UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS TESIS DOCTORAL MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Victor Rubio Susán Madrid, 2015 © Victor Rubio Susán, 1973 Propiedades biofísicas del bacteriófago O29 inéditas BIBLIOTECA UCM 5 3 0 6 7 0 5 2 1 4. PROPTEDADES BIOFISICAS DEL BACTRRIOFAGQ 029 Tosis presentada por VICTOR RUBIO SUSAN para optar al grado de Doctor en Ciencias Biologicas BIBLÎbTEC/ Madrid, Mayo, 1973 a David, Maria, Alberto y a su niadre. INDICE 1. INDICE GENERAL 2. INDICE DE FIGURAS 3. INDICE DE TABLAS 4. INDICE DE PLAÇAS INDICE GENERAL I. INTRODUCEION ......................... II. MATERIALES 11.1. Bacteria huésped y fago ...... 11.2. Medios de cultive ........... 11.3. Enzimas ...................... 11.4. Tampones ............ ........ II. 3» Productos y tnateriales varies . 11.6. Cremategrafla ............... 11.7. Electreferesis .............. 11.8. Radieactividad........ ....... 11.9. Microscopia electrônica ..... 11.10. Equipe ...... ................ III. METODOS III. 1. Creciniiente de la bacteria hués­ ped 111.2. Valoraciôn de 029 ........... 111.3. Preparaciôn de lisades de 029 • 111.4. Purificaciôn de 029 ......... 4.1. Cencentraciôn del fage ... 4.2, Croniatografia en vidrio de pere centrolado ........ 4.3- Centrifugaciôn diferencial pagina 1 17 17 17 17 18 . 18 19 21 23 23 23 25 25 27 28 28 29 29 pagina 4.4. Centrifugaciôn en cloruro de cesio ...... 30 4.5* Centrifugaciôn en gradien­ te de sacarosa ......... 30 III.3- Electroforesis en gel de poli- acrilamida ................... 31 3.1. Electroforesis en un sist^ ma con pH continue ...... 31 3.2. Electroforesis en un sist_e ma con pH discontinue .... 33 III.6. Aislamiento de la proteina de 029 .......................... 33 6.1. Tratamiento de 029 con EDI A. ..................... 33 6.2. Hidrôlisis del DNA ..... 33 6.3. Cromatografia en Sephadex G-30 36 6.4. Centrifugaciôn hasta equi­ libria de densidad en clo­ ruro de cesio .......... 36 III.7» Aislamiento del DNA de 029 ...• 36 III.8. Anâlisis quimicos ........... 37 8.1. Anâlisis de carbone y ni- trôgeno ................. 37 8.2. Anâlisis de fôsforo ..... 3# 8.3" Anâlisis de D N A ......... 39 8.4. Anâlisis de hexosas ..... 40 8.3" Anâlisis de aminoâcidos .. 4l 8.6. Anâlisis de bases ....... 43 III.9" Determinaciôn de densidades ... 48 113,10. Determinaciôn de viscosidades . 30 pagina 111.11. Determinaciôn de absorbancias.. 30 111.12. Determinaciôn de peso seco .... 32 III.13" Determinaciôn de volûmenes esp^ cificos ... 35 13.1. Volumen especifico de 029 3& 13.2. Volumen especifico de la proteina de 029 ........ 57 13.3* Volumen especifico del DNA de 029 ....... 38 III.l4. Determinaciôn de coeficientes de sedimentaciôn ............. 39 14.1. Ecuaciones fundamentales 39 14.2. Correcciôn a condiciones estandar .............. 6l 14.3. Determinaciôn experimen­ tal ................... 63 111.13. Determinaciôn de coeficientes de difusiôn ................. 67 13.1. Ecuaciones fundamentales 67 13.2. Correcciôn a condiciones standar ............... 73 13.3" Determinaciôn experimen­ tal ................... 76 1) Método de la relaciôn altura-ârea ......... 76 2) Método de Longsworth . 78 3) Método del papel de probabilidad ....... 87 111.16. Determinaciôn de movilidades electroforêticas ............ 88 111.17. Espectros ultravioleta ...... 91 JTcl^ J-llcA III.18, Microscopia electrônica ...... 92 IV. R.ESULTADOS IV.1. Purificaciôn de 029* Rendimiento y homogeneidad ................ IV.2. Composiciôn quimica de 029 .... 107 2.1. Anâlisis de fago completo .. I07 2.2. Composiciôn de amiijoâcidos de la proteina de 029 .... 113 IV.3. Absorbancia especifica de 029 ••• 117 IV.4. Absorbancia especifica de la pro­ teina de 029 .................. 121 IV.5. Volumen especifico de 029.. .... 123 IV.6. Volumen especifico de la proteina de 029.. ......................... 127 IV.7. Volumen especifico del DNA de 029 129 IV.8. Coeficiente de sedimentaciôn de 029 ............................ 131 IV.9. Coeficiente de difusiôn de 029 •• 137 9.1. Método de la relaciôn âltura-ârea ............... 137 9.2. Método de Longsworth l40 9.3. Método del papel de probabi­ lidad .................... 152 IVIO. Punto isoeléctrico de 029...... 176 IV.ll. Peso molecular de 029 .......... I8I 11.1. A partir de la ecuaciôn de Svedberg .................. I8I pagina 11.2. A partir de la composiciôn qui­ mica ............................ 183 V. . DISCUSION ................................... 188 VI. CONCLUSIONES ................................ 197 VII. BIBLIOGRAFIA INDICE DE FIGURAS pagina Figura 1. Relaciôn entre absorbancia a 660 nm y densidad bacteriana ............ 26 Figura 2. Relaciôn entre ^£60 ^ diluciôn de una disoluciôn de '029 en diluyente de fago ....... 54 Figura 3» Ensanchamiento de un limite inicial- mente nitido durante difusiôn libre 72 Figura 4. Interferograma de un limite de difu­ siôn obtenido con un interferômetro Rayleigh .......................... 80 Figura 5* Sintesis de una curva integral de dî fusiôn compléta ̂ . 82 Figura 6. Infecciôn de B. amyloliquefaciens con 029 97 Figura 7« Cromatografia de un lisado concentra do con polietilenglicol, en una co- lumna de vidrio de poro controlado.% 9& Figura 8. Centrifugaciôn en ClCs del pico ex- cluido en el cromatograma de la fig. 7 ............ 99 Figura 9- Centrifugaciôn en ClCs de las frac- ciones del pico II de la fig. 8 ... 100 Figura 10. Sedimentaciôn de 029 en un gradiente de sacarosa 5-20% en diluyente de f^ go ................................ 104 Figura H. Valoraciôn de DNA en 029 ....... 110 Figura 12. Valoraciôn de fôsforo total en 029 • 111 Figura 13* Valoraciôn de hexosas en la proteina de 029 112 pagina Figura l4. Relaciôn entre ^2S0 0^9 en dilu­ yente de. fago y peso seco del virus 119 Figura 15* Relaciôn entre densidad y concentra ciôn de 029 en diluyente de fago a 20QC......................... 125 Figura l6. Posiciôn del limite de sedimentaciôn de 029 en funciôn del tiempo.6.5 nn^ dades de 133 Figura 17« Variaciôn del coeficiente de sedimen taciôn de 029 con la concentraciôn . 135 Figura l8. Relaciôn entre (A/H)^/G^ y t durante la difusiôn de 029 en diluyente de fago a 12C. Concentraciôn = 30-0 unî dades de A^^Q ...................... 139 Figura 19- Relaciôn entre 4üt (AH/Zih)̂ y t du­ rante la difusiôn de 029 en diluyen­ te de fago a lûC.*Concentraciôn = 30.0 unidades de -^260............ . 151 Figura 20. Relaciôn entre el porcentaje de fran jas y su posiciôn respecto al eje de la célula a diferentes tiempos duran te la difusiôn de 029 en diluyente de fago a IQC. Concentraciôn = 30.0 unidades de -^260.............. 155 2Figura 21. Relaciôn entre O y t durante la di­ fusiôn de 029 en diluyente de fago a IQC. Concentraciôn = 30.0 unidades *260 ............................ ^56 Figura 22. Variaciôn del coeficiente de difu­ siôn de 029 con la concentraciôn ... 159 Figura 23. Relaciôn entre D y l/t durante la dî fusiôn de 029 en diluyente de fago a 20SC. Concentraciôn = 9,3 unidades *260 ^^5 Figura 24. Migraciôn electroforética de 029 a pH 2,7 y 1 = 0,1 en funciôn d e s j o metido a un campo de 3,^6 V cm .... I78 Figura 25. Punto isoeléctrico de 029 .... I80 INDICE DE TABLAS pagina Tabla 1. Electrof oresis en poliacrilatnida-SDS con pH discontinuo ................ 34 Tabla 2. Anâlisis de triptôfano: valores de la relaciôn molar tirosina/triptôfano en funciôn de S......................... 46 Tabla 3» Anâlisis de bases del DNA de 029 .... 49 Tabla 4. Determinaciôn de la densidad de una disoluciôn de 029 por picnometrla ... 51 Tabla 5- Determinaciôn de la absorbancia a 260 nm de una disoluciôn de 029 en diluyen«MM . . . . .te de fago .......................... 53 Tabla 6. Determinaciôn de los valores 4Dt (ÛH/ ùh.)^ a partir de un interf erograma Rayleigh de difusiôn ....... 86 Tabla ?• Purificaciôn de 029 106 Tabla 8. Composiciôn de, 029» Porcentajes de C, N y H ............................ 108 Tabla 9- Composiciôn de 029. Anâlisis de DNA y P ...................................... 109 Tabla 30. Composiciôn de aminoâcidos de la pro­ teina de 029 Il4 Tabla IL. Composiciôn de bases del DNA de 029 • 116 Tabla 12. Absorbancia especifica a 260 nm de 029 en diluyente de fago ............ 120 Tabla 13* Absorbancia especifica a 260 nm de la proteina de 029 en diluyente de fago 121 Tabla l4. Relaciôn entre densidad y concentra­ ciôn de disoluciones de 029 en dilu­ yente de fago, a 200C .............. 124 pagina Tabla 15- Volumen especifico de 029 .. 126 Tabla l6. Volumen especifico de la proteina de 029 ............................... 128 Tabla 1?. Volumen especifico del DNA de 029 - 130 Tabla l8. Sedimentaciôn de 029 en una disolu­ ciôn de concentraciôn 6.5 unidades *260 ^32 Tabla 19* Relaciôn entre coeficiente de sedi­ mentaciôn y concentraciôn de solu- ciones de 029 en diluyente de fago a 20QC ................................ 134 Tabla 20. Coeficiente de sedimentaciôn, s^„ , de 029 ?::v 136 Tabla 21. Coeficiente de difusiôn de 029 a IQÇ y 30.0 unidades de A^^^. Método de la relaciôn altura-ârea.......... I38 Tabla 22. Coeficiente de difusiôn de 029 a 12c y 30.0 unidades de A ̂ . Método de Longsworth ................... l4l-9 Tabla 23- Valores de 4Dt (AH/Ah)̂ en funciôn de t a 12c durante la difusiôn de 029 a una concentraciôn de 30-0 uni­ dades de -̂ 260 150 Tabla 24. Coeficiente de difusiôn de 029 a IQC y 30.0 unidades de A Método del papel de probabilidad .............. 153-4 Tabla 25- Relaciôn entre coeficiente de difu­ siôn y concentraciôn de soluciones de 029 en diluyente de fago a 12C . I58 Tabla 26. Coeficiente de difusiôn, D° , de 029 160 Tabla 27- Coeficiente de difusiôn de 029 a 20QC ................................ 161-73 Tabla 28. Valores de D en funciôn de l/t a 20QC durante la difusiôn de 029 a una concentraciôn de 9,3 unidades de *260 ............................. pagina Tabla 29* Distancias recorridas por 029 a pH 2,7 y I = Pli sometido a un campo de 3,46 V cm"^ ........................ 17? Tabla 30. Movilidad electroforética de 029 en tampon de Michaelis (IQC; J = 0,1) en funciôn del p H ................. 179 Tabla 31* Peso molecular de 029 a partir de la ecuaciôn de Svedberg .............. ' l82 Tabla 32. Porcentaje de N en la proteina de 029 ................................ 184 Tabla 33- Porcentaje de N y P en el DNA de 029 I85 Tabla 34. Peso molecular de 029 deducido de su composiciôn quimica y del peso mole­ cular del DNA .................... 186-7 INDICE DE PLAÇAS pagina Plaça I. Microscopia electrônica de 029 en el pico I del gradiente de ClCs de la figura 8 .......................... Plaça IL Microscopia electrônica de variantes morfolôgicos de 029 en el pico II ddL gradiente de ClCs de la figura 8 ... P3aca ni. Microscopia electrônica de componen- tes estructurales sin DNA en el pico III del gradiente de ClCs de la figu ra 8 .............................. 101 102 103 Plaça IV. Electroforesis en poliacrilamida-SDS .(pk discontinuo) de las proteinas de 029 (pico I del gradiente de la figu ra 8) ............................. 105 El trabajo que presento cotno tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias, ha sido realizado en el Departamento de Biologia Molecular del Institute G. Marahôn (C.S.I.C.) bajo la direcciôn del Dr. Ela- dio Vihuela a quien quiero expresar tni agradecimiento por su ayuda, enseiianzas y orientaciôn en el desarro- llo del trabajo. Quiero también agradecer a la Dra. Margarita Salas su apoyo y sugerencias y a ambos su continue interés por mi formaciôn. Igualmente quiero expresar mi agradecimiento al Profesor José Luis Rodriguez-Candela, director del Institute G. Marahôn, por su amable acogida en el In^ tituto. También deseo expresar mi agradecimiento al Dr. Juan Francisco Llopis y a los doctores Armando Albert, Pilar Usobiaga y José L. Saiz, del Institute Rocasolano' (C.S.I.C. ), por su ayuda en el planteamien to y realizaciôn de parte del trabajo. Asi mismo expreso mi agradecimiento al Dr. César Vâsquez de la Facultad de Medicina de Buenos Aires por su inapreciable ayuda en la microscopia electrônica. A mis compaheros Jésus Avila, Javier Co­ rral, José Miguel Hermoso, Juan José Lopez-Fando, En­ rique Méndez, Miguel Angel Moreno, Antonio Nieto, Juan Ortin, Gale Ramirez, Matilde Salinas y Antonio Tala- vera,agradezco su ayuda material y valiosas sugeren­ cias, al Sr. Eloy Blanco su ayuda técnica en el micro^ copie electrônico y fotografia, al Sr. Jésus Lôpez su ayuda en el crecimiento de bacterias, a las Srtas Eloisa Cano, Nieves Fonturbel, Irene Romo y Pilar Za­ ragoza su ayuda técnica. A las Srtas Margarita Corral, Victoria Gijôn y al Sr. Javier de la Torre su ayuda en la preparaciôn del manuscrite. Este trabajo ha sido realizado gracias a una b_e ca para la formaciôn de Personal Investigador del Mi- nisterio de Educaciôn y Ciencia. I. I N T R O D U C C I O N Un hecho esencial para la comprensiôn de la estructura y organizaciôn funcional de los virus es que el agente infeccioso es el âcido nucleico que es­ ta contenido en una cubierta proteica protectora o câpsida, que transmite el âcido nucleico de huésped a huésped. En 1956, Crick y Watson (1) hicieron la hipô- tesis de que la câpsida de los virus mâs simples es- tâ formada por subunidades de proteina idénticas aco- pladas de un modo regular. La naturaleza multiméri- ca de la câpsida es una necesidad fisica porque su, nm sa es varias veces mayor que la del âcido nucleico que encierra. La naturaleza triplete de la clave gen^ tica (2,3 ) indica que très nucleôtidos de masa media 1.000 determinan un aminoâcido de masa media 100. Es decir* un âcido nucleico puede especificar, como mâ- ximo, una masa de proteina diez veces mener que la suya propia. Ën las proteinas multiméricas, formadas por la repeticiôn de uno o un pequeho numéro de protôme- ros, estes deben disponerse de un modo regular pues, al ser iguales, deben establecer entre si contactes reciprocos idénticos, dando lugar a simetrias estruc- turales. A primera vista, podria parecer que el numé­ ro de formas con las que podria conseguirse este ob- jetivo es grande. La realidad es, sin embargo, lo contrario. De las très operaciones basicas de sime- tria (translacion, rotacion y reflexion), en las es- tructuras biologicas a nivel molecular solo hay que considerar las dos primeras y las simetrias que pue- den formarse por combinacion de las mismas (por ejem- plo, la simetria hélicoïdal), pues la presencia de âtomos de carbono asimétricos en las moléculas de los seres vivos, especialmente en proteinas y âcidos nu- cleicos, élimina las simetrias de reflexion. Un anâ­ lisis detallado de estas operaciones de simetria mues tra que el numéro posible de combinaciones es finite y enumerable (4). El anâlisis de una serie de virus bacterianos, vegetales y animales ha mostrado que la mayoria de elles pertenecen a très estilos arquitectônicos : (a) Virus alargados en forma de bastoncillo (b) Virus isométricos o esféricos (c) Virus con una forma que combina los esti­ los (a) y (b). Los disehos geométricos bâsicos para la cons- trucciôn de câpsidas formadas por la asociaciôn de subunidades de proteina idénticas son dos : el tubo heli coidal y el icosaedro. La hélice es la curva des- crita por un punto sobre la superficie lateral de un cilindro cuando éste gira alrededor de su eje longi­ tudinal y al mismo tiempo se desplaza a lo largo del mismô eje. El icosaedro es uno de los cinco poliedros regulares formado por veinte caras, triângulos equi- lateros, doce vértices y treinta aristas. Virus hélicoïdales. El virus hélicoïdal mejor estudiado es el vi­ rus del mosaico del tabaco. Cada particula de virus esta formada por una molécula de RNA, que contiene unos 6.000 nucleôtidos, y unas 2.100 subunidades idén ticas de proteina, cada una de las cuales contiene 158 aminoâcidos (5 ). Las subunidades de proteina es- tân muy erapaquetadas entre si con una distribuciôn hélicoïdal y el RNA estâ enrollado entre las vueltas de la hélice de proteina, existiendo una correspon- dencia de très nucleôtidos en el RNA por cada subuni- dad de proteina (6). ^Por qué una hélice? Partiendo de subunidades asimétricas iguales, de tal modo que la posiciôn re- lativa de cada subunidad con respecto a la sigui ait e sea la misma, las ûnicas estructuras posibles son : en una dimensiôn, una linea recta; en dos dimensiones, una linea en zig-zag y, en très dimensiones, una hé­ lice (?)• Por tanto, la propiedad fundamental de la hélice es que todas las subunidades iguales, dispues- tas a lo largo de la misma, se encuentran en posicio- nes équivalentes. Esto no ocurre en los extremes de la estructura, pero éstos quedan definidos por la longitud del RNA. Virus icosaédricos. Crick y Watson (1,8), cuando hicieron la hipô- tesis de que la câpsida de los virus sencillos debe- riâ estar formada por asociaciôn de subunidades de proteina idénticas y que esto conduce, necesariamen- te, a estructuras regulares, indicaron también que de todos los tipos de simetria posibles, sôlo la sime­ tria cûbica conduciria a una particula isométrica. La propiedad fundamental de la simetria cûbi­ ca es que las très coordenadas en el espacio son équivalentes y, por tanto, no hay preferencia por nin guna direcciôn determinada. Esto conduce, automatica- mente, a estructuras isometricas o esfericas. En cada uno de los tres tipos de simetria cû­ bica (tetraédrica (3:2), tetraedro; octaédrica (4:3: 2), cubo y octaedro; icogaédrica (5:3:2), dodecaedro e icosaedro), se pueden disponer en posicioiies équi­ valentes sobre la superficie de una esfera 12, 24 y 60 subunidades asimétricas iguales, respectivamente. A partir de 1956 un gran nûmero de observacio- nes de virus por difracciôn de rayos X y microscopia electrônica mostraron que de los tres tipos de sime­ tria cûbica, la preferida era la icosaédrica. Prâcti- camente todos los virus isométricos estudiados hasta la fecha presentan simetria icosaédrica. La demostra- ciôn mas clara de la simetria icosaédrica de los vi­ rus esféricos fué la obtenida del estudio de los vi­ rus iridiscentes de los insectos, pues estos virus son de un tamaho suficientemente grande para mostfar su estructura regular directamente en el microscopic electrônico, cuando las preparaciones se sombrean con âtomos de un métal pesado (9)* El hecho de que la forma externa de un virus sea icosaédrica no implica, necesariainente, que esta simetria se extienda hasta un nivel molecular. Sin embargo, el anâlisis de virus isométricos por difrac cion de rayos X demostro de un modo concluyente que la simetria icosaédrica no es solo externa, sino que también existe una distribuciôn geométrica icosaédri­ ca de las subunidades asimétricas de proteina (10-13) En un principle, para justificar la preferen­ cia de la simetria icosaédrica sobre la tetraédrica y la octaédrica sc hicieron dos tipos de consideracic^ nés : (a) La simetria icosaédrica permite colocar en posiciones équivalentes sobre la superficie de una esfera un numéro de subunidades asimétricas mayor que los otros dos tipos de simetria (60 comparado con 12 y 24, en el caso de las simetrias tetraédrica y oc­ taédrica, respectivamente). Por tanto, la superficie de la esfera se puede cubrir con subunidades mas pe- quehas,Io cual supone una economia de informaciôn gê­ né ti ca (l4). (b) Se puede demostrar geometricamente que si se desea cerrar un espacio alrededor de un punto cen- tral con un conjunto de elementos iguales, la rela­ ciôn entre el numéro de elementos y el area de la su­ perficie cubierta es un minimo cuando los elementos se disponen con simetria icosaédrica (l4). Sin embargo, cuando pudo determinarse el nûme­ ro de unidades morfolôgicas o capsômeros de los virus isométricos se observé que este nûmero no era 60 ni un mûltiplo de 60, como corresponderia a una estruc­ tura con simetria icosaédrica. En general, el nûmero de capsômeros era superior a 60 (15). Como se ha in- dicado antes, es imposible colocar mas de 60 elemen­ tos idénticos sobre la superficie de una esfera de mjo do que la posiciôn relativa de cada elemento se la misma. Para salir de la paradoja estructural résul­ tante de la discordancia entre la simetria icosaédri­ ca observada y el nûmero de capsômeros présente en los virus isométricos, Caspar y Klug (l4) abandonaron la idea de la equivalencia matemâtica estricta en la colocaciôn de los capsômeros reteniendo, sin embargo, los aspectos fisicos esenciales. El problema plantea- do era encontrar un modo de colocar mas de 60 elemen­ tos sobre la superficie de un esfera de modo que sus posiciones relativas sean casi équivalentes, es decir, que la desviaciôn de los ângulos de enlace de unas subunidades respecto a otras fuera minima. La soluciôn de Caspar y Klug (l4) se inspiré en los principios empleados j3or Fuller en la cons- truccién de cûpulas geodésicas (l6). Aplicando los mismos principios al diseho de la câpsida de los vi­ rus isométricos, Caspar y Klug demostraron que una câpsida isodimensional solo se puede construir de un modo general y este método especifico conduce, nece- sariamente, a una simetria icosaédrica. La hipôtesis bâsica es que la estructura de la câpsida se mantiene por el mismo tipo de enlaces en toda su extension, pero que estos enlaces pueden deformarse de modos ligeramente distintos. Esto tie- ne como consecuencia que las posiciones relativas de los capsémcros no sean équivalentes, sino casi-équi­ valentes. Si imaginâmes un poliedro formado por unidades estructurales agrupadas en capsômeros, el problema era determinar las clases de poliedros en los que la desviaciôn de los ângulos de enlace entre las unida­ des estructurales sea un minimo, comparados con los ângulos de enlace de las mismas unidades si estuvie- sen dispuestas en posiciones estrictamente equivalen- tes. Pawley (l?) ha demostrado que solo hay dos tipos de reticulos pianos, sin simetrla de reflexion, que pueden plegarse para dar lugar a un poliedro convexo en el que las posiciones relativas de los elenientos sean anâlogos a las existentes en el piano. Uno de ellos es un reticulo de cuadrados y el otro de triân- gulos equilateros. El primero solo puede plegarse pa­ ra dar lugar a un cubo, si en cada punto del reticulo se unen très aristas. Un reticulo de triângulos equi­ lateros puede plegarse para dar lugar a un tetraedro, octaedro o..icosaedro, respectivamente, si en cada vér̂ tice del reticulo se unen très, cuatro o cinco aris­ tas . Ahora supongamos que en el centro de cada cara se encuentra una unidad estructural, formando un ân- ogulo de enlace de 90 con las subunidades contiguas en el caso de un reticulo de cuadrados y un ângulo de o120 en el caso del reticulo de triângulos equilate­ ros. Si de estos reticulos pianos formamos los polie- dros indicados antes, los ângulos de enlace entre las unidades estructurales cambian un minimo en el caso del icosaedro. Por tanto, energèticamente el icosae- dro es la estructura mas estable. Si consideramos un numéro mayor de unidades e^ tructurales en un reticulo triangular, dividiendo ca­ da triângulo equilatero en otros très y en cada uno de estos colocamos très unidades estructurales idén- oticas cuyos ângulos de enlace son de 120 , al cerrar- se el reticulo para dar lugar a una estructura con si- metria icosaédrica, las unidades estructurales quedan agrupadas en grupos de seis unidades o hexâmeros, si- tuados sobre los centres de las aristas, y capsômeros de cinco unidades o pentâmeros, que ocupan los doce vertices del icosaedro. Si como hemos convenido, las unidades estructurales son iguales, los ângulos de en lace de los pentâmeros serân mènes astables que los de los hexâmeros, pero mas astables que en el caso en que los capsomeros de los vertices fuesen trimeros (tetraedro) o tetrâmeros (octaedro). El problema quedô reducido a determinar todos los poliedros con caras triangulares y simetria ico­ saédrica (icosadeltaedro). El primer miembro de la serie es el icosaedro, forniado por 20 caras triângu­ los equilâteros. Cualquier icosadeltraedro tendrâ 20 T caras triangulares, sicndo T el numéro de triangu- lacion, es decir, el numéro de triângulos equilâteros en que puede dividirse el triângulo original. El numéro de triangulaciôn, T, solo puede tomar ciertos valores dados por la expresiôn siendo f cualquier numéro entero. P viene dado por la expresiôn P = + hk + k^, siendo h y k dos numéros cualesquiera primos entre si. Para un valor fijo de P, dando a f valores su- cesivos se obtienen las triangulaciones sucesivas del deltaedro original. Cada unidad estructural puede visualizarse aco- plada a un tercio de cada cara triangular. Por tanto, el numéro total de unidades estructurales, E, sera E = 3 X 20 T = 60 T Las unidades morfolôgicas o capsômeros serân de dos tipos : hexâmeros, formados por el agrupamien- to de seis unidades estructurales, y pentâmeros, for­ mados por el agrupamiento de cinco unidades estructu­ rales. El numéro de pentâmeros, P, es igual al numé­ ro de vertices del icosaedro, es decir, doce. Para de­ terminar el numéro de hexâmeros basta tener en euenta que el numéro de unidades estructurales, 60T, es igual al numéro de unidades peresentes en hexâmeros, 6H, mas el de unidades présentés en pentâmeros, igual a 60. Es decir, 60T = 6h + 60. y, por tanto, H = lO(T-l) Virus no isométricos. Muchos virus bacterianos poseen una organiza- ciôn estructural mas complicada que la de los virus helicoidales e icosaédricos (I8), La cubierta protei- ca estâ formada por la câpsida propiamente dicha, que encierra al âcido nucleico y una cola por la que el virus se fija a los receptores de la bacteria huésped y a través de la cual se inyecta el material genético del virus. La câpsida puede presentar simetria icosaJ_ drica, como en el caso del fâgo lambda que ataca a Escherichia coli, pero en otros casos, como en el co- lifago Tâ, la câpsida es demasiado alargada para po- seer simetria icosaédrica. El virus no isométrico mejor estudiado es el fago T4. La câpsida do este virus tiene un contorno exagonal alargado longitudinalmente y encierra una mo- lecula de DNA de dos bandas con un peso molecular de 120 X 10^ (19). T4 posee una cola, unida a la cabeza a través de un cuello, formada por un nucleo central rodeado de una vaina contractil. En el extreme de la cola hay una plaça basal, con simetria exagonal, de la que salen seis fibras. La câpsida de T4 es demasiado alargada para tje ner simetria icosaédrica. Sin embargo, como extension de la teoria general de la organizacion de los virus isométricos, se ha postulado que el diseho de la câp­ sida de T4 puede originarse por plegamiento de un re­ ticulo exagonal. De este modo la cabeza de T4 se ha llamado un icosaedro prolato, formado por las pirâmi- des de un icosaedro separadas por dos bandas ecuato- riales de 10 triângulos cada una (20-22). Sin embargo, el fago T4 es, estructuralmente, muy complejo (23,24) y su quimica poco conocida, lo cual hace imposible, por ahora, hacer una correlaciôn entre la geometria general de la câpsida y las proteinas que la forman. Esto ha llevado a proponer otras formas geométricas menos convincentes para la câpsida de t4 (23)' El bacteriôfago 029 es un virus pequeho, espe- cifico para varias especies de Bacillus (26), que con^ ta de una cabeza alargada con contorno exagonal (40 x 30 nm) y con fibras (l4 x 2 nm), un cuello formado por dos collares y doce apéndices radiales y una cola cor- ta (27). El material genético de 029 es un DNA bicate- nario con un peso molecular de unos 11 x 10^ (28),que puede aislarse en una forma circular cerrada por una proteina viral que puede jugar un papel importante en el empaquetamiento del âcido nucleico dentro de la câpsida (29)• La parte proteica de 029 consta de siete pro­ teinas estructurales. La cabeza contiene, aparté de la proteina asociada al DNA, otras très proteinas, que forman la câpsida y que se han denominado HPl, HP2 y HP3. HPl es la proteina fundamental de la câpsi­ da y HP3 es la proteina que forma las fibras; la fun- ciôn de la proteina HP2 es desconocida. El collar su­ perior, el collar inferior, los apéndices del cuello y la cola parecen estar formados cada uno por una proteina denominada, respectivamente, NP2, NP3, NPl y TPI (29-32). El pequeno tamano de la partlcula viral y del DNA de 029 y la correlaciôn ya realizada entre los componentes estructurales del fago y las proteinas que los forman, hacen de este virus un material adecuado para tratar de correlacionar su geometria con las pro­ teinas que forman el virus. Para este fin es previo un estudio quimico-fisico del virus que permita deter­ minar la masa molecular de la particula. Conocida esta, la del DNA y las masas relativas y los pesos molecula- res de cada una de las proteinas estructurales, es po- sible determinar el numéro de subunidades de cada pro­ teina présentes en el virus. Esto ha permitido elabo- rar un modelo estructural para la câpsida de 029 como un icosaedro prolato, compatible no solo con las pro- piedades quimicas y quimico-fisicas del virus, sino también con la existencia de una serie de variantes morfolôgicos del fago normal, producidos espontaneamen te o por infeccion de mutantes sensibles a temperatu- ra, crecidos a la temperatura no permisiva (33-36). El trabajo que présentâmes contiene un método de purificaciôn del fago 029, que permite obtener del orden de un gramo de virus infective y homogéneo, y que se puede escalar fâcilmente, métodos de aisla- miento del DNA y de la proteina del virus, anâlisis de bases del DNA y de aminoâcidos de la proteina del virus, cuatro métodos diferentes e independientes pa- ra determinar la masa molecular de la particula viral, asi como la determinacion de una serie do constantes quimico-fisicas y anâlisis quimicos del fago. En la purificaciôn del fago se ha aislado, como una fracciôn lateral, una serie de variantes morfolôgicos de la particula normal que parecen presentar un ensamblaje anômalo de los componentes estructurales del virus. II. M A T E R I A L E s 11.1. BACTERIA HUESPED Y FAGO La bacteria huésped utilizada fué la estirpe HM de Bacillus subtilis (26), posteriorraente descrita como perteneciente a la especie B. arnyloliquefaciens (37). Dicha bacteria y el fago 029 fueron obtenidos de B.E. Reilly. 11.2. MEDIOS DE CULTIVO La triptona, extracto de levadura y el agar se compraron a Difco; la D-glucosa a Fisher Scientific Co. y el antiespuinante (Rhodorsil) a Siliconas de Es- pana S.A. 11.3. ENZIMAS La DNasa pancreâtica, recristalizada una vez (lote D-9-DH), la RNasa pancreâtica, recristalizada una vez (lote R-642-5A) y la fosfodiesterasa de vene- no de serpiente liofilizada (lote SPH-632) se compra­ ron a Worthington Chemical Co.; la lisozima de clara de huevo, recristalizada très veces (lote L-6876), a Sigma Chemical Co. y la pronasa (grado B) a Calbio- chem. Para eliminar las posibles contaminaciones de nucleasas en la pronasa, una soluciôn del enzima en Tris-CIH 10 mM, EDTA 20 mM, pH 8,1, a una concentra- ciôn de 10 mg/ml, se incube 3 horas a 37 0, se calen- tô posteriormente 5 minutes a 80~C y se enfriô inme- diatamente en hielo (38). 11.4. TAMPONES Las soluciones tampon se prepararon con agua destilada a partir de las siguientes soluciones con- centradas: Tris-CIH 1 M, pH 7,8; EDTA-Na 0,25 M, pH 7,5; acetato sôdico 1/7 M en barbital sôdico 1/7 M- CIH 0,1 M; fosfato potâsico 0,5 M, pH 7,5; Cl^Mg 1 M. 11.5. PRODUCTOS Y MATERIALES VARIOS El dorure de cesio, grado sequanal, se obtuvo de Pierce Chemical C o . , el PEG 6000 se obtuvo de Ser- va, la sacarosa de May & Baker Ltd. El fenol se corn- pro de Merk y se destilô a l80~C, calentando un ma- traz de 1 1 que contenia aproximadamente 500 g de fe­ nol; los vapores se recogieron sobre agua destilada. Los tubes de dialisis de Union Carbide Corpo­ ration se hirvieron en una disoluciôn de EDTA 20 mM, SDS 0.1% durante 15 minutes para eliminar nucleasas, se lavaron con agua destilada y se conservaron esté- riles. El resto de los productos quimicos usados fue­ ron productos especiales para anâlisis y se utilizaron sin posterior purificaciôn. II.6. CROMATOGRAFIA El Spherosil tipo C, con un diâmetro medio de particula de 100-200 yu y con un diâmetro de poro de 20-40 nm, se comprô a Serva Feinbiochemica, GMBH Go. Cada 300 g de Spherosil se resuspendieron agitando en 20 litros de agua desionizada y se dejô sedimentar pa­ ra eliminar finos por decantaciôn. Esta operaciôn se repitiô cuatro veces. A continuaciôn sc lavô con 2 li­ tros de CIH 1 M durante 15 minutos y con H^O desioni­ zada hasta eliminar el âcido, luego se tratô con 2 li­ tros de NH^OH 1 M durante 15 minutos, se eliminô la base por lavado con H^O, y finalmente, el spherosil se resuspendiô en DF y se conectô a una bomba de va- cio para eliminar el aire de los poros. El Sephadex G-50 se obtuvo de Sigma Chemical Co. 100 g de Sephadex G-50 se resuspendieron en 2 li­ tros de HgO destilada con agitaciôn y se dejô sedimen­ tar para eliminar finos por decantaciôn. Esta opera­ ciôn se repitiô 6 veces. A continuaciôn se resuspen­ diô en DF y se conectô a una bomba de vacio para eli- minar el aire de los poros. El papel Whatman 3 MM y Whatman 1 se comprô a Reeve Angel. Las résinas empleadas para el anâlisis de ami­ noâcidos fueron résinas esféricas de poliestireno sul- fonado entrecruzado con divinilbenceno. Para el anâli­ sis de los aminoâcidos bâsicos se empleô la résina PA-35 de Beckman (13 - 6 ya; 7,5% de divinilbenceno), en una columna de 2,3 x 0,9 cm,y para los aminoâcidos âcidos y neutros la résina PA-28 de Beckman (l6 - 6 yi; 7,5% de divinilbenceno), en una columna de 69 x 0,9 cm. Las résinas se limpiaron siguiendo el procedi- miento indicado en el manual de instrucciones del an^ lizador de aminoâcidos Unichrom de Beckman: i % La résina se recogiô por filtraciôn a través de l\Thatman n^ ̂ en un Buchner, se pasô a un vaso don- de se cubriô con SO^H^ 70% y la suspensiôn se mantuvo a 70-80“C durante 5 hr. La suspensiôn se diluyô cinco veces ahadiendo el contenido del vaso lentamente so­ bre 4 volûmenes de agua destilada y la résina se re­ cogiô en un Buchner con papel Whatman nQ 5, lavândose con agua destilada hasta que el filtrado dejô de sa­ lir âcido. La résina se lavô con CIH 2 M hasta que el filtrado salia incoloro y, a continuaciôn, se pasô a un vasô donde se cubriô con CIH 2 M - EDTA 0,1%. La suspensiôn se incubô 2 hr a 70-80~C, se lavô sobre un Buchner con H^O, como antes, hasta que el filtrado s^ lia neutro. La résina se pasô a un vaso donde se cu­ briô con NaOH 2 M - EDTA 0,1%, se calentô 30 min a 40"Ct se recogiô sobre papel Whatman nQ 5, lavando con agua destilada hasta tener un filtrado neutro y, finalmente, con varios volûmenes del tampôn inicial de la columna. Los tàmpones empleados, preparados de acuerdo con las normas indicadas en el manual de instruccio­ nes del analizador, fueron las siguientes : Molaridad Tampôn pH del Na^ Tampôn para la muestra 2.2-0.03 0.20 Aminoâcidos âcidos y neutros,I 3.28-0.005 0.20 Aminoâci dos âcidos y neutros,II 4.25-0.02 0.20 Aminoâcidos bâsicos 5.28^0.02 0.35 II.7. ELECTROFORESIS La acrilamida, la N , N '-metilenbisacrilarnida y el azul de Coomassie se compraron a Serva Feinbioche- mica GMBH Co., el SDS y el Sigmacote a Sigma Chemical Co. y la tetrametilendiamina a Eastman Chemical Co. La acrilamida, bisacrilamida y SDS se purifi- caron, como se describe a continuaciôn: 70 gr de acrilamida se disolvieron en 1 litro de cloroformo a 50~C y la disoluciôn se filtrô por papel. El filtrado se dejô a -20~C durante 5 horas, al menos, y los cristales se recogieron filtrando en • t Q \Buchner, se lavaron con cloroformo frio (-20 C) y se secaron en vacio (39)* 10 gr de bisacrilamida se disolvieron en 1 li­ tro de acetona a 45 C. La suspension se filtrô por , opapel y el filtrado se dejo a -20 C durante la noche. Los cristales se recogieron por filtraciôn y se seca­ ron en vacio (39)* En un erlenmeyer de 2 litros se disolvieron 60 gr de SDS en 1 litro de etanol 98% en ebulliciôn. A la disoluciôn se aiiadio Celita y se filtrô por papel Whatman 1. El filtrado se dejô en reposo durante la noche a temperatura ambiente y los cristales, recogi- dos por filtraciôn se secaron a 5O C en vacio. 11.8. RADIOACTIVIDAD El butil-PBD se comprô a Ciba Limited, el to­ luene a Carlo Erba y los filtrados de papel de fibra de vidrio Whatman GF/C y GF/A a Reeve Angel. 11.9. MICRQSCOPIA ELECTRONICA Las rejillas de cobre electrolitico (3 mm de diâmetro, 200 mallas) se compraron a Veco Zeefplaten Falnick N.V. El formvar y el colodiôn se compraron a Shawinigal Ltd. y a Mallinckrodt Chem. Co., respecti- vamente. El 1, 2-dicloro e tileno y el acetato de i s o am lo fueron productos de Sdkchardt BMBH, el âcido fos- fotûgnstico y el acetato de uranilo se adquirieron de Merck, Las rejillas de platino (tipo Siemens, 7 agu- jeros) se compraron a Siemens. Las plaças y el material fotogrâfico se ad- quieron a Agfa-Gevaret y Kodak, respectivamente. 11.10.EQUIPO Fermentadores de litros de Belenguer S.A. Centrifuga Sorvall refrigcrada modelo RC2-B y sistema KSB para flujo continua. Ultracent.rifugas preparativas Spinco de Beck­ man, inodolos L, L2-5O y L3-50- Ultracentrifuga analitica Spinco de Beclcman, modelo E. Aparato de difusion libre y electroforesis Spinco de Beckman, modelo H. pHmetro Radiometer, modelo 25, con escala ex- pandida. Fuente de alimentacion Buchler, modelo No-3- 1014 A. Cubeta de electroforesis Buchler, modelo nQ 1004 A. Espectrofotometro Gilford (modelo 240) con transporte lineal (modelo 24lO) e impresor (modelo • 2453). Espectrofotometro Cary, modelo 15. Espectrofotometro Beckman, modelo DU-2. Analizador de aminoâcidos Beckman, modelo Uni­ chrom . Microscopio electronico Jeol JEM 100-B. Liofilizador Virtis, modelo 10-146 MR - BA. Fraccionador de geles (Autogeldivider de Savant Instruments Inc.). Microcomparador Nikon, modelo 6C. III. M E T O D O S III.l CRECIMIENTO DE LA BACTERIA HUESPED B. amyloliquefaciens, cepa HM (26), se crecio a 37 C con aireacion en un medio L (40) modificado, que contenia triptona 1%, extracto de levadura 1%, ClNa 0,3%, Cl^Mn 0,01 niM .y glucosa 10 mM. Para los cultivos en fermentador el medio contenia, 0,4 ml de antiespumante por litro de medio. El medio sin gluco- osa se esterilizô en autoclave durante 20 min a 120 C; la glucosa se esterilizô por separado y se anadio al medio en condiciones de esterilidad. Los cultivos se iniciaron con un inôculo al 3% de células creciendo en fase logaritmica y el creci- miento se siguiô turbidimétricamente a 660 nm con un espectrofotometro Beckman DU-2, usando cubetas de 1 cm de paso de luz. En algunas ocasiones el crecimien- to se siguiô por contaje directe de las bacterias, aiiadiendo a 1 ml del cultive 0,1 ml de formaldehido 0,3% para contar las bacterias al microscopio en una câmara de Thonia. La figura 1 muestra la relaciôn en­ tre absorbancia y numéro de células. III.2. VALORACION DE 029» El fago se valorô por el método de la plaça de 2 !,0 01 O C\3 0/3 (3 S 0,4 0.2 _L 0.2 0,4 Acco . i . . 0,6 Figura 1. Relacion entre absorbancia a 660 nm y densidad bact eriana. lisis (4l). A 2 ml de medio L con agar 0,6%, fundido y man tenido a 45"C, se anadieron 0,5 ml de un cultive de la bacteria huésped en crecimiento logaritmico y 0,1 ml de una diluciôn del fago en DF. La mezcla se ex~ tendiô sobre una plaça de Pétri coh 25 ml de medio L sin glucosa, solidificado con agar 1,6%. Una vez soli- dificada la capa con la bacteria y el fago a tempera- otura ambiente, las plaças se incubaron a 30 C durante la noche para permitir la formaciôn de las plaças de lisis. III.3. PREPARACION DE LISADOS DE 029 16,5 1 de medio L con antiespumante en un fer- omentador de 30 1 a 37 C, se inocularon con 500 ml de B. amyloliquefaciens creciendo en fase logaritmica en el mismo medio. Cuando la A^^Q = 1 (2 x 10^ bacterias/ ml) se ahadiô 029 a una multiplicidad de infeccion de 2 fagos por bacteria y se continué la incubaciôn du­ rante 3“ ̂horas o hasta que se produjo la lisis del cultive. Durante la incubaciôn se mantuvo el pH cons­ tante entre 6,4 y 6 ,8, ahadiendo 4-8 ml de NaOH 10 M cada 30 min. El lisado se. tratô con lisozima (10 jug/ml), RNasa (0,1 jqg/ml) y DNasa (0,2 ĵ g/ml) en presencia de o ,Cl^Mg 5 mM, durante 30 min a 37 C y, a continuaciôn, se centrifugé en una Sorvall de flujo continue a 20,000 X g a un flujo de 100 ml/min para eliminar ' restes celulares. III.4. PURIFICACION DE 029 4.1. Concentraciôn del fago Para concentrar el fago del lisado se emplea- ron dos métodos : (a) precipitaciôn isoeléctrica y (b) precipitaciôn con PEG 6000. (a) Precipitaciôn isoeléctrica. Al lisado a temperatura ambiente se. ahadiô lentamente y agitando âcido acético glacial hasta bajar el pH a 4.1-4.2. Después de 1 hora sin agitaciôn se ahadieron 3 S de celita por litro y la suspensiôn se filtrô por papel de fibra de vidrio GFA con succiôn. El fago retenido en el filtro se resuspendiô en 0,1 vol de DF manteni- do a pH 7.8 por adiciôn de NaOH 10 M. (b) Precipitaciôn con PEG 6000 (42). Al lisa­ do, enfriado a 4“C en un baho de hielo, se ahadiô PEG 6000 10% (peso/volunien). Después de dejar preci- pitaiido en reposo 24-48 hr a 4-8”C, se decanté el so- brenadânte y se recogiô el sedimento suspendido en el menor volumen posible del sobrenadante. La suspensiôn se centrifugô en una Sorvall re- ofrigerada a 4 C durante 30 min a 7,500 rpm en un ro­ tor GSA. El sedimento que contenia ‘el fago se resus­ pendiô en 200 ml de DF, se incubô 30 min a 37 C con lisozima (lOO pg/ml), RNasa (1 pg/ml) y DNasa (l pg/ ml) y se volviô a centrifugar a 20~C como se ha indi­ cado antes. El fago quedô en el sobrenadante. 4.2. Cromatografia en vidrio de poro controlado (43) La muestra con el fago se cromatografiô en una columna de Spherosil tipo C, tratado como se indica en Materiales, empaquetada por gravedad y equilibrada con, al menos, 10 volûmenes de DF. El volumen de la columna era de 2,8 1 (45 cm x 63,4 cm ) y el de la muestra nunca fué superior al 10% del volumen de la columna. Una vez habia penetrado la muestra en la co­ lumna, se eluyô con DF a una velocidad de flujo de 5 ml/min, recogiéndose fracciones de 20 ml. En cada fracciôn se déterminé A^^^ y fago. 4.3. Centrifugaciôn difercncial. Las fracciones que contenian el fago se mezcla ron y centrifugaron en un rotor 19 de una ultracentri­ fuga Spinco L2-50 a l8,000 rpm y k~C durante 4 hr. El fago quedô en el sedimento y se resuspendiô en 0,05 volûmenes de DF en un agitador rotatorio a temperatu­ ra ambiente. 4.4. Centrifugaciôn en cloruro de cesio (44) Por cada gramo de la suspensiôn del fago en DF, a una concentraciôn igual o menor que I50 unidades de ^260 cm se ahadieron 0,66 g de ClCs, para obtener M ^ ■ ■ ■ . . . . . .una densidad de 1,43 g x cm .La suspensiôn se cen­ trifugô en tubos de policarbonato en un rotor 30 de una ultracentrifuga Spinco L2-50 a 13 C durante 24 hr a 24,000 rpm. La centrifuga se parô sin freno y el gradiente se fraccionô por medio de un sifôn, recogién dose fracciones de 1 ml. En cada fracciôn se determi- nô -̂260’ y en fracciones seleccionadas se deter- minô la densidad refractométricamente (45) o picnomé- tricamente con una micropipeta calibrada. Las fraccio­ nes que contenian el fago se dializaron a 4~*C contra varios cambios de DF. 4.5. Centrifugaciôn en gradiente de sacarosa (46) En tubos de nitrato de celulosa de un rotor Spinco SW5 0 , SW39 o SW25-1 se establecieron gradien­ tes de sacarosa entre el 5 y el 20% en DF y se equi- libraron a 4“C, 0,2-0,3 ml de suspension de fago con- -1teniendo no mas de 5 unidades de cm (rotores SW50 o SW3 9) o 1 ml conteniendo no mas de 25 unidades de ^260 ^ (rotor SW25 -1) se pusieron en la parte superior del gradiente y se centrifugé a 4^C durante 30 min a 36 ,000 rpm (rotores SW50 o SV39) o 60 min a 22,000 rpm (rotor SW25»l)« Una vez parade cl rotor sin freno, el gradiente se fraccionô como se ha des­ cribe antes, recogiéndose fracciones de seis gotas ( /̂ 0,12 ml) en el caso de los rotores SW50 o SW39 6 de 1 ml en el caso del rotor SW21.1. En cada fracciôn se déterminé A^^^ y/o fago. III. 5. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Las proteinas desnaturalizadas con SDS se so- metieron a electroforesis en gel de poliacrilamida usando dos sistemas de electroforesis diferentes. 5.1. Electroforesis en un sistema con pH continue Los geles de 20 cm de longitud, preparados de acuerdo con Méndez y colaboradores (30), contenian acrilamida 10%, N, N*-metilenbisacrilarnida 0,15%, te trametilendiamina 0,05%, SDS 0,1%, fosfato sodico 0,05 M, pH 7,2, y persulifato araonico 0,075% (todos los por- centajes se dan en peso per volumen, excepte en el ca­ se de la tetrametilendiamina que se dan en velumen per velumen). El electrelite era fesfate sodice 0,05 M , pH 7,2, y SDS 0,1%. La muestra (20-200 de preteina) se dializo contra acetate amonice 0,1 M, se liefilizo y el resi­ due se disolvio en 0,2-0,3 ml una selucion que conte­ nta fosfato sodico 0,005 M, pH 7,2, SDS 1%, 2-mercap- toetanol 1% y urea 2 M. La mezcla se calento 5 niin en un bano de agua a ebullicion para disgregar las pro- teinas hasta las ultimas cadenas polipeptidicas y se enfriô a temperatura ambiente. A continuacion se ana- dio a la muestra 0,01 ml de una disolucion de azul de bromofenol 0,2%. La muestra se puso sobre la parte su­ perior del gel, que habia side sometido previainente a un voltaje constante de 60 volt con objcto de eliminar el persulfato. La electroforesis se hizo a un voltaje constan­ te de 2,5 volt/cm durante unas 15 hr, tiempo que tar­ da en salir el azul de bromofenol del gel.En otras oca siones la electroforesis se hizo durante 20 hr. Una VGZ finalizada la electroforesis, los ge- les se fraccionaron con un fraccionador de geles (Autogeldivider de Savant Instruments Inc.) o se ti- heron con una disolucion de azul brillante de Coo- massie 0,25% en metanol : acido acetico ; agua (5 :1: 5), y se destiheron agitandolos en acido acetico 7%. 5.2. Electroforesis en un sisteina con pH disconti­ nu o (23). Los geles, con una longitud total de 11 cm (8 cm el gel de separacion y 3 cm el gel de concentra- cion) y 6 mm de diametro, tenian la composicion que se incia en la tabla 1, la cual muestra también la composicion del electrolito y del tampon de la mues­ tra . La electroforesis se hizo a una corriente con^ tante de 5 mA hasta que el colorante salio del gel. Los geles se fraccionaron como se ha indicado antes o se fijaron en âcido tricloroacético 50% duran- ote la noche, se tiheron durante 1 hr a 37 C en una di­ solucion recien preparada de azul brillante de Coo- massie, en âcido tricloroacético 50% y se destiheron Tabla 1 . Electroforesis en poliacrilainida-SDS con pH dise ont inno. A. Composicion del gel Componente Gel de separacion Gel de concentraciôn Tris-CIH 0,375 M (pH8,8) 0,125 M (pH 6,8) Acrilamida 10% 3% Bisacrilamida 0,25% 0,075% Dodecil sulfato sodico 0 ,1% 0 ,1% Tetrametilendiamina 0,025% 0,025% Persulfato arnônico 0,025% 0,025% ^ Todos los porcentajes se refieren a peso, excepto el de la tetrametilendiamina, que se refiere a vjo lumen. B. Composicion del electrolito Tris 0,025 M - glicina 0,192 M (pH 8,3) Dodecilsulfato sodico 0,1% C. Composicion del tampon de la muestra Tris-CIH 0,05 M (pH 6,8) Dodecilsulfato sodico 0,1% 2-mercaptoetanol 5% Azul de bromofenol 0,001% por difusiôn lavando los geles repetidas veces con âcido acetico 7%. III.6. AISLAMIENTO PE LA PROTEINA PE 029. 6.1. Tratamiento de 029 con EDTA 25 nil de una suspension de 029, a un a concen­ traciôn de 40 unidades de A^^Q cm ^,a la quo se habia ahadido EDTA a una concentraciôn final 70 niM, se in­ cubé a 37”C durante la noche con agitaciôn. En estas condiciones la mayor parte del fago libera el DNA y las particulas se disocian dando lugar a câpsidas con y sin cuello y colas con cuello (30). 6.2. Hidrôlisis del DNA ■ . , oLa mezcla se dieilizo a 4 C contra varies cain- bios de Tris-CIH 0,01 M , Cl^Mg 5 niM, pH 7,8, para eli­ minar el EDTA, y , a centinuaciôn, se incubé 30 min a 37~C con DNasa (10 pg/nil), se ajusté el pH a 9 con KOH 1 M en el pHmetro y se ahadiô fosfodiesterasa de veneno de serpiente (10 pg/ml), continuândose la in- pcubacién durante 30 min a 37 C. La mezcla se llevé a sequodad por liofilizaciôn y el residuo se disolvié en 3 ml de agua. 6,3» Crotnatografia en Sephadex G-50 La muestra se cromatografio en una columna de Sephadex G-50 con un volumen de unos 220 ml (45 cm x 24,9 cm ), equilibrada y eluida con DF a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min, recogiendose fracciones de 2 ml en los que se déterminé y A^g^. 6.4. Centrifugacién hasta equilibrio de densidad en cloruro de cesio. Las fracciones correspondientcs al volumen ex- cluido, libres de nucleétidos, se mezclaron (20-25 ml) y se centrifugaron hasta equilibrio de densidad de — ?ClCs (densidad media = 1,43 g x cm ) para separar el fago residual, no disgregado; de la proteina libre de DNA, del misnio modo como se describié antes para la purificacién del fago completo. El gradiente se fraccioné como se ha indicado antes y en cada fraccién se déterminé A^^^ y A^g^. Las fracciones de la parte superior del gradiente, li­ bres de DNA y de fago intacto, se mezclaron y diali- zaron contra varios cambios de DF a 4~C. 111.7. AISLAMIENTO DEL DNA DE 029 Una suspensién de fago (20 ml) a una concentra- cion de 1 unidad de cm ̂ se trato con 1 mg de pronasa autodigerida (38) por ml en presencia de SDS 0 ,5%, durante 3 hr a 37 0 con agitaciôn suave.Este tratamiento se repitio dos veces consecutivas mas. A la solucion viscosa se ahadiô 1 volumen de fenol destilado y equilibrado con Tris-CIH 0,1 M, pH 7.8, esteril y las dos Cases se mezclaron por agita­ ciôn suave durante 5 min a temperatura ambiente. La muestra se centrifugé 5 min a 13-000 rpm a temperatu­ ra ambiente, para separar las dos fases. La capa fe- nélica se extrajo con una pipeta esteril y la capa acuosa se volvié a tratar dos veces mas con 1 volumen de fenol. Las très fases fenélicas mezcladas se ex­ tra jeron con un volumen de Tris-CIH 0,1 M, pH 7,8, es­ teril, igual a la suspensién de fago inicial. Las dos fases acuosas se mezclaron y dializaron contra varios cambios de 0,1 x SSC a 4~C. La solucion de DNA diali- zada se conservé a 4 C. 111.8. ANALISIS QUIMICOS 8.1. Analisis de carbono y nitrégeno Las muestras de fago en DF se dializaron con­ tra acetato amonico 0,1 M y se liofilizaron repetidas veces, disolviendo cada vez el residuo en agua desti- lada eistéril. El residuo final se secô en vaclo en presencia de pentôxido de fôsforo. Otras muestras de fago en DF se precipitaron repetidas veces con 2 vo- Qlumenes de etanol absolute a 0 C, se liofilizaron y secaron como se acaba de indicar. El C, H y N se determinaron en un Analizador Elemental Perkin Elmer 240 en el Centro Nacional de Quimica Organica (C.S.I.C.), 8.2. Analisis de fôsforo (48) El reactivo se préparé inmediatamente antes del ensayo mezclando 1 volumen de SO^H^ 6 N con 2 vo- lûmenes de agua destilada, 1 volumen de molibdato am^ nico (MO^O^^ (NH^)g. 4 H^O) 2,5 % J 1 volumen de aci­ do ascérbico 10%. (1) Fôsforo inorgânico. A 1 ml del problema, conteniendo 0 ,1-1 jqg de fosforo(ajustando la concen­ traciôn con agua destilada) se ahadiô 1 ml de reacti­ vo. Los tubos se taparon con papel de parafilm y se incubaron 2 hr a 37~C, La densidad éptica a 820 nm se leyé contra un blaiico tratado de un modo anâlogo al problema. Las muestras que contenian proteina se despro- teinizaron previamente por precipitacion con acido tricloroacético o perclorico 5%, tomando para el ana­ lisis una alicuota del sobrenadante. (2) Fôsforo total. La muestra ( 1 - 10 jig de fôsforo) se evaporô a sequedad en un tubo de ensayo, se ahadieron 2 gotas de SO^H^ concentrado y se ca- lentô hasta que comenzaron a aparecer humos blancos de triôxido de azufre. A continuaciôn se ahadiô 1 go- ta de âcido perclôrico 70% y la muestra se calentô hasta que quedô clara. Después de enfriar a temperatu­ ra ambiente el volumen se ajusté a 10 ml con agua des­ tilada y se tomaron alicuotas (0,1 - 1 jig de fôsforo) para anâlisis de fôsforo inorgânico. Como patrôn se utilizô una disoluciôn de PÔ ÎÎ . 8.3. Anâlisis de DNA (49) El reactivo de difenilamina se préparé disol­ viendo 1-, 5 g de difenilamina en 100 ml de âcido aceti­ co glacial y ahadiendo ]_,5 ml de âcido sulfûrico con­ centrado. Antes de usarlo, a 20 ml de la mezcla ante­ rior se ahadiô 0,1 ml de una disoluciôn de acetaldehi- do en agua, preparada como se indiea a continuaciôn. La defenilamina se recristalizô de etanol 70% y el acetaldehido se destilo y almacenô a 4”C disuel- to en agua a una concentraciôn de l6 mg/ml. La muestra se diluyô con CIO^H 0,5 N para tener una concentraciôn final de 5 “ 80 jig de DNA por ml. A 1 ml de la muestra se ahadieron 2 m'I del reactivo y ola mezcla se incubô 16 - 20 hr a 30 C. La densidad ôptica a 600 nm se midiô contra un blanco de CIO^H 0,5 N tratado de un modo anâlogo al problema. Como patrôn se utilizô DNA de esperma de sal­ mon disuelto en NaOH 5 mM a una concentraciôn de 0,5 - 1 mg/ml. La concentraciôn del DNA patrôn se determinô por anâlisis de fôsforo total. 8.4. Anâlisis de hexosas (50) El reactivo se préparé disolviendo 0,05 S de antrona en 100 ml de âcido sulfûrico concentrado, con­ teniendo tiourea 1%. A 0,1 ml de la muestra (1-50 yag de hexosa) se ahadieron 0,5 ml de reactivo. Las muestras se incuba­ ron a 80“C durante 15 min y se determinô el espectro entre 500 y 800 nm frente a un blanco sin hexosa tra­ tado del mismo modo que el problema. Como patrones se emplearon glucosa, manosa, lactosa y fucosa, asi como triptofano. Este aminoaci- do da color con el reactivo con un maximo entre 520 y 560 nm, diferente del maximo obtenido con las hexo­ sas a 620 nm. Para el analisis de glicoproteinas en el fago o proteina del fago, las muestras procedentes de gradientes de sacarosa se dializaron durante cuatro dias contra 8 litros de DF (2 litros/dia) para elimi­ nar la sacarosa, A 1 ml de la muestra se ahadiô 0,1 ml de âcido tricloroacético 100% (en volumen) enfria- do a 4~C, se dejô 15 min en hielo y el precipitado se recogiô centrifugando 10 min a 12.000 rpm. El sedimen to se resuspendiô en un pequeho volumen de fosfato sôdico 0,01 M-SDS 0,1% (concentraciôn de proteina, 0,5 2 mg/ml) y se neutralizô con HaOH 0,5 M . Para anâlisis de hexosas se einpleô 0,1 ml de esta muestra contenien­ do 5O-8OO jiXg de proteina. 8.5. Anâlisis de aniinoâcidos (5I) Hidrôlisis de la proteina. La proteina de 029, libre de DNA, preparada co_ mo se indica en III.6, se dializô exhaustivamente con tra acetato arnônico 0,1 M a 4 C y una alicuota, que cçntenia unos 0,2 mg de proteina, se peso en un tubo de vidrio pyrex, pesado previamente. Las muestras se liofilizaron repetidas veces, disolviendo cada vez el residuo en H^O destilada. Finalinente, se pesaron los tubos con el residuo seco y se ahadieron 0,25 ml de CIH concentrado y 0,25 ml de H^O destilada. La parte superior del tubo se estirô a la llama en forma de un capilar y el contenido se congelé en una mezcla de al- cohol-nieve carbônica. El tubo se conectô a una bomba y después de hecho el vacio, se sacô el tubo del baho de congelaciôn y se cerrô el capilar mientras se se- guxa aplicando el vacio. Los tubos de hidrôlisis sé incubaron a 105 C durante 24, 48 o 72 hr. Una vez abierto el tubo, la muestra se llevô a sequedad en un evaporador rotatorio en vacio, se ahadieron 2 ml de H^O destilada y se volviô a evaporar. A veces, la muestra se llevô a sequedad en un desecador de vacio, conteniendo KOH sôlido, coneotado a una bomba durante la noche. El residuo seco se disolviô en 2,5 ml de tarnpôn de pH 2,2 y se usé 1 ml para el anâlisis de aniinoâcidos âcidos y neutres y 1 ml para el anâlisis de los amirioâcidos bâsicos. Oxidaciôn con âcido performico (52,53) El âcido performico se préparé ahadiendo a 1,8 ml de âcido formico 98%, 0,2 ml de H O 30% y mante-2 2 niendo la mezcla a temperatura ambiente durante 2 hr. Al residuo résultante de liofilizar 1 ml de la disolucion standard de aminoâcidos (2,5 Jimoles/ml) se ahadieron 0,25 ml de âcido performico y la mezcla se incubô en un baho de hielo durante 2,5 hr. A continua­ ciôn se diluyô con 2,5 ml de agua, se liofilizô y el residuo se disolviô en 2,5 ml del tarnpôn de pH 2,2 (1 j^mol/ml ) . Para la oxidaciôn de la muestra, 0,3 ml de la disoluciôn de proteina se liofilizaron y el residuo se disolviô en 0,1 ml de âcido performico. Después de incubar en un baho de hielo durante 2,5 hr se aha­ diô 1 ml de agua y se liofilizô. Al residuo se ahadie­ ron 0,3 ml de CIH 6 N y se hidrolizô 24 hr a 110“C. Las nianipulaciones subsiguientes se describen en el apartado anterior; la muestra se analizô en la colum­ na,larga y se calcularon los micromoles de âcido cis- téico y metioninasulfona con respecto a'los picos de alanina y leucina, que no se alteran por el tratamien- to con âcido perfôrmico. Anâlisis de los resultados Los picos correspondientcs a cada aminoâcido se iTitegraron manualmente, multiplicande la altura de cada pico por su anchura, determinada contando los puntos impresos existantes sobre la paralela media a la linea base. Las areas de cada pico, cornparadas con las determinadas en el anâlisis de una mezcla patron de aniinoâcidos (media de très deterniinaciones ) , permi- tiô calculer las cantidades absolûtes de cada amino­ âcido. La cantidad de treonina, serina y tiros.ina se determinaron extrapolando a tiempo cero los valores expérimentales. Para la isoleucina se tomaron los va- lores correspondientes a 72 hr. Para el resto de Los aminoâcido s se tomô la media de las très determinacio • nés. Valoraciôn del triptofano. El triptofano se determinô espectrofotometrica- mente (5^,55)• La proteina de 029, preparada como se indicô anteriormente, se disolviô en NaOH y se leyô la ab- sorciôn a 294 y 280 nm. Empiricamente se ha estable- c]do que la relaciôn molar entre tirosina y triptôfa- no es Tyr P. 592 £ 2^^ ' Try '■ 0,263 ^go ' 35^ Por tanto, conocidos los moles de tirosina del analisis de aminoâcidos, se pneden calendar los moles de triptofano. En otras ocasiones se determinô el espectro en­ tre 240 y 320 nm. En este espectro se obtienen dos mâ- ximos de absorciôn. La pendiente de la tangente a am- bos picos nos permite obtener un paramètre s = io3 . _i A 2 -Al E max donde y E^ son las absorciones en los dos mâximos, correspondientcs a unas longitudes de onda /\ 2 " respectivamcnte. La relaciôn entre S y la relaciôn molar Tyr/Try se da en la tabla 2. 8.6. Anâlisis de bases (36) A 1 ml de una disoluciôn de DNA de 029 de 1 mg/ ml, en un tubo de centrifuga, se ahadieron 2 volùmones nde acetona a 4 C y cl precipitado se recogiô centi'ifu- Tabla 2 . Anâlisis. de triptofano. Valores de la relaciôn molar tirosina/triptôfano en funciôn de S. Tyr/Try S ( nm ̂) Tyr/Try S (nm ^) 0,1 - 17,5 1,1 - 1,8 0,2 - 14,7 1,3 0,11 0,3 - 12,6' 1,5 1,5 0,4 - 10,7 2,0 4,8 0,3 - 9,0 2,5 8,4 0,7 - 6,1 3,0 11,9 0,9 - 3,9 4,0 19,4 1,0 - 2,8 S = 10^ . %2 - L 1 A 2 - Ax Emax gando 15 min a 3*000 rpm a 4~C, se sacô el sobrenadan­ te y el sedimento se secô con una corriente suave de nitrôgeno. Al DNA seco se ahadieron 0,013 ml de CIO^H 70% y el tubo tapado con parafilm se sumergiô durante 1 hr en un baho de agua hirviendo. Después de enfriar a temperatura ambiente se diluyô con 2 volunienes de agua destilada. Del hidrolizado asi obtenido se tomaron 0,01 - 0,02 ml para crornatografia en papel Whatman 1 o 3 MM, previamente lavado con el disolvcnte (isopro- panol-ClIl-H^O; 170:41:39) y secado posteriormente. Como marcadores se emplearon 0,013 ml de una mezcla de las cuatro bases del DNA a una concentraciôn de 0,3 mg/ml, disueltos con CIO^H 70% diluido con 2 volunienes de agua destilada, y DNA de esperma de sal- môn, de composicion de bases conocida, hidrolizado a la misma concentraciôn y en las mismas condiciones que el DNA de 029* Después de 20 hr de crornatografla descendente se secô el papel y las manchas se detectaron con una lanqjara ultravioleta, se recortô la zona de papel co- rrespondiente a cada maneha y el material se eluyô agitando durante la noche el papel suspendido en CIH 0,1 M. El volumen de la disoluciôn se determinô por pesada y la densidad ôptica se midiô en un espectrofo tômetro Beckman DU-2, calibrando con CrO^K^ (59), en una cubeta de 1 cm de paso de luz. Como blanco se utilizô una disoluciôn en CIH 0,1 M del material eluî do de una zona del cromatograma a la que no se habia aplicado muestra. Para cada mancha se determinaron las relacio- nes espectrales, que confirmaron la identificaciôn de las mismas. Para las diferentes bases se tomaron los coefi- cientes de extinciôn que se dan en la tabla 3, resumen de un expérimente. III.9. DETERMINACION DE DENSIDADES La densidad de disoluciones de fago o disolven- ̂ ote se determinaron por picnometria a 20 C, usando un picnômetro calibrado de 7 ml de capacidad cuya ecua- ciôn empirica de calibraciôn era WgQ = 7,12392 + 0,078 L, siendo la masa del liquide que llena el picnômetro y L la distancia desde el cero del picnômetro hasta el nemisco. o\ (M G)T5 gQ r—IO t3 m0)w(ÜrÛ G)'d m •riJfi •H1—1\(v 5 0m oPi % < S w 0%O)Pi X bO P'0 ■HÜPHOm•HQ \w *cr d d CP T3 •H •H H < H U <5 La tabla 4 indica una determinaciôn de la den­ sidad de una disoluciôn de 029» III.10.DETERMINACION DE VISCOSIDADES La viscosidad de disoluciones de determinaron a 20 C usando un viscosirnetro de Ostwald. (57 ) • III.11.DETERMINACION DE ABSORBANCIAS Las densidades ôpticas se determinaron en un espectrofotômetro Beckaman DU-2, calibrado con una so- luciôn que contenia 0,ü400 g de CrO^K^ por litro de KOH 0,05 M, usando una cubeta con un paso de luz de 1 cm (58). Las diluciones de la soluciôn concentrada para la med]da de su absorciôn a 2Ô0 nm se hicieron por diferencia de pesada, operando del modo siguiente : una cubeta del espectrofotômetro que contenia una pe- queha barra agitadora se pesô 1 ) vacia, 2~) con di- solvente (diluyente de fago) y 3~) tras ahadir, suce- sivamente 0,01-0,02 ml de la soluciôn concentrada del fago. Tras cada adiciôn se agitô el contenido, se pe­ sô la cubeta y se midiô la densidad ôptica a 2Ô0 nm y 350 nm para corregir la absorciôn debida a "scatte­ ring”. Las absorciones se corrigieron de acuerdo con ÎH 0 A ON CM S I p A. CM 0w '0 H H •H 0 0 •H O d 0P p P ü r- m (D p p P O d •r4g CD CD H P noE g 0 •• + bO H '0 '0 U) d d CD p P ■ri d CM HV ü Ü no p ON H •H •H bO eu CD CD d A A d d CM no no p H H p p H H ■0 no p 0) CD CD CD A^ d d H no nO V no no no d II •H •r4 0 0 0 0 % m II % m U} U) O P CD CD CD CD CM CD CDP A A A . A Q P la curva de calibraciôn y, por la diferencia de pesa­ da, se determinô el peso de la disoluciôn concentrada de fago ahadida a la cubeta. A partir de este valor y del peso del disolvente se determinô el factor de diluciôn (d) correspondiente a cada adiciôn, expresa- do en gramos de disoluciôn diluida de fago por gramo de disoluciôn concentrada. El producto de la abosr- ciôn a 200 nm por el factor de diluciôn correspondien­ te es una constante que indica las unidades de -̂ 260 de la soluciôn de fago original (tabla 5). Multipli- cando este valor por la densidad de la soluciôn con­ centrada del fago se obtiene la absorciôn de la solu­ ciôn por ml. En otros casos, para determinar las unidades de de la soluciôn concentrada se representô grâficamente la frente a l/d-1. Después de inter̂ polar la mejor recta por minimos cuadrados, se deter­ minô d para una A^^^ = 1. El inverso del valor obte­ nido mas 1 da, directamente, las unidades de A^^^ de la soluciôn original (tabla 5, figura 2). III.12.DETERMINACION DE PESO SECO Para determinar la abosrciôn especifica de fago, primero se midiô la ■̂ 260 la soluciôn, co- pH0 CA 0 to O H Pp H •H(H X ON O CA CA co O A CM CO O CM T l CM 4 CA O LA H CM O H LA CD NO H A CM A NO CA A NO CM II P V H r- w • r f r- T31 O H H CM CM CA 4 4 LA NO CM Q) 'Ü bO -P \P H NO U CD LA 0% r- AP 4 H C•H NC V o NO NO O O O NO O NO 4 CO II A H o A H O O O A O H 4 4

' »' «- CMP 4 LA CA (A H LA O NO H CO O P NO CM NO . CM 4 H CM CA H -— ' T3 ON H 4 ACM X Po H PT)P O 4 4 O O O 4 O NO CM \ PT3 r- r- r r- r- r- 00 V<3 co CM lA CA H LA NO 4 4 NO 4 •HP H P'0 ' * * * * O P•H Hü 4 CMP T5 H A LA H NO NO A H lA A CO H V—' H X - r- •- r •' - r- r- r- •' + 10 O H o CO NO 4 CO NO A CO NO O CA IIP NO CM H H CM H O O O O O CA H CACM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM H CM A HP < CM CM § CDP EP Ovû CM P •HüPP,ÛP0w 4^ C7N lA C3D CA LA lA 4^ A - LA O CM NO CO CM P P '0 •H ÜP1-4 •H Q H C O C O I A C A A - H 4 ^ ( A H ( A A - a - l a c u a - c a o A - no L A C 0 L A 4 ^ cA C M C M C M H H A O CO A CA CA LA LA l A l A O CA 4 A A CA LA A CM NO CO NO H CM CA 4 NO A CO O H CM CM < O O O O O O O H H H rû II II II bO P »' P P P +> ^0 H P •H NO P Ü H P > P O 'd H H O 0' 0 r p P P O '0 •H •H •H T3 P ü P p + H p P P •ri 0 P bO LAE T3 > LAP P H 0 lA p H z 0 P A -p •H m P p bO •H P CO Q P V , f -1- H lA P P P '0 '0 P H •rl H P 0 Ü H rC p •H P P pH U A < CMoo oo oo o o o LA CM O LA CM 00 A A H CM 4 LA O O H H H H O O O O O O C (D O O O O H on 4 * H (A 4" NO CO A- ON A A C O C O C O C O C O C O C O C O C O C O CM CA 4 LA NO A CO 0\ o H ! 0.C C/!- /y / / / ...L..... -.1- / / Figura 2. Relaciôn entre y diluciôn de una disolu­ ciôn de 029 en diluyente de fago. mo se acaba de indicar. A continuacion la muestra se dializo frente a agua destilada o, preferiblemente, contra acetato amonico 0,1 M. La disolucion dializada se liofilizô, el residuo se resuspendiô en agua y se volviô a liofilizar. Esta operaciôn se repitiô una vez mas. El residuo liofilizado se secô a presiôn re- oducida a 100 C en presencia de P„0_ hasta peso cons-2 5 tante (48 hr). III.13.DETERMINACION DE VOLUMENES ESPECIFICOS El volumen especifico parcial de un soluto es el incremento de volumen del disolvente al ahadir la unidad de masa de soluto a una masa, infinita de di­ solvente. V Siendo ̂ (13-1) _ O la densidad del disolvente en g cm , 3el volumen del disolvente en cm , el peso del disolvente en g y ̂ ^2 densidad, el volumen y el peso del soluto, |Û̂ , y , los de la disolu­ ciôn y el volumen especifico parcial del soluto, se tieno que Dividiendo por + — — (1 - Vr, P-.) (13-3)V V V 2 r 1 3 3 3 Puesto que por definicion de , la masa del disolvente (W^) es infinita frente a la de soluto (ŵ ) f que nos permite determinar a partir do la pendien­ te de la recta que tiene como ordenada y abcisa. 13.1. Volumen especifico de 029» La densidad del fago en diluyente de fago se determinô por picnometria a 20"'C de disoluciones de fago de concentraciones entre 10 mg/ml y 35 mg/m 1(59,68,69). La concentraciôn de las disoluciones de 029 se determinô midiendo la absorciôn ôptica como se ha in­ dicado antes; multiplicande esta por la absorciôn es- _ opecifica del fago se obtuvo la concentraciôn en g cm Representando la densidad, , de diluciones de fago en funciôn de la concentraciôn, C^, se define una recta cuya ordenada en el origen es la densidad, , del disolvente y de cuya pendiente (l-V^ ^ ̂ ), se puede calcular V^. 13-2. Volumen Gspecifico de la proteina do 029* El volumen especifico parcial de la proteina total de 029 sc obtuvo a partir de su composiciôn de aminoâcidos (60). El volumen molar aparente de una proteina de composiciôn conocida puede calcularse a partir de los incrementos de volumen de sus aminoâcidos. Si la pro­ teina contiene n. moles del aminoâcido i de peso mole1 — cular y volumen molar aparente , el volumen mo- lal de la proteina , es Por tanto, el volumen especifico aparente de la proteina, V , esp 1 S ^ n (k '"p " y " "I" Esta ecuaciôn contiene el peso molecular de la proteina, , pero este vaJ.or no es necesario conocer^ lo para determinar el volumen especifico aparente, V , Si w, es el tanto por ciento en peso del aminoâci p r — do i y V. el volumen especifico do] mismo (- / M .),1 1 1 el volumen de 100 g de proteina es w . V., y el volu-1 1 men especifico aparente, V V = --- -— — (13-7) ' 100 13*3« Volumen especifico del DNA de 029 El volumen especifico del DNA de 029 se deter minô a partir de su densidad de flotaciôn en ClCs y de su composiciôn de bases, después de corregir el agua ligada y pasar de cationes Cs a Na. La ecuaciôn Mp + l8 n — = M- V_ + 18 n (13-8)Cs Cs^Cs relaciona la masa media de la sal de Cs de los nucleô tidos del DNA con su volumen especifico (6l). es la masa media de la sal de Cs de los nu-Cs cleôtidos, n es cl numéro de moles de agua ligada por ml de nucleôtido, es la densidad de flotaciôn del DNA en ClCs y es el volumen especifico de la sal de Cs del DNA. Mearst y Vinograd (62,63), estudiando las den- sidades de flotaciôn del DNA de T4 en varias sales de cesio, determinaron que para este cation el numéro de moléculas de agua ligada por ml de nucleôtido es ?• La masa media de la sal de cesio de los nucleôtidos del DNA de 029 se determinô a partir de su composiciôn de bases, Sustituyendo estos valores en la ecuaciôn an­ terior se obtiene el volumen especifico de la sal de cesio del DNA. Para pasar de la sal de cesio a la sal sôdica hay que tener en cuenta la diferencia de volu­ men entre dichos cationes (64). Llamando C_ y C„Cs JNIci los volûmenes de los cationes indicados, el volumen especifico de la sal sôdica del DNA sera - . ^Cs ^Cs - (^Cs - S a .) II1.14.DETERMINACI0N DE CORFICIENTES DE SLDIMRNTACION. l4.1. Ecuaciônes fondamentales (69). Una macromolécula en disoluciôn contiene una cierta cantidad de disolvente por lo que, en general, la masa, y el volumen, , de la particula solva- tada son, en general, desconocidos. Si la soluciôn se somete a un campo centrifugo, la fuerza por particula es F = M^w^r (14-1)c h siendo w la velocidad angular del rotor y r la distan cia de la particula al eje de giro. Contrarrestando a la fuerza centrifuga existe una fuerza de flotaciôn, , que, por el principle de Arquimedes, es F, = V, fi w^r (14-2)b h To siendo b la densidad del disolvente.r° Por tanto, la fuerza neta por particula es F = F - F- = (M, - ù V, ) w^r (l4-3)c b h I o h La masa, y el volumen, , de la particula M = M (1 + i ) (14-4) solvatada, valen ï Vh = M (Vg + V p (14-5) siendo M el peso molecular de la particula no solva­ tada, los gramos de disolvente asociados con 1 g de la particula no solvatada, el volumen especifi­ co parcial de la particula y el volumen especifico del disolvente. Sustituyendo (l4-4) y (l4-5) on (l4-3) = M (1 - Vgû ) w^r (l4-6) La fuerza, , imparte a la particula una ve­ locidad constante, u. u = = M (1 - Vgû)w^r (14-7) siendo f e.l coeficiente de rozamiento de la particula. La velocidad, u, depende de la velocidad del rotor, w, y de la distancia, r, al eje de giro. Pof tanto, es conveniente définir una cantidad que dépen­ du solo de paramétrés moleculares. Esta cantidad es el coeficiêntc de sedimentaciôn de la particula, s. u M (1 - Vg ̂ ) (14-8) El coeficiente de sedimentaciôn es, por tanto, la velocidad que adquiere la macromolécula por campo centrifugo unidad. En el sistema CGS sus unidades son s eg. 14. 2 . Correcciôn a condiciories standard De la ecuaciôn (l4-7) es claro que el coeficien te de sedimentaciôn, s, debe variar con la concentra- ciôn, ya que depende del coeficiente de rozamiento, f, que varia con la concentraciôn. Aunque no existe una teoria general de la de- pendencia de f y, por tanto, de s con la concontra- ciôn, ernpiricamente se ha observado que para macromo- léculas compactas o simétricas, el coeficiente de se­ dimentaciôn suele variar linealmente con la concentra^ ciôn en la forma s = s° - KC (14-9) mientras que para macronioléculas asimétricas la rela- ciôn empirica es 1 1 — : = —— + KC ,(l4-10) s s Tanto en (l4-9) como en (l4-10), s° es el coe­ ficiente de sedimentaciôn a diluciôn infinita y C la concentraciôn de la disoluciôn. En las dos ecuaciones K siempre es positive, es decir, s siempre disminuye al aumentar C. Como es lôgico el valor del coeficiente de se­ dimentaciôn extrapolado a concentraciôn cero, s ,̂ dé­ pende de las propiedades del disolvente, por esta ra- zpn, el valor de se reduce a condiciones standard o _ ode agua a 20 C como disolvente. El valor de s corre- gido de este modo séria el que tendria una disoluciôn de la macromolécula en agua a 20~C si los paramétras moleculares M, y f (ecuaciôn (l4-8)) fueran cons­ tantes independientes del disolvente. Para una particula esférica no solvatada (h = o) de masa M y volumen especifico parcial el coe­ ficiente de rozamiento molar es V3 siendo y la viscosidad del medio y ij) (m, V^) una fun- ciôn de M y V^. Si la particula no es esférica y esta solvata­ da , f = b \jj (M, Vg, h) (14-12) siendo (|) (M, Vg, h) una funciôn desconocida détermina- da por la forma, tamano y solvataciôn de la particula. Sin embargo, para corregir el valor de s^ a agua a 20~C se supone que \j) (M, , h) es una constante in- dependiente del disolvente (65). Por tanto, si en un cierto disolvente, d, a una temperatura de t~C tenemos, de acuerdo con (l4-8) y (i 4-12), un valor del coeficiente de sedimentaciôn a diluciôn infinita, s? ,,t , d ’ o ̂ (14-13) ’ ^ 2 ' " ) Qy en agua, w, a 20 C ^ (i4_iA) 72o,«i(” ’̂ 2 - »') De (13) y (14) o o Vt,cl ^2 2 0 ,w fzo.w) En la ecuaciôn (l4-13) el valor del volumen es- X opecifico parcial del soluto en agua a 20 C, V_- _ ,2,20,w se suele sustituir por el valor del volumen especifi- o C O parcial en el disolvente experimental a 20 C, 20 d resultando En la correcciôn del coeficiente de sedimenta­ ciôn el factor mas importante suele ser la viscosidad ya que durante un experimento de sedimentaciôn la vi_s cosidad del disolvente puede variar de un modo apre- ciable. Por tanto, el factor debido a la viscosidad. Pt,d ^t,w Pt,dIn— = -=— X720,w 720,w yt ,w w suele separarse en dos subfactores, uno, variable con la temperatura, que da la relacion de viscosidades del agua y otro, que da la relacion de viscosidades del disolvente y del agua a la temperatura del experi­ mento. Do acuerdo con (l4-17), la ecuacion (l4-l6) se transforma en (l4-l8) 9t \ f *7d \ (^'^2s20,d ^20, w ) ^ 2 0 y W \ y w / t ^2 i t , d ^ t , dj o o ^20,w “ ^t,d 14. 3 • Det erininacion experimental Reescribiendo (l4-8), dr/dt _ 2.203 d logr ® “ 2 2w r 60 w dt’ siendo t* el tiempo en minutos, si représentâmes log r frente at' se obtiene una recta cuya pendiente nos permite conocer el valor s de la particula a la con­ centraciôn del experimento. Los coeficientes de sedimentaciôn de 029 en DF se determinaron en una serie de disoluciones de con- centraciones comprendidas entre 1 mg cm ̂y O.O56 mg cm ^, en una ultracentrifuga analitica Beckman, mode­ la E, a 10,389 rpm y a 20,0"C por el método de J.a ve­ locidad de sedimentaciôn (67,68), enipleândose un ro­ tor An-D con una célula standard de aluminio de 12 mm. El termistor se calibrô representando los valo rcs del dispositive de medida del aparato frente a las lecturas de un termômetro contrastado insertado en el orificio del rotor donde se coloca la côlula. El rotor enfriado previamente se fué calentando lent_a mente en un termostato. Para medir las distancias desde el eje de gi­ ro hasta la zona limite entre el disolvente y la di­ soluciôn se usé el sistema ôptico schlieren que per­ mite la visualizaciôn del limite en una fotorgrafia en que aparece representado el gradiente del indice de refracciôn, dn/dr, en funciôn de la distancia, r, como una curva de Gauss. En general, la variaciôn del indice de refracciôn dn, puede considerarse direc tamente proporcional a la variaciôn de concentra- ciôn (69); por tanto, para la precision requerida en la mayoria de las medidas, la figura schlieren es una grâfica de dn/dr en funciôn de r . La abcisa corres­ pond! ente a la ordenada maxima se utilizô para medir los desplazamientos del limite a diferentes tiempos, por medio de un microcomparador ôptico (68). o oEl valor obtenido para s^^ , a 20 C en dilu- yente de fago se corrigiô para agua a 20“C de acuerdo con la ecuaciôn (l4-l6) PsOiDF 6 "^2 20,DF ^20,w 920,w 20,DF ^20,20,W 20,DF y20,w V '2 20,DF r 20,DF E PO DF— , la relaciôn de viscosidades del DF /20,W oy el agua a 20 se determinô experimentalmente en un viscosimetro de Ostwald obteniôndose un valor de 1,028 - 0,004; V ̂ , el volumen especifico par- cial de 029 en DF, se determinô como se indica en la pâg. 56; la densidad del agua a 20,0"C, es 0,99823 y ^ p , la densidad del DF a 20“C, se de­ terminô experimentalmente por picnometria, obtenién- dose un valor de 1 .0072. III.I5.DRTERMINACION DE COEFICIENTES DE DIFUSION 13.1. Ecuaciones fundamentaies (63). Supongamos que en un tube que contiene una di­ soluciôn de una macromolécula de concentraciôn co- locamos sobre ella con cuidado disolvente puro• De e^ te modo se créa un limite nitido a través del cual la concentraciôn de soluto cambia bruscamente de cero a Cq . Este sistema no esta en equilibria y, si se aguajr da un cierto tiempo, el potencial quimico, del soluto sera el mismo en todo el sistema. Por tanto, la fuerza motriz que tiende a desplazar el soluto a través del limite es el cambio del potencial quimico con la distancia. El flujo, Jo, por unidad de àrea sera '2 - - ( % T - ) 115 - 1 ' El potencial quimico del soluto depende de T, P y C, pero si T y P son constantes ^ ^ 2 / 0^2 ] ) (15-2) Por tanto el gradiente de concentraciôn créa el flujo de soluto. Como 2̂ = ^ 2 + In CgY2 (15-3) donde Y2 ^s el coeficiente de actividad, que es fun­ ciôn de T,P y . Diferenciando respecto a Cg, u. 3c, RT 1 + C, (15-4) Sustituyendo (l$-4) y (.15-2) en (15-1 ) J c_ 1 + c / O Iny, 2 c o X (15-5) El factor L2/C2 ^n (15-4) es l/Nfg, siendo N el numé­ ro de Avogrado y fg el coeficiente de rozamiento del soluto (65). Por tanto, RT Nf 1. -1- C = - D 2 0 c siendo Q 1 f c Iny, T T C (15-6) (15-7) (15-8) El factor es el coeficiente de difusion, 2 ** Xcon unidades cm s eg , definido experimentalmente por la ecuaciôn (15~7) que es la primera ley de Fick. La ecuaciôn (15-8) indica que es funciôn de RT, que es una medida de la energia cinética de las moléculas, de f , que détermina el tamano y forma de la molécula y de un factor de correcciôn Olny 1 + C. que indica que D depende de la interacciôn soluto-so- luto, es decir, de la concentraciôn. Para soluciones idéales. Por tanto, (15-9) Si, ademâs, f^ no varia con la concentraciôn, es una constante. Para la determinaciôn experimental de lo mas facil es observar como varia la concentraciôn del soluto, Cg, en funciôn del tiempo en la regiôn del li mite. Esto puede obtenerse combinando la ecuaciôn (15 7) con la ecuaciôn de continuidad t / X \ ^ X / t que establece la conservaciôn de masa de la macromolé cula en el sistema. De (15-7) y (15-10) (15-11) y, si suponemos que no depende de C , obtenemos (1> X 1 x^y t (15-12) La ecuacion (15-12), que es la expresiôn de la segunda ley de Fick, indica que la velocidad de cambio de la concentraciôn de soluto en el limite de difusiôn es proporcional a la velocidad de c.ambio del gradien­ te de' concentraciôn en el limite. La ecuaciôn (15-12) puede resolverse en casos especiales, una vez definidas unas ciertas condicio­ nes iniciales y de contorno (figura 3 )• La longitud de la célula (coordenada x) puede considerarse muy larga, en relaciôn al tiempo durante el que se sigue el proceso de difusiôn. Por tanto, puede suponerse que en la parte superior e inferior (x = +Ody - qc? ) la concentraciôn no deja de ser cero y Co, respecti- vamente. A tiempo t = 0 en x = 0 se créa un limite nitido del disolvente sobre la disoluciôn. En estas condiciones de difusiôn libre la soluciôn de la ecua­ ciôn (15-I2) es ,x/2 fût Co dy (15-13) siendo 3' 2 Vot t 0 0 m, t È f V L : t, J I ':Lw' ( ' I f rU q t > 0 G) n 0 0 Cf H CO 0 r- t'*'* r.r%'/y ivj Figura 3« Ensanchamiento de un limite inicialmente nitido du­ rante difusiôn libre. La ecuaciôn (15-13) es la curva en forma de S de la figura 3, que représenta = f(x). La inte­ gral es la integral de probabilidad, cuyo valor, que es una funciôn de x/2 fût, varia desde 0 hasta V2, cuando x/2 ̂Dt varia desde 0 hasta O O . En algunos casos es mal util* tener la dCg/dx = f(x). Para ello, derivando (15-13) respecto a x, ob­ tenemos el gradiente de concentraciôn, que es la "curva de error" o campana de Gauss.: 3c. \ c„ _ - ^(fe-) ^ e (15-14) \fDt Tanto la ecuaciôn (15-13) como la (l5-l4) per- miten determinar experimentalmente el coeficiente de difusiôn. 15.2. Correcciôn a condiciones standard (65) Para interpretar el coeficiente de difusiôn obtenido, extrapolado a concentraciôn cero, D°, ha de tenerse en cuenta que una particula en disoluciôn es­ ta solvatada con una cierta cantidad de disolvente, S , adquiriendo un volumen solvatado, , dado por Vh = -y 1T (15-15) suponiendo que la particula solvatada sea una estera de radio R .o De acuerdo con la ecuaciôn (l4-5) \ = M (V^ + q V p%. V? Por tanto, <'2 ' ' 1 ' ] V3 (15-16) El coeficiente de rozamiento de la estera ideal séria f = 6 TT bR o / o siendo D la viscosidad del medio. (15-17) ? El coeficiente de rozamiento real de la parti­ cula puede expresarse en funciôn de f^, por medio de la relaciôn f/f^. f = "T— • 6 TT b R / ° (15-18) La relaciôn (f/f ) = 1 si la macromolécula sol vatada es, realmente, una estera, pero, en general, (f/f^) >1. Combinando (l5-9), y (l5-l8) RT NI'-.0 = 6 TT(7(f/f ) 3M (V. + f V, ) 1 /3 1 1 / O kir (15-19) La ecuaciôn (15-19) indica que el coeficiente de difusiôn de las partîculas, , depende de su pe­ so molecular, M, de su volumen especifico parcial, , de (f/f^), que es un indice de la desviaciôn de la particula de la forma esférica, y del indice de solvataciôn,^. De un modo anâlogo a lo hecho con el coeficien te de sedimentaciôn, s°, el coeficiente de difusiôn, D°, se corrige normalmente a condiciones standard de agua a 20“C. El valor corregido de D°, D^q ^ séria el coeficiente de difusiôn de la particula si los pa­ ramétrés moleculares, M, V^, (f/f^) y 0, (ecuaciônS I5-I9) fuesen constantes independientes del disolven­ te. Si esto fuera asi, de acuerdo con (15-19), para un cierto disolvente, d, a una temperatura 273 + t, 273+t,dy con una viscosidad tj? ° p Z l : t (15-20) QPara el agua a 20 C D°20,W = I T — — 4̂ ("'̂ 2' (15-21) 7293, W De (15-20) y (15-21) 20,W t,dV ?293, w ,d I / 293 1 / \ 273 + t / (15-22) y desdoblando la relacion de viscosidades en dos sub­ factores, igual que se hizo en la correcciôn del coe­ ficiente de sedimentaciôn, (15-2 3) / ^273 + t \ / 293___ \ 20,W t,d^ / 273+t\^293 / w V, 283 + t / 15.3" Determinaciôn experimental Los coeficientes de difusiôn de 029 en DF se determinaron en una serie de disoluciones de diferen- te concentraciôn en un aparato de difusiôn libre-elec- o otroforesis de Beckman, modelo H, a 1 C y 20 C, por très métodos diferentes. 1) Método de la relaciôn altura-area (70) Utilizando el sistema ôptico schlieren puede visualizarse en una plaça fotogrâfica el limite de difusiôn o zona de separaciôn entre el disolvente y la disoluciôn, dando una grâfica del gradiente del in­ dice de refracciôn,Qn/âx, en funciôn de la distancia. Esta grâfica es la representaciôn de la ecuaciôn (15- l4). 2 € ■ ¥ot (15-24) dx 2 V tT Dt siendo n = n^ + KC y A n la diferencia total del indi­ ce de refracciôn a través del limite. En la figura 3 , la altura, H, de la curva de Gauss, es H = f (15-25) ^ ^ X / X = 0 2 \tÏDt y el àrea. A, bajo la curva es dx = A n 2, dx ' (15-26) Sustituyendo (15-26) en (15-25) y opérande = 4TTDt (15-27) 2Por tanto, representando (A/H) en funciôn de t se obtiene una recta cuya pendiente es 4 T? D. Sin em­ bargo, en la prâctica hay que reducir las dimensiones obtenidas en la plaça a las dimensiones reales en la célula. Asi,*^n/*ix en la célula y la ordenada Y de la plaça schlieren estàn relacionadas por la ecuaciôn : = G^Y (15-28) 0 X Por otro lado, siendo G les aumentos vertica-V les, X la coordenada en la plaça y x la de la célula, X = (15-29) GV Por tanto r + 00 à n - Y dx = — — A (15-30) -00 Gv Sustituyendo (28) y (30) en (9), . A GV 2yiT D t y , siendo G = G /G, ,V h = G^ H (15-31) - 4 ( - Î ■ -TTG^ ^ H / t D = ----— I I . (15-32) 2) Método de Longsworth (70-72). Utilizando un interferômetro de Rayleigh como sistema ôptico se obtiene directamente una représenta- ciôn del indice de refracciôn frente a x a través del limite de difusiôn. Esta curva es la integral de la o^ tenida con cl sistema schlieren y esta dada por la ecuaciôn n = / x/2 Vut A n •± - g - v'dÿ (15-33) 0 siendo A n la diferencia total del Indice de refrac­ ciôn entre la disoluciôn y el disolvente a través del limite y y = x/2 \J Dt. Un limite de difusiôn libre en una célula de un interferômetro (la otra célula se llena con disolven­ te) da lugar a una diferencia de indice de refracciôn que va variando con la coordenada vertical a lo largo de la extension del limite de difusiôn. En la fotogra- fia se obtiene, por tanto, un desplazamiento horizon­ tal continue de lineas, tal como se muestra en la fi­ gura 4. Las lineas verticales en las partes superio- r (disolvente) e inferior (disoluciôn) de las fotos corresponden a regiones de la célula donde no hay lim^ te de difusiôn. Estas lineas definen, por tanto, el eje vertical de la célula. Las lineas diagonales en el centre de cada foto corresponden al limite de difu­ siôn. Cada linea corresponde a una funciôn, n(x),del indice de refracciôn en la célula; es decir, es una curva de probabilidad integral compléta (ecuaciôn 15- 33), pero como la apertura lateral del aparato esta limitada por la falta de coherencia de la luz de la I i I tt s Figura 4. Interferogrania de un limite de difusiôn obtenido con un interferômetro Rayleigh. fuente luminosa, tan pronto conio una linea se despla- za del eje mas de una cierta cantidad, se pierde; es­ to hace que no se obtenga el trazado completo de una linea a lo largo de todo el limite de difusiôn. En la figura 5 se han montado paralelas una serie de fotos idénticas de un mismo interferograma Rayleigh a dis­ tancias taies que las lineas ocupen seis posiciones relativas verdaderas. De este modo puede reconstruir- se la situaciôn que se tendria si las aperturas laté­ rales de las rendijas del interferômetro fuesen mucho mayores. En dicha figura puede verse que la grâfica correspondiente a una linea compléta es la curva in­ tegral de probabilidad dada por la ecuaciôn (15-33)* Puesto que las coordenadas verticales, H, de una figura de interferencias son proporcionales a la altura, h, (figura 3), en la célula, los puntos en los que las franjas diagonales sucesivas cortan a una vertical representan los niveles en el limite entre los que el camino ôptico difiere en una longitd de onda. Un paramétré fundamental de los calcules es el numéro total de lineas, J, que es una medida del cam­ bio total de concentraciôn a través del limite. Si ^ es el grosor de la célula, A n la diferencia del in I Figura 5. Sintosis de una curva integral de difusion com­pléta . dice de refracciôn entre la disoluciôn y el disolven- te y A la longitud de onda de la luz, T - a An ̂ A En general J no es un numéro entero; la parte entera es el numéro de lineas diagonales que cortan a una vertical;:1a porciôn decimal se détermina del mo­ do siguiente : si se traza una recta como continuaciôn de una de las lineas verticales correspondiente a la disoluciôn Komogénea situada por debajo del limite, dî cha linea no coincide en general con una linea verti­ cal en el disolventc situado sobre el limite de difu- siôn. La relaciôn entre este desplazamiento lateral y la separaciôn de lineas verticales adyacentes es la parte decimal de J. Todos los calcules que se describen a continua­ ciôn estân basados en la idea que la distribuciôn de concentraciôn en el limite de difusiôn es Gaussiana : Puesto que el numéro de la linea, j, es una medida de la concentraciôn en el limite de difusiôn y es igual a J/2 en el centre (bc - O) , figura 3, estes numéros pueden normalizarse a la misma escala que los de las tablas de funciones de probabilidad (73) usando la proporciôn ( j - = ( 2 j - J)/ J. r\ • / o2 En las tablas de funciones de probabilidad, las "coneentraclones” normalizadas \/ir J 0 estan tabuladas en funcion de las "distancias” normali zadas, hX = - 2\füt y varian desde 0 hasta 1 cuando x varia desde 0 hasta infinite. Por tanto, una vez emparejadas las lineas j -co- lumnas (l) y (2) de la tabla 6 , se calculan los valo- res (2j - J)/J para cada valor de j -columnas (3) y (4)-; puesto que las tablas de funciones de probabili­ dad solo cubren la mitad positiva de la funcion de pr^ babilidad, el signe de (2j - J)/J puede ignorarse siem pre que < J/2 y los valores de hj/2 \/Dt -colum­ nas (5) y (6)- se suman para obtener el valor del fac­ tor de normalizaciôn -columna (7)-« Las posiciones relativas, H^, de los pares de lineas emparejadas se déterminai! en un microcomporador obteniéndose las columnas (8) y (9) y la diferencia, /\h = , indica la distancia entre ambas -colum na 10-. Dividiendo los valores de la columna (lO) por los de la (l7) se obtiene el valor de 2 \/ot. (An/Zib) -columna (ll)- o sus cua.drados 40t ( AH/4h)^ -colum­ na 12-. La relaciôn AH/Ah es el factor de aumento del sistema de lentes, que se détermina fotografiando una escala exacta dibujada sobre una plaça de vidrio, que se monta delante de la célula. La comparaciôn de los intervalos de las lineas en la fotografia con los de la escala original permite determinar el valor de A H/Ah . Dividiendo los valores de la columna (12) por 2el valor de (A H/A h ) se obtiene 4Dt.- columna(13)-* Repitiendo todas las operaciones indicadas a difirentes tiempos y obtenidos los correspondientes valores de D, en general se observa que los valores del coeficiente de difusiôn suelen disminuir con el tiempo ya que el limite de difusiôn va haciéndose me- nos nitido. Representando los distintos valores obte­ nidos para D en funciôn de t puede extrapolarse para t = 0. Tabla 6. Determinaciôn de los valores 4Dt (AH/Ah) a partir de un interferograma Rayleigh de di­ fusiôn (ver tabla 22) Columna Pares de lineas apareadas; el numéro de la linea es una medi­ da de la concentraciôn en el 1^ mite de difusiôn. (3),(4) Normalizaciôn de los valores j a una escala igual que la de las funciones de probabilidad. k ’ (5),(6) (7) (8),(9) h/2 Vüt Distancias x = -h/2 VDt norinàli- zadas, obtenidas de las tablas de funciones de probabilidad a partir de los valores (2j -J)/J y (2 j^-J)/J. Factor de normalizaciôn = + Xi. Posiciones relativas de las li­ neas determinadas con un microcomparador. (10) (11) (12) (13) 2VDt(ÛH/âh) 4l)t (ÛH/Ûh) 4ot Distancia entre las lineas j h = "i-"k- k ’ Cocientre entre (lO) y (?)• (AH/Ah) , el factor de aumento del sistema de lentes, se dé­ termina como se indica en el texto. Cuadrado de (ll) Cociento entre (12) y ( A H/A h ) 24) 3) Mètodo del papel de probabilidad (72) Como ya se ha indicado antes, la ecuaciôn (13- A n 2 Vit Dt es la derivada de la ecuaciôn integral de probabilidad (15-33). Los valores de x en los dos puntos de infle­ xion de la curva, es decir, la desviaciôn standard, pueden obtenerse igualando a cero la segunda derivada de dn/dx, obteniéndose X = a = 2\/^ (15-34) Por tanto, 2 D = — — (15-35) 2t es decir, el coeficiente de difusiôn es la mitad de la 2varianza, C , dividido por el tiempo de difusiôn, t. En una distribuciôn normal de probabilidad la desviaciôn standard, a, se encuentra en una posiciôn correspondiente al l6% y al 84% del numéro total de lineas. Por tanto, una vez determinado el numéro total de lineas, se calcula que porcentaje del mismo se en­ cuentra entre el centre de cada linea y un extremo de la célula. Este porcentaje se représenta trente a la posiciôn de la linea con respecte al ej e de la célula. Siempre que el limite sea .suficientemente nitido al comienzo del experimento y el coeficiente de difusiôn no varie mucho con la concentraciôn, estes valores de- ben distribuirse como una distribuciôn normal acuinula- tiva. Representando esta funciôn sobre papel de proba­ bilidad debe obtenerse una recta en la que C corres­ ponde, con buena precisiôn, al l6 y 84% del numéro to­ tal de lineas. Representando los porcentajes de cada linea re^ pecto al total trente a sus posiciones relativas, para cada tiempo ,se obtiene una recta de la que puede deducirse el valor de J. Con los valores de 0 a dife- 2rentes tiempos, representando J en funciôn de 2t (ecuaciôn 13-35), la pendiente da el valor de D. III.l6.DETERMINACION DE MOVILIDADES ELECTROFORETICAS(65) La movilidad electroforética, u, de un policlec trolito se define como la velocidad por campo eléctri- co unidad. u = -------------- (l6“l) E De acuerdo con (16-I) las imidades de u son cm V -1seg En el caso de un polielectrolito, el numéro de grupos ionizados, positives y negatives, y por tanto su carga, es una funciôn del pH. Aquel pH para el que se hace cero la carga neta del polielectrolito se 11^ ma punto isoeléctrico, pl. Para determinar movilidades electroforéticas de un polielectrolito a diferentes pHs,con el fin de determinar el punto isoeléctrico, es necesario hacer las determinaciones a fuerza iônica constante, ya que las dimensiones de la doble capa electroquimica del macroiôn son funciôn de la fuerza iônica, I, y por tanto, una variaciôn de la fuerza iônica daria lugar a un cambio en la movilidad. Una aproximaciôn de la relaciôn entre movili­ dad y fuerza iônica esta dada por la expresiôn Z<2 X (kR) u = --------- (16-2) ôtryR 1 + kR 8IT Ne u donde k = I ---------- I , (16-3) 1000 6kT Z es el numéro de unidades de carga ( ̂ = 4,8 x 10 .e.e.), p es la viscosidad del medio, R es el radio de la particula, £ es la constante dieléctrica y I es 2la fuerza iônica del medio (I = G. Z. ).1 X K es el reciproco del radio de la nube iônica de la teoria de Debye-Hückel, que es una funciôn de la fuerza iônica del medio : si I es grande la nube iônica alrededor del macroiôn se contrae; si I es pe- quena, la nube iônica se difunde y extiende. La funciôn X (kR) es la funciôn de Henry, que varia entre 1.0 y 1.5 cuando kR cambia de cero hasta infinito. Para la determinaciôn de las movilidades elec- troforéticas de 029 a diferentes pHs se empleô un tarnpôn de barbital sôdico-acetato sôdico-ClH desde pH 2,6 a 9- A este tarnpôn se ahadiô en todos los casos ClgMg a una concentraciôn final 0,01 M y cantidades variables de ClNa segun el pH, para mantener la fuer­ za iônica constante Las medidas de movilidad se hicieron en una cé- lula de 11 ml de electroforesis libre, tipo Tiselius, ode Beckman a una temperatura dell C para evitar dis- torsiones termicas, aplicandose un campo electrico de 4,5 V cm ^. Ell todas las det erminaciones la concentra 260cion de 029 fué de 20 unidades de cm ^ Para determinar la posiciôn en funcion del tiempo del limite de separaciôn entre la disoluciôn y el disolvente en las ramas ascendante y descendante de la célula se utilizô el sistema ôptico Schlieren. Representando las distancias recorridas en funciôn del tiempo se obtiene una recta para cada pH, cuya pendiente es la velocidad media, v . Dividiendo la va ̂ m — locidad media por el campo eléctrico aplicado se ob­ tiene la movilidad electroforética. III.I7.ESPECTROS ULTRAVIOLETA Los espectros ultravioleta de 029, su proteina y DNA se determinaron en un espectrofotômetro Cary 15, previamente calibrado con una disoluciôn alcalina de CrO^K (.58). De las muestras conteniendo 0,6 - 0,7 unidades de ^260 ̂ de fago, proteina o DNA se realizaron e^ pectros entre 250 y 320 nm en una cubeta con un paso de luz de 1 cm. Los valores obtenidos se corrigieron para la absorciôn debida a "scattering". III.I8.MICROSCOPIA ELECTRONICA Preparaciôn de las rejillas. Un portaobjetos limpio y desengrasado se sumer̂ giô en un frasco de boca ancha que contenta una diso­ luciôn de colodiôn al 0,75% en acetato de isoamilo y se dejô secando a temperatura ambiente, en un reci- piente cerrado 15-30 minutes. La pelicula de colodiôn se separô del portaob­ jetos haciéndola flotar sobre una superficie limpia de agua destilada en una plaça de Pétri, y sobre la misma se colocaron las rejillas de cobre con la cara brillante hacia abajo. La pelicula con las rejillas se sacô de la plaça de Pétri introduciendo en el agua un papel de filtro tocando un extremo de la pelicula y sumergiendo lentamente hasta que toda la pelicula con las rejillas quedô adherida al mismo. El papel de filtro con las rejillas con pelicula se dejô a tempe­ ratura ambiente sobre varias hojas de papel de filtro hasta quedar completamente seco. Sobre la pelicula de colodiôn se depositô una pelicula de carbon introduciendo el papel de filtro con las rejillas en la câmara de un evaporador Sie- — Rmens. Una vez alcanzado un vacio de 1 x 10 mm de mercurio se hizo pasar una corriente de 30-50 A du­ rante 60 seg a través de dos electrodos de carbon con una superficie de contacte de aproximadamente 21 mm . De este modo se obtuvo un deposito uniforme de carbon con un espesor de menos de 100 X, sobre la pe­ licula de colodiôn. Con un capilar se puso una gota de la muestra sobre la rejilla y después de un minute se retiré la mayor parte del liquide tocando la gota con el borde de un papel de filtro. La muestra se contrasté con una gota de una disoluciôn recien preparada de aceta- -4to de uranilo 10 M en 7 agiia < , que se aplico y re­ tiré de la rejilla del modo indicado para la coloca- ciôn de la muestra. El tiempo de tinciôn fué de 60 segundos,(75)• La pelicula de colodiôn se éliminé calentando la rejilla en una estufa a l80~C durante 10 minutes, y las preparaciones se observaron al microscopic electrônico a un voltaje de 80 KV, con una apertura de 50 jim̂ a une s 4 0,000 aumento s. IV. R E S U L T A D O S IV.l.PURIFICACION DE 029. RENDIMIENTO Y HQMOGENEIDAD. Un cultive de la bacteria huésped (17 litres) en fase logaritmica se infecte a una multiplicidad de 2 fagos/bacteria cuando la densidad del cultivo era de unas 2 x 10^ bacterias/nil (figura 6) , Como puede observarse, 029 no detiene el creciniiento bacteriano y antes y poco después de la infecciôn el pH del medio signe disminuyendo; sin embargo, en el memento en que el cultivo comienza a lisar, como indica la caida de densidad optica a 660 nm, el pH aumenta de un modo marcado. El lisado cspontâneo se tratô con lisozima, DNasa y RNasa, como se indica en Métodos, y, a conti­ nuaciôn se centrifugé en flujo continue para eliminar restos celulares. El sobrenadante, que contenta el v^ rus, se tratô con polietilenglicol que précipita cuan titativamente el fago. El sedimento se pasô por una columna de esferosil, que se eluyô con DF. La figura 2_ muestra la apariciôn de un primer pico de coïncidente con el pico de infectividad y un segundo pico de material incluido que no contenta virus. El material del primer pico se concentré por centrifugaciôn y al sedimento, resuspendido en DF, se ahadiô ClCs hasta una densidad de 1,43 g cm ̂y se cen­ trifugé hasta equilibrio de densidad. La figura 8 muestra la distribuciôn de A^^Q, infectividad y densî dad en las fracciones del gradiente; a una densidad _ o de 1,44 g cm se observa la existencia de un pico principal de A^^^, que coincide con un pico de u.f.p. (pico I); en la parte superior del gradiente (fraccio­ nes 28 y 29) hay un pico de A^^^ que no contiene vi­ rus infectivo (pico III); finalmente, en la zona de _ o densidad 1,42 - 1,43 g cm se observa un pico peque- 110 de Ag^Q y u.f.p. (pico II); este ultimo se hace mas claro cuando las fracciones correspondientes a una ' - 1densidad comprendida entre 1,42 y 1,43 g cm so mez- clan y se vuelven a centrifugar hasta equilibrio en ClCs de densidad media 1,43 g cm ̂ (figura 9)» Cuando el material de los picos I, II y III se examina con el microscopio electrônico se observa que el pico I contiene 029 esencialmente homogéneo (plaça I), el pico II variantes morfolôgicos de 029 (plaça II) y el pico III, fagos cornpletos sin DNA, estructu- ras parciales del virus (cabezas con y sin cuello, que carecen de colas, cuellos con cola, etc) y varian­ tes morfolôgicos, también libres de DNA (plaça III). El material correspondiente al pico I esta esen cialmente puro, como se prueba por microscopia elec- trônica (plaça 1), por sedimentaciôn en gradiente de sacarosa (figura 10) y por electroforesis de las pro- teinas del fago (plaça IV). La tabla 7 muestra el rendimiento en la purifi- caciôn de 029 partiendo de un lisado de 17 litros. 4.0 3,0 /I ao 1,0 / 7,0 w>- ! 6,5 5 Ô Figura 6, Infecciôn de B. amyloliquefaciens con 029 C) *« -, » f 6 0 fii ii o A0 0 / 00 \/ 0 f \ 0 \ f q 1 30 40 30 ( u I i £ ! ' i ; i i . Figura ?. Cromatografia de un lisado concentrado con polieti­ lenglicol, en una columna d3 vidrio de poro contrôla do. V f C) IJ IIIoII 1/. V 25 >; f,y v ; Figura 8. Centrifugaciôn en ClCs del pico excluido en el cro matograma de la Figura ?• t /r Figuia 9» Centrifugaciôn en ClCs de las fracciones del pico II de la Figura 8. . ■ m ^ i m-9LÆAVI';#;. :ÿi,k # ; Plaça I. Microscopia electrônica de 029 en el pico I del gradiente de ClCs de la figura 8. r 0.1 p Plaça II. Microscopia electronica de variantes morfologicos de 029 en el pico II del gradiente de ClCs de la figura 8. Plaça ICI. Microscopia electrônica de component es estructu- raies sin DNA en el pico III del gradiente de ClCs de la figura 8. 0,5 Ii il y 0,4 I: \ ■)'■ 1 0 0 a 10 i. . t P i ( \ t.* « lJ * t Figura 10. Sedimentaciôn de 029 en un gradiente de sacaro sa 5-20% en diluyente de fago. Plaça IV. Electroforesis en poliacrilamida-SDS (pH discon­ tinue) de las proteinas de 029 (pico 1 del gra­ diente de la figura 8 ). 0\ CMTSl obO(C(H'O •H U(D ■PÜ(Ü OkO CM < ft ft Hs P!0)IH0> O VO CA H CM CM CO CM CM VO lA lA N lA 0 lA lA lA CM H H I—1 H H H * H O O O O O O H H H H H H X X X X X X H o lA LA lA lA H VO lA LA VO VO o o o h-H olA CO CA o r4 CA H H H Q) 03 'Ü 0 Ü < PI f t '0 03 bO Q •H o '0 Ü H H fi (C O 0 f t Ü f t 0)•H PI u f t CD 0 03 •H Pi s CO U ^0 Pi p P< •H '0 ^0 03 f t Ü f t f t CD -p Ü u Ü •P 0 • cO CO (0 U H bO bO CO u f t f t P( ïO f t -pN % ft ft 0 u 0) 0 0 ft ft bO CO ft (C V P, P P (0 > H CO CD -P -P f t « ,Û w f t A • H CO ft W CD • H H f t f t . f t U O H H H IV.2. COMPOSICIQN QUIMICA DE 029 2.1. Anâlisis de fa&o completo La composicion elemental de 029 (C,H ,N),deter- minada como se indica en Métodos, se muestra en la ta­ bla 8. El porcentaje medio de cada elemento, determin_a do en seis preparaciones diferentes del virus, fué de 43,8 - 0,3 para el carbono, 5,5 - 0,2 para el hidrô- geno y 15,8 - 0,2 para el nitrôgeno. El anâlisis de DNA y fôsforo se muestra en la tabla 9» Los valores estân referidos a la masa de fago correspondiente a un mililitro de una soluciôn de virus que tiene 1 unidad de , que équivale a 0,084 nig de 029 (ver pagina 11? )• El valor medio de ocho anâlisis del DNA de 029 fué de 46,1 - 0,4 jig ̂ tomando como patron el DNA de esperma de salmon (figura 11) , mi entras que el valor medio para el fôsforo fué 4,5 - 0,03 yug (figura 12) por 1 unidad de A^^^. La presencia de hexosas en la proteina de 029 se ensayô con antrona como se describe en Métodos.La figura 13 muestra los espectros de absorciôn de glu- cosa, manosa, galactosa, fucosa, triptôfano y la pro­ teina del fago. K % O (DTO +> Wb u 0 fH CM 0)T5 Ü'0•HÜ•HWO Ë0o CO (0HrOCOH O CO VO N O CA O O O ON CO LA O 0 o 1 N <1 CA O H O O o H CM O I 00 O O OVOCA O O o \ o O VO o o VO CA LA On CA H CM VO CM CA O CM o O 6 Q O O m CO VO lA H o O CM CO CM o lA LA VO VO lA VO r-| r4 r4 r4 1-4 1-4 CA CO CM lA O CM CO O H N CM 0 \ LA CA N O ^ O O O O O O CA CM HCM O I VO 00 0 o o 1 LA CM CM O N 0 1 LA VO ON CA lA O CA VO CA CA oo o II CO ON VO VO VO A - CM 00 CA VO CM LA O 00 LA LA LA LA VO CM LACA CO A - CM CM H VO ON VO LA O CM O CA O H O o N o O O 6 O o O LA H CO CO ON CA O CM CM CM LA X VO \ CM O CM CO VO H o o - O + I II II LA % - t ) LA CM CM O 6 IICM LA CM CA N O CM LA X VO CM CM LA o - H O - 4-1 S—' O II II CO s LA t ) H LA X VO \ CA CA r O o CM - CM + l H CO CM r N A - s—" o CO CM CA II it CA VO % CM D II H CM CA LA VO ft sQ O V ui•HW•HH'(ÜPî< ON H H H H -4 ri O O O O O <3 o o 6 O O O O O O II CM CAO OVÛ vo r* CM O< H H H H X IIbO <1 o o O O o O O O N \ CM1 1 -4 > CAO o f t r- CAO O oO + 1 lA lA lA LA VO VO -4' o LA II o LA■4̂ -4 vo -4 CA t> II CM H ON LA LA LA H LA H -4 O CM CM CM O CM LA». r r II CD -4 o O O O O O LA V /»-N CM vo Pl O CA'0 vo vo r- •H CM O Ü < H CA LA LA LA H LA LA X•H \ r. r- r* f r* r>- r* IIW faO <] CM O o O O O O -4 N0 PL \ CM ft 1 1 H -4E LA r-0 < H Oo Q LA CAH + 1 « O vo VO vo O VD CO H »■ ON - - »- - - f - II O H - 4 VO vo VD vo VO VD CM VO r CJ -4 -4 -4 ■4 -4 - 4 -4 CM S VO H CA t ) II • 4 CO H ■ H CM CA ■4 LA VD N CO i-nro G x y , O ( J , % / / L i /I ; L... ' :.. .. ; ̂ ; L: 1. J \j » ; n l; n ̂ -'t, r' / Figura 11. Valoraciôn de DNA en 029- 0,5 1,0 0,r, L P 0.4 0.2 / / /J / / / r 2 5 6 Figura 12. Valoraciôn de fôsforo total en 029 ,-“r- 2f O f\,ï i I ».< O ̂ tf., s *i * «01.' if V - u * vv 2 j :: Î .! ■o> *1'̂0 600 Figura 13. Valoraciôn de hexosas en la proteina de 029 2.2. Composicion de aminoâcidos de la proteina de 029 Para la hidrôlisis de la proteina de 029 y el posterior anâlisis de los aminoâcidos résultantes,pre- vianiente se eliminô el DNA por tratamiento del fago completo con EDTA y hidrôlisis del DNA con DNasa pancreâ tica y fosfodiesterasa de veneno de serpiente; la pro­ teina se aislô libre de nucleôtidos por flotaciôn en ClCs y filtraciôn por Sephadex G-^O, como se describe en Métodos. La cisteina y la metionina se determinaron co­ mo âcido cisteico y metioninsulfona, respectivamente, en hidrolizados de 2k horas de proteina oxidada con âcido perfôrmico. El triptôfano se determinô espectro- fotométricamente, como 'se indica en Métodos. Los demâs aminoâcidos se analizaron en hidrolizados de 24, 48 y 72 horas, corrigiendo, en el caso de serina y treonina por la descomposiciôn de estos aminoâcidos durante la hidrôlisis; en el caso de la isoleucina, por el menor valor de la constante de hidrôlisis, se tomô el valor determinado en el hidrolizado de 72 horas. La tabla 10 muestra la coinposiciôn de aminoâci­ dos de la proteina de 029. Tabla 10 . Composicion de aminoâcidos de la proteina de 029 Moles, % Aminoâcido 24 hr 48 hr 72 hr Media Lisina 4,8 4,9 4,8 Histidina — 2,0 — 2,0 Arginina 3,6 3,6 — 3,6 Acido aspârtico 13,4 13,5 13,7 13,5 Treonina . 7,9 7,4 5,6 8,0 Serina 6,8 6,0 5,7 7,0 Acido glutâmico 10,3 9,9 10,1 10,1 Prolina 2,3 2,7 2,0 2,2 Glicina 7,5' 7,4 7,6 7,5 Alanina Cisteina (âcido cisteico) 7,5 7,0 7,2 7,2 0,3 Valina Metionina(metioninsulfona) 9,1 9,8 8,9 9,3 3,9 Isoleucina 5,5 5,7 6,3 6,3 Leucina 7,6 7,3 7,9 7,6 Tirosina 2,4 2,1 2,8 2,4 F enilalanina Triptôfano 2,9 3,3 3,2 3.1 1.2 100 0 2.3. Composicion de bases del DNA de 029 Para la hidrôlisis del DNA de 029 y el poste­ rior anâlisis de las bases résultantes, previamente se eliminô la proteina del fago por tratamiento de este con pronasa en presencia de dodecilsulfato sôdico y ex trayendo la mezcla con fenol. El DNA libre de proteina se obtuvo intacte, s'edimentando en un gradiente de sa- carosa neutro o alcalino como un solo componente. El DNA se hidrolizô con CIO^H, como se describe en Métodos, y las bases se separaron por cromatografia. Después de identificar cada componente con luz ultra- violeta, cada une de elles se eluyô del papel y se euan titatizô como se describe en la decciôn de Métodos y en la tabla 3 » El valor de los percentages de cada base en el DNA de 029, media de cinco anâlisis de otras tantas preparaciones de DNA, se muestra en la tabla 11.- o VD CVJ CO o 00 ON CM Q)TJ gQ HOT3 WOmcC o ’V '0•HÜ•HWOft Eoo HH (dH rO COe* C3 O *s] N rJ<3 w* „ r> o O O O O H II CM CA 00 m On H O X O O O O O LA II CA \* ' ' CO CM o H + 1 ON H o cn N ON O CO II o CO ON CO CO ON CO -4^ CO Z o CO H H H H H ON H O H ON ON VO • NO O O O CO o o 6 O O o II CM H /—X CM CO CM cn CA r- »- X O o O O O o LA \ II CM 1 1 ' VO CM r. C 0 > o o CA + 1s-/ VO CA o VO II o VO O ON ON (TN ON CO ON % o ON CM H H H 1—1 ON H t) H H H ON O H CM CO 00 CO O CO CA II r- r VOo O CM H o VO CM LA o ON ON N O ON X II•- r- LA CM o o H H o \ > VO CM «- 1 1 1 CA VO o«• H VO CA + 1 VO VO CM lA CA lA '—' »- p - r- O LA C7N ON CM ON H CM O II »• CM CM 00 Figura l4. Relacion entre A de 029 en diluyente de fago y peso seco del virus. N<1 ON H CM ND O O O O 00 O O O o o O o O Oï ONHO CO CO H CM CM < q O 1 O O o O 1 O O 0 • bO bO (C S r—1 ON CM ON CO H H (H - r- f r* O H H CM H H CM CM G 'fi H H H H H H H V CM < G •P f i G % bO f i E H •' •H 0 "fi ü G tN lA lA lA H CM f i «3 CO ON CM VÛ ON CM 0 VÛ 00 CM • N CO CM CM ON fi H H H ir \ VÛ CM '0 •rl W G G ft Efi O \D CM O r- VÛ VÛ r \- ON O CO CO f i CM N o H H lA < H H CM CM fi fN. fi Ü •H (H 'H Ü G bO f t m fi G '0 ON CO O CM •H IT\ CO CM CM VÛ O fi f i Ü tA ON ON H H CO lA •H fi CO NÛ N O H lA ü H r f' r- r f' r* r> fi 0 O o O O H CM CM fi W •H U Q 0m rû < CM fi H P fi 0 fi & ^ H Ü iH CM CO LA VÛ A - fi •H fi H H < CM 0Ü0 m ON CM Q)T) bOe H ON CO H CO H II 2 O fi f i fi '0 X CM •H N P 0 G G f t fi H u G Ü f t fi -H fi H 0 fi G fi fi fi P fi (0 G fi Ü fi fi 0 f t f t O' Ü 73 SJ 0bOfift G V GP fi G %fi H •H73 fi G ON CM G 73 fi fi •H G P0 fi ft fi H G 73 1 OVÛ CM fi fi Ü •Hft'H Ü G ftG G fi •H Ü fifi rû fiOm <3 bO E O ü G % O •H m G ft bO fi 'O •H Ü fiI—I 0 w •H Q ON VÛ CM H O CM O 6 O CO CM lA CM O N CM VÛ CO H CM CM r- r- < CM VÛ CA LA O CO CA O CM ON CM ON O o " O bO S CM H 0\ CM O H CA LA O r- r- VÛ H H H CA CM fi ' 0 •H Ü fi H 0 W •H 73 CM H G r- 73 O bO II X CM fi ü G H Ui O r- fi O fi •H G II P 0 CM fi f t ' ft CM bO Ë X \ N H CA \00 COO O fi CM < CA H fi H rûfiH fi p G fi Ü •H H < CM ON II 2 + 1 CM D- H IV.4. ABSORBANCIA ESPECIFICA DE LA PROTEINA DE 029 La absorbancia especifica de la proteina de 029 en diluyente de fago se determinô a 2Ô0 nm de un modo anâlogo al empleado para la determinaciôn de la absorbancia especifica del fago completo. Después de deterrninar la absorbancia de la sô luciôn concentrada en diluyente de fago, diferentes alicuotas de la misma se dializaron exhaustivamente contra acetato amônico 0,1 M, éste se eliminô por lio filizaciôn y el residue se secô hasta peso constante o .en vacio a 100 C bajo P^O^. Partiendo de una disolu- ciôn de proteina con l4,3 unidades de ^260 ’ ’ se o]b tuVieron los resultados que se muestran en la tabla M l- Por tanto, en una disoluciôn de proteina con 14.3 unidades de ^260 S1 bay 12,1 mg de proteina por g de disoluciôn, es decir, la absorbancia especi- fica de la proteina de 029 en diluyente de fago es de 0,85 mg por 1 unidad de A^^^ por gramo. IV.5. VOLUMEN ESPECIFICO DE 029 El volumen especlfico de 029 se determinô a partir de la relaciôn entre densidad y concentraciôn de disoluciones de 029, determinadas como se descri­ be en Métodos. Ajustando los valores expérimentales (tabla l4) por el raétodo de los minimos cuadrados se obtie- ne una relaciôn f = (1,0072 - 0 ,001) + (0,392 - 0,006)c (figura 15) De la pendiente de la recta y el valor de la densidad del disolvente puro se obtiene (tabla 15) para el volumen especlfico de 029 en diluyente de fa­ go un valor de 0,6o4 - 0,006 cm^ g ^. fi H fifiH r* CM H f t f t f t f t 0 73 X X X X X bO H ON f t UN f i O O o O f t VO Hfi H rOfi •H> •H -rl > CM fi 'O •H O Üfi ft H H H H H H H H H H H H H H H H H H O O O O O O O O O O O O O O O O O O + I + I + I + I + I + I - I - Î + I + I + 1 + I + I + I + I + I + I + I + I r - r - v D v o CM U N O N < h u n u n c m u n u n o n h v o cm u n f t CAOO UN CA N H C M C A O v O C A U N N C M C A f t CM N O O O CAVD V D < f - : t * c A V O U N O O f t r N . - d ^ CO VO IS VO VO VO fN-VO [N -V O C O D - ON ON [N. [N_ N O O O O O O O O O O O O O O O O O O f t C M C M C M f t f t f t f t f t f t f t f t f t f t f t C M C M C M O O O O O O O O O O O O O O O O O Ofl + l + l + l + l + l + l + l + l + l-l-l + l + l + l + l + l + l + l N UN f t C A J^V O ON ON ON N CAVO N UN ON VO CM O UN CM UN 2 H H k H o + 1ft CA fN- vo o + 1 CO ON Os VO o+ I ON 00 oft ft o o + 1 CA r - o II VO O O + 1 + 1 f t CO CA ON IN- ON 0. ' f iofi •H Efi fi 73 in in o 73ft Ü ofift Efi ' 0ft Ü f t mo f t73 u %0 A fifi to fi fi Ü 0 f i 73 U fi fi f t f t fi Ü \0 ft 0 Ë fi . H 0 73 O in 0 ft ft 0 ft 0 73 0ft fi O uft uo u u0 ■§ o 73fi E0p COft ap in 0 u 0 f t • 0 0 Ü fi 0 ft fi 73 0 'H 0 73 Pft ftO 0 «•cfl o,ofi 0 ft Ü S fi fi ft fifi 0 73 fi fi U 73 fi0 0 U 0 73 0 U 73 fi f t f i f i ' O O ft 0 Ü ft fi ft 0 E E S 0 0 ft in0 fi ftft fi f t fi W < 0 CM IV.7 . VOLUMEN ESPECIFICO DEL DNA PE 029 El volumen especlfico del DNA de 029 se deter­ minô a partir de su densidad de flotaciôn en ClCs (76,77) y de su composicion de bases, corrigiendo pa­ ra la cantidad de agua ligada por nucleôtido y pasan- do de la sal de cesio a la sal sôdica. El procedimien to se detalla en Métodos. Los câlculos se muestran en la tabla 17» A par̂ tir de la fraccién molar de cada nucleôtido se déter­ miné el peso molecular medio de las sales de cesio y sodio en el DNA de 029, teniendo en cuenta el peso de la molécula de agua perdida en la formacién de cada enlace nucleotldico. El volumen especlfico obtenido para el DNA de 029 résulté 0 ,5 ̂- 0,01 cm^ g ^. Tabla 17* Volumen especlfico del DNA de 029 Fracclon molar ^Na ' ^ N a S s S s dAMP 0,311-0,002 335,31 104-1 445,12 138±1 dTMP 0,305-0,006 326,20 99-2 436,11 133^3 dCMP 0,196-0,002 311,19 6iii 421,10 8 3 S dGMP 0,188-0,003 351,22 66il 461,13 87-4 330^3 44l±5 p - 1,697 • ^Cs - ^Na " 24,9 n = 7 V 1 + l8nCs -(l8n + CC s ^ ^ S aNa ■* ®Na Ces - 1 44l + 126 -(126 + 24 Q ) 1 / 567 - 1 5 0 , 9 ) 3 3 0 1,701 , 7 ) 3 3 0 V l , 7p, = 1 3 3 0 (33â 3 - 1 5 0 , 9) = 0,55 0,5 5 i 0,01 1. Al peso molecular de cada nucleôtido se le ha restado 18, el peso de la molécula de agua perdida en la for- maciôn del enlace nucleotldico. IV.8. COEFICIENTE DE SEDIMENTACION DE 029 El coeficiente de sedimentaciôn de 029 se de­ termine como se describe en Métodos a partir de la velocidad de sedimentaciôn del fago en diluyente de fago a diferentes concentraciones. La tabla l8 y la figura l6 muestra la posiciôn del limite de la figu­ ra schlieren en funciôn del tiempo para una muestra de 029 a una concentraciôn de 6,5 unidades de Repitiendo el mismo procedimiento para dife­ rentes concentraciones de fago se obtuvieron les va- lores que se muestran en la tabla 19« Ajustando les valores obtenidos por el método de los minimes cua- drados se obtuvo para s^q (el coeficiente de sedi­ mentaciôn a diluciôn infinita en diluyente de fago a 20ôC) un valor de (246-2) x 10 seg (figura 17). Corrigiendo este valor para agua (tabla 20) se obtie- ne para 029 un s^q ^ = (251-2) x 10 seg. Tabla l8 . Sedimentaciôn de 029 en una disoluciôn de concentraciôn 6.5 unidades de Foto t,min r,cm log r 1 4,0 5,985 0,7769 2 6,0 6,006 0,7786 3 8,0 6,049 0,7817 4 12,0 6,093 0,7848 5 i6,o 6,138 0,7880 6 20,0 ' 6,181 0,7911 7 24,0 6,223 0,7940 8 28,0 6,269 0,7972 9 32,0 6,311 0,8001 10 36,0 6,347 0,8026 11 40,0 6,347 0,8026 12 44,0 6,449 0,8095 L- 0,VD 0,70 cr 10 20 50 t i o m p o , n;:nu*03 40 50 Figura l6. Posiciôn del limite de sedimentaciôn de 029 en funciôn del tiempo. 6.5 unidades de c Q), osCJ o Ti m Q) c0 •H Üpi H0 m (D13 fl'0•HÜ(Ck ■p g0Ü o Ü ü ' 0 •H Ü a •p m (Ds •H 13 ID W 0) 13 (D P • 53 O iCO 0 H H (D*H P3 13 ON H CO HA3 CO % X CNJ î A H C Q O H H H l A O r N - r H + I I + + I I I + I ÜO % ON 03 VD l f \ IT \ O ^ 0 ] CO CO CM C M C M C M C M C M C M C M C M C M C M C M CO CO [ N - C M O C O O IA O O O O 2 O 'A C'A 250 n O., v . < * ‘ Ü O ypy^wj-*-*v»i*eiaL?wi-Mapnar>: • -r^Mt^^ngnair f ■>— gçTj O 0 :00 6 8 10 f; t. t f - .--T .$ i < 'ŝ c’a A A 220 Figura 17- Variaciôn del coeficiente de sedimentaciôn de 029 con la concentraciôn. CM +1 iBÎ,b • H lA CM H lA CM CM CA CM 0)13 O 0 CM W c'0 •HÜ(C V53Q) E •H 0 OW O 13 fi O •H Ü •HCh o 0ü CM fi H H H fi -P fiH fi O fifiXJ 0 « wfi (D fi 'r i H (0fi rH (DXJ O rH mfi X3 fi fi oX3 fi0oü nfi IT\ N II i-) OVOCQ < © X3 W © fi X3 •H § Oen II O ON 00 \Û lA en CM CM ON O co H rH r^ lA O CM IN. rH CO o NO en NO o rH en O CTN ON CM lA IN. CJN . (A MO 0 0 C MO o 0) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 CO * CM CA 0 1 1 1 1 1 1 1 CA X - r i MO Pl O O O O O O O MO CA CM 0 rri rri rri H rri rri rri - 0 0 rri CA ü X X X X X X X CA CA X LA % H o rri N o CA •r i - % X lA CM CO VO N MO LA CA CM MO ' •' ' c» r- H r ^ \ CA fi i n CO N MO CA - r i MO X CA MO ^0 tri CM CA MO rri O 1 MO - •H rri CA 0 0 0 0 MO - CA in 1 1 H CA - r i f i O O 1 - r i CA CA H ' î ' o O ^ 1 X H fi CO f i O CM X' 0 0 CO 0 0 0 0 0 0 CO CO CO 1 W * •ri bO 1 I 1 1 1 1 1 X O X II y—\ ü ci O O o O O O O -f rri ' H a Cri rri H rri rri H r4 rri X CM f i CM.. r-i X X X X X X X - 1 X 1 ^ O 0 0 CM CO o CA 0 0 CM CA fi f i 03 P i '0 O f ' - CA LA CM 0 0 Xj CM - r i ’ \ X f i r i-l •• «- •' - X o\ % CM • lA CA MO + 1 - X T! CM CA IT\ CM fi ^ - r i 03 b CM II fi b fi -ri R! Il II IIr4 Il il II II .Q CM CM fiOJ O tO rri CM (A lA MO % f i rO b b b % H 6 ü . . J . 0 20 JU L Figura 22. Variacion ciel coeficiente de difusiôn de 029 con la concentraciôn. COIo H X CM CA X CM MO CM CMN CA CM32. 0-0 o 0 CM Q fi'0•H V)fi (H •riT3 0 '0 0 Pfi 0 •HÜ •rlP 0 0o VO CM fiHrüfi o 0H1oH X H + I ri COIo H COIo H rri o fc, Q O CMCS. H + IT\o o + 1 N O H II rri ri-l CM - - o CA Q CA - ON ri-l r i 0 H CM Q CA - II II r i O '—- (P CM Q II «- O ri- 0 rri 0 CM Q Q Q E-i CM ri n- CM inoo o + 1 MO H O U Ci H lA Ooo o + 1 N CM CM CA O r i H lA - CA O r i CM A- oO O - - rri H rri rri P G 01H ri- -Cx CA __/ COIo H X CM CA II N CM CM N 01o lAooo o + CM MO Ho LA Oo o HI to0X ri- w MO CM • rri /—\ CMO A - Ëo 0 H rriX lA CO N O 1O - o o H H -—/ XX -f lA CO CM LA 1 /—X OO ON o P - ri-l r i ri-lX \ II rri CM ON - Q - o b ON r i II II MO II CM o b O O CM CM Q 0 CM Q D II Q , tfl a •H ü f i (U f i eu P fi eu P f i H , O 01o CM N ed H 0 \ II CM eu T3 O f i \D \0 (M •H < U1 f i eu p 'd •H T3 m eu eu 'd 'd ed "d eu •H p f i f i f i eu •H r̂ > Ü r- •H G\ P eu II0 e j U NC\] ed H P ed H 0 ü •H U ■PyQ)5 •H% 0 ■P f i eu •H 1 6Uto < o ü •Hfi -P\(U S •HW 0■fi O •Pfi eu •H S(UAfifito < <3 % I H •n CNJ I •n(M H •n •O -p p > CM H N ■ H CM VD CA H o CM vo O N lA CA H CCI H H H O O O 6 O CM CM CO CA N CM VO d \ CO O CM H bO0 « O CO CM H H II P> 0 ■P0 k N H 00 CO 00 C3 N .CA N O lA MO O lA A 0 \ in r- MO ON CM CM MO CO CO ü'O •HÜ(Q0 Ü •H -PP3 O ü mce •H ü Ü 0) (D(H 0) ■PC H 001 o (M ce ON(N OT3 'O ' •Hm (p •rlT) Q) T3 G) •PPîQ) •H ü "H (p 0)0 CJ r^ CM ce rP ,Dce H N H II I O H X NVDVD O il -P bO 0 m O O O lA rH II -P lA 0 •P0 (p CA lA CX) 00 (M VD LA lA CA CA CA CO CM VO LA CM H CA CO CA LA ON CO -cf ON CO N ON VD H H O VD H CA CO LA Pf CA ^ CA r - ON Ü0 ü wce •H üp; CD5-1 Q)(HPh CD -P 001 o(N ce ON CN CD T5 'O •HCfl (H •H T3 CD13 O ■PÜO •H ü 'H (p CD O O r -CM ce HmO ce e [N. H II M) I O I—I % VDIT\ in O II p to o m O O O CO H VD 0 P0fe lA O ON VD ON H VD CA CO lA O CO VD LA VD CA CA CA fA VD CO' CM CM CA H 0 0 CO CA LA IcA CO CA N00 CO H ^ [N- CM VD ON H V ) O 0 0 LA -4^ LA O CM LA ON ON Q . LA 4 ^ O LA CA Q O LA CA CO0\ 4" CO CO 4 CM A - VD O A - N VD E 4 CO 4 4 CO CM CA O P O P H 4 CO LA CO N 4 CA (A CM CA 4 LA LA V ) ON ON 4 . 4 O LA ON VD CA LA LA CA LA CA CM CM O CO ON CA VD H LA CA CO V ) CO CO H N VD 4 CA CA CM CA 00 LA O 00 CA H 4 CA ce CO CO CA 4 4 4 CO 4 VD H O CA lA VD O CM CM CA O H 4 CO 4 CA CA LA LA VD 0 a ü '0 •H •H 0 Ü P (Ü 'O 0 e 0 •H •H W •P 0 0 0 p Ü A- 0 H 0> •H% II B (d 0 •rl •a A Ü 0 0 0 CD bO0 < (D P U O 1 P o 0 H H X O CO Ci lAo CM ' O (d II ON CM p ■Q. o X 0 '0 o •rl 0 £fl CO Ü 0 • •Hp CM 0 •rl P'O II vO So P •H T3 W ü 0 P 0 0 QJ 0 •H « P ü A- 0 •H QJ P 0 •H CD P S 0 0 0o P A 0♦ 0bON < Cl 0 H rO 0 H (M X q rX X < ! Èc\j X q X r X A - O ON ON NO CA NO CA NO NO N CM N NO NO CM CA A - NO lA LA LA CA CA CA CA CA o O O O O O O O ONCO INr\ CA CM CM P 00 rH 00 CM ON CM CO NO NO CM A -O 00 LA O oo ON rH CA CM A - LA CM H H O rH O O o O O O O CA LA O CM ON H CA LA P P ON 00 CA O A - CM ON LA O O O ON ON ON 00 00 CM CM CM H rH P p P O CM ON ON P ND A - CM CM IA\ 00 O A - CO CM A - LA NO NO CM N CM CO CM -P LA NO N CO O P P P P P P P O p CA CM A - P A - CA CA p LA P CA NO A - On LA P CM LA ON LA CM NO 00 NO LA CA CM CM CM CA O O O O O O O O O II S CA p O CO P CA ON NO N ON NO CO NO LA 00 00 CA A - A - P A - LA LA ON NO CA CA CM CM CM O O O O O O O O CA CM N o LA CA ON P P N LA CA P LA ON CM O CA 00 00 00 ON ON ON O O O P P P P P CM CM CM O CA CI CA ON P NO A - CM CM LA CO O tN- CO CM A - LA NO ND CM A - CM 00 CM LA NO A - A - CO O P p P P P P P CM 9 a«qVD I0 -P H " % • VO ON r CO H N Il O Q Il ••' 1 X O H \ X X ow [\_m ■p - CM H CM X I< ow H -P X Q NO lA ••' H ON II NO CA Q O • ̂ CA Il !O ^ H X NO ND -p ĈN Q H CM II s '0 •H üCJ is •H •PPl0Ü (C •HÜ ÜQ) UQ)(H UQ)4")Ü H 001 o (M 0 ONCMTSl üXJ ü '0 •rlVI (H •H XI O XJ Q)4-)Ü 0 ■ 0 • H P 0 0 Ü m 4* fl 1 * H O Ü H Fl D X o CM p H ÎH H D r- P o F!H II , p O rS'01 O CM fl A CM to TSl CD CO 0 T5 o CM Fl A '0 • • H A CO CO 0 P II •H P CD X C0 •HÜ •H (H0 0o N CM 0 r4 cd H N H II O H CM V£> O O II ■P fcO0 « Oo HVD H CM H 0 -P0 Hen O ir \ CO cOen o\ O CM h- CM (7s lA^ m m in lA CO lA CA CTs CA MO (Js CM O O CM SD H VD CO CA lA CM 0\ ^ N (7s CA CM lA CM CO CA CACACACA Ü O O m (0 'H ü Q)Sh G) (H UQ •P 5 001 O (M nJ ON CM o tj Pl'O •H . in (H •HT5 CD T! <üH-i C Q •HÜ •H (HCD0 O [N. CM Cd HrO (d H N H II I O H H O O II P O r\ m CM H 0 P0 k lA INCO 0 \lA ir\ H ON lA H CM ON CA H I^ O (A lA CA CM H O ON lAlAMO CM [T\ N N CO <0\ (ON KO\CD ON kO lA ON ON o lA VD CA o A H N N VD VD A lA ^ lA Q lA CM CM lA VD H lA ON H D - (A A «cjvo I VD CA (A CO CM O CO A VD LA (ON ^ LA LA O CM IS LA A O VD N A CO H ON O A VD CM CM S H A O A A VD A VD A fv- A A O K O A- O Q CM A A CM CM 00 A A A p AlCM VD [N. A A A A A 'O •H Ü <6 : •H -PCOÜ U]cO •H Ü ü Q) Ud) U - CM (3 r—j rO (3 H r - H II I O H lACA O C II •p bO Q)tf) O O CM MO CO CM II •P LA H 0 P ’ Ü k CA LA CM MÛ N LA CA 00 CA O 00 MO Mû Mû^ ^N UA lA lA CA 00 CO CA H CM lA lA CA H O O H MÛ lA O LA CA CM CA CA ^ 00 CM lA LA MO CO CA H CA H O MÛ A - Mû Mû LA O Q CA Mû LA CA MO CA CA H N CA H CA CA CA <3 ■cj<0 \ I X O H Q H CO Q lA H X CA <î O Tabla 28. Valores de D en funciôn de l/t a 20QC durante la difusiôn de 029 a una con­ centraciôn de 9 î3 unidades de D X 10 Agruparaiento no simétrico Agrupamiento simétrico t, seg (l/t)X 1( 2,73 3,30 11.280 0,887 2,33 2,97 15.000 0,667 1,94 2,05 18.000 0,556 1,56 1,64 21.840 0,458 1,40 1,47 25.260 0,396 0,59 0,6l 73.560 0,136 0,51 0,52 89.520 0,112 0,41 0,42 113.040 0,088 0,29 0,30 161..400 0,062 0,29 0,27 195.960 0,051 0,23 0,23 245.340 o,o4i 0,21 0,21 286.200 0,035 r — " 2,0 0 ./u .>■ y //' r\ I y ./ 9/ y y D 0,2 0,2 0.3 Figura 2 3- Relaciôn entre D y l/t durante la difusiôn de 029 en diluyente de fago a 20QC. Concentraciôn = 9,3 unidades de IV.IO.PUNTO ISOELECTRICO DE 029 El punto isoeléctrico de 029 se déterminé a IQC a partir de la relaciôn entre movilidad electro- forética y pH a fuerza iônica constante, como se de^ cribe en Métodos. La tabla 29 muestra las posiciones del pico schlieren de 029 en tampon de Michaelis (pH 2,7; I = 0,1) en la rama ascendante de una célula de Tiselius, cuando se somete a un gradiente de 3,46 V cm ^. Re- presentando la distancia rccorrida en funciôn del tiempo se obtiene una recta (figura 24), cuya pendien te (la velocidad media de migraciôn) dividida por el canipo aplicado, da una movilidad electroforética de -5 2 -1 + 5,7 X 10 cm V seg . al pH indicado. La tabla JO muestra los valores de la movili­ dad electroforética de 029 a l^C a diferentes pH y a una fuerza iônica de 0 ,1. Representando dichos valo­ res en funciôn del pH (figura 25), la intersecciôn con el eje de abcisas (u = O), da un valor para el punto isoeléctrico de 029 de 4,3. Tabla 29- Distancias recorridas por 029 a pH 2,7 y I =^0,1 sometido a un campo de 3,46 V cm Foto t , seg Borde Pico d , cm 1 0 9.050 11.285 2.735 2 3.600 9.143 12.510 3.367 3 7.500 8.938 12.963 4.025 4 9.960' 9.090 13.572 4.482 5 12.480 9.054 13.956 4.902 6 15.360 9.027 14.302 5.355 7 17.940 9.109 14.900 5.791 • 8 21.540 9.080 15.650 6.570 r"* , - ' > <-> C.) .y y y y 10 15 yyy EO ï% Figura 24. Migraciôn electroforética de 029 a pH 2,7 y I := 0,1 en funciôn de t, sometido a un campo de 3,46 V cm Tabla 30. Movilidad electroforética de 029 en tampon de Michaelis (lôC; I = 0 ,1) en funciôn del pH. 2 - -1pH u, cm V seg 2,7 + 5 ,1? X 10"5 3,'f + 4,51 X io"5 3.8 + 2,89 X io"5 4,5 - o,32x 10"5 4.9 - 0,63 X 10"^ -55.9 - 0,99x 10 ^ 6.8 - 1,62 X lo"5 7.8 - l,68x 10"^ 7.8 - l,70x io"5 9,0 - 1,71X 10"^ r - -L .. 7 Figura 25. Punto isoeléctrico de 029 IV.11. PESO MOLECULAR DE 029 11.1. A partir de la ecuaciôn de Svedberg Conocidos el coeficiente de sedimentaciôn, s^o el coeficiente de 'difusiôn, y el velu- men especifico parcial, , de 029, el peso molecu­ lar de la particula puede determinarse a partir de la ecuaciôn de Svedberg (tabla 31): M RT s D(l-vpdO De este modo se obtiene para 029 un peso mo­ lecular de (l7“l) X 10 .̂ o H HvûKDO O II CM bO U 0) « 0) >in (D T5 Pi '0 •H Ü (3 b Ü O ce I—I ü) U U •H -PShceA ce ON CM Q'O Pi ce Hb üo H0 S 0w 0Ph rH ce H 0 H o H NO ON NO H o-\ H I O H X r-| CM lA ON CM CA X O CM X (A CO ON l CM O X H N X O CM H X ON H CA 00 CM W CM S r CM m r o % co (% Cl-' CM H D CM l> H Q CM H A ' rII s CM CM H O H X co lA H CO Cvl O X NOo H X NO C?N NO H 30 I O H X cA ON CM Q t) % Q H %., to % r r r r Q r CM̂ S __ / NO O O o X NOo O H CMII X O n CA co Oco NO 1 r-4 O H X II lA 11 CM Q. CM l> I H D % Q __ CM i> I H CM r- r r NOO H X H NO CM o CM H H l> O 1 H X H X /-s H O ON ON. +1 CA 00 H' Cl___ O CM l> II 11 H CM 2 : b ;s: 11.2. A partir de la composiciôn quimica Conocido cl peso molecular del DNA de 029 (27,28), el peso molecular de la particula puede calcularse determinando el porcentaje de la masa total que es DNA (78). Para ello se déterminé primero el porcen­ taje de N en la proteina de 029 (tabla 32), a partir de la composiciôn de aminoacidos de la proteina del virus, y el porcentaje de N y P en el DNA de 029 (tabla 33), a partir de la composiciôn de bases del DNA. A partir de estes datos (tabla 34) se obtie­ ne que 1 unidad de -̂ 260 0^9 contiene 89-2 jug de virus, de les cuales,'48-l son DNA. De estos va- lores y del peso molecular del DNA, M = (ll^l) x 10 ,̂ se obtiene para 029 un peso molecular de (19-I) x 10^ Tabla 32 . Porcentaje de N en la proteina de 029 Aminoâcido Fracciôn molar 1 M W W (N) Lisina 0 048 128, 19 6 2-0 1 1 34-0 02 Histidina 0 020 137, 16 2 7-0 2 0 84±0 03 Arginina 0 036 196, 21 5 6-0 2 2 02-0 04 Acide aspârtico 0 135 119, 10 15 6±o 2 1 89-0 01 Treonina 0 080 101, 12 8 1-0 1 1 12±0 01 Serina 0 070 87, 09 6 1-0 ]. 0 98^0 01 Acido glutâmico 0 101 129, 13 13 0-0 1 1 4i±o 01 Prolina 0 022 97,13 2 1-0 1 0 31-0 01 Glicina 0 075 57,07 4 3-0 1 1 09-0 01 Alanina 0 072 71, 09 5 1-0 1 1 01-0 01 Cisteina 0 003 103, 15 0 3-0 1 0 o4±o 01 Valina 0 093 89, 15 8 3-0 1 1 30-0 01 Metionina 0 039 131, 21 5 1-0 1 0 99-0 01 Isoleucina 0 063 ' 113, 17 7 1-0 1 0 88-0 01 Leucina 0 07-6 112, 17 8 6±o 1 1 06-0 01 Tirosina 0 024 163, 19 3 9-0 2 0 34±o 01 F enilalanina 0 031 147,19 4 6-0 2 0 43-0 01 Triptofano 0 012 186, 22 2 2-0 2 0 34±0 02 108 9-0 6 16 91-0 07 r + % de N en proteina = J-.-V-’J x 100 = 15,5 - 0,1 108,9 -0,6 1. Al peso molecular de cada aminoâcido se le ha restado l8, es decir,- el peso del mol de agua liberado en la formaciôn de cada enlace pcptidico. ONCMTSl H0 n0 (0 ■p 0Üh0ft CA CA CSH aH PLi 0 •H-P'0 0H 0 1 H H CM m O o O O o+ 1 + 1 + 1 -1-1 + 1 NO i n H CO o ON ON VD i n H CA 0 H O ON CM CA CM H CM H (Q 'T' *' W' < iz; m NO H H CA CM 1—1 in P CA CA CA CA P CM NO CM c^. O o o O% o o o o'0 r- r r- iz; •H Pi(Ü O o o o Ü + 1 + 1 + 1 +10 Ü H H in NO 00 T) 0 0e H o CA CO Pi CA CA H H0 P - • n O o o O P p p p ÎA s 2 < o c3 '0 V V V H CM H CA CA / ---V O O O o O% +1 + 1 + 1 + 1 + 1CO in CM CM. [N- ►5 HCM CO CD CA H Hin A - NO o ON O H c H H 4-1 4-1 1 4-1 4-1 CA i n o O CO CA H NO O O H CA NO NO CA CA o + 1ND UAH OOH 0 CM O- f I ON II ooH CA ON i n ON O H O H + I 4* 1 4-1 4-1 n . CO O CO H O H O m CA CA CA CA CA g P PI0 P 0 'O H0 U'HÜ 0 tfl 0 • CO 0 H Ü •H 0 -0 '0 P (Q P +> 0 W 0 0 p U Ü 0 a PI 0 0 ÜH cd p 0 PIm 0 0 (d xi •H Cj4J 0 0 0 0H ■ V Ü 0 Pi : ' 0 p 0 Ü T5 0 d s Ü L 0 0 p V cd d P u •H PI T} 0 ' 0m 0 T ) P (d 0 Pim 0 rQ 0 •HH p 0 (d X 0 bO Pi (d aH 0 pi T5 0 0 P P 0 0 B B p 0 0 m -o 0 P 0V) P 0 < P % < - CM H o O < CM < OH + 1 0 + 1 +10 Q bO O Td 1 UN d UN - (H CO -4^ Pi n - cod bO bOH "4 3 ^ ü0H0 Ë O% 0P H 0 V % (0 ü•H E'H g. d '0•H ü•H0O 0 ü 0 0 O •HOpi"O 0'd ONojTSl 0T5 d Hd ü 0 H0 E G%0 lA CA H d o 1 + 1< NO Q - UN d H 0 12; OH O NO CM < \ . NO d O d CM H •H 0 + 1 X +> 0 n - H Pt CA P +1 bQ ON H N P CA CM O * O •- NO O CA CM < 4-1 d r~i P lA •' d W II S ON o NO CM . < NO O \ O NO d CA p CM fi X< O \ P 0 /—N d O P 4-1 p 12; 4-1 4:1 0 Ia 1 p Pi CO 4-1 < CO P »- 12: ^ NO I lA p Q p bO bO 11 CO CM p O NO 4- 1 4 -1 " ' CM d CM P < CM UN CO " \ CO : O O 0 O < bO 12 4 - 1 4 - 1 d 4-1 Q P - f CO 1 CA d - - ï?0 ON ON CA ^ bO P NOp Q P P - CM 4-1 0 - bO o P d P P 4-1 w fi 00 II 0 »- UN Q iz; P S 0 d 0 fi P 0 0 A 0 0 P 0 f i fi V0 fi f i 0 d ü P Pi 0 11 f i 0 P 0 O 0 Vû fi P CM 0 fi C H d '0 fi d > CA d fi A fi p W d p fi fi f i 0 0 * d * ü ON Q P P fi 0 p p P CM d 0 d d P bO d > P f i 0 d p P d 'd P p W P P CA 0 • E d g d 00 < P P f i Q P r - Q d d P P o % II CA P 0 fi ■—/ '0 < d ' d 0 X; P fi 0 0 Q - 0 0 bO 0 CA d 0 p d 0 0 \ P 0 P P d d O '—/ d 0 f i o f i fi p 0 0 0 p p g 0 0 d d ü X Q d W 0 P fi fi LA 0 f i 0 '0 p " d '0 d 0 p d p d d ü • • d ü d p 0 p p ü 0 0 p ü 0 p p 0 0 CA 0 0 /—' d 0 p.< p fi A fi fi p E P p E '0 p P 0 'd % d 0 p 'd o fi ü 0 0 fi d fi d d d d CM '0 d fi 0 P P w p P fi d P 0 ü p E 0 0 d 0 d 0 p d d d fi d . f i 0 0 0 0 d 0 0 ü 0 p 0 ü P d d fi d d d p P d p p 0 ü ü 0 ü ü d fi fi d fi d fiCA d d d d P d 0 0 0 0 0 0 d P Q Q 0 D d Q p o d P CM CA LA P 0 d X (dco P LA d • • 0 , d /—\ H fi P0 ■' o A O4-1 0 4-1 LA 0 Ofi - LA fiP 0 CO ü CM 0 CA CA p CM>' 0 P CA d 0P P p dfi fi P II d v0 ,A P fi dO d P o A '—' p dfi fi d«A* p 0 ü 0 P o p fi P 0 0 'Hfi P Ü 00 A d 0> AM co fi 0 CO - 0 P 0 LA W LA d P II c •H 0 LA ü • • LA d 00 fi* d/—\ A- 0 II fiP •r-j N fi - 1 d CA 0 O p 0 4 1 CA fi rO O 0 CO d JTA ü .p P fi d CO 0 • • p •• A 0 /-— ' P O d 0) NO 0 p p d d pd % % % ü p 0 fi /-V /— ' fid co CA •H P N d d •H ü fi d;û fiow dH 0T3 CM O + 1co lAH 00 COLA d•' d PN p orÛ dli d HP o o 0p 0 w\ tfj dNO d p •' PLA fiP P 0 0X ' "d ^ 00 12 0'd 0^ 0•A)z-' 0 dlA -H pw fip 0% p u'd fi^ fi 0-cf d p P p CA 0 0 0 0 0 0 fi'd 'd TJd nd 'du 'd^oü . po fi O P o o LA 0 0'd p 'dp "d d - ' d d P p P "ri p p LA P fiÜ fi Ü Ü Ü Ü P Ü Pfi d f i 0 f i f i \ f i Ë-d p ' d p ' d ' d O ' d f i0 0 0 0 0 o 0 0P < P 0 Q Q P Q P ND N CO CA O P ^ p P V. D I S C U S I 0 N El objetivo fundamental de esta tesis ha si- do la determinacion de la composiciôn quimica y de los paramétrés quimicofisicos del fago 029 necesa- rios para calcular su masa molecular, con el fin de estimar el numéro de subunidades de cada una de las 7 proteinas estructurales présentes en la câpsida del virus (30). Para dicho estudio era previo disponer de virus homogéneo en cantidad suficiente. Los métodos publicados para la purificaciôn de 029 eran adecua- dos para obtener pequehas cantidades de virus (27, 30), pero no para obtener la cantidad de fago sufi-: ciente para realizar los anâlisis que se describen en esta tesis. El rnétodo de purificaciôn de 029 que se des­ cribe aqui parte de 3 7 litres de un lisado de bacte- rias infectadas, pero la escala del proceso puede au- mentarse fâcilmente. Como es general en cualquier proceso de purificaciôn de macromoléculas en gran escala, uno de los primeros pasos del proceso es la concentraciôn del fago présenté en el lisado. Esta concentraciôn puede hacerse por precipitaciôn iso- elôctrica a pH 4,3 o con polietilenglicol (42). Los dos procediniientos dan lugar a una bucna recupera- ciôn del virus, pero el segundo es mas conveniente por su economia y suavidad. El segundo paso de la purificaciôn es una crô matografia a través de vidrio con poros de diâmetro medio 20-40 nm (43, 79-81), Como este tamano es in­ ferior al del virus, este aparece en el volumen ex- cluido de la columna, bien separado de los contami­ nantes de menor tamano. Después de este paso cl virus complete esta contaminado con particulas vacias (sin DNA) y otros componcntes estructurales (cabezas con o sin cuello), que no quedan retrasados en la colum­ na de vidrio poroso. Las particulas complétas pueden separarse de las que no contienen DNA, por centrifugaciôn en ClCs hasta equilibria de densidad (44). En el gradiente de densidad aparecen très zonas (1, II y III, figura ^). El pico I ( 1,44 g cm ^) es virus infective, el pico II ( ^ = 1,42) son variantes morfolôgicos es- pontâneos de la particula que contienen DNA y el pi­ co III (Ç<^1,40) contiene una mezcla de particulas sin acido nucleico. El fago 029 obtenido de este modo es homogé­ neo por varios criterios: a) Al microscopio electrônico se observan par­ ticulas virales complétas. b) El material sedimenta como un solo compo- nente en un gradiente de sacarosa. c) Por velocidad de sedimentaciôn en la ul- tracentrifuga, por difusiôn y por electroforesis li­ bre se observa sôlo un componente. d) En el material purificado sôlo se obser­ van, por electroforesis en gel de poliacrilamida las siete proteinas virales previamente identificadas analizando virus marcado con aminoacidos radioactives (30). El rendimiento de virus homogéneo obtenido, respecte al virus total présente en el lisado, fué de un 90%* Como 1 ml de una soluciôn de 029 que con­ tiene 1 unidad de -équivale a 0,084 mg de 029 (pag. 117), las 9•589.unidades de A^^g de virus ho­ mogéneo procedentes de un lisado de 17 litres (ta­ bla 7)1 equivalen a 469 mg de virus. Adoptando para 029 una masa molecular de I8 x 10^ (ver mas adelante), como 9-589 unidades de -̂ 260 15equivalen a 9*5 x 10 unidades formadoras de pla­ ças, el numéro total de particulas es ^ 89^ 0,08^ , 10:2 X 6,02 X 1 q 2 3 = 1,6 X 18 X 10 de las cuales un 34,3% (5*9 x 10^^) son infcctivas. El peso molecular de 029 s e déterminé por dos métodos: (l) a partir de la ecuaciôn de Svedberg, una vez determinados los coeficientes de sedimenta­ ciôn y difusiôn y el volumen especifico parcial de la particula y (2) a partir de anâlisis quimicos del fago complete, DNA y la proteina, y tomando para el peso molecular del DNA un valor de 11 x 10 ̂ (28). Para la determinaciôn del volumen especifico es necesario conocer la relaciôn existante entre la ^260 y ^1 peso seco del mismo. De medidas realizadas en dos expérimentes diferentes se obtuvo para 029 en diluyente de fago una absorbancia espe- cifica de 11,9 - 0,1 unidades de -̂ 260 mg de vi­ rus por g de disoluciôn. Es decir, 1 ml de una sus- pensiôn de 029 en diluyente de fago que tiene una “̂260 ~ contiene 0,084 mg de virus. El volumen especifico se déterminé a partir de la relaciôn entre densidad y concentraciôn de di- soluciônes de 029 en diluyente de fago a 202, obté- niendose un valor para v^ = 0,604 - 0,OO6 cm^ g ^. El coeficiente de sedimentaciôn de 029 se dé­ terminé a 202 en diluyente de fago a diferentes con- centraciones, se extrapolé a concentraciôn cero y,fi- nalmente, se corrigiô para el valor correspondiente a agua, obteniéndose un s^q ^ = (251 - 2) x 10 seg El coeficiente de difusiôn de 029 se determi nô en diluyente de fago a ISC con objeto de minimi- zar convecciones térmicas. Partiendo de una disolu­ ciôn concentrada de virus (30 unidades de ^260 P®^ ml) el coeficiente de difusiôn se obtuvo por très métodos diferentes, obteniéndose los siguientes rc- sultados: Método Relaciôn altura-area bon p's worth Papel de probabilidad n30 2 -11 DF ^ seg 3,9 : 0,2 4,4 i 0,1 4,3 - 0,2 Para concentraciones mas diluidas del virus el se déterminé empleando solo el método de la relaciôn altura-ârea. De la relaciôn entre coeficien­ te de difusiôn y concentraciôn se extrapolé a dilu- ciôn infinita, obteniéndose un D° = (4,9 - 0,1) - 8 2 — 1X 10 c m seg . Corrigiendo este valor para agua a 202C se obtiene para 029 un D°^ = (9,2 - 0 ,5) x ,„-8 2 -1 10 cm seg Como puede observarse, la correcciôn de tem- peratura practicamente duplica el valor del coefi- ciente de difusiôn; para garantizar la validez de la correcciôn se de.terniinô el valor del coeficiente de difusiôn de 029 a 20QC en diluyente de fago a una ùnica concentraciôn (9,3 unidades de obte­ niéndose un = (8,5 - 0,6) X 10 ̂cm^ seg ^. Corrigiendo para Las diferencias de viscosi- dad del agua y del diluyente de fago a 202 (tabla 20) se obtiene ̂ = 8,5x10 ̂X 1,028= (8,7-0,6) X 10 ̂ cm^ seg ^, 20,W " un valor muy proximo al calculado a partir de las medidas realizadas a 12C, Sustituyendo los valores de v^, s^q ^ y en la ecuaciôn de Svedberg se obtiene para la masa + , N , ,.6 , -1molecular de 029 un valor de (17 - l) x 10 g mol ' . El modo de determinar la masa molecular de un fago, conocida la masa de su DNA, se basa en anâ­ lisis puramente quimicos (78), que permiten determi­ nar el porcentaje de la masa total del virus que es DNA. Este método requiere analizar por separado el virus complète, la proteina y el DNA. Refiriendo todos los valores a 1 ml de una disoluciôn de 029 que teiiga una = 1, a partir de un anâlisis de P total en fago y de la composiciôn de bases del DNA, se obtienen 48 jig de DNA Na por unidad de ^260’ ^ste valor es muy proximo a 46,1 - 0,4 , obtenido de un anâlisis directe del DNA en fa­ go . Para calcular los microgramos de proteina de fago por unidad de A^^^ se détermina, primero, los microgramos de N en la proteina del fago, que es igual a la diferencia entre el N total en el fago, deducido del porcentaje de N en el fago y la absor­ bancia especifica del mismo, y el N en el DNA, dedu­ cido del porcentaje de N en DNA y de la absorcion especifica del DNA Na. De esta diferencia se obtie­ nen 5,8 pg de N en la proteina por unidad de -^260’ que multiplicado por el porcentaje de N en proteina, obtenido de la composiciôn de aminoâcidos, da 37 de proteina. Por tanto, si por cada 48 jrg de DN Na bay 37 yig de proteina, tomando para el DNA de 029 un valor de 11 X 10^ (27, 28) se obtiene para la masa molecu­ lar de 029 un valor de (19 - l) x 10^ g mol ^. De un modo mâs directe, el porcentaje de la masa de 029 que es DNA puede determinarse de la masa del fago (84 del anâlisis directe del DNA (46,1 estos valores, tomando para el peso molecular del DNA de 029 un valor de 11 x 10 ,̂ la masa de 029 résulta 20 xlO^g mol ^. Otro método independiente de estimar la ma­ sa del fago 029 es a partir de las absorciones es- pecificas a 260 nm de la particula, el DNA y la proteina. Tomando para la absorbancia especifica del DNA bicatenario 20, y para las absorbancias del fago complete y la proteina, 11,9 (tabla 12) y 1,2 (ta­ bla 13), respectivamente, y suponiendo que la con- tribuciôn de cada componente esta en relaciôn a su masa, tomando para la del DNA un valor de 11 x 10 ,̂ résulta para■ la masa del fago un valor de (19 - 2 ) -, ^6 1 “1 x 10 g mol . En conclusiôn, de estos resultados puede con- cluirse que la masa molecular de 029 es de unos l8 x 0 —110 g mol . Una vez conocida la masa total de], fago, puede obtenerse la masa de la câpsida restando a la primera el peso molecular del DNA, resultando, por tanto, para la câpsida protéica de 029 un peso mole- 6 -1 cular de alrededor de 7 x 10 g mol Para estudiar la morfogénesis de un fago como 029 es conveniente disponer de un modelo, que de cuenta del numéro de subunidades de cada proteina e^ tructural y su posiciôn.relativa en la particula. Una vez conocida la masa proteica del fago, los pe- SOS moleculares de cada proteina estructural y sus masas relativas, ha sido posible estimar que la ca- beza de 029 consta de 85 subunidades de proteina HPl, 5 subunidades de proteina HP2 y 55 subunidades de proteina HP3; el cuello consta de 5-6 subunidades de proteina NP2 y NP3, y 12 subunidades de proteina NPl; finalniente, la cola consta de 3 subunidades de proteina TPl. De estos datos, adoptando para la câp­ sida de 029 una siinetria bâsica icosaédrica, se ha construido un modelo que explica los datos de los anâlisis quimicos del fago y estâ de acuerdo con la estructura observada por microscopia eléctronica de la particula normal de 029 y do los variantes morfo­ lôgicos que se describen en esta tesis (82). VI. C O N C L U S I O N E S 1. El bacteriôfago 029 de Bacillus subtills sè ha puri­ ficado partiendo de 1? litros de cultive, obteniéndo­ se cerca de 0,5 g de virus homogéneo, de los cuales un 54% corresponden a particulas infectivas. 2. El virus purificado es homogéneo por los siguientes criterios: microscopia electronica, sedimentaciôn, difusiôn, electroforesis y anâlisis de las proteinas estructurales de la particula. 3. La absorbancia especifica a 260 nm de 029 y de la proteina viral, libre de DNA, en diluyente de fago es 11,9 - 0,1 y 1,2 - 0,1 unidades de A^^^ por mg de material seco por grarno de disoluciôn. 4. Los valores del volumen especifico parcial, el coe­ ficiente de sedimentaciôn y el coeficiente de difu­ siôn de 029 son, respec'tivamente, 0,6o4 - 0,006 cm^ g“ ,̂ (251 - 2) X 10"13 gcg y (9,2 - 0,5) X 10“ ̂cm^ -1 .seg . 5. El punto isoeléctrico de 029 es 4 ,3- 6. Usando la ecuaciôn de Svedberg y los datos del apar- tado 4 , el peso molecular de 029 es (l? - l) x 10^ - 1g mol 7. A partir de anâlisis quimicos, el peso molecular de 029 es (19 - 1) X 10^ g mol“ .̂ VII. B I B L I O G R A F I A 1.- Crick, F.H.C. and J.D. Watson. The structure of small viruses. Nature, 177, 473 (1956). 2.- Crick, F.H.C., L. Barnett, S. Brenner and R.J. Watts-Tobin. General nature of the genetic code for proteins. Naturae, 192, 1227 (I96I) 3.- Nishimura, S., D.S. Jones and H.G. Khorana. Stu dies on polynucleotides. XLVIII. The in vitro synthesis of a co-polypeptide containing two amino acids in alternating sequence dependent upon a DNA-like polymer containing two nucleoti­ des in alternating sequences. J. Mol. Biol. 13, 302 (1965). 4.- Klug, A. Point groups and the design of aggrega- tes. En "Symmetry and Function of Biological Systems at the Molecular Level"; eds. A. Engs- trdm and B. Strandberg, p. 425- New York: John' Wiley a Sons (1969)- 5 - - Tsugita, A., D.T. Gish, J. Young, H, Frankel-Con rat, C.A. Knight and W.M. Stanley. 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