UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Juan Manuel Blanco Portillo DIRECTOR: María José Blázquez Layunta Madrid, 2015 © Juan Manuel Blanco Portillo, 2001 Ultraestructura, distribución, cuantificación de cuerpos mamilares y fibras en relación con la viabilidad embrionaria del águila perdicera ("Hieraaetus fasciatus") Departamento de Anatomía y Anatomía Patológica Comparada ^ PiU'tlZ UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID Facultad de Veterinaria. Departamento de Anatomia y Anatomia Patologica Comparada. ULTRAESTRUCTURA, DISTRIBUCION, CUANTIFICACIÔN DE CUERPOS MAMILARES Y FIERAS EN RELACIÔN CON LA VIABILIDAD EMBRIONARIA DEL ÂGUILA PERDICERA (Hieraaetus fasciatviŝ M em oria presentada por JUAN M ANUEL BLANCO PORTILLO Para optar al grado de doctor en veterinaria M adrid, 2001. Dna. M* JO SE BLANQUEZ LAYUNTA, PROFESORA TITULAR DEL DEPARTAMENTO DE ANATOMIA Y ANATOMIA PATOLOGICA COM P ARAD AS DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID CERTIFICA: Que la tesis doctoral que tiene por titulo ULTRAESTRUCTURA, DISTRIBUCION, CUANTIFICACIÔN DE CUERPOS MAMILARES Y FIBRAS EN RELACIÔN CON LA VIABILIDAD EM BRIONARIA DEL AGUILA PERDICERA (Hieraaetus fasciat\xs\ de la que es autor el licenciado en veterinaria, D. JUAN MANUEL BLANCO PO RTILLO, se ha realizado bajo mi direccion en el Departamento de Anatomia y Anatomia Patologica Comparadas de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid, el Centro de Estudios de Rapaces Ibéricas de la Junta de Comunidades de Castilla - La Mancha y el Avian Germplasm and Gamete Physiology Laboratory del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos en Beltsville. De forma adicional se ha contado con la valiosa colaboracion del Centro de Microscopia Electronica Luis Bru de la Universidad Complutense de Madrid, el Departamento de Ecotoxicologia del Institute of Terrestrial Ecology, UK y la Universidade do Algarve. Y para que conste a todos los efectos oportunos, firmo en Madrid, 10 de Diciembre del 2000. Fdo. M ̂José Blanquez Layunta A Ursula y a mis padres, sufridores de mi obsesion por conservar las rapaces AGRADECIMIENTOS Agradecimientos La regresiôn de las especies animales en peligro es, a menudo, un problema multifactorial. En la actualidad, la investigaciôn de las causas requiere sin duda una aproximaciôn multidisciplinar. Solo mediante el concurso y colaboracion de diferentes centros especializados en areas concretas de la ciencia es posible dar respuesta a los interrogantes. Son tantos los profesionales y amigos que han hecho posible este estudio que resultarâ difïcil no pecar de injusto olvidando a alguno de ellos. Gracias es poco para reconocer a la Dra. Dna. José Blanquez Layunta su incondicional apoyo en lo cientifîco y en lo humano. Sin su ciega confianza en mi, su sabiduria y consejos jamâs hubiera concluido este trabajo. Un millon de gracias al Profesor D. Javier Puerta. Sus ensenanzas sobre embriologia de las aves y su preocupaciôn por la conservaciôn de las especies amenazadas han sido de enorme ayuda, fomentando mi interés por este campo. Mi mas sincero agradecimiento al Dr. Luis Palma, profesor de la Universidade do Algarve y reconocido experto en la biologia y ecologla del âguila perdicera en Portugal. Sin su experiencia, sabios consejos y trabajo de compilaciôn de muestras, no hubiera sido posible la realizaciôn de este estudio. Mi mas sincero reconocimiento y mi gratitud personal, no solo a sus conocimientos sino también a sus esfuerzos en la conservaciôn de la especie. Gracias al Dr. Ramesh Ramachedan por sus ensenanzas en el campo de la programaciôn y anâlisis de imagen asistido por ordenador. A él y al Profesor John Proudman, Director del Department o f Endocrinology, USD A, por permitir el acceso a sus ordenadores durante largas sesiones de trabajo. Agradecimientos Al Dr. Wess Gadner sin cuya inestimable ayuda no hubiera sido posible el procesado, digitalizaciôn y archive de mas de seiscientas imâgenes de microscopia electronica. Gracias al Dr. Ignacio Fernandez Figares no solo por su arduo trabajo en el anâlisis estadistico de los datos generados, sino ademâs por su entranable amistad, consejo y ânimo en los momentos duros. Al Dr. Tom Capema, Department of Animal Nutrition, USD A, por la libertad de utilizar sus soportes informâticos. Al Dr. David Wildt, Director cientifîco del Conservation and Research Center y al Smithsonian Institution, instituciôn a la que représenta, por posibilitar econômicamente mi estancia de investigaciôn de dos anos en USA. A la Dra Ann Donoghue, responsable del Avian Germplasm and Gamete Physiology Laboratory por su aportaciôn en el terreno cientifîco, y por permitirme trabajar con entera libertad en las instalaciones de su laboratorio. Al Profesor Murray Bakst, Director del Poultry Research Laboratory, por su inestimable ayuda en la consecuciôn de algunos de los valiosos textos antiguos para una compléta revisiôn bibliogrâfîca, y la supervisiôn en el campo de la microscopia electrônica. Al Dr. George Gee, Director del Avian Physiology Department, Patuxent Wildlife Research Center, USGS, por sus sugerencias en el campo de la anatomia comparada de la cascara y membranas testaceas en especies silvestres y generosa hospitalidad. A1 Dr. David Ellis, por su amistad y valiosa colaboraciôn en la büsqueda de muestras de câscara en centros de investigaciôn de Norte America. Agradecimientos Al Dr. lan Newton del Institute o f Terrestrial Ecology, por sus consejos y sugerencias en los estudios ultraestructurales. A1 personal técnico del Centro de Microscopia Luis Bru y en especial a Alfonso por su experiencia y buen hacer durante las innumerables sesiones de trabajo, y a su Director D. Luis Puebla por el interés mostrado. A todos los biologos, veterinarios e investigadores portugueses que han posibilitado este trabajo. En especial a Barbara Fraguas, Pedro Bella y Pedro Melo, por su ayuda y amistad, ademas de su excelencia como embaj adores y guias del hermoso pais vecino. Gracias sinceras a Bernardo Arroyo y Ernesto Ferreiro por su amistad, confianza y por compartir sus preocupaciones y conocimientos sobre la conservaciôn de esta especie en Guadalajara. A Victor Matarranz y Javier Piris, escaladores profesionales que se jugaron el fisico descendiendo por un sin numéro de cortados para obtener las muestras de la poblaciôn castellana. Los he visto suspendidos como aranas en el aire realizar su trabajo en tiempo récord con seguridad pasmosa. Mi carino y agradecimiento a toda la guarderia de Ciudad Real y en especial a Eutimio, Antonio y Pedro sin cuya ayuda hubiera sido imposible concebir este estudio. Ellos conocen mejor que nadie la problematica del âguila y fueron los primeros en observar que algo extrafio le sucedia. Gracias a los biôlogos Nicolâs Guzmân y José Ramos, por su excelente trabajo de seguimiento de las poblaciones y por tantas jomadas de campo escudrinando en la vida del âguila perdicera. Agradecimientos Al Servicio de Medio Ambiente de Ciudad y en especial a D. Victor Diaz por su confianza en la investigaciôn y su riguroso y tenaz trabajo por la conservaciôn de la especie en la provincia de Ciudad Real. Su trabajo es un ejemplo para todos. Mi gratitud a la Consejeria de Medio Ambiente y a su Director General D. Alberto Sâiz por su sensibilidad hacia los problemas de las grandes rapaces en Castilla - La Mancha. A sus técnicos y en especial a D. Rafael Ruiz y D. Javier Martin por su apuesta por la investigaciôn en el ârea de la conservaciôn. Gracias a todo el equipo del Centro de Estudios de Rapaces Ibéricas por su comprensiôn y ânimo en la realizaciôn de este estudio. Gracias a Sophia Fuentes y Heath Harley por su ayuda en la recopilaciôn de bibliografïa. Gracias a mi familia: padres y hermanos, por lo que de santidad conlleva padecer mi obsesiôn por la conservaciôn de las aves rapaces. Gracias por vuestro calor humano, comprensiôn, paciencia y en muchos casos fînanciaciôn. A mi padre, amigo y mecenas, que observa las âguilas desde abajo y desde arriba. A mi madré por todo y m âs... A Ursula, mi aima gemela, faltan palabras para agradecerte la realizaciôn y diagnôstico de los exâmenes post-mortem de embriones, el procesado de multitud de câscaras, tu experiencia en el campo de la patologia, tus consejos, tu compania, tu paciencia, tu aliento,... A las âguilas por soportar nuestras intromisiones en su territorio con estoicismo. Por dejamos entrar en su vida y mostramos la belleza de su mundo. Con la Agradecimientos esperanza de que las conclusiones de nuestras investigaciones y nuestro trabajo puedan ayudar a su conservaciôn. INDICE JUSTIFICACION.......................................................................................................1 OBJETIVOS................................................................................................................ 7 REVISION BIBLIOGRAFICA...............................................................................9 LMORFOLOGIA; ESTRUCTURA, ULTRAESTRUCTURA, Y COMPOSICIÔN DE LA CASCARA.................................................................10 1.1 .Matriz organica................................................................................................. 11 1.1.1. Membranas de la cascara.............................................'.........................12 1.1.2. Protuberancias o cuerpos mamilares....................................................15 1.1.3. Matriz de la cascara................................................................................16 1.1.4. Cuticula.................................................................................................. 17 1.1.5. Cubierta mucilaginosa........................................................................... 18 1.1.6. Diferencias interespecificas y particularidades en las aves rapaces.......................................................................................................19 1.2. Capas de cristalizacion.................................................................................... 20 1.2.1. Capa mamilar.......................................................................................... 20 1.2.2. Capa de empalizada................................................................................22 1.2.3. Capa de cristalizacion externa.............................................................. 22 1.2.4. Diferencias interespecificas.................................................................. 22 II. FORMACIÔN DE LA CASCARA Y PROCESOS METABÔLICOS ASOCIADOS..............................................................................................24 ILL Formacion de las membranas de la cascara................................................ 24 11.2. Calcificacion de la cascara y su regulaciôn................................................ 24 11.3. Regulaciôn del métabolisme del calcio.......................................................26 111.3.1. Fuentes de calcio................................................................................. 26 111.3.2. Regulaciôn hormonal y renal del calcio........................................... 27 111.3.3. Metabolismo de la vitamina D ...........................................................28 111.3.4. Movilizaciôn del calcio ôseo.............................................................. 29 III. POROS EINTERCAMBIO GASEOSO....................................................29 111.1. Morfologia, estructura y flincion de los poros..........................................29 111.2. Conductancia y variaciones interespecificas............................................. 31 IV. CASCARA Y DESARROLLO EMBRIONARIO....................................33 IV.l.Oxigeno: disponibilidad, consume y desarrollo embrionario..................33 IV.2.Metabolismo y regulaciôn del transporte del calcio................................. 34 V. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FORMACION, ESTRUCTURA Y COMPOSICIÔN DE LA CASCARA..................................................................35 V .l. Fisiolôgicos y de manejo...............................................................................35 V.2. Genéticos y de desarrollo embrionario........................................................ 36 V.3. Nutricionales................................................................................................... 37 V.3.1. Hipo e hipervitaminosis....................................................................... 37 V.3.2. Deficiencias y excesos minérales........................................................ 38 V.3.3. Lipidos y aminoâcidos......................................................................... 40 V.3.4. Derivados de plantas y microorganismos..........................................40 V.4. Ambientales.................................................................................................... 41 V.4.1. Temperatura y altitud........................................................................... 41 V.4.2. Ecotoxicolôgicos...................................................................................42 V.5. latrogénicas..................................................................................................... 46 V.6. Infecciosas........................................................................................................47 VI. MÉTODOS DE EVALUACIÔN DE LA CALIDAD DE LA CÂSCARA.............................................................................................................48 VI. 1. Fisicos y Quimicos....................................................................................... 48 VI.2. Morfolôgicos y estructurales....................................................................... 49 MATERIAL Y M ETODOS.....................................................................................51 L MATERIAL BIOLÔGICO......................................................................52 IL PROBLEMATICA DETECT ADA.........................................................56 III. AREAS GEOGRÂFICAS OBJETO DE ESTUDIO............................ 58 IV. PERIODO DE ESTUDIO.........................................................................59 V. CRITERIOS DE SELECCIÔN Y PARÂMETROS REPRODUCTIVOS DE PAREJAS EXAMINADAS....................................... 60 VI. TOMA DE MUESTRAS, TIPO Y CLASIFICACIÔN........................ 61 VII. CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES NORMALES, VALORES DE REFERENCIA Y CORRELACIÔN ENTRE MAGNITUDES.. .63 VI. 1. Tratamiento y anâlisis ultraestructural de la muestra............................. 63 VI. 1.1. Localizaciôn y extracciôn................................................................. 63 VI. 1.2. Preparaciôn para anâlisis mediante microscopia electrônica de barrido y registre grâfico..................................................................................64 VI.2. Obtenciôn de medidas y anâlisis de imagen asistido por ordenador.. . 66 VI.3. Establecimiento de valores de referencia de la especie.............................73 VI.3.1. Criterios de selecciôn........................................................................... 73 VI.3.2. Establecimiento de valores de referencia..........................................74 VI.4. Tendencias y correlaciones entre magnitudes............................................74 VIII. VARIACIÔN DE LOS PARÂMETROS ESTABLECIDOS EN FUNCIÔN DE FACTORES FISIOLÔGICOS, INDIVIDUALES, GEOGRÂFICOS Y CLIMATOLÔGICOS,GENÉTICOS E INMUNOLÔGICOS....................................................................................75 IX. DETERMINACIÔN DE LOS NIVELES DE TÔXICOS AMBIENTALES EN CONTENIDO DE HUEVOS COMO BIOINDICADORES...................................................................................78 VIII. 1. Preparaciôn de la muestra....................................................................... 78 VIII.2. Anâlisis toxicolôgico..................................................................................78 VIII.2.1 .Organoclorados...................................................................................79 VIII.2.2. Bifenilos policlorados...................................................................... 81 VIIL2.3. Metales pesados................................................................................82 VIIL3.Anâlisis estadistico..................................................................................... 83 X. DOCUMENTACIÔN DE ESTADIOS EMBRIONARIOS Y RELACIÔN CON PARÂMETROS ULTRAESTRUCTURALES...............84 IX. 1. Criterios de selecciôn de embriones........................................................84 IX.2. Toma de medidas y obtenciôn de valores de referencia. Clasiflcaciôn de estadios embrionarios................................................................84 IX.3. Relaciôn con parâmetros ultraestructurales y anâlisis estadistico 86 RESULTADOS........................................................................................................... 87 I. CARACTERISTICAS MORFOLÔGICAS Y ULTRAESTRUCTURALES NORMALES DE LA CÂSCARA, ESTABLECIMIENTO DE VALORES DE REFERENCIA Y CORRELACIÔN ENTRE MAGNITUDES........................................... 88 1.1. Caracteristicas de la muestra obtenida.......................................................... 88 1.2. Establecimiento de valores de referencia de la especie para las magnitudes descritas............................................................................................... 89 1.2.1. Tamano de la muestra seleccionada......................................................89 1.2.2. Establecimiento de valores de referencia............................................. 89 1.3. Tendencias y correlaciones entre variables cuantitativas y no cuantitativas...................................................................................................112 II. DETERMINACIÔN DE LA VARIACIÔN DE LOS PARÂMETROS ESTABLECIDOS EN FUNCIÔN, GEOGRÂFICOS Y CLIMATOLÔGICOS,GENÉTICOS E INMUNOLÔGICOS 124 II. 1. Factores geogrâficos y climatolôgicos.....................................................124 II. 1.1. Nùcleo poblacional............................................................................124 II. 1.2. Altitud del area de cria...................................................................... 126 II.2. Factores genéticos e individuales...............................................................126 IL3. Factores inmunolôgicos e infecciosos......................................................... 127 III. DESCRIPCIÔN DE ALTERACIONES ULTRA­ ESTRUCTURALES..............................................................................................128 IV. DETERMINACIÔN DE LOS NIVELES DE TÔXICOS AMBIENTALES EN CONTENIDO DE HUEVOS COMO BIOINDICADORES..................................................................................134 IV. 1. Tamano de la muestra analizada.................................................................134 IV.2. Anâlisis toxicolôgico................................................................................... 134 IV.2.1 .Organoclorados..................................................................................... 134 IV.2.2. Bifenilos policlorados......................................................................... 140 IV.2.3. Estudio de los niveles de Mercurio...................................................140 IV.3. Estudio comparativo entre poblaciones..................................................... 142 IV.4. Relaciôn de los niveles de tôxicos entre si y con los parametros ultraestructurales de la câscara..............................................................................143 V. DOCUMENTACIÔN DE ESTADIOS EMBRIONARIOS Y RELACIÔN CON PARAMETROS ULTRAESTRUCTURALES................. 144 V .l. Tamano y caracteristicas de la muestra....................................................... 144 V.2. Caracteristicas de los diferentes estadios embrionarios............................145 V.3. Correlaciôn entre parâmetros de desarrollo.................................................149 V.4. Correlaciôn entre desarrollo embrionario y parâmetros de la cascara.. 150 DISCUSIÔN................................................................................................................ 152 I. CARACTERISTICAS MORFOLÔGICAS Y ULTRAESTRUCTURALES, VALORES DE REFERENCIA Y CORRELACIÔN ENTRE MAGNITUDES.......................................... 153 1.1. Valores de referencia para la especie........................................................... 153 1.2. Tendencias y correlaciones entre magnitudes. .....................................169 II. VARIACIÔN DE LOS PARÂMETROS ESTABLECIDOS EN FUNCIÔN DE FACTORES FISIOLÔGICOS, INDIVIDUALES, GEOGRAFICOS Y CLIMATOLOGICOS,GENETICOS E INMUNOLÔGICOS................................................................................. 177 ILL Factores fisiolôgicos..................................................................................... 177 IL L 1. Edad de la hembra.............................................................................. 177 IL 1.2. Estado nutricional................................................................................. 179 IL 1.3. Grado de estres...................................................................................... 181 IL2. Factores geogrâficos y climatolôgicos......................................................... 182 II.2.1. Nucleo poblacional.............................................................................182 IL2.2. Temperatura durante los dias de puesta............................................. 184 II.2.3. Altitud del area de cria........................................................................184 II.3. Factores genéticos e individuales..................................................................185 IL4. Factores inmunolôgicos e infecciosos.......................................................... 186 III. DESCRIPCIÔN DE ALTERACIONES ULTRAESTRUCTURALES................................................................................ 186 IV. TÔXICOS AMBIENTALES EN CONTENIDO DE HUEVOS COMO BIOINDICADORES................................................................................ 189 IV. 1. Anâlisis toxicolôgico..................................................................................189 IV. 1.1 .Organoclorados...................................................................................189 IV. 1.2. Bifenilos policlorados.......................................................................192 IV. 1.3. Mercurio.............................................................................................192 IV.2. Tôxicos y aspectos ultraestructurales de la câscara y membranas testâceas....................................................................................................................194 V. DOCUMENTACIÔN DE ESTADIOS EMBRIONARIOS Y RELACIÔN CON PARÂMETROS ULTRAESTRUCTURALES........................................196 V. 1. Causas de posibles anomalias en el desarrollo embrionario detectadas en el âguila perdicera.................................................................................................. 196 V.2. Desarrollo embrionario y parâmetros ultraestructurales de la câscara. .199 V.3. Tiempo de incubaciôn y desarrollo embrionario...................................... 200 CONCLUSIONES..................................................................................................... 202 RESUMEN.................................................................................................................. 205 SUMMARY................................................................................................................. 208 b i b l i o g r a f ï a ...................................................................................................... 210 FIGURAS ANEXO FOTOGRAf ICO JUSTIFICACION Justificaciôn Naci fascinado por el mundo de las aves rapaces. El huevo de las aves, quizâ por su aparente simplicidad e independencia, siempre me ha parecido un éxito evolutive. Sin embargo, los anos de observaciôn del comportamiento matemo en las aves, y mis estudios sobre incubaciôn artificial han convertido mi creencia en una duda razonable. Citaremos algunos ejemplos que motivan nuestra duda. Variaciones minimas en la humedad relativa del aire en la sala de incubaciôn, repercuten de forma inmediata en la pérdida diaria de peso del huevo. Rotaciones inadecuadas en numéro o grades, dan lugar a un aumento en la incidencia de malposiciones y mortalidad embrionaria. Excesos o defectos en la temperatura producen un efecto similar. ^Cômo puede la hembra controlar esta ingente cantidad de factores?. En mi corta experiencia he visto a hembras de âguila raspar la superficie del huevo con el pico, quien sabe si para aumentar la conductancia y llevar a buen termine el desarrollo embrionario. En ocasiones, las hembras en la naturaleza incuban de forma intermitente en los ultimes dias, incluse he tenido la oportunidad de verlas dando sombra a los hue vos durante un tiempo prudencial. Los estudios demogrâficos indican que el âguila perdicera ha sufrido una regresiôn importante durante la pasada y présente década. En 1996, en Castilla - La Mancha, rigurosos estudios de campo, apuntaban la existencia de parejas con un historial de fracaso reproductor constatado. Poniamos entonces en marcha el présente estudio, con el objetivo de investigar algunas de las causas de infertilidad en esta especie. A la amplia y compleja toma de muestras en campo, le siguieron exâmenes post-mortem de embriones, lavar, clasificar, procesar,.... Luego vendrian muchas horas de estudios de microscopia electrônica, seguidos de complejos anâlisis toxicolôgicos, y de imagen asistido por ordenador realizados durante mis dos afios de estancia en Estados Unidos. Justificaciôn No éramos los primeros, y en este trabajo necesitariamos ayuda. En 1989, se editaba “The avian egg” una obra de los doctores Burley y Vadehra que ha sido de consulta obligada y referencia en este campo en los ùltimos diez anos. En la cuarta linea de su prefacio se hace referencia al estudio cientifîco que sobre el huevo realizaron los doctores Alexis y Anastasia Romanoff, un tratado cientifîco escrito en 1949. Durante mi estancia en Estados Unidos, gracias a un excelente cientifîco, consegui tener en mis manos uno de los originales, en su dedicatoria se lee: “A todos los cientifîcos cuyos estudios sobre el huevo han hecho posible escribir este libro”. Esto signifîcaba que los estudios sobre la estructura de la câscara habian comenzado mucho antes. Continuando esta vision retrospectiva, en 1892, Collier relaciona por primera vez el calcio con el grosor de la câscara. En 1871, Von Nathusius indica que el grosor de la câscara es caracteristico de cada especie y puede utilizarse con criterios taxonômicos. Este autor da a conocer la primera tabla comparativa que aùn hoy se emplea como referencia. Comprobé como la exhaustiva descripciôn de la morfologia de las membranas testâceas realizada por Thomson en 1859, incluia très partes dentro de la membrana extema, las mismas que vemos en el âguila perdicera en 1999. Fascinante, mâs de un siglo de riguroso estudio que sin duda ha sido vital para este trabajo. He de reconocer que la curiosidad me pudo, y la primera vez que abri el tratado de los Romanoff, lo primero fue indagar sobre los cuerpos mamilares. Como si de una profecia se tratara pude leer: “ las mamilas estân estrechamente unidas pared con pared formando un solo estrato. Sus polos estân achatados y en los lados tienen como indentaciones que encajan unas con otras, estando ademâs cementadas para formar una rigida, aunque frâgil, base para las capas mâs extemas de la câscara”. Por aquel tiempo, nada hacia sospechar al autor, que fîieran las alteraciones en estas “columnas del edificio”, las que pudieran estar causando problemas en el Justificaciôn âguila perdicera como se pone de manifiesto en nuestro estudio. No obstante, en la pâgina anterior de este tratado, aparece un grâfico en el que curiosamente se detalla la estructura de esta capa en el Aepyomis, una especie ya extinta cuyo huevo triplica en tamano al de avestruz. En los estudios sobre la câscara, en especies salvajes, la capa de los cuerpos mamilares siempre fue la cenicienta. Los numerosos trabajos sobre los efectos del DDT (Bitman et al, 1969, Grier, 1982), y los postreros sobre PCBs (Peter Lowe), o mercurio (Lundholm, 1995), tan solo informaban de reducciones en el grosor total de la câscara. Hubo que esperar hasta 1982, para que Leach y Gross describieran las primeras alteraciones en esta capa. Consistian en la formacion de mamilas grandes e irregulares, probablemente debido a la fusion de varias mamilas, durante fases tempranas de la formacion del huevo. El hallazgo fue descrito en relaciôn con la deficiencia de manganeso en gallinas. Curiosamente, en el mismo articule se indaga sobre la composiciôn de la matriz orgânica revelando una disminuciôn de hexosamina y âcido hexurônico. Comienza a tomar relevancia el proceso de biomineralizaciôn que da lugar a la câscara. Hasta entonces las miradas se habian centradô fundamentalmente en el grado de cristalizaciôn. En 1992, Arias y colaboradores realizan una caracterizaciôn bioquimica e inmunoquimica de la matriz orgânica indicando que, a nivel de los cuerpos mamilares, se compone fundamentalmente de keratân sulfato y pequenas cantidades de dermatân sulfato. Gautron y colaboradores (1996), en la introducciôn a su excepcional trabajo sobre la matriz soluble de la câscara, citan: “ La matriz orgânica facilita la nucleaciôn y régula el crecimiento de los cristales, se considéra que contribuye a las propiedades ultraestructurales y cristalogrâficas del tejido mineralizado”. Un afio mâs tarde, sus trabajos destacan la presencia de diferentes proteinas precursoras de matriz en el fluido uterino, que varian en funciôn del estadio en el proceso de biomineralizaciôn. Justificaciôn El présenté estudio monogrâfico, tiene entre sus objetivos, el establecimiento de los valores considerados como normales en la actualidad para ciertos paramètres estructurales en la câscara del âguila perdicera. No flie tarea fâcil. En aves domésticas, es bien conocida la variaciôn individual (Romanoff, 1929), genética (Taylor and Martin, 1928), o nutricional (Norris et al, 1934). Del amplio espectro de muestras obtenidas, se seleccionaron aquellas procedentes de parejas con historial reproductor intachable. A esto ahadimos exhaustives estudios toxicolôgicos, incluyendo determinaciôn de niveles de PCBs, DDT y metabolites, metales pesados, etc., con el objeto de eliminar aquellas en las que aparecieran niveles significatives. La segunda parte consistiô en un diagnôstico preliminar de la causa de aparente ffagilidad de los huevos de ciertas parejas y de la mortalidad embrionaria. Los correspondientes estudios de microscopia electrônica y los trabajos estadisticos pertinentes quedan reflejados en este estudio. El circule no se ha cerrado, los resultados de nuestro estudio revelan la cara visible del problema, lo describen y delimitan. No obstante, la causa primaria es todavia una incôgnita. La büsqueda continua, y en el memento de escribir esta tesis estâmes pendientes de establecer una colaboraciôn con la universidad de Cleveland, Ohio, para estudiar los proteoglicanos en los cuerpos mamilares de la câscara del âguila perdicera. Mientras tante, las âguilas calvas descendientes de los huevos que, a principios de los ochenta, se incubaron artificialmente debido a la ffagilidad ocasionada por el DDT, parecen tener nuevos problemas. Los biôlogos han detectado que, tras los très o cuatro primeros anos de reproducciôn, el éxito reproductor disminuye notablemente en puntos de la costa este americana. Lo contrario sucede de forma normal en aves rapaces. Como veterinario para fauna amenazada de la Junta de Comunidades de Castilla - La Mancha he podido comprobar el aumento del numéro de parejas que se reproducen sin éxito en los ùltimos afios. ^Qué esta pasando?, i Es éste Justificaciôn fenômeno tan solo parte de un ciclo, o hay algo mâs detrâs?. Es nuestra responsabilidad detectar nuestros errores y corregirlos para que no vuelvan a suceder. Que los que nos preceden puedan seguir pasando tardes inolvidables observando estas majestuosas aves. OBJETIVOS Obietivos 1. Describir las caracteristicas morfologicas y ultraestructurales normales de la câscara del huevo de âguila perdicera {Hieraaetus fasciatus), delimitar el range de les valores de referenda para la especie, estableciendo les patrones normales. 2. Estudiar los factores ecotoxicolôgicos en el âguila perdicera, utilizando el contenido y câscara de huevos no eclosionados y eclosionados, como bioindicadores. 3. Determinar el grado de correlaciôn entre los parâmetros establecidos, y su variaciôn en funciôn de factores: Fisiolôgicos, individuates, geogrâficos, y ecotoxicolôgicos. 4. Describir las alteraciones ultraestructurales de la câscara présentés en poblaciones de âguila perdicera y elaborar hipôtesis sobre su posible etiologia. 5. Documentar diferentes estadios embrionarios en el âguila perdicera. Establecer valores de referenda en medidas predeterminadas representativas, y estudiar su grado de correlaciôn con parâmetros morfolôgicos y ultraestructurales de la câscara. REVISION BIBLIOGRÂFICA Revision Bibliogrâfica I. MORFOLOGIA. ESTRUCTURA, ULTRAESTRUCTURA. Y COMPOSICION PE LA CÂSCARA En 1949 Alexis y Anastasia Romanoff, describen con sumo acierto, la câscara del huevo de las aves como una cubierta relativamente suave, dura y calcârea, adherida a la superficie externa de dos membranas. Seguidamente, los autores afirman que tan firme es la adhesion, que no pueden separarse sin cierta dificultad. Ambas estructuras estân estrechamente relacionadas, pasando a describirse en combinacion con la câscara (Simons y Wiertz, 1963; Vadehra y Nath, 1973; Burley y Vadehra, 1982). En la ultima edicion de “Avian Physiology” (Sturkey, 1999), Johnson incorpora las membranas de la câscara como parte de la matriz orgânica de la misma, de modo que seguiremos esta estructura en nuestra revision bibliogrâfica. La câscara es una estructura mineralizada altamente especializada, que protege al embriôn frente a danos fïsicos, microorganismos, e incluso pequenos predadores. La câscara es esencial para el desarrollo embrionario, y a que permite un adecuado intercambio gaseoso (Tazawa y Whittow, 1999). Ademâs, posee la conductividad térmica adecuada (Burley y Vadehra, 1982). Desde el punto de vista de su composiciôn quimica, la câscara del huevo de gallina consta de un 97.4% de solidos, 1.65 % de agua siendo el resto proteinas (incluyendo glycoproteinas) y algunas trazas de lipidos (Romanoff y Romanoff, 1949). Estudios realizados en la câscara del huevo de avestruz han revelado que contiene hasta un 0.019% de lipidos, en su mayoria fosfolfpidos (Kriesten et al., 1979). Estructuralmente, la câscara aparece a simple vista como una estructura simple, consistente en una lâmina calcificada recubierta en su cara extema por una fina cuticula, y horadada por poros. En su cara interna, posee ademâs dos 10 Revision Bibliogrâfica membranas descritas por los primeros microscopistas (Baudrimont y Martin-St- Auge, 1847; von Nathusius, 1868). Los estudios de microscopia electronica han revelado con posterioridad, complicados detalles intuidos por estos investigadores (Camarius et aL, 1996). La câscara se forma partiendo de una ffaccion orgânica que se biomineraliza, mediante el deposito de cristales de carbonato câlcico. Este proceso de biomineralizaciôn da lugar a un conglomerado, cuya estructura y composiciôn ocupan el presente capitulo. 1.1. MATRIZ ORGÂNICA La matriz orgânica incluye las membranas extemas de huevo, y constituye aproximadamente un 3.5% del total del peso de la câscara. La matriz orgânica, dentro de la capa calcificada, représenta un 2% (Gautron, 1996) y estâ bâsicamente formada por proteinas y polisacâridos ricos en grupos sulfato (Krampitz y Graser, 1988; Arias et al., 1993). Pese a la pequena fracciôn que representan en el total de la câscara, su presencia es critica en la formaciôn y resistencia de la misma. Tras la descalcificaciôn, las fracciones solubles e insolubles han sido disociadas en distintas proteinas (Hincke et al., 1992). Proteinas como la ovocleidina han sido purifîcadas hasta la homogeneidad (Hincke et al, 1995), la cual se ha demostrado origina de las células de la glândula coquilaria. En el fluido uterino, donde la calcifîcaciôn tiene lugar, parecen encontrarse determinados precursores de la matriz orgânica, los cuales pueden influir notablemente en la calcifîcaciôn (Gautron y Nys, 1993). En 1996, los mismos autores demostraron que la adiciôn in vitro de extractos intraminerales de câscara, modifîca la morfologia de la calcita. Este hallazgo clarifîca el papel de la matriz orgânica en el control del crecimiento y la estructura cristalogrâfica de la câscara de huevo. A continuaciôn, procedemos a 11 Revision Bibliogrâfica describir de forma detallada la matriz orgânica en diferentes localizaciones dentro de la câscara. 1.1.1. Membranas de la câscara Se trata de dos membranas, interna y extema, de diferente grosor (20pm y 60pm respectivamente) (Simons y Wiertz, 1965), adyacentes en toda su extension salvo a nivel del polo achatado del huevo, donde se separan para formar la câmara de aire (Leach, 1982). Estas membranas son permeables a los gases (Wangensteen et al., 1970), y poseen importantes funciones: circunscriben el albumen, sirven de anclaje a la membrana corioalantoidea durante la embriogénesis (Dunn y Fitzharris, 1987), y actuan como barrera ffente a la penetracion de las bacterias. Para este ultimo cometido, ambas membranas contienen lisozima (Vadehra et al, 1972), mientras que la b-N-acetilglucosaminidasa, otra enzima antibacteriana, solo se ha encontrado en la membrana extema (Winn y Ball, 1975). Se originan en la region del istmo pero aun existen dudas sobre si son las células epiteliales, o las tubulares glandulares, las que secretan estas fibras (Johnson, 1999). Su peso y resistencia estân sujetos a una variaciôn individual importante, segun se desprende de los estudios de Cooke y Balch (1970). Ambas difieren en su composiciôn quimica, por ejemplo el âcido y-Carboxiglutâmico no se detecta en la membrana extema, y si en la intema (Blake y Kling, 1984). La pequena cantidad de lipidos présentes en la câscara se encuentra en las membranas, fundamentalmente fosfolipidos: lecitina, cefalina, esfîngomielina y lisolecitina, pero también lipidos neutros como mono, di- y triglicéridos, ademâs de colesterol y ésteres (Hasiak, 1970). Se han observado variaciones con la edad, y las membranas de huevos de gallinas viejas contienen menos lipidos que las de jôvenes (Hasiak, 1970). Existe evidencia de la presencia de desmosina e isodesmosina en concentraciones cercanas al 0.1% (Starcher y King, 1980; Leach et al., 1981; 12 Revision Bibliogrâfica Youtz et al., 1984). Leach, en 1982, propuso una estructura hipotética para la protema de las fibras en la que las cadenas de péptidos se entrecruzan mediante puentes disulfuro y derivados de lisina. Picard et al. en 1973, aislaron mediante digestion enzimâtica diferentes glicopéptidos, acompanados de residues de serina y treonina. Wong et al. (1984), demostraron que estas membranas en la gallina, contienen pequenas cantidades de proteina similar al colâgeno tipo I y V, constituyendo cerca de un 0.6% del total de la protema de estas membranas. Hoy se conoce la existencia de moléculas colâgeno tipo X que se hallan entrecruzadas. Mediante la administraciôn de p-aminopropionitrilo, se ha podido demostrar que dichos cruzamientos juegan un papel importante en la estructura de las fibras (Arias et al., 1997). Los mismos autores han confirmado la presencia de colâgeno tipo I y V, asi como pequenas cantidades de dermatân sulfato, mediante técnicas de microanâlisis de energia dispersa. Femândez et al. (1997), han detectado la presencia de colâgeno tipo X, en los primeros estadios de formaciôn de la las membranas. Ultraestructuralmente, las fibras de la membrana extema varian en diâmetro entre 0.4 y 3.6 pm, mientras que las intemas no exceden los 2 pm (Bellairs y Boyde, 1969) en la gallina. En su interior, estas fibras constan de mâs de un cuerpo por fibra, rodeados de un espacio interfibrilar, esencialmente lipidos (Tullett, 1987), y una cubierta extema rica en carbohidratos (Wybum et al., 1973; Vadehra y Nath, 1973; Tranter y Board, 1982). En la superficie intema de la membrana intema del huevo de gallina, se ha observado una membrana denominada limitante, cuya funciôn séria retener el albumen al tiempo que posiblemente dirigir el crecimiento del corioalantoides durante el desarrollo embrionario (Bellairs y Boyde, 1969). S in embargo, parece que esta capa pueda ser caracteristica de los Galliformes (Becking, 1975). De igual modo, se ha descrito la existencia de una capa de cemento albuminoso, entre las fibras de la membrana intema (Brown et al, 1965). 13 Revision Bibliogrâfica Tabla 1: Composiciôn de la cuticula y las membranas testâceas en el huevo de gallina. Compilado de los datos procedentes de Vaehra y Nath (1973), Baker y Balch (1962), y Cooke y Balch (1970a). % en Materia seca Membranas de la câscara Componente Cuticula Mb Externa Mb Interna Ceniza Nitrôgeno Azufre Fôsforo 2.95 15.94 0.20-0.23 0.008-0.022 2.64 3.10 0.0025-0.0028 1.87 2.80-3.00 0.0028- 0.0038 PROTEINAS Total Soluble, 1% KOI Soluble en agua Insoluble 85-87 4.80-6.50 2.50-3.00 75-78 93-96 1.50-2.00 1.00-1.50 91-93 88-92 3.40-4.50 1.50-2.50 83-85 LIPIDOS 2.50-3.50 3.50-4.20 1.90-2.70 CARBOHIDRATOS Total Glucosa Hexosamina Galactosa Acido siâlico Acido urônico Ésteres sulfato 5 3.80-4.10 3.60 2.87 7.80-8.40 0 0 1.90-2.0 6.30-6.40 1.65-1.70 6.30-6.35 14 Revision Bibliogrâfica Tabla 2: Grosor de las membranas testâceas en diferentes especies de aves. (Romanof y Romanof, 1949). Especies Mb externa (mm) Mb interna (mm) Cociente E/l Avestruz 0.12 0.08 1.5 Cisne 0.11 0.05 2.0 Pavo 0.09 0.01 5.3 Polios Brahma 0.07 0.02 3.0 Leghorn 0.05 0.01 3.0 Bantam 0.04 0.01 4.0 Codorniz 0.06 0.00 7.5 La presencia de una estructura lamelar en la superficie extema de la membrana se ha observado en el polio, el pato, la codomiz y el pavo. Existen también fibras transversales que unen ambas membranas, asi como fibras que unen la membrana extema con la capa de los cuerpos mamilares (Bellairs y Boyde, 1969). 1.1.2. Protuberancias o cuerpos mamilares La matriz orgânica présenté a éste nivel puede dividirse en dos partes: los nùcleos situados en el centro de las protuberancias mamilares, y la que forma parte de las mamilas como taies (Simkiss y Tyler, 1957). Los nùcleos son proyecciones de la superficie de la membrana extema propuestas como lugares iniciales de la calcificaciôn. En la gallina pesan una media de 3.3 g por huevo, y se componen de carbohidratos incluyendo galactosamina (0.06%), glucosamina (0.86%), glucosa (0.24%), manosa (0.42%), fucosa (0.125) y galactosa (0.26%) (Salevsky y Leach, 15 Revision Bibliogrâfica 1980), Los mismos autores han detallado la composiciôn en aminoâcidos de estos nùcleos, encontrândose un total de diecinueve, entre los cuales cuantitativamente destacan cisteina, glutâmico y lisina. Los nùcleos mamilares estân aparentemente formados por interacciones covalentes y no covalentes, entre las fibras de la membrana de la câscara y la matriz de los cuerpos mamilares (Robinson y King, 1968; Bellairs y Boyde, 1969). La naturaleza de la proteina de estos nùcleos no se conoce, pero su estudio résulta de especial interés, ya que permiten la entrada de agentes capaces de producir la descalcificaciôn durante la incubaciôn del embriôn. Los estudios de microscopia electrônica muestran que la matriz orgânica, a nivel de los cuerpos mamilares, es una red de fibras de un espesor aproximado de 0.008pm, en la gallina, con pequenas vesiculas adheridas. Esta matriz orgânica de los cuerpos mamilares, esta compuesta fundamentalmente por proteina. En 1992 Hincke et al., mediante estudios cromatogrâficos, determinaron la existencia de una proteina de 81 Kda, y dos mâs pequehas de 38 y 54 Kda ligantes de calcio, asi como una cuarta insoluble de 129 Kda. Los proteoglicanos y glucosaminoglicanos, juegan un papel fundamental en la matriz orgânica de la câscara. Los estudios inmunohistoquimicos realizados por Arias et al. en 1992, revelan la presencia de cantidades pequenas de dermatân sulfato en esta capa. Por el contrario, si existen cantidades importantes de keratân sulfato como rasgo caracteristico de esta capa. Mediante anticuerpos frente a moléculas de glucosaminoglicanos, se ha verificado que estos se encuentran distribuidos en la matriz calcificada de la câscara, lo que sugiere que estén implicados en la deposiciôn de materia mineral (Arias, 1992). 1.1.3. Matriz de la câscara Ultraestructuralmente se trata de una red de fibras gruesas de aproximadamente 0.01 pm de diâmetro y 10 pm de longitud, organizadas paralelamente a la superficie de la câscara (Simons y Wiertz, 1963). Como en 16 Revision Bibliogrâfica otras areas de la matriz, esta lleva asociada una serie de vesiculas que en la gallina tienen un diâmetro aproximado de 0.4 pm, y que aparentemente contienen aire (Becking, 1975). Su funciôn no es bien conocida, si bien, pueden actuar como aislante, o bien influir en el intercambio gaseoso (Becking, 1975). Quimicamente consiste en una serie de capas de proteina y mucopolisacâridos, sobre la cual tiene lugar la cristalizaciôn para dar lugar a la capa de empalizada. Représenta aproximadamente un 2% del total de la composiciôn proteica de la câscara, y es una estructura fundamentalmente proteica (70%). En ella se han identificado, no sôlo proteinas fijadoras de calcio, sino también anhidrasa carbônica. Contiene también carbohidratos (11%) (Baker y Balch, 1962), ademâs de condroitin sulfato, xylosa, galactosa y âcido hialurônico (Cook y Balch, 1970; Robinson, 1976). Mediante gel de fîltraciôn y cromatografia de intercambio iônico se han separado mâs de un total de veinte proteinas y proteoglicanos (Krampitz y Engels, 1975; Heaney y Robinson, 1976). 1.1.4. Cuticula Es una capa fina, de grosor variable a lo largo de su extensiôn, que cubre la superficie extema del huevo. Su espesor se ha cifrado entre 5 y 10 pm (Romanoff y Romanoff, 1949), si bien El-Boushy et a l (1968) han sugerido un espesor medio de 30 pm. Ultraestmcturalmente, en la gallina, puede describirse como una capa irregular, que contiene vesiculas que contribuyen a su aspecto. En el interior de las vesiculas mâs pequenas hay grânulos que se cree puedan tener que ver con la pigmentaciôn. Simons y Wiertz (1963), constataron que el numéro de vesiculas disminuye con la edad del huevo, incrementando su tamano y suavizando su superficie. La cuticula présenta ademâs grietas radiales, algunas de ellas sobre los poros (Marshall y Cruickshank, 1938). Durante su formaciôn se observan dos o 17 Revision Bibliogrâfica mâs capas, que posteriormente a la ovoposiciôn son difïciles de discemir (Wybum, 1973). Los pigmentos estân efectivamente confinados en esta capa (Kennedy y Vevers, 1976), y son fundamentalmente derivados pirrôlicos no unidos covalentemente a la câscara. Se han citado très fondamentales : protoporfîrina (produce color marron), biliverdina IX a ( da lugar a verdes y azules) y su quelato de zinc (Baird et al., 1975). La mayoria de los huevos de color bianco contienen pequenas cantidades de pigmentos (Kennedy y Vevers, 1973). Se ha sugerido que, estmcturalmente, los pigmentos pueden conferir una cierta estabilidad por su efecto compactante de los cristales de calcita (Salomon, 1987) En 1936 Moran y Haie, afirmaron que esta capa estaba compuesta por células conteniendo mucina. Hoy se conoce que el 90% de ella es proteina, fundamentalmente insoluble, junto con un pequefio porcentaje de carbohidratos (glucosa, hexosamina, galactosa, âcido siâlico o âcido urônico) y lipidos. El peso de la cuticula en un huevo de gallina de 60 g es 12 mg (Parson, 1982). Su funciôn se ha asociado a la capacidad para repeler el agua, y posiblemente, controlar la pérdida de vapor de agua en condiciones de extrema sequedad (Board y Halls, 1973). Aùn existe controversia sobre su posible papel antimicrobiano. La eliminaciôn de la cuticula mediante lavado aumenta la perdida de agua del huevo durante la incubaciôn, pero no parece tener efectos negativos en la tasa de eclosiôn (Peebles et al., 1998). 1.1.5. Cubierta mucilaginosa Los huevos de algunas especies de aves presentan esta capa adicional situada inmediatamente sobre las capas calcifîcadas (Smith, 1958; Board et al., 1984). En algunas especies ocupa el lugar de la cuticula y puede estar mineralizada. Ultraestmcturalmente se compone de nôdulos que, segun lo descrito por Tullet et al. (1976), estân compuestos por vaterita, la forma de cristalizaciôn 18 Revision Bibliogrâfica mâs inestable del carbonato câlcico. Los mismos autores han sugerido que la funciôn de esta capa puede ser la de evitar el bloqueo de los poros. 1.1.6. Diferencias interespecificas y particularidades en las aves rapaces En cuanto al diâmetro de las fibras que componen las membranas de la câscara. Becking en 1985, encontrô diâmetros similares en nueve especies distintas. El mismo autor en 1975, comparô el numéro de vesiculas présentés en la matriz orgânica de la câscara de diversas especies de aves. Los resultados indicaron que existen en mayor numéro en especies tropicales, lo que ha dado pie a pensar que se trata de una adaptaciôn cuyo fin es facilitar el intercambio gaseoso. La composiciôn en macromoléculas solubles de la matriz orgânica varia con las especies, e incluso con las razas (Krampitz y Engels, 1975; Heaney y Robinson, 1976). La cuticula puede estar présente como en el huevo del pato, ser discontinua como en el caso de la gallina, o estar ausente como en la paloma (Board, 1974). Su grosor total varia con las especies (von Nathusius, 1868). La variaciôn en el contenido en pigmentos en.las diferentes especies es ciertamente asombrosa. De un total de 108 especies estudiadas, correspondientes a 48 familias, Kennedy y Vevers (1973), encontraron que 49 especies contienen tan solo protoporfîrina, 33 protoporfîrina y biliverdina, 17 contienen los très pigmentos, dos contienen biliverdina o protoporfîrina mâs su quelato de zinc, y cinco carecen de los très mencionados. Existe gran variaciôn en la presencia o ausencia de la cubierta de vaterita en los huevos de diferentes especies de aves. Por ejemplo, esta capa ha sido descrita en aves como el pelicano, mientras que no aparece en otras. Puede que su presencia responda a una adaptaciôn para evitar la oclusiôn de poros, que puede producirse con facilidad en el ambiente en que los huevos de estas especies son incubados. 19 Revision Bibliogrâfica El grosor de las membranas de la câscara varia con las especies. En general, aquellas especies con grosores importantes de la câscara presentan membranas fînas; mientras que câscaras fînas se acompanan de membranas muy gruesas, como sucede en el pavo o la codomiz. I.2.CAPAS DE CRISTALIZACIÔN La porciôn calcificada de la câscara puede dividirse arbitrariamente en très capas: mamilar, de empalizada y de cristalizaciôn superficial. Son responsables de la fortaleza mecânica de huevo y consisten, en un 97%, en materia inorgânica, fundamentalmente carbonato câlcico en forma de pequenos cristales de calcita (Board, 1982). Aunque el calcio es el catiôn prédominante, también contiene cantidades significativas de magnesio. Este se localiza fundamentalmente en la capa de los cuerpos mamilares, posiblemente debido a que juega un papel esencial en la sintesis de mucopolisacâridos. 1.2.1. Capa mamilar Esta capa constituye un 20-35% del total del grosor de la câscara y su contribuciôn a la fortaleza global de la misma es fundamental. Constituye los pilares esenciales donde se inicia la cristalizaciôn y crecimiento de las capas posteriores. La cristalizaciôn radial, partiendo de los nùcleos mamilares, da lugar a la formaciôn de los cuerpos mamilares. De forma adicional, los cristales crecen desde el fondo de los nùcleos mamilares de forma radial hacia el exterior, para penetrar la membrana testâcea extema. Entre los lugares de contacto, quedan espacios que comunican entre si formando toda una red aérea de canales, denominada sistema de ventilaciôn intermamilar (Romanoff y Romanoff, 1949). Su formaciôn tiene lugar en la glândula coquilaria, durante las primeras cinco horas de la calcificaciôn. El paso de agua hace que las fibras se encojan aumentando la distancia entre las fibras de la membrana. Los cristales, que crecen 20 Revision Bibliogrâfica de forma lateral, eventualmente contactai! con otras mamilas, mientras que aquellos que crecen hacia el exterior pueden alcanzar la superficie de la câscara. En determinadas localizaciones, los cristales no crecen totalmente unidos dando lugar a poros con un diâmetro de 0.3 a 0.9 pm. Tabla 3: Dimensiones de los cuerpos mamilares en diferentes especies de aves (Blasius, 1867; von Nathusius, 1874; y Burley y Vadehra, 1989). Especie Area de secciôn (mm2) Polio 0.0072-0.0163 Ansares Anser anser Anser cinereus Anser segetum Anser cygnoides Cereopsis novae hollandiae 0.021-0.024 0.023-0.025 0.0145-0.015 0.014 0.015 Palomas Columba livia domestica Columba turtur Columba palumbus Columba oenas Columba livia sera 0.011-0.014 0.0072-0.0074 0.0083-0.0098 0.011-0.012 0.013-0.014 Cuervos Corvus corone Corvus cornix 0.0094-0.0103 0.00055-0.0071 Son estructuras sobre las cuales radica el comienzo de la cristalizaciôn de la câscara. Su morfologia, tamano, distribuciôn, y la presencia de anomalias contribuyen en cierta medida a la fortaleza final de la câscara. Grandes espacios 21 Revision Bibliogrâfica entre los mismos pueden dar lugar a una excesiva debilidad. Lo mismo sucede cuando aparecen fisuras en su base. Por estas razones, son esenciales para el correcte desarrollo del embriôn. Las mamilas son estructuras estrechamente interrelacionadas con las membranas testâceas. El carâcter de dicha uniôn, mediante la imbricaciôn de fibras de la membrana extema en los lugares de nucleaciôn provee de una fortaleza digna de resenar. 1.2.2. Capa de empalizada o capa espongiforme Esta estmctura se compone de pequenos cristales de carbonato câlcico en forma de calcita, de 20-30 pm de diâmetro, en el huevo de la gallina (Perrott et al., 1981). Los cristales se agmpan formando columnas romboédricas de calcita, directamente sobre los cuerpos mamilares, y perpendicularmente a la superficie (Silyn-Roberts y Sharp, 1986). Esta capa es la responsable fimdamental de los patrones de difracciôn de rayos X, técnica mediante la cual se hâ demostrado que se vuelve mâs densa conforme avanza hacia el exterior. La capa de empalizada es densa, atravesada por numerosos canales microscôpicos, distribuidos de forma irregular. La matriz orgânica no esta uniformemente distribuida, siendo mâs abundante en la base. 1.2.3. Capa de cristalizaciôn externa La estmctura de esta capa es mâs densa que la capa de empalizada, y se situa perpendicular a la superficie de la câscara. El grosor de esta varia entre 3 y 8 pm en la gallina (Burley y Vadehra, 1989). 1.2.4. Diferencias interespecificas El grosor total de la câscara se ha utilizado como clasificaciôn taxonômica (von Nathusius, 1871). Existen diferencias importantes entre las especies 22 Revision Bibliogrâfica altriciales y las precociales en el grosor de la câscara. En las primeras el grosor es muy inferior a las segundas, por lo que el peso total de la câscara es mucho menor. Las localizaciones del calcio y el magnesio dentro de la matriz inorgânica parecen variar en funciôn de las especies. En el polio y otras galliformes el magnesio se concentra en dos lugares: la capa de los conos y la superficie de la câscara. S in embargo, en otros 19 ôrdenes de aves, este compuesto se localiza exclusivamente en la primera de estas localizaciones (Board y Love, 1980). La capa de los cuerpos mamilares es prâcticamente la ùnica en especies con câscaras muy finas como la golondrina (Romanoff y Romanoff, 1949). En el huevo de cada especie, la forma, el tamano de las mamilas y su organizaciôn interior son caracteristicas. El rango del ârea de estas mamilas es tan reducido para cada especie, que Nathusius (1874), describiô que el ârea de una secciôn transversal de la mamila, puede servir para discemir entre especies similares. Existen variaciones significativas en la orientaciôn de los cristales de la capa de empalizada. Los cristales en el huevo de avestmces y emues estân perfectamente orientados, mientras que esa orientaciôn se ve perturbada en la gallina. En la mayoria de las especies la orientaciôn es paralela a la superficie, mientras que en la gallina se encuentran mayoritariamente formando 45° (Silyn- Roberts y Sharp, 1985). En algunas especies, como las gaviotas o los pelicanos, la matriz no aparece en estrechas bandas longitudinales y transversales. El tamafio y forma de los poros se ha utilizado para distinguir entre especies muy prôximas, y sugerir la relaciôn entre otras como avestmces y emues. Estas especies tienen un amplio rango de formas inusuales (Board, 1982), incluyendo poros bifurcados y poros con multiples aperturas 23 Revision Bibliogrâfica II. FORMACION DE LA CASCARA Y PROCESOS METABOLICOS ASOCIADOS II.l. FORMACIÔN DE LAS MEMBRANAS DE LA CÂSCARA Las membranas se depositan sobre la superficie del albumen en el istmo. Hoffer (1971), y Draper et a l (1972), en la codomiz y el polio respectivamente, han descrito que este proceso tiene lugar en el istmo glandular, durante cerca de 60 min.. Las células tubulares glandulares se encargan de la sintesis de la protema, mientras que las células epitéliales no ciliadas son las responsables de la sintesis de los carbohidratos. Las fibras parece se liberan debido a la presiôn que ejerce el huevo en su descenso (Solomon, 1975). La encima lysil oxidasa, precursora del aldehido de lisina responsable de la formaciôn de enlaces cmzados desmosina-isodesmosina, se ha localizado en el istmo (Harris et a l , 1980). IL2. CALCIFICACIÔN DE LA CÂSCARA Y SU REGULACIÔN La calcificaciôn comienza en la uniôn del istmo con la glândula coquilaria, 0 regiôn tubular de la glândula de la câscara. En la gallina, el huevo permanece aqui unos 15 a 30 min.. Los nùcleos mamilares son los lugares iniciales de la calcificaciôn. Fuji y Tamura (1970), y Stemberger et a l (1977), han demostrado que uno de los primeros signos de calcificaciôn es la apariciôn de pequenos grânulos en la superficie extema de la capa extema. Estos grânulos contienen calcio, pero no carbonato, sino posiblemente citrato del que existe gran cantidad en el oviducto (Taylor y Hertelendy, 1960). La mayor parte de la calcificaciôn se produce en la glândula de la câscara durante 20 horas. En primer lugar, los fluidos empapan el albumen y este crece hasta llegar al volumen normal en el huevo. Este fluido, se ha comprobado 24 Revision Bibliogrâfica mediante gel de electroforesis que contiene 7 a 9 bandas proteicas, ademâs de anhidrasa carbônica, fosfatasa âcida y actividad esterasa (Salevsky y Leach, 1980). Gauton et a l (1997), han descrito dos glicoproteinas de 80 y 43 kDa en la fase inicial de la formaciôn de la câscara. Posteriormente, en la fase de formaciôn râpida de la câscara, aparecen cuatro proteinas de 180, 150, 116 y 32 kDa que coprecipitan con carbonato câlcico in vitro. En este estadio aparecen adicionalmente dos glicoproteinas de 36 y 20 kDa . Contiene ademâs sales de bicarbonate sôdico, cloruro sôdico, cloruro câlcico y cloruro potâsico. Se trata pues de un reservorio de iones para la câscara, a la que pasan a formar parte a una velocidad de deposiciôn de 300 mg a la hora en la gallina (Bradfleld, 1951). El calcio proviene en parte de la comida (Hurwitz y Griminger, 1962), mientras que un 30% a 40% proviene de la esponjosa de los huesos que actuan como reservorio ( Kyes y Potter, 1934; Müller et a l, 1969). El suministro de calcio depende también de su transporte, que se lleva a cabo ligado a proteinas, mientras que la porciôn en soluciôn es reducida. La transferencia de este calcio desde la sangre hasta la câscara ha sido revisada en profundidad por Eastin y Spaziani (1978). S in embargo, existen aspectos aùn desconocidos. Lundholm en 1984, descubriô una fracciôn microsômica que contiene los grânulos secretores de calcio de la glândula coquilaria en el pato. En 1985 Yamamoto et a l , determinaron que el calcio para la câscara se transporta activamente en la glândula, transporte que depende de la actividad ATP asa. Las mitocondrias en esta glândula pueden jugar un papel fundamental como fuente de energia. En lineas genéticas de gallinas con câscara fina, se ha detectado una actividad de esta enzima inferior a la de las gallinas con câscara gruesa. Esto puede indicar que estas lineas genéticas varian en su capacidad de utilizar el calcio (Watanabe et a l, 1989). El carbonato proviene de los iones bicarbonate de la sangre (Simkiss, 1967). La anhidrasa carbônica juega un papel fundamental en la calcificaciôn. 25 Revision Bibliogrâfica proveyendo de iones carbonato en el lugar de la cristalizaciôn (Burley y Vadehra, 1989). La forma como los cristales de carbonato crecen y se orientan no es bien conocida, existiendo dos teorias que difieren en su esencia. La primera confiere a las proteinas de la matriz la virtud de dirigir e iniciar el crecimiento de los cristales (Silyn-Roberts y Sharp, 1986). La segunda propone un crecimiento por epitaxia, si bien da importancia a las proteinas de los conos mamilares. Del mecanismo que contrôla el cese de la cristalizaciôn se conoce aun menos. Tullett et al., en 1976, destacaron la importancia del fôsforo en este proceso, basando sus aseveraciones en el hecho de que el fosfato interflere en la cristalizaciôn y su concentraciôn aumenta en la parte extema de la câscara. Sin embargo, estudios posteriores por Board et a l (1984), parecen inclinarse hacia un control por parte de la matriz orgânica. Las prostaglandinas pueden estar implicadas en el movimiento del calcio en la glândula de la câscara. La progesterona estimula la sintesis de prostaglandinas PGf2 alpha, PGB2 y TXB2 en homogeneizados de mucosa de la glândula. Lundholm en 1984, indagô en el papel de la progesterona, demostrando que no altera los niveles de calcio en la glândula. Finalmente, la cuticula se forma también mientras el huevo se encuentra todavia en la glândula, apareciendo cuando el crecimiento del huevo tan solo se ha completado en un 50%, lo que hace sospechar que no interflere en el paso de sustancias a la câscara. II.3. REGULACIÔN DEL METABOLISMO DEL CALCIO 11.3.1 Fuentes de calcio El calcio para la formaciôn de la câscara proviene de la sangre, teniendo como fuentes primarias la absorciôn intestinal a nivel de duodeno y yeyuno, y la resorciôn ôsea del hueso medular, pero también del cortical en caso de defîciencia. La importancia relativa de estas dos fuentes depende de la concentraciôn del calcio 26 Revision Bibliogrâfica en la dieta. Sin embargo, cuando la formaciôn del huevo no coincide con consumos de comida, como durante las fases de oscuridad, el hueso se convierte en la fuente primaria de calcio. Mongin y Sauveur (1974), demostraron que el consumo voluntario de calcio por parte de la gallina aumenta durante la fase de formaciôn del huevo. Existiendo la opciôn, el ave siempre elige aquella dieta que tiene un mayor contenido en calcio (Etches, 1987). 11.3.2. Regulaciôn hormonal y rénal del calcio El calcio en sangre se encuentra en su mayoria ligado a proteina pero también en forma ionizada. El aumento de estrôgenos durante las semanas anteriores a la puesta, hace aumentar el calcio sérico, via el aumento de las proteinas a las que se liga: vitelogenina y albumina, pero no al aumento de la fracciôn difusible. La disminuciôn de los niveles de estrôgenos dan lugar a una disminuciôn del grosor de la câscara. Durante la ovoposiciôn, las concentraciones de calcio ionizado se elevan, alcanzando mâximos cuatro horas después de la ovoposiciôn, para decrecer durante el periodo de la calcifîcaciôn. Por el contrario, las concentraciones totales de calcio oscilan minimamente durante el ciclo de puesta. (Johnson, 1999). Siendo cierto el papel de los estrôgenos en el ciclo de puesta y sus repercusiones, las investigaciones llevadas a cabo por Curl et a l (1985), ponen de manifîesto que las concentraciones de estrôgenos y progesterona en plasma, durante las seis horas antes de la ovulaciôn, no estân altamente relacionadas con la calidad de la câscara en la gallina. En relaciôn con estos aspectos, las investigaciones llevadas acabo por Soh y Koga (1994), demuestran que la progesterona produce un incremento en el acümulo de pigmentos en la glândula, mientras que estrôgenos y testosterona carecen de tal efecto. La hormona paratiroidea ejerce un papel fundamental en la regulaciôn del calcio, aumentando sus niveles durante el periodo de formaciôn de la câscara para 27 Revision Bibliogrâfica descender mâs tarde (Van de Verde, 1984). Sin embargo, se ha comprobando que esta hormona no régula los niveles de proteinas ligantes de calcio a nivel de la glândula durante la ovoposiciôn (Nys et a i , 1986). El rinôn de las aves se adapta durante la puesta para proveer el calcio necesario para la formaciôn de la câscara. Estos cambios consisten en un aumento de la actividad adenilatociclasa, dependiente de la hormona paratiroidea, la elevaciôn del numéro de receptores de esta hormona y el incremento de la sintesis de vitamina D3. Hoy se conoce que los estrôgenos regulan el sistema adenilatociclasa, dependiente de la hormona paratiroidea, ademâs del numéro de receptores a nivel renal para dicha hormona (Elaroussi, 1993). La hormona paratiroidea actùa, estimulando la absorciôn de calcio y la excreciôn de fôsforo en los tùbulos renales. Por otra parte, en el rinôn el aumento preovulatorio en los niveles de estrôgenos se traduce en un incremento de la actividad de la 1-hidroxilasa, lo que da lugar a un aumento en los niveles del metabolito de la vitamina D3, encargado de la regulaciôn del métabolisme del calcio. n.3.3. Métabolisme de la vitamina D La vitamina D juega un papel importante en la regulaciôn del métabolisme del calcio, via el metabolito l,25-(OH)2 D3. La conversiôn a esta forma tiene lugar mediante la hidroxilaciôn de la 25-hidroxivitamina D3 en el rinôn, bajo control de la hormona paratiroidea y el estradiol (Soares, 1984). Cuatro horas antes de la ovulaciôn, se produce un aumento de los niveles de éste metabolito en sangre, que persisten hasta 10 horas después de la ovulaciôn (Castillo et a l, 1979). En 1985 Rambeck y Zucker, demostraron que los metabolitos 1, 25 y 24, 25 actuan de forma sinérgica en la cantidad de calcio excretada en la câscara. La resorciôn del calcio ôseo esta regulada por la hormona paratiroidea, asi como por la vitamina D3. Esta ultima también facilita la absorciôn de calcio a nivel intestinal. Se ha demostrado que los metabolitos de la vitamina D3 no 28 Revision Bibliogrâfica regulan ni los niveles de proteinas ligantes de calcio, ni el transporte de este ion en la glândula de la câscara (Bar et al., 1984). IL3.4. Movilizacion del calcio ôseo El hueso medular se forma en la hembra durante los ültimos 10 dias antes de la ovoposiciôn, bajo la influencia de los estrôgenos y la testosterona. Los esteroides gonadales parecen actuar directamente sobre la médula, independientemente del consumo de calcio (Johnson, 1999). Durante la ovulaciôn, se alteman périodes de intensa formaciôn medular con périodes de depleciôn. Mediante radioisôtopos, en 1985 Van de Velde et al., demostraron que la cantidad de matriz de hueso medular aumenta de forma linear en la codomiz, entre las 4 y 22 horas después de la ovulaciôn. III. POROS E INTERCAMBIO GASEOSO MORFOLOGIA, ESTRUCTURA, DISTRIBUCIÔN Y FUNCIÔN DE LOS POROS Son agujeros a través de la capa calcificada, aperturas de los canales que atraviesan la câscara. Presentan diferente tamano, de grandes a muy pequenos, y su distribuciôn es irregular. Microscôpicamente son irregulares y con forma de embudo. El sistema de poros lleva acabo la misiôn fundamental de permitir el paso de oxigeno, y la salida de C02 y vapor de agua. La forma del poro influye en la difusiôn gaseosa, fundamentalmente controlada por la porciôn mâs estrecha (Toien, 1987). La câscara de la gallina contiene de 7.000 a 17.000 poros, con un diâmetro entre 15 y 65 pm en el exterior y 6 y 23 pm en el interior (Tyler, 1956; Simkiss y Taylor, 1971). Los poros no se hallan uniformemente distribuidos, lo que posiblemente contribuye a maximizar la fortaleza de la câscara (Tyler, 1955). El 29 Revision Bibliogrâfica numéro de poros varia entre especies, asi el pato posee un numéro mâs elevado que la gallina. El numéro de poros varia mucho, incluso dentro de la misma especie, sin embargo es ciertamente constante en el mismo individuo (Almquist y Holst, 1931; Romanoff, 1943). Black y Tyler (1944), encontraron que el primer huevo de la secuencia contiene un menor numéro de poros que los siguientes. Dentro de la superficie de un mismo huevo, los poros son mâs numerosos en el ecuador y en el polo achatado (Romanoff, 1949). Los canales son ùnicos en la mayoria de las especies. Sin embargo, en algunas especies extintas como el moa (Dinornis crasus), o contemporâneas como el avestruz, estas estructuras son bifurcadas terminando en un grupo de poros dentro de la misma concavidad (von Nathasius, 1871). Esta caracteristica de algunos huevos de especies altriciales, se ha asociado a una necesidad de ventilaciôn adicional en relaciôn con huevos grandes (Board, 1980). Algunos de los poros son ciegos, pero la abrasiôn de la superficie durante la incubaciôn hace que se destapen, incrementando la porosidad de la câscara (Bryant y Sharp, 1934). Tabla 4: Dimensiones mâximas y minimas de los poros en superficie de la câscara de diferentes especies de aves. (Romanof y Romanof, 1949). Especie Rango de tamano de poros Poro màximo (mm) Poro minimo (mm) Avestruz Cisne Pavo Pato Gallina Faisan Garceta Gaviota 0.05x0.05 0.042x0.038 0.055x0.037 0.036x0.031 0.029x0.022 0.014x0.012 0.090x0.057 0.016x0.013 0.02x0.02 0.029x0.026 0.037x0.031 0.014x0.012 0.011x0.009 0.013x0.010 0.011x0.006 0.011x0.010 30 Revision Bibliogrâfica Los poros pueden estar parcialmente obstruidos por la cuticula y por estructuras especiales (Board, 1980), incluyendo esferas de materia orgânica o inorgânica. En la gallina estân cubiertos por esferas de material proteinâceo (Tyler y Geake, 1953). Se ha demostrado que el numéro de poros se reduce en la misma especie a altitudes superiores (Rahn et a l, 1977; Packard et a l , 1977). La reducciôn es proporcional al descenso en la presiôn, y se baraja la posibilidad de que sean los cambios en la presiôn sanguinea los que actûen como serial modificadora (Carey, 1980). III.2. CONDUCTANCIA Y VARIACIONES INTERESPECIFICAS Los poros son la ùnica via de comunicaciôn para el intercambio de moléculas entre el embriôn en desarrollo y el medio extemo. Su nùmero y radio efectivo incrementa con la masa del huevo (Ar y Rahn, 1985). El volumen total de gases intercambiados es grande. Por ejemplo, hasta el Jiempo de la eclosiôn, un total de 20 litros pasan por la câscara de un huevo de 80 g. Las reglas que gobieman este intercambio se adecuan mâs a la primera ley de Fick que a la ley de Stefan. No obstante, Simkiss (1986), propone que la ley de Stefan es mâs adecuada en el caso de huevos con poros en clara forma de embudo. La conductancia y el flujo son directamente proporcionales al nùmero de poros. Esta relaciôn sugiere que la conductancia de los poros en su individualidad es similar en las diferentes especies, asi como la cantidad de oxigeno y vapor de agua que fluye por los mismos (Rahn et a l, 1987). Estos autores mostraron que, tras correlacionar el nùmero de poros por huevo en un total de 161 especies con su masa, la tendencia fue similar (0.77), lo que sugiere que los flujos de oxigeno y vapor de agua son muy parecidos. En un momento preciso de la incubaciôn, las propiedades de difusiôn de la câscara deben excederse para proveer la 31 Revision Bibliogrâfica concentraciôn adecuada de CO2 en la câmara de aire (6%), lo que estimula la respiraciôn pulmonar en el embriôn (Windle et a i, 1938; Visschedijk, 1968). Aunque el intercambio gaseoso del huevo con el exterior se realiza fundamentalmente por difusiôn, la naturaleza no equimolar de estos flujos da lugar a flujos adicionales por convecciôn, que crean una sobrepresiôn en el interior del huevo (Paganelli y Rahn, 1987). Los efectos sobre el intercambio gaseoso de dietas déficientes en calcio 0 la adiciôn de acetazolamida han sido estudiados por Bebout y Hempleman (1994). Estos autores han indicado que la conductancia aumenta un 30% en las dietas déficientes en calcio y se acompana de reducciones de hasta un 21% en el grosor de la câscara. El numéro de poros no se ve afectado de forma significativa. La acetazolamida aumenta un 200% la conductancia, ya que no sôlo disminuye el grosor de la câscara, sino que también aumenta el numéro de poros. Este ejemplo da una idea de la repercusiôn que los efectos de determinadas sustancias pueden tener en la câscara, y por ende en el intercambio gaseoso necesario para el embriôn. La distribuciôn de los poros en la câscara varia con las especies. Un gran nùmero de aves poséen una mayor densidad en el ecuador y el polo achatado, mientras que lo contrario sucede en otras especies (Tullett y Board, 1977). Rahn et al. en 1987, comprobaron que al comparar el flujo de vapor de agua y la conductancia en 131 especies, con el nùmero de poros en esas mismas especies, éstas dieron con un valor de conductancia de poro igual a 1.5 pg/ (d.torr)' \ Estos valores y la pérdida de vapor de agua se han determinado en varias especies, correspondientes a diferentes ôrdenes de aves incluyendo: Sphenisciformes, Proceellariformes, Pelicaniformes, Ciconiformes, Galliformes, Anseriformes, Charadriformes y Paseriformes (Rahn et al., 1987). Aquellas especies que tienen su hâbitat a grandes altitudes han reducido su conductacia para adaptarse al medio. Este fenômeno se consigue mediante la 32 Revision Bibliogrâfica reducciôn en el numéro de poros, acompanada de un aumento en el grosor de la câscara, tal y como se ha constatado en algunas aves andinas (Carey et al., 1987). IV. CÂSCARA Y DESARROLLO EMBRIONARIO La câscara y las membranas testâceas experimentan una serie de cambios quimicos durante la embriogénesis. Estes cambios estân relacionados con la difusiôn de gases y el aporte de calcio al embrion. IV .l. OXIGENO, DISPONIBILIDAD, CONSUMO Y DESARROLLO EMBRIONARIO El aire y el vapor de agua entran y salen del huevo a través de los poros de la câscara. Las membranas testâceas son imperméables al albumen, pero dejan pasar los gases. Durante la incubaciôn, el embrion necesita un suministro de oxigeno que se ha cifrado en 30 ml/h en la gallina (Tullett y Deeming, 1982); al mismo tiempo, ha de liberarse del CO2 sin perder excesiva humedad. Los huevos de todas las especies pierden aproximadamente un 15 ± 2.55% del peso inicial durante la incubaciôn, con independencia del tiempo de incubaciôn, o el peso del huevo en cuestiôn (Rahn y Ar, 1980). Durante anos se ha destacado la importancia de la porosidad de la câscara, entendida como numéro de poros y espesor de la misma, en el correcto desarrollo del embriôn. Pero, de acuerdo con Simkiss (1980), el papel de estas estructuras se ha sobredimensionado. El embriôn es capaz de adaptarse a cambios importantes en el ambiente, por lo que se sospecha existen otros mecanismos por los cuales el embriôn puede realizar estas adaptaciones. Para satisfacer las necesidades crecientes de oxigeno, - la membrana corioalantoidea actua como un pulmôn, gracias a la importante red de vasos que 33 Revision Bibliogrâfica soporta. Adicionalmente, la câscara se hace mâs permeable al oxigeno por razones aun no muy claras (Burley y Vadhera, 1989). IV.2. METABOLISMO Y REGULACIÔN DEL TRANSPORTE DE CALCIO La mayoria del calcio necesario para el esqueleto del embrion dériva de la câscara. En el polio este porcentaje se ha cifrado en el 78 a 82% (Simkiss, 1961), mientras que en la codomiz se han referido valores de hasta el 84.2% (Ono y Wakasugi, 1984). El resto del calcio proviene del vitelo. La membrana corioalantoidea es la encargada de disolver y transportât el calcio durante la incubaciôn. Esta membrana no contacta con la câscara hasta el dia 10 de incubaciôn; es entonces cuando el calcio se transporta primeramente al vitelo y de alli al embriôn. El mecanismo de solubilizaciôn del calcio no es bien conocido, si bien es posible que las células de la membrana se ayuden de la secreciôn de âcidos. Terepka et al. (1969), han propuesto que el transporte inicial se realiza por endocitosis, evitândose asi los problemas de niveles elevados de calcio libre. Los estudios realizados por Tuan (1987), demuestran que este transporte especifîco de calcio se realiza mediante el concurso de una proteina transportadora de calcio, la Ca2+ AT? asa y la anhidrasa carbônica al servicio de un mecanismo de endocitosis. Se apunta la posibilidad que la misma câscara y sus membranas inicien el movimiento del calcio. En 1984 Wakasugi, encontrô que la câscara contribuye también a pro veer un 23.5% del total del magnesio que necesita el embriôn. El mecanismo de absorciôn y transporte de magnesio parece ser distinto al del calcio, utilizando una proteina transportadora distinta. 34 Revision Bibliogrâfica V. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FORMACION, ESTRUCTURA Y COMPOSICION DE LA CÂSCARA V .l FISIOLÔGICOS Y DE MANEJO El progresivo adelgazamiento de la câscara con la edad ha sido descrito si bien no se conocen los factores exactos que contribuyen a este fenômeno, si bien se sabe que puede paliarse en cierta manera suplementando la dieta. Tras la inducciôn de la muda, la captaciôn de calcio por las células del duodeno aumenta mientras que el grosor de la cascara disminuye. Harms (1990), comprobô que el peso de la câscara y la gravidez especifîca en los huevos de gallina puestos durante la manana es superior a los obtenidos durante el resto del dia. A lo largo de esta revision hemos ido refiriendo el hecho de que existe un gran numéro de caracteristicas de la câscara que varian notablemente en funcion de la especie, pero algunas de ellas como el numéro de poros varian entre individuos de la misma especie siendo ciertamente constante para un mismo individuo. Del mismo modo el grosor total de la câscara varia dentro de un rango pequeno (Romanoff y Romanoff, 1949). El ayuno se utiliza de forma habituai en el manejo de las aves domésticas para inducir ciertos procesos como la muda. Koelkebeck et al. (1992), demostraron que periodos de ayuno de diez dias o superiores pueden dar lugar a un incremento en la calidad de la câscara. Los estudios de El-Boushy et al. (1968), revelan que im ambiente hùmedo y caluroso da lugar a un adelgazamiento de la câscara, la cuticula dégénéra, las mamilas se redondean en su base y las columnas de calcita pierden su orientaciôn habituai desarrollando cavidades. El estrés del calor excesivo da también lugar a una disminuciôn en la producciôn de huevos y las caracteristicas de la câscara. Este fenômeno, no sôlo se debe a la alteraciôn del equilibrio âcido base y los 35 Revision Bibliogrâfica niveles de calcio, sino que ademâs parece disminuir la capacidad de las células duodenales para el transporte de calcio lo que résulta un factor critico en la disponibilidad de calcio (Mahmoud, 1996). Los efectos del estrés sobre la gallina ponedora han sido revisados por Hughes et al. (1986). Aparentemente incluso los cambios mâs insignificantes en el ambiente dan lugar a anomalias. En funciôn del momento en el que se produzca el estrés, las alteraciones varian. Si se produce durante los primeros estadios de formaciôn da lugar a alteraciones en la forma del huevo mientras que en estadios avanzados se produce coloraciôn rosâcea o aspecto de cubierta de polvo, dependiendo del tiempo que hayan pasado retenidos. V.2. GENÉTICOS Y DE DESARROLLO EMBRIONARIO Se ha comprobado que variaciones mitocondriales pueden contribuir a variaciones fenotipicas en polios como puede ser el grosor de la câscara de huevo (Aggrey e/a /., 1998). En 1982 Hunton, concluye afirmando, que la variaciôn en la calidad de la câscara depende en un 58% de factures genéticos, siendo posible modificarla mediante cruzamientos. Segùn avanza el proceso de incubaciôn, el embriôn va absorbiendo el calcio de la câscara lo que se traduce en un adelgazamiento de la misma. El peso de la câscara disminuye durante la incubaciôn en aproximadamente un 5% en el polio (Simkiss, 1967). Algunos estudios indican que este adelgazamiento se produce fundamentalmente en el ultimo cuarto de la incubaciôn (Vandersoep y Richards, 1970). S in embargo algunos estudios en especies salvajes como el pelicano {Pelecanus occidentalis), o diversas especies de grullas indican que esta disminuciôn no es significativa 36 Revision Bibliogrâfica V.3. NUTRICIONALES V.3.1. Hipo e hipervitaminosis Dosis elevadas de âcido ascôrbico, entre 2.000 y 3.000 ppm, se han sugerido como capaces de mejorar notablemente el peso especifîco de los huevos, coincidiendo con un incremento en el nivel de calcio en sangre. Los estudios de Orban et a l (1993), indican que la vitamina C influencia el metabolismo del calcio en la gallina, favoreciendo la mineralizaciôn de la câscara. Mas tarde en 1995 Zapata y Gemat, sugieren que niveles de vitamina C entre 250 y 500 ppm producen un incremento en el peso de la câscara. Posteriormente en 1996 Keshavarz, concluyo afirmando que el âcido ascôrbico carece de efectos beneficiosos sobre la calidad de la câscara o la mineralizaciôn ôsea. Balnave et a l (1990), demuestran que la adiciôn de âcido ascôrbico no consigne impedir los efectos negativos de la inclusiôn de cloruro sôdico en el agua de bebida. Del mismo modo, la vitamina C, a la dosis de 100 ppm, no alterô los efectos de la adiciôn de 0.1% tiouracilo en la dieta (Peebles et a l, 1992). El suplemento de la dieta en gallinas con 6.8 a 15 pg de la-0H -D 3, se ha comprobado que reduce el consumo de comida, la calidad de la câscara y la producciôn de huevos. S in embargo, dosis inferiores, o el uso de su precursor 25- 0H-D3 no produjeron efecto adverso alguno (Soares et a l, 1982). La supresiôn de la vitamina D3 de la dieta de gallinas ponedoras dio lugar, tras dos semanas, a un descenso en los niveles de calcitriol y en el peso especifîco de los huevos. Doblando el aporte de vitamina D3 en la dieta, no se produjo efecto alguno sobre los parâmetros mencionados. La sustituciôn de la vitamina D3 por el nivel ôptimo de calcitriol mejorô el peso especifîco después de 21 semanas de tratamiento, sin elevar el nivel total de calcio o calcitriol en sangre (Tsang y Grunder, 1993). 37 Revision Bibliogrâfica Gallinas alimentadas con dictas déficientes en vitamina K, no dieron lugar a problemas reproductives, no registrandose alteraciones en la calidad de la cascara (Lavelle et a l, 1994). La suplementaciôn con niacina se ha estudiado en la gallina, con el objeto de intentar reducir el contenido en colesterol del huevo. Se ha constatado un aumento significative de la incidencia de deformaciones en la câscara (Leeson et a l, 1990), tras la administraciôn de este compuesto. V.3.2. Defîciencias y excesos minérales Niveles bajos de calcio pueden afectar severamente la calidad de la câscara (Graveland y Berends, 1997). Los mismos autores han demostrado que, la actividad en la büsqueda de calcio aumenta en paseriformes cuando se les priva de una fuente adecuada. La disminuciôn en los niveles de magnesio en la dieta, situândose entre 207 y 132 mg/kg, da lugar a una severa disminuciôn de los niveles séricos de calcio y magnesio e induce una notable disminuciôn del grosor de la câscara (Waddell et al., 1991). En estas condiciones, la cantidad de magnesio a nivel de la capa de empalizada disminuyô en comparaciôn con los huevos control. Deficiencias de manganeso en la dieta ocasionaron una disminuciôn del grosor total de la câscara y alteraciones en su ultraestructura con la apariciôn de cuerpos mamilares grandes e irregulares. El anâlisis quimico de la matriz orgânica mostrô una reducciôn de hexosamina y âcido hexurônico, relacionada con el papel prédominante del manganeso en la sintesis de estos compuestos (Leach y Gross, 1982y El aumento de calcio en la dieta, mediante suplemento en el agua de bebida, utilizando lactato de calcio, dio lugar a un aumento de la gravidez especifica del huevo (Damron y Flunker, 1995). Cierta controversia se ha planteado entomo al posible efecto de la adiciôn de sal en el agua de bebida y sus efectos negativos, sobre la calidad de la câscara 38 Revision Bibliogrâfica descritos por Balnave y Scott en 1986. Dichos efectos pueden revertirse mediante la adiciôn de compuestos de zinc (Balnave y Zhang, 1993). Mas tarde, se ha podido demostrar que el incremento de ClNa en el agua de bebida no da lugar a alteraciôn alguna en la calidad de la cascara, ni en la gravidez especifica del huevo (Damron, 1998). Por el contrario, las dietas bajas en sodio, en combinaciôn con la inducciôn de la muda, dan lugar a un incremento en el peso de la cascara en gallinas (Berry y Brake, 1986) La suplementaciôn con iodo dio* lugar a una reducciôn significativa del grosor de la cascara acompanada de una disminuciôn en el numéro de poros (Christiensen, 1990). Austic y Keshavarz (1986), demostraron que el aumento de cloro en la dieta produce una disminuciôn en la fortaleza y grosor de la câscara pero solo en niveles de calcio del 2% en dieta. Por el contrario, niveles superiores de calcio incrementan el grosor de la câscara pero sôlo en presencia de 0.86% de cloro en la dieta. Los resultados indican que la relaciôn entre ambos minérales afecta a la calcifïcaciôn de la câscara, especialmente niveles de cloro excesivos en combinaciôn con niveles limitantes de calcio. Posteriormente en 1990 los estudios de Keshavarz y Austic, sugieren que los efectos negativos de la adiciôn de fôsforo y cloro en la dieta, pueden estar en parte relacionados con el aumento de la excreciôn de calcio. Este fenômeno puede estar relacionado con la acidosis como consecuencia de las manipulaciones en la dieta. La inclusiôn en la dieta de aluminio silicato sôdico en gallinas, dio lugar a un aumento en la calidad de la câscara al igual que el suplemento con calcio. El aumento mencionado en primer lugar se produjo en verano, pero no en inviemo (Kavous y McCormick, 1990). El exceso de magnesio en la dieta provocô una disminuciôn del peso de la câscara en dietas bajas en fôsforo, mientras que produjo el efecto contrario en dietas ricas en este elemento (Hess y Britton, 1997). 39 Revision Bibliogrâfica La suplementaciôn en la dieta con bicarbonato sôdico originô un aumento de la resistencia de la câscara a la rotura. La mejora estuvo asociada a un aumento de la temperatura y el fotoperiodo, con el objeto de facilitar el consumo de alimento durante la formaciôn del huevo (Balnave y Muheereza, 1997). La deficiencia de cobre da lugar a huevos de tamano mayor o menor de lo normal con câscara distorsionada (Baumgartner et al., 1978). Esta deficiencia da lugar a la ausencia de lisil oxidasa en el oviducto, lo que limita la capacidad de formaciôn de entrecruzamientos en las fibras de la membrana haciéndolas mâs débiles, y aumentando la distancia entre nücleos mamilares que aparecen may ores. Los latirôgenos, inhibidores de la lisiloxidasa, generan idénticas anomalias (Bomen et al., 1957). V.3.3. Lipidos y aminoâcidos La adiciôn de 3% de acido palmitico o âcido oleico, a la dieta en gallinas no produce alteraciones resenables en la calidad de la câscara. Rabie et al. (1997), han demostrado que la adiciôn de 1-camitina en la dieta mejora la calidad del albumen, sin producir efectos adversos en la câscara. Del mismo modo, la suplementaciôn con metionina tampoco produjo efectos negativos signiflcativos en la mineralizaciôn de la câscara (Wideman et al., 1994). V.3.4. Derivados de plantas y mîcroorganismos La inclusiôn de osteolatirôgenos en la dieta de gallinas y concretamente semicarbacida hidroclorada y p-aminopropionitrilo fumarato, dieron lugar a alteraciones en la ultaestructura de la câscara. Dichos cambios consistieron en la disminuciôn del grado de separaciôn y ramifîcaciôn de las fibras de las membranas testâceas, con el consiguiente cambio en la distribuciôn de los lugares de nucleaciôn. Este efecto se acompanô de una disminuciôn del numéro de poros y una distribuciôn irregular de los mismos. 40 Revision Bibliogrâfica La adhesion entre las membranas y la capa de los conos mamilares disminuyô, y se observô un aumento de los intersticios en la capa de empalizada, lo que disminuye la resistencia a la fractura (Chowdhury y Davis, 1995). Los resultados han sido confrrmados recientemente (1998) por los mismos autores, afirmando que estos derivados producen aumento de la fragilidad de la câscara. La adiciôn de alcaloides como escopolamina e hiosciamina, a dosis entre 75 y 150 mg/kg, no producen efectos negativos sobre el grosor de la câscara. No obstante, a dosis mâs altas, se constataron reducciones en la producciôn de huevos (Kovatsis et al., 1994). La suplementaciôn con fitasas derivadas de microorganismos se ha comprobado que aumenta la producciôn de huevos, permitiendo la reducciôn de los niveles de fosfato tricâlcico en la dieta sin producir efectos adversos (Um y Paik, 1999). La administraciôn de 60 microgramos de LPSw (polisacarido derivado de la harina de centeno), por gallina y dia, en el agua de bebida, produce un aumento significativo de la fortaleza de la câscara y del numéro de huevos (Suzuki et al., 1992). V.4. AMBIENT ALES V.4.1. Temperatura y altitud Temperaturas ambientales entre 15.6 y 23.3°C dieron lugar a un incremento del peso del huevo y su gravedad especifica, comparado con los mismos parâmetros en gallinas mantenidas a temperaturas superiores (Roland et al., 1996). Rahn et al. (1977), demostrô que el numéro de poros se reduce en la misma especie a altitudes superiores. La reducciôn es proporcional al descenso en la presiôn, se baraja la posibilidad de que sean los cambios en la presiôn sanguinea los que actüen como sehal modificadora (Carey, 1980). 41 Revision Bibliogrâfica V.4.2. Ecotoxicolôgicas V.4.2.1. Organoclorados. En muchos lugares del mundo desde 1940, se ha venido insistiendo sobre la alarmante disminuciôn en el grosor de la cascara de los huevos de algunas especies. Este adelgazamiento de la cascara es el efecto subletal mas conocido de los pesticidas organoclorados. Estos pesticidas también producen disminuciôn de las tasas de eclosiôn y la supervivencia de los jôvenes dando lugar a fracaso reproductor (Cook, 1973). Rathcliffe (1967), Hickey y Anderson (1968), probaron la correlaciôn entre la disminuciôn del grosor de la câscara y el DDT y otros organoclorados. La mayoria de los casos de disminuciôn del grosor de la câscara en poblaciones naturales de aves se ha demostrado se debe a los efectos del DDE. Ya en 1977 Kolaja y Hinton, sugieren que el DDT da lugar a la inhibiciôn de la Ca-ATP asa. El DDE actua disminuyendo la salida del calcio de las células de la mucosa hacia la luz de la glândula de la câscara. De esta manera, se altera la relaciôn entre el calcio ligado, y las moléculas de ATP hidrolizadas durante el proceso de formaciôn de la câscara. El DDE es ademâs un potente inhibidor de la calmodûlina, que es un importante moderador de la respuesta de estas células a la progesterona y la sintesis de prostaglandinas (Lundholm, 1987). Este mismo autor demostrô en 1994, que el DDE disminuia en un 24% la sintesis de prostaglandinas en la mucosa de la glândula de la câscara. La respuesta al tôxico difîere con las especies, siendo desde prâcticamente nula en el polio y otras galliformes, hasta extrema en aves como el pelicano {Pelecanus occidentalis). Las poblaciones de diversas especies de aves rapaces se han visto afectadas por éstos tôxicos, especialmente el halcôn peregrino (Falco peregrinus), el gavilân (Accipiter nisus) (Newton y Bogan 1978), el âguila pescadora (Pandion haliaaetus) (Wiemeyer et al., 1988) y el âguila calva {Haliaeetus leucocephalus) (Wiemeyer, 1984). La presencia de niveles elevados 42 Revision Bibliogrâfica de DDE se acompana también de un aumento del numéro de poros de la câscara y su porosidad en general, tal y como se ha visto en garzas (Burton, 1986). Existen otros muchos organoclorados que actuan igualmente reduciendo el grosor de la câscara. Schwarzbach et al. (1991), han demostrado que el Difocol, entre 1 a 10 mg/kg, durante 39 dias, da lugar a una disminuciôn del grosor de la câscara similar a la producida por el DDE. Se almacena en los tejidos fundamentalmente en forma de dicofol, y el DDE no es uno de sus mayores metabolitos en el cemicalo americano {Falco sparverius). En relaciôn con este tôxico se ha analizado la toxicidad de sus metabolitos en la paloma de cuello anillado {Streptopelia risoria), obteniendo la conclusiôn de que el principio activo posee mâs toxicidad que sus metabolitos en esta especie (Schwarzbach et al., 1991). La potencia de este producto se pone de manifîesto en los estudios de Bennett et al. (1990), sobre patos {Anas platyrhynchos) en los que tras el primer dia de aplicaciôn se produjeron disminuciones considerables del grosor de la câscara similares a las producidas por el DDE. V.4.2.2. PCBs La contaminaciôn global del ambiente por estos productos es causa de enorme preocupaciôn. Su naturaleza lipofïlica y su resistencia a la degradaciôn han hecho que se encuentren distribuidos por todo el planeta. Se han descrito como agentes menos potentes en la modificaciôn de las caracteristicas de la câscara en comparaciôn con el DDE. Lincer en 1972, describiô la ausencia de efectos sobre la câscara del Aroclorl254 en cemicalos americanos a la dosis de 10 pg/g en la dieta. El mismo autor encontrô mayores reducciones en cemicalos que habian recibido 10 pg/g de Aroclor junto con 3 pg/g de DDE, que en aquellos que recibieron exclusivamente DDE. Lowe y Stendell en 1991, han referido que cemicalos americanos a los que 43 Revision Bibliogrâfica se adiciono 3 pg/g de Aroclor en la dieta, de Enero a Julio, disminuyeron el grosor de la câscara en un 5% con respecto a los contrôles. V.4.2.3. Metales pesados. Elevados niveles de zinc,, utilizados en la inducciôn de la muda, dan lugar a incrementos signiflcativos en el peso de la câscara (Berry y Brake, 1986). Por el contrario, codomices mantenidas un ano desde su nacimiento, con dietas conteniendo entre 2 y 32 ppm de cloruro de mercurio, no mostraron signo alguno de alteraciôn en el grosor total de la câscara (Hill y Shaffher, 1976). Sin embargo, una dosis oral de mercurio de entre 1 y 5 mg por ave y dia, en gallinas, da lugar a un adelgazamiento de la câscara. Se ha comprobado que el calcio présenté en la glândula no varia, si bien disminuye en un 33% la acepciôn de calcio dependiente de ATP en las células de la mucosa de la glândula (Lundholm, 1987). Esto puede deberse a una inhibiciôn de la capacidad de absorciôn intestinal, o bien de la movilizaciôn del calcio medular (Lundholm, 1995). El mismo autor informa que los iones Hg2+, Cd2+ y A13+, son agentes ecotoxicolôgicos, que causan disminuciôn del grosor de la câscara en las aves. Los iones Cu2+, Pb2+, methyl-Hg+, Zn2+ y Ni2+, pueden actuar disminuyendo el proceso de captaciôn de calcio dependiente de ATP. Una posible explicaciôn de su efecto negativo, puede ser el que estos ionos tengan afinidad por los lugares en que el calcio se liga al polipéptido calmodûlina, y de este modo influyen en el metabolismo del calcio en la mucosa de la glândula coquilaria (Lundholm y Mathson, 1986). En 1991 Lundholm, demuestra la capacidad de estos metales y en especial del mercurio para inhibir la uniôn de la progesterona a sus receptores en la mucosa de la glândula de la câscara. Cuando se incluyen pequehas cantidades de calcio en la dieta se altera la composiciôn de la matriz orgânica apareciendo una nueva proteina. Este efecto fue observado antes de que cualquier otro de los descritos apareciera, lo que hace 44 Revision Bibliogrâfica sospechar que la câscara pueda ser utilizada como depôsito para almacenar estos complejos, lo que la convertiria en un perfecto indicador del efecto de ciertos tôxicos (Burley y Vadehra, 1989). Cemicalos americanos, alimentados con dietas entre 10 y 50 ppm de plomo desde Noviembre a Mayo, aunque acumularon plomo en câscara de forma irregular, no presentaron anomalias en el grosor de la misma. V.4.2.4. Fluor. En 1983 Combs, refîere los efectos negativos de concentraciones de fluor entre 300 y 1200 ppm en gallinas. Estos consistieron en disminuciôn del grosor de la câscara, asi como en su consiguiente resistencia a la rotura. Los niveles de fluor en hueso y câscara de huevo, en gaviotas expuestas a emisiones, se correlacionan; si bien concentraciones en câscara entre 92 y 180 ppm no dieron lugar a alteraciones morfolôgicas resenables (Vikoren y Stuve, 1996). En el cârabo americano {Otus asio), la inclusiôn en la dieta de 200 ppm de fluor, dio lugar a una disminuciôn en la tasa de eclosiôn, si bien no alterô el grosor de la câscara (Patee et al., 1988). En gallinas ponedoras, se ha determinado que la ingestiôn de 4.453 mg de fluor por dia durante 74 semanas no produce efectos adversos (Coetzee, 1997). V.4.2.5. Biocidas. La inclusiôn de varias concentraciones de diflubenzurôn, entre 2 y 250 ppm, en la dieta de gallinas ponedoras, no dio lugar a alteraciones en sus parâmetros reproductivos, incluyendo el grosor de la câscara. Intoxicaciones subcrônicas por tri-n-butyltin oxido, producidas mediante la administraciôn de 36 a 150 mg/ kg de dieta basai, dieron lugar a disminuciones en la tasa de eclosiôn en codomices. Estas dosis no produjeron alteraciones en el grosor y fragilidad de la câscara (Coenen et al., 1992). 45 Revision Bibliogrâfica V.4.2.6. Otros. Existen otros tôxicos, que también se ha constatado producen disminuciôn del espesor de la câscara. Entre ellos se encuentra el hexaclorobenzeno, un pesticida industrial detectado en muchas especies de aves y que se ha visto disminuye la tasa de eclosiôn y supervivencia de las aves (Schwetz et al., 1974), causando deformaciones en aves piscivoras (Gilbertson et al., 1991). Chakravarty y Lahiri (1986), demostraron que el lindano, a la dosis de 20mg/kg de peso, disminuye el grosor de la câscara, causando alteraciones ultraestructurales. Las lesiones se caracterizan por la disminuciôn del tamano de las mamilas y también del espacio entre las mismas. También se ha apuntado inhibiciôn de la formaciôn de calcita, al tiempo que reducciôn importante en el numéro de poros. Los autores han sugerido la posibilidad de que el lindano de lugar a una deficiencia de estrôgenos. V.5. lATROGÉNICAS En 1993 Chen et al., evidenciaron que el descenso de los niveles de estrôgenos, como consecuencia de la disminuciôn de la actividad de determinadas oxidasas, da lugar a una caida en la tasa de puesta y el grosor de la câscara. La administraciôn de histamina produce hyperfosfatemia e hypocalcemia, la cual es mâs relevante durante los estadios iniciales de la formaciôn del huevo (Cabrera-Saadoun y Sauveur, 1986). La administraciôn de indometacina, droga que reduce significativamente los niveles de prostaglandinas, dio lugar a la inhibiciôn de la formaciôn de la câscara. Este fenômeno se acompanô de un espectacular incremento en los niveles de calcio en la glândula de la câscara, y una ligera disminuciôn del calcio sérico (Lundholm, 1992). La inhibiciôn de la secreciôn de jugo gâstrico mediante omeprazol disminuye el porcentaje de calcio soluble, siendo importante en la solubilizaciôn del carbonato câlcico. Sin embargo, no parece ser un factor déterminante para la 46 Revision Bibliogrâfica absorciôn de calcio en el duodeno, y tiene una minima influencia en el grosor de la câscara (Guinotte et al., 1995). La administraciôn de cimetidina a gallinas da lugar a una disminuciôn apreciable de la calidad de la câscara, por mecanismos distintos a la inhibiciôn de la sintesis de la 250-HD3. En 1969 Mueller et al., describieron la acciôn inhibidora de la acetazolamida en la formaciôn de la câscara. Mâs tarde se ha comprobado que los diuréticos saluréticos como la acetazolamida, hidroclorotiazida, clortalidona, furosemida, âcido etacrinico y amilorida inhiben la formaciôn de la câscara, siendo la furosemida el mâs potente de ellos (Lundholm, 1990). En 1992 el mismo autor, demuestra que la furosemida inhibe la captaciôn de 45C^^ por parte de la fracciôn subcelular de la mucosa de la glândula de la câscara. Niveles de tiouracilo del 0.05% en la dieta dieron lugar a un aumento de la conductancia relativa, con una mayor pérdida de agua en la gallina (Peebles et a l, 1994). Los cambios descritos se han atribuido a una disminuciôn de los niveles de calcio, como consecuencia de un descenso en el consumo de comida. V.7. INFECCIOSAS La vacunaciôn frente a la cepa F de Mycoplasma gallisepticum no produjo una disminuciôn ni en el peso del huevo ni en la fortaleza de la câscara (Branton y Deaton, 1985). Sin embargo vacunas vivas frente a reovirus se ha comprobado que disminuyen el grosor de la câscara, la fertilidad y la tasa de eclosiôn en gallinas (Giambrone et al., 1991). 47 Revision Bibliogrâfica VI. METODOS DE EVALUACION DE LA CALIDAD DE LA CÂSCARA La câscara es ciertamente resistente alcanzando fuerzas de compresion y fuerzas tensiles ciertamente considerables (Rehkugler, 1963). La medida de la resistencia de la câscara se ha asociado a la calidad de la misma (Hamilton et al., 1979; Tullett, 1987). Son diversos los factores que contribuyen a la fortaleza de la câscara, entre ellos fîguran: el grosor total, el grosor de la capa de cristalizaciôn extema, la fortaleza de la adherencia a las membranas, la densidad de poros y su distribuciôn, las propiedades de la matriz, la presencia de pigmentos, y la concentraciôn de vesiculas. Cada una de ellas es probable que se encuentre bajo regulaciôn genética, pudiendo variar considerablemente. V I.l. FISICOS Y QUIMICOS Se han desarrollado una serie de métodos fïsicos que evalùan: la resistencia a la compresiôn lateral y longitudinal, la deformaciôn, el impacto y la punciôn (Hamilton et al., 1979). Algunos de ellos han dado lugar a aplicaciones comerciales. En algunos casos, se ha utilizado anâlisis de la cantidad de calcio mediante rayos-X (Forberg y Odsjo, 1984). La deformaciôn de la câscara es un parâmetro distinto que ha recibido considerable interés (Hunt y Voisey, 1966; Tung et a l, 1968). Este ultimo autor ha concluido afirmando que la rigidez de la câscara es el parâmetro mâs importante en la predicciôn de la fuerza de rotura. La gravidez especifica se ha venido utilizando regularmente como parâmetro indicativo de la calidad de la câscara (Harms, 1991). Entwisle et al. 1995, han utilizado fuerzas de compresiôn y anillos de neopreno para medir la diferencia de resistencia entre las partes interna y extema de la câscara en huevos de gallina. 48 Revision Bibliogrâfica Bronsch y Diamantstein (1965), encontraron una correlaciôn lineal entre la concentraciôn de âcido urônico y la fortaleza de la câscara. Esto implicaria la posible importancia de los mucopolisacâridos. Silyn-Roberts y Sharp (1986), han sugerido que la matriz orgânica influye actuando como un refuerzo fîbrilar. En este sentido, la cantidad y distribuciôn de esta materia tendria cierta importancia a considerar. La presencia de pigmentos se ha comprobado que también contribuye a la fortaleza de la câscara, como hemos citado anteriormente en esta revisiôn. Se ha descrito que durante el almacenamiento varia el contenido de agua en el huevo, y que este factor modifica la fortaleza del mismo. Las câscaras con mayor contenido en agua aparecen con mayor fragilidad que aquellas secas. Esto puede estar relacionado con la rotura de los enlaces de hidrôgeno intermoleculares en la matriz (Tyler y Geake, 1964). Existen multitud de métodos quimicos utilizados para conocer la composiciôn minerai y orgânica de la câscara del huevo incluyendo: espectroscopia de masas, microanâlisis mediante sonda de electrones. No obstante, presentan ciertas limitaciones debido a su espectro puntual de determinaciôn. VI.2. MORFOLÔGICOS Y ULTRAESTRUCTURALES En 1949 Romanoff y Romanoff, culminan sus estudios afirmando que el grosor total de la câscara es, sôlo en parte, responsable de su fortaleza. De acuerdo con lo anterior. Brooks y Hale (1955), concluyen indicando que tan solo el 58% de la variaciôn en la fortaleza de la câscara puede explicarse por variaciones en su grosor. Finalmente, Ar et a l (1979), en un estudio basado en câscaras de 42 especies, encuentran que la fortaleza es proporcional al cuadrado del grosor. Existe cierta controversia sobre el papel que la parte interna de la câscara y en concreto la capa mamilar puede jugar en la fortaleza de la câscara. Esto se debe a que, por una parte, esta capa esta menos mineralizada, pero por otra, es la 49 Revision Bibliogrâfica responsable del contacte con las membranas de la câscara (Carter, 1971; Van Toledo et al., 1982). Recientemente, Camarius (1996), ha estudiado la relaciôn entre la ultraestructura y la fortaleza de la câscara media en huevos con diferentes lesiones (rotura, abolladura o fuga). Los autores no encontraron diferencias signifîcativas en el espesor de la capa mamilar y la de empalizada en los huevos con lesiones distintas. Sin embargo la resistencia a la punciôn fiie significativamente mayor en los huevos simplemente abollados. De la misma manera, existe una correlaciôn positiva entre el espesor de la capa de empalizada y el grosor total con la resistencia a la punciôn. 50 MATERIAL Y MÉTODOS 51 Material y Métodos I. MATERIAL BIOLOGICO El âguila perdicera (Hiemaetus fasciatus) es una especie escasa y de distribuciôn irregular en el Mediterrâneo. Cuenta con poblaciones relativamente numerosas en el sector mâs occidental, principalmente en Esparia y Marruecos. No existen censos periôdicos de las poblaciones de âguila perdicera en la regiôn circunmediterrânea. La revisiôn de la informaciôn bibliogrâfica existente muestra que en los ùltimos 30 anos la especie ha experimentado un acusado descenso poblacional, quedando relegadas las poblaciones mâs importantes a la Peninsula Ibérica y norte de Africa. Los datos relativos al numéro de parejas en este ârea de distribuciôn figuran en la Tabla 5. La poblaciôn circunmediterrânea del âguila perdicera constituye uno de los nücleos principales de distribuciôn de la especie en el mundo. En Europa, el âguila perdicera cuenta con una poblaciôn probablemente inferior a las 1.000 parejas y estâ considerada como una especie amenazada y en acusado declive. La poblaciôn espafiola es sedentaria. Los adultos permanecen en sus territorios durante todo el ano, y sôlo las aves jôvenes e inmaduras muestran una tendencia viajera muy extendida entre las rapaces, divagando por la Peninsula, y llegando algunas a Africa a través del Estrecho. Su alimentaciôn suele basarse en mamiferos, aves y grandes reptiles. Las presas suelen ser capturadas en el suelo, o cuando inician el despegue. Es desproporcionada la agilidad que muestra para su tamano, lo que le permite capturar en vuelo aves tan diferentes en talla y costumbres como garzas, codomices, gaviotas, cogujadas, grajillas, etc. 52 Material v Métodos Tabla 5: Numéro de parejas de âguila perdicera de los paises riberenos del Mediterrâneo. * estimas. Espana 675-751 Portugal 75-90 Francia 29-31 Italia 20-30 Ex-Yugoeslavia 8-10 Albania 0-2* Grecia 35-45* Chipre 10-15 Israel 20 Turquia 10-100* Tùnez 100* Argelia 200* Marruecos 500-1000* La poblaciôn espariola de âguila perdicera estâ compuesta por 679-775 parejas, gran parte de las cuales se distribuyen por la mitad sur peninsular y la franja costera del Mediterrâneo, lo que représenta el 80% de los efectivos de la especie en toda Europa. Pero a pesar de su importancia se halla en proceso de regresiôn, por otro lado ùnico entre las rapaces ibéricas. En la década de los 80 la poblaciôn disminuyô en un 15-20%, desapareciendo el 28% de las parejas, y su ârea de distribuciôn se ha contraido y fragmentado. Ha desaparecido por completo en âreas del norte donde era muy escasa, taies como Asturias, Cantabria, Guipùzcoa, Segovia, y ha disminuido fuertemente (+20%) en otras zonas donde era comùn, como Navarra, Burgos, Guadalajara, Madrid y Toledo. La regresiôn también ha afectado a poblaciones con alta densidad como Cataluna, 53 Material v Métodos Levante, Murcia, Albacete y Almeria, con un continuo goteo de desapariciôn de parejas. La regresiôn ha sido de tal magnitud que en el periodo 86-90, el âguila perdicera desapareciô de 6 provincias. Las ùnicas poblaciones en las que no se ha detectado disminuciôn se encuentran en Andalucia y el sur de Extremadura. La persecuciôn, la competencia con el âguila real y las alteraciones del hâbitat, son las causas de la deserciôn del 26% de los territorios. En el caso del âguila perdicera, se considéra la disminuciôn de sus presas y la calidad de alimentaciôn como una de las causas responsables de su regresiôn. Diversos autores han hecho especial hincapié en el estudio de la dieta, pero en ningùn caso han reparado en los posibles sesgos ligados a la metodologia utilizada: presas recientes présentes en el nido, restos recogidos después de la cria en el nido, egagrôpilas con las presas aportadas por los adultos. La extraordinaria abundancia de conejos en los ecosistemas mediterrâneos explicaria en parte, el encontrar a très de las grandes âguilas de la Peninsula: real, imperial y perdicera; pues podrian consumir la misma presa sin existir una fuerte competencia entre ellas. En este sentido, parece que los altos solapamientos de nicho no implicarian necesariamente competencia si la abundancia del recurso es superior a la demanda. Un anâlisis comparativo de sus dietas muestra que, en el medio montano, el âguila imperial ibérica y el âguila real tienen un valor bajo de solapamiento trôfîco de sus dietas (49%), existiendo notables diferencias. El âguila imperial ibérica consume significativamente mâs conejo y côrvidos que el âguila real; esta ultima captura mas especies del grupo "otros mamiferos" {Camivora y Rodentià) (excepto Oryctolagus, Lepus, Sus, Cervidae) y galliformes (Alectoris). En el medio no montano, lo mâs destacable es el alto grado de solapamiento trôfico de las très âguilas, siendo del 71% entre el âguila imperial ibérica y el âguila real, del 80% entre el âguila imperial ibérica y el âguila perdicera y del 90% entre el âguila real y âguila perdicera. Todo ello parece estar motivado, fundamentalmente, por la alta fi*ecuencia con que las très âguilas consumen Oryctolagus. Estos valores 54 Material v Métodos de solapamiento trôfico son mucho mâs altos que los encontrados entre otras aves de presa diumas, aunque similares a los que presentan las rapaces noctumas predadoras de microtinos. Existe una tendencia a que estas parejas muestren un comportamiento trôfico excluyente, o utilizen el territorio como una forma de disminuir la competencia, evitando, las parejas mâs cercanas, competir por las mismas presas, mientras que tienden a tener una dieta similar a las mâs lejanas. Se desconoce el alcance que la neumonia hemorrâgica virica del conejo puede tener en la supervivencia de la poblaciôn preadulta, ya que esta epidemia apareciô simultâneamente a los primeros sintomas de desequilibrio demogrâfico del âguila perdicera (1.988-89). Pero el principal problema de conservaciôn del âguila perdicera, parece radicar en la elevada mortalidad que suffen los jôvenes e inmaduros. Primero en la etapa de emancipaciôn, con un 45-59% de bajas, en algunas poblaciones se ha estimado hasta en un 83% con una duraciôn del periodo de emancipaciôn de 96 dias. Segundo en las âreas de dispersiôn, en la que se producen el 35% de las muertes. La persecuciôn y fundamentalmente la electrocuciôn en los tendidos eléctricos causan un numéro de bajas dificilmente soportable. La muerte en los primeros 15 meses de vida oscila entre el 50-77%. La informaciôn que se posee sobre el periodo de vida de las âguilas comprendido entre el abandono del nido y la incorporaciôn a un territorio de reproducciôn es escasa, y no permite establecer con certeza las tasas de mortalidad preadulta. Resultados de ejemplares con marcas alares arrojan cifras del 80-90%, siendo el disparo la causa de un 50% de las muertes, seguido por choque o electrocuciôn en tendidos eléctricos que causan el 35% de las muertes. Los modelos demogrâficos predicen que las poblaciones de âguila perdicera son muy sensibles a las variaciones en los niveles de mortalidad adulta. Moderadamente sensibles a los cambios en la mortalidad preadulta y poco sensibles a alteraciones en la productividad. Por otro lado, el modelo demogrâfico permite 55 Material v Métodos jugar con los parâmetros demogrâficos y muestra que ni siquiera elevando el valor de la productividad hasta su valor mâximo teôrico en esta especie (2 polios por pareja y ano) se consigne invertir la tendencia regresiva de las poblaciones. Es posible invertir dicha tendencia con ligeros cambios en las tasas de mortalidad adulta o preadulta. Los valores de supervivencia que serian necesarios son perfectamente realistas y compatibles con la biologia de la especie, y se alcanzarian siempre y cuando se realizaran las medidas de gestion adecuadas (tendidos eléctricos y persecuciôn directa). II. PROBLEMÂTICA DETECTADA Es muy diversa la problemâtica que afecta al âguila perdicera en toda la Peninsula Ibérica, no siendo el objeto del présente estudio la descripciôn pormenorizada de los mismos. Sin embargo, creemos importante comentar de forma resumida algunos de los factores de riesgo que actualmente afectan a la poblaciôn, y su posible incidencia sobre los parâmetros reproductivos de la especie de modo que los resultados del présente estudio puedan entenderse de forma global. La problemâtica difiere dependiendo de la localizaciôn geogrâfica. Incluso dentro de âreas como Castilla - La Mancha los factores de riesgo varian notablemente. Asi la poblaciôn de âguila perdicera asentada en la provincia de Guadalajara ha experimentado en las ultimas décadas, una fuerte regresiôn, que ha incidido tanto en el numéro de parejas como en el patrôn de distribuciôn. En el periodo comprendido entre 1980 y 1998 el tamano de la poblaciôn ha pasado de 24 a 13 parejas, lo que représenta una disminuciôn del 46% en 18 anos. Consecuentemente, la distribuciôn original de la especie se ha reducido considerablemente, constatândose la disoluciôn de la gran mayoria de los nücleos 56 Material v Métodos disperses, asi como la reducciôn y fragmentaciôn de poblaciones como las del Sistema Central y del valle del rio Tajo. Ademâs de esta tendencia regresiva, los estudios realizados desde 1995 han puesto de manifîesto la debilidad de los parâmetros reproductores, circunstancia que puede sintetizarse indicando los valores medios de la productividad, que se reduce a 0,88 pollos/pareja (n=34). Esta devaluaciôn del potencial reproductor de la especie se relaciona, indudablemente, con los problemas detectados en algo mâs del 40% de las parejas, problemas que les impiden resolver con éxito el compromise de la reproducciôn. La negativa evoluciôn de la poblaciôn y la comprobaciôn de que los niveles reproductores se mantienen por debajo de los considerados normales para la especie, son los principales elementos de diagnosis sobre la situaciôn del âguila perdicera. Ademâs de la electrocuciôn en tendidos eléctricos, la pérdida de hâbitat, unida a las molestias en las âreas de nidifîcaciôn como consecuencia de una excesiva presiôn humana, aparecen como algunos de los factores mâs importantes constatados hasta la fecha. La persecuciôn directa, y los envenenamientos son causas de muerte habituales, constituyéndose en factores adicionales que contribuyen notablemente a la regresiôn que viene sufriendo esta especie. En Cataluna y el sur de Portugal algunos de los parâmetros reproductores como la tasa de vuelo experimentan reducciones en determinadas zonas muy concretas. Esto se debe a muertes juveniles asociadas con tricomoniasis, enfermedad producida por un protozoo ligada al consumo de paloma por ésta rapaz. La alteraciôn del hâbitat y las enfermedades han afectado presas antario habituales para esta especie. Este factor ha hecho que el espectro trôfîco de algunas parejas se haya desplazado constituyéndose la paloma en la base de su dieta alcanzando en algunos casos hasta el 60% de la biomasa consumida, lo que eleva notablemente el riesgo de adquirir la enfermedad. 57 Material v Métodos En areas de la provincia de Ciudad Real se han detectado anomalias diversas en un numéro significative de parejas que dan lugar a fracaso reproductor. Las observaciones apuntan al hecho de que un numéro de incubaciones no lleguen a buen termine ya que les huevos se rompen durante las dos primeras semanas habitualmente. De forma adicional, ciertas parejas que antano ponian de forma regular le hacen ahora de forma intermitente, sin que se hayan visto alterados sus paramétrés comportamentales, y en ausencia de molestias u otras alteraciones. El présente trabajo pretende ahondar en les posibles problemas reproductives de la especie investigando sus causas. m . AREAS GEOGRÂFICAS OBJETO DE ESTUDIO El présenté estudio se desarrollô en dos paises: Portugal y Espana. Dentro de les mismos, las regiones escogidas flieron: El Algarve, Castilla - La Mancha y les Arribes del Duero. Las razones para su elecciôn flieron diversas. En primer lugar, la ecologia, paramétrés reproductives y problemâtica de estas poblaciones han side y continüan siendo estudiada per algunos de les biologos mas cualificados en el conocimiento esta especie, per le que existia una base de dates y conocimientos fundamental sobre la que partir. Las dos primeras poblaciones, presentan numerosas diferencias en factores como el habitat, alimentaciôn, factores de riesgo, latitud, altitud, uses del suelo, etc.. Estas diferencias darian una idea de como determinados factores pueden o no afectar a la ultraestructura de la câscara. De forma adicional, se estân realizando les estudios genéticos correspondientes sobre las dos poblaciones con fines comparatives. Ambas poblaciones cuentan con problemas distintos afectando a sus paramétrés reproductives. La poblaciôn del Algarve portugués cuenta con tasas de puesta y éclosion ciertamente elevadas, centrândose su mayor problemâtica en la afecciôn de polios por tricomoniasis con tasas de mortalidad importantes. Por el contrario, la 58 Material v Métodos presencia de esta patologia en las poblaciones Castellano-Manchegas es anecdôtica, centrândose la problemâtica en la reducciôn del numéro de parejas que Megan a poner, asi como la tasa de éclosion. Otros factores como la reducciôn en el tamano de la puesta no son bien conocidos, dada la dificultad para constatar determinados datos sin producir molestias. La comparaciôn entre estas dos poblaciones y la de los Arribes del Duero es de una importancia considerable ya que dicha poblaciôn présenta similitudes y diferencias con ambas. La latitud y la climatologia son factores diferenciales, pero también el ecosistema; las parejas del Algarve anidan en arboles mientras que el resto, salvo rara excepciôn, lo hacen en cantiles. Para la compilaciôn de la informaciôn requerida sobre las caracteristicas geogrâficas y ecolôgicas de las parejas implicadas en este estudio se ha contado con fichas modelo de recogida de informaciôn poniendo especial énfasis en la compilaciôn de los datos de fenologia conocidos para las parejas implicadas en este estudio. Fichas de caracterizaciôn cubren los siguientes aspectos: localizaciôn geogrâfica, hâbitat, uso y propiedad del suelo, datos de nidificaciôn (altura, orientaciôn, y numéro de nidos), grado de humanizaciôn y factores de riesgo. Segun estas fichas se han compilado los datos biolôgicos mâs relevantes de las subpoblaciones de donde las muestras proceden, de modo que puedan utilizarse en la discusiôn y elaboraciôn de conclusiones. IV. PERIODO DE ESTUDIO La toma de muestras en el présente estudio se realizô durante las épocas de reproducciôn, y especialmente en los meses de Mayo y Junio correspondientes a los anos 1997 a 1999 inclusive. El anâlisis de los datos se prolongô hasta el aho 2000. 59 Material v Métodos V. CRITERIOS DE SELECCION Y PARAMETROS REPRODUCTIVOS DE PAREJAS EXAMINADAS Durante la toma de muestras se siguieron dos criterios de selecciôn. En primer lugar, obtuvimos una representaciôn lo mâs amplia posible de cada una de las très poblaciones en las que se encontraran parejas geogrâficamente distanciadas, con diferentes niveles de éxito reproductor dentro de una misma zona, Como segundo criterio se buscô la repeticiôn del muestreo en anos sucesivos, de modo que se tuvieran muestras correspondientes a la misma pareja durante varios anos. Este ultimo punto es de vital importancia para la detecciôn del posible efecto acumulativo de ciertos tôxicos, al tiempo que se observa la posible variaciôn individual. Elaboramos dos protocolos de toma de datos generates: Ficha de antecedentes y situaciôn actual de las parejas existentes y ficha de parâmetros reproductores. La primera incluye: Datos historicos de los individuos intégrantes, historial de éxito reproductor y cambios en el ârea de reproducciôn. En la segunda se reflejan los datos correspondientes a los afios de estudio incluyendo: Proporciôn de parejas que ponen, éxito reproductor, tasa de vuelo y productividad. Para ello se han utilizado los siguientes parâmetros: r Proporciôn de parejas que ponen: Résulta de dividir el numéro de parejas que ponen entre el numéro de parejas controladas. 2® Éxito reproductor: Résulta de dividir el numéro de parejas que sacan algun polio entre el numéro de parejas que ponen. 3° Tasa de vuelo: Résulta de dividir el numéro de polios que vuelan entre el numéro de parejas que se reproducen con éxito. 4° Productividad: Résulta de dividir el numéro de polios que vuelan entre el numéro total de parejas controladas. 60 Material v Métodos VI. TOMA DE MUESTRAS. TIPO. Y CLASIFICACIÔN Para la toma de muestras contamos con la colaboraciôn de escaladores profesionales. Las parejas fueron seguidas con detenimiento durante la estaciôn reproductora, constatando los abandonos o en su momento la crianza de polios. Los nidos no fueron abordados, hasta estar seguros de no ocasionar molestias. En muchos de los casos las muestras se recogieron durante el chequeo sanitario realizado a los polios hacia los 42 dias de edad con motivo de su marcaje para radioseguimiento. En contadas ocasiones las muestras fueron tomadas debajo del nido, ya que agentes meteorologicos provocaron la caida del nido, en el caso de aquellos situados en ârbol. Las muestras obtenidas en relaciôn con el présente estudio fueron de très tipos: 1) Huevos enteros intactos no eclosionados, transcurrido un tiempo mâs que prudencial a la flnalizaciôn del periodo de incubaciôn, 2) Restos de câscara de huevos eclosionados, o no eclosionados y posteriormente dahados, o bien consumidos por algun predador. En relaciôn con los datos générales de cada resto de huevo, o cada huevo infértil hallado, se estableciô un protocole para la toma de datos entre los que se incluyeron: * Localizaciôn, pareja a la que pertenece. * Fecha de recolecciôn, y posible orden en la puesta. * Tiempo de incubaciôn, o abandono. * Examen ovoscôpico: incluyendo apariencia, descripciôn etc.. * Medidas extemas. * Examen macroscôpico: fértil-infértil y estado de conservaciôn. * Examen microbiolôgico. * Estudios genéticos. 61 Material v Métodos Tras los descensos a nidos efectuados, se procedio a su clasifîcaciôn para lo cual se dio una clave a cada resto encontrado, clave a la que irân referidos todos los hallazgos, tanto macro- como microscôpicos. Para la correcta clasifîcaciôn de las muestras examinadas se cumplimentô una ficha en la que fîguraron los siguientes aspectos: 1- Datos générales: Localizaciôn, nùcleo, tipo de muestra, fecha, tiempo de incubaciôn, tiempo abandonado y conservaciôn. 2- Examen ovoscôpico, posicionamiento del embriôn, dimensiones de la câmara de aire y aspecto. 3- Medidas del huevo: Longitud, ancho, peso total, peso del contenido, peso de la câscara. 4- Examen macroscôpico: Incluyô la observaciôn del aspecto de la câscara, asi como la toma de datos sobre el contenido, las medidas efectuadas se detallan en el apartado dedicado al estudio del embriôn posteriormente en este capitule. 5- Examen microbiolôgico: Se realizô cultivo en aérobiosis en agar sangre, XLD, y agar Sabouraud. En funciôn de los aislamientos en plaça se siguieron los protocolos de siembra en medios selectivos rutinarios en microbiologia. 6- Examen toxicolôgico: Los métodos empleados se detallan en el apartado correspondiente. 62 Material v Métodos VII. CARACTERISTICAS ULTRAESTRUCTURALES NORMALES. VALORES DE REFERENCIA Y CORRELACIÔN ENTRE MAGNITUDES VII.l. TRATAMIENTO Y ANALISIS ULTRAESTRUCTURAL DE LA MUESTRA VIL 1.1. Localizaciôn y extracciôn Los huevos enteros fueron transportados envueltos en papel de aluminio y refrigerados hasta el laboratorio. Una vez alH, los huevos fueron medidos (longitud y diâmetro extemo) y pesados mediante calibre y balanza digitales con errores de 0.01mm y 0.01g respectivamente. Las medidas macroscôpicas efectuadas y su descripciôn figuran en la tabla general de medidas de esta secciôn. Previo a la apertura se procediô a un examen ovoscôpico en el que se investigô: La apariencia y posicionamiento del embriôn, la forma de la câmara de aire, desperfectos o fisuras en la câscara, etc.. La apertura se realizô mediante tijera en un piano longitudinal paralelo al eje longitudinal, con el objeto de visualizar el posicionamiento y tamano relativo del embriôn antes de su extracciôn. Una vez evacuado el contenido, el interior de la câscara fue lavado con agua destilada, evacuada el agua y secado a temperatura ambiente (21°C) y humedad relativa del 35% durante 24 horas. Seguidamente se procediô a registrar el peso total de la câscara. Para el anâlisis ultraestructural de la câscara se tomaron porciones no superiores a 5mm x 5mm procedentes del ecuador del huevo y obtenidas mediante fractura limpia por presiôn con pinzas de precisiôn. Las membranas de la câscara se obtuvieron de idénticas localizaciones, utilizando aquellos trozos que aparecen en la zona de fractura y separândolos seguidamente de la câscara mediante pinzas. 63 Material v Métodos Cuando la muestra consistiô en restos de huevo se siguiô el mismo procedimiento intentando obtener las muestras de las mismas regiones del huevo. V II.l.2. Preparaciôn para anâlisis por microscopia electrônica de barrido y registre grâfico Para el anâlisis de las muestras se procediô a tomar trozos de una superficie aproximada de 9mm^, procedentes del ecuador mediante una cuchilla ultrafina. En el anâlisis de la secciôn transversal procedimos a la creaciôn de una nueva fractura mediante presiôn tangencial, de modo que se évita dar como anomalias, posibles abrasiones ocurridas como resultado del tratamiento, almacenamiento, o agentes extemos sobre la muestra. Las muestras de câscara fueron previamente hervidas con NaOH (2.5N) durante medio minuto. Las membranas no recibieron ningün tratamiento quimico. Las muestras de câscara se volvieron a fracturar mediante presiôn contralateral con el objeto de crear nuevas fracturas para una correcta visualizaciôn de la secciôn transversal. Seguidamente procedimos a pegar très trozos: superficie interna, superficie extema y coite sobre porta objetos cilindricos de acero especiflcos para microscopia electrônica. Para la correcta visualizaciôn del corte, las muestra se situô en el piano sagital, es decir con la superficie perpendicular a la superficie del portaobjetos. Como adhesivo se utilizô gel de metacrilato el cual se dejô secar parcialmente para evitar su absorciôn por la câscara y la creaciôn de artefactos. Para el posicionamiento de las membranas utilizamos idénticas pautas. Especial cuidado hubo de prestarse a la colocaciôn de cantidades minimas de pegamento y al correcte secado del mismo dada la porosidad de las membranas. Una vez adheridas, las muestras fueron metalizadas con oro al vacio utilizando un metalizador Sputter Coater Valfez SCD-004 por espacio de 30 min. La cubierta de oro obtenida fue de 50 pm, mediante esta metalizaciôn se convierte 64 Material v Métodos la muestra en conductora de modo que se évita que se cargue de electricidad estâtica y repela los electrones. Las muestras fueron visualizadas con ayuda de un equipo de microscopia de barrido marca GEOL JSM 6400 equipado con un detector de electrones secundario. Se utilizaron aceleraciones de 20 KV. Tras un examen general a 60 aumentos de todas las superficies se tomaron anotaciones sobre caracteristicas particulares générales de la muestra, pasando a un estudio pormenorizado de cada una de las capas realizando fotografîas en papel 12 x 17cm a los aumentos que se indican en la siguiente relaciôn, incorporando una escala de magnitudes: Tabla 6: Listado de registres grâficos establecidos de forma sistemâtica para cada muestra estudiada mediante microscopia electrônica de barrido. Vista Aumentos Superficie intema. Capa mamilar 150 Superficie extema. Cuticula 150 Secciôn transversal. 150 Detalle de la capa de empalizada. 1.000 Superficie extema de membrana testâcea extema 1.000 Superficie intema de membrana testâcea intema 1.000 Secciôn transversal de las membranas testâceas 1.000 Ademâs de las imâgenes que se han descrito, se tomaron muchas otras correspondiendo con estructuras anômalas, y detalles de especial relevancia entre las que figuran: detalles de la capa de cristalizaciôn extema y la orientaciôn de los cristales, uniôn entre la membrana extema y la capa mamilar, particularidades de la estructura y morfologia de los poros y canales, y detalles de la capa albuginea. 65 Material v Métodos Aunque no se obtuvo registre fotogrâfîco, si se tomaron anotaciones y datos cuantitativos en relaciôn con los siguientes detalles ultraestructurales A) Superficie extema: * Areas de mayor densidad de poros (300X). * Areas de menor densidad de poros (300X). * Detalle de la superficie extema (l.OOOX). Presencia de esferolitos, material amorfo, etc. B) Superficie intema: * Zonas de mayor densidad de cuerpos mamilares (lOOX). * Zonas de menor densidad de cuerpos mamilares (lOOX). * Mamilas y poros (300X). C) Corte transversal: * Perspectiva del corte (150X). * Detalle de la cuticula y capa de cristalizaciôn extema (lOOOX). VII. 2 OBTENCIÔN DE MEDIDAS Y ANALISIS DE IMAGEN ASISTIDO POR ORDENADOR Üna vez positivadas las imâgenes, estas fueron digitalizadas mediante escâner y archivadas en CD para su anâlisis mediante el sistema BIOCUANT de anâlisis de imagen. Este programa permite el tratamiento de imâgenes, al tiempo que la medida de distancias lineales, âreas, densidades, etc. Mediante el sistema automâtico de medida se determinaron las siguientes que se detallan por capas, incluyendo una serie de medidas subjetivas resultado del estudio de las imâgenes. 1. Cuticula Cuantitativos • Numéro total de poros por unidad de superficie. Para el recuento total de poros procedimos a la magnificaciôn del ârea total de la imagen mediante divisiôn de la misma en un total de 12 cuadriculas. 66 Material v Métodos Contamos los poros visualizados con independencia de su tamano, efectuamos el calcule automâtico de su ârea mediante circunscripciôn de su perimetro (Figura F3a). Se examiné un ârea total de 5x10^ pm^. • Superficie total de poros por unidad de superficie. Calculâmes de la misma forma descrita en el apartado anterior mediante suma automâtica de âreas. • Gros or de cuticula. Procedimos a la medida del grosor de la cuticula mediante el sistema de calibraciôn y medida automâtica sobre imâgenes digitalizadas. Obietivos Los siguientes aspectos se examinaron durante las sesiones de microscopia electrônica mediante examen de la superficie extema de la cuticula en fragmentes de una superficie aproximada de 2.5cm^. La constataciôn de la presencia o no de las siguientes estmcturas se llevô a cabo a 150 aumentos. • Presencia de cuticula. • Presencia de esferolitos y vesiculas. • Trazas de material en la entrada de los poros. • Apariciôn de fracturas radiales. • Aspecto de la cuticula. Se procediô a clasificar las muestras en dos tipos: de cuticula regular o irregular haciendo referenda a la mgosidad de esta capa examinada a 150 y 500 aumentos. 2. Capa de cristalizaciôn externa Cuantitativos • Area. Para el câlculo del ârea de esta capa, se utilizô el mismo programa marcando como perimetro, el limite con la cuticula o restos de ella y como borde 67 Material v Métodos inferior su limite con la capa de empalizada, siguiendo las irregularidades que aparecen en este trayecto (Figura Fl). • Grosor. Dada la irregularidad de esta estructura, se midiô su grosor en cada muestra en dos puntos representativos de mâximo y minimo grosor, para posteriormente hallar la media entre ambos valores. Los mismos puntos de referencia fueron utilizados para el câlculo del grosor de la capa de empalizada (Figura F l) • Numéro de estratos. Se realizô en la linea de mâximo grosor de la capa de cristalizaciôn extema. El total de estratos incluyô el ultimo como contacto con la capa de empalizada. • Numéro de canales. Se procediô al recuento del numéro de estos en una longitud de 800 pm medida sobre la linea de superficie extema de esta capa (Figura F2b). Obietivos • Grado de cristalizaciôn. Se evaluô el numéro de estratos, el grado de deflniciôn de los mismos, la orientaciôn de los cristales en los estratos, y por tanto la regularidad en el paralelismo de los mismos. Los grados de cristalizaciôn se establecieron de uno a très: De déficiente a bueno. 3. Capa de empalizada Cuantitativo • Ârea. Las medidas se realizaron con el mismo sistema, como en el caso de la capa de cristalizaciôn extema. El limite inferior se fîjô en el borde superior de la capa mamilar, que se encuentra bien defmido en las âguilas, de modo que prâcticamente describe una linea recta paralela a la superficie de la câscara (Figura Fl). La 68 Material v Métodos superficie fue medida sobre la secciôn transversal de la câscara de longitud igual a 600 pm utilizando una magnificaciôn de 150 aumentos. • Area y nûmero de vesiculas. Dadas las importantes diferencias y grado de definiciôn entre âreas distintas dentro de la empalizada, se calcularon de forma distinta para âreas de mayor y menor densidad registrando al mismo tiempo la superficie total de vesiculas en cada tipo de ârea de forma separada (Figura F5, F5a y F5b). Las mediciones se hicieron sobre imâgenes con una magnificaciôn de 750 aumentos sobre al capa mamilar. • Angulo de orientaciôn de los cristales. El câlculo del ângulo de orientaciôn se realizô de forma automâtica estableciéndose el eje perpendicular a la superficie de la câscara (Figura F 1). • Grosor. Se ejecutaron dos mediciones una mâxima y otra minima, defmidas por la profundidad de la capa de cristalizaciôn extema, calculândose la media de ambas medidas. Las mediciones se realizaron de forma automâtica, sobre imâgenes tomadas a 150 aumentos del corte de la câscara (Figura F 1). Obietivos • Grado de cristalizaciôn. Para la clasificaciôn del grado de cristalizaciôn se tuvieron en cuenta los siguientes aspectos: Definiciôn y disposiciôn de las columnas romboédricas, homogeneidad de los cristales, presencia de cristales amorfos, y continuidad con otras capas. La clasificaciôn se estableciô de uno (cristalizaciôn pobre o déficiente) a très (buen grado de cristalizaciôn). 4. Capa mamilar Cuantitativo 69 Material v Métodos • Grosor. Se procediô a la determinaciôn del grosor expresado en pm mediante sistema automâtico de medida, previa calibraciôn, tomando como referencia desde el limite con la capa de empalizada hasta el extremo de la mamila que contacta con la membrana extema (Figura Fl). Se trabajô sobre imâgenes digitalizadas y con una magnificaciôn original de 150 aumentos. • Area mamilar al corte y ârea mamilar. El primero de estos parâmetros se determinô sobre imâgenes de la secciôn transversal de la câscara, tomando como referencia los mismos limites mencionados para el grosor de esta capa. Las medidas se acometieron sobre una longitud de 800 pm medidos sobre la câscara. El ârea mamilar se determinô mediante dibujo del perimetro de las mamilas ubicadas en un ârea total de 5xl0^pm^ y câlculo automâtico del ârea delimitada. Esta determinaciôn se llevô a cabo sobre imâgenes de la superficie de los conos mamilares, con una magnificaciôn de 100 aumentos. • Area entre mamilas o del sistema de ventilaciôn mamilar. Sobre las mismas imâgenes utilizadas anteriormente y la misma ârea se procediô a delimitar el ârea entre mamilas y el câlculo automâtico de la misma (Figura F4). • Nûmero y distancia entre conos. Sobre imâgenes a 100 aumentos se organizô el conteo automâtico del numéro de estas estructuras en un ârea de 5x10 ^pm^, al tiempo que procediô a su cartografîa para la determinaciôn de su ârea. Para la obtenciôn de las distancias entre nùcleos se eligieron très nùcleos al azar distribuidos por el ârea total, procediéndose a medir la distancia entre cada uno de ellos y los seis mâs prôximos (Figura F4). Posteriormente se realizô el câlculo automâtico de la distancia media 70 Material v Métodos • Superficie de los nücleos mamilares. Se procediô a su câlculo siguiendo los mismos procedimientos empleados para el câlculo del ârea de las mamilas pero en este caso centrândose en circunscribir exclusivamente los nùcleos de cristalizaciôn (Figura F4a). Obietivos • Presencia de multinucleaciôn. Para la determinaciôn de este valor subjetivo examinamos fotografîas tomadas a 100 y 150 aumentos, de cada una de las muestras. Hicimos anotaciones del grado de multinucleaciôn en funciôn del numéro de nùcleos encontrados circunscritos dentro de la misma mamila (Figura F50). • Forma de las mamilas. Procedimos a la observaciôn de la forma al corte de la mamila, estableciendo très tipos distintos dentro de la generalidad. El primer tipo se denominaron mamilas planas, aquellas que presentan un relieve minimo en su ârea de contacto con la membrana extema. Mamilas intermedias, en las que se aprecio una cierta elevaciôn de la base a modo de meseta. Por ultimo, mamilas cônicas prominentes (Figuras F41 y F42). Estas observaciones se realizaron en imâgenes con una magnificaciôn de 150 aumentos. • Conexiôn con membranas testâceas. Esta evaluaciôn la efectuamos a diversos aumentos: 150, 500 y 1000, tratando en primer lugar de visualizar de forma general la cantidad de membrana adherida a la superficie total de la mamila. Seguidamente analizamos la zona de uniôn como tal y la separaciôn entre ambas estmcturas, asi como, la consistencia de la uniôn estudiada sobre cortes a 500 aumentos. Un parâmetro importante también evaluado fue la cantidad de membrana que permaneciô tras el tratamiento quimico de la câscara como indice de la fortaleza de la uniôn. En determinados casos, observamos la presencia de las formas mamilares a modo de sello en negative, adheridas a la membrana extema de la câscara (Figuras F39 y F39a) indicando una fuerte sujeciôn. 71 Material v Métodos 5. Câscara Cuantitativos • Grosor total. El grosor total de la câscara se calculé siguiendo la misma metodologia descrita anteriormente sobre imâgenes con una magnificaciôn de 150 aumentos (Figura Fl). 6. Membranas testâceas Cuantitativos • Grosor total. Se midiô de forma automâtica sobre imâgenes a 500 aumentos en las que se pudieron discemir los limites entre ambas membranas con facilidad (figura F6). 6.1. Membrana externa. Cuantitativo. • Nûmero défibras. Se trabajo sobre imâgenes a mil aumentos en las-que se trazô una linea de longitud igual a 100 pm y sobre la que se procediô a contar el numéro de fibras que cortan dicha linea (Figura F7). Aceptamos como cuantificaciôn eficaz a la hora de evitar repeticiones que ocurren durante el conteo por ârea, ya que résulta dificil delimitar hasta dônde llega cada fibra, asi como su identidad. • Diâmetro de fibras. Se ejecutaron las mediciones sobre las mismas imâgenes descritas anteriormente mediante el mismo sistema (Figura F7a). Se midieron un total de treinta fibras obteniéndose la media de las medidas realizadas. Las treinta fibras fueron las que cruzaron de forma consecutiva la linea trazada en el apartado anterior. 72 Material v Métodos • Grosor Se llevaron a efecto segun las premisas establecidas para el grosor general de la suma de ambas membranas. Obietivos • Distribuciôn de fibras. Se observaron las fibras a 500 y 1000 aumentos, clasifîcando la distribuciôn de las mismas en regular o irregular. Se considéré irregular cuando los espacios entre fibras variaron en tamano y dentro de un ârea de 2.5x 10 ̂pm 6. 2. Membrana interna Cuantitativo. • Nûmero de fibras, diâmetro y grosor de la capa. Se realizaron siguiendo la misma metodologia aplicada en el caso de la membrana extema (Figura F8). Obietivo • Distribuciôn de fibras. Se utilizô la misma clasificaciôn descrita para la membrana extema (Figura F8X Para la descripciôn de cada una de las estmcturas se empleô la nomenclatura establecida por Tyler y Becking (1975). VII. 3 ESTABLECIMIENTO DE VALORES DE REFERENCIA DE LA ESPECIE VII. 3.1. Criterios de selecciôn. Las parejas seleccionadas para establecer los valores de referencia cumplieron los siguientes criterios: • Tasas de eclosiôn por encima de 1,65. 73 Material v Métodos • Tamano de puesta no inferior a dos. • Edad de los consortes superior a 6 anos. • Factores de riesgo y estresantes minimos. Los huevos seleccionados han de cumplir los siguientes criterios: • Fecha de puesta dentro de la fenologia tipica de la especie. • Morfologia extema normal, sin alteraciones en la forma, color o tamano. • Niveles de tôxicos no detectados o 100 veces inferiores a los referidos como tôxicos en la bibliografïa. • Huevos eclosionados y no eclosionados por causas naturales constatadas (caida del nido, posible infertilidad del macho, etc.). VII. 3. 2. Establecimiento de valores de referencia Una vez seleccionadas las muestras, se obtuvieron los valores de referencia expresados como médias y desviaciôn estândar para aquellos parâmetros clasificados como cuantitativos. Para el câlculo de magnitudes se utilizô el programa estadistico Statgraphicsplus. Ademâs se incluyen descripciones de los parâmetros objetivos y subjetivos relacionados con cada una de las estmcturas de la câscara, de modo que los aspectos estmcturales queden defînidos en su conjunto. VII. 4. TENDENCIAS Y CORRELACIONES ENTRE MAGNITUDES Se han descrito correlaciones entre diferentes parâmetros en la câscara de ciertas especies (von Nathusius, 1868). En un total de 34 especies distintas, el nûmero de poros es directamente proporcional al numéro de cuerpos mamilares. En el présente estudio cada una de las variables: Cuantitativas, objetivas y subjetivas se ha correlacionado con el resto mediante los coeficientes de correlaciôn de Spearman y Pearson, que permiten establecer el grado de 74 Material v Métodos asociaciôn entre dos variables. Se realizaron ambas pruebas al no conocerse las caracteristicas gausianas de la poblaciôn analizada. El grado de signifîcaciôn se estableciô en p<0.05. Los resultados se reflejaron pues como parejas de variables para las que el grado de correlaciôn cumple los requisitos de signifîcaciôn. Mediante el test R cuadrado se examinô la idoneidad de cada uno de los modelos propuestos para cada relaciôn entre variables. Se realizô anâlisis de la varianza en la comparaciôn entre variables cuantitativas y no cuantitativas, utilizândose ANOVA de una via, estableciendo las variables cuantitativas como dependientes. El grado de confianza se estableciô en el 95% y se realizô ANOVA de tabla que desliga la varianza en dos componentes: Entre grupos y dentro del mismo grupo. El grado de signifîcaciôn se obtuvo mediante el câlculo del valor p derivado del test - F. De forma adicional se aplicô un test de rango multiple al objeto de determinar que médias son significativamente distintas de que otras. Para discriminar entre médias se utilizô el procedimiento de la menor diferencia significativa de Fisher (LSD). Mediante este procedimiento existe un 5% de riesgo de asegùrar que dos médias son distintas cuando en realidad son iguales. De forma adicional se practicaron los tests de Cochran, Bartlett, y Hartley para comprobar la hipôtesis nula, que compara las desviaciones estândar de la variable dependiente para los diferentes valores de la variable independiente. VIII. VARIACION EN LOS PARAMETROS ESTABLECIDOS EN FUNCION DE FACTORES FISIOLOGICOS. INDIVIDUALES. GEOGRÂFICOS Y CLIMATOLOGICOS. GENÉTICOS E INMUNOLOGICOS 75 Material v Métodos Para efectuar este estudio se procedio en primer lugar a una selecciôn de la informaciôn global sobre el ârea de estudio y los progenitores implicados que pudiera tener relevancia como factores implicados en variaciones individuals, geogrâficas, climatolôgicas, etc. de los parâmetros de la câscara. Los factores seleccionados figuran en la siguiente tabla. Tabla 7: Factores de posible infiuencia sobre los parâmetros ultraestructurales de la câscara. Fisiolôgicos 1. Edad de la hembra. 2. Estado nutricional de la pareja. 3. Grado de estrés de la pareja durante la época de puesta. Geogrâficos 4. Nùcleo poblacional. 5. Temperatura durante los dias de puesta. 6. Altitud del ârea del nido. Genéticos e individuates. Infecciosos 7. Presencia de enfermedades infecciosas. Estos factores se cuantificaron finalmente en una escala de 0 a 3, siguiendo los criterios que se exponen seguidamente. A cada pareja y para cada factor se le asignô de forma objetiva un valor en funciôn de los estudios de biologia y ecologia, y conocimientos 76 Material v Métodos En el caso de los niveles de tôxicos, los mârgenes se fîjaron en funciôn de los descritos como peligrosos y causantes de alteraciones, y los niveles de detecciôn de las técnicas empleadas. Ante la dificultad de evaluar el estado inmunolôgico de los adultos, se compilô la informaciôn existente en cuanto a la presencia de enfermedades transmisibles en los polios de estas parejas durante los afios de estudio. Se intentô estudiar la posible relaciôn entre la presencia de ciertas patologias en los polios y su posible transmisiôn a partir de los adultos. Tabla 8: Sistema de cuantificaciôn de factores de posible infiuencia sobre aspectos ultraestructurales de la câscara excluyendo compuestos tôxicos. Factores de posible infiuencia 0 Edad de la hembra. (3 a 6 anos) (7 a 15 anos) (16 a 25 anos) (mas de 25 anos) Grado de estrés de la pareja Nulo Minimo Medio Mâximo Desarrollo embrionario ( l a 10 dias) (11 a 20 dias) (21 a 30 dias) (31 a 39 dias) Abundancia de recursos trôfîcos. Escasez Aceptable Bueno Excelente Temperatura ambiental mâxima <15 15-20 20-25 >25 Altitud del ârea del nido. (0 a 300 m) ( 300 a 600 m) (600 a 1200 m) (>1200 m) Poblaciôn Algarve Duero Castilla - La Mancha Organoclorados. No detectados Niveles descritos como lesivos PCBs. No detectados. Niveles descritos como lesivos Metales pesados. No detectados. Niveles descritos como lesivos Infecciosos Ausentes Alguna patologia detectada 77 Material v Métodos IX. DETERMINACION DE LOS NIVELES DE TOXICOS AMBIENTALES EN CONTENIDOS DE HUEVO COMO BIOINDICADORES IX. 1. PREPARACIÔN DE LA MUESTRA Una vez examinados los embriones y complète su estudio morfolôgico y examen post-mortem (la metodologia se describe en el apartado correspondiente), el contenido fue triturado en su totalidad y homogeneizado. Seguidamente se procediô a la determinaciôn de la materia hùmeda, la materia seca, y el porcentaje de humedad. IX. 2. ANÂLISIS TOXICOLÔGICO En la detecciôn tanto de organoclorados como de PCBs se utilizô cromatografîa de gases con detector de captura de electrones. Primeramente las muestra^ se homogeneizaron con 5 g de arena lavada en âcido, adicionando 5 g de sulfato de sodio anhidro. Seguidamente se ahadieron 30 ml de una muestra de hexano y acetona 50:50. Una hora mâs tarde, el solvente fue transferido a un recipiente de 50 ml, y 10 ml de la mezcla exano-acetona se afiadieron nuevamente para extraerse pasados 15 min. El proceso se repitiô hasta completar los 50 ml del recipiente. Seguidamente, 25 ml de esta soluciôn se transflrieron a un nuevo recipiente permitiendo su evaporaciôn. Tras 24 h en un desecador se procediô a pesar y calcular el peso de la ffacciôn lipidica. La limpieza de la muestra se realizô utilizando una columna cromatogrâflca de alumina. El extracto se transfiriô a la columna y fue eludido con 5 ml de hexano. Se anadiô un estândar a cada muestra, y una vez mezclado se transfiriô a un vial cromatogrâfico para el anâlisis. 78 Material v Métodos Para asegùrar la rigurosidad y calidad del anâlisis se hicieron un blanco y un control positivo, utilizando huevo de gallina, para cada uno de los compuestos a analizar. Para cada una de las muestras se realizaron los anâlisis por triplicado. Anâlisis mediante cromatografîa de gases y captura de electrones. Se procediô a la calibraciôn del aparato previa a las determinaciones. Para este proceso se empleô diclobenil como standard intemo. La identiflcaciôn de los compuestos se llevô a cabo mediante comparaciôn con su tiempo relativo de retenciôn. Esta operaciôn se realizô de forma automâtica. Como cromatôgrafo se utilizô el modelo Varian Model 8200, trabajando a una temperatura inicial de 60°C para fmalizar a temperaturas de 170, 200, 280 y 320° C. Los resultados del blanco se restaron del resultado final. Los congénères de clorobifenil se han nombrado de acuerdo a la clasificaciôn de Ballschmitter y Zell, incluyendo la lista propuesta por el International Council for Exploration of the Sea (ICES). Los limites de detecciôn (LOD) se determinaron segun la ecuaciôn; Y= Yo + 3Sy/x , donde y = LOD, Yo = es donde y intercepta la linea de regresiôn de calibraciôn, y Sy/x es el error estândar de la regresiôn. En funciôn del tôxico a determinar se siguieron tratamientos y sistemas analiticos especiflcos que describimos por grupos de tôxicos. IX. 2.1. Organoclorados Se estudiô la presencia de los siguientes compuestos organoclorados: HCB, a-HCH, g-HCH, p,p-DDE, HEOD, p,p-TDE, y p,p-DDT. Para la determinaciôn de los niveles de estos compuestos se empleô la técnica de espectrofotometria de absorciôn atômica. Formas activas 79 Material v Métodos • Hexaclorobenceno (HCB) Se trata de un organoclorado utilizado con frecuencia como fungicida, si bien su presencia en el medio puede tener otros origenes. Aparece como contaminante de otros herbicidas (ESI, ISO) y como producto de desecho en la sintesis de solventes dorados. Las rapaces pueden verse afectadas por el consumo de presas que han ingerido semillas tratadas con este producto. • a-HCH y g-HCH Se trata de hexaclorociclohexanos, compuestos activos anâlogos del DDT, el segundo de los cuales es conocido como lindano ampliamente utilizado como insecticida en un pasado. Los isômeros a y b poseen sabor repulsivo para muchas especies de aves granivoras, por el contrario el lindano carece de olor y sabor lo que aumenta su probabilidad de ser ingerido. El lindano es menos tôxico ya que se dégrada mucho mâs râpidamente en el medio que otros organoclorados, siendo su vida media en tejidos y huevos inferior a la de otros organoclorados. Se ha comprobado que este ultimo isômero se metaboliza a compuestos hidrosolubles lo que facilita su eliminaciôn. • p,p-DDT Ha sido sin lugar a dudas el pesticida mâs usado, sobre el que no es necesario realizar comentarios sobre su peligrosidad. En la actualidad la evaluaciôn de su peligrosidad viene dada en gran medida por la detecciôn de los niveles de sus residues: DDE y DDD fundamentalmente, a los cuales se hace referencia en el apartado metabolites. Metabolitos • Dieldnn (HEOD) Se trata de un producto de oxidaciôn del Aldrin. Su estructura de epôxido le confiere una estabilidad extrema lo que le hace ciertamente peligroso. Se trata de productos extremadamente tôxicos para las aves si bien su toxicidad varia en 80 Material v Métodos funciôn de la especie. En el pasado dichos productos han dado lugar a grandes mortalidades en diferentes especies, si bien sus efectos sobre la reproducciôn también han sido documentados. Desafortunadamente no poseemos datos sobre niveles en huevos de âguila perdicera. • p,p-TDE, y p,p-DDE Se trata de metabolitos del DDT, aunque existen numerosos compuestos, el DDE es el mâs lesivo estando directamente implicado en la disminuciôn del grosor de la câscara, al tiempo que limita el éxito reproductor. La respuesta a este metabolito varia dependiendo de la especie, asi se ha comprobado que el grado de sensibilidad de diferentes especies de rapaces como el âguila calva, el âguila pescadora etc. varia. Los niveles de detecciôn para los compuestos tôxicos analizados se exponen en la tabla 9. Tabla 9: Niveles de detecciôn para los diferentes compuestos para el total del extracto. ORGANOCLORADO LOD(ng) HCB 0,42 a-HCH 0,67 g- HCH 0,48 P,pDDE 0,46 HEOD 0,45 P, pTDE 0,53 P,p-DDT 90 IX. 2. 2. Estudio de les niveles de bifenilos policlorados Los PCBs son una familia compuesta por un total de 209 congénères con similar estructura. Cada uno de ellos posee una lipofïlia, toxicidad, y metabolismo distinto, de ahi la necesidad de un anâlisis pormenorizado. Su toxicidad aguda es ciertamente rara a excepciôn de accidentes. Sin embargo su verdadero riesgo 81 Material v Métodos reside en sus efectos sobre el sistema inmune, la reproducciôn y el comportamiento. Para su determinaciôn se han seguido las mismas pautas que para los organoclorados. Procederemos en este estudio a detallar los niveles analizados de los PCBs mâs interesantes desde el punto de vista toxicolôgico en ecosistemas terrestres Los resultados se han expresado en ug/g de materia seca, hùmeda y contenido lipidico. De este modo es posible comparar con los datos emanados de otras publicaciones. Se han analizado un total de 25 congénères distintos cuyos nùmeros figuran en las tablas correspondientes. IX. 2. 3. Estudio de los niveles de metales pesados Dadas las limitaciones y el hecho de que, tan solo en el caso del mercurio se han constatado efectos significativos sobre la estructura de la câscara en aves salvajes, se decidiô restringir la bùsqueda a este compuesto. De forma adicional existia un especial interés por medir los niveles de mercurio ya que una de las zonas de estudio, Almadén, posee antecedentes histôricos relevantes en la mineria de este métal en nuestro pais. Desde hace tiempo se viene especulando con la posibilidad de que este métal pudiera estar implicado en los problemas reproductives del âguila perdicera en esta zona. Dado lo intrigante de los numerosos efectos distintos que puede producir este métal, es especialmente interesante su determinaciôn, ya que de encontrarse niveles elevados se podria indagar sobre los niveles en presas consumidas por estas aves. Existen otros metales que pueden producir problemas, si bien se trata de danos sobre otros ôrganos. El plomo es quizâ el mâs signifîcativo; sin embargo sus efectos sobre la câscara del huevo, aunque se han citado, no han llegado a demostrarse experimentalmente, por lo que hemos creido conveniente no abordarlo en este momento. 82 Material v Métodos La detecciôn de los niveles de mercurio se realize mediante espectrofotometria de absorcion atômica de vapor fric en el caso del anâlisis del contenido de los huevos. Un gramo de muestra fne desecado durante 12 horas a 80°C para determinar la humedad de la muestra. Seguidamente se ariadio âcido nitrico para realizar una digestion en frio de la muestra durante 12 horas. Las muestras se calentaron hasta 120 °C durante 30 a 60 minutes. Posteriormente se ariadio 1 ml de peroxide de hidrôgeno para completar la digestion de la muestra. Las determinaciones se realizaron utilizando un espectrofotômetro de absorcion atômica: Solar 969. El limite de detecciôn de esta técnica se fîjô en 20 ng y fue calculado siguiendo los mismos procedimientos descritos para los compuestos organoclorados y PCBs. Para el anâlisis de la posible presencia de mercurio en las câscaras de huevo se empleô microscopia electrônica de barrido acoplado a microanâlisis de energia dispersiva de rayes X (SEM-EDX). Esta ultima técnica es aleatoria en el case de los metales ya que depende en gran medida de la fortuna en el punto de incidencia no pudiendo calificarse de significativa. No obstante se decidiô realizar una serie de pruebas estipuladas. Los limites de detecciôn para esta prueba fueron de 0,5 Ug/g. IX. 3. ANALISIS ESTADÎSTICO Para el establecimiento de la existencia de diferencias significativas entre poblaciones en las variables examinadas en el présente estudio se utilizô ANOVA multifactorial estableciéndose un intervalo de confîanza del 95%. Las poblaciones se nominaron como 1, 2 y 3, y se analizaron todos los parâmetros cuantitativos obtenidos durante el examen ultraestructural de la câscara y membranas testâceas en esta especie. 83 Material v Métodos X. DOCUMENTACION DE ESTADIOS EMBRIONARIOS Y RELACION CON PARÂMETROS ULTRAESTRUCTURALES X. 1. CRITERIOS DE SELECCIÔN DE EMBRIONES Para la selecciôn de embriones se siguieron los mismos criterios establecidos para los huevos y descritos con anterioridad. De forma adicional, se descartaron aquellos embriones que presentaron anomalias debidas a posibles problemas infecciosos, tôxicos, de incubaciôn, genéticos, etc. incluyendo los agrupados en la siguiente tabla: Tabla 10: Criterios adicionales de exclusion de embriones para valores de referencia: • Asimetria o desproporciôn del cuerpo o las extremidades. • Petéquias, equimosis, serositis u otros signos de procesos infecciosos. • Malposiciôn. • Fallecidos durante la éclosion. X. 2. TOMA DE MEDIDAS Y OBTENCION DE VALORES DE REFERENCIA CLASIFICACIÔN DE ESTADIOS EMBRIONARIOS Una vez abiertos los huevos se procediô al examen post-mortem de los embriones. Durante dicho examen se utilizô la siguiente ficha para la recogida de datos: 84 Material v Métodos Tabla 11: Examen post-mortem de embriones. Datos generates. Pareja: Localizaciôn; Fecha de recolecciôn: Fecha de examen: Tiempo de incubaciôn: Tiempo de abandono: Conservaciôn: Tiempo de reffigeraciôn: Una vez obtenidas las medidas, los resultados se presentaron como médias mas menos desviaciôn standard. Los câlculos estadisticos se realizaron mediante el programa mencionado con anterioridad. Para la descripciôn de los diferentes estadios embrionarios encontrados se han utilizado de forma paralela dos clasifîcaciones distintas. La primera es la descrita por Hamilton en 1952, y que se considéra la clasifîcaciôn de referencia para las aves. Esta clasifîcaciôn se basa en caracteristicas morfolôgicas extemas. De forma adicional hemos adjuntado los estadios correspondientes en la adaptaciôn de la clasifîcaciôn de Carnegie para embriones de mamifero realizada por Buter y Juurlink para el embriôn de polio en 1987. En esta ultima clasifîcaciôn se detallan caracteristicas internas del embriôn obtenidas de los estudios detallados llevados a cabo por Romanoff (1969), Hamilton (1962), y Freeman y Vince (1972). Los estadios mas avanzados del desarrollo embrionario no se han referenciado debido a la difîcultad y falta de datos al respecto. Por lo tanto, se ha citado exclusivamente los dias de incubaciôn y las caracteristicas morfolôgicas mas relevantes. 85 Material v Métodos Tabla 12: Examen macroscopico de embriones, medidas bâsicas. Embriôn (medidas en mm): • Longitud : • Grosor: • Antebrazo: • Tarso: • Base a punta de pico: • Ojo: • Peso: • Edad: • Hallazgos patolôgicos: Anejos embrionarios (peso en g) • Amnios: • Alantoides: • Saco vitelino: Examen microbiolôgico: Examen histopatolôgico: X. 3. RELACION CON PARAMETROS ULTRA ESTRUCTURALES Y ANÂLISIS ESTADISTICOS En aquellos casos en los que se encontraron anomalias afectando a la câscara, se establecieron correlaciones entre estos parâmetros y la presencia de anomalias afectando al desarrollo embrionario. Mediante anâlisis multivariable se estudiaron estas correlaciones en funciôn de los valores de referencia establecidos para embriones. Se procediô al anâlisis de la varianza mediante ANOVA multifactorial, estableciéndose como variables dependientes todas aquellos parâmetros cuantitativos de la câscara. El grado de confîanza adoptado fue del 95%. 86 RESULTADOS 87 Resultados I. DESCRIPCION DE LAS CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS ULTRAESTRUCTURALES NORMALES DE LA CASCARA. ESTABLECIMIENTO DE VALORES DE REFERENCIA Y CORRELACIÔN ENTRE MAGNITUDES 1 .1. CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA OBTENIDA Se obtuvieron un total de 52 muestras, de las cuales 17 concemientes a 1997, 22 a 1998 y el resto a 1999. Del total de muestras, 28 correspondieron a la poblaciôn del Algarve en Portugal, 15 a la poblaciôn de Castilla - La Mancha en Esparia y el resto a la poblaciôn de los Arribes del Duero en Portugal. Del total de muestras obtenidas, 25 fueron huevos enteros, tanto infertiles como conteniendo embriones de diferentes edades. El resto de muestras consistieron en restos de câscara sin contenido. De los huevos intactos, 16 de ellos fueron fertiles, mientras que en el resto no se detectô la presencia de embriôn. De los residuos de câscara obtenidos, al menos ocho pertenecieron a huevos eclosionados. Tabla 13: Caracteristicas de la muestra obtenida. HUEVOS INTACTOS Fertiles: 16 Infertiles: 9 Total: 25 RESTOS DE CASCARA Eclosionados: 8 No eclosionados: 7 Desconocido: 13 Total: 27 88 Resultados Las muestras obtenidas fueron estudiadas mediante microscopia electrônica de barrido, estableciéndose un registro fotogrâflco consistente en un total de 432 imâgenes. Los datos se resumen en la Tabla 13. I. 2 ESTABLECIMIENTO DE VALORES DE REFERENCIA DE LA ESPECIE PARA LAS MAGNITUDES DESCRITAS I. 2 .1 Tamano de la muestra seleccionada Siguiendo los criterios descritos en el apartado: Material y métodos, se seleccionaron aquellas parejas que cumplieron con los requisitos exigidos. Dado que el estudio contempla muestras procedentes de très poblaciones separadas geogrâficamente, se procediô a establecer los valores de referencia para cada poblaciôn en concrete, lo que permitirâ comparar a posteriori diferentes paramétrés en las distintas poblaciones. I. 2 .1 Establecimiento de valores de referencia Del total de muestras se seleccionaron cuatro parejas correspondientes a la poblaciôn de El Algarve, y très por cada una de las poblaciones restantes. El estudio incluyô valores cuantitativos, descripciones objetivas y las valoraciones subjetivas sobre aspectos relativos a la ultraestructura de determinadas capas de la câscara. Procedemos a establecer los valores de referencia de forma separada para cada grupo de muestras correspondientes a poblaciones distintas y para cada uno de los parâmetros estructurales de la câscara. Trataremos en este apartado las diferencias entre valores de referencia cuantitativos en poblaciones distintas y su signifîcaciôn estadistica. Las diferencias en cuanto a los aspectos objetivos y la presencia de estructuras anormales se analiza en detalle en el apartado: Poblaciones, del capitulo dedicado a diferencias geogrâflcas. 1. Cuticula Cuantitativos 89 Resultados • Numéro total de poros por unidad de superficie. Los resultados en cuanto a numéro de poros se muestran en la Tabla 14. Los datos se expresan en numéro de poros por 5x10^ pm^ Tabla 14: Caracteristicas générales en relaciôn con los poros de la câscara del âguila perdicera en las diferentes poblaciones. CARACTERISTICAS GENERALES Poblaciôn Grosor total (pm) Area porosa (pm̂ ) N° de poros Area media (pnf) Media 410.7 12624.8 485.4 26.0 Algarve SD ±27.8 ±10711.8 ±273.3 ±3.92 (n=21) Mînimo 375.4 870.0 45.0 19.3 Màximo 488.1 48783.0 1034.0 47.2 Media 394.2 8637.8 308.0 28.0 Duero SD ±36.7 ±3035.5 ±76.7 ±3.96 (n=6) Minimo 348.3 5384.6 210.0 25.6 Maximo 437.3 12039.0 426.0 28.3 Media 390.2 7126.1 272.8 26.1 Castilla SD ±28.6 ±842.3 ±24.9 ±3.37 (n=13) Minimo 346.6 2134 140 15.2 Mâximo 440.6 29784.0 927.0 32.1 Hay que hacer notar que la câscara de esta especie posee de forma normal âreas de la cuticula con mayor densidad de poros intercaladas con zonas de menor densidad. Los datos expresados corresponden a la media de ambos tipos de âreas. Existen diferencias significativas en este parâmetro entre la poblaciôn del Algarve 90 _________________________________________________________________________ Resultados y las restantes poblaciones, siendo el numéro de poros significativamente superior en la primera. • Area media de poros. Los resultados en jum̂ fîguran en la Tabla 14 adjunta. El ârea de poros fue ciertamente variable entre individuos, al igual que el ârea total résultante. En âreas reducidas, y a grandes aumentos, pudieron discemirse poros de diferentes tamaflos (Figura F3a); mientras que a baja magnificaciôn este aspecto puede pasar desapercibido. Habitualmente, la diferencia de tamafto entre poros dentro de una misma muestra no es muy acusada. Del mismo modo no existen diferencias significativas entre poblaciones en este parâmetro. • Superficie total de poros por unidad de superficie. Se trata de un dato importante ya que refleja la capacidad de intercambio gaseoso. La media, desviaciôn estândar, maxima y minima fîguran en la Tabla 6 para cada poblaciôn. Los poros tienden a la forma circular (Figura F3a) si bien no son totalmente simétricos. En correlaciôn con lo expresado para el numéro de Estudio comparative dei nûmero de poros y eiàrea porosa delimitada en câscaras de las poblaciones objeto de estudio 15000/ 10000/ □Area porosa (um2) □ Nûmero de poros/10um2 Algarve Duero Grafico 1: Estudio comparativo del numéro de poros y el ârea porosa delimitada, en câscaras de las poblaciones objeto de estudio. 91 __________________________________________________________________________ Resultados poros, su mayor abundancia en la poblaciôn de Algarve hace que el ârea delimitada por los mismos sea significativamente superior en esta poblaciôn cuando los datos se comparan con las restantes (Grâfico 1). • Grosor de cuticula. El grosor de la cuticula en el âguila perdicera es irregular dentro de la extensiôn de cada muestra, existiendo âreas en las que se encuentra ausente. Su grosor varia entre 25 y 44 pm, pudiendo presentar en su superficie un aspecto mâs o menos irregular dependiendo de la muestra. Objetivos • Presencia o no de cuticula y rasgos caracteristicas. El huevo de esta especie posee cuticula que se extiende por toda la superficie del huevo variando su grosor en las diferentes âreas. En las très poblaciones examinadas, las muestras de referencia presentaron âreas con cuticula altemando con âreas sin cuticula, distribuidas formando un patrôn irregular. La cuticula estuvo présenté en el 100% de las muestras seleccionadas como referencia y en todas las poblaciones incluidas en este estudio. • Presencia o no de estructuras adicionales: esferolitos, vesiculas, material en la entrada de los poros y fracturas radiales. El huevo normal del âguila perdicera carece de esferolitos, fracturas radiales y vesiculas. La presencia de las dos primeras estructuras se ha detectado en relaciôn con câscaras anormales (Figura F52), mientras que la ultima no se observô en ninguna de las muestras analizadas. Algo semejante sucede con la presencia de material obstruyendo los poros (Figura F 12) y fracturas radiales, si bien estas estructuras son comunes en otras especies, no sucede lo mismo en el âguila perdicera, siendo la incidencia de apariciôn anecdôtica. • Aspecto de la cuticula. Esta estructura sufre alteraciones dependiendo de diverses factores los cuales se detallan en otras secciones. En su superficie, la apariencia varia entre regular e irregular (Figura F3b), cuestiôn que pudiera estar relacionada con el 92 Resultados tiempo de incubaciôn. De este modo la superficie es originalmente regular para ir apareciendo irregularidades conforme avanza el periodo de incubaciôn en funciôn del roce. De forma adicional, dentro de los huevos control, se ha detectado en ocasiones la apariciôn de estriaciones lineales de gran extensiôn que, si bien no es un rasgo constante. Es posible que estas lineas, dada su trayectoria puedan estar ligadas al roce que la hembra en ocasiones realiza con el pico sobre esta superficie. 2. Capa de cristalizacion externa Cuantitativos • Ârea. Esta capa se situa entre la cuticula y la capa de empalizada si bien muchos autores no la consideran como una capa en si misma, sino dentro de la capa mamilar. Su estructura y grosor es ciertamente irregular, y se combina e imbrica con la capa de empalizada de tal modo que en las zonas en la que la primera profundiza, la segunda pierde grosor (Figura F l). El ârea de esta capa se expresa en pm^ y los valores para las diferentes poblaciones fîguran en la Tabla 15, apareciendo como media, desviaciôn estândar, valor mâximo, valor minimo y numéro de muestras analizadas. • Grosor. Como el resto de los parâmetros cuantitativos de esta capa fîguran en la Tabla 15. La irregularidad en el grosor de esta capa dependiendo del lugar elegido es una constante en esta especie (Figura F l), sin embargo las diferencias entre el grosor mâximo y minimo se atenùan en determinados individuos. El grosor medio de esta capa (78 a 101 pm), es ligeramente inferior al descrito para el âguila imperial en la pasada década (118 a 128.7 pm), si bien segùn nuestras 93 Resultados observaciones en comparacion con otras especies de âguilas mediterrâneas la irregularidad en el grosor es muy superior en el âguila perdicera. • Nûmero de estratos. Esta capa présenta cristales que se orientan de forma perpendicular a la superficie del huevo formando capas paralelas a la misma (Figura F2b). Estas capas son habitualmente de dos a très, pero pueden llegar hasta cinco, como hemos confirmado mediante microscopia electrônica. Los estratos aparecen bien defînidos y son atravesados sagitalmente por los canales correspondientes a los poros en superficie (Figura F2b). En las zonas en las que el grosor de esta capa se reduce también lo hace el nûmero de estratos. Esta magnitud se relaciona obviamente con el grado subjetivo de cristalizaciôn de esta capa, a mayor numéro de estratos mejor es el grado de cristalizaciôn. • Nûmero y morfologia de los canales. El nûmero de canales perpendiculares a la superficie que surcan esta capa tiene origen en los poros en superficie y por tanto, su nûmero esta relacionado con el mismo (Figura F2b). El trayecto de estos canales es habitualmente rectilineo, si bien existen alteraciones de la trayectoria y desviaciones de los mismos a modo de intercomunicaciones, que se hacen mâs manifestas en la parte interna de esta capa. 94 Resultados Tabla 15: Caracteristicas de la capa de cristalizaciôn extema en muestras de câscara correspondientes a las diferentes poblaciones de âguila perdicera. CAPA DE CRISTALIZACION EXTERNA Poblaciôn N° canales N° estratos Grosor Area extema Media 29.8 2.6 98.9 53398.9 Algarve SD 10.4 1.0 16.7 8370.2 (n=21) Minimo 20.0 1.0 75.8 41256.4 Mâximo 69.0 5.0 142.7 72218.8 Media 26.2 2.7 78.0 49497.1 Duero SD 4.3 0.8 19.6 8262.4 (n=6) Minimo 20.0 2.0 47.5 37832.5 Mâximo 31.0 4.0 105.2 61138.3 Media 27.3 3.5 101.0 55296.1 Castilla SD 7.3 1.3 24.8 12893.6 (n=13) Minimo 19.0 1.0 53.5 28144.4 Mâximo 41.0 5.0 141.2 73104.3 La trayectoria de estos canales tiende a variar segün se adentran en la porciôn mâs extema de la capa de empalizada, de modo que confluyen en zonas cônicas para formar un solo canal que atravesarâ el resto de la capa hasta dar salida entre la base de las mamilas (Figuras FIO y 10a). La mayor estratificaciôn de esta capa parece afectar la morfologia de los canales dândoles una mayor tortuosidad. 95 Resultados Objetivos • Estructura y grado de cristalizaciôn. En el âguila perdicera es una capa ciertamente relevante que se situa por encima de la capa de empalizada y que posee un espesor muy variable en su recorrido. La orientaciôn de los cristales es perpendicular a la superficie del huevo y se disponen en estratos diferenciados y adosados de modo que dan lugar a una estructura ciertamente compacta. El numéro de estos estratos en las câscaras modelo varia entre 3 y 12 en funciôn del grosor de la zona elegida. El grado de cristalizaciôn, determinado de forma subjetiva, es muy bueno e implica la existencia de estratos defînidos y orientaciôn de los cristales formando 90 grados con la superficie. Esta capa se encuentra indefectiblemente en todas las muestras de âguila perdicera, y el grado de cristalizaciôn y orientaciôn de los cristales es ciertamente notable. 3. Capa de empalizada Cuantitativos • Ârea. Se trata de la capa que en mayor medida contribuye al grosor total de la câscara. En ella se han centrado la gran mayoria de las discusiones en cuanto al grado de cristalizaciôn de la câscara, el grosor y su alteraciôn como consecuencia del uso de pesticidas organoclorados. Los resultados de las mediciones del ârea se muestran en la Tabla 16. En esta especie, el ârea de esta capa es aproximadamente doble del ârea de la capa de cristalizaciôn extema (Figura F l), una relaciôn superior a la existente por ejemplo en el âguila imperial, lo que da una idea de la importancia de la misma. Como limite inferior se ha considerado la porciôn superior de la capa de los conos. Este limite esta generalmente muy bien defmido en otras especies de rapaces como el âguila imperial (Aquila adalberti) o el âguila real (Aquila 96 ________________________________________________________________Resultados chrysaetos\ por lo que résulta sencillo establecer una clara demarcaciôn, ya que aparece como la base de los cuerpos poliédricos que conforman esta capa. Existen diferencias notables en esta capa entre las poblaciones incluidas en este estudio. En la poblaciôn del Algarve, en el 90% de los individuos analizados aparece una banda de estratos tendentes a la perpendicularidad con el eje de las columnas poliédricas, que asemeja a la estructura de la capa de cristalizaciôn extema. Esta capa limita con los conos mamilares, y se diferencia notablemente de los mismos. Contribuciôn de las diferentes capas de la câscara al grosor total de la misma en las poblaciones objeto de estudio 100% , 80%̂ 20% f Algarve Duero CLM □ Grosor capa mamilar □ Grosor empalizada □ Grosor Ccexterna Grâfico 2: Contribuciôn de las diferentes capas de la câscara al grosor total de la misma en las poblaciones objeto de estudio. Dentro de esta capa se diferencian, en los casos en los que alcanza mayor grosor, unos estratos poco defînidos debido a la naturaleza amorfa de los cristales présentes (Figura F33 y F34). El grosor de esta estructura dentro de la capa de empalizada es variable y, dependiendo del individuo, puede llegar a representar un quinto del grosor de la capa de empalizada, y una décima parte del grosor total de la câscara. En las poblaciones restantes, esta banda de cristalizaciôn aparece en algunos individuos en la poblaciôn del Duero, y esta ausente en la poblaciôn 97 Resultados Castellano - Manchega salvo raras excepciones en las que aparece de forma irregular (Grâfico 2). Tabla 16: Caracteristicas de los diferentes parâmetros asociados a la capa de empalizada en las diferentes poblaciones de âguila perdicera estudiadas. CAPA EMPALIZADA Poblaciôn Grosor Area Angulo Area max N° de vesiculas Area min N° de poros Media 229.5 114038.1 10.5 48.5 226.9 16.8 55.4 Algarve SD 21.5 8260.5 7.1 23.2 87.1 6.9 29.1 (n=21) Minimo 186.5 99117.8 0.7 20.0 116.0 8.0 20.0 Mâximo 271.0 131151.7 20.0 96.0 452.0 30.0 114.0 Media 234.2 113323.1 12.4 56.3 241.2 16.2 52.7 Duero SD 28.9 17076.1 10.4 11.6 120.3 6.0 18.1 (n=6) Minimo 184.0 82854.8 5.3 42.0 84.0 11.0 23.0 Mâximo 264.0 129762.8 32.2 72.0 404.0 27.0 72.0 Media 201.8 101047.1 10.2 54.0 258.6 12.8 32.8 Castilla SD 19.6 10742.6 7.4 22.0 162.1 9.5 17.3 (n=13) Minimo 158.3 81804.4 0.7 12.0 43.0 3.7 14.0 Mâximo 231.4 117804.6 24.9 80.0 528.0 30.0 61.0 La presencia de esta capa conlleva un aumento considerable del grosor total de la câscara, que se hace especialmente relevante en la poblaciôn del Algarve, siendo las diferencias en grosor significativas con respecto a la poblaciôn castellana. 98 Resultados • Nûmero de vesiculas. En la capa de empalizada del huevo de las aves aparecen una serie de formaciones vesiculares que dan lugar a la denominaciôn de capa espongiforme, asemejando la textura de una esponja (Figura F5). Se trata de vesiculas de aire que se disponen de forma irregular por toda la capa. Dependiendo de la orientaciôn del corte a nivel de las columnas poliédricas, estas aparecen en mayor 0 menor numéro (Figuras F5a y F5b). La matriz orgânica de esta capa se concentra en la base, y la densidad de la capa aumenta segün se avanza hacia el exterior. Del mismo modo, se ha observado que en el âguila perdicera existen pequenos canaliculos que atraviesan la empalizada en direcciôn perpendicular al eje de las columnas romboédricas. Estas fibras se disponen en hileras con una distancia regular de entre 2 y 15 pm dependiendo del ârea (Figura F5). El numéro de vesiculas es también significativamente superior en la poblaciôn Castellana en relaciôn con la poblaciôn del Algarve, afectando tanto al ârea minima (Figura F31a y F31b) como a la mâxima en cuanto a numéro de vesiculas. • Angulo de orientaciôn de los cristales. Las columnas romboédricas que conforman gran parte de la capa de empalizada son muy aparentes en esta especie, dando un aspecto de cristalizaciôn y solidez ciertamente caracteristicos. Estas estructuras se imbrican en la capa de cristalizaciôn extema, a diferentes niveles en funciôn del grosor de ésta. Por el contrario, su base se situa siempre a un nivel similar dentro del espesor de la câscara, marcado por la capa mamilar. La orientaciôn de estas columnas es aproximadamente perpendicular a la superficie de la câscara cuando el grado de cristalizaciôn es adecuado. La variaciôn en el ângulo de orientaciôn es reducida, y semejante en todas las poblaciones, oscilando entre 0.7° y 32° de desviaciôn con respecto al eje vertical (Figura Fl). Esta desviaciôn puede ser positiva o negativa segùn las columnas. Los resultados se exponen en la Tabla 8. 99 ___________________________________________________________________________Resultados • Grosor. Este parâmetro es variable en funciôn del punto elegido y el espesor de la capa de cristalizaciôn extema. La poblaciôn Castellano - Manchega muestra una disminuciôn del grosor de esta capa en tomo a un 15% con respecto a los valores observados en las otras poblaciones (Figura F33 y F34)(Grâfico 3). Anâlisis de la varianza del grosor de la capa de empalizada entre poblaciones i I 290 ------------------------ — 260 — -- - -■ - 230 1 — 200 1 — 170 I ..............' ' “ i 11 140 ! _______________ 1 _j Algarve Duero CL M Grâfico 3: Anâlisis de la varianza del grosor de la capa de empalizada entre poblaciones. Estas diferencias no se acompanan de diferencias significativas en el grado de cristalizaciôn. Los grosores fluctùan entre 184 y 271 pm en las poblaciones portuguesas, situândose las médias entomo a los 230 pm. Estos grosores son semej antes a los referidos para el âguila impérial en el pasado siglo, y superiores a los actuales para esta especie. 100 Resultados Anâlisis de la varianza del grosor de la capa de empalizada en funciôn de la fertilidad 250 I 240 | 2 3 0 § 220 •S| 2.0 O 200 190 t - Grafico 4: Anâlisis de la varianza del grosor de la capa de empalizada en funciôn de la fertilidad. El huevo de esta ultima especie es superior en peso y tamaflo, lo que indica la importancia de esta capa en el âguila perdicera. La disminuciôn del grosor de esta capa se relaciona con infertilidad (Grâfico 4). Objetivos • Grado de cristalizaciôn. En el âguila perdicera los cristales de la capa de empalizada se organizan dando lugar a énormes formaciones romboédricas (Figura F45), cuya orientaciôn es perpendicular a la superficie del huevo como ocurre en otras aves. En el 14.8% de las câscaras examinadas, el grado de cristalizaciôn fue muy bueno, mientras que en un 12.9% de los casos este parâmetro subjetivo fue ciertamente déficiente (Figura F 46 y F46a). La zona mas interna de esta capa, la uniôn con la capa de los conos mamilares, posee especial interés y en las muestras referencia la cristalizaciôn avanza penetrando en la capa de los conos. A este nivel, existen diferencias notables entre poblaciones. 101 Resultados En la poblaciôn del Algarve las formaciones romboidales tan solo alcanzan la superficie de los conos en ciertas localizaciones, mientras que en otras se continua con una estructura de cristalizaciôn semejante a la de la capa de cristalizaciôn extema (Figura F37 y F37a). Sin embargo, a menudo los cristales pueden variar en sus dimensiones forma y orientaciôn, adoptando el aspecto de un conglomerado en ocasiones caôtico. En aquellas localizaciones en las que aparece, su limite inferior esta ciertamente marcado en su confiuencia con la capa de los conos. La incidencia de esta formaciôn es distinta en las diferentes poblaciones. Asi, aparece en todas las muestras referencia correspondientes a la poblaciôn del Algarve, mientras que en las demâs poblaciones su presencia es minima o inexistente (Figura F38 y F38a). 4.Capa mamilar. Cuantitativos • Grosor. Los valores relativos al grosor en pm de esta capa en las diferentes poblaciones figuran en la Tablai7. Comparativamente, se aprecia un mayor grosor medio en las muestras procedentes de la poblaciôn Castellana (Figura F33 y F34), si bien este aumento no es significative. El grosor total es muy inferior al de la câscara de otras especies de âguila de su âmbito como el âguila real o el âguila imperial, en las que este parâmetro se situa en valores medios de 190 y 160 pm aproximadamente. • Area mamilar al corte. Los valores para cada una de las poblaciones se compilan en la Tabla 17. No se aprecian diferencias significativas entre poblaciones en este parâmetro. La forma de la mamila al corte puede variar entre plana, con vexa y cônica (Figuras F41 y F42). Esta morfologia esta relacionada con diversos aspectos entre los que resenamos: La fertilidad o infertilidad del huevo, la edad del embriôn, la presencia 102 ________________________________________________________________Resultados de fenômenos de multinucleaciôn y la localizaciôn geogrâfica, aspectos que se analizan en los capitulos correspondientes. • Area del sistema de ventilaciôn mamilar y distancia entre mamilas. Se trata del area entre mamilas expresada en pm^ (Figura F4), y los resultados para cada poblaciôn quedan reflejados en la Tabla 17. Relaciôn entre el àrea libre entre m am ilas y la densidad de las mismas en las diferentes poblaciones 15000 10000 5000 Algarve Duero CLM □ Area intermamilar (um2) O Nûmero de mamilas/100 um2 Grâfico 5: Relaciôn entre el ârea libre entre mamilas y la densidad de las mismas en las diferentes poblaciones. Se trata de un parâmetro importante, ya que aumenta notablemente en los casos en los que aparece distribuciôn irregular de las mamilas, lo que puede contribuir a una pérdida de fortaleza en la estructura global de la câscara. Existen diferencias significativas entre la poblaciôn Castellana (Figura F51) y la poblaciôn del Algarve, siendo esta ârea entre un 10% y un 12% superior en la primera. • Distancia entre mamilas. La distancia entre mamilas se expresa en pm (Figura F4a) no existiendo diferencias significativas entre poblaciones. 103 Resultados Tabla 17: Caracteristicas de los parâmetros correspondientes a la capa mamilar en las diferentes poblaciones de âguila perdicera. CAPA MAMILAR Poblaciôn Area al corte Grosor Area intermamilar Distancia entre mamilas Area mamilar Nûmero de mamilas Media 51183.6 92.4 9421.7 105.8 264935.6 41.4 Algarve SD 17189.0 15.7 2124.5 26.5 89015.7 11.1 (n=21) Minimo 34075.5 70.2 6896.9 76.1 127432.8 20.0 Mâximo 120282.9 120.9 14418.6 189.6 455755.7 58.0 Media 49066.2 90.1 10236.3 108.4 187718.7 37.3 Duero SD 8647.4 17.5 4780.5 26.4 86911.4 19.7 (n=6) Minimo 36888.0 65.7 5554.7 73.2 107597.7 23.0 Mâximo 62720.0 118.1 16268.7 140.7 356868.8 74.0 Media 52116.5 103.2 11666.6 107.2 209920.6 34.8 Castilla SD 9903.1 17.6 3402.2 42.2 152190.1 23.6 (n=13) Minimo 8722.4 79.1 6607.3 67.2 45673.1 5.0 Mâximo 76145.0 144.9 17399.2 224.9 520242.0 101.0 • Nûmero de mamilas y àrea mamilar. Los resultados fîguran en la Tabla 17. Se ha constatado un descenso significativo del numéro de mamilas en la poblaciôn Castellana (Figura F 15) y del Duero. La fusiôn de mamilas como parte de un proceso global de multinucleaciôn es un hecho constatado en esta poblaciôn, lo que reduce el numéro total de mamilas en un 18% aproximadamente. El ârea total de superficie mamilar (Figura F4a) disminuye de forma similar, lo que hace que la diferencia en este parâmetro 104 ________________________________________________________________ Resultados sea de aproximadamente de un 30% y 21% para las poblaciones del Duero y Castilla - La Mancha respectivamente, con respecto a la poblaciôn del Algarve. • Superficie de los nûcleos mamilares. Es un aspecto importante ya que de él dependen el crecimiento de los cristales de la capa mamilar y, en parte, la adherencia de las fibras de la membrana extema a la capa mamilar (Figura F39). Los resultados se expresan en pm^ quedando compilados en la tabla adjunta. El àrea de estos nûcleos sufre una disminuciôn muy importante en el caso de las poblaciones del Duero y Castilla con reducciones médias del 52% y 37% respectivamente (Figura F24). • Nûmero de nûcleos y distancia entre nûcleos. Los valores en referencia a cada poblaciôn figuran en la Tabla 18. Se ha observado que el numéro total de nûcleos por unidad de superficie disminuye de forma notable en las poblaciones del Duero y Castilla en comparaciôn con la Caracteristicas cuantitativas de los nûcleos mam ilares y su distribuciôn en las diferentes poblaciones 1 0 0 v -- - 80 r L___Lj 60 y 40 "1 r..__I 20 0 - r n . j[ Algarve Duero CLM Grâfîco 6: Caracteristicas cuantitativas de los nûcleos mamilares y su distribuciôn en las diferentes poblaciones. poblaciôn del Algarve. Las reducciones se cifran en 52% y 47% para cada poblaciôn respectivamente (Grâfico 6). Sin embargo, la distancia media entre nûcleos (Figura F4) permanece invariable entre poblaciones. El nûmero total de 105 Resultados Tabla 18: Caracteristicas de los nûcleos mamilares en las diferentes poblaciones de âguila perdicera. NUCLEOS MAMILARES Poblaciôn Area Numéro Area de fisuras Distancia entre nûcleos Media 7319.5 58.4 5179.7 88.1 Algarve SD 4749.8 29.9 6700.0 29.3 (n=21) Minimo 1445.8 20.0 526.0 65.2 Mâximo 18576.9 135.0 25789.6 160.4 Media 3528.7 28.5 12185.7 91.6 Duero SD 5047.6 26.1 15758.5 22.4 (n=6) Minimo 744.4 11.0 547.0 49.7 Mâximo 11095.0 67.0 43380.9 109.4 Media 4627.2 31.4 2786.5 91.8 Castilla SD 4077.3 23.1 3279.8 15.1 (n=13) Minimo 865.2 5.0 0.0 73.2 Mâximo 12219.8 75.0 9211.5 114.0 Objetivos. • Grado de multinucleaciôn. Los fenômenos de multinucleaciôn no aparecen en câscaras normales de esta especie. Esta anomalia aparece de forma mas frecuente en las poblaciones del Duero y castellana (Figura 50). • Forma, tamano y distribuciôn de las mamilas. 106 Resultados Los conos mamilares presentaron las formas habituales descritas para otras especies. En el âguila perdicera, los conos son pequenos con un diâmetro aproximado entre 65 y 140 pm. La forma es ciertamente variable en su ârea de contacte con las membranas testâceas, pero es en general circular con ligeras ondulaciones. En su secciôn transversal la forma es convexa, con una cierta prominencia, pero sin llegar a ser cônica ni excesivamente plana (Figura F41 y F42). La distribuciôn de las mamilas es regular, disponiéndose de forma ordenada y compacta en su superficie de contacte con las membranas. En general, quedan pocos huecos entre mamilas y, en la base, se encuentran abigarradas y flrmemente unidas sin dejar fisuras importantes. Tan solo en los huecos correspondientes a la salida de los poros se aprecia la separaciôn précisa. • Conexiôn con membranas testâceas. La conexiôn entre membranas y conos mamilares en el âguila perdicera es regular (Figura Fi l ) . En las muestras de referencia las membranas se separaron de parcial a totalmente mediante tratamiento âcido. El grado de adherencia puede ser variable (Figuras F39 y F40) quedando reflejado durante la separaciôn de las membranas de la capa mamilar. En ninguno de los huevos referencia se detectô un aumento de la adherencia a este nivel. 5. Câscara Cuantitativos • Grosor total. Los grosores totales correspondientes a las très poblaciones se han expresado en pm como médias y desviaciones estândar que figuran en la Tabla 14. Los resultados indican un 5% de disminuciôn en el grosor total de la câscara en las poblaciones de Castilla y Arribes del Duero (Figuras F33 y F34). Esta reducciôn es estadisticamente significativa, pero un tercio aproximadamente de la detectada en otros rapaces como el âguila imperial o el âguila real, en las que se ha sugerido 107 Resultados como causa del bajo éxito reproductor. De este modo se constata que la maxima reducciôn en el grosor de la câscara en la poblaciôn de Castilla se debe en su totalidad a la reducciôn en el grosor de la capa de empalizada. Esta se palia de algün modo mediante ligeros aumentos en el grosor de la capa mamilar en esta poblaciôn. 6. Membranas testâceas Cuantitativos • Grosor total. Es la suma de los grosores de cada una de las dos membranas que la componen, figurando estos en la Tabla 19. Es necesario hacer ciertas observaciones, los datos referentes a la poblaciôn de los Arribes se han adjuntado como meras puntualizaciones y no pueden tomarse como representativos debido a la escasez de muestras. De los resultados se deduce que el grosor total es similar en las poblaciones en las que el numéro de muestras es suficientemente representativo, siendo de entre 120 y 141 pm. Résulta complejo establecer comparaciones con otras especies, ya que estos aspectos prâcticamente no han sido estudiados en aves salvajes. En comparaciôn con la membrana en el huevo de gallina, el grosor de la suma de ambas membranas es aproximadamente el doble en el âguila perdicera. Las medidas han de tomarse con cautela, ya que esta capa es obviamente mas sensible a los agentes meteorolôgicos de modo que pueden deteriorar la calidad de la muestra especialmente en el caso de restos de câscara con membranas adheridas. 6.1. Membrana externa Cuantitativos. • Numéro de fibras. 108 _______________________________________________________________ Resultados El numéro de fibras se situa entre 26 y 34 por cada 100 pm lineales, sin que se puedan establecer diferencias significativas entre poblaciones en este sentido (Figura F7). Las variaciones individuales se han referido como importantes en esta estructura del huevo en aves. En el âguila perdicera, las desviaciones standard son valores elevados si bien no en exceso. • Diàmetro de fihras. El diàmetro medio (Figura F7a) de las fibras es significativamente superior en la poblaciôn del Algarve lo que va asociado a un numéro medio de fibras ligeramente inferior (Grâfico 7). Las fibras se componen mayormente de una cubierta de carbohidratos seguida de lipidos rodeando un nùcleo proteico. En ausencia de estudios mas precisos, résulta imposible discemir en las posibles causas de una disminuciôn o aumento general del grosor. Caracterfsticas cuantitativas de la m em brana testàcea externa y sus fibras en muestras correspondientes a las diferentes poblaciones. 100 50 Algarve Duero CLM □ Numéro de fibras □ Espesor mb ext (um) □ Diàmetro medio de fibrasx 10 Grâfico 7: Caracteristicas cuantitativas de la membrana testâcea extema y sus fibras en muestras correspondientes a las diferentes poblaciones. • Grosor de la membrana. 109 Resultados Los resultados fîguran en la Tabla 19, si bien résulta difîcil establecer conclusiones ante las diferencias individuales y el estado de conservaciôn de la muestra. Tabla 19: Caracteristicas de los parâmetros correspondientes a las membranas testâceas en las diferentes poblaciones de âguila perdicera estudiadas. MEMBRANAS DE LA CASCARA Membrana externa Membrana interna Poblaciôn Numéro de fibras Espesor Diàmetro medio Numéro de fibras Espesor Diàmetro medio albuginea Media 26.7 85.5 2.6 35.4 56.7 2.1 Algarve SD 5.7 20.6 0.8 8.3 14.8 0.8 (n=21) Minime 17.0 59.0 1.4 23.0 34.0 1.3 Mâximo 42.0 113.0 4.5 50.0 73.0 4.3 Media 34.3 47.8 2.0 47.0 58.4 1.3 13.8 Duero SD 5.3 0.4 11.6 27.6 0.2 16.9 (n=6) Minime 27.0 47.8 1.7 38.0 36.9 1.1 1.9 Maxime 39.0 47.8 2.6 64.0 106.0 1.5 25.8 Media 28.8 80.4 2.1 28.7 39.3 2.9 3.4 Castilla SD 8.9 29.4 0.6 12.6 13.4 1.2 (n=13) Minime 14.0 46.0 1.6 16.0 23.1 1.5 3.4 Maxime 36.0 142.0 3.3 47.0 66.0 5.0 3.4 Obietivos. • Distribuciôn de fibras. La distribuciôn de las fibras de la membrana extema es regular, ciertamente abigarrada pero menos densa que la capa interna. Las fibras son bifurcadas pero no 110 _______ Resultados se entrelazan sino que se aposicionan en multiples capas que se hacen mas densas conforme se avanza hacia el interior. De forma adicional el grosor de las fibras disminuye en la misma direcciôn. Algunas de las fibras de esta capa penetran hacia el interior de las membranas entrelazândose con la capa interna. En la superficie de las fibras, en ocasiones se observan pequeftos mamelones y vesfculas. De nuevo se aprecian diferencias entre poblaciones. Mientras en la poblaciôn de El Algarve estas vesfculas aparecen con cierta frecuencia (92% de las muestras examinadas) (Figura F26, F47 y F47a), en la poblaciôn espaflola rara vez se presentan (12%) (Figura F25). 6.2. Membrana interna. Cuantitativos. • Nûmero y diàmetro de fibras. Los resultados figuran en la tabla 19. El numéro de las fibras es significativamente inferior en la poblaciôn espaflola mientras que aumenta el diàmetro medio de estas fibras en comparaciôn con la poblaciôn del sur de Portugal. Caracteristicas cuantitativas de la membrana testàcea interna y sus fibras en muestras correspondientes a las diferentes poblaciones Algarve Duero CLM □ Numéro de fibras □ Espesor mb int (um) □ Diàmetro medio de fibras(um)x 10 Grâfico 8: Caracteristicas cuantitativas de la membrana testàcea interna y sus fibras en muestras correspondientes a las diferentes poblaciones. 111 Resultados • Grosor de la membrana interna. Es ciertamente difîcil de discemir en algunos casos debido al grado de deterioro. En general, el grosor total de esta capa se situa entre 39 y 58 pm (Figura F6). • Presencia de capa albuginea'. Del total de las muestras analizadas, en très se encontre la capa albuginea (Figura F9). Es una capa de apariencia pétrea, que se ha denominado por otros autores como capa de cemento albuminoso. Se situa entre las fîbras de la membrana intema en el limite con el albumen. Su apariciôn es ciertamente irregular sin que conozcamos hasta el momento la causa. Su grosor varia entre 1.95 y 3.36 pm siendo este ciertamente regular en toda su extension. Esta capa empapa la porciôn mas intema de la membrana intema, en el limite con la misma. Obietivos. • Distribuciôn de fibras. Las fîbras de la membrana intema se distribuyen de forma regular y poseen mayor densidad que las fîbras de la membrana extema dejando pocos huecos entre fîbras (Figura F8 y F8a). En la mayoria de los casos y en todas las poblaciones aparecen vesfculas muy pequenas adheridas a la superficie de estas membranas. Su tamano es muy inferior al de las vesiculas présentes en ocasiones en la membrana extema. 1.3 TENDENCIAS Y CORRELACIONES ENTRE VARIABLES CUANTITATIVAS Y NO CUANTITATIVAS Conforme a los coeficientes de correlaciôn de Pearson y Spearman se estableciô el grado de asociaciôn entre todas las variables incluidas en este estudio: cuantitativas, objetivas y subjetivas. Tan solo se harâ referenda en este 112 Resultados apartado a aquellas correlaciones que han resultado significativas indicando el grado de significaciôn. El grado de dependencia de las variables cuantitativas con respecto a aspectos cualitativos, o la presencia de alteraciones se analizô mediante anâlisis de la varianza. Se observé que existen diferencias significativas entre grados de afecciôn. 1. Cuticula Cuantitativos • Numéro total de poros por unidad de superficie. El numéro de poros y el ârea total de intercambio gaseoso se correlaciona positivamente con el grosor total, grosor y area de la capa de empalizada, area entre mamilas y ârea mamilar. Por el contrario, se vincula negativamente con el ârea y grosor de la capa mamilar. Obietivos • Presencia o no de cuticula y rasgos caracteristicas. Existe una correlaciôn positiva (p=0.0426), entre la presencia de mayores âreas de cuticula y la de material obstruyendo los poros. Del mismo modo la apariciôn de âreas extensas de cuticula se asociô positivamente (p=0.0459), a la presencia de fracturas radiales en la cuticula. La existencia y abundancia de cuticula se relacionaron de forma significativa (p=0.01) con la presencia de vesiculas en las membranas de la câscara. Las câscaras con cantidades de cuticula muy reducida difirieron significativamente (p=0.01), en el ârea de superficie mamilar, de aquellas en las que se observaron âreas de médias a extensas. Estas ultimas mostraron âreas ciertamente reducidas en comparaciôn con la primera. Los resultados indican que efectivamente la presencia de superficies amplias de cuticula, se relaciona significativamente con una menor ârea de 113 ___________________________________________________________________________Resultados intercambio gaseoso y un menor numéro de poros a nivel de superficie extema de la câscara. En ambos casos los niveles de significaciôn se cifran en p=0.05. • Presencia o ausencia de estructuras adicionales: esferolitos, vesiculas, material en la entrada de los poros y fracturas radiales. La apariciôn de material en poros se relacionô positivamente con la presencia de fracturas radiales (p=0.0484). Sin embargo la correlaciôn es significativa, pero negativa, entre la presencia de fracturas y el grado de cristalizaciôn de la capa de empalizada. Esto implica que la presencia de fracturas esta ligada a grados déficientes de cristalizaciôn. Obietivos • Aspecto de la cuticula. Las muestras que mostraron un aspecto irregular en su superficie, alcanzaron grosores de la capa mamilar significativamente superiores a aquellas que presentaron un aspecto regular de la cuticula. 2. Capa de cristalizaciôn externa Cuantitativos • Area. El ârea y el grosor de esta capa se encuentran obviamente relacionados con un alto grado de significaciôn. Anilisis de U varianu del Area entre mamilas en Aincién del grado de adherenda entre con os y membrana extema. 13500 I 12500 11500 10500 9500 8500 7500 Méximo Medio Minimo Grado de adherenda Grâfico 9: Anâlisis de la varianza del ârea entre mamilas en funciôn del grado de adherenda entre conos y membrana extema. 114 Resultados Una disminuciôn en el area de esta capa se relaciona significativamente con la presencia del fenômeno de fusiôn de fibras. • Numéro de estratos. Este paramètre aumenta con el aumento del area de la capa de cristalizaciôn extema. Existe ademâs una tendencia a correlacionarse con el grosor de dicha capa con una significaciôn segùn Pearson de (p=0.07). En esta capa la cristalizaciôn es perpendicular a la superficie, pero los cristales se aposicionan formando capas que se extienden paralelamente a la superficie de la câscara. • Nûmero de canales. El numéro de canales encontrados en esta capa al corte se correlaciona significativamente con el grosor total de la câscara, tal y como explicaremos detalladamente en el apartado correspondiente. Ademâs se relaciona de forma positiva con el numéro de estratos présentes en la capa extema. Obietivo • Estructura y grado de cristalizaciôn. A mejor grado de cristalizaciôn mayor es el ârea de la capa de cristalizaciôn extema. El grado de cristalizaciôn de la capa extema se ha correlacionado positivamente con très variables distintas: El grado de cristalizaciôn de la capa de empalizada (p=0.0104), el grado de adhesiôn entre la capa de los conos mamilares y la membrana testâcea extema (p=0.0328), y la fertilidad del huevo (p=0.0456). 3. Capa de empalizada Cuantitativo • Numéro de vesiculas. En el corte se han clasiflcado dos tipos de âreas: Las mâs porosas y las de escaso numéro de poros. Existe una correlaciôn positiva entre el numéro de vesiculas présentés en el ârea mâs porosa y en la menos. Los ANOVA incluidos en 115 Resultados el anâlisis de regresiôn simple, entre el numéro de vesiculas en estas âreas y el numéro de poros en superficie indican que existe una correlaciôn significativa entre ambas variables. De idéntica manera, existe una relaciôn significativa entre el numéro de vesiculas y el grosor total de la câscara pero en este caso el vinculo entre variables es menor cuando se aplica el R cuadrado. • Grosor El grosor de esta capa se relaciona con el numéro de poros por unidad de superficie, en el exterior de la câscara. La relaciôn es positiva, a mayor grosor mayor numéro de poros Obietivo • Grado de cristalizaciôn. Cuanto mejor es el grado de cristalizaciôn de la capa de empalizada mejor es el grado de cristalizaciôn de la capa de cristalizaciôn extema. 4. Capa mamilar Cuantitativo • Grosor El grosor de esta capa se relaciona con el numéro de poros por unidad de superficie en el exterior de la câscara y también con la superficie total de intercambio gaseoso. La relaciôn es negativa, a menor grosor mayor numéro de poros. Existe una correspondencia positiva con significaciones entre 0.001 y 0.02, entre este parâmetro y el ârea mamilar, la distancia entre mamilas y el ârea entre mamilas. Esta correlaciôn es mas significativa entre el grosor y el ârea entre mamilas. • Area. Se relaciona positivamente con el grosor de esta capa. El coeficiente de Spearman, debido a que computa rangos de valores de datos en lugar de los datos en si, y por tanto es menos sensible a los “outlayers”, incorpora una relaciôn 116 __________________________________________________________________________ Resultados negativa entre este parâmetro, el numéro de poros y el ârea de intercambio gaseoso. El grado de significaciôn de esta, es inferior a la establecida entre las dos ultimas variables y el grosor de esta capa • Area del sistema de ventilaciôn mamilar. Se relaciona positivamente con la distancia entre mamilas. La correlaciôn es altamente significativa. • Nûmero de mamilas El numéro de mamilas definidas se correlaciona negativamente con el numéro de poros y su ârea, el grosor total de la câscara, el ârea mamilar y entre mamilas. • Area de mamilas Se correlaciona positivamente con el ârea de nùcleos de calcificaciôn, el ârea mamilar, y el ârea de intercambio gaseoso; pero negativamente con el numéro de mamilas • Nûmero de conos Se vincula positivamente con el ârea de mamilas, el ârea de nùcleos, y el numéro de poros y su ârea. Sin embargo, lo hace negativamente, aunque con évidente menor significaciôn, con el numéro de mamilas claramente diferenciadas. El numéro de estos nùcleos se relaciona positivamente con el diàmetro medio de las fibras y negativamente con el nûmero de las mismas. • Superficie total y media de los nùcleos mamilaxQS. De forma idéntica a lo que se apuntaba para el nûmero de conos, el ârea total de los mismos se relaciona negativamente con el nûmero de mamilas. 117 Resultados Correlaciôn entre el ârea de los nùcleos mamilares y el nûmero de fibras de la membrana testàcea externa 400 -0 200 100 'ir- 0 1 19 2 29 34 39 44 Nûmero de fibras de la membrana externa Grâfico 10: Correlaciôn entre el area de les nùcleos mamilares y el numéro de fibras de la membrana testâcea extema La superficie media de los nùcleos se relaciona positivamente con el nûmero de nùcleos, y negativamente con el nûmero de fibras de la membrana extema (Grâfico 10). La regresiôn simple establecida en este ùltimo caso mediante el uso de modelo lineal se ajusta a las necesidades y contiene un grado de correlaciôn entre variables muy elevado. • Distancia media entre nùcleos Cuanto mayor es la distancia entre nùcleos menor es el nûmero de mamilas y mayor el nûmero de nùcleos. Esta tendencia es muy significativa, al igual que la correlaciôn positiva existente entre este parâmetro, el nûmero de poros, el ârea de los mismos, el ârea entre mamilas, el ârea mamilar, y el grosor total de la câscara. Obietivos. • Grado de multinucleaciôn El grado de multinucleaciôn se asocia negativamente (p=0.0488), con un aumento en el tamafio de las mamilas, lo que implica que el fenômeno de multinucleaciôn no necesariamente da lugar a un aumento en el tamano general de las mamilas. 118 Resultados • Forma, tamano y distribuciôn de las mamilas. La forma de la mamila puede ser desde plana a casi cônica. Los resultados indican que las formas cônicas cursan con espacios entre mamilas significativamente superiores a las formas planas. La media en el primer caso prâcticamente dobla la obtenida en el segundo. Anâlisis de la varianza del grosor de la capa mamilar en funciôn de la forma de la mamila î 128 'W 1 118 a a 108 s 2 98 u 88 78 Grâfico 11; Anâlisis de la varianza del grosor de la capa mamilar en fimciôn de la forma de la mamila. Del mismo modo, las formas cônicas presentan grosores de la capa mamilar significativamente superiores a las formas planas o intermedias (Grâfico 11). 119 Resultados Las câscaras con mamilas planas presentan un numéro significativamente superior de estratos en la capa de cristalizaciôn extema en comparaciôn con las muestras con mamilas cônicas. Las membranas de la câscara y la capa mamilar estân ciertamente relacionadas. En este sentido, la presencia de formas cônicas parece derivarse de membranas internas con un numéro significativamente superior de fibras. A mayor tamafio de las mamilas menor es el grado de adherenda que présenta esta capa con la membrana extema de la câscara. TamaAos reducidos de mamilas se asocian significativamente con un aumento del ârea de vesiculas en la capa de empalizada y una disminuciôn del diàmetro de las fibras de la membrana intema (Grâfico 12). Anilisis de la varianza del diimetro de las fibras de la membrana intema en relaciôn con el tamafio de las mamilas 143 I 123 Ia 103 "S J 83 63 ; ------------------ - 1 11 Pequefias Grandes Tamafio de las mamilas Grâfico 12: Anâlisis de la varianza del diàmetro de las fibras de la membrana intema en relaciôn con el tamano de las mamilas. Los resultados estadisticos derivados del ANOVA de una via indican, que el ârea entre mamilas y el ângulo de inclinaciôn de las columnas poliédricas sobre la vertical, son significativamente superiores en aquellas muestras que presentan distribuciones de mamilas muy irregulares. Por el contrario, el numéro de 120 ________________________________________________________________________ Resultados mamilas, superficie mamilar y estratos de la capa de cristalizaciôn extema es significativamente inferior en distribuciones irregulares. • Conexiôn con membranas testâceas. Al margen de la relaciôn con el tamafio de las mamilas referidas anteriormente, existe una correlaciôn positiva y significativa entre esta adherencia y el grado de cristalizaciôn de la capa de cristalizaciôn extema. El ANOVA de una via constata que existe una relaciôn significativa entre el ârea entre mamilas y el grado de adherencia con las membranas de la câscara (Grâfico 13). Areas reducidas dan lugar a una adherencia superior. Anâlisis de ta varianza del ârea entre mamilas en funciân del grado de adherencia entre conos y membrana extema. 13500 12500 I 11500 5 • | 10500 B 9500 I 8 8500 Ĵ 7500 Mâximo Medio Minimo Grado de adherencia Grâfico 13; Anâlisis de la varianza del ârea entre mamilas en funciôn del grado de adherencia entre conos y membrana extema. 5. Câscara Cuantitativos • Grosor total El grosor total de la câscara se correlaciona significativamente con algunas de las variables indicativas del tamafio de cada una de las capas que componen la câscara en el âguila perdicera incluyendo: El grosor y ârea de la capa de 121 ________________________________________________________________________ Resultados cristalizaciôn extema, la capa de empalizada y la mamilar. Todas las correlaciones fueron positivas y mostraron un grado muy elevado de significaciôn (p=0.001 a p=0.01). No obstante, los vinculos mâs significatives se encontraron entre el grosor total y el ârea total de la capa de cristalizaciôn extema. Las otras dos capas mostraron significaciones similares aunque opuestas comparando ârea y grosor. De forma adicional, el grosor total fue superior en aquellas câscaras con mayor numéro de canales correspondientes a poros visualizados en el corte de la capa de cristalizaciôn extema. Se relaciona positivamente ademâs con el ârea mamilar, el ârea entre mamilas y el ârea total de intercambio gaseoso. En el caso del âguila perdicera, los anâlisis demuestran que existe una cierta tendencia a la significaciôn (p=0.12), en la relaciôn entre la longitud del huevo y el grosor de la câscara. Sin embargo, cuando se comparan el grosor y el ancho de la câscara la relaciôn es muy significativa (p=0.007). La correlaciôn entre el volumen del huevo y el grosor de la câscara no résulté significativa en el âguila perdicera. 6. Membranas testâceas 6.1. Membrana externa Cuantitativo • Numéro de fibras. A mayor numéro de fibras en esta membrana mayor es el numéro de las mismas en la membrana intema. • Diàmetro de fibras. El diàmetro medio de las fibras de la membrana extema se vincula significativa pero negativamente con el numéro de fibras. Esto implica que cuanto mâs gmesas menor es la densidad de las mismas. El aumento en el diàmetro medio de estas fibras se correlaciona muy significativamente (p=0.02) y de forma positiva con el ârea mamilar al corte. Semejante relaciôn se establece entre esta variable y el numéro de nùcleos mamilares o su ârea. La relaciôn entre la distancia 122 Resultados media entre nùcleos y el numéro de fibras es igualmente positiva con un importante grado de significaciôn. Obietivo • Distribuciôn de fibras. Existe una correlaciôn positiva (p=0.0010), entre la distribuciôn regular o irregular de las fibras de la membrana extema y el mismo parâmetro en la membrana intema. Cuanto mâs regular es la distribuciôn de las fibras en una, mâs regular es en la otra. Los anâlisis estadisticos indican que el modelo lineal utilizado explica un 73.05 % de la variabilidad de la distribuciôn de las fibras de la membrana extema, siendo la correlaciôn entre ambas variables muy sôlida. Distribuciones irregulares de las mamilas presentan un numéro significativamente superior de poros en superficie, acompanado de un grosor superior de la capa mamilar. Similares correlaciones se han encontrado en la relaciôn entre la distribuciôn de las fibras internas y estas dos ultimas variables. El fenômeno de fusiôn de fibras se correlaciona con una disminuciôn del ârea de nucleaciôn y del numéro de nùcleos. La presencia de fusiôn de fibras se traduce en una disminuciôn significativa del grosor y ârea de la capa mamilar (Grâfico 14). Aniifsis de la varianza del ârea mamilar en funciôn de la presencia de fusiôn de fibras 38 I 34 6 ï 30 g« 26 Ss22 < 18 14 Ausente Présente Fusiôn de fibras Grâfico 14: Anâlisis de la varianza del ârea mamilar en fimciôn de la presencia de fusiôn de fibras. 123 Resultados 6. 2. Membrana interna Cuantitativo • Diàmetro de fibras. El diàmetro medio de las fibras de la membrana intema, como ocurre en la membrana extema corresponde significativamente pero negativamente con el numéro de fibras. Esto implica que cuanto mâs gmesas menor es la densidad de las mismas. Cuanto mayor es el diàmetro de estas fîbras mayor es el diàmetro de las fibras de la membrana extema. Del mismo modo la densidad y distribuciôn de estas fibras de la membrana extema se relacionan con los mismos parâmetros en la membrana intema. IL DETERMINACION DE LA VARIACION EN LOS PARÂMETROS ESTABLECIDOS EN FUNCION DE FACTORES GEOGRÀFICOS Y CLIMATOLOGICOS. GENÉTICOS. E INMUNOLOGICOS IL 1. FACTORES GEOGRÀFICOS Y CLIMATOLÔGICOS. II .l.l . Nùcleo poblacional En la variaciôn del tamafio del huevo sobre la base de la longitud y ancho del mismo, no se encontraron diferencias significativas entre poblaciones para ninguna de las dos variables utilizando ANOVA de un factor. Lo mismo sucediô con la variable peso, si bien en este caso los resultados no son indicativos, impidiendo establecer cualquier conclusiôn vâlida para esta variable. Sin embargo, una de las muestras de la poblaciôn Castellana si presento dimensiones significativamente inferiores a las otras poblaciones. En este caso se trato de un 124 Resultados huevo no eclosionado pero fértil, en el que se diagnostico muerte embrionaria por infecciôn bacteriana. Las diferencias en el ârea de fîsuras présentés entre mamilas resultaron estadisticamente no significativas entre las poblaciones de Espana y el Algarve portugués, mientras que este parâmetro diflriô de forma significativa entre estas poblaciones y la poblaciôn del Duero en Portugal. El ârea de fîsuras entre mamilas fue muy superior en el caso de la poblaciôn del Duero situândose en una media de 12.185 pm ^ El ârea minima de vesiculas a nivel de la capa de empalizada fue significativamente inferior en la poblaciôn Castellano - Manchega en comparaciôn con las poblaciones portuguesas entre las que no se apreciaron diferencias significativas (Figura F31 y F32). La comparaciôn entre médias indica que el valor para esta ârea es aproximadamente la mitad en la poblaciôn espaflola. En relaciôn con este dato, idéntica significaciôn fue encontrada durante la valoraciôn del numéro de vesiculas présentés en las âreas de mayor densidad de la capa de empalizada. La poblaciôn espaflola alcanzô niveles significativamente inferiores a las poblaciones portuguesas, en concrete la media de la poblaciôn espaflola se situa en 18.4 vesiculas por unidad de superficie comparada mientras que las médias portuguesas se sitùan en 45.3 y 52.6 para las regiones del Algarve y Arribes del Duero respectivamente. Continuando con el estudio de los parâmetros de la capa de empalizada igualmente se encontraron diferencias altamente significativas (p=0.02), entre las poblaciones portuguesas y la espaflola en cuanto al grosor y el ârea de dicha capa que resulto significativamente inferior en la poblaciôn espanola, en concrete aproximadamente un 40% menor, mientras que los grosores de las poblaciones portuguesas fueron similares (Figuras F33 y F34). 125 Resultados La presencia de capa albuginea se constaté mayormente en la poblaciôn de Arribes de Duero, y un caso en la poblaciôn castellana mientras que esta capa estuvo ausente en la poblaciôn del Algarve portugués. Durante el estudio detallado del numéro de poros présente en la superficie de la câscara se hallaron diferencias significativas entre la poblaciôn del Algarve y la Castellano - Manchega siendo en esta ultima menos numerosos (Figuras F27 y F28), mientras que las diferencias entre la poblaciôn de los Arribes y las dos restantes no fueron significativas, figurando el numéro de poros de esta ultima dentro de un rango de valores mucho mâs amplio. II. 2. 2. Altitud del ârea de cria La mâxima diferencia en relaciôn con la altitud a la que se encuentran las plataformas de las parejas estudiadas fiie de 900 m. Los resultados de los anâlisis estadisticos arrojan diferencias no significativas en ninguno de los parâmetros estudiados, incluido el numéro de poros por unidad de superficie. Este ùltimo parâmetro se ha descrito aumenta en aves que viven a gran altura. II. 3. FACTORES GENETICOS E INDIVIDUALES Se compararon los parâmetros cuantitativos de huevos correspondientes a una misma pareja en anos consecutivos. Los resultados indican que las magnitudes mâs variables en un mismo individuo son: El numéro de estratos, el ângulo de orientaciôn de las columnas romboédricas, el ârea de intercambio gaseoso, el nûmero de poros en superficie de la câscara y los parâmetros relativos a la membrana intema de la câscara. Por el contrario determinadas variables permanecieron dentro de un rango estrecho: Los grosores de todas las capas excepto la de cristalizaciôn extema, y el ârea y distancia entre mamilas (Figura F 13 y F 14). Los estudios comparativos del nûmero de poros en huevos de la 126 Resultados misma pareja en anos consecutivos revelan un aumento significativo del numéro de poros. En relaciôn con los parâmetros subjetivos, existe aun menor variaciôn que en los cuantitativos. Los rasgos y estructuras caracteristicas y anormales, como la existencia de fusiôn de fibras, o fenômenos de multinucleaciôn permanecen invariables. IL 4. FACTORES INMUNOLOGICOS E INFECCIOSOS Alteraciones del estado inmunolôgico pueden dar lugar a una mayor predisposiciôn al padecimiento de enfermedades, incluyendo aquellas que de alguna manera pueden afectar a la fertilidad. Ante la imposibilidad de comprobar el estado inmunolôgico de las aves salvajes de forma rigurosa, se procediô a la caracterizaciôn de las parejas en funciôn de la presencia de patologlas encontradas en la descendencia durante el chequeo sanitario en nido. Entre las patologlas encontradas en los polios figuraron: Tricomoniasis, candidiasis, y salmonellosis. Todas ellas pueden teôricamente ser transmitidas de los padres a la descendencia, pudiendo ser los primeros portadores de la enfermedad o incluso padecerla. Desafortunadamente no se ha podido accéder al chequeo de la descendencia de todas las parejas de las que se poseen restos de câscara, y viceversa. No obstante, los resultados indican una superior incidencia de estas patologias en la poblaciôn portuguesa del Algarve. Cuando se correlacionô la presencia o ausencia de patologlas con determinadas caracteristicas de la câscara se obtuvieron los siguientes resultados. En la poblaciôn del Algarve, el 80% de las muestras procedentes de parejas en cuyos polios se detecto algün tipo de patologla, presentaron vesiculas en la membrana extema. Sin embargo este porcentaje no fue significativo comparado con el observado en el total de la poblaciôn (77%). De forma similar, ninguna de 127 Resultados las variables objetivas, taies como la densidad de fibras, o los fenômenos de fusiôn de fîbras o multinucleaciôn, se correlacionô con la presencia de estas enfermedades en la descendencia. Los estudios de correlaciôn entre la presencia de enfermedades y las variables cuantitativas, arrojaron resultados similares. Tan sôlo el espesor medio de la membrana intema se correlaciono con la presencia de enfermedades. Los huevos procedentes de nidos con esta problemâtica mostraron espesores inferiores al resto. III. DESCRIPCIÔN DE ALTERACIONES ULTRAESTRUCTURALES Nos referiremos exclusivamente en este capitulo a las anomalias morfolôgicas relacionadas con aspectos objetivos de la ultrestmctura de la câscara. Las variaciones en los aspectos cuantitativos se han tratado con detalle en el capitulo I. 1. Cuticula • Presencia o ausencia de cuticula En cuatro (7.4%), de las muestras analizadas, se detectaron âreas muy reducidas de cuticula, apareciendo un gran desgaste de la superficie de la misma. Estos casos pueden ser el resultado del grado de exposiciôn de esta capa a los agentes meteorolôgicos y la conservaciôn de las muestras en el medio natural. La cantidad de cuticula se ha correlacionado positivamente con la longitud el huevo. A mayor longitud mayor es la presencia de cuticula que se observa por unidad de superficie. • Presencia o ausencia esferolitos y vesiculas Tan sôlo en una de las muestras analizadas se detectô la presencia de esferolitos, muestra correspondiente a la zona de Almadén, provincia de Ciudad 128 ________________________________________________________________________ Resultados Real. En este caso (Figura F52), la presencia de esferolitos se observé de forma adicional a otras anomalias afectando a la ultraestructura de la câscara. No se observaron vesiculas en ninguna de las muestras investigadas. • Presencia o no de material en la entrada de los poros. En cuatro (7.4%) de las muestras incluidas en el présente estudio, se detectô la presencia de particulas de morfologia globular, superficie irregular y tamafio variable, situadas en la entrada de los poros (Figura F 12). En uno de los casos se acompafiô de la presencia de esferolitos, mientras que en otro se apreciô la concurrencia de fracturas radiales a partir de los poros. En très de los cuatro casos, se tratô de huevos embrionados que murieron entre los dias 8 y 25, sin que estas muertes embrionarias hayan podido atribuirse a causas infecciosas. 2. Capa de cristalizaciôn externa • Grado de cristalizaciôn En el 18.5% del total de muestras analizadas el grado de cristalizaciôn de esta capa fue bueno mientras que un 27.7% de las muestras presentaron cristalizaciones déficientes caracterizadas por una disminuciôn de la estratificaciôn acompafiada de asimetria y desorganizaciôn que dieron una apariencia amorfa a esta capa. En el resto de los casos examinados, el grado de cristalizaciôn fue aceptable. Deficiencias en el grado de cristalizaciôn de esta capa se correspondieron en todos los casos con reducciones notables en el grado de cristalizaciôn de la capa de empalizada. Las alteraciones en la cristalizaciôn de esta capa dan lugar a la apariciôn de canales irregulares con alteraciôn de su trayectoria rectilinea habituai a nivel de la capa de cristalizaciôn extema. El grado de uniformidad y definiciôn de estos poros parece pues depender en parte de este concepto. 129 Resultados 3. Capa de empalizada • Grado de cristalizaciôn Se ha constado el deterioro en el grado de cristalizaciôn de esta capa que parece afectar desigualmente a las distintas poblaciones. Asi, en la poblaciôn del Algarve, un 17.25% del total de muestras presentaron grados déficientes de cristalizaciôn, mientras que dicho porcentaje se redujo hasta 12.5% y 6.2% en las poblaciones de El Duero y Castilla - La Mancha respectivamente. Las anomalias consisten en la pérdida de homogeneidad y cambios en la orientaciôn afectando a las formaciones romboéedricas. En los casos mâs severos los cristales se vuelven amorfos y su orientaciôn ciertamente variable. La densidad de formas romboédricas disminuye notablemente dejando paso a âreas planas, carentes de estratificaciôn, pero de aspecto homogéneo, similar a las encontradas en otros grupos de aves como las Galliformes. 4. Capa mamilar • Grado de multinucleaciôn Se trata de una anomalia présente en el 25.9% de las muestras analizadas, lo que supone un porcentaje ciertamente elevado. El grado de multinucleaciôn observado fue muy similar en todas las muestras en las que estuvo présente, siendo de grado leve implicando entre un très y un seis por ciento de los conos mamilares. No se observo una relaciôn constante entre la apariciôn de este fenômeno y alteraciones severas en el grado de cristalizaciôn. Sin embargo, en un 64.2% de los casos se acompafiô de una distribuciôn irregular de los conos mamilares. En la poblaciôn del Algarve este fenômeno se présenté en el 31% de las muestras correspondientes a esa ârea mientras que en las poblaciones del Duero y Castilla - La Mancha los porcentajes disminuyeron al 12.5 % y 18.7% respectivamente. • Forma, tamano y distribuciôn de las mamilas. La apariciôn de formas aberrantes en la superficie de contacte con las membranas va ligada a fenômenos de multinucleaciôn. En estos las mamilas 130 Resultados afectadas aumentan notablemente su tamano al tiempo que su forma se desvirtùa, apareciendo mamelones como resultado de la incorporaciôn de varios nùcleos. El tamano es ciertamente variable en condiciones fîsiolôgicas, sin embargo, un aumento generalizado del tamano de las mamilas en ausencia de multinucleaciôn se ha asociado en este estudio a infertilidad y fragilidad de la câscara (Figura F51). Tan sôlo se han detectado dos casos en los que se acompafiô de distribuciôn muy irregular de las mamilas, con la apertura de grandes espacios entre las mismas y la presencia de grietas intermamilares. En ambos casos la forma al corte de la mamila fue plana. No obstante, segùn se desprende de los datos del présente estudio las formas prominentes aparecen tanto en huevos fertiles como infertiles, de modo que no puede asociarse a ninguno de estos estados. Las formas planas se registraron exclusivamente en huevos fertiles (Figura F42), en el présente estudio, si bien es posible que la muestra en este caso no haya sido suficientemente grande. • Conexiôn con membranas testâceas. El 70% de los huevos examinados que mostraron una buena adherencia entre los conos mamilares y la membrana extema fueron huevos infertiles, mientras que el resto fueron fertiles. En todos estos casos la distribuciôn de los conos mamilares fue irregular. 5. Membranas testâceas 5.1. Membrana externa • Distribuciôn y morfologia de las fîbras En el 50% de las muestras examinadas se apreciô una distribuciôn irregular de las fibras. Este fenômeno no se relacionô de forma constante con la presencia de vesiculas o con fusiôn de las fibras (Figura F49). En el 95% de la poblaciôn de El Algarve aparecen vesiculas de tamafio variable adheridas a la superficie de las fibras (figura F47 y F47a). En el 45% de estos casos, las vesiculas fueron de un tamafio entre 4 y 6 veces superior al habituai y su numéro se multiplied por 10 en los casos mâs extremos. En estas muestras se apreciô la presencia de vesiculas 131 Resultados invadiendo la capa de empalizada (Figura F48) e incluso la capa de cristalizaciôn extema. El présente estudio demuestra que la presencia de un mayor mimero y tamano de estas vesiculas, esta relacionada con la apariciôn de una capa entre la capa de empalizada y la de los conos mamilares, y cuyas caracteristicas se han descrito en las anomalias de las capas de cristalizaciôn. La apariciôn de estas vesiculas, no parece estar relacionado con la distribuciôn regular o irregular de las fîbras en el âguila perdicera. La presencia de formaciones globulares en dicha capa se correlaciona significativamente pero negativamente con la distribuciôn de las fibras en esta membrana. Cuanto mayor es el numéro de formaciones globulares mayor es la irregularidad en la distribuciôn de estas fîbras. La correlaciôn es significativa (p=0.04) y los estudios acerca de la idoneidad del modelo lineal establecido indican que es correcto. La presencia de estas formaciones se ha relacionado también con la cantidad de cuticula, asi las vesiculas tienden a presentarse cuando la cantidad de cuticula es muy reducida. Esta correlaciôn es muy significativa (p=0.01) cuando se incluye una poblaciôn de datos correspondientes a aquellos huevos en los que se sabe ha ocurrido muerte embrionaria, y los estudios estadisticos indican que el modelo lineal elegido es correcto. Los resultados indican que la presencia de estas estmcturas globulares se asocia con âreas de nucleaciôn reducidas y un aumento en la densidad de las fîbras de la membrana extema (Grâfico 15). 132 Resultados Aailisis de la varianza del Area de nûcleos mamilares en funciôn de la presencia de vesfculas ! 15 1 12 1 9 1 6 s ■S et 3 1 0 Ausencia Presencia Grâfico 15: Anâlisis de la varianza del area de nûcleos mamilares en funciôn de la presencia de vesiculas. Los fenômenos de fiisiôn de fîbras afectando a estas membranas se correlacionan signifîcativamente con un mayor grado de cristalizaciôn de la capa extema. 5.2 Membrana interna • Distribuciôn de fîbras Las distribuciones irregulares afectando a la membrana interna son ciertamente poco frecuentes en esta especie. Cuando aparecen el grado de irregularidad es siempre inferior al observado en la membrana extema, si bien siempre aparece en conjunciôn con esta. Del mismo modo los aumentos citados en el numéro de vesiculas y su tamano detectados en la membrana extema ocurren de forma sincrônica en la interna. En los casos mas extremos, siempre se observa la presencia de fîbras fusionadas en partes importantes de su trayectoria, por lo que dichos fenômenos parecen ir de alguna forma asociados. 133 Resultados IV. DETERMINACION DE LOS NIVELES DE TOXICOS AMBIENT ALES EN CQNTENIDOS DE HUEVOS COMO BIOINDICADORES IV. I. TAMANO DE LA MUESTRA ANALIZADA Se analizaron los contenidos correspondientes a un total de 32 huevos, de los cuales 24 correspondieron a la poblaciôn del Algarve, 2 a la del Duero y el resto a la poblaciôn Castellano - Manchega. No se llevo a cabo ninguna selecciôn de la muestra procediendo a analizarse todas las muestras recabadas. Para una mejor exposiciôn de los resultados se ha procedido a una separaciôn de los mismos por grupos de tôxicos: organoclorados, bifenilos policlorados y mercurio. IV. 2. ANALISIS TOXICOLÔGICO Para una mejor comprensiôn de los datos se ha procedido a expresar los niveles de cada tôxico en funciôn de materia hùmeda, materia seca y fracciôn lipidica. En cada tabla fîguran las unidades en las que se expresan los resultados. En la siguiente tabla se ha compilado la informaciôn correspondiente a los principales compuestos, para los que se han encontrado niveles apreciables segùn los rangos de detecciôn de las técnicas empleadas. Los resultados se expresan para cada poblaciôn como media, desviaciôn estândar, valor mâximo, valor minimo, y numéro de muestras analizadas. La présente tabla es un resumen de la informaciôn obtenida. El grueso de los resultados se detallan en cada secciôn segùn grupos de tôxicos. IV. 2.1. Organoclorados Se han analizado los siguientes residuos de organoclorados: HCB, a-HCH, g-HCH, p,p-DDE, HEGD, p,p-TDE, y p,p-DDT. Los resultados obtenidos fîguran en la tabla 21. 134 Resultados • Formas activas: Hexaclorobenceno (HCB), a-HCH, g-HCH y p, p- DDT. Con la técnica de detecciôn utilizada en este estudio, en el caso de las formas activas, no se detectaron niveles en un gran numéro de muestras. No se encontraron residuos de DDT, en ninguna de las muestras analizadas. Algo similar ocurriô con el a-HCH y g- HCH en el que tan solo se detectaron niveles en cuatro y très del total de 32 muestras examinadas. Los niveles de este a-HCH, se mantuvieron entre 0.006 y 0.014 pg/g. • Metabolitos: Dieldrin (HEOD), p, p-TDE, y p, p-DDE. Los resultados fîguran en la Tabla 21. Los niveles mas elevados de residuos se encontraron en el DDE, situândose entre 0.16 y 2.9 gg/g de materia hùmeda en las poblaciones objeto de estudio. Niveles medios de DDE y Dieldrin en contenido de huevos de las poblaciones objeto de estudio Algarve Duero CLM □ DDEug/LW ^Dieldrin ug/LW (x10) Grâfico 16: Niveles medios de DDE y dieldrin en contenido de huevos de. 135 Resultados Niveles medios de diferentes PCB congénères en contenido de huevos correspondientes a diferentes poblaciones Algarve Duero CLM □ PCB 105 ug/g(x10) □ PCB114ug/g(x10) □ PCB118ug/g(x10) □ PCB 138 ug/g (xlO) □ PCB 153 ug/g (xlO) □ PCB 170 ug/g (xlO) □ PCB 180 ug/g (xlO) Grâfico 17: Niveles medios de los diferentes congénères de PCBs en TabJa 20: Resumen de los niveles de tôxicos en contenidos de huevos correspondientes a las très poblaciones objeto de estudio. Los resultados se expresan en pg/g de materia grasa. r DDE HEOD 105 114 118 128 138 153 156 170 180 h g Ir ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g 1 Mean 26.5 2.0 0.8 2.2 3.2 1.2 7.8 21.5 1.7 4.1 16.5 1.7 Algarve SD 22.7 2.8 1.0 1.8 2.8 1.2 7.4 21.0 1.2 3.8 13.8 1.8 Min 4.0 0.0 0.0 0.1 0.1 0.1 0.1 1.0 0.1 0.2 0.9 0.0 Max 92.2 11.6 4.2 5.6 11.9 5.6 30.9 91.6 3.7 16.2 57.3 6.1 n 24.0 24.0 19.0 19.0 24.0 24.0 24.0 24.0 19.0 24.0 24.0 24 1 Mean 8.4 0.3 0.6 0.4 1.1 0.3 1.6 4.5 0.7 0.9 4.0 0.41 SD 2.5 0.4 0.3 0.6 0.9 0.4 1.0 2.0 0.2 0.4 1.5 0.6 Duero Min 6.6 0.0 0.4 0.0 0.4 0.0 0.9 3.0 0.5 0.7 3.0 0.0 Max 10.1 0.5 0.9 0.8 1.7 0.6 2.3 5.9 0.8 1.2 5.1 0.9 n 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 Mean 30.3 1.3 1.1 2.4 2.9 0.9 5.7 15.0 2.3 3.5 16.8 3.7 CCLM SD 13.6 1.6 1.1 1.6 3.2 1.0 5.6 10.5 1.3 2.0 8.4 3.9 Min 16.8 0.4 0.0 0.5 0.0 0.0 0.6 4.0 0.9 1.2 7.0 0.0 1 Max 49.2 3.7 2.3 3.6 6.0 1.8 11.2 26.9 3.1 5.5 25.6 7.6 1 n 4.0 4.0 3.0 3.0 4.0 4.0 4.0 4.0 3.0 4.0 4.0 4.0 136 Resultados Tabla 21: Niveles de residuos de organoclorados en contenidos de huevos de âguila perdicera expresados en pg/g de materia hùmeda. MUESTR A HCB A-HCH G-HCH P, P-DDE HEOD P, P- TDE P, P-DDT (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) 1 ND ND ND 0.336 0.026 ND ND 2 ND ND ND 0.93 0.097 0.009 ND 3 ND ND ND 0.22 0.015 ND ND 4 ND 0.013 ND 0.348 0.027 ND ND 5 0.008 ND ND 1.771 0.604 ND ND 6 0.013 ND 0.014 0.564 0.056 0.021 ND 7 ND 0.014 ND 0.21 0.014 0.017 ND 8 0.011 ND ND 1.301 0.026 0.021 ND 9 0.02 ND ND 2.026 0.04 0.082 ND 10 ND ND ND 2.969 0.048 0.018 ND 11 ND ND ND 0.166 0.012 ND ND 12 ND ND ND 0.203 0.021 ND ND 13 ND ND ND 0.8 0.026 ND ND 14 ND 0.007 ND 0.784 0.034 ND ND 15 ND ND ND 0.845 0.053 ND ND 16 0.008 ND 0.024 0.766 0.051 0.02 ND 17 ND ND ND 0.639 0.041 ND ND 18 0.009 0.006 0.003 1.736 0.118 0.007 ND 19 ND ND ND 0.441 0.01 ND ND 20 ND ND ND 0.504 0.023 ND ND 21 0.015 ND ND 0.768 0.036 ND ND 22 ND ND ND 0.387 0.014 ND ND 23 ND ND ND 0.196 ND ND ND 24 ND ND ND 0.799 0.021 ND ND 25 ND ND ND 0.522 ND ND ND 26 0.017 ND ND 1.964 0.16 ND ND 27 ND ND ND 1.01 0.03 ND ND 28 ND ND ND 0.182 0.021 ND ND 29 ND ND ND 1.161 0.067 ND ND 30 0.022 ND ND 0.973 0.049 ND ND 31 0.018 ND ND 1.973 0.193 ND ND 32 ND 0.047 ND 1.18 0.09 ND ND 137 Resultados Tablas 22 y 23: Concentraciones de diferentes congénères de PCBs expresadas en pg/g de materia hùmeda. N REF 8 18 29 28 31 52 77 101 105 114 118 123 ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g 1 ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0.021 0.032 0.006 2 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.154 0.149 0.193 0.017 3 ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0.008 0.007 ND 4 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.045 0.041 0.087 0.044 5 ND ND ND ND 0.116 ND ND 0.008 0.087 0.292 0.399 0.044 6 ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0.045 0.073 ND 7 0.093 ND ND ND ND ND ND ND 0.005 0.015 0.038 ND 8 ND ND ND ND ND ND ND 0.007 0.052 0.14 0.249 ND 9 ND ND ND ND 0.041 ND ND 0.021 0.167 0.265 0.434 0.07 10 ND ND ND ND 0.009 ND ND ND 0.014 0.041 0.049 ND 11 ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0.014 0.005 ND 12 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.011 0.009 0.036 ND 13 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.069 0.042 0.064 ND 114 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.01 0.041 0.052 0.007 15 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.035 0.161 0.206 0.02 16 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.034 0.192 0.235 ND 17 ND ND ND ND ND ND ND ND . 0.014 0.05 0.044 ND 18 ND ND 0.005 ND ND ND ND ND 0.068 0.246 0.319 ND 19 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.007 0.018 0.026 0.007 20 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.025 0.119 0.116 ND 21 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.029 0.16 0.192 0.017 22 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.066 0.1 0.092 ND 23 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.008 ND 0.009 ND 24 ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0.026 0.015 ND 25 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.012 0.021 0.015 ND 26 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.079 0.317 0.404 ND 27 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.034 28 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.017 29 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.052 30 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.138 31 ND ND ND ND ND ND ND ND 0.257 32 ND ND ND ND ND ND ND ND ND 138 Resultados NREF 126 128 138 149 153 156 157 167 169 170 180 189 209 ug/g Ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g ug/g 1 ND 0.009 0.084 ND 0.227 0.025 ND ND ND 0.037 0.217 ND ND 2 0.009 0.071 0.523 0.012 1.176 0.117 0.012 0.041 0.005 0.218 0.876 0.022 0.007 3 ND 0.012 0.006 ND 0.055 0.008 ND ND ND 0.009 0.05 ND ND 4 ND 0.029 0.122 ND 0.31 0.042 ND 0.012 0.07 0.063 0.269 ND 0.057 5 0.123 0.144 0.927 0.058 2.039 0.189 0.017 0.073 ND 0.344 1.367 0.028 0.01 6 ND 0.008 0.085 ND 0.372 0.049 ND 0.014 ND 0.065 0.349 ND ND 7 ND ND 0.011 ND 0.069 0.013 ND ND ND 0.025 0.077 ND ND 8 ND 0.084 0.469 0.011 0.978 0.141 0.012 0.052 ND 0.227 1.034 0.02 0.098 9 0.007 0.13 0.816 0.034 1.954 0.226 0.013 0.077 ND 0.398 1.86 0.031 0.023 10 ND 0.024 0.111 ND 0.296 0.032 0.01 0.01 ND 0.064 0.244 ND ND 11 ND 0.007 0.01 ND 0.047 0.011 ND ND ND 0.019 0.082 ND ND 12 ND 0.014 0.028 ND 0.081 0.01 ND 0.01 ND 0.015 0.066 ND ND 13 ND 0.024 0.128 ND 0.346 0.044 ND 0.01 0.009 0.072 0.332 ND 0.027 14 ND 0.02 0.124 ND 0.32 0.034 ND 0.014 ND 0.065 0.258 ND ND 15 0.029 0.055 0.454 ND 1.057 0.114 ND 0.038 ND 0.197 0.827 0.025 ND 16 ND 0.056 0.475 ND 1.32 0.144 0.008 0.038 ND 0.262 1.216 0.024 ND 17 ND 0.029 0.092 ND 0.286 0.039 ND ND ND 0.06 0.264 ND ND 18 0.015 0.113 0.772 0.054 1.707 0.167 0.015 0.062 0.005 0.302 1.256 0.022 0.018 19 ND 0.011 0.032 ND 0.138 0.016 ND ND ND 0.026 0.133 ND ND 20 ND 0.047 0.282 ND 0.749 0.089 ND 0.024 ND 0.166 0.769 ND ND 21 0.016 0.056 0.459 ND 1.116 0.134 0.014 0.038 ND 0.241 1.08 0.025 ND 22 ND 0.045 0.223 ND 0.627 0.077 ND 0.028 ND 0.138 0.624 ND ND 23 ND ND 0.017 ND 0.059 0.011 ND ND ND 0.013 0.058 ND ND 24 ND ND 0.03 ND 0.188 0.04 ND ND ND 0.055 0.334 ND ND 25 ND 0.015 0.04 ND 0.142 0.021 ND ND ND 0.031 0.172 ND ND 26 0.093 0.125 0.904 0.037 2.016 0.217 0.019 0.076 ND 0.364 1.471 0.036 ND 27 ND 0.011 0.084 ND 0.302 ND 28 ND 0.009 0.063 ND 0.2 ND 29 ND 0.017 0.139 ND 0.48 ND 30 ND 0.054 0.37 ND 1.323 ND 31 0.051 0.12 0.662 0.05 1.962 ND 32 ND ND 0.033 ND 0.213 ND En el caso del Dieldrin los niveles se situaron entre niveles por debajo de los limites de detecciôn y 0.604 pg/g. En el caso del TDE, tan solo se detectaron niveles en ocho del total de 32 muestras examinadas variando entre 0.007 y 0.08 pg/g de materia hùmeda. 139 _______________________________________________________________________ Resultados IV.2.2 Estudio de los niveles de bifenilos policlorados Se estudiaron un total de 25 congénères distintos: 8, 18, 29, 28, 31, 52, 77, 101, 105, 114, 118, 123, 126, 128, 138, 149, 153, 156, 157, 167, 169, 170, 180, 189, 209. Los resultados, expresados en pg/g de materia hùmeda, fîguran en las tablas correspondientes. IV.2.3 Estudio de los niveles de mercurio Se déterminé exclusivamente mercurio por las razones expuestas en el apartado de material y métodos. Los niveles variaron entre la ausencia de niveles détectables y 7.6 pg/g de materia seca. Los datos générales fîguran en la siguiente Tabla 24. Se han detectado niveles considerables de este métal en muestras concretas procedentes de la poblaciôn de Castilla - La Mancha. No se évalué la presencia de metales y otros compuestos en funciôn de los cuales la toxicidad del mercurio puede variar. Tampoco se analizô la cantidad que realmente corresponde a metilmercurio, el mas tôxico de los mercuriales conocido, en funciôn de la cual varia el grado final de toxicidad. Niveles medios de Mercurio ug/g LW en contenido de huevos correspondientes a ias diferentes pobiciones estudiadas 0 I Mercurio ug/g LW Algarve Duero CLM Grâfico 18: Niveles medios de mercurio en contenido de huevos de las diferentes poblaciones estudiadas. 140 Resultados los niveles considerados como causantes de alteraciones embrionarias (Grâfico 18), en otras especies de rapaces. Tabla 24: Niveles de mercurio présentés en las muestras analizadas. MUESTRA CONCENTRACION CONCENTRACION CONCENTRACION en el total como materia como materia Digerido (ug) hùmeda ( ug/g) seca ( ug/g) 1 0.254 0.218 1.394 2 0.957 0.587 2.666 3 ND ND ND 4 ND ND ND 5 1.812 1.105 5.66 6 0.533 0.311 1.176 7 ND ND ND 8 2.72 1.742 7.599 9 1.345 1.632 6.524 10 0.592 0.36 2.166 11 ND ND ND 12 0.204 0.181 0.958 13 0.116 0.144 0.811 14 0.093 0.11 0.641 15 0.23 0.457 3.159 16 ND ND ND 17 0.692 0.733 4.303 18 1.189 0.651 3.616 19 ND ND ND 20 ND ND ND 21 0.169 0.154 0.921 22 0.101 0.07 0.42 23 0.143 0.11 0.871 24 0.107 0.145 0.705 25 0.08 0.091 0.429 26 1.195 1.27 6.101 27 ND ND ND 28 0.173 0.189 1.33 29 0.372 0.298 1.76 30 0.021 0.044 0.25 31 0.361 0.343 1.91 32 0.035 0.044 0.21 141 Resultados IV.3. ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE POBLACIONES Se procediô al estudio comparative de los niveles de très principales grupos de tôxicos mediante ANOVA de una via. Los resultados son de especial relevancia, ya que dan una vision general de las diferencias ecotoxicolôgicas, de los diferentes habitats y localizaciones geogrâficas. En relaciôn con los contenidos en DDE, los resultados indican que no existen diferencias significativas entre poblaciones en un nivel de confianza del 95%. Sin embargo, los niveles de este compuesto son claramente superiores en la poblaciôn Castellano - Manchega observândose una tendencia a la significaciôn (p=0.17). Las diferencias en los niveles de dieldrin entre las diferentes poblaciones no fueron significativas si bien se observaron niveles superiores en la poblaciôn Castellano - Manchega. No se realizaron los anâlisis estadisticos correspondientes al resto de los compuestos organoclorados, debido a la alta incidencia de muestras en las que no se detectaron. No se apreciaron diferencias significativas entre poblaciones, en los niveles de cada uno de los congénères de PCBs analizados en este estudio. No obstante, para todos los compuestos examinados, los niveles fueron superiores en el caso de la poblaciôn espanola. Estudiados los niveles de PCBs de forma conjunta, tampoco se observaron diferencias significativas entre poblaciones. Los niveles de mercurio en contenido de huevos fueron signifîcativamente superiores en la poblaciôn Castellano - Manchega (p=0.05) con respecto a cada una de las poblaciones portuguesas. 142 Resultados IV.4. RELACION DE LOS NIVELES DE TOXICOS ENTRE SI Y CON LOS PARÂMETROS ULTRAESTRUCTURALES DE LA CÂSCARA. Se analizaron, en primer lugar, las correlaciones entre diferentes grupos de tôxicos utilizando los resultados referidos a materia lipidica. Se apreciaron correlaciones positivas aunque no significativas entre los niveles de DDE y un gran numéro de congénères de PCBs incluyendo: 114, 105, 118, 128, 138, 153, 170, 156, y 180. En el caso de los dos ùltimos se observaron tendencias importantes hacia la significaciôn (p=0.10). Se puso de m anifesto una cierta tendencia (p=0.10) positiva entre los niveles de DDE y mercurio. Las cantidades de mercurio se relacionaron positiva y signifîcativamente con los niveles de los siguientes congénères de PCBs: 114, 118, 128, 138, 153, 156, 170, 180. En todos estos casos los niveles de signifîcaciôn fueron muy altos oscilando entre 0.00 y 0.02. Las proporciones de Dieldrin se correlacionan positiva y signifîcativamente con los niveles del contenido total en PCBs, entendido como suma del total de los congénères analizados. Los niveles de DDE se correlacionaron positiva y signifîcativamente (p=0.03) con el àrea de fisuras entre mamilas (Figura F 18). Especialmente interesante fîie la correlaciôn negativa existente entre el contenido en DDE y la fertilidad. Contenidos elevados de DDE se correlacionaron (p= 0.03) con huevos infertiles. El mismo nivel de signifîcaciôn se obtuvo en la correlaciôn entre los niveles de DDE y la presencia de fusiôn de fîbras (Figura F17 y F17a). Niveles elevados de DDE se correlacionaron con numéros elevados de vesiculas y mamilas si bien esta correlaciôn no fue significativa. Del mismo modo, el aumento de los niveles de DDE tendiô a cursar con un descenso en el numéro de poros. No obstante, estas tendencias no fueron estadisticamente significativas. En el présente estudio, aumentos en los niveles de DDE no se correlacionaron con disminuciones significativas del grosor total de la câscara. 143 Resultados Los niveles de dieldrin se relacionaron positiva y signifîcativamente con el àrea de fîsuras entre mamilas, y el àrea de los centros de nucleaciôn. Niveles altos de dieldrin se correlacionaron signifîcativamente con distribuciones irregulares de las mamilas (Figura F20). Contenidos elevados de PCBs cursaron con distribuciones irregulares de las fîbras de la membrana extema de la câscara, siendo esta correlaciôn signifîcativa. No se observaron relaciones significativas con otros paràmetros. En general, el grosor total de la câscara aumentô con el aumento de los niveles de PCBs si bien esta tendencia no fue signifîcativa. La relaciôn entre los niveles de mercurio y los diferentes paràmetros cuantitativos y cualitativos de la câscara resultô particularmente interesante. A niveles mayores de mercurio le correspondieron aumentos significativos en el àrea delimitada por los poros. En relaciôn con este extremo también aumentaron signifîcativamente el numéro de poros y canales en la câscara (Figura F 19). De forma idéntica a lo expresado para los PCBs, a mayores niveles de mercurio, mayor irregularidad en la distribuciôn de las fîbras de la membrana extema (Figura F22). El aumento del contenido en mercurio se tradujo en una disminuciôn muy signifîcativa del numéro de fîbras de la membrana intema de la câscara. El aumento de los niveles de mercurio da lugar a una tendencia a la disminuciôn del àrea mamilar asi como del numéro de vesiculas. V. DOCUMENTACION DE ESTADIOS EMBRIONARIOS Y RELACION CON PARÂMETROS ULTRAESTRUCTURALES V .l. TAMANO Y CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA De un total de veinticinco huevos intactos analizados, 17 resultaron fertiles conteniendo embriones correspondientes a las siguientes edades: 5, 7, 8, 9, 15, 25, 144 Resultados 28, 35, 36, 37 y 39 dias. Tras el examen post-mortem, en cuatro de ellos se detectaron anomalias que los invalidan para formar parte de los valores de referenda. Debido a la imposibilidad de accéder a los nidos con mayor prontitud para evitar molestias a las aves, muchas de las muestras se encontraron en avanzado estado de descomposicion con la consiguiente autolisis, por lo que no pudieron realizarse estudios histopatolôgicos. En el caso de un embriôn de 28 dias se apreciô engrosamiento del pericardio acompanado de braquignatia y acortamiento significativo asimétrico de extremidades (Figura F61). En un segundo caso se observaron petequias y hemorragias generalizadas en un embriôn de 36 dias, mientras que en un embriôn de similar edad se observô serositis y edema subcutâneo (Figura F62). Por ultimo, en el cuarto de los embriones afectados, con una edad de 34 dias, se apreciô caquecsia y palidez. V.2. CARACTERISTICAS DE LOS DIFERENTES ESTADIOS EMBRIONARIOS Eliminados aquellos embriones en funciôn de las premisas establecidas en el apartado: Material y Métodos, tras la toma de medidas correspondientes, de los embriones clasifîcados por edades, y los valores para las magnitudes referencia se exponen en la siguiente tabla: 145 Resultados Tabla 25: Valores de referencia para diferentes paràmetros embrionarios en fimciôn de la edad del embriôn. EDAD PESO LONGITUD ANCHO ANTEBRAZO TARSO BASE ANEJOS OJO MICROBIOLOGIA 5 0.98 1.12 0.7 11.3 7 1.57 1.43 0.87 0.3 E. COli 8 1.79 2.14 1.32 0.22 0.15 0.91 2.44 0.3 E. coli 9 0.74 2.6 0.65 0.26 0.17 0.89 0.4 Prot spp 15 1.55 3.32 0.96 0.68 0.4 1.2 7.68 0.8 E. coli, Prot spp 25 9.36 6.6 2 1.68 1.17 1.52 0.8 E. coli, Pseud spp 28-30 14.43 6.7 2 1.65 1.33 1.5 0.6 Pseud spp 33 42.82 11.05 2.96 2.5 2.08 1.17 9.49 0.7 E. coli 35 49.25 10.66 2.8 2.54 2.09 1 11.63 0.7 E. coli 38 46.03 10.13 2.68 2.42 1.95 2 7.72 0.7 E. coli, Prot sp Descripciôn de los diferentes estadios: • Cinco dias: El embriôn de àguila perdicera de cinco dias se ajusta a los estadios 13 de la clasificaciôn de Carnegie y 17 a 18 de la clasificaciôn de Hamburger y Hamilton. En este estadio del desarrollo se aprecian ya un esbozo de los botones craneal y caudal que corresponderàn màs tarde a los miembros (Figura F53). Bajo la lupa binocular se observa el otocisto. En el présente estudio fue difïcil distinguir el numéro exacto de somitos debido al estado de conservaciôn de los embriones. La longitud del embriôn en este estadio es aproximadamente de 1.12 cm. 146 _________________________________________________________________________Resultados • Siete dias: El desarrollo observado en embriones de siete y ocho dias se corresponde con los estadios 16 de Carnegie y 23 a 24 de Hamburger y Hamilton. Los mamelones correspondientes a los miembros aparecen algo mas destacados y el proceso maxilar comienza a alargarse superando en longitud a los procesos lateral y medial mandibulares que tienden a fusionarse con el anterior (Figura F54). Si bien los coites histopatolôgicos, son simplemente indicativos debido al grado de autôlisis, se ha podido detectar la presencia de bazo y adrenales, asi como, la separaciôn entre esôfago y trâquea como aspectos de referencia. También aparecen pequenas bandas de tejido muscular alrededor del ojo. • Ocho y nueve dias: El desarrollo observado corresponde con los estadios 19 de Carnegie y 29 y 30 de Hamburger y Hamilton. Las extremidades inferiores aparecen destacadas y màs largas que las alas, en ambos miembros aparecen demarcaciones digitales pero mucho menos claras que en el polio. El pico comienza a hacerse prominente y aparece el diamante (Figura F55). Los pàrpados se hacen visibles y las narinas aparecen aùn cerradas. El cuello se alarga considerablemente. Al contrario de lo estimado para el polio no aparecen todavia esbozos de las plumas localizados en la espalda del embriôn. Los embriones en este estadio aumentan notablemente su longitud debido a la elongaciôn del cuello superando los dos centimetros. Las alas pasan a ser medibles alcanzando entre dos y très milimetros de longitud. Entre los once y doce dias estos rasgos se acentùan, aumenta la prominencia de la maxila y se estructuran los pàrpados (Figura F56). • Quince dias: El desarrollo observado corresponde al estadio 23 de Carnegie, estadio 36 de Hamburger y Hamilton. Los pàrpados comienzan a cerrarse mientras el pico se hace prominente (Figura F57) y los dedos aparecen bien diferenciados. Comienzan a aparecer algunos esbozos de foliculos fundamentalmente en las porciones caudales del embriôn. El crecimiento en longitud en esta fase no es espectacular. 147 ________________________________________________________________________ Resultados pero si el alargamiento de los miembros en esta fase del desarrollo embrionario donde las alas llegan a duplicar la longitud registrada en el estadio 19. • Veinticinco dias: En este estadio el embriôn multiplica por cuatro su peso y duplica su longitud, alcanzando los 6.6 cm de longitud. El crecimiento en esta fase es progresivo y el embriôn vuelve a triplicar la longitud de sus extremidades. Continua también la misma progresiôn en el crecimiento del pico en longitud medida desde su base. • Veintiocho a veintinueve dias: En este estadio el embriôn del âguila perdicera parece aumentar en peso con respecto a estadios anteriores (Figura F58), mientras que su crecimiento en longitud no expérimenta los incrementos notables registrados en estadios anteriores. El peso se situa entomo a los 14 g mientras que la longitud del embriôn es de 6.7 cm. Curiosamente el diâmetro ocular no varia notablemente en comparaciôn con el registrado en estadios màs avanzados del desarrollo embrionario. • Treinta y très a treinta y cinco dias: Entre los 28 y los 33 dias el embriôn expérimenta un crecimiento muy ràpido que se traduce de nuevo en un peso très veces superior al registrado a los 28 dias. Este se acompana de un aumento en longitud tanto del embriôn en su totalidad como de los miembros que casi llegan a duplicar la registrada para embriones de 28 dias. En estos estadios el embriôn esta totalmente formado pero aparecen aun cantidades importantes de vitelo por reabsorber. La longitud del pico desde su base no expérimenta variaciôn alguna, al igual que sucede con la cabeza y el ojo. Las estructuras del cràneo aparecen ya bien osiflcadas (Figura F59). • Treinta y ocho dias: En este estadio el embriôn esta completamente formado y a punto de eclosionar. En estos ùltimos estadios no expérimenta cambios notables, salvo el consumo y reabsorciôn del vitelo, y el sensible aumento de las excretas. Los 148 ________________________________________________________________________ Resultados pàrpados aparecen perfectamente formados y cerrados (Figura F60). El embriôn adopta la posiciôn fetal tipica en la que la cabeza aparece posicionada bajo el ala derecha y el diamante contactando con la membrana intema a nivel de la câmara de aire. El ombligo aparece cerrado y el desarrollo de las plumas es manifesto, si bien se han apreciado variaciones individuals en este aspecto. V.3. CORRELACIÔN ENTRE PARÂMETROS DE DESARROLLO De lo expuesto anteriormente se deduce que el desarrollo embrionario en esta especie présenta diferentes fases caracterizadas por diferencias en el ritmo y caracteristicas del crecimiento. En este sentido résulta interesante correlacionar los cambios que experimentan los diferentes paràmetros, de modo que los posibles cambios en el desarrollo embrionario debidos a factores extemos puedan relacionarse con alteraciones en determinadas fases embrionarias, o incluso con afecciôn en alguno de los paràmetros estudiados. Por esta razôn seguidamente se reflejan en g ràf cas la correlaciôn entre estos paràmetros en esta especie. 149 Resultados 60 50 - 40 Peso (g) 30 - Longitud (cm) Ancho (cm) 20 - 5 7 8 9 15 25 28 33 35 39 Edad (dias) Grâfico 19: Variaciôn dei peso, longitud y grosor del embriôn durante el desarrollo embrionario en el âguila perdicera V.4. CORRELACIÔN ENTRE DESARROLLO EMBRIONARIO Y PARÀMETROS DE LA CASCARA Résulta de especial interés las correlaciones existentes entre el desarrollo embrionario y los paràmetros de la câscara, de modo que puedan elaborarse hipôtesis sobre los posibles efectos negatives sobre el desarrollo del mismo. Realizado el coeficiente de correlaciôn de Spearman en relaciôn con la posible relaciôn entre el numéro de vesfculas présentés en las membranas testâceas y el desarrollo alcanzado por el embriôn expresado en dias, se encontrô una correlaciôn negativa significativa (p=0.04). Esto indica que a mayor numéro de vesiculas présentes, mener es la edad alcanzada por el embriôn. Existe una correlaciôn significativa entre pares de valores con un nivel de confianza del 95%. Los anâlisis estadisticos indican que el modelo lineal propuesto es adecuado para la descripciôn de estos datos. 150 _______________________________________________________________________Resultados Se compararon los grosores totales de la câscara y de cada una de sus capas con la fertilidad e infertilidad del huevo, y con el grado de desarrollo embrionario. Los resultados estadisticos indicaron que si bien el grosor es menor en huevos eclosionados, las diferencias no son significativas en cuanto al grosor de la câscara 0 de cualquiera de sus capas entre huevos fertiles e infertiles. 12 1 Longitud (cm) Antebrazo (cm) Tarso (cm) Base-punta (cm) Ojo(cm) Edad (dias) Grâfico 20: Evoluciôn de la longitud total del embriôn, antebrazo, tarso, pico desde su base y diâmetro ocular en el desarrollo embrionario del âguila perdicera. Seguidamente se realizaron las correcciones necesarias para excluir aquellos estadios iniciales inferiores al ultimo tercio de desarrollo, cuando se produce la absorciôn importante de calcio. Los resultados mejoraron en cuanto a significaciôn pero no llegando a ser significativos, situândose en p=0.20. 151 DISCUSION 152 Discusiôn I. CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS Y ULTRAESTRUCTURALES, VALORES DE REFERENCIA Y CORRELACIÔN ENTRE MAGNITUDES. 1.1. VALORES DE REFERENCIA DE LA ESPECIE 1. Cuticula • Numéro total de poros por unidad de superficie. El numéro total de poros varia notablemente entre especies (Tullett, 1975), la razôn es que las masas de los huevos son obviamente distintas. Dado que la conductancia media de los poros es similar para las diferentes especies de aves (1.5 |ig (d.torr)'% y que el flujo de oxigeno y vapor por poro es de 60 y 54 pl-d la conductacia y el flujo de gases son directamente proporcionales al numéro de poros. En el âguila perdicera el numéro total de poros varié notablemente entre poblaciones, pero también notablemente entre individups. Esta misma variaciôn ha sido observada en otras muchas especies, tanto domésticas (Ronanoff y Romanoff, 1949) como salvajes (von Nathusius, 1868). Las desviaciones standard halladas en el présente estudio asemejan a las referidas por Gonzalez e Hiraldo (1988) para el âguila imperial, lo que indica que este fenômeno también se produce en rapaces que comparten similar nicho ecolôgico. El numéro de poros en el âguila perdicera es, en términos générales, muy superior, en ocasiones hasta 50 veces los referidos para esta ultima especie. Del mismo modo, el ârea media de poros es obviamente también superior. Sin embargo, tras el estudio de los canales a través de la capa de cristalizaciôn extema y el resto de las capas de la câscara, hemos constatado que tan sôlo un pequeno porcentaje de los mismos profundiza mâs allâ del comienzo de la capa mamilar. Estos aspectos se detallan en el siguiente capitule. 153 _______ Discusiôn Tras un tratamiento âcido severo de la câscara del âguila perdicera se pone de manifesto la amplia red de canales de aireaciôn por unidad de superficie. Algunos poros se comunican mediante estos espacios y de forma inmediata con la superficie. En este sentido, la presencia de cuticula es posible que juegue un papel fundamental en la regulaciôn de la pérdida de humedad en esta especie. No obstante, hoy se sabe que la forma del poro influye de forma notable en su conductancia, y en especial el diâmetro de estos en su parte mâs estrecha ( Toien et al, 1987). El grosor de cuticula en el huevo del âguila perdicera es aproximadamente un 10% superior a la referida para el huevo de gallina (El-Boushy et al, 1968), mientras que la diferencia en peso fresco es de un 20% entre médias en las dos especies. La importancia de esta capa en la regulaciôn de la pérdida de agua ha sido constatada por Peebles et al, 1998. Sin embargo, el mismo autor indica que su eliminaciôn mediante lavado no parece tener efectos negativos en la tasa de eclosiôn en la gallina. • Presencia o ausencia de cuticula y sus caracteristicas. La presencia de cuticula no es un rasgo caracteristico de todas las especies de aves. En especies como la paloma se ha descrito la ausencia de esta estructura (Board, 1974). La presencia de cuticula en el âguila perdicera podria supuestamente estar relacionada, como en otras aves, con la incubaciôn en climas secos con lo que contribuiria a evitar la pérdida excesiva de agua durante la incubaciôn (Board y Halls, 1973). La cuticula en el âguila perdicera no présenta grânulos, lo cual es posible que esté relacionado con la ausencia total de pigmentaciôn en esta especie, ya que dichos grânulos se cree contienen pigmentes (Kennedy and Vevers, 1976). Las variaciones en la apariencia de la superficie estema de esta capa es motivo de debate. Cabe teorizar acerca de las posibles causas de esta divergencia, habiendose encontrado ambas texturas en huevos fertiles o infertiles de todas las poblaciones. 154 _________________________________________________ _______________ :_______ Discusiôn Dado que muchos de estos puede que hayan sido incubados durante periodos de tiempo ciertamente similares, cabria pensar en la posibilidad de que se trate de una variaciôn normal dentro de la especie. La textura regular aparece en muchos huevos de los que sabe por el desarrollo embrionario han sido incubados, asi como en huevos que han eclosionado con normalidad. Del mismo modo, superficies irregulares aparecen en huevos de los que se conoce han sido incubados por periodos cortos de tiempo debido a la caida del nido. Si bien la incubaciôn tiende a irregularizar la superficie, esta no es la causa de la presencia de estos dos patrones distintos. Existe controversia acerca del posible papel antimicrobiano de esta capa, si bien el paso de bacterias aprovechando los poros no se ve impedido en cualquier caso. En el âguila perdicera no se ha encontrado la capa denominada de vaterita présente en aves como el pelicano, y la cuticula asemeja a la descrita en otras aves rapaces, si bien destaca la ausencia de vesiculas en todas las muestras examinadas • Presencia o ausencia de estructuras adicionales: esferolitos, vesiculas, material en la entrada de los poros, y fracturas radiales. El hecho de que la presencia de esferolitos tan solo se baya constatado en un caso, asociado a otras anomalias estructurales, clasifican la apariciôn de estas estructuras en el âguila perdicera como anormales. Se ha especulado sobre la posible relaciôn de los esferolitos con contaminaciones por pesticidas en rapaces (Erben y Krampitz, 1971). El mismo origen ha sido sugerido por Gonzâlez e Hiraldo (1988) que destacan la posibilidad de su relaciôn con niveles elevados de DDE en el âguila imperial, especie que en ocasiones comparte habitat con el âguila perdicera en Espana, y en concrete en el ârea de Castilla-La Mancha. Estas formaciones globulares también se han descrito en aves acuâticas (Board y Scott, 1990; Board, 1991), destacândose su elevado contenido en azufre y fosfato câlcico no calcificado. En el caso positive registrado en la poblaciôn de Castilla-La Mancha, no se han detectado niveles elevados de pesticidas en 155 _________________________________________________ :_______ Discusiôn contenidos de huevos procedentes de territorios adyancentes. Résulta vital seguir investigando estos aspectos mediante la provision de muestras de contenido procedente de estas areas. La presencia de material en la entrada a los poros se ha detectado tan sôlo en cuatro del total de muestras analizadas. Sin embargo, tan sôlo en una de ellas estuvo asociada a la presencia de esferolitos y otras anomalias de la câscara. El resto fueron huevos fertiles que no llegaron a eclosionar, habiendose descartado causas de tipo infeccioso. La muerte embrionaria en estos huevos tuvo lugar en los dias 8 y 25 del desarrollo embrionario. En la gallina se ha descrito que los poros se encuentran ocluidos por esferas de material proteinâceo (Tyler y Geake, 1953), mientras que en otras especies pueden estar constituidos por material inorgânico (Board, 1980). La posible funciôn de este tipo de material no es bien conocida, si bien se cree que pueda estar relacionada con el intercambio gaseoso. Este intercambio se ve favorecido por el desgaste de la superficie producido durante la incubaciôn, lo que da lugar a un aumento de la conductacia dado que esta es directamente proporcional al numéro de poros. La presencia de este tipo de material se ha sugerido como posible causa de las diferencias encontradas para los valores de conductacia de vapor de agua en especies como la gallina (Toien, 1987). • Aspecto de la cuticula. Uno de los aspectos mâs interesantes es la apariencia regular o irregular de la cuticula. Es posible que pueda estar influenciada en parte por el periodo de incubaciôn. Sin embargo, la presencia de cuticulas de superficie irregular se ha asociado a grosores superiores de la capa mamilar. El grosor de esta capa disminuye en el ultimo cuarto de la incubaciôn pero esta variable no es probable que haya influido en la gran mayoria de las muestras analizadas, ya que fueron incubadas a tiempo completo. Es probable que otros factores implicados en el grosor de esta capa puedan influir en el grosor de la cuticula, ya que esta se forma en la glândula coquilaria 156 _________________________________________________ :_______ Discusiôn como las estructuras anejas. La irregularidad de la cuticula requiere una especial atencion, ya que cuticulas irregulares se han citado como résultantes de niveles elevados de DDE en garzas (Cooke, 1975). 2.Capa de cristalizaciôn externa La estructura y dimensiones de esta capa parecen estar relacionadas con importantes caracteristicas de la câscara, algunas de ellas esenciales para el mantenimiento de su integridad. Esta capa conforma aproximadamente mâs de un cuarto del grosor total de la câscara. La mayoria de los estudios donde se citan alteraciones de la estructura de la câscara no mencionan esta capa ya que se incluye dentro de la capa de empalizada. En concrete cuando se mencionan disminuciones en el grosor de la misma. La compactaciôn que adquiere esta capa parece importante en la capacidad de resistencia de la câscara a la fractura, y su grosor se relaciona con el de la capa mamilar y la correcta distribuciôn de los cuerpos mamilares. La disposiciôn de los canales en esta especie asemeja a la de la câscara del huevo de avestruz, si bien la captaciôn de canales se produce en la primera porciôn de la capa de empalizada y no a mayor proflindidad. Podemos argumentar que esta disposiciôn peculiar puede contribuir a minimizar el impacto de una reducciôn signifîcativa del numéro de poros en superficie, o la obliteraciôn de los mismos en funciôn de un efecto colateral. • Grado de cristalizaciôn. Se ha constatado que el grado de cristalizaciôn de esta capa es acorde con el observado en la capa de empalizada. Cuando el grado de cristalizaciôn es adecuado, pese a estar bien definidas, ambas capas se imbrican notable y progresivamente formando una sola entidad. De hecho, esta capa es descrita por otros autores como parte de la capa de empalizada (Burley y Vadehera, 1989). En ausencia de una estratificaciôn clara, acompanada de la pérdida de cristalizaciôn en la capa de empalizada, se aprecia como ambas capas llegan a 157 _________________________________________________ _______________ :_______ Discusiôn confundirse al menos hasta la mitad del espesor de la câscara. La presencia de esta capa y su alto grade de defîniciôn aparece también en otras grandes âguilas como el âguila imperial o el âguila real. En otras especies de aves como la paloma o la perdiz esta capa puede decirse que forma parte de la capa de empalizada, adoptando esta ultima la disposiciôn de cristales perpendiculares a la superficie. Tal vez por este motivo, la capa de cristalizaciôn extema no ha recibido la atenciôn necesaria. Los estudios que refieren disminuciôn del grado de cristalizaciôn como consecuencia de niveles elevados de organoclorados en aves rapaces (Ratcliffe, 1970; Newton, 1979; Gonzalez e Hiraldo, 1988) se centran en la capa de empalizada dado lo espectacular de esta en las grandes âguilas. Analizando los registres grâficos de algunos de estos estudios, es posible apreciar que las alteraciones afectan también a esta capa. El hecho de que la defîniciôn y trayectoria de los poros a este nivel se relacionen con el grado de cristalizaciôn, implica que pueda afectar a la conductancia del huevo. La conductancia se ha comprobado que depende de la forma del poro, fundamentalmente en su porciôn mas estrecha (Toien et al, 1987). Esto es especialmente notable en poros con forma de trompeta como en el caso del âguila perdicera. 3.Capa de empalizada • Area. El ârea de esta capa en el âguila perdicera es ciertamente importante y proporcionalmente superior a otras âguilas. Su magnitud es superior en la poblaciôn del Algarve. Esta diferencia es menor de la esperada, si tenemos en cuenta las amplias diferencias en el grosor como parâmetro relacionado. Esta diferencia podria justificarse por un aumento de la capa de cristalizaciôn extema en el caso de la poblaciôn Castellana. Sin embargo, este no es significative. Esto indica que, posiblemente, esta capa es mâs regular en el caso de la poblaciôn 158 _______ Discusiôn espanola. Aün cuando el grosor sea muy inferior, la regularidad hace que el ârea no disminuya de forma tan notable. • Nümero de veswulas. Hasta que punto la mayor o menor porosidad e esta capa influye en la resistencia a la rotura, es un concepto poco estudiado. En algunos de los estudios sobre los efectos de los pesticidas organoclorados se ha citado una reducciôn en la porosidad de la câscara en referenda al numéro de poros en superficie (Cooke, 1973, 1979; Peakall et al, 1973). En el présente estudio, la reducciôn del numéro de vesiculas en las âreas de menor densidad de la cuticula se une a una disminuciôn del grosor de esta capa en la poblaciôn espanola, y también en un buen numéro de muestras procedentes de la poblaciôn del Duero. Becking, en 1975, comparô el numéro de vesiculas présentés en la matriz orgânica en huevos de diferentes especies de aves. Estos se encontraron en mayor numéro en las especies tropicales, lo que ha dado lugar a la hipôtesis de que tengan un papel relevante en el intercambio gaseoso. Es posible, que el mayor numéro de vesiculas en la poblacion del Algarve responda en parte a la mayor humedad relativa existente en las âreas de cria en comparaciôn con las parejas Castellanas de climatologia mâs seca. • Angulo de orientaciôn de los cristales. Se relaciona con el grado de cristalizaciôn de la muestra y no se observan variaciones notables entre poblaciones. Esto sugiere que, en el caso de tratarse del efecto de pesticidas, estos conllevan una reducciôn en el grosor de la câscara, pero no afectan de forma significativa al grado de cristalizaciôn de la misma. La correlaciôn de la orientaciôn de los cristales con la presencia de estructuras de cristalizaciôn amorfas estâ présenté también en esta especie, El grado de significaciôn es menor que en otras especies como el âguila real (Ratcliffe, 1970) o el âguila imperial (Gonzalez e Hiraldo, 1988). • Grosor. 159 _______ Discusiôn El grosor de esta capa es muy superior en la poblaciôn del Algarve en comparaciôn con la poblaciôn castellana, mientras que la poblaciôn de los Arribes del Duero se situaria en un nivel intermedio. La causa primaria podria ser la desapariciôn de la capa de orientaciôn longitudinal en la base de la capa de empalizada en la poblaciôn espanola, y la escasa presencia de la misma en la poblaciôn del Duero. Esta capa se asemeja a la descrita en el polio por Cooke (1978) como banda clara a la transmisiôn, la cual parece disminuir progresivamente en funciôn de la reducciôn del calcio en la dieta hasta la total desapariciôn. Un fenômeno similar puede estar ocurriendo en el caso del âguila perdicera como resultado de la accion acumulativa de ciertos tôxicos. • Grado de cristalizaciôn. El grado de cristalizaciôn es un parâmetro relevante en la fortaleza final de la câscara como estructura. En general, las referencias a este aspecto en estudios sobre aves rapaces se han realizado en relaciôn con la disminuciôn del grosor de la câscara y del numéro de poros en aves con niveles elevados de organoclorados (Stickel, 1975). Gonzalez e Hiraldo (1988) han observado una disminuciôn significativa en el grado de cristalizaciôn en câscaras de âguila imperial de la decada de los ochenta comparadas con cascaras antiguas en nuestro pais. Estas alteraciones se han relacionado por otros autores con la presencia de esferolitos (Erben y Krampitz, 1971; Peakall et al, 1973; Cooke, 1979; Board y Perrot, 1979; Kiff et al, 1979). En el présente estudio la presencia de esferolitos cursô con niveles medios de cristalizaciôn. De forma adicional, si se han observado cristalizaciones déficientes ligadas a la presencia de material en los poros. Si se encontrô correlaciôn entre el grado de cristalizaciôn de la capa de cristalizaciôn extema y la capa de empalizada. 160 _________________________________________________ _______________ :________Discusiôn La forma en como los cristales de carbonato câlcico crecen y se orientan no es bien conocida. Las proteinas de la matriz pueden dirigir de alguna forma este crecimiento (Silyn-Roberts and Sharp, 1986). También es posible que el crecimiento sea por epitaxia y que, en este caso, las proteinas de los conos mamilares tengan una especial relevancia. Esta ultima es posible que sea una explicacion mâs verosimil del porqué de las disminuciones del grosor de la câscara y del numéro de poros en huevos con niveles excesivos de organoclorados. Se ha comprobado que la disminuciôn en el numéro de mamilas se acompana de una reducciôn en el numéro de poros, lo que podria explicar el cuadro observado en este tipo de intoxicaciones. 4.Capa mamilar • Grosor. El grosor de la capa mamilar en esta especie es inferior en comparaciôn con otras, en favor de grosores superiores de las capas restantes. Se aprecia un cierto aumento del grosor en la poblaciôn castellana si bien no es significative en relaciôn con las otras poblaciones. En algunas especies como el pato, se ha constatado un aumento en el grosor de esta capa como consecuencia de niveles elevados de DDT en la dieta (Cooke, 1978). Es posible que esta tendencia pueda estar relacionada con el mismo fenômeno en el âguila perdicera. Sin embargo, la tendencia en este tipo de intoxicaciones por organoclorados es a dar lugara a una reducciôn en dicha capa, que incluso llega a ser mâs significativa que la acusada en la capa de empalizada en aves como el âguila imperial (Gonzâlez e Hiraldo, 1988). • Area. En relaciôn con lo descrito en el punto anterior, este aumento en el grosor da lugar a un aumento no significativo en el ârea total al corte de esta capa en la poblaciôn Castellana. 161 ________Discusiôn El grado de cristalizaciôn, al igual que sucede en la capa de empalizada, no se ve afectado en relaciôn con otros parâmetros. Von Nathusius, en 1874, propone la utilizaciôn del area mamilar al corte como parâmetro para diferenciar entre especies, por lo que résulta interesante el estudio genético comparativo de ambas poblaciones. No obstante, es necesario decartar la influencia de posibles tôxicos ambientales tal y como mencionabamos en el apartado anterior. • Area del sistema de ventilaciôn mamilar. Se ha detectado un aumento significativo de este parâmetro en la poblaciôn castellana, esto se debe posiblemente a la alteraciôn constatada en la distribuciôn de los nùcleos de cristalizaciôn y los fenômenos de multinucleaciôn. Esto da lugar a la apariciôn de mayores espacios entre mamilas que se piensa puedan repercutir negativamente en la fortaleza de la câscara. • Distancia entre conos. Pese a las alteraciones constatadas este parâmetro no suffe apenas variaciôn. Esto puede deberse al método de cuantificaciôn. Los fenômenos de nultinucleaciôn dan lugar efectivamente a nùcleos pequehos muy cercanos dentro de la misma mamila pero, al mismo tiempo, se produce un aumento del espacio entre mamilas, de modo que tuera de ellas los nùcleos estân mâs alejados. El sistema de elecciôn al azar implica que las distancias de los nùcleos circundantes periféricos con respecto a otras mamilas aumentan la media general. • Superficie y numéro de nùcleos mamilares. La disminuciôn en estos dos parâmetros es ciertamente notable cuando se comparan las poblaciones castellana y del Duero, con el Algarve portugués. Esta radical disminuciôn es acorde con la mayor incidencia de fenômenos de multinucleaciôn en estas poblaciones. Los factores que determinan la extensiôn de estos nùcleos no se conocen en su totalidad si bien se conviene en afirmar que la estructura y distribuciôn de las fîbras de la membrana extema puedan jugar un papel fundamental. No en vano estos nùcleos se forman como resultado de enlaces covalentes entre estas estmcturas y la capa mamilar. 162 _______ Discusiôn En efecto, la reducciôn de la densidad de nùcleos mamilares es uno de los factores que parece comprobado contribuye notablemente a la reducciôn del peso de la câscara. Este hecho se ha observado en en el cemicalo americano como resultado de la intoxicaciôn por DDE, en combinaciôn con una reducciôn en el grosor de la câscara (Kiff et al, 1979). Las reducciones en el grosor de la câscara y el indice de grosor en el halcôn peregrino parece estar relacionado con un aumento en la fragilidad de la câscara (Cooke, 1979), por lo que es necesario seguir indagando en estos aspectos en el caso del âguila perdicera. • Grado de multinucleaciôn. El fenômeno de multinucleaciôn consiste en la apariciôn de mamilas que contienen varios nùcleos mamilares y por tanto generadas a partir de ellos. Esta anomalia se ha descrito en relaciôn con la ingestiôn de osteolatirôgenos como el p aminopropionitrilo o la semicarbacida (Chowdhury y Davis, 1995). Estos productos inhiben la lisil oxidasa, encima necesaria para la formaciôn de puentes cruzados entre moléculas estructurales. Este fenômeno da lugar a la fusiôn de fîbras con la consiguiente distribuciôn irregular de los puntos de nucleaciôn. En el présente estudio, el 80% de los casos de multinucleaciôn se acompanô de fusiôn de fîbras. No obstante, los grados detectados no son importantes, apareciendo una media de 3.5 nùcleos por cono afectado. Chowdhury y Davis (1995), refieren el hecho de que estas sustancias, y las alteraciones estructurales que producen, dan lugar a un debilitamiento de la uniôn entre los cuerpos mamilares y la membrana extema del huevo, lo que puede contribuir al debilitamiento general de la estructura, aumentando la fragilidad del huevo. Nuestros resultados indican que, en un 74% del total de casos de multinucleaciôn, disminuyeron o no se encontraron restos de membrana adherida a los cuerpos mamilares tras el tratamiento quimico con Na OH. Se desconoce la etiologia y los posibles factores que regulan esta adherencia. Si los 163 _________________________________________________ :_______ Discusiôn osteolatirôgenos estân implicados, quedaria por resolver el interrogante de su origen en estas aves, y de si estos podrian ingerirse al consumir las presas. • Forma, tamano y distribuciôn de las mamilas. Los resultados del présente estudio correlacionan positivamente la regular disposiciôn de las mamilas con el entramado igualmente regular de las fîbras de la membrana extema. Sin embargo, en très casos (21%), la irregularidad en la distribuciôn de las fîbras de la membrana extema no se acompafiô de anomalias en la distribuciôn de los cuerpos mamilares. Distribuciones iregulares de los cuerpos mamilares se han referido en casos de ingestiôn de osteolatirôgenos, asi como ligadas a defîciencias de manganeso en la gallina. En el primer caso se debe a la fusiôn de fîbras ocasionada por la ausencia de puentes cmzados entre proteinas, debido a la inhibiciôn de la lisil oxidasa (Chowdhury y Davis, 1995). En el segundo caso parece originarse como resultado de una disminuciôn en la sintesis de proteoglicanos (Leach y Gross, 1982X La causa primaria de las alteraciones observadas en el âguila perdicera es desconocida, si bien es claro que estâ relacionada con anomalias en la distribuciôn de las fîbras de la membrana extema. Los dos casos de mâxima irregularidad registrados correspondieron a huevos infertiles, y se observô aumento del tamano de las mamilas, posiblemente como resultado de la fusion de varios nùcleos. En 1997, Arias y colaboradores, demostraron la existencia de moléculas colâgeno tipo X entrecmzadas, esenciales en la formaciôn de las membranas. También hay pequenas cantidades de dermatân sulfato, el mismo compuesto que hoy se sabe estâ présente en cantidades importantes en la capa de empalizada. • Conexiôn con membranas testâceas. Se ha especulado sobre la importancia del grado de uniôn entre la capa de los conos mamilares y la membrana extema. Un aumento significativo de la adherencia de estas membranas a la capa mamilar se ha constatado en aves alimentadas con dictas déficientes en cobre (Baumgartner, 1978). También como 164 _______ Discusiôn resultado de la adicion de p-aminopropionitrilo (Leach et al, 1981). Ambos casos estân relacionados, ya que los latirôgenos inhiben la lisil oxidasa, encima que contiene cobre. Una mejor union entre ambas capas se ha demostrado incrementa notablemente la resistencia de la câscara a la deformaciôn (Orberg, 1990). En el caso de los osteolatirôgenos esto no ocurre debido a la irregular distribuciôn de las mamilas que débilita sin duda la estructura. En el âguila perdicera, las muestras en las que se constatô la fragilidad de la câscara con rotura de la misma durante la incubaciôn mostraron adherencias normales o reducidas. Sin embargo, en estos casos, el grado de irregularidad en la distribuciôn de los conos flie elevado, indicando que la densidad de los cuerpos mamilares contribuye a la fortaleza de la câscara. De acuerdo con Van Toldeo et al (1982), el aumento del tamano de las mamilas no se correlaciona necesariamente con un aumento en la fortaleza de la câscara, sino que este pârametro estâ mâs relacionado con el ârea entre mamilas. En el âguila perdicera, el aumento en el tamano de la superficie de contacte se correlacionô positivamente con una mala adherencia. Esta se acompanô de una distibuciôn irregular de las mamilas, lo que sin duda contribuye a un aumento de la fragilidad. 5. Câscara • Grosor total. Existen grandes diferencias entre especies en su susceptibilidad a los pesticidas que dan lugar a reducciones significativas en el grosor de la câscara. Este aspecto ha sido objeto de fuerte controversia y discusiôn durante las pasadas decadas especialmente en la interpretaciôn de los resultados (Burley y Vadehra, 1989). Se ha demostrado que, en aquellas especies susceptibles, estos insecticidas disminuyen de forma significativa el grosor de la câscara. El DDE interfiere con la acciôn de la calmodulina disminuyendo la uniôn de la progesterona a su 165 _______ Discusiôn receptor, lo que indirectamente disminuye el transporte de calcio a la câscara (Lundholm, 1988). Hoy sabemos que otros pesticidas como los PCBs también disminuyen el grosor total de la câscara en especies como el cemicalo americano (Falco sparverius)(Lowe y Stendell, 1991). En este caso, la reducciôn del grosor de la câscara cursô con una reducciôn en el indice de grosor de la câscara, a la que parece haber contribuido el aumento en el tamano del huevo como tal. El fenômeno referido no parece suceder en las poblaciones estudiadas de âguila perdicera, donde la poblaciôn con grosor mâs reducido se acompana de huevos de menor tamano con lo que este efecto parece quedar excluido. La misma conclusiôn ha sido expuesta por Ratcliffe (1970), quien refiriô que si bien el tamano de los huevos de ciertas rapaces en el Reino Unido no ha variado en los ultimos cien anos, si lo ha hecho el peso de la misma, lo que indica una reducciôn de su grosor coincidente con el uso de organoclorados. Los estudios basados en intoxicaciones con Aroclor indican que el indice de grosor de la câscara puede ser mâs sensible a la hora de evaluar los efectos del Aroclor ( Lowe y Stendell, 1991). Es importante destacar que el grosor total de la câscara depende del tamano del huevo, y se relaciona linearmente con el volumen del mismo (Romanoff y Romanoff, 1949). Sin embargo, en el caso del âguila perdicera, los anâlisis demuestran que existe una cierta tendencia a la significaciôn (p=0.12) entre la longitud del huevo y el grosor de la câscara. Mâs aun, cuando se comparan el grosor y el ancho de la câscara, la relaciôn es muy significativa (p=0.007). Posiblemente la amplitud del utero es un factor limitante en el desarrollo del huevo en mayor medida que su longitud. La correlaciôn entre el volumen del huevo y el grosor de la câscara no resultô significativa en el âguila perdicera. 6. Membranas testâceas Se trata de estructuras poco estudiadas en aves no domésticas. Se forman en el itsmo granular por espacio de tiempo aproximado de una hora (Salomon, 1975). 166 __________________________________________________ :_______ Discusiôn La parte o nùcleo proteico de las fîbras parece ser sintetizado por las glândulas tubulares, mientras que el epitelio no ciliado puede ser el responsable de la sintesis de carbohidratos. Sin embargo, como adquieren la organizaciôn en nùcleo y manto es completamente desconocido. En el âguila perdicera ignorâmes los factores que puedan llevar a un aumento en el diâmetro de las fîbras afectando a cada capa. El ùnico aspecto que parece claro es que la encima lisil oxidasa es la responsable de la formaciôn del aldehido de Usina que es el precursor de los puentes cmzados de desmosina e isodesmosina. Las defîciencias de cobre dan lugar a carencias de esta encima lo que produce formaciones anômalas de la câscara (Baumgartner, 1978). El nùmero y ârea de los cuerpos mamilares puede estar relacionado con la distribuciôn y densidad de estas fîbras. Estos aspectos resultan de sumo interés para una mejor comprensiôn de la estmctura final de la câscara. Muchos han sido los estudios que han correlacionado los niveles de diferentes pesticidas con alteraciones en la câscara. Por el contrario se ha hecho escasa o nula referencia a las alteraciones de las membranas de la câscara. Tan sôlo en el caso de los osteolatirôgenos se ha tratado ampliamente este aspecto (Chowdhury y Davis, 1995). Sin embargo, las intoxicaciones por DDE se ha constatado que reducen la densidad de los cuerpos mamilares (Kiff et al, 1979). Las defîciencias de manganeso en la dieta, dan lugar a alteraciôn en la distribuciôn de los cuerpos mamilares, lo que se traduce en una disminuciôn de su nùmero por unidad de superficie, con la apariciôn de grandes âreas intermamilares. El grosor de la membrana extema es siempre superior al de la interna, si bien la diferencia varia notablemente entre especies. Asi, en la gallina es très veces superior, mientras que en otras especies el coefîciente entre ambas magnitudes varia desde 1.5 para el avestmz hasta 7.5 para la codomiz. Este coefîciente es ciertamente constante dentro de una misma especie. En el âguila perdicera se sitùa entre 1.2 y 2.2, valores semejantes a los encontrados en el cisne, como es caracteristico de huevos medianos a grandes. 167 _______ Discusiôn Las membranas son estructuras fundamentales durante la formaciôn de la câscara, pero también a posteriori para la vida y el desarrollo embrionario. Estas estructuras permiten el intercambio gaseoso (Wanguensteen et al, 1970), y actûan combatiendo el paso de microorganismos (Vadehra et al, 1972). La gran mayoria de los lipidos de la câscara se encuentran concentrados aqui, principalmente fosfolipidos, lipidos neutros, colesterol y ésteres. En el caso del âguila perdicera desconocemos la composiciôn de estas vesiculas, si bien por su estructura es posible que contengan lipidos. Si es asi, dada la lipoafînidad de los compuestos organoclorados, la ovoposiciôn puede ser una via de excreciôn en la hembra. Sin embargo, no se ha detectado una disminuciôn del grosor de la câscara, ni del nùmero de poros en los casos estudiados. Por el momento no se conoce con exactitud si estas fîbras son secretadas por las células epiteliales, o por las células tubulares glandulares. Las alteraciones observadas pueden deberse al aumento de los niveles de organoclorados, los cuales pueden afectar a la sintesis y distribuciôn de estas membranas. En la actualidad se investiga este ùltimo extreme. El hecho de que ocurra en las dos capas al mismo tiempo implica que los mécanismes de formaciôn pueden estar alterados. En este sentido la capa interna, menos sujeta a variaciôn, contiene âcido y carboxiglutâmico, mientras que éste no aparece en la capa extema. Es posible que la presencia de este compuesto prevenga de alguna manera la formaciôn de estas vesiculas. Las estmcturas mencionadas podrian estar relacionadas con acùmulos de metales como el cobre, ya que en la gallina, se ha observado que desaparecen cuando se suministran dietas déficientes en el mismo (Baumgartner et al, 1978). Esto puede relacionarse con la inhibiciôn de la formacion de la lisyl oxidasa, la encima implicada en la formaciôn de puentes cmzados entre moléculas de colâgeno y que contiene cobre. Dada la estrecha relaciôn demostrada entre la apariciôn de estas estmcturas y la fusiôn de fîbras, es muy posible que estos 168 _________________________________________________ _______________ ;_______ Discusiôn mecanismos estan implicados, si bien la causa primaria requiere un estudio detallado. 1.2. TENDENCIAS Y CORRELACIONES ENTRE MAGNITUDES Aquellas muestras de câscara en las que se observan âreas extensas de cuticula poseen un menor nùmero de poros y el ârea total de intercambio gaseoso es menor. Este fenômeno puede deberse a que esta capa se détériora progresivamente durante la incubaciôn debido al roce, abriéndose nuevos poros que permanecian hasta entonces obliterados por esta capa. En la gallina, la presencia y tamano de las vesiculas asociadas de forma normal a esta capa varian también con la edad del huevo (Simons y Wiertz, 1985). No obstante, es posible que existan otros factores implicados en la regulaciôn del grosor de esta capa durante la ovoposiciôn, ya que la gran mayoria de las muestras fueron huevos incubados a término. Las observaciones puntuales realizadas en muestras procedentes de huevos rotos por causas accidentales durante la incubaciôn poseen âreas extensas de cuticula présenté. El mismo fenômeno se aprecia en las muestras con anomalias ultraestructurales procedentes de huevos que se sabe quebraron en las primeras dos semanas de incubaciôn. En este caso, la presencia de un menor nùmero de poros puede estar ligada a otras causas primarias. La cuticula es una cubierta que se forma en la glândula coquilaria y se distingue incluso cuando el huevo tan sôlo alcanza un 50% de su tamano, lo que indica que deja paso al material que se deposita mâs tarde. Factores diverses que modifîcan el tiempo de permanencia del huevo en esta regiôn pueden influir en el grosor de esta capa. La cuticula se ha citado como la capa mâs variable entre especies en lo que a la estructura del huevo se refiere (von Nathasius, 1868) pudiendo variar en su grosor, presencia o aspecto. 169 _________________________________________________ _______________ :________Discusiôn En especies como las grullas es de aspecto rugoso, mientras que en otras como el avestmz es ciertamente liso. La relaciôn entre el aspecto mgoso de la cuticula y el mayor grosor de la capa mamilar en el âguila perdicera no se ha descrito con anterioridad en otras especies. Sin embargo, se observa que, en la poblaciôn portuguesa, un 64% de las câscaras presentan esta apariencia mgosa, mientras que la tendencia se invierte en la poblaciôn castellano-manchega. La estratificaciôn de la la capa de cristalizaciôn extema puede contribuir al aumento del nùmero de canales o conexiones entre los mismos. La longitud de estos canales se ha referido depende del grosor de la capa que atraviesan, y en otras especies algunos de estos canales pueden ser ciegos (Ronanoff y Romanoff, 1949). Una de las explicaciones de este fenômeno séria el hecho de que, durante la incubaciôn, la superficie suffe abrasiôn lo que hace que algunos de estos canales se abran a la superficie. Este proceso daria lugar a un aumento en el nùmero de poros reales, favoreciendo la perdida de humedad. Esta teoria podria explicar el hecho de que aumentos notables del grosor total de la câscara se relacionen con un aumento del nùmero de estos canales en el âguila perdicera, lo que podria facilitar el intercambio gaseoso en estos casos. Se ha advertido que la morfologia de los canales se hace mâs tortuosa cuando aumenta la estratificaciôn en el âguila perdicera. El nùmero de canales por unidad de superficie de corte se ha correlacionado signiflcativamente con el grosor de la câscara. Curiosamente, esta relaciôn de asociaciôn no es significativa entre el grosor total y el nùmero de poros en la superficie, mientras que este ùltimo parâmetro si se asocia signiflcativamente con el grosor de la capa mamilar y de empalizada. En algunas especies se ha constatado que aumentos en la altitud dan lugar a una disminuciôn en el nùmero de poros acompahada de un aumento del grosor de la câscara (Carey et al, 1987). Por el contrario, pesticidas como el DDT 170 _______ Discusiôn producer! disminuciôn en el grosor de la câscara acompanada, en algunos casos, de una disminuciôn en el nùmero de poros. La reducciôn del calcio en la dieta se acompana de una disminuciôn del grosor de la câscara pero el nùmero de poros permanece invariable. Sin embargo, la adiciôn de acetazolamida da lugar a una reducciôn del grosor y del nùmero de poros. Dado que la conductacia depende del nùmero de poros, se trata de cambios ciertamente importantes para el desarrollo del embriôn. De lo expuesto se deduce que estas dos variables pueden actuar y ser modifîcadas de forma independiente segùn que factores. Es interesante ver como varia el nùmero de canales en estas circunstancias. En ocasiosnes se ha observado que algunos de estos canales confluyen en el âguila perdicera tal y como sucede en aves como el avestmz. Se ha sugerido que pueda tratarse de un sistema présente en huevos grandes para ayudar a la correcta pérdida de agua debido a su gran volumen. Desconocemos si el nùmero de canales y conexiones puede actuar como regulador de los cambios en la porosidad general del huevo. De esta forma, incrementos en el grosor se corresponderian con aumentos del nùmero de canales para conectar poros en el interior de la capa extema, lo que explicaria la falta de asociaciôn. El nùmero total de poros y el ârea total de intercambio gaseoso se relacionan positivamente con el grosor y ârea de la capa de empalizada, y negativamente con los mismos parâmetros de la capa mamilar. Sin embargo, el nùmero de poros se correlaciona positivamente con el nùmero de nùcleos mamilares. Los grados de significaciôn en ambos casos son idénticos. Tullett en 1975 describiô que, en 34 especies distintas de aves, el nùmero de poros por unidad de ârea es directamente proporcional al nùmero de mamilas. En el caso del âguila perdicera también se cumple, y la relaciôn es positiva y altamente significativa, ya que Tullet realmente considéra el nùmero de mamilas como el nùmero de centros de nucleaciôn. 171 _______ Discusiôn En el présente estudio es importante hacer notar esta diferencia, ya que se han estudiado de forma independiente los centros de nucleaciôn claramente visibles, de las mamilas entendidas como unidades. Esta relaciôn entre poros y centros de nucleaciôn indica que, también en el âguila perdicera, la densidad de poros puede estar controlada por la sintesis de nùcleos mamilares. El grado de cristalizaciôn de la capa de cristalizaciôn extema se correlaciona positivamente con el mismo parâmetro en la capa de empalizada. La relaciôn es lôgica ya que muchos autores describen la primera como la parte extema de la segunda (Burley and Vadehra, 1989). La presencia de dermatân sulfato como componente fundamental en ambas capas (Arias et al, 1992), pero no en la capa de los conos mamilares, indica que este compuesto pueda también estar implicado el grado final de cristalizaciôn. No obstante, es necesario abordar estudios sobre la composiciôn de la matriz orgânica en estas aves, al objeto de corroborar estas hipôtesis. Una correcta cristalizaciôn de esta capa se asocia con conexiones significativas entre las mamilas y la membrana extema. Este hecho résulta de sumo interés, ya que el keratân sulfato es el proteoglicano fundamental en esta localizaciôn. Sin embargo, existen cantidades pequeùas de dermatân sulfato que podrian influir también en la cristalizaciôn. Hoy se conoce que la matriz de los nùcleos se forma en funciôn de los enlaces covalentes que se establecen entre la matriz de los cuerpos mamilares y la membrana extema (Robinson y King, 1968; Bellairs y Boyde, 1969). En esta ùltima, en la gallina, se ha demostrado existen también pequenas cantidades de dermatân sulfato. Este extremo permite sugerir la hipôtesis de que este proteoglicano sea responsable en gran parte de la deposiciôn de cristales, y de forma secundaria, de factores fundamentales de la fortaleza de la câscara. Un correcto grado de cristalizaciôn de la membrana extema se correlacionô con infertilidad en los huevos examinados. Desconocemos el significado que pueda tener este dato y la posible influencia de la sintesis de algunos de estos proteoglicanos en el transporte espermâtico en la zona del istmo. 172 _________________________________________________________________ ;_______ Discusiôn La relaciôn entre el nümero de vesiculas en la capa de empalizada, el nùmero de poros en superficie y el grosor total de la câscara indica que la porosidad esta relacionada con la estructura global de la câscara. Posiblemente, las câscaras gruesas requieren una mayor capacidad de intercambio gaseoso. El ângulo de orientaciôn de los cuerpos poliédricos en la capa de empalizada no se relaciona signiflcativamente con otros factores de cristalizaciôn o de la matriz orgânica como el ârea de nùcleos mamilares o el nùmero de los mismos. Esto puede indicar que la orientaciôn de estas columnas se rige posiblemente por factores distintos a los implicados en la formaciôn de la matriz. La hipôtesis que sugiere la influencia de fenômenos de epitaxia quedaria reforzada. Durante la incubaciôn, el embriôn toma el calcio necesario para la formaciôn del esqueleto fundamentalmente de la câscara, cifrândose en un 82% en el caso del polio (Simkiss, 1961) y 84.2% en la codomiz (Ono y Wakasugi, 1984). La base de los conos se cree es la primera fuente de calcio para el embriôn, si bien el contacte de la membrana corioalantoidea con la câscara no ocurre hasta el dia diez de incubaciôn en el polio (Terepka et al, 1969). La absorciôn del calcio se ha argumentado como causante de un 5% de disminuciôn en el grosor total de la câscara en huevos fertiles de polio incubados a término (Simkiss, 1967), produciendose durante el ùltimo cuarto de la incubaciôn. Sin embargo, estudios en aves salvajes demuestran que en especies como el pelicano o la grulla estas diferencias no son significativas. En el caso del âguila perdicera las diferencias entre médias en relaciôn con el grosor de la capa mamilar alcanzaron el 24%, porcentaje muy superior al explicable por este fenômeno. Los estudios estadisticos muestran que la infertilidad o infertilidad del huevo no se relacionan signiflcativamente con el grosor de la capa mamilar, ni con la forma de la mamila. Mamilas cônicas parecen asociarse signiflcativamente con un mayor nùmero de fîbras de la membrana interna 173 __________________________________________________ :_______ Discusiôn Tras un examen detallado de las correlaciones existentes entre diferentes paramétrés de la capa mamilar, muchos de ellos reflejan la presencia abundante de fenômenos de multinucleaciôn extendidos en esta especie. Las correlaciones de la distancia media entre nùcleos y el ârea entre mamilas y el area mamilar explican perfectamente el fenômeno. Cuanto mayor es la distancia media entre mamilas, menor es el nùmero de estas y mayor el nùmero de nùcleos. En los casos de multinucleaciôn los nùcleos son pequehos y agregados, dando lugar a mamilas grandes e iregulares por fusiôn, pero* que dejan un gran espacio entre ellas debilitando la arquietctura global de la câscara. Los resultados indican que se trata de un proceso anômalo extendido en el âguila perdicera, sin que hasta el momento conozcamos la causa. Se comprueba estadisticamente que el aumento del ârea entre mamilas da lugar a una reduciôn notable de la adherencia entre estas y la membrana extema. La correlaciôn negativa existente entre el tamano de las mamilas y el grado de multinucleaciôn indica que, si bien el fenômeno de multinucleaciôn da lugar a mamilas compuestas de tamano muy superior al normal, esto no implica que el fenômeno se agrave con el aumento medio en el tamano de las mismas. Muy al contrario, los grados mâs elevados de multinucleaciôn ocurren en câscaras con un tamano medio de mamila pequeho. Tal y como se dériva de los resultados, éste es el mâs comùn en esta especie. Cabria de esperar que, dado que la multinucleaciôn en si conlleva una distribuciôn anômala de los nùcleos de cristalizaciôn, esta pueda estar ligada a una distribuciôn anômala de las fîbras. Sin embargo, no se ha encontrado correlaciôn significativa entre el grado de multinucleaciôn y la regularidad en la distribuciôn de las fîbras de las membranas. Esto puede implicar que la distribuciôn de los nùcleos de cristalizaciôn depende de otros factores. El hecho de que la distribuciôn de las mamilas, y por ende de estos nùcleos, no se haya correlacionado signiflcativamente con ninguna de las demâs variables habla en favor de esta hipôtesis. Diverses autores han argumentado sobre 174 _________________________________________________ :_______ Discusiôn al posibilidad de que el grado de adhesion entre membrana extema y mamilas influya de algun modo en la fortaleza de la câscara (Orberg, 1990; Chowdhury and Davis, 1995). En el présente estudio grados importantes de conexiôn entre la membrana extema y la capa de los conos se correlacionaron de forma significativa con tamanos reducidos de mamila, normales para la especie. Esto sugiere que una cohesiôn adecuada es un factor importante. Durante el examen en protundidad de aquellos casos en los que se constatô la rotura de los huevos durante el periodo de incubaciôn, se apreciaron mamilas de tamano superior al habituai y falta de adhesiôn entre estas y la membrana extema. Esta correlaciôn fue significativa (p=0.033), lo que sugiere la importancia de esta relaciôn en la ultraestmctura del huevo normal del âguila perdicera. Especialmente interesante es la relaciôn existente entre las estmcturas de la capa mamilar, el grosor total de la câscara y el numéro de poros. A estas dos ultimas magnitudes se han referido una cantidad importante de trabajos centrados en la influencia de pesticidas en la câscara. Sin embargo, el présente estudio demuestra el impacto de los fenômenos de multinucleaciôn constatando que el numéro de mamilas se relaciona negativamente con el grosor de la câscara y la superficie de intercambio aéreo. La distancia entre nùcleos y el nùmero de los mismos se relacionan positivamente. Con estos datos se puede sugerir que la presencia de multinucleaciôn, o la causa primaria que origina este fenômeno, da lugar a una disminuciôn notable del grosor de la câscara, acompanada de un descenso en el nùmero de poros por unidad de superficie. Résulta interesante analizar la posible repercusiôn de la disminuciôn en el grosor de cada una de las capas en el grosor total de la câscara en funciôn de la significaciôn de la correlaciôn entre parâmetros. El hecho de que el grado de significaciôn sea superior, en el caso del ârea y grosor de la capa de cristalizaciôn extema, sugiere que esta pueda tener una especial relevancia en el grosor total de la câscara en esta especie. Es factible 175 ________Discusiôn pensai, por tanto, que disminuciones en esta capa den lugar a importantes reducciones en el grosor total. En muchos de los estudios realizados sobre contaminantes, de los que se conoce reducen signiflcativamente el grosor de la câscara, como organoclorados (Bunk et al, 1985) o PCBs como el Aroclor ®1254 (Lowe y Stendell, 1991), no se detalla la afecciôn de las capas. Cooke en 1975, indica que a la reducciôn del grosor de la câscara en polios a los que se les adicionô sulfanilamida en la dieta contribuyeron igualmente ambas capas, mientras que en los que se les redujo el calcio en la dieta, la disminuciôn del grosor de la capa de empalizada fue mayor que en la capa mamilar. El mismo autor cita reducciones en la primera capa, pero no en la segunda, en patos a los que se adicionô DDT en la dieta. En garzas con niveles altos de organoclorados la relaciôn entre el grosor de la capa mamilar y el grosor total de la câscara fue altamente significativa, tal y como ocurre en el âguila perdicera. Existen diferencias importantes entre especies que es necesario tener en cuenta. El nùmero y diâmetro de las fîbras de las membranas testâceas se relaciona negativamente, esto implica que a mayor nùmero menor diâmetro. Este aspecto es fundamental ya que hoy se sabe que estas fîbras contienen colâgeno tipo I, V y X , y que la lysil oxidasa interviene en la formaciôn de los puentes cmzados entre moléculas. Curiosamente, a mayor nùmero de fîbras menor nùmero de nùcleos, esto implica que ha de existir un equilibrio cmcial entre estas magnitudes y que tanto excesos como defectos pueden dar lugar a alteraciones. Las sustancias como osteolatirôgenos que inhiben la lisil oxidasa dan lugar a una distribuciôn anômala de las fîbras, y a un nùmero inferior de estas por unidad de superficie estudiada. En el âguila perdicera, la disminuciôn del nùmero de fîbras se acompana de un mayor nùmero de centros de nucleaciôn, pero una mayor ârea media de los mismos. Sin embargo, las correlaciones entre el diâmetro medio de las fîbras y el ârea media por nùcleo no son significativas. Esto indica que, posiblemente, en esta 176 ________Discusiôn especie, el tamano de los centros de cristalizaciôn venga dado por la densidad de las fîbras. Sin embargo, todas estas magnitudes, incluido el diâmetro medio de fîbras, se correlacionan significativa y positivamente con el grosor de la câscara. Estas estructuras en su totalidad pueden influir en el grosor de la câscara como tal. El grado de significaciôn (p=0.04) de la correlaciôn entre el diâmetro medio de las fîbras y el grosor de la câscara sugiere que, factores implicados en la formaciôn de dichas fîbras y posiblemente en su composiciôn, puedan influir en el grosor final de la câscara. Las fîbras estan constituidas por proteinas, lipidos, y carbohidratos. Un anâlisis detallado de la variaciôn en la composiciôn en fîbras de diferente diâmetro puede ayudar a la mejor comprensiôn de los factores implicados. Un examen estadistico adicional de la correlaciôn entre el diâmetro de las fîbras y el grosor de las diferentes capas de la câscara indica que, aunque las correlaciones no son significativas, existe una tendencia importante en la correlaciôn con el grosor de la capa mamilar (p=0.07). El dermatân sulfato es un componente comùn entre la matriz orgânica de la câscara y las membranas, por lo que es posible que este relacionado con estas circunstaqcias. II. VARIACION EN LOS PARAMETROS ESTABLECIDOS EN FUNCION DE FACTORES FISIOLOGICOS. GEOGRÂFICOS v CLIMATOLOGICOS. GENÉTICOS E INMUNOLÔGICOS II .l FACTORES FISIOLOGICOS II.1.1. Edad de la hem bra 177 _______ Discusiôn En la gallina, el tamano del huevo varia con la edad de la hembra siendo los huevos menores durante los primeros anos para alcanzar un mâximo y posteriormente disminuir con la senectuz (Romanoff y Romanoff, 1949). En nuestra experiencia con aves rapaces hemos constatado la misma observaciôn. En la poblaciôn salvaje examinada es complejo saber la edad real de muchos de estos individuos, lo que dificulta el anâlisis. La variaciôn encontrada en la longitud, es de hasta un centimetro mientras que el ancho varia en medio centimetro. La presencia de huevos caracterizados como pequehos en todas las poblaciones puede indicar una variaciôn individual, posiblemente debido a la edad de la hembra. En uno de los casos, la hembra falleciô en el ùltimo ano de estudio, sin que se conozca la causa de la desapariciôn, siendo factible que se tratara de una hembra de edad avanzada. El tamaho se relaciona también con la edad de la hembra cuando alcanza su madurez sexual. Las âguilas perdiceras pueden comenzar a poner excepcionalmente durante el tercer aho de vida, cuanto mâs j oven es la hembra al realizar la primera puesta, menor es el tamaho de los huevos (Romanoff y Romanoff, 1949). Este puede ser otro de los factores que influya de forma notable en el tamaho de alguno de los huevos examinados. Obviamente este aspecto esta relacionado con el peso del ave en el momento de la puesta. En aves como la gallina, en la que existen énormes diferencias entre razas en cuanto al tamano, este afectan notablemente al tamaho del huevo y el de la hembra durante la primera puesta. Algo similar sucede a menor escala en el âguila perdicera. Hemos comprobado que los polios pertenecientes a la poblaciôn del Algarve son signiflcativamente superiores en peso y tamaho a los polios de la poblaciôn espahola con la misma edad. Este fenômeno puede deberse a diferencias genéticas, pero también de tasa de crecimiento, lo que indica que las perdiceras de Algarve de tamaho superior crecen mâs deprisa y consecuentemente pueden alcanzar la madurez sexual con mayor rapidez que la poblaciôn Castellana. Esta rapidez posiblemente pueda verse 178 _______ Discusiôn influida por las diferencias en latitud entre ambas poblaciones. Consecuentemente su tamano también sera superior al de estas ultimas durante la primera puesta, por lo que sus huevos tendràn un tamano superior, Tal y como se ha descrito en aves domésticas, el tamaho del huevo varia segùn el orden en el ciclo de puesta. El primer huevo suele ser el mayor, disminuyendo en tamaho de forma progresiva en el ciclo. Este fenômeno ocurre también en las rapaces, especialmente el ùltimo huevo de la serie de puesta. En nuestro estudio résulta prâcticamente imposible determinar el orden en la puesta, por lo que la influencia de este paramètre no ha podido determinarse. II.1.2. Ëstado nutricional y tamaho de la hembra. Los estudios realizados en aves domésticas indican que el tamaho del huevo se ve poco afectado por el estado nutricional, dentro de unos limites razonables. Este factor parece tener una mayor influencia en el nùmero de huevos por ciclo ovular (Romanoff y Romanoff, 1949). El consumo de proteina parece ser el constituyente de la dieta que mâs puede influir en este aspecto. No obstante, se han descrito un nùmero importante de micronutrientes, cuyo exceso o carencia puede dar lugar a alteraciones de la câscara. Résulta difîcil conocer el estado nutricional de los adultos implicados en este estudio basandose en datos de la abundancia de presas o en el estado nutricional de su descendencia. En las aves domésticas, se ha comprobado que el grosor de la câscara aumenta en dietas con el aporte adecuado de calcio. Obviamente el calcio no se asimila del mismo modo de todas las fuentes posibles. En el caso de aves salvajes y en concreto del âguila perdicera, la variedad de presas que consumen es importante y balanceada, resultando altamente improbable la carencia de este elemento en ausencia de ciertas patologias. No sucede lo mismo para otros 179 _______ Discusiôn elementos que, si bien se encuentran en pequena proporciôn en la câscara, se han revelado como fundamentales en su correcta formaciôn. Este es el caso del manganeso, cuya carencia da lugar a alteraciones en el tamano y por tanto la densidad y distribuciôn de las mamilas (Lach y Gross, 1982). Este efecto no es sorprendente debido al conocido papel del manganeso en la sintesis de polisacaridos, lo que da lugar a una reducciôn de hexosamina y âcido exurônico. Las investigaciones de Cooke y Blach en 1970, indicaron que los nùcleos mamilares son ricos en estos compuestos, lo que introduce la posibilidad de que se vea afectado el inicio de la formaciôn de la câscara. El resultado es un aumento el tamano de las mamilas que parece resultar de la fusiôn de las mismas. Un fenômeno similar se ha constatado en este estudio, si bien los grados de afecciôn son muy inferiores. En el caso del âguila perdicera, el consumo de presas frescas y complétas hace improbable que se derive de una defîciencia como tal. El magnesio es otro elemento fundamental en la formaciôn de la câscara. Su defîciencia se ha constatado produce un descenso signifîcativo en el grosor de la câscara (Wanddell et al, 1990). Los estudios de estos autores demuestran que el magnesio se encuentra fundamentalmente en aquellas zonas de mayor presencia de materia orgânica de la câscara. De forma adicional, existen sistemas de transporte de calcio dependientes o independientes de magnesio. En funciôn de este balance en cada especie, las câscaras pueden verse afectadas en mayor o menor medida ante una hipomagnesemia. De forma inversa, aquellas especies mâs susceptibles a los efectos de DDE serian resistentes a este fenômeno, ya que el transporte de calcio en las mismas tendria lugar independientemente de la presencia de magnesio. Asumiendo estas premisas, la disminuciôn de la capa de empalizada asociada a la poblaciôn espanola estaria ligada a la desapariciôn de la porciôn mâs interna de esta capa présenté en las poblaciones portuguesas. 180 _______ Discusiôn La disposiciôn de esta capa hace pensar que pueda tener una mayor concentraciôn de materia orgânica, y por tanto de magnesio. Asumiendo esta hipôtesis, el âguila perdicera séria en principio poco sensible a los efectos del DDE. Las alteraciones observadas en la ultraestmctura de la câscara estarian mas ligadas a alteraciones en la matriz de la câscara y de las membranas, en virtud de la correlaciôn de este fenômeno con el de multinucleaciôn y fusiôn de fîbras. No obstante, estas hipôtesis requeririan de su confimaciôn mediante anâlisis quimicos. Si es asi, la posible causa primaria de la defîciencia de estos minérales es desconocida hasta la fecha. El exceso o carencia de un nùmero importante de vitaminas da lugar a alteraciones de la câscara. Creemos que en el caso de aves salvajes predadoras es ciertamente difîcil que estas carencias aparezcan como resultado de problemas en la dieta. De nuestros estudios realizados en rapaces cautivas se desprende que, tal y como sucede en las aves domésticas (Romanoff y Romanoff, 1949), el tamano del huevo es directamente proporcional al tamano de la hembra dentro de la misma especie. Esto es especialmente cierto en aves rapaces como hemos podido comprobar existiendo una correlaciôn con un grado muy elevado de significaciôn. La relaciôn entre peso de la hembra y tamaho del huevo es lineal en las aves adultas, pero puede no serlo en aves jôvenes durante el periodo de crecimiento (Marble, 1930). II.1.3. Grado de estrés de la pareja durante la epoca de puesta Es ciertamente complejo medir el nivel de estrés al que se encuentra sometido un individuo salvaje de forma no invasiva, por lo que las apreciaciones han de tomarse con cautela. El estres puede dar lugar a importantes alteraciones en la forma de la câscara. Estas alteraciones en la gallina incluyen: huevos con formas anormales, cubiertas de calcio amorfo, huevos rosados o con aspecto polvoriento (Hughes et 181 _________________________________________________ _______________ :_______ Discusiôn al, 1986). La administraciôn de adrenalina subcutânea dio lugar a retenciones de huevo y a un aumento de la apariciôn de anomalias proporcional a la dosis. Parece claro que en muchos casos grados de estres elevados dan lugar a una disminuciôn en la producciôn de huevos. Sin embargo, grados menores de estres pueden traducirse en retrasos en la ovoposiciôn, los cuales se relacionan con la presencia posterior de cubiertas anormales de la câscara. En el âguila perdicera no hemos encontrado ninguna de estas formas anormales lo que podria traducirse en niveles bajos de estres. En cautividad el estres puntual da lugar a retraso en la ovoposiciôn en esta especie e incluso al cese de la puesta, sin embargo tampoco se han observado formas anormales salvo huevos en fârfara. En aves domésticas, factores como el ayuno o el calor excesivo dan lugar a estres, lo que se traduce en mamilas redondeadas y orientaciôn anormal de las columnas de la capa de empalizada. El adelgazamiento de la câscara se ha citado pueda estar relacionado no sôlo con la alteraciôn del equilibrio âcido-base, sino ademâs con una disminuciôn de la capacidad de las células duodenales para el transporte del calcio (Mahmoud, 1996). II. 2. FACTORES GEOGRÂFICOS Y CLIMATOLÔGICOS II.2.1. Nùcleo poblacional Los resultados estadisticos derivados de los ANOVA multifactoriales, muestran diferencias significativas entre las poblaciones evaluadas en el présente estudio. Estas diferencias constatadas son de gran interés ya que varias de ellas se relacionan directamente con el grosor de la capa de empalizada, que es la que contribuye en gran medida al grosor total de la câscara. Los resultados ponen de manifiesto que, en la poblaciôn espanola, esta capa se encuentra ciertamente alterada en comparaciôn con las otras poblaciones. Estas alteraciones severas se traducen en disminuciones importantes del grosor, acompanadas de descensos importantes en los valores de otros parâmetros con lo 182 _______ Discusiôn que se correlaciona signifîcativamente. Entre ellos figura la reducciôn drâstica en el numéro de porcs o del numéro de vesiculas en la capa de empalizada. Las reducciones en el espesor de esta capa en la poblaciôn espanola fue de entre un 25,6% y un 30,45 en comparaciôn con las poblaciones del Algarve y Arribes de Duero. Estes valores son muy significatives, y superiores a les referidos incluse en la literatura como causantes de descensos en las tasas de éclosion en otras rapaces (Ratcliffe, 1970; Stickel, 1975; Newton 1979) como consecuencia de niveles elevados de DDE. Estas diferencias doblan las encontradas entre huevos antiguos y modernes en el âguila imperial (Aquila adalberti), siendo estas del 12.3% para la capa de empalizada (Gonzalez e Hiraldo, 1988). En esta especie, sin embargo, las mayores diferencias se produjeron en la capa mamilar llegando a un 15.5% de disminuciôn. Las caracteristicas de las diferencias encontradas entre las poblaciones portuguesas y las espafiolas apuntan a la posibilidad de que se deban a niveles elevados de pesticidas organoclorados. Diferentes autores no han encontrado variaciones importantes en otras caracteristicas de la câscara como el numéro de pores, el ârea de les mismos o el numéro de conos mamilares ( Cooke, 1979; Board y Perret, 1979; Gonzalez e Hiraldo, 1988), mientras que estas variaciones si aparecen en el âguila perdicera. Este fenômeno puede deberse a diferencias especificas, o bien a niveles superiores de organoclorados en la poblaciôn castellano-manchega, le que se relacionaria con la mayor reducciôn en el espesor de la capa de empalizada encontrada. Es posible que dichas alteraciones estén ligadas a la acciôn sinérgica de organoclorados y PCBs, capaces de producir disminuciones significativas del grosor total de la câscara en aves rapaces ( Lowe y Stendell, 1991). Un 64% de las muestras procedentes de la poblaciôn portuguesa mostraron superficies de cuticula de aspecto irregular, mientras que esta tendencia se invirtiô en la poblaciôn espanola. El hecho de que las cuticulas lisas se relacionen signifîcativamente con una disminuciôn media del 16.6% en el grosor de la capa 183 _______ Discusiôn mamilar, pueden apoyar la hipôtesis del posible efecto de determinados pesticidas sobre la câscara en el âguila perdicera en nuestro pais. 11.2.2. Temperatura durante los dias de puesta La temperatura se ha demostrado experimentalmente que puede influir sobre el peso del huevo y el tamano en la gallina (Heywang, 1946). Temperaturas por encima de 21 grados, tienen un efecto negativo disminuyendo el tamano del huevo. Por el contrario, temperaturas bajas no parecen influenciar poderosamente en este parâmetro. Las aves salvajes parecen requérir varios dias de temperaturas moderadas para facilitar la formaciôn del huevo (Kendeigh, 1941). Con frecuencia hemos observado que las rapaces ajustan su puesta a périodes benignos dentro de unos mârgenes que varian poco entre anos consécutives. En este sentido, la poblaciôn del Algarve, con temperaturas mâs benignas, puede superar los limites expuestos. En este sentido, cabria esperar que aquellos huevos puestos a finales de la estaciôn reproductiva puedan haber estado condicionados por la existencia de temperaturas elevadas. Del mismo modo, se ha descrito que elevaciones de la temperatura de 20°C a 32.5°C dan lugar a reducciones significativas en el grosor de la câscara (Warren y Schneple, 1940). 11.2.3. Altitud del ârea de cria La ausencia de diferencias significativas en el numéro de poros entre muestras correspondientes a parejas cuyos habitats difieren en unos 800 m de altitud, sugiere que este rango no es suficiente para producir alteraciones notables en el âguila perdicera. 184 _______ Discusiôn II.3. FACTORES GENÉTICOS E INDIVIDUALES Existe evidencia de que un numéro limitado de genes intervienen en la heredabilidad de la forma del huevo (Marble, 1943). El aspecto mâs o menos rugoso de la cuticula parece heredarse en un 72% de la decendencia. El grosor de la câscara es una manifestacion del metabolismo del calcio y su habilidad para su asimilaciôn y excreciôn. El grosor de la câscara en el polio parece estar de algün modo bajo un*cierto control hereditario si bien estos mecanismos no se conocen con precision (Romanoff y Romanoff, 1949). La dificultad de ciertas lineas para mejorar el grosor de la câscara, incluso en las condiciones nutricionales y ambientales mâs favorables, parece ir en favor de esta hipôtesis. De nuevo existe una gran controversia en cuanto al grado de variaciôn individual y sus repercusiones en la interpretaciôn de fenômenos. Esta variaciôn depende en gran medida del parâmetro elegido en referenda a la estructura del huevo. En cuanto al grosor de la câscara, la variaciôn entre individuos es grande en especies domésticas, posiblemente debido a su domesticaciôn. En especies salvajes, esta variaciôn se reduce aunque sigue siendo amplia (Romanoff y Romanoff, 1949). Sin embargo, entre los huevos de una misma hembra la variaciôn es limitada y el grosor tiende a ser muy constante. Los resultados del présente estudio apuntan en esta direcciôn, siendo minima la variaciôn en el grosor total y de cada capa en esta especie. En contradicciôn con lo argumentado por otros autores para otras especies, el numéro de poros es ciertamente variable en los huevos de un mismo individuo correspondientes a anos consecutivos. Su aumento no se correlaciona con cambios importantes en los contenidos de pesticidas organoclorados. Igualmente, existen diferencias importantes en el ârea total de poros. 185 ____________________________________________________ ;_______ Discusiôn II.4. FACTORES INMUNOLÔGICOS E INFECCIOSOS En 1949, Romanoff y Romanoff describen con acierto: "La actividad reproductiva de la hembra esta influenciada de forma incuestionable por su condiciôn fïsica. Alteraciones flsiolôgicas debidas a enfermedades pueden alterar el tamano del huevo, incluso antes de que estas sean évidentes....". En efecto, la presencia de patologias da lugar en muchos casos a una disminuciôn del tamano del huevo, y no a un cese de la puesta, en la mayoria de las afecciones crônicas. Infecciones en el utero pueden dar lugar a huevos anormales en la forma, pero también a huevos de tamano inferior al normal. La presencia de patologias en los polios no se relacionô con ninguna de las variables cuantitativas o subjetivas investigadas en el présente estudio. Este hecho puede ser cierto, o bien deberse a la inesactitud del modelo asumido. Es posible que el estado sanitario de los polios no refleje el de sus progenitores. En las aves rapaces adultas, la mayoria de las enfermedades son procesos de tipo crônico que dan lugar a pérdida de condiciôn del ave. Previo a la puesta, las aves rapaces requieren un aumento considerable de peso. Cabe la posibilidad de que las enfermedades mâs comunes cursen mâs ffecuentemente con una inhibiciôn de la puesta, que con alteraciones morfolôgicas de la câscara. Estos aspectos requieren de investigaciones mâs profundas mediante métodos no invasivos. III. DESCRIPCIÔN DE ALTERACIONES ULTRA ESTRUCTURALES. 1. Cuticula. • Presencia o ausencia de cuticula. 186 ________Discusiôn La presencia de extensiones superiores de cuticula se correlacionô signifîcativamente con huevos mâs grandes. Este aspecto résulta fundamental ya que la presencia de vesiculas se correlaciona con cuticulas déficientes. Es posible argumentar que, si las formaciones globulares son bacterias, la presencia de procesos infecciosos pueda dar lugar a un tamano inferior del huevo. La disminuciôn de la cuticula en este caso podria haber contribuido a la penetraciôn de ciertas bacterias en la cloaca durante la ovoposiciôn. Es necesario hacer notar que el tamano del huevo depende de multiples factores. Entre los mâs importantes figuran el tamano de la hembra y su edad (Romanoff y Romanoff, 1949). En el primer caso, las aves de la poblaciôn del Algarve parecen signifîcativamente mayores en tamaôo a la poblaciôn espahola. No obstante, cuando esta variaciôn se élimina, la tendencia continua, lo que demuestra que existen otros factores implicados. • Presencia o no de estructuras especiales: esferolitos, vesiculas, material en la entrada de los poros, y fracturas radiales. El ùnico caso en el que se ha detectado la presencia de esferolitos se ha prodducido en la zona de Almadén coincidiendo con la presencia de niveles elevados de mercurio suflcientes para producir muerte embrionaria. Este hallazgo sugiere que este métal pueda ser uno de los responsables directes de algunas de las alteraciones observadas. Dada la relaciôn sugerida entre la presencia de esferolitos y de material obstruyendo los poros, es posible teorizar sobre la posible relaciôn de estas anomalias con la muerte embrionaria en estadios intermedios del desarrollo. 2.Capa de cristalizaciôn externa • Grado de cristalizaciôn. La relaciôn de este parâmetro con la resistencia de la câscara a su fractura he sido sugerida por diversos autores, si bien persiste la controversia. A falta de la realizaciôn de las pruebas fïsicas de resistencia a la presiôn, si es cierto que el 187 ________Discusiôn grado de cristalizaciôn en esta capa se relaciona signifîcativamente con el mismo parâmetro en la capa de empalizada. Dado que esta ultima, por sus dimensiones e s de una importancia capital en el âguila perdicera, sus anomalias resultan de gran importancia. Se han observado casos en los que la disminuciôn del grado de cristalizaiôn de esta capa se ha correspondido con descensos en el grosor total de la câscara lo que soportaria esta hipôtesis. 3. Capa de empalizada • Grado de cristalizaciôn. Salvo excepciones anecdôticas, la cristalizaaciôn en esta capa no parece ser un problema generalizado en ninguna de las poblaciones estudiadas. Incluso en las câscaras afectadas por fenômenos como la presencia de vesiculas, el grado de cristalizaciôn no se ha visto afectado de forma significativa. 4. Capa mamilar. • Grado de multinucleaciôn. De forma opuesta a lo descrito para la cristalizaciôn, los fenômenos de multinucleaciôn son ffecuentes. Los resultados apuntan a su estrecha relaciôn con niveles elevados de mercurio y otros compuestos tôxicos. Los estudios ultraestructurales sugieren que su pesencia puede contribuir de forma notable al debilitamiento y fragilidad de la câscara. Su presencia aparece claramente ligada a alteraciones de las membranas testâceas lo que sugiere la alteraciôn de la sintesis de proteoglicanos como posible causa primaria de ambos fenômenos. Los cuerpos mamilaes son los pilares sobre los que se estructura el resto de capas de la câscara por lo que alteraciones a este nivel puden tener consecuencias nefastas. • Forma de las mamilas. La presencia de mamilas planas es mâs frecuente en huevos eclosionados o con desarrollo embrionario llevado a término. Este fenômeno podria estar 188 ____________________________________________________ ________________ :_______ Discusiôn relacionado con el hecho constatado de la absorcion de calcio procedente de la superficie interna de estas estructuras durante el ultimo estadio del desarrollo embrionario. Este extremo puede resultar de aplicaciôn para el diagnôstico del desarrollo embrionario en restos de câscara o huevos depredados. 5. Membranas testâceas • Distribucôon de fibras. La presencia de vesiculas en las fibras corresponde con contaminaciones bacterianas. El origen y via de entrada es desconocido, si bien pudieran procéder de una contaminaciôn exôgena transcurrido el periodo de incubaciôn. No obstante, dado que el tratamiento de las muestras ha sido idéntico, unido a la correlaciôn con la presencia de estas estructuras imbricadas en la capa de empalizada en los casos mâs severos, popdria indicar la naturaleza infeciosa del fenômeno. En este caso podria sugerirse una salpingitis como causa primaria. De ser cierta esta hipôtesis, su incidencia en la poblaciôn del Algarve séria muy elevada, extremo que es necesario investigar. IV. TOXICOS AMBIENTALES EN CONTENIDOS DE HUEVO COMO BIOINDICADORES IV .l. ANÀLISIS TOXICOLÔGICO IV. 1.1. Organoclorados De entre los residuos de organoclorados determinados en el présente estudio, el DDE fue el que se encontrô en niveles superiores, en consonancia con lo referido en otros estudios realizados en el âguila imperial iberica (Gonzalez e Hiraldo, 1988). Los niveles oscilaron entre 0.16 y 2.96 pg/g de materia hümeda. 189 ________Discusiôn con una media de 0.89 ± 0.67 pg/g. Estos valores son ligeramente inferiores a los registrados para el âguila imperial (Gonzalez e Hiraldo, 1988), e inferiores a los hallados en otras especies de aves de presa que aves como parte de su dieta (Reichel et al, 1969, Ratcliffe, 1970; Newton, 1979). El grado de toxicidad de estos compuestos varia notablemente con diversos factores entre los que se incluyen la especie, la edad, el estado flsiolôgico, el estres, la condiciôn fïsica,...etc. La variaciôn interespecifîca en la susceptibilidad a este organoclorado es importante a la hora de evaluar los resultados. Niveles entomo a 4.2 pg/g de materia hümeda en el âguila pescadora se han asociado a una disminuciôn del 15% en el grosor total de la câscara (Wiemeyer et al, 1988). Sin embargo, niveles cuatro veces superiores (16 pg/g) se han asociado en el âguila calva con idénticas reducciones en el grosor de la câscara (Wiemeyer et al, 1993). Las aves que experimentan mayormente los efectos de estos compuestos son las mâs longevas, situadas en la cùspide de la pirâmide ecolôgica. El âguila perdicera se enmarca bien dentro de estas caracteristicas. Los resultados han de tomarse con cierta cautela. En patos intoxicados con Dicifol (acaricida estructuralmente similar al DDE) o DDE, se observô una disminuciôn en la resistencia de la câscara y su grosor a dosis minimas en el caso del DDE (3 pg/g). Los efectos comenzaron a aparecer de forma inmediata en el caso de ambos compuestos. Hay que hacer notar que la disminuciôn en la calidad de la câscara se produjo incluso con niveles de DDE en contenido de huevo entomo a 1.4 pg/g. Esta especie es mucho menos sensible a los efectos de DDE que las rapaces. De hecho Wiemeyer et al (1988), han demostrado que los mismos efectos se producen en cârabos americanos con dosis diez veces inferiores. En el présente estudio se han constatado disminuciones muy importantes del grosor de la capa de empalizada afectando a la poblaciôn espanola, que sin embargo se han traducido en un descenso del grosor total no superior al 5% 190 ____________________________________________________ :________Discusiôn cuando se compara con la poblaciôn del Algarve. Los niveles superiores de DDE detectados en la primera pueden estar relacionados con este fenômeno. Se desconoce la susceptibilidad de esta especie a los organoclorados, si bien se ha demostrado que rapaces como el cemicalo americano son mucho mâs susceptibles que el resto de las especies examinadas (Fry et al, 1988). Entre especies de aves rapaces, el halcôn de las praderas (Falco mexicanus) es mâs susceptible al DDE que el halcôn peregrino. Niveles entomo a 2 pg/g pueden afectar a la primera, mientras que en el halcôn peregrino son necesarios niveles entre 15 y 20 pg/g (Jarman et al, 1996). Los niveles de Dieldrin en el présente estudio variaron entre la ausencia de niveles détectables y 0.6 pg/g en materia hümeda, con una media de 0.06 pg/g. Estos valores pueden clasificarse como bajos en comparaciôn con los descritos como causantes de infertilidad en el âguila real (1 pg/g) (Lockie et al, 1969). Los niveles de dieldrin encontardos en el âguila perdicera son considerablemente superiores a los descritos para el âguila imperial (Gonzalez e Hiraldo, 1988). Es necesario considerar aspectos importantes como la diferentes susceptibilidad interespecifîca. Niveles iguales o superiores a 5 pg/g de materia hümeda en cerebro se han constatado como létales (Stickel, 1969). De hecho, el decenso de las poblaciones de halcon peregrino y otras rapaces en Estados Unidos y Europa, en las pasadas decadas, ha sido ciertamente discutido. Hoy se cree que mortalidades directas debidas al uso de dieldrin junto con otros ciclodienos contribuyeron de forma importante (Ratcliffe, 1988; Newton y Hass, 1984). Los niveles de isômeros del hepatacloro ciclohexano encontrados en las muestras analizados son infimos, no siendo detectados por las técnicas empleadas en un gran nümero de muestras. El gamma isomero o lindano tan solo se encontrô en très muestras. La DL50 de este producto no se ha estudiado en especies afines; sin embargo, niveles de 10 pg/g en huevos de faisanes no dieron lugar a alteraciones en las tasas de eclosiôn (Ash y Taylor, 1964). 191 ____________________________________________________ ________________ :________Discusiôn El uso de lindano se ha relacionado con un descenso en los parâmetros reproductivos del ganso del canada y el cemicalo americano en el ârea de Oregon y Washington, efectos que desaparecieron al sustituir este pesticida por heptaclor ( Henny et al, 1984). Los niveles de HCB en las muestras examinadas son ciertamente reducidos. Niveles medios de 0.75 pg/g se han sugerido como posibles causantes de mortalidad embrionaria en el halcôn de las praderas (Falco mexicanus) (Jarman et al, 1996). En gaviotas, niveles entomo a 1.5 pg/g dan lugar a mortalidades embrionarias del 21% (Boersma et al, 1986). En el âguila perdicera los niveles flxeron aproximadamente veinte veces inferiores a los referidos para el halcôn de las paraderas, considerado como muy sensible a los efectos de los organoclorados. Estos resultados indican que posiblemente el HCB, no este implicado en las alteraciones ultraestmcturales detectadas en este estudio. IV .l.2. Bifenilos policlorados Los niveles de bifenilos policlorados determinados en este estudio son bajos. No obstante, résulta dificil conocer las posibles implicaciones de estos compuestos y su relaciôn con otros tôxicos. IV .l.3. Mercurio. El mercurio se ha destacado como el métal mâs relevante causante de disminuciôn de las poblaciones de aves rapaces (Newton, 1979). Los niveles de mercurio detectados en las muestras examinadas, varian en funciôn de la poblaciôn y la localizaciôn. Los valores medios fueron aproximadamente el doble de los referidos para el âguila imperial en 1988 (Gonzalez e Hiraldo, 1988). Los niveles medios en el âguila perdicera fueron similares a los descritos en tejidos de acuâticas en el Parque Nacional de Donana (Gonzalez et al, 1983), sin embargo los niveles minimos fueron inferiores en el âguila perdicera. Cemicalos comunes (Falco tinnunculus), intoxicados mediante consumo de 192 ________ Discusiôn ratones contaminados con metilmercurio, mostraron niveles létales que variaron entre 49 y 122 (pg/g ww) en higado, 39 a 92 (pg/g ww) en rinon, o 20 a 33 (pg/g ww) en cerebro ( Koeman et al, 1971). En el ratonero cola roja americano, niveles en higado entre 18.8 y 20 (pg/g ww) fueron clasificados como létales. Estos niveles se elevan hasta 121 (pg/g ww) en el caso del azor (Accipiter gentilis). Como se puede apreciar, existen diferencias interespecie en la susceptibilidad a la intoxicaciôn por este tipo de compuestos, incluso entre las aves rapaces. Los embriones y polios son mâs susceptibles que las aves adultas, y niveles entre 5.46 y 7.18 pg/g ww se han referido como causantes de mortalidad embrionaria y neonatal en patos (Heinz y Locke, 1976). Niveles entomo a 3 pg/g de materia humeda se ha comprobado que producen lesiones en el cerebro caracteristicas de esta intoxicaciôn en polios de pato negro (Anas mbipres). Los niveles detectados en algunos huevos en el présente estudio se situan entre 1.2 y 1.7, la mitad de los referidos como létales en patos. De nuevo se desconoce la susceptibilidad del âguila perdicera a la intoxicaciôn por este tipo de compuestos, por lo que la interpretaciôn de estos resultados es arriesgada. Los niveles constatados parecen suficientemente elevados como para dar lugar a mortalidad embrionaria o infertilidad. De hecho, los niveles mâximos encontrados corresponden a huevos infertiles y fertiles en los que los embriones fallecieron a edades entre 30 y 35 dias. Desafortunadamente el estado de autolisis de las muestras impidiô la realizaciôn de estudios histopatolôgicos para la detecciôn de las lesiones histopatolôgicas tipicas de la intoxicaciôn. El diagnôstico de este tipo de intoxicaciones es complejo ya que determinados compuestos pueden disminuir los efectos tôxicos del mercurio. Se ha comprobado que los niveles de selenio y zinc protegen frente a la intoxicaciôn por mercurio (Norheim, 1987). Estos metales no fueron analizados en el présente estudio, esperando acometer estos anâlisis en un futuro prôximo. Otro aspecto que 193 ________ Discusiôn complica notablemente la interpretaciôn de los resultados es la cantidad de mercurio que se encuentra como metilmercurio (la forma mâs tôxica), ya que la toxicidad final varia notablemente en funciôn de este aspecto. IV.2. TOXICOS Y ASPECTOS ULTRAESTRUCTURALES DE LA CÂSCARA Y MEMBRANAS TESTÂCEAS El efecto modiflcador de la câscara de los PCBs es menos potente que el producido por el DDE. De hecho, en cemicalos americano^ (Falco sparverius) recibiendo dosis de 10 pg/g de Aroclor 1254 en la dieta, el indice de la cascara no se viô afectado (Lincer, 1972). Sin embargo, el mismo autor encontrô reducciones signifîcativamente superiores en el indice de grosor de la câscara en cemicalos que recibieron una combinacion de Aroclor y DDE, que aquellos que recibieron exclusivamente DDE. Este hallazgo muestra la dificultad de separar estos efectos en datos correspondientes a especies salvajes. En el présenté estudio no se observaron reducciones significativas del grosor de la câscara en huevos con niveles similares de DDE pero difiriendo en los niveles de PCBs. Es necesario tener en cuenta que existen un gran numéro de factores que pueden influir en el resultado final incluyendo diferencias individuals. Tan solo un aumento de la irregularidad en la distribuciôn de las fibras de la membrana extema se ha correlacionado con niveles superiores de PCBs en el présente estudio. Un importante numéro de estudios expérimentales han revelado que el metil mercurio puede interferir en la formaciôn de la câscara (Heinz, 1979; Lundholm, 1987b). Este métal, al igual que el cadmio y el aluminio parecen dar lugar a una disminuciôn del grosor de la câscara (Lundholm y Mathson, 1986). En el caso del mercurio, el mecanismo no es bien conocido, si bien las investigaciones realizadas por Lundholm indican que sus efectos sobre el metabolismo del calcio y la sintesis de prostaglandinas varian en funciôn del 194 ________Discusiôn compuesto de mercurio y la dosis. En cualquier caso, dichos efectos son diferentes a los producidos por el DDE. El metil mercurio estimula la sintesis de PGp2a y PGE2 en la mucosa de la glândula de la câscara mientras que el cloruro de mercurio solo estimula la sintesis de la segunda. La administraciôn reiterada de metil mercurio reduce la disponibilidad de calcio en la glandula coquilaria. Esto es posible que se deba a una disminuciôn de la absorciôn del calcio a nivel intestinal o de la movilizaciôn de este a partir del hueso medular (Lundholm, 1995). Las reducciones en el grosor de la câscara en patos intoxicados con 1 mg de metil mercurio alcanzaron el 13% en administraciones crônicas (50 disas). Esta reducciôn, contrariamente a lo que sucede con el DDE, tambien se produjo en polios (Lundholm, 1995). En el caso de administraciones crônicas de metil mercurio, aparecen defectos en la câscara consistentes en superficie rugosa con indentaciones, sin que se alteren los niveles de calcio y prostaglandinas en la mucosa de la glândula de la câscara. En el caso del aguila perdicera no se han detectado alteraciones significativas del grosor total o de cada una de las capas de la câscara en relaciôn con los niveles de mercurio detectados en el présente estudio. Tampoco se observô excesiva rugosidad en la câscara. Por el contrario, se aprecio un aumento signiflcativo del ârea porosa y el numéro de poros, no existiendo informaciôn sobre este aspecto en la bibliografïa. Las reducciones significativas en el indice de la câscara descritas por otros autores estan relacionadas con la disminuciôn en el grosor total de la câscara, si bien no es descartable que el aumento en la porosidad pueda estar contribuyendo a la misma. Al margen de los efectos sobre el calcio y la câscara en particular, el mercurio da lugar a una reducciôn en el tamano de la puesta e incluso a un cese de la misma (Hill y Shaffner, 1976). Clark et al (1985) han apuntado que el metil mercurio disminuye los niveles de estrôgenos y progesterona en plasma. En este sentido, los niveles encontrados en contenido de huevos reflejan de algun modo la 195 ________ Discusiôn posible problemâtica en los adultos. En estos ültimos, el mercurio podria estar ejerciendo una acciôn importante sobre el ciclo reproductor como consecuencia de su efecto sobre estas hormonas. Las especies de aves piscivoras tienen un mayor riesgo de alcanzar niveles importantes de mercurio. En el caso del âguila imperial, se ha observado que las poblaciones mâs omitôfagas poseen niveles superiores a las demâs, si bien las diferencias no son signicativas (Delives, 1978). Esta podria ser una de las explicaciones para un mayor acumulo de este métal en el âguila perdicera en comparaciôn con el âguila imperial, ya que la dieta de la primera cubre un espectro mâs amplio de presas, incluyendo aves. V. DOCUMENTACION DE ESTADIOS EMBRIONARIOS Y SU RELACIÔN CON PARÂMETROS ULTRAESTRUCTURALES V .l. CAUSAS DE POSIBLES ANOMALIAS EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO DETECTADAS EN EL AGUILA PERDICERA El ambiente que rodea al embriôn influye notablemente en su desarrollo. El embriôn requiere un intercambio gaseoso que se realiza a traves de los poros de la câscara, por lo que alteraciones en estos parâmetros pueden influir en el desarrollo embrionario. No obstante, Simkiss (1980) ha sugerido que el embriôn es capaz de adaptarse a estos cambios. El desarrollo embrionario puede verse afectado directa o indirectamente por diferentes factores incluyendo tôxicos ambientales, agentes infecciosos, o factores nutricionales. Estos pueden afectar directamente al embriôn como consecuencia de su presencia en el interior del huevo y por tanto en las fuentes de alimentaciôn del 196 ____________________________________________________ ;________ Discusiôn embriôn en desarrollo, o bien de forma indirecta como consecuencia de la alteraciôn de la estructura de la câscara. El primero de los casos anômalos examinados en este estudio consistio en un embriôn que presento braquipnatia y asimetria afectando a las alas, apareciendo el ala derecha con un mayor desarrollo que el miembro contrario. El peso del embriôn es similar al peso de referenda para un embriôn de 28 dias, sin embargo, la medida del antebrazo es signifîcativamente inferior (22%) a la normal para esa edad. Del mismo modo, las dimensiones- de la cabeza fueron muy superiores a las habituales. La causa es desconocida, si bien el acumulo de ciertos tôxicos como el mercurio (Heinz y Locke, 1976) se ha referido como muy embriotoxico en patos a concentraciones tisulares entre 5.46 y 7.48 ppm. Entre los tôxicos habituales, el selenio destaca por su enorme poder teratogénico causando mortalidad embrionaria y anomalias en el desarrollo (Heinz et al, 1989). La reducciôn en la longitud de los miembros se ha descrito en intoxicacions por Aldicarb (Chambers et al, 1989) cuando este se aplica o inyecta directamente en el huevo, habiendose referido reducciones de un 8% en la longitud del tarsometatarso en comparaciôn con los contrôles. En el caso detectado en la poblaciôn de âguila perdicera la longitud del antebrazo se redujo en un 11%. En los otros très casos los hallazgos de necropsia incluyen la presencia de petequias, hemorragias, serositis, ...etc, todos ellos apuntan a la posibilidad de que se trate de casos de penetraciôn de agentes infecciosos en el huevo. En los très casos se aislo E. coli acompanado, en dos de ellos, por Pseudomonas spp y Proteus spp. En ninguno de los casos se aislô Salmonella spp. Dado el grado de autolisis observado y el tiempo trascurrido hasta la recolecciôn de los huevos, los hallazgos microbiolôgicos son sôlo indicativos, y no es posible discemir si fue alguno de estos microorganismos el causante del proceso. La presencia de caquecs ia y petequias en el embriôn se correlacionan positivamente con los hallazgos habituales en infecciones por E. coli. 197 ____________________________________________________________ :_Discusiôn Las muertes embrinarias ocasionadas por agentes infecciosos suelen acontecer durante el ultimo periodo de desarrollo del embriôn ( Clubb y Philips, 1992). Determinadas bacterias pueden penetrar en el huevo a través de los poros de la câscara, ya que su diâmetro es inferior al de estos, y atraviesan fâcilmente la membrana. Este paso se ve facilitado por la presencia de agua en la câscara y los cambios de temperatura. Algunos autores han sugerido que la calidad de la câscara, medida en funciôn de la gravedad especifîca, es un factor importante a la hora de limitar la contaminaciôn bacteriana; argumentando que los huevos con menor gravedad especifîca son mâs susceptibles a la penetraciôn (Sauter y Peterson, 1974). En 1998, Berrang et al demostraron que, en el caso de Salmonella, no existe relaciôn entre las posibilidades de penetraciôn y la gravidez especifîca, la conductancia o el peso del huevo. Recientemente, los estudios del mismo autor indican que tras el anâlisis de membranas testâceas no se ha encontrado relaciôn entre el ârea interfîbrilar de estas y la posibilidad de penetraciôn de la Salmonella. En los casos de afecciôn del embriôn en el âguila perdicera, estos parâmetros permanecieron dentro de los rangos habituales para la especie. Esto sugiere que, tal y como se ha descrito en la gallina, existen otros factores implicados en este fenômeno. En todos los huevos que presentaron esta problemâtica la presencia de cuticula fue anecdôtica, sugiriendo que la reducciôn en el grosor de la misma pueda ser un factor condicionante. Las vesiculas detectadas fundamentalmente en las membranas testâceas extemas e internas, por su morfologia y tamano es posible que se trate de bacterias. Estas se encuentran présentes en todos los casos en los que se ha producido muerte embrionaria. No obstante, cabe la posibilidad de que la presencia de estas sea producto de una contaminaciôn posterior al periodo de incubaciôn. El estudio estadistico oportuno mediante el rango de correlaciones de Spearman y Pearson, refiere una correlaciôn significativa (p=0.04) entre la 198 ________ Discusiôn presencia de vesiculas y la muerte embrionaria. Sin embargo, no se relaciona con otras variables como el grado de cristalizaciôn, la distribuciôn de las fibras, o la distribuciôn, forma y tamano de los cuerpos mamilares. V.2. DESARROLO EMBRIONARIO Y PARÂMETROS ULTRAESTRUCTURALES DE LA CÂSCARA La correlaciôn negativa existente entre el numéro de vesiculas en las membranas testâceas y la edad alcanzada por el embriôn sugiere pueden ser un factor limitante en el desarrollo del mismo. Con independencia de la naturaleza y composiciôn de estas formaciones, su presencia o su causa primaria pueden incidir de forma negativa en el desarrollo del embriôn. Las muertes embrionarias por contaminaciones bacerianas suelen suceder en los ültimos estadios de desarrollo del embriôn, si bien pueden acontecer durante todo el desarrollo del mismo. La variaciôn en el periodo de incubaciôn se ha demostrado que es heredable en el polio (Crittenden and Bohren, 1961). Sin embargo, la influencia genética en el desarrollo embrionario es mâs dificil de demostrar. En general el descenso en la tasa relativa de crecimiento de un embriôn en funciôn del incremento en su tamano es una expresiôn del desarrollo (Ricklefs, 1987). En el caso del âguila perdicera, los embriones procedentes de huevos mâs grandes alcanzaron tambien pesos superiores tras los mismos dias de incubaciôn. En estos casos se observô que en los embriones de menor peso, sin embargo poseen extremidades mâs largas lo que indica que su desarrollo es posiblemente mâs râpido. Este fenômeno se ha observado en estadios muy primarios lo que puede indicar que el embriôn es capaz de modificar su crecimiento en funciôn del ambiente que le rodea como ha sugerido Ricklefs (1987). La ausencia de cuticula puede también estar relacionada con la ausencia de pigmento. 199 ________Discusiôn En ausencia de cuticula las bacterias pueden penetrar desde la supeflcie de la câscara con independencia del numéro de poros dando lugar a modifîcaciones estructurales en la capa de los cuerpos mamilares (Nascimento et al, 1992). Factores distintos a la conductividad y gravedad especifîca del huevo estan implicados en la penetraciôn de salmonella a través de la câscara (Berrang et al, 1998). Del mismo modo, la densidad y el espacio entre fibras de la membrana extema no estan relacionados con la capacidad de penetraciôn de la Salmonella. V.3. TIEMPO DE INCUBACIÔN Y DESARROLLO EMBRIONARIO La câscara es una importante fuente de calcio para el embriôn en formaciôn (Romanoff y Romanoff, 1949). En la gallina el grosor de la câscara disminuye un 5% como consecuencia de la incubaciôn (Simkiss, 1967). En la codomiz este porcentaje aumenta hasta el 7%, mientras que en algunas especies silvestres como el pelicano (Pelecanus occidentalis)(Anderson y Hickey, 1970), o diversas especies de garzas (Ohlendorf et al, 1979; Laporte, 1982) no se han encontrado diferencias significativas. Én aves rapaces se han registrados diferencias importantes: en la lechuza tanto el grosor como el indice de grosor son signifîcativamente menores en huevos incubados. En el cemicalo americano hay diferencias significativas en el grosor de diferentes estadios de desarrollo, pero el indice no varia. En el “screech owf'(Otus asio) americano, ninguno de los dos parâmetros varia signifîcativamente. En el caso del âguila perdicera tampoco se encontraron variaciones significativas. Hoy sabemos que engeneral las especies precociales no sôlo tienen un espesor superior de la câscara, sino que ademâas, la disminuciôn del grosor de la câscara es muy superior. For el contrario, en las especies altriciales como el âguila perdicera no ocurre de la misma manera. Las diferencias con las otras rapaces quiza puedan deberse al tamano. 200 ________ Discusiôn Es importante resenar que si bien la reducciôn no es significativa, si se aprecia un cambio en la morfologia de las mamilas en los huevos incubados a término y eclosionados. En estos casos las mamilas aparecen planas con mayor frecuencia indicando las zonas de probable resorciôn. 201 CONCLUSIONES 202 Conclusiones 1- La cascara del aguila perdicera cuenta con cuticula y areas de mayor y menor densidad de poros, siendo la superficie de intercambio gaseoso definida por estos inferior en la poblaciôn Castellana. Ocasionalmente, se observan anomalias como estrias lineales, fracturas radiales y material amorfo obstruyendo los poros. 2- La capa de cristalizaciôn extema se caracteriza su grosor irregular presentando canales rectilineos que convergen en cônicos o infundibulares, que desembocan en una capa de empalizada con grosor similar al del aguila imperial. La poblaciôn castellana no présenta banda de estrato amorfo dentro de esta capa a diferencia de la poblaciôn del Algarve, lo que reduce un 15% el grosor total de la primera. 3- La relaciôn entre el grosor de la capa mamilar y el total es inferior en el aguila perdicera comparado con el aguila imperial y real. El numéro y area de mamilas y nücleos mamilares es inferior en las poblaciones Castellano- Manchegas y del Duero en comparaciôn con el Algarve portugués, y se relaciona con la presencia de multinucleaciôn. 4- El grosor total de las membranas testâceas oscila entre 120 y 141 pm. La distribuciôn de las fibras es regular y bifurcada, no entrelazândose. Se aposicionan en multiples capas, aumentando su densidad y disminuyendo su grosor segun se avanza hacia el interior. 5- El mayor grosor total de la câscara se correlaciona significativamente con el grosor de la capa de cristalizaciôn extema, el numéro total de poros por unidad de superficie y el ârea total de intercambio gaseoso. 203 Conclusiones 6- Cuanto mejor es el grado de cristalizaciôn de la capa de cristalizaciôn extema mayor es el indice de fertilidad y menor es la incidencia de fracturas radiales. 7- El mayor numéro de mamilas se correlaciona con; el numéro de poros, el ârea mamilar al corte, y un mayor diâmetro de las fibras de la membrana extema con menor densidad de las mismas. 8- Una mayor superficie de los nücleos mamilares se corresponde con un mayor nümero de mamilas, pero una reducciôn en el nümero de fibras. Mayor nümero de nücleos conlleva un aumento de porosidad y grosor de la câscara. Por el contrario, la fusiôn de fibras reduce los nücleos y el grosor de la capa mamilar. 9- La distribuciôn irregular de las mamilas se correlaciona significativamente con un menor nümero de las mismas acompanado por un aumento del ârea entre ellas. 10-La presencia de vesiculas en las membranas y capa de empalizada se relaciona significativamente con una mayor irregularidad de las fibras. El espesor medio de la membrana interna es el ünico parâmetro relacionado con la muerte embrionaria por causas infecciosas. 11-En el 75% de los casos en los que se detectô material amorfo obstruyendo los poros se constatô muerte embrionaria, oscilando entre los 8 y 25 dias de desarrollo del embriôn. 12-Los parâmetros con un menor rango de variaciôn en muestras procedentes del mismo individuo son el ârea mamilar y la distancia entre mamilas. 204 RESUMEN 205 Resumen En el presente trabajo, hemos investigado las caracteristicas ultraestructurales normales y alteraciones de la cascara y membranas testâceas en el huevo del âguila perdicera (Hieraaetus fasciatus). Hemos establecido la variaciôn de estos parâmetros morfolôgicos de referencia, en funciôn de factores: Fisiolôgicos, individuales y geogrâficos. Utilizando el embriôn y su desarrollo como bioindicadores, estudiamos el grado de correlaciôn de los hallazgos ecotoxicolôgicos, con la presencia y magnitud de las alteraciones ultraestructurales, elaborando hipôtesis. Un total de 52 muestras de câscara correspondientes al periodo 1997-1999, procedentes de très poblaciones: Castilla - La Mancha, Algarve y Arribes del Duero fueron procesadas y analizadas mediante microscopia electrônica de barrido. Los niveles de mercurio, organoclorados y PCBs en embriones, se determinaron mediante espectrofotometria de absorciôn atômica de vapor frio en el primer caso, y cromatografïa de gases y captura de electrones en los dos ültimos. La superficie extema de la câscara se caracteriza por una cuticula y âreas de diferente densidad de poros irregularmente distribuidas. El grosor de la capa de cristalizaciôn extema es irregular siendo surcada por canales rectilineos que convergen en infundibulares. El grosor de la capa de empalizada es proporcionalmente superior en comparaciôn con otras especies de âguila, ocurriendo lo contrario con la capa mamilar. Las fibras de las membranas testâceas son bifurcadas y no se entrelazan sino que se aposicionan, aumentando en densidad y disminuyendo en grosor segün se profundiza. El aumento del grosor total de la câscara, se relaciona con un aumento de la superficie total de intercambio gaseoso. La presencia del fenômeno de fusiôn de fibras da lugar a una disminuciôn de ârea de nucleaciôn, con un patrôn irregular en la distribuciôn de mamilas y un aumento del ârea entre las mismas. Estos aspectos pueden estar contribuyendo notablemente al aumento de la fragilidad de la câscara. Los parâmetros con menor variaciôn individual son el ârea mamilar y la distancia entre mamilas. El estudio comparativo entre poblaciones indica que el nümero y ârea de poros, el grosor de la capa de empalizada, y el nümero y ârea de mamilas y nücleos son inferiores en la poblaciôn Castellana, pudiendo estar relacionado con niveles superiores de DDE y Dieldrin. La reducciôn en longitud y grosor del huevo, se relaciona con contenidos elevados en mercurio présentés en esta poblaciôn, suflcientes para producir muerte embrionaria. Estos niveles se correlacionan con alteraciones en la morfologia y distribuciôn de las fibras y de las mamilas, lo que pudiera contribuir a un aumento de la fragilidad de la câscara. Los 206 ________Resumen niveles de mercurio y PCBs estan relacionados, mientras que el contenido en DDE correlaciona significativamente y negativamente con la fertilidad. La presencia de vesiculas en membranas y capa de empalizada se acompana de alteraciones morfolôgicas, pudiendo ser un proceso de etiologia bacteriana, de elevada incidencia en la poblaciôn del Algarve. 207 SUMMARY 208 Summary Study focuses on ultraestructural characteristics o f Bonelli's eagle (Hieraaetus fasciatus) eggshell and membranes, through the establishment of reference values and their variation according to physiological, individual and geographical factors, and the description of morphological abnormalities. The presence and magnitude o f the latest have been correlated to toxicological findings using embryo tissues as bioindicators, and hypothesis raised. A total of 52 eggshell samples, collected from 1997 to 1999 and corresponding to tree different populations: Castilla - La Mancha, Algarve y Arribes del Duero were processed and analysed using Scanning Electron Microscopy. Mercury, PCBs and organochlorinated pesticides levels were determined using cold vapour atomic absortion spectrophotometry, and gas chromatography and electron capture respectively. Areas that differ in pore density are irregularly distributed on the external surface. The external crystalline layer is crossed by perpendicular channels that converge into infundibular. Palisade layer thickness is comparatively superior to other eagle species, while the opposite is observed in the mamilary layer. Fibres are bifurcated and do not cross-link, but get apositioned increasing density and decreasing thickness deeper into the membranes. Increases in eggshell thickness significantly correlate to increments in gas exchange area. Fusion of fibres may lead to a more fragile eggshell, with a decrease in nucléation area, irregular mamilar distribution, and decreased area. Mamilae area and distance between them are subjected to minimal individual variation. The Castillian population showed decreassed number of pores, palisade thickness, and area and number of mamilae and mamilary knobs, in relation to higher levels of DDE and Dieldrin. Mercury levels, high enough to cause embryo mortality in this population, significantly correlates with decreased egg length and diameter. PCBs and mercury levels positively correlates and could contribute to enhanced fragility through changes of the morphology and distribution of fibres. DDE levels significantly and positively correlate with fertility. Presence of vesicles located between fibres, and in the palisade layer could be o f bacterial origin with a highest incidence in the Algarve population. 209 BIBLIOGRAFIA 210 Bibliografia ALBANIS T.A., HELA D., PAPAKOSTAS G. y GOUTNER V. (1996). Concentration and bioaccumulation of organochlorine pesticide residues in herons and their prey in wetlands of Thermaikos Gulf, Macedonia, Greece. Sci. Total Environ. 182: 11-19. 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Grosor minimo de la capa de cristalizaciôn extema (G min ccext), grosor mâximo de la capa de empalizada (G max cemp), grosor de la capa mamilar (G cmam), ârea entre mamilas (Aem), ârea de la capa de cristalizaciôn extema (Ccext), ârea de la capa de empalizada (Cempal), ârea de la capa mamilar (Cmam), grosor mâximo de la capa de cristalizaciôn extema (G max Ccext), ângulo de orientaciôn de las columnas romboedricas (Orienta coin), grosor minimo de la capa de empalizada ( G min cemp). Magnificaciôn 150 X. FIGURA 2. Secciôn transversal de la câscara del âguila perdicera. Magnificaciôn 150 X. FIGURA 2a. Detalle de los canales con apertura en poros de superficie en un detalle de la capa de cristalizaciôn extema. Tomada de la Figura 2. m m % f i É FIGURA 3. Imagen de la superficie extema de la câscara. Ârea de baja densidad de poros. Magnificaciôn lOOX. FIGURA 3a. Detalle a mayores aumentos de la tomada de la Figura 3. FIGURA 3b. Aspecto de la superficie extema de la câscara. Tomada de la Figura 3. FIGURA 4. Microfotografia tomada como modelo para el câlculo de magnitudes en la superficie interna de la câscara o base de la capa mamilar. Imagen representativa para el estudio del ârea delimitada entre mamilas (A intermam) y distancia entre nùcleos mamilares (Dist entre Nue). Magnificaciôn 150 X. FIGURA 4a. Detalle de la superficie interna de la capa mamilar mostrando detalles del câlculo del ârea mamilar (Am) y el ârea de nùcleos mamilares (Nùcleos). Tomada de la Figura 4 v>*Ç-v mm 1 FIGURA 5. Columnas romboédricas en la capa de empalizada. Magnificaciôn 750 X. FIGURA 5a y 5b. Detalle de las areas de mayor y menor numéro de vesiculas en la capa de empalizada. Tomada de la Figura 5 FIGURA 6. Imagen tomada como modelo para las medidas realizadas en la secciôn transversal de las membranas testâceas extema e intema. Magnificaciôn 500 X. ma ï 1 i m % ' S FIGURA 7. Microfotografia mediante microscopia electrônica de barrido de la superficie extema de la membrana testâcea extema. Magnificaciôn 1000 X.ô FIGURA 7a. Detalle del diâmetro extemo de las fibras de la membrana testâcea extema, tomada de la Figura 7. FIGURA 8. Microfotografia con microscopia electrônica de barrido de la superficie extema de la membrana testâcea intema. Magnificaciôn 1000 X. FIGURA 8a. Detalle del diâmetro extemo de las fibras de la membrana testâcea intema, tomada de la Figura 8. h i I n m FIGURA 9. Capa albuginea o de cemento albuminoso ligada a la membrana testâcea intema del âguila perdicera. Magnificaciôn 1000 X. FIGURA 10. Morfologia de los canales que atraviesan la câscara en el âguila perdicera. Magnificaciôn 150 X. FIGURA 10a. Detalle de la porciôn cônica mas extema, a nivel de la capa de cristalizaciôn extema, de los canales que atraviesan la, tomada de la Figura anterior. FIGURA 11. Zona de uniôn de los cuerpos mamilares con la superficie extema de la membrana testâcea extema. Magnificaciôn 500 X. FIGURA 12. Presencia de material amorfo obstmyendo los poros situado en la superficie extema de la câscara. Magnificaciôn 100 X. FIGURA 12a. Detalle a mayores aumentos tomado de la figura anterior. ■i %: m r n m FIGURAS 13 y 14. Magnitudes que mantienen una constancia significativa en secciones transversales de câscaras correspondientes a distintos huevos de un mismo individuo. Magnificaciôn 150 X. FIGURAS 15 y 16. Deatalle de la distancia entre mamilas en la superficie intema de câscaras con distribuciôn regular e irregular de las mismas. R f* - 1 3 FIGURA 17. Fusion de fibras afectando a la membrana extema de la câscara en huevos con niveles elevados de DDE. Magnificaciôn 1000 X. FIGURA 17 a. Detalle a mayores aumentos tomado de la figura anterior. FIGURA 18. Superficie intema de la capa mamilar en la que se aprecia la presencia de una fisura en la base de las mamilas en una muestra que presentaba niveles elevados de Dieldrin y DDE. FIGURA 19. Aumento significative del numéro de poros en la superficie extema de la câscara en un huevo con niveles elevados de mercurio. Magnificaciôn 100 X. W à n n (% FIGURAS 20 y 21. Disminuciôn significativa del ârea de nucleacion en câscaras correspondientes a huevos con niveles elevados de dieldrin (20) en comparaciôn con câscaras normales (21). Magnificaciôn 150 X.. FIGURA 22. Distribuciôn irregular de las fibras de la membrana extema en huevos con contenidos elevados de mercurio. Magnificaciôn 1000 X. FIGURAS 23 Y 24. Presencia de multinucleaciôn (24) afectando a las mamilas en la superficie intema de algunas muestras procedentes de la poblaciôn castellana, en comparaciôn con la ausencia de este fenômeno (23) en la poblaciôn de Algarve. Magnificaciôn 150 y 100 X respectivamente. FIGURAS 25 y 26. Detalle de la presencia masiva de formaciones globulares présentes en la membrana testâcea extema de la câscara en muestras correspondientes a la poblaciôn del Algarve (26), en comparaciôn con la ausencia general de estas estmcturas en la poblaciôn castellana (25). FIGURAS 27 Y 28. Aumento significativo del numéro de poros a nivel de la superficie extema de la câscara en muestras correspondientes a la poblaciôn Castellano-Manchega (28), en comparaciôn con muestras control de la misma poblaciôn (27). Magnificaciôn 150 X. SiVvW- g Emm FIGURAS 29 y 30. Aumento del espacio entre bases de las mamilas en muestras correspondientes a la poblaciôn del Duero (29) en comparaciôn con câscaras control de la poblaciôn castellana (30). Magnificaciôn 150 X. FIGURAS 31, 31a, 32 y 32a.. Disminuciôn del numéro de vesiculas présentés tanto en el ârea minima (32^), como en el ârea mâxima en la poblaciôn Castellano- Manchega (32), en relaciôn con los mismos parâmetros en câscaras control de la poblaciôn del Algarve (31 y 31a). FIGURAS 33 y 34. Disminuciôn significativa del grosor de la capa de empalizada en muestras correspondientes a la poblaciôn castellana (33) en comparaciôn con las muestras de la poblaciôn del Algarve (34). Magnificaciôn 150 X. m . èti FIGURAS 35, 35a, 36 y 36a. Variaciones individuales en el grosor de las fibras de la membrana extema de la câscara de etiologia desconocida. Magnificaciôn 150 X. FIGURAS 37, 37% 38 y 38a. Presencia y grosor mâximo de la cristalizaciôn amorfa a nivel de la base de la capa de empalizada en muestras procedentes de la poblaciôn del Algarve portugués (37 y 37a), en comparaciôn con la ausencia de esta capa o formas vestigiales en la poblaciôn Castellano-Manchega (38 y 38a). Magnificaciôn 150 X. FIGURAS 39, 39% 40 y 40a. Diferentes grados de adherencia de la membrana extema de la câscara a la capa mamilar. Mâximo (39 y 39a) y minimo (40 y 40a), con ausencia de restos de membrana ligada a la base de la mamila. Magnificaciôn 150 X. FIGURAS 4 1 ,41a, 42 y 42a. Variaciôn en cuanto a la morfologia de las mamilas: de cônicas (41 y 41a) a planas (42 y 42a). FIGURAS 43 Y 44. Variaciôn individual en el numéro de poros a nivel de la superficie extema de la câscara. Magnificaciôn 100 y 150 X. FIGURAS 45, 45a , 46 y 46a. Variaciones individuales en el grado de cristalizaciôn: correcte (45 y 45a) y déficiente (46 y 46a). Magnificaciôn 150 X. i FIGURA 47. Presencia de estmcturas globulares en las membranas testâceas correspondientes a muestras procedentes de la region de Algarve. Magnificaciôn 1000 X. FIGURA 47a. Detalle de las estmcturas globulares présentes en las membranas testâceas correspondientes a muestras procedentes de la regiôn de Algarv^e. Tomada de la Figura 47. FIGURA 48. Presencia extensa de formaciones globulares extendiéndose por la capa de empalizada y en relaciôn con la presencia de la capa adicional en la base de la misma, en un caso extremo detectado en el Algarve portugués. Magnificaciôn 1000 X. FIGURA 48a. Detalle de las formaciones globulares extendiéndose por la capa de empalizada y en relaciôn con la presencia de la capa adicional en la base de la misma, en un caso extremo detectado en el Algarve portugués. Tomada de la Figura 48. FIGURA 49 y 49a. Fusiôn de fibras afectando a muestras procedentes de la poblaciôn castellano manchega en las que se detectaron niveles elevados de mercurio. Magnificaciôn 1000 X. Detalle de la fusiôn (49a). ¥ m FIGURAS 50. Fenômeno de multinucleacion. FIGURA 51. Distribuciôn anômala de mamilas con aumento del espacio intermamilar. FIGURA 52. Esferolitos présentes en la superficie extema de la câscara. A in tm a H Fim - % S 1 6 7 ^ 0 K M , v FIGURAS 53 a 60 inclusives. Embriones de âguila perdicera de 5, 7,8-9, 11-12, 15, 28-29, 33-35,38-39 dias de edad respect!vamente. ççrv n i i i i i i i i i i i ? I 1 11 j i i ^ i i i i i i l i in im uiT ( t ; { I I I I 1 1 ; i l l i I I I I F58 • OI / I n I OI Ol 7!l \ R ' II) 7 1 0 ^r^ 1/1 FIGURA 61. Embriôn de âguila perdicera mostrando asimetria de extremidades. FIGURA 62. Embriôn de âguila perdicera mostrando petequias como resultado de un proceso septicémico de etiologia bacteriana.