 1975). El hecho de que tras la separación celular, las células hijas sean más pequeñas que las células madres, junto con una división celular asimétrica, deberla provocar un tamaño celular de heterogeneidad creciente en sucesivas generaciones. Sin embargo, las poblaciones celulares mantienen un tamaño celular constante en condiciones de crecimiento uniformes. Esto indica que la duración del ciclo celular se ajusta de forma que, antes de dividirse, las células más pequeñas crecen más tiempo que las mayores. Este dato sugiere que el tamaño celular es uno de los determinantes para el inicio de un nuevo ciclo mitótico. La coordinación entre el crecimiento y el ciclo celular ocurre al final de la tase Gí, en el llamado punto “START” (Hartweli a aL, 1974>. En el punto “START” se induce la división celular por tres vías independientes; una provoca la gemación, otra la replicación del DNA, y la última, la duplicación del cuerpo polar del huso y la reorganización del citoesqueleto (Murray a aL, 1993). Una vez pasado el punto ¿ “START”. las células están obligadas a continuar el ciclo mitótico (Dirick eL aL, 1991), a replicar el DNA y reorganizar el citoesqueleto (Murras’ et aL, 1993>. 1.1.1.- Cdc28p, una protein-quinasa esencial. Entre los mutantes aL inicialmente descritos, se encontraba un grupo de complementación cuya característica principal era una parada específica del ciclo en el punto “START” con un ostensible defecto en el crecimiento y en el metabolismo celular. Corno resultado se postuló que el gen resposable de dicho fenotipo, CDC2S, tenía que codificar un elemento regulador de dicho punto del ciclo celular . Para que Cln3p pueda ser ubiquatinada, la región PEST ha de ser fosforilada por Cdc28p (Yaglom eL aL, 1995). HCS2B fue aislado como supresor multicopia de una mutación en el gen que codifica el factor de transcripción Swi4. Es una proteína de expresión cíclica con un máximo al final de la fase Gí e indetectable en el resto del ciclo. Aunque su secuencia presenta homologías con aquellas de las ciclinas N, no es capaz de sustituirlas funcionalmente en una cepa cliv (Ogas st aL, 1991) (Figura 3). CLB5 y CLB6 fueron aislados como supresores del fenotipo clw. A pesar de su homología con las ciclinas mitóticas, de las que hablaremos posteriormente, se transcriben y actuan en la fase 431 al igual que las ciclinas Cml y Cln2 . Su inactivación esta mediada por el enzima Ubc9, responsable de la conjugación con ubiquitinas (Seufert st aL, 1995) (Figura 3). 1.1.3.- Factores de transcripción reguladores del punto “START”. Los genes de expresión ciclica, se puden dividir en tres grupos según las secuencias cis que se encuentren en su promotor: A.- El primer grupo tiene un motivo llamado Elemento SCB (~wi4/Swi6 celí Q¿cle Box “CACGAAA”) que actúa como elemento activador de genes exclusivos del final de la fase Gí. Se encuentra, entre otros, en: CLN1 y CLN2 (Nasmyth eL aL, 1991>/-0 (Nasmyth, 1993; Struhl, 1993), HCS2G. El factor de transcripción responsable de esta activación es el llamado ~f~fy es un complejo heteromérico formado por dos proteínas: Swi6p (sirve de soporte y no tiene capacidad de unirse a DNA) y Swi4p (se une a Swi6p por su extremo carboxilo terminal y al DNA por su extremo amino terminal)(Koch st aL, 1994>. Ii CICLINAS 431 Cml p Cln2p ClbSp Clb6p Gemación Fases iniciales replicación del de la DNA Si Clb5p ó Clb6p no son funcionales, Cml p 6 Cln2p pueden reemplazarlas. CICLINAS MITOTICAS Clb3p Clb4p Clblp Clb2p Fases finales de la replicación deIDNA Duplicación del citoesqueleto Citoquinesis Represión de deCinlpyde la transcripción Cin2p. Cln3p —* Modulador de la expresión de las ciciEnas 431 y G2. + START 431/5 FIG RA A.- DIFERENTES TIPOS DE CICLINAS Y PROCESOS EN LOS Ql INTERVIENEN. B.- NIVEL DE TRANSCRiPCION DE LAS CICLINAS A LO LARGO DEL CICLO CELULAR. Su expresión es periódica, produciéndose un máximo para las ciclinas 431 justo antes del punto “START”, y otro para las ciciinas G2 justo antes de la mitósis. A.- 8. Cíní Cln2 CibS Clb6 Hcs26 G2/M Introducción SBF ha sido detectado en todas las etapas del ciclo (Dirick et aL, 1992) y su actividad se regula de manera post-traduccional. Para su activación, requiere la “START”, es reprimido por el complejo Clb2/Cdc28 al unirse éste a Swi4p. La formación del complejo Cln3/Cdc28 (Koch et aL,1994). A su vez, y tras el punto represión ejercida sobre SBF por Clb2/Cdc2B es prioritaria a su activación por Cln3p (Amon eta)., 1993). 4< 6.- El segundo grupo tiene un motivo t4Q~ (f4lul Celí Cycle ~ox.“ACGCGTNA”). No es exclusivo de una fase determinada del ciclo. Se encuentra en diversos genes como ¡ CLBS , CLB6, SWI4 y en la mayoría de los genes responsables de la síntesis de DNA (Koch eLal.,1994). El factor de transcripción responsable de esta activación es el llamado MBF. y es un complejo heteromérico formado por dos proteinas: Swí6p (sirve de soporte y no tiene capacidad de unirse a DNA) y Mbpl p (se une a Swi6p por su extremo carboxilo terminal y al DNA por su extremo amino terminaiftKoch eL aL, 1 993). Al igual que SBF, MBF también se transcribe a lo largo todas las etapas del ciclo (Dirick eL aL, 1992) y su actividad también se regula de manera post-traduccional. Existen evidencias de que se active por el complejo Cln3/Cdc2S, aunque el mecanismo para esta activación aún se desconoce (Koch eL aL, 1994). C.- El tercer grupo lo forman aquellos factores de transcripción que se expresan al final del ciclo: SWI5, ACE2, MCMI y 5SF. SW¡5 se expresa en la fase 432 del ciclo. Su transcripción esta regulada por un activador que forma un complejo ternario junto con los factores Mcmlp (Dohrmann eL aL, 1992). La actividad de estas dos proteínas está a su vez regulada directamente por Cdc28p. La fosforilación de Swi5p por Cdc28p cuando Swi5p es sintetizado (fases 432 y M), evita su entrada al núcleo. Por lo tanto, los genes a los que activa Swi5p sólo se expresan al E, final de la mitosis, cuando el compkjo Clb/Cdc28 es degradado . Las ciclinas ejercerán entonces su función desencadenando un cascada de procesos que tendrán como consecuencia la replicación del material genético y cambios morfogenéticos que darán lugar a la gemación. Además, la transcripción de CLNJ y CLNZ tendrá como consecuencia la inactivación del sistema de ubiquitinación responsable de la proteólisis de las ciclinas mitóticas (Amon eL aL, 1994). Esto dará lugar a una acumulación de las Clbs que inactivarán la expresión de las Cins por secuestro de Swi4p, que quedará unido al complejo Clb/Cdc28. Las ciclinas 6 también sufren un ciclo de retroalimentación positiva, es decir, activan su propia síntesis (Anion eL aL, 1993). Así, y ya en las fases del ciclo posteriores a “START” las ciclinas mitóticas generarán una serie de procesos que tendrá como consecuencia la segregación del material cromosómico y la reorganización del citoesqueleto y del material celular que concluirá en la mitosis y en la citoquinesis. De manera aún desconocida, quizás por la falta de represión por parte de las Chis inexistentes en este punto del ciclo, se activa la proteólisis de las ciclinas mitóticas iniciándose la salida de la fase Nl. El hecho de que la transcripción de las Cibs sea incompatible con la de las Clns permite, en la fase 431, la total degradación de las primeras, creándose así las condiciones propicias para comenzar un nuevo ciclo celular — , ‘~ < ..> o. (ou— (U o c u ,.9 o so ou2wC.D c‘0‘a<.3o4>c Introducción Las células de tipo sexual opuesto son detectadas por la presencia de una señal quimica: un péptido de bajo peso molecular o “Factor a”, segregado por las células a y detectado por receptores en la superficie de las células a. A su vez, las células t*. segregan “Factor a”. un péptido similar al anterior que se une a receptores situados en la superficie de las células a (Murray eL aL, 1993). Cuando los factores de apareamiento se unen a sus receptores, activan un complejo sistema intracelular de transducción de señales (Figura 5) que activa das vías diferentes: una que detiene el ciclo celular en el punto “START”; y otra que induce la expresión de los genes implicados en el apareamiento. Esta cascada de señales puede ser activada a lo largo de todo el ciclo pero, sólo aquellas células que habiendo finalizado la mitosis sufren la parada del ciclo son aptas para la conjugación (Murray et al., 1993). Una vez parado el ciclo mitótico, las células se aparean gracias a la formación de proyecciones especializadas que se alargan hacia otras células de tipo sexual opuesto. Cuando se encuentran, ambas paredes celulares se cohesionan en el punto de contacto, y la membrana plasmática de ambas células se fusiona creando un citoplasma común. Consecuentemente, los dos núcleos se unen para dar lugar a un único núcleo diploide. La célula diploide recién formada, en condiciones apropiadas, vuelve al ciclo mitótico pasando por el punto “START” y se reproduce normalmente por gemación (Figura 1) (Murray et aL, 1993). 1.3.- Ciclo meiótico. En condiciones del medio de baja concentración de amonio y una fuente de carbono pobre, los diploides de Saccharomyces cerevis¡ae inician un proceso de esporulación que implica una meiosis y origina cuatro esporas haploides. Aún en un medio propicio, la esporulación sólo se lleva a cabo en células con un determinado genotipo. Es decir, las células a tienen el alelo a del locus MAT (las células a tienen a su vez el alelo a. De esta manera, las células a expresan una proteina activadora (al) responsable de la activación de los genes específicos a. Además, tienen una proteína represora (a2) que inhibe la expresión de los genes a. Las células a expresan dos polipéptidos, al (responsable de la activación de los genes específicos a y aZ (de función desconocida)(Figura 6)(Herskowitz, 1988). Sólo los d~ploides que presenten la combinación MATa ¡MATa serán capaces de esporular. La razón principal es la formación de un complejo~j~2 que inhibe la expresión del gen RME 1 (represor de meiosis)(Mitchell et aL,1986), que es expresado normalmente en las células haploides (Herskowitz, 1988). Al iniciar el proceso de esporulación, las células duplican su cuerpo polar del huso. Esta duplicación coincide con la replicación del DNA, la cual rápidamente da lugar a la formación de los cuerpos sinápticos. Este estadio (paquitena de la profase 1 meiótica) es común a la mayoría de los organismos con reproducción sexual. Las células sufren ahora la meiosis 1 o recombinacional. Posteriormente, los cuerpos polares del huso se separan (metafase 1 de la profase melótica) y no se observan ni los cuerpos sinépticos ni los cromosomas. Más tarde, en la anafase 1 se alarga el huso acromático y se duplican de nuevo los cuerpos polares del huso. El proceso de meiosis II o reduccional empieza ahora con la metafase II; los cuerpos polares del huso duplicados se separan y se observa un haz de microtúbulos entre ellos. Alrededor suyo se forma la pared de las cuatro protoascosporas; la membrana nuclear permanece intacta mientras que los dos pares de cuerpos polares del huso se separan y migran hacia cada ascospora en formación; se desplaza también el contenido citoplasmático y las mitocondrias. Las paredes en formación van alargándose hasta cerrarse. Entonces los cuerpos polares del huso se disocian de la pared. Las ascosporas. alargadas en un principio, maduran engrosando su pared y tomando una forma esférica (Miller, 1989). 16 Receptor del factor de apareamiento (STE2/S TE3 ) ¡ (=cgí Pro teína 43 + ¡ ste11~~~~bSte1É?1I SteSp ‘—1 Ste7 ~ Stel (Dl ~~~ys3 Ir —~‘ Fus3 P Kssl —~ Kssl Px -st~1Z 2~-) -ACTIVAC~ON DE LOS GENES - 1 E~PoÑsABLEs1 OELÁPAACAN4IEF’t Far1’~~I~¿1® * 1.’> pARADA DEL CICLO ~E~QL~b.RPQR iNH( ~l~IQ~ DE.CJn1Ytlfl2~ ) = FOSFORILADO 3~QCESQSSECUENClAt~ES _____ -n ..,r%i ‘(‘dnA njNn fl tAtTtNO nc ADAUFAMIrISTrO FIGURAS: VíA DE TRANSDUCCIUN UE SENALC3 urluu~..~sn r ‘lan 1-I--’ ~ •~- _ __ El factor de apareamiento. al unirse a su receptor en la membrana celular, activa una proteína 43 formada por tres subunidades. Su activación desencadena una cascada de protein-quinasas. ancladas en Ste5p, que tendrá como resultado final la parada del ciclo celular y posteriormente la activación de los genes responsables del apareamiento. = Activación —1 Inhibición CELULA a Genes específicos a RMEl —-A MEIOSIS a 2 (11 Genes especificos a MAT u Genes específicos haploides CELULA a Genes específicos a RME1 —H MEIOSIS al .