REPLICACION DEL PLASMIDO DE AMPLIO ESPECTRO DE HUESPED pLSJ. UNIVERSIDAD COMPLUTENSE Memoriaparaoptar al grado de Doctor en CienciasBiológicas quepresentala Licenciada Gloria del Solar Dongil UniversidadComplutense Julio de 1991. El autor: ¡ <1 Gloria del Solar de Madrid, el director del trabajo: ManuelEspinosaPadrón, Profesorde Investigación, Centrode Investigaciones]3iológicas(CSIC) II ‘4 ‘ni t0 MANUEL ESPINOSA PADRON, Profesorde Investigacióndel ConsejoSuperiorde InvestigacionesCientíficas CERTIFICA que, el presentetrabajo, realizadoporGLORIA DEL SOLAR DONGIL paraoptaral Grado de Doctor en Ciencias Biológicas y titulado “REPLICACION DEL PLASMIDO DE AMPLIO ESPECTRODE HUESPED pLS 1’, ha sido realizadobajo su direcciónen el Centrode InvestigacionesBiológicas del C.S.I.C. Y paraque conste,sc extiendeel presentecertificado en Madrid, a seis de Septiembre de mil novecientosnoventay uno. 1 a Raquely a Julio AGRADECIMIENTOS Este trabajose ha llevado a cabo en el Centrode InvestigacionesBiológicas, en el laboratoriode ManuelEspinosa,quien ademásde jefey amigo es el otro culpable directo de la realizaciónde estaTesis. Agradezcoal Dr. Julian Pererael haberaceptado,sin rechistar,serponente de estaTesis. Mi más profundo, sincero y eterno agradecimientoa Maite Alda, Pedro Valiente y RemediosGalán,por su ayudatécnica,moral y nutricional. Asimismo doy las gracias: A Belén Peral,por la construccióndel plásmido pLS5copll y por el estímulo que significaba su apremiantepregunta“¿y qué has averiguadohoy?, formuladacasi a diario. A TheodoraCholi, por haber secuenciado RepA.A RamónDíaz, que me inició enel ‘mundillo’ de la replicaciónin vitro. A Dusko Ehrlich, por habermeacogido en su laboratorio para aprenderla preparacionde las monocadenas.A Aurelio Hurtado,el excelentedibujantede estaCasa,capazdeconvertir un gel mediocreen una obra de arte (sin retocar mucho las bandas,¡claro!). A los miembrosdel EquipoTécnicodel CIB, porel mantenimientode los aparatosy el arreglo de los que se empeñabanen dejar de funcionar, a vecesa horasintempestivasde la madrugada.A mis compañeros,por el tiempo “gastado” en fructíferas discusiones.A Carlota,que pusolos puntossobrelas íes, y tambiénel resto de las letrassobrelos folios que le iba introduciendo. Finalmente,quierohacerunamenciónespeciala Pabloporsu ayuda,cuidados y desvelosdurantetodos estos años.Sin pretenderlo,él ha logrado ser, sin duda, el abogadomás expertoen técnicasde “ingeniería genética”. INDICE INTRODUCCION. - Modelos de replicación. - Control de la replicación. - El plásmido pMV158. - Objetivo de la Tesis. MATERIALES. 1. ESTIRPESBACTERIANAS Y PLASMIDOS. 2. MEDIOS DE CULTIVO. 2.1. Medio de cultivo de S.pneurnoniae. 2.2. Medios de cultivo de B.subtilis. 2.3. Medios de cultivo de E cotí. 3. TAMPONES Y SOLUCIONES. 4. ENZIMAS Y OTRAS PROTEINAS. 5. MATERIAL FOTOGRAFICOY DE AUTORRADIOGRAFIA 6. OTROS PRODUCTOS. METODOS. 1. CONSERVACION DE LAS ESTIRPES. 2. CONDICIONES DE CULTIVO. 3. PUESTA EN COMPETENCIA Y TRANSFORMACION DE CELULAS BACTERIANAS. 3.1. SJpnewnon¡ae. 3.2. B.subtilis. 3.3. E.coli. 4. DETERMINACION DEL NUMERO DE COPIAS PLASMIDICO. 4.1. Determinacionesdensitométricas. 4.2. Marcaje de DNA tota] itt VIVO. 1 2 5 15 18 21 21 24 24 25 27 28 29 29 30 31 31 31 32 32 32 34 34 34 35 5. TESTSDE ESTABILIDAD. 6. TESTSDE INCOMPATIBILIDAD. 7. PREPARACIONESDE DNA. 7.1. Extractoscrudoscelulares. 7.2. Minipreparacionesplasmídicas. 7.3. Preparacióndeplásmidospuros. 7.4. Valoración del DNA. 8. FENOLIZACION, PRECIPITACION Y DIALISIS DEL DNA. 9. MANIPULACION ENZIMATICA DEL DNA. 9.1. 9.2. 9.3. 9.4. 9.5. 9.6. Digestióncon endonucleasasde restricción. Eliminación de extensionesprotuberantes. Rellenode extremos3’ recesivosmediantePol 1K. Digestióncon nucleasaBAL31. Ligación de fragmentosde DNA. Detecciónde sitios sensiblesa nucleasaSí en DNA superenrollado. 10.ELECTROFORESISDE ACIDOS NUCLEICOS. 10.1. 10.2. 10.3. 10.4. Electroforesisen gelesde agarosa. Electroforesisengelesde PAA (PAGE). Electroforesisen gelesde secuenciación. Electroforesisen gelesparala separaciónde cadenas. 11.EXTRACCION DE FRAGMENTOSDE DNA A PARTIR DE GELES. 11.1. 11.2. 11.3. Utilización de membranasde DEAE-celulosa. Utilización de “Geneclean”. Elución a partir de PAA. 12. MARCAJE RADIACTIVO DE DNA. 12.1. Marcajeen 5’ con polinucícótidoquinasa. 12.2. Marcajeen 3’ con Pol 1K. 12.3. Marcajede DNA al azarpor el método de extensiónde cebadores. 13.DENSITOMETRIA. 14.SECUENCIACIONDE DNA POREL METODO DE DEGRADACION QUíMICA. 15. DETECCIONDE FORMAS PLASMIDICAS MONOCATENARIAS. 16. REPLICACION IN VITRODE DNA DE PLASMIDOS. 17.FLUOROGRAFIA. 17.1. Fluorograffade gelesde agarosa. 17.2. Fluorografíade gelesde PAA. 3.7 38 39 39 40 40 42 42 43 43 44 44 45 45 46 46 46 4.7 47 48 49 49 49 50 50 50 51 51 52 52 54 57 61 61 61 18. DETERMINACION DE LOS PUNTOS DE INICIACION DE mRNAs MEDIANTE MAYEO CON NUCLEASA 51. 62 19. SINTESISDE PROTEíNASPLASMIDICAS EN MINICELULAS DE B.SUBTJL.JS. 64 20.HIPEREXPRESIONDE GENESBAJO EL CONTROL DEL PROMOTOR440 DEL FAGO VP. 65 21.CROMATOGRAFíA DE PROTEíNAS. 69 21.1. Filtración en gel. 69 21.2. Cromatografíade intercambioiónico. 70 21.3. Cromatografíade afinidad. 70 22. DETERMINACION DE LA CONFIGURACIONNATIVA DE PROTEíNAS. 71 22.1. Centrifugaciónanalíticaen gradientede glicerol. 71 22.2. Filtración en gel. 71 23.ELECTROFORESISDE PROTEíNAS. 72 23.1. Preparaciónde las muestrasparaelectroforesis. 72 23.2. Gelesde PAA/SDS. 72 23.3. Gelesde PAA/SDS/urea. 73 23.4. Gelesde P\Éx/SDScon DNA en Ja matriz. 73 24. VALORACJON DE PROTEíNAS. 74 24.1. Utilización del reactivoBCA. 74 24.2. Densitometríade gelesteñidoscon CBB. 74 24.3. Determinaciónde la concentraciónmolar. 74 25.DETERMINACION DE LA SECUENCIADE AMINOACIDOS DE RepA. 75 26.DETERMINACION DE LA SECUENCIAN-TERMINAL DE RepB 75 27. ANALISIS DE CONTACTOS DNA-PROTEíNA. 75 27.1. Protecciónfrentea la digestióncon DNasa1. 75 27.2. Protecciónfrentea la rotura por radical hidroxilo. 76 28.ENSAYOS DE TRANSCRIPCIONIN VITRO. 77 29.ENSAYOS DE ACTIVIDAD fi-GALACTOSIDASA. 78 30.ANALISIS ASISTIDO CON ORDENADOR. 79 RESULTADOS. 81 71. ESPECTRODE HUESPEDY ESTABILiDAD DEL PLASMIDO pMVI58 Y SUSDERIVADOS. 2. REPLICACION EN EXTRACTOS LIBRES DE CELULAS. - Optimizacióndel sistema. - Característicasdel sistemaen extractosque no contienenpiásmidoendógeno. - Característicasdel sistemaen extractoscon plásmidoendógeno. - Análisis de los productosde reacción. 3. ORIGEN Y DIRECCION DE REPLICACION DE LA CADENA LíDER. - Localizaciónde] sitio de iniciación, y determinaciónde la dirección de replicacióndel DNA de pLS1 en el sistemaiii vitro. - Intermediariosde cadenasencillageneradosdurantela replicacióniii vivo del DNA de pLSl. - Mapeode posiblesestructurassecundariasen el DNA de pLSl. - Análisis de delecióndel origen funcional. 4. EL ORIGEN DE LA CADENA RETRASADA. - Característicasgeneralesdel ori(-) de pLSil. - Localizacióndel ori(-) de pLSi. - Característicasdiferencialesde pLS4. - Característicasde la secuenciade nucleótidosen la región delecionadaen pLS4. 5. CARACTERIZACiON DE LA FUNCION INICIADORA DE LA REPLICACION. - Determinacióndel sitio de iniciación del mRNA repÁB. - Hiperexpresiónde repB. - Purificaciónde RepB. - Determinacióndel extremoN-terminal de RepB del codónde iniciación de repB. - Actividad enzimáticade RepB. 81 85 85 90 92 94 98 98 101 107 113 117 117 120 1.20 125 129 131 134 141 pura e identificación 148 150 6. REGULACiON TRANSCRIPCiONALDE repB: LA PROTEíNA RepA. - Síntesise identificaciónde RepA en minicélulas y en el sistemade expresiónde E.coli. - Purificación de RepA. - Secuenciade aminoácidosde RepA. - Pesomolecularde la proteínaRepA nativa. - Característicasde RepA. - Localizaciónde la diana de RepA. - La proteínaRepA inhibe su propio promotor iii vitro. - RepA reprime su propio promotor ¿ti vivo. - Localizacióndel operadorde RepA. - Actividad ir: vivo de RepA en su entornofisiológico. 153 de B.subrilis 155 159 163 164 165 172 177 183 185 194 7. CONTROL PRIMARIO DE LA REPLICACION: EL PAPEL DEL RNA II. 202 - Caracterizacióndel RNA II medianteensayosde transcripciónitt vitro. 202 - Elementosdel replicónpLSl que expresan incompatibilidad. 206 DISCUSION. 225 RESUMEN Y CONCLUSIONES. 263 BIBLIOGRAFíA. 267 ABREVIATURAS Ap AP r AIf? ~ME BSA cAMP CBB ccc Cm Cm cols cpm CTP dATP dCTP ddTTP DEAE dGTP DMS DM50 DNA DNasa dNTP Do dsDNA Dli? dTTP EPTA EG EGTA Et Br GTP 3j~j ]-d TVE HEPES IPTG Mi kDa MOPS MEa N4 ¡uRNA NAD Na-DOC Nov nt(s) Nr OC orf ORE PAA PAGIS pb ampicilina. resistenteso resistenciaa Ap. adenosina5’-trifosfato. g-mercaptoetanol. seroalbúminabovina. adenosina-5’-3‘-monofosfato(AMP cíclico). azul brillante de Coomassie. circular covalentementecerrado. cloramfenicol. resistenteso resitenciaa Cm. colaboradores. cuentaspor minuto. citidina 5’-trifosfato. desoxiadenosina5’-trifosfato. desoxiciridina5’-trifosfato. 2’,3’-didesoxitimidina5’-trifosfato. dieti]aminoeti]. desoxíguanosina5’-trifosfato. dimeti 1sulfato. dirnetilsu]fóxido. ácido desoxirribonucleico. desoxirribonucleasa. desoxinucícósido5’-trifosfato. densidadóptica. DNA de doble cadena. di tiotreit ol. desoxitimidina5’-trifosfato. N,N,N’,N’-etilendiamino tetraacetatodísódico. eti]eng]icoi. ácido etilenglicol-bis}fl-aminoetil éter) N-N’-tetraacético. bromurode etidio. guanosina5’-trifosfato. (metil»H) desoxitimidina5’-trifosfato. ácido N-2-hidroxietilpiperacin-N’-2-etanosulfónico. isopropii-fi-D-tioga]actopiranósido. iO~ baseso paresde bases. kílodalton(s). ácido inorfoJinopropanosulfónico. megapascal(es). movilidad relativa. RNA mensajero. nicotinamida-adenina desoxicolatosódico. novobiocina. nucleótido(s). nucleósidotrifosfato. circular abierto. frente de lecturaabierto. posible polipéptido codificadopor unaorf. poilacriJamida. electroforesisen gel de PAA. paresde bases. dinucleótido. pd(N)6 PEG PIPES PMSF Pol 1K POPOP PPO PSA RF Rif RNA RNasa rpm S.D. [ 355]-dATP SDS ssDNA Tc Tcr TCA TEMED Tris tRNA ts u u.f.c. UTP mezclade hexadesoxinucleótidos. polietilenglicol. ácido 1,4-píperazindietanosulfónico. fluoruro de fenilmetilsulfonilo. fragmentoKlenow de la DNA polimerasa1 de E.coli. 2,2’-p-fenilen-bis(5-feniloxazol). 2,5-difeniloxazol. persulfatoamónico. forma replicativa. rifampicina. ácido ribonucleico. ribonucleasa. revolucionespor minuto. sitio de unión a los ribosomas(Shine-Dalgarno). desoxiadenosina5’-a-11355]-tiotrifosfato dodecil sulfato sádico. DNA de cadenasencilla. tetracielma. resistenteso resistenciaa Tc. ácido tricloroacético. N,N,N’,N’-tetrametiletilen-diamina. trihidroximetil-amino-metano. RNA de transferencia. termosensible. unidades. unidadesformadorasde colonia. uridina 5’-trifosfato. 1 INTRODUCCION En los cercade treintay cinco añostranscurridosdesdeel descubrimientode los plásmidos bacterianos, estos elementos extracromosómicoshan contribuido notablementeal desarrollo actual de la Genética, la Biología Molecular y la Biotecnología. Las primeras investigacionesllevadas a cabo en biología plasmídica tuvieron comoobjetivo estudiarlos mecanismosde fertilidad conjugacionaly resistencia a antibióticos en bacterias entéricas. Los conocimientos aportados por estas investigaciones,junto conel desarrollode la tecnologíadel DNA recombinantey de la transformaciónbacteriana,propiciaronel usodeplásmidoscomovectoresdeclonaje.Aún en la actualidad,los plásmidosparecenrepresentarparamuchosbiotecnólogospoco más quevectorespara el clonajey expresiónde genesde interés,mientrasqueparaalgunos investigadoresen Biomedicinasóloparecenser molestoselementosde diseminaciónde resistenciasaantibióticos.En contrastecon estavisión minimalista,sóloun conocimiento profundo de la biología de los plásmidos ha permitido (y permitirá en el futuro) solucionarlos problemassurgidosen otrasáreasde investigación.Así, cuandoseemplean plásmidosrecombinantesen procesosindustriales,la capacidadpara regularel número de copiasde un replicón (manteniéndoloinicialmentebajo y amplificándolodespués) puede incrementarsu estabilidaddurantela fase de crecimiento inicial del cultivo y ayudara optimizarel rendimientodel productodurantela fasede expresión.Desdeel punto de vista médico,el conocimientode la replicaciónplasmídicapuedetener una importanteaplicaciónen losproblemasdeantibiótico-resistenciasmediadasporplásmidos y su transmisiónentrebacteriaspatógenas.Comoen un circuito de autopotenciación,los problemassurgidosen diversasáreasde la Biología aplicadahancontribuido, a su vez, a estimular la investigación básica sobre los plásmidos.Tal investigación ha sido fundamentalparael conocimientode procesosbiológicos claves, como la conjugación, el control de la expresión génica, la topología del DNA, la transposición, la recombinación,la particiónde informacióngenéticaen el momentode la división celular, y un largo etcéteraque incluye, por supuesto,la replicaciónplasmídicay su control, protagonistasprincipalesa lo largo de este trabajo. En estesentido,los plásmidosson másadecuadosque los cromosomasparael estudiode la replicacióny sucontrol, ya que al ser dispensablesparael huéspedpermitenmuchamáslibertadgenéticay bioquímica al investigador.Comola Naturalezapareceofrecerun númerolimitado de solucionesa un determinadoproblema,algunosde los mecanismosencontradosen los plásmidos 2 puedentenerun significadofuncional muchomásamplio.Quizás el descubrimientomás generalefectuadodurantelos estudiossobreel control de la replicaciónplasmídicaes queel RNA puedefuncionarcomoun represorqueactúaen trans.Este mecanismono sólo se ha encontradoposteriormenteen muchosotros circuitos reguladoresnaturales, sino que ha proporcionadotambiénun medio para introducir circuitos sintéticos de control en microbios,plantasy animales(Inouye y Dudock, 1987). Por razonesprácticas(no quiero comenzaraburriendoal sufrido lector desde tan temprano),este capítulo va a estar centrado, exclusivamente,en la replicación plasmídicay su control. Otros temasmás o menosrelacionadoscon éste,y quehanido surgiendo duranteel desarrollo de esta Tesis, se trataránde forma puntual en el correspondientecapítulode Resultadoso Discusión.Además,no voy adescribircontodo detalle los sistemasde replicación bien caracterizados,sino que me referiré sólo a aquéllosque más recuerdanal de pLSI, ya sea en la organizaciónde su circuito dc control (plásmido Rl de Eseherichiacolí), o por compartir el mismo mecanismode replicación (plásmidopTl8l de Staphylococcusaureus). Modelos de replicacién . En la replicacióndel DNA plasmidico,comoen la de cualquierotro DNA, la iniciación es una etapaclave y específicapara cadareplicón. Efectivamente,es en la iniciación donde se consiguegenerarun grupo 3’-OH libre sobre el que las DNA polimerasas (de otra forma incapacesde iniciar la replicación) incorporarán los nucícótidoscomplementariosal molde. Las estrategiasadoptadaspara conseguireste objetivo son muy diversas (revisado en Salas, 1988), pero en los plásmidosmejor conocidosde bacteriasgram-negativasimplica la síntesisde un RNA cebadoro “primer”. Así, la replicación(in vivo e in vitro) de los plásmidostipo ColE] seinicia apartir de un RNA “primer” cuya síntesis es sensiblea Rif (Clewell y cols, 1972; Sakakibaray Tomizawa, 1974). Como indica esta sensibilidad,es la RNA polimerasade E.coli el enzimaencargadodesintetizarun transcritoprecursordel “primer”, queesprocesadopor la RNasaH para dar lugar al RNA “primer” (Itoh y Tomizawa, 1980). La iniciación de la replicaciónde CoJEl es uno de los ejemplosmejor y desdemásantiguo conocidos. Otrosplásmidosdebacteriasgram-negativaspresentanunmecanismodeiniciación mucho máscomplejo,lo quehadificultado su estudioy elucidación.En ellosesesencialla acción deunaproteínainiciadoraespecífica,Rep,codificadapor el mismoreplicón.Laactuación de estasproteínasRep en la iniciación respondea un mecanismocomún: reconocen 3 secuenciasespecíficasen los orígenes de replicación, y forman con ellos complejos nucleoproteicossimilaresal descritoparaDnaA enoriC (revisadoen Giraldo, 1991).En el casodelplásmidoRl (quenosinteresaespecialmenteporquesumecanismodecontrol, aunqueno el de replicación,tiene ciertasanalogíascon el quehemosencontradopara pLSI), la iniciación de la replicaciónimplica, enprimer término, la unión específicade la respectivaproteínaRep(RepA)a una región deloriR (Masai y Arai, 1987; Giraldo, 1991). A continuación,y al parecerdirigida por RepA, se producela entradade la proteínaDnaA en la cajadnaAadyacenteal sitio deunióndeRepA(Masaiy Arai, 1987). El DNA de oriR sufre una desnaturalizaciónparcial en una región que presentatres repeticionesde 9 pb conalto contenidoenA+T (Bramhill y Kornberg,1988).La helicasa DnaB se sitúa en el complejo abierto y extiende unidireccionalmentela horquilla de replicación.Finalmentecomienzala síntesisde la hebralíder, promovidapor la primasa DnaG, que sintetizaun RNA cebador(Masai y Arai, 1989). Todoslos plásmidosmejorestudiadosdebacteriasgram-negativas(incluyendo CoIEI y Rl) replicanmedianteun mecanismotipo e, asídenominadopor la morfología que exhiben los intermediariosreplicativos.Durante largo tiempo, éste fue el único mecanismode replicaciónplasmídicaconocido.A ello sedebe,quizás,quelos resultados de los primeros análisis al microscopio electrónico de intermediariosreplicativos de plásmidosde bacteriasgram-positivas(pTlSi, pE194y pUBlIO, todosellos originarios de S.aureus)fueran interpretadoscomo un ejemplo más de este tipo de replicación (Scheer-Abramowitzy cols, 1981). Sin embargo,en experimentosposterioresrealizados conpTl8l comenzaronaacumularseunaseriede evidenciascircustancilalesquellevaron a R.P.Novick y a suscolaboradoresaproponerun mecanismodistinto parala replicación de esteplásmido(Khany cols, 1982;Koepsely cols, 1985a).Estosautoressugirieronque pTl8l replicaríamedianteun mecanismode circulo rodanteasimétrico,similaral descrito parala multip acion de la forma replicativa (RF —. RF) del DNA de los colifagosde cadenasencilla (M13, fd, ~X174,etc.; Kornberg, 1980). La replicaciónmediantecírculo rodanteimplica unaetapade iniciación independientede la síntesisde un RNA ‘primer”, ya queel grupo3’-OH libre requeridopor las DNA polimerasasesgeneradopor la rotura específicade una de las hebrasdel DNA. En lineasgenerales,el modelopropuesto(y en gran medida confirmado)para la replicación de pTl8l se basa en el mecanismo descritoparacolifagosde cadenasencilla,y es el siguiente(Novick, 1989): a) La proteínaRepC codificadapor pTl8l se une al origen de replicación de la cadenalíder [oti( + >1~ introduciendoun corte monocatenarioespecíficoen la hebra codificante[cadena(-4-)] del plásmido,entre los nucleótidos71 y 70 (1’/A). Estarotura generaun extremo3’-OH librey unextremo5’-P unido covalentementeaRepC(Koepsel 4 ori (+) y cois, 1985a). b) La síntesisde la cadenalíderseinicia por extensióndel extremo3’-OH, en tanto quela cadena(+) parentalunidaaRepCva siendodesplazada.Estaetapadeberequerir, además,unaseriede proteínasdel huésped,análogasa lasusadasen la replicaciónRF —. RE del DNA de los colifagos de cadenasencilla (SSB, holoenzimade la DNA polimerasaIII, helicasa).Demomentoparececlarala intervenciónde la DNA polimerasa III, a juzgar por la sensibilidadque muestrala replicación iii vivo de pTl8l frente al inhibidor 5-hidroxifenil azouracilo(Majumdery Novick, 1988). c) El desplazamientode la cadenaparentaly la síntesisde la cadenalídercontinúan hastaquela horquilladereplicaciónalcanzael origenreconstituido.Seproduceentonces la terminación de la cadena líder medianteuna reacción de intercambio de cadenas (presumiblementecatalizadapor la proteínaRepCunida) en el sitio dondetuvo lugar la rotura iniciadorade la replicación(Iordanescuy Projan, 1988). En estareacciónse produce,al mismo tiempo, la circularizacióny liberaciónde la cadena(+) desplazada. En estepunto, no siempresehabráiniciado la síntesisde la hebraretrasadasobre el moldede la cadenadesplazada,por lo queéstaaparece(al menosengran medida)como Rep Figura 1. Modelo de replicación plasmídica mediante círculo rodante asimétrico. El proceso se inicia cuando la proteína Rep (O) introduce una rotura específicade la cadena (-i-) en la región del origen, generandoun extremo3’-OH libre y quedandocovalentementeunida al extremo5’-P. La síntesisde la cadena líder ~ - ~ tiene lugar por extensiónen 3’, mientras la hebra (4-) parental va siendodesplazada.Cuando la horquiila de replicación alcanza el ori( +) regenerado, termina la síntesisde la cadena líder y se produce, al mismo tiempo, lacircularización y liberación de lahebra desplazada.Estapresentaríauna señal(s) reconocida por las proteínasdel huéspedpara la iniciación de lacadenaretrasada,con cuya síntesisconcluye la replicación semiconservativadel DNA del plásmido. 5 un DNA circular de bandasimple. Los productosobtenidos,pues,hastaestaetapade la replicaciónson: un DNA de doblebandacon unacadena(-) parentaly una(+) de nuevasíntesis,y un DNA circular monocatenarioquecorrespondea la cadenaparental (+). d) Sobreel DNA monocatenariose reconoceunaseñalparala iniciacióndela cadena retrasada.La síntesisde éstada lugar a una segundamolécula de DNA bicatenario formada,en estaocasión,por una cadena(+) parentaly una (-) de nuevasíntesis.Con estaetapa,similar a la que tiene lugar a partir del ori(-) de los colifagos de cadena sencilla,se completala replicacióndel plásmido. Un esquemade lo quepodríaser la replicaciónde un plásniidomedianteun mecanismode círculo rodanteasimétricosepresentaen la Figura1. Esteesquemageneral estábasadoen el modelode Novick (1989),y en los datosdel procesoreplicativode los colifagos de cadenasencilla(Kornberg, 1980). Estemodelode círculorodanteparala replicaciónplasmídicatienebienganado e] adjetivode asimétrico,ya queexisteun fuertedesacoplamientoentrela síntesisde las cadenaslíder y retrasada.Como acabamosde ver, estedesacoplamientoda lugar a la formaciónde intermediariosreplicativosmonocatenarios.No es de extrañar,por tanto, que la acumulación itt vivo de ssDNA piasmídico específico de hebra haya sido considerada,desdeel lanzamientodel modelode círculo rodanteparapTl8i, comouna indicaciónde la replicaciónde un plásmidoa travésde estemecanismo(te Riele y cols, 1986a).Con esteargumentosehapropuestoquela replicaciónde la mayoría,si no todos, de los pequeñosplásmidosmulticopia de Laureus se llevaría a cabo medianteun mecanismode círculo rodanteasimétrico(Novick, 1989). Control de la renlicación . Una consideracióngeneral e importanteacercade la replicaciónplasmídica esqueéstadebeestarsometidaa un fuertecontrol,ya queel númerode copiases una característicafija de un determinadoplásmido en un determinadohuésped,bajo condicionesconstantes.Pareceestarclaroque, encualquierprocesoreplicativo,el control se ejercea nivel de la iniciación y no durantelas etapasposterioresde elongacióny terminación (Pritchard, 1974). Esto evita un gasto energéticoinútil a la célula y es particularmenteobvio enel casode los plásmidos,en cuyareplicaciónseinvierten,como más, de 1 a 3 mm (aun cuandose trate de una moléculade gran tamaño;Nordstrómy 6 cols, 1984).Existe,además,otrarazónlógicaparaqueel controlde la replicaciónse lleve a cabodurantela etapade iniciación: dichaetapaes(comovimos antes)la queconfiere la especificidad,por lo quesu regulaciónes capazde asegurarel control autógenodel replicón. Así, la replicación de un plásmido (y por tanto su número de copias)está controladapor un sistemaqueél mismo codifica, y quedeterminala tasade iniciación de la replicación,utilizando la inhibición comoprincipal estrategia(Novick, 1987). Cuantitativamente,la regulaciónde la replicaciónes de máximaimportancia paradeterminarla incompatibilidadplasmídica,la cual sedefine como la incapacidad de dos plásmidoscorresidentespara ser heredadosde forma estableen ausenciade selecciónexterna(Novick, 1987). En términosgenerales,la incompatibilidadseproduce cuandodos plásmidoscompartenuno o máselementosde los sistemasde replicacióno partición. Sin embargo,la incompatibilidaddebidaa un sistemade partición común es, normalmente,menosfuerteque la determinadapor un elementode control replicativo compartido. La pérdida plasmídica debida a incompatibilidad es, a menudo, una consecuenciade la interferenciaconla capacidaddel plásmidoparacorregirfluctuaciones estocásticasensu númerodecopias(Novick, 1987).La incompatibilidadplasmídicadebe ser contemplada,pues,como una consecuenciaautomáticade la actividad normal de ciertasfuncionesde replicacióny mantenimiento, y no comola manifestaciónfenotípica de genes“inc’ (de incompatibilidad). Todoslos sistemasde regulaciónplasmídicaconocidoshastala fechaemplean para su funcionamiento,o bien unaestrategiainhibidor-diana,o bien unaestrategiade unión a iterones.En los sistemasinhibidor-diana,el plásmido codifica un inhibidor difusible que actúa uniéndosea una diana específicadel propio plásmido;estaunión bloqueala replicación, ya seadirectamenteo impidiendo la síntesisde un producto requerido. En los sistemas de unión a iterones, el plásmido codifica una proteína iniciadora difusible, y contiene una o varias series de oligonucleótidosdirectamente repetidos(iterones)capacesdeunir la proteína.El mecanismoreguladorinvolucratanto autorrepresiónde la proteínainiciadora(Chattorajy cols, 1985; Shaffermany cols, 1982> como unión de la proteínaa los iterones.Estaunión puedetenerun efecto inhibidor directo sobre la replicación, puede regular mediante titulación la concentraciónde iniciador, o ambascosasa la vez (Chattorajy cols, 1985; Shaffermany cols, 1982; Novick, 1987). Aunque la regulaciónplasmídicamediantela estrategiade unión a iteroneses ampliamenteempleadaen la Naturalezay ha sido estudiadaen plásmidoscomo F, Pl, pSC1O1 y R6K, los ejemplosque másnos interesanutilizan, todos ellos, un sistema reguladorde tipo inhibidor-diana. ‘7 Atendiendo a su modo de acción, un regulador negativo puede inhibir directamenteun determinadoproceso(regulacióndirecta),o puedeinhibir la síntesisde un productorequeridoparatal proceso(regulaciónindirecta).Entre los plásmidosque empleanun sistemainhibidor-dianaexistenejemplosde unoy otro tipo de regulación. Los esquemasgeneralesde regulación de los tres plásmidos inhibidor-diana más estudiados(ColEl, Rl y pTl8l) se muestranen la Figura 2. ColEl, cuyo inhibidor bloqueala síntesisdel ‘primer” de replicación,es el ejemplomás claro de regulación directa.Porsuparte,el plásmidopTl8l, cuyo inhibidor bloqueala síntesisde la proteína iniciadorade la replicación(RepC)activa en trans (Kumar y Novick, 1985), ejemplifica la regulaciónindirecta.En el casode Rl, el inhibidor tambiénbloqueala síntesisde una proteínadereplicación(RepA). Sin embargo,estaproteínaesactivaencis (Masaiy cols, 1983),por lo queel bloqueode su síntesisafectasólo a la moléculaplasmídicainhibida. Esto significa que Rl utiliza, a todos los efectos,unaregulacióndirecta.Pesea lo que pudieraparecer,la distinciónentreregulacióndirectaeindirectano respondea un simple afán de crear agrupacionesinútiles desdeel punto de vista práctico, sino que tiene importantesconsecuenciasenlo querespectaa la incompatibilidadplasmídica.Así, para los plásmidosdirectamente regulados (ColE! y Rl), el pricipal determinantede incompatibilidad es la región quecodifica el inhibidor, en tanto queel origen de PNase H _________________________________________ Primer (Gis) ~——~ ~reprimer? CoIEl ~ ori M DIRECTA mM E~ep~ mRNg v~ 0< M ¡ NOI RECTA .§i1ii¿jjj~kii3?1tjj9 RepO (trons> RNi~llDtrc.r. / ~ RepO rrRN~ F-’ Qn M Figura 2. Regulacióndirecta frente a indirecta en los plásmidoscon sistemainhibidor-diana. Cada uno de lostres plásmidosprototipo presentaun transcrito de gran tamaño (la diana de la inhibición) y un pequeño cÉRNA (el inhibidor). FI producto de la etaparegulada(el “primer deCoIEl, y las proteínas iniciadoras RepA de Rl y RepC de pTlSl) es específicoen ns para los dos plásmidos de E.col¡, pero activo en troas para pTlSl. “M” representamutacionesen la región de solapamientode inhibidor y diana; oñ indica la localización del origen de replicación y la dirección de ésta. Figura tomada de Novick (1987). 8 replicacióndonadonoproduceincompatibilidad(Novick, 1987).Paraplásmidosregulados de forma indirecta(pll8l), el origendereplicaciónconstituyeun segundodeterminante de incompatibilidad(apartedeldeterminanteprimarioquees,por supuesto,el inhibidor; Novick, 1987). Además, plásmidos directa e indirectamente regulados difieren marcadamenteen los efectos que muchas mutacionesreguladorascausansobre la incompatibilidad.Paraplásmidosreguladosde formadirecta,estasmutacionesproducen, por lo general,una asimetríaen la regulación:uno de los plásmidoses mássensibleal inhibidor del otro y, como consecuencia,resulta preferencialmenteeliminado de la poblaciónheteroplasmídicaen condicionesno selectivas(Tomizawae Itoh, 1981). Por otro lado, si ambosinhibidoresson menosactivosen la diana contrariaqueen la suya propia,se produceun gradode independenciaquepuedeconducir,en último caso,al aislamientoreguladorcompleto de ambosplásmidos (Tomizawae ítoh, 1981). Esto significa que los números de copias de uno y otro plásmido se corrigen independientemente,estableciéndosenuevasespecificidadesde incompatibilidad(los dos plásmidospertenecerána grupos de incompatibilidaddistintos). Por el contrario, en repliconesreguladosindirectamente,mutacionesque afectanal inhibidor, a la diana,o a ambos, no producen generalmenteasimetría reguladora entre dos plásmidos distinguibles (mutante y silvestre, o dos mutantesdistintos; Novick y cols, 1985). La explicacióna este hechoparececlara y predecible:aunquela diana correspondientea uno de los plásmidosseamássensibleal inhibidor codificadopor el otro, ningunode los dos plásmidosva a encontrarseen desventaja,ya queel productode la etaparegulada esunaproteínaactiva en trans, capazde iniciar la replicaciónsobrecualquierade ellos. Conestemismoargumentosepuedepredecirque,enplásmidosreguladosindirectamente, ningúncambioen la especificidadinhibidor-dianapuedellegaragenerarun nuevogrupo de incompatibilidad.Esta predicciónha sido confirmadapor Projany Novick (1986), quieneshanmostradoquemutacionesen la región reguladoradepTlSl quehacenque un plásmidoseacompletamenteinsensibleal inhibidor del otroy viceversa,no eliminan la incompatibilidadde ambosplásmidos.De forma similar, un derivadode pTl8l cuya región de control de copiasha sido reemplazadapor la de un plásmidocompatiblemuy relacionado(pC22l>, siguesiendoincompatiblecon pT181auncuandolos dos sistemas de control de copiasson totalmenteindependientes(Projany Novick, 1986). Los tres replicones con sistemainhibidor-dianaescogidoscomo prototipos (ColEl, Rl y pTl8l), tienenen comúnque los dos componentesdel sistemaregulador son moléculasde RNA complementarias.Paralos tresplásmidos,la dianade acciónes un largo transcritocuya función serequiereparala replicación.En CoIEl, el transcrito dianaesel precursordel “primer” parala replicación(Tomizaway cols, 1981),mientras 9 queparaRl y pTl8l esel mRNAparala proteínaplasmídicainiciadorade la replicación (Light y Molin, 1982a;Kumar y Novick, 1985).En cuantoal inhibidor, los tresplásmidos utilizan pequeñosRNAs (de 80 a 150 nts) que se sintetizana partir de la región que codifica el extremo 5’ del transcrito diana,en dirección opuestaa la síntesisde éste. Debido a estascaracterísticasde los RNM inhibidores,Kumar y Novick (1985) han propuestopara ellos el términode RNAs contratranscritos(ctRNAs), queusaremosen adelante.A continuaciónsedetallanlosmodelosderegulaciónde los dosplásmidosque másse acercana pLSI, ya seaen su control (Rl), o en su mecanismode replicación (pTl8l). El control de la replicacióndel plásmidoRl se ejercea nivel de la síntesisde la proteínainiciadoraRepA de origen plasmídico,cuyosnivelesdeterminanla tasade iniciación del procesoreplicativo (Light y Molin, 1982a).El gen repA puedeexpresarse apartir de dospromotores,~ ~ situados,respectivamente,en posiciónmásdistal y másproximal al inicio de su secuenciacodificante (Fig. 3). La transcripcióndesde ~copB incluye los genescopBy repA y dos orfis (3k y 7k, paraposiblesproductosde 3 y 7 kDa); la transcripcióna partir de Pr~p~ incluye, por su parte, repA y ambasorfs. En la región de control de Rl existe, además,un tercerpromotor (P1~), desdeel cual se transcribeel gencopA endirecciónopuestaa la de transcripcióndesdeP~0~8Y ~reM (Fig. 3). La síntesisde RepA estácontroladanegativamentepor los productosde los genes copA y copB, que son, respectivamente,el ctRNA CopA y la proteínaCopB. El gen copB se expresaconstitutivamente(Light y Molin, 1982b)paradar lugar a la pequeña proteínaCopB (11 kDa), que esun represortranscripcionaldel promotorP~ (Riise y Molin, 1986).En condicionesnormales,los nivelesde CopBson suficientespara saturar su sitio de acción, de forma que la expresión de repA sólo tiene lugar a partir del promotor P~ (Fig. 3). De aquí se desprendeque copB es incapaz de corregir fluctuacionesque signifiquen un incrementoen el número de copias de Rl y, en consonanciacon esto,un aumentoen la dosisde estegen no va a conducir a cambios ene]númerode copiasplasmídico(Riise y cols, 1982).La actividad de ~re~A pareceestar reservada,únicamente,a situacionesde máxima emergenciaen las que el númerode copiasde Rl caigapordebajodelnormal(Light y Molin, 1982a).En estoscasos,la caída de la represiónpor CopB permiteunarápidaautocorrecciónde los nivelesde copiasa travésde un incrementoen la transcripciónde repA (Light y Molin, 1982a). Queda,pues,claro queel principal controladorde la replicaciónde Rl esel productodel gencopA, queha sido identificadocomoun ctRNA de 93 nts de longitud (RNA-CopA), complementarioa una región del mensajeropolicist;rónico de repA 10 Cop A AtP t ~¿a CopT —Orn ~ Pccp~ IDQpb Figura 3. Esquema del replicón básico de Rl. Los productos génicos y los principales circuitos que controlan la replicación aparecenseñalados,eindica activacióndel origen de replicación por la proteína RepA; e indica control negativo de la replicación ejercido por los productos de los genescopA y copB. Símbolos: — DNA; r—- RNA; proteínas; r ‘i 0< cuyos productos no han sido identificados. Figura tomada de Berzal (1990). (Stougaardy cols, 1981; Wombley cols, 1984; Fig. 3). Se haasumidoque la síntesisdel RNA-CopA es constitutiva(Nielsen y Molin, 1984), de maneraque su concentración dependede la dosis del gencopA y, por tanto, del númerode copiasdel plásmido.El ctRNA-CopA actúabloqueandola síntesisde la proteínainiciadoraRepA de tal forma que la tasade expresiónde repA por copia plasmídicaes inversamenteproporcionala la concentracióncelularde esteinhibidor. En otraspalabras,la tasatotal de síntesisde RepA y, como consecuenoa,la frecuencia total de replicación de Rl son aproximadamenteconstantese independientesdel número de copias del plásmido (Nielseny Molin, 1984).La interacciónentreel RNA-CopA y la región complementaria en el líder del mRNA repA es, al igual que ocurre en otros plásmidosque utilizan ctRNAs, la basedel mecanismode control de la replicaciónpara Rl. Estainteracción conducea la formación de un dúplex RNA-RNA establey, como consecuencia,a la inhibición de la traducciónde repA, quese inicia a 84 nts de distanciadel extremo5’ del RNA-CopA. La estructurasecundariade los dos RNAs implicadosen la interacciónes muy importante para que ésta tenga lugar. Se sabe, por ejemplo, que la primera interacción tiene lugar a través de 6 nts que aparecenexpuestos en los lazos complementariosdesendasestructurasen forma dehorquillaqueseforman en los RNAs inhibidor y diana(Ohmany Wagner,1989; Wagnery Nordstróm,1986). Se ha sugerido, además,quela accióndel RNA-CopA sobrela región complementariadel mRNA repA 11 (denominadaCopT) estaríamoduladapor la traducciónde las orfs 3k y 7k (Wagnery cols, 1987; Thomas, 1988). La orf 7k solapacon toda la región copT (Fig. 3), y se ha propuesto que su traducción (demostrada mediante la utilización de fusiones traduccionales)realizaunafunción moduladoradebido a queel pasode los ribosomas a travésde CopT desharíala estructurasecundarianecesariaparala interaccióncon el RNA-CopA (Wagnery cols, 1987). Por su parte,la traducciónde la orf 3k (que solapa sólo con partedecopT, Fig. 3) no ha sido verificada,y su implicaciónen la interacción entreel RNA-CopA y su dianano está,de momento,muy clara (Thomas,1988; Berzal, 1990). Aunque es sabidoque la formación del dúplex CopA/CopT conducea la inhibición de la síntesisde RepA, no se conoce,sin embargo,el mecanismomolecular de estebloqueo. Dong y cols (1987) propusieronun modelo que explicabacómo la interacción del RNA-CopA con la región CopT podía producir un bloqueo de la traducciónde rejA en un sitio físicamentealejado del de la interacciónentre ambos RNAs. Estemodelosebasaen la distintaconformaciónestructuralque, de acuerdocon las prediccionesde análisispor ordenador,puedeadoptarel mRNA repA segúnse haya producido,o no, la interaccióncon el RNA-CopA (Fig. 4). En ausenciade] ctRNA, la estructurasecundariafinal delmRNA repA presentaríalasseñalesde inicio de traducción expuestasen regionesde cadenasencilla,lo quepermitiría el accesoa las mismasde la maquinariade traduccióny, en consecuencia,la síntesis de RepA (Fig. 4). Por el contrario, si durantela síntesisdel mRNA repA se producela interacciónde la región CopTconel RNA-CopA, la estructurasecundariafinal del mensajeromantendríael S.D. y el codónde iniciación de repA en regionesde apareamientointracatenario,y la síntesis de RepA quedaríabloqueada(Hg. 4). Además (y siempre según este modelo), la interaccióndel RNA-CopA con el mRNA repA sólo sepodríaproducir a lo largo de un cierto períodode la transcripción,duranteel cual los 6 nts de CopT implicadosen la interacción primera de ambos RNAs se mantendríanexpuestosen el lazo de una estructurasecundaria(Fig. 4). Esteperiodode tiempo esconsideradocomola “ventana útil” para la actuacióndel ctRNA. Si pasadoestemomentola interacciónno sehubiera producido, habría una reestructuracióndel mensajeroque colocaría los 6 nts de la interacciónprimaria en una zona de apareamientointracatenario,cerrándoseasí la “ventanaútil” de accióndel RNA-CopA(Fig. 4). La existenciade la estructuratransitoria del mRNA útil para la interaccióncon el ctRNA severíaprolongadapor la presencia deun sitio depausade la transcripción(caracterizadopor unaestructurasecundariatipo tallo-lazo muy estable;Dong y cols, 1987). Este sitio está inmediatamenteseguidopor unasecuenciaboA (Dong y cois, 1987), la cual esun sitio de reconocimientode la Inhibidor CopA 1 12 CopT Tallo — lazo Pausa Transcripci¿n Peest tu u tu r aol ¿ rl Reordenaci6n intraóaterrar la Formaclún del dúplex CopA - CopT secuestrado Figura 4. Modelo de Dong y cols (1987) para la inhibición de la síntesisde RepA por eí RNA-CopA de Rl. La interacción de CopA con la zona complementaria en la región líder delmRNA repA durante la ‘ventana útil» (antes de la reestructuración del mensajero) conduce al secuestrodel SO, de repA en una zona de apareamientointracatenario. Símbolos: RNA polimerasa (.); seis nts que constituyen Ja diana de interacción primera ene1mRNA repA (T); seis ntscomplementariosa Ten el RNA-CopA (1). SegúnDongy cols (1987). proteína NusA de E.coli (implicada en los procesosde paradade la transcripción; Friedmany Olson, 1983). Durante el período de atenuaciónde la transcripciónse decidiríala estructurafinal del mRNA repA en función de la interaccióno no del RNA- CopA. Estemodelodeaparienciatan sólidano estárefrendado,sin embargo,por los datos experimentalesobtenidos mediante el análisis estructura] del mRNA rejA sintetizadoin vi¡’ro. Así, Ohmany Wagner(1989) hanmostradoqueel mensajeroadopta la mismaestructurasecundariafinal con independenciade la presenciao ausenciadel RNA-CopA durantesu síntesis.En dicha estructurafinal, tanto el S.D. comoel codón de iniciaciónde repA seencontraríanexpuestosen regionesde cadenasencilla.Tampoco sedetectan,duranteel procesodeelongacióndel mRNArepA, cambiosestructuralesque permitan definir una ‘ventanaútil” para la interaccióncon el RNA-CopA: los 6 nts implicadosenla interaccióninicial permanecenexpuestosenunazonadecadenasencilla durante todo el procesode transcripción(Ohman y Wagner, 1989). Los autoresno lflicxací¿n Elonqac±¿n S/D accesible T L/D 13 proponen,sin embargo,ningún modeloalternativoquepuedaexplicarla regulaciónde la replicaciónde Rl por la interaccióndel RNA-CopA con su diana.Porotra parte, se ha mostrado recientementeque el dúplex RNA-CopA/mRNA rejA es procesado específicamente,tanto in vivo como iii vitro, por la RNasaIII de E.coIi, y que este procesamientoestáimplicado en la modulaciónde los nivelesde síntesisde la proteína RepA (Blombergy cols, 1990>. Sin embargo,aúnno seconoceexactamentecuál es el papelde dichoprocesamientoen el control de la replicaciónde Rl ejercidopor el RNA- CopA. El control de la replicacióndel plásmidopTl8l de S.aureusserealiza,al igual que ocurre en Rl, a nivel de la síntesisde la proteínainiciadora(RepC), la cual es el factor limitante de velocidad del procesoreplicativo (Manch-Citrony cols, 1986). El sistemainhibidor-dianade esteplásmidoutiliza dos pequeñosctRNAs (RNA 1 y RNA II, de unos 85 y 150 nts, respectivamente;Kumar y Novick, 1985), que son complementariosa unaporción de la región líder del mRNA repC. Ambos ctRNAs se inician en el mismo sitio, pero tienendistintosextremos3’ (Novick, 1987). El mecanismo de inhibición de la síntesisde RepCpor los RNAs 1 y II pareceestarahorabiendefinido. La interaccióninicial entrelos ctRNAs y el mRNA repC tendría lugar a travésde los nucieótidosexpuestosen los lazos complementariosde una estructuraen forma de horquilla, presentetantoen el RNA inhibidor comoen sudiana(Fig. 5 [a]; Novick, 1989). La acciónde los ctRNAs se ejercea distancia,en el sentidode quesu interaccióncon la dianaen el mRNArepC induceun cambioconformacionalenunaregión del mensajero alejadade la zonade complementariedadinhibidor-diana.Estecambioen la estructura secundaria conlíevaun bloqueoen la síntesisde RepC(Kumar y Novick, 1985; Novick, 1987). la basede estemecanismoreguladoresla existencia,en la regiónlíderdel mRNA repC, de los elementosde secuencia1 (tambiéndenominado“preemptor”;Novick y cols, 1989), II, III y IV. La secuencia1 (“preemptor”)puedeaparearcon el elementoII para darlugar ala estructuratallo-lazoimplicadaen la interacciónprimeracon el ctRNA (Fig. 5 [a]>.Además,el elemento1 comparteunarepeticióndirectade 9 basesconel elemento IV, el cual es complementarioal elemento III, de forma que podría darse un apareamientoentrelas secuencias1-111. En tal caso, el 8.0. de repC (incluido en la repetición directa del elementoIV) quedaríaexpuestoen el lazo de una pequeña estructurasecundaria(Fig. 5 [c]).Cuandola transcripcióndel mRNA repChaprogresado lo suficiente, la estructuraresultante del apareamiento1-111 es más estable que la correspondienteal apareamiento1-11, siendo,enconsecuencia,la configuraciónadoptada por el mensajero(Fig. 5 [e]). Esto es lo que sucederíaen ausenciade los ctRNAs, obteniéndosemRNAs funcionalesen los que 5.0. y codónde iniciación de repC se uuu UL CeCUA A GU •Ctua u.A LA e.eu CC RNA! A-u UAU CC U CC tu CC L~ La Ut eCCL C.CSC 4 CUAA e ~e ~ FI~ ~AAAAAC-GaG O LUGuAuALAL L LuLOCOLO LA CAACALA Cg e 0u U0 u AaAA C4C0 Li> ACcee. c% ut O» C ‘——7?»»> LO CG U e u e CG Cl.* %(JC e.u OC 1fI C•C tu A-o AL A C A A A A u A A A A a a u o A uu •u u a u e Le) o»-»- 188 ALitiyt Conf ‘qurol ¡cm Le C* ¼ Cg e taN — u 0’ e .di u/LA,-.--‘nt 1-188, ~ \ao LA CG ~LAttenucte~ u A a u C A oc au~ O e u o u?Cu e • CC LO 1 uL aufIe» IV a O a a AALLAAaA A U C OC * u Figura 5. Mecanismo propuesto en pi181 para la regulación de la síntesisde RepC por ctRNAs. Se muestrael plegamientosecuencialde la región líder del mRNA repC,con loselementos1, 1], 111 y IV marcados en negritas. (a) Transcrito temprano que presentael lazo diana (tg) para la interacción con el ctRNA (RNA 1); los elementos1 y 11 forman el tallo del lazo diana. (b) El transcrito líder completo, acomplejado con el ctRNA, forma el tallo 111-1V, que funciona como terminador de la transcripción; se indica el sitio de una mutación dealto número decopias (cop-623)que impide la terminación. (c) Si el transcrito líder essintetizado en ausenciade cLRNA, la estructura (a) se reorganiza dando lugar al tallo 1-111, lo cual evita la formación del terminador 111-1V y permite que secomplete la transcripción de repC. (d) Transcrito líder completo que contieneuna sustitución de tres basesen el elemento¡ (“preemptor’), de manera que el apareamiento1-111 queda impedido y se forma el terminador (111-1V) incluso en ausenciade ctRNA. Extraída de Novick y cols (1989). encuentranaccesiblesa la maquinariade traducción. Por el contrario, en caso de producirsela interacciónconlos cIRNAs, los elementos1 y II quedaríanbloqueadospor hibridacióncon el inhibidor (Fig. 5 [b]). En consecuencia,el plegamientobasadoen el apareamiento1-111 no podríaformarse,en tanto queel elementoIII quedaríalibre para aparearcon el IV. Esto daríalugara un plegamientoalternativodelmensajero,inducido por los ctRNAs, en el que el S.D. de repC se encontraríasecuestradoen el tallo de la estructurasecundariaformadapor apareamientode los elementosIII y IV (Fig. 5 [b]). Durantevariosañosseconsideróquela inhibición de la replicaciónde pTl8l por los ctRNAs sedeberíaal bloqueode la traducciónpor secuestrodel S.D. (Kumary Novick, 1985).Sin embargo,Novick y cols (1989) hanmostradorecientementequela estructura lazo/tallo 111-1V (que es seguida en 3’ por una secuenciaAU6) funciona como un terminadorde la transcripción,y que, de hecho, la terminaciónprematurade la síntesis 14 Pre-emplor Mutotienu a Ca SC 1 C.~ R C» CC U. A ¿-e-u III A C AAAAIJAA AAA 60ALL---Sint..-CCGA JuCCUÉJAAACC AAAL del mRNA repC (y no el bloqueode la traducción)constituyeel mecanismoindirecto de 15 la acciónde los ctRNAs de pTl8l. El mecanismode control de la replicaciónde este plásmidoes, como vemos,muy similar a los sistemasde atenuaciónusadospararegular la biosíntesisde aminoácidos(Kolter y Yanofsky, 1982). El ulésmidopMV1S8 . El parentaldel protagonistade estetrabajo,esdecir, el plásmidopMVl58 fue aisladopor Burdettde unaestirpepatógena,resistentea Tc, de Streprococcusagalactiae. Enseguidaseconfirmó quepMVII58 eraquienconferíala resistenciaa dichoantibiótico (Burdett, 1980), por lo que el estudio de este plásmido adquirió interés clínico. El plásmidopMVI58 (5.5 kb) contieneun determinantede resistenciaa Tc de tipo tetL (Burdetty cols, 1982), cuyo mecanismode acciónpareceestarbasadoen el bombeodel antibiótico fuera de la célula huésped(Burdett, 1986). En el trabajode Burdett(1980) sedescribetambiénquepMVl58, aunqueno es autotransmisible,puedeser movilizado conjugativamentepor una serie de factoressexuales.De esta forma se obtuvieron transconjugantesdeStreptococcus(Enterococcus)faecalisqueconteníanpMVI 58 (Burdett, 1980). Además, el plásmido fue transferido mediante movilización conjugativa a Streptococcuspneuinonzae(Smith y cols, 1980),y mediantetransformaciónaStreptococcus sanguis(Burdett, 1980)y aS.pneumoniae(Saundersy Guild, 1980).Duranteel desarrollo de un sistemaparael clonaje de genesde pneumococosserealizó la construcciónde pLSI, mediantedeleción in vitro del fragmentoEcoRí B (1.1 kb) de pMV158 (Stassiy cols, 1981).El plásmidopLSI fue primeramenteestablecidoy analizadoenpneumococos, dondese comprobóque su capacidadpara conferir Tc0 no se había modificado con respectoa pMVI58. Trabajosposteriores,tanto en nuestrolaboratoriocomo en otros, hanpermitido establecerel plásmidopMVI5S (o alguno de susderivados>enunaserie de especiesbacterianas,incluyendoel huéspedgram-negativoE.coli. Dc hecho,éstees unode los pocosejemplosde repliconesde bacteriasgram-positivascapacesde funcionar en microorganismosgram-negativos.Tan sólo secita en la literaturaun casosimilar de unplásmidooriginariodeStreptococcuscremoris(ahoraLactococcuslactis subsp.cremoris) capazde replicar por sí solo en E.coli (Kok y cols, 1984>. Por otra parte, en un trabajo anterior,Gozey Ehrlich (1980)habíanmostradoquehíbridosentrepBR322y el plásmido de LaureuspC194 se manteníancon mayor estabilidadque pBR322 en una estirpe polA(ts) de E.coli a la temperaturarestrictiva (a la quepBR322es incapazde replicar). Estosresultadoshansido interpretadoscomo unapruebade que el replicónde pC194 escapazde funcionaren el huéspedgram-negativo,por másquelos autoresreconocen no haberpodidotranferirel plásmido‘tal cual’ a célulasdeE.coli.Gozey Ehrlich (1980> 16 consideran,sin embargo,queesteresultadonegativoesdebidoa la inadecuadaexpresión del gencat depCl94 enE.coli, y no a su incapacidadparareplicaren estehuésped. A mododeresumen,el siguienteesquemarecogela informaciónactualacerca de los huéspedesy dirección de transferenciade plásmidosque presentanel replicón pLS1: S. sanguis E.coIi S. agalactioe — S. pneumoniae — 5. oralis E. faeca lis Bacillus subtilis — L. ladis Bocillus steorotermophilus Este esquemada idea de la promiscuidadde pLSI y, en consecuencia,de su utilidad comovector de clonaje.Hastala fecha, sehandonadomásde unaveintenade genesusandoestereplicón. La secuenciacompletade nucleótidosdel DNA de pLS1 ha sido determinada (Lacks y cols, 1986) y se muestra,junto con la información que de ella se desprende (putativos promotoresy S.D., secuenciade aminoácidosde las ORFs, y secuencias correspondientesa posiblesestructurasde terminaciónde la transcripción),en la Figura 6. La máslarga de las orfs de pLSI correspondeal gen te!, que determinaresistencia constitutivaa Te. El productode estegenesun polipéptidode 458 residuos(Mr 50000). El gente! depLSI presentaunahomologíasignificativacon el genjet del plásmidopTl8l de S.aureus(Khan y Novick, 1983).La proporciónde basesidénticasentreambosgenes esde un 69%, en tantoquela identidada nive] de aminoácidosesde un 61%. Además, la mayoríade los cambiosen aminoácidosson conservativos(Lacksy cols, 1986).Existe, sin embargo, una importante diferencia entre los determinantesde resistenciaal antibióticode pLSI y pTl8l: en el primercasola resistenciaa Tc semanifiestade forma constitutiva,en tanto que en pl181 es inducible por el antibiótico. La inducibilidad de la expresióndel gen jet de pTl8l se debea la existencia(en esteplásmidopero no en pLSl> deun pequeñopéptidolídersituadoa 5’ del inicio de la secuenciacodificantedel gen. Estaorganizaciónpareceser comúnparadiversosgenesinduciblesquedeterminan resistenciaa antibióticos,y cuya expresiónes reguladapor un mecanismode atenuación 17 100 200 300 CGGTCTCCCACTGCcTTCAGCflCGGGCTGTAnCACcccTGAncTTTTGAATGACATGACCcTTTGGGCTCTTflTTGTTTTTTTAGGGAGATCTTCT 400 500 600 700 fMetLysty.ÁrgLeuThrl lemrteuSerGluSerValteuGlu ÁTcrOÁÁÁAÁTGGcnGÁOÁCXrCCGG±TÁTcÁÁAÁTCTOcnTCATncTGTTGccnGGnJÁTTÁcÁAOkAÁGG+cÁÁcn>ÁÁTÁnAÁ#.Áccc 800 AsnLeuG1uL~sMetA1AÁr~C1u>1etC1yLeuSerLysSerA1sMetIleSerVaIAlaLeuGluAsnTyrLyeLysGlyGlnGIulys 900 fKetAlaLysGIwLys&íakrgtyrPhelbrPbeLtuLeuTyrfroClu 1000 Sen IeproSerAsptrpGiuLeuLysLe.iGlulhrteuGlyValProXetAlalleSerProLeufluéAspLysÁspLysSerSerlleLysGlyGln 1100 LysTyrLysLysAlaliisryrHisVc lLeuTyrI 1eAIcL~sAsnProVa1ThrÁ1aAspSerVA1ArgLysLysI leLysteuLeuteoClyGluLysSer rcr¶ÚCÁÁTCGTGcAGCTTGTTCTCÁATac«ÁÁÁATATGmTnGTATflAÁcGcÁcGÁGÁGcÁÁGGÁcGcnrGcTÁÁGÁÁGUÁCÁTGTTnTGÁI 1200 teuAlaMetValClnValVa 1LeuAsnVa1G1uAsnMetTyrLeuTyrLeuThrHigG1uSerLy~As~A1a1 leAlaLysLysLy.HusValTyrAcp flGGcTGATATAAAGCTnTCAATAATTTTGATATTGACcCTTATCTGAcGTTAOATGTCGAGGAAAAGAccGAÁcTTTTCnTGTGGTTGTATcGCTTA 1300 LysAlaAspI leLysteul lcAsnAsnPbeAspl leA.pArgTyrVa lthrLeuAspVa lGluGluLysThrGluLeuPheAsnValValVa lSerLeu 1400le 1500 AlaClyLyslhrClyPhcMettysLeuLeuPheAspG I~A1aTyrG1nArgSerLysArgG1yTbrLysAsnGluC!uArg CAAAACTACAGAAAGTAAAGÑATGAAAAGAGTAATGcTAACATAGCATTACGCATTTTATGAccGATGATCAAGAAAAGAAmGAÁÁCTTAGTTTATAT 1600 CTCOTAAAÁTCTtTTKATCAACTTTAGCÁCGAATTAÁTTATGÁAGTGTÁÁTTAATGTÁACKGGCTTCAATTAÁAACAGGOAAGCGTATCAflÁKCCCTAT 1700 1800 fMetksnthrSerTyrSerGloSerAsnLeukrgllisAsnClnlleLeul leirpteucysl leLeu 1900 SerPhel’heSerValLeuAsnGluMetVa iLsuAsoVa lSerLeuProAépI leAlaAsnAspPheAsntysProProklaSerTIrAsnTrpVs lAso AcAGccrVTÁTGTTAACcTTTTccATTGCncAGCTGTATATGGAAAGCTATcTGATcAATTACGCATcAIAAGGTTAcTccTATTIGCAAnAT&ATAA 2000 ThrAIaPbeMetLeuTbrPbeSenIleGlyThrAlsValTyrGlyLysLeuSerAspGlnLeuGlyIleLysArgLeuLeuLeuPheClyIleIleIle ATrOYTTCGGCTCCGIAATTOGGflIOTTGGcCATTCTTTCnTTCcflACTIATTATGGCtCQTTTTATTCAAGGGGC+GGTGOAGCTGCArflCCAGC 2200 AsnCysPheCiySerValI leGlyPhevalGlyHisSerPhePheSerLeuteulle>letAlaArgPheIleClaGlyAlsGlyAlaAlaAlaPheProAla 2200 LeuVsIMeCVa1Va lVaIAlaArgTyrIleProLysCluAsnArgGlyLysAlaPheGlyLeuIleGlySerIleValAlaMeeClyCluClyValGlv ccAGCGAnGCTCGAÁTGATACcccATTATATTCATTCGTccmTcTTCTACTcATTccTATGATÁAcÁATTÁTcÁCTCTTcCCTTTcTTATCAÁATrAT 2300 ProAlal leGlyGlyMetI leAlsHisTyrl lellisrpserTyrteuLeuLeulleProMetlleThnllelleTbrVslProPbe-LeuXetlysLeu TAAAGAAAGAAGTAAGGATAAAAGCTcATTTTcÁTATcWCGAAnATACTAAT0TcToTAGCCATrcTÁífl~TTTATGTTGTTTAcAACATeATATAG 2400 LeuLysLysGluva lArgI letysGlyflisPheAspl leLysClyIleTleLeuMetSerValOlyIleValPhe?heNetLeuPheihrthrSentyrser 2500 1 leSerPheLeutleValServa lLeuSerPbeteul lePhevalLysHisl leArgLysVs íThrAspProPheValAspProGlyLeuGlyLysAso 2600 1 1eProPheMetI1eCIyValLeuCysGlyG1yI1eIlePbeG1yTbrVs1Ala0lyFheVa1SerHetVslProTyrMetMeCLysAs~Va1HisC1n 2700 2800 LeulyrVa IlcuAsol leclyVallhrPbeteuserValserPbeteulhrklaserrbeteuLeue1uT1¡rlhrserlrprhelletThnllelleIle 2900 Va lPbeVa lLeuClyClyLeuSerPbeTbrLysTbrValI leSerThnI leVa lSerSerSerLeuLysClnClnGluAíaClyÁlaGlyMeLSerLeu 3000 LeuAsnPbeíhrSerPheLeuSerGluGlyTbrClyI leAlal IeValGlyGlyLeuLeuSenI leProLeueeukspGlnArgLeuteuProMetGluva 1 TCATCACICAACTTATCTGTATAGTMTTTcTTATTAcTTTTTTCÁGGAÁTcATTGTcÁTTACTTGGCTGCnAccTTCAATGTATATAAACATTCTcAA 3100 AspCln5eríhrlyrleuTyrSerAsnLeuteuLeuLeuPheserclyllelleVaií leSerTrpLeuVa lThrLeuAsnValTyrLyeUisSerCln ____ ____________ 3200 ArgAspPbe TCAAACA)SCAACTTCIICAAAAATAI CATCQACCCCTTTTCTTGATCACACAACACGCGACTTCAÁCAÁIGACACCGAACCTTTTTGGCATCAK4AAGAG 3300 3400 fHe»PbeCluValCInSerProI letrgCluthríhrAsnClrrClutysMetAspTrpLeuArgtysClnlyrGlnGluCluLeuLysLys 3500 LeuCluSerSerLysLytProteuCluAspAspLeuSenllisLeucluCluLeuLeuAsptysLysThrLysCluTyrlleLysl leAspSerCluAlaSer 3600 CluArgAlaSerGIuLeuSerLysAlaGluGlyTyrI leksnThrteoGluAsnllisSertysSerLeuCluAlsLysl leGlucysLeuGluSerAsp 3700 3800 LysCIuIIisTyCCluLeuS»rI’roCluCInPheCjuClyLeutysAlaCluValyrArgSerArgTbrbeuLeuh]isHiALysAApI IeCluLeuCIuCln 3900 A1aLysAr~C1nX’a lSerLeuArgAlaSerLysAsnTyrPheTbrAlaSerLeuGIuArgAIaLysGluLysAJaLysGlyGluSeCl íeAspArgLeL 4000 LysSerCluI lelysArgLeuLysAtncluAsnSenl leLeuArgGln0lnAsnÁspLysNetLeuClyLysLeukrgGluLeuMetProksptysAla 4100 PheLysAsnteuLeuSerGluteuLysAlalleLysfrolleValAsollelleLystysAIaI 1eG1uL~sSerLeuPhe 4200 rrÁcTTGTTGTcAXATACÁCCATGGÁATÁAAÁÁOCGTCAÁAAGTcrGAGTGGATGAmCCCTATGGIÁCTcUTTCGcCTrrGAcnTTTTGcTÁTKA 4300 TTTAACTGTCGCCACTTCTTCCCTCAGCTAATCCGAACTTAGACTGOAGGTGACCCTTOTGAAGACATTCCTCCAGCTTGTCTTTOTCCCTTTTGTCGfl 4400 GCCGTTC-3 Figura 6. Secuenciade nucieótidosdel DNA de pLSI. Se muestrala secuenciade la cadenacodificante del plásmido,comenzandoen el sitio de referencia.P~iI y extendiéndoseen dirección 5’--- 3’. Los putativos polipéptidoscodificadospor lascuatroo E.coti H56Orev F ~ ga~ ~ (int::PtacUV5-T7genl iurn2i nin5> thyA ~ met endA F.W.Stuclier S.A.Lacks Esoli XLl-BLue - + hsdRilCrk !flk ) taritda Ctac) tFnroAB ~ 2AN15 Stratagene TnlO(tet)3 recAí retAl endAl gvrAQó thi suoE44 22 TABLA 2: plásmidos utilizados Ptásmido Tamaño Marcador Observaciones Procedencia (Pb> TCr Plésmido natural aislado de S.acalactiae TCr Deleeján del fragmento ECoRI E de ~V158 TCr Deteción in vivo de un derivado de 181 en B.subtitis Deleción del fragmento I4indlII-NcoJ menor de pl85 Te r Terminador bidirecelonal de •29 donado en EcoRI de pLS4 Ter Transversión c -. A en coordenada 743 de pUSí Ter Dejecián del fragmento Hindl!!-&eol menor de pLSleoD7 Ter Deteeión por BAUM de pLS1 tinearizado en Sant TCr Construido a partir de pLSS por relleno del sitio único ~p~UI Ter Deleción por BAL3I de pLSl tinearizado en Sql ! TCr Deleción por BAL3I de pLSlcoo7 linearizado en BqLI Ter Deleejón por SAL31 de pLSl linearizado en 5gW Oeleción por BAL31 de pLSícooY tinearizado en Ter Deleción por BAL31 de pLSlcoo7 linearizado en Ter Deleción por BAUM de pLSl linearizado en Te rcmr Hibrido entre pUSí y pC194 Te rcmr Construido a partir de pJS3T por relleno del sitio único Acel eJ fleleción in vivo de pJS37. Contiene la transversión C -. A (coordenada 743 de pisí> Cmr Fragmento Pstl A de pJS3coo7 ligado al fragmento PstI 8 de pl55 eJ Fragmento Ap~Ll-Hind1I1 grande de pJS3coo7 ligado al fragmento ~p~L1-HindllIpalueño de pLSS cmr Deleción in vivo de pJS37 Cmr Nutante de copia de pCíQ4 Cmr Fragmento AluI(505>-AluI<921) de pLSlcoo7 donado en l4indl II de pcl94coo Cmr Fragmento A1u1(505>-~fljI(8O4) de pLSI donado en HindIII de pCl94coo V.Eurdett Este laboratorio Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este laboratorio Este laboratorio Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este Este Este Este laboratorio taboratorio trabajo trabajo pNV1SB pLS1 pLS5 pL 84 pLS4- pLS1coo7 pUS? pLS1A24 pLS5eoo1 1 pLSIAA4 pLS1AA12 pLS1AA15 pl 8 2tA2 1 pLS1AA23 pLS1AA34 pJS37 pJS38 pJS3coo7 pJS3O pJS3Oeoo7 pJ £4 pCl94eoe pCGA l~~pZ pCt3A3 5542 4408 4076 3138 3451 4408 3470 3835 4080 4240 4256 4313 4257 4258 4245 7315 7317 4191 3859 3859 3354 2907 3319 3199 23 TABLA 2 (continuación): Plásmidos utilizados Plásmido Tamaño Marcador Observaciones Procedencia cpb) 3199 3151 3118 Car 3088 mr 3088 3070 3139 Cmr 31139 Cmr —4030 —8100 —7050 —7050 —6100 —5020 —5020 2656 —2950 —6200 —6000 —5600 APr AprTC r Ap r 10r APr Cmr Fragment<., ALul(5O5>-~sil(804> de pisicon? donado en Hindil! de pC¶94coo Cmr Delación del fragmento pequeño ~p~LI-Hqal de pCGA3 Fragmento Alul <62>-Alul (277> de pLSl donado en Mmdlii de pCl94eoo Fragmento Alul<320>-ALui<505) de pLS1 donado en HirdIII de pCl9keor (orientación a> Cnr Fragmento AluJ(320>-Alul(505> de pLSI donado en Mmdii! de pcl94coo (orientación b> Fragmento ~~yT(758>-4jág(921> de pLS1 donado en Hindilí de pCl94eoo Fragmento Ncol-~p4L1 pequeño de pLS1L24 donado en Hindin de pCl94coo (orientación b> Fragmento Ncol-4p~LI pequeño de pLS1:24 donado en Mmdii! de pCl94eoo (orientación a> Vector de transcripción basado en pBR322 Hibrido pLS5-pET5 Daleción del fragmento PstI C de pLS2l Deleción de los dos fragmentos BeIl menores de pLS21 rAp Deleción del fragmento pequeño Hindlii-»col de pLS19 Ter Delación del fragmento Sall-Pvul mayor de pLS2I Ter Reorientación de los fragmentos EcoRí de pLS2O rAp Vector de clonaje Ap Fragmento ~p~Ll(6O7>-Xnrl(902> de pLSl donado en el sitio SmaI de pIJC19 Te rKmr Vector de bajo núriero de copias Kmr Gen renA donado en pLG339 r Ap Plásmido para fusiones traduccionales con tacZ Fragmento Hinf 1 B de plSS donado en el sitio único BamNí de pNM482 Plásnido de E.coti basado en replicón CoIEl cat de pJS3 donado en p6R322 Miniderivado de un rw.~tante de copias de Rl rAp Replicón CotE? con un marcador de resistencia a almicilina Plásmido natural de S.aureus —9900 APr APrTC r Ap ~ r Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo F.W.Studier Este laboratorio Este laboratorio Este trabajo Este trabajo Este trabajo Este trabajo B io 1 abs Este trabajo P López Este trabajo J.C.Alonso Este trabajo Biolabs Este trabajo R.Díaz R.D(az pcGA3~p7 pCGA3O pCGA6 pCGA7 pCGA8 pCOA9 pCGA1 1 pCGA12 pE15 pLS21 pLS22 pLS19 pLSl8 pLS2O pUSO 2 ~tC19 pLG339 pLSMrenA pNM482 pLSNlacS p8R322 pBAG 1 pKN 182 ColEí 4361 5497 —6500 —13000 pl181 R . P . Nov i ck 24 2. MEDIOS DE CULTIVO . 2.1. Medio de cultivo de &pnewnonzae . El medioAGCH (Lacks, 1966) fue la baseparael crecimientode las estirpes de S.pneumoniae. Medio AGCH: Hidrolizado acido de caseína 5 g Hidrolizado enzimetico de caseína 1 g L-cisteína-HCl 40 mg L- triptófano 6 mg L-asparagina 50 mg L- glutamina 10 mg Adenina 5 mg Cloruro de colina 5 mg Pantotenato elicico 1.2 mg Acido nicotínico 0.3 mg Píridoxina-HGl 0.3 mg Tiamina-HOl 0.3 mg Riboflavina 0.14 mg Biotina 0.6 ¡ng K2HP04 8.5 g NaC2H3O2 1.25 g NaHGO3 0.4 g NgG12. 611/? 0.5 g CeCí2 0.6 g FeSO4. 7H20 0.5 mg CuSO4. 51120 0.5 mg ZnSO4. 7H20 0.5 mg MnSO4.4H20 0.2 mg Albúmina bovina (tracción V) 0.5 g Catalasa 3000 u Agua destilada y desionizada c.s.p. 1 1 pH 7.5 Como medio de cultivo líquido se empleó AGCH suplementadocon sacarosay rl-- -a- ~ - ~ C.1... extractode levadura(concentracionesunaiesoc un% y 0.2%, ¡es~c~uva~¡¡cmc7.t~11 Iu~ experimentosde marcaje iii vivo del DNA, se suprimió el extractode levadura. Parael crecimientoen medio sólido seutilizó AGCH suplementadocon sacarosay extractode levadura,al cual seañadióBacto-Agaral 1% (parala capabasal)o al 0.75% (parala sobrecapa). suandofue requerido,los mediosde cultivo sesuplementaroncon antibióticos.Salvo queseindiquc otra cosa,la selecciónaplicadafue: Tc 1 gg/ml; Cm 3 gg/ml. 25 2.2. Medios de cultivo de B.subtilis . Los mediosde cultivo para la puestaen competenciay transformaciónde las estirpesMB1I y CU403,así comoparala obtenciónde minicélulas,estánbasadosen los descritospor Youngy Wilson (1972). Sales SP(Sx) K2HPO4 KH2PO4 (NH4) 2~4 Citrato trisódico Agua destilada y desionizada c.s.p. Medio GM1 Sales SP(5x) MgSO4.7H20 D-glucosa Extracto de levadura Hidrolizado de caseína libre de vitaminas Requerimientos auxotróticos de la estirpe Agua destilada y desionizada osp. pH 7.0 Medio GM2 CM 1 MgSO4.7H20 Medio sólido Sales SP(5x) MgSO4. 7H20 0-glucosa Tirnina Cada uno de los 19 aminoacidos (salvo merionina) Bacto-Agar Agua destilada y desionizada osp. Medio completo para minicélulas CHí CaCl2.2Hp MnSO4.H/? 70 g 30 g 10 g Sg 11 200 ml 0.2 g Sg lg 0.2 g 50 mg 11 11 0.6 g 200 ¡nl 0.2 g Sg 40 mg 50 mg 15 g 11 11 75 mg 17 mg 1.4 mgPeCl3.6H20 26 Sales para minicélulas Sales SP(Sx) MgSO4. 7H20 CaCl2.21120 MnSO4.1120 FeCl3.6H20 Agua destilada y desionizada c.s.p. 200 ml 0.2 g 75 ¡ng 17 mg 1.4 mg 11 Por su parte,para la puestaen competenciay transformaciónde la estirpeMB63, se utilizaron los mediosdescritospor Joenjey cols (1973). Medio MRW: Sales SP(Sx) D-glucosa Agua destilada y desionizada osp 200 ml Sg 11 Medio BWC: Sales SP(Sx) D-glucosa L-valina L-lisina L- treonina L- asparagina L-rnetionina Glicina L- arginina L-hiscidina Timina MgSO4.7H20 Agua destilada y desionizada osp. Estemedio,sin timinay suplementadoconel restode los requerimientosauxotróficos de la estirpe,fue empleadoparael marcajeiii vivo del DNA. Medio sólido BWC 11 Bacto-Agar 15 g Parael crecimientorutinario de todaslas estirpesde B.subtilisseutilizó el medioTY. Medio TV Triptona 10 g 200 ml Sg 50 mg 50 mg SO mg 50 mg 50 mg 50 mg SO mg SO mg 20 mg 1.25 g 11 Extracto de levadura Sg 27 5NaCí Agua destilada y desionizada c.s.p. pH 7.3 g 11 El medioTY fue suplementadocon Bacto-Agar al 1.5% para su utilización como mediode cultivo sólido. Cuandofue necesario,se añadieronantibióticosa las concentracionesfinales de 10 pg/ml paraTc y 20 pg/ml para Cm. 2.3. Medios de cultivo de E.coli . Parael marcajein vivo de DNA, así comoparael marcajey purificación de proteínasseempleóel mediominera!definido M9, preparadosegúndescribenManiatis y cols (1982). Medio M9 Na2HPO4 KH2PO4 NaCí NH4Cl 6g 3g 0.5 g lg El pH se ajusta a 7.4, y esta mezcla de sales se esteriliza independientemente del resto de los componentes: CaCl2. 2H20 MgSO4. 7H9 D-glucosa 14.5 mg 246 mg 2g Cuandofue necesario,estemediosesuplementócon los requerimientosauxotróficos de cadaestirpe. Parael crecimientorutinario,asícomoparala puestaen competenciay transformación de las estirpesde E.coli, se utilizó el medioLB descritopor Luna y Berrows (1957). Medio LB Bacto triptona Extracto de levadura NaCí D- glucosa Agua destilada y desionizada c.s.p. pH 7 . 5 10 g 5 g lg lg 11 Para la preparaciónde extractosde replicaciónin vitro se empleóel medioLBR. 28 Medio LBR: Consisteenel medioLB al quesesuplementaconD-glucosahastaunaconcentración final del 0.2% y se le ajustael pH a 8.0 con KOH 5 M. Cuandoalguno de estos mediosse utilizó parael crecimientoen sólido, se añadió Bacto-Agaral 1.5% Cuandose añadieronantibióticos,las concentracionesfinalesde éstosfueron: Tc 10 gg/ml Cm 15 pg/ml Ap 50 pg/ml, exceptoparalos derivadosde pETS,en los que la concentraciónfinal fue de 200gg/ml. Kanamicina25 ¡íg/ml. 3. TAMPONES Y SOLUCIONES . Sedescribenaquílos tamponesy solucionesde uso general.Aquellosquesean específicosde una técnica concretase detallaránen el apartadocorrespondientedel capítulode Métodos. Tampón TE(IO:I): Tris-HCI lOmM pH 8.0, EDTA 1 mM. Tampón TAE: Tris base 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 2 mM. El pH resultante es 8,1. Tampón TBE: Tris base89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2.5 mM. El pH resultante es8.3. TampóndecargaSLB(5x): Tris-HG250 mM pH 8.8,SDS5%, EDIA 10 mM, flME 25%, glicerol 50%, azul de bromofenol 1 mg/ml. Colorante de carga SBE(3x): Sacarosa30%, azul de bromofenol 0.075%, EDTA 2.5 mM. Colorante de carga BXGE(lOx): Azul de bromofenol 0.25%, xilencianol 0.25%, glicerol 60%, EDTA 10 mM. 29 ColorantedecargaCEC(3x): Azul de bromofenol0.02%,glicerol 50%, EDTA 2.5 mM. Colorante de carga BXF(lx): Formamida desionizada 80%, NaOH 10 mM, azul de bromofenol0.1%, xilencianol 0.1%, EDTA 1 mM. Solución SSC(20x) NaCí 3 M, citrato trisódico 0.3 M. Tamponesde enzimasmodificantesdel DNA Los tamponesparala actuacióndeendonucleasasde restriccióny otrosenzimas modificantes del DNA (DNA ligasa de T4, BAL31, nucleasaSI, etc...) fueron los recomendadospor las casassuministradoras,preparándosecomo soluciones10 veces concentradas. 4. ENZIMAS Y OTRAS PROTEINAS . Los enzimasde restricción,la DNA ligasa del fago T4, las nucleasasBAL3I y Sí, la fosfatasaalcalina de ternera, la polinucleótidoquinasadel fago T4, la DNA polimerasa1 de E.coli y su fragmento Klenow fueron suministrados por las firmas comerciales:New EnglandBiolabs, Boehringery Amersham. La RNA polimerasade E.coli fue de Promega. La DNasa 1 libre de RNasasy proteasasse obtuvo de Cooper Biomedical. La proteinasaK, la pronasa,]a RNasaA, la lisozima, la seroalbúminabovina (fracción V) y los patronesde pesomolecularde proteínasfueron suministradospor Sigma. 5. MATERIAL FOTOGRÁFICO Y DE AUTORRADIOGRAFIA . Parafotografiarlos gelesdeDNA teñidoscon EtBr,seutilizó unacámaraMP4 y películasT-55, de Polaroid, con iluminación inferior mediantetransiluminadorde 360 nm o 254 nm (Ultraviolel Products). Parala exposiciónautorradiográficade muestrasmarcadasseemplearonpelículasX- Omat 5 de Kodak. En exposicioneslargas de muestrasmarcadascon se utilizaron pantallasamplificadorasCronexLightningp]usde la casaDupont.El reveladorMicrophen y el fijador ácido Fyval fueron de las firmas llford y Valca, respectivamente. 30 6. OTROSPRODUCTOS . Los componentesde los mediosde cultivo seobtuvieronde Probus,Merck y Difco, estaúltima firma suministrótambiénel Na-DOC. Los antibióticosCm y Tc, el lPTG, el TEMED, el dimetil arsenato sódico,el DTT, la polivinilpirrolidona, el MOPS,el HEPES,e] tRNA deE.coli y los DNAs de timo de terneray de espermade salmónfueronde la casaSigma.La casaBoebringersuministró la ampicilina sódica,el PIPES, la ddlTP, y los NTPsy dNTPs no radiactivos. Las agarosas,la acrilamida,la bisacrilamida,la resmaBio-Rex (20-50 mesh),el SDS, así como los gelesde agarosay heparina-agarosafueronde Bio-Rad. Pharmaciasuministró: Ficolí, SephadexG-50, DEAE-Sephacely pd(N)5. La hidracinay el fiME fueronde la casaEastman-Kodak,el PSA fue de BRL. De la casa Aldrich-Chemie se obtuvieron el sulfato ferroso amónico y el FOTA utilizadospara la generaciónde radicaleshidroxilos. Merck suministró:EDTA, cloroformo,fenol, etanol,isopropanol,Tris, DMS, DM50, peróxido de hidrógeno,TCA, formato de piridina, piperidinay formamida. Cuandose necesitódesionizarla formamida,se procediócomo describenManiatis y cols (1982). La firma Schleicher& Schuell proporcionólos filtros de nitrocelulosaBA8S parala transferenciade Southerny el papel NA45 parala purificación de fragmentosde DNA apartir degelesde agarosa.Paraestapurificaciónseempleótambiénel Geneclean’de la casaBIO 101 Inc. El materia] radiactivofue suministradopor AmershamInternacional. 31 METODOS 1. CONSERVACION DE LAS ESTIRPES . Todas las estirpesfueron conservadasa ~70oC.Parael uso rutinario de las estirpesde pneumococosy de E.coli, sedispusotambiénde una coleccióna -300C. Antes de ser congelados,los cultivosdeS.pneumoniaey E.coli fueronajustadosa 10% de glicerol y mantenidosa 370C durante10 minutos.La descongelaciónde los cultivos en estasdos especiesse realizó a 4’C. Los cultivos deB.subti/is,por suparte,secongelarony descongelaronde forma rápida. La congelaciónse llevó a cabo en unamezclade nieve carbónicay etanol, tras añadir a los cultivos DMSO al 5%. La descongelaciónse realizó por incubaciónen un bañode aguaa 37~C 2. CONDICIONES DE CULTIVO . La temperaturade incubaciónfue de 370C para todas las estirpesutilizadas. Dado queS.pnewnoniaees unabacteriamicroaerófila,el cultivo en medio líquido de las estirpes de pneumococosse realizó en tubos o matracescuya capacidadno sobrepasarael doble del volumen del cultivo, y la incubación se realizó en baños termostatizadossin agitación. Cuando las estirpesde B.subtilis y E.coli fueron cultivadas en medio líquido, la incubación se realizó con agitacióny la capacidadde los matracesempleadosfue al menoscinco vecesmayor queel volumendel cultivo, parapermitir unabuenaaireación. El crecimientode los cultivos en medio líquido sesiguió, generalmente,midiendosu DO en un espectrofotómetroBausch& Lomb, modelo Spectronic20, a unaslongitudes de onda de 550, 600 y 650 nm paraB.subtilis,E.coli y S.pneumoniae,respectivamente. En ocasiones,el crecimientofue medido tambiéncomovariaciónen el númerode u.f.c. Para ello, se tomaron muestrasdel cultivo liquido a distintos tiempos, se diluyeron adecuadamentey se inocularonen medio sólido, que fue incubadopara permitir la formaciónde colonias.Es importanteresaltarque en S.pnewnoniaecadau.f.c. contiene unamediade cuatrocélulas (Lópezy cols, 1989). Los cultivos en medio sólido se realizaronen placaspetri con los medios indicados 32 en Materiales para cada bacteria. Para £pnewnoniae,las células y, en su caso, el antibiótico(s)fueronincluidosenunaprimeracapaquecontenía20 ml demedioconagar al 1%. Una vez solidificadala capabasal,seañadieron8 ml de medioconteniendoagar al 0.75%. En el casode B.subtilis y E.coli, el cultivo en medio sólido se realizó en superficie. 3. PUESTA EN COMPETENCIAY TRANSFORMACIONDE CELULAS BACTERIANAS . 3.1. &~pnewnoniae. ParalasestirpesdeS.pnewnoniaesesiguió el métododescritopor Lacks(1966). Un cultivo crecidohastaunaDO = 0.2 (1.5x108u.f?c./ml) fue diluido cuarentavecesen medio AGCH suplementadocon sacarosaal 0.2% y se permitió su crecimientoa 370C hastaquealcanzóde nuevouna DO = 0.2, momentoen el que podíaser congeladoy conservadoa ~7OoC.Previamentea la transformación,el cultivo fue diluido en una proporción1:20 en AGCH conteniendosacarosaal 0.2% y CaCI 2 al 0.001%.Tras una incubaciónde20 mm a 300C se añadióel DNA y secontinuó la incubacióna la misma temperaturadurante40 mm más.Parapermitir la expresiónfenotípicadel marcadorpara el que seiban a seleccionarlos transformantes,el cultivo fue incubadoa 37~C durante 90 mm. En el casode selecciónparaCmr, los últimos20 mm de expresióntuvieronlugar en presenciade 0.5 jtg/ml del antibiótico, concentraciónsubinhibitoriaque induce la expresióndel gen cat (cloramfenicolacetiltransferasa). 3.2. B.subtilis. El métodoempleadodependióde la estirpe quese deseabatransformar. B.subtiisMBIL fue puestaencompetenciay transformadasiguiendoel método descritopor Young y Wilson (1972). Una colonia aisladasobre medio sólido TY fue inoculadaen 100 ml de medio GM1. El cultivo se creciódurante12 a 14 h a 30’C en condicionesde baja aireación(el recipienteempleadofue unaprobetade 100 ml y no se empleóagitación),de forma que la DO al cabo de este tiempo no fuera superiora 0.1. El cultivo fue entoncestransferidoa un matrazde 2 1, en dondese incubó a 370C con fuerte agitación (300 rpm) hasta 90 mm despuésde que abandonarala fase 33 exponencial.Las células fueron recogidaspor centrifugacióna 10000 rpm en el rotor JAI4 (Beckman),a 40C, durante10 mm, y resuspendidasen 10 ml de sobrenadante.En estemomentolascélulaspodíansercongeladasy conservadasa-70~C.Artesde la adición delDNA, los cultivosconcentradosfuerondiluidos 100vecesenmedioGM2 e incubados a 370C con fuerteagitaciónel tiempo necesariopara alcanzarla máximacompetencia, el cual hubo de ser calculadoparacadalote de células competentes.Unavez añadido el DNA, los cultivos fueronincubadosen las mismascondicionesdurante45 mm. Para permitirla expresiónfenotípicade los marcadoresde selección,la incubaciónseprosiguió duranteotros 45 mm. Cuandose iban a seleccionartransformantesCmr, se indujo la expresióndel gencaz’ en las condicionesdescritasparaSJpneuznoniae. Paralocalizarel pico de máximacompetenciaparacadalote de células,serealizó una transformaciónempleandocomodonadorel DNA de unaestirpedeB.subz’ilis protótrofa parametionina.Unpg de esteDNA fue añadidoa 1 ml de célulascompetentesincubadas 60, 90 o 120 mm en medioGM2 y el procesosecontinuócomosedescribeen el párrafo anterior. Para determinarel número de transformantes,se extendierondiluciones apropiadasde los cultivos transformadosen placasde mediosólido. El númerototal de viablesfue tambiéndeterminadosobreplacasde estemediosuplementadocon 50 ¡sg/ml demetionina.Paracadatiempo secalculóla frecuenciade transformacióndefinidacomo el porcentajede células viablesque han sido transformadaspara dicho marcador,y se eligió el tiempo correspondientea la máximafrecuencia. Parala puestaen competenciay transformaciónde la estirpeCU403 seutilizó el método anterior, ligeramentemodificado. Así, 90 mm despuésde abandonarla fase exponencial,el cultivo fue directamentediluido enunaproporción1:10 en el medioGM2. Tras 90 mm de incubación,el cultivo fue centrifugadoy concentrado10 vecesantesde la adición del DNA. Por su parte,el métododescritopor Joenjey cols(1973),fue el utilizadopara ponercompetentey transfomarla estirpeMB63. Una coloniafue inoculadaen 50 ml de medio MBW suplementadocon 50 pg/ml de triptófano,20 ¡sg/ml de timina y 3 mM de MgSO 4.El cultivo secreciódurante12 h a37~Cencondicionesde fuerteaireación,siendo entoncesdiluido 7 vecescon medio BWC que conteníatriptófanoa una concentración final de 50 ¡sg/ml. La incubación se prosiguió en las mismascondicionesdurante3.5 horas,al cabode las cualesel cultivo podíaser congeladoy conservadoa ~70oC.Antes deañadirel DNA el cultivo sediluyó volumenavolumencon medioMBW suplementJo con los requerimientosauxotróficosy se incubó a 370C confuerteagitaciónhastaquese alcanzóel pico de máximacompetencia.Tras la adición del DNA se procediócomose hadescritoen los párrafosanteriores.El pico demáximacompetenciasedeterminópara 34 cadanuevo lote de células de manerasimilar a la descritapara la estirpeMBII, pero utilizando como fuente de DNA transformanteuna estirpeprotótrofapara triptófano. La determinacióndelnúmerode transformantesparacadatiempose realizósobreplacas de medio sólido. Este medio, suplementadocon 50 gg/ml de triptófano, se usó para determinarel númerototal de viables. 3.3. E.coli. La transformaciónbacterianade las distintasestirpesde E.coll se llevó a cabo medianteuna modificación del método descritopor Kushner (1978). Se inocularon 15 ml de medio LB con 0.1 ml de un cultivo en fase estacionaria, incubándosea 370C con agitaciónfuerte (300 rpm) hastaquese alcanzóuna DO = 0.5. Las célulasfueron recogidaspor centrifugaciónde 10 mm a 8000 rpm en el rotor JA2() (Beckman),a 4oC, y se resuspendieronen 7.5 ml de tampónA (MOPS 10 mM pH 7, KCI 10 mM). Tras unanuevacentrifugaciónen las mismascondiciones,el sedimentocelular se resuspendiómuy suavementeen 7.5 ml de tampónB (MOPS 100 mM pH 6.5, KCI 10 mM, CaO250 mM). La suspensiónseincubé30 mm a 4’C y, trascentrifugar,las células fueron suavementeresuspendidasen 1.5 ml de tampón B, añadiéndoseDMSO a una concentraciónfinal del 1.6%. A 0.2 ml de suspensiónasí tratadase le adicionaron1-200 ng del DNA transformante.Lasmezclasfueronmantenidas30 mm a 0~C antesdesometer a las célulasa un choquetérmico de 30 segundosa 43.5~C. A continuaciónse añadieron 1.3 ml de medio LB y se permitió la expresión fenotípica de los marcadorespor incubacióna 37oCdurante1 h, sin agitación.Cuandose trató del marcadorparaCmr, las célulassemantuvieronen presenciade 0.5 ¡sg/ml de Cm durantelos últimos 20 mm de expresmon. 4 DETERMINACION DEL NUMERO DE COPIAS PLASMIDICO . 4.1. Determinaciones densitométricas . Estemétodo,basadoesencialmenteenel descritopor Projany cols (1983),se utilizó para determinarlos númerosde copias relativosde diferentesplásmidosen un mismo huésped. Se prepararon,siguiendoel protocolodetalladoen el apartado7.1, extractoscrudos de los cultivos cuyocontenidoplasmídicosedeseabacuantificar.Laspreparacionesfueron 35 cargadasengelesde agarosaal 1.2%y fueronsometidasaelectroforesisentampónTAE, a 2.5 V/cm durante14 h. Los gelesse tiñeron durante30 mm en el mismo tampón conteniendo2 ¡sg/ml de EtBr, y acontinuaciónsemantuvieronsumergidos1 h en agua destilada,conobjetode reducirla fluorescenciadefondo. De cadagel serealizaronvarias fotografíasa distintostiemposde exposición,iluminando con luz ultravioletade 254 nm. Los negativosfueron analizadospor densitometría,comosedescribeen el apartado13 de estemismo capítulo. Dadoqueel grupoplanardel EtBr se intercalaen mayorgradoen las formaslineales y OC del DNA queen su forma ccc, los valoresdensitométricoscorrespondientesa esta última forma debíansermultiplicados,parael cálculode] númerode copias,por un factor de correcciónqueProjany cols (1983) hanestimadoen 1.36. El númerode moléculas de plásmidopor equivalentecromosómico(n) fue calculadoa partir de la ecuación: (Dp1 + 1.36 >c Dp2) x Mc n = DcxMp donde Dp~ es el valor determinadopor densitometríaparala bandacorrespondiente a las formasOC del plásmido. DR es e] valor determinadopor densitornetríaparala bandacorrespondiente a las formasplasmídicasccc. Mc es el tamaño del DNA genómico,estimadoen 3x10 6 pb para las tres especiesbacterianasen estudio(Lacks y coN, 1986). Dc es el valor determinadopor densitometriaparala bandacorrespondiente al DNA cromosomico. Mp es el tamañodel DNA plasmídicoen ph. 4.2. Marcajede DNA total in vivo . Se siguió el método descritopor Lacks y cols (1986). Las estirpesy medios básicosutilizadospara el marcajefueron: 36 - S.pneunioniae560, en el medio AGCH suplementadocon sacarosaal 0.2%. - B.subtilisMBÓ3, empleándoseel medioBWC sin timinay suplementadocon50 ¡sg/ml de triptófano. - E.coli H56Orev, en medio M9 suplementadocon argininay metioninaa una concentraciónfinal de 50 ¡sg/ml. Estasestirpes(véaseTabla 1), conteniendolos plásmidosde interés,se crecieron durante10 generacionesen los medios indicados,suplementadosconla concentración adecuadadel antibióticocorrespondienteal marcadorplasmídicoy con [3Hj-timidina(15 Ci/mmol) a una concentraciónfinal de 3 pM. A partir de dichoscultivos se prepararon extractosdeDNA total, siguiendoel métododescritoen el apartado7.1. de estecapítulo. Los extractosse sometierona electroforesisen geles de agarosaal 0.8%, en las condicionesdescritasenel apartadoanterior.Trasteñir conEtBr losgeles,seescindieron trozosde los mismosque conteníanlas bandascorrespondientesal DNA cromosómico y a las distintasformasde DNA plasmídico.La agarosade cadatrozo de gel se disolvió en 1 ml de DMSO y, tras la adiciónde 10 ml de líquido de centelleoReady-solvHP/fr se contó la radiactividadde las distintas bandasde DNA. El númerode moléculasde plásmido por equivalentecromosómico (n) se calculó, a partir de los valores de radiactividadde tres experimentosindependientes,usandola siguienteecuación: RpxMc n = RcxMp donde: Rp es la sumade los valoresde radiactividadde las distintasbandasde DNA plasmídicobicatenario. Rc es el valor de radiactividadcorrespondienteal DNA cromosómico. Mc es el tamañodel cromosoma(3x108 pb en las tres especies). Mp esel tamañodel plásmidoen pb. Estas determinacionesdel número de copias plasmídico se realizaron también 37 utilizandocomohuéspedesestirpesprotótrofasparatimidina. En estoscasosla eficiencia del marcaje fue menor, pero los resultadosfueron similaresa los obtenidoscon las estirpesauxótrofas. En ningunode los dos procedimientospara la determinacióndel númerode copias plasmídico(densitometríao marcajedel DNA) setuvo encuentala presenciadessDNA, que a veces,sin embargo,representaunaparteimportantedel DNA plasmídicotota]. 5. ‘FESTS DE ESTABILIDAD . Se prepararoncultivos de las estirpesqueconteníanlos plásrnidosen estudio en medio líquido selectivo, y se crecieron hasta una DO de 0.4, a la cual fueron consideradoscomocultivos departida(g=0). A continuación,los cultivos fuerondiluidos sucesivamenteen una proporción 1:1023 en medio sin antibiótico, permitiéndosesu crecimientohastaalcanzarla DO de partida.De estaforma semantuvoconstantemente en 10 el númerode generacionestranscurridoen cadadilución. Cada 10 generaciones se tomaronmuestrasde los cultivos, se diluyeron apropiadamentey se extendieronen placasde mediocon y sin presiónde selecciónparadeterminarel porcentajede células con plásmido.Cuandolos plásmidoseranmuy inestableso su velocidadde pérdidase iba incrementando,se analizaronuna a una las primerasgeneraciones.En estoscasos, los cultivosdiluidos a la mitad conmediono selectivocontendríanaúnunaconcentración deantibióticosuficienteparaseleccionarlas célulascon plásmido,por lo quelos cultivos departida(enmedioselectivoy crecidosaDO de 0.4) fueroncentrifugadosy las células se resuspendieronsuavementeen un volumenigual al inicial de medio sin antibiótico. Esta suspensiónfue consideradacomo g=0, y una muestrade la misma se analizó inmediatamente.Paracadageneración,los cultivos se diluyeron enunaproporción 1:1 con medio no selectivoy se crecieronhastauna DO de 0.4, a la cual se analizó el porcentajede células con plásmidoy se procedióa diluir nuevamentee] cultivo. La tasaexperimentalde pérdidadel plásmidopor célulay generación(Le) secalculó a partir de la ecuación: = 1 - Siendo P la frecuenciade células viablesque conservanel plásmidotras crecerel cultivo duranten generacionesen medio sin presiónselectiva. 38 Dado que, en ocasiones,el cultivo en mediocon presiónselectiva(O generaciones) presentabaya una determinadaproporción de células sin plásmido, el valor de la frecuenciade célulascon plásmidoen un momentodado debíahacerserelativo al valor de estafrecuenciaen el cultivo de partida,por lo quela ecuaciónutilizadafue: = 1 - (P/PJ’~ DondeP0 esla frecuenciainicia] de células con plásmido(en el cultivo con presión de selección). 6. TESTS DE INCOMPATIBILIDAD . Estos experimentossehan llevado a cabo utilizando como huéspedla estirpe 708 de S.pneuníoniae(Tabla 1). Se realizarondos tipos de pruebas,cuyo desarrollo experimentalfue similar al descritopor Nordstrdmy cols (1980a,1980b). Test 1. Se pusieronen competenciapneumococosque conteníane] plásmido de interés,basadoen el replicónpLS1. Lascélulasfuerontransformadasconun segundo plásmido,derivadode pCl94, cuyo efectosobre la estabilidadsegregacionaly número de copiasdel primero sedeseabaanalizar.Los transformantesfueron aisladosen placas con Cm, dado queel plásmidodonadorconfiereresistenciaa esteantibiótico.Después de permitir e] crecimientode las coloniashastaun tamañomedio, 12-24de éstasfueron inoculadasen mediolíquido conteniendodichoantibiótico.Lescultivos secrecieronhasta una DO de 0.5 y se determinó el porcentaje de células resistentesa Tc (que aún conservanel replicón pLSI). Asimismo, seanalizóel contenidototal de DNA de dichos cultivos mediantela preparaciónde extractoscrudos.Hemosestimadoquesonnecesarias unas25 generacionespara queunau.f.c. dé lugar a unacolonia de tamañomedio.Este valor seha deducidoapartir del númeromediototal de u.f.c. presentesen estascolonias (30x10 6),determinadomedianterecuentoen placas.Por otraparte,son necesariasunas 12 generacionespara que la porción de colonia inoculada en e] medio líquido (aproximadamente4x105 u.f.c. en 4.5 ml de medio) dé lugar a un cultivo crecido hasta unaDO de 0.5. Por todo ello, enestetipo de experimentosse eva]úanlos efectosde un plásmidodonadorsobrela segregacióny númerode copiasde otro plásmidoresidente, tras 37 generacionesen ausenciade presiónselectivaparaesteúltimo. 39 Test II. En estosexperimentos,un plástnidoderivadode pLS1 fue transferido a célulasque conteníancomoresidenteun plásmidobasadoen el replicónpC194.Los transformantesfueron seleccionadosindistintamentepara Tcr, marcadordel plásmido donador,o paraTcr y Cmr, Las colonias se inocularonen medio líquido en el que se mantuvola mismapresióndeselección.A partir deestoscultivosseprepararonextractos crudosparavisualizar el efectoqueejercela presenciadelplásmidoresidentesobre el número de copias del replicón pLSl. A continuación los cultivos se diluyeron sucesivamenteen medio sin presión de selecciónpara el plásmidodonador.Cada 10 generacionesse calculó el porcentaje de células que contienen el replicón pLSI (resistentesa Tc) y sevisualizóel contenidototal de DNA, mediantela preparacionde extractoscrudos. 7. PREPARACIONESDE DNA . 7.1. Extractoscrudoscelulares . Estefue el métodoelegido,porsusencillezy rapidez,paraanalizarel contenido piasmídicode las estirpesen estudio.Hay queteneren cuentaqueel DNA cromosómico no eseliminadoen estetipo depreparación.El métodofue aplicado,conmodificaciones, a los tres géneroscon los que se trabajó. Para B.subtilis y E.coli, las célulasde 10 ml de cultivo crecido hastauna 00 de 0.4 fueronrecogidaspor centrifugacióny resuspendidasen 100 pl de solución de lisis (RNasa A 20 ¡sg/m], lisozima2 mg/mi, sacarosa25%, NaCí0.1 M, Tris-HCI 50 mM, pH 8.0). La mezclafue incubada10 mm a 37’C. Para S.pneumoniae,se centrifugaron1.5 ml de cultivo crecidohastauna00 de 0.5. El sedimentocelular se resuspendióen 100 pl de solución de lisis (RNasaA 20 ¡sg/mí, sacarosa25%, citrato trisódico 0.15 M, SOS 0.01%, Na-DOC 0.1%) y la mezcla se mantuvo7 mm a temperaturaambiente. A continuación,y ya paralos tresgéneros,seañadieron10 pI de unasolución de SOS al 10%. Los usadoscelularesse agitaronvigorosamentedurante3 mm y sc sometieron a cuatrociclos de congelacióna -70’C y descongelacióna 37’C, con el fin de disminuir suviscosidadpor rotura del DNA cromosómico.Tras esteproceso,se añadióproteinasa K a una concentraciónfinal de 170 ¡sg/ml y se dejó actuara temperaturaambiente 40 durante10 mm. Se añadieronentonces50 pl del colorantede cargaCEC(3x>,conlo que los extractoscrudosquedaronlistos parasersometidosa electroforesis. 7.2. Minipreparacionesplasnildicas . Estemétodo,basadoen el descritopor Birboim y Doly (1979),consisteen la eliminación selectivadel DNA cromosómicomediantesu desnaturalizaciónalcalina y posteriorprecipitación.El procedimientose describea continuación: Se recogieron,por centrifugaciónenmicrocentrífugaEppendorf,lascélulasde 1.5 ml de cultivo en faseestacionariatemprana.El sedimentocelular fue resuspendidoen 100 ¡si de solución 1 (glucosa50 mM, EPTA. 10 mM,Tris-HCl 50 mM, pH 8.0), conteniendo 2 mg/ml de lisozima (B.subtilisyE.colO00.1%deNa-DOC(S.pnewnoniae).Las mezclas fueronincubadasa 37oC durante10 mm. La lisis total y la desnaturalizacióndel DNA cromosómicoseobtuvieronpor adiciónde200 ¡sí de solución II, quecontieneSDS al 1% y NaOH 0.2 N (B.subtilisy E.coli) o 0.17 N (S.pnewnoniae).Tras mezclarsuavemente, las preparacionesse mantuvieron5 mm a 0’C y a continuaciónse neutralizaronpor adición de 150 ¡sí de solución III (acetatopotásico3 M, pH 4.8). Las mezclas se mantuvieron60 mm a 0~C, siendoa continuación centrifugadasdurante10 mm en microcentrífuga.El sobrenadante(libre ya de DNA cromosómicoy restoscelulares)fue recogidoy tratadocon una mezclade fenol:cloroformo,y el DNA plasmídicopresente fue precipitadoy procesado,todo ello comosedescribeen el apartado8 de estecapítulo, teniendoen cuentaqueen la primeraprecipitaciónno esnecesarioañadiracetatosódico, ya quela concentraciónnecesariadecatiónmonovalenteyaesproporcionada,concreces, por el acetatopotásicopresenteen la soluciónIII. Las preparacionesde DNA, unavez disueltasen el volumendeseadode tampónTE(l0:1), quedaronlistasparaser sometidas a electroforesiso a cualquierotro tratamiento. 7.3. Preparaciónde plásmidosDuros . El método empleadopara la preparacióna gran escalade DNA plasmídico puro fue básicamenteel mismo para£pneumoniaey E.coli, diferenciándosesólo en el procedimientode lisis celular. Cultivos de 1 1 fueron crecidos hastaalcanzarla fase estacionariatemprana.Las célulasse sedimentaronpor centrifugaciónde 15 ruin a 8000 rpm, en el rotor JAlO 41 (Beckman),a40C, y seresuspendieronen200 ml de tampónTE(50:20) (Tris-HCI50 mM pH 8.0, EDTA 20 mM), centrifugándosede nuevoen las mismascondiciones. Lisis celularparaE.coli. El sedimentocelular se resuspendióen 100 ml de tampón de lisis (lisozima 2 mg/mi, sacarosa20%, EDTA 1 mM, Tris-HCl lID mM pH 8.0), incubándose10 mm a 370C. A continuaciónse añadieron80 mi de EDTA 0.25 M, y la mezclasemantuvoen hielo durante10 miii. Unalisis clara se consiguiópor adición de 100 ml de unasoluciónde SDS al 15%enTE(10:1),e incubacióna 370C durante10 mm. Lisis celularparaS.pnewnoniae.Las célulasfueronresuspendidasen12 ml deEDTA 0.25 M, añadiéndosea continuación40 ml de solución de lisis (sacarosa25%, citrato trisódico0.15 M, Na-DOC0.1%,SDS0.01%) eincubándosela mezcla5 mm a 370C. Tras la adiciónde pronasaaunaconcentraciónfinal de 0.7 mg/mí, seprosiguióla incubación a 37~C duranteotros 10 mm, transcurridoslos cualesseañadieron124 ml de TE(10:1) y 24 ml de SDS 10%, y se continuóla incubaciónhastaobservarlisis clara. A los lisadosclaros asíobtenidos,se les añadióNaCí hastauna concentraciónfinal de 1 M, manteniéndoseacontinuaciónde 12-16 h a 4~C. Los restoscelularesy granparte del DNA cromosómicofueron eliminados,como sedimento,por centrifugacióna 12000 rpm en rotor JA14 (Beckman)durante1 h a 4’C. Los ácidos nucleicospresentesen el sobrenadantefueron precipitados,durante7 Ii a 4’C, por adición de PEG-6000a una concentraciónfinal del 10%. El precipitadofue recogidopor centrifugacióna 7000 rpm en rotor JA14, 20 mm, a 40C, y resuspendidoen 10 ml de TE(l0:1), añadiéndosea continuación10.5 g de CsCI, y EtBr a una concentraciónfinal de 0.5 mg/ml. La mezclase transfirió a un tubo de ultracentrifugaBeckmantipo Quick-seal,siendocentrifugada48 horas a 40000 rpm en el rotor Ti-65 de la ultracentrífugaBeckman(mod. L-80), a 180C. El DNA sevisualizópor iluminación con una lámparade luz ultravioletade 360 nm. La bandadeDNA plasmídicoccc fue extraídamediantepunciónlateraldel tubo con una agujaacopladaa unajeringa de 1 ml. El EtBr presenteen la muestraseextrajopor adición de un volumende isopropanol saturadocon SSC(20x).Las dos fasesfueron mezcladasy, tras permitir de nuevo su separación,se retiró la fasesuperior correspondienteal isopropanoLEste procesose repitió hastaquela faseisopropanólicaquedótotalmenteincolora. Con objetode eliminarel CsCI, lasmuestrassedializaronenbolsasde diálisis,como se describeen el apartado8 de estecapítulo. 42 7.4. Valoración del DNA . La valoración de la cantidad y grado de pureza del DNA presente en una muestrase realizópor espectrofotometría,midiendola absorciónde las muestrasenun rango de longitudes de onda entre 230 y 330 nm en un espectrofotómetroShimadzu, modelo UV-160. El valor de la absorcióna 258nmpermitiócalcularla concentracióndeDNA presente en la muestra,ya que,aestalongituddeonda,unaabsorción= 1 correspondea50 ¡sg/ml de dsDNA. Por su parte,la relaciónentrelos valoresde la absorcióna258 y 280nm proporcionó una estimaciónde la purezadel DNA. En preparacionesaceptablementepuras, esta relaciónescercanaa 2. Si haycontaminaciónconproteínaso fenol,el valor de la relación disminuirásignificativamente. 8. FENOLIZACTON. PRECIPITACION Y DIALISIS DEL DNA . En general, la desproteinizaciónde las muestrasde DNA se realizó por extracciónconunamezcla1:1 (y/y) de fenol y cloroformo,endondefenol hacereferencia a fenol equilibrado con TE(l0:l) y conteniendohidroxiquinoleinaal 0.1% y gME al 0.2%, y cloroformo se refiere a una mezcla de cloroformo:alcohol isoamílico en proporción24:1 (y/y). Lasmuestrasse trataronconunvolumende fenol:cloroformo(1:1) y, tras 1 mm de vigorosa agitación, se separaronlas fases acuosay orgánica por centrifugacióndurante5 miii enla microcentrífuga,recuperándosela fasesuperioracuosa que contieneel DNA. Cuandola cantidadde DNA presenteen la muestrafue inferior a 5 ¡sg, la faseorgánicafue reextraidacon un volumende TE(l0:1). Tras el tratamientodel DNA con fosfatasaalcalina, y con el fin de asegurarla eliminación total de la actividadenzimática,las muestrasfueron tratadasunavez con fenol, una vez con fenol:cloroformo y una vez con cloroformo. Cada uno de estos tratamientosserealizócomo se ha descritoparael del fenol:cloroformo. En todoslos casos,despuésde la desproteinización,el DNA fueprecipitadodosveces y lavado con etanolal 70%, comose describea continuación. Paraprecipitarel DNA presenteen unamuestra,a éstase le añadieron0.1 volúmenesde acetatosódico3 M (ajustadoa pH 7.0 con ácido acético)y a continuación, dos volúmenesdeetanolabsolutoo bienun volumende isopropanol.Cuandola cantidad 43 de DNA a precipitarfue inferior a 4 ¡sg, se añadieron5 ¡sg de tRNA, siemprey cuando el DNA no fueraa sersometidoposteriormenteaningunareacciónenzimáticaen la que el tRNA pudieratambiénservir de sustrato.La mezclade precipitaciónse mantuvoa ~70oCduranteun mínimo de 30 mm, o a -200C durante12 horas,siendoa continuación centrifugadaa 12000 rpm en el rotor 12001 de la centrífugaSigma 2MK, a ~l0oC.La duraciónde la centrifugacióndependióde la concentracióny tamañodelDNA presente en la muestra,variandoentre6 y 40 mm. Paraeliminar los restosde salesquepudieran quedarcon el precipitado,éstese lavó cuidadosamentecon etanolal 70%, realizándose, a continuaciónuna centrifugaciónde 10 mm en lasmismascondicionesanteriores.Una vez eliminado el sobrenadante,el precipitadose secó medianteun breve tratamiento bajo vacío, y se disolvió en el tampón deseado. Paradializarmuestrasde DNA seutilizarondosprocedimientos,dependiendo del volumen de las mismas. Cuandoel volumenfue inferior a 50 ¡sí, la diálisisse realizóenfiltros VS de Millipore, los cualesfueron colocadosen una placapetri conteniendo30 ml del tampón deseado. La muestraa dializar se aplicó sobre el filtro y se permitió la diálisis a temperatura ambientedurante40 mm. En el restode los casos,la diálisis se llevó a caboen bolsas,previamentehervidasen TE(10:1). El procesose realizóa40Cfrenteavolúmenesdetampón1000vecessuperiores al de la muestrade DNA, realizándosetrescambiosde dicho tampón. 9. MANIPULACION ENZIMATICA DEL DNA . 9.11. Di2estión con endonuc]easasde restricción . Estetipo de tratamientodel DNA se realizó,por lo general,en las condiciones de tampón,temperatura,unidadesde enzimay tiempo de reacción recomendadaspor la firma suministradoracorrespondiente. Si el DNA digerido iba a ser utilizado posteriormentepara otras manipulaciones enzimáticas,se procedióa fenolizar y precipitarlas muestras,eliminandoel excesode salesde las mismasmediantedos lavadoscon etanolo por diálisis en filtro. 44 9.2. Eliminación de extensionesDrotuberantes . La digestiónde las extensionesmonocatenariasenextremosprotuberantesde fragmentosde DNA se realizó por tratamientocon la nucleasaSí o con la nucleasa ‘mung-bean’.Estetipo de tratamientoseefectuóparaconvertirextremosprotuberantes defragmentosde DNA enextremosromos,con el fin depoderligar entresí fragmentos con extremosenprincipio incompatibles.Ya quelas nucleasasSi y “mung-bean”tienen tambiénactividadsobreel RNA, éstedebeestarausentede las muestrasdeDNA que van a ser tratadascon estosenzimas. Tratamientocon nucleasaSI. Para la eliminación de extensionesprotuberantesen fragmentosde restricciónde DNA, 4 ¡sg de dichos fragmentosfueron tratadoscon 1 unidadde nucleasaSI. La reacciónse llevó a cabo enun volumende 40 pl del tampón apropiado(ZnSO41 mM, NaCí 200 mM, acetatosódico30 mM pH 4.6), por incubación a 30~C durante30 mm. Tras la reacción,las muestrasfueron fenolizadasy precipitadas como sedescribeen el apartado8, antesde ser tratadascon la DNA ligasa de T4. Tratamiento con nucleasa “mung-bean”. Para este tratamiento se siguieron las indicacionesde la casaproveedoraen lo referentea concentracióndel DNA, unidades del enzima,tampón,temperaturay tiempo de incubación.Finalizadoel tratamiento,las muestrasfueronprocesadascomo se describeen el párrafo anterior. El tratamientocon “mung-bean”tiene la ventaja,sobreel tratamientocon nucleasa Si, de que no produceroturasde doble cadenaen el DNA a partir de roturasen una solahebra. 9.3. Relleno de extremos 3’ recesivosmediante Pol 1K . Estetratamientopermitió la conversiónde fragmentosde DNA con extremos 5’ protuberantesincompatibles,en fragmentoscon extremosromos,queya podíanser ligadosentresí. La reacciónse llevó a caboen un volumende 25 ¡sí conteniendo,además del tampónapropiado,1 pg de DNA, 2.5 u del enzimay los 4 dNTPs,cadaunode ellos a unaconcentraciónfinal de 0.1 mM. Tras unaincubaciónde 30 mm a 20~C, e] enzima fue inactivadopor tratamientoa 700Cdurante10 mm, y las muestrasseprocesaroncomo erahabitual. Cuandoel objetodel tratamientoconesteenzimafue el marcajedelDNA, seprocedió como sedetallaen el apartado12.2. 45 9.4. Di~est¡éncon nucleasaBAL31 . El DNA p]asmidico se linearizó con el enzima de restricción deseadoy, previamentea la digestión con BAL31, la preparaciónde DNA se purificó mediante fenolización,precipitacióncon etanoly eliminación de los restosde sales. Las condicionesde digestióncon BAL3I (cantidad de enzimay tiempo de digestión> se calcularonpreviamentepara cadaexperimento,en función del númerode paresde basesde cadaextremodel DNA que interesabadigerir. Las digestionescon nucleasa BAL3I descritasen estetrabajose realizaronen un volumen de 100 ¡sí que conteníael tampónespecificadopor la casaproveedora,4 ¡sg de DNA, y 1 unidad del enzima.La mezclade reacciónse incubó a 300C, y a distintos tiempos(entre 1 y 15 mm) se fueron tomandoalícuotas,a las que se les añadióEGTA a unaconcentraciónfina] de 40 mM parapararla reacción.Unapartede cadaunade lasalícuotassesometióa electroforesis en gel de agarosacon el fin de analizar la extensiónde la digestiónpor BAL3I a los distintos tiempos. Despuésde juntar las alícuotasen las que los fragmentosde DNA presentabantamañosen el rangodeseado,la mezclafuefenolizaday el DNA precipitado. A continuación,el DNA digerido con BAL3I se trató con Pol 1K y, seguidamente,con DNA ligasa. 9.5. Lleación de fra2mentosde DNA . En estos tratamientosse empleó la DNA ligasa del fago T4. La reacción se llevó a caboa 1SOC, duranteun mínimo 4 horas. Para ligar entre sí diferentes moléculas de DNA se mezclaron, generalmente cantidadesequimolecularesde lasmismasenunvolumende 20 pl conteniendoel tampón especificadopor la firma comercial,entre2 y 5 ¡sg de DNA, y 1 unidadde ligasa.Tras una primerareacciónde ligación, la mezclase diluyó 10 vecesy se añadióotra unidad del enzima,conel fin de favorecerla recircularizacióndelasmoléculasantesdeproceder a la transformaciónde los cultivos bacterianos. Si los fragmentosqueiban a serligadospresentabanextremoscohesivos,las muestras semantuvieron10 mm a 65”C antesde procedera la reacciónde ligación, con el fin de eliminar los apareamientosentre los extremoscohesivosde la misma molécula o de moléculasdel mismo tipo. Parala ligación de fragmentosde DNA con extremosromos,seañadióespermidina 1 mM a la mezclade reaccióny seincrementóa] dobleJa cantidadde DNA ligasa. 46 9.6. Detección de sitios sensiblesa micleasa SI en DNA sunerenrollado . Paralocalizar los sitios sensiblesa la nucleasaSi sobreDNA superenrollado, seutilizaronlas condicionesque se detallana continuación: El DNA superenirolladodel plásmidopBR322,cuyos sitios sensiblesa Sí hansido localizados(Lilley, 1980), seempleóparaponera punto las condicionesexperimentales de estosensayosen lo querespectaa lascantidadesde enzimay sustratoy a los tiempos y temperaturasde incubación.Se vió así que, a temperaturassuperioresa 39~C, se producíala degradacióninespecíficade todo el DNA. Las condicionesescogidasfueron las queprodujeron una mayor proporción de formas linealesfrente a OC, puestoque en estetipo de experimentossólo sepuedenlocalizar los sitios en los quela nucleasaSI produceroturasde doblecadena.Las reaccionescontenían,en un volumen de 20 pl, el tampóndescritoen el apartado9.2, 1 ¡sg de ccc DNA y 1 unidaddel enzima,y fueron incubadas,bien a 37’C durante5 horas,bien a 100Cdurante12 horas.Tras la incubación, las muestrasfueronfenolizadasy el DNA precipitadoy lavado.Con el fin de posicionar los sitios sensiblesa SI conrespectoa los sitios decortepor endonucleasasde restricción, las muestrastratadascon Sí fueron digeridas,acontinuación,con enzimasde restricción paralas cualesel DNA en cuestiónpresentarauno o pocossitios de reconocimiento,y los fragmentosresultantesfueron analizadosmedianteelectroforesisen gelesde agarosa al 1%. 10. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS . 10.1. Electroforesis en gelesde agarosa . Se utilizaron geleshorizontalesde agarosaauna concentraciónvariableentre el 0.8%y el 1.5%.La agarosasedisolvió, porcalentamiento,en tampóndeelectroforesis TAE o TBE, y la solución se enfrió a 5ttC antesde ser vertida sobre la cubetade electroforesis.Antes de ser cargadas,las muestrasse ajustarona unaconcentraciónlx de colorantede cargaSBE,BXGE o CEC.La electroforesisserealizóavoltajeconstante. Las dimensionesy porcentajede agarosade los geles,asícomolas condicionesdevoltaje y duraciónde la electroforesis,se variaronsegúnlas característicasdel ácido nucleicoa analizar.Tras la electroforesis,el DNA o RNA. de los gelesse tiñó por inmersión de los mismosen el tampón utilizado para la electroforesis,al que se añadió 1 ¡sg/ml de EtBr y se mantuvocon suaveagitacióndurante20 ó 30 mm. Cuandose requirió una 47 rápida observaciónde los ácidosnucleicos,o cuandodebía seguirsela migración de los mismosdurantela electroforesis,éstase realizó enpresenciade 1 ¡sg/ml de EtBr, que fue incluido tanto en el gel comoen el tampónde electroforesis.Los ácidosnucleicos sevisualizaronmedianteluz ultravioletaen un transiluminadordeondalarga(360nm). 10.2. Electroforesis en 2elesde PAA (PAGEY Parala resolucióndc fragmentosde DNA de 50 a 500 pb se utilizaron geles verticalesde acrilamida al 5%, bisacrilamidaal 0.13%, en tampón TAE conteniendo, además,TEMED al 0.05%y PSA al 0.12%. Las dimensionesde los gelesfueron: 14.5 cm deancho,14 cm de largo y 1.2 mm de espesor.Las muestrasseprepararoncomose indica en el apartadoanterior.La electroforesisse realizó a 100 V, y, unavez finalizada, el DNA fue teñido como se describeen 10.1. 10.3. Electroforesisen 2elesde secuenciación . Estosgelesdesnaturalizantesde PAA se utilizaron para la resoluciónde los productosde las reaccionesde secuenciación,parala determinacióndel tamañode los fragmentosprotegidosde la degradaciónpornucleasa51, parael análisisde los productos de la transcripciónin virro y para la determinaciónde las regionesde DNA protegidas por RepA frente a la acciónde la DNasa1 o del radicalhidroxilo. Los geles(40 cm de largo,36 cm de anchoy 0.35 mm de espesor)fueron sometidos a preelectroforesisdurante una hora antes de cargar las muestras.Estas fueron resuspendidasdirectamenteenel colorantede cargaBXF, cuandose tratabade muestras de DNA, o en el coloranteespecificadoen el apartado28 de estecapítulo, en el caso de tratarsede RNA. Las muestras,tras ser desnaturajizadaspor caientamientoa 950C durante5 mm, fueronenfriadasrápidamenteen hielo paraevitar la renaturalizaciónde los ácidosnucleicos.La electroforesisse realizó avoltaje constantede 1900V. En todos los casos,estosgelesconteníanurea8 M y PSA al 0.06%en tampónTBE más o menos concentrado.Las concentracionesde acrilamida,bisacrilamida,TEMED, tampónTBE, así como el tiempo de electroforesis,dependierondel tamañode los fragmentosa analizar: - Pararesolverfragmentosde 1 a30 bases,los gelesconteníanunaconcentracióndel 20% deacrilamida:bisacrilamida(38:1.3).LaproporcióndeTEMED fue de 0.02%.El tampón TBE se usó 0.5x. Las muestrasse corrieron hastaque el azul de bromofenolhubo 48 migrado 12 cm. - Los fragmentosen el rangode 24 a 100 basesseanalizaronengelesqueconteníanuna concentracióndel 8% de acrilamida:bisacrilamida(38:2). La concentraciónde TEMED fue de 0.05%. El tampónde electroforesisfue TBE quesedeseabaincorporany 6 u del enzima.La reacciónsellevó acaboa200C durante 115 mm, transcurridoslos cualesse añadieron2.5 nmolesde cadauno de los cuatrodNTPs fríos y secontinuóla incubacióndurante5 minutosmás.Estopermiteque los extremos3’ recesivosse rellenencompletamente,con lo quetodas las moléculasde DNA tendránel mismo tamaño.A continuaciónse llevó a cabo una extracción con fenol:cloroformo,seguidade dos precipitacionesy lavado con etanol. 12.3. Marcaje de DNA al azar ~or el método de extensión de cebadores . Se utilizó el método descritopor Feinbergy Vogelstein (1983). El DNA moldesedesnaturalizó,previamente,por calentamientoa 95oCdurante 10 mm, realizándosea continuaciónun enfriamientorápido.La reacciónse llevó a cabo en un volumen final de 25 pl, en presenciade 0.2 ¡sg del DNA molde desnaturalizado, 0.1 M de HEPES pH 6.6, 2.5 mM de MgCl 2, 5 mM de ~ME, 50 pCi de a-[ 32P]-dCTP (actividadespecíficade 3000 Ci/mmol), 10 pM de cadauno de los restantesdNTPsfríos, 52 2.2 ¡sg de cebadorespd(N), y 5 u de Pol 1K. La mezclaseincubó a 160C durante2 horas, al cabo de las cualesla reacciónseparó por adición de 0.2 M de EDTA. Después de realizar cualquiera de estos métodos de marcaje, el isótopo radiactivono incorporadoal DNA seeliminó por cromatografíade filtración a travésde SephadexG-50. Paraello seusaronjeringasde 1 ml quese llenaroncon SephadexG- 50 equilibradoen TE(10:1). Las columnasse empaquetaronpor centrifugacióna 2000 rpm durante4 mmn en rotor basculante.A continuaciónse aplicaronsobre la columna 200 pl de TE(l0:1), y secentrifugóen lasmismascondiciones.Estelavadose repitióuna vez másantesde aplicarla muestra(en un volumende 200¡sí) sobrela columnay volver acentrifugarexactamenteen las mismascondiciones.El volumeneluido(200pl) contenía el DNA libre ya de nucleótidosno incorporados.La pruebase congelóa ~20oC. 13. DENSITOMETRIA . La densitometríade las bandasde proteínao de DNA, marcadaso teñidas,se realizóutilizandoel densitómetroLKB Ultroscan2202acopladoa un computadorApple II. 14. SECUENCIACION DE DNA POR EL METODO DE DEGRADACION qUíMICA . El métodoutilizado se basóen el descritopor Maxam y Gilbert (1980). El DNA se marcóradiactivamenteen sus extremos5’ o 3’. La marcade uno de los extremosdel fragmentode interés fue eliminada mediantedigestióncon un segundoenzimade restricción,y el fragmentoresultanteque sedeseabasecuenciarse purificó comose describeen el apartado11.3. El DNA (aproximadamenteíO~ cpm Cerenkov)fue disueltoen 30 ¡sí de unasolución de 0.3 ¡sg/pl de DNA de timo de ternerasonicado.A continuación,alícuotasde esta muestrase procesaronmediantediferentestratamientosquímicos,para los cualesse prepararonlas siguientesmezclasde reacción: 53 ReacciónA+G . - 15 pl de agua - 5 ¡sí de muestra - 2 pl de formatode piridina 1M pH 2.0 (ácidofórmico al 4%, ajustadoapH 2.0 con piridina) La reacción sellevó a cabo a 200C durante 50 mm, y se paró por adición de 10 ¡sg de DNA de timo sonicado,y congelaciónde la mezclaa~8OoC.A continuación,las muestras fueronliofilizadas 3 veces. ReacciónA+C . - 5 pl de muestra - 100 ¡sí de unasolución 1.2 N de NaOH y 1 mM de EDIA La reacciónse efectuóa 90~C durante9 mm y separó por adiciónde 150 ¡sí de ácido acético 1 N, 10 ¡sg de DNA de timo sonicadoy 800 ¡sí dc etanolabsoluto,seguidade congelacióna -80~C. Despuésde 5 mm a dicha temperatura,la mezclase centrifugó en la microcentrifuga,y el precipitadosedimentadose lavó con etanolal 70%. Los restos de sobrenadantese eliminaronmediantecapilaresestirados,y las muestrassedesecaron bajo vacío. ReacciónG . - 200 pl de unasolucióncompuestapor cacodilatosádico(dinietil arsenatosádico)50 mM pH 8.0, MgCI 2 10 mM y EDTA 1 mM. - 5 pl de la muestra - 1 pl de DM5 La reacciónse llevó a cabo durante3.5 mm a 20~C y fue paradapor adición de 50 pl de tampónde parada(acetatosódico1.5 M pH 6.0, ~ME 70 mM, tRNA 100 ¡sg/ml y DNA de timo sonicado200 ¡sg/mí) y 800 pl de etanolabsoluto.La mezclasemantuvo 5 ruin a -8WC y fue centrifugada.El sedimentofue resuspendidoy precipitadodosveces más.Tras la última centrifugación,los restosde sobrenadanteseeliminaron mediante microcapilaresestiradosy las muestrasse secaronbajo vacío. 54 ReacciónC+T . • 19.5 pl de agua - 7.5 pl de muestra 30 pl de hidracina La reacciónseefectuóa 200C durante7 mm y fue paradapor la adición simultánea de 800 pl de etanol absolutoy 200 pl de tampón de paradacompuestopor 0.3 M de acetatosódicopH 6.0, 0.1 mM de EDTA., 25 ¡sg/ml de tRNA y 50 ¡sg/ml deDNA detimo sonicado.Las muestrasse procesaroncomoen el caso anterior. ReacciónC . - 20 ¡sí de NaCí - 2 ¡sí de agua - 5 pl de muestra - 30 pl de hidracina La reacciónseefectuóy paró comoen la reacciónC+Ty las muestrasseprocesaron de igual modo. Una vez finalizadas todas las reaccionesse efectuó el tratamiento con piperidina. Para ello, las muestrasse disolvieron en 100 pl de piperidina 1 M y se mantuvieron30 mm a 92’C. Las muestrasfueron liofilizadas 3 vecespara eliminar la piperidinapresentey a continuación fueron redisueltasen el volumen apropiadode colorantede carga BXF(lx) para tener aproximadamenteio~ cpm(Cerenkov)/pl.El volumende muestraaplicadoa cadapocillo fue de 3 a 6 ¡sí, realizándosela electroforesis comosedescribeen 10.3. A continuación,películasX-Omat S de Kodak seexpusieron, a 2700Cdurante24-48 horas,a los gelessin secar,utilizándosepantallasamplificadoras. 15. DETECCIONDE FORMASPLASMIDICAS MONOCATENARIAS . Se siguió el métododescritopor te Riele y cols (1986b).Las estirpesutilizadas como huéspedespara el análisis de las formas plasmidicasmonocatenariasfueron: 55 S.pnewnoniae708, B.subtílis MBI 1 y E.colí CáGO. Se procedió,primeramente,a obtenerextractoscrudos de las células que conteníanlos plásmidosen estudio.Estos extractosfueron preparados,generalmente, comosedescribeen el apartado7.1. Sin embargo,cuandolasmuestrasibana sertratadas con nucleasaSí se siguió un protocolo ligeramentemodificado: Para S.pnewnoniae,tras la incubación en la solución de lisis, las muestras,que ya presentabanun aspectode lisis clara, fueron agitadasdurante3 mm y a continuación congeladas(~80ÓC) y descongeladas(370C) dos veces.Los usadosfueronajustadosa 200 mM de NaCí, 1 mM de ZnSO4y 30 mM de acetatosódicopH 4.6 y la mitad de cada muestra(50 pl) fue separaday tratadacon 200 u de nucleasaSI. Todaslas muestras (tantotratadascomono tratadasconSi) fueronincubadas15 mm a37~C,y acontinuación enfriadasen hielo. Tras la adición de SDS a unaconcentraciónfinal del 1%, se realizó un nuevo ciclo de congelación-descongelación.A partir de este punto se siguió el procesamientogeneral. En el caso de B.subtills y E.coli, la lisis clara de las muestrasrequirió la adición de SDS al 0.3% una vez finalizadala incubaciónen la solución de lisis. El tratamientofue, por lo demás,idénticoal descritoen el párrafo anterior. Las muestrasse sometierona electroforesisen gelesde agarosade 20 cm de longitud,utilizándosecomotampónTBEconteniendo0.6 ¡sg/ml deEtBr. La electroforesis se llevó a caboa 40 V hastaque el azul de bromofenolhubo recorridola longitud tota] del gel. Despuésde tomar unafotografíapara posicionarlas distintasbandasde DNA, el gel fue irradiado con luz ultravioleta durante 7 segundos, utilizándose un transiluminadorde onda corta (Spectroline 254 nm). A continuación se realizó la transferenciade Southern. Transferencia de Southern . El método utilizado sebasóen el descrito por Southern (1975).Dependiendo de la finalidad del experimento, el DNA de los geles fue o no desnaturalizado previamentea su transferenciaa filtros de nitrocelulosa. Tratamientode desnaturalizacióndel DNA. Con este tratamientose consigue la transferenciaposterior tanto del ssDNA como del dsDNA presentesen el gel. Previoal tratamientode desnaturalización,el DNA fue parcialmentehidrolizadopor 56 inmersiónde los gelesen UCí 0.12 M, durante15 mm. Este tratamientofavorece la transferenciade dsDNA de gran tamaño.Los gelesfueron a continuaciónlavadosdos vecescon aguadestilada.Para la desnaturalización,los geles se mantuvieron40 mm sumergidosen la soluciónSoak1 (NaOH 0.5 M, NaCí 1.5 M) y, trasdos nuevoslavados con aguadestilada,fueronsumergidosen la solución de neutralizaciónSoak JI (NaCí 3 M, Tris-HCI 0.5 M pH 7.2) duranteotros40 mm. Todosestostratamientosse realizaron a temperaturaambiente. Tratamiento sin desnaturalización. Solamente el ssDNA será posteriormente transferido.Los gelesfueron sumergidosdurante40 ruin en Soak II. A continuación,el gel secolocósobredos hojasdepapelWhatman3MM cuyos bordesestabanen contactocon unasolución 10 vecesconcentradade SSC.Sobreel gel se colocóel filtro de nitrocelulosa,previamentesumergidoen dichasolución, y sobreel filtro se dispusieron,a su vez, treshojas de papel Whatman3MM secasy una pila de aproximadamente10 cm de altura de servilletasde papel. Encimade estemontajese colocóun cristal que soportabaun pesode aproximadamente1 kg, con el fin de evitar la formación de burbujasy favorecerel contacto entre las distintascapasde papel.La transferenciadel DNA se permitió durante12 horas, al cabo de las cualesel filtro de nitrocelulosafue secadoa 370C y mantenidodurante2 horasa SMC. FI DNA transferidoal filtro se sometióa unaprehibridaciónde 2 horasen un tampónconsistenteen formamida50%,EDTA 5 mM, NaCí0.9 M, fosfato sódico48 mM pH 6.8, SDS 0.1%, DNA de espermade salmóndesnaturalizado100 pg/ml y solución Denhart’s lx (preparadasegúndescribenManiatisy cols, 1982).Para la hibridación,se añadió a este tampón el DNA sondamarcadoradiactivamente,que fue previamente desnaturalizadopor calentamientoa 950C durante10 mm. Tanto la prehibridacióncomo la hibridación se realizaronen cajasde plástico que conteníanel volumen de tampón suficienteparacubrir el filtro, llevándoseacaboa370Cconagitaciónsuave.Tras 12 horas de hibridación, los filtros fueron lavadosdos veces(10 mm cadavez) con el tampónde lavado1 (formamida50%,EDTA 2 mM, fosfatosódico20 mM pH 6.8, NaCí0.36M, SDS 0.1%) y otras dos veces(15 mm cadavez) con tampón de lavado II (EDTA 0.1 mM, fosfato sádico 1 mM pH 6.8, NaCí 18 mM, SDS 0.1%). A continuaciónfueron secados durante30 mm a 37’C sobrepapelWhatman3MM. La exposiciónde la película al filtro fue de 4 a 48 horas a -700C. 57 16. REPLICACIONIN VITRO DE DNA DE PLASMIDOS . Preparación de extractos libres de células (530). Sesiguió el métododescritopor Staudenbauer(1976), empleándosela estirpe C600 de E.coli, ya fuerasin plásmidoendógenoo conteniendolos plásmidosde interés. Doslitros de medioLBR se inocularoncon20 ml del cultivo correspondiente crecido durantela noche. El nuevo cultivo se creció a 370C con agitación, y cuando alcanzóuna DO de 0.5 seajustóel PH del medioa 8.0 con KOH 5 M. La incubación secontinuóhastaalcanzarsela DO óptimaparala preparacióndeextractosde replicación. Esta DO, así como el correspondientepeso húmedo de las células, se determinó experimentalmentepara cadauno de los plásmidoscuya replícaciónse ensayó.En este punto,el crecimientode los cultivos se parópor enfriamientoa 0~C y las células fueron recogidaspor centrifugación a 8000 rpm, durante10 mm, a OOC, en el rotor JAlO (Beckman).El sedimentocelular se resuspendióen 30 ml de tampón-2(HEPES-KOH 25 mM pH 8.0, KCI 100 mM, DTT 1 mM, p-aminobenzamidina1 mM) preparadocon agua bidestilada y enfriado a OÚC. La suspensiónse trasvasóa tubos de centrífuga previamentepesadosy secentrifugóa 10000rpmdurante10 mm,a OOC, en el rotor JA20 (Beckman).Despuésde eliminar todo el sobrenadante,sedeterminóel pesohúmedode las células sedimentadas.Estasse resuspendieronen tampón-2,en unaproporciónde 1 ml del tampónpor cadagramo de células.El volumen final de la suspensiónse midió y se transfirió a un tubo de policarbonato del rotor Ti65 (Beckman), siendo inmediatamentecongeladoennitrógenolíquido.Trasprocedera la descongelacióna 100C se añadió1/50 de volumen de unasolución reciénpreparadade lisozima (15 mg/ml en EDTA 50 mM pH 8.0), semezció bien y se mantuvoa OOC durante30 mm. La mezcla fue nuevamentecongeladay descongeladaen las mismascondiciones.En estepunto,las célulasestabannormalmentelisadasy la mezclapresentabaun aspectoviscoso.Cuando no fue así, se repitió la etapade congelación-descongelación.Los restos celularesse eliminaronpor centrifugacióna 30000rpm, durante30 mm, a 00C, en el rotor Ti65. El sobrenadantese repartióen alícuotasde 200 pl en tubosEppendorfperforadosenla tapa. Los tubosse sumergieronen nitrógenolíquido y se mantuvierona -800C. Cadaalícuota se descongelóunasolavez para evitar la inactivacióndel extractopo.r sucesivosciclos de congelación-descongelación.Una muestrade cadanuevapreparaciónde extractosse utilizó paradeterminarla concentraciónde proteínaspresentesen los mismos,mediante el empleodel reactivoBCA (apartado24.1 de estecapitulo). 58 Ensayosde replicacién br vito. Preparacióny conservaciónde las soluciones Todaslassolucionesy mezclasfueronpreparadasempleandoaguabidestilada.Salvo quese indique otra cosa, las solucionesse repartieronen alícuotasy se almacenarona 2~C dNTPsy NTPs: Se prepararonlas siguientessoluciones:ATP (100 mM); CTP, GTP y UTP (40 mM) separadamente;tambiénpor separado,dATP, dCTP, dGTPy d’JTP (10 mM). Los productosse disolvieron en HEPES-KOH25 mM pH 8.0, y se llevó el pH a 7-8 con Tris-base1 M. Creatinquinasa10 mg/ml en HEPES-KOH25 mM pH 8.0, KCI 100 mM. Creatina-fosfato0.5 M en HEPES-KOH25 mM pH 8.0. NAD 10 mM preparadoenHEPES-KOH25 mM pH 8.0. El pH se llevó a 7-8 conTris- base 1 M cAMP 10 mM en HEPES-KOH25 mM pH 8.0. La solución se llevó a pH 7-8 comoen los casosanteriores. Estassolucionesse emplearonparaprepararlas siguientesmezclas. Mezclade dNTPs: 400 pl de HEPES-KOH0.5 M pH 8.0, 110 pl de acetatomagnésico 1 M, 25 pl de cadaunade las cuatrosolucionesde dNTPs 10 mM, 25 pl de NAD 10 mN’l, 25 pl de cAMP 10 mM y 40 pl de aguabidestilada. Mezclade energía:200 pl de ATt? 100 mM, 300 ¡sí de creatina-fosfato0.5 M y 100 ¡sí de creatinquinasa10 mg/ml. Mezcla de NTPs: 100 pl de cadaunade las solucionesde CTP, GTP y UTP 40 mM. Otrassoluciones: ddTTP. Se prepararonsolucionesde distinta concentración(100 ¡sM, 300 pM, 1 mM y 3 mM) en HEPES-KOH25 mM pH 8.0, y se ajustó el pH a 7-8 conTris-baseIM. 59 SolucionesdeAntibióticos. Se prepararonsolucionesenDMSO aunaconcentración400 vecesmayor que la usadaen el ensayo.Las solucionespreparadasfueron: Nov a 10 mg/mi, Cm a 40 mg/ml y Rif a 10 mg/ml. PEO6000 al 25% en tampón-2.La soluciónseesterilizópor filtración a través de filtros Millipore de 0.45 pm y sealmacenóa 40C. DNA plasmídico.Fuepurificado como se describeen el apartado7.3 de estecapítulo y seconservóa .800C,aunaconcentraciónde 1 mg/mi, enHEPES-KOI-I25 mM pH 8.0, KCI2SmMyEDTAImM. Inmediatamenteantesde comenzarlos ensayosde replicaciónse preparóel siguientecóctel (para20 ensayos):35 ¡sí de la mezclade dNTPs, 30 pl de la mezclade energía,15 pl de la mezclade NTPsy 20 ¡sI de [3Hj-d1TP(1 mCi/mi, 43 Ci/mmol). La mezcla de reacción se preparó en tubos Eppendorfpreviamenteenfriados, añadiendoen esteorden:el volumende tampón-2necesarioparallevar el volumenfinal a 25 pl, la cantidaddeseadade DNA plasmídico(1 ¡sg, si no se especificaotra cosa),el volumen óptimo de extracto(correspondiente,en general,a unos375 ¡sg de proteína), 2.5 pI de PEG al 259’¿ y 5 pl del cóctel radiactivo.suandose deseóprobarel efectode algúnantibióticosobre la replicación,éstese diluyó primero 40 vecesen tampón-2,y se añadieron2.5 pl de la dilución a la mezclade tampón-2y DNA. Tras la adición del extractoy del PEO, se realizó una incubaciónde 5 mm a 300C con el fin de permitir la acción del antibiótico antesde que el cóctel fuera añadido.Para el tratamientocon DNasa1,1 ¡sg de DNA se digirió, en un volumen final de 5 pl, con 2 u del enzima(40 u/¡sg) en presenciade Tris-HCl 10 mM pH 8.0 y MgCI 2 5 mM. La mezcla se incubó 5 mm a 30~C, y a continuación secalentóa 70 0Cdurante10 mm parainactivarel enzima. El DNA así tratadose añadióa las mezclasde reaccion. La concentraciónfinal de los componentesde la reacciónfue: HEPES-KOHpH 8.0 50 mM; KCi 100 mM; acetatomagnésico11 mM; creatinquinasa0.1 mg/mí; creatina- fosfato 15 mM; PEG-60002.5 %; ATP 2 mM; CTP, GTP y UTP 0.4 mM; NAD, cAMP, dATP, dcTP, dGTP y [3H]-dTfP (500 cpm/pmol) 0.025 mM. Cuandose añadieron antibióticos, la concentraciónfinal de éstosfue, normalmente,de 25 ¡sg/ml para Nov y Rif, y de 100 ¡sg/ml paraCm. La mezcla se mantuvo 5 mm a 00C antes de que se iniciara la reacción por transferenciaa la temperaturade ensayo(generalmente30~C),a la quese incubódurante el tiempo deseado(120 mm, a no ser que se diga otra cosa). La reacción se terminó mediantela adiciónde 200 pl de solución de parada,compuestapor NaOH 0.5 M, SDS 0.5%, pirofosfato sódico 15 mM y DNA de timo de ternerasonicado0.5 mg/ml. La 60 mezclase transfirió a IYC y, trasañadir500 pl de TCA 2 M frío, se mantuvodurante10 ruin aestatemperaturay sefiltró a travésde filtros de fibra de vidrio tipo GF/A, de 2.5 cm de diámetro.Los filtros selavaron3 vecescon 3 ml de TCA al 5%, unavez con 5 ml de etanolabsolutoy unavez con 5 ml de éteretílico, todo ello a 00C. Los filtros se secarona 450Cdurante1 hora,se introdujeronenvialesconteniendo2.5 ml de un líquido de centelleocompuestopor tolueno,PPO6.5 g/l y POPOP0.065 g/l, y se contaronen un contadorde centelleo.La replicaciónsemidió comopmolesde dTMP incorporados al material precipitablepor TCA. Teniendoencuentala actividadespecíficafinal de la [3H]-dITP y la eficiencia del contador utilizado, 1 pmol de dTMP corresponde, aproximadamentea 500 cpm. En los experimentosen los queseutilizaron extractosque no conteníanplásmidoendógeno,se incluyó unamuestraa la queno se le añadióDNA plasmídico,y su valor en cpm fue consideradocomo fondo y descontadodel valor del resto de las muestrasen los ensayosde replicación. Cuando se utilizaron extractos preparadosa partir de cultivos queconteníanun plásmidode tipo pLSI, setomó como fondo el valor obtenido para las muestrasa las que se adicionó Nov, ya que este antibiótico bloqueabatotalmentela replicaciónde estosplásmidos. Análisis de los productos de replicación. Los productos de los ensayos de replicación se analizaron mediante electroforesisen gelesde agarosay posteriorIluorografía. Seprepararonmezclasde reacciónestándar,queseincubarona 300Cdurante2 horas, y entonceslas reaccionesfueron detenidasmediantetransferenciaa 0’C y adición de EDTA aunaconcentraciónfinal de 50 mM. A continuaciónseañadieron75 pl de tampón TE(10:1) para llevar el volumen final a 100 pl, y se procedió a fenolizar las muestras como se ha descritoen el apartado8 de estecapítulo.Una vez precipitadocon etanol, el DNA fue recogidopor centrifugacióny disueltoen 20 pl de tampónTE(I0:l), siendo sometidoa electroforesisen gel de agarosaal 0.8%. El gel fue teñido, fotografiadoy, despuésde señalarla posición de lasdistintasformasdelDNA, tratadoparafluorografia con el fin de visualizarlos productosde nuevasíntesismarcadosradiactivamente. Los productosde reacciónde ensayosenlos queseempleócomoprecursormarcado [355]-dATP(8 pCi/pl; 400Ci/mmol) fuerontambiénanalizados.Paraello, seprepararon cóctelesa los que se añadió esteprecursor en lugar de [3H]-dTTP,de forma que la concentraciónfinal de [35S]-dATPen el ensayofuerade 0.4 ¡sM o 0.8 pM. Las muestras fueronprocesadascomosedescribeen el párrafoanterior,exceptoquelos geles,enlugar de ser tratados para fluorografía, fueron secadosbajo vacío y autorradiografiados. Paracuantificar la distribución de radiactividaden los geles,una vez realizadala 61 fluorografía o autorradiografíade los mismos, se cortaron los trozos de gel seco correspondientesa las diferentesformasde DNA marcado,y a cadauno sele añadió 1 ml de DM50 paradisolverla agarosay 15 ml de líquido de centelleoReady-solvHP/b. La radiactividad de las distintas muestras se determinó en un contador de centelleo. 17. FLUOROGRAFIA . 17.1. Fluoro2rafTa de eelesde a2arosa . Se siguió el método descrito por Ludlow y cols (1985). Los gelespueden sometersea este tratamientouna vez teñidos con EtBr, ya que éste se elimina completamentedurantelas etapasde inmersión del gel en etanol.De no ser eliminado, el EtBr apantallafuertementela luz ultravioletaemitida por los agentesde centelleo, disminuyendoasí la eficiencia del método. El gel semantuvosumergidoen 4 volúmenesde etanolabsolutodurante30 minutos, a temperaturaambientey agitandomuy suavemente.Este procesose repitió dos veces mas. A continuación,el gel se empapóen 4 volúmenesde unasolución de PPOal 3% (p/v) en etanolabsoluto,y se mantuvoen ella durante3 horas.En estaetapay en las tres anteriores,es importante utilizar contenedoresque cierren bien para evitar la absorciónde agua.Porúltimo, el gel se sumergiódurante30 mm en aguadestiladapara precipitarel PPO.Parasecarel gel, éstefue colocadosobreunapila depapelesdefiltro, cubiertoconuna hoja de plásticoy, cuandosu espesorquedóreducidoa 1 ó 2 mm, fue secadoen un secadorde gelesbajo vacio, a 600C, durante90 mm. La exposiciónde la películaal gel secose realizó a -70~C. 17.2. Fluoro2rafíade Leles de PAA . Estemétodo,basadoen el descritopor Laskeyy Milís (1975),sehaempleado con una variedadde gelesde PAA/SDSparaproteínas. Una vez teñido, desteñidoy fotografiado,el gel se sumergiódirectamenteen 20volúmenesdeDMSO,y semantuvoasídurante30 mm.Despuésde renovarel DM50, seprosiguióestaetapadurante60 mm más,con el fin deeliminarcompletamenteel agua. El gel sesumergió,entonces,en 4 volúmenesde unasoluciónde PPOal 22%en DM50, 62 durante3 horas. Estasetapasse realizaronen contenedorescerradospara evitar la absorciónde agua. A continuaciónel gel se mantuvo en agua durante 1 hora para eliminar el DM50 y precipitar el PPO en el interior del gel. Esta etapa se repitió nuevamente.Todos estosprocesosse realizarona temperaturaambientey con suave agitación.Despuésdesecarel gel bajo vacíodurante2 ó 3 horas,se realizó la exposición de la película a ~70oC. 18. DETERMINACION DE LOS PUNTOS DE INICIACION DE mRNAs MEDIANTE MAPEO CON NUCLEASA Sí . Preparación de RNA total bacteriano. Para la obtención de RNA total de células de £pneurnoniaese siguió, básicamente,el métododescritopor Alba y cols (1981),con las modificacionesdescritas por López y cols (1989). Se recogieronpor centrifugaciónlas célulasde 50 ml de cultivo crecidohasta unaDO de 0.4. El sedimentocelularseresuspendióen 2.5 ml de soluciónde lisis (acetato sódico20 mM pH 5.5, EDTA 1 mM, Na-DOC01%) y se procedió a lisar las células mediantetres ciclos consecutivosde rápidacongelación(~80oC).descongelación(370C) A continuaciónseañadióSDSaunaconcentraciónfinal de 0.5%y semezclóbrevemente a 370C. Los lisadosse trataron,a 700Cdurante5 mm, con 2 volúmenesde fenol saturado con acetatosódico20 mM pH 5.5. Las fasesfenólicay acuosase separaronmediante centrifugacióna 8000 rpm durante5 mm en el rotor JA-20. Esteprocesode fenolización se repitió dos vecesmásantesde queel RNA presenteen la última faseacuosafuera precipitadopor adición de 0.1 volúmenesde acetatosódico3 M pH 7 y 3 volúmenesde etanol absoluto.El RNA fue nuevamenteprecipitadocon 0.07 volúmenesde acetato sódico3 M y 3 volúmenesde etanol.El sedimentoresultantede la centrifugaciónse lavó dos vecesconetanolal 70%y, trassecarsebrevementebajovacío,sedisolvió entampón TE(1O:l). Las preparacionesde RNA se repartieronen alícuotasy se conservaron a -70’C. La concentracióndel RNA en las muestrasse determinóa partir del valor de absorcióna 258 nm, teniendoen cuentaqueun valor de 1 equivaleaproximadamentea 40 ¡sg/ml de RNA. Las preparacionesse consideraronsuficientementepuras cuandola relaciónentre los valoresde la absorcióna 258 y 280nm fue, al menos,2. La integridad de los mRNAs se asumió comprobandola de los RNAs ribosomales(23, 16 y 5 5>, medianteelectroforesisengel de agarosa. 63 Mapeo con Sí. El procedimientoutilizadoparadeterminarlos puntosde iniciacióndemRNAs fue el descritopor López y cols (1989). Paraprepararla sonda,un fragmentode DNA queconteníael putativo sitio de iniciación de la transcripción(nucleótido + 1) se marcóensusextremos5’. La marca de la cadenacodificante se eliminó mediantedigestión con un segundoenzima de restricción,y el fragmentoquese ibaa utilizar comosondase purificó comose describe en el apartado11. Las condicionesde ensayoen lo que respectaa cantidad de RNA, temperaturade hibridación,unidadesde nucleasaSi y temperaturade incubacióncon la misma,fueron puestasa punto para cadaexperimento. Los ácidosnucleicosde mezclasquecontenían: - 30000 cpm Cerenkovdel DNA prueba(aprox. 0.1 pg) - 100-200pg de RNA total. - tRNA (para llevar la cantidadtotal de RNA a 200 ¡sg). - TampónTE(l0:l) (parallevar el volumentotal de la mezclaa 200 pl). fueronprecipitadosmediantela adiciónde acetatosódicoy etanolabsoluto.El sedimento obtenidopor centrifugaciónfue lavadocon etanolal 70%, secadobrevementebajovacio y disuelto en 10 pl de tampón de hibridación 5x (PIPES200 mM pH 6.3, NaCí 2 M, EDTA 5 mM). A continuaciónse añadióformamidapara dar una concentraciónfinal del 70%, y se completóel volumena 50 pl con agua.Las muestrasse incubarona 850C durante10 mm y se transfirieron rápidamentea bañosde aguaa la temperaturade hibridación, dondese mantuvieronsumergidasdurante3 h. A] cabode este tiempo, se añadieron450 pl del tampónde SI (acetatosódico30mM pH 4.6, NaCI 280 mM, ZnSO 4 4.5 mM, DNA de timo sonicado20 ¡sg/mi) conteniendo50 u de nucleasaSI. Después de permitir la actuacióndel enzimaa 30 0C durante20 mm, la reacciónfue paradapor transferenciade las muestrasa OOC y adición de 115 pl de tampón de parada(acetato amónico2.5 mM, EDTA 50 mM pH 8). Las muestrasfueron fenolizadasy los ácidos nucleicosprecipitadoscon isopropanolcomosedescribeen el apartado8. El excesode salesse eliminó mediantedos lavadoscon etanolal 70% y el precipitadose disolvió en 5 pl del tampón de carga BXF. Previamentea la electroforesis,las muestrasfueron calentadasa 950Cdurante5 mm y enfriadasa 00C.La electroforesisy la autorradiografía seefectuaroncomoen el casode las reaccionesde secuenciación(apartado14). Hay que tenerencuentaque, debidoa lasdiferentescaracterísticasde los productosde digestión químicay enzimáticadel DNA, los fragmentosmarcadosproducidosen las reacciones 64 desecuenciaciónmedianteel métodode Maxamy Gilbertmigran1.5 nts másrápido que los fragmentoscorrespondientesgeneradospor digestióncon 51 de los híbridosRNA- DNA (Sollner-Webby Reeder,1979). 19. SINTESISDE PROTEINAS PLASMIDICAS EN MINICELULAS DE RSUBTILIS . Purificación de minicélulas. Se siguió el métododescritopor Reevey cols (1973),utilizándosela estirpe CU403 de B.subtilis conteniendolos plásmidosde interés. Se aislaron coloniasde la estirpeelegidasobremediosólido TY suplementado con el antibiótico correspondiente.Varias colonias de aspecto translúcido fueron empleadaspara inocular 100 ml de medio completopara minicélulasque conteníala concentraciónadecuadadel antibiótico. Una vez crecido, el cultivo sirvió a su vez de inóculo para900 ml del mismo medio.El cultivo fue crecido a 370C con agitaciónhasta que abandonóla faseexponencial.Despuésde comprobarla existenciade minicélulas mediantemicroscopiadecontrastede fase,el cultivo fue centrifugadoa 8500rpmdurante 1 h, a 4~C, en el rotor JAlO. El sedimentocelular se lavó con 10 ml de salespara minicélulasy la suspensiónsecentrifugóa 12000rpm, durante30 mm, a 4’C. Las células fueron resuspendidasen 4 ml de las sales,y 2 ml de estasuspensiónfueronaplicados sobre30 ml de un gradientecontinuode sacarosadel 5% al 30%, preparadoen las sales para minicélulas.Los gradientesfueroncentrifugadosa 4500rpm, durante15 mm, a 40C, en el rotor 5W27 (Beckman).Tras la centrifugación,las minicélulasse encontrabanen una bandamuy dispersa,que fue recogiday transferidaa tubos Corex de 15 ml. Las células fueron recogidaspor centrifugación a 12000 rpm, durante20 mm, a 4’C, y resuspendidasen 2 ml de las sales.La muestrafue nuevamenteaplicadaa gradientesde sacarosa.Tras centrifugara 4000rpm, 15 mm, a 4’C, serecogióla bandade minicélulas, queestavez presentabaun aspectomásnítido. Las célulasse recogieronnuevamentepor centrifugacióna 12000 rpm durante30 mm, se lavaroncon 4 ml de las salesy, trasuna centrifugaciónde 10 mm a la mismavelocidad,se resuspendieronen 6 ml de sales.El númerode minicélulaspresentesen la preparaciónsedeterminóapartir del valor de la absorcióna 600 nm, teniendoen cuentaque una DO 600 = 0.5 equivale a unas4x10 9 minicélulas/mí.Las células se recogieronpor centrifugacióny se resuspendieronen el volumen apropiadode salespara conseguirunaconcentraciónde 1010 minicélulas/mí. Tambiénsedeterminóel númerode célulasviablescontaminantesde la suspensión.Este 65 númerodebíaser inferior a 5x105 u.f.c./ml.Despuésde añadirglicerol al 10%e incubar a 370C durante10 mm, las preparacionesde minicélulasse repartieronenalícuotasde 200 pl, quese congelarony conservarona -700C. Marcaje de proteínasen minicélulas. Parael marcajede proteínasplasmídicasen minicélulasse siguió el método descritopor Espinosay cols (1984). Una alícuota(200 pl) de la preparaciónde minicélulasse incubó durante5 mm a 32~C en presenciade glucosay timina a unasconcentracionesfinales del 1% y de 40 ¡sg/mI, respectivamente.A continuaciónseañadieron8 pCi de un aminoácidomarcado radiactivamente,prosiguiéndosela incubacióndurante30 mm más.La incorporaciónde radiactividadsedetuvopor adición de 1 ml de tampónde parada(EL>TA 0.1 M, NaCí 0.05 M, PMSF 25 ¡sg/mí)quecontenía0.1 mg del aminoácidofrío correspondiente.Las minicélulassesedimentaronporcentrifugacióndurante15 mm, a 40C,enmicrocentrífuga. El sedimento ~e lavó dos veces con 1 ml del tampón de paraday finalmente se resuspendióen 37.5 ¡sí del mismo tampón conteniendo1 mg/ml de lisozima. Tras 15 mm de incubacióna 37’C, se añadieron5 pl de SDS al 10% para completar la lisis celular,y 10.5 pl del tampónde cargaSLB(Sx). La mitad de la muestrasesometióaSOS- PAGE en gradientecontinuo del 5% al 25% de PAA. Las proteínascodificadaspor el plásmidoen estudiosevisualizaronmediantefluorografíade los geles. 20. HIPEREXPRESION DE GENES BAJO EL CONTROL DEL PROMOTOR <00 DEL FAGO T7 . El sistemade clonajevectorpET5/huéspedBL2I(DE3), descritopor Studier y Moffatt (1986),permitela hiperexpresiónespecíficade genesdonadosbajo el control del promotor440 del fago r. Descripción del sistema. La estirpe BL21(DE3) de E.coli contieneun profago defectivo derivado de lambda(lisógenoDE3) quellevael gende la RNA polimerasadel fago ‘1? bajoel control delpromotor inducible lacUVS. La RNA polimerasade ‘12 tiene una granespecificidad 66 O Promotor IocUV5 -gen RNA poltneros., de Ti U RNA polimeroso de~ fogoTi fl Promotor ~IO —e Gen(es) clonodo (s) A Producto(s) del gen(es) donodo(s) ROTURA Y PURIFIGACION Figura 7. Esquemadel sistemadc hipcrexpresióngénicabasadoen la especificidadde transcripciónpor laRNA polimerasadeTi. La estirpedeE.collutilizada,BL2l(DE3), lleva enel cromosomael genquecodifica la RNA polimerasadc 17, bajo el control del promotor inducible /acUVS (n). El plásmidovector pET5 contieneel promotor440 (A) reconocidopor la RNA polimerasade Ti. Los genescuyahiperexpres¡onse pretende,sedonanen pET5 bajo el controldeq$1O (—fl. La adiciónde IPTG inducela actividaddel promotor tacUVS, sintetizándosegran cantidadde RNA polimerasade Ti (Uy. Esto conducea la hiperexpiesión específicade los genesdonadosbajo el control de 440. Los productosde dichos genes(A) puedenser purificadosprevia lisis celular. porsuspropiospromotoresy unagraneficienciade iniciación y elongaciónde las cadenas deRNA. Además,terminadoresde la transcripciónparaotrasRNA polimerasasson muy pocoeficientesparaesteenzima.Comoestirpeparala expresióngénica,BL2 1 (DE3) tiene la ventajade carecerde las proteasascodificadaspor los genesIon y o¡npT, quepodrían degradarlas proteínasdurantesu purificación. El plásmidopEIS derivade pBR322y se ha utilizado en estesistemacomovector de transcripciónparael clonajey expresiónde genes.Esteplásmidocontieneun promotor (00) reconocidopor la RNA polimerasade T7, seguidopor un sitio único para cada uno de los enzimasde restricciónBamHI y EcoRí. El plásmidopET5 no contiene,sin embargo,señalparala iniciación de la traducción,por lo que el gen en cuestióndebe serdonadoconsupropiaseñal.EstevectorconfiereúnicamenteresistenciaaAp, ya que el DNA entre los sitios únicos BamHI y EcoRí de pBR322 (incluyendo el promotortet) ha sido del¿cionado. La adición de IPTG al sistemainduce el promotorlacUV5, de forma quese activa IPTO 67 la síntesisde la RNA polimerasade T7.Esta,a suvez,promoverála transcripciónapartir del promotor410, produciendotranscritosde varias vecesla longitud del plásmido.En muchoscasosla transcripciónpor la RNA polimerasade ‘1? es tan activaque la síntesis de RNA debidaa Japolimerasadel huéspedno puedecompetiry cesacasi por completo. La adición de Rif (inhibidor de la RNA polimerasadelhuéspedpero no de la del fago) resultaráen la expresiónespecíficade los genesplasmídicoscorrectamenteorientados respectoal promotor del fago. Un esquemade las característicasy funcionamientodel sistemade expresiónBL21(DE3)/pET5se muestraen la Figura7. Condicionesde crecimientoe inducción. Antes de procedera la purificación de un determinadoproducto génico,se pusierona punto, utilizando cultivos a pequeñaescala,las condicionesde crecimiento, induccióny tratamientoconantibióticos,quedieranun mayorrendimientode la proteína deseada.Asimismo,observamosquediversosplásmidosdiseñadospara la expresiónde un mismo gen, requeríandistintascondicionesparauna expresiónóptima. Se preparóun preinóculode la estirpedeseada[BL2I(DE3) conteniendoel plásmido de interés]en 5 ml de medio M9 suplementadocon el antibiótico correspondiente(Ap a 200 ¡sg/mí,Tc a 10 ¡sg/mí,o Ap 200 ¡sg/ml + Tc 10 ¡sg/mí). Cuandoel cultivo alcanzó una DO de 0.5, se diluyó 25 vecesen 5 ml del mismo medio y se incubó a 37~C con agitación (250 rpm» siguiendo la DO hasta que ésta llegó a 0.4-0.45. Según hemos observadoexperimentalmente(capítulodeResultados),éstees el momentoóptimo para procedera la inducción de los cultivos, ya que se evita la acumulaciónde células sin plásmidoo con un sistemano funcional.Paraensayarlas condicionesde inducción, se tomaronmuestrasde 1 ml del cultivo anteriory se les añadióeJ inductor, IPTO, a una concentraciónfinal de 0.5 mM o 1 mM. La incubación a 370C se prosiguió durante distintos tiempos(30 mm a 3 h). En las muestrastratadascon Rif, éstase añadióentre o mm y 30 mm despuésde la adicióndel IPTO. Las muestrastratadascon el antibiótico fueron incubadasa 37oC un tiempo variable(30 mm a 3 h) en presenciade 0.2 mg/ml de Rif Marcaje de proteínas de nueva síntesis. A muestrasde 1 ml tratadascomose describeen el párrafo anterior,se les añadieron50 ¡sí de [35S}-metionina(a 1 mCi/mí). Despuésde incubardurantelO mm a 68 370C separóla incorporacióndemarcapor transferenciade lasmuestrasa WCy adición de 0.1 mg de metionina fría. Las células fueron recogidaspor centrifugaciónen microcentrífuga,durante5 mm, a 40C, y lavadascon 1 ml de medio M9 suplementado con 1 mg/ml de metioninafría. Tras centrifugarnuevamente,el sedimentocelular fue resuspendidoen 1 ml de tampónde rotura (Tris-HCI 50 mM pH 8.8, SDS2%, EDTA 2mM, ~MF 1%, glicerol 10%).Lasmuestrasfueronincubadasa 95’C durante3 mm para producirla lisis celular.Trasla adiciónde 250111 de SLB(5x), las muestrasquedaronlistas paraser sometidasa SDS-PAGE.La tinción de lasproteínasde estosgelesda unaidea de la concentracióny proporción relativa de la proteína de interés en las diversas condicionesensayadas.La autorradiografíao fluorografía de los gelespermitió analizar cuantitativay cualitativamentelas proteínasquesesintetizantrasel períodode inducción y expresión. Cuandoel marcajese empleóparaseguir la proteínade interésdurantelas etapas de purificación, se evitó el empleo de SDS para lisar las células. En este caso, el sedimentocelular,unavez lavadoconM9, se resuspendióen 1 ml de Tris-HCI 0.1 M pH 7.6 que contenía250ng de lisozima. La muestrasemantuvoen hielo durante30 mm, añadiéndosea continuación45 ¡sí de Tritón X-l00 al 5%, y se agUó la mezcla hasta conseguirla lisis. El extractoobtenido se mezcló con el que conteníala proteína a purificar. Test de funcionalidad del sistema. Algunosde losgenesdonadosen el vectorpuedendarlugaraproductostóxicos parala bacteria.Si estoocurre,pequeñosescapesdel promotor/acUV5 en ausenciadel inductorpuedenconducira la muerte de las célulasbacterianasdurantecl crecimiento del cultivo. Porotraparte,la fi-Lactamasaespecificadapor el vectoressecretadaal medio y, en cultivos suficientementecrecidos,puede degradargrandescantidadesde Ap, permitiendoel crecimientode célulassin plásmido.La combinaciónde estosdosfactores podría determinarque, en el momentode la inducción,muy pocascélulas tuvieranel sistemafuncional. Antes de que los cultivos fueran inducidos, se determinaronlos porcentajesde célulasconplásmidoy de célulasen las queel sistemaerafuncional.Para ello,serealizarondilucionesadecuadasdel cultivo, y el porcentajede célulasconplásmido se determinócomo: u.f.c. en medio TY con Ap 200 ¡sg/ml x 100 u.fc. en medio TY 69 Por otra parte,las células de la estirpeBL2I(DE3) no puedencreceren presencia de ]PTG si llevan el promotor410 asociadoa un gen. Por el contrario,células que no contienenun sistemafuncionalsoncapacesde formarcoloniasenpresenciadel inductor. Entre estas células capacesde crecer en IPTG se incluyen las que han perdido el plásmido,así comomutantesquecarecende capacidadparaexpresarel DNA diana. El porcentajede célulasquecarecende sistemafuncionalse determinó,por lo tanto,como: u.f.c. en TY con IPTG 125 pM x 100 u.f.c. en TY Porsuparte,sólomutantesqueconservenel plásmidoperoseanincapacesde expresar el DNA dianacrecerántanto en presenciade Ap comode IPTG. El porcentajede estos mutantes secalculó: u.f.c. en TY con Ap 200 ¡sg/ml + IPTG 125 pM x 100 u.fc. en TY 21. CROMATOGRAFIA DE PROTEíNAS . 21.1. Filtración en 2e1 . El materialempleadofue agarosaBio-Rad A-0.5 m (200-400mesh).El gel se empaquetóen unacolumnade PharmaciaK16, de forma que el lecho resultantetenía 1.6 cm de diámetroy 84 cm de altura (169 ml de volumen total). Paraequilibrar la agarosa,así como paraeluir las proteínas,se utilizó el tampónA (Tris-HCI 20 mM pH 7.5, NaCí 0.5 M, EG 5%, EDTA 1 mM, DTT 1 mM). La velocidad del flujo fue de 18 ml/h. El volumen de muestra aplicado fue de 3 mí, que corresponde a un 1.8% del volumen total de la columna.La recogidade fraccionesy Ja mediday registro de la absorciónde lasmismasa280 mn serealizóconun equipoISCO,colectándosefracciones de 2 ml. 70 21.2. CromatoErafla de intercambio jónico . Seutilizó DEAE-Sephacelde Pharmaciacomointercambiadoraniónico.El gel se empaquetóen unacolumnaK9 de la mismacasa.Las dimensionesdel lecho fueron 419 cm de diámetroy 113 cm de altura (8.3 ¡ni de volumen total). Se empleóel tampón 13 (Tris-HCI 20 mM pH 8.0, EG 5%, EDTA 1 mM, DTT 5 mM) suplementadocon KG 100 mM. El flujo fue ajustadoa 14 ml/fr recogiéndosefraccionesde 4 ml. 21.3. Cromato2ratYade afinidad . El adsorbenteempleadoparaeste tipo de cromatografíafue heparina-agarosa Affi-Gel (Bio-Rad).SeempleóunacolumnaBio-Rad conun lechode 1.4 cm de diámetro y 4 cm de altura(6.2 ml devolumentotal>. El flujo seajustó a 14 ml/h. La columnafue equilibradacon tampón B suplementadocon KCI (a la concentraciónquese indica en el apartadode Resultadoscorrespondiente).Despuésde la aplicaciónde la muestra,el ge] se lavó con 75 ml (12 volúmenesde columna) del mismo tampón. Las proteínas adsorbidasal gel se eluyeron mediantela aplicación de un gradientelineal de KCI, preparadoen tampón B. Las proteínasque aún permanecieronunidasse eluyeron haciendopasara travésde la columnaunasolución de KCI 2 M en tampón B. La conductividadde las distintas fraccionesse midió con el conductivímetro MetrobmE382.Seconstruyóunarectapatrónrepresentandola conductividadde distintas solucionesde KCI en tampónB en función de la concentraciónde la sal. La molaridad del KCI en las fracciones sedeterminó por extrapolación a partir de esta recta patrón. El gel de heparina-agarosaseregeneróparasu reutilizaciónmedianteel lavadocon 10 volúmenesde columnade tampón 1 (Tris-HCI 20 mM pH 8.5, NaCí 0.5 M), seguido por lavadoconel mismo volumende tampónII (Tris-HCI 20 mM pH 5.5, NaCí 0.5 M), tal como recomendóla casaproveedora. Cuandono estabansiendoutilizadas, todas las columnasse mantuvieronen presenciade acidasódicaal 0.02%. 71 22. DETERMINACION DE LA CONFIGURACION NATIVA DE PROTEíNAS . 22.1. Centrifu2ación analítica en 2rad¡ente de 2licerol . Se prepararongradienteslinealesde glicerol del 15% al 35% en un tampón compuestopor Tris-HCI 20 mM pH 8.0, KCI 50 mM, EDTA 1 mM, UIT 5 mM. Los gradientes(4 mí) fueron preformadosen tubosparael rotor SW6O (Beckman).Aparte de la proteínacuya configuración se deseabaanalizar,se prepararonsolucionesde las proteínasusadascomomarcadoresde pesomolecular,a unaconcentraciónde 2 mg/ml. Todaslas proteínas se encontrabanen el mismo tampón utilizado paralos gradientes, conteniendoglicerol al 15%. Lasmuestras(150pl) seaplicaronsobrelos gradientesantes de procedera centrifugar a 59000 rpm durante15 h en rotor SW6O, a 40C. Tras la centrifugación,se recogieronfraccionesde 100 pl por punción en la basede los tubos, y se determinóla absorcióna 280 nm o la radiactividad(en su caso) de las distintas fracciones.Por representacióndel log de los pesosmolecularesde las proteínaspatrón frente a las distacrnsrelativas recorridas,se determinóuna recta que permitió deducir el pesomolecularde la forma nativa de la proteínaproblema. Las proteínasutilizadascomopatronesfueron: albúminade suero bovino (66 kDa), DNasa1(31 kDa), lisozima (14.4 kDa) y aprotinina(6.5 kDa). 22.2. Filtración en 2e1 . Se utilizó unacolumnade agarosa(Bio-RadA-0.5 m, 200-4043mesh)montada en unapipetade 25 ml. Las dimensionesdel lecho fueron 1.14 cm de diámetroy 38.5 cm de altura(39 ml devolumentotal). Se empleótampónB suplementadocon KG 200 mM. La velocidaddel flujo se ajustó a 6 ml/h. Todaslas muestrasque se iban a correr se encontrabanen el tampónde columna,y el volumen aplicadofue de 300 pl (0.77% del volumendel lecho).Lassolucionesempleadascomopatrones,y cargadasporseparado (paraevitar interferencias)fueron: azul de dextrano(2 mg/mí), mezclade albúmina bovina(12 mg/mí)y citocromoC (6 mg/mi) y, por último, mezcladeanhidrasacarbónica (6 mg/mí)y aprotinina(9 mg/mí). Medianteel empleode un equipoISCOserecogieron fraccionesde 0.5 ml y se determinósu absorcióna 280 nm. La proteínaproblema fue detectadamidiendola radiactividadpresenteen las fracciones.El volumende exclusión (Vi de la columnasedeterminócomoel volumende elución de] azul dedextrano(peso molecularaproximado:2x106 Da). El volumende elución(Ve) de los distintospatrones 72 fue tambiéndeterminado,y seconstruyóunacurvade calibradorepresentandoel log de los pesosmolecularesde estasproteínasfrentea suscorrespondientesvaloresVe/Ve. A partir de estacurvasedeterminóel pesomolecularde la proteínaproblemaensuforma nativa. Las proteínasutilizadas como marcadoresde pesomolecularfueron: albúmina de suerobovino(66 kDa), anhidrasacarbónica(29kDa), citocromoC (12.4kDa)y aprotinina (6.5 kDa). 23. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS . 23.1. Preparación de las muestras para electroforesis . Cuandolasmuestrasno podíanser cargadasdirectamenteen los gelesdebido a subajaconcentraciónenproteínas,éstasfueronprecipitadasa 00C durante30 mm en presenciade TCA al 10%. El precipitadosc recogiópor centrifugacióna 12000 rpm, durante10 mm, a 4’C, en microcentrífuga,y se lavó dosvecescon etanol:éter(1:1) para eliminar los restosde TCA. Tras la última centrifugación,el sedimentosedisolvió en el volumen apropiadode Tris-HCI 10 mM pH 8.8, siendoprocesadocomo se describea continuación. En general,a la muestraque iba a ser sometidaa electroforesisse le añadió 1/4 de volumen de SLB(5x). La muestrase incubó a 950C durante3 mm, y sedejó enfriar a temperaturaambienteantesde ser cargadaen el gel. Cuandose iba a realizar la electroforesisen presenciade urea, las muestrasse ajustarona 7 mM de fosfatosódico(pH 7.2), 1% de SDS, 1% de ~ME, 0.02% de azul de bromofenoly 6 M de urea,siendoa continuaciónprocesadascomose describeen el párrafoanterior. 23.2. Gelesde PAA/SDS . Seutilizó unavariedaddegelescondiversosporcentajesdePAA (tantolineales como en gradiente continuo de concentración). La proporción de acrilamida a bisacrilamidaempleadafue 30:0.8.Los gelescontenían,además,Tris-HC10.15 M pH 8.8, SDS 0.1%, EDTA 2 mM, TEMED 0.05% y PSA 0.08%. Las dimensionesde los geles fueron 14.5 cm de ancho,14 cm de largo y 1.2 mm de espesor. 73 La electroforesisse realizó a un voltaje constantede 150 V, duranteel tiempo deseado,en un tampónqueconteníaTris-HCI 50 mM pH8.3, glicina 380mM, SDS 0.1% y EDTh 2 mM. Tras la electroforesis,las proteínassevisualizaronpor tinciónconunasolución de CBB R-250 al 0.25% en agua:metanol:ácidoacéticoglacial (4:5:1, en volúmenes), durante60 mm a temperaturaambiente,con agitaciónsuave.El coloranteno unido a las bandasde proteínasseeliminó sumergiendolos gelesen un desteñidorcompuesto de ácido acéticoglacial al 7.5% y metanolal 5%, durante12-16 h. Cuandose deseóvisualizar proteínasmarcadasradiactivamente(con 355 o 3H), los gelesfueronpreparadospara fluorografía. 23.3. Gelesde PAA/SDS/urea . Para la resolución de polipéptidosde pesomolecularmenorde 14 kDa, se utilizó el sistema de gel de concentración-gelde resolución conteniendo urea, recomendadopor BRL (FOCUS 6:3). El gel de resoluciónconteníaPAA al 15% (acrilamida:bisacrilamida,30:0.8),fosfato sódico 0.1 M pH 7.2, SDS 0.1%, urea 6M, TEMED 0.05% y PSA 0.02%.. El gel de concentraciónconteníaPAA al 7.5% (30:0.8>,fosfato sódico0.1 M pEl 7.2, SDS 0.1% urea6M, TEMED 0.05%y PSA 0.2%.Las dimensionestotalesdel gel fueronlas mismas queen el apartadoanterior. La electroforesisse llevó a caboa 80 V, hastaqueel azul de bromofenolquedóa 1 cm delbordeinferior del gel. El tampónde electroforesisconteníafosfato sódico0.1 M pH 7.2 y SDS 0.1%. Paraaumentarla tinción de los polipéptidospequeños,los gelesse tiñeroncon una solucióncompuestade CBB 0.1%,acetatocúprico0.1%,isopropanol25%yácidoacético 20%. La destinciónde los gelesseefectuócomo en el apartadoanterior. Si estosgelesse iban a tratarparafluorografía, la ureadebíaser eliminadaantesde procedera la impregnación.Por ello, si los geles no habíansido teñidos-desteñidos previamente,se sumergierondurante30 mm en el desteñidordefinido en e] apartado anterior. 23.4. Geles de PAA/SDS con DNA en la matriz . Se prepararongeles en gradiente continuo del 10% al 20% de PAA 74 (acrilamida:bisacrilamida,30:0.8).Lesgelescontenían,además,Tris-HCI 0.15M pH 8.8, SDS0.1%, EDTA 2 mM, DNA de timo de ternera 10 pg/ml, albúmina de suero bovino 13.5 pg/ml, TEMED 0.05%y PSA 0.08%. Las dimensionesde los geles, así como las condicionesde electroforesisfueron las descritasen el apartado23.2. Tras la electroforesis,los geles se lavaron tres vecescon 500 ml de una solución compuestapor Tris-HCI 40 mM pH 7.6 y MgCI2 2 mM, incubándosea continuaciónen el mismo tampón,durante16 h a 37oC, con suaveagitación.El DNA de los gelesse tiñó añadiendoEtBr al tampón,a unaconcentraciónfinal de 1 ¡sg/ml. Cuandosedeseó,las proteínasde estosgelessevisualizaronpor tinción con CBB. 24. VALORACION DE PROTEíNAS . 24.1. Utilización del reactivo BCA . La concentraciónde proteínasde una muestrase determinómediante la utilizacióndel reactivoBCA (Pierce).Los ensayosfueronrealizadoscomoserecomienda en el protocolode la casasuministradora. 24.2. Densitometríade eelesteñidoscon CER . Este método, descritopor Bennetty Scott (1971), se utilizó para estimar la concentraciónrelativa de una proteína en una mezcla. También se empleó para determinarla concentraciónde unaproteínaen una muestrapor comparacióncon una solución estándarde la misma proteína. Se realizó la densitometríadirecta de geles secadosbajo vacío. 24.3. Determinaciónde la concentraciónmolar . La concentraciónproteica en la preparaciónde RepA pura se determinó medianteel análisisde la composiciónmolar deaminoácidos.Esteanálisisse realizó por los servicios de Química de Proteínasdel CIB. La muestrafue hidrolizada en fase gaseosa,durante20 h a 1100C, en presenciade HCI 6 N y ácido tioglicólico 5%. Los aminoácidosse analizaronmedianteun equipoBiotroník LC-7000. 75 25. DETERMINACION DE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE RenA . La secuenciaciónautomáticade la proteínaintactase realizóenel Max-Planck Institutfur MolekulareGenetik(Berlín)por la Dra.T. Choli. Se empleóun secuenciador Applied Biosystems,mod. 477A con detecciónen línea de los aminoácidosliberados.La proteínase disolvió en 20 pl de ácido trifluoroacéticoal 100% y se dispersóen un filtro de fibra de vidrio quese habíapretratadocon 2 mg de Polybrene. 26. DETERMINACION DE LA SECUENCIA N-TERMINAL DE ReDR . Una muestra(10 mi) de la proteínapura procedentede la segundacolumna de heparina-agarosase dializó frente a NH4HCO3 0.1 M. Tras la adición de 0.5 mg de SDS, la muestrafue liofilizada y redisueltacuatrovecesen 0.5 ml de aguabidestilada con el fin de eliminar el NH4HCO3. Unos5 nmolesdel polipéptidoseprocesaronen un secuenciadorde fase gaseosa(Applied Biosystems)para determinarla secuenciaN- terminal.Esteanálisisfue realizadopor el Dr. M. Kimura en el Max-PlanckInstitul fiir MolekulareGenetik (Berlín). 27. ANÁLISIS DE CONTACTOSDNA-PROTEíNA . 27.1. Protección frente a la di2estión con DNasa 1 . Seutilizó comosustratoun fragmentodeDNA marcadoenunode susextremos 5’ o 3’, con una actividadespecíficade l-2x10 7 cpm/¡ig. Cadaensayocontenía,en un volumen final de 50 pl, entre5 y 9 ng del fragmento marcado(de 25x103a 76x103 pmoies,dependiendode] tamañodel fragmentoy de la cantidadde DNA), MnCI 2 2 mM, KCI 100 mM, Tris-HCI 20 mM pH 8.0, EDTA 1 mM, UIT 5 mM, EG 5%, y de O a80 ng (0 a 16 pmoles)de proteínaRepApura. Lasmezclas se incubaron15 mm a 2WCparapermitir la uniónde la proteínaal DNA, antesde añadir entre0.007 y 0.028 u de DNasa1 (2.7 u/pg; libre de RNasasy proteasas).Tras permitir la digestión del DNA durante5 mm a 2WC, las reaccionesfueron paradaspor adición de 25 pl de una solucióncompuestapor acetatoamónico2 M, EDTA 0.15 M, acetato sódico0.8 M, DNA de timo de ternerasonicado100 ¡sg/ml y tRNA 400 ¡sg/ml. El DNA 76 fue precipitadocon etanol, lavado con etanolal 70% y disueltoen 18 pl del colorante de cargaBXF(lx). Las muestras(3 o 6 pl, dependiendode la anchuradel pocillo) fueron procesadascomosedescribeen el apartado10.3.La exposiciónautorradiográficase llevó a cabo a -70’C, empleándosepantallasamplificadoras.En ocasiones,estosensayosde protecciónpor RepA frentea la digestióncon DNasa1 se realizaronen presenciade DNA inespecifico(0.5 pg de DNA de timo de ternerasonicado). 27.2. Protecciónfrentea la rotura por radical hidroxilo . Este método, desarrolladopor Tullius y Dombroski (1986), presentados importantesventajasfrente a los queutilizan una actividad enzimática.Por una parte, la accióndel radical hidroxilo no depende,apenas,de la secuenciadel DNA, por lo que todaslas posicionesde éstepuedenser analizadasen cuantoa la existenciade contactos con proteínas.Además,debido a su pequeñotamaño,este reactivopermite una gran definición de los contactosproteína-DNAa lo largo del esqueletodel DNA. La basequímica de estemétodo es la siguiente:el complejo [Fe(EDTA)21 produceradical hidroxilo a partir del peróxido de hidrógenoy, a su vez, el producto [Fe(EDTA»] de la reacción es reducidopor ión ascorbatopara formar de nuevo el complejo de Fe(ll) que continuaría el proceso. Además, un complejo de Fe(ll) negativamentecargadoesunaventaja,ya queel reactivono seasociaelectrostáticamente con el DNA. Justoantesde comenzarlas reacciones,seprepararonlas siguientessoluciones: Fe(ID. Solución4 mM de sulfato amónicoferroso. EDTA. Solución 8 mM de EDTA de másde un 99% de pureza. Fe(II)-EDTA. Se preparómezclandovolúmenesigualesde las solucionesde Fe(II) y EDTA. 1kG 2. Peróxidode hidrógenoa] 6%. Ascorbatosódico. Solución 20 mM de ascorbatosódico. 77 Mezcla de reactivos. Se preparómezclandovolúmenesigualesde las solucionesde Fe(II)-EDTA, H202 y ascorbatosódico. 1-lay queteneren cuentaqueel glicerol, asícomootros alcoholesy azúcares, inhiben fuertementela reaccióndel radical hidroxilo. Por ello, la proteínaconservadaa ~70úCenpresenciade glicerol al 50% fue,o biendializada(frentea Tris-HCI 20 mM pH 8.0, EDTA 1 mM, DIIT 5 mM y KCI 50 mM), o bien diluida de forma que la concentraciónfinal de glicerol en el ensayofue menorque 0.1%. La unión de la proteína RepA al DNA se llevó a cabo en un volumen de 50 pl, en presenciade Tris-Ud 20 mM pH 8.0. KCl 100 mM, Dli’ 5 mM, EDTA 1 mM, 6 a 15 ng (30x10> a 127x10 pmoles)de fragmentode DNA marcadoen uno de sus extremos5’ o 3’, y 0.8 a 80 ng deproteínaRepApura (entre0.16y 16 pmoles).Asimismo, se realizaronensayoscontrolesa los queno se añadióla proteína.En algunoscasos,las mezclasde reacciónincluían, además,0.5 ¡sg de DNA competidorde timo de ternera. Todaslas muestrasfueron incubadasa 200C durante 15 mm. La rotura del DNA por radical hidroxilo se inició por adición de 9 ¡sí de la mezclade reactivos,y se permitió procedera20’C durante7 mm. Lasconcentracionesfinalesde los reactivosFe(II), EDTA, H202y ascorbatoen los ensayosfueron 100 pM, 200 pM, 0.3%y 1 mM, respectivamente. Lasreaccionesfueronparadaspor adiciónde 15 pl deunasolución compuestade acetato sódico 1.5 M pH 6.0, tiourea 40 mM y tRNA 0.7 ¡sg/íd. El DNA de las mezclasse precipitó con etanol, selavó con etanoldel 70%, y finalmente se disolvió en 18 ¡sí del colorantede carga BXF(Ix). Las muestrasfueron procesadascomo se indica en el apartadoanterior. 28. ENSAYOS DE TRANSCRIPCION IN VITRO . Los fragmentosde DNA que iban a ser utilizados como molde para estos ensayosseprepararonpor digestiónde DNA plasmídicopuro con uno o variosenzimas de restricción.Cuandolos fragmentospresentabanextremos5’ protuberantes,éstosse convirtieronen extremosromosmedianteel uso de Po! 1K. Los fragmentosdeseadosse purificaronpor electroforesisen gelesde agarosay extraccióncon ‘Geneclean”. Les ensayosde transcripción¡ti vitro sellevaron a cabo en un volumende 50 pl. Las mezclasde reacciónconteníanTris-HCI 40 mM pH 8.0, MgCl~ 10 mM, KCI 150 mM, EDTA 0.1 mM, glicerol 5%, GTP200pM, ATP 200pM, UTP 50 ¡sM, CTP50 4v!, 78 a-[32P1-UTP (400 Ci/mmol) 0.5 pM, y fragmentode DNA molde 10 nM. Las reacciones seiniciaron por adiciónde 0.15 u de la RNA polimerasade E.coli, quese dejó actuar durante10 mm a 37~C. Transcurridoeste tiempo, las reaccionesfueron paradaspor transferenciade las muestrasa 00C y adición de 50 pl de una solución conteniendo acetatosódico 600 mM pH 6.0, EDTA 30 mM y tRNA 0.2 pg/¡zJ. Despuésde su precipitacióny posterior lavado con etanol, los ácidosnucleicosfueron disueltosen el colorantedecarga(formamida98%,xilencianol 0.1%y azulde bromofenol0.1%>y, tras sudesnaturalización,fueronsometidosa electroforesisengelesdesecuenciación(apartado 10.3). La muestraaplicadaa cada pocillo (3 jil) conteníaentre 5000 y 10000 cpm Cerenkov.La exposiciónautorradiográfica(2 a 5 díaspor lo general)se realizó a -lOt, utilizándosepantallasamplificadoras. Paraprobar el efecto de la proteínaRepA sobre la transcripciónin vi/ro de un determinadogen, las mezclasde reacciónse incubaroncondistintasconcentraciones(20 nM a 400 nM) de la proteínapura durante10 mm a 2WC, antesde la adición de la RNA polimerasa.En algunosensayos,sepermitió la unión del enzimaantesde la adición de RepA. En estos casos,la RNA polimerasafue añadidaa mezclasque no contenían ningunode los NTPs,y se incubó 10 mm a 2(YC. Tras la adiciónde RepA, Ja incubación seprosiguióduranteotros 10 mm, y la síntesisde RNAs seinició, entonces,por la adición de unamezclade NTPs queconteníatambiénel cx-fl2P]-UTP. 29. ENSAYOS DE ACTIVIDAD &GALACTOSIDASA . La actividad g-galactosidasase ensayó en cultivos en fase exponencial de células de E.coli XLI-Blue (Tabla 1) conteniendolos plásmidosde interés.El método utilizado sebasóen el descritopor Miller (1972). Un preinóculode la bacteriaen cuestiónse diluyó en medioTY hastaunaDO de 0.05. Este cultivo se dividió en dos partes iguales, una de las cualesse puso en presenciade IPTG 2 mM. Ambos lotesdel cultivo fueroncrecidoshastauna DO = 0.6, momentoenquefueronenfriadosenhielo durante20 mm. Tras determinarnuevamente la DO de los cultivos a 600 nm, se tomaron0.5 ml de cadauno de ellos y semezclaron con 0.5 ml de tampón21 (Na 2HPO40.06 M, NaH2PO.,0.04 M, KG 0.01 M, MgSO,0.001 M, y fiME 0.05 M). La lisis celular de estasmuestrasse consiguiópor adición de 70 ¡sí de cloroformo y 50 ¡sí de SDS al 0.1%, seguidade agitaciónvigorosadurante30 s. Tras incubarlos extractosa 280C durante10 mm, las reaccionesse iniciaron por adición de 0.2 ml deunasoluciónconteniendo4 mg/ml de ONPG (o-nitrofenil-fi-D-galactósido)en 79 tampónfosfato0.1 M, pH 7.0. Ibasmezclasseagitaronunospocossegundos,y secontinuó la incubacióna 28~Chastael desarrollodecoloraciónamarilla.Lasreaccionessepararon añadiendo0.5 ml de unasolución 1 M de Na2CO3,y se registréel tiempo total durante el quesepermitió el desarrollode] color. Paracadamuestrase determinóla DO tanto a 420 nm (sumade las absorcionesdebidasal color y a los restoscelulares)comoa 550 nm (en que sólo hay contribuciónde la absorcióndebidaa los restoscelulares).Para determinarlas unidadesde actividadwgalactosidasase empleóla siguientefórmula: DO42, - 1.75 x DO550 u = 1000 x t x y x DO500 donde: DO42, y DO550 son las lecturasde las mezclasde reacción, DO~0 refleja la densidadcelularjusto antesdel ensayo, es el tiempo de reacciónen minutos, y esel volumen de cultivo usadoen el ensayo(0.5 mí). 30. ANÁLISIS ASISTIDO CON ORDENADOR . Se han utilizado los programasde computadorDNASTAR (Inc., UK). La predicciónde la estructurasecundariade RepA se realizó con la ayudadel programa PEPPLOT(Gribskovy cols, 1986), incluido en los programasde computadorUWCCG. Parala representacióngráfica en la predicciónde la estructurasecundariade RepA se empleóel programaPLOTCHOUFASMAN (desarrolladopor B. Jameson,5. Modrow, M. Moth y H. Wolf del Instituto Max von Pettenkoferde la Universidadde Munich). Las prediccionesde plegamientodel DNA se realizaroncon la ayudade los programas PCFOLD y MOLECULE, desarrolladospor M. Zucker y por J.R. Thompson, respectivamente. 81 RESULTADOS 1. ESPECTRODE HUESPEDY ESTABILIDAD DEL PLASMIDO pMV1S8 Y SUSDERIVADOS . El plásmido natural pMV158 fue aislado de S.agalactiae(Burdett, 1980) y transferidoa £pneumoniae(Smith y cols, 1980; Saundersy Guild, 1980) y a B.subti/is (Espinosay cols, 1982).Esteplásmidoconfiereresistenciaconstitutivaa ‘rc mediadapor un determinantede tipo tuL. Como se ha dicho en la Introducción,el mecanismode resistenciaasociadoa tuL parececonsistir en un sistemade bombeode la Tc dependiente deenergía(Burdett, 1986).En el casodepMV 158,el productodel gentu esunaproteína demembranade 458 aminoácidos(50kDa). El plásmidopLSI seconstruyópor deleción del fragmentoEcoRí B de pMVI58 (Fig. 8), y suscaracterísticasy funcioneshan sido el objetoprincipal de este trabajo. La secuenciade pLSl se numeróa partir de uno de los sitios PstI (Fig. 6), y dicha numeraciónes la utilizadaen estaTesis. Por lo tanto, las coordenadasde pLSI que se mencionarána lo largo de este trabajo puedenser localizadasen la Figura 6. A partir de un plásmidorecombinantebasadoen pLSl, y queconteníael gensu/U del cromosomade pneumococos,se obtuvieronvariosderivados delecionadosen B.subfi/ls. Todasestasdeleciones, obtenidasin vivo, mapeabanen el PsI 1 Figura 8. Mapaintroductoriode pLSl. La línea exterior indica el fragmentoEcoR[ de 1.1 kb eliminado del plásmidonaturalpMV1S8parala construccióndepLSI. Semuestratambiénla localizacióndeunadeleción espontánda(A5) que afecta al plásmidopLS5. El mapa incluye algunos de los sitios de restriccion mas relevantes,asícomo los genes(conla direcciónde transcripciónindicadapor una flecha)quedan lugar a las tresproteínasespecificadaspor pLSl. Li, 0~ 82 fragmentoPstI B de pIbSí y seseleccionaronpor conferir mayor resistenciaa sulfamida (determinadapor el gen suid), debido quizás al mayor número de copias de estos plásmidosrespectoal parental.Por eliminación del inserto cromosómicodel derivado delecionadomás pequeñose construyó el plásmido pLSS, que carece de la región comprendidaentrelas coordenadas34 y 365 (ambasincluidas)de pLSI (Fig. 8). Tanto pLSI comopLSSfueronconstruidosenS¿pneu¡noniaey setransfirieronportransformación aB.subtillsy E.ccli. Las eficienciasde transferencia de estosplásmidosa las tres especies, el número de copias en las mismas, así como la concentraciónde Tc a la cual se seleccionarony crecieronlas células con plásmido,quedanrecogidasen la Tabla 3. El DNA transformante fue purificado a partir de pneumococosy utilizado a dos concentracionesdistintas(0.1 y 1 pg por ml de transformación).Se puedeobservarque la eficiencia de transferenciaa pneumococoses superiora la obtenidapara los otros huéspedes.No hay diferenciassignificativasentre pLSI y pLS5 para S.pneumoniaeo E.co/i. Sin embargo,pLS5 transformaB.subfi/ls con una eficienciaunas40 vecesmayor que pLSI. Ya que los multímeros son las únicas formas plasmídicascapacesde transformareficientementeestaespecie,unamayor frecuenciade transformaciónpodría debersea una proporción incrementadade formas multiméricasen la preparaciónde DNA utilizada.Esteno parecíaserel caso,puestoquepLS5 presentabaigual proporción de multímeros que pLSI en las preparacionesde DNA usadasen estosexperimentos. Tampocose observarondiferenciasen la proporciónde formasmultiméricasal analizar, mediante hibridaciónde Southern,extractoscrudosde pneumococosconteniendopLSl o pLSS. Otrosplásmidosafectadospor la deleciónde pLSS tambiénpresentan,comose verámásadelante,esta incrementadaeficienciade transferenciaa B.subhhis,aunquede momentono tenemosexplicaciónpara estehecho.Análogamentea lo observadopara pLSS, el plásmidopMVIS8 presentaeficienciasde transferenciasimilaresa las de pLSl en S.pneumoniaey en E.coli, pero no así en B.subtilis, donde la frecuencia de transformacióndepMV158 esunas5 vecessuperiora la de su derivado(estosresultados no se muestran>.En este caso, las diferenciaspodríandebersea la presencia,en e] fragmentoEcoRíB de pMV158(el quese eliminó durantela construcciónde pLSl), de un ori(-) de replicaciónmuy eficienteen B.subtilis(regiónBM; vander Lelie y cols, 1989; véaseDiscusión).Otras estirpesde S.pneumnoniae,B.subti/isy E.coli utilizadas en este trabajo (Tabla 1) dieron eficiencias de transformaciónsimilares a las que aquí se relacionan. De forma similar a lo que ocurre con la frecuencia de transformación, el númerode copiasde pLSí y pLS5 (Tabla3) esmayor en pneumococosqueen los otros dos huéspedes.En las tresespecies,el númerode copiasde pLS5 esaproximadamente 83 TABLA 3~ Características de pLS1 y pLSS en Los tres huéspedes Eficiencias de transferencia NCr,ero de copias SetecciónS DNA u.f.c./mt Huésped (gg/ml> pLSl pLSS pLS1 pLSS (pg Te/mi) 0.1 16000 21000 S.nnetroniae 708 22±2 52±6 1 1.0 40000 53000 0.1 40 3800 B.subtilis MB11 4.5±0.7 9.5±1 10 1.0 330 30500 0.1 2000 3000 E.coti CáQO 3.7±0.5 6.4±1.4 10 1.0 10000 12000 (a> La selección aplicada fue La misma para pLSl y pLSS Las resistencias a Tc de las estirpes sin plásmido son inferiores a 0.1, 1 y 5 gg/nL para S.pneuuoniae, B.subtilis y E.coli, respectivamente el doble queel de pLSl. Por otro lado, pMVI58 y pLSl presentanvaloressimilaresen cuantoal númerode copias tanto en pneumococoscomoen el huéspedgram-negativo (los datosno se muestran).En B.subri/is, sin embargo,el númerode copiasde pMV 158 es unas3 vecesmayor queel de su derivadopLSI, posiblementedebido a la presencia, en el primero de estosplásmidos,de la región BA3 (véaseDiscusión). Debidoa queconocíamosla secuenciacompletadel DNA de pIbSí (pero no la del fragmento EcoRí B de pMV158), y ya que las característicasfenotípicasde ambos plásmidoseranindistinguiblesenpneumococos,estetrabajosehacentradoen el estudio de pLSl y de sus derivados,y sóloocasionalmentehemosutilizado el plásmidoparental pMV15S. Las células conteniendopLSl o pLS5 fueronseleccionadasy crecidas,en cada especie,a la concentraciónindicada de Tc (Tabla 3), la mismapara ambosplásmidos. En el casodel determinantetet de estosplásmidosno hayunarelacióndirectaentredosis génica(númerode copias)y máximaresistenciaa Tc. Es más, el productodel gen tet parecetóxico paralas células,y númerosde copia muy elevadosprovocanpérdidade la viabilidad celular. Ya quepLSl y pLS5 podíanestablecersey mantenerseconpresiónde selección en una variedadde huéspedes,era tambiéninteresanteconocersu estabilidady si ésta 84 loo lo’ o 1— U) 4 .3 D ~~1 01 LiJ (5 w o w 0.01 ~2 4 1-z w o cr 0fK~ o a- ODOOI o Figura 9. Estabilidadde pLSI y pLS5 en S.pzeunzoniae, R.subtilisy E cotí. La proporciónde célulascon plásmidoen cultivos creciendoexponenelalmentese determinécomo el porcentajede celulasTer. Símbolos: vacíos,cultivos con pLSI; llenos, cultivos con pLS5; triángulos,S.pneunioníae;cuadrados,B.subtiIis; círculos, Ecoil. En el recuadrointerior se muestrala pérdidadc pLSI y pLS5 en cultivos de Ecolí durantelas diez primerasgeneraciones. estabarelacionadacon el número de copias del plásmidoen cadaespecie.Paraello, realizamostestsde estabilidadtomandomuestrasde los cultivos cadalO generaciones y analizandoel porcentajede células que conservabanel plásmido.Despuésde 130 generacionesen ausenciadeselección,no observamosla apariciónde célulassin plásmido en cultivos de pneumococosconteniendopLSI o pLSS (Fig. 9). Este tipo de análisis, realizadoen B.subtilis MB11 durante130 generaciones,demostróquepES! y pLSS son tambiénestablesen estabacteria(Fig. 9). Curiosamente,enE.coIiC600ambosplásmidos son muy inestables,a pesarde presentarun númerode copiasaproximadamenteigual al observadoenB.subtitis MB1I. En el huéspedgram-negativo,pLSl y pLS5 sepierden tan rápidamenteque, tras40 generacionesen medio no selectivo,sólo alrededorde un 0.001% de lás células contieneestosplásmidos(Fig. 9). Teniendoen cuentaestevalor y el porcentajeinicial de células con plásmido(90%), se podríaestimaren 0.25 la tasa 0.00001 30 40 50 60 NUMERO DE GENERACIONES 85 de pérdidapor célula y generación(Lex). Sin embargo, la curva obtenida en la Figura 9 indicaría que la tasade pérdidano se mantieneconstante,sino que la disminución en la población que lleva plásmido se aceleracuandose incrementala fracción de la poblaciónqueha perdidoel plásmido.Se hadescritoqueestaaceleraciónsedeberíaa unamenortasade crecimientode las célulasque llevanplásmidoconrespectoa las que lo han perdido (Nordstrñmy cols, t980a). En estesentido,volvemos a mencionarla toxicidaddel gentet, observadaa lo largo de este trabajo,y especialmenteen E.co/i (se verámásadelante).Parapoderestimarmáscorrectamentela tasade pérdidadebidaa partición,sedeterminóel porcentajede célulasconplásmidocadageneración,desdeg = O ag=10 (Fig. 9). De nuevoobservamosunapérdidasimilar paraambosplásmidos,a pesar del mayor número de copias de pLS5, siendo 0.03 el valor estimadopara L0~ en las primerasgeneraciones. 2. REPLICACION EN EXTRACTOS LIBRES DE CELULAS . ODtimización del sistema . Ya que pMV 158y susderivados soncapacesde establecersey replicar en E.co/i, aprovechamosel desarrolloen estabacteriade sistemasiii viti-o (capacesde llevar a cabo todo el procesode replicaciónsemiconservativade DNAs plasmídicos)paraestudiarlas característicasreplicativasde estosplásmidos. En primer lugar,optimizamosel sistemaen lo quese refiereapreparaciónde los extractosacelulares,temperaturay tiempo de reacción,así como concentraciónde DNA exógenoañadidoal ensayo,paraconseguirla máximareplicaciónde pMV 158 y sus derivados.Simultáneamenteseensayaronlos plásmidospKNl82 (miniderivadode Rl) y CoIEl como controles de la capacidadreplicativa del sistemapara plásmidosque requiereno no, respectivamente,la síntesisde novo de proteínas.Paraestos estudios previos, los extractosfueron preparadosa partir de cultivos de la estirpe C600 sin plásmidoendógeno.Los cultivos (crecidosen las condicionesdescritasen el apartado16 de Métodos)se recogieronal alcanzarunasDO de 0.4, 0.5, 0.6, 0.8, 0.9, 1.35 y 1.5. Los rendimientoscelulares(g/l; pesohúmedo)correspondientesa estasDO fueron de 1.4, 1.8, 2.1, 2.7, 3.1, 4.6 y 5.2, respectivamente.A partir de estoscultivos se prepararon extractosen los que se ensayó la replicación del DNA de los distintos plásmidos, utilizando 1 pg de DNA moldeparacadaensayo(25 pl devolumentotal) y la cantidad 86 de extractonecesariapara obteneruna concentraciónfinal de proteínasde unos 15 mg/mi. Segúnpudimos comprobar,la actividad replicativade los extractossobre los DNAs ensayadosno vana apenasen un rangode concentraciónde proteínasentre 20 mg/mly 30 mg/ml. En tzstesentido,seha observadoparael sistemade replicacióntu viti-o deCoIEl quela incorporaciónde dTMP senivelaaunaconcentracióndeproteínas cercanaa 15 mg/mi, y sólo ocasionalmentese observauna inhibición de la síntesisde DNA a concentracionesmuchomásaltas(Staudenbauer,1984). La Figura 10 muestra la relaciónentrela fasedecrecimientoa la cualseprepararonlos extractosy la capacidad de los mismosparasintetizarDNA plasmídico.ParaColEI seobservaunaalta eficiencia desíntesis,casi no influenciadapor la fasedecrecimiento.Sin embargo,la capacidadde los extractosparasintetizarDNA de pMVI5S, pLSI y pLS5 dependeestrictamentede la fasede crecimientoa la cual se recogenlas células.La máxima eficiencia de síntesis correspondea un rendimientocelular de aproximadamente1.8 g/l (DO 0-5), que se alcanza25 miii antesdel final de la fasedecrecimientoexponencial.Las condicionespara la síntesisde DNA del plásmido pKNI82 son menosestrictas,aunquese detectauna bruscadisminución en la actividadde los extractospreparadosa partir de cultivos con un rendimientocelularmayorde5 g/l. LasdiferenciasobservadasentreCoIEI y los otros E o. O a 4 ir O o- O (5 z o- 1—’ r figura 10. Relación entre fase de crecimiento celular y actividad replicativa dc extractosdeE.cotiCCOO. Secrecieroncultivos hastadiferentesDO y se recogieron las células, determinándose su peso húmedo. A partir de cada cultivo se prepararon extractos y se ensayó su capacidad replicativa. La concentraciónde proteínassenormalizó para todoslosextractos.LosDIÑAs plasmídicoscuya replicación se analizó fueron: ColEl (0), pKNIS2 (u’), pMV15S (A), pLSI (O) y pLS5 (•). loo 2.5 5 7.5 0 PESO HUMEDO DE CELULAS(g/I) J 87 ___ pLal pL$5 — pKNnZ CoIEI ¡40 20 loo - 8O~- o’ E o a 22 o 4 X 20 o o- 8 8’~ r ~ IW- — 8— 7 4 2 25 30 37 42 TEMPERATURA DE ENSAYO ro> Figura 11. Relación entre temperaturaa la que se realizael ensayo de replicación y eficiencia de incorporaciónde dTMP en los distintosDNAs plasmídicos. plásmidosprobadospodríanestarreflejandodistintosmecanismosde replicaciónde cada uno de ellos. Utilizando extractospreparadosa partir de cultivos crecidoshastaunaDO de 0.5, determinamos,acontinuación,la temperaturaóptimade realizaciónde estosensayos. Paratodos los plásmidosestudiados,la máxima actividad replicativa tiene lugar a 300C (Fig. 11). A 37~Cse observaunareduccióndel 50% enla actividadde los extractospara replicarpKN 182, mientrasqueparael restode los plásmidosesta reducciónessólo del 30%, aproximadamente.Cuandolos ensayosde replicaciónse realizana250C o 420C,sólo se detectaactividadparaColEl, observándose,sin embargo,unareduccióndel 90% con respectoa la cantidadde dTMP incorporadaa 30~C. La cinética de síntesis del DNA de los plásmidos de estreptococos(Fig. 12) muestra que la incorporación de dTMP es lineal durante los primeros 60 mm y que la curva se nivela tras unos 75 mm de incubación a 300C debido, probablemente,a inactivación térmica. Dado que no se observópérdida del dTMP incorporado, ni siquiera 88 o o. 1 Y oo 4 a: o o- a: oo z 5 0- 1- -t Figura 12. Cinética de incorporación de dTMP. La síntesisde DNA seensayópor incubación de mezclas de reacción estándar a 300C. A los tiemposindicados se deterrninó la radiactividad insoluble en ácidoen los extractos. Símbolos: pMVÍ5S (a); pLS1 (O); pLS5 (e). en incubacionesmuchomáslargas(hasta150 mm), escogimos120 mm comotiempo de incubaciónde las mezclasde reacción.Con ello se aseguraunaincorporaciónmáxima, aúnen el caso de quela tasade síntesisdel DNA estuvieraalgo disminuidaen nuevas preparacionesde extractos. Por último, la influencia de la concentracióndel DNA molde sobre la incorporacióndedTMP paralos plásmidosobjetode estetrabajosemuestraen la Figura 13. La concentraciónóptimaes, en todoslos casos,1 gg de DNA paralos 25 í~l de mezcla de reacción(40 pg/ml). A mayoresconcentracionesde DNA seobservauna inhibición en la incorporaciónde dTMP. Un efectosimilar seha observadopara los plásmidosde E.coli R6K(Inuzukay Helinski, 1978)y miniderivadosdeRl (Díaz y cols, 1981),asícomo parael plásmidode amplio espectrode huéspedRSFI010 (Díazy Staudenbauer,1982). Por el contrario, la replicaciónde CoIEl casi no seve afectadacuandose incrementa la concentracióndel DNA por encimadel valor óptimo(Díaz y Staudenbauer,1982).La inhibición (específicade replicón)por altasconcentracionesde DNA podría debersea la dispersiónde uno o másfactoresde replicaciónunidosal DNA, sugiriendoquecada III 60 90 TIEMPO hin) 120 ¡50 89 9 e .5E o. oo o u 2 1-~ .7 6 5 4 3 a e y ~1’ e o 0.5 ¡.0 ¡.5 2.0 25 3.0 3.5 DNA EXOGENO %q/muestro) Figura 13. Influencia de laconcentraciónde DNA sobre laeficienciade replicación. Seprepararon mezclas de reacción estándar (25 pl) conteniendodistintas cantidadesde DNA de pMV15S (A), pLSl (O) o pLS5 (e), y seincubaron a 300Cdurante 120 mlii, antesdc determinar los pmoles dc dTMP incorporados en cada caso. origen plasmídicofuncional necesitaríamásde unamoléculade dichosfactores. De lo expuestohastaahorase desprendenlas condicionesde ensayoóptimas parala replicaciónin viti-o de los plásmidosde estreptococos:incubación,a 30’C durante 120 mm, de mezclasde reacciónquecontengan1 gg de DNA plasmídicoy la cantidad adecuadade extractopreparadoapartir de cultivoscrecidoshastaunaDO de 0.5. A no serqueseindiqueotracosa,éstashansidolascondicionesempleadasen los experimentos de replicaciónque sedescribirána continuación. Aunque en todos los ensayos habíamosobservadolos mismos niveles de incorporaciónde dTMP parapLSl y pLSS (Figs. 10-13), no podíamosdescartarapriori que ambosplásmidospresentarandistintaspropiedadesde replicaciónen el sistemaiii viti-o, yaque iii vivo el númerode copiaseradiferente.Porestarazón,unavez optimizado o o a e o o 1 el sistema,los siguientesensayosse realizaronconel DNA de los plásmidospLS1 y pLS5. 90 Características del sistemaen extractos que no contienen plésmido endéeeno . Para caracterizarel sistema de replicación in viti-o de los plásmidos de estreptococos,hemosestudiadoel efecto de varios agentessobre la incorporaciónde dTMP en el DNA de dichosplásmidos.Los mismosexperimentoslos realizamos,como controles,con los DNAs de pKN182 y ColEl, repliconescuyos requerimientosen el sistema in viti-o son bien conocidos (Staudenbauer,1984). Los resultadosde estos experimentosse muestranen la Tabla 4. En ausenciade cualquier inhibidor hay unos nivelessimilaresde incorporaciónde dTMP paralos tresplásmidosde estreptococos,no observándosediferenciassignificativas entrepESI o pMV158 y el mutante de doble númerode copiaspLSS. Ya que la síntesisde DNA puedeser replicativao reparadora, era importantedistinguir, en primer lugar, cuál de estos dos procesostenía lugar en nuestrosistema.En estesentido,se ha establecidoquela replicaciónplasmídicaes, en general, muy sensiblea inhibidores de la DNA girasa, los cuales no afectan a la reparacióndelDNA (Staudenbauer,1984).Sin embargo,Khan y cols (1981) handescrito quela replicaciónin viti-o del DNA del plásmidopTl8l sólo es inhibida en un 50% por adición de Nov (inhibidor de la DNA girasa). Así, en tanto queuna inhibición parcial de la síntesisde DNA por Nov no permitedistinguir claramenteentre reparacióno replicaciónsimilar a la descritaparapTl8l, unainhibición total no deja lugar a dudas acercadelcarácterreplicativode la incorporación.Paratodoslos plásmidosrelacionados TABLA 4: Efecto de varios inhibidores sobre La síntesis de DNA plasmidico en extractos sin plásmido endógeno Inhibidor Concentración del inhibidor (pg/mL) ddm9 incorporado (pnoles> en ~J4V158 pLS1 pLS5 p Cm 13.0 8.5 5.3 0 C600/pMV1SB ~i4V158 100 90.4 70.9 1.9 10.9 7.8 6.8 0 C600/pLSl pUSl 100 79.0 66.9 1.4 -- 10.2 7.5 7.3 0 CÓOO/pLS5 pLS5 100 74.5 50.3 3.4 CÓCO ~4V158 pLS1 pLS5 100 100 100 1 1.2 1.3 5.2 5.9 6.7 1 1.6 1.4 (a) Para los extractos con pLésmido adición de plásmido y con Nov. Para cuando no se añadió DNA exógeno. (b) EL 100% de incorporación corresponde, en todos los casos, a dTNP incorporados. endógeno, se consideró como fondo el valor obtenido sin tos extractos sin plósmido, el fondo fue el valor obtenido vaLores entre 8 y 11 pn’oles de uno de los DNAs plasmídicosseañadióa su extractocorrespondiente,hemosencontrado nivelessimilaresde incorporaciónde dTMP, independientementedequeel DNA añadido correspondao no al DNA presenteen los extractos.Como correspondea una síntesis replicativadeDNA, la incorporaciónde dTMP esbloqueadapor la adición de Nov. Para los extractosconplásmidoendógeno,hemosconsideradocomofondo losnivelesresiduales de síntesis en ensayosen los que no se añadió DNA pero sí este antibiótico. La replicaciónobservadaen extractoscon plásmidoendógenoesresistenteen gran medida (entreun 50%y un 70%) a la inhibición de la biosíntesisde proteínaspor Cm, entanto queenextractospreparadosapartir de la estirpeC600,sólo seobservannivelesresiduales de síntesisde DNA (alrededorde un 6%) tras la adición de esteantibiótico (Tabla 5). Este resultadosugierequeunao másde las proteínasrequeridasparala replicaciónde estosplásmidosestaríanpresentesen los extractoscon plásmido endógenopero no en los extractoslibres de plásmido,y que,por lo tanto, seríanespecificadaspor pMV158 y susderivados.Contrariamentea lo quesucedeen extractoslibresde plá:smido,dondeel 94 bloqueode la síntesisde DNA exógenopor Rif escasi total (Tablas4 y 5), la adiciónde esteantibiótico a los extractoscon plásmido endógenoresulta sólo en una pequeña inhibición de la síntesisde DNA (entreun 10%y un 25%).Además,estainhibición por Rif essiempremenorquela causadapor la adición de Cm (Tabla5), indicandoquela proteína(oproteínas)de replicacióncodificadapor losplásmidosdeestreptococospodría sintetizarse,al menosen parte, a través de una etapaque ya no requiere la RNA polimerasa.De estaforma, los mRNAs para dicha proteína,presentesen los extractos conplásmidoendógeno,seríanresponsablesdela replicaciónresistenteaRif perosensible a Cm. Conestosresultadosno podíamosexcluir quela resistenciaa Rif en estetipo de extractosse debiera,ademásde a la presenciade moléculasdeproteínay mRNA, aque las moléculasde plásmidoendógenoestuvieranya primadas.En estecaso, la máxima incorporaciónqueesperaríamoscuandose inhibierala síntesisdenovo de RNA “primer parael DNA añadidoseríade aproximadamenteun 8% (porcentajecorrespondientea la replicacióndelplásmidoendógenoenpresenciade Rif; Tabla5), valormuchomásbajo que el observado.Por lo tanto, la escasainhibición en presenciade Rif sugiereque la replicaciónin viti-o de losplásmidosde estreptococosno requierela síntesisde un RNA “primer” por la RNA polimerasadel huésped. Análisis de los productosde reacción . La incorporaciónde nucleótidosmarcadosen el DNA de pLS1 y pLSS se analizópor electroforesisengelesdeagarosade los productosde reacciónde los ensayos iii viti-o. El DNA seincubó con extractospreparadosapartir de célulassin plásmido,en presenciao ausenciadeantibióticos.Despuésde 120 mm a 300C,el DNA fue recuperado de las mezclasde reaccióny sometidoa electroforesisy posteriorautorradiografíao fluorografía (segúnhubiéramosempleadocomo precursormarcado[35S]-dATPo dTTP, respectivamente).Los productosde reacciónobtenidoscuandose utiliza [3%]~ dATP a 0.8 pM se muestranen la Figura 15. Tanto parapLSI como parapLS5, la mayor partede la marcase localiza, en las muestrasno tratadascon antibióticos,en la posición correspondientea las formas circularesrelajadas(cerradaso abiertas).En la posición correspondientea las formas ccc superenrolladas(que serían las esperadas como productosfinales de la replicación) apenasse detectaradiactividad.Una parte significativa de la marcaseencuentrarepartidaentrelas posicionescorrespondientesa las formasrelajaday superenrolladadecadaunode los plásmidosy, enmenorproporción, por encimade las formas relajadas.Estaseriede bandascorresponde,probablemente, a un conjuntode intermediariosreplicativos, algunosde los cuales se acumularían 98 3. ORIGEN Y DIRECCION DE REPLICACION DE LA CADENA LIDER Localización del sitio de iniciación, y determinación de la dirección de reulicación del DNA de vLSi en el sistemain viti-o . El desarrollode un sistemade replícación¡ti viti-o (cuyoproductofinal esDNA monoméricosuperenrollado;Figs. 17 y 18A) nos permitíaanalizarel sitio de iniciación y la direcciónde la replicacióndel DNA de pLSl mediantela terminaciónprematurade la síntesisde DNA por incorporaciónde ddTTP(Conrady cols, W79; Khan y cois, 1982). Estos experimentosserealizaroncon extractoslibres de plásmidoendógeno y utilizando como sustrato DNA monomérico superenrolladode pLSI. En estas condiciones,la iniciación de la replicaciónpuedeconsiderarseprácticamentesincrónica. Así, a partir de mezclasde reacción que contengandiferentes concentracionesdel inhibidor ddTTP se puedenaislar familias de moléculasque hayan iniciado, pero no completado,una rondade replicación.La digestiónde estasmoléculascon enzimasde restriccióny la determinaciónde la radiactividadespecíficade los distintos fragmentos revelaríael orden de replicaciónde los mismosy la localizacióndel sitio de iniciación. Con estefin, se prepararonmezclasde reacciónquecontenían[3H]-dTTP 25 ~ y 1 pg de DNA de pLSI, y se incubarona 30~Cdurante120 mm en ausenciade ddTTF, o con varias concentracionesdel inhibidor (5 gM, 10 pM. 25 gM, 60 pM, 150 gM y 330 pM). Cadaensayose realizó por duplicadoy, unavez finalizada la reacción,unode los lotes se utilizó para cuantificarla síntesisde DNA. La incorporacióndel precursorradiactivo a DNA plasmídicofue,paralas distintasconcentracionesde ddTTP,un 65%,51%, 26%, 16%, 11% y 5% de la máximasíntesisobtenidaen ausenciadel inhibidor. El DNA del segundolote de ensayosfue extraídode las mezclasde reacción,digeridocon Hinfl y sometido a electroforesisen gel de agarosa.En la Figura 18B y C se muestran, respectivamente,la fotografíadel gel teñido con EtBr y el fluorogramadel mismo gel. En esteúltimo seobservaquela movilidadelectroforéticade cadaunode los fragmentos conDNA de nuevasíntesisesla mismaacualquierconcentraciónde ddTFP,y queesta movilidad esigiaal que la que presentanlos fragmentoscorrespondientesde moléculas que no han replicado.En estesentido hay que señalarque el patrón de restricción observadoenel gel teñidocon EtBr corresponderíacasi exclusivamentea moléculasno replicadas,puesteniendoen cuentala cantidadde DNA añadidocomo molde (1 sg), la incorporaciónmediade dTMP en ensayosno inhibidos <10 pmoles),y la proporciónde estenucleótidoen el DNA depLSl (31%),sepuedededucirquelasmoléculasreplicadas 100 representan,como más, el 2% del total. Cuandosecomparala marcaespecíficade los distintos fragmentosde restricción,seobservaque el fragmentoHinfl D de 443 ph es el único en el queseapreciamarcaa la concentraciónde ddTTPmáselevada(Fig. 18C, carril 8), indicandoquela replicacióncomienzaen este fragmento.El ordensecuencial de marcajecontinúacon los fragmentosF (213 ph), A (1295 ph), C (855 ph), E (356ph) y B (1162 ph). En consecuencia,el ordende replicaciónseríaDFACE(G)B, teniendoen cuentaqueel fragmentoG (84 pb> hasalido del gel. Estosresultadosin viti-o demuestran que el DNA de pLSl es replicado unidireccionalmenteen la misma dirección que la síntesisde los propuestosniRNAs plasmídicos(Lacksy cols, 1986),esdecir en el sentido de lasagujasdel reloj segúnse representael mapacirculardepLSl (Fig. 19). En ausencia de dd’ITP (Fig. 18C, carril 2), la intensidadde los fragmentosA y B (de tamañosimilar perocronológicamentedistantesen la replicación)escasi igual, indicandoquela mayoría de lasmoléculasquehaniniciadounarondade replicaciónla hancompletado,tal y como sugería la aparición de monómerossuperenrolladoscomo productos finales de la replicaciónin vitro (Fig. 18A). Dado queel fragmentoen el quese inicia la replicación (Hinfl D) tiene la misma movilidad electroforéticacon independenciade que proceda o no de moléculasparcialmentereplicadas,pareceque durantela replicacióndel DNA ~ot& Figura 19. Localización de los fragmentosHiníl sobre el mapa de pLSl. Los númerosindican las coordenadasde lossitios de corteporjjj~f1. Lasletrasenla partemásexteriorhacenreferenciaa los diversos fragmentosHiníl nombradosalfabéticamenteen ordendecrecientede tamaño.Otros sitios de restricción relevantestambiénsemuestran.En eJ interior seindicanel origeny ladireccióndereplicaciónde pLSI, según sededucedelosensayos¡ti vitro. Semuestra,asimismo,ladirecciónde transcripciónde losgenesquecodifican los tresproductosproteicosde pLSl (RepA, RepE y Tet>. 8 brv D o- ‘n~ CV ~101 de pLSl no se generanmoléculasahorquilladas.Intermediariosen forma de horquilla hansido observadosen el sistemain vitro del plásmidoRSF1O3O,cuya replicacióntiene lugarmedianteun mecanismotipo e (Conrady cols, 1979). Porel contrario,parapTlSl, la ausenciade estos intermediariosha sido consideradacomo unaindicaciónde quela replicaciónde esteplásmidose lleva a cabopor unmecanismodecírculo rodante(Khan y cols, 1982). Los resultadosobtenidos con pLSl apuntarían,pues, a este tipo de mecanismoreplicativo. Si ésteestabateniendolugar realmentein vivo, deberíamosser capacesde detectarformasplasmídicasmonocatenarias,intermediariosen estetipo de replicación. Intermediariosde cadenasencilla generadosdurantela replicacióniii vivo del DNA de pLSI . El DNA plasmídicode cadenasencillasepuededetectarenextractoscelulares totalespor trescriterios: a) tiene unamovilidad electroforéticamayorengelesdeagarosa quela de las formasmonoméricasdedoblecadenaccc superenrolladas;b) seunea filtros de nitrocelulosasin necesidadde desnaturalizaciónprevia y c) estotalmentesensiblea nucleasaSI (te Riele y cols, 1986b). El análisis del DNA monocatenariogeneradoen célulasde S.pneumoniae,B.subtilisyE.coliquellevanpLSI (utilizando comosondaDNA de pLSl marcadomedianteel métodode extensióndecebadores),muestraJa presencia de DNA plasmídicode rápidamigración y sensiblea nucleasaSi, que es transferidoa nitrocelulosasin necesidadde desnaturalizaciónprevia (Fig. 20), La cantidadde DNA de cadenasencillaesmucho menoren S.pneunioniaeque en los otros dos huéspedes,a pesarde que el númerode copiasde pLSI es, aproximadamente,22 en pneumococos y 4 en B.subrilís y E.coli. Esto demuestraquela conversiónde ssDNA a dsDNA esmás eficienteen pneumococosque en las otras dos bacterias. En un mecanismode círculo rodantesólounade las dos hebrasdel DNA actúa como cadena(+) y es desplazadaparagenerarmoléculasmonocatenarias(Fig. 1). Por lo tanto,si las moléculasdessDNA depLSl detectadasen las tresespeciessonrealmente intermediarios de este tipo de mecanismo replicativo, deberían corresponder exclusivamentea unade las cadenasdel DNA, cuya identificaciónrevelaría,además,la direcciónde replicaciónde la cadena(+) in vivo. Con el fin de probarestesupuestoy paraaumentarla capacidadde detecciónde las formasmonocatenarias,preparamosy analizamosextractoscrudosde pneumococosqueconteníanpLSlcop7(mutantedepLSI quepresentaun incrementode unas5 vecestanto en el númerode copiasde dsDNA 104 sondaradiactivaparadeterminarla especificidadde cadenadel ssDNA. Los resultados de la hibridacióncon unau otra de las pruebassemuestranen la Fig. 21B. Las formas plasmídicasmonocatenariasde los derivadosdepLSI hibridansólo conla pruebaFa.La intensidadde la marcaesmuchomayorparael ssDNAde pLS4 queparael depLSlcop7, comocorrespondea una mayor acumulaciónde formas monocatenariasen el primero (severámásadelante).Por el contrario,no seobservahibridaciónsignificativaentre las formasplasmídicasde cadenasencillay la pruebaFb,ni siquieraparapLS4. El material de migraciónlenta,visible parapLSlcop7,resultaríade la hibridaciónde laspruebascon una pequeña parte de dsDNA transferido al filtro, ya que ocupa la posición correspondientea las formasmonoméricassuperenrolladasde esteplásmido(Fig. 21B). Los resultadosdemuestranquesólounade lascadenasdelDNA plasmídicoesconvertida en ssDNA, como ocurriría duranteel procesode replicación por un mecanismotipo círculo rodante. Paraidentificar quécadenadel DNA de pLSI correspondea cadauna de las pruebas(Fay Fb),diseñamosun experimentodehibridaciónbasadoen la reconstrucción de fragmentosdeDNA bicatenarioapartir deunamezclade las pruebasmonocatenarias marcadasy de fragmentosde restricciónde pLSI desnaturalizados(Fig. 22A). Paraello, 5 pg de DNA de pLSi digeridocon Hinfl semezclaronpor separadocon unau otrade las pruebas complementarias(Fa o Fb, 3x104 cpm de cada una). El DNA fue desnaturalizadoen presenciade formamidaal 80% y NaCí 0.4 M por calentamientoa 85’C durante15 mm. A continuaciónse permitió la hibridaciónpor incubacióna 350C durante16 horas enformamidaal 50%y NaCí 0.9 M. Despuésde precipitary lavar con etanol, el DNA anilladofue digerido con &lI, enzimaquecortael fragmentol-linfl E enun sitio único, dandolugar a dos fragmentosde diferentetamaño(117y 96 ph). Los productosde la digestiónsesepararonpor PAGE (12% PAA), y los fragmentosmarcados sevisualizaronmedianteautorradiografíadel gel (Fig. 22B). Paramoléculashíbridasen lasquela hebramarcadaradiactivamentecorrespondea la cadenacodificantede pLSI, el único fragmentoB211-Hinfl marcadoseráe] de 96 ph (parte izquierdadel esquema en la Fig. 22A). Por el contrario,sólo el fragmentoB2ll4IinfI de 117 pb estarámarcado tras la digestióncon B211 de moléculashíbridasen las quela cadenano codificantees la que lleva la marca(partederechadel esquema).Esto nos permitfa la identificación de la cadenapresenteen cadauna de las pruebas.Paraposicionarlos dos fragmentos Hinfl-BRII, se digirió con B211 una muestra(3x104 cpm) de DNA del fragmentoHinfl F nativo marcadoen los extremos3’ de ambascadenas.Tanto el fragmentosin digerir (Fig. 22B, calle 1), comotos dos fragmentosresultantesde estadigestión(calle 3) están marcadosy puedenser visualizados. En el autorradiogramasepresentantambiénlos 106 resultadosde los experimentosde hibridación (calles2 y 4). La mayor parte de las moléculasde una y otra pruebahanhibridadocon el DNA frío, ya queno se detectan bandasen la posicióncorrespondientea laspruebasmonocatenarias(compáresela banda observadaen la calle 5, correspondienteal ssDNAde Fb conlas bandasde las calles2 y 4). En la muestracorrespondientea la hibridacióncon la pruebaFa sólo se detectael fragmentode 117 pb (calle2), mientrasquecuandoseempleala pruebaEh,el fragmento de 96 pb esel únicoqueaparecemarcado(calle 4). Estosresultadosdemuestranquelas pruebasFay Eh corresponden,respectivamente,alascadenasno codificantey codificante de pLSI. La identificación de las pruebasse realizó tambiénpor secuenciaciónde su DNA (resultadosno mostrados).El experimentodiseñadopara identificar las pruebas presentauna seriede ventajassobre la secuenciación,incluyendola sencillezy rapidez de los ensayos,así comola pocamarcaquese necesitaparalos mismos.Así, utilizando 3x104 cpm de cadaprueba,sólo seprecisaron2 horas de exposiciónpara obtenerlos resultadosquesemuestranenla Figura22B.Además,los ensayosdehibridaciónpermiten conocer y estimar la contaminaciónde cada una de las pruebas por la prueba complementaria.En tanto que no pudimos detectar contaminaciónpor Fa en la preparaciónde Eh, unapequeñaproporciónde Fb (alrededorde un 5%) contaminaba la prueba Fa, segúnestimamosmidiendo la radiactividadpresenteen las posiciones correspondientesa los fragmentosde 117 ph y 96 ph. A partir de los resultadosmostradosen las Figuras21 y 22, podemosconcluir que sólo la cadenacodificantede pLSI es convertidaen ssDNA. Estehecho apoya de nuevouna replicacióndel plásmidotipo círculo rodantey permite, además,deducir Ja direcciónquellevaríain vivo la replicaciónde la cadenalíder (cadena+) si el plásmido 3 E 5 Figura 23. Direccióndela síntesis¡ti vivo dc la cadena líder de pLS1. Asumiendopara esteplásmido una replicación tipo círculo rodante, Ja dirección de la cadena líder seha deducido a partir de la especificidad dc hebra del ssDNA del replicón pLS1 (Figs. 21 y 22). La cadena codificante de! plásmido constituye Ja hebra (+) (la que se peía’ para dar lugar a las formas monocatenarias),y es la primera en sintetizarse durante la replicación (cadenalíder). La dirección de replicación deducida¡ti vivo (en el sentido de las agujas del reloj) coincide con la determinada ¡ti vitro a partir del marcajesecuencialde los fragmentos fI (representados por las letrascorrespondientes). 5 107 replicararealmentemedianteestemecanismo(segúnel esquemadela Fig. 23). De ocurrir así, la cadenacodificantesería,al mismo tiempo, la hebradesplazadaparadar lugar al ssDNA y la cadenalíder. Para que la síntesisde ésta se lleve a cabo de 5’—.3’, la replicacióndebedarseen el sentidode las agujasdel reloj, ya queéstees el sentido 5’—~3’ de la cadenacodificante.De estaforma, la direcciónde replicaciónde la cadena (+) in vivo coincidiríacon la direcciónde replicaciónobservadaen el sistemain viti-o de E.coli. Mareo de posiblesestructurassecundariasen el DNA de vLSI . La superbelicidaddelDNA moldepareceserun requerimentode la replicación in viti-o de los plásmidosde estreptococos:por unaparte, las formasplasmídicasOC no son sustratoseficientesen estesistema;por otra, la inhibición por Nov de la DNA girasa presenteen los extractosconducea la relajacióndel DNA molde,al tiempoquebloquca Ja replicacióndeDNA en extractoscony sin plásmidoendógeno(Fig. 17 y Tabla5). Esto podría debersea la implicación de estructurassecundariasen la replicación de estos plásmidos.Talesestructurasdeberíanlocalizarseen los alrededoresdel sitio de iniciación de la replicación(fragmentoHinfl D depLSI; Fig. 19). SecuenciasdeDNA inversamente repetidaspuedengenerarestructurasde tipo tallo-lazo quesedaríanexclusivamenteen DNA superenrollado,contribuyendoa liberar su tensióntorsional.La endonucleasaSi, específicade cadenasencilla,puedereconocerel DNA desapareadoen los lazosdeestas estructuras,produciendoroturasselectivasen las formassuperenrolladasdel DNA, pero no ensusformasrelajadao lineal (Lilley, 1980).La acciónde SI serealizaen dos etapas: en la primera, las formasccc superenrolladasdel DNA son convertidasrápidamenteen formas OC por rotura de cadenasencilla en uno de los sitios sensiblesa Si. En una segundaetapa,quetienelugar lentamente,el enzimacatalizala conversiónde las formas OC en formaslinealespor introducciónde un segundocorte opuestoal primero. Esta etapaya no requieresuperenrollamientodelDNA. Puestoquela superbelicidadsepierde a) producirsee) primer corte, cadamoléculade DNA podráser cortadapor Si en uno solo de los sitios sensibles.Por lo tanto, los productosde la acción de SI sobre DNA superenrolladoseránformas lineales,que corresponderána una mezclade moléculas linearizadasen los distintos sitios sensiblesal enzima,y una pequeñaproporción de formasOC, en las quesólo tuvo lugar la primera etapade la reacción. Para demostrarexperimentalmentela existenciade estructurassecundarias dentro,o enlasproximidades,del fragmentoHinfl D, losDNAs superenrolladosde pLS1 108 y pLSS se trataron,por separado,con Si. A continuación,los sitios sensiblesa Si se localizaronpor digestiónconEcoRI o conjE~RI y±1241,enzimasconun sitio decorte únicoen el DNA de pLS1 (coordenadas3170y 2484,respectivamente).Comosemuestra en la Figura24.4., la incubacióndel DNA de pLSI con Si a 37~C, seguidade digestión con EcoR!, revelados bandasmayoritariascomplementariasde unas3.0 kb (S1-~=iR1) y 1.4 kb (EcoRI-S1)(calle 6). Estasdos bandasno seobservan,sin embargo,cuandoel DNA de pLSSestratadode igual modo(calle 7). La dobledigestiónconEcoRíy HtrnIl del DNA de pLS1 tratadocon Si (pLS1-S1) (calle 8), muestraque el fragmentoSI- EcoRí de 3.0 kb da lugar a la apariciónde dos bandasde 2.3 kb (S1-Hpall) y 0.7 kb (HvaWiEcoRl), en tanto que el fragmento EcoRí-Sí de 1.4 kb no se modifica. El fragmentograndeEcoRI-HuaII (3.7 kb), generadoprincipalmenteapartir de moléculas de pLSI no linearizadaspor SI, tambiénse observaen estacalle. En el casodel DNA depLS5-Slsometidoa la dobledigestión(calle9), lasbandasmayoritariascorresponden a los dos fragmentosEcoRI-HpaII.Sin embargo,enestecasoseobservanvariasbandas minoritarias, no detectablesen pLSI (compárensecalles 6 con 7 y 8 con 9). Un experimentocontrol realizadocon DNA de pBR322 (calles 10 a 12), tratadocon SI a 37~C (calle 11) y posteriormentedigerido con EcoRl (calle 12), confirma resultados previosquelocalizarondos sitios sensiblesa SI en esteplásmidoa 3.2 y 3.05 kb del sitio EcoRíúnico (Lilley, 1980).A partir de los resultadospresentadosen la Figura24A, se deducequeel sitio mayoritario sensiblea SI a 370C mapeaalrededorde la coordenada 170 del DNA de pLS1, en unaregión incluida en la deleciónde pLS5. En ausenciade estesitio, seincrementala probabilidadde formaciónde otrasestructuras,quede otra forma son muy minoritarias. Se ha establecidoque la selectividad de la acción de SI sobre el DNA superenrolladode CoIEl, pBR322 y RF de ~X174 se mantieneen un rango de temperaturasentre7~C y 450C (Lilley, 1980).Paraintentardetectaren los plásmidosde estreptococosalgún cambioconformacionaldependientede la temperatura,repetimos los análisis previos, pero realizando la incubación del DNA con Si a diferentes temperaturas(Fig. 24B). A 42”C, la mayor parte del DNA sufre degradación,debido probablementeadigestióninespecíficapor SI (calles4, 7, 10 y 13). A 370C, los resultados sonidénticosa los de ensayosprevios(calles3, 6, 9 y 12). Cuandoel tratamientocon Sil selleva acaboa 100C, seapreciaunanotablediferenciaen el patróndebandasdepLSI con respectoal obtenidoen ensayosa 37~C, mientrasquepara pLSS no se observan variacionessignificativas.Así, cuandoel DNA de pLSl-SI (100C)sedigiere con EcoRí (calle 2) se observantres bandasmayoritariasde 2.7, 3.0 y 3.4 kb, ademásde sus complementarias,menosvisibles,de 1.7 y 1.4 kb (la de 1 kb esapenasperceptible)y de los linealesde 4.4 kb. Lasbandascorrespondientesa 3.0y 2.7 kb presentanintensidades 110 similares,en tanto quela bandade 3.4 kb esmás tenue.El fragmentoS1-EcoRI de 3.0 kb contieneel sitio HpaII, ya queesdigeridopor esteenzima,dandolugar a la aparición de un fragmentoSI-Hoalíde 2.3 kb (calle 8). Tal y comoobservamosen ensayosprevios, el DNA depLSI tratadocon SI a 370C tambiénda lugar a los fragmentosde 3.0 kb (SI- .L~iRI) y de2.3 Idi (S1-fl~1I), trasla digestiónconEcoRI (calle 3) y confrgRI y HnaII (calle 9), respectivamente.Por lo tanto, el sitio sensiblea Si que da lugar a estos fragmentoscorrespondeal sitio mayoritario de reconocimientoa 370C (alrededorde la coordenada170 de pI.S1). Por su parte, el fragmento S1-EcoRIde 2.7 kb permite localizar un segundositio sensiblea SI, másfrecuentea IOOC que a 370C (calles2 y 3, respectivamente).Un fragmentode igual tamañoaparecetras la digestiónconEcoRídel DNA de pLS5 tratadocon Si a lO~C (calle 5) o a 37’C (calle 6), por lo que dicho fragmentono contendríala región delecionadaen este plásmido.En doblescortes EcoRI+HpaII, estefragmentode 2.7 kb desaparece,dandolugar a un fragmentoSI- Hpafl de unas2.0 kb, tanto parapLSI (calles8 y 9) como parapLS5 (calles II y 12). No obstante,parapLSl aúnseobservauna bandatenue en la posición correspondiente a2.7 kb procedente,comoveremosmásadelante,de la digestiónconHpaII del fragmento Sí-EcoRíde 3.4 kb. Estos resultadospermitenlocalizarun segundositio de acciónde SI a 2.7 it del sitio EcoRí, alrededorde la coordenada470de pLSI. Por último, existe un tercersitio menossensiblea Si (incluso a lOt), a unadistanciade unas.3.4 kb del sitio EcoRí.El fragmentoSI-EcoRíde pLSI correspondientea estesitio esdigeridopor HpaII, apareciendounabandamuy tenue de unas2.7 kb (bastanteindefinidaentre el fondo). Esto localizaríael sitio sensiblea SI alrededorde la coordenada4170 del DNA ck pLSI. Paraconfirmar lasposicionesatribuidasa los tressitios mayoritariosde acción de 51 a lOt, el DNA de p1~S1-S1(100C> se digirió con B211 (enzimacon un solo sitio de corteen la coordenada804), o con BglI yflQlRl estas estructuraseranlos mejorescandidatosparaserconsideradoscomoelementosrequeridos paraun origen funcional, explicandoasí la necesidadde superenrollamientodel DNA queva a ser replicado. Análisis de deleciéndel ori2en funcional . A lo largo de este trabajo, distinguiremosentreel sitio de iniciación de la replicación(la localizacióndel primer nucleótidoincorporado)y el origen funcional (el menor segmentorequeridoen cts para que haya actividad biológica). En tanto que el primerohasido localizadomedianteel sistemain vitro en el fragmentoHinfI D de pLSl, la determinación del segundose ha realizadopor análisisde la secuenciade DNA de derivadosdelecionadoscapacesde replicar en pneumococos. El plásmidopLS5 tiene unadeleciónbiencaracterizada(coordenadas34 a 365 depLSI, ambasincluidas),quecomprende123 pb del fragmentoHinfl D. Paraconstruir derivadoscuyasdelecionesse adentraranmás en este fragmento,el DNA de pLSl se linearizócon Baní(enzimacon un sitio de corteúnico en la coordenada214), y sedigirió con nucleasaBAL3I de forma que segenerarandelecionesde 500 a 1000 pb. La mezcla de ligación se usó para transformarS.pnewnoniae708, realizándosea continuaciónun análisis de restricciónde 60 de los transformantesTc’. Todas las delecionesgrandes (superioresa unos 400 ph> eran asimétricas,de forma quese extendíanprincipalmente haciala izquierdadelsitio ll~iI (segúnse representa,de 5’ a3’, la secuenciade la cadena codificante).Además,encontramosuna seriede derivadosquehabíanperdido tanto la horquilla III centradaen la posición 101-102(Fig. 26), corno el putativo RNA 1. Estos derivadospresentabanun númerode copiasdoble queel del plásmidoparental,siempre quela deleciónno se extendieramuchomásallá del sitio de corte Neol en la posición 4221.Si estosucedía,el númerode copiasdescendíanuevamente,debidoala desaparición de la señalde iniciaciónde la cadenaretrasada,de la quetrataremosmásadelante.Entre los derivadosque conservanel sitio NcoI en 4221, seleccionamosel más pequeño (denominadopLSlA24) paradeterminarsusecuenciade nucleótidosen los extremosde la deleción.De estaforma hemosdeterminadoquela regióndelecionadaen esteplásmido seextiende382 ph a la izquierdadel sitio fl~nI y sólo 187 pb a su derecha,esdecirdesde el nucleótido4240 al 401, ambosincluidos. Esteplásmidoreplicanormalmente¡it vivo, y presentael fenotipo de doble númerode copiascaracterísticode los plásmidosque 114 carecende la horquilla III y/o del RNA 1. La deleción de pLSiA24 llega casi hastala basede la horquillaII (Fig.26), siendo,bastael momento,la deleciónquemásseadentra por el extremo izquierdo del fragmentoHinfl D. En otra serie de experimentosque detallaremosmásadelante,el DNA depLSI fue linearizadoen el sitio BglI (coordenada 804)y digeridocon BAL31, de forma quese obtuvieronderivadosdelecionadosque se adentranpor el extremo derechoen el fragmentoHinfl D. La deleción que más se extiendeen estesentidoesla del plásmidopLSIAA4, que incluye las coordenadas649 a 816. Las delecionesde pLSlA24 y pLS1AA4, junto con las de otros derivados obtenidosen este trabajo,nos hanpermitidodelimitar el origen funcional de pLSI. En la Figura27 semuestranlas regionesdel replicóndepLSl delecionadasen los distintos derivados.Todos estosplásmidospuedenser establecidosy mantenidosen células de pneumococos,por lo que deben poseertodos los elementosnecesariosen cis para su replicación.Sin embargo,el plásmidopLSI=A15(cuya deleciónincluye los nucleátidos 760 a 854) carece de una función requerida para su replicación, que puede ser complementadaen trans (la proteínaRepB, iniciadora de esteproceso).Por lo tanto, pLS1AA15sólopuedeestablecerseen presenciadeotroplásmidoquele suministredicha t en pJS4 (786-3278> 760-654)flA>5 (649-8>6> A A4 34-365;3284-4221) t4 4240-401>A24 —J L—~ A24 (34—365) AS — —>< rr o o — II’?’ II 1 ~ .~ pLS1 tú Re~ A pLSI/Hinf 1 D E A O EG 6 Figura 27. Análisis de delecióndelorigen funcional de replicaciónde pLS1. Las líneas por encimadel mapa de restricciónde pLSl representan las regionesdelecionadasen los distintos derivados analizados. Para los plásmidoscuya secuenciade DNA procedeexclusivamentede pLS1, los nombresde las delecionesy los nucícótidosincluidos en cHasse presentana la izquierda.AA1S: deleciónen pLS1AAI5; ÉxA4: deleciónen pLStáA4;A4: deleciónenpLS4;A24: deleciónenpLSlA24;A5: deleciónenpLS5. ParapJS4,cuyasecuencia de DNA procedeen partede pLSl y en partede pC194, se representasólo la deleciónque afectaal DNA de pLSl (coordenadasentreparéntesis).En la parteinferior de la figura se muestrael mapacorrespondiente a los fragmentosHinfl de pLSl; el fragmentoO (en el que hemos localizado el sitio de iniciación de la replicacién)aparecerayado.Entrelosdosmapasfísicosse indicala posicióndel genparaunafunción (RepE) esencialpara la replicacióndel plásmido. 115 función. Estacomplementaciónde RepBen trans seobservatambiénparael plásmido pJS4, un derivado Cm1 aislado iii vivo y basadoen el replicón pLSi. Este plásmido contienela secuencíade pLSl entrelas coordenadas3279 y 785, juntocon el gencat de pC194 (Ballestery cols, 1989). La región de pLSl delecionadaen pJS4semuestraen la Figura27. A partir de los resultadosmostradosen estaFigura,podemosestablecerque el origen funcional de pLSl estáincluidoen unaregión de247 pb queseextiendedesde el extremoderechode la delecióndepLSlA24 (nucleótido402) al extremoizquierdode la delecióndepLSlzsA4(nucleótido648).Sin embargo,no hemosconseguidoreplicación a partir del ori( +) de pLSI cuandola mínimaregión quesupuestamentelo contienees donadaenotros repliconesy la proteínainiciadoraRepBessuministradaen trans.Entre otras estrategias,tratamosde donarel fragmentoBanI(214)-ApaLI(607)de pLS1 en el sitio Hindilí único de un plásmidopCl94copcuyas funcionesde replicación han sido inactivadas.Intentos para estableceresta construcciónen pneumococosque llevan pLSIcopZ (para suministrarRepB en trans) fueron infructuosos (no se muestra>.Es posiblequela elección tanto del DNA vector comode la región de ésteen quese va a donarel ori( +) tengaunagranimportanciaala horadeconseguirunaactividadfuncional de dicho origen (véaseDiscusión). La región en la que hemosdelimitado el origen funcional de pLSl está totalmenteincluida en el fragmentoHiníl D y presenta,ademásde lashorquillas 1 y II, tres repeticionesdirectasadyacentesde 11 pb (iterones11 a 13) que se inician a 74 pb del final de la horquilla 1 (Fig. 28). Hastael momentoen que serealizó estapartedel trabajo,no se habíanencontradoelementosestructuralessimilaresen otros plásmidos pequeñosdebacteriasgram-positivas,aunquese habíandescritorepeticionesdirectasen repliconesde bacteriasgram-negativascomoF, RK2, RSF1O1Oy R6K. Estassecuencias parecenfuncionarcomo sitios de unión de las proteínasde replicaciónen la activación de los orígenes(Filutowicz y cols, 1985; Haring y cols, 1985; Stalker y cols, 1981). La búsquedade homologíascon ordenadorno ha reveladola existenciade similaridades significativasentre las repeticionesdirectasde pLSI y las de estosplásmidos.Nosotros propusimosque los tresiteronesde pLSI podríandesempeñarun papel importanteen el reconocimientodel origen por una o varias proteínasque, según los resultados obtenidosen el sistemade replicación¡ti vitro, estaríanespecificadaspor el plásmidoy se requeriríanparael procesoreplicativo.Estasprediccioneshansido ya confirmadasal comprobarqueRepBseunea lasrepeticionesdirectas,produciendounaroturaespecífica de cadenaal final del lazo de la horquilla 1, entrelos nucleótidos448 y 449 (G/A) (de la Campay cols, 1990; Fig. 28). 116 1 II 07 A C ~ 4G~-.>44$~449) 1 0 0< e-e e-e TA CC 7A 0C TA 0C r-A 00 R•~A 1Ot,STG44GG-:TAAAA4~oz ______40’ 1-A to, I4tA-? A O--4pb—-1tt~oeeAeyrrrcfooeaerrcooco.c,.r, - - 4Opb - - 014CM -. 28b~ - - T1o.oAoOTOACOOATG—.~J 1? la 13 ApoU — Figura 28. Elementosde secuenciaen la regióndondese localizael origenfuncional de pLS1. Sobrela cadena(+) del plásmidose indican los bordesde las delecionesque delimitan el origen funcional. A24: deleciónenpLS1~24;AA4: deleciónen pLS1AA4. La regióndelimitadaincluyelas horquillas¡y TI y los tres iterones(11 a 13). En la basedela borquilla 1 semuestra,dentrodeunacaja,la secuenciaconsensodeorígenes y promotores de los ONAs fágicos (Kornberg, 1980),en tanto queen eí lazo de la estructurase indica el sitio dondeRepBintroduceel cortemonocatenarioespecífico(de la Campay cols, 1990).Dentroya de la región incluida en la deleción~A4 se localiza el inicio de la secuenciacodificante de repA. El contenido en G+C de la región del origen es relativamente alto (aproximadamenteun 50%),comparadoconel contenidototal en el DNA depLSI (37%). Unabúsquedade homologíasentreestaregiónde pLSI y el origen de la cadena(+) de varioscolifagosde cadenasencillano revelasimilaridadessignificativas.Sin embargo,a nivel estructural,las horquillas 1 y II de pLSI recuerdanla estructurapropuestapara el origen del fago fi (Horiuchi, 1986). Además, la secuenciaconsensode orígenes y promotoresde DNAS fágicos (Kornberg, 1980): 5’-CACTAT-3’ 3’-GTGATA-5’ estápresenteen el extremoderechode la horquilla1 (Fig. 28). Por otraparte,no sehan encontrado cajas para DnaA ni homología con oriC en esta región de pLSI. Recientementehemosencontrado,poranálisisdeordenador,homologíasentreestaregión de pLSI y regionesde otros plásmidosde bacteriasgram-positivas(véaseDiscusión). 117 4. EL ORIGEN DE LA CADENA RETRASADA . Característicaseeneralesdel orU-) de nLSL . Comoya hemoscomentado,las célulasdeS.pneumoniae,B.subtilisy E.coIi que contienen pLSl acumulan una determinada cantidad de formas plasmidicas monocatenarias,que parecenser intermediariosen un mecanismode replicacióntipo círculo rodante.Paracompletarel procesoreplicativo,estasformasdessDNA debenser convertidasen dsDNA. Estaetaparequeriríala existenciadeuna señalqueactúecomo origen de la cadenacomplementaria,tal comoocurreen los coJifagosde cadenasencilla duranteel pasode SS -~ RF. La acumulaciónde ssDNA de pLSI esmuchomenor en pneumococosque en los otros dos huéspedes(Fig. 20), indicando que, si bien la replicación de esteplásmido se llevaría a cabo por el mismo mecanismoen las tres especies,la conversiónde ssDNA a dsDNA seríamuchomáseficienteen S.pneunioniae queen B.subriliso en E.coli. Por su parte,pC194(queparecereplicartambiénvía circulo rodante;te Riele y coN, 1986a, 1986b)acumulaunagran cantidadde ss~DNA en los dos huéspedesgram-positivos(nosotrosno hemosconseguidoestablecerpCl94 en E.coli), segúnseobservaen la Figura29. Estoshechosdemuestranquela eficienciade conversión de ssDNA a dsDNA dependedel huéspedy del replicón. El plásmidopJ537 es un híbrido compuestopor pLSI y pC194 unidosen sus sitiosHindilí únicosde formaquelascadenas(+) deambosreplicones(lasquedanlugar a formasde ssDNA) seencuentranenfrentadasen estaconstrucción.En S.pneumoniae, esteplásmidoreplica (al menosmayoritariamente)apartir de pC194,a pesarde quelos dos repliconesestán intactos.A partir de pJS37,seconstruyóun derivado(denominado pJS38)en el quese inactivó la replicaciónconducidapor pC194medianteel relleno con Fol 1K del sitio AccI único, localizadoen el genrepH (Ballestery cols, 1986, 1989).Por lo tanto, pJS37y pJS38se diferenciansólo en dos nucleótidos,pero utilizan para su replicaciónorígenesdistintos,demaneraquelas formasintermediariasdessDNA en uno y otro plásmido deben ser complementarias.Ambos plásmidostienenun númerode copiassimilar. Una forma de estimar la proporción de ssDNA plasmídico consisteen analizar (mediantehibridación con una sondamarcada)el DNA total transferido a membranatras su desnaturalización.Cuando se analiza la presenciade material plasmídicomonocatenarioencélulasdepneumococosquecontienenpJS37o pJS3S(Fig. 29) se observauna mayor acumulaciónpara pJS37,de forma que la relaciónssDNA a dsDNA paraestehíbrido essimilar a la la encontradapara pC194 (Fig. 29A), cuyas 120 Localizacióndel ori(-) de nLSl . En un capítuloanterior hemoscomentadoqueel plásmidopLS4 (basadoen el replicónpLSI) acumulaunagrancantidadde formasmonocatenariasen£pneumcn¡ae (Fig. 21B). Esteplásmidofue construidoapartir de pLS5 por eliminacióndel fragmento HindIJJ(3279)-NcoI(4221),enun intento desuprimirregionesdeDNA no esenciales(Fig. 27). Cuando el nuevo derivado delecionadose establecióen pneumococos,se hizo evidenteque presentaba,con respectoa su parentalpLS5, unaacusadadisminución en el númerodecopiasdedsDNA (de C2 parapLSSa 10 parapLS4;Tabla6; véasetambién Fig. 21A). Parecía, pues,quealgunafunción dereplicaciónhabíaresultadodañadacomo consecuenciade la deleción.Ya quela eliminación del fragmento1-lindlII-NcoI acerca el gen ~‘aa la región donde se localiza el origen de replicación (véaseFig. 35), la disminuciónen el númerode copiaspodíadeberseaunainterferenciade la transcripción de dicho gencon la replicacióndel plásmido.Paracomprobaro descartarestahipótesis, insertamosun terminadorbidireccionalde la transcripción,procedentedel bacteriófago ~29,en el sitio EcoRI único de pLS4. El nuevo plásmido,pLS4-t, presentaun número de copias similar al de pLS4, demostrandoque no existe este tipo de interferencia transcripcional(no semuestra).Otraposibilidadera que la alteraciónde la replicación ocurrieraa nivel de la síntesisde la cadenaretrasada.De ser así, la relaciónssDNA a dsDNAencélulasdepneumococosconteniendopLS4 debíaestaraumentadaconrespecto a la observadaen células quellevan otros plásmidosderivadosde pLSI. Esto es lo que ocurre en realidad, ya que hemosencontradoque para pLS4 se acumula una mayor cantidadde formasmonocatenariasqueparasu parentalpLSS(Hg. 30A), lo queunido a su menornúmerode copias (unas5 vecesmásbajo) determinaquepL-54 presenteuna proporción muy aumentadade DNA monocatenario.Estos resultadossugierenque en el fragmento jndlII(3279)-fl~QI(422l) de pLSI existe una señal que funciona eficientementeen £pneumon¡aecomooñ(-) del plásmido,cuya eliminación conducea un aumentode las formas de ssDNA y a una disminución en el númerode copias (dsDNA) plasmídico. Característicasdiferencialesde nLS4 . Dadaslas peculiarescaracterísticasquepLS4 exhibía en pneumococos(bajo númerode copias y gran acúmulode ssDNA),era interesanteconocersi estefenotipo se presentabatambiénenB.subtilisy en E.coli. Al mismo tiempo quisimosdeterminarsi 121 TABLA 6: Características diferenciales de pLS4 en cuanto a eficiencias de transformación y núnero de copias en (os tres huéspedes Huésped Eficiencias de transferencia NCmnero de copias DNA u.f.c. 1 nl Los OMs plasmídicos se purificaron de S.oneLr.oniae: el origen heteroespecífico de tos ONAs da Ligar a una disminución en La eficiencia de transferencia plasmídica en E.subtilis íEspinosa y cok, 1982) (b) Tarr~,oco se obtuvieron transformantes con el DNA del plásmido pLS7 (to~rJj-), cob7). la deleciónen pLS4 afectabade algunamaneraa su capacidadparaestablecerseen los distintoshuéspedes.Paraello, los DNAs de pLSS, pLS4 y pLSI se purificaron a partir de cultivos de pneumococosy se usaron,a las concentracionesde 0.1 y 1 pg/ml, para transformarcultivos competentesde las tresespecies.Las eficienciasde transformación obtenidas,asícomolos númerosde copia de cadaplásmidoen los distintos huéspedes, semuestranen la Tabla6. El plásmidopLS4 se transfiere,en todos los casos,con menor eficienciaquesu parentalpLS5. De hecho,no hemosconseguidoestablecerloenE.coli, y para las otras dos especiesse observauna disminución de unas5 vecesen el número de transformantes/ml.Sin embargo, comparadocon pLS1, pLS4 se transfiere más eficientementeaB.subtilis.Estamayoreficiencianoparecedebersea la presenciade más multimerosen la preparaciónde pLS4 que en la de pLSl, ya quehemosobtenido los mismosresultadosempleandodistintaspreparacionesde DNA, y en ningunade ellas hemosobservadodiferenciasentre la proporciónde multímerosde pLS1 y pLS4 por tinción del DNA con EtBr. Estadiferenciatampocose observacuand.ose analiza,por hibridaciónconunasondaradiactiva,el DNA total presenteenextractoscrudosde células de S.pneurnoniaeque contienenuno u otro plásmido.En algunasmuestrasde estos 123 a 365 depLS1, ambasincluidas),en tanto quela deleción específicade pLS4 le restaría eficaciaparatransferirsea cualquierade las tres especies. El númerode copiasplasmídicose deterruinóen cultivos de S.pnewnoníaey B.subtiliscrecidosenpresenciade Tc, tantopordensitometríacomopor marcajedeDNA in vivo, obteniéndosede ambas formas valores similares (Tabla 6). Para estas determinacionessólo se tuvieronen cuentalas formasde dsDNA. En pneumococos,la delecióndel fragmentojjindIII(3279)-.N~I(4221) conducea una disminuciónde unas 5 vecesen el número de copias. Sin embargo,en B.subtilis, pLSI y pLS4 presentan númerosde copiasaproximadamenteiguales,con lo quesólo hay unareducciónde dos vecesen el númerodecopiasde pLS4 respectoa su parentalpLS5. Estohacíainteresante la determinaciónde la cantidadde monocadenaacumuladaen células de B.subtilis que contienencada uno de estos plásmidos.Tal y como ocurre en pneumococos,pLSS acumulaen B.subrilis mayor cantidadde ssDNA que pLSI, aunquela relaciónssDNA a dsDNA se mantienepara ambosplásmidos(Fig. 30A). Comparadocon pLS1, pLS4 presenta,para unacantidadsimilar de dsDNA,unaacumulaciónprácticamenteigual de formasmonocatenarias(Fig. 30B). Estosresultadossugierenquela señaldelecionadaen pLS4, y que tan eficientementeactúaen S?pneumoniaecomoori(-), es muy poco o en absolutofuncionalenB.subtilis,y queunposiblemecanismoalternativoparala conversión de ssDNA a dsDNA es, de cualquierforma, muy poco eficienteen estehuésped. Ya quela estabilidadde un plásmidopuedeestarrelacionadacon su número de copias, quisimossabersi pLS4 se perdía de la población duranteel crecimiento exponencialde cultivos de pneumococosen ausenciade presiónselectiva.En la Figura 32A se muestranlos resultadosde los tests de estabilidad para distintos plásmidos establecidosen S.pneumoniae.Mientrasqueno se detectapérdidasignificativa de pLS1 o pLSSdurantelas 60 generacionesdel ensayo,pLS4 y su derivadopLS4-t muestranuna similar y gran inestabilidad. La tasa experimentalde pérdida (L05) para estos dos plásmidos,calculadaapartir de la curvamostradaen la Figura32k es de0.1 por célula y por generación(aplicandola ecuacióndada en el apartado5 de Métodos).Estos resultadosno dejan de ser sorprendentes,ya que la tasateórica de pérdida(L~) por distribución al azar de las copias plasmídicasentre las células hijas es 10~ para un plásmidoque, comopLS4 enpneumococos,presente10 copiaspor equivalentegenómico. Este valor de 1, se desprendede la ecuaciónbinomial: = (1/2)2n 124 A loo A—2--——-.-~——~-—~ a 2— o lo a * O a * o lO 20 30 40 50 60 NUMERO DE GENERACIONES Y O lO 20 30 NUMERO Figura 32.Estabilidad de los derivados que carecende oñ(-) enS.pncwnoniac(A) y en R.subtilis(B). La propoición de célulascon plásmido en cultivos creciendoexponencialmentesedeterminé comocl porcentaje de célulasTé. Como control, se analizósimultáneamentela estabilidaddc pLSI y pLSS. Simbolos~pLSl (¿=), pLSS (A), pLS4 (*j, pLS4-t (O), pUS? (e). e-, 1— (o 4 -J n-J Lici Li o u’ 4 1—z Li ci o o- 0.1 O Loo B e-> E- U> 4 -j D -A LA<-5 u’ O w 4 1— z u’ <-5 oo- lo A Cd •~ g—7-—vF--s--—’A-~ 40 50 60 DE GENERACIONES 125 siendo2n el númerode copiasdel plásmidoen el momentode la división. Además,en estecálculo teórico no sehan tenidoen cuentalas formasde ssDNA (muy abundantes para pLS4) que entraríantambiénen el reparto. Para determinar si la alta frecuenciade pérdida de pLS4 se debe a la disminución en el númerode copias o a la pérdidade algún elementode estabilidad, analizamosel comportamientosegregacionalde pLS7, un plásmidoquecarecetambién del fragmentoHindIII(3279)-Ncol(4221),pero cuyo númerode copias(dsDNA) estáen los niveles observadospara pLSi. Este plásmido se construyó en pneumococospor ligación de los fragmentosPstI A de pLS4 y NI B de pLSlcop7(en el que se localiza la mutaciónde copia). Por lo tanto, pLS7 carecedel ori(-) funcional en pneumococos, no presentala deleciónde pLS5 y tiene la mutacióncop7. Así, pLS7 tieneun númerode copias de 19±2y acumulaunacantidaddessDNA algosuperiora la observadaparapLS4 (Fig. 30B; las diferenciasson poco clarasya que el autorradiogramaestásaturado).El test de estabilidadde pLSY en S.pneurnoniae(Fig. 32A) muestraque el plásmido es inestabley sepierdede la poblaciónala mismavelocidadquepLS4 y pLS4-t (L05 = 0.1), a pesarde su mayor número de copias. La siguientecuestiónque se planteabaera sabersi la regióndelecionadaen pLS4 influye en la estabilidadde estosplásmidosenB.subtilis. Mientrasque parapLSl y pLS5 no hemos detectadopérdidas significativas durante 130 generacionesde crecimiento en medio no selectivo, pLS4 (similar a pLSI en número de copias y acumulaciónde ssDNA) segregarápidamentede la población,con una tasade pérdida L~>= 0.2 por célulay generación(Fig. 32B). En contrasteconestosdatos,la tasateórica de pérdida(Ir) paraun plásmidode 5 copiasque segregaraal azaresde 9.7 x 1W. Estos resultados,junto con los obtenidosen pneumococos,indican que en amboshuéspedes la segregaciónde los plásmidosque carecendel fragmentofli~dHI(3279)-flgfl(422l) es mas desventajosaque la esperadapor simple reparto al azar, y parece, además, independientedel númerode copias. Característicasde la secuenciade nucleótidosen la reEjón delecionadaen pLS4 . En la región incluida enla deleciónde pLS4, alrededorde la coordenada4170, habíamoslocalizadouno de los tres sitios sensiblesa Sí mayoritariosa 10 0C (Fig. 25), quepodríacorresponderaunalargaestructurasecundariapredichaporel ordenador(Fig. 126 ST) OC pLSI ~ O CC OC a O o A CO £0 o o Co OC CO 01 CO O II 1115 Al 421S & CCI lOO-flCCIIOCCÁ TIGO-O 5 ¡ OC CC CG pC22I ~ CO CCoc CG CI TI OC Rs. TI (ST ffi CI 15> CCIO;OSIAll%l~I,, OC Al OC CG pEIS4 ~ lo OC CI OC CO A0 TI CI CI CI OC II It lA OC el OC 00 RO. TI lo 641 ‘0 ST CCOIA&ICIIIAII Tollo Figura 33. Estructuraspropuestaspara el ori(-) de pLSl y para los elementoshomólogosde algunos plásmidosde Laureus.Las configuracionesmostradashansido generadasmedianteanálisis por computador y posteriorrefinamientoa mano.Se han subrayadolas secuenciasconservadasen la baseizquierdadel talio (RSE) y en el lazo (consensode seis bases)decadaunadelas estructuras.Las coordenadasmostradasse han tomadodelas secuenciasdadaspor Lacksy coN (1986), Projany cols (1985),Horinouehiy Weisblum (1982b), y l-lorinouchi y Weisblum(1982a). 33}. Lasepeticióninvertidwquepuededar lugar a estaestructurase- extiendeentre las coordenadas4104 y 4219 depLSi y estácentradaentrelos nucleótidos4159y 4160. Este elementopodríaser,por lo tanto, la señalpara la iniciación de la síntesisde la cadena retrasada,procesoen el cual los intermediariosde cadenasencilla se convertiríanen formas de cadenadoble. En otros plásmidos de bacteriasgram-positivasse había mencionadola existenciade largospalíndromesa los que, hastaaquelmomento,no seleshabíaasignado ningunafunción (Projan y cols, 1985). Medianteanálisispor computadorde estructuras secundariasencontramosque,al menostres plásmidosde estafilococos(pC221,pC194 y pE194),podíanformar estructurastallo-lazo similaresa la de pLSI y que, comoésta, presentabanlazos y desapareamientosinteriores (Fig. 33). Una característicade todas estasestructuras(incluidala de pLSl) esla presenciade una secuenciamuy conservada 127 enunode los extremosde la basedel tallo. Estasecuencía,denominadaRS8, habíasido definidaparalos plásmidosde estafilococoscomoun sitio específicode recombinación parala formaciónde cointegradosentreplásmidosno homólogos(Novick y cols, 1984). En la Figura33, la cadenarepresentadaparapLSJy pC194correspondea la hebraque aparececomo ssDNA (estetrabajo; te Riele y cols, 1986a),ya queéstaes la quedebe poseerla setalpara la conversióna dsDNA. De estamanera,el RS~ quedasituadoen el extremo5’ de la estructurasecundariay la secuenciade DNA de estaregión es homólogaenambosplásmidos.ComoparapC221y pE194no sehabíadefinidola cadena correspondienteal DNA monocatenario,decidimosrepresentarla que teníahomología en el RS8 con la cadena(+) de pLSl, de forma que RS8 y palíndrome quedaron orientadoscomo en esteplásmido.La búsquedade homologíasentreel palíndromede pLSl y los de los otros tres plásmidos revela, ademásdel RS8 y de las bases complementariasa ésteen el extremo3’ del tallo, unasecuenciacomún:5’-TAGCGT- 3’, queapareceen el lazo de la horquillade todosestosplásmidos,exceptuandopE194, A T 1 1 1 A 7 Y O O O 1 1 r O CC T CC A YA AY 1 7 0 e AY CC lA AT AT Al ce Al It TA lA A ce YA 1 It 1 OC lA A O 10 2368 lA 2467 It <5 )IGTATnAGTAACA (3 Figura 34. Estructurasecundariapropuestacomo señalalternativade conversiónde ssDNA a dsDNA. La con5guraciónba sidogeneradamedianteanálisispor computador.En el lazode la estructurase Jocaliza la secuenciaconsensode seis bases(en negritas). 128 parael que seobservaun cambiode unasolabase(A en lugar de T) (Fig. 33). Esta secuenciaconservadapuedeserun elementofuncional importantede estospalíndromes. El posiblesignificadode la localizaciónde dicha secuenciaen una región desapareada seplantearáen la Discusión. Dado queenS4neumoníaela delecióndel ori(-) de pLSJ alterala replicación delplásmido,pero no la impide totalmente,debeexistir unsitio omecanismoalternativo (menos eficiente) para la iniciación de la cadena retrasada.Basándonosen las característicasdelon’(-) genuino,pusimosunaseriede condicionesa la existenciade un posiblesitio alternativo:deberíapoderformarunaestructurasecundariaen cuyo lazose localizarala secuenciaconsenso,y ademásestasecuenciadebíaestaren la cadena(±). Unabúsquedaconcomputadoren el DNA depLSI muestrala existenciade 5 secuencias consenso,apartede la que se encuentraen el ori(-). Dos de ellas están en la cadena complementariay, en consecuencia,no podríanfuncionarcomoparte de unaseñal de conversión. Otras dos están en la cadena apropiada (coordenadas149 y 1810, respectivamente)perono encontramosningúnpalíndromeasociado.La últimase localiza en la coordenada2419, en el lazo de unaposibleestructurasecundariaqueseencuentra incluidaen e) gen ret (Hg. 34). Estaestructurapodríacorrespondera un sitio minoritario sensible a Si que habíamoslocalizadohacia el nucleótido 2300, ya quees e) único 40 2 Kb N — 8NcoI Psi!NcoI H~ofl EcoRI H&1á~ RNA Yet Bq~I Psi st RNA si 2Ap0 Re,8 SI ¡Ir pLS5 pLS4 pJS3 cap? u Psi! 6g1 1 Psi! Neo! ti indm Ncp 1 P~t1 pepA RepE CT~ Figura 35. Mapas de varios plásmidosbasadosen el replicónpLS1 y localizaciónen ellos dc los sitios sensiblesa Si. Sólo se indican los sitios de restricciónrelevantesparaestapartedel trabajo.Les huecosen los mapasrepresentanlas regionesdelecionadasen pLSS y pLS4. EJ plásniido pJS3cop7corresponde, básicamente,a pLSlcop7con el gen leí sustituidopor el gencaí de pC194; la parteen negrorepresentael DNA de pC194. Los polipéptidossintetizadospor losdistintosgenessepresentan en rayado, con el extremo agudocorrespbndiendoal C-terininal de las proteínas.Las flechasonduladasrepresentanel putativo RNA 1 y el ctRNA II. Los sitios principalesde acción de Sí a 100C (flechasnegras)se indican sólo sobrelos plásmidosen cuyos DNAs hansido identificados. 129 palíndromequehemospodido encontraren estaregión.La actuaciónde estaestructura comoseñalde conversiónalternativaconcuerdacon las observacionesde experimentos en los que se pretendíaintroducir la deleción de pLS4 en piS3cop7.Este plásmido, basadoen el replicón pLSI y queconfiereresistenciaa Cm (Ballestery cols, 1986; Fig. 35), contieneel ori(-) de pLSl, carecedel gen tet y por lo tanto de la señalalternativa propuesta,y tiene la señal de conversiónde pC194 en la cadena‘incorrecta0 (-). En S?pneumoniae,fuimos incapacesde recuperarderivadosde pJS3cop7en los que se hubieraeliminado el fragmentoHindIII-~~I que contieneel oñ(-) genuinode pLSI, favoreciendola hipótesis de la existenciade la señal de conversiónalternativa que proponemos. 5. CARACTERIZACION DE LA FUNCION INICIADORA DE LA REPLICACION . Los resultadosde la replicación in vitro de los plásmidosde estreptococos sugeríanla existenciade unao variasproteínasespecificadasporel plásmidoy requeridas para su replicación.En efecto, la síntesisde DNA en extractospreparadosa partir de células sin plásmido dependíatotalmentede la síntesisde novo de proteínas,mientras que en extractos con plásmido endógenola replicación era muy poco sensible a inhibidoresde la síntesisproteica.Iii vivo, unafunción necesariapara la replicacióny complementableen transestáausenteen los plásmidospLS1AA15 (cuyadeleciónincluye los nucleótidos760a 854)y pJS4(que carecede la regiónde DNA depLSI comprendida entrelos nucleótidos786-3278,ambosincluidos) (Fig. 27). Un análisis de la secuencia de DNA muestraque. en ambosderivados,la deleción elimina parcialmentedos orfs, 595 ApoLí 655 AGAE~~iGAGCAGGG T T ATG C~TTTATAAAATTTTGAGAGGTGACGCAT 6 — Rep A 3D. Figura 36. Posiblesseñalesde iniciación de transcripcióny traducción del gen repA. Se muestran,en recuadrosgrandeso pequeños,las cajas-35 y -10 de dosposiblespromotoressolapantes.El espaciadoentre ambascajases de 17 pb parael promotormásdistal (recuadrospequeños),y de 15 pb parael másproximal (recuadrosgrandes).El sitio dereconocimientode~p~LIseindicaennegritas.Sehansubrayadolas secuencias correspondientesal putativo S.D. y al codónde iniciación derepA. 131 podido identificar, por el contrario, ningunasecuenciapromotoratípica,. por lo queno podíamosdescartarqueestegen formarapartede la mismaunidadtranscripcionalque repA. Determinacióndel sitio de iniciación del mRNA renAR . Parasabersi repA y repB setranscribenrealmente,y paradeterminarlos sitios de iniciación de los mRNAs de ambosgenes,realizamosensayosde protecciónfrente a nucleasaSi. Paraello, sepreparóRNA total decultivos deS.pneumoniae708conteniendo pLSI o pLSllcop7. Como sondasse utilizaron dos fragmentosde DNA distintos, según que el ensayoestuvieraencaminadoa determinarel punto de iniciación del mRNA repA o el del mRNA repB. En el primer caso,seutilizó el fragmentode 302 pb j~igpl- Hinfl (4221-685, segúnnumeraciónde pLSIl) de pLSlA24, marcadoradiactivamenteen el extremo 5’ correspondienteal sitio jjj~fl (situadodentro de repA; véaseFig. 39). Después de permitir la hibridación (a 480C) de este fragmento con el RNA total procedentede pneumococosquecontienenpLS1, se realizó el tratamientocon Si. Los fragmentosde la cadenade DNA marcadaprotegidosfrente a la acción de SI por hibridación conRNA semuestranen la Figura37. Estosprotegidosson suficientemente pequeñoscomo para determinarcon precisiónsu tamaño.Tras descontar1.5 nts a las bandasobtenidasporSI paracorrelacionaríasconlas bandasresultantesde lasreacciones químicasde secuenciacióndelmismo fragmento,seobservaqueel protegidomayoritario tiene 56 nts (calle 1). Esto permitedefinir el puntode comienzode la transcripción en el residuoA en la coordenada633. Lasbandasminoritariasdediferentelongitudpodrían deberseaartefactosdescritosen la actuaciónde la nucleasaSI (Sollner-Webby Reeder, 1979). Aunque, debidoa la proximidadde los dos posiblespromotoressolapantes,los resultadosobtenidosno permitendistinguir cuál de ellos estásiendoutilizado para la 596 610 repAB mRNA 655 CA TGCATTGAGTGCACGGTTATGC ACTATAGTTTTAT~AAATTTTGAGAGGTGACGCATG.. . Rep A A~.nLI -10 SO. Figura 38.Secuenciade DNA de la cadena codificante de pLS1 en la región del promotor ~AE propuesto. Se indica el punto de iniciación del mRNA repAB, determinado en los experimentosmostradosen la Figura 37. Lascajas-35 y -10 del promotor~A8 se hanrecuadrado.Entre ambasselocaliza el sitio de reconocimiento deAp~L1. Tambiénse indican el S.D. y el codónde iniciación de repA. 132 transcripciónde repA, nos inclinamospor el quese encuentraalgo másalejadodel gen (Fig. 38), tantopor mostrarun espaciadoconsenso(Rosenbergy Court, 1979) de 17 pb entrelas cajas -35 y -10 (frente al corto espaciadode 15 pb que exhibiría el putativo promotorproximal), como por la localizacióndel sitio de iniciación de la transcripción a 7 pb del final de la caja-10, distanciamuchomásfrecuentequelos 4 pb quemediarían si se utilizara el promotorcontiguo. Paradeterminarel extremo5’ terminaldelmRNA repBy conocerdeestaforma si repA y repB secotranscriben,utilizamoscomosondaun fragmentodiferentede DNA que incluyee] genrepA enteroy el comienzode repB. Se trata del fragmentode 291 ph AuaLl(607)-Xmnl(902) de pLSI, marcadoen el extremo 5’ correspondientea .NrnnI, dentro de repB (véaseFig. 39). La hibridación de este fragmentocon el RNA total procedentede células quellevan el plásmidopLS1 se realizó a dos temperaturas(45OC o 460C). Tras el tratamientocon nucleasaSI sólo se observan,en cualquierade las muestras,dos bandasmarcadasradiactivamente(Fig. 37, calles2 a 5), unade las cuales correspondeal fragmentode DNA sondarenaturalizado,y la otra a un fragmento protegidode unos270 nts. Esteúltimo identificaríaun mRNA cuyo extremo5’ terminal coincidiríacon el mRNA repA. Cuandoen estos ensayosse utiliza RNA total extraído de células quecontienenpLSlcop7(Fig. 37, calle 6), se observaun fragmentoprotegido del mismo tamañoque el detectadoen los experimentosanteriores,en los queel RNA procedíade células que llevan el plásmidosilvestre. No obstante,la intensidadde la bandaestáaumentadaunas8 veces,segúnsedeterminópor análisisdensitométricodel autorradiograma(compárenselas muestrasde las calles 4 y 6, sometidasa las mismas condicionesexperimentales).Esto encaja bien con los datos que se expondránmás adelante,acercade la función del productodel gen repA: la mutacióncop7,queafecta a estegen, conducea un aumentode unas5 vecesenel númerode copiasdel plásmido, debido a que la proteínaRepA mutantetiene alteradasu función de inhibición de la síntesisdel mRNA repAR. En ningunode los experimentosanterioreshabíamosdetectadobandasque pudierancorresponderaun xnRNA quellevaraúnicamenteel mensajede repB.Tampoco obtuvimos ninguna evidenciade la existenciade un promotor exclusivo de repB en experimentosen losqueseutilizó comosondael fragmento$tyI(758)-.Xnml(902)de pLS1 marcadoen el extremo5’ generadopor corte .Xnin], ni siquiera traslargosperíodos de exposiciónautorradiográfica(no se muestra).Todos estosresultadosindican quela mayoríadel mRNA repB (si no todo) se sintetiza, iii vivo, a partir del mismo promotor que el mRNA ¡-epA. A estepromotor le denominaremos,en adelante,P~8. 1133 kl/nf1 348o Hln~ ~ ~4O4 Hindm,3279 w~coF&l ,3¶7O ~~,50~ ?,c.Ó’ 61 Proteína total 30 0.9 2100 2330 Heparina-agarosa (II), concentrada 4.1 0.81 2050 2530 Ca) Valores no cuantificables la Jr%jestra por la presencia de actividades nucteoliticas en de gelessecosteñidoscon CBB (no se muestra).El rendimientofinal de RepBfue, por lo tanto,de unos 800 pg de proteínapura obtenidosa partir de 2 1 de cultivo. Ya que RepB tiene actividad tipo topoisomerasa1 específicadel ard+) de pLSI (véaseFig. 48), hemosutilizado estapropiedadpara valorarlas diferentesetapas de su purificación (Tabla7). Hemosdefinido unaunidad de RepBcomo la cantidadde proteínarequeridapara convertir 1 pg de DNA ccc superenrolladode pLS1 en la forma ccc relajada,a 370C durante30 mm. Los ensayosde actividad enzimáticade RepB se realizaronen las condicionesdescritasmásadelante,y la cuantificaciónse realizó por densitometradode gelesen los quesehabíanseparadolos productosde reacción(véase Fig. 48). Determinacióndel extremoN-terminal dePeoRpura e identificacióndel codón de iniciación de repB . La determinaciónde la secuenciaamino-terminaldeRepB (Fig. 47) muestra que,exceptoparael residuoY8 (cuyaidentificaciónfue ambigua),los 9 primerosresiduos coincidencon los aminoácidospredichosapartir de la secuenciade DNA, comenzando en el codónde iniciaciónATG en la coordenada853. EsteATG estáprecedidopor un sitio atípicodeunión alos ribosomas(a.r.b.s.),queya hasidomencionado.Es interesante 149 p LS IAAI5 820 . . . . AAAGTCAA.ACATTTCTTGGGTATATTATACTTTATGGCTAAAGAAAAAGCAAGATACTTCACTTTT— o.r.b.s. MA K E KA R Y FI F * * * * * * * TTACTTTATCCTGAATCAATTCCAAGCGACTGGGAGCTGAAACTTGAAACGCTTGGAGTGCCGATG- L LV P E SIP SO WE L >< LEY LE VP M 960 GCAATTAGT A 1 5 Figura 47. Determinación de la secuenciaN-terminal de RepE. Se muestra la secuenciade nucícótidos deja cadena codificante de pIS] entre las coordenadas820 y 960,y los residuospredichospara RepBa partir de estasecuencia. (*) indica coincidencia entre el residuo predicho y el determinado en eí análisis dc la proteína pura; (?) indica posible identidad.Sc muestra también la secuenciacorrespondienteal a.r.b.s., el codónde iniciación de repB y el extremo derechode la región delecionadaen pLS1AA1S. Una secuenciaque podría funcionar como S.D. para la putativa RepB y la Met inicial de ésta aparecensubrayadas. hacer notarque existeun segundocodónAIG en posición 949 (Fig. 47), precedidopor una posible secuenciaS.D. (OGAGIO, coordenada940), que no pareceser usadaen E.coli, ya queen estemicroorganismosólo sedetectala proteínasintetizadaapartir del primer ATO. Sin embargo, no podíamos descartar a priori que estesegundocodón de iniciación de RepBfuerael empleadoen S.pneurnoniae,de forma quela utilización del primer codónATO fueraun artefactodebidoal sistemade expresiónde E.coIi utilizado. Paraestudiarestaposibilidad, se construyeronuna serie de derivadosdelecionadosde pLSl por digestióncon BAL31 del DNA de esteplásmidolinearizadoen el sitio único B211(804). Despuésde transformarun cultivo competentede .Sipnewnoniae708 con la mezclade ligaciónprocedentedeestosexperimentos,seaislaronvariosde estosderivados, y los que parecíanmás interesantesfueron secuenciados.Uno de ellos, denominado pLS1AA15, muestrauna deleciónque incluye las coordenadas760 a 854. Estadeleción elimina partedel genrepA (perono el promotor~A) y los dos primerosnucleótidosdel codón de iniciación de repB en 853 (Hg. 47). Además,la deleciónsitúa un codón de terminación TAA (posición 858) en fase con la lectura del fragmentodel gen repA presenteenpLS1AA15,de formaquenopodríasintetizarseunaproteínade fusiónRepA- RepB.En resumen,estederivadoplasmídicosólo codificaría,si acaso,una variantede RepB (RepB) que comenzaraen el segundocodón ATG. El clon del que se aisló pLSláA15presentaba,además,otroplásmidoacompañantede tamañosimilar al depLSI y que, según reveló un análisis de restricción, ha eliminado sólo unas pocas bases alrededordel sitio B211. El plásmidopLS1AAIS sólo pudo ser establecidoen célulasde 150 pneumococoscuandolas funcionesde replicación fueron suministradasen trans por pLS1.Losresultadosanterioresindicanqueen£pneumoniaeRepBestraducida,también, desdeel primer codónATO. Si un polipéptido RepW sintetizadoa partir del segundo codónATO, y similar a la proteínaA de ~X174,se sintetizaa partir de pLSl (o de pLSIAA1S), no pareceser suficientepara la replicaciónin vivo, al igual queocurre con la proteínaA’ (Colasantiy Denhart, 1987). Ya quela traducciónde RepBpareceusar la secuenciaa.r.b.s.tanto en E.coli comoen £pnewnoniae(y probablementetambiénen B.subtilis), el reconocimientode estasecuenciapor los ribosomaspuedeestarbastante extendidoentre las bacterias.Curiosamente,entre los plásruidosde bacteriasgram- positivas, los genesrep de la familia de pTlSl muestranuna secuenciaS.D. (Projan y Novick, 1988), mientrasqueparalos genesrep de pC194y pE194no sehanencontrado ni secuenciasS.D. ni a.r.b.s. (Horinouchi y Weisblum, 1982a, 1982b; Villafane y cois, 1987). Análisis de la estructurasecundariade RepBno predijeron la existenciade motivosdeunión a DNA de tipo c~hélice-vueIta-ahélice(Ohlendorfy cols, 1983).A partir del residuo77 de RepBse localizaunaregión con cuatroleucinasespaciadasentresí por sieteresiduos,lo cual encajaen las característicasgeneralesdel motivo de cremalleras de Leu, presentetambién en otras proteínasiniciadorasde la replicaciónplasmídica (Giraldo, 1991). Actividad enzimáticade RepB . Una vez purificada RepB, hemos probado su actividad sobre DNA ccc superenrollado.En este trabajo se describeúnicamentela caracterizaciónprimaria de estaactividad,porquesuestudiomásdetalladosehapublicadoenotrositio (dela Campa y cols, 1990). Las mezclasde reacciónpara los ensayosde actividadcontenían,en un volumenfinal de 25 pl, Tris-HCI 20 mM pH 8.0, EDTA 1 mM, KCI 100 mM, UIT 5 mM, EG 5%, MnCI2 20 mM, 0.5 pg de DNA, y la cantidadde RepB indicada en cadacaso. Despuésde la incubacióna 370C durante30 mm, se añadierona cadamuestra6 pg de proteinasaK, la cual sedejó actuardurante10 mm a temperaturaambiente.Tras añadir el colorantede carga,las muestrassecorrieron (30 V, 16 h) en gelesde agarosaal 1% en tampónTBE conteniendo1 pg/ml de EtBr. Los resultadosde ensayosde actividad de RepB sobre el DNA ccc superenrollado(forma 1) de pLSI, utilizando distintas cantidadesde la proteínapura, se muestranen la Figura48A (calles4 a 8). Como se observaen estaFigura, los productosde reacciónobtenidosconsistenenformasOC (II) 152 y formasccc relajadas(1’), queseseparanentresí durantela electroforesisenpresencia de EtBr. Estaacciónes característicade enzimasque, comola DNA topoisomerasa1, cortan(actividad nicking”) y sellan el DNA. Así, en un experimentocontrol en el que el DNA de pLSl fue incubadoen presenciade 8 u de topoisomerasa1 de germende trigo, aproximadamenteel 90% de las formas plasmídicassuperenrolladasse habían convertidoenformas1’, en30 mm de incubacióna 37’C (Fig. 48k calle2). Unaactividad tipo topoisomerasasimilar a la encontradaparaRepBha sido descritacon anterioridad para la proteínaRepCde pTlSl (Koepsely cols, 1985). Sin embargo,a diferenciade RepC,la actividadde RepBdependede la presenciade Mn2~ en la reacción,siendosu concentraciónÓptima20 mM. OtroscationesdivalentestalescomoMg2~, Ca2~y Zn2~ son inefectivos en las condicionesprobadas(de la Campay cols, 1990). Además,hemos encontradoque,enestetipo de ensayos,la actividaddeRepBestámuydisminuidaa 32~C (no se muestra),que esla temperaturautilizada en los experimentosde relajación con RepC.Comoseobservaen la Figura48A, la cantidadde formasccc relajadasproducidas a partir del DNA superenrolladoaumentaproporcionalmentecon la cantidadde RepB añadidaal ensayo,hastaunaconcentración100 nM de la proteína,a partir de la cualno seapreciaaumentodel productorelajado(calles 4 a 8). La acción tipo topoisomerasade RepB se ha probadotambiénsobre otros DNAs plasmídicosderivadosdepLSI, sin quesehayanobservadodiferenciasapreciables en la actividadde la proteínasobrelos distintossustratos.Así, hemosempleadoel DNA de pLSlA24 (cuya deleciónes la que más se acercaal ori(±)por la izquierda) para comprobar ]a actividad de RepB a lo largo de las distintas etapasde purificación (resultadossimilares,no mostrados,se obtuvieron con el DNA de pLSI). En la Figura 48B semuestranlos productosde ensayosde relajaciónen los quese utilizaron, como fuentede RepB: el extractocrudo de célulasde BL2I(DE3)/pLS19tras la precipitación de los ácidosnucleicos (calles2 y 3), la fracción de proteínasprecipitadascon sulfato amónico(70% de saturación)(calles4 y 5), las que precipitaronen ausenciade KCI (calles6 y 7), y la proteínaobtenidatrasla primeracolumnade heparina-agarosa(calles 8 y 9). La proteínaRepl3 obtenidade la segundacromatografíaen heparina-agarosa (concentradaen glicerol) es la quese empleóen los ensayospresentadosen la Figura 48A, y que acabamosde ver. Ni en el extractocrudo, ni tras el fraccionamientocon sulfato amónico,hemospodido detectaractividaddeRepB,debidoa la degradacióndel DNA por nucleasas.En amboscasosse observa,a la menorconcentraciónde proteínas en el ensayo,la conversiónde las formas plasmídicassuperenrolladas(1) en formas OC (11) y lineales(III) (Fig. 48B, calles2 y 4). Esta actividadno es, sin embargo,específica del DNA depLSí, ya quelos mismosproductos(OC y lineales)seobtienentambiénpor 153 incubacióndel DNA de pTl8l con dichasfraccionesproteicas(Fig. 48B, calles 11 y 13). A una mayor concentraciónde las proteínaspresentesen el extractocrudo y en la fracciónprecipitadaconsulfatoamónico,seobservala degradacióncasitotalde los DNAs depLSlA24 y pTl8l (calles3, 5 y 12, 14, respectivamente).En la fraccióndeproteínas precipitadasen ausenciade KO (cal]es6, 7 y 15, 16) seobserva,a la concentraciónmás baja,cierta actividadtipo topoisomerasaquesólotiene lugar sobreel DNA del replicón pLSI (calle 6), en tanto quecontinúaobservándosela aparicióninespecíficade formas OC y lineales(calles6 y 15). De nuevo,a mayoresconcentracionesproteicasseproduce la degradaciónde unoy otro DNA (calles7 y 16, respectivamente).Cuandoseutiliza la proteínaRepBobtenidatras la primera cromatografíaen heparina-agarosa,se observa claramentela apariciónde la forma 1’ (actividadRepB)apartir del DNA superenrollado de pLSlA24 (calles8 y 9). Estaactividad no se observa,sin embargo,cuandoseutiliza como sustratoDNA de pTlSl (calles 17 y 18). En estecasosólo seproduceun ligero aumento de las formas OC, probablementedebido a la existenciade una nucleasa contaminante,yaquedichoaumentono seobservacuandoseutiliza la proteínapurificada medianteuna segundacromatografíaen heparina-agarosa(no se muestra).La misma actividad contaminantese detecta al usar como sustratoDNA del replicón pLSI (compárenselas calles 3 y 7 de la Fig. 48A). Tampoco se ha observadoactividad topoisomerasade RepBpura sobre los DNAs de los plásmidospKNI82 y pBR322 de E.coli, ni sobre el de los plásmidosde estafilococospCl94 y pEl94, a pesarde queese último presentauna gran homología con pLSl en la región del ori(+) (véase en Discusión). De todos los experimentosanterioressedesprendequeRepBtieneactividades tanto endonucleasade cadenasencilla como selladora,específicasdel DNA de pLSI. Ambasactividadesseríanesperadaspara unaproteínainiciadorade la replicaciónvía círculo rodante. 6. REGULACION TRÁNSCRTPCIONAL DE repB: LA PROTEINARe.p~ . La primeraevidenciaexperimentalde la implicación de rejA en la regulación de la replicacióndepLSI vino del estudiode la mutacióncop7. Dichamutaciónapareció en un derivadode pJS37,cuandocélulasdepneumococosconteniendoestehíbridofueron sometidasaunafuertepresiónselectivaparaCmr (10 pg/ml). Enseguidasehizo evidente queel derivadodelecionadoqueseseleccionóenestascondiciones(pJS3co~p7)presentaba 154 un número de copiasunas5 vecesmás alto que pLSl, en cuyo replicón está basado pJS3cop7(Fig. 35). Con el fin de localizar de forma aproximadala mutación cap7, intercambiamoslos fragmentosPstIA y B entrelos plásmidospLSSy pJS3cap7(Fig. 49). El fragmentopequeño(B) deambosplásmidosestáconstituido,exclusivamente,porDNA de pLSl y es el que contieneel ori(+) de replicación.Estefragmentoestáafectado,en pLSS,por la deleciónde 332ph queconfieredoblenúmerode copiasplasmídico.En el fragmentoPstI A de pLSS y pJS3cop7se encuentran,respectivamente,los marcadores de resistenciaa Tc y Cm (Fig. 49). Las mezclasde ligación seusaronparatransformar un cultivo competentedeS.pneumoniae708. Lascaracterísticasdiferencialesde cadauno de los fragmentosA y B permiten la fácil seleccióne identificación de las dos nuevas construccionesformadaspor unión de un fragmentoA y otro B, aún cuandocadauno de ellos se encuentrecontaminadopor su fragmentocomplementario.La construcción formada por combinaciónde los fragmentosPstI A de pLSS y ThI B de pJS3cap7. presentael mismo tamañoque pLSi pero un númerode copias 5 vecesmayor, como correspondea la mutacióncop7. Estaconstrucción,denominadapLSlcop7,muestraun mapade restricciónexactamenteigual al de pLSl paratodos los enzimasprobados,de p H pJS3 cap? pJS3copY ntercambio fro~mentos Pst 1 tntercambw fragmentos ~ 2gLt-Hindm P H H pJS3Ocop? pLSI Figura 49. Localización primaria de la mutación cop7por intercambio de fragmentos. Se muestran los plásmidos utilizados y los fragmentosintercambiadosen los dosexperimentosquese llevarona cabo.Sitios de restricci6n:A, AyaLT; H, HindIlP P, Pstl. (t5) indica la región delecionadaen pLS5. (.) señalala localizaciónde la mutacióncop7,delimitadaen estosensayosy precisadamástardepor secuenciacióndel DNA mutante.(o) correspondeal genotipo silvestre. P P p p rJSSO pLSleop7 H pLS5 pLS5 ~1 155 forma quesi la alteracióngénicasedebíaa insercióno deleción,éstasteníanqueserde muy pequeñotamaño.Por su parte, el plásmido pJS3O,resultantede la unión de los fragmentosPstI A de piS3cop7y Lii B de pLS5, es de menor tamañoque pJS3 y su númerode copias es doble que el de pLSl, como se esperapara un plásmido con delecióncaracterísticade pLSS. De estosresultadosse desprendeque la mutacióncop7 mapeaenel fragmentoNI B (Fig. 49). Paradefinir mejor la localizaciónde la mutación, de maneraque la secuenciaciónposterior resultara más sencilla, analizamos las consecuenciasde un intercambiode fragmentosHindJII-A~LI entrepJS3cop7y pLS5. De nuevo, el fragmentopequeñoHindIII-AuaLI de ambosplásmidosestáconstituido sólo por DNA de pLSl y seencuentraafectadopor la deleciónde 332 pb de pLSS, en tanto que el fragmentogrande HindIII-ApaLI contiene el marcador de resistencia correspondientea uno y otro plásmido(Fig. 49). La nuevaconstrucciónformadapor la combinacióndel fragmentograndede pLSS y el pequeñode pJS3cop7es, en tamañoy número de copias, idéntica a pLSl. Esto indica que la mutación se encuentraen el fragmentoHindlII-ApaLI grandedepJS3copZ.Efectivamente,el plásmidoresultantedel cambiode fragmentosrecíproco,denominadopJS3Ocop7,presentael mismotamañoque pJS3Oy un número de copias 10 vecesmayor que el de pLS1, sugiriendoun efecto fenotípicoaditivo de delecióny mutaciónde copias.Estosresultadospermiten localizar la mutacióncop7 en el fragmentode 449 pb comprendidoentre los sitios MaLI en posición 607 y PstI en posición 1056 (coordenadassobre la secuenciade pLSl; Fig. 49). La determinaciónde la secuenciade DNA de pLSlcop7enesta región demostróquela mutaciónconsiste,únicamente,en la transversiónC —. A en la coordenada743, dentro del gen repA (Fig. 6). La localizaciónde unamutaciónde alto númerode copiasen repA, junto con el hechode queestegen y repB constituyenunaunidadtranscripcional,sugierenqueel productogénicode repA estáimplicado en la replicacióno regulaciónde éstaen pLSI. Síntesise identificación de RepA en minicélulasde Bsubdlis y en el sistemade exoresiónde E.coli . Las proteínasespecificadaspor pLS1 fueron analizadasen minicélulas de B.subtilis CU403por marcajecon [35S]-metionina,[3H]-valinao [3H]-lisina,seguidopor SDS-PAGEy fluorografíade los geles.Estesistemaesútil paradetectarla expresiónde genesbajo suspropiasseñalesde control. Los resultadosmuestranqueun productodel tamañoesperadoparaRepAessintetizadoenB.subtilis a partir depLS1,bajosuspropias 157 señalesde transcripcióny traducción(Fig. 50A). Comoseobserva,la máximadetección de RepA correspondea la muestramarcadacon IjH)-lisina, de acuerdocon el alto contenidode la proteínaen este aminoácido(16%). Además,sólo cuandose usaron aminoácidostritiadossepudo detectarla síntesisde RepA, a pesarde queel contenido de la proteínaen residuosVal (4%) es menor que el contenidoen Met (9%). Tal diferencia podría deberse a que la intensificación obtenida mediante detección fluorográficaes, al menos,70 vecesmayor para el 3H que parael 35S. Utilizando este sistematambiénse puede detectarel productodel gen tet que, a pesarde tenerunos 50000 Da, migra con una Mr de 38000, debido quizás a su composición altamente hidrofóbica(Lacks y cols, 1986). En minicélulasde B.subtilis no hemosdetectado,sin embargo,ningunabandaque se puedaasignara RepB, a pesarde que esta proteína presenta18 residuosLys y 14 residuosVal másqueRepA. Esto indicarlaque, aunque repA y repB se encuentranbajo el mismopromotor,la expresióngénicafinal derepB está muy disminuidacori respectoa la de repA y estaexpresióndiferencial podríadebersea la existenciade controlespostranscripcionales,comodistinta eficienciade traducciónde ambos geneso inhibición de la síntesisde RepBpor el RNA II. Parala hiperproducciónde RepA hemosutilizado el sistemade expresiónde E.coli basadoen la combinaciónhuéspedBL21(DE3),/vectorpET5. La identificaciónde RepAseconsiguiópor comparaciónde lasproteínasque,tras la inducciónconIPTG y el tratamientoconRif, son sintetizadasen sistemasen los que repA se encuentra,o no, bajo el control del promotor 440 de 12. Comoya hemosvisto, las proteínasde nueva síntesisse visualizanmedianteun brevemarcaje con [35S]-metionina,seguidode SDS- PAGE y fluorografía. Los mapasde las construccionesbasadasen el vector pETS y utilizadas en este estudio se presentaronen la Figura 40. En los sistemascon los plásmidospLS2l, pLS2Oy pLSI9, sesintetizaun polipéptido del tamañoesperadopara RepA (Fig. 50W y Fig. 51, calles 2, 3 y 5 a 7). Este polipéptido no se observaen los sistemas que llevanlos plásmidospLS22o pETS (Fig. 50B; y Fig. 51, calles 1, 4 y 8 a 10). Asimismo hemoscomprobado(datosno mostrados)quela proteínaessintetizadaen el sistemaconpLSI8, en el querepA se encuentra(al igual queen pLS2l, pLS2Oy pLSI9) bajo el control del promotor 440, mientras que no se observaen el sistemacon pLSO2, quepresentaunareorientacióndel DNA correspondientea pLS5 con respectoa dicho promotor(Fig. 40). Aunqueenminicélulasde B.suhtilishabíamosvisualizadoel producto de] gen tet de pLSI (Fig. 50A), estaproteínano ha sido observadaen el sistemade expresiónde E.coli, ni siquieraen el caso de pLS22, en el que el promotor 40 se ha acercadoal gen et (Fig. 51, calles8 a 10). 159 delsistemaconpLSl9 requiere,sin embargo,tiempos máslargosde inducción,antesde la adición de Rif. Un tratamientode 7 mm con IPTO, previo a la adicióndel antibiótico, bastaparaconseguirunaelevadatasade síntesisde RepA,comosemuestraen la Figura 51, dondesecomparala síntesisdenovodeRepAtrastreshorasdetratamiento,en estas condicionesy en condicionesde adición simultáneade inductor y Rif (calles 2 y 3, respectivamente). Finalmente, hemos ensayado la inducción de cultivos de BL21(0E3)/pLS19a tresDO distintas(0.3, 0.4 y 0.5) (Fig. 51, calles 5 a 7). A la vista delos resultadosdeestosexperimentos,seescogióla DO de 0.4, quepermiteunaelevada eficiencia de síntesisde la proteína,evitando el sobrecrecimientode los cultivos y los riesgosque ello implica. En resumen,parasobreproducirRepA en el sistemade expresiónde E.coli se eligieron lassiguientescondiciones:crecimientode cultivosconteniendopLSl9hastauna DO de 0.4, induccióncon IPTG durante7 mm seguidapor adición de Rif e incubación de los cultivos durante 3 h más. Este tratamiento tan largo permite una mayor acumulaciónde la proteína,aumentandoel rendimientototal, sin quehayamosobservado pérdidade la actividad biológica de la proteínapurificada. Purificación de RenA . La purificación de RepA se realizó a partir de un litro de cultivo de E.cofi BL2I(0F3)/pLSII9tratadocomoacabamosde describir.Lascélulasfueronrecogidaspor centrifugación,lavadascon 100 ml de tampónA (Tris-HCI 20 mM pH ‘7.5, NaCí 0.5 M, EG 5%, EDTA 1 mM, Dfl 1 mM), y suspendidasen 10 ml del mismo tampón. La pastacelular se pasó dos vecesa través de una prensaFrenchenfriada a 4’C, a una presiónde 138 MPa. El Usado secentrifugóa 12000xg durante 20 mm.. El sobrenadante se repartió en alícuotasde 2.5 mí, que fueron conservadasa ~7OoChastasu utilización, Cadaunade estasalícuotasde extractocrudose mezclócon 500 pl de extractomarcado con [35S]-metionina(unas 12000 cpm/pl), y seaplicó a unacolumnade agarosa.En las fraccionescolectadas(2 mí) sedeterminóla radiactividady concentraciónde proteínas. El perfil cromatográficoobtenidoparaestosdosparámetrossepresentaenla Figura52A. Existe un último pico de radiactividad,no representado,con unamarcasimilar a la del pico centradoen la fracción 96, y desplazado20 fraccionescon respectoa éste.Dicho pico correspondea la VS]-metionina libre, y no hemosdetectadoningunaproteína asociadaa él. La presenciade RepA seanalizó medianteSDS-PAGEde las fracciones de los picos de radiactividad,seguidade tinción con CBB y fluorografía.De estaforma 163 fluorografía de gelesde PAA/SDS(Fig. 53B). Lasfracciones68 a 76 (ambasincluidas) sejuntaron,y dos cantidadesdistintasde estamezclaseaplicaron,parasu electroforesis, en un gel de PAA/SDS/urea,junto con muestrasde las distintasetapasde purificación de RepA. La tinción paraproteínasy el fluorogramade estosgelesse muestranen la Figura54. Comoseobserva,el pesomolecularaparentede RepA esde unos5 lOa, que concuerdacon el tamañopredicho a partir de la secuenciade nucleótidos(5112 Da). Finalmente,la proteínapura seconcentrópor diálisis frente a tampónB preparadosin EG y suplementadocon 50 mM de KCI y 50% de glicerol, almacenándoseen pequeñas alícuotasa -25~C. El rendimientofinal de la purificaciónfue de 1 mg de RepA por litro de cultivo. Secuenciade aminoácidosde RepA . Debido a supequeñotamaño,erarelativamentesencillosecuenciar(y másaún que nos secuenciaran)completamentela proteína RepA purificada.Este análisis nos pareció preferible,por una serie de razones,a la simple determinaciónde su extremo amino. Efectivamente,habíamosnotadoque de existir un único error en la secuenciade DNA depLSI queafectaraal codóndeterminaciónde rejA (nucleátidos790-792),habría una sola orf que se extenderíaentre las coordenadas655 y 1482 del DNA de este plásmido.La comparaciónde las proteínassintetizadastras la inducción, especificadas por los distintos plásmidosdel sistemade expresiónde E.coli, indicabaque la proteína que habíamospurificado estabacodificadapor un gen de pLSI que setranscribíaen la misma dirección que repB. y que era afectadopor la eliminación del fragmento Pstl B del plásmido.Sin embargo,no podíamosdescartarque el polipéptidoen cuestiónfuera un productodel procesamientode la proteínade reputación,cuyo extremoamino no había sido aún determinado. Además, la caracterizaciónprecisa de RepA tiene importanciaenestudiosfuturosacercade susestructurassecundariay terciaria(de hecho. ya sehan conseguidolos primeroscristalesde la proteína).Como semuestraen la Figura 55, la secuenciade aminoácidosde RepAcoincidecon la predichaapartir de la secuencia de DNA, aunquela identificaciónde tres residuos(529,533 y 042) fue dudosa,y otros cuatrono pudieronser determinados(residuosEX?, K40, E44 y K45). De estaforma, quedabadefinitivamenteconfirmadaJa existenciade] genrepA, que era expresadoen el sistemade E.coli. Asimismo, podíamosdescartarla existenciade una contaminación cruzadacon otros péptidosde bajo pesomolecular.El productopurificado no parecía habersufrido un procesamientopost-traduccional,y conservabala metioninaenposición inicial. 164 655 ~ MR ¡. Las prediccionesde estructura secundariay característicasde RepA se obtuvieronconla ayudadeprogramasde computador.RepAtieneun punto isoeléctríco de 9.54, debidoa sus9 residuosfuertementebásicos.Las prediccionesde la estructura secundaríade RepApor el programaPEPPLOT(Gribskovy cols, 1986) muestran(Fig. 58) la existenciade un motivo ahélice-vuelta-ohélice,típico de muchasproteínasquese unena DNA (Paboy Sauer,1984). Estemotivo se extenderíaentre los residuos12 a 24 (ahélice-1)y 29 a 37 @hélice-2).Entre ambas½élicessepredice tambiénla existencia de un segmentoflexible quecomprenderíalos residuos25 a 28. Entre los residuos5 a 9 existiría una estructura~laminar.Un momento hidrofóbico relativamentealto es observableentrelos residuos12 a 22, correspondiendocasitotalmentea la ½élice-1(Fig. 58). Estacaracterísticapredicequeunacaradedicharegión da al interior de la proteína mientrasquela otra mira al exterior (Gribskovy cois, 1986). La proyeccióna lo largo del eje de la c~hélice-1de RepA (Fig. 59A) muestramásclaramentecómola distribución de residuoshidrofílicos e hidrofóbicosdefine dos dominios en estaohélice.La región hidrofílica estaríaexpuestaal medio acuoso,en tanto que la región hidrofóbicaestaría enfrentadaa la ½élice-2de RepA. El uso del programaPLOTCHOUFASMAN nos ayudóa representarel motivo ahélice-vuelta-ahélicede RepA, aunquelas estructuras predichasparecenestar ligeramentedesplazadascon respectoa las prediccionesdel PEPPLOT(Hg. 5%).Los sitios antigénicosmásclarosseencontraríanentrelos residuos 41 a 43, lo cual fue confirmadopor variosprogramasde computador. El putativomotivo cxhélice-vuelta-c~hélicedeRepA(Fig. 60A) cumpletodoslos requerimientospropuestospor Ohlendorfy cols (1983): en las posicionesrelativas5 y 9 se localizanlos residuos A y ci, altamenteconservados.Los residuosqueocupanlas 168 — .t —~ q u u .2- •4~ q.~ -c .a —.~0. a03— .3—.m< o~.< e e e e ee -~ e - ..iLA.L1.t 14 Nr t -- ____ -~ ~---—Á- 4-. rl 1 U 2 4 M— N II - 1<4 -¡Y. te “01 -— ttl 1 -\ ‘4- -ti; - + ~1 4 .2 - + -~-- — 1 EL - 04. ¡ r >¡— —e u . 04 ‘--EJ tu 0. ~- .4- tt i4.~. - 4- — ~1 0 --4- 4 1 1 1— + ~‘=-~ ~ 1 1o -~- ¡ -‘ - .2 04 + ~$-.- Q. ~~1 1 t2e.. —N> ~ É-$. 1 ¡ -4- t- - LI 1’ -i -4-— 4 44 4 -- 4 ‘4 4 1 / - -~—~ M— ‘4- eJ—-Á- ..W. ..2tL.~ -- -~nrrrn 4—-------4-r~-’-’-I------ 4- ~‘~4-— > - e e ‘4. e e e e -~ e e - -, — c .- ~4 — -- 0~ 4. 0 0 -C 4~ 4’ 0 0 -- 0 0— ‘1- .e u o o 0.t.j L. o Figura SS. Prediccionesdel programa PEPPLOT para RepA (Gribskov y cols, 1986).La parte superior muestra la secuenciay la secuenciaesquemáticade RepA con tas característicasde losresiduos indicadas a izquierda y derecha. Debajo se presentan los potenciales de conformación a y fi, las predicciones dc los extremos y los potenciales de vuelta (Chou y Fasman, 1978). Los últimos panelesrecogenlos momentos hidrofóbicosa y fi, y el perfil de hidropatía,basadosen las prediccionesde Kyte y Doolitle (1982). 169 M-lom¡nar ~- hélice Vuelto oc-hélice NH2 VLN KG E OOOH Figura 59. Prediccionesde la estructurasecundariade RepA y representaciónde la putativaabélicc-1. A, proyeccióna lo largo de su eje de la ahélice-1de RepA predichapor el programaPEPPLOT(Fig. 58). Se representanlos residuos12 a 24 de la proteína.Aparecensuperpuestoslos residuosquecoincidensobre unamismageneratrizdel cilindro descritopor laahélice.Unacarahidrofiicay otrahidrofóbicasonclaramente distinguibles.8, Prediccionesdel programaPLOTCHOUFASMAN. Se muestrala secuenciacompletade RepA.En la partesuperiorse indican las re~onespredichascomo ahélice, ~laminar y vuelta.Los extremos =4-terminaly C-terminalde RepA podríantenerunaestructurade plegamientoal azar.Los recuadrosindican los sitios antigénicosmásprobables,quefueron confirmadospor otros programasde ordenador. A Región h¡drofilicg~) Región hidrofóbíca B 1.4 RML M L 1< AEG S 170 vuelta a—hélice PepA Lambda cli Lambda cro Lambda Rep GaiR LaeR 0105 R RK2 KorE RR2 TrLB P22 Cro P22 Rep 434 cro 434 Rep mio Tet R Trp Ji Mata Posición 17 24 16 33 4 6 21 171 35 13 21 19 17 27 66 117 1 5 LEKMAJiEMGL T* *T*EAV*V QT*T*KDL*V Q*SV*DK**M 1K DV * * LA * y *YDV*EYA*V QVQL*EKAN* 2 TrtB (1,19) P22 antirep (72,90> Rl CopE (35,53) 434 Cro (9,27) Lambda clii (6,24) MKKPLTITLSESVLENLE}< * * * * * * E~O EmE Al Q ~ * * y * * * * * M G ciI~ L 1< K 211110 W L E AWI* * * *HJ O ¡• 855> D (443> E ( 356) F 1’ ¡ 5 6 7 8 9 0 ‘u’—— Figura 61. Localizaciónde la dianade RepA: ensayosde retardoen gel de complejosRepA-DNA A, retrasoespecíficoen la migración electroforéticadel fragmentoHinfí D de pLSl acomplejadocon RepA, analizado en gelesde agarosa al 1% (izquierda) o PAA al 5% (derecha).Las mezclasde reacción(25 ¡u) contenían Tris-HCI 20 mM pH 8.0, KCI 100 mM, DYF 5 mM, FOTA 1 mM, 0.8gg de DNA de pUS] digerido con 1-unU y las siguientes cantidades de RepA: 0 ng (calles 2, 3, 5, y 10), 15 ng (calles 4 y 9), 30 ng (calles 6 y 8), y 60 ng (calle ‘7). Algunas muestras contenían, también, 40 pg de DNA competidor de T7 (calles3, 4, y 7 a 10). Las mezclas seincubaron a 200C durante 15 mm y se sometieron a electroforesis.Los tamaños de los fragmentosse indicanen el centro(nótesequeel fragmentoO de 84 pb seha escapadode los geles).La flechaseñalael fragmentoHinfl D, retenidoespecíficamentepor uniónde RepA.Calle 1: estándarde longitud molecular (DNA de T7 digerido con .ffp~ll; el tamañode los fragmentosse indica a la izquierda). It, Localización del fragmento diana de RepA en los UNAs de pLS1AA4 y pL81A24. 0.8 pg de DNA dc pLSIAA4 digerido con Hinfl (calles 1 a 3) o de pLSIA24 digerido con 1-bol] + Neol (calles 4 a 6) sc incubaron, en presencia de 40 ¡íg dc DNA de Ti y en las condiciones expuestas en A, con O ng (calles 1 y 4), 15 ng (calles 2 y 5) y 30 ng (calles 3 y 6) dc RepA. La migración de los fragmentos fue analizada por electroforesis en gel deagarosaal 1%.El tamañode los fragmentosse indica eneí margenizquierdodecada gel. Las flechasseñalanla posiciónde los fragmentosespecíficamenteretenidos. A 4 5 ~; 1’73 Estos experimentos(Hg. 61) muestran que RepA actúa específicamentesobre el fragmentoHinfl D de pLSII (coordenadas242 a 685), dentro del cual se localiza el promotor ~A8 parala transcripciónconjuntade ¡-epA y repB. Paraconseguircondiciones de especificidad,la formación de complejosDNA-proteínase llevó a caboen presencia de un exceso(50x en masa)deDNA competidordel fago T7. Cuandoseanalizanen geles de agarosalas movilidadeselectroforéticasde los fragmentosHinfl de pLSl (Fig. 61A, parteizquierda),se observaquela solapresenciadel DNA de T7 (aún sin adición de RepA, calle 3) produceun retardode todos los fragmentosde restricción,probablemente debido a un atrapamientode los fragmentoscomo consecuenciade la gran cantidady alto pesomoleculardel DNA usadocomocompetidor.La adición de RepA al DNA de pLSI digerido con Hinfl (en presenciadel DNA de T7, calle 4) produce un retardo significativo del fragmentoHinfl D. Estetipo de análisisse realizó tambiénen gelesde PAA no desnaturalizantes(Hg. ÓIA, parte derecha),observándoseen este caso Ja desaparicióndel fragmentoHinfl D, especialmentea altas concentracionesde RepA (calles 7 y 8). Cuando el DNA competidor se omite (calle 6), se produce la unión inespecíficade RepA a todos los fragmentosdel DNA de pLSl. En el fragmentoHiníl D, sobreel queRepA actúade forma específica,seha localizadounade las curvaturas intrínsecas(dirigidaspor secuencia)de] DNA de pLSI, cuyo centro se encuentraunos 50 ph corriente abajodel promotor~AB (Pérez-Martíny cols, 1988).Además,la unión de RepA a su blanco induceun fuertedoblamientodel DNA en las proximidadesdel sitio ApaLí (coordenada607) (Pérez-Martíny cols, 1989). Paraprecisarmásla región de unión a RepA dentrodel fragmentoHinfl D, utilizamosdos derivadosdelecionadosde pLSl: pLSlA24 y pLS1AA4 (Fig. 62). Como ya hemosvisto, el primero de estos plásmidospresentauna deleción de 570 pb que incluye las coordenadas4240 a 401. Por su parte, la deleción en pLSIáA4 elimina la secuenciaquecodifica paraRepA, puestoqueincluye desdela coordenada649 a la 816. Ya queambosderivadospresentanel sitio específicoparaRepA dentrodel fragmento que lleva la secuenciade reconocimientopor ApaLI, según se deducede ensayosde retardoen gel de complejos DNA-proteína(Fig. 61B), estacombinaciónde plásmidos permitelocalizardicho sitio enunaregiónde 247 pb quecontieneel ori( 4-) y el promotor ~AS Una manerasencillade localizar la dianade unaproteínaque seunea DNA es el análisis de la protecciónde los complejosDNA-proteínafrentea la digestiónpor enzimasde restricción.La región de 247 pb dondehabíamosdefinido la dianade RepA incluye el sitio únicoAp~LI de pLSI (coordenada607), localizadodentrode] promotor 174 CV ti lo • - ev — Figura 62. Mapa de pLSl con los sitios de restricción pertinentes para los ensayos de localización de la diana de RepA. En el interior se indican las offs para las tres proteínascodificadaspor el plásmido. Sc muestran también la posición del oñ(-4-) y la dirección dc síntesis de la cadenalíder, así como las regiones delecionadas en pLSIAA4 (=A4)y pLS1ZS24 (=24). ~AS (Fig. 38). La protecciónde estesitio Ap~LI por RepA seensayócon los plásmidos pLS1=24y pLSIAA4 (Fig. 62). El DNA de cadauno de estosplásmidosse digirió con HincIl~ los tamañosde los fragmentosgeneradosson: 2202, 1095, 525 y 16 pb (para pLSI=24),y 2604, 1095, 525 y 16 pb (parapLSIAA4). En uno y otro caso,el fragmento Hincil mayor contieneel sitio ALI (Fig. 62). Los fragmentosde restricciónde ambos plásmidos(0.3 pmolesde cadauno) se incubaron,durante15 mm a 20’C, en presencia de variascantidadesde RepA (0, 0.4, 1.2 o 2.4 pmoles),siendoacontinuaciónsometidos a digestióncon AvaLI. Los resultadosde la electroforesisde las muestras(Fig. 63A) revelanque, trasla unión de RepA, el fragmentoHincil mayor de cadaplásmidoqueda parcial (calles2, 3 y 6, 7) o totalmente(calles4 y 8) protegidode la digestióncon ApaLl, demostrandoquela regiónalrededorde la coordenada607estáocupadapor la proteína. Sin embargo,podíaargílirsequeRepA protegíainespecíficamenteal DNA frente a la acciónde cualquierenzimade restricción.Paradescartaro aceptarestaposibilidad, el DNA de pLS1áA4(0.5 pmoles)sedigirió conHinfl y los seisfragmentosresultantesse incubaron,en las mismascondicionesque antes,con dos cantidadesde RepA (2.5 o 5 pmoles)o enausenciade la proteína.A continuación,el DNA sesometióa digestióncon distintosenzimasqueproducenun únicocorteen sitiosrepartidosalrededordel plásmido 1;t ti. o ev o’— &jeJo • — Q En “-o — c ~ ‘fZ 175 ?202— 436— 095— 766— 525— 254 5678 — 2604 — 2006 — 095 — 598 — 525 B ‘295 II 62’V 855 — 488 — 356 — 84— 2 345 678 91011121314 1295 1162 ~855 — 488 — 234 — 122 — 84 Figura 63. Protecciónespecíficapor RepA del sitio AnaL! de pLS1. A, proteccióndel sitio AnaLí en pLS1A24y pLS1AA4. 0.8 Mg de DNA de pLSlA24 (calles 1 a 4) o de pLS1AA4 (calles5 a 8) digerido con Hinclí seincubaron(15 mm a 200C),en un volumenfinal de 25 ¡iI, en presenciade Tris-HCI 20 mM pH 8.0 KCI 25 mM, MgCI> 10 mM, OIT 5 mM, EDTA 1 mM y las siguientescantidadesde RepA: O ng (calles 1 y 5), 2 ng (calles2 y 6), 6 ng (calles3 y >7) y 12 ng (calles 4 y 8). A continuaciónse añadieron10 u de ApaLí, y la mezcla se incubóa 3YC durante60 mm. El DNA se fenolizóy precipitó, y los fragmentosse separaron por electroforesisen un gel de agarosaal 1%. El tamañode los fragmentosse indica a ‘izquierda y derecha. B, proteccióndel sitio AnaLI y sensibilidadfrente a la digestióncon HnaII, SsoI y EcoRí, en presenciadc RepA. 1.3 Mg deDNA depLS1AA4 digeridocon Hinft se incubaron,en las condicionesdescritaseneí párrafo anterior,con las siguientescantidadesde RepA: O ng (calles 1, 5, 8, 9 y 14), 12 ng (calles2, 3, 6, 11 y 12), y 24 ng (calles4, 7, 10 y 13). Algunasmuestrasfueron sometidasa electroforesisen gel de agarosaal 1% sin tratamientoposterior (calles 1 y 2). El resto se incubó (en las condicionesadecuadas)con 10 u de uno de estosenzimasde restricción:AnaLí (calles3 a 5), HnalI (calles6 a 8), .~pI (calles9 a 11) oL~Rl (calles 12 a 14). Tras la fenolizacióny precipitacióndel DNA, los fragmentosse separaronmedianteelectroforesis. Los tamañosde los fragmentosse indican a derechae izquierda. Nota: 1 Mg del DNA de los plásmidos utilizadoscorresponde,aproximadamente,a 0.4 pmoles;1 ng de RepA son, aproximadamente,0.2 pmoles. 176 (Fig. 63B): ApaLI (calles3 a 5), jHp~II (calles6 a 8), SsoI (calles9 a 11), y EcoRI (calles 12 a 14) (véaseFig. 62 paraposicionarel sitio de cortede los distintosenzimas).Como seobserva(Fig. 63B), sóloel sitio ApaLI (peroningunode los otrossitios de restricción) estáprotegidopor RepA de Ja digestióncon el enzimacorrespondiente.El fragmento Hinfl de 488 pb, quecontieneel sitio ApaLí, sólo esdigerido totalmenteen ausenciade RepA (Fig. 63B, calle 5). Los mismos resultadosse obtuvieron cuando: i) estos experimentosse realizaronen presenciade DNA competidor;u) el DNA monomérico superenrolladose incubó con la proteínaantesde ser sometidoa digestióncon enzimas (—1 8 80 (—) G C .4. —un~ 1~ ~wrw ¾ -- — -e 4- A A 1 ~ApoLl A 3 * t.~/ III w A T 6c1 T ~. -ó 1? ~a~egs U ‘U-¡AíLii~1’rl wA’III O ‘—‘oA0w4 A— AAA 7A 5 Figura 64. Localización de la diana de RepA mediante ensayosde protección frente a DNasa 1, El fragmentode 302 ph NcoI-Hinfl de pLSlA24, mareadoen el extremo5’ generado por Hinfl se incubó en ausenciade RepA (-), o en presenciade fas cantidadesde proteínapuraque seindican (enng). Se incluyen los productosde las reaccionesde secuenciaMaxam y Gilbert (G, C + T y A -4- C) del mismo fragmento.La secuenciade nucleótidosde la cadenano codificantede pLSI en la zonaanalizadase muestraa la derecha, con las regionesprotegidaspor RepA recuadradas.Las cajas-35 y -10 del promotor FAB’ y el sitio de reconocimientoA~LI (coordenada607) seindican con llaves. 177 de restricción; iii) se empleóel DNA de pLSlA24 en lugar del de pLSIAA4; y iv) se probó la acciónde otros enzimasde restricción(estosresultadosno semuestran).Todo ello indicaqueno hay diferenciasaparentesen la especificidaddeRepApor DNA lineal o superenrollado,y que únicamentela región alrededordel sitio Ap~LI se encuentra específicamenteocupadapor la proteína. Paradefinir la secuenciadelDNA de pLS1 a la queseuneRepA,los contactos DNA-proteínaseanalizaronmedianteensayosdeprotecciónfrenteadigestióncon DNasa 1. Estosensayosse llevarona cabocon el fragmentode 302 pbN~I-Hinf1 de pLSI=24 (Fíg. 62), marcadoen el extremo5’ de la cadenano codificante.Estefragmentocontiene el promotor ~AE y el sitio ApaLI, que se encuentraentrelas cajas-35 y -10 de dicho promotor.En cadaensayo,5 ng del fragmentomarcadose incubaron,bien en ausencia de RepA o bien en presenciade la proteína(8 u 80 ng). El análisis electroforéticode los productosde digestióncon DNasa1 muestracuatroregionesprotegidaspor RepA, localizadasentrelas coordenadas581 y 628 (Fig. 64). Estazonaincluye el promotor~AS y, por lo tanto, el sitio ApaLI. Ya que no se observanmásregionesprotegidas,y el fragmentoutilizadoincluye los tresiterones(el sitio de unióndeRepB),sepuedeconcluir queéstosno formanpartede la dianade RepA. La unión de RepA al promotor de los genes repA y ¡-cpB, junto con las homologíasentre esta proteína y los represores transcripcionalesde origenplasmídicoTríEy CopB, sugeríanunaaccióndeRepAa nivel transcripcional,controlandosu propia síntesisy la de RepB. La proteínaRenA inhibe su propio promotor iii vitro . Paracaracterizarla accióndeRepAsobreel promotorPAR, realizamosunaserie deexperimentosde transcripciónin vÚro. En estosensayossesintetizarontranscritos‘run- off’ apartirdel promotor~AR presenteendiferentesDNAs moldes.Cuandoel fragmento de 842pb.~~I(2l4)-.~iI(1056)de pLSI seutiliza comomolde (Fig. 65B), seobtieneun transcritodeunos430 nts (Fig. 65A, calle 1). A juzgarpor su tamaño,el RNA sintetizado corresponderíaa un transcrito ‘run-off” que comenzaraa partir del promotor FAB’ de acuerdocon los resultadosdel mapeocon nucleasaSi (Fig. 37). La bandaqueaparece por encimadel transcrito hrun~offE de 430 nts podríadebersea artefactosobservadosen fragmentoscon extremosprotuberantes,a) llegar a los cuales, la RNA polimerasano siempre abandonael fragmento (Hillen y cols, 1984). Esta interpretaciónvendría favorecidapor el hechodequecuandoseempleacomomoldeun fragmentoquecontiene el promotor~AB y que presentaextremosromos,la bandaextrano sevisualiza.Aparte 178 de éstas,no seobservanmásbandasmayoritarias,io queindica queno ocurreninguna otra iniciación o terminaciónsignificativa de la transcripciónantesdel sitio PstI. Dado queestesitio selocalizabastantedentrodel genrepB (a 204 nts del inicio de susecuencia codificante),estosresultadosapoyanla conclusión(ya comentadaantes)de que ¡-epA y ¡-cpB se transcribenen el mismo mRNA. Pataconfirmar que el transcrito observado comenzabadesdeel promotor~AB y que no existíaotro promotor entreel final de repi (coordenada789) y el comienzode repB (coordenada853), el fragmento de 519 pb &lI(8O4)-SsuI(1323)de pLSl se utilizó como molde en estosensayos(Fig. 65B). Este fragmentocomienzanadamásfinalizar repA e incluye los primeros471 nts de repB. En este caso,no se observaningunabandadel tamaño esperadopara un transcritoque correspondieraexclusivamenteal gen repB (Fig. 65A, calle 3), consistentementecon los resultadosprevios. Sin embargo,ya que el putativo promotor (P~) para el RNA II contratranscrito(que veremosmásadelante)se encuentradentro del fragmentoBanI- PstI dc 842 pb, podíaargumentarseque el transcritode 430 nts observadoseestaba sintetizandoa partir de este promotor. Para descartarestaposibilidad, usamoscomo molde el fragmentode 702 pb Ssol-PvuIIde pCGA3 (Tabla2). Esteplásmidopresenta un segmentodel DNA de pLSI (coordenadas505 a 801) queincluye el promotor~AE y el genrepA entero,pero no el putativopromotorP, (Fig. 65B). El fragmentode pCGA3 usadocomo molde presentaextremosromosa amboslados. Como resultadode estos ensayosde síntesisja vírro dc RNA, seobservaunaúnica bandacorrespondientea unos 480 nts (Fig. 65A, calle 2), lo que concuerdacon un transcrito “run-off’ que se iniciara en el promotor PAB. Del análisisde transcripciónpodemosconcluir quelos genesrepA y repB se cotranscribena partir del promotor 2A5’ tanto ja vía-o (Fig. 65) como in vivo (Fig. 37). Paraconocersi RepAinhibe¡a vía-o la transcripciónapartir del promotor~AB~ seensayaronvariasconcentracionesde la proteína,empleandocomomoldeel fragmento Ssvl-PvuII (702 pb) de pCGA3. Los resultadosmuestranque la síntesisdel transcrito correspondientees inhibida por RepA, y que el grado de inhibición dependede la concentraciónde la proteínaen el ensayo(Fig. éSA, calles 4-7). La especificidadde la represiónpor RepA sobre el promotor ~AB seprobóusandoel fragmentoBan1-P~iI(842 pb) de pLSl como molde para la transcripción,de forma que el putativopromotor P (localizado dentro de estefragmento)sirviera como control interno. En presenciade concentracionescrecientesdeproteínaRepA,el promotor~AB va siendopaulatinamente callado (Fig. 65A, calles 8-11). Sin embargo,incluso a concentracionesde RepA que bloqueantotalmentela transcripcióna partir de estepromotor, la síntesisdel RNA II permaneceinalterada(Fig. 65A, calles 16-18).Los experimentosanterioresse realizaron 181 lugar,ya queel plásmidoescapazde mantenersepor sísolo en la célula huésped,para ]o quenecesitasuspropiasfuncionesdereplicación.La posiblesíntesisde un mensajero de repB a partir del DNA de pLSScopJlse analizó medianteensayosde transcripción in viftro, empleandocomomolde el fragmentoPstI B de esteplásmido.Dicho fragmento (723 pb, por presentarla deleción de pLS5) incluye el promotor~AB modificadopor la mutacióncopil (PAacopll)y el promotorP (Fig. 66). Entre los productosde transcripción mayoresde 200nts (los únicosquepuedenllevar el mensajede ¡-cpB) seobservaun RNA de unos 430 nts, que corresponderíaa un transcrito ‘run-off iniciado en PABCOplJ (Fig. 66, calles 1 y 9). A pesarde queesteRNA siguesiendounode los productosmayoritarios del ensayo,la actividad del promotormutanteestáclaramentedisminuidacon respecto a la del promotor de tipo silvestre (compárenselas calles 1 con 5, y 9 con 10). Esta disminuciónno sedebeni a una menorconcentracióndel DNA usadocomo molde ni adefectosen la purificacióndelmismo,ya quela cantidadde RNA II sintetizadoapartir de ambosmoldes (silvestrey copil) fue similar (véaseHg. 78). Ademásdel transcrito de 430 nts, seobserva(Fig. 66, calle 9) unaseriede productosmáslargos, cuyo tamaño supera,en algunoscasos,el del fragmentoutilizado comomolde.Estosproductosserían artefactos,especialmenteabundantesdebido a que ambosextremosdel fragmentode DNA molde presentanextensiones 3’ protuberantes. Por debajo de la banda correspondientea] RNA de 430 nts aparecendoso tresbandasdemenorintensidad(calle 9). Mediante una búsquedaen la secuenciade pLSl, hemos localizado una región (coordenadas761 a 790) en la que las cajas -35 y -10 de un putatívo promotor se encuentranespaciadas18 pb. La secuenciade estaregión (indicándoseen negritaslas coincidenciascon la secuenciaconsenso)es: —35 —10 5 -TGGAAAATTACAAGAAAGGTCAAGAAAAATAA-3’ 761 792 Ya quela secuenciacodificantedelgen¡-epA finalizaen la coordenada789,estepromotor serviría, exclusivamente,para la transcripción de ¡-cpB. Utilizando como molde el fragmento PstI B de pLSScopll, el transcrito ‘run-off’ sintetizado a partir de este promotor putativo tendría un tamaño aproximado de unos 260 nts. Una banda correspondientea un RNA de estalongitud se observa,efectivamente,como producto de la transcriciónin vitro en estascondiciones(Fig. 66A, calles 9 y 11). Sin embargo, debidoal carácterminoritariodeestabanday a la presenciade otrasbandas,la actividad LA U. jJA...4.>.JtL4Jflj a~ 183 quehemosconsideradoartefactos,no se ve afectadapor la presenciade RepA (Fig. 66, calles 11 y 12). Lo mismo ocurre conla síntesisdel RNA II (severámásadelante),que sirve,por ello, comocontrol internoindicativo de que la acciónde RepA no seproduce de forma inespecífica. A partir de estosresultadosse deduceque la mutacióncopil disminuye la actividad del promotor FAB’ pero no impide la unión de RepA a su operador.Esta información esimportante,ya que la mutaciónafectaa unaregión de I)NA quequeda protegida,porunión de la proteína,frenteala digestiónconDNasa1. La proteínaRepA inhibe, pues,específicamentela transcripcióna partir del promotorPAIB, tanto silvestre como mutante,bloqueandode estaforma la sfntesisdel mRNA repAB. RepA reprimesu propio oromotorlii vivo . Para sabersi RepA reprime su propia síntesisin vivo, se construyeronlos plásmidospLSM/ac5y pLSMrepA(Fig. 67). El plásmidopLSMlac5contieneel fragmento Hinfl de 1274 ph de pLS5 (coordenadas3488-685sobrela secuenciade pLSI) donado en el sitio único BamHI del plásmidopNM482 (Minton, 1984).De estaforma,pLSM/ac5 presentauna fusión traducciona]en la cual los 11 primerosresiduosde RepA están fusionados al productodel gen lacZ de pNM482, y el gen lacZ está colocadobajo el control del promotor ~AB (Fig. 67). El otro plásmido,pLSMrepA, se construyó en dos etapas.Primero, el fragmentode 295 pb AuaLI-Xmnl de pLS5 (coordenadas607-902 sobre la secuenciade pLSI) se clonó en el sitio SmaI de pUC19 para construir el plásmidopUC-A (Hg. 67). Estaconstruccióncolocael gen repA (sin promotor) bajo el control del promotor IacUVS. Además,dentrodel fragmentodonado,y antesdel codón de iniciación de RepA se localizancuatrocodonesde terminación(que cortanlas tres posibles fases de lectura), con lo que se asegura que la traducción comience, exclusivamente,a partir del codón de iniciación de repA. En una segundaetapa, el fragmentoPvull de pUC-A quelleva la fusión promotorladiVS/gen repA (620 pb) se clonó en el fragmentograndeEcoRI-HincII del plásmidopLG339 (Stokery cols, 1982), dandolugar al plásmidopLSMrepA (Fig. 67). En tanto que pLG339 presentade 6 a 8 copiaspor equivalentegenómico,pNM482 tiene un alto númerode copias,ya queestá basadoen el replicón de ColEl. Ambos plásmidosson compatibles,al igual que las construccionesderivadas de ellos. Los plásmidos pLSM¡ac5 y pLSMrepA fueron transferidos,por separadoo conjuntamente,a célulasdeE.coli XL1-Blue, unaestirpeque contieneun F’ queproporcionael productodel gen lacE en trans. Los transformantes 184 parapLSMIac5,pLSMrepA, y los doblestransformantes,seseleccionarony crecieronen presenciade Ap (50 pg/ml), Km (25 pg/ml), y Ap (50 pg/ml)+Km (25 pg/ml), respectivamente. Pararealizarlos ensayosde actividadj8-galactosidasa,seprepararoncultivos de cadauno de estos tipos de transformantes,que fueron crecidosen presenciao en ausenciade IPTG (apartado29 de Métodos).En la Tablade la Figura67 semuestran los valoresde actividad específicag-galactosidasa(unidadesMiller; Miller, 1972). En ausenciade IPTG, los niveles de fi-galactosidasadetectadosen cultivos quepresentan ambos plásmidosestándisminuidosunas 4 veces con respectoa los encontradosen O OC! PNM482 SA Kb ~1 pLSM I~8 9.9Kb Coy Actividad específica p-gatactosidaso Ptásn,ido - IRlO + PTO Hingt,,o <0.7 <0.7 pLSMrenA <0.7 <0.7 pLS>4LacS 93.7 94.6 + 22.8 3.7 Figura 67.Efecto iii vivo deRepAsobrela expresióngénicaapartirdelpromotor1’AB• En laparte superior se muestra la estrategiaseguidapara la construcción de los plásmidos pLSMIac5 y pLSMrepA. Se indica la posiciónrelativadel promotor~AB algen IacZ (puntade flechablancaenpLSM/ac5),y ladel promotor lacUV5 al genrepA (puntadeflechanegraen pLSMrepA).El DNA procedentedepLS1 sepresentasombreado.Sitios de restricción:H, Hinfl 13_BamHI A_AnaLí; X, Xninl; Sm, SinaíPv Pvull; E,~RI; y Hn, ¡-¡mdl. En la parteinferior se recogela actividad específica ~-galactosidasa(unidadesMiller; Miller, 1972) determinada en extractosde célulasdeE.coii que llevabanlos plásmidosindicados,cuandolos cultivos se trataron o no con ¡PTO. Los valores indicados son la media de cuatro ensayosindependientes 5- (,uctsX pUM ropA SKb E”, 185 cultivos cuyascélulascontienensólopLSMlac5.Estainesperadarepresiónen condiciones de no-inducción,causadapor la presenciade pLSMrcpA, podríadebersea la combinación de la fuerzadel promotorlacUV5 (responsablede la síntesisde RepA) con la bajadosis génicadel represorlacE. Sin embargo,en presenciade IPTG se observaunarepresión de unas25 vecesen la síntesisde s-galactosidasapor la inducción de la expresiónde ¡-epA encélulasquecontienentantopLSMlac5comopLSN4rcpA (Fig. 67).Estosresultados demuestranque iii vivo, al igual que ocurre ¡it vitro, el productodel genrepA reprimesu propio promotor. Localizacióndel operadorde RepA . Ya hemosvisto anteriormenteque,medianteexperimentosde digestiónparcial con DNasa1 de complejosDNA-RepA, sehan definido sobrela cadenano codificante de pLSI cuatro regionesprotegidaspor la unión de la proteína(Fig. 64). Estasregiones abarcandesdela coordenada581 a la 628, incluyendoel promotor~AP~ Paralocalizarel operadorde RepA, estosexperimentosde protecciónse llevaron a cabo utilizando el fragmentode 179 pb Fnu4HI-Hinfl depLSI (coordenadas506a 685; incluyendotambién el promotor PAj~ Este fragmentose marcó radiactivamenteen 5’ o en 3’ del extremo Fnu4HI,de forma que quedanmarcadas,respectivamente,las cadenascodificantey no codificante.Comoresultadode la digestiónconDNasa1 empleandoel fragmentomarcado en unau otra de las cadenas,se observancuatro(en la cadenano codificante) y cinco (en la codificante) regionesprotegidaspor la unión de RepA. Cadazonade protección en la cadenano codificantetiene su correspondientezona de protecciónen la cadena complementaria,aunquedesplazada1-3 pb (Fig. éSA, calles 5-6, 11-12, 17-18 y 27-28). Sin embargo, la segundaregión (contandodesdeel final del gel) de la cadenano codificanteaparecedividida, en la cadenacodificante,en dos regionesprotegidas. Un mayor refinamientode los contactosentre RepA y su DNA diana se consiguiómedianteexperimentosde protecciónfrente a la rotura por radical hidroxilo unatécnicadealta resolución(Tullius y Dombroski,1986).Todaslaszonasdeprotección frente a DNasa1 se detectantambiénpor este otro método,aunquela segundaregión protegidafrentea la nucleasaen la cadenano codificanteaparecedivididaen doscuando se aplica el método químico (Fig. 68A, calles 7-10 y 19-26). En estascondiciones,no podíamosdescartar,sin embargo,la existenciade otrasregionesprotegidasmáscercanas al comienzode la secuenciacodificantede ¡-epA, las cualesno seríandetectablespor falta de resoluciónen la partesuperiordel gel (Fig. 68). Paraclarificar estepunto, se corrió 190 de RepA. Estaposición correspondeal residuoA presenteen la coordenada615 (Fig. 68A., calles 7-8 y 23-26;y Fig. 69, calles9-10). Estehechopodríadebersea la existencia deunadeformaciónlocal de la hélice del DNA enestaposiciónprecisa.Paradeterminar si RepA exhibeunamayor afinidadpor cualquierade las regionesa las queprotege,se realizóun experimentode protecciónfrente al cortepor radical hidroxilo, en el cual la cantidadde proteínaen el ensayovarió entre2 y 8 ng. Los resultadosmuestranque la extensiónde la inhibición delcortecausadaporRepA dependede la cantidaddeproteína añadida(Fig. 68A, calles 19-26). La protecciónde las regionesmásexternasmuestrala misma dependenciaen cuantoa la concentraciónde RepA quela de las regionesmas centrales,segúnse deducede lasdensitometríasde los geles.De nuevo, la protecciónes, sin embargo,másdébil en los extremosque en el centro del áreatotal protegida,a cualquierconcentraciónde RepAutilizada. Por otro lado, no hemosencontradoninguna homología entre las secuenciascorrespondientesa las regiones protegidas. Estas observacionesindican quelas cinco zonasde protecciónno son el resultadode la unión independientedel represorRepA a cinco dianasdistintas.La debilidadde la protección en las regionesmás externaspodría debersea un efectode ‘sombreado” y no a un contactototal delDNA con RepA.En estesentido,rio podemosolvidar quela uniónde estaproteínainduce un fuerte doblamientodel DNA (Pérez-Martíny cols, 1989), que podría explicar el efecto de “sombreado”. Un patrón de cortes similar se ha descrito tambiénpara los complejosentre el Represorde lambda y su DNA diana (Tullius y Dombroski, 1986) y para los contactosLexA-operador recA (Hurstel y cols, 1988). Alternativamente,la gran extensiónde DNA protegidopor RepA podría debersea la formación de un complejo multiproteico altamentecooperativo.En la Figura 68B se ofrece una representaciónesquemáticade la región de pLSI comprendidaentre las coordenadas530y 665, dondesemuestranlos tresiterones,el promotor ~A8, los puntos de iniciación del mRNA repABy de la proteínaRepA,y susposicionesrelativasrespecto a las regionesprotegidaspor RepA frentea la acciónde la DNasa1. Paraconseguirunamejor resolucióndela regióncentraldeprotección,secorrió un gel de PAA al 6%. Los resultadosdel ataquepor radical hidroxilo, junto con las correspondientesdensitometrías(Fig. 70A, calles7 a 10, y Fig. 71) muestranunaclara visión de la simetríade los contactosentreRepA y su DNA diana. Cadaunade las regionesprotegidasen la cadenacodificantefrentea la accióndel radical hidroxilo tiene su correspondiente reflejo en la cadenano codificante,a travésde un hipotéticoeje de simetríadiádica.Esteeje se localizarladondeconvergenlas tercerasregionesprotegidas deambascadenas,por serésteel puntocentral.En estaregión,la primerabaseprotegida en la cadenacodificanteestáseparadapor 4 ph de la primerabaseprotegidaen la cadena 191 complementaria(Fig. TIC), indicandoqueRepA estáunidaa unacarade la hélice del DNA a través del surco menor. Ya que, dentro de la misma cadena,las regiones protegidasmás externasestána una y a dos vueltas de hélice de la región central correspondiente,podemosconcluirquelos contactosRepA-DNAestánen la mismacara de la hélice. Una inspecciónde la secuenciade DNA en los alrededoresde la región protegidacentral,ponede manifiestola existenciadeunasecuenciade 13 pb consimetría rotacionalbinariaalrededordelpar G-Ccentralqueocupala séptimaposición(Fig. 70B). Diez de las docebasesrestantesexhibenestasimetría,de forma quela secuenciade 13 pb es un palíndromecasiperfecto.Además,ambosladosdelelementosimétricopresentan un palíndromeinternode 4 pb (5’-TGCA-3’), que creaunasimetríainternaadicional. Dentro de la región de 13 pb, el primer (de 5’ a 3’ sobre la cadenacodificante) palíndromeinterno de 4 pb pertenecea la caja -35 del promotorRAS’ mientrasque el segundoestáincluido en el sitio único.Ap~LI del plásmidopLSi. Apartede estaregión no hemosencontradootraszonascon simetríadentrodel áreatotal cubiertapor RepA. Los ensayosdeprotecciónfrenteaDNasa1 y radicalhidroxilo sehanrealizado, también,con el fragmentode 224 pbjykpl-ApaLl del plásmidopLS1A24,marcadoen su extremo ADaLI en una u otra cadena.En este caso,el patrón de bandasobtenido en presencia de la proteína es totalmente diferente al observadoen todos los experimentos anteriores: aparecen, incluso a las concentracionesde represormás bajas, contactos RepA-DNAdistribuidosaproximadamentecadavueltadehélice(Fig.72). Estoscontactos se inician en una zona quecorresponde,aproximadamente,a las regionesprotegidasa, b, d, c’ y e’, detectadasen anterioresexperimentos,segúnsevisualizaen un gel de PAA al 20% (Fig. 72A y 72B). Estoscontactosseextienden,de forma espectacular,a lo largo de todo el fragmentode DNA analizado(Fig. 72C). Estepatrónde contactosdesaparece cuandolos ensayosse realizan en presenciade DNA competidor(Fig. 73; compárense las calles 1-2 y 25-26 con calles7-20), aunque,inclusoen estascondiciones,la adición de un excesodeproteína(calles3 y 24) reproduceel patróndecontactosinespecíficos.Esto contrastacon los resultadosobtenidosal usarel fragmentode 179 pb Fnu4HI-Hinfl de pLSl (Fig. 68A, calles5 a 12). De estaforma quedaclaro que existeuna alteraciónde la especificidadde los contactosde RepA con fragmentosde DNA que presentanel elementosimétricojusto en un extremo(por procederde la digestiónconAi~LI; Fig. 72B). Esto puede deberse,bien a que la digestión con AuaLI haya “separado”del fragmentosecuenciasimplicadasen la especificidaddeuniónde la proteína,o bien a que la localizacióndel sitio de unión de RepAjusto enun extremodel fragmentode DNA impida un posicionamientoadecuadode la proteínaen su diana.Es pertinenteseñalar aquíquelos contactosentreTrpR y su operador,descritospor Otwinowskiy cols(1988), 195 regulaciónse ejerceríaa travésde la uniónde la proteínarepresoraRepAaun operador quesolapaconel promotorPAB, inhibiéndoseasíla síntesisdelmRNA repAB.La proteína mutante (RepA?) presentaríaen posición 30 un residuo E, en lugar del residuo A presenteenla proteínasilvestre.Dadoqueel fenotipoexhibidopor el plásmidopLSlcop7 es el de un mayor númerode copias,la alteraciónen la proteínamutantedebeconducir aunadisminuciónde su actividad represora.Al igual quepLSl, pLSlcop7semantiene de forma estableen las célulasde S.pneumoniaeen ausenciade presiónselectiva,según hemos comprobadotras 60 generacionesde crecimiento exponencialen medio sin antibiótico. Duranteel crecimientode cultivos de pneumococos,hemosobservadoque el tiempo de duplicaciónde las célulasquecontienenpLSlcop7es ligeramentesuperior al de las quecontienenel plásmidosilvestre,tanto enpresenciacomo enausenciade Te. Este efectopuededebersea que el mayor númerode copiasdel plásmido pLSlcop7 determinaun incrementoen la dosisdel gen tet, cuyo productopareceser tóxico para la bacteriacuandoseencuentraenaltaconcentración.Por otro lado, no hemosobservado diferenciassignificativasentrela tasadecrecimientode pneumococosquecontienenpJS3 y la de aquéllosque llevan pJS3cop7,aunqueesteúltimo plásmidoexhibe, también,un número de copias 5 vecesmayor que el de tipo silvestre.Dado que pJS3 y pJS3cop7 corresponden,básicamente,a pLSI y pLSlcop7a los que se les ha reemplazadoel marcadorde lcr por el de Cmt, las observacionesanterioresapoyaríanla hipótesisde la relaciónentre incrementoen la dosisdel gen tet y disminuciónde la tasade crecimiento celular. Esta interpretaciónpuedeser válida, también,paraexplicarnuestrofracasoen el intento de transferirpLSlcop7a B.subtilis y a E.coli. Por el contrario, los plásmidos pJS3y pJS3cop7sí pudieronser transferidosa estasdos especies.En los treshuéspedes (S.pnewnoniae,B.subtilis y E.coli), el númerode copiasdel plásmidomutantees unas5 veces mayor que el del plásmido silvestre. Ya que la mutación cop7 se expresa fenotípicamenteen las tresespeciesbacterianas,la regulaciónde la replicaciónpor RepA debeser un mecanismogeneralpara el control del númerode copiasde pLSI en todos estoshuéspedes. Paradeterminarsi la función de RepA resulta esencialpara el plásmido,se construyeronuna serie de derivadosdelecionadosde pLS1, y las construccionesviables seseleccionaronpor su capacidadparaestablecersey replicarenpneumococos.Coneste fin, el DNA de pLSl se linearizó en su sitio único BRlI(804), queestácasi contiguoal codónde terminaciónde repA (Fig. 6), y sesometióadigestiónconBAL31. Traspreparar la mezcla de ligación, ésta se utilizó para transformarun cultivo competentede S.pneunioniae708. Los transformantesfueron seleccionadospara lcr, y su contenido plasmídicose analizómedianteelectroforesísen gel. El DNA de los cinco plásmidosde 196 TABLA 8: DeLeciones en Los derivados reoA Plásmido Coordenadas inctuidas en región detecionada Secuencia en tos bordes de la deleción Núriero de copias pLS1AA12 653 804 GTGAC 1 TGGCA 68±4 pLSltA2l 655 - 805 GACGC ¡ COCAS 16±2 pLS1AA23 656 - 805 ACOCA ¡ COCAS 28±3 PLS1AA34a 653 815 654 - 816 CTGAC 1 CGCTA ICACO 1 CC¶AA 123±12 PLS1LA4a 648 - 815 649 - 816 CAGAS 1 COSTA ASACO ¡ GCIAA 31±4 ATTTcTTGGGTATATTATACTTTATGGCTAAAGAAAAAGCAAGATACTTC TAAAGAACCCATATAATATGAAATACCGATTTCTTTTTCGTTCTATGAAG - RNA II 879 Figura 74. Secuenciadc nueleátidosde pLSl entrelas coordenadas530 y 879, mostrandolas regiones delecionadasen los derivadosrepA.Se señalan:los tres iteronesplasmídicos(Ti a 13); los promotores~ÑB y P con las cajas-35 y -10 en negritas;el sitio de iniciación del mRNA repAB; el S.D. derepA; ¡os secuencias correspondientesa los codonesde iniciación y terminaciónde la síntesisde RepA y al de iniciación de la síntesisde RepE;y las regionesdelecionadasen pLS1=A4,pLSIAAI2. pLSiAA21, pLSIAA23 y pLSIAA34 (~A4, AA12. áA2I, LA23 y =A34,respectivamente). De cualquierforma, debemostenerpresentequeestasdelecionesafectanno sólo al gen repA, sino también a otros factores de posible importancia para la regulación de la replicación(el RNA II, la secuenciay, por consiguiente,la estructuradel mRNA repB, y las posiblesinteraccionesentreambosRNAs). Con el fin de estudiariii vivo el efectodel incrementode la dosisgénicade repA sobre la replicación de pLSl, hemos realizado dos construccionesbasadasen pCl94cop(denominadaspCGA3y pCGA3cop7),enlasquese donaron, respectivamente, los genesrepA y repAcop7.Para ello, los DNAS de pLSI y pLSlcop7se digirieron con PstI y el fragmentode 1051 ph de uno y otro plásmidofue purificado. A continuación, este fragmento se trató con los enzimasde restricciónAlfil y .~gjI. Los fragmentos originados en estasdigestiones (indicando las coordenadasde sus extremos>,así como las regiones de posible relevancia contenidasen cada uno de ellos, se muestran en la Tabla9. Ya que B211 cortó sólo parcialmente,también hemosincluido en la mismaTabla el fragmento Alul (505 a 921) procedentede las moléculas en las que BgII no cortó. La 198 TABLA 9: clonaje de subfragmentos del fragmento PstI E de pLS1 y de pLSlconT Fragmento y coordenadas de corte Tamaño donado del fragrr,entoa 296 pCCA3 pCOA3coml Iterones y reoA Iterones y reoAcoo7 ~jji<804)-Alul <921) 117 -- Promotor P 1¡ AIuI<921)-AtuI<1012) 91 C -- AluT<101?)-AtuI<1036) 24 -- -- ALu¡C1036)-Pstl<1056> 16 -- -- AluI<505)~ALuI(921)b 416 pGCAlcom7 Iterones, reoAcop7 y región que codifica mt RNA II (a> EL tamaño de los fragmentos se ha corregido para los nucícótidos eliminados por digestión con Si. Ch> Fragmento parcial escapado de la digestión con (c> Plásmidos no anatizados. mezclade fragmentosprocedentesde pLSI o pLSlcop7se trató con nucleasaSI (para eliminar las extensionesprotuberantespresentesen algunos de los fragmentos)y se incubó, en presenciade ligasa, con el DNA de pCl94coplinearizadoen su sitio único HindIII y tratado tambiéncon Si. Las dos mezclasde ligación se usaron,por separado, para transformarun cultivo competentede S.pneurnoniae708. Los transformantesse seleccionaronenplacasconCm,y seanalizóel contenidoplasmídicode 200 de los clones obtenidos(100 clonesprocedentesde la transformacióncon cadauna de las mezclas). Los plásmidosque presentabanel tamañoadecuadopara algunade las construcciones de interés (Tabla 9) se mapearonmediante cortes con enzimasde restricción, para comprobarla procedenciadel DNA donado.En la Figura75, se muestranlos patrones de restricciónobtenidos(panelA), y esperados(panel B) para los distintos plásmidos. Los nombresde las construccionesverificadasse indican en la Tabla9. Como se ve, en un casoseobtuvieronlasdos orientacionesposiblesdel fragmentodonado,en tanto que en el resto de las ocasionessólo se consiguió una de ellas. En esteapartadonos 205 el ‘run-off’ que finaliza en el sitio de corte BglI, la síntesisiii vitro del RNA II debe terminarhaciala coordenada787 de pLSl. La secuenciade DNA en los alrededoresde estaposición es tal que el extremo3’ del RNA U presentaríauna larga serie de lis precedidapor una repeticióninversade 8 basesquepodría dar lugar a unaestructura secundariade tipo tallo-lazo (Fig. 79). El extremo 3’ del RNA II reúne, pues, las característicastípicas de un terminadorindependientede rho. Aplicando el algoritmo desarrolladopor d’Aubenton-Carafay cols (1990),el valor d calculadoparael putativo terminadordel RNA II esde + 59.6,con lo queseprediceunaeficienciade terminación mayor del 90%. Estos valores están entre los más altos de los 148 terminadores transcripcionalescomputadospor estos autores. Mediante análisis con ordenadorde pleganilento de secuencias,no hemos encontradoen el RNA II otras estructuras secundariasapartede la correspondientea esteterminador. 5 u - CAACAAAAATAAAAAAACCCCTCCTCCCACGCACTCCCTAAACTCAAA 3 - CTTCTTTTTATTTTTTTCCCGACCACCCTCCCTCACCCATTTCACTTT a. r. b. s. 876 5 - CATTTCTTCGCTATATTATACTTTATCCCTAAACAAAAAGCAACATAC 3 ‘- CTAAACAACCCATATAATATCAAATACCCATTTCTTTTTCGTTCTATG 1— Pranotcr CC e u A C C.C C.C A.U C.C A C.C C.C C.C 3 ‘- XJUUAUUUUUUII . AIJXRICAGIJUUCUAAACAA -5’ 787 836 Figura 79. Secuenciade DNA en la regiónquecodifica el RNA II, y estructurasecundariapredichapara éste.Se muestrala secuenciade nucleótidosdc ambascadenasentrelas coordenadas78] y 876 de pLS1. Las cajas-35 y -ID del premolarP1~ sepresentanen negritas.El mRNArepABy el RNA II (sintetizadosensentidos opuestos)sc representancomo lineas onduladas.También sc indica el propuestoa.r.b.s. de repB, y las secuenciascorrespondientesal codónde terminaciónde la síntesisde RepA (TAA en790) y al de iniciación de Jasíntesisde RepB(ATO en 853).Debajosemuestrala secuenciapropuestaparael RNA11, y su posible estructurasecundariageneradapor ordenador. 206 Los ensayosde transcripciónin vitro utilizando el fragmentode 702 pb Sspl- PvuII de pCGA3 (que contiene el promotor FAB’ pero no el promotor P; Fig. 78D), confirmaron que los pequeñostranscritosobservadosen los experimentosanteriores correspondenal RNA II sintetizadoa partir del promotorP. Así, al analizarlos RNAs sintetizadosen estosensayos,se observaúnicamenteel transcrito “run-off’ de 480 nts originado a partir del promotor ~AR (Fig. 78A, calle 2). Finalmente,en una seriede ensayosllevadosa cabocon los fragmentosLmi- PstJ(842 pb) de pLSI, o fsjl B (723 pb) de pLSScopll(Fig. 78D), hemosestudiadola acciónde RepA sobre la síntesisin viti-o del RNA II. Tanto en uno como en otro caso, la formación de los dos transcritoscorrespondientesa esteRNA no se ve inhibida por la presenciade RepA, inclusoaconcentracionesde la proteínaquebloqueantotalmente la transcripciónapartir de los promotores~AF~ o PA@COP]I (Fig. 78C).De hecho,seobserva un ligero incrementoen la cantidadde RNA II sintetizadoen presenciade RepA, efecto quepodríadebersea la inhibición del promotorPAS/PABCOP]]. De estaforma, los ensayos de transcripción¡u vitro permitendescartarla regulaciónde la síntesisdel RNA 11 por RepA. Elementosdel renlicón pLSII queexpresanincompatibilidad . Comoha quedadoimplícito enapartadosanteriores,el plásmidopCl94copes capazde establecersey replicaren pneumococos(Ballestery cols, 1990).Ya queel DNA de este plásmido no presentahomologíasignificativa con el de pLSI en las regiones implicadasen la replicación plasmídicay su posible control, erade esperarque ambos replicones pertenecierana grupos de incompatibilidad distintos. Para comprobarlo, realizamosun Testde tipo 1, en el que el DNA de pCl94copse usó para transformar célulasde pneumococosque llevabanpLSI. El contenidoenDNA total de tina serie de clonestransformantesseanalizótras unas37 generacionesde crecimientocon selección para Cmr. La presenciade pCl94copno altera en absolutoel númerode copiasni la herenciaestablede pLSl (véaseFig. 81). Cuandose realizael Test recíproco(tipo II), de formaquecélulasquellevanpCl94copsetransformancon DNA depLSI, seobtienen resultadossimilares a los anteriores: tras unas 37 generacionesde crecimiento en presenciade Tc no hay alteración en el número de copias de ninguno de los dos plásmidos,y pCl94cop continúa siendo heredadode forma estable en la estirpe heteroplasmídica(estos resultadosno se muestran).Según se desprendede estas 207 observaciones,los replicones de pLSl y de pCl94 son compatiblesy, por lo tanto, pertenecientesa distintosgrupos de incompatibilidad.En estosTests (tanto de tipo 1 como de tipo 11), hemos encontrado,a veces, que una pequeñafracción de los transformantesha perdidoel plásmidoresidente(pLSI o pCl94, respectivamente).Este tipo de fenómeno,denominadodesalojamiento,ya se había observado,anteriormente, en tests de desplazamientocon plásmidoscompatiblesen otras especiesbacterianas (Novick, 1987). Aunque el mecanismodel desalojamientocontinúasiendoun misterio (R.Novick, comunicaciónpersonal),este fenómenopareceproducirse,exclusivamente, duranteel establecimientodel plásmidoentrantey, a diferenciade lo queocurreen la incompatibilidad,la estirpeheteroplasmídicaes establey mantienepara cadaplásmido un númerode copiassimilar al de la estirpehomoplasmídicacorrespondiente. Por las característicasque acabamosde exponer(capacidadpara establecerse y replicarenS.pnewnoniae,y compatibilidadconpLSI), pCl94cophasido escogidocomo vectorparael clonaje de fragmentosde pLSi que contuvieranelementospresuntamente implicados en funcionesde mantenimientoo control de la replicació~n. El efecto qííe producela presenciade estoselementossobrela replicacióny estabilidadde pLSi ha sido analizadomedianteTests de incompatibilidadde tipo 1. En el apartadoanterior hemosvisto que las construccionesque llevan donadoel genrepA o repi cop7 (pCGA3 o pCGA3cop7,respectivamente)puedencoexistir establementeconpLSI (Fig. 77A). Por otra parte, en la Tabla 9 se recogen una serie de derivadosde pCl94cop que sc obtuvieron, al igual que pCGA3 y pCGA3cop7, del clonaje de subfragmentosdel fragmentoPstI B depLSl o pLSlcop7.Los mapasfísicos indicandola or:¡entaciónrelativa de los fragmentosdonadosen estasconstruccionesy en otras que, comoveremosmás adelante,derivande ellas, se muestranen la Figura 80. Segúnsedesprendede los estudioscomparadosde incompatibilidad(Novick, 1987), en los plásmidos con sistema de control inhibidor-diana, tanto directa corno indirectamente regulados (véase Introducción), el contratranscrito constituye un determinanteprincipal de incompatibilidad.En el plásmido pLSl, el RNA II es un contratranscritodel mRNA repiB (Fig. 79), por lo que parecíainteresanteanalizarel efecto de un aumentode su concentraciónsobre la replicación de pLSl. Un primer estudio de este efecto se ha llevado a cabo utilizando la construccióndenominada pCGAlcop7,que contienelos tres iteronesdel ori(i-), el gen repAcop7y la región que codifica el RNA 11 (Tabla9 y Fig. 80). Unavez realizadoel Test de incompatibilidadde tipo 1, el análisis del contenidoen DNA total de 12 clonestransformantesevidenciéla pérdidadel plásmido residentepLSI (Fig. SiA). Mediante recuentoen placa hemos 208 0de¡ 5 ;s~S ~ — •JNNt’J.~ ~ —— * ——tt-t-. — ~ 000 a. ~ t wOr~ O e1> de esteplásmido(sin promotor~AB ni genrepA, pero 218 con toda la informacñ5n necesariaparacodificar el RNA II) deberíaconstituir, al ser donado, un determinantede incompatibilidad frente a pLSl. Para confirmarlo, construimosel plásmidopCGA9 (fragmentode 163 pb StvI-ASI de pLSI donadoen el sitio único l-IindIII de pCl94cop;Fig. 80), y analizamosel efectode su presenciasobre el númerode copiasy la estabilidadde pLSI. El plásmidopCGA9 seconstruyó,en dos pasos,a partir de pCGAlcop7y pCl94cop(Fig. 85). En un primer paso, se realizó la ligación del fragmentoStvI A (2324 pb) de pCGAlcop7con el fragmentopequeñoStvI- HindIII (743 pb) de pCl94cop.Duranteesteproceso,y debido a la ambigliedadde la secuenciade reconocimientopor Sud (5’-C’C(A/T)(A/T)GG-3’), sólo sepuedenanillar 5 Poil K,diluc¡ón ¡¡goción y tronsforrnoc¡dn Figura85.Estrategiautilizadaparael subelonajedela regiónquecodificael RNA II. El plásmidopCGA9 (fragmentoStvI(’158)-~M»l(921)de pLSl donadoenpClY4cop) se construyópor unión del fragmentoStvl A de pCGAlcop7con el fragmentoStvI-HindIII pequeñode pGl94cop,tal y como se recogeen el esquema. Las regionescorrespondientesal DNA del replicónpLS1 se representanpor unabarravacía(). Se indica la posicióny orientaciónde losgenesquecodifican losproductosCat, RepA7y RNA II. Sitios de restricción: H StyI Pur¡f,coción de fro~mentos y ligocion 1 5 225 DISCUSION En este trabajo nos hemos centradoen el estudio de la replicación y su regulaciónen el plásmidode amplio espectrode huéspedpLSi. Aunqueel conocimiento de estosprocesoses aúnlimitado, hemosprogresadoconsiderablementeen el estudiode un plásmidodel quesólo se conocía,prácticamente,su secuenciade DNA. El plásmidonaturalpMVIS8 y susderivadospLSl y pLS5, puedenestablecerse y mantenerseen unavariedadde huéspedes,incluida la bacteriagram-negativaE cotí. Aprovechandoesta circunstancia,comenzamosel estudio de la replicación de estos plásmidosen extractosde E.coli libres de células.Estetipo de sistemain vitre habíasido ampliamenteutilizado para analizar la replicación de plásmidos de bacteriasgram- negativas(Díaz y cols. 1981; Díaz y Staudenbauer,1982ay 1982b;Staudenbauer,1976, 1984). La replicación in viti-o de pMVI58 y sus derivadoses menoseficienteque la de los plásnildosde E.colí Rl y ColE!, empleadoscomocontrolesen estos ensayos(Figs. 10 y 11). Esto podríaser unacaracterísticageneralde los plásmidosde bacteriasgram- positivas que replicanen el sistemade E.coli, ya que tenemosevidenciaspreliminares de que el plásmidopC194 de S.aureuses sintetizadoin vitre en dicho sistemacon una eficienciamenor inclusoquela de los plásmidosde estreptococosprotagonistasde este trabajo.Los resultadospresentadoscon respectoal replicónpLSl constituyenla primera y, hastael momento,única evidenciade replicación in vitre de plásmidosde bacterias gram-positivasen extractosde un microorganismogram-negativo.Paraotros plásmidos de bacteriasgram-positivas,como pTl8l de S.aureus, no se ha observadoactividad replicativaenextractosde E.coli, ni siquieracuandolos ensayosserealizaronenpresencia de la proteínaespecificadapor el plásmidoy requeridapara su replicación,previamente purificada (Koepsely cols, 1985b). Así, incluso dentrode la mismaespeciebacteriana, algunosplásmidos(como pC194) parecenmáscapacesque otros (como pTlSl) para utilizar la maquinariareplicativade un huéspedfilogenéticamentealejadodel que le es habitual. No obstantelas diferenciascomentadasentre los plásmidosde estreptococos y de E.coli, tambiénhemosencontradosimilitudes en lo quese refiere,por ejemplo, a la cinética de síntesisde su DNA (Fig. 12) (Staudenbauer,1976; Maz y cols, 1981). Además,conrespectoa la actividadreplicativadeextractospreparadosendiferentesfases del crecimientobacteriano,se observaquelos plásmidosde estreptococospresentanun 226 patrónparecidoal depKN 182 (Fig. 10), de forma queen todosellosel DNA esreplicado con mayor eficiencia en extractosprocedentesde cultivos en fase exponencial.Por el contrario, la replicaciónde ColEI ocurre muy eficientementecon independenciade la fase de crecimiento a la que se preparan los extractos (Fig. 10). El distinto comportamientode ambos grupos de replicones podría reflejar diferencias en las condicionesy procesosrequeridospara su replicación, la optimización de los cuales dependeríade la fasede crecimiento.En estesentidocaberecordarquela replicación iii viti-o del DNA de CoIEl es independientede la síntesisde novo de proteínaspero requierela transcripciónde un RNA “primer” (Staudenbauer,1976y 1984), en tanto que la deRl y susminiderivadosdependede la síntesisdeunaproteínaespecífica,involucrada en la iniciación de la replicación(Díaz y cols, 1981; Díazy Ortega,1984). Los productos finales de la replicación in vitro de los plásmidos de estreptococosson formas monoméricassuperenrolladas(Fig. 17). Además,estasmoléculasde nueva síntesishan debido completar,al menos,una rondade replicación,puestoquetodos los fragmentos procedentesde su digestióncon un enzimade restriccióntienen la misma radiactividad específica(Fig. 18). En contrastecon los resultadosobtenidoscon pT181 y con el plásmido de amplio espectrode huéspedRSF101O(Khan y cols, 1981; Díazy Staudenbauer,1982a), los extractos preparadosa partir de células sin plásmido pueden llevar a cabo la replicaciónde DNA exógenode los plásmidosde estreptococos(Tabla 5). Esto sugiere que la acumulaciónde proteínas específicaspara la replicación de pMVIS8 y sus derivados,o bien no es necesariao bien seproducedurantela realizacióndel ensayola viti-o. Para los plásmidosde estreptococosexiste, pues, la interesanteposibilidad de compararlos resultadosobtenidosal emplearextractoscony sin plásmidoendógeno.Así, mientrasque la replicación en extractoslibres de plásmido es totalmentesensiblea inhibidoresde la síntesisproteica(Rif o Cm), cuandoseempleanextractosconreplicón pLSI endógeno,el efectode estosantibióticoses muy limitado (Tabla5). De estaforma pudimosconcluir que la replicaciónde pMVISS y susderivadosrequiereunao varias proteínasespecificadaspor estosplásmidos.Mediante la construccióny el análisis de viabilidad de derivadosdelecionadosde pLSI, hemospuestode manifiestoque de las cuatroorfs descritasparael plásmido(Lacksy cols, 1986), sólo la correspondienteal gcn repB esesencialpara su replicación(Fig. 27). No obstante,el productode estegen (la proteína RepB) puede ser complementadoen trans, permitiendo la replicación de derivadosrepB quepresentanun origen funcional intacto. Otra característicadestacablede los plásmidosquepresentanel replicónpLSI 227 es que la síntesisiii viti-o de su DNA en ambostipos de extractos(con y sin plásmido endógeno)es inhibida totalmenteen presenciade Nov (25 pg/ml). Paraplásmidosde bacteriasgram-negativasse haestablecido,en los casosestudiados,quela replicaciónla viti-o esextremadamentesensiblea inhibidores de la DNA girasa (Staudenbauer,1976 y 1984; Díaz y cols, 1981). Paralos plásmidospequeñosde bacteriasgram-positivaslos datossonmáscontradictorios:Khan y cols (1981)hanencontradoquela síntesisdel DNA depTl8l enextractosde S.aureusquedareducidaal 50%enpresenciadeNov (1 uig/ml). Como en la anécdotade la botella medio vacía o medio llena (segúnse mire), este porcentajeda pie a que los autoresconsideren,unasvecesque la DNA girasa está involucradaen la replicaciónde esteplásmido(Khan y cols, 1981), y otrasque sólo lo estáen la maduraciónde lasmoléculasyareplicadas(Koepsely cols, 19855).Sin descartar quelos requerimientosreplicativosde pLSi y pTl8l seandiferentes,hay queteneren cuentaque estosautoresutilizan una concentracióndel antibiótico 25 vecesmenorque la quehemosusadonosotrosen el sistemade E.coli. Sin embargo,en ensayosde síntesis iii viti-o del DNA depTl8l en presenciade la proteínaplasmídicade replicación(RepC) pura,Koepsely cois (1985b) observanquela adición de Nov (100¡íg/ml) sólo reducela incorporación de dTMP en un 30%. Estos valores contrastan con los obtenidos recientementepara la replicación ja vitro de otro plásmido de Saureus, pC221, estrechamenterelacionadocon pTl8l (Thomas y cois, 1990). Empleando extractos preparadosa partir de la mismaestirpe utilizada para ensayarla replicación del DNA de pTl8l, y realizando los experimentosen presenciade la proteína de replicación correspondiente(RepD) pura, se observaque la síntesisdel DNA de pC221 queda inhibida en un 63% en presenciade 50 pg/mI de Nov. Los autoresconsideranqueesta inhibición es significativa y sugieren un papel para la actividad de la DNA girasa endógena,presenteen los extractos(Thomasy cols, 1990). Seacomofuereen estosdos plásmidosde estafilococos,la síntesisdel DNA de pMVI58 y de sus derivadosqueda reducidaa nivelesde fondoen presenciade Nov (Tabla5 y Figs. 15 a 17). De estaforma parececlaro que la inhibición de la actividad DNA girasaen sí misma,o el efectode relajacióndel DNA molde que seproducea consecuenciade estainhibición, bloquean la replicaciónde los plásmidosde estreptococosen el sistemaiii viti-o. En el momento en que realizamoslos ensayosde replicación iii vitro sólo disponíamosde un mutantede pLSl con alto númerode copias,el plásmidopLSS. En ningunode los parámetrosreplicativosanalizadoshemosencontradodiferenciasentre pLSI y su derivado pLS5. Puestoque estos resultadosconstituyenun dato más, muy circunstancial, acerca del posible mecanismoregulador eliminado en pLSS, serán consideradosmásadelantejunto conotrosdatos,paraelaborarunaposiblehipótesisque 228 exp]ique el fenotipo de doblenúmerode copiasde pLS5. El plásmidopLSI replicaa travésde un mecanismode círculo rodante,similar al queutilizan los colifagosde cadenasencillaM13 y #X174 (Kornberg,1980;Baas,1985) y losplásmidosdeS.aureuspTl8l (Koepsely cols, 1986)y pC194(teRieley cols, 1986a). Estaconclusiónestábasadaen los siguientesdatos: i) En ensayosdereplicacióniii viti-o en presenciade ddTTP, no hemos observadoque ningún fragmentoprocedentede moléculasparcialmentereplicadaspresenteuna movilidad electroforéticaalteradacon respectoa los fragmentosde moléculasno replicadaso totalmentereplicadas(Fig. 18), de formasimilar a lo quesehadescritoparapTlSl (Khany cols, 1982).Por el contrario, enplásmidoscomo RSF1O3O,que replicanmedianteun mecanismoe, seha observado que,enmoléculasqueestánreplicando,el fragmentoquecontieneel origenpresentauna migraciónelectroforéticaalterada(Conrady cok, 1979),indicativa de intermediariosen burbuja, característicosde este tipo de replicación. ji) Hemosdetectadola vivo formas plasmídicasmonocatenarias(Fig. 20). Estasformas son intermediariosreplicativosen el mecanismode círculo rodante.iii) Existe una señalen pLSl (Fig. 33), a la izquierdadel ori(-l-) de replicación, queestáinvolucradaen la conversiónde ssDNA a dsDNA, y su eliminaciónconducea la acumulaciónde intermediariosplasmídicosde cadenasencilla (Figs. 30 y 31). iv) La única proteínaespecificadapor pLSI que se requierepara la replicacióndel plásmido(RepB) tiene actividadesendonucleasaespecíficade secuencia (de la Campay cols, 1990) y tipo topoisomerasa(Fig. 48), que han sido previamente demostradasparala proteínaRepCiniciadorade la replicacióndepTlSl (Koepsely cois, 1985a).y) RepBproduceunaincisión de cadenasencillaen la hebracodificante(+) de pLSI (dela Campay cots, 1990),y éstaes, segúnhemoscomprobado,la única hebraque es convertidaiii vivo en ssDNA (Figs. 21 a 23>, tal y como sucederíaen un mecanismo de círculo rodante.Además, la rep]icación de pl-así medianteeste mecanismoes consistentecon la aparenteindependenciade la síntesisde un RNA ‘primer’ en el procesode iniciaciónde la replicaciónin viti-o (Tabla5). Ya quehemosdetectadoformas plasmidicasmonocatenariasen las tresespeciesbacterianasusadasen estetrabajocomo huéspedesde pLSI (Figs. 20 y 30), nos inclinamos a pensarque la replicación de este plásmidoen todasellas tendríalugarmedianteel mismo mecanismode círculo rodante. En apoyode estaidea estánlas coincidenciasentrelos resultadosobtenidosja vivo en estreptococosy los queprocedendel sistemaja viti-o de E.coli, en lo que se refiere a localizaciónanrox~madariel nricpn ,in ronl½’nrAr ~ ción de la direccióndeésta, UC t~i IlUhid y requerimiento de una proteína especificada por el plásmido para que se realice la síntesisreplicativade su DNA. 229 Cuandocomenzamosa estudiarla replicaciónde pLSl ya sehabíapostulado quepTí8l podríareplicarmedianteun mecanismode círculo rodante(Khany cois, 1982), y se conocíantambiénalgunosdatosacercade la secuenciadeDNA en la quese localiza el origen de replicación de pTl8l (Khan y cols, 1982). Sin embargo,nada se había descritoacercade la señal involucradaen la conversiónde ssDNA a dsDNA en los plásmidos de bacterias gram-positivas. Comparando la acumulación de formas monocatenarias de pLSI y pC194 en células de distintasespeciesbacterianas(Figs. 29 y 30), pareceevidentequela eficienciadeconversióna formasbicatenariasesespecífica de plásmidoy huésped.En estapartedel trabajo hemosdemostradoqueen el plásmido pLSl existe una señalde conversiónmuy eficientementereconocidaen S.pneumon¡ae. Esta señal,a la que hemosdenominadoori(-), se localiza en una larga e imperfecta repeticióninversa(Fig. 33), capazde formar,inclusoen DNA bicatenariosuperenrollado, una estructurasecundariadetectablepor digestióncon SI (Figs. 24 y 25). Aunque para explicar la funcionalidad del origen para la síntesis de la cadena retrasada bastaría con que la estructura secundaria presuntamente implicada pudieraformarsesobre ssDNA, no es éste el único caso en quedichaestructurasehadetectadosobredsDNA. Así, Lilley (1980) ha localizado,mediantemapeocon SI, el origen de la cadena(-) de ~X174sobre el DNA superenrollado de la forma replicativa. Mediante análisis con ordenador,hemos encontradoque al menos tres plásmidosde estafilococos(pC22l, pC194y pE194)podríanformarestructurastallo-lazo similaresal ori(-) de pLSI tanto en la forma general como en la secuenciade DNA (Fig. 33). En los plásmidosde estafilococos,los largospalíndromescorrespondientesa estas estructurashabían sido ya descritos y asociados con una secuencia (RS) supuestamenteutilizada para la formación de cointegradosespecíficosde sitio entre plásmidos no homólogos (Projan y cols, 1985).Sin embargo,no sehabíaasignadofunción alguna a dichos palíndromes(Projan y cols, 1985). Nosotros propusimosque estas estructurasfuncionaríancomo orígenespara la síntesisde la cadenaretrasadade los plásmidosde estafilococos.La comparaciónde secuenciasentreel oñ(-) de pLSI y los de los plásmidosde estafilococosha revelado que existen dos zonasprincipales de homología: unaa nivel de la basey comienzodel tallo, y otra en la región del lazo de la estructura(Fig. 33). La homologíaen la basecorrespondeal RSB y a la región que apareaconpartedel mismo al otro lado del tallo. La otra homologíacorrespondeauna secuenciaconsenso:5’-TAGCGT-3’ localizada,al menosenparte,en el lazode cadauna de las estructuras,exceptoen la de pE194,dondeexisteunadiscrepanciadeunasolabase (A en lugar de T). Ya que tanto nuestrosresultadoscomolos de otros autores(Gruss y cols, 1987) indican que la funcionalidad del oñ(-) tieneespecificidaddecadena,podemos 230 suponerqueal menospartede las secuenciasesencialesparael reconocimientode esta señaldebenestaren unaregión desapareadade la estructura.Estaes unacaracterística quecumplela secuenciaconsensodel lazo,queha sidopropuestapor nosotroscomouna región importantepara el reconocimientodel ori(-). Grussy cols (1987) han descrito también las señalespara la iniciación de la cadenaretrasada,que ellos denominan secuenciaspa/A, en varios plásmidosde estafilococos. En ese trabajo, los autores consideranque la única homologíasignificativa entrelos paLi de los siete plásmidos analizadosse encuentraen la basede las horquillas, es decir, a nivel del RS8 y de la secuenciaa él enfrentada(tanto apareadacomodesapareada>al otro lado del tallo. El restode la estructurala consideranmásvariable,y la subdividenen dosgruposde distinta morfología general:pa/A de tipo pTl8l (que es compartido también por pSN2 y pEl2/pIMl3), y pa/A de tipo pC22l (que sepresentatambiénen pCl94 y pE194). Sin embargo,en una revisiónposterioren la que seincluyen ya nuestrosdatosacerca del ori(-) de pLSl, Novick (1989) encuentraque la homologíaen la basede las horquillas no esgeneralparatodoslos elementospalA, ya quedosde los cincomiembrosdel grupo de pTl8l carecende ella. Por otra parte, Novick observaquedentro de cadagrupo de secuencias pa/A existe unaregión altamenteconservada,localizadaalrededordel punto pC1 94 2042 tcTTTATTCCKATTtctgctttattgacgttgagccrcgqaac~cc—rtaocaatcccaaaacttgrcgaarqqrcqgc:rAATAocTc pofl 166 gCTTTAT’rCCAATT———gctttattqacqttgagcescgqaac-cc—ísaacaatcccaeaacttgscqaatggscqgcITAATAGCTC p$194 2982 gcTTTATtCcAATT———gctttatttacattgagcctctqtac—cc—ttaacaaaccóaaaactrqtcgaatggtcgggcrAArA—CTC pC221 793 qcTTTATTCcAATT—cctctattt—gccqatqattct——qcgctcc—rtaataatccraaaqct—gsccatcggtcgaancATAccrc pE194 794 caTTTATTCcAATTtcctt——ttt—gcqtqtqatqcgcrgcg-sccaccaaaaaeccsagagctssqcaaccgaaag---TTAATAGCTC pLSl 4233 ttTTTATTccA———tggtctattt—qacaacaagt~accag5gactgccgtcctttgtccg—--tqtccgtccqa pC194 ACOcTAT—qccqa—catscqeceqcaa—gtsía—geuaagggtecttctcaaígcac—aataaarlrrcrccccA:A.xAtqcq 2206 pOXG ACGCTAT—gecqa—cattcgtctgcaa—qttÉa—qruaagggtuctlícecaacgcac-aasaaa::rTcTCGGCATAAALOCqt 004 pS194 ACGCTAt—gc—ga—cattcgtctgcaa—gttea-qtraaggqtactrcucaa--taeaaaraaawTTTcTcGccAu@J~aagc 2825 pC221 ACaCTAT-ctgac—cqctggcgcttttaqtctaa—ttaaqgq--ctcttatcqa-—-caaataqaTTTTcTcGGcATxMtqc 636 pEXS4 TcGcTAc—eacttscqcttacgcÉctaaqtatatttea4qqa--csqtcacacg———caaaaag-r1~r1-csccccAvAAAag 637 pLS1 ACGctAaagtctttcggctcgqcacgtcctagcqtactctqt—caesgcttategrcaaasaqc-tTTcAcGGCATAAASCagt 4083 pIJBll2 586 gaaTTttTttAATTtccttattqqtcqgaacctacaa——tttcacatqttg—gtqaqrrggtac~ztsctTGccATT prí 81 512 gcTrTAtTCC.AATrtccttattggtcqqaacctacagggctttatqtqttg-tsgagstzggsace,ztcsTGGcA1T pIMI3 995 gc—TTATrccAATTtccs—aííqgstggaaccaacaqgcgtraqtgtgu~g-stgaqusqgsacsíscarGGGA,-: pSN= 87 gCTTTAflCCAATTtccattttgagcagaaactttecÉ cat-atgatt tygattg-qttgttaa 9t~~ GGAArZ pleSí 1185 atTTAaaatkATTqct—ttttqacttcacgatatcgcts ta~tqatttqyattq-gttgttaagt—-—7CCAAiT pU8112 XATcCCAat—caagccca—accaactcqttaataaattaacíaacacactsatrast>ccaac—caataaqqaaasraaaaa:gcq435 ptl 81 AATCCCAattcaaqtcca—accaactcqctaacaagttagcraacacasagcccattccaac~caasaagTTTTcTcGccATAAAtqc 672 p1H13 AATcccAtgaaaccccca—accaactcgccaaaqcqreqgctaacacacacgecaesccaac-caaía—gr7-TTcrcoecArááAgcc 1151 pSN2 flTccAActtaaaaccqgcaccaa—rcqccacsgaaqsgqc-aucnattcgccreectttcscaaaatgrt:crcec.cArAAAtgc 1219 pTCS KATccAActtzaaaaccqgcaccaa—tcqccacsaaagsqg—raschtsrtcqc—íssgcutgtcaaaaa-rTTTCTCatttcAAAatq 68 Figura 90. Comparación de secuenciastipo pa/A (segúnNovick, 1989). Se muestrael alineamiento,en dos familias distintas, de las secuenciaspa/A de diez plásmidosde Laureus y de la secuenciahomóloga correspondienteal ori(-) de pLSI. Cadasecuenciase ha dividido en dos líneaspor el centrode rotacióndel palíndromeimperfecto,y se han insertadoespaciospara optimizar los alineamientos.Los segmentosen mayúsculaquerodeanel centrode rotaciónestánconservadosdentro de,pero no entre,una y otra familia. Los que aparecenen los extremosde las secuenciasson compartidospor nuevede los once elementos representados.Hay queresaltarqueel amorha representado,en lodos loscasos,la cadena (-) del plásmido, por lo que la secuenciaRS 6 correspondeal segmentoconservadoen el extremo3’ (al contrario que en la representaciónde la Figura 33, dondeel RS8 apareceen el extremo5’). 231 desimetría(Fig. 90). En concreto,paralos seiselementospa/A de tipo pC221queanaliza (dentrode los queincluye la estructuraque nosotroshabíamosasignadocomo ori(-) de pLSl), la región conservadacorrespondea la consensopropuestapor nosotrosen el lazo de la estructura,aunqueen los plásmidosdeestafilococos(perono enpLSI) la homología se extiende 10 basesmás allá de estasecuenciaconsenso(hacia 5’ sobre la cadena representadaen la Fig. 90). La localización de la secuenciaconsensopropuestapor nosotrosen una zona desapareadadel oñ(-) de todos estos plásmidos, refuerza su significado biológico. En efecto, si esta región no fuera relevantese esperaríaque presentarauna mayor variabilidad que la existente en regiones de apareamiento intracatenario,puestoque mutacionesen zonasdesapareadasno desestabilizaríanla estructurasecundariadel oñ(-) ni obligaríanamutacionescompensatoriasparamantener el apareamiento.Una observaciónrelativa a la Figura 90, extraídade unapublicación de Novick (1989),es queel autorrepresentasistemáticamentelas secuenciaspa/A en la cadena(-) de cadauno de los plásmidos,por lo que el RSE aparece,al contrarioque en nuestra representación, en el extremo 3’ del elemento. Nosotros consideramos, sin embargo,que, ya que estasestructurasfuncionaríancomo señalesde conversión de ssDNA a dsDNA en la cadena(+) de los plásmidos, es ésta la hebra que debe ser representada.Segúnsedesprendedenuestrosresultados,elementospai’A pertenecientes al mismo grupo pueden ser reconocidoscon distinta eficiencia en un determinado huésped.Así, mientrasque el ori(-) de pLSl funcionaeficientementeen pneumococos el elementopa/A de pCl94 es reconocidomáspobrementeen estabacteria(F’igs. 29 y 30). Por otra parte, los elementospa/A de los plásmidosde S.aureusfuncionan muy eficientementeen estehuésped(Grussy cols, 1987).Ya quelos elementospalA similares al ori(-) de pLSl compartencon éste la consensode 6 basesen el lazo de la estructura estahomologíapodríaindicar unaanalogíaentrelos factoresimplicadosen la conversión de ssDNA a dsDNA en uno y otro huésped(S.aureusy S.pneunzoniae).El resto de la secuenciacompartidapor los pa/A de los plásmidosde estafilococospertenecientesal grupo de pC22l, pero distinta a la quese encuentraen el ord-) de pLSI, podríaser un lugar de reconocimientoespecíficopara la maquinariadel huéspedcorrespondiente. La estructuradel DNA en la región del ori(-) depLSi podríasermáscompleja que la mostradaen la Figura 33. En efecto, análisis por ordenadorde posibles plegamientosdel DNA entrelas coordenadas4000 a 4300 de pLSI (Fig. 91), muestran una estructuracompuestapor tres horquillas, una de las cualeses casi idéntica a la previamentemostrada(Fig. 33). Estructurassimilarmentecomplejas se encontraron alrededordel ori(-) de otros plásmidosde bacteriasgram-positivas(no semuestra). 232 C ~ A A rL — 6” <. ~ lA fi, ci 1 fifiG 6 s¿/6 6 AS 16 ~l AT Lii 666*6 Ii” ITA A,si nl *16E. cC~Jflr Ti ‘~6 , A 666 1 666 lA i 1~~ cG.1 lAhPuA c e, lA ,6tGTGAÑA ¡5 6fi<6 C66C1 r”c~1’~c’é A7A 6*ci.. ~ 6e~ fi~ e AA! ‘íd A A ( AA”TA > SC~G6~l:Ac 6~ A ~ Ti Figura 91. Estructuracompleja,generadapor los programasPCFOLD y MOLECULE, de la cadena(±) de pLSl en la región del o,4-). Se muestrala predicción de apareamienlointracatenarioparala secuencía de pLSI entrelas coordenadas4000y 4300.La estructuratallo-lazocercanaal margenderechocorresponde, casi exactamente,a la presentadaen la Figura 33. Buscandohomologíasentre la región quehemosdefinido comoori(-) de pLSI y otras regionesdel plásmido,encontramosun datoqueno dejade sercuriosopor más que, finalmente,no tengamosexplicaciónplausibleacercade su significado: existe una secuencia (5’-TTTAGCGT-3’) en el ori(-) que se repite, de forma directa,en la región que codifica el putativo RNA 1. Dicho en términos de los elementosimplicados, el extremo5’ del putativo RNA 1 seria complementario, en ocho bases,a una región del lazo del ori(-) que incluye la consensode seis bases(5’-TAGCGT-3’) y las dos bases adyacentesal extremo5’ de dichaconsenso(Fig. 92). De esta forma podíamosimaginar un posiblemecanismoreguladorque explicarael mayor númerode copiasde plásmidos que, como pLS5, carecendel putativo RNA 1: la inhibición de la síntesisreplicativade la cadenaretrasadapor interacciónde dicho RNA con unasecuenciarequeridaparala conversiónde las formasplasmídicasmonocatenariasenformasbicatenarias.Sinembargo, resultadosobtenidosen este trabajo argumentanen contrade este modelo. En primer lugar, la proporciónde ssDNA es la misma para pLSi que para el mutantede copias 233 4080 TCTGAGCCATTTATGCCGTGAAACcTATTTCACAATAAGcAGTGACACAC ACACTCCCTAAATACGGCACTTTCGATAAACTGTTATTcGTCACTGTCTC TACGCTACGACGTGCCGACCCGAAACGC~I’TTAGCGTTTCGGACGGACACC ATGCCATCCTCCACGGCTCGGCTTTCCGAAATCGCAAAGCCTCCCTCTGC GACA.AAGGACGGCAGTCACTGCTTACTTGTTCTCAAATAGAcCATCCAAT CTCTTTCCTCCCGTCAGTGACCAATGAACAACAGTTTATCTGGTACCTTA 42=9 258 pb 80 CAAAAAAGAAAGAcAGTACTTGCACCTACTGTCTTTCTTTTGCGTTGTCC OTTTTTTCTTTCTGT CAT CCTGGATGACACAAA GP.AAA CG CAJx CAC O TTTTAOTTeCTCGAACTTTTAGOGTCAAGCATATTATATCATGO oceGAG AAAATCAAGGAGCTTGAAAATCGCAGTTCGL AATA~ GTACCCCGCTC RNAI O AAATTCTGTCAAAATAATGCT TTTAA CAGT TATTACGA -35 200 Figura 92. Elementosde secuenciarelativos a la región que codifica el putativo RNA 1 de pLSI. Se presentala secuenciade nucícótidosde ambascadenas,desdela coordenada4080a la 200 del DNA de pLSI. Las cajas-35 y -10 propuestaspara el promotor del putativoRNA 1 se muestranrecuadradas(nóteseque ambascajaspresentanla secuenciacanónicade los promotoresde E.coli). Una repeticióninversaperfecta de 16 pb (con espaciadode 6 ph), que en el RNA 1 podría actuar como terminadorde transcripción independientede rho,se indica subrayada(coordenada83). En negritasse representauna repeticióndirecta de 8 ph que afectaa la región que codifica el putativo RNA 1 y al oñ(-) del plásmido. Obsérveseque la consensode6 bases(subrayada)en el lazo dela estructuradeloñ(-) estáincluida enla secuenciadirectamente repetida. pLS5, ya que esteúltimo presenta,con respectoal plásmidosilvestre, un número de copias doble acompañadode un incremento similar en la cantidad de monocadena acumulada(Tabla 6 y Fig. 30). Este resultadoseríael esperadopara un mutanteque tuviera aumentada la capacidad de iniciación a partir del ori( +), peroqueno presentara ningunamodificaciónen la eficienciade utilización del ori(-) (como ocurretambiéncon pLSlcop7). Por el contrario, si, como habíamos supuesto en el modelo, la conversión de ssDNA a dsDNA se realizaramáseficientementeparapLS5 debido a la ausenciadc un inhibidor que actuara a nivel del ori(-), hubiera cabido esperar que la relación ssDNA/dsDNAfueramenoren las célulasquecontienenpLS5 queen las quecontienen pLSI. En segundolugar, ya que el modelopredice la accióna distanciadel RNA 1 (su diana de acción se encontraríaalejadaunos400 pb de la región que lo codifica), sería lógico atribuirle a estetranscritola capacidaddeactuaren trans. De nuevolos resultados obtenidoscontradicenel modelo,ya que el fenotipo de alto númerode copiasde pLS5 no es revertidoa niveles silvestrescuandoel putativo RNA 1 es suministradoen troas (Fig. 82B). Por todo ello, no sabemosaún si la repeticiónde esta secuenciade 8 pb tiene algún significadofisiológico o corresponde,simplemente,a un caprichodel azar. 234 En pneumococos,la delecióndel ori(-) de pLSI produceunaclara reducción del númerode copiasplasmídicoy unagran acumulaciónde intermediariosde cadena sencilla (Figs. 30 y 31). Sin embargo,ya que los derivadoscarentesde ori(-) pueden establecersey ser mantenidosen la célula huéspedconpresiónde selección,debeexistir una señal alternativa,mucho menoseficiente que la genuina,para la conversión de ssDNA a dsDNA. Segúnsugieren algunas observaciones,esta señal alternativa se encontraríaen unaregióncon potencialparaformarunaestructurasecundariaenforma de horquilla, en cuyo lazo se localiza la secuenciaconsensocentralde seis basesque nosotroshemospropuesto(Fig. 34). La eliminación de ambasseñalesde iniciación de la cadenaretrasada(genuina y alternativa) daría lugar a un plásmido inviable en pneumococos.En B.subíi/is la situaciónesbastantedistinta, ya que la eliminación del ori(-) de pLS1 no conduce a un incremento en la proporción de formas plasmídicas monocatenariasacumuladasen la célula (Fig. 30B). Por esta razón, no hay ninguna evidenciade que el ori(-) de pLS1 sea la señal empleadaen este huéspedpara la iniciación de la síntesisde la cadenaretrasada.ParapLSl y susderivados,la conversión de ssDNAadsDNA enB.subti/ispodríallevarsea cabomedianteun mecanismodiferente, aún desconocidoy, de cualquierforma, poco eficiente.Consistentementecon estaidea, Grussy cols (1987) encuentranque los elementospaLi de los plásmidosde S.aureus parecencarecerde función en B.subrilis, dondeseacumulauna gran cantidadde formas plasmídicasmonocatenarias,independientementede lapresenciao nodeestoselementos. Estos autoresconsideranque un posible mecanismopara la iniciación de la cadena retrasadaenestaespecieseríala formacióndc un tenedorde replicaciónpor interacción, mediada por RecA, entre moléculas monocatenarias y bicatenarias. Sin embargo, en nuestro laboratorio se ha establecido pLSI en mutantesi-ecA deB.subti/is.Otraposibilidad seríala utilización, en estehuésped,de sitios de iniciación de la cadenaretrasadano específicos(Grussy cols, 1987). En tanto que los elementospa/A de los plásmidosde estafilococosy el ori(-) de pLS1 son ineficientes en Bsutti/is, existe un elemento, denominadoBA3 (McKenziey cols, 1986), que funcionaigualmentebien en S.aureus y B.subtilis como señalde conversiónde ssDNAa dsDNA (Grussy cols, 1987). La región £A3 fue identificadaen pUBliO, el único plásmidoconocidode S.aureus quecarecede pa/A y presentaen su lugar esteorigen alternativode la cadenaretrasada.El elemento BA3 tiene una considerablesimetría diádica, pero no presentasimilaridad con los elementospa/A (Novick, 1989). Recientemente,van der Lelie y cols (1989) han identificado un elementovirtualmenteidéntico a BM en el fragmentoEcoR! B de pMV158, estoes, en el fragmentoeliminado paraconstruirpLSl. El elementoBA3 de pMV158funcionacomoun eficienteorigen de la cadenaretrasadaendos bacteriasgram- 235 positivasno relacionadas:B.subtllis y Lactococcus lachs (van der Lelie y cols, 1989). Sin embargo,nuestrosresultadosindican queel elementoBM de pMVI5S espoco o nada funcional enpneumococos,ya quepLSi presentaen estehuéspedun numerode copias y unaacumulaciónde formasmonocatenariassimilaresa las observadasparapMVI58 (Fig. 29). Hastael momento,pMV158 es e] único plásmidonatural en el que se han encontradodos tipos diferentesde orígenesde la cadenaretrasada:uno (similar a los paLi de los plásmidosde estafilococos)que funcionaeficientementeen£pneurnoniae, y otro (similar al elementoBM de pUBI 10) eficienteen B.subti/is y Llactis. Como acabamosde ver, la importanciafisiológica del ori(-) de pLSi parece ser muy diferente en S.pneunzoniae y en B.subtilis. No obstante,la deleción de este elemento produce un único efecto común para ambos huéspedes:una marcada inestabilizaciónde la herencia plasmídica (Fig. 32). Esta pérdidade estabilidad es difícilmenteatribuibleal efectoque la eliminaciónde un origen de la cadenaretrasada podríacausarsobre la tasade replicaciónplasmídica(y por lo tanto sobrela velocidad de respuestaa las fluctuacionesen el númerodecopias),ya queen B.subti/is la eficiencia de la conversiónde ssl)NA adsDNA es la mismaparapLS4, carentede oñ(-), que para pLSI (Fig. 30B). La inestabilidad segregacionalde los derivados delecionadosen el ori(-) no sedebetampocoaunadisminuciónen el valor mediodel númerode copiaspor célula,ya quepLSI y pLS4 presentanen B.subtilis idénticaacumulacióntanto de dsDNA como de ssDNA. En pneumococos,aunque la eliminación del ori(-) produce una importantedisminución en el númerode copias, la tasaexperimentalde pérdida(LCj para pLS4 (Fig. 32A) esmucho mayor que la esperada(Lj para un plásmidocuyas 10 copiaspor equivalentegenómicosedistribuyeranal azarentrelas células hijas.Además, el plásmidopLS7, quecarecetambiénde ori(-) pero quepresentaun númerode copias sólo ligeramenteinferior al depLSl, sepierdede la poblacióndepneumococosconigual velocidadque pLS4 (Fig. 32A). Así, nuestrosresultadosindican que pLSI y pLS5 son mantenidosmuy establementeen los dos huéspedesgram-positivosgraciasa la existencia de un sistema de estabilidadque se localiza, junto con el ori(-), en el fragmento HindIlI(3279)-NcoI(4221)depLSI. Resultadosrecientesobtenidosennuestrolaboratorio (Kramerycois, sin publicar),indicanquedichosistemaseencuentraestrechamenteligado al oi-i(-) depLSI. Dado queparaconseguirla estabilidadde herenciaqueseobservapara pLSI y pLS5 en S.pneurnoniae y B.subtilis (Fig. 32) bastaríaun repartoal azarde las copias entre las células hijas, el sistema implicado consiste,posiblemente,no en un “elemento activo” (que disminuiría LOG por debajo del valor teórico L4 sino en un “elementoauxiliar” (que aproximaríaL~, al valor de L~) (Nordstrñmy Austin, 1989).Este elementoauxiliar no pareceser un sistemade recombinaciónespecíficode sitio que 236 resuelvalas formas multiméricasdel plásmido,puestoque ni en pneumococosni en B.suhtilishemosobservadoquepLS4presente,conrespectoapLSI, unamayorproporción de estasformas(Fig. 31). En estesentido,el sistemade estabilidadde pLS1 recuerdaal descritoparael plásmidode E.coli pSC1OI.Esteplásmido(que tieneunas15 copiaspor célula como término medio) presentauna región, denominadapar, implicada en estabilidad(Meacocky Cohen,1980).Cuandoestaregión seelimina completamente,el mantenimientosehacemuy inestable,apesarde queel númerode copiasmedio no sufre una disminuciónsustancial(Tucker y cols, 1984).Aún no se conocebien el mecanismo de estainestabilización,pero se piensaque puedereflejar una agregaciónno covalente de copias o, como ahoraparece más probable,una fluctuación considerablede los númerosde copiasen células individuales(Nordstrñmy Austin, 1989). Recientemente sehavisto quela regiónpar de pSCIO1 esun sitio de unión específicode la DNA girasa (Wahle y Kornberg, 1988), de forma que el fenotipo de inestabilidadde mutantespor podría debersea un defecto en la topología del DNA. De igual forma, el elemento auxiliar de pLSI podría actuar disociandoagregadosplasmidicoso disminuyendolas fluctuacionesdel númerode copiasplasmídicoencélulasindividualesque vana dividirse. ~í.4GT A ~G’~ T10 6 0 66 0 6 0 gj~1AT 66 6 6r~rn A.T 1.4 A.T Al Al 4.1 1 6 6.0 6 Al , demostrándosequeRepBseuneespecíficamentea los iteronese introduceunaincisión en la cadenacodificantede pLSI entre los nucleótidos448 y 449 (G/A), localizadosen un extremode] lazo de la horquilla 1, a 85 pb del primer nucleótidodel iterón 11 (Fig. 28). Enel momentoenque realizamosestapartedel trabajo,las característicasdel ori( +) de pLS 1 resultaban muy peculiares. A diferencia de otros plásmidos de bacterias gram- positivas,cornopTISl (Khany cols, 1982)y pE194(Villafane y cols, 1987), cuyosorígenes de replicación se habíanlocalizado(aunqueerróneamenteen el casode pE194)dentro de la secuencíacodificantedel correspondientegen rep, el ori( ±) de pLSI se encuentra en una región intergénica. Además, para pTlSI se había determinado la región del origen que interaccionaespecíficamentecon RepC(Koepsely cols, 1986), no detectándose,ni en éstani en regionespróximas,la existenciadesecuenciasdirectamenterepetidas.Estos elementosde secuenciatampocose habíanlocalizadoen la región del DNA de pE194 en la que Villafane y cols (1987) delimitaronel origen de replicación.Así, pLSI es el primerejemplodescritoen la literaturade un plásmido de bacteriasgram-positivasque contieneiteronespara la unión de la proteínade replicación.Más recientementese ha encontradoque el plásmidocríptico pADB2O1 de Mycop/asrna mnycoidespresentatres repeticionesdirectasy contiguasde una secuenciade 21 pb (Bergemanny cols, 1989>. Les autores,sin embargo,no asignaronningunafunciónaestasecuenciarepetida.Cuando comparamosla región del ori(+) de pI~S1 (coordenadas402 a 648) con la secuenciade pLS1 <388,475) pE194 <840,919) pAOB2O1 (40,108) pLB4 (1185,2050) pLS 1 pE 194 pADB2O1 pLB 4 AGGGAGATGTTGTGGGGGATTTTTTCTCCGAAAAAATCTAAAA TTCTTAGAT**T*****TTA***ACGGCA*****C**A TCACTAGAT*AA*****TCACGACC A G*AT*A*AAAAT****C** TATGGGGGGCCTACTACC/ACCCCCCCTATAGTG—--CCGA-CTCCCAAIX *************/*TAC****C*AT*A*TCAT.~.TT***A**TG Plásmido Sitio de Espaciado Iterán Núnero corte pLS TACTAGO/A (35 pb) CGGCGACTTTT 3 pADB2O1 TACTACG/A (54 pb) TCTTTTGCTACGATTTCTTAA 3 pE194 TACTACG/A (14 pb) GTCGATT 3 pLE4 TAC’I’ACC/A (13 pb) GTCCATT 2 Figura 95. Comparacióndc la secuenciade DNA dcl oñ( +) de pLSI con la de regioneshomólogasen otros plásmidosde sumismafamilia.ArribasemuestraJasecuenciade nucícótidosde la cadena(+) de pLSI en los alrededoresdel sitio de corlepor RepE,alineadacon secuenciashomólogaspresentesen los demás miembrosde la familia. Las coordenadas(entre paréntesis)de las regionesmostradascorrespondena la numeracióndadapor: Lacksy cols (1986) parapL.S1; Horinouchi y Weisblum (1982a),con las correciones hechaspor Villafane y cols (1987),parapE194;Bergemanny cols (1989) para pADB2O1; y Bates y Gilbert (1989) parapLB4. Se indican los huecospermitidosparamejorar el alineamiento(O. y las identidadescon la secuenciade pLSI (*). El sitio de cortepor RepB en el oñ( +) de pLSl (ti/A; de la Campay cols, 199(1), y los putativossitios de corte por las correspondientesproteinasRep de los otros plásmidos,predichosen basea Ja homologíacon la secuenciade pLSI, se indican (/). En la tabla inferior se muestran,para cada plásmido,las secuenciastanto del propuestositio de cortepor la proteínaRep como de los iteronesdonde se uniríala proteína,localizadosa 3’ del sitio de corle. Tambiénseindica cl númerode vecesque serepite cada iterón, y la distanciaentreel sitio de corle por Rep y eí inicio de las repeticiones(espaciado). varios plásmidosde bacteriasgram-positivas,encontramosque en tres de ellos: pE194 de S.aureus (Iordanescu, 1976), pADB2OI de M.mycoides(Bergemanny cols, 1989)y pLB4 de Lactobaci//usp/antarum (Batesy Gilbert, 1989), existe una región áltamente homóloga a la horquilla 1 de pLSl, seguida a cortadistanciapor una secuenciano conservadade longitud variable (iterón), queserepite 2 o 3 vecesde forma directa (Hg. 95). Ya que ¡a posicióndel DNA de pLS1 dondese producela rotura por RepBse encuentraen la región conservada,podemos predecir el sitio donde las putativas proteínas Rep de los otros plásmidos producirán el corte de cadenasencilla con el que se iniciaría la replicación(Fig. 95). Ladistanciaentreel sitio de roturay el primer nucleótidodel iterón másproximal esbastantereducidaparapLB4 (13 pb) y pE194(14 pb), y algomayorpara pADB2OI (54 pb), aunque sin alcanzar el valor del espaciado en pLSI (85 pb). El iterón de mayor longitud (21 pb) se encuentra,paradójicamente,en el plásmidomáspequeño 240 241 (pADB2O1, de 1717 pb) y se repite, además,tres veces.Estos iteronesde pADB2O1 correspondena las tres repeticionesdirectasdetectadaspor Bergemanny cols (1989). Otro hechocurioso es quepE194y pLB4 tienenel mismo iterónbásico(5’-GTCCAIT- 3’) quese repite dos veces, aunque en el plásmidode Laureus existeuna tercera(más distal) repeticiónimperfectacon la secuencia:5’-GTCCAAA-3’. Por analogíacon pLSl, podemospredecirque los iteronesde todos estos plásmidosson los sitios de unión específica de las correspondientes proteínas Rep. Esto explicaría resultados preliminares obtenidosen nuestrolaboratoriosegúnlos cualesla proteínaRepBde pLSl esincapaz de relajar in vitro el DNA superenrolladode pE194. Había algo, sin embargo,que no dejabadesersorprendente:la regióndel DNA de pE194quecontienetanto los iterones como la secuenciaconservadaen la que, supuestamente,RepF produciríala incisión (coordenadas840 a 926) seencuentrafuerade la zonaen la queVillafane y cols (1987) pLSl (RepB> MAXE YFTFLLYPES1Y~SDWELKLETLG pADB2O1 (ORE A> MSTDIK DWTLLVYPDSAflEDWKEILDQDG pElS4 (RepE> MSENVIKETENKKNSR TFVLYPESAEIAEWLEYLKELH pLB4 (RepB> MKSESKTDWTVPRPNKNPKTKQPYKR GIVVYPESL?IERW--KDIIRO * ______ pLS1 (RepB) VP ISPLHDKL4KSSIKGQKYff~kÁÉ&4ÑIN’1IAKNPVTADSVRKKIKLLLG pADB2O1 VE -EGALHDK DP--DGTIfKKPHYHIVJ4AYSGPTTEDDVKTLCDTLDS pElS4 (RepE) IQ SPLHDR DT-EGRM--iKKEHYHILtYEGNKSYE----QIKIITE pLB4 (RepB> EPI VSPLHDI< NP-DGEK-~jjyjjLVYKGNKSEEQIDEIARSLRA pLS1 (RepB) EKSLAMVQVVLNVENMY 4ILtI~ESKDAIAKKKHV~KADIKLINNF~YDR pADB2O1 (ORF A> PKPLPL----DGVGGMWPjYMTH~-KDD-—PEKYQrLr~DsIIFTGDcF1DIP D pE194 (RepF> ELNATIPQIAGSVKGLVRfrMLHI— -MDDPNKFK--rÚ4KEDMIVYGG~~E pLB4 (RepB) PAP----QRISSLTGA —---MDNPEKYQ~flNADIETFGGIfl4E5 pLS1 (RepE> YVTLDVEEKTELBNVVVSLIRAYTLQNIFDLYDFIDENGETYGLTINLVN pADB2O1 (ORF A) YKELTKKETSDIKLGLIDIIKOKQITEYSTFIDVVSDLGDIDVFDVASKO pElS4 (RepE) LLKKTTTDRYKLIKEMIEFIDEQGIVEFKSLMDYAMKFKEIJDwFPLLCDN pLE4 (RepE) CLALSTCDKRQALRDMI.AAFISENEIMHLKOFAIJYCMSEEAPAGW-EELLT pLS 1 (RepB> EVIAGKTGFMKLLFDGAYQRSKRGTRNEER pAflB2Ol (ORF A> TIFFTSYIDSFRFKLREEMEQEKYTI< pE194 (RepE> SAYVIQEYIKSNRYKSDR pLB4 (RepE> E---RNTLFIKEYIKSNWQKQQYASKNINKESD Figura 96. Comparación de la secuenciade aminoácidosde RepE de pLSl con la de las proteínas Rep de otros plásmidosde su familia. El alineamiento serealizó permitiendo huecos(-) para mejorar la homología con RepB. Sólo se han recuadrado los bloquesde máxima homologíacomunes a las cuatro proteínas. Sobre la secuenciade RepB se indica, mediante un t la Met con la que se iniciaría la putativa RepB’. 242 habíanlocalizadoel origen de replicaciónde esteplásmido(coordenadas1389a 1588). Enun trabajoposterior,Dempseyy Dubnau(1989)redefinieronel origen depE194entre las posiciones864 y 1129, lo queya encajabiencon nuestraspredicciones. Paralelamentea lo que ocurre con el oñ(+), existe también homología significativa entre la proteína iniciadora de la replicación (RepB> de pLS1 y las correspondientesRepde losplásmidospE194 (RepF;Minton y cols, 1988),pLB4 (RepB; Batesy Gilbert, 1989)y pADB2O1 (ORFA; Bergemanny cols, 1989). La comparación simultánea deestascuatroproteínas(Fig. 96) ponedemanifiesto la existenciadebloques de aminoácidosconservados,queseencuentranen la mitad N-terminal de las diferentes Rep. Ya quetodasestasproteínasdebentenertas mismasactividadesenzimáticas,las regionesconservadaspodríanestarformandopartedel dominio activo. Esto explicaría la falta de funcionalidadde la putativa proteínaRepBr (codificada por el plásmido pLSIAAI5), la cual careceríadel primerbloque de aminoácidoscomunes(Fig. 96). Así, la viabilidad de pLS1~Al5 dependede la presencia de otro plásmido capaz de proporcionarRepB funcional en trans. Cuandose analizanlos seis “dotplot” resultantes de la comparaciónentre sí de estas cuatro proteínasRep, se observa de nuevo la homologíaen la región N-terminal (Fig. 97). Sin embargo,sólo el “dotplot” entreRepE depE194y RepBdepLB4muestraunahomologíaqueseextiendeal extremoC-terminal de ambas proteínas (Fig. 97). Esto, junto con la observaciónde que los orígenes reconocidosespecíficamenteporestasdosproteínassonlos únicosquepresentanidénticos iterones (Fig. 95), sugiere que la región C-terminal de las proteínas Rep sería la involucradaen el reconocimientoy la unión específicaal ori(+). De modosimilar, para lasRepde la familia de pTI8l se ha mostrado que el dominio C-terminal de la~ proteínas está implicado en el reconocimiento y la unión específica,mientras que la región conservadacentralcontieneel sitio activo (Novick, 1989). Basándonos en las homologías tanto a nivel de ori(+) como de proteína iniciadora de la replicación, podemos establecer una tercera familia de plásmidos de bacteriasgram-positivas,con pLSI como prototipo,que se sumaríaa las dos familias previamenteestablecidasentrelos plásmidosde S.aureus con maquinariareplicativabien conocida(Novick, 1989).Las característicasprincipalesde estostres gruposse pueden resumircomo sigue: a) Familia de pTl8l. Las proteínasRepcorrespondientesexhibengran homología. Las secuenciasde DNA alrededorde los respectivossitios de corte por Rep muestran un alto gradode similitud al sitio correspondienteen el DNA del fago M13. ano KL P E E E ID ES Pl ES en — E E E» a o u ____A- FI o E 2100 U 1150 FI 100 II - II~0 15Ñ —A--’ _ PEPES lee E 00 E FI Li LII o 1 FI E E E ES P E ES H 100 sen Figura 97. Comparaciónde las proteínasRep de los plásmidosde la familia de pLST (programa DOTPLOT). En cada una de las seis representacionesse indican, en los bordes superior e izquierdo, las proteínascomparadas.Proteínas:RepB de pLS1, OREA de pADB2G1,RepEde pEl94, y RepE de pLB4. Los puntosindican las homologíasentrelos residuosen la posiciónseñaladapor los números. 243 L PB 100 PEPE íes P FR Li ES Lino o 1 [2 E P E pI00 E qaen E 244 i» Familia de pC194. Sus respectivasproteínasRep están también claramente relacionadasentresí- Las secuenciasde DNA alrededorde los sitios de corte exhiben una homologíasustancialcon la secuenciaequivalenteen ~Xl74. e) Familia depLSI. Incluye, hastael momento,los plásmidospLSI, pEl94,pADB2OI y pLB4. Entre las proteínasRepde estegrupo existe homologíaa nivel de la región N- terminal. La comparaciónde estasRep con las de las otras dos familias no revela la existenciade homologíassignificativas. Los ori(-4-) de los miembros de esta familia presentanuna secuenciaconservada(donde se incluye el sitio de cortepor la proteína Rep), y unaregión no homóloga,constituidapor iterones,parala unión específicade la Rep correspondiente. A nivel de la secuenciade DNA en el origen, tampoco hemos encontrado homología entre los miembros de esta familia y los de las otras dos. Otra característica de los miembros de esta familia es que el ori( +) se encuentraa 5’ del sitio de iniciación del mRNA rep. Una importantecuestiónreferenteal modode acciónde RepBsobreel ori( +) de pLS1,essi la actividadendonucleásicainicial de la proteínarequiereo no la formación de la estructura cruciforme correspondiente a la horquilla 1 (Fig. 28). Aunque falta aún demostrarexperimentalmentela capacidado incapacidadde RepBparaactuarsobreun DNA bicatenario relajado o lineal, los datos de que disponemos apuntan a la necesidad deun sustratosuperenrollado.Así, cuandoel DNA usadocomo moldeen los ensa’vosde replicacióniii viú-o contenía una alta proporciónde formasOC, seobservóunaimportante disminución en la eficiencia de síntesis de nuevo DNA. Además, en un DNA que replica medianteun mecanismode círculo rodante, la inhibición de este proceso por Nov implicaría que el molde correcto es una forma superenrollada.Tal ha sido establecido para la etapa RF -~ RF de la replicación del DNA de ~Xl74(Kornberg, 1980). y constituye también nuestra interpretación del efecto de la adición de Nov sobre la replicacióniii vitro del DNA de los plásmidos basados en el replicón pLSI (Tabla 5 y Ñg. 17).Ya quela superhelicidadnegativadel DNA permiteestabilizarestructurassecundarías formadasen regionesconrepeticionesinversas(Lilley, 1980),el requerimientoreplicativo de un molde superenrolladoconferiría un significado biológico a la formación de la horquilla1 del ori(±) de pLSI, dentro de la cual seencuentrael sitio de cortepor RepB. Hay quetenerencuenta,además,quela estructuracorrespondienteala horquilla¡puede formarse,realmente,en el DNA superenrolladode pLSI, tal y comohemoscomprobado por mapeode sitios sensiblesa Si (Figs. 24, 25 y 35). Por otra parte,dado el tamafio y contenidoen G-C de la repeticióninversaresponsablede la formación de la horquilla 1 (conservada,además,en todos losmiembrosde la familia depLSI), pareceimprobable que estasecuenciaocurrapor puro azar,y su existenciarespondería,másbien, a una 246 horquilla 1 es la importancia de las rzgiones de DNA vecinas, ya que éstaspueden interferir con la formación de estructurassecundarias.la existenciade secuenciasque inhibenen cis la funcionalidaddel erigende replicacióítse hacomprobadoparapTl8l: el ori( +) de esteplásmido,donadaun pE194, no pudo ser activado por RepCen trans amenosqueseelirninarael promotordelctRNAde pTl8l o el elementopatA de pE194 (Novick, 1989).En nuestrocaso,no hemosconseguidoqueel suministrodeRepBen trans active el ori(±) de pLS1 donadoen el sitio HindIII de pC194.Sin embargo,parapE194 (que presenta una organización funcional y un ori(+) muy similares a los de pLSI) se ha podido localizar iii vivo el origen de replicaciónensayandola capacidadde distintos fragmentosde su DNA, donadosen un derivadode pUC18,paraproducir replicación dependiente de la proteína RepF suministrada en trans (Sozhamannany cols, 1990).Esto nos hace pensar que la razón de nuestro fracaso en la complementación en trans del or¡(+> de pLSI sea una desafortunada elección del vector y/o sitio de clonaje, y que puede haber secuencias inhibidoras en cis que deberían ser eliminadas para conseguir la activacióndel origen. La formaciónde estructurassecundariasdependientede la superbelicidaddel DNA ha sido consideradaimportante,también,en otros sistemascuya replicacióntiene lugar medianteun mecanismotipo círculo rodante. Así, la proteína gpII del fago fI, aunqueseune a su DNA independientemente de la superhelicidad, sólo realiza el corte específicosobreDNA superenrollado(Horiuchi, 1986).ParapTl8l las conclusionesson menosclaras,ya que los autoreshan ido modificandoa lo largo del tiempo su opinión acerca de la importancia de las estructuras secundarias y del superenrollamientodel DNA en el proceso replicativo.En estaevolución, los autorescomienzanconsiderandoque el origen de replicaciónde pTlSl carecede elementosquepuedandar lugar a estructuras secundarias (Khan y cols, 1982). Congruentemente, a partir de los resultados obtenidos en ensayos de replicación in vitro, interpretanque las formasplasmídicasrelajadaspueden actuarcomo molde (Khany cols, 1981), y que la Nov no inhibe la síntesisdel DNA de pTl8] (Khan y cols, 1982).Una posteriorrevisiónde Ja secuenciade DNA en el origen, les reveló la existenciade una repetición inversa que podría formar una estructura secundariaen el DNA superenrollado(Koepsely cols, 1986). Sin embargo,Koepsely Khan (1987) mostraronque, iii nfra, RepCpuedeintroducir el corte específico en un DNA lineal de doble cadena,sobreel queno se formaríanestructurassecundarias.Muy recientemente,Noirot y cols (1990) han detectadoin nitro (en experimentosde mapeo con Sí similaresa los mostradosen estaTesis),la existenciade unaestructuracruciforme en el origen de replicación de pTl8l. La formación de esta estructurasecundaria (correspondientea la repetición inversadel origen) dependede la superbelicidaddel 245 función precisa.A nuestroentender,estafunción con> P en 1C C u C.C C.C A.0> e.’ etC, AISlO) CC CC ~ &AIjAAAA»> Mux.aMnetAA&AA TAJA>A’TCC¿T!TTT AAICnAMAtG III TT!ATCTIMACTCAMAAAACA4A 93, Iii~CéS&TACAtT’Al~ ~ A¿ACYIACAACACAACA»flCASAIA!TAATAC&A~CAJJ4&AJAA~ATTATT~ ~rCC’&lrCl MTAAAÁ>fl—AT CCAAA3OAO~AA AECCTCCAUT IAAáC0>~AAAAA~0>IAL&CACCACICCCATGCTaC,A,C1A,CACTAAAI ‘‘ICTTAAC o— ICTAfl ACCACÉCITATTAIA TCA>OÉCCuA..MTCIA.A Tt~±s0>AAcT CA AA> ~ICCCAT TAATAIACIACACCC ‘TTIACAtTAn TIC>!; CA >0>! g!9A(,IthA> C.C AAflAAktÑ AAAosA4AAAAjAAt~xAcAuAAuCC 5’ pral. CAO,TflA’AMAT GTTCAnTnA*aU, CIATAL TA,M>~, »‘ &A&A ‘lo. a— TATA~TAAA&AésAAs~I ,T’ITCal=T,M.AcT’L&~CnTTAC>!l OICIATACC >11IC~t1A.ATCCM.ALCTOCAAC&AO OCCCCMAAATATCACAICAC lASA ?CICCATTGCI!&ATSTIIICCTIAATCACCTThCACAJ>CTGAAACIAflIATAC Pon A~ ~&AIAA~AAce~UTn5ACOcÉCAA!flA.~Aty5T0¶oMC,Mt5ATAA ,TA,TITT 53M*AcC,AI~C415MATT!TCAAACACeCAT ‘MíAn IdAS a— CA Al GASASCT CAS ICl ASAS! CC CTA luCí í!ICSC!IACA!T nACe nl> CC A CA C A 4 u.u CC CC Co CC CC 3 • LO&WASC CMAaAULt*ACA 5 Pr—OC. TlASTCll!t=lA~S,I-UflAAICTnCTlATATASTGnlAATAsAAA,~~ATASa, nl —~A— 1W’ Ci AS ISíACA TAAST~AtIIACeflCAAAfl ?CAS’SSCAACSCS&ATIAAMC&&CCA A«AASTAACTlAaIATwtIA,AAKlustTSloTl~l!ATCTlC7TC,t&&&AaTC¶C 0*~~~ A—AA T Cu,AACAJACCkAACCASA.&&A&AC&ACC TAZ U! CIAAIA.ACC 7 >7 CT 1.0>5 TITIITTTCITCC.AAATCMCACAT!AUCC&ACAAA&CATIT .Ae~. 0W! A> CC%A.l.7X7lI>%> C>C’lsl .5>05 ACCSCS> I$5t> >C7 lASO> CTTIAT LAAAMTACCCASIAIASIATCCICI Al TACAL’ lAS fluíA? It TTTITCT utICA un C A A,> C.C ~AC fl&»Sfld Figura 99. Comparación entre la región decontrol dereplicación de pLS1 y lasregionesanálogasen otros plásmidos de su familia. En todos los plásmidos de esta familia se pueden encontrar elementossimilares a los descritospara pLSI y que, segúnproponemos, serían estructural y frucionalmente equivalentesa los de esteplásmido: un promotor análogo a FAB’ implicado en la síntesistanto de una pequeñaproteína represora (similar a RepA) como de la proteína Rep del plásmido (equivalente a RepB); un promotor con la misma localización que P11, a partir del cual se sintetizaría un pequeño ctRNA (tipo RNA U). Estos ctRNAs finalizarían en una estructura tallo-lazo con las características de los terminadores rho-independientes.La secuenciade DNA que daría lugar a esta estructura esuna repetición inversa (lineas a trazos) localizada, en todoslosplásmidos,en las inmediacionesdelextremo3’ del gen tipo repA.La secuenciayestructura secundaria predicha para cada uno de los ctRNAs de esta familia se presenta debajo. Sobre la secuenciade DNA se indican también (en negritas): lasputativascajas-35 y -10 delos promotores tipo RAE’ loscodonesde iniciación y terminación de los genesanálogosa repA, el codón donde se inicia la síntesisde las respectivasproteínas Rep, y la putativa caja -10 del promotor que dirige la síntesisdel ctRNA. Para pLS1 y pE194 se señalan también las cajas -35 de estepromotor. Subrayadas, se muestran las secuenciascorrespondientesal SO. de los genestipo repA,y a la repetición directa que afecta a doszonasdistintas de la región de control de cada uno de estosplásmidos.Las coordenadasque se muestran son las referidas por losautores mencionadosen el pie de la Figura 95. 251 252 consenso(5’-TATAAT-3’) y una caja-35 bastanteinfrecuente(tantoqueno nos hemos atrevidoa señalaruna determinadasecuencia,exceptopara pE194, que fue propuesta por Villafane y cols (1987); Fig. 99). Además,el codónde iniciación de los respectivos genesrep seencuentra,invariablemente,entre las cajas-10 y -35 de los promotorespara los ctRNAs. En cuantoal tamañode los ctRNAs, en todos ellos se puedeformar una estructuratallo-lazo quepresentauna serie de Us en su extremo3’ (Fig. 99). Si, como ocurre para el RNA II de pLSl (Figs. 78 y 79), estasestructurasfuncionan como terminadoresde la transcripciónindependientesde rho, los ctRNAsresultantestendrían entre40 y 70 nts de longitud. Visto sobrela secuenciade DNA de estaregión de control, la terminaciónde los ctRNAstendríalugarenlas inmediacionesde] codónde terminación del gen análogoa repA de pLSl (se verá másadelante).Pararepresentarla posible secuenciade los cuatro ctRNAs, hemosconsideradola caja -10 predichapara cada promotor,y la región quehemosasignadoen cadacasoparala terminación.Al igual que en el RNA II de pLSl, la estructura de los uRNAs de los otros tres miembros de la familia sería muy poco compleja y presentaría un único elemento tallo-lazo, correspondienteal terminador(Fig. 99). Por otra parte,una inspeccióndel DNA en la región de control de cada uno de estos plásmidos, revela la existencia de una secuencia de 9 u 11 pb (distinta en cada caso), que se repite de forma directa en dos zonas próximas.Al igual queocurreen pLSl, unade las repeticionesse encuentraen la región que determinaríael ctRNA, y la otra al principio de la secuenciacodificantedel genrep correspondiente (Fig. 99). La fuerte analogíaentreel RNA II de pLS1 y los putativosctRNAs de pE194, pADB2O1 y pLB4, nos sugiereque estostranscritosrealmenteexisteny son funcionales en todos los miembros de esta familia. ¿Cómo se explica, entonces, que Byeon y Weisblum (1990) no hayandetectadoel ctRNA de pE194en unaserie de experimentosdiseñados paraponerde manifiestoun transcritode estetipo?. Hay queseñalarqueestosautores buscaban,en realidad,un transcritode mayor tamaño(como el propuestopor Villafane y cols, 1987) que,comenzandoapartir delpromotorquetambiénproponemosnosotros para la síntesisdel ctRNA, terminaraen el ori(+) del plásmido.Por estarazón,en los ensayosdestinadosa determinarla orientacióny longitud de los transcritossintetizados in vivo apartirde pE194,desestimanlos resultadosrelativosa RNAS depequeñotamaño, entre los cualesse encontraríael ctRNA quenosotrosproponemos.En un segundotipo deexperimentosdestinadosamapearlos extremos5’ de los transcritossintetizadosiii vivo, estosautores,en su búsquedade un contratranscritomayor, no utilizan ningunasonda adecuadaquepresentela marca5’ terminal dentrode la región que codificael ctRNA queproponemos.Nosotrospostulamos,por lo tanto,que todoslos miembrosde la familia 255 vueltade hélice (Rhodesy Klug, 1980),esevidentequeRepA contactaconel esqueleto del DNA sobreunasolacarade la hélice,y estasinteraccionesseextiendenmásallá del elementosimétricode 13 pb (Fig. 100). De hecho,los contactosRepA-DNAsedistribuyen a lo largo de unaregión de 48 pb (Fig. 70). Estalongitud pareceexcesivasi se compara con los 25 ph que, segúnTullius y Dombroski (1986),cubre un dímerodel Represorde lambdaunido a un fragmentode DNA quecontieneel operadorO~l. La comparación resultaaúnmáschocantesi setiene encuentaladiferenciade tamañoentrelasproteínas RepA (45 aminoácidos)y Represorde lambda (236 aminoácidos).No obstante,una inspección de las figuras 3 y 4 del trabajo de Tullius y Dombroski (1986) nos indica que puedenexistir, al menos,otrasdosregionesprotegidas(no consideradaspor los autores), que se encontraríanmás alejadasdel eje de simetría del Ql y que, por lo tanto, incrementaríanla longitud del DNA contactadopor el represorfágico. Seacomofuere, Tullius y Dombroski (1986) consideranque la extensiónde los contactosRepresorde lambda-DNAdefinida porellos (25ph) es,todavía,excesivaparaadaptarsea un modelo que usaB-DNA recto y un dímero del Represorcon la estructuraencontradaen los cristalesde la proteína.Segúnlos mismosautores,el doblamientodel DNA (que ya se habíasugeridopara los complejos Cro de lambda-DNA y Represorde 434-DNA), o un cambio en los contactosproteína-proteínaen el dímerodel Represorde lambda,podrían permitir la interacción entre la proteína y el DNA en sitios alejados del eje de simetría de] operador.En el DNA de pLSl existeunacurvaturadependientede secuenciaenuna región que incluye la diana de RepA (Pérez-Martíny cols, 1988). Además,la unión de la proteínaproduceen el DNA un fuertedoblamientocentradoen estaregión (Pérez- Martín y cols, 1989). Estedoblamientoinducidopodríaincrementarla longitud del DNA protegido por RepA y ser, así, responsablede la atenuaciónde la rotura por radical hidroxilo en las regionesmásexternas(Figs. 68 a 71), tal y como acabamosde ver que sehapropuestoparael complejoRepresorde lambda-DNA(Tullius y Dombroski,1986). De este modo, las regionesprotegidasmás externasse deberíanal sombreado’del esqueletode DNA por la proteínaunida, másque a un contactofísico directo RepA- DNA. De ser así, la región cubiertarealmentepor RepAseextenderíacomomáximo 28 pb (regiónentrelas áreasde contactoe y c’ de unay otra cadena;Fig. 70). Estesupuesto explicaría,además,que la atenuaciónde la rotura del esqueletode DNA seamenoren la regionesd/d’ y e/e’ queen el resto (Figs. 68 a 70). Sin embargo,en la actualidadno podemosdiscriminar si las regionesprotegidasmásexternasson debidasa sombreado’ o aunién adicionalde RepA de unaforma altamentecooperativaa partir del complejo inicial. En estepuntocabríaplantearsesi la unión de RepA dependesólo del elemento simétrico de 13 pb (en cuyo caso éstesería por sí mismo el operador),o si, por e] contrario, las secuenciasadyacentesjuegan también un importante papel en el 256 580 d b a e e - m rm m GGAAAAATAcGAAAAAGA1-:TGCAT -rGAGTGCA:CGGTT ArGOT ACTATAGTTTTAT CCTTTTTATGCTTTTTCTA1ACGTAACTCACGT’GCCAATACGATGATATCAAAATA Li W o W Li Li e e’ L a’ 5’ TGCA en copil ACGT Figura 101.Posición de la mutación copil relativa a los contactosRepA-operador silvestre. Se presenta la secuenciade nucleátidos de ambascadenasentre las coordenadas580y 634 del DNA de pLSl. Las regiones protegidaspor RepA frente a la accióndel radical hidroxilo semuestran en corchetes(a-ey a’-e’). El elemento simétrico dc 13 ph se muestrarecuadrado,con las basespalindrómicassubrayadasy el centrode simetría señaladopor un punto. La mutacióncopil conlíevala inserciónde 4 pb adyacenteal extremo derechodel elementosimétrico. reconocimiento de la proteínapor su DNA diana.Aunqueel clonaje(ya en marcha)del elementosimétrico separadode las regionesvecinasdel DNA de pLSI nos dará una respuestamásclaraacercade la secuenciaespecíficaparala unióndeRepA,disponemos de algunas indicaciones experimentales que pueden arrojar alguna luzsobreestacuestion. Así, RepAescapazde inhibir ¡u vitro de forma específicala actividad del promotor ~ del plásmidomutantepLS5cop]i,el cualtieneintactoel elementosimétricoperopresenta unainserciónde 4 pb justo a continuación(Figs. 66 y 101). Estosresultadosdemuestran que RepA puede reconocersu sitio de unión aunquela secuenciade las regionesde contactob’,c, d’ y e se hayanalejadodel elementode simetría(Fig. 101). Por otraparte, RepA se une a un DNA quepresentael elementosimétrico de 13 pb y las regionesde contactocorrientearriba de éste(b, e’, d y e’), pero cuyasecuenciacorrienteabajodel elemento ha sido completamentealterada (Pérez-Martiny Espinosa, 1991). Estos resultados,junto con la posicióncentraldel elementosimétricode 13 ph en la regióntotal protegida por RepA (Figs. 68 a 71), nos hacen pensar que dicho elemento es realmente el operadorde RepA. Tal y comoocurreconel restode los elementosrelacionadosconla replicación apartir delori( +), unainspeccióndel DNA de los plásmidosde la familia depLSl revela queen todos ellos existeuna pequeñao~ localizadadelantedel inicio de la secuencia codificantedel correspondientegen rep. Las putativasproteínasespecificadaspor estas orfs tienenun tamañoligeramentesuperioral deRepA(52aminoácidosparalas proteínas de pLB4 y pADB2OI, y 55 aminoácidospara la de pE194). La comparaciónde las proteínastipo RepA de esta familia de plásmidosrevelaun cierto gradode homología, 257 hélice 1. hélice 2 5 9 pLS 1 CRep>.) MKKRLTITLSESVLENLE1QdARE14SLSKSAMISVALENYKKGQEX pE 194 (Cap) MVVDRXEEKKVAVTLRLTTEENEILNRIKEKYNISKSDATGILIKKYAXEEYGAF pAflE 201 CORi’ E) MDKLVTLRIDEQQHEKLKEQANKLGMT 1SGYVRYLVLKSSEMKTK.ESKKKKL pLE4 (RepA) MVEVEIQO. Pl plasmid replication: multiple functionsof RepA proteinat te origin. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82: 2588-2592. Chou,P.Y.andFasman,G.D.(1978).Predictionof thesecondarystructureof proteinsfrom teir amino acid sequence. Adv.Enzimol. 47: 45-147. Clewell,D.B., Evenchik,B. and Cranston,J.W. (1972). Direct inhibition of CoIEl plasmid DNA replication in Eschericlzia ccli 1w rifampicin. Nature 237: 29-31. Colasanti,J.andDenhart,D.T.(1987>.Mechanismof replicationof bacteriophageqSXi?4. XXII. Site-specific mutagenesis of the A’ generevealsthat A protein is not essentialfor $X174 DNA replication. J.Mol.Biol. 197: 17-54. 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Washington. REPLICACIÓN DEL PLÁSMIDO DE AMPLIO ESPECTRO DE HUÉSPED pLS1 AGRADECIMIENTOS ÍNDICE ABREVIATURAS INTRODUCCIÓN - Modelos de replicación - Control de la replicación - El plásmido pMV158 - Objetivo de la Tesis MATERIALES 1. ESTIRPES BACTERIANAS Y PLÁSMIDOS 2. MEDIOS DE CULTIVO 3. TAMPONES Y SOLUCIONES 4. ENZIMAS Y OTRAS PROTEÍNAS 5. MATERIAL FOTOGRÁFICO Y DE AUTORRADIOGRAFÍA 6. OTROS PRODUCTOS MÉTODOS 1. CONSERVACIÓN DE LAS ESTIRPES 2. CONDICIONES DE CULTIVO 3. PUESTA EN COMPETENCIA Y TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS BACTERIANAS 4. DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS PLASMÍDICO 5. TESTS DE ESTABILIDAD 6. TESTS DE INCOMPATIBILIDAD 7. PREPARACIONES DE DNA 8. FENOLIZACIÓN, PRECIPITACIÓN Y DIÁLISIS DEL DNA 9. MANIPULACIÓN ENZIMÁTICA DEL DNA 10. ELECTROFÓRESIS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS 11. EXTRACCIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA A PARTIR DE GELES 12. MARCAJE RADIACTIVO DE DNA 13. DENSITOMETRÍA 14. SECUENCIACIÓN DE DNA POR EL MÉTODO DE DEGRADACIÓN QUÍMICA 15. DETECCIÓN DE FORMAS PLASMÍDICAS MONOCATENARIAS 16. REPLICACIÓN IN VITRO DE DNA DE PLÁSMIDOS 17. FLUOROGRAFÍA 18. DETERMINACIÓN DE LOS PUNTOS DE INICIACIÓN DE mRNAs MEDIANTE MAYEO CON NUCLEASA 51. 19. SÍNTESIS DE PROTEÍNAS PLASMÍDICAS EN MINICÉLULAS DE B.SUBTILIS 20. HIPEREXPRESIÓN DE GENES BAJO EL CONTROL DEL PROMOTOR #10 DEL FAGO 17 21. CROMATOGRAFÍA DE PROTEÍNAS 22. DETERMINACIÓN DE LA CONFIGURACION NATIVA DE PROTEÍNAS 23. ELECTROFÓRESIS DE PROTEÍNAS 24. VALORACIÓN DE PROTEÍNAS 25. DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE RepA 26. DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA N-TERMINAL DE RepB 27. ANÁLISIS DE CONTACTOS DNA-PROTEÍNA 28. ENSAYOS DE TRANSCRIPCIÓN IN VITRO 29. ENSAYOS DE ACTIVIDAD B-GALACTOSIDASA 30. ANÁLISIS ASISTIDO CON ORDENADOR RESULTADOS 1. ESPECTRO DE HUESPED Y ESTABILiDAD DEL PLASMIDO pMVI58 Y SUS DERIVADOS 2. REPLICACIÓN EN EXTRACTOS LIBRES DE CÉLULAS 3. ORIGEN Y DIRECCIÓN DE REPLICACIÓN DE LA CADENA LíDER 4. EL ORIGEN DE LA CADENA RETRASADA 5. CARACTERIZACIÓN DE LA FUNCION INICIADORA DE LA REPLICACIÓN 6. REGULACIÓN TRANSCRIPCiONAL DE repB: LA PROTEíNA RepA 7. CONTROL PRIMARIO DE LA REPLICACIÓN: EL PAPEL DEL RNA II. DISCUSIÓN RESUMEN Y CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA 1: