UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID 
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 

 
 

  
 
 

TESIS DOCTORAL 
 
 

Nanoliposomas a partir de productos naturales infrautilizados 
y residuos agroalimentarios como ingrediente funcional en 

alimentos 
 
 

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR 
 

PRESENTADA POR 
 

Daniel Marín Peñalver 
 

Directora 
 

M. Pilar Montero García 
M. Carmen Gómez Guillén 

Ailén Alemán Pérez 
 

Madrid 
 
 
 

© Daniel Marín Peñalver, 2019 



Daniel Marín Peñalver

11111

Madrid 2019

FACULTAD DE BIOLOGÍA
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

CSIC
CONSEJO SUPERIOR DE 

INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

DE ALIMENTOS Y NUTRICIÓN

TESIS DOCTORAL

Nanoliposomas a partir de productos

naturales infrautilizados y residuos

agroalimentarios como ingrediente

funcional en alimentos

Directores: M. Carmen Gómez Guillén
                 M. Pilar Montero García 

        Ailén Alemán Pérez

Daniel Marín Peñalver



 

   



 

   

 

 

 

 

 

 

Tesis Doctoral 
 

NANOLIPOSOMAS A PARTIR DE PRODUCTOS 

NATURALES INFRAUTILIZADOS Y RESIDUOS 

AGROALIMENTARIOS COMO INGREDIENTE 

FUNCIONAL EN ALIMENTOS 

 

Daniel Marín Peñalver 

 

TUTOR: Elena Pérez‐Urría Carril  

Departamento de Fisiología Vegetal. Universidad Complutense de Madrid 

(UCM)  

 

DIRECTORAS: María Pilar Montero García 

                María del Carmen Gómez Guillén 

                Ailén Alemán Pérez 

Grupo INNOVAPESCA. Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición 

(ICTAN). Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). 

 

 

Madrid 2019 

 

INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
DE ALIMENTOS Y NUTRICIÓN 

CONSEJO SUPERIOR DE 
INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

CSIC 

FACULTAD DE BIOLOGÍA 
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID



 



D./Dña.________________________________________________________________ 
con número de DNI/NIE/Pasaporte ____________________, estudiante en el Programa 
de Doctorado __________________________________________________________, 
de la Facultad de _____________________________ de la Universidad Complutense de 
Madrid, como autor/a de la tesis presentada para la obtención del título de Doctor y 
titulada: 

y dirigida por: 

DECLARO QUE: 

La tesis es una obra original que no infringe los derechos de propiedad intelectual ni 
los derechos de propiedad industrial u otros, de acuerdo con el ordenamiento jurídico 
vigente, en particular, la Ley de Propiedad Intelectual (R.D. legislativo 1/1996, de 12 de 
abril, por el que se aprueba el texto refundido de la Ley de Propiedad Intelectual, 
modificado por la Ley 2/2019, de 1 de marzo, regularizando, aclarando y armonizando 
las disposiciones legales vigentes sobre la materia), en particular, las disposiciones 
referidas al derecho de cita. 

Del mismo modo, asumo frente a la Universidad cualquier responsabilidad que 
pudiera derivarse de la autoría o falta de originalidad del contenido de la tesis presentada 
de conformidad con el ordenamiento jurídico vigente. 

En Madrid, a ____  de _________________________ de 20___ 

Fdo.: _______________________________ 

Esta DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y ORIGINALIDAD debe ser insertada en 
la primera página de la tesis presentada para la obtención del título de Doctor.

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y ORIGINALIDAD DE LA TESIS 
PRESENTADA PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE DOCTOR 





 

 

 

 

 

 

 

 

 

La Dra. María Pilar Montero García,  la Dra. María del Carmen Gómez Guillén y  la Dra. Ailén 
Alemán Pérez, del Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN) adscrito al 
Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC),  

Certifican:  

Que  la  presente  memoria  titulada:  “Nanoliposomas  a  partir  de  productos  naturales 
infrautilizados y residuos agroalimentarios como  ingrediente  funcional en alimentos” ha sido 
realizada por el doctorando D. Daniel Marín Peñalver, bajo su dirección en las instalaciones del 
grupo INNOVAPESCA del ICTAN, y autorizan su presentación para la defensa de tesis y optar al 
grado de Doctor por la Universidad Complutense de Madrid.  

Y para que así conste a  los efectos oportunos, firman  la presente en Madrid, a 16 de abril de 
2019.  

 

 

 

                      

 

 

Dra. María Pilar Montero García         Dra. María del Carmen Gómez Guillén          Dra. Ailén Alemán Pérez 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



PROYECTOS ASOCIADOS A LA TESIS DOCTORAL 

Esta  tesis  doctoral  ha  sido  diseñada  y  llevada  a  cabo  gracias  a  la  financiación  de  distintos 
proyectos nacionales por parte del Ministerio de Economía  y Competitividad,  siendo dichos 
proyectos los mencionados a continuación: 

 Proyecto  INTRAMURAL‐201370E036.  “Aprovechamiento  de  subproductos  pesqueros 
como fuente de nuevos productos”. 01/02/2013 – 31/01/2016. 
 

 Proyecto  AGL‐2014‐52825  (HALOFISH).  “Aprovechamiento  de  plantas  halófilas  del 
litoral y “descartes” de  la pesca para el diseño y desarrollo de productos pesqueros 

funcionales”. 01/01/2015 – 31/12/2028.  
 

 Proyecto  AGL‐2017‐84161‐C2‐1‐R  (NANOALIVAL). “Diseño  de  sistemas 
nanoparticulados a partir de residuos marinos y recursos vegetales alternativos para el 
desarrollo  de  alimentos  dirigidos  a  la  prevención  de  enfermedades”.  01/01/2018  – 
31/12/2020. 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AGRADECIMIENTOS 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 





Agradecimientos 

 

En  primer  lugar,  quería  agradecer  a  la  Universidad  Complutense  de  Madrid  y,  más 
concretamente, al Departamento de Fisiología Vegetal perteneciente a la Facultad de Ciencias 
Biológicas su compromiso con el programa de Doctorado en Biología, permitiéndome ampliar 
mi  formación  y  conocimientos mediante  el  desarrollo  de  una  tesis  doctoral,  con mención 
especial a la Dra. Elena Pérez‐Urría Carril por su apoyo y consejo, no sólo como tutora de tesis 
sino también como amiga.  

En segundo lugar, quería agradecer al Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición 
(ICTAN) perteneciente al Consejo Superior de  Investigaciones Científicas  (CSIC)  la posibilidad 
brindada para desempeñar  la tesis doctoral en sus  instalaciones, así como a otros centros de 
investigación  (Centro  de  Investigaciones Biológicas,  CIB)  o Unidades  de  Servicio  (Unidad  de 
Servicio de Técnicas Analíticas, USTA) los servicios prestados. Y aquí tiene lugar mi más sentido 
agradecimiento a las tres personas que realmente han hecho esto posible y que han estado ahí 
desde el primer día hasta el último, que depositaron su confianza en mí desde un principio y 
ésta no ha flaqueado en ningún momento. Por supuesto me refiero a mis directoras de tesis 
María Pilar Montero García, María del Carmen Gómez Guillén y Ailén Alemán Pérez. Gracias por 
permitirme realizar esta tesis doctoral bajo vuestra excepcional supervisión.  

En tercer lugar, quería dar las gracias al Grupo INNOVAPESCA perteneciente al Departamento 
de Productos (ICTAN‐CSIC) su fraternal acogida y enormes facilidades prestadas, las cuales han 
hecho mi  estancia  enormemente  agradable.  En  este  caso me  refiero  al Dr. Óscar Martínez 
Álvarez, la Dra. Elvira López Caballero, el Dr. Joaquín Gómez Estaca, Ignacio Escudero Abad, Alicia 
Sánchez Faure y Javier Dolz Martín, sin los cuales este proyecto no habría sido posible.  

No me olvido de todas aquellas personas que trabajan en el ICTAN (y CIB) que en algún momento 
me han brindado su ayuda y de aquellas que temporalmente han pasado por los laboratorios 
del Grupo  INNOVAPESCA durante mi estancia y que, de un modo u otro, han contribuido al 
desarrollo de esta tesis. Especial mención para Diego Taladrid Gandía y para Selene Pérez García, 
con quienes compartí intensas pero gratificantes mañanas y tardes de trabajo.  

Por último, agradecer el  incondicional apoyo  recibido por parte de mis compañeros de piso, 
quienes entendieron perfectamente mis largas hibernaciones en mi habitación; de mis padres, 
que aun a día de hoy estarían dispuestos a pagarme otra carrera que no fuera Biología para no 
acabar el resto de mi vida en el paro; de mi hermano y mi cuñada, que siempre estuvieron ahí 
para lo que necesitase; del resto de mi familia y de incontables amigos (destacando a Cristian 
Mateo y David Lapuente, así como a Ernesto, María y Mónica en Madrid y a mis “hermanos” en 
Murcia), que han conseguido que esta larga y dura travesía que es el doctorado fuese un poco 
más amena gracias a su amistad y fidelidad. Muchas gracias a todos.   

Mi tesis doctoral va dedicada a todos los nombrados anteriormente, y en especial a dos seres 
queridos que me abandonaron al comienzo de este camino. A mi abuela, Ana Conesa Ros, por 
todo el cariño que me dio, y a mi padrino, Juan Peñalver Conesa, que te fuiste demasiado pronto. 
Ojalá siguierais aquí para verme avanzar en la vida.  

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ÍNDICE 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Índice 

1. RESUMEN .................................................................................................................................. 1

2. ABSTRACT .................................................................................................................................. 5

3. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 9

3.1. Alimentos del siglo XXI ..................................................................................................... 11 

3.2. Aprovechamiento de materias primas residuales ........................................................... 12 

3.2.1. Residuos de la acuicultura y la pesca ....................................................................... 13 

3.2.2. Residuos agroalimentarios ....................................................................................... 15 

3.3. Encapsulación de compuestos bioactivos: liposomas ..................................................... 17 

3.3.1. Estabilización de liposomas ...................................................................................... 23 

3.3.2. Aplicaciones y regulación de la utilización de liposomas para alimentación ........... 24 

3.3.3. Absorción de nutrientes ........................................................................................... 26 

3.4. Incorporación de liposomas en matrices alimentarias .................................................... 28 

3.4.1. Incorporación en músculos de pescado ................................................................... 29 

3.4.2. Incorporación en películas comestibles ................................................................... 32 

3.5. Digestión gastrointestinal in vitro .................................................................................... 34 

3.6. Técnicas experimentales .................................................................................................. 36 

4. HIPÓTESIS ................................................................................................................................ 43

5. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 47

6. DISEÑO EXPERIMENTAL .......................................................................................................... 51

6.1. Purificación de fosfatidilcolina ......................................................................................... 53 

6.2. Estandarización de liposomas .......................................................................................... 53 

6.3. Extractos bioactivos procedentes de residuos ................................................................ 53 

6.4. Desarrollo de liposomas rellenos con bioactivos............................................................. 54 

6.5. Absorción intestinal ......................................................................................................... 54 

6.6. Aplicación en alimentos ................................................................................................... 54 

7. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................ 59

7.1. Obtención de las materias primas ................................................................................... 61 

7.2. Obtención de los extractos bioactivos ............................................................................. 61 

7.3. Elaboración de liposomas ................................................................................................ 62 

7.4. Estabilización de liposomas ............................................................................................. 63 

7.5. Aplicación de liposomas en matrices alimentarias .......................................................... 63 

7.6. Digestión gastrointestinal in vitro .................................................................................... 64 

7.7. Caracterización de materias primas ................................................................................ 65 

7.8. Caracterización de extractos bioactivos .......................................................................... 67 

7.9. Caracterización de liposomas .......................................................................................... 69 

7.10. Caracterización de homogeneizados y geles de músculo .............................................. 72 

7.11. Caracterización de películas .......................................................................................... 74 

7.12. Caracterización de los productos de la digestión gastrointestinal in vitro .................... 76 

7.13. Actividades biológicas .................................................................................................... 77 

7.14. Análisis estadístico ......................................................................................................... 78 

8. RESULTADOS ....................................................................................................................... 79

CAPÍTULO 1. PURIFICACIÓN DE FOSFATIDILCOLINA Y ESTANDARIZACIÓN DE LIPOSOMAS .. 81 

  8.1. Efecto de la composición química y del proceso de sonicación en las  propiedades de 

liposomas de lecitina de soja de grado alimentario con glicerol añadido ......................... 83 



Índice 

CAPÍTULO  2.  ENCAPSULACIÓN  DE  COMPUESTOS  BIOACTIVOS  MEDIANTE  LIPOSOMAS  DE 
FOSFATIDIL COLINA DE LECITINA DE SOJA ....................................................................... 107 

8.2. Encapsulación de compuestos procedentes de residuos alimentarios en liposomas de 

fosfatidilcolina de  soja:  efecto  de  la  liofilización,  estabilidad  de  conservación  y  aptitud 

funcional ........................................................................................................................... 109 

8.3.  Encapsulación  de  extractos  antioxidantes  acuosos  y  etanólicos  de  hinojo marino 

(Crithmum maritimum) en liposomas de fosfatidilcolina de soja liofilizados .................. 131 

8.4. Bioaccesibilidad y absorción intestinal in vitro de un extracto acuoso de hinojo marino 

(Crithmum maritimum) encapsulado en liposomas de fosfatidilcolina de soja ............... 147 

CAPÍTULO 3. APLICACIÓN DE LIPOSOMAS EN PRODUCTOS REESTRUCTURADOS ................ 155 

8.5.  Agregación  proteica,  agua  ligada  y  gelificación  térmica  de  músculo  de  merluza  

homogeneizado con sal en presencia de liposomas de fosfatidilcolina de soja con glicerol 

sometidos a diferentes tratamientos de estabilización ................................................... 157 

8.6. Agregación proteica, agua ligada y gelificación térmica de músculo de merluza de baja 

calidad funcional homogeneizado con sal en presencia de liposomas de fosfatidilcolina de 

soja con trealosa sometidos a congelación‐descongelción y liofilización ........................ 177 

8.7. Liposomas de fosfatidilcolina liofilizados encapsulando varios extractos antioxidantes 

a partir de residuos naturales como ingredientes funcionales en geles de surimi .......... 191 

CAPÍTULO 4. APLICACIÓN DE LIPOSOMAS EN PELÍCULAS COMESTIBLES ............................. 213 

8.8. Cambios en la integridad estructural de las películas de caseinato de sodio mediante 

la adición de nanoliposomas que encapsulan una fracción péptidica activa de  langostino 

(Penaeus notialis) ............................................................................................................. 215 

8.9.  Películas  de  carboximetilcelulosa  conteniendo  nanoliposomas  encapsulando  un 

hidrolizado  de  colágeno  con  capacidad  inhibitoria  de  la  enzima  convertidora  de 

angiotensina ..................................................................................................................... 227 

9. DISCUSIÓN INTEGRADORA .................................................................................................... 237

9.1. Materias primas ............................................................................................................. 239 

9.1.1. Residuos agroalimentarios y pesqueros ................................................................. 239 

9.1.2. Propiedades saludables y/o bioactivas .................................................................. 239 

9.1.3. Lecitina y fosfatidilcolina ........................................................................................ 240 

9.1.4. Extractos bioactivos ................................................................................................ 242 

9.2. Liposomas ...................................................................................................................... 246 

9.2.1. Dispersiones liposomales vacías ............................................................................. 247 

9.2.2. Dispersiones liposomales rellenas .......................................................................... 248 

9.3. Estabilización de liposomas ........................................................................................... 254 

9.3.1. Liposomas vacíos .................................................................................................... 254 

9.3.2. Liposomas rellenos ................................................................................................. 260 

9.4. Absorción intestinal ....................................................................................................... 273 

9.5. Aplicación de liposomas en reestructurados de pescado ............................................. 274 

9.5.1. Importancia del estado de hidratación de los liposomas ....................................... 274 

9.5.2. Importancia del estado de agregación del músculo y del protector  incorporado en 

los liposomas .................................................................................................................... 277 

9.5.3. Geles de pescado formulados con liposomas encapsulando bioactivos................ 287 

9.6. Aplicación de liposomas en películas comestibles ........................................................ 290 



Índice 

9.7.  Evaluación  de  las  posibles  Declaraciones  nutricionales  de  las  formulaciones  con 

liposomas .......................................................................................................................... 293 

10. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 299

11. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 303

12. ANEXO ................................................................................................................................. 331



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. RESUMEN 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Resumen 

3 

 

Título de  la  tesis: Nanoliposomas a partir de productos naturales  infrautilizados y  residuos 
agroalimentarios como ingrediente funcional en alimentos 

Los liposomas son vesículas esféricas coloidales, formadas por una bicapa lipídica de fosfolípidos 
englobando  un  núcleo  acuoso,  lo  que  le  confiere  carácter  anfipático,  y  la  posibilidad  de 
incorporar bioactivos de diferente composición y naturaleza, con propiedades funcionales. Su 
tamaño  nanométrico  y  similitud  con  las  membranas  biológicas,  les  permite  atravesar 
eficazmente  las  células  intestinales,  protegiendo  al  bioactivo  e  incorporándolo  al  torrente 
sanguíneo. El uso de materias primas infrautilizadas o desechadas por la industria alimentaria 
garantiza el carácter natural de los liposomas, así como el bajo coste del producto final, dándole 
un uso integral a dichas materias primas. Su composición, rica en ácidos grasos insaturados, les 
confiere un carácter de ingrediente saludable. La protección de compuestos activos/bioactivos 
mediante la encapsulación de los mismos para mantener por más tiempo, tras el procesado e 
ingesta,  la  actividad  biológica  es  un  mecanismo  de  gran  interés.  La  encapsulación  en 
nanoliposomas  es  un  ejemplo  de  ello.  El  objetivo  de  este  proyecto,  fue  la  obtención  de 
nanoliposomas  basados  en  productos  naturales  infrautilizados  y  residuos  de  la  industria 
agroalimentaria, para  su  aplicación  como  ingrediente  alimentario, de  acuerdo  a  su  reciente 
inclusión en la definición de nuevo alimento según el Reglamento Europeo (nº 2015/2283).  

Para  llevarlo a cabo,  inicialmente  se estandarizó el proceso de preparación de  liposomas en 
función de la materia prima encapsulante (lecitina de soja y fosfatidilcolina de soja parcialmente 
purificada mediante procesos de lavados sucesivos, 2 y 5) y del método de sonicación (fuerte y 
prolongado o débil y corto), así como de la presencia o ausencia de un estabilizador de vesículas 
como es el glicerol. Seleccionada la preparación liposomal más conveniente (con fosfatidilcolina 
purificada  mediante  5  lavados  y  método  de  sonicación  con  elevada  amplitud  y  tiempo 
prolongado, en presencia de glicerol), se procedió a la extracción y encapsulación en liposomas 
de varios extractos bioactivos de diferente naturaleza y composición: un hidrolizado peptídico 
procedente de colágeno de túnicas y pieles del calamar gigante Dosidicus gigas, una fracción 
peptídica  <1  kDa  procedente  del  langostino  Penaeus  notialis,  un  extracto  polifenólico 
procedente de piel y albedo del fruto de la granada Punica granatum, dos extractos polifenólicos 
(uno  acuoso  y  otro  etanólico)  procedentes  de  tallos  y  hojas  de  la  planta  de  hinojo marino 
Crithmum maritimum,  y  un  extracto  lipídico  rico  en  astaxantina  procedente  de  bioresiduos 
(cefalotórax, cutícula, parápodos, pleópodos y telson) del langostino Litopenaeus vannamei.  

Las correspondientes dispersiones liposomales mostraron adecuadas propiedades de partícula, 
con  vesículas  esféricas  de  tamaño  nanométrico  comprendido  entre  89,5‐150,1  nm;  una 
distribución de tamaños monomodal con una polidispersidad de 0,186‐0,370; un potencial de 
membrana entre ‐27,7 y ‐53,9 mV; y una eficacia de encapsulación del 52,4‐82,9 %, parámetros 
que varían en función del tipo de extracto y de la concentración de bioactivo incorporada.   

Se aplicaron diversos métodos de estabilización de nanoliposomas, que permitieron alargar la 
vida útil de los mismos, como altas presiones, congelación, atomización o liofilización. Cuando 
las vesículas  fueron sometidas a congelación/descongelación o a congelación/liofilización  fue 
necesaria  la  presencia  de  un  crioprotector,  como  el  glicerol;  o  de  un  lioprotector,  como  la 
trealosa. Las dispersiones liposomales rellenas se estabilizaron mediante liofilización. El proceso 
de liofilización incrementó la estabilidad de todos los liposomas (reflejado por el potencial de 
membrana más electronegativo y el aumento de la eficacia de encapsulación), así como el rango 
de tamaños hasta 171,1‐372,9 nm y la polidispersidad hasta 0,279‐0,430, con distribuciones bi‐ 
y  trimodales,  igualmente dependientes del  tipo de extracto bioactivo y  la  concentración del 
mismo. Los liposomas liofilizados rellenos con los diversos extractos bioactivos, mostraron una 
consistencia de pasta untuosa (atribuida al glicerol), una alta estabilidad física y térmica, y una 
ligera susceptibilidad a la oxidación, dada su composición rica en ácidos grasos poliinsaturados. 
Los extractos bioactivos estuvieron eficientemente encapsulados y, por tanto, poco disponibles 



Resumen 

4 

 

para  proteger  al  liposoma  de  la  oxidación,  como  demostró  el  estudio  de  las  actividades 
antioxidantes  de  los  liposomas.  De  este modo,  la  actividad  potencial  de  los  bioactivos  se 
presupone intacta hasta que el liposoma llegue al interior del organismo.  

Para comprobar su comportamiento  tras  la  ingesta, se  llevó a cabo un estudio de absorción 
intestinal  in  vitro,  a  través  de  una monocapa  de  células  Caco‐2,  de  extractos  y  liposomas 
previamente digeridos. La permeabilidad intestinal del ácido clorogénico presente en el extracto 
acuoso de hinojo fue limitada, tanto para el extracto libre como encapsulado en liposomas. Por 
otro lado, se pudo observar que los liposomas resistieron la digestión gastrointestinal.  

Los  nanoliposomas  pueden  constituir  un  ingrediente  funcional,  incluso  con  alegaciones 
alimentarias.  Entre  otras  posibilidades,  pueden  ser  incorporados  en matrices  alimentarias, 
dando lugar a nuevos productos funcionales con un alto valor añadido, los cuales ofrecen una 
amplia variedad de aplicaciones. Para evaluar su comportamiento en diferentes matrices, se 
procedió a desarrollar diferentes sistemas modelo. Por un lado, se incorporaron liposomas en 
miosistemas de músculo de merluza  fresca y de  surimi de  calamar, obteniéndose geles  con 
mayor agregación proteica, mayor capacidad de  retención de agua y estabilidad  térmica, así 
como con propiedades visco‐elásticas y mecánicas diferentes. La calidad  inicial de  la proteína 
del músculo, así como el estado de hidratación de los liposomas, fueron dos de los factores más 
determinantes  en  las  propiedades  finales  de  dichos  geles.  Por  otro  lado,  se  incorporaron 
liposomas  en  polímeros  naturales  (caseinato  sódico  y  carboximetilcelulosa  sódica), 
obteniéndose películas  comestibles  con una mayor adherencia  y mucoadhesividad,  con una 
buena  integridad  estructural  y  adecuadas  propiedades  organolépticas.  En  función  de  las 
propiedades  físicas  particulares  de  cada  película,  éstas  podrían  ser  utilizadas  bien  como 
alimento  en  sí  mismo,  o  bien  como  recubrimiento  de  otros  alimentos.  Formulaciones 
alternativas, tanto de geles como de películas biopoliméricas, demostraron  la  importancia de 
las cápsulas (nanoliposomas) en las características finales de los productos, y en la protección 
de  la actividad biológica de  los compuestos encapsulados, evitando  la  interacción directa de 
éstos con las matrices y su posible degradación durante el procesado.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. ABSTRACT 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Abstract 

7 
 

Title of the thesis: Nanoliposomes from underutilized natural products and agro‐wastes as a 
functional ingredient in foods 

Liposomes are  colloidal  spherical vesicles  formed by an aqueous  core  surrounded by a  lipid 
bilayer  of  phospholipid, which  confer  them  an  amphipathic  character,  and  the  capacity  to 
incorporate  inside bioactives of different composition and nature, with functional properties. 
Their nanometric  size and  similarity with  the biological membranes would  let  them  to cross 
efficiently through intestinal cells protecting the bioactive, which would be incorporate to the 
bloodstream. The use of underutilized or waste raw materials from the food industry guarantee 
the natural character of the liposomes and the low cost of the final product, contributing to the 
integral use of  the raw materials.  Its composition, rich  in unsaturated  fatty acids, confirms a 
healthy ingredient character. A very interesting mechanism to keep the biological activity of the 
active/bioactive compounds for more time after the processed and the intake is their protection 
through  the encapsulation process. The encapsulation  in nanoliposomes  is an example. The 
objective of  this project was  the obtaining of nanoliposomes based on underutilized natural 
products and wastes, to their application as food ingredient, according to the recent inclusion 
of liposomes in the definition of new food into the European Regulation (nº 2015/2283).  

First, the process of nanoliposomes preparation was standardized in function of the encapsulant 
raw material  (soybean  lecithin  and  purified  partially  soybean  phosphatidylcholine)  through 
successive washing steps (2 o 5), the sonication method (strong and long or weak and short) and 
the  presence  or  absence  of  a  stabilizer  of  vesicles  like  as  the  glycerol.  After  choosing  the            
five‐times purified phosphatidylcholine, with a strong and long sonication method, in presence 
of glycerol  (L5A) as the  liposomal formulation suitable, various bioactive extracts of different 
nature and composition were extracted and encapsulated in liposomes: a peptide hydrolysate 
of collagen from tunics and skin of giant squid Dosidicus gigas, a peptide fraction <1 kDa from 
shrimp Penaeus notialis, a polyphenolic extract from peel and albedo of pomegranate Punica 
granatum, polyphenolic extracts (one aqueous and other ethanolic) from stems and leaves of 
sea  fennel  Crithmum  maritimum,  and  a  lipid  extract  rich  in  astaxanthin  from  bio‐wastes 
(cephalothorax, cuticles, parapodos, pleopods and telson) of shrimp Litopenaeus vannamei.  

The  liposomal  dispersions  presented  proper  particle  properties,  with  nanometric  spherical 
vesicles  among  89,5‐150,1  nm,  a monomodal  size  distribution with  a  polydispersity  among 
0,186‐0,370, a membrane potential among ‐27,2 and ‐53,9 mV, and an entrapment efficiency 
range of 52,4‐82,9 %. All parameters changed in function of the type of extract and the bioactive 
concentration.  

Some stabilization methods were applied on liposomes to extend their useful life, such as high 
pressure, freezing, atomization or lyophilisation. The addition of a crioprotector as glycerol or a 
lioprotector  as  trehalose  is necessary when  liposomes  are  submitted  to  a  freeze/thaw or  a 
freeze/dry  process.  The  filled  liposomal  dispersions  were  stabilized  by  lyophilisation. 
Lyophilisation increased the stability (reflected by a more electronegative membrane potential 
and by the increase of entrapment efficiency), the size (171,1‐379,9 nm) and the polydispersity 
(0,279‐0,430, with bi‐ and trimodal distributions) of all liposomes. As dispersions, parameters of 
freeze‐dried liposomes were depended of the type of extract and the bioactive concentration. 
The freeze‐dried liposomes loaded with different bioactive extracts showed a smeary and gluey 
consistence  (attributed  to  the  glycerol),  a  high  physic  and  thermic  stability,  and  a  slight 
susceptibility  to  oxidation,  since  their  composition  rich  in  polyunsaturated  fatty  acids.  The 
bioactive  extracts  were  little  available  to  protect  the  liposomes  against  oxidation,  as 
demonstrated the study of antioxidant activity, because they were efficiently encapsulated. On 
this way, the potential activity of bioactives it is assumed intact until the liposome reaches the 
organism.  



Abstract 

8 

 

Based on the above, a study of intestinal absorption was carried out for extracts and digested 
liposomes through the simulation of a monolayer of Caco‐2 cells. The intestinal permeability of 
the chlorogenic acid present  in  the aqueous extract of  fennel was  limited, both  for  the  free 
extract and encapsulated in liposomes, which were resistant to digestion. 

Nanoliposomes can be a functional ingredient, even with food claims. Besides, liposomes have 
the possibility to be  incorporated  into a food matrix, obtaining new functional products with 
high value added useful  for a wide variety of applications.  I was evaluated  the behaviour of 
liposomes into various model systems. On the one hand, liposomes were incorporated into fresh 
hake muscle and into squid surimi, obtaining gels with higher protein aggregation, higher water 
holding capacity, higher thermic stability and different elastic and mechanical properties. Both, 
the initial quality of muscle protein as the hydration state of liposomes, were two determinant 
factors on  the  final properties of  the gels. On  the other hand,  liposomes were  included  into 
biopolymers (sodium caseinate and sodium carboxymethylcellulose), obtaining edible films with 
higher adherence and mucoadhesiveness, a good structural  integrity and proper organoleptic 
properties. According to the particular physical characteristics, films can be used as direct food 
or  as  covering  of  other  food.  Alternative  formulations  of  gels  and  biopolimerics  films 
demonstrated the importance of capsule (liposome) over final properties of matrix and on the 
protection  of  biological  activity  of  encapsulated  compound,  avoiding  the  direct  interaction 
between the bioactive and the matrix and it possible degradation during the processing.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. INTRODUCCIÓN 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Introducción 

11 

 

3.1. Alimentos del siglo XXI 

La población actual dispone cada vez de menos tiempo para alimentarse, principalmente debido 
a  los extensos horarios de trabajo y al gran abanico de posibilidades de ocio que ofrecen  las 
ciudades  modernas.  Por  ello,  los  consumidores  actuales  demandan  alimentos  de  rápida 
preparación y consumo, que limite el tiempo empleado en preparar la comida y deje más tiempo 
disponible para otras actividades. Estos productos deben ser versátiles, tanto para procurar una 
comida apetitosa en casa, a la vez que permita, en ocasiones, tomar los alimentos de una forma 
más rápida y cómoda,  incluso a  la vez que realizan un  trayecto ya sea a pie o en  transporte 
público, pero no por ello que pierdan  sus propiedades de comida saludable y apetitosa. Del 
mismo modo, estos productos deben llegar a otros sectores de la población, como es el caso de 
las personas de elevada edad, cada día más numerosas. Este sector también precisa, dadas sus 
limitaciones tanto motrices como cognitivas, de alimentos de rápida y sencilla preparación y fácil 
consumo, siempre manteniendo sus propiedades saludables. 

Como  respuesta  a  esta  demanda,  se  ha  promovido  en  las  últimas  décadas  el  desarrollo  y 
comercialización de productos alimentarios de fácil y rápida preparación y consumo. Este hecho 
no implica que su procesamiento también tenga que ser rápido y sencillo necesariamente. De 
hecho, existen tanto alimentos poco procesados, como sushi, sashimi, vegetales de cuarta gama, 
etc., como alimentos con un alto grado de procesamiento en el que son necesarias diversas 
tecnologías  para  su  producción,  conservación  y  envasado.  Entre  los  alimentos  altamente 
procesados se encuentran  los embutidos,  los  reestructurados de carne y pescado, purés, así 
como cualquier tipo de preparados complejos constituidos por mezclas de otros, etc. Además, 
la tendencia de utilización de este tipo de productos continúa creciendo con los años, ampliando 
las variedades y posibilidades que ofrecen, y adecuándose a los diferentes requisitos según las 
poblaciones de consumidores. A día de hoy podemos encontrar productos tan variopintos como 
frutas y vegetales desecados, comidas elaboradas listas para su consumo inmediato o envases 
inteligentes  capaces  de  mantener  estables  determinadas  condiciones  de  humedad, 
temperatura, oxígeno, etc. y/o que facilitan su conservación en óptimas condiciones.  

Paralelamente,  la  sociedad  del  siglo  XXI  ha  experimentado  un  cambio  de mentalidad  con 
respecto  a  épocas  anteriores  y  actualmente  está mucho más  concienciada  en que debe de 
mantener una alimentación sana y equilibrada, con el fin de evitar o reducir el riesgo de padecer 
enfermedades de gravedad media como la obesidad o la diabetes, y otras más graves como son 
las enfermedades cardiovasculares o neurodegenerativas, todas ellas asociadas directamente 
con  la alimentación. Para conseguir este  tipo de alimentación es necesaria  la  ingesta de una 
determinada serie de compuestos o nutrientes esenciales.  

Este  tipo  de  productos  constituyen  lo  que  se  conoce  como  “alimentos  funcionales”,  que 
surgieron por primera vez en Japón en  los años 80. Posteriormente, en 1991 el Ministerio de 
Salud y Bienestar de Japón lanzó la reglamentación para los “Alimentos para uso específico de 
salud” o  “Food  for  specified health use”  (FOSHU). En 1994  la American Dietetic Association 
(ADA) apoyó el  término de alimentos  funcionales  y un año después, en 1995,  se  celebró  la 
primera  Conferencia  Internacional  sobre  perspectivas  Oriente‐Occidente  de  los  alimentos 
funcionales con la finalidad de unificar los conceptos. En aquellos años la población japonesa ya 
era realmente longeva y evitar el tratamiento de ciertas enfermedades crónicas con fármacos, 
a través de una alimentación equilibrada, con alimentos funcionales resulta un reto saludable y 
económico de gran relevancia. 

Un  “alimento  funcional”  es  aquel  que  desempeña  una  función  favorable  y  específica  en  la 
fisiología del organismo, yendo más allá de su contenido nutricional. Para que sea considerado 
funcional  es  importante  que  la  acción  que  desempeñe  sobre  el  organismo  sea  beneficiosa, 
mejorando el estado de salud y bienestar, pudiendo reducir el riesgo de padecer enfermedades. 



Introducción 

12 

 

Recientemente,  Volpe  y  Solis  (2015)  definen  alimento  funcional  como  aquel  alimento  que 
contiene sustancias que proveen beneficios médicos o de salud y nutracéuticos.   

Dado el modo de vida actual mencionado anteriormente, no siempre es fácil tomar alimentos 
que  contengan  toda  esta  gama  de  nutrientes  y  por  ello  la  alimentación  puede  no  ser 
completamente adecuada. En base a estas deficiencias, hay una creciente tendencia por parte 
de las industrias y mercados en la producción y venta de productos enriquecidos con vitaminas, 
péptidos y otros nutrientes.  

3.2. Aprovechamiento de materias primas residuales 

Según el Ministerio del Medio Ambiente, Medio Rural y Marino de España, en la actualidad se 
generan grandes cantidades de restos y residuos variados en su composición y naturaleza. Una 
de las preocupaciones actuales es el aprovechamiento integral de estos recursos industriales y 
su manejo sostenible, que abarca la explotación de los recursos y también el mantenimiento de 
su  potencial  en  el  futuro,  así  como  la  utilización  de  subproductos  y  residuos  generados 
(Arancibia, 2014). Estas industrias generan, a través de los residuos, una importante fuente de 
contaminación que desencadena graves perjuicios sobre el ecosistema. Actualmente, existen 
diversos  Planes  y  Programas  a  nivel  estatal  y  europeo  destinados  a  reducir  la  cantidad  de 
residuos  generados,  como  es  el  Programa  Estatal  de  Prevención  de  Residuos  2014‐2020, 
englobado  dentro  de  la  Estrategia  2020  de  la  Unión  Europea  (Ministerio  de  Agricultura, 
Alimentación y Medio Ambiente, 2013), o el Plan Estatal Marco de Gestión de Residuos (PEMAR) 
2016‐2022  (Ministerio  de  Agricultura,  Alimentación  y Medio  Ambiente,  2015).  Una  de  las 
estrategias propuestas por la Unión Europea (aún en elaboración en España) fue el Paquete de 
Economía  Circular,  presentado  por  la  Comisión  Europea  en  diciembre  de  2015  (Comisión 
Europea, 2015). La economía circular plantea  la gestión de  los  residuos como un sistema de 
retroalimentación  basado  en  las  3R  (reducir,  reciclar  y  reutilizar),  donde  se maximicen  los 
recursos disponibles y se reduzca la generación de residuos. Esta estrategia busca cambiar del 
actual modelo  lineal de producción‐consumo‐eliminación (modelo agresivo con el medio que 
agotará  las  fuentes de  suministro) por un modelo  circular de producción‐consumo‐reciclaje‐
materias primas secundarias.  

Con  independencia  de  los  problemas  medioambientales  planteados,  los  productos 
infrautilizados,  subproductos  y  residuos  representan  una  cantidad  considerable  de material 
potencialmente  reutilizable y una  fuente  importante de energía. Gran parte de  los  residuos 
generados en la industria, específicamente en la industria agraria y alimentaria (conocidos como 
bioresiduos), tienen como principal destino, cuando se usan para reciclar, la alimentación animal 
o el biodiesel. No obstante, bien podrían emplearse como sustratos y nutrientes para dar lugar 
a productos para consumo humano, con  la mejora económica y social que ello produciría. El 
desarrollo de nuevas aplicaciones tecnológicas contribuye en gran medida a reducir la emisión 
de residuos contaminantes y a su utilización de forma rentable, dando lugar a la obtención de 
productos de alto valor añadido (Arancibia, 2014).  

El  empleo  de  estos  residuos  y  subproductos  como materias  primas  garantiza  un  beneficio 
medioambiental, ya que las fuentes infrautilizadas no se acumulan y los descartes no necesitan 
ser eliminados  (con  el proceso  industrial  y problemas medioambientales que  ello  conlleva), 
siendo todas estas materias revalorizadas y aprovechadas para un uso integral de las mismas. 
Este hecho permitiría reducir aún más los costos del producto final, pues se parte de materias 
primas totalmente disponibles sin ningún coste adicional por su obtención, lo que junto con su 
capacidad para elaborarse en  grandes  cantidades  (a nivel  industrial) pueden dar  lugar  a un 
producto de bajo coste accesible a cualquier tipo de consumidor. Es cierto que a veces el proceso 
de extracción del co‐producto, por su complejidad, requiere de una implementación industrial 
paralela, y ésta puede ser  la causa de que en ocasiones no  llegue a ser una  realidad a nivel 
industrial.  Es  por  ello  que  los  procesos  de  extracción  deben  ser  económicos,  y  sobre  todo 



Introducción 

13 

 

respetuosos con el medio ambiente, a la vez que debería contemplar un sistema de reutilización 
y reciclado de reactivos. 

El hecho de que  se empleen materiales que no  se usan habitualmente o que  se consideran 
residuos de  la  industria, no significa que no tengan propiedades que puedan ser de beneficio 
para  la salud, ni mucho menos que sean perjudiciales para ella. Generalmente, se descarta  la 
utilización de estos residuos debido a que no tienen valor comercial y no tienen rentabilidad por 
sí mismos, despreciando  su  reutilización.  Sin embargo,  la mayoría de estas materias primas 
poseen propiedades interesantes, que podrían y deberían ser explotadas y aprovechadas y que, 
si se combinan de la manera adecuada, pueden dar lugar a productos de alto valor añadido o 
co‐productos (Sayari et al., 2016), es decir, productos secundarios que se generan durante un 
proceso productivo y que pueden alcanzar un valor igual o mayor que el producto principal, y 
subproductos o productos derivados que pueden aportar un beneficio mayor que el de meros 
residuos.  

3.2.1. Residuos de la acuicultura y la pesca 

La  industria dedicada al procesamiento de productos pesqueros genera una gran cantidad de 
residuos  correspondiente  al  30‐50 %  del  peso  inicial,  tales  como  espinas,  pieles,  escamas, 
vísceras, cabezas y restos de músculo (Gumisiriza et al., 2009). Estos residuos constituyen una 
destacada fuente de proteínas, lípidos, minerales, vitaminas, etc., parte de los cuales se emplean 
habitualmente para alimentación animal y como fertilizantes; mientras que la parte que no se 
aprovecha contribuye a incrementar la contaminación ambiental (Arvanitoyannis & Kassaveti, 
2008).  En  los  últimos  años  se  han  desarrollado  estrategias  para  el  aprovechamiento  de  los 
residuos  de  pescado  y  de marisco,  con  la  obtención  de  productos  de  alto  valor  comercial 
destinados a la alimentación humana, tales como productos reestructurados a partir de restos 
de músculo; colágeno y gelatina a partir de escamas, pieles y espinas; quitosano a partir de 
caparazones  de  crustáceos;  lípidos  y  proteínas  procedentes  de  vísceras;  e  hidrolizados  y 
péptidos bioactivos (Giménez et al., 2012). 

Recientemente,  acorde  a  López‐Caballero  et  al.  (2013),  hay  un  creciente  interés  en  el 
aprovechamiento de descartes procedentes de la industria del pescado, pues constituyen una 
importante  fuente de péptidos bioactivos con diversas propiedades,  tales como propiedades 
antioxidantes y antihipertensivas  (Cudennec et al., 2008; Alemán et al., 2010). Los recortes y 
restos de músculo desaprovechados, normalmente adheridos a espinas o huesos, constituyen 
aproximadamente el 20 % de la proteína muscular, que corresponde a la parte más valorada del 
pescado. Aproximadamente el 30 % de los desechos pesqueros corresponden a tejido conectivo, 
en cantidad variable según especies, con un contenido en colágeno superior al 95 % del total de 
proteína  (López‐Caballero  et  al.,  2013).  Por  tanto,  existe  una  gran  cantidad  de  colágeno 
procedente  de  las  industrias  del  procesamiento  de  pescado  que  es  desaprovechado,  con 
diferentes  propiedades  según  especies.  Entre  las  alternativas  de  destino  se  encuentran  su 
aplicación en medicina y cosmética por su poder regenerador de tejidos como dermis, cartílago 
y tejido conectivo, así como su capacidad de formar hidrogeles y películas con posibilidad de 
aplicación como prótesis, apósitos, etc. Hay que mencionar que actualmente se vende en  los 
supermercados colágeno hidrolizado en forma de polvo comestible con la finalidad de fortalecer 
huesos, cartílagos y piel. Una de las más importantes fuentes de colágeno procede de uno de 
los calamares nectónicos más grandes (Dosidicus gigas), cefalópodo cuyo manto está dispuesto 
en una capa de tejido muscular intercalado entre dos túnicas de tejido conectivo (Dublán, 2006). 
Estas túnicas son estructuras ricas en colágeno tipo I (Figura 1), principal constituyente del tejido 
conectivo cuya función es la conexión entre varias células.  

La gelatina es un derivado procedente de  la desnaturalización e hidrolisis térmica de  la triple 
hélice  de  colágeno,  el  cual  habitualmente  se  somete  a  un  pretratamiento  ácido  o  alcalino 
moderado para favorecer un hinchamiento de la molécula mediante el desdoblamiento y rotura 



Introducción 

14 

 

de  enlaces  no  covalentes,  y  predisponiéndola  para  la  solubilización  posterior  durante  el 
tratamiento térmico mediante la desestabilización de la triple hélice de colágeno por rotura de 
enlaces covalentes, obteniendo así la gelatina. La gelatina es un compuesto proteico soluble en 
agua, fácilmente digerible utilizado como ingrediente para mejorar la elasticidad, consistencia y 
estabilidad de alimentos. Además, su empleo para encapsulación o formación de películas  le 
hace  interesante  desde  el  punto  de  vista  de  las  industrias  farmacéuticas,  cosméticas  y 
alimentarias  y  es  especialmente  característico  por  sus  propiedades  de  hidrogel  en  frío  y 
reversible.  

 

      

Figura 1. A) Dosidicus gigas. B) Manto del calamar gigante Dosidicus gigas. C) Residuos de túnicas con 
restos de musculo adherido procedente del procesado de surimi. 

 

Otra de las fuentes aprovechables son los hidrolizados y péptidos bioactivos obtenidos a partir 
de  la  hidrólisis  enzimática  de  los  componentes  proteicos.  Por  ejemplo,  los  hidrolizados  de 
colágeno  a  partir  de  descartes  de  calamar,  como  pieles  y  túnicas,  son  especialmente 
interesantes por no presentar pigmentos que puedan conferir coloraciones indeseables. Estos 
hidrolizados  son  conocidos  por  sus  actividades  antioxidantes,  antihipertensivas  y 
anticancerígenas (Alemán et al., 2010; Alemán et al., 2011b). Existen otros casos en los que una 
materia prima no es descartada o  infrautilizada en  fresco, sin embargo, ésta pierde su valor 
comercial, principalmente debido  a  su excesivo  y prolongado  tiempo de  conservación en  la 
industria, hecho relativamente frecuente en alimentos conservados en estado congelado. Este 
tipo de productos  continúan manteniendo gran parte de  su potencial bioactivo, aunque  sus 
propiedades  tecno‐funcionales y características sensoriales se vean mermadas, pudiendo ser 
también aprovechados y revalorizados.  

Otro de los residuos apenas explotado procedente de este sector industrial son los caparazones 
de crustáceos (especialmente cabezas o cefalotórax) que representan un 40‐50 % del peso total 



Introducción 

15 

 

de residuos sólidos. Es un hecho que en España y en países del mediterráneo se comercializa 
entero,  no  obstante,  cada  vez  son más  numerosas  las  preparaciones  donde  se  procesa  ya 
pelado, y en otros muchos países Europeos, como por ejemplo en Alemania, lo más común es 
comercializarlo totalmente pelado y solo las especies de gran tamaño se pueden vender solo sin 
cabezas. Por ello, el volumen de residuos de caparazones y cabezas o cefalotórax es muy grande, 
y generalmente  se  centralizan en  las  industrias procesadoras. Estos  residuos  constituyen un 
problema medioambiental y una fuente potencial de agentes patógenos. Sin embargo, también 
suponen  una  oportunidad  comercial,  tanto  para  alimentación  animal  como  para  consumo 
humano  (Arancibia,  2014).  A  partir  de  estos  desechos  se  pueden  obtener  determinados 
extractos de grasa de crustáceo que constituyen una mezcla heterogénea de componentes de 
interés, entre  los que destacan ácidos grasos, colesterol, proteínas, minerales, antioxidantes    
(α‐tocoferol) y pigmentos (astaxantina). De este modo, los bioresiduos (cutículas y cefalotórax) 
de langostino (Litopenaeus vannamei) (Figura 2) poseen propiedades antioxidantes atribuidas a 
compuestos antioxidantes como α‐tocoferol o astaxantina (Gómez‐Estaca et al., 2016) y a  los 
beneficios derivados de su elevado contenido en ácidos grasos poliinsaturados omega‐3 (ácido 
docosahexaenoico y ácido eicosapentaenoico). Como residuo de este proceso de extracción a 
su vez, permanecen los exoesqueletos formados por proteína, quitina y minerales, a partir de 
los  cuales  pueden  ser  extraídos  estos  compuestos.  Posteriormente,  de  la  quitina  por 
desacetilación  puede  ser  obtenido  el  quitosano  (Arancibia  et  al.,  2015),  polisacárido  con 
múltiples  funciones  sobre  el  organismo,  siendo  algunas  de  las  más  destacadas  su  poder 
antimicrobiano,  comportamiento  antioxidante,  propiedades  texturizantes,  regulador  de  la 
movilidad  intestinal, agente hipocolesterolémico o actividad  inmunológica. Por otro  lado,  los 
productos derivados de las vísceras de pescado pueden consistir en proteínas, lípidos con una 
composición  rica en ácidos grasos poliinsaturados, enzimas  con propiedades biológicas, etc. 
(López‐Caballero et al., 2013).  

 

Figura 2. Langostino Litopenaeus vannamei y sus residuos (cutículas y cefalotórax). 

 

3.2.2. Residuos agroalimentarios  

Otro sector que genera enormes cantidades de desechos potencialmente aprovechables es el 
agroalimentario, siendo una de las principales preocupaciones actuales la explotación integral 
de los recursos agrícolas y su manejo sostenible (Day et al., 2014). Entre estos residuos destacan 
los procedentes de plantas y, más concretamente, de sus frutos, que atribuido a su composición, 
poseen una elevada capacidad antioxidante (Okogoni et al., 2007).  

Uno de estos residuos  lo constituyen  las cáscaras, es decir  las pieles y albedos del fruto de  la 
granada (Punica granatum). Este fruto, originario de Oriente Medio, es muy consumido en los 
últimos años por sus propiedades antioxidantes y porque se considera una importante fuente 
de compuestos bioactivos potencialmente saludables (Mirdehghan & Rahemi, 2007). Entre los 
compuestos  bioactivos  de  la  granada  destacan  los  polifenoles,  compuestos  fenólicos  del 
metabolismo secundario de plantas. Existen  tres grandes grupos de polifenoles:  flavonoides, 
taninos y ligninas, siendo el más destacado y numeroso los flavonoides. Dentro de este grupo se 
encuentran  las  antocianinas,  flavanoles,  flavanonas,  flavonoles,  flavonas  e  isoflavonas 



Introducción 

16 

 

(Dashwood, 2007).  Se  le atribuyen otras propiedades  como  la prevención de enfermedades 
asociadas al estrés oxidativo, de enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas o cáncer, 
así como la función de regular enzimas y receptores (Manach et al., 2004).  

Cada vez es más frecuente la elaboración de zumos de granada a nivel industrial y, por tanto, la 
producción de pieles y albedo como residuos, por lo que el estudio de su composición y potencial 
de utilización es de gran  interés. La piel y albedo de granada  (Figura 3)  tiene cierta dureza y 
amargor pero presenta una excelente actividad antioxidante y antiproliferativa  (Masci et al., 
2016). La piel de granada es un bioresiduo muy rico en polifenoles, destacando el ácido elágico, 
ácido gálico, galotaninos y elagitaninos  (taninos hidrolizables)  como compuestos principales. 
Estos  cuatro  polifenoles  mayoritarios  poseen  actividades  antioxidante,  antiinflamatoria,         
antitirosinasa y antimutagénica,  todas ellas en beneficio de  la salud  (Tokton et al., 2014). Su 
actividad principal es la antioxidante, gracias a su efecto de supresión del pardeamiento de la 
pigmentación  de  la  piel  inducido  por  la  luz  ultravioleta.  Esta  actividad  antioxidante  está 
directamente  relacionada  con  su  composición  rica  en  polifenoles,  entre  los  que  destaca  la 
punicalagina como el polifenol más abundante (Tabaraki et al., 2012). Otro componente residual 
es  el  albedo  que  también  tiene  propiedades  saludables  y  no  disminuye  la  aceptación  del 
producto (Vázquez‐Araújo et al., 2011). El que este tipo de materiales se hayan desechado hasta 
hace pocos años atrás se considera que podría haber sido debido al desconocimiento de sus 
propiedades funcionales. Sin embargo, en  la última década ha crecido el  interés en el uso de 
este tipo de materiales, sobre todo en la industria de la cosmética, donde se utilizan debido a 
sus múltiples funciones beneficiosas sobre la piel. De hecho, se observó que la piel de granada 
tiene incluso mayor poder antioxidante que la pulpa del fruto (Okogoni et al., 2007).  

 

Figura 3. Piel y albedo de granada (Punica granatum). 

 

Otra fuente infrautilizada dentro del ámbito agroalimentario es el hinojo marino (Figura 4). El 
hinojo marino  (Crithmum maritimum)  es  una  planta  halófita muy  abundante  en  las  costas 
cantábrica y atlántica septentrional (Knees, 2003). Constituye una planta infrautilizada (Renna 
et al., 2017) cuyo cultivo comercial aún no ha sido explotado a nivel global (Pavela et al., 2017), 
aunque  existen  empresas  a  nivel  nacional  que  lo  comercializan,  como  planta  fresca  (Porto 
Muiños  S.L.  (A  Coruña)  o  en  tarros  de  conserva  (Sa  Llubinera  S.L.  (Menorca)  y Mel  i Untis 
(Menorca). El hinojo marino es rico en compuestos con una destacada actividad antioxidante 
(Siracusa et  al., 2011).  Los principales  compuestos bioactivos del hinojo marino  son  fenoles 
simples  como  el  ácido  clorogénico.  Este  ácido  tiene  una  función  de  defensa  frente  a 
microorganismos,  lo que demuestra ser útil contra bacterias Gram positivas  (Senatore et al., 
2000). También se le atribuyen propiedades antivirales y antiinflamatorias. Sin embargo, lo que 
hace interesante a esta molécula es su capacidad antioxidante (Meot‐Duros & Magne, 2009).  

De  los muchos  residuos  existentes,  se  han  seleccionado  para  el  presente  trabajo  aquellos 
considerados de mayor  interés por  su naturaleza peptídica procedente de  colágeno marino 
(hidrolizado de calamar), polifenólica procedente del sector agrario (piel‐albedo de granada e 
hinojo marino) y lipídica procedente de crustáceos (bioresiduos de langostino). 



Introducción 

17 

 

 

Figura 4. Planta de hinojo marino  (Crithmum maritimum)  tal y como se distribuye comercialmente en 
fresco. 
 

3.3. Encapsulación de compuestos bioactivos: Liposomas 

Los compuestos bioactivos, incluyendo los procedentes de residuos o especies infrautilizadas, 
podrían ser utilizados como nutracéuticos en alimentación humana. Sin embargo, presentan el 
inconveniente  de  que,  dado  su  estructura  y  composición,  son  muy  susceptibles  de  ser 
inactivados  o  degradados  física  y  químicamente  como  consecuencia  de  las  condiciones 
ambientales, el transcurso del tiempo, su interacción con otros componentes o incluso por los 
procesos de digestión cuando éstos son ingeridos y transportados por el organismo. Además, en 
algunas  ocasiones  pueden  presentar  otros  inconvenientes  como  baja  solubilidad,  pobre 
biodisponibilidad o atributos sensoriales desagradables, no siendo adecuada su incorporación 
directa en otros alimentos (Livney, 2015). Por tanto, son necesarias estructuras que protejan al 
bioactivo  y  permitan  que  su  actividad  y  propiedades  beneficiosas  asociadas  queden 
posteriormente biodisponibles para el organismo, a la vez que se mejoran las propiedades de 
solubilidad y aceptación sensorial, entre otras. Existen multitud de estrategias para proteger a 
estos compuestos, siendo una de las más rentables, eficaces y empleadas en las últimas décadas 
la técnica de microencapsulación.  

La microencapsulación  es  una  tecnología  que  permite  incorporar  determinadas  sustancias 
bioactivas en una estructura vesicular que las recubra con el objetivo de proteger la bioactividad 
y propiedades beneficiosas de la sustancia dentro de esta estructura (Ye et al., 2018). Dadas las 
posibilidades  que  este  tipo  de  estructuras  ofrecen,  nuestro  producto  alimenticio  funcional 
estará  basado  en  nanoencapsulados,  pues  de  todos  los  métodos  de  microencapsulación 
descritos, la nanoencapsulación es la que presenta mejores características y un mayor potencial 
de aplicación dado precisamente el pequeño tamaño de las vesículas obtenidas con este método 
(Prakash et al., 2018), lo que facilita su incursión entre los tejidos y células del organismo. Dentro 
de la nanoencapsulación existen diversas estructuras capaces de proteger a los bioactivos, que 
de manera esquemática se representan en la figura 5.  

 

 

 

 

 

 

Figura 5. Métodos de nanoencapsulación. 



Introducción 

18 

 

La más eficiente son los nanoencapsulados conformando liposomas (frente a las nano‐esferas y 
nano‐cápsulas), debido a que los liposomas son estructuras muy flexibles, que protegen mejor 
al bioactivo y que permiten la encapsulación de una gran versatilidad de compuestos, lo que les 
aporta mayores ventajas para ser empleados en la industria alimentaria (Khorasani et al., 2018), 
además de su similitud con la membrana celular. 

Los  liposomas  son  vesículas  esféricas  a modo  de  estructura  coloidal  que  pueden  variar  en 
tamaño (20 nm – 1 µm) y en estructura (unilamelares, bilamelares o multilamelares en función 
del número de bicapas, figura 6), acorde a Bryla et al. (2015). De este modo existen: vesículas 
unilamelares  pequeñas  (1  bicapa,  20‐100  nm),  unilamelares medianas  y  grandes  (1  bicapa,    
>100 nm), unilamelares gigantes (1 bicapa, >1 µm), oligolamelares (5 bicapas, 100‐1000 nm), 
multilamelares  (5‐25  bicapas,  >500  nm)  o  multi‐vesiculares  (estructura  de  varios 
compartimentos, >1 µm)  (Sen et al., 2014). Estas diferencias dependerán principalmente del 
material encapsulante, de  la sustancia bioactiva encapsulada y del método de elaboración de 
liposomas.  

 

Figura 6. Esquema de liposomas unilamelares y multilamelares. 

 

Los liposomas fueron descubiertos y primeramente fabricados por Bangham et al. (1965), por el 
método de hidratación de una película de lípidos. Existen otras tecnologías, según Zoghi et al. 
(2016), para la fabricación de liposomas, como son el método de extrusión, reemplazamiento 
de  solventes  orgánicos  por  medio  acuoso,  inyección  de  éter  (vaporización  del  solvente), 
inyección de etanol, congelación‐descongelación, evaporación en fase reversa, eliminación de 
detergentes,  calentamiento,  deshidratación‐rehidratación,  gradiente  de  pH,  emulsión  o 
sonicación. Uno de los métodos más comunes y utilizados para la elaboración de liposomas es 
la sonicación (Papahadjopoulos & Miller, 1967; Meure et al., 2008). Esta técnica es ampliamente 
utilizada para la obtención de nanopartículas pequeñas unilamelares con tamaños <100 nm a 
partir de vesículas multilamelares grandes (Zoghi et al., 2016), permitiendo reducir el tamaño 
de las vesículas (reduciendo el tamaño medio y la heterogeneidad de tamaños) sin alterar otras 
propiedades como la carga electrostática de la membrana o la eficacia de encapsulación (Chun 
et al., 2017).  

Existen dos variantes basadas en el modo de inducción de ultrasonidos: un baño de ultrasonidos 
o una probeta de sonicación, siendo ambas opciones escalables a nivel industrial. En este último 
método, la probeta es introducida directamente en la dispersión liposomal, la cual se calienta 
mucho  como  consecuencia  de  la  elevada  energía  administrada,  haciendo  necesaria  su 
colocación en un baño de agua fría o hielo (Zoghi et al., 2016). Por tanto, si se elige esta opción 
como método  de  elaboración  de  liposomas  se  tendrá  que  controlar  la  temperatura  de  la 
dispersión, para evitar un sobrecalentamiento que pueda degradar los lípidos presentes en la 
preparación.  

El proceso de fabricación de liposomas es muy repetitivo a idénticas condiciones, sin embargo, 
cualquier mínima  variación  en  alguna  de  las  condiciones  puede  dar  lugar  a  liposomas  con 
propiedades totalmente diferentes, variando no solo en el tamaño, sino también su estabilidad, 



Introducción 

19 

 

su  eficacia  de  encapsular  bioactivos,  sus  propiedades  físicas,  su  capacidad  de  atravesar  las 
membranas  celulares,  etc.  Algunos  factores  bastante  determinantes  en  el  proceso  de 
elaboración que pueden modificar las características de los liposomas son la composición de las 
vesículas (tipo de lípido, naturaleza del bioactivo, proporciones entre ambos, presencia de otros 
componentes como colesterol o crioprotectores, etc.), el método de elaboración (hidratación 
de  película,  sonicación,  etc.)  o  las  condiciones  de  conservación  (como  dispersión  fresca, 
liofilizada, en refrigeración, en congelación, etc.). Otros que, por insignificantes que parezcan, 
también determinan las características de los liposomas pueden ser la temperatura máxima a la 
que  se exponen  las vesículas, el volumen de dispersión  liposomal preparado o  la colocación 
exacta de la probeta de sonicación (Zoghi et al., 2016).  

Los liposomas están constituidos por un núcleo acuoso de carácter hidrofílico rodeado por una 
bicapa  lipídica  de  carácter  hidrofóbico,  compuesta  por  dos  capas  de  fosfolípidos  formadas 
individualmente de dos cadenas hidrocarbonadas de ácidos grasos (hidrofóbicas) situadas en el 
centro de  la bicapa unidas a una cabeza polar  (hidrófila)  localizada en ambos extremos de  la 
bicapa, es decir, en contacto con el núcleo acuoso y con el exterior (superficie de membrana) 
(Figura  7).  Esta  estructura  y  ordenamiento  les  aportan  a  los  liposomas  una  serie  de 
características peculiares, razón por las que han sido elegidos como nuestro sistema modelo de 
encapsulación.  

 

Figura 7. Estructura y conformación de un fosfolípido y de una bicapa lipídica. 
 

Son vesículas que permiten  la encapsulación en su  interior de cualquier sustancia ya sea una 
proteína, una droga, un principio activo, un gen o estructuras más complejas como extractos 
bioactivos. Además, son consideradas estructuras anfipáticas (Figura 8), es decir, que permiten 
la incorporación tanto de compuestos hidrofóbicos (en la bicapa lipídica) como de compuestos 
hidrofílicos (en el núcleo acuoso y/o en la superficie de membrana) (Fathi et al., 2012).  

 

Figura 8. Estructura básica de un liposoma con dos tipos de relleno. 



Introducción 

20 

 

Esta particularidad les da la ventaja para funcionar como transportadores de cualquier tipo de 
sustancia independientemente de su naturaleza o composición. De este modo, son capaces de 
mejorar  la  solubilidad  de  sustancias  insolubles  en  agua,  es  decir,  compuestos 
predominantemente lipofílicos como podría ser el β‐caroteno (Lin et al., 2018). 

Las  propiedades  de  una  suspensión  liposomal  dependen  no  solo  del  tipo  de  compuesto 
encapsulado  y  del  encapsulante,  sino  también  de  la  eficacia  de  encapsulación  de  dicho 
compuesto. Este parámetro determina la cantidad de bioactivo atrapada por los liposomas, ya 
sea dentro del núcleo acuoso, dentro de la bicapa lipídica, o asociados a las cabezas polares de 
los  fosfolípidos,  tanto  las  que miran  hacia  el  interior  de  la  estructura  como  las  que  están 
orientadas hacia el exterior, quedando éstas últimas adheridas a  la membrana externa de  las 
vesículas. Esta  localización dependerá de  la  composición y naturaleza del extracto bioactivo 
(hidrofílica o  lipofílica). De este modo, una baja eficacia de encapsulación podría  reducir  los 
posibles  beneficios  que  pueda  proporcionar  un  determinado  bioactivo.  La  eficacia  de 
encapsulación depende de multitud de factores, como pueden ser la naturaleza del bioactivo, el 
material encapsulante, la concentración de bioactivo incorporada en las vesículas, el método de 
elaboración de  liposomas, etc. Otros factores que pueden ser determinantes son el grado de 
lamelaridad  de  las  vesículas,  donde  liposomas  con  mayor  número  de  bicapas  (mayor 
lamelaridad)  presentan  una  eficacia  de  encapsulación  mayor,  siendo  las  vesículas 
multilamelares las de mayor tasa de encapsulación (Gerelli et al., 2008). Por otro lado, He et al. 
(2018)  observaron  en  liposomas  de  fosfatidilcolina  de  soja  conteniendo  ibuprofeno  que  un 
mayor  tiempo  y  potencia  de  sonicación  dan  lugar  a  liposomas  con  mayor  eficacia  de 
encapsulación, siendo ésta mayor para un tiempo de 20 min y potencia de 120W.  

Otra  característica  es  su  similitud  con  las membranas  biológicas  debido  a  su  estructura  y 
composición  basada  en  una  bicapa  de  fosfolípidos,  compartiendo  así  fisiología  con  las 
membranas  celulares  (Bavarsad  et  al.,  2018).  Esta  característica  les  confiere  una  gran 
permeabilidad en la piel humana (Grupta et al., 2013), lo que les permite poder fusionarse con 
ella y liberar el bioactivo encapsulado en el interior del organismo (Bavarsad et al., 2018).  

Dado  el  pequeño  tamaño  de  los  liposomas  (del  orden  nanométrico),  éstos  podrían  no  ser 
digeribles y pasar  rápidamente al  intestino  tras  su  ingestión y, gracias a  su  similitud  con  las 
membranas  celulares,  atravesar  las microvellosidades  de  enterocitos  y  colonocitos,  ya  sea 
mediante  fusión,  invaginación  o  fagocitosis,  pasando  rápidamente  al  torrente  sanguíneo  y 
liberando  al  bioactivo  en  el  sitio diana  correspondiente.  Esto  les permitiría  funcionar  como 
vehículos  naturales  para  el  transporte  (y  protección)  de  cualquier  extracto  encapsulado  al 
interior del organismo (Mozafari et al., 2008) de una manera rápida (en cuestión de minutos, 
pues teóricamente los liposomas no se digieren y pasan directamente al enterocito y de aquí a 
la sangre) y eficaz  (es capaz de atravesar  la membrana del enterocito de  forma eficiente sin 
roturas ni pérdidas de bioactivo y llegar al torrente sanguíneo intacto).  

El hecho de poder portar prácticamente cualquier bioactivo en su interior brinda la ventaja de 
encapsular extractos bioactivos procedentes de diversas  fuentes naturales,  con propiedades 
potencialmente beneficiosas y saludables para la salud. Además, el trabajar con materias primas 
naturales  (en algunos casos procedentes de bioresiduos) así como  la posibilidad de producir 
liposomas a gran escala (Jeon et al., 2015) nos permite reducir  los gastos de producción para 
que el  futuro producto  sea de bajo  coste. Por  todas estas  razones, un producto basado en 
liposomas  tiene  las  características  adecuadas  para  ser  un  alimento  saludable  acorde  a  las 
necesidades de los consumidores actuales. No solo el compuesto bioactivo encapsulado aporta 
beneficios, sino que el material encapsulante también puede tener repercusión positiva sobre 
la salud. De este modo, el uso de fosfolípidos de soja o de alguno de sus derivados (otra materia 
prima del  sector agroindustrial  infrautilizada)  como material encapsulante  aporta diferentes 
propiedades beneficiosas para el organismo.  



Introducción 

21 

 

La soja (Figura 9) es un cultivo de leguminosas originaria del sudeste asiático que data de hace 
3000 años en China  (Krishnamurthy & Shivashankar 1975). Actualmente es uno de  los cinco 
principales productos vegetales a nivel global según la FAO (Organización de las Naciones Unidas 
para  la Alimentación y  la Agricultura) y el primero en  la producción de aceite.   A  la soja se  le 
atribuyen  numerosas  actividades  funcionales  como  antioxidante,  antiinflamatoria, 
antiproliferativa,  antiestrogénica  o  hipocolesterolémica;  diversas  funciones  en  el  organismo 
como  función  inmune,  cognitiva  o  insulinotrópica;  y  beneficios  frente  a  diferentes 
enfermedades  como  la  obesidad,  diabetes,  cáncer,  enfermedades  cardiovasculares  u 
osteoporosis (Wu et al., 2017). Todas estas propiedades son consecuencia de la presencia en su 
composición de  compuestos  fenólicos  como  isoflavonas  (genisteína, daidzeína y gliciteína)  y 
fitoalexinas (glicelinas) así como otros compuestos minoritarios pero  igualmente  importantes 
como carotenoides y tocoferol (Liu, 1997).  

 

Figura 9. Planta, semillas y brotes de soja (Glycine max). 
 

Uno de los derivados más ampliamente empleados dentro de esta especie es la lecitina de soja 
(Figura  10),  que  se  obtiene  como  subproducto  de  la  producción  del  aceite  de  soja  y  está 
constituida mayormente de lípidos saponificables (formados por un alcohol unido a uno o varios 
ácidos grasos de igual o diferente cadena a través de un enlace éster) o hidrolizables (típicos de 
grasas  y  ceras).  A  la  lecitina  de  soja  se  le  atribuyen  beneficios  para  la  prevención  de 
enfermedades cardiovasculares, discapacidad cognitiva, hiperlipidemia, procesos inflamatorios 
o fatiga (Hirose et al., 2018).  

 

Figura 10. Lecitina de soja. 

 

Estas propiedades  se deben a que  la  lecitina de  soja es una mezcla  rica en  fosfolípidos que 
aportan beneficios contra una gran  cantidad de enfermedades  (Küllenberg et al., 2012). Los 
fosfolípidos  están  formados  por  dos  colas  hidrofóbicas  de  ácidos  grasos  (simétricas  o 
asimétricas) unidas a una cabeza polar hidrófila compuesta por una molécula de glicerol y un 
grupo fosfato (Figura 11).  



Introducción 

22 

 

 

Figura 11. Estructura conformacional de un fosfolípido, pudiendo componerse de ácidos grasos saturados 
y/o insaturados indistintamente.  

 

En el caso de la soja, poseen una elevada proporción de ácidos grasos poliinsaturados, los cuales 
tienen importantes funciones regulando el metabolismo lipídico (Ramdath et al., 2017) y frente 
a diversos tipos de cánceres (Liu et al. 2017). Entre los ácidos grasos poliinsaturados mayoritarios 
en  la  lecitina de soja destacan el ácido  linolénico y el ácido  linoleico (Tripathi & Misra, 2005), 
siendo éste último el más común y el más importante, reduciendo enormemente el riesgo de 
padecer arteriosclerosis (Yang et al., 2018).  

Más  concretamente,  uno  de  los  fosfolípidos  más  abundantes  en  la  lecitina  de  soja  es  la 
fosfatidilcolina, constituyente mayoritario de todas las membranas celulares y responsable de 
infinidad de propiedades beneficiosas que determinan el correcto funcionamiento del cuerpo 
humano, entre las que destacan el favorecimiento del crecimiento celular y la regeneración de 
la  membrana,  además  de  actuar  a  nivel  de  hígado,  riñones,  cerebro,  pulmones  o  tracto 
gastrointestinal  (Jäger  et  al.,  2007).  La  fosfatidilcolina  está  conformada por dos  cadenas de 
ácidos grasos  (de diferentes  tipos) unidas por una molécula de glicerol a una cabeza  (grupo 
polar) de colina portando un grupo fosfato (Figura 12).  

 

Figura 12. Estructura de la fosfatidilcolina. 
 



Introducción 

23 

 

A nivel farmacológico es frecuente la utilización de fosfatidilcolina sintética para la elaboración 
de liposomas, la cual usualmente tiene dos ácidos grasos saturados de cadenas idénticas y un 
precio  elevado.  El uso de  lecitina o  fosfatidilcolina de  soja natural,  frente  a  los  fosfolípidos 
sintéticos,  además  de  abaratar  enormemente  los  costes,  aporta  un mayor  grado  de  ácidos 
grasos  insaturados  en  su  composición,  lo que  implica mayores beneficios  saludables,  aún  a 
riesgo de comprometer  la estabilidad y permeabilidad de  la vesícula. Por otro  lado, el uso de 
lecitina de soja natural para la formación de liposomas no conlleva ningún impedimento a nivel 
de legislación alimentaria (Laye et al., 2008). 

De  esta  manera,  ambas  partes  (cápsula  y  extracto  bioactivo)  aportan  propiedades 
potencialmente  beneficiosas  para  la  salud  humana.  Además,  ambos  componentes  se 
complementan  entre  sí,  ya  que  la  cápsula  de  fosfatidilcolina  protege  al  bioactivo  de  su 
degradación manteniendo su bioactividad intacta y mejora su eficacia y estabilidad (Mosquera 
et al., 2016) así como su solubilidad; mientras que el bioactivo puede proteger a la cápsula frente 
a la oxidación debido a sus propiedades (típica de este tipo de sistemas, según Wang & Wang, 
2008) y le aportan un alto valor añadido como producto funcional.  

3.3.1. Estabilización de liposomas 

Los liposomas son utilizados normalmente como dispersiones o suspensiones frescas (en estado 
líquido), ya que se facilita su manejo y tienen una estabilidad relativa en el tiempo (Karn et al., 
2014). Sin embargo,  tiempos prolongados de conservación  (> 1 mes) pueden  inducir efectos 
negativos  sobre  las  propiedades  físicas  de  los  liposomas,  como  son  fusión,  agregación  o 
sedimentación de  las vesículas en suspensión y  la  liberación parcial o completa del bioactivo 
encapsulado (Sharma & Sharma, 1997).  

Existen diversas estrategias tecnológicas para mejorar la estabilidad de los liposomas, como son 
los  tratamientos  de  congelación  (Chen  et  al.,  2010),  liofilización  (Sebaaly  et  al.,  2016)  o 
atomización  (Gültekin‐Özgüven  et  al.,  2016).  La  alta  presión  hidrostática  es  un método  de 
pasteurización en  frío muy útil para preservar y descontaminar  los alimentos  (Rigaldie et al., 
2003), el cual ya sido implementado en la industria, pero no se ha testado cuál es el efecto en 
los liposomas sometidos a alta presión isostática.   

Sin embargo, una de las alternativas más eficientes es secar los liposomas mediante liofilización, 
proceso que elimina el agua contenida en  la muestra congelada por sublimación. Debido a  la 
ausencia de agua y a la baja temperatura utilizada, la mayoría de reacciones microbiológicas y 
de deterioro se lentifican o paran, dando lugar a un producto de excelente calidad (Ratti, 2001). 
De este modo, la liofilización incrementa la vida útil de las vesículas (evitando dichos efectos de 
fusión, sedimentación, etc.) y mejora su estabilidad en conservación, como observaron Stark et 
al. (2010) en liposomas recubiertos de polietilenglicol y conteniendo diversos crioprotectores; 
también mejora  la biodisponibilidad del bioactivo  encapsulado,  como demostraron Catalan‐
Latorre et al. (2016) en liposomas elaborados a base de fosfatidilcolina de soja comercial y una 
mezcla  de  ácido  hialurónico  y  polímeros  sintéticos  conteniendo  curcumina  como  bioactivo. 
Además,  la disponibilidad de  los  liposomas  liofilizados podría  facilitar su aplicación  industrial 
como  un  ingrediente  alimentario más  convencional.  La  liofilización  es  el mejor método  de 
eliminación de agua con obtención de productos  finales de alta calidad en comparación con 
otros métodos de secado de alimentos (Genin & René, 1995). 

Por  tanto, en  función de  la  finalidad  y del uso que  se  le quiera dar a  los  liposomas  (lo que 
condiciona su estado físico y tiempo de conservación), éstos se pueden presentar tanto como 
dispersión liposomal (líquida) como en estado liofilizado (seco), teniendo ambas formulaciones 
interesantes posibilidades de aplicación.  



Introducción 

24 

 

Una consideración a tener en cuenta es que el proceso de liofilización, a pesar de incrementar 
la estabilidad de las vesículas y del bioactivo, puede provocar efectos adversos, como son daños 
en  la bicapa  lipídica ocasionados por  la formación de cristales de hielo durante el proceso de 
congelación (paso previo y necesario para liofilizar las muestras) o problemas de agregación de 
vesículas durante el proceso de deshidratación, propia de la liofilización (Chen et al., 2010). Por 
ello,  se  recomienda  la  adición  de  compuestos  protectores  (generalmente  carbohidratos  o 
polialcoholes) en la formulación liposomal, si ésta va a ser sometida a un proceso de congelación 
y deshidratación.  

Uno de los compuestos más empleados es el glicerol (Figura 13), crioprotector reconocido por 
ser  capaz  de  proteger  a  los  liposomas  frente  a  los  posibles  daños  de  la  congelación  y  la 
liofilización (Stark et al., 2010). El glicerol podría modificar ligeramente las propiedades físicas 
de  los  liposomas  interactuando  con  los  fosfolípidos  de  la  bicapa  lipídica,  así  como  con  el 
bioactivo. Además, el glicerol ha demostrado mejorar la penetración en la piel por parte de los 
liposomas que lo contienen (Wang et al., 2014), lo que podría extrapolarse a una rápida y eficaz 
interacción con las células del intestino (enterocitos).  

 

Figura 13. Fórmula molecular del glicerol. 

 

Otro protector muy útil es la trealosa (Figura 14) (Hemanthkumar & Spandana, 2011). La trealosa 
es más conocida como lioprotector que como crioprotector. Tanto los procesos tecnológicos de 
estabilización  como  la adición de  crio‐ o  lioprotectores en  la  formulación  liposomal pueden 
condicionar las características de partícula y propiedades físicas de estos liposomas, así como su 
comportamiento  posterior  si  van  a  constituir  ingredientes  en  nuevas  formulaciones 
alimentarias.  

 

Figura 14. Fórmula molecular de la trealosa. 

 

3.3.2. Aplicaciones y Regulación de la utilización de liposomas para alimentación 

Los liposomas son estudiados y utilizados desde hace décadas, en concreto desde el año 1965 
cuando  fueron  descubiertos  y  empleados  por  primera  vez.  Desde  entonces  han  sido  una 
novedosa  y  creciente  aplicación  muy  útil  en  los  ámbitos  de  la  cosmética,  incorporando 
compuestos con beneficios potenciales para la piel tales como el ácido glicirretínico (Jia et al., 
2017), o de la medicina, empleando diferentes drogas encapsuladas en liposomas para paliar los 
efectos de diversas enfermedades, algunas de ellas  incluso  consideradas epidemias  como  la 
malaria (Tang et al., 2017) o el virus del VIH (Nayak et al., 2017). Existen actualmente numerosas 



Introducción 

25 

 

empresas que comercializan productos basados en liposomas conteniendo extractos complejos 
o compuestos bioactivos aislados destinados al ámbito de la cosmética. Un ejemplo es la casa 
comercial “MALTI DERM” que distribuye  liposomas  incorporando vitaminas antioxidantes en 
formato ampollas para el tratamiento de  las arrugas y el envejecimiento mediante aplicación 
tópica, basando su efectividad en la penetración del liposoma en la piel a capas más profundas 
donde libera el bioactivo, y evitando irritaciones superficiales. También es posible encontrar a 
la venta productos de liposomas enfocados al campo farmacéutico y médico, como es el caso 
de  la  casa  comercial  “Shire” que  comercializa  el producto ONIVYDE, un  fármaco basado  en 
liposomas con el bioactivo  irinotecán aplicable por  inyección  intravenosa para el tratamiento 
del cáncer de páncreas (Figura 15), basando en este caso la mejora del suministro del bioactivo 
por  medio  de  liposomas  a  una  mayor  persistencia  en  circulación  sistémica  de  irinotecán 
liposomal pegilado, con un  tiempo medio de permanencia de 50 horas  frente a 8 horas con 
irinotecán (Chang et al., 2015).  

    

Figura  15.  Productos  comercializados  de  liposomas  en  ámbitos  de  cosmética  (izquierda)  y medicina 
(derecha). 

 

Sin embargo,  los  liposomas han sido menos estudiados en el ámbito de  la alimentación y  la 
nutrición,  y  a  día  de  hoy  son  muy  escasos  los  productos  comercializados  incorporando 
liposomas, a pesar de las enormes aplicaciones potenciales que presentan, como pueden ser la 
mejora de la evaluación sensorial. Esta escasa comercialización ha sido en gran parte debida a 
la  restrictiva  política  de  inclusión  de  alimentos  por  parte  de  la  Unión  Europea.  Hay  que 
considerar que  las partículas de nano‐escala pueden  tener un presumible  inconveniente, en 
relación precisamente  a  su  tamaño,  sobre el    impacto que puedan ejercer  en el organismo 
humano, animales o en el medio ambiente, debido a sus potenciales efectos tóxicos, que en 
ocasiones es desconocido, pero hay que tener en cuenta la naturaleza y forma del material. Este 
tipo  de  materiales  podrían  penetrar  y  acumularse  en  tejidos  profundos,  formando  o 
modificando  enlaces  a  nivel  celular  y  subcelular,  pudiendo  ocasionar  efectos  no  deseados. 
También se desconocen sus efectos tras su aplicación en largos periodos de tiempo (Simões et 
al., 2017). Por ello,  la nanotecnología es un sector meticulosamente evaluado y regulado por 
diversos organismos para  asegurar  la bioseguridad  alimentaria  y humana. Aun  así, hay que 
mencionar que los liposomas son un tipo de vesícula de nano‐escala peculiares, dado que son 
estructuras flexibles capaces de invaginarse y de formar parte de las membranas. 

Sin  embargo,  desde  hace  escasamente  tres  años  esta  política  ha  cambiado,  pues  según  el 
Reglamento Europeo de Regulación de Alimentos (R (UE) nº 2015/2283 del Parlamento Europeo 
y del Consejo, de 25 de Noviembre de 2015), los alimentos consistentes en micelas o liposomas 
podrán  ser  incluidos  en  la  definición  oficial  de  nuevos  alimentos,  catalogada  por  la  Unión 
Europea.  

En su última  legislación establece como definición de nuevo alimento “todo alimento que no 
haya sido utilizado en una medida importante para el consumo humano en la Unión antes del 15 



Introducción 

26 

 

de mayo de 1997, con  independencia de  las fechas de adhesión de  los Estados miembros a  la 
Unión, y que esté comprendido por lo menos en una de las categorías siguientes: viii) alimento 
que  consista  en  nanomateriales  artificiales,  tal  como  se  definen  en  la  letra  f)  del  presente 
apartado: cualquier material producido intencionadamente que tenga una o más dimensiones 
del orden de  los 100 nm o menos o que esté compuesto de partes  funcionales diferenciadas, 
internamente o en superficie, muchas de las cuales tengan una o más dimensiones del orden de 
100 nm o menos, incluidas estructuras, aglomerados o agregados, que pueden tener un tamaño 
superior a los 100 nm, pero conservan propiedades que son características de la nano‐escala”. 

“Entre estas propiedades características de la nanoescala figuran: i) las relacionadas con la gran 
superficie  específica  de  los  materiales  considerados  y/o  ii)  las  propiedades  físico‐químicas 
específicas  que  son  distintas  de  la  forma  no  nanotecnológica  del mismo material”. Dado  el 
reglamento  vigente,  los  liposomas  que  se  elaboran  en  este  trabajo  podrían  llegar  a  ser 
considerados e incluidos por la Unión Europea como nuevos alimentos.  

Esta  nueva  Política  en  la  Regulación  de  Alimentos  ha  permitido  la  aparición  de  empresas 
dedicadas a  la comercialización de productos basados en  liposomas con  fines alimentarios o 
dietéticos.  Ejemplos  son  los  suplementos  dietarios  de  liposomas  “Personal  Trainer  In” 
elaborados por la División Nutraceutics Products de Idraet Group (Buenos Aires, Argentina) o los 
suplementos nutricionales de  liposomas “Altrient” conteniendo bioactivos varios (vitamina C, 
vitamina B, glutatión, ácido R‐α‐lipoico o acetil R‐carnitina) de la casa comercial Abundance & 
Health elaborados por LivOn Labs (Nevada, Estados Unidos), ambos para ser administrados vía 
oral (Figura 16).  

    

Figura 16. Productos comercializados de liposomas en el sector alimentario y dietético. 
 

Además, en la bibliografía actual existen artículos de liposomas encapsulando algunas materias 
primas naturales  infrautilizadas o descartadas con fines alimentarios, como son  liposomas de 
hidrolizado de colágeno  (Mosquera et al., 2016) y  liposomas de extractos de piel de granada 
(Altunkaya,  2014)  o  algunos  de  sus  componentes  principales,  como  liposomas  de  ácido 
clorogénico (Feng et al., 2016), y liposomas de astaxantina (Chiu et al., 2016), tocoferol (Neunert 
et al., 2015) o ácidos grasos poliinsaturados (Semenova et al., 2016), componentes de la grasa 
de los residuos de langostino.  

 

3.3.3. Absorción de nutrientes 

Cuando los liposomas entran en contacto con la superficie celular (Figura 17), el transporte de 
bioactivos tiene lugar por la fusión de las vesículas liposomales con la membrana (transferencia 



Introducción 

27 

 

mediada por proteínas) o por fagocitosis y pinocitosis (Park et al., 2014), procesos facilitados por 
el tamaño nanométrico de las vesículas y su similitud con las membranas celulares humanas. La 
fagocitosis es el proceso por el cual una célula rodea con su membrana citoplasmática a una 
sustancia sólida, la captura y la introduce en su interior. La pinocitosis es un tipo de endocitosis, 
al igual que la fagocitosis, pero en este caso la vesícula formada contiene líquido con sustancias 
en suspensión. El principal sitio de absorción es el intestino delgado, pero también puede ser en 
la boca, estómago y colon en función de la naturaleza del compuesto y el sistema de transporte 
empleado, y puede ser absorbido en su forma original o metabolizada (McClements, 2015), en 
general en las mucosas o a nivel transdérmico. Esta propiedad permite encapsular bioactivos en 
liposomas y facilitar su llegada al sitio diana en el interior del organismo, evitando su deterioro 
o degradación y permitiendo aprovechar sus propiedades funcionalmente beneficiosas para la 
salud. Existen multitud de factores que determinan una mejor o peor permeabilidad y por tanto 
absorción de liposomas por el organismo, como pueden ser la composición del bioactivo y su 
eficacia de encapsulación o  la presencia de otros componentes en  la  formulación  liposomal, 
tales como crioprotectores. Se ha demostrado que el glicerol empleado como crioprotector de 
vesículas mejora la permeabilidad y penetración en la piel de las mismas (Wang et al., 2014). 

La administración de fármacos/compuestos por vía oral se compone de dos rutas:  la mucosa 
bucal  y  la mucosa  sublingual  (Sandri  et  al., 2015). Ambas mucosas orales permiten que  los 
bioactivos  y  liposomas,  tras mezclarse  con  la  saliva,  lleguen  directamente  a  la  circulación 
sistémica  a  través de  capilares  y  venas,  favorecido por  la  elevada  vascularización de dichas 
mucosas (Patel et al., 2011) y las características propias de los liposomas. Para la administración 
oral el  rango de  tamaño  liposomal adecuado es de 100‐200 nm y  con el menor número de 
bicapas posibles (Mozafari et al., 2008).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 17. Esquema de mecanismo de absorción de compuestos. 

 

Actualmente  existen  algunos  productos  comercializados  basados  en  los  beneficios  de  la 
absorción directa de compuestos bioactivos y  liposomas que se administran por vía oral. Un 
ejemplo de ellos son los “WUG®‐Functional Gums” (Figura 18), es decir, chicles que contienen 
diversos  compuestos  bioactivos  en  su  interior  como  complemento  para  la  realización  de 
actividad física moderada o extrema, la mejora de las relaciones sexuales, evitar los síntomas de 
la resaca, activador del bronceado, con efecto relajante, etc. La ventaja de estos chicles radica 
en que al masticarlos, los bioactivos son absorbidos a través de las mucosas bucal y sublingual, 
pasando  al  torrente  sanguíneo  y  posteriormente  al  sitio  diana  de manera  rápida  y  eficaz                 

Luz intestinal 

Enterocito Sangre 



Introducción 

28 

 

(5 minutos), frente a los aproximadamente 40 minutos que requieren aquellos productos que 
son  sometidos  a  digestión  gastrointestinal,  como  es  el  caso  de  productos  sólidos,  bebidas 
energéticas,  el  café,  suplementos  vitamínicos o  comprimidos. Otro producto  con  semejante 
finalidad es “Oral Lyn” de Endorex Corporation OrasomeTM, un spray bucal a modo de inhalador 
con liposomas incorporando insulina destinado a los pacientes de diabetes. La ventaja de este 
producto  se  basa  en  la  facilidad  de  su  aplicación  (frente  a  las  inyecciones)  y  la  rapidez  de 
actuación. Según los Informes de evaluación de tecnologías sanitarias (AETSA, 2010) para este 
producto, “Los resultados para el uso pandrial de la insulina de administración oral/bucal fueron 
favorables, con  resultados equivalentes o superiores a  la  insulina  inyectada, obteniendo una 
disminución más rápida de  la glucemia postpandrial frente al tratamiento estándar y un pico 
más rápido y corto de insulinemia”. Hoy en día existen otros productos para tratamiento de la 
diabetes tipo II a nivel oral que están en fase de desarrollo. 

       

Figura 18. Productos comercializados para ser administrados vía oral. 

 

En cuanto a la absorción intestinal puede tener lugar a través de las células del intestino delgado 
(enterocitos), teniendo que ser sometido el compuesto ingerido a una digestión gastrointestinal 
previa. Las células Caco‐2 son células modelo del epitelio humano derivadas de carcinoma de 
colon. Se  trata de una población heterogénea que rápidamente se puede diferenciar en una 
monocapa de células con morfología y madurez de enterocitos (Simões et al., 2017). Es por ello 
que  son ampliamente utilizadas para estudios experimentales de absorción de  compuestos, 
entre otros. Autores  como Fernández‐Ávila et al.  (2016) estudiaron el efecto de emulsiones 
aceite‐agua encapsulando ácido  linoleico en un cultivo de células Caco‐2, observando que  las 
emulsiones protegían al bioactivo durante su  liberación, digestión y transporte a través de  la 
monocapa de células Caco‐2. Otros autores obtuvieron  resultados similares, sin embargo, es 
completamente necesario el estudio in vivo bajo condiciones de digestión reales para verificar 
los resultados obtenidos in vitro.  

3.4. Incorporación de liposomas en matrices alimentarias 

Otra ventaja o posibilidad que ofrecen  los  liposomas es  la de su  incorporación en diferentes 
matrices alimentarias (McClements & Xiao, 2017), tanto de origen animal (cárnico o pesquero, 
figura  19)  como  vegetal,  con  el  objetivo  de  que  ambas  partes  se  aporten  beneficios 
recíprocamente permitiendo obtener un producto  funcional con mejores propiedades y más 
saludables  que  cualquiera  de  los  componentes  que  lo  conforman  individualmente.  En  este 



Introducción 

29 

 

sistema, la matriz protege a los liposomas y al bioactivo encapsulado dentro de éstos, evitando 
su desestabilización o degradación por el proceso de digestión (enzimas, pH,…) mientras que el 
bioactivo  (protegido  a  su  vez  por  la  cápsula)  proporciona  la  potencial  actividad  biológica 
principal, adicional a la de la cápsula y la matriz, permitiendo obtener productos de alto valor 
añadido.  La  incorporación  de  liposomas  encapsulando  compuestos  bioactivos  en  alimentos 
funcionales  permite  un  enriquecimiento  con  componentes  saludables  y  la  prevención  de 
enfermedades (Singh, 2016). El diseño de gamas de productos diversos que puedan formar parte 
de la dieta diaria es lo que de verdad hará que los alimentos funcionales estén verdaderamente 
integrados  en  la  alimentación  de  los  consumidores.  La  elección  de  añadir  liposomas  en  las 
matrices  alimentarias  y  no  los  fosfolípidos  tal  cual  se  ha  basado  en  que  estos  últimos  son 
susceptibles de oxidación lipídica mientras que en forma de liposomas podrían reducir su grado 
de  enranciamiento  y  según  el  bioactivo  adicionado  a  su  vez  el  del  alimento.  Además,  la 
conformación  de  liposomas,  tal  y  como  se  ha  explicado  antes,  presenta  una  serie  de 
particularidades que facilitan o mejoran las características finales del producto.  

                 

Figura 19. Reestructurados de origen pesquero (izquierda) y cárnico (derecha). 

 

Existen  algunos  artículos  donde  los  autores  han  elaborado  diversas  matrices  alimentarias 
incorporando compuestos encapsulados en liposomas o estructuras similares. Un ejemplo es la 
elaboración de quesos  incorporando  liposomas con enzimas  (Kheadr et al., 2000) o péptidos 
antimicrobianos  (Malheiros  et  al.,  2012).  Esta  nanotecnología  también  se  ha  empleado  en 
margarinas y mayonesas con el objetivo de prevenir la oxidación de grasas insaturadas (Gibbs et 
al., 1999) o en alimentos a modo de lasañas proteicas, como liposomas encapsulando un péptido 
activo rodeado de poli‐Lisina  (antimicrobiano)  incorporados en matrices de películas gruesas 
(tipo obleas de pasta) formuladas con músculo de langostino cocido (Alemán et al., 2016). 

3.4.1. Incorporación en músculos de pescado 

Son numerosas las matrices alimentarias potencialmente compatibles con la incorporación de 
liposomas, siendo una de las más destacadas los modelos basados en músculo de pescado para 
la obtención de productos de alto valor añadido. El músculo de pescado es uno de los ejemplos 
más típicos de fuentes proteicas de origen animal con un alto valor nutricional. Tiene una fácil 
digestibilidad, mejora el metabolismo de lípidos, de antihipertensivos, estimula la fibrinólisis y 
actúa contra la obesidad (Hosomi et al., 2012). Al igual que en el caso de los extractos bioactivos 
y el material encapsulante para la formación de liposomas, las materias primas utilizadas como 
matriz alimentaria también podrían ser descartes y especies  infrautilizadas procedentes de  la 
industria pesquera o partes de ellas. Aproximadamente, el 81 % de  la producción mundial de 
pescado  va  destinada  al  consumo  humano, mientras  que  el  19 %  restante  (27 millones  de 
toneladas) va destinado a otros propósitos (FAO, 2010a y FAO, 2010b). Es decir, una inmensa 
cantidad  de  pescado,  principalmente  debido  a  su  bajo  valor  comercial  por  inadecuadas 
propiedades  sensoriales,  es  diariamente  descartado  y  desaprovechado.  Además,  estos 
descartes  suponen  un  problema  medioambiental  y  conducen  a  la  sobreexplotación  de 
determinadas especies debido a su consumo preferente (Guillén et al., 2018). Recientemente, 



Introducción 

30 

 

existe un interés considerable en el uso de especies procedentes de descartes de la pesca, cuyo 
valor comercial puede ser incrementado mediante novedosas tecnologías (Ordóñez‐Del Pazo et 
al., 2014), evitando problemas medioambientales y favoreciendo el equilibrio de las especies en 
los ecosistemas marinos. Los descartes de pescado no están permitidos legislativamente para el 
consumo  humano,  sin  embargo,  una  transformación  adecuada  en  productos  de  pescado 
reestructurados  basados  en  geles  a  partir  de  estos  descartes  podría  ser  una  alternativa, 
pudiendo representar un uso integral y económicamente rentable de estas fuentes desechadas. 

Los  reestructurados  provienen  generalmente  de  pescados  infrautilizados  o  de  residuos  del 
fileteado  con  bajo  valor  comercial  que  se  someten  a  un  determinado  procesado  para  la 
obtención de un producto final nuevo con un valor añadido y mejor salida en el mercado. La 
materia prima ha de ser de buena calidad, tanto higiénica como funcional. Ésta se puede utilizar 
y presentar de diversas formas, ya sea mediante modificación física, como un mince (músculo 
picado), mediante modificación física y química, como un gel (tras un proceso de gelificación 
que  implica  solubilización y establecimiento de enlaces que  se  suele  llevar a  cabo mediante 
tratamiento térmico), etc., presentando en cualquier caso excelentes propiedades sensoriales. 
El hecho de reestructurar permite controlar todas las características físico‐químicas del producto 
final, como son la coloración, textura, estructuración, composición, contenido en agua, etc., y 
sus propiedades funcionales mediante la adición de determinados componentes o ingredientes 
tecno‐funcionales.  Por  tanto,  los  reestructurados  de  pescado  suponen  una  alternativa 
tecnológica muy rentable e interesante que permiten la explotación de recursos marinos poco 
comercializados.  Además,  se  pueden  incluir  nutrientes  o  compuestos  bioactivos  en  los 
reestructurados con la finalidad de obtener un producto pesquero funcional desde el punto de 
vista nutracéutico con mayor valor añadido.   

Los reestructurados de pescado necesitan de  tratamiento o procesado para  la obtención del 
producto con características organolépticas concretas, sobre todo de textura, adecuadas para 
su  consumo.  Uno  de  estos  tratamientos  es  el  proceso  de  gelificación,  que  conlleva  una 
modificación físico‐química del sistema alimentario en su conjunto y en especial de la proteína 
miofibrilar. La gelificación del músculo parte de un proceso de molienda y mezclado con cloruro 
sódico  a  bajas  temperaturas  para  incrementar  la  solubilidad  de  las  proteínas miofibrilares, 
quedando el músculo en un estado de “sol” (homogeneizado). En el paso siguiente se procede 
a  la  adición  de  los  ingredientes  tecnológicos  y,  en  su  caso,  de  los  compuestos  bioactivos 
requeridos. Cuando la masa resultante es sometida a calentamiento y alcanza los 40 °C se forma 
una estructura de red proteica muy poco compacta y reversible principalmente  formada por 
interacciones hidrofóbicas y enlaces covalentes ε‐(γ‐glutamil)‐lisina que, con altas temperaturas 
(frecuentemente  >80  °C),  da  lugar  a  una  estructura  organizada,  compacta  y  termoestable 
reforzada por enlaces covalentes disulfuro  irreversibles, el gel de pescado  (Wei et al., 2018). 
Actualmente  existen  métodos  alternativos  a  la  gelificación  térmica  que  no  implican  el 
calentamiento de la muestra, como son las altas presiones (Montero et al., 2001) o mediante 
métodos biotecnológicos  como  la  aplicación de  enzimas que  faciliten  el  establecimiento de 
enlaces, como es la enzima transglutaminasa (Montero et al., 2005a).  

Un ejemplo de posible aprovechamiento de pescados descartados es  la obtención de surimi 
(Figura 20), con una producción de 1,5 millones de toneladas en China en 2015, según Yuan & 
Zhao  (2016).  Se  trata  de  un  concentrado  proteico  de  pescado  conteniendo  proteínas 
miofibrilares obtenido mediante la eliminación de espinas, picado, lavado y refinado a partir de 
carnes de pescado, en el cual se eliminan proteínas sarcoplasmáticas, sangre, lípidos y enzimas, 
previo a la deshidratación y mezcla con crioprotectores (Wei et al., 2018). El lavado permite la 
eliminación de  sustancias o  componentes que puedan desestabilizar  la proteína miofibrilar, 
mientras que el refinado permite la eliminación de cualquier partícula y espina residual, si bien 
disminuye el rendimiento un 15‐20 %. Constituye un producto de pescado intermedio de gran 
interés debido a su bajo contenido en grasa, y su elevado contenido en proteínas musculares 



Introducción 

31 

 

(Ueki et al., 2014). Los geles resultantes permiten el diseño de una amplia variedad de productos 
de conveniencia aptos para un rápido y fácil cocinado y consumo. Además, el surimi permite su 
combinación con otros sistemas como liposomas para la obtención de productos funcionales. 

      

Figura 20. Manto y surimi del calamar gigante (Dosidicus gigas). 
 

Existen en la bibliografía numerosos estudios sobre este tipo de productos, como el de Moreno 
et al. (2009) con surimi del calamar Dosidicus gigas o el de Suklim et al. (2003) directamente con 
el  calamar  Illex  illecebrosus  (especie  infrautilizada)  como  productos  reestructurados.  La 
elaboración  de  geles  de  surimi  a  partir  de  Dosidicus  gigas  permite  eliminar  las  enzimas 
proteolíticas y los compuestos nitrogenados (con valores realmente elevados en estas especies) 
que  dan  lugar  a  olores  y  sabores  desagradables,  a  la  vez  que  se  obtiene  un  producto  de 
procesado intermedio compuesto por un concentrado de proteína miofibrilar muy purificada, 
exento de compuestos indeseables y altamente estable a la congelación (Careche et al., 2004). 
El  tiempo  y  condiciones  de  conservación  del  surimi  pueden  ser  determinantes  en  sus 
propiedades físico‐químicas y estructurales, como son la textura, la capacidad de retención de 
agua o incluso la capacidad de su proteína para formar geles (An et al., 2018).   

Entre los músculos de pescado empleados para la elaboración de reestructurados también se 
podrían utilizar  aquellos que  excedan  la  cuota  de  captura máxima permitida por  la  Política 
Pesquera Común establecida por el Parlamento Europeo, incluso aquellas especies nobles, que 
son muy apreciadas para su consumo directo y por tanto tienen buena aceptación en el mercado 
por sí mismas. Un pescado altamente apreciado y muy consumido,  tanto en  fresco como en 
filetes congelados, es la merluza europea (Merluccius, figura 21).  

    

Figura 21. Ejemplar y filetes de la merluza europea (Merluccius merluccius). 

 

Esta especie posee una excelente  capacidad de  formar gel a partir de  su proteína muscular 
(Moreno et al., 2010), hecho que junto con las magníficas propiedades organolépticas que posee 
aportadas por su color claro, sabor suave y poca grasa, podría ser aprovechado para obtener un 
producto  funcional  saludable  con un alto valor añadido basado en un gel de merluza  como 
matriz  alimentaria.  El  uso  del  género Merluccius  como  modelo  de  pescado  para  obtener 



Introducción 

32 

 

productos reestructurados ya ha sido previamente ensayado por otros autores, como Zhou & 
Li‐Chan  (2009)  y  Cardoso  et  al.  (2008),  con  Merluccius  productus  y  Merluccius  capensis, 
respectivamente. 

La  importancia de  los  liposomas en estos sistemas bioactivo‐cápsula‐matriz radica en que  las 
actividades de los bioactivos pueden verse afectadas negativamente por la interacción excesiva 
del bioactivo con las proteínas de la matriz o por la degradación térmica durante el proceso de 
gelificación  (Montero  et  al.,  2005b).  Sin  embargo,  la  encapsulación  en  liposomas  de  los 
bioactivos mejora la eficacia y estabilidad de los mismos cuando son incorporados en sistemas 
alimentarios (Mozafari et al., 2008), ya que protegen al bioactivo de su  interacción con otros 
componentes  de  la matriz  alimentaria  (da  Silva Malheiros  et  al.,  2010)  y  de  otros  efectos 
perjudiciales asociados a factores tales como el pH del alimento o el tratamiento térmico de 
procesado  o  pasteurización. Además,  la  incorporación  de  liposomas  liofilizados  en matrices 
permite ajustar el contenido de agua del gel resultante, lo que es muy interesante para poder 
modular las propiedades de textura del mismo.  

3.4.2. Incorporación en películas comestibles 

Otra matriz modelo de interés en la industria alimentaria con un enorme potencial de aplicación 
son las películas comestibles, tanto de origen vegetal como animal. El envasado de alimentos 
tiene como finalidad la conservación y protección de los mismos, dirigidos a paliar los efectos 
del crecimiento microbiano y la oxidación (Tharanathan, 2003). Los envases plásticos cumplen 
esta  función  y  tienen  muy  buenas  propiedades,  sin  embargo,  no  son  biodegradables  y 
representan un problema medioambiental (Kirwan & Strawbridge, 2003). Por ello, en los últimos 
años se ha incrementado el interés por la elaboración de envases comestibles y biodegradables, 
los cuales se pueden elaborar a partir de materiales de desecho de  la  industria alimentaria o 
bien a partir de polímeros naturales (Figura 22).  

      

Figura 22. Fórmulas químicas de la caseína (caseinato sódico) y de la carboximetilcelulosa. 
 

El uso de películas comestibles biodegradables es una herramienta muy útil para preservar las 
propiedades potenciales de los bioactivos, evitando problemas medioambientales y mejorando 
la  sostenibilidad del procesamiento  (Pérez‐Mateos  et  al., 2009),  a  la  vez que  se obtiene un 
alimento de carácter funcional cuando son combinados con liposomas. Recientemente, existe 
un  creciente  interés  en  el  empleo  de  películas  y  recubrimientos  comestibles  de  alimentos 
elaborados  a  partir  de  biopolímeros  naturales  (Boelter &  Brandelli,  2016),  los  cuales  están 
totalmente disponibles en  la naturaleza. De especial  interés son  las estrategias basadas en el 
desarrollo de matrices alimentarias tipo película conformadas por biopolímeros en combinación 
con  la  nanotecnología,  con  el  objetivo  de  transportar  agentes  bioactivos  al  interior  del 
organismo y controlar su liberación (Chirra & Desai, 2012).  

Al  igual que  sucedía con  los modelos de músculo de pescado, dada  la susceptibilidad de  los 
péptidos a ser degradados por su exposición a condiciones extremas o por posibles interacciones 



Introducción 

33 

 

con otros componentes de la matriz (Aasen et al., 2003), la presencia de liposomas puede ser 
altamente ventajosa. Las películas permiten la protección de liposomas y bioactivos (Cui et al., 
2017b) a la vez que las vesículas son capaces de modificar las propiedades físicas de la matriz 
(Alemán et al., 2016). En la elaboración de cualquier película se hace necesaria la adición de un 
agente  plastificante  como  es  el  glicerol  (Manca  et  al.,  2013).  El  glicerol,  dada  su  elevada 
densidad,  induce  un  efecto  de  fluidificación  sobre  la  película  que  permite  su  distribución 
homogénea y su adecuada estructuración, mejorando sus propiedades mecánicas y evitando 
que ésta se rompa o agriete (Carvalho et al., 2018).  

Las películas con liposomas pueden ser empleadas de dos formas muy diferentes. Por un lado, 
pueden ser ingeridas por sí solas como un alimento funcional propio o bien pueden funcionar 
como recubrimientos de otros alimentos de baja humedad (Sathivel, 2005), como podrían ser 
“barritas  de  cereales”  (Figura  23),  para  sustituir  a  las  películas  sintéticas,  o  formando  ellas 
mismas sus propias bolsas comestibles para incluir los alimentos a modo de gyosas, ravioli, etc. 
(Figura 24),  conformando ambos  componentes el alimento  funcional.  La aplicación de estos 
recubrimientos no tiene por qué tener límites, ya que cambiando las condiciones de elaboración 
y  la  concentración del glicerol podrían obtenerse películas de mayor grosor y menor efecto 
plastificante, pudiendo tener otro tipo de aplicaciones envolventes, como podrían ser a modo 
de rollitos de primavera o fajitas (Figura 25).  

             

Figura 23. Películas comestibles útiles para recubrir otros alimentos de baja humedad. 

        

Figura 24. Películas comestibles útiles como bolsas comestibles englobando alimentos. 

        

Figura 25. Películas comestibles útiles como material envolvente. 



Introducción 

34 

 

La  elección  de  una  u  otra  “plataforma  de  película”  para  suministrar  el  bioactivo  funcional 
encapsulado  dependerá  de  varias  estrategias,  principalmente  respecto  a  las  características 
físico‐químicas del bioactivo y la dosificación (Borges et al., 2015). De este modo, mientras que 
las  películas  tipo  recubrimiento  pasarán  necesariamente  por  el  tracto  gastrointestinal 
(sometiéndose a digestión), dado que  se  ingieren en acompañamiento de otro alimento,  las 
películas  ingeridas  de  manera  separada  tienen  mayor  posibilidad  de  liberar  el  bioactivo 
directamente en la cavidad bucal.  

La mucoadhesión representa la unión de macromoléculas a la superficie de un epitelio (Sandri 
et al., 2015). De este modo, las películas podrían ser utilizadas como sistemas mucoadhesivos 
que permitan la liberación rápida y unidireccional del bioactivo en la cavidad oral mejorando así 
la biodisponibilidad de los bioactivos en boca (McClements, 2013) y previniendo su paso al tracto 
gastrointestinal (Silva et al., 2015). Esto es posible gracias a que las mucosas bucal y sublingual 
son altamente permeables y permiten que nanocápsulas y bioactivos pasen directamente al 
sistema  circulatorio  (Patel  et  al.,  2011). Diferentes  autores  describen  que  el mecanismo  de 
mucoadhesión  requiere  3  etapas  sucesivas:  contacto  (adherencia),  interpenetración  y 
consolidación.  Para  la  primera  etapa  de  adhesión,  el  estado  físico  está  fundamentalmente 
influenciado  por  la  hidratación,  en  el  segundo  se  establece  el  contacto  entre  el  polímero 
altamente adhesivo y el epitelio de la mucosa, produciendo una interacción a nivel de la capa 
de moco (con alto contenido en mucina) y en el tercero, después de un tiempo, se establecen 
vínculos mecánicos y químicos  (Ivarsson & Wahlgren, 2012; Sandri et al., 2015). Este tipo de 
películas representarían otro producto funcional alternativo destinado a que los liposomas que 
contienen sean adsorbidos a nivel bucal y sublingual, con las ventajas que ello representa. 

Los bioactivos vehiculizados en las películas a modo de recubrimiento no tienen esta facilidad 
de difusión, pues son rápidamente mezclados con el bolo alimenticio y tienden a pasan al tracto 
gastrointestinal. Estas películas protectoras permiten alargar  la vida útil de  los alimentos que 
recubren y están diseñadas para consumirlas junto al producto (Rojas‐Graü et al., 2007). Además 
de preservar la estructura de los liposomas y la actividad del bioactivo encapsulado (Campos et 
al., 2018), dichas películas actúan como barrera frente a diversos factores como son la humedad, 
el oxígeno, dióxido de carbono, aditivos o incluso componentes intrínsecos del propio alimento 
(Wu et al., 2015).  

Hay  publicados  varios  trabajos  acerca  de  películas  con  liposomas,  como  las  de 
carboximetilcelulosa  incorporando  liposomas  rellenos  con  polifenoles  de  Silva‐Weiss  et  al. 
(2018),  las elaboradas por Alemán et al. (2016) a partir de músculo de  langostino cocido con 
liposomas rellenos de péptidos antioxidantes y antihipertensivos pensada para funcionar como 
un “rollito”, o por Imran et al. (2012) a base de hidroxipropilmetilcelulosa con nanocápsulas de 
nisina, destinadas a funcionar como embalaje de alimentos.   

3.5. Digestión gastrointestinal in vitro 

La  determinación  de  la  bioactividad  y  del  contenido  de  un  compuesto  o  nutriente  no  es 
suficiente para determinar sus efectos potenciales  in vivo asociados con el metabolismo que 
tiene  lugar  tras el proceso de absorción. Por ello, es necesario evaluar  la biodisponibilidad y 
efectividad biológica de  los  compuestos bioactivos  (Karaś et  al., 2017).  La bioeficacia de un 
compuesto activo depende de  la matriz encapsulante,  las enzimas y estructuras moleculares 
implicadas en la digestión, la digestibilidad, la solubilidad del bioactivo, su bioaccesibilidad, etc. 
Además, parece  ser que  solo  a  través del  conocimiento del  tejido/órgano  específico donde 
acaban llevando a cabo su acción los compuestos encapsulados en liposomas es posible mejorar 
su  desarrollo  y  eficacia  y  garantizar  la  seguridad  alimentaria,  comprobando  la  ausencia  de 
toxicidad de dichos bioactivos (Pinheiro et al., 2017). 



Introducción 

35 

 

El  término  biodisponibilidad  de  un  compuesto  es  la  proporción  ingerida  de  un  nutriente  o 
componente que puede  ser absorbida y queda disponible en el  sistema  circulatorio para  su 
utilización.  Abarca  la  digestión  gastrointestinal  (liberación),  absorción,  distribución  en  los 
tejidos,  metabolismo  y  excreción,  y  es  determinada  in  vivo  en  animales  o  humanos        
(Carbonell‐Capela  et  al.,  2014).  Sin  embargo,  como  etapa  previa,  se  suele  determinar  la 
bioaccesibilidad,  que  generalmente  se  evalúa  mediante  digestión  gastrointestinal  in  vitro 
incluyendo varias fases: la liberación del compuesto de la matriz, las modificaciones durante el 
proceso de digestión y la absorción por las células del epitelio intestinal. La bioactividad se define 
como el efecto específico obtenido después de  la exposición de una sustancia y puede ser  in 
vivo, ex vivo o in vitro. Esta incluye la captación del bioactivo por el tejido y la repuesta fisiológica, 
ya  sea  antioxidante,  anticancerígena,  antiinflamatoria,  antialérgena  o  antibacteriana  
(Carbonell‐Capela et al., 2014). 

El proceso de digestión gastrointestinal comprende varias etapas: una fase inicial en boca donde 
se produce la hidrólisis de carbohidratos por la enzima amilasa, una fase estomacal donde tiene 
lugar  la  hidrólisis  ácida  de  lípidos  (por  la  lipasa  gástrica)  y  de  proteínas  (por  la  pepsina),  y 
finalmente una fase  intestinal que se divide a su vez en  la fase en el  intestino delgado con  la 
hidrólisis de proteínas (proteasas intestinales), almidón (amilasa) y lípidos (lipasa pancreática) y 
la  interacción  con  las microvellosidades  intestinales  (absorción),  y en  la  fase en el  intestino 
grueso, con la interacción con la microflora (Figura 26). Destacan dos mecanismos de transporte 
de  bioactivos  a  través  del  epitelio  intestinal:  entre  células  vía  uniones  estrechas  (ruta 
paracelular) o a través de las células intestinales (ruta transcelular). A lo largo de todo el proceso 
de digestión se dan algunos pasos clave, como son los cambios de pH del medio, variaciones en 
el  tipo  y  concentración  de  iones  o  la  presencia  de  enzimas,  factores  que  determinan  las 
interacciones, estado físico, composición y estructura de los liposomas (Pinheiro et al., 2017). 
Durante  la  digestión  gastrointestinal  in  vitro  (simulada)  se  dan  una  serie  de  condiciones  o 
procesos que pueden alterar las propiedades y características físico‐químicas de los liposomas, 
como son variaciones de pH, oxígeno, diluciones de la muestra, etc.  

 

Figura 26. Diagrama esquemático representando las distintas fases de la digestión humana. 
 

Mientras que  los péptidos y  los  lípidos tienen una tasa de absorción  intestinal aceptable,  los 
polifenoles presentan relativa baja absorción a partir del tracto gastrointestinal,  lo que  limita 
sus  efectos  biológicos  en  el  organismo.  Se  ha  demostrado  que  la  absorción  intestinal  de 
polifenoles y de sus metabolitos que circulan por el plasma es determinada por  la estructura 



Introducción 

36 

 

química (D´Archivio et al., 2010). La biodisponibilidad de cada clase de polifenol es determinada 
por el peso molecular, su glicosilación y su esterificación. De este modo, muchos polifenoles 
contenidos en  frutas y vegetales están glicosilados, afectando a  su absorción en el  intestino 
(Karaś et al., 2017). La encapsulación de estos compuestos polifenólicos y otros de diferente 
naturaleza en liposomas mejora su bioaccesibilidad y biodisponibilidad, mejorando su tasa de 
digestibilidad.  

3.6. Técnicas experimentales 

Se han aplicado diversas metodologías para caracterizar las propiedades tanto de los extractos 
bioactivos y los liposomas, así como de las matrices alimentarias empleadas como modelos de 
incorporación. A continuación se  introducen brevemente  los  fundamentos de algunas de  las 
técnicas más significativas de la presente Memoria.  

Tamaño medio, polidispersidad y potencial Z mediante dispersión dinámica de luz en Zetasizer 

El  tamaño  de  partículas  basadas  en  polímeros  o  coloides  es  un  factor  determinante  en  las 
propiedades de sistemas biológicos. La dispersión dinámica de  luz es una de  las técnicas más 
empleadas para medir el tamaño de partícula en soluciones o en dispersiones y para  llevar a 
cabo estudios de distribución de tamaños. Se basa en las fluctuaciones desencadenadas por la 
difusión Browniana de partículas esféricas, donde el movimiento Browniano de  las partículas 
está  relacionado con el diámetro hidrodinámico. La  técnica se emplea con mayor  frecuencia 
para 1) estudios de estabilidad de formulaciones en función del tiempo y/o la temperatura, 2) 
identificar la presencia de agregados en diferentes formulaciones, y 3) la rápida determinación 
del tamaño de partícula de muestras monodispersas (Manaia et al., 2017).  

Esta técnica utiliza una luz láser que incide sobre las partículas de una suspensión, provocando 
la dispersión de luz en todas las direcciones posibles. Estos haces de luz dispersados interfieren 
con  los  haces  de  las  otras  partículas  y  permiten  obtener  una  intensidad  de  dispersión.  Las 
partículas  de  una  suspensión  se  encuentran  en  continua  vibración  como  consecuencia  del 
movimiento browniano (movimiento aparentemente aleatorio de las partículas suspendidas en 
un  fluido,  según  Harrison  (1985)),  por  lo  que  sus  posiciones  relativas  están  cambiando 
continuamente. Esto provoca que las condiciones de interferencia y la intensidad de dispersión 
varíen en función de estas vibraciones y posiciones relativas. La  intensidad de  luz dispersada 
detectada será ligeramente más alta o más baja que la de luz incidente original (debido al efecto 
Doppler: cambio de frecuencia aparente de una onda producido por el movimiento relativo de 
una  fuente  respecto  a  otra  y  que  se  puede medir  por  interferometría),  dependiendo  de  la 
dirección en que se mueva la partícula con respecto al detector. De este modo, si las partículas 
se mueven rápidamente (partículas pequeñas) la intensidad de la dispersión se acelera pero si 
las  partículas  se  mueven  lentamente  (partículas  grandes)  la  intensidad  se  reduce                
(Cuadros‐Moreno et al., 2014).  

El tamaño medio se determina empleando un software específico, que calcula el coeficiente de 
difusión translacional aplicando la ecuación de Stokes‐Einstein (Lee et al., 2010):  

 

Donde DZ es el diámetro hidrodinámico, Dt,avg es el coeficiente de difusión translacional, KB es la 
constante Boltzmann, T es la temperatura termodinámica y ɳ es la viscosidad dinámica.  

Las dispersiones  con nanopartículas  suelen  tener diversos  tamaños de partícula, por  lo que 
tienen diferentes coeficientes de difusión translacionales (Pecora, 2000). Al medir el tamaño de 



Introducción 

37 

 

partículas mediante esta técnica se obtiene el diámetro medio, la distribución de tamaños y el 
índice  de  polidispersidad,  calculado mediante modelos matemáticos. Mediante  el  índice  de 
polidispersidad  se  puede  tener  una  idea  de  la  diversidad  de  tamaños  de  partícula  en  la 
suspensión. Este  índice oscila de 0‐1, donde 0 es el valor para suspensiones completamente 
monodispersas (Zweers et al., 2003).  

El potencial zeta es una característica de partícula fundamental también determinada mediante 
dispersión dinámica de  luz, mediante microelectroforesis Doppler  (Manaia et al., 2017).  Las 
medidas  de  potencial  zeta  proporcionan  un  análisis  preciso  del  estado  electrónico  de  la 
superficie de  las  partículas, pudiendo  ser utilizadas  como  indicador de  la  estabilidad de  las 
suspensiones.  La  inestabilidad  resulta  de  la  interacción  entre  partículas  no  cargadas  o 
débilmente cargadas, dando lugar a la formación de agregados.  

Cuando  las  partículas  entran  en  contacto  con  una  solución  acuosa,  desarrollan  una  carga 
eléctrica debido a sus características iónicas. Cada partícula es rodeada por una capa de iones 
de carga opuesta pero equivalente conocida como capa de Stern. Este conjunto se encuentra 
envuelto por una capa difusa con  iones de diferentes polaridades (Schultz et al., 2008). Estos 
iones permanecen ligados a la partícula durante todos sus desplazamientos en el medio acuoso, 
evitando colisiones con otras partículas de características similares y confiriendo estabilidad a la 
suspensión (Figura 27).  

 

Figura 27. Esquema de la representación de la doble capa eléctrica de una partícula: la imagen izquierda 
muestra  el  cambio  en  la  densidad  de  carga  alrededor  del  coloide;  la  imagen  derecha  muestra  la 
distribución de iones positivos y negativos alrededor del coloide cargado. 
 

El potencial zeta se define como la carga electrostática que existe en el límite de la capa de Stern 
y la capa difusa, y se emplea como índice de estabilidad de partículas (Gustafsson et al., 2003). 
Al incrementarse el potencial zeta (positiva o negativamente) se incrementan las interacciones 
repulsivas y se reduce la frecuencia de las colisiones entre partículas, dando lugar a una mayor 
estabilidad de suspensión (Da Silva Malheiros et al., 2010). Valores de potencial zeta inferiores 
a ‐30 mV o superiores a +30 mV son indicativos de condiciones estables (Müller et al., 2001). 

Microscopía electrónica de transmisión por criofijación 

La  microscopía  electrónica  de  transmisión  es  una  de  las  herramientas  más  útiles  para  la 
caracterización de nanomateriales a escalas espaciales para  tamaños comprendidos desde el 
nivel  atómico  entre  1‐100  nm  hasta  el  nivel  micrométrico,  con  diversas  posibilidades  de 



Introducción 

38 

 

aplicación. La técnica emplea un haz de electrones más potente que la microscopía electrónica 
de  barrido,  proporcionando  mejor  resolución  y  mayor  detalle,  permitiendo  observar  la 
estructura cristalina y granulometría de partículas. La imagen se forma a partir de los electrones 
transmitidos a través de la muestra, que se concentran en la lente, se detectan por una cámara 
y  se muestran en una pantalla. La  técnica de microscopía electrónica de  transmisión es una 
herramienta  muy  importante  en  muchos  campos  de  la  nanotecnología,  incluyendo  la 
investigación de los transportadores de sustancias bioactivas. Además, permite la detección de 
alteraciones en  la morfología de nanopartículas después de  la  incorporación de sustancias a 
distintas concentraciones (Manaia et al., 2017).  

Una alternativa para mejorar la preservación de la morfología de la muestra es la microscopía 
electrónica  de  transmisión  por  criofijación,  donde  la  muestra  es  fijada  por  congelación, 
disminuyendo los tratamientos invasivos de deshidratación o tinción típicos de la microscopía 
convencional (Manaia et al., 2017).  

Calorimetría Diferencial de Barrido 

La técnica de Calorimetría Diferencial de Barrido nos aporta información útil sobre la naturaleza 
de los cambios termodinámicos (temperatura) y energéticos (entalpía) que están asociados a la 
transformación y reordenamiento de moléculas o compuestos cuando un material pasa de un 
estado energético a otro. Es decir, cuando una muestra se somete a una transición de fase, ésta 
experimenta una serie de cambios de temperatura y entalpía que pueden dar una  idea de  la 
composición y estructura del material.  

Esta técnica es regularmente empleada en el análisis térmico de alimentos para la detección de 
pérdida de agua, desnaturalización proteica y cristalizaciones en  las propiedades termofísicas 
de los constituyentes y su información es relevante para determinar y poder mejorar la calidad, 
seguridad y estabilidad del alimento. Una de sus aplicaciones más relevantes es el estudio de las 
transiciones  de  fase  en  emulsiones  alimentarias  (Farah  et  al.,  2018).  Esta  técnica  permite 
determinar  la  estabilidad  térmica  de  los  liposomas,  lo  que  en  parte  se  correlaciona  con  su 
aptitud como alimento funcional. 

Reología dinámica oscilatoria 

La reología es el estudio del  flujo y deformación de  la materia y usualmente se emplea para 
estudiar fluidos no newtonianos. Los polímeros son grandes macromoléculas que exhiben un 
comportamiento  no  newtoniano,  donde  el  parámetro  de  viscosidad  depende  de  la  tasa  de 
deformación. Además, son materiales viscoelásticos, es decir, que poseen propiedades tanto de 
un  líquido  viscoso  como  de  sólidos  elásticos,  dependiendo  del  tiempo  y  condiciones  de 
deformación  (Aho  et  al.,  2015).  Los  estudios  reológicos  dan  información  sobre  el  grado  de 
consistencia y estabilidad de  las matrices alimentarias, así como de  la aptitud tecnológica de 
ingredientes y mezclas de compuestos para el procesado. 

Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier 

La  Espectroscopía  Infrarroja  con  Transformada  de  Fourier  es  una  técnica  espectroscópica 
vibracional  que  puede monitorizar  los  cambios  en  las  estructuras moleculares, permitiendo 
detectar los cambios moleculares de una manera rápida y no invasiva de la muestra (Wei et al., 
2018). Se basa en detectar  las vibraciones naturales de  las moléculas y de diferentes grupos 
funcionales. En función de la frecuencia exacta y de la intensidad (en absorbancia) a la que se 
detectan  los diferentes grupos  funcionales,  se pueden deducir  cambios en  la  composición y 
conformación estructural de  las muestras. En esta  técnica es aconsejable emplear muestras 



Introducción 

39 

 

secas o con un bajo contenido en agua, puesto que el agua  (externa o en solución)  también 
refleja vibraciones moleculares y puede inducir a errores en la determinación de los resultados. 

Resonancia Magnética Nuclear de Protón de Bajo Campo 

La resonancia magnética nuclear de baja resolución es una técnica apreciada y útil en la ciencia 
y  tecnología  de  los  alimentos,  permitiendo  la  investigación  de  las  relaciones  entre  las 
propiedades  de  los  alimentos  y  su  composición  y  estructura,  a  través  del  intercambio  de 
protones (esencialmente relacionados con la estructura de las moléculas de agua). Es adecuada 
para el estudio de las propiedades dinámicas de la materia, tales como difusión, flujo y relajación 
(Capitani  et  al.,  2017).  Los  dos  principales  fenómenos  de  relajación  en  resonancia  son  la 
relajación longitudinal, caracterizada por T1, y la relajación transversal, caracterizada por T2.  

Esta técnica, basada en el magnetismo nuclear es un método no invasivo y no destructivo que 
no  requiere ningún  tipo de preparación de  la muestra  (Kirtil & Oztop, 2016),  lo que amplía 
enormemente su posibilidad de aplicaciones relacionadas con los alimentos.  

Test de adherencia y mucoadhesividad 

La bioadhesión es una propiedad muy importante de las membranas biológicas. La mucosa oral 
está constituida principalmente de mucinas, glicoproteínas con funciones adherentes capaces 
de atrapar nutrientes y una amplia variedad de compuestos (Laurén et al., 2018). De este modo, 
la capacidad de adherencia y mucoadhesividad de  los polímeros que conformen  las películas 
facilitaría la retención de ingredientes activos en las mucosas (Cook et al., 2018), favoreciendo 
la incorporación de nutrientes (o bioactivos) vía oral y sublingual, que pasarían directamente al 
torrente  sanguíneo.  Pero  también  puede  ser  un  mecanismo  para  evaluar  la  adhesión  y 
mucoadhesión de determinados compuestos o estructuras en otras mucosas, por ejemplo las 
intestinales, vaginales, nasales, etc. 

El  test de adherencia  representa  la  fuerza máxima necesaria para despegar un artefacto de 
superficie plana de  la película mientras que el test de mucoadhesividad es un procedimiento 
similar  pero  donde  se  aplica  una  capa  de mucina  (proteína  glicosilada  procedente  de  las 
secreciones mucosas)  entre  la película  y  la  superficie del  artefacto, de manera que  se  crea 
contacto entre mucina y película. 

Test de tracción  

La resistencia mecánica se considera una aptitud muy importante en las películas elaboradas a 
partir  de  polímeros  naturales,  ya  que  de  ella  depende  que  la  película  pueda  romperse  o 
fracturarse, limitando así su función, sobre todo si la finalidad de la misma es ser utilizada como 
embalaje o envolvente de otros alimentos. La resistencia de una película dependerá de factores 
como son la composición del polímero, la adición de fluidificantes, el estado de hidratación final 
de la película, etc.  

El  test  de  tracción  permite  determinar  la  resistencia mecánica  de  las  películas mediante  la 
cuantificación  de  la  fuerza  de  tensión,  fuerza máxima  necesaria  para  romper  una  película 
sometida a estiramiento, y  la elongación, distancia máxima de estiramiento alcanzada por  la 
película antes de su rotura como consecuencia de dicho estiramiento.  

Estabilidad oxidativa por el método de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico 

Las especies reactivas de oxígeno, moléculas altamente reactivas responsables de la oxidación 
lipídica  y  la  descomposición  oxidativa  de  ácidos  grasos  insaturados  (Qian  et  al.,  2008),  son 



Introducción 

40 

 

eliminados, en condiciones normales, por los sistemas de defensa antioxidante del organismo, 
tanto enzimáticos (catalasa, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa) como no enzimáticos 
(vitamina  E,  vitamina  C,  glutatión).  Sin  embargo,  en  condiciones  patológicas  se  rompe  el 
equilibrio entre generación y eliminación de especies reactivas de oxígeno, incrementándose la 
generación incontrolada de radicales libres, responsables del deterioro de lípidos de membrana, 
biomacromoléculas  (ADN)  y  proteínas,  desencadenando  trastornos  como  diabetes mellitus, 
cáncer, y enfermedades cardiovasculares, inflamatorias o neurodegenerativas (Johansson et al., 
2010). Por ello es necesario el consumo de fuentes antioxidantes externas para evitar el estrés 
oxidativo (Ratnam et al., 2006).  

El fundamento de esta técnica radica en que el malonaldehído, sustancia capaz de reaccionar 
con el ácido tiobarbitúrico, es un producto resultado de la oxidación lipídica y posee un color 
rosa, tanto más intenso cuanto más compuesto hay. Las sustancias antioxidantes son capaces 
reducir este contenido en malonaldehído y por tanto la tonalidad rosácea, indicando un menor 
grado  de  oxidación  lipídica.  Esta  variación  de  color  puede  ser  cuantificada  por  métodos 
espectrofotométricos.  

Análisis sensorial 

El análisis sensorial es una técnica que utiliza personas que, mediante el uso de sus sentidos 
(gusto,  olfato,  vista,  oído  y  tacto),  identifican  y  evalúan  las  propiedades  organolépticas  de 
alimentos.  Se  utiliza  frecuentemente  como  control  de  calidad,  pero  es  una  herramienta 
francamente útil en el desarrollo de alimentos, en el cual permite caracterizar los atributos que 
van a marcar en especial un alimento o que se desean enfatizar en especial; incluso para estudios 
de comercialización, rivalidad entre marcas o cuotas de mercado es cada día más frecuente. 

Este tipo de análisis se puede afrontar mediante tres tipos de aspectos bien diferenciados: 

1. Discriminación: cuando  las preguntas al evaluador pretenden establecer diferencias o 
no entre dos o más productos. Cobran especial importancia en el Análisis de Control de 
Calidad de Productos y Estudios de Vida Útil.  

2. Descripción:  cuando  se pretende  identificar y medir  las diferencias entre productos. 
Muy  conveniente  en  el  Desarrollo  de  Productos,  reformulación  o modificación  de 
productos ya existentes.  

3. Preferencia o hedónicas: se persigue conocer el grado de agrado o aceptabilidad. Tiene 
como objetivo establecer el grado de satisfacción de  los productos en el consumidor 
(Carpenter et al., 2000).  

El tipo de análisis sensorial llevado a cabo en este trabajo es un análisis de descripción. Para la 
realización del análisis sensorial es conveniente definir qué descriptores son los que mejor van 
a  definir  las  características  que  se  desean  evaluar  en  el  producto  o  ingrediente  concreto, 
llevándose a cabo mediante unas pruebas descriptivas con un panel entrenado de jueces que 
nos permitan apreciar qué parámetros y en qué medida se modifican en un alimento por  la 
introducción en la formulación de este tipo de encapsulados. Entre los aspectos más comunes 
cabe destacar el sabor, la textura, el olor, etc. Sin embargo, en función de las características del 
alimento a valorar, los atributos estudiados pueden variar. Por ejemplo, para el análisis sensorial 
de películas se considera que deberían tenerse en cuenta parámetros como  la adherencia en 
boca, el grado de salivación, el tiempo de disolución en boca, palatabilidad, etc.   

No  se  han  encontrado  hasta  el  momento  estudios  publicados  sobre  las  propiedades 
organolépticas  de  los  liposomas  como  ingredientes  alimentarios  en  diferentes  alimentos; 
probablemente estos estudios hayan sido llevados a cabo a nivel industrial.   



Introducción 

41 

 

Actividad antioxidante  

Sería deseable establecer y estandarizar métodos que puedan medir el nivel total de capacidad 
antioxidante  directamente,  principalmente  a  partir  de  extractos  que  contienen  compuestos 
fenólicos, u otros compuestos fuertemente antioxidantes, pero frecuentemente  los extractos 
son complejos y tienen más de una especie en su composición. Lo más frecuente es tratar de 
determinar  esta  actividad mediante  diversas  aproximaciones  o  ensayos  que  nos  permitan 
apreciar  diversos mecanismos  de  capacidad  antioxidante  del material  en  su  conjunto.  Los 
ensayos de capacidad antioxidante se pueden clasificar en general como ensayos basados en 
transferencia de electrones (ET) y transferencia de átomos de hidrógeno (HAT).  

La mayoría de los ensayos HAT están basados en la cinética e implican un esquema de reacción 
competitivo en el que el antioxidante y el sustrato compiten por los radicales peroxilo generados 
térmicamente a través de la descomposición de compuestos azoicos. Los ensayos basados en 
transferencia  de  electrones miden  la  capacidad  de  un  antioxidante  en  la  reducción  de  un 
oxidante, que cambia de color cuando se reduce. Los ensayos de transferencia de electrones 
incluyen ABTS  / TEAC, Métodos CUPRAC, DPPH, Folin‐Ciocalteu y FRAP,  cada uno utilizando 
diferentes reactivos redox cromogénicos con diferentes potenciales estándar. 

Método de fotoquimioluminiscencia 

La  fotoquimioluminiscencia  combina  la  rápida  generación  de  radicales  libres  con  la  alta 
sensibilidad para su detección lumínica. Este método mide la capacidad de los antioxidantes de 
unirse al radical superóxido tanto en ambientes liposolubles como hidrosolubles. La excitación 
mediante irradiación (UV) de la sustancia fotosintentizadora (luminol) produce radicales libres 
(radical  superóxido),  radicales  que  serán  parcialmente  eliminados  al  reaccionar  con  los 
antioxidantes presentes en la muestra. El resto de los radicales libres producen luminiscencia al 
reaccionar con el luminol (doble papel), luminiscencia que se mide en el detector presente en el 
equipo (tubo fotomultiplicador). Por tanto cuanta más luminiscencia sea detectada menor será 
la capacidad antioxidante. 

Actividad antioxidante por el método de secuestro de radicales libres (ABTS) 

El  fundamento  de  esta  técnica  radica,  según  Zulueta  et  al.  (2009),  en  que  el                                   
ácido 2,2´‐azino‐bis‐3‐etilbenzotiazolin‐6‐sulfonico (ABTS) en presencia de persulfato potásico 
(K2S2O8)  es  oxidado,  formando  el  radical  ABTS+,  cromatóforo  que  presenta  una  coloración   
verde‐azulada. Pero hay sustancias antioxidantes que son capaces de reducir el ABTS, es decir, 
revertir la reacción de oxidación y de esta manera provocar la pérdida de coloración del reactivo 
ABTS+.  Esta  pérdida  de  coloración  puede  ser  medida  por  espectrofotometría  visible  y  así 
cuantificar la capacidad antioxidante de una sustancia.  

Actividad antioxidante por el método del poder reductor del hierro (FRAP) 

El  fundamento de esta  técnica se basa, acorde a Benzie & Strain  (1996), en que el complejo    
Fe3+‐  tripiridiltriazina  (incoloro)  puede  ser  reducido  por  una  sustancia  antioxidante  a                    
Fe2+‐  tripiridiltriazina  (coloreada).  Esta  aparición  de  color,  la  cual  representa  una  mayor 
reducción y por tanto una mayor capacidad antioxidante, puede ser medida y cuantificada por 
espectrofotometría.  

Actividad antioxidante por el método del contenido de sustancias reactivas al Folin‐Ciocalteu 

Esta técnica se basa, como indicó previamente Slinkard & Singleton (1977), en que el reactivo 
de  Folin  presenta  un  color  amarillento  debido  a  la  presencia  en  su  composición  del  ácido 
fosfomolibdotúngstico. Este reactivo puede interaccionar con diversas sustancias antioxidantes, 
las cuales reducen el color amarillo en favor de una coloración azulada. Este cambio de color 



Introducción 

42 

 

puede  ser  medido  por  espectrofotometría  y  la  actividad  antioxidante  de  la  sustancia 
cuantificada.  

Actividad  antihipertensiva  por  el  método  de  inhibición  de  la  enzima  convertidora  de 

angiotensina 

La enzima convertidora de angiotensina es capaz de convertir  la angiotensina  I  (inactiva) en 
angiotensina II (activa). Esta hormona activa es un decapéptido con acción vasoconstrictora de 
arteriolas y vénulas y además provoca, a través de la aldosterona, la reabsorción de agua y sodio 
y la excreción de potasio. Estos dos mecanismos conducen a un incremento de la presión arterial 
y  con  ello  un  aumento  del  riesgo  de  enfermedades  cardiovasculares,  como  puede  ser  la 
hipertensión (Kim et al., 2001). Sin embargo, existen compuestos antihipertensivos capaces de 
reducir la actividad de la enzima convertidora de angiotensina y por tanto la hipertensión. 

El método utilizado para medir la actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina 
(ACE) in vitro ha sido el descrito por Wu et al. (2002), que se basa en la cuantificación mediante 
fase reversa en cromatografía de alta eficacia (RP‐HPLC), a 228 nm, del ácido hipúrico formado 
al incubar el sustrato Hipuril‐Histidil‐L‐Leucina (HHL) con la ACE, en presencia o no de sustancias 
inhibidoras.  La  cantidad  de  ácido  hipúrico  formado,  es  relacionada  con  la  capacidad  de  la 
muestra estudiada para inhibir la actividad de la enzima. 

Actividad hipoglucémica por el método de inhibición de la enzima dipeptidil peptidasa IV 

La hiperglucemia es el  indicador más habitual de  la diabetes, enfermedad consistente en un 
conjunto  de  trastornos  metabólicos,  presentando  complicaciones  a  diversos  niveles  y  en 
distintos aparatos: pérdida de visión, problemas renales, dificultad en la circulación de la sangre 
y  riesgo  de  enfermedad  coronaria  e  infarto,  problemas  de  irrigación  intestinal,  etc.  Esta 
enfermedad  está  relacionada  directamente  con  los  niveles  elevados  de  glucosa  en  sangre, 
consecuencia de una deficiencia de  insulina (diabetes tipo I) o resistencia a  insulina (diabetes 
tipo II).  

Esta  técnica  se  basa  en  la  inhibición  por  parte  de  la  enzima  dipeptidil  peptidasa  IV  de  dos 
hormonas:  el  péptido  similar  al  glucagón  y  el  péptido  inhibidor  gástrico.  Estas  hormonas 
incretínicas favorecen el control glucémico regulando los niveles de insulina (Maes et al., 2007) 
evitando o disminuyendo enfermedades como  la diabetes. Por tanto, a mayor actividad de  la 
enzima mayor será la inhibición de estas hormonas y mayores los problemas relacionados con 
la glucemia. Existen ciertos compuestos capaces de inhibir esta enzima y por tanto reducir los 
problemas  insulínicos  asociados.  El  uso  de  inhibidores  naturales,  como  péptidos  de  origen 
animal  en  este  caso,  tiene  la  ventaja  de  evitar  los  efectos  secundarios ocasionados por  los 
inhibidores artificiales.  

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. HIPÓTESIS 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Hipótesis 

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La  sociedad  actual demanda  alimentos naturales,  saludables,  seguros  y  funcionales.  Existen 
diversas  estrategias  para  la  obtención  de  este  tipo  de  alimentos,  siendo  una  de  ellas  la 
encapsulación  de  compuestos  bioactivos  en  estructuras  que  permitan  su  protección  y 
conservación.  Por  este motivo,  la  nano‐encapsulación  en  liposomas  podría  ser  una  buena 
estrategia,  apoyada  recientemente  por  la  Política  Europea  de  nuevos  alimentos.  Estas 
estructuras ofrecen  la  posibilidad  de  vehiculizar  cualquier  sustancia bioactiva  al  interior  del 
organismo  y  también  de  ser  incorporadas  en  sistemas  alimenticios,  pudiendo  dar  lugar  a 
alimentos  alternativos  que  permitan  que  los  bioactivos manifiesten  su  actividad  llegado  el 
momento.  

Por otro lado, el aprovechamiento de especies vegetales infrautilizadas y de residuos del sector 
agroindustrial  y pesquero  como  fuente de  compuestos bioactivos  constituye una  estrategia 
atractiva dentro del programa europeo de economía circular y de sostenibilidad de los recursos 
naturales.  

Por ello, planteamos el diseño y desarrollo de un ingrediente funcional basado en liposomas de 
fosfatidilcolina parcialmente purificada procedente de la soja conteniendo diversos extractos de 
origen animal o vegetal con propiedades potencialmente beneficiosas para la salud humana a 
partir de  residuos o especies  infrautilizadas,  los cuales pueden ser  incorporados en matrices 
alimentarias para la obtención de alimentos funcionales de alto valor añadido. 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5. OBJETIVOS 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Objetivos 

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Objetivo principal 

El  objetivo  principal  de  esta Memoria  es  la  elaboración  y  caracterización  de  liposomas  de 
fosfatidilcolina  de  soja  parcialmente  purificada  para  encapsular  extractos  bioactivos  de 
diferente naturaleza y  composición  (peptídica, polifenólica y  lipídica), obtenidos a partir del 
aprovechamiento de materias primas infrautilizadas e infravaloradas, o de residuos procedentes 
del  sector agroindustrial y pesquero. Dichos  liposomas, una vez demostradas  sus adecuadas 
propiedades de partícula y su estabilidad, serán objeto de incorporación en dos tipos modelo de 
matrices  alimentarias  a modo  de  alimento  funcional:  (i)  productos  pesqueros  tipo  gel  y  (ii) 
películas comestibles.  

 

Objetivos parciales 

1. Obtención y caracterización físico‐química de fosfatidilcolina de soja parcialmente purificada 
y evaluación de su aptitud para la formación de liposomas.    
 
2.  Obtención  y  caracterización  química  y  biológica  de  extractos  bioactivos  de  diferente 
naturaleza, procedentes de fuentes naturales infrautilizadas o residuos del sector agroindustrial 
y pesquero. 
 
3. Encapsulación de los extractos bioactivos en liposomas, caracterización de sus propiedades 
físico‐químicas  y  biológicas,  y  estudio  de  estabilidad  en  el  tiempo  en  forma  de  dispersión 
liposomal o como liposomas liofilizados.  
 
4. Estudio de la absorción  intestinal de  los compuestos bioactivos encapsulados en liposomas 
tras la digestión gastrointestinal in vitro y ex vivo.    
 
5. Evaluación del comportamiento de los liposomas frente a diferentes estrategias tecnológicas 
y de su efecto sobre la capacidad de gelificación del músculo de merluza. 
 
6. Formulación de reestructurados de surimi de calamar con extractos bioactivos encapsulados 
en liposomas. Caracterización, estabilidad y bioaccesibilidad de los extractos bioactivos tras la 
digestión gastrointestinal simulada. 
 
7. Evaluación de  la  integridad estructural, efecto mucoadhesivo y propiedades organolépticas 
de películas bucodispersables de caseinato sódico enriquecidas con liposomas bioactivos. 
 
8. Evaluación del efecto de la incorporación de liposomas bioactivos en películas comestibles de 
carboximetilcelulosa, así como de la integridad de liposomas y bioaccesibilidad del bioactivo tras 
la digestión gastrointestinal simulada.  

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6. DISEÑO EXPERIMENTAL 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Diseño experimental 

53 
 

6.1. Purificación de fosfatidilcolina 

Se parte como materia prima  inicial de  lecitina de soja  (LS), compuesto natural obtenido del 
proceso de producción y refinado del aceite de soja (Glycine max). A partir de LS se obtendrá, 
mediante un proceso de purificación  con  lavados  sucesivos de acetona, dos  fosfatidilcolinas 
parcialmente purificadas, de 2  (FC2) y 5  lavados  (FC5). La composición, el perfil  lipídico y  las 
propiedades físicas de estas tres materias primas (LS, FC2 y FC5) se caracterizaron con el objetivo 
de encontrar un material encapsulante con las propiedades adecuadas para la elaboración de 
liposomas. La  lecitina de soja fue seleccionada debido a su composición rica en ácidos grasos 
poliinsaturados,  que  determinarán  la  formación  de  una  bicapa  lipídica  de  fosfolípidos  con 
propiedades  saludables.  Desde  el  punto  de  vista  industrial  podría  ser  interesante  elaborar 
liposomas a partir de lecitina de soja directamente, pues por un lado se evitaría el coste de la 
purificación de los fosfolípidos y por otro el rendimiento sería del 100 %. No obstante, hay que 
evaluar los componentes que constituyen el liposoma y las propiedades que confieren. 

6.2. Estandarización de liposomas 

En  la búsqueda del material encapsulante más  adecuado  y  tratando de determinar  si en  la 
conformación  del  liposoma  influyen  las  propiedades  de  las materias  primas  ensayadas,  se 
elaboraron diferentes formulaciones liposomales con las tres materias primas (LS, FC2 y FC5). 
Además, con la finalidad de estandarizar el proceso de fabricación de liposomas, se tuvieron en 
cuenta otros parámetros en su elaboración, como son las condiciones del método de sonicación 
(A: fuerte y prolongada o B: débil y corta) y la adición o no de un crio‐protector (ng: sin glicerol), 
obteniendo  así  un  total  de  6 muestras  (LLS,  L2A,  L2B,  L5A,  L5B,  L5Ang).  Tras  analizar  las 
características de partícula y las propiedades físicas de los liposomas, tanto como dispersiones 
liposomales  como  en  estado  seco  (liofilizados),  sólo  uno  de  ellos  fue  seleccionado  como 
preparación liposomal estándar en base a sus excelentes características, L5A, por lo que a partir 
de este momento todos los liposomas fueron elaborados siguiendo dicho protocolo.  

Acorde al actual Reglamento del Parlamento Europeo y del Consejo de la Unión Europea relativo 
a los nuevos alimentos, la definición de nuevo alimento podrá incluir los alimentos en forma de 
micelas o  liposomas, éstos últimos consistentes en vesículas muy apropiadas para vehiculizar 
cualquier sustancia al interior del organismo. La fosfatidilcolina a partir de la cual se elaboran 
los  liposomas posee una  composición altamente  rica en ácidos grasos  insaturados  (mono‐ y 
poliinsaturados), compuestos de gran interés para formar parte de un alimento funcional. Sin 
embargo, también pueden ser responsables de la rancidez del alimento, por lo que se estudiará 
si la conformación en liposomas modifica la estabilidad frente a la rancidez.  

6.3. Extractos bioactivos procedentes de residuos 

Varios  extractos  bioactivos  de  distinta  naturaleza  y  procedencia  se  obtuvieron  mediante 
diversos procesos de extracción: un extracto peptídico basado en un hidrolizado de colágeno 
(HC) procedente de túnicas de piel y manto del calamar gigante Dosidicus gigas, un extracto 
peptídico basado en una fracción <1 kDa (FP1) procedente del langostino Penaeus notialis (sin 
valor comercial), un extracto polifenólico procedente de piel y albedo de la granada (PG) Punica 
granatum, un extracto polifenólico  (tanto en  fase acuosa como etanólica) procedente de  las 
partes aéreas de la planta de hinojo marino (HM) Crithmum maritimum (especie infrautilizada) 
y un extracto  lipídico obtenido de grasa de crustáceo (GC) rica en astaxantina procedente de 
residuos  (cutículas,  cefalotórax, pleópodos, parápodos  y  telsons) del  langostino  Litopenaeus 
vannamei.  

Se consideró de interés la selección de compuestos bioactivos en base a su diferente naturaleza 
química, dado que se prevé distinto comportamiento frente a la encapsulación en liposomas de 



Diseño experimental 

54 

 

fosfatidilcolina, confiriendo distintas propiedades físico‐químicas y biológicas, así como distinta 
aptitud, tanto para su conservación como para su posible aplicación alimentaria.  

Para poder ahondar en los mecanismos de actuación de cada uno de los extractos ensayados, 
los compuestos activos principales en los extractos polifenólicos y en el lipídico, y la distribución 
de  pesos moleculares  en  el  hidrolizado  y  la  fracción  peptídica,  se  determinaron mediante 
columnas de exclusión de tamaño molecular (para los extractos peptídicos), columnas en fase 
reversa  (para  los extractos polifenólicos) y cromatografía de gases/espectrometría de masas 
(para los extractos lipídicos). Además del estudio de la composición y perfil de aminoácidos de 
los hidrolizados peptídicos y  la posible citotoxicidad de  los extractos polifenólicos en células 
Caco‐2 diferenciadas, se cuantificó el potencial bioactivo de los extractos a través de algunas de 
sus  actividades  funcionales,  tales  como  la  actividad  antioxidante  caracterizada  por  diversos 
métodos como capacidad de secuestrar radicales libres (ABTS) (HC, PG, GC, HM y FP1), poder 
reductor  del  ion  hierro  (FRAP)  (HC,  PG,  GC  y  HM),  contenido  de  sustancias  reactivas  al              
Folin‐Ciocalteu (HC, PG, GC y HM) y capacidad de secuestrar el anión superóxido determinado 
por  fotoquimioluminiscencia  (HC,  PG  y  GC);  antihipertensiva  por  el método  de  la  enzima 
convertidora de angiotensina (HC, PG, GC y FP1) e hipoglucémica por el método de la enzima 
dipeptidil peptidasa IV (FP1). Estas actividades se seleccionaron en base a la buena aptitud que 
presentan los polifenoles y carotenoides frente a las propiedades antioxidantes, y los péptidos 
bioactivos  frente a  las otras propiedades biológicas  seleccionadas, de manera que permiten 
realizar un seguimiento de su comportamiento en los diversos procesos.  

6.4. Desarrollo de liposomas rellenos con bioactivos 

Basándonos en el protocolo elegido (L5A), se encapsularon los diferentes extractos bioactivos 
para mejorar su eficacia y biodisponibilidad, permitiendo obtener así un producto o ingrediente 
funcional con propiedades potencialmente beneficiosas para la salud. 

De  este  modo,  se  obtuvieron  las  formulaciones  liposomales:  L‐HC,  L‐PG,  L‐GC,  L‐HM                          
(L‐HM acuoso y L‐HM etanólico) y L‐FP1. La concentración de bioactivo, referida respecto a la 
fosfatidilcolina, fue diferente en función de la formulación y diseño experimental: 4 % en L‐HC, 
L‐PG y L‐GC; 10 % en L‐FP1; y 8, 16, 32 y 64 % en L‐HM acuoso y L‐HM etanólico, haciendo un 
total  de  12  liposomas  distintos.  Tres  de  ellos  (L‐HC,  L‐PG  y  L‐GC)  se  estudiaron  en  detalle 
analizando, tanto en forma de dispersión liposomal como en estado liofilizado, las propiedades 
físico‐químicas  y  estructurales,  y  las  actividades  biológicas.  Además,  estos  liposomas  se 
conservaron y caracterizaron durante 4 semanas a 4 °C como dispersión liposomal (en estado 
líquido)  y durante 7 meses a  ‐20  °C en estado  liofilizado  (seco), para evaluar  su estabilidad    
físico‐química en el tiempo. Por su parte, se determinaron las características de partícula de las 
suspensiones  liposomales conteniendo  la fracción peptídica <1 kDa de  langostino (L‐FP1) y el 
extracto  de  hinojo  marino  (L‐HM),  así  como  las  características  de  partícula,  propiedades        
físico‐térmicas y actividades biológicas de los liposomas liofilizados que incorporaban el último 
extracto  (L‐HM).  Al  igual  que  para  los  extractos  bioactivos,  se  determinó  el  posible  efecto 
citotóxico de los liposomas encapsulando extractos polifenólicos.  

6.5. Absorción intestinal 

Con el objetivo de estudiar la bioaccesibilidad y permeabilidad intestinal de los liposomas y/o 
de  los extractos, se  llevó a cabo un ensayo de absorción  intestinal con células Caco‐2 para el 
extracto de hinojo marino acuoso  (HM‐acuoso) y su correspondiente  liposoma  (L‐HM‐ac 64), 
antes y después de ser sometidos a digestión gastrointestinal in vitro.  

6.6. Aplicación en alimentos 

Se llevaron a cabo dos estrategias para incorporar los liposomas en matrices alimentarias como 
modelos  de  producto  funcional  de  alto  valor  añadido.  Las  estrategias  consistieron  en  la 



Diseño experimental 

55 
 

incorporación de liposomas en (i) matrices de músculo de origen pesquero como modelos para 
la obtención de reestructurados y  (ii) polímeros naturales de naturaleza proteínica y de fibra 
como modelos  para  evaluar  su  comportamiento  en  el  desarrollo  y  obtención  de  películas 
comestibles.  

Aplicación de liposomas en reestructurados: músculo de merluza 

Se estudiaron previamente diversos métodos de estabilización de  los  liposomas,  los cuales se 
incorporaron posteriormente en homogenizados de músculo de merluza para evaluar su aptitud 
en productos gelificados.  

Los liposomas vacíos, previamente estabilizados mediante diferentes tratamientos tecnológicos 
(alta  presión  AP,  congelación‐descongelación  CD,  liofilización  LF,  atomización  A,  adición  de 
glicerol G o adición de  trealosa T),  se  caracterizaron y posteriormente  se  incluyeron en dos 
músculos de merluza  fresca  (Merluccius merluccius) de distinta  calidad proteica  (M1 de alta 
calidad y M2 de baja calidad). De esta forma se obtuvieron varios sistemas modelo a partir de 
M1 (MC 1, F, AP, CD, CD‐G, LF, LF‐G, A) y otros a partir de M2 (MC 2, CD‐T, LF‐T), de los cuales 
se evaluaron sus propiedades físico‐químicas, estructurales y gelificantes.    

Aplicación de liposomas en reestructurados: surimi de calamar 

Se incorporaron liposomas encapsulando diferentes bioactivos en sistema modelo de surimi de 
calamar para su gelificación. Se evaluó  la estabilidad de  los geles frente a  la conservación en 
estado congelado, así como  la bioaccesibilidad de  los bioactivos añadidos  tras una digestión 
gastrointestinal simulada. 

Los liposomas liofilizados encapsulando extractos bioactivos (L‐HC, L‐PG y L‐GC) se incorporaron 
en  un  homogenizado  de  surimi  de  calamar  gigante  (Dosidicus  gigas),  obteniéndose  los 
correspondientes geles tras calentar a 90 °C: G‐L‐HC, G‐L‐PG y G‐L‐GC. Un control sin liposomas 
(G) y un control con liposomas vacíos (G‐L‐V) para estudiar el potencial del bioactivo en la matriz 
se  desarrollaron  en  paralelo.  Se  diseñó  también  una  formulación  alternativa  basada  en 
incorporar  los bioactivos directamente en el homogenizado de  surimi,  sin encapsular  (G‐HC,       
G‐PG, G‐GC) para determinar la importancia de la cápsula en la formulación. Se analizaron las 
propiedades  físicas  y  mecánicas  de  los  geles  para  estudiar  la  interacción  entre  los  tres 
componentes (bioactivo, cápsula y matriz). Los geles de surimi con  liposomas se conservaron 
durante 7 meses en congelación (‐20 °C) para estudiar su estabilidad físico‐química en el tiempo. 
Además, todos los geles se sometieron a una digestión gastrointestinal in vitro, para estudiar la 
actividad  (antioxidante)  de  la  fracción  soluble  (digerible)  de  los mismos,  con  el  objetivo  de 
evaluar  la  bioaccesbilidad  de  los  extractos  incorporados,  ya  sea  en  forma  libre  o mediante 
encapsulados en liposomas, en la matriz de surimi.   

Aplicación de liposomas en películas de caseinato sódico 

Con  objeto  de  evaluar  el  grado  de  integridad,  las  características  de mucoadhesividad  y  las 
propiedades sensoriales de películas con  liposomas, se adicionaron  liposomas conteniendo  la 
fracción peptídica de  langostino <1  kDa  (L‐FP1) en  la  formulación de películas de  caseinato 
sódico (P‐L‐FP1).  

Un control sin liposomas (P) y un control con liposomas vacíos (P‐L‐V) se estudiaron en paralelo 
para determinar el efecto de  los  liposomas y del bioactivo en  la  formulación. El objetivo  fue 
elaborar películas funcionales con el fin de ser  ingeridas directamente sin tener  la función de 
recubrir, y donde el bioactivo sea absorbido a nivel bucal y sublingual pasando directamente 
desde la boca al torrente sanguíneo, por lo que se requiere unas propiedades de fácil y rápida 



Diseño experimental 

56 

 

disolución. Se estudiaron  las propiedades físicas, mecánicas, y organolépticas (a través de un 
análisis sensorial con un panel de jueces entrenados) de las películas.   

Aplicación de liposomas en películas de carboximetilcelulosa 

Las  películas  habitualmente  requieren  de  un  plastificante  para  adquirir  las  propiedades 
características de flexibilidad. Parte del diseño consistió en plantear si el plastificante, en este 
caso el glicerol, podía ser añadido al liposoma para estabilizarlo, evitando añadirlo en la película 
nuevamente, o bien ser adicionado en  la película de manera directa, evaluando por  tanto el 
comportamiento y propiedades de  las películas  resultantes. Además, dado que  se pretendía 
utilizar  la película  a modo de  recubrimiento  comestible de otro  alimento de baja humedad 
(como material envolvente), las películas se sometieron a una digestión gastrointestinal in vitro 
con el objetivo de estudiar la bioaccesibilidad de los bioactivos, determinando al mismo tiempo 
si los liposomas son resistentes al proceso de digestión. 

Dispersiones  liposomales  incorporando  el  hidrolizado  de  colágeno  (L‐HC)  se  incluyeron  en 
películas de carboximetilcelulosa sódica. Previamente, se determinó el efecto del bioactivo y del 
glicerol en  la  formulación  liposomal, estudiando  las características de partícula de  liposomas 
vacíos y rellenos con y sin glicerol (L‐V, L‐V‐G, L‐HC y L‐HC‐G). Seguidamente, se incorporaron los 
dos  liposomas  con  el  hidrolizado  de  colágeno  (L‐HC  y  L‐HC‐G)  en  las  películas  (P‐L‐HC+G  y               
P‐L‐HC‐G). Dos películas control sin liposomas se elaboraron y se estudiaron en paralelo (P+G y 
P+G+HC).  Se  analizaron  las  propiedades  físicas  y  mecánicas  de  las  películas,  así  como  su 
capacidad antihipertensiva.  La  fracción digerida de  las películas,  junto  con  la obtenida de  la 
digestión  de  los  liposomas,  permitió  determinar,  mediante  dispersión  dinámica  de  luz  en 
Zetasizer y microscopía electrónica de transmisión por criofijación, en qué medida los liposomas 
son resistentes al proceso de digestión. 

El esquema representativo del diseño experimental llevado a cabo en esta Memoria se muestra 
en la figura 28.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Diseño experimental 

57 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

LIPOSOMAS + 
BIOACTIVOS 

Propiedades físico‐
químicas, biológicas 

y estabilidad 

Lecitina de soja (LS)

Fosfatidilcolina parcialmente  
purificada de 2 lavados (FC2) 

Fosfatidilcolina parcialmente 
purificada de 5 lavados (FC5) 

L‐lecitina 

Caseinato Na
con liposomas 
bioactivos 

‐Estudio de 
digestibilidad 
‐Citotoxicidad 
‐Tránsito de 
liposomas por 
células 
intestinales 
(enterocitos) 

Surimi de calamar 
congelado con 

liposomas bioactivos 

L2A L2B L5B L5A‐ng

       Elaboración de liposomas en función de: 
‐ Materia prima (lecitina, 2 lavados o 5 lavados) 
‐ Método de sonicación (A: fuerte/B: débil) 
‐ Presencia o ausencia de glicerol (ng: sin glicerol) 

Hidrolizado 
Colágeno 

Extracto 
Piel‐albedo 
Granada 

Grasa 
Crustáceo 

Hinojo Marino 
Extracto acuoso 
Extracto etanólico 

Fracción 
peptídica 
Langostino 

BIOACTIVOS

Extracción 
Caracterización 

‐Integridad 
estructural, 
propiedades 
físicas, 
mucoadhesivas 
y sensoriales 

‐Propiedades 
estructurales 
y gelificantes 
de 
miosistemas  
de diferente 
calidad 
proteica 

‐Propiedades 
estructurales y 
estabilidad en 
congelación 
‐Bioaccesibilidad 
de extractos 
bioactivos tras 
digestión in vitro 

L5A

L‐PG L‐HC L‐GCL‐FP1L‐HM 

Elaboración de liposomas rellenos con bioactivos de 
diferente naturaleza 

MATERIAS PRIMAS

Extracción 
Caracterización  

ABSORCIÓN INTESTINAL APLICACIÓN EN ALIMENTOS

REESTRUCTURADOS PELÍCULAS 

Músculo de 
merluza con 
liposomas vacíos 
estabilizados 

Carboximetilcelulosa 
Na con liposomas 
bioactivos 

IN VITRO 

‐Propiedades 
físicas y 
mecánicas 
‐Integridad de 
liposomas 
‐Bioaccesibilidad 
de extractos 
bioactivos tras 
digestión in vitro 

Liposomas con 
extracto de hinojo 
marino acuoso 

LIPOSOMAS
Elaboración 

Caracterización  



Diseño experimental 

58 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 28. Esquema representativo del diseño experimental.

Gel de Merluza 1 sin y con liposomas: 
Músculo control (MC 1) 
Fresco (F) 
Altas presión (AP) 
Congelado/descongelado (CD) 
Congelado/descongelado + glicerol (CD‐G)  
Liofilizado (LF)  
Liofilizados + glicerol (LF‐G) 
Atomizado (A) 
Gel de Merluza 2 sin y con liposomas: 
Músculo control (MC 2) 
Congelado /descongelado + trealosa (CD‐T)  
Liofilizados + trealosa (FD‐T) 

Películas de caseinato con liposomas 

Película sin liposomas (P) 
Película con liposomas vacíos (P‐L‐V) 
Película con liposomas de fracción peptídica <1 kDa (P‐L‐FP1) 

Películas de carboximetilcelulosa con liposomas

Película con glicerol (P+G) 
Película con glicerol e hidrolizado de colágeno (P+G+HC) 
Película con glicerol y con liposomas de hidrolizado de colágeno (P‐L‐HC+G) 
Película con liposomas de hidrolizado de colágeno y glicerol (P‐L‐HC‐G) 

Gel de surimi (G)

Gel con hidrolizado de colágeno (G‐HC) 
Gel con piel de granada (G‐PG) 
Gel con grasa de crustáceo (G‐GC) 
Gel con liposomas vacíos (G‐L‐V) 
Gel con liposomas de hidrolizado de colágeno (G‐L‐HC) 
Gel con liposomas de piel de granada (G‐L‐PG) 
Gel con liposomas de grasa de crustáceo (G‐L‐GC) 

Caseinato Na 
con liposomas bioactivos 

Surimi de calamar 
homogenizado con 
liposomas bioactivos 

Músculo de merluza 
homogenizado con 
liposomas estabilizados 
con diferentes 
tratamientos 

Carboximetilcelulosa Na 
con liposomas bioactivos 

REESTRUCTURADOS

PELÍCULAS

APLICACIÓN EN ALIMENTOS



 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7. MATERIALES Y MÉTODOS 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Materiales y métodos 

61 

 

7.1. Obtención de las materias primas 

Purificación de fosfatidilcolina 

La obtención de un extracto de  fosfolípidos  rico en  fosfatidilcolina  se  llevó a  cabo  según el 
procedimiento descrito por Mosquera et al.  (2014), con  ligeras modificaciones. La  lecitina de 
soja  (Glycine max),  comprada  en Manuel  Riesgo  S.A.  (Madrid,  España),  se  homogenizó  con 
acetato de etilo (1:5, w/v) hasta que ésta adquirió una textura gomosa. Entonces, se incorporó 
agua desionizada (7,5:1, w/v) hasta la formación de dos fases diferenciadas, descartándose la 
superior. El extracto se mezcló con acetona (1:2, w/v) con agitación continua durante 30 min    
(1 lavado), reponiendo la acetona con cada nuevo lavado. El precipitado obtenido se secó en un 
desecador  a  20  °C  bajo  condiciones  de  vacío  y  oscuridad.  Finalmente,  la  fosfatidilcolina 
parcialmente  purificada  se molió  en Osterizer  (Par  Sunbeam, mod.  4153‐50, México)  hasta 
obtener un polvo fino y homogéneo, y se conservó a ‐20 °C hasta su uso.  

7.2. Obtención de los extractos bioactivos 

Extracto de piel y albedo de granada (PG) 

Pieles y albedos de granada (Punica granatum), obtenidos en un mercado local, se secaron en 
estufa a 50 °C hasta peso constante y posteriormente se molieron en Osterizer hasta obtener 
un polvo fino. La extracción polifenólica se  llevó a cabo según Basiri et al. (2015), con  ligeras 
modificaciones. Este polvo se mezcló en una proporción 1:20 (p/v) con una solución etanol/agua 
(70/30) en un baño de agua a 40  °C  y agitación  continua  (200  rev/min) durante 4 horas. A 
continuación, se dejó reposar a 21 °C durante 16 horas. Entonces, el extracto se centrifugó a 
12000 g y 4 °C durante 15 min (Sorvall RC‐5B, Sorvall Instruments) y después se filtró por filtros 
Whatman No.1.  Finalmente,  se  rotaevaporó  (Rotavapor  R‐300,  BÜCHI,  Suiza)  a  40  °C  hasta 
eliminar el solvente y se conservó a ‐20 °C hasta su uso.  

Extracto de hinojo marino (HM) 

Hinojo  marino  (Crithmum  maritimum)  proporcionado  por  la  empresa  Porto‐Muíños,  S.L. 
(Cerceda, La Coruña, España), previamente descongelado y triturado en Thermomix (Vorwerk & 
Co., Wuppertal,  Alemania)  a  intensidad  8,  durante  2 min,  se  homogenizó  con  una mezcla 
etanol/agua (70/30) en una proporción 1:20 (p/v) y se mantuvo a 60 °C en baño de agua durante 
30 min. A continuación, se sonicó (Q700 sonicator, Qsonica, Newton, CT, EEUU) a 95 % (114 W) 
5 min  con un pulso discontinuo  (2,5 min + 1  stop + 2,5 min). El extracto,  tras atemperarse             
10‐15 min, se centrifugó a 12000 g y 4 °C durante 15 min, y el sobrenadante resultante se filtró 
dos veces a vacío en un matraz Kitasato con filtros Whatman No.1. Entonces se rotaevaporó a 
60 °C hasta eliminar el solvente y se liofilizó, para finalmente conservarse a ‐20 °C hasta su uso, 
lo que constituyó el extracto etanólico de hinojo.  

Por otra parte, a partir de hinojo marino se obtuvo también un extracto acuoso, siguiendo el 
mismo procedimiento, con  las siguientes excepciones: el hinojo se homogeneizó únicamente 
con agua desionizada y no  fue necesario el paso de  rotaevaporación, pues no había ningún 
solvente orgánico que eliminar, conservándose igualmente liofilizado a ‐20 °C.  

Hidrolizado de colágeno de calamar (HC) 

Túnicas de calamar (Dosidicus gigas), adquiridas en  la  industria (PSK Océanos S.A. Pozuelo de 
Alarcón, Madrid, España), se solubilizaron con ácido acético 0,5 M (1,7:10, p/v) a 3 °C y bajo 
agitación  continua  (AGV‐8  Stirrer,  Bunsen, Madrid,  España)  durante  96  horas.  El  colágeno 
soluble en ácido obtenido se congeló a ‐80 °C y se liofilizó (VirTis mod. 6K BTEL‐85 con bomba 



Materiales y métodos 

62 

 

TRIVAC E2). Seguidamente, el  liofilizado se disolvió en agua desionizada  (30 %, p/v) para ser 
sometido a hidrólisis enzimática a 50 °C durante 3 horas utilizando Alcalasa 2,4 L (2,64 AU/g, 
EEUU), comprada en Sigma Aldrich (Sigma‐Aldrich Inc., St. Louis, MO, EEUU), con una proporción 
enzima‐substrato de 1:90, p/p, de acuerdo a Alemán et al. (2011a). La reacción se llevó a cabo 
en un pH‐stato (TIM 856, Radiometer analytical, Villeurbanne, Francia) a pH constante (pH 8) 
mediante la adición continua de una solución de NaOH 0,1 N. Acto seguido, la enzima se inactivó 
por  calor  a  90  °C  durante  10 minutos.  El  hidrolizado  de  colágeno  se  centrifugó  (Heraeus 
Multifuge 3 L‐R) a 3800 rpm y 4 °C durante 15 min y el sobrenadante se secó por atomización 
(Mini Spray Dryer B‐290 Basic, Büchi,  Flawil, Suiza) en  las  siguientes  condiciones: 195  °C de 
temperatura interna, 17 % de poder de bomba, 65 % de poder de aspiración y 7,6 L/min de flujo. 
Finalmente, el polvo resultante (HC) se conservó a ‐20 °C hasta su uso.  

Fracción peptídica <1 kDa de langostino (FP1) 

Langostinos de la especie Penaeus notialis, fueron suministrados por la empresa Gambastar S.I. 
(Burgos, España) y almacenados a ‐20 °C. Son crustáceos sin valor comercial, ya que han estado 
almacenados  por  un  tiempo  excesivamente  prolongado  (alrededor  de  6  años).  Para  su 
aprovechamiento se descongelaron y lavaron en agua fría. Las enzimas endógenas se inactivaron 
mediante calentamiento en baño de agua a 80 °C durante 20 minutos, previo empaquetamiento 
a vacío. Los langostinos se molieron en Osterizer y el homogenizado resultante se mezcló con 
buffer  fosfato 0,07 M pH 8  (1:5, p/v) para  ser  sometido  a hidrólisis enzimática  con  tripsina 
pancreática (7 unidades/mg), comprada en Novozymes (Bagsvaerd, Dinamarca), al 1 % (p/p) y 
parámetros controlados de 38  °C y pH 8 en pH‐stato durante 90 minutos. Transcurrido este 
tiempo, la enzima se inactivó mediante calentamiento a 90 °C durante 20 minutos. El hidrolizado 
se centrifugó a 12000 g durante 20 min y seguidamente se  filtró a  través de membranas de             
1 kDa obteniendo así una fracción peptídica <1 kDa (FP1), que se congeló a ‐80 °C, se liofilizó y 
finalmente se conservó a ‐20 °C hasta su uso. El grado de hidrólisis se determinó mediante el 
método de pH‐stato descrito por Adler‐Nissen (1986).  

Extracto de grasa de crustáceo (GC) 

Bioresiduos  (cutícula, parápodos, pleópodos, cefalotórax y telson) del  langostino Litopenaeus 
vannamei,  proporcionados  por  la  empresa  Angulas  Aguinaga  Burgos  (Burgos,  España),  se 
recolectaron y homogenizaron hasta un  tamaño de partícula próximo a 5 mm. La extracción 
lipídica  se  desarrolló  acorde  al  protocolo  descrito  por  Gómez‐Estaca  et  al.  (2017).  El 
homogeneizado se mezcló con acetato de etilo (1:5, p/v) y se mantuvo en agitación a 21 °C y 
condiciones  de  oscuridad  durante  30  min.  Seguidamente,  el  extracto  se  filtró  por  filtros 
Whatman No.1 y se rotaevaporó hasta eliminar el solvente. Finalmente, se conservó a ‐20 °C 
hasta su uso.  

7.3. Elaboración de liposomas 

La preparación de liposomas se llevó a cabo según el método descrito por Alemán et al. (2016), 
con algunas modificaciones.  Inicialmente, el material encapsulante  (lecitina o  fosfatidilcolina 
semipurificada) fue disuelto en buffer fosfato 0,2 M pH 7,0 (1:4, p/v) y la mezcla incubada en 
baño de agua a 80 °C durante 1 h. En este paso cabe  la posibilidad de incorporar un extracto 
bioactivo (diferente concentración según la formulación). Seguidamente, se añadió más buffer 
fosfato  (1:4,  p/v)  y  se  volvió  a mantener  en  baño  a  80  °C  1  h.  En  este  paso  se  añaden 
opcionalmente  en  la  formulación diferentes  compuestos, por  ejemplo, un  agente protector 
(1:0,6, p/v, es decir, 0,6 mL de crioprotector por cada 1 g de material encapsulante). La cantidad 
de  crioprotector  sustituye a  la de buffer  fosfato,  siendo en este  trabajo glicerol  (Panreac) o 
trealosa (Cerestar) según el experimento, tal y como se detallará en el capítulo correspondiente. 



Materiales y métodos 

63 

 

Tras este segundo calentamiento, el volumen de la suspensión se completó con buffer fosfato 
(1:12, p/v) y las suspensiones se agitaron en vórtex a 60 °C para formar vesículas multilamelares. 
Finalmente, la muestra se sonicó con el objetivo de reducir el tamaño de las vesículas, así como 
el grado de lamelaridad. En la sonicación se empleó una sonda de diámetro 1/2” (12,7 mm) para 
un  volumen  constante  de  20‐50 mL.  En  la  puesta  a  punto,  las  condiciones  de  sonicación 
establecidas fueron, por un lado, de 90 % de amplitud (120 W) durante 5 ciclos de 1 min cada 
uno, y por otro, de 20 % de amplitud (30 W) durante 2 ciclos de 1 min cada uno, con 1 min de 
parada entre ciclos. Estos minutos de parada, así como  la presencia de hielo alrededor de  la 
muestra, fueron necesarios para evitar que la temperatura de los liposomas excediese los 80 °C. 
Finalmente,  se  seleccionó  la  opción  de  sonicación  de  90  %  de  amplitud  y  5  ciclos.  Las 
dispersiones liposomales se conservaron a 4 °C hasta su uso. 

7.4. Estabilización de liposomas 

Altas presiones 

El tratamiento de alta presión (AP) se aplicó en un equipo de alta presión Stansted Fluid Power 
Iso‐lab 900 (Modelo: FPG7100:9/2C, Stansted Fluid Power Ltd., Harlow, Essex, REINO UNIDO) 
bajo condiciones isostáticas de un solo ciclo de 600 MPa, 20 °C y 20 min. 

Congelación‐descongelación 

El  tratamiento de  congelación‐descongelación  (CD)  se  aplicó mediante  congelación  a  ‐20  °C 
durante 24 h y posterior descongelación a temperatura ambiente.  

Liofilización 

Los liposomas se congelaron a ‐80 °C durante 24 horas. Al día siguiente, se liofilizaron a presión 
reducida (100 mtorr). El liofilizado resultante se conservó a ‐20 °C hasta su uso.  

Atomización 

La atomización (A) se llevó a cabo a condiciones de temperatura interna de 170 °C, temperatura 
externa 89 °C, aspiración 70 %, bomba 20 % y flujo de aire 45 mm.   

7.5. Aplicación de liposomas en matrices alimentarias 

Reestructurados de merluza 

El músculo de merluza (Merluccius merluccius), comprado en un mercado local, se homogenizó 
con sal (NaCl, 1 % p/p) en batidora (Braun, Madrid, España) durante 1 min. Seguidamente, los 
liposomas  se  añadieron  en  el  músculo  solubilizado  (1:2,  v/p)  y  posteriormente  se 
homogeneizaron durante 2 min más. Como control  se utilizó una  formulación  sin  liposomas 
añadidos. Los homogeneizados de músculo se conservaron a 4 °C hasta su uso. Una porción de 
cada homogeneizado se congeló a ‐20 °C.  

Los homogeneizados de músculo con liposomas se embutieron en tripas de celulosa de 35 mm, 
obtenidas en Viskase SA (Bagnold Cedex, Francia), y se sometieron a un proceso de gelificación 
de  la proteína muscular mediante  calentamiento  (60  °C y 80  °C) en horno Rational  (Combi‐
Master CM6) durante 45 min. Los reestructurados resultantes se enfriaron rápidamente en agua 
con hielo durante 5 min y se conservaron a 4 °C durante 12 horas.  



Materiales y métodos 

64 

 

Reestructurados de surimi de calamar 

El surimi de calamar (Dosidicus gigas), adquirido en forma de bloques congelados en la industria 
(PSK Océanos S.A. Pozuelo de Alarcón, Madrid, España), se descongeló y se homogenizó con sal 
(NaCl,  1  %  p/p)  en  homogeneizador  a  vacío  (FD112M10‐72D,  Stephan  Machinery  GmbH, 
Hameln,  Alemania)  durante  1 min.  Seguidamente,  los  liposomas  se  añadieron  en  el  surimi 
solubilizado (1:10, p/p) y posteriormente se homogeneizaron durante 2 min más. Como control 
se  utilizó  una  formulación  sin  liposomas  añadidos.  Los  homogeneizados  con  liposomas  se 
embutieron en cilindros de acero inoxidable (3 cm x 3 cm) y posteriormente se sometieron a un 
proceso de gelificación de la proteína muscular mediante calentamiento (90 °C) en baño de agua 
durante 45 min. Los reestructurados resultantes, tras mantenerse durante 5 min en agua con 
hielo,  se  conservaron  a  4  °C.  Los  geles de  surimi  también  se  conservaron  a  ‐20  °C  durante                  
7 meses para evaluar su estabilidad en estado congelado.  

Películas de caseinato sódico 

El caseinato  sódico  (MGL Molkereigesellschaft Lauingen mbH, Alemania)  se disolvió en agua 
desionizada (8 %) empleando un homogeneizador ultra‐turrax (T 25 basic, IKA®‐WERKE, Staufen, 
Alemania).  Esta  disolución  se mezcló  con  las  dispersiones  liposomales mediante  agitación 
magnética (1:0,6, v/v) y la solución resultante se sometió a 5 ciclos de sonicación de 1 min (con 
1 min  de  parada  entre  ciclos).  Las  posibles  burbujas  presentes  en  la  solución  sonicada  se 
eliminaron mediante un baño de ultrasonidos (Ultrasons, P‐Selecta). Mezclando  la disolución 
inicial  (caseinato  sódico  en  agua)  con  buffer  fosfato  pH  7  se  elaboraron  los  controles.  A 
continuación,  cada  dispersión  (80  mL)  se  vertió  en  placas  Petri  rectangulares  de                               
11,5  cm x 11,5  cm  (10 placas por muestra) y  se  secaron en estufa  (Binder, modelo FD 240, 
Tuttlingen,  Alemania)  a  45  °C  durante  24  h.  Transcurrido  ese  tiempo,  se  acondicionaron  a 
humedad relativa de 58 % a 22 °C durante 3 días antes de su utilización.  

Películas de carboximetilcelulosa 

La  carboximetilcelulosa  (Manuel  Riesgo  S.A.,  España)  se  disolvió  en  agua  desionizada  (4 %) 
empleando  un  homogeneizador  ultra‐turrax.  Esta  disolución  se mezcló  con  las  dispersiones 
liposomales mediante agitación magnética (1:1, v/v) y las burbujas se eliminaron a través de un 
baño de ultrasonidos. Mezclando la disolución inicial (carboximetilcelulosa en agua) con buffer 
fosfato pH 7 se elaboraron los controles. A continuación, cada dispersión (80 mL) se vertió en 
placas Petri rectangulares de 11,5 cm x 11,5 cm (10 placas por muestra) y se secaron en estufa 
a  45  °C  durante  24  h.  Transcurrido  ese  tiempo,  se  acondicionaron  a  humedad  relativa  de                
58 % a 22 °C, durante 3 días antes de su utilización.  

7.6. Digestión gastrointestinal in vitro 

Las muestras (extractos bioactivos, liposomas, geles y películas) se sometieron a una digestión 
gastrointestinal in vitro. Para ello, las muestras se homogeneizaron con agua desionizada y se 
ajustó el pH a 2 con HCl 6 N. Seguidamente, se añadió una disolución de pepsina (1:0,01, p/p) 
preparada en el momento en 1 mL de HCl 0,1 M y adquirida en Sigma Aldrich (Sigma‐Aldrich 
Inc., St. Louis, MO, EEUU). Las  soluciones  se  incubaron en baño de agua a 37  °C y agitación 
continua  a  120  rpm/min  durante  2  horas. A  continuación  se  introdujeron  en  hielo  durante           
10 min para detener  la 1ª etapa de digestión. Acto seguido se ajustó el pH a 6,5 con NaHCO3        
1 M y se incorporó a las disoluciones una solución de pancreatina (1:0,0625 p/p, Sigma‐Aldrich 
Inc., St. Louis, MO, EEUU) preparada en el momento en NaHCO3 1 M, y una solución de extracto 
de sales biliares (0,025 g/mL). Las muestras se incubaron nuevamente en baño de agua a 37 °C 
y agitación 120 vibraciones/min durante 2 horas. Igual que antes, se pusieron en hielo 10 min 



Materiales y métodos 

65 

 

para detener la digestión. El pH se ajustó a 7,2 con NaOH 0,5 M y finalmente  las muestras se 
sometieron a centrifugación a 15000 rpm y 4 °C durante 30 minutos. El sobrenadante (fracción 
soluble o digerible) de extractos,  liposomas y películas  se  recogió y  conservó a 4  °C,  siendo 
utilizado en el mismo día de su obtención, mientras que  la  fracción digerible de  los geles se 
congeló y liofilizó para conservarse posteriormente a     ‐20 °C hasta su uso.  

Como control de  la digestión de  los geles se preparó una  fracción acuosa con cada muestra, 
donde  el  gel  se  homogeneizó  con  agua  desionizada  (1:5,  p/p).  El  pH  se  ajustó  a  7,2  con             
NaOH  0,5 M  y  las muestras  se  centrifugaron  en  las mismas  condiciones  que  los  digeridos. 
Igualmente, el sobrenadante se  liofilizó y conservó a  ‐20  °C. Estas muestras constituyeron  la 
fracción acuosa ya que no se añadieron las enzimas de la digestión ni se modificó drásticamente 
el pH de la disolución.  

7.7. Caracterización de materias primas 

Contenido en agua 

El contenido en agua (%) se determinó, por triplicado, según el método 950.46 (AOAC, 2005). 
Las muestras se secaron en estufa a 105 °C hasta peso constante (aproximadamente 24 horas) 
y el contenido en agua se calculó por diferencia de pesos. 

Contenido en cenizas 

Las cenizas  (%) se determinaron, por  triplicado, según el método 900.02A  (AOAC, 2005). Las 
muestras  se  incineraron  a  500  °C  durante  24  horas  en  una mufla  (Select‐Horn,  P‐SELECTA,          
EQ‐056‐CAM) y el contenido en cenizas se calculó por diferencia de pesos. 

Contenido en proteína y aminoácidos 

El  perfil  de  aminoácidos  y  el  contenido  proteico  se  determinaron  (por  triplicado)  acorde  al 
método descrito por Alemán et al. (2013). Las muestras se diluyeron en agua MiliQ (1 mg/mL) y 
50 µL de cada muestra se secaron e hidrolizaron a 110 °C durante 24 horas en presencia continua 
de HCl 6 N (0,1 % fenol) en ebullición. El estándar utilizado para la hidrólisis fue la norleucina, 
adquirido en Sigma Aldrich (Sigma‐Aldrich Inc., St. Louis, MO, EEUU). Acto seguido, las muestras 
se secaron a vacío y se diluyeron en el buffer de aplicación del equipo. Finalmente, se inyectaron 
en un analizador de aminoácidos Biochrom 20 (Pharmacia, Barcelona, España) y se analizaron 
mediante cromatografía de intercambio iónico.  

Contenido en grasa 

El  contenido  lipídico  crudo  (%  grasa)  se  determinó,  por  triplicado,  según  el  procedimiento 
descrito por Bligh & Dyer  (1959), con  ligeras modificaciones. Las muestras se mezclaron con 
diclorometano  (1:5,3,  p/v)  y metanol  (1:10,6,  p/v)  con  agitación  continua  durante  2  horas. 
Seguidamente, se volvió a añadir diclorometano (1:5,3, p/v) con agitación durante 20 minutos. 
A continuación se añadió agua desionizada  (1:5,3, p/v) con agitación durante 20 minutos. La 
mezcla se dejó reposar a 4 °C durante 24 horas para permitir la separación de fases, momento 
en el que la fase superior se descartó. Por otro lado, la fase inferior se rotaevaporó a 60 °C bajo 
presión  y  posteriormente  se  secó  en  estufa  a  105  °C  durante  24  horas  para  eliminar  los 
solventes.  El  contenido  lipídico  se  calculó  por  diferencia  de  pesos,  aplicando  la  siguiente 
fórmula:  

 



Materiales y métodos 

66 

 

% grasa = ((P1 ‐ P2) / P3) x 100 

Donde P1 es el peso del matraz más la muestra tras el secado, P2 es el peso del matraz vacío y P3 
es el peso de la muestra.  

Fraccionamiento lipídico 

Las muestras se disolvieron (0,133 mg/mL) en hexano y se inyectaron (500 µL) en una columna 
SPE Bond Elut NH2 200 mg (Agilent Technologies), siguiendo el proceso descrito por Álvarez et 
al. (2009). El fraccionamiento se llevó a cabo para las tres fracciones lipídicas principales: una 
primera fase cloroformo‐isopropanol para los lípidos neutros, una segunda fase dietileter‐ácido 
acético (2 %) para ácidos grasos libres y una tercera fase metanol‐HCl (2 %) para fosfolípidos. 
Los resultados, expresados en porcentaje, fueron la media de un duplicado.  

Perfil de ácidos grasos 

Las  fracciones  anteriores  se  secaron  con  nitrógeno  y  se  derivatizaron  para  la  obtención  de 
ésteres metilados de ácidos grasos, acorde al procedimiento descrito por Gómez‐Estaca et al. 
(2017). Estos ésteres metilados de ácidos grasos se  inyectaron (1 µL) en un cromatógrafo de 
gases acoplado a un detector FID 260 ° (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EEUU), con un 
flujo  de  H2  de  40  mL/min  y  un  flujo  de  aire  de  450  mL/min.  Se  empleó  una  columna                       
HP88 60 m x 0,25 mm x 0,2 µm (Agilent). Las muestras se sometieron a cambios de temperatura 
desde 125 °C hasta 145 °C a razón de 8 °C/min, continuando hasta 220 °C a 2 °C/min y finalizando 
en 125 °C a 10 °C/min. Para su cuantificación se emplearon patrones internos de cada fracción 
(el  triglicérido  C13:0  para  la  fracción  1,  el  ácido  graso  libre  C19:0  para  la  fracción  2,  y  el 
fosfolípido C15:0 para  la  fracción 3). El análisis de  los datos  se  llevó a cabo con el  software 
EZChrom Elite (Agilent Technologies), comparando los tiempos de retención. De esta forma, se 
obtuvo el perfil de ácidos grasos de cada fracción lipídica, expresando los resultados en mg/g de 
muestra. Se realizó un duplicado de cada muestra.  

Identificación de fosfolípidos 

La  identificación  de  los  fosfolípidos  presentes  en  las  muestras  se  desarrolló  acorde  al 
procedimiento  descrito  por  Yan  et  al.  (2010),  con  ligeras modificaciones.  Las muestras  se 
diluyeron  (0,067  g/mL)  en  cloroformo  y  se  secaron  con  nitrógeno,  para  su  posterior 
resuspensión en metanol  (1:1, v/v). Las muestras  (dilución 1/200) se  inyectaron  (1 µL) en un 
cromatógrafo de líquidos (Agilent 1200) acoplado a un espectrómetro de masas (Agilent Acurate 
Mass,  Agilent  Technologies,  Santa  Clara,  Ca,  EEUU)  de  triple  cuadrupolo  (QqQ)  G6410, 
empleando  una  columna  Zorbax  Eclipse  XDB‐C8  (Agilent  Technologies)  de  dimensiones                
4,6 mm x 150 mm x 5 µm y una fuente de ionización a presión atmosférica (ESI). Como fase A se 
utilizó agua‐formiato amónico 5 mM y como fase B metanol, a condiciones de 30 °C y 1 mL/min 
de  flujo.  Los  resultados,  expresados  en  términos  de  intensidad  de  señal  y  estudiados  por 
duplicado,  se  analizaron  mediante  el  software  Masshunter  Quantitative  Analysis  B.07.00 
(Agilent Technologies).  

El área del espectro de ionización de 85 posibles combinaciones, en función de los siete grupos 
de  fosfolípidos  (fosfatidilcolina,  fosfatidiletanolamina,  fosfatidilserina,  fosfatidilinositol,  ácido 
fosfatídico,  lisofosfatidilcolina,  lisofosfatidiletanolamina) y  los  cinco principales ácidos grasos 
encontrados previamente en este tipo de material (18:2n6c, C18:1n9c, C16:0, C18:3n3 y C18:0), 
se analizó teniendo en cuenta la masa teórica de la fórmula y la masa exacta determinada, tanto 
para iones de polaridad positiva como iones de polaridad negativa, identificándose finalmente 
41 compuestos de fosfolípidos.   



Materiales y métodos 

67 

 

Cuantificación de tocoferol 

Las  muestras  se  sometieron  a  un  proceso  de  saponificación  con  hidróxido  potásico  y 
posteriormente a un proceso de extracción con cloroformo. Este extracto se secó y resuspendió 
en metanol (1:2, v/v). Las muestras se inyectaron (2 µL) en un cromatógrafo de líquidos acoplado 
a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (QqQ) G6410, acorde al método descrito por 
Gómez‐Estaca et al. (2017). Se empleó una columna Supelcosil LC‐F (4,6 mm x 150 mm x 5 µm) 
con pre‐columna, con una fase móvil de metanol a flujo isocrático de 0,6 mL/min y siempre en 
polaridad  negativa.  Los  estándares  α‐tocoferol,  δ‐tocoferol  y  γ‐tocoferol  (Sigma  Aldrich,     
Sigma‐Aldrich  Inc.,  St.  Louis,  MO,  EEUU),  se  sometieron  al  mismo  procedimiento  que  las 
muestras, registrándose en el rango 429,4‐163,1 para α y γ‐tocoferol (tiempos de retención de 
5,61 y 5,44 min, respectivamente) y en 415,4‐149,1 para el δ‐tocoferol (tiempo de retención de 
5,47  min).  Se  emplearon  curvas  de  calibración  de  tocoferol  a  concentraciones  de                           
0,04‐2,50 µg/mL para comparar con las áreas de las muestras. Para el análisis de los resultados, 
procedentes de la media de tres réplicas, se utilizó el software Masshunter Quantitative Analysis 
B.07.00 (Agilent Technologies).  

Calorimetría Diferencial de Barrido 

Las  propiedades  térmicas  de  las materias  primas  se  estudiaron  empleando  un  equipo  de 
calorimetría diferencial de barrido (modelo TA‐Q1000, TA Instruments, NewCastle, DE, EEUU), 
previamente calibrado mediante el uso de indio de alta pureza (temperatura de fusión 156,4 °C 
y entalpía de  fusión 28,44  J/g).  Las materias primas  se  resuspendieron en agua desionizada     
(250 mg/mL)  y  se  encapsularon  en  cápsulas  herméticas  de  aluminio. Una  cápsula  vacía  se 
empleó como control. Las cápsulas se sometieron a un barrido de temperatura desde  ‐35 °C 
hasta 90 °C a razón de 1 °C/min empleando nitrógeno seco como purgante. El software utilizado 
fue TA Instruments Universal Analysis 2000, mediante el cual se obtuvieron las temperaturas de 
los picos endotérmicos (pico de T, °C) y las entalpías de los cambios conformacionales (∆H, J/g). 
Las determinaciones se llevaron a cabo por duplicado.  

Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier 

La espectroscopía infrarroja de las materias primas se determinó empleando un espectrómetro 
infrarrojo (Perkin Elmer Spectrum 400, Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, EEUU) equipado con un 
accesorio de cristal ATR. La lecitina y fosfatidilcolina de 2 y 5 lavados desecadas, a temperatura 
ambiente, se colocaron a modo de fina capa sobre la superficie del prisma ATR y posteriormente 
se presionó con un émbolo de punta plana hasta que los espectros observados se mantuvieron 
estables. Los espectros se estudiaron con el software Spectrum versión 6.3.2. (Perkin Elmer Inc.). 
La resolución espectral fue de 4 cm‐1, el intervalo estudiado osciló entre 4000 y 650 cm‐1, y los 
resultados procedieron de la media de 32 repeticiones por espectro, realizando un triplicado de 
espectros por muestra.  

7.8. Caracterización de extractos bioactivos 

Contenido en agua 

El contenido en agua de los extractos bioactivos se determinó acorde al método 950.46 A.O.A.C. 
previamente descrito. 

Contenido en proteína y aminoácidos 

El contenido en proteína y perfil de aminoácidos de los extractos bioactivos se determinó del 
mismo modo que se hizo con las materias primas.  



Materiales y métodos 

68 

 

Identificación de los principales componentes activos 

Mediante  Cromatografía  Líquida  de  Alta  Resolución  en  un  cromatógrafo  Shimadzu                      
(SPE‐MA10AVP,  Kyoto,  Japón)  se  determinaron  y  cuantificaron  los  principales  compuestos 
activos de los extractos peptídicos y polifenólicos.  

La distribución de pesos moleculares de  los extractos peptídicos de HC  y  FP1  se determinó 
mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC‐HPLC), tal y como describe Alemán et al. 
(2011a), empleando una columna de péptidos Superdex PC 3.2/30 (GE Healthcare Bio‐Sciences, 
Barcelona, España).  

La  identificación de  los principales compuestos fenólicos de  los extractos PG y HM se  llevó a 
cabo  a  cabo  acorde  el procedimiento de Giménez  et  al.  (2013).  Los extractos  se  analizaron 
mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución en Fase Reversa (RP‐HPLC) empleando una 
columna analítica C18 (Tracer Excel 120 ODS‐A 5 µm 25 x 0,46, Teknokroma, Barcelona, España). 
Las muestras  se eluyeron en un  sistema de gradientes  con un  solvente A  (agua MiliQ) y un 
solvente B (metanol:acetonitrilo, 60:40), ambos conteniendo ácido acético al 1 %, con un flujo 
de 0,6 mL/min. La temperatura de la columna se mantuvo constante a 25 °C, y el volumen de 
inyección fue de 20 µL. El sistema de gradientes fue: 10 % de B durante 10 min, 10 – 60 % de B 
en 60 min, 60 – 10 % B en 10 min, 10 % de B durante 10 min. Los compuestos  fenólicos se 
monitorizaron a 253 nm y 368 nm. Su  identificación y posterior cuantificación se  llevó a cabo 
mediante curvas de calibración de estándares puros. Los análisis se llevaron a cabo al menos por 
duplicado.  

En cuanto al extracto de grasa de crustáceo (GC), sus diversos componentes se determinaron 
mediante distintas  técnicas,  acorde  a Gómez‐Estaca  et  al.  (2017):  el  perfil  de  ácidos  grasos 
mediante  cromatografía de gases  con detector de  ionización de  llama  (FID) empleando una 
columna HP‐88; el contenido en vitamina E (tocoferol) y colesterol mediante cromatografía de 
líquidos equipada con una columna Supelcosil LC‐F y acoplada a un espectrómetro de masas de 
simple cuadrupolo; y el contenido en carotenoides (astaxantina) a través de dos métodos, por 
Cromatografía Líquida de Alta Resolución en Fase Reversa acoplada a espectrometría de masas 
(RP‐HPLC‐MS)  y  por  Cromatografía  Líquida  de  Alta  Resolución  en  Fase  Reversa  acoplada  a 
detector de diodos (RP‐HPLC‐DAD) empleando una columna Develosil UG C30.  

Los  patrones  usados  para  las  diversas  determinaciones  fueron:  epigalocatequina,    
epicatequina‐3‐galato,  epigalocatequina‐galato,  catequina,  rutina,  hiperósido  y            
kaempferol‐3‐O‐glucósido de Extrasynthese (Genay, Cedex, Francia); mientras que los patrones 
quercetina,  ácido  gálico,  ácido  elágico,  ácido  cafeico,  ácido  rosmarínico, punicalagina,  ácido 
clorogénico, ácido cumárico, ácido ferúlico, ácido siríngico, vitamina C, vitamina B12, aprotinina, 
ácido hipúrico fueron de Sigma Aldrich (Sigma‐Aldrich Inc., St. Louis, MO, EEUU).  

Citotoxicidad 

Se evaluó el posible efecto citotóxico, en células Caco‐2, de los extractos bioactivos (PG y HM), 
así como de  los  liposomas encapsulando dichos extractos. El medio de cultivo utilizado para 
crecer  las células  fue el MEM  (Minimum Essential Medium) suplementado con suero bovino 
fetal 10 %, ambos comprados en Thermo Fisher Scientific (Asheville, NC, EEUU). Para evaluar la 
viabilidad  celular,  las  células  se  sembraron  en  placas  de  96  pocillos  a  una  densidad  de                 
5000 células/pocillo y se incubaron durante 24 h a 37 °C y 5 % de CO2. Transcurrido este tiempo, 
fueron tratadas con diferentes concentraciones de bioactivos e incubadas nuevamente durante 
24 h. La viabilidad celular se determinó empleando el Kit CCK‐8  (Dojindo Cell Counting Kit‐8, 
Dojindo, Rockville, MD),  siguiendo el protocolo del  fabricante.  Los  resultados  se expresaron 



Materiales y métodos 

69 

 

como  porcentaje  de  viabilidad  celular  con  respecto  a  un  control  de  células  sin  tratar.  Los 
resultados fueron la media de al menos cuatro réplicas.  

7.9. Caracterización de liposomas 

Características de partícula: tamaño, polidispersidad y potencial Z 

El  tamaño  medio  de  partícula  (expresado  como  %  de  intensidad  y  nm,  conocido  como                       
z‐average), el índice de polidispersidad y el potencial zeta (expresado como mV) se cuantificaron 
por  dispersión  dinámica  de  luz  usando  un  Zetasizer  Nano  ZS  (Malvern  Instruments  Ltd, 
Worcestershire, Reino Unido). Las dispersiones liposomales se midieron a 25 °C tras una dilución 
1/10 en agua desionizada mientras que los liposomas liofilizados primero se resuspendieron en 
agua  desionizada  (77  mg/mL)  y  posteriormente  se  analizaron  del  mismo  modo  que  las 
dispersiones, acorde a Alemán et al. (2016). El índice de refracción de cada muestra liposomal 
resuspendida  fue  determinado  en  función  de  los  grados  Brix mediante  la  utilización  de  un 
refractómetro  (modelo  50301020,  ZUZI,  I.C.T.,  S.L.,  La  Rioja,  España)  e  introducido  como 
parámetro en el software del equipo. Las muestras se midieron por triplicado. Los resultados 
fueron analizados mediante un software específico de Malvern Zetasizer PSS0012‐38 v7.12. 

Contenido en agua 

El  contenido  en  agua  de  los  liposomas  se  determinó  acorde  al  método  950.46  A.O.A.C. 
previamente descrito. 

Dispersabilidad en agua 

Los  liposomas se diluyeron en agua desionizada  (1 %, p/v) a 20  °C bajo agitación a 100  rpm 
durante  150 min,  posteriormente  se  centrifugaron  a  3500  rpm  a  4  °C  durante  5  min.  El 
sobrenadante resultante se secó en estufa a 105 °C durante 24 h y la dispersabilidad en agua, 
expresada como porcentaje, se calculó por diferencia de pesos, aplicando la siguiente fórmula: 

% Dispersabilidad en agua = ((P1 ‐ P2) / P3) x 100 

Donde P1 es el peso de la cápsula más la muestra tras el secado, P2 es el peso de la cápsula vacía 
y P3 es el peso de la muestra.  

En el cálculo se tuvo en cuenta el contenido en agua de cada muestra, empleando como P3 el 
peso seco de la muestra. La dispersabilidad se determinó por triplicado.  

Eficacia de encapsulación 

La eficacia de encapsulación de los diferentes liposomas se determinó, por triplicado, mediante 
la aplicación de la siguiente fórmula: 

% encapsulación = (cantidad de extracto encapsulado / cantidad extracto total) x 100 

La  cantidad de extracto  encapsulado  se  calculó mediante  la diferencia entre  la  cantidad de 
extracto total y la parte no encapsulada.  

La cantidad de extracto no encapsulado se determinó de  la siguiente manera en  función del 
extracto:  

Los  liposomas  con hidrolizados peptídicos  (120 mg/mL)  se homogenizaron  con  acetona,  los 
liposomas  con  extractos  polifenólicos  (PG)  se mezclaron  (120 mg/mL)  con  una  solución  de 
etanol/metanol  (1:1,  v/v),  y  los  liposomas  con  extractos  lipídicos  se  disolvieron  en  hexano          



Materiales y métodos 

70 

 

(80 mg/mL).  Las  tres mezclas  se  agitaron  en  vórtex  durante  2 minutos  y  seguidamente  se 
centrifugaron a 5000 g y 4 °C durante 30 min. El sobrenadante se filtró por filtros de membrana 
de 0,45 µm (Multiflo 15/0, 45 NYL), comprados en OSGONSA (Madrid, España), y se analizó por 
diferentes métodos. En  los  liposomas con el extracto polifenólico de hinojo marino  (HM), en 
cambio,  la parte no encapsulada  se  separó de  los  liposomas utilizando  filtros de membrana 
Amicon Ultra‐15 con un peso molecular de corte de 10 kDa (10000 MWCO, Millipore Corp.) y 
centrifugando  a  4000  g  por  30 min.  Por  otro  lado,  los  liposomas  se mezclaron  (1:1)  con            
Tritón  X‐100  (20 %,  v/v)  y  se  agitaron  en  vórtex  hasta  su  completa  homogeneización  para 
cuantificar la cantidad de extracto total. 

Las muestras  de  hidrolizados  se  secaron  en  estufa  a  60  °C  y  su  contenido  en  proteína  se 
determinó por un analizador de nitrógeno/proteína (LECO FP 2000, Corp., St. Joseph, MI, USA). 
De  las muestras con extractos polifenólicos se analizó el contenido de sustancias reactivas al 
Folin‐Ciocalteau, acorde a Slinkard & Singleton (1977). De las muestras con extractos lipídicos se 
determinó su absorbancia a 470 nm y la cantidad de astaxantina se calculó mediante la siguiente 
fórmula, como describió Gómez‐Estaca et al. (2016): 

Astaxantina (mg) = A x V x 597 / ε 

Donde A es la absorbancia obtenida a 470 nm, V es el volumen de dilución (mL), 597 es el peso 
molecular de la astaxantina y ε es el coeficiente de absorción molar (125,100 para la astaxantina 
en hexano).  

Microscopía electrónica de transmisión convencional  

Inicialmente,  100  µL  de  dispersión  liposomal  se  diluyeron  en  10 mL  de  agua  desionizada. 
Seguidamente,  la  fijación de  la muestra se  llevó a cabo depositando una gota de esta nueva 
solución sobre parafilm y posteriormente una rejilla de cobre recubierta de grafito sobre ella, 
manteniéndola así durante 5 min. Finalmente, la muestra liposomal fijada se tiñó mediante una 
solución de  acetato de uranilo  al 2 % durante 20  segundos,  y  se procedió  a  la observación 
mediante un microscopio JEOL JEM ‐1010 (JEOL, Tokyo, Japón) operando a 80 kV.  

Microscopía electrónica de transmisión a temperatura criogénica 

Los  liposomas (3 µL para dispersiones  liposomales y 30 mg/mL para  liposomas  liofilizados) se 
cargaron  en  rejillas  agujereadas  de  carbono Quantifoil  R2/2  (Quantifoil Micro  Tools GmbH, 
Groblöbichau, Alemania), previamente sometidas a una descarga luminiscente de ionización. El 
método empleado fue la vitrificación de las muestras utilizando un sistema de preparación de 
cryo‐muestras  Gatan  (Gatan  Inc.,  Pleasanton,  CA,  EEUU),  etanol  líquido  y  un  tiempo  de 
transferencia de 8‐10 segundos. La observación de la muestras se llevó a cabo en un microscopio 
electrónico de transmisión JEOL JEM‐1230 (Jeol Ltd., Akishima, Japón) operando a 100 kV y con 
un  aumento  de  30  K,  empleando  un  porta  cryo‐muestras  Gatan  626.  Las micrografías  se 
recogieron, a una  temperatura de  ‐180  °C,  con un detector de  cámara TVIPS CMOS 4k x 4k 
(TemCam‐F416).  

Colorimetría 

El color de las preparaciones liposomales se analizó mediante un colorímetro (CM‐3500d, Konica 
Minolta, Madrid, España), empleando una placa de calibración blanca CM‐A90 y una placa de 
calibración cero CM‐A124. Las condiciones utilizadas para la medición fueron de iluminante D65 
y  como  observador  estándar  D10.  Se  cuantificaron  los  parámetros  del  espacio  color 
tridimensional CIELab, así como los correspondientes valores de cromaticidad y tonalidad para 
las distintas muestras. L* indica la luminosidad oscilando entre L*=0 (negro) y L*=100 (blanco), 



Materiales y métodos 

71 

 

a* indica el intervalo entre rojo (a*>0) y verde (a*<0), b* indica el intervalo entre amarillo (b*>0) 
y azul (b*<0). El valor de cromaticidad refleja la saturación del color y el de tonalidad el tono de 
color, cuyos valores se obtienen a partir de los del espacio color Lab: 

Cromaticidad = ((a*)2 + (b*)2)1/2 

Tonalidad = arctg ((b*) / (a*)) 

Los resultados obtenidos fueron la media de al menos 10 réplicas.  

Reología dinámica oscilatoria 

Las propiedades viscoelásticas de las preparaciones liposomales liofilizadas se determinaron en 
un  reómetro  (Bohlin  Instruments  Ltd.,  modelo  CVO‐100,  Worcestershire,  Reino  Unido) 
empleando  como  geometría  un  cono‐plato  (ángulo  del  cono  4  °  y  distancia  0,15 mm).  Los 
parámetros reológicos de módulo elástico (G´, Pa), módulo viscoso (G´´, Pa) y ángulo de fase      
(δ, °) se representaron en función de un barrido de temperatura desde 15 °C hasta 80 °C a razón 
de 1 °C/min con una frecuencia continua de 1 Hz, y en función de un barrido de frecuencias 
desde 0,1 hasta 10 Hz con una amplitud de oscilación del 5 % y con una temperatura continua 
de 10  °C. Además,  se  caracterizó  la dependencia de  frecuencia de G´ mediante  la  ley de  la 
potencia aplicando la siguiente fórmula: 

G´ = G0´ωn’ 

Donde G0´ es la energía por ciclo a frecuencia 1 Hz, ω es la frecuencia y n´ es el exponente de la 
ley de la potencia. Este valor de n´ nos indica el comportamiento de nuestra muestra, donde un 
valor cercano a 0 indicaría un comportamiento elástico ideal. Al menos dos determinaciones se 
llevaron a cabo por muestra. El error experimental fue menor del 6 % en todos los casos.  

Calorimetría Diferencial de Barrido 

Las  propiedades  térmicas  de  los  liposomas  se  estudiaron  en  un  equipo  de  calorimetría 
diferencial de barrido del mismo modo que se hizo con las materias primas. Los liposomas en 
estado líquido se concentraron en Speed Vac (SPD131DDA, Thermo Fisher Scientific, Asheville, 
NC,  EEUU)  acoplado  a  una  trampa  de  vapor  de  refrigeración  (RVT4140‐230,  Thermo  Fisher 
Scientific, Asheville, NC, EEUU)  y a una bomba de  vacío  (OFP 400, Thermo  Fisher  Scientific, 
Asheville, NC, EEUU) hasta una  concentración de 250 mg/mL y después  se encapsularon en 
cápsulas  herméticas  de  aluminio  mientras  que  los  liposomas  liofilizados  se  encapsularon 
directamente o tras ser resuspendidos en agua desionizada (250 mg/mL). Una cápsula vacía se 
empleó como control. Las determinaciones se llevaron a cabo por duplicado.  

Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier 

La  espectroscopía  infrarroja  de  las  preparaciones  liposomales  secas  se  determinó  en  un 
espectrómetro infrarrojo del mismo modo que se hizo con las materias primas. Los resultados 
procedieron de la media de 32 repeticiones por espectro, realizando un triplicado de espectros 
por muestra.  

Estabilidad  oxidativa  o  enranciamiento  por  el  método  de  sustancias  reactivas  al  ácido 

tiobarbitúrico 

Los  liposomas fueron mezclados (1:3, p/v) con ácido tricloroacético (7,5 %) y centrifugados a 
5100  g  y  4  °C  durante  5 min.  El  sobrenadante  fue mezclado  entonces  (1:2,  p/v)  con  ácido 
tiobarbitúrico 0,02 M y mantenido a 20  °C en oscuridad durante 15 h  (agua desionizada  fue 



Materiales y métodos 

72 

 

usada como control). Finalmente, la absorbancia de  las muestras fue medida a 532 nm en un 
espectrofotómetro  (UV‐1601,  modelo  CPS‐240,  Shimadzu,  Kyoto,  Japón).  Una  curva  de 
calibración basada en 1,1,3,3‐tetraetoxipropano fue elaborada a concentraciones que oscilan 
entre  0,0005  y  0,0025  mg/L,  expresando  los  resultados  como  µg  de  equivalentes  de 
malonaldehído por kg de muestra en base seca. Los resultados fueron la media de 3 réplicas.  

Absorción intestinal 

Los estudios de absorción  intestinal  in vitro se  llevaron a cabo utilizando una  línea de células 
Caco‐2,  como  modelo  celular  del  epitelio  intestinal  humano.  Las  células  Caco‐2  fueron 
suministradas por el banco de células del Centro de  Investigaciones Biológicas (CIB‐CSIC). Las 
células se mantuvieron en un incubador a 37 °C y 5 % de CO2, en frascos de 75 cm2, utilizando 
como medio de cultivo MEM Alpha enriquecido con 10 % de Suero Fetal Bovino, y conteniendo 
1 %  de  antibióticos  (penicilina  y  estreptomicina).  Todos  los  reactivos  fueron  comprados  en 
Thermo Fisher Scientific  (Asheville, NC, EEUU). Para  la formación de  la monocapa celular,  las 
células  se  sembraron  a  una  densidad  de  3  x  104  células/cm2,  en  soportes  bicamerales  de                 
24 pocillos (Transwell Inserts Costar) con 6,4 mm de diámetro, 0,3 cm2 de superficie y 0,4 μm de 
poro de membrana. Se adicionó medio de cultivo tanto en el compartimento apical (con células) 
como en el basolateral (sólo medio de cultivo). Las placas se mantuvieron en el incubador hasta 
la  formación  de  la monocapa  (21  días),  cambiando  el medio  de  cultivo  cada  2‐3  días.  El 
seguimiento e  integridad de  la formación de  la monocapa celular se  llevó a cabo mediante  la 
medida de la resistencia eléctrica (TEER) utilizando un equipo Milicell‐ERS (Millipore, Watford, 
Reino Unido).  

Una vez  formada  la monocapa celular,  se  lavaron  las células  con HBSS  (Hanks Balanace Salt 
Solution, pH 7,4) y se sustituyó el medio de cultivo por dicho buffer, tanto en el compartimento 
basolateral como en el apical. A continuación, se añadieron los compuestos a analizar (extracto 
de hinojo y dispersión liposomal encapsulando dicho extracto) en el compartimento apical, y se 
volvieron a incubar las placas a 37 °C y 5 % de CO2 durante 1 hora y 3 horas. Posteriormente, se 
recogieron las muestras de ambos compartimentos y se almacenaron a ‐20 °C para su posterior 
análisis  por  RP‐HPLC,  siguiendo  las  mismas  condiciones  descritas  previamente  para  la 
identificación y cuantificación de compuestos fenólicos.   

7.10. Caracterización de homogeneizados y geles de músculo 

Contenido en agua 

El contenido en agua de los homogeneizados se determinó acorde al método 950.46 descrito 
previamente.  

Capacidad de retención de agua 

Se  pesó  una  porción  de  homogenizado  previamente  congelado  y  se  le  adicionó  un  filtro 
absorbente de peso conocido  (filtro de pipeta Gilson). Una vez descongelado se centrifugó a 
4000 g y 20 °C durante 15 min y posteriormente se pesó nuevamente el filtro. La capacidad de 
retención de  agua  se  calculó, por  triplicado, por diferencia de pesos,  aplicando  la  siguiente 
fórmula:  

% capacidad de retención de agua = (1 ‐ (((P1 ‐ P2) / P3) / % contenido en agua)) x 100 

Donde P1 es el peso del filtro tras la centrifugación, P2 es el peso del filtro seco inicial y P3 es el 
peso de la muestra inicial. En el cálculo se tuvo en cuenta el contenido en agua de cada muestra. 



Materiales y métodos 

73 

 

Solubilidad proteica 

Los homogeneizados se mezclaron (1:10, p/v) con una solución de cloruro sódico (5 %, p/v) en 
un  homogeneizador  Omni‐Mixer  (modelo  17106,  Omni  Intl.,  Waterbury,  Conn.,  EEUU)  a 
potencia  6  durante  1 min.  Entonces  las mezclas  se  agitaron  a  4  °C  durante  30 min  y  se 
centrifugaron a 6000 g y 2 °C durante 30 min. El sobrenadante obtenido (proteína soluble) se 
analizó mediante un analizador de nitrógeno/proteína (LECO), usando un factor de conversión 
de Nitrógeno para la proteína de 6,25. El contenido de proteína soluble se expresó en porcentaje 
como la proteína soluble respecto al contenido proteico total de la muestra. Se llevó a cabo un 
triplicado por muestra.   

Perfil electroforético por SDS‐PAGE 

El  perfil  electroforético  de  la  fracción  soluble  de  los  homogeneizados  se  analizó  por 
electroforesis  en  gel  de  poliacrilamida  en  condiciones  desnaturalizantes  con  dodecilsulfato 
sódico  (SDS‐PAGE)  acorde  a  Laemmli  (1970),  con  algunas modificaciones.  Las muestras  se 
mezclaron  (1:1,  v/v)  con  el  buffer  desnaturalizante  (Tris‐HCl  50mM  pH  6,8,  10  %  de                              
β‐mercaptoetanol, ácido etilendiaminotetraacético 2 mM, 0,1 % de azul de bromofenol, 5 % de 
dodecilsulfato sódico y 30 % de glicerol) y se calentaron en baño de agua a 90 °C durante 5 min. 
La concentración final de proteína fue de 2‐3 mg/mL. Seguidamente, 15 µL de cada muestra se 
cargaron en el gel (10 % Mini‐PROTEAN® TGXTM Precast Protein Gels, 12‐weel, 20 µL), así como 
10 µL del estándar de pesos moleculares (Precision Plus ProteinTM All Blue Prestained Protein 
Standards), obtenidos ambos en Bio‐Rad (Madrid, España). El gel se colocó en un porta‐geles 
conteniendo un buffer reservoir (Tris‐HCl 0,25 mM, glicina 1,92 M y 1 % de dodecilsulfato sódico, 
pH  8,3)  y  acoplado  a  dos  electrodos  cuya  corriente  eléctrica  permitió  la  separación  de  las 
proteínas hasta el final del gel en función de sus pesos moleculares. Transcurrido este paso, los 
geles se tiñeron con una solución de tinción (0,1 % de azul de Coomassie, 50 % de metanol y     
10 % de ácido acético) mediante agitación durante 1 h. Seguidamente se destiñeron con una 
solución de desteñido (30 % de metanol y 10 % de ácido acético), con agitación leve. Finalmente, 
el gel se conservó en una solución conservante (5 % glicerol y 10 % ácido acético) y se obtuvo 
una imagen del gel mediante un analizador de imagen (Gel‐Doc, BIO‐RAD).  

Caracterización de agregados: tamaño medio, polidispersidad y potencial zeta 

Las propiedades de  los agregados proteicos de  la  fracción soluble de  los homogeneizados se 
analizaron mediante dispersión dinámica de  luz en un Zetasizer del mismo modo que se hizo 
para  los  liposomas,  sometiendo  dicha  fracción  soluble  a  una  dilución  1/100  y  vertiéndola 
directamente en la cubeta. Los resultados son la media de al menos tres determinaciones. 

Resonancia Magnética Nuclear de Protón de Bajo Campo 

Los homogeneizados se sometieron a un estudio de distribución de tiempos de relajación de 
protón por relaxometría T2, desarrollada siguiendo el método descrito por Sánchez‐Alonso et 
al. (2012). Las muestras se cortaron en paralelepípedos de 1 x 1 x 2 cm (aproximadamente 2 g) 
en estado congelado y se introdujeron en tubos específicos para la técnica (1,8 cm de diámetro 
y 18 cm de altura). Las muestras se mantuvieron a 4 °C hasta su casi completa descongelación, 
sin llegar a la pérdida de agua o exudado. En este momento se llevó a cabo la determinación de 
las muestras utilizando un equipo de Resonancia Magnética Nuclear de Bajo Campo (Minispec 
mq20, Bruker Optik GmbH, Alemania) con una fuerza de campo magnético de 0,47 T y 20 MHz. 
Este equipo se acopló a un baño de refrigeración y recirculación (C/DC clase DC10‐K10, Thermo 
Haake®, Fisher Scientific S.L., Madrid, España) estabilizado a 4 °C. Los tiempos de relajación T2 
se analizaron empleando  la secuencia de  impulsos Carr‐Purcell‐Meiboom‐Gill  (CPMG) con un 



Materiales y métodos 

74 

 

valor  de  Ƭ  de  150  µs  y  16  escaneos  en  un  intervalo  de  2  segundos  con  un  total  de  3000 
repeticiones por muestra.  Los análisis  se  llevaron a  cabo por distribución de  los  tiempos de 
relajación  mediante  relaxometría  T2  (CONTIN).  Los  resultados  obtenidos,  expresados  en 
términos de amplitud de la señal (%) y tiempo de relajación (ms), fueron la media de 4 réplicas 
por muestra.  

Calorimetría Diferencial de Barrido 

Las propiedades térmicas de  los homogeneizados se analizaron en un equipo de calorimetría 
diferencial  de  barrido  del  mismo  modo  que  para  los  liposomas,  encapsulando  los 
homogeneizados directamente en las cápsulas herméticas de aluminio.  

Reología dinámica oscilatoria 

Las  propiedades  estructurales  y  gelificantes  de  los  homogeneizados  frente  a  cambios  de 
frecuencia y de temperatura se determinaron mediante reología dinámica oscilatoria siguiendo 
el mismo procedimiento que para los liposomas. 

Propiedades mecánicas 

Las propiedades mecánicas de  los geles  se analizaron mediante un  texturómetro TA‐XT Plus 
(Texture Technologies Corp., Scarsdale, NY, EEUU) con un émbolo cilíndrico de acero inoxidable 
de 5 mm de diámetro acoplado a una célula de carga de 5 kg. El método empleado fue el de 
penetración sobre  la muestra (35 mm de diámetro aproximadamente), con un parámetro de 
velocidad del émbolo de 1,0 mm/s (para los geles de surimi) y de 0,33 mm/s (para los geles de 
merluza). Los parámetros estudiados fueron la fuerza de rotura (N) y la deformación hasta rotura 
(mm),  así  como  la  resistencia  del  gel  (N  x mm),  obtenida  del  producto  de  la  fuerza  y  la 
deformación hasta rotura. Los resultados obtenidos fueron la media de al menos 3 réplicas.  

Colorimetría 

El color de los geles se determinó mediante un colorímetro del mismo modo que se hizo para 
los liposomas. 

Estabilidad  oxidativa  o  enranciamiento  por  el  método  de  sustancias  reactivas  al  ácido 

tiobarbitúrico 

La estabilidad oxidativa o rancidez de los geles se cuantificó siguiendo el mismo procedimiento 
que se llevó a cabo para los liposomas.  

7.11. Caracterización de películas 

Caracterización de partículas: tamaño medio, polidispersidad y potencial zeta 

Las  características  de  los  liposomas  contenidos  en  las  películas  se  analizaron  mediante 
dispersión dinámica de luz en Zetasizer del mismo modo que para los liposomas, utilizando una 
concentración de película de 5 mg/mL y posterior dilución 1/10.  

Microscopía electrónica de transmisión convencional 

Las  películas  de  caseinato  sódico  se  fijaron  en  una  solución  de  buffer  fosfato  0,1 M  pH  7 
conteniendo 2,5 % de glutaraldehído y 4 % de paraformaldehído durante 2 h. Tras este tiempo, 
se lavaron con agua desionizada y se post‐fijaron con tetraóxido de osmio al 1 %. A continuación, 



Materiales y métodos 

75 

 

las muestras se deshidrataron con acetona, se embebieron en una resina Epon 812 y se secaron 
a 200 °C. Finalmente, se cortaron en secciones ultrafinas con un ultramicrotomo (LKB Bromma 
2088, Suiza) y se tiñeron con acetato de uranilo al 2 %.  

Microscopía electrónica de transmisión a temperatura criogénica 

Las imágenes de las películas de carboximetilcelulosa se obtuvieron del mismo modo que para 
los liposomas, utilizando una concentración de 10‐20 mg/mL.   

Contenido en agua 

El  contenido  en  agua  de  las  películas  se  determinó  acorde  al  método  950.46  A.O.A.C. 
previamente descrito.  

Solubilidad 

La  técnica se desarrolló acorde a Alemán et al.  (2016), con  ligeras modificaciones. Trozos de 
película de dimensiones conocidas (2 x 2 cm) se colocaron en recipientes con 15 mL de agua 
desionizada,  los cuales  se mantuvieron a 22  °C y  sin agitación durante 15 h. Transcurrido el 
tiempo,  la  solución  resultante  se  filtró  a  través  de  filtros Whatman No.1  para  recuperar  la 
película sin disolver, que se desecó en estufa a 105 °C durante 24 h. La solubilidad de la película 
(%) se calculó mediante la expresión: 

[(Po‐Pf) /Po] × 100, 

Donde, Po es el peso inicial de la película expresada como materia seca y Pf es el peso del residuo 
desecado sin disolver de la película. El análisis se realizó al menos por triplicado.   

Colorimetría 

El color de las películas se determinó mediante un colorímetro del mismo modo que se hizo para 
los liposomas. 

Espesor 

El espesor de  las películas se determinó acorde al método descrito por Alemán et al.  (2016), 
empleando un micrómetro (MDC‐ 25M, Mitutoyo, Kanagawa, Japón) con el que se realizaron 
diversas mediciones aleatorias para cada película en diferentes zonas de éstas. Los resultados, 
expresados en micrómetros (µm), fueron la media de 10 medidas.  

Transparencia 

La  transparencia  de  las  películas  se  determinó  según  el método  de  Alemán  et  al.  (2016). 
Pequeños trozos de película de dimensiones conocidas (7‐8 cm de longitud y 1 cm de anchura) 
se colocaron en cubetas de cuarzo y se sometieron a un barrido de absorbancias en un rango 
desde 190 hasta 800 nm. El índice de opacidad se calculó mediante la siguiente ecuación: 

O = A / x, 

Donde, O es el  índice de opacidad, A  la absorbancia a 600 nm y x el espesor  (expresado en 
milímetros). Los resultados fueron la media de un triplicado.  



Materiales y métodos 

76 

 

Test de tracción 

El test de fuerza de tracción de las películas se llevó cabo en un texturómetro TA.XT plus TA‐XT2 
acorde  al método  descrito  por  Blanco‐Pascual  et  al.  (2013).  Las muestras  se  cortaron  en 
rectángulos (100 mm x 20 mm) y se engancharon en el apéndice del brazo del texturómetro por 
la zona estrecha, dejando una separación de 60 mm  (l0) en ambos extremos. Se empleó una 
célula de carga de 5 kg y una velocidad de estiramiento de 100 mm/min. La fuerza de tensión 
(MPa) y la elongación en la rotura [(lrotura – l0)/l0] x 100, (%), se determinaron mediante curvas de 
estrés/tensión en el punto de rotura. Las determinaciones se realizaron al menos cinco veces. 

Test de adherencia 

Esta técnica, llevada a cabo en un texturómetro TA.XT plus TA‐XT2, se basa en la fuerza máxima 
necesaria (N) para despegar la película (11,5 cm x 11,5 cm) de la superficie plana de un cilindro 
metálico (20 mm de diámetro) acoplado al brazo del texturómetro. El brazo del equipo se bajó 
a una velocidad de 0,2 mm/s hasta que el cilindro estuvo en completo contacto con la película. 
Entonces  el  brazo  se  subió  a  una  velocidad  de  2 mms/s  hasta  que  la  película  se  separó 
completamente del cilindro. Para estandarizar  la medida, una precarga de 500 mN se aplicó 
durante 15 segundos. Se realizaron al menos 8 réplicas por película.    

Test de mucoadhesividad 

Esta  técnica  se  llevó a cabo  según el método descrito por  Ivarsson & Wahlgren  (2012). Este 
método tiene el mismo fundamento que el test anterior (adherencia), con la diferencia de que 
en este caso la superficie plana del cilindro que entrará en contacto con la película se unta con 
una solución de mucina comercial (20 %, p/v), obtenida en Sigma Aldrich (Sigma‐Aldrich Inc., St. 
Louis, MO, EEUU), y se registra la fuerza máxima necesaria (N) para despegar la película de la 
capa de mucina adherida al cilindro.   

Análisis sensorial 

La evaluación sensorial de las películas la llevó a cabo con un panel de 12 evaluadores expertos 
y entrenados en este  tipo de películas comestibles. Las películas  fueron cortadas en  tiras de           
5 cm x 2 cm, que se  introdujeron en  la boca hasta su completa disolución, sin masticarlas ni 
tragarlas.  Los  parámetros  estudiados  y  su  ponderación  por  parte  de  los  jueces  entrenados 
fueron  los  siguientes:  salivación  (0=salivación  nula;  10=salivación  excesiva),  adherencia 
(0=adherencia  nula;  10=adherencia  excesiva),  aroma  (0=aromas  extraños  o  desagradables; 
10=aromas muy  agradables)  y  tiempo  de  disolución  (tiempo  corto=0‐40  segundos;  tiempo 
medio=30‐80 segundos; tiempo excesivo=más de 80 segundos). Los resultados fueron la media 
de 12 medidas (12 jueces).  

7.12. Caracterización de los productos de la digestión gastrointestinal in vitro 

Características de partícula: tamaño medio, polidispersidad y potencial zeta 

Las  propiedades  de  partícula  de  las  fracciones  solubles  recolectadas  de  la  digestión 
gastrointestinal  in  vitro  de  liposomas  y  películas  con  liposomas  se  estudiaron  mediante 
dispersión dinámica de luz en Zetasizer del mismo modo que las muestras anteriores, vertiendo 
directamente las fracciones solubles en las cubetas.  



Materiales y métodos 

77 

 

Microscopía electrónica de transmisión a temperatura criogénica  

Las imágenes por microscopía electrónica de transmisión mediante criofijación de las fracciones 
solubles  recolectadas  de  la  digestión  gastrointestinal  in  vitro  de  liposomas  y  películas  con 
liposomas se obtuvieron siguiendo el procedimiento descrito previamente.  

7.13. Actividades biológicas 

Capacidad de secuestro de radicales libres mediante foto‐quimio‐luminiscencia 

Las muestras fueron diluidas en metanol puro (40 mg/mL) y analizadas mediante un Photochem 
(Analytikjena  AG,  Jena,  Alemania),  únicamente  por  la  vía  de  compuestos  lipofílicos.  Los 
resultados  fueron expresados como mg de equivalentes de Trolox por g de muestra en base 
seca, basándose en una curva de calibración empleando Trolox como estándar. Los resultados 
fueron la media de tres ensayos.  

Capacidad de secuestro de radicales libres (ABTS) 

Esta determinación se  llevó a cabo acorde al método descrito por Alemán et al. (2011a). Las 
muestras  se mezclaron  con  el  radical  ABTS+  (1:50,  v/v),  generado  previamente  a  partir  del 
reactivo ABTS (ácido 2,2´‐azino‐bis (3‐etilbenzotiazolín)‐6‐sulfónico) 7 mM y K2S2O8 2,45 mM en 
agua  desionizada,  y  se  incubaron  en  baño  de  agua  a  30  °C  y  oscuridad  durante  10 min. 
Finalmente se leyó la absorbancia del radical a 734 nm en un espectrofotómetro. Los resultados 
se expresaron como mg de ácido ascórbico equivalentes por cada g de muestra. Las muestras 
fueron analizadas por triplicado.  

Capacidad de reducción del hierro (FRAP) 

Esta técnica se desarrolló según el método descrito por Alemán et al. (2011a). Las muestras se 
mezclaron con el  reactivo FRAP  (1:30, v/v), previamente obtenido a partir de buffer acetato 
sódico 0,1 M pH 3,6 (25 mL), una solución de 2,4,6‐tripiridil‐s‐triazina 10 mM disuelto en HCl      
40 mM (2,5 mL) y una solución de cloruro de hierro 20 mM (2,5 mL), y se incubaron en baño de 
agua  a  37  °C  y  oscuridad  durante  30 min.  Finalmente,  la  absorbancia  fue medida  en  un 
espectrofotómetro  a  595  nm.  Los  resultados  fueron  expresados  como  µmoles  de  Fe2+ 
equivalentes por gramo de muestra, en base a una curva de calibración de FeSO4. Tres réplicas 
fueron llevadas a cabo por cada muestra.  

Contenido de sustancias reactivas al Folin‐Ciocalteau 

Las muestras  fueron disueltas en agua desionizada  (1:75,  v/v),  reactivo de  Folin  (1:5,  v/v)  y 
NaCO3 (1:15, v/v), e  incubadas a temperatura ambiente y oscuridad durante 2 h. Tras ello, se 
midió su absorbancia a 765 nm en un espectrofotómetro. Los resultados se expresan como mg 
de ácido gálico equivalentes por gramo de muestra. Las muestras fueron medidas por triplicado.  

Actividad antihipertensiva 

La actividad antihipertensiva se determinó mediante la capacidad de las muestras para inhibir 
la enzima convertidora de la angiotensina (ACE). Las muestras (20 µL) se mezclaron con 50 µL 
del sustrato hipuril‐histidil‐L‐leucina  (HHL) 2,5 mM, disuelto en buffer  fosfato potásico 0,1 M    
pH 8,3, y 100 µL de  la enzima ACE (EC 3.4.15.1, 0,025 U/mL), ambos reactivos comprados en 
Sigma Aldrich  (Sigma‐Aldrich  Inc.,  St.  Louis, MO,  EEUU).  La  reacción  se  incubó  a  37  °C  con 
agitación a 160 rpm/min durante 2 horas. La enzima se inactivó con HCl 1 M. El HHL y el ácido 



Materiales y métodos 

78 

 

hipúrico  formado  tras  la  reacción,  en  presencia  o  no  de  las muestras,  se  cuantificaron  por           
RP‐HPLC  utilizando  una  columna  analítica  C18  (Tracer  Excel  120  ODS‐A  5  µm  25  x  0,46, 
Teknokroma, España) y siguiendo el método descrito por Alemán et al. (2011a). Las muestras se 
eluyeron a un flujo de 0,8 mL/min, en un sistema de gradientes con agua MiliQ como solvente 
A  y  acetonitrilo  como  solvente  B  (20‐60  %  de  B  en  26  min),  ambos  conteniendo  ácido 
trifluoroacetico al 0,1 %.  La  temperatura de  la  columna  se mantuvo  constante a 25  °C, y el 
volumen de inyección fue de 50 µL. Los resultados, que fueron la media de al menos 3 ensayos, 
se expresaron como porcentaje de inhibición a una concentración determinada, o como valores 
de IC50 (concentración necesaria para inhibir la actividad de la enzima ACE en un 50 %). 

Actividad hipoglucémica 

La actividad inhibitoria de la enzima dipeptidil peptidasa IV fue cuantificada acorde al método 
descrito por Tulipano et al. (2011). Las muestras fueron mezcladas con la enzima en una placa 
de  96  pocillos.  Tras  la  adición  del  substrato  cromogénico  (H‐Gly‐Pro‐AMC∙HBr),  la mezcla 
(concentración final de 25 µM) fue  incubada a 37 °C durante 15 min. Finalmente, se midió  la 
fluorescencia  a  355  y  460  nm  en  un  lector  de  placas Appliskan Multimode  (Thermo  Fisher 
Scientific, MA, EEUU) cada 2 min durante un periodo de 30 min, expresando los resultados como 
porcentaje  de  inhibición  en  función  del  tiempo  transcurrido.  La  regresión  logarítmica  fue 
utilizada para calcular el IC50 o valor de concentración de muestra necesaria para inhibir el 50 % 
de la actividad de la enzima. Los resultados fueron la media de al menos un duplicado.  

7.14. Análisis estadístico 

Los análisis de varianza (ANOVA) de una o varias vías (para comparar entre tres o más muestras) 
fueron  llevados a cabo en el programa de ordenador SPSS® (IBM SPSS Statistics 22 Software, 
Inc., Chicago, IL, EEUU), donde las diferencias entre muestras fueron testadas usando el test de 
Tukey, con un nivel de significancia de p≤0,05. En otras ocasiones se empleó el test T Student 
para muestras relacionadas (cuando se comparó únicamente entre dos muestras) empleando el 
mismo nivel de significancia, p≤0,05. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



8. RESULTADOS



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CAPÍTULO 1.  PURIFICACIÓN DE FOSFATIDILCOLINA Y 

ESTANDARIZACIÓN DE LIPOSOMAS 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Resultados 

83 

 

8.1.  EFECTO  DE  LA  COMPOSICIÓN  QUÍMICA  Y  DEL  PROCESO  DE  SONICACIÓN  EN  LAS 
PROPIEDADES DE LIPOSOMAS DE LECITINA DE SOJA DE GRADO ALIMENTARIO CON GLICEROL 
AÑADIDO 

Resumen 

Se estudió el efecto de los lavados con acetona, dos y cinco veces, de la lecitina de soja (LS) en 
las  propiedades  composicionales  de  fosfatidilcolinas  parcialmente  purificadas  (FC2  y  FC5). 
Cantidades traza de proteína se detectaron en las tres materias primas, con predominancia del 
ácido glutámico y del ácido aspártico.  Incrementando el número de  lavados  con acetona  se 
disminuyeron los contenidos totales de tocoferoles (α, γ, δ). La reducción de lípidos neutros fue 
similar (≈90 %) para FC2 y FC5, mientras que el detrimento de los ácidos grasos libres fue mayor 
para FC5 (78 %) que para FC2 (71 %). El ácido linoleico fue el constituyente principal tanto de la 
fracción de  lípidos neutros como de  la fracción de fosfolípidos para  las tres materias primas, 
representando un 53‐59 % del total de ácidos grasos. Sin embargo, el incremento del número 
de lavados indujo una reducción del contenido de ácido linoleico. Todas las clases de fosfolípidos 
fueron mayormente concentradas con los dos primeros lavados con acetona. Un mayor número 
de lavados aumentó la concentración de fosfatidilcolina en FC5 respecto a FC2. Se elaboraron 
diferentes  liposomas conteniendo glicerol, en  función de  la materia prima  (FC2 o FC5) y del 
método de sonicación (A: 120 W y 5 ciclos; B: 30 W y 2 ciclos) (100 mL de suspensión). Liposomas 
de lecitina de soja con glicerol (LS con sonicación A) y liposomas sin glicerol (FC5 con sonicación 
A),  se  prepararon  también  como  controles.  La  dispersión  liposomal  con  el mayor  grado  de 
purificación  y  la  sonicación más  fuerte  (L5A)  fue  claramente distinguida del  resto,  tanto  en 
tamaño  de  partícula  como  en  potencial  zeta.  Los  resultados  de  Calorimetría Diferencial  de 
Barrido mostraron que el glicerol interfiere en la estructura de membrana pero induce mínimos 
cambios en el tamaño de partícula y la carga de superficie de membrana.  

Palabras  clave:  lecitina  de  soja,  fraccionamiento  lipídico,  fosfolípidos,  fosfatidilcolina, 
liposomas, sonicación, glicerol. 

Introducción 

Los liposomas son vesículas lipídicas esféricas coloidales constituidas por una o más bicapas de 
fosfolípidos englobando un medio acuoso. Han sido muy estudiados como sistemas modelo de 
membrana, debido a  su enorme  similitud con  las membranas celulares biológicas  (Mozafari, 
2005).  Las  propiedades  de  los  liposomas  difieren  considerablemente  en  función  de  la 
composición lipídica, la carga de superficie, el tamaño y el método de preparación (Akbarzadeh 
et  al.,  2013).  Las  propiedades  de  los  liposomas  determinadas  por  su  composición  y  sus 
características  físico‐químicas y estructurales son  factores determinantes en sus capacidades 
como potencial farmacéutico y clínico, así como de sus aplicaciones alimentarias.  

Los liposomas pueden ser preparados a partir de una gran variedad de lípidos. Muchos estudios 
se han  llevado a  cabo  con  fosfatidilcolinas  sintéticas,  tales  como dipalmitoilfosfatidilcolina o 
dimiristoilfosfatidilcolina, con una composición de grupos polares y de ácidos grasos saturados 
bien definida, que dan lugar a membranas lipídicas estables y bien organizadas (Li et al., 2015). 
El uso de lípidos no sintéticos, tales como lecitina, para la producción de liposomas no plantea 
problemas  de  legislación  alimentaria  (Laye  et  al.,  2008)  y  proporciona  un  importante  valor 
nutricional asociado a la composición rica en ácidos grasos poliinsaturados, los cuales tienen un 
papel beneficioso  en  el metabolismo  lipídico  (Ramdath  et  al., 2017)  y pueden  actuar  como 
ingrediente  activo  contra  varias  enfermedades,  tales  como  cáncer,  riesgo  cardiovascular, 
desórdenes neurológicos, etc. (Küllenberg et al., 2012). Sin embargo, la predominancia de ácidos 
grasos  insaturados  da  lugar  a membranas más  permeables  y menos  estables  (Biltonen  & 



Capítulo 1 

84 

 

Lichtenberg, 1993), y puede generar hidroperóxidos y productos de oxidación secundaria, cuya 
acumulación podría aumentar la rancidez y reducir su vida útil (Wang & Wang, 2008).  

La presencia de impurezas en la lecitina podría condicionar las propiedades y estabilidad de los 
liposomas.  Los  fosfolípidos  pueden  ser  purificados  mediante  extracciones  con  solventes 
orgánicos, siendo la acetona uno de los más empleados. Sin embargo, cantidades variables de 
compuestos no  fosfolipídicos,  tales  como  carbohidratos, esteroles, pigmentos, ácidos grasos 
libres o triglicéridos podrían permanecer (Van Hoogevest & Wendel, 2014). La presencia de este 
tipo  de  impurezas  podría  ser  un  inconveniente  para  la  administración  de  liposomas  vía 
parenteral, aunque sería admisible para el resto de aplicaciones en alimentos.  

Los liposomas adquieren muchos tamaños, desde unos pocos nanómetros hasta varias micras. 
Entre los métodos para producir liposomas, la sonicación es de los más utilizados para obtener 
vesículas unilamelares pequeñas. Sin embargo, la elevada energía que se requiere podría inducir 
parte de degradación de los fosfolípidos (Silva et al., 2010).  

El  glicerol  ha  sido muy  estudiado  como  crioprotector  ya  que  incrementa  la  estabilidad  de 
liposomas tras procesos de congelación o secado (Stark et al., 2010). Esta propiedad podría ser 
de  gran  importancia  para  aplicaciones  potenciales  en  alimentos,  tales  como  alimentos 
funcionales  congelados o películas  comestibles  funcionales desecadas  (Alemán et al., 2016). 
Además,  el  glicerol  modifica  la  fluidez  de  membrana,  lo  que  podría  ampliar  el  rango  de 
aplicaciones de los liposomas facilitando su absorción a nivel celular (Manca et al., 2013).  

Objetivos 

El objetivo de este capítulo es estudiar el efecto de los lavados con acetona (dos lavados y cinco 
lavados) de  la  lecitina de soja (LS) en  las propiedades composicionales de  las fosfatidilcolinas 
parcialmente  purificadas  resultantes  (FC2  y  FC5)  y  su  influencia  en  las  propiedades 
hidrodinámicas,  la  carga de  superficie de membrana  y  las propiedades estructurales de  sus 
correspondientes  liposomas  incorporando  glicerol.  Los  liposomas  se  prepararon  a  su  vez 
comparando entre dos métodos de sonicación: A (90 % amplitud y 5 ciclos) y B (20 % amplitud 
y  2  ciclos).  A  título  comparativo,  también  se  elaboraron  liposomas  con  FC5  y método  de 
sonicación fuerte (A) sin glicerol. 

Materiales y métodos 

Inicialmente, la lecitina de soja (LS) fue sometida a un proceso de purificación mediante lavados 
en acetona, obteniéndose dos fosfatidilcolinas parcialmente purificadas, de dos lavados (FC2) y 
de cinco lavados (FC5). 

Se caracterizó su perfil lipídico (fraccionamiento lipídico, composición de ácidos grasos de cada 
fracción  lipídica  y  clases  de  fosfolípidos)  y  otros  componentes  como  el  contenido  en  agua, 
cenizas, grasa, contenido proteico, perfil aminoacídico y tocoferoles. Además, se estudiaron las 
propiedades físicas de Calorimetría Diferencial de Barrido (resuspendidas en agua desionizada 
para una concentración final de 250 mg/mL) y Espectroscopía Infrarroja con Transformada de 
Fourier de estas tres materias primas (LS, FC2 y FC5).  

Seguidamente,  se  elaboraron  diferentes  dispersiones  liposomales.  Las  tres  diferencias  se 
basaron en el material encapsulante, el método de sonicación y la presencia de glicerol. Por un 
lado, se  fabricaron  liposomas con diferentes materiales encapsulantes:  lecitina de soja  (LLS), 
fosfatidilcolina de dos  lavados  (L2) y  fosfatidilcolina de cinco  lavados  (L5). Por otro  lado, dos 
métodos de  sonicación  fueron planteados: método  intenso  (A)  con parámetros de 90 % de 
amplitud  (120 W)  y  5  ciclos  de  sonicación  o método  débil  (B)  con  parámetros  de  20 %  de 
amplitud (30 W) y 2 ciclos de sonicación. Finalmente, el crioprotector glicerol fue incorporado 



Resultados 

85 

 

en todas las formulaciones, salvo en una que se denominó con las siglas: ng. De este modo, se 
obtuvo un total de 6 dispersiones liposomales: LLS, L2A, L2B, L5A, L5B y L5ng. Se estudiaron las 
propiedades de partícula mediante dispersión dinámica de  luz en Zetasizer  (dilución 1/10) y 
microscopía  electrónica  de  transmisión  por  criofijación  (3  µL),  y  las  propiedades  físicas  de 
contenido en agua, dispersabilidad en agua y Calorimetría Diferencial de Barrido (concentradas 
en un desecador de muestras hasta una concentración final de 250 mg/mL) de las dispersiones. 
Además,  su  estabilidad  durante  3  semanas  en  refrigeración  (4  °C)  fue  analizada mediante 
dispersión dinámica de luz en Zetasizer.  

Estas dispersiones se liofilizaron y se estudiaron sus propiedades de partícula mediante Zetasizer 
(77 mg/mL y posterior dilución 1/10) y microscopía electrónica de transmisión por criofijación 
(30 mg/mL), así como sus propiedades físicas de contenido en agua, dispersabilidad en agua, 
colorimetría, Calorimetría Diferencial de Barrido (250 mg/mL) y Espectroscopía  Infrarroja con 
Transformada de Fourier.  

Resultados y discusión 

Purificación de fosfatidilcolina a partir de lecitina de soja  

Composición 

La cuantificación de la composición de la lecitina de soja y las dos fosfatidilcolinas parcialmente 
purificadas  (Tabla  1) mostró  que  el  contenido  en  agua  (humedad)  no  varió  entre muestras 
(p>0,05) con valores comprendidos entre 6,63‐5,43 %, así como tampoco lo hizo el contenido 
en proteína total (p>0,05), con valores muy bajos, comprendidos entre 0,29‐0,27 %. A pesar de 
no  encontrarse  variaciones  en  el  contenido  proteico  total,  sí  se  observaron  a  nivel  de 
aminoácidos, donde el ácido glutámico (58,4 ‰) fue el aminoácido mayoritario en la lecitina de 
soja, mientras  que  en  los  lotes  purificados  fue  la  fenilalanina  la  que más  predominó.  Esta 
cantidad y las del resto de aminoácidos disminuyeron notablemente (p≤0,05) con los procesos 
de purificación, sin diferencias entre dos y cinco lavados, salvo dos excepciones, la cisteína que 
se mantuvo estable y  la fenilalanina, que  incrementó considerablemente (p≤0,05) sus niveles 
tras los lavados con acetona, posiblemente debido a su fuerte carácter lipofílico. Por tanto, los 
aminoácidos  mayoritarios  en  las  fosfatidilcolinas  parcialmente  purificadas  fueron  el  ácido 
glutámico (51,8 mg/100 g para FC2 y 47,0 mg/100 g para FC5) y la fenilalanina (52,5 mg/100 g 
para FC2 y 48,4 mg/100 g para FC5).  

El contenido de cenizas se incrementó (p≤0,05) desde 6,70 % en LS hasta 10,77 % y 10,05 % para 
FC2 y FC5 (sin diferencias entre lavados), respectivamente, lo que se atribuye a que al aumentar 
la concentración de fosfolípidos con los lavados, se aumenta también la de los grupos fosfato 
(grupos unidos a fosfolípidos), que se consideran responsables en gran medida del aumento en 
cenizas. El contenido de grasa total disminuyó significativamente (p≤0,05) desde 75,06 % para 
LS hasta 68,55 % para FC2 y 67,71 % para FC5, posiblemente debido a que el concentrar  los 
fosfolípidos implica la eliminación de otras fracciones lipídicas como son los lípidos neutros y/o 
los ácidos grasos libres. Además, en el proceso de purificación se pueden producir pérdidas o 
variaciones de los componentes lipídicos, ya sean lípidos polares atrapados en la fase descartada 
o  compuestos  no  lipídicos  (carbohidratos  y  azúcares)  asociados  a  lípidos  que  quedan  en  la 
muestra recolectada, disminuyendo así el contenido relativo de grasa total.  

El contenido en tocoferoles (compuestos orgánicos antioxidantes), fue elevado en la lecitina de 
soja  (92,61  mg/100  g)  con  predominancia  del  γ‐tocoferol  (65,17  mg/100  g),  seguido  del                   
δ‐tocoferol (24,49 mg/100 g) y del α‐tocoferol (2,95 mg/100 g). Esta tendencia fue encontrada 
también en ambas fosfatidilcolinas parcialmente purificadas, sin embargo, los valores cayeron 
drásticamente  (p≤0,05)  con  los  lavados  hasta  valores  totales  de  5,80 mg/100  g  para  FC2  y         
1,05  mg/100  g  para  FC5,  demostrando  una  mayor  reducción  con  mayor  número  de 



Capítulo 1 

86 

 

purificaciones  (p≤0,05).  Esta  disminución  del  tocoferol  fue  totalmente  esperable  dado  el 
reconocido efecto solubilizante de la acetona sobre los tocoferoles (Wayno et al., 2016). A pesar 
de ello,  los contenidos de  tocoferoles  fueron notablemente más altos que  los obtenidos por 
Wang & Wang (2008) para lecitina de soja comercial purificada con lavados de acetona.  

 

Tabla 1. Composición de  lecitina de soja  (LS) y fosfatidilcolina parcialmente purificada después de dos 
lavados (FC2) y de cinco lavados (FC5). Diferentes letras (a, b, c) en la misma columna indican diferencias 
significativas (p≤0,05) entre muestras.   

  LS  FC2  FC5 

Composición (%)       
Grasa  75,06 ± 1,05a  68,55 ± 1,95b  67,71 ± 1,42b 
Cenizas    6,70 ± 0,21a  10,77 ± 0,85b  10,05 ± 0,10b 
Humedad    6,63 ± 1,23a    5,72 ± 0,98a    5,43 ± 1,11a 
Proteína    0,28 ± 0,01a    0,29 ± 0,01a    0,27 ± 0,01a 

Aminoácidos (mg/100 g)       
Ácido aspártico  39,7 ± 1,6a 33,0 ± 1,7b 31,3 ± 1,3b 

Treonina  11,4 ± 0,5a   9,5 ± 0,4b   8,8 ± 0,4b 

Serina  25,2 ± 1,3a 20,6 ± 0,8b 20,0 ± 1,2b 

Ácido glutámico  58,4 ± 2,8a 51,8 ± 2,2b 47,0 ± 2,5b 

Glicina  14,1 ± 0,6a 11,6 ± 0,5b 10,9 ± 0,5b 

Alanina  15,9 ± 0,8a 13,2 ± 0,7b 12,4 ± 0,5b 

Cisteína      1,2 ± 0,1ab   1,0 ± 0,1a   1,3 ± 0,1b 

Valina  15,5 ± 0,9a 12,6 ± 0,5b 11,9 ± 0,6b 

Metionina    2,4 ± 0,1a   2,0 ± 0,1b   1,6 ± 0,1c 

Isoleucina    9,6 ± 0,4a   7,7 ± 0,4b   7,3 ± 0,3b 

Leucina  17,2 ± 1,1a 14,3 ± 0,7b 13,4 ± 0,7b 

Tirosina    7,9 ± 0,5a   6,8 ± 0,4b   5,0 ± 0,2c 

Fenilalanina  15,4 ± 0,9a 52,5 ± 2,5b 48,4 ± 2,8b 

Histidina  12,3 ± 0,7a   9,8 ± 0,3b   7,7 ± 0,4c 

Lisina  24,3 ± 1,0a 18,7 ± 1,0b 17,2 ± 1,0b 

Arginina  21,0 ± 1,0a 17,1 ± 1,0b  16,6 ±  0,9b 

Prolina  12,0 ± 0,6a 10,2 ± 0,5b   9,7 ± 0,5b 

Tocoferoles (mg/100 g)  92,61 ± 3,70a  5,80 ± 0,15b  1,05 ± 0,01c 
γ‐tocoferol  65,17 ± 2,83a  3,93 ± 0,13b  0,72 ± 0,01c 
δ‐tocoferol  24,49 ± 0,94a  1,67 ± 0,02b  0,28 ± 0,00c 
α‐tocoferol    2,95 ± 0,01a  0,18 ± 0,00b  0,04 ± 0,00c 

 

Perfil lipídico 

Inicialmente se separaron las tres fracciones lipídicas mayoritarias en cada una de las materias 
primas: lípidos neutros, ácidos grasos libres y fosfolípidos (Figura 29). La lecitina de soja mostró 
un 4,1 % de ácidos grasos libres, los cuales vieron mermada su cantidad (p≤0,05) hasta valores 
de 1,2 % y 0,9 % para FC2 y FC5 (reducciones del 71 % y del 78 %, respectivamente). De igual 
manera, los valores de lípidos neutros (38,3 % para LS) se desplomaron (p≤0,05) con los procesos 
de purificación, reduciéndose en ambas fosfatidilcolinas un 90 % respecto a su cantidad inicial. 
En contraposición,  la fracción de fosfolípidos aumentó  (p≤0,05) desde 57,6 % en LS hasta un   
≈95 % para FC2 y FC5, sin diferencias significativas entre ellas. Con estos resultados se constata 
la evidente purificación en fosfolípidos llevada a cabo. Resultados similares de concentración de 
la fracción fosfolipídica fueron obtenidos por Van Hoogevest & Wendel (2014).  

 



Resultados 

87 

 

 

Figura 29. Determinación de  las principales  fracciones  lipídicas  (lípidos neutros, ácidos grasos  libres y 
fosfolípidos) en lecitina de soja (LS) y fosfatidilcolina parcialmente purificada de dos lavados (FC2) y de 
cinco lavados (FC5). Diferentes letras (a, b, c) indican diferencias significativas (p≤0,05) entre muestras.  
 

Posteriormente, mediante cromatografía de gases se estudió la composición de ácidos grasos 
de  cada  una  de  estas  fracciones  en  cada  muestra,  encontrándose  cinco  ácidos  grasos 
mayoritarios  en  todas  ellas:  ácido  palmítico  (C16:0),  ácido  esteárico  (C18:0),  ácido  oleico 
(C18:1n9c), ácido linoleico (C18:2n6c) y ácido linolénico (C18:3n3). Estos resultados así como los 
sumatorios  de  ácidos  grasos  saturados  y  ácidos  grasos  insaturados  (tanto  mono‐  como 
poliinsaturados)  se muestran en  la  tabla 2.  Lee et  al.  (2015) encontraron  composiciones de 
ácidos  grasos  similares  para  lecitina  de  soja  comercial  y  fosfatidilcolinas  parcialmente 
purificadas con acetona.  

Las fracciones de lípidos neutros y ácidos grasos libres presentaron una disminución de ácidos 
grasos (p≤0,05) tras los lavados con acetona respecto a la lecitina (LS), siendo más significativa 
la  reducción a mayor número de  lavados,  incluso para el ácido graso mayoritario en  las  tres 
fracciones (ácido linoleico, C18:2n6c), el cual representó un 53‐59 % del total de ácidos grasos. 
Esta  tendencia  de  decremento  se mantiene  en  el  sumatorio  de  ácidos  grasos  saturados  e 
insaturados, siendo mayor en el caso de  los  insaturados, probablemente debido a su elevada 
polaridad, descartándose en mayor medida tras los sucesivos lavados con acetona.  

Finalmente,  se  llevó  a  cabo  una  estimación  de  las  clases  de  fosfolípidos  presentes  en  las 
muestras  mediante  cromatografía  de  líquidos/espectrometría  de  masas  acoplada  a  un 
analizador de tipo cuadrupolo. Se consideró la combinación de las siete clases de fosfolípidos 
existentes  (fosfatidilcolina,  fosfatidiletanolamina,  fosfatidilserina,  fosfatidilinositol,  liso‐
fosfatidilcolina,  liso‐fosfatidiletanolamina  y  ácido  fosfatídico)  con  los  cincos  ácidos  grasos 
predominantes  encontrados  en  la  lecitina  y  las  fosfatidilcolinas  testadas  (ácidos  palmítico, 
esteárico, oleico, linoleico y linolénico). El análisis evidenció 41 compuestos (de los 85 posibles) 
presentes en las tres materias primas (Tabla 3).  

 

 

 

 

 

 

0

20

40

60

80

100

Lípidos neutros  Ácidos grasos libres  Fosfolípidos

%
LS

FC2

FC5

a

b

a

a

bb

b
b c



Capítulo 1 

88 

 

Tabla 2. Composición de ácidos grasos de las tres fracciones lipídicas principales (lípidos neutros, ácidos 
grasos  libres y  fosfolípidos) de  lecitina de  soja  (LS) y  fosfatidilcolinas parcialmente purificadas de dos 
lavados (FC2) y de cinco lavados (FC5). C16:0 = ácido palmítico, C18:0 = ácido esteárico, C18:1n9c = ácido 
oleico, C18:2n6c = ácido linoleico, C18:3n3 = ácido linolénico, ∑Ác. grasos saturados = sumatorio de ácidos 
grasos  saturados,  ∑Ác.  grasos  insaturados  =  sumatorio  de  ácidos  grasos  monoinsaturados  y 
poliinsaturados. Diferentes letras (a, b, c) en la misma fila indican diferencias significativas (p≤0,05) entre 
muestras para cada fracción lipídica.  
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Lípidos neutros 
(mg/g muestra) 

LS  FC2  FC5 

C16:0     34,12 ± 1,50 a   4,18 ± 0,01b  3,67 ± 0,39c 

C18:0    13,37 ± 0,61a    1,23 ± 0,02b  0,96 ± 0,04c 

C18:1n9c    56,20 ± 2,77a    2,49 ± 0,14b  1,41 ± 0,03c 

C18:2n6c  162,50 ± 6,94a  10,73 ± 0,72b  8,26 ± 0,12c 

C18:3n3    26,25 ± 1,18a    1,58 ± 0,09b  1,18 ± 0,01c 

∑Ác. Grasos 
saturados 

47,50 ± 2,11a    5,41 ± 0,03b    4,63 ± 0,43c 

∑Ác. Grasos 
insaturados 

244,95 ± 10,89a  14,79 ± 0,95b  10,85 ± 0,14c 

 

Ácidos grasos libres 
(mg/g muestra) 

LS  FC2  FC5 

C16:0    5,35 ± 0,22a  1,91 ± 0,14b 1,72 ± 0,09c 

C18:0    2,50 ± 0,07a  1,24 ± 0,15b 1,23 ± 0,05b 

C18:1n9c    6,03 ± 0,12a  1,20 ± 0,09b 0,64 ± 0,30c 

C18:2n6c  16,28 ± 0,65a  1,56 ± 0,24b 0,56 ± 0,31c 

C18:3n3    1,23 ± 0,02a  0,13 ± 0,01b 0,07 ± 0,01c 

∑Ác. Grasos 
saturados 

  7,85 ± 0,29a  3,15 ± 0,29b  2,95 ± 0,14b 

∑Ác. Grasos 
insaturados 

23,53 ± 0,79a  2,89 ± 0,34b  1,27 ± 0,62c 

 

Fosfolípidos 
(mg/g muestra) 

LS  FC2  FC5 

C16:0    88,40 ± 0,04a    97,72 ± 22,88a   92,38 ± 20,76a 

C18:0    20,10 ± 0,01a  22,15 ± 5,64a  20,91 ± 4,65a 

C18:1n9c    36,84 ± 0,51a    40,74 ± 10,11a 38,14 ± 9,01a 

C18:2n6c  259,86 ± 4,89a  287,95 ± 71,42a 267,64 ± 62,81a 

C18:3n3    33,69 ± 0,67a  37,18 ± 9,18a  34,20 ± 8,09a 

∑Ác. Grasos 
saturados 

108,50 ± 0,05a  119,87 ± 28,52a  113,29 ± 25,41a 

∑Ác. Grasos 
insaturados 

330,39 ± 6,08a  365,88 ± 90,71a  339,99 ± 79,92a 



Resultados 

89 

 

Tabla 3.  Identificación de  las diferentes especies de  fosfolípidos encontradas en  lecitina de soja  (LS) y 
fosfatidilcolina parcialmente purificada después de dos lavados (FC2) y de cinco lavados (FC5).  
 

Cabeza polar 
 

Combinación de ácidos grasos 
 

Fórmula 

Colina  C16:0/C18:3n3 C42H78O8NP 

Colina  C16:0/C18:2n6c C42H80O8NP 

Colina  C16:0/C18:1n9c C42H82O8NP 

Colina  C18:3n3/C18:3n3 C44H76O8NP 

Colina  C18:2n6c/C18:3n3 C44H78O8NP 

Colina  C18:2n6c/C18:2n6c C44H80O8NP 

Colina  C18:3n3/C18:1n9c C44H80O8NP 

Colina  C18:0/C18:3n3 C44H82O8NP 

Colina  C18:2n6c/C18:1n9c C44H82O8NP 

Colina  C18:0/C18:2n6c C44H84O8NP 

Colina  C18:1n9c/C18:1n9c C44H84O8NP 

Colina  C18:0/C18:1n9c C44H86O8NP 

Etanolamina  C16:0/C18:3n3 C39H71O8NP 

Etanolamina  C16:0/C18:2n6c C39H73O8NP 

Etanolamina  C16:0/C18:1n9c C39H75O8NP 

Etanolamina  C18:2n6c/C18:3n3 C41H71O8NP 

Etanolamina  C18:2n6c/C18:2n6c C41H73O8NP 

Etanolamina  C18:3n3/C18:1n9c C44H73O8NP 

Etanolamina  C18:0/C18:3n3 C41H75O8NP 

Etanolamina  C18:2n6c/C18:1n9c C41H75O8NP 

Etanolamina  C18:0/C18:2n6c C41H77O8NP 

Etanolamina  C18:1n9c/C18:1n9c C41H77O8NP 

Inositol  C16:0/C18:3n3 C43H76O13P 

Inositol  C16:0/C18:2n6c C43H78O13P 

Inositol  C16:0/C18:1n9c C43H78O13P 

Inositol  C18:2n6c/C18:3n3 C45H76O13P 

Inositol  C18:2n6c/C18:2n6c C45H78O13P 

Inositol  C18:3n3/C18:1n9c C45H78O13P 

Inositol  C18:0/C18:3n3 C45H80O13P 

Inositol  C18:2n6c/C18:1n9c C45H80O13P 

Inositol  C18:0/C18:2n6c C45H82O13P 

Inositol  C18:1n9c/C18:1n9c C45H82O13P 

Ácido fosfatídico  C16:0/C18:1n9c C37H68O7P 

Ácido fosfatídico  C18:0/C18:3n3 C39H68O7P 

Ácido fosfatídico  C18:2n6c/C18:1n9c C39H68O7P 

Liso‐Colina  C16:0 C24H50O7NP 

Liso‐Colina  C18:3n3 C26H48O7NP 

Liso‐Colina  C18:2n6c C26H50O7NP 

Liso‐Colina  C18:1n9c C26H52O7NP 

Liso‐Colina  C18:0 C26H54O7NP 

Liso‐Etanolamina  C18:2n6c C23H43O7NP 

 

Seguidamente, se realizó el sumatorio, en términos de intensidad de señal, para cada clase de 
fosfolípido y se expresaron los resultados de las distintas clases de fosfolípidos presentes en LS, 
FC2 y FC5, tanto en polaridad positiva (A) como en polaridad negativa (B) (Figura 30).  

La  fosfatidilcolina,  fosfatidiletanolamina,  liso‐fosfatidilcolina  y  liso‐fosfatidiletanolamina 
ionizaron  preferentemente  en  polaridad  positiva  mientras  que  el  fosfatidilinositol  y  ácido 



Capítulo 1 

90 

 

fosfatídico  lo  hicieron  en  polaridad  negativa,  no  siendo  detectada  en  ningún  caso  señal  de 
fosfatidilserina. Todas las clases de fosfolípidos detectadas mostraron un incremento (p≤0,05) 
de  su  concentración  en  las muestras  lavadas  con  acetona  (corroborando  el  aumento  de  la 
concentración  total  de  fosfolípidos  cuantificado  previamente),  no  mostrando  diferencias 
significativas en función del número de lavados y siendo los más abundantes el ácido fosfatídico 
en polaridad negativa y la fosfatidilcolina en polaridad positiva. Semejantes resultados fueron 
descritos por  Sikorski & Kolakowska  (2003), observando  cantidades notables de  fosfolípidos 
aniónicos y niveles abundantes de fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. 

La  fosfatidilcolina  fue  la clase de  fosfolípido predominante  (en  intensidad de  señal, pues  las 
comparaciones absolutas de concentración no fueron posibles de determinar), superando en 
164  veces  a  la  siguiente  en  intensidad  de  señal,  el  fosfatidilinositol.  Este  hecho  permite 
confirmar que las muestras obtenidas a partir de la lecitina que soja fueron altamente ricas en 
fosfatidilcolina, además de contar con la presencia de otros fosfolípidos en menor cantidad. Otro 
aspecto  importante  que  se  extrae de  este  análisis  es que  en  la  fosfatidilcolina  se observan 
diferencias  (p≤0,05)  entre  FC2  y  FC5, habiendo mayor  cantidad  en  la de mayor número de 
lavados.  

 

 

Figura 30. Composición de  clases de  fosfolípidos, expresados  como  intensidad de  señal en polaridad 
positiva (A) y negativa (B), de lecitina de soja (LS) y fosfatidilcolina parcialmente purificada de dos lavados 
(FC2) y de cinco lavados (FC5). Diferentes letras (a, b, c) indican diferencias significativas (p≤0,05) entre 
muestras para cada clase de fosfolípido.  

 

0,E+00

2,E+08

4,E+08

6,E+08

Fosfatidilcolina Fosfatidiletanolamina Liso‐fosfatidilcolina Liso‐fosfatidiletanolamina

In
te
n
si
d
ad

 d
e 
se
ñ
al
 e
n
 p
o
la
ri
d
ad

 p
o
si
ti
va

LS FC2 FC5

a
aa b

b

bb
bb

b

c

a

A

0,E+00

2,E+06

4,E+06

6,E+06

Fosfatidilinositol Ácido fosfatídico

In
te
n
si
d
ad

 d
e 
se
ñ
al
 e
n
 

p
o
la
ri
d
ad

 n
eg
at
iv
a

LS FC2 FC5

a

a

b

bb

b

B



Resultados 

91 

 

Calorimetría Diferencial de Barrido 

En la figura 31 se muestran las transiciones de fase analizadas mediante Calorimetría Diferencial 
de Barrido de las tres materias primas (LS, FC2 y FC5) dispersas en agua, así como su temperatura 
media de transición (T1, °C) y su entalpía (ΔH, J/g) asociada.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 31. Cambios de  temperatura  (°C) y entalpía  (ΔH,  J/g) de  las  transiciones de  fase endotérmicas 
analizadas por Calorimetría Diferencial de Barrido de dispersiones acuosas de  lecitina de soja (LS) y de 
fosfatidilcolina parcialmente purificada de dos lavados (FC2) y de cinco lavados (FC5).  

 

Los datos reflejan una única transición de fase endotérmica (analizado el rango de temperatura 
desde ‐35 °C hasta 90 °C) muy marcada para cada una de las muestras. Esta única transición se 
corresponde con la fase de fusión del agua externa, es decir, el agua contenida en la suspensión 
concentrada y no la que pueda haber dentro de las propias muestras, ya que la temperatura se 
sitúa  entre  ≈0‐1  °C,  donde  es  característica  la  fusión  del  agua  (0  °C).  Esta  transición  hace 
referencia a la interacción entre las moléculas de agua de la suspensión y los lípidos expuestos 
de las materias primas. 

La gráfica muestra una T1 para la lecitina de soja de 1,06 °C mientras que FC2 y FC5 presentaron 
valores significativamente inferiores, de 0,74 °C y 0,70 °C, respectivamente. Este descenso de T1 
fue acompañado de un incremento en la entalpía (ΔH), tal y como se ve en la figura 31, donde 
FC2 y FC5 presentaron una entalpía similar (289,4 J/g y 273,4 J/g, respectivamente) ligeramente 
superior a la de la lecitina de soja (246,2 J/g). Estos datos podrían correlacionarse con una mayor 
concentración de fosfolípidos altamente insaturados en las muestras sometidas a lavados con 
acetona, siendo mayor la concentración para FC5. 

Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier 

Los  espectros  infrarrojos  (Figura  32)  presentaron  diferencias  entre  las  muestras  para 
determinados grupos funcionales, demostrando una mayor concentración de fosfolípidos tras 
los procesos de purificación.  

-10

-5

0

-10 10

                  FC2– – – –
                  FC5–––––––
                  LS–––––––

En
ta
lp
ía
 (
J/
g)

 

Temperatura (°C) 

0,70 °C ‐‐‐ 273,4 J/g 

1,06 °C ‐‐‐ 246,2 J/g 

0,74 °C ‐‐‐ 289,4 J/g 



Capítulo 1 

92 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura  32.  Espectro  Infrarrojo  con  Transformada  de  Fourier  de  lecitina  de  soja  (LS)  y  fosfatidilcolina 
parcialmente purificada de dos lavados (FC2) y de cinco lavados (FC5). 
 

Por ejemplo, la banda de absorción a ≈3270 cm‐1 correspondiente a las vibraciones de los grupos 
O‐H  y  N‐H  tuvo  una  clara  mayor  absorbancia  para  ambas  fosfatidilcolinas  parcialmente 
purificadas. Se descarta que esta mayor detección se deba al contenido residual de agua o al 
contenido total de tocoferoles (y por tanto con los grupos O‐H) puesto que el contenido en agua 
es constante en las tres muestras y los tocoferoles se reducen con los procesos de lavado. Por 
esta  razón,  el  incremento  de  absorbancia  se  atribuye  fundamentalmente  a  los  grupos N‐H 
presentes en las cabezas polares de los fosfolípidos. Coincide además que la banda de FC5 es 
algo mayor que la de FC2, indicando un mayor grado de purificación.  

De igual modo sucede con otras bandas de absorción como la de ≈1740 cm‐1 correspondiente a 
la vibración de los grupos ésteres C=O, que disminuye en FC2 y FC5 respecto a LS. Este descenso 
se correlaciona con  la disminución de  la cantidad de  triglicéridos  (lípidos neutros) en ambas 
fosfatidilcolinas, tal y como se vio en los estudios anteriores.  

Las  bandas  de  absorción  a  ≈1655  cm‐1  (grupos  C=C),  ≈1230  cm‐1  (grupos  fosfato  PO2
‐)  y            

≈1050 cm‐1 (grupos C‐O y grupos C‐N) presentaron una notable absorbancia mayor para ambas 
fosfatidilcolinas que para  la  lecitina de  soja.  Esta mayor detección  fue debida  a una mayor 
cantidad de moléculas cis‐olefinas, asociadas a los ácidos grasos que conforman los fosfolípidos 
(C=C), de grupos fosfato localizados en las cabezas polares de los fosfolípidos (PO2

‐), de grupos 
de  glicerol  también  presentes  en  fosfolípidos  (C‐O)  y  de  grupos  colina  presentes  en  la 
fosfatidilcolina  (C‐N).  Todas  estas  variaciones  en  la  composición  de  los  grupos  funcionales 
sugieren  una  purificación  de  la  fracción  fosfolipídica  (fosfatidilcolina)  tras  los  lavados  con 
acetona.  

Una consideración a tener en cuenta es que la banda de absorción a ≈1740 cm‐1 correspondiente 
a  los  grupos  C=O  también  podría  englobar  productos  de  oxidación  secundaria  como  son 
aldehídos y cetonas, referenciados por absorber en este rango de absorbancia (Guillén & Cabo, 
2004). Es sabido que los lípidos son muy susceptibles de sufrir oxidación lipídica y en este caso 
en particular los procesos de purificación con acetona podrían causar cierto estrés oxidativo en 

LS 
FC2
FC5

0.03 

0.05 

0.07 

0.09 

0.11 

0.13 

0.15 

0.17 

0.19 

0.21

0.23 

A  

3800 3400 3000 2600 2200 1900 1700 1500 1300 1100 900 700
0 

0.01 

cm
‐1

N‐H 

C=C 

C=O 

PO
2

‐
 

C‐O 

C‐N 



Resultados 

93 

 

las muestras, ya que son muy ricas en ácidos grasos mono‐ y poliinsaturados. Además, los niveles 
de  tocoferol  (un  reconocido compuesto con poder antioxidante) se vieron  reducidos con  los 
lavados en acetona. Este hecho hay que tenerlo en cuenta a la hora de estudiar la estabilidad de 
los  liposomas o bien prevenir  la oxidación mediante  la  incorporación en  las formulaciones de 
compuestos para tal fin. 

A continuación se procederá a la estandarización del proceso de elaboración de los liposomas.  

Dispersiones liposomales 

Características de partícula 

Las  características  de  partícula  (tamaño medio,  índice  de  polidispersidad  y  potencial  zeta), 
analizadas  mediante  dispersión  dinámica  de  luz,  de  las  seis  dispersiones  liposomales  se 
muestran en  la tabla 4. El tamaño medio de  los  liposomas se situó en un rango nanométrico, 
entre 74,3 y 132,4 nm. Has et al. (2018) establece que un tamaño de vesículas entre 100‐200 nm 
para una  solución  liposomal es un  tamaño muy adecuado para aplicaciones en  las que esté 
implicada la carga de sustancias o medicamentos. Drazenovic et al. (2015) encontraron tamaños 
similares para liposomas elaborados mediante sonicación.  
 

Tabla  4.  Tamaño  medio  (nm),  índice  de  polidispersidad  y  potencial  zeta  (mV)  de  las  dispersiones 
liposomales (LLS, L2A, L2B, L5A, L5B, L5Ang) a diferentes tiempos de conservación (4°C) (en semanas). 
Diferentes  letras  (a, b, c, d, e,  f) en  la misma columna  indican diferencias significativas  (p≤0,05) entre 
liposomas para un mismo tiempo de conservación. Diferentes  letras  (m, n, o) en  la misma  fila  indican 
diferencias significativas (p≤0,05) entre diferentes tiempos de conservación para una misma formulación 
liposomal.  
 

 
  Tiempo de conservación 

   0 semanas  1 semana  2 semanas  3 semanas 

Tamaño  
(nm) 

LLS  132,4 ± 0,6e/m  140,8 ± 1,5e/n   141,9 ± 0,1f/no  143,5 ± 1,2e/o 

L2A  108,5 ± 0,4d/m  106,3 ± 1,0d/n  106,1 ± 0,9e/n  105,2 ± 1,2d/n 

L2B  102,1 ± 0,5c/n  100,5 ± 0,3c/m  101,0 ± 0,8c/n  102,8 ± 1,1c/o 

L5A    87,4 ± 0,8b/m    85,7 ± 0,0b/n      86,2 ± 0,9b/mn      86,9 ± 0,1b/mn 

L5B   101,9 ± 0,5c/mn  101,2 ± 0,2c/m  103,0 ± 1,2d/n  106,6 ± 0,3d/o 

L5Ang    74,3 ± 0,3a/m     74,0 ± 0,6a/m    74,2 ± 0,7a/m     73,9 ± 0,8a/m 

Polidispersidad 

LLS   0,222 ± 0,007ab/m   0,217 ± 0,016b/m  0,187 ± 0,012b/n  0,186 ± 0,009a/n 

L2A  0,171 ± 0,013a/m   0,151 ± 0,017a/m 0,157 ± 0,010a/m  0,171 ± 0,019a/m 

L2B  0,235 ± 0,016b/m   0,241 ± 0,002b/m  0,240 ± 0,012c/m  0,240 ± 0,010b/m 

L5A   0,240 ± 0,005bc/m   0,241 ± 0,007b/m  0,230 ± 0,007c/m  0,246 ± 0,010b/m 

L5B   0,244 ± 0,008bc/m   0,240 ± 0,004b/m  0,244 ± 0,005c/m  0,254 ± 0,009b/m 

L5Ang  0,266 ± 0,009c/m   0,241 ± 0,004b/n  0,246 ± 0,006c/n   0,251 ± 0,010b/mn 

Potencial Z 
(mV) 

LLS  ‐44,3 ± 0,2b/m     ‐42,4 ± 1,9abc/m  ‐38,2 ± 0,6b/n  ‐37,2 ± 0,1b/n 

L2A  ‐44,3 ± 4,5b/m   ‐38,4 ± 0,6ab/m  ‐38,9 ± 2,9b/m  ‐30,2 ± 0,9a/n 

L2B  ‐41,5 ± 2,8b/m  ‐46,9 ± 3,8c/m  ‐31,6 ± 2,4a/n  ‐30,3 ± 0,7a/n 

L5A  ‐35,5 ± 1,7a/m     ‐38,9 ± 1,1ab/mn  ‐43,7 ± 3,7b/n  ‐36,1 ± 2,1b/m 

L5B  ‐42,1 ± 1,3b/m    ‐44,6 ± 4,1bc/m  ‐31,6 ± 2,3a/n  ‐29,3 ± 1,9a/n 

L5Ang  ‐34,5 ± 1,9a/m   ‐36,4 ± 1,7a/m  ‐40,7 ± 2,9b/m  ‐36,6 ± 4,0b/m 

 

Los liposomas de lecitina de soja (LLS) presentaron un mayor (p≤0,05) tamaño medio de vesícula 
(132,4 nm),  seguramente atribuido a una mayor presencia de  impurezas que en el  resto de 



Capítulo 1 

94 

 

formulaciones, es decir, de componentes no  fosfolipídicos como  tocoferol o  triglicéridos,  los 
cuales quedan atrapados aleatoriamente dentro de los liposomas, ya sea en el núcleo acuoso o 
en la bicapa lipídica, provocando un notable aumento del tamaño medio (Michelon et al., 2016). 
En  cambio,  los  liposomas  L5A  y  L5Ang  presentaron  un  tamaño  medio  de  vesícula 
significativamente menor (87,4 nm y 74,3 nm, respectivamente) que el resto de formulaciones 
(L2A,  L2B  y  L5B),  que  tuvieron  tamaños  intermedios  de  108,5,  102,1  y  101,9  nm, 
respectivamente.  Por  tanto,  no  parece  haber  una  relación  clara  en  función  del  material 
encapsulante o del método de sonicación, pero se deduce que la combinación de fosfatidilcolina 
más purificada (de cinco lavados, FC5) con una mayor intensidad y mayor tiempo de sonicación 
(método de sonicación A) parece contribuir a reducir el tamaño de vesícula (formulaciones L5A). 
Da Silva Malheiros et al. (2010) también observaron una merma lineal del tamaño de vesícula 
como resultado del incremento progresivo del tiempo e intensidad de sonicación.  

Entre dispersiones L5A, los liposomas con glicerol (L5A) presentaron un tamaño mayor (p≤0,05) 
que  los  liposomas sin este compuesto (L5Ang) posiblemente debido a  la propia presencia de 
glicerol, el cual quedaría asociado a  la bicapa aumentando el tamaño medio. Esta conclusión 
coincidiría  con  los  resultados  obtenidos  por Manca  et  al.  (2013),  quienes  demostraron  un 
aumento del tamaño de  liposomas cuando  las concentraciones de glicerol superaban el 20 % 
(en los liposomas del presente trabajo es del 37,5 %). Sin embargo, la presencia de glicerol en 
las  dispersiones  liposomales  puede  favorecer  la  estabilidad  de  las  vesículas  sometidas  a 
procesos de desecación (Mozafari, 2005).  

El  índice  de  polidispersidad  refleja  la  heterogeneidad  de  tamaños  de  partícula  de  las 
dispersiones liposomales. Todas ellas mostraron una típica distribución monomodal (Figura 33) 
con una única población definida,  indicativo de una buena polidispersidad. Estos  resultados 
fueron corroborados por los valores de la tabla 4, donde el índice de polidispersidad osciló entre 
0,171 y 0,266. Acorde a da Silva Malheiros et al.  (2010), quienes definen un buen  índice de 
polidispersidad entre 0,200 y 0,300 para  sistemas preparados a partir de material biológico, 
nuestros  liposomas tuvieron un  índice de polidispersidad dentro del rango típico y por tanto, 
una distribución homogénea. No se observaron diferencias significativas en función del material 
encapsulante, del método de sonicación o de la presencia de glicerol.  

 

Figura 33. Distribución de tamaños de partícula de  las dispersiones  liposomales (L5A, L5B, L5Ang, L2A, 
L2B, LLS).  

 

El  potencial  zeta  (Tabla  4)  representa  la  estabilidad de  las  vesículas  en  función de  la  carga 
electrostática de su superficie de membrana. Según Müller et al. (2001), vesículas con valores 
de potencial inferiores a ‐30 mV son consideradas vesículas muy estables. Dado que todas las 

0

2

4

6

8

10

12

14

1 10 100 1000 10000

In
te
n
si
d
ad

(%
)

Tamaño (nm)

L5A

L5B

L5Ang

L2A

L2B

LLS



Resultados 

95 

 

dispersiones  liposomales  ensayadas  mostraron  valores  más  electronegativos  (‐34,5  hasta                
‐44,3 mV) que el límite definido por Müller, todos los liposomas pueden ser considerados como 
vesículas con una muy elevada estabilidad de partícula.  

La razón de que la carga neta de la membrana de los liposomas sea negativa es debida a que, 
aunque el fosfolípido mayoritario,  la fosfatidilcolina, tiene carga cero (las cargas positivas del 
grupo colina son contrarrestadas por las cargas negativas de los grupos fosfato), se han podido 
identificar la presencia de fosfolípidos aniónicos (fosfatidilinositol) con carga negativa. Además, 
algunas  impurezas, como trazas de proteína o tocoferol, también pueden contribuir a que el 
potencial  zeta  sea  más  electronegativo  (McClements,  2016).  El  hecho  de  que  la  carga 
electrostática de la superficie de membrana de los liposomas sea negativa puede implicar ciertas 
ventajas para determinadas aplicaciones, como por ejemplo, que éstos tengan más facilidades 
de penetración en la piel (Ogiso et al., 2001).  

No se ha encontrado una relación directa entre el potencial zeta y la materia prima empleada o 
la  intensidad de sonicación, si bien es cierto que  las dispersiones L5A y L5Ang fueron  las que 
presentaron un significativo menor potencial de membrana, con valores de ‐35,5 mV y ‐34,5 mV, 
respectivamente. Estas dos dispersiones liposomales coinciden con las preparaciones de menor 
tamaño de partícula. Sin embargo, dado que el valor del potencial zeta es inferior a ‐30 mV, la 
estabilidad  vesicular  se  sigue  considerando muy  elevada.  Por  otro  lado,  se  descarta  que  el 
glicerol influya de manera significativa en el potencial de membrana y que afecte negativamente 
a la estabilidad de las vesículas, tal y como demostró previamente Manca et al. (2013).  

Conservación en refrigeración 

En la tabla 4 se muestran también los parámetros de tamaño, polidispersidad y potencial zeta 
de las mismas dispersiones liposomales conservadas durante 3 semanas en refrigeración a 4 °C. 
Tras 3 semanas, el tamaño medio se mantuvo estable para todas las dispersiones liposomales 
(ligero  aumento  de  4,7  nm  para  L5B  y  pequeño  decremento  de  3,3  nm  para  L2A)  con  la 
excepción  de  LLS,  que  incrementó  su  tamaño medio  hasta  143,5  nm  (aumentando  así  en          
11,1 nm). De esta forma, LLS siguieron siendo los liposomas de mayor tamaño (143,5 nm), L5A 
y  L5Ang  los más  pequeños  (86,9  nm  y  73,9  nm,  respectivamente)  y  L2A  (105,2  nm),  L2B          
(102,8 nm) y L5B (106,6 nm) los de tamaños intermedios.  

El índice de polidispersidad se mantuvo muy estable (p>0,05) tras 3 semanas de conservación, 
salvo para LLS que disminuyó ligeramente a partir de la segunda semana y para L5Ang que  lo 
hizo a partir de la primera semana.  

El  potencial  zeta  varió  significativamente  en  la  mayoría  de  dispersiones  reduciéndose  su 
electronegatividad, aunque todas siguieron estando por debajo del límite de ‐30 mV, por lo que 
continuaron siendo partículas muy estables. La excepción fueron los liposomas L5A y L5Ang, que 
no  vieron modificado  su  potencial  zeta  con  el  tiempo  (p>0,05),  reflejando  así  una mayor 
estabilidad que el resto. Además, estas dos dispersiones junto con los liposomas LLS fueron los 
que tuvieron un potencial más electronegativo a las 3 semanas, considerándose los de mayor 
estabilidad.  

Microscopía electrónica de transmisión a temperatura criogénica 

Seguidamente, se  llevó a cabo un estudio morfológico de  las vesículas mediante microscopía 
electrónica de  transmisión  con  criofijación. En  la  figura 34  se muestran  las  imágenes de  las 
dispersiones de lecitina de soja (LLS) y con fosfatidilcolina de cinco lavados y sonicación fuerte, 
tanto con glicerol como sin él (L5A y L5Ang). Únicamente se estudiaron estas tres dispersiones 
puesto que  son aquéllas  con mayor  (LLS)  y menor  (L5A,  L5Ang)  tamaño medio. Además,  se 
eligieron las dos dispersiones L5A para comprobar si la presencia de glicerol en la formulación 
implica, más allá del tamaño final, algún cambio significativo de morfología.  



Capítulo 1 

96 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 34. Fotografías obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión por criofijación de las 
dispersiones  liposomales  (LLS,  L5A,  L5Ang). 1: vesículas de gran  tamaño, 2: vesículas de gran  tamaño 
irregulares, 3: vesículas pequeñas, 4: vesículas invaginadas, 5: vesículas aplanadas. 
 

Como era de esperar,  los  liposomas de  lecitina presentaron una morfología y distribución de 
tamaños más heterogénea con una importante cantidad de vesículas de gran tamaño y forma 
irregular, lo que confirma su mayor tamaño medio (132,4 nm) medido por dispersión dinámica 
de luz. Estas peculiaridades observadas por microscopía las describieron previamente Rangelov 
et al. (2010), atribuyéndose a  la presencia de  impurezas y al alto grado de  insaturación de  la 
lecitina  de  soja.  En  cambio,  los  liposomas  L5A  y  L5Ang  mostraron  mayoría  de  vesículas 
unilamelares de pequeño tamaño y morfología esférica bastante homogénea, lo que encaja con 
su pequeño tamaño determinado por dispersión dinámica de luz (87,4 nm L5A y 74,3 nm L5Ang).  

Los liposomas L5A mostraron su morfología mayormente esférica mientras que en los liposomas 
L5Ang  se  atisban  algunas  vesículas  de  forma  aplanada  así  como  mayor  número  de 
invaginaciones,  lo que explicaría su  ligero mayor  índice de polidispersidad (0,266) respecto al 
resto de dispersiones. El glicerol, por  lo tanto, podría proteger  la estructura de  los  liposomas 
frente a cambios físicos y mantener una morfología esférica más uniforme.  

Calorimetría Diferencial de Barrido 

Varias  transiciones  de  fase  endotérmicas  (con  absorción  de  calor)  se  observaron  por 
Calorimetría  Diferencial  de  Barrido  para  cada  dispersión  liposomal  (Figura  35).  La  primera 
transición observada (Figura 35A) tuvo lugar a temperaturas sub‐zero (temperaturas negativas) 
oscilando  en  un  rango  de  ‐1,7  a  ‐8,9  °C  (Tabla  5).  Este  primer  cambio  de  fase  (T1,  ΔH1)  se 
correlaciona claramente con la fusión del agua extra‐liposomal, es decir, el agua presente en la 
dispersión y no confinada en las membranas (intra‐liposomal), la cual tiene lugar a temperaturas 

L5Ang 

4 

5 

500 nm

LLS

1 

2 

500 nm L5A 

3 

500 nm



Resultados 

97 

 

cercanas a 0 °C (Lefèvre et al., 2002) y es típica de muestras en estado acuoso, como es el caso 
de nuestras dispersiones liposomales concentradas. Por tanto, esta primera transición de fase 
hace  referencia a  la  interacción entre  las moléculas de agua extra‐liposomales y  las propias 
vesículas. 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 35. Termogramas reflejando las transiciones de fase mediante Calorimetría Diferencial de Barrido 
de  las  dispersiones  liposomales  (LLS,  L2A,  L2B,  L5A,  L5B,  L5Ang).  A)  Primera  transición.  B)  Segunda 
transición. 

L

L

L5

0.5
W/g

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

H
e

at
 F

lo
w

 (
W

/g
)

-30 -20 -10 0 10 20 30

Temperature (°C)Exo Up Universal V4.1D TA I

LLS 

En
ta
lp
ía
 (
J/
g)

 

L2A 

L2B 

L5A 

L5B

L5Ang 

Temperatura (°C) 

A 

0
,5
 J/g 

0.01
W/g

-0.100

0.001

-5 0 5 10 15 20 25

Temperatura (°C) 

En
ta
lp
ía
 (
J/
g)

 

L5Ang 

L5B 

L5A 

L2B 

L2A 

LLS B 

0
,0
1
 J/g 



Capítulo 1 

98 

 

Para  las dispersiones  conteniendo  glicerol,  al  comparar  entre dos  y  cinco  lavados  con  igual 
método de sonicación se observa que la T1 es menor para las muestras de cinco lavados (L5A y 
L5B) y, por tanto, de mayor concentración de fosfatidilcolina, coincidiendo con  los resultados 
previos de Calorimetría Diferencial de Barrido para las fosfatidilcolinas parcialmente purificadas 
(Figura 31). Por otro lado, si comparamos entre métodos de sonicación fuerte y débil para un 
mismo grado de purificación observamos que T1 es menor para las muestras con el método de 
sonicación A (fuerte). Este resultado podría indicar que una sonicación más fuerte da lugar a una 
mayor cantidad de vesículas unilamelares pequeñas, tal y como demostró previamente Taylor 
& Morris  (1995). Por  tanto,  la dispersión L5A  (mayor grado de purificación y sonicación más 
fuerte)  fue  la  que  tuvo  la menor  T1  (p≤0,05)  con  un  valor  de  ‐8,9  °C,  asociada  a  su mayor 
concentración de fosfatidilcolina y a su mayor prevalencia de vesículas unilamelares pequeñas. 
Además, fue la dispersión que presentó una menor entalpía (ΔH1) para esta primera transición, 
con  un  valor  significativamente  menor  que  el  resto  (48,1  J/g),  lo  que,  según  Biltonen  & 
Lichtenberg (1993), podría indicar una menor prevalencia de vesículas unilamelares grandes, lo 
que concordaría con las observaciones anteriores.  

Por su parte, mientras que todas las dispersiones con glicerol (incluida LLS) presentaron valores 
de temperatura y entalpía relativamente parecidos (destacando L5A), la dispersión L5Ang (sin 
glicerol) mostró valores más alejados, con una T1 de ‐1,7 °C y ΔH1 de 106,2 J/g, indicando que 
L5Ang es la muestra con el valor más cercano a los 0 °C de fusión del agua. La adición de glicerol 
en la dispersión liposomal cambia los parámetros T1 y ΔH1 con respecto a la muestra L5Ang, a 
través  de  la modificación  en  la  interacción  de  las moléculas  de  agua  con  la  superficie  de 
membrana  de  las  vesículas,  reflejando  que  el  glicerol  altera  la  estructura  de  la membrana 
lipídica.  
 

Tabla 5. Temperatura (T, °C) y entalpía (∆H, J/g) de las transiciones de fase observadas por Calorimetría 
Diferencial de Barrido de las dispersiones liposomales (LLS, L2A, L2B, L5A, L5B, L5Ang). Diferentes letras 
(a, b, c, d, e) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre liposomas.  

  Tpico1 (ᵒC)  ∆H pico1 (J/g)  Tpico2 (ᵒC)  ∆H pico2 (J/g) 

LLS  ‐6,3 ± 0,3b    76,2 ± 3,8c     9,0 ± 0,5ab  4,4 ± 0,8bc 

L2A  ‐7,8 ± 0,3d    72,7 ± 2,2b    9,2 ± 0,4b 6,8 ± 1,0c 

L2B  ‐6,2 ± 0,2b    67,5 ± 4,1b    7,9 ± 0,3a 3,2 ± 0,3b 

L5A  ‐8,9 ± 0,3e    48,1 ± 1,9a  11,3 ± 0,5c 8,3 ± 0,7d 

L5B  ‐7,0 ± 0,2c     74,2 ± 2,4bc      9,0 ± 0,4ab  5,0 ± 1,0bc 

L5Ang  ‐1,7 ± 0,1a     106,2 ± 6,4d      8,4 ± 0,5ab 2,2 ± 0,1a 

 

La  segunda  transición  de  fase  (Figura  35B)  tuvo  lugar  a  valores  positivos  de  temperatura           
(7,9‐11,3 °C) y con menores valores de entalpía (2,20‐8,34 J/g) (Tabla 5). Esta transición se trata 
en realidad de una pretransición (T2) y refleja el ordenamiento y estructuración de la membrana 
a través de la interacción entre las cabezas polares de los fosfolípidos de membrana (Yokota et 
al., 2012). Es un pico muy característico que siempre está presente en este tipo de vesículas, 
salvo en los casos en los que la formulación incluye colesterol o un derivado del mismo, el cual 
puede  hacer  desaparecer  esta  pretransición  (Manca  et  al.,  2017).  La  dispersión  L5A    (más 
purificada y con mayor sonicación) destacó nuevamente, esta vez por ser la que presentó una 
mayor T2 (11,3 °C) así como mayor ΔH2 (8,3 J/g) (p≤0,05 para ambos parámetros), indicando que 
se trata de una matriz vesicular de mayor rigidez que el resto, lo que la hace menos susceptible 
de movilidad molecular (Yokota et al., 2012), mostrando de este modo una mayor estabilidad y 
un mejor  ordenamiento  de membrana  (Christensen  et  al.,  2007).  El  resto  de  dispersiones 



Resultados 

99 

 

presentaron valores inferiores tanto para temperatura como entalpía. En función del grado de 
purificación, las dispersiones con FC5 tuvieron mayores valores de T2 y ΔH2 que aquellas con FC2 
con una misma sonicación, indicando un mayor ordenamiento de membrana. En cuanto al tipo 
de  sonicación  con  un mismo  tipo  de  fosfatidilcolina,  las  sometidas  a  sonicación  fuerte  (A) 
mostraron  valores mayores de  T2  y  ΔH2  frente  a  las de  sonicación más  leve  (B).  Por  tanto, 
coincide que la dispersión con FC5 y sonicación A (L5A) sea la más estable y ordenada. Por otro 
lado, se observaron valores intermedios para la dispersión de lecitina de soja (LLS) mientras que 
L5Ang mostró el menor valor de entalpía (2,20 J/g) y el segundo menor valor de temperatura 
(8,4 °C), demostrando un comportamiento térmico diferente a la dispersión análoga con glicerol 
añadido.  

Finalmente,  la transición de fase típica de  los sistemas  liposomales (T3 y ΔH3) se trata de una 
transición endotérmica desde una fase gel hasta una fase líquido‐cristalina y tiene lugar como 
resultado de una reducción en la fuerza de las interacciones de Van der Waals, provocando un 
aumento de  la movilidad de  las cadenas de ácidos grasos de  los fosfolípidos de  la membrana 
(Pennington et al., 2016).  

Esta  transición  solo  fue  visible  en  L5Ang,  con  valores  de  17,3  °C  y  0,95  J/g  para  T3  y  ΔH3, 
respectivamente. No se observó dicha transición para ninguna de las dispersiones incorporando 
glicerol en su formulación, independientemente de la materia prima empleada o del método de 
sonicación  inducido.  Yokota  et  al.  (2012)  obtuvieron  similares  resultados  al  incorporar  un 
crioprotector en  liposomas elaborados a partir de  lecitina de soja no purificada (desparece  la 
transición por completo), al igual que Manca et al. (2017) al estudiar las transiciones de fase de 
liposomas con glicerol incorporado (observó una notable disminución de T3). Esta disminución o 
incluso desaparición de  la  transición de  fase principal se debió claramente y como acusaron 
dichos autores a  la presencia del crioprotector en  la  formulación  liposomal. Según describió 
previamente Pennington et al. (2016), el crioprotector (glicerol en nuestro caso) reemplaza las 
moléculas de agua de  la membrana  (tanto en el  interior de  la bicapa como en  la superficie), 
rompiendo  los puentes de hidrógeno de  las moléculas de agua presentes y formando nuevos 
enlaces  con  las  cabezas  polares  de  los  fosfolípidos.  De  este modo, modifica  el  estado  de 
hidratación  de  la  membrana  y  provoca  un  efecto  de  fluidificación,  ya  que  disminuye  el 
empaquetamiento  de  las  cadenas  hidrocarbonadas  aumentando  la  distancia  entre  las 
membranas de  la bicapa. Este efecto ocasiona un menor estrés de membrana (Yokota et al., 
2012)  evitando  su  posible  fusión  o  rotura  (Pennington  et  al.,  2016)  así  como  una mayor 
estabilidad de la misma.  

En  la  bibliografía  está  bien  descrito  que  la  fosfatidilcolina  sintética  o  pura  presenta  su 
temperatura de transición de fase principal (Tm) a 41 °C (Biltonen & Lichtenberg, 1993), muy por 
encima  de  nuestros  resultados.  Sin  embargo,  estos  mismos  autores  afirman  que  esta 
temperatura media puede variar en  función de  la estructura y composición del  lípido. De  tal 
modo,  la presencia de  insaturaciones, dobles enlaces cis,  cadenas hidrocarbonadas  laterales 
asimétricas, cargas  iónicas o  impurezas pueden reducir esta temperatura (Tm) hasta en 60 °C 
(incluso,  según  Svetlovics et  al.  (2012), hasta obtener  valores negativos).  Las  insaturaciones 
pueden afectar también a la amplitud del pico de la transición (incrementándola) y a la entalpía 
asociada  a  dicho  pico  (disminuyéndola),  favoreciendo  el  efecto  de  fluidificación  visto 
anteriormente (Montenegro et al., 2006).  

Liposomas liofilizados 

Las dispersiones liposomales son generalmente estables por un tiempo limitado, pudiendo sufrir 
efectos de fusión, agregación o sedimentación (Sharma & Sharma, 1997), si su almacenamiento 
se prolonga en el tiempo. Por ello, se plantea la estabilización de estas dispersiones mediante 
procesos de secado. Una estrategia muy empleada y con excelentes resultados es la liofilización, 
un proceso de secado por sublimación de muestras líquidas a vacío y temperatura controlada. 



Capítulo 1 

100 

 

Estudios previos de Porfire et al.  (2017) demostraron que  la  liofilización ayuda a preservar  la 
estabilidad de los liposomas evitando los efectos de agregación o sedimentación y aumentando 
su vida útil. Además, los liposomas liofilizados se presentan como una alternativa real en función 
de los requerimientos finales del producto. Por esta razón, todas las dispersiones liposomales 
se  sometieron  a  liofilización  y  los  datos  que  se muestran  a  continuación  corresponden  a 
liposomas secados mediante este proceso. 

Características de partícula 

Se estudiaron las características de partícula (Tabla 6) con el objetivo de evaluar si se producen 
cambios con el proceso de secado y cómo se comportan los liposomas una vez rehidratados.  
 

Tabla  6.  Tamaño  medio  (nm),  índice  de  polidispersidad  y  potencial  zeta  (mV)  de  las  dispersiones 
liposomales  (LLS,  L2A,  L2B,  L5A,  L5B,  L5Ang)  recién  preparadas  y  rehidratadas  tras  la  liofilización. 
Diferentes  letras  (a, b, c, d, e,  f) en  la misma columna  indican diferencias significativas  (p≤0,05) entre 
liposomas para un mismo estado físico, y (x, y) en la misma fila indican diferencias significativas (p≤0,05) 
entre diferentes estados físicos para una misma formulación liposomal.  

   Dispersiones  Liofilizados 

Tamaño 
(nm) 

LLS  132,4 ± 0,6e/x    987,0 ± 28,1d/y 

L2A  108,5 ± 0,4d/x    247,7 ± 13,9a/y 

L2B  102,1 ± 0,5c/x  268,3 ± 3,5a/y 

L5A    87,4 ± 0,8b/x  316,6 ± 6,7b/y 

L5B  101,9 ± 0,5c/x  303,4 ± 2,0b/y 

L5Ang    74,3 ± 0,3a/x  482,6 ± 6,2c/y 

Polidispersidad 

LLS    0,222 ± 0,007ab/x  0,577 ± 0,026b/y 

L2A  0,171 ± 0,013a/x  0,421 ± 0,033a/y 

L2B  0,235 ± 0,016b/x  0,468 ± 0,028a/y 

L5A   0,240 ± 0,005bc/x  0,374 ± 0,081a/x 

L5B   0,244 ± 0,008bc/x  0,371 ± 0,030a/y 

L5Ang  0,266 ± 0,009c/x  0,393 ± 0,040a/y 

Potencial zeta 
(mV) 

LLS  ‐44,3 ± 0,2b/x  ‐46,3 ± 0,5a/x 

L2A  ‐44,3 ± 4,5b/x   ‐51,7 ± 1,2ab/x 

L2B  ‐41,5 ± 2,8b/x   ‐51,5 ± 2,3ab/y 

L5A  ‐35,5 ± 1,7a/x  ‐54,2 ± 1,5b/y 

L5B  ‐42,1 ± 1,3b/x  ‐55,9 ± 2,4b/y 

L5Ang  ‐34,5 ± 1,9a/x  ‐46,9 ± 3,6a/y 

 

Tanto el tamaño medio como el índice de polidispersidad de todas las dispersiones liposomales 
aumentaron muy  notablemente  (p≤0,05)  tras  el  proceso  de  liofilización.  Este  efecto  ya  lo 
observaron  Chen  et  al.  (2010),  quienes  atribuyeron  este  aumento  de  tamaño  e  índice  de 
polidispersidad a fenómenos de fusión y/o agregación ocasionados por la eliminación del agua 
contenida en la muestra durante el proceso de secado. El tamaño final de los liposomas viene 
determinado por multitud de factores, como son el método y condiciones de elaboración,  la 
composición  y  proporciones  de  lípidos  empleados  en  la  formulación,  la  adición  y  tipos  de 
crioprotectores, etc. (Liu et al., 2010). Además, Rasoulianboroujeni et al. (2017) demostraron 
que  las propias condiciones establecidas en el proceso de  liofilización pueden condicionar el 
tamaño medio final de los liposomas. Aun así, hay que mencionar que el tamaño medio de los 
liposomas sometidos a  liofilización, aunque significativamente superior al de  las dispersiones 
frescas, puede seguir considerándose dentro de un rango nanométrico.  



Resultados 

101 

 

En contraposición, el potencial zeta disminuyó (se volvió más electronegativo) con la liofilización 
en  todos  los  liposomas  reflejando  así una mayor  estabilidad de membrana de  las  vesículas 
resuspendidas,  tal  y  como  describió  Porfire  et  al.  (2017).  Además,  como  se  comentó 
anteriormente,  los  liposomas  liofilizados podrían funcionar como una preparación alternativa 
factible puesto que tienen un reducido contenido en agua, lo que aumenta su estabilidad en el 
tiempo y versatilidad de uso.  

La tabla 6 muestra las propiedades de partícula de los liposomas rehidratados. Los liposomas de 
lecitina de soja (LLS) presentaron un mayor tamaño (p≤0,05), con un promedio de 987,0 nm, 
valor muy por encima de cualquier otra preparación. Además,  fueron  los que más variación 
sufrieron  tras  la  liofilización  y,  por  tanto,  los más  inestables.  En  cuanto  a  los  liposomas  de 
fosfatidilcolina  parcialmente  purificada,  aquéllos  elaborados  a  partir  de  FC2  obtuvieron  un 
tamaño menor (247,7 nm para L2A y 268,3 nm para L2B) que los más purificados, de FC5, con 
un rango de tamaño de 303,4‐482,6 nm. Sin embargo, no se encontró ninguna relación directa 
en función del método de sonicación. Comparando entre suspensiones L5, podemos apreciar 
que  L5Ang  (sin  glicerol)  mostró  un  tamaño  significativamente  mayor  (482,6  nm)  que  sus 
equivalentes con glicerol (316,6 nm para L5A y 303,4 nm para L5B). Esta diferencia se debió a 
que el glicerol ejerce algún tipo de protección sobre los liposomas, impidiendo que su tamaño 
aumente demasiado.  

Todos  los  liposomas  liofilizados presentaron una distribución de tamaños bimodal (Figura 36) 
con dos poblaciones definidas y diferenciadas. Los valores del  índice de polidispersidad, que 
también aumentaron tras la liofilización, fueron mayores (p≤0,05) para el LLS (0,577) mientras 
que  no  presentaron  diferencias  significativas  entre  el  resto  de  liposomas.  Aun  así,  hubo 
diferencias apreciables entre L2A y L2B  (con valores de 0,421 y 0,468, respectivamente) y el 
grupo conformado por L5A, L5B y L5Ang con un rango de polidispersidad de 0,371‐0,393.  

 

Figura 36. Distribución de tamaños de partícula de los liposomas liofilizados (L5A, L5B, L5Ang, L2A, L2B, 
LLS).  

 

Por otro lado, el potencial zeta mostró los valores más electronegativos (mayor estabilidad de 
partícula) para  los  liposomas L5A y L5B (‐54,2 y ‐55,9 mV, respectivamente) mientras que LLS 
con  ‐46,3  mV  y  L5Ang  con  ‐46,9  mV  fueron  los  de  menor  estabilidad,  con  potenciales 
intermedios para L2A y L2B. La menor estabilidad de LLS era esperable dado su mayor índice de 
polidispersidad y tamaño, así como su mayor incremento respecto al resto de liposomas tras el 
proceso de secado. Por su parte, la menor electronegatividad de los liposomas L5Ang se atribuyó 
nuevamente a la ausencia del glicerol. Esta característica junto con el mayor tamaño por parte 
de L5Ang parece demostrar que la presencia de un crioprotector en la formulación es necesaria 

0

2

4

6

8

10

12

10 100 1000 10000

In
te
n
si
d
ad

 (
%
)

Tamaño (nm)

L5A

L5B

L5Ang

L2A

L2B

LLS



Capítulo 1 

102 

 

si  la  muestra  va  a  ser  sometida  a  procesos  de  congelación  y  posterior  secado  mediante 
liofilización. Yang et al. (2013) observaron previamente estas mismas conclusiones, defendiendo 
que  los crioprotectores protegen  los  liposomas frente a  la  liofilización. De hecho, Stark et al. 
(2010) afirmaron que el glicerol (crioprotector empleado en nuestras formulaciones) previene 
los daños en  las  vesículas  inducidos por el proceso de  congelación‐liofilización, evitando así 
efectos de  fusión, agregación o degradación. En definitiva, exceptuando  los  liofilizados LLS y 
L5Ang, el resto de liposomas mostraron un tamaño relativamente nanométrico (superior al de 
las dispersiones) y una gran estabilidad de membrana. Dadas las diferentes propiedades de los 
liposomas  LLS  respecto  a  aquellos  elaborados  a  partir  de  fosfatidilcolinas  parcialmente 
purificadas, los liposomas de lecitina de soja se descartaron de futuros ensayos.  

Microscopía electrónica de transmisión a temperatura criogénica 

Los  resultados  obtenidos  por  dispersión  dinámica  de  luz  de  los  liposomas  liofilizados  se 
contrastaron con imágenes de microscopía electrónica de transmisión por criofijación. En este 
caso se analizaron únicamente los liposomas L5A por la misma razón que con las dispersiones, 
solo se quiere verificar cualitativamente y a grandes rasgos si el proceso de liofilización afecta a 
la morfología o tamaño de los liposomas, sin comparación entre ellos. La técnica no permite la 
visualización de muestras en estado sólido, por lo que se resuspendió la preparación en buffer 
fosfato pH 7 (buffer de preparación de liposomas) para tener una muestra líquida medible pero 
a su vez muy concentrada (30 mg/mL), adquiriendo finalmente un aspecto viscoso.  

La  imagen  microscópica  de  L5A  (Figura  37)  mostró  una  morfología  claramente  esférica, 
distinguiéndose dos poblaciones por su  tamaño, una mayoritaria de pequeño  tamaño y otra 
minoritaria  de  gran  tamaño  y  de  naturaleza  multivesicular  (coincidiendo  con  los  datos 
observados en la gráfica de distribución de tamaños). Asimismo, se aprecia un aumento en el 
número de vesículas bi‐ o multilamelares con respecto a la dispersión liposomal fresca. 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 37. Fotografías obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión por criofijación de los 
liposomas  liofilizados  y  posteriormente  resuspendidos  (L5A).  1:  vesículas  pequeñas,  2:  vesículas 
multilamelares, 3: vesículas grandes, 4: estructuras multivesiculares.  

 

Color 

Aunque como dispersiones no se observaron diferencias visuales, como  liofilizados (producto 
deshidratado)  sí  son  evidentes.  Los  liposomas  liofilizados  con  glicerol  presentaron  un  color 
marrón/ocre y una consistencia gomosa semejante a un chicle, por lo que se consideraron como 
pastas  liofilizadas.  Por  otro  lado,  los  liposomas  sin  glicerol  (L5Ang)  dieron  lugar  a  un  polvo 
granulado de color amarillo‐blanquecino tras el proceso de liofilización (Figura 38). Como ya se 

L5A re

1 

2 

500 nm L5A re 

3 4 

500 nm 



Resultados 

103 

 

explicó en apartados anteriores, el glicerol parece interferir en la estructura de la bicapa lipídica, 
probablemente dificultando el proceso de secado, lo que explicaría las diferencias en el aspecto 
de los liposomas después de liofilizarlos.  

 

Figura 38. Aspecto visual de los liposomas liofilizados. Izquierda: L5A; Derecha: L5Ang.  
 

Estas diferencias visuales se observaron también mediante evaluación  instrumental del color, 
cuyos parámetros de cromaticidad (saturación) y tonalidad se representan en la figura 39. Estos 
índices se obtuvieron a partir de  los datos primarios del sistema CIELab: L* (luminosidad), a* 
(intervalo rojo‐verde) y b* (intervalo amarillo‐azul) tal y como se indica en materiales y métodos.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 39. Gráfico reflejando los parámetros de color cromaticidad y tonalidad de los liposomas liofilizados 
(L2A, L2B, L5A, L5B, L5Ang).  
 

Todos  los  liposomas  se mantuvieron  en  un  estrecho  rango  de  tonalidad,  con  valores  entre      
70,9‐84,5, siendo L5A y L5Ang  los de mayor valor pero sin diferencias entre ellos. Aunque  la 
consistencia es totalmente diferente, sí es cierto que el color (ya sea en forma de polvo o de 
pasta)  fue de un  tono amarillento y por esta razón no hubo diferencias significativas con  los 
liposomas L5Ang.  

Sin embargo, el parámetro cromaticidad sí que presentó importantes diferencias entre L5Ang y 
los liposomas con glicerol, dado que la saturación (intensidad) del color fue muy diferente. De 
este modo, L5Ang tuvo mayor cromaticidad (intensidad más clara o brillante) que el resto de 
liposomas,  los cuales presentaron un valor  inferior y parecido entre ellos. Aun así se pueden 
apreciar ligeras diferencias: los liposomas elaborados a partir de fosfatidilcolina más purificada 
(L5A  y  L5B)  tuvieron una menor  cromaticidad que  los de menos purificada  (L2A  y  L2B).  Sin 
embargo,  no  se  observaron  diferencias  en  ningún  parámetro  en  función  del  método  de 
sonicación. Los resultados de luminosidad o L* (no mostrados aquí) reflejan un mayor valor para 

0

30

60

90

120

150

180

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0246810121416

0

2

L2A 
L2B 
L5A 
L5B 
L5Ang 

Cromaticidad 

C
ro
m
at
ic
id
ad

 



Capítulo 1 

104 

 

L5Ang (≈83) respecto al resto de liposomas (≈33) corroborando su mayor luminosidad, es decir, 
su coloración más clara, dentro un mismo rango de color, respecto a los demás liposomas.  

Contenido en agua 

En  la  tabla  7  se muestran  los  resultados  de  contenido  en  agua  residual  de  las muestras 
desecadas. Los  liposomas secos L5Ang presentaron un contenido en agua residual del 2,7 %, 
valor muy apropiado, dado que se trata de un polvo liofilizado. Con este proceso se elimina la 
mayor  parte  del  agua  contenida  en  la  muestra,  sin  embargo,  siempre  queda  un  mínimo 
porcentaje de agua remanente, procedente de moléculas de agua que forman fuertes enlaces 
con otros compuestos y quedan englobadas o asociadas a los liposomas.  

En cambio, los liposomas secos con glicerol presentaron un rango de contenido en agua entre 
13,9‐18,5 %  (sin  relación en  función del material encapsulante o del método de sonicación), 
valores a priori muy elevados para tratarse de muestras que han sido sometidas a un proceso 
de liofilización. La diferencia, tanto en la consistencia y apariencia, como en contenido en agua 
residual, se debe claramente al glicerol, el cual interfiere con las membranas de la bicapa lipídica 
y aumenta considerablemente el estado de hidratación de los liposomas (Manca et al., 2013), 
provocando  una  fluidificación  de  las  preparaciones  resultantes,  en  concordancia  con  los 
resultados previos de Calorimetría Diferencial de Barrido.  
 

Tabla 7. Contenido de agua (%) y capacidad de dispersión en agua (%) de liposomas liofilizados (L2A, L2B, 
L5A, L5B, L5Ang). Diferentes letras (a, b, c) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) 
entre liposomas. 

  Contenido en agua (%)  Capacidad de dispersión (%) 

L2A  17,5 ± 3,5a 70,0 ± 1,0b

L2B  18,5 ± 5,2a 64,4 ± 0,0a

L5A  18,5 ± 2,2a 72,3 ± 1,6b

L5B  13,9 ± 2,0a 71,4 ± 0,7b

L5Ang    2,7 ± 0,6b 98,1 ± 0,0c

 

Dispersabilidad en agua 

La dispersabilidad en agua (Tabla 7) fue muy similar en  los liposomas con glicerol, mostrando 
valores  comprendidos  entre  64,4  y  72,3  %,  sin  diferencias  significativas  entre  ellos.  Los 
liposomas  sin  glicerol  (L5Ang)  presentaron  una  dispersabilidad  casi  completa  (98,1  %), 
probablemente debido a que su estado físico en forma de polvo permite una mejor resuspensión 
en agua. Aun así hay que tener en cuenta que en esta técnica se forzó su precipitación mediante 
centrifugación. Los resultados de esta técnica reflejan los efectos tras una manipulación invasiva 
sobre los liposomas o tras el paso del tiempo, permitiendo una comparativa de su capacidad de 
dispersión  en  las  condiciones  estudiadas.  En  todos  los  casos,  los  liposomas  se  dispersaron 
aparentemente en su totalidad, sin precipitación espontánea.  

Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier 

La Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier mostró un primer pico de absorción 
característico entre 1042‐1052 cm‐1 (Figura 40A), correspondiente a los grupos colina (CH3)3‐N+ 
situados  en  las  cabezas  polares  de  los  fosfolípidos  de  membrana.  Este  pico  disminuyó 
considerablemente su absorbancia en las formulaciones que incorporaban glicerol con respecto 
a  los  liposomas  L5Ang,  indicando  que  la  presencia  de  glicerol  induce  una  alteración  en  la 
conformación de las cabezas de colina posiblemente debida a una disminución del número de 
moléculas de agua  (enlaces dipolo) que unen  los grupos  fosfato adyacentes  (Nogueira et al., 
2018). No se encontró ninguna relación para la disminución del grupo (CH3)3‐N+ en función de la 



Resultados 

105 

 

purificación de fosfolípidos (número de lavados) o del método de sonicación, así como para el 
resto de frecuencias estudiadas. Por esta razón, nos centraremos en la influencia del glicerol en 
la estructura de los liposomas, comparando los liposomas sin glicerol (L5Ang) con aquéllos que 
sí lo llevan (L2A, L2B, L5A y L5B).  

 

 

 

Figura 40. Espectros de  Infrarrojo con Transformada de Fourier de  los  liposomas  liofilizados (L2A, L2B, 
L5A, L5B, L5Ang). A) 4000‐500 cm‐1. B) 4000‐3660 cm‐1.  
 

El  siguiente  pico  característico  fue  localizado  entre  1215‐1227  cm‐1,  correspondiente  a  los 
grupos fosfato PO2

‐ de las cabezas polares. Nuevamente los liposomas L5Ang presentaron una 
mayor absorbancia que los liposomas con glicerol para este rango de frecuencias, debido a que 
el glicerol  interacciona con  los grupos fosfato de  las cabezas vecinas, rompiendo parte de  los 
puentes de hidrógeno que las mantienen unidas (Tai et al., 2017; Chiou et al., 1992), cambiando 
su estructura.  

Otro pico de absorción característico fue el localizado entre 1737‐1740 cm‐1, relacionado con la 
vibración de  los grupos  carbonilo C=O de  los ácidos grasos.  La  intensidad de dicho pico  fue 
igualmente  muy  superior  para  los  liposomas  sin  glicerol  respecto  a  los  que  sí  lo  tienen 
incorporado. Este resultado refleja que el glicerol interfiere en los grupos carbonilo situados en 
la región interfacial polar/apolar, provocando cambios en la hidratación y en el número o fuerza 
de las interacciones por puentes de hidrógeno con dichos grupos (Mannock et al., 2010).  

0

0,1

0,2

0,3

5001000150020002500300035004000

A
b
so
rb
an
ci
a

Frecuencia (cm‐1)

L2A L2B L5A L5B L5Ang

O‐H CH2 

C=O PO2
‐

(CH3)3‐N
+

A

0

0,002

3660376038603960

A
b
so
rb
an
ci
a

Frecuencia (cm‐1)

L2A L2B L5A L5B L5Ang

O‐H libre
B



Capítulo 1 

106 

 

Los  siguientes  picos  destacables  fueron  los  correspondientes  a  las  vibraciones  simétricas  y 
asimétricas  de  los  grupos  CH2  de  las  cadenas  laterales  (2853‐2854  cm‐1  y  2923‐2924  cm‐1, 
respectivamente).  Ambos  picos  fueron  ligeramente  superiores  para  los  liposomas  L5Ang 
respecto al resto, excepto los liposomas L2B que presentaron valores similares a los liposomas 
sin glicerol. Esta mayor detección de señal de  los grupos CH2  indica que  los  liposomas L5Ang 
tuvieron  una mayor movilidad  de  sus  cadenas  hidrocarbonadas  en  el  interior  de  la  bicapa 
(Nogueira et al., 2018) así como un posible mayor desorden de membrana  (Mannock et al., 
2010). Por  lo tanto,  la adición de glicerol produce una conformación estructural diferente, ya 
que modifica la configuración de los puentes de hidrógeno a distintos niveles de la bicapa dando 
lugar a una estructura más estable y ordenada.  

Con  respecto  a  la  absorción  en  el  espectro  infrarrojo  debida  a  la  vibración  del  grupo O‐H 
(relacionado con las moléculas de agua), se distinguen dos subgrupos o frecuencias, de acuerdo 
a Chiou et al. (1992):  los grupos O‐H que reflejan el agua  libre (3678‐3740 cm‐1) y  los grupos        
O‐H que reflejan el agua unida a  la membrana  (3272‐3280 cm‐1). El agua  libre procede de  la 
rotura  de  los  puentes  de  hidrógeno  que  unen  las moléculas  de  agua.  En  nuestro  estudio 
podemos ver (Figura 40B) cómo esta banda presenta mayor intensidad de absorbancia en los 
espectros de absorción de  infrarrojo (FTIR) de  los  liposomas con glicerol, confirmando  lo que 
veíamos antes, que el glicerol rompe los enlaces por puente de hidrógeno liberando parte del 
agua  que  es  detectada  como  agua  libre.  Los  liposomas  sin  glicerol  (L5Ang)  son  menos 
susceptibles de  sufrir estas modificaciones y por  tanto  su contenido de agua  libre es menor      
(2,7 %). Por otra parte, todos los liposomas presentaron la banda correspondiente al agua unida 
a  la membrana  (Figura 40B),  siendo ésta mayor para  los  liposomas  con glicerol. Esta mayor 
absorbancia para este rango de frecuencias indica que existe más agua unida a la membrana por 
puentes de hidrógeno para los liposomas con glicerol (Pawlikowska‐Pawlega et al., 2018). Esto 
se debe a que el glicerol reemplaza a las moléculas de agua y forman enlaces por puentes de 
hidrógeno con la propia membrana, incrementando así los grupos O‐H unidos a la membrana 
(adicionales a los grupos O‐H que aporta el propio glicerol).  

Conclusiones 

Se confirma que  la acetona es un solvente adecuado para  la concentración de  la fracción de 
fosfolípidos  presentes  en  la  lecitina  de  soja.  También  se  demuestra  que  el  incremento  del 
número de lavados con acetona contribuye a una reducción progresiva del contenido de lípidos 
neutros, ácidos grasos libres y tocoferoles. Sin embargo, no modifica el perfil de ácidos grasos 
de la fracción de fosfolípidos, donde predominó el ácido linoleico (C18:2n6c), representando el 
59 % de esta fracción tanto para la lecitina como para las fosfatidilcolinas. Un mayor grado de 
purificación no mostró cambios en las clases de fosfolípidos aniónicos (fosfatidilinositol y ácido 
fosfatídico),  sin  embargo,  sí  lo  hizo  en  los  catiónicos,  donde  la  fosfatidilcolina  estuvo más 
concentrada para FC5 respecto a FC2. El estudio de Calorimetría Diferencial de Barrido evidenció 
esta concentración de fosfolípidos y el de Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier 
la  posibilidad  de  acumulación  de  aldehídos  y  cetonas  en  ambas  fosfatidilcolinas.  Todas  las 
dispersiones  liposomales  presentaron  una muy  elevada  estabilidad  y  un menor  tamaño  de 
partícula  respecto  a  la  lecitina.  Sin  embargo,  la diferencia de  tamaños  solo  fue  significativa 
cuando coincidió con el método de sonicación fuerte (A), es decir, en las dispersiones L5A. De 
cara  a  aplicaciones  alimentarias,  la  fosfatidilcolina menos  purificada  (de  dos  lavados,  FC2), 
podría  ser  suficiente  para  obtener  liposomas  con  propiedades  estructurales  adecuadas. 
Además, su mayor contenido en tocoferoles podría proporcionar mejor protección frente a la 
oxidación.  La  producción  de  liposomas  con  glicerol  causó  interferencia  en  la  membrana 
incrementando su tamaño de partícula pero sin modificar su carga de superficie de membrana.  

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CAPÍTULO 2. ENCAPSULACIÓN DE COMPUESTOS 

BIOACTIVOS MEDIANTE LIPOSOMAS DE 

FOSFATIDILCOLINA DE LECITINA DE SOJA 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Resultados 

109 
 

8.2.  ENCAPSULACIÓN  DE  COMPUESTOS  PROCEDENTES  DE  RESIDUOS  ALIMENTARIOS  EN 
LIPOSOMAS DE FOSFATIDILCOLINA DE SOJA: EFECTO DE LA LIOFILIZACIÓN, ESTABILIDAD DE 
CONSERVACIÓN Y APTITUD FUNCIONAL 

Resumen 

Se  elaboraron  liposomas  de  fosfatidilcolina  de  soja  encapsulando  compuestos  de  diferente 
naturaleza procedentes de residuos de la alimentación (un hidrolizado de colágeno del manto 
de calamar, L‐HC; un extracto de piel y albedo de granada, L‐PG; y un extracto de residuos de 
langostino,  L‐GC). Estas dispersiones  se  liofilizaron y  se  conservaron en  congelación  (‐20  °C) 
durante 7 meses para evaluar su estabilidad. El proceso de liofilización incrementó el tamaño de 
partícula  a  la  vez  que  disminuyó  la  dispersabilidad  en  agua  de  las  pastas  resultantes.  Los 
liofilizados L‐HC y L‐PG presentaron vesículas grandes multivesiculares con morfología esférica 
y unilamelar. Por su parte, L‐GC presentó vesículas grandes multilamelares, coincidiendo con 
mayores  cambios estructurales en  la bicapa  lipídica  y una mejora de  la estabilidad  térmica, 
apreciado mediante  Espectroscopía  Infrarroja  con  Transformada  de  Fourier  y  Calorimetría 
Diferencial de Barrido. La reología dinámica oscilatoria reveló un ligero endurecimiento de las 
pastas  liofilizadas,  inducido  por  el  tiempo  de  almacenamiento.  La muestra  L‐GC mostró  un 
marcado incremento de rigidez en un rango de temperatura de 40‐90 °C. La encapsulación de 
liposomas con compuestos antioxidantes previno la oxidación  lipídica inducida por el proceso 
de  liofilización.  La  estabilidad  de  los  liofilizados  durante  la  conservación  y  sus  aptitudes 
tecnológicas  como  ingrediente alimentario variaron en  función de  la naturaleza química del 
compuesto encapsulado.  

Palabras clave: liposomas, fosfatidilcolina de soja, liofilización, oxidación lipídica, estabilidad de 
conservación.  

Introducción 

Los  liposomas  son  vesículas  coloidales  esféricas  anfipáticas,  característica  que  les  permite 
atrapar y proteger tanto bioactivos lipofílicos como hidrofílicos y actuar como transportadores 
de éstos en el organismo (Mozafari et al., 2008). En la industria de la alimentación se emplean 
para  enmascarar  olores  y  sabores,  así    como  transportadores  de  vitaminas,  antioxidantes, 
proteínas, enzimas y minerales, protegiendo a los compuestos encapsulados de su interacción 
con  los  componentes de matrices alimentarias y proporcionando una mejora de estabilidad 
frente a la degradación química y física (Da Silva Malheiros et al., 2010).  

El uso de lecitina de soja natural para la encapsulación de liposomas proporciona un importante 
valor  nutricional  atribuido  a  su  perfil  de  ácidos  grasos  esencialmente  poliinsaturados.  Sin 
embargo, este material puede ser susceptible de sufrir oxidación lipídica. La incorporación de 
compuestos antioxidantes en  los  liposomas podría prevenir o  reducir  la  formación de estos 
productos de oxidación (Frenzel & Steffen‐Heins, 2015). 

Existe un creciente  interés en  la recuperación de residuos de pescado, y una posibilidad es  la 
hidrólisis enzimática de su componente proteico para  la obtención de péptidos con diversas 
propiedades bioactivas. Las túnicas del calamar gigante son una excelente   fuente de péptidos 
antioxidantes  (procedentes de colágeno) que protegen a  las células  frente al daño oxidativo 
(Giménez et al., 2009; Mendis et al., 2005).  Los elevados niveles de hidroxiprolina,  residuos 
hidrofóbicos  y péptidos  glicosilados en  los hidrolizados de  gelatina de  túnica de  calamar  se 
relacionan con una magnífica actividad antioxidante (Alemán et al., 2011; Alemán et al., 2013). 
Los  residuos  de  cutículas  y  cefalotórax  procedentes  de  la  industria  del  procesamiento  de 
crustáceos también proporcionan una fuente de compuestos bioactivos con efectos saludables. 
El extracto lipídico de    langostino (L. vannamei) basado en una elevada proporción de ácidos 



Capítulo 2 

110 
 

grasos  poliinsaturados  omega‐3  (ácido  docosahexaenoico  y  ácido  eicosapentaenoico), 
astaxantina  y  α‐tocoferol  también  presenta  actividades  antioxidantes  (Gómez‐Estaca  et  al., 
2016; Gómez‐Estaca et al., 2017). Entre los residuos de plantas, los extractos de piel de granada, 
ricos  en  polifenoles  como  elagitaninos,  ácido  elágico  y  antocianinas,  son  conocidos por  sus 
efectos beneficiosos basados en sus actividades antioxidantes y antiproliferativa (Masci et al., 
2016).  

Hay numerosa información publicada acerca de liposomas encapsulando una amplia variedad 
de compuestos naturales con propiedades antioxidantes, tales como gelatina o hidrolizados de 
colágeno (Ramezanzade et al., 2017; Mosquera et al., 2014), compuestos polifenólicos (Popova 
& Hincha, 2016) o compuestos lipofílicos como carotenoides (Du et al., 2015), tocoferol (Neunert 
et al., 2015) o ácidos grasos poliinsaturados esenciales (Semenova et al., 2016). Sin embargo, las 
diferencias en  la  composición y procedimiento de elaboración de  los  liposomas dificultan  la 
comparación de sus propiedades físico‐químicas.  

Los  liposomas  son  normalmente  presentados  como  suspensiones  liposomales  acuosas, 
susceptibles de perder estabilidad, provocando fusión o agregación de vesículas, liberación del 
compuesto  encapsulado  y  sedimentación  (Sharma  &  Sharma,  1997).  La  liofilización  es  un 
proceso  alternativo  que  puede  aumentar  la  vida  útil  de  los  liposomas,  manteniendo  su 
estabilidad y preservándolos en estado  seco  (Stark et al., 2010). Sin embargo,  la  liofilización 
puede dañar la bicapa lipídica mediante la formación de cristales de hielo durante el proceso de 
congelación  previo,  la  fusión  y  agregación  de  las  vesículas,  la  deshidratación  y  posteriores 
cambios  de  transición  de  fase  durante  su  rehidratación  (Chen  et  al.,  2010).  Por  ello, 
crioprotectores, tales como carbohidratos y polialcoholes, son propuestos para prevenir el daño 
vesicular inducido por la     liofilización, siendo uno de los más empleados el glicerol (Stark et al., 
2010).  

Objetivos 

El primer objetivo parcial de este capítulo  fue el estudio del efecto de  la  liofilización y de  la 
conservación  a  largo  plazo  en  las  propiedades  físico‐químicas,  estructurales,  reológicas, 
oxidativas y funcionales de liposomas con glicerol encapsulando varios compuestos bioactivos 
antioxidantes, procedentes de  residuos de  la alimentación con alto valor añadido,  los cuales 
podrían usarse como ingredientes funcionales en alimentos.  

Materiales y métodos 

Inicialmente, se extrajo fosfatidilcolina parcialmente purificada tras cinco  lavados en acetona 
(FC5)  procedente  de  la  lecitina  de  soja  (LS).  También  se  llevó  a  cabo  la  extracción  de  los 
diferentes extractos bioactivos a encapsular: hidrolizado de colágeno, piel y albedo de granada 
y grasa de crustáceo. A continuación,  se elaboraron diferentes dispersiones  liposomales con 
glicerol. Se prepararon  liposomas  incorporando  los tres extractos bioactivos: L‐HC:  liposomas 
con hidrolizado de colágeno procedente de túnicas del manto del calamar gigante (Dosidicus 
gigas); L‐PG:  liposomas con extracto de piel y albedo de granada  (Punica granatum); y L‐GC: 
liposomas  con  grasa  de  crustáceo  procedente  de  bioresiduos  de  langostino  (Litopenaeus 
vannamei). Para ello, el compuesto bioactivo se incluyó a una concentración de 2 mg/mL en el 
primer paso del proceso, es decir, en el paso inicial de mezclar la fosfatidilcolina con el buffer 
fosfato. Dispersiones liposomales vacías (L‐V) se estudiaron en paralelo como control.  

De las dispersiones liposomales resultantes se estudiaron propiedades hidrodinámicas (tamaño 
de partícula, potencial Z y polidispersidad) por dispersión dinámica de luz en Zetasizer (dilución 
1/10), microscopía electrónica de transmisión por criofijación (3 µL), eficacia de encapsulación, 
contenido en agua y dispersabilidad en agua, propiedades térmicas por Calorimetría Diferencial 



Resultados 

111 
 

de Barrido (muestras concentradas en desecador hasta concentración final de 250 mg/mL), y 
estabilidad oxidativa mediante la determinación del índice tiobarbitúrico. Además, se estudió la 
estabilidad de las dispersiones durante 2 semanas en refrigeración (4 °C) mediante Zetasizer.  

Las  dispersiones  liposomales  se  liofilizaron  y  se  caracterizaron  analizando  sus  propiedades 
hidrodinámicas mediante  Zetasizer  (77 mg/mL  y  dilución  1/10), microscopía  electrónica  de 
transmisión  por  criofijación  (30  mg/mL),  eficacia  de  encapsulación,  contenido  en  agua  y 
dispersabilidad, colorimetría, Calorimetría Diferencial de Barrido (250 mg/mL), Espectroscopía 
Infrarroja  con  Transformada  de  Fourier,  reología  (viscoelasticidad),  y  estabilidad  oxidativa 
mediante el  índice  tiobarbitúrico. Además,  se estudió  la estabilidad durante 7 meses de  las 
pastas liposomales, estableciendo controles periódicos (0, 3 y 7 meses) en congelación (‐20 °C), 
en los cuales se caracterizaron mediante la determinación de las propiedades hidrodinámicas y 
físico‐químicas.   

Resultados y discusión 

Características de partícula  

Dispersión dinámica de luz en Zetasizer 

Se analizaron  las características de partícula de  las dispersiones  liposomales L‐V, L‐HC, L‐PG y     
L‐GC recién preparadas (Tabla 8). Todas las dispersiones liposomales encapsulantes de extractos 
bioactivos  tuvieron un  tamaño medio similar  (p>0,05), con  tamaños de 102,3 nm para L‐HC, 
104,2 nm para L‐PG y 102,2 nm para L‐GC, los cuales son tamaños típicos de liposomas (Has et 
al.,  2018).  Otros  autores  obtuvieron  tamaños  medios  parecidos  o  aproximados  para 
dispersiones similares: Mosquera et al. (2016) obtuvieron liposomas de fosfatidilcolina de soja 
rellenos de una fracción peptídica de túnica del calamar (Dosidicus gigas) por ultrasonicación 
con  un  tamaño  final  de  110  nm;  Cheng  et  al.  (2017)  elaboraron  nanopartículas  de 
epigalocatequina galato con un rango de tamaños medios de 126‐167 nm; y Peng et al. (2010) 
desarrollaron liposomas de fosfatidilcolina conteniendo astaxantina con un tamaño de 251 nm. 
Las dispersiones vacías (L‐V) presentaron un tamaño menor (87,4 nm) (p≤0,05) respecto a los 
liposomas rellenos, probablemente debido al efecto de expansión que inducen los bioactivos. 
Tai et al. (2017) obtuvieron similares resultados para dispersiones de liposomas de lecitina de 
soja vacíos, con un tamaño medio de 91,10 nm.  

Todas  las  dispersiones  mantuvieron  un  índice  de  polidispersidad  comprendido  entre               
0,240‐0,263  (p>0,05). Este  índice  se  considera aceptable para  sistemas biológicos cuando es 
inferior a 0,3 (Füredi et al., 2016). Esta buena polidispersidad es confirmada por las gráficas de 
distribución de tamaños (Figura 41A), donde todas las dispersiones liposomales presentaron una 
distribución monomodal con una única población de tamaños definida.  

Los valores de potencial zeta estuvieron comprendidos entre ‐35,5 mV y ‐43,4 mV, reflejando 
todas las dispersiones una excelente estabilidad de partícula, tal y como señalan Müller et al. 
(2001), quienes establecen una óptima estabilidad de partícula para potenciales  inferiores a          
‐30 mV. El potencial más bajo lo presentaron las dispersiones vacías, con un valor de ‐35,5 mV, 
siendo mucho más estable que el obtenido por Tai et al. (2017) para liposomas frescos (‐3,4 mV). 
El  potencial más  electronegativo  lo mostraron  las  dispersiones  de  hidrolizado  de  colágeno           
(L‐HC) con  ‐43,4 mV, siendo muy cercano a  los  ‐51 mV obtenidos por Mosquera et al. (2016) 
para liposomas frescos que contenían una fracción peptídica de gelatina de túnica de calamar. 
Estos resultados indican que la presencia del bioactivo favorece la estabilidad de membrana. 

 



Capítulo 2 

112 
 

           

Figura 41. Distribución de tamaños de partícula de liposomas vacíos y rellenos con extractos bioactivos, 
donde L‐V: liposomas vacíos; L‐HC: liposomas con hidrolizado de colágeno; L‐PG: liposomas con piel de 
granada; L‐GC: liposomas con grasa de crustáceo. 

 

Las cuatro dispersiones liposomales (L‐V, L‐HC, L‐PG y L‐GC) se conservaron en refrigeración a   
4 °C durante 2 semanas, controlando semanalmente sus características de partícula. Tras dos 
semanas  de  conservación,  tanto  el  tamaño  medio  como  el  índice  de  polidispersidad  se 
mantuvieron  estables  (p>0,05)  para  todas  las  dispersiones  liposomales.  De  este modo,  el 
tamaño medio  tras  dos  semanas  de  conservación  fue  de  86,2  nm  para  L‐V  y  del  rango  de        
104,7‐107,0  nm  para  las  tres  dispersiones  con  bioactivos,  mientras  que  el  índice  de 
polidispersidad  osciló  en  valores  comprendidos  entre  0,230‐0,264.  Dag  &  Oztop,  (2017) 
extrajeron  las mismas conclusiones para  liposomas de  lecitina de  soja  (70 %  fosfatidilcolina) 
vacíos y conteniendo un extracto polifenólico de té verde comercial conservados a 4 °C durante 
2 semanas.  

El potencial zeta de  las dispersiones de HC y GC disminuyó sus valores (p≤0,05) a  la segunda 
semana  en  refrigeración  (tras  una  semana  no  experimentaron  cambios)  hasta  valores  de                  
‐31,7 mV y de ‐32,9 mV, respectivamente. Dag & Oztop (2017) observaron que el potencial zeta 
disminuía, volviéndose menos electronegativo transcurridas dos semanas de conservación. Por 
el  contario,  en  el  presente  trabajo,  las  dispersiones  vacías  (L‐V)  se  volvieron  más 
electronegativas progresivamente  hasta  ‐43,7 mV, mientras que  las  dispersiones de piel  de 
granada  (L‐PG)  se mantuvieron estables en el  tiempo  con un  valor  final de  ‐38,8 mV. Estos 
resultados confirman  la elevada estabilidad de  las dispersiones  liposomales durante  tiempos 
cortos de conservación.  

Las características de partícula de los liposomas liofilizados y posteriormente rehidratados L‐V, 
L‐HC, L‐PG y L‐GC se muestran en la tabla 8. El proceso de liofilización incrementa el potencial 
electronegativo de  todos  los  liposomas hasta valores  comprendidos entre  ‐54,2 y  ‐59,1 mV, 
aumentando así  la estabilidad de  los  liposomas. Este potencial, aunque muy parecido entre 
muestras, fue ligeramente más electronegativo para aquellos liposomas conteniendo extractos 
bioactivos, demostrando nuevamente el efecto estabilizador de los bioactivos sobre la cápsula.  

Por otro lado, el tamaño medio y el índice de polidispersidad aumentaron considerablemente 
en todos los liposomas tras el proceso de liofilización, siendo el que contiene grasa de crustáceo 
(L‐GC) el mayor con 372,9 nm y 0,408 de polidispersidad, y el que contiene extracto polifenólico 
de piel y albedo de granada (L‐PG) el menor, con 256,8 nm y 0,279 de polidispersidad. Estos 
valores  fueron  corroborados  por  los  perfiles  de  distribución  de  tamaños, mostrados  en  las 
gráficas de la figura 41B, donde los liposomas presentaron una distribución monomodal con una 
única población de mayor tamaño que en las dispersiones frescas, salvo en los liposomas que 
contenían grasa de crustáceo (L‐GC) que mostraron una distribución bimodal con una segunda 

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Tamaño (nm)

Dispersiones liposomales

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%
)

Tamaño (nm)

Liposomas liofilizados

L‐V

L‐HC

L‐PG

L‐GC

B



Resultados 

113 
 

población de mayor  tamaño pero menor  intensidad, dando  lugar al elevado valor medio del 
índice de polidispersidad (0,408). Yang et al. (2013) obtuvieron similares resultados, observando 
un incremento del tamaño y la polidispersidad tras liofilizar los liposomas.  
 

Tabla 8. Tamaño (nm), índice de polidispersidad y potencial zeta (mV) de dispersiones liposomales frescas 
recién preparadas y conservadas a 4 °C durante 2 semanas, y de liposomas liofilizados recién preparados 
y conservados a ‐20 °C durante 7 meses, donde L‐V: liposomas vacíos; L‐HC: liposomas con hidrolizado de 
colágeno; L‐PG: liposomas con piel de granada; L‐GC: liposomas con grasa de crustáceo. Diferentes letras 
(a, b, c, d) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre liposomas para un mismo 
estado físico y tiempo de conservación; (m, n, o) en la misma fila entre tiempos de conservación para una 
misma formulación liposomal, tanto para dispersiones como para liofilizados; (x, y) en la misma fila entre 
diferentes estados físicos a tiempo 0 para una misma formulación liposomal.  
 

Dispersiones 
liposomales 

  Tiempo de conservación  

  0 semanas  1 semana  2 semanas 

Tamaño  
(nm) 

L‐V    87,4 ± 0,8a/m/x    85,7 ± 0,0a/n     86,2 ± 0,9a/mn 

L‐HC  102,3 ± 0,8b/m/x  104,2 ± 1,1b/n  104,7 ± 0,4b/n 

L‐PG  104,2 ± 0,8b/m/x  104,0 ± 0,9b/m  105,5 ± 0,8b/m 

L‐GC  102,2 ± 1,6b/m/x    105,0 ± 0,8b/mn  107,0 ± 1,7b/n 

Polidispersidad 

L‐V  0,240 ± 0,005a/m/x 0,241 ± 0,007a/m  0,230 ± 0,007a/m 

L‐HC  0,247 ± 0,019a/m/x 0,256 ± 0,007a/m   0,256 ± 0,006ab/m 

L‐PG  0,263 ± 0,017a/m/x 0,263 ± 0,008a/m  0,264 ± 0,016b/m 

L‐GC  0,246 ± 0,017a/m/x 0,254 ± 0,015a/m  0,264 ± 0,015b/m 

Potencial Z  
(mV) 

L‐V  ‐35,5 ± 1,7b/m/x   ‐38,9 ± 1,1a/mn  ‐43,7 ± 3,7a/n 

L‐HC  ‐43,4 ± 0,7a/m/x  ‐41,5 ± 1,7a/m  ‐31,7 ± 0,6c/n 

L‐PG  ‐38,2 ± 0,7b/m/x  ‐40,4 ± 1,8a/m  ‐38,8 ± 0,7b/m 

L‐GC  ‐41,9 ± 2,2a/m/x  ‐41,2 ± 0,8a/m  ‐32,9 ± 0,7c/n 
 

Liposomas 
liofilizados 

  Tiempo de conservación 

  0 meses  3 meses  7 meses 

Tamaño  
(nm) 

L‐V  316,6 ± 6,7b/m/y  261,0 ± 3,5d/n  159,0 ± 2,7a/o 

L‐HC  274,9 ± 5,5a/m/y  183,3 ± 2,0c/n  177,4 ± 2,6b/n 

L‐PG  256,8 ± 2,3a/m/y  174,5 ± 3,6b/n  178,2 ± 2,3b/n 

L‐GC    372,9 ± 15,9c/m/y  150,0 ± 0,6a/n  159,2 ± 2,4a/n 

Polidispersidad 

L‐V  0,374 ± 0,081a/m/x  0,316 ± 0,035b/m  0,368 ± 0,018b/m 

L‐HC   0,334 ± 0,033a/mn/x 0,386 ± 0,012c/m  0,311 ± 0,033a/n 

L‐PG  0,279 ± 0,021a/m/y  0,319 ± 0,021b/m  0,293 ± 0,026a/m 

L‐GC  0,408 ± 0,112a/m/x  0,264 ± 0,009a/m  0,258 ± 0,005a/m 

Potencial Z  
(mV) 

L‐V  ‐54,2 ± 1,5b/m/y   ‐47,8 ± 1,2ab/n  ‐45,5 ± 1,0a/n 

L‐HC  ‐54,9 ± 0,7b/m/y  ‐50,8 ± 1,8a/n  ‐49,8 ± 1,2b/n 

L‐PG   ‐57,2 ± 0,5ab/m/y  ‐45,2 ± 2,1b/n   ‐46,6 ± 2,1ab/n 

L‐GC  ‐59,1 ± 2,2a/m/y  ‐44,1 ± 1,1b/n   ‐47,5 ± 1,8ab/n 

 

Las pastas  liposomales  liofilizadas  (liposomas  liofilizados)  se  conservaron a  ‐20  °C durante 7 
meses, periodo durante el cual se analizaron sus características de partícula para evaluar  su 
estabilidad  (Tabla 8). El  índice de polidispersidad  se mantuvo estable  (p>0,05) durante  los 7 
meses  de  conservación  con  distribuciones monomodales  para  todos  los  liposomas,  con  la 
excepción de los liposomas que contenían grasa de crustáceo (L‐GC) que disminuyeron su valor 



Capítulo 2 

114 
 

(pasando  de  una  distribución  bimodal  a  una monomodal).  El  tamaño medio  disminuyó  sus 
valores progresivamente para los liposomas vacíos, reduciéndose hasta un ≈82 % a mitad de su 
conservación  y  un  ≈50 %  al  final  de  su  conservación, mientras  que  para  los  liposomas  con 
extractos alcanzó su talla final a los 3 meses, con un rango de valores de 150,0‐183,3 nm, muy 
similares al valor final de L‐V. A partir de este momento, el tamaño medio se mantuvo estable 
con un rango de 159,2‐178,2 nm a tiempo 7 meses.  

De igual modo sucede con el potencial zeta, que disminuye progresivamente para los liposomas 
vacíos  un  ≈11‐12  %  y  posteriormente  hasta  un  ≈16  %,  si  bien  se  mantienen  muy 
electronegativos,  mientras  que  para  liposomas  rellenos  desciende  rápidamente  en  los  3 
primeros meses, manteniéndose estable hasta el final del periodo de estudio (desde ‐46,6 hasta 
‐49,8 mV), momento en el cual  los valores se asemejaban a  los mostrados por  los  liposomas 
vacíos. Estos resultados indican que los liposomas son razonablemente estables conservados en 
congelación durante 7 meses, aunque en todos se observa un efecto de agregación inducido por 
la liofilización. Pu & Tang (2017) demostraron esta estabilidad en liposomas liofilizados durante 
4 semanas y Liu et al. (2010) en liposomas conservados durante 4 meses.  

Microscopía electrónica de transmisión a temperatura criogénica 

Mediante microscopía electrónica de transmisión por criofijación se confirmaron los resultados 
obtenidos por dispersión dinámica de luz en Zetasizer. Las dispersiones liposomales (Figura 42) 
presentaron  vesículas  unilamelares  pequeñas  de morfología  principalmente  esférica.  Estas 
vesículas mostraron un  tamaño diferente pero dentro de un  rango de  tallas similares, como 
demostraron los valores de polidispersidad. En todas las suspensiones se observa algún caso de 
configuración bivesicular o de invaginación de vesículas. 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

Figura 42.  Fotografías obtenidas mediante microscopía electrónica de  transmisión por  criofijación de 
dispersiones liposomales vacías y con extractos bioactivos recién preparadas. A) Liposomas vacíos (L‐V); 
B) Liposomas con hidrolizado de colágeno (L‐HC); C) Liposomas con piel de granada (L‐PG); D) Liposomas 
con grasa de crustáceo (L‐GC). 

(A) 

500 nm 

(B) 

500 nm

(C) 

500 nm 

(D)

500 nm



Resultados 

115 
 

Por otra parte, los liposomas liofilizados (Figura 43) mostraron vesículas de mayor tamaño y una 
distribución de tamaños más heterogénea (como mostraron los parámetros de tamaño medio y 
polidispersidad de  la  tabla 8),  incrementos debidos al proceso de  liofilización. La morfología 
permanece  mayoritariamente  esférica  aunque  se  observaron  algunas  vesículas  de  forma 
ovalada o irregular. También se apreciaron una mayor cantidad de invaginaciones y la presencia 
de  vesículas  bi  o  trilamelares  en  algunos  liposomas  conteniendo  diversos  bioactivos  y 
multilamelares en los liposomas que contienen grasa de crustáceo (L‐GC), además en este caso 
son especialmente grandes. Esta multilamelaridad fue favorecida por la naturaleza del extracto 
de grasa de crustáceo, cuya composición  lipídica permitió  la formación de varias membranas 
sobre algunas vesículas. Arranz & Corredig  (2017) obtuvieron resultados similares mostrando 
liposomas de  tamaño y morfología parecidos, algunos de ellos presentando  invaginaciones y 
otros multilamelaridad.  

  

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 43.  Fotografías obtenidas mediante microscopía electrónica de  transmisión por  criofijación de 
liposomas liofilizados vacíos y con extractos bioactivos recién preparados. A) Liposomas vacíos (L‐V); B) 
Liposomas con hidrolizado de colágeno (L‐HC); C) Liposomas con piel de granada (L‐PG); D) Liposomas con 
grasa de crustáceo (L‐GC). 

 

Eficacia de encapsulación 

La eficacia de encapsulación de los liposomas liofilizados de hidrolizado de colágeno de túnica 
de calamar (L‐HC) fue del 87,3 % (Tabla 9), valor muy superior al obtenido por Mosquera et al. 
(2016) para el mismo extracto encapsulado en  liposomas similares  (53 %). Esta diferencia se 
debió al distinto método de extracción del bioactivo (enzimas distintas) así como al diferente 
método de elaboración de los liposomas, factores que determinan una composición y estructura 
del  bioactivo  característica  y  una mayor  o menor  encapsulación  del mismo.  Este  elevada 
encapsulación se atribuye a una alta concentración de aminoácidos hidrofóbicos en el extracto 

(B) 

500 nm 

(C) 

500 nm 

(D) 

500 nm 

(A) 

500 nm 



Capítulo 2 

116 
 

(Mosquera et al., 2014). La eficacia de encapsulación para los liposomas liofilizados de piel de 
granada (L‐PG) fue del 63,2 %, muy parecida a la obtenida por Yücel & Şeker‐Karatoprak (2017) 
para liposomas incorporando ácido rosmarínico (55,6 %). Este valor fue inferior porque se trata 
de un extracto polifenólico complejo, lo que probablemente ocasiona que parte de este extracto 
no  pueda  ser  eficientemente  encapsulado.  La  eficacia  de  encapsulación  de  los  liposomas 
liofilizados de grasa de crustáceo (L‐GC) fue del 97,2 %, prácticamente idéntica a la obtenida por 
Tachaprutinuna et al. (2009) para nano‐esferas conteniendo astaxantina (98 %). Este valor se 
atribuye a la propia naturaleza lipídica del extracto de grasa de crustáceo, que se localiza dentro 
de la bicapa lipídica hidrofóbica ya que es muy poco soluble en agua. Por esta razón, cuando los 
liposomas de GC se rehidratan en agua para su caracterización, el extracto no se ve afectado y 
no sale al exterior por el efecto de dilución con el agua, permaneciendo dentro de  la bicapa, 
encapsulado prácticamente en su totalidad (Chen et al., 2010).  

La eficacia de encapsulación no varió (p≤0,05) tras la conservación de los liposomas liofilizados 
durante 7 meses a  ‐20  °C, en ninguno de  los diferentes  liposomas  rellenos con  los distintos 
bioactivos. Laverman et al. (2000) mostraron la estabilidad de liposomas liofilizados durante 1 
año.  
 

Tabla  9.  Eficacia  de  encapsulación  (%)  de  liposomas  liofilizados  con  extractos  bioactivos,  recién 
preparados y conservados a ‐20 °C durante 7 meses, donde L‐HC: liposomas con hidrolizado de colágeno; 
L‐PG: liposomas con piel de granada; L‐GC: liposomas con grasa de crustáceo. Diferentes letras (a, b) en 
la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre liposomas para un mismo tiempo de 
conservación; (m) en la misma fila entre tiempos de conservación para una misma formulación liposomal 
liofilizada. 

  
Eficacia de encapsulación (%) 

0 meses  3 meses  7 meses 

L‐HC  87,25 ± 1,97a/m  86,61 ± 5,08a/m  89,60 ± 2,20a/m 

L‐PG  63,19 ± 3,90b/m  62,88 ± 1,71b/m  62,44 ± 3,03b/m 

L‐GC  97,24 ± 0,08a/m  96,92 ± 0,00a/m  96,96 ± 0,09a/m 

 

Propiedades físicas 

Contenido en agua 

El contenido en agua de las dispersiones liposomales (Tabla 10) fue muy elevado para todas las 
muestras, con valores comprendidos entre 92‐93 %. La parte restante corresponde a materia 
seca atribuida a la fosfatidilcolina y a los extractos bioactivos encapsulados. 

El contenido en agua de  los  liposomas  liofilizados  (Tabla 10)  fue mucho menor que el de  las 
dispersiones,  con  valores  comprendidos  entre  18,5‐24,9 %,  sin  diferencias  entre  liposomas 
(p>0,05).  Ye  et  al.  (2017) mostraron  valores  de  contenidos  en  agua  inferiores  al  15 %  en 
liposomas liofilizados. Este elevado contenido en agua para las muestras liofilizadas se atribuye 
a la presencia de glicerol en las preparaciones liposomales, el cual, dada su densidad superior a 
la del agua  (1,26 g/cm3), provoca un  incremento del estado de hidratación de  las muestras 
(Manca et al., 2013), lo que da lugar a liposomas liofilizados con una textura pegajosa y grasa, 
muy diferente al típico polvo fino liofilizado con bajo contenido en agua que se presenta cuando 
carece de este compuesto. El glicerol es un reconocido crioprotector que mejora la estabilidad 
de las vesículas (Mozafari, 2005) y protege a los liposomas frente a daños ocasionados por los 
procesos de congelación y liofilización (Stark et al., 2010). Esta textura se observó claramente a 
nivel visual.  



Resultados 

117 
 

El contenido en agua de los liposomas liofilizados fue estable (p>0,05) en el tiempo durante al 
menos 7 meses (Tabla 10) para los liposomas vacíos, mientras que presentó fluctuaciones en sus 
valores para los tres tipos de liposomas conteniendo bioactivos tanto a 3 como a 7 meses. Estas 
fluctuaciones,  atribuidas  a  la  presencia  de  los  extractos  bioactivos  encapsulados  y  a  su 
interferencia con la cápsula y con el agua, fueron pequeñas y los valores finales de contenido en 
agua oscilaron entre 11,7‐18,1 % (valores cercanos a los mostrados por los liposomas vacíos). 
Estos valores  fueron  inferiores a  los  iniciales, dando a entender que se está produciendo un 
fenómeno  de  desecación  y  posterior  compactación,  como  demostraron  los  resultados  de 
Zetasizer.  

Dispersabilidad en agua 

Las dispersiones liposomales mostraron porcentajes de dispersabilidad en agua muy elevados, 
entre 74,3 y 87,6 %, indicando que la presencia de glicerol y su consecuente mayor hidratación 
no afectó negativamente a dicha propiedad. Esta dispersabilidad fue ligeramente superior para 
los liposomas rellenos con extractos que para los vacíos, indicando que los extractos bioactivos 
favorecen la dispersabilidad en agua de la cápsula, posiblemente debido a su interferencia con 
la bicapa  lipídica, ya que  las  interacciones moleculares entre  la  fosfatidilcolina y el bioactivo 
encapsulado determinan las propiedades físicas de los liposomas (Toniazzo et al., 2017). 
 

Tabla  10.  Contenido  en  agua  (%)  y  dispersabilidad  en  agua  (%)  de  dispersiones  liposomales  recién 
preparadas, y de liposomas liofilizados recién preparados y conservados a ‐20 °C durante 7 meses, donde 
L‐V: liposomas vacíos; L‐HC: liposomas con hidrolizado de colágeno; L‐PG: liposomas con piel de granada; 
L‐GC: liposomas con grasa de crustáceo. Diferentes letras (a, b, c) en la misma columna indican diferencias 
significativas (p≤0,05) entre liposomas para un mismo estado físico y tiempo de conservación; (m, n) en 
la misma fila entre tiempos de conservación para una misma formulación liposomal liofilizada; (x, y) en la 
misma fila entre diferentes estados físicos a tiempo 0 para una misma formulación liposomal. 
 

  Dispersiones  Liofilizados 

0 semanas  0 meses  3 meses  7 meses 

Contenido  
en agua (%) 

L‐V  91,97 ± 0,57a/x  18,48 ± 2,20a/m/y  16,60 ± 2,38b/m 17,06 ± 1,33a/m 

L‐HC  92,75 ± 0,27a/x  21,30 ± 1,10a/m/y  10,03 ± 2,30a/n  11,74 ± 2,29a/n 

L‐PG  92,65 ± 0,36a/x   24,39 ± 2,64a/m/y  10,27 ± 2,36a/n  15,12 ± 4,33a/n 

L‐GC  92,77 ± 0,50a/x  24,87 ± 4,55a/m/y  10,09 ± 1,78a/n  18,62 ± 4,11a/m 

Dispersabilidad 
en agua (%) 

L‐V    74,34 ± 11,49a/x  73,63 ± 2,62b/m/x  73,54 ± 0,69b/m 73,56 ± 1,77b/m 

L‐HC  87,36 ± 3,98a/x  76,45 ± 0,37b/m/y  74,51 ± 1,53b/m 87,12 ± 2,50b/n 

L‐PG  83,90 ± 3,93a/x  80,90 ± 1,66c/m/x  78,64 ± 3,59b/m   85,25 ± 13,17b/m

L‐GC  87,60 ± 3,99a/x  65,22 ± 1,33a/m/y  49,69 ± 4,19a/n   56,24 ± 5,77a/mn 

 

Los  liposomas  liofilizados mantuvieron  valores  de  dispersabilidad  significativamente  iguales 
para L‐V (73,6 %) y L‐PG (80,9 %), mientras que disminuyen (p≤0,05) para L‐HC hasta 76,5 % y 
para L‐GC hasta 65,2 %. Tras su conservación durante 7 meses en congelación, la dispersabilidad 
de  los  liposomas vacíos y de  los  liposomas de piel de granada  se mantuvo estable  (p≤0,05), 
mientras que la de los de hidrolizado de colágeno fluctúa con el tiempo hasta alcanzar a los 7 
meses  el  valor  obtenido  en  la  dispersión  fresca  inicial  (87,1 %).  Los  liposomas  de  grasa  de 
crustáceo, aparte de ser  los que más disminuyeron su valor tras ser  liofilizados, siguieron un 
comportamiento descendente con el tiempo hasta llegar a valores de 56,2 % a los 7 meses. Este 
descenso  podría  atribuirse  a  la  baja  solubilidad  en  agua  del  extracto  de  GC  y  a  la mayor 
agregación vesicular (multilamelar), la cual limita la capacidad de dispersabilidad del liofilizado. 
Peng et al. (2010) obtuvieron similares conclusiones para liposomas de astaxantina.  



Capítulo 2 

118 
 

Color 

Visualmente, los liposomas vacíos (L‐V) y con hidrolizado de colágeno (L‐HC) presentaron una 
tonalidad  amarilla‐marrón  suave,  los  liposomas  de  piel  de  granada  (L‐PG)  un  color marrón 
oscuro, y los liposomas de grasa de crustáceo (L‐GC) naranja.  

Se llevó a cabo la evaluación instrumental del color de los liposomas liofilizados (Figura 44), a 
través de  los parámetros de  cromaticidad  y  tonalidad,  así  como de  sus datos primarios del 
sistema color CIELab: L* (luminosidad), a* (intervalo rojo‐verde) y b* (intervalo amarillo‐azul). 
Los parámetros cuantitativos del sistema color CIELab confirmaron estos resultados cualitativos.  

 

Figura 44. Gráfico reflejando los parámetros de color cromaticidad y tonalidad de liposomas liofilizados 
vacíos y con extractos bioactivos recién preparados, donde L‐HC: liposomas con hidrolizado de colágeno; 
L‐PG: liposomas con piel de granada; L‐GC: liposomas con grasa de crustáceo. 

 

El  parámetro  b*  (Tabla  11),  que  representa  la  abundancia  de  color  amarillo,  fue 
significativamente mayor en L‐V (8,27) y L‐HC (10,54) que en L‐PG (5,27) y L‐GC (5,80), ya que 
estos  primeros  liposomas  presentaron  una  tonalidad  amarilla  clara.  Igual  sucede  con  el 
parámetro  L*  (luminosidad)  donde  los  liposomas  L‐V  y  L‐HC,  con  valores  de  ≈32,6,  fueron 
superiores  (p≤0,05) a L‐PG y L‐GC, puesto que una tonalidad de color más suave  implica una 
mayor claridad y por tanto luminosidad. En la figura 44 se puede apreciar como los valores de 
tonalidad  para  estos  dos  liposomas  son  relativamente  cercanos,  aunque  no  tanto  para  la 
cromaticidad. Los liposomas de piel de granada mostraron el valor significativamente más bajo 
(27,8) debido a su fuerte color marrón y su menor claridad. El parámetro a*, que representa la 
abundancia de color rojo, fue mucho mayor (p≤0,05) para los liposomas de grasa de crustáceo 
(7,1) debido a su fuerte color naranja (valor de tonalidad de 39,25 °), siendo el valor más distante 
en tonalidad de los liposomas vacíos, pero cercanos en cromaticidad, al contrario que para el 
resto de  los  liposomas. Esta coloración se corresponde con  los carotenoides presentes en el 
extracto  de GC  (Gómez‐Estaca  et  al.,  2017),  donde  los  anillos  terminales  de  la  astaxantina 
(carotenoide)  se  localizan  preferentemente  en  la  superficie  de membrana de  los  liposomas 
(Hama et al., 2012), dando lugar a esta coloración anaranjada.  

En  el  caso  de  L‐PG,  la  coloración marrón  oscura  se  atribuyó  a  la  elevada  concentración  de 
polifenoles presentes en el extracto de piel y albedo de granada (responsables de la coloración 
marrón‐morada  de  los  frutos  ricos  en  este  tipo  de  compuestos  activos). A  pesar  de  que  el 
extracto está encapsulado, la eficacia de encapsulación para estos liposomas fue del 63,2 %, lo 



Resultados 

119 
 

que indica que hay un elevado porcentaje de extracto bioactivo que se encuentra fuera de ellos 
en el espacio intervesicular, aportando esta coloración característica. El color de los liposomas 
vacíos fue correspondido con el color amarillento de la fosfatidilcolina mientras que el color de 
los liposomas de hidrolizado de colágeno fue parecido al vacío (L‐V) debido a que el extracto de 
HC,  que  posee  una  coloración  blanquecina,  no  aporta  prácticamente  color  adicional  a  los 
liposomas, confirmando su elevada eficacia de encapsulación.  
 

Tabla 11. Parámetros de color del sistema CIELab: L* (luminosidad), a* (intervalo rojo‐verde), b* (intervalo 
amarillo‐azul) de liposomas liofilizados vacíos y con extractos bioactivos recién preparados, donde L‐HC: 
liposomas con hidrolizado de colágeno; L‐PG: liposomas con piel de granada; L‐GC: liposomas con grasa 
de crustáceo. Diferentes letras (a, b, c, d) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) 
entre liposomas.  

L*(D65)  a*(D65)  b*(D65) 

L‐V  32,52 ± 0,22c 0,95 ± 0,09a    8,27 ± 0,14c 

L‐HC  32,71 ± 0,22c 3,23 ± 0,20c  10,54 ± 0,18d 

L‐PG  27,81 ± 0,22a 2,33 ± 0,07b   5,27 ± 0,27a 

L‐GC  29,06 ± 0,25b 7,10 ± 0,21d   5,80 ± 0,22b 

 

Calorimetría Diferencial de Barrido 

La  Calorimetría  Diferencial  de  Barrido  se  analizó  para  las  dispersiones  liposomales  recién 
preparadas  (Figura  45A).  Todas  las  dispersiones mostraron  un  definido  pico  endotérmico  a 
temperaturas sub‐zero (<0 °C). Dada su cercanía con el punto de fusión del agua (0 °C) y que las 
dispersiones son predominantemente acuosas  (92‐93 %), este pico endotérmico se relaciona 
con  la  fusión del agua contenida en  los  liposomas. Las dispersiones con extractos bioactivos 
presentaron esta transición de fase a una temperatura mayor (de ‐3,9 °C hasta ‐4,3 °C) que las 
dispersiones vacías (‐6,6 °C). Su valor de entalpía también fue mayor (161,8‐171,6 J/g) que en la 
dispersión vacía (120,6 J/g). Estos resultados están en concordancia con los obtenidos por Lopes 
de  Azambuja  et  al.  (2015)  para  liposomas  de  asolecitina‐genisteína,  e  indicarían  una  clara 
interferencia de los extractos bioactivos en la membrana vesicular, independientemente de la 
naturaleza de los mismos.  

L‐V  posee  un  segundo  pico  endotérmico  minoritario  (10,8  °C  y  3,0  J/g)  conocido  como                  
pre‐transición de  fase o Tg,  asociado  a un mayor ordenamiento de membrana, el  cual  está 
ausente en el resto de suspensiones, confirmando la hipótesis anterior. Esto se debe a que los 
compuestos  bioactivos  son  capaces  de  intercalarse  en  la  bicapa  lipídica  e  interferir  con  las 
cabezas  polares,  induciendo  cambios  estructurales  en  los  liposomas.  Otros  autores  ya 
describieron previamente  el efecto de desorden de membrana que ejercen  los  compuestos 
bioactivos sobre los liposomas, reflejados por la disminución de la pre‐transición Tg (Yokota et 
al., 2012) y por  la disminución de  la  temperatura media de  transición o Tm  (Nogueira et al., 
2018), que no ha sido observada en estas muestras.  

En los liposomas liofilizados (Figura 45B) se apreció un único evento endotérmico en cada una 
de las muestras. El pico de esta transición de fase fue bastante más difuso debido a la reducción 
de agua  sufrida en  la muestra, cuya ausencia dificulta  su medición. Esto dio  lugar a que  los 
valores de las entalpías asociadas a cada pico fuesen demasiado bajos (inferiores a 1 J/g) como 
para  ser  tenidos  en  cuenta  en  la  discusión.  Las  temperaturas  de  este  pico  fueron mayores 
(temperaturas >0 °C) que para las dispersiones, indicando que los liposomas en estado liofilizado 
tienen una mayor rigidez y estabilidad de membrana que las dispersiones liposomales, así como 
un mayor  y mejor  ordenamiento  de  la  bicapa  lipídica.  Esto  se  debe  a  que  el  proceso  de 



Capítulo 2 

120 
 

liofilización  provoca  una  compactación  mediante  la  eliminación  del  agua  contenida  en  la 
muestra, lo que disminuye el espacio entre las cabezas polares de los fosfolípidos de la bicapa, 
induciendo un efecto de compresión y organización de los lípidos (Koster et al., 2000).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura  45.  Termogramas  analizados  mediante  Calorimetría  Diferencial  de  Barrido  reflejando  las 
transiciones  de  fase  de  liposomas  vacíos  y  con  extractos  bioactivos  recién  preparados,  donde  L‐V: 
liposomas vacíos;  L‐HC:  liposomas  con hidrolizado de  colágeno;  L‐PG:  liposomas  con piel de granada;          
L‐GC: liposomas con grasa de crustáceo. A) Dispersiones liposomales. B) Liposomas liofilizados.  
 

Esta  mejor  estabilidad  térmica  de  los  liofilizados  fue  diferente  en  función  del  bioactivo 
incorporado.  Los  liposomas  con  extractos  de  HC  (2,0  °C)  y  PG  (1,8  °C)  mantuvieron  una 
temperatura de transición de fase inferior a la de los liposomas vacíos (4,0 °C), lo que significa 
que siguieron siendo estructuras menos ordenadas respecto a L‐V. Sin embargo, la temperatura 
de transición de los liposomas de GC fue de 11,1 °C, muy superior (p≤0,05) a la de L‐V y el resto 
de liposomas rellenos, lo que se traduce en una evidente mejor estabilidad y ordenamiento de 
membrana. Estas mejores propiedades de L‐GC se atribuyen a los compuestos liposolubles del 
extracto de GC, que fueron fuertemente embebidos en  la bicapa  lipídica contribuyendo a un 

1
W/g

2

2 L‐V

L‐HC 

L‐PG 

L‐GC 

0.02
W/g

4
20 0 20 40

L‐V

L‐HC 

L‐PG 

L‐GC 

-20                    0                      20                          40
Temperatura (°C)

En
ta
lp
ía
 (
J/
g)

 
En
ta
lp
ía
 (
J/
g)

 

A 

B 



Resultados 

121 
 

incremento  de  la  estabilidad  de  la membrana  de  los  liposomas.  En  particular,  el  colesterol 
(compuesto presente en nuestro extracto de grasa de crustáceo) es conocido por ser un agente 
activo  que  proporciona  rigidez  y  estabilidad  a  las  membranas  lipídicas  de  fosfatidilcolina 
(Sułkowski et al., 2005). Este mayor ordenamiento coincide con la mayor multilamelaridad de 
los liposomas que contienen grasa de crustáceo. 

La tabla 12 muestra los valores de los cambios de temperatura y entalpía de las transiciones de 
fase  tanto  de  las  dispersiones  como  de  los  liofilizados  conservados  en  congelación  hasta  7 
meses. Los liposomas de GC mantuvieron sus valores de temperatura de transición constantes 
durante este tiempo (p>0,05), lo que confirma su alto nivel de estructuración y estabilidad de la 
membrana.  En  contraposición,  están  los  liposomas  L‐V  y  L‐HC  que  van  disminuyendo 
progresivamente sus temperaturas con el paso del tiempo hasta llegar a valores negativos a los 
7 meses,  indicando  que  no  son muy  estables  térmicamente. Otro  caso  es  del  L‐PG,  el  cual 
disminuye drásticamente su temperatura a los 3 meses pero la vuelve a recuperar a los 7 meses, 
dando a entender que aunque recupere su valor  inicial de temperatura es una muestra algo 
inestable que sufre importantes cambios y fluctuaciones en el tiempo.  
 

Tabla  12. Cambios  de  temperatura  (T,  °C)  y  entalpía  (ΔH,  J/g)  de  las  transiciones de  fase  analizadas 
mediante  Calorimetría  Diferencial  de  Barrido  de  dispersiones  liposomales  recién  preparadas  y  de 
liposomas  liofilizados  recién preparados y conservados hasta 7 meses a  ‐20  °C, donde  L‐V:  liposomas 
vacíos; L‐HC: liposomas con hidrolizado de colágeno; L‐PG: liposomas con piel de granada; L‐GC: liposomas 
con grasa de crustáceo. Diferentes letras (a, b, c) en la misma columna indican diferencias significativas 
(p≤0,05) entre liposomas para un mismo estado físico y tiempo de conservación; (m, n) en la misma fila 
entre tiempos de conservación para una misma formulación liposomal liofilizada; (x, y) en la misma fila 
entre diferentes estados físicos a tiempo 0 para una misma formulación liposomal. 
 

    Dispersiones  Liofilizados 

  0 semanas  0 meses  3 meses  7 meses 

 
Tpico 1 
(°C) 

L‐V  ‐6,59 ± 0,20a/x    3,98 ± 1,06a/m/y 0,85 ± 0,86a/n  ‐0,53 ± 0,27a/n

L‐HC  ‐3,91 ± 0,40b/x    2,04 ± 0,00a/m/y 1,15 ± 0,92a/m  ‐1,30 ± 0,48a/n

L‐PG    ‐4,24 ± 0,66ab/x   1,76 ± 0,47a/m/y 0,48 ± 0,08a/n   1,66 ± 0,00b/m

L‐GC    ‐4,29 ± 0,35ab/x 11,05 ± 0,93b/m/y 9,69 ± 0,38b/m 10,19 ± 0,13c/m

 
Entalpía 
(J/g) 

L‐V  120,6 ± 0,64a ‐  ‐  ‐ 
L‐HC  171,6 ± 0,07b ‐  ‐  ‐ 
L‐PG  161,8 ± 4,38b ‐  ‐  ‐ 
L‐GC  166,8 ± 3,81b ‐  ‐  ‐ 

 

Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier 

La  figura  46  muestra  las  frecuencias  más  representativas  obtenidas  de  la  Espectroscopía 
Infrarroja con Transformada de Fourier de los liposomas liofilizados.  

Las variaciones a ≈2925 cm‐1 y ≈2850 cm‐1, relacionadas respectivamente con las vibraciones de 
los grupos CH2 asimétricos y simétricos, representan  los cambios que suceden en  las cadenas 
hidrocarbonadas de la bicapa lipídica. Ambas frecuencias siguieron el mismo patrón, por lo que 
se muestran únicamente  las de 2925 cm‐1  (Figura 46A). Las  frecuencias a  ≈2925 cm‐1 fueron 
idénticas para los liposomas recién liofilizados L‐V, L‐HC y L‐PG, mientras que disminuyeron para 
L‐GC. Este menor valor en L‐GC indica una menor movilidad de las cadenas hidrocarbonadas de 
los fosfolípidos y por tanto una mayor rigidez en el interior de la bicapa como consecuencia de 
la naturaleza lipofílica del extracto de GC, cuyas interacciones hidrofóbicas con las cadenas acilo 
de  la  membrana  dan  lugar  a  un  fenómeno  de  ordenamiento.  Toyran  &  Severcan  (2003) 
extrajeron  similares  conclusiones para  liposomas  con  el  compuesto hidrofóbico  vitamina D. 



Capítulo 2 

122 
 

Estas conclusiones estuvieron en concordancia con las observadas en calorimetría. Los picos de 
frecuencia  correspondientes a  los grupos  funcionales CH2 disminuyeron a periodos de 3 y 7 
meses,  indicando un  incremento en  la rigidez de  la membrana y una mejor estabilidad con el 
paso del  tiempo.  Este hecho  coincide  con  la  reducción del  tamaño medio de  los  liposomas 
liofilizados observada en Zetasizer cuando son conservados en el tiempo.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 46. Espectro Infrarrojo con Transformada de Fourier de liposomas liofilizados vacíos y con extractos 
bioactivos recién preparados y conservados hasta 7 meses a ‐20 °C, donde L‐V: liposomas vacíos; L‐HC: 
liposomas con hidrolizado de colágeno; L‐PG: liposomas con piel de granada; L‐GC: liposomas con grasa 
de  crustáceo.  A)  Vibraciones  de  estiramiento  de  los  grupos  CH2  asimétricos.  B)  Vibraciones  de 
estiramiento de los grupos C=O. C) Vibraciones de estiramiento de los grupos PO2

‐ asimétricos de doble 
enlace.  

 

Las variaciones de frecuencia en ≈1740 cm‐1 (Figura 46B) están relacionadas con las vibraciones 
de  los  grupos  funcionales  C=O,  que  reflejan  cambios  estructurales  asociados  al  estado  de 
hidratación de los grupos carbonilo de la parte interfacial de la membrana (Toyran & Severcan, 

2922

2922,5

2923

2923,5

2924

L‐V L‐HC L‐PG L‐GC

cm
‐1

0 m

3 m

7 m

A

1736

1737

1738

1739

1740

L‐E L‐HC L‐PG L‐SL

cm
‐1

0 m

3 m

7 m

L‐V               L‐HC             L‐PG          L‐GC

B 

1214

1218

1222

1226

L‐E L‐HC L‐PG L‐SL

cm
‐1

0 m

3 m

7 m

L‐V               L‐HC            L‐PG           L‐GC

C 



Resultados 

123 
 

2003). Únicamente los liposomas L‐HC presentaron cambios a esta frecuencia con respecto a los 
liposomas L‐V. Este cambio (un ligero descenso de la frecuencia) demuestra que existe una cierta 
interacción entre el extracto bioactivo (HC) y los grupos carbonilo de la cápsula. El hidrolizado 
de  colágeno es un extracto  complemente  soluble en agua, por  lo que  se presupone que  su 
localización dentro de los liposomas será preferentemente en el núcleo acuoso. Sin embargo, 
los péptidos  incorporados en  liposomas  tienden a  localizarse cerca de  la  región polar de  los 
fosfolípidos, orientados paralelamente a la superficie de membrana (Ringstad et al., 2008; Orädd 
et al., 2011),  lo que significa que  la mayor parte del péptido (HC) estaría situada en el núcleo 
acuoso cerca de  la parte  interfacial de  la bicapa, facilitando así su  interacción con  los grupos 
carbonilo de ésta. La conservación en congelación de L‐PG y L‐GC mostró un descenso de  la 
frecuencia, lo que podría indicar una deshidratación de los grupos carbonilo como consecuencia 
de  interacciones  de  estos  bioactivos  con  la membrana. Mientras  que  L‐HC  no  experimentó 
cambios con el tiempo, L‐V también sufrió un descenso de la frecuencia a partir de los 3 meses 
de conservación, lo que indicaría que la deshidratación de este grupo funcional también podría 
ser  el  resultado  de  cambios  estructurales  intrínsecos  de  la  propia  membrana, 
independientemente de la presencia o no de bioactivo encapsulado.  

Las  variaciones  de  frecuencia  a  ≈1220  cm‐1,  relacionadas  con  las  vibraciones  de  los  grupos 
funcionales PO2

‐ asimétricos, dan información sobre los grupos asociados a las cabezas polares 
de  los  fosfolípidos de  la membrana  (Figura 46C). El aumento de  frecuencia por parte de  los 
liposomas con bioactivos respecto a los vacíos indica una reducción del estado de hidratación 
de  los grupos  fosfato en  los  liposomas  rellenos como  resultado de su  fuerte  interacción por 
puentes de hidrógeno con los extractos bioactivos. Lopes de Azambuja et al. (2015) obtuvieron 
similares resultados para liposomas de genisteína liofilizados. Este incremento fue diferente en 
función del bioactivo encapsulado, en orden creciente L‐HC, L‐PG y L‐GC. Esto demuestra una 
mayor interacción del extracto de GC con los grupos fosfato que el resto de extractos, lo que 
desemboca  en  un  mayor  estado  de  deshidratación  de  dichos  grupos  y  en  una  mayor 
compactación/agregación de  los  liposomas L‐GC. Esta afirmación concuerda con sus menores 
valores de dispersabilidad en agua, dando a entender que su grado de agregación es mayor que 
en el resto de  liposomas. Tras  la conservación en congelación, L‐GC disminuye sus valores de 
frecuencia en contraposición a L‐V y L‐HC que los aumentan a partir de los 3 meses, mientras 
que en el caso de L‐PG sucede a partir de los 7 meses. Esto significa que la gran rigidez inicial de 
la  bicapa  de  los  liposomas  de  GC  y  su  fuerte  interacción  con  las  cabezas  polares  de  los 
fosfolípidos probablemente restringen futuros cambios conformacionales en el tiempo, dándole 
una mayor estabilidad. 

Reología dinámica oscilatoria 

El espectro mecánico, ajustado al modelo de la ley de la potencia (R2>0,99), representando los 
módulos elástico (G´) y viscoso (G´´) de los liposomas recién liofilizados en función de un barrido 
de frecuencias que abarca desde 0,1 Hz hasta 10 Hz y temperatura constante (10 °C), se muestra 
en la figura 47.  

Todos  los espectros presentaron mayores  valores de G´´  (viscoso) que de G´  (elástico)  y un 
ángulo  de  fase  >45  °,  lo  que  quiere  decir  que  los  liposomas  liofilizados  mostraron  un 
comportamiento predominantemente viscoelástico más típico de un fluido altamente viscoso 
que de un material sólido. Este comportamiento se atribuye al efecto plastificante del glicerol 
incorporado en todas las preparaciones liposomales. 

 

 

 



Capítulo 2 

124 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura  47.  Espectros mecánicos  en  función  de  un  barrido  de  frecuencias  desde  0,1  hasta  10  Hz  a 
temperatura  constante  de  10  °C  de  los  liposomas  liofilizados,  donde  L‐V:  liposomas  vacíos;  L‐HC: 
liposomas con hidrolizado de colágeno; L‐PG: liposomas con piel de granada; L‐GC: liposomas con grasa 
de crustáceo. A) Módulo elástico (G´, Pa). B) Módulo viscoso (G´´, Pa). 
 

Los parámetros viscoelásticos (G´, G´´ y δ) a 1 Hz y el valor del exponente n´ (obtenido del ajuste 
del espectro mecánico de G´ a la ecuación de la ley de la potencia) se presentan en la figura 48. 
Recién elaborados, los liposomas con bioactivos mostraron mayores valores tanto de G´ como 
de G´´ respecto a  los vacíos, sin cambios significativos en el ángulo de fase (siempre superior 
para G´´). Estos resultados indican que la adición del extracto bioactivo no modifica el carácter 
viscoelástico de  los  liposomas  y que  los  liofilizados  rellenos  fueron más  consistentes que  el 
liofilizado vacío. Este efecto se debió a las interacciones de los componentes bioactivos con los 
grupos de las cabezas polares de los fosfolípidos de membrana.  

El valor de la ley de la potencia refleja la estabilidad estructural de una matriz y cuanto mayor 
es su valor, menor es la estabilidad de la matriz frente a cambios de frecuencia. Mientras que   
L‐GC mostró el menor valor de n´ y por tanto una mayor estabilidad (resultado que concuerda 
con los obtenidos en calorimetría y espectroscopía infrarroja), L‐PG fue el que obtuvo el mayor 
valor de n´ y la mayor inestabilidad, coincidiendo con un mayor valor de G´´. Este efecto podría 
atribuirse a la baja eficacia de encapsulación de L‐PG (63,2 %) respecto al resto de liposomas, 
cuyos  compuestos  mayoritariamente  polifenólicos  no  encapsulados  harían  de  obstáculo  y 
dificultarían las interacciones del extracto con la bicapa y de las bicapas entre sí, reduciendo la 
estabilidad de la matriz. Estos resultados están en concordancia con la mayor dispersabilidad en 
agua encontrada para  los  liposomas de piel de granada,  la  cual es  indicativa de una menor 
compactación/agregación y por tanto menor estabilidad.  

 

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

0 1 10

G
' (
P
a)

Frecuencia (Hz)

L‐E

L‐HC

L‐PG

L‐SL

A L‐V 
L‐HC 
L‐PG 
L‐GC 

B 

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

0 1 10

G
'' 
(P
a)

Frecuencia (Hz)

L‐E
L‐HC
L‐PG
L‐SL

B L‐V 
L‐HC 
L‐PG 
L‐GC 



Resultados 

125 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 48. Parámetros viscoelásticos a frecuencia 1 Hz y temperatura 10 °C de liposomas liofilizados vacíos 
y con extractos bioactivos recién preparados y conservados hasta 7 meses a ‐20 °C, donde L‐V: liposomas 
vacíos; L‐HC: liposomas con hidrolizado de colágeno; L‐PG: liposomas con piel de granada; L‐GC: liposomas 
con grasa de crustáceo. A) Módulo elástico (G´, kPa). B) Módulo viscoso (G´´, kPa). C) Ángulo de fase (δ, 
°). D) Exponente de la ley de la potencia (n´).  
 

Los liposomas liofilizados conservados en congelación, con excepción de los encapsulados con 
extracto de piel y albedo de granada (L‐PG), mostraron un notable aumento de sus valores a        
1 Hz de G´ y G´´ a los 7 meses, lo que se traduce en un incremento de la dureza o consistencia 
de la matriz con el transcurso del tiempo, resultados que coinciden con el aumento de la rigidez 
de membrana  en  el  tiempo  observados mediante  espectroscopía  infrarroja.  Entre  ellos,  los 
liposomas vacíos  (L‐V)  fueron  los que más aumentaron, y como consecuencia mayor dureza 
experimentaron. En el caso de L‐PG, no se observa endurecimiento de  la matriz (sin cambios 
significativos en G´ y G´´) probablemente debido a su elevada  inestabilidad. En cambio, sí se 
apreció un destacado decremento en sus valores de ángulo de fase y ley de la potencia al final 
del periodo de conservación, lo que sugiere un ligero incremento de su estabilidad.  

Los  espectros de  temperatura de  los módulos  elástico  (G´)  y  viscoso  (G´´) de  los  liposomas 
liofilizados desde 20 °C hasta 90 °C a frecuencia constante (1 Hz) se muestran en la figura 49.  
 

0

5

10

15

20

25

30

35

40

L‐E L‐HC L‐PG L‐SL

G
' (
kP
a)

0 month

7 month

0 meses 
7 meses 

L‐V          L‐HC          L‐PG        L‐GC
0

5

10

15

20

25

30

35

40

L‐E L‐HC L‐PG L‐SL

G
´´
(k
P
a)

0 month

7 month
0 meses 
7 meses 

L‐V         L‐HC        L‐PG       L‐GC

0

10

20

30

40

50

60

70

L‐E L‐HC L‐PG L‐SL

δ
(°
)

0 month

7 month

0 meses 
7 meses 

L‐V          L‐HC         L‐PG        L‐GC
0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

L‐E L‐HC L‐PG L‐SL

n
'

0 month

7 month

0 meses
7 meses 

L‐V          L‐HC       L‐PG       L‐GC

A B 

C D 



Capítulo 2 

126 
 

 
 

 
 

 

 

Figura 49. Comportamiento viscoelástico en  función de un barrido de  temperatura desde 20  °C hasta        
90 °C a frecuencia constante de 1 Hz de  liposomas  liofilizados vacíos y con extractos bioactivos recién 
preparados y conservados hasta 7 meses a  ‐20  °C. A) Módulo elástico  (G´, kPa)  recién preparados. B) 
Módulo viscoso (G´´, kPa) recién preparados. C) Módulo elástico (G´, kPa) a 7 meses. D) Módulo viscoso 
(G´´, kPa) a 7 meses. 

0

5

10

15

0 20 40 60 80 100

G
' (
K
P
a)

Temperatura (ᵒC)

L‐V

L‐HC

L‐PG

L‐GC

A

0

5

10

15

0 20 40 60 80 100

G
'' 
(K
P
a)

Temperatura (ᵒC)

L‐V

L‐HC

L‐PG

L‐GC

B

0
5

10
15
20
25
30
35

0 20 40 60 80 100

G
´
(K
P
a)

Temperatura (°C)

L‐V

L‐HC

L‐PG

L‐GC

C

0

5
10
15

20
25
30
35

0 20 40 60 80 100

G
´´
(K
P
a)

Temperatura (°C)

L‐V

L‐HC

L‐PG

L‐GC

D



Resultados 

127 
 

En los liposomas recién liofilizados, con excepción de L‐GC, todas las muestras presentaron una 
disminución progresiva y constante de sus valores de G´ y G´´ con el aumento gradual de  la 
temperatura,  dando  lugar  a  una  pérdida  de  consistencia  de  la  matriz.  Tan  et  al.  (2013) 
obtuvieron resultados parecidos para liposomas de fosfatidilcolina a partir de yema de huevo 
cuando  éstos  superaron  los  50  °C  de  temperatura.  Este  fenómeno,  desencadenado  por  el 
aumento de la temperatura, fue consecuencia de la rotura de las interacciones responsables de 
la fuerzas de adhesión entre los lípidos adyacentes a la bicapa y entre los lípidos internos de la 
bicapa (Augustyńska et al., 2016). 

En el  caso de L‐GC, mientras que el módulo viscoso  (G´´)  sufre un  ligero descenso hasta  los            
66 °C, momento en el que se estabiliza, el módulo elástico (G´) se mantiene estable hasta que 
experimenta  un  pronunciado  y  continuo  incremento  a  partir  de  los  40  °C  hasta  los  90  °C, 
indicando que se ha producido la formación de una fuerte estructura tipo gel inducida por calor. 
Augustyńska  et  al.  (2016)  obtuvieron  similares  resultados  para  liposomas  incorporando                  
β‐caroteno. Este incremento se atribuyó al extracto de GC, cuya naturaleza lipofílica favoreció 
la resistencia a la ruptura de enlaces por altas temperaturas y favoreció la estabilización de la 
membrana. Además, tiene lugar la formación de interacciones hidrofóbicas termoestables entre 
la membrana  lipídica y  las moléculas hidrofóbicas del extracto de GC,  las cuales restringen  la 
movilidad de los lípidos y de este modo mejoran la rigidez y estabilidad de la membrana (Tan et 
al., 2013), permitiendo la formación de esta estructura tipo gel.  

El  comportamiento  térmico  durante  la  conservación  de  estos  liposomas  liofilizados  fue 
exactamente  el mismo  transcurridos  7 meses,  con  la  diferencia  de  que  los  fenómenos  de 
descenso y aumento de G´ y G´´ de todas las muestras fueron más marcados y los valores de los 
módulos elástico y viscoso  fueron  superiores a  los de  los  liposomas  recién  liofilizados. Estos 
resultados  indican que durante  la  conservación  se produjo un  incremento de  las  fuerzas de 
adhesión entre lípidos y un aumento de la rigidez de membrana, pero los liposomas L‐V, L‐HC y 
L‐PG  siguieron  siendo  susceptibles  de  rotura  de  enlaces  y  debilitamiento  de  su  estructura, 
mientras que L‐GC siguió siendo susceptible de la formación de interacciones hidrofóbicas que 
den lugar a la obtención de una estructura fuerte tipo gel, incluso con mejores propiedades que 
las obtenidas con los liposomas L‐GC recién liofilizados.  

Efecto oxidativo 

El efecto oxidativo de los liposomas liofilizados se determinó mediante la medida de sustancias 
reactivas  al  ácido  tiobarbitúrico, mostrada  en  la  tabla  13.  El  contenido  de  equivalentes  de 
malonaldehído en la fosfatidilcolina fue de 22,6 ± 0,9 µg/kg, valor superior al obtenido para las 
dispersiones liposomales (8,2‐18,4 µg/kg). Este menor valor para las dispersiones podría indicar 
que  la  formación de  la bicapa  lipídica durante el proceso de elaboración de  liposomas está 
limitando la interacción con las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico o que la conformación 
de  liposomas  está  limitando  la  interacción,  y  por  ello  sus  valores  son menores  a  los  de  la 
fosfatidilcolina. Estos resultados indican que, aparte de que todos los valores fueron muy bajos 
(y por tanto la oxidación fue mínima), no hubo una acumulación perceptible de productos de 
oxidación lipídica tras el proceso de preparación de liposomas. Esto podría ser debido al efecto 
antioxidante  proporcionado  tanto  por  el  contenido  intrínseco  de  α‐tocoferol  en  la 
fosfatidilcolina como por  los diferentes extractos bioactivos en el caso de  los  liposomas con 
bioactivos.  

En cuanto a los liposomas liofilizados, el contenido en malonaldehído se incrementó (p≤0,05) en 
todas las muestras tras el proceso de liofilización, y con él, la susceptibilidad de ser oxidados, 
probablemente como consecuencia de diferentes cambios conformacionales y estructurales en 
la bicapa  lipídica ocasionados por el estrés  infligido por  la  liofilización. Estos cambios podrían 
incrementar la exposición de los compartimentos hidrofóbicos de la bicapa al medio ambiente, 
y se sabe que los radicales libres y el oxígeno son más solubles en el fluido de la bicapa lipídica 



Capítulo 2 

128 
 

(zona hidrofóbica) que en solución acuosa. De hecho, acorde a Guner & Oztop (2017), el buffer 
fosfato (medio en el que se prepararon los liposomas) contiene iones fosfato dihidrógeno, los 
cuales se conocen por disminuir la solubilidad del oxígeno y aumentar la oxidación liposomal. 
De  este  modo,  la  concentración  de  oxígeno  en  la  fase  orgánica  de  la  membrana  tras  la 
rehidratación, debida a una mayor interacción del oxígeno y de los radicales libres con la bicapa 
de  los  liposomas  (dada  su  buena  afinidad  por  la  zona  hidrofóbica  expuesta  de  la  bicapa), 
produciría una mayor oxidación lipídica (Pamplona, 2008). A pesar de este aumento, los valores 
de malonaldehído fueron considerablemente bajos (46,6‐81,8 µg/kg).  
 

Tabla  13.  Oxidación  lipídica  (µg  MDA/kg  muestra  seca)  analizada  mediante  el  índice  del  ácido 
tiobarbitúrico  de  dispersiones  liposomales  recién  preparadas  y  de  liposomas  liofilizados  recién 
preparados y conservados durante 7 meses a ‐20 °C, donde L‐V: liposomas vacíos; L‐HC: liposomas con 
hidrolizado de colágeno; L‐PG: liposomas con piel de granada; L‐GC: liposomas con grasa de crustáceo. 
Diferentes  letras  (a,  b,  c,  d)  en  la  misma  columna  indican  diferencias  significativas  (p≤0,05)  entre 
liposomas para un mismo estado físico y tiempo de conservación; (m, n, o) en la misma fila entre tiempos 
de conservación para una misma formulación liposomal liofilizada; (x, y) en la misma fila entre diferentes 
estados físicos a tiempo 0 para una misma formulación liposomal. 
 

  Dispersiones  Liofilizados 

0 semanas  0 meses  3 meses  7 meses 

L‐V  8,22 ± 1,94a/x  81,8 ± 3,56a/m/y  65,2 ± 1,29a/n  38,5 ± 0,70a/o 

L‐HC  18,4 ± 2,10c/x  69,2 ± 2,97b/m/y  44,2 ± 1,25b/n  32,3 ± 1,30b/o 

L‐PG    9,80 ± 0,00ab/x  46,6 ± 2,86d/m/y  24,7 ± 5,89d/n  23,5 ± 1,23c/n 

L‐GC  12,4 ± 1,05b/x  58,5 ± 4,74c/m/y  33,3 ± 4,31c/n  15,5 ± 0,29d/o 
 

Entre  los  diferentes  liposomas  liofilizados,  los  vacíos  fueron  los  que  presentaron  un mayor 
contenido  en malonaldehído  (p≤0,05)  con  un  valor  de  81,8  µg/kg,  lo  que  significa  que  los 
extractos  bioactivos  encapsulados  están  ejerciendo  su  poder  antioxidante  y  previniendo  la 
oxidación lipídica cuando los liposomas son liofilizados. Esta inhibición de la peroxidación lipídica 
podría ser consecuencia de la combinación de dos mecanismos. Por un lado, por las propiedades 
antioxidantes  intrínsecas  de  los  propios  bioactivos  y  por  otro,  por  sus  efectos  sobre  las 
propiedades de la membrana mediante la limitación de la penetración de oxígeno en la bicapa 
lipídica (Tan et al., 2013). Entre liposomas con bioactivos, L‐PG fue el que más (p≤0,05) previno 
la oxidación (46,6 µg/kg), seguido por L‐GC (58,5 µg/kg) y finalmente L‐HC (69,2 µg/kg) (p≤0,05), 
que si bien son significativos, son valores que se encuentran cercanos. Esto se debe a que los 
tres extractos bioactivos tienen capacidad antioxidante, siendo la piel de granada debido a sus 
compuestos  polifenólicos  (Masci  et  al.,  2016)  y  la  grasa  de  crustáceo  por  su  contenido  en 
astaxantina y α‐tocoferol (Gómez‐Estaca et al., 2017) los que más poder antioxidante tienen y 
mejor  previenen  la  oxidación  de  los  liposomas.  Tras  la  conservación  en  el  tiempo  de  los 
liposomas liofilizados, todos disminuyeron significativamente sus valores de malonaldehído tras 
3  y  7 meses  en  congelación,  llegando  a  valores  finales muy  variables  (comprendidos  entre      
15,5‐38,5 µg/kg), donde los liposomas vacíos continuaron siendo los más oxidados (38,5 µg/kg, 
p≤0,05) y los liposomas de grasa de crustáceo los que menos (15,5 µg/kg, p≤0,05), seguidos por 
los liposomas de piel de granada (23,5 µg/kg). Estos resultados podrían ser indicativos de una 
inestabilidad oxidativa lipídica.  

Existe una gran variedad de productos de oxidación de fosfolípidos que son generados durante 
la peroxidación  lipídica de ácidos grasos poliinsaturados (Catalá, 2009) y muchos de ellos son 
muy reactivos y altamente inestables. La interacción de estos compuestos oxidativos altamente 
inestables con los fosfolípidos podría explicar el descenso en la cuantificación de malonaldehído, 
ocasionado por una inestabilidad en la formación y transformación de compuestos de oxidación 
de unos a otros. La espectroscopía infrarroja (Figura 46) demuestra esta oxidación lipídica de los 



Resultados 

129 
 

liposomas, donde el continuo decremento en la intensidad de la absorbancia para la región entre 
3600‐3100  cm‐1  junto  con  el  incremento  de  la  absorbancia  y  de  la  amplitud  de  la  banda  a         
1740 cm‐1 (marcador de la formación de productos de oxidación lipídica en liposomas, acorde a 
Lamba  et  al.,  1991)  en  el  tiempo,  son  indicativos de una descomposición progresiva de  los 
hidroperóxidos  para  producir  aldehídos  y  cetonas,  productos  de  oxidación  secundaria  que 
desencadenan la oxidación lipídica.  

Conclusiones 

El  proceso  de  liofilización  causó  cambios  estructurales  en  la membrana  de  la  bicapa  que 
dependen  de  la  naturaleza  química  del  compuesto  encapsulado  y  de  su  eficacia  de 
encapsulación, ya que ésta se relaciona con la posible localización de los extractos fuera de los 
liposomas.  La  encapsulación  de  varios  extractos  bioactivos  en  liposomas  no  afectó 
negativamente  a  la  estabilidad mecánica  de  las  pastas  de  liposomas  liofilizados  durante  su 
conservación y previno la oxidación lipídica. Los liposomas rellenos con compuestos lipofílicos 
experimentaron un fuerte efecto de rigidez inducido por calor, el cual debería tenerse en cuenta 
en  alimentos  que  lleven  asociado  un  tratamiento  térmico  en  su  procesado.  Los  liposomas 
liofilizados con compuestos bioactivos podrían servir como  ingredientes potenciales con una 
elevada estabilidad de conservación para el diseño de productos alimentarios funcionales con 
un contenido en agua bajo o intermedio. Para evitar la inestabilidad oxidativa de los liposomas 
liofilizados, se pueden llevar a cabo varias estrategias, tales como la optimización del proceso 
de liofilización o la estabilización de la membrana con antioxidantes anfipáticos.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Resultados 

131 
 

8.3. ENCAPSULACIÓN DE EXTRACTOS ANTIOXIDANTES ACUOSOS Y ETANÓLICOS DE HINOJO 
MARINO  (CRITHMUM  MARITIMUM)  EN  LIPOSOMAS  DE  FOSFATIDILCOLINA  DE  SOJA 
LIOFILIZADOS  

Resumen 

Se  elaboraron  liposomas  de  fosfatidilcolina  de  soja  incorporando  glicerol  y  dos  extractos 
antioxidantes  (acuoso  y  etanólico)  de  hinojo  marino  (Crithmum  maritimum),  a  diferentes 
concentraciones de bioactivo (8, 16, 32 y 64 %, expresado como proporción de bioactivo con 
respecto  a  la  cantidad  de  fosfatidilcolina)  y  posteriormente  se  liofilizaron.  De  ambas 
preparaciones  liposomales  (con  ambos  tipos de  extracto)  se  estudiaron  sus propiedades de 
partícula,  dispersabilidad  en  agua,  color,  propiedades  térmicas  y  capacidad  antioxidante 
mediante diversos métodos  (capacidad de  secuestro de  radicales  libres, poder  reductor del 
hierro y contenido total de fenoles). Ambos extractos de hinojo fueron ricos en ácido clorogénico 
(42,61 mg/g para el extracto acuoso y 58,48 mg/g para el extracto etanólico) y mostraron una 
excelente  capacidad  antioxidante,  siendo  ésta  mayor  para  el  extracto  etanólico  a  mayor 
concentración de bioactivo. Se detectaron otros compuestos minoritarios que fueron Vitamina 
C en el extracto acuoso, y  rutina y ácido  rosmarínico en el extracto etanólico. El proceso de 
liofilización provocó un incremento del tamaño de partícula y del índice de polidispersidad de 
todas las dispersiones, mientas que el potencial zeta se volvió más electronegativo, aumentando 
la  estabilidad  de membrana.  La  eficacia  de  encapsulación  de  los  liposomas  varió  según  la 
proporción de bioactivo a encapsular. Así, con 64 % de concentración de bioactivo la eficacia de 
encapsulación fue del 65,6 % y del 49,1 % para  los extractos acuoso (L‐HM‐ac 64) y etanólico    
(L‐HM‐et 64),  respectivamente,  si bien  es  similar  la  cantidad de  extracto  encapsulada  en  el 
interior  de  los  liposomas  (11,1 %  para  L‐HM‐ac  64  y  11,9 %  para  L‐HM‐et  64)  y  lo  que  les 
diferencia es la cantidad de extracto adherido a la superficie de los liposomas.  

Palabras clave: hinojo marino, ácido clorogénico, fosfatidilcolina de soja, liposomas, liofilización, 
actividad antioxidante.  

Introducción 

Las necesidades y preferencias de  los consumidores cambian continuamente con el tiempo y 
actualmente existe una creciente demanda de productos alimentarios funcionales priorizando 
los beneficios en la salud y prevención de enfermedades frente a los productos de fácil y rápida 
ingesta. El uso preferencial de compuestos bioactivos saludables a partir de fuentes naturales 
como  ingredientes  alimentarios  es  uno  de  los  objetivos  actuales  de  las  industrias  de 
alimentación. Además, el empleo de materias primas residuales o infrautilizadas como fuente 
de moléculas activas proporciona un alto valor añadido y mejora  la sostenibilidad del medio 
ambiente.  

El hinojo marino (Crithmum maritimum), también conocido como perejil marino, es una planta 
halófila comestible muy abundante en las costas del Mar Mediterráneo y del Océano Atlántico. 
Esta especie es muy rica en compuestos fenólicos con reconocidas y remarcables propiedades 
antioxidantes (Siracusa et al., 2011), tales como ácido clorogénico (compuesto mayoritario) y 
ácidos  hidroxicinámicos  (Nabet  et  al.,  2017).  El  hinojo  marino  se  considera  una  planta 
infrautilizada e infravalorada, cuyo cultivo comercial aún no se ha explotado (Pavela et al., 2017; 
Renna et al., 2017).  

Los compuestos naturales antioxidantes se pueden incluir en el diseño de alimentos funcionales 
para prevenir enfermedades  relacionadas  con el estrés oxidativo,  tales  como enfermedades 
cardiovasculares, neurodegenerativas, diabetes o cáncer (Pham‐Huy et al., 2008). Sin embargo, 
su efectividad puede verse afectada por  su  interacción  con  los  componentes alimentarios o 



Capítulo 2 

132 
 

degradada por el procesamiento industrial. Su encapsulación en liposomas podría ofrecer una 
solución  potencial  para mejorar  su  estabilidad  protegiéndolos  de  condiciones  extremas  de 
temperatura  o  pH,  o  elevadas  concentraciones  de  iones  (Mozafari  et  al.,  2008),  y  también 
permitiría una liberación más efectiva del bioactivo en el sitio diana disminuyendo su toxicidad 
(Sercombe et al., 2015). El efecto de los compuestos fenólicos sobre las propiedades de vesículas 
y sobre los cambios estructurales de la membrana podría estar influenciado por la composición 
de fenoles y de fosfolípidos (Popova & Hincha, 2016; Lopes de Azambuja et al., 2015).  

Los extractos bioactivos son comúnmente extraídos con solventes orgánicos, ya que este tipo 
de extracción permite una buena exposición y predisponibilidad de los compuestos bioactivos 
de un material.  Las  características y propiedades de  los  liposomas vienen determinadas por 
multitud  de  factores,  como  son  el método  y  condiciones  de  elaboración,  la  composición  y 
proporciones de lípidos empleados en la formulación, la adición y tipos de crioprotectores, etc. 
(Liu et al., 2010). Uno de los posibles factores determinantes podría ser la cantidad de bioactivo 
encapsulada.  

Objetivos 

El  segundo  objetivo  parcial  de  este  capítulo  fue  el  aprovechamiento  de  una materia  prima 
infrautilizada de bajo coste con excelentes propiedades  funcionales para  la obtención de un 
producto alimentario natural y  saludable con un alto valor añadido. Para ello  se prepararon 
liposomas  de  fosfatidilcolina  de  soja  liofilizados,  incorporando  dos  extractos  antioxidantes 
(acuoso  y  etanólico)  procedentes  de  tallos  y  hojas  de  hinojo  marino,  a  diferentes 
concentraciones de bioactivo, y se caracterizaron sus propiedades hidrodinámicas, estructurales 
y antioxidantes.  

Materiales y métodos 

Inicialmente, se extrajo  fosfatidilcolina parcialmente purificada de cinco  lavados con acetona 
(FC5) a partir de lecitina de soja (LS), y se obtuvieron los extractos de hinojo marino (acuoso y 
etanólico).  

De  ambos  extractos  se  caracterizó  el  contenido  en  agua,  su  contenido  proteico  total,  su 
composición  de  compuestos  bioactivos  principales,  su  citotoxicidad  in  vitro  y  su  capacidad 
antioxidante.  Además,  los  extractos  (acuoso  y  etanólico)  se  trataron  de manera  similar  al 
procesado que  sufre el  liposoma y  se  caracterizaron en  términos de  composición química y 
actividad antioxidante.  

Los estándares usados para la caracterización de los polifenoles presentes en el hinojo marino 
fueron:  ácido  clorogénico,  ácido  rosmarínico,  ácido  cumárico,  ácido  ferúlico,  ácido  siríngico, 
vitamina  C,  ácido  gálico,  ácido  elágico,  ácido  cafeico,  punicalagina,  quercetina,  rutina, 
epigalocatequina,  epigalocatequina3‐galato,  epigalocatequina  galato,  hiperósido  y    
kaempferol‐3‐O‐glucósido.   

Seguidamente, se prepararon dispersiones liposomales con fosfatidilcolina (FC5) como material 
encapsulante y glicerol, encapsulando dos extractos bioactivos (acuoso y etanólico) de hinojo 
marino, con algunas modificaciones respecto a los de diseños experimentales anteriores. Estas 
variaciones  consistieron en  la  concentración de bioactivo añadida a  la dispersión  liposomal, 
siendo en este caso concentraciones variables: 8, 16, 32 y 64 % para ambos extractos. De este 
modo, se obtuvieron un total de 8 liposomas: L‐HM‐ac 8, L‐HM‐ac 16, L‐HM‐ac 32, L‐HM‐ac 64, 
L‐HM‐et  8,  L‐HM‐et  16,  L‐HM‐et  32  y  L‐HM‐et  64.  De  estas  dispersiones  se  analizaron  sus 
características de partícula mediante dispersión dinámica de luz en Zetasizer (dilución 1/10).  



Resultados 

133 
 

Dichas  dispersiones  se  liofilizaron  y  se  estudiaron  sus  características  de  partícula mediante 
dispersión dinámica de luz en Zetasizer (77 mg/mL y posterior dilución 1/10), así como la eficacia 
de encapsulación, su contenido en agua, dispersabilidad en agua, colorimetría y Calorimetría 
Diferencial de Barrido (240 mg/mL), y su capacidad antioxidante por los métodos de secuestro 
de  radicales  libres  (ABTS),  capacidad  reductora del hierro  (FRAP)  y  contenido de  sustancias 
reactivas al Folin‐Ciocalteu.  

Resultados y discusión 

Caracterización de los extractos 

Composición 

El perfil cromatográfico por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (Figura 50) reveló que el 
ácido  clorogénico  es  el  compuesto  fenólico  mayoritario  en  ambos  extractos,  siendo  más 
abundante en el extracto etanólico (58,48 mg/g) respecto al acuoso (42,61 mg/g). 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 50. Perfiles cromatográficos por Cromatografía Líquida de Alta Resolución  (λ = 253 nm) de  los 
extractos de hinojo marino, liposomas y algunos estándares. A) Línea superior: extracto acuoso; segunda 
línea:  liposoma  L‐HM‐ac  64;  tercera  línea:  estándar  de  Vitamina  C;  cuarta  línea:  estándar  de  ácido 
clorogénico. B)  Línea  superior: extracto etanólico;  segunda  línea:  liposoma  L‐HM‐et 64;  tercera  línea: 
estándar  de  ácido  clorogénico;  cuarta  línea:  estándar  de  rutina;  quinta  línea:  estándar  de  ácido 
rosmarínico.   

A
b
so
rb
an
ci
a 

Tiempo (min)
0 10 20 30 40 min

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0
(x1,000,000)

Ácido clorogénico

Rutina
Ácido 

rosmarínico 

B 

A
b
so
rb
an
ci
a 
  

Tiempo (min)
0 10 20 30 40 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0
(x1,000,000)

Ácido clorogénico

Vitamina C

A 



Capítulo 2 

134 
 

Meot‐Duros & Magne  (2009)  determinaron  el  contenido  de  ácido  clorogénico  en  extractos 
metanólicos del hinojo marino que crece en las colinas de arena y debajo de los acantilados y 
obtuvieron  una  menor  concentración  de  ácido  clorogénico  (3‐27,9  mg/g),  probablemente 
debido a la ausencia del proceso de sonicación en su protocolo, el cual modifica el proceso de 
extracción de fenoles.  

También  se  identificaron  otros  compuestos  minoritarios,  que  variaron  su  presencia  y 
abundancia relativa en función de la naturaleza del solvente. Así, la vitamina C se cuantificó en 
el  extracto  acuoso  (1,46  mg/g)  mientras  que  los  compuestos  rutina  (4,52  mg/g)  y  ácido 
rosmarínico (2,81 mg/g) se encontraron en el extracto etanólico. Pereira et al. (2017) también 
determinaron el ácido clorogénico como el compuesto  fenólico más abundante presente en 
extractos de infusiones y decocciones de hojas y tallos de Crithmum maritimum. Otros autores 
reportaron la presencia de ácidos hidroxicinámicos, tales como ácido ferúlico o ácido cumárico, 
los cuales no se encontraron en los extractos ensayados en la presente memoria.  

Ambos extractos de hinojo, con porcentajes de eficacia de extracción del 31 % para el extracto 
etanólico  y  del  35,5 %  para  el  extracto  acuoso  respecto  a  la  planta  fresca,  presentaron  un 
elevado porcentaje de contenido en agua después de ser  liofilizados (>15 %), probablemente 
debido a su alta higroscopicidad,  la cual  fue  ligeramente superior en el extracto etanólico. A 
pesar  de  ello,  ambos mostraron  una  apariencia  típica  de  un  polvo  fino.  El  extracto  acuoso 
presentó una coloración marrón‐amarillenta con un contenido proteico total del 4,1 %, mientras 
que el etanólico, con un 2,2 % de proteína total, mostró una coloración verdosa.  

Citotoxicidad 

La figura 51 muestra la citotoxicidad de ambos extractos de hinojo.  

 

 

Figura  51.  Citotoxicidad  en  células  Caco‐2  incubadas  24  h  (porcentaje  respecto  a  células  control  no 
tratadas, C) de los extractos de hinojo marino a diferentes concentraciones (0,01‐1,0 mg/mL). A) Extracto 
acuoso. B) Extracto etanólico. Los valores representan la media de al menos cuatro determinaciones. 
 

0

20

40

60

80

100

120

C 0,01 0,1 0,5 1,0

V
ia
b
ili
d
ad

ce
lu
la
r
(%

)

Concentración de extracto (mg/mL)

A

0

20

40

60

80

100

120

C 0,01 0,1 0,5 1,0V
ia
b
ili
d
ad

ce
lu
la
r
(%

)

Concentración de extracto (mg/mL)

B



Resultados 

135 
 

El extracto acuoso (Figura 52A) no presentó efectos citotóxicos significativos (p≤0,05) en células 
Caco‐2  a  las  concentraciones  testadas.  En  cambio,  se  observó  una  ligera  reducción  en  la 
viabilidad  celular  (p≤0,05)  con  el  extracto  etanólico  (Figura  52B)  independientemente  de  la 
concentración  de  bioactivo,  atribuida  principalmente  a  la  presencia  de  etanol  residual. 
Considerando que a la concentración más elevada (1 mg/mL) la viabilidad celular fue superior al 
80 %, el posible efecto citotóxico del extracto etanólico fue prácticamente despreciable. 

Actividad antioxidante 

La actividad antioxidante del extracto etanólico fue superior (p≤0,05) a la del extracto acuoso 
para los tres métodos estudiados, con valores de 556,8 y 805,1 mg ácido ascórbico/g muestra 
en capacidad de secuestrar radicales libres, de 273,6 y 570,8 µmol eq Fe2+/g muestra en poder 
reductor del hierro, y de 76,0 y 109,0 mg ácido gálico/g muestra en contenido total de fenoles 
para los extractos acuoso y etanólico, respectivamente. Meot‐Duros & Magne (2009) obtuvieron 
32 mg ácido gálico/g muestra (contenido total de fenoles por el método de Folin‐Ciocalteu) para 
un extracto de hinojo marino obtenido  sin  sonicación. Esta menor actividad encontrada por 
estos autores podría atribuirse a que no aplican sonicación en el proceso de elaboración del 
extracto, el cual favorece  la mayor extracción de compuestos fenólicos, pero también puede 
haber otros factores como la estacionalidad de la captura, la localización geografía, etc.  

Caracterización de los liposomas 

Características de partícula 

Las características de partícula de las dispersiones liposomales de hinojo se mostraron en la tabla 
14. El incremento progresivo en la concentración de bioactivo indujo un aumento (p≤0,05) del 
tamaño medio de  los  liposomas, desde 89,5 hasta 137,1 nm para el extracto acuoso y desde  
96,3  nm  hasta  150,1  nm  para  el  etanólico.  Esta  expansión  de  los  liposomas  se  considera 
consecuencia del aumento en  la concentración de bioactivo, siendo más grande el tamaño a 
mayor  concentración  de  extracto  encapsulado.  Frenzel  &  Steffen‐Heins  (2015)  también 
observaron un aumento del tamaño de los liposomas a concentraciones crecientes de bioactivo 
(quercetina) y lo atribuyeron igualmente a un exceso de flavonoles en la bicapa, los cuales no 
fueron solubles en agua y acabaron formando agregados. 
 

Tabla 14. Características de partícula de tamaño (nm), índice de polidispersidad y potencial zeta (mV) de 
dispersiones  liposomales vacías y cargadas con dos extractos de hinojo marino  (acuoso y etanólico) a 
diferentes concentraciones de bioactivo (8, 16, 32, 64 %). Diferentes letras (a, b, c, d) en la misma columna 
indican  diferencias  significativas  (p≤0,05)  entre  liposomas  a  diferentes  concentraciones  del  mismo 
extracto bioactivo; (m, n, o, p, q, r, s) en la misma columna entre todos los liposomas incluyendo ambos 
extractos y  los vacíos  (L‐V);  (x, y) en  la misma columna entre  liposomas a  la misma concentración de 
bioactivo pero diferente extracto.  

 

Tamaño  
(nm) 

Índice de 
polidispersidad 

Potencial Zeta 
(mV) 

L‐HM‐ac 8    89,5 ± 0,9a/m/x    0,316 ± 0,025a/mn/x  ‐31,8 ± 1,9a/m/x 

L‐HM‐ac 16    97,3 ± 0,9b/n/x  0,329 ± 0,039a/n/x  ‐32,4 ± 3,7a/m/x 

L‐HM‐ac 32  111,2 ± 0,8c/p/x  0,345 ± 0,042a/n/x  ‐36,7 ± 6,4a/m/x 

L‐HM‐ac 64   137,1 ± 0,7d/r/x  0,370 ± 0,018a/n/x  ‐27,7 ± 2,8a/m/x 

L‐HM‐et 8    96,3 ± 1,3a/n/y    0,309 ± 0,027a/mn/x  ‐34,4 ± 1,1a/m/y 

L‐HM‐et 16  106,0 ± 1,3b/o/y    0,305 ± 0,017a/mn/x  ‐33,0 ± 3,2a/m/x 

L‐HM‐et 32  127,8 ± 0,2c/q/y    0,295 ± 0,018a/mn/x  ‐33,1 ± 3,2a/m/x 

L‐HM‐et 64  150,1 ± 2,0d/s/y  0,324 ± 0,044a/n/x  ‐30,1 ± 2,1a/m/x 

L‐V     87,4 ± 0,8m      0,240 ± 0,005m    ‐35,5 ± 1,7m 



Capítulo 2 

136 
 

Los  liposomas que  incorporan el extracto etanólico mostraron un tamaño superior (p≤0,05) a 
los de extracto acuoso, para una misma concentración. Esta diferencia podría deberse al mayor 
tamaño  molecular  de  los  compuestos  fenólicos  del  extracto  etanólico  (rutina  y  ácido 
rosmarínico)  respecto  al  acuoso  (vitamina  C)  y  a  su  carácter  predominantemente  lipofílico 
(frente a la naturaleza hidrofílica del extracto acuoso), el cual determina su mayor afinidad por 
las  cadenas  acilo  de  los  fosfolípidos  de  la  bicapa  (zona  hidrofóbica).  Esta  acumulación  de 
compuestos fenólicos en la parte hidrofóbica de la membrana puede ocasionar alteraciones en 
las  interacciones  entre  las  cadenas  acilo  de  los  fosfolípidos,  induciendo  un  efecto  de 
hinchamiento de la bicapa (Sebaaly et al., 2015).  

Acorde  a  estos  resultados,  los  liposomas  L‐HM‐ac  8  fueron  los  que  presentaron  un menor 
tamaño medio con un valor de 89,5 nm, siendo los liposomas que contienen el extracto acuoso 
a menor concentración, mientras que los liposomas L‐HM‐et 64 fueron los que presentaron un 
significativo mayor  tamaño medio  con  150,1  nm  (conteniendo  extracto  etanólico  a mayor 
concentración).  Feng  et  al.  (2016)  obtuvieron  similares  resultados  para  liposomas  de  soja 
conteniendo  ácido  clorogénico  extraído  en  etanol  (132,1  nm).  Los  liposomas  vacíos  (L‐V) 
mostraron un tamaño medio de 87,4 nm, valor significativamente  inferior a cualquiera de  las 
dispersiones liposomales con bioactivo, excepto L‐HM‐ac 8 (89,5 nm) que es el que tiene menor 
contenido en bioactivo, demostrando nuevamente el efecto expansor del bioactivo dentro de 
los liposomas. 

El  índice de polidispersidad no mostró diferencias significativas entre dispersiones de hinojo, 
oscilando  los  valores  entre  0,295‐0,370.  Estos  resultados  se  confirmaron  en  la  gráfica  de 
distribución de tamaños (Figura 52), la cual no mostró diferencias entre dispersiones.  

 

Figura 52. Distribución de tamaños de partícula de dispersiones  liposomales vacías y cargadas con dos 
extractos  (acuoso y etanólico) de hinojo marino a diferentes concentraciones de bioactivo  (8, 16, 32,         
64 %). 

Aun  así  se  pueden  apreciar  algunos  patrones  en  función  del  tipo  de  extracto  y  de  la 
concentración de bioactivo. Para los liposomas con extracto acuoso se observa un incremento 
de  la  polidispersidad  con  el  aumento  de  la  concentración  de  bioactivo  incorporado  en  los 
liposomas,  indicando que más  cantidad de bioactivo provoca una mayor heterogeneidad de 
tamaños. Sin embargo esta pauta no se cumple para  los de extracto etanólico cuyos valores 
fluctúan  sin  proporcionalidad  con  la  concentración.  Además,  los  valores  de  polidispersidad 
fueron menores para los liposomas etanólicos que para los acuosos cuando se comparan a igual 
concentración de bioactivo. Estos resultados indican que los liposomas etanólicos mantienen un 
rango de distribución de  tamaños más estrecho  y homogéneo  y  son más estables  frente  al 
incremento de la concentración de bioactivo. Los liposomas vacíos (L‐V) presentaron un valor 
de  polidispersidad  ligeramente  inferior  al  de  los  liposomas  rellenos  (0,240).  Los  valores  de 

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2

4

6

8

10

10 100 1000 10000

In
te
n
si
d
ad

 (
%
)

Tamaño (nm)

L‐HM‐ac 8

L‐HM‐ac 16

L‐HM‐ac 32

L‐HM‐ac 64

L‐HM‐et 8

L‐HM‐et 16

L‐HM‐et 32

L‐HM‐et 64

L‐V



Resultados 

137 
 

polidispersidad de las dispersiones estuvieron en el rango esperado para sistemas preparados a 
partir de material biológico (Da Silva Malheiros et al., 2011). 

El  potencial  zeta,  que  representa  la  carga  neta  de  los  liposomas  y  por  tanto  su  grado  de 
estabilidad  de membrana,  fue  significativamente  igual  (p>0,05)  para  todas  las  dispersiones 
liposomales de hinojo, sin relación en función del tipo de extracto o de su concentración. Estos 
valores oscilaron entre ‐27,7 mV y ‐36,7 mV, todos ellos muy electronegativos y, acorde a Müller 
et al.  (2001),  indicativos de una buena estabilidad de membrana al  ser  inferiores a  ‐30 mV. 
Tampoco presentaron diferencias  (p>0,05) con  los  liposomas vacíos (‐35,5 mV). Dag & Oztop 
(2017)  obtuvieron  similares  resultados  para  liposomas  de  lecitina  encapsulando  extracto 
polifenólico de té verde, con un potencial zeta estable de ‐30 mV.  

En la tabla 15 se muestran las características de partícula de los liposomas de hinojo liofilizados. 
El  proceso  de  liofilización  provoca  un  incremento  notable  (p≤0,05)  del  potencial  zeta, 
volviéndolo más  electronegativo  (de  ‐34,2  a  ‐48,2 mV)  y mejorando  así  la  estabilidad  de 
membrana de los liposomas. Sin embargo, también induce un ligero incremento del índice de 
polidispersidad  (0,332‐0,430)  y  un  aumento  considerable  (p≤0,05)  del  tamaño  medio           
(171,1‐311,4 nm).  
 

Tabla 15. Características de partícula de tamaño (nm), índice de polidispersidad y potencial zeta (mV) de 
liposomas  liofilizados  vacíos  y  cargados  con  dos  extractos  de  hinojo marino  (acuoso  y  etanólico)  a 
diferentes concentraciones de bioactivo (8, 16, 32, 64 %). Diferentes letras (a, b, c, d) en la misma columna 
indican  diferencias  significativas  (p≤0,05)  entre  liposomas  a  diferentes  concentraciones  del  mismo 
extracto bioactivo;  (m, n, o, p, q) en  la misma  columna entre  todos  los  liposomas  incluyendo ambos 
extractos y los vacíos (L‐V); (x, y) entre liposomas a la misma concentración de bioactivo pero diferente 
extracto.   

  Tamaño 
(nm) 

Índice de 
polidispersidad 

Potencial Zeta 
(mV) 

L‐HM‐ac 8  171,1 ± 1,6a/m/x  0,341 ± 0,004a/m/x    ‐46,1 ± 1,1a/no/x 

L‐HM‐ac 16  249,4 ± 4,0c/p/x  0,430 ± 0,010b/m/x  ‐44,6 ± 1,3a/o/x 

L‐HM‐ac 32  230,2 ± 1,0b/o/x  0,332 ± 0,046a/m/x  ‐40,0 ± 1,3b/p/x 

L‐HM‐ac 64  311,4 ± 4,4d/q/x    0,378 ± 0,025ab/m/x  ‐34,2 ± 0,9c/q/x 

L‐HM‐et 8   225,4 ± 1,8a/no/y  0,388 ± 0,067a/m/x    ‐47,3 ± 1,2a/no/y 

L‐HM‐et 16    219,3 ± 6,1a/n/y  0,371 ± 0,046a/m/x  ‐48,2 ± 1,1a/n/x 

L‐HM‐et 32   225,1 ± 4,5a/no/x  0,364 ± 0,039a/m/x  ‐40,3 ± 2,3b/p/x 

L‐HM‐et 64  216,4 ± 2,1a/n/y  0,377 ± 0,010a/m/x  ‐37,5 ± 0,5b/p/y 

L‐V     316,6 ± 6,7q      0,374 ± 0,081m     ‐54,2 ± 1,5m 

 

Mientras que el índice de polidispersidad no siguió ninguna pauta en función del extracto o de 
su concentración (Figura 53), sí lo hicieron el potencial zeta y el tamaño. El potencial zeta fue 
más  electronegativo  (p≤0,05)  a  menores  concentraciones  de  bioactivo,  sin  diferencias 
significativas entre las concentraciones de 8 % y 16 %. Estos resultados indican que los liposomas 
con menor concentración de bioactivo fueron más estables (siendo todos ellos muy estables ya 
que  fueron  inferiores a  ‐30 mV), posiblemente debido a que  la menor cantidad de bioactivo 
encapsulado  interfiere en menor medida con  la cápsula y afecta menos a  la conformación y 
estabilidad física de los liposomas. Esta afirmación la confirma la elevada carga electronegativa 
del  liposoma  vacío  (‐54,2 mV),  siendo más  electronegativa  que  el  resto  de  liposomas  con 
bioactivos. El potencial fue ligeramente más electronegativo y más estable (solo significativo a 
concentraciones de 8 % y 64 %) en los liposomas con extracto etanólico en comparación con sus 
correspondientes concentraciones de extracto acuoso, lo que significa que el extracto etanólico 
proporciona  mayor  estabilidad  de  membrana  que  el  acuoso.  Este  resultado  se  confirma 



Capítulo 2 

138 
 

analizando el potencial  zeta de  cada extracto,  siendo más electronegativo para el etanólico           
(‐17,1 mV) que para el acuoso (‐14,8 mV).  

 

Figura  53. Distribución  de  tamaños  de  partícula  de  liposomas  liofilizados  vacíos  y  cargados  con  dos 
extractos  (acuoso y etanólico) de hinojo marino a diferentes concentraciones de bioactivo  (8, 16, 32,         
64 %). 
 

El  tamaño medio  aumentó  a  cantidades  crecientes  de  bioactivo  acuoso  hasta  un  valor  de        
311,4 nm para L‐HM‐ac 64, siendo éstos los liposomas de hinojo de mayor tamaño. Sin embargo, 
para los liposomas con extracto etanólico no se observó ninguna relación con la concentración 
de  bioactivo,  con  tamaños  comprendidos  en  un  estrecho  rango  de  valores,  de  216,4  nm  a       
225,4 nm. Por  la misma razón, no hubo tampoco relación aparente entre extractos para una 
misma concentración. Estos resultados indican presuntamente que da igual la concentración de 
bioactivo etanólico que se encapsule, ya que su tamaño será más o menos el mismo, hecho que 
no  sucede  con  el  extracto  acuoso.  Por  tanto,  la  concentración  de  bioactivo  no  parece 
determinante en esta propiedad de partícula de los liposomas.  

Eficacia de encapsulación 

Se estudió la eficacia de encapsulación de los liposomas liofilizados de hinojo a concentraciones 
de 64 % de bioactivo (L‐HM‐ac 64 y L‐HM‐et 64). Para L‐HM‐ac 64, la proporción de sustancias 
libres reactivas al Folin (no encapsuladas) con respecto a la cantidad total determinada después 
de romper la membrana de los liposomas con Tritón X‐100 fue del 34,4 %, lo que significa que 
un 65,6 % de  los compuestos de extracto acuoso se atraparon en  liposomas. Al comparar  la 
cantidad de sustancias reactivas al Folin medida en la suspensión liposomal, L‐HM‐ac 64 antes y 
después del tratamiento con Tritón X‐100, se observa un aumento de 11,1 % en este último, lo 
cual es atribuido a la cantidad de sustancias reactivas al Folin en las vesículas rotas. Según estos 
resultados, solo se incluiría un 11,1 % de extracto en el núcleo interno de los liposomas, mientras 
que  el  restante  54,5 %  (hasta  completar  el  65,6 %)  permanecería  asociado  a  la membrana 
(incrustado  dentro  de  las  cadenas  de  acilo  o  adsorbido  a  la  superficie  de  la  membrana 
interactuando con los grupos de fosfato polares). En el caso del sistema liposomal con extracto 
etanólico (L‐HM‐et 64) y siguiendo este mismo enfoque, la eficacia de encapsulación fue menor 
(49,1 %),  lo  cual  es  indicativo  de  que  deben  existir  sustancias  polifenólicas  en  la  solución 
liposomal. El valor de sustancias reactivas al Folin  liberado tras  la rotura de  los  liposomas fue 
idéntico al obtenido para los liposomas L‐HM‐ac 64 (11,9 %). Por tanto, el contenido de extracto 
bioactivo  asociado  a  la membrana  externa  liposomal  y/o  a  las moléculas que  sobresalen  al 
exterior  fue  inferior  a  la  de  los  liposomas  acuosos  (37,2 %).  Feng  et  al.  (2016)  obtuvieron 

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Tamaño (nm)

L‐HM‐ac 8

L‐HM‐ac 16

L‐HM‐ac 32

L‐HM‐ac 64

L‐HM‐et 8

L‐HM‐et 16

L‐HM‐et 32

L‐HM‐et 64

L‐V



Resultados 

139 
 

similares  resultados  de  eficacia  de  encapsulación  para  liposomas  incorporando  ácido 
clorogénico (53,1 %).  

La diferencia de encapsulación entre  extractos  se debe  a diversos  factores,  tales  como  a  la 
diferente distribución de sus compuestos fenólicos en los liposomas, la cual es determinada por 
su  distinto  tamaño molecular  y  diferente  solubilidad  en  agua. Así,  en  el  extracto  acuoso  la 
elevada cantidad de vitamina C, que es completamente soluble en agua, tendría tendencia a 
ubicarse en el núcleo acuoso, de  forma que  la menor concentración de ácido clorogénico se 
empaquetaría fácilmente dentro de las cadenas acilo de ácidos grasos de la bicapa. En el caso 
del extracto  etanólico,  la mayor    concentración de  clorogénico  junto  con otros  compuestos 
fenólicos de elevado peso molecular (rutina y ácido rosmarínico) podrían dificultar su completo 
empaquetamiento dentro de la bicapa, y por tanto parte de este extracto no es encapsulado, 
dando lugar a una menor eficacia de encapsulación.  

Los perfiles cromatográficos de Cromatografía Líquida de Alta Resolución, tanto de los extractos 
como de los liposomas (Figura 54), confirmaron los resultados anteriores.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 54. Perfiles cromatográficos por Cromatografía Líquida de Alta Resolución  (λ = 253 nm) de  los 
extractos de hinojo marino y sus liposomas. A) Línea superior: extracto acuoso; segunda línea: extracto 
acuoso calentado a 80 °C (2 h) y sonicado; tercera línea: liposoma L‐HM‐ac 64. B) Línea superior: extracto 
etanólico; segunda  línea: extracto etanólico calentado a 80 °C (2 h) y sonicado; tercera  línea:  liposoma     
L‐HM‐et 64.  

A
b
so
rb
an
ci
a 

15.0 20.0 25.0 30.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

(x100,000)

A Ácido clorogénico

Tiempo (min)

A
b
so
rb
an
ci
a 

20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

(x1,000,000)

B Ácido clorogénico

Rutina

Tiempo (min)



Capítulo 2 

140 
 

Los picos asociados al ácido clorógenico en los extractos (42,61 y 58,48 mg/g para el acuoso y el 
etanólico,  respectivamente)  se  vieron  notablemente  reducidos  en  los  liposomas  (13,67  y      
20,05 mg/g para el acuoso y el etanólico,  respectivamente),  lo que  sugiere que esta menor 
cantidad detectada en los liposomas corresponde a la fracción no atrapada mientras que el resto 
ha sido eficientemente encapsulado y por eso no es detectado. Esto demuestra una eficiente 
encapsulación  del  ácido  clorogénico  en  ambos  extractos,  siendo  ésta  del  67,92 %  para  los 
liposomas acuosos y del 65,72 % para los liposomas etanólicos. 

Se observaron similares resultados para los picos asociados a la vitamina C en el extracto acuoso 
y para la rutina y ácido rosmarínico en el etanólico, indicativos de su buena encapsulación. Estos 
resultados  concuerdan  con  los  obtenidos  anteriormente mediante  el método  de  Folin.  Las 
pequeñas diferencias de eficacia de encapsulación entre ambas técnicas podrían atribuirse a las 
propiedades  moleculares  y  químicas  de  cada  compuesto  específico,  así  como  a  posibles 
interferencias con otros compuestos reactivos en el método de Folin. 

Los  cromatogramas  también  mostraron  el  incremento  en  abundancia  relativa  de  algunos 
compuestos minoritarios no identificados o incluso la aparición de otros nuevos, localizados en 
la parte no encapsulada. Estos compuestos podrían ser el resultado de la degradación térmica o 
transformación de fenoles, incluido el ácido clorogénico, durante el proceso de preparación de 
liposomas,  como  se  deduce  de  la  comparación  con  los  extractos  de  hinojo  calentados  y 
sonicados a las mismas condiciones que los liposomas (Figura 54). La altura del pico del ácido 
clorogénico disminuyó  ligeramente en  los extractos procesados, sin embargo, el decremento 
fue menos  evidente que  en  las  suspensiones  liposomales.  Por  tanto,  se puede  asumir  que, 
aunque podría estar teniendo lugar parte de degradación térmica, la mayoría del extracto fue 
encapsulada.  

La cantidad de ácido clorogénico no encapsulada determinada en las dispersiones liposomales 
fue  considerablemente menor que  la  de  sus  correspondientes  extractos  acuoso  y  etanólico 
(Tabla 16).  
 

Tabla 16. Concentración de ácido clorogénico en los extractos de hinojo marino acuoso (Ext Ac) y etanólico 
(Ext  Et),  antes  y  después  de  ser  calentados  y  sonicados  (*),  y  en  la  fracción  no  encapsulada  de  sus 
correspondientes dispersiones liposomales (L‐HM‐ac 64 y L‐HM‐et 64).   

  Ácido clorogénico 
(mg/g) 

Ext Ac  42,61 ± 0,94 

Ext Ac*  38,31 ± 1,22 

L‐HM‐ac 64  13,67 ± 0,34 

Ext Et  58,48 ± 1,01 

Ext Et*  49,94 ± 1,46 

L‐HM‐et 64  20,05 ± 0,57 

 

Además,  la  disminución  de  ácido  clorogénico  como  consecuencia  de  los  procesos  de 
calentamiento y sonicación de los extractos fue del 10 % para el extracto acuoso y del 15 % para 
el  etanólico.  Teniendo  en  cuenta  la  degradación  térmica  de  este  compuesto  durante  la 
preparación del liposoma, la cantidad de ácido clorogénico encapsulada sería del 64,3 % y del 
59,8 % para L‐HM‐ac 64 y L‐HM‐et 64, respectivamente; lo que indica que el ácido clorogénico 
en  el  extracto  acuoso  fue más  eficientemente  encapsulado que  el  extracto  etanólico.  Estos 
resultados concuerdan con la menor eficacia de encapsulación determinada por el método Folin 
del  extracto  etanólico  (49,1 %)  respecto  al  acuoso  (65,6 %).  Las  diferencias  en  la  tasa  de 



Resultados 

141 
 

encapsulación  se explican,  tanto para el método Folin  como para  la  concentración de ácido 
clorogénico,  por  las  propiedades  químicas  y moleculares  de  cada  compuesto  específico  del 
extracto así como por posibles interferencias de otros compuestos reactivos al Folin.  

Color 

Los parámetros de color de cromaticidad y tonalidad de los liposomas liofilizados de hinojo se 
mostraron  en  la  figura  55.  Sus  valores  para  el  parámetro  de  luminosidad  (L*,  0‐100)  se 
mostraron en la tabla 17.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura  55.  Gráfico  representando  los  parámetros  de  color  cromaticidad  y  tonalidad  de  liposomas 
liofilizados  vacíos  y  cargados  con  dos  extractos  (acuoso  y  etanólico)  de  hinojo marino  a  diferentes 
concentraciones de bioactivo (8, 16, 32, 64 %). 

 

Los  liposomas etanólicos presentaron mayores valores de  cromaticidad  (5,8‐9,9) y  tonalidad 
(66,0‐77,1)  (p≤0,05)  que  sus  respectivos  liposomas  acuosos  (2,4‐5,9  y  60,7‐67,4, 
respectivamente).  Igualmente,  los  liposomas  etanólicos  mostraron  valores  de  luminosidad 
ligeramente superiores (p≤0,05) (29,3‐32,1) que sus respectivos acuosos (27,1‐29,0). 
 

Tabla 17. Parámetro de color luminosidad (L*, 0‐100) de liposomas liofilizados vacíos y cargados con dos 
extractos  (acuoso y etanólico) de hinojo marino a diferentes concentraciones de bioactivo  (8, 16, 32,         
64 %). Diferentes letras (a, b, c, d) indican diferencias significativas (p≤0,05) entre liposomas a diferentes 
concentraciones del mismo extracto bioactivo; (m, n, o, p, q, r, s) entre todos los liposomas incluyendo 
ambos extractos y  los vacíos  (L‐V);  (x, y) entre  liposomas a  la misma concentración de bioactivo pero 
diferente extracto.   

  L* (D65) 

L‐HM‐ac 8  29,0 ± 0,1c/o/x

L‐HM‐ac 16  29,0 ± 0,1c/o/x

L‐HM‐ac 32  28,0 ± 0,2b/n/x

L‐HM‐ac 64  27,1 ± 0,1a/m/x

L‐HM‐et 8  30,9 ± 0,3c/q/y

L‐HM‐et 16  29,3 ± 0,5a/o/x

L‐HM‐et 32  30,2 ± 0,4b/p/y

L‐HM‐et 64  32,1 ± 0,2d/r/y

L‐V   32,5 ± 0,2s

0

30

60

90

0 2 4 6 8 10

0

2

4

6

8

10

0

0

Cromaticidad 

C
ro
m
at
ic
id
ad

 

L‐HM‐ac 8 
L‐HM‐ac 16 
L‐HM‐ac 32 
L‐HM‐ac 64 
L‐HM‐et 8 
L‐HM‐et 16 
L‐HM‐et 32 
L‐HM‐et 64 
L‐V 



Capítulo 2 

142 
 

Todos estos valores fueron menores que los observados para los liposomas vacíos, con un valor 
de cromaticidad de 8,3; tonalidad de 83,5; y L* de 32,5 (a excepción de L‐HM‐et 64 que superó 
el valor de cromaticidad  con un 9,9),  lo que  significa que estas diferencias en  los  liposomas 
etanólicos  y  acuosos  son  consecuencia  de  la  diferente  coloración  de  los  propios  extractos, 
verdosa para el etanólico y marrón‐amarillenta para el acuoso (Figura 56).  

               

Figura 56. Extractos etanólico (izquierda) y acuoso (derecha) de hinojo marino. 
 

La coloración vendría en buena parte aportada por la parte de extracto no encapsulada o la que 
está adherida a la membrana externa de los liposomas. Los liposomas con cantidades crecientes 
de bioactivo no siguen ninguna proporcionalidad definida, ni los acuosos ni los etanólicos, para 
ninguno de los parámetros estudiados (cromaticidad, tonalidad y luminosidad). Esto indica que 
la concentración de extractos bioactivos no es el factor determinante en  la coloración de  los 
liposomas liofilizados de hinojo.  

Contenido en agua 

El contenido en agua de  los  liposomas  liofilizados de hinojo (Tabla 18) no mostró relación en 
función del tipo de extracto (acuoso o etanólico) o de la concentración de bioactivo (8, 16, 32 o 
64 %), pero todos los valores fueron considerablemente altos, comprendidos entre 14,8‐38,1 %. 
Este elevado contenido en agua se debe a la presencia del glicerol en sus formulaciones, el cual 
mejora la estabilidad de las vesículas (Mozafari, 2005) y previene los daños contra la congelación 
y  liofilización  (Stark  et  al.,  2010)  pero  interfiere  en  la  estructura  de  la membrana  lipídica, 
disminuyendo  la  cantidad de agua eliminada y aumentando el estado de hidratación de  los 
liposomas  (Manca  et  al.,  2013)  debido  a  su  naturaleza  higroscópica.  Con  excepción  de                       
L‐HM‐ac 32, todos los liposomas liofilizados conteniendo extracto bioactivo tuvieron un mayor 
contenido en agua que los liposomas vacíos (18,5 %), lo que podría sugerir que una determinada 
cantidad de compuestos  fenólicos del extracto permanece  fuera de  los  liposomas  (ya sea no 
encapsulado o adherido a la membrana externa de los mismos) aumentando la higroscopicidad 
y por tanto el contenido en agua.  

Dispersabilidad en agua 

La dispersabilidad en agua de  los  liposomas  liofilizados de hinojo  (Tabla 18), que  igualmente 
parece no presentar pauta  según  la  concentración o  el  tipo de bioactivo,  fue  también muy 
elevada  en  todos  los  liposomas,  siendo  ≥79,9 %,  indicando  su  buena  predisposición  a  ser 
incorporados en el organismo. Los liposomas con una dispersabilidad significativamente mayor 
(p≤0,05) fueron L‐HM‐et 64 con un valor del 100 %. Estos valores fueron superiores al mostrado 
por los liposomas vacíos (73,6 %), lo que, junto con el menor incremento del tamaño de partícula 
observado en Zetasizer de los liposomas rellenos frente al vacío cuando éstos son liofilizados, 
podría demostrar que la presencia de los compuestos fenólicos en los liposomas atenúa el efecto 



Resultados 

143 
 

de agregación de los mismos provocado por el proceso de liofilización, dando lugar a un menor 
tamaño de partícula y una mayor dispersabilidad en agua en los liposomas con hinojo.  

 

Tabla 18. Contenido en agua (%) y dispersabilidad en agua (%) de liposomas liofilizados vacíos y cargados 
con dos extractos de hinojo marino (acuoso y etanólico) a diferentes concentraciones de bioactivo (8, 16, 
32, 64 %). Diferentes letras (a, b, c, d) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre 
liposomas a diferentes concentraciones del mismo extracto bioactivo; (m, n, o, p, q) en la misma columna 
entre  todos  los  liposomas  incluyendo ambos extractos y  los vacíos;  (x, y) en  la misma columna entre 
liposomas a la misma concentración de bioactivo pero diferente extracto. 

  Contenido en agua 
(%) 

Dispersabilidad  
(%) 

L‐HM‐ac 8  38,1 ± 0,6d/q/x 86,4 ± 6,8a/n/x

L‐HM‐ac 16  30,5 ± 1,4c/p/x   91,6 ± 1,4a/no/x

L‐HM‐ac 32  14,8 ± 1,9a/m/x   82,4 ± 2,7a/mn/x

L‐HM‐ac 64  20,9 ± 1,2b/n/x   81,4 ± 4,7a/mn/x

L‐HM‐et 8      27,0 ± 0,8ab/op/y   79,9 ± 2,5a/mn/x

L‐HM‐et 16  37,4 ± 2,5c/q/x 88,2 ± 1,8b/n/x

L‐HM‐et 32    22,8 ± 1,2a/no/y      82,5 ± 1,2ab/mn/x

L‐HM‐et 64    31,1 ± 2,6bc/p/x        100,0 ± 0,0c/o/x

L‐V        18,5 ± 2,2mn          73,6 ± 2,6m

 

Calorimetría Diferencial de Barrido 

Las  propiedades  térmicas  de  los  liposomas  liofilizados  de  hinojo  analizadas  mediante 
Calorimetría  Diferencial  de  Barrido  se  mostraron  en  la  figura  57.  Todos  los  liposomas 
presentaron una única transición de fase endotérmica difusa debido a la eliminación de parte 
del  agua  de  la  muestra  mediante  el  proceso  de  liofilización,  lo  que  dificulta  su  correcta 
visualización. Por esta razón, los valores de entalpía asociados a los picos de estas transiciones 
endotérmicas no se mostraron, ya que fueron valores muy pequeños e imprecisos (<1 J/g). Sin 
embargo,  sí  se muestran  los valores de  temperatura asociados a estos picos,  comprendidos 
entre 0,97‐5,34  °C. Este bajo rango de  temperaturas es  típico de  termogramas de  liposomas 
elaborados a partir de fosfatidilcolina de soja rica en ácidos grasos poliinsaturados (Biltonen & 
Lichtenberg, 1993).  

Un  incremento del pico de  temperatura  se observó  con el aumento de  la  concentración de 
bioactivo en ambos extractos, así como mayores temperaturas para  los  liposomas etanólicos 
(Figura 57B) frente a sus respectivos liposomas acuosos (Figura 57A). La mayor temperatura en 
los  liposomas  etanólicos  podría  ser  debida  a  la mayor  cantidad  de  compuestos  lipofílicos 
embebidos en  la membrana, dada  la naturaleza de  los extractos. Estos compuestos  lipofílicos 
interaccionan  con  la  membrana  y  son  los  responsables  de  sus  cambios  estructurales, 
aportándole una mayor estabilidad. Por otro lado, cantidades crecientes de bioactivo también 
aportan una mayor rigidez y estabilidad a la membrana, siendo los liposomas L‐HM‐et 64 los de 
mayor estabilidad, ya que el bioactivo, independientemente de su naturaleza, interfiere con la 
membrana lipídica e induce un efecto de compactación/agregación que mejora la estabilidad de 
membrana.  

 

 

 

 



Capítulo 2 

144 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 57. Cambios de  temperatura  (T,  °C)  y entalpía  (ΔH,  J/g) de  las  transiciones de  fase analizados 
mediante Calorimetría Diferencial de Barrido de liposomas liofilizados vacíos y cargados con dos extractos 
de hinojo marino  (acuoso y etanólico) a diferentes concentraciones de bioactivo  (8, 16, 32, 64 %). A) 
Liposomas acuosos. B) Liposomas etanólicos. 
 

Rashidinejad  et  al.  (2014)  obtuvieron  similares  conclusiones  tras  la  adición  de  catequina  o 
epigalocatequin galato en liposomas de fosfatidilcolina de soja. Sin embargo, Pagnussatt et al. 
(2016) y Ota et al. (2011) observaron un descenso de 1,5 °C cuando se  incorporó un extracto 
fenólico a partir de Spirulina sp. en liposomas de 1,2‐Dimiristoil‐sn‐glicero‐3‐fosfatidilcolina y un 
decremento progresivo de la temperatura con cantidades crecientes de compuestos fenólicos 
encapsulados en liposomas a partir de fosfolípidos sintéticos, respectivamente. Estos resultados 
sugieren que  las  transiciones endotérmicas de  los  liposomas dependen del  tipo de extracto 
bioactivo  encapsulado,  el  cual  determina  las  temperaturas  de  los  picos  de  transición  y  la 
estabilidad de membrana en  función de sus diferentes  interacciones con  la bicapa. También 
puede  ser un  factor determinante  la composición del  fosfolípido, en especial en  función del 
grado de  insaturación y  longitud de  las cadenas de  los ácidos grasos. Todos  los  liposomas de 

.35

.25

-20 -10 0 10 20 30 40 50

L‐V 

L‐HM‐ac 8 

L‐HM‐ac 16 

L‐HM‐ac 32 

L‐HM‐ac 64 

0,39 ± 0,37

0,97 ± 0,01

1,47 ± 0,18

2,95 ± 0,16

4,44 ± 0,57

Temperatura (°C)

En
ta
lp
ía
 (
J/
g)

 

A 

-0.35

-0.25

-20 -10 0 10 20 30 40 50

L‐HM‐et 8 

L‐HM‐et 16 

L‐HM‐et 32 

L‐HM‐et 64 

L‐V 

0,39 ± 0,37

2,11 ± 0,10

2,01 ± 0,01

3,59 ± 0,53

5,34 ± 0,63

Temperatura (°C)

En
ta
lp
ía
 (
J/
g)

 

B 



Resultados 

145 
 

hinojo tuvieron una mayor temperatura de transición de fase que los liposomas vacíos (0,39 °C), 
confirmando que el extracto bioactivo  interacciona con  la bicapa y mejora  su estabilidad de 
membrana.  

Actividad antioxidante 

Se cuantificó la actividad antioxidante de todos los liposomas liofilizados de hinojo (Figura 58).  

 
 

 

 

Figura 58. Actividades antioxidantes de los extractos de hinojo marino (acuoso y etanólico) y de liposomas 
liofilizados vacíos y  cargados  con  los dos extractos de hinojo marino a diferentes  concentraciones de 
bioactivo,  donde  Ex‐HM‐ac:  extracto  acuoso;  Ex‐HM‐et:  extracto  etanólico;  L‐V:  liposomas  vacíos;                 
L‐HM‐ac: liposomas cargados con extracto acuoso; L‐HM‐et: liposomas cargados con extracto etanólico. 
A) Método de  capacidad de  secuestro de  radicales  libres  (reactivo ABTS),  expresado  como mg  ácido 
ascórbico/g  muestra  seca.  B)  Método  de  capacidad  de  reducir  el  hierro,  expresado  como                                    
mg eq.Fe2+/g muestra seca. C) Método de contenido total de fenoles (reactivo Folin‐Ciocalteu), expresado 
como mg ácido gálico/g muestra seca.  

0

200

400

600

800

1000

1200

8 16 32 64

m
g 
ác
id
o
 a
sc
ó
rb
ic
o
/

g 
m
u
es
tr
a 
se
ca

Concentración de bioactivo (%)

L‐HM‐ac
L‐HM‐et
L‐V
Ex‐HM‐ac
Ex‐HM‐et

A

0

100

200

300

400

500

600

700

800

8 16 32 64m
g 
eq

.F
e2

+ /
g 
m
u
es
tr
a 
se
ca

Concentración de bioactivo (%)

L‐HM‐ac
L‐HM‐et
L‐V
Ex‐HM‐ac
Ex‐HM‐et

B

0

20

40

60

80

100

120

140

8 16 32 64

m
g 
ác
id
o
 g
ál
ic
o
/

g 
m
u
es
tr
a 
se
ca

Concentración de bioactivo (%)

L‐HM‐ac
L‐HM‐et
L‐V
Ex‐HM‐ac
Ex‐HM‐et

C



Capítulo 2 

146 
 

Los resultados de actividad antioxidante siguieron exactamente el mismo patrón para las tres 
técnicas ensayadas: capacidad de secuestrar radicales libres (reactivo ABTS) (Figura 58A), poder 
reductor del hierro  (Figura 58B) y  contenido  total de  fenoles determinado  como medida de 
sustancias reactivas al Folin‐Ciocalteu (Figura 58C), por lo que serán explicadas conjuntamente.  

Todos los liposomas rellenos mostraron una actividad antioxidante superior (p≤0,05) a la de los 
liposomas vacíos (la única excepción fueron los liposomas L‐HM‐ac 8 para la técnica de reducción 
del hierro), la cual fue muy pequeña (20,0 mg ácido ascórbico, 2,8 mg eq. Fe2+ y 3,4 mg ácido 
gálico/g muestra). Puesto que los liposomas no se rompieron intencionadamente, la actividad 
antioxidante cuantificada corresponde con  los componentes no encapsulados o aquellos que 
interaccionan con la superficie de membrana a través de los grupos polares fosfato. La actividad 
de los extractos fue muchísimo mayor (p≤0,05) que la de los liposomas, confirmando que solo 
se está detectando una parte del extracto en los liposomas.  

La  actividad  antioxidante  de  los  liposomas  y  el  contenido  total  de  fenoles  siguieron  una 
tendencia  lineal  creciente  (R2>0,90)  como  resultado  del  incremento  en  la  concentración  de 
bioactivo, independientemente del tipo de extracto. Con excepción de los liposomas acuosos a 
una  concentración  del  8  %  y  16  %  para  el método  ABTS,  todos  los  liposomas  etanólicos, 
independientemente de la concentración de bioactivo, mostraron mayor actividad (p≤0,05) que 
los  liposomas  acuosos  para  los  tres métodos  antioxidantes.  Del mismo modo,  la  actividad 
aumentó progresivamente con el incremento gradual de la concentración de extracto bioactivo, 
siendo los liposomas L‐HM‐et 64 los de mayor actividad para las tres técnicas (559,8 mg ácido 
ascórbico, 242,9 mg eq. Fe2+ y 56,0 mg ácido gálico/g muestra). Por un lado, hay una relación 
directa  en  la que  a mayor  cantidad de  extracto mayor  actividad  antioxidante.  Por otro,  los 
liposomas etanólicos tuvieron mayor actividad probablemente debido a su mayor composición 
de compuestos altamente antioxidantes (como su mayor concentración de ácido clorogénico, 
potente agente antioxidante) y/o a su menor eficacia de encapsulación, que da lugar a mayor 
cantidad  de  extracto  no  encapsulado  que  puede  interaccionar  en mayor  grado  dando más 
actividad.  

Conclusiones 

Se  obtuvieron  dos  extractos  antioxidantes  (acuoso  y  etanólico)  a  partir  del  hinojo marino 
mediante  un  proceso  de  extracción  que  incluye  calentamiento  y  sonicación.  El  principal 
componente fenólico en ambos extractos fue el ácido clorogénico, siendo más abundante en el 
extracto  etanólico.  Ambos  extractos  se  encapsularon  eficientemente  en  liposomas  de 
fosfatidilcolina de soja con una elevada estabilidad de partícula, encontrándose que  la mayor 
parte del extracto estaba adherido a  la membrana y no en el núcleo  interno. El proceso de 
liofilización  mejora  la  estabilidad  de  liposomas  e  incrementa  el  tamaño  medio  y  la 
polidispersidad,  siendo  este  aumento  menos  pronunciado  en  liposomas  que  incorporan 
compuestos  fenólicos.  Estos  liposomas  encapsulando  el  extracto  de  hinojo marino  podrían 
emplearse  para  el  diseño  de  alimentos  funcionales.  Futuros  ensayos  son  necesarios  para 
explorar la absorción intestinal de los extractos y liposoma y para confirmar que son capaces de 
ejercer algún efecto beneficioso en el organismo.  

 

 

 

 



Resultados 

147 
 

8.4. BIOACCESIBILIDAD Y ABSORCIÓN  INTESTINAL  IN VITRO DE UN EXTRACTO ACUOSO DE 
HINOJO  MARINO  (CRITHMUM  MARITIMUM)  ENCAPSULADO  EN  LIPOSOMAS  DE 
FOSFATIDILCOLINA DE SOJA 

Resumen 

Se seleccionaron el extracto acuoso de hinojo marino (Crithmum maritimum) y el liposoma de 
fosfatidilcolina de  soja  incorporando dicho  extracto  al  64 %  (con  respecto  a  la  cantidad  de 
fosfatidilcolina), para  estudiar  su biodisponibilidad  in  vitro.  El  ácido  clorogénico,  compuesto 
fenólico  mayoritario  en  el  extracto,  se  encapsuló  en  el  liposoma  con  una  eficacia  de 
encapsulación del 67 %. Tanto el extracto como el liposoma fueron sometidos a un proceso de 
digestión gastrointestinal simulada. La digestión del extracto dio lugar a una disminución en el 
contenido  de  ácido  clorogénico  del  40 %, mientras  que,  tras  la  digestión  del  liposoma,  la 
cantidad  del  compuesto  fenólico  se  incrementó  con  respecto  al  liposoma  no  digerido.  La 
cantidad de ácido clorogénico libre bioaccesible, no obstante, fue similar para el extracto y  la 
dispersión liposomal. En la dispersión liposomal, en cambio, podría haber ácido clorogénico que 
permanece encapsulado, pues los liposomas resistieron la digestión gastrointestinal. 

Posteriormente  se  evaluó  la  absorción  intestinal  del  ácido  clorogénico  del  extracto  y  de  la 
dispersión  liposomal,  a  través  de  una monocapa  de  células  Caco‐2.  El  porcentaje  de  ácido 
clorogénico  libre absorbido a  través de  la monocapa, después de 3 horas de  incubación,  fue 
significativamente igual para el extracto y el liposoma, tanto antes como después de la digestión 
gastrointestinal (≈ 1,5 %).  

Palabras clave: biodisponibilidad, bioaccesibilidad, ácido clorogénico, hinojo marino, liposomas, 
absorción intestinal, digestión gastrointestinal, células Caco‐2.  

Introducción 

La actividad biológica de los constituyentes de los alimentos está determinada, en gran medida, 
por su bioaccesibilidad y posterior biodisponibilidad. Previo a la absorción intestinal de cualquier 
compuesto, tiene lugar su liberación de la matriz alimentaria durante la digestión, generándose 
así la fracción bioaccesible. La biodisponibilidad, en cambio, es definida como la fracción que es 
absorbida y alcanza  la circulación sistémica, para distribuirse y  llegar al sitio específico donde 
puede ejercer su acción fisiológica (Porrini & Riso, 2008). La biotransformación que sufren los 
compuestos  fenólicos durante el proceso digestivo, y su posterior absorción  intestinal, van a 
determinar por tanto su efecto bioactivo en el organismo. La absorción de  la mayoría de  los 
compuestos fenólicos tiene lugar, principalmente, en el intestino delgado. La mayor parte de los 
polifenoles son estables a la acción de los ácidos estomacales (Gee et al., 1998), de forma que 
no se produce  la hidrólisis de  los mismos ni su absorción en esta  fase del proceso digestivo, 
llegando al intestino en su forma nativa. Algunos compuestos fenólicos como el ácido cafeico, sí 
son absorbidos en el estómago gracias a su forma no ionizada, sus análogos esterificados, como 
es el caso del ácido clorogénico, sin embargo, suelen atravesar el estómago intactos (Olthof et 
al.,  2001).  Algunos  autores  han  encontrado  que  el  ácido  clorogénico  puede 
disminuir/transformarse durante la fase gástrica de la digestión (Siracusa et al., 2011; Quan et 
al.,  2018),  aunque  la  mayoría  de  los  trabajos  de  investigación  coinciden  en  que  la 
degradación/transformación tiene  lugar principalmente durante  la fase  intestinal (Bermúdez‐
Soto et al., 2007; Miren et al., 2015; Dawidowicz & Typek 2011; Baeza et al., 2017), provocada 
principalmente por el pH alcalino del medio.  

Uno de los factores que determina la absorción de un compuesto es la permeabilidad a través 
de  la  mucosa  intestinal.  Diversos  estudios  confirman  que  la  determinación in  vitro de  la 
permeabilidad, mediante modelos basados en membranas artificiales usando cultivos celulares, 



Capítulo 2 

148 
 

puede  ayudar  a  predecir  la  absorción in  vivo de  un  compuesto.  Las  células  del  epitelio 
gastrointestinal humano no pueden utilizarse para  la realización de estos ensayos porque no 
forman monocapas celulares. Como alternativa,  se  suelen utilizar células procedentes de un 
adenocarcinoma  de  colon  (células  Caco‐2).  Estas  células,  que  se  parecen  morfológica  y 
bioquímicamente a los colonocitos sanos, pueden formar una monocapa celular semejante al 
epitelio  intestinal, condición  imprescindible para poder desarrollar  los estudios de absorción 
(Artursson, 1990).  

Las  células  relacionadas  con  la absorción  intestinal  son  células estructural y  funcionalmente 
polarizadas. La polarización de estas células se garantiza por una red bien organizada de uniones 
intercelulares que separan el dominio apical del dominio basolateral (Alberts et al., 2003). La 
absorción a través del epitelio intestinal puede producirse de varias maneras. Según el sentido, 
se distinguen dos tipos de transporte activo: transporte de absorción, que va preferentemente 
desde el dominio apical o lumen hacia la sangre, y transporte de secreción o eflujo, que devuelve 
al  lumen  intestinal  las moléculas  absorbidas  por  el  enterocito,  limitando  así  su  absorción. 
Diversos estudios han confirmado un transporte de absorción para el ácido clorogénico, aunque 
el porcentaje de este compuesto fenólico recuperado en el compartimento basolateral ha sido, 
en general, muy bajo, con valores inferiores al 3 % de la cantidad inicial del mismo en la matriz 
alimentaria (Miren et al., 2015; Konishy & Kobayashi, 2014; Farrel et al., 2012). 

Existen diversas razones por las que encapsular un compuesto bioactivo, algunas tecnológicas, 
como  se ha  visto  en  capítulos  anteriores,  y otras por  la posibilidad de proteger  frente  a  la 
digestión  gastrointestinal  y  favorecer  la  absorción  intestinal.  Diferentes  estrategias  se  han 
llevado a cabo para intentar mejorar la absorción intestinal de los compuestos fenólicos, entre 
las que se encuentra la encapsulación de los mismos en liposomas. En este sentido, Feng et al. 
(2016), en un estudio in vivo con ratones, lograron incrementar 1,29 veces la biodisponibilidad 
del ácido clorogénico mediante la utilización de liposomas de lecitina de soja y colesterol.  

La biodisponibilidad de los compuestos fenólicos en el intestino delgado, en general, es limitada 
(Manach et al., 2004)  lo  cual  sugiere que gran parte de  los mismos  suele  llegar al colon.  La 
microbiota colónica está constituida por una población diversa de bacterias que degradan  la 
matriz del alimento, transformando  los componentes a metabolitos microbianos. Los fenoles 
son  metabolizados  mediante  reacciones  de  hidrólisis,  reducción,  descarboxilación, 
desmetilación, deshidroxilación y rotura de anillos heterocíclicos para generar compuestos de 
menor peso molecular (Calani et al., 2012). Estos metabolitos microbianos, pueden ser entonces 
absorbidos  localmente y  llegar al hígado, donde podrían ser de nuevo  transformados dando 
lugar  a  derivados microbianos  glucuronidados  y  sulfatados  antes  de  alcanzar  la  circulación 
sistémica y posteriormente  los tejidos diana  (Scalbert & Williamson, 2000). Además de estas 
reacciones metabólicas,  tienen  lugar  cambios  en  cuanto  al  crecimiento  y  actividad  de  las 
bacterias debido a la influencia de los propios compuestos fenólicos y sus metabolitos (Requena 
et al., 2010). Jaquet et al. (2009), por ejemplo, encontraron que el consumo de tres tazas de café 
durante tres semanas producía un incremento de la actividad metabólica y en el contenido de 
Bifidobacterium  spp.,  lo  cual evidencia que  los compuestos  fenólicos del  café, entre  los que 
destaca el ácido clorogénico, pueden tener un efecto prebiótico.  

Objetivos 

El tercer objetivo parcial de este capítulo fue estudiar la biodisponibilidad in vitro del extracto 
acuoso  de  hinojo  marino  (tanto  sin  encapsular  como  encapsulado  en  liposomas  de 
fosfatidilcolina de soja); para lo cual se evaluó primeramente el efecto del proceso de digestión 
gastrointestinal  in  vitro  en  la  composición  fenólica  del  extracto  y  del  liposoma  relleno,  y 
posteriormente la absorción del ácido clorogénico, como compuesto fenólico mayoritario en el 



Resultados 

149 
 

extracto, en un modelo de epitelio intestinal, utilizando soportes permeables bicamerales con 
monocapas de células Caco‐2.  

Materiales y métodos 

Para el estudio de  la absorción  intestinal  se  seleccionó el extracto acuoso de hinojo marino 
(Crithmum maritimum), y el liposoma de fosfatidilcolina de soja incorporando dicho extracto al 
64 %  (L‐HM‐ac  64).  La  bioaccesibilidad  del  extracto  y  del  liposoma  se  estudió mediante  la 
simulación del proceso de digestión gastrointestinal in vitro. Tras ser sometidos a la digestión, 
la  fracción  soluble  se  analizó  mediante  cromatografía  líquida  de  alta  eficacia  (RP‐HPLC), 
utilizando una columna en fase reversa y siguiendo el método descrito para la identificación de 
compuestos fenólicos. Dado que únicamente se trabajó con el extracto acuoso de hinojo marino, 
en este diseño experimental HM corresponderá al extracto acuoso de hinojo y L‐HM al liposoma 
encapsulando dicho extracto.  

La posible citotoxicidad del extracto y el liposoma fue evaluada en células Caco‐2, mediante el 
ensayo de viabilidad celular utilizando el Dojindo Cell Counting Kit‐8.   

El estudio de absorción  intestinal  in vitro del ácido clorogénico, presente en el extracto y el 
liposoma, antes y después de ser sometidos a digestión gastrointestinal simulada, se llevó a cabo 
mediante un modelo celular de epitelio intestinal humano con células       Caco‐2. El seguimiento 
de la formación de la monocapa celular se realizó a través de la medida de la resistencia eléctrica 
transepitelial (TEER). 

Resultados y discusión 

Efecto del proceso de digestión gastrointestinal   

Para  determinar  la  bioaccesibilidad  del  extracto  acuoso  de  hinojo marino  (sin  encapsular  y 
encapsulado  en  nanoliposomas),  ambos  fueron  sometidos  a  un  proceso  de  digestión 
gastrointestinal simulada (DGI). Al final de la fase gástrica (2 horas con pepsina a pH 2, 37 °C, 
abreviada  como  DG),  el  perfil  cromatográfico  apenas  se  vio  modificado,  disminuyendo 
ligeramente (menos de un 5 %) la cantidad de ácido clorogénico en el extracto, y sin ninguna 
modificación apreciable en el liposoma (Figura 59). Algunos estudios han atribuido la estabilidad 
del ácido clorogénico durante la digestión gástrica al pH ácido del medio, que proporciona un 
entorno más adecuado para  la estabilidad química de este compuesto (Bermúdez‐Soto et al., 
2007).  

Al final de la fase intestinal (2 horas con sales biliares y pancreatina a pH 7,2, 37 °C, abreviada 
como  DGI),  en  cambio,  el  ácido  clorogénico  fue  mucho  más  sensible  a  la 
degradación/transformación,  y  la  cantidad  presente  en  el  extracto  disminuyó  en  un  40  %     
(Figura 59; Tabla 19). Los cromatogramas también mostraron el incremento y/o la aparición de 
algunos  compuestos no  identificados, que podrían  ser el  resultado de  la  transformación del 
ácido  clorogénico  u  otros  de  los  compuestos  fenólicos  presentes  en  el  extracto,  como 
consecuencia de  la  acción de  las  enzimas,  la  temperatura  y/o  el pH del medio.  Los nuevos 
compuestos  formados  podrían  corresponder  a  los  isómeros  ácidos  neoclorogénico  o 
criptoclorogénico (Bermudez‐Soto et al., 2007; Dawidowicz & Typek 2011). El ácido clorogénico, 
en  cambio,  no  parece  haber  sido  hidrolizado,  pues  entre  los  compuestos  formados  no 
identificamos  el  ácido  cafeico.  Estudios  previos  sugieren  que  las  enzimas  presentes  en  el 
intestino  delgado  no  suelen  influir  en  la  transformación  del  ácido  clorogénico,  y  que,  sin 
embargo,  son  la  temperatura,  y  especialmente  el  pH  alcalino  del  medio,  los  principales 
responsables de la disminución/transformación de éste ácido (Baeza et al., 2017). Estos autores 
encontraron una disminución en el contenido de este compuesto fenólico del 43‐45 % tras  la 
digestión gastrointestinal de bebidas preparadas a partir de yerba mate y café. Sengul et al. 



Capítulo 2 

150 
 

(2014) también encontraron que el ácido clorogénico, presente en un extracto de granada, fue 
estable  durante  la  fase  gástrica, pero  sufrió una  fuerte degradación  al  final del proceso de 
digestión  gastrointestinal,  cuantificándose  en  este  caso  una  pérdida  del  77  %  del mismo. 
Siracusa et al. (2011), en cambio, encontraron que el ácido clorogénico fue inestable tanto en la 
fase gástrica como en la intestinal, estudiando el efecto de la digestión gastrointestinal en una 
infusión de hinojo marino, con una pérdida final del 82 % del compuesto fenólico. Otros autores, 
por el contrario, han observado una alta estabilidad a lo largo de todo el proceso de digestión in 
vitro del ácido clorogénico presente en matrices alimentarias, como flores comestibles y semillas 
de frutas (Chen et al., 2015; Mosele et al., 2015; He et al., 2016).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 59. Perfil cromatográfico a λ 253 nm del extracto de hinojo (HM) y el liposoma encapsulando dicho 
extracto (L‐HM), antes y después de la DGI. A) Línea roja: HM. Línea verde: DG‐HM. Línea azul: DGI‐HM. 
B) Línea roja: L‐HM. Línea verde: DG‐L‐HM. Línea azul: DGI‐L‐HM. 

 

Como ya se había descrito previamente, la cantidad de ácido clorogénico que se cuantifica en el 
liposoma es un 33 %  inferior  con  respecto al extracto  sin encapsular, debido a que  sólo  se 
cuantifica el compuesto fenólico que está  libre (no encapsulado) en  la dispersión. Al final del 
proceso de digestión del  liposoma, contrario a  lo que ocurre con el extracto,  la cantidad de 

20.0 22.5 25.0 27.5 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

(x100,000)

Tiempo de retención (min)

A
b
so
rb
an
ci
a 

A 

22.0 23.0 24.0 25.0 26.0 27.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

(x100,000)

Tiempo de retención (min)

A
b
so
rb
an
ci
a 

B 



Resultados 

151 
 

clorogénico es mayor que en la dispersión liposomal sin digerir. Así, parte del ácido clorogénico 
que permanecía protegido en  los  liposomas se ha  liberado, mejorando  la bioaccesibilidad del 
clorogénico en  la dispersión  liposomal. El  incremento del compuesto  fenólico en el  liposoma 
digerido alcanza valores similares a los obtenidos para el extracto digerido (Tabla 19), por lo que 
la cantidad de ácido clorogénico libre bioaccesible, en principio, es similar para el extracto y el 
liposoma; sin embargo, podría permanecer cierta cantidad de clorogénico atrapada dentro de 
los  liposomas,  pues  los mismos  resisten  el  proceso  de DGI,  ya  que  pudimos  comprobar  la 
presencia de  liposomas  tras el proceso de digestión. Por otro  lado, como se ha mencionado 
anteriormente, durante la digestión gastrointestinal el ácido clorogénico liberado del liposoma 
también ha podido sufrir procesos de transformación.  
 

Tabla 19. Concentración del ácido clorogénico (µg/mL) presente en el extracto de hinojo y en la dispersión 
liposomal correspondiente  (antes y después de  la digestión gastrointestinal). Diferentes  letras  (a, b, c) 
indican diferencias significativas (p≤0,05) entre muestras.  

  Ácido clorogénico (µg/mL) 

Extracto de Hinojo (HM)  40,3 ± 0,3c 

Liposoma (L‐HM)  13,4 ± 0,8a 

Digerido HM (DGI‐HM)  24,2 ± 0,3b 

Digerido L‐HM (DGI‐L‐HM)  24,6 ± 0,5b 

 

Citotoxicidad 

Previo  al estudio de  absorción  intestinal,  se evaluó el posible  efecto  citotóxico del extracto 
acuoso de hinojo marino  y del  liposoma encapsulando dicho extracto, en  células Caco‐2. El 
extracto no presentó citotoxicidad a ninguna de las concentraciones estudiadas, tal y como se 
refirió  con  anterioridad.  El  liposoma,  en  cambio,  sí  provocó  una  ligera  disminución  en  la 
viabilidad celular (Figura 60). En cualquier caso, la viabilidad celular fue superior al 75 % en todas 
las concentraciones testadas. 

 

Figura  60.  Viabilidad  celular  frente  a  células  Caco‐2  (%  con  respecto  a  células  controles  sin  tratar) 
incubadas  durante  24  horas  a  diferentes  concentraciones  de  extracto  de  hinojo  (HM)  y  liposoma 
encapsulando el extracto (L‐HM). 

*  El  extracto  es  la misma  información  que  la  figura  51,  introducida  en  esta  figura  con  propósitos 
comparativos. 

0

20

40

60

80

100

120

0,5 0,1 0,05 0,01

V
ia
b
ili
d
ad

 c
el
u
la
r 
(%

)

Concentración (mg/mL)

HM
L‐HM



Capítulo 2 

152 
 

Absorción intestinal 

Para evaluar la biodisponibilidad del ácido clorogénico presente en el extracto de hinojo marino, 
se analizaron tanto el extracto como la dispersión liposomal, antes y después de ser sometidos 
al proceso de digestión gastrointestinal simulada. Para ello, se utilizó un modelo bien establecido 
de absorción consistente en soportes permeables bicamerales (Transwell), donde se sembraron 
e incubaron las células Caco‐2 hasta la formación de una monocapa diferenciada, emulando el 
paso del extracto por el intestino delgado.  

Como  puede  observarse  en  la  tabla  20,  la  cantidad  de  ácido  clorogénico  que  atravesó  la 
monocapa de células Caco‐2 aumentó con el tiempo. No obstante, la permeabilidad in vitro del 
compuesto  fenólico,  en  general,  fue  limitada,  siendo  el  contenido  en  el  compartimento 
basolateral apenas un 1,4‐1,6 % de la cantidad inicial al cabo de las 3 horas de incubación, sin 
encontrarse diferencias  significativas  si el extracto estaba encapsulado o no.  La  cantidad de 
ácido clorogénico que atraviesa  la membrana  fue, por  tanto, muy  inferior a  la cantidad  libre 
presente  tanto en el extracto como en  la dispersión  liposomal  (fracción no encapsulada). En 
estudios  similares  con  extractos  de  café,  otros  autores  también  han  encontrado  una  baja 
absorción  del  ácido  clorogénico.  Así,  Konishi  &  Kobayashi  (2004)  y  Dupas  et  al.  (2006) 
cuantificaron  en  el  compartimento  basolateral  valores  inferiores  al  1  y  1,5  %  del  ácido 
clorogénico  inicialmente analizado, mientras que Miren et al.  (2015)  llegaron a recuperar un    
2,8 % del ácido clorogénico en el compartimento basolateral. A pesar de que diversos estudios 
han demostrado que los liposomas pueden atravesar la membrana intestinal y ser absorbidos 
con  cierta  facilidad  (Sangsuriyawong  et  al.,  2019),  en  el  presente  trabajo  no  detectamos  la 
presencia de  liposomas en el compartimento basolateral. En un estudio “in vivo” en ratones, 
pudo observarse que la encapsulación del ácido clorogénico en liposomas de fosfatidilcolina de 
soja con colesterol, incrementó 1,29 veces la biodisponibilidad del compuesto fenólico y mejoró 
el efecto antioxidante del mismo (Feng et al., 2016). 
 

Tabla  20.  Porcentaje  de  ácido  clorogénico  que  atraviesa  la membrana  con  la monocapa  de  células        
Caco‐2 después de 1 h y 3 h de incubación. Diferentes letras (a) en la misma columna indican diferencias 
significativas (p≤0,05) entre muestras. 

 
 

 

 

 

 

 

 

Diferentes  estudios  describieron  un  mecanismo  preferente  de  absorción  para  el  ácido 
clorogénico, indicando que el transporte se daría preferentemente en sentido apical‐basolateral 
(Miren et al., 2015; Konishy & Kobayashi, 2014; Farrel et al., 2012). Una gran dificultad de este 
tipo de estudios  in vitro es  la  inestabilidad de  los compuestos fenólicos en  las condiciones de 
incubación.  Analizando  el  contenido  del  ácido  clorogénico  tanto  en  el  compartimento 
basolateral  como  en  el  apical,  encontramos  que,  al  cabo  de  las  3  h  de  incubación,  sólo  se 
recupera un 66‐68 % del compuesto original. Miren et al.  (2015)  recuperaron un porcentaje 
similar al de este trabajo (70 %) para el ácido clorogénico, mientras que Scherbl et al. (2014) 
observaron una degradación aún mayor con una pérdida de hasta el 60 % después de 4 horas 

  Ácido clorogénico 
 (% ‐ 1 h) 

Ácido clorogénico  
(% ‐ 3 h) 

Extracto de Hinojo (HM)  0,83 ± 0,09a  1,53 ± 0,30a 

Liposoma (L‐HM)  0,86 ± 0,12a   1,58 ± 0,43a 

Digerido HM (DGI‐HM)  0,91 ± 0,15a  1,42 ± 0,61a 

Digerido L‐HM (DGI‐L‐HM)  0,90 ± 0,08a   1,49 ± 0,52a 



Resultados 

153 
 

de incubación. Hay que tener en cuenta que se ha determinado el ácido clorogénico por ser el 
compuesto mayoritario del extracto de hinojo, pero no se ha considerado la determinación de 
otros compuestos del extracto, o bien metabolitos producidos y que hayan podio ser absorbidos. 

Estudios en humanos encontraron que, tras la ingesta de 200 mL de café (146 mg de derivados 
hidroxicinámicos, siendo un 29 % ácidos clorogénicos), la concentración máxima para el ácido 
clorogénico sin metabolizar  fue de 2,2 nM, mientras que otros metabolitos derivados  (ácido 
cafeico‐3‐O‐sulfato y  las  lactonas sulfatadas de  los ácidos 3‐cafeoilquínico y 4‐cafeoilquínico) 
alcanzaron valores de concentración máxima de 20‐92 nM (Stalmach et al., 2009).  

Los  resultados  del  presente  trabajo  igualmente  sugieren  que  la  mayor  parte  del  ácido 
clorogénico presente en el extracto de hinojo no fue absorbido en el intestino delgado, pudiendo 
alcanzar el colon donde sería susceptible de la acción de la microbiota colónica, teniendo lugar 
la formación de metabolitos microbianos que podrían ser entonces absorbidos, y/o presentando 
un posible efecto prebiótico, como el descrito por Jaquet et al. (2009) para un extracto de café 
rico en ácido clorogénico.  

Según  Recher  et  al.  (2004),  el  ácido  clorogénico,  mediante  dos  rutas  diferentes  de 
transformaciones de metabolitos intermedios que pueden ser absorbidos por el intestino grueso 
o por colon, podría dar lugar a 3‐hidroxihipúrico o acido hipúrico, respectivamente, en la última 
transformación en el hígado. Estudios futuros son necesarios para evaluar si los liposomas, y el 
ácido  clorogénico  encapsulado  en  los  mismos,  podrían  llegar  al  colon  y  ser  igualmente 
trasformados por la microbiota colónica. 

Conclusiones 

El extracto de hinojo marino es susceptible a la degradación/transformación durante el proceso 
de  digestión  gastrointestinal,  teniendo  lugar  una  disminución  en  el  contenido  de  ácido 
clorogénico  del  40  %.  Los  liposomas  resisten  la  DGI,  y  una  parte  del  ácido  clorogénico 
encapsulado en los mismos es liberado durante la fase intestinal de la digestión. Sin embargo, 
al final de la digestión gastrointestinal la cantidad de clorogénico libre bioaccesible es similar en 
el extracto y en la dispersión liposomal. La absorción intestinal del ácido clorogénico, estudiada 
a través de una monocapa de células Caco‐2, es limitada. La mayor parte del ácido clorogénico 
libre, así como el que permanece encapsulado en liposomas, debería alcanzar el colón. Estudios 
futuros  son  necesarios  para  conocer  la  transformación  y  el  efecto  de  los  liposomas  en  la 
microbiota colónica. 

 



 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CAPÍTULO 3. APLICACIÓN DE LIPOSOMAS EN 

PRODUCTOS REESTRUCTURADOS 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Resultados 

157 

 

8.5.  AGREGACIÓN  PROTEICA,  AGUA  LIGADA  Y  GELIFICACIÓN  TÉRMICA  DE MÚSCULO  DE 
MERLUZA HOMOGENEIZADO CON SAL EN PRESENCIA DE LIPOSOMAS DE FOSFATIDILCOLINA 
DE SOJA CON GLICEROL SOMETIDOS A DIFERENTES TRATAMIENTOS DE ESTABILIZACIÓN 

Resumen 

Diferentes  liposomas de fosfatidilcolina de soja estabilizados mediante diversos tratamientos, 
tales  como  alta  presión,  congelación‐descongelación,  liofilización  y  atomización,  se 
incorporaron en músculo de merluza (Merluccius merluccius) previamente homogeneizado con 
sal, para estudiar el efecto de  la adición de dichos  liposomas sobre  la agregación proteica,  la 
retención de  agua  y  la  gelificación  térmica del músculo.  Los  liposomas  tuvieron un  tamaño 
medio de partícula de 123‐507 nm y un potencial zeta entre ‐40,0 mV y ‐49,5 mV. La adición de 
liposomas disminuyó la solubilidad proteica e incrementó la capacidad de retención de agua del 
músculo de merluza homogeneizado con sal, independientemente del tamaño de partícula o la 
carga superficial de membrana de los liposomas. Además, los liposomas indujeron un aumento 
de la estabilidad térmica de la proteína, observado por Calorimetría Diferencial de Barrido, y un 
aumento del espacio entre las miofibrillas del músculo, dando lugar a más agua atrapada dentro 
de la red proteica miofibrilar, como se observó por Resonancia Magnética Nuclear de Protón de 
Bajo Campo. La presencia de  liposomas modificó el comportamiento viscoelástico e  interfirió 
con  la  agregación  térmica  de  las  proteínas  musculares,  siendo  los  mecanismos  de  esta 
interferencia diferentes en función del tipo de preparación liposomal (en dispersión o en estado 
seco). Los resultados obtenidos sugieren el posible uso de una especie de pescado altamente 
apreciada para el desarrollo de productos de pescado funcionales, de alto valor añadido gracias 
a la adición de liposomas.  

Palabras clave: homogeneizado/reestructurado de merluza, agregación proteica, agua  ligada, 
gelificación térmica, liposomas secos, fosfatidilcolina de soja.  

Introducción 

La merluza  (Merluccius merluccius) es una de  las especies demersales de pescado de aguas 
Europeas más apreciadas y  se encuentra ampliamente distribuida en  sus costas,  tanto en el 
Mediterráneo como en el Mar del Norte y al este del Océano Atlántico. 

Desde  el  01  de  Enero  de  2015,  el Reglamento UE  1380/2013,  aprobado  por  el  Parlamento 
Europeo  como  parte  de  una  Política  Pesquera  Común  para  la  conservación  y  explotación 
sostenible  de  los  recursos  pesqueros,  ha  comenzado  a  implementar  la  obligación  de 
desembarque  para  las  pesquerías  comerciales  con  Captura  Total  Permitida  (TAC)  o  con  un 
Tamaño Mínimo de Desembarque (MLS) en aguas europeas y para barcos europeos que pescan 
en alta mar. El pescado descartado no puede utilizarse para el consumo humano directo; sin 
embargo, una transformación apropiada en productos pesqueros gelificados representaría un 
uso económicamente rentable de estos recursos. 

La merluza  europea  es  una  especie  con  un  elevado  valor  económico,  que  normalmente  se 
consume en fresco o en filetes y piezas congeladas. Cuando se excede la cuota de captura, la 
excelente capacidad para  formar gel de  las proteínas musculares de esta especie  le podrían 
permitir ser usada para obtener productos saludables alternativos con un alto valor añadido 
(Martelo‐Vidal et al., 2016; Moreno et al., 2010). La merluza posee un color claro, bajo contenido 
en grasa y sabor suave, características muy adecuadas para el desarrollo productos funcionales 
basados  en  geles  con  la  incorporación  de  nutrientes  específicos  o  compuestos  bioactivos. 
Algunos autores han empleado homogeneizados de merluza, de otras especies de menor valor 
comercial, para la obtención de productos reestructurados de pescado, como Zhou & Li‐Chan 
(2009) con M. productus y Cardoso et al. (2008) con M. capensis.  



Capítulo 3 

158 

 

La encapsulación de compuestos bioactivos en liposomas mejora su eficacia y su resistencia a la 
degradación en sistemas alimentarios (Da Silva Malheiros et al., 2010; Mozafari et al., 2008). Las 
suspensiones  liposomales son estables durante un tiempo  limitado, a partir del cual, eventos 
como  la  agregación,  oxidación  o  desprendimiento  del  bioactivo  pueden  tener  lugar.  Para 
mejorar la estabilidad existen diferentes métodos tecnológicos, tales como la congelación (Chen 
et al., 2010), la liofilización (Sebaaly et al., 2016) o la atomización (Gültekin‐Özgüven et al., 2016). 
Además,  la adición de crioprotectores protege a  las bicapas frente al daño por congelación y 
liofilización (Stark et al., 2010). La alta presión hidrostática (APH) es una pasteurización en frío 
implementada  en  la  industria  alimentaria,  por  lo  que  también  se  considera  un  proceso 
alternativo para  la preservación y descontaminación de sistemas alimentarios (Rigaldie et al., 
2003).  

Actualmente  no  existe  información  disponible  acerca  de  la  influencia  de  las  propiedades 
hidrodinámicas de partícula y del estado  físico de  liposomas en  la agregación  térmica de  las 
proteínas musculares de pescado, lo que podría ser de interés para el desarrollo de productos 
de pescado gelificados funcionales con propiedades tecnológicas y sensoriales adecuadas.  

Objetivos 

El primer objetivo parcial de este capítulo fue evaluar el impacto de diferentes tratamientos de 
estabilización  (alta  presión,  congelación‐descongelación,  liofilización  y  atomización)  en  las 
propiedades  de  liposomas  de  fosfatidilcolina  de  soja  y  estudiar  el  efecto  de  la  adición  de 
diferentes  tipos  de  liposomas  en  la  agregación  proteica,  capacidad  de  retención  de  agua  y 
propiedades gelificantes de músculo de merluza, previamente homogeneizado con sal, utilizado 
como sistema modelo para el desarrollo de productos de pescado funcionales con base de gel.  

Materiales y métodos 

Inicialmente se extrajo fosfatidilcolina parcialmente purificada tras cinco  lavados con acetona 
(FC5) de la lecitina de soja (LS).  

Seguidamente, se prepararon dos formulaciones liposomales diferentes, una con glicerol y otra 
sin glicerol, en  la que  la cantidad correspondiente al glicerol  se  sustituye por buffer  fosfato. 
Posteriormente, ambas dispersiones se sometieron a diferentes tratamientos de estabilización: 
alta presión hidrostática, congelación‐descongelación, liofilización y atomización.  

El tratamiento de alta presión (AP) se aplicó en un equipo de alta presión bajo condiciones de 
600 MPa, 20 °C y 20 min (1 ciclo). Los liposomas denominados congelados‐descongelados (CD) 
fueron congelados a ‐20 °C durante 24 h y después se descongelaron a temperatura ambiente. 
Los  liposomas  sometidos  a  liofilización  (LF)  se  congelaron a  ‐80  °C  y después  se  liofilizaron, 
mientras  que  los  liposomas  sometidos  a  atomización  (A)  se  atomizaron  directamente  a 
condiciones de  temperatura  interna de 170  °C,  temperatura externa de 89  °C, aspiración de        
70 %, bomba 20 % y con flujo de aire de 45 mm. Una suspensión control basada en liposomas 
sin  tratamiento  tecnológico se estudió en paralelo  (F,  fresco). De esta manera se obtuvieron 
diferentes liposomas en función del tratamiento y de la formulación de partida: fresco (F), alta 
presión  (AP),  congelado‐descongelado  (CD),  congelado‐descongelado  con  glicerol  (CD‐G), 
liofilizado (LF), liofilizado con glicerol (LF‐G) y atomizado (A).  

Todas  las  dispersiones  liposomales  en  estado  fresco  se  concentraron  por  centrifugación  a      
4000  g  y  2  °C  durante  1  h  empleando  filtros  de  centrífuga,  obteniéndose  porcentajes  de 
concentración del 25,0 % para F; 24,6 % para AP; 6,4 % para CD; y 19,2 % para CD‐G; y  se 
conservaron  a  4  °C  hasta  su  utilización.  En  cambio,  los  liposomas  secados  mediante  los 
tratamientos de liofilización y atomización (LF, LF‐G y A) se mantuvieron a ‐20 °C.  



Resultados 

159 

 

De todos estos  liposomas se estudiaron sus propiedades hidrodinámicas mediante dispersión 
dinámica  de  luz  en  Zetasizer.  Las  preparaciones  desecadas  (liofilizados  y  atomizados)  se 
rehidrataron previamente a una concentración de 77 mg/mL. A  todas  las dispersiones se  les 
aplicó una dilución posterior 1/10 para realizar la medida. También se determinó el contenido 
en agua y la dispersabilidad en agua.  

A  continuación,  los  liposomas  estabilizados  con  diversos  tratamientos  se  incorporaron  en 
músculo  de merluza  fresco.  Las  dispersiones  liposomales  (F,  AP,  CD  y  CD‐G)  se  añadieron          
(1:2,  v/p)  al  músculo  de  merluza,  previamente  homogeneizado  con  sal  (NaCl  1  %),  y  se 
homogenizó  la mezcla  durante  2 min.  Por  su  parte,  los  liposomas  secos  (LF,  LF‐G  y  A)  se 
incorporaron al músculo,  también previamente homogeneizado  con  sal  (NaCl 1 %), en  igual 
proporción (1:2), pero de diferente manera. Inicialmente, 4,69 g de LF; 6,48 g de LF‐G; y 6,47 g 
de A se añadieron al músculo y se homogeneizaron durante 1 min. Seguidamente, la mezcla se 
completó  con  agua  desionizada  hasta  conseguir  la  proporción  1:2,  y  se  homogeneizó 
nuevamente durante 3 min más. De esta forma, ambas formulaciones (dispersiones y liposomas 
secos) estuvieron en  la misma proporción con respecto al músculo  (1:2) y tuvieron  la misma 
cantidad de peso seco. Un homogeneizado control sin liposomas añadidos (MC) se estudió en 
paralelo. Los homogeneizados o masas se conservaron a 4 °C hasta su uso.  

De  los  homogeneizados  de  merluza  con  liposomas  se  caracterizó  su  contenido  en  agua, 
solubilidad proteica, cantidad de agua ligada mediante la técnica de capacidad de retención de 
agua  y  por  Resonancia Magnética  Nuclear  de  Protón  de  Bajo  Campo,  propiedades  físicas 
mediante Calorimetría Diferencial de Barrido y reología dinámica oscilatoria. Los agregados de 
su fracción de proteína soluble (obtenida de la técnica de solubilidad proteica) se caracterizaron 
mediante  electroforesis  en  gel  de  poliacrilamida  y  dispersión  dinámica  de  luz  en  Zetasizer 
(dilución 1/100).  

Finalmente, los homogeneizados se sometieron a un proceso de gelificación y se estudiaron sus 
propiedades mecánicas mediante texturometría.  

Resultados y discusión 

Caracterización de liposomas estabilizados con diversos tratamientos  

Características de partícula 

Se  analizaron  las propiedades de  partícula de  liposomas  sometidos  a diversos  tratamientos 
(Tabla 21).  
 

Tabla 21. Tamaño (nm),  índice de polidispersidad y potencial zeta (mV) de  liposomas estabilizados con 
diversos  procesados,  donde  F:  fresco;  AP:  alta  presión;  CD:  congelado/descongelado;  CD‐G: 
congelado/descongelado con glicerol; LF: liofilizado; LF‐G: liofilizado con glicerol; A: atomizado. Diferentes 
letras (a, b, c, d, e, f) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre liposomas.  

  Tamaño  
(nm) 

Índice de 
polidispersidad 

Potencial Zeta 
(mV) 

F  141,3 ± 1,9b 0,225 ± 0,003a ‐44,8 ± 1,8b 

AP  141,4 ± 1,2b 0,228 ± 0,008a ‐45,0 ± 1,7b 

CD    507,1 ± 12,6e 0,545 ± 0,014c ‐39,6 ± 1,2c 

CD‐G  123,3 ± 1,0a  0,220 ± 0,011a ‐42,9 ± 1,8b 

LF  181,0 ± 5,2c 0,332 ± 0,033b ‐44,3 ± 1,7b 

LF‐G  274,6 ± 5,8d 0,383 ± 0,055b ‐49,5 ± 1,0a 

A  177,9 ± 2,8c 0,393 ± 0,025b ‐44,6 ± 0,6b 

 



Capítulo 3 

160 

 

El tratamiento de alta presión (AP) no modificó ninguna característica de partícula (p>0,05) de 
los liposomas, pues tanto los liposomas de alta presión como los liposomas frescos (control sin 
tratamiento,  F) mostraron  los mismos  valores  de  tamaño medio  (141  nm)  y  potencial  zeta              
(‐45 mV). Además, mostraron valores muy parecidos de  índice de polidispersidad (≈0,23),  los 
cuales  se  reflejaron  gráficamente  en  la  figura 61, donde  ambos mostraron una distribución 
monomodal muy similar. 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 61. Distribución de  tamaños de partícula de  liposomas  estabilizados  con diversos procesados, 
donde  F:  fresco;  AP:  alta  presión;  CD:  congelado/descongelado;  CD‐G:  congelado/descongelado  con 
glicerol; LF: liofilizado; LF‐G: liofilizado con glicerol; A: atomizado. 

 

Estos  resultados  indican  que  las  dispersiones  liposomales  podrían  ser  estabilizadas  con 
tratamientos de altas presiones a 600 MPa sin sufrir efectos de agregación o fusión. Las altas 
presiones  se emplean habitualmente para  la  inhibición del  crecimiento de microorganismos 
presentes en  los alimentos, por  lo que  los  liposomas podrían ser estabilizados mediante este 
método desde un punto de visto microbiológico. Sin embargo, Perrier‐Cornet & Gervais (2005) 
observaron cambios morfológicos consistentes en interdigitación y cambios en la fluidez de la 
membrana  lipídica  cuando  sometieron  los  liposomas  a  un  tratamiento  moderado  de  alta 
presión, por lo que pequeños cambios en los liposomas no podrían ser descartados. Aun así, las 
imágenes de microscopía de estos liposomas (Figura 62) no mostraron cambios evidentes en la 
morfología de  los  liposomas  sometidos  a  altas presiones  (AP), presentando  visualmente un 
tamaño medio y heterogeneidad de tamaños similar a la de los liposomas frescos (F), así como 
la presencia de algunas invaginaciones similares en ambas muestras.  
 

     

 

 

 

 

 

 

Figura 62. Microscopía electrónica de transmisión mediante criofijación de los liposomas estabilizados. A) 
Dispersión  liposomal  fresca  (F). B) Dispersión  liposomal  sometida  a  tratamiento de  altas presiones  a        
600 MPa (AP).  

0

2

4

6

8

10

12

14

10 100 1000 10000

In
te
n
si
d
ad

 (
%
)

Tamaño (nm)

F

AP

CD

CD‐G

LF

LF‐G

A

500 nm 

A B 

500 nm 



Resultados 

161 

 

El tratamiento de congelación/descongelación (CD) indujo un notable incremento (p≤0,05) del 
tamaño medio  (507,1 nm) y del  índice de polidispersidad  (0,545), y una pequeña  reducción 
(p≤0,05) de la carga electronegativa de la membrana (‐39,6 mV) con respecto a los liposomas 
frescos. Además, mostraron una distribución de  tamaños bimodal, con un mayor número de 
vesículas de tamaño ≈1 µm y una menor proporción de vesículas del tamaño original de 140 nm. 
Estas diferencias con el control  indican que el proceso de congelación está produciendo una 
serie de cambios morfológicos en  los  liposomas. Estos cambios  implican un mayor grado de 
agregación vesicular y una menor estabilidad liposomal.  

Los  liposomas  sometidos  al  mismo  tratamiento  de  congelación/descongelación  pero 
incorporando  el  crioprotector  glicerol  (CD‐G) mostraron mejores  propiedades  de  partícula 
(menor  tamaño  e  índice  de  polidispersidad  y  potencial más  electronegativo,  así  como  una 
distribución monomodal con una única población de pequeño tamaño) que  los  liposomas sin 
glicerol (CD) (p≤0,05). Esto demuestra que el glicerol está ejerciendo un efecto protector sobre 
los liposomas frente a los daños ocasionados por el proceso de congelación/descongelación. El 
glicerol es un reconocido crioprotector de liposomas que mejora la estabilidad de las vesículas 
y  evita  la  agregación  o  sedimentación  de  partículas  frente  a  los  procesos  de  congelación  y 
descongelación de la muestra (Mozafari, 2005).  

El tratamiento de liofilización (LF) indujo un aumento (p≤0,05) del tamaño medio (181,0 nm) y 
del  índice de polidispersidad  (0,332) con  respecto al control,  sin cambios  significativos en el 
potencial zeta (‐44,3 mV), lo que significa que no altera la estabilidad de los liposomas pero sí 
modifica el tamaño de las vesículas. Este efecto se atribuye a que el proceso de eliminación del 
agua produjo  la  rotura de puentes de hidrógeno entre  las moléculas de  agua  y  las  cabezas 
polares de los fosfolípidos de membrana, desencadenando un efecto de agregación (Stark et al., 
2010), el cual provoca el incremento del tamaño medio vesicular.  

Los liposomas liofilizados con glicerol (LF‐G) experimentaron un incremento (p≤0,05) del tamaño 
medio con respecto a sus correspondientes liposomas sin glicerol (LF), sin cambios significativos 
en el índice de polidispersidad (todos mostraron una distribución claramente monomodal con 
una  única  población  definida  de  pequeño  tamaño)  y  potencial  zeta,  aunque  este  último 
parámetro tornó hacia valores más electronegativos. La adición de glicerol ya se ha descrito que 
incrementa el tamaño de las vesículas (Manca et al., 2013). Sin embargo, Ohtake et al. (2006) 
no  observaron  incremento  en  el  tamaño medio  en  liposomas  de  dipalmitoilfosfatidilcolina 
congelados y  liofilizados. El glicerol, de acuerdo  con Mozafari  (2005),  también protege a  los 
liposomas  frente  a  los  daños  ocasionados  por  el  proceso  de  liofilización.  El  incremento 
observado podría atribuirse a su distribución desigual a lo largo de la membrana (Christensen et 
al., 2007).  

El tratamiento de atomización (A) presentó las mismas diferencias con respecto a los liposomas 
frescos que los liposomas liofilizados (LF), es decir, mantuvo la estabilidad de membrana pero 
incrementó el tamaño medio y el índice de polidispersidad, ya que estos dos liposomas tratados 
mostraron valores muy similares  (p>0,05) para  los  tres parámetros de partícula. Este mismo 
efecto  lo observaron  Frenzel et al.  (2015)  comparando entre  liposomas  frescos  y  liposomas 
atomizados.  Estos  resultados  sugieren  que  los  pequeños  cambios  de  tamaño  de  partícula 
observados tanto en liofilizados (LF) como en atomizados (A) con respecto a los frescos (F) son 
debidos al proceso de desecación de  los  liposomas. Sin embargo,  los grandes cambios en el 
tamaño medio están relacionados con el proceso de congelación. El glicerol puede alterar estas 
características de partícula.  

Los  liposomas  atomizados  presentaron  un  tamaño  de  177,9  nm,  valor muy  inferior  a  los 
obtenidos por otros autores como Frenzel et al. (2015) o Wang et al. (2015) (400‐430 nm), lo 
que se atribuye a las diferentes condiciones en el proceso de secado así como al tamaño inicial 
de los liposomas antes de ser tratados. Telang & Thorat (2010) demostraron que las variaciones 



Capítulo 3 

162 

 

en las condiciones de atomización (temperatura, presión, tasas de aspiración, de flujo de aire y 
de flujo de alimentación) tienen una fuerte influencia en el tamaño final de los liposomas, así 
como en otras propiedades físicas.  

Contenido en agua 

El contenido en agua de las dispersiones liposomales tratadas (Tabla 22) fue muy elevado, con 
valores comprendidos entre 91,6‐94,0 %, dado que son muestras en estado líquido.  
 

Tabla 22. Contenido en agua (%) y dispersabilidad en agua (%) de liposomas estabilizados con diversos 
procesados,  donde  F:  fresco;  AP:  alta  presión;  CD:  congelado/descongelado;  CD‐G: 
congelado/descongelado con glicerol; LF: liofilizado; LF‐G: liofilizado con glicerol; A: atomizado. Diferentes 
letras (a, b, c, d, e, f) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre liposomas. 

  Contenido en 
agua (%) 

Dispersabilidad en 
agua (%) 

F  93,03 ± 0,01d 100,0 ± 0,79b

AP  93,44 ± 0,38d 100,0 ± 3,69b

CD  94,04 ± 0,06d 100,0 ± 9,14b

CD‐G  92,64 ± 0,20d 93,40 ± 0,53b

LF    4,78 ± 0,72a 100,0 ± 1,55b

LF‐G  14,87 ± 2,12b 71,29 ± 1,81a

A  19,20 ± 0,84c 99,01 ± 0,54b

 

En cuanto a los liposomas desecados, su contenido en agua fue menor que en las dispersiones 
ya que son sometidos a procesos que eliminan parte del agua contenida en la muestra, siendo 
sus  valores  del  14,9 %  para  LF‐G  y  del  19,2 %  para A  (presentaron  una  consistencia  grasa, 
atribuida a la presencia de glicerol y al método de secado, respectivamente) y del 4,8 % para LF 
(con una consistencia de polvo fino debida a la ausencia de glicerol). La considerable proporción 
de agua residual retenida en las muestras LF‐G y A pudo deberse a que los procesos de secado 
no  se  realizaron  de  acuerdo  a  los  requerimientos  específicos  de  estas  formulaciones.  En 
concreto, el elevado valor de contenido en agua para los liposomas atomizados (A) podría ser 
atribuido a la alta tasa de aspiración empleada en el proceso de atomización (70 %), que podría 
dificultar la correcta extracción de agua de la muestra (Telang & Thorat, 2010). Cada preparación 
liposomal ofrece una serie de posibilidades diferentes en función de su textura y consistencia, 
siendo todas ellas muy estables y con buenas propiedades de partícula. 

Dispersabilidad en agua 

La dispersabilidad en agua de los liposomas en formato de dispersión fue excelente, con valores 
del 100 % para los liposomas F, AP y CD, y ligeramente inferior para los liposomas que tienen 
incorporado crioprotectores, CD‐G (93,4 %). Estos menores valores se debieron a la presencia 
de glicerol en las formulaciones liposomales. Las diferencias observadas en el contenido de agua 
residual no fueron determinantes en la capacidad de dispersabilidad en agua de los liposomas 
en  formato  deshidratado  (Tabla  22),  pues  todos  ellos  presentaron muy  elevadas  tasas  de 
dispersabilidad: 100 % para LF y 99,0 % para A, a excepción de LF‐G que mostró un valor de     
71,3 %,  confirmando  que  el  glicerol  dificulta  la  dispersabilidad  en  agua.  El  glicerol  evita  la 
agregación de los liposomas y ejerce otros efectos beneficiosos sobre ellos, pero puede que no 
sea el crioprotector más adecuado si  los  liposomas van a ser  liofilizados. En este caso, otros 
crioprotectores, como la trealosa, podrían ser más indicados (Stark et al., 2010).  

 

 



Resultados 

163 

 

Caracterización de homogeneizados de merluza formulados con liposomas  

Contenido en agua  

El  contenido  en  agua  de  los  homogeneizados  de  merluza  (Tabla  23)  (82,3‐86,9  %)  fue 
ligeramente superior al del músculo entero sin tratar (80,5 %), probablemente debido al agua 
extra  añadida  en  las  formulaciones,  procedente  bien  directamente  de  las  dispersiones 
liposomales, o bien del agua añadida en los homogeneizados con liposomas secos y en la masa 
sin liposomas con el fin de ajustar el contenido de humedad final. Entre los homogeneizados, 
aquellos con liposomas incorporados tuvieron valores muy similares (84,0‐85,6 %), ligeramente 
inferiores al del homogeneizado sin liposomas (MC), que fue del 86,9 %. Esta diferencia se debe 
a  la  fracción  de materia  seca  presente  tanto  en  las  dispersiones  liposomales  como  en  los 
liposomas  secos  que  no  fue  adicionada  en  el  homogeneizado  control. No  hubo  diferencias 
apreciables  en  el  contenido  en  humedad  entre  homogeneizados  en  función  del  tipo  de 
preparación liposomal incorporada.  

Solubilidad proteica 

La solubilidad proteica de las masas (Tabla 23) fue mayor (p≤0,05) para el control (MC, 78,95 %) 
que para las que incorporan liposomas (55,94‐74,59 %), lo que indica que los liposomas inducen 
la  agregación  de  la  proteína  miofibrilar  en  los  homogeneizados  de  merluza  mediante  su 
interacción  con  las  proteínas  musculares,  una  vez  desplegadas  por  la  adición  del  NaCl. 
Comparando  la  solubilidad de  los homogeneizados  con  liposomas, en  todos ellos estuvo en 
torno al 70 %, a excepción de los liposomas liofilizados, que mostraron valores del 55,94 % para 
LF y del 62,66 % para LF‐G, indicativos de un mayor grado de agregación.  

Esta reducción de la solubilidad proteica en las masas con LF y LF‐G no fue consecuencia de las 
características de partícula de los liposomas, puesto que otros liposomas tanto de mayor como 
de  menor  tamaño  obtuvieron  mayor  solubilidad  y  en  todos  los  casos  los  potenciales  de 
membrana fueron muy parecidos. Tampoco fue debida a sus menores valores de dispersabilidad 
en agua ya que  los  liposomas LF presentaron una mayor dispersabilidad en agua pero menor 
solubilidad proteica en la masa. La única diferencia destacable de estos liposomas fue su menor 
contenido en agua,  siendo del 4,78 % para  LF y del 14,87 % para  LF‐G. Por  tanto,  la mayor 
agregación  proteica  inducida  por  estos  liposomas  podría  relacionarse  con  una  mayor 
competitividad  con  las  proteínas  miofibrilares  por  las  moléculas  de  agua,  causando 
deshidratación  y  agregación  del  músculo.  Este  efecto  no  se  observó  con  los  liposomas 
atomizados  (71,04 %  de  solubilidad  proteica)  probablemente  porque  éstos  presentaron  un 
mayor contenido en agua (19,20 %). Esto concuerda con la mayor solubilidad proteica de la masa 
con los liposomas desecados de mayor contenido de agua, los liposomas LF‐G respecto a LF.  

Capacidad de retención de agua 

La capacidad de retención de agua (Tabla 23) fue considerablemente más alta (p≤0,05) en las 
muestras que contienen liposomas que en el lote control. No se pudo establecer una relación 
clara entre este parámetro y la solubilidad de la proteína en las muestras estudiadas, pero los 
valores  se  correlacionaron  inversamente  con  los  valores de humedad  (r  =  ‐0,81).  En  el  lote 
control, que presentó la humedad más alta, probablemente se añadió demasiada agua (añadida 
para igualar el contenido al resto de las formulaciones), por lo que la proteína desplegada no 
fue capaz de retenerla adecuadamente. Por el contrario, en los lotes que contienen liposomas, 
las moléculas de agua podrían unirse eficientemente a los grupos de las cabezas polares en la 
superficie de la membrana de los liposomas, lo que podría aumentar el estado de hidratación 
general  de  la  proteína miofibrilar  circundante.  Este  efecto  fue menos  pronunciado  en  las 
preparaciones  liposomales secas. La adición de glicerol a  la  formulación de  liposomas redujo 
ligeramente  (p≤0,05)  el  contenido  de  humedad  en  los músculos  homogeneizados  con  sal 



Capítulo 3 

164 

 

correspondientes (FT‐G vs. FT y FD‐G vs. D), con un aumento concomitante de la capacidad de 
retención de agua. En general, el tamaño de los liposomas o la carga de la membrana superficial 
no tuvieron un efecto significativo sobre  la capacidad de retención de agua del músculo o  la 
solubilidad  de  la  proteína.  Sin  embargo,  el  bajo  contenido  de  humedad  en  los  liposomas 
deshidratados parece  ser una  característica más  importante en  la  reducción  tanto del  agua 
ligada como del contenido de proteína soluble, probablemente al competir con las cadenas de 
proteínas por  las moléculas de agua. Entre  todos  los  lotes con  liposomas, el que contenía el 
producto liofilizado (FD) presentó los valores más bajos tanto de agua ligada como de solubilidad 
de proteína.  
 

Tabla  23.  Contenido  en  agua  (%),  solubilidad  proteica  (%)  y  capacidad  de  retención  de  agua  (%)  de 
homogeneizados de músculo de merluza con sal control (MC) y con  la adición de diferentes  liposomas 
estabilizados. F:  fresco; AP: alta presión; CD: congelado/descongelado; CD‐G: congelado/descongelado 
con glicerol; LF: liofilizado; LF‐G: liofilizado con glicerol; A: atomizado. Diferentes letras (a, b, c, d, e, f) en 
la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre homogeneizados.  

 

Contenido en 
agua (%) 

Solubilidad proteica (%) 
Capacidad de 

retención de agua 
(%) 

MC  86,87 ± 0,05f  78,95 ± 0,98e    69,13 ± 4,20a 

F  84,59 ± 0,06c    73,93 ± 2,52cd      87,17 ± 2,64cd 

AP  84,39 ± 0,04b    68,66 ± 0,95bc    91,37 ± 1,28d 

CD  85,60 ± 0,06e    74,59 ± 0,96cd      82,10 ± 3,88bc 

CD‐G  84,07 ± 0,01a    69,30 ± 0,73bc    92,12 ± 1,75d 

LF  84,91 ± 0,03d  55,94 ± 0,27a   76,02 ± 2,02b 

LF‐G  83,98 ± 0,06a  62,66 ± 0,69b    83,78 ± 2,52c 

A  84,59 ± 0,12c  71,04 ± 4,69c      81,30 ± 2,66bc 

 

Perfil electroforético 

El perfil electroforético en SDS‐PAGE de la fracción soluble de los homogeneizados de merluza 
(Figura 63) reflejó la calidad de la proteína muscular desde un punto de vista cualitativo.  

Todos ellos presentaron el mismo patrón de pesos moleculares, incluido el control (MC). Este 
patrón  común  se  caracterizó  por  la  predominancia  de  una  banda muy  intensa  a  ≈200  kDa 
asignada  a  la  cadena  pesada  de  la  miosina,  así  como  por  la  presencia  de  otras  bandas 
minoritarias  de  pesos  moleculares  inferiores  a  50  kDa  asociadas  con  otros  componentes 
proteicos miofibrilares  importantes, como son actina, troponinas, tropomiosina y  las cadenas 
ligeras de la miosina (Paredi et al., 2010). Además, una cierta cantidad de agregados proteicos 
que  no  entraron  en  el  gel  debido  a  su  elevado  peso molecular  se  observaron  en  todas  las 
muestras en la parte superior del gel, en la zona de aplicación de la muestra. Estos resultados 
indican  que,  independientemente  del  tipo  de  preparación  liposomal  añadida,  las  proteínas 
miofibrilares se solubilizaron de un modo similar desde un punto de vista cualitativo, y sugieren 
que en esta fracción soluble no se dan interacciones covalentes proteína‐lípido entre proteína 
muscular y liposomas. La menor solubilidad proteica de los homogeneizados con liposomas se 
atribuye  a  interacciones  no  covalentes,  probablemente  de  puentes  de  hidrógeno  entre  las 
cadenas  laterales  de  la  proteína  y  los  grupos  polares  de membrana  de  los  liposomas  o  a 
moléculas de agua adheridas.  

 

 



Resultados 

165 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 63. Perfil electroforético  (SDS‐PAGE) de  la  fracción  soluble de homogeneizados de músculo de 
merluza con sal control  (MC) y con  la adición de diferentes  liposomas estabilizados. F: fresco; AP: alta 
presión; CD: congelado/descongelado; CD‐G: congelado/descongelado con glicerol; LF: liofilizado; LF‐G: 
liofilizado con glicerol; A: atomizado. 
 

La tabla 24 muestra el potencial zeta en la fracción soluble de las masas. El potencial zeta abarcó 
un estrecho rango desde ‐19,2 mV hasta ‐28,7 mV. Estos valores fueron ligeramente superiores 
a  los obtenidos por Vate & Benjakul  (2016) para  soluciones de actomiosina procedentes de 
músculo de sardina.  
 

Tabla 24.  Índice de polidispersidad y zeta‐potencial (mV) de  la fracción soluble de homogeneizados de 
músculo de merluza  con  sal  control  (MC)  y  con  la  adición  de diferentes  liposomas  estabilizados por 
dispersión  dinámica  de  luz.  F:  fresco;  AP:  alta  presión;  CD:  congelado/descongelado;  CD‐G: 
congelado/descongelado con glicerol; LF: liofilizado; LF‐G: liofilizado con glicerol; A: atomizado. Diferentes 
letras (a, b, c, d, e) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre homogeneizados.  
 

 Índice de 
polidispersidad 

Potencial Zeta
(mV) 

MC  0,871 ± 0,112b  ‐20,8 ± 1,4bc 

F  0,881 ± 0,094b  ‐19,2 ± 2,2c 

AP  0,795 ± 0,105ab  ‐21,8 ± 0,4bc 

CD  0,816 ± 0,062ab  ‐28,7 ± 1,1a 

CD‐G  0,846 ± 0,054b  ‐19,5 ± 0,0c 

LF  0,688 ± 0,075ab  ‐24,5 ± 1,3b 

LF‐G  0,623 ± 0,043a  ‐21,2 ± 2,7bc 

AP  0,690 ± 0,044ab  ‐24,2 ± 1,0b 

MC F AP LF CD LF-G CD-G A 

250 

150 

20 

75 

50 

37 

25 

100 

15 

kDa 

Miosina 

Actina 



Capítulo 3 

166 

 

La carga neta electronegativa del músculo control MC (‐20,8 mV) podría ser el resultado de la 
desprotonación de los aminoácidos acídicos, como el ácido glutámico y el ácido aspártico, los 
cuales son abundantes en el músculo de pescado. La carga electronegativa correspondiente a 
los homogeneizados con liposomas no mostró diferencias (p≤0,05) con el control, excepto con 
las vesículas que fueron congeladas y descongeladas (CD) (‐28,7 mV), a pesar de la fuerte carga 
electronegativa de  los  liposomas. Estos  resultados pueden  indicar que se están produciendo 
repulsiones electrostáticas entre  las cargas negativas de  los grupos carboxilo de  las proteínas 
musculares y los grupos fosfato de las cabezas polares de la membrana de los liposomas (que 
hacen que el potencial negativo no varíe), ocasionando que los cambios conformacionales por 
la interacción entre ambos componentes sean mínimos. 

Caracterización de agregados mediante dispersión dinámica de luz en Zetasizer 

La técnica de dispersión dinámica de luz permitió un estudio más minucioso del tamaño de los 
agregados proteicos presentes en la fracción soluble de los homogeneizados, no evidenciado en 
el estudio electroforético.  

Las fracciones solubles presentaron distribuciones de tamaños bimodales y trimodales (Figura 
64),  indicativas  del  elevado  índice  de  polidispersidad  de  todos  los  homogeneizados                 
(0,623‐0,881).  Se  observó  una  primera  población  de  menor  intensidad  con  tamaños 
comprendidos entre 100‐170 nm. Se descarta que este tamaño pueda ser debido a los liposomas 
libres de la fracción soluble, ya que la población también fue observada para la fracción soluble 
del homogeneizado  control  sin  liposomas. Por  tanto, esta población de pequeño  tamaño  se 
podría atribuir a la molécula de miosina, cuya longitud es de ≈164 nm (Lanier et al., 2013). 

Se apreció una segunda población mayoritaria de amplio rango de tamaños entre 460‐830 nm, 
probablemente atribuidos a agregados proteicos solubles, ya que se presentaron para todas las 
masas,  incluida MC. Para esta población mayoritaria  se observaron diferencias entre el  lote 
control y el resto de homogeneizados, debidas en parte a la interacción de los liposomas con la 
matriz muscular. En cuanto a las masas con las dispersiones liposomales (Figura 64A), mientras 
que F y CD‐G no mostraron diferencias con respecto al control MC (≈712 nm), CD incrementó el 
tamaño de esta segunda población hasta los ≈825 nm (además de incrementar la intensidad de 
este pico) y AP lo redujo hasta los ≈531 nm (reduciendo también la intensidad del pico), a pesar 
de tener las mismas propiedades de partícula que F. Además, AP presentó una tercera población 
asociada  a  agregados proteicos de  gran  tamaño  (≈5,5 µm).  Estos  resultados  en AP parecen 
indicar la desintegración de agregados proteicos en otros de menor tamaño paralelamente a la 
aparición  de  otros  agregados  de  gran  tamaño.  Estas  diferencias  podrían  deberse  al 
procesamiento inicial de los liposomas de alta presión, que podría haber promovido la unión de 
moléculas de agua a la superficie de membrana mediante puentes de hidrógeno, afectando así 
a  las  interacciones  proteína‐proteína,  creando mayor  alteración  conformacional  proteica  y 
dando lugar a agregados proteicos de mayor tamaño que en el resto de homogeneizados con 
dispersiones liposomales.  

Por otro lado, los liposomas liofilizados (Figura 64B) modificaron en mayor medida la intensidad 
y el  tamaño de estos agregados proteicos,  reduciendo  sus  tamaños hasta  los  ≈459 nm.  Los 
liposomas  atomizados  (Figura  64B),  en  cambio, mantuvieron  el  tamaño  en  ≈825  nm  pero 
disminuyeron notablemente la intensidad de este pico. Estos tres liposomas secos (LF, LF‐G y A) 
también  presentaron  agregados  proteicos  de  elevado  tamaño  (≈5,5  µm).  Estos  resultados 
confirman la mayor alteración conformacional proteica en estos homogeneizados y estuvieron 
en concordancia con la baja solubilidad proteica encontrada en ellos, lo que sugiere que estos 
tres liposomas podrían dificultar la adecuada desnaturalización y solubilización de los músculos 
de merluza, dando lugar a estructuras más agregadas.  



Resultados 

167 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 64. Distribución de tamaños de partícula de la fracción soluble de homogeneizados de músculo de 
merluza  con  sal  control  (MC)  y  con  la  adición  de  diferentes  liposomas  estabilizados  por  dispersión 
dinámica de luz. F: fresco; AP: alta presión; CD: congelado/descongelado; CD‐G: congelado/descongelado 
con  glicerol;  LF:  liofilizado;  LF‐G:  liofilizado  con  glicerol;  A:  atomizado.  A)  Homogeneizados  con 
dispersiones liposomales. B) Homogeneizados con liposomas en estado seco. 

 

Resonancia Magnética Nuclear de Protón de Bajo Campo 

La distribución de  tiempos de  relajación T2 analizada por  relaxometría  transversal mediante 
Resonancia Magnética Nuclear de Protón de Bajo Campo se muestra en la figura 65 y sus valores 
cuantificados en la tabla 25. Uno de los componentes principales de relajación T2 es T21 (Figura 
65A), que representa el agua localizada dentro de estructuras proteicas altamente organizadas. 
Este  pico  estuvo  comprendido  en  un  rango  de  77,8‐92,9 ms.  Sánchez‐Alonso  et  al.  (2014) 
obtuvieron  tiempos  de  relajación  más  cortos  para  músculos  de  merluza  congelado  y 
descongelado.  Estas  diferencias  se  deben  principalmente  a  un  desplegamiento  inicial  de  la 
estructura proteica mediante la adición de NaCl (para permitir una mejor interacción de estas 
estructuras proteicas con  los  liposomas),  lo que provoca una expansión de  la  red proteica y 
aumenta  el  tiempo  de  relajación  de  los  protones  de  agua  del  espacio  intramiofibrilar.  El 
homogeneizado  control  (MC)  fue  el  que  presentó  (p≤0,05)  un menor  tiempo  de  relajación      
(77,8 ms) y una menor amplitud de pico (105,3 %) respecto a los homogeneizados formulados 
con  liposomas,  lo que  indica que  la adición de estas vesículas aumenta el espacio entre  las 
miofibrillas (mayor tiempo) lo que conlleva una mayor cantidad de agua atrapada dentro de la 
red proteica miofibrilar en estructuras altamente organizadas (mayor amplitud). 

0

5

10

15

20

25

10 100 1000 10000

In
te
n
si
d
ad

 (
%
)

Tamaño (nm)

MC LF LF‐G A

B

0

5

10

15

20

25

10 100 1000 10000

In
te
n
si
d
ad

 (
%
)

Tamaño (nm)

MC F AP CD CD‐G

A



Capítulo 3 

168 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 65. Curvas de distribución de tiempos de relajación T2 analizados mediante Resonancia Magnética 
Nuclear de Protón de Bajo Campo de homogeneizados de músculo de merluza con sal control (MC) y con 
la adición de diferentes liposomas estabilizados. F: fresco; AP: alta presión; CD: congelado/descongelado; 
CD‐G: congelado/descongelado con glicerol; LF: liofilizado; LF‐G: liofilizado con glicerol; A: atomizado. A) 
Picos T21 y T22. B) Picos T2b1 y T2b2.  
 

La otra componente principal de relajación, T22 (Figura 65A), representa el agua extramiofibrilar 
y está asociada a cambios morfológicos y estructurales, los cuales por ejemplo Sánchez‐Alonso 
et al.  (2014)  los  relacionan con el proceso de congelación. Este pico mostró  (p≤0,05) menor 
tiempo de relajación (273,3 ms) y mayor amplitud (9,0 %) para el homogeneizado control (MC), 
indicando que posee más agua extramiofibrilar en comparación con  las  formulaciones de  las 
masas que contienen liposomas. De hecho, de estos últimos homogeneizados solo dos de ellos 
presentaron este pico T22 (CD‐G y LF‐G), lo que significa que el agua extramiofibrilar en el resto 
de muestras es prácticamente inexistente.  

Estas dos componentes de relajación reflejan el intercambio químico de agua y protones que se 
produce  desde  el  interior  de  las  miofibrillas  (T21)  al  exterior  de  las  mismas  (T22)  como 
consecuencia de  la desnaturalización y agregación proteica  (Hills et al., 1989). Los resultados 
obtenidos sugieren que  la masa control, dado que presentó un pico T21 de menor amplitud y 
tiempo de relajación y un pico T22 de mayor amplitud, está perdiendo más cantidad de agua, que 

0

2

4

6

8

10

1 10

A
m
p
lit
u
d
 (
%
)

Tiempo (ms)

MC F AP CD CD‐G LF LF‐G A

B

T2b2

T2b1

0

50

100

150

200

250

10 100 1000

A
m
p
lit
u
d
 (
%
)

Tiempo (ms)

MC F AP CD CD‐G LF LF‐G A

A

T22

T21



Resultados 

169 

 

sale desde el interior de sus miofibrillas al exterior, y da lugar a una estructura peor organizada. 
Estos resultados están en concordancia con los obtenidos en la capacidad de retención de agua, 
donde MC fue el que tuvo menos capacidad de  ligar agua en el  interior de su estructura, en 
comparación con los homogeneizados con liposomas.  

Se  observaron  otros  dos  picos minoritarios  de  relajación  en  todas  las muestras,  T2b1,  que 
representa el agua fuertemente ligada a macromoléculas de la matriz muscular (Erikson et al., 
2012),  y  T2b2, que  refleja  el  grado de  disociación del miosistema  (Figura  65B). Ambos picos 
mostraron  un  significativo  menor  tiempo  de  relajación  y  menor  amplitud  de  pico  en  el 
homogeneizado control  (1,0 ms y 1,0 % para T2b1 y 2,7 ms y 2,0 % para T2b2)  respecto a  los 
homogeneizados formulados incluyendo liposomas (a excepción de la amplitud de T2b2 para CD 
y A), lo que significa que MC posee menos agua unida fuertemente a macromoléculas, lo que 
desestabiliza  en mayor medida  su  estructura,  y  que  los  liposomas modifican  el  grado  de 
disociación del músculo. Entre los homogeneizados con liposomas no se observaron diferencias 
significativas para estos dos picos minoritarios. Sin embargo, se podrían destacar los liposomas 
F  (fresco)  y AP  (alta  presión)  ya  que,  en  términos  globales,  tienden  a  presentar  una mejor 
estabilidad estructural respecto al resto de formulaciones conteniendo liposomas.  
 

Tabla 25. Parámetros de tiempos de relajación T2 (ms) y su amplitud (%) analizados mediante Resonancia 
Magnética Nuclear de Protón de Bajo Campo de homogeneizados de músculo de merluza con sal control 
(MC)  y  con  la  adición  de  diferentes  liposomas  estabilizados.  F:  fresco;  AP:  alta  presión;  CD: 
congelado/descongelado; CD‐G: congelado/descongelado con glicerol; LF: liofilizado; LF‐G: liofilizado con 
glicerol; A: atomizado. Diferentes letras (a, b, c, d, e) en la misma columna indican diferencias significativas 
(p≤0,05) entre homogeneizados.  
 

  
  

Tiempo (ms) 

T2b1   T2b2   T2 (3)  T21   T22   T2 (6) 

MC   1,0 ± ,0,0a  2,7 ± 0,6a  10,0 ± 0,0a  77,8 ± 1,6a  273,3 ± 11,6a  ‐ 

F   1,1 ± 0,1ab  3,5 ± 1,3a  16,0 ± 5,5a  88,7 ± 1,3d  ‐  900,0 ± 0,0b 

AP   1,1 ± 0,0ab  2,8 ± 0,4a  12,5 ± 3,1a  85,0 ± 0,7c  ‐  900,0 ± 0,0b 

CD  1,4 ± 0,4b  5,0 ± 3,4a  15,5 ± 9,7a  92,9 ± 1,1e  ‐  900,0 ± 0,0b 

CD‐G  1,2 ± 0,2ab  4,1 ± 2,2a  10,5 ± 2,1a    84,0 ± 0,5bc  557,5 ± 211,7b  ‐ 

LF  1,1 ± 0,1ab  5,1 ± 0,7a  20,0 ± 8,2a  82,1 ± 0,8b  ‐  890,0 ± 14,1b 

LF‐G  1,2 ± 0,1ab  4,3 ± 1,9a  13,3 ± 7,5a  82,7 ± 1,1b  685,0 ± 139,9b  ‐ 

A  1,2 ± 0,1ab  3,5 ± 1,0a  10,3 ± 1,3a  85,4 ± 0,3c  ‐  810,0 ± 80,4a 

 

  
  

Amplitud (%) 

A2b1  A2b2  A (3)  A21  A22  A (6) 

MC  1,0 ± 0,0a  2,0 ± 0,0a  2,0 ± 0,0a  105,3 ± 7,4a  9,0 ± 4,0a  ‐ 

F     5,3 ± 2,1bcd    2,8 ± 0,5ab  2,3 ± 0,5a      206,3 ± 30,3cd  ‐   1,5 ± 0,6ab 

AP     4,7 ± 1,2bcd  4,5 ± 1,7b  2,0 ± 0,8a    230,0 ± 13,2d  ‐   2,0 ± 0,0bc 

CD     2,8 ± 2,2abc  2,0 ± 0,8a  1,8 ± 1,0a     187,3 ± 14,0bc  ‐  1,0 ± 0,0a 

CD‐G   2,3 ± 1,3ab   3,0 ± 0,8ab  1,5 ± 0,7a    166,5 ± 24,3b  3,3 ± 1,0b  ‐ 

LF  8,0 ± 0,8d   2,8 ± 1,0ab  1,0 ± 0,8a      189,8 ± 11,6bc  ‐  2,3 ± 0,5c 

LF‐G    5,8 ± 2,2cd   2,5 ± 1,3ab  2,3 ± 0,6a      184,0 ± 16,4bc  3,3 ± 1,0b  ‐ 

A      5,5 ± 1,0bcd  2,0 ± 0,0a  1,3 ± 0,5a  161,3 ± 7,8b  ‐  2,0 ± 0,0bc 

 

 



Capítulo 3 

170 

 

Calorimetría Diferencial de Barrido 

Las  propiedades  térmicas  analizadas  por  Calorimetría  Diferencial  de  Barrido  de  los 
homogeneizados de merluza con liposomas se muestran en la figura 66.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 66. Termogramas reflejando las transiciones de fase mediante los cambios de temperatura (T, °C) 
y entalpía (ΔH, W/g) analizados por Calorimetría Diferencial de Barrido de homogeneizados de músculo 
de merluza con sal control (MC) y con la adición de diferentes liposomas estabilizados. F: fresco; AP: alta 
presión; CD: congelado/descongelado; CD‐G: congelado/descongelado con glicerol; LF: liofilizado; LF‐G: 
liofilizado  con  glicerol;  A:  atomizado.  A)  Homogeneizados  con  dispersiones  liposomales.  B) 
Homogeneizados con liposomas en estado seco. 
 

Tres transiciones de fase endotérmicas se observaron para el homogeneizado control (MC): dos 
transiciones principales con eventos a 40,5 °C y 61,2 °C (temperaturas de inicio de la transición, 
T0)  asociadas  a  la  desnaturalización  térmica  de  la  cola  de  la  miosina  y  de  la  F‐actina, 

‐0,62

‐0,6

‐0,58

‐0,56

‐0,54

25 35 45 55 65 75 85

En
ta
lp
ía
(J
/g
)

M 

F 

AP 

CD 

CD-G 

0
,0
2
 J/g 

Temperatura (°C)

‐0,63

‐0,61

‐0,59

‐0,57

‐0,55

‐0,53

25 35 45 55 65 75 85

En
ta
lp
ía
(J
/g
)

Temperatura (°C)

0
,0
2
 J/g

MC 

LF 

LF-G 

A

B 

A 



Resultados 

171 

 

respectivamente. En realidad, el primer evento corresponde a la interacción de la miosina con 
la proteína del tejido conectivo (Careche et al., 2002). Una transición endotérmica minoritaria 
adicional, con una T0 de 27,8 °C, se asigna al subfragmento S1 de la miosina. Estas transiciones 
aparecieron  bastante  difusas  (picos  no  bien  definidos)  y  desplazadas  hacia  menores 
temperaturas, tanto la miosina como la actina, respecto a las obtenidas por Beas et al. (1990) 
en músculo de merluza  fresco. Este efecto, mucho más acusado en el  caso de  la  cola de  la 
miosina  (segunda transición), se atribuye al proceso de solubilización y homogeneización del 
músculo  con NaCl  (Fernández‐Martín  et  al.,  1998).  Esto  significa que  la  F‐actina  resultó  ser 
mucho más resistente a la desnaturalización inducida por sal que la miosina, hecho confirmado 
por su evento endotérmico más pronunciado. 

La  adición  de  liposomas  al  homogeneizado  indujo  un  incremento  notable  (p≤0,05)  de  las 
temperaturas de las tres transiciones endotérmicas y un descenso de la entalpía, sugiriendo que 
los  liposomas  inducen un aumento de  la estabilidad  térmica  tanto de  la miosina como de  la 
actina. El tipo de preparación liposomal no influyó en el comportamiento de la miosina tras su 
desnaturalización ya que no se observaron diferencias significativas en los dos primeros eventos 
endotérmicos: subfragmento S1 de miosina (27,8‐31,5 °C) y cola de miosina (40,5‐44,3 °C). En 
cambio, influyó en el comportamiento de la actina (tercer evento, 61,2‐67,6 °C), donde la adición 
de liposomas secos (LF, LF‐G y A) aumentó la temperatura de transición con respecto a la adición 
de  dispersiones  liposomales.  Esta mayor  estabilidad  en  estas  tres masas  fue  consecuencia 
probablemente de su mayor grado de agregación proteica. Estos resultados coinciden con los 
observados en dispersión dinámica de  luz para  la  fracción  soluble del músculo, donde estos 
homogeneizados presentaron agregados proteicos de mayor  tamaño como resultado de una 
solubilización proteica insuficiente.  

Reología dinámica oscilatoria 

El comportamiento viscoelástico reflejando  los parámetros de módulo elástico (G´) y módulo 
viscoso  (G´´) de  los homogeneizados  formulados con  liposomas en  función de un barrido de 
frecuencias desde 0,1 hasta 10 Hz a temperatura constante de 10 °C se muestra en la figura 67. 
En  todas  las  formulaciones  desarrolladas,  incluyendo  el  control,  el  valor  de G´  fue  siempre 
superior al de G´´, indicando que estas masas tuvieron un comportamiento viscoelástico típico 
de un gel (Badii & Howell, 2002). 

Los parámetros viscoelásticos de módulo elástico (G0´) determinado a 1 Hz, obtenido del barrido 
de frecuencias, y del valor del exponente n´, obtenido del ajuste del espectro mecánico de G´ a 
la ecuación de la ley de la potencia (R2>0,99), se muestran en la tabla 26.  
 

Tabla 26. Parámetros viscoelásticos de G0´ (Pa) y el valor de la ley de la potencia (n´) cuantificados a 1 Hz 
y 10 °C de homogeneizados de músculo de merluza con sal control (MC) y con la adición de diferentes 
liposomas  estabilizados.  F:  fresco;  AP:  alta  presión;  CD:  congelado/descongelado;  CD‐G: 
congelado/descongelado con glicerol; LF: liofilizado; LF‐G: liofilizado con glicerol; A: atomizado. Diferentes 
letras (a, b, c) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre homogeneizados.  

 G0´  n´ 

MC   3567,7 ± 97,6bc   0,134 ± 0,005a 

F  2999,7 ± 53,4b   0,161 ± 0,001ab 

AP      3350,0 ± 265,3bc   0,169 ± 0,006ab 

CD  2043,8 ± 73,1a   0,175 ± 0,009ab 

CD‐G  3158,2 ± 79,5b  0,203 ± 0,033b 

LF    4117,7 ± 359,4c    0,149 ± 0,017ab 

LF‐G    4172,5 ± 336,1c    0,156 ± 0,003ab 

A      3459,3 ± 330,3bc   0,142 ± 0,016a 



Capítulo 3 

172 

 

 

 
 

 

Figura  67.  Comportamiento  viscoelástico  en  función  de  un  barrido  de  frecuencias  (0,1‐10  Hz)  y 
temperatura constante (10 °C) de homogeneizados de músculo de merluza con sal control (MC) y con la 
adición de diferentes liposomas estabilizados. F: fresco; AP: alta presión; CD: congelado/descongelado; 
CD‐G: congelado/descongelado con glicerol; LF: liofilizado; LF‐G: liofilizado con glicerol; A: atomizado. A) 
Módulo elástico (G´). B) Módulo viscoso (G´´). 
 

La adición de  las dispersiones  liposomales en el músculo de merluza homogeneizado con sal 
indujo  un  descenso  en  la  consistencia  de  gel  (2043,8‐3350,0  Pa)  con  respecto  al  control       
(3567,7  Pa),  especialmente  con  la  adición  de  la  dispersión  CD  (2043,8  Pa).  En  cambio,  los 
homogeneizados formulados con liposomas secos (LF y LF‐G) experimentaron aumento (p≤0,05) 
de su G0´  (4117,7‐4172,5 Pa) y, por  tanto, de su consistencia de gel, con  la excepción de  las 
formulaciones con liposomas atomizados (3459,3 Pa), que no variaron con respecto a MC. Estos 
mismos resultados se observan también en la figura 67.  

El valor de n´ refleja la estabilidad estructural y conformación de la red proteica de tal modo que 
mayores valores de n´ reflejan una mayor inestabilidad de la matriz proteica frente a cambios 
de  frecuencia  (Ojagh  et  al.,  2011).  Todos  los  homogeneizados  formulados  con  liposomas 
mostraron un mayor valor de n´ (0,142‐0,203) respecto al control (0,134), lo que indica que los 
liposomas interfieren con las interacciones proteína‐proteína de la matriz muscular y crean en 
ella discontinuidad, lo que disminuye su estabilidad estructural. Este efecto de discontinuidad 
fue más pronunciado cuando los liposomas fueron incorporados como dispersiones liposomales 
(resultado  que  coincide  con  sus menores  valores  de  G´  y  su menor  consistencia  de  gel), 
especialmente  en CD‐G  (0,203), probablemente debido  a que  al  añadirse  en  estado  líquido 

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0,1 1 10

G
´
(P
a)

Frecuencia (Hz)

MC

F

AP

CD

CD‐G

LF

LF‐G

A

A

0

500

1000

1500

0,1 1 10

G
´´
(P
a)

Frecuencia (Hz)

MC

F

AP

CD

CD‐G

LF

LF‐G

A

B



Resultados 

173 

 

podrían  acceder más  fácilmente  a  las  cadenas  laterales  proteicas  que  los  liposomas  secos, 
produciendo  una mayor  interferencia  con  las  proteínas  y mayor  inestabilidad  de  la matriz 
muscular. Esta afirmación estaría en concordancia con los resultados obtenidos en Resonancia 
Magnética Nuclear, donde  los homogeneizados con  las dispersiones  liposomales  tuvieron un 
mayor valor de tiempo de relajación para el parámetro T21, lo que demuestra que tienen más 
espacio intramiofibrilar y más capacidad de englobar agua en su interior.  

El comportamiento viscoelástico del módulo elástico (G´), del módulo viscoso (G´´) y del ángulo 
de fase (δ) de las masas en función de un barrido de temperaturas desde 15 °C  hasta 80 °C, a 
frecuencia constante de 1 Hz, se muestra en la figura 68. La masa control (MC) mostró un perfil 
de  agregación  térmica  de  la  proteína  típico  de  la  formación  de  un  gel:  desde  el  inicio  del 
calentamiento hasta los ≈25 °C el músculo experimentó una primera desestabilización proteica 
asociada a  la  rotura de enlaces por puentes de hidrógeno  sensibles al  calor. Esta  rotura de 
enlaces promueve el desplegamiento de  la proteína y el que sus sitios reactivos queden más 
expuestos,  lo que dio  lugar a  la  subsecuente  formación de nuevos enlaces  intermoleculares 
hasta los ≈37 °C, momento en el que alcanzó valor máximo relativo de G´. Este pico es conocido 
como  asentamiento o  “setting”,  fenómeno por  el  cual  se  forma una  red proteica ordenada 
preliminar,  estabilizada  mediante  interacciones  proteína‐proteína  relativamente  fuertes, 
predominantemente  interacciones  hidrofóbicas  y  enlaces  covalentes  ε‐(γ‐glutamil)‐lisina 
inducidos por la actividad transglutaminasa endógena (Lanier et al., 2013). Posteriormente, G´ 
sufrió un descenso hasta los ≈47 °C, fenómeno conocido como modori. El modori consiste en la 
desintegración de la red proteica anterior debido a la actividad de proteasas activadas por calor. 
Finalmente, el homogeneizado aumentó nuevamente sus valores de G´ hasta ≈78 °C, momento 
en  el  que  se  estabilizó  y  se  formó  una  red  proteica  de  gel  termoestable  compuesta 
principalmente  por  interacciones  hidrofóbicas  así  como  por  enlaces  covalentes  disulfuro 
termoestables intra‐ e intermoleculares, el gel definitivo.  

La adición de las dispersiones liposomales al músculo homogeneizado con sal provocó enormes 
cambios  en  el  perfil  de  gelificación  proteica.  Su  presencia,  sin  embargo,  no  modificó  las 
temperaturas  a  las  que  se  produjeron  los  fenómenos  de  asentamiento  (actividad  de  la 
transglutaminasa  endógena)  y  modori  (degradación  proteica  autolítica),  manteniendo  las 
temperaturas de ambos picos a ≈40 °C y ≈47 °C, respectivamente. Sin embargo, su presencia 
inhibió  la  primera  desestabilización  proteica  que  tenía  lugar  en  torno  a  25  °C  e  indujo  un 
aumento  progresivo  de  la G´  hasta  el  fenómeno  de  asentamiento.  Este  hecho  provocó  un 
incremento  del  valor  de  G´  con  respecto  a MC  desde  el  punto  de  asentamiento  hasta  la 
formación  final del  gel. De hecho,  la  temperatura a  la que  se  alcanzó el mayor  valor de G´ 
(momento de  formación de  la  red proteica organizada o gel)  fue considerablemente  inferior 
(p≤0,05) que la del control, siendo este valor de ≈60 °C frente a los ≈80 °C del control.  

Estos resultados  indican que  las dispersiones  liposomales  llevaron a una gelificación proteica 
mucho más rápida, posiblemente como consecuencia del mayor espacio intramiofibrilar (T21) y 
su mayor exposición de los sitios reactivos proteicos, lo que promueve un notable aumento de 
las  interacciones  hidrofóbicas  inducidas  por  calor  y  de  los  enlaces  covalentes  disulfuro 
posteriores. Esta proliferación rápida y excesiva de interacciones proteicas fuertes dio lugar a 
una mayor discontinuidad de  la matriz  (como  vimos en el  comportamiento  viscoelástico en 
función de la frecuencia) y a una red proteica de gel menos ordenada. Esta peor estructuración 
proteica conlleva a la formación de geles más débiles, hecho confirmado por los mayores valores 
de ángulo de fase  (δ) en el momento de gelificación máxima (mayor G´) observados para  las 
masas formuladas con  dispersiones liposomales (Figura 68C).  

Por el contrario, cuando los liposomas se incorporaron en estado seco (LF, LF‐G y A), el perfil de 
gelificación proteica de sus homogeneizados fue bastante similar al del control (MC). Las únicas 
diferencias  reseñables  fueron  su mayor  ángulo  de  fase  en  el  punto  de máxima  gelificación 



Capítulo 3 

174 

 

(mayor G´), lo que indica que también se obtuvieron geles más débiles al control, y que a partir 
de ≈55 °C su incremento de G´, que fue constante y progresivo hasta los 80 °C desde el fenómeno 
de modori, fue más  limitado, terminando su gelificación a  la misma temperatura pero menor 
valor de G´ que el control, probablemente debido al elevado grado de agregación proteica de 
estos homogeneizados con liposomas secos. Este resultado confirma la obtención de geles más 
débiles  con  respecto  a  la masa  control,  pero  de mejor  estructura  proteica  de  gel  que  los 
obtenidos con las masas formuladas con dispersiones liposomales.  

 

 

 

Figura 68. Comportamiento viscoelástico en función de un barrido de temperatura (15‐80 °C) y frecuencia 
constate a 1 Hz de homogeneizados de músculo de merluza con  sal control  (MC) y con  la adición de 
diferentes  liposomas  estabilizados.  F:  fresco;  AP:  alta  presión;  CD:  congelado/descongelado;  CD‐G: 
congelado/descongelado con glicerol; LF: liofilizado; LF‐G: liofilizado con glicerol; A: atomizado. A) Módulo 
elástico (G´). B) Módulo viscoso (G´´). C) Ángulo de fase (δ).  

0

4000

8000

12000

16000

0 20 40 60 80 100

G
´
(P
a)

Temperatura (°C)

MC

F

AP

CD

CD‐G

LF

LF‐G

A

A

0

500

1000

1500

2000

0 20 40 60 80 100

G
´´
(P
a)

Temperatura (°C)

MC

F

AP

CD

CD‐G

LF

LF‐G

A

B

4

6

8

10

12

14

0 20 40 60 80 100

δ
(°
)

Temperatura (°C)

MC

F

AP

CD

CD‐G

LF

LF‐G

A

C



Resultados 

175 

 

Propiedades mecánicas 

Los parámetros de fuerza (N), deformación (mm) y fuerza de gel (N x mm) de los geles de merluza 
tanto a 60 °C como a 80 °C se muestran en la figura 69.  

 

 

 

Figura 69. Propiedades mecánicas de los geles de músculo de merluza con sal control (MC) y con la adición 
de diferentes  liposomas estabilizados. F:  fresco; AP: alta presión; CD: congelado/descongelado; CD‐G: 
congelado/descongelado con glicerol; LF: liofilizado; LF‐G: liofilizado con glicerol; A: atomizado. Diferentes 
letras (a, b, c, d, e) indican diferencias significativas (p≤0,05) entre geles para una temperatura de 80 °C y 
(m, n, o, p, q, r) entre geles para una temperatura de 60 °C. A) Fuerza de rotura (N). B) Deformación (mm). 
C) Fuerza de gel (N x mm).  

 

Se pretende evaluar si la gelificación está consolidada a 60 °C, o por el contrario continúa hasta 
temperaturas superiores. El gel control fue el que presentó una mayor fuerza de gel (p≤0,05) a 

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

MC F AP CD CD‐G LF LF‐G A

Fu
er
za
 (
N
)

60 °C

80 °C

mm
n

o
p

q

r

a

b b
b

c

d d

e

m

A

0

2

4

6

8

10

MC F AP CD CD‐G LF LF‐G A

D
ef
o
rm

ac
ió
n
 (
m
m
)

60 °C

80 °C

m

m

n

mn
mn

mn

mn mna

b b

c

ab
ab

ab ab

B

0

2

4

6

8

10

MC F AP CD CD‐G LF LF‐G A

Fu
er
za
 d
e 
ge
l (
N
 x
 m

m
)

60 °C

80 °C

m

n
n

o

mn mnmn
mn

aab
abc

bc
c c

c

d
C



Capítulo 3 

176 

 

60  °C  (Figura 69C) atribuida a  su mayor  fuerza de  rotura  (Figura 69A), puesto que no hubo 
diferencias significativas entre los geles para el parámetro de deformación (Figura 69B). Cardoso 
et al.  (2010) obtuvieron una mayor  fuerza de gel para geles a partir de homogeneizados de 
merluza calentados a 90 °C durante 1 h, probablemente debido en parte al menor contenido en 
agua encontrado en sus masas (80 % vs. 85 %) y a su mayor proporción de NaCl (2,5 % vs. 1 %). 
Estos  resultados  confirman  que  los  liposomas  interfieren  en  la  agregación  térmica  de  las 
proteínas del músculo y en  la formación de una red proteica de gel adecuada, dando  lugar a 
geles  más  débiles.  No  hubo  diferencias  significativas  (p>0,05)  entre  homogeneizados  con 
liposomas. Los geles formados a 80 °C siguieron el mismo comportamiento que  los de 60 °C, 
donde el gel control presentó la mayor fuerza de gel y los liposomas AP, LF y LF‐G la menor (con 
excepción de A), atribuidas estas diferencias a  la fuerza de rotura y no a  la deformación. Sin 
embargo, los geles a 80 °C mostraron una mayor fuerza de gel, fuerza de rotura y deformación 
que los geles a 60 °C, indicando que estos geles siguieron formándose desde los 60 °C hasta los 
80 °C, reforzando su estructura. 

Esta  incongruencia  con  los  resultados  obtenidos  en  reología  dinámica  oscilatoria  (donde 
concluimos que los geles que contenían las dispersiones liposomales completaban su formación 
a los 60 °C) podría deberse al diferente régimen de calentamiento en el proceso de formación 
de  los  geles. Mientras  que  en  la  reología  dinámica  oscilatoria  el  calentamiento  fue  lento  y 
progresivo (aumentando 1 °C cada 1 min con un tiempo total de gelificación >1 hora), el proceso 
de gelificación para el estudio de las propiedades mecánicas de fuerza de gel fue más rápido e 
intenso desde el principio  (45 min a  temperaturas de 60  °C y 80  °C desde el comienzo de  la 
gelificación).  Estas  diferencias  podrían  ser  las  responsables  del  diferente  comportamiento 
térmico  de  los  geles,  determinando  que  alcancen  su  gelificación  máxima  a  diferentes 
velocidades de calentamiento.  

Conclusiones 

Los  tratamientos  tecnológicos  de  estabilización  indujeron  cambios  destacables  en  las 
propiedades de los liposomas, siendo la congelación el método que más incrementó el tamaño 
de  partícula.  El  factor  clave  que  determinó  las  interacciones  musculares  proteicas  y  la 
gelificación térmica del músculo homogeneizado fue el estado de hidratación de la preparación 
liposomal, más allá del tamaño de partícula o del potencial de membrana. En general la adición 
de  liposomas  al  músculo  de  merluza  previamente  homogeneizado  con  sal  contribuyó  a 
aumentar la capacidad de retención de agua del sistema e interfirió en la gelificación térmica de 
la proteína. Las dispersiones  liposomales  indujeron una  rápida gelificación  favorecida por un 
mayor  desplegamiento  proteico  durante  la  homogeneización  con  sal,  al  contrario  que  los 
liposomas añadidos en forma seca, los cuales dificultaron la correcta solubilización proteica con 
sal. A pesar de reducir ligeramente la fuerza de gel, las formulaciones de músculo de merluza 
con liposomas constituyeron una matriz adecuada para el desarrollo de productos de pescado 
basados en geles con un alto potencial nutricional y saludable.  

 

 

 

 

 

 



Resultados 

177 

 

8.6.  AGREGACIÓN  PROTEICA,  AGUA  LIGADA  Y  GELIFICACIÓN  TÉRMICA  DE MÚSCULO  DE 
MERLUZA  DE  BAJA  CALIDAD  FUNCIONAL  HOMOGENEIZADO  CON  SAL  EN  PRESENCIA  DE 
LIPOSOMAS DE FOSFATIDILCOLINA DE SOJA CON TREALOSA SOMETIDOS A CONGELACIÓN-
DESCONGELCIÓN Y LIOFILIZACIÓN 

Resumen 

Se elaboraron  liposomas de fosfatidilcolina de soja utilizando trealosa como  lioprotector y se 
sometieron a procesos de estabilización de congelación‐descongelación (dispersión liposomal) 
y de liofilización (formato deshidratado). Posteriormente, dichos liposomas se incorporaron en 
un músculo  de merluza  (Merluccius merluccius)  previamente  homogeneizado  con  sal  para 
estudiar  su  efecto  en  la  agregación proteica,  capacidad de  retención de  agua  y  gelificación 
térmica.  Ambos  tipos  de  liposomas,  una  vez  resuspendidos,  tuvieron  un  tamaño medio  de 
partícula similar (≈215 nm) y un potencial de membrana electronegativo (‐46 mV). La adición de 
ambos tipos de preparaciones liposomales en las formulaciones con músculo homogeneizado 
con sal dio lugar a más agua atrapada dentro de las miofibrillas, hecho que se observó tanto por 
la  técnica de Capacidad de Retención de Agua  como por Resonancia Magnética Nuclear de 
Protón de Bajo Campo. Sin embargo, los liposomas interfirieron fuertemente con la capacidad 
de gelificación térmica de la proteína muscular. El análisis de Calorimetría Diferencial de Barrido 
mostró que  los  liposomas  indujeron un  incremento de  la  temperatura de  transición de  fase, 
asociado a la molécula de actina, acompañado de una reducción de la entalpía total. La adición 
de  liposomas disminuyó  la dureza de  los geles, sin embargo, el estado de hidratación de  los 
liposomas con trealosa no resultó un factor clave en el perfil de gelificación térmica.  

Palabras  clave:  homogeneizado  de  merluza,  liposomas,  trealosa,  agua  ligada,  gelificación 
térmica.  

Introducción 

Tal y como se ha comentado en el anterior trabajo experimental, con el nuevo reglamento (01 
Enero 2015, Reglamento UE 1380/2013) una vez que  la cuota de captura de merluzas se ha 
agotado, cualquier merluza que llegue a puerto constituye un descarte, y no puede ser vendida 
para consumo directo. Ha ser transformada bien para consumo animal o, lo que resultaría de 
mayor interés, transformado en producto reestructurado para consumo humano. 

Tal y como  se comentó en el apartado anterior, existen varios  tratamientos para mejorar  la 
estabilidad de los liposomas, como la congelación (Chen et al., 2010) o la liofilización (Sebaaly et 
al., 2016). Sin embargo, ambos  tratamientos pueden dar  lugar a  la  formación de agregados 
debidos  a  la  fusión  entre  bicapas  adyacentes.  Los  crio‐  y  lioprotectores,  tales  como 
carbohidratos o polialcoholes,  son  incluidos en  la preparación de  liposomas para mejorar  la 
estabilidad vesicular y evitar la agregación y sedimentación de partículas durante los procesos 
de congelación y liofilización (Stark et al., 2010; Wolkers et al., 2010). En particular, la trealosa 
es un efectivo lioprotector de liposomas debido a sus mecanismos de reemplazamiento de agua 
y  vitrificación,  aunque  también  podría  contribuir  con  efectos  de  deshidratación  osmótica  y 
kosmotrópica  (Chen  et  al.,  2010).  La  cantidad  de  lioprotector,  la  composición  lipídica  y  las 
condiciones de congelación y liofilización son factores determinantes en el tamaño final de las 
vesículas (Arshinova et al., 2012).  

En trabajos experimentales previos se ha demostrado la importancia del estado de hidratación 
de  los  sistemas  liposomales  en  las  propiedades  estructurales  y  gelificantes  de músculo  de 
merluza  homogeneizado  con  sal  y  formulados  con  estos  liposomas.  Este  comportamiento 
también podría estar  influenciado por  la calidad funcional  inicial del músculo o por el tipo de 



Capítulo 3 

178 

 

crio‐ o  lioprotector añadido a  la  formulación  liposomal, el cual puede modificar el estado de 
hidratación de las membranas y, como consecuencia, la interacción con la matriz muscular.  

Objetivos 

El  segundo  trabajo  experimental  de  este  capítulo  tiene  como  objetivo  evaluar  el  efecto  de 
liposomas  de  fosfatidilcolina  de  soja,  previamente  procesados  mediante  tratamientos  de 
congelación y de liofilización, utilizando trealosa como lioprotector, en la agregación proteica, 
capacidad de retención de agua y propiedades gelificantes de músculo de merluza previamente 
homogeneizado con sal.  

Materiales y métodos 

La fosfatidilcolina parcialmente purificada con cinco lavados de acetona (FC5) se extrajo de la 
lecitina de soja (LS).  

Seguidamente, se prepararon los liposomas con fosfatidilcolina de cinco lavados (FC5). En este 
caso,  se  sustituyó  el  glicerol  por  la  trealosa,  pero  a  idénticas  concentraciones  y modo  de 
inclusión. Las dispersiones liposomales se sometieron a congelación‐descongelación (se congeló 
a ‐20 °C durante 24 h y después se descongeló a temperatura ambiente) y liofilización (previa 
congelación a ‐80 °C durante 24 h y posterior liofilización). Liposomas control sin tratamiento se 
estudiaron en paralelo. De este modo, se obtuvieron tres preparaciones liposomales distintas: 
fresco  (F),  congelado‐descongelado  conteniendo  trealosa  (CD‐T)  y  liofilizado  conteniendo 
trealosa (LF‐T). De estos liposomas se caracterizaron sus propiedades hidrodinámicas mediante 
dispersión dinámica de luz en Zetasizer (77 mg/mL para los liofilizados y posterior dilución 1/10 
para todos los liposomas) y su contenido en agua y dispersabilidad en agua.  

Estos liposomas con trealosa se incorporaron en músculo de merluza fresco de diferente forma 
en función de su estado de hidratación. Las dispersiones  liposomales (F y CD‐T) se mezclaron 
con el músculo de merluza  (1:2, v/p), previamente homogeneizado  con  sal  (NaCl 1 %), y  se 
homogeneizaron  nuevamente  durante  2  minutos.  En  cambio,  para  el  liofilizado  (LF‐T)  se 
añadieron 6,38 g de liposomas (en estado seco) al músculo previamente homogeneizado con sal 
(NaCl  1 %),  homogenizándose  de  nuevo  durante  1 min.  Seguidamente,  se  añadió  el  agua 
correspondiente  hasta  establecer  una  proporción  1:2  (v/p)  entre  preparación  liposomal  y 
músculo,  y  se mezcló  nuevamente  durante  3 min más.  De  este modo,  el músculo  con  la 
dispersión  (CD‐T)  tuvo  no  solo  la  misma  proporción  preparación  liposomal/músculo  sino 
también el mismo peso seco de liposomas que el músculo con el liofilizado (LF‐T). Una fórmula 
de homogeneizado de músculo con sal y agua (control) sin liposomas añadidos (MC) se estudió 
en paralelo.  

Estas masas  formuladas  se  caracterizaron  en  términos  de  contenido  en  agua  y  solubilidad 
proteica,  retención  de  agua mediante  la  técnica de Capacidad  de Retención de Agua  y  por 
Resonancia Magnética  Nuclear  de  Protón  de  Bajo  Campo,  y  propiedades  físicas mediante 
Calorimetría Diferencial de Barrido (directamente) y reología dinámica oscilatoria. Además, se 
determinó el perfil electroforético de  la fracción de proteína soluble mediante SDS‐PAGE, así 
como las propiedades hidrodinámicas de dicha fracción soluble mediante dispersión dinámica 
de luz en Zetasizer.  

Finalmente,  las  masas  de  merluza  (con  y  sin  liposomas)  se  sometieron  a  un  proceso  de 
gelificación y se estudiaron sus propiedades mecánicas mediante texturometría.  

 

 



Resultados 

179 

 

Resultados y discusión 

Caracterización de liposomas estabilizados  

Características de partícula 

Las características de partícula de  los  liposomas con trealosa se muestran en  la tabla 27. Los 
liposomas sometidos a congelación (CD‐T) y a  liofilización (LF‐T) mostraron un tamaño medio 
similar (p>0,05), indicando que la presencia de trealosa no parece interferir en las propiedades 
de partícula de los liposomas según el método de estabilización. Estos tamaños fueron mayores 
(p≤0,05)  que  los  de  los  liposomas  frescos  control  (F),  sugiriendo  que  ambos  procesos  de 
estabilización,  junto  posiblemente  con  la  presencia  de  la  trealosa,  son  responsables  del 
incremento del tamaño medio. Ohtake et al. (2006) afirmaron que la interacción fosfolípidos‐
trealosa y su distribución a  lo  largo de  la membrana  liposomal es similar tanto en  liposomas 
liofilizados como en liposomas rehidratados, no observando ningún incremento de partícula en 
vesículas de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) en presencia de trealosa sometidas a congelación 
o liofilización. El incremento de partícula obtenido en nuestros liposomas podría deberse a una 
concentración  insuficiente de trealosa o a su  irregular distribución a  lo  largo de  la membrana 
(Christensen et al., 2007).  
 

Tabla 27. Tamaño (nm),  índice de polidispersidad y potencial zeta (mV) de  liposomas estabilizados con 
diversos procesados, donde F: fresco; CD‐T: congelado/descongelado con trealosa; LF‐T:  liofilizado con 
trealosa. Diferentes  letras  (a, b) en  la misma columna  indican diferencias  significativas  (p≤0,05) entre 
liposomas.  

  Tamaño  
(nm) 

Índice de 
polidispersidad  

Potencial Zeta 
(mV) 

F  141,3 ± 1,9a 0,225 ± 0,003a ‐44,8 ± 1,8a 

CD‐T  219,7 ± 7,7b 0,277 ± 0,030b ‐45,8 ± 2,9a 

LF‐T  210,0 ± 3,5b 0,303 ± 0,027b ‐47,3 ± 3,1a 

 

El  índice  de  polidispersidad  siguió  el  mismo  comportamiento  que  el  tamaño,  donde  los 
liposomas frescos (0,225) presentaron un valor significativamente menor que los liposomas con 
trealosa (0,277 para CD‐T y 0,303 para LF‐T), sin diferencias (p>0,05) entre ellos. Estos resultados 
fueron confirmados por el perfil de distribución de tamaños (Figura 70), donde se observó que 
los  liposomas  frescos presentaron una distribución bimodal que  se  convirtió en  trimodal en 
liposomas  con  trealosa  congelados/descongelados  y  liofilizados,  aumentando  el  tamaño  de 
ambas poblaciones y apareciendo una nueva población de mayor tamaño.  

 

Figura 70. Distribución de  tamaños de partícula de  liposomas  estabilizados  con diversos procesados, 
donde F: fresco; CD‐T: congelado/descongelado con trealosa; LF‐T: liofilizado con trealosa. 

0

3

6

9

12

15

10 100 1000 10000

In
te
n
si
d
ad

 (
%
)

Tamaño (nm)

F

CD‐T

LF‐T



Capítulo 3 

180 

 

El  potencial  zeta,  en  cambio,  no mostró  diferencias  significativas  en  ninguna  preparación 
liposomal,  con  valores  comprendidos  entre  ‐44,8 mV  y  ‐47,3 mV,  indicativos de una  buena 
estabilidad de membrana.  

Contenido en agua 

El contenido en agua de los liposomas con trealosa congelados/descongelados y liofilizados se 
muestra en la tabla 28, siendo del 93,03 % para los liposomas frescos (F), del 91,60 % para los 
liposomas  congelados  (CD‐T)  y del  1,53 % para  los  liposomas  liofilizados  (LF‐T).  Esta última 
formulación  presentó una  apariencia de polvo  fino blanquecino,  indicativo de un  adecuado 
proceso de deshidratación. Wolkers et al. (2010) propusieron que la trealosa ejerce un efecto 
protector en liposomas desecados a través del control de la tasa de pérdida de agua y la captura 
de agua alrededor de las cabezas polares de los fosfolípidos durante la fase inicial del secado. 

Dispersabilidad en agua 

La dispersabilidad en agua de los liposomas con trealosa congelados/descongelados y liofilizados 
se muestra en la tabla 28, con un rango de valores significativamente similares y muy elevados. 
Estos resultados indican que la agregación vesicular inducida por los procesos de congelación y 
liofilización fue baja, a pesar del notable incremento del tamaño de partícula en CD‐T y LF‐T.  
 

Tabla 28. Contenido en agua (%) y dispersabilidad en agua (%) de liposomas estabilizados con diversos 
procesados, donde F: fresco; CD‐T: congelado/descongelado con trealosa; LF‐T: liofilizado con trealosa. 
Diferentes letras (a, b, c) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre liposomas. 

  Contenido en 
agua (%) 

Dispersabilidad (%) 

F  93,03 ± 0,01a 100,0 ± 0,79a

CD‐T  91,60 ± 0,05b 95,24 ± 5,95a

LF‐T    1,53 ± 0,31c 97,15 ± 1,17a

 

Caracterización de homogeneizados de merluza formulados con liposomas 

Contenido en agua 

El contenido en agua de los homogeneizados de merluza conteniendo los liposomas con trealosa 
(congelados/descongelados  y  liofilizados)  se muestra  en  la  tabla  29.  La masa  sin  liposomas 
mostró mayor  contenido en agua  (85,1 %) que aquellas  con  liposomas  (82,3 % para CD‐T y       
82,8  %  para  LF‐T),  probablemente  debido  a  que  las  fórmulas  con  liposomas  CD‐T  y  LF‐T 
presentan una determinada cantidad de materia seca (la misma en ambos) correspondiente a 
los propios  liposomas, mientras que a  la fórmula control (MC) se  le ha adicionado solamente 
agua y sal.  

Solubilidad proteica 

La  solubilidad  proteica  de  los  homogeneizados  de  merluza  con  liposomas  de  trealosa 
estabilizados se muestra en la tabla 29. La fórmula control (MC) presentó una mayor (p≤0,05) 
solubilidad  proteica  (71,35 %)  que  la  de  los  liposomas  CD‐T  (49,17 %)  y  los  liposomas  LF‐T      
(37,47 %). Estos resultados indican que la adición de liposomas aumenta el estado de agregación 
de  la  proteína  miofibrilar.  Aunque  no  hubo  diferencias  significativas  entre  las  masas  con 
liposomas,  la adición de  liposomas  liofilizados al homogeneizado  tendió a  inducir una mayor 
deshidratación  y  agregación  proteica,  posiblemente  debido  a  que  establecen  una  mayor 
competitividad con las proteínas miofibrilares por las moléculas de agua.  

 



Resultados 

181 

 

Capacidad de retención de agua 

La capacidad de retención de agua de los formulados de merluza que contienen liposomas con 
trealosa,  tanto  congelados/descongelados  como  liofilizados,  se muestra  en  la  tabla  29.  Los 
formulados  con  liposomas presentaron una mayor  retención de  agua  (90,27 % para CD‐T  y   
85,88 %  para  LF‐T,  sin  diferencias  significativas  entre  ellos)  que  el  homogeneizado  control   
(57,26 %).  Estos  resultados  no  coinciden  con  la  solubilidad  proteica  y  no  dependen  de  las 
propiedades de partícula de  los  liposomas, ni del contenido en agua de  los mismos, o de  las 
diferentes  formulaciones.  Sin  embargo,  podrían  atribuirse  a  que,  a  pesar  de  tener menor 
solubilidad proteica y por tanto los sitios de unión a las moléculas de agua menos expuestos, los 
liposomas presentes en estas masas permiten  también  la unión de moléculas de agua a  sus 
grupos fosfato de la membrana, incrementando así el valor de retención de agua, incluso por 
encima del homogeneizado control.  
 

Tabla  29.  Contenido  en  agua  (%),  solubilidad  proteica  (%)  y  capacidad  de  retención  de  agua  (%)  de 
homogeneizados de músculo de merluza con sal control (MC) y con  la adición de diferentes  liposomas 
estabilizados. CD‐T: congelado/descongelado con trealosa; LF‐T: liofilizado con trealosa. Diferentes letras 
(a, b, c) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre homogeneizados.  

  Contenido en 
agua (%) 

Solubilidad proteica (%) 
Capacidad de 

retención de agua (%) 

MC  85,11 ± 0,13c  71,35 ± 1,59b 57,26 ± 2,44b 

CD‐T  82,28 ± 0,02a  49,17 ± 5,44a 90,27 ± 1,86a 

LF‐T  82,79 ± 0,11b  37,47 ± 0,09a 85,88 ± 1,73a 

 

Perfil electroforético 

El perfil electroforético (SDS‐PAGE) de  la fracción soluble de  las diferentes masas formuladas 
con y sin liposomas se muestra en la figura 71.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 71. Perfil electroforético  (SDS‐PAGE) de  la  fracción  soluble de homogeneizados de músculo de 
merluza  con  sal  control  (MC)  y  con  la  adición  de  diferentes  liposomas  estabilizados.  CD‐T: 
congelado/descongelado con trealosa; LF‐T: liofilizado con trealosa. 

Miosina 

Troponina 

250

150

100

75

50

37

25
20

15

kDa 

MC CD-T LF-T

Tropomiosina 



Capítulo 3 

182 

 

Se caracterizó por la ausencia de la cadena pesada de la miosina (≈200 kDa), lo que significa que 
esta  proteína  se  encuentra  mayormente  insolubilizada  y  el  músculo  no  presenta  elevada 
funcionalidad proteica. Otras bandas observadas de pesos moleculares inferiores corresponden 
muy probablemente a  la actina soluble  (<50 kDa) y a  las proteínas troponina y tropomiosina  
(≈37 kDa). Se pudo apreciar un ligero descenso en la intensidad de las bandas asociadas a estas 
tres proteínas  en  el  caso de  los homogeneizados  formulados  con  liposomas, de  forma más 
acusada en LF‐T, resultado que confirma la mayor agregación proteica en estas formulaciones y 
en concreto en los liposomas liofilizados (LF‐T). Sin embargo, dado que el perfil electroforético 
no se ve afectado en cuanto al número y posición de las bandas, no existen signos evidentes de 
interacciones covalentes proteína‐lípido en esta  fracción soluble. La baja solubilidad proteica 
obtenida  en  las  masas  con  liposomas  podría  deberse  a  interacciones  no  covalentes, 
probablemente  de  puentes  de  hidrógeno  entre  las  cadenas  laterales  de  las  proteínas  y  los 
grupos polares de la membrana de los liposomas o a moléculas de agua adheridas. No se vieron 
agregados proteicos de elevado peso molecular en la parte superior del gel de poliacrilamida. 

Caracterización de agregados mediante dispersión dinámica de luz en Zetasizer 

La dispersión dinámica de luz se usó para obtener una idea de la distribución del tamaño de los 
agregados de proteína soluble en los diversos sistemas musculares (Figura 72), que no pudo ser 
evidenciado por el estudio electroforético.  

 

Figura 72. Distribución de tamaños de partícula de la fracción soluble de homogeneizados de músculo de 
merluza  con  sal  control  (MC)  y  con  la  adición  de  diferentes  liposomas  estabilizados  por  dispersión 
dinámica de luz. CD‐T: congelado/descongelado con trealosa; LF‐T: liofilizado con trealosa. 
 

La  proteína  soluble  de  los  tres  sistemas musculares mostró  una  distribución  de  tamaño  de 
agregados bimodal similar. La población predominante alcanzó un máximo en el rango entre 
494 nm para  la formulación control (MC) y 596 nm para el  lote LF‐T. Se encontró una escasa 
contribución  de  fragmentos  proteicos más  pequeños  con  un  pico  entre  159  y  182  nm.  Los 
liposomas LF‐T causaron un mayor desplazamiento del tamaño medio de los agregados que la 
preparación de CD‐T. Sin embargo, la reducción notable en la intensidad del pico asociado con 
la población de agregados más pequeños en el lote de CD‐T sugirió una disminución considerable 
en  la presencia de estos pequeños  fragmentos, que probablemente puedan haber entrado a 
formar parte de agregados de mayor tamaño que podrían haber pasado a la fracción insoluble 
de la proteína. Este hecho sería consistente con los valores encontrados para la solubilidad de 
la proteína ligeramente menor (Tabla 29) y la reducción de la intensidad de la banda de proteína 
(Figura 71) encontrada en el lote de CD‐T. 

 

0

5

10

15

20

10 100 1000 10000

In
te
n
si
d
ad

 (
%
)

Tamaño (nm)

MC CD‐T LF‐T



Resultados 

183 

 

Resonancia Magnética Nuclear de Protón de Bajo Campo 

La distribución de tiempos de relajación analizados mediante relaxometría transversal T2 por 
Resonancia Magnética Nuclear de Protón de Bajo Campo se muestra en la figura 73 y sus valores 
se expresan en la tabla 30. La componente principal de relajación, T21, que refleja el agua interior 
unida  a  estructuras proteicas  altamente organizadas, presentó un  valor  de  85,4 ms para  la 
fórmula de masa control (MC) (Figura 73A). Sánchez‐Alonso et al. (2014) obtuvieron tiempos de 
relajación más cortos para la componente T21 de músculo de merluza congelado y sin congelar, 
probablemente debido al desplegamiento  inicial de  la estructura proteica  inducido por NaCl, 
que expande la red proteica y aumenta así el espacio intramiofibrilar y el tiempo de relajación 
del agua. La otra componente de relajación importante, T22, que refleja el agua extramiofibrilar, 
presentó un valor de 491,3 ms para la fórmula de masa control (MC). Esta componente suele 
aparecer en el rango de tiempos comprendido entre 120‐360 ms, como resultado de cambios 
morfológicos en la proteína después de la congelación (Sánchez‐Alonso et al., 2014).  

 

Figura  73.  Curvas  de  distribución  de  tiempos  de  relajación  T2  analizados  por  Resonancia Magnética 
Nuclear de Protón de Bajo Campo de homogeneizados de músculo de merluza con sal control (MC) y con 
la  adición  de  diferentes  liposomas  estabilizados.  CD‐T:  congelado/descongelado  con  trealosa;  LF‐T: 
liofilizado con trealosa. A) Picos T21 y T22. B) Picos T2b1 y T2b2.  

 

La  adición  de  liposomas  al  homogeneizado  de merluza  no modificó  significativamente  los 
tiempos  de  relajación  de  las  componentes  T21  y  T22.  Sin  embargo,  los  homogeneizados  con 
liposomas mostraron una amplitud de pico de T21 notablemente mayor (p≤0,05) (160,5 % para 
CD‐T y 145,8 % para LF‐T) que la fórmula control (55,8 %), indicando que tienen más cantidad 
de agua unida a estructuras altamente organizadas. La componente T22 mostró una amplitud de 
pico mayor  (p≤0,05)  para  la masa  control  (11,8  %)  respecto  a  las masas  formuladas  con 
liposomas  (2,3 % para CD‐T y 2,0 % para LF‐T),  lo que significa que el control tuvo más agua 
extramiofibrilar y fue susceptible de más cambios morfológicos.  

Estas dos componentes de relajación reflejan el intercambio químico de agua y protones que se 
produce  desde  el  interior  de  las  miofibrillas  (T21)  al  exterior  de  las  mismas  (T22)  como 
consecuencia de  la desnaturalización y agregación proteica  (Hills et al., 1989). Los resultados 
obtenidos sugieren que la masa control, dado que presentó un pico T21 de menor amplitud y un 
pico T22 de mayor amplitud, está perdiendo más cantidad de agua, que sale desde el interior de 
sus miofibrillas al exterior. Estos  resultados están en concordancia con  los obtenidos para  la 
capacidad de  retención de agua, donde  la masa control  fue  la que  retuvo menos agua en el 
interior de su estructura, en comparación con las formulaciones con liposomas.  
 

0

50

100

150

200

250

10 100 1000

A
m
p
lit
u
d
 (
%
)

Tiempo (ms)

MC CD‐T LF‐T

A

T21

T22

0

2

4

6

8

10

1 10

A
m
p
lit
u
d
 (
%
)

Tiempo (ms)

MC CD‐T LF‐T

B

T2b1

T2b2



Capítulo 3 

184 

 

Tabla 30. Parámetros de  tiempos de  relajación T2  (ms)  y  su  amplitud  (%)  analizados por Resonancia 
Magnética Nuclear de Protón de Bajo Campo de homogeneizados de músculo de merluza con sal control 
(MC) y con la adición de diferentes liposomas estabilizados. CD‐T: congelado/descongelado con trealosa; 
LF‐T:  liofilizado  con  trealosa.  Diferentes  letras  (a,  b,  c)  en  la  misma  columna  indican  diferencias 
significativas (p≤0,05) entre homogeneizados.  
 

   T2 (1)  T2 (2)  T2 (3)  T2 (4)  T2 (5) 

MC  ‐   2,1 ± 0,3a    7,0 ± 1,0a  85,4 ± 3,0a  491,3 ± 16,5a 

CD‐T   1,2 ± 0,1a    2,7 ± 0,5ab  10,5 ± 3,9a  85,2 ± 0,6a    705,0 ± 183,8a 

LF‐T  1,2 ± 0,1a  3,5 ± 0,6b    9,3 ± 1,5a  87,7 ± 0,2a    665,0 ± 153,5a 

 

   A (1)  A (2)  A (3)  A (4)  A (5) 

MC  ‐  2,0 ± 0,0a  1,0 ± 0,0a     55,8 ± 3,5a  11,8 ± 1,5a 

CD‐T  2,8 ± 1,0a  3,5 ± 1,3a  1,0 ± 0,8a  160,5 ± 5,8c    2,3 ± 0,5b 

LF‐T  3,8 ± 1,5a  2,0 ± 1,2a  1,5 ± 0,6a  145,8 ± 9,4b    2,0 ± 0,0b 

 

Otras dos componentes de relajación minoritarias (Figura 73B) son T2b1, que representa el agua 
unida  fuertemente  a macromoléculas  (Erikson  et  al.,  2012),  y  T2b2,  que  refleja  el  grado  de 
disociación del músculo. La masa control (MC) presentó ausencia del pico T2b1 (ausencia de agua 
unida a macromoléculas) y menor  tiempo de  relajación para el pico T2b2  (diferente grado de 
disociación  del  músculo).  Estos  resultados  sugieren  cambios  morfológicos  de  la  proteína 
muscular en la masa control, lo cual se atribuye a la disociación con sal que ha sufrido durante 
el homogeneizado.  Este evento aparentemente cambió hacia tiempos de relajación más altos 
en las formulaciones de las masas con liposomas (2,7 ms en LFT y 3,5 ms en CD‐T), indicativos 
de  cambios morfológicos  en  las  proteínas,  en  especial  las masas  que  contienen  liposomas 
liofilizados (LF‐T).  

La amplitud ligeramente mayor de T21 en el lote FT‐T coincidiendo con una mayor amplitud en 
el componente de T2b parece ser consistente con una mayor cantidad de agua estrechamente 
unida a la proteína. Un nuevo componente más rápido que surge en 1,2 ms se podría relacionar 
directamente con  la presencia de  las vesículas de fosfolípidos, ya que no se detectó señal de 
resonancia en la formulación control (MC). Sin embargo, estudios previos con muestras similares 
mostraron que este pico sí aparecía en la formulación control, por lo que se descarta su relación 
estricta con las vesículas o los fosfolípidos.  

Calorimetría Diferencial de Barrido 

Las  propiedades  térmicas  analizadas  mediante  Calorimetría  Diferencial  de  Barrido  de  las 
formulaciones de los homogeneizados de merluza con y sin liposomas se muestran en la figura 
74. El termograma de la masa control (MC) mostró tres transiciones de fase endotérmicas: dos 
de ellas minoritarias a temperaturas de 29,2 °C y 42,0 °C relacionadas con el subfragmento S1 
de la miosina y con la cola de la miosina, respectivamente, y una principal a 69,4 °C asociada con 
la desnaturalización térmica de  la F‐actina. Las transiciones en  la molécula de miosina fueron 
difusas debido a la desnaturalización de la proteína miosina como consecuencia del proceso de 
homogenización del músculo  con NaCl  (Fernández‐Martín  et  al., 1998).  La  F‐actina  fue más 
resistente a la desnaturalización, como evidencia su evento térmico más pronunciado. 

La  adición  de  liposomas  en  los  homogeneizados  de merluza  dio  lugar  a  eventos  térmicos 
asociados  a  la miosina más difusos  y  causó un  incremento de  la  temperatura de  transición 
asociada a  la molécula de actina,  con una disminución de  la entalpía  total. Estos  resultados 
indican cambios estructurales notables en la proteína miofibrilar, causados por la interacción de 



Resultados 

185 

 

los liposomas con la matriz muscular. El tipo de preparación liposomal no produjo ningún cambio 
significativo en  la desnaturalización de  la miosina. Sin embargo, el aumento de  la estabilidad 
térmica de la F‐actina como consecuencia de la adición de liposomas fue más acusado cuando 
los liposomas fueron añadidos en estado seco (LF‐T), probablemente debido a su mayor grado 
de  agregación  proteica  resultado  de  la  insuficiente  solubilización  de  la  estructura  proteica 
cuando fue homogeneizado con NaCl, como corroboraron sus resultados de menor solubilidad 
proteica y menor cantidad de agregados de pequeño tamaño.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 74. Termogramas reflejando las transiciones de fase mediante los cambios de temperatura (T, °C) 
y entalpía  (ΔH, W/g)  analizados mediante Calorimetría Diferencial de Barrido de homogeneizados de 
músculo de merluza con sal control  (MC) y con  la adición de diferentes  liposomas estabilizados. CD‐T: 
congelado/descongelado con trealosa; LF‐T: liofilizado con trealosa. 
 

Reología dinámica oscilatoria 

El espectro mecánico de  las masas con y sin  liposomas reflejando el módulo elástico (G´) y el 
módulo  viscoso  (G´´)  en  función  de  un  barrido  de  frecuencias  de  0,1‐10 Hz  a  temperatura 
constante de 10 °C se muestra en la figura 75. Los valores de G´ prevalecieron sobre los de G´´, 
indicando que estos homogeneizados tuvieron un comportamiento viscoelástico típico de un gel 
(Badii & Howell, 2002). 

Los  parámetros  del  espectro mecánico  de  G0´,  obtenido  del  barrido  de  frecuencias,  y  n´, 
obtenido del ajuste del espectro mecánico al modelo de la ley de la potencia (R2>0,99), a 1 Hz 
de las diferentes formulaciones de masas de merluza con y sin liposomas se muestran en la tabla 
31.  La  adición  de  liposomas  incrementó  el  valor  de  G0´  desde  2034,3  Pa  hasta  valores  de      
2655,7 Pa para CD‐T y de 3645,6 Pa para LF‐T; y el valor de n´ desde 0,157 hasta 0,185 para      
CD‐T  y  0,161  para  LF‐T,  indicando  una  mayor  inestabilidad  estructural  en  las  masas  que 
contienen liposomas, atribuida a su mayor valor de n´ (Campos & Tovar, 2008). Esta inestabilidad 
fue más  acusada  en  CD‐T  (mayor  valor  de  n´),  probablemente  debido  a  que  la  dispersión 
liposomal puede acceder más fácilmente a las cadenas laterales de la proteína con respecto a la 
formulación liofilizada, induciendo una mayor discontinuidad de la matriz por su interferencia 
con las interacciones proteína‐proteína.  

0.02
W/g

MC 

CD-T 

LF-T 

T
inicio 

= 29,2°C

T
inicio 

= 42,0°C

T
max 

= 69,4 °C 
ΔH= 0,237 J/g 

T
max 

= 71,7 °C 
ΔH= 0,118 J/g 

T
max 

= 73,4 °C 
ΔH= 0,019 J/g 

En
ta
lp
ía
 (
J/
g)

 

20 30 40 6050 80 70

Temperatura (°C)

0,02  
J/g 



Capítulo 3 

186 

 

 

Figura  75.  Comportamiento  viscoelástico  en  función  de  un  barrido  de  frecuencias  (0,1‐10  Hz)  y 
temperatura constante (10 °C) de homogeneizados de músculo de merluza con sal control (MC) y con la 
adición  de  diferentes  liposomas  estabilizados.  CD‐T:  congelado/descongelado  con  trealosa;  LF‐T: 
liofilizado con trealosa. A) Módulo elástico (G´). B) Módulo viscoso (G´´). 
 

Tabla 31. Parámetros viscoelásticos de G0´ (Pa) y valor de la ley de la potencia (n´) medidos a 1 Hz y 10 °C 
de homogeneizados de músculo de merluza con sal control (MC) y con la adición de diferentes liposomas 
estabilizados. CD‐T: congelado/descongelado con trealosa; LF‐T: liofilizado con trealosa. Diferentes letras 
(a, b, c) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre homogeneizados.  

  G0´ (Pa)  n´ 

MC   2034,3 ± 138,2a   0,157 ± 0,012a

CD‐T  2655,7 ± 44,4ab 0,185 ± 0,001a

LF‐T   3645,6 ± 545,4b 0,161 ± 0,009a

 

El  comportamiento  viscoelástico  de  los  formulados  de  merluza  con  liposomas  expresado 
mediante el módulo elástico (G´), el módulo viscoso (G´´) y el ángulo de fase (δ) en función de 
un barrido de temperaturas de 15 a 80 °C, a frecuencia constante de 1 Hz, se muestra en la figura 
76. El homogeneizado control presentó una caída pronunciada tanto de G´ como de G´´ (Figura 
76A  y  76B,  respectivamente)  entre  20  °C  y  30  °C,  atribuida  a  la  desnaturalización  proteica 
resultante de  la  rotura de puentes de hidrógeno  sensibles al  calor. Este efecto promovió el 
desplegamiento de la estructura proteica y la mayor exposición de sus sitios reactivos, lo que 
permitió la subsecuente formación de enlaces intermoleculares a temperaturas superiores. Este 
efecto fue más pronunciado en la masa control, lo que coincide con su mayor incremento tanto 
de  G´  como  de  G´´  a  elevadas  temperaturas,  en  comparación  con  aquellas  que  contienen 
liposomas. En todas las muestras se observó un pico de G´ a ≈38 °C, asociado con el fenómeno 
de  asentamiento,  que  corresponde  a  una  estabilización  proteica  preliminar  mediante 
interacciones hidrofóbicas y enlaces covalentes ε‐(γ‐glutamil)‐lisina  inducidos por  la actividad 
transglutaminasa endógena (Lanier et al., 2013). En torno a 45 °C se observó también en las tres 
muestras un pico conocido como fenómeno modori, caracterizado por la desintegración de la 
red proteica debido a la actividad de proteasas. El subsecuente aumento de G´ y disminución 
del ángulo de fase (Figura 76C) en el rango de temperaturas de 45 °C a 80 °C indicó la formación 
de  la  red  proteica  de  gel  inducida  por  interacciones  hidrofóbicas  termoestables  y  enlaces 
disulfuro covalentes.   

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 5 10

G
´
(P
a)

Frecuencia (Hz)

MC CD‐T LF‐T

A

0

200

400

600

800

1000

0 5 10

G
´´
(P
a)

Frecuencia (Hz)

MC CD‐T LF‐T

B



Resultados 

187 

 

 

 

 

Figura 76. Comportamiento viscoelástico en función de un barrido de temperatura (15‐80 °C) y frecuencia 
constate a 1 Hz de homogeneizados de músculo de merluza con  sal control  (MC) y con  la adición de 
diferentes  liposomas  estabilizados.  CD‐T:  congelado/descongelado  con  trealosa;  LF‐T:  liofilizado  con 
trealosa. A) Módulo elástico (G´). B) Módulo viscoso (G´´). C) Ángulo de fase (δ). 
 

La gelificación térmica tuvo lugar en dos fases: desde 45 °C hasta 60 °C se observó un aumento 
tanto  de G´  como  de G´´,  pero  a mayores  temperaturas  el modulo  viscoso  (G´´)  empezó  a 
disminuir,  lo que  indica que  la matriz de gel ya ha  completado  su  formación a  los 60  °C. El 

0

3000

6000

9000

12000

15000

0 20 40 60 80 100

G
´
(P
a)

Temperatura (°C)

MC CD‐T LF‐T

A

0

500

1000

1500

2000

0 20 40 60 80 100

G
´´
(P
a)

Temperatura (°C)

MC CD‐T LF‐T

B

0

3

6

9

12

15

0 20 40 60 80 100

δ
(°
)

Temperatura (°C)

MC CD‐T LF‐T

C



Capítulo 3 

188 

 

aumento progresivo de G´ hasta los 80 °C podría deberse a un reforzamiento del gel atribuido a 
enlaces disulfuro covalentes. Por tanto, la presencia de liposomas no dificultó los fenómenos de 
asentamiento  o modori  y  permitió mantener  un  perfil  de  gelificación  similar  al  de  la masa 
control. Sin embargo, difirieron esencialmente en que a partir de 55 °C el incremento de G´ fue 
mucho más limitado. La presencia de liposomas contrarrestó la extensa formación de enlaces 
intermoleculares mediante  su  interferencia  en  las  interacciones proteína‐proteína.  El mayor 
grado de agregación proteica en las formulaciones de las masas con liposomas añadidos dificultó 
la disponibilidad de los sitios reactivos de las proteínas para la posterior gelificación térmica de 
la proteína.   

Propiedades mecánicas 

Las propiedades mecánicas en función de los parámetros de fuerza de rotura (N), deformación 
(mm) y fuerza de gel (N x mm) de los geles obtenidos a partir de las diversas masas de merluza 
con y sin liposomas se muestran en la figura 77.  

 

 

Figura  77.  Propiedades mecánicas  de  los  geles  de músculo  de merluza  con  sal  control  (MC)  y  con 
liposomas  estabilizados.  CD‐T:  congelado/descongelado  con  trealosa;  LF‐T:  liofilizado  con  trealosa. 
Diferentes  letras  (a, b)  indican diferencias significativas  (p≤0,05) entre geles para una  temperatura de       
60 °C. A) Fuerza de rotura (N). B) Deformación (mm). C) Fuerza de gel (N x mm).  

 

El gel control (MC) presentó la mayor fuerza de gel (p≤0,05) (Figura 77C) como resultado de su 
mayor  fuerza  de  rotura  (Figura  77A)  y  su  mayor  deformación  (Figura  77B).  El  estado  de 
hidratación de los liposomas no fue un factor determinante en las propiedades mecánicas de los 
geles, puesto que no se observaron diferencias significativas (p>0,05) entre CD‐T y LF‐T. Estos 
resultados estuvieron en concordancia con el similar comportamiento viscoelástico encontrado 
para estas dos muestras. Los  resultados obtenidos confirman que  la presencia de  liposomas 
interfiere  fuertemente  con  la  formación de  la  red de  gel,  dando  lugar  a  geles más débiles. 

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

MC CD‐T LF‐T

Fu
er
za
 (
N
)

a

b b

A

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

MC CD‐T LF‐T

D
ef
o
rm

ac
ió
n
 (
m
m
)

a

b
b

B

0

2

4

6

8

10

MC CD‐T LF‐TFu
er
za
 d
e 
ge
l (
N
 x
 m

m
)

a

bb

C



Resultados 

189 

 

Cardoso et al. (2010) obtuvieron una mayor fuerza de gel en geles de merluza formados a 90 °C 
durante 1 h, probablemente debido a su menor contenido en agua (80 % vs. 85 %) y su mayor 
proporción de NaCl (2,5 % vs. 1 %). 

Conclusiones 

Los  liposomas de  fosfatidilcolina de  soja con  trealosa  sometidos a congelación y  liofilización 
tuvieron propiedades de partícula similares. Independientemente del estado de hidratación, los 
liposomas incrementaron la capacidad de retención de agua de los homogeneizados de merluza, 
pero dificultaron su capacidad de gelificación  térmica mediante el  incremento del estado de 
agregación de la proteína miofibrilar. El efecto de los liposomas en las propiedades mecánicas 
de  los geles de pescado debería considerarse para el futuro diseño de productos de pescado 
funcionales.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Resultados 

191 

 

8.7. LIPOSOMAS DE FOSFATIDILCOLINA LIOFILIZADOS ENCAPSULANDO VARIOS EXTRACTOS 
ANTIOXIDANTES A PARTIR DE RESIDUOS NATURALES COMO INGREDIENTES FUNCIONALES EN 
GELES DE SURIMI  

Resumen 

Se encapsularon tres extractos bioactivos antioxidantes (un hidrolizado de colágeno, un extracto 
de piel y albedo de granada y un extracto lipídico de langostino) en liposomas de fosfatidilcolina 
de soja con glicerol. El tamaño de partícula de las dispersiones osciló entre 75,7 y 81,0 nm y el 
potencial zeta desde ‐64,6 mV hasta ‐88,2 mV. La liofilización incrementó el tamaño de partícula 
hasta  un  rango  de  199‐283  nm  y  disminuyó  ligeramente  el  potencial  zeta.  Los  liposomas 
liofilizados se  incorporaron en geles de surimi de calamar a una concentración del 10,5 %. Se 
preparó  también  una  formulación  funcional  alternativa mediante  la  adición  directa  de  los 
extractos bioactivos en el surimi  (2 %), sin encapsular. Se caracterizó el color,  la  textura y  la 
estabilidad  oxidativa  de  los  geles,  recién  procesados  y  tras  un  determinado  tiempo  de 
conservación en congelación. La incorporación de liposomas liofilizados causó una disminución 
de la fuerza de gel y contribuyó a mantener la estabilidad de los geles en el tiempo. También se 
determinaron  las propiedades antioxidantes de  los extractos bioactivos,  liposomas y geles de 
surimi sometidos a una digestión in vitro.  

Palabras clave: fosfatidilcolina de soja,  liposomas,  liofilización, geles de surimi, conservación, 
antioxidantes.  

Introducción 

Los consumidores buscan cada vez más un estilo de vida más saludable, haciendo que haya que 
prestar más atención a las dietas equilibradas, las cuales garantizan un buen estatus nutricional 
y  la  prevención  de  enfermedades  crónicas.  Hace  algunos  años  las  industrias  alimentarias 
empezaron a incorporar ingredientes saludables en las comidas preparadas, también llamados 
“alimentos  funcionales”,  con  el  objetivo  de  proporcionar  nutrientes  importantes  y  otras 
sustancias bioactivas en la dieta. Los productos alimenticios con propiedades antioxidantes son 
adecuados para la prevención de diversas enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo, 
tales como enfermedades cardiovasculares o neurodegenerativas, diabetes y cáncer (Pham‐Huy 
et al., 2008). Las materias primas a partir de  residuos animales y vegetales  representan una 
importante fuente de compuestos antioxidantes que se podrían incluir en la composición de los 
alimentos funcionales.  

Los  geles  de  surimi  constituyen  una  matriz  alimentaria  idónea  para  la  incorporación  de 
ingredientes funcionales, dando  lugar a productos con una gran versatilidad de presentación. 
Proporcionan una fuente de proteínas musculares capaces, tras su digestión gastrointestinal, de 
liberar péptidos con actividades biológicas (Ueki et al., 2014). Sin embargo, estas actividades 
pueden verse afectadas por degradación térmica durante el proceso de gelificación o por  las 
interacciones excesivas con los componentes de la matriz (Montero et al., 2005b), afectando así 
a  la bioaccesibilidad del compuesto bioactivo presente. Una manera de mejorar  la eficacia y 
estabilidad  de  las  sustancias  bioactivas  en  sistemas  alimentarios  es  la  encapsulación  en 
liposomas (Mozafari et al., 2008). 

Las propiedades hidrodinámicas, eficacia de encapsulación y estabilidad de  los  liposomas con 
bioactivos varían en función de la naturaleza y concentración del bioactivo encapsulado (Tan et 
al., 2013). La incorporación de liposomas secos permite la posibilidad tecnológica de ajustar el 
contenido de agua del producto tipo gel resultante, lo que es de gran importancia para modular 
sus propiedades mecánicas.  



Capítulo 3 

192 

 

Además, los fosfolípidos naturales de la soja pueden interaccionar con las membranas celulares, 
cambiando su composición de ácidos grasos. De este modo pueden actuar como ingredientes 
activos para el tratamiento de varias enfermedades, tales como procesos inflamatorios, riesgo 
cardiovascular, desórdenes neurológicos, cáncer, etc. (Küllenberg et al., 2012).  

Objetivos 

El tercer objetivo parcial de este capítulo fue encapsular tres extractos (hidrolizado de colágeno, 
extracto  de  piel  y  albedo  de  granada  y  extracto  lipídico  de  langostino)  en  liposomas  de 
fosfatidilcolina de soja, someterlos a liofilización y finalmente incorporarlos en geles de surimi. 
Se estudiaron  las propiedades de partícula de  los  liposomas y el color,  textura y estabilidad 
oxidativa de los geles de surimi (recién preparados y después de 3 y 7 meses de conservación en 
congelación). Estos geles se sometieron a una digestión gastrointestinal in vitro para determinar 
el potencial biológico de  los correspondientes digeridos. También se analizó una formulación 
funcional alternativa basada en  los extractos bioactivos  incluidos directamente en  las masas 
para elaborar los geles de surimi, sin encapsular en liposomas.  

Materiales y métodos 

La fosfatidilcolina parcialmente purificada con cinco lavados de acetona (FC5) se extrajo a partir 
de lecitina de soja (LS).  

Por  otro  lado,  se  obtuvieron  tres  extractos  bioactivos  mediante  diferentes  procesos:  un 
hidrolizado peptídico de colágeno (HC) procedente de túnicas del manto del calamar gigante 
Dosidicus gigas, un extracto polifenólico de piel y albedo de granada (PG) procedente de Punica 
granatum, y un extracto lipídico rico en astaxantina (GC) procedente de bioresiduos (cutículas, 
cefalotórax,  telson, pleópodos y parápodos) del  langostino Litopenaeus vannamei. Se  llevó a 
cabo una caracterización composicional de cada uno de los extractos obtenidos.   

Seguidamente, se elaboraron liposomas con glicerol a partir de fosfatidilcolina de cinco lavados 
(FC5). En este caso,  los diferentes extractos bioactivos  (HC, PG y GC) se encapsularon en  los 
liposomas a una concentración final de bioactivo del ≈4,0 %, incluyéndolos en la disolución inicial 
con  la  fosfatidilcolina.  Se  estudiaron  las  propiedades  hidrodinámicas  mediante  dispersión 
dinámica  de  luz  en  Zetasizer  (dilución  1/10).  Estas  dispersiones  se  liofilizaron  y,  tras  ser 
resuspendidas, se caracterizaron sus propiedades hidrodinámicas mediante dispersión dinámica 
de luz en Zetasizer (77 mg/mL y posterior dilución 1/10), contenido en agua, dispersabilidad en 
agua y eficacia de encapsulación.  

Finalmente,  estos  liposomas  liofilizados  se  incorporaron  en  surimi  de  calamar.  El  surimi, 
previamente descongelado a 4 °C durante 24 horas, se homogeneizó con sal (NaCl, 1 %) a 2 °C 
con la cantidad de agua necesaria para obtener una humedad final del 80,5 % en el surimi. Los 
liposomas se añadieron (10 %; 28 % en base seca) a este homogeneizado de surimi y la mezcla 
se  removió  durante  otros  5 min  hasta  su  completa  homogeneización.  Las  concentraciones 
finales de  los componentes de  los  liposomas dentro del homogeneizado de surimi fueron de 
0,15  %  (0,60  %  en  base  seca)  de  extracto  bioactivo,  3,80  %  (15,6  %  en  base  seca)  de 
fosfatidilcolina y 2,90 % (11,8 % en base seca) de glicerol. A continuación, los reestructurados se 
sometieron a un proceso de gelificación. Un gel control con  liposomas sin extracto bioactivo     
(G‐L‐V) y un gel control sin liposomas ni bioactivo (G) se llevaron a cabo en paralelo. Los geles 
obtenidos  (G‐L‐HC,  G‐L‐PG  y  G‐L‐GC)  se  enfriaron  en  hielo  10  min  y  posteriormente  se 
conservaron, un lote a 4 °C hasta su uso y otro a ‐20 °C, para realizar posteriormente estudios 
de estabilidad en estado congelado (0, 3 y 7 meses). Una formulación funcional alternativa se 
preparó  en  paralelo,  consistiendo  en  los  extractos  bioactivos  incluidos  directamente  en  el 
surimi,  sin presencia de  liposomas  (ni  fosfatidilcolina ni glicerol). Estas  formulaciones  (G‐HC,       



Resultados 

193 

 

G‐PG y G‐GC) se trataron y conservaron de manera análoga, constituyendo el bioactivo en este 
caso el 2 % (9 % en base seca) del total del homogeneizado o masa.  

De estos geles de surimi obtenidos conteniendo liposomas liofilizados así como del gel de surimi 
control sin extractos se estudiaron sus propiedades de solubilidad proteica y color, propiedades 
mecánicas mediante texturometría, propiedades oxidativas mediante el índice tiobarbitúrico, y 
su estabilidad en congelación hasta un total de 7 meses (controles a 0, 3 y 7 meses) mediante 
estas mismas técnicas. De la formulación alternativa, es decir, aquella que contenía los extractos 
de manera  libremente  añadida  como  ingredientes  en  la masa  para  elaborar  los  geles,  se 
caracterizó su propiedad física de color y el exudado aparente de agua. Por último, todos  los 
geles (surimi control sin extractos y los geles con extractos, tanto añadidos directamente como 
encapsulados en liposomas, incluido el gel con liposomas vacíos) se sometieron a una digestión 
gastrointestinal in vitro, y se estudió la actividad antioxidante por los métodos de secuestro de 
radicales libres (ABTS), poder reductor del hierro (FRAP) y contenido de sustancias reactivas al 
Folin.  

Resultados y discusión 

Caracterización de los extractos bioactivos 

El hidrolizado de colágeno (HC)  liofilizado, con aspecto de un polvo fino blanquecino de muy 
bajo contenido en agua, presentó (Figura 78) una mayor proporción de los aminoácidos glicina 
(253 ‰), ácido glutámico (117 ‰), alanina (98 ‰) y ácido aspártico (92 ‰).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 78. Composición de aminoácidos del extracto de hidrolizado de colágeno (HC). 
 

La proporción de aminoácidos hidrofóbicos fue relativamente baja (28 %), muy inferior al 62 % 
obtenido por Mosquera et al. (2014) para un extracto de colágeno pero de diferente especie, ya 
que el de estos autores es de escamas de dorada y el del presente  trabajo es de  túnica de 
calamar,  por  lo  que  a  pesar  de  ser  la  misma  proteína  puede  mostrar  diferente  perfil 
aminoacídico.  Esta  baja  proporción  de  aminoácidos  hidrofóbicos  podría  ser  consecuencia 
además del diferente método de  extracción del hidrolizado. Mientras que  el de  los  citados 
autores está hidrolizado con una endopeptidasa (Esperasa),  el colágeno de túnica de calamar 
en la presente Memoria se hidrolizó con Alcalasa (endo‐ y exopeptidasa), con lo que se ha podido 
provocar  que  muchos  aminoácidos  de  carácter  hidrofóbico  quedasen  descartados  como 

0

50

100

150

200

250

300

N
º 
re
si
d
u
o
s/
1
0
0
0
 r
es
id
u
o
s



Capítulo 3 

194 

 

aminoácidos  libres.  Se  determinaron  importantes  cantidades  de  hidroxilisina  (20  ‰)  e 
hidroxiprolina (44 ‰) en el extracto HC, dado que son aminoácidos frecuentes en el colágeno. 

El perfil de distribución de pesos moleculares del extracto HC (Figura 79) mostró cuatro rangos 
de  pesos  moleculares:  6500‐1355  Da,  1355‐502  Da,  502‐75  Da  y  <75  Da,  con  diferente 
proporción para cada uno de ellos. El peso molecular predominante fue menor de 1355 Da, ya 
que la proporción entre 1355‐502 Da fue del 47 %, y la proporción inferior a 502 Da supone un 
42 %, y únicamente un 11 % es superior a 1355 Da.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

Figura 79. Distribución de pesos moleculares del extracto de hidrolizado de colágeno (HC). 
 

El extracto de piel y albedo de granada  (PG), desecado por rotaevaporación, consistió en un 
extracto  polifenólico  de  color marrón/ocre  y  de  textura  similar  a  un  caramelo,  donde  los 
principales compuestos bioactivos fueron, en orden descendente de  intensidad de detección:  
β‐punicalagina, ácido elágico, α‐punicalagina, rutina y epigalocatequina (Figura 80). La presencia 
predominante de los polifenoles elagitaninos (punicalaginas y ácido elágico) en extractos de piel 
de granada fue previamente descrita por Sun et al. (2017).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 80. Perfil cromatográfico por Cromatografía Líquida de Alta Resolución en Fase Reversa (RP‐HPLC) 
de los compuestos fenólicos principales presentes en el extracto de piel y albedo de granada (PG).  

10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min
0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0
( , )

Ácido elágico 

Rutina 

Epigalocatequina 

β-Punicalagina 

α-Punicalagina 

Tiempo (min) 

A
b
so
rb
an
ci
a 
(n
m
) 

50.0 75.0 100.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

( , , )

6500-
1355 
Da 

< 75 Da 1355-502  
Da

502-75 
Da

A
b
so
rb
an
ci
a 
(n
m
) 

Tiempo (min)



Resultados 

195 

 

El extracto de grasa de crustáceo (GC) fue un extracto bioactivo de aspecto y textura  líquido‐
viscosa con un perfil principalmente lipídico, por lo que el contenido en ácidos grasos así como 
otros  componentes  lipídicos  fueron  determinados  mediante  espectrometría  de  masas.  La 
concentración  de  ácidos  grasos  (Tabla  32),  determinada  por  cromatografía  de  gases  en  un 
trabajo previo, fue de 804 mg/g extracto, donde el 31 % fueron ácidos grasos saturados y el       
69 % ácidos grasos insaturados (25 % monoinsaturados y 44 % poliinsaturados). Estos resultados 
confirman que nuestro extracto es muy rico en material lipídico (ácidos grasos) y que el grado 
de  insaturación  es  bastante  elevado. Otros  componentes  lipídicos  presentes  en  el  extracto 
fueron colesterol (65 mg/g), α‐tocoferol (126 mg/g) y astaxantina (7 mg/g), tanto en forma libre 
como conformando mono y di‐ésteres, siendo el compuesto responsable del característico color 
naranja del extracto. El mono‐éster ácido docosahexaenoico fue el componente más abundante 
de la astaxantina (Gómez‐Estaca et al., 2017).  
 

Tabla 32. Composición lipídica del extracto de grasa de crustáceo (GC). 

Ácidos grasos: 
Saturados 

Monoinsaturados 
Poliinsaturados 

804 mg/g 
31 % 
25 % 
44 % 

Colesterol  65 mg/g 
α‐tocoferol  126 mg/g 
Astaxantina  7 mg/g 

 

Caracterización de liposomas encapsulando bioactivos 

Características de partícula 

Las características de partícula de los tres liposomas con glicerol encapsulando bioactivos, tanto 
en  forma de dispersión  liposomal  (frescos) como  liofilizados, se muestran en  la  tabla 33. Las 
dispersiones presentaron un tamaño nanométrico, con valores similares para L‐PG (81,0 nm) y 
L‐GC (80,3 nm) y ligeramente inferior (p≤0,05) para L‐HC (75,7 nm). Otros autores obtuvieron 
tamaños similares, como Mosquera et al. (2016) para liposomas de fosfatidilcolina incorporando 
una fracción peptídica <1 kDa de túnica de calamar preparados por el método de hidratación de 
film; Charcosset et al. (2015) para liposomas conteniendo α‐tocoferol preparados por el método 
de inyección de etanol; y Memoli et al. (1995) para liposomas de fosfolípidos de soja preparados 
por  el  método  de  sonicación.  No  se  observaron  diferencias  (p>0,05)  en  el  índice  de 
polidispersidad  entre  las  tres  dispersiones,  con  valores  comprendidos  entre  0,218  y  0,238, 
valores  dentro  del  rango  0,2‐0,3  esperados  para  sistemas  preparados  a  partir  de material 
biológico (Da Silva Malheiros et al., 2011). El potencial zeta de las dispersiones mostró cargas 
muy electronegativas, con valores de ‐68,4 mV para L‐HC y ‐64,6 mV para L‐PG. La dispersión     
L‐GC  destacó  por  presentar  una  carga  mucho  más  electronegativa  (p≤0,05)  que  las  dos 
anteriores,  con  ‐88,2 mV.  Estos  resultados  son  indicativos  de  una  excelente  estabilidad  de 
membrana, ya que, acorde a Müller et al. (2001),  las dispersiones se consideran estables con 
valores inferiores a ‐30 mV.   

Tras el proceso de liofilización y posterior rehidratación, el tamaño medio aumentó para los tres 
tipos de liposomas, donde L‐HC (198,9 nm) siguió siendo el de menor tamaño (p≤0,05), seguido 
por L‐PG (274,2 nm) y L‐GC (282,9 nm). El índice de polidispersidad también se incrementó tras 
la  liofilización  hasta  valores  comprendidos  entre  0,462‐0,523,  sin  diferencias  significativas 
(p>0,05) entre liposomas. Estos cambios se vieron reflejados en la distribución de tamaños de 
partícula  (Figura 81), donde  las distribuciones  típicamente monomodales de  las dispersiones 
pasaron a ser bi‐ o trimodales en los liposomas liofilizados. El liofilizado L‐HC mantuvo el 62 % 



Capítulo 3 

196 

 

de  las vesículas (expresado en  intensidad) de un tamaño de 162 nm, en contraste con L‐PG y      
L‐GC, que  registraron un  30 % de  vesículas de 121 nm  y un 26 % de  vesículas de 111 nm, 
respectivamente. Además, estos dos últimos  liposomas mostraron una  tercera población de 
mayor tamaño (0,5‐1,0 µm), lo que apoya sus mayores valores de tamaño medio.  

Estos cambios inducidos por el proceso de liofilización (p≤0,05) son probablemente debidos a la 
rotura  de  puentes  de  hidrógeno  entre  las moléculas  de  agua  y  los  grupos  polares  de  los 
fosfolípidos  (Stark  et  al.,  2010).  Durante  la  liofilización,  los  liposomas  son  inicialmente 
concentrados  por  la  propagación  de  hielo  y  seguidamente  experimentan  cambios  en  la 
membrana  atribuidos  a  la  eliminación  del  agua  (Chen  et  al.,  2010),  desembocando  en  un 
fenómeno de agregación. Sin embargo, como muestran los resultados de la figura 81, un gran 
porcentaje de vesículas permanecen en el rango de  la escala nanométrica  (≈100 nm)  incluso 
después  de  ser  liofilizadas.  El  potencial  zeta mantuvo  una  gran  estabilidad  de  partícula  y 
continuó muy electronegativo después de la liofilización y rehidratación de los liposomas, con 
valores comprendidos entre ‐58,5 mV y ‐62,9 mV.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 81. Distribución de tamaños de partícula de liposomas liofilizados encapsulando: A) hidrolizado de 
colágeno (L‐HC), B) extracto de piel de granada (L‐PG), C) extracto de grasa de crustáceo (L‐GC).  

Tamaño (nm)

In
te
n
si
d
ad

 (
%
) 

A 

Tamaño (nm)

In
te
n
si
d
ad

 (
%
) 

B 

Tamaño (nm)

In
te
n
si
d
ad

 (
%
) 

C 



Resultados 

197 

 

Tabla 33. Tamaño medio (nm), índice de polidispersidad y potencial zeta (mV) de dispersiones liposomales 
y liposomas liofilizados encapsulando: hidrolizado de colágeno (L‐HC), piel de granada (L‐PG) y grasa de 
crustáceo (L‐GC). Diferentes letras (a, b, c) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) 
entre liposomas en un mismo estado físico; y (x, y) en la misma fila entre una misma formulación liposomal 
en diferentes estado físicos.  

  Dispersiones 
liposomales 

Liposomas 
liofilizados 

Tamaño medio 
(nm) 

L‐HC  75,7 ± 0,5a/x 198,9 ± 2,8a/y 

L‐PG  81,0 ± 0,6b/x 274,2 ± 3,3b/y 

L‐GC  80,3 ± 1,1b/x 282,9 ± 2,3c/y 

Índice de 
polidispersidad  

L‐HC  0,231 ± 0,010a/x 0,462 ± 0,035a/y 

L‐PG  0,238 ± 0,012a/x 0,518 ± 0,029a/y 

L‐GC  0,218 ± 0,013a/x 0,523 ± 0,037a/y 

Potencial zeta 
(mV) 

L‐HC  −68,4 ± 1,8a/x −62,9 ± 1,2b/x 

L‐PG  −64,6 ± 1,8a/x −58,5 ± 1,6a/y 

L‐GC  −88,2 ± 2,7b/x −62,5 ± 1,7b/y 
 

 

Eficacia de encapsulación 

La  eficacia  de  encapsulación  de  los  liposomas  liofilizados  varió  en  función  del  bioactivo 
encapsulado. El  liposoma L‐HC  fue el que presentó una mayor tasa de encapsulación  (95 %), 
probablemente debido al bajo peso molecular del extracto HC (mayoritariamente <1,3 kDa) y a 
la escasa cantidad de residuos hidrofóbicos. La mayor abundancia de péptidos hidrofílicos se 
situarían en el núcleo acuoso o adheridos a  la superficie de membrana de  los  liposomas. Los 
liposomas  L‐GC mostraron una eficacia de encapsulación del 90 %, aunque en este  caso, el 
bioactivo se localizaría preferentemente dentro de la bicapa dado su carácter lipofílico. Tan et 
al.  (2013) obtuvieron  similares  resultados  (82,64‐91,98 %) para  liposomas de  fosfatidilcolina 
incorporando  luteína.  Los  liposomas  de  piel  de  granada  (L‐PG)  mostraron  una  tasa  de 
encapsulación inferior a los dos anteriores, con un valor del 63 %, atribuida a una cierta cantidad 
de extracto no encapsulado. Hue et al. (2010) obtuvieron una tasa de encapsulación del 89 % 
para liposomas de lecitina de soja incorporando procianidina extraída de la piel de la granada. 
Los  compuestos  fenólicos  polares  del  extracto  de  PG,  tales  como  punicalagina  y  rutina,  se 
localizarían  preferentemente  en  el  núcleo  acuoso  o  asociados  a  las  cabezas  polares  de  los 
fosfolípidos.  Sin  embargo,  el  ácido  elágico  (poco  soluble  en  solventes  polares)  quedaría 
intercalado  en  las  cadenas  alifáticas  de  la membrana,  con  una  presumible  baja  eficacia  de 
encapsulación. Los compuestos fenólicos son conocidos por interaccionar con los grupos polares 
y por intercalarse en la membrana de la bicapa lipídica (Pawlikowska‐Pawlęga et al., 2014). La 
eficacia de encapsulación depende de la naturaleza y composición del material encapsulante, el 
método de preparación, la presencia de crioprotectores y la concentración y tipo de bioactivo 
(Tan et al., 2016).  

Contenido en agua 

En cuanto al contenido de agua de  los  liposomas  liofilizados (Tabla 34), fue bastante elevado 
para todas  las muestras  (34,7‐37,1 %), sin diferencias significativas  (p>0,05) entre  liposomas. 
Estos resultados fueron muy superiores a los obtenidos por Van Winden et al. (1997), con un 
rango de 0,4‐0,7 %. Este elevado porcentaje de contenido en agua se atribuye principalmente a 
la presencia de glicerol en la formulación liposomal (42 % en base seca). El glicerol se incluye en 
la formulación para proteger la estabilidad de los liposomas durante el proceso de liofilización 
mediante  el mantenimiento  de  la  integridad  vesicular  y  la  prevención  de  sedimentación  y 
liberación  del  bioactivo  (Mozafari,  2005).  Sin  embargo,  el  glicerol  actúa  como  plastificante 
induciendo un incremento de la hidratación de las bicapas lipídicas (Manca et al., 2013), lo que 



Capítulo 3 

198 

 

aumenta el contenido en agua de  la muestra final y da  lugar a  liposomas con una apariencia 
gomosa (Stark et al., 2010).   
 

Tabla  34.  Contenido  en  agua  (%)  y  dispersabilidad  agua  (%)  de  liposomas  liofilizados  encapsulando: 
hidrolizado de colágeno (L‐HC), piel de granada (L‐PG) y grasa de crustáceo (L‐GC). Diferentes letras (a) en 
la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre liposomas.  

  Liposomas liofilizados 

Contenido en 
agua (%) 

L‐HC  34,7 ± 2,4a

L‐PG  37,1 ± 5,0a

L‐GC  35,3 ± 1,3a

Dispersabilidad 
en agua (%) 

L‐HC  82,2 ± 1,0a

L‐PG  84,9 ± 0,6a

L‐GC  83,1 ± 0,3a

 

Dispersabilidad en agua 

La dispersabilidad en agua de los liposomas liofilizados (Tabla 34) fue muy elevada para los tres 
liposomas,  sin  diferencias  (p>0,05)  entre  ellos.  Estos  valores  fueron  superiores  al  80  %             
(82,2‐84,9 %), indicando una muy buena dispersabilidad en agua. Estos resultados indican por 
un  lado que el glicerol no afecta negativamente a esta propiedad  liposomal y por otro que  la 
estructura de  liposomas mejora  la dispersabilidad en agua del extracto de GC, a pesar de su 
fuerte naturaleza lipofílica. Peng et al. (2010) observaron los mismos resultados encapsulando 
astaxantina.  

Caracterización de geles de surimi formulados con liposomas 

Color 

El gráfico reflejando  los parámetros de color, cromaticidad y tonalidad, de  los geles con y sin 
liposomas se muestra en la figura 82. La adición de los extractos HC y PG al surimi (G‐HC y G‐PG) 
modificó ligeramente sus valores de cromaticidad y tonalidad con respecto al gel control (G), sin 
diferencias entre geles que tienen incorporados los diferentes bioactivos como ingrediente de 
manera  libre,  sin  añadirlo  a  liposomas.  En  cambio,  la  adición  de  GC  (G‐GC)  modificó 
notablemente ambos parámetros con respecto al gel control y a los geles con HC y PG. Este gel 
con GC  tuvo un mayor valor de cromaticidad y  tonalidad comprendido en  la  región naranja‐
rojiza, debido a su llamativo color naranja, atribuido a la presencia de astaxantina presente en 
el extracto de grasa de crustáceo.  

La adición de  los bioactivos encapsulados en  liposomas al  surimi  siguió un  comportamiento 
diferente. Los geles que contienen liposomas de HC (G‐L‐HC) fueron muy similares al gel control 
(G), mientras que los geles que contienen liposomas de PG y GC (G‐L‐PG y G‐L‐GC) tuvieron un 
destacado mayor valor de cromaticidad y un menor valor de tonalidad que el control, diferencias 
atribuidas a los extractos bioactivos (ya sea la parte no encapsulada o la que queda adherida a 
la membrana externa). Una vez más la formulación con GC fue la más diferente del control. Los 
geles  con  liposomas  vacíos  (G‐L‐V)  mostraron  valores  intermedios  entre  el  control  y  los 
bioactivos encapsulados. 

Si  comparamos  únicamente  entre  formulaciones  con  bioactivos,  aquéllas  con  el  bioactivo 
añadido directamente en el surimi presentaron una ligera disminución del tono con respecto al 
control, y un mayor valor de cromaticidad (excepto las muestras de PG), reflejando una mayor 
saturación del color como consecuencia de la adición directa del bioactivo.  

 



Resultados 

199 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura  82.  Gráfico  reflejando  los  parámetros  de  color  cromaticidad  y  tonalidad  de  geles  de  surimi 
formulados con extractos (G‐HC, G‐PG y G‐GC) y formulados con extractos encapsulados en  liposomas   
(G‐L‐V, G‐L‐HC, G‐L‐PG y G‐L‐GC), y un gel control sin liposomas (G).  
 

Estos  resultados  fueron confirmados por el aspecto visual de dichos geles  (Figura 83). El gel 
control (G) mostró un color blanco intenso (“A”) correspondiente al color del surimi, mientras 
que  los  geles  con  liposomas  presentaron  tonalidades  suaves  del  color  de  los  extractos 
encapsulados, en algunos casos algo más intensas, como por ejemplo en G‐L‐PG (“D”) y G‐L‐GC 
(“E”). El gel con los liposomas de hidrolizado de colágeno (G‐L‐HC) presentó un color amarillento 
(“C”) atribuido más al color de la fosfatidilcolina (amarillo) que al del propio extracto (el cual era 
blanco). Esto se confirmó con el color del gel que contiene liposomas vacíos (G‐L‐V) que mostró 
un  color amarillento  (“B”), muy  similar al de G‐L‐HC, que  se  corresponde  con el  color de  la 
fosfatidilcolina. En cambio, el gel con hidrolizado de colágeno  (G‐HC) sí que mostró un color 
blanquecino atribuido únicamente al color del extracto (“F”). La ausencia de la cápsula permite 
que el gel adquiera un tono más  intenso del color del extracto, como mostraron también  los 
geles G‐GC (“G”) y G‐PG (“H”), con intenso color naranja y marrón, respectivamente.  

Los  geles  con  bioactivos  añadidos  directamente mostraron  un  color mucho más  intenso  y 
llamativo, sin embargo, no presentaron una estructura y consistencia adecuada. Además, como 
se observa en la figura 83 (muestras “F”, “G” y “H”), estos geles tuvieron importantes pérdidas 
de agua como consecuencia de la ausencia de la cápsula (liposomas) y la interacción directa del 
bioactivo con  la matriz muscular. Esto pone de manifiesto que requerirían de un  ingrediente 
ligante en la formulación de este sistema modelo para conferir una estructura adecuada, lo cual 
es  habitual  a  nivel  industrial.  Por  el  contrario,  los  geles  que  contienen  liposomas  como 
ingrediente no parece que precisen de ingredientes adicionales para una formulación definitiva.  

 

 

 

0

30

60

90

120

150

180

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0510152025303540

0

5

G 
G‐GC 
G‐HC 
G‐PG 

G‐L‐GC 
G‐L‐HC 
G‐L‐PG 

G‐L‐V 

Cromaticidad 



Capítulo 3 

200 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura  83.  Fotografías  de  los  diferentes  geles  de  surimi. A:  gel  control  sin  liposomas  (G);  B:  gel  con 
liposomas vacíos (G‐L‐V); C: gel con liposomas de HC (G‐L‐HC); D: gel con liposomas de PG (G‐L‐PG); E: gel 
con liposomas de GC (G‐L‐GC); F: gel con extracto de HC (G‐HC); G: gel con extracto de PG (G‐PG); H: gel 
con extracto de GC (G‐GC). 

 

De hecho, la solubilidad proteica mostró valores muy bajos y similares (p>0,05) para todos los 
geles que contenían  liposomas  (7,81‐14,42 %),  incluido el gel control  (8,36 %)  formulado sin 
liposomas, como cabía esperar, pues ya se ha  formado el gel definitivo, y   por tanto enlaces 
covalentes que implican una fuerte agregación proteica. Aun así queda alrededor de un 10 % de 
proteína soluble no agregada.  

Los geles con liposomas se conservaron durante 7 meses a temperatura de congelación (‐20 °C) 
y se estudiaron sus parámetros de color cromaticidad y tonalidad durante este tiempo (Tabla 
35). Todos  los  geles mantuvieron  constantes  ambos parámetros durante  todo el  tiempo de 
conservación, manteniendo por tanto el mismo color durante 7 meses y reflejando una buena 
estabilidad en el tiempo.  

 

 

F 
HG

A B

C D E 



Resultados 

201 

 

Tabla 35. Parámetros de color cromaticidad y tonalidad de geles de surimi con liposomas (G‐L‐V, G‐L‐HC, 
G‐L‐PG, G‐L‐GC) y gel control sin liposomas (G), y su conservación hasta 7 meses a ‐20 °C. Diferentes letras 
(a, b, c, d, e) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre geles para un mismo 
tiempo de conservación y (m, n, o) en  la misma fila entre diferentes tiempos de conservación para un 
mismo gel. 

  0 meses  3 meses  7 meses 

Cromaticidad 

G    6,24 ± 0,06a/m   5,67 ± 0,06a/n   5,55 ± 0,04a/o 

G‐L‐V  14,76 ± 0,04c/m 14,83 ± 0,03d/m 15,08 ± 0,11d/n 

G‐L‐HC  14,89 ± 0,05d/m 13,57 ± 0,07c/n 13,62 ± 0,11c/n 

G‐L‐PG  12,47 ± 0,06b/m 11,10 ± 0,21b/n 10,81 ± 0,21b/o 

G‐L‐GC   24,94 ± 0,15e/mn 24,87 ± 0,12e/m 25,04 ± 0,13e/n 

Tonalidad 

G  122,64 ± 0,17e/m 132,12 ± 0,49d/o 129,25 ± 0,24d/n 

G‐L‐V    86,38 ± 0,10d/m   86,14 ± 0,06c/n   85,34 ± 0,14c/o 

G‐L‐HC    86,08 ± 0,07c/m   86,15 ± 0,12c/m   85,25 ± 0,14c/n 

G‐L‐PG    78,69 ± 0,19b/m   78,58 ± 0,30b/m   79,28 ± 0,49b/n 

G‐L‐GC    54,76 ± 0,05a/m   54,37 ± 0,09a/o   54,57 ± 0,03a/n 

 

Propiedades mecánicas 

Las propiedades mecánicas de fuerza de rotura (N), deformación (mm) y fuerza de gel (N x mm) 
de los geles formulados con liposomas se muestran en la tabla 36. El gel control (G) tuvo el mayor 
valor (p≤0,05) de fuerza de gel (8,98 N x mm) en comparación con cualquiera de los geles con 
liposomas (1,81‐2,91 N x mm), atribuido a sus mayores valores tanto de fuerza de rotura (N) 
como de deformación del gel (mm). Estas diferencias se debieron a que los liposomas interfieren 
en las interacciones proteína‐proteína de la matriz, disminuyendo la fuerza de gel y dando lugar 
a geles más débiles.  

Los  geles  con  liposomas G‐L‐HC  y G‐L‐GC  tuvieron  valores  similares  (p>0,05),  a  pesar  de  la 
diferente naturaleza de su extracto, y fueron superiores a G‐L‐V y G‐L‐PG, que mostraron  los 
valores más bajos de fuerza de gel, atribuidos a sus menores valores de deformación y de fuerza 
de rotura. En particular, G‐L‐PG fue el de menor valor (1,81 N x mm) de fuerza de gel,  lo que 
coincide con su mayor solubilidad proteica, obteniéndose un gel más débil. Esto indica que los 
liposomas que encapsulan el extracto de piel de granada inducen una mayor alteración en la red 
proteica  del  gel,  probablemente  debido  a  la  gran  cantidad  de  compuestos  fenólicos  no 
encapsulados.  

Tras conservar los geles en congelación a ‐20 °C durante 7 meses (Tabla 36), el gel control (G) 
mostró un endurecimiento progresivo y acentuado hasta valores  finales de  fuerza de gel de 
19,79 N x mm (y continuó siendo el que mostró más agregación y compactación), atribuido al 
aumento a 3 y 7 meses de conservación del parámetro de fuerza de rotura, sin apenas cambios 
en el de deformación. En  cambio,  los geles que  contienen  liposomas  fueron más estables y 
previnieron  en  mayor  medida  la  agregación  proteica  inducida  por  la  conservación  en 
congelación. Todos ellos experimentaron un leve incremento de su fuerza de gel a los 3 meses, 
debido a aumentos tanto de su fuerza de rotura como de la deformación de gel. Sin embargo, a 
partir de este momento los geles se mantuvieron estables manteniéndose los valores de fuerza 
de gel constantes durante el resto del periodo de conservación, excepto para G‐L‐GC que siguió 
aumentando hasta un valor final de 5,90 N x mm, atribuido al aumento de ambos parámetros. 
Entre ellos, el gel que contiene liposomas encapsulando el extracto de piel de granada (G‐L‐PG) 
fue el que más  incrementó su fuerza de gel, probablemente debido a su mayor  inestabilidad 
estructural inicial.  
 



Capítulo 3 

202 

 

Tabla 36. Propiedades mecánicas de fuerza de rotura (N), deformación (mm) y fuerza de gel (N x mm) de 
geles de surimi formulados con liposomas (G‐L‐V, G‐L‐HC, G‐L‐PG, G‐L‐GC) y gel control sin liposomas (G), 
y su conservación hasta 7 meses a ‐20 °C. Diferentes  letras (a, b, c, d, e) en  la misma columna  indican 
diferencias significativas  (p≤0,05) entre geles para un mismo tiempo de conservación y  (m, n, o) en  la 
misma fila entre diferentes tiempos de conservación para un mismo gel.  

  0 meses  3 meses  7 meses 

Fuerza de 
rotura 
(N) 

G  1,25 ± 0,05c/m  1,71 ± 0,13c/n  2,47 ± 0,03e/o 

G‐L‐V  0,43 ± 0,02b/m  0,62 ± 0,06a/n  0,57 ± 0,01a/n 

G‐L‐HC   0,41 ± 0,01ab/m  0,76 ± 0,04a/n  0,74 ± 0,02b/n 

G‐L‐PG  0,35 ± 0,03a/m  0,94 ± 0,01b/n  1,02 ± 0,01d/o 

G‐L‐GC  0,47 ± 0,02b/m  0,57 ± 0,08a/m  0,87 ± 0,02c/n 

Deformación 
(mm) 

G  7,15 ± 0,16d/m   6,98 ± 0,04bc/m  8,00 ± 0,00e/n 

G‐L‐V  4,33 ± 0,06a/m  5,01 ± 0,01a/n  5,32 ± 0,13a/o 

G‐L‐HC     6,39 ± 0,12cd/mn   6,91 ± 0,39bc/n  6,01 ± 0,07b/m 

G‐L‐PG  5,21 ± 0,75b/m  7,76 ± 0,12c/n  7,23 ± 0,05d/n 

G‐L‐GC  6,13 ± 0,06c/m   6,21 ± 1,17ab/m  6,81 ± 0,13c/m 

Fuerza de gel 
(N x mm) 

Gel  8,98 ± 0,56c/m  11,94 ± 0,95d/n  19,79 ± 0,21e/o 

G‐L‐V  1,87 ± 0,06a/m    3,11 ± 0,30a/n     3,04 ± 0,11a/n 

G‐L‐HC  2,63 ± 0,02b/m    5,24 ± 0,50b/o     4,45 ± 0,10b/n 

G‐L‐PG  1,81 ± 0,24a/m    7,29 ± 0,17c/n     7,38 ± 0,11d/n 

G‐L‐GC  2,91 ± 0,16b/m    3,59 ± 1,03a/m     5,90 ± 0,18c/n 

 

Efecto oxidativo 

La estabilidad oxidativa de  los geles con  liposomas se determinó mediante el  índice del ácido 
tiobarbitúrico  (Tabla  37),  que  cuantifica  el  contenido  de  malonaldehído,  un  reconocido 
compuesto de oxidación secundaria responsable de la oxidación lipídica. La adición de liposomas 
al  surimi  incrementó  el  contenido  de  malonaldehído  en  los  geles  respecto  al  gel  control        
(0,088  µg/kg  gel),  siendo  mayor  para  G‐L‐HC  (0,511  µg/kg  gel)  y  menor  para  G‐L‐PG                  
(0,276 µg/kg gel), posiblemente debido a la excelente actividad antioxidante del extracto de piel 
de granada  (PG), atribuida a  su  composición  rica en  compuestos  fenólicos. Estos  resultados 
indican que  la adición de  liposomas puede  causar oxidación  lipídica, que puede  tener  lugar 
durante el proceso de preparación de liposomas, ya que éstos sufren un calentamiento a 80 °C 
durante el procesado y posteriormente se someten a ultrasonicación, adicionalmente pueden 
sufrir también un tratamiento térmico extra (90 °C) durante el proceso de gelificación. Por tanto, 
estos  geles  que  contienen  liposomas  pueden  ser  susceptibles  de  oxidación,  dado  que  la 
composición de ácidos grasos de la fosfatidilcolina procedente de la lecitina de soja es altamente 
insaturada y por tanto susceptible de sufrir oxidación (Wang & Wang, 2008). Aun así, todos los 
valores de malonaldehído fueron muy bajos, indicando que el grado de oxidación fue leve. Todos 
los extractos bioactivos incorporados tienen una destacada actividad antioxidante, sin embargo, 
ésta  no  estuvo  disponible  para  proteger  al  gel,  lo  que  confirma  su  elevada  eficacia  de 
encapsulación  en  los  liposomas.  De  hecho,  L‐PG  fue  el  que  tuvo  una  menor  eficacia  de 
encapsulación  y  como  consecuencia G‐L‐PG  tuvo  un menor  contenido  de malonaldehído  y 
menor oxidación lipídica.  

Tras su conservación a ‐20 °C (Tabla 37), los geles fueron estables durante 3 meses, manteniendo 
inalterables  sus  valores  (p>0,05).  Sin  embargo,  transcurridos  7 meses  de  conservación,  los 
niveles de malonaldehído aumentaron notablemente  (p≤0,05) en  todos  los geles,  incluido el 
control, siendo mayores en aquellos que contienen liposomas. Esto significa que los bioactivos 
siguen estando eficientemente encapsulados y no disponibles de proteger al gel de la oxidación, 



Resultados 

203 

 

aunque ejerzan algo de efecto ya que el gel con liposomas sin extracto (G‐L‐V) mostró un mayor 
contenido de malonaldehído tras 7 meses. Aun así, los valores siguieron siendo bastante bajos 
en términos generales.   
 

Tabla 37. Contenido acumulativo de malonaldehído, expresado en µg malonaldehído/kg gel, analizado 
mediante  el método  del  índice  tiobarbitúrico,  en  geles  de  surimi  formulados  con  liposomas  (G‐L‐V,              
G‐L‐HC, G‐L‐PG, G‐L‐GC) y gel control sin  liposomas  (G), y en su conservación hasta 7 meses a  ‐20  °C. 
Diferentes  letras (a, b, c, d) en  la misma columna  indican diferencias significativas (p≤0,05) entre geles 
para un mismo tiempo de conservación y (m, n, o) en la misma fila entre tiempos de conservación para 
un mismo gel.  

  0 meses  3 meses  7 meses 

G  0,088 ± 0,000a/m 0,015 ± 0,000a/m 0,333 ± 0,074a/n 

G‐L‐V  0,286 ± 0,074b/m  0,302 ± 0,072bc/m 1,560 ± 0,533c/m 

G‐L‐HC  0,511 ± 0,042d/m 0,508 ± 0,059d/m   1,090 ± 0,048bc/n 

G‐L‐PG  0,276 ± 0,027b/m   0,220 ± 0,050b/m   0,763 ± 0,085ab/n 

G‐L‐GC  0,386 ± 0,042c/m   0,380 ± 0,072cd/m   0,848 ± 0,052ab/n 

 

Actividad antioxidante 

La  actividad  antioxidante de  los  extractos bioactivos HC, PG  y GC,  libres  y  encapsulados  en 
liposomas, cuantificada por el método del secuestro de radicales libres (ABTS) y expresada como 
mg de ácido ascórbico/gramo de muestra seca o de bioactivo se muestra en  la  figura 84. El 
extracto de hidrolizado de colágeno (HC) tuvo 22,36 mg ácido ascórbico/g muestra (Figura 84A), 
valor ligeramente inferior a los 35 mg ácido ascórbico/g muestra obtenidos por Alemán et al. 
(2011a) para gelatina de Dosidicus gigas hidrolizada con alcalasa. El extracto de piel de granada 
(PG) presentó un significativo (p≤0,05) mayor valor con 360,01 mg ácido ascórbico/g muestra, 
muy superior a los 0,99 mg ácido ascórbico/g muestra mostrados por Li et al., (2006) para un 
extracto similar, atribuida a su composición rica en compuestos fenólicos (Masci et al., 2016). La 
actividad antioxidante del extracto de grasa de crustáceo (GC) no pudo ser determinada debido 
a que es un extracto de  carácter  fuertemente hidrofóbico  (no  soluble en agua) y  la  técnica 
antioxidante emplea una fase acuosa. Sin embargo, el extracto de GC posee componentes como 
son el α‐tocoferol y la astaxantina, compuestos conocidos por su elevada capacidad antioxidante 
(Gómez‐Estaca et al., 2017).  

Los extractos incorporados en liposomas mostraron menores valores de actividad antioxidante 
(Figura 84A) que sus  respectivos extractos  libres para HC y PG, siendo estas  reducciones del        
91 % para HC  y del 98,5 % para PG.  Estos  resultados  sugieren que  ambos bioactivos  están 
eficazmente encapsulados dentro de los liposomas. Aun así, ambos liposomas mostraron algo 
de actividad,  incluso superior en L‐PG a la de los liposomas vacíos (2,07 mg ácido ascórbico/g 
muestra). Dicha actividad podría atribuirse a los propios liposomas vacíos, a parte del extracto 
bioactivo que haya quedado adherido a la membrana externa de los liposomas, o bien a la parte 
de bioactivo no encapsulada. La mayor actividad en L‐PG (p≤0,05) podría deberse bien a la mayor 
cantidad  de  extracto  no  encapsulado  (36,8  %)  o  bien  a  su mayor  poder  antioxidante,  en 
comparación  con  L‐HC. El  liposoma  L‐GC mostró una  actividad de 1,1 mg  ácido  ascórbico/g 
muestra, atribuida en principio a los liposomas vacíos (2,07 mg ácido ascórbico/g muestra), dada 
la insolubilidad del extracto en agua. Sin embargo, no se puede descartar que dicha actividad 
proceda del extracto.  

Analizando  la actividad de  los  liposomas expresada por gramo de bioactivo  (Figura 84B),  los 
liposomas  que  encapsulan  los  tres  tipos  de  bioactivos  muestran  una  destacada  actividad 
antioxidante. El liposoma L‐HC presentó un valor de 52,33 mg ácido ascórbico/g bioactivo, valor 
superior al mostrado por el extracto. Estos valores superiores de actividad no se atribuyen a la 



Capítulo 3 

204 

 

cápsula, ya que la vesícula vacía mostró valores de 2,07 mg ácido ascórbico/g bioactivo, sino a 
una posible mejora de  la  conformación peptídica para el  secuestro de  radicales  libres en  la 
superficie de membrana, donde se encuentra parte de este bioactivo, o al resto de componentes 
que conforman el bioactivo. La actividad del liposoma L‐PG mostró una disminución (146,63 mg 
ácido ascórbico/g bioactivo) con respecto a la de su respectivo extracto, probablemente debido 
a una degradación parcial de sus compuestos fenólicos durante el proceso de preparación de 
los  liposomas o por una menor disponibilidad de  los sitios reactivos como consecuencia de  la 
interacción de  los fenoles con  la bicapa  lipídica (Lopes de Azambuja et al., 2015). Aun así,  los 
liposomas de PG siguieron siendo los de mayor actividad antioxidante (p≤0,05). Por el contrario, 
los liposomas de GC presentaron una actividad de 28,54 mg ácido ascórbico/g bioactivo, muy 
superior a  la observada en  las dos  formulaciones anteriores, demostrando que este extracto 
tiene un  importante poder antioxidante enmascarado por  la  insolubilización de  su extracto. 
Estos resultados sugieren que los extractos son muy antioxidantes pero su potencial bioactivo 
está eficientemente protegido por los liposomas, evitando su degradación.   

 

 

Figura 84. Actividad antioxidante como secuestro de radicales libres (ABTS) de los extractos bioactivos HC, 
PG y GC libres y encapsulados en liposomas, expresada como A) mg ácido ascórbico por gramo de muestra 
seca y B) mg ácido ascórbico por gramo de bioactivo. Un control de liposomas sin extracto se estudió en 
paralelo  (barra  amarilla).  Diferentes  letras  (a,  b,  c)  indican  diferencias  significativas  (p≤0,05)  entre 
diferentes bioactivos dentro de una misma formulación. 
  

La  figura 85 muestra  la actividad antioxidante  (capacidad reductora) de  los extractos  libres y 
encapsulados  expresada  como  µmol  de  equivalentes  Fe2+/g muestra  seca  y  como  µmol  de 

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L-V        Extractos        Liposomas

HC

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sc
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L-V       Extractos         Liposomas

HC

PG

GC

a
b

c

c

B

a

b



Resultados 

205 

 

equivalentes Fe2+/g bioactivo determinado mediante el poder  reductor del hierro  (FRAP). Se 
observaron (Figura 85A)  los mismos resultados que para el método de secuestro de radicales 
libres, con alguna excepción. El extracto HC mostró 7,11 µmol eq Fe2+/g muestra, valor inferior 
a  los 16‐17 µmol eq Fe2+/g muestra obtenidos por Giménez et al.  (2009). El extracto de PG 
(4622,59 µmol eq Fe2+/g muestra) tuvo la mayor actividad (p≤0,05). El extracto de GC no pudo 
ser determinado debido a su baja solubilidad en agua.  

 

 

Figura 85. Actividad antioxidante determinada como poder reductor del hierro (FRAP) de  los extractos 
bioactivos HC, PG y GC libres y encapsulados en liposomas, expresada como A) µmol eq. Fe2+ por gramo 
de muestra seca y B) µmol eq. Fe2+ por gramo de bioactivo. Un control de liposomas sin extracto se estudió 
en paralelo  (barra amarilla). Diferentes  letras  (a, b,  c)  indican diferencias  significativas  (p≤0,05) entre 
diferentes bioactivos dentro de una misma formulación.  

 

Cuando los extractos se encapsularon en liposomas, la actividad determinada fue menor para  
L‐PG (76,24 µmol eq Fe2+/g muestra, reducción del 98,4 %), demostrando la eficaz encapsulación 
del  bioactivo,  y mayor  para  L‐GC  (50,09  µmol  eq  Fe2+/g muestra),  demostrando  el  poder 
antioxidante del extracto de GC. En ambos casos la actividad se atribuye al bioactivo, dado que 
los liposomas vacíos únicamente mostraron 6,75 µmol eq Fe2+/g muestra. Los anillos terminales 
de la astaxantina se localizan preferentemente en la superficie de membrana de los liposomas 
y en la interfaz de la membrana, estando disponibles para el secuestro de radicales libres (Hama 
et al., 2012), lo que sugiere que la estructura de liposomas mejora la disponibilidad del extracto 
lipofílico.  

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L-V      Extractos          Liposomas

HC

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L-V       Extractos          Liposomas

HC

PG

GC

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b

c

b

B



Capítulo 3 

206 

 

La excepción fue L‐HC, cuyo valor (50,09 µmol eq Fe2+/g muestra) fue mucho mayor que el del 
extracto.  Esta  mayor  actividad,  no  atribuida  a  la  baja  actividad  de  los  liposomas  vacíos               
(6,75 µmol eq Fe2+/g muestra), podría deberse a una  reacción de Maillard o glicosilación no 
enzimática. Esta reacción, típica en alimentos ricos en proteínas y péptidos (HC es un hidrolizado 
peptídico),  tiene  lugar  entre  un  azúcar  reductor  y  un  grupo  amino  libre,  dando  lugar  a  la 
formación de unos compuestos llamados melanoidinas (Olmos et al., 2009), los cuales podrían 
aportar la actividad antioxidante excedente en la determinación de L‐HC (Miranda et al., 2007).  

Analizándolos por gramo de bioactivo (Figura 85B), tiene un comportamiento semejante, si bien 
los valores aumentan. La capacidad antioxidante aumenta en L‐HC hasta los 1302,23 µmol eq 
Fe2+g bioactivo y en L‐GC hasta los 1302,34 µmol eq Fe2+g bioactivo, disminuyendo en L‐PG hasta 
los 1982,34 µmol eq Fe2+g bioactivo, debido a la posible degradación parcial del extracto. Estos 
resultados confirman  la excelente actividad antioxidante de  los extractos (mayor en PG) y su 
eficaz encapsulación en liposomas.  

La figura 86 muestra la actividad antioxidante determinada mediante el contenido de sustancias 
reactivas al Folin‐Ciocalteu expresada como mg ácido gálico por gramo de muestra seca y de 
bioactivo de extractos libres y encapsulados, con similar comportamiento que en las actividades 
antioxidantes vistas anteriormente.  

 

 

Figura  86.  Actividad  antioxidante  como  contenido  de  sustancias  reactivas  al  Folin‐Ciocalteu  de  los 
extractos bioactivos HC, PG y GC libres y encapsulados en liposomas, expresada como A) mg ácido gálico 
por gramo de muestra seca y B) mg ácido gálico por gramo de bioactivo. Un control de  liposomas sin 
extracto se estudió en paralelo (barra amarilla). Diferentes letras (a, b, c) indican diferencias significativas 
(p≤0,05) entre diferentes bioactivos dentro de una misma formulación. 

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HC

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L-V       Extractos           Liposomas

HC

PG

GC

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B



Resultados 

207 

 

Los valores de  los extractos  fueron  (Figura 86A) 14,89 mg ácido gálico/g muestra para HC y   
166,0 mg ácido gálico/g muestra para PG  (p≤0,05), sin determinación para GC. Estos valores 
disminuyeron  para  los  correspondientes  bioactivos  encapsulados,  un  45 %  para  L‐HC  y  un        
91,2 % para L‐PG, mientras que los liposomas que contienen GC mostraron actividad (9,29 mg 
ácido gálico/g muestra).  

Cuando se expresa la actividad por bioactivo seco (Figura 86B), al igual que en las actividades 
antioxidantes  anteriores,  el  comportamiento  es  similar,  pero  los  valores muy  superiores  a 
cuando  se expresa por gramo de muestra. Así,  las actividades aumentaron hasta 213,38 mg 
ácido gálico/g bioactivo para L‐HC y hasta 241,48 mg ácido gálico/g bioactivo para L‐GC. En este 
caso también aumentó para L‐PG (379,02 mg ácido gálico/g bioactivo), posiblemente debido a 
otros componentes adicionales a los compuestos fenólicos que reaccionan con el reactivo de la 
técnica (Folin‐Ciocalteu), dada la baja actividad de los liposomas vacíos (2,38 mg ácido gálico/g 
bioactivo). Estos resultados confirman las conclusiones anteriores. 

La actividad antioxidante, determinada por fotoquimioluminiscencia para el material lipofílico, 
mostró (Figura 87) valores muy diferentes tanto en los extractos como en los liposomas, y como 
en casos anteriores, los valores con liposomas muy inferiores para la mayoría de los casos. En el 
hidrolizado  de  colágeno,  debido  a  su  naturaleza  hidrofílica  (solo  el  28 %  es  de  naturaleza 
hidrofóbica),  los  valores  fueron  notablemente  inferiores  al  resto  (0,378  mg  eq  Trolox/g 
muestra), mientras  que  para  el  extracto  de  piel  y  albedo  de  granada mostró  valores muy 
elevados  (644541,275 mg eq Trolox/g muestra) y para el extracto de grasa de crustáceo  los 
valores fueron intermedios (60,892 mg eq Trolox/g muestra). Estos resultados indican que PG 
fue el extracto con mayor poder antioxidante, constituido por una  importante proporción de 
compuestos fenólicos  lipofílicos, que deben estar embebidos en  la membrana  lipídica. En  los 
correspondientes extractos encapsulados en  liposomas  la actividad disminuyó notablemente 
para L‐PG y L‐GC, confirmando la buena eficacia de encapsulación, dado que la actividad de los 
liposomas vacíos fue de 0,02 mg eq Trolox/g muestra. En cambio, la actividad de L‐HC (0,326 mg 
eq Trolox/g muestra) fue similar a la de su extracto; dado que esta actividad se determina en 
medio lipofílico, refleja la actividad de  los componentes hidrofóbicos del hidrolizado, que son 
una parte minoritaria.  

 

Figura 87. Actividad antioxidante por el método de  fotoquimioluminiscencia  (en  fase  lipofílica) de  los 
extractos bioactivos HC, PG y GC libres y encapsulados en liposomas, expresada como mg equivalentes de 
trolox por gramo de muestra. Un control de liposomas sin extracto se estudió en paralelo (barra amarilla).  

 

Con el fin de obtener una idea de la bioaccesibilidad potencial, los geles de surimi que incorporan 
los extractos encapsulados en liposomas se sometieron a digestión gastrointestinal simulada. La 
capacidad de secuestro de radicales residual (método ABTS) se determinó en  las digestiones, 

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L-V              Extractos           Liposomas



Capítulo 3 

208 

 

expresadas por g de muestra en base a peso seco y en base a cantidad de bioactivo (Figura 88). 
Con  fines  comparativos,  también  se  analizaron  geles  con  extractos  añadidos  libres  (no 
encapsulados),  aunque,  como  se  discutió  anteriormente,  no mostraron  propiedades  de  gel 
adecuadas.  

 

 

Figura 88. Actividad antioxidante como secuestro de radicales libres (ABTS) de geles de surimi digeridos 
con los extractos bioactivos HC, PG y GC incorporados directamente (Libre) y en liposomas (liposomas), 
expresada como A) mg ácido ascórbico por gramo de muestra seca y B) mg ácido ascórbico por gramo de 
bioactivo. Un control de liposomas (barra amarilla) y un control de surimi (barra rosa) se estudiaron en 
paralelo. Diferentes  letras  (a, b)  indican diferencias  significativas  (p≤0,05)  entre diferentes bioactivos 
dentro de una misma formulación. 
 

La  capacidad  de  secuestro  de  radicales  de  los  digeridos  fue  menor  cuando  los  extractos 
bioactivos se añadieron encapsulados en liposomas en comparación con la forma libre. El valor 
de ABTS del digerido del gel de surimi sin extracto fue de 6,53 ± 0,09 mg /g muestra, que fue 
notablemente  menor  que  con  los  liposomas  añadidos  (alrededor  de  14,5  mg  muestra/g 
muestra). La actividad antioxidante encontrada en los geles de surimi después de la digestión 
gastrointestinal  in  vitro  se  relacionó  con  la  liberación  de  péptidos  cortos  de  la  miosina 
polimerizada térmicamente en el gel (Ueki et al., 2014). Los valores de ABTS aumentaron cuando 
se incorporaron los diferentes extractos, especialmente en el modo libre, aunque hubo ligeras 
diferencias dependiendo del tipo de extracto (p≤0,05). Una posible explicación para la obtención 
de resultados similares en el secuestro de radicales de los diferentes digeridos de geles con los 
distintos liposomas encapsulando bioactivos, es que la actividad de los bioactivos es muy inferior 

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B



Resultados 

209 

 

a la que pueda aportar el músculo tras la digestión. La digestión de proteínas podría haber sido 
favorecida en las matrices de gel más pobres y más débiles, resultantes de la distorsión de las 
interacciones proteína‐proteína por la presencia de extractos bioactivos o liposomas. El efecto 
fue más evidente con los extractos añadidos en forma libre, que produjeron geles inadecuados. 
Los valores más bajos de ABTS encontrados en todos los geles que contienen liposomas serían 
también el resultado del efecto de dilución producido por el contenido de liposomas (10,5 %) en 
la proteína miofibrilar digerida.  

También debería tenerse en cuenta que la actividad de los diversos extractos, además, podría 
haber sido modificada como resultado de la digestión. A este respecto, se encontró un aumento 
en la actividad de secuestro de radicales del hidrolizado de colágeno después de someter a éste 
(HC) a la digestión, aumentando los valores de ABTS de 22,36 a 33,17 mg ácido ascórbico/g de 
extracto seco. Resultados similares fueron obtenidos por Alemán et al. (2013) para fracciones 
de péptidos digeridos a partir de hidrolizado de calamar. Este efecto podría contribuir, aunque 
levemente, a aumentar los valores de ABTS en los correspondientes geles de surimi digeridos. 
Por el contrario, la actividad de PG después de digerirlo disminuyó significativamente (p≤0,05) 
de 360,01 a 188,30 mg ácido ascórbico/g de extracto seco, lo que indica una notable inactivación 
de compuestos fenólicos después de la digestión (Surek & Nilufer‐Erdil, 2016). Esta podría ser 
una razón por la cual, a pesar de que tenía mucha más actividad, la diferencia resultante en el 
gel que tiene incorporado extracto de piel de granada (PG) era pequeña en comparación con los 
geles que contienen los otros dos extractos, HC y GC. 

En cuanto a los geles que contienen liposomas, no se encontraron diferencias significativas en 
la  actividad  antioxidante  mostrada  entre  las  formulaciones  que  contienen  liposomas 
encapsulando HC y encapsulando PG, y mostrando una actividad  ligeramente mayor para  los 
geles que contienen  liposomas con GC (p≤0,05), si bien  las diferencias son muy pequeñas. En 
todos los casos la actividad cuando se expresa por g de muestra fue muy inferior en comparación 
a la de los geles que contenían el extracto directamente en forma libre. Esto se debe a la mayor 
concentración de extracto que tienen los geles que contienen los extractos en forma libre (2 % 
de extracto) con respecto a  los geles que contienen  los extractos encapsulados en  liposomas 
(0,4 % extracto), dado que como se puede apreciar en la figura 88B, en las muestras digeridas y 
expresadas  por  cantidad  de  extracto  son  mucho  más  antioxidantes  aquellas  que  estaban 
inicialmente encapsuladas y mantienen su biodisponibilidad después de la digestión. Otro factor 
que apoya estos resultados es el que en los geles formulados con los bioactivos incorporados en 
liposomas, los extractos estarían eficientemente encapsulados en los mismos, reflejando así una 
menor actividad que en los geles formulados con los bioactivos incorporados directamente, en 
los que la ausencia de la cápsula favorece la cuantificación de la actividad correspondiente a los 
extractos bioactivos. Por tanto,  los geles que contienen extractos encapsulados en  liposomas 
son una buena estrategia tecnológica con excelentes propiedades estructurales y mecánicas que 
mejoran la bioaccesibilidad de los extractos bioactivos.   

La  actividad  antioxidante  de  los  geles  de  surimi  digeridos  con  y  sin  liposomas mediante  la 
capacidad de reducción del hierro (FRAP) se muestra en la figura 89. Los resultados obtenidos 
mostraron una comportamiento diferente a los observados en el secuestro de radicales libres. 
Lo más destacable es la elevada actividad que manifiestan los geles que contienen extracto de 
piel de granada, ya sea añadido en forma libre o en forma encapsulada en liposomas (p≤0,05), 
en comparación al resto, que hace que sea inapreciable/despreciable el resto de actividades. De 
hecho, los valores para estas dos últimas formulaciones (geles con extractos de HC y GC, tanto 
libres como encapsulados en liposomas) son semejantes (p≤0,05) a los obtenidos en el digerido 
del gel sin adición de extractos ni liposomas (2,58 ± 0,04 µg equivalentes Fe2+/g muestra), y en 
el  que  contenía  liposomas  vacíos  (6,75  µg  equivalentes  Fe2+/g muestra). Al  igual  que  en  la 
actividad anterior, se pone en evidencia el efecto de dilución, apreciando, cuando se expresa 
por  cantidad  de  extracto  (Figura  89B),  cómo  tras  la  digestión  los  geles  con  extractos 



Capítulo 3 

210 

 

encapsulados en liposomas manifiestan una actividad considerablemente más elevada (p≤0,05) 
que cuando se digieren los geles con extractos adicionados de forma libre. 

 

 

Figura 89. Actividad antioxidante determinada como poder reductor del hierro (FRAP) de geles de surimi 
digeridos  con  los extractos bioactivos HC, PG y GC  incorporados directamente  (Libre) y en  liposomas 
(liposomas), expresada como A) µg equivalentes Fe2+ por gramo de muestra seca y B) µg equivalentes Fe2+ 
por gramo de bioactivo. Un control de liposomas (barra amarilla) y un control de surimi (barra rosa) se 
estudiaron en paralelo. Diferentes letras (a, b) indican diferencias significativas (p≤0,05) entre diferentes 
bioactivos dentro de una misma formulación. 

 

La actividad antioxidante  como  contenido en  sustancias  reactivas al Folin  (Figura 90)  tras  la 
digestión gastrointestinal in vitro de los geles muestra un comportamiento bastante similar al 
observado en el secuestro de radicales libres, aunque hubo excepciones, ya que mientras que la 
presencia de piel de granada en forma  libre en  los geles manifestaba con diferencia  la mayor 
actividad (p≤0,05), cuando se adicionada encapsulada en liposomas, los digeridos de éstos geles 
mostraban los menores valores (p≤0,05), aunque en este caso los valores se encontraban dentro 
del mismo rango que el resto de formulaciones.  

La determinación de las sustancias reactivas al Folin es un método ampliamente utilizado para 
la determinación de fenoles, pero no son los únicos compuestos con los que pueden reaccionar, 
hay otros como azúcares y aminoácidos que también son reactivos al Folin. Por ello, los geles de 
surimi que contienen tanto HC como GC (ya sea en forma libre o encapsulada), que tienen en su 
composición aminoácidos y péptidos en mayor o menor grado, pueden mostrar actividad en 

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L-V  G             Libre            Liposoma

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a a

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Resultados 

211 

 

esta técnica. Otra explicación para la falta aparente de actividad en los geles con liposomas de 
granada sería que parte del extracto de piel de granada no encapsulado haya sido digerido y 
parcialmente degradado. En este  sentido,  la digestión gastrointestinal  simulada del extracto 
provocó  una  disminución  de  su  capacidad  reductora  desde  4622,59  hasta  2323,33  µg 
equivalentes Fe2+/g extracto. Este hallazgo coincide con los resultados de Surek & Nilufer‐Erdil 
(2016) para un extracto de piel de granada, los cuales observaron una notable inactivación de 
compuestos fenólicos después de ser digeridos. 

 

 

Figura 90. Actividad antioxidante como contenido en sustancias reactivas al Folin‐Ciocalteu de geles de 
surimi  digeridos  con  los  extractos  bioactivos  HC,  PG  y  GC  incorporados  directamente  (Libre)  y  en 
liposomas (liposomas), expresada como A) mg ácido gálico (AG) por gramo de muestra seca y B) mg ácido 
gálico (AG) por gramo de bioactivo. Un control de  liposomas (barra amarilla) y un control de surimi se 
estudiaron en paralelo. Diferentes letras (a, b) indican diferencias significativas (p≤0,05) entre diferentes 
bioactivos dentro de una misma formulación. 

 

Conclusiones 

Los tres extractos procedentes de diferentes fuentes naturales, que constituyen un residuo en 
la industria alimentaria, se encapsularon eficientemente en liposomas de fosfatidilcolina de soja 
con una elevada estabilidad de partícula. Aunque la liofilización incrementa el tamaño medio y 
el  índice  de  polidispersidad  de  los  liposomas  rehidratados,  un  importante  porcentaje  de 
vesículas mantienen  su  tamaño  en  el  rango  de  nanoescala.  La  liofilización  representa  una 
solución factible para ajustar el contenido final de agua en los geles de surimi. La incorporación 
de  liposomas  liofilizados proporcionó  integridad  al  gel  y mantuvo  su  estabilidad durante  su 

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b b b

B



Capítulo 3 

212 

 

conservación en congelación a largo plazo. Los geles de surimi sometidos a digestión mostraron 
una  destacada  capacidad  antioxidante  atribuida  principalmente  a  la  proteína  miofibrilar 
digerida. Los extractos encapsulados no fueron capaces de proteger a la matriz de la oxidación 
lipídica completamente, que en cualquier caso fue muy baja. Por tanto, se podría decir que los 
extractos  están  eficientemente  encapsulados  y  protegidos  de  su  degradación  o  interacción 
directa con  la matriz por  la membrana de  los  liposomas. Sin embargo, ensayos  in vivo serían 
necesarios  para  comprobar  la  biodisponibilidad  de  los  extractos  bioactivos  encapsulados  e 
incorporados en geles de surimi.  

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CAPÍTULO 4. APLICACIÓN DE LIPOSOMAS EN PELÍCULAS 

COMESTIBLES 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Resultados 

215 

 

8.8.  CAMBIOS  EN  LA  INTEGRIDAD  ESTRUCTURAL  DE  PELÍCULAS DE  CASEINATO DE  SODIO 
MEDIANTE  LA  ADICIÓN  DE NANOLIPOSOMAS  ENCAPSULANDO UNA  FRACCIÓN  PEPTÍDICA 
ACTIVA DE LANGOSTINO (PENAEUS NOTIALIS) 

Resumen 

Langostinos (Penaeus notialis) sin valor comercial (congelados durante 6 meses) se sometieron 
a hidrólisis enzimática con tripsina y se aisló la fracción peptídica de peso molecular <1 kDa (FP1). 
La fracción peptídica liofilizada presentó actividad biológica: capacidad de secuestro de radicales 
libres  (método ABTS: 69,13 mg  ácido  ascórbico/gramo muestra),  capacidad  antihipertensiva 
(inhibición  de  la  enzima  convertidora  de  angiotensina,  IC50  =  74  µg/mL)  y  capacidad 
hipoglucémica (inhibición de la enzima dipeptidil peptidasa IV, IC50 = 0,46 mg/mL). Se elaboraron 
liposomas de fosfatidilcolina de soja parcialmente purificada, conteniendo la fracción peptídica 
FP1 (5 mg/mL en buffer fosfato, pH 7), en presencia de 5 % de glicerol (L‐FP1), este último para 
preservar  la bicapa durante el proceso de deshidratación en  la  formación de  la película.  Se 
prepararon  liposomas vacíos sin el péptido en condiciones similares (L‐V) con el propósito de 
comparar. La fracción peptídica fue encapsulada con una eficacia del 52,37 %. El tamaño medio 
de L‐FP1 y de L‐V fue de 99,98 nm y de 87,40 nm, y el potencial zeta fue de  ‐53,87 mV y de               
‐35,53  mV,  respectivamente.  Las  suspensiones  de  liposomas  vacíos  y  de  liposomas 
encapsulando  la  fracción  peptídica  se  incorporaron  en  películas  comestibles  de  caseinato 
sódico, dando lugar a matrices de distribución uniforme y estructura vesicular bien preservada. 
Las  películas  con  liposomas  fueron más  solubles  en  agua,  sin  cambios  en  el  espesor  o  la 
transparencia.  Los  liposomas  intensificaron  el  efecto  de  adhesividad  y  de  mucoadhesión, 
especialmente las películas con el péptido. La evaluación sensorial mostró una percepción del 
sabor muy  favorable,  independientemente de  la presencia y  tipo de  liposomas añadidos. Se 
observaron diferencias en el tiempo de disolución oral en boca, siendo más rápida en películas 
formuladas con liposomas como resultado de la discontinuidad de la matriz. La película podría 
usarse en diferentes diseños de alimentos sin distorsionar la aceptación sensorial del producto 
final. 

Palabras clave: fracción peptídica de músculo de langostino, liposomas, películas comestibles, 
mucoadhesión, integridad estructural, propiedades sensoriales.  

Introducción 

En el sector de la alimentación existe una demanda creciente de productos de origen natural, 
con capacidad bioactiva, baja toxicidad y que no desencadenen problemas medioambientales. 
Para  la elaboración de estos productos puede emplearse una amplia variedad de moléculas 
activas  como  ingrediente. Gran  parte  de  estas moléculas  podrían  derivar  de  residuos  o  de 
subproductos de la industria alimentaria. La valorización de estas materias resultaría en un doble 
beneficio,  económico  y medioambiental,  a  la  vez  que  obtenemos  productos  de  alto  valor 
añadido o co‐productos (López‐Caballero et al., 2013).  

La obtención de hidrolizados proteicos a partir de residuos de la industria pesquera ha recibido 
una considerable atención en la última década (López‐Caballero et al., 2013). Estos hidrolizados 
son  una  importante  fuente  de  péptidos  bioactivos  con  diversas  propiedades  tales  como 
antioxidante, antihipertensiva o hipoglucémica  (López‐Caballero et al., 2013; Ketnawa et al., 
2016;  Ji  et  al.,  2017).  Estos  péptidos  bioactivos  podrían  emplearse  como  ingredientes 
potenciales  en  alimentos  funcionales.  Sin  embargo,  durante  el  almacenamiento  y/o 
procesamiento  de  alimentos,  los  péptidos  pueden  estar  sujetos  a  degradación  proteolítica, 
mostrar inestabilidad en condiciones extremas (pH, temperatura, oxígeno...) y/o interactuar con 
otros componentes (cationes divalentes, lípidos, proteínas...) (Aasen et al., 2003; Chollet et al., 
2008; Mozafari et al., 2008). Todos estos  factores  limitan sus beneficios potenciales y hacen 



Capítulo 4 

216 

 

necesaria la búsqueda de mecanismos protectores para mantener a los péptidos activos hasta 
su consumo o incluso su liberación en los sitios activos.  

Los liposomas son ampliamente estudiados por ser un buen mecanismo de encapsulación para 
proteger y transportar los péptidos bioactivos (Da Silva Malheiros et al., 2010). Además, el uso 
de  películas  como  vehículos  de  liposomas  encapsulando  péptidos  podría  representar  una 
estrategia versátil para introducirlos en un alimento funcional, sin necesidad de reestructurar o 
afectar en gran medida a la presentación del alimento. Al mismo tiempo, podrían evitarse los 
efectos no deseables derivados de  las  interacciones excesivas de  los péptidos bioactivos con 
otros componentes de la matriz, o el sabor fuerte que pudieran producir.   

Merece la pena destacar que la película podría considerarse por sí misma un sistema modelo de 
alimento  con  bajo  contenido  en  agua.  Sin  embargo,  los  péptidos  libres  o  encapsulados  en 
liposomas podrían inducir cambios físicos en la estructura de la película que deberían tenerse 
en cuenta. Giménez et al.  (2009) observaron que  la  incorporación de hidrolizados peptídicos 
indujo un efecto plastificante en películas de gelatina. También se observó que  la adición de 
liposomas podría modificar la estructura molecular de las películas de quitosano, dando lugar a 
una disminución de la densidad y de la fuerza a la tracción, junto con un aumento simultáneo 
de  la solubilidad en agua  (Cui et al., 2017). Por otro  lado, se ha descrito que  las películas de 
caseinato son excelentes matrices para incorporar nisina encapsulada en liposomas sin alterar 
la resistencia mecánica y las propiedades térmicas de estas películas (Boelter & Brandelli, 2016).  

El  empleo  de  películas  comestibles  mucoadhesivas  transportando  liposomas  con  péptidos 
bioactivos encapsulados  (ya sea como una  tira comestible de rápida disolución o como  films 
para envolver alimentos) podría ser un modo interesante para la liberación de estas moléculas 
activas en boca.  Las mucosas bucal  y  sublingual  son  altamente permeables  y permiten que 
nanocápsulas conteniendo bioactivos pasen directamente al sistema circulatorio y penetren en 
los tejidos a través de finos capilares (Patel et al., 2011). Investigaciones recientes indican que 
estos sistemas mucoadhesivos deben proporcionar un liberación rápida en la cavidad oral (Silva 
et al., 2015; Mašek et al., 2017). Independientemente del modo de presentación, la respuesta 
en boca de las películas mucoadhesivas requiere una rápida disolución, evitando la impresión 
de ingerir un plástico artificial.  

Objetivos 

El objetivo de este experimento fue la preparación de una película funcional de caseinato sódico 
con propiedades mucoadhesivas y buenas propiedades sensoriales mediante  la  incorporación 
de  nanoliposomas  conteniendo  una  fracción  peptídica  obtenida  a  partir  de  descartes  de 
langostinos  con  actividad  biológica,  la  cual  se  caracterizó  en  términos  de  peso molecular, 
composición  de  aminoácidos  y  actividad  biológica  in  vitro  (capacidades  antioxidante, 
antihipertensiva e hipoglucémica).  

Materiales y métodos 

Se utilizó fosfatidilcolina parcialmente purificada de cinco lavados (FC5) a partir de lecitina de 
soja (LS). También se llevó a cabo la extracción de una fracción peptídica (FP1) procedente de 
langostino (Penaeus notialis) sin valor comercial. Brevemente, una vez inactivadas las enzimas 
endógenas por  calor,  los  langostinos enteros  se  trataron  con  tripsina  (38  °C, pH 8, 90 min). 
Posteriormente  se  inactivó  la  enzima  y  el  hidrolizado  se  pasó  a  través  de  un  sistema  de 
ultrafiltración tangencial con un filtro de 1 kDa (FP1). Se estudió el perfil de pesos moleculares y 
la composición de aminoácidos de FP1, así como su actividad antioxidante por el método de 
secuestro de radicales libres (ABTS), antihipertensiva por el método de inhibición de la enzima 



Resultados 

217 

 

convertidora  de  angiotensina  e  hipoglucémica  por  el  método  de  inhibición  de  la  enzima 
dipeptidil peptidasa IV.  

Se elaboraron liposomas de fosfatidilcolina purificada con cinco lavados (FC5) incorporando la 
fracción peptídica  (L‐FP1). Antes del primer calentamiento se  incorporó  la  fracción peptídica 
(0,1:4, p/v) y antes del segundo calentamiento se añadió el glicerol (0,6:4, v/v). Paralelamente, 
se  preparó  una  dispersión  liposomal  sin  extracto  bioactivo  (L‐V).  De  estas  dispersiones  se 
analizaron  sus  características de partícula mediante dispersión dinámica de  luz  en  Zetasizer 
(dilución 1/10), eficacia de encapsulación y microscopía electrónica de transmisión.  

Estos  liposomas, tanto vacíos como encapsulando el bioactivo (fracción peptídica <1 kDa), se 
incorporaron  en  películas  de  caseinato  sódico.  Inicialmente,  8  g  de  caseinato  sódico  se 
disolvieron  en  100 mL  de  buffer  fosfato  10 mM  pH  7.  La mezcla  se  sometió  a  5  ciclos  de 
sonicación de 1 min a 90 % amplitud (120 W), con 1 min de parada entre ciclos. Seguidamente, 
se mezcló esta disolución con la dispersión liposomal (1:0,6, v/v), con y sin extracto bioactivo, 
mediante  agitación magnética  y  las  soluciones  se  vertieron  en  placas  Petri,  eliminando  las 
posibles burbujas presentes en ellas. A  la  vez,  se  realizó una película  control  sin  liposomas. 
Finalmente,  las  tres  películas  elaboradas  (P:  películas  sin  liposomas,  P‐L‐V:  películas  con 
liposomas vacíos y P‐L‐FP1: películas con liposomas encapsulando la fracción peptídica <1 kDa 
de músculo  de  langostino)  se  secaron  a  45  °C  durante  12  h.  Las  placas  se  conservaron  a 
temperatura  ambiente  y humedad  controlada  (58 %).  También  se preparó una  formulación 
alternativa con los tres tipos de películas pero conservadas a una humedad relativa del 75 %. De 
las  películas  se  estudió  la  presencia  de  liposomas  en  su  estructura mediante microscopía 
electrónica de transmisión, sus propiedades físicas de contenido en agua, solubilidad en agua, 
espesor, transparencia y densidad, sus propiedades mecánicas de adherencia y mucoadhesión 
(incluyendo las formulaciones al 75 %) y sus propiedades sensoriales.  

Resultados y discusión 

Propiedades de la fracción peptídica <1 kDa (FP1) 

Composición 

La fracción peptídica de langostino liofilizada (FP1), presentada en forma de polvo blanquecino, 
mostró mayoría de  residuos de glicina  (18,5 %) y ácido glutámico  (11,5 %), con  importantes 
cantidades de alanina (9,0 %) y ácido aspártico (8,2 %) (Figura 91).  

 

Figura 91. Composición de aminoácidos de la fracción peptídica de langostino (FP1). 

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Capítulo 4 

218 

 

Otros autores (Cobb et al., 1974; Mente et al., 2002; Chaurand et al., 2013) también encontraron 
abundancia de glicina y alanina en diferentes especies de crustáceos. Además, cabe destacar los 
residuos de hidroxilisina e hidroxiprolina, aminoácidos específicos del colágeno, atribuidos a la 
hidrólisis del tejido conectivo intramuscular. Teniendo en cuenta el cómputo de aminoácidos, el 
contenido total de residuos hidrofóbicos fue del 52 %.  

La fracción FP1 presentó un perfil de pesos moleculares con dos poblaciones diferenciadas a        
λ = 214 nm, con valores medios en torno a 550 Da y a 200 Da  (Figura 92). El perfil de pesos 
moleculares fue diferente a λ = 280 nm, con tres poblaciones diferenciadas de tamaños 490, 240 
y  150  nm.  Estos  resultados  indican  la  presencia  de  diferentes  poblaciones  de  péptidos;  las 
fracciones  en  torno  a  200‐240  Da  corresponden  a  dipéptidos  pequeños,  las  fracciones  de           
150 Da a residuos aromáticos libres, y las fracciones de 490 y 550 nm a péptidos conformados 
por 4‐5 residuos. Cao et al. (2009) encontraron un rango relativamente similar (915‐207 Da) en 
hidrolizados de langostinos empleando alcalasa como enzima de hidrólisis. Teniendo en cuenta 
la  abundancia  relativa  de  los  diferentes  aminoácidos  observados  en  la  figura  92,  se  podría 
esperar una elevada  frecuencia de dipéptidos  incluyendo glicina o alanina en  la  fracción de       
200 Da. En cambio, la fracción de 240 Da contendría dipéptidos incluyendo residuos de tirosina, 
triptófano o fenilalanina.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 92. Distribución de pesos moleculares de la fracción peptídica de langostino (FP1). 
 

Actividades biológicas 

La  actividad  antioxidante  de  la  fracción  peptídica  FP1  fue  de  69,13  mg  ácido  ascórbico 
equivalente/gramo muestra. Alemán et al. (2016) obtuvieron un valor significativamente mayor 
(122,16 mg ácido ascórbico equivalente/g muestra) para una  fracción peptídica <10  kDa de 
músculo de langostino (Litopenaeus vannamei) hidrolizada con alcalasa. La destacada actividad 
antioxidante de FP1 puede estar relacionada con la considerable gran cantidad de aminoácidos 
hidrofóbicos  presentes  en  el  extracto  (Mendis  et  al.,  2005),  y más  específicamente  con  la 
abundancia de prolina, alanina, valina y leucina.  

La fracción FP1 también mostró una marcada actividad antihipertensiva (IC50 = 74 µg/mL), valor 
muy similar a los 70 µg/mL obtenidos por Cheung & Li‐Chan (2010) para residuos de langostino 
(Pandalopsis  dispar)  hidrolizados  con  Protamex.  La  actividad  antihipertensiva de  FP1  puede 
deberse en parte a la gran cantidad de aminoácidos hidrofóbicos y de prolina presentes en la 

0 10 20 30 40 
0.0 

1.0 

2.0 

3.0 

4.0 

5.0 
550 Da 

200 Da 

240 Da 
490 Da 

150 Da 
214 nm 
280 nm 

Tiempo (min) 

U
A

 



Resultados 

219 

 

cadena peptídica. También se asocia con la presencia de péptidos pequeños (Kim et al., 2012). 
Algunos de estos péptidos, contenidos en  la BIOPEP DATABASE creada por Minkiewicz et al. 
(2008), podrían ser leucina‐valina‐tirosina‐prolina (490 Da) o tirosina‐alanina (252 Da).  

La actividad hipoglucémica mostró un valor de  IC50 = 0,46 mg/mL,  ligeramente menor que el 
encontrado en otras fuentes proteicas como el caso de Ji et al. (2017) para la proteína de krill 
(0,83 mg/mL), Li‐Chan et al. (2012) para gelatina de salmón atlántico (1,35 mg/mL) o Sila et al. 
(2015) para proteína de barbo argelino (1,94 mg/mL). La mayoría de los péptidos inhibidores de 
esta enzima contienen de 2 a 8 residuos de aminoácidos (Li‐Chan et al., 2012; Sila et al., 2015). 
Pero  el  factor más  determinante  es  la  secuencia  peptídica,  ya  que  esta  enzima  presenta 
especificidad por substratos del tipo X‐alanina‐Y y X‐prolina‐Y en el extremo N‐terminal de  la 
cadena peptídica  (Yazbeck et al., 2009). De hecho,  Ji et al.  (2017) demostró que el binomio 
alanina‐prolina es uno de los péptidos que actúa como inhibidor de la enzima. Este dipéptido 
bien podría estar presente en la fracción peptídica <1 kDa utilizada en el presente trabajo, dado 
que los aminoácidos alanina y prolina resultan ser los residuos hidrofóbicos más abundantes. La 
presencia  de  aminoácidos  hidrofóbicos  en  la  posición  N‐terminal  también  parece  ser  de 
importancia para la inhibición enzimática (Sila et al., 2015).  

Propiedades de los liposomas 

Características de partícula 

Las características de partícula de la dispersión liposomal vacía (L‐V) y la que contiene la fracción 
peptídica (L‐FP1) se muestran en la tabla 38. El tamaño medio de L‐FP1 fue de 99,98 nm, valor 
significativamente superior al de los liposomas vacíos (87,40 nm), debido a que la presencia del 
bioactivo produce una ligera expansión de la cápsula. Taylor et al. (2007) observaron un efecto 
similar  para  liposomas  de  fosfatidilcolina  encapsulando  nisina,  sin  relación  entre  la 
concentración de nisina y el tamaño promedio de los liposomas. En el presente trabajo, tanto 
las concentraciones de péptido como de fosfatidilcolina se seleccionaron de acuerdo a estudios 
previos (Mosquera et al., 2014). El índice de polidispersidad fue de 0,240 para L‐V y 0,186 para 
L‐FP1,  ambos  indicativos  de  una  distribución  de  tamaños  homogénea,  acorde  a  Da  Silva 
Malheiros et al. (2011).  

Ambas  dispersiones  mostraron  un  potencial  zeta  muy  electronegativo  con  valores  de                           
‐35,53 mV para L‐V y de ‐53,86 mV para L‐FP1, reflejando así una gran estabilidad de membrana, 
significativamente mayor (p≤0,05) en la dispersión con la fracción peptídica. La composición de 
fosfolípidos y su interacción con el compuesto encapsulado pueden determinar la superficie de 
carga de los liposomas (Da Silva Malheiros et al., 2011). De hecho, la interacción química de los 
péptidos con la membrana de fosfolípidos podría ejercer un efecto estabilizante en las vesículas 
(Taylor et al., 2007). Los liposomas de fosfatidilcolina suelen presentar monocapas no cargadas 
o ligeramente aniónicas a valores de pH neutros (Bailey & Sullivan, 2000). Taylor et al. (2007) 
obtuvieron un potencial zeta para  liposomas vacíos a partir de fosfatidilcolina de ‐8 mV, muy 
inferior  al  nuestro,  lo  que  sugiere  que  otros  lípidos  e  impurezas  de  la  fosfatidilcolina 
parcialmente purificada pueden haber influido en la carga de membrana. Como se describió en 
el capítulo 1, en el experimento 8.1., el glicerol incluido en la producción de los liposomas no fue 
el responsable del elevado potencial zeta electronegativo. El glicerol se ha usado para mantener 
la  integridad  de  las  vesículas,  prevenir  la  sedimentación  de  las mismas  y  la  pérdida  de  los 
péptidos atrapados en la solución filmogénica, la cual se debe deshidratar posteriormente para 
producir la película de caseinato de sodio. Las vesículas lipídicas deshidratadas o liofilizadas en 
ausencia  de  un  soluto  protector  pueden  experimentar  una  fusión masiva  con  la  liberación 
concomitante  del material  atrapado.  A  este  respecto,  se  ha  demostrado  que  la  bicapa  de 
vesículas de fosfatidilcolina presenta alta permeabilidad al glicerol, el cual a  la concentración 
adecuada  se  equilibra  a  ambos  lados  de  la membrana  vesicular,  dando  lugar  a  una mayor 
protección contra  la fuga  inducida por congelación‐descongelación (Mozafari, 2005). Por otro 



Capítulo 4 

220 

 

lado, vesículas compuestas de fosfolípidos, glicerol y agua,  los denominados gliosomas, se ha 
descrito que aumentan la fluidez de la bicapa liposomal (Manca et al., 2013). 

Eficacia de encapsulación 

La eficacia de encapsulación de FP1 en  los  liposomas  fue del 52,37 %,  siendo éste un  valor 
intermedio entre los diferentes valores para péptidos descritos en la literatura, donde es posible 
encontrar valores entre 20 y 90 % (Were et al., 2003; Da Silva Malheiros et al., 2011; Mosquera 
et al., 2014). Esta eficacia depende en gran medida de las interacciones electrostáticas entre los 
péptidos  y  los  fosfolípidos  (Were  et  al.,  2003).  La  fracción  peptídica  tiene  un  contenido  en 
aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos equilibrado,  lo que significa que  la mitad del material 
puede localizarse en el núcleo acuoso o adherido a las cabezas polares de la superficie externa 
de membrana  (parte  polar), mientras que  la otra mitad  estaría  interactuando  con  las  colas 
hidrofóbicas de la bicapa lipídica (parte apolar) (Mozafari et al., 2008). 
 

Tabla 38. Propiedades de partícula de tamaño medio (nm), índice de polidispersidad, potencial zeta (mV) 
y eficacia de encapsulación (%) de dispersiones liposomales vacías (L‐V) y rellenas con la fracción peptídica 
de  langostino  (L‐FP1). Diferentes  letras  (a,  b)  en  la misma  columna  indican  diferencias  significativas 
(p≤0,05) entre liposomas.  

  Tamaño  
Medio (nm) 

Índice de 
polidispersidad 

Potencial  
Zeta (mV) 

Eficacia de 
encapsulación (%) 

L‐V  87,39 ± 0,82a  0,240 ± 0,005a ‐35,53 ± 1,68a ‐ 
L‐FP1  99,98 ± 4,00b  0,186 ± 0,006b ‐53,86 ± 2,91b 52,37 ± 2,38 

 

Microscopía electrónica de transmisión convencional 

Las  imágenes  obtenidas  por  microscopía  electrónica  de  transmisión  de  las  dispersiones 
liposomales se muestran en la figura 93.  

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 93. Microscopía electrónica de transmisión de dispersiones liposomales A) vacías (L‐V) y B) rellenas 
con fracción peptídica de langostino (L‐FP1).  
 

Las  vesículas  de  ambas muestras  presentaron  una morfología  globular  bien  definida, más 
uniformemente dispersa en el caso de los liposomas vacíos (L‐V) (Figura 93A). Además, la bicapa 
formada por las colas hidrofóbicas de la fosfatidilcolina fue más visible en L‐V, lo que se atribuye 
a  la  interferencia del material peptídico más hidrofóbico en el  interior de  la bicapa  lipídica, 
siendo  además  responsable  del  incremento  del  tamaño medio,  así  como  de  la  excelente 
estabilidad  liposomal.  La  dispersión  L‐FP1  (Figura  93B)  mostró  algunas  zonas  de  aspecto 
reticulado alrededor de las vesículas, que corresponde a material peptídico interaccionando con 
las cabezas polares de la fosfatidilcolina. 

BA 

100 nm 200 nm 



Resultados 

221 

 

Propiedades de la película 

La dispersión con la fracción peptídica encapsulada se incorporó a la formulación de películas 
comestibles preparadas con caseinato de sodio (P‐L‐FP1). Con el fin de determinar el efecto de 
la adición de liposomas con péptidos en las propiedades de la película, también se prepararon 
películas análogas con liposomas vacíos (P‐L‐V) y sin liposomas (P).  

Microscopía electrónica de transmisión convencional 

La  integridad  estructural  de  los  liposomas  en  la  película  se  verificó mediante microscopía 
electrónica de transmisión (Figura 94).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 94. Microestructura de las películas obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión. 
A) y B) corresponden a películas con liposomas vacíos (P‐L‐V) y C) y D) a películas con liposomas rellenos 
(P‐L‐FP1), con diferentes grado de aumentos.  

 

Ambos tipos de liposomas mostraron una distribución uniforme y se integraron bien en la matriz 
proteica de  la película  a  pesar de provocar una  evidente discontinuidad. Con  respecto  a  la 
morfología  liposomal,  generalmente  se  observa  una  tendencia  a  perder  la  forma  esférica, 
produciendo estructuras perimetrales más irregulares y ovales, mientras se mantiene en general 
la  integridad  estructural  y  el  tamaño  original. No  se  observó  fusión  vesicular  o  agregación 
evidente,  independientemente  del  tipo  de  formulación  liposomal.  La  bicapa  lipídica  fue 
claramente visible tanto en los liposomas vacíos como en los liposomas con péptidos. 

Propiedades físicas 

Las características de las películas se muestran en la tabla 39. El contenido en agua fue mayor 
(p≤0,05) en la película control sin liposomas (P, 37,58 %) respecto a las películas con liposomas 
(21,96 % para P‐L‐V y 28,49 % para P‐L‐FP1). Estas diferencias se deben al incremento en materia 
seca  (fosfatidilcolina y extracto bioactivo) en  las películas P‐L‐V y P‐L‐FP1. Además,  la matriz 
discontinua  inducida por  la presencia de  liposomas podría haber favorecido  la eliminación de 
agua durante la etapa de deshidratación de la película. 
 

BA 

2000 nm 200 nm 

C D

200 nm 1000 nm 



Capítulo 4 

222 

 

Tabla 39. Contenido en agua (%), espesor (mm), densidad (g/cm3), solubilidad en agua (%) y transparencia 
de  las películas, donde P: película  control; P‐L‐V: película  con  liposomas  vacíos; P‐L‐FP1: película  con 
liposomas rellenos con fracción peptídica de langostino. Diferentes letras (a, b, c) en la misma columna 
indican diferencias significativas (p≤0,05) entre películas.  

 

Contenido 
en agua 

Espesor  Densidad  Solubilidad  Transparencia  

P  37,58 ± 1,39a  0,10 ± 0,02a  1,07 ± 0,05a   37,58 ± 1,40a 1,07 ± 0,37a 

P‐L‐V  21,96 ± 1,94b  0,09 ± 0,02a  1,15 ± 0,02b   91,52 ± 1,20b  1,00 ± 0,16a 

P‐L‐FP1  28,49 ± 1,26c  0,10 ± 0,03a  1,32 ± 0,01c   58,39 ± 2,40c 1,22 ± 0,02a 

 

No se encontraron diferencias significativas (p>0,05) para el espesor o el nivel de transparencia, 
lo que se atribuye al pequeño tamaño (rango nano) de los liposomas añadidos. Sin embargo, la 
incorporación de lípidos emulsionados (de tamaño medio 0,8‐2,5 µm) en películas de caseinato 
sódico produjo un descenso evidente en la transparencia de las películas (Fabra et al., 2010).  

Se observó un ligero incremento (p≤0,05) en la densidad de las películas cuando los liposomas 
fueron incorporados, más acusado para los liposomas incorporando la fracción peptídica. Esto 
se debe a que a mayor cantidad de componentes en la formulación liposomal y en la formulación 
de  la película, mayor densidad  tendrá  la misma,  sin modificar  los parámetros de espesor o 
transparencia. Esta diferencia de densidad se puede observar claramente en la figura 95.  
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 95. Aspecto visual de las películas de caseinato sódico. 
 

Ambas películas con liposomas fueron significativamente más solubles en agua que la película 
sin las nanovesículas, a pesar de la naturaleza hidrofóbica de la fosfatidilcolina empleada como 
material encapsulante.  Este  aumento de  solubilidad podría deberse  a  la discontinuidad que 
producen  los  liposomas  en  la matriz  agregada de  caseinato  sódico, más pronunciadamente 
cuando  se  incluyen  los  liposomas  vacíos.  La  fracción  peptídica  no  encapsulada  en  P‐L‐FP1 
probablemente contribuiría a  reducir  la discontinuidad de  la matriz proteica al  favorecer  las 

P

P‐L‐FP1P‐L‐V 



Resultados 

223 

 

interacciones peptídicas que conducen a una notable menor solubilidad en agua con respecto a 
aquellas matrices que contienen liposomas vacíos. 

Propiedades mecánicas 

Se  determinaron  las  propiedades  mecánicas  de  las  películas  mediante  los  parámetros  de 
adherencia y mucoadhesividad  (Tabla 40). Diversos autores describen que el mecanismo de 
mucoadhesión requiere tres etapas sucesivas: el contacto (adhesión),  la  interpenetración y  la 
consolidación (Ivarsson & Wahlgren, 2012). Para la primera fase de adhesión, el estado físico es 
principalmente influenciado por el estado de hidratación; en la segunda, se establece el contacto 
entre los polímeros altamente adhesivos y el epitelio de la mucosa; y en la tercera, se establecen 
los enlaces mecánicos y químicos (Sandri et al., 2015).  

Asumiendo la importancia de la hidratación, y dado que presumiblemente la absorción a nivel 
oral es prácticamente instantánea, y que la película se disolvería muy rápidamente, las medidas 
se han llevado a cabo en paralelo en películas con dos grados de humedad relativa diferentes: 
58 % y 75 %, que es una humedad considerablemente más alta, pero aún permite que estas 
películas se manejen fácilmente.  

Los valores de la mucoadhesión son mucho más altos que los que se muestran para la prueba 
de  adherencia,  lo  que  es  indicativo  de  un  efecto mucoadhesivo  de  la  película  (Ivarsson & 
Wahlgren,  2012).  Este  efecto  se  observó  para  ambas  humedades  relativas,  aunque  las 
diferencias  son menores a 75 %  (la  relación mucoadhesión/adherencia a 58 % de humedad 
relativa osciló entre 74,59 y 38,97, mientras que a 75 % entre 33,34 y 18,32). A 58 % de humedad 
relativa, se pudo observar un aumento significativo de la adherencia y la mucoadhesión con la 
inclusión  de  liposomas  dentro  de  la  película,  y  aún  más  cuando  éstos  llevaron  péptidos 
incorporados. Este efecto se atribuye al efecto plastificante de los liposomas que favorecen la 
discontinuidad y una mayor solubilización de la matriz biopolimérica. Sin embargo, al 75 % de 
humedad  relativa,  en  la  prueba  de  mucoadhesión  no  hay  diferencias  significativas, 
probablemente porque a esta humedad la matriz es bastante más laxa.  

 

Tabla 40. Propiedades mecánicas de adherencia y mucoadhesión, expresadas como fuerza máxima (N), 
de películas a distintas humedades relativas (58 % y 75 %), donde P: película control; P‐L‐V: película con 
liposomas vacíos; P‐L‐FP1: película con liposomas rellenos de fracción peptídica de langostino. Diferentes 
letras  (a, b, c) en  la misma columna  indican diferencias  significativas  (p≤0,05) entre películas para un 
mismo parámetro y humedad relativa y (x, y) en la misma fila entre humedades relativas para un mismo 
parámetro y película.  

  
  

Adherencia  Mucoadhesividad  Adherencia  Mucoadhesividad 

58 %  75 % 

P   1,18 ± 0,00a/x    87,64 ± 1,95a/x  4,23 ± 0,04a/y    140,92 ± 12,70a/y 

P‐L‐V  2,34 ± 0,20b/x  127,45 ± 6,85b/x  6,58 ± 0,21b/y  170,27 ± 5,01b/y 

P‐L‐FP1  3,55 ± 0,30c/x    138,32 ± 10,24c/x  9,58 ± 0,88c/y  175,48 ± 4,10c/y 

 

Análisis sensorial 

Dado que el requisito de estas películas es que se disuelvan en la boca, ya sea con la intención 
de mejorar la palatabilidad o con la intención de que los liposomas pasen a través de la mucosa 



Capítulo 4 

224 

 

bucal  y  sublingual  a  los  capilares  sanguíneos,  con  la  posterior  liberación  del  bioactivo 
encapsulado, las propiedades de disolución fácil y rápida son de gran interés. 

De acuerdo con Souza et al. (2009), la solubilidad deseada en una película comestible depende 
de  la función requerida, de modo que películas menos solubles podrían usarse para proteger 
productos con humedad elevada, mientras que las películas altamente solubles en agua podrían 
servir como vehículos bioactivos y permitir  la absorción en  la cavidad oral (Heinemann et al., 
2013).  

Se realizó una evaluación sensorial de las películas (Figura 96). Durante la disolución en la boca, 
ninguna  de  las  tres  películas mostró  diferencias  significativas  (p>0,05)  en  la  intensidad  de 
salivación, que fue baja, o una incómoda sensación de adherencia a los dientes. Tampoco hubo 
diferencias significativas en el sabor, que los jueces describieron como un sabor agradable y que 
recordaba a leche y/o a caramelo, lo cual se atribuyó a la presencia de caseína y al tratamiento 
térmico moderado para su preparación. No hubo signos de amargor o astringencia que pudiera 
causar la presencia de aminoácidos o péptidos libres. En cuanto al tiempo de disolución de la 
película, todos los jueces consideraron que el tiempo fue en general "corto" para las 3 muestras. 
Sin embargo, se observaron diferencias notables entre los que contenían liposomas (rellenos o 
vacíos), que demoraban no más de 40 segundos, y los que no tenían liposomas, que tardaban 
más  tiempo  en  disolverse,  entre  40  s  y  80  s  (p≤0,05). Como  se discutió  anteriormente,  los 
liposomas  produjeron  cierta  discontinuidad  en  la  matriz  de  la  película,  lo  que  facilita  su 
desintegración y su mayor solubilidad. 
 

 

Figura 96. Atributos sensoriales de salivación, aroma y adherencia (0‐10) de películas de caseinato sódico 
conteniendo  liposomas  (P: película control; P‐L‐V: película con  liposomas vacíos; P‐L‐FP1: película con 
liposomas rellenos de fracción peptídica de langostino).  

 

Todos los parámetros estudiados son factores que pueden influir en el prototipo de una película 
transportadora de liposomas encapsulando péptidos, siendo estos liposomas buenos candidatos 
para  la obtención de películas  funcionales destinadas a que  sus compuestos bioactivos  sean 
absorbidos  por  las membranas  de  las mucosas  de  la  cavidad  oral,  o  bien  sean  a modo  de 
envoltura,  como nuevo diseño de un producto  funcional  con palatabilidad mejorada. En  los 
últimos años, algunos autores han indicado que estas características son las apropiadas para la 
absorción vía oral y sublingual (Masek et al., 2017). Esta absorción tiene la particularidad de ser 
rápida  y  directa,  previniendo  la  degradación  de  los  compuestos  activos  en  el  tracto 

0

2

4

6

8

10
Salivación

AdherenciaAroma

P P‐L‐V P‐L‐FP1



Resultados 

225 

 

gastrointestinal,  siendo  además  un método  atractivo  cuando  se  compara  con  los métodos 
tradicionales para personas con dificultades al deglutir (Heinemann et al., 2013).    

Conclusiones 

Una  fracción peptídica de bajo peso molecular  (<1  kDa) procedente de  langostino  sin  valor 
comercial,  con  actividad  biológica  (antioxidante,  antihipertensiva  e  hipoglucémica),  fue 
encapsulada en liposomas de fosfatidilcolina de soja parcialmente purificada. Estos liposomas 
presentaron un tamaño medio de ≈100 nm, una elevada estabilidad de partícula y una eficacia 
de encapsulación del 52 %. La adición de estos liposomas en películas comestibles de caseinato 
sódico  no  afecta  aparentemente  a  la  estabilidad  estructural  de  las  películas,  pero  causa 
discontinuidades internas en la matriz, incrementando su solubilidad en agua. La capacidad de 
mucoadhesión de la película se vio favorecida por el aumento de la humedad de la película y la 
presencia de  liposomas, especialmente cuando encapsulan  la fracción peptídica. Las películas 
resultantes  tienen  características  sensoriales  apropiadas  para  disolverse  rápidamente  en  la 
boca, especialmente las que contienen liposomas, con un sabor muy agradable y mejorando la 
palatabilidad.  

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Resultados 

227 

 

8.9.  PELÍCULAS  DE  CARBOXIMETILCELULOSA  CONTENIENDO  NANOLIPOSOMAS 
ENCAPSULANDO  UN  HIDROLIZADO  DE  COLÁGENO  CON  CAPACIDAD  INHIBITORIA  DE  LA 
ENZIMA CONVERTIDORA DE ANGIOTENSINA 

Resumen 

Se encapsuló un hidrolizado de colágeno procedente de túnicas del calamar gigante (Dosidicus 
gigas) en liposomas de fosfatidilcolina de soja parcialmente purificada, en presencia y ausencia 
de glicerol. El  tamaño medio de  los  liposomas estuvo entre 92,4 y 96,0 nm, mientras que el 
potencial zeta varió desde ‐30,4 hasta ‐34,5 mV. La eficacia de encapsulación fue del 80‐83 %, 
con  una  capacidad  inhibitoria  de  la  enzima  convertidora  de  angiotensina  (actividad 
antihipertensiva)  del  ≈50  %.  Las  dispersiones  liposomales  se  incorporaron  en  películas  de 
carboximetilcelulosa, comparando dos modos de incorporar el glicerol: directamente sobre  la 
solución  de  carboximetilcelulosa  o  previamente  incluido  en  los  liposomas.  La microscopía 
electrónica de transmisión a temperaturas criogénicas corroboró la presencia de los liposomas 
en las películas, los cuales inducen una disminución de la solubilidad de la película así como un 
incremento de  su  adhesividad.  Los  resultados demostraron que  los  liposomas  resistieron  el 
proceso de secado de la película y también el posterior proceso de digestión gastrointestinal in 
vitro,  tras  el  cual  los  liposomas  vieron  incrementado  su  potencial  antihipertensivo, 
independientemente de  la presencia o ausencia de glicerol. Además, aquellos  liposomas que 
contenían  glicerol  preservaron  mejor  el  tamaño  y  la  morfología  de  sus  vesículas  que  la 
formulación donde el glicerol se añadió directamente sobre la solución que origina la película.  

Palabras  clave:  hidrolizado  de  colágeno,  liposomas  de  fosfatidilcolina,  glicerol,  películas, 
digestión gastrointestinal in vitro, actividad antihipertensiva.  

Introducción 

Una  alternativa  para  la  obtención  de  productos  alimentarios  de  alto  valor  añadido  sería  el 
empleo de materiales residuales procedentes de la industria alimentaria o incluso de materias 
primas infrautilizadas. Esta acción implica que estos residuos no sean eliminados y puedan ser 
explotados y revalorizados, dándoles un uso integral, lo que tendría importantes repercusiones 
beneficiosas desde el punto de vista medioambiental y económico, con la posibilidad de obtener 
co‐productos o productos de alto valor añadido (Sayari et al., 2016). En este aspecto, existe un 
creciente interés en la obtención de hidrolizados proteicos a partir de residuos de la industria 
pesquera (López‐Caballero et al., 2013), dado que son excelentes fuentes de péptidos bioactivos 
con propiedades antioxidantes y antihipertensivas (Cudennec et al., 2008), representando un 
material atractivo para la elaboración de productos alimentarios funcionales.  

Sin  embargo,  estos péptidos bioactivos  son  susceptibles de degradación proteolítica  y/o de 
pérdida de funcionalidad durante su proceso de preparación o de conservación (Chollet et al., 
2008), efectos más pronunciados si además son sometidos a digestión gastrointestinal debidos 
al pH ácido y a las enzimas. Además, también pueden aportar ciertos sabores desagradables o 
amargor que afectan negativamente a  la aceptación  sensorial. Hay diversas estrategias para 
proteger  a  los  bioactivos  y  enmascarar  sus  características,  como  la  encapsulación  en 
nanoliposomas.  

Los  liposomas  son  estructuras  vesiculares  coloidales  de  naturaleza  anfipática  capaces  de 
englobar  y  proteger  compuestos  bioactivos  de  cualquier  naturaleza  (Mozafari  et  al.,  2008), 
incluyendo péptidos o hidrolizados peptídicos, manteniendo  inalterable su actividad (Da Silva 
Malheiros  et  al.,  2010).  Existen  estudios  previos  con  liposomas  encapsulando  fracciones 
peptídicas  con  capacidad  antihipertensiva,  sin  embargo,  aún  no  se  ha  estudiado  su 



Capítulo 4 

228 

 

comportamiento,  estabilidad  y  potencial  antihipertensivo  después  de  ser  sometidos  a  una 
digestión gastrointestinal in vitro.  

En  las  últimas  décadas  hay  un  interés  creciente  en  el  uso  de  películas  para  proteger  a  los 
liposomas y los bioactivos encapsulados en su interior (Cui et al., 2017b), sobre todo a partir de 
polímeros  naturales  para  su  aplicación  como  envase  o  protección  de  alimentos  (Boelter & 
Brandelli,  2016). A  día  de  hoy,  la mayoría  de  películas  para  recubrimiento  empleadas  para 
preservar  las  propiedades  de  los  alimentos  son  sintéticas.  Sin  embargo,  el  uso  de  películas 
comestibles o biodegradables es una tecnología útil para proteger las potenciales actividades, 
evitar problemas medioambientales y mejorar la sostenibilidad del procesado (Pérez‐Mateos et 
al., 2009). Estas películas para recubrimiento favorecen el mantenimiento de  la estructura de 
los liposomas y de la actividad bioactiva (Campos et al., 2018) mediante su acción como barrera 
frente a  la humedad, oxígeno, dióxido de carbono, aditivos o compuestos  intrínsecos de  los 
alimentos  (Wu  et  al.,  2015),  mejorando  la  liberación  controlada  del  bioactivo  dentro  del 
organismo  (Chirra & Desai, 2012). Además, estas películas constituyen un alimento funcional 
por sí mismas.  

La  carboximetilcelulosa  es  un  compuesto  orgánico  natural  no  tóxico  con  propiedades 
espesantes,  típicas de un polímero derivado de  la celulosa, que es el material orgánico más 
abundante en  la naturaleza. En  la bibliografía no hay muchos estudios acerca de películas de 
carboximetilcelulosa incorporando liposomas y ninguno con liposomas encapsulando péptidos 
antihipertensivos.  Sin  embargo,  Silva‐Weiss  et  al.  (2018)  diseñaron  películas  de 
carboximetilcelulosa  incorporando  liposomas  rellenos de polifenoles como  la quercetina o  la 
rutina;  Imran  et  al.  (2012)  incorporaron  liposomas  rellenos  de  nisina  en  películas  de 
hidroxipropilmetilcelulosa que emplearon como envolvente de alimentos; y Alemán et al. (2016) 
obtuvieron  películas  basadas  en  proteína muscular  procedente  de  langostino  a  las  que  se 
incorporaron  liposomas rellenos de péptidos con una excelente actividad antihipertensiva. El 
tipo de biopolímero puede determinar las propiedades finales de la película.  

El glicerol es un compuesto habitualmente adicionado durante la elaboración de películas a base 
de polímeros, dado que es capaz de  incrementar el estado de  fluidez  (Manca et al., 2013) y 
proteger  contra  el  proceso  de  deshidratación  (Stark  et  al.,  2010),  evitando  la  rotura  de  las 
películas. Su modo de inclusión en las películas podría determinar las propiedades de las mismas. 
La presencia de liposomas y glicerol podrían conferir propiedades adhesivas y mucoadhesivas 
sobre la película, favoreciendo así en el tracto intestinal la adhesión de la película a la membrana 
del intestino y sus mucosas durante el proceso de digestión gastrointestinal, mejorando de este 
modo la absorción intestinal de los liposomas.  

Objetivos 

El  objetivo  de  este  trabajo  experimental  fue  evaluar  la  estabilidad  y  bioaccesibilidad  de 
liposomas de  fosfatidilcolina de soja parcialmente purificada  incorporando un hidrolizado de 
colágeno procedente de túnicas del calamar gigante (Dosidicus gigas) y embebidos en películas 
comestibles de carboximetilcelulosa. En este trabajo se busca evaluar la importancia del modo 
de  inclusión  del  glicerol  (adicionado  directamente  en  la  solución  de  carboximetilcelulosa  o 
incluido previamente en los liposomas) y su efecto plastificante, así como la influencia de una 
digestión gastrointestinal in vitro sobre la integridad estructural y la actividad antihipertensiva 
de los liposomas.  

Materiales y métodos 

Inicialmente, se extrajo fosfatidilcolina parcialmente purificada tras cinco lavados (FC5) a partir 
de lecitina de soja (LS).  



Resultados 

229 

 

Seguidamente,  se  llevó a cabo  la obtención del hidrolizado de colágeno  (HC) procedente de 
túnicas  del  manto  del  calamar  gigante  (Dosidicus  gigas),  caracterizándose  su  perfil  de 
aminoácidos, su contenido proteico total, su distribución de pesos moleculares y su potencial 
antihipertensivo antes y después de ser digerido durante 4 horas.  

A continuación, se elaboraron liposomas de fosfatidilcolina purificada mediante cinco lavados, 
tanto vacíos (L‐V) como rellenos de hidrolizado de colágeno (L‐HC). El hidrolizado se incorporó 
al  buffer  fosfato  antes  del  primer  calentamiento  en  una  concentración  de  2  mg/mL  y  el 
crioprotector  (glicerol)  antes  del  segundo  calentamiento  en  una  proporción  0,6  mL/g 
fosfatidilcolina,  obteniendo  así  los  liposomas  L‐V,  L‐V‐G,  L‐HC  y  L‐HC‐G.  Se  estudiaron  las 
características de partícula mediante dispersión dinámica de luz en Zetasizer (dilución 1/10) y la 
eficacia de encapsulación, así como la capacidad antihipertensiva por el método de la inhibición 
de la enzima convertidora de angiotensina de todas las dispersiones liposomales.  

Seguidamente, las suspensiones liposomales conteniendo el hidrolizado de colágeno, sin y con 
glicerol  (L‐HC  y  L‐HC‐G),  se  incorporaron  en  películas  de  carboximetilcelulosa  sódica.  Este 
polímero  se disolvió al 4 % en agua desionizada  y  la disolución  resultante  se mezcló  con  la 
solución liposomal en proporción 1:1. En la muestra que no contenía glicerol en la formulación 
liposomal (L‐HC), se adicionó el glicerol a la solución a la misma proporción a la que se encuentra 
éste contenido en los liposomas (L‐HC‐G), siendo esta cantidad de 4,8 mL. Las soluciones finales 
fueron  vertidas en placas Petri  y  secadas  a 45  °C durante 24 horas.  Las películas obtenidas            
(P‐L‐HC+G y P‐L‐HC‐G) se acondicionaron hasta una humedad relativa del 58 %. Con propósitos 
de  comparación,  se  elaboraron dos películas  control  sin  liposomas utilizando buffer  fosfato        
pH 7 como sustituto de la dispersión (proporción 1:1 con la solución del polímero), una de ellas 
conteniendo únicamente glicerol (P+G) y la otra incorporando glicerol e hidrolizado de colágeno 
(P+G+HC), manteniendo  las  proporciones  de  glicerol  (4,8 mL)  y  de  hidrolizado  de  colágeno 
(0,320  g).  De  las  cuatro  películas  desarrolladas  se  estudió  la  integridad  estructural  de  las 
vesículas mediante microscopía electrónica de transmisión por criofijación (10‐20 mg/mL, 4 µL); 
las propiedades  físicas de humedad,  solubilidad en agua,  transparencia, espesor y  color;  las 
propiedades mecánicas mediante el test de adhesividad y el test de tracción (resistencia a  la 
tracción y elongación hasta  rotura); y  la  capacidad antihipertensiva  (inhibición de  la enzima 
convertidora de angiotensina).  

Finalmente,  los  liposomas  rellenos  fueron  sometidos  posteriormente  a  una  digestión 
gastrointestinal  in  vitro,  caracterizándose de  los digeridos  su  capacidad  antihipertensiva,  en 
función del número de horas de digestión (dos horas de digestión gástrica y a continuación dos 
horas de digestión  intestinal). Para comparar el efecto protector de  los  liposomas durante  la 
digestión gastrointestinal in vitro, el hidrolizado en forma libre también fue sometido a digestión 
de  forma similar  (4 horas). Las películas  formuladas con  liposomas  (P‐L‐HC+G y P‐L‐HC‐G)  se 
sometieron a una digestión gastrointestinal in vitro y se estudió su integridad por microscopía 
electrónica  de  transmisión  por  criofijación  y  su  capacidad  antihipertensiva,  en  función  del 
número de horas de digestión (4 horas).  

Resultados y discusión 

Caracterización del hidrolizado de colágeno (HC) 

El hidrolizado de colágeno es el mismo que el utilizado en los capítulos 2 (diseño experimental 
8.2.) y 3 (diseño experimental 8.7.), y  la caracterización del hidrolizado de colágeno (HC) está 
descrita en el diseño experimental 8.7. del capítulo 3.   

 

 



Capítulo 4 

230 

 

Caracterización de liposomas  

Características de partícula 

Las características de partícula (tamaño medio, índice de polidispersidad y potencial zeta) de las 
suspensiones liposomales se muestran en la tabla 41. Las dispersiones mantuvieron un tamaño 
medio nanométrico similar (p>0,05) con valores comprendidos entre 92,4 y 96,0 nm. Del mismo 
modo, los valores del índice de polidispersidad estuvieron comprendidos en un estrecho rango 
de valores, de 0,235 a 0,319. La adición de glicerol contribuye a  incrementar  ligeramente  la 
polidispersidad únicamente en el caso de los liposomas vacíos. Acorde a Da Silva Malheiros et 
al. (2011), quien establece valores entre 0,2‐0,3 como buenos  índices de polidispersidad para 
sistemas  elaborados  a partir de material biológico,  todas  las dispersiones mostraron buena 
polidispersidad.  

El potencial zeta, comprendido entre ‐30,4 y ‐34,5 mV (p≤0,05), es indicativo de la superficie de 
carga de  la membrana externa de  las vesículas y por  tanto de  la estabilidad de membrana. 
Valores  de  potencial más  electronegativos  de  ‐30 mV  reflejan  una  elevada  estabilidad  de 
membrana, según Müller et al. (2001), por lo que todas las dispersiones liposomales ensayadas 
presentaron una excelente estabilidad vesicular.  

No  se  observaron  diferencias  significativas  (p>0,05)  entre  las  características  de  partícula 
(tamaño medio, polidispersidad y potencial zeta) de las suspensiones en función de la adición 
del hidrolizado de colágeno o del glicerol, probablemente porque el glicerol está fuertemente 
asociado  a  las  cabezas  polares  de  los  fosfolípidos  y  el  hidrolizado  de  colágeno  está 
eficientemente encapsulado ya sea en el núcleo del  liposoma o bien  interaccionando con  las 
cabezas polares de la superficie de membrana. Los liposomas cargados con HC presentaron una 
elevada eficacia de encapsulación, con valores del 80,0 % para L‐HC y del 82,9 % paran L‐HC‐G, 
demostrando que la adición de glicerol apenas modifica la eficacia de encapsulación.  
 

Tabla  41.  Tamaño  medio  (nm),  índice  de  polidispersidad  y  potencial  zeta  (mV)  de  dispersiones 
liposomales. Diferentes  letras  (a, b, c) en  la misma columna  indican diferencias  significativas  (p≤0,05) 
entre liposomas.  

  Tamaño medio 
(nm) 

Índice de 
polidispersidad 

Potencial zeta  
(mV) 

L‐V  96,0 ± 1,5a         0,271 ± 0,030ab      ‐30,4 ± 1,9c 
L‐V‐G  94,2 ± 0,8a      0,319 ± 0,039b        ‐33,4 ± 0,6ab 
L‐HC  95,4 ± 2,2a      0,235 ± 0,006a      ‐34,5 ± 0,4a 
L‐HC‐G  92,4 ± 0,4a      0,255 ± 0,005a        ‐31,5 ± 0,4bc 

 

Caracterización de las películas de carboximetilcelulosa 

Los  liposomas  encapsulando  el hidrolizado de  colágeno  (L‐HC  y  L‐HC‐G)  se  incorporaron  en 
películas  de  carboximetilcelulosa  y  se  adicionó  glicerol  a  la  que  contenía  L‐HC  (a  la misma 
concentración que el glicerol contenido en  los  liposomas L‐HC‐G), obteniéndose dos películas 
con los mismos componentes a las mismas concentraciones (P‐L‐HC+G y P‐L‐HC‐G) pero con el 
glicerol  incorporado  de  diferente  manera  (libre  o  en  los  liposomas).  Con  propósitos 
comparativos, se diseñaron y caracterizaron dos películas control, una con glicerol (P+G) y otra 
con glicerol e hidrolizado de colágeno (P+G+HC), ambas formulados con buffer fosfato en vez de 
dispersión liposomal. El glicerol se añadió en todas las formulaciones ya que es un compuesto 
plastificante que aporta  flexibilidad a  las películas, evitando su  rotura. Además, protege a  la 
membrana liposomal durante el proceso de secado de la película, evitando la agregación de las 
vesículas.    



Resultados 

231 

 

Microscopía electrónica de transmisión a temperatura criogénica 

Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión por criofijación de las películas disueltas 
en agua (Figura 97) mostraron que los liposomas son resistentes al proceso de secado durante 
la elaboración de las películas, con predominancia de vesículas unilamelares esféricas, aunque 
se observan algunos casos de invaginación, de bi‐ o multilamelaridad e incluso de estructuras 
multivesiculares. En las películas con glicerol adicionado directamente (P‐L‐HC+G) (Figura 97A y 
97B), se observó una mayor proporción de vesículas grandes (superiores a 200 nm), mientras 
que en las películas con el glicerol incluido dentro de los liposomas (P‐L‐HC‐G) (Figura 97C y 97D) 
predominaron las vesículas de pequeño tamaño (inferiores a 200 nm), indicando que esta última 
estructura vesicular fue mejor preservada.   

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura  97. Microscopía  electrónica de  transmisión por  criofijación de películas disueltas  conteniendo 
liposomas. A y B: películas con glicerol y liposomas rellenos de hidrolizado de colágeno (P‐L‐HC+G). C y D: 
películas con liposomas rellenos de hidrolizado de colágeno y glicerol (P‐L‐HC‐G).  

 

Color 

El  color  de  las  películas,  según  se  analiza  por  los  parámetros  de  color  del  sistema  CIELAB                 
L*  (luminosidad, 0‐100), a*  (intervalo  rojo‐verde), b*  (intervalo amarillo‐azul), y el  índice de 
blancura,  se  muestra  en  la  tabla  42.  Las  cuatro  películas  mostraron  valores  similares  de 
luminosidad y estuvieron dentro de un estrecho rango de valores para el intervalo rojo‐verde 
(a*), mostrando las películas sin liposomas una ligera menor luminosidad y mayor tendencia a 

A 

200 nm

B 

200 nm 

C 

200 nm

D 

200 nm 



Capítulo 4 

232 

 

una  coloración  verdosa  (p≤0,05).  Sin  embargo,  respecto  al  intervalo  amarillo‐azul  (b*),  las 
películas con liposomas mostraron una clara tendencia positiva, atribuido al característico color 
amarillento de los liposomas. El índice de blancura fue similar en ambas películas con liposomas 
(p>0,05), pero notablemente menor que aquéllas que no los incorporan. La diferencia total de 
color (ΔE) por la incorporación del hidrolizado de colágeno en la formulación de la película fue 
bastante baja  (0,76). Por el contrario, cuando se  incorporaron  los  liposomas  la diferencia de 
color fue considerablemente mayor (8,38 para P‐L‐HC+G y 8,63 para P‐L‐HC‐G), sin diferencias 
significativas entre ellos (p>0,05).    
 

Tabla 42. Parámetros de color L* (luminosidad, 0‐100), a* (rango rojo‐verde), b* (rango amarillo‐azul) e 
índice de blancura de las películas, donde P+G: película con glicerol; P+G+HC: película con glicerol y con 
hidrolizado de  colágeno; P‐L‐HC+G: película  con glicerol y  con  liposomas  incorporando hidrolizado de 
colágeno; P‐L‐HC‐G: película con  liposomas  incorporando hidrolizado de colágeno y glicerol. Diferentes 
letras (a, b, c) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre películas. 

  L*  a*  b*  Blancura 

P+G  30,38 ± 0,59a  ‐0,43 ± 0,07b ‐0,74 ± 0,12a   32,60 ± 0,95a 
P+G+HC  30,16 ± 0,25a  ‐0,60 ± 0,05a ‐0,04 ± 0,13b 30,27 ± 0,42b 
P‐L‐HC+G  31,85 ± 0,22b  ‐0,34 ± 0,18b  7,48 ± 0,56c   9,41 ± 1,80c 
P‐L‐HC‐G  31,86 ± 0,21b  ‐0,13 ± 0,20c  7,73 ± 0,56c   8,66 ± 1,67c 

 

Propiedades físicas 

El  contenido de humedad  (Tabla 43)  fue  inferior  en  las películas  formuladas  con  liposomas 
respecto  a  las  que  no  contienen  liposomas,  debido  a  la mayor  cantidad  de materia  seca 
(fosfatidilcolina)  en  las  primeras  formulaciones.  Valencia‐Sullca  et  al.  (2016)  obtuvieron 
resultados similares de humedad (24 %) para películas de quitosano incorporando liposomas de 
lecitina. En el diseño experimental anterior (8.8.) se ha observado un comportamiento similar al 
incorporar liposomas en películas comestibles de caseinato sódico, indicando que la presencia 
de liposomas en las películas produce discontinuidades en la matriz que favorecen la eliminación 
del agua durante el proceso de secado de la película.  
 

Tabla 43. Propiedades  físicas de  las películas, donde P+G: película  con glicerol; P+G+HC: película  con 
glicerol  y  con hidrolizado de  colágeno; P‐L‐HC+G: película  con  glicerol  y  con  liposomas  incorporando 
hidrolizado  de  colágeno;  P‐L‐HC‐G:  película  con  liposomas  incorporando  hidrolizado  de  colágeno  y 
glicerol. Diferentes  letras  (a, b) en  la misma  columna  indican diferencias  significativas  (p≤0,05) entre 
películas.  

  Humedad (%)  Solubilidad (%)  Espesor (µm)  Opacidad 

P+G  31,8 ± 3,9b  66,1 ± 9,5b 207 ± 50a 3,58 ± 0,25b  
P+G+HC  32,8 ± 2,8b  59,1 ± 5,1b 215 ± 31a 4,78 ± 0,19c 

P‐L‐HC+G  24,2 ± 2,0a  37,6 ± 3,8a 342 ± 25b 1,89 ± 0,21a 

P‐L‐HC‐G  21,7 ± 2,9a  37,6 ± 5,1a 328 ± 39b 1,29 ± 0,46a 

 

Esta menor humedad en las películas que contienen liposomas condujo a una menor solubilidad 
en agua (Tabla 43) de dichas películas (37,6 %), en contraste con las que no contenían liposomas 
(66,1‐59,1 %). Valencia‐Sullca  et  al.  (2016) obtuvieron  resultados  casi  idénticos  (37 %)  para 
películas de quitosano con  liposomas. Además,  la naturaleza hidrofóbica de  la fosfatidilcolina 
podría  favorecer  la  baja  solubilidad  en  agua  de  las  películas  que  contienen  liposomas  de 
fosfatidilcolina parcialmente purificada. De acuerdo a Souza et al. (2009), la solubilidad de una 
película comestible determina su futura función, de modo que aquellas menos solubles podrían 
emplearse como protectoras de alimentos. Dada la baja solubilidad cuantificada en las películas 



Resultados 

233 

 

comestibles estudiadas, éstas podrían destinarse  a  funcionar  como  recubrimientos de otros 
alimentos de baja humedad.  

El espesor medio (Tabla 43) fue superior en las películas formuladas con liposomas respecto a 
las formuladas sin ellos, probablemente atribuido al mayor contenido en materia seca, dado que 
la adición del péptido no incrementa significativamente el espesor de la película. Hay que tener 
en  cuenta  que  el  relativo  elevado  espesor  obtenido  (>200  µm)  fue  producido 
intencionadamente mediante el empleo de una solución de carboximetilcelulosa al 4 %, para 
permitir  la  carga  de  una  alta  cantidad  de  liposomas  en  las  películas  sin  comprometer  la 
integridad de la película ni su posterior manejo. Cui et al. (2017a) observaron un incremento de 
espesor en películas de quitosano tras  la adición de  liposomas de  lecitina‐colesterol mientras 
que Alemán et al. (2016) no observaron diferencias de espesor cuando incorporaron liposomas 
conteniendo un hidrolizado proteico en películas de proteína miofibrilar de langostino cocido. 
Cui et al.  (2017a)  indicaron que el espesor de una película depende de  la composición de  la 
misma y de las interacciones que se establezcan tras la adición de los diferentes componentes.  

Las  películas  conteniendo  liposomas  mostraron  un  menor  grado  de  opacidad  (mayor 
transparencia) (Tabla 43). Rodsmran & Sothornvit (2018) obtuvieron un grado de transparencia 
similar  (3,2)  para  películas  carboximetilcelulosa  incorporando  microcápsulas.  En  términos 
generales  las  películas  de  carboximetilcelulosa  elaboradas  no  fueron  muy  transparentes, 
aunque  la  adición de  liposomas  incrementa notablemente  este parámetro,  favoreciendo  su 
versatilidad de aplicación en alimentos, puesto que a menudo se desea que el producto pueda 
ser visualizado sin cobertura que lo enmascare.  

Propiedades mecánicas 

La capacidad de adhesión de las películas, determinada como la fuerza máxima requerida para 
separar  la  película  de  una  superficie,  se muestra  en  la  tabla  44.  La  adhesividad  fue  similar 
(p>0,05) en ambas películas sin liposomas, por lo que el hidrolizado peptídico no influye en las 
propiedades mecánicas de  las películas. Los valores de adhesividad  fueron mayores  (p≤0,05) 
para  las películas formuladas con  liposomas, debido al efecto plastificante que ejercen éstos, 
incrementando  así  la  fuerza necesaria para despegarlas.  En  el diseño  experimental  anterior 
(8.8.) se observó un comportamiento similar al incorporar liposomas en películas de caseinato 
sódico trabajando bajo condiciones idénticas de humedad relativa (58 %). La mayor capacidad 
de adhesividad de las películas incorporando liposomas les hace ser estructuras apropiadas para 
actuar como recubrimientos de otros productos, quedándose bien adheridas a ellos. Entre ellas, 
la que contiene el glicerol añadido directamente (P‐L‐HC+G) mostró un valor superior (p≤0,05) 
respecto a la que lo tiene dentro de los liposomas (P‐L‐HC‐G), siendo los valores de 429,32 y de 
392,13 mN,  respectivamente,  sugiriendo que  el  glicerol  interactúa  en mayor medida  con  la 
película cuando éste es incorporado en forma libre, confirmando el efecto plastificante de dicho 
compuesto (Cui et al., 2017a).  

Los parámetros de resistencia a la tracción, fuerza máxima necesaria para romper una película 
sometida a estiramiento, y elongación hasta rotura, valor máximo de estiramiento alcanzado 
por  la película antes de su rotura, también se muestran en  la tabla 44. Según Giménez et al. 
(2009),  la  adición  de  hidrolizados  peptídicos  en  películas  podría modificar  las  propiedades 
mecánicas de las mismas garantizando un efecto plastificante. Sin embargo, la resistencia a la 
tracción no se vio modificada por la adición en la película del hidrolizado libre (p>0,05), por lo 
que  el hidrolizado de  colágeno no  fue un  factor  determinante  en  las propiedades  de  estas 
películas.  En  cambio,  sí  que  disminuyó  en  presencia  de  liposomas,  aunque  únicamente  de 
manera significativa (p≤0,05) cuando el glicerol se añadió directamente (P‐L‐HC+G). El grado de 
elongación  fue  bastante  elevado  (≈50  %),  sin  diferencias  entre  películas  (p>0,05).  Estas 
propiedades proporcionan a las películas una excelente versatilidad para elaborar y/o envasar 
productos alimentarios. Ebrahimi et al. (2018) obtuvieron una resistencia a  la tracción mayor 



Capítulo 4 

234 

 

(14 MPa) y menor elongación a rotura (25 %) en películas de carboximetilcelulosa con glicerol, 
aunque  éstas  tenían  menor  espesor.  Sin  embargo,  Zhu  et  al.  (2018)  obtuvieron  valores 
superiores  en  ambos  parámetros  para  películas  de  hidroxipropilmetilcelulosa  incorporando 
liposomas a base de  fosfolípidos y colesterol. Cui et al.  (2017a) obtuvieron valores parecidos 
para  películas  de  quitosano  incorporando  glicerol  y  liposomas  de  lecitina  de  soja,  con  una 
elongación del 45‐55 % y una resistencia a la tracción de 11‐13 MPa (N/mm2), demostrando la 
importancia del biopolímero en las propiedades de la matriz.  
 

Tabla 44. Propiedades mecánicas de las películas, donde P+G: película con glicerol; P+G+HC: película con 
glicerol e hidrolizado de colágeno; P‐L‐HC+G: película con glicerol y liposomas rellenos de hidrolizado de 
colágeno; P‐L‐HC‐G: película con liposomas rellenos de hidrolizado de colágeno y glicerol. Diferentes letras 
(a, b, c) en la misma Columba indican diferentes significativas (p≤0,05) entre películas.  

  Adhesividad  
(mN) 

Resistencia a la tracción 
(N/mm2) 

Elongación hasta rotura 
(%) 

P+G  37,8 ± 6,7a  6,0 ± 0,7b 51,2 ± 8,6a 

P+G+HC  37,6 ± 3,3a  5,8 ± 0,8b 53,2 ± 9,3a 

P‐L‐HC+G  429,3 ± 26,4c  4,2 ± 0,8a 45,6 ± 7,2a 

P‐L‐HC‐G  392,1 ± 25,1b    5,2 ± 0,6ab 51,0 ± 7,7a 

 

Efecto de la digestión gastrointestinal in vitro 

Los  péptidos  pueden  sufrir  cambios  debidos  a  su  interacción  con  otros  componentes 
alimentarios durante el procesamiento y después de la ingestión oral por la acción de proteasas 
digestivas. De igual manera, los liposomas pueden sufrir alteraciones que afecten a la integridad 
y bioaccesibilidad del bioactivo encapsulado. Por este motivo, las películas se sometieron a una 
digestión gastrointestinal in vitro durante 4 horas, donde las dos primeras horas corresponden 
a  la digestión gástrica y  las dos últimas a  la digestión  intestinal, con el objetivo de conocer el 
comportamiento de los liposomas después de ser sometidos a una digestión gastrointestinal in 
vitro, en términos de integridad estructural y de actividad funcional.  

Las imágenes obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión por criofijación de las 
películas digeridas evidenciaron que los liposomas son resistentes a la digestión, sin presentar 
signos de ruptura (Figura 98).  

La  morfología  y  el  tamaño  medio  de  las  vesículas  fueron  bastante  similares  a  sus 
correspondientes sin digerir, aunque con menos eventos de bi‐ o multilamelaridad. Por otro 
lado, se observa un considerable número de estructuras multivesiculares.  

Las películas P‐L‐HC+G digeridas presentaron un mayor número de vesículas de gran tamaño 
respecto a  la películas P‐L‐HC‐G digeridas, en  las que predominan  las  vesículas de pequeño 
tamaño, tanto en forma libre como incluidas en estructuras multivesiculares. Estos resultados 
indican que el glicerol protege la integridad de las vesículas de forma más efectiva, tanto durante 
el  secado de  la película como durante  su posterior digestión, cuando  se añade previamente 
durante la formación de la dispersión liposomal.  

 

 

 

 

 



Resultados 

235 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 98. Microscopía electrónica de  transmisión por criofijación de películas conteniendo  liposomas 
sometidas a una digestión gastrointestinal in vitro (4 h). A y B: películas con glicerol y liposomas rellenos 
de hidrolizado de colágeno (P‐L‐HC+G). C y D: películas con liposomas rellenos de hidrolizado de colágeno 
y glicerol (P‐L‐HC‐G). 

 

Actividad antihipertensiva 

La actividad del hidrolizado de colágeno (a una concentración de 0,8 mg/mL) fue del 43,96 % 
(Tabla 45). Su digestión gastrointestinal  in vitro  indujo un progresivo  incremento de actividad 
hasta  las 3 h de digestión, momento a partir del cual disminuye (p≤0,05). Este  incremento se 
atribuye a que el proceso de digestión ocasiona  la hidrólisis del extracto con  la formación de 
péptidos más pequeños de mayor actividad (Alemán et al., 2013), pero existe un límite donde la 
hidrólisis puede ser excesiva y la actividad disminuya (Gong et al., 2016).  

La presencia de glicerol en los liposomas (L‐HC‐G) no modificó (p>0,05) la actividad comparada 
con  aquéllos  que  no  lo  contienen  (L‐HC).  Ambos  liposomas  tuvieron  un  mayor  potencial 
antihipertensivo  que  el  propio  hidrolizado  de  colágeno  (p≤0,05),  probablemente  como 
consecuencia de la interacción del bioactivo con la membrana liposomal, lo que podría favorecer 
una configuración peptídica más activa. La digestión gastrointestinal  in vitro de  los  liposomas 
aumentó la actividad de los mismos (p≤0,05), sin diferencias significativas en función de las horas 
de digestión. Gong et al. (2016) observaron el mismo efecto en liposomas elaborados a partir de 
fosfolípidos de soja y colesterol sometidos a digestión  in vitro durante 2 horas. Estos mismos 
autores  determinaron  una  mayor  actividad  antihipertensiva  en  nanoliposomas  que  en 
liposomas, y mayor en éstos que en el hidrolizado  libre, concluyendo que  los nanoliposomas 
tuvieron  la mayor biodisponibilidad después de ser digeridos, debido en parte al efecto de  la 
pepsina  y  la  pancreatina  sobre  dicha  actividad.  Además,  se  debe  tener  en  cuenta  que  la 

A

200 nm

B 

200 nm 

C

200 nm

D 

200 nm 



Capítulo 4 

236 

 

disminución de actividad en  los hidrolizados tras 4 h de digestión no se encontró en ninguna 
dispersión liposomal, corroborando el papel protector de los liposomas.  
 

Tabla 45. Actividad antihipertensiva (expresada como porcentaje de inhibición de la enzima convertidora 
de  angiotensina) del hidrolizado  (HC)  y de  los  liposomas  con  glicerol  (L‐HC‐G)  y  sin él  (L‐HC)  antes  y 
después de  ser  sometidos  a  una digestión  gastrointestinal  in  vitro  durante  2  h de digestión  gástrica 
seguida de 2 h de digestión intestinal. Diferentes letras (a, b, c, d) indican diferencias significativas (p≤0,05) 
entre las diferentes horas de digestión de una misma muestra; (x, y) entre muestras para un mismo tiempo 
de digestión.  

Hidrolizado  Inhibición (%)  Liposoma Inhibición (%) Liposoma Inhibición (%) 

HC  43,96 ± 0,84a/x  L‐HC 49,88 ± 1,42a/y L‐HC‐G 51,18 ± 1,29a/y 

HC 1 h  55,23 ± 0,24c/x  L‐HC 1 h 63,03 ± 2,80b/y L‐HC‐G 1 h 63,98 ± 2,09b/y 

HC 2 h  58,56 ± 0,22d/x  L‐HC 2 h 64,11 ± 2,48b/x L‐HC‐G 2 h 65,15 ± 1,64b/x 

HC 3 h  60,11 ± 0,99d/x  L‐HC 3 h 64,02 ± 2,56b/x L‐HC‐G 3 h 63,12 ± 2,28b/x 

HC 4 h  51,12 ± 0,12b/x  L‐HC 4 h 68,90 ± 2,02b/y L‐HC‐G 4 h 66,22 ± 0,55b/y 

 

La actividad antihipertensiva de  las películas digeridas no pudo  ser determinada debido a  la 
fuerte  interferencia causada por  la carboximetilcelulosa, cuya naturaleza de  fibra  le hace ser 
altamente  viscosa  en  solución  acuosa.  Del  mismo  modo,  cuando  se  intentó  separar  la 
carboximetilcelulosa por centrifugación, no se detectó actividad en el sobrenadante, dado que 
los liposomas fueron arrastrados junto con la fibra hasta el precipitado.  

Existen  estudios  que  demuestran  la  capacidad  de  transporte  de  las  matrices  de 
carboximetilcelulosa,  liberando  el  compuesto  bioactivo  en  la  fase  intestinal  de  la  digestión 
gastrointestinal  in  vitro,  lo  que  sugiere  que  son  adsorbidos  principalmente  en  el  intestino 
delgado.  Feng  et  al.  (2013) observaron que  cuando  administraban doxorubicina  cargada  en 
liposomas, que a su vez fueron incorporados en matrices de quitosano con carboximetilcelulosa, 
la biodisponibilidad del bioactivo aumentaba con respecto a su forma libre.  

Para evaluar correctamente si los liposomas son atrapados por la fibra y el grado en que están 
disponibles para cruzar el epitelio de membrana, serían necesarios una serie de experimentos 
que serían objeto de un trabajo diferente. No obstante, se evaluó la integridad de los liposomas 
en  la matriz de  la película tras  la digestión gastrointestinal  in vitro mediante visualización por 
microscopía electrónica de transmisión a temperatura criogénica. 

Conclusiones 

Las propiedades de partícula  (tamaño medio y potencial zeta) de  los  liposomas no se vieron 
afectadas ni por la presencia del hidrolizado de colágeno ni por la del glicerol. La presencia de 
glicerol no interfirió en la capacidad antihipertensiva de los liposomas con HC, siendo ésta más 
elevada  que  la  del  propio  hidrolizado  de  colágeno  (dadas  las  nuevas  interacciones  en  la 
conformación liposomal) e incrementada durante el proceso de digestión gastrointestinal.   

Los liposomas incorporados en películas de carboximetilcelulosa fueron resistentes al proceso 
de secado de las películas y también al posterior proceso de digestión gastrointestinal in vitro. 
El aumento de adhesividad en las películas con liposomas podría ser de interés en promover las 
interacciones con la membrana intestinal y favorecer la absorción liposomal. La inclusión previa 
del  glicerol  en  liposomas  contribuye  a  estabilizar  el  tamaño  y morfología  de  las  vesículas 
embebidas en películas de carboximetilcelulosa en mayor medida que si se agrega el glicerol en 
forma  libre a  la solución formadora de película. Este efecto fue observado tanto antes como 
después de que dichas películas fueran sometidas a una digestión gastrointestinal in vitro. 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

9. DISCUSIÓN INTEGRADORA 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Discusión integradora 

239 

 

9.1. Materias primas 

9.1.1. Residuos agroalimentarios y pesqueros 

Las  industrias  encargadas  del  procesado  de  productos  alimentarios  generan  una  ingente 
cantidad de residuos, desechos que son descartados y posteriormente eliminados. Dos de  las 
industrias  alimentarias  que  generan  una mayor  cantidad  de  estos  residuos  son  la  industria 
pesquera y de acuicultura y la industria agraria. En el sector pesquero cada vez es más frecuente 
el  deshecho  de  diversas  estructuras  que  forman  parte  de  la  anatomía  de  los  pescados  y 
productos marinos, como pueden ser vísceras, espinas, pieles, escamas, cabezas, cutículas, etc., 
comercializando  los  productos  ya  limpios  presentados  en  diversas  preparaciones,  con  la 
finalidad de facilitarle al consumidor el manejo y consumo del producto. Esto facilita el acumulo 
de residuos en las plantas procesadoras y por tanto la potencial gestión de los mismos. En otras 
ocasiones, no es un residuo propiamente dicho, sino más bien un producto infrautilizado, ya que 
es el ejemplar entero el que es descartado como consecuencia de su bajo valor comercial o 
debido a que se excede la cuota máxima de captura de una determinada especie (aunque sea 
ésta muy  apreciada),  acorde  a  la política pesquera  europea.  Por  su parte,  el  sector  agrario 
genera  importantes cantidades de desechos procedentes de partes o componentes de frutos 
que no son consumidos habitualmente, como pueden ser semillas, pedúnculos o cáscaras (de 
granada,  naranja,  etc.).  Existen  otras  fuentes  independientes  de  los  descartes  que  también 
podrían  ser  utilizadas  para  un  mejor  aprovechamiento  y  explotación  de  sus  recursos  y 
propiedades, como son las especies vegetales infrautilizadas, bien sea por su escasa utilización, 
o bien porque tiene una gran producción muy superior a su consumo. En Europa hay extensos y 
numerosos  cultivos de  especies  como  la  soja o  incluso de  especies  salvajes  como  el hinojo 
marino que, por su desconocimiento o baja demanda, no se utilizan y acaban abandonados o 
echándose a perder, desaprovechando su posible potencial. Estas especies son consideradas 
como infrautilizadas. 

Los  descartes  suponen  un  problema  medioambiental  ya  que  necesitan  de  un  procesado 
adicional  para  ser  degradados  y  eliminados,  y  muy  frecuentemente  son  arrojados 
descuidadamente en el entorno natural, provocando su acumulación excesiva y su interacción 
con animales y plantas, con el posible efecto negativo que ello conlleva. Además, la eliminación 
de estos desechos,  tanto  los que  llegan a  la planta de residuos como  los que no, supone un 
considerable gasto económico. Por estas razones principalmente, en las últimas décadas existe 
un  creciente  interés  por  parte  de  las  industrias  y  de  la  sociedad  en  general  en  el 
aprovechamiento de algunos residuos o desechos, así como de algunas especies infrautilizadas, 
para intentar alcanzar en lo posible un uso integral, con el objetivo de evitar los efectos nocivos 
en  el medioambiente  y  reducir  el  coste  económico.  A  su  vez,  aprovechar  las  propiedades 
beneficiosas  que  los  componentes  de  estos  residuos  contienen:  propiedades  funcionales 
interesantes desde el punto de vista tecnológico y bioactivo que pueden dar lugar a su potencial 
aplicación en base a diversos aspectos.  

9.1.2. Propiedades saludables y/o bioactivas 

Otra razón de peso que incentiva el aprovechamiento de los residuos y plantas infrautilizadas es 
su potencial bioactivo. El hecho de que no hayan sido explotadas hasta hace unos años se debe 
a la ausencia de industrias encargadas de tal cometido como consecuencia del desconocimiento 
de las propiedades beneficiosas que puedan tener estos residuos y especies infrautilizadas. Sin 
embargo,  se  ha  demostrado  recientemente  que  la mayoría  de  ellos  poseen  importantes  y 
destacadas actividades biológicas que desencadenan beneficios y propiedades saludables sobre 
la salud humana, por lo que su aprovechamiento cada vez cobra más importancia.  

Los residuos procedentes de componentes del pescado, a pesar de ser descartados, son fuente 
de compuestos con diferentes propiedades funcionales, tanto tecnológicas como nutracéuticas, 



Discusión integradora 

240 

 

como es el  caso de  las espinas, escamas  y pieles, que  constituyen una  fuente de  colágeno, 
proteína presente en todos  los animales  implicada en el fortalecimiento óseo y regeneración 
tisular, entre otras funciones; o las cutículas de crustáceos, conocidas por su poder antioxidante 
atribuido a  la presencia de carotenoides y  compuestos antioxidantes  como el  tocoferol, por 
mencionar  la parte que se ha utilizado en  la presente memoria, pero sin olvidar el papel tan 
importante que están adquiriendo la quitina y quitosano en los últimos años en el campo de la 
cosmética y medicina y que también provienen de la cutícula de los crustáceos principalmente. 
Por otro lado, las especies de bajo valor comercial y aquellas que exceden la cuota de captura, 
aunque no tengan salida en el mercado para consumo directo, podrían ser sometidas a procesos 
de  transformación  industrial mediante  la  adición de diversos  compuestos bioactivos, dando 
lugar a nuevos productos comerciales de valor añadido, además del aprovechamiento de un 
recurso  proteico  que  ello  conllevaría.  Los  residuos  del  sector  agrario  y  especies  vegetales 
infrautilizadas también poseen marcadas propiedades funcionales saludables, siendo una de las 
más  comunes  su  potencial  antioxidante  atribuido  a  su  composición  rica  en  polifenoles.  En 
algunos casos, la actividad de algunos componentes desechados llega a ser incluso mayor que 
la  del  componente  normalmente  utilizado.  Además,  por  supuesto,  de  las  propiedades 
tecnológicas  que  cada  uno  de  los  compuestos  pueda  conferir  según  sus  características 
intrínsecas. 

9.1.3. Lecitina y fosfatidilcolina 

Como ya avanzábamos en el apartado anterior, el  cultivo de  soja  (Glycine max) es un  claro 
ejemplo de especie vegetal infrautilizada, dado que sus cultivos se extienden ampliamente por 
el centro de Europa y otras vastas regiones del mundo sin ser adecuadamente aprovechados. La 
soja tiene multitud de beneficios sobre la salud, destacando sus efectos a nivel cognitivo, contra 
diversas enfermedades cardiovasculares y su capacidad de reducir el colesterol. Cuando se trata 
del  ámbito  nutricional  habitualmente  se  habla  de  la  semilla  de  soja,  conocida  por  su  alto 
contenido proteico. A partir de dicha semilla se puede obtener un subproducto resino‐aceitoso 
con  importantes propiedades beneficiosas atribuidas a  su composición  rica en ácidos grasos 
poliinsaturados, la lecitina de soja. La lecitina es un producto orgánico cuyos componentes están 
presentes de forma natural en cerebro, hígado, riñones y médula ósea, por  lo que su  ingesta 
adicional proporciona un mejor desarrollo y funcionamiento de distintos órganos y estructuras, 
así como del metabolismo orgánico en general.  

El análisis composicional de la lecitina de soja (LS) utilizada en el presente trabajo mostró una 
proporción de fosfolípidos del 57,55 % del total de lípidos que lo constituyen, donde la mayoría 
de ellos (52,38 % del total) corresponden a fosfatidilcolina (Figura 99).  

 

Figura  99.  Contenido  en  fosfatidilcolina,  expresada  como  porcentaje  (%),  de  lecitina  de  soja  (LS)  y 
fosfatidilcolina parcialmente purificada mediante dos (FC2) y cinco lavados (FC5).  
 

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Discusión integradora 

241 

 

El resto de componentes son principalmente lipídicos (lípidos neutros y ácidos grasos libres) con 
una pequeña presencia de compuestos que pueden considerarse  impurezas de  la extracción 
(colesterol, triglicéridos, proteínas, carbohidratos, etc.). Por tanto, la mitad de  la composición 
de la lecitina corresponde a fosfatidilcolina, fosfolípido con cabeza polar de colina con beneficios 
sobre  la  salud  cognitiva.  La  composición  de  ácidos  grasos  de  estos  fosfolípidos  fue 
predominantemente  insaturada  (mono‐  y  poliinsaturada),  factor  que  desencadena  efectos 
beneficiosos en el organismo, como la reducción de colesterol. 

Además,  la  lecitina  de  soja mostró  un muy  elevado  contenido  en  tocoferoles  (γ‐tocoferol,              
δ‐tocoferol y α‐tocoferol) (Figura 100), compuesto antioxidante con efectos beneficiosos frente 
al  estrés  oxidativo  y  la  proliferación  de  especies  reactivas  de  oxígeno.  En  función  de  estos 
componentes  podemos  afirmar  que  la  lecitina  de  soja  es  un  compuesto  orgánico  rico  en 
compuestos bioactivos con propiedades muy beneficiosas para la salud.  

 

Figura  100.  Contenido  en  tocoferoles  totales,  expresados  como mg/100g,  de  lecitina  de  soja  (LS)  y 
fosfatidilcolina parcialmente purificada mediante dos (FC2) y cinco lavados (FC5).  

 

Dadas  las propiedades saludables de  la fosfatidilcolina, se procuró obtener un derivado de  la 
lecitina de soja con la mayor concentración posible en fosfatidilcolina, mediante su purificación 
con  lavados  sucesivos  en  acetona.  De  este  modo,  se  obtuvieron  dos  fosfatidilcolinas 
parcialmente  purificadas, mediante  dos  (FC2)  y  cinco  lavados  (FC5).  Ambas mostraron  una 
mayor concentración de fosfolípidos totales respecto a la lecitina (94,77 % y 95,74 % para FC2 y 
FC5,  respectivamente)  y,  también,  de  fosfatidilcolina  (85,82 %  y  87,58 %  para  FC2  y  FC5, 
respectivamente) (Figura 99), manteniendo el elevado grado de ácidos grasos  insaturados en 
esta  fracción.  Esta  composición  tan  rica  en  fosfolípidos  y  fosfatidilcolina  aportará 
presumiblemente  mayores  beneficios  sobre  el  organismo.  Sin  embargo,  uno  de  los 
inconvenientes de estas fosfatidilcolinas parcialmente purificadas es que el lavado con acetona 
(reconocido  como  uno  de  los  mejores  solventes  para  concentrar  la  fosfatidilcolina)  es 
responsable de la eliminación concomitante de otros componentes presentes en la lecitina que 
pueden ser de interés, fundamentalmente por su capacidad para estabilizar la oxidación de los 
lípidos presentes. Tal es el caso de los tocoferoles, cuyo contenido se reduce un 93,74 % en FC2 
y un 98,87 % en FC5  (Figura 100). Por  tanto, estas materias primas derivadas pierden buena 
parte de su mecanismo antioxidante intrínseco.  

Ambas  fosfatidilcolinas presentaron una  composición  fosfolipídica muy  interesante desde  el 
punto de vista nutricional, aunque sin grandes diferencias entre ellas, lo que indica que un mayor 
grado de purificación no mejora sustancialmente la composición lipídica. Por tanto, aunque la 
fosfatidilcolina de cinco lavados (FC5) fue la que presentó un mayor grado de purificación, para 
la mayoría  de  aplicaciones  alimentarias  la  fosfatidilcolina  de  dos  lavados  (FC2)  podría  ser 
suficiente para obtener una materia prima de excelentes propiedades, sin necesidad de tener 
que purificar cinco veces (FC5). En cambio,  la  lecitina de soja (LS), presentó una composición 
diferente con respecto a sus derivados, caracterizada por una considerable menor proporción 

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Discusión integradora 

242 

 

de fosfolípidos (y fosfatidilcolina) pero una concentración de tocoferoles mucho más elevada. 
Estos  resultados  sugieren  que  la  lecitina  es  otra  materia  prima  lipídica  con  excelentes 
propiedades  que  también  podría  ser  utilizada  en muchos  ámbitos  alimentarios,  sobre  todo 
aquellos  en  los  que  no  sea  necesario  o  imprescindible  un  elevado  grado  de  pureza  en 
fosfolípidos.  Presenta  la  ventaja  de  poseer  un  presumible  elevado  poder  antioxidante, 
importante  propiedad  en muestras  poliinsaturadas  susceptibles  de  sufrir  oxidación  lipídica 
(como es el caso), y de no necesitar ningún tratamiento, pudiendo ser empleada sin demoras.   

Si se considera la posible utilización, tanto para fines alimentarios como cosméticos o dietéticos, 
de  la fosfatidilcolina extraída en comparación con  las comerciales, ésta es notablemente más 
económica y de un elevado grado de pureza, pudiendo ser realmente competitiva. 

9.1.4. Extractos bioactivos 

Se obtuvieron diferentes extractos bioactivos procedentes de diversas  fuentes naturales: un 
hidrolizado peptídico de  colágeno  (HC) procedente de piel  y  túnicas del manto del  calamar 
gigante  (Dosidicus  gigas),  una  fracción  peptídica  <1  kDa  (FP1)  procedente  de  langostino 
(Penaeus notialis), un extracto polifenólico (PG) de piel y albedo del fruto de la granada (Punica 
granatum), un extracto polifenólico (HM) de  las partes aéreas (tallos y hojas) de  la planta de 
hinojo marino (Crithmum maritimum) y un extracto lipídico rico en astaxantina (GC) procedente 
de residuos (cutículas, cefalotórax, parápodos, pleópodos y telson) de langostino (Litopenaeus 
vannamei).  

Todos  los  extractos  bioactivos  fueron  obtenidos  a  partir  de  fuentes  naturales  (animales  o 
vegetales) que normalmente se consideran desechos (pieles y túnicas del manto de calamar, 
piel y albedo de granada o residuos de langostino), están infrautilizadas (el hinojo marino), o no 
tienen  valor  comercial  por  una  conservación  excesivamente  prolongada  (langostinos  de  la 
especie Penaeus notialis conservados  intencionadamente durante 6 años en congelación). De 
este modo, se pretende dar un uso integral a las materias primas intentando aproximarse a la 
filosofía de  residuos  cero, buscando por  tanto un mejor aprovechamiento de  sus diferentes 
partes  que  se  van  fraccionando  durante  el  procesamiento  y  un mayor  rendimiento  de  las 
mismas.  Además,  la  diversa  procedencia  de  éstas,  permite  la  obtención  de  potenciales 
bioactivos de diferente naturaleza: peptídica, polifenólica y caroteno‐lipídica.  

Este potencial bioactivo se obtiene mediante procesos de extracción con solventes orgánicos o 
enzimas, los cuales permiten una mayor concentración de sus compuestos de interés en función 
del solvente y/o enzima utilizado. Así, una mezcla etanol/agua fue empleada para los extractos 
polifenólicos (PG y HM), acetato de etilo para el extracto lipídico (GC) y las enzimas alcalasa y 
tripsina pancreática para los extractos peptídicos (HC y FP1, respectivamente). Destacar que HC 
fue obtenido a partir de la fracción colagenosa soluble en ácido mientras que FP1 a partir de la 
fracción acuosa del langostino entero hidrolizado.  

Caracterización físico‐química 

Ambos hidrolizados peptídicos, HC y FP1, se presentaron en forma de polvo fino blanquecino de 
baja humedad, debido a que se sometieron a un proceso de secado por liofilización similar. Sin 
embargo, dada su distinta procedencia (músculo de langostino y túnica de calamar) presentaron 
un  perfil  aminoacídico  diferente.  Aunque  ambos  extractos  mostraron  el  mismo  orden 
descendente para los cuatro aminoácidos mayoritarios (glicina, ácido glutámico, alanina y ácido 
aspártico) y cantidades similares de  los tres últimos, el extracto de HC destacó por su mayor 
contenido  en  glicina  (253  ‰),  así  como  cantidades  superiores  de  hidroxilisina  (20  ‰)  e 
hidroxiprolina  (44 ‰)  respecto  al  extracto  de  FP1  (185,  2  y  7 ‰,  respectivamente).  Estas 
diferencias  se atribuyen a  la  fuente de  la que proceden, ya que el  colágeno  (HC) es  rico en 
residuos de glicina  (Matilla et al., 2002) y  los aminoácidos de hidroxilisina e hidroxiprolina se 



Discusión integradora 

243 

 

forman  durante  la  síntesis  del  colágeno  (Cruz  et  al.,  2009).  La  cantidad  de  aminoácidos 
hidrofóbicos, expresada como suma de los presentes, fue muy diferente entre ambos extractos, 
siendo del 52 % para FP1 y del 28 % para HC. Este bajo valor en el hidrolizado de colágeno fue 
probablemente consecuencia de su proceso de extracción en ácido acético, pudiendo quedar 
gran parte de aminoácidos hidrofóbicos en la parte no soluble en ácido descartada.  

El perfil de pesos moleculares también fue diferente. Esto, en gran medida, se debe al proceso 
de  filtración: FP1  fue  filtrado previo a  su análisis por una membrana de 1 kDa,  limitando  su 
tamaño máximo a 1000 Da, de ahí que las poblaciones de tamaños encontradas sean de 550 Da 
y 200 Da para una absorbancia a 214 nm, y de 490 Da, 240 Da y 150 Da para una absorbancia de 
280 nm; todas ellas inferiores a 550 Da. Si en esta hidrólisis con la enzima tripsina pancreática 
hubiera algún fragmento por encima de 1 kDa quedaría eliminado por  la membrana utilizada 
para filtrar. Por el contrario, HC no fue sometido a ningún paso previo de filtración, por lo que 
su distribución de tamaños es el que presenta tras el proceso de hidrólisis. En principio es más 
variada y con poblaciones de mayor peso molecular, encontrándose una población minoritaria 
(11 %) con un tamaño comprendido entre 6500‐1355 Da y dos poblaciones mayoritarias con un 
tamaño de 1355‐502 Da (47 %) y <502 Da de (42 %). Por tanto, mientras que el 100 % de  las 
poblaciones de FP1 fueron ≈<500 Da, únicamente el ≈42 % de las poblaciones de HC lo fueron. 
Estos  resultados  indican  que  los  extractos  peptídicos  fueron  diferentes  en  términos  de 
composición de aminoácidos y peso molecular, como consecuencia de la utilización de materias 
primas diferentes (músculo de  langostino y túnica de calamar), un proceso de obtención con 
enzimas también diferentes (alcalasa y tripsina), y un paso de filtrado adicional sólo en uno de 
los hidrolizados.  

En cuanto al aspecto de los extractos polifenólicos deshidratados, el extracto etanólico de piel y 
albedo de granada  (PG) presentó un  color marrón  y una  consistencia  semejante a  la de un 
caramelo duro, mientras que los extractos de hinojo marino (HM) se presentaron en forma de 
polvo  fino de color verde  (HM‐etanólico) y marrón  (HM‐acuoso). La particular  textura de PG 
podría atribuirse a que, a diferencia de los extractos de HM, el extracto de piel de granada es 
una  mezcla  compleja  y  variada  de  compuestos  fenólicos,  como  mostraron  sus  perfiles 
cromatográficos. Estos perfiles reflejaron una variada presencia de polifenoles en PG, siendo su 
composición  en  orden  decreciente:  β‐punicalagina,  ácido  elágico,  α‐punicalagina,  rutina  y 
epigalocatequina.  En  el  espectro  se  observan  otros  picos  de  intensidad  intermedia  no 
identificados con ninguno de  los patrones y estándares más típicos en este tipo de muestras 
(epigalocatequina‐3‐galato,  epigalocatequina  galato,  hiperósido,  quercetina,                 
kaempferol‐3‐O‐glucósido, ácido gálico, ácido cafeico, ácido clorogénico, ácido cumárico, ácido 
ferúlico, ácido siríngico, ácido rosmarínico, vitamina C). La presencia de unos u otros compuestos 
puede atribuirse a muchos factores, que al ser residuos de productos comerciales no pueden 
valorarse, por ejemplo, la época de producción, localidad, clima, etc… Por este motivo no van a 
ser objeto de discusión, pero sí nos parece  importante destacar  las grandes diferencias entre 
éste  y  otros  resultados  de  la  bibliografía,  que  pueden  ser  atribuidos  bien  a  las  diferencias 
intrínsecas de la materia prima y sus condiciones ambientales, así como al proceso de obtención 
del extracto. 

En cambio, los extractos de hinojo fueron bastante más sencillos en cuanto a su composición, 
mostrando el extracto de hinojo etanólico predominancia  (58,48 mg/g) de ácido clorogénico 
(conformado por un enlace éster entre los ácidos hidroxicinámicos cafeico y quínico) y pequeñas 
cantidades de rutina (4,52 mg/g) y ácido rosmarínico (2,81 mg/g); y el extracto acuoso de hinojo 
igualmente ácido clorogénico como compuesto fenólico mayoritario (42,61 mg/g) y pequeñas 
cantidades de vitamina C (1,46 mg/g). Uno de los picos de intensidad intermedia en el extracto 
acuoso  de  hinojo  marino  quedó  sin  identificar  ya  que  no  se  encontró  ningún  patrón  de 
compuesto fenólico a semejante tiempo de retención, a pesar de todos los patrones testados. 
Estos resultados demuestran  la diferente composición de  los extractos vegetales estudiados, 



Discusión integradora 

244 

 

con  compuestos  polifenólicos muy  diferentes  entre  sí  como  consecuencia  de  su  diferente 
materia prima de procedencia.  

El  proceso  de  ultrasonicación  parece mejorar  la  eficacia  de  extracción  de  los  compuestos 
polifenólicos, al menos en el extracto de hinojo marino, obteniéndose una mayor concentración 
del  compuesto  fenólico  mayoritario  (ácido  clorogénico)  que  en  el  resto  de  experimentos 
observados  en  la  bibliografía.  Sin  embargo,  otros  tratamientos,  como  es  el  caso  del 
calentamiento y sonicación durante el proceso de encapsulación, han evidenciado una  ligera 
disminución de dicho  compuesto mayoritario  en  el  extracto,  induciendo  la degradación  y/o 
transformación de los bioactivos. Por tanto, el procedimiento de extracción y procesado de los 
compuestos  bioactivos  son  factores  críticos,  pues  algunos  tratamientos  podrían  alterar  la 
composición del extracto y como consecuencia disminuir su potencial bioactivo.  

Ninguno  de  los  extractos  polifenólicos  se  consideró  citotóxico  como  tal,  ya  que,  salvo  la 
concentración máxima testada (1 mg/mL) en el extracto de piel de granada (PG) que tuvo un 
valor del 74 % de viabilidad celular, ningún extracto a cualquier concentración ensayada mostró 
una  viabilidad  celular  inferior  al  80 %  (Figura  101),  indicativo  de  un  bajo  efecto  citotóxico. 
Además,  la concentración de 1 mg/mL se considera una concentración de extracto bastante 
elevada. El extracto acuoso de hinojo marino, al estar extraído únicamente en agua, fue el que 
presentó una menor citotoxicidad (viabilidad celular >90 %) en comparación con los extraídos 
en etanol (HM‐et y PG). 

 

Figura 101. Citotoxicidad, expresada como porcentaje de viabilidad celular, de los extractos polifenólicos 
(hinojo marino acuoso y etanólico, así como de piel y albedo de granada) a diferentes concentraciones.  

 

El extracto procedente de residuos (cefalotórax, cutículas, parápodos, pleópodos y telson) de 
langostino  (GC)  es  un  extracto  lipídico  (≈80  %  ácidos  grasos)  compuesto  por  una  elevada 
proporción  de  ácidos  grasos  insaturados  (69 %),  rico  en  astaxantina  (carotenoide  típico  de 
crustáceos)  y  otros  componentes  como  colesterol  y  α‐tocoferol  (potente  antioxidante).  Se 
presenta  como  un  líquido  viscoso  de  color  rojo‐anaranjado,  atribuido  a  la  presencia  de 
astaxantina, con  fuerte olor a crustáceo.   Debido a este perfil nutricional puede ser de gran 
interés  como  ingrediente  alimentario  tanto  para  nutrición  animal  como  humana.  En 
alimentación animal, además de  su  interés por el perfil de  lípidos altamente  insaturados,  la 
presencia  de  carotenoides  y  fuerte  coloración  naranja  le  hace  especialmente  idóneo  para 
alimentación de salmónidos y aves de corral entre otros. La adición de carotenoides de síntesis 
en  el  alimento  encarece  considerablemente  éste,  por  lo  que  la  recuperación  de  restos  del 

60

70

80

90

100

110

V
ia
b
ili
d
ad

 c
el
u
la
r 
(%

)

Concentración de extracto (mg/mL)

HM‐ac HM‐et PG

C             0,01             0,1              0,5                1



Discusión integradora 

245 

 

procesamiento con este fin podría ser de especial interés. En alimentación humana manifiesta 
los mismos intereses nutricionales que para el consumo animal, y debido a su composición y su 
coloración puede  tener diversas aplicaciones  como  ingrediente alimentario. No obstante,  su 
composición grasa limita su aplicabilidad en medio acuoso y su estabilidad oxidativa, por lo que 
la encapsulación puede ser una estrategia adecuada para solventar ambas limitaciones.  

Actividades biológicas 

La actividad antioxidante, testada por la técnica de secuestro de radicales libres (ABTS), fue de 
69,13 mg ácido ascórbico/g para la fracción peptídica FP1, notablemente superior a la mostrada 
por el hidrolizado HC (22,36 mg ácido ascórbico/g muestra). Esta mayor actividad antioxidante 
en  la  fracción  peptídica  de  langostino  podría  deberse  a  su  gran  cantidad  de  aminoácidos 
hidrofóbicos, o  al menor  peso molecular de  los péptidos  presentes,  que  sugiere que  en  su 
mayoría  son  dipéptidos.  Además,  la  posible  presencia  de  astaxantina  residual  (carotenoide 
presente en crustáceos) podría contribuir a incrementar dicha actividad antioxidante.   

La actividad anti‐radicalaria del extracto de PG  fue de 360,01 mg ácido ascórbico/g extracto, 
mientras que la de los extractos de hinojo fue de 556,8 y 805,1 mg ácido ascórbico/g extracto, 
para  los extractos acuoso y etanólico,  respectivamente. Estos  resultados  indican que ambos 
extractos  polifenólicos  tuvieron  un  poder  antioxidante  notablemente  más  elevado  que 
cualquiera  de  los  extractos  peptídicos,  atribuido  precisamente  a  su  composición  rica  en 
polifenoles  (Ismail  et  al.,  2012).  Entre  extractos  polifenólicos,  los  de  hinojo  tuvieron  una 
actividad antioxidante superior a los de piel de granada, siendo mayor para el extracto etanólico 
respecto al acuoso como consecuencia de una mayor concentración de compuestos fenólicos, 
consecuencia  de  su  extracción  con  el  solvente  orgánico  etanol.  La mayor  actividad  en  los 
extractos de hinojo respecto al de granada, incluso sin emplear un solvente orgánico (extracto 
acuoso), podría deberse en parte al proceso de sonicación al que se somete el hinojo durante la 
extracción, que permite una extracción más eficiente de los compuestos fenólicos antioxidantes.  

Sin embargo, para  los métodos antioxidantes determinados por el poder reductor del hierro 
(4622,59  µmol  eq  Fe2+/g muestra)  y  el  contenido  de  sustancias  reactivas  al  Folin‐Ciocalteu  
(166,0 mg ácido gálico/g muestra), el extracto de PG mostró una mayor actividad antioxidante 
que el extracto de hinojo (273,6 y 570,8 µmol eq Fe2+/g muestra en poder reductor del hierro; y 
76,0 y 109,0 mg ácido gálico/g muestra en contenido de sustancias reactivas al Folin para  los 
extractos  acuoso  y etanólico,  respectivamente). Estos  resultados demuestran que PG  fue  el 
extracto polifenólico, y el bioactivo en general  (HC presentó 7,11 µmol eq Fe2+/g muestra y  
14,89 mg ácido gálico/g muestra), con mayor capacidad reductora.  

Ninguna de las técnicas antioxidantes estudiadas dio actividad para el extracto de GC, debido a 
su naturaleza hidrofóbica  y  su  consecuente  insolubilidad  en  la  fase  acuosa utilizada para  la 
cuantificación de las actividades. Una de las razones por las que se seleccionó este extracto fue 
precisamente  por  su  naturaleza  fuertemente  lipofílica,  con  el  objetivo  de  comprobar  si  su 
encapsulación en liposomas permite o mejora su solubilidad en agua, resultados que veremos 
más adelante. Sin embargo, el hecho de que no se puedan cuantificar las actividades biológicas 
por estas técnicas no quiere decir que el extracto no posea poder antioxidante. Dicho poder se 
vio  reflejado  con  el  método  de  fotoquimioluminiscencia  en  fase  lipofílica  (capacidad  de 
secuestro del radical superóxido), obteniéndose un valor de 60,89 mg eq Trolox/g muestra. Por 
lo tanto, el extracto de grasa de crustáceo tiene un considerable poder antioxidante, siendo muy 
superior,  por  ejemplo,  al  del  hidrolizado  de  colágeno  (0,38 mg  eq  Trolox/g muestra).  Esta 
importante  actividad  se  debe  a  los  compuestos  antioxidantes minoritarios  presentes  en  el 
extracto de GC, como son  la astaxantina y el α‐tocoferol. También hay que mencionar que el 
extracto  de  HC  es  predominantemente  hidrofílico,  razón  por  la  cual  su  cuantificación  por 



Discusión integradora 

246 

 

fotoquimioluminiscencia (en fase hidrofóbica) fue tan baja. El extracto de PG, con un valor de 
644541,28 mg eq Trolox/g muestra, confirmó su enorme capacidad antioxidante.  

Otros autores han cuantificado la actividad antioxidante de sus muestras predominantemente 
lipofílicas utilizando  solventes  como etanol, metanol o hexano. Tal es el  caso de Sowmya & 
Sachindra  (2012),  con  valores  de  1520 mg  ácido  ascórbico/g muestra  para  un  aislado  de 
astaxantina procedente de residuos de Penaeus indicus, y de Sowmya et al. (2011) con un valor 
de 1150 mg  ácido ascórbico/g muestra para un aislado  carotenoide a partir de  residuos de 
Penaeus monodon;  y, mediante el  contenido de  sustancias  reactivas al  Folin, Guerard et  al. 
(2007) obtuvieron un valor de 0,50‐0,65 mg ácido gálico/g muestra para un hidrolizado rico en 
lípidos a partir de descartes de los langostinos Penaeus braziliensis y Penaeus subtilis. 

La actividad antihipertensiva  se expresó  como porcentaje de  inhibición a una  concentración 
determinada o como valores de IC50 (concentración de muestra necesaria para inhibir el 50 % 
de la actividad de la enzima convertidora de angiotensina). La fracción peptídica de langostino 
(FP1) presentó un valor de IC50 de 74 µg/mL, muy similar a los 85 µg/mL obtenidos por Alemán 
et al. (2013) para una fracción peptídica <1 kDa a partir de colágeno de piel de calamar. Esta 
notable  actividad  antihipertensiva  en  FP1  podría  atribuirse  en  parte  a  la  gran  cantidad  de 
aminoácidos hidrofóbicos presentes en la cadena peptídica y también se asocia con la presencia 
de  péptidos  pequeños,  en  especial  dipéptidos.  Esta  actividad  antihipertensiva  fue 
considerablemente menor que  la obtenida por Alemán  et  al.  (2011a) para  el medicamento 
comercial Enalapril (7,34 µg/mL) por el mismo procedimiento, sin embargo, cabe suponer que 
la fracción peptídica de langostino no tendría los efectos secundarios que tiene el medicamento. 
El hidrolizado de colágeno  (HC), en cambio, presentó un valor de  IC50 de 910 µg/mL,  lo que 
significa que se requiere mayor cantidad de muestra para inhibir el 50 % de la enzima y por tanto 
su  capacidad  antihipertensiva  es menor.  Esta  baja  actividad,  comparada  con  FP1,  se  debe 
probablemente al proceso de extracción en ácido acético del  colágeno del que procede HC, 
hecho que ha dado lugar a un bajo contenido proteico (47 %) y, como consecuencia, a un bajo 
poder antihipertensivo. 

Con  respecto  a  la  actividad  antihipertensiva  del  extracto  de  piel  de  granada  (PG),  a  una 
concentración de 0,8 mg/mL provocó una  reducción del 25 % de  la actividad de  la enzima, 
valores muy por debajo de  los observados para HC (43 %) a  igual concentración. La actividad 
antihipertensiva en el caso de los polifenoles, entre ellos flavanoles y procianidinas, se debe a 
que tienen un efecto inhibitorio sobre la enzima convertidora de angiotensina ya que compiten 
con el sustrato por los sitios activos de la enzima (Actis‐Goretta et al., 2003). Además, el extracto 
PG posee un 3,8 % de proteína, que podría contribuir a  incrementar su actividad. Aun así,  la 
actividad de PG es muy  inferior a  la de  los extractos peptídicos  (FP1 y HC). Por otro  lado, el 
extracto  de  grasa  de  crustáceo  (GC)  no  permitió  la  determinación  de  su  actividad 
antihipertensiva debido nuevamente a su naturaleza lipofílica.  

En  resumen,  aunque  todos  los  extractos  estudiados  pueden  tener  diversas  propiedades 
funcionales,  cabe  destacar  las  actividades  más  características  o  predominantes  para  cada 
extracto.  De  este  modo,  los  extractos  peptídicos  FP1  y  HC  destacan  por  su  capacidad 
antihipertensiva; el extracto de GC por sus propiedades potenciales antioxidantes, así como los 
beneficios nutricionales asociados a su composición rica en ácidos grasos poliinsaturados; y los 
extractos polifenólicos de HM y PG por sus excelentes actividades antioxidantes.  

9.2. Liposomas 

Los liposomas son vesículas esféricas coloidales de tamaño nanométrico conformadas por una 
o más bicapas de fosfolípidos englobando un núcleo acuoso. Esta conformación le aporta una 
naturaleza anfipática, es decir,  la posibilidad de  incorporar en  su  interior  tanto  compuestos 
lipofílicos (en el interior de la bicapa, asociados a las colas hidrocarbonadas hidrofóbicas que la 



Discusión integradora 

247 

 

componen) como compuestos hidrofílicos (en el núcleo acuoso o bien adheridos a la superficie 
externa de  la membrana mediante  su unión  a  las  cabezas polares de  los  fosfolípidos).  Esta 
propiedad junto con su pequeño tamaño y su similitud con las membranas celulares humanas, 
les permite la posibilidad de funcionar como transportadores de cualquier tipo de sustancia al 
interior del organismo, de una manera rápida, eficaz y saludable. Por esta razón, los liposomas 
podrían  llegar  a  ser  empleados  como  un  producto  funcional  de  alto  valor  añadido,  hecho 
facilitado  por  la  actual  Política  Europea  de  Nuevos  Alimentos,  que  reconoce  como  tal  los 
productos basados en micelas y liposomas.  

9.2.1. Dispersiones liposomales vacías 

En un primer trabajo experimental se estudiaron las propiedades físico‐químicas y estructurales 
de liposomas vacíos elaborados a partir de diferentes materias, todas ellas procedentes de una 
fuente  natural  como  es  la  soja,  y  sometidos  a  diferentes  tratamientos  con  el  objetivo  de 
seleccionar  la formulación  liposomal con mejores propiedades, y condiciones más adecuadas 
para la futura incorporación de bioactivos en su interior, a la vez que sea idónea desde el punto 
de visto de su aplicación como alimento.  

Por  ello,  se  diseñaron  dispersiones  liposomales  con  tres  materias  primas  encapsulantes 
diferentes:  lecitina  de  soja  (LS),  fosfatidilcolina  purificada  mediante  dos  lavados  (FC2)  y 
fosfatidilcolina purificada mediante cinco  lavados (FC5). Al mismo tiempo,  las dispersiones se 
sometieron  a  distintos  tratamientos  de  sonicación: método A  (5  ciclos  a  90 %  de  amplitud        
≈120 W) y método B (2 ciclos a 20 % de amplitud ≈30 W). Una última variante fue la adición o 
no  en  la  formulación  del  crioprotector  glicerol  (ng  significa  sin  glicerol). De  este modo,  se 
elaboraron las siguientes dispersiones liposomales frescas en función del material de partida y 
de las condiciones de fabricación: LLS, L2A, L2B, L5A, L5B, L5Ang, con el objetivo de estandarizar 
el proceso de elaboración de liposomas.  

Los liposomas de lecitina de soja (LLS) presentaron el mayor tamaño de partícula de todas las 
dispersiones,  así  como  la  peor  estabilidad  en  refrigeración,  resultados  que  se  confirmaron 
mediante microscopía  electrónica  de  transmisión  por  criofijación,  donde  los  liposomas  LLS 
presentaron vesículas de tamaño superior y mayor heterogeneidad de tamaños y morfología 
respecto a aquellos elaborados  con  fosfatidilcolinas parcialmente purificadas. Este hecho  se 
atribuye a que la composición de lípidos de la lecitina es más heterogénea con mayor contenido 
en tocoferol, colesterol, triglicéridos y ácidos grasos libres, que ocupan espacio e incluso pueden 
romper en parte el orden de la bicapa, siendo probablemente la causa de un tamaño mayor y 
una  mayor  polidispersidad.  Sin  embargo,  el  potencial  Z  indica  que  son  bastante  estables 
manteniéndose en un rango entre ‐44,3 y ‐37,2 mV.  

Analizando  las  características  de  partícula,  así  como  las  propiedades  estructurales  de  las 
dispersiones  liposomales  realizadas  a  partir  de  fosfatidilcolina  parcialmente  purificada 
conteniendo  glicerol,  no  se  observa  una  tendencia  clara  en  función  de  la  materia  prima 
empleada  (con  igual método de  sonicación) ni  en  función de  las  condiciones de  sonicación 
inducidas  (con  la misma materia prima), mostrando todos ellos vesículas más pequeñas y de 
mejor estabilidad que las de LLS. Sin embargo, la combinación de los dos parámetros estudiados, 
en  concreto de  fosfatidilcolina parcialmente purificada de  cinco  lavados  (FC5)  y método de 
sonicación fuerte y prolongado (A), sí que presentó diferencias significativas respecto al resto 
de formulaciones. De este modo, los liposomas con FC5 y sonicación A, es decir, L5A y L5Ang, 
fueron los que presentaron un menor tamaño medio de partícula, con una buena estabilidad de 
membrana  y  una  excelente  estabilidad  en  refrigeración.  La  diferencia  entre  estas  dos 
dispersiones se basa en la presencia de glicerol en L5A y su ausencia en L5Ang, cuyo efecto se 
vio reflejado en las propiedades estructurales de los liposomas. El glicerol, aunque no modifica 
las características de partícula de las vesículas, reemplaza las moléculas de agua de la membrana 
lipídica aumentando la fluidificación de la misma e incrementando el estado de hidratación de 



Discusión integradora 

248 

 

la  membrana.  Este  fenómeno  aumenta  el  espacio  de  separación  entre  las  membranas 
disminuyendo el estrés de ésta y favoreciendo su mejor estabilidad estructural. Además, podría 
favorecer otros movimientos intrínsecos de la propia membrana (Figura 102).  

 

 

 

 

 

 

 

Figura 102. Posibles movimientos de los fosfolípidos dentro de una bicapa lipídica. 
 

En  conclusión,  podemos  afirmar  que  un  solo  factor  no  es  suficiente  para  determinar  las 
propiedades de los liposomas, sin embargo, la combinación de varios de ellos sí lo es. De este 
modo,  los  liposomas elaborados con fosfatidilcolina parcialmente purificada de cinco  lavados 
(FC5), método  de  sonicación  fuerte  y  prolongado  (método A)  y  presencia  de  glicerol  (L5A), 
fueron los que presentaron mejores características de partícula y propiedades físico‐químicas y 
estructurales, siendo elegida L5A como la formulación liposomal más adecuada.   

Esto no significa que el resto de formulaciones liposomales sean defectuosas, sino que no fueron 
las  de  mejores  propiedades  en  función  de  nuestros  requerimientos  para  dispersiones 
liposomales. Todas ellas  tuvieron aceptables propiedades de partícula y  físicas, pudiendo ser 
empleadas como formulaciones alternativas para otras finalidades. Por ejemplo, los liposomas 
de lecitina de soja (LLS) podrían aplicarse cuando el tamaño medio no sea un factor excluyente 
o cuando haga  falta  su aplicación  inmediata. Estos  liposomas  tienen buenas propiedades de 
partícula  y  pueden  ser  utilizados  en  el  acto,  sin  la  necesidad  de  purificar  la materia  prima 
encapsulante. En cambio, si lo que se busca es únicamente un tamaño de vesícula menor, los 
liposomas  con  fosfatidilcolina  de  dos  lavados  y/o  método  de  sonicación  B  podrían  ser 
adecuados, de hecho, las dispersiones liposomales elaboradas con fosfatidilcolina de 2 lavados 
son  relativamente próximas  en propiedades  y pueden presentar  ciertas  ventajas,  como por 
ejemplo su mayor contenido en tocoferol. Finalmente, si lo que se pretende es, como en este 
caso,  la  utilización  de  liposomas  de  pequeño  tamaño  y  además  una  excelente  estabilidad 
estructural habría que remitirse a los liposomas L5A. Por tanto, a partir de este momento, todos 
los liposomas que se elaboren se harán basándose en la formulación L5A.  

9.2.2. Dispersiones liposomales rellenas  

Los  extractos  obtenidos  en  esta Memoria  son  concentrados  de  compuestos  bioactivos  de 
diferente naturaleza con importantes propiedades funcionales que pueden aportar beneficios 
sobre  la salud. Sin embargo, estos compuestos bioactivos quedan muy expuestos y por tanto 
son susceptibles de degradación y/o  interacción con  la matriz del alimento, tanto durante el 
procesado como por los procesos de digestión gastrointestinal, donde las enzimas gástricas y el 
bajo pH pueden degradar dichos bioactivos antes de que puedan ser absorbidos y aprovechados 
por  el  organismo.  Por  esta  razón,  es  conveniente  su  encapsulación  en  vesículas,  como  por 
ejemplo liposomas, las cuales protegen al extracto bioactivo en su interior frente al deterioro y 
la degradación, manteniendo inalterables sus propiedades potenciales. Además, en este caso la 
cápsula, por su perfil rico en lípidos insaturados, constituye un aporte nutricional de interés. 

Flexión Rotación

Difusión lateral 

Flip‐Flop 



Discusión integradora 

249 

 

La  encapsulación  en  liposomas  de  los  extractos  bioactivos  permite  que  se  establezca  un 
beneficio recíproco entre cápsula y bioactivo, pues al incorporar los extractos en liposomas no 
solo conseguimos el beneficio de la cápsula sobre el extracto, que es proteger al mismo de su 
degradación para que sus  funciones potenciales puedan ser aprovechadas por el organismo, 
sino que además se obtiene el beneficio del extracto sobre la cápsula, que es el de interaccionar 
con  ella  pudiendo mejorar  su  estabilidad  y  propiedades  estructurales  o  conformacionales. 
Además, los bioactivos aportan nuevas propiedades funcionales al sistema liposomal adicionales 
a las de la cápsula, permitiendo la obtención de un producto basado en liposomas con un alto 
valor añadido en el sector de la alimentación. 

Todos  los  bioactivos  seleccionados  poseen  notables  propiedades  antioxidantes,  las  cuales 
ejercen en parte su acción sobre  la cápsula, protegiendo así a  los  liposomas de  la oxidación 
lipídica. Este era uno de los inconvenientes planteados al estudiar la composición de las materias 
primas encapsulantes, su posible oxidación derivada de su composición estrictamente lipídica y 
altamente insaturada, siendo las fosfatidilcolinas parcialmente purificadas las más susceptibles 
de oxidación. Este problema se subsana en gran medida si se  incorporan extractos bioactivos 
con elevado poder antioxidante (como los seleccionados) en liposomas de fosfatidilcolina.   

De  este  modo,  se  elaboraron  liposomas  L5A  (FC5,  sonicación  A  y  presencia  de  glicerol) 
incorporando  los  diferentes  extractos  bioactivos  estudiados,  obteniéndose  las  siguientes 
dispersiones liposomales rellenas: L‐FP1 (liposoma con fracción peptídica <1 kDa de langostino), 
L‐HC (liposoma con hidrolizado de colágeno), L‐PG (liposoma con extracto de piel de granada), 
L‐GC  (liposoma con extracto de grasa de crustáceo) y L‐HM  (L‐HM‐acuoso y L‐HM‐etanólico) 
(liposomas con extractos acuoso y etanólico de hinojo marino), de  las que se estudiaron sus 
características de partícula y propiedades físico‐estructurales. Hay que mencionar que todas las 
formulaciones se prepararon de igual modo, con la salvedad de la concentración de bioactivo, 
que fue, con respecto a la fosfatidilcolina, del 4 % en L‐HC, L‐PG y L‐GC; del 10 % en L‐FP1; y del 
8, 16, 32 y 64 % en L‐HM, tanto para el extracto acuoso como para el etanólico, que junto con 
los liposomas vacíos utilizados como control (L‐V) constituyen las 13 formulaciones liposomales 
ensayadas en la presente Memoria. Este estudio integrado nos permitirá, además de comparar 
entre extractos bioactivos en función de su naturaleza y composición, determinar la importancia 
de la concentración de bioactivo en las características y propiedades de los liposomas.  

Las características de partícula  (tamaño medio,  índice de polidispersidad y potencial zeta) de 
todas  las dispersiones  ensayadas  se muestran  en  la  tabla 46.  Las dispersiones  sin bioactivo 
encapsulado (L‐V) mostraron el menor tamaño medio (p≤0,05) de vesículas en comparación con 
cualquiera de las dispersiones rellenas, excepto L‐HM‐ac 8 (p>0,05), es decir L‐HM‐ac relleno al 
8 %. Este menor tamaño en L‐V fue consecuencia de la ausencia de bioactivo en la preparación 
liposomal, el cual puede ocupar espacio tanto en  la bicapa como en el núcleo,  induciendo  la 
expansión de los liposomas y el incremento en el tamaño medio de los mismos (Sebaaly et al., 
2015).  

Entre dispersiones con bioactivos incorporados se observan notables diferencias, oscilando los 
tamaños entre 89,5‐150,0 nm. Para bajas concentraciones de bioactivo (hasta un 16 %) no existe 
una  relación  proporcional  entre  este  parámetro  y  el  tamaño medio de  los  liposomas, pues 
dispersiones con una menor concentración de bioactivo poseen tamaños tanto mayores como 
menores que dispersiones con mayor concentración. Por ejemplo, las dispersiones con HC, PG y 
GC (4 % bioactivo) tienen un tamaño mayor (p≤0,05) que las dispersiones con HM‐et con 8 % de 
bioactivo y con HM‐ac con 16 % de bioactivo. Por tanto, la concentración de bioactivo (hasta un 
16 %) no  es un  factor determinante  en  el diámetro medio de  las  vesículas  liposomales.  En 
cambio, la naturaleza y composición específica de cada extracto bioactivo es la que determina 
su eficacia de encapsulación y su localización en los distintos compartimentos de los liposomas 
y, como consecuencia, un mayor o menor empaquetamiento del bioactivo y tamaño medio. De 



Discusión integradora 

250 

 

este modo, un primer grupo de dispersiones con un tamaño medio menor comprendido entre 
89,5‐99,9 nm fueron las correspondientes a L‐HC, L‐PG y L‐GC (4 %), L‐FP1 (10 %), L‐HM‐ac (8 % 
y 16 %) y L‐HM‐et (8 % y 16 %).  
 

Tabla  46.  Características  de  partícula  (tamaño medio,  índice  de  polidispersidad  y  potencial  zeta)  de 
dispersiones liposomales. El número adyacente a cada liposoma indica su concentración de bioactivo en 
porcentaje (%) respecto a la fosfatidilcolina. Diferentes letras (a, b, c, d, e, f, g, h) en la misma columna 
indican diferencias significativas (p≤0,05) entre liposomas.  

Muestra 
% de 

bioactivo 
Tamaño (nm)  Polidispersidad  

Potencial zeta 
(mV) 

L‐V  ‐   87,4 ± 0,8a   0,240 ± 0,005ab     ‐35,5 ± 1,7cde 

L‐HC   4  102,3 ± 0,8cd     0,247 ± 0,019abc  ‐43,4 ± 0,7b 

L‐PG   4    104,2 ± 0,8d     0,263 ± 0,017bcd     ‐38,2 ± 0,7bcd 

L‐GC   4   102,2 ± 1,6cd     0,246 ± 0,017abc    ‐41,9 ± 2,2bc 

L‐FP1   10     99,9 ± 4,0bc  0,186 ± 0,006a   ‐53,9 ± 2,9a 

L‐HM‐ac   8    89,5 ± 0,9a      0,316 ± 0,025cdef    ‐31,8 ± 1,9de 

L‐HM‐ac   16    97,3 ± 0,9b    0,329 ± 0,039def    ‐32,4 ± 3,7de 

L‐HM‐ac   32  111,2 ± 0,8e  0,345 ± 0,042ef      ‐36,7 ± 6,4bcd 

L‐HM‐ac   64  137,1 ± 0,7g       0,370 ± 0,018f   ‐27,7 ± 2,8e 

L‐HM‐et   8    96,3 ± 1,3b       0,309 ± 0,027bcdef     ‐34,4 ± 1,1cde 

L‐HM‐et   16  106,0 ± 1,3d       0,305 ± 0,017bcdef   ‐33,0 ± 3,2de 

L‐HM‐et   32  127,8 ± 0,2f      0,295 ± 0,018bcde    ‐33,1 ± 3,2de 

L‐HM‐et   64   150,1 ± 2,0h     0,324 ± 0,044def    ‐30,1 ± 2,1de 

 

Por otro lado, concentraciones de bioactivo iguales o superiores al 32 % son determinantes en 
el tamaño medio de las vesículas, estableciendo una proporcionalidad directa (Figura 103).  

 

Figura  103.  Relación  entre  la  concentración  de  bioactivo  (%)  y  el  tamaño  (nm)  de  las  dispersiones 
liposomales rellenas.  

0

10

20

30

40

50

60

70

0

20

40

60

80

100

120

140

160

C
o
n
ce
n
tr
ac
ió
n
 (
%
)

Ta
m
añ
o
 (
m
m
)

Tamaño Concentración



Discusión integradora 

251 

 

Así, las dispersiones de hinojo marino (L‐HM) con 32 % de bioactivo tuvieron un tamaño menor 
(p≤0,05) que las dispersiones con 64 % de bioactivo, tanto para los liposomas acuosos como para 
los etanólicos. Estos resultados indican que una concentración de bioactivo ≥32 % es suficiente 
cantidad para  influir en el tamaño medio de  las dispersiones  liposomales. Además, el tipo de 
extracto  bioactivo  sigue  siendo  importante  en  el  tamaño,  pues  aquellas  dispersiones  con 
extractos etanólicos presentaron un tamaño mayor (p≤0,05) que las dispersiones con extractos 
acuosos, a igual concentración de bioactivo. 

El  índice de polidispersidad sí parece tener relación directa con  la concentración de bioactivo 
(Figura 104), dado que todas las dispersiones con hinojo marino (L‐HM) tuvieron un mayor valor 
(0,295‐0,370)  que  las  dispersiones  con  otros  compuestos  bioactivos  (0,186‐0,263), 
probablemente debido a sus mayores concentraciones de bioactivo. Sin embargo, la excepción 
fue L‐FP1 que presentó un significativo (p≤0,05) menor índice de polidispersidad que el resto de 
dispersiones, incluida la dispersión sin extracto (L‐V) correspondiente. Otro aspecto a resaltar es 
que una concentración del 4 % de bioactivo no afecta (p>0,05) al valor de polidispersidad con 
respecto  a  las  dispersiones  sin  extracto.  Hay  que  destacar  que  todas  las  preparaciones 
mostraron una distribución de tamaños predominantemente monomodal.  

 

Figura  104.  Relación  entre  la  concentración  de  bioactivo  (%)  y  el  índice  de  polidispersidad  de  las 
dispersiones liposomales rellenas.  

 

El potencial zeta, que refleja el potencial y estabilidad de la membrana lipídica, depende también 
tanto del tipo de extracto encapsulado como de su concentración en los liposomas. Por un lado, 
influye  la concentración de bioactivo, dado que  las dispersiones con 4 % de bioactivo  (L‐HC,          
L‐PG y L‐GC) presentaron un potencial zeta más electronegativo que las dispersiones de hinojo 
con 8, 16 y 32 % de bioactivo (sin diferencias entre ellos), y éstas a su vez más electronegativo 
que  las dispersiones de hinojo con 64 % de bioactivo. Estos  resultados  sugieren que cuanto 
mayor es  la concentración de bioactivo menos electronegativo es el potencial de membrana, 
posiblemente  como  consecuencia  de  la  interacción  de  la  fracción  hidrofílica  del  extracto 
localizado en  la  superficie de membrana  con  la misma. Esta parte del  extracto es  capaz de 
contrarrestar  la  carga  negativa  de  la membrana,  siendo  el  cambio más  acusado  a mayor 
concentración de bioactivo. Por otro  lado, también  influye el tipo de extracto, puesto que  las 
dispersiones vacías (L‐V) presentan un potencial  intermedio y  las dispersiones con  la fracción 
peptídica de  langostino  (L‐FP1) mostraron el potencial más electronegativo  con un 10 % de 
bioactivo, sugiriendo que la composición del bioactivo también tiene influencia en el potencial 
zeta.  

0

10

20

30

40

50

60

70

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

C
o
n
ce
n
tr
ac
ió
n
 (
%
)

P
o
lid
is
p
er
si
d
ad

Polidispersidad Concentración



Discusión integradora 

252 

 

Estos resultados  indican que  la presencia del bioactivo, así como su concentración creciente, 
pueden  afectar  a  la  estabilidad  de membrana  de  los  liposomas  como  consecuencia  de  su 
localización  e  interferencia  con  la  bicapa  lipídica,  razón  por  la  que  disminuye  su 
electronegatividad y con ello su estabilidad. Sin embargo, todos  los valores obtenidos fueron 
inferiores a  ‐30 mV (a excepción de L‐HM‐ac 64, con un potencial de  ‐27,7 mV), valor que se 
define como límite de estabilidad para dispersiones liposomales. Por tanto, podemos garantizar 
que todas las dispersiones ensayadas fueron muy estables. El análisis multivariante de todos los 
parámetros estudiados hasta el momento (concentración, tamaño, polidispersidad y potencial 
zeta) en las dispersiones rellenas determinó que únicamente existe una correlación significativa, 
positiva, entre concentración y tamaño (0,92), de modo que a mayor concentración de bioactivo 
mayor será el tamaño de los liposomas.  

Todas  las dispersiones  liposomales analizadas por microscopía electrónica de transmisión, ya 
sea por el método convencional (L‐FP1) o por criofijación (L‐V, L‐HC, L‐PG y L‐GC), mostraron 
predominancia de  vesículas unilamelares pequeñas de morfología  esférica  y distribución de 
tamaños homogénea, acorde a los resultados de tamaños medios e índices de polidispersidad 
observados  por  dispersión  dinámica  de  luz,  sin  diferencias  aparentes  entre  las  diversas 
dispersiones liposomales. En algunas dispersiones se aprecian algunas estructuras bivesiculares 
o fenómenos de invaginación (Figura 105).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 105. Microscopía electrónica de  transmisión de dispersiones  liposomales  vacías  y  rellenas  con 
extractos bioactivos. A) Dispersión con grasa de crustáceo (L‐GC). B) Dispersión vacía (L‐V). C) Dispersión 
con fracción peptídica <1 kDa de langostino (L‐FP1).  
 

Las dispersiones con la fracción peptídica de langostino (L‐FP1; C) reflejaron parte del material 
peptídico fuera de las vesículas, interaccionando con las cabezas polares de los fosfolípidos de 

CB 

A 

500 nm 500 nm 

500 nm 



Discusión integradora 

253 

 

membrana y formando una red proteica. Este material peptídico podría corresponder a parte 
de extracto no encapsulado (47,6 % la fracción no encapsulada) o bien a extracto adosado a la 
superficie  externa  de  la  membrana,  cuyas  moléculas  asoman  al  exterior  de  las  vesículas 
permitiendo la formación de esta red. 

La  eficacia de  encapsulación determina  cuantitativamente  la  cantidad de  extracto bioactivo 
encapsulada en los liposomas, ya sea en el núcleo acuoso, en la bicapa lipídica o adheridos a la 
superficie externa de la membrana de las vesículas, cuya localización dependerá de la naturaleza 
y composición del extracto bioactivo. De tal forma, los compuestos hidrofóbicos se situarán en 
la bicapa lipídica asociados a las colas hidrocarbonadas hidrofóbicas de los fosfolípidos que la 
componen, mientras que los compuestos hidrofílicos se localizarán en el núcleo acuoso o bien 
adheridos a la superficie externa de la bicapa, hacia la que se encuentran orientadas las cabezas 
polares  hidrófilas  de  los  fosfolípidos.  Igualmente,  la  eficacia  de  encapsulación  depende  de 
diversos  factores  y  condiciones,  aunque  el  factor  determinante  en  este  caso  parece  ser  la 
composición del extracto bioactivo.  

Los liposomas conteniendo el hidrolizado de colágeno (L‐HC) presentaron una elevada eficacia 
de encapsulación del 82,9 % (Tabla 47), valor muy superior al 52,4 % (p≤0,05) obtenido para los 
liposomas  encapsulando  la  fracción  peptídica  <1  kDa  (L‐FP1),  a  pesar  de  constituir  ambos 
extractos peptídicos. Esta gran diferencia se atribuye principalmente a la diferente composición 
de los bioactivos y a la cantidad de extracto adicionada inicialmente en el proceso de elaboración 
de  los  liposomas,  pues mientras HC  se  añadió  a  una  concentración  del  4 %  (respecto  a  la 
fosfatidilcolina) permitiendo una excelente capacidad de encapsulación, FP1 se adicionó al 10 % 
(también respecto a la fosfatidilcolina), dificultando así la encapsulación, debido probablemente 
a que quizá suponga un exceso de extracto incorporado. Además, las dispersiones liposomales 
conteniendo el hidrolizado de colágeno sin glicerol mostraron una eficacia del 80,0 %, reflejando 
que la presencia de glicerol no influye en la tasa de encapsulación del bioactivo.  
 

Tabla 47. Eficacia de encapsulación de las dispersiones liposomales. El número adyacente a cada liposoma 
indica su concentración de bioactivo en porcentaje (%) respecto a la fosfatidilcolina. Diferentes letras (a, 
b, c) indican diferencias significativas (p≤0,05) entre dispersiones liposomales.   

Muestra 
% de 

bioactivo

Eficacia de 
encapsulación 

(%) 

L‐HC   4  82,9 ± 0,1c 

L‐PG   4  54,1 ± 1,3a  

L‐GC   4  81,0 ± 0,1c 

L‐HM‐ac  64  67,0 ± 1,5b 

L‐FP1   10  52,4 ± 2,4a 

 

Por otro  lado,  los  liposomas  con piel de  granada  (L‐PG)  también mostraron una eficacia de 
encapsulación  relativamente  baja  (54,1  %),  en  este  caso  debido  a  la  propia  naturaleza 
polifenólica del extracto, donde la compleja y variada mezcla de polifenoles detectados dificulta 
su  correcta encapsulación  (concentración de extracto del 4 %). Estos  resultados podrían  ser 
confirmados por la mayor eficacia de encapsulación (p≤0,05) de los liposomas con hinojo marino 
(67,0 %) respecto a los de piel de granada, donde un extracto polifenólico de composición no 
tan  compleja  se  encapsula  más  eficientemente  en  liposomas.  Sin  embargo,  la  mayor 
encapsulación  en  L‐HM  frente  a  L‐PG  también  podría  deberse  a  la  gran  diferencia  de 
concentración de bioactivo entre ambas dispersiones (4 % en L‐PG respecto a 64 % en L‐HM).  



Discusión integradora 

254 

 

En  cambio,  los  liposomas  con  grasa  de  crustáceo  (L‐GC),  también  al  4 %  de  concentración, 
presentaron una eficacia del 81,0 % (similar a L‐HC, p>0,05), atribuida al fuerte carácter lipofílico 
del extracto, lo que facilita su unión a la bicapa lipídica. Estos resultados indican que la eficacia 
de encapsulación de  las dispersiones  liposomales depende claramente del extracto bioactivo 
encapsulado y podría depender en parte de la concentración, en especial cuando ésta es elevada 
(aunque harían  falta más estudios para confirmarlo), pero no de  la presencia o ausencia de 
glicerol.  El  análisis  multivariante  de  los  parámetros  anteriores,  incluyendo  la  eficacia  de 
encapsulación de  las dispersiones rellenas, demostró que  tanto  tamaño como potencial zeta 
están  inversamente  correlacionados  con  la  eficacia  de  encapsulación,  con  coeficientes  de 
correlación de ‐0,72 y ‐0,86, respectivamente. De este modo, a mayor tamaño y potencial más 
electronegativo, menor será la eficacia de encapsulación. 

En función de  los resultados obtenidos, se seleccionaron tres dispersiones  liposomales (L‐HC,    
L‐PG y L‐GC), junto con las dispersiones control vacías (L‐V), para el estudio de su estabilidad en 
el tiempo conservados durante 2 semanas en refrigeración (4 °C). Todas las muestras reflejaron 
una excelente estabilidad de partícula durante  las dos semanas de conservación, sin cambios 
significativos  (p>0,05)  en  el  tamaño medio  ni  en  el  índice  de  polidispersidad,  y  con  ligeras 
modificaciones en el potencial zeta, únicamente para las dispersiones L‐HC y L‐GC, que al igual 
que el resto de dispersiones mantuvieron su potencial de membrana más electronegativo de       
‐30 mV, confirmando una alta estabilidad.   

Como  hemos  visto,  factores  como  la  composición‐naturaleza  del  extracto  bioactivo  y  la 
concentración  adicionada  del  mismo  para  su  elaboración  son  determinantes  en  las 
características de partícula y propiedades  físico‐estructurales de  las dispersiones  liposomales 
rellenas. Independientemente de dichos factores, todas las dispersiones estudiadas presentaron 
excelentes  características de  vesícula,  con una eficacia de encapsulación  relativamente alta, 
morfología  adecuada,  diámetro  medio  y  distribución  de  tamaños  aceptables,  elevada 
estabilidad de membrana, así como una excelente estabilidad en el  tiempo de  los  liposomas 
conservados  en  refrigeración.  Por  tanto,  estas  dispersiones  rellenas  tendrían  propiedades 
idóneas para ser utilizadas como productos o ingredientes alimentarios.  

9.3. Estabilización de liposomas 

Las dispersiones liposomales frescas fueron estables en el tiempo durante al menos 2 semanas, 
tal y como se ha demostrado, pudiendo llegar incluso a serlo durante aproximadamente un mes, 
según la bibliografía. Sin embargo, tiempos más prolongados de conservación podrían inducir 
efectos negativos  sobre  las dispersiones,  tales  como  fusión,  agregación o  sedimentación de 
vesículas, así como la liberación parcial o total de los bioactivos encapsulados. Por ello, existen 
diferentes estrategias tecnológicas para mejorar  la estabilidad de  los  liposomas, permitiendo 
alargar su vida útil.  

9.3.1. Liposomas vacíos 

Altas presiones 

Los  tratamientos  de  altas  presiones  hidrostáticas,  también  conocidos  como  pascalización  o 
presurización, son una tecnología de gran interés en la industria de los alimentos, especialmente 
utilizada para la conservación de los mismos, ya que a grandes rasgos merece la pena destacar 
que elimina gran parte de los microorganismos, incluso virus, sin alterar los micronutrientes, por 
lo que los compuestos bioactivos pueden permanecer sin alterar. Esta tecnología se basa en una 
pasteurización en frío, es decir, someter al alimento, previamente envasado en un recipiente 
hermético, flexible y resistente al agua, a un alto nivel de presión hidrostática e isostática.   



Discusión integradora 

255 

 

Los liposomas sometidos a un tratamiento de alta presión hidrostática (600 MPa a 20 °C durante 
20 minutos) no mostraron diferencias (p>0,05) en  las propiedades de partícula respecto a  los 
liposomas sin tratar (frescos), con un tamaño medio de ≈141 nm, un índice de polidispersidad 
≈0,23  y  un  potencial  de membrana  ≈‐45 mV.  Las  imágenes  de microscopía  electrónica  de 
transmisión por criofijación confirmaron  los resultados obtenidos por dispersión dinámica de 
luz,  presentando  ambas  dispersiones  una  distribución  de  tamaños  homogénea  similar  con 
vesículas  de  morfología  esférica  (Figura  62;  capítulo  3).  Igualmente,  ambas  preparaciones 
presentaron el mismo contenido en agua e idéntica capacidad de dispersabilidad en agua. Estos 
resultados  sugieren  que  los  liposomas  podrían  ser  estabilizados  desde  un  punto  de  visto 
microbiológico con un tratamiento de alta presión hidrostática, sin modificar las características 
de partícula o propiedades físicas de los liposomas.  

Congelación 

El tratamiento de congelación es otro de los métodos más empleados para la estabilización de 
vesículas.  Los  liposomas  se  congelaron  a  ‐20  °C  durante  24  horas  y  posteriormente  se 
descongelaron  a  temperatura  ambiente,  procediendo  a  caracterizar  las  propiedades  de 
partícula. En estas preparaciones se hace necesaria la inclusión de un compuesto crioprotector 
en  la  formulación  liposomal  que  proteja  a  los  liposomas  de  los  posibles  efectos  adversos 
inducidos por el propio proceso de congelación, como podrían ser fusión y agregación de  las 
vesículas o la formación de cristales hielo, con la consecuente expansión de los liposomas y daño 
en  las membranas  lipídicas.  En  este  caso,  como  crioprotector  se  incorporó  el  glicerol,  un 
polialcohol reconocido por mejorar la estabilidad de las vesículas mediante su protección frente 
al proceso de congelación, entre otros beneficios.  

Tal y como se preveía, los liposomas congelados‐descongelados sin glicerol mostraron daño en 
su estructura liposomal, reflejado por un importante incremento del tamaño medio (258,9 %) y 
del índice de polidispersidad (142,2 %) (p≤0,05) respecto al liposoma control (F), así como una 
disminución  del  potencial  electronegativo  (11,6  %),  lo  que  demuestra  que  el  proceso  de 
congelación  induce  una  expansión  excesiva  de  las  vesículas,  dando  lugar  a  una  población 
heterogénea de tamaños (pasando a tener una distribución bimodal), y disminuye la estabilidad 
de las mismas, sin afectar al contenido en agua ni a la capacidad de dispersabilidad en agua. Por 
otro  lado,  los  liposomas  congelados‐descongelados  con glicerol presentaron propiedades de 
partícula parecidas  (tamaño medio, polidispersidad y potencial zeta) a  las observadas en  los 
liposomas control sin tratamiento, lo que confirma la acción crioprotectora del glicerol sobre los 
liposomas y la importancia de su inclusión cuando éstos son sometidos a congelación. Park & 
Huang (1992) demostraron el efecto crioprotector ejercido por glicolípidos sintéticos sobre  la 
membrana  de  liposomas  cuando  éstos  fueron  sometidos  a  un  tratamiento  de  congelación, 
reflejando  la  capacidad  de  estabilización  de  liposomas  congelados  por  parte  de  los  lípidos 
sintéticos.  El  hecho  de  trabajar  con  un  material  constituido  por  lípidos  insaturados  (no 
sintéticos) de diversos tipos de cadena origina que los liposomas sean más heterogéneos y por 
tanto más laxos y flexibles (Hoogevest & Wendel, 2014).  

Mientas que la presencia de glicerol no modificó el contenido en agua de los liposomas, sí que 
disminuyó  ligeramente (7 %)  la dispersabilidad en agua de  los mismos. Esta reducción podría 
deberse a la elevada densidad del glicerol (1,26 g/cm3).  

Posteriormente,  se  desarrolló  otra  formulación  sometida  a  congelación‐descongelación 
incorporando el  lioprotector trealosa, disacárido formado por  la unión de dos glucosas y más 
reconocido por su protección frente a los daños ocasionados por la liofilización que frente a los 
de  la  congelación.  Estos  liposomas mantuvieron  estable  el  potencial  de membrana  de  las 
vesículas, aunque aumentaron su tamaño medio (55,5 %) y el índice de polidispersidad (23,1 %) 
con  respecto  a  los  liposomas  frescos  sin  tratamiento,  demostrando  que  no  son  el mejor 



Discusión integradora 

256 

 

compuesto  para  actuar  como  crioprotector  de  liposomas.  Sin  embargo,  bien  es  cierto  que 
presentaron  mejores  propiedades  de  partícula  que  aquellos  liposomas  congelados‐
descongelados sin crioprotector, lo que sugiere que ejerce algún tipo de efecto de protección. 
No mostraron diferencias significativas (p>0,05) en el contenido en agua y dispersabilidad en 
agua con los frescos. Por tanto, si los liposomas van a ser sometidos a congelación y después 
descongelados, mejor utilizar glicerol y, en su defecto, trealosa.  

Liofilización 

Uno de los métodos de estabilización de dispersiones liposomales posiblemente más utilizados 
es el secado por liofilización. Este tratamiento consiste en someter a los liposomas, previamente 
congelados  (en el presente trabajo se sometieron a  ‐80 °C durante al menos 24 horas), a un 
proceso de  secado a  temperaturas de congelación  (a presión  reducida de 100 mtorr) con el 
objetivo de eliminar el agua contenida en la dispersión liposomal por sublimación, con el fin de 
mejorar su estabilidad y preservación en el tiempo, con el consecuente incremento de vida útil 
(Stark et al., 2010). La temperatura de congelación fue tan baja (‐80 °C) para asegurar que no se 
produjera el colapso de la muestra por transiciones de fase inadecuadas durante el secado. Esto 
es debido a que la fosfatidilcolina empleada en la preparación de los liposomas era parcialmente 
purificada  a  partir  de  la  lecitina  de  soja,  y  por  tanto,  con  alto  contenido  en  ácidos  grasos 
insaturados, que, a diferencia de los fosfolípidos sintéticos, tienden a reducir de forma drástica 
las  temperaturas  de  transición  de  fase.  Esto  se  evidencia  en  los  resultados  de  Calorimetría 
Diferencial  de  Barrido  (Figura  45;  capítulo  2).  Estos  resultados  reflejan  la  temperatura  de 
transición media de los liposomas en torno a los 0 °C, en contraposición a liposomas preparados 
con fosfatidilcolina sintética, donde esta temperatura ronda los 41 °C (Biltonen & Lichtenberg, 
1993).  La  temperatura  de  transición media  obtenida  en  los  liposomas  es  la  habitual  para 
liposomas elaborados a partir de ácidos grasos insaturados, pudiendo incluso ser inferior a los 0 
°C (Hoogevest & Wendel, 2014). 

Frente a los ya mencionados problemas que puede inducir el proceso de congelación y también 
la posterior  liofilización sobre  las propiedades de  los  liposomas,  la adición en  la  formulación 
liposomal  de  compuestos  crioprotectores  y  lioprotectores  es  necesaria.  Según  Stark  et  al. 
(2010), el glicerol evita o reduce los daños en los liposomas ocasionados por la liofilización, así 
como por el proceso previo a ella. El glicerol es una molécula que forma parte de las cabezas 
polares de los propios fosfolípidos de la membrana, por lo que es presumible que la mayor parte 
del glicerol añadido en los liposomas se sitúe adherido a estas cabezas polares, aumentando así 
el espacio entre dos cabezas polares adyacentes (Figura 106).  

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 106. Mecanismo de acción del glicerol en las bicapas lipídicas. 

Región 
hidrofílica 

Región 
hidrofóbica 

Región 
hidrofílica 

Glicerol Fosfato Ácidos 



Discusión integradora 

257 

 

Acorde a Chen et al. (2010),  la trealosa es un  lioprotector que protege frente a  la  liofilización 
mediante sus efectos de reemplazamiento de agua y vitrificación. Stark et al. (2010) defiende 
que este disacárido actúa como estabilizador de  la membrana al preservar el espacio  lateral 
entre  las cabezas polares de  los fosfolípidos, evitando que éste se reduzca y amplificando  las 
fuerzas de Van der Waals entre las cadenas acilo (Figura 107). Además, también son capaces de 
formar una matriz vítrea amorfa alrededor de la bicapa.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura  107.  Mecanismo  de  acción  de  la  trealosa  en  las  bicapas  lipídicas,  tras  liofilización  y  tras 
rehidratación.  

 

Para su correcta comparación con las dispersiones frescas, los liposomas desecados deben ser 
rehidratados, con el  fin de que vuelvan a adquirir su conformación  liposomal. Los  liposomas 
liofilizados sin glicerol mostraron un tamaño e  índice de polidispersidad notablemente mayor 
(p≤0,05) que los liposomas control frescos (incremento del 28,1 % y del 47,6 % para el tamaño 
y  la  polidispersidad,  respectivamente),  manteniendo  estable  el  potencial  de  membrana 
(p>0,05), resultados que reflejan que la ausencia de glicerol hace a los liposomas susceptibles 
de  sufrir  modificaciones.  La  adición  de  glicerol  como  crioprotector  y  de  trealosa  como 
lioprotector en la formulación liofilizada tornó el potencial de membrana más electronegativo, 
aumentando ligeramente la estabilidad (solo siendo significativo el cambio para los liposomas 
con glicerol, 10,5 %), e incrementó el tamaño medio de partícula (94,3 % para LF‐G y 48,6 % para 
LF‐T) y  la polidispersidad  (70,2 % para LF‐G y 34,7 % para LF‐T) con respecto a  los  liposomas 
frescos, e  incluso en comparación con  los  liposomas  liofilizados sin crio‐ ni  lioprotector. Este 
incremento fue más acentuado en ambos parámetros para  los  liposomas con glicerol (45,7 % 
para el tamaño y 35,5 % para la polidispersidad). Estos resultados indicarían por un lado que el 
glicerol no es el crioprotector más adecuado si los liposomas se someten a liofilización. Por otro 
lado, la trealosa, aunque no consigue mantener las propiedades de vesícula intactas, protege a 
los liposomas de manera eficiente impidiendo en gran medida su expansión. Aunque hay que 
recordar que  los  liposomas sin ningún protector añadido son susceptibles de un aumento del 
tamaño de partícula mucho mayor que en presencia de ellos.   

Acorde a  los  resultados obtenidos por dispersión dinámica de  luz podríamos pensar que es 
preferible no añadir crioprotectores ni  lioprotectores  si  los  liposomas van a  ser  sometidos a 
liofilización,  dado  que  ambos  aumentan  su  tamaño  y  heterogeneidad  de  los mismos.  Sin 
embargo,  tanto  glicerol  como  trealosa  tienen  la  capacidad  de mejorar  la  estabilidad  de  las 
vesículas y proteger a las membranas lipídicas, siendo el glicerol el más recomendado en este 
caso, por las razones que se exponen a continuación.  

Hidratada 

Con daño 

Sin daño

LIOFILIZACIÓN REHIDRATACIÓN 



Discusión integradora 

258 

 

El glicerol reemplaza al agua en su interacción con la membrana y esto provoca la modificación 
de  las  cabezas  polares  de  los  fosfolípidos  que  adoptan  una  conformación más  estable  con 
respecto a los liposomas que no incorporan glicerol (Figura 108).  

 

 

 

 

 

 

Figura 108. Reemplazamiento del agua en la bicapa lipídica por parte del glicerol. 

 

Además, la posible interferencia de este compuesto con las cadenas hidrocarbonadas altamente 
insaturadas  induce  un  cambio  estructural  del  interior  de  la  bicapa  lipídica,  aumentando  la 
movilidad de las mismas y produciendo un efecto de fluidificación, que es capaz de mejorar el 
ordenamiento y estructura de la membrana, favoreciendo su estabilidad física. 

Que la adición de un crioprotector como es el glicerol pueda mejorar la organización interna de 
la membrana de  los  liposomas podría no entenderse si estuviéramos tratando con  liposomas 
elaborados a partir de fosfolípidos sintéticos, pues éstos son capaces de formar vesículas muy 
estables  con  un  ordenamiento  muy  definido,  donde  cualquier  sustancia  adicional  que  se 
incorpore provocaría una modificación de  la membrana. Esto es debido al elevado grado de 
pureza  de  los  fosfolípidos,  que  además  presentan  cadenas  hidrocarbonadas  totalmente 
simétricas, de  igual  longitud, de ácidos grasos saturados, enlaces trans y otras características 
que permiten la fabricación de bicapas lipídicas con un ordenamiento simétrico y prácticamente 
perfecto y sin huecos. Kato et al. (2015) demostraron que los liposomas elaborados a partir de 
fosfolípidos  sintéticos  (dimiristoilfosfatidilcolina  con  cadenas  hidrocarbonadas  uniformes)  se 
transforman más fácilmente (modificaciones morfológicas de sus membranas liposomales) ante 
la  adición  de  cualquier  sustancia  que  aquellos  preparados  con  fosfolípidos  naturales  (no 
sintéticos), como consecuencia de la estructura y organización característica.  

En cambio, los fosfolípidos no sintéticos o parcialmente purificados obtenidos a partir de lecitina 
de  soja  dan  lugar  a  liposomas  con membranas  lipídicas  imperfectas,  donde  las  impurezas, 
insaturaciones, enlaces cis o cadenas hidrocarbonadas asimétricas (elementos típicos de estos 
fosfolípidos)  inducen  un  ordenamiento  de membrana  diferente  y  no  tan  perfecto.  Esto  no 
significa que no  sean  estables,  sino  simplemente  que  tienen  características diferentes.  Esta 
imperfección es  la que provoca que dependiendo de  la sustancia que añadamos,  los efectos 
sean beneficiosos o perjudiciales. En este trabajo,  la adición de glicerol como crioprotector a 
esta membrana  lipídica heterogénea y “desorganizada” provoca un nuevo ordenamiento que 
mejora su estructura y estabilidad.   

La presencia de glicerol confirma la reducción de la capacidad de dispersabilidad en agua de los 
liposomas que  lo  incorporan, en comparación con aquellos que no  lo  incluyen e  incluso con 
aquellos  liposomas que  incorporan trealosa, donde  la dispersabilidad es prácticamente total. 
Aunque hay  que  recordar que  todos  los  liposomas,  incluidos  los  liofilizados  con  glicerol,  se 
resuspendieron rápida y eficientemente en agua, sin embargo, mostraron un precipitado mayor 
tras ser centrifugados y forzados a precipitar.  

Otra  diferencia  destacable  es  el  contenido  en  agua  residual  de  estos  liposomas  desecados, 
derivado  de  su  consistencia  física. Mientras  las  preparaciones  con  trealosa mostraron  una 

Agua Glicerol 



Discusión integradora 

259 

 

apariencia  típica  de  un  polvo  fino  blanquecino  (contenido  en  agua  del  1,53  %),  las  que 
incorporan glicerol se presentan como una pasta pegajosa de color marrón‐ocre (contenido en 
agua  del  14,87 %).  Este  elevado  contenido  en  agua  es  el  que  le  aporta  dicha  consistencia 
untuosa,  atribuida  a  la  presencia  de  glicerol  y más  concretamente  a  su  elevada  densidad         
(1,26 g/cm3), dado que  los  liposomas sin protector  también presentaron apariencia de polvo 
fino con un contenido en agua del 4,78 %. Estas texturas tan diferentes permiten la aplicación 
de una u otra formulación liposomal en función de cuales sean los requerimientos y del objetivo 
final que se pretenda, siendo todas las formulaciones estudiadas adecuadas para su aplicación 
en el ámbito de la alimentación.  

Atomización 

Otro método  de  estabilización  de  vesículas  por  secado  es  la  atomización,  proceso  que  no 
requiere la congelación previa de la muestra, pero que puede someterla a un pequeño estrés 
térmico. Las dispersiones  liposomales  se  someten a este  tratamiento en estado  líquido y  se 
obtiene directamente un producto seco. La  técnica se basa en el secado de  las dispersiones 
mediante  aspiración  con  aire  seco  y  caliente.  Posee  algunas  ventajas,  así  como  algún 
inconveniente.  Entre  las  ventajas  destaca  que  es  un  proceso mucho más  eficiente  a  nivel 
energético y, por tanto, más económico, y  la rapidez tanto de utilización (no requiere ningún 
procesado previo) como de aplicación (el proceso de atomización es relativamente rápido y se 
pueden atomizar varios litros en unas pocas horas). Entre los inconvenientes mencionar que los 
rendimientos son más bajos que en la liofilización, es decir, hace falta mucha cantidad líquida 
de dispersión para obtener una  cantidad  considerable de producto  seco, y  también que  los 
liposomas podrían ser susceptibles del daño en sus membranas por oxidación, dado que se eleva 
bastante la temperatura de la preparación liposomal.  

Los  liposomas  atomizados  tuvieron  un  tamaño  y  polidispersidad  semejante  a  los  liposomas 
liofilizados  sin protector  añadido,  siendo por  tanto  superior  a  los  liposomas  frescos  control   
(25,9 % para el tamaño y 74,7 % para la polidispersidad) pero inferior a los liposomas con glicerol 
y con trealosa. Estos resultados reflejan que el proceso de secado (liofilización y atomización) es 
uno de  los  factores que  aumentan el  tamaño de  las  vesículas,  siendo el otro el  compuesto 
protector añadido. Teóricamente, dado que  los  liposomas atomizados no  son  congelados ni 
liofilizados, no son susceptibles de sufrir modificaciones internas que afecten a la estabilidad de 
sus membranas, al menos por estos  tratamientos, aunque no hay que olvidar que sufren un 
choque de calor (170 °C), si bien es puntual. Esto podría sugerir que los liposomas atomizados 
mantienen un tamaño relativamente cercano a los liposomas control (como los liofilizados) pero 
manteniendo  una mejor  estructura  y  organización  de membrana  que  éstos.  Como  era  de 
esperar, estos liposomas presentaron una dispersabilidad en agua completa debido a la ausencia 
de glicerol. Sin embargo, mostraron un elevado contenido en agua residual (19,20 %), atribuido 
al  rápido  proceso  de  secado.  Al  igual  que  con  las  formulaciones  liofilizadas  anteriores,  los 
liposomas atomizados ofrecen una serie de posibles aplicaciones alternativas en función de su 
contenido en agua y consistencia física.  

En resumen, existen diferentes estrategias de estabilización de liposomas, algunas de ellas no 
modifican las propiedades de partícula de las vesículas como son las altas presiones hidrostáticas 
y la congelación‐descongelación (cuando se incorpora glicerol) y otras sí lo hacen, como son la 
liofilización y la atomización, aunque tienen otros beneficios, como por ejemplo su facilidad de 
almacenamiento, manejo y transporte. Además,  la versatilidad de unas y otras preparaciones 
permite un abanico de posibilidades a la hora de su aplicación en el diseño de productos. Por 
tanto, todas las formulaciones podrían ser empleadas en función del estado de hidratación de 
la muestra y del tamaño medio de sus vesículas, dependiendo de cuál sea el objetivo buscado.  



Discusión integradora 

260 

 

Entre todos los ensayados, los liposomas liofilizados con el crioprotector glicerol fueron los que 
consideramos más  interesantes debido a que, a pesar de tener un  tamaño superior al resto, 
presentaron  propiedades  de  partícula  muy  aceptables  con  una  excelente  estabilidad  de 
membrana, cuya estructura interna está mejor organizada. Además, su particular textura ofrece 
una  amplia  gama  de  posibles  aplicaciones,  como  son  su  incorporación  en  otras  matrices 
alimentarias tipo músculos de pescado o películas comestibles, donde su consistencia liofilizada 
y la presencia de glicerol permiten la obtención de una matriz nueva con diferentes y variadas 
propiedades estructurales y potenciales. Esta habilidad les permite funcionar como ingredientes 
alimentarios de alto valor añadido para la reformulación de productos y alimentos. Por tanto, 
las próximas dispersiones  liposomales  rellenas  con  los diferentes  extractos bioactivos  serán 
sometidas  al  proceso  de  secado  por  liofilización  para  mejorar  su  estabilidad,  previa 
incorporación de glicerol en el proceso de elaboración.  

9.3.2. Liposomas rellenos 

 Liofilización 

Las dispersiones liposomales conteniendo extractos bioactivos fueron adicionadas con glicerol 
como crioprotector y posteriormente liofilizadas, obteniéndose así diferentes liofilizados: L‐HC, 
L‐PG, L‐GC, L‐HM‐acuoso y L‐HM‐etanólico. La liofilización fue el único método de estabilización 
de  vesículas  estudiado  en  este  caso.  Dada  la  consistencia  y  apariencia  de  los  liposomas 
liofilizados, éstos también se nombrarán como pastas o pastas liofilizadas.  

Tras el proceso de liofilización, todos los liposomas incrementaron (p≤0,05) su tamaño medio 
(262,2 % para L‐V; 264,9 % para L‐GC; 76,1‐168,7 % para el resto de liposomas) y su índice de 
polidispersidad (2,2‐65,9 %; con la excepción de L‐HM‐ac 32 que disminuyó un 3,7 %) (Tabla 48).  
 

Tabla  48.  Características  de  partícula  (tamaño medio,  índice  de  polidispersidad  y  potencial  zeta)  de 
liposomas  liofilizados. El número adyacente a  cada  liposoma  indica  su  concentración de bioactivo en 
porcentaje (%) respecto a la fosfatidilcolina. Diferentes letras (a, b, c, d, e, f) en la misma columna indican 
diferencias significativas (p≤0,05) entre liposomas. 

 Muestra 
% 

bioactivo 
Tamaño (nm)  Polidispersidad  Potencial zeta (mV) 

L‐V  0  316,6 ± 6,7e  0,374 ± 0,081a  ‐54,2 ± 1,5b 

L‐HC   4  274,9 ± 5,5d  0,334 ± 0,033a  ‐54,9 ± 0,7b 

L‐PG   4  256,8 ± 2,3c  0,279 ± 0,021a    ‐57,2 ± 0,5ab 

L‐GC   4    372,9 ± 15,9f  0,408 ± 0,112a  ‐59,1 ± 2,2a 

L‐HM‐ac   8  171,1 ± 1,6a  0,341 ± 0,004a    ‐46,1 ± 1,1cd 

L‐HM‐ac   16  249,4 ± 4,0c  0,430 ± 0,010a  ‐44,6 ± 1,3d 

L‐HM‐ac   32  230,2 ± 1,0b  0,332 ± 0,046a  ‐40,0 ± 1,3e 

L‐HM‐ac   64  311,4 ± 4,4e  0,378 ± 0,025a  ‐34,2 ± 0,9f 

L‐HM‐et   8  225,4 ± 1,8b  0,388 ± 0,067a    ‐47,3 ± 1,2cd 

L‐HM‐et   16  219,3 ± 6,1b  0,371 ± 0,046a  ‐48,2 ± 1,1c 

L‐HM‐et   32  225,1 ± 4,5b  0,364 ± 0,039a  ‐40,3 ± 2,3e 

L‐HM‐et   64  216,4 ± 2,1b  0,377 ± 0,010a  ‐37,5 ± 0,5e 

 

Estas variaciones podrían ser debidas a fenómenos de fusión o agregación ocasionados por la 
eliminación del agua en  la muestra  (Chen et al., 2010) y a  la hinchazón de  la bicapa  tras  la 



Discusión integradora 

261 

 

rehidratación, lo que provoca la rotura de puentes de hidrógeno entre las moléculas de agua y 
las  cabezas polares de  los  fosfolípidos  (Stark et al., 2010). Del mismo modo,  se  incrementó 
(p≤0,05) el potencial electronegativo de membrana de todos los  liposomas tras la liofilización   
(9 % para L‐HM‐ac 32 y 21,8‐52,7 % para el resto de liposomas), mejorando así la estabilidad de 
todas las preparaciones liposomales resuspendidas.  

El tamaño medio y el perfil de distribución de tamaños de los liposomas liofilizados dependieron 
únicamente del tipo de bioactivo encapsulado, dado que el índice de polidispersidad no mostró 
diferencias (p>0,05) entre liposomas, conservando todos una distribución predominantemente 
monomodal, y que algunos liposomas de menor concentración de bioactivo tuvieron un mayor 
tamaño  medio.  Entre  todos  ellos,  los  liposomas  de  hinojo  con  extracto  acuoso  al  8  %                         
(L‐HM‐ac 8)  fueron  los más pequeños con un  tamaño de 171,1 nm,  lo que coincide con una 
fracción hidrofílica presumiblemente situada en el  interior del  liposoma y con polifenoles de 
tamaño no muy grande, ya que, como se apreció en el perfil cromatográfico, predominaba  la 
presencia de ácido clorogénico y vitamina C de manera destacada. Por otro lado, los liposomas 
liofilizados de grasa de crustáceo (L‐GC) fueron los más grandes, con un tamaño de 379,9 nm, 
coincidiendo con su mayor valor de índice de polidispersidad (0,408). El mayor tamaño de L‐GC 
podría  atribuirse  a  la  naturaleza  lipofílica  del  extracto  y  a  la  presencia  de  vesículas 
multilamelares  en  estos  liposomas  tras  ser  liofilizados.  Probablemente  la  interacción  y 
localización  preferente  de  la  grasa  de  crustáceo  en  el  interior  de  la  bicapa  incremente  la 
superficie de la membrana y por tanto el tamaño promedio del liposoma. Además, debido a la 
heterogeneidad de la composición, probablemente sea más flexible la membrana y de lugar o 
facilite  un  mayor  número  de  invaginaciones  favoreciendo  la  formación  de  vesículas 
multilamelares. 

Si nos fijamos en los liposomas rellenos con extracto acuoso de hinojo marino, se aprecia una 
tendencia creciente en el tamaño a mayor concentración de bioactivo. Estos resultados sugieren 
que la concentración del extracto bioactivo en liposomas liofilizados solo influye si comparamos 
entre preparaciones con el mismo extracto. Sin embargo, esta tendencia no fue observada para 
los  liposomas  rellenos  con  el  extracto  etanólico del hinojo marino,  volviendo  a  ser  clave  la 
naturaleza y composición del bioactivo. Así, por ejemplo, se observó que en el extracto etanólico 
la concentración de ácido clorogénico era mayor que en el acuoso, además de la presencia de 
vitamina C en el acuoso y de rutina y ácido rosmarínico en el etanólico. Por tanto, los liposomas 
poseerán diferentes propiedades en función de  la capacidad de empaquetamiento de unos y 
otros compuestos en el interior del liposoma, así como del carácter hidrofóbico de cada uno de 
ellos.  

En  realidad,  el  tamaño medio  de  las  vesículas  no  depende  únicamente  de  la  naturaleza  y 
composición del extracto bioactivo y/o de  la concentración del mismo en  los  liposomas, pues 
intervienen multitud de factores. Entre ellos caben destacar tanto los debidos a la naturaleza y 
composición de la materia prima, como los debidos al procesado (condiciones de elaboración, 
clase de crioprotector, las proporciones entre cada componente), condiciones conservación, de 
congelación  (Arshinova  et  al.,  2012),  así  como  las  condiciones  de  liofilización 
(Rasoulianboroujeni et al., 2017), etc. Para hacer una idea, citemos por ejemplo la sonicación. El 
tamaño final de los liposomas varía en función de las condiciones de ésta, hasta tal punto que 
incluso  la  cantidad de dispersión o  la  colocación de  la probeta de  sonicación  influyen en el 
tamaño  final  de  los  liposomas.  Eso  sí,  a  idénticas  condiciones  y  composición  los  liposomas 
deberían ser prácticamente iguales.  

El potencial zeta de los liposomas liofilizados (Tabla 48), al igual que sucede en las dispersiones, 
sigue  una  proporcionalidad  en  función  de  la  concentración  de  bioactivo,  donde  menores 
concentraciones dan  lugar a potenciales más electronegativos, mostrando nuevamente todos 
los liposomas un excelente potencial y estabilidad de membrana. De este modo, los liposomas 



Discusión integradora 

262 

 

sin extracto (L‐V) y los rellenos de HC, PG y GC fueron los más electronegativos, seguidos de los 
liposomas de hinojo en orden creciente de cantidad de bioactivo. Al igual que con los parámetros 
de tamaño y polidispersidad, no solo la presencia y el tipo de extracto bioactivo determinan la 
carga de superficie de membrana, sino que también influyen otros factores como la composición 
del  material  encapsulante  o  la  posible  presencia  de  protectores  externos.  El  análisis 
multivariante de  los parámetros  estudiados hasta  el momento  (concentración de  bioactivo, 
tamaño, polidispersidad y potencial zeta) de los liposomas liofilizados rellenos determinó que 
existe una correlación positiva entre la concentración y el potencial zeta (0,85), de manera que 
a  mayor  concentración  de  bioactivo,  menos  electronegativo  será  el  potencial  zeta.  Estos 
resultados coinciden con los de las dispersiones liposomales.  

Cuando las dispersiones se liofilizaron (L‐V, L‐HC, L‐PG y L‐GC), las vesículas incrementaron su 
tamaño  así  como  la  heterogeneidad  de  los  mismos,  observándose  mediante  microscopía 
electrónica de transmisión por criofijación dos poblaciones diferenciadas de distinto tamaño, 
acorde a los resultados obtenidos en dispersión dinámica de luz. Se aprecia un mayor número 
de fenómenos de invaginación y estructuras bi‐ y multivesiculares, así como vesículas bi‐, tri‐ e 
incluso multilamelares (como en L‐GC, lo que explica su mayor tamaño medio y polidispersidad), 
como consecuencia del proceso de liofilización (Figura 43; capítulo 2). Es importante destacar 
que  los  liposomas  mantienen  su  estructura  coloidal  de  vesículas  tras  ser  liofilizados  y 
posteriormente rehidratados, permitiendo la protección del bioactivo. 

La eficacia de encapsulación de  los  liposomas  liofilizados aumentó  ligeramente en  todas  las 
muestras respecto a su eficacia como dispersiones (Tabla 49), obteniéndose valores del 87,3 % 
para L‐HC, del 97,2 % para L‐GC y del 63,2 % para L‐PG, con la excepción de L‐HM‐ac, donde la 
eficacia se mantuvo estable  (p>0,05). Este  incremento podría deberse bien a que existe una 
mínima liberación de bioactivo por parte de los liposomas contenidos en las dispersiones, o bien 
a  que  en  el  momento  de  liofilización  la  dispersión  sufre  un  proceso  de  compactación  y 
agregación como consecuencia de la pérdida de agua, proceso que podría provocar que parte 
del bioactivo no encapsulado quede adherido a la superficie externa de los liposomas, pasando 
a formar parte del bioactivo encapsulado. Este incremento fue más acusado en el liposoma con 
grasa de crustáceo, hasta una encapsulación casi completa.  
 

Tabla 49. Eficacia de encapsulación de los liposomas liofilizados. El número adyacente a cada liposoma 
indica su concentración de bioactivo en porcentaje (%) respecto a la fosfatidilcolina. Diferentes letras (a, 
b, c, d) indican diferencias significativas (p≤0,05) entre liposomas liofilizados.  

Muestra 
% 

bioactivo

Eficacia de 
encapsulación 

(%) 

L‐HC   4  87,3 ± 2,0c 

L‐PG   4  63,2 ± 3,9b 

L‐GC   4  97,2 ± 0,1d 

L‐HM‐ac   64  65,6 ± 3,4b 

L‐HM‐et   64  49,1 ± 0,5a 

 

En las preparaciones liofilizadas las eficacias de encapsulación de los liposomas conteniendo el 
extracto peptídico y el extracto lipídico fueron muy elevadas con valores superiores al 87 %. Sin 
embargo, los liposomas con extractos polifenólicos, dada su naturaleza, poseen eficacias mucho 
menores, con valores del 63,2 % para L‐PG, 65,6 % para L‐HM‐ac 64 y 49,1 % para L‐HM‐et 64. 
Como vemos, la eficacia de encapsulación en liposomas liofilizados parece depender del tipo de 
extracto  bioactivo  (diferencias  significativas  p≤0,05  de  L‐HC  y  L‐GC  respecto  a  L‐PG,  y  de                  



Discusión integradora 

263 

 

L‐HM‐ac  respecto  a  L‐HM‐et)  y  no  tanto  de  la  concentración,  pues  los  tres  liposomas  con 
extracto polifenólico mantuvieron  resultados  relativamente  similares  (sin diferencias p>0,05 
entre  L‐PG  y  L‐HM‐ac),  a  pesar  de  las  grandes  diferencias  de  concentración  de  bioactivo 
encapsuladas (4 % respecto a 64 %).  

En cuanto al contenido en agua residual de los liposomas liofilizados (Tabla 50), se reduce un 
73,2‐79,9  %  con  respecto  al  de  las  dispersiones  (≈90  %),  consiguiendo  una  desecación 
considerable como método de estabilización. Los  resultados no dependieron de ningún otro 
parámetro estudiado en los liposomas, como son el tamaño de partícula, la concentración de 
bioactivo o el tipo de extracto encapsulado, siendo las diferencias probablemente atribuidas al 
proceso de liofilización que, aunque siempre se llevó a cabo en las mismas condiciones (tiempo 
y temperatura de congelación, recipiente y cantidad de congelación y liofilización, parámetros 
de la liofilización, etc.), podría estar variando (siendo más o menos eficiente en la eliminación 
del agua residual) en cada lote de liposomas (14,8‐38,1 %). Hay que mencionar que se observa 
una tendencia al incremento del contenido en agua residual en los liposomas rellenos respecto 
a los vacíos, únicamente siendo inferior en los liposomas L‐HM‐ac 32 en comparación con los 
vacíos (18,5 %), posiblemente debido a que la presencia del bioactivo interacciona con el agua 
y  dificulta  parcialmente  la  eliminación  de  ésta  de  la muestra  por  su  interferencia  con  las 
membranas lipídicas. Entre los liposomas con bioactivos, L‐HM‐ac 32 presentó el menor valor 
(14,8 %) y L‐HM‐ac 8 el mayor (38,1 %).  Estos datos son algo elevados para tratarse de muestras 
que han  sido  secadas por  liofilización,  los  cuales  se atribuyen a  la gran higroscopicidad que 
manifiesta el glicerol presente en la formulación, tal y como ya se vio para los liposomas vacíos 
liofilizados, pudiendo verse favorecida a su vez por las propiedades del extracto incorporado. 

 

Tabla 50. Contenido en agua (%) y dispersabilidad en agua (%) de  los  liposomas  liofilizados. El número 
adyacente  a  cada  liposoma  indica  su  concentración  de  bioactivo  en  porcentaje  (%)  respecto  a  la 
fosfatidilcolina. Diferentes letras (a, b, c, d, e, f, g) en la misma columna indican diferencias significativas 
(p≤0,05) entre liposomas. 

 Muestra 
% 

bioactivo
Contenido en 
agua (%) 

Dispersabilidad 
en agua (%) 

L‐V  ‐    18,5 ± 2,2ab   73,6 ± 2,6b 

L‐HC   4    21,3 ± 1,1bc    76,5 ± 0,4bc 

L‐PG   4    24,4 ± 2,6cd      80,9 ± 1,7cde 

L‐GC   4    24,9 ± 4,6cd   65,2 ± 1,3a 

L‐HM‐ac   8  38,1 ± 0,6f    86,4 ± 6,8ef 

L‐HM‐ac   16  30,5 ± 1,4e   91,6 ± 1,4f 

L‐HM‐ac   32  14,8 ± 1,9a     82,4 ± 2,7de 

L‐HM‐ac   64    20,9 ± 1,2bc      81,4 ± 4,7cde 

L‐HM‐et   8    27,0 ± 0,8de     79,9 ± 2,5cd 

L‐HM‐et   16  37,4 ± 2,5f   88,2 ± 1,8f 

L‐HM‐et   32     22,8 ± 1,2bcd    82,5 ± 1,2de 

L‐HM‐et   64  31,1 ± 2,6e  100,0 ± 0,0g 
 

La  dispersabilidad  en  agua  de  los  liposomas  rellenos  liofilizados  (Tabla  50)  disminuyó 
ligeramente en comparación con la de las dispersiones. Esta capacidad no está relacionada con 
el  tamaño  de  partícula  ni  con  el  contenido  en  agua  residual  de  la muestra.  Los  resultados 



Discusión integradora 

264 

 

parecen indicar que podría depender tanto de la naturaleza del extracto bioactivo como de la 
concentración del mismo. Todos los liposomas de hinojo marino, independientemente del tipo 
de extracto (acuoso o etanólico) y de su concentración, mostraron una mejor dispersabilidad 
que los liposomas rellenos con el resto de bioactivos. Los liposomas de hinojo presentan mayor 
concentración de bioactivo que  los demás, por  lo  tanto,  cabría  suponer que  liposomas  con 
concentraciones de bioactivo superiores al 4 %  tienden a presentar una mejor capacidad de 
dispersión  en  agua.  Sin  embargo,  no  se  encontró  una  proporcionalidad  directa  con 
concentraciones  crecientes  (8, 16, 32  y 64 %) de bioactivo en  los  liposomas de hinojo para 
ninguno de sus extractos, siendo L‐HM‐et 64 el de mayor capacidad (100,0 %).  

Por  otro  lado,  la  naturaleza  del  extracto  también  tiene  influencia  en  este  parámetro.  Por 
ejemplo,  el  extracto de  grasa de  crustáceo  (GC)  es un bioactivo de naturaleza  fuertemente 
lipofílica (como demostró su caracterización), lo que dificulta su solubilidad en agua y la menor 
capacidad de dispersión en agua de  los  liposomas que  lo  incorporan  (L‐GC), presentando el 
menor valor (65,2 %). Sin embargo, tampoco se observa una relación clara entre extractos de 
hinojo  a  igual  concentración,  por  lo  que,  probablemente,  la  dispersabilidad  en  agua  de  los 
liposomas  esté  influenciada  parcialmente  por  la  combinación  del  tipo  de  bioactivo  y  su 
concentración, pudiendo influir otros aspectos. La importancia del extracto es corroborada dado 
que todos los liposomas rellenos de bioactivos mostraron una capacidad de dispersión mayor 
que la de los liposomas vacíos (L‐V), indicando que el bioactivo favorece su dispersión en agua. 
En  términos  generales  todos mostraron  una  buena  dispersabilidad  en  agua,  lo  que  podría 
reflejar su buena disponibilidad para ser transportadores eficientes de compuestos bioactivos al 
interior del organismo (Li et al., 2017). 

El  color  de  las  dispersiones  liposomales  (Figura  109)  fue  diferente  en  función  del  extracto 
bioactivo  incorporado,  indicando  que  es  el  extracto,  fundamentalmente  la  fracción  no 
encapsulada, el que determina el color final de las preparaciones liposomales. Así, los liposomas 
con hidrolizado de colágeno tuvieron un color amarillento, los liposomas de piel de granada un 
color marrón oscuro,  los  liposomas de grasa de crustáceo un color rojo‐anaranjado, mientras 
que los liposomas de hinojo marino un color verdoso, tanto los que contienen extracto acuoso 
como etanólico.  

 

Figura 109. Aspecto visual de  las dispersiones  liposomales rellenas con extractos bioactivos.  Izquierda:     
L‐HC; Centro: L‐PG; Derecha: L‐GC.  

 

Cuando  los  liposomas  se  liofilizaron  (Figura  110)  éstos mantuvieron  el  color original de  sus 
extractos.  

 

Figura 110. Aspecto visual de los liposomas liofilizados rellenos con extractos bioactivos. Izquierda: L‐HC; 
Centro: L‐PG; Derecha: L‐GC. 



Discusión integradora 

265 

 

Por tanto, el color es un parámetro que depende fuertemente del tipo de extracto encapsulado, 
ya  que  las  diferentes  concentraciones  de  bioactivo  en  los  liposomas  de  hinojo marino  no 
reflejaron  ninguna  relación  con  ninguno  de  los  parámetros  de  color  estudiados.  Hay  que 
mencionar que el proceso de liofilización mantiene el color original de la dispersión, pero tiende 
a oscurecer las pastas liofilizadas resultantes, es decir aumenta la cromaticidad. De este modo, 
los  liposomas  liofilizados  se mantuvieron en un estrecho  rango de  valores de  cromaticidad, 
destacando L‐HC con la mayor saturación y L‐HM‐ac 32 con la menor. Respecto a la tonalidad, 
los valores fueron muy similares debido a este fenómeno de oscurecimiento, con la excepción 
de L‐GC (39,25) que presentó un valor muy diferente al resto de formulaciones, atribuido a su 
marcado color naranja.  

Los  liposomas  liofilizados, a diferencia de  las dispersiones  liposomales, presentan una única 
transición de  fase  (Tabla 51),  relacionada no con  la  fusión del agua, sino con  la estructura y 
estabilidad de las membranas lipídicas de los liposomas, lo que origina que dicha transición sea 
muy difusa como consecuencia de su bajo contenido en agua. El valor de  la  temperatura de 
transición para  los  liposomas  vacíos  (L‐V)  fue  la media de  los  valores obtenidos  en  los dos 
trabajos experimentales (8.2. y 8.3.; capítulo 2). Este valor (2,19 °C) fue intermedio entre el resto 
de formulaciones con bioactivos.  

 

Tabla 51. Temperatura  (°C) asociada a  la  transición de  fase observada por Calorimetría Diferencial de 
Barrido de  los  liposomas  liofilizados. El número adyacente a cada  liposoma  indica su concentración de 
bioactivo  en  porcentaje  (%)  respecto  a  la  fosfatidilcolina.  Diferentes  letras  (a,  b,  c,  d,  e,  f)  indican 
diferencias significativas (p≤0,05) entre liposomas.  
 

Muestra  
% 

bioactivo 
Temperatura (°C) 

L‐V  ‐      2,19 ± 0,72ab 

L‐HC   4      2,04 ± 0,00ab 

L‐PG   4      1,76 ± 0,47ab 

L‐GC   4  11,05 ± 0,93f 

L‐HM‐ac   8    0,97 ± 0,01a 

L‐HM‐ac   16    1,47 ± 0,18a 

L‐HM‐ac   32     2,95 ± 0,16bc 

L‐HM‐ac   64     4,44 ± 0,57de 

L‐HM‐et   8     2,11 ± 0,10ab 

L‐HM‐et   16     2,01 ± 0,01ab 

L‐HM‐et   32     3,59 ± 0,53cd 

L‐HM‐et   64   5,34 ± 0,63e 

 

Nuevamente,  la naturaleza  y  concentración del bioactivo  son  factores determinantes en  las 
propiedades físicas y estructurales de los liposomas liofilizados. Así, cantidades crecientes de un 
mismo extracto bioactivo (L‐HM‐acuoso y L‐HM‐etanólico) muestran una mayor temperatura de 
transición de fase. Del mismo modo, hay extractos que presentan una mayor temperatura que 
otros  a  igual  concentración,  como  son  los  etanólicos  de  hinojo  marino  respecto  a  sus 
correspondientes acuosos. Por  tanto,  los  liposomas  rellenos de extracto etanólico de hinojo 
marino  a  la mayor  concentración  estudiada  (64  %)  presentaron  la mayor  temperatura  de 
transición (5,34 °C), asociada con una mayor rigidez y estabilidad de membrana, en comparación 



Discusión integradora 

266 

 

con el resto de formulaciones liposomales de hinojo (0,97‐4,44 °C). Sin embargo, la importancia 
del  extracto  bioactivo  es  tal  que  los  liposomas  de  grasa  de  crustáceo  (L‐GC),  con  una 
concentración de bioactivo del 4 % (inferior a cualquiera de los liposomas de hinojo), mostraron 
una  temperatura  mucho  más  elevada  (11,05  °C)  que  el  resto  de  formulaciones,  como 
consecuencia de su naturaleza lipofílica y localización preferente entre las cadenas hidrofóbicas 
del interior de la bicapa, lo cual le aporta una mayor estabilidad térmica de membrana.  

En resumen, el proceso de liofilización incrementa el tamaño de los liposomas, pero también su 
eficacia de encapsulación y mejora  la estabilidad de  los mismos, aumentando así su vida útil. 
Nuevamente  los factores de naturaleza del extracto y concentración de bioactivo determinan 
las  propiedades  físico‐estructurales  de  los  liposomas  liofilizados,  presentando  todos  ellos 
adecuadas características de partícula y propiedades estructurales para  ser empleados en  la 
industria como productos o ingredientes alimentarios.  

Conservación en estado congelado 

Al  igual que en el  caso de  las dispersiones  liposomales,  se  seleccionaron  tres preparaciones 
liofilizadas  de  liposomas  rellenos  de  extractos  (L‐HC,  L‐PG  y  L‐GC),  todos  ellos  a  la misma 
concentración (4 %), para estudiar su estabilidad en el tiempo tras ser conservados durante 7 
meses  a  temperaturas  de  congelación  (‐20  °C).  Las  tres  pastas  liofilizadas  estudiadas 
presentaron un  incremento de su dureza y rigidez con el progresivo transcurso de  los meses, 
reflejando  un mayor  grado  de  agregación/compactación  de  su  estructura,  sin  pérdidas  del 
bioactivo  encapsulado,  lo  que  demuestra  en  cierto modo  que  se mantienen  relativamente 
estables en el tiempo almacenados en congelación. Entre ellos, destacan los liposomas de grasa 
de crustáceo (L‐GC) por ser los de mayor estabilidad, la cual se ve incrementada en el tiempo 
debido a la naturaleza lipofílica del extracto, que permite un mejor ordenamiento de membrana. 
En contraste,  los  liposomas de piel y albedo de granada (L‐PG) serían  los de peor estabilidad 
física y estructural, siendo más susceptibles de modificaciones durante su conservación, lo cual 
podría estar  relacionado  con  la menor eficacia de  encapsulación del extracto. En definitiva, 
aunque hay que tener en cuenta las pequeñas modificaciones que pueden sufrir los liposomas 
cuando  son  conservados,  podemos  afirmar  que  estas  formulaciones  liposomales  liofilizadas 
fueron estables a temperaturas de congelación (‐20 °C) durante al menos 7 meses, destacando 
que  los bioactivos  se mantuvieron eficientemente encapsulados durante  todo el proceso de 
conservación. 

Aptitud funcional 

Las pastas  liofilizadas de  liposomas rellenos mostraron un comportamiento reológico estable 
durante  la  conservación  a  largo plazo,  con  ligeras  variaciones en  función de  la naturaleza  y 
composición del bioactivo. Estos  liposomas presentaron una  consistencia  típica de un  fluido 
viscoso concentrado, más que de un material sólido, en parte debido a la presencia de glicerol 
en la formulación, que provocó la fluidificación de las pastas y el  incremento de su estado de 
hidratación.  Estas  propiedades  coinciden  con  el  elevado  contenido  en  agua  observado 
previamente en estas pastas liofilizadas, atribuido igualmente a la presencia del glicerol. Como 
ya se mencionó, esta particularidad, presentándose en forma de pasta untuosa y no como un 
polvo fino de aspecto desecado,  junto con sus particulares propiedades estructurales, ofrece 
diferentes posibilidades de uso y aplicación, ya sea por sí mismos o en combinación con otros 
componentes.  Una  de  ellas  es  la  ser  materiales  adecuados  para  ser  incorporados  como 
ingredientes  funcionales  en  matrices  alimentarias,  este  es  el  caso  de  los  productos 
reestructurados, tanto de carne como de pescado, o películas comestibles a partir de polímeros 
naturales. La peculiar consistencia de  los  liposomas  liofilizados  les podría facilitar su correcta 



Discusión integradora 

267 

 

homogeneización con las matrices, permitiendo además ajustar el contenido en humedad de los 
productos resultantes.  

Los  liposomas  de  este  trabajo  están  elaborados  a  partir  de  fosfatidilcolina  parcialmente 
purificada,  rica  en  ácidos  grasos  insaturados  (tanto mono‐  como  poliinsaturados),  teniendo 
como ácido graso principal y mayoritario el ácido linoleico (≈59 %), un ácido graso insaturado. 
La predominancia de ácidos grasos insaturados en una muestra puede dar lugar a la formación 
de hidroperóxidos y productos de oxidación secundaria (Wang & Wang, 2008), desencadenando 
la oxidación  lipídica y el deterioro de  la muestra por rancidez. Por tanto, nuestros  liposomas 
serían susceptibles de sufrir oxidación  lipídica como consecuencia de su composición rica en 
ácidos grasos insaturados. La conservación de los liposomas liofilizados en congelación bajo las 
condiciones ensayadas (Figura 111) no fue suficiente para prevenir  la oxidación parcial de  los 
liposomas, a pesar de la incorporación de extractos bioactivos con capacidades antioxidantes, y 
quizá  sería  interesante  llevar a  cabo nuevas estrategias en un  futuro a  la hora de elaborar, 
liofilizar y conservar los liposomas, con el fin de reducir aún más los niveles de oxidación, por 
ejemplo mediante su incorporación en otras matrices alimentarias, o recubriendo los liposomas. 
Aun así, hay que mencionar que el grado de oxidación lipídica apreciado en los liposomas fue 
bastante bajo, siendo todos ellos relativamente estables durante al menos 7 meses. 

 

Figura  111.  Efecto  oxidativo,  expresado  como  contenido  acumulativo  del  producto  de  oxidación 
malonaldehído,  de  los  liposomas  vacíos  y  rellenos  liofilizados  recién  preparados  y  conservados  en 
congelación (‐20 °C) durante 7 meses.  

 

Uno de los aspectos clave para que estos liposomas liofilizados puedan actuar como productos 
funcionales es el potencial que pueden mostrar sus propiedades biológicas con beneficios para 
la salud derivadas de los bioactivos encapsulados, o de la propia materia prima que constituye 
el  liposoma. En  los  capítulos  ya  se  vio  reflejado el enorme poder antioxidante de  todos  los 
extractos  bioactivos,  siendo  superior  en  aquellos  de  composición  polifenólica  (PG  y  HM) 
respecto a los lipídicos (GC) y los peptídicos (HC y FP1). Ahora se tratará de mostrar el efecto de 
los bioactivos encapsulados.  

Hay que tener en cuenta que los liposomas son vesículas capaces de englobar y proteger a los 
extractos  bioactivos  en  su  interior.  Por  ello,  los  liposomas  no  deberían mostrar  actividad 
antioxidante, más que  la que pueda aportar  la propia cápsula, dado que  los bioactivos están 
encapsulados y protegidos. Sin embargo, dada  la naturaleza y composición de cada extracto 
bioactivo, hemos  comprobado que éstos  se pueden  localizar en distintos  compartimentos o 
zonas de los liposomas: tanto en el interior de la bicapa lipídica si son hidrofóbicos como en el 

0

30

60

90

0 meses 3 meses 7 meses

µ
g 
m
al
o
n
al
d
eh

íd
o
/g
 m

u
es
tr
a

L‐V L‐HC L‐PG L‐GC



Discusión integradora 

268 

 

núcleo acuoso o adheridos a las cabezas polares de los fosfolípidos que asoman hacia el exterior 
de la membrana si son hidrofílicos (Figura 112). De este modo, existe cierta cantidad de bioactivo 
(la que “asoma" hacia el exterior, bien porque esté adherida a  las cabezas polares externas o 
bien porque se trate de una molécula de gran longitud y doble carácter procedente de la bicapa 
lipídica), que podría interaccionar con los cromóforos de las técnicas utilizadas para determinar 
las actividades y dar medida como actividad antioxidante. Otra parte del bioactivo que podría 
reflejar actividad antioxidante es aquella no encapsulada dentro de los liposomas pero que se 
encuentra libre en la matriz liposomal, entre las vesículas.   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 112. Esquema de la posible localización de los extractos bioactivos en los liposomas en función de 
la  naturaleza  y  composición  de  los  primeros.  A)  Extractos  peptídicos.  B)  Extractos  polifenólicos.  C) 
Extractos lipídicos.  
 

Todos  los  liposomas mostraron actividad antioxidante,  siendo  siempre menor que  la de  sus 
respectivos extractos  libres puros,  lo que confirma que solo se está cuantificando parte de  la 
actividad del extracto; el resto estaría dentro de los liposomas sin interacción con el exterior, 
como cabía esperar ya que se trata de liposomas enteros y rellenos. Por otro lado, la mayoría de 
liposomas  rellenos  mostraron  mayor  actividad  que  los  liposomas  vacíos  (L‐V),  con  las 
excepciones de L‐HC y L‐GC para la técnica de secuestro de radicales libres y L‐HM‐ac 8 para la 
técnica de poder reductor del hierro. Estos resultados indican que la cápsula tiene un mínimo 
poder  antioxidante,  no  atribuible  a  la  actividad  cuantificada  en  los  liposomas  rellenos  de 
bioactivos, confirmando el potencial bioactivo de los extractos.  

A B 

C 



Discusión integradora 

269 

 

La cuantificación por  los métodos de secuestro de radicales  libres (ABTS), poder reductor del 
hierro (FRAP) y contenido de sustancias reactivas al Folin‐Ciocalteu de los liposomas liofilizados 
se muestra en la figura 113.  

 

 

 

Figura 113. Actividad antioxidante de  los  liposomas  liofilizados  rellenos de extractos bioactivos  (L‐HC,         
L‐PG, L‐GC, L‐HM‐ac y L‐HM‐et) mediante las técnicas de A) secuestro de radicales libres (ABTS), B) poder 
reductor del hierro (FRAP) y C) sustancias reactivas al Folin‐Ciocalteu.  

0

100

200

300

400

500

600
m
g 
ác
id
o
 a
sc
ó
rb
ic
o
/g
 m

u
es
tr
a 
se
ca

Concentración de bioactivo (%)

L‐HM‐ac

L‐HM‐et

L‐HC

L‐PG

L‐GC

A

4        8                16               32              64

0

100

200

300

m
g 
eq

.F
e2

+ /
g 
m
u
es
tr
a 
se
ca

Concentración de bioactivo (%)

L‐HM‐ac

L‐HM‐et

L‐HC

L‐PG

L‐GC

B

4         8               16              32              64

0

10

20

30

40

50

60

m
g 
ác
id
o
 g
ál
ic
o
/g
 m

u
es
tr
a 

se
ca

Concentración de bioactivo (%)

L‐HM‐ac

L‐HM‐et

L‐HC

L‐PG

L‐GC

C

4 8               16              32              64



Discusión integradora 

270 

 

Estos resultados demostraron, en términos generales, que la actividad antioxidante depende de 
la concentración de bioactivo, así como de la naturaleza y composición del mismo. Cantidades 
crecientes de un mismo bioactivo implican una mayor actividad, de tal modo que los liposomas 
de  hinojo  marino,  tanto  acuoso  como  etanólicos,  con  64  %  de  bioactivo  fueron  los  que 
presentaron mayor actividad. Por otro lado, el tipo de extracto también influye de manera que 
todos  los  liposomas  con  extractos  etanólicos  de  hinojo  tuvieron mayor  actividad  que  sus 
respectivos liposomas con extractos acuosos, a la misma concentración de bioactivo. 

Si estos liposomas de hinojo los comparamos con liposomas incorporando otros bioactivos, el 
poder antioxidante dependerá de ambos parámetros. Además, la técnica en cuestión también 
es determinante, ya que en  función del bioactivo cuantificará una mayor o menor actividad 
dependiendo de  las  interferencias de  los extractos con  los cromóforos de  la técnica. De este 
modo, mientras los liposomas L‐HC, L‐PG y L‐GC mostraron menor actividad que los de hinojo 
por secuestro de radicales libres, también tuvieron una mayor actividad que los de hinojo por 
poder reductor del hierro, a pesar de poseer una menor concentración de bioactivo.  

En definitiva, podríamos decir que  los  liposomas  L‐HC  y  L‐GC poseen una notable  actividad 
antioxidante, siendo muy similar entre ambos liposomas a pesar de su diferente naturaleza. La 
actividad de L‐HC se atribuye principalmente a su contenido en aminoácidos hidrofóbicos, así 
como a la relativa elevada cantidad de prolina, mientras que en L‐GC se atribuye principalmente 
a  la astaxantina y al  tocoferol presentes en el extracto.  La actividad de estos  liposomas  fue 
inferior a la de los liposomas de hinojo, donde la actividad se incrementa progresivamente con 
la concentración de bioactivo, siendo superior en  los  liposomas con el extracto etanólico. En 
cuanto  a  los  liposomas  de  piel  de  granada  (L‐PG),  mostraron  una  excelente  actividad 
antioxidante (ABTS, FRAP y Folin), siendo incluso superior a la de los liposomas de hinojo con     
8  %  de  bioactivo  (ambas  actividades  atribuidas  al  diferente  contenido  polifenólico).  Estos 
resultados  indican  que,  aunque  los  liposomas  de  mayor  actividad  cuantificada  fueron                        
L‐HM‐et 64,  los  liposomas L‐PG tuvieron una mayor actividad potencial que  los  liposomas de 
hinojo y, probablemente, liposomas encapsulando concentraciones superiores de PG serían los 
más antioxidantes, atribuido a la enorme capacidad antioxidante del extracto de piel y albedo 
de granada.  

El  análisis multivariante  de  la mayoría  de  parámetros  estudiados  (concentración,  tamaño, 
polidispersidad, potencial zeta, humedad, dispersabilidad, temperatura de transición y actividad 
antioxidante por métodos ABTS, FRAP y Folin) en los liposomas liofilizados rellenos reflejó varios 
aspectos interesantes. El análisis discriminante (Figura 114) agrupa los liposomas en función de 
sus  características  comunes,  reflejando  por  ejemplo  diferencias  entre  aquellos  con  4 %  de 
bioactivo  (L‐HC,  L‐PG  y  L‐GC)  respecto  a  los  de  mayor  concentración  (L‐HM),  así  como 
distinciones entre los de mayor y menor concentración de hinojo. Además, dado que el análisis 
establece que el 100 % de los casos fueron agrupados y clasificados correctamente, se podría 
decir que incluso los liposomas considerados dentro de un mismo grupo (muy próximos) tienen 
propiedades  características  distinguibles  del  resto,  determinando  que  cada  formulación  sea 
única y no reemplazable.  

 

 

 

 

 

 



Discusión integradora 

271 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 114. Análisis multivariante (discriminante) de los liposomas liofilizados rellenos. 

 

El análisis factorial (Figura 115; tabla 52) determina la relación e importancia de cada uno de los 
parámetros estudiados.  

 

Tabla 52. Matriz de componente rotado del análisis multivariante factorial de los liposomas liofilizados 
rellenos.  
 

 

Componentes 

1  

(48,25 %) 

2  

(24,64 %) 

ABTS  0,986  ‐0,072 

FOLIN  0,976  0,039 

CONCENTRACIÓN  0,964  0,126 

FRAP  0,850  0,182 

POTENCIALZ  0,836  ‐0,218 

TAMAÑO  ‐0,181  0,918 

Tª TRANSICIÓN  0,123  0,870 

DISPERSABILIDAD  0,643  ‐0,679 

HUMEDAD  ‐0,042  ‐0,582 

POLIDISPERSIDAD  0,146  0,162 

 

L‐HC 
L‐PG 
L‐GC 
L‐HM‐ac 8 
L‐HM‐ac 16 
L‐HM‐ac 32 
L‐HM‐ac 64 
L‐HM‐et 8 
L‐HM‐et 16 
L‐HM‐et 32 
L‐HM‐et 64 



Discusión integradora 

272 

 

Las actividades antioxidantes  (ABTS, FRAP y Folin),  la concentración y el potencial zeta están 
positivamente  relacionadas  entre  sí  y  constituyen  los  parámetros  de  mayor  peso  en  las 
propiedades finales de las muestras (Tabla 52), con una relación superior a 0,836 respecto a la 
componente 1 (48,25 % de varianza). La dispersabilidad también está relacionada positivamente 
con  las  anteriores,  aunque  con  una  relación menor  con  la  componente  1  (0,643).  Por  el 
contrario, el tamaño de partícula y  la temperatura de transición se relacionan positivamente 
entre sí y negativamente con  la humedad y  la dispersabilidad,  respecto de  la componente 2 
(24,64 % de varianza).    

 

Figura 115. Análisis multivariante (factorial) de los liposomas liofilizados rellenos. 
 

Por  tanto,  dadas  las  buenas  propiedades  estructurales,  relativa  estabilidad  oxidativa  y 
excelentes actividades biológicas,  los  liposomas  liofilizados encapsulando extractos bioactivos 
poseen  aptitudes  funcionales  adecuadas  para  poder  actuar  como  productos  o  ingredientes 
funcionales de alto valor añadido en la industria alimentaria.  

Además, los liposomas liofilizados que contienen extractos polifenólicos (L‐PG y L‐HM‐ac), que 
son los que han sido estudiados, no muestran efecto citotóxico sobre las células Caco‐2 para una 
concentración  de  0,01 mg/mL,  con  una  viabilidad  celular  que  desciende  paulatinamente  a 
medida que se aumenta la dosis de exposición (Figura 116). Los liposomas con extracto acuoso 
de hinojo marino mostraron, a partir precisamente de 0,5 mg/mL, un notable menor efecto 
citotóxico que los liposomas de piel y albedo de granada, atribuido a la extracción del bioactivo 
en agua (L‐HM‐ac) respecto a etanol (L‐PG). Por otro lado, los liposomas vacíos presentaron una 
reducción  ligera  de  la  viabilidad  celular  a  partir  de  concentraciones  de  0,1 mg/mL.  Estos 
resultados  indican  que  los  liposomas  elaborados  en  este  trabajo  podrían  emplearse  en  la 
industria alimentaria dado que no presentan efectos citotóxicos destacables. 



Discusión integradora 

273 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura  116.  Citotoxicidad,  expresada  como  porcentaje  de  viabilidad  celular,  de  liposomas  liofilizados 
vacíos  (L‐V)  y  encapsulando  diferentes  extractos  bioactivos  (L‐PG  y  L‐HM‐ac  64)  a  diferentes 
concentraciones de extracto (valor entre paréntesis).  

 

9.4. Absorción intestinal  

Una vez evaluada su aptitud funcional, habría que comprobar si estos liposomas de alto valor 
añadido con potencial beneficioso para la salud son capaces de atravesar la mucosa intestinal, 
para ser absorbidos y llegar al órgano diana del organismo. Para ello, se realizó un ensayo de 
permeabilidad a  través de una monocapa de células Caco‐2, dejando pasar  tanto al extracto 
acuoso de hinojo marino como al liposoma encapsulando dicho extracto, antes y después de ser 
digeridos (digestión gastrointestinal in vitro). Se eligió el extracto de hinojo debido a que tiene 
una  composición  fenólica  relativamente  simple,  en  el  que  se  determinó  un  compuesto 
mayoritario  (el ácido clorogénico), en contraposición con el extracto de piel de granada, que 
está  constituido  por multitud  de  compuestos  de  intensidades  parecidas,  resultando  ser  un 
extracto  bastante  complejo.  De  hecho,  los  resultados  de  permeabilidad  se  expresaron  en 
términos  de  concentración  de  ácido  clorogénico.  Además,  se  seleccionó  expresamente  el 
extracto acuoso por su total ausencia de citotoxicidad (capítulo 2, diseño experimental 8.3.).  

Los  resultados mostraron  que  solo  una  pequeña  fracción  del  ácido  clorogénico,  tanto  del 
extracto  libre  como  de  la  fracción  libre  de  la  dispersión  liposomal,  fue  capaz  de  pasar  la 
monocapa de Caco‐2. Es bien sabido que los polifenoles no son preferentemente absorbidos a 
nivel intestinal y tienden a pasar al tracto colónico. Los estudios de dispersión dinámica de luz 
evidenciaron  que  no  había  liposomas  en  las  soluciones,  por  lo  que  cabe  suponer  que  los 
liposomas no han atravesado  la monocapa, ya  sea entre  las células o a  través de ellas. Una 
opción factible sería que los liposomas hubiesen sido invaginados o fagocitados por las células, 
dada  su  gran  similitud  de  membranas,  pudiendo  liberar  en  cualquier  momento  el  ácido 
clorogénico,  favoreciendo  así  su  absorción.  La  otra  opción  es  que,  al  igual  que  el  resto  de 
polifenoles  no  absorbidos  intestinalmente,  pasen  al  colon.  Pero  no  cabe  duda  de  que  hay 
numerosos trabajos que citan el paso de  los  liposomas a través de  la mucosa  intestinal, tal y 
como se indica en la introducción y en el capítulo correspondiente. 

Aunque  en  el  colon  también  puede  existir  una  cierta  tasa  de  absorción,  la  mayoría  de 
compuestos polifenólicos presentes  aquí  tienen otras  funciones  en el organismo,  como  son 
mejorar  la flora colónica o  la formación de otros compuestos más activos y que se absorben 

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6

V
ia
b
ili
d
ad

 c
el
u
la
r 
(%

)

Concentración de extracto (mg/mL)

L‐V L‐PG (4) L‐HM‐ac (64)

C             0,01             0,1             0,5              1,0



Discusión integradora 

274 

 

mejor, conocidos como metabotipos (Tomás‐Barberán et al., 2016). Al igual que en el intestino, 
en  el  colon  los  liposomas  podrían  ser  capaces  tanto  de  liberar  parte  del  ácido  clorogénico 
encapsulado  como  de  adherirse  e  invaginarse  dentro  de  las  células  de  la  pared  del  colon 
(colonocitos). Aun así, son necesarios más ensayos y con mayor detalle para determinar cuál es 
la función de los liposomas una vez lleguen al tracto intestinal.   

9.5. Aplicación de liposomas en reestructurados de pescado  

Los  liposomas,  tanto  en  su  forma  fresca  (dispersión  liposomal)  como  en  estado  seco 
(liofilizados), permiten su incorporación en matrices alimentarias de diferente naturaleza. En la 
presente se han ensayado diferentes ejemplos, uno de ellos es su  inclusión en el músculo de 
pescado como ejemplo de miosistema. Su adición en este tipo de matrices da lugar a productos 
reestructurados de alto valor añadido en el que las vesículas liposomales pueden modificar las 
características físico‐químicas de la matriz resultante y sus propiedades nutricionales y activas, 
esto  último  especialmente  por  las  propiedades  que  los  extractos  bioactivos  encapsulados 
pueden aportar, confiriendo un valor añadido mayor derivado de sus propiedades funcionales 
con beneficios para la salud. Del mismo modo, la matriz podría favorecer la estabilidad de los 
liposomas, mejorando la protección de los bioactivos encapsulados. Las propiedades finales del 
reestructurado resultante pueden depender de diversos factores: unos intrínsecos a la calidad 
del músculo, como son el estado de agregación inicial de la proteína muscular o la formulación 
del homogenizado, como por ejemplo la presencia de sal; otros propios del liposoma, como el 
estado de hidratación de  los  liposomas  incorporados o  la  composición de  las  formulaciones 
liposomales;  y  por  último  los  debidos  a  las  condiciones  del  proceso  de  elaboración  del 
reestructurado y tratamientos posteriores del producto.  

9.5.1. Importancia del estado de hidratación de los liposomas 

En  un  primer  ensayo  se  diseñaron  liposomas  de  fosfatidilcolina  de  soja  vacíos  sometidos  a 
diferentes  tratamientos  de  estabilización:  alta  presión  hidrostática  (AP), 
congelación/descongelación (CD), liofilización (LF) y atomización (A), en combinación algunos de 
ellos con  la adición del crioprotector glicerol  (CD‐G y LF‐G). Un  lote de  liposomas control sin 
tratamiento (frescos, F) se estudió en paralelo. Cada una de  las formulaciones  liposomales se 
incorporó como  ingrediente funcional en músculo de merluza fresco (Merluccius merluccius), 
previamente homogeneizado con sal (NaCl, 1 %), con el objetivo de determinar el efecto de la 
adición de liposomas en las propiedades ligantes de agua y gelificantes de los homogeneizados 
de músculo de merluza en  función del  tipo de  tratamiento de estabilización y del estado de 
hidratación de los liposomas. Con fines comparativos, un lote sin liposomas añadidos (músculo 
control, MC), también previamente homogeneizado con sal, se estudió en paralelo. Todas estas 
formulaciones  se  prepararon  con  músculo  M1.  La  figura  117  muestra  el  aspecto  del 
homogeneizado control MC,  idéntico visualmente al  resto de homogeneizados  incorporando 
liposomas.   

La  adición  de  liposomas  en  el  músculo  de  merluza  homogeneizado  con  sal  disminuyó  la 
solubilidad proteica de las masas con respecto al homogeneizado control (MC), induciendo un 
efecto de agregación de la proteína muscular, siendo más acusado cuando los liposomas fueron 
incorporados en estado seco. Esta agregación fue consecuencia del menor contenido en agua 
en las masas que contenían liposomas (menor aún en aquellas con liposomas deshidratados), 
estableciendo competitividad por  las moléculas de agua con  las proteínas miofibrilares. Dado 
que se añadió la misma cantidad de agua en todas las formulaciones y que no existe pérdida de 
ésta tras la formación del homogeneizado, la cantidad de agua es la misma en todos ellos; sin 
embargo, su localización es diferente, de modo que podemos deducir que los homogeneizados 
incorporando  liposomas secos están más agregados y  tienen menos habilidad para captar el 
agua añadida en su  interior, quedando ésta de manera  libre en  los  intersticios de  las células, 



Discusión integradora 

275 

 

siendo más fácilmente  liberada durante el procesado y  la conservación posterior. Este mayor 
grado de agregación encontrado para estas formulaciones podría deberse a que los liposomas 
deshidratados dificultan la adecuada desnaturalización y posterior solubilización del músculo de 
merluza, dando lugar a estructuras más agregadas.  

 

Figura 117. Fotografía de los homogeneizados de músculo de merluza con sal (1 %). 
 

Por otro  lado, el  control MC mostró una menor  capacidad de  ligar agua que  las masas  con 
liposomas, hecho observado tanto mediante su capacidad de retención de agua, así como por 
Resonancia Magnética Nuclear de Protón de Bajo Campo. Este efecto se atribuye a que en las 
masas que contienen liposomas, las cabezas polares de los fosfolípidos son capaces de atrapar 
parte del agua (a través de los radicales OH de los grupos fosfato), a pesar de que la estructura 
en su conjunto esté más agregada (Figura 118). La adición de liposomas deshidratados ocasionó 
una menor cantidad de agua ligada a estructuras proteicas respecto a la adición de dispersiones 
frescas, como consecuencia de su menor contenido en agua y el mayor grado de agregación. 
Hay que mencionar que las formulaciones incorporando glicerol en los liposomas presentaron 
una mayor capacidad ligante de agua que sus respectivas formulaciones sin glicerol, debido a su 
gran higroscopicidad, es decir a la capacidad de atrapar agua de los grupos OH de la molécula 
de glicerol, hecho que confirma la capacidad ligante de las cabezas polares de los fosfolípidos de 
los liposomas.  

 

Figura 118. Representación gráfica de la estructura proteica estándar (izquierda) y con la incorporación 
de liposomas embebidos en la matriz proteica (derecha).   



Discusión integradora 

276 

 

Los  homogeneizados  formulados  con  liposomas  mostraron  temperaturas  más  altas  de 
desnaturalización y menores valores de entalpía en todas sus transiciones de fase observadas 
por Calorimetría Diferencial de Barrido, lo que implica la mayor estabilidad térmica tanto de la 
miosina como de la actina en estas masas. Cuando los liposomas fueron incorporados en estado 
seco,  el  incremento  de  temperatura  fue  superior  en  las  transiciones  asociadas  a  la  actina, 
indicando que favorecen en mayor grado la estabilidad de la actina respecto a las dispersiones 
liposomales, sin diferencias para la miosina. Esta mayor estabilidad fue debida al mayor grado 
de agregación proteica mostrado en los homogeneizados conteniendo liposomas deshidratados, 
lo que concuerda con los resultados obtenidos en solubilidad proteica.  

El  comportamiento  viscoelástico  en  función  de  un  barrido  de  frecuencias  reflejó  que  los 
liposomas  interfirieron con  las  interacciones proteína‐proteína de  la matriz muscular creando 
discontinuidad  en  ella,  lo  que  disminuyó  la  estabilidad  estructural  del  homogeneizado 
resultante, siendo este efecto más acusado en el caso de dispersiones liposomales. Este hecho 
coincide con  la menor consistencia de gel cuantificada para  las masas conteniendo  liposomas 
añadidos  en  forma  de  dispersión  liposomal  en  comparación  con  aquellas  con  liposomas 
incorporados  en  forma  deshidratada  (liposomas  secos).  Estos  resultados  se  deben  a  que  al 
añadirse  los  liposomas en estado  líquido (dispersiones) podrían acceder más fácilmente a  las 
cadenas  laterales  proteicas,  produciendo mayor  inestabilidad  de  la matriz muscular,  lo  que 
estaría en consonancia con los resultados obtenidos en Resonancia Magnética Nuclear, donde 
las masas adicionadas con dispersiones liposomales mostraron mayor espacio intramiofibrilar y 
más capacidad de englobar agua en su interior.  

El  comportamiento  viscoelástico  en  función  de  un  barrido  de  temperaturas  demostró 
nuevamente  las conclusiones anteriores, donde  la adición de  liposomas en estado  líquido dio 
lugar  a  homogeneizados  más  débiles  y  de  peor  estructura,  reflejado  por  un  proceso  de 
gelificación  térmica  más  rápido  atribuido  a  su  mayor  espacio  intramiofibrilar  y  su  mayor 
exposición  de  los  sitios  reactivos  proteicos,  lo  que  desencadena  un  mayor  grado  de 
discontinuidad de  la matriz. En  cambio,  la  adición de  liposomas en  estado  seco permitió  la 
obtención de geles de mejor estructuración que con las dispersiones, aunque igualmente fueron 
más débiles que  los geles  control  (MC),  como  consecuencia del mayor grado de agregación 
proteica  encontrado  en  los  homogeneizados  incorporando  este  tipo  de  liposomas.  Las 
propiedades mecánicas de los geles formulados con liposomas preparados tanto a 60 °C como 
a 80 °C reflejaron el mismo comportamiento, con diferencias respecto a los resultados obtenidos 
en reología dinámica oscilatoria (comportamiento viscoelástico), debida al diferente régimen de 
calentamiento  entre  ambas  técnicas  (Figura  119).  Dado  que  todas  las masas  conteniendo 
dispersiones liposomales con glicerol (F, AP, CD y CD‐G) mostraron en reología una gelificación 
completa y finalizada a 60 °C, las propiedades mecánicas de los geles (ensayo por texturometría) 
se estudiaron a esta supuesta máxima temperatura de gelificación (60 °C) y a una temperatura 
mayor  (80  °C)  con  el  objetivo  de  verificar  si  el  gel  experimenta  cambios  a  temperaturas 
superiores a los 60 °C. Tras analizar los resultados, se demuestra que todos los geles refuerzan 
su proceso de gelificación desde  los 60 °C hasta  los 80 °C, momento en el que completan su 
formación, coincidiendo así con los resultados obtenidos en reología para las masas control y las 
que contienen liposomas deshidratados.  

En  resumen,  podríamos  concluir  que  la  adición  de  liposomas  en  el  músculo  de  merluza 
homogeneizado con sal dio lugar a la obtención de una matriz donde las proteínas miofibrilares 
se encuentran más agregadas y con menor acceso a  las moléculas de agua, pero que en  su 
conjunto presenta mayor capacidad ligante de agua gracias a la presencia de las cabezas polares 
de  los  fosfolípidos de  los  liposomas. Además, éstos  indujeron un aumento de  la estabilidad 
térmica de  la proteína e  interfirieron con  la agregación  térmica de  las proteínas musculares, 
alterando la estabilidad estructural de la matriz. Esta interferencia fue mayor tras la adición de 
dispersiones en estado líquido debido a la mayor discontinuidad creada en la matriz. En cambio, 



Discusión integradora 

277 

 

la adición de  liposomas en estado seco ocasionó  la obtención de estructuras más agregadas, 
atribuido  a una dificultosa desnaturalización  y  solubilización  del músculo,  lo que determina 
menor agua ligada, pero mejor estabilidad térmica. Por tanto, los resultados obtenidos sugieren 
el posible uso de esta especie de pescado altamente apreciada, la merluza, para el desarrollo de 
productos de pescado funcionales de alto valor añadido, gracias a la adición de liposomas.  
 

 

 

Figura  119.  Fotografías  de  las  masas  homogeneizadas  de  músculo  de  merluza  y  de  los  geles.  A) 
Homogeneizado control. B) Homogeneizado con liposomas. C) Geles de músculo de merluza.  

 

9.5.2. Importancia del estado de agregación del músculo y del protector incorporado en  los 
liposomas 

Se  ha  comprobado  que  el  estado  de  hidratación  de  liposomas  conteniendo  glicerol  y 
estabilizados mediante  distintos  procesados  determina  las  propiedades  ligantes  de  agua  y 
gelificantes de los homogeneizados de músculo de merluza. Sin embargo, estudios posteriores 
con  liposomas  estabilizados  mediante  procesados  similares  conteniendo  trealosa  como 
protector  en  lugar  de  glicerol  e  incorporados  en músculo  de merluza  de menor  capacidad 
funcional de proteína (menor capacidad de retención de agua y menor poder de gelificación), 
han demostrado que  las propiedades de dichos músculos no dependen  tanto del estado de 
hidratación de los liposomas como del estado de conservación de la materia prima (Capítulo 3; 
diseño  experimental  8.6.).  Por  tanto,  las  condiciones  cambiantes  en  el  presente  estudio 
comparativo (músculo de distinta calidad proteica y diferente protector de vesículas) serían las 
determinantes en las propiedades de los homogeneizados. Estos resultados sugieren, tal y como 
adelantábamos, que existen diversos factores que pueden condicionar las propiedades físicas y 
estructurales de las matrices alimentarias enriquecidas con compuestos bioactivos.  

Con la finalidad de estudiar la importancia de algunos de estos parámetros mencionados sobre 
las propiedades de  la proteína muscular,  se han  comparado masas de músculo de merluza 
(Merluccius merluccius), previamente homogeneizado con sal (NaCl, 1 %), de distinto grado de 
agregación proteica  inicial  (que  llamaremos MC 1, de alta calidad  funcional y MC 2, de baja 

A B 

C 



Discusión integradora 

278 

 

calidad  funcional),  formuladas  con  liposomas  sometidos  a  diferentes  tratamientos  de 
estabilización (CD: congelación‐descongelación y LF: liofilización) y con distinta composición de 
protector  de  vesículas  (G:  glicerol  o  T:  trealosa).  De  este  modo,  se  compararon  6 
homogeneizados  de  músculo  de  merluza  incorporando  liposomas:  MC  1,  CD‐G  y  LF‐G 
(formulaciones M1), y MC 2, CD‐T y LF‐T (formulaciones M2). De esta forma estudiaremos el 
efecto  de  la  adición  de  liposomas  en  las  propiedades  ligantes  de  agua  y  gelificantes  de 
homogeneizados de merluza, valorando  la  influencia de  los siguientes  factores: el estado de 
agregación inicial de la proteína muscular (comparando entre formulaciones M1 y M2) y el tipo 
de  crio‐/lioprotector  añadido  en  la  formulación  liposomal  (comparando  entre  glicerol  y 
trealosa),  teniendo en  cuenta que el estado de hidratación  fue hallado  importante para  las 
formulaciones M1 (liposomas con glicerol) pero no tanto en las formulaciones M2 (liposomas 
con trealosa).  

Como ya  se  vio en apartados anteriores,  la adición de  liposomas en el músculo de merluza 
solubilizado con sal incrementó considerablemente (p≤0,05) la capacidad de retención de agua 
de los homogeneizados con respecto al homogeneizado control correspondiente, favorecido por 
la  capacidad  de  los  grupos  fosfato  de  los  fosfolípidos  de  los  liposomas  de  unir  agua.  El 
homogeneizado control MC 1 mostró una mayor (p≤0,05) capacidad de retención de agua que 
el homogeneizado control MC 2 (Tabla 53), alrededor de un 10 % más, confirmando que MC 2 
presenta  una  estructura  proteica  más  agregada  respecto  a  MC  1.  Sin  embargo,  los 
homogeneizados  que  incorporan  liposomas  con  trealosa  como  protector mostraron  valores 
similares (p>0,05) a aquellos que incorporan liposomas con glicerol, indicando por un lado que, 
a  priori,  el  tipo  de  protector  no  parece  influir  en  la  capacidad  ligante  de  agua  de  los 
homogeneizados, y por otro, que, a pesar de las diferencias del estado inicial de la proteína del 
músculo, la adición de liposomas permite incrementar la capacidad de retención de agua hasta 
valores  parecidos  comprendidos  entre  83,8‐92,1  %  (Tabla  53),  eliminando  las  diferencias 
atribuibles a la diferente funcionalidad proteica de los músculos.  
 

Tabla 53. Capacidad de retención de agua, expresada como porcentaje (%), de los homogeneizados de 
merluza con sal control (MC 1 y MC 2) y formulados con liposomas (CD‐G: congelado‐descongelado con 
glicerol;  LF‐G:  liofilizado  con glicerol; CD‐T:  congelado‐descongelado  con  trealosa;  LF‐T:  liofilizado  con 
trealosa). Diferentes letras (a, b, c) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre 
homogeneizados con un mismo tipo de músculo y (x, y) en la misma fila entre homogeneizados sometidos 
a un mismo tratamiento.  

Capacidad de retención de agua (%) 

MC 1    69,13 ± 4,20a/x  MC 2  57,26 ± 2,44a/y 

CD‐G    92,12 ± 1,75c/x  CD‐T  90,27 ± 1,86b/x 

LF‐G    83,78 ± 2,52b/x  LF‐T  85,88 ± 1,73b/x 

 

La Resonancia Magnética Nuclear de Protón de Bajo Campo (Figura 120; tabla 54) confirmó los 
resultados  anteriores.  Los  resultados  reflejaron  que  la  adición  de  liposomas  disminuye  las 
pérdidas de agua y aumenta la cantidad de la misma unida a estructuras proteicas altamente 
organizadas  (mayor amplitud y  tiempo de  retención de T21  junto con una menor amplitud y 
mayor tiempo de retención de T22 con respecto a los homogeneizados control).  

El  homogeneizado  control  MC  1  también  presentó  menores  pérdidas  de  agua  que  el 
homogeneizado control MC 2 (Figura 120A y 120C), reflejado por más agua unida a estructuras 
dentro de las miofibrillas (mayor amplitud y tiempo de retención de T21) y menos agua fuera de 
ellas (menor amplitud de T22), indicando que la masa MC 2 experimenta mayor intercambio de 
protones +H con mayores pérdidas de agua. Además, MC 2 no presentó pico T2b1 (Figura 120B y 
120D),  asociado  al  agua  unida  fuertemente  a macromoléculas,  lo  que  apoya  los  resultados 



Discusión integradora 

279 

 

anteriores asociados a los picos T21 y T22. A pesar de las notables diferencias entre MC 1 y MC 2, 
cuando se  incorporaron  los correspondientes  liposomas en estos músculos de merluza no se 
observaron diferencias (salvo alguna excepción) entre formulaciones M1 y formulaciones M2 
(Tabla 54), tal y como sucedía con la capacidad de retención de agua. Estos resultados parecen 
indicar que la adición de liposomas es capaz de suplir las diferencias encontradas en la capacidad 
ligante de agua de  los homogeneizados con distinta  funcionalidad proteica  inicial,  sin poder 
establecerse diferencias entre liposomas con glicerol y liposomas con trealosa.  

 

 

 

 

Figura 120. Curvas de distribución de tiempos de relajación T2 analizados mediante Resonancia Magnética 
Nuclear de Protón de Bajo Campo de  los homogeneizados de merluza con sal control (MC 1 y MC 2) y 
formulados  con  liposomas  (CD‐G:  congelado‐descongelado  con  glicerol;  LF‐G:  liofilizado  con  glicerol;       
CD‐T:  congelado‐descongelado  con  trealosa;  LF‐T:  liofilizado  con  trealosa).  A)  Picos  T21  y  T22  de 
formulaciones con M1. B) Picos T2b1 y T2b2 de formulaciones con M1. C) Picos T21 y T22 de formulaciones 
con M2. D) Picos T2b1 y T2b2 de formulaciones con M2. 

 

 

 

 

 

0

2

4

6

8

10

1 10
A
m
p
lit
u
d
 (
%
)

Tiempo (ms)

MC 1

CD‐G

LF‐G

B

T2b2

T2b1

0

50

100

150

200

250

10 100 1000

A
m
p
lit
u
d
 (
%
)

Tiempo (ms)

MC 2

CD‐T

LF‐T

C

T21

T22

0

2

4

6

8

10

1 10

A
m
p
lit
u
d
 (
%
)

Tiempo (ms)

MC 2

CD‐T

LF‐T

D

T2b1

T2b2

0

50

100

150

200

10 100 1000

A
m
p
lit
u
d
 (
%
)

Tiempo (ms)

MC 1

CD‐G

LF‐G

A

T22

T21



Discusión integradora 

280 

 

Tabla 54. Parámetros de tiempo (ms) y amplitud (%) de los picos de relajación T2 analizados mediante 
Resonancia Magnética Nuclear de Protón de Bajo Campo de  los homogeneizados de merluza  con  sal 
control  (MC 1 y MC 2) y  formulados con  liposomas  (CD‐G: congelado‐descongelado con glicerol; LF‐G: 
liofilizado  con  glicerol;  CD‐T:  congelado‐descongelado  con  trealosa;  LF‐T:  liofilizado  con  trealosa). 
Diferentes  letras  (a,  b,  c)  en  la  misma  columna  indican  diferencias  significativas  (p≤0,05)  entre 
homogeneizados. A)  Tiempo de  formulaciones M1. B) Amplitud de  formulaciones M1. C)  Tiempo de 
formulaciones M2. D) Amplitud de formulaciones M2.  

A  
  

Tiempo (ms) 

T2 (1)  T2 (2)  T2 (3)  T2 (4)  T2 (5) 

MC 1   1,0 ± 0,0a  2,7 ± 0,6a  10,0 ± 0,0a  77,8 ± 1,6a  273,3 ± 11,6a 

CD‐G    1,2 ± 0,2b  4,1 ± 2,2a  10,5 ± 2,1a  84,0 ± 0,5b    557,5 ± 211,7b 

LF‐G   1,2 ± 0,1b  4,3 ± 1,9a  13,3 ± 7,5a  82,7 ± 1,1b    685,0 ± 139,9b 

 

 B 
  

Amplitud (%) 

A (1)  A (2)  A (3)  A (4)  A (5) 

MC 1  1,0 ± 0,0a  2,0 ± 0,0a   2,0 ± 0,0ab  105,3 ± 7,4a  9,0 ± 4,0a 

CD‐G  2,3 ± 1,3a  3,0 ± 0,8a  1,5 ± 0,7a    166,5 ± 24,3b  3,3 ± 1,0b 

LF‐G  5,8 ± 2,2b  2,5 ± 1,3a  2,3 ± 0,6b    184,0 ± 16,4b  3,3 ± 1,0b 

 

 C 
Tiempo (ms) 

T2 (1)  T2 (2)  T2 (3)  T2 (4)  T2 (5) 

MC 2  ‐   2,1 ± 0,3a    7,0 ± 1,0a  85,4 ± 3,0a  491,3 ± 16,5a 

CD‐T   1,2 ± 0,1a   2,7 ± 0,5ab  10,5 ± 3,9a  85,2 ± 0,6a    705,0 ± 183,8a 

LF‐T  1,2 ± 0,1a  3,5 ± 0,6b    9,3 ± 1,5a  87,7 ± 0,2a    665,0 ± 153,5a 

 

D 
Amplitud (%) 

A (1)  A (2)  A (3)  A (4)  A (5) 

MC 2  ‐  2,0 ± 0,0a  1,0 ± 0,0a    55,8 ± 3,5a  11,8 ± 1,5a 

CD‐T  2,8 ± 1,0a  3,5 ± 1,3a  1,0 ± 0,8a  160,5 ± 5,8c    2,3 ± 0,5b 

LF‐T  3,8 ± 1,5a  2,0 ± 1,2a  1,5 ± 0,6a  145,8 ± 9,4b    2,0 ± 0,0b 

 

El  perfil  electroforético  de  la  fracción  soluble  de  los  homogeneizados  mostró  que, 
independientemente del tipo de preparación liposomal añadida al músculo homogeneizado con 
sal, las proteínas miofibrilares se solubilizaron de un modo similar (cualitativamente) cuando se 
comparan  entre  homogeneizados  formulados  con  un mismo  tipo  de músculo  (Figura  121), 
descartándose  en  esta  fracción  la  presencia  de  interacciones  proteína‐lípido  entre matriz  y 
liposomas.  

Cuando comparamos entre homogeneizados control, observamos que MC 1 y MC 2 fueron muy 
diferentes  entre  sí  con  una  funcionalidad  proteica  completamente  distinta.  En  contraste  a         
MC 1,  la fracción soluble de  la masa MC 2 no presentó banda para  la miosina,  indicando que 
esta proteína pasó a formar parte de  la fracción  insoluble, y por tanto no se muestra en este 
perfil, corroborando el elevado grado de agregación inicial de dicho músculo. Del mismo modo, 
la actina, aunque presente también en MC 2, mostró una intensidad de banda mucho menor, 
reflejando que parte de esta proteína también fue  insolubilizada, confirmando  la baja calidad 
proteica de MC 2 en comparación con MC 1. En este caso, la incorporación de liposomas en las 
masas homogeneizadas con sal no consiguió mejorar notoriamente el estado de agregación del 



Discusión integradora 

281 

 

músculo. Dada la enorme diferencia entre ambas proteínas musculares (MC 1 y MC 2), se hizo 
imposible la comparación entre formulaciones con glicerol y formulaciones con trealosa.  
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 121. Perfil electroforético mediante SDS‐PAGE de  la fracción soluble de  los homogeneizados de 
merluza con sal control (MC 1 y MC 2) y formulados con liposomas (CD‐G: congelado‐descongelado con 
glicerol;  LF‐G:  liofilizado  con glicerol; CD‐T:  congelado‐descongelado  con  trealosa;  LF‐T:  liofilizado  con 
trealosa). Izquierda: formulaciones con M1. Derecha: formulaciones con M2.  
 

La dispersión dinámica de  luz en Zetasizer permitió cuantificar  la distribución de tamaños de 
partícula de  los agregados proteicos  solubles de  los homogeneizados no evidenciados en el 
estudio electroforético (Figura 122). 

No se apreciaron diferencias en la distribución de tamaños de los agregados entre MC 1 y MC 2, 
presentando  ambas masas  una  distribución  bimodal  con  una  población  de menor  tamaño 
minoritaria  y otra de mayor  tamaño mayoritaria.  La población minoritaria mostró  su pico  a    
≈164 nm en ambas masas, atribuido a  la molécula de miosina en su forma monomérica, que 
presenta precisamente una longitud similar. Sin embargo, la población mayoritaria, que refleja 
agregados proteicos  solubles de  tamaño medio,  fue diferente entre homogenizados control, 
mostrando un mayor tamaño medio para MC 1 (825 nm; figura 122A) que para MC 2 (531 nm; 
figura 122B), corroborando un mayor estado de agregación del músculo MC 2, dado que  los 
agregados de mayor tamaño han ido migrando hacia la fracción insoluble. Cuando los liposomas 
fueron  incorporados en  los homogeneizados, el perfil de distribución de  tamaños no  se  vio 
modificado  en  los  homogeneizados  conteniendo  liposomas  con  trealosa  con  respecto  a  su 
control (distribuciones bimodales con tamaños medios de agregados solubles similares), pero sí 
en  aquellos  incorporando  liposomas  con  glicerol  (distribuciones  trimodales)  con  respecto  al 
suyo. Estos resultados sugieren que la presencia de trealosa en los liposomas permite mantener 
estable el tamaño de los agregados proteicos de los homogeneizados de músculo de merluza, 
no  así  la  presencia  de  glicerol.  Estas  diferencias  se  atribuyen  al mayor  estado  general  de 
agregación  proteica  en  MC  2,  y  también  a  las  diferencias  moleculares  entre  ambos 
crioprotectores, que pueden condicionar su localización e interacción con los liposomas. 

MC 1 

250 

150 

20 

75 

50 

37 

25 

100 

15 

kDa 

Miosina

Actina

CD‐G LF‐G 

Troponina

250

150

100

75

50

37

25

20

15

kDa 

MC 2 CD‐T LF‐T 

Tropomiosina



Discusión integradora 

282 

 

 

 

Figura  122. Distribución  de  tamaños  de  agregados  de  la  fracción  soluble  de  los  homogeneizados  de 
merluza con sal control (MC 1 y MC 2) y formulados con liposomas (CD‐G: congelado‐descongelado con 
glicerol;  LF‐G:  liofilizado  con glicerol; CD‐T:  congelado‐descongelado  con  trealosa;  LF‐T:  liofilizado  con 
trealosa). A) Formulaciones con M1. B) Formulaciones con M2.  

 

El  potencial  zeta  de  los  agregados  proteicos  de  la  fracción  soluble  de  los  homogeneizados 
mostró grandes diferencias entre MC 1 (‐20,8 mV) y MC 2 (‐0,8 mV) (Tabla 55).  
 

Tabla 55. Potencial Z (mV) de la fracción soluble de homogeneizados de merluza con sal control (MC 1 y 
MC  2)  y  formulados  con  liposomas  (CD‐G:  congelado‐descongelado  con  glicerol;  LF‐G:  liofilizado  con 
glicerol; CD‐T: congelado‐descongelado con trealosa; LF‐T: liofilizado con trealosa). Diferentes letras (a, b, 
c) en la misma columna indican diferencias significativas (p≤0,05) entre homogeneizados con un mismo 
tipo de músculo y (x, y) en la misma fila entre homogeneizados sometidos a un mismo tratamiento. 

Potencial Z (mV) 

MC 1  ‐20,8 ± 1,4a/x  MC 2    ‐0,8 ± 0,4a/y 
CD‐G  ‐19,5 ± 0,0a/x  CD‐T  ‐29,0 ± 3,7c/y 
LF‐G  ‐21,2 ± 2,7a/x  LF‐T  ‐10,7 ± 0,1b/y 

 

El menor potencial de MC 2 se atribuye al elevado grado de agregación proteica del músculo de 
merluza  empleado,  que  dificulta  la  desprotonación  de  los  aminoácidos  acídicos  durante  el 
proceso de homogeneización con sal, dando lugar a un potencial mucho menos electronegativo 
que MC 1. La adición de liposomas en los homogeneizados no modificó los valores de potencial 
zeta  cuando  los  liposomas  incorporaban  glicerol,  dadas  las  repulsiones  electrostáticas  que 
tienen lugar entre los grupos carboxilo de las proteínas y los grupos fosfato de los liposomas, 

0

5

10

15

20

25

10 100 1000 10000

In
te
n
si
d
ad

 (
%
)

Tamaño (nm)

MC 1

CD‐G

LF‐G

A

0

5

10

15

20

25

10 100 1000 10000

In
te
n
si
d
ad

 (
%
)

Tamaño (nm)

MC 2

CD‐T

LF‐T

B



Discusión integradora 

283 

 

que mantienen estable el potencial zeta. En cambio, en los homogenizados M2, con un mayor 
grado de agregación y muy bajo potencial Z,  la presencia de  liposomas con trealosa tornó el 
potencial zeta más electronegativo en función del tipo de tratamiento/estado de hidratación de 
los liposomas, siendo más electronegativo en CD‐T, probablemente debido a que al incorporarse 
en los homogeneizados con sal en forma líquida penetra mejor e interacciona más directamente 
con  las cadenas  laterales de  las proteínas musculares. El mayor potencial electronegativo en 
estos  homogeneizados  con  liposomas  se  atribuye  a  la  presencia  de  los  grupos  cargados 
negativamente de  los  liposomas  (grupos fosfato). Por tanto,  las diferencias observadas entre 
formulaciones M1 y M2 (incluyendo los homogeneizados que contienen liposomas) se atribuyen 
directamente a la diferente calidad funcional del músculo de merluza de partida.    

Todos los homogeneizados, tanto controles (homogeneizados de músculo MC 1 y MC 2) como 
incorporando liposomas a estas formulaciones, presentaron un comportamiento viscoelástico 
tipo gel, reflejado por un mayor valor de G´ respecto a G´´ en todas las masas sometidas a un 
barrido de frecuencias a temperatura constante (Figura 123).  

 

 

Figura 123. Espectros mecánicos en función de un barrido de frecuencias desde 0,1‐10 Hz a temperatura 
constante de 10 °C de los homogeneizados de merluza con sal control (MC 1 y MC 2) y formulados con 
liposomas  (CD‐G:  congelado‐descongelado con glicerol;  LF‐G:  liofilizado  con glicerol; CD‐T:  congelado‐
descongelado con trealosa; LF‐T: liofilizado con trealosa). A) Módulo elástico (G´) de formulaciones con 
M1. B) Módulo viscoso (G´´) de formulaciones con M1. C) Módulo elástico (G´) de formulaciones con M2. 
D) Módulo viscoso (G´´) de formulaciones con M2.  

 

El homogeneizado MC 1 mostró una mayor consistencia de gel a condiciones de temperatura  
10 °C y frecuencia 1 Hz que el homogeneizado MC 2, representado por un valor superior de G0´ 

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 5 10

G
´
(P
a)

Frecuencia (Hz)

MC 1

CD‐G

LF‐G

A

0

300

600

900

1200

1500

0 5 10

G
´´
(P
a)

Frecuencia (Hz)

MC 1

CD‐G

LF‐G

B

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 5 10

G
´
(P
a)

Frecuencia (Hz)

MC 2
CD‐T
LF‐T

C

0

300

600

900

1200

1500

0 5 10

G
´´
(P
a)

Frecuencia (Hz)

MC 2

CD‐T

LF‐T

D



Discusión integradora 

284 

 

(Tabla 56). Del mismo modo, las masas conteniendo liposomas de formulación MC 1 tuvieron 
mayores  valores  de  G0´  y,  por  tanto, mayor  consistencia  de  gel  que  aquellas  conteniendo 
liposomas de formulación MC 2. Estos resultados confirman la baja funcionalidad de la proteína 
muscular de  las masas MC 2,  fenómeno que da  lugar  a  la  formación de  estructuras menos 
organizadas  en  las  formulaciones  elaboradas  a partir de  este  tipo de músculo.  En  términos 
generales, se aprecia una tendencia de incremento de G0´ en las formulaciones con liposomas 
respecto a su control sin ellos, con  la excepción de CD‐G. Este aumento fue en ambos casos, 
formulaciones M1  y M2,  superior  para  los músculos  que  incorporan  liposomas  liofilizados, 
siendo únicamente significativo (p≤0,05) el incremento para LF‐T respecto a MC 2. 
 

Tabla 56. Parámetros viscoelásticos de G0´ (Pa), obtenido del valor a 1 Hz en el barrido de frecuencias, y 
n´,  obtenido  del  ajuste  del módulo  elástico  del  espectro mecánico  a  la  ley  de  la  potencia,  de  los 
homogeneizados de merluza con sal control (MC 1 y MC 2) y formulados con liposomas (CD‐G: congelado‐
descongelado  con  glicerol;  LF‐G:  liofilizado  con  glicerol;  CD‐T:  congelado‐descongelado  con  trealosa;        
LF‐T: liofilizado con trealosa). A) Formulaciones con M1. B) Formulaciones con M2. Diferentes letras (a, b) 
indican diferencias significativas (p≤0,05) entre homogeneizados con un mismo tipo de músculo y (x, y) 
entre homogeneizados sometidos a un mismo tratamiento.  

  G0´ (Pa)  n´ 

MC 1    3567,7 ± 97,6ab/x  0,134 
CD‐G  3158,2 ± 79,5a/x  0,203 
LF‐G    4172,5 ± 336,1b/x  0,156 
MC 2    2034,3 ± 138,2a/x  0,157 
CD‐T   2655,7 ± 44,4ab/y  0,185 
LF‐T    3645,6 ± 545,4b/x  0,161 

 

El modelo de  la  ley de  la potencia  se ha utilizado para describir  las propiedades de  flujo de 
muchos  fluidos.  En  el  valor de n´  se puede  apreciar una  gran  estabilidad  estructural de  los 
homogeneizados. Además, se aprecia la misma tendencia en ambas formulaciones: la adición 
de  liposomas  incrementa  el  valor  de  n´  (disminuyendo  la  estabilidad)  respecto  al  control, 
demostrando que su presencia modifica la estabilidad estructural de las masas homogeneizadas 
con  sal,  siendo  esta  variación más  acusada  en  los  homogeneizados  conteniendo  liposomas 
sometidos a congelación/descongelación, reflejando que las masas adicionadas con liposomas 
en estado liofilizado presentan una estructura más estable que aquellas conteniendo liposomas 
en estado líquido.   

El homogeneizado control MC 1 (menor valor de n´) presentó una mayor estabilidad estructural 
que MC 2, corroborando  la distinta calidad y  funcionalidad proteica observada entre ambos 
músculos  de  merluza.  Sin  embargo,  cuando  se  incorporaron  los  liposomas  en  los 
homogeneizados  no  hubo  diferencias  entre  formulaciones,  no  encontrándose  una  relación 
apreciable en función del tipo de protector añadido.  

Los perfiles de gelificación térmica de la proteína de los homogeneizados de músculo de merluza 
(Figura 124)  se  caracterizaron por una primera desestabilización proteica a  ≈27‐30  °C  como 
consecuencia de la rotura de enlaces por puentes de hidrógeno sensibles al calor. Este efecto 
promovió el desplegamiento de la proteína, dando lugar a una mayor exposición de sus sitios 
reactivos, hecho necesario para la subsecuente formación de enlaces intermoleculares. Así, en 
torno a ≈38‐42 °C tuvo lugar el fenómeno de asentamiento o “setting”, proceso por el que se 
forma una primera red proteica ordenada estabilizada mediante  interacciones hidrofóbicas y 
enlaces covalentes ε‐(γ‐glutamil)‐lisina  inducidos por  la actividad transglutaminasa endógena. 
Posteriormente, tuvo lugar el fenómeno de modori a ≈46 °C, caracterizado por la desintegración 
de la red proteica como consecuencia de la activación de proteasas estables al calor. Finalmente, 
nuevos enlaces intermoleculares tuvieron lugar en la matriz hasta la formación de la red proteica 



Discusión integradora 

285 

 

final  (conocida como gel) en  torno a  ≈80  °C, basada en  interacciones hidrofóbicas y enlaces 
covalentes disulfuro  termoestables  intra‐ e  intermoleculares. Destacar que en mitad de este 
último proceso se detectó una fase de reordenamiento en torno a ≈65 °C, a partir de la cual se 
produce un reforzamiento del gel por el predominio de la formación de enlaces disulfuro.  

 

 

Figura 124. Comportamiento viscoelástico, expresado como módulo elástico (G´, Pa), en función de un 
barrido de temperatura desde 15 °C hasta 80 °C a frecuencia constante de 1 Hz, de los homogeneizados 
de merluza con sal control (MC 1 y MC 2) y formulados con liposomas (CD‐G: congelado‐descongelado 
con glicerol; LF‐G: liofilizado con glicerol; CD‐T: congelado‐descongelado con trealosa; LF‐T: liofilizado con 
trealosa). A) Formulaciones con M1. B) Formulaciones con M2.  
 

Las masas control (MC 1 y MC 2) presentaron temperaturas muy similares para todos los eventos 
térmicos descritos, sin embargo, MC 2 mostró en todos ellos un mayor valor de G´ que MC 1, 
incluyendo el momento de partida a 15 °C y el momento de formación final del gel a 80 °C. Estos 
resultados se deben al mayor grado de agregación proteica del músculo MC 2 en comparación 
con MC 1.  

Cuando  se  incorporaron  los  liposomas  en  los  homogeneizados  con  sal,  el  comportamiento 
térmico de  las masas  fue parecido entre  todas ellas,  con  la excepción de CD‐G, que mostró 
valores muy superiores de G´, atribuido al estado de hidratación de los liposomas (líquidos) y al 
menor grado de agregación del músculo MC 1. Es muy significativo destacar cómo a partir de la 
masa elaborada con M2 y adicionando los liposomas se obtiene un perfil similar al de la masa 
M1,  lo  que  se  atribuye  a  que  los  liposomas  son  capaces  de  interrumpir  en  el  agregado 
favoreciendo su disociación.  

Las propiedades mecánicas de los geles obtenidos a partir de los homogeneizados de músculo 
de merluza  con  sal y diferentes  liposomas añadidos  (Figura 125)  reflejaron que  los geles, al 
menos los que contenían liposomas con glicerol, continuaban su proceso de gelificación térmica 

0

2.000

4.000

6.000

8.000

10.000

12.000

14.000

0 50 100

G
´
(P
a)

Temperatura (°C)

MC 1

CD‐G

LF‐G

A

0

2.000

4.000

6.000

8.000

10.000

12.000

14.000

0 50 100

G
´
(P
a)

Temperatura (°C)

MC 2

CD‐T

LF‐T

B



Discusión integradora 

286 

 

desde  los 60 °C hasta  los 80 °C  (Figura 125A), momento en el que alcanzan el estado de red 
proteica organizada termoestable, hecho que coincide con los resultados obtenidos en reología 
dinámica  oscilatoria  (Figura  124).  La  única  excepción  fue  el  gel  CD‐G  que  completaba  su 
gelificación en torno a los 60 °C, tal y como se observa en los estudios reológicos, debido a, como 
ya explicamos en el capítulo 3 (Diseño experimental 8.5.), el diferente régimen de calentamiento 
entre ambas técnicas junto con la formulación característica de dicho gel.  

 

 

 

Figura 125. Propiedades mecánicas, expresadas como fuerza de gel (N x mm), de  los geles de merluza 
control  (MC 1 y MC 2) y  formulados con  liposomas  (CD‐G: congelado‐descongelado con glicerol; LF‐G: 
liofilizado  con  glicerol;  CD‐T:  congelado‐descongelado  con  trealosa;  LF‐T:  liofilizado  con  trealosa).  A) 
Formulaciones  con M1 preparadas a 60  °C y 80  °C. B) Formulaciones  con M2 preparadas a 60  °C. C) 
Formulaciones con M1 y M2 preparadas a 60 °C. Diferentes letras (a, b, c) indican diferencias significativas 
(p≤0,05) entre geles con un mismo tipo de músculo y preparados a una misma temperatura; (m, n) entre 
geles M1 con un mismo tratamiento; (x, y) entre geles M1 y M2, a igual tratamiento y temperatura. 

0

2

4

6

8

10

MC 1 CD‐G LF‐G

Fu
er
za
 d
e 
ge
l (
N
 x
 m

m
)

60 °C 80 °CA

a/m

a/n

b/m

b/n

c/m

c/n

0

2

4

6

8

10

MC 2 CD‐T LF‐T

Fu
er
za
 d
e 
ge
l (
N
 x
 m

m
)

MC 2

CD‐T

LF‐T

a

bb

B

0

2

4

6

8

10

Fu
er
za
 d
e 
ge
l (
N
 x
 m

m
)

MC 1  MC 2                CD‐G   CD‐T                 LF‐G   LF‐T

MC 1 MC 2

x
x

y

x y

C

x



Discusión integradora 

287 

 

En ambas  formulaciones  (MC 1 y MC 2),  la adición de  liposomas en  los homogeneizados de 
merluza dio lugar a la formación de geles más débiles en comparación con los geles control sin 
liposomas,  resultados  que  concuerdan  con  los  obtenidos  en  reología  dinámica  oscilatoria. 
Además, también coincide el hecho de que el gel control MC 2 presentó una mayor fuerza de 
gel que el control MC 1, indicando que la proteína del músculo MC 2 se encuentra inicialmente 
más agregada.  

La  incorporación  de  liposomas  en  los  homogeneizados  de merluza  con  sal  desembocó  en 
comportamientos distintos en los geles obtenidos cuando se añaden liposomas liofilizados con 
glicerol o con  trealosa  (LF‐G y LF‐T)  (p≤0,05) pero no cuando se añaden congelados  (CD‐G y       
CD‐T), atribuyendo estas diferencias a la diferente calidad proteica del músculo (MC 1 y MC 2) y 
a  la  presencia  de  los  distintos  protectores  en  la  formulación  liposomal  (glicerol  y  trealosa) 
cuando están liofilizados.   

En resumen, MC 2 presentó menos agua ligada a estructuras proteicas, las proteínas miosina y 
actina  desnaturalizadas  e  insolubilizadas  total  y  parcialmente,  respectivamente,  agregados 
proteicos solubles de menor tamaño con potencial zeta menos electronegativo, peor estabilidad 
estructural y geles más débiles  con menor organización estructural,  lo que  se atribuye a un 
mayor estado de agregación inicial de su proteína y una peor calidad y funcionalidad proteica 
del músculo, en comparación con MC 1. A pesar de las enormes diferencias encontradas entre 
las propiedades de MC 1 y MC 2,  la adición de  liposomas al homogeneizado de músculo de 
merluza con sal permitió equiparar algunas propiedades del músculo en ambas formulaciones, 
como la capacidad de ligar agua a estructuras proteicas altamente organizadas, eliminando las 
diferencias  iniciales atribuidas a  la distinta funcionalidad proteica entre ambos músculos. Por 
tanto,  estrategias  alimentarias  basadas  en músculo  de merluza  adicionado  con  liposomas 
permiten  la  obtención de productos  reestructurados de  alto  valor  añadido de  gran  interés, 
incluso si la calidad funcional de la proteína muscular es deficiente.  

El hecho de no observar diferencias apreciables en las propiedades físicas y estructurales de los 
homogeneizados de merluza en función del estado de hidratación de los liposomas cuando éstos 
llevan trealosa en su formulación pero sí cuando llevan glicerol implica que el tipo de protector 
también  puede  tener  influencia  en  las  propiedades  del  músculo,  aparte  del  estado  de 
hidratación de  los  liposomas. Sin embargo, dado que  la calidad del músculo no fue  la misma 
entre formulaciones M1 (liposomas con glicerol) y M2 (liposomas con trealosa), las diferencias 
encontradas  entre  ambos  músculos  no  se  pueden  atribuir  a  un  único  factor,  sino  a  la 
combinación de varios de ellos. En este último ensayo, aunque el tipo de  tratamiento en  los 
liposomas (congelación/descongelación y liofilización) y el tipo de protector añadido (glicerol y 
trealosa) pueden modificar en cierto modo las propiedades finales de los homogeneizados/geles 
resultantes,  el  factor  clave  que  determina  dichas  propiedades  fue  la  diferente  calidad  del 
músculo empleado en cada caso, ya que enmascara las posibles diferencias atribuibles a otros 
factores. Para una comparación más estricta en función de los parámetros relacionados con los 
liposomas,  serían  necesarios  nuevos  ensayos  utilizando  el mismo músculo  de merluza  para 
evitar que las diferencias se puedan atribuir a factores intrínsecos de la proteína. 

9.5.3. Geles de pescado formulados con liposomas encapsulando bioactivos 

A  continuación,  se  elaboraron  liposomas de  fosfatidilcolina de  soja  incorporando diferentes 
extractos  bioactivos:  un  hidrolizado  peptídico  procedente  de  piel  y  túnicas  del manto  del 
calamar gigante Dosidicus gigas  (HC), un extracto polifenólico a partir de piel y albedo de  la 
granada Punica granatum (PG), y un extracto  lipídico rico en astaxantina obtenido a partir de 
residuos (cutículas, cefalotórax, etc.) del langostino Litopenaeus vannamei (GC). Paralelamente, 
se diseñó una formulación liposomal control sin bioactivo (L‐V), denominado liposoma vacío. Los 
liposomas en estado liofilizado (responsables de aportar al músculo propiedades más adecuadas 
que las dispersiones según los ensayos anteriores) se incluyeron en surimi de calamar (Dosidicus 



Discusión integradora 

288 

 

gigas), previamente homogeneizado con sal (NaCl, 1 %) y, posteriormente, las masas obtenidas 
se sometieron a un proceso de gelificación a 90 °C. De este modo, se obtuvieron los siguientes 
geles de surimi: G‐L‐V, G‐L‐HC, G‐L‐PG y G‐L‐GC. Un gel de surimi control sin liposomas (G) se 
estudió en paralelo. Además, se elaboró una formulación alternativa basada en la adición de los 
bioactivos directamente en el gel, sin liposomas, obteniendo los geles G‐HC, G‐PG y G‐GC. Todos 
los geles obtenidos (8 en total) se sometieron a una digestión gastrointestinal in vitro.  

El objetivo perseguido en este ensayo  fue estudiar  la  interacción de  los  liposomas  (esta vez 
rellenos con bioactivos de diferente naturaleza y composición) con otra matriz alimentaria de 
músculo  de  origen  pesquero  (surimi  de  calamar)  y  cómo  influyen  en  sus  propiedades 
estructurales y gelificantes. Además se quiso cuantificar la biodisponibilidad y bioaccesibilidad 
de  los  extractos  bioactivos,  mediante  sus  actividades  potenciales  antioxidante  y 
antihipertensiva,  cuando  son  incorporados  (encapsulados  en  liposomas)  en  el  surimi,  tras 
someter los geles correspondientes a una digestión gastrointestinal in vitro (para comprobar si 
la presencia de  liposomas mejora  la digestibilidad proteica de  los  geles). Para demostrar  la 
importancia  de  la  cápsula  en  este  tipo  de  formulaciones,  se  compararon  las  actividades 
potenciales de  los geles con bioactivos encapsulados en  liposomas y con bioactivos añadidos 
directamente.   

Los liposomas conteniendo los extractos bioactivos (L‐HC, L‐PG y L‐GC) se volvieron a elaborar y 
a caracterizar, con la finalidad de comprobar que tuvieran propiedades de partícula adecuadas 
para ser incorporados en el surimi. Estas propiedades no tienen por qué ser exactamente iguales 
a  las  obtenidas  para  los  liposomas  conteniendo  los mismos  extractos  (Capítulo  2;  diseño 
experimental 8.2.) ya que la cantidad total de suspensión liposomal preparada fue diferente a la 
utilizada en el ensayo anterior, diferencia suficiente como para que las características de unos y 
otros sean distintas. Sin embargo, cuando  las condiciones de elaboración de  liposomas sean 
exactamente las mismas en todos los parámetros, sus propiedades deberían ser prácticamente 
idénticas, siendo un proceso repetitivo.  

Los tres  liposomas  liofilizados rellenos con HC, PG y GC presentaron un tamaño nanométrico 
(198,9‐282,9  nm),  una  distribución  de  tamaños  relativamente  homogénea  y  un  excelente 
potencial de membrana (entre ‐58,5 y ‐62,9 mV), además de una elevada tasa de encapsulación 
(63‐95 %), por  lo que  fueron considerados  liposomas adecuados para ser  incorporados en  la 
matriz de surimi.  

Los geles conteniendo los extractos sin encapsular tuvieron un color más llamativo e intenso que 
sus respectivos geles incorporando los extractos en liposomas (Figura 83; capítulo 3). Además, 
las primeras formulaciones sufrieron importantes pérdidas de agua no experimentadas por el 
resto de geles. Estos geles están formulados como sistemas modelos, en los que solo contiene 
músculo y sal, por tanto su capacidad de retención de agua no es óptima. Una formulación para 
producto terminado tendría que considerar entre sus ingredientes algún ligante de agua para 
evitar la pérdida de ésta durante el procesado y posterior conservación del producto. En este 
sentido,  la presencia de  liposomas podría actuar como tal, ya que se ha observado que estas 
vesículas coloidales ayudan a mantener una estructura organizada y a aumentar la capacidad de 
retención  de  agua  en  estos  geles  y  reestructurados  de  pescado  (como  ya  se  vio  con  los 
homogeneizados  de merluza  del  apartado  anterior).  La  ausencia  de  liposomas  ocasiona  la 
interacción  directa  entre  extracto  y músculo,  lo  que  causa  una  fuerte  interferencia  en  la 
formación de la red proteica, debido probablemente a una alteración en el estado de hidratación 
de la proteína miofibrilar. Por tanto, concluimos que la presencia de liposomas es de gran interés 
para obtener  geles mejor organizados estructuralmente,  sin pérdidas de  agua,  a  la  vez que 
permite enmascarar el color cuando sea éste el  interés, y por supuesto proteger mediante el 
recubrimiento al compuesto activo de posibles interacciones con la matriz que le hagan menos 
activo y disponible o bien más sensible al procesado. Por el contrario,  los geles sin  liposomas 



Discusión integradora 

289 

 

requieren de completar la formulación con ingredientes ligantes para retener el agua, si bien en 
este caso los compuestos bioactivos no se verán protegidos de las posibles interacciones con el 
resto de la matriz durante el procesado. 

Centrados  ya  únicamente  en  los  geles  conteniendo  extractos  bioactivos  encapsulados  en 
liposomas  (G‐L‐HC, G‐L‐PG y G‐L‐GC), con  los dos controles correspondientes  (G y G‐L‐V),  las 
propiedades estudiadas mostraron que todos los geles tuvieron una baja solubilidad proteica, 
como cabía esperar a su estado de red o matriz agregada. La adición de liposomas aumenta esta 
solubilidad, probablemente porque interfieren con la matriz muscular y alteran su organización 
estructural, dando lugar a geles menos agregados y ligeramente más débiles. El estudio de las 
propiedades  mecánicas  de  los  geles  aportó  las  mismas  conclusiones,  donde  los  geles 
conteniendo liposomas (tanto vacíos como con extractos) mostraron una menor fuerza de gel y 
como consecuencia la obtención de geles más débiles respecto al gel control (G). Esta conclusión 
concuerda con la obtenida en el capítulo 3 con los homogeneizados de músculo de merluza. Por 
tanto, podemos concluir que los liposomas interfieren en las interacciones proteína‐proteína de 
la matriz muscular y modifican sus propiedades estructurales. En general, es conocido que las 
proteínas  de  pescado  tienen  una  fácil  digestibilidad,  no  obstante,  durante  el  proceso  de 
gelificación, debido  al  aumento de enlaces entrecruzados  y  covalentes, disminuye,  como  se 
puede apreciar de manera indirecta a la vista de la gran disminución de su solubilidad proteica 
como una primera aproximación, sin que ocurra un tratamiento enzimático de digestibilidad in 
vitro por medio. No obstante, es evidente que la presencia de liposomas en el reestructurado 
facilita  el  grado  de  solubilización  de  la  matriz  del  gel,  por  lo  que  cabe  esperar  que 
presumiblemente sea más digerible. 

Dado que los geles portan liposomas, estructuras que por su composición rica en ácidos grasos 
poliinsaturados  son  susceptibles  de  sufrir  oxidación  lipídica,  dichos  geles  también  serían 
susceptibles de sufrir  la oxidación de  los  lípidos. La cuantificación del producto de oxidación 
secundaria malonaldehído, por la técnica de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, reflejó 
que  los  extractos  bioactivos  estuvieron  eficientemente  encapsulados  en  los  liposomas  y no 
disponibles  para  evitar  totalmente  la  oxidación  de  los  geles,  que  experimentaron  un  ligero 
aumento  de  la  rancidez  probablemente  debido  al  proceso  de  formación  de  liposomas  y/o 
posterior proceso de gelificación de  las matrices de surimi.   Hay que tener en cuenta que  los 
valores  de  oxidación  fueron muy  bajos  en  todos  los  casos  y  que  la  adición  de  liposomas 
liofilizados en el músculo de surimi ayudó a mantener  la estabilidad de  los geles  resultantes 
durante largos periodos de tiempo (hasta 7 meses) conservados en congelación a ‐20 °C. 

Finalmente, se cuantificó la actividad antioxidante y antihipertensiva de los geles con bioactivos 
libres  y  encapsulados  en  liposomas,  así  como  del  gel  control,  sometidos  a  digestión 
gastrointestinal  in  vitro  con el objetivo de estudiar  la biodisponibilidad de  los extractos y  la 
importancia de  la  cápsula en  la protección de bioactivos  cuando éstos  son  incorporados en 
matrices alimentarias. Los resultados demostraron el efecto protector de  los  liposomas sobre 
los extractos bioactivos y, aunque no  fueron concluyentes para  la actividad antihipertensiva, 
confirmaron,  a  través  de  la  actividad  antioxidante,  que  la  formulación  de  geles  de  surimi 
garantiza  que  el  poder  antioxidante  de  los  bioactivos  (mucho  más  destacado  para  las 
formulaciones  con  PG)  pueda  ser  aprovechado  una  vez  llegue  al  interior  del  organismo, 
demostrando  la  importancia  de  la  matriz  muscular  en  la  mejora  de  la  bioaccesibilidad  y 
biodisponibilidad de  los extractos bioactivos cuando éstos son  incorporados encapsulados en 
liposomas.  

El hecho de que no sea concluyente para  la capacidad antihipertensiva se debe a que, tras  la 
digestión gastrointestinal simulada, no se puede diferenciar si el origen de la actividad proviene 
de  la matriz o del bioactivo encapsulado  inicialmente. Pero  sí  se puso de manifiesto que  la 
digestión  del  gel  fue  efectiva  y  por  tanto  la  agregación  de  la matriz,  producida  tanto  con 



Discusión integradora 

290 

 

liposomas  como  sin  ellos,  continúa  ofreciendo  las  propiedades  de  fácil  digestibilidad  que 
caracteriza  al músculo  de  pescado.  Podríamos  concluir  que  la  incorporación  de  liposomas 
rellenos de bioactivos en surimi de calamar da lugar a geles con una fuerza de cohesión diferente 
a  la del control y  favorece  la conservación a  largo plazo de  los mismos  (susceptibles de una 
mínima oxidación), donde el bioactivo está eficientemente encapsulado en  liposomas  incluso 
después  de  ser  incorporados  éstos  en  la matriz  de  surimi  de  calamar,  siendo  protegido  y 
quedando su bioactividad disponible para ser posteriormente aprovechada. Por tanto, la adición 
de  liposomas  liofilizados  conteniendo  extractos  bioactivos  en  músculo  de  surimi  es  una 
estrategia  adecuada  para  la  obtención  de  geles  de  pescado  funcionales  con  un  alto  valor 
añadido, gracias a la incorporación de los liposomas.   

9.6. Aplicación de liposomas en películas comestibles 

Otra de  las aplicaciones que ofrecen  los  liposomas es  la de ser  incorporados en biopolímeros 
naturales  para  la  obtención  de  películas  comestibles  activas.  Los  biopolímeros  pueden  ser 
polisacáridos, proteínas o lípidos, siempre que tengan la capacidad de formar películas, es decir, 
que puedan aportar propiedades texturizantes, estabilizantes y/o espesantes. La matriz es capaz 
de  proteger  a  los  liposomas  y  al  bioactivo  encapsulado, mientras  que  las  vesículas  pueden 
modificar  las propiedades  físico‐estructurales de  la película, además de aportar propiedades 
funcionales, permitiendo  la obtención de un producto de alto valor añadido. Estas películas 
pueden  ser  ingeridas  por  sí  solas,  como  alimento  o  preparado  de  alto  valor  nutricional  o 
bioactivo, o bien funcionar a modo de recubrimiento de otros alimentos de baja humedad. En 
función de las propiedades finales de la película, ésta podrá tener diversas aplicaciones como 
envoltura de otros alimentos, como pueden ser frutos secos o barritas de cereales, como matriz 
tipo pasta (ravioli y otros), como masa envolvente (tipo “wrap”) utilizada para fajitas, burritos y 
similares,  etc.  Estas  películas  son  capaces  de  aislar  el  producto  que  recubren,  actuando  de 
barrera frente a diversos compuestos como el oxígeno, dióxido de carbono, agentes patógenos, 
partículas externas  indeseables, etc.,  incrementando así  la vida útil del producto. Además, el 
hecho  de  que  sean  comestibles  les  hace  ser  también  biodegradables,  lo  que  permite  la 
sustitución  de  las  películas  sintéticas,  reduciendo  el  coste  económico  y  los  problemas 
medioambientales que conlleva el uso de plásticos. Actualmente se emplean también en otros 
ámbitos como en el de la medicina, donde soluciones de polímeros, como carboximetilcelulosa, 
forman geles y son utilizados en diversos tipos de cirugías.  

Los liposomas contenidos en las películas comestibles, cuando son consumidos, no solo están 
destinados a ser absorbidos en el intestino tras pasar por el tracto digestivo (digestión), sino que 
también pueden ser absorbidos previamente a nivel bucal, a través del tracto sublingual. Para 
ello, las propiedades finales de las películas deberán ser las adecuadas en cada caso. Para que 
los liposomas sean correcta y eficientemente absorbidos a nivel bucal y sublingual, las películas, 
además  de  ingerirse  aisladamente,  deberían  ser  solubles  en  boca  (disolución  rápida)  y 
relativamente  adherentes.  Sin  embargo,  si  las  películas  están  destinadas  a  funcionar  como 
recubrimiento de otro alimento  (ya sea por sus propiedades tecno‐funcionales o activas),  los 
liposomas presentes en ellas serán mayormente absorbidos a nivel intestinal, en cuyo caso no 
primarían las propiedades de solubilidad y mucoadherencia en las películas, y sí otras como el 
grosor, el grado de transparencia o  la  flexibilidad, si bien  la mucoadherencia podría  jugar un 
papel posterior relevante a nivel intestinal, pero hoy por hoy es mera especulación.  

Con tal propósito, se llevaron a cabo dos estudios de liposomas en películas comestibles: unas 
películas a base de caseinato sódico incorporando los liposomas que encapsulaban una fracción 
peptídica <1 kDa procedente de langostino (P‐L‐FP1‐G), con su correspondiente control (PCAS +G), 
y  otras  películas  a  base  de  carboximetilcelulosa  sódica  incorporando  los  liposomas  que 
contenían un hidrolizado de  colágeno procedente de  túnicas de  calamar  (P‐L‐HC‐G),  con  su 
respectivo control (PCMC+G). Todas  las películas elaboradas  incluían glicerol en  la formulación, 



Discusión integradora 

291 

 

dado que este compuesto no sólo preserva y mantiene la estabilidad de los liposomas, sino que 
también  aporta  flexibilidad  y  plasticidad  a  la  película,  evitando  su  posible  rotura  o 
resquebrajamiento.  El  glicerol  puede  ser  incorporado,  como  vimos  en  el  capítulo  4  (diseño 
experimental 8.9.), tanto directamente sobre la disolución del biopolímero como previamente 
durante la fabricación de los liposomas. Las películas de caseinato sódico (P‐L‐FP1‐G), dadas las 
características  propias  del  biopolímero,  estarán  destinadas  a  funcionar  como  un  producto 
alimenticio en sí mismo (siendo ingeridas por sí solas) donde los liposomas incorporados sean 
absorbidos  a  nivel  bucal  y  sublingual.  En  cambio,  las  películas  de  carboximetilcelulosa                     
(P‐L‐HC‐G)  tendrán  como  aplicación  la  de  envolver  a  otros  alimentos  de  baja  humedad, 
funcionando  como  un  recubrimiento  comestible  donde  los  liposomas  sean  principalmente 
absorbidos intestinalmente tras el proceso de digestión.  

Los  péptidos  bioactivos  (FP1  y HC)  son  los  encargados  de  aportar,  principalmente,  el  valor 
funcional a  la matriz, adicional al propio del biopolímero y de  los fosfolípidos que forman  los 
liposomas. Sin embargo, estos péptidos no  influyeron  significativamente en  las propiedades 
físicas de las películas. La presencia de liposomas en dichas películas fue confirmada mediante 
microscopía electrónica de  transmisión a  temperatura  criogénica  constatando  su morfología 
esférica.  En  términos  generales,  la  adición  de  liposomas  en  ambas  películas  indujo  una 
disminución  de  su  contenido  en  agua,  debido  a  la  mayor  presencia  de  material  seco 
(fosfatidilcolina)  en  la  fórmula  y  un  incremento muy  notable  de  su  capacidad  adherente  y 
mucoadhesiva,  facilitando  así  su  unión  a  otras  superficies,  como  las mucosas.  El  resto  de 
propiedades físicas de  las películas (solubilidad en agua, espesor o transparencia) variaron en 
función del  tipo de biopolímero empleado en  la  formulación. De hecho, el  tipo de polímero 
utilizado como matriz es uno de los factores más determinantes en las propiedades finales de 
las películas. Otro  factor definitivo o  concluyente es el producto  sobre el que  se  aplique  la 
película, o más bien  las  interacciones resultantes de dicha aplicación. Por ejemplo, Cui et al. 
(2017a)  observaron  una  evidente  actividad  frente  a  E.  coli  en  tomates  cherry  por  parte  de 
liposomas encapsulando fagos y embebidos en una película de quitosano, demostrando que los 
liposomas  liberaban gradualmente el fago. Sin embargo, Haghju et al. (2016) observaron que 
liposomas de lecitina de soja incorporados en una película de quitosano reducían la capacidad 
antimicrobiana del extracto de ortiga encapsulado. En este último estudio  la película no  fue 
aplicada sobre ningún alimento y, como vemos, tuvo un efecto totalmente opuesto al obtenido 
en el estudio de Cui et al. (2017a).   

Por esta razón, las diferencias que se verán a continuación entre las películas de caseinato y las 
de carboximetilcelulosa se deben principalmente al diferente tipo de biopolímero utilizado y a 
las características intrínsecas y propias de cada uno de ellos, ya que ambas incorporan el mismo 
tipo de  liposomas (de fosfatidilcolina parcialmente purificada a partir de  lecitina de soja) con 
glicerol, encapsulando en ambos casos péptidos bioactivos de relativa similitud (FP1 y HC), no 
habiendo sido ninguna de ellas aplicada como recubrimiento de ningún producto o alimento.   

Las películas de caseinato sódico presentaron un ligero mayor contenido en humedad que las 
películas de carboximetilcelulosa sódica (CMC) (Tabla 57), aunque sin diferencias significativas. 
Del mismo modo,  las de  caseinato mostraron una  reseñable  capacidad adherente, muy por 
encima (p≤0,05) de la encontrada para las de carboximetilcelulosa. En cambio, las películas de 
carboximetilcelulosa  tuvieron un mayor grado de opacidad  (p≤0,05),  lo que  coincide  con  su 
también mayor espesor (p≤0,05). Este mayor espesor en las películas de CMC fue diseñado con 
la  finalidad de poder  incorporar una mayor cantidad de  liposomas en su  interior. A pesar de 
disolver la CMC a una concentración menor (4 %) que el caseinato (8 %), se consiguió el esperado 
mayor  espesor  en  las  películas  de  carboximetilcelulosa,  atribuyéndose  esta  propiedad  a  las 
características intrínsecas del biopolímero. Estos resultados se repiten cuando los liposomas son 
incorporados en  las correspondientes matrices poliméricas (Tabla 57), aunque sin diferencias 
significativas en el caso de  la opacidad. Hay que destacar que tras  la adición de  liposomas el 



Discusión integradora 

292 

 

espesor no varía en las películas de caseinato, pero sí aumenta en las de carboximetilcelulosa. 
Estos resultados se deben a la mayor concentración de liposomas en la formulación de CMC (1:1, 
v/v) frente a la de caseinato (1:0,6, v/v).  
 

Tabla 57. Propiedades  físicas  y mecánicas de  las películas de  caseinato  y  carboximetilcelulosa  (CMC) 
incorporando  liposomas  cargados  con péptidos bioactivos. Diferentes  letras  (x,  y)  indican diferencias 
significativas  (p≤0,05)  entre  películas  vacías  y  entre  películas  incorporando  liposomas,  con  distinto 
biopolímero. 

  Humedad  
(%) 

Solubilidad 
(%) 

Espesor  
(µm) 

Opacidad  Adherencia  
(N) 

Caseinato  37,6 ± 1,4x  37,6 ± 1,4x 100 ± 20x 1,1 ± 0,4x 1180 ± 0,0x 

CMC  31,8 ± 3,9x  66,1 ± 9,5y 207 ± 50y 3,6 ± 0,3y 37,8 ± 6,7y 

Caseinato‐L‐FP1  28,5 ± 1,3x  58,4 ± 2,4x 100 ± 30x 1,2 ± 0,0x 3550 ± 300x 

CMC‐L‐HC  21,7 ± 2,9x  37,6 ± 5,1y 328 ± 39y 1,3 ± 0,5x 392,1 ± 25,1y 
 

Por  otro  lado,  la  solubilidad  en  agua  fue  superior  en  las  películas  de  carboximetilcelulosa 
(p≤0,05), aunque tras la adición de los liposomas ésta fue mayor para las películas de caseinato 
(p≤0,05). Este resultado indica que la solubilidad puede estar relacionada con el espesor, ya que, 
aunque  las matrices de carboximetilcelulosa son  las más gruesas y con mayor solubilidad,  la 
inclusión  de  una  mayor  cantidad  de  liposomas  en  el  polímero  origina  una  película 
considerablemente más gruesa y menos soluble. 

A  rasgos generales, dados  los  resultados obtenidos, podríamos  concluir que  las películas de 
caseinato con y sin liposomas tienen mayor contenido en agua y, como consecuencia, son más 
adherentes. Estas características les hacen ser películas finas y muy adhesivas. Las películas de 
carboximetilcelulosa  incorporando  liposomas,  mientras  tanto,  son  películas  relativamente 
gruesas,  menos  opacas,  más  fuertes  y  flexibles,  con  menor  capacidad  adherente.  Estas 
diferencias son claramente visibles en la figura 126.  

 

Figura 126.  Imágenes de  las películas. A) Película de caseinato. B) Película de carboximetilcelulosa. C) 
Película de caseinato con liposomas. D) Película de carboximetilcelulosa con liposomas. 
 

Los liposomas en el caseinato se quedan como inclusiones que disgregan o interrumpen la matriz 
y le confieren sus propiedades características, probablemente por las cualidades de la caseína. 



Discusión integradora 

293 

 

La  caseína  es  un  conjunto  de  subunidades  de  peso molecular  comprendido  entre  20,000  y 
25,000  Da.  Los  liposomas  en  la  CMC  parece  que  quedan  enmarañados  en  su  interior, 
probablemente porque  la CMC  tiene un peso molecular mínimo de 90,000 Da  (casi 4 veces 
superior al de la caseína), envolviéndolos y aportándole las características de mayor espesor y 
flexibilidad.  Estas  diferencias,  aportadas  por  el  tipo  de  biopolímero  empleado,  ofrecen 
diferentes  posibilidades  de  aplicación.  Así,  las  películas  elaboradas  con  caseinato  podrían 
emplearse  como  alimentos  por  sí  mismos,  ya  que  serían  películas  que  se  adherirían 
correctamente a la lengua dada su elevada capacidad de adhesión y se disgregarían fácilmente 
en boca dado su bajo grosor y su buena solubilidad, permitiendo una eficiente absorción a través 
del tracto sublingual. Un análisis sensorial confirmó estos resultados y  la buena aceptabilidad 
del producto para ser consumido como tal (Capítulo 4, diseño experimental 8.8.). Por otro lado, 
las películas de carboximetilcelulosa podrían utilizarse como material envolvente comestible de 
alimentos de baja humedad, dado su mayor grosor y flexibilidad. Además, el elevado grado de 
transparencia obtenido en las películas de carboximetilcelulosa con liposomas es el adecuado 
para este tipo de productos, ya que permite  la correcta visualización del material o alimento 
envuelto por  la película, factor muy tenido en cuenta por  los consumidores. El hecho de que 
disminuya su solubilidad (cuando  incorporan  liposomas) podría facilitar su función de barrera 
frente a compuestos externos (gases, humedad, etc.) y limitar la interacción con el producto que 
envuelvan, evitando así posibles modificaciones en el mismo y aumentando  la aplicabilidad a 
alimentos con mayor grado de humedad. En este caso, los liposomas pasarían preferentemente 
al tracto digestivo, siendo sometidos a digestión (han demostrado ser resistentes al proceso de 
digestión,  como  se  vio  en  el  diseño  experimental  8.9.  del  capítulo  4)  y  posteriormente 
absorbidos en el intestino. 

Actualmente existen varios productos comercializados basados en películas comestibles, tanto 
para  absorción  oral  como  para  ser  digeridos.  Entre  los  más  conocidos  destacan  películas 
conteniendo cafeína (Patel et al., 2011) o películas de insulina (Modi et al., 2002), ambas para 
administración  oral  y  absorción  a  nivel  bucal  y  sublingual.  Sin  embargo,  cada  día  es más 
frecuente la aplicación de aerosoles para la formación de películas instantáneas con liposomas 
o fármacos, a nivel farmacológico, para aplicación nasal y de otras zonas mucosas del cuerpo, 
para que el bioactivo pase directamente a través de las mucosas. Esto sugiere la viabilidad de 
las películas y la versatilidad de su aplicación, lo cual le augura un futuro prometedor. Aunque 
se trata de un área que está recibiendo gran interés en la comunidad científica, aún no existen 
en  el  mercado  productos  basados  en  películas  comestibles  incorporando  bioactivos 
previamente encapsulados en liposomas, a pesar de las enormes ventajas y posibilidades que 
ofrece  la adición de  liposomas en dichas películas, por  lo que  la comercialización de películas 
comestibles como las desarrolladas en esta Memoria sería de gran interés.  

9.7. Evaluación de las posibles Declaraciones nutricionales de las formulaciones con liposomas 

Los alimentos basados en liposomas poseen propiedades beneficiosas para la salud atribuidas 
tanto a  la propia matriz como al  liposoma en sí y al bioactivo encapsulado, tal y como se ha 
demostrado en  los diversos capítulos. Dado que  los  liposomas son el  ingrediente base de  las 
matrices alimentarias estudiadas en esta Memoria,  se abordarán  las propiedades  saludables 
derivadas de los mismos. Como ya se mencionó al comienzo de esta discusión integradora, los 
liposomas, debido a que están elaborados a partir de fosfatidilcolina parcialmente purificada 
con una composición rica en ácidos grasos poliinsaturados, aportarían enormes beneficios sobre 
la salud. Puesto que esta es una afirmación muy genérica, se ha  llevado a cabo un detallado 
estudio de  composición en  sustancias beneficiosas que pueden aportar  los  liposomas,  tanto 
aislados  como  embebidos  en  las  matrices  alimentarias,  en  función  de  cada  uno  de  sus 
compuestos lipídicos principales. A este respecto, podríamos resumir que, dada la composición 
lipídica de la fosfatidilcolina purificada cinco veces (FC5) vista en el capítulo 1, los liposomas son 



Discusión integradora 

294 

 

ricos en ácidos grasos insaturados, destacando entre ellos el ácido linoleico (C18:2n6c), el ácido 
linolénico (C18:3n3) y el ácido oleico (C18:1n9c).  

Según el Reglamento de la Comisión (Nº 116, 2010) por el que se modifica el Reglamento (CE) 
1924/2006  del  Parlamento  Europeo  y  del  Consejo  en  lo  relativo  a  la  lista  de  declaraciones 
nutricionales y el Reglamento de la Comisión Europea (Nº 432, 2012) por el que se establece la 
lista de declaraciones autorizadas de propiedades saludables de  los alimentos distintas de  las 
relativas a  la  reducción del  riesgo de enfermedad y al desarrollo y  la  salud de  los niños,  los 
alimentos  sujetos  a  estudio  nutricional  deben  aportar  cantidades  mínimas  necesarias  de 
determinados  compuestos  para  que  se  le  atribuyan  las  propiedades  saludables 
correspondientes a dichos compuestos. De este modo, la mayoría de formulaciones basadas en 
liposomas  que  se  han  elaborado  en  esta  Memoria  pueden  considerarse  productos  que 
“contribuyen a mantener niveles normales de colesterol sanguíneo” en base a un alto contenido 
en grasas insaturadas ya que, de acuerdo a los reglamentos mencionados, “al menos un 70 % de 
los  ácidos  grasos  presentes  en  el  producto  proceden  de  grasas  insaturadas  y  las  grasas 
insaturadas aportan más del 20 % de valor energético del producto” (Tabla 58).  

Más específicamente,  las  formulaciones pueden considerarse también productos con un alto 
contenido  en  grasas  poliinsaturadas,  puesto  que  “al menos  un  45 %  de  los  ácidos  grasos 
presentes  en  el  producto  proceden  de  grasas  poliinsaturadas  y  las  grasas  poliinsaturadas 
aportan más del 20 % del valor energético del producto” (Tabla 58). Además, esta declaración 
establece que los productos sean ricos en ácido oleico. 
 

Tabla 58. Grasas insaturadas y poliinsaturadas de las formulaciones con liposomas. 

Producto  Muestra 
Grasas insaturadas  Grasas poliinsaturadas 

Proporción 
(%) 

Valor 
energético (%)

Proporción 
(%) 

Valor 
energético (%) 

Dispersiones 
liposomales 

L‐V  74,4*  59,4*  66,0*  52,7* 

L‐GC  74,4*  59,9*  66,0*  53,1* 

Liposomas 
liofilizados 

L‐V  74,4*  59,4*  66,0*  52,7* 

L‐GC  74,4*  59,9*  66,0*  53,1* 

Películas 
caseinato 

P‐L‐V  74,4*  30,5*  66,0*  27,0* 

P‐L‐FP1  74,4*  30,0*  66,0*  26,6* 

Películas 
CMC 

P‐L‐HC‐G  74,4*  51,4*  66,0*  45,6* 

Reestructurados 
merluza 

F, AP, CD, 
CD‐G, CD‐T 

74,4*  19,9  66,0*  17,6 

LF  74,4*  24,1*  66,0*  21,3* 

LF‐G  74,4*  17,7  66,0*  15,7 

A  74,4*  26,7*  66,0*  23,7* 

LF‐T  74,4*  20,4*  66,0*  18,1 

Geles 
surimi 

G‐L‐V  74,4*  22,7*  66,0*  20,1* 

G‐L‐HC  74,4*  22,2*  66,0*  19,7 

G‐L‐PG  74,4*  22,1*  66,0*  19,6 

G‐L‐GC  74,4*  23,0*  66,0*  20,4* 
 

*Formulaciones liposomales que cumplen los requisitos establecidos por los reglamentos europeos para 
cada parámetro. 



Discusión integradora 

295 

 

Los Reglamentos anteriores establecen una cantidad mínima de “1,5 g de ácido  linoleico por    
100 g y 100 Kcal”, así como una cantidad mínima de “0,3 g de ácido alfa‐linolénico por 100 g y 
100  Kcal”,  para  que  dichos  productos  sean  considerados  ricos  en  ácido  linoleico  y/o  ácido 
linolénico, respectivamente. Las tablas 59 y 60 reflejan las cantidades de ambos ácidos grasos 
poliinsaturados aportadas por cada producto, por cada 100 g de producto (Tabla 59) y por cada 
100 Kcal (Tabla 60).  
 

Tabla 59. Contenido en ácido linoleico, ácido linolénico y sumatorio de ácido eicosapentaenoico (EPA) y 
ácido docosahexaenoico (DHA), y sus calorías aportadas, por cada 100 g de producto con liposomas.  

Producto  Muestra 
por 100 g producto 

Ác. linoleico 
(g) 

Ác. linolénico 
(g) 

EPA + DHA 
(mg) 

Kcal 

Dispersiones 
liposomales  

L‐V  2,93*  0,38*  ‐  56,34 

L‐GC  2,94*  0,38*  33,12  58,14 

Liposomas 
liofilizados  

L‐V  27,14*  3,48*  ‐  522,9 

L‐GC  27,47*  3,50*  276,55*  486,03 

Películas 
caseinato  

P‐L‐V  10,30*  1,32*  ‐  386,3 

P‐L‐FP1  9,24*  1,19*  ‐  352,97 

Películas 
CMC  

P‐L‐HC‐G  17,67*  2,27*  ‐  393,2 

Reestructurados 
merluza  

F, AP, CD, 
CD‐G, CD‐T  

0,97  0,12  ‐  56,06 

LF  1,15  0,15  ‐  55,12 

LF‐G  0,82  0,11  ‐  53,05 

A  1,36  0,17  ‐  58,18 

LF‐T  1,02  0,13  ‐  57,16 

Geles 
surimi  

G‐L‐V  2,24*  0,29  ‐  112,94 

G‐L‐HC  2,18*  0,28  ‐  112,4 

G‐L‐PG  2,18*  0,28  ‐  112,8 

G‐L‐GC  2,27*  0,29  24,84  113,18 
 

*Formulaciones liposomales que cumplen los requisitos establecidos por los reglamentos europeos para 
cada parámetro.  
 

Respecto  al  ácido  linoleico,  todas  las  formulaciones  ensayadas  aportan  la  cantidad mínima 
necesaria (>1,5 g/100 g producto y 100 Kcal), excepto los reestructurados de merluza. A pesar 
de no aplicarse esta declaración para los reestructurados, estos productos aportan cantidades 
considerables de ácido linoleico, quedando bastante cerca de los límites necesarios. En cuanto 
al ácido  linolénico,  la declaración es  cumplida por  todas  las  formulaciones  (>0,3 g/100 g de 
producto y 100 Kcal) exceptuando reestructurados de merluza y geles de surimi. De igual modo 
que en el anterior, ambos tipos de productos aportan cantidades de ácido linolénico a tener en 
cuenta, sobre todo los geles de surimi que quedan por debajo del límite necesario por apenas 
0,02 g. 

Por otro lado, los reglamentos establecen una declaración de fuente de ácidos grasos omega‐3 
para aquellos productos que aporten “al menos 40 mg de la suma de ácido eicosapentaenoico y 
ácido docosahexaenoico por 100 g y 100 Kcal”. Para esta declaración solo se tendrán en cuenta 



Discusión integradora 

296 

 

aquellos productos que contengan el bioactivo de grasa de crustáceo (GC), es decir, la dispersión 
liposomal  y  el  liposoma  liofilizado  conteniendo  el  bioactivo  (L‐GC)  y  el  gel  de  surimi  que 
incorpora  el  liposoma  con  la  grasa  de  crustáceo  encapsulada  (G‐L‐GC).  Únicamente  la 
formulación del liposoma liofilizado cumplió los requisitos, facilitado por su menor contenido en 
agua. La dispersión liposomal también aportó cantidades considerables del sumatorio de ambos 
ácidos.  
 

Tabla 60. Contenido en ácido linoleico, ácido linolénico y sumatorio de ácido eicosapentaenoico (EPA) y 
ácido docosahexaenoico (DHA) por cada 100 Kcal de producto con liposomas. 

Producto  Muestra 
por 100 Kcal de producto 

Ác. linoleico 
(g) 

Ác. linolénico 
(g) 

EPA + DHA 
(mg) 

Dispersiones 
liposomales  

L‐V  5,20*  0,67*  ‐ 

L‐GC  5,06*  0,65*  56,97* 

Liposomas 
liofilizados  

L‐V  5,19*  0,67*  ‐ 

L‐GC  5,65*  0,72*  56,90* 

Películas 
caseinato  

P‐L‐V  2,67*  0,34*  ‐ 

P‐L‐FP1  2,62*  0,34*  ‐ 

Películas 
CMC  

P‐L‐HC‐G  4,49*  0,58*  ‐ 

Reestructurados 
merluza  

F, AP, CD, 
CD‐G, CD‐T 

1,73*  0,21  ‐ 

LF  2,09*  0,27*  ‐ 

LF‐G  1,55*  0,21*  ‐ 

A  2,34*  0,29*  ‐ 

LF‐T  1,78*  0,23*  ‐ 

Geles 
surimi  

G‐L‐V  1,98*  0,26  ‐ 

G‐L‐HC  1,94*  0,25  ‐ 

G‐L‐PG  1,93*  0,25  ‐ 

G‐L‐GC  2,01*  0,26  21,95 
 

*Formulaciones liposomales que cumplen los requisitos establecidos por los reglamentos europeos para 
cada parámetro. 

 

Por  tanto, alguno de  los productos elaborados con  liposomas puede  considerarse  fuente de 
ácidos grasos omega 3 (L‐GC liofilizado) y la mayoría de las formulaciones con un alto contenido 
en  ácidos  grasos  poliinsaturados,  destacando  como  principales  el  ácido  linoleico  y  el  ácido 
linolénico.  Entre  formulaciones,  las  dispersiones  liposomales,  los  liposomas  liofilizados  y  las 
películas comestibles son los productos que más alegaciones de salud presentan en términos de 
propiedades  aportadas  por  los  liposomas  (fosfatidilcolina),  en  comparación  con  los 
reestructurados de merluza y  los geles de  surimi, debido al efecto de dilución provocado al 
incorporar los liposomas en las matrices musculares.  

La tabla 61 muestra las cantidades diarias de ingesta necesarias de cada producto para conseguir 
el efecto beneficioso de  los diferentes compuestos. Dado que  los productos más  saludables 
(dispersiones, liofilizados y películas) son aquellos con mayores cantidades de los diversos ácidos 
grasos poliinsaturados, hace falta ingerir menos cantidad de dichos productos para obtener el 



Discusión integradora 

297 

 

beneficio asociado a sus componentes. Por tanto, estas tres formulaciones son las más rentables 
para conseguir las propiedades saludables que aportan los ácidos grasos sin tener que consumir 
cantidades diarias excesivas de producto, como podría ser el caso de  los  reestructurados de 
merluza y los geles de surimi. Sin embargo, el consumo moderado de cualquiera de estos dos 
últimos productos aportaría cantidades considerables de ácidos grasos poliinsaturados o bien 
se puede combinar la ingesta moderada de ellos junto con otros productos ricos en ácidos grasos 
poliinsaturados para obtener las propiedades beneficiosas diarias.   
 

Tabla 61. Cantidad necesaria que habría que  ingerir diariamente de cada producto con  liposomas para 
obtener los beneficios asociados a cada uno de los ácidos mostrados en la tabla.  

Producto  Muestra 
Ác. linoleico 

(10g) 
Ác. linolénico 

(2g) 
EPA + DHA 
(250mg) 

Dispersiones  
liposomales 

L‐V  341,3  533,3  ‐ 

L‐GC  340,1  529,1  754,8 

Liposomas  
liofilizados 

L‐V  36,8  57,5  ‐ 

L‐GC  36,4  57,1  90,4 

Películas  
caseinato 

P‐L‐V  97,1  151,5  ‐ 

P‐L‐FP1  108,2  168,1  ‐ 

Películas  
CMC 

P‐L‐HC‐G  56,6  88,1  ‐ 

Reestructurados  
merluza 

F, AP, CD,  
CD‐G, CD‐T 

1030,9  1666,7  ‐ 

LF  869,6  1333,3  ‐ 

LF‐G  1219,5  1818,2  ‐ 

A  736,3  1176,5  ‐ 

LF‐T  980,4  1538,5  ‐ 

Geles  
surimi 

G‐L‐V  446,4  689,7  ‐ 

G‐L‐HC  458,7  714,3  ‐ 

G‐L‐PG  458,7  714,3  ‐ 

G‐L‐GC  440,5  689,7  1006,4 

 

También hay que considerar que  las dispersiones  liposomales para el estudio de  la presente 
Memoria  se han  realizado en una  solución estándar y única, pero podría plantearse  realizar 
alguna más concentrada, si bien habría que estudiar estabilidad de las partículas en este caso. 
Así,  dispersiones  liposomales  más  concentradas  podrían  ser  adicionadas  en  matrices 
alimentarias  tipo  miosistemas  u  otras,  cumpliendo  con  los  reglamentos  para  obtener  un 
beneficio asociado. 



 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

10. CONCLUSIONES 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Conclusiones 

301 

 

Purificación y procesado 

1. La purificación de fosfolípidos de la lecitina de soja disminuyó progresivamente el contenido 
en  lípidos  neutros,  ácidos  grasos  libres  y  tocoferol,  y  condujo  a  un  enriquecimiento  del 
compuesto  mayoritario,  la  fosfatidilcolina.  Los  ácidos  grasos  predominantes  fueron 
poliinsaturados, siendo el más abundante el ácido linoleico (C18:2n6c).  

2. Los nanoliposomas producidos a partir de fosfolípidos más purificados, con sonicación fuerte 
y prolongada  y  con presencia de  glicerol  (L5A) presentaron menor diámetro de partícula,  y 
mayor estabilidad térmica y en el tiempo que el resto de liposomas estudiados. Los liposomas 
producidos  con  fosfolípidos  menos  purificados  no  perdieron  el  rango  nanométrico  y 
presentaron mayor contenido en tocoferol.  

Tratamientos de estabilización 

3. La congelación/descongelación, atomización o  liofilización de  los  liposomas  incrementaron 
notablemente el tamaño de partícula y alteraron su estructura. La adición de protectores, como 
el glicerol o la trealosa, contribuyeron parcialmente a evitar dichos efectos. El glicerol se mostró 
muy efectivo como crioprotector, mientras que ambos, glicerol y trealosa, mostraron un efecto 
lioprotector moderado. Por el contrario, un tratamiento de alta presión (600 MPa/20 °C/20 min) 
no alteró las propiedades de partícula. 

Encapsulación de bioactivos 

4. Todos los liposomas de fosfatidilcolina (L5A) rellenos de extractos bioactivos presentaron un 
tamaño  nanométrico  (90‐150  nm)  con  distribución  de  tamaños  relativamente  homogénea, 
elevada estabilidad de partícula (potencial zeta entre ‐28 y    ‐54 mV) y alta tasa de encapsulación 
del bioactivo, variando entre un 52 % y un 83 %, en función del extracto. Además mostraron una 
alta estabilidad durante al menos 3 semanas de conservación en refrigeración. 

5. El proceso de liofilización aumentó la eficacia de encapsulación y causó cambios estructurales 
en la membrana lipídica en función de la naturaleza química del compuesto encapsulado, siendo 
los  liposomas  rellenos  del  extracto  de  grasa  los  de  mayor  estabilidad  y  los  del  extracto 
polifenólico de piel‐albedo de granada  los menos estables. Sin embargo,  la  incorporación de 
cualquiera de  los extractos mantuvo  la estabilidad en el  tiempo de  los  liposomas  liofilizados 
durante su conservación y protegió de la oxidación lipídica.  

6.  Los  liposomas  mantuvieron  o  incrementaron  las  actividades  biológicas  (antioxidante, 
antihipertensiva e hipoglucemiante) propias de cada uno de los extractos ensayados. Además, 
la encapsulación en nanoliposomas permitió la determinación de la actividad antioxidante de la 
grasa de crustáceo en un sistema hidrofílico.  

7.  Los  liposomas  resistieron  la  digestión  gastrointestinal  in  vitro,  tras  la  cual  aumentó  la 
bioaccesibilidad del ácido clorogénico en liposomas con extracto acuoso de hinojo, y también la 
del  hidrolizado  de  colágeno  encapsulado,  evaluada  esta  última  en  términos  de  actividad 
antihipertensiva. 

8. La absorción intestinal in vitro del ácido clorogénico presente en el extracto acuoso de hinojo, 
determinada a través de un modelo celular de epitelio intestinal humano con células Caco‐2, fue 
del 1,5 %, siendo similar a la de la fracción libre de la dispersión liposomal.  

 



Conclusiones 

302 

 

Aplicación en matrices alimentarias 

En sistemas musculares 

9. La adición de liposomas en miosistemas de merluza y de calamar interfirió en las interacciones 
proteína‐proteína de  la matriz y aumentó  la capacidad de  retención de agua. Los  liposomas 
dieron  lugar  a  geles  más  blandos  y  menos  deformables,  pero  más  estables  durante  el 
almacenamiento en congelación.  

10.  Los  liposomas,  con  independencia  del  tipo  de  extracto  encapsulado,  favorecieron  la 
digestibilidad del gel y aumentaron su actividad antioxidante.  

11. La encapsulación de los extractos, además, se mostró como una estrategia tecnológica para 
mitigar coloraciones demasiado intensas y evitar el exudado de agua en los reestructurados. 

En películas comestibles 

12. Los liposomas resistieron el proceso de secado de las películas y su incorporación aumentó 
la  adhesividad  de  las  mismas,  sin  embargo  otras  propiedades  dependieron  del  tipo  de 
biopolímero. Así, en matrices de caseinato sódico  los  liposomas dieron  lugar a películas muy 
mucoadhesivas  y  solubles,  características que  facilitan  su  rápida disolución  en boca,  lo  cual 
podría  favorecer  su absorción a nivel oral y  sublingual. Además,  la adición de  liposomas no 
afectó  al  sabor  y  mejoró  la  palatabilidad  de  las  películas.  Por  otro  lado,  en  matrices  de 
carboximetilcelulosa los liposomas redujeron la solubilidad y aumentaron la resistencia de las 
películas, lo que permitiría su utilización como recubrimiento.  

13.  Los  liposomas  resistieron  la  digestión  gastrointestinal  in  vitro  de  las  películas  de 
carboximetilcelulosa, en mayor medida cuando el glicerol se incorporó como parte del liposoma, 
en vez de añadido como plastificante en la película, ya que contribuyó a estabilizar el tamaño y 
la morfología de los liposomas. 

 

Conclusión general 

Los  liposomas,  encapsulando  o  no  compuestos  bioactivos,  pueden  ser  utilizados  como 
ingredientes tecno‐funcionales estables y de gran versatilidad para el desarrollo de alimentos 
funcionales.  

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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12. ANEXO 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Anexo 

333 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Anexo 

334 
 

 

 

 

 

 
 

 

 

 



Anexo 

335 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Anexo 

336 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 



 

 

 

 

 

 

 


	Tesis Daniel Marín Peñalver
	PORTADA
	AGRADECIMIENTOS
	ÍNDICE
	1. RESUMEN
	2. ABSTRACT
	3. INTRODUCCIÓN
	4. HIPÓTESIS
	5. OBJETIVOS
	6. DISEÑO EXPERIMENTAL
	7. MATERIALES Y MÉTODOS
	8. RESULTADOS
	CAPÍTULO 1. PURIFICACIÓN DE FOSFATIDILCOLINA YESTANDARIZACIÓN DE LIPOSOMAS
	CAPÍTULO 2. ENCAPSULACIÓN DE COMPUESTOSBIOACTIVOS MEDIANTE LIPOSOMAS DEFOSFATIDILCOLINA DE LECITINA DE SOJA
	CAPÍTULO 3. APLICACIÓN DE LIPOSOMAS ENPRODUCTOS REESTRUCTURADOS
	CAPÍTULO 4. APLICACIÓN DE LIPOSOMAS EN PELÍCULAS COMESTIBLES

	9. DISCUSIÓN INTEGRADORA
	10. CONCLUSIONES
	11. BIBLIOGRAFÍA
	12. ANEXO


	DDña: DANIEL MARÍN PEÑALVER
	DNINIEPasaporte: 15482697V
	Programa de Doctorado: D9BA-DOCTORADO EN BIOLOGÍA
	titulada 1: NANOLIPOSOMAS A PARTIR DE PRODUCTOS NATURALES INFRAUTILIZADOS Y RESIDUOS AGROALIMENTARIOS
	y dirigida por 1: DRA. MARÍA PILAR MONTERO GARCÍA
	y dirigida por 2: DRA. MARÍA DEL CARMEN GÓMEZ GUILLÉN
	y dirigida por 3: DRA. AILÉN ALEMÁN PÉREZ
	titulada 2: COMO INGREDIENTE FUNCIONAL EN ALIMENTOS
	Facultades: [Ciencias Biológicas]
	dia: [16]
	año: [19]
	mes: [abril]