~EizZZ1—~~. Genes específicos a MATa Genes específicos haploides CELULA (1/a Genes especificas a Inducción de genesal a2 ________________________ RMEI —~ específicos de meiosis aí—’ t?=.4-t~h—~~~...jjj7 Genes específicos a Genes específicos haploides FIGURA 6: VISION MOLECULAR DE LA ACTIVACION DE LA MEIOSIS EN £ cera vjsiae. Los péptidos codificados tanto en el locus MATa como en el a son responsables de modular la expresión de genes que determinan el tipo sexual de la célula y de inhibir la meiosis en el caso de células haploides. Introducción Existen mutaciones que afectan a una sola de las dos fases meióticas, o bien evitan una de las dos, dando como producto final dos esporas diploides (esporas apomicticas): los mutantes spv)3 sufren un detecto que soslaya la meiosis 1 (Buckingham et aL, 1 990), por el cual algunos cromosomas se segregan corno si lo hicieran en la meiosis 1 y otros como si lo hicieran en la meiosis II . 2.- LA RESPUESTA A NUTRIENTES MEDIADA POR LA VíA Ras-AMPc. Los genes RAS codifican proteínas de bajo peso molecular que median, vía AMPc, en una amplia variedad de procesos de transducción de señales en células eucariotas. En 5. cerevisiae, median en la decisión celular entre crecimiento o parada del ciclo en G0 y esporulación (Broach, 1991). Principalmente la vía se activa gracias al producto del gen CDC25, que codifica una proteina de intercambio GDP-GTP (Camonis eL aL, 1986). Cdc25p tiene tres regiones funcionalmente diferentes: Una esencial para el crecimiento en glucosa, otra requerida para la esporulación aunque no para el desarrollo mitótico, y una última necesaria para la esporulación y para la gluconeogénesis aunque no para el crecimiento en presencia de glucosa. La zona carboxilo terminal de Cdc25p interacciona directamente con Ras2p activando así el resto de la vía (Munder ot aL, 1988>. Existen dos genes que regulan la actividad de la adenilato ciclasa (Cdc35p>. RAS) y RAS2. (Murray et aL, 1993). Las proteínas Ras son sintetizadas como precursores citoplasmáticos. Para alcanzar su localización final en la cara interna de la membrana plasmética tienen que ser procesadas y finalmente farnesiladas (Broach, 1991). La activación de estos genes por CdcZ5p supone un incremento del AMPo por hidrolisis de ATP. Contrariamente, su función se ve disminuida por el incremento de 2rotelnas activadoras de GTPasas (GAPs), codificadas por los genes IRA 1 y 2, que interaccionan con el complejo GTP/RAS, hidrolizan el GTP e inactivan el complejo (Murray eL aL, 1993) (Figura 7). La formación de AMPc por la adenilato ciclasa activa a una serie de protein- quinasas (TPK7, TPK2, TPK3) (Toda eraL, 1987). Las Tpks son responsables de dos hechos que provocan la progresión del ciclo mitótico: la inhibición de la esporulación por represión del gen IME 1 (Lnductor de la meiosis)(Malone, 19901 y la activación de Cln3p (Hubler eta)., 1993). También se ha demostrado que un incremento en la señal de AMPo inhibe, temporalmente y de una manera dependiente del tamaño celular, la expresión de Clnlp y Cmn2p (aunque no Cln3p). Este hecho pone de manifiesto la dependencia que existe entre el punto “START” y el tamaño celular (Baroni eL al., 1994; Tokiwa et aL, 1994; Hartwell, 1 994)(Figura 7). 3.- MORFOGENESIS DE Saccharomyces cerev¡siaO. La polaridad celular es fundamental para el desarrollo y el correcto funcionamientO de todos los organismos. Su definición más simple es ‘una organización celular asimétrica” (Chant. 1994). Las células de £ cerevis¡ae sufren un crecimiento polarizado durante dos etapas de su ciclo vital: durante la formación de la yema en el ciclo mitótico y durante el desarrollo de la proyección de apareamiento. Durante la gemación, la orientación de la polaridad está determinada por un programa interno de patrones de gemación que es específico del tipo celular: las células haploides geman de manera axial y las diploides lo hacen de manera bipolar. En el patrón bipolar, 19 t (¿~) — Cdc3Sp Activa Nutrierttes 4 ATP ~ AMPc Ciclo meiótico -4—-—-—- Imel T Rme 1 >1~ Tpks —1 Cm 3 P + C¡nlp, Ciclo Cln2p, —~ mitótico Hcs2Gp Tamaño celular FIGURA 7: LA VíA RAS/AMPo y EL CICLO CELULAR. La señal se transduce desde la membrana celula, hasta el núcleo. La proteína Ras activada por su unión a 431? fosforila la adenilato ciclase (Cdc3 Sp) que transforma el Al? en AMPc. Este, a su vez, activa a las Tpks (protein-quinasas dependientes de AMPc), que inhibirán la esporulación, activarán la expresión de Cln3p e inhibiran la expresión de otras ciclinas Gí. Gil’o Cdc35p Inactive + Introducción las yemas nacen en extremos opuestos de las células contrastando con el axial, donde las nuevas yemas nacen en un punto adyacente a la gemación anterior (Madden eL aL, 993; Chant, 1994). La gemación es una división celular asimétrica en la cual la yema crece pero la célula madre no. Antes de que se forme la yema, ciertos componentes de la célula se distribuyen de manera polarizada para producir un crecimiento selectivo de la yema y para preparar la división del núcleo entre la célula madre y la hija. Ciertas estructuras, incluyendo la actina y los microtúbulos, están orientadas paralelamente al eje célula madre/célula hija (Chant, 1994). La actina cortical se polariza en el area por donde crece la membrana en la yema y los cables de actína se prolongan desde la célula madre a la hija . De esta manera, la actina, los microtúbulos y las proteínas responsables de la localización de la yema se ensamblan de una manera polarizada y sincronizada antes de la emergencia de la yema (Chant J., 1994). 3.1.1.- Establecimiento de la polaridad (Figura 9> En la búsqueda de mutantes de ciclo celular que tuvieran un defecto en gemación y polaridad, se identificó el gen CDC2A. En su ausencia, las células crecen de una manera amorfa sin llegar nunca a gemar. Esto se debe a que la secreción y el crecimiento de la superficie celular, que debería estar localizados en la yema, se producen uniformemente a lo largo de toda la superficie celular; Cdc3p, Spa2p, Gemí p y Cap2p se hallan deslocalizados. Posteriormente se identificaron CDCA2, CDC43 y BEM 1 corno esenciales para el establecimiento de la polaridad celular (Adanis eL aL, 1990). Cdc42p es una GTPasa de la familia Rho/Rac implicada en el control de la organización de la actina en mamiferos, Presenta en su extremo carboxilo un residuo de geranilación que permitirá su anclaje a la membrana (Johnson eL aL, 1 990). CDCI3 21 o * +os ccc» cto GEMACION AXIAL Células aoci GEMACION BIPOLAR APAREAMIENTO Células a/a Q +o + co *ce + 0 Q * st + FIGURA 8: POLARIDAD CELULAR DURANTE LA GEMACION Y EL APAREAMIENTO EN £ cerevisiae. Las células haploides geman de manera axial, al lado de la cicatriz de la gemación anterior. Las células diploides gernan de manera bipolar o bipolar/axial, en el extremo celular opuesto a la gemación anterior. En el apareamiento las células emiten una prolongación hacia la célula de tipo sexual opuesto que al unirse daré paso a la fusión citoplasmética y nuclear. AXIAL BIPOLAR APAREAMIENTO FILAMENTOS DEL EJE MADRE/HIJAt 9EDst-t 1 SEÑAL EN EL PUNTO DE GEMACION LOCALJZACION DE UN GRADIENTE DE FACTOR SEXUAL OPUESTO 1 ¡ t SISTEMA DE TRANSDUCCION DE SEÑALES I 4% Nt ¡ * BUD’l GT ¡ ¡ y 4% 4% 444% 4% *FILAMENtOS DEL EJE MADRE/HIJA *CITOESQUELETO *SECRECION 7 CDC24 + 1 URA 9: CONTROL DE LA POLARIDAD CELULAR. Se pueden diferenciar por una parte los mecanismos responsables de la elección del sitio de gemación y por otra los reponsables del crecimiento polarizado. Ambos procesos estan relacionados y se dan de una manera secuencial: primero la célula “decide’t el lugar de gemación o apareamiento para posteriormente comenzar la orientación del material intracelular hacia ese punto. Ambos procesos se rigen por la activación de proteínas de tipo RAS (Budí p, Cdc42p), cuyos factores de intercambio GTP/GDP son BudS y Cdc24p y donde Bud2p y Bem3p actuan coma GAPs (activadores de GTPasas>. Tanto el mecanismo que determina el patrón bipolar de gemación como la relación entre Budl p y Cdc24p sólo son modelos sin existir evidencias de su mecanismos de acción. Introducción codifica la subunidad II de la geranil-geranil transferasa responsable de la modificación de Cdc42p (Finegoid et aL, 1991). La actividad GTPasica de Cdc42p se ve incrementada, “Pi vito”, por Bem3p (Ron, 1991). El mecanismo por el que se controla la polaridad celular aún no está claro. Podría ser que en la transición entre GTP/Cdc42p y GDP/Cdc42p, mediada por Cdc24p (factor de intercambio de nucleótidos de Cdc42p> . El mecanismo de gemación bipolar es desconocido por ahora. Se propone que los extremos celulares queden de alguna manera marcados durante la gemación (Chant a aL. 1994). 3.1.3.- El ciclo de la GTPasa Budí p (Figura 9) Para que las células gemen en posiciones predeterminadas, las señales espaciales deben ser transducidas a la maquinaria que establece la polaridad celular. Un ciclo en que esta implicada la GTPasa Budí p y además del que Bud2p y BudSp parecen ser los reponsables. Budlp, Bud2p y BudSp codifican, respectivamente, una proteína ras relacionada con las GrPasas (Chant eL aL, 1991)’ una proteína activadora de GTPasas (Park eL al., 1993) y un factor intercambiador de nucleótidos . 24 Introducción Una hipótesis sobre el modo de acción de Bud Ip es la siguiente. Esta proteína oscilada entre el citoplasma y la membrana plasmática dependiendo de su unión a GTP o a GDP. De esta manera, podría reclutar a otras proteínas corno Cdc24p y unirlas al sitio de gemación (Park et aL, 1993). Otra posibilidad, es que Budlp esté distribuida uniformemente en la membrana plasmática y que sea localmente activada en el sitio de gemación, desencadenando asi, vta Cdc24p, el proceso de gemación y procesos relacionados con el control de enzimás hidroliticas, las cuales de alguna manera controlaran las modificaciones de la pared (giucanasas, quitinasas...) (Cabib et aL, 1975). De esta manera, se aislaron genes reponsables de un fenotipo autolitico termosensible, es decir, cuya lisis es dependiente de la temperatura (Nombela a al., 1984; Torres a al., 1991; Molero eL al., 1993; Cid a aL 1994). Este tipo de mutantes fueron aislados en una búsqueda de cepas que liberaran su contenido intracelular y que se detectaran midiendo la actividad de la fosfatasa alcalina (Cabib eL aL, 1975). Complementariamente, estos mutantes se pueden aislar de manera más precisa por citometría de flujo con oduro de propidio. Sólo las células que hayan perdido su integridad seran permeables a dicho fluorocromo . Tabla III. Cepas de Schizosaccharomyces pombo utilizadas en este trabajo Cepa Genotipo Procedencia o referencia SMi h+, urat íe& . S. Moreno, Salamanca SMZ h ura , leu 5. Moreno, Salamanca 30 ia., N vi o ~j — 4 ., 2E 2 c -, .4 0 1/) u ) -,(4 45 E tij 4>a 4> a — ‘- o 0 ~>u a> w <4 ~ c E u a> a> o E .~ 4 -, u> <~ O tu -— o> c~ E 4> 4> 4 -, E c‘o -~ ~ E ~ .2 o o- u O x E E 4>o -~ Z12 L. L o o o ~ 4 -’ ua> a> ca > > > > u u,o2N iuU ) SC4 -, o.4.-uti’ a> « 3 - E‘oNIV 4- --a 2 2 cauecaEca -oe--> -tiE4>caaou4.4 ca -c E 0) .22 u -~ e.J n u o 4 > U (oo.o __ ua>•0o4-a>EEo.0a>tie.2uElE .!~ 4-.-~ o s 4 > ’> > 1 ) “o. E E ‘it ‘ituen en ‘it n - en Z Zwu D — i- < ‘it t .c o o o zx«3 o o en N cn «3 o a o. a o > - » o-> U 4.4a> 1 < 4.- a> 4> -Ee->E 4> ‘o , u) uU ) do, -oo,4- 4 44> 44(o4>e4>(oo-ti -Dti’ cau(o ‘Ea,4-, uca(a uca4-a>‘4 -a>4-ea>e>4.- o04 4eo,4>6>4-(A4 4u(a4-(aua>4-- .0Eoz 4> > - -c (au -n n 4 -J o en O ¿ •~ d 3 U 0 a>_ > 0 ) o-‘ito4-, u,u1‘itD‘A <4E4>‘ti o.ou4> tfl o — ~3O E S OC C (a — .0 ~> 0 ‘> 4 - 0 oca -o ..- 4—u ’- 4 > 4 > u , uooC hEnu,---2 4.- U > o <~> U )o. Materiales y Métodos Medio 506 utilizado en la transformación por el método de Hanahan (1985) (triptona 1 2 gIl, extracto de levadura 5 gil, cloruro sódico 1 OmM, adicionándose tras su esterilización cloruro potásico y cloruro magnésico a una concentración final 2.5 mM y 10 mM respectivamente). Medio SOC empleado para expresar la resistencia al antibiótico en experimentos de transformación por el método de Hanahan (1985) (medio SOB al que se le añade, en esterilidad, glucosa hasta una concentración final 2OmM). A estos medios se añaden, cuando es necesario: - Ampicilina (50 yg/mi) para seleccionar células resistentes. - Xgal (20 ¡sg/mí) e IPTG (0.1 mM) para seleccionar clones portadores del gen que codifica la B-galactosidasa. 2.2 Medios de cultivo para Saccharomyces corevis¡ao. Para lograr la solidificación del medio, cuando es pertinente, se añade “Bacto”- agar a una concentración final de 20 gil. Medio YE, medio completo empleado para el cultivo de levaduras (extracto de levadura 10 gil). Como fuente de carbono se añade según elección glucosa 20 g/l, galactosa 30 gIl, acetato potásico 20 gil, glicerol 2%, etanol 2% o rafinosa 20 gil. Medio YPD, medio rico empleado rutinariamente para el crecimiento (extracto de levadura 10 g/l, glucosa 20 g/l, peptona 20 gIl). Medio SD, medio sintético utilizado para seleccionar y mantener ks transformantes de levaduras o para determinar las auxotrofias de una determinada cepa (base nitrogenada de levadura sin aminoácidos &7 gil, glucosa 20 gIl, aminóacidos proteinogénicos o bases nitrogenadas -según necesidad- a una concentración final de 30 mg/mi). Medio M P E, utilizado principalmente para inducir la esporulación , 4.9. Desfosfatización del extremo 5’ del DNA. Para evitar en las ligaciones la recircularización del vector cuando este habla sido cortado con un solo enzima de restricción, se procedió a la desfosfatización del extremo 5 del fragmento lineal. Se realizó un tratamiento con fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIAP) según el procedimiento descrito por Sambrook eL aL, <1989); con material suministrado por Boehringer Mannheim (Penzeberg, Alemania>. 4.10. Ligación del DNA. De nuevo se siguieron las recomendaciones de Sambrook et aL, (1989); utilizando la DNA ligasa del fago T4 con su tampón correspondiente, procedentes ambos de la casa Boehringer Mannheirn (Penzeberg, Alemania). Las ligaciones se realizaron, en el caso en que los extremos a unir fueran cohesivos, durante al menos 1 2 horas a 1 3’C; con los extremos romos, se harían a 22’C durante el mismo periodo de tiempo. 4.11. Transformación de DNA. La transformación de plásmidos en las distintas cepas de E. col! se llevó a cabo habitualmente mediante el método descrito por Hanahan (1985). Aquellos plásmidos, que tras su integración en levaduras fueron recuperados y recircularizados, se transformaron por electroporación usando un modelo “Electro Ccli Manipulator 600 (BXT), siguiendo la técnica descrita por Dower st at, (1988). La transformación de 5. cerev¡síae se realizó utilizando células enteras tratadas con cationes alcalinos (acetato de litio), según el método descrito por Ita a aL, (1983). 4. 2. Marcaje radiactivo de Fragmentos de DNA. Los fragmentos de DNA empleados como sondas fueron marcados radiactivamente con (32P)dCTP (3000 Ci/mmol, Amersham), por el procedimiento de “Randon, Primer”, según la técnica descrita por Feinberg y Vogelscein <1984), utlizando el kit de marcaje suministrado por la casa Amersham International. Se basa en el uso de una mezcla aleatoria de hexanucieótidos que, actuando como cebadores sobre una cadena de DNA desnaturalizado, permiten al fragmento “Kienow” de la DNA polimerasa 1 sintetizar ~acadena complementaria, introduciendo nucleátidos marcados radiactivamente. 37 Materiales y Métodos Los nucleótidos no incorporados se eliminaron mediante cromatografla de filtración en minicolumnas de “Sephadex G-50” (Sambrook et aL, (1989)). Se marcaron cada vez aproximadamente 2S ng de DNA, usando para hibridar c.p.m totales. 4.13. Hibridación DNA-DNA. 4.1 3.1 Transferencia del DNA a una membrana de nylon. Esta técnica se basa en la capacidad de las membranas de nylon cargadas positivamente de adsorber DNA desnaturalizado en condiciones alcalinas. Para la desnaturalización del DNA, una vez realizada una electroforesis en agarosa de alta pureza, se sumergió dos veces el gel en una solución de ácido clorhídrico 0.25N durante 10 minutos; posteriormente y tras lavarlo con agua destilada se introdujo el gel 20 minutos en una solución neutralizante (0.4W hidróxido sádico, 1 M cloruro sódico) para finalizar lavando el gel tres veces durante 10 minutos en una solución desnaturalizante (acetato sódico 3M, pH=5. 5). La transferencia, as! como la fijación, del DNA a la membrana fue siempre unidireccional, siguiendo el protocolo descrito por Sambrook a al., (1989) Una vez fijado el DNA a la membrana se usó como matriz para hibridar con sondas marcadas radiactivamente como anteriormente se ha descrito. 4.14. Hibridación RNA-DNA, técnica de Northern. 4.14.1 Transferencia del RNA a una membrana de nylon. Esta técnica también, se basa en la capacidad de las membranas de nylon cargadas positivamente de adsorber RNA desnaturalizado. La desnaturalización del RNA se realiza antes (a las muestras-Spl-se les añade MOPS lx, 1 5pm de formamida y 5pm de formaidehido; y se calientan 1 5 minutos a 600C) y durante la electroforesis usando un gel desnaturalizante (agarosa al 1%, 25% de formaldehido y lx MOPS). El tampón de electrodos será lx MOPS y 0.2% formaldehido. La transferencia, asi como la fijación, del RNA a la membrana fue siempre unidireccional, siguiendo el protocolo descrito por Sambrook a aL, (1989) Una vez fijado el RNA a la membrana, se usó como matriz para hibridar con sondas marcadas de DNA radiactivamentecomo anteriormente se ha descrito. 38 RESULTADOS Resultados En un trabajo anterior, realizado en el Departamento de Microbiología II de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid, se concluyó que la cepa mutante lytl presenta un fenotipo Utico a 37C durante el ciclo mitótico y, que tiene afectada la capacidad de esporulación independientemente de la temperatura de incubación. La lisis se produce siempre en el mismo punto del ciclo celular, con un tamaño de yema grande. El defecto en el ciclo mitótico es complementado por expresión en vectores muiticopia del gen SPOI2 (Molero, 1992). OBJETIVO DEL PRESENTE TRABAJO El objetivo de este trabajo fue la caracterización del fenotipo Lytt & Saccharomyces corevis¡ae, así como el aislamiento del gen o genes cuya mutación era la responsable de dicho fenotipo. Complementariamente, también se consideró importante la posibilidad de aislar genes heterólogos capaces de complementar el fenotipo, pues se pensó que podría deberse a un defecto en una función conservada filogenéticamerite. 1.- CARACTERIZACION FENOTIPICA DE LA CEPA MUTANTE Iyt 1 1.1- Localización del punto de parada de la cepa Iyt 1 en el ciclo celular El estudio de los procesos que tienen lugar a lo largo del ciclo celular de Saccharoniyces cerev¡siae se pueden realizar además de con mutantes cris, con agentes químicos que interfieren en el ciclo, parándolo en un punto determinado por inhibición de algún proceso imprescindible para su progresión. Con el objeto de localizar el punto de parada de la estirpe mutante Iytl, se usaron hidroxiurea y benomil, Además se estudió, mediante microscopia y citometña de flujo, el momento de la división nuclear en que ocurría la parada del ciclo celular a la temperatura restrictiva. 1 .1A.- Crecimiento en hidroxiurea. La hidroxiurea es una droga que impide la síntesis del DNA por inhibición del enzima ribonucleótido reductasa (Timson, 1975) y previene la unión de pequeños fragmentos de ácidos núcleicos nucleares, mitocondriales y plasmídicos (Síater, 1973). Si el punto de parada de la cepa mutante 1>4 Y estuviera antes del punto de acción de la hidroxiurea, la mutación se expresarla en su presencia dando lugar a un fenotipo lítico a 37’C. Sin embargo, como se muestra en la figura 10, en presencia de OSM de hidroxiurea, el mutante lyt 1 (L2C24d) se comporta como la cepa silvestre a 370C, y aunque detiene su crecimiento no se lisa. 1.1.2.- Crecimiento con Benomil (MBC). El benoniil (MBC), metilbenzimidazol-2-il-carbamatO, es un reactivo químico que previene la elongación del citoesqueleto por impedir el ensamblaje de los microtúbulos (Quinlan et aL, 1980). Al igual que sucede con la hidroxiurea, si el fenotipo Lyti fuera debido a un defecto que tuviera lugar después del ensamblaje de los microtúbulos, no se expresarla en presencia de benomil puesto que se habría bloqueado el ciclo en un punto anterior. Eso es lo que ocurre en nuestro caso, como se muestra en la figura 11. En presencia de O.SmM de benomil, disuelto en un 0.5% (y/y) de DMSO (Quinlan ea aL, 1980), las células se paran presentando un fenotipo de células en dobletes y, a 37«C, no hay lisis. 40 Resultados 1 .1.3.- Tinción de núcleos. El material génico es desplazado despúes de duplicarse a lo largo del citoesqueleto para que tanto la célula madre como la hija queden con una copia de todo el genoma. Así, la distancia entre ambos núcleos en la célula en división es proporcional al tamaño del citoesqueleto. Para comprobar que el citoesqueleto se hallaba duplicado y elongado en el momento de parada del mutante lyt 1 a 37C, lo que confirmarla que la parada es posterior al punto de acción del benomil, decidimos hacer una tinción de núcleos con el fluorocromo ioduro de propidio (de la Fuente et al., 1991). Procedimos a una incubación a la temperatura restrictiva de nuestro mutante. Tras 6 horas y una vez manifestado el fenotipo tomamos una muestra que fue fijada con etanol 70% e incubada en presencia de RNAsa (para evitar un fondo inespecifico) 30 minutos a 37t. Posteriormente, las células se tiñeron con ioduro de propidio (0.005%) y se observaron en el microscopio (100X) con y sin iluminación de epifluorescencia. Como se puede ver en las fotografias de la figura 12, los núcleos se encuentran en anafase, situados en los polos de la célula en división y el material génico totalmente dividido. Lo que indica que, en efecto, el citoesqueleto se encuentra totalmente alargado. 1 .1.4.- Ciclo celular. Para cuantificar lo anteriormente visto al microscopio, se procedió al estudio del la progresión de la replicación DNA a lo largo del ciclo celular de la estirpe mutante lyt 1, tanto a 24t como a 3TC, por citometria de flujo. Como se muestra en la figura 13, mientras que a 24C se pudo observar una transición periódica y normal entre las fases 01 y 02 del ciclo, a 37<’C tras dos horas de incubación el ciclo se para en 02. También, y de una manera secuencial a la parada del ciclo, se puede apreciar el inicio de la lisis celular. 1.2- El proceso de autólisis depende de una síntesis activa de proteínas. En este punto de la caracterización fenotipica de nuestro mutante, se creyó conveniente saber cómo era el crecimiento en otras fuentes de carbono distintas de glucosa, si era dependiente de una fuente de carbono fermentable y de una sintesis activa de proteínas. Existen mutantes de ciclo celular con un crecimiento limitado a glucosa/galactosa (F. Cross, comunicación personal>. l.2.E- Crecimiento de la estirpe mutante lyt 1 en fuentes de carbono distintas de glucosa. Se incubé la cepa L2C24d, portadora de la mutación lyt 1, tanto a 24C como a 370C, en medio mínimo suplementado con galactosa o glicerol, como ejemplo representativo de una fuente de carbono fermentable y una oxidativa. Como se muestra en la figura 14, el crecimiento es mínimo en estas das fuentes de carbono, si mo comparamos con el crecimiento en glucosa, a ambas temperaturas. La lisis tambíen decreció en estas fuentes de carbono, llegando a ser la diferencia máxima con respecto a glucosa, de un 70% en el caso de glicerol y de un 50% en el de la galactosa tras 24 horas de incubación a 37C. 43 E!S2IIB¿ la: ESTUDIO CITOMETRICO DEL CICLO CELULAR DE LA CEPA MUTANTE lyt 1. En la figura, las abdsas representan el número de células y las ordenadas la intensidad de fluorescencia . LISÍMYO9MflROOI\FLP’F Ivorescence 2 A PREIMOC 4D 268 409 ¿~ eée idee U3u MY99MflR00E’~rLt~FltAOr#SCCflCe E VS: NyOstIARS8$NFLE\FIuort%CeflCQ a e- t EH 24C 209 460 ~6e SM idee VS: Nve9M4Re04NFL2~F1uorescence 2 4H 24C A. 200 400 660 800 ¡080 VS: NYOSMAROO6\FLE\rluorescence 2 EH 24C a 0 408 600 608 ¡000 ‘33: MYO9MÑROOSNFLE\rIuorescence 2 OH 24C e. 1~ EH 370 aéo 4e s4e eée ¡~ee VS: MYe9M~R005NFLa’F 1 uorescencS 2 4$ sic ‘st ,t. Kb. Kb. ‘iii VS. MYe9M~9e7NFLeNFIuorescetx# 2 VS: Nv09tlw0e9\FLa~PIt*orescence E V3:MYO9NAROI 1~FLt~FIUOr0SCOflC a ‘33: NYGSMÑROIO\rLa\rluorescence 2 24$ 24t 1606 Resultados 1 .2.2.- Crecimiento de la estirpe mutante Iyt 1 en eritromicina. Se decidió determinar entonces si la falta de crecimiento y de lisis en glicerol era debida a un defecto mitocondrial que fuera el causante de que dicha fuente de carbono no se metabolizara. Para comprobar este hecho se estudió el fenotipo Lytl en presencia de 0.5 mg/ml de eritromicina, inhibidor de la función mitocondrial en eucariotas una gemación bipolar abortada por la detención del ciclo. La cepa silvestre, a 370C, gema de manera axial. 47 Resultados 1.4.- Estudio del defecto meiótico del diploide hornozigótico Iyt 1/Iyt 1. La cepa mutante diploide homozigótica lytl/1yt1 tiene un defecto en esporulación independiente de la temperatura (Molero, 1992>. La mutación Aspoi’2 detiene el ciclo meiótico tras la primera división meiótica (Malavasíc ea aL, 1992). Se decidió hacer un seguimiento, por citometría de flujo, del ciclo meiótico de dícho diploide para determinar el punto exacto en que paraba la esporulación, usando una cepa Aspo 12 homozigótica como control. De esta manera pudimos comprobar que el DNA se duplicaba normalmente y que tras la división reduccional el ciclo meiótico se paraba (Figura 18) con una sef~al de DNA intermedia entre 2n y 4n. 2.- CLONACION DEL GEN ESTRUCTURAL REPONSABLE DEL FENOTIPO Lytl. Para el aislamiento del gen estructural reponsable del fenotipo Lytl, se procedió a la transformación de células intactas, por el método de acetato de litio, de la cepa L2C24d con una genoteca genómica comercial de la cepa 5. ceraWsiae AB320 ligada al punto BaniHl del vector YCp5O. El tamaflo medio de inserto era de 10-15 Kb. 7.000 transformantes fueron obtenidos (3.100 eran necesarios para representar el genoma) y replicados en medio sólido para estudiar su capacidad de complementar el defecto de crecimiento del mutante a 3TC. Catorce transformantes (Ti, T2, T3, T4, T5, TE, Ti, T8, 1% TíO, Ti 1, TiZ, 113 y T63) fueron capaces de crecer a la temperatura restrictiva en medio sólido. Todos excepto T3, TS, T8 y T9 fueron capaces de complementar la lisis al menos en un 50% tras 24 horas de crecimiento a la temperatura restrictiva (límite aleatorio pero que se fijó como criterio para la complemetación del fenotipo htico) 2.1- Estudio de los insertos que portaban los transformantes aislados. A los transformantes aislados se les extrajo los plásmidos que portaban para ser sometidos a un análisis de restricción preliminar. Así, se pudo observar que T2 portaba el mismo inserto que T12. Lo mismo ocurría con T63 y TíO. Este hecho redujo el numero de transformantes a estudiar a ocho (T1,T2, T4, TE, Ti, TíO, Vil yTl3). Para comprobar que la complementación del fenotipo se debia a la presencia de los plásmidos, éstos se retransformarOn y se estudió tanto su capacidad de complementar de nuevo el fenotipo en el ciclo mitótico así como el defecto de esporulación (Figura 19). Al haber una clara diferencia en la capacidad de complementarla mutación entre los transformantes T2 y Ti y el resto , se decidió estudiarlos con más precisión, pues era posible que portaran el gen estructural cuya deficiencia causaba el fenotipo Lyt 1. 2.2.- Caracterización fenotipica de las estirpes transformantes T2 y Ti. 2.2.1.- CrecimientO a 24C y a 37C Como se muestra en la figura 20, las cepas transformantes T2 y Ti son capaces de crecer a la temperatura restrictiva de manera similar a una cepa silvestre. Existe una clara diferencia de viabilidad, incluso tras 4 horas de incubación a 3VC, entre las cepas transformadas y el mutante original. si CEPA LISIS ESPORULACION RETRANSFORMACION LISIS ESPORUL4CIOH Ti 40% POSITIVA Tía Tlb Tic 95% 80% 99% POSITiVA POSITIVA POSITIVA T2 10% POSITIVA T2a T2b 5% 5% POSITIVA POSITIVA T4 40% POSITIVA T4a T4b 45% 40% POSITIVA POSiTIVA T6 40% POSITiVA TEa TGb 25% 30% POSITIVA POSEliVA Ti 1 5% POSITIVA Tía 5% POSITIVA TíO 45% POSiTIVA TlOa TlOb 25% 3036 POSITIVA POSITIVA T13 45% POSITIVA Tl3a Tl3b Tl3c 8% 40% 45% NEGATIVA NEGATIVA NEGATIVA FIGURA 19: Esquema de los datos de lisis y esp&ulación de los transformantes y retransformantes aislados como supresores del fenotipo LytI Resultados 2.2.2.- Morfología celular al microscopio de contraste de fases Las células de las cepas transformantes, después de ocho horas de incubación a 3VC, presentan una morfología normal, permaneciendo refringentes al igual que la cepa silvestre. As? mismo se puede observar que a 37C el patrón de gemación en haploides es axial, habiéndo sido restaurado también este defecto fenotipico del mutante original. 2.2.3r Esporulación Ambos plásmidos son capaces de restaurar el ciclo meiótico de una estirpe mutante diploide homozigótica Iyt l/Iyt 1. Se producen ascas con 4 ascosporas viables, a los cinco o seis días de ser incubados a 24t en nied~o sólido de esporuiación digeridos con Sal y CJal. Como se muestra en la Figura 24, la sonda hibridó con 12 y 17, confirmando los resultados que se hablan obtenido anteriormente por secuenciación. 2.4.- ¿CDC 15 y NPK 1 reponsabies del fenotipo Lytl? Los datos anteriores parecen indicar que el fenotipo Lytl no sólo se debe a la deficiencia de un solo gen sino a la de dos genes consecutivos, CDC)5 y NPK 1. Se decidió comprobar este hecho mediante distintos ensayos. 2.4.1.- Estudio del fenotipo de la estirpe diploide heterozigóUca cdc? 5//yt 1. Se contruyó la cepa diploide MY1, con un fondo genético cdcl5/Iytl. Se estudió su fenotipo a 24t ya 37C tanto para el ciclo mitótico como pare el meiótko. 57 Resukados Pudimos observar que la cepa presentaba parada del ciclo y lisis a la temperatura restrictiva a unos niveles similares a los de la cepa mutante Iyt 1 , en la cepa L2C24d para comprobar la compiementación del fenotipo htico y del defecto en el patrón de gemación. Como se muestra en la figura 25, el gen CDCP5 es capaz de restaurar, en una cepa mutante Iyt Y, el ciclo mitótico y gemación normal a 370C, incluso transformado en un vector de bajo número de copias. En este punto cabe destacar, como hemos indicadoantes, que CDC 75 (fragmentos T2X1 y T7N1 Xl) no es capaz de complementar el defecto meiótico de la cepa diploide mutante homozigótica Iyt Y/Iyt 1, hecho que se confirmó con la transformación del piásmido pBS9 en este diploide. 2.4.3.- Estudio fenotipico de la cepa DU3 (diploide homozigótico Iyt 1/Iyt 1) transformada con el gen NPK 1 Se subclonó el fragmento BarriH 1 -BamHl que incluye tanto el promotor como el marco abierto de lectura del gen NPKI (Figura 23) en el vector centromérico pHR7O para transformar la construcción en el diploide mutante homozigótico Iyt l/Iyt Y y poder así estudiar el fenotipo de la cepa transformada. Respecto al ciclo mitótico, la copia extragenica de NPK 1 no es capaz de suprimir el fenotipo Lytl. Así pues, la cepa transformada se lisa a 37t, con un patrón de gemación anormal, en un porcentaje similar al control sin transformar (Figura 26). En cuanto al ciclo meiótico, el NPKI extragénico es capaz de restituir una esporulación normal, tanto en medio sólido como en líquido. 2.4.4.- Estudio del nivel de expresión de los genes CDC 15 y NPK Y en una cepa mutante Iyt 1. Para saber si el nivel de expresión de CDC) Sy de NPK 7 estaba disminuido en la cepa mutante Iyt 1 en comparación con una cepa sUvestre, decidimos hacer un estudio de la expresión midiendo la cantidad de RNA que de ambos genes habla en la cepa mutante. Para ello se hizo una hibridación RNA-DNA (técnica de “Northern”) usando como matriz el RNA total de la estirpe mutante fyt ¡ y de la cepa silvestre S288C, y como sonda el fragmento SaA -Xba4 (3320 pb) del inserto Ti. Dicha sonda incluye el fragmento 3 del CDCY5y el 5 del NPKI. Como patrón interno de expresión, se hibridé con una sonda de 1.75 Kb (H¡nct II -BamHl) que incluye al gen ACfl de S. cerev¡SÍM. 60 Resultados Como se muestra en la figura 27, la expresión de dichos genes se encuentra claramente disminuida, la banda es apenas perceptible, en nuestra cepa en comparación con una cepa silvestre (banda claramente visible). 2.5.- RESCATE ALELICO DEL GEN CDC 15 DE LA CEPA MUTANTE lyt’1 Para caracterizar la mutación que en el lyt 1 causaba el fenotipo de parada y lisis en el ciclo mitótico se rescató el alelo mutado del gen CDCISde la cepa L2C24d. Para ello se subclonó el gen CDC1S silvestre (fragmento PvtA 1 -Pvdl del piásmido pBS9) (Schweitzer y Phiiippsen, 1991), en el punto NruE del plásmido integrativo Ylp5. Esta construcción se transformó linearizada con figAl (316 pb) en la cepa mutante, tal y como se muestra en la figura 28. A los transformantes obtenidos, se les extrajo el DNA genómico que fue cortado con los enzimas PvtAl y Sphl. El corte con Pvdl rescataría el marco abierto de lectura c-dclS(lytl) bajo el promotor CDCI5 silvestre. El corte con SpIi rescatarla el marco abierto de lectura CDC 15 silvestre bajo la dirección del promotor cdcISffytl). El producto de la restricción fue ligado y transfomado en E. cali. Los transformantes crecieron bajo una selección con ampicilina. Sólo aquellos fragmentos que al ligarse hubieran incluido el vector (Figura 28), serian capaces de expresar la B-iactamasa responsable de la resistencia a ampicilina. Tras amplificar en E. coil ambas contrucciones, se subclonaron en un vector centromérico de S. cercvisiae (YCpSO). Despues se comprobó su funcionalidad en la cepa L2C24d. De esta manera se pudo comprobar que la construcción promotor cdcl S(~>~ 1)- ORF CDC 15(silvestre) era capaz de complementar el defecto en el ciclo mitótico de la estirpe mutante lyt 1 (Figura 29). Predeciblemente, la quimera constituida por el promotor cdcls(silvestre) - ORF cdcls(Iytl) no fue capaz de complementar dicho fenotipo. 2.5.1.- Estudio de lisis y esporulación del diploide heterozigótico cdcl5 (lyt 1) ¡ CDC15 (integrado en un fondo genético lyt 1). Se construyó a partir de la cepa haploide donde se habla integrado el CDC 15 por apareamiento con una cepa haploide Iyt 1 del tipo sexual opuesto (L2C2Gb) y posterior micromanipuiación, un diploide con un fondo genético Iyt 1 que portaba, integrada en su genoma, una copia de un gen CDC 15 silvestre. Como se muestra en la figura 29, esta cepa creció de manera normal y no se apreció una lisis significativa a 37C, comportándose igual que el diploide heterozigótico. Este resultado nos indica que una sola copia silvestre de CDC 15 es suficiente para complementar el fenotipo Lytl. También se estudió el ciclo meiótico de dicho diploide. En medio de esporulación sólido, tras 13 días de incubación a 2QC, no se observó ninguna espora. 2.6.- RESCATE ALELICO DEL GEN NPK Y DE LA ESTIRPE MUTANTE lyt 1 Para caracterizar la mutación que en el fenotipo Lytl causaba deficiencia en esporulación, se rescató el alelo mutado del gen NPK 1 de la cepa L2CZ4d. Para ello se subclonó el fragmento BambA -BembA del plásmido T7 que incluye todo el marco abierto de lectura y el promotor del gen NPK1, en el punto SambA del vector integrativo Ylp5. Esta construcción se transformó linearizada con AmI (956 pb) en la cepa mutante, tal y como se muestra en la figura 30. 63 SphI PvdI Mutante ~ 2 ‘tl) 14 LISIS FIGURA 28: RESCATE DEL ALELO cdclS DE LA ESTIRPE MIJTANTE Iytl Resultados A los transformantes obtenidos que portaban una copia del gen NPK 1 silvestre se les extrajo el DNA genómico que fue cortado con los enzimas H¡ndll y Sal. El corte con Hindíl rescataría el extremo 5’ del gen npkl<’IyÉl) (1-958 pb> unido al extremo Y silvestre. El corte con SaA rescatarla el extremo 3’ del gen (958-1048 pb) unido al extremo 5 silvestre, El producto de la restricción fue ligado y transfomado en E. ccli. Los transformantes crecieron bajo una selección con ampicilina. Sólo aquellos fragmentos que al ligarse hubieran incluido el vector (Figura 30), serian capaces de expresar la B-lactamasa responsable de la resistencia a ampicilina. Tras amplificar en E. cali ambas contrucciones, se subclonaron en un vector centroniérico de 5. cerevisiae (YCp5O). Despues se comprobó su funcionalidad en una cepa homozigótica lyt i/Iyt Y. De esta manera se observó que el rescate del extremo 3’ del gen npkí(lyt 1) unido al 5’ silvestre fue capaz de complementar el defecto de esporulación obteniéndose ascosporas, tras 7 dlas de incubación en medio sólido. 2.6.1.- Estudio de lisis y esporuiación del diploide heterozigótico npkl(Iyt 1)/NPKI (integrado en un fondo genético lyt Y) - Se construyó a partir de la cepa haploide donde se había integrado el NPKI por apareamiento con una cepa haploide Iytl del tipo sexual opuesto (L2C2Gb) y posterior micromanipulación, un diploide con un fondo genético lyt 1 que portaba, integrada en su genonla, una copia de un gen NPK 1 silvestre. Como se muestra en la figura 31, esta cepa creció de manera similar al mutante original apreciandose una lisis significativa a 37C. Este resultado nos indica que una sola copia silvestre de NPK Y no revierte el defecto del ciclo mitótico de ¡yt 1. También se estudió el ciclo meiótico de dicho diploide. En medio de esparulación sólido, tras 5 dias de incubación a 24C, se observó una esporulación normal observándose en el cultivo ascas con cuatro ascosporas. 67 hUnoill SaA lutante Iytl L2C24d) B8mHI 1 —4 CDC1S npkl(IytY) ADEl BamHl ESPORLJLACION - uRA- 4 flinoiHBatflHI al SaA SaA Orn m R ¡tncAíV Xbal SaA Ban,HI CDC1S NPK1 ADEl CDC1S NPK1 ADEl Hindil/Ligación Safl/Ligac¡ón 4 Subclonac¡ón en YCpSO Transformación en Iyt 111)41 Subclonación en YCp5O Transformación en Iyt 1 11$ Y ESPORULACION + ESPORULACION - FIGURA 30: RESCATE DEL ALELO npkl DE LA ESTIRPE MUTANtE IytY. CIX1 5 Linearizamos con Xbai (958 pb) NPK1 NPKI 4 4, 4 Resultados 3.- CARACTERIZACION DE GENES HETEROLOGOS SUPRESORES DEL FENOTIPO Lytl. 3.1.- CLONACION DEL GEN sítí (Schizosacharomyces [yt fl DE Schizosaccharomyces pombe. Se transformó la cepa /yt 1 L2C24d, por el método de acetato de litio, con una genoteca de cDNA de Sch¡zosaccharomycespornbe ligada al vector episómico pDB2O, bajo la expresión del promotor constitutivo ADH de Saccharomyces cerev¡s¡ae. Tras 24 horas a 24C, los transformantes se incubaron directamente a 37C. Sólo obtuvimos una colonia capaz de crecer en placa a esta temperatura, que contenia el plásmido que portaba el inserto que denominamos MTS 1”. 3.1.1.- Caracterización del fenotipo conferido a la cepa mutante Jytl por TS1 Como se muestra en la figura 32, la cepa transformante TS1 es capaz de crecer parcialmente a la temperatura restrictiva. La lisis es parcialmente complementada llegando a ser de un 40-50% tras 6-8 horas de incubación a 37C. Respecto al ciclo meiótico TS1 es capaz de suprimir el defecto de esporuiación puesto que se obtuvieron ascosporas tras 5 días de incubación en medio de esporulación a 240C. Ambos resultados son debidos al piásmido que portaba a TS1 puesto que se repitieron tras la retransformación del plásmido aislado originalmente. 3.1 .2.- Secuenciación del gen sití El estudio de 151 nos reveló que portaba un inserto de 1700 pb aproximadamente. La secuenciación de dicho inserto nos descubrió la existencia de un marco abierto de lectura de 433 aminoácidos. El gen fue denominado sití cr >0V OCA ‘102 OX 033 QIG CIC CM TIC GAT Mt AN3 OIT W~ OX OX 032 MA T L CXC TAA N~ ¶03 TIC ‘IGA MA MA ATA CTA OCA PS.. CM ¶03 TIC a..T MT 032 @CTtV E HL T DV HG HE YO H y O DES LO MT ‘1CA ‘ItT ‘IWI’ PCA ¶01’ PCA ¶03 TAA ‘IGA ATA ‘KA MA ¶XE OCA PCA OCA CN XV ‘¡CA MALEE L NO Ql E VI QB QE E QL MT 032 OIT PCA PS—. 021’ CM ‘1(1 PCA MT ~ Pal’ ~T ‘IVA >03 OCA PCA M~ JG Al? AL R It KA TE DAR QE V LO 01 OH 032 ‘rI’V QY MA CM 032 MT ¶CA OCA ¶02 MC OCA PCA Pat mr OCA OCA MT ‘itA >O~ R SFR O Y LEER E OEA RL 0EV Y ‘103 MA ATT OX ‘IVA ATA OIT OCA ¶G~ >03 OCA PCA PiCA 032 ¶03 TI? OCA CA GVA TI~ LEO L QE R RAPEN VV R Tít R It TIT OCA OCA >12V OCA PC~ OX TIC >02 TI? ‘IVA MA ‘101’ ¶01’ >03 132 IVA ¶03 <213 OCA MA 032 OX ‘103 MA OIT LB Rl LV E DSP N MO LV VAN NF 02 ¶02 oit ap.. nC N32 CM TAT OCA 021’ ¶01 >01’ OX MA flA n’l’ QQ MP 1 H HP VV DOY! L L KB LB a21~ OCA MT 01’? TAT rin.. ‘¡CA ¶02 Par air u.CA PCA M1 TAT ‘IC1’ 021’ @A (~C ‘ICl’ ¶03 N P KL 1< SL T N KL AH T LEO STO CM ‘102CM 02? CM alt 02V GAC CM CM >02 OX OCA TIC ‘¡a PCA ‘KA @fl TIC OCA Y L H NL HE FA Y LP K T T ME L HE 03? 021’ CM CM ‘It? CAA (CA TI? 032 ATA TI? MT C2~A APC ac MT OCA OC? CM CM KV A Q T L LS LIB YO lEA K RL L CM PflT 032 OCA abC G1’t 021’ a~ OIT MT >03 CtA OCA MT N~ >132 MA Nr ‘itt -‘v-x O A 5V 5 DE E LS R TELA EL Ii DV OCA >02 TPO ¶01’ TIC ‘IVA ‘IVA mA 021’ TIC i~ cx OCA OIT 032 OCA ATt CM mA ‘ITA L LA A OB RS 14K ECHAR It E ID L ¶TP ATt 032 ¶02 ‘ItA >03 ~fl Oit ~PM(2iA >03 ¶Cfl MA ¶02 TIC MA PCA TAP ‘IVA OIT TARES PS TSE A OMS It GAL HP MC ‘102 ¶03 ‘PSA GAG OX Alt OC Alt TI? OX PCA 0T alt C?A >133 ¶02TI? CM ¶02 D P E VI E P E DEP T TER NP LEA rICA (02 PiCA Pat C.AT ‘IVA Ny: ‘¡CA ¡CA OCA Mt TIC ~2 OIT ‘lIC MA OX AC.YV PCA OX L LS TaO VS VV SS DE DV E 5V R ATt OIT Alt OC ‘¡03 ItA ATA TIC Pal’ 031’ APiS TIC ‘IVA ‘¡CA OCA 032 ‘It? MC ‘102 ¶03 D E D DG T L PI ESTO TVE E PI D ‘ISA TI? PSA It? 033 ac OX’!’ Mt TAT rICA TiC TIC OCA >112 >01’ ‘It? PICA (1)2 (2tT MSA ri’ KA GE 1< LTD SS KO PS?w VAS CM 032033 PS.. CM ATT MC ‘IVA 013 CIC MA fl Mt nc Mt TCC ‘¡GV ‘P32 ‘INCA E Y SN E TESAS P KG VE? DV KB n n~ (XC TAA ‘IVA Q..C OIT TIC 03201V T~ TAA Mii 03? ‘IVA MC TQt ¶0? MA CWI E (3 8 N N H E Q a S E 14 E 1> E 5 N y o E ‘IVA PIE MG CM CM ‘KA ‘iVA fl Nr CXC MT TPA ‘It?. Mt TAA MC TAA TGT ‘¡VA OIt 14 D SAS PR R PS SQA SL R H N V T TAA ‘IVA TIC ¶02 Alt ‘Ifl2 CM MG Nr Mt nC ‘IVA >02 MC TI? Mfl ¡CA TAA 211V ‘ix: E VP DE DA AGA mr OX ‘¡VA mA OCA ¶02 CD? ‘102 TAA CtA OCA PCA MT OCA PCA TIC Mt WA ‘KA CI? ¶112 ATT @A CAT ‘NC QN’ ‘IVA Mt ATA AA? QI1~ OIT fl ATt A1~ VI? 0V? IrA? CM ¶t32 MT VIT lA? PCti AtA MT TtP. y ‘¡a MA E rl? ‘IVA CM 2~iA AM ATA mA (IT MC ATA APA AA? [FIGURA 33: SECUENCIA Y MARCO A6IERTO DE LECTURA DE síU cb Schizosaccharotnycespombe. Códigode acceso E.MB.L.: X86009. En la figura, hemos ¡-ecuadrado los nexos deunión (“Iinkers”) usadospara la construcción dela genoteca. Resultados 3.2.- CLONACION DEL GEN HLTI (humano jyt fl DE Horno sapienS Se transformó la cepa LZC24d (Lytl), por el método de acetato de litio, con una genoteca de cDNA humana de células HEPG2, ligada al vector episómico pA823-BXN, bajo la expresión del promotor constitutivo GAP de Saccharomyces ocre vislea Tras 24 horas a 240C, se incubó la transformación directamente a 37C. Sólo obtuvimos 5 colonias capaces de crecer en placa a esta temperatura. Un somero análisis de restricción de los plásmidos que portaban dichas colonias nos reveló que todas contentan el mismo plásmido, al que denominamos: ‘TH”. 3.2.1.- Caracterización del transformante ~yt1-TH Como se muestra en la figura 35, la cepa transformante TH es capaz de crecer parcialmente a la temperatura restrictiva. La lisis tras 8 horas es de un 6O% pero tras 24 horas de incubación a 37t alcanza un 95%. A pesar de este alto porcentaje de lisis, hay que destacar que ésta sigue siendo menor que la del mutante original. Respecto al ciclo meiótico, TH es capaz de suprimir el defecto de esporulación puesto que se obtuvieron ascosporas tras 5 días de incubación en medio de esporulación sólido a 240C. Ambos resultados son debidos al plésmido TH, puesto que se repitieron tras la retransformación del plésmido aislado originalmente. 3.L2.- Secuenciación del gen HLTI El estudio de TH nos reveló que portaba un inserto de 1000 ph aproximadamente. El gen fue denominado HLTI (tiumanoiyli) En la busqueda de homologías de la secuencia preliminar de la totalidad de HLT3 con bases de datos internacionales, no se ha hallado ninguna similitud significativa con cualquier otra secuencia en ellos depositada. 75 Resultados 4.- INTERACCION DEL Lytl CON OTROS GENES RELACIONADOS SPOJ2 fue donado en nuestro laboratorio como supresor del defecto fenotípico en el ciclo mitótico que presenta una cepa mutante lytl (Molero at aL, 1993). Posteriormente, fue donado como supresor de Dbf2p, una protein-quinasa implicada en la separación de las crométidas en la división nuclear mitótica (Parkes et al., 1992). Para identificar la posible relación de la estirpe mutante Jyt 1 con una dbf2, asE como la posible relación de SPQl2concdclS,seestudiólaepistasia entre estosgenesa un nivel fenotipico. 4.1.- RELACION CON Dbf2p. Para estudiar la relación Lytl/DbfZ se siguieron dos aproximaciones: 4.1W- Estudio fenotipico del diploide MY4O (lyt lIdtbZ heterozigótico). Fenotípicamente, la mutación dbf2- 1 es similar a la 1$? pues también produce la detención del crecimiento, a temperatura restrictiva, con un lenotipo de células en dobletes (Parkes et aL, 1992). Así pues, se contruyó el diploide heterozigótico MY4O (MATa/MATa. dbf2/DBF2, LYTI/Iytl, uraSA 52/ura3ti52, trp 7-2/ TRP 1-2, ADE/adel> por micromanipuiación y se estudió tanto el fenotipo mitótico a 370 como su capacidad para esporular. El diploide resuitó ser totalmente normal en ambos aspectos fenotipicos, lo que nos indicó que la semejanza fenotípica Lytl y Dbf2 se debe a una coincidencia en la fase del ciclo celular donde ambos paran a la temperatura restrictiva. 4.1.2.- Estudio fenotipico de la estirpe mutante dUZ-! transformada con los genes relacionados descritos en este trabajo. Se decidió buscar supresores del fenotipo conferido por una mutación en el gen DBF2, entre los genes que hablan sido donados como supresores de la mutación Iyt 1. Para ello se transformó una cepa haploide dbf2- 1, por acetato de litio, con los siguientes plásmidos: * 12 (Centromérico, CDCI5, NPKI) * 17 (Centromérico, CDCI5, NPKI) * TS1 (Episómico, sítí) * TJ-l (Episómico, HLTI) * cSPO1 2 (Centromérico,SPOIZ) * mSPO12 (Episómico.5P012> * pBS9 (Centromérico, CDC 15) Tal como se muestra en la figura 36, sólo SPOIZ expresado en un vector multicopia es capaz de suprimir totalmente el fenotipo Dbf 2 aunque es importante resaltar la complementación parcial del fenotipo por parte de los genes sItl y HUY 1- 4.2.- RELACION CdclS/5p012. Corno se había demostrado previamente que SPOIZ era capaz de complementar el defecto mitótico Lytl, nos interesó saber si también era capaz de suprimir en otro fondo genético una única mutación «klS. Para ello se transformó una cepa haploide cdc 75-!, por acetato de litio, con los siguientes plásmidos: 77 Resultados * T2 (Centromérico, CDC 15, NPKI) * TS1 (Episómico, sití) * cSPO1 2 (Centromérico,SPQ 12) * pBS9 (Centromérico, CDCI5) * T7 (Centromérico, CDC 15, NPKI) * TH (Episómico, HLTI) * mSPO12 ~ 1. El objetivo de este estudio fue caracterizar con precisión el defecto que, en esporulación, presentaba esta cepa para poder determinar cual era el punto de la división meiótica que se encontraba afectado. Usamos corno control en este estudio una cepa diploide homozigótica tspolZ (Malavasic y Elder, 1992), cuyo defecto tiene como consecuencia la formación cii esporas apomícticas (2n) y que cuyo ciclo meiótico se detiene en un punto similar al que se sospechaba para el mutante/yt 1. El inicio del ciclo fue normal, comparado con la cepa control: la replicación del DNA tuvo lugar observándose un estadiotetrahaploide, similar tantoenel mutante ¡ye) comoenel AspolZ. Posteriormente, se observó el inicio tía primera división me,ót¡ca, dondela célula tendría que pasar de un estado4n a formar dos núcleos 2n (como es el caso ch Aspo 12) (Figura 18). La cepa diploide homozigótica ¡ye I/Iyt 7 empieza la división recombinacional, pero no la llega a completar. En lugar de formarse dos núcleos diploides, se forma un estadio aberrante 2n-4n. A partir de ese momento, la lisis se incrementa hasta llegar a más de un 50%, lo que probablemente se deba a la división cromosómica incompleta quese observa por citometría. La meiosis 1 es la fase del ciclo meiótico dondese produce el entrecruzamiento cromosómicoy la recombinación génica. Posteriormente, las cromátidas hermanas se han deseparar para proseguir cotila meiosis reduccional. Este pasoes ‘similar” a la separación de las cromátidas hermanas que se produce en el ciclo mitótico, en la anafase, paso defectivo también en cdclS (Johnston eL al.. 1990; Schweitzer y Philippsen, 1991; Toyn eL aL, 1993, 1994). Se podria hipotetizar que en ambos ciclos el proceso de separación de las cromátidas tiene lugar por un mecanismo semejante. Además, en nuestro caso, quizás por la conjunción de las dos mutaciones que presenta la estirpe mutante ¡ye?, se vean afectadcslos cbs ciclos. 1.4.- EXISTE UN DEFECTO, A 3TC, EN LA ELECCION DEL PATRON DE GEMACION EN CELULAS HAPLOIDES El patrón de gemación de 5. cerevis¡ae está determinado genéticamente y difiere entre las células haploides (gemación exclusivamente axial) y las diploides (gemación predominantemente bipolar). Se ha observado que en las cepas haploides ¡ye!, a 370C, las yemas inician una gemación apical Jiol- Aid, esencial para la complementación del defectocxt de la cepa mutante /ytl. La secuencia de este último fragmento nos reveló que hablamos aislado cts genes contiguos fisicamente, ambos aparentemente responsables del fenotipo Lytl: CDCISy NPKI. Cdcl 5p es una protein-quinasa implicada en la mitosis y citoquinesis celular. Es esencial para la consecución del ciclo celular y su defecto supone la parada de la división en anafase, con un tamaño de yema grande. Hasta ahora, no se le ha descrito ningún papel en el ciclo meiótico. Sus sustratos o efectores son desconocidos (Schweitzer y Philippsen, 1991), aunque posiblemente su función esté relacionada con la degradación de Clb2p (Amon et al., 1993). 85 Discusión En nuesto caso, el gen responsable del defectoautolitico termosensible en el ciclo mitótico del Iytl es el CDC 15, si bien el fenotipo Lytl difiere del fenotipo Cdcl5 descrito anteriormente (Wheals, 1983; Schweitzer y Philippsen, 1992), puesto que nunca antes se había descrito un proceso de lisis asociado a este mutante. Así pues, en este trabajo1 se describe por primera vez un mutante cdcl5 lítico (sólo un 20% de células viables tras ochohoras de incubación ala temperatura restrictiva). Se podría relacionar de manera lateral, a este gen de función m definida, y más en concreto, la mutación que porta el alelo responsable del fenotipo Lyt 1, con algún proceso de mantenimiento de la integridad de la pared tras la parada del ciclo celular en condiciones restrictivas. Varios datos confirman la identidad de CDC 15 como responsable del fenotipo autolitico Cdcque presenta la cepa mutante ¡yt?: 1.- El pertenecer al mismo grupodecomplementaciónqueRH2l0-3c (MATa, cdc 15, adeZ-), his4, trpl, ura3, ¡cuZ, bar 1) (Schweitzer y Philippsen, 1991). El diploide heterozigótico cdcls/iytI, aunque presenta una esporulación silvestre, presenta un fenotipo Cdc autolítico y termosensible (Figura 25), similar al qie presenta el diploide homozigótico ¡yt 1/lyt 1, o al fenotipo Cdc descrito para el diploide homozigotico cdcls/cdcl5 (Schweitzer y Phiiippsen, 1991; J. Jiménez, comunicación personal). Este datonos indica determinantemente que las mutaciones que presentan ambas cepas se encuentran en el mismo gen, puesto que en ni cdcl5 ni ¡ye? son mutaciones dominantes(Schweitzer y Phiiippsen, 1991; G. Molero,1992). 2.- La supresión del fenotipo Cdc autolitico terrnosensibe tanto por la expresión de CDCISen un vector debajo número decopias (Figura 25), corno por la expresión endógenade una copia silvestre de dicho gen integrada en el genoma en una cepa haploide Iytl (Figura 29). Sin embargo, un defectoen CDCI5 no es responsable del defecto Lytl en el ciclo meiótico, puesto que una expresión del gen silvestre no es capaz de restituir la esporulación deun diploide homozigóticolytl/IytI. 3.- El rescate alélico dela copia mutada del gen CDC 75 de la estirpe mutante ¡ytl y la construcción de quimeras entre el gen silvestre y la copia mutada(Figura 28), nos mostró quela mutación se encuentra en el marco abierto de lectura y no en el promotor (Figura 28). La quimera construlda con el promotor del gen silvestre y el marco abierto delectura decdcls(iytl) era incapaz de suprimir el defectoen el ciclo mitótico Lyt1. Corno cabe esperar, la quimera construida con el promotor del alelo mutado rescatado y el marco abierto del lectura silvestre si fue capaz cb complementar la mutación de manera similar al gen totalmente silvestre (Figura 29). 4.- La transcripción deCDClsestádisminuida enla estirpe mutante/ytl ni en esporulación (Schweitzer y Philippsen, 1992). En este trabajo, se ha demostrado que en un fondo genético cdc 15, un defecto en Npkl p es reponsable de la parada del ciclo melótico tras la meiosis 1, impidiendo una esporulación normal. Tres datos fundamentan principalmente esta aseveración: 1 . - El hecho que dicho gen sea capaz de complementar sólo el defecto cii esporulación de la cepa diploide homozigótica ‘ye Y cuando se halla integrada una copia silvestre en su locus genómico. Además, colateralmente al experimento anterior, se transformó NFKI (fragmento BamH 1 -BamHl del inserto T7NI) en un vector de bajo número de copias observándose que sólo es capaz de complementar el defectode esporulación Iyt 1, sin ser capaz de suprimir el defectoautolitico ctE 2.- En la estirpe mutante /ytl, NPKI está mutado. Asi se demuestra en el rescate alélico de dicho gen(Figura 30). La construcción de la quimera formada por el extremo 5’ (1-958 pb) del alelo rescatado de la cepa mutantey por él 3’ silvestre <938-1054 ph), mostró que la mutación se halla en las primeras 958 bases del marco abierto de lectura (en las cpe incluyen ochodorninios conservados delos once descritos para las protein-quinasas), puesto que esta construcción fue incapaz de suprimir el defecto de esporulación de la diploide homozigótica ¡ye 1/lyt 1. Comocabía esperar, la quimera construida a partir del extremo 5 del gen silvestre (1-958 pb) y del 3’del alelo rescatado (938-1054 pb), expresada en un vector centroméríco, complementóel defectoen esporulación del mutante ¡yt?, de manera similar al gen NPKI silvestre. 87 Discusión 3.- Se detectauna expresión menor de NPK 1 en una cepa Iyt 1, respecto a una cepa silvestre, lo que indica que la transcripción está disminuida en el ciclo mitótico dela cepa mutante(Figura 24>. Los hechos anteriormente expuestos confirman que Lytl es un fenotipo causado por la mutación de dos genes: CDC? 5 y NPK 1, Es la primera vez que se describe un fenotipo para NPK 1 que, a pesar de no ser un gen especifico de esporulación, puesto que se transcribe en células en ciclo mitótico (como se muestra en el “Northern”), es esencial en esporulación cuanck CDCI5es defectivo. Caberesaltar quesólo la conjunción de ambas mutaciones inhibe el proceso de esporulación, puesto que ninguna de ellas por separado muestra un fenotipoen ciclo meiótico. Se podría hipotetizar, aunque no tenemos evidencias para ello, que ambas quinasas actúen complementariamente sobre un mismo sustrato cuya fosforilación sea esencial para la consecución del ciclo meiótico. De esta manera, se podría justificar que ni la cepa mutante cdcls ni la npkl muestren un ciclo meiótico aberrante y que sólo cuando ambas quinasas son defectivas, como es nuestro caso, no se concluya la esporulación. 2.1 .- ESTUDIO DEL Lytl EN RELACION CON OTROS GENES Y MUTACIONES SF072 fue aislado comogen específico para la esporulación cuyo defectotiene como consecuencia la formación de esporas apomícticas (Malavasic y Elder, 1992>. Posteriormente, fue aislado como supresor del defecto mitótico de la cepa mutante Iytl (Molero et al., 1993) y de dbf2-1 (Johnston et aL, 1990; Parkes et aL, 1992>. Dbf2p es una protein-quinasa que forma un complejo junto con Dbf2Op y Spol 2p con una función esencial en la separación de las cromátidas hermanas en la citoquinesis celular. Tiene una transcripción periódica con un máximo en la fase M; sin embargo, la actividad quinasa medida para esta proteína es posterior a este máximo, no tiene lugar hasta la anafase y está regulada posttradticcionalmente (Johnston etal., 1990; Toyn etal., 1994). Al mismo tiempo se describió una interacción entre Dbf2p y Cdcl 5p, al ser esta última supresora en sobreexpresión del defecto de la primera (Toyn et al., 1994>. Debido a estas interacciones se decidió estudiar la relación entre estos genes y Lytl y, si habla algún tipo de relación con sítí de 5. pombo y 1-itT? humano, que se comentarán posteriormente. Para ello, se transformó una cepa dbf2-7 con CDC 15, T7, SF072, sltl y HLTI, y seestudiósu fenotipoa 37’C durante 24 horas. Como se esperaba, la sobreexpresión de SF012 suprimía el fenotipo Dbf2. Sin embargo, la expresión en un vector de bajo número de copias de CDC7S, COCZS +NPKY o SF0?2 no restituyó un fenotipo silvestre. Paradójicamente, los genes ~eterólogoSsítí y HLT?, que hablan sido aislados por su capacidad de complementar el defecto de esporulación de una cepa mutante homozigótica ¡yt 1/¡yt 1 eran capaces de suprimir parcialmente el fenotipo mitótico termosensible Dbf2. 88 Discusión Este hecho confirma que el defecto iyt 1 de esporulación es similar al defecto dbf2 en división mitótica, y que se debe posiblemente a un defectoen la separación de cromátidas tras la recombinación gótica. Además, otorga un posible mecanismo ch acción a los genes heterólogos aislados, hasta ahora de función desconocidadebido a la falta de homologías con las proteinas depositadas en las bases de datos internacionales. Una segunda apróximación, complementaria a la anterior, para el estudio de estasespistásias fue la transformación la cepa RH21O-3c (MATa, cdcl5, ade2-7, his4, trpl, ura 3, leu2, bar1) (Schweitzer y Philippsen, 1992) con los genes anteriormente utilizados para el estudiodedbf2. El estudio del fenotipo termosensible Cdcl 5 de los transformantes nos reveló que sólo la expresión de SF012 en vectores multicopia era capaz de suprimirlo (además, por supuestode CDCISy CDCI5+NPK1). Sin embargo, se observa una diferencia entre las mutaciones cdcl5y ¡ytl. SF012, sólo cuandoes expresado en un vector multicopia, es capaz de suprimir totalmente el defectomitótico de la estirpe mutante Jyt 1. En el caso de la cepa cdcls, a pesar de qae existe crecimiento a 370C sin observarse lisis, las células presentan un grave defectoen citoquinesis formándose largas cadenas de células que no llegan a separarse. Esta diferencia puededeberse a que el fondo genéticodistirito que poseen ambas cepas, influya, dealguna manera que desconocemos, en acentuar el fenotipo en el casodela cepaRH2lO-3c (cdcl5) pero noen el casodela cepaL2C24d(/Ytl>. Toda esta serie de interacciones nos lleva a proponer una hipótesis de accLón deCdcl5ptantoen la división mitótica comoenla meiótica. En el ciclo mitótico, parece lógico queCdclspactuedemanera que transmita la señal de “citoquinesis”, quizás proveniente de Clb2p, a Dbf2p/Dbf2Op que coordinan la separación de las crométidas hermanas en mitósis. En el ciclo niciótico, Cdcl 5p y Npkl p podrían actuar de manera complementaria, transmitiendo una señal para la separación de cromatídas tras la meiosis 1, de manera similar a c6moio hace CDCIS en mitósis. Esto explicarla que la disfunción conjunta de CDC15 y NPKI hiciera inviable la esporulación, comoocurre en nuestro caso, hecho no descrito hasta ahora. 3.- ESTUDIO DE DOS GENES HETEROLOGOS CAPACES DE COMPLEMENTAR EL DEFECTO DE ESPORULACION Lyt1 3.1.- sltl DE Sch¡zosaCcharOfllYCOS pombo. sití es un gen aislado a partir de una genoteca de cDNA ch SchizosaccharOfllYces pombo que fue transformada en la cepa L2CZ4d con objeto ch buscar genes heterólogoscapaces de complementar el fenotipo Lytl. En el estudio fenotipico de la cepa transformante portadora del gen slt 1, en un vector de sobreexpresión bajo el promotor ADH de Saccharomyces cerevjsiae, se observó que era capaz de complementar el defecto en el ciclo melótico Lytl. Sin embargo, no era capaz de suprimir el defectoen el ciclo mitótico, puesto que la cepa transformante seguía presentando un fenotipo Cdc a temperatura restrictiva, si bien éste no era tan acusado como en la cepa parental (Figura 32), puesto que la lisis decrecía en un 50% tras 8 horas de incubación a la temperatura restrictiva. 89 Discusión La secuencia del inserto aislado reveló la existencia de un marco abierto ch lectura de 433 aminoácidos. El análisis teórico de Sítí p nos muestra una proteína ch 49.546 Kd de peso molecular, altamente hidrofílica y pronostica una estructura secundaria mayoritariamente en hélice alfa. El hecho de que s It 1, que se expresa habitualmente en el ciclo mitótico ch Schizosaccharomyces pombe, como se pudo comprobar por “Northern”, esté complementando un defecto de esporulación en Saccharomyces cerevis¡ae, podría indicar que existe una función paralela tanto en el ciclo mitótico como meiótico, probablemente relacionada con las fases finales de la división del DNA. En nuestro caso al ser defectiva la esporulación por la mutación de NP/O en un fondo genético cdcls, sití podría estar sustituyendo funcionalmente a NPKI o a algún sustrato por ella fosforilado; a pesar de no ser similares en cuanto a su secuencia nucleotídica ni tener en común motivos peptidicos, ni siquiera los motivos conservados de las protein-quinasas que aparecen en NPK 1. Además, la diferencia en el porcentaje del número de viables, en condiciones restrictivas, que se observa en la cepa transformada con sití en comparación con el mutante original, pudiera deberse, aunque no tenemosevidencias para ello, a que sltl podría estar sustituyendo funcionalmente de manera parcial a algún componente en la ruta queinicia COCJS, lo que parcialmente sustituiría su defecto. Existe un proyecto para el estudio funcional de sítí en Schizosaccharomyces pombe, tanto en el ciclo mitótico como en el meiótico. Además, existe también un proyecto para el aislamiento del homo¿ógo funcional del CDC 15 de Saccharomyces cerevisiae, hasta ahora no descrito. Al estar implicada la anafase nuclear así comola citoquinesis, procesos conservados filogenéticamente en células eucariotas, habrían de existir en en Schizosaccharomyces pombe genes similares a los presentes en S. cerevis/aa Al contarcon CDCI5y consití, mediantela “técnica dedoshíbridos” (Fields y Song, 1989) que permite detectar “in vivo” interacción entre proteínas, debeuía ser posible la identificación de proteínas funcionalmente relacionadas con síU, en Saccharomyces cerev¡siae y podría aclarar la función que esta proteína heteróloga está ejerciendo en el ciclo meiótico deesta levadura. 3.2.- HLTI HUMANO. 1-ILTI fue aislado a partir de una genoteca de cDNA proveniente de la linea celular hepática humana HEPG2. Al igual que en el caso de Schizossacharoaiyces pombe, el objeto con el que se transformó esta genotecafue la búsqueda de supresores heterólogos del fenotipoLyt 1 de Saccharoniyces cerevis¡ae. 1-ILTI fue aislado por su capacidad de complementar el defecto que en el ciclo meiótico presenta la estirpe diploide homozigótica lyt 7/Iyt 1. Si bien, se pudo observar que también es capaz de complementar parcialmente el fenotipo Cdc qe presenta en el ciclo mitótico, puesto que la lisis, tras ocho horas de incubación a temperatura restrictiva, es la mitad que la del mutante original, tal y como se muestra en la figura 32. 90 Discusión El inserto aislado es de 1000 pb y no presenta homología con genes anteriormente descritos, ni tan siquiera con NPKIó sítí. La falta de similitud cori otras familias de proteínas, nos hace dudar sobre la posible función de este gen; aunque se podría adelantar que debe actuar de manera similar a NPK 1 (ahora bien, teniendo en cuenta que no presenta estructura de protein-quinasa) o bien sustituyendo funcionalmente al sustrato que NPK 1 fosforile en el ciclo meiótico. HLTI se comporta funcionalmente de manera similar a sit 1, y se puede pensar que ambos estan relacionados con la separación de los cromosomas tras su replicación, principalmente tras la primera división meiótica. El hecho que el defecto de esporulación de la cepa lyt 1 de 5. cerevisiae sea suprimido por dos genes heterólogos, indica que se podría tratar de una función conservada en la escala filogenética, que no debe ser específica de levaduras, sino tratarse más bien de una función general, probablemente relacionada con la separación de cromátidas hermanas en la replicación del DNA. El defectoen el ciclo mitótico, queme confiere un fenotipo Cdc autofltico, se debe posiblemente a un fallo en la citoquinesis, posiblemente debida a una deficiencia en la consecución de la anafase nuclear. El modo de acción de Cdcl Sp esta aún por definir, puesto que las diferentes hipótesis lanzadas por otros grupos trabajan en el mismo area del ciclo celular mitótico (Schweitzer y Philippsen, 1992, Amon st aL, 1993) estan aún por demostrar. Sin embargo, en este trabajo, se ha demostrado, por primera vez, la implicación de CDC5, junto con NPK7, en el ciclo meiótico de Saccharomyces cerev¡siae. 91 CONCLUSIONES Conclusiones 1 -- La estirpe mutante lyt 1 de Saccharomyces tete vJs¡ae presenta des caracteristicas fenotípicas independientes: a.- Un fenotipo Cdc autolitico termosensibie a 37C. b.- Una incapacidad de esporular debido a la parada del ciclo melótico tras la Meiosis 1. 2.- El fenotipo Cdc es debido a una mutación en el marco abierto de lectura del gen CDC 15. Se clonó dicho gen a partir de una genotecagenómica de Saccharomyces cerevisiae y se caracterizó como responsable del defecto cdc de la cepa mutante lytl. El rescate alélico de la copia de CDC) 5 defectiva de la estirpe mutante lyt 1 muestra que la mutación se halla en el marco abierto de lectura y no en el promotor, a pesar que la transcripción de CDC 15 se encuentra disminuida en la cepa mutante Iyt 7. 3.- El defectoen esporulación es debido a una mutación en el gen NPK 1. Este hechose confirmó gracias a la donación y caracterización de dicho gen a partir de una genoteca genómica de Saccharomyces cerevisiae, como supresor de la incapacidad de esporulación de la cepa diploide homozigótica iyti/lyt. El rescate alélico de la copia defectiva de NPKI de la estirpe mutante lytl, muestra que la mutación se halla en el extremo 7 del marco abierto de lectura. 4.- Npklp, protein-quinasa hasta ahora de función desconocida, es imprescindible, en un fondo genético cdc 15, para la consecución del ciclo meiótico y la esporulación en Saccharomyces cerevisiae. 5.- Se ha aislado el gen sítí de Schizosaccharomytes pombe, como supresor del defectomeiótico de la cepa mutante lyt 7 de Saccharomytes cerevisiaa Codifica una proteína de 433 aminoácidos, de función desconocida hasta ahora puesto que no presenta homologías significativas en bancos de datosinternacionales. 6.- Se ha aislado el gen HLTI humano comosupresor del defectomeiótico de la estirpe mutante lytl de Saccharomyces cerevls¡ae. Su secuencia preliminar no ha revelado ninguna homología relevante en bancos de datosinternacioflales. 93 BIBLIOGRAFIA Bibliografía Adams, A., R. M. Johnson, 6. F. Longenecker, 6. F. Sloat, y .1 R. Pr ingle. 1990. CDC42 and CDC43, two additional genes involved in budding and i n the establishment of ceil polarity in Saccharornyces cerevisise. 1 Ccli 8/aL 111:131—142. Amatruda, J. F., D. J. Gattermeir, T. 5. Karpova, y J. A. Cooper. 1992. Effects of nulí mutations and overexpression of capping protein al morphogenesis, actin distribution and polarized secretion in yeast. J. Ccli 8/of. 119:1151-1162. Amon, A., 1. Irniger, y K. Nasmyth. 1994. Closing the celí cycie cicle in yeast: G2 cyclin proteolysis initiated at mitosis persists until the activation of Gí cyclins in the next cycle. Ccli 77:1037-1050. Amon, A., M. Tyers, 8. Futcher, y K. Nasmyth. 1993. Mechariisms That Help the Yeast Celí Cycle Clock Tick: 62 Cyclins Transcriptionally activate G2 Cyclins andRepress 61 Cyclins. Ce¡l7 4:993-1007. Andrews, B. J. y 5. W. Mason. 1993. GeneExpression andtheCell Cycle: A Family Affair. Sc/ence 261:1 543-1 544. Baroni, M., P. Monti, y L. Alberghina. 1994. Repression of growth- regulated Cl cyclin expression by cyclic AMP in budding yeast. Nature 371:339- 342. Barton, AB., C.J. Davis, C.A. III Hutchison y D.B. Kaback. 1992. Cloning of chromosome 1 DNA from Saccharomyces cerevis/ae: analysis of the FUN52 gene, whose product has homologytoprotein kinases. Gene 11 7:1 37-140. Bender, A. y J. R. Pringle. 1989. Multicopy supression of cdcZ4 budding defectin yeast by CDC42 and three newly identified genes including the RAS related geneRSR 1. Proc. NatL Atad ScL USA 86:9976-9980. Bevan, E. A. y W. P. Costello. 1964. The preparation and use of an enzymewhich breaks openyeastasci. Microbiol. GenoL Buil. 21:5. Broach, J. R. 1991. Ras-regulated signaling processes in Saccharoniyces cerev¡siae. Curr. Opin. Gert Dcv. 1:370-377. Brockerhoff, 5. E. y T. N Davis. 1992. Caimodulin concentrates at regions of celí growth in Saccharomycescerev/s/ae. 1 Ccli Biol. 11 8:61 9-62 9. Buckingham, L. E., H. -T. Wang, R. T. Elder, R. M. McCarroll, M. L. Siater y R. E. Esposito. 1990. Nucleotide sequenceand promoter anaiysis of SPO 13, a meiosis specific gene of Saccharomyces cerevis¡ae. Proc. Natt Atad ScA USA 87:9406-9410. Byers, 6. 1981. Re Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. Coid Spring Harbor Laboratory Press, New York. Cabib, E. y A. Duran. 1975. Simple andsensitive procedure for screening yeast mutants that lyse at non-permissive temperatures. .1 Bacteriot 1 24:1 604- 1606. 95 Bibliografía Camonis, J. H., M. Kalekine, 6. Gondré, H. Garreau, E. Boy- Marcotte, y M. Jacquet. 1986. Characterization, cloniflg andsequenceanalysls of the CDC2S gene which controls the cyclic AMP level of SaCchatOmYCOS cerevisfae. EMBOJ., 2:375-380. Chant, J. 1994. CeIl polarity in yeast. TIG 10, 9 Chant, J., 1<. Corrado, J. R. Pringle, y 1. HerSkOWitZ. 1991. Yeast BUD5, Encoding a Putative GDP-GTP Exchange Factor, Is NeCO5sarY for Bud Site Selection andlnteractswith BudFormation Gene BEMY. Cefl6 5:1213-1224. Chant, J. y 1. Herskowitz. 1991. Genetic Control of Bud Site Selection in Yeast by a Set of Gene Products That Constitute a Morphogefletic Pathway. Ce¡¡ 65:1203-1212. Chant, J. y J. R. Pringie. 1991. Budding and Ceil polarity in Saccharomyces cerevis/Be. Curr. Cpb,. Gen. Dey. 1:342-3 50. Cid, V. J., A. Duran, F. de Rey, C. Nombela, y M. Sanchez. 1995. The molecular basis of ceil ¡ntegrity and morphogenesis in Saccharntiiytes cerevisiae (sometido a revisión). Cid, y. J, M. Sanchez, y C. Nombela. 1 994. Characterization of thermosensitive autolytic mutants from di ploid Saccharcmyces corevisiae, Microbiol 140:559-568. Cross, F. R - 1988. DAFí, a mutant gene affecting size control, pheromone arrest, andcell cycle kinetics of Saccharoniycescerev¡s¡ae. Mcl. CeIL B/ol. 8:4675- 4684. Cross, F. R. y A. H. Tinkelenberg. 1991. A Potential Positive Feedback Loopcontrolling CLN1 and CLN2 gene Expression at the Start of the Yeast Celí Cycie. Ce/¡6 5:875-883. Davis, L. G., M. 0. Dibner, y J. F. Battey. 1986. Basic Methods it Molecular Biology. Elsevier Science Publishing Co., New York. de la Fuente, J. M., A. Alvarez, C. Nombela, y M. Sanchez. 1992. Flow cytometric analysis of Saccharomyces cerevisiae autolytic mutants and protoplasts. Yeast 8:39-45. Deshaies, R. J., V. Chau, y M. K¡rschner. 1995. Ubiquitination ofthe Gí cyclin Cln2p by a Cdc34p-dependent pathway. EMBO JI 4 , 2:303-31 2. Dirick, L., T. Molí, H. Auer, y K. Nasmyth. 1992. A central role for SWI6 in modulating celí cycle start-specific transcription it yeast. Nature 357:508-513. Dirick, L. y K. Nasmyth. 1991. Positive feedback in the activation of Cl cyciins in yeast. Nature 351:754-757. 96 Bibliografía Dohrmann, P. R., 6. Butíer, K. Tamai, 5. Dorland, J. R. Greene, D. J. Thiele, y O. J. Stiilman. 1992. Parallel Pathways of Gene Regulation: Homologousregulators SW/¡5 and ACE2 differentially control Transcription of ¡-U and Chitinase. Genes&Dcv. 6:93-104. Dower, W. J., J. F. Miller, y C. W. Ragsdale. 1988. High efficency transformation of E. co¡¡ by high voltage electroporation. Nucle¡c Acids Res 16:6127-6145. Drubin, O., K. Miller, y O. Botstein. 1988. Yeast actin binding proteins: evidence for a role in morphogenesis. J. Cel¡ B¡o¡. 1 07:1141-11 54. Epstein, C. B. y F. R. Cross. 1992. CLBS: a novel B cyciin from buding yeastwith arole En 5 phase. Genes& Dey. 6:1695-1706. Evans, T., E. T. Rosenthal, J. Youngbom, D. Distel, y T. Hunt. 1983. Cyciin: a protein specified by maternal mRNA in sea urchin eggs that i s destroyed at each cleavage division. Ccl) 3 3:389-396. Feinberg, A. P. y B. Vogelstein. 1984. A technique for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Addendum. AnaL B¡ochemest¡y. 137:266-267. Fields,S. y O. Song 1989. Anovel geneticsystemtodetectproteifl-prOteirl interactions. Nature. 340:245-246. Finegoid, A. A. 1991. Proc. NatA AcatÉ Sc!. USA 88:4448-4452. Fink, 6. R. 1971. Methodsin enzymology. Vol. XVII. Academic Press, New York, London. Fitch, 1., C. Dahmann, U. Surana, A. Amon, K. Nasmyth, L. Goestch, B. Byers, y B. Futcher. 1992. Characterization of Four B-type Cyclin Genes of the Budding Yeast Saccharomyccscerevis¡ae. Mo). 8/o). CeIl 3:805-81 8. Ford, 5. K. y U. R. Pringle. 1991. Cellular morphogenesis in the Saccharomyces cerev¡s/ae Celí cycle: localization of the CDC?? gene product and the timing of events at the budding site. Dcv. Gcnet. 1 2:281 -292. Glotzer, M., A. W. Murray, y M. W. Kirschner. 1991. Cyclir is degradedby the ubiquitin pathway. Nature 349:1 32-1 38. Grandin, N. y 5. 1. Reed. 1993. Differential Function andExpression of Saccharoniyces cerevisiae B-Type Cyclins it Mitosis and Meiosis. Alo). Ce)). 8/o!. 13, 4:2113-2125. Jones D.G.L. y U. Rosamond. 1990. Gene9O:87-92. Hadwiger, U. A, C. Wittenberg, M. Richardson, M. De Barros Lopes, y 5. 1. Reed. 1989. Afamily of cyclin homologsthat control the Gí phase in yeast. Proc. NatA AcatÉ Sct USA 86:6255-6259. 97 Bibliografla Hanahan, D. 1985. Techniques for transformation of E. coil, p. 120-121. In O. M. Glover (ed.>, DNA Cioning. RL Press, Oxford, England. Hartweli, L. H. 1970. Periodic Density Fluctuation During the Yeast Gemí Cycle andtheSelection of Synchronous Cultures. 1 Bacterioh 104, 3:1280-1285. Hartweil, L. H. 1974. Saccharomycescerev/siacCell cycle. Bacteriolog!cal Rey. 3 8:164, Hartwell, L. H. 1978. Gemí division from a genetio perspective. J. Ceil 8/o). 7 7:627-637. Hartwell, L. H. 1994. cAMP[ng outNature37 1:286. Herskowitz, 1. 1988. Life Cycle of the Budding Yeast Saccharornyces cero y¡siae. M/crobiol. Rey. 52, 4:536-553. Holmes, D. 5. y M. Quigley. 1981. A rapid boíling method for the preparation of bacterial plasmids. AnaL B/ochcrn. 11 4:1 93-1 97. Ito, H., Y. Fukuda, 1<. Murata, y A. Kim ura. 1983. Transforrnation of intactyeastCells treatedwith aikali cations. J. Bacter/oI. 1 53:163-168 Johnson, 0. 1. y J. R. Pringle. 1990. Molecular characterization of CDC42, a Sacctiaromyces cerevisiae gene involved it the development of Celí polarity. J. Ce)) Biol. 111:143-152, Johnston, L. II. 1992. Gemí cycle control of gene expression in yeast. Trcnds Cotí Blol 2:353-357. Johnston, M. y R. W. Davis. 1984. Sequencesthatregulate the divergent GAL?- GALlO promotor in Saccharomyces cerev/s¡ae. Mo). CeIL 8/o!. 4:1 440-1 448. Johnston, L. H., S.L. Eberiy, J.W. Chapman, 8. Araki, y A. Sugino. 1990. The product of the Saccharomyces cercvisiae Celí Cycle Gene DBF2 Has Homology with Protein Kinases and Is Periodically Expressed in tha Celí Cycle. M.C.B. 10,4:1358-1 366. Jonhston, J. R. y R. K. Mortimer. 1959. Use of snail digestivejuice in isolation of yeast spore tetrads. J. Bacteriot 78:292. Kilmartin, J. y. y A. E. M. Adams. 1984. Structural rearrangements of tubulin and actin during the Celí cycle of Saccharomyces cercvis¡’ae. J. Ccli 8/ok 98:922-933. Kim, H. B., B. 1<. Haarer, y J. R. Pringle. 1991. Cellular morphogenesis in the Saccharoniyces cercvisiae Celí cycle:localization of the CDC3 gene product and the timing of events at the budding site. .1. Ce)) Biol. 11 2:535-544. Koch, C., T. Molí, M. Neuberg, H. Ahorn, y K. Nasmyth. 1993. A Role for the Transcriptior’ Factors Mbpl and Swi4 in Progressiot from 01 to S Phase. Sc/ence :1551-1 557. 98 U Bibliografía Koch, C. y K. Nasmyth. 1994. Celí cycle regulated transcriptor’ in yeast. Curr Qpin Ce)) Biol6:451-459. Kúhne, C. y P. Linder. 1993. A new pair of B-type cyclins from Saccharomyces cerevis¡ae that function early it the Celí cycle. EMBO J 1 2, 9:3437-3447. Lagunas, R. y C. Gancedo. 1983. Role of phosphate it the regulation of the Pasteur effect in Saccharomyces cerevisjae. Eur J. Bici :479-48 3. Lew, O. J. y 5. 1. Reed. 1992. Aproliferation of cyclins. Trends Ce)) Bici 2:77-81 - Lillie, 5. H. y 5. 5. Brown. 1994. J Cefi BicI. 125:825-842. Lydall, D., G. Ammerer, y K. Nasmyth. 1991. Anew role for A4CAIY ir’ yeast: Celí Cycle regulation ofSWl5transcription. Genes& Dey. 5:2405-2419. L6rincz, A. y 5. 1. Reed. 1984. Primary structure homology between the product of the yeast division control gene CDC28 and vertebrate oncogenes~ Nature 307:183-185. Madden, K., C. Costigan, y M. Snyder. 1992. Gemí polarity and morphogenesis Es Saccharomycescerevisiae. Trends Ce)! BicI 2:22-29. Malavasic, M. J. y R. T. Elder. 1990. Compiementary transcripts from two genes necessary for normal meiosis ir’ the yeast Saccharomyces cerevislee. Mc). CoIL Biol. 10:2809-2819. Malone, R. E. 1990. Dual regulation of meiosis ir’ yeast. Ccli 61:375- 378. Miller, J. J - 1989. Sporulation on Saccharomyces cerevislee, p. 489- 550. Ir’ A. H. Rose andJ. 5. Harrison (ed.), TheYeasts. AcademicPress, Ltd., London. Molero, G. 1992. Caracterización de un gen especifico de esporulación camz de complementar una mutación que determina fenotipo autolítico en ciclo mitótico ch Saccharomycescerevisiae. Tesis Doctoral - U. C. M. - Molero, G., M. Yuste-Rojas, A. Montesi, A. Vazquez, C. Nombela, y M. Sánchez. 1993. A cdc-Like Autolytic Saccharcniyces cerevisiae Mutant Altered it Budding Site Selection Is Complementedby SF012, a Sporulation Gene. J. Bacerioh 1 72,2 0:6562-6570. Molí, T., G. Tebb, U. Surana, H. Robitsch, y K. Nasmyth. 1991. The role of phosphoryiation and the CDC28 protein kinase in Ceil cycre-regulated nuclear import of the Saccharomyces cerev¡siae transcription factor 5w15. Ce!) 66:743-758. Munder, T., M. Mink, y H. KOntzel. 1988. Oomains of the Saccharomyces cerevisiae CDC25 gene controlling mitosis and meiosis. AoL Gen. Genet2l 4:271-277. 99 U Bibliografía Murray, A. W. y T. Hunt. 1993, The Celí cycle: an ititroductior’. Oxford University Press, New York. Nash, R., G. Tokiwa, S. Anand, K. Ericksot, y B. Futcher. 1988. The WHI 1 + geneof Saccharomycescerey¡siao tethers Celí division to Ccli size and i s acyclin homolog.EMBOJ 7:4335-4346. Nasmyth, K. 1993. Regulating the ¡-O endonuclease ir’ yeast. Curn Opin. Gen. Dey. 3:286-294. Nasmyth, K. y L. Dirick. 1991. The role of 51484 and SWIG Ir’ the activity of Gí cyciir’s ir’ yeast. CelJ66:995-101 3. Nasmyth, K. y T. Hunt. 1993. Damsandsluices. Natura 366:634-635. Nombela, C. y C. Santamaría. 1984. Genetics of yeast Ccli wall autolysis, p. 249-260. Ir’ C. Nombela (ed.), Microb[al Celí wall synthesis art autolysis. Elsevier Science, Amsterdam. Ogas, J., 8. J. Andrews, y 1. Herskowitz. 1991. Transcriptional activation of CLN, CLN2 and a putative new Gí cyclin (HCS2B) by 5W14, a positive regulator of Cl -specific transcription. CalI 66:101 5-1026. Ogur et al. 1957. Sc/ence 1 25:928. Park, H-O., J. Chant, y 1. Herskowitz. 1993. BuD2encodesa GiPase- activating protein for Budl/Rsrl r’ecessary for proper bud-site selection En yeast. Natura 36 5:269-274. Parkes, y. y , L.H. Johnston.1992. SF072 and SIT4 suppress mutations ir’ DBF2, which encodesa celí cycle proteir’ kinase that is periodicaily expressed. Nucle¡c. Ac.Research. 20, 21:5617-5623. Quinlan, R. A., C. 1. Pogson, y K. GuIl. 1980. The influence of the microtubule inhibitor, methyl benzimidazol-2-yl-carbamate (MBC> on nuclear division andtheCell cycle in Saccharomycescereidsiae. J Cali. Sc). 46:341-352. Reed, 5. 1.1991. TIG7:95-99. Reed, S. 1 - 1992. The role of p34 Kinases on the Cl to S-phase transition. Annu.Rev. CalI 8/01. 8:529-561. Ron, 0. 1993. NewB¡oI. 37 2:379. Santamaría, C. 1985. “Aislamiento y caracterización de mutantes de 5. cerevis¡ae alterados en los mecanismos de autólisis de la pared celular”. Tesis Doctoral. Ur’iv. Complutense, Madrid. Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis. 1989. Molecular Clor’ing: a laboratory manual. Coid Spring Harbor Laboratory Press, New York. 100 8 ¡ U Iiog rafia Schweitzer, B. y P. Philippsen. 1991. CDCT5, An Essentiai Celí Cycle Gene ir’ Saccharomyces cerevisise, Encodes a Protein Kinase Domain. Yeast 7:265 - 273. Schweitzer, B. y P. Philippsen. 1992. NPKI, a nonessential protein kinase gene ir’ Saccharomyces cera yis¡ae with similarity to Asperg/IIus nidulans nimA. Mo). Gen. Genet234:164-1 67. Schwob, E. y K. Nasmyth. 1993. CLB5andCLBB, anew pair of B cyclir’s involved ir’ DNA replication ir’ Saccharoniyces cera y/siae. Genes & Dcv. 7:1 1 60- 1175. Sherman, F., G. R. Fink, y B. Hicks. 1983. Methods ir’ yeast genetics. Coid Spring Harbor Laboratory Press, New York. Síater, M. L. 1973. Effect of reversible inhibition of deoxiribonucleic acid synthesis ontheyeastCell cycle. 1 Bacteria!. 11 3:263-270. Snyder, M., 5. Gehrung, y 6. 0. Page. 1991. Studies Concerr’irig the Temporal ar-id Genetic Control of Cali Polarity in Saccharomyces cera vis/aa. 1 CalI 8/oh 114, 3:515-532. Struhl, K., O. T. Stinchcomb, 5. Scherer, y R. W. Davis. 1979. High-frequency transformation of yeast: autonomus replicatior’ of hybrid DNA molecules. Proc. Natí. AcatÉ Sc). USA 76:1035-1039. Surana, U., A. Aman, C. Dowzer, J. McGrew, B. Byers, y K. Nasmyth. 1993. Destructior’ of the CDC28/CLB mitotic kinase is not required for the metaphasetoanaphasetransition ir’ budding yeast. EMBO .112, 5:1969-1978. Tebb, G., T. Molí, C. Dowzer, y K. Nasmyth. 1993. 514/15 ir’stability may be necessary but is not sufficient for asymmetric FO expression ir’ yeast. Genes &Dey. 7:517-528. Timsor’, J. 1975. Mutation Resaarch 32:115. Toda, T., 5. Cameron, P. Sass, M. Zoller, y M. Wigier. 1987. Three different genes ir’ Saccharomyces cerayisiae encode the catalytic subunits of the AMPc-dependent proteim kinase. CalI 50:277-287. Tokiwa, G., M. Tyers, T. Voipe, y B. Futcher. 1994. Inhibitor of Gí cyclir’ activity by the Ras/cAMP pathway ir’ yeast. Natura 37 1:342-345. Torres, L., H. Martin, M.l. García-Saez, J. Arroyo, M. Molina, M. Sánchez and C. Nombela. 1991. Aprotein Kir’ase genecomplementsthelytic phenotype of Saccharomyces carevis/ae lyt2 mutar’ts. Mo). Al/crob/oI. 5: 2 845- 2954. Toyn, J.H. y, L.H. Jonhstor’. 1993. Spol 2 Is a Limiting Factor That lnteracts With the Cali Cycle Protein Kinases Dbf2 and Dbf2O, Wich Are mnvoived ir’ Mitotic Chromatid Disjur’ctior’. Genatics 1 35: 963-971. 101 Bibí logra fía Toyn, J.H. y, L.H. Jonhston. 1994. The Dbf2 and Dbf2O protein kinases of budding yeast are activated after the metaphase to anaphase ceil cycie transition. EMBOJ.13, 5:1103-1113. Treisman, R. y 6. Ammerer. 1992. The SRF and MCM1 transoription factors. Curr. Op/a. Gen. Dey. 2:22 1-226. Tyers, M., 6. Tokiwa, y 6. Futcher. 1993. Comparison of the Saccharomycas carevisiae Cl cyclins: C1n3 may be an upstream activator of Uní, Cln2 andothercyclins. EMBOJ 12,5:1955-1968. Wheals, A. E. 1987. The Yeasts. Academio press, Inc., London. Wittenberg, C. y 5. 1. Reed. 1988. Control of the yeast Celí cycle is associated with assembly/disassembly of the CdcZ8 protein kinase complex. Cali 5 4:1 06 1 -1 072. Yaglom, J., M. H. K. Lir’skens, S. Sadis, O. M. Rubin, B. Futcher, y D. Finley. 1995. p34Cdc2B-Mediated Control of Cln3 Cyclin Degradation. Mo). CeIL Rio). 15, 2:731-741. Yanisch-Perron, C., J. Vieira, y J. Messing. 1985. improved Ml 3 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the Ml 3mpl 8 art pUCl9vectors. Gane33:109-119. Zher’g, Y., R. Cerione, y A. Bender. 1993. Control oftheyeast bud-site assembly GTPaseCdc42.J. Rio!. Chem 269:2369-2372. Ziman, M. 1991. MoL Cali. Biol. 11:3537-3544. Ziman, M. 1993. MoL CeIL Biol. 4:1207-1316. 102 Tesis María Yuste Rojas IMPLICACIÓN DE LOS GENES CDC15Y NPK1 EN EL FENOTIPO AUTOLÍTICO Lyt1 DE Saccharomyces cerevisie Y AISLAMIENTO DE DOS GENES... AGRADECIMIENTOS ABREVIATURAS ÍNDICE I.- INTRODUCCIÓN Genes que afectanal ciclo celular que se citan en este trabajo 1.- CICLO BIOLÓGICO DE Saccharomyces cerevisiae 2.- LA RESPUESTA A NUTRIENTES MEDIADA POR L VÍA Ras-AMPc 3.- MORFOGÉNESIS DE Saccharomycos cerevisiae 4.- CONCEPTO DE INTEGRIDAD Y AUTOLISIS II. MATERIALES Y MÉTODOS 1.- MICROORGANISMOS Y MATERIAL GÉNICO UTILIZADOS 2.- MEDIOS DE CULTIVO 3.- MANIPULACIÓN DE MICROORGANISMOS 4.- MANIPULACIÓN DE DNA. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR III.- RESULTADOS OBJETIVO DEL PRESENTE TRABAJO 1.- CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LA CEPA MUTANTE Iyt 1 2.- CLONACIÓN DEL GEN ESTRUCTURAL RESPONSABLE DEL FENOTIPO Lyt1 3.- CARACTERIZACIÓN DE GENES HETEROLOGOS SUPRESORES DEL FENOTIPO Lyt1 4.- INTERACCIÓN DEL Lyt1 CON OTROS GENES RELACIONADOS III.- DISCUSIÓN 1 .- ANÁLISIS DE LAS CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS DE LA ESTIRPE Iyt 1, UN MUTANTE cdc DE Saccharomyces cerevisiae 2.- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LOS GENES RESPONSABLES DEL FENOTIPO Lyt1 3.- ESTUDIO DE DOS GENES HETEROLOGOS CAPACES DE COMPLEMENTAR EL DEFECTO DE ESPORULACIÓN Lyt 1 IV.- CONCLUSIONES V.- BIBLIOGRAFÍA KÑ: PÇ: P: PO: