UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA HOSPITAL UNIVERSITARIO “DOCE DE OCTUBRE” DEPARTAMENTO DE ANATOMíA PATOLOGICA SECCION DE NEUROPATOLOGíA Efectos del ácido vaiproico sobre el metabolismo de la carnitina: Estudio bioquímico y morfológico en la rata Tesis Doctoral Santiago Madero García Director: Prof. J. R. Ricoy Campo Madrid, Septiembre 1992 D. JULIAN SANZ ESPONERA. CATEDRATICO DE ANATOMIA PATOLOGICA Y DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE ANATOMíA PATOLOGICA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID, INFORMA Que el trabajo EFECTOS DEL ACIDO VALPROICO SOBRE EL METABOLISMO DE LA CARNITINA. ESTUDIO BIOQUIMICO Y MORFOLOGICO EN LA RATA ha sido realizado por D. Santiago Madero García bajo la dirección del Prof. D. José Ramón Ricov Campo. Se trata de un trabajo cuyo planteamiento, desarrollo y exposición de resultados y conclusiones tienen características adecuadas, por lo Que me es grato emitir este informe favorable como Director del Departamento para Que sea defendido para optar al grado de Doctor. Lo aue firmo en Madrid a 24 de Septiembre de 1992 Prof. Julián Sanz Esponera D. JOSÉ RAMON RICOY CAMPO, PROFESOR TIULAR DE ANATOMíA PATOLOGICA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID CERTIFICA Que D. Santiago Madero García ha realizado en este Departamento, y bajo mi dirección, el trabajo titulado Efectos del ácido valproico sobre el metabolismo de la carnitina. Estudio bioquímico y morfológico en la rata, y que dicho trabajo reúne las condiciones necesarias para ser leido como Tesis Doctoral con objeto de optar al grado de Doctor. A petición del interesado, y para que conste donde proceda, firmo el presente certificado en Madrid a die2 y seis de Septiembre de 1992. Prof. José Ramón Ricoy Campo i INDICE Página Agradecimientos 1 Abreviaturas 3 Indice de figuras 5 INTRODUCCION 6 1. Carnitina 8 II. Acido vaiproico 10 HIPOTESIS Y OBJETIVOS 20 MATERIAL Y METODOS 1. Material 22 II. Métodos 23 TEA. Desarrollo de la fase experimental 23 II.B. Metodología del estudio bioquímico 25 11.0. Metodología del estudio anatomopatológico 26 11.0.1. Microscopia 6ptica 26 11.0.2. Microscopia electrónica ... 29 11.0.3. Morfometria 30 II.D. Metodología del estudio estadístico 32 ILE. Metodología del estudio bibliográfico y características de edición 35 u RESULTADOS 1. Desarrollo de la fase experimental 37 II. Peso corporal 37 III. Resultados del estudio bioquímico 38 III.A. Plasma 39 III.B. Hígado 46 111.0. Músculo sóleo 54 IV. Resultados del estudio óptico 60 IV.A. Músculo esquelético 60 IV.B. Hígado 66 IV.C. Corazón 67 V. Resultados del estudio ultraestructural . 67 V.A. Area mitocondrial 67 V.B. Grosor de la banda 2 70 DISCUSION 1. Desarrollo de la fase experimental 72 II. Peso corporal 73 III. Estudio bioquímico 75 IV. Estudio con microscopIa óptica 82 V. Estudio con microscopia electrónica 87 CONCLUSIONES 90 FIGURAS 92 RESUMEN 101 iii ANEXO 1. 1 Características del músculo esquelético en relación con el metabolismo lipidico II. Carnitina II.A. Características generales II.B. Metabolismo 11.0. Mecanismo de acción II.D. Síndromes por deficiencia de carnitina II.E. Utilización clínica y experimental vaiproico Características generales Mecanismo de acción Farmacocinética Utilización clínica y III. Acido III .A. III.B. 111.0. III.D. experimental 105 lío 110 111 119 127 136 153 153 154 158 169 III.E. Toxicidad y efectos secundarios -. ANEXO 2 1. Técnicas bioquinicas 183 II. Técnicas histoquimicas 186 ANEXO 3 Datos del peso corporal Datos bioquímicos Datos de morfometria óptica Datos de morfometria ultraestructural. 1. II. III. IV. 175 190 191 192 193 BIBLIOGRAFíA 196 1 AGRADECIMIENTOS En la realización de este trabajo ha participado, de uno u otro modo, un buen número de personas cuya contribución ha sido importante para la finalización del mismo. El Prof. Dr. U. José Ramón Ricoy Campo, director de esta Tesis, diseñó el estudio y me animó constantemente a llevarlo a cabo durante su larga fase de realización. El Prof. Dr. U. Julián Sanz Esponera informó favorablemente para que fuera leido como Tesis Doctoral. El Prof. Dr. U. Pedro García Barreno facilitó la utilización del animalario donde se llevó a cabo la tase experimental. El Prof. Dr. O. Francisco J. Martinez Tello, Jete del Opto. de Anatomía Patológica del Hospital Doce de Octubre, y los demás compañeros del Upto. aportaron sus ideas y su disponibilidad. La Dra. Oña. Ana Cabello Fernández, Jefe de la Sección de Neuropatología del Hospital Doce de Octubre, facilitó la utilización de todo el material necesario para el estudio de los aspectos óptico, ultraestructural y morfométrico de este trabajo. Aportó también ideas sobre aspectos metodológicos basadas en su dilatada experiencia en el estudio anatomopatológico del sistema nervioso periférico. 2 Dña. María Jesús Torres, Don Salvador Romero y Uña. María Teresa Martinez, ATS de la Sección de Neuropatología, realizaron toda la parte técnica del estudio anatomopatológico. El Dr. D. Juan Manuel Oñate Cuchet participó activamente en el desarrollo de la fase experimental. El Dr. U. Julio Ferrero Arias facilitó la utilización del programa estadístico SPSS y contribuyó de forma inestimable al análisis estadístico de los resultados. El Dr. D. Joaquín Arenas Barbero permitió la utilización del material necesario para el estudio de los aspectos bioquímicos de este trabajo. Su gran experiencia fué esencial para el análisis de los resultados bioquímicos. El Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social ayudó económicamente de forma apreciable. Finalmente, Maril, Gon, Acho y Popi aportaron tiempo, amistad y cariño, y su contribución para la realización de esta Tesis tué decisiva. A todos ellos, mi más sincero agradecimiento. 3 ABREVIATURAS AC AC/CL AMP ANOVA ATP ATPasa BHE CAT CD-ROM CK-MB CL CoA CPT CTA CTOT DE EEM ELD FFA CABA HDL HE IC 95% IV LCAC LCFA LCR MPTP NADH Acil carnitina Cociente acil carnitina/carnitina libre Adenosin monotosfato Análisis de la varianza Adenosin tritosfato Adenosintritosfatasa Barrera hematoencefálica Carnitina acetil transterasa Compact Disk—Read Only Memory Creatinquinasa MB Carnitina libre Coenzima A Carnitina palmitoil transferasa Carnitina acetil transterasa Carnitina total Desviación estándar Error estándar de la Músculo extensor largo Acidos grasos libres Acido T-aminobutirico Lipoproteina de alta densidad Hematoxilina y eosina Intervalo de confianza de la media del 95% Intravenosa Aci carnitina de cadena larga Acido graso de cadena larga Liquido cefalorraquideo Metil—tenil-tetrahidropiridina Nicotinamida adenina dinucleótido media de los dedos 4 Proteína no colágena PAZ PC SCAC SDC SDH SNC SPSS VPA Acido peryódico de Schitf Ordenador personal Acil carnitina de cadena Síndrome por deficiencia carnitina Succinico deshidrogenasa Sistema nervioso central Paquete estadístico para sociales Acido valproico corta en ciencias NCP VPS Valproato sódico 5 INDICE DE FIGURAS Página Figura 1.- Peso corporal al inicio y al final de la fase experimental Figura 2.- Figura 3.— Niveles medios de CL, en plasma Niveles medios de CL, en hígado SCAC y LCAC 94 SCAC y LCAC 95 Figura 4.— Niveles medios de CL, en músculo sóleo SCAC y LCAC 96 Figura 5.— Figura 6.— Figura 7.— Figura 8.— Diámetro medio de las fibras tipo 1 y tipo II en el músculo sóleo Diámetro medio de las fibras tipo 1 y tipo II en el músculo ELD Densidad de volumen mitocondrial en los músculos sóleo y ELD Grosor de la banda Z en los músculos sóleo y ELD 93 97 98 99 .100 Introducción 6 INTRODUCCION La carnitina es un cofactor esencial en el metabolismo de los ácidos grasos cuya acción a distintos niveles permite la entrada de ácidos grasos de cadena larga al interior de la mitocondria así como el mantenimiento de un cociente CoA/acil—CoA intramitocondrial adecuado (Bremer J, 1983), de manera que dos de los trastornos clínicos producidos por la deficiencia de carnitina de cualquier causa son la miopatia lipidica y la hepatotoxicidad en torna de crisis de insuficiencia hepática aguda de tipo Reye (Engel AG, 1986b; Coulter DL, 1991) El mecanismo patogénico más probable en la miopatia lipidica secundaria a deficiencia de carnitina es la acumulación de lípidos en el sarcoplasma debido a la imposibilidad que tienen los LCFA para atravesar la membrana mitocondrial e introducirse en la cascada de la B—oxidación de los ácidos grasos, mientras que en lo relativo a los cuadros agudos de hepatotoxicidad el mecanismo patogénico posible es la acumulación intramitocondrial de grupos acil—CoA de carácter tóxico para cadena respiratoria y otros procesos mitocondriales (Engel AG, 198Gb>. Por otra parte, la administración de carnitina exógena a los pacientes con deficiencia de carnitina es capaz de revertir estos efectos debido a que al reestablecer los depósitos intramitocondriales de carnitina puede seguir ejerciendo su acción de tamponamiento de los grupos acil— CoA y puede seguir introduciendo los LOFA hacia el interior de la mitocondria . En clínica se reconocen dos formas de síndrome por deficiencia en carnitina (SDC>, la forma miopática y la sistémica (Engel AG, 1986b). La forma miopática fué identificada por primera vez por Engel y Angelini en 1973, en una paciente que presentaba debilidad muscular, deficiencia de carnitina en músculo esquelético y miopatia lipidica (Engel AG et al, 1973), que constituyen precisamente las características principales del SDC miopático. Por otra parte, la deficiencia de carnitina constituye la causa más frecuente, aunque no la única, de miopatia lipídica (Brownell AKW et al, 1978), cuadro que se caracteriza a nivel anatomopatológico por la acumulación de lípido (principalmente triglicéridos) en el músculo esquelético Introducción 9 en forma de corpúsculos no revestidos de membrana situados en filas paralelas entre las miofibrillas o en la zona subsarcolemal, acompañado frecuentemente por alteraciones mitocondriales consistentes en incremento en el número o tamaño de las mitocondrias, presencia de inclusiones cristalinas o paracristalinas intramitocondriales y borramiento de las crestas (Engel AG, 1986b) El SDC sistémico fué identificado en primer lugar por Karpati y colaboradores en 1915 (Rarpati G et al, 1915). Esta forma de SUC cursa con episodios de insuficiencia hepática aguda de tipo Reye con estupor progresivo, coma, hipoglucemia e hiperamonieniia. Los pacientes presentan también debilidad muscular, hipocarnitinemia, deficiencia de carnitina en músculo y otros tejidos, y miopatia lipidica. A nivel morfológico, se observa la acumulación de lípido neutro en diversos tejidos, principalmente hígado, músculo esquelético y miocardio, así como un aumento de tamaño de las mitocondrias en asociación con el incremento del número y tamaño de los glóbulos lipidicos en varios tejidos como hígado y SNC (Kimura et al, 1990). La mayor parte de los SDC, tanto miopáticos como sistémicos, son secundarios a defectos genéticos del metabolismo intermedio o bién a otros procesos que pueden cursar con deficiencia nutricional de carnitina, disminución en su biosíntesis, alteraciones en el control renal de la carnitina o trastornos en el transporte activo de la carnitina en células y tejidos; no obstante, el mecanismo patogénico más frecuente en los SUC es la eliminación excesiva de ésteres de carnitina por la acumulación intramitocondrial de acil—CoA de diferente Introducción 10 origen, de manera que la formación excesiva de acilcarnitinas y su eliminación por orina provocarían la deficiencia de carnitina (Engel AG, 1986b). Con respecto al tratamiento de los SUC, la mayor parte de los pacientes ha respondido en mayor o menor medida a la administración de carnitina exógena (Karpati O et al, 1975; Chapoy PP et al, 1980; Prockop LD et al, 1983; DiDonato 5 et al, 1984), aunque en un cierto número de casos no se ha obtenido respuesta (Carroll JE et al, 1980) con este tratamiento. En términos generales, la dosis de mantenimiento ha oscilado entre 2 y 4 g/dia, por vía intramuscular. II. El ácido valproico y sus efectos sobre el. metabolismo de la carnitina El ácido 2—propilpentanoico (ácido valproico, VPA) es un ácido graso de cadena corta (isómero del ácido octanoico) que está comercializado en forma de sal sódica y que se utiliza en clínica fundamentalmente como fármaco antiepiléptico. Constituye uno de los agentes anticomiciales de primera linea para crisis generalizadas y parciales, y en 1988 se calculaba que lo estaban tomando más de 1.000.000 de pacientes en todo el mundo (Binek J et al, 1991); se administra por vía oral a dosis que oscilan entre 15 y 30 mg/kg para alcanzar niveles plasmáticos terapéuticos. Su metabolismo se realiza en el hígado mediante Introducción 11 glucuronidación, B—oxidación mitocondrial y ~-oxidación microsomal, principalmente a través de la primera vía para dosis terapéuticas (Chapman A et al, 1982). En lo relativo a la 13—oxidación, se dirige mediante difusión desde el citosol hasta la matriz mitocondrial, donde es activado por la acil—CoA sintetasa correspondiente para formar 2—propilpentanoil--CoA (valproil-CoA) que se introduce en la secuencia oxidativa (Ontko JA, 1986>. A nivel clínico, su principal efecto secundario es la hepatotoxicidad, que se manifiesta fundamentalmente en forma de elevaciones asintomáticas de las transaminasas y en forma de cuadros de insuficiencia hepática aguda de tipo Reye con estupor, coma e hiperamoniemia, cuya incidencia se ha estimado en aproximadamente 1 caso por cada 7.000 pacientes que reciben VPA (Powell—Jackson PR et al, 1984). Los cuadros de tipo Reye asociados al tratamiento con VPA fueron observados inicialmente en los años 1979 y 1980 (Sackellares JC et al, 1979; Geber N et al, 1979; Young RSK et al, 1980; Coulter DL et al, 1980). En 1981, Coulter y Alíen observaron que los pacientes tratados con VPA podían presentar hiperamoniemia incluso sin signos bioquímicos de disfunción hepática, atribuyendo esta alteración a un incremento en los niveles de propionato con inhibición secundaria de la enzima intramitocondrial del ciclo de la urea carbamil— fosfato sintetasa (Coulter DL et al, 1981). Introducción 12 No obstante, Coude y colaboradores, en un estudio experimental efectuado ese mismo año, administraron VPA a ratas y observaron hiperamoniemia con niveles normales de carbainil-fosfato sintetasa, ornitina transcarbamilasa y N—acetilglutamato sintetasa, proponiendo que la causa de la hiperamoniemia podía ser una reducción de N—acetil glutamato en el hígado con la consiguiente disminución de la citrulinogénesis (Coude FX et al, 1981). En 1982, Ohtani y colaboradores realizaron por primera vez la medición de los niveles de carnitina en plasma en relación con los niveles de amoniaco en pacientes tratados con VPA. Este grupo de investigación observó que las concentraciones plasmáticas de carnitina libre y total aparecían significativamente reducidas en pacientes tratados con VPA, en comparación con las observadas en pacientes epilépticos tratados con otras medicaciones anticomiciales y también en comparación con las concentraciones del grupo control, de manera que en estos dos últimos grupos las concentraciones de carnitina fueron practicamente similares. No obstante, el cociente carnitina libre/carnitina total no presentó diferencias en los tres grupos de estudio. Se observó también una correlación inversa significativa entre la concentración plasmática de carnitina y la dosis de VPA. Por otra parte, las concentraciones séricas de amoniaco en los pacientes tratados con VRA fueron significativamente mayores que en los pacientes de los otros dos grupos. Estas concentraciones se correlacionaron con la dosis de VPA y presentaron una relación inversa significativa con las concentraciones plasmáticas de carnitina. Introducción 13 Tras la administración oral de carnitina a los pacientes tratados con VPA se normalizaron los niveles sanguíneos de amoniaco y las concentraciones plasmáticas de carnitina. Los autores de este estudio atribuyeron la hipocarnitinemia a un efecto adverso dosis—dependiente del VPA, aunque señalaron que “... en el momento presente no existen datos para explicar la deficiencia de carnitina en los pacientes tratados con VPA.” (Ohtani Y et al, 1982). También en 1982 aparecen las primeras referencias que relacionan al VPA con la aparición de cuadros de tipo Reye y con la presencia de hipocarnitinemia (Bóhíes H et al, 1982>. Stumpf y colaboradores señalaron en 1983 que la toxicidad del VPA puede ser debida a la acumulación de metabolitos acil—CoA que inhiben el ciclo del citrato y otros sistemas enzimáticos. La carnitina podría disminuir este efecto al transformar los acil—CoA tóxicos en compuestos acil—carnitina de carácter menos tóxico, sugiriendo la formación de valproil-carnitina (Stumpf DA et al, 1983). Esta hipótesis se vió corroborada posteriormente por Veitch y colaboradores que incubaron mitocondrias de hígado de rata con VPA concluyendo que la inhibición que produce este ácido graso de cadena ramificada sobre la 13— oxidación nitocondrial puede ser debida al secuestro de CoA en forma de valproil-CoA (Veitch 1< et al, 1990). En 1983, Thurston y colaboradores señalaron que la administración crónica de valproato disminuye la cetogénesis en ayunas en los niños, proponiendo que la toxicidad hepática del VPA está en relación con la Introducción 14 hipocetonemia y no con los niveles de carnitina (Thurston JH et al, 1983). No obstante, DiDonato y colaboradores ya habían observado en 1980 la importancia de los niveles hepáticos de carnitina para la activación de la cetogénesis (DiDonato 5 et al, 1980). David L. Coulter propuso en 1984 que el mecanismo de la hepatotoxicidad del VPA es la deficiencia de carnitina en plasma e hígado a que da lugar, con la consiguiente alteración en el metabolismo de los SCFA—LCFA y su relación con los cuadros clinicos de tipo Peye , mientras que sólo disminuye de forma significativa los niveles de CL plasmáticos cuando se administra de forma más prolongada (Camifia MF et al, 1991b). Con respecto a las posibles alteraciones morfológicas inducidas en los tejidos por la administración de VPA, la información que existe en la literatura médica es muy escasa puesto que únicamente en dos de los modelos experimentales citados se ha estudiado desde el punto de vista anatomopatológico el higado de ratas Wistar tratadas con VPA , observándose en ambos un incremento en la superficie de las mitocondrias en este tejido (Sugimoto T et al, 1987a; Murakami K et al, 1990). No existe en el momento actual ningún estudio experimental en el que se hayan estudiado de forma sistemática las características morfológicas del músculo esquelético, hígado y corazón en pacientes o animales de Introducción 18 experimentación tratados con VPA. La modificación de los efectos que produce el VPA sobre el metabolismo de la carnitina por la administración de carnitina exógena a animales de experimentación sólo ha sido estudiada por el equipo de Tateo Sugimoto, que ha observado una reversión de los mismos (Nishida N et al, 1987; Sugimoto T et al, 1987b). Como resumen de lo expuesto se puede destacar que: 1. En la actualidad se acepta que el ácido valproico produce alteraciones en el metabolismo de la carnitina, con aparición de deficiencia de carnitina en plasma en la mayor parte de los pacientes y animales de experimentación que lo reciben; que este efecto puede tener un carácter dependiente de la dosis de VPA utilizada, y que la administración de carnitina exógena puede revertir los efectos del VPA sobre el metabolismo de la carnitina. 2. Son muy escasamente conocidos los efectos que puede producir el VPA sobre el metabolismo de la carnitina a nivel tisular, así como las posibles modificaciones que en los mismos podría dar lugar la administración de carnítina exógena. 3. Son muy escasos los estudios anatomopatológicos efectuados sobre las alteraciones que la deficiencia de carnitina secundaria a la administración de VPA puede producir sobre los tejidos de pacientes o animales de experimentación tratados con este fármaco antiepiléptico, así como las posibles modificaciones que Introducción 19 en las mismas podría dar lugar la administración de carnitina exógena. Por todo ello, hemos diseñado un modelo experimental sobre rata Wistar para conocer los efectos del VrA sobre el metabolismo de la carnitina y sus repercusiones sobre los niveles plasmáticos, hepáticos y musculares de CL y AC; para estudiar la posible traducción morfológica de estos efectos del VPA, y para comprobar las modificaciones que introduce en los mismos la administración de carnitina exógena. Hipótesis y Objetivos 20 NIPOTESIS Y OBJETIVOS La hipótesis planteada en este trabajo es la de que si el ácido vaiproico produce deficiencia de carnitina, y la deficiencia de carnitina produce acumulación de lípido en los tejidos, entonces la administración de carnitina exógena puede revertir el ambos efectos, directo e indirecto, del ácido vaiproico. El objetivo general del presente trabajo es el de comprobar en un modelo experimental las alteraciones que puede producir el ácido valproico sobre el metabolismo de la carnitina, la posible traducción morfológica de estas alteraciones, y la posible reversión de las mismas por la administración de carnitina exógena. Este objetivo general se plasma en los siguientes objetivos concretos: 1. Conocer el efecto producido por el ácido valproico sobre el peso y la evolución de los animales tratados con el mismo. 2. Conocer el efecto producido por el ácido valproico sobre los niveles plasmáticos, musculares y hepáticos de carnitina libre, acilcarnitina de cadenas larga y corta, y carnitina total, y sobre el cociente acilcarnitina/carnitina libre en los tres compartimentos. 3. Conocer el efecto producido por el VPA sobre las características generales, diámetro de las fibras y densidad de volumen mitocondrial en el músculo esquelético, así como la posible aparición de depósito lipidico en músculo esquelético, hígado y corazón. Hipótesis y Objetivos 21 4. Conocer si los efectos que puede producir el ácido valproico sobre el metabolismo de la carnitina tienen carácter dependiente de la dosis. 5. Conocer las modificaciones que la administración de carnitina exógena puede producir sobre los efectos que el ácido valproico puede inducir en el metabolismo de la carnitina. Material y Métodos 22 MAflRIAL Y METODOS 1. Material Se utilizaron 30 ratas Wistar hembra de una cepa procedente de Panlab SL (Madrid), criadas en el Departamento de Medicina Experimental del Hospital “Gregorio Marañón” de Madrid, libres de ecto y endoparásitos, micoplasmas y pasteurella, con un peso inicial comprendido entre 160 g y 180 q, y con una edad comprendida entre 49 dias y 52 dias. Durante el periodo de experimentación, los animales permanecieron en cubetas de Makrolon de 40 X 25 X 15 cm, sobre una base de serrín, en grupos de cinco, con alimentación y bebida ad libitum a base de pienso comercial para animales de laboratorio (LetikaR) y agua corriente no tratada. Las cubetas se mantuvieron en una habitación con temperatura y humedad relativa constantes de 22tC y 55+10% respectivamente, y con un fotoperiodo de 12 horas (7,30 AM a 7,30 PM). Las líneas de actuación que se han seguido en cuanto a habitáculos y accesorios de los animales, alimentación, manejo, vigilancia, control sanitario, saneamiento ambiental y comportamiento ético con los animales se han ajustado a las normas recomendadas por la ICLAS (International Council for Laboratory Animal Science) y por la Asamblea Parlamentaria del Consejo de Europa sobre “La utilización de los animales vivos con fines experimentales o industriales” celebrada en Septiembre de 1982 en Estrasburgo (Francia> (Saiz Moreno L et al, 1983) Material y Métodos 23 II. Métodos II.A. Desarrollo de la fase exnerimental La fase experimental se desarrolló durante 90 dias, desde el 17 de Febrero de 1991 hasta el 17 de Abril de 1991, periodo durante el cual los animales recibieron la medicación diariamente en una sola toma (a las 8 AM) y en intervalos de 6 dias, con un dia de descanso al final de cada uno de estos intervalos. Es decir, no recibieron la medicación los dias 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, y 84 del periodo de experimentación, por lo que en conjunto fueron tratadas farmacologicamente durante un total acumulado de 78 dias. La carnitina se administró mediante inyección intramuscular en la masa glútea de la extremidad posterior derecha. La solución administrada de esta forma se preparaba inmediatamente antes de la inyección disolviendo en 45 ml de agua destilada los 5 ml de una ampolla de carnicorR por via intramuscular. Grupo 5: Recibió 25 mg/dia de valproato sódico por via oral más 10 mg/dia de carnitina por via intramuscular. Grupo 6: Recibió 10 mg/dia de carnitina por via intramuscular. Se efectuó el pesaje de los animales al inicio de la fase experimental, a los cinco dias de iniciada la misma, y posteriormente cada siete dias (dias 17—2, 22—2, 29—2, 07—3, 14—3, 21—3, 28—3, 11—4, 18—4, 25—4 y 02—5 de 1991). El peso medio de las 30 ratas al inicio de la fase experimental fué de 171,7 g, lo que hace que en este momento la dosis de VPA de 15 mg/día correspondiera a 87,36 mg/kg/día y la de 25 mg/día a 145,6 mg/kg/día, mientras que al final de la fase experimental (con un Material y Métodos 25 peso medio de las 30 ratas de 266 g) estas correspondencias fueron de 56,4 mg/kg/día y 94,0 mg/kg/día, respectivamente. La carnitina se administró a una dosis de 10 mg/día, que corresponden a 58,24 mg/kg/día al inicio de la fase experimental, y a 37,6 mg/kg/día al final de la fase experimental. Durante los 90 dias de la fase de experimentación no se detectaron incidencias ni se produjo el fallecimiento de animales. El dia 90 del periodo experimental las ratas fueron sacrificadas mediante fractura cervical previa anestesia con tiopental sódico (Pentotal sódico, Laboratorios Abbott) por via intraperitoneal a una dosis de 3 mg/kg. De forma inmediata, se realizó la disección de la extremidad posterior izquierda para aislar y extraer los músculos sóleo y extensor largo de los dedos (ELD). De forma practicamente simultánea se realizó la autopsia reglada a cada animal, incluyendo el sistema nervioso central. Durante la autopsia, y después de exponer el contenido de la cavidad torácica tras incision cutánea y sección costal, se efectuó la punción del ventrículo izquierdo con extracción de un volumen de sangre intracardiaca que osciló entre 1,5 y 3,2 ml. II.B. Metodolocia del estudio bioquímico El estudio bioquímico se efectuó sobre muestras de Material y Métodos 26 músculo sóleo, higado y plasma. El músculo y el hígado se congelaron directamente en nitrógeno liquido tras el sacrificio de las ratas, y el plasma se obtuvo mediante centrifugación de la sangre intracardiaca. Se realizó la determinación de los niveles de carnitina libre (CL), ésteres acil-carnitina de corta cadena (SCAC) y ésteres acil—carnitina de larga cadena (LCAC) en homogenados de músculo sóleo, plasma e hígado de cada rata, siguiendo básicamente el método radioenzimático descrito por DiDonato y colaboradores (DiDonato S et al, 1984) II.C. Netodoloctia del estudio anatomonatolóctico II.C.l. Microscopia óptica En cada rata, se efectuó el estudio microscópico óptico de muestras de los músculos sóleo y ELD, hígado y corazon. Todas las preparaciones para microscopia óptica fueron estudiadas con un microscopio Laborlux 11 de LeitzR II.C.l.a. Músculo esquelético Se eligieron los músculos sóleo y ELD debido a que sus características han sido bién estudiadas en la rata y a que están compuestos por poblaciones de fibras muy diferentes: el sóleo presenta aproximadamente un 87% de fibras tipo 1 (Anustrong RE et al, 1984). Material y Métodos 27 Tras su extracción del miembro posterior izquierdo de cada rata, se efectuaron varios cortes transversales en la parte central de los vientres de ambos músculos. Estos cortes transversales fueron orientados, montados en medio acuoso (Tissue Tek OCTR, Miles 4583>, congelados durante 2 minutos en isopentano (2-metil—butano, Fluka Chemie AG 59075R> previamente enfriado hasta aproximadamente —150’C por contacto a través de cristal con nitrógeno liquido, y conservados posteriormente inmersos en nitrógeno liquido a una temperatura similar a la indicada. En una fase posterior, los músculos congelados de esta forma fueron cortados en criostato a —20’C, obteniendose cortes seriados de aproximadamente 6 ji de grosor que fueron colocados sobre portaobjetos y conservados en congelador a —20C hasta la relización de las técnicas de histoquimica. En cada músculo, sóleo y ELD, de cada rata se efectuaron las siguientes tinciones y técnicas de histoquirnica: 1) Hematoxilina—eosina (HE) 2) Acido peryódico de Schiff (PAS) para demostración de glucógeno 3) }iADH-deshidrogenasa (Nachías MM et al, 1958) 4) ATPasa con preincubación a pH 9,4 (ATP—asa A) (~ound JM et al, 1980) 5) ATPasa con preincubación a pH 4,6 (ATP—asa B) (Round JM et al, 1980) 6) ATPasa con preincubación a pH 4,2 (ATP-asa O) (Round Material y Métodos 28 JM et al, 1980) 7) SDH (succínico deshidrogenasa) para demostración de enzimas oxidativas intramitocondriales 8) Sudán Rojo para demostración de lípidos neutros II.C.l.b. Hígado Tras la extracción del paquete visceral en la autopsia, de cada rata se tomaron dos cuñas de tejido hepático de un tamaño aproximado de 2 X 1 X 0.5 cm. Una de estas muestras fué congelada de forma directa a —70 C para su estudio bioquímico. La otra muestra fué fijada en formaldehido al 10% tamponado y posteriormente dividida en dos fragmentos de tamaño similar. tino de estos fragmentos fué incluido en bloques de parafina de donde se realizaron cortes de 7 ji de espesor. Sobre estos cortes se realizaron técnicas de HE, PAS, tricrómico de Masson y reticulina. El otro fragmento fijado en formalina fué congelado, realizándose cortes de 6 ji de grosor sobre el bloque congelado. Estos cortes fueron teñidos con la técnica de Sudán Rojo descrita en el apartado anterior. II.C.1.c. Corazón Tras la extracción del paquete visceral en la autopsia, se extrajo la víscera cardiaca íntegra que se fijó en formaldehido al 10% tamponado. Posteriormente se realizaron dos secciones transversales a través de la Material y Métodos 29 parte superior de los ventrículos. Una de estas secciones fué incluida en bloques de parafina de donde se relizaron cortes de 7 ji de espesor que fueron teñidos con HE. La otra sección fué congelada a —70’ 0, realizandose cortes de 6 ji de grosor sobre el bloque congelado. Estos cortes fueron teñidos con la técnica de Sudán Rojo descrita anteriormente. II.C.2. MicroscopIa electrónica El estudio ultraestructural se realizó sobre muestras de músculo sóleo y músculo ELD. Inmediatamente tras su disección, y antes de congelarlos en isopentano, se cortaron pequeños fragmentos longitudinales de los músculos sóleo y ELD, fragmentos que fueron fijados en glutaraldehido al 5% tamponado con buffer de cacodilato 0.1 M a 4’ 0. Al cabo de 2 horas de la fijación los fragmentos de músculo fueron lavados en tres pases de buffer de cacodilato 0,1 M durante 7 dias. Posteriormente se realizó la postfijación de los mismos con tetróxido de osmio al 2% en buffer de cacodilato 0,1 M durante 3 horas, deshidratandolos con etanol a concentraciones crecientes e incluyendolos en resma REpon , orientados para secciones longitudinales. Se realizaron cortes semifinos de 0.5 ji teflidos con azul de toluidina en los que se seleccionaron las áreas mejor orientadas y conservadas. Por último, se efectuaron cortes ultrafinos de estas áreas, tiñendolos con acetato de uranilo y citrato de plomo y examinandolos y fotografiandolos en un microscopio electrónico Hitachi H2JA. Para el estudio ultraestructural, se incluyeron en Material y Métodos 30 conjunto los músculos sóleo y ELD de los animales de cada grupo de tratamiento, de manera que la microscopia electrónica se realizó sobre 12 casos, constituido cada uno de ellos por la mezcla de los cinco músculos sóleo o de los cinco músculos ELD de cada grupo de tratamiento. Se asumió que los cinco músculos, sóleo y ELD, de cada grupo ultraestructural presentaban características homogéneas y que las fibras observadas en el estudio ultraestructural corresponderían con mayor probabilidad a las predominantes en cada músculo, es decir, tipo 1 en el sóleo y tipo II en el ELD; de todas formas, el estudio morfométrico realizado sobre la densidad de volumen mitocondrial y sobre el grosor de la banda 2 nos permitió confirmar esta suposición. Además del estudio mediante visión directa de estos doce casos, se realizaron seis fotograflas ultraestructurales (de la parte central de las fibras, alejadas de la zona subsarcolemal) de cada uno de ellos a 12.200 aumentos, lo que hace que las copias fotográficas muestren una imagen aumentada 38.400 veces sobre una superficie para cada copia fotográfica de 29 g2. Las tres fotografías más representativas de cada caso fueron utilizadas para el estudio morfométrico del área mitocondrial y del grosor de la banda Z, según se detalla en el apartado de Morfometria. II.C.3. Morfometria El estudio morfométrico se ha efectuado mediante métodos estereológicos basados en los principios de probabilidad geométrica que permiten cuantificar estructuras tridimensionales a partir del estudio de cortes Material y Métodos 31 bidimensionales de las mismas (Engel AG, 1986a). Se ha realizado el estudio morfométrico de las muestras de músculo esquelético, tanto a nivel óptico como ultraestructural. En lo relativo a la microscopia óptica, en cada músculo (sóleo y ELD) de cada animal se midieron los diámetros de las fibras completas incluidas en un total de 4 campos de 400 aumentos, escogiendo los campos menos artefactados y mejor orientados. Los diámetros medidos correspondieron al “mayor perpendicular al mayor” (Brooke MM et al, 1969) . Las mediciones se efectuaron sobre las preparaciones de ATPasa A y ATPasa B, clasificando las fibras en tipo 1 y tipo II. Con respecto a la microscopia electrónica, se midió la anchura de 30 de las bandas Z de las fibras elegidas, así como el número y área ocupada por las mitocondrias completas incluidas en las tres fotografías ultraestructurales (superficie total de 87 ji 2> más representativas de las seis realizadas por cada caso. En el estudio del área mitocondrial se incluyó la densidad de volumen mitocondrial en aplicación del principio de Delesse, que señala que la densidad de volumen de un componente en una estructura tridimensional es igual a la densidad de área de ese componente en un plano que corta la estructura tridimensional (Engel AG, 1986a). Como instrumento de medición, almacenamiento de datos, cálculo de la estadística descriptiva y realización de histogramas de frecuencia de las mediciones efectuadas con microscopia óptica y electrónica se utilizó un equipo básico de análisis de imagen constituido por hardware Material y Métodos 32 MOP-Videoplan (CP/M 2.2) como soporte del programa de morfometria Rontron V5.42, acoplado a una videocámara y un monitor de vídeo, y como periférico interactivo un tablero de digitalización electromagnética con pluma, según especificaciones convencionales (Marchevsky Aid et al, 1987). II.D. Metodología del estudio estadístico El análisis estadístico se ha efectuado por separado para las muestras estudiadas mediante bioquímica, morfometria óptica y morfometría ultraestructural. Las tablas correspondientes a la estadística descriptiva se refieren a cada una de las variables analizadas e incluyen el grupo, la media aritmética, la desviación estándar (DE), el error estándar de la media (EEM) y el intervalo de confianza del 95% de la media (lO 95%>. En cada uno de estos tres grupos de análisis estadístico se ha realizado inicialmente un análisis de la varianza para dos factores (twoway ALNOVA> para verificar la existencia o inexistencia de relación matemática entre los dos factores analizados (VPA y 1-carnitina) y los efectos producidos por los distintos tratamientos. De esta forma, comprobamos la homo o heterogeneidad de los grupos de tratamiento y, en el caso de heterogeneidad (varianza explicada, pc0,05), conocemos si las diferencias entre los grupos se pueden explicar por la interacción de los dos factores (p<0,OS) o bién por la acción de uno de ellos. En los casos de varianza explicada significativa (pcO,05> y ausencia de Material y Métodos 33 interacción entre los dos factores analizados (p>0,0S), se ha realizado el análisis de la varianza para un sólo factor (oneway ANOVA) que nos permite comprobar de nuevo el grado de homogeneidad de los grupos de tratamiento así como el de las propias varianzas mediante los tests de Cochrans y de Bartlett—Box. En los casos en los que la probabilidad de estos dos test no ha ido en contra de la homogeneidad de las varianzas, se ha realizado la comparación de los valores medios de cada grupo con los de todos los demás mediante la prueba de contraste de medias a posteriori de Scheff e aceptando niveles de significación a partir de pcO,05. En los casos en los que el análisis de la varianza para dos factores ha señalado la presencia de interacción significativa entre ambos, se ha analizado los valores medios y los IC 95% para comprobar la existencia o inexistencia de significación en las diferencias. En cada variable se ha comprobado el ajuste de la distribución de los datos a la distribución normal (p>0,OS) mediante la prueba de Kolmogorov—Smirnov, con objeto de poder aplicar las pruebas paramétricas que acabamos de señalar. En lo relativo al peso inicial y final de los diferentes grupos de ratas (debido a la escasa dispersión de los valores medios) y en lo relativo a la morfometria ultraestructural sobre las mitocondrias (debido al número diferente de mediciones en cada grupo), se ha efectuado la prueba de comparación de múltiples medias de Newman— Keuls. Esta prueba se basa en una estimación global de la varianza de la población a la que pertenecerían todas las muestras en la hipótesis de igualdad de medias y en el cálculo, a partir de ella, de la máxima diferencia Material y Métodos 34 permisible entre medias en esa hipótesis, asumiendo una distribución normal. Las variables consideradas en cada grupo de estudio (bioquímico, óptico y ultraestructural) serán especificadas a propósito de los resultados. En todos los casos, se ha asumido un riesgo a bilateral igual a 0,05, aceptando significación estadística cuando la hipótesis planteada se podía asumir en más del 95% de las comprobaciones (riesgo máximo aceptado para rechazar la hipótesis nula menor del 5%, Pc0,05). De esta forma, el término ‘estadisticamente significativo’ se ha considerado equiparable a ‘rechazo de la hipótesis nula’ (es decir, indica que la variación en el muestreo constituye un explicación improbable de la discrepancia existente entre los valores de la hipótesis nula y Los de la muestra). El análisis de la varianza se ha llevado a cabo mediante el programa SPSS/PC+R (Statistical Package for Social Sciences) V4.0 (Norusis MJ, 1990) sobre un ordenador IBM R R PS/2 con microprocesador INTEL 386. La prueba de Newman—Keuls se ha llevado a cabo mediante el programa Presta PC V2.2 de Procesamientos Estadísticos (Abraira y et al, Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social, 1992) sobre un ordenador personal portatil AT Toshiba TlOOOLE. La bibliografía utilizada para el estudio estadístico corresponde a Milton y Tsokos (Milton JS y Tsokos JO, 1987), Colton (Colton T, 1979) y Norusis MJ entre el peso medio al inicio de la tase y el peso medio al final de la misma (Newman-Keuls, 48 grados de libertad>. III. Resultados bioquímicos El estudio bioquímico se llevó a cabo sobre muestras de plasma, hígado y músculo esquelético obtenidas inmediatamente tras la muerte de los animales, y en cada Resultados 39 uno de estos tres compartimentos se determinaron tres parámetros directos (concentraciones de CL, SCAC y LCAC) y dos parámetros derivados de una forma independiente de la dosis. La carnitina exógena revierte este efecto del VPA. III.B.4. Concentración de CTOT en hígado Con respecto a las comcentraciones hepáticas de CTOT, la distribución de las mismas se refleja en el histograma: n Punto medio 1 6,1 1 6,5 3 6,9 3 7.3 4 7,7 4 8,1 2 8,5 1 8,9 1 9,3 1 9,7 1 10,1 4 10,5 2 10,9 1 11,3 0 11,7 0 12,1 1 12,5 0 1 2 3 4 5 Resultados 52 La tabla descriptiva de los valores medios de estas concentraciones en cada grupo de tratamiento se incluye a continuación: n Media DE EEM 5 9,1120 5 9,1000 5 7,9800 5 9,3000 5 7,5200 5 9,2740 1, 5941 1,6628 1,6438 2,2201 0, 7293 1,6001 0,7129 0,7436 0, 73 51 0,9928 0,3262 0,7156 7,1327 7,0354 5,9390 6,5435 6,6144 7,2873 Total 30 8,7143 1,6480 0,3009 8,0990 a a 11,0913 a 11,1646 a 10,0210 a 12,0565 a 8,4256 a 11,2607 9,3297 El análisis de la varianza indica que las concentraciones medias de CTOT en los grupos de tratamiento no pertenecen a poblaciones distintas que en el resto de los grupos de tratamiento que en el resto de los grupos (grupos 1, 4, 5 y 6). Además, la del grupo 2 también es significativamente mayor que la del grupo 3. Con respecto a la DVM, también las de los grupos tratados con VPA sin carnitina (grupos 2 y 3) es significativamente mayor que la del resto de los grupos (grupos 1, 4, 5 y 6). V.B. Grosor de la banda 2 El grosor o anchura de la banda Z fué cuantificado morfométricamente en los músculos sóleo y ELD. Todas las mediciones relativas a la banda 2 están expresadas en nanóxnetros (mg). Resultados 71 V.B.1. Grosor de la banda Z en músculo sóleo La descripción de los grosores medios de la banda 2 en el músculo sóleo de los grupos de tratamiento fué la siguiente: n Media DE EEM IC 95% 126,0000 129,0000 123 E 3333 146,3333 145, 0000 152,0000 13,7966 11,5520 13,4762 15,1960 12,7982 18,2700 2,5189 2,1091 2,4604 2,7744 2,3366 3,3356 120,8483 a 131,1517 124,6864 a 133,3136 118,3012 a 128,3654 140,6590 a 152,0016 140,2211 a 149,7789 145,1779 a 158,8221 Total 180 136,9444 18,0346 1,3442 134,2919 a 139,5970 V.B.2. Grosor de la banda Z en músculo ELD Con respecto al músculo ELD, las anchuras medias medias de la banda Z se recogen en la siguiente tabla: n Media DE 13,6836 12,4522 13,3089 8,5029 9,8553 12,2990 EEM 2,4983 2,2735 2,4299 1, 5524 1,7993 2,2455 IC 95% 67,8905 79,0169 97, 3 637 73,1583 84,6533 94,7408 a 78,1095 a 88,3164 a 107,3030 a 79,5084 a 92,0134 a 103,9258 Total 180 87,1667 15,9705 1,1904 84,8177 a 89,5156 Para cada grupo de tratamiento, el grosor de la banda Z fué significativamente mayor en las fibras del músculo sóleo (fibras tipo 1) que en las del músculo ELD (fibras Grp 1 Grp 2 Grp 3 Grp 4 Grp 5 Grp 6 30 30 30 30 30 30 Grp 1 Grp 2 Grp 3 Grp 4 Grp 5 Grp 6 30 30 30 30 30 30 73,0000 83 E 6667 102,3333 76,3333 88,3333 99,3333 tipo II) (Newman-Keuls, 348 grados de libertad). Discusión 72 DISCUSION La discusión se estructurará siguiendo la misma línea de exposición que en el apartado Resultados. 1. Desarrollo de la fase experimental Las dosis de VPA utilizadas en nuestro estudio fueron de 15 mg/dla y 25 mg/día, correspondientes a 87,36 mg/kg/día y 145,6 mg/kg/día al inicio de la fase experimental, y a 56,4 mg/kg/día y 94,0 mg/kg/día al final de la misma. Tanto al inicio como al final de la fase experimental, la dosis de VPA administrada a los grupos de animales tratados con este fármaco es muy superior a la recomendada en clínica, que oscila entre 15 y 30 mg/kg/día (dependiendo de la edad) para conseguir niveles plasmáticos terapéuticos de 40 mg/mL como mínimo. En modelos experimentales publicados en la literatura en relación con los efectos del VPA sobre las concentraciones de carnitina se han utilizado dosis de VPA de 100 mg/kg de forma aguda (Coude FX et al, 1981), 500 mg/kg/día durante 7 días con y sin 200 mg/kg/día de carnitina (Sugimoto T et al, 1987a; Sugioto T et al, 1987b; Nishida N et al, 1987), 50 mg/kg de forma aguda . En lo relativo a la carnitina, aunque parece poseer un Discusión 75 efecto trófico sobre diversos tejidos como músculo esquelético (Spagnoli LG et al, 1990), hígado (Blaha y et al, 1990) y nervio periférico (Fernandez E et al, 1990), no se ha observado que produzca modificaciones en el peso corporal en el ser humano ni en animales de experimentación (Sugimoto T et al, 1987a; Sugimoto T et al, 1987b; Nishida N et al, 1987) III. Estudio bioquímico El estudio bioquímico llevado a cabo se ha efectuado sobre plasma, hígado y músculo sóleo, debido a que constituyen tres compartimentos donde es probable que la administración de VPA refleje la aparición de modificaciones en el metabolismo lipidico relacionado con la carnitina. III.A. Plasma En conjunto, la interacción estadística observada en el análisis de la varianza entre el VPA y la carnitina en el plasma ha sido muy intensa en los cinco parámetros estudiados por lo que las diferencias observadas entre los grupos de tratamiento, aún siendo estadisticamente significativas en lo relativo a cuatro de los parámetros, no pueden ser atribuidas a la acción independiente de ninguno de los dos fármacos sino a la interacción entre ambos. Los resultados obtenidos en nuestro estudio indican que, a nivel plasmático, el VPA disminuyó de forma significativa la concentración de CL y aumentó la de ésteres de carnitina de cadenas larga (LCAC) y corta Discusión 76 (SCAC) E y que ambos efectos fueron dependientes de la dosis. La administración de carnitina exógena produjo una reversión de los efectos del VPA sobre la CL y los LCAC, así como un incremento del efecto del VPA sobre los SCAC. Por otra parte, el VPA incrementó el cociente AC/CL de una forma dependiente de la dosis, y este efecto también fué contrarrestado por la carnitina exógena, posiblemente porque el efecto de ésta tuvo mayor intensidad sobre los LCAC que sobre los SCAC. En lo que respecta a la concentración plasmática de CTOT, el VPA no produjo modificaciones significativas en las ratas que recibieron esta medicación. La mayor parte de los autores que han estudiado estas modificaciones en pacientes tratados con VPA han observado disminución de la concentración plasmática de CL, incremento en la de AC y en el cociente AC/CL, y disminución del nivel de CTOT (Ohtani Y et al, 1982; Laub 14 et al, 1986; MeleghB et al, 1990; Beghi E et al, 1990; Shapira Y et al, 1991; Opala G et al, 1991; Riva R et al, 1991). En la serie de Ohtani y colaboradores, el efecto del VP?. tuvo un carácter dependiente de la dosis . Este mismo grupo de investigación estudió posteriormente, también en la rata Wistar, el efecto producido por la administración de VPA (50 mg/kg/día) durante 7 y 28 días, sobre los niveles de CL y AC en plasma, hígado, músculo esqulético, orina y hematíes. A los 7 días no se observaron diferencias significativas en los niveles plasmáticos de AC y CL, ni tampoco en los valores de CTOT y AC/CL, entre el grupo control y el grupo tratado con VPA. No obstante, a los 28 días de tratamiento, en este último grupo se observaron niveles plasmáticos significativamente menores de CL y mayores de AC, así como un cociente AC/CL también significativamente mayor, con respecto al grupo control (Murakami K et al, 1990). Camiña y colaboradores estudiaron en el ratón Swiss albino los efectos producidos por la administración de VPA (150 mg/kg/día) durante 7 días sobre los niveles de CL, AC y CTOT, y sobre el cociente AC/CL, en plasma, Discusión 78 hígado, músculo esquelético, corazón, riñón y orina. En plasma, y con respecto al grupo control, el VPA produjo disminución de la CL y la CTOT, y aumento en el nivel de AC y en el cociente AC/CL, aunque en todos los casos sin significación estadística (Camiña MF et al, 1991a). Posteriormente, los mismos investigadores estudiaron la evolución en el ratón Swiss albino de las concentraciones de CL y AC en plasma, hígado, músculo esquelético, corazón y rilión tras la administración de una unica dosis terapéutica de VPA. A nivel plasmático, el VP?. dió lugar a una disminución significativa de la concentración de CL y de AC (Camiña MF et al, 1991b). El mecanismo más probable para explicar los efectos del VPA sobre las concentraciones plasmáticas de CL es el incremento en el requerimiento intramitocondrial de carnitina para tamponar el exceso de residuos acil—CoA de cadena corta , así como la inhibición en la reabsorción tubular renal de carnitina libre producida por el VPA (Engel AG et al, 1981). En la matriz mitocondrial se formarían grandes cantidades de SCAC, principalmente acetil-carnitina y valproil— carnitina (Bohan TP et al, 1984), que abandonarían la mitocondria por acción de la acilcarnitina translocasa alcanzando el plasma e incrementando los niveles de AC en este compartimento, a pesar de que el VPA inhibe la reabsorción tubular renal de AC (Ohtani Y et al, 1984). La inhibición de la 3—oxidación mitocondrial inducida por el VPA (Haas R et al, 1981) daría lugar también a una acumulación de residuos acil—Co?. de cadena larga que Discusión 79 serian eliminados de la mitocondria hacia el plasma en forma de LCAC. Estos efectos dependerían de la dosis de VP?. administrada debido a que al aumentar la cantidad de este ácido que alcanza la mitocondria se incrementarían de forma cuantitativa los mecanismos que acabamos de señalar. Con respecto a la 1—carnitina exógena, su administración incrementa las reservas de carnitina en todos los compartimentos, por lo que aumenta la concentración plasmática de CL. Por otra parte, el aumento de carnitina en la mitocondria facilita la eliminación de SCAC hacia el plasma y disminuye la concentración plasmática de LCAC al facilitar su entrada en la propia mitocondria y dirigirlos hacia la 3-oxidación. III.B. Hictado En nuestro estudio, el VPA disminuyó el nivel de CL en hígado de una forma dependiente de la dosis, y la carnitina exógena revirtió este efecto. Con respecto a las acilcarnitinas, el VPA incrementó significativamente la concentración de LCAC en hígado, efecto que fué independiente de la dosis administrada y que desapareció al administrar carnitina exógena. Por otra parte, el VPA no modificó significativamente los niveles hepáticos de SCAC ni de CTOT. En lo relativo al cociente AC/CL en tejido hepático, el VPA dió lugar a un incremento significativo del mismo, efecto que tuvo un carácter dependiente de la dosis y que Discusión 80 desapareció al administrar carnitina exógena. A nivel clínico no existen estudios sobre las concentraciones hepáticas de CL y AC en pacientes tratados con VPA. A nivel experimental, en la rata Wistar, Nishida y colaboradores no observaron diferencias significativas entre las concentraciones hepáticas de CL, AC y CTOT del grupo control y las del grupo tratado con VPA ( 500 mg/kg/día, 7 días) (Nishida 14 et al, 1987>, así como tampoco Murakami y colaboradores en un modelo experimental similar con duraciones de tratamiento distintas (VPA 50 mg/kg/día, 7 y 28 días). Camiña y colaboradores observaron unos niveles hepáticos de CL y CTOT significativamente mayores en ratones tratados con VPA (150 mg/kg/día, 7 días) que en el grupo control, sin diferencias significativas en lo relativo a los niveles de AC y al cociente AC/CL. Los autores señalan que la disminución de CL en plasma puede inducir un incremento en la síntesis hepática de carnitina (Camiña MF et al, 1991b). El metabolismo completo de los residuos acil requiere su procesamiento hepático, de manera que son transportados desde los tejidos hasta el hígado en forma de AC donde son reconvertidos en acil—Co?. y metabolizados . Camiña y colaboradores, en su modelo experimental comentado previamente, no encuentraron diferencias significativas en las concentraciones intramusculares de CL, AC y CTOT, ni en el cociente AC/CL, entre el grupo tratado con VPA (150 mg/kg/día, 7 días) y el grupo control (Camiña MF et al, 1991b). El mecanismo más probable para explicar el incremento intramuscular en los LCAC, y en consecuencia en el cociente AC/CL, en nuestro estudio puede ser la inhibición de la 13-oxidación producida por el VPA, que daría lugar a una acumulación intramitocondrial de residuos acil—CoA de cadena larga, que serian eliminados hacia el sarcoplasma en forma de LCAC. IV. Estudio con microscopLa óptica TWA. Músculo esquelético En el estudio morfológico convencional del músculo esquelético, el dato más relevante de nuestro trabajo ha Discusión 83 sido la ausencia de depósito de material lipidico en las fibras musculares de las ratas tratadas con VPA, lo que quiere decir que el VPA no indujo el cuadro histológico de miopatia lipidica en ninguno de los animales que lo recibieron, incluso los incluidos en el grupo tratado con VPA dosis mayor sin carnitina Ea> — o . 1 -a > O a> a 0 1 -o OO a>> 1 .2c•— eoEu1 ~ o oo0 a o o o o mg, o mg, o CM CM r r 0mg, qq 0oa.A - o> 001 oeE•1E•1- oeoeE~13 Eouea u r o ¡ 3 1 omg, 94 oo• aE• —C E • — fl%0 o . • a SI-. Coo ~ 1EEE R L1 a~xxxxsE -aIg, o ¶ - r r mg, g-J E$3 qq 0oo.A-o> 0 , 8eEeeE O ’ 1 1 ¡ il~.. 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C 0a> • —1 - 4 5O>Eo1 - OE o=oo,=E uu1~uE 40IDqqCV> 01 oad auu o n 0A- e O > oauunu r ¡ ¡ o o o o o ID qq CV> 01 r o 99 0 — -I~O>O c 1 -a >E 0 > • —1 -a > -e -.,, (b ,~ E 0 L I— o , C a > L\U ’ tu , 40IDIt 0oo.6.O > u>01 eu1~ nS S - Uue‘uu. oe3uu r 0 40 It 01 0 loo 1 - 1 -tu 4 -.,, C o c 0 > 0 1 - n oE‘1 - 1 - CE d aeEoEuE S U S S S U uu1 ~ na — ~ e ea a. ue A-O > E toeuu ¡ ¡ ¡ ¡ 0 0 0 0 0 I t v 4 0 r r r r 0 0 0 0 0 0 4 0 ItQ 4 40IDqqCV> 01r Resumen 101 RESUMEN En el ser humano y en animales de experimentación se ha señalado que el ácido vaiproico produce disminución de las concentraciones de carnitina libre en plasma y en diversos tejidos, y que este efecto tiene un carácter dependiente de la dosis. Asimismo, se ha propuesto que estos efectos pueden ser revertidos por la administración de carnitina exógena. Debido a que la deficiencia de carnitina de cualquier causa puede producir clinicamente crisis de insuficiencia hepática aguda de tipo Reye y cuadros de miopatia lipidica, procesos que se traducen morfológicamente al menos por el incremento de material lipidico en distintos tejidos, se ha desarrollado un modelo experimental sobre rata Wistar para conocer los efectos bioquímicos y/o morfológicos producidos en plasma, hígado y músculo esqulético por la administración de ácido valproico, así como las modificaciones introducidas en estos efectos por la administración de carnitina ex6gena a los animales tratados con ácido valproico. Se establecieron seis grupos de estudio, cada uno con cinco animales. Uno de los grupos no recibió ninguna medicación y sirvió de control. Dos de los grupos recibieron únicamente ácido valproico, a dosis de 15 mg/día y 25 mg/día por vía oral, respectivamente. Otros dos grupos recibieron estas mismas dosis de ácido valproico más 10 mg/día de 1-carnitina por vía intramuscular. Por último, el sexto grupo recibió únicamente 1—carnitina, a una dosis de 10 mg/día por vía intramuscular. Resumen 102 La fase experimental tuvo una duración de 90 días. Los resultados más destacables obtenidos tras el estudio bioquímico y/o morfológico de las muestras de plasma, hígado, músculo esquelético y corazón han sido los siguientes: 1. El ácido valproico no ha producido crisis de insuficiencia hepática aguda de tipo Reye ni cuadros de miopatia lipidica. 2. Desde el punto de vista bioquímico, el ácido valproico ha disminuido la concentración de carnitina libre en plasma e hígado, sin modificar estos niveles en músculo. Por otra parte, en los tres compartimentos ha incrementado la concentración de acilcarnitina de cadena larga y el cociente acilcarnitina/carnitina libre, aunque sólo en plasma ha producido aumento del nivel de acilcarnitina de cadena corta. El ácido vaiproico no ha modificado las concentraciones de carnitina total en plasma, hígado ni músculo. Con excepción de la acilcarnitina de cadena larga en hígado, las alteraciones bioquímicas secundarias al efecto del ácido valproico sobre el metabolismo de la carnitina han tenido un carácter dependiente de la dosis. Todas las alteraciones bioquímicas producidas por el ácido valproico sobre las concentraciones de carnitina libre y acilcarnitina en plasma, hígado y músculo sóleo han sido revertidas por la administración de carnitina exógena, excepto en lo relativo a la acilcarnitina de cadena corta en plasma. Resumen 103 3. Desde el punto de vista anatomopatológico con microscopia óptica, el ácido valproico no ha producido alteraciones relevantes ni depósito de material lipidico en hígado, corazón ni músculo esquelético. A nivel morfométrico, el ácido vaiproico ha dado lugar a un incremento en el diámetro de las fibras tipo 1 del músculo sóleo, efecto que ha sido independiente de la dosis y que ha desaparecido tras la administración de carnitina exógena. 4. Desde el punto de vista anatomopatológico con microscopia electrónica, el ácido valproico no ha producido alteraciones relevantes ni depósito de material lipidico en los músculos sóleo y extensor largo de los dedos. A nivel morfonétrico, el ácido valproico ha dado lugar a un incremento de la densidad de volumen mitocondrial en el músculo extensor largo de los dedos (fibras tipo II), mientras que no ha modificado este parámetro en el músculo sóleo (fibras tipo 1). El efecto sobre el músculo extensor largo de los dedos ha sido independiente de la dosis y ha sido revertido por la administración de carnitina exógena. Las conclusiones más destacables del estudio se pueden resumir señalando que el ácido valproico produjo, con carácter dependiente de la dosis, una disminución significativa en los niveles de carnitina libre en plasma e hígado, sin modificar de forma importante estos niveles en el músculo sóleo; que estas alteraciones bioquímicas no se tradujeron morfológicamente en acumulación de material lipidico en hígado, músculo esquelético ni corazón, y que la administración de carnitina exógena Resumen 104 permitió revertir la mayor parte de los efectos que produjo el ácido valproico sobre el metabolismo de la carnitina. Anexo 1 105 LIIEXO 1 1. características del músculo esquelético en relación con el metabolismo lipídico El metabolismo de los lípidos tiene una importancia decisiva para el funcionamiento adecuado de los sistemas musculares debido a que los lípidos constituyen el principal sustrato para la producción de energía tanto en reposo como durante la contracción. Además, los lípidos constituyen componentes esenciales de las estructuras de membrana celulares y subcelulares cuya integridad es esencial para el funcionamiento normal (Ontko JA, 1986). El metabolismo celular de los lípidos está en íntima relación con el de los carbohidratos, proteínas y ácidos nucleicos, junto con minerales, vitaminas y otras muchas moléculas de bajo peso molecular, de forma que la modificación o alteración de cualquiera de los múltiples procesos implicados va a dar lugar a efectos secundarios a diferentes niveles. En este contexto, los cuerpos cetónicos (acetoacetato y beta-hidroxibutirato) son considerados como lípidos debido a que estos compuestos altamente energéticos constituyen el producto final de la oxidación de los ácidos grasos en el hígado y se introducen en la circulación para alcanzar los tejidos extrahepáticos donde son eficazmente utilizados (Ontko JA, 1986) I.A. Comt,osición lipidica del músculo Aproximadamente, el músculo esquelético constituye el 42% Anexo 1 106 del peso del cuerpo humano, superando con mucho al segundo tejido en cuanto a peso, el tejido adiposo, que normalmente constituye un 18%. La composición general del músculo esquelético incluye un 20% de proteínas, un 5% de lípidos, un 1% de carbohidratos, un 2% de otros constituyentes orgánicos e inorgánicos, y un 72% de agua. El componente lipidico del músculo esquelético está representado por los lípidos neutros y por los fosfolípidos. Los lípidos neutros en este órgano están constituidos por triglicéridos (80%), colesterol (15%) y una parte menor (5%) de diglicéridos, monoglicéridos y otros compuestos lipídicos. Unicamente el 10% del colesterol está en forma esterificada, mientras que la mayor parte (90%) lo está en forma libre. Los fosfolípidos se localizan predominantemente en las estructuras de membrana. Los principales tosfolipidos que se encuentran en el músculo esquelético son, por este orden, fosfatidilcolina, fosfatidi letanolamina, fosfatidilinositol y fosfatidilgijoerol. También existen cantidades relativamente importantes de colina y etanolamina, mientras que son mucho menores las cantidades de fostatidilserina, esfingonielina, lisofosfatidilcolina, ácido fosfatidico y fosfatidilglicerol. Los ácidos grasos más abundantes en los fosfolipidos del músculo esquelético son palmítico, esteárico, oléico, linoléico y araquidónico. No obstante, son los ácidos grasos de los triglicéridos (palmítico, oléico y linoléico) los que mejor reflejan la composición plasmática de ácidos grasos libres (FFA) así como el contenido de ácidos grasos de la Anexo 1 107 dieta, que representan los precursores del contenido intracelular de FFA en el músculo esquelético. I.B. Cantación de unidos nor el músculo esquelético Las moléculas procedentes del plasma se introducen en las células musculares atravesando las propias células endoteliales o bien filtrándose a través de los poros que existen entre estas células y difundiendo hasta el liquido intersticial que rodea a las fibras musculares. Los lípidos, que son muy solubles en la bicapa de las estructuras de membrana, utilizan preferentemente la primera vía mientras que las moléculas hidrosolubles de bajo peso molecular, como los cuerpos cetónicos, utilizan principalmente la segunda. Parece claro que la célula endotelial participa activamente en el transporte de los FFA al interior de las células musculares, teniendo en cuenta la afinidad de los mismos por las membranas bicapa, su escasa hidrosolubilidad y su rápida desaparición de la circulación (Spector A, 1971). Los lípidos atraviesan la membrana plasmática mediante 7 posibles mecanismos: 1. Difusión simple: Utilizada como mecanismo único por los ácidos grasos de cadenas media (6-10 0) y corta (2- 4 0), y también por los cuerpos cetónicos. Los LOFA pueden atravesar la membrana plasmática mediante difusión aunque no como mecanismo único. Anexo 1 108 2. Transferencia por colisión: Mecanismo importante para la introducción del colesterol de las lipoproteinas (Miller KM et al, 1983) 3. Difusión lateral en las membranas: Utilizada por los LOFA (Scow RO, 1980). 4. catálisis enzimática en la membrana plasmática con difusión de los productos de reacción: La reacción clásica es la hidrólisis que produce la lipoproteina lipasa sobre los triglicéridos de las lipoproteinas de densidad baja y muy baja, hidrólisis que da lugar a la liberación de FFA y glicerol. Los LOFA difunden posteriormente a través de la membrana plasmática muscular (Nilsson-Ehle P et al, 1980). 5. Transferencia mediada por receptor de un factor ligador unido a una proteína plasmática transportadora: Mecanismo utilizado por los LOFA unidos a albúmina (Weisiger R et al, 1981). 6. Fijación a receptor y endocitosis de macromoléculas: Mecanismo importante para las lipoproteinas de baja densidad y que permite la captación por el músculo de colesterol procedente del hígado (Goldstein JL et al, 1983) 7. Endocitosis inespecifica: Posiblemente es un mecanismo de muy poca operatividad en la captación intracelular de lipidos. Anexo 1 109 1.0. Metabolismo lipídico en el músculo Los procesos básicos del metabolismo lipidico intracelular son <1) activación de los ácidos grasos y cuerpos cetónicos; (2) oxidación de los ácidos grasos y cuerpos cetónicos; (3) síntesis de triglicéridos, fosfolipidos y otros ésteres de ácidos grasos, y (4) hidrólisis de estos ésteres lipidicos. La activación de los LOFA es imprescindible para el metabolismo de los ácidos grasos; los acil—CoA resultantes de esta activación sufren oxidación en la mitocondria y producen la energía necesaria para la contracción muscular. Los procesos intramitocondriales a este respecto son la beta—oxidación de los acil—CoA de ácidos grasos hacia acetil—CoA, la activación y conversión de los cuerpos cetónicos en acetil—CoA, y la combustión completa de los grupos acetilo en el ciclo del ácido cítrico de Krebs. La mayor parte de la energía celular procede de estos procesos metabólicos. Por otra parte, las reacciones de esterificación dan lugar a la síntesis de triglicéridos, que son almacenados en forma de glóbulos lipidicos en el citosol, y de fosfolípidos de membrana. La proporción de FFA que es esterificada es mínima en comparación con la que sufre oxidación. No obstante, la, esterificación de ácidos grasos es vital para la función energética celular y para la biogénesis de membranas. Por un lado, los triglicéridos actúan como reservorio de ácidos grasos que pueden ser utilizados en su momento para la producción de energía a través de la oxidación. Por otro, la síntesis de triglicéridos permite eliminar el exceso de FFA y de acil—CoA de cadena larga, compuestos que tienen caracter Anexo 1 110 tóxico cuando se acumulan. La síntesis de fosfolipidos, por su parte, es esencial para el mantenimiento de las estructuras de membrana celulares (Belí PM et al, 1981). II. Carnitina n.A. Características aenerales El ácido 3—hidroxi-4—N-trimetil-aminobutirico (1- carnitina) es un cofactor esencial del metabolismo de los ácidos grasos que fué descubierto en el músculo esquelético en 1905 y cuya fórmula fué establecida en 1927. La acción que desempeña permaneció en el terreno de lo desconocido hasta que Fraenkel observó que la carnitina era acetilada enzimaticamente por el acetil— CoA, y Fritz demostró que la carnitina estimulaba la oxidación de los ácidos grasos por homogenados de hígado (citado por Enqel AG, 198Gb). Posteriormente se estableció que la carnitina actúa como transportador de grupos acilo—graso de cadena larga hacia el interior de la mitocondria donde sufren beta—oxidación. En los tejidos humanos y de animales superiores, la carnitina se encuentra como isómero 1 metabólicamente activo, y procede de sintesis endógena y de aporte nutricional. Su fórmula química estructural es la siguiente: CH3 ~1 OH--CH--CH2-N--CH3 CH2 CH3 coO Anexo 1 111 En España está comercializada como 1-carnitina (Carnicor, Laboratorios Sigma-Tau> en forma de ampollas inyectables por vía intramuscular, solución al 30% y viables bebibles, recomendando el fabricante la administración de una dosis para el adulto de 1 a 5 g/dia según la indicación. La determinación de las distintas formas de carnitina (libre, esterificada y total) en plasma, tejidos y orina se realizó inicialmente mediante la técnica radioinétrica enzimática descrita por Cederbíad y Lindstedt en 1972 (Cederbíad G et al, 1972), técnica que fué modificada posteriormente en 1976 (McGarry JD et al, 1976). Más tarde se introdujeron las técnicas de croxnatograf la en columnas y de espectrometria de masas (Bieber L et al, 1986) - Muy recientemente se ha propuesto un método de tipo radio-enzimático para la determinación de 1 - carnitina y acilcarnitinas cuya sensibilidad alcanza los 10 mgmol/L utilizando 10 microlitros de plasma u orina, o bién una muestra tisular de 10 mg (De Sousa O et al, 1990) II.B. Metabolismo de la carnitina II.B.l. Síntesis endógena La 1—carnitina se sintetiza endógenamente a partir de la lisina y la metionina, a través de los productos intermedios epsilon-N-trimetil-lisina, beta-hidroxi— epsilon-N-trimetil-lisina, gamma-trimetil— aminobutiraldehido y gamma-butirobetaina o desoxicarnitina (Rebouche CJ et al, 1980a). Anexo 1 112 El proceso sintético se inicia con la metilación de la lisina unida a proteínas dando lugar a epsilon—N— trimetil—lisina. Las enzimas biosintéticas son citosólicas con excepción de la epsilon—N—trimetil—lisina hidroxilasa que es mitocondrial (Rebouche CJ et al, 1980b>. En el ser humano, la reacción final del proceso sintético es la hidroxilación de la desoxicarnitina por la gamina—butirobetaina hidroxilasa, reacción que tiene lugar en hígado, riñón y cerebro pero no en músculo cardiaco ni esquelético (Rebouche CJ et al, 192Da). A diferencia del ser humano, en el rifx6n de la rata no existen las enzimas necesarias para la síntesis de carnitina a partir de N-trimetil-lisina (Guder WC et al, 1990) Con respecto al resto de los tejidos, existe un mecanismo de transporte intertisular de los precursores de la carnitina de manera que, por ejemplo, la epsilon—N— trimetil-lisina liberada por el músculo (el órgano que posee mayor cantidad de este precursor de la carnitina) hacia el torrente sanguíneo es captada en su mayor parte por el riñón y convertida en gamma—butirobetaina y carnitina mediante actividad de beta—hidroxilasa, aunque parte de la desoxicarnitina sintetizada en el riñón es transportada al hígado y convertida en carnitina en este órgano. Por último, la carnitina sintetizada en estos órganos es enviada de nuevo al plasma de donde la captan los músculos mediante un proceso de difusión—intercambio con desoxicarnitina (Siliprandi N et al, 1989). En el momento actual no existen datos precisos sobre las concentraciones de desoxicarnitina en los diferentes tejidos, sangre y orina, aunque recientemente se ha introducido un nuevo método que permite valorar Anexo 1 113 cantidades en picomoles (Noel H et al, 1984). Para la actividad óptima de la epsilon-N-trimetil—lisina hidroxilasa y la gamma—butirobetaina hidroxilasa son importantes el ácido ascórbico, el Fe2~, el 02 y el ácido alfacetoglutárico (Lindstedt O et al, 1970) - A su vez, la piridoxina es cofactor de la aldolasa que fragmenta la epsilon—N-trimetil—lisina en gamma—trimetil— aminobutiraldehido y glicina (Dunn WA et al, 1982>, y en la rata se ha demostrado que es necesaria para la biosíntesis endógena de la carnitina (Cho YO et al, 1990). No obstante, al menos en la rata, la trimetil— lisina no parece ser imprescindible para la biosíntesis de carnitina (Davis AT, 1990). En el ser humano, la síntesis de carnitina es de 100—200 pmol/día (Engel AG et al, 1984). En la rata y el ser humano no existen datos que indiquen la existencia de degradación intracelular de carnitina (Rebouche CJ et al, 1984a y b). II.B.2. Aporte exógeno y farmacocinética En relación al aporte exógeno de carnitina, los productos cárnicos, especialmente las carnes rojas, y los productos lácteos constituyen la principal fuente nutricional de 1 - carnitina (Rudman D et al, 1977). La dieta normal proporciona 300-400 umol/dia de carnitina (Guarnieri G et al, 1987). Aunque hasta el momento presente no se han establecido las contribuciones relativas de la síntesis endógena y el aporte exógeno en relación al mantenimiento de los Anexo 1 114 depósitos tisulares de carnitina, probablemente el aporte nutricional es importante en el lactante debido a que los niveles tisulares relativamente bajos de gamma— butirobetaina hidroxilasa que se observan de forma fisiológica durante esta fase de la vida limitan la biosíntesis endógena de carnitina (Rebouche CJ et al, 1980a) En un estudio efectuado en 1986 en voluntarios sanos, se observó que existe una relación significativa entre la cantidad de carnitina ingerida y la concentración total de carnitina en plasma, mientras que no parece existir esta relación entre la carnitina de la dieta y la concentración de carnitina en músculo esquelético (Lennon DLF et al, 1986). II.B.2.a. Absorción y biodisponibilidad Tras la ingestión oral de 1—carnitina exógena se produce su absorción en yeyuno e íleon mediante un mecanismo activo saturable dependiente de la bomba sodio—potasio y contra gradiente de concentración; también se absorbe en el colon, aunque en este caso a través de difusión pasiva (Hamilton ¿1W et al, 1986>. No obstante, recientemente se ha postulado por el mismo grupo de investigación la inexistencia de un mecanismo activo de transporte de la carnitina en la membrana del enterocito al observar únicamente difusión pasiva de la misma a través del borde en cepillo de las células yeyunales en la rata (Li BU et al, 1990>. Además, parece que la difusión pasiva a través del componente lipidico de la barrera intestinal es más rápida para los ésteres de la carnitina (Marciani P et al, 1991) Anexo 1 115 Parte de la carnitina administrada por vía oral sufre degradación bacteriana en el sistema gastrointestinal y algunos de los productos de degradación son absorbidos y eliminados a través de orina y heces (Rebouche CJ et al, 1991) La absorción intestinal de la 1-carnitina y su aparición en sangre son procesos muy lentos, lo que ha sido explicado por el parecido estructural de la 1—carnitina con los sustratos del transportador de aminoácidos, por su posible unión a membranas intracelulares, y por el hecho de que la mayor parte de la carnitina absorbida por el intestino se acumula en el hígado liberándose posteriormente de forma lenta hacia la circulación (Gudjonsson H et al, 1985). El mismo mecanismo de captación activa contra gradiente de concentración y de carácter saturable observado en los enterocitos ha sido demostrado en otras muchas células y tejidos, incluyendo miocardio, músculo esquelético, fibroblastos, nefronas y hepatocitos (Shaw RD et al, 1983) Este mecanismo activo puede ser útil para prevenir las pérdidas de carnitina en los estados de ayuno y también para la absorción de las dosis farmacológicas que se administran en los distintos estados de deficiencia de carnitina; además, tiene un denominador común en Las distintos tejidos donde actúa: su actividad es óptima para concentraciones plasmáticas de carnitina de orden fisiológico (Herrera—Carranza ¿1 et al, 1989). Anexo 1 116 II.B.2.b. Distribución El volumen de distribución aparente de la 1-carnitina administrada por vía intravenosa es del 26% expresado como porcentaje del peso corporal (Cederbíad G, 1984). Existe una redistribución continua de la carnitina entre el plasma y los eritrocitos, de manera que el porcentaje aproximado de carnitina total en los hematíes es el 37+9% del total de carnitina en la sangre (Borun PR, 1987). No obstante, la cantidad del precursor de la carnitina trimetil—lisina en los eritrocitos es en la rata 10 veces mayor que en el resto de los tejidos (Mizobuchi M et al, 1990) La cantidad total de carnitina en un adulto de 70 kg de peso es aproximadamente de 100 mmol. El 98% de esta cantidad se localiza en el músculo esquelético y cardiaco, el 0,6% en el liquido extracelular y el 1,6% en los tejidos renal y hepático : Anexo 1 117 Carnitina libre Carnitina total Plasma (nmol/mL) Varón 46,8±10,0 59,3±11,9 Mujer 40,1±9,5 51,5+11 6 Músculo esquelético (nmol/mg NCP) Varón 18,0±8,1 20,5±8,4 Mujer 17,3±5,3 20,1±5,3 Hígado (nmol/mg NCP) varón y mujer 7,3 10,2 No obstante, los niveles de carnitina en plasma, tejidos y orina varian en relación con la edad, de manera que los valores más bajos los presentan los niños (Deufel T, 1990> En la rata, los niveles circulantes de carnitina se correlacionan fuertemente con las concentraciones de carnitina en músculo esquelético y cardiaco, aunque únicamente para niveles de 26—69 pM y no para concentraciones superiores de carnitina en plasma. Por su parte, los niveles de carnitina en higado y riñón sS. Anexo 1 118 presentan una correlación mantenida con los plasmáticos para cualquier valor de estos últimos (Rebouche CJ, 1990) De todas formas, los niveles plasmáticos y la distribución de la carnitina están influidos por diversos factores hormonales. Existe una relación inversa entre la concentración de estradiol y la concentración plasmática de carnitina sin que se modifiquen los niveles de esta última en los eritrocitos (Boruin PR, 1980>. Se ha demostrado que la insulina y el glucagón influyen en los niveles plasmáticos de carnitina debido a que, para niveles adecuados de glucagón, se produce un incremento en la retención de carnitina por parte del hígado mientras que la insulina invierte este efecto aumentando la concentración plasmática de carnitina (Kispal G et al, 1987) Por su parte, los glucocorticoides también influyen sobre la distribución de la carnitina de manera que incrementan las concentraciones intracelulares de la misma, debido probablemente a que aumentan el número de transportadores de la carnitina a nivel de la membrana citoplásmica (Molstad P et al, 1979). La vida media de la 1—carnitina observada en voluntarios sanos y en pacientes con coronariopatia oscila entre 2 y 15 horas tras la adinistración de una dósis única oral o intravenosa de 0.5-2 g de 1-carnitina (Cederbíad G, 1984) Anexo 1 119 II.B.2.c. Metabolismo y eliminación Como ya hemos señalado, la carnitina no es metabolizada a nivel intracelular por lo que se elimina en forma de carnitina libre y de ésteres de la carnitina a través de la orina y las heces «1%). En el estado fisiológico, el umbral de excreción urinaria para ambas formas de carnitina está muy próximo al nivel sérico de carnitina (aproximadamente 50 gM), lo que sugiere que este umbral es el mecanismo que regula el nivel sérico de la carnitina , y que esta enzima debe existir también en el músculo esquelético . La acil-CoA sintetasa presenta especificidad en relación con la longitud de la cadena del ácido graso. La máxima actividad se obtiene con el ácido palmítico; en segundo lugar, y en orden descendente de actividad, se sitúan los ácidos grasos mirístico, laurico, palmitoleico, linolénico, oléico, decanáico, esteárico, araquidónico, linoléico y araquidico (Tanaka T et al, 1979). II.C.2. Formación de acilcarnitina La mitocondria posee tres aciltransterasas, las carnitina palmitoiltransferasas 1 y II (CPT 1 y II) y la carnitina acetiltransferasa . La CPT 1 también es inhibida por el malonil—CoA (McGarry JD et al, 1978; Bremer ¿1, 1990; Kashfi K et al, 1991), aunque en el músculo no se ha determinado la importancia de esta inhibición debido a que la síntesis de ácidos grasos es escasa en este órgano, a diferencia del hígado (Mccarry JD et al, 1980). Por otra parte, los esteroides anabolizantes estimulan la Anexo 1 124 CPT 1 en la rata (Guzman M et al, 1991). 11.0.3. Transiocación de la acilcarnitina La evidencia de que existe una transiocasa específica que transporta la acilcarnitina a través de la membrana interna jaitocondrial fué obtenida en 1975 (Pande 5V, 1975; Ramsay RR et al, 1975). La acilcarnitina producida por la acción de la CPT 1 y situada en el espacio intermembrana es transportada al interior de la matriz mitocondrial por acción de la acilcarnitina transiocasa, intercambiandose por carnitina de la matriz. La afinidad de fijación de la translocasa es mayor para la acilcarnitina que para la carnitina libre. Su Km disminuye a medida que aumenta la longitud de la cadena del grupo acil por lo que esta enzima transporta preferencialmente las acilcarnitinas de larga cadena (Pande SV et al, 1976). Hasta el momento no existe evidencia de que la acetilcarnitina sea transportada por una translocasa diferente por lo que la acilarnitina translocasa también puede estar implicada en le eliminación de acetilcarnitina de la matriz mitocondrial en condiciones de aumento del nivel de acetil—CoA en la matriz. II.C.4. Formación de grupos acil—CoA de cadena larga Una vez en la matriz mitocondrial, la acilcarnitina de cadena larga es convertida en el correspondiente acil— CoA por la CPT II que se localiza en la supeficie interna Anexo 1 125 de la membrana interna de la mitocondria. Todavía no ha sido establecido si las enzimas CPT 1 y CPT II constituyen la misma proteína o bien son diferentes proteínas. A este respecto se han obtenido datos contradictorios debido probablemente a que las proteínas de membrana son muy dificilmente aislables (Bergstrbm JD et al, 1980) - No obstante recientemente se ha señalado que, en cada tejido concreto, ambas enzimas son diferentes (MoGarry JD et al, 1991). II.C.5. Formación de acetil-carnitina Parte del acetil—CoA que se introduce en el ciclo de Krebs procede del reservorio citosólico de grupos acetilo, que se introducen en la mitocondria en forma de acetilcarnitina (Kispal O et al, 1991). La reacción está mediada por la CAT, un monómero de 60.5 kDa que presenta actividad máxiina en presencia de propionil—CoA y para un pH de 8.7 (Bloisi W et al, 1990>. En resumen, la carnitina, junto con las carnitina aciltransferasas y la carnitina—acilcarnitina translocasa, desempeña un papel clave en la producción de energía en el músculo esquelético y otros órganos porque es imprescindible para que los LCFA, que constituyen con mucho el principal sustrato lipidico oxidable por la mitocondria, atraviesen la membrana interna mitocondrial y puedan alcanzar la matriz para introducirse en la secuencia de la beta—oxidación y generar acetil—CoA para su utilización en el ciclo del ácido cítrico con la consiguiente producción de ATP. En última instancia, la carnitina permite la regulación de la concentración de Anexo 1 126 CoA intramitocondrial y el control del cociente CoA/acil— CoA en el interior de la mitocondria (Engel AG, 198Gb). Existen otros dos mecanismos extramitocondriales para la oxidación de los ácidos grasos en los que no es necesaria la participación de la carnitina: a. Los ácidos grasos de cadena muy larga son oxidados exclusivamente, al menos en sus fases iniciales, en los peroxisoinas (Jakobs BS et al, 1991). Los peroxisomas pueden captar grupos acil—CoA de ácidos grasos de cadena muy larga (C22 a 0=6> produciendose la beta—oxidación de los mismos con formación de acetil—CoA. La existencia de este mecanismo de oxidación en el músculo no ha sido establecida y, además,no se observa un cuadro de miopatia lipidica en las dos enfermedadesen las que existe un trastorno de la oxidación peroxisomal de los ácidos grasos, es decir, el síndrome de Zellweger y la adrenoleucodistrofia (Moser AE et al, 1984). No obstante, a través de la carnitina octanoiltransferasa peroxisosomal, la carnitina puededesempeñarun papel en este mecanismo extramitocondrial de oxidación lipidica debido a que realiza la transferencia de grupos acil— ácido graso de cadena acortada por la beta—oxidación peroxisosomal desde el interior al exterior de los peroxisomashepáticos, de manera que su oxidación pueda ser completadaposteriormentepor la mitocondria (Bremer ¿1, 1983>. Recientemente, se ha sugerido que los peroxisomasoxidan los ácidos grasos de cadena media a través de un mecanismo independiente de la carnitina pero que la oxidación de los ácidos grasos de cadena larga si Anexo 1 127 requiere la participación de la misma (Buechíer KF et al, 1990) b. En el hígado, las enzimas microsomales catalizan la omega—hidroxilación de diversos ácidos grasos que son oxidados posteriormente hacia ácidos dicarboxílicos mediante enzimas solubles o microsomales (Bj~rkhem 1 et al, 1970). 11.0. Síndromes nor deficiencia de carnitina Los síndromes por deficiencia de carnitina (500) se definen como las situaciones clínicas en las que el nivel intracelular de carnitina libre es insuficiente para que la carnitina pueda llevar a cabo sus dos principales funciones, es decir, el transporte de los LOFA a través de la membranainterna de la mitocondria y la modulación del cociente intramitocondrial CoA/acil—CoA (Engel AG, 1986b) 11.0.1. Mecanismospatogénicos de la deficiencia de carnitina en los SDC: a. Degradación excesiva de carnitina: Como ya hemos señalado, no existe evidencia convincente del la degradación intracelular de la carnitina en personas sanas ni tampoco en pacientes con SDC. b. Deficiencia nutricional de carnitina: Se acepta habitualmente que la deficiencia nutricional de carnitina, por si misma, no da lugar a un SDC a menos que esté comprometido el metabolismo de la carnitina Anexo 1 128 por algún otro mecanismo, como la disminución de la biosíntesis hepática de carnitina en la cirrosis (Rudman D et al, 1977> o en el prematuro (por inmadurez hepática) (Schmidt—SommerfeldE et al, 1982>. No obstante, la administración de dietas hipocalór itas a pacientes obesosha producido hipocarnitinemia (Davis AT et al, 1990). c. Disminución de la biosíntesis de carnitina: No es un mecanisinopatogénico que haya sido claramente demostradoen pacientes con SDC, aunque ha sido propuesta en algunos casos la disminución en la síntesis de carnitina a partir de epsilon—N-trimetil— lisina (Coates PM et al, 1984>. d. Alteración en el control renal de la carnitina: Aunque diversos pacientes puedenpresentar pérdidas excesivas de carnitina por orina junto con algún otro trastorno del metabolismo de la carnitina, con excepción del síndrome de Fanconi renal (Netzloff ML et al, 1981>, no se acepta que la eliminación excesiva de carnitina por orina, por sí misma, pueda ser causa de un SDC. e. Eliminación excesiva de ésteres de carnitina de células y tejidos: La salida excesiva de ésteres de carnitina de células muscularesy hepáticas constituye un importante mecanismode depleción de carnitina en las acidurias orgánicas. Esta alteración se debe al acúmulo intramitocondrial de diferentes acil—CoA, lo que incrementa la formación de acilcarnitinas que salen de la mitocondria y la célula y son eliminadas por el riñón. Mientras que el aporte de carnitina libre es adecuado, los acil—CoA t6xicos son eliminados en forma de ésteres de carnitina, permaneciendo Anexo 1 129 constante el nivel de CoA y el cociente CoA/ acil—CoA intramitocondrial. No obstante, cuando se hacen insuficientes los mecanismos compensadores se acumulan los acil—OoA y se compromete todavía inás el metabolismo energético porque la depleción de carnitina impide el transporte de LOFA al interior de la nxitocondria para la beta-oxidación. f. Alteración en el transporte activo de la carnitina en células y tejidos: Comentadopreviamente a propósito del primer caso descrito de SDC miopático (Treem WR et al, 1989; Stanley CA et al, 1991>. II.D.2. Formas clínicas de los SDC II.D.2.a. SDC miopático El primer SDC miopático fué identificado en 1973 cuando Engel y Angelini observaron que los homogenados de músculo esquelético de una paciente con debilidad muscular progresiva y miopatía lipidica oxidaban los LOFA con una lentitud excesiva, lentitud que se corregía al añadir carnitina (Engel AG et al, 1973>. En estudios posteriores realizados en esta paciente se detectó una alteración en el mecanismode transporte de la carnitina al interior del músculo esquelético , cardiomiopatia (21%>, crisis recidivantes de mioglobinuria <12%), debilidad y inialgias al realizar ejercicio <12%). A nivel bioquímico, la mayor parte de estos pacientes presentan niveles normales de carnitina en suero y en hígado, y disininución de la carnitina en el músculo esquelético. A este respecto, se ha descrito un cuadro de miopatia lipídica con deficiencia de carnitina en músculo esquelético asociada a cardiomiopatia hipertrófica de carácter familiar (Bautista ¿1 et al, 1990). También se han observado casos de miopatia lipidica asociada a deficiencia de carnitina y a trastornos del metabolismo del glucógeno (Sugie H et al, 1988; Verity MA, 1991) II.D.2.b. SDC sistémico En 1975 se describió por primera vez un SDC de carácter sistémico y desde entonces se han descrito en la literatura médica al menos una treintena de casos. Anexo 1 132 Clinicamente, las alteraciones más frecuentes son la aparición de crisis de tipo Reye (SugiyamaN et al, 1991> y la debilidad muscular. Las crisis agudas del SDC sistémico cursan con estupor progresivo y coma, aumento en los niveles séricos de enzimas hepáticas, hepatomegalia, hipoglucemia, hipoprotrombinemia e hiperamonemia. Estos cuadros se producen en todos los SDC sistémicos asociados a acidurias orgánicas y también en defciencias sistémicas de carnitina no asociadas a otros trastornos metabólicos, por lo que la deficiencia de carnitina puede, por si misma, desencadenar este tipo de crisis metabólica. Desde el punto de vista metabólico, la deficiencia de carinitina limita la entrada de LOFA en la mitocondria, lo que da lugar a una menor formación de acetil—CoA y de cuerpos cetónicos con disminución en la producción de energía. En esta situación, la célula incrementa la utilización de aminoácidos de cadena ramificada y de cuerpos cetónicos como fuentes de energía para aumentar la gluconeogénesis. De esta forma, aumenta la concentración intramitocondrial de acil-CoA y disminuye el cociente CoA/acil—CoA. En condiciones normales la carnitina mantiene este cociente en equilibrio, con niveles adecuados de CoA libre, formando ésteres acilcarnitina que son intercambiados por carnitina citosólica mediante el sistema de la carnitina— acilcarnitina translocasa. Los acil—CoA que se acumulan inhiben múltiples vías metabólicas y su perfil en orina nos permite conocer el punto del blgueo metabólico (Stumpf DA et al, 1985). A nivel anatomopatológico todos los pacientes presentan miopatia lipidica y, en las autopsia que se han Anexo 1 133 realizado, se han observado importantes acúmulos de lípido en músculo, hígado, corazón y riñón (Boudin O et al, 1976; Ware AJ et al, 1978). Bioquimicamente, los pacientes presentan disminución de los niveles de carnitina en músculo esquelético, plasma, hígado y corazón. II.D.2.c. Otras formas de SDC A partir de 1981 se comenzarona publicar en la literatura médica casos de SDC asociados a hemodialisis crónica, caquexia, miopatías crónicas, kwashiorkor y otras situaciones clínicas que expondremos a continuaci6n. II.D.3. Formas etiopatogénicas de SDC La clasificación más aceptada de los procesos que pueden cursar con un SDC es la siguiente: a. SDC secundario a defectos genéticos del metabolismo intermedio (ReboucheCJ, 1983> 1. Deficiencia de acil-CoA deshidrogenasas 1. síndrome de Reye idiopático 2. Síndrome de Fanconi renal 3. Insuficiencia renal crónica tratada con hemodiálisis 4. Nutrición parenteral total en lactantes prematuros 5. Kwashiorkor 6. Miopatías crónicas de grado intenso 7. Mixedema, hipopituitarismo e insuficiencia suprarrenal 8. Embarazo 9. Tratamiento con ácido valproico 10. Tratamiento con benzoato sódico 11. Tratamiento con pivampicilina 12. Cirrosis con caquexia (Rudman O et al, 1977) 11.0.4. Diagnóstico y tratamiento de los SDC Se debe sospechar un SDC, miopático o sistémico, en cualquier paciente que presente una miopatía lipidica. Además, se debedescartar este diagnóstico en un paciente Anexo 1 135 que presente cardiomiopatia hipertrófica con ondas T picudas en derivaciones precordiales, crisis agudas recidivantes de tipo síndrome de Reye o bién un diagnóstico establecido de aciduria orgánica (Brandt NJ, 1984) Para el diagnóstico de un SDC es esencial la medición precisa de los niveles de carnitina total y de acilcarnitinas en tejidas y líquidos tisulares. Con respecto al tratamiento, a nivel teórico el tratamiento sustitutivo con carnitina debería ser eficaz en todos los casos de SDC. No obstante, las respuestas clínicas y tisulares frente a la administración de carnitina son divergentes debido a la importante heterogeneidad clínica y bioquímica de los SDC. De todas formas, en todos los casos de deficiencia de carnitina se debe evitar el ayuno, administrar comidas frecuentes con elevado contenido en carbohidratos y bajo contenido en grasa, y administrar carnitina. Las crisis agudas se deben tratar por vía intravenosa para corregir o prevenir la hipoglucemia con una dosis inicial de 100 mg/kg de ¡—carnitina seguida de 25 mg/kg cada 4 a 6 horas (Stumpf DA et al, 1985>. El tratamiento de mantenimiento consiste en 100 mg/kg/día para lactantes y niños, y 2 a 4 g/dia para adultos. La mayor parte de los pacientes con SDC de cualquier tipo y secundario a cualquier trastorno mejoran clínica y bioquimicamente al ser tratados con 1—carnitina , aunque no en todos los casos (Carroll JE et al, 1980; Seccombe DW et al, 1982; SeccombeDW et al, 1986). Anexo 1 137 II.E.l.b. Hemodiálisis En los pacientes con insuficiencia renal crónica sometidos a diálisis intermitente prolongada se observa una disminución del 30%—90% de las concentraciones séricas de carnitina, con respecto a los controles, debido tanto a la disminución en la síntesis de carnitina por parte del riñón como a la pérdida de carnitina en el liquido de dializado (Rodriguez-Segade5 et al, 1986). En el músculo esquelético de pacientes dializados, incluso pacientes con concentraciones plasmáticas de carnitina normales, se han detectado bajos niveles de la inisma relacionados con síntomas de tipo calambres y astenia (Bohmer T et al, 1978). Por otra parte, la hiperlípoproteinemia e hipertrigliceridemia quepresentan estos pacientes puede estar en relación con la hipocarnitinemia, dado el papel que desempeña la carnitina en el metabolismo de los ácidos grasos en los tejidos (Borum PR et al, 1986). La administración oral o IV de 1—carnitina a estos pacientes eleva las concentraciones musculares de carnitina hasta niveles normales o superiores a los normales con atenuación importante de la sintomatología de tipo muscular e incremento de la activida electromiográfica (Vacha GM et al, 1985>. No obstante, otros investigadores no han observadosignos objetivos de mejoría en la fuerza, resistencia o actividad metabólica del músculo, ni tampoco en la velocidad de conducción nerviosa, en pacientes en hemodiálisis tratados con 1 — carnitina <2 g/día, durante 6 semanas>, a pesar del aumentodel 60% en la concentraciónmuscular de carnitina (Fagher B et al, 1985>. Anexo 1 138 De todas formas, aunqueparece demostradoel valor de la 1—carnitina para la normalización de la homeostasisde la carnitina en los pacientes sometidos a diálisis (Siami O et al, 1991), se ha llamado la atención para no utilizar dosis excesivas, recomendándosela utilización de 15 mg/kg/día (Wanner C et al, 1990). Con respecto a la hipertrigliceridemia, en diversos estudios se ha observadola disminución en los niveles de triglicéridos en los pacientes hemodializados tratados con 1—carnitina (Vacha GM et al, 1983>, aunque en otros no se han detectado variaciones y en otros se han observado incluso aumentos en los niveles de triglicéridos (Weschler A et al, 1984>. En los niños sometidos a diálisis peritoneal ambulatoria no se ha observado deficiencia de carnitina, y la administración de 1—carnitina no ha dado lugar a la resolución de la hipertrigliceridemia (Warady BA et al, 1990) Otro aspectoterapéutico de la 1—carnitina exógenaen los pacientes urémicos sometidos a hemodiálisis crónica se refiere al incremento en el hematócrito, entre el 23% y el 32%, lo que ha sido atribuido al aumento en la actividad de la Na/IC—ATPasa que eliminaría el acúmulo de ésteres acilcarnitina de cadena larga en el interior del eritrocito (Bellinghieri G et al, 1983). Algunos autores han observadouna correlación positiva entre los niveles séricos de carnitina y la respuesta a la eritropoyetina recombinante humana en pacientes con anemia secundaria a nefropatía terminal (Kooistra MP et al, 1991). Anexo 1 139 II.E.1.c. Nutrición parenteral total Durante la nutrición parenteral total intravenosa a recién nacidos prematuros y a enfermos graves o malnutridos se ha observadouna importante disminución en los niveles de carnitina en plasma y orina (Schmidt— Sominerfeldt E et al, 1983>. Durante la vida intrauterina el feto presenta un increinento progresivo en sus depósitos de carnitina a través de la madre; tras la interrupción de la unidad materno—fetal, el recién nacido prematuro depende exclusivamente del aporte exógeno de carnitina para mantener sus niveles normales debido a que su inmadurez hepática no le permite la biosíntesis adecuada de carnitina, por lo que se ha recomendado el aporte suplementario en estos casos . Esta hipocarnitinemia podría contribuir a la alteración del metabolismo graso que pueden presentar estos pacientes (Phillips CD et al, 1982). En las deficiencias nutricionales de carnitina, el riñón puede conservar la carnitina libre y las acilcarnitinas de cadena corta, aunque existe una excreción renal obligatoria de otros ésteresde carnitina que contribuye a la hipocarnitinemia . Estos datos han sido refrendados en un estudio posterior (Amodio P et al, 1990). No obstante, la administración de carnitina previene la toxicidad aguda por amoniaco (Ohtsuka Y et al, 1991) y aumenta la eliminación del mismo en forma de urea y glutainina, atenuando además los efectos tóxicos del amoniaco mediados por peroxidación lipidica, de manera que se ha propuesto su utilización en el tratainiento de los síndromes hiperamoniémicos (O’Connor JE et al, 1991> como la propia cirrosis hepática o los trastornos del ciclo de la urea como la deficiencia de ornitina transcarbamilasa (Mayatepek E et al, 1991> o la deficiencia de carbamil-fosfato sintetasa (Sakuma T, 1991) De esta forma, la administración de 1—carnitina a pacientes cirróticos da lugar a la obtención de mejores resultados en la prueba de tolerancia al amoníaco y en las pruebas psicométricas, lo que ha hecho que se proponga su evaluación como tratamiento de la encefalopatía establecida (Del Olmo JA et al, 1991>. II.E. i.g. Fenilcetonuria En la fenilcetonuria se han identificado varios casos de hipocarnitinemia que ha sido atribuida a la deficiencia de hierro, que constituye un cofactor esencial para la síntesis de carnitina, y también a la deficiencia de carnitina en la dieta hipoproteica estricta que siguen estos pacientes, recomendándose la inclusión de carnitina exógena en estas dietas . Anexo 1 142 II.E.2. En otros procesos y contextos II.E.2.a. Cardiotoxicidad inducida por antraciclinas En animales de experimentación, la 1—carnitina protege a las células cardiacas frente a los efectos tóxicos de la doxorrubicina (adriamicina) (De Leonardis 51 et al, 1985). La doxorrubicina inhibe diversas fases del metabolismo cardíaco, como la captación de oxigeno, la concentración de ATP y la síntesis proteica. El resultado es que, para 2dosis acumulativas superiores a los 500 mg/m aparecen con frecuencia cuadros de cardiomiopatia congestiva tardía. En diversos estudios con pacientes se ha observado que la 1—carnitina disminuye las concentraciones enzimáticas de CK—MB y mejora diversos parámetros de la actividad cardiaca (Neri B et al, 1983>. II.E.2.b. Ejercicio físico La utilización de suplementos de -carnitina por parte de atletas se ha hecho muy popular durante los últimos años incluso aunque no existen hasta el momento resultados inequívocos en el ser humano que apoyen esta actitud en corredores de fondo (Angelini C et al, 1986). Para ejercicios de intensidad máxima, la administración de 1—carnitina incrementa la captación máxima de oxigeno al favorecer los procesos aeróbicos, dando lugar a un mayor rendimiento (Vecchiet L et al, 1990). Por otra parte, esta misma dosis ha dado lugar a un aumento estadisticamente significativo en la distancia recorrida sobre cinta rodante por pacientes con claudicación intermitente (Brevetti G et al, 1986). En un estudio experimental realizado con rata en ejercicio, la admistración de 1-carnitina incremento la oxidación de ácidos grasos aunque no disminuyó la cantidad de glucógeno metabolizado durante el ejercicio tísico (Decombaz JE et al, 1990>. En otro estudio en el que se utilizó el mismo modelo experimental, la administración de 1—carnitina no incrementó la capacidad de ejercicio de los animales ni tampoco la glucogenolisis muscular o hepática; además, la hipocarnitinemia inducida por la administración de d-carnitina no produjo efectos sobre el metabolismo energético durante el ejercicio hasta que no se alcanzó el rango de SDC «20 mpmol/L> (Smi B et al, 1990). La administración de 2 g de 1-carnitina por vía oral antes del inicio de una sesión de ejercicio máximo por Anexo 1 144 parte de personas moderadamenteentrenadas da lugar a disminuciones importantes en los niveles plasmáticos de lactato y piruvato con incremento en los de acetilcarnitina, probablementepor estimulación de la piruvato deshidrogenasa, lo que hace que el piruvato se dirija hacia la formación de acetilcarnitina y no de lactato (Siliprandi N et al, 1990). En el perro, la administración de 1—carnitina incrementa la fuerza muscular del dorsal ancho en un 34%, lo que es atribuido a una facilitación de la oxidación de los ácidos grasos en las células endoteliales (Dubelaar ML et al, 1991) Recientemente, Arenas y colaboradores han observado que los atletas entrenados pueden presentar disininución en los niveles de carnitina libre tanto en plasma como en músculo esquelético, efecto que parece deberse al incremento en las pérdidas de acilcarnitina de cadena corta por orina, y que puede revertirse por la administración de 1—carnitina exógena (Arenas ¿1 et al, 1991) II.E.2.c. Hiperlipidemia La 1—carnitina a una dosis de 3—4 g/dia permite disminuir de forma significativa las concentracionesséricas de colesterol total y/o triglicéridos, aumentando las de HDl—colesterol . Este patrón de modificación del perfil lipidico ha sido observado también en alcohólicos . II.E.2.g. Aumento del surfactante pulmonar En la rata, la administración de 1-carnitina a la madre gestante estimula de forma significativa la síntesis de fosfolipidos en los neumocitos tipo II del pulmón fetal, incrementándose de esta forma el contenido de dipaliaitoil-fosfatidilcolina . En el modelo de trasplante pulmonar en el perro, la 1 — carnitina también incrementa de forma significativa el contenido de dipalmitoil-fosfatidilcolina en el lavado brocoalveolar mejorando la función del pulmón injertado, lo que se ha atribuido a un amortiguamiento del efecto isquémico sobre el metabolismo de los neumocitos tipo II (Klepetko W et al, 1990) II.E.2.h. Efecto trófico sobre el músculo esquelético Anexo 1 148 La administración de 2 g/dia de 1-carnitina por vía IV durante 12 meses a pacientes en hemodiálisis crónica ha producido un importante incremento en los niveles de carnitina en plasma y músculo además de hipertrofia y predominio de fibras tipo 1, sin modificaciones en las fibras tipo II; los autores de este estudio utilizan parámetros morfométricos y sugieren que la 1—carnitina presenta un efecto trófico especifico sobre las fibras musculares de tipo 1 caracterizadas por su metabolismo oxidativo (Spagnoli LO et al, 1990>. II.E.2.i. Efecto protector frente a la toxicidad por MPTP La adición de 1-carnitina a cultivos de hepatocitos tratados con 1—metil—4—fenil-1, 2,3, 6-tetrahidropiridina (MPTP) impide la depleción celular de ATP producida por este compuesto tóxico, probablemente porque su toxicidad está mediada por alteraciones en el metabolismo de los ácidos grasos (Snyder 3W et al, 1990). II.E. 2. j. 1-acetilcarnitina En el contexto clínico—experimental, el derivado de la carnitina que ha sido estudiado con mayor intensidad en los últimos años es la 1—acetilcarnitina. La 1—acetilcarnitina es un precursor de la acetilcolina porque los grupos acetil—CoA citoplásmicos constituyen el sustrato de la colina acetiltransferasa, lo que explica la utilidad de la 1—acetilcarnitina en los déficit colinérgicos (White HL et al, 1990). Anexo 1 149 La acetilcarnitina facilita la liberación de acetilcolina por receptores muscarinicos M3 en el hipocampo de la rata, receptores implicados en el proceso de envejecimiento . Este éster de la carnitina ha sido utilizado con buenos resultados: — En la depresión y el síndrome cerebral orgánico del anciano (Sinforiani E et al, 1990; Bella R et al, 1991), —En el tratamiento de los déficit cognitivos que produce el alcoholismo crónico (Tempesta E et al, 1990), —En la demencia de tipo Alzheimer especialmente por su efecto beneficioso sobre las alteraciones de la memoria reciente, —En la demencia que acompaña a la enfermedad de Huntington (Goety CG et al, 1990), —En la potenciación de los efectos regenerativos del nervio ciático tras su sección y reparación (Fernandez E et al, 1990), —En los déficit cognitivos asociados al envejecimiento en ratas (Markowska AL et al, 1990; Blokland A et al, 1990) debido probablemente a que la 1—acetilcarnitina normaliza el incremento en los niveles de colesterol libre y Anexo 1 150 esterificado que presenta la rata de edad avanzada . — En los patrones de sueño nocturno en la enfermedad de Parkinson (Puca FM et al, 1990>, — En los tiempos de reacción de los pacientes con insuficiencia cerebrovascular (Arrigo A et al, 1990) debido probablemente a que incrementa el flujo sanguíneo cerebral , — Potenciando la inhibición recurrente de los pacientes con paraparesia espástica (Mazzocchio R et al, 1990), —En el shock circulatorio de origen séptico, cardiaco o traumático por su capacidad para reestablecer la actividad enzimática inhibida por la hipoxia actuando como donante de grupos acetilo (Gasparetto A et al, 1991) —En las disfunciones retinianas con vulnerabilidad selectiva para las frecuencias espaciales de tipo medio— alto debido a su efecto excitador sobre la transmisión colinérgica (Falsini B et al, 1991), —En la reinervación muscular tras denervación II.F. Toxicidad y efectos colaterales La 1—carnitina se tolera muy bien y no presenta practicamente toxicidad. Para dosis muy elevadas, hasta 15 g/día, se han observado casos esporádicos de episodios diarréicos (Snyder TM et al, 1982>. Las dosis más habituales de 2 g/dia por vía oral pueden dar lugar a gastralgia, náuseas y diarrea en un 2%-6% de pacientes. La administración de dí—carnitina a pacientes urémicos ha dado lugar a cuadros de tipo miastenia gravis, lo que no se ha observado nunca en los tratamientos con 1 — camnitina, y que se ha atribuido al acúmulo del isómero d de la camnitina en los pacientes con insuficiencia renal, acúmulo que podría dar lugar a un bloqueo de tipo hemicolinico . No se ha observado toxicidad discernible por 1—carnitina ni siquiera tras la administración de dosis elevadas por via IV para el tratamiento de cuadros de acidurias orgánicas (Roe CR et al, 1990). Anexo 1 153 III. Acido vaiproico III.A. Caracteristicas generales El ácido 2-propilpentanoico (ácido vaiproico, VPA) es un fármaco antiepiléptico que fue sintetizado por primera vez por Burton en 1881. Sus propiedades anticonvulsivantes fueron descubiertas de forma casual en 1962 cuando Meunier, utilizando ácido valproico como disolvente orgánico de medicamentos cumarínicos, observó que los animales inyectados quedaban protegidos de las crisis convulsivas que desencadena el pentametilentetrazol. Su estructura química difiere de la de cualquier otro fármaco antiepiléptico conocido. Es un ácido graso de cadena corta, abierta y ramificada que carece de grupos heterociclicos aromáticos y que no presenta en su estructura ningún átomo de nitrógeno. En España se comercializa en forma de propilpentanoato sódico (valproato de sodio, Depakine, Labaz) que es la sal sódica del ácido valproico y cuyas fórmulas son: Empírica: CE HíS 02 Na Estructural: CH3—CH2-CH2 \ CH-C=O CH3—CH2—CH2 / ¡ O Na Anexo 1 154 En su forma física, el valproato sódico es un polvo blanco, inodoro, higroscópico, microcristalino y con un sabor ligeramente picante. Muy soluble en agua y alcoholes como metanol y etanol, y escasamente soluble en disolventes orgánicos menos polares. Su peso molecular es de 166,2 y su pKa de 4,95. En EE.UU. se comercializa en forma de sodio—hidrógeno bis (2—propilpentanoato> a nivel cerebral. El CABA es un aminoácido no proteico (amina biógena), producto de la decarboxilación del ácido glutámico, que existe normalmente en concentraciones elevadas en el cerebro y que actúa como neurotransmisor para neuronas inhibidoras y como bloqueante de sinapsis. Su fórmula estructural es: Anexo 1 155 CH2-0H2—COOH NH2 Además, el GABA se encuentra intercalado en una ruta secundaria del ciclo del citrato: en el cerebro, practicamente todo el ácido alfa-cetoglutárico se transforma en ácido glutámico que es decarboxilado a CABA, que posteriormente sufre transaminación hacia hemialdehido succinico siendo este, a su vez, oxidado a ácido succinico que se reintroduce en el ciclo de Krebs. Aunque de forma predominante en el sistema límbico (Nagaki S et al, 1990), el VPA incrementa los niveles de CABA en diversas regiones del sistema nervioso central (SNC> a través de la: - Activación de la glutámico descarboxilasa (Schmutz M et al, 1979> - Inhibición de la alfa—cetoglutarato deshidrogenasa, lo que incrementa el aporte de alfa—cetoglutarato hacia la formación de CABA inhibiendo el ciclo del ácido cítrico — Disminución selectiva de la corriente de calcio de bajo umbral (Kelly et al, 1990). — Disminución de los niveles de somatostatina en SNC (Nagaki 5 et al, 1990). — Acumulación de valproil—CoA (2—propilpentanoil- CoA, un metabolito del VPA identificado previamente en el hígado) en el SNC, metabolito que contribuiría a la actividad antiepiléptica del VPA estimulando la actividad de la Na+, K+-ATPasa cuando la concentración cerebral de ATP es baja . Además, mediante autorradiografia, se ha observado el depósito practicamente selectivo de VPA marcado con 14C en las porciones medial y dorsal . Anexo 1 159 III.C.2. Distribución y fijación a proteinas Una vez absorbido, el VPA se une parcialmente a proteinas mientras que otra parte circula en forma libre. Unicamente se metaboliza la forma libre, de manera que probablemente los efectos antiepilépticos y tóxicos del VPA están en relación con la concentración de la fracción libre del mismo (Scheyer RD et al, 1990). Por esta razón, para el ajuste de dosis en pacientes se prefiere utilizar el cociente nivel plasmático libre de VPA/dosis al cociente nivel plasmático total de VPA/dosis (Abadin JA et al, 1991> Existe una fuerte correlación positiva entre la dosis de VPA (mg/kg/dia) y los niveles séricos total y libre de VPA hasta el límite de 15 mg/kg/dia, a partir del cual ambos niveles de VPA no aumentan proporcionalmente a la dosis administrada (Ieiri 1 et al, 1990). El porcentaje de fracción libre para concentraciones totales elevadas presenta una amplia variabilidad inter e intra individual . Otros factores que influyen en las concentraciones total y libre de VPA en plasma son la concentración de albúmina, el nivel de transaminasa glutámico oxalacética y la administración simultánea de carbanacepina o fenitoina que disminuyen el cociente nivel/dosis del VPA Tambien disminuye la fijación a proteinas en ciertos estados fisiológicos como el envejecimiento (Bauer LA et al, 1985), la época neonatal (Cal P et al, 1988), y el embarazo (Nau H et al, 1986>; y en algunos estados patológicos como la insuficiencia renal (Orr 3M et al, 1983) , la hemodiálisis (Bruni ¿1 et al, 1980) , la insuficiencia hepática (Klotz U et al, 1978 y la diabetes mellitus (Gatti G et al, 1987>. La disminución del porcentaje de VPA unido a proteínas en estos estados fisiológicos y patológicos hace que en todos ellos se incremente de forma proporcional el nivel de valproato libre con la consiguiente posibilidad de toxicidad. Por ello, se recomienda en estos pacientes la monitorización del cociente nivel de valproato libre/ dosis. El volumen aparente de distribución del VPS, determinado Anexo 1 161 en relación con la concentración total en plasma, es de 0,1—0,41 L/Kg El tejido donde se fija preferencialmente el valproato es el SNC, donde se han observado concentraciones del 6,8%— 27,9% de los niveles plasmáticos totales (p\0.O5) en pacientes tratados desde 72 horas antes de una craneotomia (Vajda FJE et al, 1981). No obstante, en otro estudio no se observó correlación entre los niveles detectados en parénquima cerebral y los medidos en liquido cefalorraquideo , lo que sugiere un mecanismo asimétrico de transporte a través de la barrera hemato—encefálica (BHE) para el valproato (Loscher W et al, 1988). Se ha propuesto que el VPA atraviesa la EHE mediante un sistema transportador especifico para ácidos monocarboxilicos situado en la BHE y dependiente del pH (Kang YS et al, 1990) El VPS se excreta escasamente por la saliva debido a su bajo pKa, por lo que sus niveles en este medio no reflejan probablemente su concentración libre en plasma (Knott C et al, 1984). En el semen de voluntarios sanos, los niveles de VPS son bajos con relación a los niveles de la forma libre en plasma . En el momento del nacimiento, los niveles séricos de VPS en el cordón umbilical son superiores a los observados en la sangre de la madre, lo que se atribuye al incrmento de las concentraciones séricas maternas de ácidos grasos en el momento del nacimiento, lo que da como resultado un Anexo 1 163 desplazamiento parcial del valproato de los puntos de fijación maternos; el mayor grado de fijación protéica en el feto en este momento favorece la transferencia placentaria adicional con acumulación del fármaco en el feto (Albani F et al, 1979). En el ratón se ha propuesto que el VPA atraviesa la barrera placentaria debido a gradientes de pH (Srivastava M et al, 1991). 111.0.3. Eliminación II.C.3.a. Aclaramiento plasmático El aclaramiento plasmático total es el producto del flujo de sangre hepático y la proporción de extracción hepática. Para el valproato, la prporción de extracción hepática es baja, más baja incluso que la fracción libre, lo que indica que su aclaramiento plasmático es de tipo restrictivo limitándose unicamente a la fracción libre, y que este aclaramiento es independiente del flujo sanguineo hepático (Klotz U et al, 1977>. En voluntarios sanos, el aclaramiento plasmático de valproato oscila entre 7 y 11 mL/hr/kg y, al igual que el volumen de distribución, es independiente de lLa via de administración y mayor en niños que en adultos (Hall K et al, 1985; Levy PH et al, 1982). II.C.3.b. Vida media de eliminación La vida media de eliminación del valproato es de 8 a 20 horas, tanto en tratamientos crónicos como en estudios de dosis única, lo que sugiere que en el metabolismo del Anexo 1 164 valproato no se produce saturación ni autoinducción (Hall K et al, 1985). Recientemente se ha observado que, al menos en la rata, el VPA si produce una autoinducción de su metabolismo en tratamientos crónicos (Fisher JE et al, 1991) En neonatos y ancianos, la vida media de eliminación es más larga, mientras que la administración simultánea de fármacos antiepilépticos con capacidad de inducción enzimática está considerablemente disminuida (Cramer JA et al, 1986). II.C.3.c. Aclaramiento renal Dado que el valproato se metaboliza de forma casi completa en el hígado, su eliminación por orina en forma inalterada es muy pequeña, correpondiendo al 1.8% de la dosis oral única y al 3,2% de la dosis en situación de nivel estable . El aclaramiento renal de la forma libre de valproato es muy pequeño en comparación con la tasa de filtración glomerular, lo que sugiere que se reabsorbe de forma importante (Levy PH et al, 1982). En cuanto a la eliminación renal de los metabolitos del valproato sódico, se ha observado en ratas la eliminación en la orina de las primeras 24 horas del 40—50% de la dosis única administrada, principalmente en forma de VPA conjugado y de productos de la omega—oxidación (5—OH-VPA, ácido 2—propil—glutárico); en tratamientos crónicos le eliminación renal de los metabolitos se aproxima al 75%, fundamentalmente en forma de productos de la glucuronidación y de la beta-oxidacón del VPA (sin modificación o incluso disminución de los productos de la Anexo 1 165 omega-oxidación), lo que sugiere que, al menos en la rata, el VPA da lugar a una inducción de su propio metabolismo en tratamientos prolongados (Fisher JE et al, 1991> En pacientes con insuficiencia renal se observa un aumento del volumen de distribución y del aclaramiento plasmático total, posiblemente como resultado de la menor fijación a proteinas con el consiguiente incremento en la proporción de valproato libre (Robson Rl-! et al, 1980; Orr 3M et al, 1983). Se ha observado una buena correlación entre el porcentaje de valproato libre y el nivel de creatinina en suero, el aclaramiento de creatinina, el nivel de nitrógeno y ácido úrico en sangre en pacientes con insuficiencia renal no sometidos a diálisis . La hemodiálisis disminuye de forma más importante la fijación a proteínas debido a que la heparina administrada durante la misma activa la lipoprotein— lipasa, produciendo como resultado un importante incremento de ácidos grasos libres en suero, ácidos grasos que compiten con el valproato por los puntos de fijación a la albúmina (Bruni ¿1 et al, 1980). De todas formas, ni la diálisis peritoneal ni la hemodiálisis dan lugar a una eliminación significativa de valproato para concentraciones plasmáticas terapéuticas del mismo Anexo 1 166 con niveles muy altos de la forma libre, la hemodiálisis permite una eliminación importante de valproato , que es deshidroqenado a 2-propil-2-pentenoil-CoA por La 2—metil—cadena ramificada acil-CoA deshidrogenasa, e hidratado a 3-OH-2-propilpentanoil—CoA por la enoil—CoA hidratasa
  • . Para dosis muy bajas, la vía metabólica principal para el valproato es la beta—oxidación mitocondrial (Granneman GR et al, 1984) . Para dosis mayores aumenta la proporción de fármaco metabolizada a través de omega— y omegal— oxidación microsomal, y para las dosis del rango terapéutico la vía metabólica principal es la glucuronización (Chapman A et al, 1982), de manera que en la orina de las primeras 24 horas se elimina en forma de glucurónido el 70% de la dosis administrada (Cugler R et al, 1980). En relación a las proporciones relativas de oxidación mitocondrial (beta) y microsomal (omega y omegal), se ha observado un patrón invertido en al menos un estudio experimental sobre rata en el que, tras la administración de 200 mg/kg/a hr mediante inyección intraperitoneal durante 6 semanas, los autores detectan un incremento importante en la eliminación renal de metabolitos procedentes de la beta—oxidación con disminución relativa en la eliminación de los procedentes de las oxidaciones microsomales, lo que atribuyen a una autoinducción del Anexo 1 168 VPA sobre su propio metabolismo en tratamientos prolongados (Fisher JE et al, 1991>. El patrón de los metabolitos del valproato en suero en condiciones normales parece ser estable en tratamientos a largo plazo y la administración simultánea de otros fármacos que estimulan la oxidación microsomal del valproato . No obstante, los estudios efectuados en animales de experimentación utilizando 2—en VPA demuestran que este metabolito es más potente que el fármaco inicial cuando en los cálculos se toman en cuenta factores como la fijación a proteinas y la distribución tisular del VPA y el 2-en VPA, por lo que la actividad antiepiléptica de los metabolitos en tratamientos prolongados puede ser significativamente mayor que la calculada a partir de sus concentraciones en plasma (Loscher W et al, 1983; Keane PE et al, 1985). Además, el 2—en VPA parece desempeñar un papel predominante en los cuadros de toxicidad neurológica por sobredosis de VPA (Dupuis RE et al, 1990>. A pesar de ello, los niveles de metabolitos del valproato observados en el LCR de niños epilépticos tratados de forma crónica son muy bajos . En términos generales, los metabolitos insaturados (2—en VPA, 3—en VPA, 4—en VPA) presentan una mayor fijación a proteínas que el VPA, posiblemente porque la presencia de un doble enlace en su esqueleto carbonado incrementa su afinidad por la albúmina. Por otra parte, las vidas medias de aclaramiento son más largas para todos los metabolitos en comparación con la que presenta el compuesto inicial, fundamentalmente los metabolitos no saturados, que se eliminan más lentamente que los hidroxilados (Pollack CM et al, 1986). III.D. Utilización clínica III.D.l. Como antiepiléptico En la actualidad, se considera que el tratamiento inicial de la epilepsia debe efectuarse mediante monoterapia con algún agente antiepiléptico de primera línea como fenitoina, fenobarbital, primidona, carbamazepina, etosuximida, benzodiacepinas, acetazolamida o ácido valproico . Posteriormente, en distintas series de estudio sobre pacientes se ha demostrado que el valproato es muy efectivo en epilepsias generalizadas primarias, especialmente en ausencias y crisis miocónicas, y que, al Anexo 1 170 igual que otros antiepilépticos, es menos eficaz en las crisis parciales (Dulac O et al, 1984). En 1988 lo estaban recibiendo más de 1.000.000 de pacientes en todo el mundo para el tratamiento de cuadros convulsivos (Binek ¿1 et al, 1991). En los estudios comparativos de la monoterapia de valproato con la administración de otros fármacos antiepilépticos como clonazepam (Shakir RA et al, 1979), etosuximida y carbamazepina (Loiseau P, 1984), el valproato ha presentado una eficacia al menos similar a la de los otros fármacos. En un estudio efectuado en 1987 se concluye que el valproato es un agente monoterapéutico tan eficaz como la carbamazepina y la fenitoina en el tratamiento de las crisis generalizadas primarias y secundarias, y de las crisis parciales (Chadwick DW, 1987>. Numerosos autores señalan que en el control y el pronostico de las crisis, y además del fármaco antiepiléptico utilizado, desempeñan un papel fundamental otros factores como son el tipo de crisis, la edad de comienzo del cuadro, la frecuencia de las crisis, la historia previa prolongada de crisis y la presencia de sintomas neurológicos o psiquiátricos asociados (Turnbull DM et al, 1985; Oallaghan N et al, 1985). En España, el laboratorio fabricante del valproato sódico recomienda la dosis de 30 mg/kg en neonatos, 20-30 mg/kg para adolescentes y adultos, y 15—20 mg/kg para alcanzar niveles plasmáticos suficientes para conseguir actividad antiepiléptica. El valproato tiene éxito habitualmente en los siguientes tipos específicos de crisis: III.D.l.a. Crisis de ausencia La monoterapia con valproato constituye un tratamiento de primera línea para todas las formas de crisis de ausencia, fundamentalmente las simples (petit mal> y las complejas; en las ausencias mioclónicas es más eficaz cuando se administra junto a etosuximida (Dulac O et al, 1984; Rowan AJ et al, 1983; Covanis A et al, 1982; Jeavons PM et al, 1977). También se ha utilizado en los estados de ausencia (Sander 3W et al, 1990>. III.D.l.b. Crisis mioclónicas Fundamentalmente la epilepsia mioclónica juvenil, en la que la monoterapia con valproato permite un control adecuado o total de las crisis mientras que los demás fármacos antiepilépticos son ineficaces . III.D.l.d. Epilepsia fotosensible: Anexo 1 172 La monoterapia con valproato permite conseguir un control adecuado en el 57% de los casos (Jeavons PM et al, 1986). III.D.1.e. Epilepsia parcial Incluye los cuadros de crisis parciales simples, crisis parciales complejas y crisis tónico—clónicas secundariamente generalizadas. Aunque el valproato es más eficaz en las parciales simples y en las tónico—clónicas generalizadas, tomando en conjunto todas las crisis parciales se obtiene una desaparición de las crisis a largo plazo en el 43% de los pacientes tratados con este fármaco en forma de monoterapia (Dean SC et al, 1988; Dulac O et al, 1986). III.D.l.f. Síndrome de West El valproato permite controlar la frecuencia de las crisis en un 70% de los pacientes y hace desaparecer el cuadro en aproximadamente un 30% de los mismos (Kotlarek F et al, 1987; Dulac O et al, 1986; Prats 3M et al, 1991>. En un estudio sobre 13 pacientes, la administración de valproato junto con vitamina B6 dió lugar a la aparición de un número significativamente menor de crisis que la administración aislada de valproato ( Ita M et al, 1991). Además, en el tratamiento de este síndrome es al menos igual de eficaz que la adrenocorticotropina (ACTH) sin producir efectos adversos tan importantes (Dyken PR et al, 1985). Anexo 1 173 III.D.1.g. Síndrome de Lennox—Gastaut Es una de las epilepsias de más dificil tratamiento. Aún así, la monoterapia con valproato permite la disminución del 80% de las crisis . b. Como alternativa al carbonato de litio en los pacientes con psicosis maniaco—depresiva resistentes a este tratamiento (Post PM, 1990; Mauri MC et al, 1990; Shliselberg N et al, 1990; Calabrese JR et al 1990>. c. Actividad antiulcerogénica en ratas, al igual que el N—ftaloil CABA (Bhowmick 5 et al, 1990). d. En el tratamiento de la corea de Sydenham, a dosis de 15—20 mg/kg/dia (Daoud AS et al, 1990). e. Efectos ansioliticos en diferentes pruebasde conducta animal (ratas>, asX. como otros agonistas CABA como muscimol y baclofen (Shephard RA et al, 1990>. f. Atenúa el desarrollo de hipertensión en ratas con hipertensión espontánea, al igual que el agonista del receptor GABA muscimol (Sasaki 5 et al, 1990). g. En trastornos fóbicos (Primeau F et al, 1990> h. En el tratamiento de la incontinencia anal de grado Anexo 1 174 leve en pacientes sometidos a anastomosis ileo—anal (Kusunoki M et al, 1990). i. En el tratamiento de los cuadros coreiformes asociados al envejecimiento (Hoffman AS et al, 1990) j. En la toxicidad aguda por cocaína disminuye de forma notable el cuadro convulsivo (Derlet RW et al, 1990>. k. En el tratamiento de la epilepsia postraumática (Fesler FA, 1991>. 1. Para el control rápido de los cuadros de manía aguda , incluso en el contexto del síndrome de Down (Sovner R, 1991), y en las formas de manía del anciano (McFarland BH et al, 1990>. in. En hamsters dtsz mutantes atenúa los movimientos distónicos (Fredow G et al, 1991). n. En la profilaxis de la cefalea recidivante crónica (Mathew NT et al, 1991). ñ. En el tratamiento de la enfermedad de Cushing de origen hipotaláinico por su acción inhibidora de la hormona liberadora de corticotropina (CRI) (Beckers A et al, 1990; García—Rojas JF et al, 1991). o. En el tratamiento de la mioclonia espinal (Jimenez EJ et al, 1991). p. En el control de las mioclonias en la enfermedad de Huntington (Vogel CM et al, 1991). Anexo 1 175 q. En el tratamiento de la esquizofrenia, asociado a neurolépticos (Moriñigo A et al, 1989>. r. En la estabilización a largo plazo de los cuadros de migraña (Raskin NH, 1990). III.E. Toxicidad y efectos secundarios III.E.1. Efectos hepáticos El mecanismo responsable de la hepatotoxicidad del ácido valproico no ha sido completamente aclarado aunque parece de tipo idiosincrásico, no relacionado con la dosis, y relacionado con alguna alteración metabólica que da lugar a la aprición de metabolitos tóxicos (Ziinmerman HJ et al, 1982; Lenn NJ et al, 1990). Se ha propuesto que la hepatotoxicidad del valproato puede representar las consecuencias de una sobrecarga del mismo debido a una capacidadlimitada de la beta—oxidaciónmitocondrial del valproato, fundamentalmente en la fase catalizada por las acil—CoA deshidrogenasas de ácidos grasos, con el consiguiente acúmulo de algún producto tóxico procedente del metabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada (Eadie MJ et al, 1990) y la subsiguiente alteración en el metaboUsmo de los ácidos grasos (Appleton RE et al, 1990> La toxicidad hepática se manifiesta en forma de cuadros de insuficiencia hepática aguda de tipo Reye y de caracter mortal, y en forma de elevación asintomática de transaminasas. Esta última suele tener carácter transitorio, responde a la disminución de la dosis y su Anexo 1 176 incidencia en pacientes que reciben tratamientos prolongados es de aproximadamente el 11% (Powell—Jackson PR et al, 1984). Los cuadros de insuficiencia hepática grave son mucho menos frecuentes, del arden de 1 caso por cada 7,000 pacientes que reciben valproato, y aparecen claramente relacionados con varios factores de riesgo: a. Alteraciones metabólicas congénitas, fundamentalmente las relacionadas con el ciclo de la urea (deficiencia de ornitina—carbamiltransferasa) (Hjelm M et al, 1986; Kay JDS et al, 1986) y la deficiencia de carnitina (Coulter DL, 1984). b. Enfermedad cerebral orgánica asociada a crisis graves, retraso mental u otras enfermedades neurológicas (Dreifuss FE et al, 1987). c. Politerapia: La administración simultánea de fenobarbital, fenitoina o carbamazepina, que tienen capacidad inductora sobre el citocromo P—450, hace posible la producción de metabolitos tóxicos del valproato a traves de la w—oxidación . Los síntomas prodrómicos específicos de la toxicidad hepática aguda son vómitos, anorexia, aletargamiento, debilidad, somnolencia, edema, ictericia y pérdida del control de las crisis (Jeavons PM, 1984). Anexo 1 177 La identificación de los pacientes de riesgo elevado ha dado lugar a una disminución ostensible en la frecuencia de aparición de los cuadros de insuficiencia hepática aguda de caracter mortal (Dreifuss FE et al, 1988; Willmore U et al, 1991). Aunque en algunos casos la supresión del fármaco ha dado lugar a la recuperación del paciente (Thygesen ¿1 et al, 1982>, en otros ha progresado hacia un coma irreversible a pesar de la interrupción en la administración de valproato. III.E.2. Efectos pancreáticos Se han descrito cuadros de hiperamilasemia asintomática y cuadros de pancreatitis aguda. Los primeros suelen ser de naturaleza transitoria (Bale JE et al, 1982). En relación con la pancreatitis aguda, su incidencia es escasa en los pacientes en tratamiento con valproato, y no parece ser un efecto relacionado con la dosis (Williams LHP et al, 1983). Se inicia con náusea, dolor abdominal agudo y vómitos y puede dar lugar a una pancreatitis hemorrágica (Wyllie E et al, 1984>. Al menos en un caso ha presentado una evolución mortal en asociación con insuficiencia hepática aguda (Bouget J et al, 1990). III.E.3. Efectos metabólicos El efecto metabólico del valproato que tiene mayor repercusión en clínica es la hiperamonemia. Se ha propuesto que la hiperamonemia es fundamentalmente Anexo 1 178 de origen renal: los riñones liberan hacia el torrente circulatorio una cantidad de amoniaco superior a la normal debido, posiblemente, a un incremento del catabolismo de la glutamina o a una disminución en la síntesis de la misma . Otros factores que aumentan la incidencia de hiperamonemia en pacientes que reciben valproato son la ingesta de carbohidratos y proteinas (Laub MC, 1986> y el ejercicio físico (Zaret BS et al, 1985). III.E.4. Efectos hematológicos El efecto hematológico principal del valproato es la Anexo 1 179 trombocitopenia, que es infrecuente y que habitualmente responde a la supresión o a la disminución de la dosis del fármaco. La normalidad del componente megacariocitario en la médula ósea de los pacientes que han presentado esta complicación sugiere que la trombocitopenia se debe a un consumo excesivo de plaquetas . También se ha propuesto un mecanismo inmunológico para la trombocitopenia debido a la observación de anticuerpos IgM circulantes o fijados a plaquetas . b. Prolongación del tiempo de hemorragia . d. Disminución en los niveles de fibrinógeno . Independientemente de la hiperamonemia, el valproato puede dar lugar a cuadros de estupor, confusión y coma en pacientes aislados, posiblemente por una acción sedante intrinseca del valproato a nivel cerebral . III.E.6. Otros efectos a. Gastrointestinales: Su incidencia es muy variable, oscilando entre el 6% y el 45%, y consisten en pirosis, nauseas, vómitos, diarrea y anorexia (Covanis A et al, 1982). Su incidencia disminuyó en gran medida al sustituir la formulación ácida (ácido valproico) por la Anexo 1 181 sal sódica correspondiente (valproato sódico) (Sherard ES et al, 1980>. La introducción de grageas con recubrimiento entérico ha eliminad en la práctica los efectos secundarios gástricos . Posiblemente, el efecto adverso más frecuente producido por la administración de valproato es el aumento de peso de los pacientes, aumento que está en relación con el aumento del apetito, el incremento en el depósito de grasa y el edema que aparece e ocasiones en este tipo de pacientes (Egger J et al, 1981; Dinesen E et al, 1984). c. Dermatológicos: Los más frecuentes son los cambios en la neturaleza del cabello, cuya incidencia oscila entre el 2.6% y el 11%, y qu consisten en adelgazamiento y ondulación del mismo (Gupta AR, 1988). En ocasiones se produce alopecia transitoria (Hassan MN et al, 1976). Se han descrito también casos muy aislados de erupciones cutáneas de caracter inespecifico y evolución autolimitada (Bruni ¿1 et al, 1983), así como un caso de porfiria cutánea tarda y de vasculitis cutánea . En embriones de ratón se ha demostrado un acúmulo selectivo del valproato en el neuroepitelio (Dencker L et al, 1990). Se ha descrito también un “síndrome valproico fetal” de caracter dismórfico que incluye aplasia radial bilateral, focomelia proximal unilateral en miembro superior, hipoplasia renal y atrofia cerebral (Verloes A et al, 1990) e. Sobredosis: La sobredosis accidental o voluntaria produce depresión grave del SNO y dificultad respiratoria con fallecimiento para concentraciones plasmáticas 20 veces superiores a los niveles terapéuticos (Schnabel E et al, 1984). A nivel sistémico, la sobredosis de valproato produce hiperamonemia, trombocitopenia y pancreatitis (Bigler D, 1985). A nivel bioquímico, se han observado hiperamilasemia, hipocalcemia, hipernatremia e hiperglucemia - Agitar y dejar en hielo 10 minutos — Oentrifugar 1,5 minutos a 8000 rpm — Se decanta el sobrenadante, que contiene CL y SOAC — El precipitado se lava dos veces con 1000 uL de PCA 0,3 N centrifugándose cada vez 1,5 minutos a 8000 rpm 2. Dosificación diferencial de carnitina y ésteres de cadena corta — Se incuba 45 minutos a 37 0 — Se neutraliza con HOl 2 N (aprox, 3 gotas) utilizando pH—metro - Añadir 20 uL de Hepes KOH 0,5 M a pH 7 — Obtenemos ésteres de cadena corta 3. Obtención - Al de ésteres de cadena larga (012-020): precipitado lavado con PCA se le añaden 400 uL de H20 — 1 gota de Rojo Fenol — Se sonica — Se añaden 30 uL de 1<11003 3M * — Se incuba 90 minutos a 56 0 - Reneutralizamos con HOL 2N 100 uL - NEM 3 mM (3,8 mg/lmL) 100 uL - Hepes EDTA KOH 0,5 M pH 7 500 uL 5. Preparación de la curva standar: Mezcla standar - 100 uL de Hepes KOH a pH 8,5 — Gota de Rojo Fenol - 1000 uL de PCA - 1000 uL de 1-carnitina 25 uM - 380-400 uL de CO3HK hasta pH 7 — Hacemos las siguientes fracciones Fracciones H20 Mezcla standar Blanco 500 uL —- 400 400 uL 100 uL 800 300 uL 200 uL 1600 100 uL 400 uL - Añadir a cada fracción 20 uL de Hepes 1<011 a pH 7 6. Dosificación radioquimica — 100 uL de muestras (por duplicado) — 100 uL de mezcla de incubación — 20 uL de CAT (diluida al 1/10) — Agitar y dejar 30 minutos a temperatura ambiente - Añadir 300 uL de resma Dowex 400 mientras se agita - Agitar y 5 minutos en hielo (3 veces) - Centrifugar 2 minutos a 8000 rpm — Coger 300 uL de sobrenadante — Añadir 3 mL de liquido de centelleo Anexo 3 186 — Agitar bien — Esperar 24 h — Leer en contador II. Técnicas histoquimicas A. NADH—deshidroczenasa (Nachías MM et al, 1958) a) Incubación 30 mm, a 37’C en una solución a pH 7,4 con: - Buffer tris 0,2 M (pH 7,4> R(Sigma T—1503 ) lOmí — Nitroazul de Tetrazolio (Sigma 6876R)~• 10 mg — NADH (DPNH) a) Incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos en una solución a pH 9,4 con: — Buffer barbital-acetato 0,1 M 2 ml — Cloruro cálcico 0,18 M 2 ml — Agua destilada 6 ml b) Incubación a temperatura ambiente durante 45 minutos en una solución a pH 9,4 con: — Buffer barbital—acetato 0,1 M 2 ml Anexo 3 187 — Cloruro cálcico 0,18 M 1 ml — Agua destilada 7 ml — ATP, sal sódica 25 mg c> Lavado en tres baños de cloruro cálcico al 1% durante un total de 10 minutos d) Lavado en cloruro de cobalto (Merck 2539> al 2% durante 3 minutos e) Lavado en ocho baños de buffer barbital—acetato 0,01 M f) Lavado en agua corriente durante 60 segundos g) Lavado en solución de sulfuro de amonio Incubación en buffer barbital—acetato a pH 4,2 durante 5 minutos b) Lavado con la solución del paso a) de la técnica 4 durante 30 segundos c) Posteriormente se siguen los mismos pasos que los descritos en la técnica n’ 4 a partir del b) Anexo 3 188 inclusive El buffer barbital-acetato utilizado en las técnicas de histoquimica para demostración de ATP-asa (A, B y O) se prepara de la siguiente manera: a> Solución de: — Acetato sódico 1/7 M (Merck 6267R) .. 19,43 g — Barbital sódico (Merck 6318R) 29,43 g — Agua destilada 1 1 b> El buffer se prepara con 50 ml de esta solución, 20 inI de cloruro sódico al 8,5% y ácido clorhídrico 0,1 N <1 ml para la ATP-asa A, 101,5 ml para la ATP-asa B y 117,5 ml para la ATP—asa completando con agua destilada hasta 250 ml. E. SDH .... 100 mg R — Nitroazul de tetrazolio (Sigma 6876 ) 10 mg — Buffer tris 0,1 M (Sigma TlSO3R) lo mí b) Pases sucesivos por acetona al 30%, 60%, 90%, 60% y 30% c) Lavado en agua destilada R d) Montaje en medio acuoso 42,74 (223) 42, 51< 173> 43,70(211) 48,95(237> 54, 10(215) 52,58<185) 47,88(243) 51,30(217) 50,33(256) 47,15(56) 35,33(77> 39,67<22> 50, 71<42> 31,49< 1) 3 11 57,05(243) 3 12 60,95<234) 3 13 51,10(213) 3 14 53,42(188> 3 15 57,11<235) 4 16 50,54(265) 4 17 54,42(220) 4 18 50,05(277) 4 19 54,04(233) 4 20 50,65(270) 30,82< 1> 46,23 (34) 45, 46 (51) 49,19<46) 29,93( 1) 22,55< 1) 41,64 <13> 46,99<19) 41,21(30) 55,80< 1> 30,57(36) 26,40<38) 28,24 (39) 28,21<27) 31,49(52> 26, 59 25,48(38> 39,23 (27) 29,48<39) 30,19(37) 38,44 (221> 39,87 (219) 40,77(214) 38, 98 (234) 44, 08 (2 14) 43,05 ~ 45, 51< 272) 51,41<245) 48,39(248> 47,09(280) 52,25<217) 49,43<247> 48,07(267> 50,07(245) 42,47 (302) 51,88 (~~> 43,05<70) 45,12(37) 47,76( 6) 37,80<35> 32,01 30,43 30,94 28,33 30,43 (26) (19) (30) ( 2) (19) 42,49(286) 44,94<267> 44,25(273) 48,07(242) 44,94 (267) 6 26 46,27(267) 6 27 50,41(268) 6 28 48,08(235) 6 29 49,24(234) 6 30 47,88(273) 46,63 47,43 49,37 46,28 47,43 <27) (36) (60) (21) <36) 26, 91< 23) 25,27(32> 24,62(26) 25,60(27) 25,60<27) 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 2 6 2 7 2 8 2 9 2 10 24,95 26,37 32,65 29,24 35,27 (29> (49) (23) (41) <16) 37,43 39,43 43,36 41,02 47,52 (202) (232> (238) <234) (197) 5 21 5 22 5 23 5 24 5 25 49,83 46,32 40,00 45,38 45,38 <242) (266) (299) (269> (269) Anexo 3 193 IV. Datos crudos de la morfometria ultraestructural A. Area mitocondrial Las mediciones de la superficie mitocondrial (en jA) efectuadas en el músculo sóleo (fibras tipo 1) de cada grupo de tratamiento fueron las siguientes (la cifra entre paréntesis indica el número de mediciones realizadas): SOLEO Grpl Grp2 Grp3 Grp4 Grp5 Grp6 0,02< 1> 0,02< 1> 0,01< 5) 0,01< 3) 0,0l( 4> 0,01( 1) 0,03( 6> 0,03( 2> 0,02(31) 0,02( 5) 0,02< 8) 0,02< 1) 0,04< 9) 0,04< ~> 0,03(33) 0,03< 3) 0,03< 9> 0,03( 7) 0,05<11> 0,05< 9) 0,04(20) 0,04( ~> 0,04< 2) 0,04< ~> 0,06< 5) 0,06< 9) 0,05(10) 0,05(10) 0,05(14) 0,05( 4) 0,07< 8) 0,07< 6) 0,06(14> 0,06( 1> 0,06< 6) 0,06( 7) 0,08< 4) 0,08( 6) 0,07< ~> 0,07( 2) 0,07< 2) 0,07< 5) 0,09( 3) 0,09( ~> 0,08< 2) 0,08< 4) 0,08( 1> 0,08(10) 0,l1( ~> 0,10< 4) 0,10< 1) 0,09< 1> 0,09< 1) 0,09< 4> 0,13< 3) 0,1l( 4) 0,11< 1) 0,10< 2) 0,1l( 1) 0,10< ~> 0,14< 3) 0,12( 3) 0,12< 2) 0,13< 2) 0,11< 3) 0,15< 2> 0,13< 2> 0,16< 2> 0,14< 2) 0,12< 2) 0,17< 1> 0,14< 1) 0,33< 1) 0,25< 1) 0,13< 3) 0,19< 1> 0,15( 4) 0,16< 1> 0,20( 1> 0,16< 1) 0,19< 1) 0,21< 1) 0,17< 3) 0,22< 2) 0,23< 1) 0,20< 1) 0,25< 1) 0,26< 1> 0,37< 1) 0,56< 1) Anexo 3 194 Con respecto al músculo ELD fueron las siguientes 0,03< 4) 0,04( 2) 0,05< 3) 0,06< 7) 0,07< 1> 0,08< 1) 0,09< 2> 0,11< 1> 0,12< 1) 0,13< 2> 0,14< 2> 0,18( 2) 0,19< 2> 0,21< 1) 0,23< 1) 0,43< i) 0,44< 1) 0,03( 3) 0,04< 3) 0,05< 9> 0,06< 7) 0,07< 7) 0,08< 1) 0,09< 2) 0,10( 3) 0,12< 2) 0,13< 2) 0,14< 2> 0,16< 1> 0,25< 1) 0,34< 1) 0,01< 1> 0,02< 4) 0,02< 8) 0,03< 6) 0,03(18) 0,04< 4) 0,04(18) 0,05< 1) 0,05< 5> 0,08< 2) 0,07< 3> 0,10< 2) 0,08< 1) 0,16< 1> 0,09< 1> 0,15< 1) B. Grosor de la banda Z A continuación se incluyen las mediciones del grosor de la banda 2, en ni», de los músculos sóleo (fibras tipo 1> y ELD (fibras tipo II) en cada grupo de tratamiento: 0,01(12) 0,02< 8) 0,03(11) 0,04< 9> 0,05( 5) 0,06< 4) 0,07< 2) 0,08< 2) 0,10< 3) 0,1l( 2) 0,13< 1) 0,16< 1) 0,01< 1> 0,02< 5) 0,03< 6) 0,04< 3) 0,05< 4) 0,06< 1> 0,07< 3) 0,08< 1) 0,10< 1> 0,11< 1> 0,12( 1) Anexo 3 195 Sóleo 1 2 3 4 5 6 130 140 130 120 140 150 110 130 120 140 130 130 130 120 140 140 110 130 120 140 120 120 110 100 120 100 140 110 110 150 120 120 150 120 130 110 130 140 140 120 120 120 120 110 120 140 130 140 130 140 110 130 140 150 130 130 130 120 130 150 130 150 130 150 120 120 120 120 130 140 110 110 120 120 110 110 100 110 110 140 130 130 120 130 130 140 120 140 100 110 130 150 120 110 140 170 150 150 140 140 130 140 140 160 120 140 160 150 160 160 150 150 150 170 170 130 140 160 150 160 140 130 140 160 130 160 130 160 130 140 140 150 160 150 160 140 150 140 130 130 140 160 130 170 130 150 130 160 150 160 160 160 190 170 130 150 160 140 140 170 160 150 150 190 180 150 120 130 130 150 140 130 170 170 160 160 140 140 130 140 ELD 1 2 3 4 5 6 070 070 080 080 080 060 090 070 070 080 070 080 060 080 080 070 070 080 070 080 080 070 070 080 080 080 080 080 100 070 090 080 110 090 090 110 090 060 100 080 080 090 080 090 080 060 070 080 080 090 090 090 070 090 090 090 060 080 070 080 090 120 100 110 100 090 110 100 110 100 070 090 110 090 120 110 100 090 090 100 100 100 120 110 130 130 110 100 080 100 070 060 070 070 080 080 080 070 070 060 090 080 060 080 080 080 090 070 070 080 070 080 080 070 080 080 080 090 090 080 100 100 080 090 070 080 090 070 080 070 100 090 090 100 090 090 090 090 100 100 loo 080 100 090 080 090 100 080 080 080 100 080 090 090 090 3.00 080 090 100 130 090 090 110 090 120 110 100 120 100 100 090 080 100 110 100 090 100 110 090 100 Bibliograf la 196 EIBLIOGWIA Abadin JA, Duran JA, Sanchez A, Serrano JS Total and free valproic acid: plasma level/dose ratio in n~onotherapy Methods Find Exp Clin Pbarmacol 13: 221—225, 1991 Abraira y, Zaplana J En Abraira y, Zaplana J (edsj: Presta V2.2 para PCs . 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Carnitina II. Ácido valproico HIPÓTESIS Y OBJETIVOS MATERIAL Y MÉTODOS I. Material II. Métodos RESULTADOS I. Desarrollo de la fase experimental II. Peso corporal III. Resultados del estudio bioquímico IV. Resultados del estudio óptico V. Resultados del estudio ultraestructural DISCUSIÓN I. Desarrollo de la fase experimental II. Peso corporal III. Estudio bioquímico IV. Estudio con microscopía óptica V. Estudio con microscopía electrónica CONCLUSIONES FIGURAS RESUMEN ANEXO 1 ANEXO 2 BIBLIOGRAFÍA